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EVALUACIÓN DE LAS PROPIEDADES FÍSICO-QUÍMICAS,
MECÁNICAS Y BIOLÓGICAS DE SCAFFOLDS DE
HIDROXIAPATITA E HIDROXIAPATITA CON
RECUBRIMIENTO DE QUITOSANO OBTENIDAS POR
DIVERSOS MÉTODOS.
DEISY NATALI MESA OSPINA
POSGRADO EN INGENIERÍA DE MATERIALES
FACULTAD DE INGENIERÍA
UNIVERSIDAD DE ANTIOQUIA
MEDELLÍN, 2017
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Evaluación de Recubrimientos de Quitosano sobre
Scaffolds de HA
EVALUACIÓN DE LAS PROPIEDADES FÍSICO-QUÍMICAS, MECÁNICAS Y BIOLÓGICAS DE SCAFFOLDS DE HIDROXIAPATITA E
HIDROXIAPATITA CON RECUBRIMIENTO DE QUITOSANO OBTENIDAS POR DIVERSOS MÉTODOS.
DEISY NATALI MESA OSPINA
Trabajo de grado para optar al título de Msc en Ingeniería de
Materiales
Directora
DIANA MARCELA ESCOBAR SIERRA Ing Met. Ph.D. en Ciencias Químicas
Grupo de Investigación en Biomateriales
UNIVERSIDAD DE ANTIOQUIA FACULTAD DE INGENIERÍA
MEDELLÍN 2017
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Evaluación de Recubrimientos de Quitosano sobre
Scaffolds de HA
AGRADECIMIENTOS
Mi primer agradecimiento sin sonar a cliché es para Dios porque en especial me ha
dado tanto, un poco más de lo que he merecido siempre, por sus tantas bendiciones,
amor, por no abandonarme a pesar de todo.
A mi asesora Diana Marcela Escobar docente del programa de Bioingeniería y
coordinadora del laboratorio de Biomateriales del Programa de Bioingeniería, porque
ha sido la única persona que se ha preocupado realmente por el apoyo tanto
académico como personal en esta investigación, me ha estimulado y corregido todo el
tiempo que ha sido necesario, dando un gran aporte intelectual y algunas bases
necesarias hasta para la vida.
A Andrés López gran amigo y persona, que hizo parte esencial en este proceso,
ayudándome con el trabajo de laboratorio, el apoyo y la compañía en momentos que
necesite de alguien, de una mano y un apoyo; que quede plasmado aquí mi gran
admiración y agradecimiento para estas dos últimas personas.
Al laboratorio de BIOMAT por el acceso a todas sus instalaciones, equipos, reactivos y
demás mientras estuve en experimentación. A los docentes Diego Giraldo y Ricardo
Aristizabal de Ingeniería de Materiales por el préstamo de algunos equipos para los
ensayos mecánicos y químicos respectivamente. A Dayana Meza del SEM por su gran
amabilidad y disposición siempre. A Sara Robledo y Victoria Ospina del PECET que
contribuyeron en una parte esencial del proyecto con las pruebas y ensayos biológicos
in vitro.
Y por último a mi Alma Mater la Universidad de Antioquia por existir y formarme en
todos los aspectos, porque en ella he pasado los mejores y peores momentos de mi
vida. Porque siempre la tendré en el corazón y no existe una Universidad que me
hubiese hecho sentir tan orgullosa de ser egresada…
¡Mil Gracias!
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Evaluación de Recubrimientos de Quitosano sobre
Scaffolds de HA
TABLA CONTENIDO
ÍNDICE DE FIGURAS................................................................................................................... 6
ÍNDICE DE TABLAS................................................................................................................... 12
GLOSARIO ............................................................................................................................... 14
ABREVIATURAS ....................................................................................................................... 16
RESUMEN ................................................................................................................................ 17
ABSTRACT ............................................................................................................................... 19
CAPÍTULO 1. INTRODUCCIÓN, PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA Y ALCANCES .................. 21
1.1. INTRODUCCIÓN ........................................................................................................... 21
1.2. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA ............................................................................. 22
1.3. ALCANCE DEL PROYECTO ............................................................................................. 24
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS CAPÍTULO 1 .......................................................................... 25
CAPÍTULO 2. MARCO TEÓRICO Y ESTADO DEL ARTE ............................................................. 26
2.1. TEJIDO ÓSEO ................................................................................................................ 26
2.2. BIOMATERIALES DE USO EN MEDICINA REGENERATIVA ........................................... 35
2.3. CARACTERIZACIÓN DE LAS PROPIEDADES DE LOS BIOMATERIALES PARA IT .......... 62
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS CAPÍTULO 2 .......................................................................... 66
CAPÍTULO 3. OBJETIVOS Y METODOLOGÍA EXPERIMENTAL ................................................. 74
3.1. OBJETIVOS.................................................................................................................... 74
3.2. MATERIALES Y METODOLOGÍA EXPERIMENTAL......................................................... 74
3.2.2.4. Preferencias de Diseño .......................................................................................... 79
3.2.5. Caracterización físico-química de scaffolds de HA con y sin recubrimiento de Qo 83
3.2.6. Caracterización morfológica y superficial de los scaffolds de HA con y sin
recubrimiento de Qo .......................................................................................................... 84
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Evaluación de Recubrimientos de Quitosano sobre
Scaffolds de HA
3.2.7. Caracterización mecánica de los scaffolds mediante ensayos de compresión ..... 92
3.2.8. Evaluación de la biocompatibilidad mediante ensayos biológicos in vitro ............ 93
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS CAPÍTULO 3 .......................................................................... 99
CAPÍTULO 4. RESULTADOS, ANÁLISIS Y DISCUSIÓN ............................................................ 101
4.1. CARACTERIZACIÓN FÍSICO-QUÍMICA DE LOS SCAFFOLDS DE HA CON Y SIN
RECUBRIMIENTO DE Qo ....................................................................................................... 101
4.1.1. Obtención de los scaffolds de HA .......................................................................... 101
4.1.2. Obtención de los recubrimientos de Qo sobre scaffolds de HA ........................... 102
4.1.3. Fluorescencia de rayos X (FRX) .............................................................................. 103
4.1.4. Espectroscopía de dispersión de energía (EDS). .................................................... 104
4.1.5. Difracción de rayos X (DRX) ................................................................................... 105
4.1.6. Espectroscopía Infrarroja por Transformada de Fourier (FTIR) ............................ 108
4.2. CARACTERIZACIÓN MORFÓLOGICA Y SUPERFICIAL DE LOS SCAFFOLDS ..................... 113
4.2.1. Estereomicroscopía de la superficie de los scaffolds ............................................ 113
4.2.2. Microscopía electrónica de barrido (SEM) ............................................................ 115
4.2.3. Ensayo de degradabilidad in vitro en SBF .............................................................. 123
4.2.4. Porosidad e interconectividad de los scaffolds ..................................................... 130
4.2.5. Mojabilidad y adhesividad de los recubrimientos de Qo ..................................... 139
4.2.6. Trabajo de adhesión termodinámico (Wad) ........................................................... 143
4.3. CARACTERIZACIÓN MECÁNICA DE LOS SCAFFOLDS ..................................................... 144
4.3.1. Ensayo de resistencia mecánica a la compresión .................................................. 144
4.3.2. Correlación De Datos .............................................................................................. 151
4.4. CARACTERIZACIÓN BIOLÓGICA DE LOS SCAFFOLDS ..................................................... 153
4.4.1. Citotoxicidad celular de los scaffolds de HA con recubrimiento de Qo ............... 153
4.4.2. Proliferación celular de los scaffolds de HA con recubrimiento de Qo ................ 155
4.4.3. Adhesión, interacción y morfología celular de los scaffolds de HA con
recubrimiento de Qo. ....................................................................................................... 157
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS CAPÍTULO 4 ........................................................................ 165
CAPÍTULO 5. CONCLUSIONES ............................................................................................... 171
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Evaluación de Recubrimientos de Quitosano sobre
Scaffolds de HA
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1. Diagrama que representa los componentes del tejido óseo [3]. ...................... 27
Figura 2. Corte longitudinal para ilustrar el hueso cortical y trabecular a nivel
macroscópico (a) Corte longitudinal y transversal de hueso cortical ilustrando a nivel
microscópico las osteonas, la capilarización, el endiostio y el periostio (b) [2]. .............. 28
Figura 3. Tipos de células óseas [6]. ................................................................................... 30
Figura 4. Fases del remodelado óseo normal (BRU: Unidad de Remodelado Óseo; CL:
línea de cemento; OS: osteoide) [10]. ................................................................................ 33
Figura 5. Tipos de implantes para regeneración de tejido. ............................................... 34
Figura 6. Evolución histórica de las técnicas utilizadas para el tratamiento de diferentes
afecciones [11]. .................................................................................................................... 36
Figura 7. Ingeniería de tejidos aprovechada para regeneración de tejidos. Existen dos
estrategias diferentes in vivo e in vitro. Ambos métodos usan scaffolds porosos los
cuales son cargados con células [21]. ................................................................................. 38
Figura 8. Estructura química de la quitosano [31]. ............................................................ 47
Figura 9. Esquema en el que se representan los principales tipos de recubrimientos
superficiales sobre materiales [33]. .................................................................................... 54
Figura 10. Tipo de crecimiento de un cultivo celular (monocapa, en suspensión o
tridimensionales con esquema de las morfologías de las células en cultivo [60]. ........... 58
Figura 11. Tipos de cultivo de tejidos, adaptada y modificada de Handbook [58 y 60]. . 59
Figura 12. Diferentes cultivos celulares de acuerdo a su origen, modificación genética y
fenotípica [60]. ..................................................................................................................... 61
Figura 13. Esquema de procesos (unidad experimental y variables del diseño
experimental). ...................................................................................................................... 77
Figura 14. Esquema del procedimiento planteado para la obtención de scaffolds de HA
por la técnica gel-casting. ................................................................................................... 80
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Evaluación de Recubrimientos de Quitosano sobre
Scaffolds de HA
Figura 15. Técnica de recubrimiento obtenido entre la superficie de contacto que une el
film y el material que actúa de sustrato, siendo en este caso HA. ................................... 82
Figura 16. Técnica de recubrimiento obtenido entre la superficie de contacto que une el
film y el material que actúa de sustrato, siendo en este caso HA. ................................... 83
Figura 17. Estereomicroscopio Zeiss DV4 con cámara digital incorporada. ..................... 84
Figura 18. Microscopio Electrónico de Barrido marca Jeol JSM-6490LV. ........................ 85
Figura 19. Obtención de degradabilidad in vitro en SBF. .................................................. 87
Figura 20. Montaje para la obtención del porcentaje de porosidad e interconectividad
de los scaffolds. ................................................................................................................... 88
Figura 21. Esquema del sistema de ángulo de contacto [10]. .......................................... 90
Figura 22. Imagen de los componentes del tensiómetro digital Krüss K-12. ................... 91
Figura 23. Tensiómetro de superficie (a) Método de placa de Wilhelmy (b) [11]. .......... 92
Figura 24. Ensayos de compresión para scaffolds en Máquina Universal Diggimes. ...... 93
Figura 25. Metodología general propuesta para los ensayos biológicos. ........................ 94
Figura 26. Línea celular SAOS2 (anclo dependientes) al microscopio óptico (X20 y X40).
.............................................................................................................................................. 95
Figura 27. Esquema del área de trabajo y disposición de materiales en campana de
cultivo celular para evaluación biológica in vitro, adaptada y modificada de [12]. ......... 95
Figura 28. Montaje para el ensayo de citotoxicidad con MTT. ......................................... 97
Figura 29. Scaffolds de HA obtenidos por gel-casting, sin sinterizar (a), con 50% de
sólidos (b) y con 60% de sólidos (c). ................................................................................. 101
Figura 30. Soluciones de Qo a diferentes concentraciones (a), scaffolds recubiertos en
solución de Qo (b). ............................................................................................................ 102
Figura 31. Imágenes obtenidas al SEM de scaffolds de HA por gel-casting (a) Espectros
EDS correspondiente a las superficies de los Scaffolds de HA (b). ................................. 104
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Evaluación de Recubrimientos de Quitosano sobre
Scaffolds de HA
Figura 32. Difractograma obtenido para scaffolds de HA preparados por gel-casting (a)
scaffolds de HA con recubrimientos de Qo a diferentes concentraciones (b - e) con
menor tiempo de exposición (5min). ............................................................................... 106
Figura 33. Difractograma obtenido para scaffolds de HA preparados por gel-casting (a) y
para scaffolds de HA con recubrimientos de Qo a diferentes concentraciones (b - e) con
mayor tiempo de exposición (30min). ............................................................................. 108
Figura 34. Espectro infrarrojo obtenido para el Qo (a), scaffolds de HA preparados por
gel - casting (b) y scaffolds de HA con recubrimientos de quitosano a diferentes
concentraciones (c – f) a mayor tiempo de exposición (20 min). ................................... 109
Figura 35. Espectro Infrarrojo de estándares de hidroxiapatita HAp (a), quitosano CS (b)
y partículas hibridas de HAp – CS a diferentes concentraciones (c y d) [14]. ................ 112
Figura 36. Scaffolds de HA preparados por gel-casting vistos con aumentos de 8X (a) y
16X (b) al estereomicroscopio. ......................................................................................... 113
Figura 37. Scaffolds de HA con recubrimientos de Qo observadas al estereomicroscopio
en aumentos de 8X y 16X. ................................................................................................. 114
Figura 38. Scaffolds de HA obtenidos por gel-casting observados al SEM en aumentos de
40X (a), 500X (b), 1000X (c) y 2500X (d). .......................................................................... 116
Figura 39. Scaffolds de HA reportados en la literatura observados al SEM a diferentes
aumentos, poros esféricos de 100–200 µm (a), superficie de scaffolds (b) [16, 17, 18].
............................................................................................................................................ 117
Figura 40. Imágenes al SEM y EDS obtenidos para scaffolds de HA con recubrimiento de
Qo al 0.5%, menor tiempo de inmersión (5 min) en aumento de 1000X. ..................... 118
Figura 41. Imágenes al SEM y EDS obtenidos para scaffolds de HA con recubrimiento de
Qo al 1%, menor tiempo de inmersión (5 min) en aumento de 2000X. ......................... 118
Figura 42. Imágenes al SEM y EDS obtenidos para scaffolds de HA con recubrimiento de
Qo al 1.5%, menor tiempo de inmersión (5 min) en aumento de 500X......................... 119
Figura 43. Imágenes al SEM y EDS obtenidos para scaffolds de HA con recubrimiento de
Qo al 2%, menor tiempo de inmersión (5 min) en aumentos de 500X. ......................... 119
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Evaluación de Recubrimientos de Quitosano sobre
Scaffolds de HA
Figura 44. Imágenes al SEM (a) y EDS (b) obtenidos para scaffolds de HA con
recubrimiento de Qo (0.5%), mayor tiempo de inmersión (20 min) aumento de 500X.
............................................................................................................................................ 120
Figura 45. Imágenes al SEM (a) y EDS (b) obtenidos para scaffolds de HA con
recubrimiento de Qo (1%), mayor tiempo de inmersión (20 min), aumentos de 2000X.
............................................................................................................................................ 120
Figura 46. Imágenes al SEM (a) y EDS (b) obtenidos para scaffolds de HA con
recubrimiento de Qo (1.5%), mayor tiempo de inmersión (20 min), aumento de 500X.
............................................................................................................................................ 121
Figura 47. Imágenes al SEM (a) y EDS (b) obtenidos para scaffolds de HA con
recubrimiento de Qo (2%), mayor tiempo de inmersión (20 min), aumento de 2000X.
............................................................................................................................................ 121
Figura 48. Gráfico de barras obtenido para la pérdida de peso de los scaffolds de HA con
y sin recubrimiento de Qo con su respectiva D.E. ........................................................... 125
Figura 49. Estadística descriptiva para datos de degradabilidad de las muestras. ........ 126
Figura 50. Gráfico de pH vs tiempo para scaffolds de HA con y sin recubrimiento de Qo
para el menor tiempo de inmersión. ................................................................................ 128
Figura 51. Gráfico de pH vs tiempo para scaffolds de HA con y sin recubrimiento de Qo
para el mayor tiempo de inmersión. ................................................................................ 128
Figura 52. Representación de la degradación de las películas de Qo en SBF. ............... 126
Figura 53. Morfología celular en scaffold microporoso [29].. ......................................... 126
Figura 54. Estructura y medidas de porosidad obtenidas al SEM para scaffolds de HA
patrón (sin recubrimiento de Qo) a 40X, 200X y 500X. .................................................. 133
Figura 55. Estructura y medidas de porosidad obtenidas al SEM para scaffolds de HA con
recubrimiento de Qo a diferentes concentraciones (0.5, 1. 1.5 y 2%) y menor tiempo de
inmersión (5 min) a 35X y 200X. ....................................................................................... 134
Figura 56. Estructura y medidas de porosidad obtenidas al SEM para scaffolds de HA con
recubrimiento de Qo a diferentes concentraciones (0.5, 1. 1.5 y 2%) y mayor tiempo de
inmersión (20 min) a 40X y 200X. ..................................................................................... 135
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Evaluación de Recubrimientos de Quitosano sobre
Scaffolds de HA
Figura 57. Hueso esponjoso o trabecular al SEM 200X (Narváez, 2004) [35].. .............. 151
Figura 58. Estadística descriptiva para datos de porosidad de las muestras. .. ............. 151
Figura 59. Estadística descriptiva para datos de interconectividad de las muestras. .. . 151
Figura 60. Curva obtenida con el método de Washburn para los scaffolds de HA con
solución de Qo a diferentes concentraciones (0.5, 1, 1.5 y 2%)... .................................. 151
Figura 61. Curva obtenida con el método de Washburn para los scaffolds de HA con
solución de Qo a diferentes concentraciones (0.5, 1, 1.5 y 2%). .. ................................. 151
Figura 62. Curvas de tensión – Deformación para scaffolds de HA patrón y con
recubrimientos de Qo a menor tiempo de inmersión..................................................... 151
Figura 63. Curvas de tensión – Deformación para scaffolds de HA patrón y con
recubrimientos de Qo a mayor tiempo de inmersión. .. ................................................. 151
Figura 64. Scaffolds con y sin recubrimiento de Qo obtenidos después del ensayo de
compresión (a mayor tiempo de inmersión). .. ............................................................... 151
Figura 65. Estadística descriptiva para datos de resistencia mecánica de las muestras. ..
............................................................................................................................................ 151
Figura 66. Estadística descriptiva para datos de módulo elástico de las muestras. .. ... 151
Figura 67. Correlación de variables respuesta. . .. ........................................................... 151
Figura 68. Resultados de citotoxicidad mediante ensayo de MTT para las muestras de
los scaffolds evaluados y el control. . .. ............................................................................ 151
Figura 69. Evaluación in vitro: Las imágenes corresponden al cultivo de células Saos-2 en
presencia de los biomateriales luego de 48 horas de incubación. A: M1, B: M2, C: M3, D:
M4, E: M5 y F: Células sin biomaterial (Aumento 20X). . .. ............................................. 151
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Evaluación de Recubrimientos de Quitosano sobre
Scaffolds de HA
Figura 70. Prueba de adherencia de las células Saos2 al M1 (scaffold de HA patrón). Las
flechas indican la presencia de las células adheridas al material luego de 48 horas de
cultivo, aumentos de 1000 y 3000X. . .. ........................................................................... 151
Figura 71. Prueba de adherencia de las células Saos2 al M2 (scaffold de HA con
recubrimiento 0,5% Qo). Las flechas indican la presencia de las células adheridas al
material luego de 48 horas de cultivo, aumentos de 1000 y 3000X. ............................. 159
Figura 72. Prueba de adherencia de las células Saos2 al M3 (scaffold de HA con
recubrimiento 1% Qo). Las flechas indican la presencia de las células adheridas al
material luego de 48 horas de cultivo, aumentos de 1000 y 3000X. . ........................... 151
Figura 73. Prueba de adherencia de las células Saos2 al M4 (scaffold de HA con
recubrimiento 1,5% Qo). Las flechas indican la presencia de las células adheridas al
material luego de 48 horas de cultivo, aumentos de 1000, 3000 y 4000X. ................... 161
Figura 74. Prueba de adherencia de las células Saos2 al M5 (scaffold de HA con
recubrimiento 2% Qo). Las flechas indican la presencia de las células adheridas al
material luego de 48 horas de cultivo, aumentos de 1000 y 3000X. ............................. 161
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Evaluación de Recubrimientos de Quitosano sobre
Scaffolds de HA
ÍNDICE DE TABLAS
Tabla 1. Propiedades mecánicas del hueso cortical y trabecular [5]. ............................... 29
Tabla 2. Tipos de respuestas del tejido al implante [25]. .................................................. 41
Tabla 3. Propiedades de la Hidroxiapatita [31]. ................................................................. 44
Tabla 4. Métodos para modificación superficial de biomateriales [21]. .......................... 53
Tabla 5. Parámetros de las formulaciones generadas en el diseño de experimentos. ... 78
Tabla 6. Concentración de iones del SBF y plasma sanguíneo humano [3, 4]. ................ 86
Tabla 7. Orden, cantidad y peso fórmula de los reactivos para preparación de SBF. ..... 86
Tabla 8. Composición química de scaffolds de hidroxiapatita obtenidos por gel-casting.
............................................................................................................................................ 103
Tabla 9. Análisis químico por EDS para scaffolds de HA sin recubrimiento. .................. 105
Tabla 10. Comparación de valores de los difractogramas de rayos X. ........................... 107
Tabla 11. Bandas de vibración reportadas en la literatura [13]. .................................... 110
Tabla 12. Características obtenidas al SEM reportadas para los scaffolds de HA con
recubrimientos de Qo a diferentes concentraciones y tiempos. .................................... 123
Tabla 13. Porcentaje de pérdida de peso de los scaffolds (Degradabilidad). ................ 124
Tabla 14. Resultados de Porosidad e Interconectividad para los scaffolds de HA con y sin
recubrimiento de Qo y su respectiva D.E. ........................................................................ 130
Tabla 15. Valores promedio de los tamaños de poro obtenidos al SEM. ....................... 136
Tabla 16. Ángulo de contacto para scaffolds de HA con las diferentes soluciones de Qo.
............................................................................................................................................ 140
Tabla 17. Tensión superficial y viscosidad de las soluciones de Qo a diferentes
concentraciones. ............................................................................................................... 141
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Evaluación de Recubrimientos de Quitosano sobre
Scaffolds de HA
Tabla 18. Trabajo de adhesión (Wad), para la interacción entre los sustratos
HA/recubrimientos Qo. ..................................................................................................... 143
Tabla 19. Propiedades mecánicas de los scaffolds de HA con y sin recubrimientos de Qo.
............................................................................................................................................ 146
Tabla 20. Resumen estadístico de datos de las variables respuesta.. ............................ 152
Tabla 21. Correlaciones de Pearson entre variables respuesta. ..................................... 152
Tabla 22. Porcentajes de viabilidad de células (Saos-2) cultivadas en los scaffolds
evaluados con y sin recubrimiento de Qo. ....................................................................... 154
Tabla 23. Porcentajes de proliferación celular (Saos-2) cultivadas en los scaffolds
evaluados con y sin recubrimiento... ................................................................................ 152
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Evaluación de Recubrimientos de Quitosano sobre
Scaffolds de HA
GLOSARIO
Biomaterial: Cualquier sustancia o combinación de sustancias, distinta de las drogas, de
origen sintético o natural, que puede ser usada por cualquier período de tiempo para
aumentar o reemplazar parcialmente o totalmente cualquier tejido, órgano o función
del cuerpo, con el fin de mantener o mejorar su función. Éstos deben cumplir unos
requisitos imprescindibles como no ser citotóxico, mutágeno, alergénico, cancerígeno,
ni radiactivo. Para que esto se cumpla deben ser química, mecánica, y clínicamente
compatibles y sus productos de degradación no deben ser tóxicos.
Biocompatibilidad: Capacidad de un material para cumplir su función en una aplicación
específica con una respuesta apropiada por parte del tejido. Capacidad de para cumplir
su función terapéutica sin producir efectos indeseados, sean locales o sistémicos, en el
beneficiario del tratamiento, pero sí originando la respuesta más apropiada a nivel
celular o tisular en esa situación concreta, optimizando así el efecto terapéutico
beneficioso más relevante de dicho tratamiento.
Biodegradabilidad: Un material biodegradable, es no tóxico y se disuelve al colocarlo en
el medio biológico. La composición del material debe ser tal que pueda ser disuelto
químicamente por los fluidos fisiológicos o bien consumido por los macrófagos.
Diseñado para degradarse gradualmente en el tiempo y ser remplazado por tejido
natural
Ingeniería de tejidos: Es la aplicación de principios y métodos de ingeniería para el
entendimiento de estructuras funcionales y el desarrollo de sustitutos biológicos para
restaurar, mantener o mejorar tejidos y sus funciones.
Scaffold: Son estructuras tridimensionales porosas que sirven como base o soporte y
poseen nutrientes esenciales para la proliferación celular. La traducción de la palabra
scaffold es andamio, pero en español se conoce como matriz o cuerpo poroso.
Recubrimiento: Corresponde a películas superficiales formadas con los productos de
una reacción o adhesión entre el sustrato y el medio circundante que se adhiere a dicha
superficie, constituyendo una barrera física cuyas características más apreciadas son
impermeabilidad, invisibilidad, tenacidad, baja solubilidad, aumento de la vida útil,
protección, etc.
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Evaluación de Recubrimientos de Quitosano sobre
Scaffolds de HA
Hidroxiapatita: La HA es un fosfato de calcio (Ca10(PO4)6OH) con composición similar a la
parte mineral del tejido óseo, es biocompatible y bioactiva, por lo cual es un material
ideal para regeneración ósea.
Quitosano: [poli (1-4)-β-D-glucosamina] es un biopolímero resultante de la N-
desacetilación de la quitina y se obtiene principalmente a partir de crustáceos, hongos y
algunas algas. Segundo polímero natural más abundante de la tierra y posee
comportamiento policationico capaz de atraer moléculas cargadas negativamente, que
da como resultado su naturaleza antibacteriana.
Gel-Casting: Este proceso consiste en la polimerización de una solución acuosa de polvo
cerámico y monómeros orgánicos para formar una espuma, obteniéndose cuerpos con
porosidad abierta e interconectada que posibilitan el crecimiento celular y la
vascularización en su interior al momento de ser implantados; mejorando así la
osteointegración del material.
Osteoinductividad: Es el proceso mediante el cual las células madre y osteoprogenitoras,
células pluripotenciales, son reclutadas en el sitio de regeneración ósea y estimuladas
para diferenciarse a osteoblastos.
Formazan: Es un compuesto artificial insoluble en agua, producto de la reducción de
sales de tetrazolio por deshidrogenasas y reductasas y es utilizado entre otras cosas
para pruebas con células para identificar la cantidad de células vivas por medio de
densitometría óptica. Tiene una variedad de colores de azul oscuro a rojo profundo a
naranja, dependiendo de la sal de tetrazolio original utilizado como sustrato para la
reacción.
Alamar Blue: Colorante indicador redox que produce un cambio colorimétrico y una
señal fluorescente en respuesta a la actividad metabólica. Es seguro y no tóxico y se
utiliza para el análisis cuantitativo de la viabilidad celular y la proliferación celular,
bioensayos de citoquinas y en estudios de citotoxicidad in vitro.
Proliferación celular: Es el incremento del número de células por división celular.
Resistencia mecánica: Capacidad de los materiales de soportar fuerzas que pasan a
través de ellos.
Módulo elástico: Indica la resistencia a la deformación de un material.
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Evaluación de Recubrimientos de Quitosano sobre
Scaffolds de HA
ABREVIATURAS
HA: Hidroxiapatita
Qo: Quitosano
IT: Ingeniería de tejidos
ASTM: American Society for Testing Materials
SBF: Fluido Corporal Simulado (Simulated Body Fluid)
SFB: Suero Fetal Bovino
SEM: Microscopía Electrónica de Barrido
EDS: Espectroscopia por electrones dispersos
DRX: Difracción de Rayos X
FTIR: Espectroscopia Infrarroja por transformada de Fourier
XRF: Espectroscopía de fluorescencia de rayos X
TGA: Análisis Termo gravimétrico
MO: Microscopia Óptica
MTT: Bromuro de 3-(5,4 dimetil tizol-2-I) -2-5 difenil tretrazolium)
Ti6Al4V: Aleación de titanio con aluminio al 6% y vanadio al 4%
BMP: Proteína morfogenética ósea
ECM: Matriz Extracelular
DMEM: Medio mínimo esencial para el cultivo celular
PMMA: Polimetil metacrilato
PVA: Polivinil alcohol
ANOVA: Análisis de varianza de una vía
MANOVA: Analisis multivariante de la varianza
UV: Ultravioleta visible
MPa: Megapascales
E: Módulo elástico
σ: Tensión
ɛ: Deformación
ρ: Densidad
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Evaluación de Recubrimientos de Quitosano sobre
Scaffolds de HA
RESUMEN
Un material ideal para reemplazar el hueso tiene que imitar al tejido que reemplaza
respondiendo de manera adecuada a sus requerimientos de forma y funcionamiento,
además de promover una respuesta adecuada del sistema biológico sin inducir ningún
tipo de afección. A medida que interactúa con el tejido debe adquirir sus cualidades
como estructura, funcionalidad y además ser tolerado adecuadamente por el
organismo. Generalmente, el tejido óseo extraído del propio paciente es el sustituto
que más se emplea, por ser el que facilita mejor su recuperación. Sin embargo, es
limitada la cantidad de tejido que puede ser auto trasplantado y a veces es necesaria
otra intervención quirúrgica, la cual puede resultar en un procedimiento traumático.
Por lo anterior, las investigaciones en el área de ingeniería de tejidos como alternativa
de solución para reemplazo óseo tienen como fundamento esencial el uso de
biomateriales usados para plataformas de crecimiento celular o soporte, conocidos
como scaffolds y el uso de células asociadas a éstos, esto exige que las variables de
estudio correspondan en lo posible al entorno real. Por otra parte, la literatura
especializada para ingeniería de tejidos muestra además un aumento en la tendencia
hacia el desarrollo de andamiajes con materiales compuestos por cerámica y adición de
polímeros, ya que la preparación de estos va a permitir la incorporación de propiedades
favorables de ambos componentes.
Debido a esta tendencia, en esta investigación se desarrollaron scaffolds de
hidroxiapatita (HA) con 50% de sólidos por medio de la técnica gel-casting basada en la
polimerización in situ de monómeros de acrilamida para formar un cuerpo poroso, estos
fueron recubiertos con un polímero natural biodegradable llamado Quitosano a
diferentes concentraciones mediante una metodología sencilla de inmersión a
diferentes tiempos de exposición y en condiciones ambientales. El recubrimiento de
Quitosano se realizó con el fin de verificar la influencia de este en las propiedades
mecánicas, la estabilidad de los scaffolds y el comportamiento celular, comparando con
las propiedades del hueso a fin de mejorar los prerrequisitos necesarios para un
implante ortopédico.
Este material fue evaluado in vitro mediante pruebas de citotoxicidad, proliferación, y
adhesión con el fin de observar las interacciones de las células óseas con el material,
18
Evaluación de Recubrimientos de Quitosano sobre
Scaffolds de HA
con el fin de verificar su biocompatibilidad. Además, estos materiales fueron analizados
mediante ensayos mecánicos y técnicas de caracterización tales como difracción de
rayos X (XRD), espectroscopía infrarroja por transformada de fourier (FTIR) y
microscopía electrónica de barrido (SEM) para determinar la porosidad y la
interconexión, así como otras propiedades químicas, físicas y superficiales, entre otras.
Por último, con este proyecto se obtuvieron características de un material el cual puede
ser una buena alternativa en términos mecánicos y biológicos para ser utilizado en
campo de la ortopedia y regeneración de hueso.
Los resultados de todas las pruebas mostraron que los scaffolds de HA con
recubrimientos de quitosano presentaron en general buenas propiedades de resistencia
mecánica y de degradabilidad, adecuadas para su uso en regeneración de tejido óseo,
confirmando considerablemente mejoras en éstas y demostrando un blindaje eficaz y
eficiente de los scaffolds de HA en condiciones fisiológicas a mayor concentración de
quitosano con respecto a los scaffolds de HA sin recubrimiento. Los ensayos de
biocompatibilidad revelaron resultados favorables.
Palabras clave: Hidroxiapatita, quitosano, biopolímero, scaffold, biocompatibilidad,
ensayos in vitro, gel-casting, inmersión.
19
Evaluación de Recubrimientos de Quitosano sobre
Scaffolds de HA
ABSTRACT
An ideal material for bone replacements needs to have the faculty of imitating the host
tissue reacting in a suitable manner to requirements of form and function, also
providing a proper response to the biological system without induce any kind of disease.
While the material interacts with tissue, simultaneously it must acquire its properties
like structure, functionality and be tolerated by the host. Generally, autologous implants
are the most often used due to their high compatibility and recuperation. However, this
option is limited for the amount of available tissue and these required a second surgery
which can do of this a traumatic procedure.
Therefore, researches around tissue engineering focused on find alternative solution for
the bone replacement have a main purpose the use of biomaterials as platform to
induce the cell growth, these structures are called as scaffolds, and the use of cells
associated with them, in this conditions is important to have the control of variables as
close as possible to the real environment. On the other hand, specialized literature in
tissue engineering shows an increasing trend toward the development of scaffolds
mixing ceramic and polymers with the purpose to improve and complement the
properties of both materials.
Due to this trend, in this research, scaffolds of Hydroxyapatite (HA) with 50% solids will
be produced by gel-casting based on polymerization in situ of acrylamide monomers to
form a porous body, and were coated with a biodegradable natural polymer chitosan
different concentrations, by the technique of dip coating at different times under
environmental conditions. The coating of chitosan is performed in order to verify
the influence of the mechanical properties, the stability of scaffolds and cell
behavior, compared to the properties of bone to improve the prerequisites for an
orthopedic implant.
This material will be evaluated in vitro using cytotoxicity, proliferation, adhesion test
and by observation of interactions of bone cells with the material in order to verify their
biocompatibility. Furthermore, these materials will be analyzed by mechanical tests and
characterization techniques such as X-ray diffraction (XRD), Fourier transform infrared
spectroscopy (FTIR) and Scanning electron microscopy (SEM) to determine porosity and
interconnectivity as well as other properties. Finally with this project we expect to have
a good material which can be a good alternative in mechanical and biological terms to
be used in orthopedic field and bone regeneration.
20
Evaluación de Recubrimientos de Quitosano sobre
Scaffolds de HA
The results of the tests indicated that scaffolds of HA with coatings of chitosan
presented in general good properties of mechanical resistance and degradability,
suitable for their use in regeneration of bone tissue, showing improvements and
demonstrating an efficient protection of HA scaffolds under physiological conditions at
higher concentration of chitosan with respect to uncoated HA scaffolds. The
biocompatibility tests revealed favorable results.
Key words: Hydroxyapatite, chitosan, biopolymers, scaffolds, biocompatibility, in vitro
tests, gel- casting, dip coating.
21
Evaluación de Recubrimientos de Quitosano sobre
Scaffolds de HA
CAPÍTULO 1.
INTRODUCCIÓN, PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA Y ALCANCES
1.1. INTRODUCCIÓN
Un material ideal para reemplazar o regenerar el hueso tiene que imitar al tejido
respondiendo de manera adecuada a sus requerimientos de forma y funcionamiento,
además de promover una respuesta adecuada del sistema biológico sin inducir ningún
tipo de infección. A medida que interactúa con el tejido debe adquirir sus cualidades y
ser tolerado adecuadamente por el organismo [1]. Generalmente, el tejido óseo
extraído del propio paciente es el sustituto que más se emplea, por ser el que facilita
mejor su recuperación. Sin embargo, es limitada la cantidad de tejido que puede ser
auto trasplantado y a veces es necesaria otra intervención quirúrgica ya que puede
presentarse infección o rechazo [2].
Debido a esto surge la ingeniería de tejidos como una disciplina necesaria debido a los
múltiples daños degenerativos a los que está expuesto el hueso ya sea por enfermedad
o traumatismo; con el empleo de factores bioactivos y de scaffolds como soportes
pueden obtenerse estructuras conductoras e inductoras, que proporcionan apoyo
mecánico e integridad al hueso y que permiten a su vez un crecimiento adecuado del
tejido natural [3].
La producción de scaffolds es una de las opciones que más se está empleando en la
actualidad debido a que se pueden utilizar células del propio paciente, lo que disminuye
el rechazo. Las características que deben cumplir éstos son las de biocompatibilidad, la
no generación de productos tóxicos de desecho, estructura de poros accesibles,
interconectados y de tamaño adecuado, además si éste es de un material
biodegradable la degradación no debe darse antes de que las células logren realizar una
proliferación adecuada. Para tal fin se han usado técnicas de síntesis de scaffolds
utilizando diversas técnicas y materiales, entre estos, algunos cerámicos bioactivos
como la Hidroxiapatita (HA), la cual debido a su capacidad de enlazarse directamente al
tejido óseo resulta ser idóneo para regeneración ósea, sin embargo, como presenta
muy baja resistencia, no es posible su implantación en lugares del cuerpo con altas
cargas mecánicas [4].
22
Evaluación de Recubrimientos de Quitosano sobre
Scaffolds de HA
Por otra parte, cabe resaltar que la matriz ósea está compuesta por dos fases
principales; una inorgánica que es la fase dura compuesta por minerales de tipo fosfato
de calcio tipo apatitas y la orgánica compuesta por proteínas y colágeno, esta
asociación de materiales permite darle la resistencia necesaria para soportar las cargas.
Para tratar de simular este tipo de estructuras en la ingeniería de tejidos se ha dado una
mayor tendencia a desarrollar scaffolds híbridos con materiales compuestos de
cerámica y polímeros, buscando asociar las excelentes propiedades osteoconductivas
de los cerámicos, a su vez la flexibilidad y degradabilidad de los polímeros [5]. De ahí
que la preparación de compuestos de fosfatos de calcio y biopolímeros, permitan la
asociación de propiedades favorables de ambos componentes.
En los últimos años el quitosano ha mostrado grandes ventajas para aplicaciones
biomédicas, este polímero natural es no tóxico, biodegradable, biocompatible y
bioadhesivo, otra ventaja muy importante es su excelente propiedad de
bioestimulación, la cual facilita la reconstrucción y vascularización de los tejidos
dañados, además de poseer la capacidad para compensar las deficiencias de los
componentes celulares que conducen a la formación de cicatrices pequeñas [6].
1.2. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
En la medicina regenerativa, la ingeniería de tejidos juega un papel muy importante;
específicamente el uso de sustitutos óseos, ya sea para reemplazar el tejido afectado o
para favorecer su regeneración. Un material ideal para reemplazo tiene que imitar al
tejido que reemplaza respondiendo de forma adecuada a sus requerimientos de forma
y funcionamiento, además de promover una respuesta adecuada del sistema biológico
sin inducir infecciones. A medida que interactúa con el tejido debe adquirir sus
cualidades y ser tolerado adecuadamente por el organismo.
Generalmente, el tejido óseo extraído del propio paciente es el sustituto más
comúnmente empleado, por ser el que facilita la mejor recuperación. Sin embargo, es
limitada la cantidad de tejido que puede ser auto trasplantado y a veces es necesaria
otra intervención quirúrgica [7]. Por esto se hace necesario buscar otras alternativas de
regeneración, como por ejemplo, el uso de biocerámicas para la creación de
plataformas tridimensionales (scaffolds) que sirvan de estructura de soporte temporal
para hacer crecer las células óseas, y una vez implantados estos scaffolds se forme el
nuevo tejido.
Uno de los materiales más estudiados en este campo para la fabricación scaffolds es la
Hidroxiapatita [HA, Ca10 (PO4)6(OH)2], cuya composición química es similar a la del hueso
23
Evaluación de Recubrimientos de Quitosano sobre
Scaffolds de HA
(fase inorgánica). Es un cerámico bioactivo debido a su capacidad de enlazarse
directamente al tejido óseo y es uno de los más utilizados debido a esta característica y
a las propiedades que posee de biocompatibilidad y osteointegración, está entre los
más importantes sustitutos del hueso humano en implantes [8], además ofrece diversas
posibilidades de conformación, siendo posible fabricar polvos, recubrimientos, cuerpos
densos y scaffolds; estos últimos pueden ser utilizados para el relleno de defectos óseos
o como plataformas de crecimiento celular [9].
La principal desventaja de este material es que presenta baja resistencia mecánica, sin
embargo, con el fin de mejorar esta propiedad y producir scaffolds cerámicos que
puedan ser usadas como scaffolds, se han desarrollado diferentes técnicas de
procesamiento entre las cuales están la infiltración de espumas poliméricas, el gel-
casting, la liofilización, el prototipado rápido y las combinaciones entre ellas, etc. A su
vez, con la utilización de agentes reticulantes se logra mejorar la resistencia mecánica y
otorgar porosidades que promuevan la adhesión, la migración, el crecimiento y la
proliferación celular, para una buena integración con el tejido circundante, a fin de
mejorar la respuesta biológica del hueso y ser un firme candidato como sustituto de
injertos óseos [2, 10].
Cabe resaltar además que la matriz ósea está compuesta por dos fases principales; una
inorgánica que es la fase dura compuesta por minerales de tipo fosfato y la orgánica
compuesta por proteínas y colágeno, esta asociación de materiales permite darle la
resistencia necesaria para soportar las cargas. Para tratar de simular este tipo de
estructuras en la ingeniería de tejidos se ha dado una mayor tendencia a desarrollar
scaffolds híbridos con materiales compuestos por cerámica y polímeros, buscando
asociar las excelentes propiedades osteoconductivas de los cerámicos, a su vez la
flexibilidad y degradabilidad de los polímeros. De ahí que la preparación de compuestos
de fosfatos de calcio y biopolímeros, permitan la asociación de propiedades favorables
de ambos componentes.
Por lo expuesto anteriormente y a la tendencia a desarrollar scaffolds para ingeniería de
tejidos con materiales cerámicos y poliméricos se plantea en este proyecto la
posibilidad de realizar un método alternativo que permita la obtención de estas
estructuras porosas con un cerámico comercial de hidroxiapatita por el método de gel-
casting y recubrirlas con películas de quitosano a diferentes concentraciones con el fin
de comprobar el efecto que pueda aportar este biopolímero sobre los scaffolds de HA
con respecto a sus diversas propiedades físicas, químicas, mecánicas y biológicas, con el
fin de determinar si cumplirán los requisitos de biocompatibilidad y biofuncionalidad
idóneos para ser considerados en la regeneración ósea.
24
Evaluación de Recubrimientos de Quitosano sobre
Scaffolds de HA
1.3. ALCANCE DEL PROYECTO
Este proyecto empieza con una serie de fundamentos teóricos y un estado del arte que
contextualizan al lector, luego se detalla la obtención de los scaffolds de hidroxiapatita,
el desarrollo de los recubrimientos y de las técnicas de caracterización y por último, se
presentan los resultados obtenidos.
Básicamente se centra en los siguientes aspectos:
Capítulo 2. Marco teórico y Estado del arte: Se encuentran los fundamentos teóricos
sobre los elementos utilizados para desarrollar los materiales y recubrimientos de
estudio, las características de biomateriales en general, scaffolds y recubrimientos, las
técnicas de caracterización y un acercamiento a los cultivos celulares
Capítulo 3. Objetivos, Materiales y métodos: Se describen los objetivos planteados para
el desarrollo de la investigación y se detallan los materiales y métodos utilizados para
obtener los scaffolds y recubrimientos con el biopolímero, como caracterizarlos
química, física, mecánica y biológicamente y el diseño experimental aplicado a dicha
investigación.
Capítulo 4. Resultados y discusión: contiene los resultados obtenidos en proceso de
obtención y ensayos de caracterización, con una breve discusión y explicación de cada
uno de ellos.
Capítulo 5. Conclusiones: conclusiones generales extraídas de toda la experimentación y
los resultados obtenidos durante la investigación.
Cada capítulo cuenta con sus respectivas referencias bibliográficas; trabajos de
investigación, tesis, artículos científicos utilizados para la realización del proyecto,
patentes, libros y consultas de internet.
25
Evaluación de Recubrimientos de Quitosano sobre
Scaffolds de HA
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
CAPÍTULO 1
[1] R. Sastre, S. Aza, and J. San Román, Biomateriales. Castelló de la Plana: Faenza
Editrice Ibérica, 2004.
[2] C. A. Martínez and A. Ozols, “Biomateriales utilizados en cirugía ortopédica como
sustitutos del tejido óseo,” Rev. la Asoc. Argentina Ortop. y Traumatol., vol. 77, no. 2,
pp. 140–146, 2012.
[3] G. Wei and P. X. Ma, “Macroporous and nanofibrous polymer scaffolds and
polymer/bone-like apatite composite scaffolds generated by sugar spheres,” J. Biomed.
Mater. Res. - Part A, vol. 78, no. 2, pp. 306–315, 2006.
[4] C. B. Carter and G. Norton, Ceramic Materials: Science and Engineering, Second.
USA: Springer New york, 2013.
[5] C. Peniche, Y. Solís, N. Davidenko, and R. García, “Materiales compuestos de
quitosana e hidroxiapatita,” Biotecnología Aplicada, vol. 27, no. 3. Madrid - España, p.
10, 2010.
[6] S. K. Mishra and S. Kannan, “Development, mechanical evaluation and surface
characteristics of Chitosan/polyvinyl alcohol based polymer composite coatings on
titanium metal,” J. Mech. Behav. Biomed. Mater., vol. 40, pp. 314–324, 2014.
[7] U. Valle and U. Valle, “Desarrollo y caracterización de cementos óseos macroporosos
de fosfato de calcio,” vol. 37, p. 129, 2006.
[8] P. Sepulveda, J. G. P. Binner, S. O. Rogero, O. Z. Higa, and J. C. Bressiani, “Production
of porous hydroxyapatite by the gel-casting of foams and cytotoxic evaluation,” J.
Biomed. Mater. Res., vol. 50, no. 1, pp. 27–34, 2000.
[9] A. Woesz, M. Rumpler, J. Stampfl, F. Varga, N. Fratzl-Zelman, P. Roschger, K.
Klaushofer, and P. Fratzl, “Towards bone replacement materials from calcium
phosphates via rapid prototyping and ceramic gelcasting,” Mater. Sci. Eng. C, vol. 25,
no. 2, pp. 181–186, 2005.
[10] K. Zhao, Y. F. Tang, Y. S. Qin, and J. Q. Wei, “Porous hydroxyapatite ceramics by ice
templating: Freezing characteristics and mechanical properties,” Ceram. Int., vol. 37, no.
2, pp. 635–639, 2011.
26
Evaluación de Recubrimientos de Quitosano sobre
Scaffolds de HA
CAPÍTULO 2.
MARCO TEÓRICO Y ESTADO DEL ARTE
2.1. TEJIDO ÓSEO
El conocimiento de la estructura, la fisiología, los mecanismos de formación y de
regeneración ósea son fundamentales para la medicina regenerativa y la ingeniería de
tejido óseo. Por esta razón se presenta a continuación un resumen de las características
del hueso bajo condiciones fisiológicas normales sin patologías.
2.1.1. Características generales del hueso
El tejido óseo, denominado comúnmente hueso forma la base o sostén del sistema
locomotor y constituye el esqueleto del organismo, y junto con los dientes es el tejido
más duro del cuerpo. Es una forma especializada de tejido conjuntivo que está
compuesto dentro del componente orgánico por matriz extracelular la cual se conoce
también como osteoide (conformada en un 90% por varios tipos de colágeno en su
mayoría tipo I y el 10% de proteínas no colágenas como son los proteoglucanos, las
proteínas multiadhesivas, factores de crecimiento, citocinas entre otras) y diferentes
tipos de células. En cuanto al componente inorgánico que está representado por un
65% del peso seco y está constituido por cristales de Hidroxiapatita [Ca10 (PO4)6(OH)2],
bicarbonato, citrato, magnesio, sodio y potasio; esto hace que una de las características
que distinga al tejido óseo de los otros tipos de tejidos conjuntivos sea la mineralización
de su matriz, la cual produce un tejido muy duro capaz de proveer sostén y protección
[1, 2].
Se muestra en la figura 1 un diagrama de los componentes del tejido óseo de forma
resumida.
27
Evaluación de Recubrimientos de Quitosano sobre
Scaffolds de HA
Figura 1. Diagrama que representa los componentes del tejido óseo [3].
2.1.2. Estructura y fisiología del hueso
Existen dos variedades de tejido óseo atendiendo a sus características macroscópicas
(anatómicas); tejido óseo compacto y tejido óseo esponjoso o laminar, estos dos tipos
de hueso sólo se distinguen en el grado de porosidad y densidad, básicamente debido a
la organización y al nivel de mineralización de la matriz de colágeno. El tejido óseo
compacto se compone de un 80 a 90% de calcio, está formado por una masa ósea
densa, compacta sin espacios, el cual se encuentra en la porción más externa de todos
los huesos y en la mayor parte de la diáfisis de los huesos largos. El tejido óseo
esponjoso sólo tiene un 15 a 25% de calcio y está constituido por finas trabéculas
(delgadas espículas de tejido óseo anastomosadas) que se entrecruzan dando lugar a un
entramado en forma de red cuyos espacios están intercomunicados y albergan la
médula ósea. Este tipo de tejido está en la porción central de los huesos planos y en las
epífisis de los huesos largos, tiene una porosidad media del 75 al 95% y una densidad de
aproximadamente 0,2g/cm3 [4].
28
Evaluación de Recubrimientos de Quitosano sobre
Scaffolds de HA
La unidad básica estructural del hueso es la osteona o sistema de Havers, que con un
tamaño de 200 µm se compone de láminas concéntricas de matriz colágena
mineralizada y contiene un canal central por el que pasan capilares y nervios. Estas
osteonas se agrupan y ordenan formando láminas que a la vez se unen para conformar
la parte cortical del hueso (figura 2) [2].
Figura 2. Corte longitudinal para ilustrar el hueso cortical y trabecular a nivel macroscópico (a) Corte longitudinal y transversal de hueso cortical ilustrando a nivel
microscópico las osteonas, la capilarización, el endiostio y el periostio (b) [2].
Por otra parte, es importante destacar que el tejido óseo en general tiene poros de
tamaño que van de 1 a 100 micras para el hueso cortical normal y de 200 a 400 micras
para el hueso trabecular, en este último el 55 al 70% de los poros están interconectados
[5]. Estos dos tipos de hueso también tienen diferentes propiedades mecánicas como se
observa en la Tabla 1.
29
Evaluación de Recubrimientos de Quitosano sobre
Scaffolds de HA
Tabla 1. Propiedades mecánicas del hueso cortical y trabecular [5].
PROPIEDADES MECÁNICAS HUESO
CORTICAL
HUESO
TRABECULAR
Resistencia a la compresión (MPa) 150 - 230 2 - 12
Resistencia a la tracción (MPa) 100 - 150 10 - 20
Resistencia a la flexión (MPa) 100 - 240 ---
Deformación de pre-fallo (%) 1 - 3 5 - 7
Resistencia al agrietamiento (MPa·m1/2) 2 - 12 ---
Módulo elástico (MPa) 7000 - 30000 400 – 1700
Porosidad (%) 5 - 30 30 - 90
El hueso es un órgano muy importante y éste tiene que cumplir múltiples funciones
tanto a nivel mecánico como metabólico. Las funciones del tejido óseo son:
Mecánicas: La protección de los órganos internos (por ejemplo, el cráneo
protege el cerebro y las costillas protegen el corazón y los pulmones); además
da forma y apoyo al cuerpo, esto permite el movimiento a través de la
interacción con los músculos [5].
Síntesis: La producción de células rojas y blancas de la sangre en la medula ósea,
la cual se encuentra en la parte interior del hueso [5].
Metabólica: Es una fuente importante de minerales, tales como el calcio y el
fósforo, factores de crecimiento como la proteína morfogenética ósea (BMP) y
el factor de crecimiento transformante (TGF) y grasa (la de la médula ósea
amarilla que actúa como reserva de almacenamiento de ácidos grasos). Además,
el hueso amortigua la sangre contra los cambios de pH excesivos mediante la
absorción o liberación de sales, la desintoxicación de la sangre de metales
pesados almacenándolos y evitando su influencia en otros órganos [5].
En virtud de su contenido mineral, el tejido óseo sirve como sitio de depósito de calcio y
fosfato, los cuales pueden ser movilizados de la matriz ósea y captados por la sangre
según sea necesario para mantener las concentraciones adecuadas en todo el
organismo. Por consiguiente, además de sostén y protección, el tejido óseo desempeña
un papel secundario importante en la regulación homeostática de la calcemia
(concentración de calcio en la sangre) [1].
30
Evaluación de Recubrimientos de Quitosano sobre
Scaffolds de HA
2.1.3. Células óseas
En la matriz ósea hay espacios llamados lagunas u osteoplastos, cada uno de los cuales
contiene una célula ósea u osteocito; estos son osteoblastos que quedan atrapados
entre la matriz ósea calcificada, dentro de cavidades llamadas lagunas óseas. El
osteocito extiende una gran cantidad de prolongaciones en túneles estrechos
denominados canalículos. Los canalículos atraviesan la matriz mineralizada para
conectar las lagunas contiguas y permitir el contacto entre las prolongaciones de
osteocitos vecinos. De esta manera se forma una red continua de canalículos y lagunas
con células y sus prolongaciones en toda la masa del tejido mineralizado. El tejido óseo
depende de los osteocitos para mantener su viabilidad ya que mantienen el intercambio
de sustancias nutritivas entre los vasos sanguíneos del tejido óseo y la matriz ósea y
depositan o extraen pequeñas cantidades de sales de calcio cuando el metabolismo del
hueso así lo requiere. Sin embargo, además de los osteocitos, en el tejido óseo hay
otros tipos de células, en la figura 3 se muestran las principales [2, 3, 6].
Figura 3. Tipos de células óseas [6].
2.1.3.1. Células osteoprogenitoras
Estas se derivan de células madre mesenquimáticas que se encuentran en las
superficies externas e internas de los huesos (periostio y endostio). Son células
indiferenciadas similares a los fibroblastos. Durante la formación del hueso, estas
células se dividen y se diferencian en dos tipos de células formadoras de tejido óseo: los
osteoblastos y los preosteoclastos, que darán origen a los osteocitos y osteoclastos
31
Evaluación de Recubrimientos de Quitosano sobre
Scaffolds de HA
respectivamente. Son capaces de dividirse y proliferar para la formación y reparación
ósea. Asimismo, tienen la capacidad de diferenciarse a otros tipos celulares: adipocitos,
condroblastos y fibroblastos. Estructuralmente, son células de núcleo oval y cromatina
laxa, citoplasma escaso y con forma ahusada [7].
2.1.3.2. Osteoblastos
Son células que secretan la matriz extracelular del tejido óseo; una vez que la célula
queda rodeada por la matriz secretada pasa a llamarse osteocito. Son células
formadoras de tejido óseo y por su capacidad de dividirse, se asemejan a los
fibroblastos y los condroblastos. Secretan el colágeno y la sustancia fundamental que
constituyen el tejido óseo no mineralizado, sustancia osteoide o preósea, que es la
parte orgánica de la matriz ósea (colágeno tipo I, proteoglucanos y glucoproteínas) [7].
2.1.3.3. Osteoclastos
Son células móviles cuya función es la resorción ósea, están presentes en las superficies
óseas donde el hueso se está eliminando o remodelando (reorganizando) o donde el
hueso se ha lesionado, estos no están emparentados con los osteoblastos sino que
derivan de la fusión de células progenitoras hematopoyéticas mononucleares [1]. Son
células de gran tamaño o gigantes, multinucleadas (6 - 50 núcleos) y acidófilas. En su
ultra estructura se destaca un citoplasma granuloso y vacuolado. Cuando el osteoclasto
está en actividad, se apoya y adhiere directamente sobre la superficie ósea donde se
producirá el mecanismo de resorción, formando por debajo una excavación poco
profunda, que se denomina laguna de Howship. La superficie celular de los osteoclastos
que está en contacto con la matriz ósea posee microvellosidades y recibe el nombre de
superficie activa, borde rugoso o borde plegado [3, 7].
Las células osteoprogenitoras y los osteoblastos son precursores del desarrollo de los
osteocitos. Los osteoclastos son células fagocíticas producto de la fusión de células
progenitoras hematopoyéticas de la médula ósea que dan origen a los linajes
granulocítico, neutrófilo y monocítico [1].
2.1.3.4. Células de revestimiento óseo
Estas permanecen en la superficie ósea cuando no hay crecimiento activo. Derivan de
aquellos osteoblastos que quedan después del cese del depósito óseo. En los sitios en
32
Evaluación de Recubrimientos de Quitosano sobre
Scaffolds de HA
los que no se está produciendo remodelado del tejido óseo maduro, las superficies
óseas están revestidas por una capa de células aplanadas con citoplasma muy delgado y
orgánulos escasos más allá de la región perinuclear. Las células de revestimiento óseo
ubicadas en las superficies externas del hueso reciben el nombre de células periósticas
y las que tapizan las superficies internas con frecuencia se denominan células
endósticas. También se cree que intervienen en el mantenimiento y la nutrición de los
osteocitos incluidos en la matriz ósea subyacente y que regulan el movimiento del
calcio y el fosfato desde la sangre hacia el hueso y desde el hueso hacia la sangre [1].
2.1.3.5. Remodelado óseo
El remodelado óseo es una secuencia de eventos celulares que tiene como función
principal el rejuvenecimiento del esqueleto o reestructuración del hueso existente, este
proceso renueva anualmente un 3,5% del hueso cortical y alrededor de un 30% del
trabecular que está en constante formación y reabsorción. De manera secundaria
desempeña un papel preponderante en el control de la homeostasis mineral, mediante
la liberación al torrente sanguíneo de iones de calcio-fosforo [8].
A nivel microscópico, el remodelado óseo se produce en las unidades básicas
multicelulares, donde los osteoclastos reabsorben una cantidad determinada de hueso
y los osteoblastos forman la matriz osteoide y la mineralizan para rellenar la cavidad
previamente creada. En estas unidades hay osteoclastos, macrófagos, preosteoblastos y
osteoblastos que están regidos por una serie de factores, tanto generales como locales,
permitiendo el normal funcionamiento del hueso y el mantenimiento de la masa ósea.
Es importante destacar que cuando este proceso se desequilibra aparece la patología
ósea, bien sea por exceso (osteopetrosis) o por deterioro (osteoporosis) [9].
La remodelación se inicia cuando un conjunto de osteoclastos erosiona una cavidad en
la superficie ósea. En ausencia de osteoblastos, se establece un intervalo quiescente
(fase de inversión). En ese período la superficie irregular de la cavidad se alisa y se
deposita un estrato de sustancia de cemento. Posteriormente, un conjunto de
osteoblastos sustituye el hueso recientemente erosionado. El remodelado óseo es un
ciclo que se produce en 5 etapas sucesivas que son quiescencia, activación, reabsorción,
inversión y formación (figura 4) [10].
33
Evaluación de Recubrimientos de Quitosano sobre
Scaffolds de HA
Figura 4. Fases del remodelado óseo normal (BRU: Unidad de Remodelado Óseo; CL: línea de cemento; OS: osteoide) [10].
2.1.4. Patologías óseas y su relevancia
Como se ha mencionado, el hueso es un tejido dinámico en constante formación y
reabsorción, que permite el mantenimiento del volumen óseo, la reparación del daño
tisular y la homeostasis del metabolismo fosforo/calcio [9]. Sin embargo este tejido
reacciona ante una gran diversidad de trastornos, muchos de las cuales tienen su origen
fuera del sistema esquelético. Estas reacciones sirven como espejo de enfermedades,
en el sentido que refleja la naturaleza de la anomalía subyacente. Por tanto, las
reacciones del hueso como órgano y como estructura son importantes en el diagnóstico
y tratamiento de los pacientes. Sin un adecuado conocimiento del hueso, como órgano
y estructura se corre el riesgo de diseñar productos terapéuticos no adecuados [11].
La osteoporosis, la enfermedad de Paget, la osteogénesis imperfecta, el raquitismo, la
osteomalacia, la displasia fibrosa entre otras, son solamente algunos de los trastornos
que pueden afectar muy seriamente tanto la calidad, como la cantidad de masa ósea en
el cuerpo. Todo esto genera uno de los mayores problemas de salud pública para
muchos países del mundo, además de los altos costos debido a los tratamientos. En la
mayoría de casos quienes requieren una intervención ya sea preventiva o curativa se
encuentran incapacitadas para pagar o acceder a dichos tratamientos y de no ser
tratadas oportunamente dichas patologías pueden llevar a que el paciente pierda sus
capacidades funcionales o afecte su calidad de vida [8].
34
Evaluación de Recubrimientos de Quitosano sobre
Scaffolds de HA
2.1.5. Estrategias terapéuticas para la regeneración de tejido óseo
Tradicionalmente los defectos óseos se han tratado con terapias convencionales
implantando tejidos autólogos, alogénicos o xenogénicos o materiales sustitutos en
otros casos (figura 5). En las últimas décadas se ha incrementado de forma exponencial
la utilización de tejido óseo en la práctica habitual de la cirugía ortopédica y dental. No
obstante, las complicaciones vinculadas a la toma de injertos autólogos como son la
limitada cantidad de hueso a extraer y la morbilidad en el lugar de extracción (dolor,
infección, hematoma, hernias abdominales, etc.) y los potenciales riesgos de carácter
infeccioso e inmunológico (hepatitis, VIH, priones, etc.) en relación con los aloinjertos y
heteroinjeros han impulsado la búsqueda de alternativas diferentes a éstas [12].
Figura 5. Tipos de implantes para regeneración de tejido.
En la actualidad se cuenta con una gran variedad de implantes de materiales que no
tienen su origen en seres vivos como son los polímeros, cerámicos, metales o
composites cuyo fin es lograr productos con propiedades químicas, físicas y mecánicas
más parecidas al hueso y con los cuales se pueda lograr un mejor desempeño funcional
como sustitutos del injerto de hueso. Sin embargo, muchos de estos materiales
presentan varias desventajas, ya que están sujetos a la fatiga, fractura, toxicidad y
desgaste; por lo demás, no se remodelan con el tiempo. Por ejemplo se pueden
presentar problemas de integración del implante con los tejidos adyacentes, puesto que
35
Evaluación de Recubrimientos de Quitosano sobre
Scaffolds de HA
no pueden adherirse a éste de forma correcta y de esta manera se crean deficiencias de
tipo mecánico [13].
A causa de obstáculos como la escasez de donantes, la transmisión de enfermedades, la
morbilidad del sitio de extracción y la incapacidad de los materiales para remodelarse y
reaccionar ante condiciones fisiológicas, ninguno de los tratamientos convencionales ha
podido suplir todas las necesidades a la hora de tratar problemas relacionados con la
pérdida o deterioro del tejido óseo; por lo tanto, se hace necesaria la búsqueda de
soluciones alternas. Esta creciente necesidad de órganos ha llevado a los investigadores
a plantear la posibilidad de utilizar células y materiales de diversa naturaleza para la
reconstrucción de órganos y tejidos, para dar así nacimiento a una disciplina conocida
como Ingeniería de Tejidos (IT) que es definida como el uso de los principios y métodos
de la ingeniería, la biología, la bioquímica y las ciencias de la vida orientados a la
comprensión de la estructura y la función de los tejidos normales y patológicos de los
mamíferos, y el consecuente desarrollo de sustitutos biológicos para restaurar,
mantener o mejorar las funciones de los organismos [14, 15].
En todos los casos, estos materiales tienen que cumplir una serie de requisitos ya que
son considerados biomateriales, por tanto deben ser biocompatibles con el organismo
receptor, es decir, no generar rechazo, ni daños, deben tener una determinada vida
media para desarrollar su tarea y aportar las prestaciones necesarias para realizar bien
la función a la que van destinados [16]. A continuación se destacan algunos materiales
de uso común en medicina regenerativa, su clasificación y características.
2.2. BIOMATERIALES DE USO EN MEDICINA REGENERATIVA
La ciencia de los Biomateriales es una disciplina que surge a partir de la necesidad de
reparar o reconstruir tejidos u órganos del cuerpo humano que han sido dañados ya sea
por enfermedades, defectos congénitos, accidentes traumatológicos, entre otros. Esta
es una ciencia interdisciplinar donde intervienen especialistas en muchas áreas que van
desde la medicina hasta la ingeniería y se desarrolló rigurosamente en la segunda mitad
del siglo XX, ofreciendo actualmente múltiples tratamientos favorables contra las
diferentes afecciones humanas [11]. La figura 6 muestra de forma esquemática la
evolución histórica del concepto y aplicación de técnicas a lo largo del tiempo para el
tratamiento de las afecciones sin tener en cuenta su causa.
36
Evaluación de Recubrimientos de Quitosano sobre
Scaffolds de HA
Figura 6. Evolución histórica de las técnicas utilizadas para el tratamiento de diferentes afecciones [11].
Un biomaterial es cualquier sustancia o combinación de sustancias de origen natural o
sintético, solas o en combinación con drogas como parte de un dispositivo en el
tratamiento, aumento o remplazo de algún tejido u órgano sin causar daño agudo o
crónico al huésped mientras mantiene su efectividad física y biológica durante su vida
útil in vivo [17]. Estos pueden ser utilizados sin incompatibilidades como dispositivos
biomédicos y además colocarse en contacto con los tejidos vivos sin provocar daños o
alteraciones. Por lo anterior deben cumplir los requerimientos de la aplicación
específica para la cual son diseñados además de presentar una alta biocompatibilidad al
ser evaluado su comportamiento in vitro e in vivo [18].
En la actualidad, el uso de biomateriales tiene aplicación en casi todos los sistemas del
organismo humano y existe un rango muy amplio de materiales útiles para todo tipo de
aplicaciones biomédicas, estos se pueden clasificar según su naturaleza química en
metales, polímeros, cerámicos y compuestos; sin embargo mantener el equilibrio entre
la biocompatibilidad y las propiedades mecánicas de estos restringen su uso en esta
área. Entre los biomateriales más empleados se encuentran los metales y sus
aleaciones, los cuales fueron los primeros usados para implantes y actualmente son los
37
Evaluación de Recubrimientos de Quitosano sobre
Scaffolds de HA
más usados por su resistencia mecánica y a la corrosión. Los polímeros también son
ampliamente utilizados por su variedad de composiciones, facilidad de producción con
diferentes modelos geométricos y con determinadas propiedades, pueden ser rígidos o
blandos y algunos resultan adecuados para reemplazos temporales por su composición
biodegradable. Las cerámicas también son muy útiles por su alta estabilidad y dureza, y
por último están los compuestos que son una combinación artificial de dos o más
materiales que difieren en forma o composición donde cada constituyente va a
mantener su identidad física o química. Todos tienen un amplio espectro de
aplicaciones de acuerdo a una necesidad específica [18, 19].
Cabe resaltar que son muchas las enfermedades y lesiones que requieren una
intervención quirúrgica para implantar un biomaterial o un dispositivo médico. En
general, los índices de éxito de dichas intervenciones son elevados, pero todavía hay
aspectos mejorables entre los que cabe destacar el diseño de técnicas quirúrgicas
menos agresivas, la anticipación del tratamiento de las enfermedades degenerativas y
la mejora de los biomateriales y dispositivos implantables [20].
La medicina regenerativa ha traído grandes expectativas para un número significativo
de enfermedades humanas actuales en todo el mundo. Enfermedades, tales como la
enfermedad de Parkinson, el Alzheimer, la osteoporosis, lesiones de columna, el cáncer,
entre otras pueden tratarse en un futuro próximo con métodos que tienen como
objetivo la regeneración de tejidos enfermos o dañados El objetivo ideal de la medicina
regenerativa es la de la regeneración in vitro o in vivo de un órgano funcional complejo
que consta de un andamio o Scaffold hecho a partir de materiales sintéticos o naturales
que se han cargado con células vivas. Debido a esto surge la ingeniería de tejidos, un
campo de investigación que tiene como objetivo desarrollar sustitutos para los órganos
y los tejidos dañados por enfermedad o accidentes, evitando los trasplantes que
requieren un donante o minimizando de alguna forma el riesgo al rechazo. Lo que se
busca es desarrollar tejidos a partir de las propias células del paciente. En primer lugar,
las células se cultivan fuera del cuerpo, en un soporte apropiado que simula el entorno
externo de la célula y posteriormente, cuando su crecimiento es el adecuado, se
trasplanta al cuerpo, figura 7 [21].
38
Evaluación de Recubrimientos de Quitosano sobre
Scaffolds de HA
Figura 7. Ingeniería de tejidos aprovechada para regeneración de tejidos. Existen dos estrategias diferentes in vivo e in vitro. Ambos métodos usan scaffolds porosos los
cuales son cargados con células [21].
El término ingeniería de tejidos fue acuñado oficialmente en un taller de la National
Science Fundation en 1988 abarcando principios y métodos de las ciencias de la vida y
de la ingeniería. Para estos desarrollos se construyen pequeños andamios que sirven
para definir la forma del órgano a reemplazar. El reto de la ingeniería de tejidos es
imitar lo que sucede en la naturaleza. En términos generales la ingeniería tisular tiene
como objetivo fabricar tejidos u órganos similares a los tejidos u órganos originales de
un paciente que, dañados o enfermos, deben ser sustituidos [15,22].
La ingeniería de tejidos requiere 3 componentes críticos: Las células, los niveles
adecuados de moléculas biofuncionales solubles e insolubles y el scaffold para el
soporte de las células en crecimiento y formación de tejidos. Este último actúa como
una matriz extracelular que permite la fijación de células temporalmente y la
adaptación al medio ambiente. Para lograr el objetivo final de la formación de tejido, el
andamio debe poseer varias características muy importantes, que incluyen la
biocompatibilidad, la formación de subproductos de degradación no tóxicos, estructura
de la porosidad accesible (poros interconectados) y la degradación del andamio en un
tiempo apropiado que permita la invasión de células y la reestructuración del tejido.
Para la infiltración de células en los andamios, el diámetro de poro debe ser lo
suficientemente grande para la invasión celular y la migración dentro del andamio. La
39
Evaluación de Recubrimientos de Quitosano sobre
Scaffolds de HA
porosidad y la interconectividad de los poros debe ser lo suficientemente grande para la
distribución celular adecuada, pero lo suficientemente pequeña para evitar el
desprendimiento de las células por el flujo de fluidos corporales [23]. Es importante
destacar que el diseño apropiado del scaffold y la evaluación de su estructura tras su
fabricación, son muy importantes para obtener las características requeridas y
adecuadas para ser usado en reparación de tejido óseo.
La clasificación de los biomateriales puede realizarse atendiendo a su comportamiento
cuando se implantan o bien atendiendo a su naturaleza química [16].
2.2.1. Clasificación de biomateriales según su naturaleza química
Entre los biomateriales más usados en ingeniería de tejidos se encuentran los siguientes
grupos:
2.2.1.1. Metales y sus aleaciones
Fueron los primeros materiales utilizados para los implantes y actualmente son los más
usados por su buena resistencia mecánica y a la corrosión [17]. Los metales han sido
muy utilizados como biomateriales con dos propósitos principales los cuales son la
fabricación de prótesis para reemplazar una parte del cuerpo (articulaciones, placas
craneales, clavos, etc.), o implantes utilizados en la estabilización y ayuda al proceso
normal de reparación de un tejido (por ejemplo, unión de huesos rotos). Entre los
metales más utilizados con estos fines cabe destacar las diferentes clases de aceros
inoxidables, las aleaciones de Co-Cr (con Mo y Ni), el titanio y sus aleaciones (con Al, V,
Ni), entre otros. Uno de los problemas que pueden presentar este tipo de materiales es
la liberación de productos al medio lo que produce consecuentemente, una
determinada reacción tisular adversa [16].
2.2.1.2. Polímeros
Son ampliamente usados por sus grandes posibilidades, presentan una amplia variedad
de composiciones, son fáciles de producir, con diferentes modelos geométricos y con
determinadas propiedades, son versátiles, pueden ser rígidos, fluidos o blandos, de
origen natural o sintético y son adecuados para reemplazos temporales por su
composición biodegradable. Las aplicaciones biomédicas de los polímeros se pueden
clasificar atendiendo a la función que desempeña el polímero en cuestión. Una de las
aplicaciones biomédicas más importantes de los polímeros es su utilización como
40
Evaluación de Recubrimientos de Quitosano sobre
Scaffolds de HA
suturas, liberación de fármacos, apósitos para heridas, matrices de crecimiento celular,
membranas de diálisis, entre otros [16].
2.2.1.3. Cerámicos
Las cerámicas como biomateriales a pesar de que son mecánicamente débiles o frágiles
resultan muy llamativas debido a que son materiales químicamente inertes, lo que
sugiere que no suelen desencadenar respuestas no deseadas en el tejido en el que se
implantan y no son susceptibles a ataque microbiano. Estas son muy estables,
resistentes al desgaste y se comportan como buenos aislantes térmicos y eléctricos.
Todas estas propiedades son ventajosas para el desarrollo de prótesis óseas. Bajo este
calificativo se incluye a la alúmina (óxido de aluminio), la hidroxiapatita (fosfatos
cálcicos) y los denominados biovidrios (composición basada en SiO2 - CaO - Na2O - P2O5
y algunos que contienen MgO y K2O) [11, 19, 24]. Sus principales características se
mencionarán con más detalle en siguientes apartados.
2.2.1.4. Compuestos
Es la combinación artificial de dos o más fases de materiales que difieren en forma o
composición y consigue una conjunción de las propiedades de cada una de estas por
separado. Cada constituyente mantiene su identidad física o química. Los composites
tienen un amplio espectro de aplicaciones, las amalgamas dentales se encuentran
dentro de este grupo, las matrices de colágeno- hidroxiapatita [11,16].
En la actualidad, el uso de los biomateriales está generalizado existiendo una clara
complementariedad entre las opciones que ofrece cada grupo de materiales
mencionados anteriormente. Estos biomateriales tienen su aplicación en casi todos los
sistemas del organismo humano.
2.2.2. Clasificación de biomateriales según la respuesta del tejido
La evaluación de un material para ser usado en implantes o prótesis pasa
necesariamente por el análisis del tipo de reacción que induce en la interfaz
biomaterial-tejido, la cual a su vez, determina el mecanismo de adhesión al tejido. Es
ampliamente aceptado que ningún material probado hasta ahora en un tejido vivo
puede considerarse totalmente inerte ya que se ha demostrado que todos generan una
respuesta en dicho tejido, afectando invariablemente el proceso normal de curación.
41
Evaluación de Recubrimientos de Quitosano sobre
Scaffolds de HA
Generalmente se acepta la existencia de cuatro clases de respuesta tisular y cuatro
formas de adhesión del biomaterial al tejido [25].
La Tabla 2 resume de manera precisa las clases de respuesta del tejido al material
implantado.
Tabla 2. Tipos de respuestas del tejido al implante [25].
MATERIAL RESPUESTA
Material tóxico Genera tejido circundante y provoca una reacción
adversa con el receptor
Material inerte No tóxico y biológicamente inactivo. Se forma un tejido
fibroso de espesor variable alrededor del implante
Material bioactivo No tóxico y biológicamente activo. Se forma un enlace
interfacial entre el implante y el tejido huésped
Material biodegradable No tóxico y se degrada. El tejido circundante reemplaza
el material que se disuelve.
Los materiales que se utilizan actualmente para reemplazos óseos y articulares en
general son de naturaleza metálica, esto es debido a sus propiedades y alta resistencia
mecánica, sin embargo tienen varios inconvenientes por ejemplo en el caso de los
aceros inoxidables estos no tienen la capacidad de establecer interacciones con el tejido
óseo para promover su regeneración, debido a su respuesta inerte no propician una
integración con el organismo lo que puede afectar directamente al tejido circundante
por alteración directa del entorno químico, ya sea por cambios electroquímicos que
afectan el comportamiento o la conducta celular, liberación de iones metálicos que
pueden afectar el metabolismo celular, inducción de una reacción de inflamación
crónica por liberación de los productos de corrosión, etc. Otro problema de este tipo de
materiales resulta de las elevadas propiedades mecánicas comparadas con el tejido
óseo las cuales generan problemas de aflojamiento por apantallamiento de tensiones
[16, 26].
El objeto de este trabajo es presentar una vista general del potencial de un material
biocerámico como es la hidroxiapatita la cual ha sido altamente estudiada y la cual será
recubierta con un polímero natural llamado quitosano con el fin de modificar su
superficie para otorgar una respuesta más favorable cuando estén en contacto con el
tejido y reforzar las propiedades mecánicas, se exponen a continuación las
características de los biomateriales cerámicos en especial la HA haciendo énfasis en una
de sus características primordiales, la bioactividad. Por otro lado se muestra también la
42
Evaluación de Recubrimientos de Quitosano sobre
Scaffolds de HA
información de los polímeros naturales más utilizados en ingeniería de tejidos para
regeneración tisular, centrándose en el quitosano.
2.2.3. Biocerámicos usados en Ingeniería de tejidos
Las cerámicas utilizadas en la reparación y reconstrucción de partes de cuerpo dañadas
o enfermas se denominan biocerámicas [18, 24]. La norma ISO/TR 10993-9 (1994)
define una biocerámica como un material cerámico diseñado para lograr un
comportamiento fisiológico específico al ser usado en la construcción de prótesis u
órganos artificiales internos [11]. Tradicionalmente la cerámica ha estado limitada en
cuanto a sus aplicaciones, por su fragilidad, su baja resistencia mecánica a la tracción
y/o flexión y a su baja resistencia al impacto; sin embargo, a partir de finales de los años
sesenta, se han desarrollado nuevas cerámicas con propiedades mejoradas y su uso se
ha extendido considerablemente [26].
Los trabajos de investigación y desarrollo de biomateriales para sustitución ósea a nivel
mundial actualmente están centrados en el desarrollo de andamios bioactivos,
osteoconductores y sustancias osteoinductoras capaces de estimular las células
osteoprogenitoras en el sitio de la lesión, característica de los biocomposites cerámico -
proteína. Los materiales sintetizados de mayor interés incluyen hidroxiapatita
particulada y en forma de andamios (scaffolds), biocerámicos y biocomposites,
hidroxiapatita con óxidos biocompatibles (ZrO2, TiO2) y biocerámicos con polímeros
como colágeno y/o factores de crecimiento [27,28].
2.2.3.1. Vidrios bioactivos y vitrocerámicas
Los materiales bioactivos (vidrios y vitrocerámicas), se unen directamente al hueso a
través de una capa de HA biológicamente activa, la cual proporciona la unión interfacial
con el tejido. Dicha fase es química y estructuralmente equivalente a la fase mineral
constituyente del hueso y la responsable de la unión interfacial. Los vidrios bioactivos
forman parte de un grupo especial de cerámicos bioactivos que son capaces de
promover una respuesta biológica específica en la interface del material, lo que resulta
en la formación de una unión entre los tejidos y el material. L. Hench define el
concepto de bioactividad, de forma simple, como la característica de un material
implantado que le permite formar una unión con el tejido vivo [11].
La posibilidad de enlazar químicamente el hueso con vidrios de cierta composición fue
demostrada por primera vez por Hench y col. en 1969. El primer vidrio bioactivo
desarrollado por estos investigadores fue el denominado Bioglass® 45S5, el cual
43
Evaluación de Recubrimientos de Quitosano sobre
Scaffolds de HA
presenta una gran bioactividad, pudiendo incluso unirse a los tejidos blandos. Es
también la composición de biovidrio más estudiada. Su composición en porcentaje de
peso es 45% SiO2, 24.4% CaO, 24.5% Na2O y 6% P2O5. A partir de este descubrimiento
de Hench de que algunos vidrios pertenecientes al sistema SiO2-CaO-Na2O-P2O5 no
inducen la formación de tejido fibroso al ponerlos en contacto con el tejido circundante,
sino que interactúan con él formando una unión química, se despertó un gran interés
en el desarrollo y utilización de los vidrios y vitrocerámicas bioactivos como materiales
biomédicos [29].
Entre otras propiedades importantes de los vidrios bioactivos se encuentran su falta de
elasticidad, resistencia a la corrosión, son inertes a los tejidos, buena adherencia a los
tejidos, alta resistencia a la compresión y al desgaste. Aunque las cerámicas y los vidrios
no sufren corrosión, presentan alguna forma de degradación cuando son expuestos al
medio biológico [25]. La limitación fundamental en la aplicación de los vidrios bioactivos
deriva de sus relativamente bajas propiedades mecánicas, sobre todo en zonas donde
se involucren esfuerzos mecánicos. Para intentar obviar estas limitaciones se ha
recurrido a diferentes métodos para proporcionar resistencia a dichas estructuras
vítreas y de esta manera permitir su utilización en implantes [11].
2.2.3.2. Hidroxiapatita (HA)
La hidroxiapatita (HA) es un fosfato de calcio cuya fórmula química (Ca10 (PO4)6(OH)2 es
similar a la del mineral óseo, se utiliza comúnmente como una biocerámica debido a sus
propiedades biológicas de biocompatibilidad, bioactividad y osteoconductividad, es el
candidato ideal para ingeniería tisular debido a que es muy utilizada en aplicaciones
como cirugía oral y cráneo-facial, odontología, cirugía ortopédica, traumatología y como
relleno óseo en cirugías tumorales. Está ampliamente estudiada en clínica y además
existen más de 50 preparados comerciales disponibles en el mercado, esto la hace más
fácil de obtener. Las cerámicas de este tipo influyen positivamente en la diferenciación
y proliferación celular, pero la fragilidad inherente y baja resistencia a la tracción de las
estos materiales limitan sus aplicaciones médicas. Sin embargo la HA es muy utilizada como
reemplazo de partes pequeñas de hueso, relleno de cavidades en odontología y recubrimiento
de superficies metálicas para implantes, entre otras aplicaciones. Existen diversos métodos de
obtención de este material ya sea por precipitación acuosa, síntesis hidrotérmica, procesado en
sólido, hidrólisis, sol-gel entre otras. Los procedimientos o condiciones bajo las cuales se
sintetiza pueden influir en sus características físicas y químicas, por esta razón sus propiedades
pueden variar ampliamente, los rangos promedio se observan en la Tabla 3. Estos datos
resultan importantes ya que al compararlos con las propiedades mecánicas de la mayoría de las
prótesis metálicas o poliméricas, estas pueden ajustarse a condiciones más similares a las del
tejido óseo [30, 31].
44
Evaluación de Recubrimientos de Quitosano sobre
Scaffolds de HA
Tabla 3. Propiedades de la Hidroxiapatita [31].
PROPIEDADES CARACTERÍSTICA
Densidad Teórica 3,156 g/ml
Dureza 5 Mohs
Esfuerzo de Tensión 40 - 100 MPa
Esfuerzo de Flexión 20 – 80 MPa
Esfuerzo de Compresión 100 – 900 MPa
Tenacidad a la fractura ≈ 1 MPa m0.5
Módulo de Young 70 – 120 GPa
Debido a que la aplicación clínica de este material está muy limitada por su baja
resistencia mecánica, se ha investigado la producción de compuestos de hidroxiapatita
con otros materiales, para su uso potencial en aplicaciones como biomateriales. Estas
investigaciones han dado como resultado material con mejores propiedades mecánicas
sin deteriorar sus propiedades bioactivas [31].
2.2.4. Polímeros usados en Medicina Regenerativa
2.2.4.1. Generalidades de los polímeros
Los polímeros son compuestos formados por unidades más pequeñas (monómeros)
habitualmente repetidas, unidas por enlaces covalentes, estos compuestos forman con
frecuencia grandes macromoléculas (biopolímeros, plásticos). Estos pueden ser,
termoplásticos, termoestables o elastómeros, según su comportamiento térmico. Los
primeros son polímeros compuestos por cadenas poliméricas unidas entre sí por
fuerzas débiles de Van der Waals y fuerzas dipolo‐dipolo, al aumentar la temperatura,
rompen sus fuerzas de atracción y se vuelven fluidos pudiendo ser fácilmente
moldeables. Se pueden disolver con cierta facilidad, para formar films y otras
estructuras. Además, presentan cierta facilidad a la degradación gracias a la hidrólisis o
por la acción de proteínas y polisacáridos [32,33]. Por otro lado se encuentran los
polímeros termoestables, los cuales, presentan unas cadenas poliméricas unidas entre
sí por enlaces covalentes (reticulación) lo que le confiere unas características diferentes
en función del grado de estos enlaces. Estos no se pueden fundir y no se pueden
disolver sin romper su estructura interna. Y por último están los elastómeros que suelen
ser normalmente polímeros termoestables de bajo grado de reticulación, pero pueden
ser también termoplásticos, tienen normalmente una estructura amorfa [33].
45
Evaluación de Recubrimientos de Quitosano sobre
Scaffolds de HA
Algunos polímeros también se pueden caracterizar por su biodegradabilidad. El término
biodegradación hace referencia a la transformación y deterioro que se produce en el
polímero debido a la acción de enzimas y/o microorganismos como bacterias, hongos y
algas. La biodegradación puede ser parcial o total. La primera consiste en la alteración
en la estructura química del material y la pérdida de propiedades específicas. Por
contra, en la total el material es degradado totalmente por la acción de
microorganismos con la producción de CO2 (bajo condiciones aeróbicas) y metano (bajo
condiciones anaeróbicas), agua, sales minerales, biomasa o temperatura [32,34].
En el área de la Ingeniería de Tejidos un material biodegradable se caracteriza por que
puede ser absorbido por el cuerpo humano una vez implantado en éste. Esta es una
característica que actualmente los hace útiles en diversos productos destinados a
aplicaciones médicas que están en contacto con sistemas biológicos como son las
suturas, encapsulamiento de fármacos, plasmas, matrices de crecimiento celular entre
otros [32].
Los materiales poliméricos en general tienen una amplia variedad de aplicaciones en el
campo de la implantología médica ya que presentan propiedades físicas, químicas y
mecánicas más cercanas a las de los tejidos vivos, que en su mayor parte están
formados por polímeros naturales, como las proteínas y los polisacáridos. Además, son
de fácil procesado y pueden obtenerse en diversas formas Actualmente existen
numerosos polímeros utilizados en el campo biomédico entre los cuales se pueden
encontrar los artificiales y los naturales. Los primeros se obtienen por procesos de
polimerización controlados por el hombre a partir de materias primas de bajo peso
molecular y los segundos provienen directamente de la naturaleza en esta categoría se
encuentran también los biológicos (proteínas, ácidos nucleicos entre otros) [35].
2.2.4.2. Polímeros artificiales
El uso de polímeros artificiales en el área de los biomateriales está muy extendido y
entre sus aplicaciones más comunes se encuentran las prótesis articulares (polietileno),
suturas quirúrgicas (polipropileno y poliamida), injertos vasculares (poliésteres), la
fabricación de matrices y los sistemas de liberación de medicamentos; para estos los
polímeros degradables desarrollados más utilizados son los poli-α-hidroxi ésteres,
especialmente el ácido poliláctico (PLA) y el ácido poliglicólico (PGA), la policaprolactona
(PCL) y el poli vinil alcohol (PVA). Estos scaffolds poliméricos sintéticos poseen las
ventajas de la fiabilidad del origen de los polímeros y de la reproducibilidad de su
síntesis mediante IT [32, 34, 36].
46
Evaluación de Recubrimientos de Quitosano sobre
Scaffolds de HA
2.2.4.3. Polímeros naturales
El desarrollo de andamios (scaffolds) que permitan la adhesión celular y el crecimiento
de tejidos ha ganado especial importancia en los últimos años. Los biopolímeros
orgánicos, especialmente el colágeno y el quitosano han sido los más usados como
componentes principales para tales andamios. Estos materiales tienen algunas
limitaciones desde el punto de vista de sus propiedades mecánicas por lo cual hay una
mayor tendencia a la utilización de materiales compuestos o reforzados, sin embargo
con respecto a la biocompatibilidad los polímeros naturales ofrecen el mayor potencial
[35].
2.2.4.3.1. Colágeno
El colágeno es la proteína fibrosa principal del cuerpo y un constituyente importante de
la matriz extracelular natural (ECM), es también el componente orgánico principal del
hueso, cartílago y tendones, además es conocido como promotor de la interacción de
las células específicas, tales como señales de reconocimiento celular, adhesión y
migración celular, diferenciación y expresión de genes, etc. Se describen varios tipos de
colágeno que varían en sus estructuras de orden superior y funciones, y se numeran
con cifras romanas según el orden de su descubrimiento (del tipo I al tipo XIX) [37, 38].
Esta macromolécula estructural de la ECM en su conformación incluye uno o varios
dominios con una forma característica de triple hélice. A lo largo de las fibrillas de
colágeno hay puntos específicos que sirven como sitios de nucleación para los cristales
minerales del hueso. Las fibrillas de colágeno guían la precipitación y el crecimiento de
cristales de nano-apatita para formar una arquitectura nano-estructurada que consiste
en nano cristales de HA orientados uniaxialmente. Su estructura molecular,
microestructura y macroestructura únicas le dan al hueso la propiedad de resistir la
carga dinámica. Por lo anterior los andamios hechos a partir de colágeno se han
utilizado en una variedad de aplicaciones debido a un sin número de propiedades, tales
como la baja antigenicidad, es hemostático y sus propiedades mecánicas [37, 38, 39].
2.2.4.3.2. Quitosano
El quitosano es un polímero natural el cual posee una estructura cristalina altamente
organizada y está compuesto por 2–amino–2–desoxi–D–glucosa (glucosamina) y 2–
acetamida–2–desoxi–D–glucosa (N acetilglucosamina) unidas por enlaces glicosídicos β-
1-4 (figura 8), se obtiene por desacetilación termo alcalina de la quitina, la cual es el
segundo polisacárido más abundante en la naturaleza, después de la celulosa. Se
47
Evaluación de Recubrimientos de Quitosano sobre
Scaffolds de HA
encuentra disponible en la naturaleza en los caparazones de moluscos, algunos hongos
y algas. Cuando el quitosano se disuelve en un medio ácido diluido, los grupos amino se
protonan y las cargas positivas resultantes confieren un comportamiento poli-
electrolito similar a las macromoléculas. Posee propiedades físico-químicas únicas que
incluyen la biocompatibilidad, la actividad antimicrobiana, biodegradabilidad y una
excelente capacidad para formar películas o films, lo que ha atraído el interés científico
e industrial en muchos campos como la biotecnología, la farmacéutica, la biomedicina,
el tratamiento de aguas residuales, la cosmética y la ciencia de los alimentos, entre
otros [19, 27, 40].
Figura 8. Estructura química de la quitosano [31].
También es importante destacar que el quitosano es un candidato adecuado para la
aplicación como recubrimiento de protección contra la corrosión de sustratos
metálicos, y desprendimiento (pérdida de material) de los cerámicos frágiles debido a
sus propiedades específicas, tales como son la buena capacidad de formación de
películas, la buena asociación a las superficies metálicas o cerámicas y la versatilidad
asociada con la facilidad de funcionalización química [40].
2.2.5. Características y desarrollo de scaffolds para IT
La ingeniería de tejidos se basa en el uso, de forma conjunta o separada, de tres
elementos críticos: (1) cultivo de células, (2) niveles adecuados de moléculas
biofuncionales solubles e insolubles que son compuestos químicos que tienen un efecto
o causan una reacción en el tejido vivo y actúan enviando señales químicas (factores de
crecimiento por ejemplo), (3) estructuras tridimensionales o andamios (Scaffolds) para
soporte de las células en crecimiento y formación de tejidos. Este último actúa como
una matriz extracelular que permite la fijación de células temporalmente y la
adaptación al medio ambiente. Para lograr el objetivo final de la formación de tejido, el
andamio debe poseer varias características muy importantes, que incluyen la
biocompatibilidad, la formación de subproductos de degradación no tóxicos, estructura
de la porosidad accesible (poros interconectados) y la degradación del andamio en un
tiempo apropiado que permita la invasión de células y la reestructuración del tejido.
48
Evaluación de Recubrimientos de Quitosano sobre
Scaffolds de HA
Para la infiltración de células en los andamios, el diámetro de poro debe ser lo
suficientemente grande para la invasión celular y la migración dentro del andamio,
mientras que la porosidad y la interconectividad de los poros debe ser lo
suficientemente grande para la distribución celular adecuada pero lo suficientemente
pequeña para evitar el desprendimiento de las células por el flujo de fluidos corporales
[23]. Por esto es importante un diseño apropiado y la evaluación de su estructura tras la
fabricación con el fin de obtener las características requeridas y adecuadas para su uso
como scaffold.
2.2.5.1. Tamaño de poro e interconectividad
Los scaffolds usados para IT como se mencionó anteriormente deben tener una
estructura porosa interconectada y una alta porosidad que permita la difusión de
nutrientes a las células dentro de su arreglo y la correcta invasión o migración celular.
Esta estructura debe tener una interconectividad suficiente para eliminar los productos
de desecho fuera del andamiaje, al igual que los productos derivados de la degradación
del material y así eliminarlos del cuerpo sin interferencia con otros órganos o tejidos
generando productos de alta toxicidad. El tamaño de poro es importante debido a que
las células en primer lugar interaccionan vía ligandos (grupos químicos) en la superficie
del material, para ello, los biomateriales sintéticos derivados de materiales
extracelulares naturales, poseen ligandos como Arg-Gly-Asp (RGD), mientras que a los
andamios fabricados sintéticamente se les deben incorporar sintéticamente ligandos
para que se puedan acoplar las proteínas [23, 33].
Es importante resaltar que cuando se implanta un nuevo material existe una respuesta
de vascularización con respecto a la invasión, esto da lugar a todos los mecanismos
necesarios que hacen frente a este cuerpo extraño, este mecanismo de integración es
lento y suele llevar 3 semanas o más para scaffolds sintéticos pequeños, por esta razón
la distancia a donde llegan estas vascularizaciones es importante a tener en cuenta
cuando se diseña el scaffold ya que se debe permitir que todos los nutrientes y factores
necesarios lleguen a todos los puntos del material con el fin de facilitar el proceso de
distribución de los vasos en el tejido [33].
2.2.5.2. Tridimensionalidad
Los tejidos in vivo se construyen en estructuras tridimensionales, por lo tanto el cultivo
de células en 3D se asemejará en gran medida a los escenarios in vivo. Se ha
demostrado que el cultivo en dos dimensiones (2D) o en tres dimensiones afecta al
49
Evaluación de Recubrimientos de Quitosano sobre
Scaffolds de HA
fenotipo celular. Estas diferencias pueden ser el resultado de la interacción entre las
integrinas y los receptores, los eventos producidos por las señales y la diferente
composición de las proteínas de la matriz extracelular (ECM). Bajo el sistemas de cultivo
2D, la superficie cubierta con las proteínas de la ECM confieren rigidez a las células, esta
es una de las mayores diferencias entre el 2D y el 3D. Esta diferencia de la rigidez de la
matriz causa un nivel diferente y una distribución da la adhesión y resulta en una
respuesta y una regulación en las señales producida en tumores [33].
2.2.5.3. Topografía superficial
La modificación de la topografía superficial y la rigidez del material es otro punto que
mejora la interacción entre el implante y el tejido. Un aspecto fundamental en un
biomaterial es el mimetismo con el ambiente celular o lo que es lo mismo la interacción
célula‐superficie. La respuesta biológica al biomaterial se controla mediante la química y
la estructura de la superficie, algunos materiales pueden ser depositados en la
superficie de un biomaterial para para mejorar su bioactividad, vascularización y/o
biocompatibilidad. En esta interacción célula‐superficie existen dos parámetros
importantes que caracterizan la superficie, estos son la hidrofilicidad y la carga [23, 33].
2.2.5.3.1. Hidrofilicidad
La hidrofilicidad es un aspecto que afecta en gran medida el comportamiento de las
células en un biomaterial. La mayoría de las células se adhieren exclusivamente a
superficies que tengan receptores apropiados a su efecto. En el caso de no tener estos
receptores, como es el caso de la mayoría de los biomateriales sintéticos, estas células
no se adhieren. Sin embargo, la absorción de proteínas en biomateriales da como
resultado la adhesión celular sobre la superficie con una hidrofilicidad de 20° a 40° de
ángulo de contacto en agua [33].
2.2.5.3.2. Carga
Además de la hidrofilicidad superficial, otro punto importante para la adhesión celular
es la carga positiva de la superficie. Los polímeros que poseen cargas positivas en la
superficie a pH fisiológico aproximadamente 7.4, aumentan la adhesión de las células y
el crecimiento en presencia de proteínas. Las células prefieren superficies hidrofílicas y
cargadas positivamente que las superficies neutras o negativas. Algunos ejemplos
demuestran que los condrocitos por ejemplo aumentan su adhesión en superficies de
PLLA o PGLA recubiertas con polilisina (proteína cargada positivamente). Por
50
Evaluación de Recubrimientos de Quitosano sobre
Scaffolds de HA
consiguiente, un andamio cargado positivamente puede inducir de mejor forma la
formación de un tejido [33].
2.2.5.4. Scaffolds de materiales compuestos para IT
Actualmente hay una mayor tendencia a desarrollar scaffolds para ingeniería de tejidos
con materiales compuestos tanto cerámicos como poliméricos, esto se basa tanto en
las excelentes propiedades osteoinductivas y osteoconductivas de los biocerámicos
como en la degradabilidad y estabilidad mecánica de los polímeros, por lo que resulta
importante hacer referencia a trabajos no sólo de scaffolds de HA, sino además sobre
HA con diversos compuestos obtenidos por diversas técnicas [41]. La adhesión de
células a los scaffolds es a menudo una necesidad, ya que así el andamio posea macro
poros completamente interconectados, existe una mortalidad celular muy alta y la
supervivencia se restringe a aquellas células que se encuentran en la superficie [30].
Con la incorporación de componentes bioactivos a los scaffolds se confiere al
compuesto la propiedad de osteoinducción y el asocio de polímeros biodegradables
aumenta la afinidad de los materiales por las proteínas [42].
Las diferentes características encontradas en scaffolds compuestos de tipo
(cerámico/polímero) han sido variadas, por ejemplo en el año 1999 Shikinami encontró
que la HA y el ácido poliláctico mejoraban las propiedades mecánicas y las acercaba a
las del hueso cortical además aumentaba la reabsorbibilidad, bioactividad y
osteoconductividad de éste [43], se resalta la facilidad de procesarlos por técnicas
específicas de conformación por presión en caliente como las empleadas por Ignjatovic
y Uskokovic quienes al variar la presión del proceso obtuvieron diferentes grados de
porosidad en estos materiales [44].
También han sido evaluados por otros investigadores como Seok y colaboradores en
2004 cementos óseos bioactivos integrados de hidroxiapatita natural de hueso en
polvo, asociados con polímeros degradables como son el quitosano y estables como el
polimetil-metacrilato (PMMA) para su uso en cirugías ortopédicas, como la
vertebroplastia o como relleno óseo [45]. En 2005 Gallardo y colaboradores reportaron
la obtención de scaffolds tridimensionales de compuestos de fosfatos de calcio y
quitosano para su utilización en ingeniería de tejido óseo, demostrando que estos
sistemas exhibían una rápida diferenciación y crecimiento de osteoblastos y mostraban
efectos osteogénicos [46].
Existen además reportes mostrados por Degirmenbas en 2006 sobre biocompuestos de
nanohidroxiapatita con colágeno y alcohol polivinilo (PVA), en los cuales se realizan
51
Evaluación de Recubrimientos de Quitosano sobre
Scaffolds de HA
mezclas de estos materiales para comparar características como la elasticidad y el
tamaño de los poros, según este investigador, el colágeno y el alcohol polivinilo tienen
un gran potencial para utilizarse en aplicaciones de ingeniería de tejidos como en la
reparación y reconstrucción de huesos [47]. Lee y colaboradores obtuvieron por su
parte un soporte formulado asociando de varios polímeros como quitosana, GAG,
colágeno y lo cargaron además con un factor de crecimiento TGF-β1 para promover la
regeneración articular mediante la liberación controlada de éste. Los autores
demostraron que la adición de quitosano al soporte mejoró las propiedades mecánicas
y la estabilidad del enrejado formado por las macromoléculas de colágeno, e inhibieron
la acción de las colagenasas, mejorando la regeneración del tejido [39].
Cabe resaltar que a nivel mundial los lugares donde más se han realizado estudios y
avances sobre biocompuestos cerámico/polímero y recubrimientos poliméricos son
México, China, Rusia, Europa, Estados Unidos y Cuba. La mayoría de estos países
realizan este tipo de investigaciones para evitar la importación de materiales o del
producto final en sí [41].
Por otra parte a nivel nacional, en el año 2013 se realizó un proyecto en el grupo de
Biomateriales del programa de Bioingeniería de la Universidad de Antioquia relacionado
con la producción de scaffolds cerámicos por González Jazmín en el cual se evaluaron
las propiedades de scaffolds de hidroxiapatita, obtenidos por gel-casting e infiltración
en espumas poliméricas, en este se optimizó la técnica de obtención de scaffolds
cerámicos haciendo un amplio estudio sobre la reología de las suspensiones y se llegó a
obtener unas buenas propiedades mecánicas para estos comparando con lo reportado
en la literatura [48].
En la última década, se ha reportado la fabricación de matrices porosas mediante
diferentes técnicas, entre las que se destacan: gas foaming, solvent casting/particulate
leaching, rapid prototyping, H2O2 foaming, liofilización, etc, que permiten el
procesamiento de materiales metálicos, cerámicos (hidroxiapatita, fosfato tricálcico) y
poliméricos, de origen natural (colágeno, ácido hialurónico, fibrinógeno, quitosano) o
sintético (policarbonatos, polímeros de ácido poliláctico (PLA), ácido poliglicólico (PGA),
entre otros [49].
De acuerdo con lo anterior, el reto de la ingeniería de tejidos óseos es diseñar matrices
tridimensionales capaces de imitar las propiedades naturales del hueso, que
proporcionan una ayuda temporal para la regeneración del tejido, y balancear la
degradación y la pérdida de las propiedades mecánicas con el crecimiento y la
formación del hueso. Si se optimizan estos aspectos, se puede esperar que las
alternativas sintéticas simulen de manera precisa las propiedades del hueso natural. El
52
Evaluación de Recubrimientos de Quitosano sobre
Scaffolds de HA
uso de matrices o scaffolds con los cuales se puedan controlar las funciones de las
células osteoblásticas se encuentra todavía en sus primeras etapas de investigación en
el país; se espera que la expansión de este campo permita desarrollar nuevas terapias y
tecnologías para la reparación y regeneración del tejido óseo.
2.2.6. Obtención de recubrimientos sobre biomateriales
Cuando la superficie no es adecuada para el crecimiento celular y para la integración, la
modificación superficial cobra mayor sentido, ya que el fin es determinar como la célula
va a interactuar con el material que actúa como soporte. Como se ha mencionado la
topografía es una de las señales físicas más importantes para las células, esta influye en
la adhesión, la proliferación y la diferenciación celular y más recientemente se ha
mostrado que también guía el comportamiento celular en gran medida; en algunas
aplicaciones guiar la orientación de la célula es esencial para lograr un tejido funcional.
Las señales químicas en forma de diversas biomoléculas, tales como proteínas
adhesivas o factores de crecimiento también influyen en el comportamiento celular, por
ejemplo, la fibronectina y la laminina son capaces de mejorar la adhesión de diferentes
tipos de células, por lo tanto se han hecho esfuerzos considerables para modificar
superficies de biomateriales químicamente por inmovilización de estas biomoléculas
[33, 50, 51].
Por otra parte, también pueden ser depositados o se pueden añadir en bajas
concentraciones diferentes elementos o compuestos en los materiales base con el fin
de que reaccionen de forma espontánea, ya sea reforzando o mejorando una
propiedad, por ejemplo, los recubrimientos de apatita nanocristalina producida por
métodos sol-gel o electrodeposición por pulso se han utilizado comúnmente para
mejorar la osteointegración de dispositivos ortopédicos, también la deposición de
polielectrólitos con cargas positivas como el quitosano pueden ser útil para sistemas de
liberación de fármacos [52] y funcionalización superficial de las superficies de los
biomateriales [53].
Debido a que la topografía parece tener un papel tan esencial en guiar el
comportamiento de las células in vivo, actualmente se está utilizando como una
herramienta para el control de la regeneración de tejidos. Una amplia variedad de
técnicas se han usado para producir características específicas en superficies de
biomateriales, algunos métodos dan lugar a una topografía ordenada con un patrón
controlado regularmente, mientras que otros conducen a la topografía desordenada
con orientación aleatoria; en la tabla 4 se describen algunas técnicas comunes para
obtener patrones organizados aleatoriamente como desmezcla de polímero, ataque
químico y litografía coloidal [21].
53
Evaluación de Recubrimientos de Quitosano sobre
Scaffolds de HA
Tabla 4. Métodos para modificación superficial de biomateriales [21].
LITOGRAFÍA SUAVE
Litografía suave es el término general para diferentes
técnicas basada en el uso de un sello elastomérico
(hecho comúnmente de poli-dimetilsiloxano (PDMS))
para estructurar una superficie de un material. Este
sello se produce mediante el uso de un patrón
específico y se utiliza para reproducir el modelo en un
sustrato.
* Moldeo por microtransferencia: Ver Figura 9(a) para
más detalles.
* Impresión por microcontacto: Ver Figura 9(b) para
más detalles. Esto se utiliza para transferir moléculas
desde el sello a un sustrato en una forma geométrica
controlada.
* Micromoldeo en capilares: Un sello PDMS se coloca
en el sustrato que se modela para formar una red de
canales vacíos entre el sustrato y el sello. Se coloca
una gota de polímero en un extremo de los canales y
después los canales están ocupados por capilaridad. El
sello de PDMS se retira después del curado.
* Moldeo por replica: El patrón de PDMS se utiliza
como un molde para la infiltración de otro polímero,
que después de restablecido, dará una réplica
negativa del PDMS.
Figura 9. (a) Moldeo por microtransferencia (b) Impresión
por microcontacto.
* Micromoldeo asistido por disolvente: Un disolvente
se usa para humedecer el sello PDMS, que se coloca
contra el sustrato. El sustrato se disuelve por el
disolvente y el líquido resultante es moldeado con el
patrón de PDMS. Después de la evaporación del
disolvente y la solidificación del sustrato, se obtiene
una estructura complementaria al PDMS.
LITOGRAFÍA COLOIDAL DESMEZCLA DE POLÍMERO
Este utiliza una solución nanocoloidal para actuar
como una máscara de ataque. La solución se dispersa
como una monocapa sobre un sustrato y se
autoensambla electrostáticamente. En los alrededores
las partículas nanocoloidales (también de las propias
partículas) se graban con un bombardeo de haz de
iones reactivos creando así un patrón sobre el
sustrato, permite recubrimientos de áreas extensas
con reducido número de defectos.
Este se basa en la separación de fase espontánea sea
por calentamiento, centrifugación, entre otras de una
mezcla de polímeros en el marco del proceso de
ruptura o fundición sobre un sustrato (silicio, vidrio,
etc.). La forma (poros, cintas, etc) y el tamaño de las
características se pueden modular por cualquier
cambio en la relación o la concentración del polímero.
El control preciso de la altura (dirección vertical)
puede ser alcanzado hasta un tamaño > 13nm.
ESTAMPADO EN CALIENTE LITOGRAFÍA E-BEAM O HAZ IÓNICO (EUV)
El material se calienta hasta un punto intermedio
entre la temperatura de transición vítrea (Tg) y la
temperatura de fusión (Tf) y después la herramienta
se presiona contra el material uniaxialmente para
producir un patrón.
Este utiliza la exposición a partículas para producir un
patrón que puede ser revelado químicamente en un
segundo paso, o se puede utilizar directamente para
iniciar el injerto de polímeros, mediante el rastreo de
un haz energético de electrones.
54
Evaluación de Recubrimientos de Quitosano sobre
Scaffolds de HA
Por otra parte en la Figura 9 se muestran otras formas de modificación superficial, éstas
pueden emplearse dependiendo de los fines deseados. En general, la modificación
superficial se divide en dos categorías (1) la modificación de los átomos, compuestos o
moléculas existentes en la superficie mediante alteración química o física y (2) un
recubrimiento de la superficie existente con un material de composición diferente. En
función del material, pueden obtenerse unas características u otras dependiendo del
tipo de tratamiento empleado [33].
Figura 9. Esquema en el que se representan los principales tipos de recubrimientos superficiales sobre materiales [33].
55
Evaluación de Recubrimientos de Quitosano sobre
Scaffolds de HA
2.2.7. Cultivos celulares in vitro en la Ingeniería de tejidos
Los ensayos de citotoxicidad in vitro se incluyen en los estudios de la primera fase de
evaluación de los biomateriales e implantes. La evaluación citotóxica constituye una vía
simple, rápida y económica para obtener una valiosa información acerca de la
biocompatibilidad de los biomateriales y de la interacción substrato/célula. Estos
estudios pueden ser realizados directamente sobre un material o sobre una extracción
de éste, utilizándose métodos in vivo y por sistemas de cultivo celular. Los cultivos
celulares son sistemas ideales para el estudio y observación de un determinado tipo de
células bajo condiciones específicas, dado que estos sistemas no presentan con la
complejidad que un sistema in vivo conlleva, debido al gran número de variables que
interaccionan [54,55].
Las células se encuentran normalmente en un microambiente complejo. Este está
formado por matriz extracelular, citokinas, factores de crecimiento, así como células
adyacentes. Cuando una célula se une a un substrato y forma adherencias, se generan
fuerzas desde el citoesqueleto hasta estas uniones adhesivas. Se cree que las células
crean unas adherencias más resistentes en relación directa a la rigidez del sustrato [56].
Con el ambiente apropiado, la mayoría de estas células sean vegetales o animales
pueden vivir, multiplicarse e incluso expresar propiedades diferenciadas en una placa
de cultivo. Este método permite que se puedan observar mediante microscopía o ser
analizadas bioquímicamente, así como comprobar los efectos de añadir o retirar
diferentes moléculas específicas como factores de crecimiento, entre otras
posibilidades [32].
El cultivo de tejidos comenzó en el año 1907, mediante la experimentación en
neurobiología y la denominada hipótesis neuronal, que estableció que cada fibra
nerviosa es la prolongación de una única célula nerviosa y no el producto de la fusión de
muchas. La mayoría de las células para cultivo celular, requieren de un substrato sólido
sobre el que crecer y dividirse. En la actualidad los cultivos celulares suelen llevarse a
cabo sobre placas a las que se adhieren las células, migran y proliferan [32].
Los cultivos preparados directamente de tejido sin división celular se denominan
cultivos primarios. En muchos casos las células de un cultivo primario pueden hacerse
proliferar hacia un gran número de cultivos secundarios, de esta forma se pueden
cultivar de manera repetida durante días, semanas o meses. Estas células expresan
muchas veces propiedades adecuadas a su origen celular, como la producción de matriz
extracelular específica, entre otras [32].
56
Evaluación de Recubrimientos de Quitosano sobre
Scaffolds de HA
Los cultivos celulares tienen una serie de ventajas innegables, entre las que se pueden
citar las siguientes:
Permiten un control preciso y fino del medio ambiente. En un cultivo se pueden
controlar todos los factores del medio: físico-químicos (pH, temperatura,
presión osmótica, niveles de O2, CO2, tensión superficial, etc) y fisiológicos
(hormonas, factores de crecimiento, densidad celular, etc). Esto es cierto sólo
para algunas líneas celulares para las que se han determinado los denominados
medios definidos (aquel en el que se conocen todos y cada uno de s
componentes que lo forman y la concentración exacta en que se encuentran)
[57,58].
Caracterización y homogeneidad de la muestra. Las células en cultivo de una
línea celular (cultivo primario propagado) o de una línea continua son
homogéneas, con morfología y composición uniformes. Se pueden obtener con
facilidad un número elevado de réplicas idénticas, con lo que se supera el grave
problema de heterogeneidad de las muestras inherente asociado al uso de
animales de experimentación [23,58].
Economía. Suponen un bajo costo en el uso de reactivos, drogas o materiales a
estudiar pues al realizarse en volúmenes reducidos y con un acceso directo de
las células al sustrato las cantidades requeridas son mucho más bajas que en un
animal completo. Es diferente el coste de investigación de un nuevo material en
cantidades del orden del gramo (para el estudio en animales) que con pocos
miligramos [57,58].
Motivaciones éticas. La investigación biomédica supone el sacrificio cada año de
muchos miles de animales de experimentación. El cultivo celular no puede
reemplazar siempre al ensayo in vivo pero es una alternativa válida en muchas
situaciones. Incluso un cultivo celular primario permite realizar experimentos
que suponen el sacrificio de uno o pocos animales, pero con ellos se pueden
ensayar un número de condiciones experimentales que pueden suponer si el
estudio se hace con animales de experimentación el sacrificio de decenas o
cientos [57,58].
Un cultivo celular exitoso depende en gran medida del mantenimiento de las células,
estas deben estar libres de contaminación por microorganismos tales como
micoplasma, bacterias, hongos y virus, por lo tanto es importante la esterilización de
materiales, medios de cultivo y reactivos, ya que son fuentes de contaminación
biológica por microorganismos las superficies de trabajo e incubadoras sucias, las
57
Evaluación de Recubrimientos de Quitosano sobre
Scaffolds de HA
partículas en el aire y las deficientes técnicas de asepsia. El cultivo celular estéril
depende de una serie de procedimientos para reducir la probabilidad de contaminación
por estas fuentes [58, 59].
El medio de cultivo también es esencial para conseguir un ambiente adecuado para el
desarrollo y mantenimiento celular, este además de poseer los factores de crecimiento
necesarios para un tipo específico de células, debe contener los factores nutricionales
adecuados, tener un pH, temperatura y osmolaridad correctos y paralelamente es
necesario que aporten los gases esenciales como oxígeno y dióxido de carbono [32].
En el proceso del establecimiento del cultivo celular se seleccionan las células que
crecerán según numerosos criterios. Así solo formarán el cultivo aquellas células que
sean por una parte capaces de superar el proceso de disgregación, y por otra, capaces
de adherirse al sustrato y proliferar en forma de monocapa o en suspensión [58]. A
continuación se amplía más sobre este tema.
2.2.7.1. Clasificación y tipos de cultivos celulares
El cultivo celular permite el mantenimiento, la supervivencia y/o multiplicación in vitro
de células provenientes de órganos específicos o de linajes celulares tratando de
conservar al máximo sus propiedades fisiológicas, bioquímicas y genéticas. Una de estas
propiedades es la capacidad de adherencia a superficies, lo que permite que las células
crezcan ya sea en monocapa o en suspensión (figura 10) [60]. El crecimiento en
monocapa significa que las células se adherirán al sustrato y en esa forma inician la
proliferación. Muchas líneas celulares son anclo dependientes, es decir no inician la
proliferación hasta que se han adherido al sustrato, este es el modo normal de
proliferación de la mayor parte de las células, con excepción de las células
hematopoyéticas maduras. Por otro lado el crecimiento en suspensión es propio de
aquellas células capaces de proliferar sin necesidad de adherirse al sustrato,
independientes de anclaje, y es propio de las células hematopoyéticas, algunas líneas
celulares transformadas y de células procedentes de tumores. Es de destacar que en
todo tejido existe una fracción o tipo celular que es capaz de crecer en suspensión. A
pesar de que su origen no está claro se cree que se trata de células cepa (stem cells)
indiferenciadas [58].
Esta propiedad de adherencia está en general asociada con el tipo de célula de la cual
derivan y depende del tipo de proteínas presentes en su superficie. Se sabe que muchos
cultivos celulares se encuentran anclados a una superficie celular debido a que
58
Evaluación de Recubrimientos de Quitosano sobre
Scaffolds de HA
sintetizan proteínas relacionadas con la matriz extracelular la cual está encargada de
mantener unidas a las células y posee un papel regulador sobre las mismas in vivo.
Algunas de las macromoléculas involucradas son la colágena, la fibronectina, la laminina
y el proteoglucano, las cuales establecen interacciones con las proteínas de la
membrana citoplásmica de la célula, denominadas integrinas, CAMs y cadherinas. Estas
proteínas además de mantener unidas a las células también participan en la transmisión
de señales del exterior hacia el interior de las células. En cultivos en monocapa, la
interacción de este conjunto de proteínas se da por medio de las adhesiones focales
[60].
Figura 10. Tipo de crecimiento de un cultivo celular (monocapa, en suspensión o tridimensionales con esquema de las morfologías de las células en cultivo [60].
Hay varios métodos para iniciar un cultivo (figura 11), los tipos más comunes que se
pueden encontrar son:
Cultivo celular. Supone una disgregación celular ya sea por medios enzimáticos o
mecánicos. La suspensión celular se puede cultivar como una monocapa
adherente o en suspensión en el medio de cultivo. Este tipo de cultivo permite
su propagación, aumentando notablemente la masa celular del cultivo a lo largo
de las generaciones. Como característica negativa se pierde la heterogeneidad
celular de partida, la población se hace uniforme y homogénea al predominar en
59
Evaluación de Recubrimientos de Quitosano sobre
Scaffolds de HA
el cultivo aquellos tipos celulares que tienen superior tasa de crecimiento
[58,61].
Explantes primarios. Fragmentos de tejidos o de órganos extraídos de un
organismo que se coloca in vitro en un medio artificial o se adhiere a una
superficie en la que proliferan las células de la periferia del explante. Esto
constituye un cultivo primario [58,61].
Cultivo celular. Supone una disgregación celular ya sea por medios enzimáticos o
mecánicos. La suspensión celular se puede cultivar como una monocapa
adherente o en suspensión en el medio de cultivo. Este tipo de cultivo permite
su propagación, aumentando notablemente la masa celular del cultivo a lo largo
de las generaciones. Como característica negativa se pierde la heterogeneidad
celular de partida, la población se hace uniforme y homogénea al predominar en
el cultivo aquellos tipos celulares que tienen superior tasa de crecimiento [58,
61].
Figura 11. Tipos de cultivo de tejidos, adaptada y modificada de Handbook [58 y 60].
60
Evaluación de Recubrimientos de Quitosano sobre
Scaffolds de HA
En la actualidad los cultivos celulares son los más empleados fundamentalmente por la
posibilidad de propagación, así como por las ventajas en la cuantificación,
caracterización y reproducibilidad de las muestras. A fin de compensar la ausencia de
interacciones heterotípicas se realizan desde hace unos años cultivos mixtos con
importantes éxitos. La medicina regenerativa, que pretende conseguir la regeneración,
total o parcial, de los tejidos que han perdido masa celular, utiliza técnicas de trasplante
celular para implantar células troncales o células madre. Con respecto al tejido óseo
recientemente se han publicado varios estudios sobre el cultivo de células madre
humanas y su diferenciación sobre scaffolds celulares como ya se ha descrito. Las
células madre mesenquimales humanas son una fuente interesante de células ya que
pueden extraerse de la médula ósea, expandirse y diferenciarse a osteoblastos in vitro.
El número de células madre aisladas de médula ósea es muy pequeño, por lo que se
necesita realizar una condensación de la fase con mayor riqueza de éstas para la
siembra de scaffolds, el proceso requiere un paso de diferenciación intermedio por lo
que se necesitan de 3 a 4 semanas en cultivo para demostrar la formación de hueso en
una matriz de HA cálcica [32].
2.2.7.2. Líneas celulares
Cuando las células se mantienen en cultivo, por regla general conservan su carácter
original. Cada tipo celular parece tener una memoria de su desarrollo y estar fija en su
forma especializada, aunque pueden suceder algunos cambios o transformaciones
limitadas. Las células madre en cultivo en cambio pueden continuar dividiéndose y se
diferencian en uno o más tipos celulares, cada célula madre en particular sirve para la
regeneración de un tejido concreto. Existen diferencias muy importantes entre una
línea celular continua, una línea primaria o un cultivo primario (figura 12) [32,58].
Cultivo primario y subcultivo: Es un cultivo establecido a partir de un tejido u
órgano (células aisladas por digestión tisular). Las células mantienen la viabilidad
un periodo de tiempo limitado y no se reproducen en cultivo. En general en
cultivo presentan una reducción en el número total de células vivas a lo largo del
tiempo, se caracterizan por estar constituidos por diferentes tipos de células
(por lo que a veces pueden recibir el nombre de cocultivos) cuya morfología es
predominantemente la de las células del órgano del que fueron aisladas, sus
cromosomas tienen un número diploide, su crecimiento in vitro es limitado y
presentan inhibición por contacto generada por vías de señalización intra e
intercelulares. Estas células son consideradas como cultivo primario hasta que
se subcultiven con éxito (es decir, sean transferidas, con o sin dilución, de un
recipiente de cultivo a otro). Ejemplos: hepatocitos obtenidos de hígado adulto,
neuronas, etc. [58, 60].
61
Evaluación de Recubrimientos de Quitosano sobre
Scaffolds de HA
Línea primaria. Es un cultivo establecido a partir de un tejido u órgano que se
mantiene un periodo de tiempo limitado pero con reproducción de las células
en el cultivo (cultivos secundarios). Las células pueden crecer a una velocidad
constante en diversos subcultivos sucesivos, recibiendo cada uno de ellos el
nombre relacionado con el pase. Ejemplos: fibroblastos dérmicos,
queratinocitos, células endoteliales de aorta bovina (BAEC), células endoteliales
de cordón umbilical (HUVEC), etc [58].
Línea celular establecida (continua). Células que se diferencian genética y
morfológicamente de las células de las cuales se originaron. Pueden provenir de
tumores o de un proceso de transformación de un cultivo primario por medio de
una pérdida de regulación debido al subcultivo continuo o mediante
transfección con oncogenes, o el tratamiento con agentes carcinogénicos. Las
líneas celulares continuas son aquellas que han demostrado posibilidades de ser
subcultivadas in vitro por lo menos 70 pases indefinidamente y que presentan
características genotípicas diferentes al tejido del cual fueron originadas. Las
líneas celulares continuas pueden ser transfectadas con genes específicos para
la producción de proteínas de interés, se les conoce como líneas celulares
transformadas genéticamente. En general, algunas de estas líneas se
caracterizan por no tener inhibición por contacto y crecer de manera indefinida
e independiente del número de pases o subcultivos [60].
Figura 12. Diferentes cultivos celulares de acuerdo a su origen, modificación genética y
fenotípica [60].
62
Evaluación de Recubrimientos de Quitosano sobre
Scaffolds de HA
2.3. CARACTERIZACIÓN DE LAS PROPIEDADES DE LOS BIOMATERIALES PARA IT
La caracterización de materiales se refiere al establecimiento de las características de
un material determinado a partir del estudio de sus propiedades físicas, químicas,
estructurales, entre otras. Existen para ello distintas técnicas de caracterización, de
acuerdo al interés o uso que se vaya a dar a dicho material. Una vez conocidas las
características del material puede establecerse la naturaleza del mismo, así como sus
posibles aplicaciones. Las diferentes técnicas disponibles (cromatografía, difracción de
rayos X, espectroscopía infrarroja, microscopía electrónica de barrido, microscopía de
sonda de barrido, análisis térmico diferencial, etc.), plantean requerimientos específicos
en cuanto a cantidad de muestra, geometrías de probetas particulares o procesos de
acondicionamiento previos de los materiales a ensayar. Algunas de las técnicas son de
naturaleza “destructiva” y otras “no destructiva”, las cuales proporcionan información
cualitativa y cuantitativa, absoluta o complementaria, brindando resultados de mayor o
menor resolución o sensibilidad [11].
La superficie de cualquier material muestra las características específicas diferentes de
sus zonas internas, existen una serie de fenómenos de tipo mecánico (fricción y
desgaste) o químico (corrosión, degradación) que afectan exclusivamente la superficie
de los cuerpos. Es por esto que cada vez se utilizan más las técnicas de modificación
superficial con el objetivo de mejorar estos comportamientos, es necesario por ende
conocer con mayor precisión las técnicas disponibles para caracterizar estas superficies
y cuantificar de este modo su comportamiento durante el tiempo de vida útil [62].
2.3.1. Propiedades físico-químicas, superficiales y mecánicas de biomateriales
para Ingeniería de Tejidos
La identificación de los constituyentes de un material propuesto para ser utilizado en
medicina regenerativa o ingeniería de tejidos permite evaluar su riesgo y los datos
obtenidos pueden ser utilizados en la estimación total de la seguridad biológica de
éstos, cualquiera de los elementos de un material o aditivos utilizados en el proceso de
fabricación o síntesis pueden ser potencialmente biodisponible o tóxico. Las
características exigidas por el cuerpo humano hacen que las propiedades requeridas en
los materiales utilizados en prótesis o materiales de regeneración sean muy restrictivas.
La información obtenida a partir de la caracterización físico- química de los
biomateriales facilita su identificación y la selección de las pruebas de toxicidad
biológica que se requieren para demostrar su seguridad [63].
Entre las características físico-químicas más significativas de los materiales utilizados en
medicina regenerativa se incluyen aspectos como la forma y estado del material (sólido,
63
Evaluación de Recubrimientos de Quitosano sobre
Scaffolds de HA
líquido o gas, etc), la adsorción superficial de los componentes químicos de la sangre, la
absorción de fluidos, los cambios de estado físico al estar contacto acto con fluidos
biológicos, las propiedades adhesivas y electroquímicas, los efectos de los procesos de
esterilización, entre otras [63].
Las técnicas físico-químicas que se utilizan para una completa caracterización de los
materiales pueden clasificarse en: microscópicas, espectroscópicas, de difracción y
análisis térmico. Estas proporcionan información valiosa para evaluar o predecir las
diversas propiedades de los materiales como son su composición, estructura, topología,
topografía, morfología, etc. Entre ellas se pueden encontrar la difracción de rayos X, la
espectroscopia infrarroja y fotoelectrónica, la microscopía óptica y electrónica, entre
otras [64].
Por otro lado la morfología y la topografía de las superficies son propiedades en los
biomateriales que también han tomado un especial significado en los últimos años. Por
ejemplo se ha determinado la importancia que hay en la caracterización de las
superficies para determinar la seguridad biológica o biocompatibilidad de los materiales
minimizando las reacciones del organismo frente a un cuerpo extraño. Se ha
demostrado también la relación que hay entre la integración de los tejidos con algunas
superficies que tienen una configuración, forma o rugosidad determinadas y facilitan
con esto la adhesión celular (osteointegración por ejemplo) y a su vez tratan de evitar la
adhesión microbiana [53,65].
Otro aspecto que se debe considerar son las propiedades mecánicas, la caracterización
de este tipo incluye aspectos como la dureza, la tenacidad, la elasticidad, la plasticidad,
características de desgaste dinámico, la estabilidad mecánica con el tiempo, entre otras.
El cambio de cualquiera de estas propiedades puede provocar la inestabilidad de
algunos implantes o prótesis disminuyendo así su funcionalidad y vida útil de servicio. El
incremento de la resistencia mecánica de los materiales implica un incremento en los
costos de obtención, la mejor opción consiste en la modificación superficial para
mejorar dichas propiedades [62, 63, 66].
2.3.2. Evaluación de la biocompatibilidad de Scaffolds usados para IT
En la actualidad un biomaterial debe cumplir una serie de requisitos para ser
considerado en aplicaciones de regeneración, entre estos se encuentra el ser
biocompatible, es decir, debe ser aceptado por el organismo y no provocar que éste
desarrolle sistemas de rechazo ante su presencia [33]. Los estudios de
biocompatibilidad evalúan el potencial tóxico de un elemento, éstos pueden ser
64
Evaluación de Recubrimientos de Quitosano sobre
Scaffolds de HA
realizados directamente sobre un material o sobre una extracción de éste, utilizándose
sistemas de cultivo celular o métodos in vivo. Los estudios in vitro son el primer paso
que se suele utilizar para la comprensión de la interacción substrato/célula y la no
toxicidad de los materiales. Los cultivos celulares son sistemas ideales para el estudio y
observación de un determinado tipo de células bajo condiciones específicas, dado que
estos sistemas no presentan la complejidad que un sistema in vivo conlleva debido al
gran número de variables que interaccionan allí [35].
Con respecto a ensayos in vitro de cerámicas bioactivas para ingeniería de tejidos Zhang
ha publicado diversos trabajos en los que obtuvo andamiajes porosos de biopolímeros
reforzados con HAp en polvo y de compuestos de fosfatos de calcio/quitosano,
incorporando biovidrio para el cultivo de células osteoblásticas humanas (MG63). En
todos los materiales compuestos hubo una proliferación o diferenciación solamente de
células osteoblásticas (proliferación fenotípica). El empleo de soportes de quitosano con
biovidrios de fosfatos de calcio evita la rápida degradación en un medio fisiológico, lo
que trae consigo la liberación de subproductos ácidos que pudieran afectar la
diferenciación de las células osteoblásticas [67].
Por su parte Zhao y colaboradores prepararon un enrejado 3D de
HAp/quitosana/gelatina (compuesto con estructura similar al hueso humano) mediante
precipitación in situ, para inducir una adhesión, crecimiento y diferenciación
osteogénica favorable de un cultivo de células mesenquimales humanas, empleando
estas matrices en ingeniería de tejido óseo [68].
Diversos estudios a nivel mundial han demostrado que los biocompuestos son
prometedores respecto a los materiales convencionales y técnicas utilizadas en la
actualidad en la ingeniería clínica y de tejidos. En cuanto a lo que se ha realizado en
Latinoamérica para la fabricación de espumas de HA por diferentes técnicas, se
encontró que Gallegos y colaboradores, analizaron el desempeño estructural de
espumas de HA fabricadas por el método de polímero soluble en agua y comparando
los resultados experimentales con modelos numéricos y teóricos concluyeron que los
modelos propuestos pueden ser usados para predecir con exactitud, el desempeño
mecánico-estructural de las espumas de HA para diferentes valores de porosidad [69].
Para Colombia se reporta un trabajo de Duran y colaboradores en 2012 titulado
Adhesión de osteoblastos sobre andamios de PLA-PLG-hidroxiapatita-quitosano por
electroactivación, el objetivo era explicar el aumento de la adhesión de células como
resultado del cambio en la hidrofilia de una matriz de regeneración celular, variando el
intercambio iónico intracelular, inducida por la aplicación de la adición de elementos
bioactivos a los polímeros [70].
65
Evaluación de Recubrimientos de Quitosano sobre
Scaffolds de HA
Por otra parte, recientemente en el año 2014 fue reportado por Plazas un estudio
acerca de la presencia en la superficie de un material polimérico (policaprolactona) de
partículas de apatita o vidrios bioactivos obtenidas por técnicas de recubrimiento, para
inducir y acelerar el crecimiento de tejido óseo cuando este material se implanta para la
regeneración o reparación ósea, en el cual se concluyó que para obtener un material
con un buen balance entre las propiedades mecánicas y biológicas buscadas se debe
complementar el estudio con cultivos de células y ensayos in vivo, en condiciones
adecuadas para la evaluación de materiales tridimensionales [71].
A nivel mundial sólo por mencionar una investigación Dutta y otros han realizado
estudios in vivo en dos tipos de espumas de HA, la primera obtenida a partir de una
matriz polimérica diseñada por prototipado rápido con poros macroscópicos y otro
usando una matriz de estructura porosa convencional; evaluando la ventaja de la
arquitectura controlada proporcionada por la técnica. Concluyeron que la espuma con
poros macroscópicos presentó mayor neoformación ósea, en comparación con el otro
tipo de espuma. Como hallazgo importante encontraron cantidades significativas de
nuevo hueso en los poros con un tamaño menor a 100 µm [72].
Esta información es importante si se tiene en cuenta que la idea principal de realizar
este tipo de investigaciones en Colombia es proponer nuevos materiales que puedan
ser fabricados con mejores propiedades a menores costos, evitando la importación de
este tipo de productos, para ofrecer un material más económico en el mercado y fácil
de obtener con las materias primas del país, aunque la técnica y los materiales han sido
ampliamente estudiados. El estado actual en cuanto al desarrollo de scaffolds de HA y
compuestos HA/polímeros para ingeniería de tejidos en el Colombia, muestra en
general que se han hecho estudios de los materiales, la optimización de los protocolos
de obtención, caracterizaciones físicas, químicas y mecánicas, en general, sin embargo
con respecto a su comportamiento biológico in vitro e in vivo si se adelantan estudios al
respecto la información es muy limitada.
La mayoría de investigaciones encontradas se basan en materiales compuestos pero
donde la matriz principal es el polímero y se refuerza para mejorar la osteointegración
con cerámico tipo fosfatos de calcio o biovidrio, en menores proporciones. También se
encuentran algunas investigaciones en las cuales estos compuestos se utilizan como
recubrimientos de materiales metálicos para prótesis, como la mezcla de polímeros e
hidroxiapatita, adelantada por investigadores para obtener implantes o prótesis más
biocompatibles y livianas, sin embargo la utilización de polímeros naturales utilizados
como recubrimientos sobre materiales cerámicos no es muy común, ni está muy
referenciada hasta el momento.
66
Evaluación de Recubrimientos de Quitosano sobre
Scaffolds de HA
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74
Evaluación de Recubrimientos de Quitosano sobre
Scaffolds de HA
CAPÍTULO 3.
OBJETIVOS Y METODOLOGÍA EXPERIMENTAL
3.1. OBJETIVOS
3.1.1. Objetivo General
Evaluar las propiedades de scaffolds de hidroxiapatita producidos por gel-casting
e hidroxiapatita con recubrimiento de quitosano producidos por gel-
casting/inmersión.
3.1.2. Objetivos Específicos
Obtener scaffolds de HA producidos por gel-casting e hidroxiapatita con
recubrimientos de quitosano producidos por gel-casting e inmersión.
Evaluar las propiedades físico-químicas y mecánicas de los scaffolds obtenidos
por medio de diversas técnicas de caracterización.
Determinar el comportamiento biológico in vitro de los scaffolds de
hidroxiapatita mediante ensayos de citotoxicidad, adhesión y proliferación
celular.
Comparar las propiedades de los scaffolds obtenidas por las diversas técnicas
con el fin de determinar la más adecuada para uso como matrices de
regeneración ósea.
3.2. MATERIALES Y METODOLOGÍA EXPERIMENTAL
3.2.1. Materiales
Para el desarrollo de los scaffolds se utilizó como material sólido hidroxiapatita
comercial marca Strem Chemicals, el dispersante fue ácido metacrílico marca Aldrich
75
Evaluación de Recubrimientos de Quitosano sobre
Scaffolds de HA
Chemical Co, el monómero utilizado fue acrilamida marca Merck, el iniciador Persulfato
de amonio marca Aldrich Chemical Co, el catalizador TEMED marca Merck, como
surfactantes se usaron el tergitol marca α químicos Ltda y el dodecil sulfato de sodio
marca J.T Baker.
Para la obtención de los recubrimientos sobre los scaffolds de HA se utilizó quitosano
comercial marca Sigma-Aldrich con porcentaje de desacetilación >75% y ácido acético
glacial marca Panreac como disolvente de éste. Todas las soluciones acuosas se
prepararon con agua desionizada a pH neutro.
3.2.2. Diseño de experimentos y tratamiento estadístico de los datos
3.2.2.1. Identificación de elementos del experimento
Unidad experimental: Scaffolds de Hidroxiapatita (HA) con recubrimientos de
quitosano obtenidos por inmersión fueron las unidades experimentales del
trabajo de investigación sobre las que se realizaron las diferentes medidas y se
obtuvieron las variables respuesta.
Variables de control o factores: En esta investigación se tienen dos factores los
cuales son (1) la concentración de quitosano en cuatro niveles (0.5, 1, 1.5 y 2%)
y (2) el tiempo de recubrimiento en dos niveles (5 y 20 minutos).
Variables de entrada (constantes): Las constantes del experimento fueron (1) la
composición de los scaffolds de HA ya que la cantidad y tipo del entrecruzante,
dispersante, iniciador y catalizador se mantendrá iguales en la síntesis de los
scaffolds por medio de la técnica gel-casting, (2) el pH (neutro) debido a la
aplicación para la cual serán aplicados los scaffolds ya que cualquier cambio
puede afectar el comportamiento y la biocompatibilidad del material, (3) la
temperatura de sinterización para la consolidación de la estructura de los
scaffolds se hace a temperaturas muy altas para obtener mejor resistencia en
este caso se llevaron hasta 1200°C, (4) el tamaño de los scaffolds con el fin de
evaluar las propiedades a las mismas condiciones se obtienen scaffolds en un
molde asegurando tamaño y peso similares.
Factores molestia: Entre estos se encuentran (1) la temperatura ambiente y la
humedad, ya que esto sólo puede ser controlado en los procesos de secado y
sinterización, sin embargo en la síntesis, preparación de los scaffolds y
76
Evaluación de Recubrimientos de Quitosano sobre
Scaffolds de HA
obtención de los recubrimientos no, esto puede influenciar en los reactivos y las
reacciones, por ende en las variables respuesta, (2) la contaminación ambiental
ya que los scaffolds serán para aplicación biomédica, por ende se debe evaluar
su biocompatibilidad con diversas pruebas in vitro, sin embargo, en el proceso
de síntesis de scaffolds y obtención de recubrimientos es difícil controlar la
contaminación ambiental ya que el lugar en el cual se obtienen las muestras no
está aislado, ni desinfectado y los materiales y equipos no tienen las condiciones
de asepsia favorables.
Aleatorización: Para mejorar los factores molestia mencionados se realizó una
aleatorización del experimento; realizando mediciones sin seguir un orden
específico. Todos los experimentos se realizaron por triplicado, pero el orden de
los experimentos fue aleatorio en diferentes días y épocas del año para así evitar
sesgamiento. La aleatorización se hizo con ayuda de la función sample en R para
las corridas.
Variables respuesta: En el experimento se evaluaron diversas variables como
respuesta (1) la degradabilidad o pérdida de peso la cual es importante para
determinar el efecto del recubrimiento polimérico sobre la estabilidad (no
desintegración del material) y las propiedades mecánicas, (2) el tamaño de poro
y (3) la interconectividad, (4) la resistencia a la compresión y (5) el módulo de
elasticidad , debido a que el comportamiento mecánico del hueso es
anisotrópico y viscoelástico ya que sus propiedades mecánicas son sensibles
tanto a la velocidad de deformación como al tiempo de aplicación de la carga,
(6) la citotoxicidad, que mide la supervivencia y proliferación celular, se
determina mediante el método MTT, los valores de viabilidad celular ideales
para los biomateriales son del 75 % al 100%, esto es un indicador de que el
material no presentan toxicidad para los tipos de líneas celulares que sean
estudiadas.
Interacciones: se dan entre dos factores cuando los niveles de uno de ellos
varían con respecto a los niveles del otro. Por lo tanto al tratarse de un diseño
factorial los tratamientos se forman combinando los niveles de los factores en
estudio en este caso entre la concentración del polímero y el tiempo de
recubrimiento.
A continuación se muestra en la figura 13 un esquema resumido de la unidad
experimental sus variables de entrada, factores, ruido y las variables respuesta.
77
Evaluación de Recubrimientos de Quitosano sobre
Scaffolds de HA
Figura 13. Esquema de procesos (unidad experimental y variables del diseño
experimental).
3.2.2.2. Descripción del pre muestreo
La prueba piloto se realizó solo para evaluar y seleccionar la técnica más adecuada para realizar los recubrimientos de quitosano sobre los scaffolds de HA, estas técnicas seleccionadas fueron (1) inmersión y (2) aspersión del polímero, las cuales se realizaron con el fin de garantizar un recubrimiento homogéneo y significativo sobre la muestra. Se realizó este pre muestreo debido a la restricción del presupuesto por los altos costos de los reactivos, material de síntesis y caracterización, además del tiempo que se requiere para obtener cada muestra. Esta evaluación se hizo para las propiedades mecánicas (resistencia a la compresión y módulo de elasticidad) y obtención de la porosidad (interconectividad y tamaño de poro).
3.2.2.3. Planteamiento experimental
Una vez determinada la técnica de recubrimiento se estudió la influencia de los
parámetros mediante el uso de un diseño de experimentos factorial mezclado. Se
variaron dos factores experimentales, el factor “Concentración Qo” (cuatro niveles) y el
factor “Tiempo de recubrimiento” (dos niveles) generándose una matriz experimental
de ocho formulaciones a estudiar (véase la tabla 5), como variables respuesta se
escogieron la degradabilidad (Y1), interconectividad (Y2), porosidad (Y3), resistencia a la
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Evaluación de Recubrimientos de Quitosano sobre
Scaffolds de HA
compresión (Y4) y módulo elástico (Y5). Debido a las múltiples respuestas que se
obtienen, el análisis estadístico es multivariado. Para este estudio fueron realizadas tres
réplicas de cada formulación. Todas las respuestas de las formulaciones se compararon
con scaffolds de HA sin recubrimiento.
Tabla 5. Parámetros de las formulaciones generadas en el diseño de experimentos.
Formulación Factores Respuestas
Concentración Qo (%)
Tiempo (min)
Y1 Y2 Y3 Y4 Y5
M1 0.5 5 Y11 Y21 Y31 Y41 Y51
M2 0.5 20 Y12 Y22 Y32 Y42 Y52
M3 1 5 Y13 Y23 Y33 Y43 Y53
M4 1 20 Y14 Y24 Y34 Y44 Y54
M5 1.5 5 Y15 Y25 Y35 Y45 Y55
M6 1.5 20 Y16 Y26 Y36 Y46 Y56
M7 2 5 Y17 Y27 Y37 Y47 Y57
M8 2 20 Y18 Y28 Y38 Y48 Y58
M9 0 0 Y19 Y29 Y39 Y49 Y59
La descripción de los datos se presenta por medio de análisis exploratorios con gráficos como histogramas, diagramas box-plot y gráficos de medias para cada nivel. Se realizó un chequeo de normalidad de los datos, pruebas de independencia y varianza constante, todo a través de pruebas gráficas y estadísticas. La comparación de los datos se efectuó por medio de test de hipótesis o contrastes de
hipótesis, con lo que se pudo determinar si las medias de los valores fueron diferentes o
iguales.
Se estudiaron con un diseño simple, en el que intervienen sólo dos factores. Para el
factor A (concentración de quitosano) hay 4 niveles (a) y para el factor B (tiempo de
inmersión) hay dos niveles (b), cada réplica del experimento contiene todas las posibles
combinaciones de tratamientos, es decir contiene los ab tratamientos posibles.
Para el análisis estadístico de la matriz generada en el diseño del experimento propuesto, el Análisis de Varianza se realizó mediante la tabla de ANOVA, utilizando el programa estadístico Statgraphics Centurion versión 16.1.11, el cual es una herramienta de análisis de datos que combina una amplia gama de procedimientos analíticos con gráficos interactivos para proporcionar un entorno integrado de análisis, este software incluye funciones estadísticas avanzadas, capaces de proporcionar
79
Evaluación de Recubrimientos de Quitosano sobre
Scaffolds de HA
rigurosos análisis, con ayuda de los datos entregados por este programa se evaluaron los efectos principales y las interacciones entre los factores de entrada planteados en el proyecto, con respecto a los factores de salida, para los experimentos realizados con cada parámetro de recubrimiento de Qo sobre los scaffolds de HA.
3.2.2.4. Preferencias de Diseño
El modelo estadístico para las variables de este diseño será:
𝑦𝑖𝑗= 𝜇 + 𝜏𝑖 + βj + (𝜏β)ij + 𝜀𝑖𝑗, 𝑖=1,2,…….,𝑎 𝑦 𝑗=1,2,…….,𝑛.
Donde 𝑦𝑖𝑗 es la variable respuesta de los scaffolds que representa la observación
correspondiente al nivel (i) del factor concentración de polímero y al nivel (j) del factor
tiempo de inmersión.
𝜇 es la media global de las variables respuestas
𝜏𝑖 es el efecto asociado al 𝑖- ésimo % concentración de polímero.
Βj es el efecto asociado al j- ésimo tiempo de inmersión.
(𝜏β)ij es el efecto producido por la interacción entre la concentración del polímero y el
tiempo de inmersión.
𝜀𝑖𝑗 es el componente del error aleatorio con distribución normal, media cero y varianza
constante σ2~N(0, σ2).
El diseño seleccionado consiste en un experimento con dos factores, y los datos
adquiridos tanto para la degradabilidad, porosidad e interconectividad, resistencia
mecánica y módulo elástico, como para la citotoxicidad han sido tratados y analizados
por medio de medidas de tendencia central, como interpretación de la media, la
mediana, los valores máximos y mínimos. Para determinar si los datos tienen o no una
distribución normal se plantearán las siguientes pruebas de hipótesis:
Ho: los datos siguen una distribución normal.
Ha: los datos no siguen una distribución normal.
Todos los análisis se realizaron por triplicado y se expresaron como la media ± desviación estándar (S.D). Se utilizó la prueba de Tukey utilizando el software estadístico para probar la significancia de la media (P <0,05).
Posteriormente se hizo un análisis de varianza ANOVA con sus respectivas hipótesis.
80
Evaluación de Recubrimientos de Quitosano sobre
Scaffolds de HA
3.2.3. Fabricación de scaffolds de HA
La obtención de los scaffolds o cuerpos porosos se realizó siguiendo el método de gel-
casting descrito por J. González [1]. Utilizando un porcentaje de sólidos del 50% de HA,
y realizando una modificación en el tiempo de agitación reportado. El procedimiento se
hizo en una cámara de vacío con atmósfera de nitrógeno (N2) para evitar reacción con
el oxígeno (O2) lo cual inhibe la polimerización de los monómeros.
Para este proceso inicialmente se mezclaron durante 3 minutos con un agitador
magnético (BOECO, Germany) el agua destilada y el monómero (acrilamida). Luego se
adicionó esta solución en un recipiente polimérico que contenía el polvo de HA y el
iniciador (persulfato de amonio), esto se mezcló durante 10 minutos con la ayuda de un
agitador mecánico (IKA Labortechnik-RW 20n) para romper los aglomerados de las
partículas del polvo (es importante resaltar que las aspas del agitador se recubren con
algún tipo de cinta para evitar la contaminación de las mezclas). Pasado este tiempo se
adicionó el entrecruzante (bisacrilamida) y el dispersante (ácido metacrílico), para
obtener una adecuada homogenización de los componentes. Se adicionó luego de 3
minutos el catalizador (TEMED) y se siguió homogenizando durante 5 minutos más.
Posteriorimente se agregaron los surfactantes (tergitol y dodecil sulfato de sodio) para
la generación de la espuma. Finalmente se realizó el vaciado en los moldes dejando
dentro de la cámara durante 30 minutos para completar el proceso de polimerización.
La figura 14 muestra el esquema seguido en el proceso.
Figura 14. Esquema del procedimiento planteado para la obtención de scaffolds de HA por la técnica gel-casting.
81
Evaluación de Recubrimientos de Quitosano sobre
Scaffolds de HA
Una vez obtenidos los moldes se realizó un tratamiento térmico, el cual inició con un
secado a temperatura ambiente durante 24 horas para eliminar el exceso de humedad,
seguido por un secado en estufa a (70°C ± 1°C) por 15 horas, para quitar por completo
la humedad del scaffold y proporcionar resistencia en verde para la manipulación de las
muestras, finalmente los scaffolds se sinterizaron hasta (1200°C± 1°C) subiendo
1°/minuto por 3 horas con incrementos graduales de 300ºC/min, con el fin de
consolidar la estructura porosa y así generar una mayor resistencia mecánica [1].
Algunos scaffolds de HA obtenidos serán usados como patrones con el fin de comparar
sus propiedades con los scaffolds que serán recubiertos con quitosano a diferentes
concentraciones.
3.2.4. Obtención de los recubrimientos de quitosano sobre los scaffolds de HA
3.2.4.1. Preparación de las soluciones de quitosano
El quitosano comercial fue diluido en ácido acético glacial (1% v/v) para preparar
soluciones poliméricas a diferentes concentraciones (0.5%, 1%, 1.5%, 2% p/v), todas las
diluciones se prepararon con agua destilada, una agitación a 700 rpm por 2h en un
agitador magnético (BOECO, Germany) a temperatura ambiente.
3.2.4.2. Obtención de los recubrimientos sobre los scaffolds
La técnica de inmersión también conocida como dip-coating se basa en producir un recubrimiento sobre una superficie determinada mediante la inmersión de la muestra tratando de controlar los siguientes parámetros:
- Velocidad de entrada de la muestra en la solución. - Tiempo de inmersión. - Velocidad de salida de la muestra de la solución.
Debido a que la entrada y salida del material en la solución se realiza de forma manual, es difícil controlar este parámetro, sin embargo se realiza atando el scaffold con hilo delgado a un soporte metálico de altura constante y se deja caer lentamente, igualmente para la extracción se retira lentamente el scaffold de la solución de quitosano. En la siguiente imagen de la figura 15 se puede observar el proceso de Inmersión o Dip-
coating utilizado para recubrir los scaffolds de HA en solución de quitosano a diferentes
concentraciones.
82
Evaluación de Recubrimientos de Quitosano sobre
Scaffolds de HA
Figura 15. Técnica de recubrimiento obtenido entre la superficie de contacto que une el film y el material que actúa de sustrato, siendo en este caso HA.
Scaffolds de HA de radio 3 mm, altura 4 mm y peso (0,7 a 1,0 g) aproximadamente
fueron recubiertos por inmersión en 50 ml de solución de quitosano a diferentes
concentraciones en condiciones ambientales.
Para activar químicamente la superficie de los cuerpos poroso de HA se realizó un
lavado de estos con etanol al 70% v/v y seguidamente con abundante agua destilada,
para eliminar los excesos de grasa, partículas, impurezas y residuos. Luego se dejaron
en el ultrasonido por 5 min a 60Hz y se secaron a 70°C durante 1 hora.
Los scaffolds activados son suspendidos en las soluciones de quitosano y se dejan
inmersos durante dos tiempos diferentes (5 y 20 min), con el fin de evaluar la influencia
del tiempo, una vez se retiran de la solución, éstos fueron irradiados con luz ultravioleta
durante 10 minutos en una cámara de flujo laminar marca ESCO con longitud de onda
de 280 nm, este proceso se realizó para mejorar la adhesión del recubrimiento (esta
adhesión se da por el efecto de la fotoxidación por irradiación con UV) [2]. Una vez
transcurrido este tiempo se secaron a 40°C durante 2 horas en una estufa marca
BINDER. Luego de la inmersión y el secado los scaffolds se lavaron suavemente con
etanol al 70% y agua destilada para eliminar los residuos y excesos de material y fueron
son secados nuevamente.
En la Figura 16 se resume todo el proceso seguido para la obtención de los
recubrimientos de quitosano sobre los scaffolds de hidroxiapatita.
83
Evaluación de Recubrimientos de Quitosano sobre
Scaffolds de HA
Figura 16. Técnica de recubrimiento obtenido entre la superficie de contacto que une el film y el material que actúa de sustrato, siendo en este caso HA.
3.2.5. Caracterización físico-química de scaffolds de HA con y sin recubrimiento de Qo
3.2.5.1. Fluorescencia de rayos X (FRX)
Se realizó un análisis de la composición química y se determinó la relación molar Ca/P
por medio de la técnica FRX por perlado, con un espectrómetro de fluorescencia de
rayos X marca Thermo, modelo Optim´x para los scaffolds de HA obtenidos siguiendo el
método de gel-casting, los cuales fueron utilizados como patrones sobre los cuales se
hicieron los recubrimientos de quitosano por el método de inmersión.
3.2.5.2. Difracción de rayos X (DRX)
Las muestras de polvo de los scaffolds recubiertos se obtienen por molienda usando un
mortero cerámico. El DRX se realizó utilizando un difractómetro de rayos X marca XPert
PANalytical Empyrean Series II con detector Pixel 3D usando radiación CuKα (0,154 nm),
en un rango 2θ de 5 a 60°, se hicieron a una velocidad de barrido de 4°/min y tamaño
de paso de 0,04°, este ensayo se realizó con el fin de verificar la obtención de los
recubrimientos de Qo sobre los scaffolds de HA, para determinar las fases del
compuesto orgánico e inorgánico y la cristalinidad de las muestras.
84
Evaluación de Recubrimientos de Quitosano sobre
Scaffolds de HA
3.2.5.3. Espectroscopia infrarroja por transformada de Fourier (FTIR)
Los scaffolds en polvo se mezclaron con bromuro de potasio (KBr) grado
espectroscópico en una relación muestra:KBr de 1:100 p/p, para realizar una pastilla
con lo cual se lleva a cabo el análisis a temperatura de 24°C. Los espectros de
transmisión de las muestras se realizaron usando un espectrofotómetro Shimadzu IR
AFFINITY-1 en un rango de número de onda (ν) desde 400 hasta 4000 cm-1 con
resolución de 4 cm-1 con un número de barridos de 16. Este análisis muestra las bandas
características y la presencia de los grupos funcionales principales del quitosano y la HA,
también del carbonato asociado a la apatita y la posible interacción entre los
componentes.
3.2.6. Caracterización morfológica y superficial de los scaffolds de HA con y sin
recubrimiento de Qo
3.2.6.1. Estereomicroscopía
Las muestras secas se observaron a 8X y 16X en un estereomicroscopio marca Zeiss DV4
combinado con cámara digital incorporada (figura 17), con el fin de obtener
información estructural y superficial de los recubrimientos, homogeneidad, morfología
y porosidad de los scaffolds, entre otras características. Se utilizó el estereomicroscopio
ya que permite observar la estructura tridimensional de éstos, aunque su aumento es
menor que el del microscopio óptico.
Figura 17. Estereomicroscopio Zeiss DV4 con cámara digital incorporada.
85
Evaluación de Recubrimientos de Quitosano sobre
Scaffolds de HA
3.2.6.2. Microscopía electrónica de barrido (SEM) y Espectroscopia de dispersión de
energía (EDS).
Se empleó microscopía electrónica de barrido (SEM) para caracterizar la morfología,
tamaño de poro, tipo de porosidad e interconectividad de los scaffolds de HA y las
características de los recubrimientos de Qo, por otra parte la espectroscopia de energía
dispersa (EDS) se usó para verificar la distribución homogénea de las fases y observar
cambios químicos al realizar la fabricación de los compuestos. Para esto empleó un
Microscopio electrónico de barrido (SEM) marca Jeol JSM-6490LV con EDS incorporado
marca Oxford Instrument INCA PentaFETx3 para análisis químico ya que permite
conocer los elementos y la proporción con que se encuentran en la muestra (figura 18).
Las muestras fueron recubiertas con una capa de oro y observadas a altas
magnificaciones (50X, 100X, 500X, 1000X, 2000X). El ensayo se realizó en la Sede de
Investigación Universitaria (SIU) de la Universidad de Antioquia.
Figura 18. Microscopio Electrónico de Barrido marca Jeol JSM-6490LV.
3.2.6.3. Análisis de degradabilidad in vitro en SBF
La disolución de los scaffolds de HA recubiertos con diferentes concentraciones de
quitosano fue realizada en una solución fisiológica (SBF: Simulated Body Fluid) cuya
concentración iónica es casi equivalente al plasma del cuerpo humano (tabla 6). Para la
preparación del fluido corporal simulado (SBF) se utilizó el protocolo publicado por T.
Kokubo y colaboradores [3, 4].
86
Evaluación de Recubrimientos de Quitosano sobre
Scaffolds de HA
En la tabla 7 se muestra el orden, la cantidad, la pureza y el peso molecular de los
reactivos usados para preparar 1000 mL de solución.
Tabla 6. Concentración de iones del SBF y plasma sanguíneo humano [3, 4].
Fluido
Concentración iones (mM)
Na+ K+ Mg2+ Ca2+ Cl- HCO3- HPO4
2- SO42-
Plasma sanguíneo 142,0 5,0 1,5 2,5 103,0 27,0 1,0 0,5
SBF (original) 142,0 5,0 1,5 2,5 148,8 4,2 1,0 0
SBF (nuevo y
mejorado)
142,0 5,0 1,5 2,5 103,0 4,2 1,0 0,5
Nota: El SBF es ajustado a pH neutro 7.25 a 36,5°C con Tris o HCl
Tabla 7. Orden, cantidad y peso fórmula de los reactivos para preparación de SBF.
Orden Reactivo Cantidad (g) Peso fórmula
1 NaCl 8,035 58,44
2 NaHCO3 0,355 84,01
3 KCl 0,225 74,55
4 K2HPO4 . 3H2O 0,231 228,22
5 MgCl2 . 6H2O 0,311 203,30
6 1.0M HCl 39 ml ---
7 CaCl2 0,292 110,98
8 Na2SO4 0,072 142,04
9 Tris 6,118 121,13
10 1.0M HCl 0 - 5ml ---
Las muestras de peso y área aproximados de 1.0 g y 0.4 cm2 respectivamente se
introdujeron en 50 ml de SBF a pH neutro (7.0) y se incubaron a 37°C por 21 días, se
realizaron mediciones del pH cada 1, 7, 14 y 21 días con un pH metro pH2000 Cii.
Pasado este tiempo las muestras fueron removidas de la solución y lavadas con etanol
al 70% v/v y abundante agua destilada, posteriormente se secaron por 24 horas a 40°C
y se pesaron en una balanza de precisión Sartorious, KAIKA LTDA, en la figura 19 se
muestra este proceso. La pérdida de peso (degradación) se expresa como el porcentaje
del peso inicial como sigue en la ecuación 1 [5]:
87
Evaluación de Recubrimientos de Quitosano sobre
Scaffolds de HA
% 𝑃 = 𝑊𝑖−𝑊𝑓
𝑊𝑖∗ 100% (1)
Donde P es el porcentaje de pérdida de peso (%), Wi es el peso inicial de la muestra seca
(g) y Wf es el peso final de la muestra pasados los 21 días de inmersión e incubación en
SBF (g).
Figura 19. Obtención de degradabilidad in vitro en SBF.
3.2.6.4. Porcentaje de Porosidad e Interconectividad de Scaffolds
El procedimiento para hallar la porosidad e interconectividad presente en cada uno de
los cuerpos porosos se realizó según lo reportado por por Liu et al. [6].
Inicialmente se obtuvo el peso neto de las muestras en seco (Wnet), seguidamente se
saturaron con agua destilada según la norma NTC 4321-3, cuyo procedimiento es
detallado a continuación:
88
Evaluación de Recubrimientos de Quitosano sobre
Scaffolds de HA
En un beaker con agua se sumergió la muestra asegurando mínimo 5 cm de agua
alrededor de ella, se llevó a ebullición por 2 horas (ver Figura 20), luego se deja enfriar a
temperatura ambiente con la muestra aún dentro del agua, después se extrae del
beaker y se seca superficialmente con una toalla de papel y posteriormente fue pesada
(Wsat).
Figura 20. Montaje para la obtención del porcentaje de porosidad e interconectividad de los scaffolds.
Luego con estos valores y utilizando la ecuación (2) se determina la porosidad másica
(Φm) que se define también como la capacidad de absorción de agua:
𝜑𝑚 =(𝑊𝑠𝑎𝑡−𝑊𝑛𝑒𝑡)
𝑊𝑛𝑒𝑡 * 100 (2)
Mediante la fórmula (3) se determinó la porosidad abierta (Φa) que se refiere al porcentaje de poros comunicados con el exterior:
𝜑𝑎 =𝑊𝑠𝑎𝑡−𝑊𝑛𝑒𝑡
𝜌𝑎𝑉 (3)
Luego se obtuvieron los valores para la porosidad total (Φt) que corresponde a la suma
de los poros abiertos y cerrados existentes en la muestra con respecto al volumen total,
con ayuda de la ecuación (4):
𝜑𝑡 = 1 − 𝜌
𝜌∗ (4)
Para obtener la interconectividad de los poros (𝑃𝑖) que se refiere al porcentaje de poros
comunicados entre sí se utiliza la ecuación (5):
𝑃𝑖 =𝜑𝑎
𝜑𝑡 (5)
89
Evaluación de Recubrimientos de Quitosano sobre
Scaffolds de HA
Donde V es el volumen del cuerpo poroso, ρ* es la densidad real del material, ρ es la
densidad aparente del scaffold y ρa es la densidad teórica del agua (1 g/cm3), se utiliza la
densidad teórica de la HA como de 3.156 g/cm3 [7].
Además de las mediciones de porosidad de los scaffold con el método de Liu, se
realizaron mediciones a través de análisis de imágenes usando el software acoplado al
SEM el cual permite procesar las imágenes a una escala de colores grises y finalmente
medir el tamaño de los distintos poros obtenidos, sacando un promedio de valores
cuantitativos de estos.
3.2.6.5. Adhesividad de los recubrimientos de Qo
Una de las propiedades superficiales más importantes de controlar en un recubrimiento
es su capacidad de adhesión. Esta adhesión depende fundamentalmente de la
estructura de la superficie, y por consiguiente de su energía libre de superficie. Los
fenómenos que se manifiestan en la interacción son la elevación, depresión capilar y la
mojabilidad, muy importantes cuando se utilizan recubrimientos [8].
Asumiendo que se tiene una superficie sólida de alta energía donde los fenómenos de
adsorción y la presión de difusión son importantes, se debe considerar de manera
explícita el trabajo de adhesión, el cual viene dado por la ecuación (6) [9]:
𝑊𝑎𝑑 = 𝛾𝐿 (1 + 𝑐𝑜𝑠𝜃) (6)
La determinación de Wad que es el trabajo de adherencia del líquido sobre la superficie
sólida se basa en la ecuación de Young-Dupré donde γL corresponde la tensión
superficial del líquido (solución de quitosano) y theta (θ) es el ángulo de contacto
obtenido [9], en este caso, entre la superficie del scaffold de HA con cada solución de
polímero a las diferentes concentraciones.
Se evaluó en esta investigación el trabajo de adhesión de los recubrimientos de
quitosano a diferentes concentraciones en contacto con scaffolds de HA, esto se realizó
mediante la medición de los ángulos de contacto y la tensión superficial, obtenidos por
métodos de capilaridad e inmersión que serán descritos a continuación.
90
Evaluación de Recubrimientos de Quitosano sobre
Scaffolds de HA
3.2.6.5.1. Análisis de Mojabilidad: Ángulo de contacto de los scaffolds de
HA con recubrimientos de Qo
Para analizar la mojabilidad que tiene una superficie se utilizó el método de ángulo de
contacto. Mediante este método, se obtuvo información sobre el recubrimiento
obtenido y la hidrofobicidad de la superficie.
El ángulo de contacto se midió con una gota de un líquido (solución de quitosano) sobre
un sólido (Scaffolds de HA). De esta manera se contabiliza la energía entre las tres
interfaces presentes: sólido-vapor (𝛾𝑆𝑉), sólido-líquido (𝛾𝑆𝐿) y líquido-vapor (𝛾𝐿𝑉) [8, 9,
10].
El ángulo de contacto (θ) se puede determinar por los métodos de gota, elevación
capilar, entre otros y mediante la ecuación de Young (7) que se muestra a continuación:
𝛾𝑆𝑉 = 𝛾𝑆𝐿 + 𝛾𝐿𝑉 ∗ 𝑐𝑜𝑠𝜃 (7)
En la figura 21 se puede observar cómo se representa este sistema.
Figura 21. Esquema del sistema de ángulo de contacto [10].
En esta investigación se midió la adhesión entre las soluciones de quitosano y el
sustratos sólido (HA), empleando el método de Celda de Washburn o de sorción. La
teoría de Washburn (1921) indica que si un sólido poroso se pone en contacto con un
líquido de modo que el sólido no se sumerja en el líquido, sino que simplemente esté
tocando su superficie, entonces se produce un ascenso del líquido a través de los poros
por capilaridad. El método resultante de esta teoría sirve para determinar
principalmente dos propiedades de materiales sólidos porosos y de materiales
absorbentes tales como: la velocidad de absorción de líquido y el ángulo de contacto
promedio [8, 9, 10].
91
Evaluación de Recubrimientos de Quitosano sobre
Scaffolds de HA
El equipo utilizado para este ensayo fue un tensiómetro digital Krüss con referencia K-
12. Este equipo permitió medir el ángulo de contacto entre el sustrato sólido y la gota
de la solución líquida (agua destilada como referencia y las soluciones de Qo a
diferentes concentraciones) a temperatura ambiente de 24,2°C. Para la medición
mediante el método Washburn un tubo de vidrio se llenó de la muestra sólida y se puso
en contacto con el líquido de ensayo. La solución líquida fue estirada como resultado de
la acción capilar. El aumento de la masa del tubo, que estaba suspendido de un sensor
de fuerza, se determinó con respecto al tiempo de la medición. El proceso se describe
por la ecuación de Washburn (8):
𝑚2
𝑡 =
𝑐∗𝜌2∗𝜎∗𝑐𝑜𝑠𝜃
η (8)
Donde m = Masa; t = Tiempo flujo; σ = Tensión Superficial del líquido; c = Capilaridad
constante del sólido; ρ = Densidad del líquido; θ = Ángulo de contacto; η = Viscosidad
del líquido [8].
Si el ángulo de contacto fuera mayor que 90° no se podría medir con este método, ya
que no se daría la humectación de la muestra sólida.
El diseño y montaje del tensiómetro digital comprende tres componentes
fundamentales: Mecánico, Óptico y Tratamiento de imagen. La Figura 22, muestra una
imagen del conjunto de los componentes del equipo utilizado.
Figura 22. Imagen de los componentes del tensiómetro digital Krüss K-12.
Para determinar el ángulo de contacto mediante la ecuación 3 se debió obtener,
además, la viscosidad del líquido (soluciones de quitosano a diferentes
concentraciones). Se obtuvo este parámetro a temperatura ambiente (23°C ± 1°C) con
92
Evaluación de Recubrimientos de Quitosano sobre
Scaffolds de HA
un viscosímetro de Brookfield modelo LVT (basado en el principio de radio infinito)
utilizando un beacker de 500 ml como cilindro exterior. Se realizaron determinaciones a
gradientes de velocidad ascendentes 0 - 30 rpm en 10 minutos y luego descendentes
comprobando que no tuvieran un comportamiento tixotrópico.
3.2.6.5.2. Tensión superficial de los recubrimientos de Qo
Dado que la tensión superficial de un fluido está asociada a la cantidad de energía
necesaria para aumentar su superficie por unidad de área se llevó a cabo este ensayo
en el tensiómetro Krüss con referencia K-12, mediante el método de Placa de Wilhelmy,
la solución de quitosano a diferentes concentraciones (muestra líquida) se colocó en un
recipiente y una placa fina de platino de geometría conocida, la medida de la fuerza se
hace uniendo la placa a una balanza sensible de torsión y un dispositivo de elevación
sea para bajar la placa hacia la superficie del líquido o elevar la superficie del líquido
hacia la placa que se sumergió dentro de ella como se observa en la figura 23.
Figura 23. Tensiómetro de superficie (a) Método de placa de Wilhelmy (b) [11].
En la ecuación presentada en la figura 19 (b) la tensión superficial se denota por (γ), la
medición de la fuerza actuando sobre el plato es (F), el perímetro del plato (L) y el
ángulo de contacto del plato y el líquido es (θ).
3.2.7. Caracterización mecánica de los scaffolds mediante ensayos de compresión
Las propiedades mecánicas de los scaffolds obtenidos con y sin recubrimientos de
quitosano a diferentes concentraciones, se determinaron mediante ensayos uniaxiales
93
Evaluación de Recubrimientos de Quitosano sobre
Scaffolds de HA
de compresión sobre las muestras cilíndricas bajo la Norma ASTM D882 utilizando una
máquina universal de ensayos marca Diggimes, con una celda de carga con capacidad
para 4900 N, velocidad de carga de 5 mm/min y con un límite de desplazamiento o
deformación hasta el 75% (figura 24). Se utilizaron scaffolds cilíndricos homogéneos en
su superficie, de altura y áreas similares para todos los ensayos y sus réplicas, se obtuvo
mediante este ensayo el módulo de elasticidad y la resistencia a la compresión, con el
fin de compararlas y determinar los valores más adecuados para su uso como soportes
celulares óseos.
Figura 24. Ensayos de compresión para scaffolds en Máquina Universal Diggimes.
3.2.8. Evaluación de la biocompatibilidad mediante ensayos biológicos in vitro
La respuesta celular fue estudiada mediante diversos ensayos in vitro de citotoxicidad,
proliferación y adhesión. El ensayo de citotoxicidad permitió estudiar el efecto tóxico
del material sobre un tipo determinado de células, se hizo con el método MTT por
contacto indirecto. La adhesión y la proliferación son comportamientos celulares
indicadores de la funcionalidad celular. La adhesión celular es el proceso mediante el
cual la célula se ancla a un substrato y condiciona en gran parte eventos posteriores
como la proliferación y la diferenciación. Por lo tanto, los resultados de estos dan una
buena idea sobre el tipo de respuesta que se puede esperar al utilizar este tipo de
biomateriales in vivo.
En la figura 25 se muestra de manera global un diagrama de la metodología seguida
para los diversos ensayos biológicos los cuales serán descritos en detalle en los
numerales a continuación.
94
Evaluación de Recubrimientos de Quitosano sobre
Scaffolds de HA
Figura 25. Metodología general propuesta para los ensayos biológicos.
3.2.8.1. Línea celular para evaluación biológica (SAOS2)
Para todos los ensayos se emplearon células provenientes de la línea celular SAOS2
(ATCC HTB-85) obtenidas de células de osteosarcoma humano de tipo osteoblástico,
ampliamente en estudios biológicos (Adquiridas del banco de células ATCC: American
Type Cell Collection en Estados Unidos). Las células SAOS2 que crecen de forma
adherente, se cultivaron en medio McCoy (Sigma/Aldrich) suplementado con suero fetal
bovino (SBF Invitrogen) al 10%, se mantuvieron en botellas de cultivo y fueron
incubadas en condiciones estándar (5% CO2 en el aire, temperatura de 37°C y 100% de
humedad relativa), durante una semana. En la figura 26 puede observarse una
fotografía de este tipo de células obtenida al microscopio óptico a un aumento de 40X,
donde se observan claramente las diferencias en su morfología ya que son tipo
adherente estas se anclan al substrato y tienen forma aplanada.
95
Evaluación de Recubrimientos de Quitosano sobre
Scaffolds de HA
Figura 26. Línea celular SAOS2 (anclo dependientes) al microscopio óptico (X20 y X40).
3.2.8.2. Equipos y material para cultivo biológico celular
Para la realización de los ensayos in vitro fue necesario obtener el cultivo biológico con
la línea celular de interés (SAOS2), para esto es importante contar con los equipos y
materiales adecuados. El cultivo celular se llevó a cabo en una cabina de flujo laminar la
cual se mantuvo en forma limpia y ordenada, desinfectando cada elemento colocado en
la cabina con etanol al 70%. La disposición de elementos dentro de la campana de
cultivo celular se describe a continuación y se muestra en la figura 27, pero se puede
modificar para incluir elementos adicionales en otras aplicaciones específicas.
Figura 27. Esquema del área de trabajo y disposición de materiales en campana de cultivo celular para evaluación biológica in vitro, adaptada y modificada de [12].
96
Evaluación de Recubrimientos de Quitosano sobre
Scaffolds de HA
Para la realización del cultivo celular en cuarto limpio fueron necesarias las siguientes condiciones, equipos y materiales:
• Un espacio amplio de trabajo (Cabina limpia), con los recipientes de cultivo celular en
el centro.
• Reactivos y medios de cultivo en la parte posterior derecha para permitir el fácil
pipeteado.
• Pipeta en la parte delantera derecha, donde se puede llegar fácilmente.
• Gradilla en el centro con los reactivos adicionales cerca del cultivo celular.
• Recipiente pequeño a la izquierda con solución de hipoclorito para el descarte de los
residuos líquidos y sólidos.
Una vez establecida la línea celular osteoblástica en los recipientes adecuados se ubicó
en una incubadora para proporcionar el entorno adecuado para su crecimiento y
proliferación, controlando la temperatura, la humedad y la concentración de gases. La
limpieza frecuente de esta incubadora es esencial para evitar la contaminación de los
cultivos celulares.
El cultivo celular exitoso depende en gran medida del mantenimiento de las células
libres de contaminación por microorganismos como micoplasma, hongos, bacterias y
virus. Por lo tanto, todos los materiales usados son sometidos a esterilización y
desinfección. El manejo de las técnicas asépticas adecuadas proporciona una barrera
para los microorganismos y reducen el efecto adverso de la contaminación.
Todas las muestras fueron esterilizadas con óxido de etileno para todos los ensayos
descritos a continuación.
3.2.8.3. Ensayo de citotoxicidad
Los estudios de citotoxicidad se hicieron utilizando el método MTT, este ensayo se basa
en la reducción metabólica del Bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-ilo)-2,5-difeniltetrazol
(MTT) realizado por la enzima mitocondrial succinato-deshidrogenasa en un compuesto
coloreado de color azul llamado formazan, permitiendo determinar la funcionabilidad
mitocondrial de las células tratadas. Este método ha sido muy utilizado para medir
supervivencia y proliferación celular. La cantidad de células vivas es proporcional a la
cantidad de formazan producido, esto se presentan en los resultados. La lectura se hizo
mediante densidad óptica (D.O) y los valores de absorbancia se obtuvieron en relación a
la media del blanco [13].
97
Evaluación de Recubrimientos de Quitosano sobre
Scaffolds de HA
Los ensayos se realizaron en dos experimentos independientes y con dos replicas por
ensayo.
Para este ensayo se tomó la botella de cultivo con las células osteoblásticas y se
descartó el sobrenadante, seguidamente se adicionaron 2ml de Phosphate Buffer Saline
(PBS) para hacer lavados y eliminar rastros del medio de cultivo, una vez eliminado el
PBS se adicionaron 1,5 ml de tripsina (Invitrogen) a una concentración de 1X con el fin
de desprender las células y se ubicaron en la incubadora a 37°C durante 10 minutos.
Pasado este tiempo las células se desprendieron de la botella dando golpes suaves, el
contenido de la botella se dispuso en un tubo falcón de 15 ml que contenía 4ml de
medio de cultivo McCoy con SBF al 10% lo cual inactivó la tripsina. El falcon con el
contenido celular se llevó a centrifugación durante 10 minutos a 1300 rpm. Pasado este
tiempo se recuperó el precipitado del fondo del tubo y se dispuso a realizar el conteo
celular en cámara Neubauer. Se adicionó sobre cada muestra una suspensión celular de
10.000 cel/cm2, el plato se llevó a la incubadora a 37ºC por 72 h.
Una vez pasado el tiempo de incubación, se procedió a despegar las células de cada
muestra evaluada con ayuda de la pipeta, se adicionaron 50 μl a cada pozo del reactivo
MTT a una concentración de 5mg/ml y se llevó a incubación a 37°C durante 4 horas.
Pasado este tiempo se adicionaron 100 μl de la solución de parada la cual está
compuesta por 10% de Dodecil Sulfato de Sodio (SDS -Fisher) y 50% de Isopropanol esta
se utilizó para disolver los cristales de formazan.
En la figura 28 se observa el procedimiento seguido para el ensayo de citotoxicidad
mediante la prueba MTT.
Figura 28. Montaje para el ensayo de citotoxicidad con MTT.
98
Evaluación de Recubrimientos de Quitosano sobre
Scaffolds de HA
La producción de cristales de formazan se determinó mediante un lector de Elisa con
filtro de 570 nm (longitud de onda del formazan) y con los datos arrojados se obtuvo el
porcentaje de células vivas para cada material.
3.2.8.4. Proliferación celular
Se procedió de igual manera que para el ensayo de citotoxicidad en la primera parte
variando la concentración celular a 5.000 cel/cm2 pero la proliferación celular fue
determinada utilizando reactivo Alamar Blue o azul de alamar. Los osteoblastos fueron
sembrados sobre el material en platos de cultivo en medio McCoy con suero fetal
bovino al 10%. Se incubaron durante 72 horas a 37ºC, 5%CO2 (tiempo suficiente para
que las células comenzaran la etapa de diferenciación).Pasado el tiempo de incubación
se procedió a adicionar el reactivo a cada muestra y se llevó a incubación a 37°C
durante 1 hora y 30 minutos.
Los valores de fluorescencia fueron determinados a 530nm de excitación y 590 nm de
emisión en un fluorómetro. Los porcentajes de proliferación fueron calculados y se
representan en los resultados. Los ensayos se realizaron en dos experimentos
independientes y con dos replicas por ensayo.
3.2.8.5. Adhesión e interacción celular
Para la adhesión celular se utilizaron igualmente células de la línea celular SAOS2, ya
que este tipo de células como se ha mencionado anteriormente son anclo dependientes
por lo que permiten observar la adherencia al material.
Los ensayos se realizaron en dos experimentos independientes y con dos replicas por
ensayo. Las imágenes se muestran en los resultados.
El plato con las células cultivadas sobre el material en medio de cultivo McCoy se llevó a
incubación a 37ºC y 5%CO2 por 48 horas. Pasado este tiempo de incubación se observó
la adhesión celular sobre las muestras. Una vez se obtuvieron las células fijadas y
deshidratadas, las muestras se secaron y recubrieron con oro para ser observadas al
SEM, se analizan la adhesión, la morfología y proliferación celular sobre cada uno de los
scaffolds con y sin recubrimiento de Qo.
99
Evaluación de Recubrimientos de Quitosano sobre
Scaffolds de HA
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
CAPÍTULO 3
[1] J. González, M. Escobar, C.P. Ossa, Manufacturing and characterization of
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PLG-hidroxiapatita-quitosano por electroactivación. Dyna Revista Facultad Nacional de
Minas [online]. Vol.79, n.176, pp. 99-104. ISSN 0012-7353, 2012.
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phosphate-mediated gene delivery using simulated body fluid (SBF). Int. J. Pharm., vol.
434, N°1–2, p.p. 199–208, 2012.
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sinterización. Universidad Industrial de Santander. Bucaramanga (2007).
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efectos antibacterianos. Universidad Politécnica de Cataluña. Barcelona, 2013.
[9] K. L. Mittal, Contact Angle, Wettability and Adhesion, Volume 6. ISBN
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100
Evaluación de Recubrimientos de Quitosano sobre
Scaffolds de HA
[10] G. L. García, Influencia del acabado superficial sobre la resistencia de juntas
adhesivas para fijación de elementos cilíndricos. Universidad Nacional de Colombia.
Facultad de minas. Medellín, 2006.
[11] P. Ghosh, Surface Tension, in Colloid and Interface Science, Asoke K. Grosh,PHI
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[12] M. Harrison, I. Rae, Handbooks in Practical Animal Cell Biology: General techniques
of cell culture. Cambridge University Press. Published in the United States of America by
Cambridge University Press. ISBN 0 521 57364 5. New York, 1997.
[13] R. Sastre, S. Aza, and J. San Román, Biomateriales. Castelló de la Plana: Faenza
Editrice Ibérica, 2004.
101
Evaluación de Recubrimientos de Quitosano sobre
Scaffolds de HA
CAPÍTULO 4.
RESULTADOS, ANÁLISIS Y DISCUSIÓN
Los datos estadísticos del diseño experimental descritos en la metodología se presentan
en cada numeral correspondiente a los ensayos para cada variable respuesta, esto con
el fin de facilitar la comprensión y son descritos mediante tablas y gráficos arrojados por
los programas estadísticos Statgraphics y R.
4.1. CARACTERIZACIÓN FÍSICO-QUÍMICA DE LOS SCAFFOLDS DE HA CON Y SIN
RECUBRIMIENTO DE Qo
4.1.1. Obtención de los scaffolds de HA
Todos los scaffolds de HA fueron obtenidos basados en un protocolo, establecido por el
laboratorio de Biomateriales de la Universidad de Antioquia mediante la técnica de gel-
casting, por González, J [1], sin embargo, a este protocolo se le variaron el tiempo de
agitación (aumento) y la cantidad de sólidos (HA). En la figura 29 pueden observarse los
scaffolds obtenidos sin sinterizar (a), con 50% sólidos (b) y con 60% sólidos (c):
Figura 29. Scaffolds de HA obtenidos por gel-casting, sin sinterizar (a), con 50% de sólidos (b) y con 60% de sólidos (c).
Los scaffolds con 50% de sólidos (HA) que se muestran en la figura 29 (b) se observaron
con una forma adecuada y presentaron resistencia a la manipulación sin
desprendimiento, los poros aparentemente interconectados y bien distribuidos, para
los scaffolds que tenían un 60% de sólidos se observaron poros más cerrados y de
mayor tamaño, debido a que la HA se precipitó en el fondo de los recipientes de
102
Evaluación de Recubrimientos de Quitosano sobre
Scaffolds de HA
moldeo, resultando con una apariencia menos homogénea, más aglomerados en su
base como se observa en la figura 29 (c) y eran difícilmente manipulables al tacto, ya
que tenían una tendencia a desmoronarse en la parte superior.
Luego de un pre-muestreo y de que se establecieran las condiciones adecuadas para su
desarrollo (buena distribución de la porosidad, fácil manejo, entre otros.), los scaffolds
seleccionados para la realización de los recubrimientos fueron los que tenían un 50% de
sólidos (HA), debido a que estos presentaron características físicas y de manipulación
más convenientes para el desarrollo del proyecto.
4.1.2. Obtención de los recubrimientos de Qo sobre scaffolds de HA
Los scaffolds obtenidos por la técnica de gel-casting con el 50% de sólidos se
recubrieron con soluciones de Qo a diferentes concentraciones (0.5, 1, 1.5, 2%) y
tiempos (5 y 20 min). En la figura 30 (a) se observan las soluciones preparadas de Qo
con las que se recubrió cada uno de los scaffolds, al aumentar la concentración de
quitosano se observó una disminución de la transparencia, aumento en la coloración y
en la viscosidad. En la figura 30 (b) se muestran los scaffolds luego de su inmersión en
las soluciones de Qo (sin secado).
Figura 30. Soluciones de Qo a diferentes concentraciones (a), scaffolds recubiertos en solución de Qo (b).
El uso de esta técnica resulta importante debido a que el recubrimiento obtenido forma
enlaces de tipo secundarios (Van der Waals) entre la superficie de contacto que une el
film y el material que actúa de sustrato, siendo en este caso la HA [2]. Por tanto la
adhesión que se obtiene entre el quitosano y la HA se espera que sea la adecuada para
proporcionar las condiciones óptimas y mejorar las características con respecto a los
scaffolds de HA sin recubrimiento.
103
Evaluación de Recubrimientos de Quitosano sobre
Scaffolds de HA
4.1.3. Fluorescencia de rayos X (FRX)
En el análisis FRX fueron identificados los compuestos en los scaffolds de hidroxiapatita
obtenidos por gel-casting con 50% de sólidos utilizados como patrones (sin
recubrimiento de quitosano), este análisis se realizó para diversas muestras obtenidas
inicialmente (tabla 8) con el fin de determinar la reproducibilidad del método y
compararlo con lo reportado en la literatura.
Tabla 8. Composición química de scaffolds de hidroxiapatita obtenidos por gel-casting.
Con los datos obtenidos en la tabla 8, se calcularon los valores de la relación molar Ca/P
para los scaffolds de HA obtenidos por gel- casting sin recubrimientos de quitosano, con
su desviación estándar.
Como se observa la relación molar obtenida para las muestras fue de 1,70 ± 0,02, los
scaffolds de HA obtenidos sugieren que hay una reproducibilidad del método ya que
como puede observarse la desviación estándar y la distribución de los datos es baja, se
obtienen valores que están en el rango de [0,68 – 1,72].
Teniendo la información anterior en cuenta, se sabe que la HA que se encuentra en el
hueso natural está constituida principalmente por fósforo y calcio en una relación molar
de 1,67 idealmente, el valor obtenido para esta relación en la tabla 8 sugiere que la fase
mineral de los scaffolds es hidroxiapatita no estequiométrica, ya que al comparar estos
datos se comprueba la similitud, y aunque no son exactamente iguales, se encuentra
cerca al rango y existen además en la literatura valores reportados que sugieren que
esta relación de Ca/P puede variar desde 1,0 hasta 2,16, siendo por ejemplo las apatitas
biológicas carbonatadas, presentan un aumento en la relación Ca/P. La mayoría de
estudios aseguran que el valor estequiométrico de la hidroxiapatita es de 1,67, sin
embargo, otros más recientemente han atribuido a la hidroxiapatita un valor
estequiométrico de relación Ca/P que oscila entre 0,98 y 2,85 para el tejido óseo
lamelar adulto [3]. Este dato varía dependiendo de la calcificación del hueso, la
madurez, la presencia de otros compuestos, entre otros.
Scaffold de HA
Compuesto Peso (%) Elemento Peso (%) Moles Relación Ca/P
CaO 60,81 ± 0,24 Ca 43,48 ± 0,17 1,08 1,70 ± 0,02
P2O5 43,68 ± 0,24 Px 19,30 ± 0,11 0,62
104
Evaluación de Recubrimientos de Quitosano sobre
Scaffolds de HA
4.1.4. Espectroscopía de dispersión de energía (EDS).
Con ayuda de esta técnica se realiza una caracterización química de la composición de
los scaffolds de HA con el fin de especificar sus componentes, establecer su pureza y
determinar la relación Ca/P para asegurar que la relación molar siga siendo la más
cercana al hueso. En la figura 31 se observa una imagen obtenida al SEM para scaffolds
de HA obtenidos por gel-casting sin recubrimiento (utilizados como patrón) y un EDS
correspondiente a la zona señalada mostrando los elementos químicos presentes, se
observa el Ca, P y O como componentes principales indicando que se trata de scaffolds
de HA, se observa además que no hay presencia de otros componentes o impurezas en
cantidades significativas.
Figura 31. Imágenes obtenidas al SEM de scaffolds de HA por gel-casting (a) Espectros
EDS correspondiente a las superficies de los Scaffolds de HA (b).
Adicionalmente en la tabla 9 se muestra la composición química y los porcentajes de
estos elementos para varias áreas analizadas de los scaffolds de HA, la relación calcio/
fosforo promedio con su respectiva desviación estándar.
105
Evaluación de Recubrimientos de Quitosano sobre
Scaffolds de HA
Tabla 9. Análisis químico por EDS para scaffolds de HA sin recubrimiento.
Elemento Peso (%) Ca/P
O 35,8 ± 1,8
1,61 ± 0,05 P 18,5 ± 1,0
Ca 38,3 ± 0,9
De los datos obtenidos en los espectros de EDS para los scaffolds de HA se observa que
no hay elementos diferentes a los correspondientes a la HA y que la relación Ca/P se
encuentra en los rangos reportados para hueso de 1,67 mencionado anteriormente.
Al analizar los resultados de las tablas (8 y 9) obtenidos por las técnicas de FRX y EDS
conviene destacar la escasa diferencia entre los valores medios obtenidos con los dos
métodos. Sin embargo estas variaciones pueden deberse a la diferencia en la técnica y
sensibilidad de los métodos. El EDS es un método semi-cuantitativo el cual no es tan
sensible como otros métodos ópticos, por lo tanto no se considera adecuado para los
elementos ligeros o de bajo peso molecular, se puede presentar solapamiento de picos
y además detecta mayores cantidades de ruido en las señales, entre otros, estos
factores pueden afectar en el análisis de las muestras, este tipo de análisis es
complementario a medidas posteriores con otras técnicas más precisas. Por otro lado,
con la técnica FRX, debido a que la longitud de onda es única para cada elemento, esta
permite hacer una inequívoca identificación del elemento y además permite hacer
análisis cuantitativos, ya que la intensidad de los rayos X es proporcional a la
concentración del elemento [4].
4.1.5. Difracción de rayos X (DRX)
Esta caracterización resulta muy importante a la hora de estudiar la estabilidad de las
fases y determinar la cristalinidad de la HA, además de la presencia del quitosano como
recubrimiento. El análisis de los difractogramas permitió identificar los picos relevantes
de los materiales utilizados y estudiar la forma (amorfa o cristalina) de dichos
componentes, ya que estas propiedades pueden afectar las características de absorción
de agua y la biodegradabilidad sobre todo en los polímeros [5].
Los difractogramas de rayos X para los scaffolds de HA fabricados por gel-casting con y
sin recubrimientos de Qo se muestran en las figuras 32 y 33 para el menor y mayor
tiempo de exposición al recubrimiento respectivamente (5 y 20 min). En los
difractogramas los asteriscos (*) denotan los picos característicos del quitosano y los
círculos (o) denotan los picos de la hidroxiapatita. La figura 32 (a) muestra un
difractograma para scaffolds de HA sin recubrimiento, este se utilizó como patrón de
106
Evaluación de Recubrimientos de Quitosano sobre
Scaffolds de HA
comparación con los scaffolds recubiertos con Qo. Este espectro patrón muestra una
alta cristalinidad y sus picos característicos de mayor intensidad en 2θ = 31.7°, 32.2°,
32.9°, y unos de menor intensidad en 25.9°, 40, 46.7° y 49.4° lo que corresponde con lo
reportado en la literatura para la HA sintética [6].
Para los scaffolds de HA con recubrimientos de Qo a diferentes concentraciones con
menor tiempo de exposición (5 min), mostrados en las figuras 32 (b, c, d), se observa en
los difractogramas unas zonas más amorfas y con picos de menor intensidad en 10° y
20° que son característicos para el quitosano a las diferentes concentraciones con
variaciones muy pequeñas en la intensidad [7,8,9], sin embargo para los scaffolds de HA
con recubrimientos de Qo al 0,5% en la figura 32 (e) no hay presencia del pico en 20°, lo
que indica que en la muestra no había presencia de este polímero, esto puede dar una
leve idea de que cuando los scaffolds se recubren con menores concentraciones y
tiempos de exposición no hay una adhesión suficiente entre la superficie sólida y el
polímero.
Figura 32. Difractograma obtenido para scaffolds de HA preparados por gel-casting (a) scaffolds de HA con recubrimientos de Qo a diferentes concentraciones (b - e) con
menor tiempo de exposición (5min).
107
Evaluación de Recubrimientos de Quitosano sobre
Scaffolds de HA
Adicionalmente se observa en la tabla 10 los valores de los picos obtenidos para
scaffolds de HA, el quitosano comercial utilizado para los recubrimientos de los
scaffolds y los scaffolds obtenidos con el recubrimiento de Qo.
Tabla 10. Comparación de valores de los difractogramas de rayos X.
Picos 2θ
(°)
Qo comercial Scaffold HA
(patrón)
Scaffolds de HA
recubiertos con Qo
Primarios 9 - 10 32.2, 33.9, 34.9
11 y 20 Qo
19 - 20 32,33,34 HA
Secundarios 25.9, 46.7 y 49.4 26 y 47 HA
Menor Intensidad 30 28.8, 34.0 y 53.2 28, 50 y 53 HA
En la figura 33 se muestran igualmente los difractogramas para los scaffolds de HA con
y sin recubrimiento para un mayor tiempo de exposición al recubrimiento (20 minutos),
se observan igualmente los picos característicos.
Como era de esperar, todos los picos de HA se observan para todos los espectros DRX y
los picos característicos de quitosano para los scaffolds con recubrimientos, para la
menor concentración de 0,5% de Qo figura 33 (e) a diferencia de la figura 32 (e) si se
observó un pico en 20° típico del quitosano de baja intensidad. Esto puede indicar que
en poco tiempo es más difícil que la superficie de la HA sea recubierta por el quitosano,
ya que como se observa en los gráficos a medida que aumentan la concentración de
quitosano y los tiempos de exposición al recubrimiento, la intensidad de los picos de
quitosano también se ve aumentada, aunque en algunos sea poco perceptibles.
La cristalinidad de las muestras observadas en los difractogramas, en general, resulta de
la interacción intermolecular entre cadenas a través de enlaces de hidrogeno
intermolecular, enlaces de van der Waals (fuerzas atractivas o repulsivas que incluyen
atracciones entre átomos, moléculas y superficies, que constituyen las fuerzas
intermoleculares que dan cohesión a una estructura) que se forman entre la superficie
de la HA y el Qo (comportamiento catiónico), ya que es una unión de tipo mecánico que
se da debido a las cargas de ambos materiales (adhesión electrostática) [7].
108
Evaluación de Recubrimientos de Quitosano sobre
Scaffolds de HA
Figura 33. Difractograma obtenido para scaffolds de HA preparados por gel-casting (a) y para scaffolds de HA con recubrimientos de Qo a diferentes concentraciones (b - e) con
mayor tiempo de exposición (30min).
4.1.6. Espectroscopía Infrarroja por Transformada de Fourier (FTIR)
La figura 34 muestra el espectro FTIR del quitosano utilizado para los recubrimientos
(a), los scaffolds de HA preparados por gel – casting sin recubrimiento (b) y los scaffolds
de HA recubiertos con las diferentes concentraciones de Qo 0.5% (c), 1% (d) 1,5% (e) y
2% (f) obtenidas en el mayor tiempo de inmersión (20 min). Se observan los grupos
funcionales característicos en las bandas de absorción. En los espectros los asteriscos
(*) denotan los picos característicos del quitosano (Qo) y los círculos (o) denotan los
picos de la hidroxiapatita (HA).
109
Evaluación de Recubrimientos de Quitosano sobre
Scaffolds de HA
Figura 34. Espectro infrarrojo obtenido para el Qo (a), scaffolds de HA preparados por gel - casting (b) y scaffolds de HA con recubrimientos de quitosano a diferentes
concentraciones (c – f) a mayor tiempo de exposición (20 min).
La figura 34 (a) corresponde a un espectro con las bandas principales para el quitosano,
puede observarse un pico para el grupo amida I en aproximadamente 1630 cm-1, en
1550 cm-1 para NH2, en la banda 1200 cm-1 para la amida III y en 3450 para el grupo de
tensión OH–, estas bandas corresponden a valores muy similares reportados en la
literatura [8, 9]
En la figura 34 (b) se observan las bandas características para la HA. Los picos alrededor
de 630 cm-1 y 3570 cm-1 corresponden al estiramiento de los grupos hidroxil –OH
presentes en la HA o la absorción de agua. Se observan además las bandas de absorción
110
Evaluación de Recubrimientos de Quitosano sobre
Scaffolds de HA
del fosfato PO43- en aproximadamente 1024 cm-1 y en 560 cm-1 una de las señales más
importantes para la HA [10, 11]. Una HA típica muestra bandas para un espectro FTIR en
(3600, 3569, 3578, 3448 y 633) cm-1 correspondientes a grupos OH-; bandas en (474,
571, 601, 692, 1032 ≈ 1087, 1092, 1040) cm-1 correspondientes a grupos PO43- y bandas
entre (870, 1420 y 1480) cm-1 si la muestra contiene grupos CO3- [10].
En los espectros de los scaffolds de HA con recubrimiento de Qo a diferentes
concentraciones figura 34 (c - f) son observadas bandas características del grupo
carboximetil del Qo (*) los cuales aparecen alrededor 1580 y 1400 cm-1. Como era de
esperarse todos los picos de HA y Qo son observados para los scaffolds recubiertos [12,
13]. Estos espectros de FTIR indicaron también un desplazamiento de bandas
características de la amina (1630 cm-1) y la amida (1550 cm-1) en el quitosano para
reducir el número de onda en el compuesto como resultado de la interacción entre el
quitosano y la HA, a través de enlaces de hidrógeno entre -NH2 y -OH, así como la
quelación entre -NH2 y Ca2+ [13]. Puede observarse además en estos espectros que la
magnitud de estas bandas se volvió más débil y estrecha debido a la hibridación in situ.
La estructura fina e intensa de las señales pertenecientes a los espectros (c, d, e y f)
representa un claro indicio de la elevada estabilidad que posee el recubrimiento
obtenido, la cual aumenta con el aumento de la concentración de quitosano, como se
observa en el gráfico.
Es importante destacar que algunos picos característicos del quitosano se solapan por
los de hidroxiapatita, además de la aparición de una banda distinta que se detectó en
1550 cm-1, lo que significa la formación de un enlace -C=N- debido a la interacción entre
la HA y el quitosano en los scaffolds recubiertos.
Las bandas características principales de los diferentes grupos funcionales presentes en
scaffolds de HA con recubrimientos de Qo se muestran en la Tabla 11.
Tabla 11. Bandas de vibración reportadas en la literatura [13].
Compuesto Asignación Frecuencia Infrarroja (cm-1)
Qo Amina –NH2 1544
Qo Amida –CONH2 1631
Qo Metileno –CH2 2887
HA PO4 555
HA PO4 1024
HA Carbonato CO32 1382
HA OH estructural 3431
111
Evaluación de Recubrimientos de Quitosano sobre
Scaffolds de HA
El FTIR de la figura 34 reveló la presencia de fases características en las muestras de HA
con y sin recubrimiento, lo que concuerda con lo mostrado en los análisis de DRX y la
literatura.
En la figura 35 se muestran los espectros infrarrojos reportados en la literatura por
Ruphuy y col. (2016) para una pasta de hidroxiapatita HAp pulverizada (a) y quitosano
CS (b) usados como muestras estándar, los espectros de ambas muestran las bandas
típicas de sus grupos principales, para la HAp se observa el grupo fosfato PO4 en picos a
1093 y 1032 cm-1 y bandas en 3567 cm-1 para el grupo hidroxilo OH, mientras que las
bandas en 3421 y 1653 cm-1 se asignan al agua absorbida. Los grupos característicos del
quitosano también se confirmaron en el correspondiente espectro (b), donde la banda a
3468 cm-1 fue asignada al modo de estiramiento del grupo OH, solapada con el modo
de estiramiento de NH. Los picos a 1300-1450 cm-1 pueden corresponder a una
combinación de CN-NH, CH2-OH y bandas CH3.
Para los espectros en (c y d) correspondientes a partículas híbridas de HAp y CS
presentan todas las bandas típicas de los grupos característicos de la HAp y el
quitosano, lo que demuestra que las partículas de HAp se incorporan en una matriz de
quitosano dando lugar a productos finales con diferentes propiedades [14]. Esta
información corrobora lo que sucede igualmente con los espectros mostrados en esta
investigación donde se observó una coincidencia para los picos característicos para los
materiales estándar (HA y Qo) y para los recubrimientos de Qo sobre los scaffolds de HA
los espectros muestran algunos cambios en las bandas de vibración y corrimientos,
obteniéndose un material con características de ambos, pero propiedades diferentes.
112
Evaluación de Recubrimientos de Quitosano sobre
Scaffolds de HA
Figura 35. Espectro Infrarrojo de estándares de hidroxiapatita HAp (a), quitosano CS (b) y partículas hibridas de HAp – CS a diferentes concentraciones (c y d) obtenido por
Ruphuy y col. (2016) [14].
113
Evaluación de Recubrimientos de Quitosano sobre
Scaffolds de HA
4.2. CARACTERIZACIÓN MORFÓLOGICA Y SUPERFICIAL DE LOS SCAFFOLDS
La morfología y superficie de las muestras se analizó mediante Microscopía estereoscópica y Microscopía electrónica de barrido (SEM). A continuación, se muestran las fotografías de los scaffolds de HA con y sin recubrimientos en seco y se hace una breve descripción de algunas características de su estructura, morfología y porosidad.
4.2.1. Estereomicroscopía de la superficie de los scaffolds
El estereomicroscopio tiene la capacidad de mostrar objetos de mayor tamaño con
profundidad, una característica muy importante a la hora de evaluar un scaffold, sin
embargo, esto se da a muy bajos aumentos. En la figura 36 se muestran las fotografías
de scaffolds de HA sin recubrimientos tomadas en el Estereomicroscopio marca Zeiss
DV4 con aumentos de 8X y 16 X respectivamente.
Figura 36. Scaffolds de HA preparados por gel-casting vistos con aumentos de 8X (a) y
16X (b) al estereomicroscopio.
Se observa en éstos una estructura totalmente porosa, este tipo de morfología se debe
a la utilización de la técnica de gel-casting la cual permite obtener poros
interconectados, homogéneos y de diferentes tamaños que pueden ir desde los 200 µm
hasta los 800 µm aproximadamente. Esta información cuantitativa se corrobora mejor
con las imágenes obtenidas al SEM.
En la figura 37 se observan algunas fotografías de scaffolds de HA con recubrimientos
de Qo a diferentes concentraciones 1,5% y tiempos de inmersión 5 y 20 min (a y b
114
Evaluación de Recubrimientos de Quitosano sobre
Scaffolds de HA
respectivamente) y 2% y tiempos de inmersión 5 y 20 min (c y d respectivamente)
obtenidos por gel-casting/inmersión, a menores concentraciones no se logra obtener
en este equipo con tan pocos aumentos imágenes del recubrimiento debido a las
características del film de Qo que se forma sobre la superficie de HA. La adhesividad y
transparencia de éste dificulta observarlo claramente, sin embargo en las imágenes se
resalta mediante flechas azules la presencia del recubrimiento como zonas brillantes en
algunas partes de los scaffolds, sin embargo pese a esto se observan las características
de porosidad interconectada y superficie que concuerdan con las imágenes obtenidas
en la figura 36 para los scaffolds no recubiertos. Otra característica importante de
destacar es que no se presenta aparentemente taponamiento de los poros por la
presencia de los recubrimientos para ninguna de las concentraciones, esta información
será corroborada también con las imágenes obtenidas al SEM.
Figura 37. Scaffolds de HA con recubrimientos de Qo observadas al estereomicroscopio
en aumentos de 8X y 16X.
115
Evaluación de Recubrimientos de Quitosano sobre
Scaffolds de HA
Debido a la porosidad de todas las muestras es difícil diferenciar defectos, fisuras u
otras características importantes para estas; sin embargo, se observa la similitud en la
morfología para cada scaffold, su estructura porosa e interconectada y en los scaffolds
con recubrimiento hay presencia de una capa semi-transparente y brillante
perteneciente al Qo. Los recubrimientos tienen superficies irregulares debido a la
variación en el tamaño de las partículas de polvo dispersadas en cada substrato
mediante la técnica de inmersión.
La porosidad es un efecto relevante a la hora de explicar el comportamiento mecánico y
biológico de los scaffolds, debido a que estos representan concentradores de tensiones
cuando tienen un mayor tamaño, ya que si se someten a grandes esfuerzos estos
pueden conectarse formando planos de falla que alteran su desempeño; además se
puede producir el desprendimiento del recubrimiento. Sin embargo, obtener una
estructura porosa es importante debido a que esta característica está relacionada con la
proliferación e interacción celular, ya que deben estar en un rango adecuado para que
se den estos fenómenos celulares.
4.2.2. Microscopía electrónica de barrido (SEM)
La caracterización de las muestras mediante SEM permitió establecer la morfología,
uniformidad, distribución de los poros, además de otras características superficiales
para su posterior análisis. Se realizaron evaluaciones, tanto en la zona superficial, como
en un corte transversal, para observar la composición química y estructura de las
muestras obtenidas. Estas imágenes de scaffolds de HA (andamiajes para regeneración
tisular) con y sin recubrimiento de Qo están constituidos mediante canales (poros
interconectados), las cuales se muestran a continuación y se hace una descripción y
análisis de su distribución, morfología externa e interna, microestructura superficial
porosa y tamaño e interconectividad de los poros, características que dan idea de la
importancia de estos materiales como soporte para el cultivo de las células, las cuales
pueden promover o suspender el crecimiento celular y la circulación de nutrientes [15].
En la figura 38 se muestran fotografías al SEM de scaffolds de HA obtenidos por gel-
casting sin recubrimientos de Qo a diferentes aumentos de 40X (a), 500X (b), 1000X (c)
y 2500X (d).
116
Evaluación de Recubrimientos de Quitosano sobre
Scaffolds de HA
Figura 38. Scaffolds de HA obtenidos por gel-casting observados al SEM en aumentos de 40X (a), 500X (b), 1000X (c) y 2500X (d).
Como se observa en la figura 38 (a), para los scaffolds de HA obtenidos por gel-casting,
la geometría de los poros es bastante similar a lo reportado en la literatura, se observa
además una estructura macroporosa y altamente interconectada con tamaño de poro
comprendido en el intervalo de los 100 a 600 µm. Este tipo de morfología y dimensión
de poro ha demostrado ser adecuado para fines en ingeniería de tejido óseo [15, 16,
17].
En la figura 38 (b) se muestra más de cerca uno de los poros abiertos de la estructura, el
cual se conecta con otro poro más pequeño que va hacia el interior de la muestra, lo
que supone que los poros están interconectados y se observan interconexiones entre
los 100 y 400 micrómetros aproximadamente.
117
Evaluación de Recubrimientos de Quitosano sobre
Scaffolds de HA
En las figuras 38 (c) y (d) se muestra la superficie de la HA la cual se presenta en forma
de cristales característicos y algunas partículas aglomeradas, las cuales corresponden a
lo reportado en la literatura para scaffolds obtenidos de HA por diferentes técnicas
como las que se muestran en la figura 39 (a) y (b) [16, 17, 18].
Figura 39. Scaffolds de HA reportados en la literatura observados al SEM a diferentes
aumentos 500X, 1000X y 2000X, poros esféricos de 100–200 µm (a), superficie de scaffolds (b) [16, 17, 18].
En las figuras 40 a 43 a continuación se muestran las fotografías obtenidas al SEM (a)
con su respectivo EDS (b) para los scaffolds de HA recubiertos con las diferentes
concentraciones de Qo (0.5%, 1%, 1.5% y 2%) obtenidos por gel-casting/inmersión para
el menor tiempo (5min), en aumentos de 500X, 1000X y 2000X.
118
Evaluación de Recubrimientos de Quitosano sobre
Scaffolds de HA
Figura 40. Imágenes al SEM y EDS obtenidos para scaffolds de HA con recubrimiento de Qo al 0.5%, menor tiempo de inmersión (5 min) en aumento de 1000X.
Figura 41. Imágenes al SEM y EDS obtenidos para scaffolds de HA con recubrimiento de
Qo al 1%, menor tiempo de inmersión (5 min) en aumento de 2000X.
119
Evaluación de Recubrimientos de Quitosano sobre
Scaffolds de HA
Figura 42. Imágenes al SEM y EDS obtenidos para scaffolds de HA con recubrimiento de Qo al 1.5%, menor tiempo de inmersión (5 min) en aumento de 500X.
Figura 43. Imágenes al SEM y EDS obtenidos para scaffolds de HA con recubrimiento de Qo al 2%, menor tiempo de inmersión (5 min) en aumentos de 500X.
Se observa en estas imágenes la superficie característica de la HA en forma de cristales, una estructura porosa e interconectada para todos los scaffolds obtenidos, sin embargo en las diferentes fotografías al SEM de los scaffolds de HA sin recubrimiento los cristales de HAP están presentes como bloques, mientras que en los scaffolds con recubrimientos de Qo, el recubrimiento se deposita como una película o film con granos de material orgánico sobre los scaffolds de HA, revistiendo estos bloques.
120
Evaluación de Recubrimientos de Quitosano sobre
Scaffolds de HA
El grosor de estos recubrimientos es delgado, pero es difícil de cuantificar numéricamente sus espesores (pueden estar entre 1 y 2 µm aproximadamente). Es importante resaltar la presencia de Carbono mostrada en los EDS para todos los scaffolds con recubrimiento de Qo, a menor concentración del polímero disminuye la cantidad de C en el espectro.
En las figuras 44 a 47 a continuación se muestran igualmente las fotografías al SEM (a) y
su respectivos EDS (b) para los scaffolds de HA recubiertos con las diferentes
concentraciones de Qo (0.5%, 1%, 1.5% y 2%) obtenidos por gel-casting/inmersión para
el mayor tiempo (20 min), en aumentos de 500X, 1000X y 2000X.
Figura 44. Imágenes al SEM (a) y EDS (b) obtenidos para scaffolds de HA con recubrimiento de Qo (0.5%), mayor tiempo de inmersión (20 min) aumento de 500X.
Figura 45. Imágenes al SEM (a) y EDS (b) obtenidos para scaffolds de HA con recubrimiento de Qo (1%), mayor tiempo de inmersión (20 min), aumentos de 2000X.
121
Evaluación de Recubrimientos de Quitosano sobre
Scaffolds de HA
Figura 46. Imágenes al SEM (a) y EDS (b) obtenidos para scaffolds de HA con recubrimiento de Qo (1.5%), mayor tiempo de inmersión (20 min), aumento de 500X.
Figura 47. Imágenes al SEM (a) y EDS (b) obtenidos para scaffolds de HA con recubrimiento de Qo (2%), mayor tiempo de inmersión (20 min), aumento de 2000X.
Al comparar las imágenes al SEM de los scaffolds con y sin recubrimiento de quitosano
(a los diferentes tiempos de inmersión) no se observan diferencias significativas en
cuanto a porosidad, sin embargo, si hay diferencias en cuanto a su superficie y
presencia de una capa o film orgánico que bordea los cristales de la HA en sobre todo
en el caso de los scaffolds con recubrimientos al 1, 1.5, y 2%. Se puede apreciar en estos
que el film de Qo está distribuido homogéneamente sobre la superficie de los scaffolds
122
Evaluación de Recubrimientos de Quitosano sobre
Scaffolds de HA
de HA, formando una estructura igualmente porosa, esto sugiere una buena adhesión
(aunque no fue corroborado directamente con esta técnica), sin embargo cabe resaltar
que a medida que se aumentó la concentración de quitosano la capa adherente que se
forma sobre los scaffolds es relativamente más gruesa y en los que están recubiertos
con el 2% de Qo se ve un leve taponamiento de los poros en algunas zonas. Para los
demás la morfología permanece semejante lo que indica que la incorporación de
diferentes porcentajes de Qo no afecta la morfología de la muestra, sin embargo, es
importante resaltar los componentes presentes en el EDS, la presencia del C del
material orgánico (Qo) favorece la respuesta biológica.
En las imágenes de todos los especímenes se observó que los poros estaban
interconectados debido a que las paredes que forman las cavidades son discontinuas.
Los recubrimientos en los scaffolds de HA se componen de diferentes cantidades,
espesores y orientaciones para cada una de las concentraciones de Qo utilizadas, lo que
se corrobora en el EDS con la composición química y presencia de Carbono (C) atribuido
al quitosano ya que los demás elementos que componen este material no son
detectados por esta técnica. Las concentraciones más bajas de polímero (0.5 %Qo en
ambos tiempos) generan superficies de recubrimiento más suaves sobre los scaffolds
sin embargo hay mayor cantidad de zonas desiertas que no presentan recubrimiento
del material orgánico Qo, lo que indica que hubo poca impregnación o adhesión de las
partículas del polímero durante el método de inmersión.
Otra característica importante a resaltar de los recubrimientos de Qo sobre los scaffolds
de HA es la apariencia de éstos, ya que todas las películas que se formaron exhibieron
una morfología superficial uniforme y lisa, se observan además flexibles, no quebradizas
y sin grietas, ni tampoco partículas de quitosano no disuelto sobre éstos, por lo tanto, la
mejora de las propiedades mecánicas con el recubrimiento de quitosano puede inhibir
el desprendimiento severo de partículas y el colapso de la estructura de los scaffolds de
HA. Esta observación podría estar relacionada con la buena deposición o adhesión que
se produjo entre el Qo y la superficie de HA mediante la adaptación de una metodología
sencilla durante la inmersión en el polímero. Esto puede explicarse debido a que el
quitosano es mucho más reactivo que otros polímeros naturales. Puede ser definido
como una poliamina lineal de alto peso molecular con grupos amino e hidroxilo
reactivos. Se comporta como un polielectrolito catiónico y por debajo de pH 6,5
presenta una alta densidad de carga, por lo tanto, este se adhiere fácilmente a las
superficies cargadas negativamente, en este caso el sustrato de HA [19].
En la tabla 12 se muestra de forma resumida algunas características que se observaron
para los scaffolds con y sin recubrimiento de Qo al SEM.
123
Evaluación de Recubrimientos de Quitosano sobre
Scaffolds de HA
Tabla 12. Características obtenidas al SEM reportadas para los scaffolds de HA con recubrimientos de Qo a diferentes concentraciones y tiempos.
Nomenclatura Observaciones
0,5% - 1T Poros interconectados, sin aparente taponamiento.
0,5% - 2T Poros interconectados, sin aparente taponamiento.
1% - 1T Poros interconectados, sin aparente taponamiento.
1% - 2T Poros interconectados, capa de polímero embebiendo la superficie
del scaffold, sin aparente taponamiento.
1,5% - 1T Poros interconectados y leve taponamiento con formación de capa
delgada sobre algunas zonas en la superficie del scaffold.
1,5% - 2T Poros interconectados con formación de capa aparentemente gruesa
y leve taponamiento en algunas zonas.
2% - 1T Poros interconectados y leve taponamiento en algunas zonas
2% - 2T
Poros interconectados y formación de capas de polímeros levemente
gruesas sobre la superficie del scaffold y taponamiento de poros en
algunas zonas
Patrón HA Estructura macroporosa, porosidad interconectada, superficie
rugosa, no hay recubrimiento polimérico.
*Nota: 1T = 5min, 2T=20min
4.2.3. Ensayo de degradabilidad in vitro en SBF
Esta prueba fue planteada para determinar el porcentaje de pérdida de masa, como
indicativo de degradación de los scaffolds, se realizaron ensayos de gravimetría, para los
cuales se consideraron los datos de peso inicial (Wi) de las muestras antes de su
inmersión en la solución, así como también los valores de los pesos húmedos (Wf). Cada
muestra fue introducida en un recipiente cubierto totalmente que contenía SBF con
temperatura aproximadamente constante de 37°C.
Los datos de degradabilidad fueron registrados y reportados en la tabla 13 para los
scaffolds con y sin recubrimiento de quitosano.
124
Evaluación de Recubrimientos de Quitosano sobre
Scaffolds de HA
Tabla 13. Porcentaje de pérdida de peso de los scaffolds (Degradabilidad).
Recubrimiento de Qo (concentración y tiempo)
Pérdida Peso ± D.E (%)
0,5% - 1T 6,76 ± 3,76
0,5% - 2T 3,92 ± 0,19
1% - 1T 6,12 ± 2,90
1% - 2T 4,44 ± 1,11
1,5% - 1T 4,52 ± 0,11
1,5% - 2T 2,95 ± 0,98
2% - 1T 4,27 ± 0,25
2% - 2T 1,31 ± 0,74
Patrón HA 8,85 ± 0,83
Nota: 1T = 5min, 2T = 20 min (Inmersión)
Los análisis de estos datos del ensayo de degradación permitieron obtener información
sobre la variación de la masa, hinchamiento, pérdida de material y posible protección
de los scaffolds de HA con la formación de películas de Qo sobre estos, en un sistema
de degradación hidrolítica y por cambios de pH, mostrando diferentes resultados para
cada concentración de polímero. Cambios superficiales fueron detectados mediante la
variación del pH y desintegración del material, los cuales fueron relacionados con la
transferencia de carga a través de la interfase polímero/solución y cerámico/polímero y
que están directamente relacionadas con la pérdida de masa del polímero, cabe resaltar
que al hablar de degradabilidad se refiere a la desintegración de la estructura de los
scaffold de HA, ya que por ser el film de Qo sobre la superficie de estos tan delgado, es
casi imperceptible algún cambio en el peso con respecto solo al polímero.
En la figura 48 se muestra estos datos en forma de gráficos de columnas, con su
respectiva desviación estándar, para mejor visualización y análisis de los resultados
obtenidos.
125
Evaluación de Recubrimientos de Quitosano sobre
Scaffolds de HA
Figura 48. Gráfico de barras obtenido para la pérdida de peso de los scaffolds de HA con y sin recubrimiento de Qo con su respectiva D.E.
De los datos obtenidos se puede deducir que el valor de pérdida de masa mayor se
presentó en los scaffolds de HA patrón (sin recubrimiento) indicando un aumento en la
degradación del material. Finalmente, el valor más bajo se observó en los scaffolds de
HA con una concentración mayor de Qo y tiempo de inmersión (2%Qo - 2T), puede
destacarse además de este gráfico que a medida que va disminuyendo la concentración
de Qo y el tiempo de inmersión utilizados para recubrir los scaffolds de HA la pérdida de
masa aumenta en gran medida, lo que indica que a mayores porcentajes de Qo y mayor
tiempo de inmersión hay una mayor resistencia a la degradación o pérdida de material
debido a la estabilidad y compactibilidad que les proporcionó a los scaffolds de HA la
capa de polímero que se formó sobre estos, mejorando además sus propiedades
mecánicas y de desintegración.
Una variedad de polímeros hidrolíticamente degradables se han desarrollado y probado
en aplicaciones como scaffolds para ingeniería de tejidos, entre estos se encuentra el
quitosano, su comportamiento biodegradable y capacidad para formar films sobre una
superficie es una ventaja para esta área, además de la cirugía reconstructiva ya que
estos materiales no tienen que ser retirados y pueden dejar espacio para la
regeneración de tejidos mientras se degradan por procesos naturales y dan espacio a la
vascularización del tejido con mayor rapidez actuando además como barreras
protectoras y mejorando las propiedades mecánicas cuando es integrado a otro tipo de
materiales como la HA.
6,76
3,92
6,12
4,44 4,52
2,95
4,27
1,31
8,85
3,77
0,20
2,90
1,11
0,11
0,99 0,25 0,74 0,83
DEGRADABILIDAD (%)
PÉRDIDA DE PESO (%) D.E
126
Evaluación de Recubrimientos de Quitosano sobre
Scaffolds de HA
Es importante este ensayo debido a que la degradación del quitosano se debe
principalmente a la susceptibilidad de ser hidrolizado enzimáticamente. Las
macromoléculas son comúnmente degradadas fuera de las células a unidades mono o
diméricas por la acción de exoenzimas y esos productos son absorbidos por las mismas.
Y es debido a su biodegradabilidad que el quitosano abre un gran potencial económico
y benéfico en el área de los empaques y películas o recubrimientos, dada las similitudes
con los materiales sintéticos [20]. Sin embargo, debe tenerse en cuenta que la
biodegradación depende del tamaño del implante, de su forma, densidad, lugar de
implantación y peso molecular del material empleado.
La comparación de los datos se efectuó por medio de test de hipótesis o contrastes de
hipótesis, con lo que se pudo determinar si las medias de los valores fueron diferentes o
iguales.
Para la degradabilidad se plantearon las siguientes hipótesis nula y alterna:
Ho(D): la degradabilidad para todas las muestras es igual µD1 = µD2 = µD3 = µD4
Ha(D): la degradabilidad para alguna muestra es diferente µD1 ≠ µD2
Figura 49. Estadística descriptiva para datos de degradabilidad de las muestras.
127
Evaluación de Recubrimientos de Quitosano sobre
Scaffolds de HA
Como se observa en los gráficos de la figura 49, la distribución de los datos de degradabilidad es levemente asimétrica sesgada poco a la derecha (sesgo positivo), sin presencia de datos atípicos. Para la degradabilidad se obtiene un P-valor = 0,00018, por lo tanto, se rechaza la hipótesis nula para alfa (α) = 0,05, que dice que la degradabilidad para todos los % de concentración de polímero es igual.
En este ensayo también se determinó a su vez el cambio de pH que experimentaron
cada uno de los scaffolds de HA con y sin recubrimiento sumergidos en la solución de
SBF durante los 21 días. En las figuras 50 y 51 se muestran los resultados de este ensayo
para el menor y mayor tiempo de inmersión respectivamente. La determinación del pH
de los medios hidrolíticos experimentó variaciones apreciables, donde se obtuvo un
aumento del pH a valores alcalinos rápidamente para todos los scaffolds de HA con y sin
recubrimiento de Qo, excepto para los scaffolds de HA con recubrimiento de Qo al 2% y
mayor tiempo de inmersión, donde los valores se mantuvieron más estables.
Figura 50. Gráfico de pH vs tiempo para scaffolds de HA con y sin recubrimiento de Qo para el menor tiempo de inmersión.
7
7,5
8
8,5
9
9,5
0 7 14 21
pH
Tiempo (días)
pH vs Tiempo
0,5%Qo - 1T
1%Qo - 1T
1,5%Qo - 1T
2%Qo - 1T
HA patrón
128
Evaluación de Recubrimientos de Quitosano sobre
Scaffolds de HA
Figura 50. Gráfico de pH vs tiempo para scaffolds de HA con y sin recubrimiento de Qo
para el mayor tiempo de inmersión.
Puede verse de las gráficas anteriores que las películas de quitosano más delgadas
(menor concentración de Qo) tienen una mayor permeabilidad a la solución de SBF, el
pH aumenta más rápidamente en los scaffolds con menor concentración de polímero y
a menores tiempos de inmersión (5 min). Esta propiedad se ve mejorada en los
recubrimientos de mayor concentración de polímero y mayores tiempos de inmersión
(20 min) debido a que demuestran aumento de la permeabilidad, por lo que la
interacción e intercambio de iones se ve disminuida.
Los scaffolds de HA patrón (sin recubrimiento de Qo), muestran cambios de pH mucho
más alcalinos con respecto a los scaffolds de HA con recubrimientos de Qo, cabe
destacar que estos cambios de pH tan altos no son adecuados para mejorar la viabilidad
celular, por ejemplo el pH en la sangre humana tiene una gama muy estrecha de
alrededor de 7,35 a 7,45. El pH interno en la mayoría de los microorganismos está en el
rango de 6,0 a 8,0. Si el pH del cuerpo se desvía de este rango las células dejan de
funcionar correctamente y pueden obstaculizar la eficiencia de la química y las
funciones del organismo [21]. El comportamiento de la degradación fue similar en todos
los casos y se caracterizó por una degradación lenta cambios de pH muy altos en los
primeros días, más notorios en los scaffolds de HA sin recubrimiento.
7
7,5
8
8,5
9
9,5
0 7 14 21
pH
Tiempo (días)
pH vs Tiempo
0,5%Qo - 2T
1%Qo - 2T
1,5%Qo - 2T
2%Qo - 2T
HA patrón
129
Evaluación de Recubrimientos de Quitosano sobre
Scaffolds de HA
La Figura 52 representa un esquema que muestra cómo sería la degradación de las
películas de Qo en solución SBF. En la imagen se observan tres interfaces:
polímero/electrolito, capa adsorbida/polímero y cerámico/polímero. Se observa que la
película obtenida y degradada presenta inicialmente un posible hinchamiento las
primeras horas debida a la penetración de la solución acuosa en el polímero, después se
presenta la degradación de la película, la cual está asociada a una disminución de la
masa del recubrimiento, aumentando el comportamiento resistivo por la formación de
poros y a la captura de electrolitos en estos poros. Después de penetrar en los poros, la
propagación del electrolito entre el cerámico y la película delgada, aumenta la fracción
del área del cerámico expuesto a la solución. Al mismo tiempo, la capa de Qo disminuye
su valor inicial, lo cual confirma un aumento de heterogeneidades superficiales por la
capa parcialmente degradada.
Figura 52. Representación de la degradación de las películas de Qo en SBF
Los cambios que se producen en el pH se deben principalmente a la interacción entre
los iones calcio y fosfato del electrolito y el scaffold de HA, ya que hay presencia de una
interfase relacionada con adsorción, formando productos en la superficie del polímero
que está en constante degradación. Cabe destacar que los productos de degradación
del Qo son la glucosamina o la N-acetil glucosamina, los cuales se dispersan en el
organismo sin ningún efecto tóxico en el mismo [22].
Los biomateriales poliméricos degradables poseen un alto potencial para ser aplicados
como recubrimientos en las prótesis para regeneración ósea. Por tal motivo se hace
necesario estudiar las propiedades de biodegradación de estos materiales con el fin de
determinar su estabilidad durante los procesos de osteointegración con el cuerpo
humano en la rehabilitación de huesos fracturados o en los reemplazos por enfermedad
ósea [23].
130
Evaluación de Recubrimientos de Quitosano sobre
Scaffolds de HA
4.2.4. Porosidad e interconectividad de los scaffolds
A continuación, en la tabla 14 se presentan los resultados obtenidos de porosidad
(abierta, másica, y total) e interconectividad obtenidas para los scaffolds de HA con y sin
recubrimiento de Qo a diferentes concentraciones y tiempos de inmersión en el
polímero.
Tabla 14. Resultados de Porosidad e Interconectividad para los scaffolds de HA con y sin recubrimiento de Qo y su respectiva D.E.
En la tabla 14 se comparan los tamaños de poro obtenidos para los diferentes
tratamientos. Todos los scaffolds presentaron alta porosidad e interconectividad entre
el 70 y 85% de porosidad total y entre el 45 y 70% de interconectividad
aproximadamente, ambos datos con desviaciones estándar relativamente bajas. Se
observó que todos los scaffolds tienen tamaño de poros bien definidos y semejantes
antes y después de ser recubiertos con quitosano, la mayor influencia en este
parámetro la da el recubrimiento, ya que se observa una disminución en la
interconectividad a medida que aumenta la concentración de Qo usada como
recubrimiento y el tiempo de inmersión.
El tamaño de poro medio es un aspecto esencial en scaffolds para ingeniería tisular. Es
importante destacar que si los poros son demasiado pequeños las células no pueden
migrar hacia el centro de la matriz por tanto la difusión de nutrientes y la eliminación de
productos de desecho serán limitados. De modo contrario si los poros son demasiado
grandes se produce una disminución en el área superficial específica y la unión de
células disponibles será limitada. Sin embargo, la relación entre el tamaño de los poros
Nomenclatura
Porosidad Abierta (%)
Porosidad
Másica (%)
Porosidad Total (%)
Interconectividad
(%)
HA patrón 49,92 ± 12,8 96,93 ± 5,5 82,17 ± 1,0 66,89 ± 7,8
0,5%Qo - 1T 54,81 ± 7,1 91,87 ± 11,7 80,34 ± 1,2 68,15 ± 7,8
0,5%Qo - 2T 53,15 ± 0,8 70,71 ± 0,9 76,40 ± 0,2 69,55 ± 0,8
1%Qo - 1T 46,05 ± 3,5 70,29 ± 5,7 79,24 ± 0,1 54,86 ± 0,2
1%Qo - 2T 44,10 ± 0,9 65,12 ± 1,7 75,46 ± 5,3 53,73 ± 1,6
1,5%Qo - 1T 44,89 ± 5,4 90,29 ± 7,3 83,42 ± 0,6 54,72 ± 4,8
1,5%Qo - 2T 37,22 ± 5,6 75,85 ± 1,3 78,78 ± 3,1 46,52 ± 4,4
2%Qo - 1T 42,71 ± 2,1 64,77 ± 17,7 78,15 ± 7,0 54,99 ± 7,6
2%Qo - 2T 42,83 ± 3,0 80,21 ± 1,2 83,67 ± 0,1 49,39 ± 1,2
131
Evaluación de Recubrimientos de Quitosano sobre
Scaffolds de HA
del scaffold y la actividad de las células es poco conocida y como resultado hay informes
contradictorios en la literatura sobre el tamaño óptimo de los poros requerido para el
éxito de la ingeniería tisular. Estudios previos en ingeniería de tejidos óseos han
indicado que el intervalo de tamaños de poro medios (96 a 150 µm) facilita una unión
óptima. Otros estudios han demostrado la necesidad de poros más grandes (300 a 800
µm) para un crecimiento óseo exitoso en scaffolds. Estos resultados contradictorios
indican que debe establecerse un equilibrio entre la obtención de la unión celular
óptima y facilitar el crecimiento del tejido óseo [24, 25, 26].
En estudios más recientes se ha discutido sobre el efecto del tamaño medio de los
poros en scaffolds y se ha determinado en ingeniería de tejido óseo un tamaño de poro
> 100 µm son deseables, así como una alta interconectividad de éstos, con el fin de
facilitar la fijación y la proliferación de las células, el crecimiento interno de nuevo tejido
formado y la mejora de la vascularización [25].
Por otro lado, las porosidades típicas reportadas en la literatura varían entre un amplio
rango que va desde el 40 al 92% [25, 26, 27, 28], los resultados obtenidos en la
experimentación se encuentran dentro de este rango.
En la figura 53 se muestra un esquema de como las células que se unen a los scaffolds
microestructurados aplanándose, por lo tanto presentan una morfología similar a la
asumida en la superficie plana.
Figura 53. Morfología celular en scaffold microporoso [29].
En lo que respecta a la IT ósea, específicamente el tamaño ideal del poro está
reportado que varía entre 100 y 500 μm [30, 31]. Para que se dé una correcta
osteogénesis, es necesaria una adecuada vascularización del tejido, por lo que los poros
son un elemento significativo y no solo la presencia de estos, sino además el control de
132
Evaluación de Recubrimientos de Quitosano sobre
Scaffolds de HA
su tamaño medio. Se consigue una adecuada vascularización del tejido con poros de
aproximadamente 200 micrómetros [32]. Distintos estudios parecen mostrar que, poros
de tamaño inferior a 50 μm favorecen la formación de tejido fibroide (que desencadena
un aumento en la producción y deposición de matriz extracelular y por tanto algunas
enfermedades), poros menores de 100 μm, favorecen el desarrollo de tejido osteoide, y
poros de tamaño mayor de 100 μm, dan lugar a la formación de hueso mineralizado
[33].
El objetivo del scaffold es la interacción celular, para ello, es necesaria la presencia de
determinados grupos químicos o ligandos, en la superficie del material. La superficie
disponible dentro de un poro, va a influir en la cantidad de ligando que pueden
adherirse al constructo, que influirá directamente en la adhesión celular. Esto depende
de la mediada del tamaño de los poros en el scaffold. Por tanto, los poros deben ser lo
suficientemente grandes para permitir que las células migren a la estructura, donde
finalmente quedarán ancladas a los ligandos, pero lo suficientemente pequeño para
establecer una superficie específica suficientemente alta, lo que lleva a una mínima
densidad de ligando que permite la unión eficiente de un número crítico de las células
al scaffold. El tamaño de los poros dependerá fundamentalmente del tipo de célula que
sea necesaria, así como de los ligandos que estas células requieran [33].
Además de las mediciones cuantitativas de porosidad e interconectividad de los scaffold
obtenidas anteriormente con ayuda del protocolo de Liu y colaboradores [34], se
obtuvo la medición de los tamaños de poro promedio para todos los scaffolds de HA
con y sin recubrimientos de Qo a través de un análisis usando el software de la
herramienta del SEM procesando las imágenes a una escala de colores negro y blanco.
En la figura 54 se observan las imágenes obtenidas a partir de SEM para los scaffold HA
patrón, es decir, sin ningún recubrimiento de polímero con algunas medidas de los
tamaños de sus poros.
En las figuras 55 y 56 se muestran los scaffolds de HA con recubrimientos de Qo a
diferente concentración y menor tiempo de inmersión (5 min) y mayor tiempo de
inmersión (20 min) respectivamente. Se observan igualmente las estructuras porosas
para cada scaffold y una serie de líneas (verdes) que muestran los diámetros de los
poros con sus respectivas medidas, también se puede observar la capa de polímeros
sobre algunos de éstos, principalmente los de mayor concentración.
133
Evaluación de Recubrimientos de Quitosano sobre
Scaffolds de HA
Figura 51. Estructura y medidas de porosidad obtenidas al SEM para scaffolds de HA patrón (sin recubrimiento de Qo) a 40X, 200X y 500X.
134
Evaluación de Recubrimientos de Quitosano sobre
Scaffolds de HA
Figura 52. Estructura y medidas de porosidad obtenidas al SEM para scaffolds de HA con recubrimiento de Qo a diferentes concentraciones (0.5, 1. 1.5 y 2%) y menor tiempo de
inmersión (5 min) a 35X y 200X.
135
Evaluación de Recubrimientos de Quitosano sobre
Scaffolds de HA
Figura 53. Estructura y medidas de porosidad obtenidas al SEM para scaffolds de HA con recubrimiento de Qo a diferentes concentraciones (0.5, 1. 1.5 y 2%) y mayor tiempo de
inmersión (20 min) a 40X y 200X.
136
Evaluación de Recubrimientos de Quitosano sobre
Scaffolds de HA
En la tabla 15 se muestra de manera resumida los tamaños de poro y su promedio
obtenidos mediante estas imágenes al SEM (debido a la cantidad de muestras y poros
se escogieron al azar sólo 4 de éstos para cada scaffold).
Tabla 15. Valores promedio de los tamaños de poro obtenidos al SEM.
Con ayuda del software del SEM se obtuvieron los tamaños de poro promedio para los
diferentes scaffolds, de las figuras 54-56 y la tabla 15 se observa que la gran mayoría de
probetas presentaron un tamaño de poro adecuado según lo reportado en la literatura,
es decir oscilan entre los 150 y 400 micrómetros [34]. No tan pequeños como para no
permitir el paso de células a través del scaffold, pero no tan grandes como para debilitar
las propiedades mecánicas del mismo. Los tamaños de los poros presentan para la
mayoría de los scaffolds con y sin recubrimiento valores muy similares, sin embargo hay
una alta dispersión en los datos como puede verse en la tabla 15, donde se observan
medidas de poros grandes y poros pequeños, sin embargo estos están dentro del rango
aceptado.
Por otra parte, se buscó evidenciar mediante estas imágenes que los scaffolds con
recubrimientos presentaran porosidad interconectada y que no hubiesen
taponamientos de los poros por la presencia de las películas de recubrimiento de Qo,
esto se evidenció en la figura 55 (flechas azules) para los scaffolds con recubrimientos a
mayores concentraciones y tiempos de inmersión (1,5 y 2%Qo, 20 min), debido a la
viscosidad de las soluciones de quitosano y los tiempos de exposición al polímero
(20min), pudo darse este fenómeno, en el que dichos scaffolds presentaron
taponamiento de algunos de sus poros internos.
Nomenclatura
Poro 1 (µm)
Poro 2 (µm)
Poro 3 (µm)
Poro 4 (µm)
Tamaño de poro Promedio (µm)
D.E
HA patrón 442,72 236,27 162,44 97,32 234,68 198,19
0,5%Qo - 1T 293,67 250,7 276,21 186,47 251,76 75,80
0,5%Qo - 2T 411,36 390,5 284,28 330,33 346,61 57,30
1%Qo - 1T 388,86 244,37 320,1 302,1 346,62 61,35
1%Qo - 2T 231,97 325,24 380,78 340,3 313,86 76,60
1,5%Qo - 1T 442,72 407,95 241,31 284,77 319,57 111,69
1,5%Qo - 2T 291,24 278,03 225,36 234,49 344,19 34,85
2%Qo - 1T 306,03 225,08 94,52 177,2 264,88 91,10
2%Qo - 2T 487,76 400,53 204,44 302,12 200,71 131,27
137
Evaluación de Recubrimientos de Quitosano sobre
Scaffolds de HA
Cabe resaltar que el tejido óseo se puede clasificar en dos tipos principalmente; el
hueso trabecular y el cortical. El material básico de ambos huesos pareciera ser el
mismo y la distinción entre ellos estaría dada por el grado de porosidad y su
distribución. El rango de porosidad del hueso cortical es de 5% al 30%, mientras que en
el hueso esponjoso es del 30% al 90%. La porosidad del hueso no es fija y puede
cambiar con el transcurso del tiempo en respuesta a una alteración de cargas,
enfermedad y envejecimiento [35].
En lo que respecta al hueso esponjoso, también conocido como poroso o trabecular
(figura 57), está compuesto de una red interconectada de placas y barras que reciben el
nombre de trabéculas, que a su vez, están compuestas de cristales de hidroxiapatita
dentro de una matriz de fibras de colágeno.
Figura 57. Hueso esponjoso o trabecular al SEM 200X (Narváez, 2004) [35].
De los datos obtenidos en este ensayo (cualitativos y cuantitativos) puede observarse la
similitud con las características del hueso trabecular como son el tamaño de poro, la
apariencia, rugosidad, porosidad e interconectividad y composición en comparación
con los scaffolds, rasgos que los hacen adecuados para su uso en ingeniería de tejidos
ósea.
Para la porosidad se plantearon las siguientes hipótesis nula y alterna:
Ho(P): la porosidad para todas las muestras es igual µp1 = µp2 = µp3 = µp4
Ha(P): la porosidad para alguna muestra es diferente µp1 ≠ µp2
En las figuras 58 y 59 se muestran los datos graficados con su respectiva distribución
para la porosidad y la interconectividad de las muestras.
138
Evaluación de Recubrimientos de Quitosano sobre
Scaffolds de HA
Figura 58. Estadística descriptiva para datos de porosidad de las muestras.
Estos datos presentan una distribución bimodal de los datos cuantitativos alrededor de dos modos separados. Sugiere dos poblaciones separadas de distribución normal de las que se extraen los datos. El Box – plot presenta un sesgo a la derecha y no se observan datos atípicos. Para la porosidad el P-valor = 0, por lo tanto por ser mayor a 0.05 se rechaza la hipótesis
nula para alpha (α) = 0.05, por lo tanto la porosidad para todas las muestras no es igual.
Para la interconectividad se presentan las siguientes hipótesis nula y alterna:
Ho(I): la interconectividad para todas las muestras es igual µI1 = µI2 = µI3 = µI4
Ha(I): la interconectividad para alguna muestra es diferente µI1 ≠ µI2
139
Evaluación de Recubrimientos de Quitosano sobre
Scaffolds de HA
Figura 59. Estadística descriptiva para datos de interconectividad de las muestras.
La tendencia de los datos muestra una distribución sesgada y bimodal, con sesgamiento positivo (hacia la derecha) y sin presencia de datos atípicos. La tendencia de los valores no es central y están levemente dispersos. Para la interconectividad el P – valor = 3,32859x10-8. Por lo tanto se rechaza la hipótesis nula para alpha (α) = 0,05. Para las muestras los valores de interconectividad no son iguales.
4.2.5. Mojabilidad y adhesividad de los recubrimientos de Qo
En este ensayo se evaluó la capacidad de humectación y se determinaron los ángulos de
contacto para scaffolds de HA con recubrimiento de Qo con ayuda del método Celda de
Washburn (debido a que este permite medir el ángulo de contacto y la energía libre de
superficie de materiales porosos y/o materiales absorbentes).
En sistemas absorbentes o sea cuando el líquido penetra el sustrato, el ángulo de
contacto cambiará continuamente como una función del tiempo. Debido a que estos
sistemas no son estáticos sino dinámicos, el procedimiento de medida empleado para
medir el ángulo de contacto debe ser con tensiómetro [36].
140
Evaluación de Recubrimientos de Quitosano sobre
Scaffolds de HA
La medición del ángulo de contacto se utilizó para evaluar que tan adherentes fueron
los recubrimientos de Qo realizados sobre los scaffolds de HA, y que tanto se mejoró la
mojabilidad del material sólido con cada recubrimiento a las diferentes concentraciones
de polímero que se usaron durante el desarrollo del proyecto, propiedad bastante
importante en el caso de usar éste material para fabricar implantes o dispositivos
protésicos, ya que se busca que durante la vida útil de éste no se generan trombos o
rechazo del material, además de mejorar la hidrofobicidad de la superficie.
En la figura 60 se muestra los tipos de contacto, ángulo y mojabilidad que pueden darse
en un líquido sobre un sustrato sólido con rugosidad o porosidad.
Figura 60. Ejemplos de diferentes mojados superficiales [36].
En la tabla 16 se muestran los valores de los ángulos de contacto obtenidos para los
scaffolds de HA con las soluciones de Qo a diferentes concentraciones empleadas (0.5,
1, 1.5, 2%) y como un control se obtuvo el ángulo de contacto de la superficie de HA
con agua destilada.
Tabla 16. Ángulo de contacto para scaffolds de HA con las diferentes soluciones de Qo.
Nomenclatura Ángulo de contacto (º)
0.5%Qo
0
1%Qo
1.5%Qo
2%Qo
Agua 81
141
Evaluación de Recubrimientos de Quitosano sobre
Scaffolds de HA
Se considera que un líquido moja a un sólido cuando el ángulo de contacto es inferior a
90º. Esto sólo se produce cuando la tensión superficial del líquido es igual o inferior a la
energía superficial del sustrato, en caso contrario se dice que tal líquido no moja al
sólido en cuestión [36].
De la tabla 16 se observa que para todas las concentraciones de quitosano usadas sobre
los scaffolds de HA se obtuvo un ángulo de contacto de cero grados (0º), es un caso
extremo donde el líquido se expande sobre el sólido, lo que indica que se da un mojado
completo o perfecto sobre las superficie sólida de HA, para el agua destilada presenta
un ángulo de contacto de (81º) lo que indica que el sustrato de HA presenta una alta
mojabilidad y adhesión con respecto a ambas soluciones siendo mejor para los
recubrimiento de Qo a las diferentes concentraciones. Esto puede deberse a varias
razones entre las cuales están la rugosidad superficial de la muestra y/o porosidad del
scaffold o las bajas tensiones superficiales de las diferentes concentraciones de
quitosano obtenidas con el método de Placa de Wilhelmy las cuales se muestran en la
tabla 17. En general todos los adhesivos tienen una tensión superficial muy baja (30 a
47mN/m), lo que los hace tener una fuerza de cohesión muy alta al sustrato y por tanto
tienen una excelente mojabilidad [37].
Tabla 17. Tensión superficial y viscosidad de las soluciones de Qo a diferentes concentraciones.
Nomenclatura Tensión superficial
(mN/m)
Viscosidad
(cP*)
0.5%Qo 31,40 76
1%Qo 30,04 272
1.5%Qo 29,25 1060
2%Qo 29,60 2519
Agua 72,20 0,902
* 1 Poise (P) = 10-1 Pa·s
Estos resultados corresponden con los obtenidos por Fernández, Zamani, Morris y otros
[38, 39, 40].
Con respecto a la tabla 17 no se observan cambios sustanciales en la tensión superficial
de las soluciones para las diferentes concentraciones de Qo pero si hay una variación
pronunciada de la viscosidad, como era de esperarse debido a que al aumentar la
concentración de Qo la solución se tornaba más espesa (viscosa).
142
Evaluación de Recubrimientos de Quitosano sobre
Scaffolds de HA
Sin embargo, es necesario aclarar que la medida de los ángulos de contacto está
sometida a severas limitaciones y estos valores deben considerarse con reserva, debido
a que ciertos aspectos limitan sus resultados, como son el líquido seleccionado y la
rugosidad de la superficie. Además, otro factor importante es la porosidad del sustrato
sólido el cual está íntimamente relacionado con el ángulo de contacto, debido
principalmente a los fenómenos de capilaridad. Una mayor porosidad disminuye theta
(θ) en sistemas con un buen mojado [36, 41]
En la figura 61 se muestran las curvas típicas obtenidas en la medición del ángulo de
contacto por el método de Washburn.
Figura 61. Curva obtenida con el método de Washburn para los scaffolds de HA con solución de Qo a diferentes concentraciones (0.5, 1, 1.5 y 2%).
A partir de los datos de m2 Vs t de cada líquido (solución de Qo) sobre los scaffolds de
HA se construyeron las curvas presentadas en la figura 59 y mediante la aplicación de la
ecuación propuesta por Washburn (8).
𝑚2
𝑡 =
𝑐∗𝜌2∗𝜎∗𝑐𝑜𝑠𝜃
η (8)
Esta ecuación presenta la relación entre las características de un líquido que penetra
por capilaridad a través de un material, el ángulo de contacto formado en la interfase
(θ) y la velocidad a la cual ocurre la absorción, representada por la relación entre la
masa (m) y el tiempo transcurrido (t) [42].
143
Evaluación de Recubrimientos de Quitosano sobre
Scaffolds de HA
Como se ha mencionado antes, en materiales absorbentes o porosos cuando el líquido
penetra en el sustrato, el ángulo de contacto cambiará continuamente como una
función del tiempo, al representar la masa de la fase líquida versus el tiempo se aprecia
que en general todas las curvas presentan un comportamiento similar sigmoideo, las
cuales inician en cero y aumentan su pendiente (positiva) rápidamente y finalizan con
una suavización en esta pendiente, llegando a alcanzar una leve estabilidad sobre todo
para las concentraciones de 1.5 y 2% de Qo, que son más viscosas.
4.2.6. Trabajo de adhesión termodinámico (Wad)
Finalmente, como se mencionó en el apartado anterior para el cálculo del trabajo de
adhesión termodinámico (Wad) se empleó la ecuación de Young - Dupré que relaciona
los parámetros de interacción entre los scaffolds porosos de HA al entrar en contacto
con los recubrimientos líquidos de Qo a las diferentes concentraciones. En la tabla 18 se
reportan los valores del trabajo de adhesión termodinámico obtenidos mediante la
solución de la ecuación.
Tabla 18. Trabajo de adhesión (Wad), para la interacción entre los sustratos HA/recubrimientos Qo.
Material del sustrato HA
Interacción substrato/recubrimiento (mN/m)
0.5%Qo 1%Qo 1.5%Qo 2%Qo Agua
62,8 60,1 58,0 59,2 128,3
Se observa entonces de la tabla 18 que para ángulos de contacto 0º el trabajo de
adhesión entre el sólido y el líquido es igual al trabajo de cohesión del líquido o sea
(Wad = 2γL); por lo tanto, el líquido se adhiere espontáneamente sobre la superficie, ya
que para el sistema es indiferente si el líquido se encuentra en contacto consigo mismo
o con el sólido. Cuando la superficie es rugosa y el ángulo de contacto es mayor que
90º, la adhesión puede no ocurrir, por otra parte si θ fuera igual a 180º el líquido no
moja ni se adhiere sobre el sólido. En consecuencia, el aumento de la rugosidad en
estos casos convierte a la adhesión en un hecho menos probable [43].
Según esto el efecto del recubrimiento sobre el trabajo de adhesión (Wad) para cada
una de las interacciones substrato/recubrimiento es prácticamente similar, sus valores
indican que la función básica que desempeñó el Qo es simplemente la de facilitar el
mojado de la superficie del sustrato. La etapa siguiente al proceso de humectación se
llama penetración; en ella, el vehículo ingresa por capilaridad al interior de los poros de
144
Evaluación de Recubrimientos de Quitosano sobre
Scaffolds de HA
las partículas del sustrato sólido o bien a los intersticios del conjunto de partículas o
agregados. Para asegurar la rápida penetración de la fase líquida es necesario un alto
valor de la tensión superficial del mismo, así como también un muy bajo valor del
ángulo de contacto; debido a que estas dos hipótesis son contradictorias, se concluye
que para lograr un resultado efectivo el requisito fundamental es asegurar un ángulo de
contacto cercano a 0º aún con valores moderados de la tensión superficial [43].
Por tanto, el trabajo de humectación o mojabilidad que refiere en términos energéticos
a la inmersión de un cuerpo sólido en el seno de un líquido, considera el desarrollo del
proceso de humectación en tres etapas importantes (adhesión, penetración y
propagación o extensión). Por consiguiente y haciendo un análisis de los datos de las
tensiones superficiales y ángulo de contacto obtenidos los valores bajos para las
diferentes concentraciones de Qo otorgaron mejores resultados durante el proceso de
humectación y adhesividad sobre el sustrato que con respecto al control utilizado
(agua) para la cual se tiene un valor adecuado de ángulo de contacto (θ < 90º), sin
embargo la fuerza para unión o adhesividad aplicada debe ser mayor para unir estas
dos interfaces, que para las soluciones de Qo.
4.3. CARACTERIZACIÓN MECÁNICA DE LOS SCAFFOLDS
4.3.1. Ensayo de resistencia mecánica a la compresión
Los recubrimientos obtenidos tienen una alta aplicabilidad cuando se necesita proteger
a un substrato del desgaste, la degradación, desintegración, corrosión, entre otros, a la
vez que pueden utilizarse como barreras térmicas, entre otras amplias y extensas
aplicaciones. La propia naturaleza de este tipo de recubrimientos y sus espesores, hace
que sus propiedades mecánicas sean difíciles de determinar. Además, la remoción del
recubrimiento, sin utilizar métodos químicos que podrían dañar el recubrimiento, es
relativamente difícil lo que dificulta adicionalmente dicha evaluación. La determinación
de propiedades mecánicas es útil a la hora de comparar las condiciones a las que se
realizó el recubrimiento y permite seleccionar mejor un recubrimiento para una
aplicación concreta [44].
Las propiedades elasto-plásticas de los scaffolds de HA fabricados con y sin
recubrimientos de Qo fueron evaluadas mediante ensayos uniaxiales de compresión
sobre las muestras cilíndricas porosas. Para ello, se empleó una máquina
electromecánica universal de ensayos (DIGIMESS), con una velocidad de la deformación
145
Evaluación de Recubrimientos de Quitosano sobre
Scaffolds de HA
de 5mm/min, límite en el desplazamiento de 75% y carga máxima de 500 N. De los
datos obtenidos se muestran las curvas de tensión - deformación en las figuras 62 y 63.
Figura 62. Curvas de tensión – Deformación para scaffolds de HA patrón y con recubrimientos de Qo a menor tiempo de inmersión.
Figura 63. Curvas de tensión – Deformación para scaffolds de HA patrón y con
recubrimientos de Qo a mayor tiempo de inmersión.
146
Evaluación de Recubrimientos de Quitosano sobre
Scaffolds de HA
Las películas de quitosano más delgadas (menor concentración de Qo y tiempo de
inmersión) tienen una resistencia a la compresión más baja, pero mayor capacidad de
deformación. Esta propiedad se ve mejorada en los recubrimientos con mayor
concentración de polímero a mayores tiempos de inmersión, debido a que demuestran
aumento de la rigidez y la resistencia mecánica y una leve disminución en el módulo
elástico. En ambas gráficas se observa que las curvas de la HA patrón tuvieron menor
resistencia mecánica y baja pendiente.
A su vez, en la tabla 19 se resumen los datos promedio obtenidos de las curvas de
Tensión/Deformación para la resistencia a la compresión y el módulo de elasticidad
para cada uno de los materiales evaluados y su respectiva desviación estándar.
Tabla 19. Propiedades mecánicas de los scaffolds de HA con y sin recubrimientos de Qo.
Recubrimiento Qo (%)
Tiempo de inmersión (min)
Resistencia Máxima (σ) (MPa)
Módulo Elástico (Y) (MPa)
0,5 5 3,72 ± 1,55 601,40 ± 26,07
0,5 20 5,27 ± 1,66 470,15 ± 33,64
1 5 5,76 ± 3,40 845,00 ± 53,35
1 20 6,34 ± 3,20 623,17 ± 24,51
1,5 5 7,54 ± 2,70 1005,32 ± 46,91
1,5 20 7,77 ± 2,99 897,39 ± 22,64
2 5 8,07 ± 2,12 1452,27 ± 38,74
2 20 9,80 ± 2,73 2929,71 ± 48,71
HA patrón --- 2,68 ± 1,04 287,99 ± 36,30
Según algunas investigaciones reportadas en la literatura por Choi y colaboradores
(1990), Rho y colaboradores (1993), M. E. Navarro (2005) y A. Bernadette (2013) entre
otros, para el hueso trabecular la resistencia mecánica a la compresión oscila entre 2,2
y 10 MPa y el módulo elástico puede variar entre los 400 y 1700 MPa [45, 46, 47,48].
Como se observa en la tabla 19 la mayoría de los scaffolds de HA con recubrimiento de
Qo tienen valores de resistencia mecánica dentro del rango reportado en la literatura
incluyendo los scaffolds patrón (sin recubrimiento), sin embargo sus valores son muy
bajos con respecto a los otros, por lo que cabe resaltar que la capa de polímero
funcionó de manera positiva con respecto a esta propiedad observándose un aumento
en estos valores para los scaffolds con concentraciones de Qo y tiempos de inmersión
147
Evaluación de Recubrimientos de Quitosano sobre
Scaffolds de HA
mayores. Las desviaciones estándar en general no son muy altas para estos valores lo
cual significa que los datos están menos dispersos y que se encuentran más cercanos al
promedio.
Sin embargo al observar los datos del Módulo de elasticidad (Y), se muestra que para los
scaffolds de HA patrón (cuadro rojo) estos valores de pendiente fueron muy bajos con
respecto a los scaffolds con recubrimientos de Qo y para los scaffolds con mayor
concentración de 2% Qo y tiempo de inmersión 20 min (cuadro azul), ambos valores
difieren en un buen porcentaje con respecto a los valores reportados para hueso
trabecular, esta propiedad los hace poco atractivos para su uso en ingeniería de tejidos
óseo.
La determinación de estas propiedades mecánicas es útil a la hora de comparar las
condiciones de obtención del material y permite seleccionar mejor un recubrimiento
para una aplicación concreta. En este estudio se han evaluado la resistencia máxima y el
módulo de elasticidad de scaffolds de HA con recubrimientos de Qo a diferentes
concentraciones obtenidos por inmersión a dos tiempos (5 y 20 min).
Se han observado importantes diferencias respecto al valor que se obtiene para los
sustratos de HA sin recubrimientos. El daño en los ensayos mecánicos se produce de
forma importante a través de los poros que lo constituyen, indicando que éstas son
zonas de unión relativamente débiles, sin embargo, debido a la presencia de un
recubrimiento polimérico se ayuda a mejorar la cohesión y éste actúa como una especie
de adhesivo, por lo tanto, estas propiedades o resistencia al daño pudieron ser
mejoradas. Dada la propia naturaleza de este tipo de recubrimientos, sus espesores y a
la anisotropía de las muestras, hace que sus propiedades mecánicas sean difíciles de
determinar, sin embargo, se han relacionado las propiedades mecánicas analizadas con
la estructura de los recubrimientos.
En la figura 64 se observan algunas de las muestras obtenidas de los scaffolds de HA con
y sin recubrimiento de Qo (a mayor tiempo de inmersión) luego de ser sometidos al
ensayo de compresión.
148
Evaluación de Recubrimientos de Quitosano sobre
Scaffolds de HA
Figura 64. Scaffolds con y sin recubrimiento de Qo obtenidos después del ensayo de compresión (a mayor tiempo de inmersión).
Se observa como a medida que aumenta la concentración de Qo la integridad de los
scaffolds se ve mejorada, el recubrimiento de Qo actuó como un adhesivo que permitió
mantener las partículas juntas aún luego de someterlos a los ensayos, no hubo tanta
desintegración del material, como en el caso de los scaffolds de HA patrón y con
recubrimiento de 0,5% Qo donde las muestras se destruyeron completamente.
Para la resistencia mecánica se presentan las siguientes hipótesis nula y alterna:
Ho(R): la resistencia mecánica para todas las muestras es igual µR1 = µR2 = µR3 = µR4
Ha(R): la resistencia mecánica para alguna muestra es diferente µR1 ≠ µR2
Los datos obtenidos para resistencia a la compresión y el módulo elástico fueron
graficados y se muestran en las figuras 65 y 66 a continuación:
149
Evaluación de Recubrimientos de Quitosano sobre
Scaffolds de HA
Figura 65. Estadística descriptiva para datos de resistencia mecánica de las muestras.
La distribución de los datos para la resistencia mecánica muestra una distribución más
normal, sin sesgamientos, la tendencia de los datos es central y sin presencia de datos
atípicos.
Para la resistencia mecánica el P-Valor = 0,000028 por lo tanto se rechaza la hipótesis nula para alpha = 0,05. Por lo tanto, todos los valores para todas las muestras son diferentes. Para el módulo elástico se presentan las siguientes hipótesis nula y alterna:
Ho(M): el módulo elástico para todas las muestras es igual µM1 = µM2 = µM3 = µM4
Ha(M): el módulo elástico para alguna muestra es diferente µM1 ≠ µM2
150
Evaluación de Recubrimientos de Quitosano sobre
Scaffolds de HA
Figura 66. Estadística descriptiva para datos de módulo elástico de las muestras.
Para el módulo elástico puede verse que la distribución de los datos esta sesgada a la derecha (sesgo positivo), Para la mayoría de las muestras la distribución tiene tendencia normal sin embargo hay presencia de un dato atípico por lo que se presentan asimetría. La distribución de los datos es muy grande, sin tendencia media central. Aquí el P-valor = 0,0050, por lo que se rechaza la hipótesis nula, todos los datos de Módulo elástico son diferentes. Por otro lado, la tabla 20 muestra el resumen estadístico para cada una de las variables
de los datos seleccionados. Incluye las medidas de tendencia central, medidas de
variabilidad, y las medidas de forma. De particular interés aquí son la asimetría y la
curtosis estandarizada normalizada, que se puede utilizar para determinar si la muestra
proviene de una distribución normal. Los valores estadísticos fuera del rango de -2 a +2
indican desviaciones significativas de la normalidad, que tenderían a invalidar muchos
de los procedimientos estadísticos que normalmente se aplican a estos datos. En este
caso, solamente el Módulo Elástico (MPa) muestra valores de asimetría y curtosis
estandarizados fuera del rango esperado como se observa en rojo.
151
Evaluación de Recubrimientos de Quitosano sobre
Scaffolds de HA
Tabla 20. Resumen estadístico de datos de las variables respuesta.
Degradabilidad
(%)
Interconectividad
(%)
Porosidad
(%)
Resistencia
Mecánica
(MPa)
Módulo
Elástico
(MPa)
Promedio 4,79333 57,6444 79,7367 6,32778 1012,49
Desviación
Estándar 2,20375 8,42728 2,92459 2,24135 794,519
Coef. de
variación 45,9752% 14,6194% 3,66781% 35,4209% 78,4719%
Valor Mínimo 1,31 46,52 75,46 2,68 287,99
Valor Máximo 8,85 69,55 83,67 9,8 2929,71
Rango 7,54 23,03 8,21 7,12 2641,72
Asimetría
estándar 0,50204 0,517296 0,0400659 -0,274584 2,53435
Curtosis
estándar 0,318492 -0,849645 -0,726987 -0,292487 2,94808
4.3.2. Correlación De Datos
En la figura 67 se muestra una matriz de dispersiones divariadas para todos los pares de
variables. En la matriz, cualquier par de variables es graficado dos veces, una con la
primera variable sobre el eje X y una con esa variable sobre el eje Y. Esta gráfica se usa
frecuentemente para identificar aquellas variables que están altamente
correlacionadas, así como puntos lejanos ocasionales. De esta manera juzgar las
relaciones que existen entre las variables.
Figura 654. Correlación de variables respuesta.
152
Evaluación de Recubrimientos de Quitosano sobre
Scaffolds de HA
Statgraphics presenta los coeficientes de correlación como una matriz, de la cual se
muestra una sección a continuación en la tabla 21, esto entrega las correlaciones de
Pearson entre cada par de variables. Estos coeficientes de correlación oscilan entre -1 y
+1 y miden la fuerza de la relación lineal entre las variables. Entre mayor sea el valor
absoluto de la correlación, más fuerte es la relación lineal entre las dos variables.
También se muestra en paréntesis el número de pares de valores de datos utilizados
para calcular cada coeficiente. El tercer número en cada ubicación de la tabla es un
valor P (negrilla) que pone a prueba la significación estadística de las correlaciones
estimadas. Los valores de P inferiores a 0,05 indican correlaciones que no son cero
estadísticamente significativas en el nivel de confianza del 95,0%.
Tabla 20. Correlaciones de Pearson entre variables respuesta.
Degradabilidad (%)
Interconectividad (%)
Porosidad (%)
Resistencia Mecánica
(MPa)
Módulo Elástico (MPa)
Degradabilidad (%) 0,6522 0,0526 -0,9049 -0,7177
(9) (9) (9) (9)
0,0569 0,8932 0,0008 0,0295
Interconectividad (%)
0,6522 -0,1073 -0,8276 -0,5820
(9) (9) (9) (9)
0,0569 0,7836 0,0059 0,1001
Porosidad (%)
0,0526 -0,1073 0,1390 0,4558
(9) (9) (9) (9)
0,8932 0,7836 0,7214 0,2175
Resistencia Mecánica (MPa)
-0,9049 -0,8276 0,1390 0,8162
(9) (9) (9) (9)
0,0008 0,0059 0,7214 0,0073
Módulo Elástico (MPa)
-0,7177 -0,5820 0,4558 0,8162
(9) (9) (9) (9)
0,0295 0,1001 0,2175 0,0073
Los siguientes pares de variables tienen valores de P por debajo de 0,05. Lo que significa
que tienen alta correlación entre ellas.
Degradabilidad (%) y Resistencia Mecánica (MPa)
Degradabilidad (%) y Módulo Elástico (MPa)
Interconectividad (%) y Resistencia Mecánica (MPa)
Resistencia Mecánica (MPa) y Módulo Elástico (MPa)
En la tabla anterior se observa también que algunos pares de variables muestran
correlaciones significativas, sin embargo otros no, como son:
153
Evaluación de Recubrimientos de Quitosano sobre
Scaffolds de HA
Degradabilidad (%) e Interconectividad (%)
Degradabilidad (%) y Porosidad (%)
Interconectividad (%) y Porosidad (MPa)
Interconectividad (%) y Módulo Elástico (MPa)
Resistencia Mecánica (MPa) y Porosidad (%)
Módulo Elástico (MPa) y Porosidad (%)
4.4. CARACTERIZACIÓN BIOLÓGICA DE LOS SCAFFOLDS
4.4.1. Citotoxicidad celular de los scaffolds de HA con recubrimiento de Qo
Los ensayos de citotoxicidad in vitro se incluyen en los estudios de una primera fase de
evaluación de los biomateriales implantables. La evaluación citotóxica constituye una
vía simple, rápida y económica para obtener una valiosa información acerca de la
biocompatibilidad de los biomateriales. Se han realizado en este estudio ensayos de
citotoxicidad, proliferación y adhesión «in vitro», basados en metodologías de detección
bioquímica (MTT y Alamar Blue) y morfológicas (microscopía SEM) con el fin de
establecer el grado de biocompatibilidad y en adelante se muestran los resultados.
En el ensayo de citotoxicidad por contacto indirecto la cantidad de formazan producido
se evalúo mediante medidas de absorbancia en un espectrofotómetro y está
relacionado con el número de células viables, es decir, el número de células
metabólicamente activas dentro del cultivo. En este caso se partió de células de
osteoblastos congeladas de la línea Saos2. Se decidió utilizar esta línea celular debido a
que los scaffolds van a estar en contacto directo con el hueso y serán recubiertos por el
mismo. Por eso es más conveniente la utilización de células osteoblásticas humanas.
Las muestras fueron definidas en los resultados como M1 a M5, donde M1 corresponde
al scaffold de HA sin recubrimiento usado como patrón de comparación, de M2 a M4
corresponden a los scaffolds con recubrimiento a mayor tiempo de inmersión (20 min) y
aumentando la concentración desde 0,5 a 2% respectivamente y MC corresponde a un
control negativo, o sea células sembradas en medio de cultivo, sin el biomaterial y
corresponden sus resultados al 100% de la viabilidad celular o ausencia de citotoxicidad.
Los resultados de esta prueba se resumen en la tabla 22 y son expresados como el
porcentaje de viabilidad de las células Saos-2 cultivadas con los biomateriales
(scaffolds).
154
Evaluación de Recubrimientos de Quitosano sobre
Scaffolds de HA
Tabla 21. Porcentajes de viabilidad de células (Saos-2) cultivadas en los scaffolds evaluados con y sin recubrimiento de Qo.
MATERIAL VIABILIDAD Saos-2 (%) MTT
M1 41,9 ± 1,8
M2 60,0 ± 3,9
M3 65,5 ± 1,0
M4 97,1 ± 7,2
M5 82,9 ± 1,0
MC 100 ± 0,05
De la tabla 22 se observa que los scaffolds de HA con recubrimientos de Qo (M2 a M5)
en general no presentan citotoxicidad significativa ya que no se produce la muerte
celular, caso contrario para la muestra M1 correspondiente a los scaffolds de HA patrón
(sin recubrimiento) los cuales muestran porcentajes bajos para la viabilidad celular en
MTT, estos pueden clasificarse como ligeramente citotóxicos. Se resalta que esta
característica evaluada es mejorada para los scaffolds de HA recubiertos con mayores
porcentajes de Qo (1,5 y 2%), donde se observan los valores más altos de viabilidad.
Los resultados de citotoxicidad celular para las condiciones estudiadas se muestran igualmente en la figura 68:
Figura 68. Resultados de citotoxicidad mediante ensayo de MTT para las muestras de los scaffolds evaluados y el control.
0
20
40
60
80
100
M1 M2 M3 M4 M5 MC
41,9
60 65,5
97,1
82,9
100
1,8 3,9 1 7,2
1 0,05
Via
bili
dad
Cel
ula
r (%
)
Muestras evaluadas
CITOTOXICIDAD
VIABILIDAD Saos-2 (%) D.E
155
Evaluación de Recubrimientos de Quitosano sobre
Scaffolds de HA
Se observa que para casi todas las condiciones de estudio no se presentan efectos
tóxicos para el desarrollo de la vida celular, sin embargo para los scaffolds de HA patrón
si, sin embargo tampoco se presentan para estos un valor de citotoxicidad superior al
25% por lo que no se consideran severamente tóxicos [49]. El MTT demuestra la
ausencia de citotoxicidad (supervivencia > 90%) para las mayores concentraciones de
Qo (1,5 y 2%) y para los scaffolds de HA patrón existe una toxicidad media inicial (≈40%)
[50].
4.4.2. Proliferación celular de los scaffolds de HA con recubrimiento de Qo
La proliferación celular es la medida del número de células que se dividen en un cultivo.
Para este ensayo las condiciones iniciales son las mismas que para la citotoxicidad en el
apartado anterior, con utilización de reactivo Alamar blue y un tiempo de incubación
mayor. El ensayo ha tenido resultados óptimos para casi todas las muestras de scaffolds
de HA con recubrimiento de Qo y se observan en la tabla 23.
Tabla 23. Porcentajes de proliferación celular (Saos-2) cultivadas en los scaffolds
evaluados con y sin recubrimiento.
MATERIAL PROLIFERACIÓN Saos-2 (%)
Alamar Blue
M1 47, 9 ± 3,0
M2 85,7 ± 0,8
M3 86,9 ± 3,0
M4 99,9 ± 3,8
M5 99,9 ± 5,7
MC 100 ± 2,0
Con respecto a este ensayo se observa de la tabla 23 que para todos los casos
exceptuando los scaffolds de HA patrón (sin recubrimiento) hay un alto porcentaje de
proliferación celular lo que indica que al estar en contacto las células con los extractos
de material estás han aumentado en cantidad, con el tiempo de incubación. Si se
comparan los resultados de actividad celular de las células en contacto con los
materiales y los del control negativo de citotoxicidad se puede ver que la proliferación
no llega al mismo nivel sin embargo su valor es muy similar aumentando a medida que
aumenta la concentración de Qo, sobre todo para los scaffolds con recubrimientos de
mayor concentración 1.5 y 2% de quitosano (M4 y M5) donde hay un alto porcentaje
incluso comparable con el control (MC). En resumen, a partir de los ensayos biológicos
realizados se puede llegar a la conclusión que la superficie de los scaffolds de HA con
156
Evaluación de Recubrimientos de Quitosano sobre
Scaffolds de HA
recubrimientos de Qo a diferentes concentraciones no son citotóxicos y mejoran la
proliferación celular osteoblástica, en todos los casos.
Las imágenes obtenidas al microscopio óptico en el ensayo de proliferación se muestran
en la figura 69 en un aumento de 20X, estas corresponden al cultivo de células Saos-2
en presencia de los scaffolds con y sin recubrimiento luego de 48 horas de incubación,
la imagen A pertenece a los scaffolds de HA patrón (sin recubrimiento), de la B a la E
scaffolds de HA con recubrimientos de 0.5, 1, 1.5 y 2% respectivamente y F serían las
células sin biomaterial en medio de cultivo.
Figura 69. Evaluación in vitro: Las imágenes corresponden al cultivo de células Saos-2 en presencia de los biomateriales luego de 48 horas de incubación. A: M1, B: M2, C: M3, D:
M4, E: M5 y F: Células sin biomaterial (Aumento 20X).
157
Evaluación de Recubrimientos de Quitosano sobre
Scaffolds de HA
Los osteoblastos son células adherentes las cuales crecen en monocapa adheridas a un
sustrato. Por lo que su aspecto se ve plano y su núcleo es pronunciado. De la figura 69
(A) se observa que para los scaffolds de HA patrón (sin recubrimiento) hay muy poco
crecimiento celular, una insignificante cantidad de células son observadas en el plato de
cultivo sin llegar a formarse una monocapa celular, lo que indica que para esta muestra
no existe proliferación celular activa.
Con respecto a los scaffolds de HA con recubrimientos de Qo figura 69 (B-E) si se
observa una mayor proliferación llegándose a la confluencia celular en algunos casos,
sin embargo esta propagación se observa aún más en los scaffolds de HA recubiertos
con quitosano al 1,5 y 2%, lo que indica que estas concentraciones podrían indicar un
aumento en la osteoconductividad y osteoinductividad, factores importantes en la
osteointegración de los scaffolds. Sin embargo para determinar esto se deben
establecer curvas de crecimiento, que tienen el inconveniente de requerir de mucho
tiempo. Para los scaffolds con 0.5 y 1% de Qo aunque existe un grado un buen grado de
proliferación y adhesión, no son tan altos como el control. En general para todos los
platos de cultivo la morfología de las células no muestra modificaciones en ninguno de
los casos, tienen cuerpo celular ensanchado, multipolar, con pseudópodos.
Para el control (células sin biomaterial) figura 69 (F) el desarrollo del cultivo es óptimo y
hay una mayor cantidad de células con alta adhesión y ausencia de alteraciones
celulares internas o externas, se ha dado una proliferación muy activa, estando bien
unidas al sustrato y formándose una monocapa celular continua, esto es un
comportamiento normal cuando hay un medio de cultivo rico en nutrientes sin material
o un agente externo que interfiera en su diferenciación y crecimiento.
En general no se observan fenómenos de muerte celular por necrosis y/o apoptosis ni
alteraciones morfológicas celulares en ninguna de las imágenes pero en los scaffolds
patrón como se ha mencionado la proliferación se ve reducida en un alto porcentaje,
produciéndose pérdida de superficie ocupada por muerte celular.
4.4.3. Adhesión, interacción y morfología celular de los scaffolds de HA con
recubrimiento de Qo.
La evaluación cualitativa de la adhesión celular se basó en la observación al SEM de las
células sobre el material a estudiar. Estas células están especializadas en el
establecimiento y mantenimiento de la estructura de la matriz extracelular, en cuya
función son muy importantes las interacciones célula-célula y célula-sustrato. Esta es
una línea celular establecida, disponible y bien caracterizada la cual ha demostrado
resultados reproducibles en muchos experimentos. Se analizó la respuesta biológica de
158
Evaluación de Recubrimientos de Quitosano sobre
Scaffolds de HA
células humanas con carácter osteoblástico sobre las cinco superficies de scaffolds para
determinar aquella con mejor comportamiento en términos de adhesión celular.
En las figuras 70 a 74 se muestran las fotografías obtenidas al SEM de colonización de
osteoblastos (Saos2) sobre los scaffolds evaluados (M1 a M5). La caracterización de las
muestras permitió establecer la morfología, uniformidad, y distribución de las células
sobre la superficie de los scaffolds con y sin recubrimientos de Qo.
Figura 70. Prueba de adherencia de las células Saos2 al M1 (scaffold de HA patrón). Las flechas indican la presencia de las células adheridas al material luego de 48 horas de
cultivo, aumentos de 1000 y 3000X.
159
Evaluación de Recubrimientos de Quitosano sobre
Scaffolds de HA
Figura 71. Prueba de adherencia de las células Saos2 al M2 (scaffold de HA con recubrimiento 0,5% Qo). Las flechas indican la presencia de las células adheridas al
material luego de 48 horas de cultivo, aumentos de 1000 y 3000X.
160
Evaluación de Recubrimientos de Quitosano sobre
Scaffolds de HA
Figura 72. Prueba de adherencia de las células Saos2 al M3 (scaffold de HA con recubrimiento 1% Qo). Las flechas indican la presencia de las células adheridas al
material luego de 48 horas de cultivo, aumentos de 1000 y 3000X.
161
Evaluación de Recubrimientos de Quitosano sobre
Scaffolds de HA
Figura 73. Prueba de adherencia de las células Saos2 al M4 (scaffold de HA con recubrimiento 1,5% Qo). Las flechas indican la presencia de las células adheridas al
material luego de 48 horas de cultivo, aumentos de 1000, 3000 y 4000X.
162
Evaluación de Recubrimientos de Quitosano sobre
Scaffolds de HA
Figura 74. Prueba de adherencia de las células Saos2 al M5 (scaffold de HA con recubrimiento 2% Qo). Las flechas indican la presencia de las células adheridas al
material luego de 48 horas de cultivo, aumentos de 1000 y 3000X.
163
Evaluación de Recubrimientos de Quitosano sobre
Scaffolds de HA
Todos los scaffolds de las figuras 70 a la 74 mostraron estructuras con una porosidad
interconectada y la topografía irregular característica de este tipo de materiales
utilizados para la regeneración celular. Las propiedades de la superficie son esenciales
para la adhesión celular y la proliferación. Todas estas imágenes mostraron los scaffolds
con células o capas de éstas adheridas en su superficie, adecuadamente.
Los resultados de las fotografías para este ensayo mostraron, además, que la adhesión
de osteoblastos es favorecida por las superficies de los scaffolds de HA recubiertas con
las diferentes concentraciones de Qo, superando los scaffolds de HA patrón (figura 70).
Esto demuestra que las superficies con recubrimiento sobre todo a mayor
concentración de Qo tienen una mejor osteoinducción (figuras 73 y 74). Este
incremento posiblemente se debe a la interacción celular como consecuencia de las
características únicas de los scaffolds y en particular las propiedades superficiales por la
presencia del polímero (topografía, naturaleza química, mojabilidad y energía
superficial).
Los scaffolds de HA con y sin recubrimientos de Qo mostraron crecimiento adecuado de
células óseas. Sin embargo la incorporación de quitosano parece incentivar los procesos
celulares lo que se manifiesta en andamios con formación de matriz extracelular,
debido a que el depósito y maduración de la matriz ósea extracelular es más destacado
en los andamios con quitosano sobre todo para las concentraciones de 1, 1.5 y 2 %, con
una aparente adecuada distribución y cobertura de las células donde se aprecia mucho
mejor la formación de una monocapa celular perfectamente distribuida con presencia
de extensiones o filopodios que permiten la interacción célula-sustrato
adecuadamente.
Como se observa en las fotografías algunas células están aisladas o formando
agrupaciones. Para los scaffolds de HA patrón su morfología es globosa, poco aplanadas
y sin prolongaciones, lo que indica que ha habido poca diferenciación, proliferación
celular y una mínima adhesión al sustrato. Para los scaffolds de HA con Qo a menor
concentración (0,5%) las células son un poco menos elevadas, por tanto, viables,
aunque con un nivel bajo de adhesión al sustrato comparados con los demás. En las
imágenes con recubrimientos de Qo al 1, 1.5 y 2 % aunque existe un grado bueno de
proliferación y de adhesión, las células, aunque carecen de largas prolongaciones se
muestran aplanadas, exhibiendo morfologías particulares, específicamente para el Qo al
2% se ha dado una proliferación muy activa, estando bien unidas al sustrato y
formándose una monocapa celular continua sobre toda la superficie del scaffold.
164
Evaluación de Recubrimientos de Quitosano sobre
Scaffolds de HA
A pesar que se evidenció depósito y maduración de matriz ósea extracelular en todos
los scaffolds, es evidente una diferencia entre los que tienen recubrimiento de Qo y el
patrón, donde se manifestó menor presencia de células inmersas en la matriz.
Cabe destacar que el tejido óseo está formado principalmente por las células óseas
(osteoblastos, osteocitos, células de recubrimiento y osteoclastos) y por su matriz
extracelular. La matriz ósea extracelular a nivel ultra estructural está constituida por
fibras de colágeno (en su mayoría tipo I) rodeadas e infiltradas por un compuesto
mineral formado principalmente por fosfatos de calcio, glicoproteínas transmembrana,
proteoglicanos y glicolípidos; la matriz extracelular interactúa con la célula cumpliendo
funciones de soporte y participando en procesos como migración, diferenciación y
comunicación [51]. Los scaffolds porosos de material compatible con la matriz
extracelular y presencia de estructuras compatibles con células inmersas dentro de ella
se depositan y se incluyen en el. Se observa en las fotografías que la mayoría de las
estructuras celulares dentro de su matriz, ocupan los espacios de los poros de los
scaffolds, estos dejan de permanecer abiertos y son reemplazándose por las células
conectadas entre sí.
Por último, es importante resaltar que los resultados dados por algunas técnicas de
caracterización mencionadas anteriormente como son DRX, FTIR y SEM son relevantes a
pesar de que no dan información con respecto a las variables respuesta, ya que éstas
dan una idea del comportamiento químico, físico y estructural de los scaffolds
permitiendo la identidad y composición química del material, la obtención de
información cualitativa y cuantitativa de los compuestos y la formación de enlaces, y
determinación de la presencia del recubrimiento de quitosano sobre la superficie de
éstos. Además, permitieron explicar su comportamiento superficial, mecánico y
biológico. Factores clave a la hora de seleccionar cuál de los tratamientos resultó ser el
más adecuado para su uso en ingeniería de tejidos óseo.
165
Evaluación de Recubrimientos de Quitosano sobre
Scaffolds de HA
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CAPÍTULO 4.
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Evaluación de Recubrimientos de Quitosano sobre
Scaffolds de HA
CAPÍTULO 5.
CONCLUSIONES
Los métodos utilizados para la obtención de los scaffolds y sus recubrimientos
fueron sencillos, lo que aumenta su reproducibilidad. Los recubrimientos de
quitosano Qo fueron depositados sobre sustratos de hidroxiapatita HA con
ayuda de la técnica de inmersión. La formación de un film de quitosano
proporcionó una mejorada resistencia a la degradabilidad y mecánica, así como
una mejor capacidad biológica y de interacción celular en los scaffolds.
Se han obtenido estructuras recubiertas altamente porosas, utilizando el
método de gel casting/inmersión, las observaciones al SEM de la
microestructura indican una porosidad interconectada, una morfología y
tamaño de poro que logran generar un efecto importante en la adhesión celular,
la proliferación y la difusión de nutrientes haciendo a los scaffolds adecuados
para una potencial aplicación en la ingeniería de tejido óseo. La porosidad de los
scaffolds tiene una gran influencia en las propiedades mecánicas, ya que ésta es
uno de los principales inconvenientes con respecto a su aplicación en la
ingeniería de tejidos en condiciones donde se deben soportar altas cargas. La
adición de otro material polimérico como recubrimiento sobre los scaffolds de
HA ayudó a mejorar la resistencia a la compresión, pero la alteración de la
microestructura (tamaño y forma de poro, la interconectividad, etc) del material
fue inevitable, debido a que a medida que la concentración de Qo se
aumentaba, la posibilidad de presentar taponamiento en los poros era mayor.
Los recubrimientos de quitosano se desarrollan como una alternativa
prometedora para preservación y conservación de estructuras tridimensionales
con las ventajas de su bajo costo y facilidad de procesamiento. En el
recubrimiento de quitosano, las grandes moléculas de quitosano están ligadas y
deshidratadas para generar un recubrimiento osmótico. La superioridad de
estos recubrimientos radica en que permiten una dispersión uniforme de las
partículas y generan enlaces de hidrógeno con moléculas de quitosano a través
del grupo hidroxilo de la superficie, lo que significa la posibilidad de
proporcionar mejores propiedades mecánicas y una buena permeabilidad. En el
proceso de conservación o protección, los recubrimientos de quitosano
suprimen el tránsito del oxígeno, dióxido de carbono y vapor de agua y por tanto
172
Evaluación de Recubrimientos de Quitosano sobre
Scaffolds de HA
restringen el deterioro del material base, esto se pudo observar en las pruebas
de degradabilidad.
El ensayo MTT en scaffolds de HA recubiertos con Qo no ha mostrado toxicidad
para ninguna de las concentraciones usadas, lo cual es un requisito esencial para
su potencial aplicación biomédica. Sin embargo, los resultados negativos en los
ensayos de citotoxicidad para los scaffolds de HA usados como patrones (sin
recubrimiento), da una idea que se debe tener mayor cuidado en la síntesis
inicial y revisar los protocolos existentes en la literatura ya que a pesar de la
protección que genera el recubrimiento, si estos presentan productos
intermedios tóxicos pueden involucrar la biocompatibilidad de los scaffolds a
largo plazo.
La obtención de recubrimientos de Qo sobre scaffolds de HA con el método de
inmersión ha sido poco estudiado lo que resulta interesante debido a que se
logra obtener información relevante de propiedades como la adhesividad y el
tipo de interacción que presenta este polímero sobre sustratos cerámicos como
la HA, de la cual no se encuentra mucha información en la literatura.
Con respecto a la concentración y el tiempo de inmersión de los scaffolds en la
solución de quitosano, a pesar de que en general todos los scaffolds
presentaron buenas propiedades físico-químicas, biológicas y mecánicas, los que
tenían mayores concentraciones de Qo y tiempos de inmersión (1.5% y 2% y 20
min) presentaron las mejores características para ser usados como scaffolds en
regeneración de tejido óseo, debido a sus excelentes propiedades
oseoinductivas obtenidas en las pruebas de viabilidad, proliferación y adhesión
celular así como sus propiedades mecánicas (resistencia a la compresión y
módulos elásticos muy cercanos al hueso).
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