ginecología - 03 - biología molecular en ginecología
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BIOLOGÍA MOLECULAR EN GINECOLOGÍAGustavo A. Sandoval, MSc.gsandovalp@usmp.pe
Ginecología y Obstetricia2015-II
Flora Microbiana Humana
Microbiota Vaginal
Permite amplificar millones de veces
Emplea nucleótidos y cebadores
Catalizada por una polimerasa termoestable
Técnicas en Biología Molecular
Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
• Componentes– Desoxinucleotidos (dNTPs) dATP, dTTP, dGTP, dCTP
– Enzima Taq (Thermus aquaticus)
– Iniciadores (Primers) Complementarios a la cadena de ADN
– ADN molde Concentracion de 20ng
Desoxinucleotidos (dNTPs)
Bases Nitrogenadas del ADN Union por puentes de hidrogeno
Adenina-TiminaGuanina-Citocina
ADN polimerasa
Actuar altas temperaturas
Thermus aquaticus
Thermococcus litoralis
Estable a altas temperaturas
Enzima de 95kd.
Actividad Exonucleasa: 5’—3’
5’ 3’
5’
5’
3’
3’
PRIMERS(Iniciadores, Cebadores)
Únicos: Asegura alta especificidad:
La secuencia del extremo 3’ es critica para el funcionamiento
Dos oligonucleótidos que son, cada uno, complementarios a una de las dos hebras del ADN.
CARACTERÍSTICAS IMPORTANTES
ÚnicosTamañoDimeros de primers
5’ 3’
3’ 5’
Denaturación94 oC 94 oC
Anillaje50-60oC
Extension72 oC
Tem
pera
tura
100
0
50
Tiempo
1. Denaturación: Apertura de la doble cadena2. Alineamiento: Anillaje de primers3. Extensión: Generación de la nueva cadena
Etapas de la PCR
30 ciclos Denaturación
El numero de copias del DNA delimitado por los primers se duplica en cada ciclo de PCR
0
1
3
8
2
4
1
2
4
16
5
32
6
64
Numero de ciclos
Numero de copias
Electroforesis de ADN
Agarosa y su preparación
Gel actúa como filtro molecular, controlando la migración en función del peso molecular
Agarosa
Mezclar agarosa con una solución tampón como el TBE (tris-ac.
Borico-EDTA)
Calentar
Electroforesis
Separación de moléculas en un campo eléctrico
Cámara de electroforesisElectrodo (+)
Electrodo (-)
Cubetas para preparación del gel de agarosa
Fuente de poder
Tinción con Bromuro de etidio
Agente intercalante Bromuro de Etidio Molécula fluorescente que se intercala entre las bases de la molécula de ADN
Absorción a 312 nm (UV)emisión en luz visible
Técnicas derivadas/basadas en PCR
PCR Nested :Amplificación de una secuencia dentro de otro previamente amplificada
PCR Multiplex :Varios targets diferentes en forma simultánea
PCR-RFLP :Polimorfismo genético
Reverse Transcriptase-PCR : Detección de mRNA
Real Time PCR :Cuantificación de copias iniciales – en tiempo real
SEGUNDA PCR
1 ReacciónPrimers externos para amplificación de una secuencia extensa
2 ReacciónPrimers internos para amplificación de una región especifica
PCR Nested (anidada)Dos rondas de amplificación con diferentes pares de primers
Genera mayor ESPECIFICIDAD
PCR Multiplex
• Amplificación de varias secuencias de forma simultanea
• Diferentes set de primers• Tamaño menor del amplicon
APLICACIONES
Ensayos de deleciones Amplifica exones
Ensayos forensesBiomarcadores polimórficos
Ensayos microbiológicosCepas y especies
PCR en tiempo real (RT-PCR)
La técnica RT-PCR combina la amplificación del DNA con la detección de los productos en un solo tubo.
“Tiempo Real”: Detección de productos de PCR en la medida que se van generandoMonitoreando la amplificación de una secuencia especifica en tiempo real
utilizando tecnologías fluorescentes
UTILIDADES - Genotipificación - Cuantificación de carga viral - Cuantificación del numero de copias de un gen - Expresión génica (RNA) Retrotranscripción
Componentes RT-PCR
Target Segmento de ADN que se ha seleccionado para amplificar. Es el molde (Muestra).
DNA Polimerasa Enzima capaz de copiar el ADN usado como molde una hebra simple de ADN (produce una hebra complementaria).
Primer Segmentos cortos de ADN de cadena simple específico para un segmento de DNA. Los primers son usados como punto inicial de la actividad de la DNA polimerasa.
Nucleótidos Pequeñas unidades de ADN; “letras“ del alfabeto biológico (A, T, C, G).
Solución Buffer Solución que reúne las condiciones necesarias para que la reacción de amplificación se de.
Sonda Segmento corto de ADN complementario al target (marcadores fluorescentes)
Termociclador Equipo que produce ciclos térmicos (Capacidad de detectar sondas)
PCR tradicional
PCR en Tiempo Real
Preparación de la Muestra Amplificación Detección
Preparación de la Muestra Amplificación y
Detección
PCR Convencional Vs. PCR en Tiempo Real
Patógenos bacterianos detectados
Avances Recientes
Número de niños afectados: de 400,000 a 200,000 en 4 años
Frecuencia Inicial durante gestación, parto o lactancia: de 15-45% a 1%
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