herramientas analiticas - espectrofotometria.pptx.pdf

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HerramientasAnalí.cas–Espectrofotometría

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Espectrometría/Espectroscopía  Estudiosparaobtenerlacuan.ficacióndelespectroelectromagné.codeemisión

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Espectrofotometría

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EspectrovsEspectrograma

Dinámicoconrespectodel.empo

hHp://faculty.irsc.edu/FACULTY/TFischer/bio%201%20files/absorp.on%20spectrum2.jpg hHp://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/7/77/Spectrogram_‐iua‐.png/800px‐Spectrogram_‐iua‐.png

Está.coconrespectoal.empo

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Espectro

hHp://www1.sura.org/2000/SURA_Electromagne.c_Spectrum_Full_Chart.jpg

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TiposdeMoléculas  DNA

  RNA

  Proteínas

  Cualquierotro.poqueabsorba(cercanoalavisible):  Industriatex.l,pinturas,.nciones,impresoras,imprentas

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ComposicióndeunEspectrofotómetroFuenteUV

Filtro Muestra Filtro Detector

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CalibraciónoBlanco  Antesdehacercualquiermedición,se.enequecalibrarelespectrofotómetroalasmismaslongitudesdeondaquesevanausar

  Seusalamismasolución(solvente)enlacubetasinmuestrayseajustalalecturaaCERO

  Seenjuagalacubeta,seagregalamuestraysehacelalectura

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MedicióndeRNAyDNA  Losácidosnucléicosabsorbenlamáximaenergíaenλ=260nm

  Proteínasabsorbenaλ=280nm

  Siseusanambas,sepuedencalculartantolaconcentracióncomolapurezadeácidosnucléicos

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MedicióndeRNAyDNA  Absorbancia=DensidadÓp.ca(OD)

  1Abs=1OD=50μg/mLDNAcadenadoble(aprox.)

  1Abs=1OD=40μg/mLRNA/DNAcadenasencilla(aprox.)

  Pureza(contaminaciónconproteínasyalgodefenolocloroformo)seob.eneconlarelación:

  Abs260nm/Abs280nm~=[1.8–2]

  Entremasbajalarelación,máscontaminación.ene

  pHafecta,usarbuffers,pH~7.5

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MedicióndeProteínas  Tipicamenteaλ=280nm

  Debidoa

  Fenilalanina

  Tirosina

  Triptófano

BiochemistryTheChemicalReac.onsOfLivingCells2dEdVols1&2‐DavidE.Metzler

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Ejemplos–CálculodeConcentracióndeRNA/DNA  Beer’sLaw

A=εbc  A–Absorbancia  ε–AbsobabilidadMolar(L/cm)  b–longitud(cm)  c–Concentración(mg/L)

  Ejemplo:Lecturaa260nmde0.422,deunadiluciónde1:100deDNA

c=0.422*50ug/ml=21.1ug/ml(encubeta)

C=c*100=2.11mg/ml(ensolución)

  1Abs=50mg/L=50μg/mldsDNA

  1Abs=40mg/L=40μg/mlssRNA

  1Abs=33mg/L=33μg/mlssDNA?

MolecularDiagnos.csFundamentalsMethodsandClinicalApplica.ons‐Buckingham‐Flaws‐Davis

hHp://www.bmglabtech.com/applica.on‐notes/absorbance/absorbance‐dna‐quan.ta.on‐168.cfm

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CurvasdeCalibración  Ayudana…

  Lecturasconsistentes(aparato)

  Muestraconfiable  Cubetaenbuenestado  DetectarerroresdePipeteo

  DeterminacióndeLINEARIDAD  Determinacióndelmejorlugarpara

mediryhacersolo1mediciónenfuturosensayos

  Seob.eneconlecturasrepe.dasendilucionesseriadas

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EjerciciodeCálculodeCurvadeCalibración  Enequiposde4ó5personas

  CalcularcorrelaciónusandoExcel

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Consideraciones  Simplesin.nciones

  pHafecta

  Dejarcalentarelespectro,.picamente10a15minutos

  Lascubetasnodebenabsorveralaλdelectura.

  MezclasdeRNA/DNA/Proteínas

  ParaconcentracionesPRECISASdeentre10y100ng/mL,fluorometríaespreferida

  Calibraciones

  MantenimientoAnual,calibrandoconfiltrosconocidosentodoelrangodelongitudesdeonda,

  Rangolinealdelaparato,absorbancias.picamenteentre0.05y0.8(vermanualdelaparato)

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Espectrofotómetros

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Espectrofotómetros‐Nanodrop

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OtrosTiposdeEspectrofotometría  UV

  FTIR

  “MASS”?

  Par.cleSize

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Tarea  Amano,1ó2cuar.llasmáximo,paralasiguienteclase

  Queescromatogra{ay2aplicaciones