implementaciÓn de un ensayo pcr multiplex para la identificaciÓn de las enterovariedades de...

IMPLEMENTACIÓN DE UN ENSAYO PCR MULTIPLEX PARA LA IDENTIFICACIÓN DE LAS

ENTEROVARIEDADES DE Escherichia coli PATÓGENAS

Autora: Andrea Zambrano Cobos

Directora: BSc. Karina PonceCodirector: Dr. Marcelo Grijalva

Sangolquí - Ecuador2012

TABLA DE CONTENIDOS TABLA DE CONTENIDOS

Escherichia coli (Enterobacteriaceae)

CARACTERÍSTICAS:

•Anaerobio facultativo, Gram -•Pared celular rígida y porosa •Flagelos y pilis•Membrana celular (lípidos y proteínas) •Una sola cadena circular de ADN•Aproximadamente 5000 genes

1. EPEC2. ETEC3. EIEC4. EHEC5. EAEC6. DAEC

CATEGORIAS DIARREOGÉNICAS

•Poseer distintos factores de virulencia•Causar un síndrome diarreico diferente•Presentar distinta epidemiología•Pertenecer a distintos serotipos O:H

Métodos específicos de detección

MECANISMO DE PATOGENICIDAD MECANISMO DE PATOGENICIDAD

Variabledepende E. coli diarreicas

• Invasividad.

• Adherencia a la superficie de la mucosa.

• Producción de enterotoxinas.

• Producción de citotoxinas

ETAs

EHEC: La distribución es universal. Los alimentos asociados a brotes son el arroz, carne contaminada, salsa de vainilla.

ETEC: Diarrea del viajero. Países en desarrollo. La transmisión ocurre por la ingesta de alimentos o agua contaminados.

EIEC: Genéticamente igual a Shigella spp. Presentan colitis inflamatoria y disentería.

EPEC: En niños menores de 2 años. Elevadas tasas de morbilidad y mortalidad. Trasmisión por contaminación fecal

EAEC: La causa más frecuente de diarrea persistente en lactantes

DAEC: Predomina en pre-escolares, niños pequeños y lactantes

VIGILANCIA EPIDEMIOLÓGICA

• Países desarrollados y subdesarrollados

• Datos epidemiológicos

• No existen reporte de E. coli patógenas

DETECCIÓN

1. Propiedades bioquímicas

2. Serotipo (Ciertas variedades)

3. Reacciones inmunoenzimáticas 4. Cultivos celulares

5. PCR

6. Hibridación de sondas

Para estudios epidemiológicos PFGE, MLST

PCR MÚLTIPLEX

Simple identificación 2 ó más loci en la Rxn

Amplifica

• Diagnóstico rápido

• Alta confiabilidad

• Sensible y específico

Esta correlacionado con la presencia de genes involucrados con la patogenicidad

Objetivo General

Implementar un ensayo PCR múltiplex para la identificación de las enterovariedades de Escherichia coli patógenas 

OBJETIVOS DE LA INVESTIGACIÓN

• Optimizar el sistema según los parámetros: Temperatura de hibridación, concentración de primers, tiempo y ciclos de amplificación

• Identificar los genes eltB y estA de E.coli enterotoxigénica, los genes vt1, vt2 y eaeA de E.coli enterohemorrágica, el gen ipaH de E.coli enteroinvasiva, el gen eaeA de E.coli enteropátogena, el gen aggR de E.coli enteroagregativa, el gen DA de E.coli difusa adherente

 • Determinar la sensibilidad analítica del sistema.  • Elaborar un protocolo de implementación del ensayo PCR multiplex para la

identificación de las enterovariedades Escherichia coli patógenas.

Objetivos específicos

MATERIALES Y MÉTODOS

DISEÑO DE TIPO EXPLORATORIO - CONFIRMATORIO

Optimización: [primers], Tº Hibridación, Ciclos y tiempo de amplificación.

Diseño PCR Multiplex

Sensibilidad

Especificidad

Controles positivos y primers

Instituto de Ciencias Biomédicas de la Universidad de Chile y Dr. James Nataro de la Universidad de Virginia

Cebadores

DAEC EPEC EHEC EIEC EAEC ETEC

eltBestAeae vt1 vt2 ipaH aggRDa

322 pb

147pb

376pb

130pb

298pb

600pb

254pb

750pb

Extracción ADN genómico

Kit comercial de Promega Wizard Genomic DNA Purification

Temperatura de hibridación

Rango: 56ºC-68ºC

OPTIMIZACIÓN

Concentración de Primers

0,2 uM - 0,4 uM - 0,5 uM - 0,75 uM - 1uM

DISEÑO DE PCR MULTIPLEX

1. Ensayo PCR: 8 pares primers en una Rxn

2. Ensayo PCR: Combinación de 2 pares de primers con cada DEC

3. Ensayo PCR: 2 PCR multiplex A y B

Tiempos de amplificación

1 min-45 seg- 30 seg

LÍMITE DE DETECCIÓNCepas de referencia : EHEC y ETEC

ESPECIFICIDAD

Escherichia coli Escherichia coli ATCC 51313Escherichia coli ATCC 25922Klebsiella pneumoniaeSalmonella serotipo EnteritidisVibrio cholerae

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Microbiología

ADN Genómico

ETEC: 33,6ng/uL

EPEC: 20,2 ng/uL

EIEC: 17,8 ng/uL

EHEC: 17,3 ng/uL

EAEC: 47,5 ng/uL

DAEC: 10,8 ng/uL

Temperatura de hibridación

M ipaH ipaH ipaH ipaH eae eae eae eae

M eltB eltB eltB eltB aggR aggR aggR aggR

EIE

C-E

PE

CE

TE

C-E

AE

C

EIE

C-E

CD

A M ipaH ipaH ipaH ipaH Da Da Da Da

M vt2 vt2 vt2 vt2 vt2 vt2 vt2 c-

EH

EC

Concentración de cebadores

0,4 uM 0,2 uM

vt1 eae eltB aggR Da vt1 eae eltB estA Da Da Da

Diseño PCR multiplex

Pool DNA

Primer Ensayo

Concentración de primers

Segundo Ensayo

PCR Dúplex

Tercer Ensayo

MULTIPLEX A Y B

A: EHEC-EPEC-DAEC

B: ETEC-EIEC-EAEC

B A

Tercer Ensayo

MULTIPLEX A Y B

Limite de detección

Multiplex A : EHEC

Multiplex B : ETEC

0,0029 ng/uL

0,011 ng/uL

ESPECIFICIDAD

M ETEC Salm Vibrio K.pneu C-

Amplifica E. coli patógenas!!!

Prueba de Campo

M m1 m2 C1+ C1- m1 m2 C2+ C2-

Múltiplex A Múltiplex B

EPEC ETEC

Conclusiones

Se logro detectar los 8 genes virulentos de la E. coli diarreicas en dos PCR multiplex

Los parámetros que fueron optimizados en la PCR monoplex variaron al momento de diseñar la PCR multiplex.

Las [primers] oscilan entre 0,1 uM a 1,25 uM, la Tº de hibridación optimizada fue de 57ºC, el tiempo de los pasos de la PCR fueron de 45”.

Se dividió en 2 PCR multiplex: A identifica ECEH, ECEP, y ECDA. B identifica a ECET, ECEI, ECEA.

La sensibilidad PCR multiplex A fue de 0,0029 ng/uL y B fue de 0,011 ng/uL.

La especificidad del sistema se evaluó en otros microorganismos, resultando negativo la amplificación

Recomendaciones

Realizar la técnica directamente desde las muestras de heces o desde la bacteria, aislando el ADN mediante kits comerciales. Antes de diseñar la PCR multiplex

optimizar la temperatura de hibridación de cada cebador y la concentraciones de los mismos.

Usar la PCR múltiplex para investigar un número elevado de microorganismos.

Hacer uso de esta técnica para estudios a mayor escala como es la prevalencia de las diferentes enterovariedades de E. coli, caracterización genotípica, etc.

AGRADECIMIENTOS