genomas: genotipado para diagnÓstico daniel grinberg departament de genètica universitat de...

GENOMAS: GENOTIPADO

PARA DIAGNÓSTICO

Daniel Grinberg

Departament de Genètica

Universitat de Barcelona

GENOTIPADO PARA DIAGNÓSTICO

Si sabemos cuál es el gen: - búsqueda de

mutaciones

Es una enfermedad MONOGENICA, autosómica recesiva.

Tener estas 2 mutaciones => patología

Ej: Gaucher N370S/L444P

Si no sabemos cuál es el gen:

GENOTIPADO PARA DIAGNÓSTICO

- búsqueda del gen en todo el GENOMA (con o sin candidatos)

- búsqueda de mutaciones

Pero no nos quedaremos en las enfermedades Monogénicas

También veremos enfermedades MULTIFACTORIALES

GENOTIPADO PARA DIAGNÓSTICO

En las enfermedades MULTIFACTORIALES:

el genotipado se hará en posiciones del genoma que están asociadas a una mayor susceptibilidad a padecer la enfermedad

GENOTIPADO PARA DIAGNÓSTICO

Tanto en las enfermedades MONOGÉNICAS como en las MULTIFACTORIALES

buscaremos en todo el genoma

el (o los) gen(es) responsable(s) de la patología

MUTACION y POLIMORFISMOS

Mutación

Polimorfismos

Patogénica

Susceptibilidad

Neutros(marcadores)

En genética humana:

POLIMORFISMOS

Microsatélites

SNPs

Por ej.: (CA)n

Por ej.: C G

DIPs Por ej.: 7A 8A

Estrategias para encontrar genesen enfermedades monogénicas

Loci anónimos

Genes candidatos

Linkage

Análisismutacional

Cosegregación

Búsqueda del gen

(genes candidatos)

Enzymatic cascade in visual

transduction11-cis-retinal

opsina

RHOall-trans-retinal

IRBP

IRBP

LIGHT

all-trans-retinol

T α - GTPT βγ+PHOS

PDEαβ GMPGMPc

GMPc

GTP Tαβγ - GDP

PDEαβγ

+γ

GC*RHO-RHO P

- -all trans retinol 11- -cis retinal11- -cis retinol

SAG

Ca

Na+++

dark

dark

light

ROD OUTER SEGMENT

CRBP CRALBP RETINAL PIGMENT EPITHELIUM

RDS1ROM

CNCG

GCAP

Ca++

Na+

Decidimos estudiar si el gen PDEB (que codifica a la subunidad beta de la fosfodiesterasa) podía ser el responsablede la ARRP.

PDEB D4S111 D4S95 D4S127

1 1 1 2 2 3 5 4

1 1 1 2 4 3 4 4

1 1 2 2 3 3 4 4

1 1 2 1 - - 4 4

1 1 1 1 - - 5 4

Familia B4: estudios de cosegregación con marcadores del gen PDEB y cercanos

CGGCGC CGGCGC

CGGCGC

CGGCGC

CGGCGC

CGGCGC CGGCGC

5'GAG AGC ACG GCG CTG CTG GAG CTG GTG CAG GAT ATG CAG GAG AGC ATC AAC ATG GAG CGC GTG GTC TTC AAG GTC

500

DUPLICATIONCT A CGG CGC TGC TGG AGC TGG TGC AGG ATA TGC AGG AGA GCA TCA ACA TGG AGC GCG TGG TCT TCA AGA TCC T GC GGC GCC 3'

571

repeat 1T......................G C...

repeat 2

repeat 1 repeat 2

unequal crossing-over

DUPLICATED

............ A

C............ A

CGGCGC

T........................A T......................Grepeat 1 repeat 1

... Arepeat 2

DELETEDrepeat 2

C...

C......................... G

572

T.......................G

B4 family: Characterization of the 71 bp duplication

Búsqueda del gen

(análisis de ligamiento)

* Ahora (y cada vez más): “positional candidate”

Down syndrome

Retinitis pigmentosa

I-1

II-7 II-8 II-10 II-11 II-12 II-13 II-14

I-2

II-1 II-2 II-3 II-4 II-5 II-6

P2 family

I-1 I-2

5 66 32 13 24 45 33 34 7

4 61 31 12 25 48 33 39 7

5 41 11 12 25 58 83 19 6

5 46 12 13 24 55 83 14 6

5 66 32 13 24 45 33 34 7

4 61 31 12 25 48 33 39 7

4 41 11 12 25 58 83 19 6

5 66 12 13 24 55 83 14 6

5 46 12 13 24 55 83 14 6

4 41 11 12 25 58 83 19 6

4 41 11 12 25 58 83 19 7

5 66 12 13 24 55 83 14 6

4 41 11 12 25 58 83 19 6

4 51 61 22 35 48 53 39 4

4 61 31 12 25 48 31 36 7

II-1

D2S148D2S364D2S350D2S318D2S118D2S389D2S161D2S117

II-2 II-3 II-4 II-5 II-6 II-7 II-8 II-10 II-11 II-12 II-14 II-15

Family P2: haplotype for the 2q31-q33 region

Marker Recombination fraction ( ) 0.00 0.01 0.05 0.1 0.2 0.3 0.4 Zmax max D2S148 - 1.53 1.95 1.91 1.51 0.95 0.34 1.96 0.06 D2S364 4.03 3.93 3.55 3.07 2.15 1.26 0.43 4.02 0.00 D2S350 2.19 2.14 1.93 1.68 1.19 0.72 0.27 2.19 0.00 D2S318 1.99 1.95 1.76 1.54 1.10 0.68 0.25 1.99 0.00 D2S118 4.12 4.02 3.63 3.14 2.19 1.28 0.44 4.12 0.00 D2S389 4.12 4.02 3.63 3.15 2.20 1.29 0.44 4.12 0.00 D2S161 0.31 0.41 0.60 0.66 0.58 0.38 0.13 0.66 0.11 D2S117 - 0.77 1.45 1.56 1.28 0.79 0.27 1.56 0.09

Lod scores between ARRP and markers on 2q in family P2

Journal of Medical GeneticsCopyright © 1998 by Journal of Medical Genetics.Volume 35(2) February 1998 pp 141-145

A new autosomal recessive retinitis pigmentosa locus maps on chromosome 2q31-q33

Bayes, Monica; Goldaracena, Begona; Martinez-Mir, Amalia; Iragui-Madoz, Maria Ignacia; Solans, Teresa; Chivelet, Pilar; Bussaglia, Elena; Ramos-Arroyo, Maria Antonia; Baiget, Montserrat; Vilageliu, Lluisa; Balcells, Susana; Gonzalez-Duarte, Roser; Grinberg, Daniel

FACTORES DE SUSCEPTIBILIDAD A LA OSTEOPOROSIS

Enfermedad Compleja

Gen 1

Gen 3Gen 2

Gen 4

Factor ambiental 1

Factor ambiental 3

Factorambiental 2

Factor ambiental 4

¿Cómo se sabe si una enfermedad es genética?

Mayor concordancia en mellizos:

que en mellizos:

monozigóticos dizigóticos

Componente hereditario de la Cardiopatía Isquémica

Estudios de mellizos

Concord. MZ

Concord. DZ

Daneses (352 m. por CAI)

Hombres Mujeres

39 % 44 %

26 % 14 %

Suecos (2810 m. por CAI)

Hombres Mujeres

40,5 % 32,6 %

32,8 % 16,3 %

¿Cómo se sabe si una enfermedad es genética?

Mayor riesgo para: que para:

Familiar de persona afecta

Familiar de persona sana

? ?

Bases Genéticas de Enfermedades

• Efecto grande

• Mutaciones poco frecuentes

• Explican una parte pequeña de la variabilidad poblacional

• Efecto leve

• Mutaciones comunes (polimorfismos)

• Explican gran parte de la variabilidad poblacional

GEN DE EFECTO PRINCIPAL

GENES DE SUSCEPTIBILIDAD

Bases Genéticas de Enfermedades

• Efecto grande

• Mutaciones poco frecuentes

• Explican una parte pequeña de la variabilidad poblacional

• Efecto leve

• Mutaciones comunes (polimorfismos)

• Explican gran parte de la variabilidad poblacional

GEN DE EFECTO PRINCIPAL

GENES DE SUSCEPTIBILIDAD

Estrategias para encontrar genes responsables de enfermedades

complejas

Loci anónimos

Genes candidatos

Linkage

Sib pairs

Asociación

Sib pairs

Estrategias para encontrar genes responsables de enfermedades

complejas

Loci anónimos

Genes candidatos

Linkage

Sib pairs

Asociación

Sib pairs

SIB PAIRS (pares de hermanos)

AB CD

AC ACADBCBD

AB CD AB CD

AC ACACAD

AC

General Dominante Recesivo

(1/4) (1/2) (1/1)

Estrategias para encontrar genes responsables de enfermedades

complejas

Loci anónimos

Genes candidatos

Linkage

Sib pairs

Asociación

Sib pairs

ASOCIACION

1 2 3

C

1 2 3

T

Gen candidato

Fenotipo Fenotipo

(riesgo patología) (riesgo patología)

(1)

B - b : polimorfismo que se detectaX1 - X2 : variante que es causa de la enfermedad

b B

X1 X2

(2)

b B

Desequilibrio de ligamiento

X1 X2

Individuos necesarios para los distintos estudios

ASOCIACION

SIB PAIRSLINKAGE

Posible efecto de un polimorfismo en una región

reguladora

Individuo 1 Individuo 2

Interacción polimorfismos/ambiente

AFA

Individuo 1 Individuo 2A FA

AFA

II

I

IMPLICACIÓN DE POLIMORFISMOS DEL PROMOTOR DEL GEN COLIA1 EN LA OSTEOPOROSIS

La osteoporosis es una enfermedad común

que se caracteriza por:

Densidad mineral ósea reducida

(pérdida excesiva de hueso)

Deterioro de la micro-

arquitectura del tejido óseo

Incremento del riesgo de

fractura.

El riesgo de fracturas osteoporóticas depende tanto del pico de masa ósea conseguida durante el crecimiento como de la tasa de pérdida de hueso a lo largo de la vida.

LA DENSIDAD MINERAL ÓSEA (DMO) ES EL PRINCIPAL DETERMINANTE DEL RIESGO DE FRACTURA ÓSEA

GENÉTICAGENÉTICA

MULTIFACTORIAL

INCIDENCIA EN PAISES DESARROLLADOS

40% MUJERES Y 12% HOMBRES

HEREDABILIDAD DE LA MASA ÓSEA :

50-70 % ESTUDIOS INTERGENERACIONALES

80-90 % ESTUDIOS DE MELLIZOS

46-62 % DESPUÉS DE AJUSTAR LA DENSIDAD ÓSEA POR EDAD, PESO Y HÁBITOS DE VIDA.

GENES CANDIDATOSGENES CANDIDATOS

RECEPTOR DE VITAMINA D

RECEPTOR DE ESTRÓGENOS

IL-6

TGFβ

COLÁGENO TIPO I

ESTUDIOS DE ASOCIACIÓN HECHOS CON ESTOS GENES HAN DADO RESULTADOS CONTROVERTIDOS DEPENDIENDO DE LA POBLACIÓN ESTUDIADA .

-2.3 Kb -1.8 Kb -1.67 Kb

PROMOTOR DEL COLAGEN DE TIPO I CADENA α 1

-2.0 Kb -1.50 Kb

F3 F2 F1

REGIÓN REGULADORA ESPECÍFICA DE OSTEOBLASTOS IN VIVO

SSCP F3 SSCP F2 SSCP F1

2 nous SNPs en el promotor del gen del COL2 nous SNPs en el promotor del gen del COL·LA·LAGEN 1GEN 1αα112 nous SNPs en el promotor del gen del COL2 nous SNPs en el promotor del gen del COL·LA·LAGEN 1GEN 1αα11

GGTT

TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT

PROMOTORPROMOTOR GEN COL·LCOL·LAAGENGEN

-1663indelT

-1997 G/T

PCOL1PCOL2

ANÁLISIS DE LA VARIANCIA (ANOVA)

FUENTE gl F Sig.

EDAD 1 4.986 0.026

MENOPAUSIA 1 9.312 0.003

PESO 1 10.092 0.002

PCOL2 2 4.324 0.014

PCOL1 2 1.441 0.239

PCOL1*PCOL2 2 4.011 0.019

VARIABLE DEPENDIENTE : DMO

8T

8A

7T

7A

PCOL1

8T

8A **

8T

8AExtracto - + + + + + + +

Sp

1G

RE

PC

OL

2

G

C

T

A

Competidores:

*C

Oligo marcado

PCOL2

Extracto - + + + + + + +

* G

G

C

Sp

1

GR

E

G

C

T

A

AC

competidores

*C

Oligo marcado

PCOL2

Extracto - + + + + + + +

IR

Luc+

-1997 G/T -1663indelT

0 1 2 3

IRD

LP

IR

SP

Relative Luciferase Activity (LUC/BGAL)

**

*

Haplotips del promotor de COL1A1

0

1

2

3

4

G/8T T/8T G/7T T/7T SP IR G/8T T/8T G/7T T/7T

**

* *

**LP

IRD

Al·lels independents del promotor de COL1A1

0

1

2

3

4

G/8T -1997 G -1997 T -1663indelT 8T -1663indelT 7T G/8T -1997 G -1997 T -1663indelT 8T -1663indelT 7T

*LP

IRD

8T 7T

G T G T 8T 7T

1.Rotterdam

GENE POLYMORPHISMS

Vitamin DReceptor

BsmI ApaI TaqI Cdx FokI

3502 / 7081 3502 / 7081 3502 / 7081 3402 / 7081 2589 / 7081

EstrogenReceptor -α PvuII XbaI (TA )n VNTR

4746 / 7081 4746 / 7081 3100 / 7081

-G 800A C-509T Le 10u Pro 25Arg Pro Th 263r IleTGF-β

3070 / 7081 3059 / 7081 3063/ 7081 3054 / 7081 3069 / 7081

COLI 1A Sp1

3055/7081

Proyecto GENOMOS n = 30.000

ESR1

6q25.1, 140 kb, 7 promotors (en osteoblasts promotor B)

(TA)n

XbaIPvuII

ESR1

ER (TA)

ER (TA)

26

25

24

23

22

21

20

19

18

17

16

15

14

13

12

11

10

9

Porcentaje

40

30

20

10

0

535 mostres Al.lel L (9-17) 57,3% H (18-26) 42,7%Genotips LL 33,6% LH 47,5% HH 18,9%

Població italiana Població holandesa Població xinesa

MICROSATÈL.LIT (TA)n -1174

XX vs. Xx and xx

Aarhus F

Aberdeen F

Barcelona F

Cambridge F

Cambridge M

DOPS F

Florence F

Oxagen F

Oxagen M

Rotterdam F

Rotterdam M

TOTAL-FE

TOTAL-RE

WOMEN-FE

WOMEN-RE

Odds ratio for vertebral fractures (95% CI)

6421.8.6.4.2.1

Pico SnapShotPolimorfismoSNPLL Pico1 i 2ER1C/T23 pb25.6 / 27.53 i 4VDR4C/T28 pb31.9 / 33.55 i 6ER2C/T33 pb35.6 / 37.57 i 8PCOL2C/A37 pb41.3 / 42.39 i 10VDR2C/T41 pb45.3 / 46.411 i 12VDR1C/T45 pb48.7 / 49.913 i 14VDR3G/T49 pb53.4 / 54.415 i 16Aro1G/A57 pb59.0 / 59.717 i 18Aro2C/A61 pb62.8 / 63.1

1 2

5

9

3

7

6 10

12 14 15

16

17

18

4

11

13

GA CCGG AA GG CC AA CC GA CA GG CA

SNPlex-48 plex

Haplotipo

B/bA/a C/c D/d

BA c D

ba C d

RecombinaciónFG

L

HI

J

K

M

N

O

fg

l

hi

j

k

m

n

o

FG

L

HI

J

K

m

n

o

fg

l

hi

j

k

M

N

O

Haplotipos

B/bA/a C/c D/d

BA c D

ba C d

ABCDABCdABcDAbCDaBCDABcdAbCdaBCd

AbcDaBcDabCDabcDabCdaBcdAbcdabcd

Haplotipos teóricos:

Haplotipos reales (98%):

ABcDabCDabCd

Entre estos polimorfismos habrá que encontrarel funcional.

HAPMAP

Bloques haplotípicos

5

tagSNP 13