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Facu l tad de C ienc ias
Desarrollo de nuevos métodos de vacunación basados en
la anafilotoxina C5a y la proteína extra A de la
fibronectina y péptidos sintéticos inhibidores de las
células T reguladoras
Francesc Rudilla Salvador
2011
-
F a c u l t a d d e C i e n c i a s
Desarrollo de nuevos métodos de vacunación basados en la
anafilotoxina C5a y la proteína extra A de la fibronectina y
péptidos sintéticos inhibidores de las células T reguladoras
Memoria presentada por D. Francesc Rudilla Salvador para aspirar al grado
de Doctor por la Universidad de Navarra
El presente trabajo ha sido realizado bajo mi dirección en el Departamento de Hepatología y Terapia Génica y autorizo su presentación ante el Tribunal que lo ha de juzgar.
Pamplona, 17 de Junio de 2011
Dr. Juan José Lasarte Sagastibelza
-
A mi mujer Sílvia
y a mi hijo Biel.
“Caminant sempre junts”
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AGRADECIMIENTOS
-
Han sido muchas las personas que me han ayudado y apoyado antes y durante
la realización de esta tesis. El espacio para darles las más sinceras gracias se
hace corto. A todas ellas quiero darles las gracias y espero de todo corazón no
dejarme a nadie.
A la Clínica Universidad de Navarra por la formación especializada en
Inmunología que he recibido.
Por la formación académica que en ellas he adquirido, quiero expresar
mi más profundo y sincero agradecimiento a la Universidad de Navarra, a la
Universitat de Girona y a la Universitat Autònoma de Barcelona.
Al Dr. Jesús Prieto, por permitirme formar parte del equipo de la
División de Terapia Génica y Hepatología y por el gran entusiasmo que
muestra en los proyectos. Muchas gracias por su apoyo.
A mi director de tesis, el Dr. Juan José Lasarte, creador de este proyecto.
Gracias por confiar en mí y darme la oportunidad de trabajar con un equipo
humano extraordinario. Gracias por tu dedicación e ilusión en el trabajo, tus
brillantes ideas, tu optimismo y por tener siempre en cuenta mis opiniones.
A los Dres. Francisco Borrás y Pablo Sarobe, por todas las buenas ideas
que aportáis y porque siempre se puede contar con vuestra inestimable ayuda y
objetividad científica, muchas gracias.
Quiero expresar, también, mi gratitud y mi consideración más sincera a
la Dra Noelia Casares y al Dr Javier Dotor porque cuando más lo he necesitado
me han proporcionado una dosis de esperanza e ilusión. Muchas Gracias Noe,
muchas gracias Dotor.
Mi gratitud también para la Dra Laura Arribillaga y la Dra Maika
Durántez, por su estímulo y ayuda desinteresada.
Para Cristina Mansilla, Marta Martínez, Teresa Lozano y Lorea
Villanueva por ser unas excelentes compañeras de trabajo. Muchas gracias por
vuestro apoyo.
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A todos los peptídicos, tengo la gran suerte de poder contar con vosotros
siempre que lo he necesitado, por eso esta tesis también es en parte vuestra.
Muchas gracias.
Al resto de mis compañeros del departamento y, en especial, a aquellos
con los que comparto planta gracias por hacer agradable el simple hecho de
estar. Gracias al Dr José Ignacio Riezu, por tener siempre una sonrisa. Muchas
gracias Edurne por tu ayuda en el trabajo realizado.
Quiero agradecer al Dr Rubén Pío por proporcionarme ratones C5aR ko
y al Dr Daniel Ajona por su entusiasmo y apoyo en el proyecto.
A la Dra Claude Leclerc, y a Catherine por su colaboración con los
ensayos con ratones TLR4 ko.
Al equipo del animalario, por ser un apoyo imprescindible para la
manipulación de los ratones.
Han sido prácticamente cinco años de trabajo tres de los cuales han sido
especialmente duros, por tener que combinar el trabajo como biólogo residente
(guardias incluidas) con la tesis doctoral y vivir lejos de la familia. Quiero
agradecer profundamente a mis padres Núria y Francisco por el apoyo que
constituyen en mi vida y por animarme siempre a mirar hacia delante sin
perder el presente. A mis hermanas Núria y Laia por el cariño que siempre me
han transmitido y por hacerme saber que siempre tendré cerca a mis hermanas.
A mis amigos y compañeros de viaje, gracias por ayudarme a crecer
como persona.
Mis últimas palabras de agradecimiento son para ti, Sílvia. Cada día
recibo mucho de ti, me apoyas incondicionalmente en todo aquello que me
propongo realizar y sin tu apoyo este proyecto no hubiese terminado. Muchas
gracias por ayudarme en todo aquello que has podido y gracias por permitirme
crecer a tu lado.
A todas aquellas personas que, aunque no he nombrado, han sido muy
importantes y necesarias. Muchas y muchísimas gracias.
-
ABREVIATURAS
-
Aa: aminoácido
AMPc: adenosín monofosfato cíclico
APC: célula presentadora de antígeno (del inglés antigen presenting cell)
as: antisentido (aplicado a los cebadores)
CFSE: carboxifluorescein succinimidil ester
CML: cultivo mixto leucocitario
CpG: regiones de DNA viral o bacteriano ricas en pares de citosina y guanina enlazados por fosfatos
Cpm: cuentas por minuto
DAF: factor acelerador de la degradación
DC: célula dendrítica (del inglés dendritic cell)
DIDS: ácido 4,4'-diisotiocianostilbeno-2,2'-disulfónico
DNA: ácido desoxirribonucléico (del inglés deoxyribonucleic acid)
DTc: determinante T citotóxico
DTh: determinante T helper
EDA: dominio extra A de la fibronectina (del inglés, extradomain-A fibronectin)
FBS: suero fetal bovino (del inglés foetal bovine serum)
FITC: isotiocianato de fluoresceína
FPLC: cromatografía liquida de proteína (del inglés Fast protein liquid chromatography)
GM-CSF: factor estimulador de colonias de granulocitos y macrófagos (del inglés, granulocyte-macrophage colony stimulatory factor)
HPPTLP: péptido señal de la pre-pro-tripsina humana (del inglés human preprotrypsin leader peptide)
Ig: inmunoglobulina
IL: interleucina
i.p.: intraperitoneal
IPTG: isopropil β-D-1-tiogalactopiranosido
i.t.: intratumoral
i.v.: intravenosa
LB: linfocitos B
LPS: lipopolisacárido
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LTc: linfocito T citotóxico
LTh: linfocito T helper
MC: medio completo
MHC: complejo principal de histocompatibilidad (del inglés major histocompatibility complex)
MyD88: factor de diferenciación mieloide 88 (del inglés myeloid differentiation factor 88)
NF-кB: factor de transcripción nuclear kappa de los linfocitos B (del inglés, nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells)
NK: célula asesina natural (del inglés natural killer)
NKT: linfocitos T asesinos naturales (del inglés natural killer T lymphocyte)
PAMP: patrones de moléculas asociados a patógenos (del inglés pathogen-associated molecular patterns)
PBS: tampón fosfato salino (del inglés phosphate buffered saline)
PCR: reacción en cadena de la polimerasa (del inglés polymerase chain reaction)
PE: ficoeritrina (del inglés phycoerythrin)
poly(I:C): ácido poliinosínico:policitidílico
PRR: receptores de patrones de reconocimiento (del inglés pattern recognition receptors)
RNA: ácido ribonucléico (del inglés ribonucleic acid)
s: sentido (aplicado a los cebadores)
TCR: receptor de células T (del inglés T cell receptor)
TLR: receptores tipo peaje (del inglés toll-like receptors)
TNF: factor de necrosis tumoral (del inglés tumor necrosis factor)
Treg: células T reguladoras
-
ÍNDICE
-
INTRODUCCIÓN................................................................................................................................................. 1
1. Sistema inmunitario ......................................................................................................................................... 3
1.1. Inmunidad innata.................................................................................................................................... 3
1.1.1. Receptores Toll-like (TLR) y vías de señalización.......................................................................... 5
1.1.2. Sistema del complemento. Generalidades ...................................................................................... 9
1.1.2.1. Activación del complemento ................................................................................................... 10
1.1.2.1.1. Vía clásica del complemento ............................................................................................. 10
1.1.2.1.2. Vía de las lectinas................................................................................................................ 11
1.1.2.1.3. Vía alternativa o sistema properdina ............................................................................... 12
1.1.2.1.4. Rutas alternativas de la activación del complemento.................................................... 12
1.1.2.2. Funciones efectoras del complemento ................................................................................... 13
1.1.3. Interacción del complemento con los receptores Toll like (TLR)................................................. 16
1.2. Inmunidad adaptativa o adquirida .................................................................................................... 20
1.2.1. Respuesta humoral........................................................................................................................... 20
1.2.2. Respuesta celular.............................................................................................................................. 21
1.2.2.1. Linfocitos Th............................................................................................................................... 21
1.2.2.2. Linfocitos T citotóxicos ............................................................................................................. 22
1.2.2.3. Linfocitos T reguladores CD4+CD25+.................................................................................... 24
1.3. Activación de una respuesta inmunitaria .......................................................................................... 25
1.3.1. Presentación antigénica .................................................................................................................. 25
1.3.2. Células dendríticas .......................................................................................................................... 27
1.3.3. Señalización del calcio en la activación linfocitaria .................................................................... 30
2. Estrategias de vacunación .............................................................................................................................. 31
2.1. DNA desnudo ......................................................................................................................................... 35
2.2. Proteínas recombinantes de fusión basadas en el dominio extra A de la fibronectina (EDA). 36
2.2.1. El domino extra A de la fibronectina (EDA) ................................................................................ 37
2.3. Péptidos inhibidores de las células T reguladoras........................................................................... 39
2.4. Anafilotoxinas. Generalidades ............................................................................................................ 40
2.4.1. Efecto biológico de C5a................................................................................................................... 40
2.4.2. Receptores del fragmento C5a ....................................................................................................... 45
2.4.2.1. Receptor C5aR (CD88) .............................................................................................................. 46
2.4.2.2. Receptor C5L2 (GPR77) ............................................................................................................ 47
2.5. Adyuvantes.............................................................................................................................................. 48
-
OBJETIVOS........................................................................................................................................................... 51
MATERIAL Y MÉTODOS ............................................................................................................................... 55
2. Células............................................................................................................................................................... 57
2. Ratones.............................................................................................................................................................. 58
3. Antígenos.......................................................................................................................................................... 58
3.1. Péptidos.................................................................................................................................................... 58
3.1.1. Síntesis de péptidos......................................................................................................................... 58
3.1.2. Péptidos comerciales....................................................................................................................... 61
3.1.3. Análisis de interacción biomolecular............................................................................................ 61
3.2. Plásmidos de expresión......................................................................................................................... 61
3.2.1. Construcción .................................................................................................................................... 61
3.2.2. Transfección en células adherentes ............................................................................................... 63
3.2.2.1. Western blot ............................................................................................................................... 64
3.3. Proteínas recombinantes de fusión ..................................................................................................... 65
3.3.1. Construcción .................................................................................................................................... 65
3.3.2. Purificación....................................................................................................................................... 67
3.3.2.1. Purificación por afinidad.......................................................................................................... 68
3.3.2.2. Intercambio iónico..................................................................................................................... 69
3.3.2.3. Replegado y detoxificado ......................................................................................................... 69
3.3.3. Análisis de la pureza....................................................................................................................... 71
3.3.3.1. Geles SDS-PAGE y tinción con Azul de Coomassie ............................................................. 71
3.3.4. Ensayos de actividad....................................................................................................................... 72
3.3.3.1. Análisis de activación de monocitos ....................................................................................... 72
3.3.4.2. Análisis de maduración de células dendríticas ..................................................................... 72
3.3.4.2.1. Diferenciación DC ............................................................................................................... 72
3.3.4.2.2. Análisis in vitro de la maduración de las células dendríticas......................................... 73
3.3.4.2.2.1. Expresión de marcadores de maduración .................................................................. 74
3.3.4.2.2.2. Producción de citocinas ................................................................................................ 74
3.3.4.3. Presentación antigénica ............................................................................................................ 74
3.3.4.4. Migración celular....................................................................................................................... 75
4. Estudio in vitro de los intercambiadores de iones cloruro, calcio y potasio en la activación linfocitaria ........................................................................................................................................................ 75
4.1. Análisis de la expresión de mRNA por PCR quantitativa .............................................................. 75
4.2. Purificación de células T reguladoras................................................................................................. 76
4.3. Ensayos de proliferación celular.......................................................................................................... 76
-
4.4. Cinéticas de calcio intracelular ............................................................................................................ 76
5. Estudio de la apoptosis linfocitaria in vitro ............................................................................................... 77
5.1. Técnica de Tunel..................................................................................................................................... 77
6. Estudio de la respuesta inmunitaria en ratones......................................................................................... 78
6.1. Inmunización .......................................................................................................................................... 78
6.1.1. Plásmido ........................................................................................................................................... 78
6.1.2. Proteína............................................................................................................................................. 78
6.2. Estudio in vitro e in vivo de las respuestas inmunitarias inducidas............................................. 78
6.2.1. Aislamiento de esplenocitos........................................................................................................... 78
6.2.2. ELISPOT ........................................................................................................................................... 79
6.2.3. In vivo killing ..................................................................................................................................... 79
6.2.4. Inducción de la respuesta inmunitaria en ausencia de señalización C5aR.............................. 80
6.2.5. Depleción in vivo de células NK1.1 ............................................................................................... 80
6.3. Estudios in vivo de protección tumoral .............................................................................................. 81
6.3.1. Modelo tumoral ................................................................................................................................ 81
6.3.2. Estudios de protección de tumores ................................................................................................ 81
6.3.3. Estudios de tratamiento de tumores .............................................................................................. 82
7. Estadística ......................................................................................................................................................... 82
RESULTADOS ..................................................................................................................................................... 83
1. Implicación de los intercambiadores de Cl- y canales de Ca2+ en la activación celular de los linfocitos T efectores y T reguladores (CD4+CD25+FOXP3+) ................................................................ 85
1.1. Efecto de la inhibición de los intercambiadores de aniones cloruro sobre la acción de las células T reguladoras (CD4+CD25+FOXP3+)................................................................................. 85
1.2. Efecto de la inhibición de los intercambiadores de aniones cloruro sobre la expresión de mRNAs en los linfocitos T................................................................................................................ 90
1.3. Efecto de la inhibición de los intercambiadores de aniones cloruro sobre el flujo de entrada de calcio en los linfocitos ................................................................................................................... 92
2. Desarrollo de péptidos inhibidores del intercambiador cloruro/bicarbonato AE2............................. 97
2.1. Síntesis de los péptidos y ensayos funcionales de selección de los péptidos inhibidores ...... 97
2.2. Ensayos de unión del péptido AE2-17 al bucle 3 del intercambiador AE2 .................................. 99
2.3. Efecto del péptido p17AE2 en la proliferación celular .................................................................. 102
2.4. Efecto del péptido p17AE2 en la apoptosis celular......................................................................... 106
3. Estudio del potencial inmunomodulador de las anafilotoxinas para el desarrollo de vacunas...... 107
3.1. Cribado con plásmidos de expresión................................................................................................ 107
3.2. Utilización del fragmento C5a como adyuvante de vacunación .................................................. 110
3.2.1. Purificación de las proteínas recombinantes de fusión ............................................................. 110
3.2.1.1. Purificación de EDA-SIINFEKL.............................................................................................. 113
-
3.2.1.2. Purificación de C5a-EDA-SIINFEKL ..................................................................................... 113
3.2.1.3. Purificación de EDA-SIINFEKL-C5a y SIINFEKLC5a......................................................... 115
3.2.2. Inducción de la producción de TNF-α por la línea THP-1........................................................ 117
3.2.3. Maduración de células dendríticas. ............................................................................................. 118
3.2.3.1. Estudio de la expresión de marcadores de superficie en las células dendríticas ............. 118
3.2.3.2. Inducción de citocinas y quimiocinas por las células dendríticas...................................... 120
3.2.4. Análisis in vitro de la quimiotaxis inducida por C5a ................................................................ 121
3.2.5. Presentación antigénica de EDA-SIINFEKL, EDA-SIINFEKL-C5a y SIINFEKL-C5a .......... 124
3.2.6. Inducción de la respuesta inmunitaria frente a SIINFEKL ...................................................... 125
3.2.7. Efecto de las proteínas recombinantes sobre la población de las células T reguladoras en la inducción de la respuesta inmunitaria ........................................................................................ 128
3.2.8. Inducción de la respuesta inmunitaria en ausencia de señalización TLR4............................ 130
3.2.9. Inducción de la respuesta inmunitaria en ausencia de señalización C5aR............................ 132
3.2.10. Inducción de la respuesta inmunitaria NK. ............................................................................. 134
3.2.11. Inducción de protección antitumoral y tratamiento de tumores establecidos .................... 137
DISCUSIÓN........................................................................................................................................................ 141
1. Estudio del desarrollo de inhibidores de la acción de las células T reguladoras .............................. 143
2. Estudio del efecto adyuvante de las proteínas del complemento......................................................... 147
CONCLUSIONES ............................................................................................................................................. 155
BIBLIOGRAFÍA................................................................................................................................................. 159
ANEXOS ............................................................................................................................................................... 179
-
INTRODUCCIÓN
-
Introducción
3
1. Sistema inmunitario
El sistema inmunitario está compuesto de muchos tipos celulares
interdependientes que en conjunto protegen al organismo contra bacterias,
parásitos, hongos, infecciones virales y frente al crecimiento tumoral. Muchos
de estos tipos celulares tienen funciones especializadas, pueden engullir
bacterias y parásitos o eliminar células tumorales o células propias del
organismo infectadas por virus. Por lo tanto, es un sistema que discrimina entre
lo propio y lo ajeno, permitiendo actuar de forma específica. Cuando esta
tolerancia inmunológica se altera, es decir, cuando falla la no respuesta a lo
propio y a lo no dañino, se generan respuestas frente a estructuras propias
dando lugar a procesos autoinmunes o bien procesos de hipersensibilidad
donde el sistema inmunitario responde de forma exagerada a estructuras
foráneas no patógenas, produciendo daño al organismo.
La respuesta inmunitaria está formada por dos tipos principales de
respuesta en función de la naturaleza de las estructuras de reconocimiento del
patógeno. Estas estructuras pueden ser genéricas (respuesta innata) o bien
específicas, utilizando receptores generados al azar que tienen un repertorio de
reconocimiento prácticamente ilimitado (respuesta adaptativa).
La interacción entre ambas formas de respuesta es esencial para una
respuesta inmunológica eficaz. Los mecanismos innatos son fundamentales
para la iniciación de las respuestas adaptativas y además permiten controlar el
tipo de respuesta inducida, por otra parte la respuesta innata también es
reclutada en la fase efectora de la respuesta adaptativa. Es importante destacar
que las interacciones entre ambas respuestas son muchas, complejas y
bidireccionales, formando parte de una única respuesta global de defensa.
1.1. Inmunidad innata
La inmunidad innata constituye la primera línea de defensa contra las
infecciones. Comprende toda una serie de mecanismos de defensa constitutivos
y listos para movilizarse cuando se produzca una infección, preparados para
responder con gran rapidez. Se caracteriza por ser una respuesta no antígeno
-
Introducción
4
específica que reacciona inicialmente del mismo modo frente a una amplia
variedad de infecciones. Es una respuesta que no genera memoria
inmunológica, es decir, que en encuentros posteriores con el mismo patógeno
no se produce una respuesta mejorada y por lo tanto no es una respuesta
inmunitaria duradera.
Los mecanismos defensivos de la respuesta innata están formados por
barreras físicas como la piel, las mucosas, el ácido estomacal, el reflejo de la tos
entre otros y barreras químicas como la fiebre, la inflamación y el sistema del
complemento. El sistema del complemento constituye el mayor componente
humoral de la respuesta innata y actúa como mediador de varios mecanismos
de la respuesta adaptativa, entre ellos la citotoxicidad mediada por anticuerpos.
Además, la respuesta innata tiene un componente celular importante
cuyo mecanismo defensivo es la fagocitosis y la citotoxicidad celular. Las
poblaciones celulares responsables del desarrollo de una respuesta inmunitaria
innata son las células fagocíticas (macrófagos, neutrófilos, células dendríticas),
mastocitos, basófilos, eosinófilos y las células citotóxicas naturales o células NK
(del inglés natural killer). Las células de la respuesta innata también son
importantes mediadores en la activación del sistema inmune adaptativo. Un
ejemplo es la secreción de interferón gamma (IFN-γ) por parte de las células NK
(Mandelboim et al. 1998; Arase et al. 1996; Young and Hardy 1995); otro
ejemplo lo encontramos en las células dendríticas que presentan antígenos a las
células T, uno de los tipos celulares clave del sistema inmunitario adaptativo
(Guermonprez et al. 2002). Los determinantes reconocidos por los componentes
de la respuesta innata (no específica) difieren de los reconocidos por la
respuesta adaptativa (específica). Mientras que los componentes de la respuesta
adaptativa reconocen y reaccionan frente a un patógeno en particular, los
componentes del sistema inmunitario innato reconocen amplios patrones
moleculares que se encuentran en grupos de patógenos relacionados,
careciendo de un alto grado de especificidad. Los patrones moleculares
comunes reconocidos por el sistema inmunitario innato han sido llamados
patrones moleculares asociados a patógenos (PAMP, del inglés “pathogen
-
Introducción
5
associated molecular patterns”), y sus receptores se llaman receptores de patrones
de reconocimiento (PRR, del inglés pattern recognition receptors) (Medzhitov
2001; Janeway and Medzhitov 2002).
1.1.1. Receptores Toll-like (TLR) y vías de señalización
Los PRR se pueden dividir en tres clases dependiendo de su ubicación:
secretables, de membrana o citosólicos. Los PRR transmembrana incluyen
varios tipos de receptores, entre ellos destacamos la familia de los receptores
TLR (del inglés Toll-like receptors).
Los TLR son glicoproteínas transmembrana tipo I formadas por un
dominio extracelular N terminal rico en leucinas, contiene entre 15-30 LRR (del
inglés leucine-rich repeats) que media el reconocimiento de los PAMPs, un
dominio transmembrana y el dominio intracelular C terminal, conocido como
TIR (del inglés Toll/Interleukin-1 receptor) que está implicado en la transducción
de la señalización. El número de TLRs puede diferir en función de la especie, se
han identificado entre 10 y 12 TLRs funcionales en humanos y ratones
respectivamente. Los TLRs 1-9 están conservados en ambas especies. Los
PAMPs reconocidos por los TLR son lípidos, lipoproteínas, proteínas y ácidos
nucleicos derivados de una amplia gama de microbios, como bacterias, virus,
parásitos y hongos. Se localizan principalmente en células presentadoras de
antígeno profesionales (células mononucleares, dendríticas y macrófagos) y en
diferentes células epiteliales (Takeda et al. 2003; Akira and Takeda 2004).
Los TLRs se clasifican en dos tipos en función de su localización y sus
respectivos ligandos PAMPs. Por un lado, los TLR 1, 2, 4, 5 y 6 reconocen
principalmente productos bacterianos (lipoproteínas, lípidos y proteínas), por
lo que se expresan en la membrana. Y por otro lado, los TLR 3, 7, 8 y 9 que se
localizan en los endosomas, retículo endoplasmático, lisosomas y
endolisosomas donde reconocen ácidos nucleicos virales (Tabla 1).
Está descrita la existencia de una comunicación cruzada entre los TLRs y
las moléculas adaptadoras, lo que aumenta la especificidad y amplía el patrón
de PAMPs reconocidos por un mismo receptor (Latz et al. 2003; Martin et al.
-
Introducción
6
2005). Se ha observado que algunos de estos TLR forman heterodímeros (como
los formados por TLR1-TLR2) y homodímeros (TLR3-TLR3) (Kumar et al. 2009).
Tabla 1. Resumen de los diferentes TLR junto con sus principales características. Adaptado de
Kumar, Kawai et al 2009. (Kumar et al. 2009)
TLR Localización Principales PAMPs Vía de señalización
Factor de
transcripción Citocinas inducidas
TLR1/2 Superficie celular Triacil-lipopéptidos TIRAP/MyD88 NFкB Cit. inflamatorias (TNF-, IL-6)
TLR2 Superficie celular Peptidoglicano, Hemaglutinina
TIRAP/MyD88 NFкB Cit. inflamatorias (TNF-, IL-6)
TLR3 Endosomas virus RNAss, virus DNAds
TRIF NFкB, IRF3,7 Cit. inflamatorias (TNF-, IL-6), IFN
TLR4 Superficie celular LPS TIRAP/MyD88, TRAM/TRIF
NFкB, IRF3,7 Cit. inflamatorias (TNF-, IL-6), IFN
TLR5 Superficie celular Flagelina MyD88 NFкB Cit. inflamatorias (TNF-, IL-6)
TLR6/2 Superficie celular Diacil-lipopéptidos TIRAP/MyD88 NFкB Cit. inflamatorias (TNF-, IL-6)
TLR7 Endosomas virus RNAss MyD88 NFкB, IRF7 Cit. inflamatorias (TNF-, IL-6), IFN
TLR8 Endosomas virus RNAss MyD88 NFкB, IRF7 Cit. inflamatorias (TNF-, IL-6), IFN
TLR9 Endosomas virus DNAds, motivos CpG
MyD88 NFкB, IRF7 Cit. inflamatorias (TNF-, IL-6), IFN
TLR11 Superficie celular Profilin like protein MyD88 NFкB Cit. inflamatorias (TNF-, IL-6)
Cada receptor TLR produce efectos biológicos específicos tras el
reconocimiento de sus ligandos, debido al reclutamiento de moléculas
adaptadoras con dominios de unión TIR, como MyD88, TIRAP, TRIF y TRAM.
Las vías de señalización de los TLR se pueden clasificar en dos vías
distintas. La vía dependiente de My-D88 que conlleva la activación de NF-κB
con la posterior inducción de citocinas pro-inflamatorias (TNF- o IL-6) o la vía
dependiente de TRIF responsable de la inducción de interferón tipo I. La unión
de TLR1, 2, 5, 6, 7, 8, 9 y 11 con sus respectivos ligandos recluta MyD88.
Además, TLR1, 2 y 6 lo hacen a través del adaptador TIRAP, que sirve de unión
entre los dominios TIR de los TLR y la molécula MyD88. TLR3 por su parte
recluta TRIF. El receptor TLR4 recluta a las cuatro moléculas adaptadoras
siendo capaz de señalizar a través de ambas vías, ya sea mediante la unión a
TIRAP que lleva al reclutamiento de MyD88, o a TRAM para activar la vía de
-
Introducción
7
señalización de TRIF. Para la inducción de citocinas pro-inflamatorias a través
de TLR4 es necesaria la activación de ambas vías de señalización (Figuras 1 y 2 )
(Kawai and Akira 2010).
Figura 1. Esquema de las vías de señalización de los TLR de membrana (Kawai and Akira 2010).
Figura 2. Esquema de las vías de señalización de los TLR intracelulares (Kawai and Akira 2010).
-
Introducción
8
Hay una creciente evidencia de que los receptores TLR juegan un papel
clave en la mediación de las respuestas sistémicas, a la invasión de patógenos
durante la sepsis, así como también en otras enfermedades inflamatorias y
autoinmunes. En consecuencia, se ha sugerido que el bloqueo de la función de
los TLR puede, en el futuro, traer nuevas posibilidades terapéuticas con el
objetivo de suprimir estados de inflamación. Algunos de los inhibidores
estudiados son variantes de las moléculas adaptadoras, ubiquitin ligasas,
deubiquitinasas, micro RNAs y reguladores transcripcionales (O'Neill and
Bowie 2007; Kawai and Akira 2010).
Por otra parte, la señalización de los TLR podría utilizarse para potenciar
el efecto terapéutico de las vacunas, puesto que la activación de la señalización
TLR provoca una activación rápida de la inmunidad innata mediante la
maduración de las células dendríticas (DC), producción de citocinas pro-
inflamatorias y citocinas antivirales, así como la expresión de moléculas co
estimuladoras y receptores de quimiocinas (Aderem and Ulevitch 2000; Kaisho
and Akira 2002; Werling and Jungi 2003). Además, está descrita la importancia
de la señalización TLR en células T efectoras y en células T reguladoras,
asociándose dichas vías a la diferenciación de las células T memoria (Pasare
and Medzhitov 2004; Salem et al. 2005), polarización de la respuesta Th1
(Schnare et al. 2001), pérdida temporal de la función supresora de las células T
reguladoras (reduciendo la expresión de Foxp3) (Hackl et al. 2011; Liu et al.
2006; Sutmuller et al. 2006), la generación de células Th17 o el bloqueo de la
conversión de las células T reguladoras promoviendo la respuesta autoinmune
(Chen et al. 2007; Abdollahi-Roodsaz et al. 2008). En definitiva, los TLR
permiten modular la respuesta celular T a través de la respuesta innata y
directamente por su acción en la respuesta adaptativa, permitiendo la inducción
de una inmunidad adaptativa eficaz. En este sentido se pueden considerar
receptores adyuvantes.
-
Introducción
9
1.1.2. Sistema del complemento. Generalidades
El complemento es un conjunto de proteínas termolábiles, la gran
mayoría plasmáticas y algunas de membrana, cuya función principal es
potenciar la inflamación, la fagocitosis y la lisis de los microorganismos. El
hepatocito es el principal productor de factores del complemento, también los
macrófagos activados en el foco inflamatorio, lo que es de gran importancia
porque así se garantiza la presencia de estos factores del complemento en el
foco inflamatorio. Las citocinas inflamatorias (IL-1, IL-6 y TNFα) y el IFNγ,
incrementan la síntesis de algunos factores del complemento en el hígado.
La gran mayoría de los factores del complemento son enzimas
proteolíticas. Cuando una de estas enzimas actúa sobre su sustrato, este se
escinde en dos fragmentos. Estos fragmentos se nombran igual que al sustrato
pero añadiéndoles una letra minúscula. Por ejemplo, C3 se escinde en dos
fragmentos, al mayor se le llama C3b y al menor C3a. Los dos fragmentos
resultantes tienen actividad biológica, si bien dichas acciones son distintas para
cada uno de ellos. Son un ejemplo, algunos pequeños péptidos con actividad de
anafilotoxinas, liberados durante la activación del complemento. El más potente
es el C5a, seguido por el C3a. Por lo tanto, durante la activación del
complemento tienen lugar una serie de reacciones en cascada, en cada reacción
se genera un producto activo, que además de determinar que la cadena prosiga
hasta la reacción siguiente, puede tener funciones biológicas en la defensa
frente a microorganismos.
El complemento es activado por tres vías distintas, la clásica, la de las
lectinas (MBL) y la alternativa (o properdina) (Vergani 1986) (Figura 3). Las tres
tienen en común la activación del componente C3 y por lo tanto confluyen en
una vía común de ataque a membrana, pero difieren en la naturaleza del
reconocimiento. La vía clásica es activada por anticuerpos liberados tras una
respuesta humoral. La vía de las lectinas es activada tras el reconocimiento e
interacción de patrones asociados a patógenos (PAMP´s) por proteínas lectinas.
Y por último, la vía alternativa se diferencia del resto debido a una activación
-
Introducción
10
espontánea de C3 con una tasa muy moderada (cuya activación y amplificación
ocurren solamente en presencia de ciertos agentes, principalmente bacterias) y a
su promiscuidad en interaccionar con un amplio rango de aceptores.
Figura 3. Vías de activación del complemento (Kemper and Atkinson 2007).
1.1.2.1. Activación del complemento
1.1.2.1.1. Vía clásica del complemento
Esta vía se activa tras la unión del componente C1q del factor C1, a la
fracción constante de las inmunoglobulinas IgG (clases IgG1, IgG2, IgG3) o IgM
(Holme and Whaley 1989). Estos anticuerpos deben formar el complejo
antígeno anticuerpo para que se produzca tal activación, en el caso de la IgG
que es una inmunoglobulina monomérica se necesitan al menos dos complejos
antígeno anticuerpo, mientras que en el caso de la IgM al ser pentamérica sólo
es necesario un complejo Ag-Ac. Las inmunoglobulinas solubles no activarán al
factor C1. También el C1q reconoce factores endógenos como células muertas,
proteínas de la matriz extracelular, pentraxinas, priones, depósitos amiloides y
DNA.
El factor C1 forma un complejo C1qr2s2 estabilizado por Ca2+. Tras la
unión del factor C1 con la región constante de la cadena µ de IgM o de la
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Introducción
11
cadena γ de IgG, tendrá lugar una activación en secuencia de la actividad
proteolítica de los componentes C1r y C1s. C1r activa a C1s. Por acción de C1s,
con actividad serín proteasa, se escinde el fragmento C4, liberándose un
pequeño fragmento C4a y un C4b. C4a tiene una actividad anafilotoxina leve, y
C4b tiene actividad opsonina. En presencia de Mg2+, C2 forma un complejo con
C4b y se transforma en un nuevo sustrato para C1s, formándose el complejo
C4b2a con actividad C3 convertasa para escindir C3. La escisión de C3 implica
que se agrega C3b al complejo C4b2a formando la C5 convertasa (C4b2a3b). La
degradación de C4b2a es inducida por una proteína de unión a C4 (C4bp) o a
un receptor de C3b (C1R) en presencia del factor I.
C5 se escinde en C5a y C5b por la acción de la C5a convertasa. C5a es la
anafilotoxina más potente. En este momento empieza la segunda fase de
activación del complemento que consiste en el ensamblaje de los componentes
terminales. C6 se une a C5b y luego a C7, se insertan en la membrana
plasmática y posteriormente se une C8, causando una penetración en la
membrana plasmática y la inducción de la polimerización de C9 en membrana.
El resultado final es la formación del complejo de ataque a membrana (CAM) o
componente terminal del complemento (CTC), con la generación de un poro de
100 Å en la membrana plasmática que causa la osmólisis celular (Morgan 1989;
Bhakdi et al. 1990).
1.1.2.1.2. Vía de las lectinas
Es una vía análoga a la clásica que se activa por proteínas homólogas a
C1q: ficolinas y lectina de unión a manosa (MBL). Su activación es
independiente de anticuerpos. Estas proteínas reconocen específicamente
carbohidratos en la superficie de patógenos o células apoptóticas, como la
manosa y la N-acetil-glucosamina (GlcNac). Tras su unión con los
carbohidratos, la proteína de unión a manosa activa al complejo C1qrs. Otras
proteínas, las serín proteasas asociadas a MBL (MASP-1 y MASP-2) funcionan
de manera análoga a C1r y C1s, hidrolizando los componentes C4 y C2 para
formar la C3 convertasa (C4bC2a), que es común para ambas vías, la clásica y la
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Introducción
12
de la lectina. Los fragmentos C3b generados presentan actividad opsónica,
estimulando la opsonización para el aclaramiento de microorganismos y
residuos celulares resultantes de la apoptosis.
1.1.2.1.3. Vía alternativa o sistema properdina
La vía alternativa se inicia por la interacción del componente C3 con
polisacáridos, su activación es independiente de anticuerpos, presenta un
mecanismo de acción distinto a la vía clásica y a la lectina. Constituye una
primera línea de defensa en la respuesta innata. Es la vía más primitiva.
Constituye un estado de activación permanente del componente C3, se
inicia tras la hidrólisis espontánea de C3 y en presencia de niveles bajos de C3.
En ausencia de microorganismos, la cantidad de C3b producida es inactivada
por el Factor H. En presencia de microorganismos, C3 se une a la superficie
invasora evadiendo la acción del Factor H, se forma un complejo con el Factor
B, el cual se fragmenta por acción del factor D en presencia de Mg2+. El
complejo C3bBb es altamente inestable y la vía alternativa no continúa sin la
presencia de una proteína circulante llamada properdina, que permite
estabilizar el complejo C3bBb. Se forma la C3 convertasa de la vía alternativa
(compuesta por C3bBb), que actuará enzimáticamente sobre moléculas de C3,
amplificando la cascada. Parte de este C3b se puede unir a la C3 convertasa y
formar la C5 convertasa de la vía alternativa (C3bBb3b) que activará a C6,
convergiendo en los mismos pasos no enzimáticos y de ensamblaje finales de la
vía clásica.
1.1.2.1.4. Rutas alternativas de la activación del complemento
Además de los tres principales mecanismos de activación del
complemento, hay varias rutas accesorias que permiten activar el sistema del
complemento en respuesta a varios estados.
La vía de “la lectina ligadora de manosa” (MBL) puede ser activada
directamente por la unión de lectina de unión a manosa (MBL) a
inmunoglobulina IgM que interacciona con antígenos isquémicos de células
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Introducción
13
endoteliales en situación de daño por isquemia-reperfusión (McMullen et al.
2006).
En ausencia de C2 y C4 pero en presencia de componentes de la vía
alternativa es posible que complejos antígeno anticuerpo o oligonucleótidos
activen a C1 o lectina de unión a manosa (MBL) respectivamente (Selander et al.
2006).
Está descrito que las anafilotoxinas se pueden generar por la acción de
ciertas proteasas extrínsecas, el componente C3 puede ser degradado y activado
por proteasas como la trombina o la calicreína (Markiewski et al. 2007; Amara et
al. 2008), además el componente C5 puede degradarse por la trombina sin la
necesidad de la acción de C3 (Huber-Lang et al. 2006). Por lo tanto existe un
nexo entre el sistema del complemento y la cascada de coagulación. Asimismo,
las anafilotoxinas C3a y C5a se pueden generar directamente de los
componentes C3 y C5 respectivamente por proteasas que se presentan en
procesos alérgicos, en mecanismos que involucran la generación de radicales
libres y en la activación de la calicreína debido a la presencia de fibras de
amianto y de sílice (Maruo et al. 1997; Governa et al. 2000; Governa et al. 2005)
1.1.2.2. Funciones efectoras del complemento
El sistema de complemento funciona como una herramienta de vigilancia
inmunológica. En un ambiente sano, hay una actividad constitutiva y ligera del
complemento, asegurándose un sondeo que es llevado a cabo por la presencia
de proteínas solubles que reconocen estructuras propias y proteínas de
membrana reguladoras del complemento, de modo que se previene la
amplificación de la señal de activación del complemento. Un ejemplo de estas
proteínas de membrana es el factor DAF (factor acelerador de la degradación)
que está ampliamente distribuído y cuya función es inhibir la unión y facilitar la
disociación de C4b y C2a. De este modo, estos factores reguladores pueden
prevenir la lisis de las células autólogas vivas. En presencia de células
apoptóticas o de microorganismos bacterianos se produce un descenso de estos
factores reguladores, al mismo tiempo que las proteínas que reconocen los
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Introducción
14
patrones moleculares asociados a patógenos (PAMPs) amplifican la activación
del complemento. Tiene lugar la opsonización de la célula apoptótica o del
microorganismo por fragmentos del complemento y la posterior fagocitosis o la
formación del complejo de ataque a membrana que conlleva la lisis celular, la
señalización pro-inflamatoria mediada por la liberación de los fragmentos del
complemento con actividad biológica llamados anafilotoxinas, y además, se
induce una estimulación downstream de la respuesta inmune.
Por lo tanto tiene lugar una acción de reconocimiento, activación y
regulación del sistema del complemento, condicionada a la presencia de células
sanas, apoptóticas o microorganismos bacterianos.
Las proteínas reguladoras del complemento pueden ser solubles o de
membrana y ayudan al control del sistema de ataque del complemento
ajustando su severidad, propagación y destino en la célula diana. Ejercen su
acción en distintos puntos, tanto en la vía clásica como en la alternativa o de las
lectinas, centrándose fundamentalmente en la activación de C3.
El sistema del complemento tiene una diversidad de funciones biológicas
defensivas. Estas funciones se llevan a cabo por diferentes fracciones activas del
complemento que interaccionan con sus respectivos receptores de membrana.
Las acciones anafilotóxicas, quimiotáxicas y opsonizantes del
complemento lo convierten en un factor fundamental en la potenciación de la
inflamación, fenómeno básico en la defensa frente a la infección y a los procesos
tumorales. Las principales acciones del complemento son las siguientes:
Acción lítica: la lisis se produce como consecuencia de la formación del
CAM (complejo de ataque a la membrana), este complejo puede lisar bacterias
gram-negativas, parásitos, virus encapsulados, eritrocitos y células nucleadas.
Las bacterias gram positivas son bastante resistentes a la acción lítica del
complemento. Se conoce como citotoxicidad dependiente de complemento.
Respuesta inflamatoria. Acción anafilotóxica: como consecuencia de la
fragmentación de distintos componentes del complemento se generan unos
fragmentos activos llamados anafilotoxinas, estos son el C3a, C4a y C5a. Estas
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Introducción
15
anafilotoxinas se unen a sus respectivos receptores induciendo la liberación de
mediadores de la inflamación. Estas sustancias aumentan la vasodilatación y la
permeabilidad de los vasos sanguíneos. Así mismo, inducen la extravasación de
los leucocitos al endotelio. C3a y C5a son potentes quimiotácticos para
neutrófilos, monocitos y macrófagos hacia el lugar de activación del
complemento. Causan una fuerte señalización inflamatoria a través de sus
receptores acoplados a proteínas G (Ames et al. 1996; Monk et al. 2007). C5a
también co-regula la fagocitosis mediada por inmunocomplejos, modulando la
expresión de los receptores de activación FcγRI/II y de inhibición FcγRIIB
(Shushakova et al. 2002; Kumar et al. 2006). La única regulación endógena de
C3a y C5a, es la pérdida de un residuo de arginina terminal mediada por la
actividad carboxipeptidasa, dando lugar a C5a desArg y C3a desArg (Bokisch
and Muller-Eberhard 1970). Estos productos son activos pero con un diferente
espectro de acción (Jalili et al. ; Ratajczak et al. 2006; MacLaren et al. 2008).
Opsonización: C3b es la principal opsonina del complemento. Los
antígenos recubiertos con C3b se unen a receptores específicos en células
fagocíticas facilitando la fagocitosis.
La neutralización de virus: C3b induce la agregación de partículas virales
formando una capa gruesa que bloquea la fijación de los virus a la célula. Este
agregado puede ser fagocitado mediante la interacción de receptores del
complemento y C3b en las células fagocíticas.
Eliminación de inmunocomplejos: Los inmunocomplejos (complejos
antígeno-anticuerpo circulantes) pueden ser eliminados de la circulación si el
complejo se une a C3b. Los eritrocitos tienen receptores del complemento que
interactúan con los complejos inmunes cubiertos por C3b y los lleva al hígado y
al bazo para su destrucción.
A continuación, mostramos una tabla resumen (Tabla 2) que muestra las
principales funciones efectoras del complemento, en función de la interacción
entre el fragmento del complemento y su receptor.
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Introducción
16
Tabla 2. Resumen de los diferentes receptores de los fragmentos del complemento junto con sus
funciones y tipos celulares donde se expresan.
1.1.3. Interacción del complemento con los receptores Toll like (TLR)
Tras una infección se activan rápidamente dos mecanismos de la
respuesta innata, el sistema del complemento y la señalización a través de los
receptores TLR. Ambos proporcionan una primera línea de defensa y
constituyen un puente de unión entre la respuesta innata y la respuesta
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Introducción
17
humoral y celular (Dunkelberger and Song 2010; Bhakdi et al. 1990). Coordinan
la respuesta innata en cooperación bidireccional, potenciando la respuesta
innata con acciones sinérgicas o bien regulando un exceso de respuesta
mediante acciones antagónicas (Hajishengallis and Lambris 2010).
La producción de algunas citocinas pro-inflamatorias, inducidas in vivo
por la señalización de los receptores TLR (principalmente TLR4, TLR2, TLR6 y
TLR9), están reguladas por el complemento a través de los receptores C5aR y
C3aR. Las vías de señalización de estos receptores TLR convergen con la
señalización de las anafilotoxinas C3a y C5a a nivel de MAP quinasas,
especialmente ERK1/2 y JNK (Zhang et al. 2007). La interacción de ambos
sistemas, se observa cuando al inhibir la vía de señalización de C5a, se confiere
protección frente a la sepsis que es inducida por altas dosis de LPS (Guo et al.
2004). Recíprocamente, la activación de los receptores TLR induce la expresión
de componentes del complemento y de sus receptores (Kaczorowski et al. 2010).
Como demostraron Zhang et al, los ratones knockout para el factor
acelerador de la degradación DAF, cuando son tratados con LPS, zymosan o
CpG, presentan aumentados los niveles en suero de citocinas pro-inflamatorias
como el factor de necrosis tumoral (TNFα), las interleucinas 1β (IL-1β) y 6 (IL-6)
pero también tienen disminuidos los niveles de la interleucina 12 (IL-12) en
comparación con ratones wild-type. Este fenotipo es mediado por las
anafilotoxinas C5a (en el caso del receptor TLR4) y C3a (en el caso del receptor
TLR9). También demostraron que tras la activación con LPS, estos ratones
knockout para DAF presentan mayor inducción del factor de transcripción NF-
кB y se incrementa la fosforilación de MAP quinasas como ERK y JNK. La
inmunización de estos ratones con distintos antígenos y en combinación con el
adyuvante completo de Freund (CFA) presenta una mayor respuesta T efectora
y de memoria. Además, estos ratones muestran susceptibilidad a procesos
autoinmunes y de inflamación (Zhang et al. 2007). Este es un ejemplo en el que
el complemento y los receptores TLR, promueven la inflamación y modulan la
inmunidad adaptativa.
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Introducción
18
Sin embargo otros estudios afirman que el fragmento C5a inhibe la
señalización del TLR4. Según el estudio de Hawlisch et al, el fragmento C5a
regula negativamente la señalización mediada por TLR4 y por la molécula
CD40, inhibiendo la síntesis de citocinas inducidas por la familia de la citocina
IL-12 (IL-12, IL-23 e IL-27) en macrófagos activados. Esta disminución se
traduce en una respuesta Th1 disminuida in vitro e in vivo, observándose una
mayor respuesta Th1 en ratones deficientes del receptor C5aR, confiriéndose
una protección contra la infección por Leishmania major (Hawlisch et al. 2005).
Sin embargo, C5a no inhibe la producción de IL-12 mediada por TLR y por la
interacción entre la molécula CD40 y CD154 en células dendríticas humanas y
murinas. De hecho, en las células dendríticas, la activación de los receptores
C5aR y C3aR promueve la producción de las citocinas IL-12 y IL-23. Además,
los ratones deficientes en ambos receptores presentan un déficit en la
estimulación de la respuesta T in vivo e in vitro. La activación de los receptores
C5aR y C3aR da lugar a la activación de las proteínas ERK1/2 y así, mientras en
macrófagos se induce la inhibición de la producción de IL-12, en las células
dendríticas se produce el efecto opuesto. Una explicación del efecto producido
por el factor C5a al receptor TLR4 en la producción de IL-12 en las células
dendríticas, es la capacidad de C5aR para inhibir la señalización de la proteína
quinasa A (PKA) dependiente de AMPc, incrementando los niveles de TNFα y
disminuyendo la producción de IL-10 (Peng et al. 2009).
El complemento también puede modular la acción de los ligandos para
TLR9, como por ejemplo los oligodeoxinucleótidos CpG. Los CpG inducen la
maduración de las células presentadoras de antígeno (APC) a través de su
receptor TLR9. La inhibición del componente C3 del sistema del complemento
inhibe la acción de los CpG en las células dendríticas, influyendo
negativamente en la señalización TLR9. Es un ejemplo de una
inmunomodulación de la función CpG dependiente del complemento y del
receptor TLR9 (Mangsbo et al. 2009).
El bloqueo de la molécula CD14, co-receptor de TLR4 y TLR2, inhibe
algunas actividades del complemento, esto indica la existencia de un cierto
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Introducción
19
grado de cooperación entre el complemento y la molécula CD14 (Lappegard et
al. 2009). Esta cooperación se podría atribuir a las interacciones extracelulares
entre la molécula CD14 y los receptores del complemento o bien a fragmentos
activos del complemento que podrían activar directamente la señalización de
los receptores TLR.
Hay evidencias de que la señalización de los TLR también puede afectar
a la expresión de los receptores del complemento y por lo tanto a su actividad.
Está descrito que la inducción de IL-6 a través del TLR4 induce un aumento de
la expresión de los receptores C5aR y C3aR (Koleva et al. 2002).
En la Tabla 3 se resumen las interacciones descritas entre el
complemento y los receptores TLR.
Tabla 3. Interacción entre el complemento y la señalización TLR. Adaptada de Hajishengallis y
Lambris (Hajishengallis and Lambris 2010).
Receptores
Función Puntos de interacción
Sistema experimental
C3aR
C5aR
TLR2
TLR4
TLR9
Inducción de TNFα, IL-1β e IL-6. Descenso de la respuesta Th1, aumento de la respuesta Th17.
MAPK (ERK1/2,JNK), PI3K
Macrófagos murinos,
monocitos humanos.
C3aR
C5aR CD14/TLR4
Aumento del estrés oxidativo, de la respuesta pro-inflamatoria y de la fagocitosis.
No descrito. Sangre periférica humana.
C3aR
C5aR
CR3
TLR9 Aumento de la expresión de marcadores de activación y maduración en APC.
No descrito. Sangre periférica humana.
C5aR TLR2 Inducción de AMPc. Adenilato ciclasa. Macrófagos murinos
C3aR
C5aR TLR4 Incremento de IL-12 e IL-23. ERK1/2 Dendríticas humanas y
murinas, modelo in vivo.
CR3 TLR2
TLR4
Inhibición IL-12, reclutamiento de TIRAP y aumento de algunas citocinas pro-inflamatorias.
ERK1/2 Macrófagos murinos y
monocitos humanos.
CR3 TLR2
Activación de la unión del ligando de CR3 a CR3.
Rac1, PI3K y citoesina 1 Macrófagos murinos y
monocitos humanos.
C5L2 TLR4 Inducción de HMGB1. MAPK Macrófagos murinos y modelos de sepsis murina.
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Introducción
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C5L2 TLR4 Inhibición de TNFα, aumento de IL-6 y CR3.
MAPK Neutrófilos murinos.
C5L2 TLR4 Inhibición de TNFα, IL-6 y CD86. ERK1/2 y Akt Macrófagos murinos.
gC1qR TLR4 Inhibición IL-12. PI3K Monocitos y células dendríticas humanas.
cC1qR TLR4 Aumento de la expresión de moléculas de coestímulo, de las citocinas TNFα, IL-12. Inducción de respuesta Th1.
NFкB Células dendríticas humanas.
CD46 TLR4 Descenso IL-12. Mecanismo postranscripcional
Monocitos y macrófagos humanos.
CD46 TLR4 Aumento de respuesta Th17.
Incremento de IL-12p35, IL-23p19, IL-12/ IL-23p40.
No descrito Células dendríticas humanas.
1.2. Inmunidad adaptativa o adquirida
La inmunidad adaptativa constituye una respuesta inmunitaria que tiene
lugar cuando la respuesta innata es evadida. Es una respuesta lenta pero muy
eficaz y selectiva ya que requiere del contacto previo con el agente patógeno
(sensibilización) y por lo tanto es antígeno específica. Es una respuesta que
genera memoria inmunológica, es decir, hay un incremento en la intensidad de
respuesta ante los subsiguientes contactos con el mismo antígeno y está
mediada principalmente por linfocitos.
Se caracteriza por presentar dos tipos de respuesta: la respuesta humoral
(mediada por anticuerpos) y la respuesta celular (mediada por linfocitos T
citotóxicos y linfocitos T colaboradores).
1.2.1. Respuesta humoral
Es la respuesta basada en la acción de los anticuerpos secretados por
activación antigénica con el objetivo de combatir patógenos extracelulares y sus
toxinas.
El linfocito B capta el antígeno a través de sus receptores y lo procesa
para presentarlo vía MHC de clase II a los lifocitos T colaboradores (Th), estos
linfocitos inducen la expansión clonal y diferenciación del linfocito B que
producirá anticuerpos específicos frente al antígeno. Cuando los antígenos son
-
Introducción
21
de naturaleza no proteica, no se requiere de la presencia de los linfocitos Th
para la activación de las células B. Estos anticuerpos pueden tener efecto
neutralizante del patógeno directamente o indirectamente a través de células
fagocíticas, activación del complemento o por unión de las células NK a la
fracción Fc de la inmunoglobulina.
1.2.2. Respuesta celular
Los linfocitos T son los responsables de la respuesta inmunitaria celular
permitiendo la destrucción de las células infectadas o células tumorales. Esta
respuesta presenta una fase de activación (expansión de las células T
citotóxicas), una fase efectora (encuentro y eliminación de la célula infectada o
tumoral) y una fase de contracción (apoptosis y memoria).
Los linfocitos T después de un proceso de selección tímica, donde forman
un repertorio de linfocitos T con un receptor clonal (TCR) que les permite
reconocer determinantes antigénicos presentados por moléculas MHC, migran
a los órganos linfoides secundarios donde tendrá lugar la presentación
antigénica mediante la interacción entre su receptor TCR (del inglés T Cell
Receptor) y el complejo MHC-antígeno (expresado en la superfície de las APC)
(Germain et al. 1988; McMichael 1979; Townsend and Bodmer 1989).
Dentro de esta población celular encontramos varias subpoblaciones,
entre las que destacan los linfocitos T CD4+ o colaboradores (Th) , los linfocitos
CD8+ o citotóxicos (Tc), los linfocitos T CD4+CD25 + reguladores (Treg), los
linfocitos Th17 y las NKT (del inglés natural killer T lymphocyte).
1.2.2.1. Linfocitos Th
Los linfocitos T colaboradores o helper (Th) fueron descritos por primera
vez por Mossman y Coffman, observaron que las células T podían dividirse en
dos subgrupos que llamaron las células Th1 y Th2 en función de su patrón de
producción de citocinas, interferón-γ, TNF- e IL-2 (células Th1) o interleucina-
4 (IL-4), IL-5, IL-6, IL-10 e IL-13 (células Th2) (Mosmann and Coffman 1989;
Cherwinski et al. 1987). Pero la relevancia entre la distinción de ambos subtipos
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Introducción
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fue descrita por Heinzel et al. (Heinzel et al. 1989), observaron que en ratones
una respuesta predominantemente Th1 permitía superar la infección por
Leishmania major mientras que una respuesta tipo Th2 no era capaz de combatir
dicha infección.
Estos linfocitos Th no presentan actividad citotóxica, pero controlan la
respuesta inmunitaria dirigiendo a otras células para que realicen esas tareas,
tienen efectos protectores y promotores de la función de las células B, T CD8+ y
macrófagos. Los linfocitos Th1 están asociados a respuestas inmunitarias
mediadas por linfocitos T citotóxicos, macrófagos y neutrófilos. Los linfocitos
Th2 están destinados a ayudar a las células B en la producción de anticuerpos y
a activar a los eosinófilos. Además, los linfocitos Th pueden tener un papel
antiviral directo a través de las citocinas que producen.
1.2.2.2. Linfocitos T citotóxicos
Los linfocitos T CD8+ (Tc) tienen su capacidad de actuación restringida
por las moléculas MHC-I por lo tanto se encargan de combatir las infecciones
intracelulares destruyendo las células infectadas, de eliminar células tumorales
o células dañadas por otras causas. El principal mecanismo efector utilizado es
la inducción de la apoptosis segregando una serie de moléculas inductoras de la
apoptosis (FasL, perforina, granzimas) (Harty et al. 2000; Pardoll 1993;
Zinkernagel and Althage 1977). Son los principales causantes del rechazo de
tejidos y órganos transplantados (Bothwell 1999; Onoe et al. 1997), estando
también implicados en fenómenos de autoinmunidad (Billet et al. 2006).
En virtud de un conjunto definido de receptores de homing como la
molécula CD62L y receptores de quimiocinas, como el receptor CCR7, los
linfocitos T CD8+, del mismo modo que los linfocitos T CD4+, circulan por el
torrente circulatorio hasta llegar a los órganos linfoides secundarios, donde
tiene lugar la presentación antigénica por las células dendríticas (DC) que
actúan como células presentadoras de antígeno profesionales. Los linfocitos Tc
tras este encuentro se expanden, proliferan y se diferencian a células efectoras.
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Introducción
23
La activación del linfocito Tc tiene unos controles muy estrictos y, por lo
general, requiere una señal de activación muy fuerte por parte del complejo
MHC-I/DTc y de señales adicionales proporcionadas por las células T
colaboradoras (Bourgeois et al. 2002; Freeman et al. 1993; Linsley and Ledbetter
1993). Sin embargo, no siempre la ayuda CD4 es indispensable, existiendo
varios modelos de activación de linfocitos CD8 en donde las células CD4 no
participan (Bachmann et al. 1998; Lasarte et al. 1995).
Los linfocitos T CD8+ ejercen su función antiviral mediante mecanismos
no citolíticos con la producción de citocinas (IFN-, TNF- o IL-2) y a través de
mecanismos citolíticos que convergen en la inducción de apoptosis en la célula
diana por activación de caspasas. Uno de los mecanismos consiste en la
liberación de gránulos que contienen la molécula formadora de poros perforina
y la serín esterasa granzima B. El otro mecanismo implica la expresión de Fas
ligando (CD95L) y su interacción con la molécula Fas (CD95) expresada en la
superficie de la célula diana.
La gran mayoría de células efectoras tras cumplir con su cometido
entrarán en apoptosis celular, el resto formarán un pool de células memoria.
Estos linfocitos memoria tienen una vida larga pudiendo circular durante meses
o años y están preparados para desencadenar una respuesta inmunitaria rápida
y potente si se produce una nueva exposición con el mismo patógeno (Ahmed
and Gray 1996). De hecho, éste es el principal objetivo de las vacunas, generar
linfocitos memoria (T y B) de manera que el organismo responda de manera
rápida y eficaz frente al patógeno activo (Ahmed and Gray 1996).
Está descrito que se requiere la presencia de los linfocitos T CD4+ para la
generación de estos linfocitos T CD8+ memoria en respuestas inmunitarias
contra virus y bacterias (Shedlock and Shen 2003), así como en la erradicación
de tumores (Marzo et al. 2000), aunque las células T CD8+ memoria podrían
generarse en su ausencia, siendo menos eficaces que las generadas con su
ayuda (Janssen et al. 2003; Shedlock and Shen 2003). La población de los
linfocitos T CD8+ memoria se regula mediante mecanismos homeostáticos para
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Introducción
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mantener a lo largo del tiempo una representación de la misma.
Fundamentalmente dos citocinas son las responsables de la homeostasis de esta
población celular: la IL-7, que es esencial para su supervivencia, y la IL-15, que
se encarga principalmente de su proliferación para mantener una población
mínima de reserva (Surh and Sprent 2008).
1.2.2.3. Linfocitos T reguladores CD4+CD25+
A principios de los años 70 se describió por primera vez la presencia de
unos linfocitos T capaces de suprimir las respuestas inmunitarias. En 1995,
Sakaguchi y col. (Sakaguchi et al. 1995) encontraron que una población
minoritaria de células CD4+ (10%) que co-expresaban la cadena alfa del
receptor para la interleuquina 2 (CD25) era crucial para el control de las células
autorreactivas y la autoinmunidad in vivo. Desde entonces, muchos grupos han
demostrado que esta subpoblación de células CD4+CD25+, también conocidas
como células Treg o linfocitos Treg, son inmunosupresoras (Takahashi et al.
1998; Thornton and Shevach 1998). Estas células fueron identificadas primero
en ratones pero después han sido ampliamente caracterizadas en humanos
(Dieckmann et al. 2001; Jonuleit et al. 2001; Levings et al. 2001). Actualmente, la
existencia de una subpoblación inmunosupresora específica es aceptada
ampliamente por la comunidad científica y se busca la forma de manipular su
actividad para su uso clínico. La principal cuestión es cómo podría modularse
su actividad.
Los linfocitos Treg son esenciales para la protección frente a las
enfermedades autoinmunes y para la prevención del rechazo a los transplantes;
por ello, la posibilidad de potenciar su actividad tiene un gran potencial en el
tratamiento de las enfermedades autoinmunes y en los transplantes de órganos.
Sin embargo, debido a que los tumores expresan autoantígenos, los linfocitos
Treg pueden ser capaces de inhibir la activación de respuestas inmunitarias
frente al cáncer.
Varios grupos, han demostrado que la simple eliminación de las células
CD4+CD25+FOXP3+ (Treg) por la administración in vivo de anticuerpos
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Introducción
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deplecionantes facilita la inducción de inmunidad antitumoral y la protección
frente al desarrollo del cáncer (Casares et al. 2003; Onizuka et al. 1999; Shimizu
et al. 1999; Steitz et al. 2001; Sutmuller et al. 2001). Así, se cree que las células
Treg están continuamente frenando la activación de los linfocitos T efectores
para evitar procesos de autoinmunidad, pero dificultando a su vez la correcta
activación de una respuesta antitumoral cuando ésta es necesaria.
1.3. Activación de una respuesta inmunitaria
1.3.1. Presentación antigénica
Para que tenga lugar una activación específica de la respuesta
inmunitaria frente a un antígeno, es necesario que se de la presentación
antigénica (Mellman 2005), un proceso de reconocimiento molecular entre el
péptido expuesto por moléculas de MHC (complejo mayor de
histocompatibilidad) en las APC y el receptor TCR o BCR de linfocitos T y B
respectivamente. Para ello, el antígeno debe ser previamente capturado por la
APC y procesado hasta ser convertido en péptido. Además, se requieren señales
de coestímulo (interacción de factores solubles y proteínas de membrana) para
una activación eficaz del linfocito y por lo tanto de la respuesta inmunitaria
(Koch et al. 1996; Vazeux et al. 1992; Zhang et al. 1999; Zuckerman et al. 1998).
Esta interacción entre la APC y el linfocito se conoce como sinapsis
inmunológica.
Existen dos vías principales de presentación antigénica, la vía clase I y la
vía clase II, en función del origen y la vía de entrada del antígeno (Jensen 2007;
Villadangos and Schnorrer 2007) (Figura 4).
La vía clase I consiste en la presentación de antígenos endógenos
procedentes de proteínas propias, proteínas intracelulares derivadas de un
patógeno que ha infectado la célula o proteínas inducidas durante el desarrollo
de un tumor que son procesadas por el proteosoma. Tras la degradación de la
proteína en el proteosoma, los fragmentos peptídicos generados (determinantes
T citotóxicos) son transportados mediante un transportador dependiente de
ATP llamado TAP (del inglés, transporter associated protein) desde el citoplasma
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hasta el retículo endoplasmático, donde se unen a las moléculas MHC de clase
I. El complejo MHC-I/DTc pasa a través del Golgi antes de llegar a la superficie
celular, donde será presentado a los linfocitos CD8+ citotóxicos. Todas las
células nucleadas pueden presentar determinantes antigénicos mediante esta
ruta. En estos casos, la presentación de antígenos puede ocurrir en ausencia de
otras señales inmunoestimuladoras (como moléculas de coestímulo situadas
sobre las APC o señales emitidas por los LTh), por lo que este proceso puede
terminar en tolerancia.
La vía clase II es propia de las APC y consiste en la captación e
internalización en endosomas de los antígenos exógenos. Los antígenos se
procesan en el lisosoma por la acción de enzimas proteolíticas y los péptidos
resultantes del procesamiento antigénico se unen a moléculas MHC de clase II.
El complejo MHC-II/determinante T helper es transportado a la superficie
celular para ser presentado a los linfocitos T colaboradores (Th).
Ciertos antígenos exógenos a pesar de ser fagocitados por las APC
profesionales, son capaces de salir de los fagosomas y entrar en el citosol. De
esta forma son procesados por la ruta citosólica mediante mecanismos que
pueden ser tanto dependientes como independientes del proteasoma. Así, los
antígenos son presentados a través del MHC-I de la APC al LTc (Gil-Torregrosa
et al. 1998; Heath and Carbone 2001; Rock and Shen 2005). Este proceso se
conoce como cross-presentation (presentación cruzada).
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Figura 4. Esquema del procesamiento y presentación de los péptidos (Heath and Carbone 2001).
1.3.2. Células dendríticas
Las DC son células que derivan de las células madre hematopoyéticas de
médula ósea y han sido identificadas como las APC más eficaces. Actúan de
enlace entre la inmunidad innata y adaptativa permitiendo el inicio y la
modulación de la activación de ambas respuestas. Su papel principal es la
captura, procesamiento y presentación de antígenos a través del MHC a los
linfocitos T y, de este modo, activación de la respuesta inmunitaria mediante la
producción de citocinas y la inducción de la activación de los linfocitos.
Constituye una población celular heterogénea que controla tanto la
inmunidad como la tolerancia inmunológica. En sangre se distinguen dos tipos
de DC, en función de sus características fenotípicas (expresión diferencial de
marcadores de superficie) y funcionales (patrón diferencial de citocinas). Estas
células dendríticas son las DC mieloides y las DC plasmacitoides.
Las DC convencionales o mieloides (DCm), provienen de la línea
mieloide y su función principal es la presentación antigénica. Migran a los
tejidos periféricos, donde interceptan y capturan los patógenos, antes de su
migración a los ganglios linfáticos para activar la respuesta T (Belmonte et al.
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2007). Se caracterizan por su capacidad para producir citocinas como IL-12 y
TNF-α, con el objetivo de promover una respuesta de tipo Th1 y desarrollo de
linfocitos T citotóxicos. La segunda subpoblación de DC, de origen linfoide, se
denomina DC plasmacitoide (DCp). Se distinguen de las DCm por no expresar
CD11c y se caracterizan por su capacidad para producir grandes cantidades de
IFN-γ en respuesta a infecciones virales (Cella et al. 1999; Siegal et al. 1999; Sun
et al. 1998), cumpliendo de esta forma un importante papel en la respuesta
inmunitaria innata. Al contrario de las DCm, migran directamente de la sangre
a los tejidos linfáticos secundarios. El IFN de tipo I inducido por las DCp puede
activar las células NK y las células T CD8+, regular la producción de IL-12
mediada por las DCm, e intervenir en la diferenciación de células B en células
plasmáticas (Liu 2005). Otra función de las DCp es el procesamiento de
antígenos y su presentación a los linfocitos T. Sin embargo, las DCm son más
eficaces en esta función (Krug et al. 2003).
La capacidad de las DC para activar la repuesta inmunitaria depende de
su estado de maduración. Se encuentran ampliamente distribuidas como células
inmaduras en todos los tejidos, especialmente en los que interactúan con el
medio ambiente (epitelios de la piel y mucosas). La internalización de antígenos
extraños puede desencadenar su maduración y la migración desde los tejidos
periféricos a los órganos linfoides donde tendrá lugar la activación linfocitaria.
En estado inmaduro, poseen una gran capacidad fagocítica y expresan
un amplio espectro de receptores (TLR, receptores de quemoquinas entre otros).
Sin embargo, el nivel de expresión en la superficie celular de moléculas de
MHC, coestímulo y adhesión es muy bajo. La principal función de estas células
consiste en detectar la presencia de agentes extraños, capturarlos y
transportarlos a los nódulos linfoides. Si la DC reconoce señales de peligro sufre
un proceso de maduración que activa el proceso de migración a los nódulos
linfoides. Durante la migración, las DC maduras, presentan un cambio en su
morfología, aumentan su movilidad y se vuelven muy eficaces en la
presentación antigénica y en la estimulación de los linfocitos T vírgenes. Los
procesos de maduración y migración están íntimamente ligados y la completa
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maduración finaliza después de la migración. Tras el reconocimiento
antigénico, se produce un aumento en los niveles de expresión del ligando de
CD40 en la superficie del linfocito Th. Este ligando interacciona con la molécula
CD40 presente en la superficie de las DC, promoviendo su activación (Steinman
and Young 1991; Bennett et al. 1998). Estas interacciones inducen la expresión
de altos niveles de MHC y de moléculas de adhesión y coestímulo (CD40,
CD54, CD80, CD86) en la superficie de las DC, así como la producción de
citocinas pro-inflamatorias (IL-12, TNF-α) (Cella et al. 1999; Koch et al. 1996).
Los linfocitos T, tras ser activados, van a migrar desde los nódulos
linfoides a través de la circulación sanguínea hasta donde se encuentre el
antígeno para eliminarlo (Figura 5).
En resumen, la función efectora de las DC está influenciada por la etapa
de maduración, la concentración de antígeno, la vía de entrada antigénica, y el
microambiente de citocinas presente.
Figura 5. Esquema del proceso de activación de la respuesta inmunitaria adaptativa.
Maduración y migración
APC madura
Presentación del Ag a los linfocitos T
Tejidos periféricos
Entrada de Ag
Expresión de moléculas de coestímulo
y producción de citocinas
APC inmadura
Captura y procesamiento de Ag
Linfocitos T
Eliminación del antígeno
Ganglio linfático
Vasos inflamados
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1.3.3. Señalización del calcio en la activación linfocitaria
Los iones de Ca2+ funcionan como segundos mensajeros en todas las
células eucariotas, incluyendo células del sistema inmunitario. La entrada de
Ca2+ al interior celular es la señal crucial para la correcta activación de los
linfocitos, la realización de sus funciones efectoras, de diferenciación, la correcta
sinapsis entre células dendríticas y células T, así como, la exocitosis en células T
citotóxicas.
Un influjo de Ca2+ en el citosol ocurre después de la unión a
inmunorreceptores de superficie celular, por ejemplo la unión al BCR (B cell
receptor) o al TCR (T cell receptor) (van Leeuwen and Samelson 1999). En los
linfocitos el principal mecanismo de incremento de las concentraciones celulares
de calcio ocurre tras el vaciado de los depósitos intracelulares, mecanismo
conocido como SOCE (store operated calcium entry), con la participación de la
activación de los canales de liberación de calcio CRAC situados en la membrana
plasmática (Feske 2007) (Figura 6).
Figura 6. Mecanismo SOCE (store operated calcium entry) de Stefan Feske (Feske 2007).
Cuando tiene lugar el reconocimiento
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