estrategias biotecnolÓgicas aplicadas en...

“ESTRATEGIAS BIOTECNOLÓGICAS APLICADAS EN EL MEJORAMIENTO

AGRÍCOLA”

Iris Pérez Almeida, PhD

La información contenida en los genes de los distintos individuos de una especie.

Diversidad Genética

• Arte y ciencia que permite cambiar y mejorar la herencia de las

plantas

• Cambio en la media de la población, para un carácter en particular,

de acuerdo al objetivo del mejorador.

Mejora genética

• Ciencia que trata de aprovechar el potencial genético de las

plantas para beneficio del hombre.

Mejora genética

Ejemplos de variabilidad fenotípica

F = G + A + I

La información contenida en los genes de los distintos individuos de una especie.

Diversidad Genética

Marcadores Morfológicos

Marcadores Morfológicos

Marcadores Moleculares (MM)

Secuencia de ADN identificable, de herencia mendeliana que facilita el estudio de la herencia de un carácter o de un gen ligado

Mapa molecular tomate Mapa de carreteras

Marcadores genéticos son puntos de marca o anclaje (etiquetas) cuando éstas se encuentran unidas o cercanas a las secuencias propias de los genes.

Nociones Básicas

núcleo

citoplasma

Estructura de las proteínas

Aislamiento de proteínas

1. Selección de la muestra biológica (fuente)

¿Cuál es el primer paso?

MÉTODOS PARA REALIZAR LA ROTURA CELULAR

1. Lisis celular válido para células sin pared celular como las células de

tejidos animales, pero no es suficiente para células vegetales o bacterias.

2. Destrucción mecánica Congelación-descongelación, prensa de

French, sonicación, macerado con N2

líquido

3. Lisis con detergentes

Una vez que la proteína se ha extraído de su entorno

natural está expuesta a

muchos agentes que pueden dañarla!!!!!!.

¿Cómo protegemos a la proteína de interés?

UTILIZAR:

Soluciones amortiguadoras

Inhibidores de proteasas

Bajas temperaturas (4°C)

EVITAR

Altas temperaturas

Manipular demasiado la muestra

PROCURAR

que el proceso sea lo más corto posible.

Algunos agentes estabilizadores son:

El resultado de la lisis celular es un lisado u

homogenado que contiene una mezcla de

proteínas, membranas y células rotas.

Esta preparación se somete a filtración y/o

centrifugación

Para obtener el clarificado

OBTENCIÓN DEL EXTRACTO CRUDO

Isoenzimas

Isoenzimas o Isozimas son “cualquiera de las múltiples formas de

una enzima, proveniente de diferencias determinadas genéticamente

en la estructura primaria”.

* El término Isoenzima es un término operacional, que hace

referencias a un conjunto de enzimas (con el mismos código EC) que

catalizan la misma reacción en la misma célula o en el mismo organismo.

* El término Isoenzima abarca también a las alelozimas, que se definen

“como cualquiera de dos o más variantes de una enzima particular (con

propiedades catalíticas semejantes) cuyas secuencias de aminoácidos

están codificadas en genes alélicos.

1. En la misma célula y en el mismo compartimento, como ocurre con las

isoenzimas de la enzima Lactato deshidrogenasa (EC 1.1.1.27) que se

encuentran todas en el citosol.

2. En la misma célula pero en diferentes compartimentos celulares, como es

el caso de Glutamato oxalacetato transaminasa (EC 2.6.1.1) que se

encuentra en el citoplasma y en las mitocondrias.

3. En diferentes tejidos de un mismo organismo, como es el caso de la

Glutaminasa activada por fosfato (EC. 3.5.1.2)

4. En el mismo individuo y en el mismo tejido, pero en diferentes fases del

desarrollo, como es el caos de la Piruvato quinasa (EC 2.7.1.40)

Localización de las Isoenzimas

* Las isoenzimas suelen caracterizarse por su movilidad electroforética, ya que un cambio de aminoácidos o una

modificación, puede afectar la carga de la molécula.

* Cuando en una electroforesis se separan varias bandas con la misma actividad enzimática, las isoenzimas se suelen

numerar a partir del ánodo (isoenzima-1, isoenzima-2, ....).

Asignación de Grupos y Lecturas recomendadas

Aspectos claves en Genética y Genómica

Un gen es una secuencia ordenada de nucleótidos en la molécula de ADN (o ARN, en el caso de algunos virus) que contiene la información necesaria para la síntesis de una macromolécula con función celular específica, habitualmente proteínas pero también ARNm, ARNr y ARNt.

Muchos genes se encuentran constituidos por regiones codificantes (exones) interrumpidas por regiones no codificantes (intrones) que son eliminadas en el procesamiento del ARN (splicing). En células procariotas esto no ocurre pues los genes de procariotas carecen de intrones. La secuencia de bases presente en el ARN determina la secuencia de aminoácidos de la proteína por medio del código genético.

Aspectos claves en Genética y Genómica

A, estructura simple concebida como secuencia de ADN constituida por exones e intrones; B, estructura que incluye regiones reguladoras y promotoras.

Esquema de un gen

El análisis genético

1. La variación fenotípica 2. El cruce genético

El estudio de los genes a través de su variación (del fenotipo al genotipo)

Dos elementos básicos:

Enzimas de restricción

Cortan ADN en puntos específicos, generan fragmentos de ADN

AISLAMIENTO DE ADN

AISLAMIENTO DE ADN

Hasta el momento usted debería saber

Caso de estudio Lino

putative active site residue (proton donor)

catalytic nucleophile base

G-G-P-[LIVM](2)-X(2)-Q-X-E-N-E-[FY]

Consensus sequence

Isolation of a Flax -gal genomic sequence

Alignment of 10 plant -galactosidases

Galtom1 KF TTK IVDM M K AEKLYETQ G G PII LS QI EN EY..G PME WE 187

Galatm7 KF TTK IVNM M K AERL FESQ G G PII LS QI EN EY..G PMEYE 197

Galtom2 GFVQK IVNM M KSENL FESQ G G PII MA QI EN EY..G PVE WE 188

Galapp1 KF TEK IVSM M K AEKL FQTQC G PII LS QI EN EF..G PVE WE 189

Gallup1 KF TEK IVNIM K AEKL FQSQ G G PII LS QI EN EY..G PVE WE 198

Galasp1 KF TEK IVSM M K AEGLYETQ G G PII LS QI EN EY..G PVEYY 190

Galatf2 KF TKK IVDM M KEEKL FETQ G G PII LS QI EN EY..G PMQW E 192

Galcar1 VF TTK IVDM M K AEKL FHWQ G G PII LN QI EN EY..G PVE WE 194

Galtom4 GYAEK IVNLM KSHNL FESQ G G PII LS QI EN EY..G PQAKV 191

Galtom3 RF TAK IVDMI KQENLYASQ G G PVI LS QI EN EYGNGDIESR 198

Catalytic site

Isolation of a Flax -gal genomic sequence

800 bp

350 bp

Gal3/Gal4

Amplification of Flax genomic DNA

Cloning of the amplicons

Sequencing

Genome Walker

Homology with plant -Gals

Isolation of ~ 1.2 Kb sequence upstream of catalytic site

Deduced translation product similar to plant -Gals

Southern blot probed with Lugal1

Hin

c II

Hin

d III

Nc

o I

Nd

e I

Ps

t I

Sp

e I

Stu

I

Xb

a I

Xh

o I

15 kb

1.7 kb

3 kb

5 kb

In red:

enzymes cut inside the probe

CLASE MARTES

REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (1983)

Termociclador

Taq polimerasa

Tipo de Marcadores con PCR

Utiliza un cebador único (en lugar de un par de primers) con una secuencia arbitraria, por lo tanto desconocida. Para que ocurra la amplificación, dos secuencias complementarias al cebador arbitrario deben estar lo suficientemente adyacentes y en orientación opuesta que permita la amplificación exponencial por la ADN-polimerasa

Son marcadores dominantes

Para esta técnica no es necesario conocer previamente la secuencia del ADN.

RAPD: Amplificación aleatoria de ADN polimórfico (Random Amplified Polymorphic DNA)

Buena resolución en RAPDs

Desventajas de los RAPDs

Caso estudio

SSR

Genotipado de materiales genéticos del Programa de Arroz INIAP EELS

Selección asistida por marcadores

Selección asistida por marcadores

La selección está basada en los genotipos ya que no son afectados por el medio ambiente o por las condiciones del cultivo como el fenotipo Análisis en estado de plántula/semilla ya que son detectables en todos estados de crecimiento de la planta Selección simultánea de muchos caracteres, especialmente en generaciones tempranas.

Mejoramiento Genético Asistido por Marcadores o Selección Asistida por Marcadores (SAM)

Requisitos: Marcadores altamente heredables, muy ligados al alelo de interés. Técnica de evaluación debe ser muy reproducible, económica, sencilla y de fácil uso o amigable Gran utilidad cuando el carácter de interés es de difícil de cuantificar ó identificar. Aumenta la eficiencia en programas de mejoramiento.

Tecnología MAS debe estar integrada a programas de mejoramiento

Fitomejoramiento y Biotecnología El Impacto se mide por desarrollo y entrega de variedades. Esfuerzo multidisciplinario es esencial para seguir progresando.

Mejoramiento Genético Asistido por Marcadores o Selección Asistida por Marcadores (SAM)

Tipos de MM y Características principales

Descrita en 1993 aprovecha que los RAPD proporcionan principalmente fragmentos de ADN

altamente repetido

Usan cebadores de 16 a 24 pb, diseñados a partir de los extremos de marcadores RAPD

clonados

Esta técnica transforma una banda —propensa a dificultades de interpretación o de

reproducibilidad— en un marcador muy confiable

SCAR (Regiones amplificadas caracterizadas y secuenciadas) Sequence-Characterized Amplified Region

M 1 2 3

Gel de RAPD

Banda polimórfica

Diagrama del procedimiento para obtener un SCAR

Se identifica, en un gel de RAPD, una banda que despierta un interés potencial

La banda se corta y se retira del gel

El fragmento de ADN se clona en un vector y se

obtiene su secuencia

Se diseñan cebadores específicos (16 a 24 pb de longitud) para amplificar ese

fragmento de ADN

La reamplificación del ADN patrón con los nuevos cebadores

presentará un patrón de PCR nuevo, más sencillo fácil de interpretar

Ventajas:

• Patrones más sencillos que los RAPD

• Ensayo sólido gracias al uso de cebadores largos específicos

• Herencia mendeliana. Son marcadores codominantes

Desventajas:

• Requieren un conocimiento mínimo de las secuencias

• Requieren esfuerzo y gastos para diseñar cebadores específicos de cada locus

Dado que los cebadores empleados son más largos que los que se usan en los RAPD, los SCAR

se caracterizan por ser más reproducibles que los RAPD, de los cuales se derivan.

Ventajas y desventajas SCARS

El objetivo de esta técnica descrita en 1993 es convertir una banda amplificada, que no muestra

variación, en una banda polimórfica

Los CAPS son como los SCAR, pero con una paso adicional (una digestión con enzima de restricción) para

favorecer la identificación de polimorfismos que quizás no hubieran podido identificarse entre el total de

productos de la PCR.

Las variaciones se detectan por presencia o ausencia de sitios de restricción. Se pueden así localizar

cambios finos en una zona específica.

Tanto los SCAR como los CAPS se basan en la presencia de cambios en los nucleótidos o de inserciones o

deleciones, los cuales causan diferencias entre las secuencias experimentales.

CAPS (Secuencia polimórfica amplificada y cortada)

Referencia Konieczny, A. y F.M. Ausubel. 1993. A procedure for mapping Arabidopsis mutations using codominant ecotype-specific PCR-based markers. Plant J. 4(2):403-410.

Se reconoce la importancia de una banda, de un fragmento de ADN, de una secuencia génica o de otro tipo de marcador Se diseñan cebadores específicos partiendo de la secuencia del fragmento El producto de la PCR se somete a digestión con varios enzimas de restricción Una vez identificado un polimorfismo con un enzima de restricción específico, los cebadores pueden rediseñarse sobre la base de los fragmentos recién generados, para optimizar la detección y la visualización del polimorfismo. En cuanto sea posible, los cebadores deben elegirse de modo que exista la probabilidad de que los productos de la PCR incluyan intrones. Así aumentarán las oportunidades de obtener polimorfismos.

Pasos que requiere la generación de CAPS

Ventajas:

• Ensayo sólido, porque se usan cebadores específicos largos

• Marcadores co-dominantes

• Favorecido por marcadores que pueden estar ya localizados en un mapa genético

• Identifican polimorfismos en marcadores que anteriormente no eran informativos

Desventajas:

• Requieren, al menos, un mínimo nivel de conocimiento de las secuencias

• El diseño de cebadores específicos para cada locus requiere trabajo

adicional y más gastos

VENTAJAS Y DESVENTAJAS

Caso de estudio: Tomate

EVALUACIÓN MOLECULAR DE GENOTIPOS DE TOMATE POR SU RESISTENCIA A PATÓGENOS

Caracterizar accesiones de germoplasma silvestre y cultivado de tomate (Solanum spp.) mediante marcadores moleculares asociados con la resistencia a Fusarium oxysporum f.sp. lycopersici y Melodoigyne incognita.

PCR 94°C 5 ‘ 94°C 30s 54°C 30s 72°C 1’ 72°C 7’

EVALUACIÓN MOLECULAR DE GENOTIPOS DE TOMATE POR SU RESISTENCIA A PATÓGENOS Se escogieron 5 marcadores moleculares tipo SCAR (Sequence Characterized Amplified Region ó Secuencia amplificada de una región conocida)

Amplificaciones

Mezcla reacción PCR 3mM MgCl2 10X Buffer GoTaq Promega® 400μM dNTPs 10μM de cada iniciador 1U GoTaq polimerasa Promega® 25ng de ADN genómico. Volumen final = 10 μL

Electroforesis Horizontal Visualización

Geles de agarosa 1,5%, con SyBrSafe (1μL/mL), a 45mA y 100V, durante 1h en buffer TAE 1X, pH 8.

ChemiDoc BIORAD

EVALUACIÓN MOLECULAR DE GENOTIPOS DE TOMATE POR SU RESISTENCIA A PATÓGENOS

I1

130 pb

At2-F3//At2R3 para detectar resistencia a Fusarium raza 1 (Arens et al., 2010)

I2

600 pb 700 pb

I-2/5F//I-2/5R (resistencia a Fusarium raza 2; Yu & Zou, 2008)

Mi 1.2

400 pb 350 pb

Mi-23F//Mi-23R asociado a resistencia a Meloidogyne sp. (Seah et al., 2007; Pérez-Almeida et al., 2015)

I3

875 pb

650 pb

P7-43DF1/P7-43DF3//P7-43DR1 (resistencia a Fusarium raza 3; Barillas et al., 2008)

Utilizando el marcador asociado al gen de resistencia Mi-1.2, se pudo determinar que los materiales estudiados resultaron susceptibles a los nematodos del género Meloidogyne, excepto el testigo comercial SENA, el cual posee el gen Mi-1.2 de resistencia.

El uso de estos marcadores moleculares permitió diferenciar genotipos resistentes, susceptibles y heterocigotas, por lo que constituyen una herramienta de análisis sencilla, eficiente y confiable para estimar la presencia o no de genes de resistencia en distintas accesiones de tomate, de acuerdo al patrón de amplificación.

EVALUACIÓN MOLECULAR DE GENOTIPOS DE TOMATE POR SU RESISTENCIA A PATÓGENOS

La mayoría de las accesiones de tomate analizadas contienen el gen de resistencia I-1, sin embargo, resultaron susceptibles, heterocigotas o resistentes para los genes I-2 e I-3.

MATERIALES Mi 23 I1 I2 I3 (F3/R1) I3 (F1/R1)

14,1 S R S S HT

21,1 S R S S na

136,3 S R HT HT HT

145,2 S R HT HT na

69,3 S R S S na

69,4 S R S S HT

141,5 na R S S na

178,2 S R HT HT na

130,6 S R S S na

90,6 na R na na na

120,1 na R na na na

37,1 S R S S HT

61,3 S R S S HT

PS3 na R R S na

PS16 S R R S HT

Pimpi PA S na HT HT na

19 S R S S R

20 S R S S R

78,2 S R S S HT

26,1 S R S S S

83,6 S R HT HT HT

88,5 S R na na S

121,4 S R HT S na

SENA R R S S na

FLORA na R S S na

135 S R S S HT

135,15 S R S S S

135,9 S R S S HT

Se estableció cuales materiales genéticos se pueden usar como testigos resistentes o susceptibles en futuras investigaciones.