informe de laboratorio javier,regina,juan(1).docx
Post on 22-Dec-2015
247 Views
Preview:
TRANSCRIPT
INFORME DE LABORATORIO
MICROBIOLOGÍA
Regina Gutiérrez Villegas ID 00027312
Luis Javier Rojas García ID 000297039
Juan Carlos Pino Vallecilla ID 000
Laura Marcela Trujillo Vargas
DOCENTE
PROGRAMA MAESTRÍA EN BIOTECNOLOGÍA
UNIVERSIDAD PONTIFICIA BOLIVARIANA
MEDELLÍN COLOMBIA
2015
INTRODUCCIÓN
Los microorganismos en general tienen la posibilidad de crecer en los más
diversos ambientes, dado el potencial metabólico y la capacidad respiratoria.
En esta práctica de laboratorio se trabajó con la levadura Sacchharomyces
cerevisiae, la cual es capaz de asimilar una gran variedad de monosacáridos.
También puede hidrolizar y consumir algunos carbohidratos mayores, como la
sacarosa, maltosa, rafinosa, maltotriosa y pectina, pero carece de las enzimas
necesarias para utilizar la lactosa, el glucan y el almidón. Los carbohidratos
asimilados son degradados y oxidados durante el catabolismo a través del ciclo de
la Glucólisis (o vía Embden-Meyerhof-Parnas). La levadura aprovecha la energía
liberada de cada mol de glucosa: para formar dos moles de ATP y la usa en la
etapa anabólica. (Madigan, et al)
Para medir su actividad frente a los diferentes sustratos de la levadura se emplea
un equipo para determinar la biodegradabilidad de sustancias nutritivas,
impurezas, contaminantes o residuos mediante la actividad microbiana, se realizan
a menudo las denominadas mediciones de la respiración (= mediciones del
agotamiento). En estas pruebas se determina en condiciones definidas la
respiración de los organismos, medida como absorción de oxígeno o generación
de dióxido de carbono. Las mediciones se realizan mediante sistemas cerrados
con OxiTop®-C y el Controlador OC 110.
Por otro lado se realizó la determinación de proteína en muestras de tusa de
maíz inoculadas con el hongo Pleurotus Pulmonaris correspondientes a 0 dias , 5
días, 10 días , 12 días , 15 días y a 20 días , de inoculación, se realizó una curva
de calibración.
Se llevaron a cabo dos practicas más que fueron una tinción de gram y un
aislamiento microbiológico en medios: agar nutritivo y agar PDA, solo como
practicas demostrativas para aprender el procedimiento.
METODOLOGIA
Practica Nᵒ 1
Materiales y equipos
Levadura Saccharomyces cervisiae Agua destilada Azúcar Jugo de mango criollo Jugo de uva Equipo Oxitop NaOH Magnetos Balanza electrónica Beaker
Probeta
Fundamento
Como se dijo en la introducción se va a realizar una prueba que consiste en
observar el crecimiento de la Sacaromyces cereviciae en varios tipos de sustrato,
empleando para esto el equipo del OXITOP, el cual permite determina en
condiciones definidas, la respiración de los organismos medida como absorción
de oxígeno o generación de dióxido de carbono, este última será la que
emplearemos.
Se preparan 5 muestras así:
Levadura activada 22 ml + agua 200 ml + azúcar 5 grs azucar
Levadura activada 22 ml + agua 200 ml
Levadura activada 22 ml + jugo de uva 200 ml
Levadura activada 22 ml+ jugo de mango 200 ml
Levadura activada 22 ml + jugo de mango 200 ml + azúcar 5 grs
Las muestras preparadas son llevadas a los frascos correspondientes previamente
marcados.
Se introduce 200 ml de la cantidad de muestra problema más 22 mililitros del
levadura activada ( se activa en 100 ml de agua , 5 grs de azúcar y 1 grs de
levadura la cual se activa a una temperatura de 30 ᵒC), el inoculo en la solución
debe tener una concentración del 10% en porcentaje V/V y como se tienen 200mL
de cada medio de cultivo, por medio de un análisis de conversión se realiza un
cálculo obteniendo que se debe adicionar 22 mL de inoculo (Levadura activada)
en cada medio de cultivo a cada una de las muestras y se introducen en botellas
ámbar. Dentro de la botella ámbar se introduce magneto para que realice
agitación constante.
El orden en que se introducen es el siguiente:
1. Muestra problema
2. Inoculo de la levadura activada
3. El magneto en el fondo de la botella, verificar que esté funcionando
perfectamente
4. Al chupón negro se le agregan 3 pastillas de NaOH
5. Cerrar con el cabezote
Una vez montadas las muestras en las botellas se procede a la programación del
controlador. Una vez programadas se llevan a la Plataforma de agitación a una
temperatura de 25° - 35°C, asegurándose que esté en continua agitación. Para
que registre la actividad dentro de las botellas durante siete días.
Incubación de las muestras por 7 días
Practica Nᵒ2
Determinación de proteína por el método de Biuret
Fundamento
El nombre de la reacción procede del compuesto coloreado formado por la
condensación de dos moléculas de urea con eliminación de amoníaco. Reacción
del Biuret
Si una solución fuertemente alcalina de sulfato cúprico (CuSO4) se añade a una
solución de proteína se forma una complejo entre el ion cúprico y los enlaces
peptídicos, con aparición de una coloración violeta-púrpura, que presenta un
máximo de absorción a 540 nm.
Las características más importantes de la reacción son:
La reacción del Biuret se aplica, a partir de los tetrapéptidos, a todos los
péptidos y proteínas.
Su rango de determinación es de 1 a 6 mg/ml.
No depende de la composición de aminoácidos. · Algunos compuestos
(NH4 + , Tris, etc.) dan la reacción
Violeta-púrpura Complejo proteína-Cu(II)
Consultado en (Bradford MM 1976)
MATERIALES Y EQUIPOS
Cultivos de PLeurotus pulmonarius de 0 dias , 5 dias, 10 dias , 12 dias , 15 dias y a 20 dias
Buffer FOSFATO – NaCl pH=8.5mM. (Frio) Balanza electrónica. Erlenmeyer. Agitador. Filtro de papel. Embudo de filtración. Soporte metálico para montaje de filtración. Beaker pequeño. Reactivo de Biuret. Micropipetas y puntas. Pipetas y bomba de succión. Albumina Suero bovino: solución 10g/l. Tubos de ensayo con tapas. Espectrofotómetro (Shimadzu UV – 1601PC.). Computador.
PASOS
A. Extracción de la proteína
a. Para llevar a cabo la extracción de la proteína se procede a emplear un Buffer ( fosfato – NaCl, pH=8 ,50 mM, debe estar frio para obtener mejores resultados)
b. Se pesa 1,5 grs de la muestra( cultivo del hongo Pleurotus Pulmonaris en tusa de maíz a (nosotros nos tocó la muestra de 15 días de incubación) Se le adicionan 20 ml de buffer frio y se deja macerar agitando por 60 minutos a 150rpm ( en la plataforma de agitación), también se puede macerar la muestra con un mortero., y luego se agita
c. Filtrar la muestrad. Guardar el filtrado para hacer la lectura por el método de Biuret
FOTOS DEL MONTAJE DE LA PRUEBA DE DETERMINACION DE PROTEINAS ( METODO BIURET)
Muestras del cultivo del hongo Pleurotus Pulmonaris en tusa de maíz
Frascos en los que se llevo a cabo la extracción de la proteína antes de Adicionar el buffer
Muestras en agitación para extraer la proteina
Filtración de la muestra para obtener el buffer con la proteina
Filtrados obtenidos
B. Determinación de la proteína por método colorimétrico
Esta prueba se realiza en dos partes:1. Obtener la proteína del cultivo del hongo ( ya se realizó en el
paso A)2. Realizar una curva de calibración
Para este método se empleó el reactivo de Biuret el cual se prepara así:
a. Solución estándar de Biuret (reactivo A) se prepara con
CuSO4 . 5 H2O ( Carlo Erba) 1,5 grsEDAT (MOL LABS) 6,0grsKL ( Carlo Erba) 1,0grsNa(OH) (2.5 N )( Merck) 300 ml
b. Solución de Albumina de suero bovino ( 10g/lit para la curva de calibración. (Reactivo B)
La curva de calibración
Número del tubo ReactivosTubo 1 8 ml de A
2 ml de B0 ml de H2O
Tubo 2 8 ml de A1.6 ml de B0,4 ml de H2O
Tubo 3 8 ml de A1.2 ml de B0,8 ml de H2O
Tubo 4 8 ml de A0,8 ml de B1,2 ml de H2O
Tubo 5 8 ml de A0,4 ml de B1,6 ml de H2O
Tubo 6 8 ml de A0.2 ml de B1,8 ml de H2O
Tubo 7 8 ml de A0 ml de B2 ml de H2O
PREPARACION DE LAS MUESTRAS
Las muestras se preparan adicionando 8 ml del reactivo de Biuret y 2 mil de muestra que contiene el extracto proteico se deja reposar media hora para leerlo en el espectrofotometro
Luego de prepararlos se mezclan bien con el Vortex y se dejan reposar por 30 minutos en el Shaker.
Aquí se evidencia el momento de la lectura
En este momento se ve en el computador como se genera la curva de calibración.
RESULTADOS PRACTICA CRECIMIENTO MICROBIANO
El OXITOP hace alrededor de 199 determinaciones de CO2, con cuyos datos se construye la curva de crecimiento. Por lo que la tabla de datos no se anexa en el caso de las curvas de crecimiento
CASO 1 GRAFICA DE CRECIMIENTO DE LA LEVADURA CON AGUA DESTILADA
Se observa una gráfica en la cual el crecimiento de la levadura se da de forma inmediata sin pasar por la fase lag , pasa a la fase logarítmica o cremiento acelerado hasta las 53,48 horas ( 2 días aproximados) de fermentación , con una concentración de CO2 de 400, luego la concentración de CO2 tiene una caída leve disminuyendo a 377 ppm a las 73,888 horas osea a los 3,07 días aproximadamente, la concentración de CO2 nuevamente se incrementa a 400 ppm, en ese mismo día osea a las 89,44 horas que corresponde a ( 3,78 días) de fermentación para ser más precisos y continua aumentando sin presentar fase estacionaria , continua entonces su proceso fermentativo hasta los 6,44 días en
que se detiene la
fermentación para realizar las lecturas correspondientes , con una concentración de CO2 final de 515 ppm
CASO 2 GRAFICA DE CRECIMIENTO DE LA LEVADURA CON AGUA DESTILADA MAS AZUCAR
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 1000
100
200
300
400
500
600 Levadura sin Azúcar
Tiempo
Conc
entr
ació
n CO
2
C
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 1000
100
200
300
400
500
600Levadura + Azúcar
Tiempo
Conc
entr
ació
n CO
2
Se observa una gráfica en la cual el crecimiento de la levadura se evidencia en forma inmediata ya que a los 46 minutos ya observa una concentración de CO2 de 5,6 ppm, sin embargo a las 9,33 horas aproximadamente hasta las 10,88 horas se detiene su crecimiento, esto se evidencia en que la concentración de CO2 este tiempo se mantiene en 59,1 ppm, el crecimiento continua en forma lenta y se normaliza a las 18,66 horas con una concentración de 78,8 ppm, a partir de este momento crece en forma acelerada y a las 56,44 horas alcanza una concentración de CO2 de 400ppm , sin embargo entre estos instantes y las 70,77 horas , la levadura sufre una leve esta de crecimiento que sin ser estacionaria , es muy lento temiendo a veces lecturas en la concentración de CO2 , de disminución y aumento en forma muy leve, luego se normaliza y reinicia una fase de crecimiento acelerado hasta obtener a los 6,44 días una concentración final de CO2 , de 537 ppm
CASO 3
GRAFICA DE CRECIMIENTO DE LA LEVADURA CON JUGO DE MORA
0 20 40 60 80 100 120 140 1600
50
100
150
200
250
300
350
Jugo de mora y levadura
Tiempo
Conc
entr
ació
n CO
2
En esta grafica se observa que la levadura inicia su crecimiento en forma inmediata osea sin pasar por la fase lag llegando al máximo de producción de CO2
que fue de 301 ppm a los 5,08 días y a los 6,44 día inicia fase de decrecimiento o muerte celular
RESULTADOS PRACTICA DETERMINACION DE PROTEINA
Datos iniciales
Concentración inicial (C1)= 10 g/L
Volumen inicial (V1)= 2 ml =0.002 L
Volumen final (V2)= 10 ml = 0.01 L
Se debe hallar la concentración final (C2) para cada una de ellas, y se hizo la siguiente operación:
C1.V1 = C2 X V2
Despejamos la concentración final que es la que no conocemos y nos quedó:
C2= C1 X V1/ V2f
Reemplazamos los valores y se obtiene el resultado para cada una de ellas.
Se leyó en el espectrofotómetro (Shimadzu UV- 1601PC)(a una longitud de onda de 540 nm). Se realizó la curva de absorbancia Vs concentración.
0 50 100 150 200 2500
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
f(x) = 0.00233029010238908 x + 0.168745733788396R² = 0.954805385737726
Concentración (ppm)
Abs
Curva de calibración
En el eje X se anotan los datos de la concentración de proteína En el eje Y se anota la absorbancia (ppm).
DATOS CURVA DE CALIBRACION
CONCENTRACION (PPM) ABS
200 0,616160 0,52120 0,503
80 0,34240 0,293
20 0,2390 0,113
Volumenes C2
2 200
1,6 160
1,2 120
0,8 80
0,4 40
0,2 20
0 0
0 5 10 15 20 250
10
20
30
40
50
60
Contenido proteina Pleurotus P + Tusa Maiz
Dias
Canti
dad
de P
rote
ina
DATOS LECTURA DE LAS MUESTRAS CON Peorotus. ps.
C1 1000 ppmV2 10 ml
DIAS CONCENTRACION
0 21,8695652
5 19,6956522
10 28,826087
12 41,8695652
15 52,7391304
20 56,6521739
ANALISIS DE RESULTADOS
PRACTICA 1 CRECIMIENTO MICROBIANO EVALUADO CON EL OXITOP
Las fuentes de carbono utilizadas por las levaduras varían desde los carbohidratos
hasta los aminoácidos. Además, la capacidad de utilizar ciertos tipos de azúcares
ha sido tradicionalmente empleada para la caracterización de las distintas razas
que esta especie presenta. Entre los azúcares que puede utilizar están
monosacaridos como la glucosa, fructosa, manosa y galactosa, entre otros.
También son capaces de utilizar disacáridos como la maltosa y la sacarosa y
trisacáridos como la rafinosa. Uno de los azúcares que no puede metabolizar es
la lactosa, utilizándose este azúcar para distinguir esta especie de Kluyveromyces
lactis. También es capaz de utilizar otras fuentes de carbono distintas a
carbohidratos y aminoácidos. Entre las más destacadas se encuentra la capacidad
de utilizar tanto etanol como glicerol. Por norma general, las levaduras mantienen
dos tipos de metabolismo muy bien diferenciados. Por una parte, en condiciones
en las que existen altas concentraciones de glucosa, fructosa o maltosa, la
tendencia es a realizar una fermentación alcohólica de estos, es decir, se realiza
la glucólisis y posteriormente se forma etanol. Una vez que estos azúcares
escasean, se produce la respiración del etanol, vía ciclo de Krebs. Evolutivamente
esto es un proceso que, a priori, no es ventajoso por ser energéticamente
desfavorable para la reproducción del organismo, dado que se obtiene mucha
menos energía en el primer proceso que en el segundo. No obstante, la gran
mayoría de los organismos son muy sensibles al etanol, por lo que se ha
entendido como un proceso de competencia por sustrato. Las levaduras, además
de necesitar una fuente de carbono, necesitan tanto fuentes de nitrógeno —como
podrían ser el amonio, la urea o distintos tipos de aminoácidos— como fuentes de
fósforo. Además, son necesarias vitaminas como la Biotina, también
llamada Vitamina H, y distintos elementos traza (Feldmann G.J., 2005 )
CASO 1
En la gráfica que representa el crecimiento de la S. cereviciae en agua destilada ,
se observa un crecimiento que no es coherente con el medio de cultivo en el que
se encuentra la levadura, obviamente el inoculo de levadura viene con azúcar
blanca osea sacarosa, con esta azúcar se activa la levadura , pero ingresa a un
medio sin ningún nutriente ni minerales ( agua destilada) , no debería presentar un
crecimiento como el que muestra, este fenómeno se podría explicar desde el
punto de vista de que como tantos participamos en la preparación de la prueba
pudo incurrirse en un error y se le adiciono azúcar en más poca cantidad o la
levadura con el azúcar del inoculo tuvo suficiente para crecer y dar la gráfica que
se presenta en este momento.
CASO 2
En la gráfica del crecimiento de la levadura con agua destilada y azúcar se
observa un crecimiento coherente con los nutrientes del medio , también se
observa que la levadura no pasa por la fase lag , esto quizás se deba a que ya
viene acondicionada al sustrato ya que se activó en un sustrato similar y continua
su crecimiento hasta agotar los nutrientes que trae al ser inoculada en el medio ,
una vez los finaliza continua con la sacarosa del medio para lo cual debe iniciar
con desdoblar esta molécula para poder reiniciar su proceso de crecimiento, de
ahí esa pequeña parte de la curva que semeja una fase lag , este mismo
fenómeno parece ocurrir en la gráfica del caso 1 ( levadura con agua) , pero no tan
pronunciada .
CASO 3
En la gráfica del crecimiento con jugo de mora se observa un crecimiento normal
de la levadura en el jugo de mora, es importante recordar que la mora posee
varios azucares como se pueden (ver en la tabla) con un crecimiento acelerado sin
pasar por la fase lag ya que venía al igual que en los otros dos casos analizados,
activada, los azucares de la mora son fácilmente metabolizados por levadura de
allí su crecimiento tan acelerado , entra en fase estacionaria y de muerte a una
concentración de 300ppm , debido quizás a :
Disminución de los nutrientes
Metabolitos tóxicos de su proceso metabólico concentrados en el medio de
cultivo
Cambio de ph del medio por la fermentación
La siguiente tabla muestra una lista de la cantidad de hidratos de carbono simples de la mora:
Nutriente Cantidad Nutriente CantidadAzúcar 6,24 g. Lactosa 0 g.Fructosa 3,11 g. Maltosa 0 g.Galactosa 0 g. Oligosacaridos 0 g.Glucosa 2,96 g. Sacarosa 0,17 g.
Fuente: On line http://alimentos.org.es/calorias-mora
ANALISIS GRAFICA RECUENTO DE PROTEINA METODO BIURET
TABLA DE CALIBRACION
El error presentado por la curva de calibración, se debió a que muchos
colaboramos en elaborar la muestras problema de allí que el factor de error
humano fuese tan alto.
Al analizar los resultados de las muestras con Pleorotus p, desde los cero días
hasta los 10 observamos que, el Pleorotus p, encuentra en una fase lag , de ahí
en adelante sigue con su proceso de crecimiento presentado la fase logarítmica no
se evidencia que hubiese llegado ya a la fase estacionaria o de muerte celular,
con las muestras analizadas
CONCLUSIONES
Sería interesante evaluar como es el crecimiento de la levadura en
ausencia de nutrientes
De los tres medios evaluados se evidencia mejor crecimiento de la levadura
en presencia de agua con azúcar.
Para el trabajo con curvas de calibración es importante minimizar al máximo
el número de personas que realizan el montaje de las muestras y la lectura
de los resultados, de esta forma se maneja un margen de error menor.
La tusa de maíz , parece ser un sustrato bueno para el crecimiento de
Pleorotus p, aun que es necesario hacer más evaluaciones.
BIBLIOGRAFIA
Ugarte M. V., Tesis para maestría obtención y caracterización de cepas de
Saccharomyces cerevisiae superproductoras de glutatión
Willey, J.M., Sherwood, L.M., Woolverton C. J. (2008) Microbiologia 7ma
edicion, la curva de crecimiento pag 123
Paul Held, Monitoring growth of Beer brewing strain of Saccharomyces
cerevisiae. on-line
2015
.
http://www.biotek.com/assets/tech_resources/SynergyH1_Yeast_Growth_A
pp_Note.pdf 2)
Kevin A. Morano, The response to heat shock and oxidative stress in
Saccharomyces cerevisiae. On line 2015 :
http://www.genetics.org/content/190/4/1157.full 3)
Mike A Singer & Susan Lindquist, Thermo tolerance in Saccharomyces
cerevisiae: The Yin and Yang of trehalose. On line 2015 .
http://www.cell.com/trends/biotechnology/abstract/S0167-7799(98)01251-7 .
Arroyo-López, Effects of temperature, pH and sugar concentration on the
growth parameters of Saccharomyces cerevisiae, S. kudriavzevii and their
interspecific hybrid. On line
2015 :http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19246112 5)
Arjun Singh. Genetic analysis of mutations affecting growth of
Saccharomyces cerevisiae at los temperature. Citado el 21 de Septiembre
del 2013. Disponible on-line en:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1213157
Madigan T., Michael, Martinko M., Jhon, Parker, Jack. Brock Biología de los
microorganismos. Pearson Prentice Hall. Décima edición. p: 957-985
Bradford MM (1976): A rapid and sensitive method for the quantitation of
microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.
Anal Biochem. 72: 248-254.
Feldmann G.J., 2005. Levaduras y biotecnología pag 26-44
top related