hb fetal, ham test y sucrosa test
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HEMOGLOBINA FETAL
HEMOGLOBINA FETAL
Método de Singer
A1, A2
Fetal
Normales
S, C, D, E
Álcalis
540 nm
Patológicas
Procedimiento
6,8 ml Sulfato de Amonio 50%
TUBO A
3,2 ml
0,2 ml Solución deHemolizado 10%
1 min
TUBO B
Procedimiento
- 0,02 ml Solución deHemolizado 10%
- 5ml de Agua destilada
Filtro verde
TUBO C
TUBOS B Y C
Cálculos
% Hb F = ¼ Lectura B x 100 Lectura C
Solución B: 1/50
Solución C: 1/200
VR: < 2% En Adultos
Utilidad Clínica
45 al 90%Fetal
15% 5% 2%
Utilidad Clínica
Utilidad Clínica
Talasemia mayor Hb fetal 40-100%
Talasemia menor Hb fetal A2
Hb fetalPersistencia del gen Hb Fetal
26%
Solución de Hemolizado
SSF
5 min10 ultima3000rpm
Agua destilada
30 a 60 minutos
Agregar volumenIgual de cloroformo
AGITAR5 min 15 min
3000rpm
Descartar el sobrenadante, donde se encuentra el hemolizado. Por debajo se debe situar, una capa del estroma de color rojo, y en el fondo, el cloroformo utilizado para la extracción. Finalmente se determina la concentración de hemoglobina, del hemolizado, y se ajusta al10% si es necesario según la tabla confeccionada para tal fin.Cuando a la solución de hemolizado se
le noten grumos volver a centrifugar, para poder ser utilizado debe de tener menos de 40 horas.
Solución de Hemolizado
Solución de Hemolizado
Hidróxido de potasio, 12N: A 1 volumen de hidróxido de potasio N/A (50ml). Añadir 2 volúmenes de agua destilada (100ml. Solución estable a medio ambiente.
Sulfato de amonio al 50% de saturación: 50ml sulfato, 50ml agua, 0,25 de acido clorhídrico concentrado.
REACTIVOS
TEST DE HAMPrueba de suero ácido para el diagnóstico de la Hemoglobinuria Paroxística Nocturna
Hemoglobinuria Paroxística Nocturna
Anemia Hemolítica
Defectos en la membrana del eritrocito.
Es adquirida.Mutación en el gen que
codifica a la proteína GPI.Eritrocitos susceptibles a la
lisis mediada por el complemento (vía alternativa)
Fundamento
En la HPN, el paciente tiene una población de eritrocitos inusualmente sensibles a la lisis por el complemento, el cual se activa por la vía alterna y se une a ellos en el suero acidificado.
BbC3b
C3b Vía Alterna del
Complemento Medio Ácido
GPI
Fundamento
Hemólisis
Procedimiento
Sangre del paciente sin
Anticoagulante
Suspensión 50% de
Eritrocitos con SSF
Suero Normal Inactivado (56ºC 30’ a 1 h)
Suero Fresco
No Hemolisado
NH4OH HCl
--- --- --- 0.5 ml 0.5 ml
0.5 ml 0.5 ml --- --- ---
--- --- 0.5 ml --- ---
--- 0.05 ml 0.05 ml --- 0.05 ml
0.05 ml 0.05ml 0.05 ml 0.05 ml 0.05 ml
Suero Normal Fresco
Susp.. 50% de
Eritrocitos
HCL 0,2 N
Suero Normal
Inactivado
Suero del Paciente
1 2 3 54
Esquema del procedimiento
(-) (+++++) (-) (+++) (++++)
Esquema del procedimiento
MEZCLAR 37ºC 30’
CENTRIFUGAR
Comprobar si hay señales de lisis en el
líquido sobrenadante
Utilidad Clínica
Cuando una prueba de hemólisis de la sucrosa da un resultado positivo, se recurre al Test de HAM como prueba confirmatoria de la Hemoglobinuria Paroxística Nocturna (HPN)
La lisis de las células de la HPN se produce con suero acidificado normal y del paciente. (Prueba positiva)
Si también se observa lisis con el suero normal acidificado inactivado por el calor (Prueba negativa) Las células marcadamente esferocíticas pueden reaccionar de esta forma.
Utilidad Clínica
Diagnóstico de:
1. Hemoglobinuria Paroxística Nocturna
2. Anemia Aplásica3. Anemia Diseritropoyética
congénita tipo II (da la prueba del suero acidificado positiva, pero la prueba de sucrosa es negativa)
TEST DE SUCROSAPRUEBA SELECTIVA DE LA
SANGRE TOTAL
Fundamento
La sucrosa o sacarosa isotónica proporciona un medio de bajo contenido iónico que promueve la unión de los componente del complemento a los eritrocitos
En la HPN, una porción de los eritrocitos es anormalmente sensible a la lisis mediada por el complemento, el cual es activado hasta el final de la cascada de activación con la consecuente lisis de los eritrocitos anormales.
BbC3b
C3b Vía Alterna del
Complemento Sucrosa 10%
GPI
Fundamento
Hemólisis
Materiales
Sangre completa del paciente con anticoagulante (Citrato de Na 3.8% o Oxalato de K)
10 g de Sucrosa disueltos en agua destilada hasta un volumen final de 100 ml
SUCROSA AL 10%
Procedimiento
1 parte 9 partesCENTRIFUGAR
30’ a Tº Ambiente
INCUBAR5’ a máx. revolución
Observar la hemólisis en el líquido sobrenadante
MEZCLAR
SUCR
OS
A
PACIENTE
Resultados e Interpretación
Presencia de hemólisis en el sobrenadante, indica que hay que realizar la prueba confirmatoria de hemólisis de la sucrosa para confirmar HPN
Ausencia de hemólisis en el sobrenadante indica que no existe HPN. Una muestra sangre control normal debe dar negativo.
Causas de Error
FALSOS POSITIVOS
FALSOS NEGATIVOS
1. Utilizando sangre desfibrinada2. Pacientes anémicos sin HPN3. La solución de sucrosa al 10% que no
ha sido recién preparada.
1. Utilizar heparina o EDTA como anticoagulantes
2. Excesiva centrifugación3. Reactivo de Coombs
contaminado o inactivado.
TEST DE SUCROSAPRUEBA CONFIRMATORIA DE
SUCROSA
Materiales
REACTIVOS: • Solución isotónica de sucrosa• Hidróxido de amonio (NH4OH) 0,01M
5 min máx. rpmCENTRIFUGAR
sobrenadante
en cada lavada
DESCARTAR
Lavar los eritrocitos procedentes del paciente y de una persona normal (control negativo), suero compatible de tipo ABO , el cual debe estar almacenado a – 70ºC o Tº inferiores.
Preparar suspensiones al 50% en solución de NaCl 0.15 M (paciente y suero control).
PACIENTE P.NORMAL
SSF
LAVAR
2 a 3 veces
Procedimiento
MEZCLAR MEZCLAR
0.05 ml 0.85 ml
SUERO
SUCR
OS
A
0.1 ml 0.1 ml
Suspensión de
EritrocitosPACIENTE P.
NORM
AL
5 minmáx. rpm
INCUBARTº Amb por 30’
CENTRIFUGAR
LEER540 nm
ESTÁNDAR: 0.1ml de suspensión de eritrocitos del paciente mas 0.9 ml de NH4OH 0.01M o agua destilada.
BLANCO: Mezcla de suero y sacarosa
Resultados e Interpretación
Hemólisis > 10%. Diagnóstico de HPN, pero es recomendable hacer una prueba de HAM. También la Anemia Hemolítica Autoinmune y Leucemia dan resultados falsos positivos.Hemólisis ≤ del 5 %. Es considerado un resultado dudoso cuando va la hemólisis del 5 al 10%
Causas de error
FALSOS POSITIVOS
FALSOS NEGATIVOS
1. Raramente, en casos de hemólisis autoinmune o anemia megaloblástica.
2. Si se guarda la solución de sucrosa durante largo período antes de utilizarlo
1. Suero sin actividad de complemento por haber sido almacenado inadecuadamente.
Entra por la entrada estrecha; porque ancha es la entrada y
espacioso el camino que lleva a la perdición,
y son muchos los que entran por ella; mas
¡qué estrecha la entrada y qué angosto el camino que lleva a la Vida!; y poco son los que lo
encuentran.
Mateo 7: 13-14
¡GRACIAS!
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