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Herramientas diagnós.cas para la determinación de alérgenos en
alimentos
Mgr., Bqca. Patricia Silvina Knass Romer Labs La:n America Adviser
Resumen de la presentación
• ¿Porqué vamos a analizar? • ¿Qué vamos a analizar? • ¿Cuales son las técnicas disponibles? • ¿Cuales son las fortalezas y debilidades de algunos métodos?
• Errores y problemas comunes en el análisis de alérgenos
• Cuando analizar • Validación
¿Porqué vamos a analizar?
• Las verdaderas alergias alimentarias presentan una respuesta inmunológica a proteínas específicas de algunos alimentos.
• Los métodos analí:cos pueden determinar las proteínas de interés o el material gené:co que produce esas proteínas (DNA)
• El método analí:co debe ser lo más específico posible para el producto de interés.
• El método analí:co debe ser capaz de detectar el/los analito/s de interés bajo una gran variedad de circunstancias (procesos a los que se somete al alimento, incluyendo el tratamiento térmico)
Retiro de Productos
mercado ‘Allergen-free’
Interés de los medios
Protección de la marca
Alérgenos alimentarios = riesgo para la inocuidad alimentaria
Legislación y estándares
Determinación de Alérgenos: Tendencias
Cual es el escenario para el analista?
Validaciones & Aprobaciones
Unidades y definiciones
Toma de muestra
Niveles umbral
Calibración
Test kits
El análisis es solo una pequeña parte
¿Qué vamos a analizar? (donde buscar alérgenos)
• Ingredientes o materias primas. • Productos terminados. • Muestras ambientales. • Limpieza
o Superficies en contacto con alimentos o Agua de enjuague o Primera porción de la producción
¿Qué vamos a analizar? Analitos: alérgenos/marcadores
Proteínas involucradas
en las reacciones adversas
Marcadores DNA
Proteína no involucrada en la reacción adversa,
pero caracterís:ca del
alimento considerado
como alergénico
Qué marcador estamos utilizando?
¿Cuáles son las técnicas disponibles? • Métodos inmunoquímicos:
o ELISA o Disposi.vos de Flujo lateral (FLD) o Mul.plex
• Métodos de biología molecular: o PCR o Mul.plex
• Espectrometría de masas • Genéricos/No específicos (limpieza)
o Proteínas o ATP o Inspección visual
• Otros métodos
Selección de un método para detectar alérgenos
• Propósito • Tipo de muestra • Matriz o producto • Efecto del Procesamiento • Tiempo de Respuesta • Disponibilidad de recursos
ELISA • Detección de la proteína específica (u otra asociada) por medio de an:cuerpos
• ELISA Sándwich es más común en métodos para alérgenos
• 1 a 2 horas para el análisis • Cualita:vo o Cuan:ta:vo • Empleado para ingredientes, productos finales, muestras ambientales, hisopos, agua de enjuague.
Ventajas y Limitaciones del ELISA
Ventajas • Sensible (ppm) • Cuantitativo o
semicuantitativo • Anticuerpos que detectan
proteínas alergénicas o marcadoras
• Relativamente rápido • Poco equipamiento • Nivel de habilidad: medio
Limitaciones • Entrenamiento /Seguir el
protocolo • Muestreo • Extracción • Matriz (polifenoles, pH,
procesamiento, aceites) • Tipo de proteína • Falta de matrices de
referencia • Necesidad de validación
“in house”
Y además…. (cuando monitoreamos después de la limpieza)
• Cuando la proteína alergénica se desnaturaliza (detergentes, procesos) se presentan falsos nega:vos.
• En presencia de leche de soja, no se detecta gluten con el an:cuerpo R5 cuando se extrae con EtOH 60%
• La prueba inmunoquímica puede verse afectada por la presencia de residuos de detergentes o desinfectantes.
Métodos alterna.vos!!!!!!
FLD (.ras) • Dispositivos basados en la tecnología ELISA. (Cualitativos / Semi-
cuantitativos) • Se visualiza con la aparición de una línea de color • Muestras ambientales, verificación de limpieza, screening de
alimentos. • Rápidos (10´) / In Situ
PCR
Método cualita.vo DNA, primers, dNTPs,
polimerasa, termociclador Desnaturalización (95°C) Unión del primer Síntesis de DNA (DNA-‐
polimerasa 72°C) Siguiente ciclo
→ Electroforesis en gel de
agarosa
PCR • Método para la detección del DNA específico de la especie
(no la proteína alergénica) • Es un método cualitativo donde se amplifica el DNA
específico y luego se detecta. • Es útil cuando los resultados de ELISA son cuestionables
(proteínas liofilizadas, para aceites – problemas con la extracción acuosa-, lecitina de soja en leche en polvo)
• Se requiere de habilidad y equipamiento más costoso.
Real.me PCR
Método cuan.ta.vo
Sonda adicional de ADN (TaqMan probe)
Ciclo umbral
Realtime PCR
• PCR en Tiempo Real es un método cuan:ta:vo
• Se adiciona una sonda específica de ADN • Cuando la sonda encuentra el target, se
elimina el quencher y se emite una señal fluorescente.
• Durante la reacción se mide la fluorescencia en el termociclador.
• La cuan:ficación se lleva a cabo a par:r del ciclo umbral (Ct value).
• La can:dad original de DNA se calcula con estándares internos.
Mar:n Röder, Stefan Vieths, Thomas Holzhauser, Sensi:ve and specific detec:on of poten:ally allergenic almond (Prunus dulcis) in complex food matrices by Taqman® real-‐:me polymerase chain reac:on in comparison to commercially available protein-‐based enzyme-‐linked immunosorbent assay, Analy:ca Chimica Acta, Volume 685, Issue 1, 24 January 2011, Pages 74-‐83,)
Espectrometría de Masas • Detecta proteínas y pép:dos • Extracción, cleanup, ionización, separación de las proteínas/pép:dos
ionizados, detección • Alto grado de sensibilidad y resolución • Provee información de la composición proteica, estructura y
secuencia. • Detección y confirmación de la proteína en un solo paso • Detección y cuan:ficación de pép:dos sencilla.
Ventajas y Limitaciones de MS Ventajas • Identificación y
cuantificación certera de las proteínas alergénicas
• Método muy sensible • Método de elección para
la confirmación
Limitaciones • Mucha experiencia • Equipamiento costoso • Laborioso y gran inversión
de tiempo • Se requiere de extracción
y cleanup • No es útil para los
procedimiento de rutina
hpp://www.intechopen.com/books/a-‐comprehensive-‐survey-‐of-‐interna:onal-‐soybean-‐research-‐gene:cs-‐physiology-‐agronomy-‐and-‐nitrogen-‐rela:onships/proteomics-‐and-‐its-‐use-‐in-‐obtaining-‐superior-‐soybean-‐genotypes
Antes de los métodos no específicos….
Validación y Verificación
• Los procedimientos de limpieza requieren de ambos: de validación y verificación
• Validación – que la limpieza será efec:va • Verificación – que la limpieza fue efec:va
Validación y Verificación Métodos de Validación Métodos de Verificación
ELISA Pruebas rápidas para alérgenos
Microbiología tradicional Bioluminiscencia de ATP Métodos PCR (DNA) Proteínas (colorimetría)
Toma de muestra para validar la limpieza • Debe asegurar la recuperación de los residuos de alérgenos de la superficie o del producto final, y el nivel de recuperación y repe:bilidad debe ser suficiente para cumplir con los criterios definidos para considerar efec:va la limpieza.
• Donde, cuando y como deben tomarse las muestras puede inferir en el resultado de la validación.
Toma de muestras: Aguas de lavado y enjuague • Agua de enjuague: solo cuando no pueda accederse al equipo (CIP) • Agua de lavado: si se recicla o si es común (lavado de bandejas o
utensilios. • Agua de pre-‐enjuague y de enjuague (para verificar la reducción del
alérgeno) • Material de purga: limpieza a seco (industria farmacéu:ca) Análisis de agua de enjuague y primer producto para determinar maní (4 limpiezas/3 muestras)
Etapa de la limpieza ELISA para maní (ug/ml) Test de Bradford (ug/ml) Resultado
Agua de enjuague
Pre-‐lavado 98,5 – 1.379 85,9 – 917,6 posi:vo
Luego de limp. alc. ND ND nega:vo
Luego de limp. Ac. ND ND nega:vo
Producto
Luego de limpieza ND – 1,1 ND nega:vo Stephan et al (2004)
Toma de muestras: Superficies • Hisopos pre-‐humedecidos (compa:bles con el método analí:co
seleccionado) • Enjuague de partes con una can:dad conocida de solución de
extracción. • En caso de polvos alérgenos (harinas) permi:r que se asiente antes
de tomar la muestra.
Toma de muestras: Producto final
• Primer producto del lote (luego de la limpieza) • Verificar que las materias primas no contengan alérgeno
Método no específico: Bioluminiscencia de ATP
• Efec.vidad de la sani.zación • Detecta ATP proveniente de fuentes biológicas • Hisopos convencionales de ATP (higiene) • Hisopos de alta sensibilidad (residuos de alimentos) • Ventajas:
– rápido (< 30 segundos) – Más económico que ELISA – La prueba se lleva a cabo in situ (“:empo real”)
• Limitaciones: Aplicación (limpieza húmeda de superficies) • Puede tomar ATP de la fuente de suministro de agua • Mide la presencia de ATP, no de alérgenos • Indicador de alérgeno: solamente validando y correlacionando con
prueba alérgeno-‐específica
Método no específico: Proteínas totales • Efec.vidad de la sani.zación • Ventajas:
– rápido (< 30 segundos) – Más económico que ELISA – Mide proteínas
• Limitaciones: Aplicación (limpieza húmeda de superficies) – Determina todas las proteínas (no solo alérgenos)
Desacos en la detección de alérgenos
• Falta de materiales de referencia
• Sin estandares cer.ficados disponibles Qué an.cuerpo detecta la „proteína correcta“??
• For:ficación diwcil – Extracto de la proteína (que se detecta?) – Alérgeno (alimento) – For:ficar extracto – For:ficar muestra
¿Cuando analizar alérgenos?
• Inves:gación de reclamos • Validación de métodos de limpieza • Validación de materias primas • (Análisis del producto terminado?)
Herramientas diagnós.cas para la determinación de alérgenos en
alimentos
Mgr., Bqca. Patricia Silvina Knass Romer Labs La:n America Adviser
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