guia de microbiologia 2014-1
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ASOCIACION
UNIVERSIDAD PRIVADA SAN JUAN BAUTISTA
FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD
Escuela Profesional de Estomatologa
GUA DE PRCTICA
Ciclo : III
Curso : MICROBIOLOGIA
Docente : C.D. Lzaro Sierra Garmendia
Semestre Acadmico : 2013 II
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PRIMERA SEMANA
PRACTICA No. 1
INSTRUMENTOS Y MATERIALES BSICOS EN EL LABORATORIO
DE MICROBIOLOGIA
OBJETIVOS:
A. Conocer los principales instrumentos, equipos y material de vidrio usados en un
laboratorio de microbiologa, para el diagnstico de enfermedades infecciosas.
B. Familiarizar al estudiante con el manejo y uso adecuado de instrumentos,
materiales y reactives en la prctica microbiolgica.
INSTRUMENTOS:
El laboratorio de microbiologa requiere de equipos y materiales de vidrio, metlicos o
de otra naturaleza, con funciones especficas que permitan el estudio de los diversos
microorganismos patgenos que afectan al hombre.
Es casi imprescindible en el diagnstico de las enfermedades infecciosas el uso de los
Anlisis Clnicos o. Anlisis de Laboratorio; que incluyen: Hematologa, Bioqumica,
Toxicologa," Serologa y Microbiologa, entre otros. La importancia de su uso es tan
significativa que sus resultados ratifican o rectifican el diagnstico presuntivo del
mdico o estomatlogo.
Siendo la estomatologa una especialidad mdica y existiendo muchas infecciones en
el sistema estomatogntico causados por diversos microorganismos; la asignatura
trata de impartir en la parte prctica los conocimientos bsicos de:
Microbiologa e Inmunologa
Principales Tcnicas de Laboratorio
Interpretacin de Anlisis
Terminologa de uso ms frecuente.
Con esta finalidad en esta primera prctica conoceremos los materiales, instrumentos
y equipo ms utilizados y sus condiciones de uso en los procedimientos de laboratorio
ms frecuentes en microbiologa como son los siguientes:
a) Toma de muestra
b) Coloracin
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c) Cultivo
d) Serologa
A continuacin se mencionan los instrumentos, indicando alguna caracterstica de uso
y su funcin especfica.
MICROSCOPIO
Los microscopios ms usados son el ptico de campo claro (hasta 2000 aumentos) y
el electrnico (hasta 100,000 aumentos), adems existen otros con fines ms
especficos como los microscopios pticos de inmunofluorescencia, el de campo
oscuro, el de contraste de fases.
Se describe a continuacin las caractersticas del microscopio ptico.
Partes:
1. Mecnica
2. ptica
3. Sistema de Iluminacin
1. Mecnica:
a) Pie
b) Platina (Circular o rectangular fija o mvil, el vernier y el sistema de movimiento
o tren)
c) Tubo ptico, revlver
d) Sistema de enfoque: tornillos micromtricos y macromtricos (cremallera)
2. Sistema ptico:
a) Oculares; 05-10-20X
b) Objetivos; 05-10-40-100X
Objetivos de observacin en seco y en inmersin.
3. Sistema de iluminacin:
a) Espejo: Plano y Cncavo
b) Condensador
c) Diafragma filtros
d) Fuentes de iluminacin natural y artificial
Para determinar el aumento del microscopio se multiplica la cifra del ocular con la
del objetivo; ambas representan el aumento proporcionado por cada lente. (Utilice
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los objetivos secos para pequeos aumentos).
A menor aumento se requiere menor iluminacin, Jo cual se consigue bajando el
condensador y cerrando parcialmente el diafragma.
La observacin de las muestras hmedas, es decir en fresco se hace con lentes de
menor aumento o sea sin inmersin; este queda para las muestras coloreadas y en
general para aquellos casos en que se requiere la mxima cantidad de luz y se
practica con el auxilio del aceite de cedro u otra sustancia que tenga un ndice de
refraccin parecido.
Para la observacin microscpica proceda segn el siguiente orden:
Ilumine empleando el espejo cncavo o plano; la eleccin depende de la fuente
de luz, aumentos empleados y otros factores.
Enfoque de preferencia con la lente de menor aumento que por lo comn tiene
un tope inferior que impide la ruptura de las lminas la observar.
Una vez enfocado el objeto, haga rotar el revlver y utilice el objetivo deseado.
Si se va a usar el de inmersin, coloque previamente una gota de aceite de
cedro sobre la preparacin. Al colocarse la lente en posicin debe haber una
continuidad entre ellas. Para el enfoque preciso, use tornillo micromtrico.
Mantener los ojos abiertos, aunque el microscopio sea monocular.
Al terminar la observacin limpie el objetivo con un papel especial para lente o
con algodn o, un lienzo fino. Si hay impregnacin de aceite utilice xilol en
pequea cantidad y seque bien. Las lminas una vez observadas, se
depositarn en un recipiente apropiado el que contiene mezcla sulfocrmica.
La composicin de la mezcla es como sigue:
Bicromato de potasio 100 grs. Acido sulfrico 100 grs. Agua destilada 1000 ml.
Esta mezcla es empleada en los frascos
en la que se desecha todo material contaminado.
AUTOCLAVE
Destinado a la esterilizacin con calor hmedo y presin (121 Cx15' a 15 Lbs/pulg2),
se esteriliza: materiales de desecho, medio de cultivo, ropa de sala de operaciones,
agua destilada, etc.
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HORNO
Destinado a la esterilizacin con calor seco (se llama tambin horno Pasteur o
Poupinel).
La temperatura usual es de 160-180C por 1-2 horas.
Se esteriliza material de vidrio, de laboratorio e instrumentos metlicos.
ESTUFA O INCUBADORA
D una temperatura que se mantiene fija mediante un termostato; esta temperatura se
elige segn el requerimiento del germen a cultivar. Generalmente es a 37C.
REFRIGERADOR O NEVERA
Permite conseguir bajas temperaturas y se utiliza con fines de conservacin de
grmenes, de medios de cultivos, muestras, reactivos, etc. Por lo general se usa a
temperatura de 00 a 4C.
CENTRIGUGA
Aparato de muy diversa capacidad que permite separar una sustancia slida en
suspensin del lquido respectivo.
Por ejemplo para centrifugar orina o sangre, para obtener el "sedimento urinario o el
suero" respectivamente.
LA BALANZA
Se usa en bacteriologa para pesar colorantes; componentes de medios de cultivos,
reactivos etc. Las hay de diferentes tipos segn su aplicacin y su sensibilidad.
BAO MARIA
Permite la transmisin indirecta y atenuada de calor, de un lquido sobre una sustancia
a travs de un recipiente.
Evita el calor directo.
Se emplea entre otras cosas para licuar medios y para inactivacin de sueros, Existen
diversos modelos segn su aplicacin.
AGITADOR MECNICO
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Es un equipo de diversos diseos y con frecuencia variable por el nmero de veces
que oscilan por minuto. Se utilizan para agitar tubos, frascos, pipetas y lminas
excavadas.
POTENCIOMETRO
Aparato destinado a determinar la concentracin de iones H (pH en una solucin). El
ms perfeccionado es el de Beckman.
BOMBA DE VACIO
Produce presin negativa y se utiliza de preferencia para filtrar muestras de agua
potable, a travs de una membrana filtrante donde se retienen las bacterias
contaminantes.
CONTADOR DE COLONIAS
De la marca (Quebec) se utiliza para el recuento de colonias en un placa de cultivo; de
una manera ms exacta y con mayor facilidad.
MATERIALES DE VIDRIO:
Tubos de ensayo, balones, matraces, kitasatos, vasos, probetas, buretas, pipetas,
placa Petri, placas de Roux, placas de Brewer, tubos de centrfuga, tubos de vidrio de
diversos calibres pipetas Pasteur, jeringas, frascos, goteros, perlas de vidrio,
embudos, micropipetas de la marca EPPENDORF o de la marca OXFORD, etc.
OTROS MATERIALES. VIDRIO CORRIENTE, MADERA Y PORCELANA
Lminas excavadas de vidrio, lminas portaobjetos y cubreobjetos, termmetros,
mechero de alcohol, gradillas ASA DE KOLLE o asa Bacteriolgica, pinzas de madera,
piln y mortero de porcelana.
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SEGUNDA SEMANA
PRACTICA No. 2 Y 3
MEDIOS DE CULTIVO
1. OBJETIVO:
a. Conocer algunos medios de cultivo cuyo uso en microbiologa es frecuente.
b. Comprender que los microorganismos requieren variados nutrientes los que
deben tenerse en cuenta al preparar los diversos medios de cultivo.
2. FUNDAMENTEO TEORICO:
MEDIOS DE CULTIVO:
Son sustancias nutritivas lquidas o slidas que se utilizan en el laboratorio para
proporcionar sustrato nutritivo para el crecimiento y multiplicacin de los
microorganismos (bacterias, hongos, etc.) pudiendo ser similares a substratos
naturales, en los cuales estos crecen normalmente. Sus componentes bsicos
deben satisfacer las mnimas exigencias nutricionales para el desarrollo
microbiano y varan segn el tipo de bacteria.
Incluyen: Agua, nutrientes como fuentes de nitrgeno, de carbono y energa y en
ciertos casos factores de crecimiento.
La mayora de los medios empleados para el desarrollo inicial y aislamiento de
microorganismos heterotrficos, son ricos en componentes proteicos obtenidos de
carnes de animales (especialmente de corazn, cerebro, etc.). protenas vegetales
como soya, que se obtiene por digestin con enzimas proteolticas (pepsina,
tripsina o papaina). Los diversos medios de cultivo tienen como ingredientes
bsicos: extracto de carne, peptona, agar, extracto de levadura, etc.
Los medios de cultivo son sustancias nutritivas estriles que sirven para el
crecimiento bacteriano.
Los medios de cultivo permiten:
a. Desarrollo y crecimiento de los grmenes
b. Aislamiento e identificacin de los grmenes
c. Clasificar a los grmenes
d. Obtencin de los productos bacterianos, como enzimas (glutamato monosdico
o ajinomoto)
e. Cosechar cepas bacterianas y de esta manera poder fabricar vacunas
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f. Obtener toxinas para estudiarlas y crear antitoxinas
Para crecer, los microorganismos deben tomar del ambiente todas las sustancias
que requieren para la sntesis de sus materiales celulares y para la generacin de
energa.
Estas sustancias se denominan nutrientes. Un medio de cultivo debe tener, por
tanto, todos los nutrientes, necesarios en cantidad apropiadas a los requerimientos
especficos de los microorganismos para los que han sido diseados.
Sin embargo, los microorganismos son extraordinariamente diversos en cuanto a
sus propiedades fisiolgicas especficas y, por consiguiente, diversos en cuanto a
sus requerimientos de nutrientes especficos. Literalmente hablando, son miles de
medios diferentes los que existen.
AGUA.-
Para la preparacin de los medios de cultivo y de los reactives solo se debe usar
agua destilada o agua desmineralizada que se haya ensayado previamente y se
haya encontrado exenta de huellas de metales disueltos y de compuestos
bactericidas o inhibitorios.
EXTRACTO DE CARNE.-
Se puede usar cualquier marca conocida de extracto de carne que conduzca a
resultados satisfactorios. No se debe usar infusin de carne.
PEPTONA.-
Es una Protena degradada parcialmente que bajo esa forma es de fcil
asimilacin por los microorganismos, se puede usar cualquier peptona que por
pruebas comparativas previas, haya demostrado que conduce a resultados
satisfactorios.
AZUCARES.-
Todos los azcares que se usen para la preparacin de los medios de cultivo
deben ser qumicamente puros y adecuados para propsitos bacteriolgicos.
AGAR.-
Producto gelatinoso obtenido de ciertas algas marinas. El agar que se emplea ya
sea granular o fragmentado ser de calidad bacteriolgica.
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REACTIVOS GENERALES.-
Todos los reactives generales que se empleen como ingredientes en los medios de
cultivo deben ser de grado CS o de calidad analtica.
COLORANTES.-
Para la preparacin de los medios solo se deben emplear colorantes certificados
A partir de estos ingredientes es posible preparar un medio capaz de permitir el
crecimiento de muchas bacterias hetertrofas.
TIPOS DE MEDIOS DE CULTIVOS.
Aunque muchos de los hetertrofos se desarrollan muy bien en agar nutritivo, otros
no crecen bien porque necesitan nutrientes especficos por ejemplo; vitaminas,
factores de crecimiento etc.
A los medios de cultivo se les puede clasificar de la siguiente manera:
1. Medos Comunes: Tienen los componentes esenciales y destinan para cultivar
la mayora de la bacteria, por ejemplo: Agua peptonada, Agua comn, Caldo
nutritivo, Agar nutritivo, Gelatina, etc.
2. Medios especiales:
Son aquellas que se forman a partir de un medio basal o comn. Al que se le
aade diversas sustancias de acuerdo a la finalidad deseada y pueden ser:
Medios Enriquecidos
Cuando se le adiciona sustancia de mayor poder nutritivo como: huevos,
extracto de levadura, sangre, vitaminas etc.
Sirven para cultivar microorganismos exigentes en sus necesidades
NUTRICIONALES,
Ejm.:
- Agar Sangre.- Cuando un medio basal o comn se le aade entre 5 a
10 % de sangre (la mayora de bacterias patgenas).
- Agar Ogawa o Lowenstein.- Jensen (bacilo de Koch).
- Agar Chocolate.- Cuando el agar sangre se calienta entre 60-80C
hasta que tome un color chocolate (gonococos y meningococos).
- Caldo Cerebro, Corazn (Brain, Heart Infusin, BHI), microorganismos
exigentes.
- Caldo de carne+Hemina y vitamina K (microorganismos anaerobios
exigentes).
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Medios Selectivos:
Que tienen la finalidad de favorecer el desarrollo de una bacteria y al mismo
tiempo inhibe el desarrollo de otras, para este fin se adicionan sustancias
de efectos conocidos llamados INHIBIDORES (sal, colorantes, sales
biliares o antibiticos).
Estos medios son llamados tambin MEDIOS DE AISLAMIENTO:
- Agar Mac Conkey (E. coli y otras enterobacterias)
- Agar Cetrimide (Pseudonomas).
- Agar Manitol Salado. (Estafilococos)
- Agar Mitis Salivarius (Streptococos orales)
- Agar Clindamicina (Eikenella corrodens)
- Agar GMC (gelatina, metronidazol y cadmio), sirve para el aislamiento
de Actinomyces viscosus, A. naeslundii y A. odontolyticus.
- Agar TCBS(Vibrio cholerae)
- Agar Sabouraud (Hongos)
Medios Diferenciales:
Son los que nos permiten evidenciar las actividades bioqumicas de un
microorganismo, frente a un sustrato determinado, cambiando sus
caractersticas observables; esto gracias a los indicadores de pH que tienen
estos medios.
Ejm.
- Medio Ox-Ferm.- (Oxidacin - Fermentacin).
- Citrato de Simons (determinar el uso de citrato como fuente de carbono)
- TSI (triple azcar hierro) (determinar uso de: lactosa y glucosa)y
adems la produccin de H2S
- LIA (lisina agar - determinar el metabolismo de lisina).
- Agar Manitol Salado. (determina uso del manitol)
- Agar Urea
- Agar SIM.
Medios de Transporte:
Son medios de cultivo especiales, que permiten mantener viables a las
bacterias, mientras son conducidas a los laboratorios, desde el lugar de
toma de muestra.
Ejm.:
-
- Medio Cary Blair
- Medio Stuart
- Medio Amies
- Caldo Hajna
A veces se combina las caractersticas de cada uno de estos medios y por
lo tanto el medio resultante ser enriquecido, selectivo diferencial.
La divisin planteada no es rgida, sino por el contrario flexible y didcticas.
PREPARACION DE MEDIOS DE CULTIVO MATERIALES:
- Agar comn deshitratado
- Placas petri
- Tubos de ensayo
- Mechero
- Algodn
- Matraces o balones
- Cocina elctrica
- Plumn marcador
PROCEDIMIENTO
1. Pesar las sustancias indicadas en los medios respectivos calculando
en relacin con los volmenes requeridos.
2. Disolverlas en la cantidad de agua necesaria y hervir en un matraz.
3. Esterilizar en el autoclave a 121C por 15
4. Repartir en tubos o placas siempre en ambiente estril (frente a un
mechero)
5. Se comprueba la esterilidad de los medios, colocndolos en una estufa
a 37C por 24 horas.
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SEGUNDA SEMANA
PRACTICA No. 3 Y 2
SIEMBRA Y AISLAMIENTO DE BACTERIAS
1. OBJETIVOS:
Ensear al estudiante de Estomatologa, la manuabilidad y las tcnicas necesarias
para sembrar diferentes muestras procedentes de la cavidad bucal en medios de
cultivo.
2. INTRODUCCION:
La siembra es uno de los pasos principales e iniciales en el estudio completo de
un microorganismo dado; por lo tanto es indispensable ejecutarlo correctamente.
(Teniendo en cuenta las mximas condiciones de esterilidad, desde la toma de
muestra hasta la accin misma del sembrado. Efectuar la siembra a la brevedad
posible).
Es necesario precisar algunos trminos:
SIEMBRA: Es la accin de trasladar las bacterias de un medio natural y ponerlas
en contacto con un medio artificial como es el medio de cultivo. Si el medio es
slido se formarn colonias y si el medio es lquido se observar: turbidez,
sedimento, pelcula o flculo, etc.,
RESIEMBRA O AISLAMIENTO: Permite lograr la pureza de un cultivo, consiste
en extraer con el asa de kolle o aguja de kolle una fraccin de colonia y sembrarla
en un medio lquido o slido.
TRASPLANTE O REPICAJE: Significa la separacin primaria de la cepa a un
medio de cultivo apropiado que puede ser lquido o slido contenido en un tubo.
Conservndose la cepa pura y por subsiguientes transplantes en medios
especiales, se logra conocer las propiedades culturales y bioqumicas, dando
como resultado la identificacin especfica de aquella.
Los transplantes se pueden realizar:
a. De lquido a slido.
b. De lquido a lquido.
c. De slido a lquido.
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d. De slido a slido
COLONIA: Conjunto de microorganismos que crecen en un medio slido, y
que est constituido por un mismo tipo de bacterias.
CULTIVO PURO: Es aquel que consta de una sola especie bacteriana a partir
de sta se estudia sus caractersticas morfolgicas, fisiolgicas y bioqumicas.
CEPA: Es un cultivo puro plenamente identificado y ubicado en su taxonoma
correspondiente, gracias a los mtodos de identificacin bacteriana
bioqumicos serolgicos o genticos.
MUESTRAS BIOLOGICAS: Las muestras biolgicas pueden proceder de
diferentes parte del organismo humano y pueden ser: sangre, orina, esputo,
heces, lquido cefaloraquideo, uas, pelos, piel, fluido gingival, placa dental,
saliva, abcesos, etc.
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MATERIALES:
- Medio de agar nutritivo (en placas y tubos)
- Caldo nutritivo Asa de kolle
- Mechero
- Hisopos
- Lmina portaobjetos
- Aguja de Kolle
- Solucin salina fisiolgica
- Tubos de prueba.
PROCEDIMIENTO:
Las modalidades de siembra varan segn los medios que se usan (puede ser
medios lquidos o slidos). Si el medio es lquido bastar tocar la superficie de
ste con el inculo, si l medio es slido puede ser por estras, por puntura, por
diseminacin, por agotamiento o por incorporacin.
SIEMBRA POR INOCULACION: Con el asa de siembra previamente esterilizada
tomar una cantidad suficiente de inculo y ponerla en contacto con el medio
lquido.
SIEMBRA POR ESTRIA: Deslizar suavemente en zigzag el asa sobre la
superficie del medio slido ya sea en petri o en plano inclinado de un tubo. (Es til
para el estudio bioqumico y desarrollo bacteriano).
SIEMBRA POR PUNTURA O PICADURA: Consiste en tomar una pequea
cantidad de la muestra, con la aguja de kolle y sembrar introduciendo la aguja
hasta cerca del fondo del tubo que contiene medio slido. (Esta modalidad es
utilizada por ver el comportamiento bioqumico de las bacterias).
SIEMBRA POR INCORPORACIN: Consiste en diluir la muestra y aadir el
medio de cultivo licuado y enfriado a 45C, repartir esta mezcla en placas petri,
dejar enfriar sembrar e incubar. (Sirve para el recuento de bacterias y ver si son
anaerbicas facultativas o microaerofilas).
SIEMBRA POR AGOTAMIENTO O DISPERSION: Consiste en repartir el inculo
sobre la superficie del medio slido en zig zag en 3 o 4 campos de la placa o por
estriado simple en toda la placa. Es til para obtener colonias aisladas.
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RECOMENDACIONES:
Una vez realizado la siembra con la modalidad adecuada se debe incubar en
la estufa a 37C por 24 horas al cabo de los cuales se hace la lectura
correspondiente.
En la estufa, las placas deben quedar con las tapas hacia abajo para que el
agua de condensacin desprendida por el calor de la estufa, no malogre la
siembra.
El asa se esteriliza antes y despus del uso.
La boca de los tubos se flamean al destaparlos y antes de volverlos a tapar.
Todas las manipulaciones de siembra, se realizan frente a una llama de un
mechero de alcohol o de gas.
Los tubos y las placas se marcan con un plumn de tinta indeleble poniendo
nombre, fecha u otros datos de importancia.
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TERCERA SEMANA
PRACTICA N 4
LECTURA E INTERPRETACION DE LAS COLONIAS
1. OBJETIVOS:
Reconocer los diversos tipos de crecimiento bacteriano en medios lquidos y
slidos.
Relacionar las caractersticas del crecimiento bacteriano con los microorganismos
Probables, para llegar a su identificacin final.
2. INTRODUCCION:
Si ha seguido bien las instrucciones podr visualizar sobre algunos planos del
medio, definidas masas microbianas separadas entre s, llamadas colonias en
medio slido, y turbidez, pelcula o flculo, en medio lquido.
Cada colonia es resultado de la multiplicacin logartmica de una clula bacteriana
depositada en un punto del medio slido que en condiciones ptimas de
crecimiento forman su progenie con sus caractersticas de especie o de grupo.
Estas caractersticas de crecimiento nos ayudarn en la identificacin de las
bacterias.
3. MATERIALES:
- Cultivos en placas petri, sembradas por estras o por diseminacin o cualquier
modalidad
- Cultivos en medio diferenciales de microorganismos diversos
- Asas de siembra, lpiz, gradilla
- Set de Coloracin Gram
- Microscopio y aceite de cedro.
4. PROCEDIMIENTO:
1. Realice las lecturas de las colonias desarrolladas en placas y/o tubos
describiendo sus principales caractersticas morfolgicas.
2. Realizar las lecturas en medio lquido, determinando la forma de crecimiento,
formacin de pelcula, floculacin, turbidez, sedimentacin y olor (que puede
ser aromtico o fecaloide).
Describir las principales caractersticas morfolgicas de las colonias en medio
slido, teniendo en cuenta los siguientes aspectos:
a. Tamao: medir el dimetro de la colonia en mm
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b. Forma: redondeada, esfrica, ovalada, irregulares, en roco, ameboide,
rizoide.
c. Elevacin: Plana, convexa, crateriforme, umbilicada, cnica, papilada.
d. Superficie: lisa, rugosa, granular, escamosa, en ondas.
e. Borde: entero, filamentoso, aserrado, irregular, ondulado.
f. Consistencia: cremosa, membranosa, gomosa o mucosa.
g. Cromognesis: pigmentos de color amarillo, anaranjado, violeta, azul, rojo,
verde.
h. Grado de transparencia: transparente, translcido, opaco.
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C. Radiaciones
Afectan el crecimiento y desarrollo bacteriano.
a) Rayos Infrarrojos: efecto y accin calorfica.
b) Rayos Ultravioleta: el efecto depende -d9Jj intensidad y distancia al
foco.
c) Rayos ionizantes: rayos x y rayos 8, penetran ms que rayos
ultravioletas; e ioniza tomos inactivando enzimas y genoma
bacteriano.
Uso: esterilizar jeringas descartables, catteres endovenosos,
medicamentos (hormonas, vitaminas, antibiticos), prtesis)
AGENTES QUMICOS
Tienen dos tipos de actividad segn su concentracin: bacteriostticos o
bactericidas a altas concentraciones.
Segn el mecanismo de accin, pueden afectar las siguientes estructuras
bacterianas.
Membranas Citoplasmticas y Pared Celular
Mecanismo: alteracin. Sntesis de pared.
- Se combina con lpidos (agentes tensoactivos: detergentes).
- Altera mecanismo de transporte activo y accin osmtica.
- Accin corrosiva (cidos y lcalis)
- Inhibe cadena transportadora de electrones (hexaclorofeno)
Protenas y Enzimas
Mecanismo: coagulacin y desnaturalizacin de protenas del citoplasma
a. Sales de metales pesados.
Mercurio: Mercuriocromo
Merthiolate
Plata: Nitrato de plata
Sulfato de cobre
Alcohol: isoproplico, benzlico, etlico, glicoles y etilenglicoles, xido
de etileno.
Fenoles: fenol, timol, crisoles, hexaclorofeno.
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b. Txico sobre enzimas: por oxidacin radicales libres oxidantes.
Halgenos: cloro y derivados
- Leja, hipocloritos
- Lodo y derivados
Otros: H2O2
- Permanganato de potasio
c. Alteracin del ncleo: alteracin de los genes por combinarse con
grupos sulfricos o nucleoprotenas.
Aldehidos:
- Formol
- Agentes alquilantes
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CUARTA SEMANA
PRACTICA No. 5
COLORANTES Y COLORACIONES
1. OBJETIVOS:
1. Que el estudiante conozca los colorantes y las principales tcnicas de
coloracin utilizadas en Bacteriologa.
2. Estudiarla morfologa y las estructuras bacterianas.
2. INTRODUCCION:
El uso de los colorantes nos permite ver las estructuras bacterianas. Existen 2
coloraciones diferenciales importantes en Microbiologa una de ellas es la
coloracin Gram y la otra es la: Ziehl Neelsen. La primera se utiliza con carcter
taxonmico porque nos permite clasificar a las bacterias en Gram Positivas (color
violeta) y Gram negativas (color rojo). La coloracin Ziehl Neelsen nos permite la
observacin del Mycobacterium tuberculosis, M. Leprae y otras Mycobacterias.
3. COLORANTES
3.1 Por su naturaleza: se clasifican en colorantes naturales y artificiales.
3.1.1. Los colorantes naturales: pueden ser de origen animal y vegetal.
Por ejemplo: El Carmn es obtenido de la cochinilla; la hematoxilina
y el tornasol que son obtenidas de las plantas.
3.1.2. Los colorantes artificiales o sintticos: son obtenidos como derivados
del carbn de piedra o hulla y son conocidos como anilinas (azul de
metileno, safranina, violeta de genciana, etc.)
3.2 Por su afinidad tintorial: De acuerdo al comportamiento qumico del colorante
se clasifica en:
a. Colorantes cidos
b. Colorantes bsicos
c. Colorantes neutros
a) Colorantes cidos: Se dice que un colorante es cido o aninico, cuando
la parte bsica o catinica es incolora y la parte cida o aninico es
coloreada y tiene afinidad por el citoplasma. Ejemplo: Acido pcrico,
Fucsina cida, Eosina, etc.
-
b) Colorantes bsicos: Son colorantes catinicos los que tienen la parte
bsica o catinica coloreada y la parte cida o aninica incolora, tienen
afinidad por el ncleo. Ejemplo: Cristal violeta, Violeta de genciana,
Fucsina bsica, Hematoxilina, Tionina, etc.
c) Colorantes neutros: Son aquellos que tienen la parte cida y bsica
coloreada y tien al ncleo de un color y al citoplasma de otro color.
Ejemplo: Leishman, Giemsa, Wright, Eosinato azul de metileno, etc.
4. TINCION:
El proceso de tincin supone una reaccin de intercambio de iones entre
colorantes y los sitios activos de la superficie o del interior de la clula.
4.1 Tipos de coloracin
Existen 2 tipos de coloracin: Simple y Compuesta o combinada.
4.1.1.1 Simple: cuando se utiliza un solo colorante. Ejemplo: Azul de metileno.
4.1.1.2 Compuesta: donde se usa ms de un colorante, generalmente dos.
Ejemplo: Coloracin Gram y Coloracin Ziehl-Neelsen.
4.2 Coloracin diferencial
Son procedimientos de coloracin que ponen de manifiesto diferencias entre
clulas bacterianas o partes de la estructura bacteriana, siendo las ms
conocidas:
4.2.1.1 Coloracin Gram: que permite la clasificacin de las bacterias en
Gram (+) de color violeta y las Gram (-) de color rojo.
4.2.1.2 Coloracin Ziehl-Neelsen: Para grmenes cido-alcohol resistentes
como las mycobacterias las que producen enfermedades como la
tuberculosis y la lepra.
5. PASOS GENERALES DE UNA COLORACION:
a) Extensin.- Consiste en colocar sobre una lmina portaobjetos la muestra
extendindola uniformemente.
b) Fijacin.- Fijar la muestra sobre la lmina portaobjeto utilizando alcohol o ter o
flameando suavemente sobre el mechero o dejarlo simplemente al medio
ambiente.
c) Tincin.- Se utiliza el colorante requerido cubriendo la muestra en su totalidad
por un tiempo determinado.
d) Lavado.- Lavar utilizando un chorro suave de agua
-
e) Secado.- Dejar secar la lmina al calor del mechero
f) Observacin.- Observar utilizando aceite de cedro con el objetivo de inmersin.
6. MATERIALES:
Lminas portaobjetos
Mechero
Aceite de inmersin
Microscopio compuesto Set para coloracin GRAM:
a) Cristal violeta
b) Lugol
c) Alcohol acetona
d) Safranina.
7. ESQUEMA DE LA PRACTICA:
Utilizar para el desarrollo de esta prctica, como material para colorear frotices de
placa dental, raspado de mucosa bucal, saliva; etc.
Seguir los pasos de la coloracin GRAM y observar con objetivo de inmersin
anotando la morfologa, la coloracin y la agrupacin de los grmenes.
COLORACION GRAM: Creada por Christian Gram (1884-1886)
Procedimiento:
a) Cubrir la preparacin con 2 o 3 gotas de cristal violeta. Dejar por 2 o 3 minutos
b) Lave suavemente y cubra con solucin de lugol dejando actuar el mordiente
durante 1 o 2 minutos.
c) Lavar y decolorar con alcohol acetona
d) Lavar y cubrir con safranina por 30 segundos o por 1 minuto.
e) Lave, seque y observe, adicionando aceite 'de cedro o aceite de inmersin.
Al final de la coloracin los grmenes pueden quedar teidos de violeta o rojo; las
bacterias que toman color violeta se llaman GRAM (+) y las que toman color rojo
se llaman GRAM (-).
Los grmenes GRAM (+) son los que por accin del lugol consiguen una mayor
fijacin del cristal violeta. .
En trminos generales son GRAM (+) todos los cocos excepto las Neisserias y
Veillonellas, todos los bacilos son GRAM (-) a excepcin de los esporulados
gneros: (Clostridium Bacillus) Lactobacillus, Actinomyces, Bacterionema, etc.
-
COLORACION ZIEHL - NEELSEN (BK):
1. Preparar frotis
2. Cubrir ntegramente con el colorante fucsina fenolada
3. Calentar a la llama hasta desprendimiento de vapores, por tres veces
consecutivas sin llegar a ebullicin.
4. Lavar intensamente a chorro de agua
5. S. Decolorar con alcohol-cido. lavar
6. Colorear con azul de metileno por 30 seg.
Los grmenes que retienen el color rojo a pesar de la decoloracin con el alcohol
cido son los llamados cido alcohol resistente (a.a.r.) y destacan en un fondo de
color azul, cuando se usa el azul de metileno.
Aquellos grmenes no cido alcohol resistente ceden su color al decolorante
alcohol cido y al quedar desprovistos de coloracin tienen aptitud para tomar el
colorante de fondo (azul).
Por lo tanto las mycobacterias se observaran de color rojo o rosado y las que no lo
son (Streptococos, Stafilococo y otros bacilos) se tien de color azul.
COLORACIONES ESPECIALES:
Utilizadas para teir estructuras bacterianas especiales
a. WIRTZ para observar esporas bacterianas
b. SCHAEFFER-FULTON: Para observar esporas bacterianas
c. MANEVAL: para ver cpsulas
d. ANTHONY-WELCH: para ver cpsulas
e. Coloracin de Tinta China o Nigrosina: Para ver cpsulas
f. ALBERTI Para ver grnulos metacromticos
g. LEIFSON: para ver flagelos
h. CASARES-GIL: Para ver flagelos
i. FEULGEN: Para observar regin nuclear
-
QUINTA SEMANA
EXAMEN PARCIAL PRCTICO
SEXTA SEMANA
PRACTICA N 6
ANTIBIOGRAMA: KIRBY BAUER
Incluir 4 o 5 colonias de microorganismos en estudio en 5ml de TSB o Mueller Hinton Broth.
Diluir el inculo con SSF estril, hasta encontrar el STANDARD DE TURBIDEZ
Introducir un hispo estril en el cultivo y exprimir el exceso del lquido, rotando el algodn
contra la pared del tubo.
Sembrar las placas de TSA o Mueller Hinton Agar por estras en tres diferentes
direcciones. Dejar que el inculo seque durante 5 minutos por lo menos y 20 minutos
como mximo
Distribuir los discos de sensibilidad sobre la superficie del agar. Se presionan suavemente los
discos sobre la superficie del medio empleando pinzas estriles. La distancia entre disco y
disco debe ser no menor de 15 cm.
INCUBAR A 37 X 24 h
LECTURA DE LAS ZONAS DE INHIBICIN
(Medir los halos en mm)
SENSIBLES INTERMEDIO RESISTENTE
Nota: La sensibilidad o resistencia de las bacterias, est expresada en las TABLAS DE
INTERPRETACION de las zonas de inhibicin, que es imprescindible consultar cuando se
realiza la lectura de un antibiograma.
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Agente antimicrobiano Cdigo Concentracin Resistente Intermedio Sensible
AMIKACINA MK-AK 30 g 14 15 - 16
AMOXICILINA /AC CLAVULANIC AM ESTAFILOCOCOS 20/10 g 19 AMPICILINA GRAM NEGATIVOS 10 g 11 12 -13
ESTAFILOCOCOS 10 g 28 ESTREPTOCOCOS 10 g 21 AGUMENTIN - ESTAFILOCOCOS 20/10 g 19 CARBENICILINA PSEUDOMONAS CB 100 g 17 18 - 22
CEFAMANDOL MA 30 g 14 15 - 17
CEFAZOLINAS CZ 30 g 14 15 - 17
CEFACLOR CEC-CC 30 g 14 15 - 17
CEFALOTINA CF 30 g 14 15 - 17
CEFOPERAZONA CFP 75 g 15 16 - 20
FECOTAXIMA CTX 30 g 14 15 - 22
CEFOXITINA FOX-CFT 30 g 14 15 - 17
CEFTRIAXONA CRO 30 g 13 14 - 20
CEFUROXINA RBA 30 g 14 15 - 17
CINOXACINA CIN 100 g 14 15 - 18
CIPROFLOXACINO CIP 5 g 15 16 - 20
CLINDAMICINA CM-DA 2 g 14 15 - 16
CKORANFENICL C 30 g 12 13 - 17
DOXICICLINA D 30 g 12 13 - 15
ERITROMICINA E 15 g 13 14 - 17
GENTAMICINA GM-GE 10 g 12 13 - 14
IMIPENEM IPM-LDP 10 g 13 14 - 15
KANAMICINA K 30 g 13 14 - 17
METICILINA - ESTAFILOCOCOS ME 5 g 9 10 - 13
MINOCICLINA MI 30 g 14 15 - 18
NAFCILINA - ESTAFILOCOCOS NF 1 g 10 11 - 12
ACIDO NALIDIXICO NAL 30. g 13 14 - 18
NITROFURANTOINA FD 300 g 14 15 - 16
NORFLOXACINA NOR 10 g 12 13 - 16
OXACILINA - ESTAFILOCOCOS AO 1 g 10 11 - 12
PENICILINA G - NEUMOCOCOS P 1 g 19 -
ESTAFILOCOCOS 10U 28 -
N. Gonorrhoeae 10U 19 -
SULFONAMIDAS G 250 g 12 13 - 16
TETRACICLINA T 30 g 14 15 - 18
TOBRAMICINA NN 10 g 12 13 - 14
TRIMETOPRIMA TMP 5 g 10 11 - 15
TRIMETOPRIMA + SULFAMETOXAZOL SXT
70 g
23.75 g 10 11 - 15
VANCOMICINA V 30 g 9 10 - 11
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SEPTIMA SEMANA
PRACTICA N 7
INMUNOLOGIA
FAGOCITOSIS IN VIVO E IN VITRO
INTRODUCCION
Si un agente agresor vence las barreras naturales de la inmunidad, un segundo
mecanismo de defensa entra en actividad: LA FAGOCITOSIS.
La FAGOCITOSIS, es una forma de defensa que puede ser medida por una variedad
de clulas asociadas con el sistema sanguneo, siendo los ms importases, los
neutrfilos polimorfonucleares y macrfagos, tanto fijos como circulantes, ambos tipos
de clulas son extradas a los lugares de infeccin o dao tisular por una serie de
factores quimiotcticos solubles, lo que vendra a constituir el primer paso dentro de
todo el proceso fagocitario.
Una vez que las clulas fagocitarias llegan al lugar donde se encuentra el agente
extrao, entra en contacto con l, mediante una actividad mecnica u opsnica. El
paso siguiente es la ingestin del antgeno y la consecuente formacin de los
FAGOSOMAS, que son vesculas delimitadas por la membrana celular que se van a
internar en el citoplasma. Los granos celulares adquieren gran movilidad y se
aproximarn al fagosoma, depositando en su interior su contenido corla consecuente y
final digestin del antgeno.
El estudio de la fagocitosis es importante pues permite en casos, determinar
deficiencias en los mecanismos de defensa a travs de:
1. ndice de fagocitosis
Que se realiza, colocando en una suspensin de leucocitos frescos de
partculas inertes.
Despus de un periodo de incubacin, se observan las propiedades
Polimorfonucleares, que tienen en su interior partculas fagocitadas.
2. La actividad bactericida
Que se efecta en forma similar a la anterior, pero en lugar de partculas
inertes, se colocan en suspensin bacterias y posteriormente con tcnicas de
cultivo se establece la propiedad de bacterias destruidas por las lizosimas de
los fagosomas de los leucocitos.
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RESULTADOS
OBSERVACIONES 10' 20' 30'
N de bacterias fagocitadas
FAGOCITOSIS IN VIVO
MATERIALES Y METODOS
- Cultivo en caldo de Escherichia coli (24 horas)
- Cultivo en caldo de Escherichia coli (calentado)
- Ratones
- Estuche de diseccin
- Lminas portaobjetos
- Jeringa de tuberculina
- Torradas de algodn
- Agujas N 25 de
- Cmara de ter
- Colorante Wright
- Agua tamponada
- Alcohol yodado
PROCEDIMIENTO
1. Inocular un ratn albino, 0,5 ml de un cultivo de Escherichia coli calentado por 10' a
80C, por va intraperitoneal.
2. Dejar el ratn en reposo por una semana, controlndole peridicamente.
3. Dos horas antes de la prueba, el ratn que ha sido previamente inoculado, inyectar
por va intraperitoneal 0,5 ml de cultivo en caldo de Escherichia coli, ajustando al
tubo N 3 de escala de Mac Farland
4. Hacer una inoculacin igual a otro ratn, al que no ha sido inoculado previamente.
Otro servir de control.
-
SHOCK ANAFILACTICO
INTRODUCCIN
La anafilaxia es una forma especial de hipersensibilidad que puede ser provocado
artificialmente en animales de experimentacin. En la produccin de anafilaxia siempre
intervienen sustancias denominadas sensibilizantes o anafilactgenos que despus de
un periodo, de incubacin colocan al organismo en condicin de reaccionar de manera
especial cuando estas mismas sustancias son inyectadas nuevamente. A esta
segunda inyeccin (dosis desencadenarte) la reaccin es tumultuosa c. inmediata de
un conjunto de sntomas que se denomina SHOCK ANAFILCTICO. Este representa
el grado mximo de los fenmenos de hipersensibilidad.
OBJETIVOS
Que el alumno conozca una de las formas ms generalizadas de hipersensibilidad.
MATERIALES Y MTODOS
MATERIALES
- Albmina de huevo 1/100
- Albmina bovina 1/100
- Conejos
- Jeringas
- Agujas hipodrmicas
- Alcohol
- Algodn
PROCEDIMIENTO
PREPARACIN PRELIMINAR (dosis sensibilizante)
a) Tomar 3 conejos y marcarlos con las letras A, B y C
b) Inyectar por va intraperitoneal 1 ml de solucin de ovoalbmina al conejo A,
repetir esta operacin con el conejo B usando 1 ml de albmina bovina y no
inyectar al conejo C.
-
DOSIS DESENCADENANTE
a) Despus de un lapso de 10 das a 3 semanas de la primera inyeccin inocular
va intracardiaca 1 ml de solucin de ovoalbmina al conejo A y C inyectar 1 ml
de solucin de suero bovino al conejo B.
b) Observar las reacciones en los conejos.
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OCTAVA SEMANA
PRCTICA N 8
REACCIONES SEROLGICAS
OBJETIVOS
Conocer las pruebas serolgicas de uso ms frecuente en el diagnstico de
enfermedades infecciosas en nuestro medio.
INTRODUCCIN
Las reacciones o pruebas serolgicas son reacciones antgeno anticuerpo que se
realizan in vitro. Estas pruebas sirven para detectar por ejemplo anticuerpos presentes
en el suero, para lo cual el antgeno debe ser conocido (prueba indirecta).
Si lo que se desea es encontrar antgenos, entonces los anticuerpos correspondientes
debern ser conocidos (prueba directa).
Estas reacciones pueden ser CUALITATIVAS 0. CUANTITATIVAS; las primeras
determinan presencia o ausencia de antgenos o de anticuerpos y las segundas
cuantifican los anticuerpos o antgenos. Este ltimo tipo es el que tiene mayor uso en
el diagnstico de enfermedades infecciosas.
El tipo de reaccin serolgica que se usa depende bsicamente del estado fsico del
antgeno con que se cuenta y/o de la enfermedad que se quiere diagnsticas.
Existen muchos tipos de-reacciones serolgicas, siendo los que a continuacin se
indican, los tipos ms usados.
A) AGLUTINACIN
Es la reaccin donde el antgeno, se caracteriza por ser celular, o particulado o forme
(g. No soluble) y que al unirse con su anticuerpo correspondiente forma grupos.
(Aglutinacin (+).
Este tipo reaccin se utiliza para diagnosticar serolgicamente algunas enfermedades
como la brucelosis, Tifoidea y otras; adems es muy usada en la determinacin de
grupos sanguneos.
-
B) PRECIPITACIN
Es una reaccin antgeno anticuerpo, y se caracteriza porque el antgeno est en
solucin (Ag soluble) y cuando se encuentra con su anticuerpo especfico se forma
una zona o anillo de precipitacin.
Este tipo de reaccin se usa:
a) Determinacin en el laboratorio de enfermedades como la sfilis (VDRL) a esta
prueba tambin se le llama de floculacin, tambin es til para el diagnstico de
CARBUNCO o NTRAX, de HIDATIDOSIS etc.
b) Tambin se usa este tipo de reaccin para la identificacin de sangre u lquido
seminal en manchas de ropa, armas y otros con fines mdicos legales.
c) Otro de los fines de esta reaccin de descubrir adulteraciones de alimentos, por
ejemplo carne (vender carne de equino por carne de vacuno).
-
NOVENA SEMANA
PRCTICA N 9 Y 10
BACTERIOLOGA: ESTREPTOCOCOS
1. OBJETIVOS
Que el alumno conozca las caractersticas morfolgicas, de tincin, de cultivo,
serolgicas y antgenas de este grupo bacteriano.
2. INTRODUCCIN
Los estreptococos son bacterias de forma esfrica de ah su nombre de cocos, se
presentan agrupados en cadenas pares, algunas especies son anaerobias
estrictas como los peptococos y los peptoestreptococos, las dems especies son
anaerobias facultativas. Son Gram +, fermentan los carbohidratos produciendo
CO2 + cidos (lctico y pirvico) y ATP; algunos son pigenos y todos con catalasa
(-).
Los estreptococos se clasifican teniendo en cuenta diversos criterios; 2 de los ms
importantes son:
a. Por el grado de hemlisis que producen
- Alfa hemlisis o hemlisis parcial (halos verdes) Ejs. Estreptococos del grupo
viridans, Estreptococo pneumoniae,
- Beta hemlisis o hemlisis completa (halos transparentes) Ejs. S. Pyogenes, S.
Agalactiae.
- Gamma hemolisis (no existe hemolisis) Ejs. S. Bovis.
b. De acuerdo al carbohidrato "C" de su pared celular
Lancefield (Dra. Rebeca Lancefield)
Los estreptocosos se clasifican en 22 grupos serolgicos de la A a la W
(excepto I. J, LL, )
ESTREPTOCOCOS DE INTERS MDICO
Especies Grupo
lancefield
Tipo de
hemlisis Enfermedad que originan
S. pyogenes A Beta Faringitis, fiebre reumtica,
glomerulonefritis, erisipela
S. agalactiae B Beta Fiebre puerperal, septicemia,
-
faringitis, piodermia, meningitis
y neumona del recin nacido.
S. Grupo C-G C y G Beta Sinusitis, bacteremia,
endocarditis.
S. Faecalis D Alfa Infecciones del tracto urinario y
biliar.
S. del grupo
Viridans
H
Alfa
Endocarditis, caries,
enfermedades
periodontolgicas.
S. pneumoniae - Alfa
Neumona, sinusitis, otitis
media
-
DIAGNSTICO DE LABORATORIO
Muestras
Secrecin faringea (hisopado faringeo), esputo, material purulento, sangre, orina,
heces, etc.
Coloracin
GRAM +
Microscopa
Cocos dispuestos en cadenas
Cultivo
Se utiliza comnmente agar sangre (bacterias exigentes) para determinar el tipo de
hemlisis. Para aislar estreptococos bucales, se usa en el medio Agar mitis salivarius.
(Se utiliza las pruebas bioqumicas correspondientes para determinar las
especies).
Los antibiogramas son recomendados, una vez que han sido identificados los
estreptococos.
Serologa: Actualmente se utiliza la prueba de ELISA para identificar antgenos o
anticuerpos en algunas infecciones estreptoccicas.
Existe una prueba serolgica Ilamada Antiestreptolisina "O" (aeo; aso) para el
diagnstico de fiebre reumtica glomerulonegritis, (enfermedades de origen
estreptoccicas) y consiste en determinar cuantitativamente anticuerpos reaccin
contra el antgeno estreptolisina "O" de los estreptococos.
Una cantidad por encima de 160 - 200 unidades TODD indican una infeccin reciente
la faringitis, fiebre, reumtica o glomerulonefritis.
La prueba serolgica es indirecta y cuantitativa.
RECONOCIMIENTO BIOQUMICO DEL P. PNENUMONIAE
Prueba de la optoquina: Esta prueba demuestra la susceptibilidad del diplococcus
pneumoniae a la optoquina (reactivo cprico).
En una placa de agar sangre se siembra por diseminacin la muestra, luego
aspticamente se coloca con pinza el disco de optoquina y se incuba a 37C por 24
horas, la prueba es positiva si se forma un halo de inhibicin alrededor del disco mayor
de 14 mm.
-
NOVENA SEMANA
PRCTICA N 10 Y 9
BACTERIOLOGA: ESTAFILOCOCOS
1. OBJETIVOS
Reconocer los aspectos morfolgicos, fisiolgicos, tintoriales y de cultivo,
necesarios para la identificacin de este importante gnero bacteriano.
2. INTRODUCCIN
Los estafilococos, son cocos Gram+, generalmente muy pigenos, se presentan
dispuestos en racimos o en pequeos grupos, pueden ser aerbicos y
anaerbicos facultativos.
Desde el punto de vista clnico, los estafilococos patgenos dan lugar a la lesin
tpica como es el furnculo o absceso localizado, sin embargo, tambin pueden
diseminarse a travs de los vasos linfticos y sanguneos a diferentes regiones del
organismo, dando lugar a neumonas, meningitis, empiemas, endocartitis, etc.
Otros estafilococos de baja invasividad pueden dar lugar a procesos drmicos
tales como el acn y el imptigo.
Algunas cepas de estafilococos producen una enterotoxina causante de una
intoxicacin alimentaria de pocas horas de duracin (vmitos, diarreas) y con
ausencia de fiebre. Los estafilococos son beta hemolticos, catalasa + y slo el
staphylococcus aureus es coagulasa(+).
Una caracterstica importante a resaltar es que los estafilococos tienden a resistir
la accin de los antibiticos, especialmente de la penicilina (mediante mecanismos
genticos donde intervienen sus plsmidos, "R". Se puede determinar en el
laboratorio la resistencia a los antibiticos beta lactmicos usando como patrn la
meticilina u oxacilina.
Algunas especies de inters mdico:
Staphylococcus aureus (es la especie ms patgena) ocasiona bacteremia,
endocartitis, neumona, osteomielitis, meningitis.
S. Epidermitis (flora normal de la piel y vas respiratorias) ocasiona infecciones
drmicas (Acn)
S. Albus (flora normal bucal)
-
S. saprophyticus (flora vaginal)
MATERIAL Y PROCEDIMIENTOS PARA LA IDENTIFICACIN EN
LABORATORIO
Muestras:
Material purulento, exudado de lesiones superficiales, sangre, hisopado traqueal,
LCR, abscesos periapicales, osteomielitis de maxilares, etc.)
Tambin se examinan los alimentos o bebidas (para buscar estafilococos
productores de enterotoxinas)
Coloracin
Gram +
Cultivo
Se utilizan frecuentemente:
1. Agar Manitol Salado (el medio se torna cido y degrada al manitol produciendo
una coloracin amarilla del medio, el estafilococo puede vivir en un medio
hipertnico como es el de este medio donde el alto contenido de Na CI (7.5 gr.)
inhibe a otros gneros bacterianos.
2. Agar sangre (para determinar la hemlisis)
3. TSB o TSA
PRUEBAS BIOQUMICAS PARA DETERMINAR LA PRESENCIA DE
ESTAFILOCOCOS:
Coagulasa: (prueba para determinar la pagotenidad del estafilococo)
En un tubo de ensayo se coloca plasma citratado de conejo al que se le aade un
cultivo de estafilococos, se incuba a 37C por 4 horas y luego se pueden leer los
siguientes resultaos: Si hay coagulacin del plasma Coagulasa + (presencia de S.
Aureus).
Si no hay coagulacin del plasma Coagulasa (presencia de otros estafilococos
diferentes a S. Aureus).
Catalasa:
En una lmina portaobjeto estril, se deja caer una gota de perxido de hidrgeno
(agua oxigenada) y con el asa de Kolle estril se transporta la muestra de
estafilococos, la que al ponerse en contacto con perxido, produce la inmediata
-
formacin de burbujas pues la enzima catalasa ha descompuesto al perxido en
agua y oxgeno naciente, segn frmula: "2H2O2 + catalasa 2H2 + O2"
Gelatinasa
En un tubo de prueba conteniendo gelatina se siembra por puncin o picadura con
el agua de Kolle una muestra de estafilococos, se lleva el tubo a incubacin a
37C por 24 horas, a la lectura se observar que se ha producido la licuefaccin
del medio en forma de cono invertido.
Ureasa:
Esta prueba nos permite determinar como un (en este caso el estafilococo)
microorganismo es capaz de descomponer la molcula de urea (NH2 CO-NH2)
por accin enzimtica generando 2 molculas de amoniaco y una de carbonato de
amoniaco las que aumenta el ph haciendo virar el indicador de rojo a fucsia o
grosella: ureasa (+)
REDUCCIN DE NITRATOS A NITRATOS (NO3 A NO2)
Esa reduccin se lleva a cabo con un ambiente anaerobio y cuando al cultivo
incubado las 24 horas se le agrega 2 reactivos (Caldo de cultivo) 1 gota de dimetil
naftilmina y 1 gota de cido sulfanilico.
La reaccin es positiva cuando hay un viraje de color amarillo a rojo en el punto de
contacto de los reactivos con el microorganismo.
-
DECIMA SEMANA
EXAMEN PARCIAL PRCTICO
DECIMA PRIMERA SEMANA
PRCTICA N 11
NEISSERIAS
OBJETIVO:
- Diferenciar el papel de las especies de Neisserias no patgenas y otras especies
de Neisserias patgenas para el ser humano,
- Identificacin de estos microorganismos mediante las diferentes tcnicas de
laboratorio.
INTRODUCCIN:
El gnero Neisseria constituye un grupo de microorganismos de inters odontolgico
ya que podemos encontrar considerable nmero de especies en la mucosa
orofarngea, adems que especies como N. gonorrhoeae puede producir lesiones a
nivel de la mucosa bucal.
Adems debemos considerar que la N. gonorroeae al patgeno ms frecuente de este
gnero puede producir lesiones a nivel bucal.
Las Neisserias son cocos gramnegativos que suelen encontrarse en pares(diplococos)
de aspecto arrionado de alrededor de 0,6 a 1,5micras, poco resistentes a las
condiciones ambientales, cuyos requerimientos nutricionales son algo exigentes y
requieren una temperatura ptima para su desarrollo de 37C. Son microaerfilas y
anaerobias facultativas.
La prueba de oxidasa es clave para la identificacin de estos microorganismos ya que
en forma general, todas las Neisserias producen oxidasa (oxidasa +); son no
esporulados ni presentan movilidad, adems que algunas especies pueden ser
capsuladas y presentar fimbrias. La mayora de Neisserias fermentan carbohidratos y
producen cidos, sin producir gas.
Tomando como referencia la patogenicidad las Neisserias pueden ser:
-
a. Neisserias de la flora bucal normal (no patgenas): forman parte de la microbiota
normal de la mucosa nasofarngea: N. flavescens, N. cinerea, N. elongata, N. sirca,
N. subflava, N. mucosa, N. lactamica.
b. Neisserias patgenas para el hombre:
- N. gonorrhoeae: agente etiolgico de la gonorrea.
- N. meningitidis: ageffle etiolgico de la meningitis.
N. gonorrhoeae y N. meningitidis se encuentran de manera tpica, relacionados
con leucocitos polimorfonucleares o dentro de los mismos. Gonococos y
meningococos tienen una homologa del DNA de 70%
DIAGNSTICO DE LABORATORIO DE NEISSERIA GONORRHOEAE (Gonococo)
Muestras biolgicas:
Secreciones uretrales, secreciones de cuello uterino, recto, garganta, lquido sinovial,
conjuntiva; sangre (solo en infecciones generalizadas)
Microscopa:
Se pueden observar en el interior de los leucocitos polimorfonucleares(PMN)
diplococos gramnegativos; esta prueba tiene una sensibilidad del 90%, especialmente
si la muestra es un exudado uretral del varn. Por el contrario, la sensibilidad de esta
prueba se reduce al 50% si la muestra es del cuello uterino. En las mujeres, cuyo
exudado uretral d resultados negativos, es necesario efectuar los cultivos.
N. gonorrhoeae en el interior de
Leucocitos PMN a partir de un
Frotis cervical
-
Cultivo:
Por lo general, se utilizan dos medios enriquecidos: Agar Thayer-Martn modificado y
Agar chocolate; en ambos casos a estos medios se les aade antimicrobianos que
actan inhibiendo la flora acompaante (Vancomicina, Anfotericina B, colistina y
Trimetoprim).
Despus de 48 horas de incubacin a 37C se observan colonias pequeas,
circulares, transparentes o ligeramente grises de bordes enteros o ligeramente
festoneados de 1-4mm de dimetro.
Serologa:
No es usual realizar pruebas serolgicas debido a que los gonococos poseen
diversidad de antgenos, los anticuerpos son lentos en aparecer y pueden estar
presentes en personas no enfermas de gonorrea.
Pruebas bioqumicas:
- Reaccin de la oxidasa: todas las especies de Neisserias, producen la
enzima oxidasa, que cuando se encuentra en presencia de oxgeno
atmosfrico, citocromo "C" y un reactivo oxidasa (tetra metil-para-
fenilendiamina 2 HCI al 1%) oxida al reactivo para formar un compuesto
coloreado.
Para la prctica, se embebe una tira de papel de filtro con el reactivo oxidasa,
luego se toma una azada de la muestra biolgica, se realiza el frotis de la
misma sobre el papel y se espera dos minutos. Si el color de la tira de papel se
oscurece es oxidasa (+), pero si el papel no cambia de color, la prueba es
oxidasa negativa.
- Degradacin de carbohidratos: N. gonorrhoeae no fermenta maltosa, pero si
degrada glucosa.
-
DIAGNSTICO DE LABORATORIO DE NEISSERIA MININGITIDIS
(Meningococo)
Muestras biolgicas:
Lquido cefalorraqudeo (LCR), sangre (para hemocultivo), hisopado nasofarngeo
(para investigar portadores).
Hisopado nasofarngeo
Microscopa:
Se pueden observar en el interior como en el exterior de los leucocitos
polimorfonucleares (PMN) diplococos gramnegativos.
Cultivo:
Se utilizan dos medios enriquecidos: Agar Thayer-Martin modificado y Agar
chocolate; en ambos medios se les aade antimicrobianos que actan inhibiendo
la flora acompaante (Vancomicina, Anfotericina B, colistina y Trimetoprim).
Despus de 48 horas de incubacin a 37C se observan colonias de 1 a 4 micras
de dimetro, opaco blanquecinas o ligeramente amarillentas de bordes irregulares.
Jarra de anaerobiosis que permite la
Incubacin en condiciones anoxignicas
(sin oxgeno)
-
DECIMO SEGUNDA SEMANA
PRACTICA N 12
MICOBACTERIAS: M. TUBERCULOSIS
1. OBJETIVO:
- Conocerlas principales caractersticas morfolgicos tintoriales y de cultivo
de Mycobacterias y especficamente de M. tuberculosis.
- Comprender los principales procedimientos de diagnstico de tuberculosis.
2. INTRODUCCIN:
Las micobacterias son bacterias bacilares finas, aerobias, no forman esporas,
caracterizadas porque su cubierta externa, es sumamente rica en cidos
grasos especialmente en cidos miclicos, lo que le confiere a estos bacilos
resistencia a la desecacin, a la coloracin y a muchos agentes qumicos.
Existen aproximadamente 50 especies de Mycobacterium, de las cuales 3 so-i
las ms prevalentes, produciendo enfermedad en humanos: M.t., M. leprae y
M. bovis y 11 o 12 son potencialmente patgenas entre las que destacan M.
avium y M. kansaii y pueden trasmitirse por agua, suelo, aves y otros animales
e infectan a personas inmunodeficientes.
Las especies de micobacterias de mayor inters mdico son dos:
- M. tuberculosis (descubierto en 1882 por el mdico alemn Dr. Roben
Koch). Son bacilos delgados, exigentes, es el agente etiolgico de la
Tuberculosis la que al principio afecta los pulmones para luego invadir otros
rganos como rin, piel, huesos, intestinos, etc. Los bacilos de la
Tuberculosis son resistentes a la desecacin y pueden vivir varios das en
aspectos secos.
- M. leprae (descubierto por el mdico Noruego Dr. Gerald Hansen 1873).
Este bacilo es el agente etiolgico de la Lepra, cuya localizacin es
bsicamente en la piel las mucosas, este bacilo no ha sido posible cultivarlo
en el laboratorio (in vitro); pero se puede inocular en las patas de los
armadillos (in vivo) donde se desarrolla una lepra lepromatosa.
El diagnstico de la enfermedad se realiza por aspecto clnico de las lesiones y
por la Microscopia de las muestras coloreadas con Ziehl Neelsen.
-
MATERIAL BIOLGICO
MUESTRAS:
- Esputo, lavado gstrico, lquido cefalorraqudeo, lquido articular,- orina y
biopsias de diversos tejidos.
- Previamente a su estudio, las muestras deben descontaminarse con NaOH,
neutralizarse y con un buffer concentrarse por centrifugacin.
PROCEDIMIENTOS:
Los procedimientos o mtodos de laboratorio ms usuales para diagnosticar
TBC son: La coloracin Ziehl-Neelsen (BK, baciloscopia o coloracin a.a.r), la
Prueba de Tuberculina y el cultivo.
COLORACIN Z.N.
Se realiza el frotis de la muestra y se procede a colorear con la tcnica descrita en
la Prctica 2. Cuando la muestra es orina o lavado micobacterias no patgenas
que pueden estar en tales muestras y las
Tambin es posible usar la microscopia por fluorescencia
La coloracin Z.N. Es el mtodo ms usado para diagnosticar tuberculosis en el
Per.
CARACTERSTICAS AL REALIZAR LA BACILOSCOPIA (BK)
a. Verificar la calidad y cantidad de expectoracin, debindose obtener una
muestra de volumen suficiente a 2 ml. Que contenga partculas slidas o
purulentas y no solamente saliva.
(La expectoracin proviene de una tos profunda y arrastra un fluido
mucopurulento proveniente del rbol respiratorio).
b. Para la preparacin del frotis: el lugar en donde existen mayores
probabilidades de encontrar bacilos es en las partculas slidas de la
expectoracin.
c. La lectura se realiza con el lente de inmersin, la misma que debe efectuarse
sistemticamente, empezando por la periferia y concluyendo en el centro.
d. El nmero de bacilos encontrados es muy importante como elemento de
informacin, dada su relacin con el grado de contagiosidad del paciente, as
como con la severidad de la enfermedad, por esta razn el examen no slo es
cualitativo sino eminentemente cuantitativo.
La lectura de la coloracin, se hace teniendo en cuenta el nmero de
microorganismos observados:
-
BK(+) 0-1 por campo, en 100 campos microscpicos
BK(++) = 1-9 por campo, en 50 campos microscpicos
BK(+++) = +10 por campo, en 20 campos microscpicos
e. La eliminacin de las lminas una vez ledas, ser en depsitos que contengan
mezcla sulfo-crmica.
CULTIVO
El medio de cultivo ms adecuado y ms usado en nuestro medio es el Lowenstein
Jensen. Tambin se est utilizando el medio Ogawa.
La bacteria requiere por lo menos de 15 das para presentar un desarrollo visible
macroscpicamente sobre el medio de cultivo y necesita hasta 8 semanas de
incubacin, debindose incubar un promedio de 30 das; sus colonias son de color
blanco cremoso, son secas rugosas opacas, polimorfas y de dimensiones variables.
Para identificar M. tuberculosis, se debe tener en cuenta la tasa de crecimiento, la
morfologa de las colonias, la pigmentacin y las pruebas bioqumicas, tales como la
reduccin de nitratos, ureasa, catalasa, niacina, arilsulfatosa, etc.
Es necesario mencionar que hay algunas micobacterias-cromgenas, producen
pigmento en luz, y en oscuridad, hecho que se considera un criterio de clasificacin.
En la actualidad las pruebas genticas representan uno de los mtodos ms sensibles
de identificacin de micobacterias.
Otro de los mtodos de identificacin es la CROMATOGRAFA LIQUIDA DE ALTA
RESOLUCIN; se basa en determinar tipos y cantidad de cidos micolicos, los que
varan de una especie a otra.
Los laboratorios especializados, realizan pruebas de susceptibilidad antibitica
(antibiograma) de las cepas aisladas y que ofrecen resistencia al tratamiento
convencional.
PRUEBA DE TUBERCULINA
- Inocular intradrmicamente en el antebrazo 0.1 ml. De PPD (derivado proteico
purificado) de Mycobacterias.
- Esperar 24-48 horas.
- Determinar la formacin de una ppula y medir su dimetro. Se mide > 10 mm.
Se considera la prueba (+).
NOTA: Esta es una prueba complementaria, por s sola no indica presencia de
enfermedad.
-
DECIMO TERCERA SEMANA
PRACTICA N 13
AISLAMIENTO DE ENTERO-PATOGENOS: COPROCULTIVO
Materiales:
- Medio de transporte: Cary y Blair (CB)
- Isopo
- Medio Mac Conkey (MC)
- Medio Desoxicolato citrato (DC)
- Caldo selenito (CS)
- Asa bacteriolgica en argolla
Procedimiento:
1. La muestra en el medio de transporte (CB) se sembrar segn indicaciones del
profesor de prcticas en los medios de aislamiento primaria. Para estas prcticas
se usar: el (MC) y el (DC).
2. Sembrar el medio de enriquecimiento (CS),. Siguiendo las indicaciones del
profesor.
3. Incubar a 37C por 24 horas.
Comentario:
Los enteropatgenos actan por invasividad, pudiendo llegar hasta la sangre. Tambin
lo hacen por toxigenicidad en ambos casos es posible el aislamiento del agente a
partir de las heces fecales. Sin embargo un solo medio o cultivo no es suficiente para
aislar todos los agentes de infecciones entricos, siendo necesario el uso de varios
medio de cultivo para el aislamiento primario y otros tantos para el aislamiento previo
enriquecimiento. En nuestras prcticas se incidir mayormente en
ENTEROBACTERIACEAE.
-
DIFERENCIACIN BIOQUIMICA
Materiales:
- Placas con colonias en (MC - DC)
- Tubos de TSI (5)
- Tubos de LIA (5)
- Papel para indol (5)
- Caldo selenito sembrado
- Placas con SS agar
- Asa en aguja
Procedimiento:
1. Estudiar las caractersticas de las colonias en los diferentes medios de cultivo.
2. Con el asa en aguja picar la colonia escogida y repicar por una sola vez en TSI
hasta el fondo y con el mismo inculo repicar por tercera vez en el espeso del
medio LIA hasta el fondo.
3. Colocar el papel para indol en el tubo de LIA.
4. Sembrar con el asa en argolla el medio S:S agar a partir del selenito.
5. Incubar a 37C por 18 24 horas.
Comentario:
La prueba bioqumica permite diferenciar a los patgenos de otros inocuos. Estas
pruebas son bsicas y previas al estudio o paso siguiente que son las pruebas
serolgicas.
El medio TSI tiene como sustrato: la glucosa (1%), lactosa (10%) adems se puede
leer la produccin de H2S y la produccin de gas a partir de los azcares usados. La
produccin o no de gas y de H2S en TSI pude dividir en dos grupos a las
ENTEROBACTERIACEAE. Segn el cuadro adjunto:
FAMILIA ENTEROBACTERIACEAE TSI:
Gas (+) Gas (-)
H2S (+) SALMONELLA
ARIZONA
EDWARDSIELLA
CITROBACTER
PROTEUS
SALMONELLA TYPHI
-
H2S(-) ECHERICHIA
ENTEROBACTER
KLEBSIELLA
PROVIDENCIA SERRATIA
SALMONELLA PARATI/A
SHIGELLA
YERSINIA
PROTEUS
PROVIDENCIA SERRATIA
ESCHERICHIA ENTEROBACTER
El medio LIA tiene como sustrato principal a la Lisina la cual puede ser desaminada,
descarboxilada o bien no ser lisada. Como sustrato diferencial este medio tiene
glucosa (1%). Segn estas indicaciones se puede observar las siguientes divisiones.
ESTUDIO DE BACILOS AEROBIOS ESPORULADOS: BACILLUS
A este gnero pertenecen microorganismos de forma bacilar, Gram + (positivo)
esporulados, que se agrupan en cadenas y que requiere O2 para su metabolismo; son
en su mayora saprofitos (B. cereus, B. subtilis), excepto el B. anthracis que es
patgeno para el hombre y animales. En la presente prctica se pondr en evidencia
los caracteres microscpicos (forma del bacilo, localizacin de las esporas), culturales,
presencia de hemlisis, accin sobre las protenas (gelatina), movilidad y accin sobre
el almidn.
A. OBSERVACION MICROSCOPICA: COLORACION DE GRAM Y WIRTZ
1. Tomar una muestra de espcimen clnico o cepa de Bacillus y hacer frotis en 2
lminas. Teir una de ellas con Gram y la otra con Verde Malaquita (col. De
Wirtz).
2. Secar las lminas y observar al microscopio con lente de Inmersin.
B. SIEMBRA EN MEDIOS DE CULTIVO
Medios de cultivo a usarse: Agar Sangre, Medio SIM, Medio Gelatina, Agar
Almidn, 2 de cada uno.
Material: Cepas de B, anthracis y B. subtilis en caldo
Mechero, Asa de Kolle
Procedimiento:
1. Sembrar por estra las cepas de B. anthracis y B. subtilis en una de cada placa
de Agar Sangre y Agar Almidn.
2. Sembrar cada cepa, por puntura en el medio SIM, hace lo mismo con los tubos
del medio Gelatina.
-
3. Incubar a 37C por 24 horas, marcando previamente cada placa y tubo.
Resultados:
MEDIO BACILLUS anthracis BACILLUS subtilis
Agar Sangre
(Hemlisis)
Negativo, o Alfa
Leve
Beta
Agar almidn No hidroliza el
Almidn
Hidroliza del
Almidn
Gelatina No lica o lo hace
lentamente
Lica rpidamente
Medio SIM No Mvil
Pino invertido
Mvil
Nota: Para observar la hidrlisis del Almidn, dejar caer unas gotas de lugol sobre
la superficie de la placa con este medio, tratando de que se distribuya
regularmente. La zona del medio en la que no ha habido hidrlisis del almidn se
teir de azul, mientr4as que aquellas en que si ha ocurrido la hidrlisis se teir
de color marrn propio del lugol.
GENERO CORYNEBACTERIUM.-
Introduccin: Son bacilos Gram(+), no esporulados, Inmviles; algunas especies
forman parte de la flora normal del Sistema Respiratorio, piel, etc. La especie
patgena representativa de este gnero es el C. diphtheriae productora de una
poderosa exotoxina causante del cuadro clnico en el hombre.
El aspecto morfolgico es caracterstico, presentando forma alargada con
dilatacin de uno de sus extremos, en su interior se observan los grnulos
Metacromticos que son teidos intensamente por los colorantes bsicos. El
cultivo se realiza en el Medio de Suero Coagulado de Loeffer o en Gelosa Sangre
cistina-telurito en el cual se puede diferenciar los tres tipos de C. diphtheriae: Mitis,
Gravis e Intermedius.
Materiales: (observacin del crecimiento)
- Cepa de C. diphtheriae
- Placas con medio de cultivo
- Asa y mechero
-
Procedimiento
- Coger 2 azadas del caldo que contiene C. d. y sembrar en la placa por estras.
- Llevar a la incubadora por 24 hrs.
- Hacer la lectura para identificar las diferentes variedades al siguiente da.
Materiales: (Observacin morfolgica y grnulos metacromticos) Coloracin de
Gram y Albert.
- Cepas de C. Diptherae
- Lminas
- Azul de metileno
- Lugol
Procedimiento: (Col. De Albert para observar grnulos metacromticos)
- Fijar la muestra
- Cubrir la lmina con azul de metileno de 1 a 2 min.
- Lavar con agua corriente
- Aplicar lugol por 1 min.
- Lavar con agua
- Secar y observar a inmersin
- Haga otro frotis, colores con tincin de Gram para obs. morfologa.
GENERO CLOSTRIDIUM (BACILOS Anaerobios Esporulados)
Introduccin.- Son bacilos Gram (+) producen esporas, son anaerobios. Su hbitat
natural es el suelo o el intestino del hombre, existen especies saprofitas y otras
patgenas, dentro de estas ltimas tenemos:
C. Botulinum causa el Botulismo
C. tetani causa el Tetanos
C. perfringens causa la Gangrena gaseosa
Estos microorganismos para su crecimiento requieren de condiciones especiales
como es la ausencia de O2 (medio anaerobis), el cual puede lograrse utilizando la
cmara Brewer o el Gaspack y medio reductores como el caldo carne, o el empleo
de agentes reductores como el thioglicolato.
Para la observacin de la morfologa se debe tener presente la posicin de las
esporas en la diferentes especies antes mencionadas.
-
Materiales.- (Observacin del crecimiento)
- Cepa de Clostridium
- Tubos con caldo carne o thioglicolato
- Asa y mechero
Materiales.- (Observacin de la morfologa y esporas)
- Cepas de clostridium
- Colorante de verde de malaquita y safranina
- Asa y mechero
Procedimiento.- Coloracin Wirtz
- Fijar la muestra tomndola de la parte ms turbia del tubo.
- Agregar verde de malaquita y realizar 3 flameados en 5 min.
- Lavar a chorro lento
- Agregar colorante de contraste
- Lavar y secar
- Observar las esporas
-
DECIMO CUARTA SEMANA
PRACTICA N 14
MICOLOGA: LOS HONGOS
1. OBJETIVOS:
- Conocer la metodologa para diagnosticar micosis en el laboratorio
- Reconocer las principales caractersticas macro, microscpicas de los hongos.
- Identificar las diferentes especies de inters mdico - estomatolgico
2. INTRODUCCIN:
Los hongos son organismos eucariontes, sus paredes celulares estn compuestas
por carbohidratos complejos tales como la quitina, glucano, manano, celulosa , etc.
Son seres heterotrofos, no realizan fotosntesis por carecer de clorofila.
Aproximadamente existen 150,000 especies de hongos, de ellos 100 ms o menos
son patgenos, otros son no patgenos y un gran grupo son utilizados en diversas
industrias.
Desde el punto de vista celular los hongos pueden ser de dos clases Unicelulares
o levaduriformes y miceliales o pluricelulares.
3. MATERIALES PARA LA PRACTICA:
- Placa petri con Agar Sabouraud y otro con Agar Sangre
- Hidrxido de potasio al 20%
- Azul de lactofenol
- Lminas montadas de hongos unicelulares, pluricelulares
- Lminas petri cultivadas
- Microscopio binocular
4. PROCEDIMIENTO :
Muestras biolgicas de micosis superficiales: Piel, cabellos o uas.
En micosis sistmicas que afecten rganos internos como pulmones, intestinos,
ganglios linfticos, cavidad bucal, etc. la muestra ser SANGRE, esputo ,
biopsias, etc.
Coloracin y Microscopia:
Las muestras de micosis superficiales deben ser desqueratinizadas con hidrxido
de potasio al 10 o al 20% , luego se colorean con Azul de Lactofenol.
-
Siembra Micolgica:
Los medios de cultivo ms utilizados son
- Agar sabouraud
- Agar sangre
- Infusin de cerebro y corazn (BHI)
- Agar Levadura
- Mycobiotic Agar
- Czapeck
- Agar Mycophil
- Agar Mycosil
- Agar Sangre Glucosa cisteina
- Agar Lactosado de Sabouraud
Los hongos unicelulares o levaduriformes se incuban a 37 por 72 horas mientras
que los pluricelulares o miceliales se incuban a la temperatura ambiental de 5 a 7
das.
Mtodos indirectos para diagnostico de micosis sistemicas o profundas
A. Intradermo reacciones:
- Histoplasmina
- Paracoccidiodomicotina
- Esporotriquina
- Candidina
B. Reacciones Serologicas:
- Aglutinacin
- Precipitacin
- Fijacin de complemento Inmunodifusin
- Prueba adicional: Lmpara de Wood.
DIAGNOSTICO DE ALGUNAS MICOSIS SISTMICAS
1. Candidiasis
Muestras:
-
Incluyen frotis y raspado de lesiones superficiales, sangre, lquido
cefalorraqudeo, biopsia de tejido, orina, exudados, material retirado del catter
intravenoso.
Microscopa:
Buscando clulas en gemacin y seudohifas (lo que confirma la presencia de
Candida albicans.
Cultivo:
En sabouraud se observan las colonias cremosas y pequeas
Serologa: Estas pruebas tienen uso limitado, pudiendo usarse tambin
intradermo reacciones como candidina.
2. Histoplasmosis
Muestras para cultivo:
Esputo, orina, raspado de lesiones superficiales, aspirado de medula sea.
Coloracin y Microcospia:
Los cortes histolgicos se colorean con Giemsa, se observan levaduras en
forma de clulas ovoides dentro de las clulas del tejido afectado.
Cultivo:
En sabouraud (a 25 30C) Tambin puede emplearse Agar sangre glucosa
cisteina a 37C (la incubacin es de cuatro semanas como mnimo).
Serologa:
Las pruebas se hacen positivas entre la segunda a quinta semana despus de
la infeccin.
Intradermo-reaccin:
Esta prueba cutnea con histoplasmina se hace positiva despus de la
infeccin y permanece positiva durante varios aos.
3. Paracoccidiadomicosis
Muestras Biolgicas:
Esputo, exudado de las lesiones bucales, biopsia.
Microscopa:
En la Microscopa directa de estas muestras, aparecen las levaduras.
-
DECIMO QUINTA SEMANA
PRACTICA N 15
ESTUDIO DE BACTERIOFAGOS, METODO DE AISLAMIENTO DE VIRUS
BACTERIANO
El descubrimiento de los bacterifagos se hizo en 1915 por Twort, quien aport mucho
es en estudios de organizacin y replicacin del material gentico. Existe un
bacterifago para cada especie bacteriana, esta especialidad es debida a receptores
especficos existentes en las bacterias, la accin de los bacterifagos en ellas puede
ser:
a: Interaccin ltica.- Donde se multiplica el virus causando lisis de la bacteria.
b: Interaccin transformadora.- Donde el genoma viral se integra al genoma del
husped.
El ciclo de multiplicacin viral se divide en:
- Absorcin (atraccin cnica y receptores especficos)
- Penetracin (Ingreso del citoplasma viral al husped)
- Multiplicacin (en la bacteria receptora)
Procedimiento:
- Colocar en un tubo de prueba: 0.5 cc de fago, agregar 0.2 de cepa de E. coli
(incubado previamente durante 4 horas), agregar Cloruro de Calcio 2 gotas
- Preparar placas Petri con agar slido
- En los tubos con agar semislido agregar la mezcla de fago
- Mezclar bien los contenidos del tubo y agregar la superficie de la placa de agar
slido.
- Mover la placa suavemente de tal manera que el agar forme una capa uniforme
sobre el agar slido.
- Marcar las placas. Incubar a 37C y examinar a las 24 horas.
LECTURA DE LAS PLACAS CON BACTERIOFAGO. INOCULACION DE HUEVOS
EMBRIONADOS
Los Virus respiratorios son los principales responsables de la afecciones
Respiratorias.
Producen cuadros respiratorios altos, el virus de la influenza y el adenovirus.
-
Producen resfriado comn y gripe: Rhinovirus
Afecciones de vas respiratorias bajas, bronquitis: Virus Respiratorio Sincisial
Producen Traqueitis y neumonitis: Virus de Parainfluenza
Algunos de estos virus son ADN o ARN, y tiene afinidad por la mucina
Inoculacin en huevos embrionados de 7 a 9 das por va alantoidea y
amnitica:
Procedimiento:
Va alantoidea
- Visualizar al mebrin en el ovoscopio, marcar al embrin y la cmara de aire.
- Perforar la cscara en el borde de la cmara de aire.
- Usando una jeringa de 1 cc con agua calibre 22 inocular a travs de la perforacin
de la cscara y en un ngulo de 45 en relacin al eje longitudinal del huevo y
alejado del embrin, en zona libre de vascularizacin, inyectar 0.1 de la muestra.
Va amnitica:
- Visualizar en la forma anterior
- Perforar la cscara en el centro de la cmara de aire.
- Sostener el huevo en el ovoscopio y con jeringa de 1 cc de aguja calibre 22 de 1 y
pulgadas inocular en direccin del embrin 0.1 del inoculo en la cmara
amnitica.
OBSERVACION DE LAMINAS CON EFECTO CITOPATICO
En cultivo de clulas el virus ingresa y prolifera en las clulas y en muchos sistemas
clula virus, las clulas llegan a granular ya a desintegrarse despus de una hora o
das. Este efecto destructivo producido por el virus es conocido como efecto
citoptico.
Una lnea de clulas no es susceptible a todos los virus, por lo que es necesario
emplear diferentes clulas para los distintos virus.
Materiales:
- Lminas coloreadas con H.E. (Hematoxilina Eosina) de la lnea de clulas
establecidas Hep2 normal
- Lmina coloreada con H.E. Hep-2 infectada con poliovirus
- Lmina coloreada con H.E. Hep-2 infectada con adenovirus
- Microscopio
-
Lectura de las lminas:
1. Lmina Hep-2 normales se observa una capa de clulas poligonales unidas unas
con otras, formando una alfombrilla.
2. Lmina infectada con polioviorus (heces positivas de poliomielitis), se apreciar un
efecto citopatognico, con clulas redondeadas refringentes y desprendimiento
celular (lisis celular)
3. Lmina infectada con adenovirus (exudado amigdaliano positivo), se observa
retraccin celular, las clulas pierden su forma normal, el efecto citoptico es
caracterizado por la agrupacin de clulas formando racimos.
DECIMO SEXTA SEMANA
SEMINARIO
DECIMO SEPTIMA SEMANA
EXAMEN FINAL PRCTICO
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