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https://doi.org/10.22319/rmcp.v10i2.4483
Artículo
Evaluación de métodos nutricionales para reactivar inóculo ruminal
preservado analizado a través de cinética de fermentación y
digestibilidad de forrajes in vitro
María G. Domínguez-Ordóñez a
Luis A. Miranda-Romero a
Pedro A. Martínez-Hernández a
Maximino Huerta-Bravo a
Ezequias Castillo-Lopez b*
a Universidad Autónoma Chapingo. Departamento de Zootecnia, 56220. Texcoco, Estado
de México, México.
b Universidad Nacional Autónoma de México. Facultad de Estudios Superiores
Cuautitlán, Medicina Veterinaria y Zootecnia. Cuautitlán, Estado de México, México.
*Autor de correspondencia: ezequias@huskers.unl.edu
Resumen:
Se evaluó el efecto del medio de cultivo y tiempo de pre-incubación para reactivar inóculo
ruminal preservado, evaluando parámetros de la cinética de fermentación y digestibilidad
in vitro de materia seca (DIVMS). En el primer experimento, los tratamientos fueron 1)
CONTROL, líquido ruminal fresco; 2) BAJO24, inóculo reactivado pre-incubándolo
durante 24 h en una solución base; 3) MODE24, inóculo reactivado pre-incubándolo
durante 24 h en una solución base, extracto de levaduras y peptona de caseína; y 4)
ALTO24, inóculo reactivado pre-incubándolo durante 24 h en una solución base, extracto
de levaduras, peptona de caseína y carbohidratos. En el segundo experimento, los
tratamientos fueron 1) CONTROL, líquido ruminal fresco, y 2) ALTO12, similar a
ALTO24, pero el inóculo fue pre-incubado durante 12 h. Se realizaron tres réplicas. Se
midió el volumen máximo de gas (Vm), la fase lag (L), la tasa de producción de gas (S) y
DIVMS usando cuatro substratos. Se analizaron los efectos principales de inóculos y
substratos e interacciones. Comparado con el CONTROL, la preservación del inóculo
afectó (P<0.01) Vm, L y S. Sin embargo, ALTO24 mejoró (P<0.01) la cinética de
fermentación y DIVMS comparado con el tratamiento MODE24 o BAJO24. En el
segundo experimento, DIVMS fue menor (P<0.01) para el tratamiento ALTO12 a las 72
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h de fermentación comparado con el CONTROL. La alfalfa y el pasto ovillo tuvieron
mayor (P<0.01) Vm y DIVMS comparado con el cocuite y el pasto de Guinea. La
reactivación del inóculo ruminal preservado por pre-incubación durante 24 h en medio
que contiene extracto de levaduras, peptona de caseína y carbohidratos tuvo un
desempeño mejor que la pre-incubación por 12 h; sin embargo, la cinética de
fermentación y DIVMS no fueron comparables al líquido ruminal fresco.
Palabras clave: Digestibilidad del forraje, Fermentación, Preservación, Inóculo ruminal.
Recibido: 09/05/2017
Aceptado: 08/03/2018
Introducción
Las técnicas in vitro se usan comúnmente para evaluar la fermentación y la digestibilidad
de los ingredientes de los alimentos utilizados en las raciones de rumiantes(1,2,3). Sin
embargo, la necesidad de animales fistulados para la recolección de líquido ruminal es
una limitación importante de estas técnicas(4,5,6). Por lo tanto, la preservación del fluido
ruminal podría superar esta limitación, ya que permite el uso del inóculo sin tener que
mantener animales donantes(7,8,9). Esto se lleva a cabo utilizando glicerol para minimizar
el daño celular microbiano(10,11,12) y mantener la comunidad microbiana(13,14).
La reactivación apropiada del inóculo conservado antes de ser utilizado sigue siendo, en
gran parte, desconocida. El líquido ruminal liofilizado subestima la fermentación in vitro
y la digestibilidad de la materia seca, en comparación con el líquido ruminal fresco
cuando se reconstituye en el buffer de McDougall(8). La depresión en los parámetros de
fermentación(15) presumiblemente debido al daño celular(8,9) o la muerte microbiana(9)
puede explicar esta subestimación. Además, las limitaciones en la disponibilidad de
nutrientes como el nitrógeno(16,17) y los carbohidratos(18,19,20) pueden influir en la
reactivación, el crecimiento y la actividad de los microbios ruminales. Por lo tanto,
recientemente, se ha reconocido que la reactivación de bacterias conservadas es un paso
crítico para obtener microorganismos activos, y que las condiciones de reactivación deben
optimizarse (21,22,23).
Debido a la limitada información sobre estrategias para mejorar la reactivación del
inóculo ruminal, se requiere realizar investigación para encontrar un enfoque rentable y
práctico. Por lo tanto, los objetivos de este estudio consistieron en evaluar los efectos del
medio de cultivo utilizado y el tiempo de incubación necesario para la reactivación
adecuada del inóculo ruminal liofilizado. Las variables de respuesta evaluadas se basaron
en la cinética de fermentación in vitro y la digestibilidad de la materia seca de alfalfa,
pasto ovillo, cocuite y pasto de Guinea. La hipótesis fue que no habría diferencias en la
digestibilidad del forraje in vitro y la cinética de fermentación entre el inóculo ruminal
fresco y el preservado.
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Material y métodos
Los experimentos se llevaron a cabo en la Universidad Autónoma Chapingo. Los
animales utilizados en los experimentos se manejaron de acuerdo con las directrices y las
regulaciones de la Universidad.
Sustratos de fermentación y análisis químico
Se utilizaron cuatro especies de forraje comúnmente utilizadas para rumiantes de pastoreo
en México como sustratos de fermentación (Cuadro 1): alfalfa (Medicago sativa L.) cv
San Miguel, pasto ovillo (Dactylis glomerata L) cv Potomac, cocuite (Gliricidia sepium
(Jacq.) Kunth ex Walp.) y pasto de Guinea (Panicum maximum Jacq.) cv Tanzania. La
alfalfa, el pasto de Guinea y el pasto de ovillo se cortaron a 7 cm por encima del nivel del
suelo; sólo las hojas de cocuite se recolectaron a mano de las ramas de varios árboles. Se
reunió suficiente material para obtener al menos 1 kg de muestra (base DM) para cada
especie de forraje. Las muestras recolectadas se secaron en un horno de aire forzado a 60
ºC durante 96 h; se molieron a través de un tamiz de 1 mm (Wiley Mill, Arthur H. Thomas
Co., Filadelfia, PA) y se analizaron para medir el contenido de proteína cruda, ceniza,
extracto etéreo(24) (métodos # 976.06; # 942.05; # 920.39, respectivamente). La fibra
detergente ácido (ADF)(25), la fibra detergente neutro (NDF) se analizaron sin amilasa
estable al calor y se expresaron con la inclusión de ceniza residual(25) y azúcares
solubles(26).
Cuadro 1: Composición química (g/kg MS) de especies forrajeras utilizadas como
sustratos de fermentación
Composición química (g/kg MS)
Especies
forrajeras
Proteína
bruta Ceniza
Extracto
etéreo FDA FDNA Azúcares
Alfalfa 206 119 11 350 442 41
Pasto ovillo 197 163 26 400 540 35
Cocuite 183 85 24 367 465 47
Pasto Guinea 65 123 5 564 779 29
FDA= fibra detergente ácida; FDN= fibra detergente neutra. A Se ensayó fibra detergente neutra sin amilasa termoestable y expresada incluyendo ceniza residual.
Recolección, conservación y reactivación de fluidos ruminales
Los procedimientos in vitro para cada experimento incluyeron tres repeticiones(27,28). De
manera similar a los estudios previos(29), para cada ensayo in vitro se recolectó líquido
ruminal fresco de tres carneros criollos adultos fistulados con un peso promedio de 53.0
kg. Los carneros donantes fueron alimentados con una dieta que contenía 80 % de forraje
y 20 % de concentrado. Se ofreció alimentación a las 9:00 h y a las 15:00 h todos los días;
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se permitió la ingesta ad libitum. Además, se dispuso de agua fresca y limpia ad libitum.
Los carneros se equiparon con una cánula ruminal para recoger el fluido ruminal por
succión(30). El fluido ruminal recogido se filtró a través de cuatro capas de estopilla y se
combinaron volúmenes iguales de fluido ruminal de cada donante para obtener una
muestra representativa y evitar variaciones entre animales(31,32,33).
Se incorporó 5% (v/v) de glicerol (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) para servir como
crioprotector del inóculo ruminal(12,13). Se colocaron alícuotas en recipientes de vidrio
estériles de 10 ml. Los contenedores se cerraron herméticamente y se congelaron a -70
ºC durante 3 días. La liofilización se realizó como se describió anteriormente(8) (Labconco
Lyph Lock, modelo 195) al vacío (-0.133 mBar), y el inóculo se almacenó hasta su uso
posterior. La reactivación del inóculo conservado se realizó mediante la reconstitución de
muestras liofilizadas en una solución de cisteína a un volumen igual al del fluido ruminal
filtrado original. Esta solución contenía 2.5 g de L-cisteína, 2.5 g de sulfito de sodio y 0.1
mL de resazurina (1%) disuelta en 15 mL de hidróxido de sodio (2N), se agregó agua
destilada para hacer un volumen total de 100 mL (Cuadro 2), que sirvió como
amortiguador y creó un entorno reducido en los medios, simulando las condiciones
reducidas del rumen. El inóculo reconstituido se incubó a temperatura ambiente durante
10 min para permitir la rehidratación, el inóculo reconstituido se transfirió a 100 ml de
medio de cultivo y luego se incubó previamente a 39 °C durante 24 o 12 h. El medio de
cultivo utilizado y el tiempo de preincubación variaron según el experimento, como se
describe a continuación.
Cuadro 2: Composición de los ingredientes de los tres medios de cultivo utilizados para
la reactivación del inóculo ruminal liofilizado
Tipo de inóculo
Ingrediente del medio utilizado
para la reactivación BAJO 24 MODE 24 ALTO 24
---------- Cantidad por 100 mL ----------
Agua destilada, ml 50 50 50
Líquido ruminalA, ml 29 29 29
Solución de carbonato de sodio
(8%), ml
5 5 5
Solución mineral IB, ml 7 7 7
Solución mineral IIC, ml 7 7 7
Solución de cisteínaD, ml 2 2 2
Solución de resazurina 1%, ml 0.10 0.10 0.10
Extracto de levadura, g --- 0.50 0.50
Peptona de caseína, g --- 0.50 0.50
Forraje molidoE, g 0.25 0.25 0.25
Glucosa, g --- --- 0.30
Celobiosa, g --- --- 0.30
Almidón, g --- --- 0.25 A= colado a través de 4 capas de estopilla, centrifugado 2 veces a 13,416 ×g y esterilizado a 15 psi durante
15 min. B= con 6.0 g de potasio hidrógeno fosfato por litro de agua destilada(44).
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CCon 6.0 g de fosfato de potasio monobásico, 6.0 g de sulfato de amonio, 12 g de cloruro de sodio, 2.45 g
de monohidrato de sulfato de magnesio, y 1.6 g de monohidrato de cloruro de calcio por litro de agua
destilada(44). D2.5 g de L-cisteína disueltos en 15 ml de hidróxido de sodio (2N), 2.5 g de sulfuro de sodio y 0,1 ml de
rezasurina (1%); el volumen fue llevado a 100 ml; la solución se calentó y se esterilizó mediante
autoclave. EPasto de Guinea molido.
Inóculo ruminal evaluado
Experimento 1. Se evaluaron cuatro tipos de inóculo ruminal para las mediciones de
cinética de fermentación y DIVMS. Se comparó un fluido ruminal fresco (control) con
inóculos liofilizados reactivados por preincubación durante 24 h en 1 de 3 medios de
cultivo (Cuadro 2). Específicamente, los tratamientos fueron 1) CONTROL, fluido
ruminal fresco; 2) BAJO24, el inóculo se reactivó en un medio que contenía 100 ml de
una solución de cultivo basal (compuesta de 50 % de agua destilada, 29 % de líquido
ruminal clarificado, 14 % de soluciones minerales I y II, 5 % de carbonato de sodio, 2 %
de solución de cisteína) y 0.1 % de resazurina; 3) MODE24, el inóculo reactivado en un
medio que contiene 100 ml de la solución de cultivo basal, resazurina al 0.1 %, 0.5 g de
extracto de levadura (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) y 0.5 g de peptona de caseína
(Bioxon Becton Dickinson, México); y 4) ALTO24, el inóculo reactivado en un medio
que contiene 100 ml de una solución de cultivo basal, 0.1% de resazurina, 0.5 g de
extracto de levadura (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), 0,5 g de peptona de caseína (Bioxon
Becton Dickinson , México), 0.3 g de glucosa, 0.3 g de celobiosa y 0.25 g de almidón.
Los medios también incluyeron 0.25 g de forraje de tierra sobre una base de DM (Cuadro
2).
Experimento 2. En el segundo experimento se compararon dos tipos de fluido ruminal: 1)
CONTROL, fluido ruminal fresco, y 2) ALTO12, inóculo reactivado utilizando un medio
descrito previamente para ALTO24. Sin embargo, en este experimento, el inóculo
ruminal preservado se reactivó mediante preincubación durante solo 12 h en un intento
de encontrar un enfoque más práctico y más rápido para el proceso de reactivación.
Cinética de fermentación y DIVMS
En cada experimento, se combinaron inóculos ruminales frescos y reactivados con un
agente diluyente que contenía las soluciones minerales reducidas I y II y la solución de
cisteína(34) en una proporción de 1: 9 (v/v, fluido ruminal: agente de dilución, Cuadro 2).
El CO2 se agregó mientras se añadía el agente de dilución al fluido ruminal, que se
mantuvo a 39 ºC.
Posteriormente, se determinaron las cinéticas de fermentación y DIVMS de forraje
combinando 90 ml de inóculo ruminal diluido con 0.5 g de sustrato de fermentación
utilizando botellas de vidrio de 125 ml. La determinación de los parámetros de cinética
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de fermentación se basó en el procedimiento utilizado para la medición de gas(35,36).
Específicamente, se registró la presión del gas (kg / cm2) a 1, 2, 4, 6, 10, 14, 18, 24, 30,
38, 48 y 72 h de incubación. Después de registrar este valor en cada punto de tiempo, la
presión del gas se restableció a cero. Los valores de presión se convirtieron después en
volumen de gas (ml / g de MS de sustrato); para hacerlo, primero se generó una curva
estándar al inyectar volúmenes conocidos de CO2. La ecuación de esta curva estándar se
generó agregando una línea de regresión lineal, y esta ecuación fue: volumen de gas (mL
/ g de sustrato) = presión (kg/cm2) * 39.46 + 0, con un R2 de 0.94. Esta curva estándar se
generó a temperatura ambiente. El uso de esta técnica también ha sido registrado
recientemente por otros investigadores(29).
El volumen acumulado de gas en cada punto de tiempo se utilizó para estimar los
parámetros de la cinética de fermentación: volumen máximo de gas (Vm; mL / g), fase de
retraso (L; h) y la tasa de producción de gas (S; h -1). Esto se realizó utilizando un modelo
logístico descrito por Schofield et al(37):
Volumen de gas =𝑉𝑚
1+𝑒𝑥𝑝(2 − 4 × 𝑆 × (𝑡−𝐿))
(Ecuación 1)
Donde Vm es el volumen máximo; S es la tasa de producción de gas; t es el punto temporal
de la medición, y L es la fase de retraso. Además de los parámetros de cinética de
fermentación, la DIVMS de los sustratos se determinó a las 24 y 72 h de fermentación
(DIVMS 24 y DIVMS 72, respectivamente). En cada momento, el contenido de las
botellas de fermentación correspondientes se filtró a través del papel filtro Whatman No.
4. El residuo se secó a 100 ºC durante 12 h en un horno de aire forzado y se registró el
peso seco. Posteriormente, se calculó la DIVMS en relación con la cantidad de muestra
original utilizada.
Análisis estadístico
Se utilizó el procedimiento GLM de SAS(38). En cada experimento (n= 3), los valores
medios dentro de cada sustrato de fermentación se consideraron como la unidad
experimental. Dadas las condiciones experimentales controladas, se declaró un efecto
significativo a P <0.01; este nivel de importancia también puede contribuir a reducir el
riesgo de error de tipo I. Solo cuando la interacción de primer orden no fue significativa,
la separación de medias para los efectos principales se llevó a cabo mediante la prueba de
Tukey; de lo contrario, se realizó una separación de medias pareada mediante la prueba
t. El parámetro de dispersión reportado es el error estándar más grande de la media (SEM).
Los datos del Exp 1 se analizaron como un diseño experimental completamente al azar
con una disposición factorial de tratamientos 4×4 (4 tipos de inóculo y 4 sustratos de
fermentación). Los datos del Exp 2 se analizaron de acuerdo con un diseño experimental
completamente al azar con una disposición factorial de tratamientos 2×4 (2 tipos de
inóculo y 4 sustratos de fermentación). En ambos experimentos se analizaron los efectos
principales del tipo de inóculo y el sustrato de fermentación. También se evaluó la
interacción del inóculo tipo × y el sustrato de fermentación. El modelo estadístico para
los análisis fue:
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Yijk = µ + τi + βj + τβij + εijk
Donde:
Yijk representa la observación del tratamiento ijk;
µ representa la media general;
τi representa el inóculo tipo i;
βj representa el substrato de fermentación j;
τβij representa el efecto de interacción del inóculo tipo i y el substrato de fermentación j;
El término residual εijk se asumió como distribuido de forma normal, independiente e
idéntica con varianza σ2e.
Resultados
Composición química de los forrajes utilizados como sustratos de
fermentación
La composición química analizada de los cuatro forrajes utilizados se incluye en el
Cuadro 1. El pasto de Guinea fue bajo en proteína cruda y alto en contenido de fibra (65.0
y 779.0 g / kg de MS para proteína cruda y NDF, respectivamente); mientras que la alfalfa
fue alta en proteína y baja en contenido de fibra (206.0 y 442.0 g / kg de MS para proteína
cruda y NDF, respectivamente); el valor de estos nutrientes en pasto de ovillo y el cocuite
fue intermedio.
Cinética de fermentación y DIVMS para inóculos reactivados por
preincubación de 24 h
La Figura 1 ilustra la producción de gas in vitro para el CONTROL y los inóculos
reactivados por preincubación durante 24 h. El CONTROL mostró la producción máxima
y más rápida de gas en comparación con los otros tratamientos. Incluso con el tratamiento
ALTO24, la fermentación se redujo en 50 %, aproximadamente, durante las primeras
horas de incubación. Entre los inóculos preservados, ALTO24 registró la mayor
producción de gas, seguido del tratamiento MODE24 y del BAJO24. La Figura 2 ilustra
la producción de gas para cada substrato de fermentación. La alfalfa tuvo la producción
máxima y más rápida de gas en comparación con el resto de los forrajes. El pasto de ovillo
tuvo valores intermedios para la producción de gas, y el cocuite y el pasto de Guinea, los
valores más bajos.
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Figura 1: Producción de gas in vitro para el control y los inóculos preservados y
reactivados por pre-incubación durante 24 h en diferentes medios de cultivo.
CONTROL, líquido ruminal fresco; BAJO24, inóculo reactivado por pre-incubación durante 24 h en una
solución de cultivo basal; MODE24, similar a BAJO24, pero incluye extracto de levadura y peptona de
caseína; ALTO24, similar a MODE24, pero incluye carbohidratos. Testigo: Vm=387.15 mL/g, L=4.06 h,
S=0.041 h-1; BAJO24: Vm=266.11 mL/g, L=13.70 h, S=0.018 h-1; MODE24: Vm=288.22 mL/g, L=7.62 h,
S=0.023 h-1; ALTO24: Vm=332.83 mL/g, L=8.05 h, S=0.32 h-1.
Figura 2. Producción de gas in vitro de cuatro forrajes cuando se promediaron los
valores de líquido ruminal fresco y de los inóculos reactivados por pre-incubación
durante 24 h
Alfafa: Vm=357.90 mL/g, L=5.22 h, S=0.030 h-1; Ovillo: Vm=333.50 mL/g, L=11.77 h, S=0.029 h-1; cocuite:
Vm=291.50 mL/g, L=3.83 h, S=0.030 h-1; Guinea: Vm=291.20 mL/g, L=12.20 h, S=0.025 h-1.
Específicamente, la cinética de fermentación, la DIVMS 24 y la DIVMS 72 se vieron
afectadas por el substrato de tratamiento y fermentación (Cuadro 3). Independientemente
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
0 10 20 30 40 50 60 70 80
Pro
du
cció
n d
e g
as,
ml/g
MS
Tiempo de fermentación, horas
CONTROL BAJO24 MODE24 ALTO24
0
50
100
150
200
250
300
350
400
0 10 20 30 40 50 60 70 80
Pro
du
cció
n d
e g
as,
ml/g
MS
Tiempo de fermentación, horas
Alfalfa Ovillo Cocuite Guinea
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de la composición de nutrientes del medio utilizado para reactivar el inóculo, hubo una
disminución de Vm (P<0.01) cuando se usó inóculo reactivado en comparación con el
líquido ruminal fresco, siendo esta diferencia mayor durante las primeras 24 h (Figura 1).
Sin embargo, el tratamiento ALTO24 mostró una mayor Vm (P<0.01) en comparación
con los tratamientos MODE24 o BAJO24 independientemente del sustrato de
fermentación. Además, tanto la alfalfa como el pasto de ovillo tuvieron los Vm más altos
(P<0.01) en todos los tratamientos, con un promedio de 345.7 ± 14.40 mL/g. La
interacción del tratamiento × sustrato de fermentación fue significativa (P<0.01) para L
y S. Específicamente, L fue más alta (P<0.01) para el tratamiento BAJO24 cuando se usó
pasto de ovillo o pasto de Guinea como sustrato de fermentación con una estimación de
22.29 h. Sin embargo, no hubo diferencia en la L entre los tratamientos cuando se utilizó
cocuite como sustrato de fermentación. Además, S fue menor (P<0.01) para el tratamiento
BAJO24 independientemente de los sustratos de fermentación, con un promedio de 0.018
h-1. Sin embargo, S alcanzó los valores más altos (P<0.01) en la mayoría de los sustratos
de fermentación cuando se utilizó el CONTROL como inóculo seguido de ALTO24.
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Cuadro 3: Parámetros de la cinética de fermentación (Vm, L y S) y digestibilidad in
vitro de la materia seca a las 24 y 72 h (DIVMS24, DIVMS72) para inóculos reactivados
mediante pre-incubación durante 24 h
Parámetro de fermentaciónA
Inóculo Substrato Vm (mL/g) L (h) S (h-1) DIVMS24
(g/kg)
DIVMS72
(g/kg)
% gas a
72 h
% DIVMS a
24h/72h
TESTIGO
Alfalfa 435.75a 2.80d 0.043a 558.0a 622.0a 100.0 89.7
Ovillo 390.25a 4.89d 0.041ba 538.0a 618.0a 100.0 87.1
Cocuite 346.25a 2.46d 0.044a 466.0ba 508.0dc 100.0 91.7
Guinea 376.35a 6.09dc 0.036cb 398.0c 550.0cb 99.9 72.4
LOW24
Alfalfa 309.30b 7.31bc 0.019e 432.0cb 590.0b 94.9 73.2
Ovillo 303.20b 20.2a 0.017e 314.0d 624.0a 87.1 50.3
Cocuite 207.85c 2.89d 0.020e 324.0d 454.0e 97.1 71.4
Guinea 244.10c 24.38a 0.016e 180.0f 424.0e 94.0 42.5
MODE24
Alfalfa 319.45b 5.14dc 0.025d 482.0ba 674.0a 99.1 71.5
Ovillo 307.75b 10.32bc 0.018e 402.0c 636.0a 92.0 63.2
Cocuite 288.80c 4.91d 0.025d 382.0c 516.0c 99.1 74.0
Guinea 236.90c 10.12bc 0.021ed 252.0e 484.0d 96.1 52.1
HIGH24
Alfalfa 367.15a 5.64dc 0.033cb 524.0a 630.0a 99.9 83.2
Ovillo 333.00b 11.68bc 0.039ba 502.0ba 656.0a 99.9 76.5
Cocuite 323.25b 5.04dc 0.030dc 404.0c 512.0c 99.8 78.9
Guinea 307.75b 9.85bc 0.025d 324.0d 554.0b 98.5 58.5
Medias inóculo
CONTROLy 387.15ª 4.06c 0.041a 490.0a 574.5a 100.0 85.3
BAJO24x 266.11c 13.70a 0.018d 312.5d 523.0b 90.0 59.8
MODE24w 288.22c 7.62b 0.023c 379.5c 577.5a 98.1 65.7
ALTO24v 332.83b 8.05b 0.032b 438.5b 588.0a 99.8 74.6
Alfalfa 357.90a 5.22b 0.030a 499.0a 629.0a 99.8 79.3
Medias forraje Ovillo 333.50a 11.77a 0.029a 439.0b 633.5a 99.3 69.3
Cocuite 291.50b 3.83b 0.030a 394.0c 497.5b 99.8 79.2
Guinea 291.20b 12.61a 0.025b 288.5d 503.0b 98.1 57.4
EEMB 14.40 1.290 0.0012 10.80 10.50
P-values
Inoculum 0.001 0.001 0.001 0.001 0.001
Forage 0.001 0.001 0.001 0.001 0.001
Inoculum × forage 0.0766 0.001 0.0002 0.0012 0.0001
AVm= volumen máximo de gas; L= fase lag; S= porcentaje de producción de gas.
EEM= mayor estandar de la media. a-f Medias en columna con distinta literal son diferentes (P<0.01).
La interacción entre el tratamiento y el sustrato de fermentación fue significativa (P<0.01)
para la DIVMS24 y la DIVMS72. Específicamente, cuando se utilizó alfalfa como
sustrato de fermentación, la DIVMS24 para los tratamientos MODE24 y ALTO24 fue
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325
similar (P≥0.1) al CONTROL, con un promedio de 521.3 ± 10.8 g/ kg. Sin embargo, la
DIVMS24 para alfalfa fue menor (P<0.01) para el tratamiento BAJO24 en comparación
con el CONTROL con estimaciones de 432.0 y 558.0 ± 10.8 g/kg para el tratamiento
BAJO y el CONTROL, respectivamente. Igualmente, las DIVMS 72 para los tratamientos
MODE24 y ALTO24 fueron similares (P≥0.1) al CONTROL, con un promedio de 642.0
± 10.5 g/ kg. Sin embargo, la DIVMS72 para alfalfa fue menor (P<0.01) para el
tratamiento BAJO24 en comparación con el CONTROL 24, con estimaciones de 590 y
622.0 ± 10.5 g/kg para el tratamiento BAJO24 y el CONTROL, respectivamente. Se
observó la DIVMS72 más baja (P<0.01) para el tratamiento BAJO24 cuando se usó
cocuite como sustrato de fermentación con un promedio de 439.0 ± 10.5 g/kg. En general,
independientemente del sustrato de fermentación, hubo una depresión (P<0.01) en la
DIVMS para el tratamiento BAJO24 en comparación con cualquiera de los otros
tratamientos.
Cinética de fermentación y DIVMS para el inóculo reactivado por 12 h
en preincubación
La Figura 3 ilustra la producción de gas in vitro para el CONTROL y el inóculo reactivado
por incubación durante 12 h. El CONTROL mostró una producción de gas máxima más
rápida y mayor en comparación con el tratamiento ALTO12. La Figura 4 ilustra la
producción de gas para cada sustrato de fermentación. La alfalfa mostró la producción
máxima y más rápida de gas en comparación con el resto de los forrajes, con cocuite y el
pasto de Guinea, que tienen los valores más bajos.
Figura 3. Producción de gas in vitro del testigo y del inóculo preservado y reactivado
por pre-incubación durante 12 h en un medio de cultivo
CONTROL, líquido ruminal fresco; ALTO12, inóculo reactivado por pre-incubación durante 12 h en una
solución de cultivo basal, extracto de levadura, peptona de caseína y carbohidratos. Testigo: Vm=410.80
mL/g, L=5.42 h, S=0.032 h-1; ALTO12: Vm=264.97 mL/g, L=4.29 h, S=0.017 h-1.
0
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100
150
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Pro
du
cció
n d
e g
as,
ml/g
MS
Tiempo de fermentación, horas
CONTROL ALTO12
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Figura 4. Producción de gas in vitro de cuatro forrajes cuando se promediaron los
valores de líquido ruminal fresco e inóculo reactivado por pre-incubación durante 12 h
Alfafa: Vm=368.30 mL/g, L=2.13 h, S=0.032 h-1; pasto de ovillo: Vm=352.51 mL/g, L=9.19 h, S=0.033 h-
1; cocuite: Vm=334.16 mL/g, L=3.79 h, S=0.027 h-1; pasto de Guinea: Vm=296.56 mL/g, L=4.31 h,
S=0.025 h-1.
Específicamente, la cinética de fermentación, la DIVMS 24 y la DIVMS 72 se vieron
afectadas por el sustrato de tratamiento y fermentación (Cuadro 4). El Vm fue mayor
(P<0.01) para el CONTROL en comparación con el tratamiento ALTO12, con
estimaciones de 410.80 y 264.97 ± 13.050 mL / g, respectivamente. La interacción del
tipo de inóculo × sustrato de fermentación fue significativa para L (P<0.011); el pasto de
ovillo y la alfalfa incubados en el tratamiento ALTO12 tuvieron la mayor y menor (P
<0.01) L, respectivamente, con estimaciones de 12.4 y 0.07 ± 0.700 h-1 para pasto de
ovillo y alfalfa. Asimismo, se detectó una interacción (P<0.01) para S; la alfalfa incubada
en el CONTROL y el cocuite incubado en el tratamiento ALTO12 tuvieron la mayor y
menor S, respectivamente; con estimaciones de 0.047 y 0.013 ± 0.007 h-1 para alfalfa y
cocuite. Independientemente del tipo de forraje, la DIVMS 24 fue mayor para el
CONTROL en comparación con el tratamiento ALTO12, con estimaciones de 520.6 y
374.3 ± 12.70 g/kg, respectivamente. Hubo una interacción de tipo de inóculo x sustrato
de fermentación (P<0.01) para la DIVMS72, alfalfa y pasto de ovillo incubados en el
CONTROL tuvieron la mayor DIVMS72, y cocuite y el pasto de Guinea tuvieron los
valores más bajos de DIVMS72.
0
50
100
150
200
250
300
350
400
0 10 20 30 40 50 60 70 80
Pro
du
cció
n d
e g
as,
ml/g
MS
Tiempo de fermentación, horas
Alfalfa Ovillo Cocuite Guinea
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Cuadro 4: Parámetros de fermentación, cinética (Vm, L and S) y digestibilidad in vitro
de la materia seca a 24 y 72 h (DIVMS24, DIVMS72) para inóculos reactivados 12 h pre-
incubación
Parámetros de fermentaciónA
Inóculo Substrato Vm
(mL/g) L (h) S (h-1)
DIVMS24
(g/kg)
DIVMS24
(g/kg)
% gas a
72 h
% DIVMS
a 24 h
Testigo
Alfalfa 457.33d 4.19b 0.047f 625.3a 673.3d 100.0 92.9
Ovillo 409.96c 6.14b 0.042e 594.6a 678.6d 100.0 87.6
Cocuite 400.80c 4.36b 0.041e 463.9b 573.3b 100.0 80.9
Guinea 375.10b 7.00b 0.034d 398.6c 551.9b 99.9 72.2
ALTO12
Alfalfa 279.26a 0.07a 0.017b 461.3b 619.9c 94.7 74.4
Ovillo 295.06a 12.24c 0.024c 407.9b 657.3d 97.7 62.1
Cocuite 267.53a 3.23ab 0.013a 350.6c 478.6a 82.9 73.3
Guinea 218.03a 1.63ab 0.015ab 278.6d 459.9a 90.2 60.6
Medias de
inóculo
Testigo 410.80b 5.42 0.041b 520.6a 619.3b 100.0 84.1
ALTO12 264.97a 4.29 0.017a 374.3b 553.9a 93.1 67.6
Medias de
forraje
Alfalfa 368.30b 2.13a 0.032 543.3a 646.6b 99.9 84.0
Ovillo 352.51b 9.19c 0.033c 501.3a 667.9b 99.8 75.1
Cocuite 334.16b 3.79ab 0.027b 407.3b 525.9a 99.5 77.4
Guinea 296.56a 4.31b 0.025a 338.6c 505.9a 99.2 66.9
EEMB 13.050 0.700 0.0007 12.70 7.80
Inóculo 0.0001 0.0359 0.0001 0.0001 0.0001
P-values Forraje 0.0003 0.0001 0.0001 0.0001 0.0001
Inóculo ×
forraje 0.1200 0.0001 0.0001 0.0295 0.0006
A Modelo para producción de gas, Schofield et al. (1994): Volumen de gas =𝑉𝑚
1+𝑒𝑥𝑝(2 − 4 × 𝑆 × (𝑡−𝐿))
Donde Vm = valor máximo de gas; L= fase lag, S= tasa de producción de gas.
BEEM= mayor estándar de la media reportado.
a-f: Medias en columna con distinta literal son diferentes (P<0.01).
Discusión
Muestreo de líquido ruminal y el uso de glicerol como crioprotector
Los estudios(31,32,33) han encontrado diferencias en los patrones de fermentación in vitro
entre el fluido ruminal de diferentes donantes. La fuente de líquido ruminal puede influir
en los ensayos de fermentación y digestibilidad in vitro(31,39). Las diferencias en los
patrones de fermentación entre los animales observados por esos investigadores pueden
atribuirse parcialmente a las diferencias en la composición de la comunidad bacteriana
establecida entre los animales huéspedes(40,41). Por lo tanto, en el presente estudio, las
muestras de líquido ruminal de tres donantes se agruparon para obtener una muestra
representativa para evitar el sesgo debido a la fuente de líquido ruminal.
El uso de glicerol mejora la preservación de la comunidad bacteriana ruminal(12,13,14). Los
beneficios del glicerol pueden explicarse por la vitrificación periférica que brinda
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328
protección a las membranas citoplásmicas bacterianas del daño potencial que puede
causar la formación de cristales de hielo(42). Específicamente, el glicerol penetra en las
células, lo que puede protegerlas de los daños al mantener un estado semifluido(43,44). En
consecuencia, el uso de glicerol no solo protege la integridad y la viabilidad de las células
bacterianas ruminales, sino que también puede prevenir la degradación del ADN
microbiano(13).
La cinética de la fermentación in vitro y la DIVMS revelaron diferencias entre el líquido
ruminal fresco y el liofilizado. Cuando se comparó con el líquido ruminal fresco, se
observó la mayor depresión en los parámetros cinéticos de fermentación cuando los
inóculos liofilizados se reactivaron en medios sin azúcares ni promotores del crecimiento.
Estas observaciones concuerdan con otros estudios(15), que indican una depresión en los
parámetros de fermentación con inóculos congelados, lo que puede explicarse por una
disminución en la actividad microbiana debido a la muerte microbiana o la limitación de
nutrientes(9). Además, los investigadores han informado(8) que las tasas de degradación de
proteínas con microorganismos ruminales preservados fueron de 4 a 8 veces más lentas
que cuando se usa líquido ruminal fresco. Además, el uso de inóculo conservado por
congelación afecta los parámetros de fermentación durante las primeras horas de
fermentación(30), y la ultracongelación puede representar un método de conservación
mejor en comparación con la congelación a –20 ° C. En consecuencia, de acuerdo con
informes recientes, la reactivación de bacterias conservadas es uno de los pasos más
críticos para obtener microorganismos activos y efectivos para los ensayos de
fermentación in vitro(21,22,23).
En este estudio, en comparación con el líquido ruminal fresco, los efectos negativos de la
liofilización sobre la cinética de la fermentación y la DIVMS fueron menos graves cuando
los inóculos ruminales se reactivaron en un medio rico en nutrientes que incluye una
solución de cultivo basal, promotores del crecimiento y azúcares. Estas observaciones
indican que los promotores del crecimiento como el extracto de levadura y la peptona de
la caseína y los carbohidratos como la glucosa, la celobiosa y el almidón aumentan la
reactivación de los microorganismos ruminales, mejorando así la fermentación in vitro.
La necesidad de extracto de levadura en el medio para una reactivación bacteriana
adecuada y el crecimiento puede atribuirse a la ausencia de los genes para la síntesis de
algunos aminoácidos proteinogénicos como la arginina y la asparagina en el genoma de
algunas especies de bacterias ruminales(45,46), lo que indica que estos aminoácidos
contenidos en el extracto de levadura deben incluirse en el medio. Además, la peptona de
la caseína y los carbohidratos proporcionan una reactivación, crecimiento y actividad
microbiana adecuada y estimulada por la energía y el nitrógeno fácilmente
disponibles(19,47). Es interesante observar los diferentes patrones (producción de gas en
diferentes puntos de tiempo) entre las curvas de fermentación, lo que sugiere que
diferentes poblaciones microbianas pueden actuar sobre los sustratos en cada punto de
tiempo de fermentación. Investigación futura en el tema debe tener como objetivo evaluar
los cambios en la estructura de la comunidad microbiana(48,49) utilizando técnicas como
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329
la secuenciación de ADN de alto rendimiento(50,51,52), que permite una evaluación amplia
del perfil de la comunidad microbiana de los niveles taxonómicos de mayor a menor.
Se ha encontrado que, en comparación con el fluido ruminal fresco, la digestibilidad de
la alfalfa disminuyó 17.63% cuando se usó inóculo congelado o inóculo liofilizado
reactivado por 24 h de preincubación en la solución de McDougall(9). En contraste con
observaciones anteriores(9), en el presente estudio, la DIVMS 72 no se vio afectada
cuando se usó inóculo liofilizado reactivado por 24 h de preincubación en un medio rico
en nutrientes; lo que indica que, en comparación con el uso de la solución de McDougall,
usar un medio rico en nutrientes que contenga una gama más amplia de nutrientes
constituye un mejor enfoque para estimular la reactivación y la actividad de los
microorganismos ruminales.
Cuando se promedió a través de sustratos de fermentación (es decir, alfalfa, pasto ovillo,
cocuite y pasto de Guinea), la DIVMS para cualquiera de los inóculos reactivados resultó
afectada negativamente, en comparación con los valores obtenidos con el control. Sin
embargo, dentro de los inóculos liofilizados, la reactivación mediante preincubación de
24 h en un medio rico en nutrientes mostró el mejor rendimiento. Además, cuando el
inóculo se reactivó 12 h antes de la incubación, los valores de DIVMS fueron más bajos
en comparación con el líquido ruminal fresco del control. Es importante tener en cuenta
que, a las 72 h de fermentación, todos los forrajes, excepto el cocuite, alcanzaron casi
100% del gas total producido. Esto indica que las tasas de fermentación de 72 h no son
adecuadas para medir la efectividad de los tratamientos, lo que también sugiere que un
mejor enfoque sería medir las tasas de fermentación y el DIVMS a las 24 o 48 h de
fermentación.
Efecto del sustrato de fermentación sobre la cinética de fermentación y
DIVMS
El uso de sustratos de fermentación con una amplia gama de composición de nutrientes
facilitó la evaluación de nuestra hipótesis en diferentes escenarios. En general, los
resultados revelaron que los forrajes de zonas templadas, a saber, alfalfa y pasto de ovillo,
tenían un mayor Vm y una mayor DIVMS en comparación con sus contrapartes de las
regiones tropicales. Estas observaciones probablemente se debieron a las diferencias en
los componentes estructurales de la pared celular de la planta que existen entre los forrajes
de zonas templadas y los de las zonas tropicales(53).
Por otro lado, se han sugerido fuentes de inóculo alternativas para las fermentaciones in
vitro. Una de estas fuentes son las heces de rumiantes; sin embargo, los resultados han
sido inconsistentes. Por ejemplo, se ha demostrado que el inóculo fecal es eficaz para los
estudios de producción de gas in vitro(54); sin embargo, el inóculo fecal de ovejas no fue
comparable con el líquido ruminal fresco cuando se evaluó la digestibilidad de la materia
seca in vitro(55). Además, otros estudios han revelado que el inóculo fecal no funciona tan
bien como el líquido ruminal en las técnicas de fermentación in vitro(55,56), lo que puede
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330
deberse a diferencias en las poblaciones bacterianas entre el rumen y el tracto
gastrointestinal inferior(57).
Conclusiones e implicaciones
La cinética de la fermentación in vitro y la DIVMS se vieron afectadas por la liofilización
del líquido ruminal. En la mayoría de los casos, los parámetros de fermentación Vm, L y
S se afectaron negativamente cuando se utilizó el inóculo ruminal liofilizado. Sin
embargo, cuando se añadió glicerol al inóculo ruminal liofilizado y se reactivó durante
24 h en un medio rico en nutrientes previo a la incubación, incluidos los promotores del
crecimiento y los azúcares, los efectos negativos de la liofilización en la cinética de la
fermentación in vitro y la DIVMS fueron menos graves. Como se esperaba, la alfalfa y el
pasto de ovillo tuvieron un mayor Vm y una mayor DIVMS en comparación con el cocuite
y el pasto de Guinea. Los resultados presentados en este estudio proporcionan nuevos
conocimientos sobre la reactivación del inóculo ruminal preservado, así como su
utilización en ensayos de fermentación y digestión in vitro para laboratorios con acceso
limitado a animales fistulados o líquido ruminal fresco. Investigaciones futuras deberían
explorar los cambios en las poblaciones microbianas del rumen durante las
fermentaciones in vitro utilizando la secuenciación de ADN de alto rendimiento para
comprender cómo los cambios en los perfiles microbianos conducen a los diferentes
patrones observados entre las curvas de fermentación.
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