hplc y desarrollo 2009

Cromatografía de Líquidos de Alta Resolución

1. Definición2. Formas de Cromatografía Líquida3. Instrumentación4. El cromatograma• componentes• Parámetros de retención, separación, eficiencia

2. Formas de Cromatografía LíquidaLíquido - Sólido (Adsorción)Fase Unida

NormalInversa

Intercambio IónicoExclusión molecularAfinidad

Cromatografía de Adsorción

•La fase estacionaria es un sólido.•El analito y la fase móvil compiten por los sitios activos de la fase estacionaria

Fases estacionarias: sílica, alumina

Cromatografía de Adsorción

• Sílica y alúmina son las fases más utilizadas

• Soluto y solvente son atraídos por los sitios activos de la fase estacionaria

• La separación es posible si los solutos tienen diferentes grados de atracción

La separación se basa en la diferencia de afinidad (solubilidad) del soluto entre la fase móvil y la fase

estacionaria

Partición

KD =

Conc. analito en fase estacionaria

Conc. analito en fase móvil

Cromatografía de Partición

•Basada en el mismo principio de extracción

•Las especies más retenidas son las que tienen mayor afinidad (solubilidad) por la fase estacionaria

•La separación de los solutos está basada en las diferencias de solubilidad

Tipos de fase unida

Normal: La fase estacionaria es polar y el solvente es no polar

Inversa: Fase estacionaria no polar y solvente polar

Cromatografía de Exclusión molecular

La separación se basa en la diferencia en el volumen molecularPartículas más pequeñas son retenidas más tiempo

INTERCAMBIO IÓNICO

+ +

+

+ + + +

---

----

IntercambiadoresCatiónicos: ácido sulfónico R- SO3

-H+

ácido carboxílico R- CO-H+

Aniónicos: sales de amonio cuaternarias R-NH3

+OH-

Características de los solventes

•No reaccionen químicamente con analito ni la fase estacionaria

•Transparente a la región UV visible

•Bajas presiones de vapor

•No tóxicos

•Bajo costo

Clases de solventes

Aceptor de protones

Donador de protones polares

Solventes comunes en fase reversa

•Metanol acido•acetonitrilo base•THF altamente polar•agua modificador de polaridad

Todos poseen: baja viscosidad transparente al UV miscibles disponibles de alta pureza

Ventajas de la elución con gradiente

• reducción del tiempo de análisis• mejor resolución• mejora forma del pico

Ventajas de la elución con gradiente

• reducción del tiempo de análisis• mejor resolución• mejora forma del pico

a.Reservorio y controlador de gradiente

b Bomba

c Inyector

d Columna

e Detector

f Registrador

Equipo básico HPLC

Detectores empleados en HPLC

•Indice de Refracción•Ultravioleta - Visible (DAD)•Fluorescencia•Electroquímico•Espectrómetro de masas

to

tR1 tR

2

R.D.

tiempo ( min )

w1 w2

El cromatograma

Línea base ancho del pico (w)Tiempo de retención (tR) tiempo muerto ( tRo)Tiempo de retención corregido (tR´)

OPTIMACIÓN DE PARÁMETROS

Retención tR, k´Separación Resolución REficiencia: N, H

resolución

to

tR1 tR2

R.D.

tiempo (min)

w1 w2

Grado de separación entre dos picos

Su valor óptimo es 1,5

2 (tR2 - tR1)R = w1 + w2

resoluciónresolución

R = k’ k’+ 1

- 1

Factor de capacidadnumero deplatos teóricos

selectividad

N4

factor de capacidad k’

# de moléculas de soluto en fase estacionaria # de moléculas de soluto en fase móvila mayor k’ mayor tR

tRk’ = to

tR

to

K’ = tR to

factor de capacidad k’factor de capacidad k’

R.D.

tiempo

Para mezclas simples k’ entre 2 y 10

Para mezclas complejas k’ entre 0,5 y 20

Variación de k’

k’ k’+ 1

k’

K’ depende de la fuerza de la fase móvil

k’ k’+ 1

0 0 1 0.5 2 0.67 3 0.7510 0.91

Número de platos teóricos N

Representa la eficiencia de una columna

N = 16 tR

w

2

H = LN

Número de platos teóricos N

Se optimiza modificando:• flujo • longitud de columna• tamaño de partícula

N N4

100 2.5200 3.5400 5.0

Factor de selectividad

to

tr1 tr2

w1 w2

selectividad de la fase estacionariahacia dos solutos

tr2

tr1

==

Variación de

Depende de las interacciones entrefase estacionaria-soluto y

fase móvil-soluto

- 1 Se optimiza:

• Cambiando solventes• Optimizando el empaque• Cambiando fase estacionaria

Selectividad

1.00 01.05 0.051.10 0.091.50 0.33

valor óptimo es mayor de 1,2

Desarrollo del Método

Selección de Fase Estacionaria

Desarrollo de un método

• preparación de la muestra

• elección del sistema cromatográfico

fase móvil fase estacionaria

• optimización del métodoajuste de parámetros cromatográficos

Selección del solvente

Factores a considerar:

*Fuerza del solvente: medida relativa de la polaridad (Capacidad para desplazar al soluto)

*Escala basada en sílica o alúmina

Indice de polaridad: indice de polaridad relativo usado en fase reversa

Fuerza de solvente e índice de polaridad

Clases de solventes

Aceptor de protones

Donador de protones polares

Ventajas de la elución con gradiente

• reducción del tiempo de análisis• mejor resolución• mejora forma del pico

Elución con gradiente

Se usa en

Intercambio iónicofase unidaadsorción

*No es posible emplearlo en exclusión molecular

Clasificación de la muestra

• peso molecular• solubilidad• carácter iónico o polar

Desarrollo de un métodomuestra objetivos

Sistema preliminar

•Preparación de la muestra

• Elección del sistema cromatográficofase móvil fase estacionaria

•Optimización del método

Muestra

PM menor de 2000P M

Mayor de 2000

Soluble en agua

Filtración en gel

Soluble en Solventes orgánicos

Permeación en gel

Exclusión molecular

Elección del Sistema Cromatográfico

Muestra

PM menor de 2000PM mayor de 2000

Soluble en hexano

Soluble en metanol

Soluble en solventes orgánicos

Soluble en Agua

•Adsorción

•Fase Unida Normal

•Fase Unida Normal

•Fase Unida Reversa

Muestra

PM menor de 2000

No iónicoIónico oionizable

Soluble en Agua

Soluble en solventes orgánicos

Fase Unida Reversa

Par iónico

Intercambioiónico

resoluciónresolución

R = k’ k’+ 1

- 1

Factor de capacidadnumero deplatos teóricos

selectividad

N4

Optimización de parámetros

selectividad

k’ factor de capacidad

N número de platos teóricos

R resolución

resoluciónresolución

R = k’ k’+ 1

- 1

Factor de capacidadnumero deplatos teóricos

selectividad

N4

Optimización en Adsorción y Fase Normal

Inyectar muestra.Solvente polar

compuestos compuestos salen rápido salen lento

disminuir polaridad cambiar fase de solvente ajustar k’

cont….

Cont…

¿k’ = 2 - 10?

medir es mayormenor a

cambiar fase móvil usar sílica más activa

optimizar N

flujo longitud de columna

Optimización en Fase Reversa

Inyectar muestra.100% metanol

compuestos compuestos salen rápido salen lento

adicionar agua cambiar fase ajustar k’

continua….

Cont…

¿k’ = 2 - 10?

medir es mayormenor a

cambiar fase móvil

optimizar N

flujo longitud de columna