“evaluaciÓn del efecto genotÓxico de la argentatina b mediante el ensayo de cbmn en cÉlulas...

UNIVERSIDAD TECNICA PARTICULAR DE LOJAESCUELA DE BIOQUIMICA Y FARMACIA

“EVALUACIÓN DEL EFECTO GENOTÓXICO DE LA ARGENTATINA B MEDIANTE EL ENSAYO DE CBMN EN CÉLULAS MCF-7 (CÁNCER DE MAMA)”

Previo a la obtención del título de Bioquímico Farmacéutico

AUTORIA:Lorena Elizabeth Palacios Arrobo

DIRECTORA: Dra. Natalia Bailón Moscoso

Loja – Ecuador2009

Grupo de más de 100 enfermedades.

Crecimiento descontrolado de las células debido a cambios en los mecanismos de proliferación, diferenciación y muerte celular.

CÁNCER

Ecuador 12.000

1.615

American Cancer Society 2007

CÁNCER

Yépez, 2006

Garrido et al., 2003

CA Cancer J Clin 2006;56:106–130

CÁNCER

CÁNCER

Cirugía Radioterapia Quimioterapia

ANTINEOPLASICOS

TRATAMIENTO DEL CÁNCER

De los agentes aprobados por la FDA para el tratamiento del cáncer, aproximadamente el 65% son metabolitos secundarios o análagos semi-sintéticos o sintéticos basados en farmacóforos obtenidos de metabolitos secundarios.

Newman, D.J. and Cragg, G.M. Natural Products as Sources of New Drugs over the Last 25 Years. J. Nat. Prod., 70, 3, 461 - 477, 2007

Triterpenos

Alcaloides de la vinca Epipodofilotoxinas Taxanos

Se han descrito más de 100 triterpenos con actividad citotóxica.

Parthenium argentatum.

ARGENTATINA B

Parra, 2005 Evaluation of the cytoticity, cytostaticity and genotoxicity of Argentatina A and Argentatina B from Partheniium argentatum (Gray). Life Sciences 77, 2844-2865.

ARGENTATINA B: estudios realizados en LINFOCITOS HUMANOS

• Fig. 3. Nuclear división index, calculated for argentatin B tested at 5, 15 and 25 uM and mitomycin C at 1 uM. (P<0.001)

Parra, 2005 Evaluation of the cytoticity, cytostaticity and genotoxicity of Argentatina A and Argentatina B from Partheniium argentatum (Gray). Life Sciences 77, 2844-2865.

ENSAYO DE MICRONUCLEOS CON BLOQUEO DE CITOCINESIS

Citocalasina B (impide citocinesis celular)

Efecto genotoxico (clastogénico y aneugénico)

EN UNA DE LAS LINEAS CELULARES EN QUE LA ARGENTATINA B TIENE ACTIVIDAD CITOTOXICA, PROBABLEMENTE NO PRESENTE ACTIVIDAD GENOTÓXICA.

HIPÓTESIS

• Evaluar el efecto genotóxico de la Argentatina B mediante el ensayo de CBMN en células MCF-7 (cáncer de mama).

• Establecer las dosis subtóxicas a probar en el ensayo de micronúcleos con bloqueo de citoquinesis

•Determinar los efectos citostáticos de la Argentatina B mediante la determinación del Índice de División Nuclear en células MCF-7

• Determinar los efectos genotóxicos de la Argentatina B mediante la evaluación de Micronúcleos en células MCF-7.

GENERAL

ESPECÍFICOS

Argentatina B

Viabilidad (FDA)

CBMN5, 15 y 25 uM

MCF-7

37ºC 5% de CO2

24 horas

37ºC 5% de CO2

24 horas

3x105

células

Células MCF-7

Argentatina B

DMSO 5 uM 15 uM 25 uM DOX

DOXORUCINA

DMSO 0.05 uM 0.1uM0.075 uM

3 REPETICIONES

54 PLACAS

PBSRPMI

FDAPBSEtBr

Células +

200 CÉLULAS

VIVASMUERTAS

ESQUEMA VIABILIDAD (FDA)

37ºC 5% de CO2

24 horas

Fijador de Carnoi 3:1

Tinción

37ºC 5% de CO2

24 horas

3x105

células

Células MCF-7

ARGENTATINA B

DMSO 5 uM 15 uM 25 uM DOX

DOX

DMSO 0.05 uM 0.1uM0.075 uM

3 REPETICIONES 54 PLACAS

ESQUEMA CBMN

CITOSTACIDAD

GENOTOXICIDAD

200 células mono, bi y tetraIDN = {CMN + 2 (CBN) + 3 (CPN)} / N

Frecuencia de MN en 1000 CBN

54 PLACAS

ESQUEMA CBMN

Gráfica No. 1 Porcentaje de viabilidad (FDA) de MCF-7 tratados con Doxorubicina. Cada barra representa la media ± EE de tres experimentos independientes que se realizaron por duplicado. P < 0.001

ACTIVIDAD CITOTÓXICA DE LA DOX

Gráfica No. 2 Índice de división nuclear calculado para la Doxorubicina. Cada barra representa la media ± EE de tres experimentos independientes por duplicado. P<0,05.

Gráfica No. 3 Efecto de la Doxorubicina en relación al control negativo (DMSO 0.1%) sobre la frecuencia de CBN con MN. Las barras representan la media ± EE de tres experimentos independientes por duplicado.P >0,001

Gráfico No. 4 Porcentaje de viabilidad de MCF-7 tratadas con Argentatina B y DOX (0.1uM). Cada barra representa la media de tres experimentos independientes con su respectivo error estándar cada uno por duplicado. p < 0,001

ACTIVIDAD CITOTÓXICA DE LA ARGENTATINA B

Gráfica No. 5 Índice de división nuclear calculado para las células MCF-7 tratados con Argentatina B. La doxorubicina se empleó como control (DOX) a 1 μM. Cada barra representa la media ± EE de tres experimentos independientes por duplicado. P<0.001

• Fig. 3. Nuclear división index, calculated for argentatin B tested at 5, 15 and 25 uM and mitomycin C at 1 uM. (P<0.001)

Parra, 2005.

Gráfica No. 6 Efecto de la Argentatina B (5, 15, y 25 uM) y DOX (0.1 Um) sobre la frecuencia de CBN con MN. Las barras representan la media ± EE de tres experimentos independientes por duplicado. P > 0,001

Parra, 2005.

Las concentraciones probadas de Argentatina B no afectan la viabilidad de las células MCF-7, puesto que presentó una supervivencia mayor al 70%.

La Argentatina B no tiene actividad citostática en la línea celular MCF-7 evaluado mediante el IDN.

La Argentatina B no produce daño genotóxico in vitro a concentraciones de 5, 15 y 25 uM en células MCF-7 evaluado mediante MN.

GRACIAS…