establecimiento de un medio de cultivo sumergido para
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ldquoESTABLECIMIENTO DE UN MEDIO DE CULTIVO SUMERGIDO PARA
Psilocybe sprdquo
PILAR GARCIacuteA GOacuteMEZ
NATALIA RAMIacuteREZ LALINDE
DEPARTAMENTO DE INGENIERIacuteA DE PROCESOS
ESCUELA DE INGENIERIacuteA
UNIVERSIDAD EAFIT
MEDELLIacuteN
2009
ldquoESTABLECIMIENTO DE UN MEDIO DE CULTIVO SUMERGIDO PARA
Psilocybe sprdquo
PILAR GARCIacuteA GOacuteMEZ
NATALIA RAMIacuteREZ LALINDE
Proyecto de grado para optar al tiacutetulo de
Ingeniero de Procesos
ASESOR
ALEX ARMANDO SAacuteEZ VEGA
Quiacutemico MSc En Biotecnologiacutea
DEPARTAMENTO DE INGENIERIacuteA DE PROCESOS
ESCUELA DE INGENIERIacuteA
UNIVERSIDAD EAFIT
MEDELLIacuteN
2009
Nota de aceptacioacuten
Jurado
Jurado
Jurado
Ciudad y fecha
iv
A Dios por habernos brindado la oportunidad de lograr este
triunfo en nuestras vidas
A nuestras familias por todo el apoyo que nos brindaron durante
el desarrollo de este proyecto y por habernos dado la gran oportunidad de convertirnos
en profesionales
A toda la docencia por la educacioacuten y orientacioacuten
recibida por eacutesta
v
AGRADECIMIENTOS
Los autores expresan sus agradecimientos a todas las personas que desde su experiencia y profesioacuten brindaron apoyo durante el desarrollo de este proyecto Alex Armando Saacuteez V Quiacutemico MSc En Biotecnologiacutea Candidato a Doctorado Profesor Universidad EAFIT Personal de laboratorio de Ingenieriacutea de Procesos Edgar Arbelaacuteez John Estrada y especialmente Sigifredo Caacuterdenas encargado del laboratorio de Biotecnologiacutea de la Universidad EAFIT Luz Deisy Mariacuten Palacio Ingeniera de Procesos Profesora Universidad EAFIT Diego Acosta PhD Engineering and Material Science Profesor Universidad EAFIT Carlos Correa Ingeniero Quiacutemico Profesor Universidad EAFIT Valeska Villegas E Msc En Biotecnologiacutea Candidata a Doctorado Profesora Universidad EAFIT
vi
TABLA DE CONTENIDO
LISTA DE TABLAS _________________________________________________________________________ IX
LISTA DE FIGURAS ________________________________________________________________________ XI
LISTA DE GRAacuteFICOS ______________________________________________________________________ XII
LISTA DE ECUACIONES ____________________________________________________________________ XV
LISTAS DE ANEXOS ______________________________________________________________________ XVI
RESUMEN _____________________________________________________________________________ XVII
INTRODUCCIOacuteN _________________________________________________________________________ 19
OBJETIVOS _____________________________________________________________________________ 21
GENERAL_____________________________________________________________________________ 21
ESPECIacuteFICOS __________________________________________________________________________ 21
1 MARCO TEOacuteRICO ___________________________________________________________________ 22
11 CONCEPTOS GENERALES DE HONGOS _______________________________________________ 22
111 Hongos laminares (Agaricales) ____________________________________________________ 22
12 MEDIOS DE CULTIVO_____________________________________________________________ 24
121 Medio sumergido _______________________________________________________________ 25
13 ALCALOIDES ___________________________________________________________________ 26
131 Generalidades _______________________________________________________________ 26
132 Propiedades fisicoquiacutemicas _____________________________________________________ 27
133 Reconocimiento de los alcaloides ________________________________________________ 27
134 Clasificacioacuten de los alcaloides ___________________________________________________ 28
1341 Alcaloides alifaacuteticos ____________________________________________________________ 28
1342 Alcaloides de origen diverso _____________________________________________________ 28
1343 Alcaloides aromaacuteticos __________________________________________________________ 28
13 PSILOCIBINA Y PSILOCINA _________________________________________________________ 31
131 Antecedentes acerca de la obtencioacuten de Psilocibina y Psilocina ________________________ 32
2 MATERIALES Y MEacuteTODOS_____________________________________________________________ 34
21 LOCALIZACIOacuteN _________________________________________________________________ 34
22 MICROORGANISMO DE ESTUDIO ___________________________________________________ 34
23 COMPONENTES DEL MEDIO DE CULTIVO (FANG-ZHONG) _______________________________ 35
24 PREPARACIOacuteN DE LOS DIFERENTES PREINOacuteCULOS DE P CUBENSIS EMPLEADOS PARA LAS
FERMENTACIONES SUMERGIDAS _________________________________________________________ 35
25 PREPARACIOacuteN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO Y LOS INOacuteCULOS DE P CUBENSIS UTILIZADOS PARA LAS
FERMENTACIONES SUMERGIDAS _________________________________________________________ 36
26 CUANTIFICACIOacuteN DEL CRECIMIENTO DE BIOMASA MEDIANTE LOS MEacuteTODOS DE PESO HUacuteMEDO Y
PESO SECO PARA CULTIVO SUMERGIDO DE P CUBENSIS ________________________________________ 37
27 AJUSTE DE LA CINEacuteTICA DE CRECIMIENTO DE P CUBENSIS AL MODELO CINEacuteTICO LOGIacuteSTICO ____ 37
vii
28 EVALUACIOacuteN DEL CONSUMO DE SUSTRATO Y DEL CONSUMO DE PROTEIacuteNA POR PARTE DEL P
CUBENSIS CULTIVADO EN MEDIO SUMERGIDO ________________________________________________ 39
29 MEacuteTODO CUALITATIVO PARA DETERMINAR LA PRESENCIA DE ALCALOIDES (PSILOCIBINA)
MEDIANTE EL USO DEL REACTIVO DE DRAGENDORFF _________________________________________ 40
210 MEacuteTODO PARA DETERMINAR LA PRESENCIA DE PSILOCIBINA MEDIANTE CROMATOGRAFIacuteA
LIacuteQUIDA DE ALTA EFICIENCIA (HPLC) _______________________________________________________ 40
211 DETERMINACIOacuteN CUALITATIVA DE LA RESOLUCIOacuteN DEL ALCALOIDE DE INTEREacuteS PARA LOS
DIFERENTES ENSAYOS __________________________________________________________________ 41
212 DETERMINACIOacuteN PORCENTUAL DE COMPUESTOS PARA LOS DIFERENTES ENSAYOS __________ 42
213 CULTIVO SUMERGIDO DE P CUBENSIS EN PRESENCIA DE FA ______________________________ 42
214 DISENtildeO DE EXPERIMENTOS Y ANAacuteLISIS ESTADIacuteSTICO ___________________________________ 43
3 RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN ___________________________________________________________ 45
31 CINEacuteTICA DE CRECIMIENTO MICELIAL DE P CUBENSIS EN CULTIVO SUMERGIDO (FANG-ZHONG)
UTILIZANDO DIFERENTES FUENTES DE CARBONO ____________________________________________ 45
311 Crecimiento micelial de P cubensis en medio sumergido utilizando diferentes concentraciones
de glucosa _________________________________________________________________________ 45
312 Crecimiento micelial del P cubensis en medio sumergido utilizando diferentes concentraciones
de sacarosa ________________________________________________________________________ 50
313 Comparacioacuten entre el crecimiento micelial de P cubensis en los cultivos sumergidos utilizando
glucosa y sacarosa como fuente de carbono ______________________________________________ 55
314 Crecimiento micelial del P cubensis en cultivo sumergido utilizando glucosa y fenilalanina en el
medio 56
32 ESTUDIO DE LA CINEacuteTICA DE CONSUMO DE SUSTRATO POR PARTE DEL P CUBENSIS CULTIVADO EN
MEDIO SUMERGIDO (FANG-ZHONG) ______________________________________________________ 61
321 Consumo de sustrato por parte del P cubensis en medio sumergido utilizando diferentes
concentraciones de glucosa ___________________________________________________________ 62
322 Consumo de sustrato por parte del P cubensis en medio sumergido utilizando diferentes
concentraciones de sacarosa __________________________________________________________ 63
323 Comparacioacuten entre el consumo de sustrato de P cubensis en los cultivos sumergidos con
diferentes fuentes de carbono _________________________________________________________ 65
324 Consumo de sustrato por parte del P cubensis en medio sumergido utilizando glucosa y
fenilalanina en el medio ______________________________________________________________ 66
33 ESTUDIO DE LA CINEacuteTICA DE CONSUMO DE PROTEIacuteNA POR PARTE DEL P CUBENSIS CULTIVADO EN
MEDIO SUMERGIDO (FANG-ZHONG) ______________________________________________________ 69
331 Consumo de proteiacutena por P cubensis en medio sumergido utilizando diferentes
concentraciones de glucosa ___________________________________________________________ 69
332 Consumo de proteiacutena por P cubensis en medio sumergido utilizando diferentes
concentraciones de sacarosa __________________________________________________________ 71
333 Comparacioacuten entre el consumo de proteiacutena de P cubensis en los cultivos sumergidos con
diferentes fuentes de carbono _________________________________________________________ 72
334 Consumo de proteiacutena por P cubensis en medio sumergido utilizando glucosa y FA en el medio
73
34 ESTUDIO CUALITATIVO DE LA PRESENCIA DEL ALCALOIDE _______________________________ 76
viii
341 Produccioacuten de compuestos producidos por P cubensis cuando el medio no conteniacutea FA ____ 76
342 Produccioacuten de compuestos producidos por P cubensis cuando el medio conteniacutea FA ______ 79
35 ESTUDIO PORCENTUAL (AacuteREA) DEL ALCALOIDE REALIZADO PARA LOS DIFERENTES ENSAYOS ___ 81
351 Porcentaje de la Psilocibina (suposicioacuten) cuando el medio no conteniacutea FA _______________ 81
352 Porcentaje de aacuterea de compuestos presentes en P cubensis cuando el medio conteniacutea FA _ 83
CONCLUSIONES _________________________________________________________________________ 86
RECOMENDACIONES _____________________________________________________________________ 89
ANEXOS _______________________________________________________________________________ 90
BIBLIOGRAFIacuteA _________________________________________________________________________ 121
ix
LISTA DE TABLAS
TABLA 1 COMPOSICIOacuteN DEL MEDIO DE CULTIVO SUMERGIDO PARA EVALUAR EL CRECIMIENTO MICELIAL
DEL P CUBENSIS 35
TABLA 2 PARAacuteMETROS CINEacuteTICOS OBTENIDOS MEDIANTE EL MODELO LOGIacuteSTICO PARA LAS DIFERENTES
FERMENTACIONES DE P CUBENSIS UTILIZANDO GLUCOSA COMO FUENTE DE CARBONO 48
TABLA 3 PARAacuteMETROS CINEacuteTICOS OBTENIDOS MEDIANTE EL MODELO LOGIacuteSTICO PARA LAS DIFERENTES
FERMENTACIONES DE P CUBENSIS UTILIZANDO SACAROSA COMO FUENTE DE CARBONO 53
TABLA 4 PARAacuteMETROS CINEacuteTICOS OBTENIDOS MEDIANTE EL MODELO LOGIacuteSTICO PARA LAS DIFERENTES
FERMENTACIONES DE P CUBENSIS UTILIZANDO 50 GL DE GLUCOSA COMO FUENTE DE CARBONO Y
DIFERENTES CONCENTRACIONES DE FA 60
TABLA 5 PORCENTAJE DE AacuteREA HALLADO MEDIANTE HPLC PARA LOS UacuteLTIMOS TRES DIacuteAS DE LA
FERMENTACIOacuteN CON CONCENTRACIONES DE 30 GL 50 GL Y 70 GL DE GLUCOSA Y SACAROSA CON
UN TIEMPO DE RETENCIOacuteN DE 62 Y 72 MINUTOS 81
TABLA 6 PORCENTAJE HALLADO MEDIANTE HPLC PARA LOS UacuteLTIMOS TRES DIacuteAS DE LA FERMENTACIOacuteN
CON CONCENTRACIONES DE 05 GL 10 GL Y 15 GL DE FA Y 50 GL DE GLUCOSA CON UN TIEMPO
DE RETENCIOacuteN ENTRE 62 Y 72 MINUTOS 83
TABLA 7 ANAacuteLISIS DE VARIANZA PARA EL CRECIMIENTO MICELIAL (GLUCOSA) 90
TABLA 8 ANAacuteLISIS MUacuteLTIPLE DE RANGOS PARA EL CRECIMIENTO MICELIAL (GLUCOSA) 90
TABLA 9 ANAacuteLISIS DE VARIANZA PARA EL CRECIMIENTO MICELIAL (SACAROSA) 91
TABLA 10 ANAacuteLISIS MUacuteLTIPLE DE RANGOS PARA EL CRECIMIENTO MICELIAL (SACAROSA) 91
TABLA 11 ANAacuteLISIS DE VARIANZA PARA EL CRECIMIENTO MICELIAL (GLUCOSA Y SACAROSA) 92
TABLA 12 ANAacuteLISIS MUacuteLTIPLE DE RANGOS PARA EL CRECIMIENTO MICELIAL (GLUCOSA Y SACAROSA) 92
TABLA 13 ANAacuteLISIS DE VARIANZA PARA EL CRECIMIENTO MICELIAL (GLUCOSA 50 GL Y FA) 93
TABLA 14 ANAacuteLISIS MUacuteLTIPLE DE RANGOS PARA EL CRECIMIENTO MICELIAL (GLUCOSA 50 GL Y FA) 93
TABLA 15 ANAacuteLISIS DE VARIANZA PARA EL CONSUMO DE SUSTRATO SIN FA 94
TABLA 16 ANAacuteLISIS MUacuteLTIPLE DE RANGOS PARA EL CONSUMO DE SUSTRATO SIN FA 94
TABLA 17 ANAacuteLISIS DE VARIANZA PARA EL CONSUMO DE SUSTRATO CON FA 95
TABLA 18 ANAacuteLISIS MUacuteLTIPLE DE RANGOS PARA EL CONSUMO DE SUSTRATO CON FA 95
TABLA 19 ANAacuteLISIS DE VARIANZA PARA EL CONSUMO DE PROTEIacuteNA SIN FA 96
TABLA 20 ANAacuteLISIS MUacuteLTIPLE DE RANGOS PARA EL CONSUMO DE PROTEIacuteNA SIN FA 96
TABLA 21ANAacuteLISIS DE VARIANZA PARA EL CONSUMO DE PROTEIacuteNA CON FA 97
TABLA 22 ANAacuteLISIS MUacuteLTIPLE DE RANGOS PARA EL CONSUMO DE PROTEIacuteNA CON FA 97
TABLA 23 ANAacuteLISIS DE VARIANZA PARA LA PRODUCCIOacuteN DE PSILOCIBINA SIN FA 98
TABLA 24 ANAacuteLISIS MUacuteLTIPLE DE RANGOS PARA LA PRODUCCIOacuteN DE PSILOCIBINA SEGUacuteN EL SUSTRATO
SIN FA 98
TABLA 25 ANAacuteLISIS DE VARIANZA PARA LA PRODUCCIOacuteN DE PSILOCIBINA CON FA 99
TABLA 26 ANAacuteLISIS MUacuteLTIPLE DE RANGOS PARA LA PRODUCCIOacuteN DE PSILOCIBINA SEGUacuteN EL DIacuteA CON FA
99
TABLA 27 ANAacuteLISIS DE VARIANZA PARA LA CUANTIFICACIOacuteN DE PSILOCIBINA SIN FA 100
TABLA 28 ANAacuteLISIS MUacuteLTIPLE DE RANGOS PARA LA CUANTIFICACIOacuteN DE PSILOCIBINA SEGUacuteN EL TIPO DE
SUSTRATO SIN FA 100
TABLA 29 ANAacuteLISIS DE VARIANZA PARA LA CUANTIFICACIOacuteN DE PSILOCIBINA CON FA 101
x
TABLA 30 ANAacuteLISIS MUacuteLTIPLE DE RANGOS PARA LA CUANTIFICACIOacuteN DE PSILOCIBINA SEGUacuteN LA
CONCENTRACIOacuteN CON FA 101
TABLA 31 AacuteREAS OBTENIDAS DE LOS CROMATOGRAMAS PARA EL P CUBENSIS EN MEDIO FANG-ZHONG
EN EL DIacuteA 12 PARA CONCENTRACIONES DE 30GL GLUCOSA Y 30GL SACAROSA 109
TABLA 32 AacuteREAS OBTENIDAS DE LOS CROMATOGRAMAS PARA EL P CUBENSIS EN MEDIO FANG-ZHONG
EN EL DIacuteA 12 PARA CONCENTRACIONES DE 50GL GLUCOSA Y 50GL SACAROSA 110
TABLA 33 AacuteREAS OBTENIDAS DE LOS CROMATOGRAMAS PARA EL P CUBENSIS EN MEDIO FANG-ZHONG
EN EL DIacuteA 12 PARA CONCENTRACIONES DE 50GL GLUCOSA Y 50GL SACAROSA 111
TABLA 34 AacuteREAS OBTENIDAS DE LOS CROMATOGRAMAS PARA EL P CUBENSIS EN MEDIO FANG-ZHONG
EN EL DIacuteA 12 PARA CONCENTRACIONES DE 50GL Y GLUCOSA 50GL SACAROSA 112
TABLA 35 AacuteREAS OBTENIDAS DE LOS CROMATOGRAMAS PARA EL P CUBENSIS EN MEDIO FANG-ZHONG
EN EL DIacuteA 13 PARA CONCENTRACIONES DE 30GL GLUCOSA Y 30GL SACAROSA 113
TABLA 36 AacuteREAS OBTENIDAS DE LOS CROMATOGRAMAS PARA EL P CUBENSIS EN MEDIO FANG-ZHONG
EN EL DIacuteA 13 PARA CONCENTRACIONES DE 50GL GLUCOSA Y 50GL SACAROSA 114
TABLA 37 AacuteREAS OBTENIDAS DE LOS CROMATOGRAMAS PARA EL P CUBENSIS EN MEDIO FANG-ZHONG
EN EL DIacuteA 13 PARA CONCENTRACIONES DE 70GL GLUCOSA Y 70GL SACAROSA 115
TABLA 38 AacuteREAS OBTENIDAS DE LOS CROMATOGRAMAS PARA EL P CUBENSIS EN MEDIO FANG-ZHONG
EN EL DIacuteA 13 PARA CONCENTRACIONES DE 50GL Y GLUCOSA 50GL SACAROSA 116
TABLA 39 AacuteREAS OBTENIDAS DE LOS CROMATOGRAMAS PARA EL P CUBENSIS EN MEDIO FANG-ZHONG
EN EL DIacuteA 14 PARA CONCENTRACIONES DE 30GL GLUCOSA Y 30 GL SACAROSA 117
TABLA 40 AacuteREAS OBTENIDAS DE LOS CROMATOGRAMAS PARA EL P CUBENSIS EN MEDIO FANG-ZHONG
EN EL DIacuteA 14 PARA CONCENTRACIONES DE 50GL GLUCOSA Y 50GL SACAROSA 118
TABLA 41 AacuteREAS OBTENIDAS DE LOS CROMATOGRAMAS PARA EL P CUBENSIS EN MEDIO FANG-ZHONG
EN EL DIacuteA 14 PARA CONCENTRACIONES DE 70GL GLUCOSA Y 70GL SACAROSA 119
TABLA 42 AacuteREAS OBTENIDAS DE LOS CROMATOGRAMAS PARA EL P CUBENSIS EN MEDIO FANG-ZHONG
EN EL DIacuteA 13 PARA CONCENTRACIONES DE 50GL GLUCOSA Y 50GL SACAROSA 120
xi
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1 HONGO AGARICALES (LAMINAR) (KUO 2007) 23
FIGURA 2 ALCALOIDES DERIVADOS DEL TRIPTOFANO (MERCANO Y HASEGAWA 1991) 29
FIGURA 3 TRIPTAMINAS SIMPLES (SEIGLER 1981) 31
FIGURA 4 PSILOCIBINA Y PSILOCINA (MANDRILE ET AL 1984) 32
FIGURA 5 PSILOCYBE CUBENSIS (EAH01) CULTIVADA EN MEDIO SOacuteLIDO AGAR MALTA 34
FIGURA 6 CROMATOGRAMAS DE DOS DIFERENTES FERMENTACIONES DE P CUBENSIS QUE ILUSTRAN EL
CRITERIO DE ESCOGENCIA DEL MEJOR ENSAYO REALIZADO (A) 50 GL GLUCOSA (B) 50 GL
SACAROSA 78
FIGURA 7 CROMATOGRAMAS DE DOS DIFERENTES FERMENTACIONES DE P CUBENSIS QUE ILUSTRAN EL
CRITERIO DE ESCOGENCIA DEL MEJOR ENSAYO REALIZADO (A) 05 GL FA (B) 15 GL FA 80
FIGURA 8 MUESTRA DE BIOMASA UNA VEZ ANALIZADA MEDIANTE EL REACTIVO DE DRAGENDORFF 107
FIGURA 9 PERFIL CROMATOGRAacuteFICO (TSUJIKAWA ET AL 2003) 108
xii
LISTA DE GRAacuteFICOS
GRAacuteFICO 1 CINEacuteTICA DE CRECIMIENTO MICELIAL DE P CUBENSIS EN MEDIO SUMERGIDO (FANG-ZHONG)
UTILIZANDO TRES DIFERENTES CONCENTRACIONES DE GLUCOSA COMO FUENTE DE CARBONO (PESO
SECO) 46
GRAacuteFICO 2 CRECIMIENTO MICELIAL DE P CUBENSIS EN CULTIVO SUMERGIDO BAJO TRES
CONCENTRACIONES DE GLUCOSA 47
GRAacuteFICO 3 VALORES DE CONCENTRACIOacuteN DE BIOMASA EXPERIMENTAL Y TEOacuteRICO GRAFICADOS CON
RESPECTO AL TIEMPO PARA LAS FERMENTACIONES CON DIFERENTES CONCENTRACIONES DE
GLUCOSA 49
GRAacuteFICO 4 CINEacuteTICA DE CRECIMIENTO MICELIAL DE P CUBENSIS EN MEDIO SUMERGIDO (FANG-ZHONG)
UTILIZANDO DIFERENTES CONCENTRACIONES DE SACAROSA COMO FUENTE DE CARBONO (PESO
SECO) 50
GRAacuteFICO 5 CRECIMIENTO MICELIAL PARA TRES DIFERENTES CONCENTRACIONES DE SACAROSA 52
GRAacuteFICO 6 VALORES DE CONCENTRACIOacuteN DE BIOMASA EXPERIMENTAL Y TEOacuteRICO GRAFICADOS CON
RESPECTO AL TIEMPO PARA LAS FERMENTACIONES CON DIFERENTES CONCENTRACIONES DE
SACAROSA 54
GRAacuteFICO 7 CRECIMIENTO MICELIAL PARA DOS DIFERENTES FUENTES DE CARBONO (GLUCOSA Y
SACAROSA) 56
GRAacuteFICO 8 CINEacuteTICA DE CRECIMIENTO MICELIAL DE P CUBENSIS EN MEDIO SUMERGIDO (FANG-ZHONG)
UTILIZANDO DIFERENTES CONCENTRACIONES DE FA Y 50 GL DE GLUCOSA COMO FUENTE DE
CARBONO (PESO SECO) 57
GRAacuteFICO 9 CRECIMIENTO MICELIAL PARA GLUCOSA A UNA CONCENTRACIOacuteN DE 50 GL Y TRES
DIFERENTES CONCENTRACIONES DE FA 59
GRAacuteFICO 10 VALORES DE CONCENTRACIOacuteN DE BIOMASA EXPERIMENTAL Y TEOacuteRICO GRAFICADOS CON
RESPECTO AL TIEMPO PARA LAS FERMENTACIONES CON DIFERENTES CONCENTRACIONES DE FA Y
50 GL DE GLUCOSA 61
GRAacuteFICO 11 CINEacuteTICA DE CONSUMO DE SUSTRATO POR PARTE DEL P CUBENSIS EN MEDIO SUMERGIDO
UTILIZANDO DIFERENTES CONCENTRACIONES DE GLUCOSA COMO FUENTE DE CARBONO 62
GRAacuteFICO 12 CINEacuteTICA DE CONSUMO DE SUSTRATO POR PARTE DEL P CUBENSIS EN MEDIO SUMERGIDO
UTILIZANDO DIFERENTES CONCENTRACIONES DE SACAROSA COMO FUENTE DE CARBONO 64
GRAacuteFICO 13 CONSUMO DE SUSTRATO PARA CADA UNA DE LAS FUENTES DE CARBONO UTILIZADAS 66
GRAacuteFICO 14 CINEacuteTICA DE CONSUMO DE SUSTRATO POR PARTE DEL P CUBENSIS EN MEDIO SUMERGIDO
UTILIZANDO 50 GL DE GLUCOSA COMO FUENTE DE CARBONO Y DIFERENTES CONCENTRACIONES DE
FA 67
GRAacuteFICO 15 CONSUMO DE SUSTRATO PARA CADA UNA DE LAS CONCENTRACIONES DE FA UTILIZADAS 68
GRAacuteFICO 16 CINEacuteTICA DE CONSUMO DE PROTEIacuteNA POR PARTE DEL P CUBENSIS EN MEDIO SUMERGIDO
UTILIZANDO DIFERENTES CONCENTRACIONES DE GLUCOSA COMO FUENTE DE CARBONO 70
GRAacuteFICO 17 CINEacuteTICA DE CONSUMO DE PROTEIacuteNA POR PARTE DEL P CUBENSIS EN MEDIO SUMERGIDO
UTILIZANDO DIFERENTES CONCENTRACIONES DE SACAROSA COMO FUENTE DE CARBONO 71
GRAacuteFICO 18 CONSUMO DE PROTEIacuteNA PARA CADA UNA DE LAS FUENTES DE CARBONO UTILIZADAS 73
xiii
GRAacuteFICO 19 CINEacuteTICA DE CONSUMO DE PROTEIacuteNA POR PARTE DEL P CUBENSIS EN MEDIO SUMERGIDO
UTILIZANDO 50 GL DE GLUCOSA COMO FUENTE DE CARBONO Y DIFERENTES CONCENTRACIONES DE
FA 74
GRAacuteFICO 20 CONSUMO DE PROTEIacuteNA PARA LOS ENSAYOS CON Y SIN FA 75
GRAacuteFICO 21 AacuteREA DEL COMPUESTO OBTENIDO DE P CUBENSIS EN TIEMPO DE RETENCIOacuteN ENTRE 62 Y
72 MINUTOS PARA LAS DOS FUENTES DE CARBONO 77
GRAacuteFICO 22 AacuteREA DEL COMPUESTO OBTENIDO DE P CUBENSIS EN TIEMPO DE RETENCIOacuteN ENTRE 62 Y
72 MINUTOS EN LOS UacuteLTIMOS TRES DIacuteAS DE LA FERMENTACIOacuteN CON FA Y GLUCOSA 79
GRAacuteFICO 23 AacuteREA DEL COMPUESTO OBTENIDO DE P CUBENSIS EN TIEMPO DE RETENCIOacuteN ENTRE 62 Y
72 MINUTOS PARA CADA UNA DE LAS FUENTES DE CARBONO UTILIZADAS 82
GRAacuteFICO 24 AacuteREA DEL COMPUESTO OBTENIDO DE P CUBENSIS EN TIEMPO DE RETENCIOacuteN ENTRE 62 Y
72 MINUTOS PARA CADA UNA DE LAS CONCENTRACIONES DE FA UTILIZADAS 85
GRAacuteFICO 25 CROMATOGRAMAS DEL DIacuteA 12 PARA EL P CUBENSIS CULTIVADO EN MEDIO SUMERGIDO
FANG-ZHONG CON DOS DIFERENTES TIPOS DE SUSTRATOS (A) 30 GL GLUCOSA (B) 30 GL SACAROSA
109
GRAacuteFICO 26 CROMATOGRAMAS DEL DIacuteA 12 PARA EL P CUBENSIS CULTIVADO EN MEDIO SUMERGIDO
FANG-ZHONG CON DOS DIFERENTES TIPOS DE SUSTRATOS (A) 50 GL GLUCOSA (B) 50 GL SACAROSA
110
GRAacuteFICO 27 CROMATOGRAMAS DEL DIacuteA 12 PARA EL P CUBENSIS CULTIVADO EN MEDIO SUMERGIDO
FANG-ZHONG CON DOS DIFERENTES TIPOS DE SUSTRATOS (A) 50 GL GLUCOSA (B) 50 GL SACAROSA
111
GRAacuteFICO 28 CROMATOGRAMA DEL DIacuteA 12 PARA EL P CUBENSIS CULTIVADO EN MEDIO SUMERGIDO
FANG-ZHONG CON FUENTE DE CARBONO GLUCOSA Y ADICIOacuteN DE FENILALANINA EN TRES
CONCENTRACIONES (A) 05 GL FA (B) 1 GL FA (C) 15GL FA 112
GRAacuteFICO 29 CROMATOGRAMAS DEL DIacuteA 13 PARA EL P CUBENSIS CULTIVADO EN MEDIO SUMERGIDO
FANG-ZHONG CON DOS DIFERENTES TIPOS DE SUSTRATOS (A) 30 GL GLUCOSA (B) 30 GL SACAROSA
113
GRAacuteFICO 30 CROMATOGRAMAS DEL DIacuteA 13 PARA EL P CUBENSIS CULTIVADO EN MEDIO SUMERGIDO
FANG-ZHONG CON DOS DIFERENTES TIPOS DE SUSTRATOS (A) 50 GL GLUCOSA (B) 50 GL SACAROSA
114
GRAacuteFICO 31 CROMATOGRAMAS DEL DIacuteA 13 PARA EL P CUBENSIS CULTIVADO EN MEDIO SUMERGIDO
FANG-ZHONG CON DOS DIFERENTES TIPOS DE SUSTRATOS (A) 70 GL GLUCOSA (B) 70 GL SACAROSA
115
GRAacuteFICO 32 CROMATOGRAMAS DEL DIacuteA 12 PARA EL P CUBENSIS CULTIVADO EN MEDIO SUMERGIDO
FANG-ZHONG CON FUENTE DE CARBONO GLUCOSA Y ADICIOacuteN DE FENILALANINA EN TRES
CONCENTRACIONES (A) 05 GL FA (B) 1 GL FA (C) 15GL FA 116
GRAacuteFICO 33 CROMATOGRAMAS DEL DIacuteA 14 PARA EL P CUBENSIS CULTIVADO EN MEDIO SUMERGIDO
FANG-ZHONG CON DOS DIFERENTES TIPOS DE SUSTRATOS (A) 30 GL GLUCOSA (B) 30 GL SACAROSA
117
GRAacuteFICO 34 CROMATOGRAMAS DEL DIacuteA 14 PARA EL P CUBENSIS CULTIVADO EN MEDIO SUMERGIDO
FANG-ZHONG CON DOS DIFERENTES TIPOS DE SUSTRATOS (A) 50 GL GLUCOSA (B) 50 GL SACAROSA
118
xiv
GRAacuteFICO 35 CROMATOGRAMAS DEL DIacuteA 14 PARA EL P CUBENSIS CULTIVADO EN MEDIO SUMERGIDO
FANG-ZHONG CON DOS DIFERENTES TIPOS DE SUSTRATOS (A) 70 GL GLUCOSA (B) 70 GL SACAROSA
119
GRAacuteFICO 36 CROMATOGRAMAS DEL DIacuteA 12 PARA EL P CUBENSIS CULTIVADO EN MEDIO SUMERGIDO
FANG-ZHONG CON FUENTE DE CARBONO GLUCOSA Y ADICIOacuteN DE FENILALANINA EN TRES
CONCENTRACIONES (A) 05 GL FA (B) 1 GL FA (C) 15GL FA (A) 05 GL FA (B) 1 GL FA (C)
15GL FA 120
xv
LISTA DE ECUACIONES
ECUACIOacuteN 1 ECUACIOacuteN LINEALIZADA DEL MODELO LOGIacuteSTICO 38
ECUACIOacuteN 2 VALORES TEOacuteRICOS DE BIOMASA EN EL TIEMPO 39
xvi
LISTAS DE ANEXOS
ANEXO 1 ANAacuteLISIS DE VARIANZA (ANOVA) PARA EL CRECIMIENTO DE BIOMASA DE LAS
FERMENTACIONES CON GLUCOSA _____________________________________________________ 90
ANEXO 2 ANAacuteLISIS DE VARIANZA (ANOVA) PARA EL CRECIMIENTO DE BIOMASA DE LAS
FERMENTACIONES CON SACAROSA ____________________________________________________ 91
ANEXO 3 ANAacuteLISIS DE VARIANZA (ANOVA) PARA EL CRECIMIENTO DE BIOMASA DE LAS
FERMENTACIONES CON GLUCOSA Y SACAROSA __________________________________________ 92
ANEXO 4 ANAacuteLISIS DE VARIANZA (ANOVA) PARA EL CRECIMIENTO DE BIOMASA DE LAS
FERMENTACIONES CON GLUCOSA 50 GL Y FA ___________________________________________ 93
ANEXO 5 ANAacuteLISIS DE VARIANZA (ANOVA) PARA EL CONSUMO DE SUSTRATO EN LAS FERMENTACIONES
SIN FA ____________________________________________________________________________ 94
ANEXO 6 ANAacuteLISIS DE VARIANZA (ANOVA) PARA EL CONSUMO DE SUSTRATO EN LAS FERMENTACIONES
CON FA ___________________________________________________________________________ 95
ANEXO 7 ANAacuteLISIS DE VARIANZA (ANOVA) PARA EL CONSUMO DE PROTEIacuteNA EN LAS FERMENTACIONES
SIN FA ____________________________________________________________________________ 96
ANEXO 8 ANAacuteLISIS DE VARIANZA (ANOVA) PARA EL CONSUMO DE PROTEIacuteNA EN LAS FERMENTACIONES
CON FA ___________________________________________________________________________ 97
ANEXO 9 ANAacuteLISIS DE VARIANZA (ANOVA) PARA LA PRODUCCIOacuteN DE PSILOCIBINA EN LAS
FERMENTACIONES SIN FA ____________________________________________________________ 98
ANEXO 10 ANAacuteLISIS DE VARIANZA (ANOVA) PARA LA PRODUCCIOacuteN DE PSILOCIBINA EN LAS
FERMENTACIONES CON FA ___________________________________________________________ 99
ANEXO 11 ANAacuteLISIS DE VARIANZA (ANOVA) PARA LA CUANTIFICACIOacuteN PORCENTUAL DE PSILOCIBINA EN
LAS FERMENTACIONES SIN FA _______________________________________________________ 100
ANEXO 12 ANAacuteLISIS DE VARIANZA (ANOVA) PARA LA CUANTIFICACIOacuteN PORCENTUAL DE PSILOCIBINA EN
LAS FERMENTACIONES CON FA ______________________________________________________ 101
ANEXO 13 DETERMINACIOacuteN DE CONSUMO DE AZUacuteCARES POR EL MEacuteTODO DE DNS (AacuteCIDO
DINITROSALICIacuteLICO) ________________________________________________________________ 102
ANEXO 14 CINEacuteTICA DE CONSUMO DE SUSTRATO ___________________________________________ 104
ANEXO 15 DETERMINACIOacuteN DE CONSUMO DE PROTEIacuteNAS POR EL MEacuteTODO DE LOWRY ____________ 105
ANEXO 16 CINEacuteTICA CONSUMO DE PROTEIacuteNA ______________________________________________ 106
ANEXO 17 PRUEBA DE REACTIVO DE DRAGENDORFF _________________________________________ 107
ANEXO 18 BARRIDO ESPECTRAL PARA EL PSILOCYBE CUBENSIS _________________________________ 108
ANEXO 19 CROMATOGRAMAS (HPLC) DEL DIacuteA 12 DE FERMENTACIOacuteN ___________________________ 109
ANEXO 20 CROMATOGRAMAS (HPLC) DEL DIacuteA 13 DE FERMENTACIOacuteN __________________________ 113
ANEXO 21 CROMATOGRAMAS (HPLC) DEL DIacuteA 14 DE FERMENTACIOacuteN __________________________ 117
xvii
RESUMEN
El Psilocybe cubensis es un hongo de gran importancia a nivel industrial gracias a
la presencia de una sustancia llamada Psilocibina en su cuerpo fructiacutefero
Dicho alcaloide derivado de la triptamina es muy similar al neurotransmisor
serotonina el cual es responsable de la percepcioacuten sensorial la regulacioacuten de la
temperatura el inicio del reposo nocturno del hiacutegado y los rintildeones Por tal motivo
este estudio se enfocoacute en la produccioacuten de la Psilocibina mediante el cultivo del P
cubensis en medio sumergido (Fang-Zhong)
Se evaluaron los efectos de dos fuentes de carbono (glucosa y sacarosa) a tres
concentraciones diferentes en cultivo sumergido para Psilocybe cubensis con el
fin de determinar la incidencia de eacutestas en la produccioacuten de biomasa y en la
produccioacuten y presencia de Psilocibina alcaloide de intereacutes Para las
concentraciones de glucosa de 30 gL 50 gL y 70 gL se presentoacute un crecimiento
maacuteximo de biomasa de 048 gL 055 gL y 062 gL y un porcentaje de alcaloide
de 6065 wv 7396 wv y 6733 wv respectivamente Esto uacuteltimo si se
asume que el tiempo de retencioacuten oscila entre 62 y 72 minutos contaacutendose con
una fase moacutevil de HCOONH4 en una columna C18 Mientras que para las mismas
concentraciones de sacarosa se presentoacute un crecimiento maacuteximo de biomasa de
026 gL 045 gL y 057 gL con porcentajes del compuesto presente entre el
rango de 62 y 72 minutos de 3664 wv 5857 wv y 5583 wv
respectivamente
Una vez realizada la investigacioacuten se encontroacute que las diferencias existentes en
cuanto a la cantidad de biomasa generada con respecto al tipo de sustrato
utilizado no fueron significativas es decir era irrelevante si se utilizaba glucosa o
sacarosa como principal fuente de carbono para la fermentacioacuten del P cubensis
xviii
en medio sumergido con el fin de obtener biomasa sin embargo se hallaron
diferencias significativas con respecto a las diferentes concentraciones empleadas
de dichas fuentes de carbono
Al analizar las muestras mediante cromatografiacutea liacutequida de alta eficiencia (HPLC)
se determinoacute que el medio que conteniacutea 50 gL de glucosa era el deseado debido
a que fue en eacuteste donde se presentaron picos maacutes definidos mostrando una mejor
resolucioacuten del compuesto Adicionalmente presentoacute un buen crecimiento micelial
Una vez elegido dicho criterio se evaluoacute el efecto que teniacutea la adicioacuten de un
aminoaacutecido llamado Fenilalanina (FA) al medio que conteniacutea 50 gL de glucosa
con el fin de determinar si eacuteste teniacutea alguna incidencia positiva en la produccioacuten de
biomasa y en la generacioacuten del alcaloide de intereacutes cabe resaltar que se utilizaron
diferentes concentraciones de FA correspondientes a 05 gL 10 gL y 15 gL
Finalizados dichos ensayos se obtuvieron valores de crecimiento de biomasa
maacutexima de 106 gL 108 gL y 101 gL y un porcentaje de aacuterea de 7549 wv
6236 wv y 2721 wv respectivamente
Es necesario hacer hincapieacute en que las diferencias obtenidas mediante el anaacutelisis
estadiacutestico entre cada una de las concentraciones de FA con respecto a la
generacioacuten de biomasa y la produccioacuten del compuesto no fueron significativas lo
que llevoacute a elegir una concentracioacuten de 05 gL de FA debido a que fue la menor
cantidad utilizada de este compuesto durante la investigacioacuten suponieacutendose asiacute
una disminucioacuten en los costos de materia prima
Palabras claves
Psilocybe cubensis Psilocibina Alcaloide HPLC Cultivo Sumergido Fuentes de
Carbono Fenilalanina
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INTRODUCCIOacuteN
Los hongos son una rica fuente de productos naturales con una alta actividad
bioloacutegica Desafortunadamente el cultivo de eacutestos en cuerpo fructiacutefero toma
varios meses disminuyendo su calidad debido a los cambios climaacuteticos y plagas
por tal razoacuten se implementoacute la metodologiacutea de medio sumergido la cual es
prometedora gracias a una alta productividad de compuestos bioactivos (Arora
1986)
El Geacutenero Psilocybe pertenece al Reino Fungiacute con un Phylum Basidiomicota
una Clase Homobasidiomicetes un Orden Agaricales una Familia Strofariaceae
(Paris y Hurabielle 1981)
Dicho geacutenero es considerado de gran importancia a nivel mundial debido a que su
cuerpo fructiacutefero y biomasa micelial contienen Psilocibina la cual posee un alto
valor para la industria farmaceacuteutica por su uso en la elaboracioacuten de productos
antidepresivos Este alcaloide derivado de FA cuenta con una estructura muy
similar al neurotransmisor segregado por el cerebro llamado serotonina que
controla el estado de aacutenimo el suentildeo el hiacutegado y los rintildeones (Mandrile et al
1984) esta caracteriacutestica le otorga la gran importancia a la Psilocibina en el
mercado puesto que tiene un alto impacto en la sociedad como ayudante
antidepresivo debido a que no todas las personas segregan la cantidad necesaria
(10 mg con liacutemites que variacutean desde 5 a 20 mg) de serotonina (Mandrile et al
1984) Adicionalmente se estaacute empleando como una gran ayuda para la
disminucioacuten de la adiccioacuten a sustancias como heroiacutena y cocaiacutena gracias a que
este alcaloide no genera dependencia (Lee et al 2004)
Debido a que su consumo puede generar alucinaciones era consumido por las
culturas aboriacutegenes centroamericanas con el fin de realizar manifestaciones
20
religiosas Su uso se remonta a maacutes de 3500 antildeos y era nombrado por los
aztecas como ―Teonunaltl que significa ―carne de dioses (Mandrile et al 1984)
La alternativa que se utilizoacute durante esta investigacioacuten fue el cultivo del P
cubensis mediante medio sumergido debido principalmente a las notables
ventajas frente a los sistemas convencionales que eacuteste posee entre las cuales se
destacan la disminucioacuten del tiempo para la obtencioacuten de la biomasa (14 diacuteas) y la
reduccioacuten de los costos de obtencioacuten (Lee et al 2004) De acuerdo a lo
dimensionado anteriormente este estudio estaba orientado primordialmente a la
buacutesqueda de alternativas que permitieran la produccioacuten de biomasa de forma
raacutepida y confiable
Con el fin de llevar a cabo lo dicho anteriormente se pretendioacute evaluar el efecto
del uso de dos diferentes fuentes de carbono en este caso glucosa y sacarosa en
el crecimiento micelial de la cepa P cubensis
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OBJETIVOS
GENERAL
Evaluar el efecto de la fuente de carbono en el crecimiento micelial de una
cepa Psilocybe sp
ESPECIacuteFICOS
Evaluar la cineacutetica de crecimiento de la cepa Psilocybe cubensis en los
diferentes medios de cultivo sumergido mediante la cuantificacioacuten de
biomasa por medio de la metodologiacutea de peso seco
Evaluar el consumo de sustrato para los diferentes ensayos por medio de
teacutecnicas espectrofotomeacutetricas
Determinar la presencia de Psilocibina mediante el uso del reactivo de
Dragendorff
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1 MARCO TEOacuteRICO
11 CONCEPTOS GENERALES DE HONGOS
Los hongos son organismos eucariotas que no contienen clorofila con nutricioacuten
por absorcioacuten generalmente con reproduccioacuten sexual y asexual el cuerpo
consiste generalmente de filamentos ramificados con pared celular quitinosa
(Miles y Chang 1999)
Constituyen uno de los grupos de organismos maacutes importantes para la vida del
hombre ya que son los responsables de gran parte de la descomposicioacuten de la
materia orgaacutenica aumentando su disponibilidad en el suelo pueden ser
comestibles venenosos o psicotroacutepicos muchos son patoacutegenos otros producen
ciertas sustancias beneficiosas o intervienen en procesos de elaboracioacuten de
algunos comestibles (Miles y Chang 1999)
111 Hongos laminares (Agaricales)
El orden Agaricales tambieacuten conocido como Euagaricales es el mayor orden de
setas y hongos que incluye maacutes de la mitad de todas las especies conocidas de la
clase Homobasidiomycetes (Hibbett et al 1997 Hibbett y Thorn 2001) Maacutes de
9000 especies y alrededor de 350 geacuteneros se han atribuido a este orden que
contiene 26 familias (Kirk et al 2001) Un consenso de mayor nivel de
clasificacioacuten de los Agaricales ha sido difiacutecil de lograr debido a la competencia de
sistemas que restringen geacuteneros y familias (o incluso orden) de diferentes
maneras (Bas 1998 Juumllich 1981 Kirk et al 2001 Kuumlhner 1980 Singer 1986)
23
La base para la clasificacioacuten de los hongos fue construida por Fries (1874) quien
hizo hincapieacute en las caracteriacutesticas macroscoacutepicas como la textura del tallo la
separacioacuten de los filamentos (laminas) presencia o ausencia de velo y color de las
esporas
Posteriormente dividioacute los hongos Agaricales en varias especies de acuerdo al
color de las esporas depositadas las cuales pueden ser de color blanco rosado
marroacuten puacuterpura ndash marroacuten y negro El sistema macroscoacutepico de Fries que
reconocioacute inicialmente 12 geacuteneros de hongos carnosos que forman los hongos es
taxonoacutemicamente praacutectico Eacuteste fue relativamente invariable hasta que Fayod
(1989) estudioacute la anatomiacutea y las caracteriacutesticas microscoacutepicas de muchos
Agaricales reconociendo 108 geacuteneros (Arora 1986)
Al igual que todas las setas los hongos laminares son faacutebricas de esporas
creados con el uacutenico propoacutesito de fabricar esporas microscoacutepicas para dejarse
llevar por las corrientes de aire y con suerte caer en un lugar adecuado en la
tierra para germinar y comenzar un nuevo organismo Las probabilidades de que
cualquier individuo que tiene esporas de este tipo tenga suerte son tan bajas que
el hongo produce millones de esporas para compensar esto En las laacuteminas se
encuentran numerosas esporas las cuales aumentan considerablemente el
nuacutemero de esporas que el hongo puede producir Ambos lados de cada laacutemina
estaacute cubierta con esporas microscoacutepicas (Kuo 2007) A continuacioacuten se muestra
de manera ilustrativa en la figura 1 las laacuteminas que poseen los hongos Agaricales
en las cuales se da la formacioacuten de las esporas
Figura 1 Hongo Agaricales (Laminar) (Kuo 2007)
24
12 MEDIOS DE CULTIVO
Uno de los sistemas maacutes importantes para la identificacioacuten de microorganismos es
observar su crecimiento en sustancias alimenticias artificiales preparadas en el
laboratorio El material alimenticio en el que crecen los microorganismos es el
medio de cultivo (Garciacutea 1995)
Para que los microorganismos crezcan adecuadamente en un medio de cultivo
artificial eacuteste debe reunir una serie de condiciones como lo son temperatura
grado de humedad y presioacuten asiacute como un grado correcto de acidez o alcalinidad
Un medio de cultivo contiene los nutrientes y factores de crecimiento necesarios
para que el microorganismo se desarrolle correctamente y debe estar exento de
cualquier tipo de microorganismo que pueda generar contaminacioacuten (Garciacutea
1995)
121 Tipos de medios de cultivo
En la actualidad existen diversos tipos de medio de cultivo si se centra en la
composicioacuten eacutestos pueden ser medios sinteacuteticos que contienen fuente de
carbono fuente de nitroacutegeno sales que suplan los iones y demaacutes elementos tales
como estimuladores del crecimiento medios complejos que contienen ingredientes
tales como extracto de levadura peptona infusioacuten de cerebro etc ricos en
nutrientes medios de enriquecimiento siendo estos complejos con aditivos
adicionales para favorecer asiacute al crecimiento y desarrollo de determinados
microorganismos medios selectivos los cuales son disentildeados para favorecer el
crecimiento especiacutefico de un microorganismo determinado o un grupo
microbiano medios diferenciales que proporcionan la distincioacuten microbiana de una
mezcla por sus propiedades diferenciales de crecimiento en dichos medios
medios de mantenimiento siendo disiacutemiles de los de crecimiento oacuteptimo por el
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crecimiento raacutepido y proliacutefico que deriva en la muerte raacutepida de las ceacutelulas (Garciacutea
1995)
Atendiendo a su estado los medios de cultivo pueden presentarse como medios
sumergidos y medios soacutelidos que contienen agar que gelifica por debajo de 45
degC y cuya concentracioacuten en su uso es de 15 y medios semisoacutelidos que contiene
un agar a una concentracioacuten de 07 (Garciacutea 1995)
121 Medio sumergido
Debido a que cultivar el cuerpo fructiacutefero toma varios meses y se dificulta el control
de calidad del producto final porque se estaacute sujeto a los cambios permanentes del
clima y las plagas se ha empleado la metodologiacutea de medio sumergido la cual es
una alternativa muy prometedora para la produccioacuten eficiente del micelio y de los
metabolitos (Lindequist y Niedermeyer 2005)
Dicha forma es la mejor para producir extraer y purificar metabolitos de un cultivo
de hongo ya que facilita una mayor produccioacuten de biomasa en menor tiempo y
de mayor calidad que el cultivo en medio soacutelido ademaacutes facilita la dispersioacuten y
adaptacioacuten del hongo y reduce los vectores de contaminacioacuten De igual forma un
cultivo de esta iacutendole es la opcioacuten maacutes viable si se quiere escalar procesos
fermentativos en aras de desarrollar mercados como en este caso el de
metabolitos medicinales (Navarro et al 1998)
A su vez el uso de cultivo sumergido puede beneficiar la produccioacuten de muchos
metabolitos secundarios y disminuir los costos de produccioacuten por reducir las
labores que involucran los meacutetodos de etapas soacutelidas (Domiacutenguez y Webb 2003)
Los metabolitos bioactivos de los hongos pueden ser potencialmente producidos a
nivel industrial mediante el uso de la metodologiacutea de cultivo sumergido pero el
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eacutexito a escala comercial depende del costo comparado con la tecnologiacutea existente
y la ventaja econoacutemica que la industria puede ver usando este meacutetodo El uso de
la tecnologiacutea puede ser facilitada por el aumento en el rendimiento de la
produccioacuten y el desarrollo del sistema (Hwang et al 2004)
El cultivo de hongos sumergidos se caracteriza por un aumento en la viscosidad
del caldo con el tiempo debido a uno o maacutes factores tales como el aumento de la
concentracioacuten de ceacutelulas los cambios de la morfologiacutea del crecimiento o la
produccioacuten de productos extracelulares que alteran el caraacutecter reoloacutegico de la
cultura del liacutequido El aumento en la viscosidad puede ser visto como un fenoacutemeno
indeseable pero inevitable ya que causan dificultades en el suministro de oxiacutegeno
en la eliminacioacuten de dioacutexido de carbono y en posibles problemas de agitacioacuten
(Hwang et al 2004)
13 ALCALOIDES
131 Generalidades
La diversidad estructural y la variedad en la actividad bioloacutegica hacen de los
alcaloides como tambieacuten de los antibioacuteticos los grupos maacutes importantes entre las
sustancias naturales de intereacutes terapeacuteutico (Paris y Hurabielle 1981)
Se han aislado principalmente en plantas superiores y se han encontrado en maacutes
de 100 familias de Faneroacutegamas (aquellas plantas que se reproducen por semillas
producidas en sus inflorescencias) Su actividad bioloacutegica a nivel del sistema
nervioso dio pie a las primeras investigaciones siendo los alcaloides las primeras
sustancias naturales estudiadas (Paris y Hurabielle 1981)
El teacutermino alcaloide propuesto por el farmaceacuteutico W Meissner en 1819 se aplicoacute
a los compuestos de origen vegetal con propiedades alcalinas este caraacutecter
baacutesico es debido a la presencia de nitroacutegeno amiacutenico en su estructura Los
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alcaloides se pueden considerar como ―Un compuesto orgaacutenico de origen natural
nitrogenado derivados generalmente de aminoaacutecidos maacutes o menos baacutesico de
distribucioacuten restringida con propiedades farmacoloacutegicas importantes a dosis bajas
y que responden a reacciones comunes de precipitacioacuten (Paris y Hurabielle
1981)
132 Propiedades fisicoquiacutemicas
Los alcaloides tienen masas moleculares que variacutean entre 100 y 9000 gmol son
casi siempre incoloros son normalmente soacutelidos a temperatura ambiente a
excepcioacuten de los alcaloides no oxigenados Los alcaloides son poco solubles en
agua gracias a su caraacutecter baacutesico dicho caraacutecter se debe al par de electrones
libres del nitroacutegeno (Paris y Hurabielle 1981)
En la naturaleza se encuentran en forma de sales generalmente En las plantas
se consideraba que eran productos obtenidos durante la extraccioacuten y poco
solubles en disolventes tiacutepicos de extraccioacuten por su polaridad Son solubles en
disolventes orgaacutenicos como cloroformo etanol metanol acetato de etilo eacuteter
benceno En forma de sales son solubles en agua excepto las sales de berberina
(Paris y Hurabielle 1981)
Todos los alcaloides son activos a la luz polarizada Presentan una fluorescencia
caracteriacutestica bajo la luz UV o IR dando lugar a espectros caracteriacutesticos (Paris y
Hurabielle 1981)
133 Reconocimiento de los alcaloides
Las teacutecnicas de reconocimiento son basadas en la capacidad que tienen los
alcaloides en estado de sal (extractos aacutecidos) de combinarse con el yodo y
metales pesados como bismuto mercurio tungsteno formando precipitados se
28
utilizan reactivos generales para detectar alcaloides como reactivo de Wagner
reactivo de Mayer reactivo de Dragendorff reactivo de Hager reactivo de
Bertrand reactivo de Ehrlich y reactivo de Vitali-Morin (Paris y Hurabielle 1981)
134 Clasificacioacuten de los alcaloides
Habitualmente los alcaloides se han clasificado en funcioacuten de su estructura
distinguieacutendose principalmente los compuestos heterociacuteclicos de los no
heterociacuteclicos Actualmente existen varias formas de clasificarlos (Bruneton
1987) entre ellas se pueden distinguir
1341 Alcaloides alifaacuteticos
a Derivados de la ornitina (pirrolidinas tropaacutenicos pirrolizidiacutenicos)
b Derivados de la lisina (piperidinas quinolizidiacutenicos)
1342 Alcaloides de origen diverso
a Alcaloides terpeacutenicos y esteroidales
b Alcaloides diversos (purinas macrociclos etc)
1343 Alcaloides aromaacuteticos
a Derivados del aacutecido nicotiacutenico (piridinas)
b Derivados de la fenilalanina y tirosina (isoquinoleinas)
c Derivados del triptofano (indoacutelicos quinoleinas)
d Derivados de la histidina (imidazoles)
29
Alcaloides derivados del triptofano (Alcaloides Indoacutelicos)
Desde el punto de vista farmacoloacutegico ha habido mucho intereacutes sobre las bases
que contienen el nuacutecleo indoacutelico a raiacutez del descubrimiento de la actividad
alucinoacutegena del LSD asiacute como la actividad sedante de la reserpina aislada del
geacutenero Rauwolfia El auge del estudio fitoquiacutemico ocurrioacute en la deacutecada de los 60 y
se dirigiacutea principalmente a la familia Apocynaceae (Mercano y Hasegawa 1991)
Existen unos 800 alcaloides de este tipo distribuidos principalmente en la familia
Apocynaceae (geacuteneros Rauwolfia Aspidos-perma Strychnos y Vinca) menos
frecuentes en hongos y familias como Leguminoseae Malphigiaceae Rubiaceae y
Rutaceae donde los alcaloides presentan el grupo indoacutelico sencillo (Mercano y
Hasegawa 1991)
El triptofano es el precursor de estos alcaloides los cuales se clasifican en
triptaminas y en no triptaminas las triptaminas a su vez se subdividen en b-
carbolinas y en indoleninas y pueden ser triptaminas simples o triptaminas
complejas y estas pueden ser isopreacutenicas o no isopreacutenicas (Mercano y Hasegawa
1991) La figura 2 muestra la estructura quiacutemica del triptofano triptamina y sus
divisiones
Figura 2 Alcaloides derivados del Triptofano (Mercano y Hasegawa 1991)
30
Triptaminas simples
Las triptaminas simples juegan un importante papel en la cultura indiacutegena de
Ameacuterica por sus efectos alucinoacutegenos y extaacuteticos en sus ceremonias maacutegico
religiosas (Furst 1994) Se han encontrado en hongos alucinoacutegenos de
Mesoameacuterica del geacutenero Psilocybe Stropharia y Conocybe (―teonacatl o ―carne
de los dioses) usados por los indios Aztecas en sus ceremonias religiosas desde
hace maacutes de 1700 antildeos Se han encontrado en estos hongos los alcaloides
alucinoacutegenos la Psilocina y la Psilocibina que al ingerirlos produce diferentes
sensaciones auditivas y visuales relajacioacuten muscular depresiones y euforias
alternadas (Mercano y Hasegawa 1991)
La serotonina que juega un importante papel en la actividad neuronal se
encuentra tambieacuten en vegetales Se ha aislado en el pericarpio del banano el cual
seco cuando es fumado actuacutea como un alucinoacutegeno ligero (Seigler 1981)
De las glaacutendulas paroacutetidas del sapo comuacuten Bufo vulgaris se aiacutesla la bufotenina
derivado N-dimetilado de la serotonina que tambieacuten es el principio activo del Yopoacute
polvo de las semillas de Anadenanthera peregrina (Piptadenia peregrina)
Leguminoseae y especies del geacutenero Virola (Myristicaceae) que contiene tambieacuten
triptaminas son mezclados con cenizas e inhalados por medio de tubos de bambuacute
por los indiacutegenas del Orinoco en ceremonias maacutegico religiosas produciendo
alucinacioacuten e incoordinacioacuten motriz (Seigler 1981)
En la figura 3 se observan las estructuras de aquellos compuestos que estaacuten
clasificados como triptaminas simples
31
Figura 3 Triptaminas simples (Seigler 1981)
13 PSILOCIBINA Y PSILOCINA
La Psilocibina y la Psilocina son bioloacutegicamente sintetizadas en los hongos
pertenecientes a los geacuteneros de Psilocybe (Bigwood y Beug 1982 Wurst et al
1984)
La Psilocibina y la Psilocina se han identificado en todo el mundo en una variedad
de setas que son llamados hongos maacutegicos La ingestioacuten de pequentildeas
cantidades de alucinoacutegenos provoca el eacutextasis La actividad alucinoacutegena de la
Psilocibina es relativamente maacutes baja que la de la Psilocina Sin embargo la
Psilocibina se convierte faacutecilmente en Psilocina (componente activo principal) en
los sistemas bioloacutegicos Asiacute el desarrollo de un meacutetodo de determinacioacuten de la
Psilocibina es importante lo misma que la de la Psilocina (Kimie et al 2005)
La hidroacutelisis de la Psilocibina se consigue saturando con anhiacutedido carboacutenico una
solucioacuten acuosa de Psilocibina (para eliminar el oxiacutegeno del aire y calentaacutendola)
obteniendo asiacute una moleacutecula de 4hidroxi-dimetiltriptamina y una moleacutecula de aacutecido
fosfoacuterico (Mandrile et al 1984)
Como todos los faacutermacos derivados del indol estas sustancias han despertado
intereacutes porque se sospechoacute la posibilidad de que algunas de ellas se formen en el
32
organismo y que en ciertas psicosis especialmente en la esquizofrenia se
produzcan elevados niveles sanguiacuteneos que ocasionan algunos de los siacutentomas
(Mandrile et al 1984)
La figura 4 muestra la estructura quiacutemica de alcaloides como la Psilocibina y
Psilocina
Figura 4 Psilocibina y Psilocina (Mandrile et al 1984)
131 Antecedentes acerca de la obtencioacuten de Psilocibina y Psilocina
Una gran variedad de meacutetodos cromatograacuteficos para la determinacioacuten de
Psilocibina y Psilocina presentes en las incautaciones de hongos se han
publicado La cromatografiacutea de capa fina es utilizada debido a que eacutesta es muy
apropiada para la deteccioacuten de sustancias derivadas del triptofano (Brown et al
1972 Tanimukai 1967 Beug y Bigwood 1981) Aun asiacute meacutetodos que involucran
tanto la cromatografiacutea de alta eficiencia (HPLC) como la deteccioacuten fotomeacutetrica de
UV (Beug y Bigwood 1981 Wurst et al 1984 Borner y Brenneisen 1987 Perkal
et al 1980 Vanhaelen-Faestreacute y Vanhaelen 1984 Thomson 1980 White 1979
Sottolano y Lurie 1983) fueron establecidas y optimizadas para la cuantificacioacuten
de Psilocibina
Durante los uacuteltimos antildeos se han venido utilizando diferentes tipos de columna y
fase moacutevil con el fin de obtener la mayor cantidad posible de la sustancia de
intereacutes (Psilocibina)
33
En el antildeo 1981 en el instituto farmaceacuteutico de la Universidad de Oslo realizaron
una investigacioacuten con una columna de siacutelice con una fase moacutevil de metanol-nitrato
de amonio en donde no soacutelo se logroacute obtener Psilocibina y Psilocina sino tambieacuten
un nuevo producto conocido como beocistiacuten Se logroacute un porcentaje de separacioacuten
maacutexima de 75 ww (Christiansen et al 1981)
Asimismo en el antildeo 1984 en el instituto de microbiologiacutea de Amsterdam se
realizoacute un estudio con una columna C18 de siacutelice y una fase moacutevil de agua-etanol-
aacutecido aceacutetico de forma isocraacutetica en donde se obtuvo un porcentaje 025-115
y 002-016 de Psilocibina y Psilocina respectivamente en el hongo (Wurst
1984)
De igual manera en el antildeo 2003 en el instituto de ciencia policiaca en Japoacuten se
ejecutoacute la cromatografiacutea de alta eficiencia utilizando una columna C18 con una
fase moacutevil de aacutecido foacutermico de forma isocraacutetica y un detector de 220 nm un rango
de porcentaje de Psilocibina 014-042 wv en la capa mientras un 009-03
wv en el tallo (Tsujikawa et al 2003)
34
2 MATERIALES Y MEacuteTODOS
21 LOCALIZACIOacuteN
Las fermentaciones la medicioacuten del crecimiento micelial y la cuantificacioacuten del
consumo del sustrato y de proteiacutena se llevaron a cabo en el laboratorio de
Biotecnologiacutea de la Universidad EAFIT mientras que los anaacutelisis de cromatografiacutea
liacutequida de alta eficiencia (HPLC) se realizaron en el laboratorio de Quiacutemica
Instrumental de dicha Universidad
22 MICROORGANISMO DE ESTUDIO
La cepa del hongo Psilocybe cubensis (EAH01) con la cual se trabajoacute fue donada
por Joseacute Rodrigo Moreno Ingeniero del laboratorio de la Universidad Catoacutelica de
Oriente (UCO) La EAH01 permanece auacuten en el laboratorio de Biotecnologiacutea de la
Universidad EAFIT
Dicha cepa se cultivoacute en una caja Petri que conteniacutea Agar Extracto de Malta
(MEA) y se incuboacute a 30ordmC en una incubadora digital del laboratorio de
Biotecnologiacutea de la Universidad EAFIT La figura 5 representa una cepa de P
cubensis cultivada en medio soacutelido MEA
Figura 5 Psilocybe cubensis (EAH01) cultivada en medio soacutelido Agar Malta
35
23 COMPONENTES DEL MEDIO DE CULTIVO (FANG-ZHONG)
El medio sumergido utilizado para llevar a cabo las diferentes fermentaciones de
P cubensis fue el descrito por Fang-Zhong (2002) La tabla 1 muestra los
componentes de dicho medio y la concentracioacuten de cada uno de ellos Se destaca
que las fuentes de carbono utilizadas fueron glucosa y sacarosa usaacutendolas cada
una por separado para cada experimento y haciendo variaciones de
concentraciones de las mismas para los distintos ensayos
Tabla 1 Composicioacuten del medio de cultivo sumergido para evaluar el crecimiento micelial del P cubensis
Componentes Cantidad (gL)
Fuente de Carbono 30 ndash 50 - 70
Peptona 5
Extracto de levadura 5
KH2PO4 1
MgSO47H2O 05
Vitamina B1 005
24 PREPARACIOacuteN DE LOS DIFERENTES PREINOacuteCULOS DE P cubensis
EMPLEADOS PARA LAS FERMENTACIONES SUMERGIDAS
Con el propoacutesito de llevar a cabo cada uno de los ensayos fue necesario realizar
la preparacioacuten de un preinoacuteculo eacutesto con el fin de realizar un proceso de
adaptacioacuten del P cubensis al medio favoreciendo la disminucioacuten en cuanto a
tiempo (preferiblemente la eliminacioacuten de la aparicioacuten de un fase de latencia una
vez comenzada la fermentacioacuten)
La preparacioacuten de cada uno de los preinoacuteculos se realizoacute en 6 erlenmeyers de
1000 mL con 200 mL de medio cada uno los cuales fueron esterilizados a 120degC
por 15 minutos e inoculados con 4 discos de 5 mm aproximadamente de P
36
cubensis provenientes de la cepa previamente activada en Agar Malta durante 6
diacuteas Los erlenmeyers se llevaron a un agitador orbital por 6 diacuteas a 30ordmC y 100
rpm
25 PREPARACIOacuteN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO Y LOS INOacuteCULOS DE P
cubensis UTILIZADOS PARA LAS FERMENTACIONES SUMERGIDAS
Una vez realizado el preinoacuteculo se procedioacute a preparar los medios de cultivo
utilizados para realizar los distintos experimentos de la siguiente manera se
prepararon medios que diferiacutean en la fuente de carbono (glucosa o sacarosa) y en
la concentracioacuten de la misma (30 gL 50 gL y 70 gL) teniendo asiacute un total de
seis fermentaciones Las demaacutes cantidades de los componentes del medio de
Fang-Zhong fueron las mismas que las usadas en el preinoacuteculo descritas en la
Tabla 1
En primer lugar se llevaron a cabo las tres fermentaciones de glucosa
preparando un total de 90 erlenmeyers (30 por cada concentracioacuten de azuacutecar por
duplicado) cada uno de los frascos conteniacutea 50 mL del medio en erlenmeyers de
250 mL e inoculados con 01 g de peso huacutemedo del preinoacuteculo aproximadamente
Los 90 frascos se llevaron durante 14 diacuteas a un agitador orbital a 100 rpm con una
temperatura de 30 degC
Posteriormente se llevaron a cabo las tres fermentaciones de sacarosa siguiendo
el mismo proceso descrito anteriormente para la glucosa
Una vez terminadas las fermentaciones de glucosa y sacarosa y realizados todos
los anaacutelisis correspondientes (generacioacuten de biomasa consumo de sustrato
consumo de proteiacutena y evaluacioacuten de la presencia de Psilocibina por medio de
cromatografiacutea liacutequida de alta eficiencia (HPLC)) se procedioacute a elegir la fuente de
carbono y concentracioacuten que mejores resultados arrojoacute tanto para la generacioacuten
37
de biomasa como para la produccioacuten del alcaloide con el fin de evaluarla
nuevamente adicionaacutendole un precursor (FA)
Para finalizar se procedioacute a preparar los medios con la fuente de carbono y la
concentracioacuten de la misma que arrojoacute mejores resultados es decir los ensayos
realizados con una concentracioacuten de 50 gL de glucosa adicionaacutendole al medio
FA a diferentes concentraciones correspondiente a valores de 05 gL 10 gL y
15 gL las demaacutes cantidades de los componentes remanentes del medio fueron
las mismas que las descritas anteriormente en la tabla 1
26 CUANTIFICACIOacuteN DEL CRECIMIENTO DE BIOMASA MEDIANTE LOS
MEacuteTODOS DE PESO HUacuteMEDO Y PESO SECO PARA CULTIVO
SUMERGIDO DE P cubensis
La cuantificacioacuten de biomasa para cada uno de los tratamientos se realizoacute usando
la metodologiacutea de peso huacutemedo y peso seco Para la cuantificacioacuten de biomasa
mediante el meacutetodo de peso huacutemedo se tomaron dos muestras provenientes de
cada erlenmeyer cada 24 horas las cuales fueron filtradas y pesadas con el fin de
obtener el valor de peso huacutemedo para cada tratamiento del P cubensis
Posteriormente la biomasa retenida en el papel filtro fue llevada a un secador que
se encontraba a una temperatura de 50ordmC durante 24 horas transcurrido el
tiempo la biomasa seca fue pesada con el fin de obtener datos de peso seco
Durante los 14 diacuteas de la fermentacioacuten se obtuvieron datos de peso huacutemedo y
peso seco por duplicado para cada una de las fermentaciones
27 AJUSTE DE LA CINEacuteTICA DE CRECIMIENTO DE P cubensis AL
MODELO CINEacuteTICO LOGIacuteSTICO
Una vez realizada la recoleccioacuten de muestras para cada uno de los ensayos y su
posterior anaacutelisis se decidioacute modelar dichos datos mediante el modelo logiacutestico
38
(ecuacioacuten 1) el cual permite obtener variables cineacuteticas tales como la cantidad de
biomasa inicial (Xo) y la velocidad maacutexima de crecimiento (micromaacutex) para cada uno de
los tratamientos
Se decidioacute emplear el modelo logiacutestico ya que eacuteste muestra resultados maacutes reales
cuando se cultivan hongos debido a que su morfologiacutea es muy diferente a otros
microorganismos (pellets) dificultando la transferencia de masa (Bailey et al
1986)
Una vez linealizada la ecuacioacuten que describe dicho modelos se llega a la siguiente
expresioacuten
Ecuacioacuten 1 Ecuacioacuten linealizada del modelo logiacutestico
Posterior a la linealizacioacuten de la ecuacioacuten se procedioacute a graficar Ln ((XmaacutexX)-1)
vs tiempo con el fin de obtener como pendiente la velocidad maacutexima de
crecimiento (micromaacutex) y como intercepto el Ln ((XmaacutexXo)-1) el cual permitioacute la
obtencioacuten de la concentracioacuten inicial de biomasa
Obtenieacutendose asiacute los paraacutemetros cineacuteticos para cada ensayo correspondientes a
micromax y Xo
Se debe definir la concentracioacuten maacutexima de biomasa (Xmaacutex) para poder hallar los
paraacutemetros cineacuteticos mediante dicho modelo cabe aclarar que dicho valor se toma
de los resultados de biomasa adquiridos para cada uno de los ensayos mediante
la metodologiacutea de peso seco este valor variacutea para cada fermentacioacuten
Una vez ajustados los datos de cada tratamiento al modelo logiacutestico se procedioacute a
calcular de manera teoacuterica los valores de X (biomasa) que variacutea con el tiempo
39
teniendo en cuenta los paraacutemetros cineacuteticos arrojados mediante el modelo
logiacutestico utilizando la siguiente ecuacioacuten
Ecuacioacuten 2 Valores teoacutericos de biomasa en el tiempo
Estos valores de X teoacutericos obtenidos mediante la foacutermula anterior se grafican con
respecto a los valores de X obtenidos de manera experimental con el fin de
observar el ajuste del modelo logiacutestico a cada uno de los datos experimentales
28 EVALUACIOacuteN DEL CONSUMO DE SUSTRATO Y DEL CONSUMO DE
PROTEIacuteNA POR PARTE DEL P cubensis CULTIVADO EN MEDIO
SUMERGIDO
Con el fin de evaluar el consumo de sustrato y proteiacutena por parte del P cubensis
durante las fermentaciones que conteniacutean glucosa en el medio se recolectaron
muestras cada 24 horas del liacutequido obtenido despueacutes de realizada la filtracioacuten de
la muestra que se utilizoacute para efectos de caacutelculo de peso seo dicho liacutequido
denominado sobrenadante fue almacenado a -4 degC Finalizadas cada una de las
fermentaciones se procedioacute a realizar el protocolo para evaluar el consumo de
sustrato para cada medio (Miller 1959) mediante el meacutetodo de DNS (Aacutecido
Dinitrosaliciacutelico) (Anexo 13) y el consumo de proteiacutenas mediante el meacutetodo de
LOWRY para cada fermentacioacuten (Anexo 15)
Para llevar a cabo la cuantificacioacuten de sustrato y proteiacutena en los distintos ensayos
fue necesario realizar las curvas de calibracioacuten correspondientes dichas curvas
con sus respectivos valores de concentracioacuten se muestran en los anexos 14 y 16
40
29 MEacuteTODO CUALITATIVO PARA DETERMINAR LA PRESENCIA DE
ALCALOIDES (PSILOCIBINA) MEDIANTE EL USO DEL REACTIVO DE
DRAGENDORFF
Como se mencionoacute anteriormente el reactivo de Dragendorff es usado para
determinar de manera cualitativa la ausencia o presencia de alcaloides en una
muestra determinada Para llevar a cabo dicha prueba se recolectaron muestras
de la biomasa seca correspondientes a los diacuteas 12 13 y 14 de cada fermentacioacuten
las cuales fueron almacenadas a -4degC
Para determinar la presencia de Psilocibina se realizoacute el proceso descrito seguacuten
Musshoff et al (2000) el cual consistioacute en macerar cada una de las muestras de
biomasa hasta obtener un polvo fino luego se pesaron 10 mg de dicho polvo y a
esta cantidad se le agregoacute 1 mL de metanol Posteriormente una pequentildea
cantidad de esta mezcla se esparcioacute en un papel filtro en donde se le adicionoacute una
gota del reactivo de Dragendorff
Una vez realizada la prueba se dice que la muestra contiene presencia de
alcaloides si eacutesta presenta una coloracioacuten rojizo-amarilla
210 MEacuteTODO PARA DETERMINAR LA PRESENCIA DE PSILOCIBINA
MEDIANTE CROMATOGRAFIacuteA LIacuteQUIDA DE ALTA EFICIENCIA (HPLC)
Una vez evaluada la presencia del alcaloide mediante el reactivo de Dragendorff
se procedioacute a determinar mediante el uso de cromatografiacutea liacutequida de alta
eficiencia (HPLC) la presencia de los alcaloides en la mezcla con sus respectivos
tiempos de retencioacuten para llevar a cabo la extraccioacuten de la Psilocibina se siguioacute el
meacutetodo descrito por Musshoff et al (2000) Para ello la muestra de biomasa
seca fue macera en un mortero hasta convertirla en un polvo fino Diez miligramos
41
de la muestra en polvo se extrajeron dos veces con 1 mL de metanol en un bantildeo
de ultrasonido durante 30 minutos Posterior a eacutesto se centrifugaron las muestras
a 3000 rpm durante 2 minutos el sobrenadante se depositoacute en un vial
independiente
El sobrenadante fue evaporado hasta sequedad bajo una corriente de nitroacutegeno
gaseoso Una parte de los residuos se disolvioacute en 200 microL de la fase moacutevil que
contiene HCOONH4 con una concentracioacuten 10 microM y un pH de 35
El equipo utilizado para realizar todos los anaacutelisis correspondientes a HPLC
cuenta con las siguientes caracteriacutesticas equipo Agient Technologies que consta
de una columna C18 de 46 mm 250 mm 5 mm con una fase moacutevil de
HCOONH4 con un flujo de 1 mLminuto un detector UV de 214 nm y una inyeccioacuten
de 20 μL y una temperatura de 25degC El experimento se corrioacute de modo isocraacutetico
con una fase moacutevil de agua 70 y HCOONH4 de 30
211 DETERMINACIOacuteN CUALITATIVA DE LA RESOLUCIOacuteN DEL
ALCALOIDE DE INTEREacuteS PARA LOS DIFERENTES ENSAYOS
Con el fin de determinar de manera cualitativa cuaacutel de los cromatogramas
arrojados mediante la teacutecnica de HPLC presentoacute mejor resolucioacuten del alcaloide
fue necesario realizar un supuesto acerca del tiempo de retencioacuten de la Psilocibina
durante la cromatografiacutea puesto que a pesar de haber contado con un
cromatograma (Tsujikawa et al 2003) (Anexo 18) y haber trabajado en las
mismas condiciones de eacuteste no se utilizoacute la misma fase moacutevil lo que puedo
generar variaciones en dicho tiempo Se asumioacute que el tiempo de retencioacuten varioacute
entre 62 y 72 minutos es decir entre este tiempo se encontroacute el pico de intereacutes
de la investigacioacuten
42
La eleccioacuten del criterio de pureza del compuesto de intereacutes se realizoacute observando
cuaacutel de los picos obtenidos muestra menor ruido es decir que a su alrededor no
tenga presencia de otros compuestos (Anexos 19 20 y 21)
212 DETERMINACIOacuteN PORCENTUAL DE COMPUESTOS PARA LOS
DIFERENTES ENSAYOS
La cuantificacioacuten de los compuestos se hizo mediante un porcentaje de aacuterea bajo
la curva debido a que no se contoacute con un estaacutendar interno
Para realizar dicho porcentaje se obtuvo la totalidad de las aacutereas presentes en el
perfil cromatograacutefico obtenido para las muestras de los diacuteas 12 13 y 14 de cada
fermentacioacuten y el porcentaje del aacuterea del metabolito de intereacutes la cual oscilaba
entre un tiempo de retencioacuten entre 62 y 72 minutos
En el momento de analizar los cromatogramas y de elegir el medio que mejor
resultados arrojoacute en cuanto a la produccioacuten de alcaloide se observoacute la resolucioacuten
del metabolito en cada una de las fermentaciones
213 CULTIVO SUMERGIDO DE P cubensis EN PRESENCIA DE FA
Despueacutes de haber elegido la fuente de carbono (glucosa) y su respectiva
concentracioacuten (50 gL) que mejores resultados arrojaron durante la investigacioacuten
se realizaron nuevamente fermentaciones del P cubensis en medio sumergido
(Fang-Zhong) donde la diferencia de estos medios con respecto a los
anteriormente utilizados radicoacute en la presencia de FA aminoaacutecido
Para dichas fermentaciones se contoacute con tres concentraciones diferentes de FA
(05 gL 1 gL 15 gL) realizadas por duplicado adicionalmente se montoacute
43
simultaacuteneamente con dichos ensayos las muestras correspondientes a los uacuteltimos
tres diacuteas de fermentacioacuten sin FA en el medio para efectos de comparacioacuten y asiacute
poder llevar a cabo un anaacutelisis estadiacutestico apropiado
Los datos obtenidos fueron analizados por medio de una ANOVA con el fin de
observar si existiacutean o no diferencias significativas en cuanto al crecimiento micelial
(concentracioacuten de biomasa) del P cubensis y asiacute poder determinar el medio que
mejores resultados arrojoacute durante la investigacioacuten
214 DISENtildeO DE EXPERIMENTOS Y ANAacuteLISIS ESTADIacuteSTICO
El disentildeo estadiacutestico utilizado para realizar los anaacutelisis correspondientes a las
diferentes fermentaciones es un disentildeo factorial 23 Este estudio se basoacute en dos
factores que fueron las dos fuentes de carbono (glucosa y sacarosa) a su vez se
apoyoacute en tres niveles que fueron la variacioacuten en la concentracioacuten de las mismas
(30 gL 50 gL y 70 gL) De igual manera se fundamentoacute en dos variables de
respuesta el crecimiento micelial de P cubensis y el porcentaje de Psilocibina
presente en el microorganismo
Por medio del Software Statgraphics plus 51 se realizoacute un anaacutelisis estadiacutestico
basado en una ANOVA factorial Con ello se pretendioacute comparar estadiacutesticamente
los resultados de crecimiento micelial de biomasa (concentracioacuten) y produccioacuten de
Psilocibina para cada uno de los medios durante los 14 diacuteas de fermentacioacuten y en
especial en los uacuteltimos tres diacuteas de la misma puesto que durante este periacuteodo fue
evaluada la presencia del alcaloide
Es necesario hacer hincapieacute que para realizar dicha estadiacutestica fue necesario
ejecutar un estudio de normalidad el cual se comproboacute utilizando la graacutefica de
probabilidad normal a su vez se requirioacute un anaacutelisis de igualdad de varianza por
medio de una graacutefica de residuos Vs previsto con el fin de ver visualmente la
44
hipoacutetesis de la homocedasticidad todo ello con el fin de garantizar que la
investigacioacuten se comportoacute de forma normal Adicionalmente se contoacute con una
hipoacutetesis nula (Ho) y una Hipoacutetesis alterna (Ha) las cuales permitieron realizar las
conclusiones respectivas A continuacioacuten se enunciaraacuten cada una de eacutestas y los
paraacutemetros necesarios para dicho estudio
Ho Todas las medias son iguales es decir no existen diferencias
significativas entre los datos analizados
Ha Alguna de las medias es diferente lo que quiere decir que siacute existen
diferencias significativas
Paraacutemetro
Pvalor gt 005 Se acepta Ho
Pvalor le 005 Se rechaza Ho
45
3 RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN
31 CINEacuteTICA DE CRECIMIENTO MICELIAL DE P cubensis EN CULTIVO
SUMERGIDO (FANG-ZHONG) UTILIZANDO DIFERENTES FUENTES DE
CARBONO
Con el propoacutesito de evaluar el crecimiento micelial del P cubensis en medio
sumergido durante los 14 diacuteas de la fermentacioacuten se recurrioacute al uso de
metodologiacuteas conocidas como peso huacutemedo y peso seco en dicho trabajo soacutelo se
exponen los datos arrojados por el meacutetodo de peso seco
A continuacioacuten se presentan cada una de las fermentaciones de acuerdo al tipo de
sustrato empleado en las mismas los respectivos valores de peso seco obtenidos
y los anaacutelisis pertinentes para cada uno de los casos
311 Crecimiento micelial de P cubensis en medio sumergido utilizando
diferentes concentraciones de glucosa
Inicialmente se evaluaron tres concentraciones de glucosa en el cultivo de P
cubensis en medio sumergido (Fang-Zhong) correspondientes a 30 gL 50 gL y
70 gL siendo en este caso la glucosa la principal fuente de carbono del P
cubensis
A continuacioacuten se muestran los valores de peso seco obtenidos para cada una de
las concentraciones de glucosa utilizadas durante los 14 diacuteas de la fermentacioacuten
46
0
01
02
03
04
05
06
07
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Bio
ma
sa (g
L)
Tiempo (diacuteas)30gL 50gL 70gL
Graacutefico 1 Cineacutetica de crecimiento micelial de P cubensis en medio sumergido (Fang-Zhong) utilizando tres diferentes concentraciones de
glucosa como fuente de carbono (Peso seco)
Del graacutefico 1 se puede observar que no hubo evidencia de fase de latencia para
ninguno de los ensayos posteriormente se aprecia que el crecimiento de biomasa
aumentoacute con el tiempo para las diferentes concentraciones de glucosa empleadas
Analizando las fermentaciones que conteniacutean 50 gL y 70 gL de glucosa se
puede afirmar que ambas presentan un comportamiento similar mostrando una
fase exponencial hasta el diacutea 11 y una fase estacionaria hasta el diacutea 14 de la
fermentacioacuten mientras que la fermentacioacuten que conteniacutea 30 gL de glucosa no
presentoacute fase estacionaria la fermentacioacuten durante los 14 diacuteas se encontraba en
fase exponencial a pesar de que entre los diacuteas 8 y 11 el crecimiento de P
cubensis se mantuvo constante
Asimismo se puede observar que el crecimiento maacutes bajo en cuanto a
concentracioacuten de biomasa se generoacute en la concentracioacuten de 30 gL siendo eacuteste
de 048 gL mientras que en las concentraciones de 50 gL y 70 gL de glucosa
los crecimientos maacuteximos fueron muy similares 055 gL y 062 gL
respectivamente
47
Lo dicho anteriormente se ratifica una vez analizados los resultados obtenidos
estadiacutesticamente donde se obtuvo un P-valor igual a cero indicando que existen
diferencias significativas en cuanto al crecimiento micelial de biomasa
(concentracioacuten de biomasa durante los 14 diacuteas de la fermentacioacuten) El graacutefico 2
ilustra la presencia de dos grupos homogeacuteneos lo que indica que las
concentraciones de 50 gL y 70 gL no tienen diferencias significativas del
crecimiento micelial entre cada una de ellas mientras que la concentracioacuten de 30
gL siacute presenta dichas diferencias significativas con respecto a las dos
concentraciones anteriores (Anexo 1)
Con todo eacutesto se expone que la concentracioacuten de glucosa de 50 gL es la que se
eligioacute debido a que es maacutes econoacutemico utilizar 50 gL de glucosa que 70 gL
Tratamientos con diferentes concentraciones de glucosa
Media 30 gL glucosa (a) 022
Media 50 gL glucosa (b) 032
Media 70 gL glucosa (b) 034
a
bb
0
005
01
015
02
025
03
035
04
045
Co
nce
ntr
acioacute
n b
iom
asa
(gL
)
Letras diferentes denotan diferencias significativas (prueba LSD)
Graacutefico 2 Crecimiento micelial de P cubensis en cultivo sumergido bajo tres concentraciones de glucosa
48
Modelo logiacutestico para las fermentaciones donde se utilizoacute glucosa
como fuente de carbono
Una vez realizada la cineacutetica de crecimiento del P cubensis en medio sumergido
(Fang-Zhong) usando diferentes concentraciones de glucosa se procedioacute a
ajustar los datos obtenidos al modelo logiacutestico Los crecimientos maacuteximos de
biomasa obtenidos mediante el meacutetodo de peso seco para cada uno de los
ensayos fueron 048 gL 065 gL y 062 gL para concentraciones de 30 gL 50
gL y 70 gL de glucosa respectivamente La tabla 2 muestra los paraacutemetros
cineacuteticos obtenidos mediante el modelo para cada una de las concentraciones
Tabla 2 Paraacutemetros cineacuteticos obtenidos mediante el modelo logiacutestico para las diferentes fermentaciones de P cubensis utilizando glucosa como fuente
de carbono
30gL 50gL 70gL
microx (diacutea-sup1) 016 microx (diacutea-sup1) 017 microx (diacutea-sup1) 015
micromax (diacutea-sup1) 027 micromax (diacutea-sup1) 035 micromax (diacutea-sup1) 034
X0 (gL) 005 X0 (gL) 008 X0 (gL) 008
R2 096 R2
092 R2 085
De la tabla 2 se puede observar que la concentracioacuten inicial de biomasa (Xo)
estuvo muy cercana para cada una de las concentraciones de glucosa utilizadas
Para 30 gL de glucosa la velocidad maacutexima de crecimiento (micromax) fue mucho
menor que la obtenida para 50 gL y 70 gL eacutesto pudo ser debido a que fue el
medio que menor cantidad de glucosa conteniacutea mientras que para las otras dos
concentraciones de glucosa la velocidad maacutexima de crecimiento fue similar
Al comparar las velocidades maacuteximas de las tres concentraciones de glucosa
utilizadas se evidencia que la fermentacioacuten que conteniacutea 50 gL presentoacute una
micromaacutex mayor correspondiente a 035 diacutea-1 esto sugiere que a mayores
concentracioacuten de glucosa (70 gL) puede ocurrir una inhibicioacuten por sustrato otro
49
criterio que afirma que dicha concentracioacuten fue la que mejores resultados arrojoacute de
las tres concentraciones de glucosa utilizadas para el crecimiento del P cubensis
en el medio de Fang-Zhong Ademaacutes se observa que este experimento fue el que
mayor velocidad especiacutefica de crecimiento presento siendo esta de 017 diacutea-1
Finalmente se calcularon los valores de biomasa teoacutericos utilizando la ecuacioacuten
descrita anteriormente en la metodologiacutea con el propoacutesito de observar que tanto
se ajustaron los valores de biomasa hallados experimentalmente con los valores
de biomasa teoacutericos arrojados por el modelo logiacutestico El graacutefico 3 muestra los
valores de biomasa (X) tanto teoacutericos como experimentales con respecto al
tiempo
0
01
02
03
04
05
06
07
0 2 4 6 8 10 12 14
Biom
asa
(gL
)
Tiempo (diacutea)
X exp (30 gL) X exp (50 gL) X exp (70 gL)
X teoacuterico (30 gL) X teoacuterico (50 gL) X teoacuterico (70 gL)
Graacutefico 3 Valores de concentracioacuten de biomasa experimental y teoacuterico
graficados con respecto al tiempo para las fermentaciones con diferentes concentraciones de glucosa
Al observar el graacutefico 3 se puede notar que para los ensayos de 50 gL y 70 gL
de glucosa los valores de biomasa teoacutericos se encuentran un poco desfasados de
los valores de biomasa hallados de manera experimental mientras que para el
ensayo que conteniacutea 30 gL de glucosa se observa un buen ajuste de los datos
50
obtenidos experimentalmente al modelo logiacutestico La tabla 2 reitera lo dicho
anteriormente al exponer los valores de R2 los cuales explican la relacioacuten que
tienen los datos teoacutericos con los experimentales
312 Crecimiento micelial del P cubensis en medio sumergido utilizando
diferentes concentraciones de sacarosa
Una vez evaluado el crecimiento de biomasa usando glucosa como fuente de
carbono se procedioacute a evaluar el efecto que teniacutea el cambio de la fuente de
carbono por sacarosa en el crecimiento micelial del P cubensis en medio
sumergido
El graacutefico 4 muestra de manera ilustrativa como fue el crecimiento micelial del P
cubensis para cada una de las concentraciones de sacarosa utilizadas durante los
14 diacuteas mediante el meacutetodo de peso seco
0
01
02
03
04
05
06
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Biom
asa (
gL)
Tiempo (diacuteas)
30 gL 50 gL 70 gL
Graacutefico 4 Cineacutetica de crecimiento micelial de P cubensis en medio sumergido (Fang-Zhong) utilizando diferentes concentraciones de sacarosa
como fuente de carbono (Peso seco)
51
En el graacutefico 4 se puede observar que tanto para una concentracioacuten de 30 gL
como para 70 gL de sacarosa el hongo llega a su fase estacionaria cerca del
quinto diacutea de la fermentacioacuten mientras que para una concentracioacuten de 50 gL se
observa un comportamiento diferente puesto que el microorganismo tiene un
crecimiento exponencial hasta el diacutea 5 en donde entra a una etapa de transicioacuten o
estacionaria durante 3 diacuteas aproximadamente luego de la cual inicia nuevamente
su crecimiento de forma exponencial hasta llegar al diacutea 11 en donde siacute empieza
su fase estacionaria
Al igual que en las tres fermentaciones que conteniacutean glucosa en estas
fermentaciones de sacarosa se observa mediante el graacutefico anterior que no hubo
presencia de fase de latencia
El crecimiento maacuteximo de biomasa en cuanto a concentracioacuten lo presentoacute aquella
fermentacioacuten que conteniacutea 70 gL de sacarosa el cual fue de 057 gL seguida de
la de 50 gL con un crecimiento maacuteximo de biomasa de 045 gL y posteriormente
la concentracioacuten de 30 gL obtuvo un crecimiento maacuteximo de 026 gL
De acuerdo al anaacutelisis estadiacutestico que se realizoacute para cada una de las
fermentaciones se dedujo que las diferencias en cuanto al crecimiento micelial de
biomasa con respecto a la concentracioacuten de la misma son significativas entre
cada una de las fermentaciones es decir fue diferente la concentracioacuten de
biomasa obtenida cuando se trabajoacute con cada una de distintas concentraciones de
sacarosa Lo dicho anteriormente se muestra a traveacutes del graacutefico 5 (Anexo 2)
52
Tratamientos con diferentes concentraciones de sacarosa
Media 30 gL sacarosa (a) 02
Media 50 gL sacarosa (b) 032
Media 70 gL sacarosa (c) 043
a
b
c
0
02
04
Co
nce
ntr
acioacute
n b
iom
asa
(gL
)
Letras diferentes denotan diferencias significativas (prueba LSD)
Graacutefico 5 Crecimiento micelial para tres diferentes concentraciones de sacarosa
Modelo logiacutestico para las fermentaciones donde se utilizoacute sacarosa
como fuente de carbono
Una vez realizadas las cineacuteticas de crecimiento del P cubensis para cada
concentracioacuten de sacarosa empleada se procedioacute a ajustar los datos obtenidos al
modelo logiacutestico cabe recalcar que es necesario establecer los crecimientos
maacuteximos de biomasa obtenidos para cada uno de los ensayos los cuales fueron
026 gL 045 gL y 057 gL para concentraciones de 30 gL 50 gL y 70 gL de
sacarosa respectivamente
Una vez aplicado el modelo logiacutestico para cada tratamiento se obtuvieron valores
de velocidad maacutexima de crecimiento y biomasa inicial para cada concentracioacuten de
sacarosa utilizada en el medio los cuales se muestran en la tabla 3
53
Tabla 3 Paraacutemetros cineacuteticos obtenidos mediante el modelo logiacutestico para las diferentes fermentaciones de P cubensis utilizando sacarosa como
fuente de carbono
30gL 50gL 70gL
microx (diacutea-sup1) 030 microx (diacutea-sup1) 014 microx (diacutea-sup1) 041
micromax (diacutea-sup1) 037 micromax (diacutea-sup1) 042 micromax (diacutea-sup1) 067
X0 (gL) 01 X0(gL) 01 X0 (gL) 011
R2 061 R2 089 R2 095
De la tabla 3 se ratifica que se utilizoacute una concentracioacuten inicial de biomasa igual
para cada una de las fermentaciones aproximadamente 01 gL ademaacutes se
observa un aumento en la velocidad maacutexima de crecimiento con respecto a la
cantidad de sacarosa empleada es decir que el hecho de haber aumentado la
concentracioacuten de sacarosa en el medio favorecioacute el aumento en la velocidad
maacutexima de crecimiento del P cubensis siendo eacutesta mayor cuando se trabajoacute a una
concentracioacuten de 70 gL de sacarosa De igual manera se aprecia que el
tratamiento que conteniacutea 70 gL de sacarosa presentoacute una velocidad especiacutefica de
crecimiento mayor que los demaacutes siendo eacutesta de 041 diacutea-1
Finalmente se calcularon los valores de biomasa teoacutericos el graacutefico 6 ilustra los
valores de biomasa (X) tanto teoacutericos como experimentales graficados con
respecto al tiempo
54
0
01
02
03
04
05
06
0 2 4 6 8 10 12 14
Bio
mas
a (g
L)
Tiempo (Diacutea)
X exp (30 gL) X exp (50 gL) X exp (70 gL)
X teoacuterico (30 gL) X teoacuterico (50 gL) X teoacuterico (70 gL)
Graacutefico 6 Valores de concentracioacuten de biomasa experimental y teoacuterico graficados con respecto al tiempo para las fermentaciones con diferentes
concentraciones de sacarosa
Del graacutefico 6 se puede observar como los valores de biomasa experimentales se
ajustaron a los valores de biomasa teoacutericos arrojados por el modelo logiacutestico lo
que quiere decir la cineacutetica de crecimiento del P cubensis en medio sumergido
cuando se utilizoacute 70 gL se ajustoacute correctamente al modelo logiacutestico lo que se
corrobora en la tabla 2 gracias al valor obtenido para el R2 que indica la relacioacuten
de los datos teoacutericos con respecto a los experimentales Por otro lado para las
fermentaciones de 30 gL y 50 gL de sacarosa a pesar de parecer que
presentaron un buen ajuste al calcular la relacioacuten de los datos teoacutericos con
respecto a los experimentales (R2) se concluye que el ajuste no fue tan bueno
55
313 Comparacioacuten entre el crecimiento micelial de P cubensis en los
cultivos sumergidos utilizando glucosa y sacarosa como fuente de
carbono
Ahora bien es igualmente importante realizar un anaacutelisis comparativo entre ambas
fuentes de carbono empleadas con el fin de determinar si existen o no diferencias
significativas entre dichas fuentes de carbono
De acuerdo al anaacutelisis estadiacutestico se dice que existen diferencias significativas del
crecimiento micelial del P cubensis en cuanto al diacutea y la concentracioacuten de
sustrato empleado es decir concentracioacuten de glucosa y sacarosa (Anexo 3) pero
se observa claramente que no hay diferencias significativas de dicho crecimiento
con respecto al tipo de sustrato utilizado debido a que el P-valor arrojado por la
estadiacutestica fue de 01217 lo que sugiere que se debe utilizar la sacarosa gracias
a la disminucioacuten de costos que se generariacutean durante el proceso todo ello gracias
al costo de la sacarosa es inferior al de glucosa Sin embargo para elegir la fuente
de carbono que mejores resultados arrojoacute no soacutelo se basoacute en la cantidad de
biomasa producida sino que se procedioacute a examinar los barridos espectrales
arrojados por el anaacutelisis de HPLC con el fin de determinar la fuente de carbono
que mejor resolucioacuten mostroacute del alcaloide que en esta investigacioacuten fue glucosa a
una concentracioacuten de 50 gL
De igual manera el graacutefico 7 muestra las medias obtenidas mediante el anaacutelisis
estadiacutestico para las fermentaciones trabajadas con glucosa y sacarosa Aun asiacute
es necesario hacer hincapieacute que eacuteste no es el criterio principal para la obtencioacuten
del medio que mejores resultados arrojoacute durante la investigacioacuten por lo tanto se
deben seguir realizando los diferentes anaacutelisis descritos anteriormente en este
trabajo
56
Tratamientos de las dos fuentes de carbono usadas sin FA (glucosa y
sacarosa)
Media para glucosa (a) 029
Media para sacarosa (a) 032
aa
0
01
02
03
Conc
entr
acioacute
n bi
omas
a (g
L)
Letras diferentes denotan diferencias significativas (Prueba LSD)
Graacutefico 7 Crecimiento micelial para dos diferentes fuentes de carbono (glucosa y sacarosa)
314 Crecimiento micelial del P cubensis en cultivo sumergido utilizando
glucosa y fenilalanina en el medio
Se decidioacute realizar un uacuteltimo ensayo acerca del efecto que teniacutea la adicioacuten de un
aminoaacutecido llamado Fenilalanina (FA) al medio Fang-Zhong sobre la produccioacuten
del alcaloide y por ende sobre la generacioacuten de biomasa
Debido a los anaacutelisis realizados anteriormente se concluyoacute que la mejor fuente de
carbono fue la glucosa a una concentracioacuten de 50 gL De la misma manera que
en los numerales anteriores se evaluoacute la cineacutetica del crecimiento micelial del P
cubensis mediante los meacutetodos de peso huacutemedo y peso seco Las mediciones
fueron realizadas por duplicado y promediadas para la fuente de carbono elegida
(glucosa 50 gL) y las diferentes concentraciones de FA en el medio
correspondientes a 05 gL 1 gL 15 gL con el fin de encontrar el medio que
mejores resultados arrojoacute en cuanto a crecimiento micelial y generacioacuten del
57
alcaloide de intereacutes Los datos obtenidos mediante el meacutetodo de peso seco se
muestran en el graacutefico 8
Cabe resaltar que junto con las tres fermentaciones de 05 gL 10 gL y 15 gL
de FA se montaron a su vez seis muestras correspondientes a los diacuteas 12 13 y
14 de la fermentacioacuten que conteniacutea 0 gL de FA eacutesto con el propoacutesito de analizar
los datos de manera estadiacutestica y poder hacer comparaciones con respecto a la
generacioacuten de biomasa y a la produccioacuten del alcaloide de intereacutes ambas medidas
con respecto a la concentracioacuten
0
01
02
03
04
05
06
07
08
09
1
11
12
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Biom
asa
(gL
)
Tiempo (diacuteas)
05 gL 1 gL 15 gL
Graacutefico 8 Cineacutetica de crecimiento micelial de P cubensis en medio sumergido (Fang-Zhong) utilizando diferentes concentraciones de FA y 50
gL de glucosa como fuente de carbono (Peso seco)
Al analizar el graacutefico 8 es decir el crecimiento micelial (concentracioacuten de
biomasa) seguacuten la concentracioacuten de FA en el tiempo se puede notar que no hubo
presencia de fase de latencia para ninguna de las concentraciones de FA
utilizadas ademaacutes el crecimiento de biomasa en cada caso se aprecia de manera
58
muy similar llegando los tres ensayos a la fase estacionaria el diacutea 12 de la
fermentacioacuten
Observando el graacutefico 8 se puede identificar que el mayor contenido de biomasa
fue de 108 gL obtenida el diacutea 13 para una concentracioacuten 10 gL de FA para
concentraciones de 05 gL y 15 gL de FA la concentracioacuten maacutexima de biomasa
fue 106 gL y 101 gL respectivamente Auacuten asiacute al considerar los resultados
obtenidos se puede ratificar que es indiferente la cantidad de FA necesaria para
obtener concentracioacuten de biomasa por ende se decide que el medio que mejores
resultados arrojoacute fue el que conteniacutea 05 gL FA debido a que fue la
concentracioacuten de FA que mejor resolucioacuten del alcaloide presentoacute paraacutemetro
observado mediante los cromatogramas obtenidos del anaacutelisis de HPLC (Anexos
19 20 y 21) y ademaacutes porque con dicha cantidad los costos de la materia prima
seriacutean menores Cabe resaltar que el uso de FA generoacute un aumento significativo
duplicando la produccioacuten de biomasa por lo tanto se testifica que siacute hubo
duplicacioacuten en cuanto a la concentracioacuten de biomasa en los medios que conteniacutea
FA con respecto a los medios que no conteniacutean FA se dice entonces que a su
vez se podriacutea haber generado mayor cantidad de Psilocibina en los medios que
teniacutean FA ya que dicho alcaloide se produce de manera intracelular por tal
razoacuten al aumentar la cantidad de biomasa en el medio se aumenta la cantidad de
dicho alcaloide
De igual manera se analizaron los datos estadiacutesticamente y se llegoacute a apreciar
que no existen diferencias significativas en cuanto a la produccioacuten de biomasa y la
cantidad de FA utilizada en el medio Del mismo modo al analizar la tabla de
contrastes muacuteltiple de rangos se reitera que siacute existen diferencias significativas
entre el crecimiento micelial de biomasa (concentracioacuten de biomasa) en el tiempo
cuando se trabajoacute con FA o sin eacuteste Eacutesto se puede observar en el graacutefico 9
(Anexo 4)
59
Tratamientos con y sin FA
Media 0 gL FA (a) 032
Media 05 gL FA (b) 065
Media 10 gL FA (b) 066
Media 15 gL FA (b) 069
a
b b b
0
01
02
03
04
05
06
07
08
09
Conc
entr
acioacute
n bi
omas
a (g
L)
Letras diferentes denotan diferencias significativas (Prueba LSD)
Graacutefico 9 Crecimiento micelial para glucosa a una concentracioacuten de 50 gL y tres diferentes concentraciones de FA
Modelo logiacutestico para las fermentaciones donde se utilizoacute 50 gL de
glucosa como fuente de carbono y diferentes concentraciones de FA
En primer lugar se fijaron los valores de crecimiento maacuteximo de biomasa para
cada una de las concentraciones obtenidos mediante el meacutetodo de peso seco con
el fin de hallar los paraacutemetros cineacuteticos mediante el modelo logiacutestico Los
crecimientos maacuteximos de biomasa obtenidos fueron los siguientes 106 gL 108
gL y 101 gL para concentraciones de 05 gL 10 gL y 15 gL de FA
respectivamente y 50 gL de glucosa
Una vez realizado el modelo logiacutestico para cada tratamiento se obtuvieron los
valores de velocidad maacutexima de crecimiento y concentracioacuten de biomasa inicial
para cada ensayo los cuales se muestran en la tabla 4
60
Tabla 4 Paraacutemetros cineacuteticos obtenidos mediante el modelo logiacutestico para las diferentes fermentaciones de P cubensis utilizando 50 gL de glucosa
como fuente de carbono y diferentes concentraciones de FA
05gL 10gL 15gL
microx (diacutea-sup1) 018 microx (diacutea-sup1) 012 microx (diacutea-sup1) 012
micromax (diacutea-sup1) 045 micromax (diacutea-sup1) 035 micromax (diacutea-sup1) 044
X0 (gL) 01 X0 (gL) 017 X0 (gL) 016
R2 095 R2 082 R2 088
Seguacuten los valores arrojados por el modelo logiacutestico que se encuentran
presentados en la tabla 4 se puede decir que se presentoacute una valor de biomasa
inicial similar para los tratamientos de 1 gL y 15 gL de FA mientras que para las
fermentaciones que conteniacutean 05 gL de FA se tiene una diferencia de un 50
aproximadamente Ademaacutes se puede observar que a la concentracioacuten de 05 gL
de FA es la que mayor velocidad maacutexima de crecimiento presenta siendo esta
045 diacuteamacrsup1 a su vez dicha concentracioacuten presentaacute la microx mayor correspondiente a
018 diacutea-1 Debido a eacutesto y al criterio de mejor resolucioacuten del alcaloide observado
en los anaacutelisis de HPLC (Anexos 19 20 y 21) se concluye que el medio que
mejores resultados arrojoacute durante la investigacioacuten para la generacioacuten de biomasa
y la produccioacuten de la Psilocibina es 05 gL de FA y 50 gL de glucosa
Finalmente se calcularon los valores de biomasa teoacutericos el graacutefico 10 muestra
los valores de biomasa (X) tanto teoacutericos como experimentales graficados con
respecto al tiempo
61
0
02
04
06
08
1
12
0 2 4 6 8 10 12 14 16
Bio
mas
a (g
L)
Tiempo (Diacutea)
X exp (05 gL) X exp (10 gL) X exp (15 gL)
X teoacuterico (05 gL) X teoacuterico (10 gL) X teoacuterico (15 gL)
Graacutefico 10 Valores de concentracioacuten de biomasa experimental y teoacuterico graficados con respecto al tiempo para las fermentaciones con diferentes
concentraciones de FA y 50 gL de glucosa
Se puede decir gracias al graacutefico 10 que los valores de biomasa experimentales
se ajustaron a los valores de biomasa teoacutericos hallados mediante el modelo
logiacutestico es decir la cineacutetica de crecimiento del P cubensis en medio sumergido
cuando se usaron diferentes concentraciones de FA en el medio se ajustoacute
correctamente al modelo logiacutestico esto se reitera con los valores de R2 mostrados
anteriormente en la tabla 4
32 ESTUDIO DE LA CINEacuteTICA DE CONSUMO DE SUSTRATO POR PARTE
DEL P cubensis CULTIVADO EN MEDIO SUMERGIDO (FANG-ZHONG)
La evaluacioacuten del consumo de sustrato durante la fermentacioacuten con respecto al
tiempo es de suma importancia puesto que eacuteste es el principal componente
limitante del crecimiento presente en el medio de cultivo
62
A continuacioacuten se analizaraacuten dichos consumos para los diferentes ensayos
321 Consumo de sustrato por parte del P cubensis en medio sumergido
utilizando diferentes concentraciones de glucosa
Una vez halladas las concentraciones de sustrato para cada una de las
fermentaciones que conteniacutean glucosa en el medio se procedioacute a graficar dichos
valores con respecto al tiempo
El graacutefico 11 ilustra los datos obtenidos sobre el consumo de sustrato de las tres
fermentaciones que conteniacutean glucosa y a su vez como se comportoacute el
crecimiento de biomasa para cada ensayo durante los 14 diacuteas de fermentacioacuten
0
01
02
03
04
05
06
07
0
10
20
30
40
50
60
70
80
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14B
iom
asa
(gL
)
Glu
cosa
(gL
)
Tiempo (diacuteas)
30 GL 50GL 70 GL 30gL 50gL 70gL
Graacutefico 11 Cineacutetica de consumo de sustrato por parte del P cubensis en medio sumergido utilizando diferentes concentraciones de glucosa como
fuente de carbono
Al observar el graacutefico 11 se expone que el P cubensis consumioacute mayor cantidad
de glucosa cuando esta estaba a una concentracioacuten de 70 gL correspondiendo a
63
un porcentaje de 62 mientras que para 50 gL y 30 gL fue de 23 y 30
respectivamente
Comparando el consumo de glucosa en sus diferentes concentraciones con el
crecimiento micelial del hongo se puede observar que a una concentracioacuten de
glucosa de 30 gL no soacutelo se tuvo un menor consumo de sustrato sino que
tambieacuten se generoacute un menor crecimiento de biomasa Mientras que a
concentraciones de 50 gL y 70 gL de glucosa a pesar de presentar diferencias
en cuanto al porcentaje de sustrato consumido el crecimiento micelial es similar
(no presenta diferencias significativas) lo que indica que el hongo no requiere
tanta concentracioacuten de glucosa para su crecimiento eacutesto se puede afirmar soacutelo
para este ensayo a estas condiciones
De igual manera en el graacutefico 11 al analizar la tendencia del consumo de
sustrato las concentraciones de glucosa de 50 gL y 70 gL presentan una
disminucioacuten notoria hasta el diacutea 11 para dicho consumo Esto se debe a que en
ese diacutea inicioacute la fase estacionaria del hongo en ambas fermentaciones en donde
el P cubensis requeriacutea alimento uacutenicamente para mantenerse y producir
metabolitos secundarios Mientras que para la concentracioacuten de glucosa de 30 gL
el consumo de glucosa fue muy poco a partir del quinto diacutea de la fermentacioacuten
esto se atribuye a que la cineacutetica de crecimiento micelial del P cubensis presentoacute
una fase estacionaria temprana entre los diacuteas 8 y 11 indicando que no necesitaba
consumir casi glucosa puesto que no estaba creciendo
322 Consumo de sustrato por parte del P cubensis en medio sumergido
utilizando diferentes concentraciones de sacarosa
Los datos obtenidos sobre el consumo de sacarosa para cada una de las
concentraciones utilizadas (30 gL 50 gL y 70 gL de sacarosa) durante los 14
diacuteas de la fermentacioacuten se muestran en el graacutefico 12 a su vez se ilustran en dicho
64
graacutefico el comportamiento del crecimiento micelial para cada ensayo durante los
14 diacuteas de fermentacioacuten para efectos de anaacutelisis
0
01
02
03
04
05
06
0
10
20
30
40
50
60
70
80
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Bio
mas
a (g
L)
Sac
aro
sa (g
L)
Tiempo (diacuteas)
30gL 50gL 70gL 30 gL 50 gL 70 gL
Graacutefico 12 Cineacutetica de consumo de sustrato por parte del P cubensis en medio sumergido utilizando diferentes concentraciones de sacarosa como
fuente de carbono
Al observar el graacutefico 12 se puede decir que el P cubensis consumioacute mayor
cantidad de sacarosa cuando eacutesta estaba a una concentracioacuten de 70 gL en el
medio presentando un porcentaje de consumo del 49 mientras que para las
concentraciones de 50 gL y 30 gL de sacarosa se tuvo un porcentaje de
consumo de 24 y 37 Esto igual que en el consumo de glucosa se puede
deber a que al tener mayor concentracioacuten de sustrato en el medio el P cubensis
genera mayor afinidad por el mismo haciendo que dicho hongo se consuma
grandes cantidades de sacarosa durante el tiempo
Igualmente se observa que aproximadamente en el noveno diacutea de la
fermentacioacuten las tres diferentes concentraciones de glucosa (30 gL 50 gL y 70
65
gL) se mantienen casi constantes en el tiempo ello gracias a que en este diacutea el
hongo se encontraba en fase estacionaria en los tres ensayos
323 Comparacioacuten entre el consumo de sustrato de P cubensis en los
cultivos sumergidos con diferentes fuentes de carbono
Con el fin de identificar cuaacutel de las dos fuentes de carbono fue consumida en
mayor proporcioacuten por parte del P cubensis se procedioacute a realizar un anaacutelisis
estadiacutestico donde comparamos las dos fuentes de carbono empleados con
respecto al consumo de sustrato obtenido (concentracioacuten de glucosa y sacarosa
en cada uno de los medios) donde se consiguioacute un P-valor de 00811 con
respecto al tipo de sustrato lo que indica que no existen diferencias en cuanto al
consumo de sustrato y el tipo del mismo es decir es indiferente cuaacutel de los dos
sustratos (glucosa o sacarosa) se utilice para que se del consumo del mismo por
parte del P cubensis Observacioacuten que se reitera en la tabla de contraste muacuteltiple
que muestra que se trabajoacute como un grupo homogeacuteneo Igualmente el graacutefico 13
muestra las medias de consumo de sustrato (concentracioacuten durante los 14 diacuteas)
obtenidas mediante el anaacutelisis estadiacutestico y reitera que no existen diferencias
significativas con respecto al tipo de sustrato utilizado para el cultivo del P
cubensis en medio sumergido (Anexo 5)
66
Tratamientos de las dos fuentes de carbono usadas sin FA (glucosa y sacarosa)
Media glucosa (a) 3431
Media sacarosa (a) 3678
a
a
32
34
36
38
Co
nce
ntr
acioacute
n s
ust
rato
(g
L)
Letras diferentes denotan diferencias significativas (Prueba LSD)
Graacutefico 13 Consumo de sustrato para cada una de las fuentes de carbono utilizadas
Aun asiacute al comparar los graacuteficos 11 y 12 se puede observar un mayor consumo
de glucosa que de sacarosa lo que lleva a concluir que es mejor emplear la
primera (glucosa)
324 Consumo de sustrato por parte del P cubensis en medio sumergido
utilizando glucosa y fenilalanina en el medio
Los datos obtenidos acerca del consumo de sustrato durante los 14 diacuteas de la
fermentacioacuten para cada uno de los medios que conteniacutean 50 gL de glucosa y
diferentes concentraciones de FA (05 gL 1 gL y 15 gL) se muestran en el
graacutefico 14 De igual manera se ilustran en dicho graacutefico las cineacuteticas de
crecimiento micelial para cada una de las fermentaciones que teniacutean 50 gL de
glucosa y diferentes concentraciones de FA con el fin de realizar los anaacutelisis
pertinentes
67
0
02
04
06
08
1
12
0
10
20
30
40
50
60
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Bio
mas
a (g
L)
Glu
cosa
50
gL
+ F
A (g
L)
Tiempo (diacuteas)
05gL 10gL 15gL 05 gL 1 gL 15 gL
Graacutefico 14 Cineacutetica de consumo de sustrato por parte del P cubensis en medio sumergido utilizando 50 gL de glucosa como fuente de carbono y
diferentes concentraciones de FA
Analizando el graacutefico 14 se puede decir que el consumo de glucosa durante el
tiempo fue igual para las fermentaciones que conteniacutea concentraciones de 1 gL y
15 gL de FA dichos consumos corresponde a valores de 23 mientras que
para el ensayo que teniacutea una concentracioacuten de 05 gL de FA el porcentaje de
consumo fue del 18 Asimismo se presentaron diferencias significativas en
cuanto al consumo de sustrato entre los diferentes ensayos
El graacutefico 15 expone las medias del consumo de sustrato (concentracioacuten) de cada
una de las muestras y las diferencias existentes entre ellas se evidencia que la
adicioacuten de FA disminuyoacute el consumo de glucosa ademaacutes que en los ensayos se
presentaron tres grupos homogeacuteneos diferentes En el primer grupo (a) que
contiene las fermentaciones del P cubensis con una concentracioacuten de 50 gL de
glucosa y en ausencia de FA se obtuvo una media de 356 gL la cual indica un
mayor consumo de sustrato Luego el segundo grupo (c) se compone de las
concentraciones de 1 gL y 15 gL de FA presentando una media de 413 gL y
de 426 gL respectivamente y el uacuteltimo grupo (b) corresponde a una
68
concentracioacuten de 05 gL de FA el cual presenta el menor consumo de glucosa al
exponer una media 466 gL
Seguacuten lo anterior y el graacutefico 15 se dice que siacute existieron diferencias significativas
en cuanto al consumo de sustrato (concentracioacuten durante los 14 diacuteas) en los
uacuteltimos tres diacuteas cuando se trabajo con FA y sin FA y a su vez se encontraron
diferencias significativas de la concentracioacuten de sustrato en el medio cuando se
teniacutea una concentracioacuten de FA correspondiente a 05 gL con relacioacuten a las otras
dos concentraciones de FA (10 gL y 15 gL) mientras que entre estas dos
uacuteltimas concentraciones de FA (10 gL y 15 gL) no se encontraron diferencias
significativas (Anexo 6)
Tratamientos con y sin FA
Media 0 gL FA (a) 3564
Media 05 gL FA (b) 466
Media 10 gL FA (c) 4131
Media 15 gL FA (c) 426
a
b c c
0
10
20
30
40
50
60
Conc
entr
acioacute
n su
stra
to (g
L)
Letras diferentes denotan diferencias significativas (prueba LSD)
Graacutefico 15 Consumo de sustrato para cada una de las concentraciones de FA utilizadas
69
33 ESTUDIO DE LA CINEacuteTICA DE CONSUMO DE PROTEIacuteNA POR PARTE
DEL P cubensis CULTIVADO EN MEDIO SUMERGIDO (FANG-ZHONG)
Las fuentes de proteiacutena que posee el medio de Fang-Zhong son extracto de
levadura y peptona que representan una cantidad de 10 gL para cada ensayo
eacutesta cantidad se mantuvo constante para cada fermentacioacuten
Se evaluoacute el consumo de proteiacutena por parte del P cubensis durante los 14 diacuteas
de la fermentacioacuten para cada uno de los ensayos
A continuacioacuten se analizan los resultados obtenidos para cada uno de los
tratamientos
331 Consumo de proteiacutena por P cubensis en medio sumergido utilizando
diferentes concentraciones de glucosa
Una vez se calcularon las concentraciones de proteiacutena en el medio para cada
ensayo se graficaron dichos valores con respecto al tiempo
El graacutefico 16 muestra como se comportoacute el consumo de proteiacutena con respecto al
tiempo para cada una de las tres concentraciones de glucosa utilizadas y a su vez
como se comportoacute el crecimiento de biomasa para cada ensayo durante los 14
diacuteas de fermentacioacuten
70
0
01
02
03
04
05
06
07
0
5
10
15
20
25
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Bio
mas
a (g
L)
Pro
tein
a (g
L)
Tiempo (diacuteas)
30 GL 50 GL 70 GL 30 gL Biomasa 50 gL Biomasa 70 gL Biomasa
Graacutefico 16 Cineacutetica de consumo de proteiacutena por parte del P cubensis en medio sumergido utilizando diferentes concentraciones de glucosa como
fuente de carbono
Analizando el graacutefico 16 se puede observar que el consumo de proteiacutena se dio
casi en su totalidad El ensayo que mayor consumo de proteiacutena presentoacute fue el
que conteniacutea 30 gL de glucosa arrojando un porcentaje de consumo del 98
mientras que las fermentaciones realizadas a concentraciones de 50 gL y 70 gL
de glucosa presentaron un porcentaje de consumo de proteiacutena del 91 y 90
respectivamente
Al enfocarnos en la relacioacuten existente entre el consumo de proteiacutena y el
crecimiento micelial del P cubensis se puede notar gracias al graacutefico 16 que la
relacioacuten es directamente proporcional debido a que el consumo de proteiacutena fue
permanente mientras el hongo se encontraba en fase exponencial es decir el P
cubensis necesitaba de la proteiacutena para aumentar su crecimiento mientras que en
el momento en que el microorganismo comenzoacute su fase estacionaria la
concentracioacuten de proteiacutena en el medio se mantuvo constante esto uacuteltimo soacutelo es
vaacutelido para concentraciones de 50 gL y 70 gL de glucosa puesto que ambas
llegaron a la fase estacionaria
71
332 Consumo de proteiacutena por P cubensis en medio sumergido utilizando
diferentes concentraciones de sacarosa
Una vez obtenidos los valores de consumo de proteiacutena para cada concentracioacuten
de sacarosa utilizada se precedioacute a graficarlos con respecto al tiempo dichos
datos se encuentran en el graacutefico 17 De igual manera en este graacutefico se
representa la cineacutetica de crecimiento de biomasa para el P cubensis de acuerdo a
las distintas concentraciones de sacarosa utilizadas
0
01
02
03
04
05
06
0
2
4
6
8
10
12
14
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Bio
mas
a (g
L)
Prot
eiacutena
(gL
)
Tiempo (diacuteas)
30 GL 50 GL 70 GL 30 gL 50 gL 70 gL
Graacutefico 17 Cineacutetica de consumo de proteiacutena por parte del P cubensis en medio sumergido utilizando diferentes concentraciones de sacarosa como
fuente de carbono
El graacutefico 17 ilustra el consumo casi en su totalidad de la proteiacutena para cada uno
de los tratamientos El ensayo que mayor consumo de proteiacutena presentoacute fue el
que conteniacutea 30 gL de sacarosa exponiendo un porcentaje de consumo del 89
mientras que las concentraciones de 50 gL y 70 gL de sacarosa arrojaron
porcentajes de consumo del 86 y 57 respectivamente
Ahora bien al analizar el crecimiento del P cubensis con respecto al consumo de
proteiacutena se evidencia claramente que el consumo disminuyoacute permanentemente
72
en el tiempo mientras el hongo se encontraban en estado exponencial indicando
el intereacutes del P cubensis por la proteiacutena siendo eacutesta utilizada por el mismo para
aumentar su tamantildeo y biomasa
Durante los diacuteas 4 y 10 las fermentaciones que conteniacutean concentraciones de 30
gL y 70 gL de sacarosa presentaron un alto consumo de proteiacutena a pesar de
que el P cubensis se encontraba en estos dos ensayos en fase estacionaria fase
en la cual no se requiere consumir grandes cantidades de sustrato puesto que el
hongo soacutelo necesitaba alimentarse para mantenerse o para producir productos no
ligados al crecimiento maacutes no para cambiar la cantidad de biomasa presente en el
medio Asimismo la concentracioacuten de 50 gL de sacarosa tambieacuten presentoacute un
alto consumo de proteiacutena durante los diacuteas 4 y 8 en donde se creiacutea estar en una
fase estacionaria temprana lo dicho anteriormente reitera una vez maacutes la afinidad
que el P cubensis presentoacute con respecto a las fuentes de proteiacutena usadas
333 Comparacioacuten entre el consumo de proteiacutena de P cubensis en los
cultivos sumergidos con diferentes fuentes de carbono
Con el fin de conocer cuaacutel de los dos tipos de sustrato empleado fue mayormente
consumido se realizoacute un anaacutelisis estadiacutestico
En el graacutefico 18 se ilustran las medias de consumo de proteiacutena (concentracioacuten)
arrojadas mediante el anaacutelisis estadiacutestico sobre el consumo de proteiacutena cuando se
utilizoacute glucosa o sacarosa en el medio y se evidencia que existen diferencias
significativas en cuanto a la concentracioacuten de proteiacutena en el tiempo en el medio
cuando se realizoacute el experimento con glucosa y cuando se utilizoacute sacarosa
arrojando asiacute dos grupos homogeacuteneos el primero (a) presenta una media de 465
gL mientras que el grupo dos (b) arroja un valor de media de 609 gL indicando
un menor consumo de proteiacutena por parte del P cubensis en el medio sumergido
73
de Fang-Zhong cuando se utilizoacute sacarosa como principal fuente de carbono
(Anexo 7)
Tratamientos de las dos fuentes de carbono usadas sin FA (glucosa y sacarosa)
Media glucosa (a) 465
Media sacarosa (b) 609
a
b
0
1
2
3
4
5
6
7
8
Conc
entr
acioacute
n pr
oteiacute
na (g
L)
Letras diferentes denotan diferencias significativas (prueba LSD)
Graacutefico 18 Consumo de proteiacutena para cada una de las fuentes de carbono utilizadas
334 Consumo de proteiacutena por P cubensis en medio sumergido utilizando
glucosa y FA en el medio
Una vez se obtuvo la concentracioacuten de proteiacutena en el medio para cada
concentracioacuten de FA utilizada se precedioacute a graficar dichos valores con respecto
al tiempo los cuales se ilustran en el graacutefico 19 ademaacutes se muestran en dicho
graacutefico las cineacuteticas de crecimiento de biomasa para cada ensayo
74
0
02
04
06
08
1
12
0
2
4
6
8
10
12
14
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Bio
mas
a (g
L)
Pro
teiacuten
a (g
L)
Tiempo (diacuteas)
05 gL 1 gL 15 gL 05 gL 1 gL 15 gL
Graacutefico 19 Cineacutetica de consumo de proteiacutena por parte del P cubensis en medio sumergido utilizando 50 gL de glucosa como fuente de carbono y
diferentes concentraciones de FA
De igual forma que para la fermentacioacuten que teniacutea 50 gL de glucosa en el medio
realizada anteriormente para dichos ensayos el consumo de proteiacutena fue
permanente y se dio casi en su totalidad El ensayo que mayor consumo de
proteiacutena presentoacute fue el que conteniacutea 05 gL de FA arrojando un porcentaje de
consumo del 86 aun asiacute el porcentaje de consumo arrojado por la fermentacioacuten
de 1 gL de FA fue del 84 indicando que no existen diferencias con respecto al
consumo de proteiacutena entre dichas cantidades de FA utilizadas Mientras que el
porcentaje de consumo para 15 gL de FA fue inferior presentando un valor del
72 De acuerdo a los resultados mencionados anteriormente se puede decir que
a mayor concentracioacuten de FA en el medio se presenta menor consumo de
proteiacutena por parte del P cubensis esto se puede afirmar uacutenicamente para los
resultados obtenidos durante esta investigacioacuten a ciertas condiciones
Analizando ahora la relacioacuten entre el consumo de proteiacutena y el crecimiento
micelial se puede ver que al igual que para los ensayos con glucosa a 50 gL se
75
tiene un consumo permanente mientras se estaacute en fase exponencial y una vez se
llega a la fase estacionario alrededor del diacutea 12 la concentracioacuten de proteiacutena en
el medio se estabilizoacute
A la hora de indagar los datos estadiacutesticamente se puede observar que no existen
diferencias significativas sobre el consumo de proteiacutena (concentracioacuten) en el
tiempo con respecto al tipo de sustrato pero al comparar los resultados con los
ensayos donde se antildeadioacute FA al medio se encontroacute que siacute existen diferencias
significativas Se crearon dos grupos homogeacuteneos el primero cuenta con glucosa
y sacarosa presentando medias (cantidad de proteiacutena en el medio) de 468 gL y
473 gL respectivamente mientras que el ensayo con FA se encuentra en otro
grupo en donde su consumo de proteiacutena fue menor presentando una media
(cantidad de proteiacutena en el medio) de 614 gL (Anexo 8)
Tratamientos con y sin FA
Media glucosa (a) 468
Media sacarosa Proteiacutena (a) 473
Media fenilalanina (b) 614
a a
b
0
1
2
3
4
5
6
7
8
Co
nce
ntr
acioacute
n p
rote
iacutena
(gL
)
Letras diferentes denotan diferencias significativas (prueba LSD)
Graacutefico 20 Consumo de proteiacutena para los ensayos con y sin FA
76
34 ESTUDIO CUALITATIVO DE LA PRESENCIA DEL ALCALOIDE
Posterior a las fermentaciones de glucosa sacarosa y glucosa 50 gL con FA y
los respectivos anaacutelisis se realizoacute un uacuteltimo anaacutelisis que a la vez fue el de mayor
relevancia a la hora de determinar cuaacutel de los medios fue el que mejores
resultados arrojoacute En primera instancia se utilizoacute el reactivo de Dragendorff como
indicador de alcaloide para analizar las muestras de los diacuteas 12 13 y 14 con el fin
de esclarecer la presencia de alcaloides (Anexo 17)
Una vez detectada la presencia de alcaloides gracias a la coloracioacuten naranja
presentada en las muestras se procedioacute a realizar la teacutecnica de HPLC con el fin
de hallar un porcentaje del compuesto de intereacutes basado en las aacutereas obtenidas
de los cromatogramas (asumiendo un tiempo de retencioacuten entre 62 y 72
minutos)
341 Produccioacuten de compuestos producidos por P cubensis cuando el
medio no conteniacutea FA
A la hora de analizar y confirmar cuaacutel fue el mejor ensayo de los experimentos
realizados se tuvo como criterio base determinar la fuente de carbono y su
respectiva concentracioacuten que mejor presencia del compuesto de intereacutes arrojoacute
supuesto a un tiempo de retencioacuten entre 62 y 72 minutos
Inicialmente al obtener los anaacutelisis estadiacutesticos se deduce que no existieron
diferencias significativas entre el aacuterea del pico de intereacutes con respecto a todos los
picos arrojados por el cromatograma y los factores estudiados (tipo de sustrato
diacutea de fermentacioacuten y concentracioacuten) puesto que se obtuvieron valores de P-valor
77
de 03310 09580 y 08336 respectivamente es decir no importa queacute tipo de
sustrato se utilice la produccioacuten de alcaloide no tendraacute variaciones (Anexo 9)
Al analizar el graacutefico 21 se puede observar que las medias de las aacutereas halladas
para los diferentes ensayos con glucosa y sacarosa no presentaron diferencias
significativas es decir pertenecen al mismo grupo homogeacuteneo (a) lo que ratifica
lo dicho anteriormente
Tratamiento de las dos fuentes de carbono usadas sin FA (glucosa y sacarosa)
Media glucosa (a) 235916
Media sacarosa (a) 337147
a
a
0
7000
14000
21000
28000
35000
42000
Aacutere
a de
Com
pues
to
Letras diferentes denotan diferencias significativas (prueba LSD)
Graacutefico 21 Aacuterea del compuesto obtenido de P cubensis en tiempo de retencioacuten entre 62 y 72 minutos para las dos fuentes de carbono
Por tal razoacuten fue necesario hacer un anaacutelisis cualitativo de los cromatogramas
obtenidos mediante HPLC el cual se basoacute en la forma del pico arrojado por la
teacutecnica La figura 6 ilustra dicho anaacutelisis
78
Buena resolucioacuten de pico Mala resolucioacuten de pico
(a) (b)
Figura 6 Cromatogramas de dos diferentes fermentaciones de P cubensis que ilustran el criterio de escogencia del mejor ensayo realizado (a) 50 gL
glucosa (b) 50 gL sacarosa
Primero fue necesario observar el tamantildeo del pico y posterior a eacutesto determinar
su resolucioacuten La figura 6 ilustra dos ejemplos el de 50 gL de glucosa el diacutea 13 y
50 gL de sacarosa el diacutea 14 mientras el primero muestra un pico grande y
definido la segunda fermentacioacuten ilustra un pico grande pero poco definido
indicando que en este caso no se resolvioacute correctamente el alcaloide es decir no
se logroacute una buena separacioacuten De esta manera se analizaron los diferentes
cromatogramas para los diacuteas 12 (Anexo 19) 13 (Anexo 20) y 14 (Anexo 21) de
cada fermentacioacuten arrojando diferencias entre los ensayos y llevando a la
conclusioacuten de que la fermentacioacuten que mejores resultados arrojoacute fue la que
conteniacutea 50 gL de glucosa
79
342 Produccioacuten de compuestos producidos por P cubensis cuando el
medio conteniacutea FA
Despueacutes de realizada la fermentacioacuten con glucosa 50 gL y concentraciones de
FA de 05 gL 10 gL y 15 gL se procedioacute de igual manera que en el estudio sin
FA a evaluar cuaacutel de estas tres concentraciones de FA exhibioacute mejor resolucioacuten
del alcaloide
Inicialmente se realizoacute un anaacutelisis estadiacutestico el cual arrojoacute que no existen
diferencias significativas con respecto al aacuterea de pico que en este caso debido al
supuesto representa la Psilocibina y los diacuteas 12 13 y 14 de la fermentacioacuten
Mediante el graacutefico 22 se puede decir que en los uacuteltimos tres diacuteas de las
fermentaciones que conteniacutean FA en el medio no existen diferencias significativas
con respecto al alcaloide de intereacutes obtenido es decir en los tres se produjo el
alcaloide (Anexo 10)
Tratamientos de los uacuteltimos tres diacuteas de fermentacioacuten usando FA
Media diacutea 12 (a) 411758
Media diacutea 13 (a) 413401
Media diacutea 14 (a) 44860
a a a
0
10000
20000
30000
40000
50000
Aacutere
a Co
mpu
esto
Letras diferentes denotan diferencias significativas
Graacutefico 22 Aacuterea del compuesto obtenido de P cubensis en tiempo de retencioacuten entre 62 y 72 minutos en los uacuteltimos tres diacuteas de la fermentacioacuten
con FA y glucosa
80
Igual que en numeral anterior fue necesario realizar anaacutelisis cualitativo para los
cromatogramas por ende se requirioacute observar el tamantildeo del pico y posterior a
eacutesto determinar su resolucioacuten
Buena resolucioacuten de pico Mala resolucioacuten de pico
(a) (b)
Figura 7 Cromatogramas de dos diferentes fermentaciones de P cubensis que ilustran el criterio de escogencia del mejor ensayo realizado (a) 05 gL
FA (b) 15 gL FA
La figura 7 ejemplifica el anaacutelisis realizado para la seleccioacuten del mejor ensayo
ejecutado Se tienen dos cromatogramas el de 05 gL de FA en el diacutea 13 y el de
15 gL de FA para el mismo diacutea
A todos los cromatogramas obtenidos para los diacuteas 12 (Anexo 19) 13 (Anexo 20)
y 14 (Anexo 21) se realizoacute el mismo anaacutelisis y se concluyoacute que la concentracioacuten
maacutes apropiada para la obtencioacuten de la los compuestos producidos por P cubensis
fue de 05 gL de FA debido a que eacuteste generariacutea una disminucioacuten en los costos
81
35 ESTUDIO PORCENTUAL (AacuteREA) DEL ALCALOIDE REALIZADO PARA
LOS DIFERENTES ENSAYOS
Se calculoacute el porcentaje de aacuterea correspondiente al pico que identificoacute que se
asumioacute como el correspondiente a la Psilocibina gracias a la suposicioacuten realizada
del tiempo de retencioacuten
A continuacioacuten se presentan los valores obtenidos y sus respectivos anaacutelisis para
cada tratamiento
351 Porcentaje de la Psilocibina (suposicioacuten) cuando el medio no conteniacutea
FA
Debido a que no se contaba con un estaacutendar de Psilocibina los resultados
mostrados en la tabla 5 se obtuvieron realizando un porcentaje con respecto a las
aacutereas bajo la curva arrojadas mediante el anaacutelisis de cromatografiacutea de alta
eficiencia (Anexos 19 20 y 21) En dichos anexos se encuentran resaltadas en
negrilla aquellas aeacutereas utilizadas
Tabla 5 Porcentaje de aacuterea hallado mediante HPLC para los uacuteltimos tres diacuteas de la fermentacioacuten con concentraciones de 30 gL 50 gL y 70 gL de glucosa
y sacarosa con un tiempo de retencioacuten de 62 y 72 minutos
Diacutea Glucosa
(gL)
Aacuterea
(compuesto
Tr= 62-72)
Sacarosa
(gL)
Aacuterea
(compuesto
Tr= 62-72)
12 30 60650 30 3664
12 50 7396 50 5857
12 70 4816 70 3415
13 30 702 30 2876
13 50 6815 50 4113
13 70 6733 70 5583
14 30 4824 30 2756
14 50 4821 50 2792
14 70 017 70 1429
82
A la hora de analizar los datos de la tabla 5 se puede observar que el mayor
porcentaje de aacuterea se obtuvo cuando se trabajoacute con glucosa como fuente de
carbono y concretamente a una concentracioacuten de 50 gL
Analizando los datos estadiacutesticamente no se obtuvieron diferencias significativas
en cuanto a la produccioacuten del compuesto (aacuterea) con respecto al tipo de sustrato
utilizado durante las fermentaciones es decir es indiferente si se utiliza glucosa o
sacarosa en el cultivo de P cubensis en medio sumergido de Fang-Zhong
El graacutefico 23 ilustra las medias (aacuterea) obtenidas para la produccioacuten de alcaloide en
las dos diferentes fuentes de carbono es decir glucosa y sacarosa exponiendo
un uacutenico grupo homogeacuteneo con medias (produccioacuten de alcaloide) de aacutereas de
219635 y 234391 para glucosa y sacarosa respectivamente (Anexo 11)
Tratamientos de las dos fuentes de carbono usadas sin FA (glucosa y sacarosa)
Media glucosa (a) 219635
Media sacarosa (a) 234391
a
a
2000
2100
2200
2300
2400
Aacuterea
Com
pues
to
Letras diferentes denotan diferencias significativas (prueba LSD)
Graacutefico 23 Aacuterea del compuesto obtenido de P cubensis en tiempo de retencioacuten entre 62 y 72 minutos para cada una de las fuentes de carbono
utilizadas
Aun asiacute estudiando los graacuteficos de HPLC con el criterio mencionado
anteriormente es decir observando el tamantildeo del pico y su resolucioacuten del mismo
83
se observoacute claramente que la presencia del alcaloide (tiempo de retencioacuten
supuesto entre 62 y 72 minutos) fue mejor cuando se trabajoacute con glucosa a una
concentracioacuten de 50 gL debido que presenta el mejor pico
352 Porcentaje de aacuterea de compuestos presentes en P cubensis cuando
el medio conteniacutea FA
Con el fin de observar si la adicioacuten de FA al medio si arrojoacute mejores resultados en
cuanto a la produccioacuten del compuesto presente entre un rango de 62 y 72
minutos como tiempo de retencioacuten se procedioacute a calcular el porcentaje del aacuterea
de intereacutes de acuerdo a las aacutereas arrojadas para cada ensayo por medio del
anaacutelisis de HPLC Los datos obtenidos se ilustran a continuacioacuten en la tabla 6
Tabla 6 Porcentaje hallado mediante HPLC para los uacuteltimos tres diacuteas de la fermentacioacuten con concentraciones de 05 gL 10 gL y 15 gL de FA y 50 gL
de glucosa con un tiempo de retencioacuten entre 62 y 72 minutos
Diacutea
Glucosa
50 gL +
FA
Aacuterea
(compuesto
Tr=62-72)
12 0 4315
12 05 2931
12 1 6236
12 15 847
13 0 3257
13 05 7549
13 1 4790
13 15 2721
14 0 4822
14 05 3863
14 1 5801
14 15 2102
84
Al detallar la tabla 6 puede observarse que el ensayo que mayor porcentaje de
aacuterea arrojoacute fue el que conteniacutea 05 gL de FA arrojando su maacuteximo porcentaje
correspondiente a 755 el diacutea 13 Aun asiacute las diferencias existentes entre ellos
no fueron significativas
Ahora bien al analizarlos estadiacutesticamente se encontroacute que la produccioacuten del
alcaloide en presencia de FA presentoacute la misma tendencia que los ensayos
analizados anteriormente sin eacutesta pero gracias a que este aminoaacutecido duplico la
cantidad de biomasa y debido a que el compuesto de intereacutes se produce
intracelularmente se afirma que el uso de FA aumentoacute la generacioacuten del
compuesto evaluado (Anexo 12)
El graacutefico 24 presenta las diferentes medias en cuanto al porcentaje de aacuterea del
compuesto presente entre 62 y 72 minutos para los diferentes tratamientos de
glucosa a una concentracioacuten de 50 gL y sus concentraciones respectivas de FA
Claramente se ve que soacutelo existe un grupo homogeacuteneo lo que reafirma que no
existen diferencias significativas de la produccioacuten con respecto a las
concentraciones de FA
85
Tratamientos con y sin FA
Media 0 gL FA (a) 3122
Media 05 gL FA (a) 2391
Media 10 gL FA (a) 2823
Media 15 gL FA (a) 2113
a
aa
a
0
5
10
15
20
25
30
35
40
Aacutere
a Co
mpu
esto
Letras diferentes denotan diferencias significativas (prueba LSD)
Graacutefico 24 Aacuterea del compuesto obtenido de P cubensis en tiempo de retencioacuten entre 62 y 72 minutos para cada una de las concentraciones de
FA utilizadas
Debido a que no se encontraron diferencias significativas en cuanto al porcentaje
de aacuterea obtenido mediante los cromatogramas se concluye que el mejor medio es
el que tiene como fuente de carbono glucosa a una concentracioacuten de 50 gL y una
adicioacuten de 05 gL de FA puesto que genera una disminucioacuten en costos
86
CONCLUSIONES
No existen diferencias significativas en el crecimiento micelial de P
cubensis en medio sumergido Fang-Zhong cuando se trabaja con fuentes
de carbono glucosa y sacarosa sin embargo se decide trabajar con 50 gL
de glucosa puesto que eacuteste tiene una buena presencia de alcaloide y a su
vez una mejor produccioacuten de biomasa
La concentracioacuten de glucosa utilizada para el crecimiento de P cubensis
influye en el crecimiento micelial obteniendo concentraciones de biomasa
de 062 gL 055 gL y 048 gL para concentraciones de sustrato de 70 50
y 30 gL de glucosa siendo las dos primeras significativamente diferentes
con respecto a la de 30 gL
La concentracioacuten de sacarosa utilizada para el crecimiento de P cubensis
influye en el crecimiento micelial obteniendo concentraciones de biomasa
de 057 gL 045 gL y 026 gL para concentraciones de sustrato de 70 50
y 30 gL de sacarosa siendo significativamente diferentes entre ellas
La resolucioacuten de los picos obtenidos por RP-HPLC del extracto de P
cubensis fue mayor para las fermentaciones realizadas con una
concentracioacuten de 50 gL de glucosa lo que conllevoacute a utilizarlo al realizar
los ensayos que conteniacutean en el medio FA
La concentracioacuten de biomasa de P cubensis obtenida en cultivo sumergido
en medio Fang-Zhong con glucosa se duplicoacute con la adicioacuten de FA No
obstante no existen diferencias significativas entre las concentraciones de
FA utilizadas
87
El consumo de proteiacutena presentada por P cubensis en medio Fang-Zhong
fue casi del 100 mientras que el consumo de sustrato para el mismo
medio estuvo alrededor del 40
El consumo de sustrato durante el transcurso de las fermentaciones que no
conteniacutean FA en el medio no presentoacute diferencias significativas con
respecto a las dos fuentes de carbono utilizadas Mientras que en aquellas
fermentaciones donde se agregoacute FA al medio siacute existieron diferencias
significativas entre las fermentaciones de 15 y 1 gL de FA con respecto a
los ensayos realizados con 05 gL FA Sin embargo el P cubensis
consumioacute mayor cantidad de sustrato cuando el medio no conteniacutea FA
Se evidencioacute que el P cubensis consumioacute mayor cantidad de proteiacutena
cuando el sustrato utilizado en el medio fue glucosa y a su vez se detecto
que la adicioacuten de FA al medio tuvo como efecto la disminucioacuten en el
consumo de sustrato por parte del microorganismo
El consumo de sustrato y de proteiacutena tuvo un comportamiento similar
puesto que fue consumido permanentemente durante la fase exponencial
para cada uno de los tratamientos realizados es decir las concentraciones
de 30 gL 50 gL y 70 gL de glucosa y sacarosa como fuente de carbono y
de 05 gL 1 gL y 15 gL de FA teniendo como fuente de carbono glucosa
a una concentracioacuten de 50 gL mientras que en la fase estacionaria su
consumo se disminuyoacute permaneciendo casi constante
Despueacutes de realizados los estudios en cuanto a la produccioacuten del
compuesto presente entre 62 y 72 minutos para cada uno de los ensayos
no se evidenciaron diferencias significativas entre las dos fuentes de
carbono utilizadas (glucosa y sacarosa)
88
La adicioacuten del precursor llamado Fenilalanina (FA) al medio sumergido
Fang-Zhong para llevar a cabo el cultivo del P cubensis tuvo influencia en
cuanto a la produccioacuten de compuesto presente entre tiempo de retencioacuten de
62 y 72 minutos debido a que eacuteste duplicoacute la concentracioacuten de biomasa
en el medio se dice entonces que la produccioacuten aumentoacute al ser eacuteste de
produccioacuten intracelular
La resolucioacuten del compuesto presente entre el tiempo de retencioacuten de 62 a
72 minutos se obtuvo mejor en el ensayo que conteniacutea 05 gL de FA y al
saber que no existieron diferencias significativas en la produccioacuten en cuanto
al porcentaje de aacutereas obtenido con respecto a las demaacutes concentraciones
de FA se afirma que eacuteste es el medio que mejores resultados arrojoacute para
el crecimiento de P cubensis y la produccioacuten de Psilocibina
89
RECOMENDACIONES
Se sugiere observar el efecto que tiene la variacioacuten de las revoluciones a
las cuales se realizaron las fermentaciones para ver como variacutea el
crecimiento del P cubensis en medio sumergido Fang-Zhong con respecto
a dicho factor
Debido a que soacutelo se realizaron anaacutelisis sobre el crecimiento del P
cubensis en medio sumergido haciendo uso de dos sustratos diferentes
(glucosa y sacarosa) seriacutea recomendable realizar el mismo anaacutelisis para
otro tipo de sustrato como por ejemplo melaza por su bajo costo
Del mismo modo seriacutea apropiado realizar el estudio con otro tipo de
precursor y en otras concentraciones para ver la incidencia de eacuteste en el
comportamiento del hongo
Se recomienda realizar un escalamiento de dicho proceso en un biorreactor
con el fin de evaluar a mayor escala el crecimiento del P cubensis y la
produccioacuten del alcaloide
Debido a que la proteiacutena se comportoacute como el principal nutriente se sugiere
para una proacutexima investigacioacuten evaluar diferentes concentraciones de
proteiacutena en el medio
90
ANEXOS
Anexo 1 Anaacutelisis de varianza (ANOVA) para el crecimiento de biomasa de
las fermentaciones con glucosa
Tabla 7 Anaacutelisis de Varianza para el crecimiento micelial (glucosa)
Tabla 8 Anaacutelisis Muacuteltiple de Rangos para el crecimiento micelial (glucosa)
91
Anexo 2 Anaacutelisis de Varianza (ANOVA) para el crecimiento de biomasa de
las fermentaciones con sacarosa
Tabla 9 Anaacutelisis de Varianza para el crecimiento micelial (sacarosa)
Tabla 10 Anaacutelisis Muacuteltiple de Rangos para el crecimiento micelial (sacarosa)
92
Anexo 3 Anaacutelisis de Varianza (ANOVA) para el crecimiento de biomasa de
las fermentaciones con glucosa y sacarosa
Tabla 11 Anaacutelisis de Varianza para el crecimiento micelial (glucosa y
sacarosa)
Tabla 12 Anaacutelisis Muacuteltiple de Rangos para el crecimiento micelial (glucosa y
sacarosa)
93
Anexo 4 Anaacutelisis de Varianza (ANOVA) para el crecimiento de biomasa de
las fermentaciones con glucosa 50 gL y FA
Tabla 13 Anaacutelisis de Varianza para el crecimiento micelial (glucosa 50 gL y
FA)
Tabla 14 Anaacutelisis Muacuteltiple de Rangos para el crecimiento micelial (glucosa
50 gL y FA)
94
Anexo 5 Anaacutelisis de varianza (ANOVA) para el consumo de sustrato en las
fermentaciones sin FA
Tabla 15 Anaacutelisis de Varianza para el consumo de Sustrato sin FA
Tabla 16 Anaacutelisis Muacuteltiple de Rangos para el consumo de Sustrato sin FA
95
Anexo 6 Anaacutelisis de Varianza (ANOVA) para el consumo de sustrato en las
fermentaciones con FA
Tabla 17 Anaacutelisis de Varianza para el consumo de Sustrato con FA
Tabla 18 Anaacutelisis Muacuteltiple de Rangos para el consumo de Sustrato con FA
96
Anexo 7 Anaacutelisis de Varianza (ANOVA) para el consumo de proteiacutena en las
fermentaciones sin FA
Tabla 19 Anaacutelisis de Varianza para el consumo de Proteiacutena sin FA
Tabla 20 Anaacutelisis Muacuteltiple de Rangos para el consumo de Proteiacutena sin FA
97
Anexo 8 Anaacutelisis de Varianza (ANOVA) para el consumo de proteiacutena en las
fermentaciones con FA
Tabla 21Anaacutelisis de Varianza para el consumo de Proteiacutena con FA
Tabla 22 Anaacutelisis Muacuteltiple de Rangos para el consumo de Proteiacutena con FA
98
Anexo 9 Anaacutelisis de Varianza (ANOVA) para la produccioacuten de Psilocibina en
las fermentaciones sin FA
Tabla 23 Anaacutelisis de Varianza para la produccioacuten de Psilocibina sin FA
Tabla 24 Anaacutelisis Muacuteltiple de Rangos para la produccioacuten de Psilocibina
seguacuten el Sustrato sin FA
99
Anexo 10 Anaacutelisis de Varianza (ANOVA) para la produccioacuten de Psilocibina en las fermentaciones con FA
Tabla 25 Anaacutelisis de Varianza para la produccioacuten de Psilocibina con FA
Tabla 26 Anaacutelisis Muacuteltiple de Rangos para la produccioacuten de Psilocibina
seguacuten el diacutea con FA
100
Anexo 11 Anaacutelisis de Varianza (ANOVA) para la cuantificacioacuten porcentual de
Psilocibina en las fermentaciones sin FA
Tabla 27 Anaacutelisis de Varianza para la cuantificacioacuten de Psilocibina sin FA
Tabla 28 Anaacutelisis Muacuteltiple de Rangos para la cuantificacioacuten de Psilocibina
seguacuten el tipo de sustrato sin FA
101
Anexo 12 Anaacutelisis de Varianza (ANOVA) para la cuantificacioacuten porcentual de
Psilocibina en las fermentaciones con FA
Tabla 29 Anaacutelisis de Varianza para la cuantificacioacuten de Psilocibina con FA
Tabla 30 Anaacutelisis Muacuteltiple de Rangos para la cuantificacioacuten de Psilocibina
seguacuten la concentracioacuten con FA
102
Anexo 13 Determinacioacuten de consumo de azuacutecares por el meacutetodo de DNS
(Aacutecido Dinitrosaliciacutelico)
a DNS para glucosa
Pasos para preparar DNS
Disolver 16 gr de NaOH en agua destilada
Adicionar 30 gr de tartrato de Na y K
Aforar a 100 ml con agua destilada
Almacenar en frascos aacutembar a 4degC
Se debe mantener un stock de glucosa 4mgml y almacenarlo a 4degC A partir
de la solucioacuten de glucosa se preparan las soluciones para hacer la curva
patroacuten con las siguientes concentraciones (gL) 025 050 100 200 y 400
Procedimiento
Tomar 05 ml de cada dilucioacuten y agregar 05 ml de reactivo DNS
Preparar una muestra blanco por dilucioacuten de 05 ml de agua destilada a 05
ml de reactivo de DNS
Agitar todas las muestras
Colocar a ebullir las muestras en bantildeo mariacutea por cinco minutos
Enfriar con hielo
Adicionar 5 ml de agua destilada
Agitar y dejar en reposo 15 minutos
Leer en espectrofotoacutemetro a 540 nm
Realizar la curva Absorbancia Vs Concentracioacuten Debe tener un coeficiente
de correlacioacuten de 0991 a 0999
b DNS para sacarosa
Pasos para preparar DNS sacarosa
Preparacioacuten de la solucioacuten Standard stock de sacarosa (30 gL) tomar 30
gr de sacarosa anhiacutedrida grado reactivo con exactitud hasta la deacutecima de
mg disolver ajustar a aforo de 100 ml con agua desionizada empacar en
viales y almacenar en congelador
Preparacioacuten DNS pesar 16 gr de hidroacutexido de sodio grado reactivo 30 gr
de tartrato de sodio y potasio y disolverlos juntos con 50 ml de agua
103
desionizada aparte pesar 10 gr del DNS disolver con 30 ml de agua
desionizada agregar lentamente y con agitacioacuten la solucioacuten del DNS a la
solucioacuten de tartrato y NaOH anteriormente preparadas ajustar a 100 ml
filtrar envasar en frasco aacutembar y rotular con fecha de vencimiento incluida
(3 meses maacuteximo) mantener a la temperatura del laboratorio
Preparacioacuten del reactivo NaOH 10 N (500 ml) pesar con exactitud hasta
la deacutecima de mg 20 gr de NaOH grado reactivo por cada 500 ml de
solucioacuten disolver primero con 300 ml de agua desionizada y luego aforar a
500 ml envasar y rotular correctamente y mantener a la temperatura del
laboratorio
Preparacioacuten de HCL 10 (100 ml) tomar 27 ml de aacutecido clorhiacutedrico al
37 grado reactivo y aforar hasta 100 ml con agua desionizada envasar
rotular correctamente de acuerdo a la norma del laboratorio y almacenar a
la temperatura del laboratorio
Se debe mantener un stock de glucosa 30 gL y almacenarlo a 4degC A partir
de la solucioacuten de glucosa se preparan las soluciones para hacer la curva
patroacuten con las siguientes concentraciones (gL) 3 6 12 18 24 y 30
Procedimiento
Preparar en cada tubo (las soluciones de la curva patroacuten de sacarosa las
muestras problemas diluidas si es necesario y como blanco agua
desionizada) 100microl de solucioacuten
Adicionar 200 microl de HCL 10 a cada tubo y agitar todos los tubos en vortex
Llevar a ebullicioacuten por 10 minutos en bantildeo mariacutea precalentado a 95degC
Enfriar hasta temperatura ambiente raacutepidamente
Adicionar a cada tubo 1 ml de NaOH 10 N y agitar los tubos en vortex
Aparte tomar 05 ml de cada tubo en otros tubos rotulados y agregar 05 ml
del DNS
Agitar todas las muestras en vortex
Llevar a ebullicioacuten por 5 minutos en bantildeo mariacutea precalentado a 96degC
Enfriar hasta temperatura ambiente raacutepidamente
Adicionar 5 ml de H2O desionizada agitar en vortex y dejar reposar por 15
minutos
Leer en espectrofotoacutemetro a 540 nm
Realizar la curva Absorbancia Vs Concentracioacuten Debe tener un coeficiente
de correlacioacuten de 0991 a 0999
104
Anexo 14 Cineacutetica de Consumo de Sustrato
La cineacutetica de consumo de sustrato se realizoacute por el meacutetodo de Aacutecido
Dinitrosaliciacutelico (DNS) Los rangos de concentracioacuten y absorbancia para cada caso
se citan a continuacioacuten
Rangos de concentraciones y absorbancias para las fermentaciones que
usaron glucosa (30 gL 50 gL y 70 gL) como sustrato
Concentracioacuten de 02 a 12 gL
Absorbancia de 01234 a 06612
Ecuacioacuten Y = 19174x -00517 R2 = 09923
Rangos de concentraciones y absorbancias para las fermentaciones que
usaron sacarosa (30 gL 50 gL y 70 gL) como sustrato
Concentracioacuten de 3 a 30 gL
Absorbancia de 00822 a 11112
Ecuacioacuten Y = 25983x + 04857 R2 = 09978
Rangos de concentraciones y absorbancias para las fermentaciones que
usaron glucosa 50 gL como sustrato y FA
Concentracioacuten de 02 a 12 gL
Absorbancia de 0097 a 063
Ecuacioacuten Y = 18785x + 00019 R2 = 09986
105
Anexo 15 Determinacioacuten de consumo de proteiacutenas por el meacutetodo de LOWRY
Pasos para la preparacioacuten de LOWRY
Para obtener la curva estaacutendar de Albuacutemina se preparan 5 soluciones
patrones de Albuacutemina en NaCL al 09 (PV) de las siguientes
concentraciones 152 80 200 300 400 Pgml Si la concentracioacuten de
Proteiacutena total es menor de 500 Pgml se lee la absorbancia a 750 nm si
estaacute entre 1000 y 2000 Pgml se lee a 550nm
Se prepara un blanco que no lleva Albuacutemina y en su reemplazo se adiciona
0-5 ml de solucioacuten salina (NaCL) al 09 (PV) Se aplica el mismo
procedimiento que a las demaacutes muestras
Procedimiento
Servir en tubos de ensayo 05 ml de las soluciones patroacuten de Albuacutemina las
muestras problema y NaCL al 09 como blanco Deben estar marcados
para conservar el orden de concentraciones para la curva
Adicionar a cada tubo 05 ml de NaOH 2N y llevar al bantildeo Mariacutea
precalentado a 100degC por un tiempo de 10 minutos
Dejar enfriar hasta que alcance la Temperatura Ambiente
Agregar a cada tubo 5 ml de la solucioacuten complejante mezclar y dejar
reposar por 10 minutos
Adicionar 05 ml del reactivo de Folin-Ciocalteu 11 vortexiar durante 20
segundos
Reposar en un cuarto oscuro durante 30 minutos
Leer la absorbancia a 750 nm y con las soluciones patroacuten construir la
graacutefica Absorbancia Vs Concentracioacuten de Albuacutemina Seacuterica de Bovina
(BSA) con eacutesta se puede determinar la concentracioacuten de las muestras
problema interpolando el valor de la Absorbancia La curva estaacutendar debe
tener un coeficiente de correlacioacuten de 0991 a 0999
106
Anexo 16 Cineacutetica consumo de Proteiacutena
La cineacutetica de consumo de proteiacutena se realizoacute por el meacutetodo LOWRY Los rangos
de concentracioacuten y absorbancia para cada caso se citan a continuacioacuten
Rangos de concentraciones y absorbancias para las fermentaciones que
usaron glucosa (30 gL 50 gL y 70 gL) como sustrato
Concentracioacuten de 0016 a 04 gL
Absorbancia de 00094 a 05382
Ecuacioacuten Y = 07427x ndash 00021 R2 = 09955
Rangos de concentraciones y absorbancias para las fermentaciones que
usaron sacarosa (30 gL 50 gL y 70 gL) como sustrato
Concentracioacuten de 0016 a 04 gL
Absorbancia de 00374 a 06178
Ecuacioacuten Y = 06567x ndash 00166 R2 = 09968
Rangos de concentraciones y absorbancias para las fermentaciones que
usaron glucosa 50 gL como sustrato y FA
Concentracioacuten de 0016 a 04 gL
Absorbancia de 00708 a 04647
Ecuacioacuten Y = 09814x ndash 00581 R2 = 09992
107
Anexo 17 Prueba de reactivo de Dragendorff
Preparacioacuten de reactivo de Dragendorff para alcaloides
Reactivo de Dragendorff se prepara mezclando 8 gr de nitrato de bismuto
pentahidratado en 20 ml de aacutecido niacutetrico al 30 con una solucioacuten de 272 g de
yoduro de potasio en 50 ml de agua Se deja en reposo por 24 horas se decanta y
se afora a 100 ml La presencia de alcaloides se detecta por la formacioacuten de un
precipitado naranja rojizo cuando se le adiciona esta reactivo a una solucioacuten aacutecida
de alcaloides De los precipitados lavados se puede recuperar los alcaloides con
una solucioacuten saturada de carbonato de sodio (Mercano y Hasegawa 1991)
La figura mostrada a continuacioacuten refleja la presencia del alcaloide debido a la
coloracioacuten amarillo-rojiza que eacutesta sufrioacute
Figura 8 Muestra de biomasa una vez analizada mediante el reactivo de Dragendorff
108
Anexo 18 Barrido Espectral para el Psilocybe cubensis
La metodologiacutea mencionada a continuacioacuten estaacute basada en artiacuteculo base
(Tsujikawa et al 2003)
El Sistema de HPLC consiste en un Shimadzu LC-10ordf Series Cromatografiacutea
Liacutequida equipada con un diodo SPD-M10A detector de red fija en 220nm La
separacioacuten cromatograacutefica ser realizoacute con una columna simeacutetrica C18 (21 mm a
150 mm 5mm Waters Assoc Milford EEUU
La fase moacutevil utilizada fue de 10 mm de formato de amonio-aacutecido foacutermico (955
VV) a un pH de 35 y bombeado a un caudal de 02 mlminuto
El perfil cromatograacutefico obtenido durante la investigacioacuten de Tsujikawa et al
(2003) se muestra en le figura 6 que aparece a continuacioacuten
Figura 9 Perfil cromatograacutefico (Tsujikawa et al 2003)
109
Anexo 19 Cromatogramas (HPLC) del diacutea 12 de fermentacioacuten
Tabla 31 Aacutereas obtenidas de los cromatogramas para el P cubensis en
medio Fang-Zhong en el diacutea 12 para concentraciones de 30gL glucosa y
30gL sacarosa
SustratoConcentracioacuten
(gL)
Tiempo
(s)Aacuterea
Glucosa 30 2957 3837
Glucosa 30 6838 474753
Glucosa 30 9144 47256
Glucosa 30 9489 16822
Glucosa 30 10124 224349
Sacarosa 30 6538 143772
Sacarosa 30 7234 269458
Sacarosa 30 9721 33646
Sacarosa 30 11845 24384
(a) (b)
Graacutefico 25 Cromatogramas del diacutea 12 para el P cubensis cultivado en medio
sumergido Fang-Zhong con dos diferentes tipos de sustratos (a) 30 gL
glucosa (b) 30 gL sacarosa
110
Tabla 32 Aacutereas obtenidas de los cromatogramas para el P cubensis en
medio Fang-Zhong en el diacutea 12 para concentraciones de 50gL glucosa y
50gL sacarosa
SustratoConcentracioacuten
(gL)
Tiempo
(s)Aacuterea
Glucosa 50 0524 319
Glucosa 50 6298 5991
Glucosa 50 7172 237042
Glucosa 50 9144 16387
Glucosa 50 10009 6077
Sacarosa 50 169 24011
Sacarosa 50 3105 28573
Sacarosa 50 6916 112166
Sacarosa 50 9136 4057
Sacarosa 50 9933 8821
Sacarosa 50 10398 13872
(a) (b)
Graacutefico 26 Cromatogramas del diacutea 12 para el P cubensis cultivado en medio
sumergido Fang-Zhong con dos diferentes tipos de sustratos (a) 50 gL
glucosa (b) 50 gL sacarosa
111
Tabla 33 Aacutereas obtenidas de los cromatogramas para el P cubensis en
medio Fang-Zhong en el diacutea 12 para concentraciones de 50gL glucosa y
50gL sacarosa
SustratoConcentracioacuten
(gL)
Tiempo
(s)Aacuterea
Glucosa 70 7217 168598
Glucosa 70 9145 9977
Glucosa 70 997 80558
Sacarosa 70 6803 287387
Sacarosa 70 7517 131049
Sacarosa 70 7775 4434
Sacarosa 70 7871 77109
Sacarosa 70 823 96239
Sacarosa 70 9039 5114
Sacarosa 70 9778 25394
(a) (b)
Graacutefico 27 Cromatogramas del diacutea 12 para el P cubensis cultivado en medio
sumergido Fang-Zhong con dos diferentes tipos de sustratos (a) 50 gL
glucosa (b) 50 gL sacarosa
112
Tabla 34 Aacutereas obtenidas de los cromatogramas para el P cubensis en
medio Fang-Zhong en el diacutea 12 para concentraciones de 50gL y glucosa
50gL sacarosa
SustratoConcentracioacuten
(gL)
Tiempo
(s)Aacuterea
Glucosa 50 05 0818 4722
Glucosa 50 05 2423 52579
Glucosa 50 05 3502 88765
Glucosa 50 05 6137 16009
Glucosa 50 05 6722 275258
Glucosa 50 05 733 226399
Glucosa 50 05 8339 65139
Glucosa 50 05 9101 36797
Glucosa 50 05 9815 130883
Glucosa 50 1 1105 743
Glucosa 50 1 2746 2701
Glucosa 50 1 4304 80304
Glucosa 50 1 6167 19649
Glucosa 50 1 6794 51753
Glucosa 50 1 8282 82997
Glucosa 50 1 9116 38659
Glucosa 50 1 9899 136953
Glucosa 50 15 1198 3313
Glucosa 50 15 2937 37875
Glucosa 50 15 4332 51079
Glucosa 50 15 614 25602
Glucosa 50 15 6737 668905
Glucosa 50 15 8209 107332
Glucosa 50 15 9602 38902
Glucosa 50 15 9752 139613
Diacutea 12
(a) (b)
(c)
Graacutefico 28 Cromatograma del diacutea 12 para el P cubensis cultivado en medio
sumergido Fang-Zhong con fuente de carbono glucosa y adicioacuten de
fenilalanina en tres concentraciones (a) 05 gL FA (b) 1 gL FA (c) 15gL
FA
113
Anexo 20 Cromatogramas (HPLC) del diacutea 13 de fermentacioacuten
Tabla 35 Aacutereas obtenidas de los cromatogramas para el P cubensis en
medio Fang-Zhong en el diacutea 13 para concentraciones de 30gL glucosa y
30gL sacarosa
SustratoConcentracioacuten
(gL)
Tiempo
(s)Aacuterea
Glucosa 30 0225 1155
Glucosa 30 2847 699
Glucosa 30 4043 1038
Glucosa 30 6231 4994
Glucosa 30 6787 295182
Glucosa 30 7462 241146
Glucosa 30 9066 51836
Glucosa 30 10004 158746
Sacarosa 30 1734 135
Sacarosa 30 5838 1857
Sacarosa 30 6803 147867
Sacarosa 30 7305 30464
Sacarosa 30 7599 174643
Sacarosa 30 9107 8564
Sacarosa 30 9897 104278
(a) (b)
Graacutefico 29 Cromatogramas del diacutea 13 para el P cubensis cultivado en medio
sumergido Fang-Zhong con dos diferentes tipos de sustratos (a) 30 gL
glucosa (b) 30 gL sacarosa
114
Tabla 36 Aacutereas obtenidas de los cromatogramas para el P cubensis en
medio Fang-Zhong en el diacutea 13 para concentraciones de 50gL glucosa y
50gL sacarosa
SustratoConcentracioacuten
(gL)
Tiempo
(s)Aacuterea
Glucosa 50 1408 13982
Glucosa 50 6949 331449
Glucosa 50 9012 25201
Glucosa 50 9936 27216
Sacarosa 50 1543 7293
Sacarosa 50 6813 437765
Sacarosa 50 9085 35897
Sacarosa 50 10049 184461
(a) (b)
Graacutefico 30 Cromatogramas del diacutea 13 para el P cubensis cultivado en medio
sumergido Fang-Zhong con dos diferentes tipos de sustratos (a) 50 gL
glucosa (b) 50 gL sacarosa
115
Tabla 37 Aacutereas obtenidas de los cromatogramas para el P cubensis en
medio Fang-Zhong en el diacutea 13 para concentraciones de 70gL glucosa y
70gL sacarosa
SustratoConcentracioacuten
(gL)
Tiempo
(s)Aacuterea
Glucosa 70 1456 3223
Glucosa 70 2985 2423
Glucosa 70 54 7586
Glucosa 70 6262 5149
Glucosa 70 7151 248331
Glucosa 70 9039 19346
Glucosa 70 9929 4906
Glucosa 70 11051 33698
Sacarosa 70 0437 342
Sacarosa 70 1428 812
Sacarosa 70 2948 2191
Sacarosa 70 5473 4854
Sacarosa 70 6286 5336
Sacarosa 70 6848 3649
Sacarosa 70 733 11383
Sacarosa 70 9073 1018
Sacarosa 70 9878 11072
Sacarosa 70 10267 18797
(a) (b)
Graacutefico 31 Cromatogramas del diacutea 13 para el P cubensis cultivado en medio
sumergido Fang-Zhong con dos diferentes tipos de sustratos (a) 70 gL
glucosa (b) 70 gL sacarosa
116
Tabla 38 Aacutereas obtenidas de los cromatogramas para el P cubensis en
medio Fang-Zhong en el diacutea 13 para concentraciones de 50gL y glucosa
50gL sacarosa
SustratoConcentracioacuten
(gL)
Tiempo
(s)Aacuterea
Glucosa 50 05 4067 22222
Glucosa 50 05 7379 55573
Glucosa 50 05 902 19513
Glucosa 50 05 9716 119261
Glucosa 50 05 1173 19427
Glucosa 50 1 0793 14776
Glucosa 50 1 2868 28537
Glucosa 50 1 6224 1206
Glucosa 50 1 6782 571299
Glucosa 50 1 8303 92665
Glucosa 50 1 9081 30371
Glucosa 50 1 9738 168959
Glucosa 50 1 11813 27921
Glucosa 50 15 0412 269
Glucosa 50 15 2482 14692
Glucosa 50 15 3486 91059
Glucosa 50 15 6039 6892
Glucosa 50 15 6627 216986
Glucosa 50 15 7216 260795
Glucosa 50 15 8112 65776
Glucosa 50 15 8888 19083
Glucosa 50 15 9497 37812
Glucosa 50 15 9839 65922
Glucosa 50 15 11655 7331
(a) (b)
(c)
Graacutefico 32 Cromatogramas del diacutea 12 para el P cubensis cultivado en medio
sumergido Fang-Zhong con fuente de carbono glucosa y adicioacuten de
fenilalanina en tres concentraciones (a) 05 gL FA (b) 1 gL FA (c) 15gL
FA
117
Anexo 21 Cromatogramas (HPLC) del diacutea 14 de fermentacioacuten
Tabla 39 Aacutereas obtenidas de los cromatogramas para el P cubensis en
medio Fang-Zhong en el diacutea 14 para concentraciones de 30gL glucosa y 30
gL sacarosa
SustratoConcentracioacuten
(gL)
Tiempo
(s)Aacuterea
Glucosa 30 1054 181
Glucosa 30 2553 8939
Glucosa 30 6219 7557
Glucosa 30 6585 77083
Glucosa 30 7158 285069
Glucosa 30 8987 33875
Glucosa 30 9848 87461
Glucosa 30 10694 52151
Glucosa 30 12482 7992
Glucosa 30 12943 23064
Glucosa 30 1493 5948
Sacarosa 30 7309 7075
Sacarosa 30 9984 1680
Sacarosa 30 10442 15395
Sacarosa 30 11211 8511
Sacarosa 30 13405 3398
(a) (b)
Graacutefico 33 Cromatogramas del diacutea 14 para el P cubensis cultivado en medio
sumergido Fang-Zhong con dos diferentes tipos de sustratos (a) 30 gL
glucosa (b) 30 gL sacarosa
118
Tabla 40 Aacutereas obtenidas de los cromatogramas para el P cubensis en
medio Fang-Zhong en el diacutea 14 para concentraciones de 50gL glucosa y
50gL sacarosa
SustratoConcentracioacuten
(gL)
Tiempo
(s)Aacuterea
Glucosa 50 2029 8318
Glucosa 50 6257 5782
Glucosa 50 6875 306684
Glucosa 50 9068 22819
Glucosa 50 9808 92492
Glucosa 50 12113 8823
Glucosa 50 12752 23988
Sacarosa 50 1036 3783
Sacarosa 50 2356 7005
Sacarosa 50 653 44831
Sacarosa 50 6657 127617
Sacarosa 50 7264 66908
Sacarosa 50 7464 255141
Sacarosa 50 9035 26172
Sacarosa 50 9458 28427
Sacarosa 50 9889 37574
Sacarosa 50 10312 140881
Sacarosa 50 12335 13391
Sacarosa 50 1292 17066
(a) (b)
Graacutefico 34 Cromatogramas del diacutea 14 para el P cubensis cultivado en medio
sumergido Fang-Zhong con dos diferentes tipos de sustratos (a) 50 gL
glucosa (b) 50 gL sacarosa
119
Tabla 41 Aacutereas obtenidas de los cromatogramas para el P cubensis en
medio Fang-Zhong en el diacutea 14 para concentraciones de 70gL glucosa y
70gL sacarosa
SustratoConcentracioacuten
(gL)
Tiempo
(s)Aacuterea
Glucosa 70 6257 5879
Glucosa 70 6373 145551
Glucosa 70 7015 68223
Glucosa 70 7199 9085
Glucosa 70 735 265755
Glucosa 70 9014 4642
Glucosa 70 9877 97804
Glucosa 70 107 67421
Glucosa 70 12625 26231
Glucosa 70 1305 65607
Sacarosa 70 2283 4683
Sacarosa 70 5191 93
Sacarosa 70 6304 3719
Sacarosa 70 6795 136542
Sacarosa 70 726 29869
Sacarosa 70 7515 75545
Sacarosa 70 7872 119563
Sacarosa 70 9166 1244
Sacarosa 70 9658 23096
Sacarosa 70 9871 25866
Sacarosa 70 10421 105108
Sacarosa 70 12347 11115
Sacarosa 70 12861 35503
Sacarosa 70 14272 3676
(a) (b)
Graacutefico 35 Cromatogramas del diacutea 14 para el P cubensis cultivado en medio
sumergido Fang-Zhong con dos diferentes tipos de sustratos (a) 70 gL
glucosa (b) 70 gL sacarosa
120
Tabla 42 Aacutereas obtenidas de los cromatogramas para el P cubensis en medio Fang-Zhong en el diacutea 13 para concentraciones de 50gL glucosa y
50gL sacarosa
SustratoConcentracioacuten
(gL)
Tiempo
(s)Aacuterea
Glucosa 50 05 0123 173
Glucosa 50 05 0699 7584
Glucosa 50 05 2594 2742
Glucosa 50 05 6104 11663
Glucosa 50 05 6616 487848
Glucosa 50 05 7235 287918
Glucosa 50 05 8183 135793
Glucosa 50 05 8903 5143
Glucosa 50 05 9484 66817
Glucosa 50 05 9679 168855
Glucosa 50 05 11671 4216
Glucosa 50 1 0345 295
Glucosa 50 1 2654 11981
Glucosa 50 1 412 45301
Glucosa 50 1 6111 12626
Glucosa 50 1 6757 526655
Glucosa 50 1 8093 104277
Glucosa 50 1 894 25251
Glucosa 50 1 9643 158685
Glucosa 50 1 11666 22779
Glucosa 50 15 0353 283
Glucosa 50 15 2522 15272
Glucosa 50 15 3577 83963
Glucosa 50 15 6668 47137
Glucosa 50 15 7304 371442
Glucosa 50 15 8226 117611
Glucosa 50 15 8923 61949
Glucosa 50 15 9657 19618
Glucosa 50 15 11668 35606
(a) (b)
(c)
Graacutefico 36 Cromatogramas del diacutea 12 para el P cubensis cultivado en medio sumergido Fang-Zhong con fuente de carbono glucosa y adicioacuten de
fenilalanina en tres concentraciones (a) 05 gL FA (b) 1 gL FA (c) 15gL FA (a) 05 gL FA (b) 1 gL FA (c) 15gL FA
121
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ldquoESTABLECIMIENTO DE UN MEDIO DE CULTIVO SUMERGIDO PARA
Psilocybe sprdquo
PILAR GARCIacuteA GOacuteMEZ
NATALIA RAMIacuteREZ LALINDE
Proyecto de grado para optar al tiacutetulo de
Ingeniero de Procesos
ASESOR
ALEX ARMANDO SAacuteEZ VEGA
Quiacutemico MSc En Biotecnologiacutea
DEPARTAMENTO DE INGENIERIacuteA DE PROCESOS
ESCUELA DE INGENIERIacuteA
UNIVERSIDAD EAFIT
MEDELLIacuteN
2009
Nota de aceptacioacuten
Jurado
Jurado
Jurado
Ciudad y fecha
iv
A Dios por habernos brindado la oportunidad de lograr este
triunfo en nuestras vidas
A nuestras familias por todo el apoyo que nos brindaron durante
el desarrollo de este proyecto y por habernos dado la gran oportunidad de convertirnos
en profesionales
A toda la docencia por la educacioacuten y orientacioacuten
recibida por eacutesta
v
AGRADECIMIENTOS
Los autores expresan sus agradecimientos a todas las personas que desde su experiencia y profesioacuten brindaron apoyo durante el desarrollo de este proyecto Alex Armando Saacuteez V Quiacutemico MSc En Biotecnologiacutea Candidato a Doctorado Profesor Universidad EAFIT Personal de laboratorio de Ingenieriacutea de Procesos Edgar Arbelaacuteez John Estrada y especialmente Sigifredo Caacuterdenas encargado del laboratorio de Biotecnologiacutea de la Universidad EAFIT Luz Deisy Mariacuten Palacio Ingeniera de Procesos Profesora Universidad EAFIT Diego Acosta PhD Engineering and Material Science Profesor Universidad EAFIT Carlos Correa Ingeniero Quiacutemico Profesor Universidad EAFIT Valeska Villegas E Msc En Biotecnologiacutea Candidata a Doctorado Profesora Universidad EAFIT
vi
TABLA DE CONTENIDO
LISTA DE TABLAS _________________________________________________________________________ IX
LISTA DE FIGURAS ________________________________________________________________________ XI
LISTA DE GRAacuteFICOS ______________________________________________________________________ XII
LISTA DE ECUACIONES ____________________________________________________________________ XV
LISTAS DE ANEXOS ______________________________________________________________________ XVI
RESUMEN _____________________________________________________________________________ XVII
INTRODUCCIOacuteN _________________________________________________________________________ 19
OBJETIVOS _____________________________________________________________________________ 21
GENERAL_____________________________________________________________________________ 21
ESPECIacuteFICOS __________________________________________________________________________ 21
1 MARCO TEOacuteRICO ___________________________________________________________________ 22
11 CONCEPTOS GENERALES DE HONGOS _______________________________________________ 22
111 Hongos laminares (Agaricales) ____________________________________________________ 22
12 MEDIOS DE CULTIVO_____________________________________________________________ 24
121 Medio sumergido _______________________________________________________________ 25
13 ALCALOIDES ___________________________________________________________________ 26
131 Generalidades _______________________________________________________________ 26
132 Propiedades fisicoquiacutemicas _____________________________________________________ 27
133 Reconocimiento de los alcaloides ________________________________________________ 27
134 Clasificacioacuten de los alcaloides ___________________________________________________ 28
1341 Alcaloides alifaacuteticos ____________________________________________________________ 28
1342 Alcaloides de origen diverso _____________________________________________________ 28
1343 Alcaloides aromaacuteticos __________________________________________________________ 28
13 PSILOCIBINA Y PSILOCINA _________________________________________________________ 31
131 Antecedentes acerca de la obtencioacuten de Psilocibina y Psilocina ________________________ 32
2 MATERIALES Y MEacuteTODOS_____________________________________________________________ 34
21 LOCALIZACIOacuteN _________________________________________________________________ 34
22 MICROORGANISMO DE ESTUDIO ___________________________________________________ 34
23 COMPONENTES DEL MEDIO DE CULTIVO (FANG-ZHONG) _______________________________ 35
24 PREPARACIOacuteN DE LOS DIFERENTES PREINOacuteCULOS DE P CUBENSIS EMPLEADOS PARA LAS
FERMENTACIONES SUMERGIDAS _________________________________________________________ 35
25 PREPARACIOacuteN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO Y LOS INOacuteCULOS DE P CUBENSIS UTILIZADOS PARA LAS
FERMENTACIONES SUMERGIDAS _________________________________________________________ 36
26 CUANTIFICACIOacuteN DEL CRECIMIENTO DE BIOMASA MEDIANTE LOS MEacuteTODOS DE PESO HUacuteMEDO Y
PESO SECO PARA CULTIVO SUMERGIDO DE P CUBENSIS ________________________________________ 37
27 AJUSTE DE LA CINEacuteTICA DE CRECIMIENTO DE P CUBENSIS AL MODELO CINEacuteTICO LOGIacuteSTICO ____ 37
vii
28 EVALUACIOacuteN DEL CONSUMO DE SUSTRATO Y DEL CONSUMO DE PROTEIacuteNA POR PARTE DEL P
CUBENSIS CULTIVADO EN MEDIO SUMERGIDO ________________________________________________ 39
29 MEacuteTODO CUALITATIVO PARA DETERMINAR LA PRESENCIA DE ALCALOIDES (PSILOCIBINA)
MEDIANTE EL USO DEL REACTIVO DE DRAGENDORFF _________________________________________ 40
210 MEacuteTODO PARA DETERMINAR LA PRESENCIA DE PSILOCIBINA MEDIANTE CROMATOGRAFIacuteA
LIacuteQUIDA DE ALTA EFICIENCIA (HPLC) _______________________________________________________ 40
211 DETERMINACIOacuteN CUALITATIVA DE LA RESOLUCIOacuteN DEL ALCALOIDE DE INTEREacuteS PARA LOS
DIFERENTES ENSAYOS __________________________________________________________________ 41
212 DETERMINACIOacuteN PORCENTUAL DE COMPUESTOS PARA LOS DIFERENTES ENSAYOS __________ 42
213 CULTIVO SUMERGIDO DE P CUBENSIS EN PRESENCIA DE FA ______________________________ 42
214 DISENtildeO DE EXPERIMENTOS Y ANAacuteLISIS ESTADIacuteSTICO ___________________________________ 43
3 RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN ___________________________________________________________ 45
31 CINEacuteTICA DE CRECIMIENTO MICELIAL DE P CUBENSIS EN CULTIVO SUMERGIDO (FANG-ZHONG)
UTILIZANDO DIFERENTES FUENTES DE CARBONO ____________________________________________ 45
311 Crecimiento micelial de P cubensis en medio sumergido utilizando diferentes concentraciones
de glucosa _________________________________________________________________________ 45
312 Crecimiento micelial del P cubensis en medio sumergido utilizando diferentes concentraciones
de sacarosa ________________________________________________________________________ 50
313 Comparacioacuten entre el crecimiento micelial de P cubensis en los cultivos sumergidos utilizando
glucosa y sacarosa como fuente de carbono ______________________________________________ 55
314 Crecimiento micelial del P cubensis en cultivo sumergido utilizando glucosa y fenilalanina en el
medio 56
32 ESTUDIO DE LA CINEacuteTICA DE CONSUMO DE SUSTRATO POR PARTE DEL P CUBENSIS CULTIVADO EN
MEDIO SUMERGIDO (FANG-ZHONG) ______________________________________________________ 61
321 Consumo de sustrato por parte del P cubensis en medio sumergido utilizando diferentes
concentraciones de glucosa ___________________________________________________________ 62
322 Consumo de sustrato por parte del P cubensis en medio sumergido utilizando diferentes
concentraciones de sacarosa __________________________________________________________ 63
323 Comparacioacuten entre el consumo de sustrato de P cubensis en los cultivos sumergidos con
diferentes fuentes de carbono _________________________________________________________ 65
324 Consumo de sustrato por parte del P cubensis en medio sumergido utilizando glucosa y
fenilalanina en el medio ______________________________________________________________ 66
33 ESTUDIO DE LA CINEacuteTICA DE CONSUMO DE PROTEIacuteNA POR PARTE DEL P CUBENSIS CULTIVADO EN
MEDIO SUMERGIDO (FANG-ZHONG) ______________________________________________________ 69
331 Consumo de proteiacutena por P cubensis en medio sumergido utilizando diferentes
concentraciones de glucosa ___________________________________________________________ 69
332 Consumo de proteiacutena por P cubensis en medio sumergido utilizando diferentes
concentraciones de sacarosa __________________________________________________________ 71
333 Comparacioacuten entre el consumo de proteiacutena de P cubensis en los cultivos sumergidos con
diferentes fuentes de carbono _________________________________________________________ 72
334 Consumo de proteiacutena por P cubensis en medio sumergido utilizando glucosa y FA en el medio
73
34 ESTUDIO CUALITATIVO DE LA PRESENCIA DEL ALCALOIDE _______________________________ 76
viii
341 Produccioacuten de compuestos producidos por P cubensis cuando el medio no conteniacutea FA ____ 76
342 Produccioacuten de compuestos producidos por P cubensis cuando el medio conteniacutea FA ______ 79
35 ESTUDIO PORCENTUAL (AacuteREA) DEL ALCALOIDE REALIZADO PARA LOS DIFERENTES ENSAYOS ___ 81
351 Porcentaje de la Psilocibina (suposicioacuten) cuando el medio no conteniacutea FA _______________ 81
352 Porcentaje de aacuterea de compuestos presentes en P cubensis cuando el medio conteniacutea FA _ 83
CONCLUSIONES _________________________________________________________________________ 86
RECOMENDACIONES _____________________________________________________________________ 89
ANEXOS _______________________________________________________________________________ 90
BIBLIOGRAFIacuteA _________________________________________________________________________ 121
ix
LISTA DE TABLAS
TABLA 1 COMPOSICIOacuteN DEL MEDIO DE CULTIVO SUMERGIDO PARA EVALUAR EL CRECIMIENTO MICELIAL
DEL P CUBENSIS 35
TABLA 2 PARAacuteMETROS CINEacuteTICOS OBTENIDOS MEDIANTE EL MODELO LOGIacuteSTICO PARA LAS DIFERENTES
FERMENTACIONES DE P CUBENSIS UTILIZANDO GLUCOSA COMO FUENTE DE CARBONO 48
TABLA 3 PARAacuteMETROS CINEacuteTICOS OBTENIDOS MEDIANTE EL MODELO LOGIacuteSTICO PARA LAS DIFERENTES
FERMENTACIONES DE P CUBENSIS UTILIZANDO SACAROSA COMO FUENTE DE CARBONO 53
TABLA 4 PARAacuteMETROS CINEacuteTICOS OBTENIDOS MEDIANTE EL MODELO LOGIacuteSTICO PARA LAS DIFERENTES
FERMENTACIONES DE P CUBENSIS UTILIZANDO 50 GL DE GLUCOSA COMO FUENTE DE CARBONO Y
DIFERENTES CONCENTRACIONES DE FA 60
TABLA 5 PORCENTAJE DE AacuteREA HALLADO MEDIANTE HPLC PARA LOS UacuteLTIMOS TRES DIacuteAS DE LA
FERMENTACIOacuteN CON CONCENTRACIONES DE 30 GL 50 GL Y 70 GL DE GLUCOSA Y SACAROSA CON
UN TIEMPO DE RETENCIOacuteN DE 62 Y 72 MINUTOS 81
TABLA 6 PORCENTAJE HALLADO MEDIANTE HPLC PARA LOS UacuteLTIMOS TRES DIacuteAS DE LA FERMENTACIOacuteN
CON CONCENTRACIONES DE 05 GL 10 GL Y 15 GL DE FA Y 50 GL DE GLUCOSA CON UN TIEMPO
DE RETENCIOacuteN ENTRE 62 Y 72 MINUTOS 83
TABLA 7 ANAacuteLISIS DE VARIANZA PARA EL CRECIMIENTO MICELIAL (GLUCOSA) 90
TABLA 8 ANAacuteLISIS MUacuteLTIPLE DE RANGOS PARA EL CRECIMIENTO MICELIAL (GLUCOSA) 90
TABLA 9 ANAacuteLISIS DE VARIANZA PARA EL CRECIMIENTO MICELIAL (SACAROSA) 91
TABLA 10 ANAacuteLISIS MUacuteLTIPLE DE RANGOS PARA EL CRECIMIENTO MICELIAL (SACAROSA) 91
TABLA 11 ANAacuteLISIS DE VARIANZA PARA EL CRECIMIENTO MICELIAL (GLUCOSA Y SACAROSA) 92
TABLA 12 ANAacuteLISIS MUacuteLTIPLE DE RANGOS PARA EL CRECIMIENTO MICELIAL (GLUCOSA Y SACAROSA) 92
TABLA 13 ANAacuteLISIS DE VARIANZA PARA EL CRECIMIENTO MICELIAL (GLUCOSA 50 GL Y FA) 93
TABLA 14 ANAacuteLISIS MUacuteLTIPLE DE RANGOS PARA EL CRECIMIENTO MICELIAL (GLUCOSA 50 GL Y FA) 93
TABLA 15 ANAacuteLISIS DE VARIANZA PARA EL CONSUMO DE SUSTRATO SIN FA 94
TABLA 16 ANAacuteLISIS MUacuteLTIPLE DE RANGOS PARA EL CONSUMO DE SUSTRATO SIN FA 94
TABLA 17 ANAacuteLISIS DE VARIANZA PARA EL CONSUMO DE SUSTRATO CON FA 95
TABLA 18 ANAacuteLISIS MUacuteLTIPLE DE RANGOS PARA EL CONSUMO DE SUSTRATO CON FA 95
TABLA 19 ANAacuteLISIS DE VARIANZA PARA EL CONSUMO DE PROTEIacuteNA SIN FA 96
TABLA 20 ANAacuteLISIS MUacuteLTIPLE DE RANGOS PARA EL CONSUMO DE PROTEIacuteNA SIN FA 96
TABLA 21ANAacuteLISIS DE VARIANZA PARA EL CONSUMO DE PROTEIacuteNA CON FA 97
TABLA 22 ANAacuteLISIS MUacuteLTIPLE DE RANGOS PARA EL CONSUMO DE PROTEIacuteNA CON FA 97
TABLA 23 ANAacuteLISIS DE VARIANZA PARA LA PRODUCCIOacuteN DE PSILOCIBINA SIN FA 98
TABLA 24 ANAacuteLISIS MUacuteLTIPLE DE RANGOS PARA LA PRODUCCIOacuteN DE PSILOCIBINA SEGUacuteN EL SUSTRATO
SIN FA 98
TABLA 25 ANAacuteLISIS DE VARIANZA PARA LA PRODUCCIOacuteN DE PSILOCIBINA CON FA 99
TABLA 26 ANAacuteLISIS MUacuteLTIPLE DE RANGOS PARA LA PRODUCCIOacuteN DE PSILOCIBINA SEGUacuteN EL DIacuteA CON FA
99
TABLA 27 ANAacuteLISIS DE VARIANZA PARA LA CUANTIFICACIOacuteN DE PSILOCIBINA SIN FA 100
TABLA 28 ANAacuteLISIS MUacuteLTIPLE DE RANGOS PARA LA CUANTIFICACIOacuteN DE PSILOCIBINA SEGUacuteN EL TIPO DE
SUSTRATO SIN FA 100
TABLA 29 ANAacuteLISIS DE VARIANZA PARA LA CUANTIFICACIOacuteN DE PSILOCIBINA CON FA 101
x
TABLA 30 ANAacuteLISIS MUacuteLTIPLE DE RANGOS PARA LA CUANTIFICACIOacuteN DE PSILOCIBINA SEGUacuteN LA
CONCENTRACIOacuteN CON FA 101
TABLA 31 AacuteREAS OBTENIDAS DE LOS CROMATOGRAMAS PARA EL P CUBENSIS EN MEDIO FANG-ZHONG
EN EL DIacuteA 12 PARA CONCENTRACIONES DE 30GL GLUCOSA Y 30GL SACAROSA 109
TABLA 32 AacuteREAS OBTENIDAS DE LOS CROMATOGRAMAS PARA EL P CUBENSIS EN MEDIO FANG-ZHONG
EN EL DIacuteA 12 PARA CONCENTRACIONES DE 50GL GLUCOSA Y 50GL SACAROSA 110
TABLA 33 AacuteREAS OBTENIDAS DE LOS CROMATOGRAMAS PARA EL P CUBENSIS EN MEDIO FANG-ZHONG
EN EL DIacuteA 12 PARA CONCENTRACIONES DE 50GL GLUCOSA Y 50GL SACAROSA 111
TABLA 34 AacuteREAS OBTENIDAS DE LOS CROMATOGRAMAS PARA EL P CUBENSIS EN MEDIO FANG-ZHONG
EN EL DIacuteA 12 PARA CONCENTRACIONES DE 50GL Y GLUCOSA 50GL SACAROSA 112
TABLA 35 AacuteREAS OBTENIDAS DE LOS CROMATOGRAMAS PARA EL P CUBENSIS EN MEDIO FANG-ZHONG
EN EL DIacuteA 13 PARA CONCENTRACIONES DE 30GL GLUCOSA Y 30GL SACAROSA 113
TABLA 36 AacuteREAS OBTENIDAS DE LOS CROMATOGRAMAS PARA EL P CUBENSIS EN MEDIO FANG-ZHONG
EN EL DIacuteA 13 PARA CONCENTRACIONES DE 50GL GLUCOSA Y 50GL SACAROSA 114
TABLA 37 AacuteREAS OBTENIDAS DE LOS CROMATOGRAMAS PARA EL P CUBENSIS EN MEDIO FANG-ZHONG
EN EL DIacuteA 13 PARA CONCENTRACIONES DE 70GL GLUCOSA Y 70GL SACAROSA 115
TABLA 38 AacuteREAS OBTENIDAS DE LOS CROMATOGRAMAS PARA EL P CUBENSIS EN MEDIO FANG-ZHONG
EN EL DIacuteA 13 PARA CONCENTRACIONES DE 50GL Y GLUCOSA 50GL SACAROSA 116
TABLA 39 AacuteREAS OBTENIDAS DE LOS CROMATOGRAMAS PARA EL P CUBENSIS EN MEDIO FANG-ZHONG
EN EL DIacuteA 14 PARA CONCENTRACIONES DE 30GL GLUCOSA Y 30 GL SACAROSA 117
TABLA 40 AacuteREAS OBTENIDAS DE LOS CROMATOGRAMAS PARA EL P CUBENSIS EN MEDIO FANG-ZHONG
EN EL DIacuteA 14 PARA CONCENTRACIONES DE 50GL GLUCOSA Y 50GL SACAROSA 118
TABLA 41 AacuteREAS OBTENIDAS DE LOS CROMATOGRAMAS PARA EL P CUBENSIS EN MEDIO FANG-ZHONG
EN EL DIacuteA 14 PARA CONCENTRACIONES DE 70GL GLUCOSA Y 70GL SACAROSA 119
TABLA 42 AacuteREAS OBTENIDAS DE LOS CROMATOGRAMAS PARA EL P CUBENSIS EN MEDIO FANG-ZHONG
EN EL DIacuteA 13 PARA CONCENTRACIONES DE 50GL GLUCOSA Y 50GL SACAROSA 120
xi
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1 HONGO AGARICALES (LAMINAR) (KUO 2007) 23
FIGURA 2 ALCALOIDES DERIVADOS DEL TRIPTOFANO (MERCANO Y HASEGAWA 1991) 29
FIGURA 3 TRIPTAMINAS SIMPLES (SEIGLER 1981) 31
FIGURA 4 PSILOCIBINA Y PSILOCINA (MANDRILE ET AL 1984) 32
FIGURA 5 PSILOCYBE CUBENSIS (EAH01) CULTIVADA EN MEDIO SOacuteLIDO AGAR MALTA 34
FIGURA 6 CROMATOGRAMAS DE DOS DIFERENTES FERMENTACIONES DE P CUBENSIS QUE ILUSTRAN EL
CRITERIO DE ESCOGENCIA DEL MEJOR ENSAYO REALIZADO (A) 50 GL GLUCOSA (B) 50 GL
SACAROSA 78
FIGURA 7 CROMATOGRAMAS DE DOS DIFERENTES FERMENTACIONES DE P CUBENSIS QUE ILUSTRAN EL
CRITERIO DE ESCOGENCIA DEL MEJOR ENSAYO REALIZADO (A) 05 GL FA (B) 15 GL FA 80
FIGURA 8 MUESTRA DE BIOMASA UNA VEZ ANALIZADA MEDIANTE EL REACTIVO DE DRAGENDORFF 107
FIGURA 9 PERFIL CROMATOGRAacuteFICO (TSUJIKAWA ET AL 2003) 108
xii
LISTA DE GRAacuteFICOS
GRAacuteFICO 1 CINEacuteTICA DE CRECIMIENTO MICELIAL DE P CUBENSIS EN MEDIO SUMERGIDO (FANG-ZHONG)
UTILIZANDO TRES DIFERENTES CONCENTRACIONES DE GLUCOSA COMO FUENTE DE CARBONO (PESO
SECO) 46
GRAacuteFICO 2 CRECIMIENTO MICELIAL DE P CUBENSIS EN CULTIVO SUMERGIDO BAJO TRES
CONCENTRACIONES DE GLUCOSA 47
GRAacuteFICO 3 VALORES DE CONCENTRACIOacuteN DE BIOMASA EXPERIMENTAL Y TEOacuteRICO GRAFICADOS CON
RESPECTO AL TIEMPO PARA LAS FERMENTACIONES CON DIFERENTES CONCENTRACIONES DE
GLUCOSA 49
GRAacuteFICO 4 CINEacuteTICA DE CRECIMIENTO MICELIAL DE P CUBENSIS EN MEDIO SUMERGIDO (FANG-ZHONG)
UTILIZANDO DIFERENTES CONCENTRACIONES DE SACAROSA COMO FUENTE DE CARBONO (PESO
SECO) 50
GRAacuteFICO 5 CRECIMIENTO MICELIAL PARA TRES DIFERENTES CONCENTRACIONES DE SACAROSA 52
GRAacuteFICO 6 VALORES DE CONCENTRACIOacuteN DE BIOMASA EXPERIMENTAL Y TEOacuteRICO GRAFICADOS CON
RESPECTO AL TIEMPO PARA LAS FERMENTACIONES CON DIFERENTES CONCENTRACIONES DE
SACAROSA 54
GRAacuteFICO 7 CRECIMIENTO MICELIAL PARA DOS DIFERENTES FUENTES DE CARBONO (GLUCOSA Y
SACAROSA) 56
GRAacuteFICO 8 CINEacuteTICA DE CRECIMIENTO MICELIAL DE P CUBENSIS EN MEDIO SUMERGIDO (FANG-ZHONG)
UTILIZANDO DIFERENTES CONCENTRACIONES DE FA Y 50 GL DE GLUCOSA COMO FUENTE DE
CARBONO (PESO SECO) 57
GRAacuteFICO 9 CRECIMIENTO MICELIAL PARA GLUCOSA A UNA CONCENTRACIOacuteN DE 50 GL Y TRES
DIFERENTES CONCENTRACIONES DE FA 59
GRAacuteFICO 10 VALORES DE CONCENTRACIOacuteN DE BIOMASA EXPERIMENTAL Y TEOacuteRICO GRAFICADOS CON
RESPECTO AL TIEMPO PARA LAS FERMENTACIONES CON DIFERENTES CONCENTRACIONES DE FA Y
50 GL DE GLUCOSA 61
GRAacuteFICO 11 CINEacuteTICA DE CONSUMO DE SUSTRATO POR PARTE DEL P CUBENSIS EN MEDIO SUMERGIDO
UTILIZANDO DIFERENTES CONCENTRACIONES DE GLUCOSA COMO FUENTE DE CARBONO 62
GRAacuteFICO 12 CINEacuteTICA DE CONSUMO DE SUSTRATO POR PARTE DEL P CUBENSIS EN MEDIO SUMERGIDO
UTILIZANDO DIFERENTES CONCENTRACIONES DE SACAROSA COMO FUENTE DE CARBONO 64
GRAacuteFICO 13 CONSUMO DE SUSTRATO PARA CADA UNA DE LAS FUENTES DE CARBONO UTILIZADAS 66
GRAacuteFICO 14 CINEacuteTICA DE CONSUMO DE SUSTRATO POR PARTE DEL P CUBENSIS EN MEDIO SUMERGIDO
UTILIZANDO 50 GL DE GLUCOSA COMO FUENTE DE CARBONO Y DIFERENTES CONCENTRACIONES DE
FA 67
GRAacuteFICO 15 CONSUMO DE SUSTRATO PARA CADA UNA DE LAS CONCENTRACIONES DE FA UTILIZADAS 68
GRAacuteFICO 16 CINEacuteTICA DE CONSUMO DE PROTEIacuteNA POR PARTE DEL P CUBENSIS EN MEDIO SUMERGIDO
UTILIZANDO DIFERENTES CONCENTRACIONES DE GLUCOSA COMO FUENTE DE CARBONO 70
GRAacuteFICO 17 CINEacuteTICA DE CONSUMO DE PROTEIacuteNA POR PARTE DEL P CUBENSIS EN MEDIO SUMERGIDO
UTILIZANDO DIFERENTES CONCENTRACIONES DE SACAROSA COMO FUENTE DE CARBONO 71
GRAacuteFICO 18 CONSUMO DE PROTEIacuteNA PARA CADA UNA DE LAS FUENTES DE CARBONO UTILIZADAS 73
xiii
GRAacuteFICO 19 CINEacuteTICA DE CONSUMO DE PROTEIacuteNA POR PARTE DEL P CUBENSIS EN MEDIO SUMERGIDO
UTILIZANDO 50 GL DE GLUCOSA COMO FUENTE DE CARBONO Y DIFERENTES CONCENTRACIONES DE
FA 74
GRAacuteFICO 20 CONSUMO DE PROTEIacuteNA PARA LOS ENSAYOS CON Y SIN FA 75
GRAacuteFICO 21 AacuteREA DEL COMPUESTO OBTENIDO DE P CUBENSIS EN TIEMPO DE RETENCIOacuteN ENTRE 62 Y
72 MINUTOS PARA LAS DOS FUENTES DE CARBONO 77
GRAacuteFICO 22 AacuteREA DEL COMPUESTO OBTENIDO DE P CUBENSIS EN TIEMPO DE RETENCIOacuteN ENTRE 62 Y
72 MINUTOS EN LOS UacuteLTIMOS TRES DIacuteAS DE LA FERMENTACIOacuteN CON FA Y GLUCOSA 79
GRAacuteFICO 23 AacuteREA DEL COMPUESTO OBTENIDO DE P CUBENSIS EN TIEMPO DE RETENCIOacuteN ENTRE 62 Y
72 MINUTOS PARA CADA UNA DE LAS FUENTES DE CARBONO UTILIZADAS 82
GRAacuteFICO 24 AacuteREA DEL COMPUESTO OBTENIDO DE P CUBENSIS EN TIEMPO DE RETENCIOacuteN ENTRE 62 Y
72 MINUTOS PARA CADA UNA DE LAS CONCENTRACIONES DE FA UTILIZADAS 85
GRAacuteFICO 25 CROMATOGRAMAS DEL DIacuteA 12 PARA EL P CUBENSIS CULTIVADO EN MEDIO SUMERGIDO
FANG-ZHONG CON DOS DIFERENTES TIPOS DE SUSTRATOS (A) 30 GL GLUCOSA (B) 30 GL SACAROSA
109
GRAacuteFICO 26 CROMATOGRAMAS DEL DIacuteA 12 PARA EL P CUBENSIS CULTIVADO EN MEDIO SUMERGIDO
FANG-ZHONG CON DOS DIFERENTES TIPOS DE SUSTRATOS (A) 50 GL GLUCOSA (B) 50 GL SACAROSA
110
GRAacuteFICO 27 CROMATOGRAMAS DEL DIacuteA 12 PARA EL P CUBENSIS CULTIVADO EN MEDIO SUMERGIDO
FANG-ZHONG CON DOS DIFERENTES TIPOS DE SUSTRATOS (A) 50 GL GLUCOSA (B) 50 GL SACAROSA
111
GRAacuteFICO 28 CROMATOGRAMA DEL DIacuteA 12 PARA EL P CUBENSIS CULTIVADO EN MEDIO SUMERGIDO
FANG-ZHONG CON FUENTE DE CARBONO GLUCOSA Y ADICIOacuteN DE FENILALANINA EN TRES
CONCENTRACIONES (A) 05 GL FA (B) 1 GL FA (C) 15GL FA 112
GRAacuteFICO 29 CROMATOGRAMAS DEL DIacuteA 13 PARA EL P CUBENSIS CULTIVADO EN MEDIO SUMERGIDO
FANG-ZHONG CON DOS DIFERENTES TIPOS DE SUSTRATOS (A) 30 GL GLUCOSA (B) 30 GL SACAROSA
113
GRAacuteFICO 30 CROMATOGRAMAS DEL DIacuteA 13 PARA EL P CUBENSIS CULTIVADO EN MEDIO SUMERGIDO
FANG-ZHONG CON DOS DIFERENTES TIPOS DE SUSTRATOS (A) 50 GL GLUCOSA (B) 50 GL SACAROSA
114
GRAacuteFICO 31 CROMATOGRAMAS DEL DIacuteA 13 PARA EL P CUBENSIS CULTIVADO EN MEDIO SUMERGIDO
FANG-ZHONG CON DOS DIFERENTES TIPOS DE SUSTRATOS (A) 70 GL GLUCOSA (B) 70 GL SACAROSA
115
GRAacuteFICO 32 CROMATOGRAMAS DEL DIacuteA 12 PARA EL P CUBENSIS CULTIVADO EN MEDIO SUMERGIDO
FANG-ZHONG CON FUENTE DE CARBONO GLUCOSA Y ADICIOacuteN DE FENILALANINA EN TRES
CONCENTRACIONES (A) 05 GL FA (B) 1 GL FA (C) 15GL FA 116
GRAacuteFICO 33 CROMATOGRAMAS DEL DIacuteA 14 PARA EL P CUBENSIS CULTIVADO EN MEDIO SUMERGIDO
FANG-ZHONG CON DOS DIFERENTES TIPOS DE SUSTRATOS (A) 30 GL GLUCOSA (B) 30 GL SACAROSA
117
GRAacuteFICO 34 CROMATOGRAMAS DEL DIacuteA 14 PARA EL P CUBENSIS CULTIVADO EN MEDIO SUMERGIDO
FANG-ZHONG CON DOS DIFERENTES TIPOS DE SUSTRATOS (A) 50 GL GLUCOSA (B) 50 GL SACAROSA
118
xiv
GRAacuteFICO 35 CROMATOGRAMAS DEL DIacuteA 14 PARA EL P CUBENSIS CULTIVADO EN MEDIO SUMERGIDO
FANG-ZHONG CON DOS DIFERENTES TIPOS DE SUSTRATOS (A) 70 GL GLUCOSA (B) 70 GL SACAROSA
119
GRAacuteFICO 36 CROMATOGRAMAS DEL DIacuteA 12 PARA EL P CUBENSIS CULTIVADO EN MEDIO SUMERGIDO
FANG-ZHONG CON FUENTE DE CARBONO GLUCOSA Y ADICIOacuteN DE FENILALANINA EN TRES
CONCENTRACIONES (A) 05 GL FA (B) 1 GL FA (C) 15GL FA (A) 05 GL FA (B) 1 GL FA (C)
15GL FA 120
xv
LISTA DE ECUACIONES
ECUACIOacuteN 1 ECUACIOacuteN LINEALIZADA DEL MODELO LOGIacuteSTICO 38
ECUACIOacuteN 2 VALORES TEOacuteRICOS DE BIOMASA EN EL TIEMPO 39
xvi
LISTAS DE ANEXOS
ANEXO 1 ANAacuteLISIS DE VARIANZA (ANOVA) PARA EL CRECIMIENTO DE BIOMASA DE LAS
FERMENTACIONES CON GLUCOSA _____________________________________________________ 90
ANEXO 2 ANAacuteLISIS DE VARIANZA (ANOVA) PARA EL CRECIMIENTO DE BIOMASA DE LAS
FERMENTACIONES CON SACAROSA ____________________________________________________ 91
ANEXO 3 ANAacuteLISIS DE VARIANZA (ANOVA) PARA EL CRECIMIENTO DE BIOMASA DE LAS
FERMENTACIONES CON GLUCOSA Y SACAROSA __________________________________________ 92
ANEXO 4 ANAacuteLISIS DE VARIANZA (ANOVA) PARA EL CRECIMIENTO DE BIOMASA DE LAS
FERMENTACIONES CON GLUCOSA 50 GL Y FA ___________________________________________ 93
ANEXO 5 ANAacuteLISIS DE VARIANZA (ANOVA) PARA EL CONSUMO DE SUSTRATO EN LAS FERMENTACIONES
SIN FA ____________________________________________________________________________ 94
ANEXO 6 ANAacuteLISIS DE VARIANZA (ANOVA) PARA EL CONSUMO DE SUSTRATO EN LAS FERMENTACIONES
CON FA ___________________________________________________________________________ 95
ANEXO 7 ANAacuteLISIS DE VARIANZA (ANOVA) PARA EL CONSUMO DE PROTEIacuteNA EN LAS FERMENTACIONES
SIN FA ____________________________________________________________________________ 96
ANEXO 8 ANAacuteLISIS DE VARIANZA (ANOVA) PARA EL CONSUMO DE PROTEIacuteNA EN LAS FERMENTACIONES
CON FA ___________________________________________________________________________ 97
ANEXO 9 ANAacuteLISIS DE VARIANZA (ANOVA) PARA LA PRODUCCIOacuteN DE PSILOCIBINA EN LAS
FERMENTACIONES SIN FA ____________________________________________________________ 98
ANEXO 10 ANAacuteLISIS DE VARIANZA (ANOVA) PARA LA PRODUCCIOacuteN DE PSILOCIBINA EN LAS
FERMENTACIONES CON FA ___________________________________________________________ 99
ANEXO 11 ANAacuteLISIS DE VARIANZA (ANOVA) PARA LA CUANTIFICACIOacuteN PORCENTUAL DE PSILOCIBINA EN
LAS FERMENTACIONES SIN FA _______________________________________________________ 100
ANEXO 12 ANAacuteLISIS DE VARIANZA (ANOVA) PARA LA CUANTIFICACIOacuteN PORCENTUAL DE PSILOCIBINA EN
LAS FERMENTACIONES CON FA ______________________________________________________ 101
ANEXO 13 DETERMINACIOacuteN DE CONSUMO DE AZUacuteCARES POR EL MEacuteTODO DE DNS (AacuteCIDO
DINITROSALICIacuteLICO) ________________________________________________________________ 102
ANEXO 14 CINEacuteTICA DE CONSUMO DE SUSTRATO ___________________________________________ 104
ANEXO 15 DETERMINACIOacuteN DE CONSUMO DE PROTEIacuteNAS POR EL MEacuteTODO DE LOWRY ____________ 105
ANEXO 16 CINEacuteTICA CONSUMO DE PROTEIacuteNA ______________________________________________ 106
ANEXO 17 PRUEBA DE REACTIVO DE DRAGENDORFF _________________________________________ 107
ANEXO 18 BARRIDO ESPECTRAL PARA EL PSILOCYBE CUBENSIS _________________________________ 108
ANEXO 19 CROMATOGRAMAS (HPLC) DEL DIacuteA 12 DE FERMENTACIOacuteN ___________________________ 109
ANEXO 20 CROMATOGRAMAS (HPLC) DEL DIacuteA 13 DE FERMENTACIOacuteN __________________________ 113
ANEXO 21 CROMATOGRAMAS (HPLC) DEL DIacuteA 14 DE FERMENTACIOacuteN __________________________ 117
xvii
RESUMEN
El Psilocybe cubensis es un hongo de gran importancia a nivel industrial gracias a
la presencia de una sustancia llamada Psilocibina en su cuerpo fructiacutefero
Dicho alcaloide derivado de la triptamina es muy similar al neurotransmisor
serotonina el cual es responsable de la percepcioacuten sensorial la regulacioacuten de la
temperatura el inicio del reposo nocturno del hiacutegado y los rintildeones Por tal motivo
este estudio se enfocoacute en la produccioacuten de la Psilocibina mediante el cultivo del P
cubensis en medio sumergido (Fang-Zhong)
Se evaluaron los efectos de dos fuentes de carbono (glucosa y sacarosa) a tres
concentraciones diferentes en cultivo sumergido para Psilocybe cubensis con el
fin de determinar la incidencia de eacutestas en la produccioacuten de biomasa y en la
produccioacuten y presencia de Psilocibina alcaloide de intereacutes Para las
concentraciones de glucosa de 30 gL 50 gL y 70 gL se presentoacute un crecimiento
maacuteximo de biomasa de 048 gL 055 gL y 062 gL y un porcentaje de alcaloide
de 6065 wv 7396 wv y 6733 wv respectivamente Esto uacuteltimo si se
asume que el tiempo de retencioacuten oscila entre 62 y 72 minutos contaacutendose con
una fase moacutevil de HCOONH4 en una columna C18 Mientras que para las mismas
concentraciones de sacarosa se presentoacute un crecimiento maacuteximo de biomasa de
026 gL 045 gL y 057 gL con porcentajes del compuesto presente entre el
rango de 62 y 72 minutos de 3664 wv 5857 wv y 5583 wv
respectivamente
Una vez realizada la investigacioacuten se encontroacute que las diferencias existentes en
cuanto a la cantidad de biomasa generada con respecto al tipo de sustrato
utilizado no fueron significativas es decir era irrelevante si se utilizaba glucosa o
sacarosa como principal fuente de carbono para la fermentacioacuten del P cubensis
xviii
en medio sumergido con el fin de obtener biomasa sin embargo se hallaron
diferencias significativas con respecto a las diferentes concentraciones empleadas
de dichas fuentes de carbono
Al analizar las muestras mediante cromatografiacutea liacutequida de alta eficiencia (HPLC)
se determinoacute que el medio que conteniacutea 50 gL de glucosa era el deseado debido
a que fue en eacuteste donde se presentaron picos maacutes definidos mostrando una mejor
resolucioacuten del compuesto Adicionalmente presentoacute un buen crecimiento micelial
Una vez elegido dicho criterio se evaluoacute el efecto que teniacutea la adicioacuten de un
aminoaacutecido llamado Fenilalanina (FA) al medio que conteniacutea 50 gL de glucosa
con el fin de determinar si eacuteste teniacutea alguna incidencia positiva en la produccioacuten de
biomasa y en la generacioacuten del alcaloide de intereacutes cabe resaltar que se utilizaron
diferentes concentraciones de FA correspondientes a 05 gL 10 gL y 15 gL
Finalizados dichos ensayos se obtuvieron valores de crecimiento de biomasa
maacutexima de 106 gL 108 gL y 101 gL y un porcentaje de aacuterea de 7549 wv
6236 wv y 2721 wv respectivamente
Es necesario hacer hincapieacute en que las diferencias obtenidas mediante el anaacutelisis
estadiacutestico entre cada una de las concentraciones de FA con respecto a la
generacioacuten de biomasa y la produccioacuten del compuesto no fueron significativas lo
que llevoacute a elegir una concentracioacuten de 05 gL de FA debido a que fue la menor
cantidad utilizada de este compuesto durante la investigacioacuten suponieacutendose asiacute
una disminucioacuten en los costos de materia prima
Palabras claves
Psilocybe cubensis Psilocibina Alcaloide HPLC Cultivo Sumergido Fuentes de
Carbono Fenilalanina
19
INTRODUCCIOacuteN
Los hongos son una rica fuente de productos naturales con una alta actividad
bioloacutegica Desafortunadamente el cultivo de eacutestos en cuerpo fructiacutefero toma
varios meses disminuyendo su calidad debido a los cambios climaacuteticos y plagas
por tal razoacuten se implementoacute la metodologiacutea de medio sumergido la cual es
prometedora gracias a una alta productividad de compuestos bioactivos (Arora
1986)
El Geacutenero Psilocybe pertenece al Reino Fungiacute con un Phylum Basidiomicota
una Clase Homobasidiomicetes un Orden Agaricales una Familia Strofariaceae
(Paris y Hurabielle 1981)
Dicho geacutenero es considerado de gran importancia a nivel mundial debido a que su
cuerpo fructiacutefero y biomasa micelial contienen Psilocibina la cual posee un alto
valor para la industria farmaceacuteutica por su uso en la elaboracioacuten de productos
antidepresivos Este alcaloide derivado de FA cuenta con una estructura muy
similar al neurotransmisor segregado por el cerebro llamado serotonina que
controla el estado de aacutenimo el suentildeo el hiacutegado y los rintildeones (Mandrile et al
1984) esta caracteriacutestica le otorga la gran importancia a la Psilocibina en el
mercado puesto que tiene un alto impacto en la sociedad como ayudante
antidepresivo debido a que no todas las personas segregan la cantidad necesaria
(10 mg con liacutemites que variacutean desde 5 a 20 mg) de serotonina (Mandrile et al
1984) Adicionalmente se estaacute empleando como una gran ayuda para la
disminucioacuten de la adiccioacuten a sustancias como heroiacutena y cocaiacutena gracias a que
este alcaloide no genera dependencia (Lee et al 2004)
Debido a que su consumo puede generar alucinaciones era consumido por las
culturas aboriacutegenes centroamericanas con el fin de realizar manifestaciones
20
religiosas Su uso se remonta a maacutes de 3500 antildeos y era nombrado por los
aztecas como ―Teonunaltl que significa ―carne de dioses (Mandrile et al 1984)
La alternativa que se utilizoacute durante esta investigacioacuten fue el cultivo del P
cubensis mediante medio sumergido debido principalmente a las notables
ventajas frente a los sistemas convencionales que eacuteste posee entre las cuales se
destacan la disminucioacuten del tiempo para la obtencioacuten de la biomasa (14 diacuteas) y la
reduccioacuten de los costos de obtencioacuten (Lee et al 2004) De acuerdo a lo
dimensionado anteriormente este estudio estaba orientado primordialmente a la
buacutesqueda de alternativas que permitieran la produccioacuten de biomasa de forma
raacutepida y confiable
Con el fin de llevar a cabo lo dicho anteriormente se pretendioacute evaluar el efecto
del uso de dos diferentes fuentes de carbono en este caso glucosa y sacarosa en
el crecimiento micelial de la cepa P cubensis
21
OBJETIVOS
GENERAL
Evaluar el efecto de la fuente de carbono en el crecimiento micelial de una
cepa Psilocybe sp
ESPECIacuteFICOS
Evaluar la cineacutetica de crecimiento de la cepa Psilocybe cubensis en los
diferentes medios de cultivo sumergido mediante la cuantificacioacuten de
biomasa por medio de la metodologiacutea de peso seco
Evaluar el consumo de sustrato para los diferentes ensayos por medio de
teacutecnicas espectrofotomeacutetricas
Determinar la presencia de Psilocibina mediante el uso del reactivo de
Dragendorff
22
1 MARCO TEOacuteRICO
11 CONCEPTOS GENERALES DE HONGOS
Los hongos son organismos eucariotas que no contienen clorofila con nutricioacuten
por absorcioacuten generalmente con reproduccioacuten sexual y asexual el cuerpo
consiste generalmente de filamentos ramificados con pared celular quitinosa
(Miles y Chang 1999)
Constituyen uno de los grupos de organismos maacutes importantes para la vida del
hombre ya que son los responsables de gran parte de la descomposicioacuten de la
materia orgaacutenica aumentando su disponibilidad en el suelo pueden ser
comestibles venenosos o psicotroacutepicos muchos son patoacutegenos otros producen
ciertas sustancias beneficiosas o intervienen en procesos de elaboracioacuten de
algunos comestibles (Miles y Chang 1999)
111 Hongos laminares (Agaricales)
El orden Agaricales tambieacuten conocido como Euagaricales es el mayor orden de
setas y hongos que incluye maacutes de la mitad de todas las especies conocidas de la
clase Homobasidiomycetes (Hibbett et al 1997 Hibbett y Thorn 2001) Maacutes de
9000 especies y alrededor de 350 geacuteneros se han atribuido a este orden que
contiene 26 familias (Kirk et al 2001) Un consenso de mayor nivel de
clasificacioacuten de los Agaricales ha sido difiacutecil de lograr debido a la competencia de
sistemas que restringen geacuteneros y familias (o incluso orden) de diferentes
maneras (Bas 1998 Juumllich 1981 Kirk et al 2001 Kuumlhner 1980 Singer 1986)
23
La base para la clasificacioacuten de los hongos fue construida por Fries (1874) quien
hizo hincapieacute en las caracteriacutesticas macroscoacutepicas como la textura del tallo la
separacioacuten de los filamentos (laminas) presencia o ausencia de velo y color de las
esporas
Posteriormente dividioacute los hongos Agaricales en varias especies de acuerdo al
color de las esporas depositadas las cuales pueden ser de color blanco rosado
marroacuten puacuterpura ndash marroacuten y negro El sistema macroscoacutepico de Fries que
reconocioacute inicialmente 12 geacuteneros de hongos carnosos que forman los hongos es
taxonoacutemicamente praacutectico Eacuteste fue relativamente invariable hasta que Fayod
(1989) estudioacute la anatomiacutea y las caracteriacutesticas microscoacutepicas de muchos
Agaricales reconociendo 108 geacuteneros (Arora 1986)
Al igual que todas las setas los hongos laminares son faacutebricas de esporas
creados con el uacutenico propoacutesito de fabricar esporas microscoacutepicas para dejarse
llevar por las corrientes de aire y con suerte caer en un lugar adecuado en la
tierra para germinar y comenzar un nuevo organismo Las probabilidades de que
cualquier individuo que tiene esporas de este tipo tenga suerte son tan bajas que
el hongo produce millones de esporas para compensar esto En las laacuteminas se
encuentran numerosas esporas las cuales aumentan considerablemente el
nuacutemero de esporas que el hongo puede producir Ambos lados de cada laacutemina
estaacute cubierta con esporas microscoacutepicas (Kuo 2007) A continuacioacuten se muestra
de manera ilustrativa en la figura 1 las laacuteminas que poseen los hongos Agaricales
en las cuales se da la formacioacuten de las esporas
Figura 1 Hongo Agaricales (Laminar) (Kuo 2007)
24
12 MEDIOS DE CULTIVO
Uno de los sistemas maacutes importantes para la identificacioacuten de microorganismos es
observar su crecimiento en sustancias alimenticias artificiales preparadas en el
laboratorio El material alimenticio en el que crecen los microorganismos es el
medio de cultivo (Garciacutea 1995)
Para que los microorganismos crezcan adecuadamente en un medio de cultivo
artificial eacuteste debe reunir una serie de condiciones como lo son temperatura
grado de humedad y presioacuten asiacute como un grado correcto de acidez o alcalinidad
Un medio de cultivo contiene los nutrientes y factores de crecimiento necesarios
para que el microorganismo se desarrolle correctamente y debe estar exento de
cualquier tipo de microorganismo que pueda generar contaminacioacuten (Garciacutea
1995)
121 Tipos de medios de cultivo
En la actualidad existen diversos tipos de medio de cultivo si se centra en la
composicioacuten eacutestos pueden ser medios sinteacuteticos que contienen fuente de
carbono fuente de nitroacutegeno sales que suplan los iones y demaacutes elementos tales
como estimuladores del crecimiento medios complejos que contienen ingredientes
tales como extracto de levadura peptona infusioacuten de cerebro etc ricos en
nutrientes medios de enriquecimiento siendo estos complejos con aditivos
adicionales para favorecer asiacute al crecimiento y desarrollo de determinados
microorganismos medios selectivos los cuales son disentildeados para favorecer el
crecimiento especiacutefico de un microorganismo determinado o un grupo
microbiano medios diferenciales que proporcionan la distincioacuten microbiana de una
mezcla por sus propiedades diferenciales de crecimiento en dichos medios
medios de mantenimiento siendo disiacutemiles de los de crecimiento oacuteptimo por el
25
crecimiento raacutepido y proliacutefico que deriva en la muerte raacutepida de las ceacutelulas (Garciacutea
1995)
Atendiendo a su estado los medios de cultivo pueden presentarse como medios
sumergidos y medios soacutelidos que contienen agar que gelifica por debajo de 45
degC y cuya concentracioacuten en su uso es de 15 y medios semisoacutelidos que contiene
un agar a una concentracioacuten de 07 (Garciacutea 1995)
121 Medio sumergido
Debido a que cultivar el cuerpo fructiacutefero toma varios meses y se dificulta el control
de calidad del producto final porque se estaacute sujeto a los cambios permanentes del
clima y las plagas se ha empleado la metodologiacutea de medio sumergido la cual es
una alternativa muy prometedora para la produccioacuten eficiente del micelio y de los
metabolitos (Lindequist y Niedermeyer 2005)
Dicha forma es la mejor para producir extraer y purificar metabolitos de un cultivo
de hongo ya que facilita una mayor produccioacuten de biomasa en menor tiempo y
de mayor calidad que el cultivo en medio soacutelido ademaacutes facilita la dispersioacuten y
adaptacioacuten del hongo y reduce los vectores de contaminacioacuten De igual forma un
cultivo de esta iacutendole es la opcioacuten maacutes viable si se quiere escalar procesos
fermentativos en aras de desarrollar mercados como en este caso el de
metabolitos medicinales (Navarro et al 1998)
A su vez el uso de cultivo sumergido puede beneficiar la produccioacuten de muchos
metabolitos secundarios y disminuir los costos de produccioacuten por reducir las
labores que involucran los meacutetodos de etapas soacutelidas (Domiacutenguez y Webb 2003)
Los metabolitos bioactivos de los hongos pueden ser potencialmente producidos a
nivel industrial mediante el uso de la metodologiacutea de cultivo sumergido pero el
26
eacutexito a escala comercial depende del costo comparado con la tecnologiacutea existente
y la ventaja econoacutemica que la industria puede ver usando este meacutetodo El uso de
la tecnologiacutea puede ser facilitada por el aumento en el rendimiento de la
produccioacuten y el desarrollo del sistema (Hwang et al 2004)
El cultivo de hongos sumergidos se caracteriza por un aumento en la viscosidad
del caldo con el tiempo debido a uno o maacutes factores tales como el aumento de la
concentracioacuten de ceacutelulas los cambios de la morfologiacutea del crecimiento o la
produccioacuten de productos extracelulares que alteran el caraacutecter reoloacutegico de la
cultura del liacutequido El aumento en la viscosidad puede ser visto como un fenoacutemeno
indeseable pero inevitable ya que causan dificultades en el suministro de oxiacutegeno
en la eliminacioacuten de dioacutexido de carbono y en posibles problemas de agitacioacuten
(Hwang et al 2004)
13 ALCALOIDES
131 Generalidades
La diversidad estructural y la variedad en la actividad bioloacutegica hacen de los
alcaloides como tambieacuten de los antibioacuteticos los grupos maacutes importantes entre las
sustancias naturales de intereacutes terapeacuteutico (Paris y Hurabielle 1981)
Se han aislado principalmente en plantas superiores y se han encontrado en maacutes
de 100 familias de Faneroacutegamas (aquellas plantas que se reproducen por semillas
producidas en sus inflorescencias) Su actividad bioloacutegica a nivel del sistema
nervioso dio pie a las primeras investigaciones siendo los alcaloides las primeras
sustancias naturales estudiadas (Paris y Hurabielle 1981)
El teacutermino alcaloide propuesto por el farmaceacuteutico W Meissner en 1819 se aplicoacute
a los compuestos de origen vegetal con propiedades alcalinas este caraacutecter
baacutesico es debido a la presencia de nitroacutegeno amiacutenico en su estructura Los
27
alcaloides se pueden considerar como ―Un compuesto orgaacutenico de origen natural
nitrogenado derivados generalmente de aminoaacutecidos maacutes o menos baacutesico de
distribucioacuten restringida con propiedades farmacoloacutegicas importantes a dosis bajas
y que responden a reacciones comunes de precipitacioacuten (Paris y Hurabielle
1981)
132 Propiedades fisicoquiacutemicas
Los alcaloides tienen masas moleculares que variacutean entre 100 y 9000 gmol son
casi siempre incoloros son normalmente soacutelidos a temperatura ambiente a
excepcioacuten de los alcaloides no oxigenados Los alcaloides son poco solubles en
agua gracias a su caraacutecter baacutesico dicho caraacutecter se debe al par de electrones
libres del nitroacutegeno (Paris y Hurabielle 1981)
En la naturaleza se encuentran en forma de sales generalmente En las plantas
se consideraba que eran productos obtenidos durante la extraccioacuten y poco
solubles en disolventes tiacutepicos de extraccioacuten por su polaridad Son solubles en
disolventes orgaacutenicos como cloroformo etanol metanol acetato de etilo eacuteter
benceno En forma de sales son solubles en agua excepto las sales de berberina
(Paris y Hurabielle 1981)
Todos los alcaloides son activos a la luz polarizada Presentan una fluorescencia
caracteriacutestica bajo la luz UV o IR dando lugar a espectros caracteriacutesticos (Paris y
Hurabielle 1981)
133 Reconocimiento de los alcaloides
Las teacutecnicas de reconocimiento son basadas en la capacidad que tienen los
alcaloides en estado de sal (extractos aacutecidos) de combinarse con el yodo y
metales pesados como bismuto mercurio tungsteno formando precipitados se
28
utilizan reactivos generales para detectar alcaloides como reactivo de Wagner
reactivo de Mayer reactivo de Dragendorff reactivo de Hager reactivo de
Bertrand reactivo de Ehrlich y reactivo de Vitali-Morin (Paris y Hurabielle 1981)
134 Clasificacioacuten de los alcaloides
Habitualmente los alcaloides se han clasificado en funcioacuten de su estructura
distinguieacutendose principalmente los compuestos heterociacuteclicos de los no
heterociacuteclicos Actualmente existen varias formas de clasificarlos (Bruneton
1987) entre ellas se pueden distinguir
1341 Alcaloides alifaacuteticos
a Derivados de la ornitina (pirrolidinas tropaacutenicos pirrolizidiacutenicos)
b Derivados de la lisina (piperidinas quinolizidiacutenicos)
1342 Alcaloides de origen diverso
a Alcaloides terpeacutenicos y esteroidales
b Alcaloides diversos (purinas macrociclos etc)
1343 Alcaloides aromaacuteticos
a Derivados del aacutecido nicotiacutenico (piridinas)
b Derivados de la fenilalanina y tirosina (isoquinoleinas)
c Derivados del triptofano (indoacutelicos quinoleinas)
d Derivados de la histidina (imidazoles)
29
Alcaloides derivados del triptofano (Alcaloides Indoacutelicos)
Desde el punto de vista farmacoloacutegico ha habido mucho intereacutes sobre las bases
que contienen el nuacutecleo indoacutelico a raiacutez del descubrimiento de la actividad
alucinoacutegena del LSD asiacute como la actividad sedante de la reserpina aislada del
geacutenero Rauwolfia El auge del estudio fitoquiacutemico ocurrioacute en la deacutecada de los 60 y
se dirigiacutea principalmente a la familia Apocynaceae (Mercano y Hasegawa 1991)
Existen unos 800 alcaloides de este tipo distribuidos principalmente en la familia
Apocynaceae (geacuteneros Rauwolfia Aspidos-perma Strychnos y Vinca) menos
frecuentes en hongos y familias como Leguminoseae Malphigiaceae Rubiaceae y
Rutaceae donde los alcaloides presentan el grupo indoacutelico sencillo (Mercano y
Hasegawa 1991)
El triptofano es el precursor de estos alcaloides los cuales se clasifican en
triptaminas y en no triptaminas las triptaminas a su vez se subdividen en b-
carbolinas y en indoleninas y pueden ser triptaminas simples o triptaminas
complejas y estas pueden ser isopreacutenicas o no isopreacutenicas (Mercano y Hasegawa
1991) La figura 2 muestra la estructura quiacutemica del triptofano triptamina y sus
divisiones
Figura 2 Alcaloides derivados del Triptofano (Mercano y Hasegawa 1991)
30
Triptaminas simples
Las triptaminas simples juegan un importante papel en la cultura indiacutegena de
Ameacuterica por sus efectos alucinoacutegenos y extaacuteticos en sus ceremonias maacutegico
religiosas (Furst 1994) Se han encontrado en hongos alucinoacutegenos de
Mesoameacuterica del geacutenero Psilocybe Stropharia y Conocybe (―teonacatl o ―carne
de los dioses) usados por los indios Aztecas en sus ceremonias religiosas desde
hace maacutes de 1700 antildeos Se han encontrado en estos hongos los alcaloides
alucinoacutegenos la Psilocina y la Psilocibina que al ingerirlos produce diferentes
sensaciones auditivas y visuales relajacioacuten muscular depresiones y euforias
alternadas (Mercano y Hasegawa 1991)
La serotonina que juega un importante papel en la actividad neuronal se
encuentra tambieacuten en vegetales Se ha aislado en el pericarpio del banano el cual
seco cuando es fumado actuacutea como un alucinoacutegeno ligero (Seigler 1981)
De las glaacutendulas paroacutetidas del sapo comuacuten Bufo vulgaris se aiacutesla la bufotenina
derivado N-dimetilado de la serotonina que tambieacuten es el principio activo del Yopoacute
polvo de las semillas de Anadenanthera peregrina (Piptadenia peregrina)
Leguminoseae y especies del geacutenero Virola (Myristicaceae) que contiene tambieacuten
triptaminas son mezclados con cenizas e inhalados por medio de tubos de bambuacute
por los indiacutegenas del Orinoco en ceremonias maacutegico religiosas produciendo
alucinacioacuten e incoordinacioacuten motriz (Seigler 1981)
En la figura 3 se observan las estructuras de aquellos compuestos que estaacuten
clasificados como triptaminas simples
31
Figura 3 Triptaminas simples (Seigler 1981)
13 PSILOCIBINA Y PSILOCINA
La Psilocibina y la Psilocina son bioloacutegicamente sintetizadas en los hongos
pertenecientes a los geacuteneros de Psilocybe (Bigwood y Beug 1982 Wurst et al
1984)
La Psilocibina y la Psilocina se han identificado en todo el mundo en una variedad
de setas que son llamados hongos maacutegicos La ingestioacuten de pequentildeas
cantidades de alucinoacutegenos provoca el eacutextasis La actividad alucinoacutegena de la
Psilocibina es relativamente maacutes baja que la de la Psilocina Sin embargo la
Psilocibina se convierte faacutecilmente en Psilocina (componente activo principal) en
los sistemas bioloacutegicos Asiacute el desarrollo de un meacutetodo de determinacioacuten de la
Psilocibina es importante lo misma que la de la Psilocina (Kimie et al 2005)
La hidroacutelisis de la Psilocibina se consigue saturando con anhiacutedido carboacutenico una
solucioacuten acuosa de Psilocibina (para eliminar el oxiacutegeno del aire y calentaacutendola)
obteniendo asiacute una moleacutecula de 4hidroxi-dimetiltriptamina y una moleacutecula de aacutecido
fosfoacuterico (Mandrile et al 1984)
Como todos los faacutermacos derivados del indol estas sustancias han despertado
intereacutes porque se sospechoacute la posibilidad de que algunas de ellas se formen en el
32
organismo y que en ciertas psicosis especialmente en la esquizofrenia se
produzcan elevados niveles sanguiacuteneos que ocasionan algunos de los siacutentomas
(Mandrile et al 1984)
La figura 4 muestra la estructura quiacutemica de alcaloides como la Psilocibina y
Psilocina
Figura 4 Psilocibina y Psilocina (Mandrile et al 1984)
131 Antecedentes acerca de la obtencioacuten de Psilocibina y Psilocina
Una gran variedad de meacutetodos cromatograacuteficos para la determinacioacuten de
Psilocibina y Psilocina presentes en las incautaciones de hongos se han
publicado La cromatografiacutea de capa fina es utilizada debido a que eacutesta es muy
apropiada para la deteccioacuten de sustancias derivadas del triptofano (Brown et al
1972 Tanimukai 1967 Beug y Bigwood 1981) Aun asiacute meacutetodos que involucran
tanto la cromatografiacutea de alta eficiencia (HPLC) como la deteccioacuten fotomeacutetrica de
UV (Beug y Bigwood 1981 Wurst et al 1984 Borner y Brenneisen 1987 Perkal
et al 1980 Vanhaelen-Faestreacute y Vanhaelen 1984 Thomson 1980 White 1979
Sottolano y Lurie 1983) fueron establecidas y optimizadas para la cuantificacioacuten
de Psilocibina
Durante los uacuteltimos antildeos se han venido utilizando diferentes tipos de columna y
fase moacutevil con el fin de obtener la mayor cantidad posible de la sustancia de
intereacutes (Psilocibina)
33
En el antildeo 1981 en el instituto farmaceacuteutico de la Universidad de Oslo realizaron
una investigacioacuten con una columna de siacutelice con una fase moacutevil de metanol-nitrato
de amonio en donde no soacutelo se logroacute obtener Psilocibina y Psilocina sino tambieacuten
un nuevo producto conocido como beocistiacuten Se logroacute un porcentaje de separacioacuten
maacutexima de 75 ww (Christiansen et al 1981)
Asimismo en el antildeo 1984 en el instituto de microbiologiacutea de Amsterdam se
realizoacute un estudio con una columna C18 de siacutelice y una fase moacutevil de agua-etanol-
aacutecido aceacutetico de forma isocraacutetica en donde se obtuvo un porcentaje 025-115
y 002-016 de Psilocibina y Psilocina respectivamente en el hongo (Wurst
1984)
De igual manera en el antildeo 2003 en el instituto de ciencia policiaca en Japoacuten se
ejecutoacute la cromatografiacutea de alta eficiencia utilizando una columna C18 con una
fase moacutevil de aacutecido foacutermico de forma isocraacutetica y un detector de 220 nm un rango
de porcentaje de Psilocibina 014-042 wv en la capa mientras un 009-03
wv en el tallo (Tsujikawa et al 2003)
34
2 MATERIALES Y MEacuteTODOS
21 LOCALIZACIOacuteN
Las fermentaciones la medicioacuten del crecimiento micelial y la cuantificacioacuten del
consumo del sustrato y de proteiacutena se llevaron a cabo en el laboratorio de
Biotecnologiacutea de la Universidad EAFIT mientras que los anaacutelisis de cromatografiacutea
liacutequida de alta eficiencia (HPLC) se realizaron en el laboratorio de Quiacutemica
Instrumental de dicha Universidad
22 MICROORGANISMO DE ESTUDIO
La cepa del hongo Psilocybe cubensis (EAH01) con la cual se trabajoacute fue donada
por Joseacute Rodrigo Moreno Ingeniero del laboratorio de la Universidad Catoacutelica de
Oriente (UCO) La EAH01 permanece auacuten en el laboratorio de Biotecnologiacutea de la
Universidad EAFIT
Dicha cepa se cultivoacute en una caja Petri que conteniacutea Agar Extracto de Malta
(MEA) y se incuboacute a 30ordmC en una incubadora digital del laboratorio de
Biotecnologiacutea de la Universidad EAFIT La figura 5 representa una cepa de P
cubensis cultivada en medio soacutelido MEA
Figura 5 Psilocybe cubensis (EAH01) cultivada en medio soacutelido Agar Malta
35
23 COMPONENTES DEL MEDIO DE CULTIVO (FANG-ZHONG)
El medio sumergido utilizado para llevar a cabo las diferentes fermentaciones de
P cubensis fue el descrito por Fang-Zhong (2002) La tabla 1 muestra los
componentes de dicho medio y la concentracioacuten de cada uno de ellos Se destaca
que las fuentes de carbono utilizadas fueron glucosa y sacarosa usaacutendolas cada
una por separado para cada experimento y haciendo variaciones de
concentraciones de las mismas para los distintos ensayos
Tabla 1 Composicioacuten del medio de cultivo sumergido para evaluar el crecimiento micelial del P cubensis
Componentes Cantidad (gL)
Fuente de Carbono 30 ndash 50 - 70
Peptona 5
Extracto de levadura 5
KH2PO4 1
MgSO47H2O 05
Vitamina B1 005
24 PREPARACIOacuteN DE LOS DIFERENTES PREINOacuteCULOS DE P cubensis
EMPLEADOS PARA LAS FERMENTACIONES SUMERGIDAS
Con el propoacutesito de llevar a cabo cada uno de los ensayos fue necesario realizar
la preparacioacuten de un preinoacuteculo eacutesto con el fin de realizar un proceso de
adaptacioacuten del P cubensis al medio favoreciendo la disminucioacuten en cuanto a
tiempo (preferiblemente la eliminacioacuten de la aparicioacuten de un fase de latencia una
vez comenzada la fermentacioacuten)
La preparacioacuten de cada uno de los preinoacuteculos se realizoacute en 6 erlenmeyers de
1000 mL con 200 mL de medio cada uno los cuales fueron esterilizados a 120degC
por 15 minutos e inoculados con 4 discos de 5 mm aproximadamente de P
36
cubensis provenientes de la cepa previamente activada en Agar Malta durante 6
diacuteas Los erlenmeyers se llevaron a un agitador orbital por 6 diacuteas a 30ordmC y 100
rpm
25 PREPARACIOacuteN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO Y LOS INOacuteCULOS DE P
cubensis UTILIZADOS PARA LAS FERMENTACIONES SUMERGIDAS
Una vez realizado el preinoacuteculo se procedioacute a preparar los medios de cultivo
utilizados para realizar los distintos experimentos de la siguiente manera se
prepararon medios que diferiacutean en la fuente de carbono (glucosa o sacarosa) y en
la concentracioacuten de la misma (30 gL 50 gL y 70 gL) teniendo asiacute un total de
seis fermentaciones Las demaacutes cantidades de los componentes del medio de
Fang-Zhong fueron las mismas que las usadas en el preinoacuteculo descritas en la
Tabla 1
En primer lugar se llevaron a cabo las tres fermentaciones de glucosa
preparando un total de 90 erlenmeyers (30 por cada concentracioacuten de azuacutecar por
duplicado) cada uno de los frascos conteniacutea 50 mL del medio en erlenmeyers de
250 mL e inoculados con 01 g de peso huacutemedo del preinoacuteculo aproximadamente
Los 90 frascos se llevaron durante 14 diacuteas a un agitador orbital a 100 rpm con una
temperatura de 30 degC
Posteriormente se llevaron a cabo las tres fermentaciones de sacarosa siguiendo
el mismo proceso descrito anteriormente para la glucosa
Una vez terminadas las fermentaciones de glucosa y sacarosa y realizados todos
los anaacutelisis correspondientes (generacioacuten de biomasa consumo de sustrato
consumo de proteiacutena y evaluacioacuten de la presencia de Psilocibina por medio de
cromatografiacutea liacutequida de alta eficiencia (HPLC)) se procedioacute a elegir la fuente de
carbono y concentracioacuten que mejores resultados arrojoacute tanto para la generacioacuten
37
de biomasa como para la produccioacuten del alcaloide con el fin de evaluarla
nuevamente adicionaacutendole un precursor (FA)
Para finalizar se procedioacute a preparar los medios con la fuente de carbono y la
concentracioacuten de la misma que arrojoacute mejores resultados es decir los ensayos
realizados con una concentracioacuten de 50 gL de glucosa adicionaacutendole al medio
FA a diferentes concentraciones correspondiente a valores de 05 gL 10 gL y
15 gL las demaacutes cantidades de los componentes remanentes del medio fueron
las mismas que las descritas anteriormente en la tabla 1
26 CUANTIFICACIOacuteN DEL CRECIMIENTO DE BIOMASA MEDIANTE LOS
MEacuteTODOS DE PESO HUacuteMEDO Y PESO SECO PARA CULTIVO
SUMERGIDO DE P cubensis
La cuantificacioacuten de biomasa para cada uno de los tratamientos se realizoacute usando
la metodologiacutea de peso huacutemedo y peso seco Para la cuantificacioacuten de biomasa
mediante el meacutetodo de peso huacutemedo se tomaron dos muestras provenientes de
cada erlenmeyer cada 24 horas las cuales fueron filtradas y pesadas con el fin de
obtener el valor de peso huacutemedo para cada tratamiento del P cubensis
Posteriormente la biomasa retenida en el papel filtro fue llevada a un secador que
se encontraba a una temperatura de 50ordmC durante 24 horas transcurrido el
tiempo la biomasa seca fue pesada con el fin de obtener datos de peso seco
Durante los 14 diacuteas de la fermentacioacuten se obtuvieron datos de peso huacutemedo y
peso seco por duplicado para cada una de las fermentaciones
27 AJUSTE DE LA CINEacuteTICA DE CRECIMIENTO DE P cubensis AL
MODELO CINEacuteTICO LOGIacuteSTICO
Una vez realizada la recoleccioacuten de muestras para cada uno de los ensayos y su
posterior anaacutelisis se decidioacute modelar dichos datos mediante el modelo logiacutestico
38
(ecuacioacuten 1) el cual permite obtener variables cineacuteticas tales como la cantidad de
biomasa inicial (Xo) y la velocidad maacutexima de crecimiento (micromaacutex) para cada uno de
los tratamientos
Se decidioacute emplear el modelo logiacutestico ya que eacuteste muestra resultados maacutes reales
cuando se cultivan hongos debido a que su morfologiacutea es muy diferente a otros
microorganismos (pellets) dificultando la transferencia de masa (Bailey et al
1986)
Una vez linealizada la ecuacioacuten que describe dicho modelos se llega a la siguiente
expresioacuten
Ecuacioacuten 1 Ecuacioacuten linealizada del modelo logiacutestico
Posterior a la linealizacioacuten de la ecuacioacuten se procedioacute a graficar Ln ((XmaacutexX)-1)
vs tiempo con el fin de obtener como pendiente la velocidad maacutexima de
crecimiento (micromaacutex) y como intercepto el Ln ((XmaacutexXo)-1) el cual permitioacute la
obtencioacuten de la concentracioacuten inicial de biomasa
Obtenieacutendose asiacute los paraacutemetros cineacuteticos para cada ensayo correspondientes a
micromax y Xo
Se debe definir la concentracioacuten maacutexima de biomasa (Xmaacutex) para poder hallar los
paraacutemetros cineacuteticos mediante dicho modelo cabe aclarar que dicho valor se toma
de los resultados de biomasa adquiridos para cada uno de los ensayos mediante
la metodologiacutea de peso seco este valor variacutea para cada fermentacioacuten
Una vez ajustados los datos de cada tratamiento al modelo logiacutestico se procedioacute a
calcular de manera teoacuterica los valores de X (biomasa) que variacutea con el tiempo
39
teniendo en cuenta los paraacutemetros cineacuteticos arrojados mediante el modelo
logiacutestico utilizando la siguiente ecuacioacuten
Ecuacioacuten 2 Valores teoacutericos de biomasa en el tiempo
Estos valores de X teoacutericos obtenidos mediante la foacutermula anterior se grafican con
respecto a los valores de X obtenidos de manera experimental con el fin de
observar el ajuste del modelo logiacutestico a cada uno de los datos experimentales
28 EVALUACIOacuteN DEL CONSUMO DE SUSTRATO Y DEL CONSUMO DE
PROTEIacuteNA POR PARTE DEL P cubensis CULTIVADO EN MEDIO
SUMERGIDO
Con el fin de evaluar el consumo de sustrato y proteiacutena por parte del P cubensis
durante las fermentaciones que conteniacutean glucosa en el medio se recolectaron
muestras cada 24 horas del liacutequido obtenido despueacutes de realizada la filtracioacuten de
la muestra que se utilizoacute para efectos de caacutelculo de peso seo dicho liacutequido
denominado sobrenadante fue almacenado a -4 degC Finalizadas cada una de las
fermentaciones se procedioacute a realizar el protocolo para evaluar el consumo de
sustrato para cada medio (Miller 1959) mediante el meacutetodo de DNS (Aacutecido
Dinitrosaliciacutelico) (Anexo 13) y el consumo de proteiacutenas mediante el meacutetodo de
LOWRY para cada fermentacioacuten (Anexo 15)
Para llevar a cabo la cuantificacioacuten de sustrato y proteiacutena en los distintos ensayos
fue necesario realizar las curvas de calibracioacuten correspondientes dichas curvas
con sus respectivos valores de concentracioacuten se muestran en los anexos 14 y 16
40
29 MEacuteTODO CUALITATIVO PARA DETERMINAR LA PRESENCIA DE
ALCALOIDES (PSILOCIBINA) MEDIANTE EL USO DEL REACTIVO DE
DRAGENDORFF
Como se mencionoacute anteriormente el reactivo de Dragendorff es usado para
determinar de manera cualitativa la ausencia o presencia de alcaloides en una
muestra determinada Para llevar a cabo dicha prueba se recolectaron muestras
de la biomasa seca correspondientes a los diacuteas 12 13 y 14 de cada fermentacioacuten
las cuales fueron almacenadas a -4degC
Para determinar la presencia de Psilocibina se realizoacute el proceso descrito seguacuten
Musshoff et al (2000) el cual consistioacute en macerar cada una de las muestras de
biomasa hasta obtener un polvo fino luego se pesaron 10 mg de dicho polvo y a
esta cantidad se le agregoacute 1 mL de metanol Posteriormente una pequentildea
cantidad de esta mezcla se esparcioacute en un papel filtro en donde se le adicionoacute una
gota del reactivo de Dragendorff
Una vez realizada la prueba se dice que la muestra contiene presencia de
alcaloides si eacutesta presenta una coloracioacuten rojizo-amarilla
210 MEacuteTODO PARA DETERMINAR LA PRESENCIA DE PSILOCIBINA
MEDIANTE CROMATOGRAFIacuteA LIacuteQUIDA DE ALTA EFICIENCIA (HPLC)
Una vez evaluada la presencia del alcaloide mediante el reactivo de Dragendorff
se procedioacute a determinar mediante el uso de cromatografiacutea liacutequida de alta
eficiencia (HPLC) la presencia de los alcaloides en la mezcla con sus respectivos
tiempos de retencioacuten para llevar a cabo la extraccioacuten de la Psilocibina se siguioacute el
meacutetodo descrito por Musshoff et al (2000) Para ello la muestra de biomasa
seca fue macera en un mortero hasta convertirla en un polvo fino Diez miligramos
41
de la muestra en polvo se extrajeron dos veces con 1 mL de metanol en un bantildeo
de ultrasonido durante 30 minutos Posterior a eacutesto se centrifugaron las muestras
a 3000 rpm durante 2 minutos el sobrenadante se depositoacute en un vial
independiente
El sobrenadante fue evaporado hasta sequedad bajo una corriente de nitroacutegeno
gaseoso Una parte de los residuos se disolvioacute en 200 microL de la fase moacutevil que
contiene HCOONH4 con una concentracioacuten 10 microM y un pH de 35
El equipo utilizado para realizar todos los anaacutelisis correspondientes a HPLC
cuenta con las siguientes caracteriacutesticas equipo Agient Technologies que consta
de una columna C18 de 46 mm 250 mm 5 mm con una fase moacutevil de
HCOONH4 con un flujo de 1 mLminuto un detector UV de 214 nm y una inyeccioacuten
de 20 μL y una temperatura de 25degC El experimento se corrioacute de modo isocraacutetico
con una fase moacutevil de agua 70 y HCOONH4 de 30
211 DETERMINACIOacuteN CUALITATIVA DE LA RESOLUCIOacuteN DEL
ALCALOIDE DE INTEREacuteS PARA LOS DIFERENTES ENSAYOS
Con el fin de determinar de manera cualitativa cuaacutel de los cromatogramas
arrojados mediante la teacutecnica de HPLC presentoacute mejor resolucioacuten del alcaloide
fue necesario realizar un supuesto acerca del tiempo de retencioacuten de la Psilocibina
durante la cromatografiacutea puesto que a pesar de haber contado con un
cromatograma (Tsujikawa et al 2003) (Anexo 18) y haber trabajado en las
mismas condiciones de eacuteste no se utilizoacute la misma fase moacutevil lo que puedo
generar variaciones en dicho tiempo Se asumioacute que el tiempo de retencioacuten varioacute
entre 62 y 72 minutos es decir entre este tiempo se encontroacute el pico de intereacutes
de la investigacioacuten
42
La eleccioacuten del criterio de pureza del compuesto de intereacutes se realizoacute observando
cuaacutel de los picos obtenidos muestra menor ruido es decir que a su alrededor no
tenga presencia de otros compuestos (Anexos 19 20 y 21)
212 DETERMINACIOacuteN PORCENTUAL DE COMPUESTOS PARA LOS
DIFERENTES ENSAYOS
La cuantificacioacuten de los compuestos se hizo mediante un porcentaje de aacuterea bajo
la curva debido a que no se contoacute con un estaacutendar interno
Para realizar dicho porcentaje se obtuvo la totalidad de las aacutereas presentes en el
perfil cromatograacutefico obtenido para las muestras de los diacuteas 12 13 y 14 de cada
fermentacioacuten y el porcentaje del aacuterea del metabolito de intereacutes la cual oscilaba
entre un tiempo de retencioacuten entre 62 y 72 minutos
En el momento de analizar los cromatogramas y de elegir el medio que mejor
resultados arrojoacute en cuanto a la produccioacuten de alcaloide se observoacute la resolucioacuten
del metabolito en cada una de las fermentaciones
213 CULTIVO SUMERGIDO DE P cubensis EN PRESENCIA DE FA
Despueacutes de haber elegido la fuente de carbono (glucosa) y su respectiva
concentracioacuten (50 gL) que mejores resultados arrojaron durante la investigacioacuten
se realizaron nuevamente fermentaciones del P cubensis en medio sumergido
(Fang-Zhong) donde la diferencia de estos medios con respecto a los
anteriormente utilizados radicoacute en la presencia de FA aminoaacutecido
Para dichas fermentaciones se contoacute con tres concentraciones diferentes de FA
(05 gL 1 gL 15 gL) realizadas por duplicado adicionalmente se montoacute
43
simultaacuteneamente con dichos ensayos las muestras correspondientes a los uacuteltimos
tres diacuteas de fermentacioacuten sin FA en el medio para efectos de comparacioacuten y asiacute
poder llevar a cabo un anaacutelisis estadiacutestico apropiado
Los datos obtenidos fueron analizados por medio de una ANOVA con el fin de
observar si existiacutean o no diferencias significativas en cuanto al crecimiento micelial
(concentracioacuten de biomasa) del P cubensis y asiacute poder determinar el medio que
mejores resultados arrojoacute durante la investigacioacuten
214 DISENtildeO DE EXPERIMENTOS Y ANAacuteLISIS ESTADIacuteSTICO
El disentildeo estadiacutestico utilizado para realizar los anaacutelisis correspondientes a las
diferentes fermentaciones es un disentildeo factorial 23 Este estudio se basoacute en dos
factores que fueron las dos fuentes de carbono (glucosa y sacarosa) a su vez se
apoyoacute en tres niveles que fueron la variacioacuten en la concentracioacuten de las mismas
(30 gL 50 gL y 70 gL) De igual manera se fundamentoacute en dos variables de
respuesta el crecimiento micelial de P cubensis y el porcentaje de Psilocibina
presente en el microorganismo
Por medio del Software Statgraphics plus 51 se realizoacute un anaacutelisis estadiacutestico
basado en una ANOVA factorial Con ello se pretendioacute comparar estadiacutesticamente
los resultados de crecimiento micelial de biomasa (concentracioacuten) y produccioacuten de
Psilocibina para cada uno de los medios durante los 14 diacuteas de fermentacioacuten y en
especial en los uacuteltimos tres diacuteas de la misma puesto que durante este periacuteodo fue
evaluada la presencia del alcaloide
Es necesario hacer hincapieacute que para realizar dicha estadiacutestica fue necesario
ejecutar un estudio de normalidad el cual se comproboacute utilizando la graacutefica de
probabilidad normal a su vez se requirioacute un anaacutelisis de igualdad de varianza por
medio de una graacutefica de residuos Vs previsto con el fin de ver visualmente la
44
hipoacutetesis de la homocedasticidad todo ello con el fin de garantizar que la
investigacioacuten se comportoacute de forma normal Adicionalmente se contoacute con una
hipoacutetesis nula (Ho) y una Hipoacutetesis alterna (Ha) las cuales permitieron realizar las
conclusiones respectivas A continuacioacuten se enunciaraacuten cada una de eacutestas y los
paraacutemetros necesarios para dicho estudio
Ho Todas las medias son iguales es decir no existen diferencias
significativas entre los datos analizados
Ha Alguna de las medias es diferente lo que quiere decir que siacute existen
diferencias significativas
Paraacutemetro
Pvalor gt 005 Se acepta Ho
Pvalor le 005 Se rechaza Ho
45
3 RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN
31 CINEacuteTICA DE CRECIMIENTO MICELIAL DE P cubensis EN CULTIVO
SUMERGIDO (FANG-ZHONG) UTILIZANDO DIFERENTES FUENTES DE
CARBONO
Con el propoacutesito de evaluar el crecimiento micelial del P cubensis en medio
sumergido durante los 14 diacuteas de la fermentacioacuten se recurrioacute al uso de
metodologiacuteas conocidas como peso huacutemedo y peso seco en dicho trabajo soacutelo se
exponen los datos arrojados por el meacutetodo de peso seco
A continuacioacuten se presentan cada una de las fermentaciones de acuerdo al tipo de
sustrato empleado en las mismas los respectivos valores de peso seco obtenidos
y los anaacutelisis pertinentes para cada uno de los casos
311 Crecimiento micelial de P cubensis en medio sumergido utilizando
diferentes concentraciones de glucosa
Inicialmente se evaluaron tres concentraciones de glucosa en el cultivo de P
cubensis en medio sumergido (Fang-Zhong) correspondientes a 30 gL 50 gL y
70 gL siendo en este caso la glucosa la principal fuente de carbono del P
cubensis
A continuacioacuten se muestran los valores de peso seco obtenidos para cada una de
las concentraciones de glucosa utilizadas durante los 14 diacuteas de la fermentacioacuten
46
0
01
02
03
04
05
06
07
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Bio
ma
sa (g
L)
Tiempo (diacuteas)30gL 50gL 70gL
Graacutefico 1 Cineacutetica de crecimiento micelial de P cubensis en medio sumergido (Fang-Zhong) utilizando tres diferentes concentraciones de
glucosa como fuente de carbono (Peso seco)
Del graacutefico 1 se puede observar que no hubo evidencia de fase de latencia para
ninguno de los ensayos posteriormente se aprecia que el crecimiento de biomasa
aumentoacute con el tiempo para las diferentes concentraciones de glucosa empleadas
Analizando las fermentaciones que conteniacutean 50 gL y 70 gL de glucosa se
puede afirmar que ambas presentan un comportamiento similar mostrando una
fase exponencial hasta el diacutea 11 y una fase estacionaria hasta el diacutea 14 de la
fermentacioacuten mientras que la fermentacioacuten que conteniacutea 30 gL de glucosa no
presentoacute fase estacionaria la fermentacioacuten durante los 14 diacuteas se encontraba en
fase exponencial a pesar de que entre los diacuteas 8 y 11 el crecimiento de P
cubensis se mantuvo constante
Asimismo se puede observar que el crecimiento maacutes bajo en cuanto a
concentracioacuten de biomasa se generoacute en la concentracioacuten de 30 gL siendo eacuteste
de 048 gL mientras que en las concentraciones de 50 gL y 70 gL de glucosa
los crecimientos maacuteximos fueron muy similares 055 gL y 062 gL
respectivamente
47
Lo dicho anteriormente se ratifica una vez analizados los resultados obtenidos
estadiacutesticamente donde se obtuvo un P-valor igual a cero indicando que existen
diferencias significativas en cuanto al crecimiento micelial de biomasa
(concentracioacuten de biomasa durante los 14 diacuteas de la fermentacioacuten) El graacutefico 2
ilustra la presencia de dos grupos homogeacuteneos lo que indica que las
concentraciones de 50 gL y 70 gL no tienen diferencias significativas del
crecimiento micelial entre cada una de ellas mientras que la concentracioacuten de 30
gL siacute presenta dichas diferencias significativas con respecto a las dos
concentraciones anteriores (Anexo 1)
Con todo eacutesto se expone que la concentracioacuten de glucosa de 50 gL es la que se
eligioacute debido a que es maacutes econoacutemico utilizar 50 gL de glucosa que 70 gL
Tratamientos con diferentes concentraciones de glucosa
Media 30 gL glucosa (a) 022
Media 50 gL glucosa (b) 032
Media 70 gL glucosa (b) 034
a
bb
0
005
01
015
02
025
03
035
04
045
Co
nce
ntr
acioacute
n b
iom
asa
(gL
)
Letras diferentes denotan diferencias significativas (prueba LSD)
Graacutefico 2 Crecimiento micelial de P cubensis en cultivo sumergido bajo tres concentraciones de glucosa
48
Modelo logiacutestico para las fermentaciones donde se utilizoacute glucosa
como fuente de carbono
Una vez realizada la cineacutetica de crecimiento del P cubensis en medio sumergido
(Fang-Zhong) usando diferentes concentraciones de glucosa se procedioacute a
ajustar los datos obtenidos al modelo logiacutestico Los crecimientos maacuteximos de
biomasa obtenidos mediante el meacutetodo de peso seco para cada uno de los
ensayos fueron 048 gL 065 gL y 062 gL para concentraciones de 30 gL 50
gL y 70 gL de glucosa respectivamente La tabla 2 muestra los paraacutemetros
cineacuteticos obtenidos mediante el modelo para cada una de las concentraciones
Tabla 2 Paraacutemetros cineacuteticos obtenidos mediante el modelo logiacutestico para las diferentes fermentaciones de P cubensis utilizando glucosa como fuente
de carbono
30gL 50gL 70gL
microx (diacutea-sup1) 016 microx (diacutea-sup1) 017 microx (diacutea-sup1) 015
micromax (diacutea-sup1) 027 micromax (diacutea-sup1) 035 micromax (diacutea-sup1) 034
X0 (gL) 005 X0 (gL) 008 X0 (gL) 008
R2 096 R2
092 R2 085
De la tabla 2 se puede observar que la concentracioacuten inicial de biomasa (Xo)
estuvo muy cercana para cada una de las concentraciones de glucosa utilizadas
Para 30 gL de glucosa la velocidad maacutexima de crecimiento (micromax) fue mucho
menor que la obtenida para 50 gL y 70 gL eacutesto pudo ser debido a que fue el
medio que menor cantidad de glucosa conteniacutea mientras que para las otras dos
concentraciones de glucosa la velocidad maacutexima de crecimiento fue similar
Al comparar las velocidades maacuteximas de las tres concentraciones de glucosa
utilizadas se evidencia que la fermentacioacuten que conteniacutea 50 gL presentoacute una
micromaacutex mayor correspondiente a 035 diacutea-1 esto sugiere que a mayores
concentracioacuten de glucosa (70 gL) puede ocurrir una inhibicioacuten por sustrato otro
49
criterio que afirma que dicha concentracioacuten fue la que mejores resultados arrojoacute de
las tres concentraciones de glucosa utilizadas para el crecimiento del P cubensis
en el medio de Fang-Zhong Ademaacutes se observa que este experimento fue el que
mayor velocidad especiacutefica de crecimiento presento siendo esta de 017 diacutea-1
Finalmente se calcularon los valores de biomasa teoacutericos utilizando la ecuacioacuten
descrita anteriormente en la metodologiacutea con el propoacutesito de observar que tanto
se ajustaron los valores de biomasa hallados experimentalmente con los valores
de biomasa teoacutericos arrojados por el modelo logiacutestico El graacutefico 3 muestra los
valores de biomasa (X) tanto teoacutericos como experimentales con respecto al
tiempo
0
01
02
03
04
05
06
07
0 2 4 6 8 10 12 14
Biom
asa
(gL
)
Tiempo (diacutea)
X exp (30 gL) X exp (50 gL) X exp (70 gL)
X teoacuterico (30 gL) X teoacuterico (50 gL) X teoacuterico (70 gL)
Graacutefico 3 Valores de concentracioacuten de biomasa experimental y teoacuterico
graficados con respecto al tiempo para las fermentaciones con diferentes concentraciones de glucosa
Al observar el graacutefico 3 se puede notar que para los ensayos de 50 gL y 70 gL
de glucosa los valores de biomasa teoacutericos se encuentran un poco desfasados de
los valores de biomasa hallados de manera experimental mientras que para el
ensayo que conteniacutea 30 gL de glucosa se observa un buen ajuste de los datos
50
obtenidos experimentalmente al modelo logiacutestico La tabla 2 reitera lo dicho
anteriormente al exponer los valores de R2 los cuales explican la relacioacuten que
tienen los datos teoacutericos con los experimentales
312 Crecimiento micelial del P cubensis en medio sumergido utilizando
diferentes concentraciones de sacarosa
Una vez evaluado el crecimiento de biomasa usando glucosa como fuente de
carbono se procedioacute a evaluar el efecto que teniacutea el cambio de la fuente de
carbono por sacarosa en el crecimiento micelial del P cubensis en medio
sumergido
El graacutefico 4 muestra de manera ilustrativa como fue el crecimiento micelial del P
cubensis para cada una de las concentraciones de sacarosa utilizadas durante los
14 diacuteas mediante el meacutetodo de peso seco
0
01
02
03
04
05
06
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Biom
asa (
gL)
Tiempo (diacuteas)
30 gL 50 gL 70 gL
Graacutefico 4 Cineacutetica de crecimiento micelial de P cubensis en medio sumergido (Fang-Zhong) utilizando diferentes concentraciones de sacarosa
como fuente de carbono (Peso seco)
51
En el graacutefico 4 se puede observar que tanto para una concentracioacuten de 30 gL
como para 70 gL de sacarosa el hongo llega a su fase estacionaria cerca del
quinto diacutea de la fermentacioacuten mientras que para una concentracioacuten de 50 gL se
observa un comportamiento diferente puesto que el microorganismo tiene un
crecimiento exponencial hasta el diacutea 5 en donde entra a una etapa de transicioacuten o
estacionaria durante 3 diacuteas aproximadamente luego de la cual inicia nuevamente
su crecimiento de forma exponencial hasta llegar al diacutea 11 en donde siacute empieza
su fase estacionaria
Al igual que en las tres fermentaciones que conteniacutean glucosa en estas
fermentaciones de sacarosa se observa mediante el graacutefico anterior que no hubo
presencia de fase de latencia
El crecimiento maacuteximo de biomasa en cuanto a concentracioacuten lo presentoacute aquella
fermentacioacuten que conteniacutea 70 gL de sacarosa el cual fue de 057 gL seguida de
la de 50 gL con un crecimiento maacuteximo de biomasa de 045 gL y posteriormente
la concentracioacuten de 30 gL obtuvo un crecimiento maacuteximo de 026 gL
De acuerdo al anaacutelisis estadiacutestico que se realizoacute para cada una de las
fermentaciones se dedujo que las diferencias en cuanto al crecimiento micelial de
biomasa con respecto a la concentracioacuten de la misma son significativas entre
cada una de las fermentaciones es decir fue diferente la concentracioacuten de
biomasa obtenida cuando se trabajoacute con cada una de distintas concentraciones de
sacarosa Lo dicho anteriormente se muestra a traveacutes del graacutefico 5 (Anexo 2)
52
Tratamientos con diferentes concentraciones de sacarosa
Media 30 gL sacarosa (a) 02
Media 50 gL sacarosa (b) 032
Media 70 gL sacarosa (c) 043
a
b
c
0
02
04
Co
nce
ntr
acioacute
n b
iom
asa
(gL
)
Letras diferentes denotan diferencias significativas (prueba LSD)
Graacutefico 5 Crecimiento micelial para tres diferentes concentraciones de sacarosa
Modelo logiacutestico para las fermentaciones donde se utilizoacute sacarosa
como fuente de carbono
Una vez realizadas las cineacuteticas de crecimiento del P cubensis para cada
concentracioacuten de sacarosa empleada se procedioacute a ajustar los datos obtenidos al
modelo logiacutestico cabe recalcar que es necesario establecer los crecimientos
maacuteximos de biomasa obtenidos para cada uno de los ensayos los cuales fueron
026 gL 045 gL y 057 gL para concentraciones de 30 gL 50 gL y 70 gL de
sacarosa respectivamente
Una vez aplicado el modelo logiacutestico para cada tratamiento se obtuvieron valores
de velocidad maacutexima de crecimiento y biomasa inicial para cada concentracioacuten de
sacarosa utilizada en el medio los cuales se muestran en la tabla 3
53
Tabla 3 Paraacutemetros cineacuteticos obtenidos mediante el modelo logiacutestico para las diferentes fermentaciones de P cubensis utilizando sacarosa como
fuente de carbono
30gL 50gL 70gL
microx (diacutea-sup1) 030 microx (diacutea-sup1) 014 microx (diacutea-sup1) 041
micromax (diacutea-sup1) 037 micromax (diacutea-sup1) 042 micromax (diacutea-sup1) 067
X0 (gL) 01 X0(gL) 01 X0 (gL) 011
R2 061 R2 089 R2 095
De la tabla 3 se ratifica que se utilizoacute una concentracioacuten inicial de biomasa igual
para cada una de las fermentaciones aproximadamente 01 gL ademaacutes se
observa un aumento en la velocidad maacutexima de crecimiento con respecto a la
cantidad de sacarosa empleada es decir que el hecho de haber aumentado la
concentracioacuten de sacarosa en el medio favorecioacute el aumento en la velocidad
maacutexima de crecimiento del P cubensis siendo eacutesta mayor cuando se trabajoacute a una
concentracioacuten de 70 gL de sacarosa De igual manera se aprecia que el
tratamiento que conteniacutea 70 gL de sacarosa presentoacute una velocidad especiacutefica de
crecimiento mayor que los demaacutes siendo eacutesta de 041 diacutea-1
Finalmente se calcularon los valores de biomasa teoacutericos el graacutefico 6 ilustra los
valores de biomasa (X) tanto teoacutericos como experimentales graficados con
respecto al tiempo
54
0
01
02
03
04
05
06
0 2 4 6 8 10 12 14
Bio
mas
a (g
L)
Tiempo (Diacutea)
X exp (30 gL) X exp (50 gL) X exp (70 gL)
X teoacuterico (30 gL) X teoacuterico (50 gL) X teoacuterico (70 gL)
Graacutefico 6 Valores de concentracioacuten de biomasa experimental y teoacuterico graficados con respecto al tiempo para las fermentaciones con diferentes
concentraciones de sacarosa
Del graacutefico 6 se puede observar como los valores de biomasa experimentales se
ajustaron a los valores de biomasa teoacutericos arrojados por el modelo logiacutestico lo
que quiere decir la cineacutetica de crecimiento del P cubensis en medio sumergido
cuando se utilizoacute 70 gL se ajustoacute correctamente al modelo logiacutestico lo que se
corrobora en la tabla 2 gracias al valor obtenido para el R2 que indica la relacioacuten
de los datos teoacutericos con respecto a los experimentales Por otro lado para las
fermentaciones de 30 gL y 50 gL de sacarosa a pesar de parecer que
presentaron un buen ajuste al calcular la relacioacuten de los datos teoacutericos con
respecto a los experimentales (R2) se concluye que el ajuste no fue tan bueno
55
313 Comparacioacuten entre el crecimiento micelial de P cubensis en los
cultivos sumergidos utilizando glucosa y sacarosa como fuente de
carbono
Ahora bien es igualmente importante realizar un anaacutelisis comparativo entre ambas
fuentes de carbono empleadas con el fin de determinar si existen o no diferencias
significativas entre dichas fuentes de carbono
De acuerdo al anaacutelisis estadiacutestico se dice que existen diferencias significativas del
crecimiento micelial del P cubensis en cuanto al diacutea y la concentracioacuten de
sustrato empleado es decir concentracioacuten de glucosa y sacarosa (Anexo 3) pero
se observa claramente que no hay diferencias significativas de dicho crecimiento
con respecto al tipo de sustrato utilizado debido a que el P-valor arrojado por la
estadiacutestica fue de 01217 lo que sugiere que se debe utilizar la sacarosa gracias
a la disminucioacuten de costos que se generariacutean durante el proceso todo ello gracias
al costo de la sacarosa es inferior al de glucosa Sin embargo para elegir la fuente
de carbono que mejores resultados arrojoacute no soacutelo se basoacute en la cantidad de
biomasa producida sino que se procedioacute a examinar los barridos espectrales
arrojados por el anaacutelisis de HPLC con el fin de determinar la fuente de carbono
que mejor resolucioacuten mostroacute del alcaloide que en esta investigacioacuten fue glucosa a
una concentracioacuten de 50 gL
De igual manera el graacutefico 7 muestra las medias obtenidas mediante el anaacutelisis
estadiacutestico para las fermentaciones trabajadas con glucosa y sacarosa Aun asiacute
es necesario hacer hincapieacute que eacuteste no es el criterio principal para la obtencioacuten
del medio que mejores resultados arrojoacute durante la investigacioacuten por lo tanto se
deben seguir realizando los diferentes anaacutelisis descritos anteriormente en este
trabajo
56
Tratamientos de las dos fuentes de carbono usadas sin FA (glucosa y
sacarosa)
Media para glucosa (a) 029
Media para sacarosa (a) 032
aa
0
01
02
03
Conc
entr
acioacute
n bi
omas
a (g
L)
Letras diferentes denotan diferencias significativas (Prueba LSD)
Graacutefico 7 Crecimiento micelial para dos diferentes fuentes de carbono (glucosa y sacarosa)
314 Crecimiento micelial del P cubensis en cultivo sumergido utilizando
glucosa y fenilalanina en el medio
Se decidioacute realizar un uacuteltimo ensayo acerca del efecto que teniacutea la adicioacuten de un
aminoaacutecido llamado Fenilalanina (FA) al medio Fang-Zhong sobre la produccioacuten
del alcaloide y por ende sobre la generacioacuten de biomasa
Debido a los anaacutelisis realizados anteriormente se concluyoacute que la mejor fuente de
carbono fue la glucosa a una concentracioacuten de 50 gL De la misma manera que
en los numerales anteriores se evaluoacute la cineacutetica del crecimiento micelial del P
cubensis mediante los meacutetodos de peso huacutemedo y peso seco Las mediciones
fueron realizadas por duplicado y promediadas para la fuente de carbono elegida
(glucosa 50 gL) y las diferentes concentraciones de FA en el medio
correspondientes a 05 gL 1 gL 15 gL con el fin de encontrar el medio que
mejores resultados arrojoacute en cuanto a crecimiento micelial y generacioacuten del
57
alcaloide de intereacutes Los datos obtenidos mediante el meacutetodo de peso seco se
muestran en el graacutefico 8
Cabe resaltar que junto con las tres fermentaciones de 05 gL 10 gL y 15 gL
de FA se montaron a su vez seis muestras correspondientes a los diacuteas 12 13 y
14 de la fermentacioacuten que conteniacutea 0 gL de FA eacutesto con el propoacutesito de analizar
los datos de manera estadiacutestica y poder hacer comparaciones con respecto a la
generacioacuten de biomasa y a la produccioacuten del alcaloide de intereacutes ambas medidas
con respecto a la concentracioacuten
0
01
02
03
04
05
06
07
08
09
1
11
12
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Biom
asa
(gL
)
Tiempo (diacuteas)
05 gL 1 gL 15 gL
Graacutefico 8 Cineacutetica de crecimiento micelial de P cubensis en medio sumergido (Fang-Zhong) utilizando diferentes concentraciones de FA y 50
gL de glucosa como fuente de carbono (Peso seco)
Al analizar el graacutefico 8 es decir el crecimiento micelial (concentracioacuten de
biomasa) seguacuten la concentracioacuten de FA en el tiempo se puede notar que no hubo
presencia de fase de latencia para ninguna de las concentraciones de FA
utilizadas ademaacutes el crecimiento de biomasa en cada caso se aprecia de manera
58
muy similar llegando los tres ensayos a la fase estacionaria el diacutea 12 de la
fermentacioacuten
Observando el graacutefico 8 se puede identificar que el mayor contenido de biomasa
fue de 108 gL obtenida el diacutea 13 para una concentracioacuten 10 gL de FA para
concentraciones de 05 gL y 15 gL de FA la concentracioacuten maacutexima de biomasa
fue 106 gL y 101 gL respectivamente Auacuten asiacute al considerar los resultados
obtenidos se puede ratificar que es indiferente la cantidad de FA necesaria para
obtener concentracioacuten de biomasa por ende se decide que el medio que mejores
resultados arrojoacute fue el que conteniacutea 05 gL FA debido a que fue la
concentracioacuten de FA que mejor resolucioacuten del alcaloide presentoacute paraacutemetro
observado mediante los cromatogramas obtenidos del anaacutelisis de HPLC (Anexos
19 20 y 21) y ademaacutes porque con dicha cantidad los costos de la materia prima
seriacutean menores Cabe resaltar que el uso de FA generoacute un aumento significativo
duplicando la produccioacuten de biomasa por lo tanto se testifica que siacute hubo
duplicacioacuten en cuanto a la concentracioacuten de biomasa en los medios que conteniacutea
FA con respecto a los medios que no conteniacutean FA se dice entonces que a su
vez se podriacutea haber generado mayor cantidad de Psilocibina en los medios que
teniacutean FA ya que dicho alcaloide se produce de manera intracelular por tal
razoacuten al aumentar la cantidad de biomasa en el medio se aumenta la cantidad de
dicho alcaloide
De igual manera se analizaron los datos estadiacutesticamente y se llegoacute a apreciar
que no existen diferencias significativas en cuanto a la produccioacuten de biomasa y la
cantidad de FA utilizada en el medio Del mismo modo al analizar la tabla de
contrastes muacuteltiple de rangos se reitera que siacute existen diferencias significativas
entre el crecimiento micelial de biomasa (concentracioacuten de biomasa) en el tiempo
cuando se trabajoacute con FA o sin eacuteste Eacutesto se puede observar en el graacutefico 9
(Anexo 4)
59
Tratamientos con y sin FA
Media 0 gL FA (a) 032
Media 05 gL FA (b) 065
Media 10 gL FA (b) 066
Media 15 gL FA (b) 069
a
b b b
0
01
02
03
04
05
06
07
08
09
Conc
entr
acioacute
n bi
omas
a (g
L)
Letras diferentes denotan diferencias significativas (Prueba LSD)
Graacutefico 9 Crecimiento micelial para glucosa a una concentracioacuten de 50 gL y tres diferentes concentraciones de FA
Modelo logiacutestico para las fermentaciones donde se utilizoacute 50 gL de
glucosa como fuente de carbono y diferentes concentraciones de FA
En primer lugar se fijaron los valores de crecimiento maacuteximo de biomasa para
cada una de las concentraciones obtenidos mediante el meacutetodo de peso seco con
el fin de hallar los paraacutemetros cineacuteticos mediante el modelo logiacutestico Los
crecimientos maacuteximos de biomasa obtenidos fueron los siguientes 106 gL 108
gL y 101 gL para concentraciones de 05 gL 10 gL y 15 gL de FA
respectivamente y 50 gL de glucosa
Una vez realizado el modelo logiacutestico para cada tratamiento se obtuvieron los
valores de velocidad maacutexima de crecimiento y concentracioacuten de biomasa inicial
para cada ensayo los cuales se muestran en la tabla 4
60
Tabla 4 Paraacutemetros cineacuteticos obtenidos mediante el modelo logiacutestico para las diferentes fermentaciones de P cubensis utilizando 50 gL de glucosa
como fuente de carbono y diferentes concentraciones de FA
05gL 10gL 15gL
microx (diacutea-sup1) 018 microx (diacutea-sup1) 012 microx (diacutea-sup1) 012
micromax (diacutea-sup1) 045 micromax (diacutea-sup1) 035 micromax (diacutea-sup1) 044
X0 (gL) 01 X0 (gL) 017 X0 (gL) 016
R2 095 R2 082 R2 088
Seguacuten los valores arrojados por el modelo logiacutestico que se encuentran
presentados en la tabla 4 se puede decir que se presentoacute una valor de biomasa
inicial similar para los tratamientos de 1 gL y 15 gL de FA mientras que para las
fermentaciones que conteniacutean 05 gL de FA se tiene una diferencia de un 50
aproximadamente Ademaacutes se puede observar que a la concentracioacuten de 05 gL
de FA es la que mayor velocidad maacutexima de crecimiento presenta siendo esta
045 diacuteamacrsup1 a su vez dicha concentracioacuten presentaacute la microx mayor correspondiente a
018 diacutea-1 Debido a eacutesto y al criterio de mejor resolucioacuten del alcaloide observado
en los anaacutelisis de HPLC (Anexos 19 20 y 21) se concluye que el medio que
mejores resultados arrojoacute durante la investigacioacuten para la generacioacuten de biomasa
y la produccioacuten de la Psilocibina es 05 gL de FA y 50 gL de glucosa
Finalmente se calcularon los valores de biomasa teoacutericos el graacutefico 10 muestra
los valores de biomasa (X) tanto teoacutericos como experimentales graficados con
respecto al tiempo
61
0
02
04
06
08
1
12
0 2 4 6 8 10 12 14 16
Bio
mas
a (g
L)
Tiempo (Diacutea)
X exp (05 gL) X exp (10 gL) X exp (15 gL)
X teoacuterico (05 gL) X teoacuterico (10 gL) X teoacuterico (15 gL)
Graacutefico 10 Valores de concentracioacuten de biomasa experimental y teoacuterico graficados con respecto al tiempo para las fermentaciones con diferentes
concentraciones de FA y 50 gL de glucosa
Se puede decir gracias al graacutefico 10 que los valores de biomasa experimentales
se ajustaron a los valores de biomasa teoacutericos hallados mediante el modelo
logiacutestico es decir la cineacutetica de crecimiento del P cubensis en medio sumergido
cuando se usaron diferentes concentraciones de FA en el medio se ajustoacute
correctamente al modelo logiacutestico esto se reitera con los valores de R2 mostrados
anteriormente en la tabla 4
32 ESTUDIO DE LA CINEacuteTICA DE CONSUMO DE SUSTRATO POR PARTE
DEL P cubensis CULTIVADO EN MEDIO SUMERGIDO (FANG-ZHONG)
La evaluacioacuten del consumo de sustrato durante la fermentacioacuten con respecto al
tiempo es de suma importancia puesto que eacuteste es el principal componente
limitante del crecimiento presente en el medio de cultivo
62
A continuacioacuten se analizaraacuten dichos consumos para los diferentes ensayos
321 Consumo de sustrato por parte del P cubensis en medio sumergido
utilizando diferentes concentraciones de glucosa
Una vez halladas las concentraciones de sustrato para cada una de las
fermentaciones que conteniacutean glucosa en el medio se procedioacute a graficar dichos
valores con respecto al tiempo
El graacutefico 11 ilustra los datos obtenidos sobre el consumo de sustrato de las tres
fermentaciones que conteniacutean glucosa y a su vez como se comportoacute el
crecimiento de biomasa para cada ensayo durante los 14 diacuteas de fermentacioacuten
0
01
02
03
04
05
06
07
0
10
20
30
40
50
60
70
80
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14B
iom
asa
(gL
)
Glu
cosa
(gL
)
Tiempo (diacuteas)
30 GL 50GL 70 GL 30gL 50gL 70gL
Graacutefico 11 Cineacutetica de consumo de sustrato por parte del P cubensis en medio sumergido utilizando diferentes concentraciones de glucosa como
fuente de carbono
Al observar el graacutefico 11 se expone que el P cubensis consumioacute mayor cantidad
de glucosa cuando esta estaba a una concentracioacuten de 70 gL correspondiendo a
63
un porcentaje de 62 mientras que para 50 gL y 30 gL fue de 23 y 30
respectivamente
Comparando el consumo de glucosa en sus diferentes concentraciones con el
crecimiento micelial del hongo se puede observar que a una concentracioacuten de
glucosa de 30 gL no soacutelo se tuvo un menor consumo de sustrato sino que
tambieacuten se generoacute un menor crecimiento de biomasa Mientras que a
concentraciones de 50 gL y 70 gL de glucosa a pesar de presentar diferencias
en cuanto al porcentaje de sustrato consumido el crecimiento micelial es similar
(no presenta diferencias significativas) lo que indica que el hongo no requiere
tanta concentracioacuten de glucosa para su crecimiento eacutesto se puede afirmar soacutelo
para este ensayo a estas condiciones
De igual manera en el graacutefico 11 al analizar la tendencia del consumo de
sustrato las concentraciones de glucosa de 50 gL y 70 gL presentan una
disminucioacuten notoria hasta el diacutea 11 para dicho consumo Esto se debe a que en
ese diacutea inicioacute la fase estacionaria del hongo en ambas fermentaciones en donde
el P cubensis requeriacutea alimento uacutenicamente para mantenerse y producir
metabolitos secundarios Mientras que para la concentracioacuten de glucosa de 30 gL
el consumo de glucosa fue muy poco a partir del quinto diacutea de la fermentacioacuten
esto se atribuye a que la cineacutetica de crecimiento micelial del P cubensis presentoacute
una fase estacionaria temprana entre los diacuteas 8 y 11 indicando que no necesitaba
consumir casi glucosa puesto que no estaba creciendo
322 Consumo de sustrato por parte del P cubensis en medio sumergido
utilizando diferentes concentraciones de sacarosa
Los datos obtenidos sobre el consumo de sacarosa para cada una de las
concentraciones utilizadas (30 gL 50 gL y 70 gL de sacarosa) durante los 14
diacuteas de la fermentacioacuten se muestran en el graacutefico 12 a su vez se ilustran en dicho
64
graacutefico el comportamiento del crecimiento micelial para cada ensayo durante los
14 diacuteas de fermentacioacuten para efectos de anaacutelisis
0
01
02
03
04
05
06
0
10
20
30
40
50
60
70
80
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Bio
mas
a (g
L)
Sac
aro
sa (g
L)
Tiempo (diacuteas)
30gL 50gL 70gL 30 gL 50 gL 70 gL
Graacutefico 12 Cineacutetica de consumo de sustrato por parte del P cubensis en medio sumergido utilizando diferentes concentraciones de sacarosa como
fuente de carbono
Al observar el graacutefico 12 se puede decir que el P cubensis consumioacute mayor
cantidad de sacarosa cuando eacutesta estaba a una concentracioacuten de 70 gL en el
medio presentando un porcentaje de consumo del 49 mientras que para las
concentraciones de 50 gL y 30 gL de sacarosa se tuvo un porcentaje de
consumo de 24 y 37 Esto igual que en el consumo de glucosa se puede
deber a que al tener mayor concentracioacuten de sustrato en el medio el P cubensis
genera mayor afinidad por el mismo haciendo que dicho hongo se consuma
grandes cantidades de sacarosa durante el tiempo
Igualmente se observa que aproximadamente en el noveno diacutea de la
fermentacioacuten las tres diferentes concentraciones de glucosa (30 gL 50 gL y 70
65
gL) se mantienen casi constantes en el tiempo ello gracias a que en este diacutea el
hongo se encontraba en fase estacionaria en los tres ensayos
323 Comparacioacuten entre el consumo de sustrato de P cubensis en los
cultivos sumergidos con diferentes fuentes de carbono
Con el fin de identificar cuaacutel de las dos fuentes de carbono fue consumida en
mayor proporcioacuten por parte del P cubensis se procedioacute a realizar un anaacutelisis
estadiacutestico donde comparamos las dos fuentes de carbono empleados con
respecto al consumo de sustrato obtenido (concentracioacuten de glucosa y sacarosa
en cada uno de los medios) donde se consiguioacute un P-valor de 00811 con
respecto al tipo de sustrato lo que indica que no existen diferencias en cuanto al
consumo de sustrato y el tipo del mismo es decir es indiferente cuaacutel de los dos
sustratos (glucosa o sacarosa) se utilice para que se del consumo del mismo por
parte del P cubensis Observacioacuten que se reitera en la tabla de contraste muacuteltiple
que muestra que se trabajoacute como un grupo homogeacuteneo Igualmente el graacutefico 13
muestra las medias de consumo de sustrato (concentracioacuten durante los 14 diacuteas)
obtenidas mediante el anaacutelisis estadiacutestico y reitera que no existen diferencias
significativas con respecto al tipo de sustrato utilizado para el cultivo del P
cubensis en medio sumergido (Anexo 5)
66
Tratamientos de las dos fuentes de carbono usadas sin FA (glucosa y sacarosa)
Media glucosa (a) 3431
Media sacarosa (a) 3678
a
a
32
34
36
38
Co
nce
ntr
acioacute
n s
ust
rato
(g
L)
Letras diferentes denotan diferencias significativas (Prueba LSD)
Graacutefico 13 Consumo de sustrato para cada una de las fuentes de carbono utilizadas
Aun asiacute al comparar los graacuteficos 11 y 12 se puede observar un mayor consumo
de glucosa que de sacarosa lo que lleva a concluir que es mejor emplear la
primera (glucosa)
324 Consumo de sustrato por parte del P cubensis en medio sumergido
utilizando glucosa y fenilalanina en el medio
Los datos obtenidos acerca del consumo de sustrato durante los 14 diacuteas de la
fermentacioacuten para cada uno de los medios que conteniacutean 50 gL de glucosa y
diferentes concentraciones de FA (05 gL 1 gL y 15 gL) se muestran en el
graacutefico 14 De igual manera se ilustran en dicho graacutefico las cineacuteticas de
crecimiento micelial para cada una de las fermentaciones que teniacutean 50 gL de
glucosa y diferentes concentraciones de FA con el fin de realizar los anaacutelisis
pertinentes
67
0
02
04
06
08
1
12
0
10
20
30
40
50
60
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Bio
mas
a (g
L)
Glu
cosa
50
gL
+ F
A (g
L)
Tiempo (diacuteas)
05gL 10gL 15gL 05 gL 1 gL 15 gL
Graacutefico 14 Cineacutetica de consumo de sustrato por parte del P cubensis en medio sumergido utilizando 50 gL de glucosa como fuente de carbono y
diferentes concentraciones de FA
Analizando el graacutefico 14 se puede decir que el consumo de glucosa durante el
tiempo fue igual para las fermentaciones que conteniacutea concentraciones de 1 gL y
15 gL de FA dichos consumos corresponde a valores de 23 mientras que
para el ensayo que teniacutea una concentracioacuten de 05 gL de FA el porcentaje de
consumo fue del 18 Asimismo se presentaron diferencias significativas en
cuanto al consumo de sustrato entre los diferentes ensayos
El graacutefico 15 expone las medias del consumo de sustrato (concentracioacuten) de cada
una de las muestras y las diferencias existentes entre ellas se evidencia que la
adicioacuten de FA disminuyoacute el consumo de glucosa ademaacutes que en los ensayos se
presentaron tres grupos homogeacuteneos diferentes En el primer grupo (a) que
contiene las fermentaciones del P cubensis con una concentracioacuten de 50 gL de
glucosa y en ausencia de FA se obtuvo una media de 356 gL la cual indica un
mayor consumo de sustrato Luego el segundo grupo (c) se compone de las
concentraciones de 1 gL y 15 gL de FA presentando una media de 413 gL y
de 426 gL respectivamente y el uacuteltimo grupo (b) corresponde a una
68
concentracioacuten de 05 gL de FA el cual presenta el menor consumo de glucosa al
exponer una media 466 gL
Seguacuten lo anterior y el graacutefico 15 se dice que siacute existieron diferencias significativas
en cuanto al consumo de sustrato (concentracioacuten durante los 14 diacuteas) en los
uacuteltimos tres diacuteas cuando se trabajo con FA y sin FA y a su vez se encontraron
diferencias significativas de la concentracioacuten de sustrato en el medio cuando se
teniacutea una concentracioacuten de FA correspondiente a 05 gL con relacioacuten a las otras
dos concentraciones de FA (10 gL y 15 gL) mientras que entre estas dos
uacuteltimas concentraciones de FA (10 gL y 15 gL) no se encontraron diferencias
significativas (Anexo 6)
Tratamientos con y sin FA
Media 0 gL FA (a) 3564
Media 05 gL FA (b) 466
Media 10 gL FA (c) 4131
Media 15 gL FA (c) 426
a
b c c
0
10
20
30
40
50
60
Conc
entr
acioacute
n su
stra
to (g
L)
Letras diferentes denotan diferencias significativas (prueba LSD)
Graacutefico 15 Consumo de sustrato para cada una de las concentraciones de FA utilizadas
69
33 ESTUDIO DE LA CINEacuteTICA DE CONSUMO DE PROTEIacuteNA POR PARTE
DEL P cubensis CULTIVADO EN MEDIO SUMERGIDO (FANG-ZHONG)
Las fuentes de proteiacutena que posee el medio de Fang-Zhong son extracto de
levadura y peptona que representan una cantidad de 10 gL para cada ensayo
eacutesta cantidad se mantuvo constante para cada fermentacioacuten
Se evaluoacute el consumo de proteiacutena por parte del P cubensis durante los 14 diacuteas
de la fermentacioacuten para cada uno de los ensayos
A continuacioacuten se analizan los resultados obtenidos para cada uno de los
tratamientos
331 Consumo de proteiacutena por P cubensis en medio sumergido utilizando
diferentes concentraciones de glucosa
Una vez se calcularon las concentraciones de proteiacutena en el medio para cada
ensayo se graficaron dichos valores con respecto al tiempo
El graacutefico 16 muestra como se comportoacute el consumo de proteiacutena con respecto al
tiempo para cada una de las tres concentraciones de glucosa utilizadas y a su vez
como se comportoacute el crecimiento de biomasa para cada ensayo durante los 14
diacuteas de fermentacioacuten
70
0
01
02
03
04
05
06
07
0
5
10
15
20
25
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Bio
mas
a (g
L)
Pro
tein
a (g
L)
Tiempo (diacuteas)
30 GL 50 GL 70 GL 30 gL Biomasa 50 gL Biomasa 70 gL Biomasa
Graacutefico 16 Cineacutetica de consumo de proteiacutena por parte del P cubensis en medio sumergido utilizando diferentes concentraciones de glucosa como
fuente de carbono
Analizando el graacutefico 16 se puede observar que el consumo de proteiacutena se dio
casi en su totalidad El ensayo que mayor consumo de proteiacutena presentoacute fue el
que conteniacutea 30 gL de glucosa arrojando un porcentaje de consumo del 98
mientras que las fermentaciones realizadas a concentraciones de 50 gL y 70 gL
de glucosa presentaron un porcentaje de consumo de proteiacutena del 91 y 90
respectivamente
Al enfocarnos en la relacioacuten existente entre el consumo de proteiacutena y el
crecimiento micelial del P cubensis se puede notar gracias al graacutefico 16 que la
relacioacuten es directamente proporcional debido a que el consumo de proteiacutena fue
permanente mientras el hongo se encontraba en fase exponencial es decir el P
cubensis necesitaba de la proteiacutena para aumentar su crecimiento mientras que en
el momento en que el microorganismo comenzoacute su fase estacionaria la
concentracioacuten de proteiacutena en el medio se mantuvo constante esto uacuteltimo soacutelo es
vaacutelido para concentraciones de 50 gL y 70 gL de glucosa puesto que ambas
llegaron a la fase estacionaria
71
332 Consumo de proteiacutena por P cubensis en medio sumergido utilizando
diferentes concentraciones de sacarosa
Una vez obtenidos los valores de consumo de proteiacutena para cada concentracioacuten
de sacarosa utilizada se precedioacute a graficarlos con respecto al tiempo dichos
datos se encuentran en el graacutefico 17 De igual manera en este graacutefico se
representa la cineacutetica de crecimiento de biomasa para el P cubensis de acuerdo a
las distintas concentraciones de sacarosa utilizadas
0
01
02
03
04
05
06
0
2
4
6
8
10
12
14
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Bio
mas
a (g
L)
Prot
eiacutena
(gL
)
Tiempo (diacuteas)
30 GL 50 GL 70 GL 30 gL 50 gL 70 gL
Graacutefico 17 Cineacutetica de consumo de proteiacutena por parte del P cubensis en medio sumergido utilizando diferentes concentraciones de sacarosa como
fuente de carbono
El graacutefico 17 ilustra el consumo casi en su totalidad de la proteiacutena para cada uno
de los tratamientos El ensayo que mayor consumo de proteiacutena presentoacute fue el
que conteniacutea 30 gL de sacarosa exponiendo un porcentaje de consumo del 89
mientras que las concentraciones de 50 gL y 70 gL de sacarosa arrojaron
porcentajes de consumo del 86 y 57 respectivamente
Ahora bien al analizar el crecimiento del P cubensis con respecto al consumo de
proteiacutena se evidencia claramente que el consumo disminuyoacute permanentemente
72
en el tiempo mientras el hongo se encontraban en estado exponencial indicando
el intereacutes del P cubensis por la proteiacutena siendo eacutesta utilizada por el mismo para
aumentar su tamantildeo y biomasa
Durante los diacuteas 4 y 10 las fermentaciones que conteniacutean concentraciones de 30
gL y 70 gL de sacarosa presentaron un alto consumo de proteiacutena a pesar de
que el P cubensis se encontraba en estos dos ensayos en fase estacionaria fase
en la cual no se requiere consumir grandes cantidades de sustrato puesto que el
hongo soacutelo necesitaba alimentarse para mantenerse o para producir productos no
ligados al crecimiento maacutes no para cambiar la cantidad de biomasa presente en el
medio Asimismo la concentracioacuten de 50 gL de sacarosa tambieacuten presentoacute un
alto consumo de proteiacutena durante los diacuteas 4 y 8 en donde se creiacutea estar en una
fase estacionaria temprana lo dicho anteriormente reitera una vez maacutes la afinidad
que el P cubensis presentoacute con respecto a las fuentes de proteiacutena usadas
333 Comparacioacuten entre el consumo de proteiacutena de P cubensis en los
cultivos sumergidos con diferentes fuentes de carbono
Con el fin de conocer cuaacutel de los dos tipos de sustrato empleado fue mayormente
consumido se realizoacute un anaacutelisis estadiacutestico
En el graacutefico 18 se ilustran las medias de consumo de proteiacutena (concentracioacuten)
arrojadas mediante el anaacutelisis estadiacutestico sobre el consumo de proteiacutena cuando se
utilizoacute glucosa o sacarosa en el medio y se evidencia que existen diferencias
significativas en cuanto a la concentracioacuten de proteiacutena en el tiempo en el medio
cuando se realizoacute el experimento con glucosa y cuando se utilizoacute sacarosa
arrojando asiacute dos grupos homogeacuteneos el primero (a) presenta una media de 465
gL mientras que el grupo dos (b) arroja un valor de media de 609 gL indicando
un menor consumo de proteiacutena por parte del P cubensis en el medio sumergido
73
de Fang-Zhong cuando se utilizoacute sacarosa como principal fuente de carbono
(Anexo 7)
Tratamientos de las dos fuentes de carbono usadas sin FA (glucosa y sacarosa)
Media glucosa (a) 465
Media sacarosa (b) 609
a
b
0
1
2
3
4
5
6
7
8
Conc
entr
acioacute
n pr
oteiacute
na (g
L)
Letras diferentes denotan diferencias significativas (prueba LSD)
Graacutefico 18 Consumo de proteiacutena para cada una de las fuentes de carbono utilizadas
334 Consumo de proteiacutena por P cubensis en medio sumergido utilizando
glucosa y FA en el medio
Una vez se obtuvo la concentracioacuten de proteiacutena en el medio para cada
concentracioacuten de FA utilizada se precedioacute a graficar dichos valores con respecto
al tiempo los cuales se ilustran en el graacutefico 19 ademaacutes se muestran en dicho
graacutefico las cineacuteticas de crecimiento de biomasa para cada ensayo
74
0
02
04
06
08
1
12
0
2
4
6
8
10
12
14
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Bio
mas
a (g
L)
Pro
teiacuten
a (g
L)
Tiempo (diacuteas)
05 gL 1 gL 15 gL 05 gL 1 gL 15 gL
Graacutefico 19 Cineacutetica de consumo de proteiacutena por parte del P cubensis en medio sumergido utilizando 50 gL de glucosa como fuente de carbono y
diferentes concentraciones de FA
De igual forma que para la fermentacioacuten que teniacutea 50 gL de glucosa en el medio
realizada anteriormente para dichos ensayos el consumo de proteiacutena fue
permanente y se dio casi en su totalidad El ensayo que mayor consumo de
proteiacutena presentoacute fue el que conteniacutea 05 gL de FA arrojando un porcentaje de
consumo del 86 aun asiacute el porcentaje de consumo arrojado por la fermentacioacuten
de 1 gL de FA fue del 84 indicando que no existen diferencias con respecto al
consumo de proteiacutena entre dichas cantidades de FA utilizadas Mientras que el
porcentaje de consumo para 15 gL de FA fue inferior presentando un valor del
72 De acuerdo a los resultados mencionados anteriormente se puede decir que
a mayor concentracioacuten de FA en el medio se presenta menor consumo de
proteiacutena por parte del P cubensis esto se puede afirmar uacutenicamente para los
resultados obtenidos durante esta investigacioacuten a ciertas condiciones
Analizando ahora la relacioacuten entre el consumo de proteiacutena y el crecimiento
micelial se puede ver que al igual que para los ensayos con glucosa a 50 gL se
75
tiene un consumo permanente mientras se estaacute en fase exponencial y una vez se
llega a la fase estacionario alrededor del diacutea 12 la concentracioacuten de proteiacutena en
el medio se estabilizoacute
A la hora de indagar los datos estadiacutesticamente se puede observar que no existen
diferencias significativas sobre el consumo de proteiacutena (concentracioacuten) en el
tiempo con respecto al tipo de sustrato pero al comparar los resultados con los
ensayos donde se antildeadioacute FA al medio se encontroacute que siacute existen diferencias
significativas Se crearon dos grupos homogeacuteneos el primero cuenta con glucosa
y sacarosa presentando medias (cantidad de proteiacutena en el medio) de 468 gL y
473 gL respectivamente mientras que el ensayo con FA se encuentra en otro
grupo en donde su consumo de proteiacutena fue menor presentando una media
(cantidad de proteiacutena en el medio) de 614 gL (Anexo 8)
Tratamientos con y sin FA
Media glucosa (a) 468
Media sacarosa Proteiacutena (a) 473
Media fenilalanina (b) 614
a a
b
0
1
2
3
4
5
6
7
8
Co
nce
ntr
acioacute
n p
rote
iacutena
(gL
)
Letras diferentes denotan diferencias significativas (prueba LSD)
Graacutefico 20 Consumo de proteiacutena para los ensayos con y sin FA
76
34 ESTUDIO CUALITATIVO DE LA PRESENCIA DEL ALCALOIDE
Posterior a las fermentaciones de glucosa sacarosa y glucosa 50 gL con FA y
los respectivos anaacutelisis se realizoacute un uacuteltimo anaacutelisis que a la vez fue el de mayor
relevancia a la hora de determinar cuaacutel de los medios fue el que mejores
resultados arrojoacute En primera instancia se utilizoacute el reactivo de Dragendorff como
indicador de alcaloide para analizar las muestras de los diacuteas 12 13 y 14 con el fin
de esclarecer la presencia de alcaloides (Anexo 17)
Una vez detectada la presencia de alcaloides gracias a la coloracioacuten naranja
presentada en las muestras se procedioacute a realizar la teacutecnica de HPLC con el fin
de hallar un porcentaje del compuesto de intereacutes basado en las aacutereas obtenidas
de los cromatogramas (asumiendo un tiempo de retencioacuten entre 62 y 72
minutos)
341 Produccioacuten de compuestos producidos por P cubensis cuando el
medio no conteniacutea FA
A la hora de analizar y confirmar cuaacutel fue el mejor ensayo de los experimentos
realizados se tuvo como criterio base determinar la fuente de carbono y su
respectiva concentracioacuten que mejor presencia del compuesto de intereacutes arrojoacute
supuesto a un tiempo de retencioacuten entre 62 y 72 minutos
Inicialmente al obtener los anaacutelisis estadiacutesticos se deduce que no existieron
diferencias significativas entre el aacuterea del pico de intereacutes con respecto a todos los
picos arrojados por el cromatograma y los factores estudiados (tipo de sustrato
diacutea de fermentacioacuten y concentracioacuten) puesto que se obtuvieron valores de P-valor
77
de 03310 09580 y 08336 respectivamente es decir no importa queacute tipo de
sustrato se utilice la produccioacuten de alcaloide no tendraacute variaciones (Anexo 9)
Al analizar el graacutefico 21 se puede observar que las medias de las aacutereas halladas
para los diferentes ensayos con glucosa y sacarosa no presentaron diferencias
significativas es decir pertenecen al mismo grupo homogeacuteneo (a) lo que ratifica
lo dicho anteriormente
Tratamiento de las dos fuentes de carbono usadas sin FA (glucosa y sacarosa)
Media glucosa (a) 235916
Media sacarosa (a) 337147
a
a
0
7000
14000
21000
28000
35000
42000
Aacutere
a de
Com
pues
to
Letras diferentes denotan diferencias significativas (prueba LSD)
Graacutefico 21 Aacuterea del compuesto obtenido de P cubensis en tiempo de retencioacuten entre 62 y 72 minutos para las dos fuentes de carbono
Por tal razoacuten fue necesario hacer un anaacutelisis cualitativo de los cromatogramas
obtenidos mediante HPLC el cual se basoacute en la forma del pico arrojado por la
teacutecnica La figura 6 ilustra dicho anaacutelisis
78
Buena resolucioacuten de pico Mala resolucioacuten de pico
(a) (b)
Figura 6 Cromatogramas de dos diferentes fermentaciones de P cubensis que ilustran el criterio de escogencia del mejor ensayo realizado (a) 50 gL
glucosa (b) 50 gL sacarosa
Primero fue necesario observar el tamantildeo del pico y posterior a eacutesto determinar
su resolucioacuten La figura 6 ilustra dos ejemplos el de 50 gL de glucosa el diacutea 13 y
50 gL de sacarosa el diacutea 14 mientras el primero muestra un pico grande y
definido la segunda fermentacioacuten ilustra un pico grande pero poco definido
indicando que en este caso no se resolvioacute correctamente el alcaloide es decir no
se logroacute una buena separacioacuten De esta manera se analizaron los diferentes
cromatogramas para los diacuteas 12 (Anexo 19) 13 (Anexo 20) y 14 (Anexo 21) de
cada fermentacioacuten arrojando diferencias entre los ensayos y llevando a la
conclusioacuten de que la fermentacioacuten que mejores resultados arrojoacute fue la que
conteniacutea 50 gL de glucosa
79
342 Produccioacuten de compuestos producidos por P cubensis cuando el
medio conteniacutea FA
Despueacutes de realizada la fermentacioacuten con glucosa 50 gL y concentraciones de
FA de 05 gL 10 gL y 15 gL se procedioacute de igual manera que en el estudio sin
FA a evaluar cuaacutel de estas tres concentraciones de FA exhibioacute mejor resolucioacuten
del alcaloide
Inicialmente se realizoacute un anaacutelisis estadiacutestico el cual arrojoacute que no existen
diferencias significativas con respecto al aacuterea de pico que en este caso debido al
supuesto representa la Psilocibina y los diacuteas 12 13 y 14 de la fermentacioacuten
Mediante el graacutefico 22 se puede decir que en los uacuteltimos tres diacuteas de las
fermentaciones que conteniacutean FA en el medio no existen diferencias significativas
con respecto al alcaloide de intereacutes obtenido es decir en los tres se produjo el
alcaloide (Anexo 10)
Tratamientos de los uacuteltimos tres diacuteas de fermentacioacuten usando FA
Media diacutea 12 (a) 411758
Media diacutea 13 (a) 413401
Media diacutea 14 (a) 44860
a a a
0
10000
20000
30000
40000
50000
Aacutere
a Co
mpu
esto
Letras diferentes denotan diferencias significativas
Graacutefico 22 Aacuterea del compuesto obtenido de P cubensis en tiempo de retencioacuten entre 62 y 72 minutos en los uacuteltimos tres diacuteas de la fermentacioacuten
con FA y glucosa
80
Igual que en numeral anterior fue necesario realizar anaacutelisis cualitativo para los
cromatogramas por ende se requirioacute observar el tamantildeo del pico y posterior a
eacutesto determinar su resolucioacuten
Buena resolucioacuten de pico Mala resolucioacuten de pico
(a) (b)
Figura 7 Cromatogramas de dos diferentes fermentaciones de P cubensis que ilustran el criterio de escogencia del mejor ensayo realizado (a) 05 gL
FA (b) 15 gL FA
La figura 7 ejemplifica el anaacutelisis realizado para la seleccioacuten del mejor ensayo
ejecutado Se tienen dos cromatogramas el de 05 gL de FA en el diacutea 13 y el de
15 gL de FA para el mismo diacutea
A todos los cromatogramas obtenidos para los diacuteas 12 (Anexo 19) 13 (Anexo 20)
y 14 (Anexo 21) se realizoacute el mismo anaacutelisis y se concluyoacute que la concentracioacuten
maacutes apropiada para la obtencioacuten de la los compuestos producidos por P cubensis
fue de 05 gL de FA debido a que eacuteste generariacutea una disminucioacuten en los costos
81
35 ESTUDIO PORCENTUAL (AacuteREA) DEL ALCALOIDE REALIZADO PARA
LOS DIFERENTES ENSAYOS
Se calculoacute el porcentaje de aacuterea correspondiente al pico que identificoacute que se
asumioacute como el correspondiente a la Psilocibina gracias a la suposicioacuten realizada
del tiempo de retencioacuten
A continuacioacuten se presentan los valores obtenidos y sus respectivos anaacutelisis para
cada tratamiento
351 Porcentaje de la Psilocibina (suposicioacuten) cuando el medio no conteniacutea
FA
Debido a que no se contaba con un estaacutendar de Psilocibina los resultados
mostrados en la tabla 5 se obtuvieron realizando un porcentaje con respecto a las
aacutereas bajo la curva arrojadas mediante el anaacutelisis de cromatografiacutea de alta
eficiencia (Anexos 19 20 y 21) En dichos anexos se encuentran resaltadas en
negrilla aquellas aeacutereas utilizadas
Tabla 5 Porcentaje de aacuterea hallado mediante HPLC para los uacuteltimos tres diacuteas de la fermentacioacuten con concentraciones de 30 gL 50 gL y 70 gL de glucosa
y sacarosa con un tiempo de retencioacuten de 62 y 72 minutos
Diacutea Glucosa
(gL)
Aacuterea
(compuesto
Tr= 62-72)
Sacarosa
(gL)
Aacuterea
(compuesto
Tr= 62-72)
12 30 60650 30 3664
12 50 7396 50 5857
12 70 4816 70 3415
13 30 702 30 2876
13 50 6815 50 4113
13 70 6733 70 5583
14 30 4824 30 2756
14 50 4821 50 2792
14 70 017 70 1429
82
A la hora de analizar los datos de la tabla 5 se puede observar que el mayor
porcentaje de aacuterea se obtuvo cuando se trabajoacute con glucosa como fuente de
carbono y concretamente a una concentracioacuten de 50 gL
Analizando los datos estadiacutesticamente no se obtuvieron diferencias significativas
en cuanto a la produccioacuten del compuesto (aacuterea) con respecto al tipo de sustrato
utilizado durante las fermentaciones es decir es indiferente si se utiliza glucosa o
sacarosa en el cultivo de P cubensis en medio sumergido de Fang-Zhong
El graacutefico 23 ilustra las medias (aacuterea) obtenidas para la produccioacuten de alcaloide en
las dos diferentes fuentes de carbono es decir glucosa y sacarosa exponiendo
un uacutenico grupo homogeacuteneo con medias (produccioacuten de alcaloide) de aacutereas de
219635 y 234391 para glucosa y sacarosa respectivamente (Anexo 11)
Tratamientos de las dos fuentes de carbono usadas sin FA (glucosa y sacarosa)
Media glucosa (a) 219635
Media sacarosa (a) 234391
a
a
2000
2100
2200
2300
2400
Aacuterea
Com
pues
to
Letras diferentes denotan diferencias significativas (prueba LSD)
Graacutefico 23 Aacuterea del compuesto obtenido de P cubensis en tiempo de retencioacuten entre 62 y 72 minutos para cada una de las fuentes de carbono
utilizadas
Aun asiacute estudiando los graacuteficos de HPLC con el criterio mencionado
anteriormente es decir observando el tamantildeo del pico y su resolucioacuten del mismo
83
se observoacute claramente que la presencia del alcaloide (tiempo de retencioacuten
supuesto entre 62 y 72 minutos) fue mejor cuando se trabajoacute con glucosa a una
concentracioacuten de 50 gL debido que presenta el mejor pico
352 Porcentaje de aacuterea de compuestos presentes en P cubensis cuando
el medio conteniacutea FA
Con el fin de observar si la adicioacuten de FA al medio si arrojoacute mejores resultados en
cuanto a la produccioacuten del compuesto presente entre un rango de 62 y 72
minutos como tiempo de retencioacuten se procedioacute a calcular el porcentaje del aacuterea
de intereacutes de acuerdo a las aacutereas arrojadas para cada ensayo por medio del
anaacutelisis de HPLC Los datos obtenidos se ilustran a continuacioacuten en la tabla 6
Tabla 6 Porcentaje hallado mediante HPLC para los uacuteltimos tres diacuteas de la fermentacioacuten con concentraciones de 05 gL 10 gL y 15 gL de FA y 50 gL
de glucosa con un tiempo de retencioacuten entre 62 y 72 minutos
Diacutea
Glucosa
50 gL +
FA
Aacuterea
(compuesto
Tr=62-72)
12 0 4315
12 05 2931
12 1 6236
12 15 847
13 0 3257
13 05 7549
13 1 4790
13 15 2721
14 0 4822
14 05 3863
14 1 5801
14 15 2102
84
Al detallar la tabla 6 puede observarse que el ensayo que mayor porcentaje de
aacuterea arrojoacute fue el que conteniacutea 05 gL de FA arrojando su maacuteximo porcentaje
correspondiente a 755 el diacutea 13 Aun asiacute las diferencias existentes entre ellos
no fueron significativas
Ahora bien al analizarlos estadiacutesticamente se encontroacute que la produccioacuten del
alcaloide en presencia de FA presentoacute la misma tendencia que los ensayos
analizados anteriormente sin eacutesta pero gracias a que este aminoaacutecido duplico la
cantidad de biomasa y debido a que el compuesto de intereacutes se produce
intracelularmente se afirma que el uso de FA aumentoacute la generacioacuten del
compuesto evaluado (Anexo 12)
El graacutefico 24 presenta las diferentes medias en cuanto al porcentaje de aacuterea del
compuesto presente entre 62 y 72 minutos para los diferentes tratamientos de
glucosa a una concentracioacuten de 50 gL y sus concentraciones respectivas de FA
Claramente se ve que soacutelo existe un grupo homogeacuteneo lo que reafirma que no
existen diferencias significativas de la produccioacuten con respecto a las
concentraciones de FA
85
Tratamientos con y sin FA
Media 0 gL FA (a) 3122
Media 05 gL FA (a) 2391
Media 10 gL FA (a) 2823
Media 15 gL FA (a) 2113
a
aa
a
0
5
10
15
20
25
30
35
40
Aacutere
a Co
mpu
esto
Letras diferentes denotan diferencias significativas (prueba LSD)
Graacutefico 24 Aacuterea del compuesto obtenido de P cubensis en tiempo de retencioacuten entre 62 y 72 minutos para cada una de las concentraciones de
FA utilizadas
Debido a que no se encontraron diferencias significativas en cuanto al porcentaje
de aacuterea obtenido mediante los cromatogramas se concluye que el mejor medio es
el que tiene como fuente de carbono glucosa a una concentracioacuten de 50 gL y una
adicioacuten de 05 gL de FA puesto que genera una disminucioacuten en costos
86
CONCLUSIONES
No existen diferencias significativas en el crecimiento micelial de P
cubensis en medio sumergido Fang-Zhong cuando se trabaja con fuentes
de carbono glucosa y sacarosa sin embargo se decide trabajar con 50 gL
de glucosa puesto que eacuteste tiene una buena presencia de alcaloide y a su
vez una mejor produccioacuten de biomasa
La concentracioacuten de glucosa utilizada para el crecimiento de P cubensis
influye en el crecimiento micelial obteniendo concentraciones de biomasa
de 062 gL 055 gL y 048 gL para concentraciones de sustrato de 70 50
y 30 gL de glucosa siendo las dos primeras significativamente diferentes
con respecto a la de 30 gL
La concentracioacuten de sacarosa utilizada para el crecimiento de P cubensis
influye en el crecimiento micelial obteniendo concentraciones de biomasa
de 057 gL 045 gL y 026 gL para concentraciones de sustrato de 70 50
y 30 gL de sacarosa siendo significativamente diferentes entre ellas
La resolucioacuten de los picos obtenidos por RP-HPLC del extracto de P
cubensis fue mayor para las fermentaciones realizadas con una
concentracioacuten de 50 gL de glucosa lo que conllevoacute a utilizarlo al realizar
los ensayos que conteniacutean en el medio FA
La concentracioacuten de biomasa de P cubensis obtenida en cultivo sumergido
en medio Fang-Zhong con glucosa se duplicoacute con la adicioacuten de FA No
obstante no existen diferencias significativas entre las concentraciones de
FA utilizadas
87
El consumo de proteiacutena presentada por P cubensis en medio Fang-Zhong
fue casi del 100 mientras que el consumo de sustrato para el mismo
medio estuvo alrededor del 40
El consumo de sustrato durante el transcurso de las fermentaciones que no
conteniacutean FA en el medio no presentoacute diferencias significativas con
respecto a las dos fuentes de carbono utilizadas Mientras que en aquellas
fermentaciones donde se agregoacute FA al medio siacute existieron diferencias
significativas entre las fermentaciones de 15 y 1 gL de FA con respecto a
los ensayos realizados con 05 gL FA Sin embargo el P cubensis
consumioacute mayor cantidad de sustrato cuando el medio no conteniacutea FA
Se evidencioacute que el P cubensis consumioacute mayor cantidad de proteiacutena
cuando el sustrato utilizado en el medio fue glucosa y a su vez se detecto
que la adicioacuten de FA al medio tuvo como efecto la disminucioacuten en el
consumo de sustrato por parte del microorganismo
El consumo de sustrato y de proteiacutena tuvo un comportamiento similar
puesto que fue consumido permanentemente durante la fase exponencial
para cada uno de los tratamientos realizados es decir las concentraciones
de 30 gL 50 gL y 70 gL de glucosa y sacarosa como fuente de carbono y
de 05 gL 1 gL y 15 gL de FA teniendo como fuente de carbono glucosa
a una concentracioacuten de 50 gL mientras que en la fase estacionaria su
consumo se disminuyoacute permaneciendo casi constante
Despueacutes de realizados los estudios en cuanto a la produccioacuten del
compuesto presente entre 62 y 72 minutos para cada uno de los ensayos
no se evidenciaron diferencias significativas entre las dos fuentes de
carbono utilizadas (glucosa y sacarosa)
88
La adicioacuten del precursor llamado Fenilalanina (FA) al medio sumergido
Fang-Zhong para llevar a cabo el cultivo del P cubensis tuvo influencia en
cuanto a la produccioacuten de compuesto presente entre tiempo de retencioacuten de
62 y 72 minutos debido a que eacuteste duplicoacute la concentracioacuten de biomasa
en el medio se dice entonces que la produccioacuten aumentoacute al ser eacuteste de
produccioacuten intracelular
La resolucioacuten del compuesto presente entre el tiempo de retencioacuten de 62 a
72 minutos se obtuvo mejor en el ensayo que conteniacutea 05 gL de FA y al
saber que no existieron diferencias significativas en la produccioacuten en cuanto
al porcentaje de aacutereas obtenido con respecto a las demaacutes concentraciones
de FA se afirma que eacuteste es el medio que mejores resultados arrojoacute para
el crecimiento de P cubensis y la produccioacuten de Psilocibina
89
RECOMENDACIONES
Se sugiere observar el efecto que tiene la variacioacuten de las revoluciones a
las cuales se realizaron las fermentaciones para ver como variacutea el
crecimiento del P cubensis en medio sumergido Fang-Zhong con respecto
a dicho factor
Debido a que soacutelo se realizaron anaacutelisis sobre el crecimiento del P
cubensis en medio sumergido haciendo uso de dos sustratos diferentes
(glucosa y sacarosa) seriacutea recomendable realizar el mismo anaacutelisis para
otro tipo de sustrato como por ejemplo melaza por su bajo costo
Del mismo modo seriacutea apropiado realizar el estudio con otro tipo de
precursor y en otras concentraciones para ver la incidencia de eacuteste en el
comportamiento del hongo
Se recomienda realizar un escalamiento de dicho proceso en un biorreactor
con el fin de evaluar a mayor escala el crecimiento del P cubensis y la
produccioacuten del alcaloide
Debido a que la proteiacutena se comportoacute como el principal nutriente se sugiere
para una proacutexima investigacioacuten evaluar diferentes concentraciones de
proteiacutena en el medio
90
ANEXOS
Anexo 1 Anaacutelisis de varianza (ANOVA) para el crecimiento de biomasa de
las fermentaciones con glucosa
Tabla 7 Anaacutelisis de Varianza para el crecimiento micelial (glucosa)
Tabla 8 Anaacutelisis Muacuteltiple de Rangos para el crecimiento micelial (glucosa)
91
Anexo 2 Anaacutelisis de Varianza (ANOVA) para el crecimiento de biomasa de
las fermentaciones con sacarosa
Tabla 9 Anaacutelisis de Varianza para el crecimiento micelial (sacarosa)
Tabla 10 Anaacutelisis Muacuteltiple de Rangos para el crecimiento micelial (sacarosa)
92
Anexo 3 Anaacutelisis de Varianza (ANOVA) para el crecimiento de biomasa de
las fermentaciones con glucosa y sacarosa
Tabla 11 Anaacutelisis de Varianza para el crecimiento micelial (glucosa y
sacarosa)
Tabla 12 Anaacutelisis Muacuteltiple de Rangos para el crecimiento micelial (glucosa y
sacarosa)
93
Anexo 4 Anaacutelisis de Varianza (ANOVA) para el crecimiento de biomasa de
las fermentaciones con glucosa 50 gL y FA
Tabla 13 Anaacutelisis de Varianza para el crecimiento micelial (glucosa 50 gL y
FA)
Tabla 14 Anaacutelisis Muacuteltiple de Rangos para el crecimiento micelial (glucosa
50 gL y FA)
94
Anexo 5 Anaacutelisis de varianza (ANOVA) para el consumo de sustrato en las
fermentaciones sin FA
Tabla 15 Anaacutelisis de Varianza para el consumo de Sustrato sin FA
Tabla 16 Anaacutelisis Muacuteltiple de Rangos para el consumo de Sustrato sin FA
95
Anexo 6 Anaacutelisis de Varianza (ANOVA) para el consumo de sustrato en las
fermentaciones con FA
Tabla 17 Anaacutelisis de Varianza para el consumo de Sustrato con FA
Tabla 18 Anaacutelisis Muacuteltiple de Rangos para el consumo de Sustrato con FA
96
Anexo 7 Anaacutelisis de Varianza (ANOVA) para el consumo de proteiacutena en las
fermentaciones sin FA
Tabla 19 Anaacutelisis de Varianza para el consumo de Proteiacutena sin FA
Tabla 20 Anaacutelisis Muacuteltiple de Rangos para el consumo de Proteiacutena sin FA
97
Anexo 8 Anaacutelisis de Varianza (ANOVA) para el consumo de proteiacutena en las
fermentaciones con FA
Tabla 21Anaacutelisis de Varianza para el consumo de Proteiacutena con FA
Tabla 22 Anaacutelisis Muacuteltiple de Rangos para el consumo de Proteiacutena con FA
98
Anexo 9 Anaacutelisis de Varianza (ANOVA) para la produccioacuten de Psilocibina en
las fermentaciones sin FA
Tabla 23 Anaacutelisis de Varianza para la produccioacuten de Psilocibina sin FA
Tabla 24 Anaacutelisis Muacuteltiple de Rangos para la produccioacuten de Psilocibina
seguacuten el Sustrato sin FA
99
Anexo 10 Anaacutelisis de Varianza (ANOVA) para la produccioacuten de Psilocibina en las fermentaciones con FA
Tabla 25 Anaacutelisis de Varianza para la produccioacuten de Psilocibina con FA
Tabla 26 Anaacutelisis Muacuteltiple de Rangos para la produccioacuten de Psilocibina
seguacuten el diacutea con FA
100
Anexo 11 Anaacutelisis de Varianza (ANOVA) para la cuantificacioacuten porcentual de
Psilocibina en las fermentaciones sin FA
Tabla 27 Anaacutelisis de Varianza para la cuantificacioacuten de Psilocibina sin FA
Tabla 28 Anaacutelisis Muacuteltiple de Rangos para la cuantificacioacuten de Psilocibina
seguacuten el tipo de sustrato sin FA
101
Anexo 12 Anaacutelisis de Varianza (ANOVA) para la cuantificacioacuten porcentual de
Psilocibina en las fermentaciones con FA
Tabla 29 Anaacutelisis de Varianza para la cuantificacioacuten de Psilocibina con FA
Tabla 30 Anaacutelisis Muacuteltiple de Rangos para la cuantificacioacuten de Psilocibina
seguacuten la concentracioacuten con FA
102
Anexo 13 Determinacioacuten de consumo de azuacutecares por el meacutetodo de DNS
(Aacutecido Dinitrosaliciacutelico)
a DNS para glucosa
Pasos para preparar DNS
Disolver 16 gr de NaOH en agua destilada
Adicionar 30 gr de tartrato de Na y K
Aforar a 100 ml con agua destilada
Almacenar en frascos aacutembar a 4degC
Se debe mantener un stock de glucosa 4mgml y almacenarlo a 4degC A partir
de la solucioacuten de glucosa se preparan las soluciones para hacer la curva
patroacuten con las siguientes concentraciones (gL) 025 050 100 200 y 400
Procedimiento
Tomar 05 ml de cada dilucioacuten y agregar 05 ml de reactivo DNS
Preparar una muestra blanco por dilucioacuten de 05 ml de agua destilada a 05
ml de reactivo de DNS
Agitar todas las muestras
Colocar a ebullir las muestras en bantildeo mariacutea por cinco minutos
Enfriar con hielo
Adicionar 5 ml de agua destilada
Agitar y dejar en reposo 15 minutos
Leer en espectrofotoacutemetro a 540 nm
Realizar la curva Absorbancia Vs Concentracioacuten Debe tener un coeficiente
de correlacioacuten de 0991 a 0999
b DNS para sacarosa
Pasos para preparar DNS sacarosa
Preparacioacuten de la solucioacuten Standard stock de sacarosa (30 gL) tomar 30
gr de sacarosa anhiacutedrida grado reactivo con exactitud hasta la deacutecima de
mg disolver ajustar a aforo de 100 ml con agua desionizada empacar en
viales y almacenar en congelador
Preparacioacuten DNS pesar 16 gr de hidroacutexido de sodio grado reactivo 30 gr
de tartrato de sodio y potasio y disolverlos juntos con 50 ml de agua
103
desionizada aparte pesar 10 gr del DNS disolver con 30 ml de agua
desionizada agregar lentamente y con agitacioacuten la solucioacuten del DNS a la
solucioacuten de tartrato y NaOH anteriormente preparadas ajustar a 100 ml
filtrar envasar en frasco aacutembar y rotular con fecha de vencimiento incluida
(3 meses maacuteximo) mantener a la temperatura del laboratorio
Preparacioacuten del reactivo NaOH 10 N (500 ml) pesar con exactitud hasta
la deacutecima de mg 20 gr de NaOH grado reactivo por cada 500 ml de
solucioacuten disolver primero con 300 ml de agua desionizada y luego aforar a
500 ml envasar y rotular correctamente y mantener a la temperatura del
laboratorio
Preparacioacuten de HCL 10 (100 ml) tomar 27 ml de aacutecido clorhiacutedrico al
37 grado reactivo y aforar hasta 100 ml con agua desionizada envasar
rotular correctamente de acuerdo a la norma del laboratorio y almacenar a
la temperatura del laboratorio
Se debe mantener un stock de glucosa 30 gL y almacenarlo a 4degC A partir
de la solucioacuten de glucosa se preparan las soluciones para hacer la curva
patroacuten con las siguientes concentraciones (gL) 3 6 12 18 24 y 30
Procedimiento
Preparar en cada tubo (las soluciones de la curva patroacuten de sacarosa las
muestras problemas diluidas si es necesario y como blanco agua
desionizada) 100microl de solucioacuten
Adicionar 200 microl de HCL 10 a cada tubo y agitar todos los tubos en vortex
Llevar a ebullicioacuten por 10 minutos en bantildeo mariacutea precalentado a 95degC
Enfriar hasta temperatura ambiente raacutepidamente
Adicionar a cada tubo 1 ml de NaOH 10 N y agitar los tubos en vortex
Aparte tomar 05 ml de cada tubo en otros tubos rotulados y agregar 05 ml
del DNS
Agitar todas las muestras en vortex
Llevar a ebullicioacuten por 5 minutos en bantildeo mariacutea precalentado a 96degC
Enfriar hasta temperatura ambiente raacutepidamente
Adicionar 5 ml de H2O desionizada agitar en vortex y dejar reposar por 15
minutos
Leer en espectrofotoacutemetro a 540 nm
Realizar la curva Absorbancia Vs Concentracioacuten Debe tener un coeficiente
de correlacioacuten de 0991 a 0999
104
Anexo 14 Cineacutetica de Consumo de Sustrato
La cineacutetica de consumo de sustrato se realizoacute por el meacutetodo de Aacutecido
Dinitrosaliciacutelico (DNS) Los rangos de concentracioacuten y absorbancia para cada caso
se citan a continuacioacuten
Rangos de concentraciones y absorbancias para las fermentaciones que
usaron glucosa (30 gL 50 gL y 70 gL) como sustrato
Concentracioacuten de 02 a 12 gL
Absorbancia de 01234 a 06612
Ecuacioacuten Y = 19174x -00517 R2 = 09923
Rangos de concentraciones y absorbancias para las fermentaciones que
usaron sacarosa (30 gL 50 gL y 70 gL) como sustrato
Concentracioacuten de 3 a 30 gL
Absorbancia de 00822 a 11112
Ecuacioacuten Y = 25983x + 04857 R2 = 09978
Rangos de concentraciones y absorbancias para las fermentaciones que
usaron glucosa 50 gL como sustrato y FA
Concentracioacuten de 02 a 12 gL
Absorbancia de 0097 a 063
Ecuacioacuten Y = 18785x + 00019 R2 = 09986
105
Anexo 15 Determinacioacuten de consumo de proteiacutenas por el meacutetodo de LOWRY
Pasos para la preparacioacuten de LOWRY
Para obtener la curva estaacutendar de Albuacutemina se preparan 5 soluciones
patrones de Albuacutemina en NaCL al 09 (PV) de las siguientes
concentraciones 152 80 200 300 400 Pgml Si la concentracioacuten de
Proteiacutena total es menor de 500 Pgml se lee la absorbancia a 750 nm si
estaacute entre 1000 y 2000 Pgml se lee a 550nm
Se prepara un blanco que no lleva Albuacutemina y en su reemplazo se adiciona
0-5 ml de solucioacuten salina (NaCL) al 09 (PV) Se aplica el mismo
procedimiento que a las demaacutes muestras
Procedimiento
Servir en tubos de ensayo 05 ml de las soluciones patroacuten de Albuacutemina las
muestras problema y NaCL al 09 como blanco Deben estar marcados
para conservar el orden de concentraciones para la curva
Adicionar a cada tubo 05 ml de NaOH 2N y llevar al bantildeo Mariacutea
precalentado a 100degC por un tiempo de 10 minutos
Dejar enfriar hasta que alcance la Temperatura Ambiente
Agregar a cada tubo 5 ml de la solucioacuten complejante mezclar y dejar
reposar por 10 minutos
Adicionar 05 ml del reactivo de Folin-Ciocalteu 11 vortexiar durante 20
segundos
Reposar en un cuarto oscuro durante 30 minutos
Leer la absorbancia a 750 nm y con las soluciones patroacuten construir la
graacutefica Absorbancia Vs Concentracioacuten de Albuacutemina Seacuterica de Bovina
(BSA) con eacutesta se puede determinar la concentracioacuten de las muestras
problema interpolando el valor de la Absorbancia La curva estaacutendar debe
tener un coeficiente de correlacioacuten de 0991 a 0999
106
Anexo 16 Cineacutetica consumo de Proteiacutena
La cineacutetica de consumo de proteiacutena se realizoacute por el meacutetodo LOWRY Los rangos
de concentracioacuten y absorbancia para cada caso se citan a continuacioacuten
Rangos de concentraciones y absorbancias para las fermentaciones que
usaron glucosa (30 gL 50 gL y 70 gL) como sustrato
Concentracioacuten de 0016 a 04 gL
Absorbancia de 00094 a 05382
Ecuacioacuten Y = 07427x ndash 00021 R2 = 09955
Rangos de concentraciones y absorbancias para las fermentaciones que
usaron sacarosa (30 gL 50 gL y 70 gL) como sustrato
Concentracioacuten de 0016 a 04 gL
Absorbancia de 00374 a 06178
Ecuacioacuten Y = 06567x ndash 00166 R2 = 09968
Rangos de concentraciones y absorbancias para las fermentaciones que
usaron glucosa 50 gL como sustrato y FA
Concentracioacuten de 0016 a 04 gL
Absorbancia de 00708 a 04647
Ecuacioacuten Y = 09814x ndash 00581 R2 = 09992
107
Anexo 17 Prueba de reactivo de Dragendorff
Preparacioacuten de reactivo de Dragendorff para alcaloides
Reactivo de Dragendorff se prepara mezclando 8 gr de nitrato de bismuto
pentahidratado en 20 ml de aacutecido niacutetrico al 30 con una solucioacuten de 272 g de
yoduro de potasio en 50 ml de agua Se deja en reposo por 24 horas se decanta y
se afora a 100 ml La presencia de alcaloides se detecta por la formacioacuten de un
precipitado naranja rojizo cuando se le adiciona esta reactivo a una solucioacuten aacutecida
de alcaloides De los precipitados lavados se puede recuperar los alcaloides con
una solucioacuten saturada de carbonato de sodio (Mercano y Hasegawa 1991)
La figura mostrada a continuacioacuten refleja la presencia del alcaloide debido a la
coloracioacuten amarillo-rojiza que eacutesta sufrioacute
Figura 8 Muestra de biomasa una vez analizada mediante el reactivo de Dragendorff
108
Anexo 18 Barrido Espectral para el Psilocybe cubensis
La metodologiacutea mencionada a continuacioacuten estaacute basada en artiacuteculo base
(Tsujikawa et al 2003)
El Sistema de HPLC consiste en un Shimadzu LC-10ordf Series Cromatografiacutea
Liacutequida equipada con un diodo SPD-M10A detector de red fija en 220nm La
separacioacuten cromatograacutefica ser realizoacute con una columna simeacutetrica C18 (21 mm a
150 mm 5mm Waters Assoc Milford EEUU
La fase moacutevil utilizada fue de 10 mm de formato de amonio-aacutecido foacutermico (955
VV) a un pH de 35 y bombeado a un caudal de 02 mlminuto
El perfil cromatograacutefico obtenido durante la investigacioacuten de Tsujikawa et al
(2003) se muestra en le figura 6 que aparece a continuacioacuten
Figura 9 Perfil cromatograacutefico (Tsujikawa et al 2003)
109
Anexo 19 Cromatogramas (HPLC) del diacutea 12 de fermentacioacuten
Tabla 31 Aacutereas obtenidas de los cromatogramas para el P cubensis en
medio Fang-Zhong en el diacutea 12 para concentraciones de 30gL glucosa y
30gL sacarosa
SustratoConcentracioacuten
(gL)
Tiempo
(s)Aacuterea
Glucosa 30 2957 3837
Glucosa 30 6838 474753
Glucosa 30 9144 47256
Glucosa 30 9489 16822
Glucosa 30 10124 224349
Sacarosa 30 6538 143772
Sacarosa 30 7234 269458
Sacarosa 30 9721 33646
Sacarosa 30 11845 24384
(a) (b)
Graacutefico 25 Cromatogramas del diacutea 12 para el P cubensis cultivado en medio
sumergido Fang-Zhong con dos diferentes tipos de sustratos (a) 30 gL
glucosa (b) 30 gL sacarosa
110
Tabla 32 Aacutereas obtenidas de los cromatogramas para el P cubensis en
medio Fang-Zhong en el diacutea 12 para concentraciones de 50gL glucosa y
50gL sacarosa
SustratoConcentracioacuten
(gL)
Tiempo
(s)Aacuterea
Glucosa 50 0524 319
Glucosa 50 6298 5991
Glucosa 50 7172 237042
Glucosa 50 9144 16387
Glucosa 50 10009 6077
Sacarosa 50 169 24011
Sacarosa 50 3105 28573
Sacarosa 50 6916 112166
Sacarosa 50 9136 4057
Sacarosa 50 9933 8821
Sacarosa 50 10398 13872
(a) (b)
Graacutefico 26 Cromatogramas del diacutea 12 para el P cubensis cultivado en medio
sumergido Fang-Zhong con dos diferentes tipos de sustratos (a) 50 gL
glucosa (b) 50 gL sacarosa
111
Tabla 33 Aacutereas obtenidas de los cromatogramas para el P cubensis en
medio Fang-Zhong en el diacutea 12 para concentraciones de 50gL glucosa y
50gL sacarosa
SustratoConcentracioacuten
(gL)
Tiempo
(s)Aacuterea
Glucosa 70 7217 168598
Glucosa 70 9145 9977
Glucosa 70 997 80558
Sacarosa 70 6803 287387
Sacarosa 70 7517 131049
Sacarosa 70 7775 4434
Sacarosa 70 7871 77109
Sacarosa 70 823 96239
Sacarosa 70 9039 5114
Sacarosa 70 9778 25394
(a) (b)
Graacutefico 27 Cromatogramas del diacutea 12 para el P cubensis cultivado en medio
sumergido Fang-Zhong con dos diferentes tipos de sustratos (a) 50 gL
glucosa (b) 50 gL sacarosa
112
Tabla 34 Aacutereas obtenidas de los cromatogramas para el P cubensis en
medio Fang-Zhong en el diacutea 12 para concentraciones de 50gL y glucosa
50gL sacarosa
SustratoConcentracioacuten
(gL)
Tiempo
(s)Aacuterea
Glucosa 50 05 0818 4722
Glucosa 50 05 2423 52579
Glucosa 50 05 3502 88765
Glucosa 50 05 6137 16009
Glucosa 50 05 6722 275258
Glucosa 50 05 733 226399
Glucosa 50 05 8339 65139
Glucosa 50 05 9101 36797
Glucosa 50 05 9815 130883
Glucosa 50 1 1105 743
Glucosa 50 1 2746 2701
Glucosa 50 1 4304 80304
Glucosa 50 1 6167 19649
Glucosa 50 1 6794 51753
Glucosa 50 1 8282 82997
Glucosa 50 1 9116 38659
Glucosa 50 1 9899 136953
Glucosa 50 15 1198 3313
Glucosa 50 15 2937 37875
Glucosa 50 15 4332 51079
Glucosa 50 15 614 25602
Glucosa 50 15 6737 668905
Glucosa 50 15 8209 107332
Glucosa 50 15 9602 38902
Glucosa 50 15 9752 139613
Diacutea 12
(a) (b)
(c)
Graacutefico 28 Cromatograma del diacutea 12 para el P cubensis cultivado en medio
sumergido Fang-Zhong con fuente de carbono glucosa y adicioacuten de
fenilalanina en tres concentraciones (a) 05 gL FA (b) 1 gL FA (c) 15gL
FA
113
Anexo 20 Cromatogramas (HPLC) del diacutea 13 de fermentacioacuten
Tabla 35 Aacutereas obtenidas de los cromatogramas para el P cubensis en
medio Fang-Zhong en el diacutea 13 para concentraciones de 30gL glucosa y
30gL sacarosa
SustratoConcentracioacuten
(gL)
Tiempo
(s)Aacuterea
Glucosa 30 0225 1155
Glucosa 30 2847 699
Glucosa 30 4043 1038
Glucosa 30 6231 4994
Glucosa 30 6787 295182
Glucosa 30 7462 241146
Glucosa 30 9066 51836
Glucosa 30 10004 158746
Sacarosa 30 1734 135
Sacarosa 30 5838 1857
Sacarosa 30 6803 147867
Sacarosa 30 7305 30464
Sacarosa 30 7599 174643
Sacarosa 30 9107 8564
Sacarosa 30 9897 104278
(a) (b)
Graacutefico 29 Cromatogramas del diacutea 13 para el P cubensis cultivado en medio
sumergido Fang-Zhong con dos diferentes tipos de sustratos (a) 30 gL
glucosa (b) 30 gL sacarosa
114
Tabla 36 Aacutereas obtenidas de los cromatogramas para el P cubensis en
medio Fang-Zhong en el diacutea 13 para concentraciones de 50gL glucosa y
50gL sacarosa
SustratoConcentracioacuten
(gL)
Tiempo
(s)Aacuterea
Glucosa 50 1408 13982
Glucosa 50 6949 331449
Glucosa 50 9012 25201
Glucosa 50 9936 27216
Sacarosa 50 1543 7293
Sacarosa 50 6813 437765
Sacarosa 50 9085 35897
Sacarosa 50 10049 184461
(a) (b)
Graacutefico 30 Cromatogramas del diacutea 13 para el P cubensis cultivado en medio
sumergido Fang-Zhong con dos diferentes tipos de sustratos (a) 50 gL
glucosa (b) 50 gL sacarosa
115
Tabla 37 Aacutereas obtenidas de los cromatogramas para el P cubensis en
medio Fang-Zhong en el diacutea 13 para concentraciones de 70gL glucosa y
70gL sacarosa
SustratoConcentracioacuten
(gL)
Tiempo
(s)Aacuterea
Glucosa 70 1456 3223
Glucosa 70 2985 2423
Glucosa 70 54 7586
Glucosa 70 6262 5149
Glucosa 70 7151 248331
Glucosa 70 9039 19346
Glucosa 70 9929 4906
Glucosa 70 11051 33698
Sacarosa 70 0437 342
Sacarosa 70 1428 812
Sacarosa 70 2948 2191
Sacarosa 70 5473 4854
Sacarosa 70 6286 5336
Sacarosa 70 6848 3649
Sacarosa 70 733 11383
Sacarosa 70 9073 1018
Sacarosa 70 9878 11072
Sacarosa 70 10267 18797
(a) (b)
Graacutefico 31 Cromatogramas del diacutea 13 para el P cubensis cultivado en medio
sumergido Fang-Zhong con dos diferentes tipos de sustratos (a) 70 gL
glucosa (b) 70 gL sacarosa
116
Tabla 38 Aacutereas obtenidas de los cromatogramas para el P cubensis en
medio Fang-Zhong en el diacutea 13 para concentraciones de 50gL y glucosa
50gL sacarosa
SustratoConcentracioacuten
(gL)
Tiempo
(s)Aacuterea
Glucosa 50 05 4067 22222
Glucosa 50 05 7379 55573
Glucosa 50 05 902 19513
Glucosa 50 05 9716 119261
Glucosa 50 05 1173 19427
Glucosa 50 1 0793 14776
Glucosa 50 1 2868 28537
Glucosa 50 1 6224 1206
Glucosa 50 1 6782 571299
Glucosa 50 1 8303 92665
Glucosa 50 1 9081 30371
Glucosa 50 1 9738 168959
Glucosa 50 1 11813 27921
Glucosa 50 15 0412 269
Glucosa 50 15 2482 14692
Glucosa 50 15 3486 91059
Glucosa 50 15 6039 6892
Glucosa 50 15 6627 216986
Glucosa 50 15 7216 260795
Glucosa 50 15 8112 65776
Glucosa 50 15 8888 19083
Glucosa 50 15 9497 37812
Glucosa 50 15 9839 65922
Glucosa 50 15 11655 7331
(a) (b)
(c)
Graacutefico 32 Cromatogramas del diacutea 12 para el P cubensis cultivado en medio
sumergido Fang-Zhong con fuente de carbono glucosa y adicioacuten de
fenilalanina en tres concentraciones (a) 05 gL FA (b) 1 gL FA (c) 15gL
FA
117
Anexo 21 Cromatogramas (HPLC) del diacutea 14 de fermentacioacuten
Tabla 39 Aacutereas obtenidas de los cromatogramas para el P cubensis en
medio Fang-Zhong en el diacutea 14 para concentraciones de 30gL glucosa y 30
gL sacarosa
SustratoConcentracioacuten
(gL)
Tiempo
(s)Aacuterea
Glucosa 30 1054 181
Glucosa 30 2553 8939
Glucosa 30 6219 7557
Glucosa 30 6585 77083
Glucosa 30 7158 285069
Glucosa 30 8987 33875
Glucosa 30 9848 87461
Glucosa 30 10694 52151
Glucosa 30 12482 7992
Glucosa 30 12943 23064
Glucosa 30 1493 5948
Sacarosa 30 7309 7075
Sacarosa 30 9984 1680
Sacarosa 30 10442 15395
Sacarosa 30 11211 8511
Sacarosa 30 13405 3398
(a) (b)
Graacutefico 33 Cromatogramas del diacutea 14 para el P cubensis cultivado en medio
sumergido Fang-Zhong con dos diferentes tipos de sustratos (a) 30 gL
glucosa (b) 30 gL sacarosa
118
Tabla 40 Aacutereas obtenidas de los cromatogramas para el P cubensis en
medio Fang-Zhong en el diacutea 14 para concentraciones de 50gL glucosa y
50gL sacarosa
SustratoConcentracioacuten
(gL)
Tiempo
(s)Aacuterea
Glucosa 50 2029 8318
Glucosa 50 6257 5782
Glucosa 50 6875 306684
Glucosa 50 9068 22819
Glucosa 50 9808 92492
Glucosa 50 12113 8823
Glucosa 50 12752 23988
Sacarosa 50 1036 3783
Sacarosa 50 2356 7005
Sacarosa 50 653 44831
Sacarosa 50 6657 127617
Sacarosa 50 7264 66908
Sacarosa 50 7464 255141
Sacarosa 50 9035 26172
Sacarosa 50 9458 28427
Sacarosa 50 9889 37574
Sacarosa 50 10312 140881
Sacarosa 50 12335 13391
Sacarosa 50 1292 17066
(a) (b)
Graacutefico 34 Cromatogramas del diacutea 14 para el P cubensis cultivado en medio
sumergido Fang-Zhong con dos diferentes tipos de sustratos (a) 50 gL
glucosa (b) 50 gL sacarosa
119
Tabla 41 Aacutereas obtenidas de los cromatogramas para el P cubensis en
medio Fang-Zhong en el diacutea 14 para concentraciones de 70gL glucosa y
70gL sacarosa
SustratoConcentracioacuten
(gL)
Tiempo
(s)Aacuterea
Glucosa 70 6257 5879
Glucosa 70 6373 145551
Glucosa 70 7015 68223
Glucosa 70 7199 9085
Glucosa 70 735 265755
Glucosa 70 9014 4642
Glucosa 70 9877 97804
Glucosa 70 107 67421
Glucosa 70 12625 26231
Glucosa 70 1305 65607
Sacarosa 70 2283 4683
Sacarosa 70 5191 93
Sacarosa 70 6304 3719
Sacarosa 70 6795 136542
Sacarosa 70 726 29869
Sacarosa 70 7515 75545
Sacarosa 70 7872 119563
Sacarosa 70 9166 1244
Sacarosa 70 9658 23096
Sacarosa 70 9871 25866
Sacarosa 70 10421 105108
Sacarosa 70 12347 11115
Sacarosa 70 12861 35503
Sacarosa 70 14272 3676
(a) (b)
Graacutefico 35 Cromatogramas del diacutea 14 para el P cubensis cultivado en medio
sumergido Fang-Zhong con dos diferentes tipos de sustratos (a) 70 gL
glucosa (b) 70 gL sacarosa
120
Tabla 42 Aacutereas obtenidas de los cromatogramas para el P cubensis en medio Fang-Zhong en el diacutea 13 para concentraciones de 50gL glucosa y
50gL sacarosa
SustratoConcentracioacuten
(gL)
Tiempo
(s)Aacuterea
Glucosa 50 05 0123 173
Glucosa 50 05 0699 7584
Glucosa 50 05 2594 2742
Glucosa 50 05 6104 11663
Glucosa 50 05 6616 487848
Glucosa 50 05 7235 287918
Glucosa 50 05 8183 135793
Glucosa 50 05 8903 5143
Glucosa 50 05 9484 66817
Glucosa 50 05 9679 168855
Glucosa 50 05 11671 4216
Glucosa 50 1 0345 295
Glucosa 50 1 2654 11981
Glucosa 50 1 412 45301
Glucosa 50 1 6111 12626
Glucosa 50 1 6757 526655
Glucosa 50 1 8093 104277
Glucosa 50 1 894 25251
Glucosa 50 1 9643 158685
Glucosa 50 1 11666 22779
Glucosa 50 15 0353 283
Glucosa 50 15 2522 15272
Glucosa 50 15 3577 83963
Glucosa 50 15 6668 47137
Glucosa 50 15 7304 371442
Glucosa 50 15 8226 117611
Glucosa 50 15 8923 61949
Glucosa 50 15 9657 19618
Glucosa 50 15 11668 35606
(a) (b)
(c)
Graacutefico 36 Cromatogramas del diacutea 12 para el P cubensis cultivado en medio sumergido Fang-Zhong con fuente de carbono glucosa y adicioacuten de
fenilalanina en tres concentraciones (a) 05 gL FA (b) 1 gL FA (c) 15gL FA (a) 05 gL FA (b) 1 gL FA (c) 15gL FA
121
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Nota de aceptacioacuten
Jurado
Jurado
Jurado
Ciudad y fecha
iv
A Dios por habernos brindado la oportunidad de lograr este
triunfo en nuestras vidas
A nuestras familias por todo el apoyo que nos brindaron durante
el desarrollo de este proyecto y por habernos dado la gran oportunidad de convertirnos
en profesionales
A toda la docencia por la educacioacuten y orientacioacuten
recibida por eacutesta
v
AGRADECIMIENTOS
Los autores expresan sus agradecimientos a todas las personas que desde su experiencia y profesioacuten brindaron apoyo durante el desarrollo de este proyecto Alex Armando Saacuteez V Quiacutemico MSc En Biotecnologiacutea Candidato a Doctorado Profesor Universidad EAFIT Personal de laboratorio de Ingenieriacutea de Procesos Edgar Arbelaacuteez John Estrada y especialmente Sigifredo Caacuterdenas encargado del laboratorio de Biotecnologiacutea de la Universidad EAFIT Luz Deisy Mariacuten Palacio Ingeniera de Procesos Profesora Universidad EAFIT Diego Acosta PhD Engineering and Material Science Profesor Universidad EAFIT Carlos Correa Ingeniero Quiacutemico Profesor Universidad EAFIT Valeska Villegas E Msc En Biotecnologiacutea Candidata a Doctorado Profesora Universidad EAFIT
vi
TABLA DE CONTENIDO
LISTA DE TABLAS _________________________________________________________________________ IX
LISTA DE FIGURAS ________________________________________________________________________ XI
LISTA DE GRAacuteFICOS ______________________________________________________________________ XII
LISTA DE ECUACIONES ____________________________________________________________________ XV
LISTAS DE ANEXOS ______________________________________________________________________ XVI
RESUMEN _____________________________________________________________________________ XVII
INTRODUCCIOacuteN _________________________________________________________________________ 19
OBJETIVOS _____________________________________________________________________________ 21
GENERAL_____________________________________________________________________________ 21
ESPECIacuteFICOS __________________________________________________________________________ 21
1 MARCO TEOacuteRICO ___________________________________________________________________ 22
11 CONCEPTOS GENERALES DE HONGOS _______________________________________________ 22
111 Hongos laminares (Agaricales) ____________________________________________________ 22
12 MEDIOS DE CULTIVO_____________________________________________________________ 24
121 Medio sumergido _______________________________________________________________ 25
13 ALCALOIDES ___________________________________________________________________ 26
131 Generalidades _______________________________________________________________ 26
132 Propiedades fisicoquiacutemicas _____________________________________________________ 27
133 Reconocimiento de los alcaloides ________________________________________________ 27
134 Clasificacioacuten de los alcaloides ___________________________________________________ 28
1341 Alcaloides alifaacuteticos ____________________________________________________________ 28
1342 Alcaloides de origen diverso _____________________________________________________ 28
1343 Alcaloides aromaacuteticos __________________________________________________________ 28
13 PSILOCIBINA Y PSILOCINA _________________________________________________________ 31
131 Antecedentes acerca de la obtencioacuten de Psilocibina y Psilocina ________________________ 32
2 MATERIALES Y MEacuteTODOS_____________________________________________________________ 34
21 LOCALIZACIOacuteN _________________________________________________________________ 34
22 MICROORGANISMO DE ESTUDIO ___________________________________________________ 34
23 COMPONENTES DEL MEDIO DE CULTIVO (FANG-ZHONG) _______________________________ 35
24 PREPARACIOacuteN DE LOS DIFERENTES PREINOacuteCULOS DE P CUBENSIS EMPLEADOS PARA LAS
FERMENTACIONES SUMERGIDAS _________________________________________________________ 35
25 PREPARACIOacuteN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO Y LOS INOacuteCULOS DE P CUBENSIS UTILIZADOS PARA LAS
FERMENTACIONES SUMERGIDAS _________________________________________________________ 36
26 CUANTIFICACIOacuteN DEL CRECIMIENTO DE BIOMASA MEDIANTE LOS MEacuteTODOS DE PESO HUacuteMEDO Y
PESO SECO PARA CULTIVO SUMERGIDO DE P CUBENSIS ________________________________________ 37
27 AJUSTE DE LA CINEacuteTICA DE CRECIMIENTO DE P CUBENSIS AL MODELO CINEacuteTICO LOGIacuteSTICO ____ 37
vii
28 EVALUACIOacuteN DEL CONSUMO DE SUSTRATO Y DEL CONSUMO DE PROTEIacuteNA POR PARTE DEL P
CUBENSIS CULTIVADO EN MEDIO SUMERGIDO ________________________________________________ 39
29 MEacuteTODO CUALITATIVO PARA DETERMINAR LA PRESENCIA DE ALCALOIDES (PSILOCIBINA)
MEDIANTE EL USO DEL REACTIVO DE DRAGENDORFF _________________________________________ 40
210 MEacuteTODO PARA DETERMINAR LA PRESENCIA DE PSILOCIBINA MEDIANTE CROMATOGRAFIacuteA
LIacuteQUIDA DE ALTA EFICIENCIA (HPLC) _______________________________________________________ 40
211 DETERMINACIOacuteN CUALITATIVA DE LA RESOLUCIOacuteN DEL ALCALOIDE DE INTEREacuteS PARA LOS
DIFERENTES ENSAYOS __________________________________________________________________ 41
212 DETERMINACIOacuteN PORCENTUAL DE COMPUESTOS PARA LOS DIFERENTES ENSAYOS __________ 42
213 CULTIVO SUMERGIDO DE P CUBENSIS EN PRESENCIA DE FA ______________________________ 42
214 DISENtildeO DE EXPERIMENTOS Y ANAacuteLISIS ESTADIacuteSTICO ___________________________________ 43
3 RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN ___________________________________________________________ 45
31 CINEacuteTICA DE CRECIMIENTO MICELIAL DE P CUBENSIS EN CULTIVO SUMERGIDO (FANG-ZHONG)
UTILIZANDO DIFERENTES FUENTES DE CARBONO ____________________________________________ 45
311 Crecimiento micelial de P cubensis en medio sumergido utilizando diferentes concentraciones
de glucosa _________________________________________________________________________ 45
312 Crecimiento micelial del P cubensis en medio sumergido utilizando diferentes concentraciones
de sacarosa ________________________________________________________________________ 50
313 Comparacioacuten entre el crecimiento micelial de P cubensis en los cultivos sumergidos utilizando
glucosa y sacarosa como fuente de carbono ______________________________________________ 55
314 Crecimiento micelial del P cubensis en cultivo sumergido utilizando glucosa y fenilalanina en el
medio 56
32 ESTUDIO DE LA CINEacuteTICA DE CONSUMO DE SUSTRATO POR PARTE DEL P CUBENSIS CULTIVADO EN
MEDIO SUMERGIDO (FANG-ZHONG) ______________________________________________________ 61
321 Consumo de sustrato por parte del P cubensis en medio sumergido utilizando diferentes
concentraciones de glucosa ___________________________________________________________ 62
322 Consumo de sustrato por parte del P cubensis en medio sumergido utilizando diferentes
concentraciones de sacarosa __________________________________________________________ 63
323 Comparacioacuten entre el consumo de sustrato de P cubensis en los cultivos sumergidos con
diferentes fuentes de carbono _________________________________________________________ 65
324 Consumo de sustrato por parte del P cubensis en medio sumergido utilizando glucosa y
fenilalanina en el medio ______________________________________________________________ 66
33 ESTUDIO DE LA CINEacuteTICA DE CONSUMO DE PROTEIacuteNA POR PARTE DEL P CUBENSIS CULTIVADO EN
MEDIO SUMERGIDO (FANG-ZHONG) ______________________________________________________ 69
331 Consumo de proteiacutena por P cubensis en medio sumergido utilizando diferentes
concentraciones de glucosa ___________________________________________________________ 69
332 Consumo de proteiacutena por P cubensis en medio sumergido utilizando diferentes
concentraciones de sacarosa __________________________________________________________ 71
333 Comparacioacuten entre el consumo de proteiacutena de P cubensis en los cultivos sumergidos con
diferentes fuentes de carbono _________________________________________________________ 72
334 Consumo de proteiacutena por P cubensis en medio sumergido utilizando glucosa y FA en el medio
73
34 ESTUDIO CUALITATIVO DE LA PRESENCIA DEL ALCALOIDE _______________________________ 76
viii
341 Produccioacuten de compuestos producidos por P cubensis cuando el medio no conteniacutea FA ____ 76
342 Produccioacuten de compuestos producidos por P cubensis cuando el medio conteniacutea FA ______ 79
35 ESTUDIO PORCENTUAL (AacuteREA) DEL ALCALOIDE REALIZADO PARA LOS DIFERENTES ENSAYOS ___ 81
351 Porcentaje de la Psilocibina (suposicioacuten) cuando el medio no conteniacutea FA _______________ 81
352 Porcentaje de aacuterea de compuestos presentes en P cubensis cuando el medio conteniacutea FA _ 83
CONCLUSIONES _________________________________________________________________________ 86
RECOMENDACIONES _____________________________________________________________________ 89
ANEXOS _______________________________________________________________________________ 90
BIBLIOGRAFIacuteA _________________________________________________________________________ 121
ix
LISTA DE TABLAS
TABLA 1 COMPOSICIOacuteN DEL MEDIO DE CULTIVO SUMERGIDO PARA EVALUAR EL CRECIMIENTO MICELIAL
DEL P CUBENSIS 35
TABLA 2 PARAacuteMETROS CINEacuteTICOS OBTENIDOS MEDIANTE EL MODELO LOGIacuteSTICO PARA LAS DIFERENTES
FERMENTACIONES DE P CUBENSIS UTILIZANDO GLUCOSA COMO FUENTE DE CARBONO 48
TABLA 3 PARAacuteMETROS CINEacuteTICOS OBTENIDOS MEDIANTE EL MODELO LOGIacuteSTICO PARA LAS DIFERENTES
FERMENTACIONES DE P CUBENSIS UTILIZANDO SACAROSA COMO FUENTE DE CARBONO 53
TABLA 4 PARAacuteMETROS CINEacuteTICOS OBTENIDOS MEDIANTE EL MODELO LOGIacuteSTICO PARA LAS DIFERENTES
FERMENTACIONES DE P CUBENSIS UTILIZANDO 50 GL DE GLUCOSA COMO FUENTE DE CARBONO Y
DIFERENTES CONCENTRACIONES DE FA 60
TABLA 5 PORCENTAJE DE AacuteREA HALLADO MEDIANTE HPLC PARA LOS UacuteLTIMOS TRES DIacuteAS DE LA
FERMENTACIOacuteN CON CONCENTRACIONES DE 30 GL 50 GL Y 70 GL DE GLUCOSA Y SACAROSA CON
UN TIEMPO DE RETENCIOacuteN DE 62 Y 72 MINUTOS 81
TABLA 6 PORCENTAJE HALLADO MEDIANTE HPLC PARA LOS UacuteLTIMOS TRES DIacuteAS DE LA FERMENTACIOacuteN
CON CONCENTRACIONES DE 05 GL 10 GL Y 15 GL DE FA Y 50 GL DE GLUCOSA CON UN TIEMPO
DE RETENCIOacuteN ENTRE 62 Y 72 MINUTOS 83
TABLA 7 ANAacuteLISIS DE VARIANZA PARA EL CRECIMIENTO MICELIAL (GLUCOSA) 90
TABLA 8 ANAacuteLISIS MUacuteLTIPLE DE RANGOS PARA EL CRECIMIENTO MICELIAL (GLUCOSA) 90
TABLA 9 ANAacuteLISIS DE VARIANZA PARA EL CRECIMIENTO MICELIAL (SACAROSA) 91
TABLA 10 ANAacuteLISIS MUacuteLTIPLE DE RANGOS PARA EL CRECIMIENTO MICELIAL (SACAROSA) 91
TABLA 11 ANAacuteLISIS DE VARIANZA PARA EL CRECIMIENTO MICELIAL (GLUCOSA Y SACAROSA) 92
TABLA 12 ANAacuteLISIS MUacuteLTIPLE DE RANGOS PARA EL CRECIMIENTO MICELIAL (GLUCOSA Y SACAROSA) 92
TABLA 13 ANAacuteLISIS DE VARIANZA PARA EL CRECIMIENTO MICELIAL (GLUCOSA 50 GL Y FA) 93
TABLA 14 ANAacuteLISIS MUacuteLTIPLE DE RANGOS PARA EL CRECIMIENTO MICELIAL (GLUCOSA 50 GL Y FA) 93
TABLA 15 ANAacuteLISIS DE VARIANZA PARA EL CONSUMO DE SUSTRATO SIN FA 94
TABLA 16 ANAacuteLISIS MUacuteLTIPLE DE RANGOS PARA EL CONSUMO DE SUSTRATO SIN FA 94
TABLA 17 ANAacuteLISIS DE VARIANZA PARA EL CONSUMO DE SUSTRATO CON FA 95
TABLA 18 ANAacuteLISIS MUacuteLTIPLE DE RANGOS PARA EL CONSUMO DE SUSTRATO CON FA 95
TABLA 19 ANAacuteLISIS DE VARIANZA PARA EL CONSUMO DE PROTEIacuteNA SIN FA 96
TABLA 20 ANAacuteLISIS MUacuteLTIPLE DE RANGOS PARA EL CONSUMO DE PROTEIacuteNA SIN FA 96
TABLA 21ANAacuteLISIS DE VARIANZA PARA EL CONSUMO DE PROTEIacuteNA CON FA 97
TABLA 22 ANAacuteLISIS MUacuteLTIPLE DE RANGOS PARA EL CONSUMO DE PROTEIacuteNA CON FA 97
TABLA 23 ANAacuteLISIS DE VARIANZA PARA LA PRODUCCIOacuteN DE PSILOCIBINA SIN FA 98
TABLA 24 ANAacuteLISIS MUacuteLTIPLE DE RANGOS PARA LA PRODUCCIOacuteN DE PSILOCIBINA SEGUacuteN EL SUSTRATO
SIN FA 98
TABLA 25 ANAacuteLISIS DE VARIANZA PARA LA PRODUCCIOacuteN DE PSILOCIBINA CON FA 99
TABLA 26 ANAacuteLISIS MUacuteLTIPLE DE RANGOS PARA LA PRODUCCIOacuteN DE PSILOCIBINA SEGUacuteN EL DIacuteA CON FA
99
TABLA 27 ANAacuteLISIS DE VARIANZA PARA LA CUANTIFICACIOacuteN DE PSILOCIBINA SIN FA 100
TABLA 28 ANAacuteLISIS MUacuteLTIPLE DE RANGOS PARA LA CUANTIFICACIOacuteN DE PSILOCIBINA SEGUacuteN EL TIPO DE
SUSTRATO SIN FA 100
TABLA 29 ANAacuteLISIS DE VARIANZA PARA LA CUANTIFICACIOacuteN DE PSILOCIBINA CON FA 101
x
TABLA 30 ANAacuteLISIS MUacuteLTIPLE DE RANGOS PARA LA CUANTIFICACIOacuteN DE PSILOCIBINA SEGUacuteN LA
CONCENTRACIOacuteN CON FA 101
TABLA 31 AacuteREAS OBTENIDAS DE LOS CROMATOGRAMAS PARA EL P CUBENSIS EN MEDIO FANG-ZHONG
EN EL DIacuteA 12 PARA CONCENTRACIONES DE 30GL GLUCOSA Y 30GL SACAROSA 109
TABLA 32 AacuteREAS OBTENIDAS DE LOS CROMATOGRAMAS PARA EL P CUBENSIS EN MEDIO FANG-ZHONG
EN EL DIacuteA 12 PARA CONCENTRACIONES DE 50GL GLUCOSA Y 50GL SACAROSA 110
TABLA 33 AacuteREAS OBTENIDAS DE LOS CROMATOGRAMAS PARA EL P CUBENSIS EN MEDIO FANG-ZHONG
EN EL DIacuteA 12 PARA CONCENTRACIONES DE 50GL GLUCOSA Y 50GL SACAROSA 111
TABLA 34 AacuteREAS OBTENIDAS DE LOS CROMATOGRAMAS PARA EL P CUBENSIS EN MEDIO FANG-ZHONG
EN EL DIacuteA 12 PARA CONCENTRACIONES DE 50GL Y GLUCOSA 50GL SACAROSA 112
TABLA 35 AacuteREAS OBTENIDAS DE LOS CROMATOGRAMAS PARA EL P CUBENSIS EN MEDIO FANG-ZHONG
EN EL DIacuteA 13 PARA CONCENTRACIONES DE 30GL GLUCOSA Y 30GL SACAROSA 113
TABLA 36 AacuteREAS OBTENIDAS DE LOS CROMATOGRAMAS PARA EL P CUBENSIS EN MEDIO FANG-ZHONG
EN EL DIacuteA 13 PARA CONCENTRACIONES DE 50GL GLUCOSA Y 50GL SACAROSA 114
TABLA 37 AacuteREAS OBTENIDAS DE LOS CROMATOGRAMAS PARA EL P CUBENSIS EN MEDIO FANG-ZHONG
EN EL DIacuteA 13 PARA CONCENTRACIONES DE 70GL GLUCOSA Y 70GL SACAROSA 115
TABLA 38 AacuteREAS OBTENIDAS DE LOS CROMATOGRAMAS PARA EL P CUBENSIS EN MEDIO FANG-ZHONG
EN EL DIacuteA 13 PARA CONCENTRACIONES DE 50GL Y GLUCOSA 50GL SACAROSA 116
TABLA 39 AacuteREAS OBTENIDAS DE LOS CROMATOGRAMAS PARA EL P CUBENSIS EN MEDIO FANG-ZHONG
EN EL DIacuteA 14 PARA CONCENTRACIONES DE 30GL GLUCOSA Y 30 GL SACAROSA 117
TABLA 40 AacuteREAS OBTENIDAS DE LOS CROMATOGRAMAS PARA EL P CUBENSIS EN MEDIO FANG-ZHONG
EN EL DIacuteA 14 PARA CONCENTRACIONES DE 50GL GLUCOSA Y 50GL SACAROSA 118
TABLA 41 AacuteREAS OBTENIDAS DE LOS CROMATOGRAMAS PARA EL P CUBENSIS EN MEDIO FANG-ZHONG
EN EL DIacuteA 14 PARA CONCENTRACIONES DE 70GL GLUCOSA Y 70GL SACAROSA 119
TABLA 42 AacuteREAS OBTENIDAS DE LOS CROMATOGRAMAS PARA EL P CUBENSIS EN MEDIO FANG-ZHONG
EN EL DIacuteA 13 PARA CONCENTRACIONES DE 50GL GLUCOSA Y 50GL SACAROSA 120
xi
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1 HONGO AGARICALES (LAMINAR) (KUO 2007) 23
FIGURA 2 ALCALOIDES DERIVADOS DEL TRIPTOFANO (MERCANO Y HASEGAWA 1991) 29
FIGURA 3 TRIPTAMINAS SIMPLES (SEIGLER 1981) 31
FIGURA 4 PSILOCIBINA Y PSILOCINA (MANDRILE ET AL 1984) 32
FIGURA 5 PSILOCYBE CUBENSIS (EAH01) CULTIVADA EN MEDIO SOacuteLIDO AGAR MALTA 34
FIGURA 6 CROMATOGRAMAS DE DOS DIFERENTES FERMENTACIONES DE P CUBENSIS QUE ILUSTRAN EL
CRITERIO DE ESCOGENCIA DEL MEJOR ENSAYO REALIZADO (A) 50 GL GLUCOSA (B) 50 GL
SACAROSA 78
FIGURA 7 CROMATOGRAMAS DE DOS DIFERENTES FERMENTACIONES DE P CUBENSIS QUE ILUSTRAN EL
CRITERIO DE ESCOGENCIA DEL MEJOR ENSAYO REALIZADO (A) 05 GL FA (B) 15 GL FA 80
FIGURA 8 MUESTRA DE BIOMASA UNA VEZ ANALIZADA MEDIANTE EL REACTIVO DE DRAGENDORFF 107
FIGURA 9 PERFIL CROMATOGRAacuteFICO (TSUJIKAWA ET AL 2003) 108
xii
LISTA DE GRAacuteFICOS
GRAacuteFICO 1 CINEacuteTICA DE CRECIMIENTO MICELIAL DE P CUBENSIS EN MEDIO SUMERGIDO (FANG-ZHONG)
UTILIZANDO TRES DIFERENTES CONCENTRACIONES DE GLUCOSA COMO FUENTE DE CARBONO (PESO
SECO) 46
GRAacuteFICO 2 CRECIMIENTO MICELIAL DE P CUBENSIS EN CULTIVO SUMERGIDO BAJO TRES
CONCENTRACIONES DE GLUCOSA 47
GRAacuteFICO 3 VALORES DE CONCENTRACIOacuteN DE BIOMASA EXPERIMENTAL Y TEOacuteRICO GRAFICADOS CON
RESPECTO AL TIEMPO PARA LAS FERMENTACIONES CON DIFERENTES CONCENTRACIONES DE
GLUCOSA 49
GRAacuteFICO 4 CINEacuteTICA DE CRECIMIENTO MICELIAL DE P CUBENSIS EN MEDIO SUMERGIDO (FANG-ZHONG)
UTILIZANDO DIFERENTES CONCENTRACIONES DE SACAROSA COMO FUENTE DE CARBONO (PESO
SECO) 50
GRAacuteFICO 5 CRECIMIENTO MICELIAL PARA TRES DIFERENTES CONCENTRACIONES DE SACAROSA 52
GRAacuteFICO 6 VALORES DE CONCENTRACIOacuteN DE BIOMASA EXPERIMENTAL Y TEOacuteRICO GRAFICADOS CON
RESPECTO AL TIEMPO PARA LAS FERMENTACIONES CON DIFERENTES CONCENTRACIONES DE
SACAROSA 54
GRAacuteFICO 7 CRECIMIENTO MICELIAL PARA DOS DIFERENTES FUENTES DE CARBONO (GLUCOSA Y
SACAROSA) 56
GRAacuteFICO 8 CINEacuteTICA DE CRECIMIENTO MICELIAL DE P CUBENSIS EN MEDIO SUMERGIDO (FANG-ZHONG)
UTILIZANDO DIFERENTES CONCENTRACIONES DE FA Y 50 GL DE GLUCOSA COMO FUENTE DE
CARBONO (PESO SECO) 57
GRAacuteFICO 9 CRECIMIENTO MICELIAL PARA GLUCOSA A UNA CONCENTRACIOacuteN DE 50 GL Y TRES
DIFERENTES CONCENTRACIONES DE FA 59
GRAacuteFICO 10 VALORES DE CONCENTRACIOacuteN DE BIOMASA EXPERIMENTAL Y TEOacuteRICO GRAFICADOS CON
RESPECTO AL TIEMPO PARA LAS FERMENTACIONES CON DIFERENTES CONCENTRACIONES DE FA Y
50 GL DE GLUCOSA 61
GRAacuteFICO 11 CINEacuteTICA DE CONSUMO DE SUSTRATO POR PARTE DEL P CUBENSIS EN MEDIO SUMERGIDO
UTILIZANDO DIFERENTES CONCENTRACIONES DE GLUCOSA COMO FUENTE DE CARBONO 62
GRAacuteFICO 12 CINEacuteTICA DE CONSUMO DE SUSTRATO POR PARTE DEL P CUBENSIS EN MEDIO SUMERGIDO
UTILIZANDO DIFERENTES CONCENTRACIONES DE SACAROSA COMO FUENTE DE CARBONO 64
GRAacuteFICO 13 CONSUMO DE SUSTRATO PARA CADA UNA DE LAS FUENTES DE CARBONO UTILIZADAS 66
GRAacuteFICO 14 CINEacuteTICA DE CONSUMO DE SUSTRATO POR PARTE DEL P CUBENSIS EN MEDIO SUMERGIDO
UTILIZANDO 50 GL DE GLUCOSA COMO FUENTE DE CARBONO Y DIFERENTES CONCENTRACIONES DE
FA 67
GRAacuteFICO 15 CONSUMO DE SUSTRATO PARA CADA UNA DE LAS CONCENTRACIONES DE FA UTILIZADAS 68
GRAacuteFICO 16 CINEacuteTICA DE CONSUMO DE PROTEIacuteNA POR PARTE DEL P CUBENSIS EN MEDIO SUMERGIDO
UTILIZANDO DIFERENTES CONCENTRACIONES DE GLUCOSA COMO FUENTE DE CARBONO 70
GRAacuteFICO 17 CINEacuteTICA DE CONSUMO DE PROTEIacuteNA POR PARTE DEL P CUBENSIS EN MEDIO SUMERGIDO
UTILIZANDO DIFERENTES CONCENTRACIONES DE SACAROSA COMO FUENTE DE CARBONO 71
GRAacuteFICO 18 CONSUMO DE PROTEIacuteNA PARA CADA UNA DE LAS FUENTES DE CARBONO UTILIZADAS 73
xiii
GRAacuteFICO 19 CINEacuteTICA DE CONSUMO DE PROTEIacuteNA POR PARTE DEL P CUBENSIS EN MEDIO SUMERGIDO
UTILIZANDO 50 GL DE GLUCOSA COMO FUENTE DE CARBONO Y DIFERENTES CONCENTRACIONES DE
FA 74
GRAacuteFICO 20 CONSUMO DE PROTEIacuteNA PARA LOS ENSAYOS CON Y SIN FA 75
GRAacuteFICO 21 AacuteREA DEL COMPUESTO OBTENIDO DE P CUBENSIS EN TIEMPO DE RETENCIOacuteN ENTRE 62 Y
72 MINUTOS PARA LAS DOS FUENTES DE CARBONO 77
GRAacuteFICO 22 AacuteREA DEL COMPUESTO OBTENIDO DE P CUBENSIS EN TIEMPO DE RETENCIOacuteN ENTRE 62 Y
72 MINUTOS EN LOS UacuteLTIMOS TRES DIacuteAS DE LA FERMENTACIOacuteN CON FA Y GLUCOSA 79
GRAacuteFICO 23 AacuteREA DEL COMPUESTO OBTENIDO DE P CUBENSIS EN TIEMPO DE RETENCIOacuteN ENTRE 62 Y
72 MINUTOS PARA CADA UNA DE LAS FUENTES DE CARBONO UTILIZADAS 82
GRAacuteFICO 24 AacuteREA DEL COMPUESTO OBTENIDO DE P CUBENSIS EN TIEMPO DE RETENCIOacuteN ENTRE 62 Y
72 MINUTOS PARA CADA UNA DE LAS CONCENTRACIONES DE FA UTILIZADAS 85
GRAacuteFICO 25 CROMATOGRAMAS DEL DIacuteA 12 PARA EL P CUBENSIS CULTIVADO EN MEDIO SUMERGIDO
FANG-ZHONG CON DOS DIFERENTES TIPOS DE SUSTRATOS (A) 30 GL GLUCOSA (B) 30 GL SACAROSA
109
GRAacuteFICO 26 CROMATOGRAMAS DEL DIacuteA 12 PARA EL P CUBENSIS CULTIVADO EN MEDIO SUMERGIDO
FANG-ZHONG CON DOS DIFERENTES TIPOS DE SUSTRATOS (A) 50 GL GLUCOSA (B) 50 GL SACAROSA
110
GRAacuteFICO 27 CROMATOGRAMAS DEL DIacuteA 12 PARA EL P CUBENSIS CULTIVADO EN MEDIO SUMERGIDO
FANG-ZHONG CON DOS DIFERENTES TIPOS DE SUSTRATOS (A) 50 GL GLUCOSA (B) 50 GL SACAROSA
111
GRAacuteFICO 28 CROMATOGRAMA DEL DIacuteA 12 PARA EL P CUBENSIS CULTIVADO EN MEDIO SUMERGIDO
FANG-ZHONG CON FUENTE DE CARBONO GLUCOSA Y ADICIOacuteN DE FENILALANINA EN TRES
CONCENTRACIONES (A) 05 GL FA (B) 1 GL FA (C) 15GL FA 112
GRAacuteFICO 29 CROMATOGRAMAS DEL DIacuteA 13 PARA EL P CUBENSIS CULTIVADO EN MEDIO SUMERGIDO
FANG-ZHONG CON DOS DIFERENTES TIPOS DE SUSTRATOS (A) 30 GL GLUCOSA (B) 30 GL SACAROSA
113
GRAacuteFICO 30 CROMATOGRAMAS DEL DIacuteA 13 PARA EL P CUBENSIS CULTIVADO EN MEDIO SUMERGIDO
FANG-ZHONG CON DOS DIFERENTES TIPOS DE SUSTRATOS (A) 50 GL GLUCOSA (B) 50 GL SACAROSA
114
GRAacuteFICO 31 CROMATOGRAMAS DEL DIacuteA 13 PARA EL P CUBENSIS CULTIVADO EN MEDIO SUMERGIDO
FANG-ZHONG CON DOS DIFERENTES TIPOS DE SUSTRATOS (A) 70 GL GLUCOSA (B) 70 GL SACAROSA
115
GRAacuteFICO 32 CROMATOGRAMAS DEL DIacuteA 12 PARA EL P CUBENSIS CULTIVADO EN MEDIO SUMERGIDO
FANG-ZHONG CON FUENTE DE CARBONO GLUCOSA Y ADICIOacuteN DE FENILALANINA EN TRES
CONCENTRACIONES (A) 05 GL FA (B) 1 GL FA (C) 15GL FA 116
GRAacuteFICO 33 CROMATOGRAMAS DEL DIacuteA 14 PARA EL P CUBENSIS CULTIVADO EN MEDIO SUMERGIDO
FANG-ZHONG CON DOS DIFERENTES TIPOS DE SUSTRATOS (A) 30 GL GLUCOSA (B) 30 GL SACAROSA
117
GRAacuteFICO 34 CROMATOGRAMAS DEL DIacuteA 14 PARA EL P CUBENSIS CULTIVADO EN MEDIO SUMERGIDO
FANG-ZHONG CON DOS DIFERENTES TIPOS DE SUSTRATOS (A) 50 GL GLUCOSA (B) 50 GL SACAROSA
118
xiv
GRAacuteFICO 35 CROMATOGRAMAS DEL DIacuteA 14 PARA EL P CUBENSIS CULTIVADO EN MEDIO SUMERGIDO
FANG-ZHONG CON DOS DIFERENTES TIPOS DE SUSTRATOS (A) 70 GL GLUCOSA (B) 70 GL SACAROSA
119
GRAacuteFICO 36 CROMATOGRAMAS DEL DIacuteA 12 PARA EL P CUBENSIS CULTIVADO EN MEDIO SUMERGIDO
FANG-ZHONG CON FUENTE DE CARBONO GLUCOSA Y ADICIOacuteN DE FENILALANINA EN TRES
CONCENTRACIONES (A) 05 GL FA (B) 1 GL FA (C) 15GL FA (A) 05 GL FA (B) 1 GL FA (C)
15GL FA 120
xv
LISTA DE ECUACIONES
ECUACIOacuteN 1 ECUACIOacuteN LINEALIZADA DEL MODELO LOGIacuteSTICO 38
ECUACIOacuteN 2 VALORES TEOacuteRICOS DE BIOMASA EN EL TIEMPO 39
xvi
LISTAS DE ANEXOS
ANEXO 1 ANAacuteLISIS DE VARIANZA (ANOVA) PARA EL CRECIMIENTO DE BIOMASA DE LAS
FERMENTACIONES CON GLUCOSA _____________________________________________________ 90
ANEXO 2 ANAacuteLISIS DE VARIANZA (ANOVA) PARA EL CRECIMIENTO DE BIOMASA DE LAS
FERMENTACIONES CON SACAROSA ____________________________________________________ 91
ANEXO 3 ANAacuteLISIS DE VARIANZA (ANOVA) PARA EL CRECIMIENTO DE BIOMASA DE LAS
FERMENTACIONES CON GLUCOSA Y SACAROSA __________________________________________ 92
ANEXO 4 ANAacuteLISIS DE VARIANZA (ANOVA) PARA EL CRECIMIENTO DE BIOMASA DE LAS
FERMENTACIONES CON GLUCOSA 50 GL Y FA ___________________________________________ 93
ANEXO 5 ANAacuteLISIS DE VARIANZA (ANOVA) PARA EL CONSUMO DE SUSTRATO EN LAS FERMENTACIONES
SIN FA ____________________________________________________________________________ 94
ANEXO 6 ANAacuteLISIS DE VARIANZA (ANOVA) PARA EL CONSUMO DE SUSTRATO EN LAS FERMENTACIONES
CON FA ___________________________________________________________________________ 95
ANEXO 7 ANAacuteLISIS DE VARIANZA (ANOVA) PARA EL CONSUMO DE PROTEIacuteNA EN LAS FERMENTACIONES
SIN FA ____________________________________________________________________________ 96
ANEXO 8 ANAacuteLISIS DE VARIANZA (ANOVA) PARA EL CONSUMO DE PROTEIacuteNA EN LAS FERMENTACIONES
CON FA ___________________________________________________________________________ 97
ANEXO 9 ANAacuteLISIS DE VARIANZA (ANOVA) PARA LA PRODUCCIOacuteN DE PSILOCIBINA EN LAS
FERMENTACIONES SIN FA ____________________________________________________________ 98
ANEXO 10 ANAacuteLISIS DE VARIANZA (ANOVA) PARA LA PRODUCCIOacuteN DE PSILOCIBINA EN LAS
FERMENTACIONES CON FA ___________________________________________________________ 99
ANEXO 11 ANAacuteLISIS DE VARIANZA (ANOVA) PARA LA CUANTIFICACIOacuteN PORCENTUAL DE PSILOCIBINA EN
LAS FERMENTACIONES SIN FA _______________________________________________________ 100
ANEXO 12 ANAacuteLISIS DE VARIANZA (ANOVA) PARA LA CUANTIFICACIOacuteN PORCENTUAL DE PSILOCIBINA EN
LAS FERMENTACIONES CON FA ______________________________________________________ 101
ANEXO 13 DETERMINACIOacuteN DE CONSUMO DE AZUacuteCARES POR EL MEacuteTODO DE DNS (AacuteCIDO
DINITROSALICIacuteLICO) ________________________________________________________________ 102
ANEXO 14 CINEacuteTICA DE CONSUMO DE SUSTRATO ___________________________________________ 104
ANEXO 15 DETERMINACIOacuteN DE CONSUMO DE PROTEIacuteNAS POR EL MEacuteTODO DE LOWRY ____________ 105
ANEXO 16 CINEacuteTICA CONSUMO DE PROTEIacuteNA ______________________________________________ 106
ANEXO 17 PRUEBA DE REACTIVO DE DRAGENDORFF _________________________________________ 107
ANEXO 18 BARRIDO ESPECTRAL PARA EL PSILOCYBE CUBENSIS _________________________________ 108
ANEXO 19 CROMATOGRAMAS (HPLC) DEL DIacuteA 12 DE FERMENTACIOacuteN ___________________________ 109
ANEXO 20 CROMATOGRAMAS (HPLC) DEL DIacuteA 13 DE FERMENTACIOacuteN __________________________ 113
ANEXO 21 CROMATOGRAMAS (HPLC) DEL DIacuteA 14 DE FERMENTACIOacuteN __________________________ 117
xvii
RESUMEN
El Psilocybe cubensis es un hongo de gran importancia a nivel industrial gracias a
la presencia de una sustancia llamada Psilocibina en su cuerpo fructiacutefero
Dicho alcaloide derivado de la triptamina es muy similar al neurotransmisor
serotonina el cual es responsable de la percepcioacuten sensorial la regulacioacuten de la
temperatura el inicio del reposo nocturno del hiacutegado y los rintildeones Por tal motivo
este estudio se enfocoacute en la produccioacuten de la Psilocibina mediante el cultivo del P
cubensis en medio sumergido (Fang-Zhong)
Se evaluaron los efectos de dos fuentes de carbono (glucosa y sacarosa) a tres
concentraciones diferentes en cultivo sumergido para Psilocybe cubensis con el
fin de determinar la incidencia de eacutestas en la produccioacuten de biomasa y en la
produccioacuten y presencia de Psilocibina alcaloide de intereacutes Para las
concentraciones de glucosa de 30 gL 50 gL y 70 gL se presentoacute un crecimiento
maacuteximo de biomasa de 048 gL 055 gL y 062 gL y un porcentaje de alcaloide
de 6065 wv 7396 wv y 6733 wv respectivamente Esto uacuteltimo si se
asume que el tiempo de retencioacuten oscila entre 62 y 72 minutos contaacutendose con
una fase moacutevil de HCOONH4 en una columna C18 Mientras que para las mismas
concentraciones de sacarosa se presentoacute un crecimiento maacuteximo de biomasa de
026 gL 045 gL y 057 gL con porcentajes del compuesto presente entre el
rango de 62 y 72 minutos de 3664 wv 5857 wv y 5583 wv
respectivamente
Una vez realizada la investigacioacuten se encontroacute que las diferencias existentes en
cuanto a la cantidad de biomasa generada con respecto al tipo de sustrato
utilizado no fueron significativas es decir era irrelevante si se utilizaba glucosa o
sacarosa como principal fuente de carbono para la fermentacioacuten del P cubensis
xviii
en medio sumergido con el fin de obtener biomasa sin embargo se hallaron
diferencias significativas con respecto a las diferentes concentraciones empleadas
de dichas fuentes de carbono
Al analizar las muestras mediante cromatografiacutea liacutequida de alta eficiencia (HPLC)
se determinoacute que el medio que conteniacutea 50 gL de glucosa era el deseado debido
a que fue en eacuteste donde se presentaron picos maacutes definidos mostrando una mejor
resolucioacuten del compuesto Adicionalmente presentoacute un buen crecimiento micelial
Una vez elegido dicho criterio se evaluoacute el efecto que teniacutea la adicioacuten de un
aminoaacutecido llamado Fenilalanina (FA) al medio que conteniacutea 50 gL de glucosa
con el fin de determinar si eacuteste teniacutea alguna incidencia positiva en la produccioacuten de
biomasa y en la generacioacuten del alcaloide de intereacutes cabe resaltar que se utilizaron
diferentes concentraciones de FA correspondientes a 05 gL 10 gL y 15 gL
Finalizados dichos ensayos se obtuvieron valores de crecimiento de biomasa
maacutexima de 106 gL 108 gL y 101 gL y un porcentaje de aacuterea de 7549 wv
6236 wv y 2721 wv respectivamente
Es necesario hacer hincapieacute en que las diferencias obtenidas mediante el anaacutelisis
estadiacutestico entre cada una de las concentraciones de FA con respecto a la
generacioacuten de biomasa y la produccioacuten del compuesto no fueron significativas lo
que llevoacute a elegir una concentracioacuten de 05 gL de FA debido a que fue la menor
cantidad utilizada de este compuesto durante la investigacioacuten suponieacutendose asiacute
una disminucioacuten en los costos de materia prima
Palabras claves
Psilocybe cubensis Psilocibina Alcaloide HPLC Cultivo Sumergido Fuentes de
Carbono Fenilalanina
19
INTRODUCCIOacuteN
Los hongos son una rica fuente de productos naturales con una alta actividad
bioloacutegica Desafortunadamente el cultivo de eacutestos en cuerpo fructiacutefero toma
varios meses disminuyendo su calidad debido a los cambios climaacuteticos y plagas
por tal razoacuten se implementoacute la metodologiacutea de medio sumergido la cual es
prometedora gracias a una alta productividad de compuestos bioactivos (Arora
1986)
El Geacutenero Psilocybe pertenece al Reino Fungiacute con un Phylum Basidiomicota
una Clase Homobasidiomicetes un Orden Agaricales una Familia Strofariaceae
(Paris y Hurabielle 1981)
Dicho geacutenero es considerado de gran importancia a nivel mundial debido a que su
cuerpo fructiacutefero y biomasa micelial contienen Psilocibina la cual posee un alto
valor para la industria farmaceacuteutica por su uso en la elaboracioacuten de productos
antidepresivos Este alcaloide derivado de FA cuenta con una estructura muy
similar al neurotransmisor segregado por el cerebro llamado serotonina que
controla el estado de aacutenimo el suentildeo el hiacutegado y los rintildeones (Mandrile et al
1984) esta caracteriacutestica le otorga la gran importancia a la Psilocibina en el
mercado puesto que tiene un alto impacto en la sociedad como ayudante
antidepresivo debido a que no todas las personas segregan la cantidad necesaria
(10 mg con liacutemites que variacutean desde 5 a 20 mg) de serotonina (Mandrile et al
1984) Adicionalmente se estaacute empleando como una gran ayuda para la
disminucioacuten de la adiccioacuten a sustancias como heroiacutena y cocaiacutena gracias a que
este alcaloide no genera dependencia (Lee et al 2004)
Debido a que su consumo puede generar alucinaciones era consumido por las
culturas aboriacutegenes centroamericanas con el fin de realizar manifestaciones
20
religiosas Su uso se remonta a maacutes de 3500 antildeos y era nombrado por los
aztecas como ―Teonunaltl que significa ―carne de dioses (Mandrile et al 1984)
La alternativa que se utilizoacute durante esta investigacioacuten fue el cultivo del P
cubensis mediante medio sumergido debido principalmente a las notables
ventajas frente a los sistemas convencionales que eacuteste posee entre las cuales se
destacan la disminucioacuten del tiempo para la obtencioacuten de la biomasa (14 diacuteas) y la
reduccioacuten de los costos de obtencioacuten (Lee et al 2004) De acuerdo a lo
dimensionado anteriormente este estudio estaba orientado primordialmente a la
buacutesqueda de alternativas que permitieran la produccioacuten de biomasa de forma
raacutepida y confiable
Con el fin de llevar a cabo lo dicho anteriormente se pretendioacute evaluar el efecto
del uso de dos diferentes fuentes de carbono en este caso glucosa y sacarosa en
el crecimiento micelial de la cepa P cubensis
21
OBJETIVOS
GENERAL
Evaluar el efecto de la fuente de carbono en el crecimiento micelial de una
cepa Psilocybe sp
ESPECIacuteFICOS
Evaluar la cineacutetica de crecimiento de la cepa Psilocybe cubensis en los
diferentes medios de cultivo sumergido mediante la cuantificacioacuten de
biomasa por medio de la metodologiacutea de peso seco
Evaluar el consumo de sustrato para los diferentes ensayos por medio de
teacutecnicas espectrofotomeacutetricas
Determinar la presencia de Psilocibina mediante el uso del reactivo de
Dragendorff
22
1 MARCO TEOacuteRICO
11 CONCEPTOS GENERALES DE HONGOS
Los hongos son organismos eucariotas que no contienen clorofila con nutricioacuten
por absorcioacuten generalmente con reproduccioacuten sexual y asexual el cuerpo
consiste generalmente de filamentos ramificados con pared celular quitinosa
(Miles y Chang 1999)
Constituyen uno de los grupos de organismos maacutes importantes para la vida del
hombre ya que son los responsables de gran parte de la descomposicioacuten de la
materia orgaacutenica aumentando su disponibilidad en el suelo pueden ser
comestibles venenosos o psicotroacutepicos muchos son patoacutegenos otros producen
ciertas sustancias beneficiosas o intervienen en procesos de elaboracioacuten de
algunos comestibles (Miles y Chang 1999)
111 Hongos laminares (Agaricales)
El orden Agaricales tambieacuten conocido como Euagaricales es el mayor orden de
setas y hongos que incluye maacutes de la mitad de todas las especies conocidas de la
clase Homobasidiomycetes (Hibbett et al 1997 Hibbett y Thorn 2001) Maacutes de
9000 especies y alrededor de 350 geacuteneros se han atribuido a este orden que
contiene 26 familias (Kirk et al 2001) Un consenso de mayor nivel de
clasificacioacuten de los Agaricales ha sido difiacutecil de lograr debido a la competencia de
sistemas que restringen geacuteneros y familias (o incluso orden) de diferentes
maneras (Bas 1998 Juumllich 1981 Kirk et al 2001 Kuumlhner 1980 Singer 1986)
23
La base para la clasificacioacuten de los hongos fue construida por Fries (1874) quien
hizo hincapieacute en las caracteriacutesticas macroscoacutepicas como la textura del tallo la
separacioacuten de los filamentos (laminas) presencia o ausencia de velo y color de las
esporas
Posteriormente dividioacute los hongos Agaricales en varias especies de acuerdo al
color de las esporas depositadas las cuales pueden ser de color blanco rosado
marroacuten puacuterpura ndash marroacuten y negro El sistema macroscoacutepico de Fries que
reconocioacute inicialmente 12 geacuteneros de hongos carnosos que forman los hongos es
taxonoacutemicamente praacutectico Eacuteste fue relativamente invariable hasta que Fayod
(1989) estudioacute la anatomiacutea y las caracteriacutesticas microscoacutepicas de muchos
Agaricales reconociendo 108 geacuteneros (Arora 1986)
Al igual que todas las setas los hongos laminares son faacutebricas de esporas
creados con el uacutenico propoacutesito de fabricar esporas microscoacutepicas para dejarse
llevar por las corrientes de aire y con suerte caer en un lugar adecuado en la
tierra para germinar y comenzar un nuevo organismo Las probabilidades de que
cualquier individuo que tiene esporas de este tipo tenga suerte son tan bajas que
el hongo produce millones de esporas para compensar esto En las laacuteminas se
encuentran numerosas esporas las cuales aumentan considerablemente el
nuacutemero de esporas que el hongo puede producir Ambos lados de cada laacutemina
estaacute cubierta con esporas microscoacutepicas (Kuo 2007) A continuacioacuten se muestra
de manera ilustrativa en la figura 1 las laacuteminas que poseen los hongos Agaricales
en las cuales se da la formacioacuten de las esporas
Figura 1 Hongo Agaricales (Laminar) (Kuo 2007)
24
12 MEDIOS DE CULTIVO
Uno de los sistemas maacutes importantes para la identificacioacuten de microorganismos es
observar su crecimiento en sustancias alimenticias artificiales preparadas en el
laboratorio El material alimenticio en el que crecen los microorganismos es el
medio de cultivo (Garciacutea 1995)
Para que los microorganismos crezcan adecuadamente en un medio de cultivo
artificial eacuteste debe reunir una serie de condiciones como lo son temperatura
grado de humedad y presioacuten asiacute como un grado correcto de acidez o alcalinidad
Un medio de cultivo contiene los nutrientes y factores de crecimiento necesarios
para que el microorganismo se desarrolle correctamente y debe estar exento de
cualquier tipo de microorganismo que pueda generar contaminacioacuten (Garciacutea
1995)
121 Tipos de medios de cultivo
En la actualidad existen diversos tipos de medio de cultivo si se centra en la
composicioacuten eacutestos pueden ser medios sinteacuteticos que contienen fuente de
carbono fuente de nitroacutegeno sales que suplan los iones y demaacutes elementos tales
como estimuladores del crecimiento medios complejos que contienen ingredientes
tales como extracto de levadura peptona infusioacuten de cerebro etc ricos en
nutrientes medios de enriquecimiento siendo estos complejos con aditivos
adicionales para favorecer asiacute al crecimiento y desarrollo de determinados
microorganismos medios selectivos los cuales son disentildeados para favorecer el
crecimiento especiacutefico de un microorganismo determinado o un grupo
microbiano medios diferenciales que proporcionan la distincioacuten microbiana de una
mezcla por sus propiedades diferenciales de crecimiento en dichos medios
medios de mantenimiento siendo disiacutemiles de los de crecimiento oacuteptimo por el
25
crecimiento raacutepido y proliacutefico que deriva en la muerte raacutepida de las ceacutelulas (Garciacutea
1995)
Atendiendo a su estado los medios de cultivo pueden presentarse como medios
sumergidos y medios soacutelidos que contienen agar que gelifica por debajo de 45
degC y cuya concentracioacuten en su uso es de 15 y medios semisoacutelidos que contiene
un agar a una concentracioacuten de 07 (Garciacutea 1995)
121 Medio sumergido
Debido a que cultivar el cuerpo fructiacutefero toma varios meses y se dificulta el control
de calidad del producto final porque se estaacute sujeto a los cambios permanentes del
clima y las plagas se ha empleado la metodologiacutea de medio sumergido la cual es
una alternativa muy prometedora para la produccioacuten eficiente del micelio y de los
metabolitos (Lindequist y Niedermeyer 2005)
Dicha forma es la mejor para producir extraer y purificar metabolitos de un cultivo
de hongo ya que facilita una mayor produccioacuten de biomasa en menor tiempo y
de mayor calidad que el cultivo en medio soacutelido ademaacutes facilita la dispersioacuten y
adaptacioacuten del hongo y reduce los vectores de contaminacioacuten De igual forma un
cultivo de esta iacutendole es la opcioacuten maacutes viable si se quiere escalar procesos
fermentativos en aras de desarrollar mercados como en este caso el de
metabolitos medicinales (Navarro et al 1998)
A su vez el uso de cultivo sumergido puede beneficiar la produccioacuten de muchos
metabolitos secundarios y disminuir los costos de produccioacuten por reducir las
labores que involucran los meacutetodos de etapas soacutelidas (Domiacutenguez y Webb 2003)
Los metabolitos bioactivos de los hongos pueden ser potencialmente producidos a
nivel industrial mediante el uso de la metodologiacutea de cultivo sumergido pero el
26
eacutexito a escala comercial depende del costo comparado con la tecnologiacutea existente
y la ventaja econoacutemica que la industria puede ver usando este meacutetodo El uso de
la tecnologiacutea puede ser facilitada por el aumento en el rendimiento de la
produccioacuten y el desarrollo del sistema (Hwang et al 2004)
El cultivo de hongos sumergidos se caracteriza por un aumento en la viscosidad
del caldo con el tiempo debido a uno o maacutes factores tales como el aumento de la
concentracioacuten de ceacutelulas los cambios de la morfologiacutea del crecimiento o la
produccioacuten de productos extracelulares que alteran el caraacutecter reoloacutegico de la
cultura del liacutequido El aumento en la viscosidad puede ser visto como un fenoacutemeno
indeseable pero inevitable ya que causan dificultades en el suministro de oxiacutegeno
en la eliminacioacuten de dioacutexido de carbono y en posibles problemas de agitacioacuten
(Hwang et al 2004)
13 ALCALOIDES
131 Generalidades
La diversidad estructural y la variedad en la actividad bioloacutegica hacen de los
alcaloides como tambieacuten de los antibioacuteticos los grupos maacutes importantes entre las
sustancias naturales de intereacutes terapeacuteutico (Paris y Hurabielle 1981)
Se han aislado principalmente en plantas superiores y se han encontrado en maacutes
de 100 familias de Faneroacutegamas (aquellas plantas que se reproducen por semillas
producidas en sus inflorescencias) Su actividad bioloacutegica a nivel del sistema
nervioso dio pie a las primeras investigaciones siendo los alcaloides las primeras
sustancias naturales estudiadas (Paris y Hurabielle 1981)
El teacutermino alcaloide propuesto por el farmaceacuteutico W Meissner en 1819 se aplicoacute
a los compuestos de origen vegetal con propiedades alcalinas este caraacutecter
baacutesico es debido a la presencia de nitroacutegeno amiacutenico en su estructura Los
27
alcaloides se pueden considerar como ―Un compuesto orgaacutenico de origen natural
nitrogenado derivados generalmente de aminoaacutecidos maacutes o menos baacutesico de
distribucioacuten restringida con propiedades farmacoloacutegicas importantes a dosis bajas
y que responden a reacciones comunes de precipitacioacuten (Paris y Hurabielle
1981)
132 Propiedades fisicoquiacutemicas
Los alcaloides tienen masas moleculares que variacutean entre 100 y 9000 gmol son
casi siempre incoloros son normalmente soacutelidos a temperatura ambiente a
excepcioacuten de los alcaloides no oxigenados Los alcaloides son poco solubles en
agua gracias a su caraacutecter baacutesico dicho caraacutecter se debe al par de electrones
libres del nitroacutegeno (Paris y Hurabielle 1981)
En la naturaleza se encuentran en forma de sales generalmente En las plantas
se consideraba que eran productos obtenidos durante la extraccioacuten y poco
solubles en disolventes tiacutepicos de extraccioacuten por su polaridad Son solubles en
disolventes orgaacutenicos como cloroformo etanol metanol acetato de etilo eacuteter
benceno En forma de sales son solubles en agua excepto las sales de berberina
(Paris y Hurabielle 1981)
Todos los alcaloides son activos a la luz polarizada Presentan una fluorescencia
caracteriacutestica bajo la luz UV o IR dando lugar a espectros caracteriacutesticos (Paris y
Hurabielle 1981)
133 Reconocimiento de los alcaloides
Las teacutecnicas de reconocimiento son basadas en la capacidad que tienen los
alcaloides en estado de sal (extractos aacutecidos) de combinarse con el yodo y
metales pesados como bismuto mercurio tungsteno formando precipitados se
28
utilizan reactivos generales para detectar alcaloides como reactivo de Wagner
reactivo de Mayer reactivo de Dragendorff reactivo de Hager reactivo de
Bertrand reactivo de Ehrlich y reactivo de Vitali-Morin (Paris y Hurabielle 1981)
134 Clasificacioacuten de los alcaloides
Habitualmente los alcaloides se han clasificado en funcioacuten de su estructura
distinguieacutendose principalmente los compuestos heterociacuteclicos de los no
heterociacuteclicos Actualmente existen varias formas de clasificarlos (Bruneton
1987) entre ellas se pueden distinguir
1341 Alcaloides alifaacuteticos
a Derivados de la ornitina (pirrolidinas tropaacutenicos pirrolizidiacutenicos)
b Derivados de la lisina (piperidinas quinolizidiacutenicos)
1342 Alcaloides de origen diverso
a Alcaloides terpeacutenicos y esteroidales
b Alcaloides diversos (purinas macrociclos etc)
1343 Alcaloides aromaacuteticos
a Derivados del aacutecido nicotiacutenico (piridinas)
b Derivados de la fenilalanina y tirosina (isoquinoleinas)
c Derivados del triptofano (indoacutelicos quinoleinas)
d Derivados de la histidina (imidazoles)
29
Alcaloides derivados del triptofano (Alcaloides Indoacutelicos)
Desde el punto de vista farmacoloacutegico ha habido mucho intereacutes sobre las bases
que contienen el nuacutecleo indoacutelico a raiacutez del descubrimiento de la actividad
alucinoacutegena del LSD asiacute como la actividad sedante de la reserpina aislada del
geacutenero Rauwolfia El auge del estudio fitoquiacutemico ocurrioacute en la deacutecada de los 60 y
se dirigiacutea principalmente a la familia Apocynaceae (Mercano y Hasegawa 1991)
Existen unos 800 alcaloides de este tipo distribuidos principalmente en la familia
Apocynaceae (geacuteneros Rauwolfia Aspidos-perma Strychnos y Vinca) menos
frecuentes en hongos y familias como Leguminoseae Malphigiaceae Rubiaceae y
Rutaceae donde los alcaloides presentan el grupo indoacutelico sencillo (Mercano y
Hasegawa 1991)
El triptofano es el precursor de estos alcaloides los cuales se clasifican en
triptaminas y en no triptaminas las triptaminas a su vez se subdividen en b-
carbolinas y en indoleninas y pueden ser triptaminas simples o triptaminas
complejas y estas pueden ser isopreacutenicas o no isopreacutenicas (Mercano y Hasegawa
1991) La figura 2 muestra la estructura quiacutemica del triptofano triptamina y sus
divisiones
Figura 2 Alcaloides derivados del Triptofano (Mercano y Hasegawa 1991)
30
Triptaminas simples
Las triptaminas simples juegan un importante papel en la cultura indiacutegena de
Ameacuterica por sus efectos alucinoacutegenos y extaacuteticos en sus ceremonias maacutegico
religiosas (Furst 1994) Se han encontrado en hongos alucinoacutegenos de
Mesoameacuterica del geacutenero Psilocybe Stropharia y Conocybe (―teonacatl o ―carne
de los dioses) usados por los indios Aztecas en sus ceremonias religiosas desde
hace maacutes de 1700 antildeos Se han encontrado en estos hongos los alcaloides
alucinoacutegenos la Psilocina y la Psilocibina que al ingerirlos produce diferentes
sensaciones auditivas y visuales relajacioacuten muscular depresiones y euforias
alternadas (Mercano y Hasegawa 1991)
La serotonina que juega un importante papel en la actividad neuronal se
encuentra tambieacuten en vegetales Se ha aislado en el pericarpio del banano el cual
seco cuando es fumado actuacutea como un alucinoacutegeno ligero (Seigler 1981)
De las glaacutendulas paroacutetidas del sapo comuacuten Bufo vulgaris se aiacutesla la bufotenina
derivado N-dimetilado de la serotonina que tambieacuten es el principio activo del Yopoacute
polvo de las semillas de Anadenanthera peregrina (Piptadenia peregrina)
Leguminoseae y especies del geacutenero Virola (Myristicaceae) que contiene tambieacuten
triptaminas son mezclados con cenizas e inhalados por medio de tubos de bambuacute
por los indiacutegenas del Orinoco en ceremonias maacutegico religiosas produciendo
alucinacioacuten e incoordinacioacuten motriz (Seigler 1981)
En la figura 3 se observan las estructuras de aquellos compuestos que estaacuten
clasificados como triptaminas simples
31
Figura 3 Triptaminas simples (Seigler 1981)
13 PSILOCIBINA Y PSILOCINA
La Psilocibina y la Psilocina son bioloacutegicamente sintetizadas en los hongos
pertenecientes a los geacuteneros de Psilocybe (Bigwood y Beug 1982 Wurst et al
1984)
La Psilocibina y la Psilocina se han identificado en todo el mundo en una variedad
de setas que son llamados hongos maacutegicos La ingestioacuten de pequentildeas
cantidades de alucinoacutegenos provoca el eacutextasis La actividad alucinoacutegena de la
Psilocibina es relativamente maacutes baja que la de la Psilocina Sin embargo la
Psilocibina se convierte faacutecilmente en Psilocina (componente activo principal) en
los sistemas bioloacutegicos Asiacute el desarrollo de un meacutetodo de determinacioacuten de la
Psilocibina es importante lo misma que la de la Psilocina (Kimie et al 2005)
La hidroacutelisis de la Psilocibina se consigue saturando con anhiacutedido carboacutenico una
solucioacuten acuosa de Psilocibina (para eliminar el oxiacutegeno del aire y calentaacutendola)
obteniendo asiacute una moleacutecula de 4hidroxi-dimetiltriptamina y una moleacutecula de aacutecido
fosfoacuterico (Mandrile et al 1984)
Como todos los faacutermacos derivados del indol estas sustancias han despertado
intereacutes porque se sospechoacute la posibilidad de que algunas de ellas se formen en el
32
organismo y que en ciertas psicosis especialmente en la esquizofrenia se
produzcan elevados niveles sanguiacuteneos que ocasionan algunos de los siacutentomas
(Mandrile et al 1984)
La figura 4 muestra la estructura quiacutemica de alcaloides como la Psilocibina y
Psilocina
Figura 4 Psilocibina y Psilocina (Mandrile et al 1984)
131 Antecedentes acerca de la obtencioacuten de Psilocibina y Psilocina
Una gran variedad de meacutetodos cromatograacuteficos para la determinacioacuten de
Psilocibina y Psilocina presentes en las incautaciones de hongos se han
publicado La cromatografiacutea de capa fina es utilizada debido a que eacutesta es muy
apropiada para la deteccioacuten de sustancias derivadas del triptofano (Brown et al
1972 Tanimukai 1967 Beug y Bigwood 1981) Aun asiacute meacutetodos que involucran
tanto la cromatografiacutea de alta eficiencia (HPLC) como la deteccioacuten fotomeacutetrica de
UV (Beug y Bigwood 1981 Wurst et al 1984 Borner y Brenneisen 1987 Perkal
et al 1980 Vanhaelen-Faestreacute y Vanhaelen 1984 Thomson 1980 White 1979
Sottolano y Lurie 1983) fueron establecidas y optimizadas para la cuantificacioacuten
de Psilocibina
Durante los uacuteltimos antildeos se han venido utilizando diferentes tipos de columna y
fase moacutevil con el fin de obtener la mayor cantidad posible de la sustancia de
intereacutes (Psilocibina)
33
En el antildeo 1981 en el instituto farmaceacuteutico de la Universidad de Oslo realizaron
una investigacioacuten con una columna de siacutelice con una fase moacutevil de metanol-nitrato
de amonio en donde no soacutelo se logroacute obtener Psilocibina y Psilocina sino tambieacuten
un nuevo producto conocido como beocistiacuten Se logroacute un porcentaje de separacioacuten
maacutexima de 75 ww (Christiansen et al 1981)
Asimismo en el antildeo 1984 en el instituto de microbiologiacutea de Amsterdam se
realizoacute un estudio con una columna C18 de siacutelice y una fase moacutevil de agua-etanol-
aacutecido aceacutetico de forma isocraacutetica en donde se obtuvo un porcentaje 025-115
y 002-016 de Psilocibina y Psilocina respectivamente en el hongo (Wurst
1984)
De igual manera en el antildeo 2003 en el instituto de ciencia policiaca en Japoacuten se
ejecutoacute la cromatografiacutea de alta eficiencia utilizando una columna C18 con una
fase moacutevil de aacutecido foacutermico de forma isocraacutetica y un detector de 220 nm un rango
de porcentaje de Psilocibina 014-042 wv en la capa mientras un 009-03
wv en el tallo (Tsujikawa et al 2003)
34
2 MATERIALES Y MEacuteTODOS
21 LOCALIZACIOacuteN
Las fermentaciones la medicioacuten del crecimiento micelial y la cuantificacioacuten del
consumo del sustrato y de proteiacutena se llevaron a cabo en el laboratorio de
Biotecnologiacutea de la Universidad EAFIT mientras que los anaacutelisis de cromatografiacutea
liacutequida de alta eficiencia (HPLC) se realizaron en el laboratorio de Quiacutemica
Instrumental de dicha Universidad
22 MICROORGANISMO DE ESTUDIO
La cepa del hongo Psilocybe cubensis (EAH01) con la cual se trabajoacute fue donada
por Joseacute Rodrigo Moreno Ingeniero del laboratorio de la Universidad Catoacutelica de
Oriente (UCO) La EAH01 permanece auacuten en el laboratorio de Biotecnologiacutea de la
Universidad EAFIT
Dicha cepa se cultivoacute en una caja Petri que conteniacutea Agar Extracto de Malta
(MEA) y se incuboacute a 30ordmC en una incubadora digital del laboratorio de
Biotecnologiacutea de la Universidad EAFIT La figura 5 representa una cepa de P
cubensis cultivada en medio soacutelido MEA
Figura 5 Psilocybe cubensis (EAH01) cultivada en medio soacutelido Agar Malta
35
23 COMPONENTES DEL MEDIO DE CULTIVO (FANG-ZHONG)
El medio sumergido utilizado para llevar a cabo las diferentes fermentaciones de
P cubensis fue el descrito por Fang-Zhong (2002) La tabla 1 muestra los
componentes de dicho medio y la concentracioacuten de cada uno de ellos Se destaca
que las fuentes de carbono utilizadas fueron glucosa y sacarosa usaacutendolas cada
una por separado para cada experimento y haciendo variaciones de
concentraciones de las mismas para los distintos ensayos
Tabla 1 Composicioacuten del medio de cultivo sumergido para evaluar el crecimiento micelial del P cubensis
Componentes Cantidad (gL)
Fuente de Carbono 30 ndash 50 - 70
Peptona 5
Extracto de levadura 5
KH2PO4 1
MgSO47H2O 05
Vitamina B1 005
24 PREPARACIOacuteN DE LOS DIFERENTES PREINOacuteCULOS DE P cubensis
EMPLEADOS PARA LAS FERMENTACIONES SUMERGIDAS
Con el propoacutesito de llevar a cabo cada uno de los ensayos fue necesario realizar
la preparacioacuten de un preinoacuteculo eacutesto con el fin de realizar un proceso de
adaptacioacuten del P cubensis al medio favoreciendo la disminucioacuten en cuanto a
tiempo (preferiblemente la eliminacioacuten de la aparicioacuten de un fase de latencia una
vez comenzada la fermentacioacuten)
La preparacioacuten de cada uno de los preinoacuteculos se realizoacute en 6 erlenmeyers de
1000 mL con 200 mL de medio cada uno los cuales fueron esterilizados a 120degC
por 15 minutos e inoculados con 4 discos de 5 mm aproximadamente de P
36
cubensis provenientes de la cepa previamente activada en Agar Malta durante 6
diacuteas Los erlenmeyers se llevaron a un agitador orbital por 6 diacuteas a 30ordmC y 100
rpm
25 PREPARACIOacuteN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO Y LOS INOacuteCULOS DE P
cubensis UTILIZADOS PARA LAS FERMENTACIONES SUMERGIDAS
Una vez realizado el preinoacuteculo se procedioacute a preparar los medios de cultivo
utilizados para realizar los distintos experimentos de la siguiente manera se
prepararon medios que diferiacutean en la fuente de carbono (glucosa o sacarosa) y en
la concentracioacuten de la misma (30 gL 50 gL y 70 gL) teniendo asiacute un total de
seis fermentaciones Las demaacutes cantidades de los componentes del medio de
Fang-Zhong fueron las mismas que las usadas en el preinoacuteculo descritas en la
Tabla 1
En primer lugar se llevaron a cabo las tres fermentaciones de glucosa
preparando un total de 90 erlenmeyers (30 por cada concentracioacuten de azuacutecar por
duplicado) cada uno de los frascos conteniacutea 50 mL del medio en erlenmeyers de
250 mL e inoculados con 01 g de peso huacutemedo del preinoacuteculo aproximadamente
Los 90 frascos se llevaron durante 14 diacuteas a un agitador orbital a 100 rpm con una
temperatura de 30 degC
Posteriormente se llevaron a cabo las tres fermentaciones de sacarosa siguiendo
el mismo proceso descrito anteriormente para la glucosa
Una vez terminadas las fermentaciones de glucosa y sacarosa y realizados todos
los anaacutelisis correspondientes (generacioacuten de biomasa consumo de sustrato
consumo de proteiacutena y evaluacioacuten de la presencia de Psilocibina por medio de
cromatografiacutea liacutequida de alta eficiencia (HPLC)) se procedioacute a elegir la fuente de
carbono y concentracioacuten que mejores resultados arrojoacute tanto para la generacioacuten
37
de biomasa como para la produccioacuten del alcaloide con el fin de evaluarla
nuevamente adicionaacutendole un precursor (FA)
Para finalizar se procedioacute a preparar los medios con la fuente de carbono y la
concentracioacuten de la misma que arrojoacute mejores resultados es decir los ensayos
realizados con una concentracioacuten de 50 gL de glucosa adicionaacutendole al medio
FA a diferentes concentraciones correspondiente a valores de 05 gL 10 gL y
15 gL las demaacutes cantidades de los componentes remanentes del medio fueron
las mismas que las descritas anteriormente en la tabla 1
26 CUANTIFICACIOacuteN DEL CRECIMIENTO DE BIOMASA MEDIANTE LOS
MEacuteTODOS DE PESO HUacuteMEDO Y PESO SECO PARA CULTIVO
SUMERGIDO DE P cubensis
La cuantificacioacuten de biomasa para cada uno de los tratamientos se realizoacute usando
la metodologiacutea de peso huacutemedo y peso seco Para la cuantificacioacuten de biomasa
mediante el meacutetodo de peso huacutemedo se tomaron dos muestras provenientes de
cada erlenmeyer cada 24 horas las cuales fueron filtradas y pesadas con el fin de
obtener el valor de peso huacutemedo para cada tratamiento del P cubensis
Posteriormente la biomasa retenida en el papel filtro fue llevada a un secador que
se encontraba a una temperatura de 50ordmC durante 24 horas transcurrido el
tiempo la biomasa seca fue pesada con el fin de obtener datos de peso seco
Durante los 14 diacuteas de la fermentacioacuten se obtuvieron datos de peso huacutemedo y
peso seco por duplicado para cada una de las fermentaciones
27 AJUSTE DE LA CINEacuteTICA DE CRECIMIENTO DE P cubensis AL
MODELO CINEacuteTICO LOGIacuteSTICO
Una vez realizada la recoleccioacuten de muestras para cada uno de los ensayos y su
posterior anaacutelisis se decidioacute modelar dichos datos mediante el modelo logiacutestico
38
(ecuacioacuten 1) el cual permite obtener variables cineacuteticas tales como la cantidad de
biomasa inicial (Xo) y la velocidad maacutexima de crecimiento (micromaacutex) para cada uno de
los tratamientos
Se decidioacute emplear el modelo logiacutestico ya que eacuteste muestra resultados maacutes reales
cuando se cultivan hongos debido a que su morfologiacutea es muy diferente a otros
microorganismos (pellets) dificultando la transferencia de masa (Bailey et al
1986)
Una vez linealizada la ecuacioacuten que describe dicho modelos se llega a la siguiente
expresioacuten
Ecuacioacuten 1 Ecuacioacuten linealizada del modelo logiacutestico
Posterior a la linealizacioacuten de la ecuacioacuten se procedioacute a graficar Ln ((XmaacutexX)-1)
vs tiempo con el fin de obtener como pendiente la velocidad maacutexima de
crecimiento (micromaacutex) y como intercepto el Ln ((XmaacutexXo)-1) el cual permitioacute la
obtencioacuten de la concentracioacuten inicial de biomasa
Obtenieacutendose asiacute los paraacutemetros cineacuteticos para cada ensayo correspondientes a
micromax y Xo
Se debe definir la concentracioacuten maacutexima de biomasa (Xmaacutex) para poder hallar los
paraacutemetros cineacuteticos mediante dicho modelo cabe aclarar que dicho valor se toma
de los resultados de biomasa adquiridos para cada uno de los ensayos mediante
la metodologiacutea de peso seco este valor variacutea para cada fermentacioacuten
Una vez ajustados los datos de cada tratamiento al modelo logiacutestico se procedioacute a
calcular de manera teoacuterica los valores de X (biomasa) que variacutea con el tiempo
39
teniendo en cuenta los paraacutemetros cineacuteticos arrojados mediante el modelo
logiacutestico utilizando la siguiente ecuacioacuten
Ecuacioacuten 2 Valores teoacutericos de biomasa en el tiempo
Estos valores de X teoacutericos obtenidos mediante la foacutermula anterior se grafican con
respecto a los valores de X obtenidos de manera experimental con el fin de
observar el ajuste del modelo logiacutestico a cada uno de los datos experimentales
28 EVALUACIOacuteN DEL CONSUMO DE SUSTRATO Y DEL CONSUMO DE
PROTEIacuteNA POR PARTE DEL P cubensis CULTIVADO EN MEDIO
SUMERGIDO
Con el fin de evaluar el consumo de sustrato y proteiacutena por parte del P cubensis
durante las fermentaciones que conteniacutean glucosa en el medio se recolectaron
muestras cada 24 horas del liacutequido obtenido despueacutes de realizada la filtracioacuten de
la muestra que se utilizoacute para efectos de caacutelculo de peso seo dicho liacutequido
denominado sobrenadante fue almacenado a -4 degC Finalizadas cada una de las
fermentaciones se procedioacute a realizar el protocolo para evaluar el consumo de
sustrato para cada medio (Miller 1959) mediante el meacutetodo de DNS (Aacutecido
Dinitrosaliciacutelico) (Anexo 13) y el consumo de proteiacutenas mediante el meacutetodo de
LOWRY para cada fermentacioacuten (Anexo 15)
Para llevar a cabo la cuantificacioacuten de sustrato y proteiacutena en los distintos ensayos
fue necesario realizar las curvas de calibracioacuten correspondientes dichas curvas
con sus respectivos valores de concentracioacuten se muestran en los anexos 14 y 16
40
29 MEacuteTODO CUALITATIVO PARA DETERMINAR LA PRESENCIA DE
ALCALOIDES (PSILOCIBINA) MEDIANTE EL USO DEL REACTIVO DE
DRAGENDORFF
Como se mencionoacute anteriormente el reactivo de Dragendorff es usado para
determinar de manera cualitativa la ausencia o presencia de alcaloides en una
muestra determinada Para llevar a cabo dicha prueba se recolectaron muestras
de la biomasa seca correspondientes a los diacuteas 12 13 y 14 de cada fermentacioacuten
las cuales fueron almacenadas a -4degC
Para determinar la presencia de Psilocibina se realizoacute el proceso descrito seguacuten
Musshoff et al (2000) el cual consistioacute en macerar cada una de las muestras de
biomasa hasta obtener un polvo fino luego se pesaron 10 mg de dicho polvo y a
esta cantidad se le agregoacute 1 mL de metanol Posteriormente una pequentildea
cantidad de esta mezcla se esparcioacute en un papel filtro en donde se le adicionoacute una
gota del reactivo de Dragendorff
Una vez realizada la prueba se dice que la muestra contiene presencia de
alcaloides si eacutesta presenta una coloracioacuten rojizo-amarilla
210 MEacuteTODO PARA DETERMINAR LA PRESENCIA DE PSILOCIBINA
MEDIANTE CROMATOGRAFIacuteA LIacuteQUIDA DE ALTA EFICIENCIA (HPLC)
Una vez evaluada la presencia del alcaloide mediante el reactivo de Dragendorff
se procedioacute a determinar mediante el uso de cromatografiacutea liacutequida de alta
eficiencia (HPLC) la presencia de los alcaloides en la mezcla con sus respectivos
tiempos de retencioacuten para llevar a cabo la extraccioacuten de la Psilocibina se siguioacute el
meacutetodo descrito por Musshoff et al (2000) Para ello la muestra de biomasa
seca fue macera en un mortero hasta convertirla en un polvo fino Diez miligramos
41
de la muestra en polvo se extrajeron dos veces con 1 mL de metanol en un bantildeo
de ultrasonido durante 30 minutos Posterior a eacutesto se centrifugaron las muestras
a 3000 rpm durante 2 minutos el sobrenadante se depositoacute en un vial
independiente
El sobrenadante fue evaporado hasta sequedad bajo una corriente de nitroacutegeno
gaseoso Una parte de los residuos se disolvioacute en 200 microL de la fase moacutevil que
contiene HCOONH4 con una concentracioacuten 10 microM y un pH de 35
El equipo utilizado para realizar todos los anaacutelisis correspondientes a HPLC
cuenta con las siguientes caracteriacutesticas equipo Agient Technologies que consta
de una columna C18 de 46 mm 250 mm 5 mm con una fase moacutevil de
HCOONH4 con un flujo de 1 mLminuto un detector UV de 214 nm y una inyeccioacuten
de 20 μL y una temperatura de 25degC El experimento se corrioacute de modo isocraacutetico
con una fase moacutevil de agua 70 y HCOONH4 de 30
211 DETERMINACIOacuteN CUALITATIVA DE LA RESOLUCIOacuteN DEL
ALCALOIDE DE INTEREacuteS PARA LOS DIFERENTES ENSAYOS
Con el fin de determinar de manera cualitativa cuaacutel de los cromatogramas
arrojados mediante la teacutecnica de HPLC presentoacute mejor resolucioacuten del alcaloide
fue necesario realizar un supuesto acerca del tiempo de retencioacuten de la Psilocibina
durante la cromatografiacutea puesto que a pesar de haber contado con un
cromatograma (Tsujikawa et al 2003) (Anexo 18) y haber trabajado en las
mismas condiciones de eacuteste no se utilizoacute la misma fase moacutevil lo que puedo
generar variaciones en dicho tiempo Se asumioacute que el tiempo de retencioacuten varioacute
entre 62 y 72 minutos es decir entre este tiempo se encontroacute el pico de intereacutes
de la investigacioacuten
42
La eleccioacuten del criterio de pureza del compuesto de intereacutes se realizoacute observando
cuaacutel de los picos obtenidos muestra menor ruido es decir que a su alrededor no
tenga presencia de otros compuestos (Anexos 19 20 y 21)
212 DETERMINACIOacuteN PORCENTUAL DE COMPUESTOS PARA LOS
DIFERENTES ENSAYOS
La cuantificacioacuten de los compuestos se hizo mediante un porcentaje de aacuterea bajo
la curva debido a que no se contoacute con un estaacutendar interno
Para realizar dicho porcentaje se obtuvo la totalidad de las aacutereas presentes en el
perfil cromatograacutefico obtenido para las muestras de los diacuteas 12 13 y 14 de cada
fermentacioacuten y el porcentaje del aacuterea del metabolito de intereacutes la cual oscilaba
entre un tiempo de retencioacuten entre 62 y 72 minutos
En el momento de analizar los cromatogramas y de elegir el medio que mejor
resultados arrojoacute en cuanto a la produccioacuten de alcaloide se observoacute la resolucioacuten
del metabolito en cada una de las fermentaciones
213 CULTIVO SUMERGIDO DE P cubensis EN PRESENCIA DE FA
Despueacutes de haber elegido la fuente de carbono (glucosa) y su respectiva
concentracioacuten (50 gL) que mejores resultados arrojaron durante la investigacioacuten
se realizaron nuevamente fermentaciones del P cubensis en medio sumergido
(Fang-Zhong) donde la diferencia de estos medios con respecto a los
anteriormente utilizados radicoacute en la presencia de FA aminoaacutecido
Para dichas fermentaciones se contoacute con tres concentraciones diferentes de FA
(05 gL 1 gL 15 gL) realizadas por duplicado adicionalmente se montoacute
43
simultaacuteneamente con dichos ensayos las muestras correspondientes a los uacuteltimos
tres diacuteas de fermentacioacuten sin FA en el medio para efectos de comparacioacuten y asiacute
poder llevar a cabo un anaacutelisis estadiacutestico apropiado
Los datos obtenidos fueron analizados por medio de una ANOVA con el fin de
observar si existiacutean o no diferencias significativas en cuanto al crecimiento micelial
(concentracioacuten de biomasa) del P cubensis y asiacute poder determinar el medio que
mejores resultados arrojoacute durante la investigacioacuten
214 DISENtildeO DE EXPERIMENTOS Y ANAacuteLISIS ESTADIacuteSTICO
El disentildeo estadiacutestico utilizado para realizar los anaacutelisis correspondientes a las
diferentes fermentaciones es un disentildeo factorial 23 Este estudio se basoacute en dos
factores que fueron las dos fuentes de carbono (glucosa y sacarosa) a su vez se
apoyoacute en tres niveles que fueron la variacioacuten en la concentracioacuten de las mismas
(30 gL 50 gL y 70 gL) De igual manera se fundamentoacute en dos variables de
respuesta el crecimiento micelial de P cubensis y el porcentaje de Psilocibina
presente en el microorganismo
Por medio del Software Statgraphics plus 51 se realizoacute un anaacutelisis estadiacutestico
basado en una ANOVA factorial Con ello se pretendioacute comparar estadiacutesticamente
los resultados de crecimiento micelial de biomasa (concentracioacuten) y produccioacuten de
Psilocibina para cada uno de los medios durante los 14 diacuteas de fermentacioacuten y en
especial en los uacuteltimos tres diacuteas de la misma puesto que durante este periacuteodo fue
evaluada la presencia del alcaloide
Es necesario hacer hincapieacute que para realizar dicha estadiacutestica fue necesario
ejecutar un estudio de normalidad el cual se comproboacute utilizando la graacutefica de
probabilidad normal a su vez se requirioacute un anaacutelisis de igualdad de varianza por
medio de una graacutefica de residuos Vs previsto con el fin de ver visualmente la
44
hipoacutetesis de la homocedasticidad todo ello con el fin de garantizar que la
investigacioacuten se comportoacute de forma normal Adicionalmente se contoacute con una
hipoacutetesis nula (Ho) y una Hipoacutetesis alterna (Ha) las cuales permitieron realizar las
conclusiones respectivas A continuacioacuten se enunciaraacuten cada una de eacutestas y los
paraacutemetros necesarios para dicho estudio
Ho Todas las medias son iguales es decir no existen diferencias
significativas entre los datos analizados
Ha Alguna de las medias es diferente lo que quiere decir que siacute existen
diferencias significativas
Paraacutemetro
Pvalor gt 005 Se acepta Ho
Pvalor le 005 Se rechaza Ho
45
3 RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN
31 CINEacuteTICA DE CRECIMIENTO MICELIAL DE P cubensis EN CULTIVO
SUMERGIDO (FANG-ZHONG) UTILIZANDO DIFERENTES FUENTES DE
CARBONO
Con el propoacutesito de evaluar el crecimiento micelial del P cubensis en medio
sumergido durante los 14 diacuteas de la fermentacioacuten se recurrioacute al uso de
metodologiacuteas conocidas como peso huacutemedo y peso seco en dicho trabajo soacutelo se
exponen los datos arrojados por el meacutetodo de peso seco
A continuacioacuten se presentan cada una de las fermentaciones de acuerdo al tipo de
sustrato empleado en las mismas los respectivos valores de peso seco obtenidos
y los anaacutelisis pertinentes para cada uno de los casos
311 Crecimiento micelial de P cubensis en medio sumergido utilizando
diferentes concentraciones de glucosa
Inicialmente se evaluaron tres concentraciones de glucosa en el cultivo de P
cubensis en medio sumergido (Fang-Zhong) correspondientes a 30 gL 50 gL y
70 gL siendo en este caso la glucosa la principal fuente de carbono del P
cubensis
A continuacioacuten se muestran los valores de peso seco obtenidos para cada una de
las concentraciones de glucosa utilizadas durante los 14 diacuteas de la fermentacioacuten
46
0
01
02
03
04
05
06
07
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Bio
ma
sa (g
L)
Tiempo (diacuteas)30gL 50gL 70gL
Graacutefico 1 Cineacutetica de crecimiento micelial de P cubensis en medio sumergido (Fang-Zhong) utilizando tres diferentes concentraciones de
glucosa como fuente de carbono (Peso seco)
Del graacutefico 1 se puede observar que no hubo evidencia de fase de latencia para
ninguno de los ensayos posteriormente se aprecia que el crecimiento de biomasa
aumentoacute con el tiempo para las diferentes concentraciones de glucosa empleadas
Analizando las fermentaciones que conteniacutean 50 gL y 70 gL de glucosa se
puede afirmar que ambas presentan un comportamiento similar mostrando una
fase exponencial hasta el diacutea 11 y una fase estacionaria hasta el diacutea 14 de la
fermentacioacuten mientras que la fermentacioacuten que conteniacutea 30 gL de glucosa no
presentoacute fase estacionaria la fermentacioacuten durante los 14 diacuteas se encontraba en
fase exponencial a pesar de que entre los diacuteas 8 y 11 el crecimiento de P
cubensis se mantuvo constante
Asimismo se puede observar que el crecimiento maacutes bajo en cuanto a
concentracioacuten de biomasa se generoacute en la concentracioacuten de 30 gL siendo eacuteste
de 048 gL mientras que en las concentraciones de 50 gL y 70 gL de glucosa
los crecimientos maacuteximos fueron muy similares 055 gL y 062 gL
respectivamente
47
Lo dicho anteriormente se ratifica una vez analizados los resultados obtenidos
estadiacutesticamente donde se obtuvo un P-valor igual a cero indicando que existen
diferencias significativas en cuanto al crecimiento micelial de biomasa
(concentracioacuten de biomasa durante los 14 diacuteas de la fermentacioacuten) El graacutefico 2
ilustra la presencia de dos grupos homogeacuteneos lo que indica que las
concentraciones de 50 gL y 70 gL no tienen diferencias significativas del
crecimiento micelial entre cada una de ellas mientras que la concentracioacuten de 30
gL siacute presenta dichas diferencias significativas con respecto a las dos
concentraciones anteriores (Anexo 1)
Con todo eacutesto se expone que la concentracioacuten de glucosa de 50 gL es la que se
eligioacute debido a que es maacutes econoacutemico utilizar 50 gL de glucosa que 70 gL
Tratamientos con diferentes concentraciones de glucosa
Media 30 gL glucosa (a) 022
Media 50 gL glucosa (b) 032
Media 70 gL glucosa (b) 034
a
bb
0
005
01
015
02
025
03
035
04
045
Co
nce
ntr
acioacute
n b
iom
asa
(gL
)
Letras diferentes denotan diferencias significativas (prueba LSD)
Graacutefico 2 Crecimiento micelial de P cubensis en cultivo sumergido bajo tres concentraciones de glucosa
48
Modelo logiacutestico para las fermentaciones donde se utilizoacute glucosa
como fuente de carbono
Una vez realizada la cineacutetica de crecimiento del P cubensis en medio sumergido
(Fang-Zhong) usando diferentes concentraciones de glucosa se procedioacute a
ajustar los datos obtenidos al modelo logiacutestico Los crecimientos maacuteximos de
biomasa obtenidos mediante el meacutetodo de peso seco para cada uno de los
ensayos fueron 048 gL 065 gL y 062 gL para concentraciones de 30 gL 50
gL y 70 gL de glucosa respectivamente La tabla 2 muestra los paraacutemetros
cineacuteticos obtenidos mediante el modelo para cada una de las concentraciones
Tabla 2 Paraacutemetros cineacuteticos obtenidos mediante el modelo logiacutestico para las diferentes fermentaciones de P cubensis utilizando glucosa como fuente
de carbono
30gL 50gL 70gL
microx (diacutea-sup1) 016 microx (diacutea-sup1) 017 microx (diacutea-sup1) 015
micromax (diacutea-sup1) 027 micromax (diacutea-sup1) 035 micromax (diacutea-sup1) 034
X0 (gL) 005 X0 (gL) 008 X0 (gL) 008
R2 096 R2
092 R2 085
De la tabla 2 se puede observar que la concentracioacuten inicial de biomasa (Xo)
estuvo muy cercana para cada una de las concentraciones de glucosa utilizadas
Para 30 gL de glucosa la velocidad maacutexima de crecimiento (micromax) fue mucho
menor que la obtenida para 50 gL y 70 gL eacutesto pudo ser debido a que fue el
medio que menor cantidad de glucosa conteniacutea mientras que para las otras dos
concentraciones de glucosa la velocidad maacutexima de crecimiento fue similar
Al comparar las velocidades maacuteximas de las tres concentraciones de glucosa
utilizadas se evidencia que la fermentacioacuten que conteniacutea 50 gL presentoacute una
micromaacutex mayor correspondiente a 035 diacutea-1 esto sugiere que a mayores
concentracioacuten de glucosa (70 gL) puede ocurrir una inhibicioacuten por sustrato otro
49
criterio que afirma que dicha concentracioacuten fue la que mejores resultados arrojoacute de
las tres concentraciones de glucosa utilizadas para el crecimiento del P cubensis
en el medio de Fang-Zhong Ademaacutes se observa que este experimento fue el que
mayor velocidad especiacutefica de crecimiento presento siendo esta de 017 diacutea-1
Finalmente se calcularon los valores de biomasa teoacutericos utilizando la ecuacioacuten
descrita anteriormente en la metodologiacutea con el propoacutesito de observar que tanto
se ajustaron los valores de biomasa hallados experimentalmente con los valores
de biomasa teoacutericos arrojados por el modelo logiacutestico El graacutefico 3 muestra los
valores de biomasa (X) tanto teoacutericos como experimentales con respecto al
tiempo
0
01
02
03
04
05
06
07
0 2 4 6 8 10 12 14
Biom
asa
(gL
)
Tiempo (diacutea)
X exp (30 gL) X exp (50 gL) X exp (70 gL)
X teoacuterico (30 gL) X teoacuterico (50 gL) X teoacuterico (70 gL)
Graacutefico 3 Valores de concentracioacuten de biomasa experimental y teoacuterico
graficados con respecto al tiempo para las fermentaciones con diferentes concentraciones de glucosa
Al observar el graacutefico 3 se puede notar que para los ensayos de 50 gL y 70 gL
de glucosa los valores de biomasa teoacutericos se encuentran un poco desfasados de
los valores de biomasa hallados de manera experimental mientras que para el
ensayo que conteniacutea 30 gL de glucosa se observa un buen ajuste de los datos
50
obtenidos experimentalmente al modelo logiacutestico La tabla 2 reitera lo dicho
anteriormente al exponer los valores de R2 los cuales explican la relacioacuten que
tienen los datos teoacutericos con los experimentales
312 Crecimiento micelial del P cubensis en medio sumergido utilizando
diferentes concentraciones de sacarosa
Una vez evaluado el crecimiento de biomasa usando glucosa como fuente de
carbono se procedioacute a evaluar el efecto que teniacutea el cambio de la fuente de
carbono por sacarosa en el crecimiento micelial del P cubensis en medio
sumergido
El graacutefico 4 muestra de manera ilustrativa como fue el crecimiento micelial del P
cubensis para cada una de las concentraciones de sacarosa utilizadas durante los
14 diacuteas mediante el meacutetodo de peso seco
0
01
02
03
04
05
06
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Biom
asa (
gL)
Tiempo (diacuteas)
30 gL 50 gL 70 gL
Graacutefico 4 Cineacutetica de crecimiento micelial de P cubensis en medio sumergido (Fang-Zhong) utilizando diferentes concentraciones de sacarosa
como fuente de carbono (Peso seco)
51
En el graacutefico 4 se puede observar que tanto para una concentracioacuten de 30 gL
como para 70 gL de sacarosa el hongo llega a su fase estacionaria cerca del
quinto diacutea de la fermentacioacuten mientras que para una concentracioacuten de 50 gL se
observa un comportamiento diferente puesto que el microorganismo tiene un
crecimiento exponencial hasta el diacutea 5 en donde entra a una etapa de transicioacuten o
estacionaria durante 3 diacuteas aproximadamente luego de la cual inicia nuevamente
su crecimiento de forma exponencial hasta llegar al diacutea 11 en donde siacute empieza
su fase estacionaria
Al igual que en las tres fermentaciones que conteniacutean glucosa en estas
fermentaciones de sacarosa se observa mediante el graacutefico anterior que no hubo
presencia de fase de latencia
El crecimiento maacuteximo de biomasa en cuanto a concentracioacuten lo presentoacute aquella
fermentacioacuten que conteniacutea 70 gL de sacarosa el cual fue de 057 gL seguida de
la de 50 gL con un crecimiento maacuteximo de biomasa de 045 gL y posteriormente
la concentracioacuten de 30 gL obtuvo un crecimiento maacuteximo de 026 gL
De acuerdo al anaacutelisis estadiacutestico que se realizoacute para cada una de las
fermentaciones se dedujo que las diferencias en cuanto al crecimiento micelial de
biomasa con respecto a la concentracioacuten de la misma son significativas entre
cada una de las fermentaciones es decir fue diferente la concentracioacuten de
biomasa obtenida cuando se trabajoacute con cada una de distintas concentraciones de
sacarosa Lo dicho anteriormente se muestra a traveacutes del graacutefico 5 (Anexo 2)
52
Tratamientos con diferentes concentraciones de sacarosa
Media 30 gL sacarosa (a) 02
Media 50 gL sacarosa (b) 032
Media 70 gL sacarosa (c) 043
a
b
c
0
02
04
Co
nce
ntr
acioacute
n b
iom
asa
(gL
)
Letras diferentes denotan diferencias significativas (prueba LSD)
Graacutefico 5 Crecimiento micelial para tres diferentes concentraciones de sacarosa
Modelo logiacutestico para las fermentaciones donde se utilizoacute sacarosa
como fuente de carbono
Una vez realizadas las cineacuteticas de crecimiento del P cubensis para cada
concentracioacuten de sacarosa empleada se procedioacute a ajustar los datos obtenidos al
modelo logiacutestico cabe recalcar que es necesario establecer los crecimientos
maacuteximos de biomasa obtenidos para cada uno de los ensayos los cuales fueron
026 gL 045 gL y 057 gL para concentraciones de 30 gL 50 gL y 70 gL de
sacarosa respectivamente
Una vez aplicado el modelo logiacutestico para cada tratamiento se obtuvieron valores
de velocidad maacutexima de crecimiento y biomasa inicial para cada concentracioacuten de
sacarosa utilizada en el medio los cuales se muestran en la tabla 3
53
Tabla 3 Paraacutemetros cineacuteticos obtenidos mediante el modelo logiacutestico para las diferentes fermentaciones de P cubensis utilizando sacarosa como
fuente de carbono
30gL 50gL 70gL
microx (diacutea-sup1) 030 microx (diacutea-sup1) 014 microx (diacutea-sup1) 041
micromax (diacutea-sup1) 037 micromax (diacutea-sup1) 042 micromax (diacutea-sup1) 067
X0 (gL) 01 X0(gL) 01 X0 (gL) 011
R2 061 R2 089 R2 095
De la tabla 3 se ratifica que se utilizoacute una concentracioacuten inicial de biomasa igual
para cada una de las fermentaciones aproximadamente 01 gL ademaacutes se
observa un aumento en la velocidad maacutexima de crecimiento con respecto a la
cantidad de sacarosa empleada es decir que el hecho de haber aumentado la
concentracioacuten de sacarosa en el medio favorecioacute el aumento en la velocidad
maacutexima de crecimiento del P cubensis siendo eacutesta mayor cuando se trabajoacute a una
concentracioacuten de 70 gL de sacarosa De igual manera se aprecia que el
tratamiento que conteniacutea 70 gL de sacarosa presentoacute una velocidad especiacutefica de
crecimiento mayor que los demaacutes siendo eacutesta de 041 diacutea-1
Finalmente se calcularon los valores de biomasa teoacutericos el graacutefico 6 ilustra los
valores de biomasa (X) tanto teoacutericos como experimentales graficados con
respecto al tiempo
54
0
01
02
03
04
05
06
0 2 4 6 8 10 12 14
Bio
mas
a (g
L)
Tiempo (Diacutea)
X exp (30 gL) X exp (50 gL) X exp (70 gL)
X teoacuterico (30 gL) X teoacuterico (50 gL) X teoacuterico (70 gL)
Graacutefico 6 Valores de concentracioacuten de biomasa experimental y teoacuterico graficados con respecto al tiempo para las fermentaciones con diferentes
concentraciones de sacarosa
Del graacutefico 6 se puede observar como los valores de biomasa experimentales se
ajustaron a los valores de biomasa teoacutericos arrojados por el modelo logiacutestico lo
que quiere decir la cineacutetica de crecimiento del P cubensis en medio sumergido
cuando se utilizoacute 70 gL se ajustoacute correctamente al modelo logiacutestico lo que se
corrobora en la tabla 2 gracias al valor obtenido para el R2 que indica la relacioacuten
de los datos teoacutericos con respecto a los experimentales Por otro lado para las
fermentaciones de 30 gL y 50 gL de sacarosa a pesar de parecer que
presentaron un buen ajuste al calcular la relacioacuten de los datos teoacutericos con
respecto a los experimentales (R2) se concluye que el ajuste no fue tan bueno
55
313 Comparacioacuten entre el crecimiento micelial de P cubensis en los
cultivos sumergidos utilizando glucosa y sacarosa como fuente de
carbono
Ahora bien es igualmente importante realizar un anaacutelisis comparativo entre ambas
fuentes de carbono empleadas con el fin de determinar si existen o no diferencias
significativas entre dichas fuentes de carbono
De acuerdo al anaacutelisis estadiacutestico se dice que existen diferencias significativas del
crecimiento micelial del P cubensis en cuanto al diacutea y la concentracioacuten de
sustrato empleado es decir concentracioacuten de glucosa y sacarosa (Anexo 3) pero
se observa claramente que no hay diferencias significativas de dicho crecimiento
con respecto al tipo de sustrato utilizado debido a que el P-valor arrojado por la
estadiacutestica fue de 01217 lo que sugiere que se debe utilizar la sacarosa gracias
a la disminucioacuten de costos que se generariacutean durante el proceso todo ello gracias
al costo de la sacarosa es inferior al de glucosa Sin embargo para elegir la fuente
de carbono que mejores resultados arrojoacute no soacutelo se basoacute en la cantidad de
biomasa producida sino que se procedioacute a examinar los barridos espectrales
arrojados por el anaacutelisis de HPLC con el fin de determinar la fuente de carbono
que mejor resolucioacuten mostroacute del alcaloide que en esta investigacioacuten fue glucosa a
una concentracioacuten de 50 gL
De igual manera el graacutefico 7 muestra las medias obtenidas mediante el anaacutelisis
estadiacutestico para las fermentaciones trabajadas con glucosa y sacarosa Aun asiacute
es necesario hacer hincapieacute que eacuteste no es el criterio principal para la obtencioacuten
del medio que mejores resultados arrojoacute durante la investigacioacuten por lo tanto se
deben seguir realizando los diferentes anaacutelisis descritos anteriormente en este
trabajo
56
Tratamientos de las dos fuentes de carbono usadas sin FA (glucosa y
sacarosa)
Media para glucosa (a) 029
Media para sacarosa (a) 032
aa
0
01
02
03
Conc
entr
acioacute
n bi
omas
a (g
L)
Letras diferentes denotan diferencias significativas (Prueba LSD)
Graacutefico 7 Crecimiento micelial para dos diferentes fuentes de carbono (glucosa y sacarosa)
314 Crecimiento micelial del P cubensis en cultivo sumergido utilizando
glucosa y fenilalanina en el medio
Se decidioacute realizar un uacuteltimo ensayo acerca del efecto que teniacutea la adicioacuten de un
aminoaacutecido llamado Fenilalanina (FA) al medio Fang-Zhong sobre la produccioacuten
del alcaloide y por ende sobre la generacioacuten de biomasa
Debido a los anaacutelisis realizados anteriormente se concluyoacute que la mejor fuente de
carbono fue la glucosa a una concentracioacuten de 50 gL De la misma manera que
en los numerales anteriores se evaluoacute la cineacutetica del crecimiento micelial del P
cubensis mediante los meacutetodos de peso huacutemedo y peso seco Las mediciones
fueron realizadas por duplicado y promediadas para la fuente de carbono elegida
(glucosa 50 gL) y las diferentes concentraciones de FA en el medio
correspondientes a 05 gL 1 gL 15 gL con el fin de encontrar el medio que
mejores resultados arrojoacute en cuanto a crecimiento micelial y generacioacuten del
57
alcaloide de intereacutes Los datos obtenidos mediante el meacutetodo de peso seco se
muestran en el graacutefico 8
Cabe resaltar que junto con las tres fermentaciones de 05 gL 10 gL y 15 gL
de FA se montaron a su vez seis muestras correspondientes a los diacuteas 12 13 y
14 de la fermentacioacuten que conteniacutea 0 gL de FA eacutesto con el propoacutesito de analizar
los datos de manera estadiacutestica y poder hacer comparaciones con respecto a la
generacioacuten de biomasa y a la produccioacuten del alcaloide de intereacutes ambas medidas
con respecto a la concentracioacuten
0
01
02
03
04
05
06
07
08
09
1
11
12
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Biom
asa
(gL
)
Tiempo (diacuteas)
05 gL 1 gL 15 gL
Graacutefico 8 Cineacutetica de crecimiento micelial de P cubensis en medio sumergido (Fang-Zhong) utilizando diferentes concentraciones de FA y 50
gL de glucosa como fuente de carbono (Peso seco)
Al analizar el graacutefico 8 es decir el crecimiento micelial (concentracioacuten de
biomasa) seguacuten la concentracioacuten de FA en el tiempo se puede notar que no hubo
presencia de fase de latencia para ninguna de las concentraciones de FA
utilizadas ademaacutes el crecimiento de biomasa en cada caso se aprecia de manera
58
muy similar llegando los tres ensayos a la fase estacionaria el diacutea 12 de la
fermentacioacuten
Observando el graacutefico 8 se puede identificar que el mayor contenido de biomasa
fue de 108 gL obtenida el diacutea 13 para una concentracioacuten 10 gL de FA para
concentraciones de 05 gL y 15 gL de FA la concentracioacuten maacutexima de biomasa
fue 106 gL y 101 gL respectivamente Auacuten asiacute al considerar los resultados
obtenidos se puede ratificar que es indiferente la cantidad de FA necesaria para
obtener concentracioacuten de biomasa por ende se decide que el medio que mejores
resultados arrojoacute fue el que conteniacutea 05 gL FA debido a que fue la
concentracioacuten de FA que mejor resolucioacuten del alcaloide presentoacute paraacutemetro
observado mediante los cromatogramas obtenidos del anaacutelisis de HPLC (Anexos
19 20 y 21) y ademaacutes porque con dicha cantidad los costos de la materia prima
seriacutean menores Cabe resaltar que el uso de FA generoacute un aumento significativo
duplicando la produccioacuten de biomasa por lo tanto se testifica que siacute hubo
duplicacioacuten en cuanto a la concentracioacuten de biomasa en los medios que conteniacutea
FA con respecto a los medios que no conteniacutean FA se dice entonces que a su
vez se podriacutea haber generado mayor cantidad de Psilocibina en los medios que
teniacutean FA ya que dicho alcaloide se produce de manera intracelular por tal
razoacuten al aumentar la cantidad de biomasa en el medio se aumenta la cantidad de
dicho alcaloide
De igual manera se analizaron los datos estadiacutesticamente y se llegoacute a apreciar
que no existen diferencias significativas en cuanto a la produccioacuten de biomasa y la
cantidad de FA utilizada en el medio Del mismo modo al analizar la tabla de
contrastes muacuteltiple de rangos se reitera que siacute existen diferencias significativas
entre el crecimiento micelial de biomasa (concentracioacuten de biomasa) en el tiempo
cuando se trabajoacute con FA o sin eacuteste Eacutesto se puede observar en el graacutefico 9
(Anexo 4)
59
Tratamientos con y sin FA
Media 0 gL FA (a) 032
Media 05 gL FA (b) 065
Media 10 gL FA (b) 066
Media 15 gL FA (b) 069
a
b b b
0
01
02
03
04
05
06
07
08
09
Conc
entr
acioacute
n bi
omas
a (g
L)
Letras diferentes denotan diferencias significativas (Prueba LSD)
Graacutefico 9 Crecimiento micelial para glucosa a una concentracioacuten de 50 gL y tres diferentes concentraciones de FA
Modelo logiacutestico para las fermentaciones donde se utilizoacute 50 gL de
glucosa como fuente de carbono y diferentes concentraciones de FA
En primer lugar se fijaron los valores de crecimiento maacuteximo de biomasa para
cada una de las concentraciones obtenidos mediante el meacutetodo de peso seco con
el fin de hallar los paraacutemetros cineacuteticos mediante el modelo logiacutestico Los
crecimientos maacuteximos de biomasa obtenidos fueron los siguientes 106 gL 108
gL y 101 gL para concentraciones de 05 gL 10 gL y 15 gL de FA
respectivamente y 50 gL de glucosa
Una vez realizado el modelo logiacutestico para cada tratamiento se obtuvieron los
valores de velocidad maacutexima de crecimiento y concentracioacuten de biomasa inicial
para cada ensayo los cuales se muestran en la tabla 4
60
Tabla 4 Paraacutemetros cineacuteticos obtenidos mediante el modelo logiacutestico para las diferentes fermentaciones de P cubensis utilizando 50 gL de glucosa
como fuente de carbono y diferentes concentraciones de FA
05gL 10gL 15gL
microx (diacutea-sup1) 018 microx (diacutea-sup1) 012 microx (diacutea-sup1) 012
micromax (diacutea-sup1) 045 micromax (diacutea-sup1) 035 micromax (diacutea-sup1) 044
X0 (gL) 01 X0 (gL) 017 X0 (gL) 016
R2 095 R2 082 R2 088
Seguacuten los valores arrojados por el modelo logiacutestico que se encuentran
presentados en la tabla 4 se puede decir que se presentoacute una valor de biomasa
inicial similar para los tratamientos de 1 gL y 15 gL de FA mientras que para las
fermentaciones que conteniacutean 05 gL de FA se tiene una diferencia de un 50
aproximadamente Ademaacutes se puede observar que a la concentracioacuten de 05 gL
de FA es la que mayor velocidad maacutexima de crecimiento presenta siendo esta
045 diacuteamacrsup1 a su vez dicha concentracioacuten presentaacute la microx mayor correspondiente a
018 diacutea-1 Debido a eacutesto y al criterio de mejor resolucioacuten del alcaloide observado
en los anaacutelisis de HPLC (Anexos 19 20 y 21) se concluye que el medio que
mejores resultados arrojoacute durante la investigacioacuten para la generacioacuten de biomasa
y la produccioacuten de la Psilocibina es 05 gL de FA y 50 gL de glucosa
Finalmente se calcularon los valores de biomasa teoacutericos el graacutefico 10 muestra
los valores de biomasa (X) tanto teoacutericos como experimentales graficados con
respecto al tiempo
61
0
02
04
06
08
1
12
0 2 4 6 8 10 12 14 16
Bio
mas
a (g
L)
Tiempo (Diacutea)
X exp (05 gL) X exp (10 gL) X exp (15 gL)
X teoacuterico (05 gL) X teoacuterico (10 gL) X teoacuterico (15 gL)
Graacutefico 10 Valores de concentracioacuten de biomasa experimental y teoacuterico graficados con respecto al tiempo para las fermentaciones con diferentes
concentraciones de FA y 50 gL de glucosa
Se puede decir gracias al graacutefico 10 que los valores de biomasa experimentales
se ajustaron a los valores de biomasa teoacutericos hallados mediante el modelo
logiacutestico es decir la cineacutetica de crecimiento del P cubensis en medio sumergido
cuando se usaron diferentes concentraciones de FA en el medio se ajustoacute
correctamente al modelo logiacutestico esto se reitera con los valores de R2 mostrados
anteriormente en la tabla 4
32 ESTUDIO DE LA CINEacuteTICA DE CONSUMO DE SUSTRATO POR PARTE
DEL P cubensis CULTIVADO EN MEDIO SUMERGIDO (FANG-ZHONG)
La evaluacioacuten del consumo de sustrato durante la fermentacioacuten con respecto al
tiempo es de suma importancia puesto que eacuteste es el principal componente
limitante del crecimiento presente en el medio de cultivo
62
A continuacioacuten se analizaraacuten dichos consumos para los diferentes ensayos
321 Consumo de sustrato por parte del P cubensis en medio sumergido
utilizando diferentes concentraciones de glucosa
Una vez halladas las concentraciones de sustrato para cada una de las
fermentaciones que conteniacutean glucosa en el medio se procedioacute a graficar dichos
valores con respecto al tiempo
El graacutefico 11 ilustra los datos obtenidos sobre el consumo de sustrato de las tres
fermentaciones que conteniacutean glucosa y a su vez como se comportoacute el
crecimiento de biomasa para cada ensayo durante los 14 diacuteas de fermentacioacuten
0
01
02
03
04
05
06
07
0
10
20
30
40
50
60
70
80
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14B
iom
asa
(gL
)
Glu
cosa
(gL
)
Tiempo (diacuteas)
30 GL 50GL 70 GL 30gL 50gL 70gL
Graacutefico 11 Cineacutetica de consumo de sustrato por parte del P cubensis en medio sumergido utilizando diferentes concentraciones de glucosa como
fuente de carbono
Al observar el graacutefico 11 se expone que el P cubensis consumioacute mayor cantidad
de glucosa cuando esta estaba a una concentracioacuten de 70 gL correspondiendo a
63
un porcentaje de 62 mientras que para 50 gL y 30 gL fue de 23 y 30
respectivamente
Comparando el consumo de glucosa en sus diferentes concentraciones con el
crecimiento micelial del hongo se puede observar que a una concentracioacuten de
glucosa de 30 gL no soacutelo se tuvo un menor consumo de sustrato sino que
tambieacuten se generoacute un menor crecimiento de biomasa Mientras que a
concentraciones de 50 gL y 70 gL de glucosa a pesar de presentar diferencias
en cuanto al porcentaje de sustrato consumido el crecimiento micelial es similar
(no presenta diferencias significativas) lo que indica que el hongo no requiere
tanta concentracioacuten de glucosa para su crecimiento eacutesto se puede afirmar soacutelo
para este ensayo a estas condiciones
De igual manera en el graacutefico 11 al analizar la tendencia del consumo de
sustrato las concentraciones de glucosa de 50 gL y 70 gL presentan una
disminucioacuten notoria hasta el diacutea 11 para dicho consumo Esto se debe a que en
ese diacutea inicioacute la fase estacionaria del hongo en ambas fermentaciones en donde
el P cubensis requeriacutea alimento uacutenicamente para mantenerse y producir
metabolitos secundarios Mientras que para la concentracioacuten de glucosa de 30 gL
el consumo de glucosa fue muy poco a partir del quinto diacutea de la fermentacioacuten
esto se atribuye a que la cineacutetica de crecimiento micelial del P cubensis presentoacute
una fase estacionaria temprana entre los diacuteas 8 y 11 indicando que no necesitaba
consumir casi glucosa puesto que no estaba creciendo
322 Consumo de sustrato por parte del P cubensis en medio sumergido
utilizando diferentes concentraciones de sacarosa
Los datos obtenidos sobre el consumo de sacarosa para cada una de las
concentraciones utilizadas (30 gL 50 gL y 70 gL de sacarosa) durante los 14
diacuteas de la fermentacioacuten se muestran en el graacutefico 12 a su vez se ilustran en dicho
64
graacutefico el comportamiento del crecimiento micelial para cada ensayo durante los
14 diacuteas de fermentacioacuten para efectos de anaacutelisis
0
01
02
03
04
05
06
0
10
20
30
40
50
60
70
80
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Bio
mas
a (g
L)
Sac
aro
sa (g
L)
Tiempo (diacuteas)
30gL 50gL 70gL 30 gL 50 gL 70 gL
Graacutefico 12 Cineacutetica de consumo de sustrato por parte del P cubensis en medio sumergido utilizando diferentes concentraciones de sacarosa como
fuente de carbono
Al observar el graacutefico 12 se puede decir que el P cubensis consumioacute mayor
cantidad de sacarosa cuando eacutesta estaba a una concentracioacuten de 70 gL en el
medio presentando un porcentaje de consumo del 49 mientras que para las
concentraciones de 50 gL y 30 gL de sacarosa se tuvo un porcentaje de
consumo de 24 y 37 Esto igual que en el consumo de glucosa se puede
deber a que al tener mayor concentracioacuten de sustrato en el medio el P cubensis
genera mayor afinidad por el mismo haciendo que dicho hongo se consuma
grandes cantidades de sacarosa durante el tiempo
Igualmente se observa que aproximadamente en el noveno diacutea de la
fermentacioacuten las tres diferentes concentraciones de glucosa (30 gL 50 gL y 70
65
gL) se mantienen casi constantes en el tiempo ello gracias a que en este diacutea el
hongo se encontraba en fase estacionaria en los tres ensayos
323 Comparacioacuten entre el consumo de sustrato de P cubensis en los
cultivos sumergidos con diferentes fuentes de carbono
Con el fin de identificar cuaacutel de las dos fuentes de carbono fue consumida en
mayor proporcioacuten por parte del P cubensis se procedioacute a realizar un anaacutelisis
estadiacutestico donde comparamos las dos fuentes de carbono empleados con
respecto al consumo de sustrato obtenido (concentracioacuten de glucosa y sacarosa
en cada uno de los medios) donde se consiguioacute un P-valor de 00811 con
respecto al tipo de sustrato lo que indica que no existen diferencias en cuanto al
consumo de sustrato y el tipo del mismo es decir es indiferente cuaacutel de los dos
sustratos (glucosa o sacarosa) se utilice para que se del consumo del mismo por
parte del P cubensis Observacioacuten que se reitera en la tabla de contraste muacuteltiple
que muestra que se trabajoacute como un grupo homogeacuteneo Igualmente el graacutefico 13
muestra las medias de consumo de sustrato (concentracioacuten durante los 14 diacuteas)
obtenidas mediante el anaacutelisis estadiacutestico y reitera que no existen diferencias
significativas con respecto al tipo de sustrato utilizado para el cultivo del P
cubensis en medio sumergido (Anexo 5)
66
Tratamientos de las dos fuentes de carbono usadas sin FA (glucosa y sacarosa)
Media glucosa (a) 3431
Media sacarosa (a) 3678
a
a
32
34
36
38
Co
nce
ntr
acioacute
n s
ust
rato
(g
L)
Letras diferentes denotan diferencias significativas (Prueba LSD)
Graacutefico 13 Consumo de sustrato para cada una de las fuentes de carbono utilizadas
Aun asiacute al comparar los graacuteficos 11 y 12 se puede observar un mayor consumo
de glucosa que de sacarosa lo que lleva a concluir que es mejor emplear la
primera (glucosa)
324 Consumo de sustrato por parte del P cubensis en medio sumergido
utilizando glucosa y fenilalanina en el medio
Los datos obtenidos acerca del consumo de sustrato durante los 14 diacuteas de la
fermentacioacuten para cada uno de los medios que conteniacutean 50 gL de glucosa y
diferentes concentraciones de FA (05 gL 1 gL y 15 gL) se muestran en el
graacutefico 14 De igual manera se ilustran en dicho graacutefico las cineacuteticas de
crecimiento micelial para cada una de las fermentaciones que teniacutean 50 gL de
glucosa y diferentes concentraciones de FA con el fin de realizar los anaacutelisis
pertinentes
67
0
02
04
06
08
1
12
0
10
20
30
40
50
60
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Bio
mas
a (g
L)
Glu
cosa
50
gL
+ F
A (g
L)
Tiempo (diacuteas)
05gL 10gL 15gL 05 gL 1 gL 15 gL
Graacutefico 14 Cineacutetica de consumo de sustrato por parte del P cubensis en medio sumergido utilizando 50 gL de glucosa como fuente de carbono y
diferentes concentraciones de FA
Analizando el graacutefico 14 se puede decir que el consumo de glucosa durante el
tiempo fue igual para las fermentaciones que conteniacutea concentraciones de 1 gL y
15 gL de FA dichos consumos corresponde a valores de 23 mientras que
para el ensayo que teniacutea una concentracioacuten de 05 gL de FA el porcentaje de
consumo fue del 18 Asimismo se presentaron diferencias significativas en
cuanto al consumo de sustrato entre los diferentes ensayos
El graacutefico 15 expone las medias del consumo de sustrato (concentracioacuten) de cada
una de las muestras y las diferencias existentes entre ellas se evidencia que la
adicioacuten de FA disminuyoacute el consumo de glucosa ademaacutes que en los ensayos se
presentaron tres grupos homogeacuteneos diferentes En el primer grupo (a) que
contiene las fermentaciones del P cubensis con una concentracioacuten de 50 gL de
glucosa y en ausencia de FA se obtuvo una media de 356 gL la cual indica un
mayor consumo de sustrato Luego el segundo grupo (c) se compone de las
concentraciones de 1 gL y 15 gL de FA presentando una media de 413 gL y
de 426 gL respectivamente y el uacuteltimo grupo (b) corresponde a una
68
concentracioacuten de 05 gL de FA el cual presenta el menor consumo de glucosa al
exponer una media 466 gL
Seguacuten lo anterior y el graacutefico 15 se dice que siacute existieron diferencias significativas
en cuanto al consumo de sustrato (concentracioacuten durante los 14 diacuteas) en los
uacuteltimos tres diacuteas cuando se trabajo con FA y sin FA y a su vez se encontraron
diferencias significativas de la concentracioacuten de sustrato en el medio cuando se
teniacutea una concentracioacuten de FA correspondiente a 05 gL con relacioacuten a las otras
dos concentraciones de FA (10 gL y 15 gL) mientras que entre estas dos
uacuteltimas concentraciones de FA (10 gL y 15 gL) no se encontraron diferencias
significativas (Anexo 6)
Tratamientos con y sin FA
Media 0 gL FA (a) 3564
Media 05 gL FA (b) 466
Media 10 gL FA (c) 4131
Media 15 gL FA (c) 426
a
b c c
0
10
20
30
40
50
60
Conc
entr
acioacute
n su
stra
to (g
L)
Letras diferentes denotan diferencias significativas (prueba LSD)
Graacutefico 15 Consumo de sustrato para cada una de las concentraciones de FA utilizadas
69
33 ESTUDIO DE LA CINEacuteTICA DE CONSUMO DE PROTEIacuteNA POR PARTE
DEL P cubensis CULTIVADO EN MEDIO SUMERGIDO (FANG-ZHONG)
Las fuentes de proteiacutena que posee el medio de Fang-Zhong son extracto de
levadura y peptona que representan una cantidad de 10 gL para cada ensayo
eacutesta cantidad se mantuvo constante para cada fermentacioacuten
Se evaluoacute el consumo de proteiacutena por parte del P cubensis durante los 14 diacuteas
de la fermentacioacuten para cada uno de los ensayos
A continuacioacuten se analizan los resultados obtenidos para cada uno de los
tratamientos
331 Consumo de proteiacutena por P cubensis en medio sumergido utilizando
diferentes concentraciones de glucosa
Una vez se calcularon las concentraciones de proteiacutena en el medio para cada
ensayo se graficaron dichos valores con respecto al tiempo
El graacutefico 16 muestra como se comportoacute el consumo de proteiacutena con respecto al
tiempo para cada una de las tres concentraciones de glucosa utilizadas y a su vez
como se comportoacute el crecimiento de biomasa para cada ensayo durante los 14
diacuteas de fermentacioacuten
70
0
01
02
03
04
05
06
07
0
5
10
15
20
25
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Bio
mas
a (g
L)
Pro
tein
a (g
L)
Tiempo (diacuteas)
30 GL 50 GL 70 GL 30 gL Biomasa 50 gL Biomasa 70 gL Biomasa
Graacutefico 16 Cineacutetica de consumo de proteiacutena por parte del P cubensis en medio sumergido utilizando diferentes concentraciones de glucosa como
fuente de carbono
Analizando el graacutefico 16 se puede observar que el consumo de proteiacutena se dio
casi en su totalidad El ensayo que mayor consumo de proteiacutena presentoacute fue el
que conteniacutea 30 gL de glucosa arrojando un porcentaje de consumo del 98
mientras que las fermentaciones realizadas a concentraciones de 50 gL y 70 gL
de glucosa presentaron un porcentaje de consumo de proteiacutena del 91 y 90
respectivamente
Al enfocarnos en la relacioacuten existente entre el consumo de proteiacutena y el
crecimiento micelial del P cubensis se puede notar gracias al graacutefico 16 que la
relacioacuten es directamente proporcional debido a que el consumo de proteiacutena fue
permanente mientras el hongo se encontraba en fase exponencial es decir el P
cubensis necesitaba de la proteiacutena para aumentar su crecimiento mientras que en
el momento en que el microorganismo comenzoacute su fase estacionaria la
concentracioacuten de proteiacutena en el medio se mantuvo constante esto uacuteltimo soacutelo es
vaacutelido para concentraciones de 50 gL y 70 gL de glucosa puesto que ambas
llegaron a la fase estacionaria
71
332 Consumo de proteiacutena por P cubensis en medio sumergido utilizando
diferentes concentraciones de sacarosa
Una vez obtenidos los valores de consumo de proteiacutena para cada concentracioacuten
de sacarosa utilizada se precedioacute a graficarlos con respecto al tiempo dichos
datos se encuentran en el graacutefico 17 De igual manera en este graacutefico se
representa la cineacutetica de crecimiento de biomasa para el P cubensis de acuerdo a
las distintas concentraciones de sacarosa utilizadas
0
01
02
03
04
05
06
0
2
4
6
8
10
12
14
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Bio
mas
a (g
L)
Prot
eiacutena
(gL
)
Tiempo (diacuteas)
30 GL 50 GL 70 GL 30 gL 50 gL 70 gL
Graacutefico 17 Cineacutetica de consumo de proteiacutena por parte del P cubensis en medio sumergido utilizando diferentes concentraciones de sacarosa como
fuente de carbono
El graacutefico 17 ilustra el consumo casi en su totalidad de la proteiacutena para cada uno
de los tratamientos El ensayo que mayor consumo de proteiacutena presentoacute fue el
que conteniacutea 30 gL de sacarosa exponiendo un porcentaje de consumo del 89
mientras que las concentraciones de 50 gL y 70 gL de sacarosa arrojaron
porcentajes de consumo del 86 y 57 respectivamente
Ahora bien al analizar el crecimiento del P cubensis con respecto al consumo de
proteiacutena se evidencia claramente que el consumo disminuyoacute permanentemente
72
en el tiempo mientras el hongo se encontraban en estado exponencial indicando
el intereacutes del P cubensis por la proteiacutena siendo eacutesta utilizada por el mismo para
aumentar su tamantildeo y biomasa
Durante los diacuteas 4 y 10 las fermentaciones que conteniacutean concentraciones de 30
gL y 70 gL de sacarosa presentaron un alto consumo de proteiacutena a pesar de
que el P cubensis se encontraba en estos dos ensayos en fase estacionaria fase
en la cual no se requiere consumir grandes cantidades de sustrato puesto que el
hongo soacutelo necesitaba alimentarse para mantenerse o para producir productos no
ligados al crecimiento maacutes no para cambiar la cantidad de biomasa presente en el
medio Asimismo la concentracioacuten de 50 gL de sacarosa tambieacuten presentoacute un
alto consumo de proteiacutena durante los diacuteas 4 y 8 en donde se creiacutea estar en una
fase estacionaria temprana lo dicho anteriormente reitera una vez maacutes la afinidad
que el P cubensis presentoacute con respecto a las fuentes de proteiacutena usadas
333 Comparacioacuten entre el consumo de proteiacutena de P cubensis en los
cultivos sumergidos con diferentes fuentes de carbono
Con el fin de conocer cuaacutel de los dos tipos de sustrato empleado fue mayormente
consumido se realizoacute un anaacutelisis estadiacutestico
En el graacutefico 18 se ilustran las medias de consumo de proteiacutena (concentracioacuten)
arrojadas mediante el anaacutelisis estadiacutestico sobre el consumo de proteiacutena cuando se
utilizoacute glucosa o sacarosa en el medio y se evidencia que existen diferencias
significativas en cuanto a la concentracioacuten de proteiacutena en el tiempo en el medio
cuando se realizoacute el experimento con glucosa y cuando se utilizoacute sacarosa
arrojando asiacute dos grupos homogeacuteneos el primero (a) presenta una media de 465
gL mientras que el grupo dos (b) arroja un valor de media de 609 gL indicando
un menor consumo de proteiacutena por parte del P cubensis en el medio sumergido
73
de Fang-Zhong cuando se utilizoacute sacarosa como principal fuente de carbono
(Anexo 7)
Tratamientos de las dos fuentes de carbono usadas sin FA (glucosa y sacarosa)
Media glucosa (a) 465
Media sacarosa (b) 609
a
b
0
1
2
3
4
5
6
7
8
Conc
entr
acioacute
n pr
oteiacute
na (g
L)
Letras diferentes denotan diferencias significativas (prueba LSD)
Graacutefico 18 Consumo de proteiacutena para cada una de las fuentes de carbono utilizadas
334 Consumo de proteiacutena por P cubensis en medio sumergido utilizando
glucosa y FA en el medio
Una vez se obtuvo la concentracioacuten de proteiacutena en el medio para cada
concentracioacuten de FA utilizada se precedioacute a graficar dichos valores con respecto
al tiempo los cuales se ilustran en el graacutefico 19 ademaacutes se muestran en dicho
graacutefico las cineacuteticas de crecimiento de biomasa para cada ensayo
74
0
02
04
06
08
1
12
0
2
4
6
8
10
12
14
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Bio
mas
a (g
L)
Pro
teiacuten
a (g
L)
Tiempo (diacuteas)
05 gL 1 gL 15 gL 05 gL 1 gL 15 gL
Graacutefico 19 Cineacutetica de consumo de proteiacutena por parte del P cubensis en medio sumergido utilizando 50 gL de glucosa como fuente de carbono y
diferentes concentraciones de FA
De igual forma que para la fermentacioacuten que teniacutea 50 gL de glucosa en el medio
realizada anteriormente para dichos ensayos el consumo de proteiacutena fue
permanente y se dio casi en su totalidad El ensayo que mayor consumo de
proteiacutena presentoacute fue el que conteniacutea 05 gL de FA arrojando un porcentaje de
consumo del 86 aun asiacute el porcentaje de consumo arrojado por la fermentacioacuten
de 1 gL de FA fue del 84 indicando que no existen diferencias con respecto al
consumo de proteiacutena entre dichas cantidades de FA utilizadas Mientras que el
porcentaje de consumo para 15 gL de FA fue inferior presentando un valor del
72 De acuerdo a los resultados mencionados anteriormente se puede decir que
a mayor concentracioacuten de FA en el medio se presenta menor consumo de
proteiacutena por parte del P cubensis esto se puede afirmar uacutenicamente para los
resultados obtenidos durante esta investigacioacuten a ciertas condiciones
Analizando ahora la relacioacuten entre el consumo de proteiacutena y el crecimiento
micelial se puede ver que al igual que para los ensayos con glucosa a 50 gL se
75
tiene un consumo permanente mientras se estaacute en fase exponencial y una vez se
llega a la fase estacionario alrededor del diacutea 12 la concentracioacuten de proteiacutena en
el medio se estabilizoacute
A la hora de indagar los datos estadiacutesticamente se puede observar que no existen
diferencias significativas sobre el consumo de proteiacutena (concentracioacuten) en el
tiempo con respecto al tipo de sustrato pero al comparar los resultados con los
ensayos donde se antildeadioacute FA al medio se encontroacute que siacute existen diferencias
significativas Se crearon dos grupos homogeacuteneos el primero cuenta con glucosa
y sacarosa presentando medias (cantidad de proteiacutena en el medio) de 468 gL y
473 gL respectivamente mientras que el ensayo con FA se encuentra en otro
grupo en donde su consumo de proteiacutena fue menor presentando una media
(cantidad de proteiacutena en el medio) de 614 gL (Anexo 8)
Tratamientos con y sin FA
Media glucosa (a) 468
Media sacarosa Proteiacutena (a) 473
Media fenilalanina (b) 614
a a
b
0
1
2
3
4
5
6
7
8
Co
nce
ntr
acioacute
n p
rote
iacutena
(gL
)
Letras diferentes denotan diferencias significativas (prueba LSD)
Graacutefico 20 Consumo de proteiacutena para los ensayos con y sin FA
76
34 ESTUDIO CUALITATIVO DE LA PRESENCIA DEL ALCALOIDE
Posterior a las fermentaciones de glucosa sacarosa y glucosa 50 gL con FA y
los respectivos anaacutelisis se realizoacute un uacuteltimo anaacutelisis que a la vez fue el de mayor
relevancia a la hora de determinar cuaacutel de los medios fue el que mejores
resultados arrojoacute En primera instancia se utilizoacute el reactivo de Dragendorff como
indicador de alcaloide para analizar las muestras de los diacuteas 12 13 y 14 con el fin
de esclarecer la presencia de alcaloides (Anexo 17)
Una vez detectada la presencia de alcaloides gracias a la coloracioacuten naranja
presentada en las muestras se procedioacute a realizar la teacutecnica de HPLC con el fin
de hallar un porcentaje del compuesto de intereacutes basado en las aacutereas obtenidas
de los cromatogramas (asumiendo un tiempo de retencioacuten entre 62 y 72
minutos)
341 Produccioacuten de compuestos producidos por P cubensis cuando el
medio no conteniacutea FA
A la hora de analizar y confirmar cuaacutel fue el mejor ensayo de los experimentos
realizados se tuvo como criterio base determinar la fuente de carbono y su
respectiva concentracioacuten que mejor presencia del compuesto de intereacutes arrojoacute
supuesto a un tiempo de retencioacuten entre 62 y 72 minutos
Inicialmente al obtener los anaacutelisis estadiacutesticos se deduce que no existieron
diferencias significativas entre el aacuterea del pico de intereacutes con respecto a todos los
picos arrojados por el cromatograma y los factores estudiados (tipo de sustrato
diacutea de fermentacioacuten y concentracioacuten) puesto que se obtuvieron valores de P-valor
77
de 03310 09580 y 08336 respectivamente es decir no importa queacute tipo de
sustrato se utilice la produccioacuten de alcaloide no tendraacute variaciones (Anexo 9)
Al analizar el graacutefico 21 se puede observar que las medias de las aacutereas halladas
para los diferentes ensayos con glucosa y sacarosa no presentaron diferencias
significativas es decir pertenecen al mismo grupo homogeacuteneo (a) lo que ratifica
lo dicho anteriormente
Tratamiento de las dos fuentes de carbono usadas sin FA (glucosa y sacarosa)
Media glucosa (a) 235916
Media sacarosa (a) 337147
a
a
0
7000
14000
21000
28000
35000
42000
Aacutere
a de
Com
pues
to
Letras diferentes denotan diferencias significativas (prueba LSD)
Graacutefico 21 Aacuterea del compuesto obtenido de P cubensis en tiempo de retencioacuten entre 62 y 72 minutos para las dos fuentes de carbono
Por tal razoacuten fue necesario hacer un anaacutelisis cualitativo de los cromatogramas
obtenidos mediante HPLC el cual se basoacute en la forma del pico arrojado por la
teacutecnica La figura 6 ilustra dicho anaacutelisis
78
Buena resolucioacuten de pico Mala resolucioacuten de pico
(a) (b)
Figura 6 Cromatogramas de dos diferentes fermentaciones de P cubensis que ilustran el criterio de escogencia del mejor ensayo realizado (a) 50 gL
glucosa (b) 50 gL sacarosa
Primero fue necesario observar el tamantildeo del pico y posterior a eacutesto determinar
su resolucioacuten La figura 6 ilustra dos ejemplos el de 50 gL de glucosa el diacutea 13 y
50 gL de sacarosa el diacutea 14 mientras el primero muestra un pico grande y
definido la segunda fermentacioacuten ilustra un pico grande pero poco definido
indicando que en este caso no se resolvioacute correctamente el alcaloide es decir no
se logroacute una buena separacioacuten De esta manera se analizaron los diferentes
cromatogramas para los diacuteas 12 (Anexo 19) 13 (Anexo 20) y 14 (Anexo 21) de
cada fermentacioacuten arrojando diferencias entre los ensayos y llevando a la
conclusioacuten de que la fermentacioacuten que mejores resultados arrojoacute fue la que
conteniacutea 50 gL de glucosa
79
342 Produccioacuten de compuestos producidos por P cubensis cuando el
medio conteniacutea FA
Despueacutes de realizada la fermentacioacuten con glucosa 50 gL y concentraciones de
FA de 05 gL 10 gL y 15 gL se procedioacute de igual manera que en el estudio sin
FA a evaluar cuaacutel de estas tres concentraciones de FA exhibioacute mejor resolucioacuten
del alcaloide
Inicialmente se realizoacute un anaacutelisis estadiacutestico el cual arrojoacute que no existen
diferencias significativas con respecto al aacuterea de pico que en este caso debido al
supuesto representa la Psilocibina y los diacuteas 12 13 y 14 de la fermentacioacuten
Mediante el graacutefico 22 se puede decir que en los uacuteltimos tres diacuteas de las
fermentaciones que conteniacutean FA en el medio no existen diferencias significativas
con respecto al alcaloide de intereacutes obtenido es decir en los tres se produjo el
alcaloide (Anexo 10)
Tratamientos de los uacuteltimos tres diacuteas de fermentacioacuten usando FA
Media diacutea 12 (a) 411758
Media diacutea 13 (a) 413401
Media diacutea 14 (a) 44860
a a a
0
10000
20000
30000
40000
50000
Aacutere
a Co
mpu
esto
Letras diferentes denotan diferencias significativas
Graacutefico 22 Aacuterea del compuesto obtenido de P cubensis en tiempo de retencioacuten entre 62 y 72 minutos en los uacuteltimos tres diacuteas de la fermentacioacuten
con FA y glucosa
80
Igual que en numeral anterior fue necesario realizar anaacutelisis cualitativo para los
cromatogramas por ende se requirioacute observar el tamantildeo del pico y posterior a
eacutesto determinar su resolucioacuten
Buena resolucioacuten de pico Mala resolucioacuten de pico
(a) (b)
Figura 7 Cromatogramas de dos diferentes fermentaciones de P cubensis que ilustran el criterio de escogencia del mejor ensayo realizado (a) 05 gL
FA (b) 15 gL FA
La figura 7 ejemplifica el anaacutelisis realizado para la seleccioacuten del mejor ensayo
ejecutado Se tienen dos cromatogramas el de 05 gL de FA en el diacutea 13 y el de
15 gL de FA para el mismo diacutea
A todos los cromatogramas obtenidos para los diacuteas 12 (Anexo 19) 13 (Anexo 20)
y 14 (Anexo 21) se realizoacute el mismo anaacutelisis y se concluyoacute que la concentracioacuten
maacutes apropiada para la obtencioacuten de la los compuestos producidos por P cubensis
fue de 05 gL de FA debido a que eacuteste generariacutea una disminucioacuten en los costos
81
35 ESTUDIO PORCENTUAL (AacuteREA) DEL ALCALOIDE REALIZADO PARA
LOS DIFERENTES ENSAYOS
Se calculoacute el porcentaje de aacuterea correspondiente al pico que identificoacute que se
asumioacute como el correspondiente a la Psilocibina gracias a la suposicioacuten realizada
del tiempo de retencioacuten
A continuacioacuten se presentan los valores obtenidos y sus respectivos anaacutelisis para
cada tratamiento
351 Porcentaje de la Psilocibina (suposicioacuten) cuando el medio no conteniacutea
FA
Debido a que no se contaba con un estaacutendar de Psilocibina los resultados
mostrados en la tabla 5 se obtuvieron realizando un porcentaje con respecto a las
aacutereas bajo la curva arrojadas mediante el anaacutelisis de cromatografiacutea de alta
eficiencia (Anexos 19 20 y 21) En dichos anexos se encuentran resaltadas en
negrilla aquellas aeacutereas utilizadas
Tabla 5 Porcentaje de aacuterea hallado mediante HPLC para los uacuteltimos tres diacuteas de la fermentacioacuten con concentraciones de 30 gL 50 gL y 70 gL de glucosa
y sacarosa con un tiempo de retencioacuten de 62 y 72 minutos
Diacutea Glucosa
(gL)
Aacuterea
(compuesto
Tr= 62-72)
Sacarosa
(gL)
Aacuterea
(compuesto
Tr= 62-72)
12 30 60650 30 3664
12 50 7396 50 5857
12 70 4816 70 3415
13 30 702 30 2876
13 50 6815 50 4113
13 70 6733 70 5583
14 30 4824 30 2756
14 50 4821 50 2792
14 70 017 70 1429
82
A la hora de analizar los datos de la tabla 5 se puede observar que el mayor
porcentaje de aacuterea se obtuvo cuando se trabajoacute con glucosa como fuente de
carbono y concretamente a una concentracioacuten de 50 gL
Analizando los datos estadiacutesticamente no se obtuvieron diferencias significativas
en cuanto a la produccioacuten del compuesto (aacuterea) con respecto al tipo de sustrato
utilizado durante las fermentaciones es decir es indiferente si se utiliza glucosa o
sacarosa en el cultivo de P cubensis en medio sumergido de Fang-Zhong
El graacutefico 23 ilustra las medias (aacuterea) obtenidas para la produccioacuten de alcaloide en
las dos diferentes fuentes de carbono es decir glucosa y sacarosa exponiendo
un uacutenico grupo homogeacuteneo con medias (produccioacuten de alcaloide) de aacutereas de
219635 y 234391 para glucosa y sacarosa respectivamente (Anexo 11)
Tratamientos de las dos fuentes de carbono usadas sin FA (glucosa y sacarosa)
Media glucosa (a) 219635
Media sacarosa (a) 234391
a
a
2000
2100
2200
2300
2400
Aacuterea
Com
pues
to
Letras diferentes denotan diferencias significativas (prueba LSD)
Graacutefico 23 Aacuterea del compuesto obtenido de P cubensis en tiempo de retencioacuten entre 62 y 72 minutos para cada una de las fuentes de carbono
utilizadas
Aun asiacute estudiando los graacuteficos de HPLC con el criterio mencionado
anteriormente es decir observando el tamantildeo del pico y su resolucioacuten del mismo
83
se observoacute claramente que la presencia del alcaloide (tiempo de retencioacuten
supuesto entre 62 y 72 minutos) fue mejor cuando se trabajoacute con glucosa a una
concentracioacuten de 50 gL debido que presenta el mejor pico
352 Porcentaje de aacuterea de compuestos presentes en P cubensis cuando
el medio conteniacutea FA
Con el fin de observar si la adicioacuten de FA al medio si arrojoacute mejores resultados en
cuanto a la produccioacuten del compuesto presente entre un rango de 62 y 72
minutos como tiempo de retencioacuten se procedioacute a calcular el porcentaje del aacuterea
de intereacutes de acuerdo a las aacutereas arrojadas para cada ensayo por medio del
anaacutelisis de HPLC Los datos obtenidos se ilustran a continuacioacuten en la tabla 6
Tabla 6 Porcentaje hallado mediante HPLC para los uacuteltimos tres diacuteas de la fermentacioacuten con concentraciones de 05 gL 10 gL y 15 gL de FA y 50 gL
de glucosa con un tiempo de retencioacuten entre 62 y 72 minutos
Diacutea
Glucosa
50 gL +
FA
Aacuterea
(compuesto
Tr=62-72)
12 0 4315
12 05 2931
12 1 6236
12 15 847
13 0 3257
13 05 7549
13 1 4790
13 15 2721
14 0 4822
14 05 3863
14 1 5801
14 15 2102
84
Al detallar la tabla 6 puede observarse que el ensayo que mayor porcentaje de
aacuterea arrojoacute fue el que conteniacutea 05 gL de FA arrojando su maacuteximo porcentaje
correspondiente a 755 el diacutea 13 Aun asiacute las diferencias existentes entre ellos
no fueron significativas
Ahora bien al analizarlos estadiacutesticamente se encontroacute que la produccioacuten del
alcaloide en presencia de FA presentoacute la misma tendencia que los ensayos
analizados anteriormente sin eacutesta pero gracias a que este aminoaacutecido duplico la
cantidad de biomasa y debido a que el compuesto de intereacutes se produce
intracelularmente se afirma que el uso de FA aumentoacute la generacioacuten del
compuesto evaluado (Anexo 12)
El graacutefico 24 presenta las diferentes medias en cuanto al porcentaje de aacuterea del
compuesto presente entre 62 y 72 minutos para los diferentes tratamientos de
glucosa a una concentracioacuten de 50 gL y sus concentraciones respectivas de FA
Claramente se ve que soacutelo existe un grupo homogeacuteneo lo que reafirma que no
existen diferencias significativas de la produccioacuten con respecto a las
concentraciones de FA
85
Tratamientos con y sin FA
Media 0 gL FA (a) 3122
Media 05 gL FA (a) 2391
Media 10 gL FA (a) 2823
Media 15 gL FA (a) 2113
a
aa
a
0
5
10
15
20
25
30
35
40
Aacutere
a Co
mpu
esto
Letras diferentes denotan diferencias significativas (prueba LSD)
Graacutefico 24 Aacuterea del compuesto obtenido de P cubensis en tiempo de retencioacuten entre 62 y 72 minutos para cada una de las concentraciones de
FA utilizadas
Debido a que no se encontraron diferencias significativas en cuanto al porcentaje
de aacuterea obtenido mediante los cromatogramas se concluye que el mejor medio es
el que tiene como fuente de carbono glucosa a una concentracioacuten de 50 gL y una
adicioacuten de 05 gL de FA puesto que genera una disminucioacuten en costos
86
CONCLUSIONES
No existen diferencias significativas en el crecimiento micelial de P
cubensis en medio sumergido Fang-Zhong cuando se trabaja con fuentes
de carbono glucosa y sacarosa sin embargo se decide trabajar con 50 gL
de glucosa puesto que eacuteste tiene una buena presencia de alcaloide y a su
vez una mejor produccioacuten de biomasa
La concentracioacuten de glucosa utilizada para el crecimiento de P cubensis
influye en el crecimiento micelial obteniendo concentraciones de biomasa
de 062 gL 055 gL y 048 gL para concentraciones de sustrato de 70 50
y 30 gL de glucosa siendo las dos primeras significativamente diferentes
con respecto a la de 30 gL
La concentracioacuten de sacarosa utilizada para el crecimiento de P cubensis
influye en el crecimiento micelial obteniendo concentraciones de biomasa
de 057 gL 045 gL y 026 gL para concentraciones de sustrato de 70 50
y 30 gL de sacarosa siendo significativamente diferentes entre ellas
La resolucioacuten de los picos obtenidos por RP-HPLC del extracto de P
cubensis fue mayor para las fermentaciones realizadas con una
concentracioacuten de 50 gL de glucosa lo que conllevoacute a utilizarlo al realizar
los ensayos que conteniacutean en el medio FA
La concentracioacuten de biomasa de P cubensis obtenida en cultivo sumergido
en medio Fang-Zhong con glucosa se duplicoacute con la adicioacuten de FA No
obstante no existen diferencias significativas entre las concentraciones de
FA utilizadas
87
El consumo de proteiacutena presentada por P cubensis en medio Fang-Zhong
fue casi del 100 mientras que el consumo de sustrato para el mismo
medio estuvo alrededor del 40
El consumo de sustrato durante el transcurso de las fermentaciones que no
conteniacutean FA en el medio no presentoacute diferencias significativas con
respecto a las dos fuentes de carbono utilizadas Mientras que en aquellas
fermentaciones donde se agregoacute FA al medio siacute existieron diferencias
significativas entre las fermentaciones de 15 y 1 gL de FA con respecto a
los ensayos realizados con 05 gL FA Sin embargo el P cubensis
consumioacute mayor cantidad de sustrato cuando el medio no conteniacutea FA
Se evidencioacute que el P cubensis consumioacute mayor cantidad de proteiacutena
cuando el sustrato utilizado en el medio fue glucosa y a su vez se detecto
que la adicioacuten de FA al medio tuvo como efecto la disminucioacuten en el
consumo de sustrato por parte del microorganismo
El consumo de sustrato y de proteiacutena tuvo un comportamiento similar
puesto que fue consumido permanentemente durante la fase exponencial
para cada uno de los tratamientos realizados es decir las concentraciones
de 30 gL 50 gL y 70 gL de glucosa y sacarosa como fuente de carbono y
de 05 gL 1 gL y 15 gL de FA teniendo como fuente de carbono glucosa
a una concentracioacuten de 50 gL mientras que en la fase estacionaria su
consumo se disminuyoacute permaneciendo casi constante
Despueacutes de realizados los estudios en cuanto a la produccioacuten del
compuesto presente entre 62 y 72 minutos para cada uno de los ensayos
no se evidenciaron diferencias significativas entre las dos fuentes de
carbono utilizadas (glucosa y sacarosa)
88
La adicioacuten del precursor llamado Fenilalanina (FA) al medio sumergido
Fang-Zhong para llevar a cabo el cultivo del P cubensis tuvo influencia en
cuanto a la produccioacuten de compuesto presente entre tiempo de retencioacuten de
62 y 72 minutos debido a que eacuteste duplicoacute la concentracioacuten de biomasa
en el medio se dice entonces que la produccioacuten aumentoacute al ser eacuteste de
produccioacuten intracelular
La resolucioacuten del compuesto presente entre el tiempo de retencioacuten de 62 a
72 minutos se obtuvo mejor en el ensayo que conteniacutea 05 gL de FA y al
saber que no existieron diferencias significativas en la produccioacuten en cuanto
al porcentaje de aacutereas obtenido con respecto a las demaacutes concentraciones
de FA se afirma que eacuteste es el medio que mejores resultados arrojoacute para
el crecimiento de P cubensis y la produccioacuten de Psilocibina
89
RECOMENDACIONES
Se sugiere observar el efecto que tiene la variacioacuten de las revoluciones a
las cuales se realizaron las fermentaciones para ver como variacutea el
crecimiento del P cubensis en medio sumergido Fang-Zhong con respecto
a dicho factor
Debido a que soacutelo se realizaron anaacutelisis sobre el crecimiento del P
cubensis en medio sumergido haciendo uso de dos sustratos diferentes
(glucosa y sacarosa) seriacutea recomendable realizar el mismo anaacutelisis para
otro tipo de sustrato como por ejemplo melaza por su bajo costo
Del mismo modo seriacutea apropiado realizar el estudio con otro tipo de
precursor y en otras concentraciones para ver la incidencia de eacuteste en el
comportamiento del hongo
Se recomienda realizar un escalamiento de dicho proceso en un biorreactor
con el fin de evaluar a mayor escala el crecimiento del P cubensis y la
produccioacuten del alcaloide
Debido a que la proteiacutena se comportoacute como el principal nutriente se sugiere
para una proacutexima investigacioacuten evaluar diferentes concentraciones de
proteiacutena en el medio
90
ANEXOS
Anexo 1 Anaacutelisis de varianza (ANOVA) para el crecimiento de biomasa de
las fermentaciones con glucosa
Tabla 7 Anaacutelisis de Varianza para el crecimiento micelial (glucosa)
Tabla 8 Anaacutelisis Muacuteltiple de Rangos para el crecimiento micelial (glucosa)
91
Anexo 2 Anaacutelisis de Varianza (ANOVA) para el crecimiento de biomasa de
las fermentaciones con sacarosa
Tabla 9 Anaacutelisis de Varianza para el crecimiento micelial (sacarosa)
Tabla 10 Anaacutelisis Muacuteltiple de Rangos para el crecimiento micelial (sacarosa)
92
Anexo 3 Anaacutelisis de Varianza (ANOVA) para el crecimiento de biomasa de
las fermentaciones con glucosa y sacarosa
Tabla 11 Anaacutelisis de Varianza para el crecimiento micelial (glucosa y
sacarosa)
Tabla 12 Anaacutelisis Muacuteltiple de Rangos para el crecimiento micelial (glucosa y
sacarosa)
93
Anexo 4 Anaacutelisis de Varianza (ANOVA) para el crecimiento de biomasa de
las fermentaciones con glucosa 50 gL y FA
Tabla 13 Anaacutelisis de Varianza para el crecimiento micelial (glucosa 50 gL y
FA)
Tabla 14 Anaacutelisis Muacuteltiple de Rangos para el crecimiento micelial (glucosa
50 gL y FA)
94
Anexo 5 Anaacutelisis de varianza (ANOVA) para el consumo de sustrato en las
fermentaciones sin FA
Tabla 15 Anaacutelisis de Varianza para el consumo de Sustrato sin FA
Tabla 16 Anaacutelisis Muacuteltiple de Rangos para el consumo de Sustrato sin FA
95
Anexo 6 Anaacutelisis de Varianza (ANOVA) para el consumo de sustrato en las
fermentaciones con FA
Tabla 17 Anaacutelisis de Varianza para el consumo de Sustrato con FA
Tabla 18 Anaacutelisis Muacuteltiple de Rangos para el consumo de Sustrato con FA
96
Anexo 7 Anaacutelisis de Varianza (ANOVA) para el consumo de proteiacutena en las
fermentaciones sin FA
Tabla 19 Anaacutelisis de Varianza para el consumo de Proteiacutena sin FA
Tabla 20 Anaacutelisis Muacuteltiple de Rangos para el consumo de Proteiacutena sin FA
97
Anexo 8 Anaacutelisis de Varianza (ANOVA) para el consumo de proteiacutena en las
fermentaciones con FA
Tabla 21Anaacutelisis de Varianza para el consumo de Proteiacutena con FA
Tabla 22 Anaacutelisis Muacuteltiple de Rangos para el consumo de Proteiacutena con FA
98
Anexo 9 Anaacutelisis de Varianza (ANOVA) para la produccioacuten de Psilocibina en
las fermentaciones sin FA
Tabla 23 Anaacutelisis de Varianza para la produccioacuten de Psilocibina sin FA
Tabla 24 Anaacutelisis Muacuteltiple de Rangos para la produccioacuten de Psilocibina
seguacuten el Sustrato sin FA
99
Anexo 10 Anaacutelisis de Varianza (ANOVA) para la produccioacuten de Psilocibina en las fermentaciones con FA
Tabla 25 Anaacutelisis de Varianza para la produccioacuten de Psilocibina con FA
Tabla 26 Anaacutelisis Muacuteltiple de Rangos para la produccioacuten de Psilocibina
seguacuten el diacutea con FA
100
Anexo 11 Anaacutelisis de Varianza (ANOVA) para la cuantificacioacuten porcentual de
Psilocibina en las fermentaciones sin FA
Tabla 27 Anaacutelisis de Varianza para la cuantificacioacuten de Psilocibina sin FA
Tabla 28 Anaacutelisis Muacuteltiple de Rangos para la cuantificacioacuten de Psilocibina
seguacuten el tipo de sustrato sin FA
101
Anexo 12 Anaacutelisis de Varianza (ANOVA) para la cuantificacioacuten porcentual de
Psilocibina en las fermentaciones con FA
Tabla 29 Anaacutelisis de Varianza para la cuantificacioacuten de Psilocibina con FA
Tabla 30 Anaacutelisis Muacuteltiple de Rangos para la cuantificacioacuten de Psilocibina
seguacuten la concentracioacuten con FA
102
Anexo 13 Determinacioacuten de consumo de azuacutecares por el meacutetodo de DNS
(Aacutecido Dinitrosaliciacutelico)
a DNS para glucosa
Pasos para preparar DNS
Disolver 16 gr de NaOH en agua destilada
Adicionar 30 gr de tartrato de Na y K
Aforar a 100 ml con agua destilada
Almacenar en frascos aacutembar a 4degC
Se debe mantener un stock de glucosa 4mgml y almacenarlo a 4degC A partir
de la solucioacuten de glucosa se preparan las soluciones para hacer la curva
patroacuten con las siguientes concentraciones (gL) 025 050 100 200 y 400
Procedimiento
Tomar 05 ml de cada dilucioacuten y agregar 05 ml de reactivo DNS
Preparar una muestra blanco por dilucioacuten de 05 ml de agua destilada a 05
ml de reactivo de DNS
Agitar todas las muestras
Colocar a ebullir las muestras en bantildeo mariacutea por cinco minutos
Enfriar con hielo
Adicionar 5 ml de agua destilada
Agitar y dejar en reposo 15 minutos
Leer en espectrofotoacutemetro a 540 nm
Realizar la curva Absorbancia Vs Concentracioacuten Debe tener un coeficiente
de correlacioacuten de 0991 a 0999
b DNS para sacarosa
Pasos para preparar DNS sacarosa
Preparacioacuten de la solucioacuten Standard stock de sacarosa (30 gL) tomar 30
gr de sacarosa anhiacutedrida grado reactivo con exactitud hasta la deacutecima de
mg disolver ajustar a aforo de 100 ml con agua desionizada empacar en
viales y almacenar en congelador
Preparacioacuten DNS pesar 16 gr de hidroacutexido de sodio grado reactivo 30 gr
de tartrato de sodio y potasio y disolverlos juntos con 50 ml de agua
103
desionizada aparte pesar 10 gr del DNS disolver con 30 ml de agua
desionizada agregar lentamente y con agitacioacuten la solucioacuten del DNS a la
solucioacuten de tartrato y NaOH anteriormente preparadas ajustar a 100 ml
filtrar envasar en frasco aacutembar y rotular con fecha de vencimiento incluida
(3 meses maacuteximo) mantener a la temperatura del laboratorio
Preparacioacuten del reactivo NaOH 10 N (500 ml) pesar con exactitud hasta
la deacutecima de mg 20 gr de NaOH grado reactivo por cada 500 ml de
solucioacuten disolver primero con 300 ml de agua desionizada y luego aforar a
500 ml envasar y rotular correctamente y mantener a la temperatura del
laboratorio
Preparacioacuten de HCL 10 (100 ml) tomar 27 ml de aacutecido clorhiacutedrico al
37 grado reactivo y aforar hasta 100 ml con agua desionizada envasar
rotular correctamente de acuerdo a la norma del laboratorio y almacenar a
la temperatura del laboratorio
Se debe mantener un stock de glucosa 30 gL y almacenarlo a 4degC A partir
de la solucioacuten de glucosa se preparan las soluciones para hacer la curva
patroacuten con las siguientes concentraciones (gL) 3 6 12 18 24 y 30
Procedimiento
Preparar en cada tubo (las soluciones de la curva patroacuten de sacarosa las
muestras problemas diluidas si es necesario y como blanco agua
desionizada) 100microl de solucioacuten
Adicionar 200 microl de HCL 10 a cada tubo y agitar todos los tubos en vortex
Llevar a ebullicioacuten por 10 minutos en bantildeo mariacutea precalentado a 95degC
Enfriar hasta temperatura ambiente raacutepidamente
Adicionar a cada tubo 1 ml de NaOH 10 N y agitar los tubos en vortex
Aparte tomar 05 ml de cada tubo en otros tubos rotulados y agregar 05 ml
del DNS
Agitar todas las muestras en vortex
Llevar a ebullicioacuten por 5 minutos en bantildeo mariacutea precalentado a 96degC
Enfriar hasta temperatura ambiente raacutepidamente
Adicionar 5 ml de H2O desionizada agitar en vortex y dejar reposar por 15
minutos
Leer en espectrofotoacutemetro a 540 nm
Realizar la curva Absorbancia Vs Concentracioacuten Debe tener un coeficiente
de correlacioacuten de 0991 a 0999
104
Anexo 14 Cineacutetica de Consumo de Sustrato
La cineacutetica de consumo de sustrato se realizoacute por el meacutetodo de Aacutecido
Dinitrosaliciacutelico (DNS) Los rangos de concentracioacuten y absorbancia para cada caso
se citan a continuacioacuten
Rangos de concentraciones y absorbancias para las fermentaciones que
usaron glucosa (30 gL 50 gL y 70 gL) como sustrato
Concentracioacuten de 02 a 12 gL
Absorbancia de 01234 a 06612
Ecuacioacuten Y = 19174x -00517 R2 = 09923
Rangos de concentraciones y absorbancias para las fermentaciones que
usaron sacarosa (30 gL 50 gL y 70 gL) como sustrato
Concentracioacuten de 3 a 30 gL
Absorbancia de 00822 a 11112
Ecuacioacuten Y = 25983x + 04857 R2 = 09978
Rangos de concentraciones y absorbancias para las fermentaciones que
usaron glucosa 50 gL como sustrato y FA
Concentracioacuten de 02 a 12 gL
Absorbancia de 0097 a 063
Ecuacioacuten Y = 18785x + 00019 R2 = 09986
105
Anexo 15 Determinacioacuten de consumo de proteiacutenas por el meacutetodo de LOWRY
Pasos para la preparacioacuten de LOWRY
Para obtener la curva estaacutendar de Albuacutemina se preparan 5 soluciones
patrones de Albuacutemina en NaCL al 09 (PV) de las siguientes
concentraciones 152 80 200 300 400 Pgml Si la concentracioacuten de
Proteiacutena total es menor de 500 Pgml se lee la absorbancia a 750 nm si
estaacute entre 1000 y 2000 Pgml se lee a 550nm
Se prepara un blanco que no lleva Albuacutemina y en su reemplazo se adiciona
0-5 ml de solucioacuten salina (NaCL) al 09 (PV) Se aplica el mismo
procedimiento que a las demaacutes muestras
Procedimiento
Servir en tubos de ensayo 05 ml de las soluciones patroacuten de Albuacutemina las
muestras problema y NaCL al 09 como blanco Deben estar marcados
para conservar el orden de concentraciones para la curva
Adicionar a cada tubo 05 ml de NaOH 2N y llevar al bantildeo Mariacutea
precalentado a 100degC por un tiempo de 10 minutos
Dejar enfriar hasta que alcance la Temperatura Ambiente
Agregar a cada tubo 5 ml de la solucioacuten complejante mezclar y dejar
reposar por 10 minutos
Adicionar 05 ml del reactivo de Folin-Ciocalteu 11 vortexiar durante 20
segundos
Reposar en un cuarto oscuro durante 30 minutos
Leer la absorbancia a 750 nm y con las soluciones patroacuten construir la
graacutefica Absorbancia Vs Concentracioacuten de Albuacutemina Seacuterica de Bovina
(BSA) con eacutesta se puede determinar la concentracioacuten de las muestras
problema interpolando el valor de la Absorbancia La curva estaacutendar debe
tener un coeficiente de correlacioacuten de 0991 a 0999
106
Anexo 16 Cineacutetica consumo de Proteiacutena
La cineacutetica de consumo de proteiacutena se realizoacute por el meacutetodo LOWRY Los rangos
de concentracioacuten y absorbancia para cada caso se citan a continuacioacuten
Rangos de concentraciones y absorbancias para las fermentaciones que
usaron glucosa (30 gL 50 gL y 70 gL) como sustrato
Concentracioacuten de 0016 a 04 gL
Absorbancia de 00094 a 05382
Ecuacioacuten Y = 07427x ndash 00021 R2 = 09955
Rangos de concentraciones y absorbancias para las fermentaciones que
usaron sacarosa (30 gL 50 gL y 70 gL) como sustrato
Concentracioacuten de 0016 a 04 gL
Absorbancia de 00374 a 06178
Ecuacioacuten Y = 06567x ndash 00166 R2 = 09968
Rangos de concentraciones y absorbancias para las fermentaciones que
usaron glucosa 50 gL como sustrato y FA
Concentracioacuten de 0016 a 04 gL
Absorbancia de 00708 a 04647
Ecuacioacuten Y = 09814x ndash 00581 R2 = 09992
107
Anexo 17 Prueba de reactivo de Dragendorff
Preparacioacuten de reactivo de Dragendorff para alcaloides
Reactivo de Dragendorff se prepara mezclando 8 gr de nitrato de bismuto
pentahidratado en 20 ml de aacutecido niacutetrico al 30 con una solucioacuten de 272 g de
yoduro de potasio en 50 ml de agua Se deja en reposo por 24 horas se decanta y
se afora a 100 ml La presencia de alcaloides se detecta por la formacioacuten de un
precipitado naranja rojizo cuando se le adiciona esta reactivo a una solucioacuten aacutecida
de alcaloides De los precipitados lavados se puede recuperar los alcaloides con
una solucioacuten saturada de carbonato de sodio (Mercano y Hasegawa 1991)
La figura mostrada a continuacioacuten refleja la presencia del alcaloide debido a la
coloracioacuten amarillo-rojiza que eacutesta sufrioacute
Figura 8 Muestra de biomasa una vez analizada mediante el reactivo de Dragendorff
108
Anexo 18 Barrido Espectral para el Psilocybe cubensis
La metodologiacutea mencionada a continuacioacuten estaacute basada en artiacuteculo base
(Tsujikawa et al 2003)
El Sistema de HPLC consiste en un Shimadzu LC-10ordf Series Cromatografiacutea
Liacutequida equipada con un diodo SPD-M10A detector de red fija en 220nm La
separacioacuten cromatograacutefica ser realizoacute con una columna simeacutetrica C18 (21 mm a
150 mm 5mm Waters Assoc Milford EEUU
La fase moacutevil utilizada fue de 10 mm de formato de amonio-aacutecido foacutermico (955
VV) a un pH de 35 y bombeado a un caudal de 02 mlminuto
El perfil cromatograacutefico obtenido durante la investigacioacuten de Tsujikawa et al
(2003) se muestra en le figura 6 que aparece a continuacioacuten
Figura 9 Perfil cromatograacutefico (Tsujikawa et al 2003)
109
Anexo 19 Cromatogramas (HPLC) del diacutea 12 de fermentacioacuten
Tabla 31 Aacutereas obtenidas de los cromatogramas para el P cubensis en
medio Fang-Zhong en el diacutea 12 para concentraciones de 30gL glucosa y
30gL sacarosa
SustratoConcentracioacuten
(gL)
Tiempo
(s)Aacuterea
Glucosa 30 2957 3837
Glucosa 30 6838 474753
Glucosa 30 9144 47256
Glucosa 30 9489 16822
Glucosa 30 10124 224349
Sacarosa 30 6538 143772
Sacarosa 30 7234 269458
Sacarosa 30 9721 33646
Sacarosa 30 11845 24384
(a) (b)
Graacutefico 25 Cromatogramas del diacutea 12 para el P cubensis cultivado en medio
sumergido Fang-Zhong con dos diferentes tipos de sustratos (a) 30 gL
glucosa (b) 30 gL sacarosa
110
Tabla 32 Aacutereas obtenidas de los cromatogramas para el P cubensis en
medio Fang-Zhong en el diacutea 12 para concentraciones de 50gL glucosa y
50gL sacarosa
SustratoConcentracioacuten
(gL)
Tiempo
(s)Aacuterea
Glucosa 50 0524 319
Glucosa 50 6298 5991
Glucosa 50 7172 237042
Glucosa 50 9144 16387
Glucosa 50 10009 6077
Sacarosa 50 169 24011
Sacarosa 50 3105 28573
Sacarosa 50 6916 112166
Sacarosa 50 9136 4057
Sacarosa 50 9933 8821
Sacarosa 50 10398 13872
(a) (b)
Graacutefico 26 Cromatogramas del diacutea 12 para el P cubensis cultivado en medio
sumergido Fang-Zhong con dos diferentes tipos de sustratos (a) 50 gL
glucosa (b) 50 gL sacarosa
111
Tabla 33 Aacutereas obtenidas de los cromatogramas para el P cubensis en
medio Fang-Zhong en el diacutea 12 para concentraciones de 50gL glucosa y
50gL sacarosa
SustratoConcentracioacuten
(gL)
Tiempo
(s)Aacuterea
Glucosa 70 7217 168598
Glucosa 70 9145 9977
Glucosa 70 997 80558
Sacarosa 70 6803 287387
Sacarosa 70 7517 131049
Sacarosa 70 7775 4434
Sacarosa 70 7871 77109
Sacarosa 70 823 96239
Sacarosa 70 9039 5114
Sacarosa 70 9778 25394
(a) (b)
Graacutefico 27 Cromatogramas del diacutea 12 para el P cubensis cultivado en medio
sumergido Fang-Zhong con dos diferentes tipos de sustratos (a) 50 gL
glucosa (b) 50 gL sacarosa
112
Tabla 34 Aacutereas obtenidas de los cromatogramas para el P cubensis en
medio Fang-Zhong en el diacutea 12 para concentraciones de 50gL y glucosa
50gL sacarosa
SustratoConcentracioacuten
(gL)
Tiempo
(s)Aacuterea
Glucosa 50 05 0818 4722
Glucosa 50 05 2423 52579
Glucosa 50 05 3502 88765
Glucosa 50 05 6137 16009
Glucosa 50 05 6722 275258
Glucosa 50 05 733 226399
Glucosa 50 05 8339 65139
Glucosa 50 05 9101 36797
Glucosa 50 05 9815 130883
Glucosa 50 1 1105 743
Glucosa 50 1 2746 2701
Glucosa 50 1 4304 80304
Glucosa 50 1 6167 19649
Glucosa 50 1 6794 51753
Glucosa 50 1 8282 82997
Glucosa 50 1 9116 38659
Glucosa 50 1 9899 136953
Glucosa 50 15 1198 3313
Glucosa 50 15 2937 37875
Glucosa 50 15 4332 51079
Glucosa 50 15 614 25602
Glucosa 50 15 6737 668905
Glucosa 50 15 8209 107332
Glucosa 50 15 9602 38902
Glucosa 50 15 9752 139613
Diacutea 12
(a) (b)
(c)
Graacutefico 28 Cromatograma del diacutea 12 para el P cubensis cultivado en medio
sumergido Fang-Zhong con fuente de carbono glucosa y adicioacuten de
fenilalanina en tres concentraciones (a) 05 gL FA (b) 1 gL FA (c) 15gL
FA
113
Anexo 20 Cromatogramas (HPLC) del diacutea 13 de fermentacioacuten
Tabla 35 Aacutereas obtenidas de los cromatogramas para el P cubensis en
medio Fang-Zhong en el diacutea 13 para concentraciones de 30gL glucosa y
30gL sacarosa
SustratoConcentracioacuten
(gL)
Tiempo
(s)Aacuterea
Glucosa 30 0225 1155
Glucosa 30 2847 699
Glucosa 30 4043 1038
Glucosa 30 6231 4994
Glucosa 30 6787 295182
Glucosa 30 7462 241146
Glucosa 30 9066 51836
Glucosa 30 10004 158746
Sacarosa 30 1734 135
Sacarosa 30 5838 1857
Sacarosa 30 6803 147867
Sacarosa 30 7305 30464
Sacarosa 30 7599 174643
Sacarosa 30 9107 8564
Sacarosa 30 9897 104278
(a) (b)
Graacutefico 29 Cromatogramas del diacutea 13 para el P cubensis cultivado en medio
sumergido Fang-Zhong con dos diferentes tipos de sustratos (a) 30 gL
glucosa (b) 30 gL sacarosa
114
Tabla 36 Aacutereas obtenidas de los cromatogramas para el P cubensis en
medio Fang-Zhong en el diacutea 13 para concentraciones de 50gL glucosa y
50gL sacarosa
SustratoConcentracioacuten
(gL)
Tiempo
(s)Aacuterea
Glucosa 50 1408 13982
Glucosa 50 6949 331449
Glucosa 50 9012 25201
Glucosa 50 9936 27216
Sacarosa 50 1543 7293
Sacarosa 50 6813 437765
Sacarosa 50 9085 35897
Sacarosa 50 10049 184461
(a) (b)
Graacutefico 30 Cromatogramas del diacutea 13 para el P cubensis cultivado en medio
sumergido Fang-Zhong con dos diferentes tipos de sustratos (a) 50 gL
glucosa (b) 50 gL sacarosa
115
Tabla 37 Aacutereas obtenidas de los cromatogramas para el P cubensis en
medio Fang-Zhong en el diacutea 13 para concentraciones de 70gL glucosa y
70gL sacarosa
SustratoConcentracioacuten
(gL)
Tiempo
(s)Aacuterea
Glucosa 70 1456 3223
Glucosa 70 2985 2423
Glucosa 70 54 7586
Glucosa 70 6262 5149
Glucosa 70 7151 248331
Glucosa 70 9039 19346
Glucosa 70 9929 4906
Glucosa 70 11051 33698
Sacarosa 70 0437 342
Sacarosa 70 1428 812
Sacarosa 70 2948 2191
Sacarosa 70 5473 4854
Sacarosa 70 6286 5336
Sacarosa 70 6848 3649
Sacarosa 70 733 11383
Sacarosa 70 9073 1018
Sacarosa 70 9878 11072
Sacarosa 70 10267 18797
(a) (b)
Graacutefico 31 Cromatogramas del diacutea 13 para el P cubensis cultivado en medio
sumergido Fang-Zhong con dos diferentes tipos de sustratos (a) 70 gL
glucosa (b) 70 gL sacarosa
116
Tabla 38 Aacutereas obtenidas de los cromatogramas para el P cubensis en
medio Fang-Zhong en el diacutea 13 para concentraciones de 50gL y glucosa
50gL sacarosa
SustratoConcentracioacuten
(gL)
Tiempo
(s)Aacuterea
Glucosa 50 05 4067 22222
Glucosa 50 05 7379 55573
Glucosa 50 05 902 19513
Glucosa 50 05 9716 119261
Glucosa 50 05 1173 19427
Glucosa 50 1 0793 14776
Glucosa 50 1 2868 28537
Glucosa 50 1 6224 1206
Glucosa 50 1 6782 571299
Glucosa 50 1 8303 92665
Glucosa 50 1 9081 30371
Glucosa 50 1 9738 168959
Glucosa 50 1 11813 27921
Glucosa 50 15 0412 269
Glucosa 50 15 2482 14692
Glucosa 50 15 3486 91059
Glucosa 50 15 6039 6892
Glucosa 50 15 6627 216986
Glucosa 50 15 7216 260795
Glucosa 50 15 8112 65776
Glucosa 50 15 8888 19083
Glucosa 50 15 9497 37812
Glucosa 50 15 9839 65922
Glucosa 50 15 11655 7331
(a) (b)
(c)
Graacutefico 32 Cromatogramas del diacutea 12 para el P cubensis cultivado en medio
sumergido Fang-Zhong con fuente de carbono glucosa y adicioacuten de
fenilalanina en tres concentraciones (a) 05 gL FA (b) 1 gL FA (c) 15gL
FA
117
Anexo 21 Cromatogramas (HPLC) del diacutea 14 de fermentacioacuten
Tabla 39 Aacutereas obtenidas de los cromatogramas para el P cubensis en
medio Fang-Zhong en el diacutea 14 para concentraciones de 30gL glucosa y 30
gL sacarosa
SustratoConcentracioacuten
(gL)
Tiempo
(s)Aacuterea
Glucosa 30 1054 181
Glucosa 30 2553 8939
Glucosa 30 6219 7557
Glucosa 30 6585 77083
Glucosa 30 7158 285069
Glucosa 30 8987 33875
Glucosa 30 9848 87461
Glucosa 30 10694 52151
Glucosa 30 12482 7992
Glucosa 30 12943 23064
Glucosa 30 1493 5948
Sacarosa 30 7309 7075
Sacarosa 30 9984 1680
Sacarosa 30 10442 15395
Sacarosa 30 11211 8511
Sacarosa 30 13405 3398
(a) (b)
Graacutefico 33 Cromatogramas del diacutea 14 para el P cubensis cultivado en medio
sumergido Fang-Zhong con dos diferentes tipos de sustratos (a) 30 gL
glucosa (b) 30 gL sacarosa
118
Tabla 40 Aacutereas obtenidas de los cromatogramas para el P cubensis en
medio Fang-Zhong en el diacutea 14 para concentraciones de 50gL glucosa y
50gL sacarosa
SustratoConcentracioacuten
(gL)
Tiempo
(s)Aacuterea
Glucosa 50 2029 8318
Glucosa 50 6257 5782
Glucosa 50 6875 306684
Glucosa 50 9068 22819
Glucosa 50 9808 92492
Glucosa 50 12113 8823
Glucosa 50 12752 23988
Sacarosa 50 1036 3783
Sacarosa 50 2356 7005
Sacarosa 50 653 44831
Sacarosa 50 6657 127617
Sacarosa 50 7264 66908
Sacarosa 50 7464 255141
Sacarosa 50 9035 26172
Sacarosa 50 9458 28427
Sacarosa 50 9889 37574
Sacarosa 50 10312 140881
Sacarosa 50 12335 13391
Sacarosa 50 1292 17066
(a) (b)
Graacutefico 34 Cromatogramas del diacutea 14 para el P cubensis cultivado en medio
sumergido Fang-Zhong con dos diferentes tipos de sustratos (a) 50 gL
glucosa (b) 50 gL sacarosa
119
Tabla 41 Aacutereas obtenidas de los cromatogramas para el P cubensis en
medio Fang-Zhong en el diacutea 14 para concentraciones de 70gL glucosa y
70gL sacarosa
SustratoConcentracioacuten
(gL)
Tiempo
(s)Aacuterea
Glucosa 70 6257 5879
Glucosa 70 6373 145551
Glucosa 70 7015 68223
Glucosa 70 7199 9085
Glucosa 70 735 265755
Glucosa 70 9014 4642
Glucosa 70 9877 97804
Glucosa 70 107 67421
Glucosa 70 12625 26231
Glucosa 70 1305 65607
Sacarosa 70 2283 4683
Sacarosa 70 5191 93
Sacarosa 70 6304 3719
Sacarosa 70 6795 136542
Sacarosa 70 726 29869
Sacarosa 70 7515 75545
Sacarosa 70 7872 119563
Sacarosa 70 9166 1244
Sacarosa 70 9658 23096
Sacarosa 70 9871 25866
Sacarosa 70 10421 105108
Sacarosa 70 12347 11115
Sacarosa 70 12861 35503
Sacarosa 70 14272 3676
(a) (b)
Graacutefico 35 Cromatogramas del diacutea 14 para el P cubensis cultivado en medio
sumergido Fang-Zhong con dos diferentes tipos de sustratos (a) 70 gL
glucosa (b) 70 gL sacarosa
120
Tabla 42 Aacutereas obtenidas de los cromatogramas para el P cubensis en medio Fang-Zhong en el diacutea 13 para concentraciones de 50gL glucosa y
50gL sacarosa
SustratoConcentracioacuten
(gL)
Tiempo
(s)Aacuterea
Glucosa 50 05 0123 173
Glucosa 50 05 0699 7584
Glucosa 50 05 2594 2742
Glucosa 50 05 6104 11663
Glucosa 50 05 6616 487848
Glucosa 50 05 7235 287918
Glucosa 50 05 8183 135793
Glucosa 50 05 8903 5143
Glucosa 50 05 9484 66817
Glucosa 50 05 9679 168855
Glucosa 50 05 11671 4216
Glucosa 50 1 0345 295
Glucosa 50 1 2654 11981
Glucosa 50 1 412 45301
Glucosa 50 1 6111 12626
Glucosa 50 1 6757 526655
Glucosa 50 1 8093 104277
Glucosa 50 1 894 25251
Glucosa 50 1 9643 158685
Glucosa 50 1 11666 22779
Glucosa 50 15 0353 283
Glucosa 50 15 2522 15272
Glucosa 50 15 3577 83963
Glucosa 50 15 6668 47137
Glucosa 50 15 7304 371442
Glucosa 50 15 8226 117611
Glucosa 50 15 8923 61949
Glucosa 50 15 9657 19618
Glucosa 50 15 11668 35606
(a) (b)
(c)
Graacutefico 36 Cromatogramas del diacutea 12 para el P cubensis cultivado en medio sumergido Fang-Zhong con fuente de carbono glucosa y adicioacuten de
fenilalanina en tres concentraciones (a) 05 gL FA (b) 1 gL FA (c) 15gL FA (a) 05 gL FA (b) 1 gL FA (c) 15gL FA
121
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WURST M SEMERDZIEVA M VOKOUN J (1984) Analysis of
psychotropic compounds in fungi of the genus Psilocybe by reversed-phase
highperformance liquid chromatography Journal of chromatography 286
229-235
iv
A Dios por habernos brindado la oportunidad de lograr este
triunfo en nuestras vidas
A nuestras familias por todo el apoyo que nos brindaron durante
el desarrollo de este proyecto y por habernos dado la gran oportunidad de convertirnos
en profesionales
A toda la docencia por la educacioacuten y orientacioacuten
recibida por eacutesta
v
AGRADECIMIENTOS
Los autores expresan sus agradecimientos a todas las personas que desde su experiencia y profesioacuten brindaron apoyo durante el desarrollo de este proyecto Alex Armando Saacuteez V Quiacutemico MSc En Biotecnologiacutea Candidato a Doctorado Profesor Universidad EAFIT Personal de laboratorio de Ingenieriacutea de Procesos Edgar Arbelaacuteez John Estrada y especialmente Sigifredo Caacuterdenas encargado del laboratorio de Biotecnologiacutea de la Universidad EAFIT Luz Deisy Mariacuten Palacio Ingeniera de Procesos Profesora Universidad EAFIT Diego Acosta PhD Engineering and Material Science Profesor Universidad EAFIT Carlos Correa Ingeniero Quiacutemico Profesor Universidad EAFIT Valeska Villegas E Msc En Biotecnologiacutea Candidata a Doctorado Profesora Universidad EAFIT
vi
TABLA DE CONTENIDO
LISTA DE TABLAS _________________________________________________________________________ IX
LISTA DE FIGURAS ________________________________________________________________________ XI
LISTA DE GRAacuteFICOS ______________________________________________________________________ XII
LISTA DE ECUACIONES ____________________________________________________________________ XV
LISTAS DE ANEXOS ______________________________________________________________________ XVI
RESUMEN _____________________________________________________________________________ XVII
INTRODUCCIOacuteN _________________________________________________________________________ 19
OBJETIVOS _____________________________________________________________________________ 21
GENERAL_____________________________________________________________________________ 21
ESPECIacuteFICOS __________________________________________________________________________ 21
1 MARCO TEOacuteRICO ___________________________________________________________________ 22
11 CONCEPTOS GENERALES DE HONGOS _______________________________________________ 22
111 Hongos laminares (Agaricales) ____________________________________________________ 22
12 MEDIOS DE CULTIVO_____________________________________________________________ 24
121 Medio sumergido _______________________________________________________________ 25
13 ALCALOIDES ___________________________________________________________________ 26
131 Generalidades _______________________________________________________________ 26
132 Propiedades fisicoquiacutemicas _____________________________________________________ 27
133 Reconocimiento de los alcaloides ________________________________________________ 27
134 Clasificacioacuten de los alcaloides ___________________________________________________ 28
1341 Alcaloides alifaacuteticos ____________________________________________________________ 28
1342 Alcaloides de origen diverso _____________________________________________________ 28
1343 Alcaloides aromaacuteticos __________________________________________________________ 28
13 PSILOCIBINA Y PSILOCINA _________________________________________________________ 31
131 Antecedentes acerca de la obtencioacuten de Psilocibina y Psilocina ________________________ 32
2 MATERIALES Y MEacuteTODOS_____________________________________________________________ 34
21 LOCALIZACIOacuteN _________________________________________________________________ 34
22 MICROORGANISMO DE ESTUDIO ___________________________________________________ 34
23 COMPONENTES DEL MEDIO DE CULTIVO (FANG-ZHONG) _______________________________ 35
24 PREPARACIOacuteN DE LOS DIFERENTES PREINOacuteCULOS DE P CUBENSIS EMPLEADOS PARA LAS
FERMENTACIONES SUMERGIDAS _________________________________________________________ 35
25 PREPARACIOacuteN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO Y LOS INOacuteCULOS DE P CUBENSIS UTILIZADOS PARA LAS
FERMENTACIONES SUMERGIDAS _________________________________________________________ 36
26 CUANTIFICACIOacuteN DEL CRECIMIENTO DE BIOMASA MEDIANTE LOS MEacuteTODOS DE PESO HUacuteMEDO Y
PESO SECO PARA CULTIVO SUMERGIDO DE P CUBENSIS ________________________________________ 37
27 AJUSTE DE LA CINEacuteTICA DE CRECIMIENTO DE P CUBENSIS AL MODELO CINEacuteTICO LOGIacuteSTICO ____ 37
vii
28 EVALUACIOacuteN DEL CONSUMO DE SUSTRATO Y DEL CONSUMO DE PROTEIacuteNA POR PARTE DEL P
CUBENSIS CULTIVADO EN MEDIO SUMERGIDO ________________________________________________ 39
29 MEacuteTODO CUALITATIVO PARA DETERMINAR LA PRESENCIA DE ALCALOIDES (PSILOCIBINA)
MEDIANTE EL USO DEL REACTIVO DE DRAGENDORFF _________________________________________ 40
210 MEacuteTODO PARA DETERMINAR LA PRESENCIA DE PSILOCIBINA MEDIANTE CROMATOGRAFIacuteA
LIacuteQUIDA DE ALTA EFICIENCIA (HPLC) _______________________________________________________ 40
211 DETERMINACIOacuteN CUALITATIVA DE LA RESOLUCIOacuteN DEL ALCALOIDE DE INTEREacuteS PARA LOS
DIFERENTES ENSAYOS __________________________________________________________________ 41
212 DETERMINACIOacuteN PORCENTUAL DE COMPUESTOS PARA LOS DIFERENTES ENSAYOS __________ 42
213 CULTIVO SUMERGIDO DE P CUBENSIS EN PRESENCIA DE FA ______________________________ 42
214 DISENtildeO DE EXPERIMENTOS Y ANAacuteLISIS ESTADIacuteSTICO ___________________________________ 43
3 RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN ___________________________________________________________ 45
31 CINEacuteTICA DE CRECIMIENTO MICELIAL DE P CUBENSIS EN CULTIVO SUMERGIDO (FANG-ZHONG)
UTILIZANDO DIFERENTES FUENTES DE CARBONO ____________________________________________ 45
311 Crecimiento micelial de P cubensis en medio sumergido utilizando diferentes concentraciones
de glucosa _________________________________________________________________________ 45
312 Crecimiento micelial del P cubensis en medio sumergido utilizando diferentes concentraciones
de sacarosa ________________________________________________________________________ 50
313 Comparacioacuten entre el crecimiento micelial de P cubensis en los cultivos sumergidos utilizando
glucosa y sacarosa como fuente de carbono ______________________________________________ 55
314 Crecimiento micelial del P cubensis en cultivo sumergido utilizando glucosa y fenilalanina en el
medio 56
32 ESTUDIO DE LA CINEacuteTICA DE CONSUMO DE SUSTRATO POR PARTE DEL P CUBENSIS CULTIVADO EN
MEDIO SUMERGIDO (FANG-ZHONG) ______________________________________________________ 61
321 Consumo de sustrato por parte del P cubensis en medio sumergido utilizando diferentes
concentraciones de glucosa ___________________________________________________________ 62
322 Consumo de sustrato por parte del P cubensis en medio sumergido utilizando diferentes
concentraciones de sacarosa __________________________________________________________ 63
323 Comparacioacuten entre el consumo de sustrato de P cubensis en los cultivos sumergidos con
diferentes fuentes de carbono _________________________________________________________ 65
324 Consumo de sustrato por parte del P cubensis en medio sumergido utilizando glucosa y
fenilalanina en el medio ______________________________________________________________ 66
33 ESTUDIO DE LA CINEacuteTICA DE CONSUMO DE PROTEIacuteNA POR PARTE DEL P CUBENSIS CULTIVADO EN
MEDIO SUMERGIDO (FANG-ZHONG) ______________________________________________________ 69
331 Consumo de proteiacutena por P cubensis en medio sumergido utilizando diferentes
concentraciones de glucosa ___________________________________________________________ 69
332 Consumo de proteiacutena por P cubensis en medio sumergido utilizando diferentes
concentraciones de sacarosa __________________________________________________________ 71
333 Comparacioacuten entre el consumo de proteiacutena de P cubensis en los cultivos sumergidos con
diferentes fuentes de carbono _________________________________________________________ 72
334 Consumo de proteiacutena por P cubensis en medio sumergido utilizando glucosa y FA en el medio
73
34 ESTUDIO CUALITATIVO DE LA PRESENCIA DEL ALCALOIDE _______________________________ 76
viii
341 Produccioacuten de compuestos producidos por P cubensis cuando el medio no conteniacutea FA ____ 76
342 Produccioacuten de compuestos producidos por P cubensis cuando el medio conteniacutea FA ______ 79
35 ESTUDIO PORCENTUAL (AacuteREA) DEL ALCALOIDE REALIZADO PARA LOS DIFERENTES ENSAYOS ___ 81
351 Porcentaje de la Psilocibina (suposicioacuten) cuando el medio no conteniacutea FA _______________ 81
352 Porcentaje de aacuterea de compuestos presentes en P cubensis cuando el medio conteniacutea FA _ 83
CONCLUSIONES _________________________________________________________________________ 86
RECOMENDACIONES _____________________________________________________________________ 89
ANEXOS _______________________________________________________________________________ 90
BIBLIOGRAFIacuteA _________________________________________________________________________ 121
ix
LISTA DE TABLAS
TABLA 1 COMPOSICIOacuteN DEL MEDIO DE CULTIVO SUMERGIDO PARA EVALUAR EL CRECIMIENTO MICELIAL
DEL P CUBENSIS 35
TABLA 2 PARAacuteMETROS CINEacuteTICOS OBTENIDOS MEDIANTE EL MODELO LOGIacuteSTICO PARA LAS DIFERENTES
FERMENTACIONES DE P CUBENSIS UTILIZANDO GLUCOSA COMO FUENTE DE CARBONO 48
TABLA 3 PARAacuteMETROS CINEacuteTICOS OBTENIDOS MEDIANTE EL MODELO LOGIacuteSTICO PARA LAS DIFERENTES
FERMENTACIONES DE P CUBENSIS UTILIZANDO SACAROSA COMO FUENTE DE CARBONO 53
TABLA 4 PARAacuteMETROS CINEacuteTICOS OBTENIDOS MEDIANTE EL MODELO LOGIacuteSTICO PARA LAS DIFERENTES
FERMENTACIONES DE P CUBENSIS UTILIZANDO 50 GL DE GLUCOSA COMO FUENTE DE CARBONO Y
DIFERENTES CONCENTRACIONES DE FA 60
TABLA 5 PORCENTAJE DE AacuteREA HALLADO MEDIANTE HPLC PARA LOS UacuteLTIMOS TRES DIacuteAS DE LA
FERMENTACIOacuteN CON CONCENTRACIONES DE 30 GL 50 GL Y 70 GL DE GLUCOSA Y SACAROSA CON
UN TIEMPO DE RETENCIOacuteN DE 62 Y 72 MINUTOS 81
TABLA 6 PORCENTAJE HALLADO MEDIANTE HPLC PARA LOS UacuteLTIMOS TRES DIacuteAS DE LA FERMENTACIOacuteN
CON CONCENTRACIONES DE 05 GL 10 GL Y 15 GL DE FA Y 50 GL DE GLUCOSA CON UN TIEMPO
DE RETENCIOacuteN ENTRE 62 Y 72 MINUTOS 83
TABLA 7 ANAacuteLISIS DE VARIANZA PARA EL CRECIMIENTO MICELIAL (GLUCOSA) 90
TABLA 8 ANAacuteLISIS MUacuteLTIPLE DE RANGOS PARA EL CRECIMIENTO MICELIAL (GLUCOSA) 90
TABLA 9 ANAacuteLISIS DE VARIANZA PARA EL CRECIMIENTO MICELIAL (SACAROSA) 91
TABLA 10 ANAacuteLISIS MUacuteLTIPLE DE RANGOS PARA EL CRECIMIENTO MICELIAL (SACAROSA) 91
TABLA 11 ANAacuteLISIS DE VARIANZA PARA EL CRECIMIENTO MICELIAL (GLUCOSA Y SACAROSA) 92
TABLA 12 ANAacuteLISIS MUacuteLTIPLE DE RANGOS PARA EL CRECIMIENTO MICELIAL (GLUCOSA Y SACAROSA) 92
TABLA 13 ANAacuteLISIS DE VARIANZA PARA EL CRECIMIENTO MICELIAL (GLUCOSA 50 GL Y FA) 93
TABLA 14 ANAacuteLISIS MUacuteLTIPLE DE RANGOS PARA EL CRECIMIENTO MICELIAL (GLUCOSA 50 GL Y FA) 93
TABLA 15 ANAacuteLISIS DE VARIANZA PARA EL CONSUMO DE SUSTRATO SIN FA 94
TABLA 16 ANAacuteLISIS MUacuteLTIPLE DE RANGOS PARA EL CONSUMO DE SUSTRATO SIN FA 94
TABLA 17 ANAacuteLISIS DE VARIANZA PARA EL CONSUMO DE SUSTRATO CON FA 95
TABLA 18 ANAacuteLISIS MUacuteLTIPLE DE RANGOS PARA EL CONSUMO DE SUSTRATO CON FA 95
TABLA 19 ANAacuteLISIS DE VARIANZA PARA EL CONSUMO DE PROTEIacuteNA SIN FA 96
TABLA 20 ANAacuteLISIS MUacuteLTIPLE DE RANGOS PARA EL CONSUMO DE PROTEIacuteNA SIN FA 96
TABLA 21ANAacuteLISIS DE VARIANZA PARA EL CONSUMO DE PROTEIacuteNA CON FA 97
TABLA 22 ANAacuteLISIS MUacuteLTIPLE DE RANGOS PARA EL CONSUMO DE PROTEIacuteNA CON FA 97
TABLA 23 ANAacuteLISIS DE VARIANZA PARA LA PRODUCCIOacuteN DE PSILOCIBINA SIN FA 98
TABLA 24 ANAacuteLISIS MUacuteLTIPLE DE RANGOS PARA LA PRODUCCIOacuteN DE PSILOCIBINA SEGUacuteN EL SUSTRATO
SIN FA 98
TABLA 25 ANAacuteLISIS DE VARIANZA PARA LA PRODUCCIOacuteN DE PSILOCIBINA CON FA 99
TABLA 26 ANAacuteLISIS MUacuteLTIPLE DE RANGOS PARA LA PRODUCCIOacuteN DE PSILOCIBINA SEGUacuteN EL DIacuteA CON FA
99
TABLA 27 ANAacuteLISIS DE VARIANZA PARA LA CUANTIFICACIOacuteN DE PSILOCIBINA SIN FA 100
TABLA 28 ANAacuteLISIS MUacuteLTIPLE DE RANGOS PARA LA CUANTIFICACIOacuteN DE PSILOCIBINA SEGUacuteN EL TIPO DE
SUSTRATO SIN FA 100
TABLA 29 ANAacuteLISIS DE VARIANZA PARA LA CUANTIFICACIOacuteN DE PSILOCIBINA CON FA 101
x
TABLA 30 ANAacuteLISIS MUacuteLTIPLE DE RANGOS PARA LA CUANTIFICACIOacuteN DE PSILOCIBINA SEGUacuteN LA
CONCENTRACIOacuteN CON FA 101
TABLA 31 AacuteREAS OBTENIDAS DE LOS CROMATOGRAMAS PARA EL P CUBENSIS EN MEDIO FANG-ZHONG
EN EL DIacuteA 12 PARA CONCENTRACIONES DE 30GL GLUCOSA Y 30GL SACAROSA 109
TABLA 32 AacuteREAS OBTENIDAS DE LOS CROMATOGRAMAS PARA EL P CUBENSIS EN MEDIO FANG-ZHONG
EN EL DIacuteA 12 PARA CONCENTRACIONES DE 50GL GLUCOSA Y 50GL SACAROSA 110
TABLA 33 AacuteREAS OBTENIDAS DE LOS CROMATOGRAMAS PARA EL P CUBENSIS EN MEDIO FANG-ZHONG
EN EL DIacuteA 12 PARA CONCENTRACIONES DE 50GL GLUCOSA Y 50GL SACAROSA 111
TABLA 34 AacuteREAS OBTENIDAS DE LOS CROMATOGRAMAS PARA EL P CUBENSIS EN MEDIO FANG-ZHONG
EN EL DIacuteA 12 PARA CONCENTRACIONES DE 50GL Y GLUCOSA 50GL SACAROSA 112
TABLA 35 AacuteREAS OBTENIDAS DE LOS CROMATOGRAMAS PARA EL P CUBENSIS EN MEDIO FANG-ZHONG
EN EL DIacuteA 13 PARA CONCENTRACIONES DE 30GL GLUCOSA Y 30GL SACAROSA 113
TABLA 36 AacuteREAS OBTENIDAS DE LOS CROMATOGRAMAS PARA EL P CUBENSIS EN MEDIO FANG-ZHONG
EN EL DIacuteA 13 PARA CONCENTRACIONES DE 50GL GLUCOSA Y 50GL SACAROSA 114
TABLA 37 AacuteREAS OBTENIDAS DE LOS CROMATOGRAMAS PARA EL P CUBENSIS EN MEDIO FANG-ZHONG
EN EL DIacuteA 13 PARA CONCENTRACIONES DE 70GL GLUCOSA Y 70GL SACAROSA 115
TABLA 38 AacuteREAS OBTENIDAS DE LOS CROMATOGRAMAS PARA EL P CUBENSIS EN MEDIO FANG-ZHONG
EN EL DIacuteA 13 PARA CONCENTRACIONES DE 50GL Y GLUCOSA 50GL SACAROSA 116
TABLA 39 AacuteREAS OBTENIDAS DE LOS CROMATOGRAMAS PARA EL P CUBENSIS EN MEDIO FANG-ZHONG
EN EL DIacuteA 14 PARA CONCENTRACIONES DE 30GL GLUCOSA Y 30 GL SACAROSA 117
TABLA 40 AacuteREAS OBTENIDAS DE LOS CROMATOGRAMAS PARA EL P CUBENSIS EN MEDIO FANG-ZHONG
EN EL DIacuteA 14 PARA CONCENTRACIONES DE 50GL GLUCOSA Y 50GL SACAROSA 118
TABLA 41 AacuteREAS OBTENIDAS DE LOS CROMATOGRAMAS PARA EL P CUBENSIS EN MEDIO FANG-ZHONG
EN EL DIacuteA 14 PARA CONCENTRACIONES DE 70GL GLUCOSA Y 70GL SACAROSA 119
TABLA 42 AacuteREAS OBTENIDAS DE LOS CROMATOGRAMAS PARA EL P CUBENSIS EN MEDIO FANG-ZHONG
EN EL DIacuteA 13 PARA CONCENTRACIONES DE 50GL GLUCOSA Y 50GL SACAROSA 120
xi
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1 HONGO AGARICALES (LAMINAR) (KUO 2007) 23
FIGURA 2 ALCALOIDES DERIVADOS DEL TRIPTOFANO (MERCANO Y HASEGAWA 1991) 29
FIGURA 3 TRIPTAMINAS SIMPLES (SEIGLER 1981) 31
FIGURA 4 PSILOCIBINA Y PSILOCINA (MANDRILE ET AL 1984) 32
FIGURA 5 PSILOCYBE CUBENSIS (EAH01) CULTIVADA EN MEDIO SOacuteLIDO AGAR MALTA 34
FIGURA 6 CROMATOGRAMAS DE DOS DIFERENTES FERMENTACIONES DE P CUBENSIS QUE ILUSTRAN EL
CRITERIO DE ESCOGENCIA DEL MEJOR ENSAYO REALIZADO (A) 50 GL GLUCOSA (B) 50 GL
SACAROSA 78
FIGURA 7 CROMATOGRAMAS DE DOS DIFERENTES FERMENTACIONES DE P CUBENSIS QUE ILUSTRAN EL
CRITERIO DE ESCOGENCIA DEL MEJOR ENSAYO REALIZADO (A) 05 GL FA (B) 15 GL FA 80
FIGURA 8 MUESTRA DE BIOMASA UNA VEZ ANALIZADA MEDIANTE EL REACTIVO DE DRAGENDORFF 107
FIGURA 9 PERFIL CROMATOGRAacuteFICO (TSUJIKAWA ET AL 2003) 108
xii
LISTA DE GRAacuteFICOS
GRAacuteFICO 1 CINEacuteTICA DE CRECIMIENTO MICELIAL DE P CUBENSIS EN MEDIO SUMERGIDO (FANG-ZHONG)
UTILIZANDO TRES DIFERENTES CONCENTRACIONES DE GLUCOSA COMO FUENTE DE CARBONO (PESO
SECO) 46
GRAacuteFICO 2 CRECIMIENTO MICELIAL DE P CUBENSIS EN CULTIVO SUMERGIDO BAJO TRES
CONCENTRACIONES DE GLUCOSA 47
GRAacuteFICO 3 VALORES DE CONCENTRACIOacuteN DE BIOMASA EXPERIMENTAL Y TEOacuteRICO GRAFICADOS CON
RESPECTO AL TIEMPO PARA LAS FERMENTACIONES CON DIFERENTES CONCENTRACIONES DE
GLUCOSA 49
GRAacuteFICO 4 CINEacuteTICA DE CRECIMIENTO MICELIAL DE P CUBENSIS EN MEDIO SUMERGIDO (FANG-ZHONG)
UTILIZANDO DIFERENTES CONCENTRACIONES DE SACAROSA COMO FUENTE DE CARBONO (PESO
SECO) 50
GRAacuteFICO 5 CRECIMIENTO MICELIAL PARA TRES DIFERENTES CONCENTRACIONES DE SACAROSA 52
GRAacuteFICO 6 VALORES DE CONCENTRACIOacuteN DE BIOMASA EXPERIMENTAL Y TEOacuteRICO GRAFICADOS CON
RESPECTO AL TIEMPO PARA LAS FERMENTACIONES CON DIFERENTES CONCENTRACIONES DE
SACAROSA 54
GRAacuteFICO 7 CRECIMIENTO MICELIAL PARA DOS DIFERENTES FUENTES DE CARBONO (GLUCOSA Y
SACAROSA) 56
GRAacuteFICO 8 CINEacuteTICA DE CRECIMIENTO MICELIAL DE P CUBENSIS EN MEDIO SUMERGIDO (FANG-ZHONG)
UTILIZANDO DIFERENTES CONCENTRACIONES DE FA Y 50 GL DE GLUCOSA COMO FUENTE DE
CARBONO (PESO SECO) 57
GRAacuteFICO 9 CRECIMIENTO MICELIAL PARA GLUCOSA A UNA CONCENTRACIOacuteN DE 50 GL Y TRES
DIFERENTES CONCENTRACIONES DE FA 59
GRAacuteFICO 10 VALORES DE CONCENTRACIOacuteN DE BIOMASA EXPERIMENTAL Y TEOacuteRICO GRAFICADOS CON
RESPECTO AL TIEMPO PARA LAS FERMENTACIONES CON DIFERENTES CONCENTRACIONES DE FA Y
50 GL DE GLUCOSA 61
GRAacuteFICO 11 CINEacuteTICA DE CONSUMO DE SUSTRATO POR PARTE DEL P CUBENSIS EN MEDIO SUMERGIDO
UTILIZANDO DIFERENTES CONCENTRACIONES DE GLUCOSA COMO FUENTE DE CARBONO 62
GRAacuteFICO 12 CINEacuteTICA DE CONSUMO DE SUSTRATO POR PARTE DEL P CUBENSIS EN MEDIO SUMERGIDO
UTILIZANDO DIFERENTES CONCENTRACIONES DE SACAROSA COMO FUENTE DE CARBONO 64
GRAacuteFICO 13 CONSUMO DE SUSTRATO PARA CADA UNA DE LAS FUENTES DE CARBONO UTILIZADAS 66
GRAacuteFICO 14 CINEacuteTICA DE CONSUMO DE SUSTRATO POR PARTE DEL P CUBENSIS EN MEDIO SUMERGIDO
UTILIZANDO 50 GL DE GLUCOSA COMO FUENTE DE CARBONO Y DIFERENTES CONCENTRACIONES DE
FA 67
GRAacuteFICO 15 CONSUMO DE SUSTRATO PARA CADA UNA DE LAS CONCENTRACIONES DE FA UTILIZADAS 68
GRAacuteFICO 16 CINEacuteTICA DE CONSUMO DE PROTEIacuteNA POR PARTE DEL P CUBENSIS EN MEDIO SUMERGIDO
UTILIZANDO DIFERENTES CONCENTRACIONES DE GLUCOSA COMO FUENTE DE CARBONO 70
GRAacuteFICO 17 CINEacuteTICA DE CONSUMO DE PROTEIacuteNA POR PARTE DEL P CUBENSIS EN MEDIO SUMERGIDO
UTILIZANDO DIFERENTES CONCENTRACIONES DE SACAROSA COMO FUENTE DE CARBONO 71
GRAacuteFICO 18 CONSUMO DE PROTEIacuteNA PARA CADA UNA DE LAS FUENTES DE CARBONO UTILIZADAS 73
xiii
GRAacuteFICO 19 CINEacuteTICA DE CONSUMO DE PROTEIacuteNA POR PARTE DEL P CUBENSIS EN MEDIO SUMERGIDO
UTILIZANDO 50 GL DE GLUCOSA COMO FUENTE DE CARBONO Y DIFERENTES CONCENTRACIONES DE
FA 74
GRAacuteFICO 20 CONSUMO DE PROTEIacuteNA PARA LOS ENSAYOS CON Y SIN FA 75
GRAacuteFICO 21 AacuteREA DEL COMPUESTO OBTENIDO DE P CUBENSIS EN TIEMPO DE RETENCIOacuteN ENTRE 62 Y
72 MINUTOS PARA LAS DOS FUENTES DE CARBONO 77
GRAacuteFICO 22 AacuteREA DEL COMPUESTO OBTENIDO DE P CUBENSIS EN TIEMPO DE RETENCIOacuteN ENTRE 62 Y
72 MINUTOS EN LOS UacuteLTIMOS TRES DIacuteAS DE LA FERMENTACIOacuteN CON FA Y GLUCOSA 79
GRAacuteFICO 23 AacuteREA DEL COMPUESTO OBTENIDO DE P CUBENSIS EN TIEMPO DE RETENCIOacuteN ENTRE 62 Y
72 MINUTOS PARA CADA UNA DE LAS FUENTES DE CARBONO UTILIZADAS 82
GRAacuteFICO 24 AacuteREA DEL COMPUESTO OBTENIDO DE P CUBENSIS EN TIEMPO DE RETENCIOacuteN ENTRE 62 Y
72 MINUTOS PARA CADA UNA DE LAS CONCENTRACIONES DE FA UTILIZADAS 85
GRAacuteFICO 25 CROMATOGRAMAS DEL DIacuteA 12 PARA EL P CUBENSIS CULTIVADO EN MEDIO SUMERGIDO
FANG-ZHONG CON DOS DIFERENTES TIPOS DE SUSTRATOS (A) 30 GL GLUCOSA (B) 30 GL SACAROSA
109
GRAacuteFICO 26 CROMATOGRAMAS DEL DIacuteA 12 PARA EL P CUBENSIS CULTIVADO EN MEDIO SUMERGIDO
FANG-ZHONG CON DOS DIFERENTES TIPOS DE SUSTRATOS (A) 50 GL GLUCOSA (B) 50 GL SACAROSA
110
GRAacuteFICO 27 CROMATOGRAMAS DEL DIacuteA 12 PARA EL P CUBENSIS CULTIVADO EN MEDIO SUMERGIDO
FANG-ZHONG CON DOS DIFERENTES TIPOS DE SUSTRATOS (A) 50 GL GLUCOSA (B) 50 GL SACAROSA
111
GRAacuteFICO 28 CROMATOGRAMA DEL DIacuteA 12 PARA EL P CUBENSIS CULTIVADO EN MEDIO SUMERGIDO
FANG-ZHONG CON FUENTE DE CARBONO GLUCOSA Y ADICIOacuteN DE FENILALANINA EN TRES
CONCENTRACIONES (A) 05 GL FA (B) 1 GL FA (C) 15GL FA 112
GRAacuteFICO 29 CROMATOGRAMAS DEL DIacuteA 13 PARA EL P CUBENSIS CULTIVADO EN MEDIO SUMERGIDO
FANG-ZHONG CON DOS DIFERENTES TIPOS DE SUSTRATOS (A) 30 GL GLUCOSA (B) 30 GL SACAROSA
113
GRAacuteFICO 30 CROMATOGRAMAS DEL DIacuteA 13 PARA EL P CUBENSIS CULTIVADO EN MEDIO SUMERGIDO
FANG-ZHONG CON DOS DIFERENTES TIPOS DE SUSTRATOS (A) 50 GL GLUCOSA (B) 50 GL SACAROSA
114
GRAacuteFICO 31 CROMATOGRAMAS DEL DIacuteA 13 PARA EL P CUBENSIS CULTIVADO EN MEDIO SUMERGIDO
FANG-ZHONG CON DOS DIFERENTES TIPOS DE SUSTRATOS (A) 70 GL GLUCOSA (B) 70 GL SACAROSA
115
GRAacuteFICO 32 CROMATOGRAMAS DEL DIacuteA 12 PARA EL P CUBENSIS CULTIVADO EN MEDIO SUMERGIDO
FANG-ZHONG CON FUENTE DE CARBONO GLUCOSA Y ADICIOacuteN DE FENILALANINA EN TRES
CONCENTRACIONES (A) 05 GL FA (B) 1 GL FA (C) 15GL FA 116
GRAacuteFICO 33 CROMATOGRAMAS DEL DIacuteA 14 PARA EL P CUBENSIS CULTIVADO EN MEDIO SUMERGIDO
FANG-ZHONG CON DOS DIFERENTES TIPOS DE SUSTRATOS (A) 30 GL GLUCOSA (B) 30 GL SACAROSA
117
GRAacuteFICO 34 CROMATOGRAMAS DEL DIacuteA 14 PARA EL P CUBENSIS CULTIVADO EN MEDIO SUMERGIDO
FANG-ZHONG CON DOS DIFERENTES TIPOS DE SUSTRATOS (A) 50 GL GLUCOSA (B) 50 GL SACAROSA
118
xiv
GRAacuteFICO 35 CROMATOGRAMAS DEL DIacuteA 14 PARA EL P CUBENSIS CULTIVADO EN MEDIO SUMERGIDO
FANG-ZHONG CON DOS DIFERENTES TIPOS DE SUSTRATOS (A) 70 GL GLUCOSA (B) 70 GL SACAROSA
119
GRAacuteFICO 36 CROMATOGRAMAS DEL DIacuteA 12 PARA EL P CUBENSIS CULTIVADO EN MEDIO SUMERGIDO
FANG-ZHONG CON FUENTE DE CARBONO GLUCOSA Y ADICIOacuteN DE FENILALANINA EN TRES
CONCENTRACIONES (A) 05 GL FA (B) 1 GL FA (C) 15GL FA (A) 05 GL FA (B) 1 GL FA (C)
15GL FA 120
xv
LISTA DE ECUACIONES
ECUACIOacuteN 1 ECUACIOacuteN LINEALIZADA DEL MODELO LOGIacuteSTICO 38
ECUACIOacuteN 2 VALORES TEOacuteRICOS DE BIOMASA EN EL TIEMPO 39
xvi
LISTAS DE ANEXOS
ANEXO 1 ANAacuteLISIS DE VARIANZA (ANOVA) PARA EL CRECIMIENTO DE BIOMASA DE LAS
FERMENTACIONES CON GLUCOSA _____________________________________________________ 90
ANEXO 2 ANAacuteLISIS DE VARIANZA (ANOVA) PARA EL CRECIMIENTO DE BIOMASA DE LAS
FERMENTACIONES CON SACAROSA ____________________________________________________ 91
ANEXO 3 ANAacuteLISIS DE VARIANZA (ANOVA) PARA EL CRECIMIENTO DE BIOMASA DE LAS
FERMENTACIONES CON GLUCOSA Y SACAROSA __________________________________________ 92
ANEXO 4 ANAacuteLISIS DE VARIANZA (ANOVA) PARA EL CRECIMIENTO DE BIOMASA DE LAS
FERMENTACIONES CON GLUCOSA 50 GL Y FA ___________________________________________ 93
ANEXO 5 ANAacuteLISIS DE VARIANZA (ANOVA) PARA EL CONSUMO DE SUSTRATO EN LAS FERMENTACIONES
SIN FA ____________________________________________________________________________ 94
ANEXO 6 ANAacuteLISIS DE VARIANZA (ANOVA) PARA EL CONSUMO DE SUSTRATO EN LAS FERMENTACIONES
CON FA ___________________________________________________________________________ 95
ANEXO 7 ANAacuteLISIS DE VARIANZA (ANOVA) PARA EL CONSUMO DE PROTEIacuteNA EN LAS FERMENTACIONES
SIN FA ____________________________________________________________________________ 96
ANEXO 8 ANAacuteLISIS DE VARIANZA (ANOVA) PARA EL CONSUMO DE PROTEIacuteNA EN LAS FERMENTACIONES
CON FA ___________________________________________________________________________ 97
ANEXO 9 ANAacuteLISIS DE VARIANZA (ANOVA) PARA LA PRODUCCIOacuteN DE PSILOCIBINA EN LAS
FERMENTACIONES SIN FA ____________________________________________________________ 98
ANEXO 10 ANAacuteLISIS DE VARIANZA (ANOVA) PARA LA PRODUCCIOacuteN DE PSILOCIBINA EN LAS
FERMENTACIONES CON FA ___________________________________________________________ 99
ANEXO 11 ANAacuteLISIS DE VARIANZA (ANOVA) PARA LA CUANTIFICACIOacuteN PORCENTUAL DE PSILOCIBINA EN
LAS FERMENTACIONES SIN FA _______________________________________________________ 100
ANEXO 12 ANAacuteLISIS DE VARIANZA (ANOVA) PARA LA CUANTIFICACIOacuteN PORCENTUAL DE PSILOCIBINA EN
LAS FERMENTACIONES CON FA ______________________________________________________ 101
ANEXO 13 DETERMINACIOacuteN DE CONSUMO DE AZUacuteCARES POR EL MEacuteTODO DE DNS (AacuteCIDO
DINITROSALICIacuteLICO) ________________________________________________________________ 102
ANEXO 14 CINEacuteTICA DE CONSUMO DE SUSTRATO ___________________________________________ 104
ANEXO 15 DETERMINACIOacuteN DE CONSUMO DE PROTEIacuteNAS POR EL MEacuteTODO DE LOWRY ____________ 105
ANEXO 16 CINEacuteTICA CONSUMO DE PROTEIacuteNA ______________________________________________ 106
ANEXO 17 PRUEBA DE REACTIVO DE DRAGENDORFF _________________________________________ 107
ANEXO 18 BARRIDO ESPECTRAL PARA EL PSILOCYBE CUBENSIS _________________________________ 108
ANEXO 19 CROMATOGRAMAS (HPLC) DEL DIacuteA 12 DE FERMENTACIOacuteN ___________________________ 109
ANEXO 20 CROMATOGRAMAS (HPLC) DEL DIacuteA 13 DE FERMENTACIOacuteN __________________________ 113
ANEXO 21 CROMATOGRAMAS (HPLC) DEL DIacuteA 14 DE FERMENTACIOacuteN __________________________ 117
xvii
RESUMEN
El Psilocybe cubensis es un hongo de gran importancia a nivel industrial gracias a
la presencia de una sustancia llamada Psilocibina en su cuerpo fructiacutefero
Dicho alcaloide derivado de la triptamina es muy similar al neurotransmisor
serotonina el cual es responsable de la percepcioacuten sensorial la regulacioacuten de la
temperatura el inicio del reposo nocturno del hiacutegado y los rintildeones Por tal motivo
este estudio se enfocoacute en la produccioacuten de la Psilocibina mediante el cultivo del P
cubensis en medio sumergido (Fang-Zhong)
Se evaluaron los efectos de dos fuentes de carbono (glucosa y sacarosa) a tres
concentraciones diferentes en cultivo sumergido para Psilocybe cubensis con el
fin de determinar la incidencia de eacutestas en la produccioacuten de biomasa y en la
produccioacuten y presencia de Psilocibina alcaloide de intereacutes Para las
concentraciones de glucosa de 30 gL 50 gL y 70 gL se presentoacute un crecimiento
maacuteximo de biomasa de 048 gL 055 gL y 062 gL y un porcentaje de alcaloide
de 6065 wv 7396 wv y 6733 wv respectivamente Esto uacuteltimo si se
asume que el tiempo de retencioacuten oscila entre 62 y 72 minutos contaacutendose con
una fase moacutevil de HCOONH4 en una columna C18 Mientras que para las mismas
concentraciones de sacarosa se presentoacute un crecimiento maacuteximo de biomasa de
026 gL 045 gL y 057 gL con porcentajes del compuesto presente entre el
rango de 62 y 72 minutos de 3664 wv 5857 wv y 5583 wv
respectivamente
Una vez realizada la investigacioacuten se encontroacute que las diferencias existentes en
cuanto a la cantidad de biomasa generada con respecto al tipo de sustrato
utilizado no fueron significativas es decir era irrelevante si se utilizaba glucosa o
sacarosa como principal fuente de carbono para la fermentacioacuten del P cubensis
xviii
en medio sumergido con el fin de obtener biomasa sin embargo se hallaron
diferencias significativas con respecto a las diferentes concentraciones empleadas
de dichas fuentes de carbono
Al analizar las muestras mediante cromatografiacutea liacutequida de alta eficiencia (HPLC)
se determinoacute que el medio que conteniacutea 50 gL de glucosa era el deseado debido
a que fue en eacuteste donde se presentaron picos maacutes definidos mostrando una mejor
resolucioacuten del compuesto Adicionalmente presentoacute un buen crecimiento micelial
Una vez elegido dicho criterio se evaluoacute el efecto que teniacutea la adicioacuten de un
aminoaacutecido llamado Fenilalanina (FA) al medio que conteniacutea 50 gL de glucosa
con el fin de determinar si eacuteste teniacutea alguna incidencia positiva en la produccioacuten de
biomasa y en la generacioacuten del alcaloide de intereacutes cabe resaltar que se utilizaron
diferentes concentraciones de FA correspondientes a 05 gL 10 gL y 15 gL
Finalizados dichos ensayos se obtuvieron valores de crecimiento de biomasa
maacutexima de 106 gL 108 gL y 101 gL y un porcentaje de aacuterea de 7549 wv
6236 wv y 2721 wv respectivamente
Es necesario hacer hincapieacute en que las diferencias obtenidas mediante el anaacutelisis
estadiacutestico entre cada una de las concentraciones de FA con respecto a la
generacioacuten de biomasa y la produccioacuten del compuesto no fueron significativas lo
que llevoacute a elegir una concentracioacuten de 05 gL de FA debido a que fue la menor
cantidad utilizada de este compuesto durante la investigacioacuten suponieacutendose asiacute
una disminucioacuten en los costos de materia prima
Palabras claves
Psilocybe cubensis Psilocibina Alcaloide HPLC Cultivo Sumergido Fuentes de
Carbono Fenilalanina
19
INTRODUCCIOacuteN
Los hongos son una rica fuente de productos naturales con una alta actividad
bioloacutegica Desafortunadamente el cultivo de eacutestos en cuerpo fructiacutefero toma
varios meses disminuyendo su calidad debido a los cambios climaacuteticos y plagas
por tal razoacuten se implementoacute la metodologiacutea de medio sumergido la cual es
prometedora gracias a una alta productividad de compuestos bioactivos (Arora
1986)
El Geacutenero Psilocybe pertenece al Reino Fungiacute con un Phylum Basidiomicota
una Clase Homobasidiomicetes un Orden Agaricales una Familia Strofariaceae
(Paris y Hurabielle 1981)
Dicho geacutenero es considerado de gran importancia a nivel mundial debido a que su
cuerpo fructiacutefero y biomasa micelial contienen Psilocibina la cual posee un alto
valor para la industria farmaceacuteutica por su uso en la elaboracioacuten de productos
antidepresivos Este alcaloide derivado de FA cuenta con una estructura muy
similar al neurotransmisor segregado por el cerebro llamado serotonina que
controla el estado de aacutenimo el suentildeo el hiacutegado y los rintildeones (Mandrile et al
1984) esta caracteriacutestica le otorga la gran importancia a la Psilocibina en el
mercado puesto que tiene un alto impacto en la sociedad como ayudante
antidepresivo debido a que no todas las personas segregan la cantidad necesaria
(10 mg con liacutemites que variacutean desde 5 a 20 mg) de serotonina (Mandrile et al
1984) Adicionalmente se estaacute empleando como una gran ayuda para la
disminucioacuten de la adiccioacuten a sustancias como heroiacutena y cocaiacutena gracias a que
este alcaloide no genera dependencia (Lee et al 2004)
Debido a que su consumo puede generar alucinaciones era consumido por las
culturas aboriacutegenes centroamericanas con el fin de realizar manifestaciones
20
religiosas Su uso se remonta a maacutes de 3500 antildeos y era nombrado por los
aztecas como ―Teonunaltl que significa ―carne de dioses (Mandrile et al 1984)
La alternativa que se utilizoacute durante esta investigacioacuten fue el cultivo del P
cubensis mediante medio sumergido debido principalmente a las notables
ventajas frente a los sistemas convencionales que eacuteste posee entre las cuales se
destacan la disminucioacuten del tiempo para la obtencioacuten de la biomasa (14 diacuteas) y la
reduccioacuten de los costos de obtencioacuten (Lee et al 2004) De acuerdo a lo
dimensionado anteriormente este estudio estaba orientado primordialmente a la
buacutesqueda de alternativas que permitieran la produccioacuten de biomasa de forma
raacutepida y confiable
Con el fin de llevar a cabo lo dicho anteriormente se pretendioacute evaluar el efecto
del uso de dos diferentes fuentes de carbono en este caso glucosa y sacarosa en
el crecimiento micelial de la cepa P cubensis
21
OBJETIVOS
GENERAL
Evaluar el efecto de la fuente de carbono en el crecimiento micelial de una
cepa Psilocybe sp
ESPECIacuteFICOS
Evaluar la cineacutetica de crecimiento de la cepa Psilocybe cubensis en los
diferentes medios de cultivo sumergido mediante la cuantificacioacuten de
biomasa por medio de la metodologiacutea de peso seco
Evaluar el consumo de sustrato para los diferentes ensayos por medio de
teacutecnicas espectrofotomeacutetricas
Determinar la presencia de Psilocibina mediante el uso del reactivo de
Dragendorff
22
1 MARCO TEOacuteRICO
11 CONCEPTOS GENERALES DE HONGOS
Los hongos son organismos eucariotas que no contienen clorofila con nutricioacuten
por absorcioacuten generalmente con reproduccioacuten sexual y asexual el cuerpo
consiste generalmente de filamentos ramificados con pared celular quitinosa
(Miles y Chang 1999)
Constituyen uno de los grupos de organismos maacutes importantes para la vida del
hombre ya que son los responsables de gran parte de la descomposicioacuten de la
materia orgaacutenica aumentando su disponibilidad en el suelo pueden ser
comestibles venenosos o psicotroacutepicos muchos son patoacutegenos otros producen
ciertas sustancias beneficiosas o intervienen en procesos de elaboracioacuten de
algunos comestibles (Miles y Chang 1999)
111 Hongos laminares (Agaricales)
El orden Agaricales tambieacuten conocido como Euagaricales es el mayor orden de
setas y hongos que incluye maacutes de la mitad de todas las especies conocidas de la
clase Homobasidiomycetes (Hibbett et al 1997 Hibbett y Thorn 2001) Maacutes de
9000 especies y alrededor de 350 geacuteneros se han atribuido a este orden que
contiene 26 familias (Kirk et al 2001) Un consenso de mayor nivel de
clasificacioacuten de los Agaricales ha sido difiacutecil de lograr debido a la competencia de
sistemas que restringen geacuteneros y familias (o incluso orden) de diferentes
maneras (Bas 1998 Juumllich 1981 Kirk et al 2001 Kuumlhner 1980 Singer 1986)
23
La base para la clasificacioacuten de los hongos fue construida por Fries (1874) quien
hizo hincapieacute en las caracteriacutesticas macroscoacutepicas como la textura del tallo la
separacioacuten de los filamentos (laminas) presencia o ausencia de velo y color de las
esporas
Posteriormente dividioacute los hongos Agaricales en varias especies de acuerdo al
color de las esporas depositadas las cuales pueden ser de color blanco rosado
marroacuten puacuterpura ndash marroacuten y negro El sistema macroscoacutepico de Fries que
reconocioacute inicialmente 12 geacuteneros de hongos carnosos que forman los hongos es
taxonoacutemicamente praacutectico Eacuteste fue relativamente invariable hasta que Fayod
(1989) estudioacute la anatomiacutea y las caracteriacutesticas microscoacutepicas de muchos
Agaricales reconociendo 108 geacuteneros (Arora 1986)
Al igual que todas las setas los hongos laminares son faacutebricas de esporas
creados con el uacutenico propoacutesito de fabricar esporas microscoacutepicas para dejarse
llevar por las corrientes de aire y con suerte caer en un lugar adecuado en la
tierra para germinar y comenzar un nuevo organismo Las probabilidades de que
cualquier individuo que tiene esporas de este tipo tenga suerte son tan bajas que
el hongo produce millones de esporas para compensar esto En las laacuteminas se
encuentran numerosas esporas las cuales aumentan considerablemente el
nuacutemero de esporas que el hongo puede producir Ambos lados de cada laacutemina
estaacute cubierta con esporas microscoacutepicas (Kuo 2007) A continuacioacuten se muestra
de manera ilustrativa en la figura 1 las laacuteminas que poseen los hongos Agaricales
en las cuales se da la formacioacuten de las esporas
Figura 1 Hongo Agaricales (Laminar) (Kuo 2007)
24
12 MEDIOS DE CULTIVO
Uno de los sistemas maacutes importantes para la identificacioacuten de microorganismos es
observar su crecimiento en sustancias alimenticias artificiales preparadas en el
laboratorio El material alimenticio en el que crecen los microorganismos es el
medio de cultivo (Garciacutea 1995)
Para que los microorganismos crezcan adecuadamente en un medio de cultivo
artificial eacuteste debe reunir una serie de condiciones como lo son temperatura
grado de humedad y presioacuten asiacute como un grado correcto de acidez o alcalinidad
Un medio de cultivo contiene los nutrientes y factores de crecimiento necesarios
para que el microorganismo se desarrolle correctamente y debe estar exento de
cualquier tipo de microorganismo que pueda generar contaminacioacuten (Garciacutea
1995)
121 Tipos de medios de cultivo
En la actualidad existen diversos tipos de medio de cultivo si se centra en la
composicioacuten eacutestos pueden ser medios sinteacuteticos que contienen fuente de
carbono fuente de nitroacutegeno sales que suplan los iones y demaacutes elementos tales
como estimuladores del crecimiento medios complejos que contienen ingredientes
tales como extracto de levadura peptona infusioacuten de cerebro etc ricos en
nutrientes medios de enriquecimiento siendo estos complejos con aditivos
adicionales para favorecer asiacute al crecimiento y desarrollo de determinados
microorganismos medios selectivos los cuales son disentildeados para favorecer el
crecimiento especiacutefico de un microorganismo determinado o un grupo
microbiano medios diferenciales que proporcionan la distincioacuten microbiana de una
mezcla por sus propiedades diferenciales de crecimiento en dichos medios
medios de mantenimiento siendo disiacutemiles de los de crecimiento oacuteptimo por el
25
crecimiento raacutepido y proliacutefico que deriva en la muerte raacutepida de las ceacutelulas (Garciacutea
1995)
Atendiendo a su estado los medios de cultivo pueden presentarse como medios
sumergidos y medios soacutelidos que contienen agar que gelifica por debajo de 45
degC y cuya concentracioacuten en su uso es de 15 y medios semisoacutelidos que contiene
un agar a una concentracioacuten de 07 (Garciacutea 1995)
121 Medio sumergido
Debido a que cultivar el cuerpo fructiacutefero toma varios meses y se dificulta el control
de calidad del producto final porque se estaacute sujeto a los cambios permanentes del
clima y las plagas se ha empleado la metodologiacutea de medio sumergido la cual es
una alternativa muy prometedora para la produccioacuten eficiente del micelio y de los
metabolitos (Lindequist y Niedermeyer 2005)
Dicha forma es la mejor para producir extraer y purificar metabolitos de un cultivo
de hongo ya que facilita una mayor produccioacuten de biomasa en menor tiempo y
de mayor calidad que el cultivo en medio soacutelido ademaacutes facilita la dispersioacuten y
adaptacioacuten del hongo y reduce los vectores de contaminacioacuten De igual forma un
cultivo de esta iacutendole es la opcioacuten maacutes viable si se quiere escalar procesos
fermentativos en aras de desarrollar mercados como en este caso el de
metabolitos medicinales (Navarro et al 1998)
A su vez el uso de cultivo sumergido puede beneficiar la produccioacuten de muchos
metabolitos secundarios y disminuir los costos de produccioacuten por reducir las
labores que involucran los meacutetodos de etapas soacutelidas (Domiacutenguez y Webb 2003)
Los metabolitos bioactivos de los hongos pueden ser potencialmente producidos a
nivel industrial mediante el uso de la metodologiacutea de cultivo sumergido pero el
26
eacutexito a escala comercial depende del costo comparado con la tecnologiacutea existente
y la ventaja econoacutemica que la industria puede ver usando este meacutetodo El uso de
la tecnologiacutea puede ser facilitada por el aumento en el rendimiento de la
produccioacuten y el desarrollo del sistema (Hwang et al 2004)
El cultivo de hongos sumergidos se caracteriza por un aumento en la viscosidad
del caldo con el tiempo debido a uno o maacutes factores tales como el aumento de la
concentracioacuten de ceacutelulas los cambios de la morfologiacutea del crecimiento o la
produccioacuten de productos extracelulares que alteran el caraacutecter reoloacutegico de la
cultura del liacutequido El aumento en la viscosidad puede ser visto como un fenoacutemeno
indeseable pero inevitable ya que causan dificultades en el suministro de oxiacutegeno
en la eliminacioacuten de dioacutexido de carbono y en posibles problemas de agitacioacuten
(Hwang et al 2004)
13 ALCALOIDES
131 Generalidades
La diversidad estructural y la variedad en la actividad bioloacutegica hacen de los
alcaloides como tambieacuten de los antibioacuteticos los grupos maacutes importantes entre las
sustancias naturales de intereacutes terapeacuteutico (Paris y Hurabielle 1981)
Se han aislado principalmente en plantas superiores y se han encontrado en maacutes
de 100 familias de Faneroacutegamas (aquellas plantas que se reproducen por semillas
producidas en sus inflorescencias) Su actividad bioloacutegica a nivel del sistema
nervioso dio pie a las primeras investigaciones siendo los alcaloides las primeras
sustancias naturales estudiadas (Paris y Hurabielle 1981)
El teacutermino alcaloide propuesto por el farmaceacuteutico W Meissner en 1819 se aplicoacute
a los compuestos de origen vegetal con propiedades alcalinas este caraacutecter
baacutesico es debido a la presencia de nitroacutegeno amiacutenico en su estructura Los
27
alcaloides se pueden considerar como ―Un compuesto orgaacutenico de origen natural
nitrogenado derivados generalmente de aminoaacutecidos maacutes o menos baacutesico de
distribucioacuten restringida con propiedades farmacoloacutegicas importantes a dosis bajas
y que responden a reacciones comunes de precipitacioacuten (Paris y Hurabielle
1981)
132 Propiedades fisicoquiacutemicas
Los alcaloides tienen masas moleculares que variacutean entre 100 y 9000 gmol son
casi siempre incoloros son normalmente soacutelidos a temperatura ambiente a
excepcioacuten de los alcaloides no oxigenados Los alcaloides son poco solubles en
agua gracias a su caraacutecter baacutesico dicho caraacutecter se debe al par de electrones
libres del nitroacutegeno (Paris y Hurabielle 1981)
En la naturaleza se encuentran en forma de sales generalmente En las plantas
se consideraba que eran productos obtenidos durante la extraccioacuten y poco
solubles en disolventes tiacutepicos de extraccioacuten por su polaridad Son solubles en
disolventes orgaacutenicos como cloroformo etanol metanol acetato de etilo eacuteter
benceno En forma de sales son solubles en agua excepto las sales de berberina
(Paris y Hurabielle 1981)
Todos los alcaloides son activos a la luz polarizada Presentan una fluorescencia
caracteriacutestica bajo la luz UV o IR dando lugar a espectros caracteriacutesticos (Paris y
Hurabielle 1981)
133 Reconocimiento de los alcaloides
Las teacutecnicas de reconocimiento son basadas en la capacidad que tienen los
alcaloides en estado de sal (extractos aacutecidos) de combinarse con el yodo y
metales pesados como bismuto mercurio tungsteno formando precipitados se
28
utilizan reactivos generales para detectar alcaloides como reactivo de Wagner
reactivo de Mayer reactivo de Dragendorff reactivo de Hager reactivo de
Bertrand reactivo de Ehrlich y reactivo de Vitali-Morin (Paris y Hurabielle 1981)
134 Clasificacioacuten de los alcaloides
Habitualmente los alcaloides se han clasificado en funcioacuten de su estructura
distinguieacutendose principalmente los compuestos heterociacuteclicos de los no
heterociacuteclicos Actualmente existen varias formas de clasificarlos (Bruneton
1987) entre ellas se pueden distinguir
1341 Alcaloides alifaacuteticos
a Derivados de la ornitina (pirrolidinas tropaacutenicos pirrolizidiacutenicos)
b Derivados de la lisina (piperidinas quinolizidiacutenicos)
1342 Alcaloides de origen diverso
a Alcaloides terpeacutenicos y esteroidales
b Alcaloides diversos (purinas macrociclos etc)
1343 Alcaloides aromaacuteticos
a Derivados del aacutecido nicotiacutenico (piridinas)
b Derivados de la fenilalanina y tirosina (isoquinoleinas)
c Derivados del triptofano (indoacutelicos quinoleinas)
d Derivados de la histidina (imidazoles)
29
Alcaloides derivados del triptofano (Alcaloides Indoacutelicos)
Desde el punto de vista farmacoloacutegico ha habido mucho intereacutes sobre las bases
que contienen el nuacutecleo indoacutelico a raiacutez del descubrimiento de la actividad
alucinoacutegena del LSD asiacute como la actividad sedante de la reserpina aislada del
geacutenero Rauwolfia El auge del estudio fitoquiacutemico ocurrioacute en la deacutecada de los 60 y
se dirigiacutea principalmente a la familia Apocynaceae (Mercano y Hasegawa 1991)
Existen unos 800 alcaloides de este tipo distribuidos principalmente en la familia
Apocynaceae (geacuteneros Rauwolfia Aspidos-perma Strychnos y Vinca) menos
frecuentes en hongos y familias como Leguminoseae Malphigiaceae Rubiaceae y
Rutaceae donde los alcaloides presentan el grupo indoacutelico sencillo (Mercano y
Hasegawa 1991)
El triptofano es el precursor de estos alcaloides los cuales se clasifican en
triptaminas y en no triptaminas las triptaminas a su vez se subdividen en b-
carbolinas y en indoleninas y pueden ser triptaminas simples o triptaminas
complejas y estas pueden ser isopreacutenicas o no isopreacutenicas (Mercano y Hasegawa
1991) La figura 2 muestra la estructura quiacutemica del triptofano triptamina y sus
divisiones
Figura 2 Alcaloides derivados del Triptofano (Mercano y Hasegawa 1991)
30
Triptaminas simples
Las triptaminas simples juegan un importante papel en la cultura indiacutegena de
Ameacuterica por sus efectos alucinoacutegenos y extaacuteticos en sus ceremonias maacutegico
religiosas (Furst 1994) Se han encontrado en hongos alucinoacutegenos de
Mesoameacuterica del geacutenero Psilocybe Stropharia y Conocybe (―teonacatl o ―carne
de los dioses) usados por los indios Aztecas en sus ceremonias religiosas desde
hace maacutes de 1700 antildeos Se han encontrado en estos hongos los alcaloides
alucinoacutegenos la Psilocina y la Psilocibina que al ingerirlos produce diferentes
sensaciones auditivas y visuales relajacioacuten muscular depresiones y euforias
alternadas (Mercano y Hasegawa 1991)
La serotonina que juega un importante papel en la actividad neuronal se
encuentra tambieacuten en vegetales Se ha aislado en el pericarpio del banano el cual
seco cuando es fumado actuacutea como un alucinoacutegeno ligero (Seigler 1981)
De las glaacutendulas paroacutetidas del sapo comuacuten Bufo vulgaris se aiacutesla la bufotenina
derivado N-dimetilado de la serotonina que tambieacuten es el principio activo del Yopoacute
polvo de las semillas de Anadenanthera peregrina (Piptadenia peregrina)
Leguminoseae y especies del geacutenero Virola (Myristicaceae) que contiene tambieacuten
triptaminas son mezclados con cenizas e inhalados por medio de tubos de bambuacute
por los indiacutegenas del Orinoco en ceremonias maacutegico religiosas produciendo
alucinacioacuten e incoordinacioacuten motriz (Seigler 1981)
En la figura 3 se observan las estructuras de aquellos compuestos que estaacuten
clasificados como triptaminas simples
31
Figura 3 Triptaminas simples (Seigler 1981)
13 PSILOCIBINA Y PSILOCINA
La Psilocibina y la Psilocina son bioloacutegicamente sintetizadas en los hongos
pertenecientes a los geacuteneros de Psilocybe (Bigwood y Beug 1982 Wurst et al
1984)
La Psilocibina y la Psilocina se han identificado en todo el mundo en una variedad
de setas que son llamados hongos maacutegicos La ingestioacuten de pequentildeas
cantidades de alucinoacutegenos provoca el eacutextasis La actividad alucinoacutegena de la
Psilocibina es relativamente maacutes baja que la de la Psilocina Sin embargo la
Psilocibina se convierte faacutecilmente en Psilocina (componente activo principal) en
los sistemas bioloacutegicos Asiacute el desarrollo de un meacutetodo de determinacioacuten de la
Psilocibina es importante lo misma que la de la Psilocina (Kimie et al 2005)
La hidroacutelisis de la Psilocibina se consigue saturando con anhiacutedido carboacutenico una
solucioacuten acuosa de Psilocibina (para eliminar el oxiacutegeno del aire y calentaacutendola)
obteniendo asiacute una moleacutecula de 4hidroxi-dimetiltriptamina y una moleacutecula de aacutecido
fosfoacuterico (Mandrile et al 1984)
Como todos los faacutermacos derivados del indol estas sustancias han despertado
intereacutes porque se sospechoacute la posibilidad de que algunas de ellas se formen en el
32
organismo y que en ciertas psicosis especialmente en la esquizofrenia se
produzcan elevados niveles sanguiacuteneos que ocasionan algunos de los siacutentomas
(Mandrile et al 1984)
La figura 4 muestra la estructura quiacutemica de alcaloides como la Psilocibina y
Psilocina
Figura 4 Psilocibina y Psilocina (Mandrile et al 1984)
131 Antecedentes acerca de la obtencioacuten de Psilocibina y Psilocina
Una gran variedad de meacutetodos cromatograacuteficos para la determinacioacuten de
Psilocibina y Psilocina presentes en las incautaciones de hongos se han
publicado La cromatografiacutea de capa fina es utilizada debido a que eacutesta es muy
apropiada para la deteccioacuten de sustancias derivadas del triptofano (Brown et al
1972 Tanimukai 1967 Beug y Bigwood 1981) Aun asiacute meacutetodos que involucran
tanto la cromatografiacutea de alta eficiencia (HPLC) como la deteccioacuten fotomeacutetrica de
UV (Beug y Bigwood 1981 Wurst et al 1984 Borner y Brenneisen 1987 Perkal
et al 1980 Vanhaelen-Faestreacute y Vanhaelen 1984 Thomson 1980 White 1979
Sottolano y Lurie 1983) fueron establecidas y optimizadas para la cuantificacioacuten
de Psilocibina
Durante los uacuteltimos antildeos se han venido utilizando diferentes tipos de columna y
fase moacutevil con el fin de obtener la mayor cantidad posible de la sustancia de
intereacutes (Psilocibina)
33
En el antildeo 1981 en el instituto farmaceacuteutico de la Universidad de Oslo realizaron
una investigacioacuten con una columna de siacutelice con una fase moacutevil de metanol-nitrato
de amonio en donde no soacutelo se logroacute obtener Psilocibina y Psilocina sino tambieacuten
un nuevo producto conocido como beocistiacuten Se logroacute un porcentaje de separacioacuten
maacutexima de 75 ww (Christiansen et al 1981)
Asimismo en el antildeo 1984 en el instituto de microbiologiacutea de Amsterdam se
realizoacute un estudio con una columna C18 de siacutelice y una fase moacutevil de agua-etanol-
aacutecido aceacutetico de forma isocraacutetica en donde se obtuvo un porcentaje 025-115
y 002-016 de Psilocibina y Psilocina respectivamente en el hongo (Wurst
1984)
De igual manera en el antildeo 2003 en el instituto de ciencia policiaca en Japoacuten se
ejecutoacute la cromatografiacutea de alta eficiencia utilizando una columna C18 con una
fase moacutevil de aacutecido foacutermico de forma isocraacutetica y un detector de 220 nm un rango
de porcentaje de Psilocibina 014-042 wv en la capa mientras un 009-03
wv en el tallo (Tsujikawa et al 2003)
34
2 MATERIALES Y MEacuteTODOS
21 LOCALIZACIOacuteN
Las fermentaciones la medicioacuten del crecimiento micelial y la cuantificacioacuten del
consumo del sustrato y de proteiacutena se llevaron a cabo en el laboratorio de
Biotecnologiacutea de la Universidad EAFIT mientras que los anaacutelisis de cromatografiacutea
liacutequida de alta eficiencia (HPLC) se realizaron en el laboratorio de Quiacutemica
Instrumental de dicha Universidad
22 MICROORGANISMO DE ESTUDIO
La cepa del hongo Psilocybe cubensis (EAH01) con la cual se trabajoacute fue donada
por Joseacute Rodrigo Moreno Ingeniero del laboratorio de la Universidad Catoacutelica de
Oriente (UCO) La EAH01 permanece auacuten en el laboratorio de Biotecnologiacutea de la
Universidad EAFIT
Dicha cepa se cultivoacute en una caja Petri que conteniacutea Agar Extracto de Malta
(MEA) y se incuboacute a 30ordmC en una incubadora digital del laboratorio de
Biotecnologiacutea de la Universidad EAFIT La figura 5 representa una cepa de P
cubensis cultivada en medio soacutelido MEA
Figura 5 Psilocybe cubensis (EAH01) cultivada en medio soacutelido Agar Malta
35
23 COMPONENTES DEL MEDIO DE CULTIVO (FANG-ZHONG)
El medio sumergido utilizado para llevar a cabo las diferentes fermentaciones de
P cubensis fue el descrito por Fang-Zhong (2002) La tabla 1 muestra los
componentes de dicho medio y la concentracioacuten de cada uno de ellos Se destaca
que las fuentes de carbono utilizadas fueron glucosa y sacarosa usaacutendolas cada
una por separado para cada experimento y haciendo variaciones de
concentraciones de las mismas para los distintos ensayos
Tabla 1 Composicioacuten del medio de cultivo sumergido para evaluar el crecimiento micelial del P cubensis
Componentes Cantidad (gL)
Fuente de Carbono 30 ndash 50 - 70
Peptona 5
Extracto de levadura 5
KH2PO4 1
MgSO47H2O 05
Vitamina B1 005
24 PREPARACIOacuteN DE LOS DIFERENTES PREINOacuteCULOS DE P cubensis
EMPLEADOS PARA LAS FERMENTACIONES SUMERGIDAS
Con el propoacutesito de llevar a cabo cada uno de los ensayos fue necesario realizar
la preparacioacuten de un preinoacuteculo eacutesto con el fin de realizar un proceso de
adaptacioacuten del P cubensis al medio favoreciendo la disminucioacuten en cuanto a
tiempo (preferiblemente la eliminacioacuten de la aparicioacuten de un fase de latencia una
vez comenzada la fermentacioacuten)
La preparacioacuten de cada uno de los preinoacuteculos se realizoacute en 6 erlenmeyers de
1000 mL con 200 mL de medio cada uno los cuales fueron esterilizados a 120degC
por 15 minutos e inoculados con 4 discos de 5 mm aproximadamente de P
36
cubensis provenientes de la cepa previamente activada en Agar Malta durante 6
diacuteas Los erlenmeyers se llevaron a un agitador orbital por 6 diacuteas a 30ordmC y 100
rpm
25 PREPARACIOacuteN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO Y LOS INOacuteCULOS DE P
cubensis UTILIZADOS PARA LAS FERMENTACIONES SUMERGIDAS
Una vez realizado el preinoacuteculo se procedioacute a preparar los medios de cultivo
utilizados para realizar los distintos experimentos de la siguiente manera se
prepararon medios que diferiacutean en la fuente de carbono (glucosa o sacarosa) y en
la concentracioacuten de la misma (30 gL 50 gL y 70 gL) teniendo asiacute un total de
seis fermentaciones Las demaacutes cantidades de los componentes del medio de
Fang-Zhong fueron las mismas que las usadas en el preinoacuteculo descritas en la
Tabla 1
En primer lugar se llevaron a cabo las tres fermentaciones de glucosa
preparando un total de 90 erlenmeyers (30 por cada concentracioacuten de azuacutecar por
duplicado) cada uno de los frascos conteniacutea 50 mL del medio en erlenmeyers de
250 mL e inoculados con 01 g de peso huacutemedo del preinoacuteculo aproximadamente
Los 90 frascos se llevaron durante 14 diacuteas a un agitador orbital a 100 rpm con una
temperatura de 30 degC
Posteriormente se llevaron a cabo las tres fermentaciones de sacarosa siguiendo
el mismo proceso descrito anteriormente para la glucosa
Una vez terminadas las fermentaciones de glucosa y sacarosa y realizados todos
los anaacutelisis correspondientes (generacioacuten de biomasa consumo de sustrato
consumo de proteiacutena y evaluacioacuten de la presencia de Psilocibina por medio de
cromatografiacutea liacutequida de alta eficiencia (HPLC)) se procedioacute a elegir la fuente de
carbono y concentracioacuten que mejores resultados arrojoacute tanto para la generacioacuten
37
de biomasa como para la produccioacuten del alcaloide con el fin de evaluarla
nuevamente adicionaacutendole un precursor (FA)
Para finalizar se procedioacute a preparar los medios con la fuente de carbono y la
concentracioacuten de la misma que arrojoacute mejores resultados es decir los ensayos
realizados con una concentracioacuten de 50 gL de glucosa adicionaacutendole al medio
FA a diferentes concentraciones correspondiente a valores de 05 gL 10 gL y
15 gL las demaacutes cantidades de los componentes remanentes del medio fueron
las mismas que las descritas anteriormente en la tabla 1
26 CUANTIFICACIOacuteN DEL CRECIMIENTO DE BIOMASA MEDIANTE LOS
MEacuteTODOS DE PESO HUacuteMEDO Y PESO SECO PARA CULTIVO
SUMERGIDO DE P cubensis
La cuantificacioacuten de biomasa para cada uno de los tratamientos se realizoacute usando
la metodologiacutea de peso huacutemedo y peso seco Para la cuantificacioacuten de biomasa
mediante el meacutetodo de peso huacutemedo se tomaron dos muestras provenientes de
cada erlenmeyer cada 24 horas las cuales fueron filtradas y pesadas con el fin de
obtener el valor de peso huacutemedo para cada tratamiento del P cubensis
Posteriormente la biomasa retenida en el papel filtro fue llevada a un secador que
se encontraba a una temperatura de 50ordmC durante 24 horas transcurrido el
tiempo la biomasa seca fue pesada con el fin de obtener datos de peso seco
Durante los 14 diacuteas de la fermentacioacuten se obtuvieron datos de peso huacutemedo y
peso seco por duplicado para cada una de las fermentaciones
27 AJUSTE DE LA CINEacuteTICA DE CRECIMIENTO DE P cubensis AL
MODELO CINEacuteTICO LOGIacuteSTICO
Una vez realizada la recoleccioacuten de muestras para cada uno de los ensayos y su
posterior anaacutelisis se decidioacute modelar dichos datos mediante el modelo logiacutestico
38
(ecuacioacuten 1) el cual permite obtener variables cineacuteticas tales como la cantidad de
biomasa inicial (Xo) y la velocidad maacutexima de crecimiento (micromaacutex) para cada uno de
los tratamientos
Se decidioacute emplear el modelo logiacutestico ya que eacuteste muestra resultados maacutes reales
cuando se cultivan hongos debido a que su morfologiacutea es muy diferente a otros
microorganismos (pellets) dificultando la transferencia de masa (Bailey et al
1986)
Una vez linealizada la ecuacioacuten que describe dicho modelos se llega a la siguiente
expresioacuten
Ecuacioacuten 1 Ecuacioacuten linealizada del modelo logiacutestico
Posterior a la linealizacioacuten de la ecuacioacuten se procedioacute a graficar Ln ((XmaacutexX)-1)
vs tiempo con el fin de obtener como pendiente la velocidad maacutexima de
crecimiento (micromaacutex) y como intercepto el Ln ((XmaacutexXo)-1) el cual permitioacute la
obtencioacuten de la concentracioacuten inicial de biomasa
Obtenieacutendose asiacute los paraacutemetros cineacuteticos para cada ensayo correspondientes a
micromax y Xo
Se debe definir la concentracioacuten maacutexima de biomasa (Xmaacutex) para poder hallar los
paraacutemetros cineacuteticos mediante dicho modelo cabe aclarar que dicho valor se toma
de los resultados de biomasa adquiridos para cada uno de los ensayos mediante
la metodologiacutea de peso seco este valor variacutea para cada fermentacioacuten
Una vez ajustados los datos de cada tratamiento al modelo logiacutestico se procedioacute a
calcular de manera teoacuterica los valores de X (biomasa) que variacutea con el tiempo
39
teniendo en cuenta los paraacutemetros cineacuteticos arrojados mediante el modelo
logiacutestico utilizando la siguiente ecuacioacuten
Ecuacioacuten 2 Valores teoacutericos de biomasa en el tiempo
Estos valores de X teoacutericos obtenidos mediante la foacutermula anterior se grafican con
respecto a los valores de X obtenidos de manera experimental con el fin de
observar el ajuste del modelo logiacutestico a cada uno de los datos experimentales
28 EVALUACIOacuteN DEL CONSUMO DE SUSTRATO Y DEL CONSUMO DE
PROTEIacuteNA POR PARTE DEL P cubensis CULTIVADO EN MEDIO
SUMERGIDO
Con el fin de evaluar el consumo de sustrato y proteiacutena por parte del P cubensis
durante las fermentaciones que conteniacutean glucosa en el medio se recolectaron
muestras cada 24 horas del liacutequido obtenido despueacutes de realizada la filtracioacuten de
la muestra que se utilizoacute para efectos de caacutelculo de peso seo dicho liacutequido
denominado sobrenadante fue almacenado a -4 degC Finalizadas cada una de las
fermentaciones se procedioacute a realizar el protocolo para evaluar el consumo de
sustrato para cada medio (Miller 1959) mediante el meacutetodo de DNS (Aacutecido
Dinitrosaliciacutelico) (Anexo 13) y el consumo de proteiacutenas mediante el meacutetodo de
LOWRY para cada fermentacioacuten (Anexo 15)
Para llevar a cabo la cuantificacioacuten de sustrato y proteiacutena en los distintos ensayos
fue necesario realizar las curvas de calibracioacuten correspondientes dichas curvas
con sus respectivos valores de concentracioacuten se muestran en los anexos 14 y 16
40
29 MEacuteTODO CUALITATIVO PARA DETERMINAR LA PRESENCIA DE
ALCALOIDES (PSILOCIBINA) MEDIANTE EL USO DEL REACTIVO DE
DRAGENDORFF
Como se mencionoacute anteriormente el reactivo de Dragendorff es usado para
determinar de manera cualitativa la ausencia o presencia de alcaloides en una
muestra determinada Para llevar a cabo dicha prueba se recolectaron muestras
de la biomasa seca correspondientes a los diacuteas 12 13 y 14 de cada fermentacioacuten
las cuales fueron almacenadas a -4degC
Para determinar la presencia de Psilocibina se realizoacute el proceso descrito seguacuten
Musshoff et al (2000) el cual consistioacute en macerar cada una de las muestras de
biomasa hasta obtener un polvo fino luego se pesaron 10 mg de dicho polvo y a
esta cantidad se le agregoacute 1 mL de metanol Posteriormente una pequentildea
cantidad de esta mezcla se esparcioacute en un papel filtro en donde se le adicionoacute una
gota del reactivo de Dragendorff
Una vez realizada la prueba se dice que la muestra contiene presencia de
alcaloides si eacutesta presenta una coloracioacuten rojizo-amarilla
210 MEacuteTODO PARA DETERMINAR LA PRESENCIA DE PSILOCIBINA
MEDIANTE CROMATOGRAFIacuteA LIacuteQUIDA DE ALTA EFICIENCIA (HPLC)
Una vez evaluada la presencia del alcaloide mediante el reactivo de Dragendorff
se procedioacute a determinar mediante el uso de cromatografiacutea liacutequida de alta
eficiencia (HPLC) la presencia de los alcaloides en la mezcla con sus respectivos
tiempos de retencioacuten para llevar a cabo la extraccioacuten de la Psilocibina se siguioacute el
meacutetodo descrito por Musshoff et al (2000) Para ello la muestra de biomasa
seca fue macera en un mortero hasta convertirla en un polvo fino Diez miligramos
41
de la muestra en polvo se extrajeron dos veces con 1 mL de metanol en un bantildeo
de ultrasonido durante 30 minutos Posterior a eacutesto se centrifugaron las muestras
a 3000 rpm durante 2 minutos el sobrenadante se depositoacute en un vial
independiente
El sobrenadante fue evaporado hasta sequedad bajo una corriente de nitroacutegeno
gaseoso Una parte de los residuos se disolvioacute en 200 microL de la fase moacutevil que
contiene HCOONH4 con una concentracioacuten 10 microM y un pH de 35
El equipo utilizado para realizar todos los anaacutelisis correspondientes a HPLC
cuenta con las siguientes caracteriacutesticas equipo Agient Technologies que consta
de una columna C18 de 46 mm 250 mm 5 mm con una fase moacutevil de
HCOONH4 con un flujo de 1 mLminuto un detector UV de 214 nm y una inyeccioacuten
de 20 μL y una temperatura de 25degC El experimento se corrioacute de modo isocraacutetico
con una fase moacutevil de agua 70 y HCOONH4 de 30
211 DETERMINACIOacuteN CUALITATIVA DE LA RESOLUCIOacuteN DEL
ALCALOIDE DE INTEREacuteS PARA LOS DIFERENTES ENSAYOS
Con el fin de determinar de manera cualitativa cuaacutel de los cromatogramas
arrojados mediante la teacutecnica de HPLC presentoacute mejor resolucioacuten del alcaloide
fue necesario realizar un supuesto acerca del tiempo de retencioacuten de la Psilocibina
durante la cromatografiacutea puesto que a pesar de haber contado con un
cromatograma (Tsujikawa et al 2003) (Anexo 18) y haber trabajado en las
mismas condiciones de eacuteste no se utilizoacute la misma fase moacutevil lo que puedo
generar variaciones en dicho tiempo Se asumioacute que el tiempo de retencioacuten varioacute
entre 62 y 72 minutos es decir entre este tiempo se encontroacute el pico de intereacutes
de la investigacioacuten
42
La eleccioacuten del criterio de pureza del compuesto de intereacutes se realizoacute observando
cuaacutel de los picos obtenidos muestra menor ruido es decir que a su alrededor no
tenga presencia de otros compuestos (Anexos 19 20 y 21)
212 DETERMINACIOacuteN PORCENTUAL DE COMPUESTOS PARA LOS
DIFERENTES ENSAYOS
La cuantificacioacuten de los compuestos se hizo mediante un porcentaje de aacuterea bajo
la curva debido a que no se contoacute con un estaacutendar interno
Para realizar dicho porcentaje se obtuvo la totalidad de las aacutereas presentes en el
perfil cromatograacutefico obtenido para las muestras de los diacuteas 12 13 y 14 de cada
fermentacioacuten y el porcentaje del aacuterea del metabolito de intereacutes la cual oscilaba
entre un tiempo de retencioacuten entre 62 y 72 minutos
En el momento de analizar los cromatogramas y de elegir el medio que mejor
resultados arrojoacute en cuanto a la produccioacuten de alcaloide se observoacute la resolucioacuten
del metabolito en cada una de las fermentaciones
213 CULTIVO SUMERGIDO DE P cubensis EN PRESENCIA DE FA
Despueacutes de haber elegido la fuente de carbono (glucosa) y su respectiva
concentracioacuten (50 gL) que mejores resultados arrojaron durante la investigacioacuten
se realizaron nuevamente fermentaciones del P cubensis en medio sumergido
(Fang-Zhong) donde la diferencia de estos medios con respecto a los
anteriormente utilizados radicoacute en la presencia de FA aminoaacutecido
Para dichas fermentaciones se contoacute con tres concentraciones diferentes de FA
(05 gL 1 gL 15 gL) realizadas por duplicado adicionalmente se montoacute
43
simultaacuteneamente con dichos ensayos las muestras correspondientes a los uacuteltimos
tres diacuteas de fermentacioacuten sin FA en el medio para efectos de comparacioacuten y asiacute
poder llevar a cabo un anaacutelisis estadiacutestico apropiado
Los datos obtenidos fueron analizados por medio de una ANOVA con el fin de
observar si existiacutean o no diferencias significativas en cuanto al crecimiento micelial
(concentracioacuten de biomasa) del P cubensis y asiacute poder determinar el medio que
mejores resultados arrojoacute durante la investigacioacuten
214 DISENtildeO DE EXPERIMENTOS Y ANAacuteLISIS ESTADIacuteSTICO
El disentildeo estadiacutestico utilizado para realizar los anaacutelisis correspondientes a las
diferentes fermentaciones es un disentildeo factorial 23 Este estudio se basoacute en dos
factores que fueron las dos fuentes de carbono (glucosa y sacarosa) a su vez se
apoyoacute en tres niveles que fueron la variacioacuten en la concentracioacuten de las mismas
(30 gL 50 gL y 70 gL) De igual manera se fundamentoacute en dos variables de
respuesta el crecimiento micelial de P cubensis y el porcentaje de Psilocibina
presente en el microorganismo
Por medio del Software Statgraphics plus 51 se realizoacute un anaacutelisis estadiacutestico
basado en una ANOVA factorial Con ello se pretendioacute comparar estadiacutesticamente
los resultados de crecimiento micelial de biomasa (concentracioacuten) y produccioacuten de
Psilocibina para cada uno de los medios durante los 14 diacuteas de fermentacioacuten y en
especial en los uacuteltimos tres diacuteas de la misma puesto que durante este periacuteodo fue
evaluada la presencia del alcaloide
Es necesario hacer hincapieacute que para realizar dicha estadiacutestica fue necesario
ejecutar un estudio de normalidad el cual se comproboacute utilizando la graacutefica de
probabilidad normal a su vez se requirioacute un anaacutelisis de igualdad de varianza por
medio de una graacutefica de residuos Vs previsto con el fin de ver visualmente la
44
hipoacutetesis de la homocedasticidad todo ello con el fin de garantizar que la
investigacioacuten se comportoacute de forma normal Adicionalmente se contoacute con una
hipoacutetesis nula (Ho) y una Hipoacutetesis alterna (Ha) las cuales permitieron realizar las
conclusiones respectivas A continuacioacuten se enunciaraacuten cada una de eacutestas y los
paraacutemetros necesarios para dicho estudio
Ho Todas las medias son iguales es decir no existen diferencias
significativas entre los datos analizados
Ha Alguna de las medias es diferente lo que quiere decir que siacute existen
diferencias significativas
Paraacutemetro
Pvalor gt 005 Se acepta Ho
Pvalor le 005 Se rechaza Ho
45
3 RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN
31 CINEacuteTICA DE CRECIMIENTO MICELIAL DE P cubensis EN CULTIVO
SUMERGIDO (FANG-ZHONG) UTILIZANDO DIFERENTES FUENTES DE
CARBONO
Con el propoacutesito de evaluar el crecimiento micelial del P cubensis en medio
sumergido durante los 14 diacuteas de la fermentacioacuten se recurrioacute al uso de
metodologiacuteas conocidas como peso huacutemedo y peso seco en dicho trabajo soacutelo se
exponen los datos arrojados por el meacutetodo de peso seco
A continuacioacuten se presentan cada una de las fermentaciones de acuerdo al tipo de
sustrato empleado en las mismas los respectivos valores de peso seco obtenidos
y los anaacutelisis pertinentes para cada uno de los casos
311 Crecimiento micelial de P cubensis en medio sumergido utilizando
diferentes concentraciones de glucosa
Inicialmente se evaluaron tres concentraciones de glucosa en el cultivo de P
cubensis en medio sumergido (Fang-Zhong) correspondientes a 30 gL 50 gL y
70 gL siendo en este caso la glucosa la principal fuente de carbono del P
cubensis
A continuacioacuten se muestran los valores de peso seco obtenidos para cada una de
las concentraciones de glucosa utilizadas durante los 14 diacuteas de la fermentacioacuten
46
0
01
02
03
04
05
06
07
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Bio
ma
sa (g
L)
Tiempo (diacuteas)30gL 50gL 70gL
Graacutefico 1 Cineacutetica de crecimiento micelial de P cubensis en medio sumergido (Fang-Zhong) utilizando tres diferentes concentraciones de
glucosa como fuente de carbono (Peso seco)
Del graacutefico 1 se puede observar que no hubo evidencia de fase de latencia para
ninguno de los ensayos posteriormente se aprecia que el crecimiento de biomasa
aumentoacute con el tiempo para las diferentes concentraciones de glucosa empleadas
Analizando las fermentaciones que conteniacutean 50 gL y 70 gL de glucosa se
puede afirmar que ambas presentan un comportamiento similar mostrando una
fase exponencial hasta el diacutea 11 y una fase estacionaria hasta el diacutea 14 de la
fermentacioacuten mientras que la fermentacioacuten que conteniacutea 30 gL de glucosa no
presentoacute fase estacionaria la fermentacioacuten durante los 14 diacuteas se encontraba en
fase exponencial a pesar de que entre los diacuteas 8 y 11 el crecimiento de P
cubensis se mantuvo constante
Asimismo se puede observar que el crecimiento maacutes bajo en cuanto a
concentracioacuten de biomasa se generoacute en la concentracioacuten de 30 gL siendo eacuteste
de 048 gL mientras que en las concentraciones de 50 gL y 70 gL de glucosa
los crecimientos maacuteximos fueron muy similares 055 gL y 062 gL
respectivamente
47
Lo dicho anteriormente se ratifica una vez analizados los resultados obtenidos
estadiacutesticamente donde se obtuvo un P-valor igual a cero indicando que existen
diferencias significativas en cuanto al crecimiento micelial de biomasa
(concentracioacuten de biomasa durante los 14 diacuteas de la fermentacioacuten) El graacutefico 2
ilustra la presencia de dos grupos homogeacuteneos lo que indica que las
concentraciones de 50 gL y 70 gL no tienen diferencias significativas del
crecimiento micelial entre cada una de ellas mientras que la concentracioacuten de 30
gL siacute presenta dichas diferencias significativas con respecto a las dos
concentraciones anteriores (Anexo 1)
Con todo eacutesto se expone que la concentracioacuten de glucosa de 50 gL es la que se
eligioacute debido a que es maacutes econoacutemico utilizar 50 gL de glucosa que 70 gL
Tratamientos con diferentes concentraciones de glucosa
Media 30 gL glucosa (a) 022
Media 50 gL glucosa (b) 032
Media 70 gL glucosa (b) 034
a
bb
0
005
01
015
02
025
03
035
04
045
Co
nce
ntr
acioacute
n b
iom
asa
(gL
)
Letras diferentes denotan diferencias significativas (prueba LSD)
Graacutefico 2 Crecimiento micelial de P cubensis en cultivo sumergido bajo tres concentraciones de glucosa
48
Modelo logiacutestico para las fermentaciones donde se utilizoacute glucosa
como fuente de carbono
Una vez realizada la cineacutetica de crecimiento del P cubensis en medio sumergido
(Fang-Zhong) usando diferentes concentraciones de glucosa se procedioacute a
ajustar los datos obtenidos al modelo logiacutestico Los crecimientos maacuteximos de
biomasa obtenidos mediante el meacutetodo de peso seco para cada uno de los
ensayos fueron 048 gL 065 gL y 062 gL para concentraciones de 30 gL 50
gL y 70 gL de glucosa respectivamente La tabla 2 muestra los paraacutemetros
cineacuteticos obtenidos mediante el modelo para cada una de las concentraciones
Tabla 2 Paraacutemetros cineacuteticos obtenidos mediante el modelo logiacutestico para las diferentes fermentaciones de P cubensis utilizando glucosa como fuente
de carbono
30gL 50gL 70gL
microx (diacutea-sup1) 016 microx (diacutea-sup1) 017 microx (diacutea-sup1) 015
micromax (diacutea-sup1) 027 micromax (diacutea-sup1) 035 micromax (diacutea-sup1) 034
X0 (gL) 005 X0 (gL) 008 X0 (gL) 008
R2 096 R2
092 R2 085
De la tabla 2 se puede observar que la concentracioacuten inicial de biomasa (Xo)
estuvo muy cercana para cada una de las concentraciones de glucosa utilizadas
Para 30 gL de glucosa la velocidad maacutexima de crecimiento (micromax) fue mucho
menor que la obtenida para 50 gL y 70 gL eacutesto pudo ser debido a que fue el
medio que menor cantidad de glucosa conteniacutea mientras que para las otras dos
concentraciones de glucosa la velocidad maacutexima de crecimiento fue similar
Al comparar las velocidades maacuteximas de las tres concentraciones de glucosa
utilizadas se evidencia que la fermentacioacuten que conteniacutea 50 gL presentoacute una
micromaacutex mayor correspondiente a 035 diacutea-1 esto sugiere que a mayores
concentracioacuten de glucosa (70 gL) puede ocurrir una inhibicioacuten por sustrato otro
49
criterio que afirma que dicha concentracioacuten fue la que mejores resultados arrojoacute de
las tres concentraciones de glucosa utilizadas para el crecimiento del P cubensis
en el medio de Fang-Zhong Ademaacutes se observa que este experimento fue el que
mayor velocidad especiacutefica de crecimiento presento siendo esta de 017 diacutea-1
Finalmente se calcularon los valores de biomasa teoacutericos utilizando la ecuacioacuten
descrita anteriormente en la metodologiacutea con el propoacutesito de observar que tanto
se ajustaron los valores de biomasa hallados experimentalmente con los valores
de biomasa teoacutericos arrojados por el modelo logiacutestico El graacutefico 3 muestra los
valores de biomasa (X) tanto teoacutericos como experimentales con respecto al
tiempo
0
01
02
03
04
05
06
07
0 2 4 6 8 10 12 14
Biom
asa
(gL
)
Tiempo (diacutea)
X exp (30 gL) X exp (50 gL) X exp (70 gL)
X teoacuterico (30 gL) X teoacuterico (50 gL) X teoacuterico (70 gL)
Graacutefico 3 Valores de concentracioacuten de biomasa experimental y teoacuterico
graficados con respecto al tiempo para las fermentaciones con diferentes concentraciones de glucosa
Al observar el graacutefico 3 se puede notar que para los ensayos de 50 gL y 70 gL
de glucosa los valores de biomasa teoacutericos se encuentran un poco desfasados de
los valores de biomasa hallados de manera experimental mientras que para el
ensayo que conteniacutea 30 gL de glucosa se observa un buen ajuste de los datos
50
obtenidos experimentalmente al modelo logiacutestico La tabla 2 reitera lo dicho
anteriormente al exponer los valores de R2 los cuales explican la relacioacuten que
tienen los datos teoacutericos con los experimentales
312 Crecimiento micelial del P cubensis en medio sumergido utilizando
diferentes concentraciones de sacarosa
Una vez evaluado el crecimiento de biomasa usando glucosa como fuente de
carbono se procedioacute a evaluar el efecto que teniacutea el cambio de la fuente de
carbono por sacarosa en el crecimiento micelial del P cubensis en medio
sumergido
El graacutefico 4 muestra de manera ilustrativa como fue el crecimiento micelial del P
cubensis para cada una de las concentraciones de sacarosa utilizadas durante los
14 diacuteas mediante el meacutetodo de peso seco
0
01
02
03
04
05
06
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Biom
asa (
gL)
Tiempo (diacuteas)
30 gL 50 gL 70 gL
Graacutefico 4 Cineacutetica de crecimiento micelial de P cubensis en medio sumergido (Fang-Zhong) utilizando diferentes concentraciones de sacarosa
como fuente de carbono (Peso seco)
51
En el graacutefico 4 se puede observar que tanto para una concentracioacuten de 30 gL
como para 70 gL de sacarosa el hongo llega a su fase estacionaria cerca del
quinto diacutea de la fermentacioacuten mientras que para una concentracioacuten de 50 gL se
observa un comportamiento diferente puesto que el microorganismo tiene un
crecimiento exponencial hasta el diacutea 5 en donde entra a una etapa de transicioacuten o
estacionaria durante 3 diacuteas aproximadamente luego de la cual inicia nuevamente
su crecimiento de forma exponencial hasta llegar al diacutea 11 en donde siacute empieza
su fase estacionaria
Al igual que en las tres fermentaciones que conteniacutean glucosa en estas
fermentaciones de sacarosa se observa mediante el graacutefico anterior que no hubo
presencia de fase de latencia
El crecimiento maacuteximo de biomasa en cuanto a concentracioacuten lo presentoacute aquella
fermentacioacuten que conteniacutea 70 gL de sacarosa el cual fue de 057 gL seguida de
la de 50 gL con un crecimiento maacuteximo de biomasa de 045 gL y posteriormente
la concentracioacuten de 30 gL obtuvo un crecimiento maacuteximo de 026 gL
De acuerdo al anaacutelisis estadiacutestico que se realizoacute para cada una de las
fermentaciones se dedujo que las diferencias en cuanto al crecimiento micelial de
biomasa con respecto a la concentracioacuten de la misma son significativas entre
cada una de las fermentaciones es decir fue diferente la concentracioacuten de
biomasa obtenida cuando se trabajoacute con cada una de distintas concentraciones de
sacarosa Lo dicho anteriormente se muestra a traveacutes del graacutefico 5 (Anexo 2)
52
Tratamientos con diferentes concentraciones de sacarosa
Media 30 gL sacarosa (a) 02
Media 50 gL sacarosa (b) 032
Media 70 gL sacarosa (c) 043
a
b
c
0
02
04
Co
nce
ntr
acioacute
n b
iom
asa
(gL
)
Letras diferentes denotan diferencias significativas (prueba LSD)
Graacutefico 5 Crecimiento micelial para tres diferentes concentraciones de sacarosa
Modelo logiacutestico para las fermentaciones donde se utilizoacute sacarosa
como fuente de carbono
Una vez realizadas las cineacuteticas de crecimiento del P cubensis para cada
concentracioacuten de sacarosa empleada se procedioacute a ajustar los datos obtenidos al
modelo logiacutestico cabe recalcar que es necesario establecer los crecimientos
maacuteximos de biomasa obtenidos para cada uno de los ensayos los cuales fueron
026 gL 045 gL y 057 gL para concentraciones de 30 gL 50 gL y 70 gL de
sacarosa respectivamente
Una vez aplicado el modelo logiacutestico para cada tratamiento se obtuvieron valores
de velocidad maacutexima de crecimiento y biomasa inicial para cada concentracioacuten de
sacarosa utilizada en el medio los cuales se muestran en la tabla 3
53
Tabla 3 Paraacutemetros cineacuteticos obtenidos mediante el modelo logiacutestico para las diferentes fermentaciones de P cubensis utilizando sacarosa como
fuente de carbono
30gL 50gL 70gL
microx (diacutea-sup1) 030 microx (diacutea-sup1) 014 microx (diacutea-sup1) 041
micromax (diacutea-sup1) 037 micromax (diacutea-sup1) 042 micromax (diacutea-sup1) 067
X0 (gL) 01 X0(gL) 01 X0 (gL) 011
R2 061 R2 089 R2 095
De la tabla 3 se ratifica que se utilizoacute una concentracioacuten inicial de biomasa igual
para cada una de las fermentaciones aproximadamente 01 gL ademaacutes se
observa un aumento en la velocidad maacutexima de crecimiento con respecto a la
cantidad de sacarosa empleada es decir que el hecho de haber aumentado la
concentracioacuten de sacarosa en el medio favorecioacute el aumento en la velocidad
maacutexima de crecimiento del P cubensis siendo eacutesta mayor cuando se trabajoacute a una
concentracioacuten de 70 gL de sacarosa De igual manera se aprecia que el
tratamiento que conteniacutea 70 gL de sacarosa presentoacute una velocidad especiacutefica de
crecimiento mayor que los demaacutes siendo eacutesta de 041 diacutea-1
Finalmente se calcularon los valores de biomasa teoacutericos el graacutefico 6 ilustra los
valores de biomasa (X) tanto teoacutericos como experimentales graficados con
respecto al tiempo
54
0
01
02
03
04
05
06
0 2 4 6 8 10 12 14
Bio
mas
a (g
L)
Tiempo (Diacutea)
X exp (30 gL) X exp (50 gL) X exp (70 gL)
X teoacuterico (30 gL) X teoacuterico (50 gL) X teoacuterico (70 gL)
Graacutefico 6 Valores de concentracioacuten de biomasa experimental y teoacuterico graficados con respecto al tiempo para las fermentaciones con diferentes
concentraciones de sacarosa
Del graacutefico 6 se puede observar como los valores de biomasa experimentales se
ajustaron a los valores de biomasa teoacutericos arrojados por el modelo logiacutestico lo
que quiere decir la cineacutetica de crecimiento del P cubensis en medio sumergido
cuando se utilizoacute 70 gL se ajustoacute correctamente al modelo logiacutestico lo que se
corrobora en la tabla 2 gracias al valor obtenido para el R2 que indica la relacioacuten
de los datos teoacutericos con respecto a los experimentales Por otro lado para las
fermentaciones de 30 gL y 50 gL de sacarosa a pesar de parecer que
presentaron un buen ajuste al calcular la relacioacuten de los datos teoacutericos con
respecto a los experimentales (R2) se concluye que el ajuste no fue tan bueno
55
313 Comparacioacuten entre el crecimiento micelial de P cubensis en los
cultivos sumergidos utilizando glucosa y sacarosa como fuente de
carbono
Ahora bien es igualmente importante realizar un anaacutelisis comparativo entre ambas
fuentes de carbono empleadas con el fin de determinar si existen o no diferencias
significativas entre dichas fuentes de carbono
De acuerdo al anaacutelisis estadiacutestico se dice que existen diferencias significativas del
crecimiento micelial del P cubensis en cuanto al diacutea y la concentracioacuten de
sustrato empleado es decir concentracioacuten de glucosa y sacarosa (Anexo 3) pero
se observa claramente que no hay diferencias significativas de dicho crecimiento
con respecto al tipo de sustrato utilizado debido a que el P-valor arrojado por la
estadiacutestica fue de 01217 lo que sugiere que se debe utilizar la sacarosa gracias
a la disminucioacuten de costos que se generariacutean durante el proceso todo ello gracias
al costo de la sacarosa es inferior al de glucosa Sin embargo para elegir la fuente
de carbono que mejores resultados arrojoacute no soacutelo se basoacute en la cantidad de
biomasa producida sino que se procedioacute a examinar los barridos espectrales
arrojados por el anaacutelisis de HPLC con el fin de determinar la fuente de carbono
que mejor resolucioacuten mostroacute del alcaloide que en esta investigacioacuten fue glucosa a
una concentracioacuten de 50 gL
De igual manera el graacutefico 7 muestra las medias obtenidas mediante el anaacutelisis
estadiacutestico para las fermentaciones trabajadas con glucosa y sacarosa Aun asiacute
es necesario hacer hincapieacute que eacuteste no es el criterio principal para la obtencioacuten
del medio que mejores resultados arrojoacute durante la investigacioacuten por lo tanto se
deben seguir realizando los diferentes anaacutelisis descritos anteriormente en este
trabajo
56
Tratamientos de las dos fuentes de carbono usadas sin FA (glucosa y
sacarosa)
Media para glucosa (a) 029
Media para sacarosa (a) 032
aa
0
01
02
03
Conc
entr
acioacute
n bi
omas
a (g
L)
Letras diferentes denotan diferencias significativas (Prueba LSD)
Graacutefico 7 Crecimiento micelial para dos diferentes fuentes de carbono (glucosa y sacarosa)
314 Crecimiento micelial del P cubensis en cultivo sumergido utilizando
glucosa y fenilalanina en el medio
Se decidioacute realizar un uacuteltimo ensayo acerca del efecto que teniacutea la adicioacuten de un
aminoaacutecido llamado Fenilalanina (FA) al medio Fang-Zhong sobre la produccioacuten
del alcaloide y por ende sobre la generacioacuten de biomasa
Debido a los anaacutelisis realizados anteriormente se concluyoacute que la mejor fuente de
carbono fue la glucosa a una concentracioacuten de 50 gL De la misma manera que
en los numerales anteriores se evaluoacute la cineacutetica del crecimiento micelial del P
cubensis mediante los meacutetodos de peso huacutemedo y peso seco Las mediciones
fueron realizadas por duplicado y promediadas para la fuente de carbono elegida
(glucosa 50 gL) y las diferentes concentraciones de FA en el medio
correspondientes a 05 gL 1 gL 15 gL con el fin de encontrar el medio que
mejores resultados arrojoacute en cuanto a crecimiento micelial y generacioacuten del
57
alcaloide de intereacutes Los datos obtenidos mediante el meacutetodo de peso seco se
muestran en el graacutefico 8
Cabe resaltar que junto con las tres fermentaciones de 05 gL 10 gL y 15 gL
de FA se montaron a su vez seis muestras correspondientes a los diacuteas 12 13 y
14 de la fermentacioacuten que conteniacutea 0 gL de FA eacutesto con el propoacutesito de analizar
los datos de manera estadiacutestica y poder hacer comparaciones con respecto a la
generacioacuten de biomasa y a la produccioacuten del alcaloide de intereacutes ambas medidas
con respecto a la concentracioacuten
0
01
02
03
04
05
06
07
08
09
1
11
12
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Biom
asa
(gL
)
Tiempo (diacuteas)
05 gL 1 gL 15 gL
Graacutefico 8 Cineacutetica de crecimiento micelial de P cubensis en medio sumergido (Fang-Zhong) utilizando diferentes concentraciones de FA y 50
gL de glucosa como fuente de carbono (Peso seco)
Al analizar el graacutefico 8 es decir el crecimiento micelial (concentracioacuten de
biomasa) seguacuten la concentracioacuten de FA en el tiempo se puede notar que no hubo
presencia de fase de latencia para ninguna de las concentraciones de FA
utilizadas ademaacutes el crecimiento de biomasa en cada caso se aprecia de manera
58
muy similar llegando los tres ensayos a la fase estacionaria el diacutea 12 de la
fermentacioacuten
Observando el graacutefico 8 se puede identificar que el mayor contenido de biomasa
fue de 108 gL obtenida el diacutea 13 para una concentracioacuten 10 gL de FA para
concentraciones de 05 gL y 15 gL de FA la concentracioacuten maacutexima de biomasa
fue 106 gL y 101 gL respectivamente Auacuten asiacute al considerar los resultados
obtenidos se puede ratificar que es indiferente la cantidad de FA necesaria para
obtener concentracioacuten de biomasa por ende se decide que el medio que mejores
resultados arrojoacute fue el que conteniacutea 05 gL FA debido a que fue la
concentracioacuten de FA que mejor resolucioacuten del alcaloide presentoacute paraacutemetro
observado mediante los cromatogramas obtenidos del anaacutelisis de HPLC (Anexos
19 20 y 21) y ademaacutes porque con dicha cantidad los costos de la materia prima
seriacutean menores Cabe resaltar que el uso de FA generoacute un aumento significativo
duplicando la produccioacuten de biomasa por lo tanto se testifica que siacute hubo
duplicacioacuten en cuanto a la concentracioacuten de biomasa en los medios que conteniacutea
FA con respecto a los medios que no conteniacutean FA se dice entonces que a su
vez se podriacutea haber generado mayor cantidad de Psilocibina en los medios que
teniacutean FA ya que dicho alcaloide se produce de manera intracelular por tal
razoacuten al aumentar la cantidad de biomasa en el medio se aumenta la cantidad de
dicho alcaloide
De igual manera se analizaron los datos estadiacutesticamente y se llegoacute a apreciar
que no existen diferencias significativas en cuanto a la produccioacuten de biomasa y la
cantidad de FA utilizada en el medio Del mismo modo al analizar la tabla de
contrastes muacuteltiple de rangos se reitera que siacute existen diferencias significativas
entre el crecimiento micelial de biomasa (concentracioacuten de biomasa) en el tiempo
cuando se trabajoacute con FA o sin eacuteste Eacutesto se puede observar en el graacutefico 9
(Anexo 4)
59
Tratamientos con y sin FA
Media 0 gL FA (a) 032
Media 05 gL FA (b) 065
Media 10 gL FA (b) 066
Media 15 gL FA (b) 069
a
b b b
0
01
02
03
04
05
06
07
08
09
Conc
entr
acioacute
n bi
omas
a (g
L)
Letras diferentes denotan diferencias significativas (Prueba LSD)
Graacutefico 9 Crecimiento micelial para glucosa a una concentracioacuten de 50 gL y tres diferentes concentraciones de FA
Modelo logiacutestico para las fermentaciones donde se utilizoacute 50 gL de
glucosa como fuente de carbono y diferentes concentraciones de FA
En primer lugar se fijaron los valores de crecimiento maacuteximo de biomasa para
cada una de las concentraciones obtenidos mediante el meacutetodo de peso seco con
el fin de hallar los paraacutemetros cineacuteticos mediante el modelo logiacutestico Los
crecimientos maacuteximos de biomasa obtenidos fueron los siguientes 106 gL 108
gL y 101 gL para concentraciones de 05 gL 10 gL y 15 gL de FA
respectivamente y 50 gL de glucosa
Una vez realizado el modelo logiacutestico para cada tratamiento se obtuvieron los
valores de velocidad maacutexima de crecimiento y concentracioacuten de biomasa inicial
para cada ensayo los cuales se muestran en la tabla 4
60
Tabla 4 Paraacutemetros cineacuteticos obtenidos mediante el modelo logiacutestico para las diferentes fermentaciones de P cubensis utilizando 50 gL de glucosa
como fuente de carbono y diferentes concentraciones de FA
05gL 10gL 15gL
microx (diacutea-sup1) 018 microx (diacutea-sup1) 012 microx (diacutea-sup1) 012
micromax (diacutea-sup1) 045 micromax (diacutea-sup1) 035 micromax (diacutea-sup1) 044
X0 (gL) 01 X0 (gL) 017 X0 (gL) 016
R2 095 R2 082 R2 088
Seguacuten los valores arrojados por el modelo logiacutestico que se encuentran
presentados en la tabla 4 se puede decir que se presentoacute una valor de biomasa
inicial similar para los tratamientos de 1 gL y 15 gL de FA mientras que para las
fermentaciones que conteniacutean 05 gL de FA se tiene una diferencia de un 50
aproximadamente Ademaacutes se puede observar que a la concentracioacuten de 05 gL
de FA es la que mayor velocidad maacutexima de crecimiento presenta siendo esta
045 diacuteamacrsup1 a su vez dicha concentracioacuten presentaacute la microx mayor correspondiente a
018 diacutea-1 Debido a eacutesto y al criterio de mejor resolucioacuten del alcaloide observado
en los anaacutelisis de HPLC (Anexos 19 20 y 21) se concluye que el medio que
mejores resultados arrojoacute durante la investigacioacuten para la generacioacuten de biomasa
y la produccioacuten de la Psilocibina es 05 gL de FA y 50 gL de glucosa
Finalmente se calcularon los valores de biomasa teoacutericos el graacutefico 10 muestra
los valores de biomasa (X) tanto teoacutericos como experimentales graficados con
respecto al tiempo
61
0
02
04
06
08
1
12
0 2 4 6 8 10 12 14 16
Bio
mas
a (g
L)
Tiempo (Diacutea)
X exp (05 gL) X exp (10 gL) X exp (15 gL)
X teoacuterico (05 gL) X teoacuterico (10 gL) X teoacuterico (15 gL)
Graacutefico 10 Valores de concentracioacuten de biomasa experimental y teoacuterico graficados con respecto al tiempo para las fermentaciones con diferentes
concentraciones de FA y 50 gL de glucosa
Se puede decir gracias al graacutefico 10 que los valores de biomasa experimentales
se ajustaron a los valores de biomasa teoacutericos hallados mediante el modelo
logiacutestico es decir la cineacutetica de crecimiento del P cubensis en medio sumergido
cuando se usaron diferentes concentraciones de FA en el medio se ajustoacute
correctamente al modelo logiacutestico esto se reitera con los valores de R2 mostrados
anteriormente en la tabla 4
32 ESTUDIO DE LA CINEacuteTICA DE CONSUMO DE SUSTRATO POR PARTE
DEL P cubensis CULTIVADO EN MEDIO SUMERGIDO (FANG-ZHONG)
La evaluacioacuten del consumo de sustrato durante la fermentacioacuten con respecto al
tiempo es de suma importancia puesto que eacuteste es el principal componente
limitante del crecimiento presente en el medio de cultivo
62
A continuacioacuten se analizaraacuten dichos consumos para los diferentes ensayos
321 Consumo de sustrato por parte del P cubensis en medio sumergido
utilizando diferentes concentraciones de glucosa
Una vez halladas las concentraciones de sustrato para cada una de las
fermentaciones que conteniacutean glucosa en el medio se procedioacute a graficar dichos
valores con respecto al tiempo
El graacutefico 11 ilustra los datos obtenidos sobre el consumo de sustrato de las tres
fermentaciones que conteniacutean glucosa y a su vez como se comportoacute el
crecimiento de biomasa para cada ensayo durante los 14 diacuteas de fermentacioacuten
0
01
02
03
04
05
06
07
0
10
20
30
40
50
60
70
80
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14B
iom
asa
(gL
)
Glu
cosa
(gL
)
Tiempo (diacuteas)
30 GL 50GL 70 GL 30gL 50gL 70gL
Graacutefico 11 Cineacutetica de consumo de sustrato por parte del P cubensis en medio sumergido utilizando diferentes concentraciones de glucosa como
fuente de carbono
Al observar el graacutefico 11 se expone que el P cubensis consumioacute mayor cantidad
de glucosa cuando esta estaba a una concentracioacuten de 70 gL correspondiendo a
63
un porcentaje de 62 mientras que para 50 gL y 30 gL fue de 23 y 30
respectivamente
Comparando el consumo de glucosa en sus diferentes concentraciones con el
crecimiento micelial del hongo se puede observar que a una concentracioacuten de
glucosa de 30 gL no soacutelo se tuvo un menor consumo de sustrato sino que
tambieacuten se generoacute un menor crecimiento de biomasa Mientras que a
concentraciones de 50 gL y 70 gL de glucosa a pesar de presentar diferencias
en cuanto al porcentaje de sustrato consumido el crecimiento micelial es similar
(no presenta diferencias significativas) lo que indica que el hongo no requiere
tanta concentracioacuten de glucosa para su crecimiento eacutesto se puede afirmar soacutelo
para este ensayo a estas condiciones
De igual manera en el graacutefico 11 al analizar la tendencia del consumo de
sustrato las concentraciones de glucosa de 50 gL y 70 gL presentan una
disminucioacuten notoria hasta el diacutea 11 para dicho consumo Esto se debe a que en
ese diacutea inicioacute la fase estacionaria del hongo en ambas fermentaciones en donde
el P cubensis requeriacutea alimento uacutenicamente para mantenerse y producir
metabolitos secundarios Mientras que para la concentracioacuten de glucosa de 30 gL
el consumo de glucosa fue muy poco a partir del quinto diacutea de la fermentacioacuten
esto se atribuye a que la cineacutetica de crecimiento micelial del P cubensis presentoacute
una fase estacionaria temprana entre los diacuteas 8 y 11 indicando que no necesitaba
consumir casi glucosa puesto que no estaba creciendo
322 Consumo de sustrato por parte del P cubensis en medio sumergido
utilizando diferentes concentraciones de sacarosa
Los datos obtenidos sobre el consumo de sacarosa para cada una de las
concentraciones utilizadas (30 gL 50 gL y 70 gL de sacarosa) durante los 14
diacuteas de la fermentacioacuten se muestran en el graacutefico 12 a su vez se ilustran en dicho
64
graacutefico el comportamiento del crecimiento micelial para cada ensayo durante los
14 diacuteas de fermentacioacuten para efectos de anaacutelisis
0
01
02
03
04
05
06
0
10
20
30
40
50
60
70
80
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Bio
mas
a (g
L)
Sac
aro
sa (g
L)
Tiempo (diacuteas)
30gL 50gL 70gL 30 gL 50 gL 70 gL
Graacutefico 12 Cineacutetica de consumo de sustrato por parte del P cubensis en medio sumergido utilizando diferentes concentraciones de sacarosa como
fuente de carbono
Al observar el graacutefico 12 se puede decir que el P cubensis consumioacute mayor
cantidad de sacarosa cuando eacutesta estaba a una concentracioacuten de 70 gL en el
medio presentando un porcentaje de consumo del 49 mientras que para las
concentraciones de 50 gL y 30 gL de sacarosa se tuvo un porcentaje de
consumo de 24 y 37 Esto igual que en el consumo de glucosa se puede
deber a que al tener mayor concentracioacuten de sustrato en el medio el P cubensis
genera mayor afinidad por el mismo haciendo que dicho hongo se consuma
grandes cantidades de sacarosa durante el tiempo
Igualmente se observa que aproximadamente en el noveno diacutea de la
fermentacioacuten las tres diferentes concentraciones de glucosa (30 gL 50 gL y 70
65
gL) se mantienen casi constantes en el tiempo ello gracias a que en este diacutea el
hongo se encontraba en fase estacionaria en los tres ensayos
323 Comparacioacuten entre el consumo de sustrato de P cubensis en los
cultivos sumergidos con diferentes fuentes de carbono
Con el fin de identificar cuaacutel de las dos fuentes de carbono fue consumida en
mayor proporcioacuten por parte del P cubensis se procedioacute a realizar un anaacutelisis
estadiacutestico donde comparamos las dos fuentes de carbono empleados con
respecto al consumo de sustrato obtenido (concentracioacuten de glucosa y sacarosa
en cada uno de los medios) donde se consiguioacute un P-valor de 00811 con
respecto al tipo de sustrato lo que indica que no existen diferencias en cuanto al
consumo de sustrato y el tipo del mismo es decir es indiferente cuaacutel de los dos
sustratos (glucosa o sacarosa) se utilice para que se del consumo del mismo por
parte del P cubensis Observacioacuten que se reitera en la tabla de contraste muacuteltiple
que muestra que se trabajoacute como un grupo homogeacuteneo Igualmente el graacutefico 13
muestra las medias de consumo de sustrato (concentracioacuten durante los 14 diacuteas)
obtenidas mediante el anaacutelisis estadiacutestico y reitera que no existen diferencias
significativas con respecto al tipo de sustrato utilizado para el cultivo del P
cubensis en medio sumergido (Anexo 5)
66
Tratamientos de las dos fuentes de carbono usadas sin FA (glucosa y sacarosa)
Media glucosa (a) 3431
Media sacarosa (a) 3678
a
a
32
34
36
38
Co
nce
ntr
acioacute
n s
ust
rato
(g
L)
Letras diferentes denotan diferencias significativas (Prueba LSD)
Graacutefico 13 Consumo de sustrato para cada una de las fuentes de carbono utilizadas
Aun asiacute al comparar los graacuteficos 11 y 12 se puede observar un mayor consumo
de glucosa que de sacarosa lo que lleva a concluir que es mejor emplear la
primera (glucosa)
324 Consumo de sustrato por parte del P cubensis en medio sumergido
utilizando glucosa y fenilalanina en el medio
Los datos obtenidos acerca del consumo de sustrato durante los 14 diacuteas de la
fermentacioacuten para cada uno de los medios que conteniacutean 50 gL de glucosa y
diferentes concentraciones de FA (05 gL 1 gL y 15 gL) se muestran en el
graacutefico 14 De igual manera se ilustran en dicho graacutefico las cineacuteticas de
crecimiento micelial para cada una de las fermentaciones que teniacutean 50 gL de
glucosa y diferentes concentraciones de FA con el fin de realizar los anaacutelisis
pertinentes
67
0
02
04
06
08
1
12
0
10
20
30
40
50
60
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Bio
mas
a (g
L)
Glu
cosa
50
gL
+ F
A (g
L)
Tiempo (diacuteas)
05gL 10gL 15gL 05 gL 1 gL 15 gL
Graacutefico 14 Cineacutetica de consumo de sustrato por parte del P cubensis en medio sumergido utilizando 50 gL de glucosa como fuente de carbono y
diferentes concentraciones de FA
Analizando el graacutefico 14 se puede decir que el consumo de glucosa durante el
tiempo fue igual para las fermentaciones que conteniacutea concentraciones de 1 gL y
15 gL de FA dichos consumos corresponde a valores de 23 mientras que
para el ensayo que teniacutea una concentracioacuten de 05 gL de FA el porcentaje de
consumo fue del 18 Asimismo se presentaron diferencias significativas en
cuanto al consumo de sustrato entre los diferentes ensayos
El graacutefico 15 expone las medias del consumo de sustrato (concentracioacuten) de cada
una de las muestras y las diferencias existentes entre ellas se evidencia que la
adicioacuten de FA disminuyoacute el consumo de glucosa ademaacutes que en los ensayos se
presentaron tres grupos homogeacuteneos diferentes En el primer grupo (a) que
contiene las fermentaciones del P cubensis con una concentracioacuten de 50 gL de
glucosa y en ausencia de FA se obtuvo una media de 356 gL la cual indica un
mayor consumo de sustrato Luego el segundo grupo (c) se compone de las
concentraciones de 1 gL y 15 gL de FA presentando una media de 413 gL y
de 426 gL respectivamente y el uacuteltimo grupo (b) corresponde a una
68
concentracioacuten de 05 gL de FA el cual presenta el menor consumo de glucosa al
exponer una media 466 gL
Seguacuten lo anterior y el graacutefico 15 se dice que siacute existieron diferencias significativas
en cuanto al consumo de sustrato (concentracioacuten durante los 14 diacuteas) en los
uacuteltimos tres diacuteas cuando se trabajo con FA y sin FA y a su vez se encontraron
diferencias significativas de la concentracioacuten de sustrato en el medio cuando se
teniacutea una concentracioacuten de FA correspondiente a 05 gL con relacioacuten a las otras
dos concentraciones de FA (10 gL y 15 gL) mientras que entre estas dos
uacuteltimas concentraciones de FA (10 gL y 15 gL) no se encontraron diferencias
significativas (Anexo 6)
Tratamientos con y sin FA
Media 0 gL FA (a) 3564
Media 05 gL FA (b) 466
Media 10 gL FA (c) 4131
Media 15 gL FA (c) 426
a
b c c
0
10
20
30
40
50
60
Conc
entr
acioacute
n su
stra
to (g
L)
Letras diferentes denotan diferencias significativas (prueba LSD)
Graacutefico 15 Consumo de sustrato para cada una de las concentraciones de FA utilizadas
69
33 ESTUDIO DE LA CINEacuteTICA DE CONSUMO DE PROTEIacuteNA POR PARTE
DEL P cubensis CULTIVADO EN MEDIO SUMERGIDO (FANG-ZHONG)
Las fuentes de proteiacutena que posee el medio de Fang-Zhong son extracto de
levadura y peptona que representan una cantidad de 10 gL para cada ensayo
eacutesta cantidad se mantuvo constante para cada fermentacioacuten
Se evaluoacute el consumo de proteiacutena por parte del P cubensis durante los 14 diacuteas
de la fermentacioacuten para cada uno de los ensayos
A continuacioacuten se analizan los resultados obtenidos para cada uno de los
tratamientos
331 Consumo de proteiacutena por P cubensis en medio sumergido utilizando
diferentes concentraciones de glucosa
Una vez se calcularon las concentraciones de proteiacutena en el medio para cada
ensayo se graficaron dichos valores con respecto al tiempo
El graacutefico 16 muestra como se comportoacute el consumo de proteiacutena con respecto al
tiempo para cada una de las tres concentraciones de glucosa utilizadas y a su vez
como se comportoacute el crecimiento de biomasa para cada ensayo durante los 14
diacuteas de fermentacioacuten
70
0
01
02
03
04
05
06
07
0
5
10
15
20
25
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Bio
mas
a (g
L)
Pro
tein
a (g
L)
Tiempo (diacuteas)
30 GL 50 GL 70 GL 30 gL Biomasa 50 gL Biomasa 70 gL Biomasa
Graacutefico 16 Cineacutetica de consumo de proteiacutena por parte del P cubensis en medio sumergido utilizando diferentes concentraciones de glucosa como
fuente de carbono
Analizando el graacutefico 16 se puede observar que el consumo de proteiacutena se dio
casi en su totalidad El ensayo que mayor consumo de proteiacutena presentoacute fue el
que conteniacutea 30 gL de glucosa arrojando un porcentaje de consumo del 98
mientras que las fermentaciones realizadas a concentraciones de 50 gL y 70 gL
de glucosa presentaron un porcentaje de consumo de proteiacutena del 91 y 90
respectivamente
Al enfocarnos en la relacioacuten existente entre el consumo de proteiacutena y el
crecimiento micelial del P cubensis se puede notar gracias al graacutefico 16 que la
relacioacuten es directamente proporcional debido a que el consumo de proteiacutena fue
permanente mientras el hongo se encontraba en fase exponencial es decir el P
cubensis necesitaba de la proteiacutena para aumentar su crecimiento mientras que en
el momento en que el microorganismo comenzoacute su fase estacionaria la
concentracioacuten de proteiacutena en el medio se mantuvo constante esto uacuteltimo soacutelo es
vaacutelido para concentraciones de 50 gL y 70 gL de glucosa puesto que ambas
llegaron a la fase estacionaria
71
332 Consumo de proteiacutena por P cubensis en medio sumergido utilizando
diferentes concentraciones de sacarosa
Una vez obtenidos los valores de consumo de proteiacutena para cada concentracioacuten
de sacarosa utilizada se precedioacute a graficarlos con respecto al tiempo dichos
datos se encuentran en el graacutefico 17 De igual manera en este graacutefico se
representa la cineacutetica de crecimiento de biomasa para el P cubensis de acuerdo a
las distintas concentraciones de sacarosa utilizadas
0
01
02
03
04
05
06
0
2
4
6
8
10
12
14
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Bio
mas
a (g
L)
Prot
eiacutena
(gL
)
Tiempo (diacuteas)
30 GL 50 GL 70 GL 30 gL 50 gL 70 gL
Graacutefico 17 Cineacutetica de consumo de proteiacutena por parte del P cubensis en medio sumergido utilizando diferentes concentraciones de sacarosa como
fuente de carbono
El graacutefico 17 ilustra el consumo casi en su totalidad de la proteiacutena para cada uno
de los tratamientos El ensayo que mayor consumo de proteiacutena presentoacute fue el
que conteniacutea 30 gL de sacarosa exponiendo un porcentaje de consumo del 89
mientras que las concentraciones de 50 gL y 70 gL de sacarosa arrojaron
porcentajes de consumo del 86 y 57 respectivamente
Ahora bien al analizar el crecimiento del P cubensis con respecto al consumo de
proteiacutena se evidencia claramente que el consumo disminuyoacute permanentemente
72
en el tiempo mientras el hongo se encontraban en estado exponencial indicando
el intereacutes del P cubensis por la proteiacutena siendo eacutesta utilizada por el mismo para
aumentar su tamantildeo y biomasa
Durante los diacuteas 4 y 10 las fermentaciones que conteniacutean concentraciones de 30
gL y 70 gL de sacarosa presentaron un alto consumo de proteiacutena a pesar de
que el P cubensis se encontraba en estos dos ensayos en fase estacionaria fase
en la cual no se requiere consumir grandes cantidades de sustrato puesto que el
hongo soacutelo necesitaba alimentarse para mantenerse o para producir productos no
ligados al crecimiento maacutes no para cambiar la cantidad de biomasa presente en el
medio Asimismo la concentracioacuten de 50 gL de sacarosa tambieacuten presentoacute un
alto consumo de proteiacutena durante los diacuteas 4 y 8 en donde se creiacutea estar en una
fase estacionaria temprana lo dicho anteriormente reitera una vez maacutes la afinidad
que el P cubensis presentoacute con respecto a las fuentes de proteiacutena usadas
333 Comparacioacuten entre el consumo de proteiacutena de P cubensis en los
cultivos sumergidos con diferentes fuentes de carbono
Con el fin de conocer cuaacutel de los dos tipos de sustrato empleado fue mayormente
consumido se realizoacute un anaacutelisis estadiacutestico
En el graacutefico 18 se ilustran las medias de consumo de proteiacutena (concentracioacuten)
arrojadas mediante el anaacutelisis estadiacutestico sobre el consumo de proteiacutena cuando se
utilizoacute glucosa o sacarosa en el medio y se evidencia que existen diferencias
significativas en cuanto a la concentracioacuten de proteiacutena en el tiempo en el medio
cuando se realizoacute el experimento con glucosa y cuando se utilizoacute sacarosa
arrojando asiacute dos grupos homogeacuteneos el primero (a) presenta una media de 465
gL mientras que el grupo dos (b) arroja un valor de media de 609 gL indicando
un menor consumo de proteiacutena por parte del P cubensis en el medio sumergido
73
de Fang-Zhong cuando se utilizoacute sacarosa como principal fuente de carbono
(Anexo 7)
Tratamientos de las dos fuentes de carbono usadas sin FA (glucosa y sacarosa)
Media glucosa (a) 465
Media sacarosa (b) 609
a
b
0
1
2
3
4
5
6
7
8
Conc
entr
acioacute
n pr
oteiacute
na (g
L)
Letras diferentes denotan diferencias significativas (prueba LSD)
Graacutefico 18 Consumo de proteiacutena para cada una de las fuentes de carbono utilizadas
334 Consumo de proteiacutena por P cubensis en medio sumergido utilizando
glucosa y FA en el medio
Una vez se obtuvo la concentracioacuten de proteiacutena en el medio para cada
concentracioacuten de FA utilizada se precedioacute a graficar dichos valores con respecto
al tiempo los cuales se ilustran en el graacutefico 19 ademaacutes se muestran en dicho
graacutefico las cineacuteticas de crecimiento de biomasa para cada ensayo
74
0
02
04
06
08
1
12
0
2
4
6
8
10
12
14
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Bio
mas
a (g
L)
Pro
teiacuten
a (g
L)
Tiempo (diacuteas)
05 gL 1 gL 15 gL 05 gL 1 gL 15 gL
Graacutefico 19 Cineacutetica de consumo de proteiacutena por parte del P cubensis en medio sumergido utilizando 50 gL de glucosa como fuente de carbono y
diferentes concentraciones de FA
De igual forma que para la fermentacioacuten que teniacutea 50 gL de glucosa en el medio
realizada anteriormente para dichos ensayos el consumo de proteiacutena fue
permanente y se dio casi en su totalidad El ensayo que mayor consumo de
proteiacutena presentoacute fue el que conteniacutea 05 gL de FA arrojando un porcentaje de
consumo del 86 aun asiacute el porcentaje de consumo arrojado por la fermentacioacuten
de 1 gL de FA fue del 84 indicando que no existen diferencias con respecto al
consumo de proteiacutena entre dichas cantidades de FA utilizadas Mientras que el
porcentaje de consumo para 15 gL de FA fue inferior presentando un valor del
72 De acuerdo a los resultados mencionados anteriormente se puede decir que
a mayor concentracioacuten de FA en el medio se presenta menor consumo de
proteiacutena por parte del P cubensis esto se puede afirmar uacutenicamente para los
resultados obtenidos durante esta investigacioacuten a ciertas condiciones
Analizando ahora la relacioacuten entre el consumo de proteiacutena y el crecimiento
micelial se puede ver que al igual que para los ensayos con glucosa a 50 gL se
75
tiene un consumo permanente mientras se estaacute en fase exponencial y una vez se
llega a la fase estacionario alrededor del diacutea 12 la concentracioacuten de proteiacutena en
el medio se estabilizoacute
A la hora de indagar los datos estadiacutesticamente se puede observar que no existen
diferencias significativas sobre el consumo de proteiacutena (concentracioacuten) en el
tiempo con respecto al tipo de sustrato pero al comparar los resultados con los
ensayos donde se antildeadioacute FA al medio se encontroacute que siacute existen diferencias
significativas Se crearon dos grupos homogeacuteneos el primero cuenta con glucosa
y sacarosa presentando medias (cantidad de proteiacutena en el medio) de 468 gL y
473 gL respectivamente mientras que el ensayo con FA se encuentra en otro
grupo en donde su consumo de proteiacutena fue menor presentando una media
(cantidad de proteiacutena en el medio) de 614 gL (Anexo 8)
Tratamientos con y sin FA
Media glucosa (a) 468
Media sacarosa Proteiacutena (a) 473
Media fenilalanina (b) 614
a a
b
0
1
2
3
4
5
6
7
8
Co
nce
ntr
acioacute
n p
rote
iacutena
(gL
)
Letras diferentes denotan diferencias significativas (prueba LSD)
Graacutefico 20 Consumo de proteiacutena para los ensayos con y sin FA
76
34 ESTUDIO CUALITATIVO DE LA PRESENCIA DEL ALCALOIDE
Posterior a las fermentaciones de glucosa sacarosa y glucosa 50 gL con FA y
los respectivos anaacutelisis se realizoacute un uacuteltimo anaacutelisis que a la vez fue el de mayor
relevancia a la hora de determinar cuaacutel de los medios fue el que mejores
resultados arrojoacute En primera instancia se utilizoacute el reactivo de Dragendorff como
indicador de alcaloide para analizar las muestras de los diacuteas 12 13 y 14 con el fin
de esclarecer la presencia de alcaloides (Anexo 17)
Una vez detectada la presencia de alcaloides gracias a la coloracioacuten naranja
presentada en las muestras se procedioacute a realizar la teacutecnica de HPLC con el fin
de hallar un porcentaje del compuesto de intereacutes basado en las aacutereas obtenidas
de los cromatogramas (asumiendo un tiempo de retencioacuten entre 62 y 72
minutos)
341 Produccioacuten de compuestos producidos por P cubensis cuando el
medio no conteniacutea FA
A la hora de analizar y confirmar cuaacutel fue el mejor ensayo de los experimentos
realizados se tuvo como criterio base determinar la fuente de carbono y su
respectiva concentracioacuten que mejor presencia del compuesto de intereacutes arrojoacute
supuesto a un tiempo de retencioacuten entre 62 y 72 minutos
Inicialmente al obtener los anaacutelisis estadiacutesticos se deduce que no existieron
diferencias significativas entre el aacuterea del pico de intereacutes con respecto a todos los
picos arrojados por el cromatograma y los factores estudiados (tipo de sustrato
diacutea de fermentacioacuten y concentracioacuten) puesto que se obtuvieron valores de P-valor
77
de 03310 09580 y 08336 respectivamente es decir no importa queacute tipo de
sustrato se utilice la produccioacuten de alcaloide no tendraacute variaciones (Anexo 9)
Al analizar el graacutefico 21 se puede observar que las medias de las aacutereas halladas
para los diferentes ensayos con glucosa y sacarosa no presentaron diferencias
significativas es decir pertenecen al mismo grupo homogeacuteneo (a) lo que ratifica
lo dicho anteriormente
Tratamiento de las dos fuentes de carbono usadas sin FA (glucosa y sacarosa)
Media glucosa (a) 235916
Media sacarosa (a) 337147
a
a
0
7000
14000
21000
28000
35000
42000
Aacutere
a de
Com
pues
to
Letras diferentes denotan diferencias significativas (prueba LSD)
Graacutefico 21 Aacuterea del compuesto obtenido de P cubensis en tiempo de retencioacuten entre 62 y 72 minutos para las dos fuentes de carbono
Por tal razoacuten fue necesario hacer un anaacutelisis cualitativo de los cromatogramas
obtenidos mediante HPLC el cual se basoacute en la forma del pico arrojado por la
teacutecnica La figura 6 ilustra dicho anaacutelisis
78
Buena resolucioacuten de pico Mala resolucioacuten de pico
(a) (b)
Figura 6 Cromatogramas de dos diferentes fermentaciones de P cubensis que ilustran el criterio de escogencia del mejor ensayo realizado (a) 50 gL
glucosa (b) 50 gL sacarosa
Primero fue necesario observar el tamantildeo del pico y posterior a eacutesto determinar
su resolucioacuten La figura 6 ilustra dos ejemplos el de 50 gL de glucosa el diacutea 13 y
50 gL de sacarosa el diacutea 14 mientras el primero muestra un pico grande y
definido la segunda fermentacioacuten ilustra un pico grande pero poco definido
indicando que en este caso no se resolvioacute correctamente el alcaloide es decir no
se logroacute una buena separacioacuten De esta manera se analizaron los diferentes
cromatogramas para los diacuteas 12 (Anexo 19) 13 (Anexo 20) y 14 (Anexo 21) de
cada fermentacioacuten arrojando diferencias entre los ensayos y llevando a la
conclusioacuten de que la fermentacioacuten que mejores resultados arrojoacute fue la que
conteniacutea 50 gL de glucosa
79
342 Produccioacuten de compuestos producidos por P cubensis cuando el
medio conteniacutea FA
Despueacutes de realizada la fermentacioacuten con glucosa 50 gL y concentraciones de
FA de 05 gL 10 gL y 15 gL se procedioacute de igual manera que en el estudio sin
FA a evaluar cuaacutel de estas tres concentraciones de FA exhibioacute mejor resolucioacuten
del alcaloide
Inicialmente se realizoacute un anaacutelisis estadiacutestico el cual arrojoacute que no existen
diferencias significativas con respecto al aacuterea de pico que en este caso debido al
supuesto representa la Psilocibina y los diacuteas 12 13 y 14 de la fermentacioacuten
Mediante el graacutefico 22 se puede decir que en los uacuteltimos tres diacuteas de las
fermentaciones que conteniacutean FA en el medio no existen diferencias significativas
con respecto al alcaloide de intereacutes obtenido es decir en los tres se produjo el
alcaloide (Anexo 10)
Tratamientos de los uacuteltimos tres diacuteas de fermentacioacuten usando FA
Media diacutea 12 (a) 411758
Media diacutea 13 (a) 413401
Media diacutea 14 (a) 44860
a a a
0
10000
20000
30000
40000
50000
Aacutere
a Co
mpu
esto
Letras diferentes denotan diferencias significativas
Graacutefico 22 Aacuterea del compuesto obtenido de P cubensis en tiempo de retencioacuten entre 62 y 72 minutos en los uacuteltimos tres diacuteas de la fermentacioacuten
con FA y glucosa
80
Igual que en numeral anterior fue necesario realizar anaacutelisis cualitativo para los
cromatogramas por ende se requirioacute observar el tamantildeo del pico y posterior a
eacutesto determinar su resolucioacuten
Buena resolucioacuten de pico Mala resolucioacuten de pico
(a) (b)
Figura 7 Cromatogramas de dos diferentes fermentaciones de P cubensis que ilustran el criterio de escogencia del mejor ensayo realizado (a) 05 gL
FA (b) 15 gL FA
La figura 7 ejemplifica el anaacutelisis realizado para la seleccioacuten del mejor ensayo
ejecutado Se tienen dos cromatogramas el de 05 gL de FA en el diacutea 13 y el de
15 gL de FA para el mismo diacutea
A todos los cromatogramas obtenidos para los diacuteas 12 (Anexo 19) 13 (Anexo 20)
y 14 (Anexo 21) se realizoacute el mismo anaacutelisis y se concluyoacute que la concentracioacuten
maacutes apropiada para la obtencioacuten de la los compuestos producidos por P cubensis
fue de 05 gL de FA debido a que eacuteste generariacutea una disminucioacuten en los costos
81
35 ESTUDIO PORCENTUAL (AacuteREA) DEL ALCALOIDE REALIZADO PARA
LOS DIFERENTES ENSAYOS
Se calculoacute el porcentaje de aacuterea correspondiente al pico que identificoacute que se
asumioacute como el correspondiente a la Psilocibina gracias a la suposicioacuten realizada
del tiempo de retencioacuten
A continuacioacuten se presentan los valores obtenidos y sus respectivos anaacutelisis para
cada tratamiento
351 Porcentaje de la Psilocibina (suposicioacuten) cuando el medio no conteniacutea
FA
Debido a que no se contaba con un estaacutendar de Psilocibina los resultados
mostrados en la tabla 5 se obtuvieron realizando un porcentaje con respecto a las
aacutereas bajo la curva arrojadas mediante el anaacutelisis de cromatografiacutea de alta
eficiencia (Anexos 19 20 y 21) En dichos anexos se encuentran resaltadas en
negrilla aquellas aeacutereas utilizadas
Tabla 5 Porcentaje de aacuterea hallado mediante HPLC para los uacuteltimos tres diacuteas de la fermentacioacuten con concentraciones de 30 gL 50 gL y 70 gL de glucosa
y sacarosa con un tiempo de retencioacuten de 62 y 72 minutos
Diacutea Glucosa
(gL)
Aacuterea
(compuesto
Tr= 62-72)
Sacarosa
(gL)
Aacuterea
(compuesto
Tr= 62-72)
12 30 60650 30 3664
12 50 7396 50 5857
12 70 4816 70 3415
13 30 702 30 2876
13 50 6815 50 4113
13 70 6733 70 5583
14 30 4824 30 2756
14 50 4821 50 2792
14 70 017 70 1429
82
A la hora de analizar los datos de la tabla 5 se puede observar que el mayor
porcentaje de aacuterea se obtuvo cuando se trabajoacute con glucosa como fuente de
carbono y concretamente a una concentracioacuten de 50 gL
Analizando los datos estadiacutesticamente no se obtuvieron diferencias significativas
en cuanto a la produccioacuten del compuesto (aacuterea) con respecto al tipo de sustrato
utilizado durante las fermentaciones es decir es indiferente si se utiliza glucosa o
sacarosa en el cultivo de P cubensis en medio sumergido de Fang-Zhong
El graacutefico 23 ilustra las medias (aacuterea) obtenidas para la produccioacuten de alcaloide en
las dos diferentes fuentes de carbono es decir glucosa y sacarosa exponiendo
un uacutenico grupo homogeacuteneo con medias (produccioacuten de alcaloide) de aacutereas de
219635 y 234391 para glucosa y sacarosa respectivamente (Anexo 11)
Tratamientos de las dos fuentes de carbono usadas sin FA (glucosa y sacarosa)
Media glucosa (a) 219635
Media sacarosa (a) 234391
a
a
2000
2100
2200
2300
2400
Aacuterea
Com
pues
to
Letras diferentes denotan diferencias significativas (prueba LSD)
Graacutefico 23 Aacuterea del compuesto obtenido de P cubensis en tiempo de retencioacuten entre 62 y 72 minutos para cada una de las fuentes de carbono
utilizadas
Aun asiacute estudiando los graacuteficos de HPLC con el criterio mencionado
anteriormente es decir observando el tamantildeo del pico y su resolucioacuten del mismo
83
se observoacute claramente que la presencia del alcaloide (tiempo de retencioacuten
supuesto entre 62 y 72 minutos) fue mejor cuando se trabajoacute con glucosa a una
concentracioacuten de 50 gL debido que presenta el mejor pico
352 Porcentaje de aacuterea de compuestos presentes en P cubensis cuando
el medio conteniacutea FA
Con el fin de observar si la adicioacuten de FA al medio si arrojoacute mejores resultados en
cuanto a la produccioacuten del compuesto presente entre un rango de 62 y 72
minutos como tiempo de retencioacuten se procedioacute a calcular el porcentaje del aacuterea
de intereacutes de acuerdo a las aacutereas arrojadas para cada ensayo por medio del
anaacutelisis de HPLC Los datos obtenidos se ilustran a continuacioacuten en la tabla 6
Tabla 6 Porcentaje hallado mediante HPLC para los uacuteltimos tres diacuteas de la fermentacioacuten con concentraciones de 05 gL 10 gL y 15 gL de FA y 50 gL
de glucosa con un tiempo de retencioacuten entre 62 y 72 minutos
Diacutea
Glucosa
50 gL +
FA
Aacuterea
(compuesto
Tr=62-72)
12 0 4315
12 05 2931
12 1 6236
12 15 847
13 0 3257
13 05 7549
13 1 4790
13 15 2721
14 0 4822
14 05 3863
14 1 5801
14 15 2102
84
Al detallar la tabla 6 puede observarse que el ensayo que mayor porcentaje de
aacuterea arrojoacute fue el que conteniacutea 05 gL de FA arrojando su maacuteximo porcentaje
correspondiente a 755 el diacutea 13 Aun asiacute las diferencias existentes entre ellos
no fueron significativas
Ahora bien al analizarlos estadiacutesticamente se encontroacute que la produccioacuten del
alcaloide en presencia de FA presentoacute la misma tendencia que los ensayos
analizados anteriormente sin eacutesta pero gracias a que este aminoaacutecido duplico la
cantidad de biomasa y debido a que el compuesto de intereacutes se produce
intracelularmente se afirma que el uso de FA aumentoacute la generacioacuten del
compuesto evaluado (Anexo 12)
El graacutefico 24 presenta las diferentes medias en cuanto al porcentaje de aacuterea del
compuesto presente entre 62 y 72 minutos para los diferentes tratamientos de
glucosa a una concentracioacuten de 50 gL y sus concentraciones respectivas de FA
Claramente se ve que soacutelo existe un grupo homogeacuteneo lo que reafirma que no
existen diferencias significativas de la produccioacuten con respecto a las
concentraciones de FA
85
Tratamientos con y sin FA
Media 0 gL FA (a) 3122
Media 05 gL FA (a) 2391
Media 10 gL FA (a) 2823
Media 15 gL FA (a) 2113
a
aa
a
0
5
10
15
20
25
30
35
40
Aacutere
a Co
mpu
esto
Letras diferentes denotan diferencias significativas (prueba LSD)
Graacutefico 24 Aacuterea del compuesto obtenido de P cubensis en tiempo de retencioacuten entre 62 y 72 minutos para cada una de las concentraciones de
FA utilizadas
Debido a que no se encontraron diferencias significativas en cuanto al porcentaje
de aacuterea obtenido mediante los cromatogramas se concluye que el mejor medio es
el que tiene como fuente de carbono glucosa a una concentracioacuten de 50 gL y una
adicioacuten de 05 gL de FA puesto que genera una disminucioacuten en costos
86
CONCLUSIONES
No existen diferencias significativas en el crecimiento micelial de P
cubensis en medio sumergido Fang-Zhong cuando se trabaja con fuentes
de carbono glucosa y sacarosa sin embargo se decide trabajar con 50 gL
de glucosa puesto que eacuteste tiene una buena presencia de alcaloide y a su
vez una mejor produccioacuten de biomasa
La concentracioacuten de glucosa utilizada para el crecimiento de P cubensis
influye en el crecimiento micelial obteniendo concentraciones de biomasa
de 062 gL 055 gL y 048 gL para concentraciones de sustrato de 70 50
y 30 gL de glucosa siendo las dos primeras significativamente diferentes
con respecto a la de 30 gL
La concentracioacuten de sacarosa utilizada para el crecimiento de P cubensis
influye en el crecimiento micelial obteniendo concentraciones de biomasa
de 057 gL 045 gL y 026 gL para concentraciones de sustrato de 70 50
y 30 gL de sacarosa siendo significativamente diferentes entre ellas
La resolucioacuten de los picos obtenidos por RP-HPLC del extracto de P
cubensis fue mayor para las fermentaciones realizadas con una
concentracioacuten de 50 gL de glucosa lo que conllevoacute a utilizarlo al realizar
los ensayos que conteniacutean en el medio FA
La concentracioacuten de biomasa de P cubensis obtenida en cultivo sumergido
en medio Fang-Zhong con glucosa se duplicoacute con la adicioacuten de FA No
obstante no existen diferencias significativas entre las concentraciones de
FA utilizadas
87
El consumo de proteiacutena presentada por P cubensis en medio Fang-Zhong
fue casi del 100 mientras que el consumo de sustrato para el mismo
medio estuvo alrededor del 40
El consumo de sustrato durante el transcurso de las fermentaciones que no
conteniacutean FA en el medio no presentoacute diferencias significativas con
respecto a las dos fuentes de carbono utilizadas Mientras que en aquellas
fermentaciones donde se agregoacute FA al medio siacute existieron diferencias
significativas entre las fermentaciones de 15 y 1 gL de FA con respecto a
los ensayos realizados con 05 gL FA Sin embargo el P cubensis
consumioacute mayor cantidad de sustrato cuando el medio no conteniacutea FA
Se evidencioacute que el P cubensis consumioacute mayor cantidad de proteiacutena
cuando el sustrato utilizado en el medio fue glucosa y a su vez se detecto
que la adicioacuten de FA al medio tuvo como efecto la disminucioacuten en el
consumo de sustrato por parte del microorganismo
El consumo de sustrato y de proteiacutena tuvo un comportamiento similar
puesto que fue consumido permanentemente durante la fase exponencial
para cada uno de los tratamientos realizados es decir las concentraciones
de 30 gL 50 gL y 70 gL de glucosa y sacarosa como fuente de carbono y
de 05 gL 1 gL y 15 gL de FA teniendo como fuente de carbono glucosa
a una concentracioacuten de 50 gL mientras que en la fase estacionaria su
consumo se disminuyoacute permaneciendo casi constante
Despueacutes de realizados los estudios en cuanto a la produccioacuten del
compuesto presente entre 62 y 72 minutos para cada uno de los ensayos
no se evidenciaron diferencias significativas entre las dos fuentes de
carbono utilizadas (glucosa y sacarosa)
88
La adicioacuten del precursor llamado Fenilalanina (FA) al medio sumergido
Fang-Zhong para llevar a cabo el cultivo del P cubensis tuvo influencia en
cuanto a la produccioacuten de compuesto presente entre tiempo de retencioacuten de
62 y 72 minutos debido a que eacuteste duplicoacute la concentracioacuten de biomasa
en el medio se dice entonces que la produccioacuten aumentoacute al ser eacuteste de
produccioacuten intracelular
La resolucioacuten del compuesto presente entre el tiempo de retencioacuten de 62 a
72 minutos se obtuvo mejor en el ensayo que conteniacutea 05 gL de FA y al
saber que no existieron diferencias significativas en la produccioacuten en cuanto
al porcentaje de aacutereas obtenido con respecto a las demaacutes concentraciones
de FA se afirma que eacuteste es el medio que mejores resultados arrojoacute para
el crecimiento de P cubensis y la produccioacuten de Psilocibina
89
RECOMENDACIONES
Se sugiere observar el efecto que tiene la variacioacuten de las revoluciones a
las cuales se realizaron las fermentaciones para ver como variacutea el
crecimiento del P cubensis en medio sumergido Fang-Zhong con respecto
a dicho factor
Debido a que soacutelo se realizaron anaacutelisis sobre el crecimiento del P
cubensis en medio sumergido haciendo uso de dos sustratos diferentes
(glucosa y sacarosa) seriacutea recomendable realizar el mismo anaacutelisis para
otro tipo de sustrato como por ejemplo melaza por su bajo costo
Del mismo modo seriacutea apropiado realizar el estudio con otro tipo de
precursor y en otras concentraciones para ver la incidencia de eacuteste en el
comportamiento del hongo
Se recomienda realizar un escalamiento de dicho proceso en un biorreactor
con el fin de evaluar a mayor escala el crecimiento del P cubensis y la
produccioacuten del alcaloide
Debido a que la proteiacutena se comportoacute como el principal nutriente se sugiere
para una proacutexima investigacioacuten evaluar diferentes concentraciones de
proteiacutena en el medio
90
ANEXOS
Anexo 1 Anaacutelisis de varianza (ANOVA) para el crecimiento de biomasa de
las fermentaciones con glucosa
Tabla 7 Anaacutelisis de Varianza para el crecimiento micelial (glucosa)
Tabla 8 Anaacutelisis Muacuteltiple de Rangos para el crecimiento micelial (glucosa)
91
Anexo 2 Anaacutelisis de Varianza (ANOVA) para el crecimiento de biomasa de
las fermentaciones con sacarosa
Tabla 9 Anaacutelisis de Varianza para el crecimiento micelial (sacarosa)
Tabla 10 Anaacutelisis Muacuteltiple de Rangos para el crecimiento micelial (sacarosa)
92
Anexo 3 Anaacutelisis de Varianza (ANOVA) para el crecimiento de biomasa de
las fermentaciones con glucosa y sacarosa
Tabla 11 Anaacutelisis de Varianza para el crecimiento micelial (glucosa y
sacarosa)
Tabla 12 Anaacutelisis Muacuteltiple de Rangos para el crecimiento micelial (glucosa y
sacarosa)
93
Anexo 4 Anaacutelisis de Varianza (ANOVA) para el crecimiento de biomasa de
las fermentaciones con glucosa 50 gL y FA
Tabla 13 Anaacutelisis de Varianza para el crecimiento micelial (glucosa 50 gL y
FA)
Tabla 14 Anaacutelisis Muacuteltiple de Rangos para el crecimiento micelial (glucosa
50 gL y FA)
94
Anexo 5 Anaacutelisis de varianza (ANOVA) para el consumo de sustrato en las
fermentaciones sin FA
Tabla 15 Anaacutelisis de Varianza para el consumo de Sustrato sin FA
Tabla 16 Anaacutelisis Muacuteltiple de Rangos para el consumo de Sustrato sin FA
95
Anexo 6 Anaacutelisis de Varianza (ANOVA) para el consumo de sustrato en las
fermentaciones con FA
Tabla 17 Anaacutelisis de Varianza para el consumo de Sustrato con FA
Tabla 18 Anaacutelisis Muacuteltiple de Rangos para el consumo de Sustrato con FA
96
Anexo 7 Anaacutelisis de Varianza (ANOVA) para el consumo de proteiacutena en las
fermentaciones sin FA
Tabla 19 Anaacutelisis de Varianza para el consumo de Proteiacutena sin FA
Tabla 20 Anaacutelisis Muacuteltiple de Rangos para el consumo de Proteiacutena sin FA
97
Anexo 8 Anaacutelisis de Varianza (ANOVA) para el consumo de proteiacutena en las
fermentaciones con FA
Tabla 21Anaacutelisis de Varianza para el consumo de Proteiacutena con FA
Tabla 22 Anaacutelisis Muacuteltiple de Rangos para el consumo de Proteiacutena con FA
98
Anexo 9 Anaacutelisis de Varianza (ANOVA) para la produccioacuten de Psilocibina en
las fermentaciones sin FA
Tabla 23 Anaacutelisis de Varianza para la produccioacuten de Psilocibina sin FA
Tabla 24 Anaacutelisis Muacuteltiple de Rangos para la produccioacuten de Psilocibina
seguacuten el Sustrato sin FA
99
Anexo 10 Anaacutelisis de Varianza (ANOVA) para la produccioacuten de Psilocibina en las fermentaciones con FA
Tabla 25 Anaacutelisis de Varianza para la produccioacuten de Psilocibina con FA
Tabla 26 Anaacutelisis Muacuteltiple de Rangos para la produccioacuten de Psilocibina
seguacuten el diacutea con FA
100
Anexo 11 Anaacutelisis de Varianza (ANOVA) para la cuantificacioacuten porcentual de
Psilocibina en las fermentaciones sin FA
Tabla 27 Anaacutelisis de Varianza para la cuantificacioacuten de Psilocibina sin FA
Tabla 28 Anaacutelisis Muacuteltiple de Rangos para la cuantificacioacuten de Psilocibina
seguacuten el tipo de sustrato sin FA
101
Anexo 12 Anaacutelisis de Varianza (ANOVA) para la cuantificacioacuten porcentual de
Psilocibina en las fermentaciones con FA
Tabla 29 Anaacutelisis de Varianza para la cuantificacioacuten de Psilocibina con FA
Tabla 30 Anaacutelisis Muacuteltiple de Rangos para la cuantificacioacuten de Psilocibina
seguacuten la concentracioacuten con FA
102
Anexo 13 Determinacioacuten de consumo de azuacutecares por el meacutetodo de DNS
(Aacutecido Dinitrosaliciacutelico)
a DNS para glucosa
Pasos para preparar DNS
Disolver 16 gr de NaOH en agua destilada
Adicionar 30 gr de tartrato de Na y K
Aforar a 100 ml con agua destilada
Almacenar en frascos aacutembar a 4degC
Se debe mantener un stock de glucosa 4mgml y almacenarlo a 4degC A partir
de la solucioacuten de glucosa se preparan las soluciones para hacer la curva
patroacuten con las siguientes concentraciones (gL) 025 050 100 200 y 400
Procedimiento
Tomar 05 ml de cada dilucioacuten y agregar 05 ml de reactivo DNS
Preparar una muestra blanco por dilucioacuten de 05 ml de agua destilada a 05
ml de reactivo de DNS
Agitar todas las muestras
Colocar a ebullir las muestras en bantildeo mariacutea por cinco minutos
Enfriar con hielo
Adicionar 5 ml de agua destilada
Agitar y dejar en reposo 15 minutos
Leer en espectrofotoacutemetro a 540 nm
Realizar la curva Absorbancia Vs Concentracioacuten Debe tener un coeficiente
de correlacioacuten de 0991 a 0999
b DNS para sacarosa
Pasos para preparar DNS sacarosa
Preparacioacuten de la solucioacuten Standard stock de sacarosa (30 gL) tomar 30
gr de sacarosa anhiacutedrida grado reactivo con exactitud hasta la deacutecima de
mg disolver ajustar a aforo de 100 ml con agua desionizada empacar en
viales y almacenar en congelador
Preparacioacuten DNS pesar 16 gr de hidroacutexido de sodio grado reactivo 30 gr
de tartrato de sodio y potasio y disolverlos juntos con 50 ml de agua
103
desionizada aparte pesar 10 gr del DNS disolver con 30 ml de agua
desionizada agregar lentamente y con agitacioacuten la solucioacuten del DNS a la
solucioacuten de tartrato y NaOH anteriormente preparadas ajustar a 100 ml
filtrar envasar en frasco aacutembar y rotular con fecha de vencimiento incluida
(3 meses maacuteximo) mantener a la temperatura del laboratorio
Preparacioacuten del reactivo NaOH 10 N (500 ml) pesar con exactitud hasta
la deacutecima de mg 20 gr de NaOH grado reactivo por cada 500 ml de
solucioacuten disolver primero con 300 ml de agua desionizada y luego aforar a
500 ml envasar y rotular correctamente y mantener a la temperatura del
laboratorio
Preparacioacuten de HCL 10 (100 ml) tomar 27 ml de aacutecido clorhiacutedrico al
37 grado reactivo y aforar hasta 100 ml con agua desionizada envasar
rotular correctamente de acuerdo a la norma del laboratorio y almacenar a
la temperatura del laboratorio
Se debe mantener un stock de glucosa 30 gL y almacenarlo a 4degC A partir
de la solucioacuten de glucosa se preparan las soluciones para hacer la curva
patroacuten con las siguientes concentraciones (gL) 3 6 12 18 24 y 30
Procedimiento
Preparar en cada tubo (las soluciones de la curva patroacuten de sacarosa las
muestras problemas diluidas si es necesario y como blanco agua
desionizada) 100microl de solucioacuten
Adicionar 200 microl de HCL 10 a cada tubo y agitar todos los tubos en vortex
Llevar a ebullicioacuten por 10 minutos en bantildeo mariacutea precalentado a 95degC
Enfriar hasta temperatura ambiente raacutepidamente
Adicionar a cada tubo 1 ml de NaOH 10 N y agitar los tubos en vortex
Aparte tomar 05 ml de cada tubo en otros tubos rotulados y agregar 05 ml
del DNS
Agitar todas las muestras en vortex
Llevar a ebullicioacuten por 5 minutos en bantildeo mariacutea precalentado a 96degC
Enfriar hasta temperatura ambiente raacutepidamente
Adicionar 5 ml de H2O desionizada agitar en vortex y dejar reposar por 15
minutos
Leer en espectrofotoacutemetro a 540 nm
Realizar la curva Absorbancia Vs Concentracioacuten Debe tener un coeficiente
de correlacioacuten de 0991 a 0999
104
Anexo 14 Cineacutetica de Consumo de Sustrato
La cineacutetica de consumo de sustrato se realizoacute por el meacutetodo de Aacutecido
Dinitrosaliciacutelico (DNS) Los rangos de concentracioacuten y absorbancia para cada caso
se citan a continuacioacuten
Rangos de concentraciones y absorbancias para las fermentaciones que
usaron glucosa (30 gL 50 gL y 70 gL) como sustrato
Concentracioacuten de 02 a 12 gL
Absorbancia de 01234 a 06612
Ecuacioacuten Y = 19174x -00517 R2 = 09923
Rangos de concentraciones y absorbancias para las fermentaciones que
usaron sacarosa (30 gL 50 gL y 70 gL) como sustrato
Concentracioacuten de 3 a 30 gL
Absorbancia de 00822 a 11112
Ecuacioacuten Y = 25983x + 04857 R2 = 09978
Rangos de concentraciones y absorbancias para las fermentaciones que
usaron glucosa 50 gL como sustrato y FA
Concentracioacuten de 02 a 12 gL
Absorbancia de 0097 a 063
Ecuacioacuten Y = 18785x + 00019 R2 = 09986
105
Anexo 15 Determinacioacuten de consumo de proteiacutenas por el meacutetodo de LOWRY
Pasos para la preparacioacuten de LOWRY
Para obtener la curva estaacutendar de Albuacutemina se preparan 5 soluciones
patrones de Albuacutemina en NaCL al 09 (PV) de las siguientes
concentraciones 152 80 200 300 400 Pgml Si la concentracioacuten de
Proteiacutena total es menor de 500 Pgml se lee la absorbancia a 750 nm si
estaacute entre 1000 y 2000 Pgml se lee a 550nm
Se prepara un blanco que no lleva Albuacutemina y en su reemplazo se adiciona
0-5 ml de solucioacuten salina (NaCL) al 09 (PV) Se aplica el mismo
procedimiento que a las demaacutes muestras
Procedimiento
Servir en tubos de ensayo 05 ml de las soluciones patroacuten de Albuacutemina las
muestras problema y NaCL al 09 como blanco Deben estar marcados
para conservar el orden de concentraciones para la curva
Adicionar a cada tubo 05 ml de NaOH 2N y llevar al bantildeo Mariacutea
precalentado a 100degC por un tiempo de 10 minutos
Dejar enfriar hasta que alcance la Temperatura Ambiente
Agregar a cada tubo 5 ml de la solucioacuten complejante mezclar y dejar
reposar por 10 minutos
Adicionar 05 ml del reactivo de Folin-Ciocalteu 11 vortexiar durante 20
segundos
Reposar en un cuarto oscuro durante 30 minutos
Leer la absorbancia a 750 nm y con las soluciones patroacuten construir la
graacutefica Absorbancia Vs Concentracioacuten de Albuacutemina Seacuterica de Bovina
(BSA) con eacutesta se puede determinar la concentracioacuten de las muestras
problema interpolando el valor de la Absorbancia La curva estaacutendar debe
tener un coeficiente de correlacioacuten de 0991 a 0999
106
Anexo 16 Cineacutetica consumo de Proteiacutena
La cineacutetica de consumo de proteiacutena se realizoacute por el meacutetodo LOWRY Los rangos
de concentracioacuten y absorbancia para cada caso se citan a continuacioacuten
Rangos de concentraciones y absorbancias para las fermentaciones que
usaron glucosa (30 gL 50 gL y 70 gL) como sustrato
Concentracioacuten de 0016 a 04 gL
Absorbancia de 00094 a 05382
Ecuacioacuten Y = 07427x ndash 00021 R2 = 09955
Rangos de concentraciones y absorbancias para las fermentaciones que
usaron sacarosa (30 gL 50 gL y 70 gL) como sustrato
Concentracioacuten de 0016 a 04 gL
Absorbancia de 00374 a 06178
Ecuacioacuten Y = 06567x ndash 00166 R2 = 09968
Rangos de concentraciones y absorbancias para las fermentaciones que
usaron glucosa 50 gL como sustrato y FA
Concentracioacuten de 0016 a 04 gL
Absorbancia de 00708 a 04647
Ecuacioacuten Y = 09814x ndash 00581 R2 = 09992
107
Anexo 17 Prueba de reactivo de Dragendorff
Preparacioacuten de reactivo de Dragendorff para alcaloides
Reactivo de Dragendorff se prepara mezclando 8 gr de nitrato de bismuto
pentahidratado en 20 ml de aacutecido niacutetrico al 30 con una solucioacuten de 272 g de
yoduro de potasio en 50 ml de agua Se deja en reposo por 24 horas se decanta y
se afora a 100 ml La presencia de alcaloides se detecta por la formacioacuten de un
precipitado naranja rojizo cuando se le adiciona esta reactivo a una solucioacuten aacutecida
de alcaloides De los precipitados lavados se puede recuperar los alcaloides con
una solucioacuten saturada de carbonato de sodio (Mercano y Hasegawa 1991)
La figura mostrada a continuacioacuten refleja la presencia del alcaloide debido a la
coloracioacuten amarillo-rojiza que eacutesta sufrioacute
Figura 8 Muestra de biomasa una vez analizada mediante el reactivo de Dragendorff
108
Anexo 18 Barrido Espectral para el Psilocybe cubensis
La metodologiacutea mencionada a continuacioacuten estaacute basada en artiacuteculo base
(Tsujikawa et al 2003)
El Sistema de HPLC consiste en un Shimadzu LC-10ordf Series Cromatografiacutea
Liacutequida equipada con un diodo SPD-M10A detector de red fija en 220nm La
separacioacuten cromatograacutefica ser realizoacute con una columna simeacutetrica C18 (21 mm a
150 mm 5mm Waters Assoc Milford EEUU
La fase moacutevil utilizada fue de 10 mm de formato de amonio-aacutecido foacutermico (955
VV) a un pH de 35 y bombeado a un caudal de 02 mlminuto
El perfil cromatograacutefico obtenido durante la investigacioacuten de Tsujikawa et al
(2003) se muestra en le figura 6 que aparece a continuacioacuten
Figura 9 Perfil cromatograacutefico (Tsujikawa et al 2003)
109
Anexo 19 Cromatogramas (HPLC) del diacutea 12 de fermentacioacuten
Tabla 31 Aacutereas obtenidas de los cromatogramas para el P cubensis en
medio Fang-Zhong en el diacutea 12 para concentraciones de 30gL glucosa y
30gL sacarosa
SustratoConcentracioacuten
(gL)
Tiempo
(s)Aacuterea
Glucosa 30 2957 3837
Glucosa 30 6838 474753
Glucosa 30 9144 47256
Glucosa 30 9489 16822
Glucosa 30 10124 224349
Sacarosa 30 6538 143772
Sacarosa 30 7234 269458
Sacarosa 30 9721 33646
Sacarosa 30 11845 24384
(a) (b)
Graacutefico 25 Cromatogramas del diacutea 12 para el P cubensis cultivado en medio
sumergido Fang-Zhong con dos diferentes tipos de sustratos (a) 30 gL
glucosa (b) 30 gL sacarosa
110
Tabla 32 Aacutereas obtenidas de los cromatogramas para el P cubensis en
medio Fang-Zhong en el diacutea 12 para concentraciones de 50gL glucosa y
50gL sacarosa
SustratoConcentracioacuten
(gL)
Tiempo
(s)Aacuterea
Glucosa 50 0524 319
Glucosa 50 6298 5991
Glucosa 50 7172 237042
Glucosa 50 9144 16387
Glucosa 50 10009 6077
Sacarosa 50 169 24011
Sacarosa 50 3105 28573
Sacarosa 50 6916 112166
Sacarosa 50 9136 4057
Sacarosa 50 9933 8821
Sacarosa 50 10398 13872
(a) (b)
Graacutefico 26 Cromatogramas del diacutea 12 para el P cubensis cultivado en medio
sumergido Fang-Zhong con dos diferentes tipos de sustratos (a) 50 gL
glucosa (b) 50 gL sacarosa
111
Tabla 33 Aacutereas obtenidas de los cromatogramas para el P cubensis en
medio Fang-Zhong en el diacutea 12 para concentraciones de 50gL glucosa y
50gL sacarosa
SustratoConcentracioacuten
(gL)
Tiempo
(s)Aacuterea
Glucosa 70 7217 168598
Glucosa 70 9145 9977
Glucosa 70 997 80558
Sacarosa 70 6803 287387
Sacarosa 70 7517 131049
Sacarosa 70 7775 4434
Sacarosa 70 7871 77109
Sacarosa 70 823 96239
Sacarosa 70 9039 5114
Sacarosa 70 9778 25394
(a) (b)
Graacutefico 27 Cromatogramas del diacutea 12 para el P cubensis cultivado en medio
sumergido Fang-Zhong con dos diferentes tipos de sustratos (a) 50 gL
glucosa (b) 50 gL sacarosa
112
Tabla 34 Aacutereas obtenidas de los cromatogramas para el P cubensis en
medio Fang-Zhong en el diacutea 12 para concentraciones de 50gL y glucosa
50gL sacarosa
SustratoConcentracioacuten
(gL)
Tiempo
(s)Aacuterea
Glucosa 50 05 0818 4722
Glucosa 50 05 2423 52579
Glucosa 50 05 3502 88765
Glucosa 50 05 6137 16009
Glucosa 50 05 6722 275258
Glucosa 50 05 733 226399
Glucosa 50 05 8339 65139
Glucosa 50 05 9101 36797
Glucosa 50 05 9815 130883
Glucosa 50 1 1105 743
Glucosa 50 1 2746 2701
Glucosa 50 1 4304 80304
Glucosa 50 1 6167 19649
Glucosa 50 1 6794 51753
Glucosa 50 1 8282 82997
Glucosa 50 1 9116 38659
Glucosa 50 1 9899 136953
Glucosa 50 15 1198 3313
Glucosa 50 15 2937 37875
Glucosa 50 15 4332 51079
Glucosa 50 15 614 25602
Glucosa 50 15 6737 668905
Glucosa 50 15 8209 107332
Glucosa 50 15 9602 38902
Glucosa 50 15 9752 139613
Diacutea 12
(a) (b)
(c)
Graacutefico 28 Cromatograma del diacutea 12 para el P cubensis cultivado en medio
sumergido Fang-Zhong con fuente de carbono glucosa y adicioacuten de
fenilalanina en tres concentraciones (a) 05 gL FA (b) 1 gL FA (c) 15gL
FA
113
Anexo 20 Cromatogramas (HPLC) del diacutea 13 de fermentacioacuten
Tabla 35 Aacutereas obtenidas de los cromatogramas para el P cubensis en
medio Fang-Zhong en el diacutea 13 para concentraciones de 30gL glucosa y
30gL sacarosa
SustratoConcentracioacuten
(gL)
Tiempo
(s)Aacuterea
Glucosa 30 0225 1155
Glucosa 30 2847 699
Glucosa 30 4043 1038
Glucosa 30 6231 4994
Glucosa 30 6787 295182
Glucosa 30 7462 241146
Glucosa 30 9066 51836
Glucosa 30 10004 158746
Sacarosa 30 1734 135
Sacarosa 30 5838 1857
Sacarosa 30 6803 147867
Sacarosa 30 7305 30464
Sacarosa 30 7599 174643
Sacarosa 30 9107 8564
Sacarosa 30 9897 104278
(a) (b)
Graacutefico 29 Cromatogramas del diacutea 13 para el P cubensis cultivado en medio
sumergido Fang-Zhong con dos diferentes tipos de sustratos (a) 30 gL
glucosa (b) 30 gL sacarosa
114
Tabla 36 Aacutereas obtenidas de los cromatogramas para el P cubensis en
medio Fang-Zhong en el diacutea 13 para concentraciones de 50gL glucosa y
50gL sacarosa
SustratoConcentracioacuten
(gL)
Tiempo
(s)Aacuterea
Glucosa 50 1408 13982
Glucosa 50 6949 331449
Glucosa 50 9012 25201
Glucosa 50 9936 27216
Sacarosa 50 1543 7293
Sacarosa 50 6813 437765
Sacarosa 50 9085 35897
Sacarosa 50 10049 184461
(a) (b)
Graacutefico 30 Cromatogramas del diacutea 13 para el P cubensis cultivado en medio
sumergido Fang-Zhong con dos diferentes tipos de sustratos (a) 50 gL
glucosa (b) 50 gL sacarosa
115
Tabla 37 Aacutereas obtenidas de los cromatogramas para el P cubensis en
medio Fang-Zhong en el diacutea 13 para concentraciones de 70gL glucosa y
70gL sacarosa
SustratoConcentracioacuten
(gL)
Tiempo
(s)Aacuterea
Glucosa 70 1456 3223
Glucosa 70 2985 2423
Glucosa 70 54 7586
Glucosa 70 6262 5149
Glucosa 70 7151 248331
Glucosa 70 9039 19346
Glucosa 70 9929 4906
Glucosa 70 11051 33698
Sacarosa 70 0437 342
Sacarosa 70 1428 812
Sacarosa 70 2948 2191
Sacarosa 70 5473 4854
Sacarosa 70 6286 5336
Sacarosa 70 6848 3649
Sacarosa 70 733 11383
Sacarosa 70 9073 1018
Sacarosa 70 9878 11072
Sacarosa 70 10267 18797
(a) (b)
Graacutefico 31 Cromatogramas del diacutea 13 para el P cubensis cultivado en medio
sumergido Fang-Zhong con dos diferentes tipos de sustratos (a) 70 gL
glucosa (b) 70 gL sacarosa
116
Tabla 38 Aacutereas obtenidas de los cromatogramas para el P cubensis en
medio Fang-Zhong en el diacutea 13 para concentraciones de 50gL y glucosa
50gL sacarosa
SustratoConcentracioacuten
(gL)
Tiempo
(s)Aacuterea
Glucosa 50 05 4067 22222
Glucosa 50 05 7379 55573
Glucosa 50 05 902 19513
Glucosa 50 05 9716 119261
Glucosa 50 05 1173 19427
Glucosa 50 1 0793 14776
Glucosa 50 1 2868 28537
Glucosa 50 1 6224 1206
Glucosa 50 1 6782 571299
Glucosa 50 1 8303 92665
Glucosa 50 1 9081 30371
Glucosa 50 1 9738 168959
Glucosa 50 1 11813 27921
Glucosa 50 15 0412 269
Glucosa 50 15 2482 14692
Glucosa 50 15 3486 91059
Glucosa 50 15 6039 6892
Glucosa 50 15 6627 216986
Glucosa 50 15 7216 260795
Glucosa 50 15 8112 65776
Glucosa 50 15 8888 19083
Glucosa 50 15 9497 37812
Glucosa 50 15 9839 65922
Glucosa 50 15 11655 7331
(a) (b)
(c)
Graacutefico 32 Cromatogramas del diacutea 12 para el P cubensis cultivado en medio
sumergido Fang-Zhong con fuente de carbono glucosa y adicioacuten de
fenilalanina en tres concentraciones (a) 05 gL FA (b) 1 gL FA (c) 15gL
FA
117
Anexo 21 Cromatogramas (HPLC) del diacutea 14 de fermentacioacuten
Tabla 39 Aacutereas obtenidas de los cromatogramas para el P cubensis en
medio Fang-Zhong en el diacutea 14 para concentraciones de 30gL glucosa y 30
gL sacarosa
SustratoConcentracioacuten
(gL)
Tiempo
(s)Aacuterea
Glucosa 30 1054 181
Glucosa 30 2553 8939
Glucosa 30 6219 7557
Glucosa 30 6585 77083
Glucosa 30 7158 285069
Glucosa 30 8987 33875
Glucosa 30 9848 87461
Glucosa 30 10694 52151
Glucosa 30 12482 7992
Glucosa 30 12943 23064
Glucosa 30 1493 5948
Sacarosa 30 7309 7075
Sacarosa 30 9984 1680
Sacarosa 30 10442 15395
Sacarosa 30 11211 8511
Sacarosa 30 13405 3398
(a) (b)
Graacutefico 33 Cromatogramas del diacutea 14 para el P cubensis cultivado en medio
sumergido Fang-Zhong con dos diferentes tipos de sustratos (a) 30 gL
glucosa (b) 30 gL sacarosa
118
Tabla 40 Aacutereas obtenidas de los cromatogramas para el P cubensis en
medio Fang-Zhong en el diacutea 14 para concentraciones de 50gL glucosa y
50gL sacarosa
SustratoConcentracioacuten
(gL)
Tiempo
(s)Aacuterea
Glucosa 50 2029 8318
Glucosa 50 6257 5782
Glucosa 50 6875 306684
Glucosa 50 9068 22819
Glucosa 50 9808 92492
Glucosa 50 12113 8823
Glucosa 50 12752 23988
Sacarosa 50 1036 3783
Sacarosa 50 2356 7005
Sacarosa 50 653 44831
Sacarosa 50 6657 127617
Sacarosa 50 7264 66908
Sacarosa 50 7464 255141
Sacarosa 50 9035 26172
Sacarosa 50 9458 28427
Sacarosa 50 9889 37574
Sacarosa 50 10312 140881
Sacarosa 50 12335 13391
Sacarosa 50 1292 17066
(a) (b)
Graacutefico 34 Cromatogramas del diacutea 14 para el P cubensis cultivado en medio
sumergido Fang-Zhong con dos diferentes tipos de sustratos (a) 50 gL
glucosa (b) 50 gL sacarosa
119
Tabla 41 Aacutereas obtenidas de los cromatogramas para el P cubensis en
medio Fang-Zhong en el diacutea 14 para concentraciones de 70gL glucosa y
70gL sacarosa
SustratoConcentracioacuten
(gL)
Tiempo
(s)Aacuterea
Glucosa 70 6257 5879
Glucosa 70 6373 145551
Glucosa 70 7015 68223
Glucosa 70 7199 9085
Glucosa 70 735 265755
Glucosa 70 9014 4642
Glucosa 70 9877 97804
Glucosa 70 107 67421
Glucosa 70 12625 26231
Glucosa 70 1305 65607
Sacarosa 70 2283 4683
Sacarosa 70 5191 93
Sacarosa 70 6304 3719
Sacarosa 70 6795 136542
Sacarosa 70 726 29869
Sacarosa 70 7515 75545
Sacarosa 70 7872 119563
Sacarosa 70 9166 1244
Sacarosa 70 9658 23096
Sacarosa 70 9871 25866
Sacarosa 70 10421 105108
Sacarosa 70 12347 11115
Sacarosa 70 12861 35503
Sacarosa 70 14272 3676
(a) (b)
Graacutefico 35 Cromatogramas del diacutea 14 para el P cubensis cultivado en medio
sumergido Fang-Zhong con dos diferentes tipos de sustratos (a) 70 gL
glucosa (b) 70 gL sacarosa
120
Tabla 42 Aacutereas obtenidas de los cromatogramas para el P cubensis en medio Fang-Zhong en el diacutea 13 para concentraciones de 50gL glucosa y
50gL sacarosa
SustratoConcentracioacuten
(gL)
Tiempo
(s)Aacuterea
Glucosa 50 05 0123 173
Glucosa 50 05 0699 7584
Glucosa 50 05 2594 2742
Glucosa 50 05 6104 11663
Glucosa 50 05 6616 487848
Glucosa 50 05 7235 287918
Glucosa 50 05 8183 135793
Glucosa 50 05 8903 5143
Glucosa 50 05 9484 66817
Glucosa 50 05 9679 168855
Glucosa 50 05 11671 4216
Glucosa 50 1 0345 295
Glucosa 50 1 2654 11981
Glucosa 50 1 412 45301
Glucosa 50 1 6111 12626
Glucosa 50 1 6757 526655
Glucosa 50 1 8093 104277
Glucosa 50 1 894 25251
Glucosa 50 1 9643 158685
Glucosa 50 1 11666 22779
Glucosa 50 15 0353 283
Glucosa 50 15 2522 15272
Glucosa 50 15 3577 83963
Glucosa 50 15 6668 47137
Glucosa 50 15 7304 371442
Glucosa 50 15 8226 117611
Glucosa 50 15 8923 61949
Glucosa 50 15 9657 19618
Glucosa 50 15 11668 35606
(a) (b)
(c)
Graacutefico 36 Cromatogramas del diacutea 12 para el P cubensis cultivado en medio sumergido Fang-Zhong con fuente de carbono glucosa y adicioacuten de
fenilalanina en tres concentraciones (a) 05 gL FA (b) 1 gL FA (c) 15gL FA (a) 05 gL FA (b) 1 gL FA (c) 15gL FA
121
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v
AGRADECIMIENTOS
Los autores expresan sus agradecimientos a todas las personas que desde su experiencia y profesioacuten brindaron apoyo durante el desarrollo de este proyecto Alex Armando Saacuteez V Quiacutemico MSc En Biotecnologiacutea Candidato a Doctorado Profesor Universidad EAFIT Personal de laboratorio de Ingenieriacutea de Procesos Edgar Arbelaacuteez John Estrada y especialmente Sigifredo Caacuterdenas encargado del laboratorio de Biotecnologiacutea de la Universidad EAFIT Luz Deisy Mariacuten Palacio Ingeniera de Procesos Profesora Universidad EAFIT Diego Acosta PhD Engineering and Material Science Profesor Universidad EAFIT Carlos Correa Ingeniero Quiacutemico Profesor Universidad EAFIT Valeska Villegas E Msc En Biotecnologiacutea Candidata a Doctorado Profesora Universidad EAFIT
vi
TABLA DE CONTENIDO
LISTA DE TABLAS _________________________________________________________________________ IX
LISTA DE FIGURAS ________________________________________________________________________ XI
LISTA DE GRAacuteFICOS ______________________________________________________________________ XII
LISTA DE ECUACIONES ____________________________________________________________________ XV
LISTAS DE ANEXOS ______________________________________________________________________ XVI
RESUMEN _____________________________________________________________________________ XVII
INTRODUCCIOacuteN _________________________________________________________________________ 19
OBJETIVOS _____________________________________________________________________________ 21
GENERAL_____________________________________________________________________________ 21
ESPECIacuteFICOS __________________________________________________________________________ 21
1 MARCO TEOacuteRICO ___________________________________________________________________ 22
11 CONCEPTOS GENERALES DE HONGOS _______________________________________________ 22
111 Hongos laminares (Agaricales) ____________________________________________________ 22
12 MEDIOS DE CULTIVO_____________________________________________________________ 24
121 Medio sumergido _______________________________________________________________ 25
13 ALCALOIDES ___________________________________________________________________ 26
131 Generalidades _______________________________________________________________ 26
132 Propiedades fisicoquiacutemicas _____________________________________________________ 27
133 Reconocimiento de los alcaloides ________________________________________________ 27
134 Clasificacioacuten de los alcaloides ___________________________________________________ 28
1341 Alcaloides alifaacuteticos ____________________________________________________________ 28
1342 Alcaloides de origen diverso _____________________________________________________ 28
1343 Alcaloides aromaacuteticos __________________________________________________________ 28
13 PSILOCIBINA Y PSILOCINA _________________________________________________________ 31
131 Antecedentes acerca de la obtencioacuten de Psilocibina y Psilocina ________________________ 32
2 MATERIALES Y MEacuteTODOS_____________________________________________________________ 34
21 LOCALIZACIOacuteN _________________________________________________________________ 34
22 MICROORGANISMO DE ESTUDIO ___________________________________________________ 34
23 COMPONENTES DEL MEDIO DE CULTIVO (FANG-ZHONG) _______________________________ 35
24 PREPARACIOacuteN DE LOS DIFERENTES PREINOacuteCULOS DE P CUBENSIS EMPLEADOS PARA LAS
FERMENTACIONES SUMERGIDAS _________________________________________________________ 35
25 PREPARACIOacuteN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO Y LOS INOacuteCULOS DE P CUBENSIS UTILIZADOS PARA LAS
FERMENTACIONES SUMERGIDAS _________________________________________________________ 36
26 CUANTIFICACIOacuteN DEL CRECIMIENTO DE BIOMASA MEDIANTE LOS MEacuteTODOS DE PESO HUacuteMEDO Y
PESO SECO PARA CULTIVO SUMERGIDO DE P CUBENSIS ________________________________________ 37
27 AJUSTE DE LA CINEacuteTICA DE CRECIMIENTO DE P CUBENSIS AL MODELO CINEacuteTICO LOGIacuteSTICO ____ 37
vii
28 EVALUACIOacuteN DEL CONSUMO DE SUSTRATO Y DEL CONSUMO DE PROTEIacuteNA POR PARTE DEL P
CUBENSIS CULTIVADO EN MEDIO SUMERGIDO ________________________________________________ 39
29 MEacuteTODO CUALITATIVO PARA DETERMINAR LA PRESENCIA DE ALCALOIDES (PSILOCIBINA)
MEDIANTE EL USO DEL REACTIVO DE DRAGENDORFF _________________________________________ 40
210 MEacuteTODO PARA DETERMINAR LA PRESENCIA DE PSILOCIBINA MEDIANTE CROMATOGRAFIacuteA
LIacuteQUIDA DE ALTA EFICIENCIA (HPLC) _______________________________________________________ 40
211 DETERMINACIOacuteN CUALITATIVA DE LA RESOLUCIOacuteN DEL ALCALOIDE DE INTEREacuteS PARA LOS
DIFERENTES ENSAYOS __________________________________________________________________ 41
212 DETERMINACIOacuteN PORCENTUAL DE COMPUESTOS PARA LOS DIFERENTES ENSAYOS __________ 42
213 CULTIVO SUMERGIDO DE P CUBENSIS EN PRESENCIA DE FA ______________________________ 42
214 DISENtildeO DE EXPERIMENTOS Y ANAacuteLISIS ESTADIacuteSTICO ___________________________________ 43
3 RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN ___________________________________________________________ 45
31 CINEacuteTICA DE CRECIMIENTO MICELIAL DE P CUBENSIS EN CULTIVO SUMERGIDO (FANG-ZHONG)
UTILIZANDO DIFERENTES FUENTES DE CARBONO ____________________________________________ 45
311 Crecimiento micelial de P cubensis en medio sumergido utilizando diferentes concentraciones
de glucosa _________________________________________________________________________ 45
312 Crecimiento micelial del P cubensis en medio sumergido utilizando diferentes concentraciones
de sacarosa ________________________________________________________________________ 50
313 Comparacioacuten entre el crecimiento micelial de P cubensis en los cultivos sumergidos utilizando
glucosa y sacarosa como fuente de carbono ______________________________________________ 55
314 Crecimiento micelial del P cubensis en cultivo sumergido utilizando glucosa y fenilalanina en el
medio 56
32 ESTUDIO DE LA CINEacuteTICA DE CONSUMO DE SUSTRATO POR PARTE DEL P CUBENSIS CULTIVADO EN
MEDIO SUMERGIDO (FANG-ZHONG) ______________________________________________________ 61
321 Consumo de sustrato por parte del P cubensis en medio sumergido utilizando diferentes
concentraciones de glucosa ___________________________________________________________ 62
322 Consumo de sustrato por parte del P cubensis en medio sumergido utilizando diferentes
concentraciones de sacarosa __________________________________________________________ 63
323 Comparacioacuten entre el consumo de sustrato de P cubensis en los cultivos sumergidos con
diferentes fuentes de carbono _________________________________________________________ 65
324 Consumo de sustrato por parte del P cubensis en medio sumergido utilizando glucosa y
fenilalanina en el medio ______________________________________________________________ 66
33 ESTUDIO DE LA CINEacuteTICA DE CONSUMO DE PROTEIacuteNA POR PARTE DEL P CUBENSIS CULTIVADO EN
MEDIO SUMERGIDO (FANG-ZHONG) ______________________________________________________ 69
331 Consumo de proteiacutena por P cubensis en medio sumergido utilizando diferentes
concentraciones de glucosa ___________________________________________________________ 69
332 Consumo de proteiacutena por P cubensis en medio sumergido utilizando diferentes
concentraciones de sacarosa __________________________________________________________ 71
333 Comparacioacuten entre el consumo de proteiacutena de P cubensis en los cultivos sumergidos con
diferentes fuentes de carbono _________________________________________________________ 72
334 Consumo de proteiacutena por P cubensis en medio sumergido utilizando glucosa y FA en el medio
73
34 ESTUDIO CUALITATIVO DE LA PRESENCIA DEL ALCALOIDE _______________________________ 76
viii
341 Produccioacuten de compuestos producidos por P cubensis cuando el medio no conteniacutea FA ____ 76
342 Produccioacuten de compuestos producidos por P cubensis cuando el medio conteniacutea FA ______ 79
35 ESTUDIO PORCENTUAL (AacuteREA) DEL ALCALOIDE REALIZADO PARA LOS DIFERENTES ENSAYOS ___ 81
351 Porcentaje de la Psilocibina (suposicioacuten) cuando el medio no conteniacutea FA _______________ 81
352 Porcentaje de aacuterea de compuestos presentes en P cubensis cuando el medio conteniacutea FA _ 83
CONCLUSIONES _________________________________________________________________________ 86
RECOMENDACIONES _____________________________________________________________________ 89
ANEXOS _______________________________________________________________________________ 90
BIBLIOGRAFIacuteA _________________________________________________________________________ 121
ix
LISTA DE TABLAS
TABLA 1 COMPOSICIOacuteN DEL MEDIO DE CULTIVO SUMERGIDO PARA EVALUAR EL CRECIMIENTO MICELIAL
DEL P CUBENSIS 35
TABLA 2 PARAacuteMETROS CINEacuteTICOS OBTENIDOS MEDIANTE EL MODELO LOGIacuteSTICO PARA LAS DIFERENTES
FERMENTACIONES DE P CUBENSIS UTILIZANDO GLUCOSA COMO FUENTE DE CARBONO 48
TABLA 3 PARAacuteMETROS CINEacuteTICOS OBTENIDOS MEDIANTE EL MODELO LOGIacuteSTICO PARA LAS DIFERENTES
FERMENTACIONES DE P CUBENSIS UTILIZANDO SACAROSA COMO FUENTE DE CARBONO 53
TABLA 4 PARAacuteMETROS CINEacuteTICOS OBTENIDOS MEDIANTE EL MODELO LOGIacuteSTICO PARA LAS DIFERENTES
FERMENTACIONES DE P CUBENSIS UTILIZANDO 50 GL DE GLUCOSA COMO FUENTE DE CARBONO Y
DIFERENTES CONCENTRACIONES DE FA 60
TABLA 5 PORCENTAJE DE AacuteREA HALLADO MEDIANTE HPLC PARA LOS UacuteLTIMOS TRES DIacuteAS DE LA
FERMENTACIOacuteN CON CONCENTRACIONES DE 30 GL 50 GL Y 70 GL DE GLUCOSA Y SACAROSA CON
UN TIEMPO DE RETENCIOacuteN DE 62 Y 72 MINUTOS 81
TABLA 6 PORCENTAJE HALLADO MEDIANTE HPLC PARA LOS UacuteLTIMOS TRES DIacuteAS DE LA FERMENTACIOacuteN
CON CONCENTRACIONES DE 05 GL 10 GL Y 15 GL DE FA Y 50 GL DE GLUCOSA CON UN TIEMPO
DE RETENCIOacuteN ENTRE 62 Y 72 MINUTOS 83
TABLA 7 ANAacuteLISIS DE VARIANZA PARA EL CRECIMIENTO MICELIAL (GLUCOSA) 90
TABLA 8 ANAacuteLISIS MUacuteLTIPLE DE RANGOS PARA EL CRECIMIENTO MICELIAL (GLUCOSA) 90
TABLA 9 ANAacuteLISIS DE VARIANZA PARA EL CRECIMIENTO MICELIAL (SACAROSA) 91
TABLA 10 ANAacuteLISIS MUacuteLTIPLE DE RANGOS PARA EL CRECIMIENTO MICELIAL (SACAROSA) 91
TABLA 11 ANAacuteLISIS DE VARIANZA PARA EL CRECIMIENTO MICELIAL (GLUCOSA Y SACAROSA) 92
TABLA 12 ANAacuteLISIS MUacuteLTIPLE DE RANGOS PARA EL CRECIMIENTO MICELIAL (GLUCOSA Y SACAROSA) 92
TABLA 13 ANAacuteLISIS DE VARIANZA PARA EL CRECIMIENTO MICELIAL (GLUCOSA 50 GL Y FA) 93
TABLA 14 ANAacuteLISIS MUacuteLTIPLE DE RANGOS PARA EL CRECIMIENTO MICELIAL (GLUCOSA 50 GL Y FA) 93
TABLA 15 ANAacuteLISIS DE VARIANZA PARA EL CONSUMO DE SUSTRATO SIN FA 94
TABLA 16 ANAacuteLISIS MUacuteLTIPLE DE RANGOS PARA EL CONSUMO DE SUSTRATO SIN FA 94
TABLA 17 ANAacuteLISIS DE VARIANZA PARA EL CONSUMO DE SUSTRATO CON FA 95
TABLA 18 ANAacuteLISIS MUacuteLTIPLE DE RANGOS PARA EL CONSUMO DE SUSTRATO CON FA 95
TABLA 19 ANAacuteLISIS DE VARIANZA PARA EL CONSUMO DE PROTEIacuteNA SIN FA 96
TABLA 20 ANAacuteLISIS MUacuteLTIPLE DE RANGOS PARA EL CONSUMO DE PROTEIacuteNA SIN FA 96
TABLA 21ANAacuteLISIS DE VARIANZA PARA EL CONSUMO DE PROTEIacuteNA CON FA 97
TABLA 22 ANAacuteLISIS MUacuteLTIPLE DE RANGOS PARA EL CONSUMO DE PROTEIacuteNA CON FA 97
TABLA 23 ANAacuteLISIS DE VARIANZA PARA LA PRODUCCIOacuteN DE PSILOCIBINA SIN FA 98
TABLA 24 ANAacuteLISIS MUacuteLTIPLE DE RANGOS PARA LA PRODUCCIOacuteN DE PSILOCIBINA SEGUacuteN EL SUSTRATO
SIN FA 98
TABLA 25 ANAacuteLISIS DE VARIANZA PARA LA PRODUCCIOacuteN DE PSILOCIBINA CON FA 99
TABLA 26 ANAacuteLISIS MUacuteLTIPLE DE RANGOS PARA LA PRODUCCIOacuteN DE PSILOCIBINA SEGUacuteN EL DIacuteA CON FA
99
TABLA 27 ANAacuteLISIS DE VARIANZA PARA LA CUANTIFICACIOacuteN DE PSILOCIBINA SIN FA 100
TABLA 28 ANAacuteLISIS MUacuteLTIPLE DE RANGOS PARA LA CUANTIFICACIOacuteN DE PSILOCIBINA SEGUacuteN EL TIPO DE
SUSTRATO SIN FA 100
TABLA 29 ANAacuteLISIS DE VARIANZA PARA LA CUANTIFICACIOacuteN DE PSILOCIBINA CON FA 101
x
TABLA 30 ANAacuteLISIS MUacuteLTIPLE DE RANGOS PARA LA CUANTIFICACIOacuteN DE PSILOCIBINA SEGUacuteN LA
CONCENTRACIOacuteN CON FA 101
TABLA 31 AacuteREAS OBTENIDAS DE LOS CROMATOGRAMAS PARA EL P CUBENSIS EN MEDIO FANG-ZHONG
EN EL DIacuteA 12 PARA CONCENTRACIONES DE 30GL GLUCOSA Y 30GL SACAROSA 109
TABLA 32 AacuteREAS OBTENIDAS DE LOS CROMATOGRAMAS PARA EL P CUBENSIS EN MEDIO FANG-ZHONG
EN EL DIacuteA 12 PARA CONCENTRACIONES DE 50GL GLUCOSA Y 50GL SACAROSA 110
TABLA 33 AacuteREAS OBTENIDAS DE LOS CROMATOGRAMAS PARA EL P CUBENSIS EN MEDIO FANG-ZHONG
EN EL DIacuteA 12 PARA CONCENTRACIONES DE 50GL GLUCOSA Y 50GL SACAROSA 111
TABLA 34 AacuteREAS OBTENIDAS DE LOS CROMATOGRAMAS PARA EL P CUBENSIS EN MEDIO FANG-ZHONG
EN EL DIacuteA 12 PARA CONCENTRACIONES DE 50GL Y GLUCOSA 50GL SACAROSA 112
TABLA 35 AacuteREAS OBTENIDAS DE LOS CROMATOGRAMAS PARA EL P CUBENSIS EN MEDIO FANG-ZHONG
EN EL DIacuteA 13 PARA CONCENTRACIONES DE 30GL GLUCOSA Y 30GL SACAROSA 113
TABLA 36 AacuteREAS OBTENIDAS DE LOS CROMATOGRAMAS PARA EL P CUBENSIS EN MEDIO FANG-ZHONG
EN EL DIacuteA 13 PARA CONCENTRACIONES DE 50GL GLUCOSA Y 50GL SACAROSA 114
TABLA 37 AacuteREAS OBTENIDAS DE LOS CROMATOGRAMAS PARA EL P CUBENSIS EN MEDIO FANG-ZHONG
EN EL DIacuteA 13 PARA CONCENTRACIONES DE 70GL GLUCOSA Y 70GL SACAROSA 115
TABLA 38 AacuteREAS OBTENIDAS DE LOS CROMATOGRAMAS PARA EL P CUBENSIS EN MEDIO FANG-ZHONG
EN EL DIacuteA 13 PARA CONCENTRACIONES DE 50GL Y GLUCOSA 50GL SACAROSA 116
TABLA 39 AacuteREAS OBTENIDAS DE LOS CROMATOGRAMAS PARA EL P CUBENSIS EN MEDIO FANG-ZHONG
EN EL DIacuteA 14 PARA CONCENTRACIONES DE 30GL GLUCOSA Y 30 GL SACAROSA 117
TABLA 40 AacuteREAS OBTENIDAS DE LOS CROMATOGRAMAS PARA EL P CUBENSIS EN MEDIO FANG-ZHONG
EN EL DIacuteA 14 PARA CONCENTRACIONES DE 50GL GLUCOSA Y 50GL SACAROSA 118
TABLA 41 AacuteREAS OBTENIDAS DE LOS CROMATOGRAMAS PARA EL P CUBENSIS EN MEDIO FANG-ZHONG
EN EL DIacuteA 14 PARA CONCENTRACIONES DE 70GL GLUCOSA Y 70GL SACAROSA 119
TABLA 42 AacuteREAS OBTENIDAS DE LOS CROMATOGRAMAS PARA EL P CUBENSIS EN MEDIO FANG-ZHONG
EN EL DIacuteA 13 PARA CONCENTRACIONES DE 50GL GLUCOSA Y 50GL SACAROSA 120
xi
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1 HONGO AGARICALES (LAMINAR) (KUO 2007) 23
FIGURA 2 ALCALOIDES DERIVADOS DEL TRIPTOFANO (MERCANO Y HASEGAWA 1991) 29
FIGURA 3 TRIPTAMINAS SIMPLES (SEIGLER 1981) 31
FIGURA 4 PSILOCIBINA Y PSILOCINA (MANDRILE ET AL 1984) 32
FIGURA 5 PSILOCYBE CUBENSIS (EAH01) CULTIVADA EN MEDIO SOacuteLIDO AGAR MALTA 34
FIGURA 6 CROMATOGRAMAS DE DOS DIFERENTES FERMENTACIONES DE P CUBENSIS QUE ILUSTRAN EL
CRITERIO DE ESCOGENCIA DEL MEJOR ENSAYO REALIZADO (A) 50 GL GLUCOSA (B) 50 GL
SACAROSA 78
FIGURA 7 CROMATOGRAMAS DE DOS DIFERENTES FERMENTACIONES DE P CUBENSIS QUE ILUSTRAN EL
CRITERIO DE ESCOGENCIA DEL MEJOR ENSAYO REALIZADO (A) 05 GL FA (B) 15 GL FA 80
FIGURA 8 MUESTRA DE BIOMASA UNA VEZ ANALIZADA MEDIANTE EL REACTIVO DE DRAGENDORFF 107
FIGURA 9 PERFIL CROMATOGRAacuteFICO (TSUJIKAWA ET AL 2003) 108
xii
LISTA DE GRAacuteFICOS
GRAacuteFICO 1 CINEacuteTICA DE CRECIMIENTO MICELIAL DE P CUBENSIS EN MEDIO SUMERGIDO (FANG-ZHONG)
UTILIZANDO TRES DIFERENTES CONCENTRACIONES DE GLUCOSA COMO FUENTE DE CARBONO (PESO
SECO) 46
GRAacuteFICO 2 CRECIMIENTO MICELIAL DE P CUBENSIS EN CULTIVO SUMERGIDO BAJO TRES
CONCENTRACIONES DE GLUCOSA 47
GRAacuteFICO 3 VALORES DE CONCENTRACIOacuteN DE BIOMASA EXPERIMENTAL Y TEOacuteRICO GRAFICADOS CON
RESPECTO AL TIEMPO PARA LAS FERMENTACIONES CON DIFERENTES CONCENTRACIONES DE
GLUCOSA 49
GRAacuteFICO 4 CINEacuteTICA DE CRECIMIENTO MICELIAL DE P CUBENSIS EN MEDIO SUMERGIDO (FANG-ZHONG)
UTILIZANDO DIFERENTES CONCENTRACIONES DE SACAROSA COMO FUENTE DE CARBONO (PESO
SECO) 50
GRAacuteFICO 5 CRECIMIENTO MICELIAL PARA TRES DIFERENTES CONCENTRACIONES DE SACAROSA 52
GRAacuteFICO 6 VALORES DE CONCENTRACIOacuteN DE BIOMASA EXPERIMENTAL Y TEOacuteRICO GRAFICADOS CON
RESPECTO AL TIEMPO PARA LAS FERMENTACIONES CON DIFERENTES CONCENTRACIONES DE
SACAROSA 54
GRAacuteFICO 7 CRECIMIENTO MICELIAL PARA DOS DIFERENTES FUENTES DE CARBONO (GLUCOSA Y
SACAROSA) 56
GRAacuteFICO 8 CINEacuteTICA DE CRECIMIENTO MICELIAL DE P CUBENSIS EN MEDIO SUMERGIDO (FANG-ZHONG)
UTILIZANDO DIFERENTES CONCENTRACIONES DE FA Y 50 GL DE GLUCOSA COMO FUENTE DE
CARBONO (PESO SECO) 57
GRAacuteFICO 9 CRECIMIENTO MICELIAL PARA GLUCOSA A UNA CONCENTRACIOacuteN DE 50 GL Y TRES
DIFERENTES CONCENTRACIONES DE FA 59
GRAacuteFICO 10 VALORES DE CONCENTRACIOacuteN DE BIOMASA EXPERIMENTAL Y TEOacuteRICO GRAFICADOS CON
RESPECTO AL TIEMPO PARA LAS FERMENTACIONES CON DIFERENTES CONCENTRACIONES DE FA Y
50 GL DE GLUCOSA 61
GRAacuteFICO 11 CINEacuteTICA DE CONSUMO DE SUSTRATO POR PARTE DEL P CUBENSIS EN MEDIO SUMERGIDO
UTILIZANDO DIFERENTES CONCENTRACIONES DE GLUCOSA COMO FUENTE DE CARBONO 62
GRAacuteFICO 12 CINEacuteTICA DE CONSUMO DE SUSTRATO POR PARTE DEL P CUBENSIS EN MEDIO SUMERGIDO
UTILIZANDO DIFERENTES CONCENTRACIONES DE SACAROSA COMO FUENTE DE CARBONO 64
GRAacuteFICO 13 CONSUMO DE SUSTRATO PARA CADA UNA DE LAS FUENTES DE CARBONO UTILIZADAS 66
GRAacuteFICO 14 CINEacuteTICA DE CONSUMO DE SUSTRATO POR PARTE DEL P CUBENSIS EN MEDIO SUMERGIDO
UTILIZANDO 50 GL DE GLUCOSA COMO FUENTE DE CARBONO Y DIFERENTES CONCENTRACIONES DE
FA 67
GRAacuteFICO 15 CONSUMO DE SUSTRATO PARA CADA UNA DE LAS CONCENTRACIONES DE FA UTILIZADAS 68
GRAacuteFICO 16 CINEacuteTICA DE CONSUMO DE PROTEIacuteNA POR PARTE DEL P CUBENSIS EN MEDIO SUMERGIDO
UTILIZANDO DIFERENTES CONCENTRACIONES DE GLUCOSA COMO FUENTE DE CARBONO 70
GRAacuteFICO 17 CINEacuteTICA DE CONSUMO DE PROTEIacuteNA POR PARTE DEL P CUBENSIS EN MEDIO SUMERGIDO
UTILIZANDO DIFERENTES CONCENTRACIONES DE SACAROSA COMO FUENTE DE CARBONO 71
GRAacuteFICO 18 CONSUMO DE PROTEIacuteNA PARA CADA UNA DE LAS FUENTES DE CARBONO UTILIZADAS 73
xiii
GRAacuteFICO 19 CINEacuteTICA DE CONSUMO DE PROTEIacuteNA POR PARTE DEL P CUBENSIS EN MEDIO SUMERGIDO
UTILIZANDO 50 GL DE GLUCOSA COMO FUENTE DE CARBONO Y DIFERENTES CONCENTRACIONES DE
FA 74
GRAacuteFICO 20 CONSUMO DE PROTEIacuteNA PARA LOS ENSAYOS CON Y SIN FA 75
GRAacuteFICO 21 AacuteREA DEL COMPUESTO OBTENIDO DE P CUBENSIS EN TIEMPO DE RETENCIOacuteN ENTRE 62 Y
72 MINUTOS PARA LAS DOS FUENTES DE CARBONO 77
GRAacuteFICO 22 AacuteREA DEL COMPUESTO OBTENIDO DE P CUBENSIS EN TIEMPO DE RETENCIOacuteN ENTRE 62 Y
72 MINUTOS EN LOS UacuteLTIMOS TRES DIacuteAS DE LA FERMENTACIOacuteN CON FA Y GLUCOSA 79
GRAacuteFICO 23 AacuteREA DEL COMPUESTO OBTENIDO DE P CUBENSIS EN TIEMPO DE RETENCIOacuteN ENTRE 62 Y
72 MINUTOS PARA CADA UNA DE LAS FUENTES DE CARBONO UTILIZADAS 82
GRAacuteFICO 24 AacuteREA DEL COMPUESTO OBTENIDO DE P CUBENSIS EN TIEMPO DE RETENCIOacuteN ENTRE 62 Y
72 MINUTOS PARA CADA UNA DE LAS CONCENTRACIONES DE FA UTILIZADAS 85
GRAacuteFICO 25 CROMATOGRAMAS DEL DIacuteA 12 PARA EL P CUBENSIS CULTIVADO EN MEDIO SUMERGIDO
FANG-ZHONG CON DOS DIFERENTES TIPOS DE SUSTRATOS (A) 30 GL GLUCOSA (B) 30 GL SACAROSA
109
GRAacuteFICO 26 CROMATOGRAMAS DEL DIacuteA 12 PARA EL P CUBENSIS CULTIVADO EN MEDIO SUMERGIDO
FANG-ZHONG CON DOS DIFERENTES TIPOS DE SUSTRATOS (A) 50 GL GLUCOSA (B) 50 GL SACAROSA
110
GRAacuteFICO 27 CROMATOGRAMAS DEL DIacuteA 12 PARA EL P CUBENSIS CULTIVADO EN MEDIO SUMERGIDO
FANG-ZHONG CON DOS DIFERENTES TIPOS DE SUSTRATOS (A) 50 GL GLUCOSA (B) 50 GL SACAROSA
111
GRAacuteFICO 28 CROMATOGRAMA DEL DIacuteA 12 PARA EL P CUBENSIS CULTIVADO EN MEDIO SUMERGIDO
FANG-ZHONG CON FUENTE DE CARBONO GLUCOSA Y ADICIOacuteN DE FENILALANINA EN TRES
CONCENTRACIONES (A) 05 GL FA (B) 1 GL FA (C) 15GL FA 112
GRAacuteFICO 29 CROMATOGRAMAS DEL DIacuteA 13 PARA EL P CUBENSIS CULTIVADO EN MEDIO SUMERGIDO
FANG-ZHONG CON DOS DIFERENTES TIPOS DE SUSTRATOS (A) 30 GL GLUCOSA (B) 30 GL SACAROSA
113
GRAacuteFICO 30 CROMATOGRAMAS DEL DIacuteA 13 PARA EL P CUBENSIS CULTIVADO EN MEDIO SUMERGIDO
FANG-ZHONG CON DOS DIFERENTES TIPOS DE SUSTRATOS (A) 50 GL GLUCOSA (B) 50 GL SACAROSA
114
GRAacuteFICO 31 CROMATOGRAMAS DEL DIacuteA 13 PARA EL P CUBENSIS CULTIVADO EN MEDIO SUMERGIDO
FANG-ZHONG CON DOS DIFERENTES TIPOS DE SUSTRATOS (A) 70 GL GLUCOSA (B) 70 GL SACAROSA
115
GRAacuteFICO 32 CROMATOGRAMAS DEL DIacuteA 12 PARA EL P CUBENSIS CULTIVADO EN MEDIO SUMERGIDO
FANG-ZHONG CON FUENTE DE CARBONO GLUCOSA Y ADICIOacuteN DE FENILALANINA EN TRES
CONCENTRACIONES (A) 05 GL FA (B) 1 GL FA (C) 15GL FA 116
GRAacuteFICO 33 CROMATOGRAMAS DEL DIacuteA 14 PARA EL P CUBENSIS CULTIVADO EN MEDIO SUMERGIDO
FANG-ZHONG CON DOS DIFERENTES TIPOS DE SUSTRATOS (A) 30 GL GLUCOSA (B) 30 GL SACAROSA
117
GRAacuteFICO 34 CROMATOGRAMAS DEL DIacuteA 14 PARA EL P CUBENSIS CULTIVADO EN MEDIO SUMERGIDO
FANG-ZHONG CON DOS DIFERENTES TIPOS DE SUSTRATOS (A) 50 GL GLUCOSA (B) 50 GL SACAROSA
118
xiv
GRAacuteFICO 35 CROMATOGRAMAS DEL DIacuteA 14 PARA EL P CUBENSIS CULTIVADO EN MEDIO SUMERGIDO
FANG-ZHONG CON DOS DIFERENTES TIPOS DE SUSTRATOS (A) 70 GL GLUCOSA (B) 70 GL SACAROSA
119
GRAacuteFICO 36 CROMATOGRAMAS DEL DIacuteA 12 PARA EL P CUBENSIS CULTIVADO EN MEDIO SUMERGIDO
FANG-ZHONG CON FUENTE DE CARBONO GLUCOSA Y ADICIOacuteN DE FENILALANINA EN TRES
CONCENTRACIONES (A) 05 GL FA (B) 1 GL FA (C) 15GL FA (A) 05 GL FA (B) 1 GL FA (C)
15GL FA 120
xv
LISTA DE ECUACIONES
ECUACIOacuteN 1 ECUACIOacuteN LINEALIZADA DEL MODELO LOGIacuteSTICO 38
ECUACIOacuteN 2 VALORES TEOacuteRICOS DE BIOMASA EN EL TIEMPO 39
xvi
LISTAS DE ANEXOS
ANEXO 1 ANAacuteLISIS DE VARIANZA (ANOVA) PARA EL CRECIMIENTO DE BIOMASA DE LAS
FERMENTACIONES CON GLUCOSA _____________________________________________________ 90
ANEXO 2 ANAacuteLISIS DE VARIANZA (ANOVA) PARA EL CRECIMIENTO DE BIOMASA DE LAS
FERMENTACIONES CON SACAROSA ____________________________________________________ 91
ANEXO 3 ANAacuteLISIS DE VARIANZA (ANOVA) PARA EL CRECIMIENTO DE BIOMASA DE LAS
FERMENTACIONES CON GLUCOSA Y SACAROSA __________________________________________ 92
ANEXO 4 ANAacuteLISIS DE VARIANZA (ANOVA) PARA EL CRECIMIENTO DE BIOMASA DE LAS
FERMENTACIONES CON GLUCOSA 50 GL Y FA ___________________________________________ 93
ANEXO 5 ANAacuteLISIS DE VARIANZA (ANOVA) PARA EL CONSUMO DE SUSTRATO EN LAS FERMENTACIONES
SIN FA ____________________________________________________________________________ 94
ANEXO 6 ANAacuteLISIS DE VARIANZA (ANOVA) PARA EL CONSUMO DE SUSTRATO EN LAS FERMENTACIONES
CON FA ___________________________________________________________________________ 95
ANEXO 7 ANAacuteLISIS DE VARIANZA (ANOVA) PARA EL CONSUMO DE PROTEIacuteNA EN LAS FERMENTACIONES
SIN FA ____________________________________________________________________________ 96
ANEXO 8 ANAacuteLISIS DE VARIANZA (ANOVA) PARA EL CONSUMO DE PROTEIacuteNA EN LAS FERMENTACIONES
CON FA ___________________________________________________________________________ 97
ANEXO 9 ANAacuteLISIS DE VARIANZA (ANOVA) PARA LA PRODUCCIOacuteN DE PSILOCIBINA EN LAS
FERMENTACIONES SIN FA ____________________________________________________________ 98
ANEXO 10 ANAacuteLISIS DE VARIANZA (ANOVA) PARA LA PRODUCCIOacuteN DE PSILOCIBINA EN LAS
FERMENTACIONES CON FA ___________________________________________________________ 99
ANEXO 11 ANAacuteLISIS DE VARIANZA (ANOVA) PARA LA CUANTIFICACIOacuteN PORCENTUAL DE PSILOCIBINA EN
LAS FERMENTACIONES SIN FA _______________________________________________________ 100
ANEXO 12 ANAacuteLISIS DE VARIANZA (ANOVA) PARA LA CUANTIFICACIOacuteN PORCENTUAL DE PSILOCIBINA EN
LAS FERMENTACIONES CON FA ______________________________________________________ 101
ANEXO 13 DETERMINACIOacuteN DE CONSUMO DE AZUacuteCARES POR EL MEacuteTODO DE DNS (AacuteCIDO
DINITROSALICIacuteLICO) ________________________________________________________________ 102
ANEXO 14 CINEacuteTICA DE CONSUMO DE SUSTRATO ___________________________________________ 104
ANEXO 15 DETERMINACIOacuteN DE CONSUMO DE PROTEIacuteNAS POR EL MEacuteTODO DE LOWRY ____________ 105
ANEXO 16 CINEacuteTICA CONSUMO DE PROTEIacuteNA ______________________________________________ 106
ANEXO 17 PRUEBA DE REACTIVO DE DRAGENDORFF _________________________________________ 107
ANEXO 18 BARRIDO ESPECTRAL PARA EL PSILOCYBE CUBENSIS _________________________________ 108
ANEXO 19 CROMATOGRAMAS (HPLC) DEL DIacuteA 12 DE FERMENTACIOacuteN ___________________________ 109
ANEXO 20 CROMATOGRAMAS (HPLC) DEL DIacuteA 13 DE FERMENTACIOacuteN __________________________ 113
ANEXO 21 CROMATOGRAMAS (HPLC) DEL DIacuteA 14 DE FERMENTACIOacuteN __________________________ 117
xvii
RESUMEN
El Psilocybe cubensis es un hongo de gran importancia a nivel industrial gracias a
la presencia de una sustancia llamada Psilocibina en su cuerpo fructiacutefero
Dicho alcaloide derivado de la triptamina es muy similar al neurotransmisor
serotonina el cual es responsable de la percepcioacuten sensorial la regulacioacuten de la
temperatura el inicio del reposo nocturno del hiacutegado y los rintildeones Por tal motivo
este estudio se enfocoacute en la produccioacuten de la Psilocibina mediante el cultivo del P
cubensis en medio sumergido (Fang-Zhong)
Se evaluaron los efectos de dos fuentes de carbono (glucosa y sacarosa) a tres
concentraciones diferentes en cultivo sumergido para Psilocybe cubensis con el
fin de determinar la incidencia de eacutestas en la produccioacuten de biomasa y en la
produccioacuten y presencia de Psilocibina alcaloide de intereacutes Para las
concentraciones de glucosa de 30 gL 50 gL y 70 gL se presentoacute un crecimiento
maacuteximo de biomasa de 048 gL 055 gL y 062 gL y un porcentaje de alcaloide
de 6065 wv 7396 wv y 6733 wv respectivamente Esto uacuteltimo si se
asume que el tiempo de retencioacuten oscila entre 62 y 72 minutos contaacutendose con
una fase moacutevil de HCOONH4 en una columna C18 Mientras que para las mismas
concentraciones de sacarosa se presentoacute un crecimiento maacuteximo de biomasa de
026 gL 045 gL y 057 gL con porcentajes del compuesto presente entre el
rango de 62 y 72 minutos de 3664 wv 5857 wv y 5583 wv
respectivamente
Una vez realizada la investigacioacuten se encontroacute que las diferencias existentes en
cuanto a la cantidad de biomasa generada con respecto al tipo de sustrato
utilizado no fueron significativas es decir era irrelevante si se utilizaba glucosa o
sacarosa como principal fuente de carbono para la fermentacioacuten del P cubensis
xviii
en medio sumergido con el fin de obtener biomasa sin embargo se hallaron
diferencias significativas con respecto a las diferentes concentraciones empleadas
de dichas fuentes de carbono
Al analizar las muestras mediante cromatografiacutea liacutequida de alta eficiencia (HPLC)
se determinoacute que el medio que conteniacutea 50 gL de glucosa era el deseado debido
a que fue en eacuteste donde se presentaron picos maacutes definidos mostrando una mejor
resolucioacuten del compuesto Adicionalmente presentoacute un buen crecimiento micelial
Una vez elegido dicho criterio se evaluoacute el efecto que teniacutea la adicioacuten de un
aminoaacutecido llamado Fenilalanina (FA) al medio que conteniacutea 50 gL de glucosa
con el fin de determinar si eacuteste teniacutea alguna incidencia positiva en la produccioacuten de
biomasa y en la generacioacuten del alcaloide de intereacutes cabe resaltar que se utilizaron
diferentes concentraciones de FA correspondientes a 05 gL 10 gL y 15 gL
Finalizados dichos ensayos se obtuvieron valores de crecimiento de biomasa
maacutexima de 106 gL 108 gL y 101 gL y un porcentaje de aacuterea de 7549 wv
6236 wv y 2721 wv respectivamente
Es necesario hacer hincapieacute en que las diferencias obtenidas mediante el anaacutelisis
estadiacutestico entre cada una de las concentraciones de FA con respecto a la
generacioacuten de biomasa y la produccioacuten del compuesto no fueron significativas lo
que llevoacute a elegir una concentracioacuten de 05 gL de FA debido a que fue la menor
cantidad utilizada de este compuesto durante la investigacioacuten suponieacutendose asiacute
una disminucioacuten en los costos de materia prima
Palabras claves
Psilocybe cubensis Psilocibina Alcaloide HPLC Cultivo Sumergido Fuentes de
Carbono Fenilalanina
19
INTRODUCCIOacuteN
Los hongos son una rica fuente de productos naturales con una alta actividad
bioloacutegica Desafortunadamente el cultivo de eacutestos en cuerpo fructiacutefero toma
varios meses disminuyendo su calidad debido a los cambios climaacuteticos y plagas
por tal razoacuten se implementoacute la metodologiacutea de medio sumergido la cual es
prometedora gracias a una alta productividad de compuestos bioactivos (Arora
1986)
El Geacutenero Psilocybe pertenece al Reino Fungiacute con un Phylum Basidiomicota
una Clase Homobasidiomicetes un Orden Agaricales una Familia Strofariaceae
(Paris y Hurabielle 1981)
Dicho geacutenero es considerado de gran importancia a nivel mundial debido a que su
cuerpo fructiacutefero y biomasa micelial contienen Psilocibina la cual posee un alto
valor para la industria farmaceacuteutica por su uso en la elaboracioacuten de productos
antidepresivos Este alcaloide derivado de FA cuenta con una estructura muy
similar al neurotransmisor segregado por el cerebro llamado serotonina que
controla el estado de aacutenimo el suentildeo el hiacutegado y los rintildeones (Mandrile et al
1984) esta caracteriacutestica le otorga la gran importancia a la Psilocibina en el
mercado puesto que tiene un alto impacto en la sociedad como ayudante
antidepresivo debido a que no todas las personas segregan la cantidad necesaria
(10 mg con liacutemites que variacutean desde 5 a 20 mg) de serotonina (Mandrile et al
1984) Adicionalmente se estaacute empleando como una gran ayuda para la
disminucioacuten de la adiccioacuten a sustancias como heroiacutena y cocaiacutena gracias a que
este alcaloide no genera dependencia (Lee et al 2004)
Debido a que su consumo puede generar alucinaciones era consumido por las
culturas aboriacutegenes centroamericanas con el fin de realizar manifestaciones
20
religiosas Su uso se remonta a maacutes de 3500 antildeos y era nombrado por los
aztecas como ―Teonunaltl que significa ―carne de dioses (Mandrile et al 1984)
La alternativa que se utilizoacute durante esta investigacioacuten fue el cultivo del P
cubensis mediante medio sumergido debido principalmente a las notables
ventajas frente a los sistemas convencionales que eacuteste posee entre las cuales se
destacan la disminucioacuten del tiempo para la obtencioacuten de la biomasa (14 diacuteas) y la
reduccioacuten de los costos de obtencioacuten (Lee et al 2004) De acuerdo a lo
dimensionado anteriormente este estudio estaba orientado primordialmente a la
buacutesqueda de alternativas que permitieran la produccioacuten de biomasa de forma
raacutepida y confiable
Con el fin de llevar a cabo lo dicho anteriormente se pretendioacute evaluar el efecto
del uso de dos diferentes fuentes de carbono en este caso glucosa y sacarosa en
el crecimiento micelial de la cepa P cubensis
21
OBJETIVOS
GENERAL
Evaluar el efecto de la fuente de carbono en el crecimiento micelial de una
cepa Psilocybe sp
ESPECIacuteFICOS
Evaluar la cineacutetica de crecimiento de la cepa Psilocybe cubensis en los
diferentes medios de cultivo sumergido mediante la cuantificacioacuten de
biomasa por medio de la metodologiacutea de peso seco
Evaluar el consumo de sustrato para los diferentes ensayos por medio de
teacutecnicas espectrofotomeacutetricas
Determinar la presencia de Psilocibina mediante el uso del reactivo de
Dragendorff
22
1 MARCO TEOacuteRICO
11 CONCEPTOS GENERALES DE HONGOS
Los hongos son organismos eucariotas que no contienen clorofila con nutricioacuten
por absorcioacuten generalmente con reproduccioacuten sexual y asexual el cuerpo
consiste generalmente de filamentos ramificados con pared celular quitinosa
(Miles y Chang 1999)
Constituyen uno de los grupos de organismos maacutes importantes para la vida del
hombre ya que son los responsables de gran parte de la descomposicioacuten de la
materia orgaacutenica aumentando su disponibilidad en el suelo pueden ser
comestibles venenosos o psicotroacutepicos muchos son patoacutegenos otros producen
ciertas sustancias beneficiosas o intervienen en procesos de elaboracioacuten de
algunos comestibles (Miles y Chang 1999)
111 Hongos laminares (Agaricales)
El orden Agaricales tambieacuten conocido como Euagaricales es el mayor orden de
setas y hongos que incluye maacutes de la mitad de todas las especies conocidas de la
clase Homobasidiomycetes (Hibbett et al 1997 Hibbett y Thorn 2001) Maacutes de
9000 especies y alrededor de 350 geacuteneros se han atribuido a este orden que
contiene 26 familias (Kirk et al 2001) Un consenso de mayor nivel de
clasificacioacuten de los Agaricales ha sido difiacutecil de lograr debido a la competencia de
sistemas que restringen geacuteneros y familias (o incluso orden) de diferentes
maneras (Bas 1998 Juumllich 1981 Kirk et al 2001 Kuumlhner 1980 Singer 1986)
23
La base para la clasificacioacuten de los hongos fue construida por Fries (1874) quien
hizo hincapieacute en las caracteriacutesticas macroscoacutepicas como la textura del tallo la
separacioacuten de los filamentos (laminas) presencia o ausencia de velo y color de las
esporas
Posteriormente dividioacute los hongos Agaricales en varias especies de acuerdo al
color de las esporas depositadas las cuales pueden ser de color blanco rosado
marroacuten puacuterpura ndash marroacuten y negro El sistema macroscoacutepico de Fries que
reconocioacute inicialmente 12 geacuteneros de hongos carnosos que forman los hongos es
taxonoacutemicamente praacutectico Eacuteste fue relativamente invariable hasta que Fayod
(1989) estudioacute la anatomiacutea y las caracteriacutesticas microscoacutepicas de muchos
Agaricales reconociendo 108 geacuteneros (Arora 1986)
Al igual que todas las setas los hongos laminares son faacutebricas de esporas
creados con el uacutenico propoacutesito de fabricar esporas microscoacutepicas para dejarse
llevar por las corrientes de aire y con suerte caer en un lugar adecuado en la
tierra para germinar y comenzar un nuevo organismo Las probabilidades de que
cualquier individuo que tiene esporas de este tipo tenga suerte son tan bajas que
el hongo produce millones de esporas para compensar esto En las laacuteminas se
encuentran numerosas esporas las cuales aumentan considerablemente el
nuacutemero de esporas que el hongo puede producir Ambos lados de cada laacutemina
estaacute cubierta con esporas microscoacutepicas (Kuo 2007) A continuacioacuten se muestra
de manera ilustrativa en la figura 1 las laacuteminas que poseen los hongos Agaricales
en las cuales se da la formacioacuten de las esporas
Figura 1 Hongo Agaricales (Laminar) (Kuo 2007)
24
12 MEDIOS DE CULTIVO
Uno de los sistemas maacutes importantes para la identificacioacuten de microorganismos es
observar su crecimiento en sustancias alimenticias artificiales preparadas en el
laboratorio El material alimenticio en el que crecen los microorganismos es el
medio de cultivo (Garciacutea 1995)
Para que los microorganismos crezcan adecuadamente en un medio de cultivo
artificial eacuteste debe reunir una serie de condiciones como lo son temperatura
grado de humedad y presioacuten asiacute como un grado correcto de acidez o alcalinidad
Un medio de cultivo contiene los nutrientes y factores de crecimiento necesarios
para que el microorganismo se desarrolle correctamente y debe estar exento de
cualquier tipo de microorganismo que pueda generar contaminacioacuten (Garciacutea
1995)
121 Tipos de medios de cultivo
En la actualidad existen diversos tipos de medio de cultivo si se centra en la
composicioacuten eacutestos pueden ser medios sinteacuteticos que contienen fuente de
carbono fuente de nitroacutegeno sales que suplan los iones y demaacutes elementos tales
como estimuladores del crecimiento medios complejos que contienen ingredientes
tales como extracto de levadura peptona infusioacuten de cerebro etc ricos en
nutrientes medios de enriquecimiento siendo estos complejos con aditivos
adicionales para favorecer asiacute al crecimiento y desarrollo de determinados
microorganismos medios selectivos los cuales son disentildeados para favorecer el
crecimiento especiacutefico de un microorganismo determinado o un grupo
microbiano medios diferenciales que proporcionan la distincioacuten microbiana de una
mezcla por sus propiedades diferenciales de crecimiento en dichos medios
medios de mantenimiento siendo disiacutemiles de los de crecimiento oacuteptimo por el
25
crecimiento raacutepido y proliacutefico que deriva en la muerte raacutepida de las ceacutelulas (Garciacutea
1995)
Atendiendo a su estado los medios de cultivo pueden presentarse como medios
sumergidos y medios soacutelidos que contienen agar que gelifica por debajo de 45
degC y cuya concentracioacuten en su uso es de 15 y medios semisoacutelidos que contiene
un agar a una concentracioacuten de 07 (Garciacutea 1995)
121 Medio sumergido
Debido a que cultivar el cuerpo fructiacutefero toma varios meses y se dificulta el control
de calidad del producto final porque se estaacute sujeto a los cambios permanentes del
clima y las plagas se ha empleado la metodologiacutea de medio sumergido la cual es
una alternativa muy prometedora para la produccioacuten eficiente del micelio y de los
metabolitos (Lindequist y Niedermeyer 2005)
Dicha forma es la mejor para producir extraer y purificar metabolitos de un cultivo
de hongo ya que facilita una mayor produccioacuten de biomasa en menor tiempo y
de mayor calidad que el cultivo en medio soacutelido ademaacutes facilita la dispersioacuten y
adaptacioacuten del hongo y reduce los vectores de contaminacioacuten De igual forma un
cultivo de esta iacutendole es la opcioacuten maacutes viable si se quiere escalar procesos
fermentativos en aras de desarrollar mercados como en este caso el de
metabolitos medicinales (Navarro et al 1998)
A su vez el uso de cultivo sumergido puede beneficiar la produccioacuten de muchos
metabolitos secundarios y disminuir los costos de produccioacuten por reducir las
labores que involucran los meacutetodos de etapas soacutelidas (Domiacutenguez y Webb 2003)
Los metabolitos bioactivos de los hongos pueden ser potencialmente producidos a
nivel industrial mediante el uso de la metodologiacutea de cultivo sumergido pero el
26
eacutexito a escala comercial depende del costo comparado con la tecnologiacutea existente
y la ventaja econoacutemica que la industria puede ver usando este meacutetodo El uso de
la tecnologiacutea puede ser facilitada por el aumento en el rendimiento de la
produccioacuten y el desarrollo del sistema (Hwang et al 2004)
El cultivo de hongos sumergidos se caracteriza por un aumento en la viscosidad
del caldo con el tiempo debido a uno o maacutes factores tales como el aumento de la
concentracioacuten de ceacutelulas los cambios de la morfologiacutea del crecimiento o la
produccioacuten de productos extracelulares que alteran el caraacutecter reoloacutegico de la
cultura del liacutequido El aumento en la viscosidad puede ser visto como un fenoacutemeno
indeseable pero inevitable ya que causan dificultades en el suministro de oxiacutegeno
en la eliminacioacuten de dioacutexido de carbono y en posibles problemas de agitacioacuten
(Hwang et al 2004)
13 ALCALOIDES
131 Generalidades
La diversidad estructural y la variedad en la actividad bioloacutegica hacen de los
alcaloides como tambieacuten de los antibioacuteticos los grupos maacutes importantes entre las
sustancias naturales de intereacutes terapeacuteutico (Paris y Hurabielle 1981)
Se han aislado principalmente en plantas superiores y se han encontrado en maacutes
de 100 familias de Faneroacutegamas (aquellas plantas que se reproducen por semillas
producidas en sus inflorescencias) Su actividad bioloacutegica a nivel del sistema
nervioso dio pie a las primeras investigaciones siendo los alcaloides las primeras
sustancias naturales estudiadas (Paris y Hurabielle 1981)
El teacutermino alcaloide propuesto por el farmaceacuteutico W Meissner en 1819 se aplicoacute
a los compuestos de origen vegetal con propiedades alcalinas este caraacutecter
baacutesico es debido a la presencia de nitroacutegeno amiacutenico en su estructura Los
27
alcaloides se pueden considerar como ―Un compuesto orgaacutenico de origen natural
nitrogenado derivados generalmente de aminoaacutecidos maacutes o menos baacutesico de
distribucioacuten restringida con propiedades farmacoloacutegicas importantes a dosis bajas
y que responden a reacciones comunes de precipitacioacuten (Paris y Hurabielle
1981)
132 Propiedades fisicoquiacutemicas
Los alcaloides tienen masas moleculares que variacutean entre 100 y 9000 gmol son
casi siempre incoloros son normalmente soacutelidos a temperatura ambiente a
excepcioacuten de los alcaloides no oxigenados Los alcaloides son poco solubles en
agua gracias a su caraacutecter baacutesico dicho caraacutecter se debe al par de electrones
libres del nitroacutegeno (Paris y Hurabielle 1981)
En la naturaleza se encuentran en forma de sales generalmente En las plantas
se consideraba que eran productos obtenidos durante la extraccioacuten y poco
solubles en disolventes tiacutepicos de extraccioacuten por su polaridad Son solubles en
disolventes orgaacutenicos como cloroformo etanol metanol acetato de etilo eacuteter
benceno En forma de sales son solubles en agua excepto las sales de berberina
(Paris y Hurabielle 1981)
Todos los alcaloides son activos a la luz polarizada Presentan una fluorescencia
caracteriacutestica bajo la luz UV o IR dando lugar a espectros caracteriacutesticos (Paris y
Hurabielle 1981)
133 Reconocimiento de los alcaloides
Las teacutecnicas de reconocimiento son basadas en la capacidad que tienen los
alcaloides en estado de sal (extractos aacutecidos) de combinarse con el yodo y
metales pesados como bismuto mercurio tungsteno formando precipitados se
28
utilizan reactivos generales para detectar alcaloides como reactivo de Wagner
reactivo de Mayer reactivo de Dragendorff reactivo de Hager reactivo de
Bertrand reactivo de Ehrlich y reactivo de Vitali-Morin (Paris y Hurabielle 1981)
134 Clasificacioacuten de los alcaloides
Habitualmente los alcaloides se han clasificado en funcioacuten de su estructura
distinguieacutendose principalmente los compuestos heterociacuteclicos de los no
heterociacuteclicos Actualmente existen varias formas de clasificarlos (Bruneton
1987) entre ellas se pueden distinguir
1341 Alcaloides alifaacuteticos
a Derivados de la ornitina (pirrolidinas tropaacutenicos pirrolizidiacutenicos)
b Derivados de la lisina (piperidinas quinolizidiacutenicos)
1342 Alcaloides de origen diverso
a Alcaloides terpeacutenicos y esteroidales
b Alcaloides diversos (purinas macrociclos etc)
1343 Alcaloides aromaacuteticos
a Derivados del aacutecido nicotiacutenico (piridinas)
b Derivados de la fenilalanina y tirosina (isoquinoleinas)
c Derivados del triptofano (indoacutelicos quinoleinas)
d Derivados de la histidina (imidazoles)
29
Alcaloides derivados del triptofano (Alcaloides Indoacutelicos)
Desde el punto de vista farmacoloacutegico ha habido mucho intereacutes sobre las bases
que contienen el nuacutecleo indoacutelico a raiacutez del descubrimiento de la actividad
alucinoacutegena del LSD asiacute como la actividad sedante de la reserpina aislada del
geacutenero Rauwolfia El auge del estudio fitoquiacutemico ocurrioacute en la deacutecada de los 60 y
se dirigiacutea principalmente a la familia Apocynaceae (Mercano y Hasegawa 1991)
Existen unos 800 alcaloides de este tipo distribuidos principalmente en la familia
Apocynaceae (geacuteneros Rauwolfia Aspidos-perma Strychnos y Vinca) menos
frecuentes en hongos y familias como Leguminoseae Malphigiaceae Rubiaceae y
Rutaceae donde los alcaloides presentan el grupo indoacutelico sencillo (Mercano y
Hasegawa 1991)
El triptofano es el precursor de estos alcaloides los cuales se clasifican en
triptaminas y en no triptaminas las triptaminas a su vez se subdividen en b-
carbolinas y en indoleninas y pueden ser triptaminas simples o triptaminas
complejas y estas pueden ser isopreacutenicas o no isopreacutenicas (Mercano y Hasegawa
1991) La figura 2 muestra la estructura quiacutemica del triptofano triptamina y sus
divisiones
Figura 2 Alcaloides derivados del Triptofano (Mercano y Hasegawa 1991)
30
Triptaminas simples
Las triptaminas simples juegan un importante papel en la cultura indiacutegena de
Ameacuterica por sus efectos alucinoacutegenos y extaacuteticos en sus ceremonias maacutegico
religiosas (Furst 1994) Se han encontrado en hongos alucinoacutegenos de
Mesoameacuterica del geacutenero Psilocybe Stropharia y Conocybe (―teonacatl o ―carne
de los dioses) usados por los indios Aztecas en sus ceremonias religiosas desde
hace maacutes de 1700 antildeos Se han encontrado en estos hongos los alcaloides
alucinoacutegenos la Psilocina y la Psilocibina que al ingerirlos produce diferentes
sensaciones auditivas y visuales relajacioacuten muscular depresiones y euforias
alternadas (Mercano y Hasegawa 1991)
La serotonina que juega un importante papel en la actividad neuronal se
encuentra tambieacuten en vegetales Se ha aislado en el pericarpio del banano el cual
seco cuando es fumado actuacutea como un alucinoacutegeno ligero (Seigler 1981)
De las glaacutendulas paroacutetidas del sapo comuacuten Bufo vulgaris se aiacutesla la bufotenina
derivado N-dimetilado de la serotonina que tambieacuten es el principio activo del Yopoacute
polvo de las semillas de Anadenanthera peregrina (Piptadenia peregrina)
Leguminoseae y especies del geacutenero Virola (Myristicaceae) que contiene tambieacuten
triptaminas son mezclados con cenizas e inhalados por medio de tubos de bambuacute
por los indiacutegenas del Orinoco en ceremonias maacutegico religiosas produciendo
alucinacioacuten e incoordinacioacuten motriz (Seigler 1981)
En la figura 3 se observan las estructuras de aquellos compuestos que estaacuten
clasificados como triptaminas simples
31
Figura 3 Triptaminas simples (Seigler 1981)
13 PSILOCIBINA Y PSILOCINA
La Psilocibina y la Psilocina son bioloacutegicamente sintetizadas en los hongos
pertenecientes a los geacuteneros de Psilocybe (Bigwood y Beug 1982 Wurst et al
1984)
La Psilocibina y la Psilocina se han identificado en todo el mundo en una variedad
de setas que son llamados hongos maacutegicos La ingestioacuten de pequentildeas
cantidades de alucinoacutegenos provoca el eacutextasis La actividad alucinoacutegena de la
Psilocibina es relativamente maacutes baja que la de la Psilocina Sin embargo la
Psilocibina se convierte faacutecilmente en Psilocina (componente activo principal) en
los sistemas bioloacutegicos Asiacute el desarrollo de un meacutetodo de determinacioacuten de la
Psilocibina es importante lo misma que la de la Psilocina (Kimie et al 2005)
La hidroacutelisis de la Psilocibina se consigue saturando con anhiacutedido carboacutenico una
solucioacuten acuosa de Psilocibina (para eliminar el oxiacutegeno del aire y calentaacutendola)
obteniendo asiacute una moleacutecula de 4hidroxi-dimetiltriptamina y una moleacutecula de aacutecido
fosfoacuterico (Mandrile et al 1984)
Como todos los faacutermacos derivados del indol estas sustancias han despertado
intereacutes porque se sospechoacute la posibilidad de que algunas de ellas se formen en el
32
organismo y que en ciertas psicosis especialmente en la esquizofrenia se
produzcan elevados niveles sanguiacuteneos que ocasionan algunos de los siacutentomas
(Mandrile et al 1984)
La figura 4 muestra la estructura quiacutemica de alcaloides como la Psilocibina y
Psilocina
Figura 4 Psilocibina y Psilocina (Mandrile et al 1984)
131 Antecedentes acerca de la obtencioacuten de Psilocibina y Psilocina
Una gran variedad de meacutetodos cromatograacuteficos para la determinacioacuten de
Psilocibina y Psilocina presentes en las incautaciones de hongos se han
publicado La cromatografiacutea de capa fina es utilizada debido a que eacutesta es muy
apropiada para la deteccioacuten de sustancias derivadas del triptofano (Brown et al
1972 Tanimukai 1967 Beug y Bigwood 1981) Aun asiacute meacutetodos que involucran
tanto la cromatografiacutea de alta eficiencia (HPLC) como la deteccioacuten fotomeacutetrica de
UV (Beug y Bigwood 1981 Wurst et al 1984 Borner y Brenneisen 1987 Perkal
et al 1980 Vanhaelen-Faestreacute y Vanhaelen 1984 Thomson 1980 White 1979
Sottolano y Lurie 1983) fueron establecidas y optimizadas para la cuantificacioacuten
de Psilocibina
Durante los uacuteltimos antildeos se han venido utilizando diferentes tipos de columna y
fase moacutevil con el fin de obtener la mayor cantidad posible de la sustancia de
intereacutes (Psilocibina)
33
En el antildeo 1981 en el instituto farmaceacuteutico de la Universidad de Oslo realizaron
una investigacioacuten con una columna de siacutelice con una fase moacutevil de metanol-nitrato
de amonio en donde no soacutelo se logroacute obtener Psilocibina y Psilocina sino tambieacuten
un nuevo producto conocido como beocistiacuten Se logroacute un porcentaje de separacioacuten
maacutexima de 75 ww (Christiansen et al 1981)
Asimismo en el antildeo 1984 en el instituto de microbiologiacutea de Amsterdam se
realizoacute un estudio con una columna C18 de siacutelice y una fase moacutevil de agua-etanol-
aacutecido aceacutetico de forma isocraacutetica en donde se obtuvo un porcentaje 025-115
y 002-016 de Psilocibina y Psilocina respectivamente en el hongo (Wurst
1984)
De igual manera en el antildeo 2003 en el instituto de ciencia policiaca en Japoacuten se
ejecutoacute la cromatografiacutea de alta eficiencia utilizando una columna C18 con una
fase moacutevil de aacutecido foacutermico de forma isocraacutetica y un detector de 220 nm un rango
de porcentaje de Psilocibina 014-042 wv en la capa mientras un 009-03
wv en el tallo (Tsujikawa et al 2003)
34
2 MATERIALES Y MEacuteTODOS
21 LOCALIZACIOacuteN
Las fermentaciones la medicioacuten del crecimiento micelial y la cuantificacioacuten del
consumo del sustrato y de proteiacutena se llevaron a cabo en el laboratorio de
Biotecnologiacutea de la Universidad EAFIT mientras que los anaacutelisis de cromatografiacutea
liacutequida de alta eficiencia (HPLC) se realizaron en el laboratorio de Quiacutemica
Instrumental de dicha Universidad
22 MICROORGANISMO DE ESTUDIO
La cepa del hongo Psilocybe cubensis (EAH01) con la cual se trabajoacute fue donada
por Joseacute Rodrigo Moreno Ingeniero del laboratorio de la Universidad Catoacutelica de
Oriente (UCO) La EAH01 permanece auacuten en el laboratorio de Biotecnologiacutea de la
Universidad EAFIT
Dicha cepa se cultivoacute en una caja Petri que conteniacutea Agar Extracto de Malta
(MEA) y se incuboacute a 30ordmC en una incubadora digital del laboratorio de
Biotecnologiacutea de la Universidad EAFIT La figura 5 representa una cepa de P
cubensis cultivada en medio soacutelido MEA
Figura 5 Psilocybe cubensis (EAH01) cultivada en medio soacutelido Agar Malta
35
23 COMPONENTES DEL MEDIO DE CULTIVO (FANG-ZHONG)
El medio sumergido utilizado para llevar a cabo las diferentes fermentaciones de
P cubensis fue el descrito por Fang-Zhong (2002) La tabla 1 muestra los
componentes de dicho medio y la concentracioacuten de cada uno de ellos Se destaca
que las fuentes de carbono utilizadas fueron glucosa y sacarosa usaacutendolas cada
una por separado para cada experimento y haciendo variaciones de
concentraciones de las mismas para los distintos ensayos
Tabla 1 Composicioacuten del medio de cultivo sumergido para evaluar el crecimiento micelial del P cubensis
Componentes Cantidad (gL)
Fuente de Carbono 30 ndash 50 - 70
Peptona 5
Extracto de levadura 5
KH2PO4 1
MgSO47H2O 05
Vitamina B1 005
24 PREPARACIOacuteN DE LOS DIFERENTES PREINOacuteCULOS DE P cubensis
EMPLEADOS PARA LAS FERMENTACIONES SUMERGIDAS
Con el propoacutesito de llevar a cabo cada uno de los ensayos fue necesario realizar
la preparacioacuten de un preinoacuteculo eacutesto con el fin de realizar un proceso de
adaptacioacuten del P cubensis al medio favoreciendo la disminucioacuten en cuanto a
tiempo (preferiblemente la eliminacioacuten de la aparicioacuten de un fase de latencia una
vez comenzada la fermentacioacuten)
La preparacioacuten de cada uno de los preinoacuteculos se realizoacute en 6 erlenmeyers de
1000 mL con 200 mL de medio cada uno los cuales fueron esterilizados a 120degC
por 15 minutos e inoculados con 4 discos de 5 mm aproximadamente de P
36
cubensis provenientes de la cepa previamente activada en Agar Malta durante 6
diacuteas Los erlenmeyers se llevaron a un agitador orbital por 6 diacuteas a 30ordmC y 100
rpm
25 PREPARACIOacuteN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO Y LOS INOacuteCULOS DE P
cubensis UTILIZADOS PARA LAS FERMENTACIONES SUMERGIDAS
Una vez realizado el preinoacuteculo se procedioacute a preparar los medios de cultivo
utilizados para realizar los distintos experimentos de la siguiente manera se
prepararon medios que diferiacutean en la fuente de carbono (glucosa o sacarosa) y en
la concentracioacuten de la misma (30 gL 50 gL y 70 gL) teniendo asiacute un total de
seis fermentaciones Las demaacutes cantidades de los componentes del medio de
Fang-Zhong fueron las mismas que las usadas en el preinoacuteculo descritas en la
Tabla 1
En primer lugar se llevaron a cabo las tres fermentaciones de glucosa
preparando un total de 90 erlenmeyers (30 por cada concentracioacuten de azuacutecar por
duplicado) cada uno de los frascos conteniacutea 50 mL del medio en erlenmeyers de
250 mL e inoculados con 01 g de peso huacutemedo del preinoacuteculo aproximadamente
Los 90 frascos se llevaron durante 14 diacuteas a un agitador orbital a 100 rpm con una
temperatura de 30 degC
Posteriormente se llevaron a cabo las tres fermentaciones de sacarosa siguiendo
el mismo proceso descrito anteriormente para la glucosa
Una vez terminadas las fermentaciones de glucosa y sacarosa y realizados todos
los anaacutelisis correspondientes (generacioacuten de biomasa consumo de sustrato
consumo de proteiacutena y evaluacioacuten de la presencia de Psilocibina por medio de
cromatografiacutea liacutequida de alta eficiencia (HPLC)) se procedioacute a elegir la fuente de
carbono y concentracioacuten que mejores resultados arrojoacute tanto para la generacioacuten
37
de biomasa como para la produccioacuten del alcaloide con el fin de evaluarla
nuevamente adicionaacutendole un precursor (FA)
Para finalizar se procedioacute a preparar los medios con la fuente de carbono y la
concentracioacuten de la misma que arrojoacute mejores resultados es decir los ensayos
realizados con una concentracioacuten de 50 gL de glucosa adicionaacutendole al medio
FA a diferentes concentraciones correspondiente a valores de 05 gL 10 gL y
15 gL las demaacutes cantidades de los componentes remanentes del medio fueron
las mismas que las descritas anteriormente en la tabla 1
26 CUANTIFICACIOacuteN DEL CRECIMIENTO DE BIOMASA MEDIANTE LOS
MEacuteTODOS DE PESO HUacuteMEDO Y PESO SECO PARA CULTIVO
SUMERGIDO DE P cubensis
La cuantificacioacuten de biomasa para cada uno de los tratamientos se realizoacute usando
la metodologiacutea de peso huacutemedo y peso seco Para la cuantificacioacuten de biomasa
mediante el meacutetodo de peso huacutemedo se tomaron dos muestras provenientes de
cada erlenmeyer cada 24 horas las cuales fueron filtradas y pesadas con el fin de
obtener el valor de peso huacutemedo para cada tratamiento del P cubensis
Posteriormente la biomasa retenida en el papel filtro fue llevada a un secador que
se encontraba a una temperatura de 50ordmC durante 24 horas transcurrido el
tiempo la biomasa seca fue pesada con el fin de obtener datos de peso seco
Durante los 14 diacuteas de la fermentacioacuten se obtuvieron datos de peso huacutemedo y
peso seco por duplicado para cada una de las fermentaciones
27 AJUSTE DE LA CINEacuteTICA DE CRECIMIENTO DE P cubensis AL
MODELO CINEacuteTICO LOGIacuteSTICO
Una vez realizada la recoleccioacuten de muestras para cada uno de los ensayos y su
posterior anaacutelisis se decidioacute modelar dichos datos mediante el modelo logiacutestico
38
(ecuacioacuten 1) el cual permite obtener variables cineacuteticas tales como la cantidad de
biomasa inicial (Xo) y la velocidad maacutexima de crecimiento (micromaacutex) para cada uno de
los tratamientos
Se decidioacute emplear el modelo logiacutestico ya que eacuteste muestra resultados maacutes reales
cuando se cultivan hongos debido a que su morfologiacutea es muy diferente a otros
microorganismos (pellets) dificultando la transferencia de masa (Bailey et al
1986)
Una vez linealizada la ecuacioacuten que describe dicho modelos se llega a la siguiente
expresioacuten
Ecuacioacuten 1 Ecuacioacuten linealizada del modelo logiacutestico
Posterior a la linealizacioacuten de la ecuacioacuten se procedioacute a graficar Ln ((XmaacutexX)-1)
vs tiempo con el fin de obtener como pendiente la velocidad maacutexima de
crecimiento (micromaacutex) y como intercepto el Ln ((XmaacutexXo)-1) el cual permitioacute la
obtencioacuten de la concentracioacuten inicial de biomasa
Obtenieacutendose asiacute los paraacutemetros cineacuteticos para cada ensayo correspondientes a
micromax y Xo
Se debe definir la concentracioacuten maacutexima de biomasa (Xmaacutex) para poder hallar los
paraacutemetros cineacuteticos mediante dicho modelo cabe aclarar que dicho valor se toma
de los resultados de biomasa adquiridos para cada uno de los ensayos mediante
la metodologiacutea de peso seco este valor variacutea para cada fermentacioacuten
Una vez ajustados los datos de cada tratamiento al modelo logiacutestico se procedioacute a
calcular de manera teoacuterica los valores de X (biomasa) que variacutea con el tiempo
39
teniendo en cuenta los paraacutemetros cineacuteticos arrojados mediante el modelo
logiacutestico utilizando la siguiente ecuacioacuten
Ecuacioacuten 2 Valores teoacutericos de biomasa en el tiempo
Estos valores de X teoacutericos obtenidos mediante la foacutermula anterior se grafican con
respecto a los valores de X obtenidos de manera experimental con el fin de
observar el ajuste del modelo logiacutestico a cada uno de los datos experimentales
28 EVALUACIOacuteN DEL CONSUMO DE SUSTRATO Y DEL CONSUMO DE
PROTEIacuteNA POR PARTE DEL P cubensis CULTIVADO EN MEDIO
SUMERGIDO
Con el fin de evaluar el consumo de sustrato y proteiacutena por parte del P cubensis
durante las fermentaciones que conteniacutean glucosa en el medio se recolectaron
muestras cada 24 horas del liacutequido obtenido despueacutes de realizada la filtracioacuten de
la muestra que se utilizoacute para efectos de caacutelculo de peso seo dicho liacutequido
denominado sobrenadante fue almacenado a -4 degC Finalizadas cada una de las
fermentaciones se procedioacute a realizar el protocolo para evaluar el consumo de
sustrato para cada medio (Miller 1959) mediante el meacutetodo de DNS (Aacutecido
Dinitrosaliciacutelico) (Anexo 13) y el consumo de proteiacutenas mediante el meacutetodo de
LOWRY para cada fermentacioacuten (Anexo 15)
Para llevar a cabo la cuantificacioacuten de sustrato y proteiacutena en los distintos ensayos
fue necesario realizar las curvas de calibracioacuten correspondientes dichas curvas
con sus respectivos valores de concentracioacuten se muestran en los anexos 14 y 16
40
29 MEacuteTODO CUALITATIVO PARA DETERMINAR LA PRESENCIA DE
ALCALOIDES (PSILOCIBINA) MEDIANTE EL USO DEL REACTIVO DE
DRAGENDORFF
Como se mencionoacute anteriormente el reactivo de Dragendorff es usado para
determinar de manera cualitativa la ausencia o presencia de alcaloides en una
muestra determinada Para llevar a cabo dicha prueba se recolectaron muestras
de la biomasa seca correspondientes a los diacuteas 12 13 y 14 de cada fermentacioacuten
las cuales fueron almacenadas a -4degC
Para determinar la presencia de Psilocibina se realizoacute el proceso descrito seguacuten
Musshoff et al (2000) el cual consistioacute en macerar cada una de las muestras de
biomasa hasta obtener un polvo fino luego se pesaron 10 mg de dicho polvo y a
esta cantidad se le agregoacute 1 mL de metanol Posteriormente una pequentildea
cantidad de esta mezcla se esparcioacute en un papel filtro en donde se le adicionoacute una
gota del reactivo de Dragendorff
Una vez realizada la prueba se dice que la muestra contiene presencia de
alcaloides si eacutesta presenta una coloracioacuten rojizo-amarilla
210 MEacuteTODO PARA DETERMINAR LA PRESENCIA DE PSILOCIBINA
MEDIANTE CROMATOGRAFIacuteA LIacuteQUIDA DE ALTA EFICIENCIA (HPLC)
Una vez evaluada la presencia del alcaloide mediante el reactivo de Dragendorff
se procedioacute a determinar mediante el uso de cromatografiacutea liacutequida de alta
eficiencia (HPLC) la presencia de los alcaloides en la mezcla con sus respectivos
tiempos de retencioacuten para llevar a cabo la extraccioacuten de la Psilocibina se siguioacute el
meacutetodo descrito por Musshoff et al (2000) Para ello la muestra de biomasa
seca fue macera en un mortero hasta convertirla en un polvo fino Diez miligramos
41
de la muestra en polvo se extrajeron dos veces con 1 mL de metanol en un bantildeo
de ultrasonido durante 30 minutos Posterior a eacutesto se centrifugaron las muestras
a 3000 rpm durante 2 minutos el sobrenadante se depositoacute en un vial
independiente
El sobrenadante fue evaporado hasta sequedad bajo una corriente de nitroacutegeno
gaseoso Una parte de los residuos se disolvioacute en 200 microL de la fase moacutevil que
contiene HCOONH4 con una concentracioacuten 10 microM y un pH de 35
El equipo utilizado para realizar todos los anaacutelisis correspondientes a HPLC
cuenta con las siguientes caracteriacutesticas equipo Agient Technologies que consta
de una columna C18 de 46 mm 250 mm 5 mm con una fase moacutevil de
HCOONH4 con un flujo de 1 mLminuto un detector UV de 214 nm y una inyeccioacuten
de 20 μL y una temperatura de 25degC El experimento se corrioacute de modo isocraacutetico
con una fase moacutevil de agua 70 y HCOONH4 de 30
211 DETERMINACIOacuteN CUALITATIVA DE LA RESOLUCIOacuteN DEL
ALCALOIDE DE INTEREacuteS PARA LOS DIFERENTES ENSAYOS
Con el fin de determinar de manera cualitativa cuaacutel de los cromatogramas
arrojados mediante la teacutecnica de HPLC presentoacute mejor resolucioacuten del alcaloide
fue necesario realizar un supuesto acerca del tiempo de retencioacuten de la Psilocibina
durante la cromatografiacutea puesto que a pesar de haber contado con un
cromatograma (Tsujikawa et al 2003) (Anexo 18) y haber trabajado en las
mismas condiciones de eacuteste no se utilizoacute la misma fase moacutevil lo que puedo
generar variaciones en dicho tiempo Se asumioacute que el tiempo de retencioacuten varioacute
entre 62 y 72 minutos es decir entre este tiempo se encontroacute el pico de intereacutes
de la investigacioacuten
42
La eleccioacuten del criterio de pureza del compuesto de intereacutes se realizoacute observando
cuaacutel de los picos obtenidos muestra menor ruido es decir que a su alrededor no
tenga presencia de otros compuestos (Anexos 19 20 y 21)
212 DETERMINACIOacuteN PORCENTUAL DE COMPUESTOS PARA LOS
DIFERENTES ENSAYOS
La cuantificacioacuten de los compuestos se hizo mediante un porcentaje de aacuterea bajo
la curva debido a que no se contoacute con un estaacutendar interno
Para realizar dicho porcentaje se obtuvo la totalidad de las aacutereas presentes en el
perfil cromatograacutefico obtenido para las muestras de los diacuteas 12 13 y 14 de cada
fermentacioacuten y el porcentaje del aacuterea del metabolito de intereacutes la cual oscilaba
entre un tiempo de retencioacuten entre 62 y 72 minutos
En el momento de analizar los cromatogramas y de elegir el medio que mejor
resultados arrojoacute en cuanto a la produccioacuten de alcaloide se observoacute la resolucioacuten
del metabolito en cada una de las fermentaciones
213 CULTIVO SUMERGIDO DE P cubensis EN PRESENCIA DE FA
Despueacutes de haber elegido la fuente de carbono (glucosa) y su respectiva
concentracioacuten (50 gL) que mejores resultados arrojaron durante la investigacioacuten
se realizaron nuevamente fermentaciones del P cubensis en medio sumergido
(Fang-Zhong) donde la diferencia de estos medios con respecto a los
anteriormente utilizados radicoacute en la presencia de FA aminoaacutecido
Para dichas fermentaciones se contoacute con tres concentraciones diferentes de FA
(05 gL 1 gL 15 gL) realizadas por duplicado adicionalmente se montoacute
43
simultaacuteneamente con dichos ensayos las muestras correspondientes a los uacuteltimos
tres diacuteas de fermentacioacuten sin FA en el medio para efectos de comparacioacuten y asiacute
poder llevar a cabo un anaacutelisis estadiacutestico apropiado
Los datos obtenidos fueron analizados por medio de una ANOVA con el fin de
observar si existiacutean o no diferencias significativas en cuanto al crecimiento micelial
(concentracioacuten de biomasa) del P cubensis y asiacute poder determinar el medio que
mejores resultados arrojoacute durante la investigacioacuten
214 DISENtildeO DE EXPERIMENTOS Y ANAacuteLISIS ESTADIacuteSTICO
El disentildeo estadiacutestico utilizado para realizar los anaacutelisis correspondientes a las
diferentes fermentaciones es un disentildeo factorial 23 Este estudio se basoacute en dos
factores que fueron las dos fuentes de carbono (glucosa y sacarosa) a su vez se
apoyoacute en tres niveles que fueron la variacioacuten en la concentracioacuten de las mismas
(30 gL 50 gL y 70 gL) De igual manera se fundamentoacute en dos variables de
respuesta el crecimiento micelial de P cubensis y el porcentaje de Psilocibina
presente en el microorganismo
Por medio del Software Statgraphics plus 51 se realizoacute un anaacutelisis estadiacutestico
basado en una ANOVA factorial Con ello se pretendioacute comparar estadiacutesticamente
los resultados de crecimiento micelial de biomasa (concentracioacuten) y produccioacuten de
Psilocibina para cada uno de los medios durante los 14 diacuteas de fermentacioacuten y en
especial en los uacuteltimos tres diacuteas de la misma puesto que durante este periacuteodo fue
evaluada la presencia del alcaloide
Es necesario hacer hincapieacute que para realizar dicha estadiacutestica fue necesario
ejecutar un estudio de normalidad el cual se comproboacute utilizando la graacutefica de
probabilidad normal a su vez se requirioacute un anaacutelisis de igualdad de varianza por
medio de una graacutefica de residuos Vs previsto con el fin de ver visualmente la
44
hipoacutetesis de la homocedasticidad todo ello con el fin de garantizar que la
investigacioacuten se comportoacute de forma normal Adicionalmente se contoacute con una
hipoacutetesis nula (Ho) y una Hipoacutetesis alterna (Ha) las cuales permitieron realizar las
conclusiones respectivas A continuacioacuten se enunciaraacuten cada una de eacutestas y los
paraacutemetros necesarios para dicho estudio
Ho Todas las medias son iguales es decir no existen diferencias
significativas entre los datos analizados
Ha Alguna de las medias es diferente lo que quiere decir que siacute existen
diferencias significativas
Paraacutemetro
Pvalor gt 005 Se acepta Ho
Pvalor le 005 Se rechaza Ho
45
3 RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN
31 CINEacuteTICA DE CRECIMIENTO MICELIAL DE P cubensis EN CULTIVO
SUMERGIDO (FANG-ZHONG) UTILIZANDO DIFERENTES FUENTES DE
CARBONO
Con el propoacutesito de evaluar el crecimiento micelial del P cubensis en medio
sumergido durante los 14 diacuteas de la fermentacioacuten se recurrioacute al uso de
metodologiacuteas conocidas como peso huacutemedo y peso seco en dicho trabajo soacutelo se
exponen los datos arrojados por el meacutetodo de peso seco
A continuacioacuten se presentan cada una de las fermentaciones de acuerdo al tipo de
sustrato empleado en las mismas los respectivos valores de peso seco obtenidos
y los anaacutelisis pertinentes para cada uno de los casos
311 Crecimiento micelial de P cubensis en medio sumergido utilizando
diferentes concentraciones de glucosa
Inicialmente se evaluaron tres concentraciones de glucosa en el cultivo de P
cubensis en medio sumergido (Fang-Zhong) correspondientes a 30 gL 50 gL y
70 gL siendo en este caso la glucosa la principal fuente de carbono del P
cubensis
A continuacioacuten se muestran los valores de peso seco obtenidos para cada una de
las concentraciones de glucosa utilizadas durante los 14 diacuteas de la fermentacioacuten
46
0
01
02
03
04
05
06
07
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Bio
ma
sa (g
L)
Tiempo (diacuteas)30gL 50gL 70gL
Graacutefico 1 Cineacutetica de crecimiento micelial de P cubensis en medio sumergido (Fang-Zhong) utilizando tres diferentes concentraciones de
glucosa como fuente de carbono (Peso seco)
Del graacutefico 1 se puede observar que no hubo evidencia de fase de latencia para
ninguno de los ensayos posteriormente se aprecia que el crecimiento de biomasa
aumentoacute con el tiempo para las diferentes concentraciones de glucosa empleadas
Analizando las fermentaciones que conteniacutean 50 gL y 70 gL de glucosa se
puede afirmar que ambas presentan un comportamiento similar mostrando una
fase exponencial hasta el diacutea 11 y una fase estacionaria hasta el diacutea 14 de la
fermentacioacuten mientras que la fermentacioacuten que conteniacutea 30 gL de glucosa no
presentoacute fase estacionaria la fermentacioacuten durante los 14 diacuteas se encontraba en
fase exponencial a pesar de que entre los diacuteas 8 y 11 el crecimiento de P
cubensis se mantuvo constante
Asimismo se puede observar que el crecimiento maacutes bajo en cuanto a
concentracioacuten de biomasa se generoacute en la concentracioacuten de 30 gL siendo eacuteste
de 048 gL mientras que en las concentraciones de 50 gL y 70 gL de glucosa
los crecimientos maacuteximos fueron muy similares 055 gL y 062 gL
respectivamente
47
Lo dicho anteriormente se ratifica una vez analizados los resultados obtenidos
estadiacutesticamente donde se obtuvo un P-valor igual a cero indicando que existen
diferencias significativas en cuanto al crecimiento micelial de biomasa
(concentracioacuten de biomasa durante los 14 diacuteas de la fermentacioacuten) El graacutefico 2
ilustra la presencia de dos grupos homogeacuteneos lo que indica que las
concentraciones de 50 gL y 70 gL no tienen diferencias significativas del
crecimiento micelial entre cada una de ellas mientras que la concentracioacuten de 30
gL siacute presenta dichas diferencias significativas con respecto a las dos
concentraciones anteriores (Anexo 1)
Con todo eacutesto se expone que la concentracioacuten de glucosa de 50 gL es la que se
eligioacute debido a que es maacutes econoacutemico utilizar 50 gL de glucosa que 70 gL
Tratamientos con diferentes concentraciones de glucosa
Media 30 gL glucosa (a) 022
Media 50 gL glucosa (b) 032
Media 70 gL glucosa (b) 034
a
bb
0
005
01
015
02
025
03
035
04
045
Co
nce
ntr
acioacute
n b
iom
asa
(gL
)
Letras diferentes denotan diferencias significativas (prueba LSD)
Graacutefico 2 Crecimiento micelial de P cubensis en cultivo sumergido bajo tres concentraciones de glucosa
48
Modelo logiacutestico para las fermentaciones donde se utilizoacute glucosa
como fuente de carbono
Una vez realizada la cineacutetica de crecimiento del P cubensis en medio sumergido
(Fang-Zhong) usando diferentes concentraciones de glucosa se procedioacute a
ajustar los datos obtenidos al modelo logiacutestico Los crecimientos maacuteximos de
biomasa obtenidos mediante el meacutetodo de peso seco para cada uno de los
ensayos fueron 048 gL 065 gL y 062 gL para concentraciones de 30 gL 50
gL y 70 gL de glucosa respectivamente La tabla 2 muestra los paraacutemetros
cineacuteticos obtenidos mediante el modelo para cada una de las concentraciones
Tabla 2 Paraacutemetros cineacuteticos obtenidos mediante el modelo logiacutestico para las diferentes fermentaciones de P cubensis utilizando glucosa como fuente
de carbono
30gL 50gL 70gL
microx (diacutea-sup1) 016 microx (diacutea-sup1) 017 microx (diacutea-sup1) 015
micromax (diacutea-sup1) 027 micromax (diacutea-sup1) 035 micromax (diacutea-sup1) 034
X0 (gL) 005 X0 (gL) 008 X0 (gL) 008
R2 096 R2
092 R2 085
De la tabla 2 se puede observar que la concentracioacuten inicial de biomasa (Xo)
estuvo muy cercana para cada una de las concentraciones de glucosa utilizadas
Para 30 gL de glucosa la velocidad maacutexima de crecimiento (micromax) fue mucho
menor que la obtenida para 50 gL y 70 gL eacutesto pudo ser debido a que fue el
medio que menor cantidad de glucosa conteniacutea mientras que para las otras dos
concentraciones de glucosa la velocidad maacutexima de crecimiento fue similar
Al comparar las velocidades maacuteximas de las tres concentraciones de glucosa
utilizadas se evidencia que la fermentacioacuten que conteniacutea 50 gL presentoacute una
micromaacutex mayor correspondiente a 035 diacutea-1 esto sugiere que a mayores
concentracioacuten de glucosa (70 gL) puede ocurrir una inhibicioacuten por sustrato otro
49
criterio que afirma que dicha concentracioacuten fue la que mejores resultados arrojoacute de
las tres concentraciones de glucosa utilizadas para el crecimiento del P cubensis
en el medio de Fang-Zhong Ademaacutes se observa que este experimento fue el que
mayor velocidad especiacutefica de crecimiento presento siendo esta de 017 diacutea-1
Finalmente se calcularon los valores de biomasa teoacutericos utilizando la ecuacioacuten
descrita anteriormente en la metodologiacutea con el propoacutesito de observar que tanto
se ajustaron los valores de biomasa hallados experimentalmente con los valores
de biomasa teoacutericos arrojados por el modelo logiacutestico El graacutefico 3 muestra los
valores de biomasa (X) tanto teoacutericos como experimentales con respecto al
tiempo
0
01
02
03
04
05
06
07
0 2 4 6 8 10 12 14
Biom
asa
(gL
)
Tiempo (diacutea)
X exp (30 gL) X exp (50 gL) X exp (70 gL)
X teoacuterico (30 gL) X teoacuterico (50 gL) X teoacuterico (70 gL)
Graacutefico 3 Valores de concentracioacuten de biomasa experimental y teoacuterico
graficados con respecto al tiempo para las fermentaciones con diferentes concentraciones de glucosa
Al observar el graacutefico 3 se puede notar que para los ensayos de 50 gL y 70 gL
de glucosa los valores de biomasa teoacutericos se encuentran un poco desfasados de
los valores de biomasa hallados de manera experimental mientras que para el
ensayo que conteniacutea 30 gL de glucosa se observa un buen ajuste de los datos
50
obtenidos experimentalmente al modelo logiacutestico La tabla 2 reitera lo dicho
anteriormente al exponer los valores de R2 los cuales explican la relacioacuten que
tienen los datos teoacutericos con los experimentales
312 Crecimiento micelial del P cubensis en medio sumergido utilizando
diferentes concentraciones de sacarosa
Una vez evaluado el crecimiento de biomasa usando glucosa como fuente de
carbono se procedioacute a evaluar el efecto que teniacutea el cambio de la fuente de
carbono por sacarosa en el crecimiento micelial del P cubensis en medio
sumergido
El graacutefico 4 muestra de manera ilustrativa como fue el crecimiento micelial del P
cubensis para cada una de las concentraciones de sacarosa utilizadas durante los
14 diacuteas mediante el meacutetodo de peso seco
0
01
02
03
04
05
06
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Biom
asa (
gL)
Tiempo (diacuteas)
30 gL 50 gL 70 gL
Graacutefico 4 Cineacutetica de crecimiento micelial de P cubensis en medio sumergido (Fang-Zhong) utilizando diferentes concentraciones de sacarosa
como fuente de carbono (Peso seco)
51
En el graacutefico 4 se puede observar que tanto para una concentracioacuten de 30 gL
como para 70 gL de sacarosa el hongo llega a su fase estacionaria cerca del
quinto diacutea de la fermentacioacuten mientras que para una concentracioacuten de 50 gL se
observa un comportamiento diferente puesto que el microorganismo tiene un
crecimiento exponencial hasta el diacutea 5 en donde entra a una etapa de transicioacuten o
estacionaria durante 3 diacuteas aproximadamente luego de la cual inicia nuevamente
su crecimiento de forma exponencial hasta llegar al diacutea 11 en donde siacute empieza
su fase estacionaria
Al igual que en las tres fermentaciones que conteniacutean glucosa en estas
fermentaciones de sacarosa se observa mediante el graacutefico anterior que no hubo
presencia de fase de latencia
El crecimiento maacuteximo de biomasa en cuanto a concentracioacuten lo presentoacute aquella
fermentacioacuten que conteniacutea 70 gL de sacarosa el cual fue de 057 gL seguida de
la de 50 gL con un crecimiento maacuteximo de biomasa de 045 gL y posteriormente
la concentracioacuten de 30 gL obtuvo un crecimiento maacuteximo de 026 gL
De acuerdo al anaacutelisis estadiacutestico que se realizoacute para cada una de las
fermentaciones se dedujo que las diferencias en cuanto al crecimiento micelial de
biomasa con respecto a la concentracioacuten de la misma son significativas entre
cada una de las fermentaciones es decir fue diferente la concentracioacuten de
biomasa obtenida cuando se trabajoacute con cada una de distintas concentraciones de
sacarosa Lo dicho anteriormente se muestra a traveacutes del graacutefico 5 (Anexo 2)
52
Tratamientos con diferentes concentraciones de sacarosa
Media 30 gL sacarosa (a) 02
Media 50 gL sacarosa (b) 032
Media 70 gL sacarosa (c) 043
a
b
c
0
02
04
Co
nce
ntr
acioacute
n b
iom
asa
(gL
)
Letras diferentes denotan diferencias significativas (prueba LSD)
Graacutefico 5 Crecimiento micelial para tres diferentes concentraciones de sacarosa
Modelo logiacutestico para las fermentaciones donde se utilizoacute sacarosa
como fuente de carbono
Una vez realizadas las cineacuteticas de crecimiento del P cubensis para cada
concentracioacuten de sacarosa empleada se procedioacute a ajustar los datos obtenidos al
modelo logiacutestico cabe recalcar que es necesario establecer los crecimientos
maacuteximos de biomasa obtenidos para cada uno de los ensayos los cuales fueron
026 gL 045 gL y 057 gL para concentraciones de 30 gL 50 gL y 70 gL de
sacarosa respectivamente
Una vez aplicado el modelo logiacutestico para cada tratamiento se obtuvieron valores
de velocidad maacutexima de crecimiento y biomasa inicial para cada concentracioacuten de
sacarosa utilizada en el medio los cuales se muestran en la tabla 3
53
Tabla 3 Paraacutemetros cineacuteticos obtenidos mediante el modelo logiacutestico para las diferentes fermentaciones de P cubensis utilizando sacarosa como
fuente de carbono
30gL 50gL 70gL
microx (diacutea-sup1) 030 microx (diacutea-sup1) 014 microx (diacutea-sup1) 041
micromax (diacutea-sup1) 037 micromax (diacutea-sup1) 042 micromax (diacutea-sup1) 067
X0 (gL) 01 X0(gL) 01 X0 (gL) 011
R2 061 R2 089 R2 095
De la tabla 3 se ratifica que se utilizoacute una concentracioacuten inicial de biomasa igual
para cada una de las fermentaciones aproximadamente 01 gL ademaacutes se
observa un aumento en la velocidad maacutexima de crecimiento con respecto a la
cantidad de sacarosa empleada es decir que el hecho de haber aumentado la
concentracioacuten de sacarosa en el medio favorecioacute el aumento en la velocidad
maacutexima de crecimiento del P cubensis siendo eacutesta mayor cuando se trabajoacute a una
concentracioacuten de 70 gL de sacarosa De igual manera se aprecia que el
tratamiento que conteniacutea 70 gL de sacarosa presentoacute una velocidad especiacutefica de
crecimiento mayor que los demaacutes siendo eacutesta de 041 diacutea-1
Finalmente se calcularon los valores de biomasa teoacutericos el graacutefico 6 ilustra los
valores de biomasa (X) tanto teoacutericos como experimentales graficados con
respecto al tiempo
54
0
01
02
03
04
05
06
0 2 4 6 8 10 12 14
Bio
mas
a (g
L)
Tiempo (Diacutea)
X exp (30 gL) X exp (50 gL) X exp (70 gL)
X teoacuterico (30 gL) X teoacuterico (50 gL) X teoacuterico (70 gL)
Graacutefico 6 Valores de concentracioacuten de biomasa experimental y teoacuterico graficados con respecto al tiempo para las fermentaciones con diferentes
concentraciones de sacarosa
Del graacutefico 6 se puede observar como los valores de biomasa experimentales se
ajustaron a los valores de biomasa teoacutericos arrojados por el modelo logiacutestico lo
que quiere decir la cineacutetica de crecimiento del P cubensis en medio sumergido
cuando se utilizoacute 70 gL se ajustoacute correctamente al modelo logiacutestico lo que se
corrobora en la tabla 2 gracias al valor obtenido para el R2 que indica la relacioacuten
de los datos teoacutericos con respecto a los experimentales Por otro lado para las
fermentaciones de 30 gL y 50 gL de sacarosa a pesar de parecer que
presentaron un buen ajuste al calcular la relacioacuten de los datos teoacutericos con
respecto a los experimentales (R2) se concluye que el ajuste no fue tan bueno
55
313 Comparacioacuten entre el crecimiento micelial de P cubensis en los
cultivos sumergidos utilizando glucosa y sacarosa como fuente de
carbono
Ahora bien es igualmente importante realizar un anaacutelisis comparativo entre ambas
fuentes de carbono empleadas con el fin de determinar si existen o no diferencias
significativas entre dichas fuentes de carbono
De acuerdo al anaacutelisis estadiacutestico se dice que existen diferencias significativas del
crecimiento micelial del P cubensis en cuanto al diacutea y la concentracioacuten de
sustrato empleado es decir concentracioacuten de glucosa y sacarosa (Anexo 3) pero
se observa claramente que no hay diferencias significativas de dicho crecimiento
con respecto al tipo de sustrato utilizado debido a que el P-valor arrojado por la
estadiacutestica fue de 01217 lo que sugiere que se debe utilizar la sacarosa gracias
a la disminucioacuten de costos que se generariacutean durante el proceso todo ello gracias
al costo de la sacarosa es inferior al de glucosa Sin embargo para elegir la fuente
de carbono que mejores resultados arrojoacute no soacutelo se basoacute en la cantidad de
biomasa producida sino que se procedioacute a examinar los barridos espectrales
arrojados por el anaacutelisis de HPLC con el fin de determinar la fuente de carbono
que mejor resolucioacuten mostroacute del alcaloide que en esta investigacioacuten fue glucosa a
una concentracioacuten de 50 gL
De igual manera el graacutefico 7 muestra las medias obtenidas mediante el anaacutelisis
estadiacutestico para las fermentaciones trabajadas con glucosa y sacarosa Aun asiacute
es necesario hacer hincapieacute que eacuteste no es el criterio principal para la obtencioacuten
del medio que mejores resultados arrojoacute durante la investigacioacuten por lo tanto se
deben seguir realizando los diferentes anaacutelisis descritos anteriormente en este
trabajo
56
Tratamientos de las dos fuentes de carbono usadas sin FA (glucosa y
sacarosa)
Media para glucosa (a) 029
Media para sacarosa (a) 032
aa
0
01
02
03
Conc
entr
acioacute
n bi
omas
a (g
L)
Letras diferentes denotan diferencias significativas (Prueba LSD)
Graacutefico 7 Crecimiento micelial para dos diferentes fuentes de carbono (glucosa y sacarosa)
314 Crecimiento micelial del P cubensis en cultivo sumergido utilizando
glucosa y fenilalanina en el medio
Se decidioacute realizar un uacuteltimo ensayo acerca del efecto que teniacutea la adicioacuten de un
aminoaacutecido llamado Fenilalanina (FA) al medio Fang-Zhong sobre la produccioacuten
del alcaloide y por ende sobre la generacioacuten de biomasa
Debido a los anaacutelisis realizados anteriormente se concluyoacute que la mejor fuente de
carbono fue la glucosa a una concentracioacuten de 50 gL De la misma manera que
en los numerales anteriores se evaluoacute la cineacutetica del crecimiento micelial del P
cubensis mediante los meacutetodos de peso huacutemedo y peso seco Las mediciones
fueron realizadas por duplicado y promediadas para la fuente de carbono elegida
(glucosa 50 gL) y las diferentes concentraciones de FA en el medio
correspondientes a 05 gL 1 gL 15 gL con el fin de encontrar el medio que
mejores resultados arrojoacute en cuanto a crecimiento micelial y generacioacuten del
57
alcaloide de intereacutes Los datos obtenidos mediante el meacutetodo de peso seco se
muestran en el graacutefico 8
Cabe resaltar que junto con las tres fermentaciones de 05 gL 10 gL y 15 gL
de FA se montaron a su vez seis muestras correspondientes a los diacuteas 12 13 y
14 de la fermentacioacuten que conteniacutea 0 gL de FA eacutesto con el propoacutesito de analizar
los datos de manera estadiacutestica y poder hacer comparaciones con respecto a la
generacioacuten de biomasa y a la produccioacuten del alcaloide de intereacutes ambas medidas
con respecto a la concentracioacuten
0
01
02
03
04
05
06
07
08
09
1
11
12
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Biom
asa
(gL
)
Tiempo (diacuteas)
05 gL 1 gL 15 gL
Graacutefico 8 Cineacutetica de crecimiento micelial de P cubensis en medio sumergido (Fang-Zhong) utilizando diferentes concentraciones de FA y 50
gL de glucosa como fuente de carbono (Peso seco)
Al analizar el graacutefico 8 es decir el crecimiento micelial (concentracioacuten de
biomasa) seguacuten la concentracioacuten de FA en el tiempo se puede notar que no hubo
presencia de fase de latencia para ninguna de las concentraciones de FA
utilizadas ademaacutes el crecimiento de biomasa en cada caso se aprecia de manera
58
muy similar llegando los tres ensayos a la fase estacionaria el diacutea 12 de la
fermentacioacuten
Observando el graacutefico 8 se puede identificar que el mayor contenido de biomasa
fue de 108 gL obtenida el diacutea 13 para una concentracioacuten 10 gL de FA para
concentraciones de 05 gL y 15 gL de FA la concentracioacuten maacutexima de biomasa
fue 106 gL y 101 gL respectivamente Auacuten asiacute al considerar los resultados
obtenidos se puede ratificar que es indiferente la cantidad de FA necesaria para
obtener concentracioacuten de biomasa por ende se decide que el medio que mejores
resultados arrojoacute fue el que conteniacutea 05 gL FA debido a que fue la
concentracioacuten de FA que mejor resolucioacuten del alcaloide presentoacute paraacutemetro
observado mediante los cromatogramas obtenidos del anaacutelisis de HPLC (Anexos
19 20 y 21) y ademaacutes porque con dicha cantidad los costos de la materia prima
seriacutean menores Cabe resaltar que el uso de FA generoacute un aumento significativo
duplicando la produccioacuten de biomasa por lo tanto se testifica que siacute hubo
duplicacioacuten en cuanto a la concentracioacuten de biomasa en los medios que conteniacutea
FA con respecto a los medios que no conteniacutean FA se dice entonces que a su
vez se podriacutea haber generado mayor cantidad de Psilocibina en los medios que
teniacutean FA ya que dicho alcaloide se produce de manera intracelular por tal
razoacuten al aumentar la cantidad de biomasa en el medio se aumenta la cantidad de
dicho alcaloide
De igual manera se analizaron los datos estadiacutesticamente y se llegoacute a apreciar
que no existen diferencias significativas en cuanto a la produccioacuten de biomasa y la
cantidad de FA utilizada en el medio Del mismo modo al analizar la tabla de
contrastes muacuteltiple de rangos se reitera que siacute existen diferencias significativas
entre el crecimiento micelial de biomasa (concentracioacuten de biomasa) en el tiempo
cuando se trabajoacute con FA o sin eacuteste Eacutesto se puede observar en el graacutefico 9
(Anexo 4)
59
Tratamientos con y sin FA
Media 0 gL FA (a) 032
Media 05 gL FA (b) 065
Media 10 gL FA (b) 066
Media 15 gL FA (b) 069
a
b b b
0
01
02
03
04
05
06
07
08
09
Conc
entr
acioacute
n bi
omas
a (g
L)
Letras diferentes denotan diferencias significativas (Prueba LSD)
Graacutefico 9 Crecimiento micelial para glucosa a una concentracioacuten de 50 gL y tres diferentes concentraciones de FA
Modelo logiacutestico para las fermentaciones donde se utilizoacute 50 gL de
glucosa como fuente de carbono y diferentes concentraciones de FA
En primer lugar se fijaron los valores de crecimiento maacuteximo de biomasa para
cada una de las concentraciones obtenidos mediante el meacutetodo de peso seco con
el fin de hallar los paraacutemetros cineacuteticos mediante el modelo logiacutestico Los
crecimientos maacuteximos de biomasa obtenidos fueron los siguientes 106 gL 108
gL y 101 gL para concentraciones de 05 gL 10 gL y 15 gL de FA
respectivamente y 50 gL de glucosa
Una vez realizado el modelo logiacutestico para cada tratamiento se obtuvieron los
valores de velocidad maacutexima de crecimiento y concentracioacuten de biomasa inicial
para cada ensayo los cuales se muestran en la tabla 4
60
Tabla 4 Paraacutemetros cineacuteticos obtenidos mediante el modelo logiacutestico para las diferentes fermentaciones de P cubensis utilizando 50 gL de glucosa
como fuente de carbono y diferentes concentraciones de FA
05gL 10gL 15gL
microx (diacutea-sup1) 018 microx (diacutea-sup1) 012 microx (diacutea-sup1) 012
micromax (diacutea-sup1) 045 micromax (diacutea-sup1) 035 micromax (diacutea-sup1) 044
X0 (gL) 01 X0 (gL) 017 X0 (gL) 016
R2 095 R2 082 R2 088
Seguacuten los valores arrojados por el modelo logiacutestico que se encuentran
presentados en la tabla 4 se puede decir que se presentoacute una valor de biomasa
inicial similar para los tratamientos de 1 gL y 15 gL de FA mientras que para las
fermentaciones que conteniacutean 05 gL de FA se tiene una diferencia de un 50
aproximadamente Ademaacutes se puede observar que a la concentracioacuten de 05 gL
de FA es la que mayor velocidad maacutexima de crecimiento presenta siendo esta
045 diacuteamacrsup1 a su vez dicha concentracioacuten presentaacute la microx mayor correspondiente a
018 diacutea-1 Debido a eacutesto y al criterio de mejor resolucioacuten del alcaloide observado
en los anaacutelisis de HPLC (Anexos 19 20 y 21) se concluye que el medio que
mejores resultados arrojoacute durante la investigacioacuten para la generacioacuten de biomasa
y la produccioacuten de la Psilocibina es 05 gL de FA y 50 gL de glucosa
Finalmente se calcularon los valores de biomasa teoacutericos el graacutefico 10 muestra
los valores de biomasa (X) tanto teoacutericos como experimentales graficados con
respecto al tiempo
61
0
02
04
06
08
1
12
0 2 4 6 8 10 12 14 16
Bio
mas
a (g
L)
Tiempo (Diacutea)
X exp (05 gL) X exp (10 gL) X exp (15 gL)
X teoacuterico (05 gL) X teoacuterico (10 gL) X teoacuterico (15 gL)
Graacutefico 10 Valores de concentracioacuten de biomasa experimental y teoacuterico graficados con respecto al tiempo para las fermentaciones con diferentes
concentraciones de FA y 50 gL de glucosa
Se puede decir gracias al graacutefico 10 que los valores de biomasa experimentales
se ajustaron a los valores de biomasa teoacutericos hallados mediante el modelo
logiacutestico es decir la cineacutetica de crecimiento del P cubensis en medio sumergido
cuando se usaron diferentes concentraciones de FA en el medio se ajustoacute
correctamente al modelo logiacutestico esto se reitera con los valores de R2 mostrados
anteriormente en la tabla 4
32 ESTUDIO DE LA CINEacuteTICA DE CONSUMO DE SUSTRATO POR PARTE
DEL P cubensis CULTIVADO EN MEDIO SUMERGIDO (FANG-ZHONG)
La evaluacioacuten del consumo de sustrato durante la fermentacioacuten con respecto al
tiempo es de suma importancia puesto que eacuteste es el principal componente
limitante del crecimiento presente en el medio de cultivo
62
A continuacioacuten se analizaraacuten dichos consumos para los diferentes ensayos
321 Consumo de sustrato por parte del P cubensis en medio sumergido
utilizando diferentes concentraciones de glucosa
Una vez halladas las concentraciones de sustrato para cada una de las
fermentaciones que conteniacutean glucosa en el medio se procedioacute a graficar dichos
valores con respecto al tiempo
El graacutefico 11 ilustra los datos obtenidos sobre el consumo de sustrato de las tres
fermentaciones que conteniacutean glucosa y a su vez como se comportoacute el
crecimiento de biomasa para cada ensayo durante los 14 diacuteas de fermentacioacuten
0
01
02
03
04
05
06
07
0
10
20
30
40
50
60
70
80
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14B
iom
asa
(gL
)
Glu
cosa
(gL
)
Tiempo (diacuteas)
30 GL 50GL 70 GL 30gL 50gL 70gL
Graacutefico 11 Cineacutetica de consumo de sustrato por parte del P cubensis en medio sumergido utilizando diferentes concentraciones de glucosa como
fuente de carbono
Al observar el graacutefico 11 se expone que el P cubensis consumioacute mayor cantidad
de glucosa cuando esta estaba a una concentracioacuten de 70 gL correspondiendo a
63
un porcentaje de 62 mientras que para 50 gL y 30 gL fue de 23 y 30
respectivamente
Comparando el consumo de glucosa en sus diferentes concentraciones con el
crecimiento micelial del hongo se puede observar que a una concentracioacuten de
glucosa de 30 gL no soacutelo se tuvo un menor consumo de sustrato sino que
tambieacuten se generoacute un menor crecimiento de biomasa Mientras que a
concentraciones de 50 gL y 70 gL de glucosa a pesar de presentar diferencias
en cuanto al porcentaje de sustrato consumido el crecimiento micelial es similar
(no presenta diferencias significativas) lo que indica que el hongo no requiere
tanta concentracioacuten de glucosa para su crecimiento eacutesto se puede afirmar soacutelo
para este ensayo a estas condiciones
De igual manera en el graacutefico 11 al analizar la tendencia del consumo de
sustrato las concentraciones de glucosa de 50 gL y 70 gL presentan una
disminucioacuten notoria hasta el diacutea 11 para dicho consumo Esto se debe a que en
ese diacutea inicioacute la fase estacionaria del hongo en ambas fermentaciones en donde
el P cubensis requeriacutea alimento uacutenicamente para mantenerse y producir
metabolitos secundarios Mientras que para la concentracioacuten de glucosa de 30 gL
el consumo de glucosa fue muy poco a partir del quinto diacutea de la fermentacioacuten
esto se atribuye a que la cineacutetica de crecimiento micelial del P cubensis presentoacute
una fase estacionaria temprana entre los diacuteas 8 y 11 indicando que no necesitaba
consumir casi glucosa puesto que no estaba creciendo
322 Consumo de sustrato por parte del P cubensis en medio sumergido
utilizando diferentes concentraciones de sacarosa
Los datos obtenidos sobre el consumo de sacarosa para cada una de las
concentraciones utilizadas (30 gL 50 gL y 70 gL de sacarosa) durante los 14
diacuteas de la fermentacioacuten se muestran en el graacutefico 12 a su vez se ilustran en dicho
64
graacutefico el comportamiento del crecimiento micelial para cada ensayo durante los
14 diacuteas de fermentacioacuten para efectos de anaacutelisis
0
01
02
03
04
05
06
0
10
20
30
40
50
60
70
80
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Bio
mas
a (g
L)
Sac
aro
sa (g
L)
Tiempo (diacuteas)
30gL 50gL 70gL 30 gL 50 gL 70 gL
Graacutefico 12 Cineacutetica de consumo de sustrato por parte del P cubensis en medio sumergido utilizando diferentes concentraciones de sacarosa como
fuente de carbono
Al observar el graacutefico 12 se puede decir que el P cubensis consumioacute mayor
cantidad de sacarosa cuando eacutesta estaba a una concentracioacuten de 70 gL en el
medio presentando un porcentaje de consumo del 49 mientras que para las
concentraciones de 50 gL y 30 gL de sacarosa se tuvo un porcentaje de
consumo de 24 y 37 Esto igual que en el consumo de glucosa se puede
deber a que al tener mayor concentracioacuten de sustrato en el medio el P cubensis
genera mayor afinidad por el mismo haciendo que dicho hongo se consuma
grandes cantidades de sacarosa durante el tiempo
Igualmente se observa que aproximadamente en el noveno diacutea de la
fermentacioacuten las tres diferentes concentraciones de glucosa (30 gL 50 gL y 70
65
gL) se mantienen casi constantes en el tiempo ello gracias a que en este diacutea el
hongo se encontraba en fase estacionaria en los tres ensayos
323 Comparacioacuten entre el consumo de sustrato de P cubensis en los
cultivos sumergidos con diferentes fuentes de carbono
Con el fin de identificar cuaacutel de las dos fuentes de carbono fue consumida en
mayor proporcioacuten por parte del P cubensis se procedioacute a realizar un anaacutelisis
estadiacutestico donde comparamos las dos fuentes de carbono empleados con
respecto al consumo de sustrato obtenido (concentracioacuten de glucosa y sacarosa
en cada uno de los medios) donde se consiguioacute un P-valor de 00811 con
respecto al tipo de sustrato lo que indica que no existen diferencias en cuanto al
consumo de sustrato y el tipo del mismo es decir es indiferente cuaacutel de los dos
sustratos (glucosa o sacarosa) se utilice para que se del consumo del mismo por
parte del P cubensis Observacioacuten que se reitera en la tabla de contraste muacuteltiple
que muestra que se trabajoacute como un grupo homogeacuteneo Igualmente el graacutefico 13
muestra las medias de consumo de sustrato (concentracioacuten durante los 14 diacuteas)
obtenidas mediante el anaacutelisis estadiacutestico y reitera que no existen diferencias
significativas con respecto al tipo de sustrato utilizado para el cultivo del P
cubensis en medio sumergido (Anexo 5)
66
Tratamientos de las dos fuentes de carbono usadas sin FA (glucosa y sacarosa)
Media glucosa (a) 3431
Media sacarosa (a) 3678
a
a
32
34
36
38
Co
nce
ntr
acioacute
n s
ust
rato
(g
L)
Letras diferentes denotan diferencias significativas (Prueba LSD)
Graacutefico 13 Consumo de sustrato para cada una de las fuentes de carbono utilizadas
Aun asiacute al comparar los graacuteficos 11 y 12 se puede observar un mayor consumo
de glucosa que de sacarosa lo que lleva a concluir que es mejor emplear la
primera (glucosa)
324 Consumo de sustrato por parte del P cubensis en medio sumergido
utilizando glucosa y fenilalanina en el medio
Los datos obtenidos acerca del consumo de sustrato durante los 14 diacuteas de la
fermentacioacuten para cada uno de los medios que conteniacutean 50 gL de glucosa y
diferentes concentraciones de FA (05 gL 1 gL y 15 gL) se muestran en el
graacutefico 14 De igual manera se ilustran en dicho graacutefico las cineacuteticas de
crecimiento micelial para cada una de las fermentaciones que teniacutean 50 gL de
glucosa y diferentes concentraciones de FA con el fin de realizar los anaacutelisis
pertinentes
67
0
02
04
06
08
1
12
0
10
20
30
40
50
60
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Bio
mas
a (g
L)
Glu
cosa
50
gL
+ F
A (g
L)
Tiempo (diacuteas)
05gL 10gL 15gL 05 gL 1 gL 15 gL
Graacutefico 14 Cineacutetica de consumo de sustrato por parte del P cubensis en medio sumergido utilizando 50 gL de glucosa como fuente de carbono y
diferentes concentraciones de FA
Analizando el graacutefico 14 se puede decir que el consumo de glucosa durante el
tiempo fue igual para las fermentaciones que conteniacutea concentraciones de 1 gL y
15 gL de FA dichos consumos corresponde a valores de 23 mientras que
para el ensayo que teniacutea una concentracioacuten de 05 gL de FA el porcentaje de
consumo fue del 18 Asimismo se presentaron diferencias significativas en
cuanto al consumo de sustrato entre los diferentes ensayos
El graacutefico 15 expone las medias del consumo de sustrato (concentracioacuten) de cada
una de las muestras y las diferencias existentes entre ellas se evidencia que la
adicioacuten de FA disminuyoacute el consumo de glucosa ademaacutes que en los ensayos se
presentaron tres grupos homogeacuteneos diferentes En el primer grupo (a) que
contiene las fermentaciones del P cubensis con una concentracioacuten de 50 gL de
glucosa y en ausencia de FA se obtuvo una media de 356 gL la cual indica un
mayor consumo de sustrato Luego el segundo grupo (c) se compone de las
concentraciones de 1 gL y 15 gL de FA presentando una media de 413 gL y
de 426 gL respectivamente y el uacuteltimo grupo (b) corresponde a una
68
concentracioacuten de 05 gL de FA el cual presenta el menor consumo de glucosa al
exponer una media 466 gL
Seguacuten lo anterior y el graacutefico 15 se dice que siacute existieron diferencias significativas
en cuanto al consumo de sustrato (concentracioacuten durante los 14 diacuteas) en los
uacuteltimos tres diacuteas cuando se trabajo con FA y sin FA y a su vez se encontraron
diferencias significativas de la concentracioacuten de sustrato en el medio cuando se
teniacutea una concentracioacuten de FA correspondiente a 05 gL con relacioacuten a las otras
dos concentraciones de FA (10 gL y 15 gL) mientras que entre estas dos
uacuteltimas concentraciones de FA (10 gL y 15 gL) no se encontraron diferencias
significativas (Anexo 6)
Tratamientos con y sin FA
Media 0 gL FA (a) 3564
Media 05 gL FA (b) 466
Media 10 gL FA (c) 4131
Media 15 gL FA (c) 426
a
b c c
0
10
20
30
40
50
60
Conc
entr
acioacute
n su
stra
to (g
L)
Letras diferentes denotan diferencias significativas (prueba LSD)
Graacutefico 15 Consumo de sustrato para cada una de las concentraciones de FA utilizadas
69
33 ESTUDIO DE LA CINEacuteTICA DE CONSUMO DE PROTEIacuteNA POR PARTE
DEL P cubensis CULTIVADO EN MEDIO SUMERGIDO (FANG-ZHONG)
Las fuentes de proteiacutena que posee el medio de Fang-Zhong son extracto de
levadura y peptona que representan una cantidad de 10 gL para cada ensayo
eacutesta cantidad se mantuvo constante para cada fermentacioacuten
Se evaluoacute el consumo de proteiacutena por parte del P cubensis durante los 14 diacuteas
de la fermentacioacuten para cada uno de los ensayos
A continuacioacuten se analizan los resultados obtenidos para cada uno de los
tratamientos
331 Consumo de proteiacutena por P cubensis en medio sumergido utilizando
diferentes concentraciones de glucosa
Una vez se calcularon las concentraciones de proteiacutena en el medio para cada
ensayo se graficaron dichos valores con respecto al tiempo
El graacutefico 16 muestra como se comportoacute el consumo de proteiacutena con respecto al
tiempo para cada una de las tres concentraciones de glucosa utilizadas y a su vez
como se comportoacute el crecimiento de biomasa para cada ensayo durante los 14
diacuteas de fermentacioacuten
70
0
01
02
03
04
05
06
07
0
5
10
15
20
25
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Bio
mas
a (g
L)
Pro
tein
a (g
L)
Tiempo (diacuteas)
30 GL 50 GL 70 GL 30 gL Biomasa 50 gL Biomasa 70 gL Biomasa
Graacutefico 16 Cineacutetica de consumo de proteiacutena por parte del P cubensis en medio sumergido utilizando diferentes concentraciones de glucosa como
fuente de carbono
Analizando el graacutefico 16 se puede observar que el consumo de proteiacutena se dio
casi en su totalidad El ensayo que mayor consumo de proteiacutena presentoacute fue el
que conteniacutea 30 gL de glucosa arrojando un porcentaje de consumo del 98
mientras que las fermentaciones realizadas a concentraciones de 50 gL y 70 gL
de glucosa presentaron un porcentaje de consumo de proteiacutena del 91 y 90
respectivamente
Al enfocarnos en la relacioacuten existente entre el consumo de proteiacutena y el
crecimiento micelial del P cubensis se puede notar gracias al graacutefico 16 que la
relacioacuten es directamente proporcional debido a que el consumo de proteiacutena fue
permanente mientras el hongo se encontraba en fase exponencial es decir el P
cubensis necesitaba de la proteiacutena para aumentar su crecimiento mientras que en
el momento en que el microorganismo comenzoacute su fase estacionaria la
concentracioacuten de proteiacutena en el medio se mantuvo constante esto uacuteltimo soacutelo es
vaacutelido para concentraciones de 50 gL y 70 gL de glucosa puesto que ambas
llegaron a la fase estacionaria
71
332 Consumo de proteiacutena por P cubensis en medio sumergido utilizando
diferentes concentraciones de sacarosa
Una vez obtenidos los valores de consumo de proteiacutena para cada concentracioacuten
de sacarosa utilizada se precedioacute a graficarlos con respecto al tiempo dichos
datos se encuentran en el graacutefico 17 De igual manera en este graacutefico se
representa la cineacutetica de crecimiento de biomasa para el P cubensis de acuerdo a
las distintas concentraciones de sacarosa utilizadas
0
01
02
03
04
05
06
0
2
4
6
8
10
12
14
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Bio
mas
a (g
L)
Prot
eiacutena
(gL
)
Tiempo (diacuteas)
30 GL 50 GL 70 GL 30 gL 50 gL 70 gL
Graacutefico 17 Cineacutetica de consumo de proteiacutena por parte del P cubensis en medio sumergido utilizando diferentes concentraciones de sacarosa como
fuente de carbono
El graacutefico 17 ilustra el consumo casi en su totalidad de la proteiacutena para cada uno
de los tratamientos El ensayo que mayor consumo de proteiacutena presentoacute fue el
que conteniacutea 30 gL de sacarosa exponiendo un porcentaje de consumo del 89
mientras que las concentraciones de 50 gL y 70 gL de sacarosa arrojaron
porcentajes de consumo del 86 y 57 respectivamente
Ahora bien al analizar el crecimiento del P cubensis con respecto al consumo de
proteiacutena se evidencia claramente que el consumo disminuyoacute permanentemente
72
en el tiempo mientras el hongo se encontraban en estado exponencial indicando
el intereacutes del P cubensis por la proteiacutena siendo eacutesta utilizada por el mismo para
aumentar su tamantildeo y biomasa
Durante los diacuteas 4 y 10 las fermentaciones que conteniacutean concentraciones de 30
gL y 70 gL de sacarosa presentaron un alto consumo de proteiacutena a pesar de
que el P cubensis se encontraba en estos dos ensayos en fase estacionaria fase
en la cual no se requiere consumir grandes cantidades de sustrato puesto que el
hongo soacutelo necesitaba alimentarse para mantenerse o para producir productos no
ligados al crecimiento maacutes no para cambiar la cantidad de biomasa presente en el
medio Asimismo la concentracioacuten de 50 gL de sacarosa tambieacuten presentoacute un
alto consumo de proteiacutena durante los diacuteas 4 y 8 en donde se creiacutea estar en una
fase estacionaria temprana lo dicho anteriormente reitera una vez maacutes la afinidad
que el P cubensis presentoacute con respecto a las fuentes de proteiacutena usadas
333 Comparacioacuten entre el consumo de proteiacutena de P cubensis en los
cultivos sumergidos con diferentes fuentes de carbono
Con el fin de conocer cuaacutel de los dos tipos de sustrato empleado fue mayormente
consumido se realizoacute un anaacutelisis estadiacutestico
En el graacutefico 18 se ilustran las medias de consumo de proteiacutena (concentracioacuten)
arrojadas mediante el anaacutelisis estadiacutestico sobre el consumo de proteiacutena cuando se
utilizoacute glucosa o sacarosa en el medio y se evidencia que existen diferencias
significativas en cuanto a la concentracioacuten de proteiacutena en el tiempo en el medio
cuando se realizoacute el experimento con glucosa y cuando se utilizoacute sacarosa
arrojando asiacute dos grupos homogeacuteneos el primero (a) presenta una media de 465
gL mientras que el grupo dos (b) arroja un valor de media de 609 gL indicando
un menor consumo de proteiacutena por parte del P cubensis en el medio sumergido
73
de Fang-Zhong cuando se utilizoacute sacarosa como principal fuente de carbono
(Anexo 7)
Tratamientos de las dos fuentes de carbono usadas sin FA (glucosa y sacarosa)
Media glucosa (a) 465
Media sacarosa (b) 609
a
b
0
1
2
3
4
5
6
7
8
Conc
entr
acioacute
n pr
oteiacute
na (g
L)
Letras diferentes denotan diferencias significativas (prueba LSD)
Graacutefico 18 Consumo de proteiacutena para cada una de las fuentes de carbono utilizadas
334 Consumo de proteiacutena por P cubensis en medio sumergido utilizando
glucosa y FA en el medio
Una vez se obtuvo la concentracioacuten de proteiacutena en el medio para cada
concentracioacuten de FA utilizada se precedioacute a graficar dichos valores con respecto
al tiempo los cuales se ilustran en el graacutefico 19 ademaacutes se muestran en dicho
graacutefico las cineacuteticas de crecimiento de biomasa para cada ensayo
74
0
02
04
06
08
1
12
0
2
4
6
8
10
12
14
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Bio
mas
a (g
L)
Pro
teiacuten
a (g
L)
Tiempo (diacuteas)
05 gL 1 gL 15 gL 05 gL 1 gL 15 gL
Graacutefico 19 Cineacutetica de consumo de proteiacutena por parte del P cubensis en medio sumergido utilizando 50 gL de glucosa como fuente de carbono y
diferentes concentraciones de FA
De igual forma que para la fermentacioacuten que teniacutea 50 gL de glucosa en el medio
realizada anteriormente para dichos ensayos el consumo de proteiacutena fue
permanente y se dio casi en su totalidad El ensayo que mayor consumo de
proteiacutena presentoacute fue el que conteniacutea 05 gL de FA arrojando un porcentaje de
consumo del 86 aun asiacute el porcentaje de consumo arrojado por la fermentacioacuten
de 1 gL de FA fue del 84 indicando que no existen diferencias con respecto al
consumo de proteiacutena entre dichas cantidades de FA utilizadas Mientras que el
porcentaje de consumo para 15 gL de FA fue inferior presentando un valor del
72 De acuerdo a los resultados mencionados anteriormente se puede decir que
a mayor concentracioacuten de FA en el medio se presenta menor consumo de
proteiacutena por parte del P cubensis esto se puede afirmar uacutenicamente para los
resultados obtenidos durante esta investigacioacuten a ciertas condiciones
Analizando ahora la relacioacuten entre el consumo de proteiacutena y el crecimiento
micelial se puede ver que al igual que para los ensayos con glucosa a 50 gL se
75
tiene un consumo permanente mientras se estaacute en fase exponencial y una vez se
llega a la fase estacionario alrededor del diacutea 12 la concentracioacuten de proteiacutena en
el medio se estabilizoacute
A la hora de indagar los datos estadiacutesticamente se puede observar que no existen
diferencias significativas sobre el consumo de proteiacutena (concentracioacuten) en el
tiempo con respecto al tipo de sustrato pero al comparar los resultados con los
ensayos donde se antildeadioacute FA al medio se encontroacute que siacute existen diferencias
significativas Se crearon dos grupos homogeacuteneos el primero cuenta con glucosa
y sacarosa presentando medias (cantidad de proteiacutena en el medio) de 468 gL y
473 gL respectivamente mientras que el ensayo con FA se encuentra en otro
grupo en donde su consumo de proteiacutena fue menor presentando una media
(cantidad de proteiacutena en el medio) de 614 gL (Anexo 8)
Tratamientos con y sin FA
Media glucosa (a) 468
Media sacarosa Proteiacutena (a) 473
Media fenilalanina (b) 614
a a
b
0
1
2
3
4
5
6
7
8
Co
nce
ntr
acioacute
n p
rote
iacutena
(gL
)
Letras diferentes denotan diferencias significativas (prueba LSD)
Graacutefico 20 Consumo de proteiacutena para los ensayos con y sin FA
76
34 ESTUDIO CUALITATIVO DE LA PRESENCIA DEL ALCALOIDE
Posterior a las fermentaciones de glucosa sacarosa y glucosa 50 gL con FA y
los respectivos anaacutelisis se realizoacute un uacuteltimo anaacutelisis que a la vez fue el de mayor
relevancia a la hora de determinar cuaacutel de los medios fue el que mejores
resultados arrojoacute En primera instancia se utilizoacute el reactivo de Dragendorff como
indicador de alcaloide para analizar las muestras de los diacuteas 12 13 y 14 con el fin
de esclarecer la presencia de alcaloides (Anexo 17)
Una vez detectada la presencia de alcaloides gracias a la coloracioacuten naranja
presentada en las muestras se procedioacute a realizar la teacutecnica de HPLC con el fin
de hallar un porcentaje del compuesto de intereacutes basado en las aacutereas obtenidas
de los cromatogramas (asumiendo un tiempo de retencioacuten entre 62 y 72
minutos)
341 Produccioacuten de compuestos producidos por P cubensis cuando el
medio no conteniacutea FA
A la hora de analizar y confirmar cuaacutel fue el mejor ensayo de los experimentos
realizados se tuvo como criterio base determinar la fuente de carbono y su
respectiva concentracioacuten que mejor presencia del compuesto de intereacutes arrojoacute
supuesto a un tiempo de retencioacuten entre 62 y 72 minutos
Inicialmente al obtener los anaacutelisis estadiacutesticos se deduce que no existieron
diferencias significativas entre el aacuterea del pico de intereacutes con respecto a todos los
picos arrojados por el cromatograma y los factores estudiados (tipo de sustrato
diacutea de fermentacioacuten y concentracioacuten) puesto que se obtuvieron valores de P-valor
77
de 03310 09580 y 08336 respectivamente es decir no importa queacute tipo de
sustrato se utilice la produccioacuten de alcaloide no tendraacute variaciones (Anexo 9)
Al analizar el graacutefico 21 se puede observar que las medias de las aacutereas halladas
para los diferentes ensayos con glucosa y sacarosa no presentaron diferencias
significativas es decir pertenecen al mismo grupo homogeacuteneo (a) lo que ratifica
lo dicho anteriormente
Tratamiento de las dos fuentes de carbono usadas sin FA (glucosa y sacarosa)
Media glucosa (a) 235916
Media sacarosa (a) 337147
a
a
0
7000
14000
21000
28000
35000
42000
Aacutere
a de
Com
pues
to
Letras diferentes denotan diferencias significativas (prueba LSD)
Graacutefico 21 Aacuterea del compuesto obtenido de P cubensis en tiempo de retencioacuten entre 62 y 72 minutos para las dos fuentes de carbono
Por tal razoacuten fue necesario hacer un anaacutelisis cualitativo de los cromatogramas
obtenidos mediante HPLC el cual se basoacute en la forma del pico arrojado por la
teacutecnica La figura 6 ilustra dicho anaacutelisis
78
Buena resolucioacuten de pico Mala resolucioacuten de pico
(a) (b)
Figura 6 Cromatogramas de dos diferentes fermentaciones de P cubensis que ilustran el criterio de escogencia del mejor ensayo realizado (a) 50 gL
glucosa (b) 50 gL sacarosa
Primero fue necesario observar el tamantildeo del pico y posterior a eacutesto determinar
su resolucioacuten La figura 6 ilustra dos ejemplos el de 50 gL de glucosa el diacutea 13 y
50 gL de sacarosa el diacutea 14 mientras el primero muestra un pico grande y
definido la segunda fermentacioacuten ilustra un pico grande pero poco definido
indicando que en este caso no se resolvioacute correctamente el alcaloide es decir no
se logroacute una buena separacioacuten De esta manera se analizaron los diferentes
cromatogramas para los diacuteas 12 (Anexo 19) 13 (Anexo 20) y 14 (Anexo 21) de
cada fermentacioacuten arrojando diferencias entre los ensayos y llevando a la
conclusioacuten de que la fermentacioacuten que mejores resultados arrojoacute fue la que
conteniacutea 50 gL de glucosa
79
342 Produccioacuten de compuestos producidos por P cubensis cuando el
medio conteniacutea FA
Despueacutes de realizada la fermentacioacuten con glucosa 50 gL y concentraciones de
FA de 05 gL 10 gL y 15 gL se procedioacute de igual manera que en el estudio sin
FA a evaluar cuaacutel de estas tres concentraciones de FA exhibioacute mejor resolucioacuten
del alcaloide
Inicialmente se realizoacute un anaacutelisis estadiacutestico el cual arrojoacute que no existen
diferencias significativas con respecto al aacuterea de pico que en este caso debido al
supuesto representa la Psilocibina y los diacuteas 12 13 y 14 de la fermentacioacuten
Mediante el graacutefico 22 se puede decir que en los uacuteltimos tres diacuteas de las
fermentaciones que conteniacutean FA en el medio no existen diferencias significativas
con respecto al alcaloide de intereacutes obtenido es decir en los tres se produjo el
alcaloide (Anexo 10)
Tratamientos de los uacuteltimos tres diacuteas de fermentacioacuten usando FA
Media diacutea 12 (a) 411758
Media diacutea 13 (a) 413401
Media diacutea 14 (a) 44860
a a a
0
10000
20000
30000
40000
50000
Aacutere
a Co
mpu
esto
Letras diferentes denotan diferencias significativas
Graacutefico 22 Aacuterea del compuesto obtenido de P cubensis en tiempo de retencioacuten entre 62 y 72 minutos en los uacuteltimos tres diacuteas de la fermentacioacuten
con FA y glucosa
80
Igual que en numeral anterior fue necesario realizar anaacutelisis cualitativo para los
cromatogramas por ende se requirioacute observar el tamantildeo del pico y posterior a
eacutesto determinar su resolucioacuten
Buena resolucioacuten de pico Mala resolucioacuten de pico
(a) (b)
Figura 7 Cromatogramas de dos diferentes fermentaciones de P cubensis que ilustran el criterio de escogencia del mejor ensayo realizado (a) 05 gL
FA (b) 15 gL FA
La figura 7 ejemplifica el anaacutelisis realizado para la seleccioacuten del mejor ensayo
ejecutado Se tienen dos cromatogramas el de 05 gL de FA en el diacutea 13 y el de
15 gL de FA para el mismo diacutea
A todos los cromatogramas obtenidos para los diacuteas 12 (Anexo 19) 13 (Anexo 20)
y 14 (Anexo 21) se realizoacute el mismo anaacutelisis y se concluyoacute que la concentracioacuten
maacutes apropiada para la obtencioacuten de la los compuestos producidos por P cubensis
fue de 05 gL de FA debido a que eacuteste generariacutea una disminucioacuten en los costos
81
35 ESTUDIO PORCENTUAL (AacuteREA) DEL ALCALOIDE REALIZADO PARA
LOS DIFERENTES ENSAYOS
Se calculoacute el porcentaje de aacuterea correspondiente al pico que identificoacute que se
asumioacute como el correspondiente a la Psilocibina gracias a la suposicioacuten realizada
del tiempo de retencioacuten
A continuacioacuten se presentan los valores obtenidos y sus respectivos anaacutelisis para
cada tratamiento
351 Porcentaje de la Psilocibina (suposicioacuten) cuando el medio no conteniacutea
FA
Debido a que no se contaba con un estaacutendar de Psilocibina los resultados
mostrados en la tabla 5 se obtuvieron realizando un porcentaje con respecto a las
aacutereas bajo la curva arrojadas mediante el anaacutelisis de cromatografiacutea de alta
eficiencia (Anexos 19 20 y 21) En dichos anexos se encuentran resaltadas en
negrilla aquellas aeacutereas utilizadas
Tabla 5 Porcentaje de aacuterea hallado mediante HPLC para los uacuteltimos tres diacuteas de la fermentacioacuten con concentraciones de 30 gL 50 gL y 70 gL de glucosa
y sacarosa con un tiempo de retencioacuten de 62 y 72 minutos
Diacutea Glucosa
(gL)
Aacuterea
(compuesto
Tr= 62-72)
Sacarosa
(gL)
Aacuterea
(compuesto
Tr= 62-72)
12 30 60650 30 3664
12 50 7396 50 5857
12 70 4816 70 3415
13 30 702 30 2876
13 50 6815 50 4113
13 70 6733 70 5583
14 30 4824 30 2756
14 50 4821 50 2792
14 70 017 70 1429
82
A la hora de analizar los datos de la tabla 5 se puede observar que el mayor
porcentaje de aacuterea se obtuvo cuando se trabajoacute con glucosa como fuente de
carbono y concretamente a una concentracioacuten de 50 gL
Analizando los datos estadiacutesticamente no se obtuvieron diferencias significativas
en cuanto a la produccioacuten del compuesto (aacuterea) con respecto al tipo de sustrato
utilizado durante las fermentaciones es decir es indiferente si se utiliza glucosa o
sacarosa en el cultivo de P cubensis en medio sumergido de Fang-Zhong
El graacutefico 23 ilustra las medias (aacuterea) obtenidas para la produccioacuten de alcaloide en
las dos diferentes fuentes de carbono es decir glucosa y sacarosa exponiendo
un uacutenico grupo homogeacuteneo con medias (produccioacuten de alcaloide) de aacutereas de
219635 y 234391 para glucosa y sacarosa respectivamente (Anexo 11)
Tratamientos de las dos fuentes de carbono usadas sin FA (glucosa y sacarosa)
Media glucosa (a) 219635
Media sacarosa (a) 234391
a
a
2000
2100
2200
2300
2400
Aacuterea
Com
pues
to
Letras diferentes denotan diferencias significativas (prueba LSD)
Graacutefico 23 Aacuterea del compuesto obtenido de P cubensis en tiempo de retencioacuten entre 62 y 72 minutos para cada una de las fuentes de carbono
utilizadas
Aun asiacute estudiando los graacuteficos de HPLC con el criterio mencionado
anteriormente es decir observando el tamantildeo del pico y su resolucioacuten del mismo
83
se observoacute claramente que la presencia del alcaloide (tiempo de retencioacuten
supuesto entre 62 y 72 minutos) fue mejor cuando se trabajoacute con glucosa a una
concentracioacuten de 50 gL debido que presenta el mejor pico
352 Porcentaje de aacuterea de compuestos presentes en P cubensis cuando
el medio conteniacutea FA
Con el fin de observar si la adicioacuten de FA al medio si arrojoacute mejores resultados en
cuanto a la produccioacuten del compuesto presente entre un rango de 62 y 72
minutos como tiempo de retencioacuten se procedioacute a calcular el porcentaje del aacuterea
de intereacutes de acuerdo a las aacutereas arrojadas para cada ensayo por medio del
anaacutelisis de HPLC Los datos obtenidos se ilustran a continuacioacuten en la tabla 6
Tabla 6 Porcentaje hallado mediante HPLC para los uacuteltimos tres diacuteas de la fermentacioacuten con concentraciones de 05 gL 10 gL y 15 gL de FA y 50 gL
de glucosa con un tiempo de retencioacuten entre 62 y 72 minutos
Diacutea
Glucosa
50 gL +
FA
Aacuterea
(compuesto
Tr=62-72)
12 0 4315
12 05 2931
12 1 6236
12 15 847
13 0 3257
13 05 7549
13 1 4790
13 15 2721
14 0 4822
14 05 3863
14 1 5801
14 15 2102
84
Al detallar la tabla 6 puede observarse que el ensayo que mayor porcentaje de
aacuterea arrojoacute fue el que conteniacutea 05 gL de FA arrojando su maacuteximo porcentaje
correspondiente a 755 el diacutea 13 Aun asiacute las diferencias existentes entre ellos
no fueron significativas
Ahora bien al analizarlos estadiacutesticamente se encontroacute que la produccioacuten del
alcaloide en presencia de FA presentoacute la misma tendencia que los ensayos
analizados anteriormente sin eacutesta pero gracias a que este aminoaacutecido duplico la
cantidad de biomasa y debido a que el compuesto de intereacutes se produce
intracelularmente se afirma que el uso de FA aumentoacute la generacioacuten del
compuesto evaluado (Anexo 12)
El graacutefico 24 presenta las diferentes medias en cuanto al porcentaje de aacuterea del
compuesto presente entre 62 y 72 minutos para los diferentes tratamientos de
glucosa a una concentracioacuten de 50 gL y sus concentraciones respectivas de FA
Claramente se ve que soacutelo existe un grupo homogeacuteneo lo que reafirma que no
existen diferencias significativas de la produccioacuten con respecto a las
concentraciones de FA
85
Tratamientos con y sin FA
Media 0 gL FA (a) 3122
Media 05 gL FA (a) 2391
Media 10 gL FA (a) 2823
Media 15 gL FA (a) 2113
a
aa
a
0
5
10
15
20
25
30
35
40
Aacutere
a Co
mpu
esto
Letras diferentes denotan diferencias significativas (prueba LSD)
Graacutefico 24 Aacuterea del compuesto obtenido de P cubensis en tiempo de retencioacuten entre 62 y 72 minutos para cada una de las concentraciones de
FA utilizadas
Debido a que no se encontraron diferencias significativas en cuanto al porcentaje
de aacuterea obtenido mediante los cromatogramas se concluye que el mejor medio es
el que tiene como fuente de carbono glucosa a una concentracioacuten de 50 gL y una
adicioacuten de 05 gL de FA puesto que genera una disminucioacuten en costos
86
CONCLUSIONES
No existen diferencias significativas en el crecimiento micelial de P
cubensis en medio sumergido Fang-Zhong cuando se trabaja con fuentes
de carbono glucosa y sacarosa sin embargo se decide trabajar con 50 gL
de glucosa puesto que eacuteste tiene una buena presencia de alcaloide y a su
vez una mejor produccioacuten de biomasa
La concentracioacuten de glucosa utilizada para el crecimiento de P cubensis
influye en el crecimiento micelial obteniendo concentraciones de biomasa
de 062 gL 055 gL y 048 gL para concentraciones de sustrato de 70 50
y 30 gL de glucosa siendo las dos primeras significativamente diferentes
con respecto a la de 30 gL
La concentracioacuten de sacarosa utilizada para el crecimiento de P cubensis
influye en el crecimiento micelial obteniendo concentraciones de biomasa
de 057 gL 045 gL y 026 gL para concentraciones de sustrato de 70 50
y 30 gL de sacarosa siendo significativamente diferentes entre ellas
La resolucioacuten de los picos obtenidos por RP-HPLC del extracto de P
cubensis fue mayor para las fermentaciones realizadas con una
concentracioacuten de 50 gL de glucosa lo que conllevoacute a utilizarlo al realizar
los ensayos que conteniacutean en el medio FA
La concentracioacuten de biomasa de P cubensis obtenida en cultivo sumergido
en medio Fang-Zhong con glucosa se duplicoacute con la adicioacuten de FA No
obstante no existen diferencias significativas entre las concentraciones de
FA utilizadas
87
El consumo de proteiacutena presentada por P cubensis en medio Fang-Zhong
fue casi del 100 mientras que el consumo de sustrato para el mismo
medio estuvo alrededor del 40
El consumo de sustrato durante el transcurso de las fermentaciones que no
conteniacutean FA en el medio no presentoacute diferencias significativas con
respecto a las dos fuentes de carbono utilizadas Mientras que en aquellas
fermentaciones donde se agregoacute FA al medio siacute existieron diferencias
significativas entre las fermentaciones de 15 y 1 gL de FA con respecto a
los ensayos realizados con 05 gL FA Sin embargo el P cubensis
consumioacute mayor cantidad de sustrato cuando el medio no conteniacutea FA
Se evidencioacute que el P cubensis consumioacute mayor cantidad de proteiacutena
cuando el sustrato utilizado en el medio fue glucosa y a su vez se detecto
que la adicioacuten de FA al medio tuvo como efecto la disminucioacuten en el
consumo de sustrato por parte del microorganismo
El consumo de sustrato y de proteiacutena tuvo un comportamiento similar
puesto que fue consumido permanentemente durante la fase exponencial
para cada uno de los tratamientos realizados es decir las concentraciones
de 30 gL 50 gL y 70 gL de glucosa y sacarosa como fuente de carbono y
de 05 gL 1 gL y 15 gL de FA teniendo como fuente de carbono glucosa
a una concentracioacuten de 50 gL mientras que en la fase estacionaria su
consumo se disminuyoacute permaneciendo casi constante
Despueacutes de realizados los estudios en cuanto a la produccioacuten del
compuesto presente entre 62 y 72 minutos para cada uno de los ensayos
no se evidenciaron diferencias significativas entre las dos fuentes de
carbono utilizadas (glucosa y sacarosa)
88
La adicioacuten del precursor llamado Fenilalanina (FA) al medio sumergido
Fang-Zhong para llevar a cabo el cultivo del P cubensis tuvo influencia en
cuanto a la produccioacuten de compuesto presente entre tiempo de retencioacuten de
62 y 72 minutos debido a que eacuteste duplicoacute la concentracioacuten de biomasa
en el medio se dice entonces que la produccioacuten aumentoacute al ser eacuteste de
produccioacuten intracelular
La resolucioacuten del compuesto presente entre el tiempo de retencioacuten de 62 a
72 minutos se obtuvo mejor en el ensayo que conteniacutea 05 gL de FA y al
saber que no existieron diferencias significativas en la produccioacuten en cuanto
al porcentaje de aacutereas obtenido con respecto a las demaacutes concentraciones
de FA se afirma que eacuteste es el medio que mejores resultados arrojoacute para
el crecimiento de P cubensis y la produccioacuten de Psilocibina
89
RECOMENDACIONES
Se sugiere observar el efecto que tiene la variacioacuten de las revoluciones a
las cuales se realizaron las fermentaciones para ver como variacutea el
crecimiento del P cubensis en medio sumergido Fang-Zhong con respecto
a dicho factor
Debido a que soacutelo se realizaron anaacutelisis sobre el crecimiento del P
cubensis en medio sumergido haciendo uso de dos sustratos diferentes
(glucosa y sacarosa) seriacutea recomendable realizar el mismo anaacutelisis para
otro tipo de sustrato como por ejemplo melaza por su bajo costo
Del mismo modo seriacutea apropiado realizar el estudio con otro tipo de
precursor y en otras concentraciones para ver la incidencia de eacuteste en el
comportamiento del hongo
Se recomienda realizar un escalamiento de dicho proceso en un biorreactor
con el fin de evaluar a mayor escala el crecimiento del P cubensis y la
produccioacuten del alcaloide
Debido a que la proteiacutena se comportoacute como el principal nutriente se sugiere
para una proacutexima investigacioacuten evaluar diferentes concentraciones de
proteiacutena en el medio
90
ANEXOS
Anexo 1 Anaacutelisis de varianza (ANOVA) para el crecimiento de biomasa de
las fermentaciones con glucosa
Tabla 7 Anaacutelisis de Varianza para el crecimiento micelial (glucosa)
Tabla 8 Anaacutelisis Muacuteltiple de Rangos para el crecimiento micelial (glucosa)
91
Anexo 2 Anaacutelisis de Varianza (ANOVA) para el crecimiento de biomasa de
las fermentaciones con sacarosa
Tabla 9 Anaacutelisis de Varianza para el crecimiento micelial (sacarosa)
Tabla 10 Anaacutelisis Muacuteltiple de Rangos para el crecimiento micelial (sacarosa)
92
Anexo 3 Anaacutelisis de Varianza (ANOVA) para el crecimiento de biomasa de
las fermentaciones con glucosa y sacarosa
Tabla 11 Anaacutelisis de Varianza para el crecimiento micelial (glucosa y
sacarosa)
Tabla 12 Anaacutelisis Muacuteltiple de Rangos para el crecimiento micelial (glucosa y
sacarosa)
93
Anexo 4 Anaacutelisis de Varianza (ANOVA) para el crecimiento de biomasa de
las fermentaciones con glucosa 50 gL y FA
Tabla 13 Anaacutelisis de Varianza para el crecimiento micelial (glucosa 50 gL y
FA)
Tabla 14 Anaacutelisis Muacuteltiple de Rangos para el crecimiento micelial (glucosa
50 gL y FA)
94
Anexo 5 Anaacutelisis de varianza (ANOVA) para el consumo de sustrato en las
fermentaciones sin FA
Tabla 15 Anaacutelisis de Varianza para el consumo de Sustrato sin FA
Tabla 16 Anaacutelisis Muacuteltiple de Rangos para el consumo de Sustrato sin FA
95
Anexo 6 Anaacutelisis de Varianza (ANOVA) para el consumo de sustrato en las
fermentaciones con FA
Tabla 17 Anaacutelisis de Varianza para el consumo de Sustrato con FA
Tabla 18 Anaacutelisis Muacuteltiple de Rangos para el consumo de Sustrato con FA
96
Anexo 7 Anaacutelisis de Varianza (ANOVA) para el consumo de proteiacutena en las
fermentaciones sin FA
Tabla 19 Anaacutelisis de Varianza para el consumo de Proteiacutena sin FA
Tabla 20 Anaacutelisis Muacuteltiple de Rangos para el consumo de Proteiacutena sin FA
97
Anexo 8 Anaacutelisis de Varianza (ANOVA) para el consumo de proteiacutena en las
fermentaciones con FA
Tabla 21Anaacutelisis de Varianza para el consumo de Proteiacutena con FA
Tabla 22 Anaacutelisis Muacuteltiple de Rangos para el consumo de Proteiacutena con FA
98
Anexo 9 Anaacutelisis de Varianza (ANOVA) para la produccioacuten de Psilocibina en
las fermentaciones sin FA
Tabla 23 Anaacutelisis de Varianza para la produccioacuten de Psilocibina sin FA
Tabla 24 Anaacutelisis Muacuteltiple de Rangos para la produccioacuten de Psilocibina
seguacuten el Sustrato sin FA
99
Anexo 10 Anaacutelisis de Varianza (ANOVA) para la produccioacuten de Psilocibina en las fermentaciones con FA
Tabla 25 Anaacutelisis de Varianza para la produccioacuten de Psilocibina con FA
Tabla 26 Anaacutelisis Muacuteltiple de Rangos para la produccioacuten de Psilocibina
seguacuten el diacutea con FA
100
Anexo 11 Anaacutelisis de Varianza (ANOVA) para la cuantificacioacuten porcentual de
Psilocibina en las fermentaciones sin FA
Tabla 27 Anaacutelisis de Varianza para la cuantificacioacuten de Psilocibina sin FA
Tabla 28 Anaacutelisis Muacuteltiple de Rangos para la cuantificacioacuten de Psilocibina
seguacuten el tipo de sustrato sin FA
101
Anexo 12 Anaacutelisis de Varianza (ANOVA) para la cuantificacioacuten porcentual de
Psilocibina en las fermentaciones con FA
Tabla 29 Anaacutelisis de Varianza para la cuantificacioacuten de Psilocibina con FA
Tabla 30 Anaacutelisis Muacuteltiple de Rangos para la cuantificacioacuten de Psilocibina
seguacuten la concentracioacuten con FA
102
Anexo 13 Determinacioacuten de consumo de azuacutecares por el meacutetodo de DNS
(Aacutecido Dinitrosaliciacutelico)
a DNS para glucosa
Pasos para preparar DNS
Disolver 16 gr de NaOH en agua destilada
Adicionar 30 gr de tartrato de Na y K
Aforar a 100 ml con agua destilada
Almacenar en frascos aacutembar a 4degC
Se debe mantener un stock de glucosa 4mgml y almacenarlo a 4degC A partir
de la solucioacuten de glucosa se preparan las soluciones para hacer la curva
patroacuten con las siguientes concentraciones (gL) 025 050 100 200 y 400
Procedimiento
Tomar 05 ml de cada dilucioacuten y agregar 05 ml de reactivo DNS
Preparar una muestra blanco por dilucioacuten de 05 ml de agua destilada a 05
ml de reactivo de DNS
Agitar todas las muestras
Colocar a ebullir las muestras en bantildeo mariacutea por cinco minutos
Enfriar con hielo
Adicionar 5 ml de agua destilada
Agitar y dejar en reposo 15 minutos
Leer en espectrofotoacutemetro a 540 nm
Realizar la curva Absorbancia Vs Concentracioacuten Debe tener un coeficiente
de correlacioacuten de 0991 a 0999
b DNS para sacarosa
Pasos para preparar DNS sacarosa
Preparacioacuten de la solucioacuten Standard stock de sacarosa (30 gL) tomar 30
gr de sacarosa anhiacutedrida grado reactivo con exactitud hasta la deacutecima de
mg disolver ajustar a aforo de 100 ml con agua desionizada empacar en
viales y almacenar en congelador
Preparacioacuten DNS pesar 16 gr de hidroacutexido de sodio grado reactivo 30 gr
de tartrato de sodio y potasio y disolverlos juntos con 50 ml de agua
103
desionizada aparte pesar 10 gr del DNS disolver con 30 ml de agua
desionizada agregar lentamente y con agitacioacuten la solucioacuten del DNS a la
solucioacuten de tartrato y NaOH anteriormente preparadas ajustar a 100 ml
filtrar envasar en frasco aacutembar y rotular con fecha de vencimiento incluida
(3 meses maacuteximo) mantener a la temperatura del laboratorio
Preparacioacuten del reactivo NaOH 10 N (500 ml) pesar con exactitud hasta
la deacutecima de mg 20 gr de NaOH grado reactivo por cada 500 ml de
solucioacuten disolver primero con 300 ml de agua desionizada y luego aforar a
500 ml envasar y rotular correctamente y mantener a la temperatura del
laboratorio
Preparacioacuten de HCL 10 (100 ml) tomar 27 ml de aacutecido clorhiacutedrico al
37 grado reactivo y aforar hasta 100 ml con agua desionizada envasar
rotular correctamente de acuerdo a la norma del laboratorio y almacenar a
la temperatura del laboratorio
Se debe mantener un stock de glucosa 30 gL y almacenarlo a 4degC A partir
de la solucioacuten de glucosa se preparan las soluciones para hacer la curva
patroacuten con las siguientes concentraciones (gL) 3 6 12 18 24 y 30
Procedimiento
Preparar en cada tubo (las soluciones de la curva patroacuten de sacarosa las
muestras problemas diluidas si es necesario y como blanco agua
desionizada) 100microl de solucioacuten
Adicionar 200 microl de HCL 10 a cada tubo y agitar todos los tubos en vortex
Llevar a ebullicioacuten por 10 minutos en bantildeo mariacutea precalentado a 95degC
Enfriar hasta temperatura ambiente raacutepidamente
Adicionar a cada tubo 1 ml de NaOH 10 N y agitar los tubos en vortex
Aparte tomar 05 ml de cada tubo en otros tubos rotulados y agregar 05 ml
del DNS
Agitar todas las muestras en vortex
Llevar a ebullicioacuten por 5 minutos en bantildeo mariacutea precalentado a 96degC
Enfriar hasta temperatura ambiente raacutepidamente
Adicionar 5 ml de H2O desionizada agitar en vortex y dejar reposar por 15
minutos
Leer en espectrofotoacutemetro a 540 nm
Realizar la curva Absorbancia Vs Concentracioacuten Debe tener un coeficiente
de correlacioacuten de 0991 a 0999
104
Anexo 14 Cineacutetica de Consumo de Sustrato
La cineacutetica de consumo de sustrato se realizoacute por el meacutetodo de Aacutecido
Dinitrosaliciacutelico (DNS) Los rangos de concentracioacuten y absorbancia para cada caso
se citan a continuacioacuten
Rangos de concentraciones y absorbancias para las fermentaciones que
usaron glucosa (30 gL 50 gL y 70 gL) como sustrato
Concentracioacuten de 02 a 12 gL
Absorbancia de 01234 a 06612
Ecuacioacuten Y = 19174x -00517 R2 = 09923
Rangos de concentraciones y absorbancias para las fermentaciones que
usaron sacarosa (30 gL 50 gL y 70 gL) como sustrato
Concentracioacuten de 3 a 30 gL
Absorbancia de 00822 a 11112
Ecuacioacuten Y = 25983x + 04857 R2 = 09978
Rangos de concentraciones y absorbancias para las fermentaciones que
usaron glucosa 50 gL como sustrato y FA
Concentracioacuten de 02 a 12 gL
Absorbancia de 0097 a 063
Ecuacioacuten Y = 18785x + 00019 R2 = 09986
105
Anexo 15 Determinacioacuten de consumo de proteiacutenas por el meacutetodo de LOWRY
Pasos para la preparacioacuten de LOWRY
Para obtener la curva estaacutendar de Albuacutemina se preparan 5 soluciones
patrones de Albuacutemina en NaCL al 09 (PV) de las siguientes
concentraciones 152 80 200 300 400 Pgml Si la concentracioacuten de
Proteiacutena total es menor de 500 Pgml se lee la absorbancia a 750 nm si
estaacute entre 1000 y 2000 Pgml se lee a 550nm
Se prepara un blanco que no lleva Albuacutemina y en su reemplazo se adiciona
0-5 ml de solucioacuten salina (NaCL) al 09 (PV) Se aplica el mismo
procedimiento que a las demaacutes muestras
Procedimiento
Servir en tubos de ensayo 05 ml de las soluciones patroacuten de Albuacutemina las
muestras problema y NaCL al 09 como blanco Deben estar marcados
para conservar el orden de concentraciones para la curva
Adicionar a cada tubo 05 ml de NaOH 2N y llevar al bantildeo Mariacutea
precalentado a 100degC por un tiempo de 10 minutos
Dejar enfriar hasta que alcance la Temperatura Ambiente
Agregar a cada tubo 5 ml de la solucioacuten complejante mezclar y dejar
reposar por 10 minutos
Adicionar 05 ml del reactivo de Folin-Ciocalteu 11 vortexiar durante 20
segundos
Reposar en un cuarto oscuro durante 30 minutos
Leer la absorbancia a 750 nm y con las soluciones patroacuten construir la
graacutefica Absorbancia Vs Concentracioacuten de Albuacutemina Seacuterica de Bovina
(BSA) con eacutesta se puede determinar la concentracioacuten de las muestras
problema interpolando el valor de la Absorbancia La curva estaacutendar debe
tener un coeficiente de correlacioacuten de 0991 a 0999
106
Anexo 16 Cineacutetica consumo de Proteiacutena
La cineacutetica de consumo de proteiacutena se realizoacute por el meacutetodo LOWRY Los rangos
de concentracioacuten y absorbancia para cada caso se citan a continuacioacuten
Rangos de concentraciones y absorbancias para las fermentaciones que
usaron glucosa (30 gL 50 gL y 70 gL) como sustrato
Concentracioacuten de 0016 a 04 gL
Absorbancia de 00094 a 05382
Ecuacioacuten Y = 07427x ndash 00021 R2 = 09955
Rangos de concentraciones y absorbancias para las fermentaciones que
usaron sacarosa (30 gL 50 gL y 70 gL) como sustrato
Concentracioacuten de 0016 a 04 gL
Absorbancia de 00374 a 06178
Ecuacioacuten Y = 06567x ndash 00166 R2 = 09968
Rangos de concentraciones y absorbancias para las fermentaciones que
usaron glucosa 50 gL como sustrato y FA
Concentracioacuten de 0016 a 04 gL
Absorbancia de 00708 a 04647
Ecuacioacuten Y = 09814x ndash 00581 R2 = 09992
107
Anexo 17 Prueba de reactivo de Dragendorff
Preparacioacuten de reactivo de Dragendorff para alcaloides
Reactivo de Dragendorff se prepara mezclando 8 gr de nitrato de bismuto
pentahidratado en 20 ml de aacutecido niacutetrico al 30 con una solucioacuten de 272 g de
yoduro de potasio en 50 ml de agua Se deja en reposo por 24 horas se decanta y
se afora a 100 ml La presencia de alcaloides se detecta por la formacioacuten de un
precipitado naranja rojizo cuando se le adiciona esta reactivo a una solucioacuten aacutecida
de alcaloides De los precipitados lavados se puede recuperar los alcaloides con
una solucioacuten saturada de carbonato de sodio (Mercano y Hasegawa 1991)
La figura mostrada a continuacioacuten refleja la presencia del alcaloide debido a la
coloracioacuten amarillo-rojiza que eacutesta sufrioacute
Figura 8 Muestra de biomasa una vez analizada mediante el reactivo de Dragendorff
108
Anexo 18 Barrido Espectral para el Psilocybe cubensis
La metodologiacutea mencionada a continuacioacuten estaacute basada en artiacuteculo base
(Tsujikawa et al 2003)
El Sistema de HPLC consiste en un Shimadzu LC-10ordf Series Cromatografiacutea
Liacutequida equipada con un diodo SPD-M10A detector de red fija en 220nm La
separacioacuten cromatograacutefica ser realizoacute con una columna simeacutetrica C18 (21 mm a
150 mm 5mm Waters Assoc Milford EEUU
La fase moacutevil utilizada fue de 10 mm de formato de amonio-aacutecido foacutermico (955
VV) a un pH de 35 y bombeado a un caudal de 02 mlminuto
El perfil cromatograacutefico obtenido durante la investigacioacuten de Tsujikawa et al
(2003) se muestra en le figura 6 que aparece a continuacioacuten
Figura 9 Perfil cromatograacutefico (Tsujikawa et al 2003)
109
Anexo 19 Cromatogramas (HPLC) del diacutea 12 de fermentacioacuten
Tabla 31 Aacutereas obtenidas de los cromatogramas para el P cubensis en
medio Fang-Zhong en el diacutea 12 para concentraciones de 30gL glucosa y
30gL sacarosa
SustratoConcentracioacuten
(gL)
Tiempo
(s)Aacuterea
Glucosa 30 2957 3837
Glucosa 30 6838 474753
Glucosa 30 9144 47256
Glucosa 30 9489 16822
Glucosa 30 10124 224349
Sacarosa 30 6538 143772
Sacarosa 30 7234 269458
Sacarosa 30 9721 33646
Sacarosa 30 11845 24384
(a) (b)
Graacutefico 25 Cromatogramas del diacutea 12 para el P cubensis cultivado en medio
sumergido Fang-Zhong con dos diferentes tipos de sustratos (a) 30 gL
glucosa (b) 30 gL sacarosa
110
Tabla 32 Aacutereas obtenidas de los cromatogramas para el P cubensis en
medio Fang-Zhong en el diacutea 12 para concentraciones de 50gL glucosa y
50gL sacarosa
SustratoConcentracioacuten
(gL)
Tiempo
(s)Aacuterea
Glucosa 50 0524 319
Glucosa 50 6298 5991
Glucosa 50 7172 237042
Glucosa 50 9144 16387
Glucosa 50 10009 6077
Sacarosa 50 169 24011
Sacarosa 50 3105 28573
Sacarosa 50 6916 112166
Sacarosa 50 9136 4057
Sacarosa 50 9933 8821
Sacarosa 50 10398 13872
(a) (b)
Graacutefico 26 Cromatogramas del diacutea 12 para el P cubensis cultivado en medio
sumergido Fang-Zhong con dos diferentes tipos de sustratos (a) 50 gL
glucosa (b) 50 gL sacarosa
111
Tabla 33 Aacutereas obtenidas de los cromatogramas para el P cubensis en
medio Fang-Zhong en el diacutea 12 para concentraciones de 50gL glucosa y
50gL sacarosa
SustratoConcentracioacuten
(gL)
Tiempo
(s)Aacuterea
Glucosa 70 7217 168598
Glucosa 70 9145 9977
Glucosa 70 997 80558
Sacarosa 70 6803 287387
Sacarosa 70 7517 131049
Sacarosa 70 7775 4434
Sacarosa 70 7871 77109
Sacarosa 70 823 96239
Sacarosa 70 9039 5114
Sacarosa 70 9778 25394
(a) (b)
Graacutefico 27 Cromatogramas del diacutea 12 para el P cubensis cultivado en medio
sumergido Fang-Zhong con dos diferentes tipos de sustratos (a) 50 gL
glucosa (b) 50 gL sacarosa
112
Tabla 34 Aacutereas obtenidas de los cromatogramas para el P cubensis en
medio Fang-Zhong en el diacutea 12 para concentraciones de 50gL y glucosa
50gL sacarosa
SustratoConcentracioacuten
(gL)
Tiempo
(s)Aacuterea
Glucosa 50 05 0818 4722
Glucosa 50 05 2423 52579
Glucosa 50 05 3502 88765
Glucosa 50 05 6137 16009
Glucosa 50 05 6722 275258
Glucosa 50 05 733 226399
Glucosa 50 05 8339 65139
Glucosa 50 05 9101 36797
Glucosa 50 05 9815 130883
Glucosa 50 1 1105 743
Glucosa 50 1 2746 2701
Glucosa 50 1 4304 80304
Glucosa 50 1 6167 19649
Glucosa 50 1 6794 51753
Glucosa 50 1 8282 82997
Glucosa 50 1 9116 38659
Glucosa 50 1 9899 136953
Glucosa 50 15 1198 3313
Glucosa 50 15 2937 37875
Glucosa 50 15 4332 51079
Glucosa 50 15 614 25602
Glucosa 50 15 6737 668905
Glucosa 50 15 8209 107332
Glucosa 50 15 9602 38902
Glucosa 50 15 9752 139613
Diacutea 12
(a) (b)
(c)
Graacutefico 28 Cromatograma del diacutea 12 para el P cubensis cultivado en medio
sumergido Fang-Zhong con fuente de carbono glucosa y adicioacuten de
fenilalanina en tres concentraciones (a) 05 gL FA (b) 1 gL FA (c) 15gL
FA
113
Anexo 20 Cromatogramas (HPLC) del diacutea 13 de fermentacioacuten
Tabla 35 Aacutereas obtenidas de los cromatogramas para el P cubensis en
medio Fang-Zhong en el diacutea 13 para concentraciones de 30gL glucosa y
30gL sacarosa
SustratoConcentracioacuten
(gL)
Tiempo
(s)Aacuterea
Glucosa 30 0225 1155
Glucosa 30 2847 699
Glucosa 30 4043 1038
Glucosa 30 6231 4994
Glucosa 30 6787 295182
Glucosa 30 7462 241146
Glucosa 30 9066 51836
Glucosa 30 10004 158746
Sacarosa 30 1734 135
Sacarosa 30 5838 1857
Sacarosa 30 6803 147867
Sacarosa 30 7305 30464
Sacarosa 30 7599 174643
Sacarosa 30 9107 8564
Sacarosa 30 9897 104278
(a) (b)
Graacutefico 29 Cromatogramas del diacutea 13 para el P cubensis cultivado en medio
sumergido Fang-Zhong con dos diferentes tipos de sustratos (a) 30 gL
glucosa (b) 30 gL sacarosa
114
Tabla 36 Aacutereas obtenidas de los cromatogramas para el P cubensis en
medio Fang-Zhong en el diacutea 13 para concentraciones de 50gL glucosa y
50gL sacarosa
SustratoConcentracioacuten
(gL)
Tiempo
(s)Aacuterea
Glucosa 50 1408 13982
Glucosa 50 6949 331449
Glucosa 50 9012 25201
Glucosa 50 9936 27216
Sacarosa 50 1543 7293
Sacarosa 50 6813 437765
Sacarosa 50 9085 35897
Sacarosa 50 10049 184461
(a) (b)
Graacutefico 30 Cromatogramas del diacutea 13 para el P cubensis cultivado en medio
sumergido Fang-Zhong con dos diferentes tipos de sustratos (a) 50 gL
glucosa (b) 50 gL sacarosa
115
Tabla 37 Aacutereas obtenidas de los cromatogramas para el P cubensis en
medio Fang-Zhong en el diacutea 13 para concentraciones de 70gL glucosa y
70gL sacarosa
SustratoConcentracioacuten
(gL)
Tiempo
(s)Aacuterea
Glucosa 70 1456 3223
Glucosa 70 2985 2423
Glucosa 70 54 7586
Glucosa 70 6262 5149
Glucosa 70 7151 248331
Glucosa 70 9039 19346
Glucosa 70 9929 4906
Glucosa 70 11051 33698
Sacarosa 70 0437 342
Sacarosa 70 1428 812
Sacarosa 70 2948 2191
Sacarosa 70 5473 4854
Sacarosa 70 6286 5336
Sacarosa 70 6848 3649
Sacarosa 70 733 11383
Sacarosa 70 9073 1018
Sacarosa 70 9878 11072
Sacarosa 70 10267 18797
(a) (b)
Graacutefico 31 Cromatogramas del diacutea 13 para el P cubensis cultivado en medio
sumergido Fang-Zhong con dos diferentes tipos de sustratos (a) 70 gL
glucosa (b) 70 gL sacarosa
116
Tabla 38 Aacutereas obtenidas de los cromatogramas para el P cubensis en
medio Fang-Zhong en el diacutea 13 para concentraciones de 50gL y glucosa
50gL sacarosa
SustratoConcentracioacuten
(gL)
Tiempo
(s)Aacuterea
Glucosa 50 05 4067 22222
Glucosa 50 05 7379 55573
Glucosa 50 05 902 19513
Glucosa 50 05 9716 119261
Glucosa 50 05 1173 19427
Glucosa 50 1 0793 14776
Glucosa 50 1 2868 28537
Glucosa 50 1 6224 1206
Glucosa 50 1 6782 571299
Glucosa 50 1 8303 92665
Glucosa 50 1 9081 30371
Glucosa 50 1 9738 168959
Glucosa 50 1 11813 27921
Glucosa 50 15 0412 269
Glucosa 50 15 2482 14692
Glucosa 50 15 3486 91059
Glucosa 50 15 6039 6892
Glucosa 50 15 6627 216986
Glucosa 50 15 7216 260795
Glucosa 50 15 8112 65776
Glucosa 50 15 8888 19083
Glucosa 50 15 9497 37812
Glucosa 50 15 9839 65922
Glucosa 50 15 11655 7331
(a) (b)
(c)
Graacutefico 32 Cromatogramas del diacutea 12 para el P cubensis cultivado en medio
sumergido Fang-Zhong con fuente de carbono glucosa y adicioacuten de
fenilalanina en tres concentraciones (a) 05 gL FA (b) 1 gL FA (c) 15gL
FA
117
Anexo 21 Cromatogramas (HPLC) del diacutea 14 de fermentacioacuten
Tabla 39 Aacutereas obtenidas de los cromatogramas para el P cubensis en
medio Fang-Zhong en el diacutea 14 para concentraciones de 30gL glucosa y 30
gL sacarosa
SustratoConcentracioacuten
(gL)
Tiempo
(s)Aacuterea
Glucosa 30 1054 181
Glucosa 30 2553 8939
Glucosa 30 6219 7557
Glucosa 30 6585 77083
Glucosa 30 7158 285069
Glucosa 30 8987 33875
Glucosa 30 9848 87461
Glucosa 30 10694 52151
Glucosa 30 12482 7992
Glucosa 30 12943 23064
Glucosa 30 1493 5948
Sacarosa 30 7309 7075
Sacarosa 30 9984 1680
Sacarosa 30 10442 15395
Sacarosa 30 11211 8511
Sacarosa 30 13405 3398
(a) (b)
Graacutefico 33 Cromatogramas del diacutea 14 para el P cubensis cultivado en medio
sumergido Fang-Zhong con dos diferentes tipos de sustratos (a) 30 gL
glucosa (b) 30 gL sacarosa
118
Tabla 40 Aacutereas obtenidas de los cromatogramas para el P cubensis en
medio Fang-Zhong en el diacutea 14 para concentraciones de 50gL glucosa y
50gL sacarosa
SustratoConcentracioacuten
(gL)
Tiempo
(s)Aacuterea
Glucosa 50 2029 8318
Glucosa 50 6257 5782
Glucosa 50 6875 306684
Glucosa 50 9068 22819
Glucosa 50 9808 92492
Glucosa 50 12113 8823
Glucosa 50 12752 23988
Sacarosa 50 1036 3783
Sacarosa 50 2356 7005
Sacarosa 50 653 44831
Sacarosa 50 6657 127617
Sacarosa 50 7264 66908
Sacarosa 50 7464 255141
Sacarosa 50 9035 26172
Sacarosa 50 9458 28427
Sacarosa 50 9889 37574
Sacarosa 50 10312 140881
Sacarosa 50 12335 13391
Sacarosa 50 1292 17066
(a) (b)
Graacutefico 34 Cromatogramas del diacutea 14 para el P cubensis cultivado en medio
sumergido Fang-Zhong con dos diferentes tipos de sustratos (a) 50 gL
glucosa (b) 50 gL sacarosa
119
Tabla 41 Aacutereas obtenidas de los cromatogramas para el P cubensis en
medio Fang-Zhong en el diacutea 14 para concentraciones de 70gL glucosa y
70gL sacarosa
SustratoConcentracioacuten
(gL)
Tiempo
(s)Aacuterea
Glucosa 70 6257 5879
Glucosa 70 6373 145551
Glucosa 70 7015 68223
Glucosa 70 7199 9085
Glucosa 70 735 265755
Glucosa 70 9014 4642
Glucosa 70 9877 97804
Glucosa 70 107 67421
Glucosa 70 12625 26231
Glucosa 70 1305 65607
Sacarosa 70 2283 4683
Sacarosa 70 5191 93
Sacarosa 70 6304 3719
Sacarosa 70 6795 136542
Sacarosa 70 726 29869
Sacarosa 70 7515 75545
Sacarosa 70 7872 119563
Sacarosa 70 9166 1244
Sacarosa 70 9658 23096
Sacarosa 70 9871 25866
Sacarosa 70 10421 105108
Sacarosa 70 12347 11115
Sacarosa 70 12861 35503
Sacarosa 70 14272 3676
(a) (b)
Graacutefico 35 Cromatogramas del diacutea 14 para el P cubensis cultivado en medio
sumergido Fang-Zhong con dos diferentes tipos de sustratos (a) 70 gL
glucosa (b) 70 gL sacarosa
120
Tabla 42 Aacutereas obtenidas de los cromatogramas para el P cubensis en medio Fang-Zhong en el diacutea 13 para concentraciones de 50gL glucosa y
50gL sacarosa
SustratoConcentracioacuten
(gL)
Tiempo
(s)Aacuterea
Glucosa 50 05 0123 173
Glucosa 50 05 0699 7584
Glucosa 50 05 2594 2742
Glucosa 50 05 6104 11663
Glucosa 50 05 6616 487848
Glucosa 50 05 7235 287918
Glucosa 50 05 8183 135793
Glucosa 50 05 8903 5143
Glucosa 50 05 9484 66817
Glucosa 50 05 9679 168855
Glucosa 50 05 11671 4216
Glucosa 50 1 0345 295
Glucosa 50 1 2654 11981
Glucosa 50 1 412 45301
Glucosa 50 1 6111 12626
Glucosa 50 1 6757 526655
Glucosa 50 1 8093 104277
Glucosa 50 1 894 25251
Glucosa 50 1 9643 158685
Glucosa 50 1 11666 22779
Glucosa 50 15 0353 283
Glucosa 50 15 2522 15272
Glucosa 50 15 3577 83963
Glucosa 50 15 6668 47137
Glucosa 50 15 7304 371442
Glucosa 50 15 8226 117611
Glucosa 50 15 8923 61949
Glucosa 50 15 9657 19618
Glucosa 50 15 11668 35606
(a) (b)
(c)
Graacutefico 36 Cromatogramas del diacutea 12 para el P cubensis cultivado en medio sumergido Fang-Zhong con fuente de carbono glucosa y adicioacuten de
fenilalanina en tres concentraciones (a) 05 gL FA (b) 1 gL FA (c) 15gL FA (a) 05 gL FA (b) 1 gL FA (c) 15gL FA
121
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vi
TABLA DE CONTENIDO
LISTA DE TABLAS _________________________________________________________________________ IX
LISTA DE FIGURAS ________________________________________________________________________ XI
LISTA DE GRAacuteFICOS ______________________________________________________________________ XII
LISTA DE ECUACIONES ____________________________________________________________________ XV
LISTAS DE ANEXOS ______________________________________________________________________ XVI
RESUMEN _____________________________________________________________________________ XVII
INTRODUCCIOacuteN _________________________________________________________________________ 19
OBJETIVOS _____________________________________________________________________________ 21
GENERAL_____________________________________________________________________________ 21
ESPECIacuteFICOS __________________________________________________________________________ 21
1 MARCO TEOacuteRICO ___________________________________________________________________ 22
11 CONCEPTOS GENERALES DE HONGOS _______________________________________________ 22
111 Hongos laminares (Agaricales) ____________________________________________________ 22
12 MEDIOS DE CULTIVO_____________________________________________________________ 24
121 Medio sumergido _______________________________________________________________ 25
13 ALCALOIDES ___________________________________________________________________ 26
131 Generalidades _______________________________________________________________ 26
132 Propiedades fisicoquiacutemicas _____________________________________________________ 27
133 Reconocimiento de los alcaloides ________________________________________________ 27
134 Clasificacioacuten de los alcaloides ___________________________________________________ 28
1341 Alcaloides alifaacuteticos ____________________________________________________________ 28
1342 Alcaloides de origen diverso _____________________________________________________ 28
1343 Alcaloides aromaacuteticos __________________________________________________________ 28
13 PSILOCIBINA Y PSILOCINA _________________________________________________________ 31
131 Antecedentes acerca de la obtencioacuten de Psilocibina y Psilocina ________________________ 32
2 MATERIALES Y MEacuteTODOS_____________________________________________________________ 34
21 LOCALIZACIOacuteN _________________________________________________________________ 34
22 MICROORGANISMO DE ESTUDIO ___________________________________________________ 34
23 COMPONENTES DEL MEDIO DE CULTIVO (FANG-ZHONG) _______________________________ 35
24 PREPARACIOacuteN DE LOS DIFERENTES PREINOacuteCULOS DE P CUBENSIS EMPLEADOS PARA LAS
FERMENTACIONES SUMERGIDAS _________________________________________________________ 35
25 PREPARACIOacuteN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO Y LOS INOacuteCULOS DE P CUBENSIS UTILIZADOS PARA LAS
FERMENTACIONES SUMERGIDAS _________________________________________________________ 36
26 CUANTIFICACIOacuteN DEL CRECIMIENTO DE BIOMASA MEDIANTE LOS MEacuteTODOS DE PESO HUacuteMEDO Y
PESO SECO PARA CULTIVO SUMERGIDO DE P CUBENSIS ________________________________________ 37
27 AJUSTE DE LA CINEacuteTICA DE CRECIMIENTO DE P CUBENSIS AL MODELO CINEacuteTICO LOGIacuteSTICO ____ 37
vii
28 EVALUACIOacuteN DEL CONSUMO DE SUSTRATO Y DEL CONSUMO DE PROTEIacuteNA POR PARTE DEL P
CUBENSIS CULTIVADO EN MEDIO SUMERGIDO ________________________________________________ 39
29 MEacuteTODO CUALITATIVO PARA DETERMINAR LA PRESENCIA DE ALCALOIDES (PSILOCIBINA)
MEDIANTE EL USO DEL REACTIVO DE DRAGENDORFF _________________________________________ 40
210 MEacuteTODO PARA DETERMINAR LA PRESENCIA DE PSILOCIBINA MEDIANTE CROMATOGRAFIacuteA
LIacuteQUIDA DE ALTA EFICIENCIA (HPLC) _______________________________________________________ 40
211 DETERMINACIOacuteN CUALITATIVA DE LA RESOLUCIOacuteN DEL ALCALOIDE DE INTEREacuteS PARA LOS
DIFERENTES ENSAYOS __________________________________________________________________ 41
212 DETERMINACIOacuteN PORCENTUAL DE COMPUESTOS PARA LOS DIFERENTES ENSAYOS __________ 42
213 CULTIVO SUMERGIDO DE P CUBENSIS EN PRESENCIA DE FA ______________________________ 42
214 DISENtildeO DE EXPERIMENTOS Y ANAacuteLISIS ESTADIacuteSTICO ___________________________________ 43
3 RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN ___________________________________________________________ 45
31 CINEacuteTICA DE CRECIMIENTO MICELIAL DE P CUBENSIS EN CULTIVO SUMERGIDO (FANG-ZHONG)
UTILIZANDO DIFERENTES FUENTES DE CARBONO ____________________________________________ 45
311 Crecimiento micelial de P cubensis en medio sumergido utilizando diferentes concentraciones
de glucosa _________________________________________________________________________ 45
312 Crecimiento micelial del P cubensis en medio sumergido utilizando diferentes concentraciones
de sacarosa ________________________________________________________________________ 50
313 Comparacioacuten entre el crecimiento micelial de P cubensis en los cultivos sumergidos utilizando
glucosa y sacarosa como fuente de carbono ______________________________________________ 55
314 Crecimiento micelial del P cubensis en cultivo sumergido utilizando glucosa y fenilalanina en el
medio 56
32 ESTUDIO DE LA CINEacuteTICA DE CONSUMO DE SUSTRATO POR PARTE DEL P CUBENSIS CULTIVADO EN
MEDIO SUMERGIDO (FANG-ZHONG) ______________________________________________________ 61
321 Consumo de sustrato por parte del P cubensis en medio sumergido utilizando diferentes
concentraciones de glucosa ___________________________________________________________ 62
322 Consumo de sustrato por parte del P cubensis en medio sumergido utilizando diferentes
concentraciones de sacarosa __________________________________________________________ 63
323 Comparacioacuten entre el consumo de sustrato de P cubensis en los cultivos sumergidos con
diferentes fuentes de carbono _________________________________________________________ 65
324 Consumo de sustrato por parte del P cubensis en medio sumergido utilizando glucosa y
fenilalanina en el medio ______________________________________________________________ 66
33 ESTUDIO DE LA CINEacuteTICA DE CONSUMO DE PROTEIacuteNA POR PARTE DEL P CUBENSIS CULTIVADO EN
MEDIO SUMERGIDO (FANG-ZHONG) ______________________________________________________ 69
331 Consumo de proteiacutena por P cubensis en medio sumergido utilizando diferentes
concentraciones de glucosa ___________________________________________________________ 69
332 Consumo de proteiacutena por P cubensis en medio sumergido utilizando diferentes
concentraciones de sacarosa __________________________________________________________ 71
333 Comparacioacuten entre el consumo de proteiacutena de P cubensis en los cultivos sumergidos con
diferentes fuentes de carbono _________________________________________________________ 72
334 Consumo de proteiacutena por P cubensis en medio sumergido utilizando glucosa y FA en el medio
73
34 ESTUDIO CUALITATIVO DE LA PRESENCIA DEL ALCALOIDE _______________________________ 76
viii
341 Produccioacuten de compuestos producidos por P cubensis cuando el medio no conteniacutea FA ____ 76
342 Produccioacuten de compuestos producidos por P cubensis cuando el medio conteniacutea FA ______ 79
35 ESTUDIO PORCENTUAL (AacuteREA) DEL ALCALOIDE REALIZADO PARA LOS DIFERENTES ENSAYOS ___ 81
351 Porcentaje de la Psilocibina (suposicioacuten) cuando el medio no conteniacutea FA _______________ 81
352 Porcentaje de aacuterea de compuestos presentes en P cubensis cuando el medio conteniacutea FA _ 83
CONCLUSIONES _________________________________________________________________________ 86
RECOMENDACIONES _____________________________________________________________________ 89
ANEXOS _______________________________________________________________________________ 90
BIBLIOGRAFIacuteA _________________________________________________________________________ 121
ix
LISTA DE TABLAS
TABLA 1 COMPOSICIOacuteN DEL MEDIO DE CULTIVO SUMERGIDO PARA EVALUAR EL CRECIMIENTO MICELIAL
DEL P CUBENSIS 35
TABLA 2 PARAacuteMETROS CINEacuteTICOS OBTENIDOS MEDIANTE EL MODELO LOGIacuteSTICO PARA LAS DIFERENTES
FERMENTACIONES DE P CUBENSIS UTILIZANDO GLUCOSA COMO FUENTE DE CARBONO 48
TABLA 3 PARAacuteMETROS CINEacuteTICOS OBTENIDOS MEDIANTE EL MODELO LOGIacuteSTICO PARA LAS DIFERENTES
FERMENTACIONES DE P CUBENSIS UTILIZANDO SACAROSA COMO FUENTE DE CARBONO 53
TABLA 4 PARAacuteMETROS CINEacuteTICOS OBTENIDOS MEDIANTE EL MODELO LOGIacuteSTICO PARA LAS DIFERENTES
FERMENTACIONES DE P CUBENSIS UTILIZANDO 50 GL DE GLUCOSA COMO FUENTE DE CARBONO Y
DIFERENTES CONCENTRACIONES DE FA 60
TABLA 5 PORCENTAJE DE AacuteREA HALLADO MEDIANTE HPLC PARA LOS UacuteLTIMOS TRES DIacuteAS DE LA
FERMENTACIOacuteN CON CONCENTRACIONES DE 30 GL 50 GL Y 70 GL DE GLUCOSA Y SACAROSA CON
UN TIEMPO DE RETENCIOacuteN DE 62 Y 72 MINUTOS 81
TABLA 6 PORCENTAJE HALLADO MEDIANTE HPLC PARA LOS UacuteLTIMOS TRES DIacuteAS DE LA FERMENTACIOacuteN
CON CONCENTRACIONES DE 05 GL 10 GL Y 15 GL DE FA Y 50 GL DE GLUCOSA CON UN TIEMPO
DE RETENCIOacuteN ENTRE 62 Y 72 MINUTOS 83
TABLA 7 ANAacuteLISIS DE VARIANZA PARA EL CRECIMIENTO MICELIAL (GLUCOSA) 90
TABLA 8 ANAacuteLISIS MUacuteLTIPLE DE RANGOS PARA EL CRECIMIENTO MICELIAL (GLUCOSA) 90
TABLA 9 ANAacuteLISIS DE VARIANZA PARA EL CRECIMIENTO MICELIAL (SACAROSA) 91
TABLA 10 ANAacuteLISIS MUacuteLTIPLE DE RANGOS PARA EL CRECIMIENTO MICELIAL (SACAROSA) 91
TABLA 11 ANAacuteLISIS DE VARIANZA PARA EL CRECIMIENTO MICELIAL (GLUCOSA Y SACAROSA) 92
TABLA 12 ANAacuteLISIS MUacuteLTIPLE DE RANGOS PARA EL CRECIMIENTO MICELIAL (GLUCOSA Y SACAROSA) 92
TABLA 13 ANAacuteLISIS DE VARIANZA PARA EL CRECIMIENTO MICELIAL (GLUCOSA 50 GL Y FA) 93
TABLA 14 ANAacuteLISIS MUacuteLTIPLE DE RANGOS PARA EL CRECIMIENTO MICELIAL (GLUCOSA 50 GL Y FA) 93
TABLA 15 ANAacuteLISIS DE VARIANZA PARA EL CONSUMO DE SUSTRATO SIN FA 94
TABLA 16 ANAacuteLISIS MUacuteLTIPLE DE RANGOS PARA EL CONSUMO DE SUSTRATO SIN FA 94
TABLA 17 ANAacuteLISIS DE VARIANZA PARA EL CONSUMO DE SUSTRATO CON FA 95
TABLA 18 ANAacuteLISIS MUacuteLTIPLE DE RANGOS PARA EL CONSUMO DE SUSTRATO CON FA 95
TABLA 19 ANAacuteLISIS DE VARIANZA PARA EL CONSUMO DE PROTEIacuteNA SIN FA 96
TABLA 20 ANAacuteLISIS MUacuteLTIPLE DE RANGOS PARA EL CONSUMO DE PROTEIacuteNA SIN FA 96
TABLA 21ANAacuteLISIS DE VARIANZA PARA EL CONSUMO DE PROTEIacuteNA CON FA 97
TABLA 22 ANAacuteLISIS MUacuteLTIPLE DE RANGOS PARA EL CONSUMO DE PROTEIacuteNA CON FA 97
TABLA 23 ANAacuteLISIS DE VARIANZA PARA LA PRODUCCIOacuteN DE PSILOCIBINA SIN FA 98
TABLA 24 ANAacuteLISIS MUacuteLTIPLE DE RANGOS PARA LA PRODUCCIOacuteN DE PSILOCIBINA SEGUacuteN EL SUSTRATO
SIN FA 98
TABLA 25 ANAacuteLISIS DE VARIANZA PARA LA PRODUCCIOacuteN DE PSILOCIBINA CON FA 99
TABLA 26 ANAacuteLISIS MUacuteLTIPLE DE RANGOS PARA LA PRODUCCIOacuteN DE PSILOCIBINA SEGUacuteN EL DIacuteA CON FA
99
TABLA 27 ANAacuteLISIS DE VARIANZA PARA LA CUANTIFICACIOacuteN DE PSILOCIBINA SIN FA 100
TABLA 28 ANAacuteLISIS MUacuteLTIPLE DE RANGOS PARA LA CUANTIFICACIOacuteN DE PSILOCIBINA SEGUacuteN EL TIPO DE
SUSTRATO SIN FA 100
TABLA 29 ANAacuteLISIS DE VARIANZA PARA LA CUANTIFICACIOacuteN DE PSILOCIBINA CON FA 101
x
TABLA 30 ANAacuteLISIS MUacuteLTIPLE DE RANGOS PARA LA CUANTIFICACIOacuteN DE PSILOCIBINA SEGUacuteN LA
CONCENTRACIOacuteN CON FA 101
TABLA 31 AacuteREAS OBTENIDAS DE LOS CROMATOGRAMAS PARA EL P CUBENSIS EN MEDIO FANG-ZHONG
EN EL DIacuteA 12 PARA CONCENTRACIONES DE 30GL GLUCOSA Y 30GL SACAROSA 109
TABLA 32 AacuteREAS OBTENIDAS DE LOS CROMATOGRAMAS PARA EL P CUBENSIS EN MEDIO FANG-ZHONG
EN EL DIacuteA 12 PARA CONCENTRACIONES DE 50GL GLUCOSA Y 50GL SACAROSA 110
TABLA 33 AacuteREAS OBTENIDAS DE LOS CROMATOGRAMAS PARA EL P CUBENSIS EN MEDIO FANG-ZHONG
EN EL DIacuteA 12 PARA CONCENTRACIONES DE 50GL GLUCOSA Y 50GL SACAROSA 111
TABLA 34 AacuteREAS OBTENIDAS DE LOS CROMATOGRAMAS PARA EL P CUBENSIS EN MEDIO FANG-ZHONG
EN EL DIacuteA 12 PARA CONCENTRACIONES DE 50GL Y GLUCOSA 50GL SACAROSA 112
TABLA 35 AacuteREAS OBTENIDAS DE LOS CROMATOGRAMAS PARA EL P CUBENSIS EN MEDIO FANG-ZHONG
EN EL DIacuteA 13 PARA CONCENTRACIONES DE 30GL GLUCOSA Y 30GL SACAROSA 113
TABLA 36 AacuteREAS OBTENIDAS DE LOS CROMATOGRAMAS PARA EL P CUBENSIS EN MEDIO FANG-ZHONG
EN EL DIacuteA 13 PARA CONCENTRACIONES DE 50GL GLUCOSA Y 50GL SACAROSA 114
TABLA 37 AacuteREAS OBTENIDAS DE LOS CROMATOGRAMAS PARA EL P CUBENSIS EN MEDIO FANG-ZHONG
EN EL DIacuteA 13 PARA CONCENTRACIONES DE 70GL GLUCOSA Y 70GL SACAROSA 115
TABLA 38 AacuteREAS OBTENIDAS DE LOS CROMATOGRAMAS PARA EL P CUBENSIS EN MEDIO FANG-ZHONG
EN EL DIacuteA 13 PARA CONCENTRACIONES DE 50GL Y GLUCOSA 50GL SACAROSA 116
TABLA 39 AacuteREAS OBTENIDAS DE LOS CROMATOGRAMAS PARA EL P CUBENSIS EN MEDIO FANG-ZHONG
EN EL DIacuteA 14 PARA CONCENTRACIONES DE 30GL GLUCOSA Y 30 GL SACAROSA 117
TABLA 40 AacuteREAS OBTENIDAS DE LOS CROMATOGRAMAS PARA EL P CUBENSIS EN MEDIO FANG-ZHONG
EN EL DIacuteA 14 PARA CONCENTRACIONES DE 50GL GLUCOSA Y 50GL SACAROSA 118
TABLA 41 AacuteREAS OBTENIDAS DE LOS CROMATOGRAMAS PARA EL P CUBENSIS EN MEDIO FANG-ZHONG
EN EL DIacuteA 14 PARA CONCENTRACIONES DE 70GL GLUCOSA Y 70GL SACAROSA 119
TABLA 42 AacuteREAS OBTENIDAS DE LOS CROMATOGRAMAS PARA EL P CUBENSIS EN MEDIO FANG-ZHONG
EN EL DIacuteA 13 PARA CONCENTRACIONES DE 50GL GLUCOSA Y 50GL SACAROSA 120
xi
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1 HONGO AGARICALES (LAMINAR) (KUO 2007) 23
FIGURA 2 ALCALOIDES DERIVADOS DEL TRIPTOFANO (MERCANO Y HASEGAWA 1991) 29
FIGURA 3 TRIPTAMINAS SIMPLES (SEIGLER 1981) 31
FIGURA 4 PSILOCIBINA Y PSILOCINA (MANDRILE ET AL 1984) 32
FIGURA 5 PSILOCYBE CUBENSIS (EAH01) CULTIVADA EN MEDIO SOacuteLIDO AGAR MALTA 34
FIGURA 6 CROMATOGRAMAS DE DOS DIFERENTES FERMENTACIONES DE P CUBENSIS QUE ILUSTRAN EL
CRITERIO DE ESCOGENCIA DEL MEJOR ENSAYO REALIZADO (A) 50 GL GLUCOSA (B) 50 GL
SACAROSA 78
FIGURA 7 CROMATOGRAMAS DE DOS DIFERENTES FERMENTACIONES DE P CUBENSIS QUE ILUSTRAN EL
CRITERIO DE ESCOGENCIA DEL MEJOR ENSAYO REALIZADO (A) 05 GL FA (B) 15 GL FA 80
FIGURA 8 MUESTRA DE BIOMASA UNA VEZ ANALIZADA MEDIANTE EL REACTIVO DE DRAGENDORFF 107
FIGURA 9 PERFIL CROMATOGRAacuteFICO (TSUJIKAWA ET AL 2003) 108
xii
LISTA DE GRAacuteFICOS
GRAacuteFICO 1 CINEacuteTICA DE CRECIMIENTO MICELIAL DE P CUBENSIS EN MEDIO SUMERGIDO (FANG-ZHONG)
UTILIZANDO TRES DIFERENTES CONCENTRACIONES DE GLUCOSA COMO FUENTE DE CARBONO (PESO
SECO) 46
GRAacuteFICO 2 CRECIMIENTO MICELIAL DE P CUBENSIS EN CULTIVO SUMERGIDO BAJO TRES
CONCENTRACIONES DE GLUCOSA 47
GRAacuteFICO 3 VALORES DE CONCENTRACIOacuteN DE BIOMASA EXPERIMENTAL Y TEOacuteRICO GRAFICADOS CON
RESPECTO AL TIEMPO PARA LAS FERMENTACIONES CON DIFERENTES CONCENTRACIONES DE
GLUCOSA 49
GRAacuteFICO 4 CINEacuteTICA DE CRECIMIENTO MICELIAL DE P CUBENSIS EN MEDIO SUMERGIDO (FANG-ZHONG)
UTILIZANDO DIFERENTES CONCENTRACIONES DE SACAROSA COMO FUENTE DE CARBONO (PESO
SECO) 50
GRAacuteFICO 5 CRECIMIENTO MICELIAL PARA TRES DIFERENTES CONCENTRACIONES DE SACAROSA 52
GRAacuteFICO 6 VALORES DE CONCENTRACIOacuteN DE BIOMASA EXPERIMENTAL Y TEOacuteRICO GRAFICADOS CON
RESPECTO AL TIEMPO PARA LAS FERMENTACIONES CON DIFERENTES CONCENTRACIONES DE
SACAROSA 54
GRAacuteFICO 7 CRECIMIENTO MICELIAL PARA DOS DIFERENTES FUENTES DE CARBONO (GLUCOSA Y
SACAROSA) 56
GRAacuteFICO 8 CINEacuteTICA DE CRECIMIENTO MICELIAL DE P CUBENSIS EN MEDIO SUMERGIDO (FANG-ZHONG)
UTILIZANDO DIFERENTES CONCENTRACIONES DE FA Y 50 GL DE GLUCOSA COMO FUENTE DE
CARBONO (PESO SECO) 57
GRAacuteFICO 9 CRECIMIENTO MICELIAL PARA GLUCOSA A UNA CONCENTRACIOacuteN DE 50 GL Y TRES
DIFERENTES CONCENTRACIONES DE FA 59
GRAacuteFICO 10 VALORES DE CONCENTRACIOacuteN DE BIOMASA EXPERIMENTAL Y TEOacuteRICO GRAFICADOS CON
RESPECTO AL TIEMPO PARA LAS FERMENTACIONES CON DIFERENTES CONCENTRACIONES DE FA Y
50 GL DE GLUCOSA 61
GRAacuteFICO 11 CINEacuteTICA DE CONSUMO DE SUSTRATO POR PARTE DEL P CUBENSIS EN MEDIO SUMERGIDO
UTILIZANDO DIFERENTES CONCENTRACIONES DE GLUCOSA COMO FUENTE DE CARBONO 62
GRAacuteFICO 12 CINEacuteTICA DE CONSUMO DE SUSTRATO POR PARTE DEL P CUBENSIS EN MEDIO SUMERGIDO
UTILIZANDO DIFERENTES CONCENTRACIONES DE SACAROSA COMO FUENTE DE CARBONO 64
GRAacuteFICO 13 CONSUMO DE SUSTRATO PARA CADA UNA DE LAS FUENTES DE CARBONO UTILIZADAS 66
GRAacuteFICO 14 CINEacuteTICA DE CONSUMO DE SUSTRATO POR PARTE DEL P CUBENSIS EN MEDIO SUMERGIDO
UTILIZANDO 50 GL DE GLUCOSA COMO FUENTE DE CARBONO Y DIFERENTES CONCENTRACIONES DE
FA 67
GRAacuteFICO 15 CONSUMO DE SUSTRATO PARA CADA UNA DE LAS CONCENTRACIONES DE FA UTILIZADAS 68
GRAacuteFICO 16 CINEacuteTICA DE CONSUMO DE PROTEIacuteNA POR PARTE DEL P CUBENSIS EN MEDIO SUMERGIDO
UTILIZANDO DIFERENTES CONCENTRACIONES DE GLUCOSA COMO FUENTE DE CARBONO 70
GRAacuteFICO 17 CINEacuteTICA DE CONSUMO DE PROTEIacuteNA POR PARTE DEL P CUBENSIS EN MEDIO SUMERGIDO
UTILIZANDO DIFERENTES CONCENTRACIONES DE SACAROSA COMO FUENTE DE CARBONO 71
GRAacuteFICO 18 CONSUMO DE PROTEIacuteNA PARA CADA UNA DE LAS FUENTES DE CARBONO UTILIZADAS 73
xiii
GRAacuteFICO 19 CINEacuteTICA DE CONSUMO DE PROTEIacuteNA POR PARTE DEL P CUBENSIS EN MEDIO SUMERGIDO
UTILIZANDO 50 GL DE GLUCOSA COMO FUENTE DE CARBONO Y DIFERENTES CONCENTRACIONES DE
FA 74
GRAacuteFICO 20 CONSUMO DE PROTEIacuteNA PARA LOS ENSAYOS CON Y SIN FA 75
GRAacuteFICO 21 AacuteREA DEL COMPUESTO OBTENIDO DE P CUBENSIS EN TIEMPO DE RETENCIOacuteN ENTRE 62 Y
72 MINUTOS PARA LAS DOS FUENTES DE CARBONO 77
GRAacuteFICO 22 AacuteREA DEL COMPUESTO OBTENIDO DE P CUBENSIS EN TIEMPO DE RETENCIOacuteN ENTRE 62 Y
72 MINUTOS EN LOS UacuteLTIMOS TRES DIacuteAS DE LA FERMENTACIOacuteN CON FA Y GLUCOSA 79
GRAacuteFICO 23 AacuteREA DEL COMPUESTO OBTENIDO DE P CUBENSIS EN TIEMPO DE RETENCIOacuteN ENTRE 62 Y
72 MINUTOS PARA CADA UNA DE LAS FUENTES DE CARBONO UTILIZADAS 82
GRAacuteFICO 24 AacuteREA DEL COMPUESTO OBTENIDO DE P CUBENSIS EN TIEMPO DE RETENCIOacuteN ENTRE 62 Y
72 MINUTOS PARA CADA UNA DE LAS CONCENTRACIONES DE FA UTILIZADAS 85
GRAacuteFICO 25 CROMATOGRAMAS DEL DIacuteA 12 PARA EL P CUBENSIS CULTIVADO EN MEDIO SUMERGIDO
FANG-ZHONG CON DOS DIFERENTES TIPOS DE SUSTRATOS (A) 30 GL GLUCOSA (B) 30 GL SACAROSA
109
GRAacuteFICO 26 CROMATOGRAMAS DEL DIacuteA 12 PARA EL P CUBENSIS CULTIVADO EN MEDIO SUMERGIDO
FANG-ZHONG CON DOS DIFERENTES TIPOS DE SUSTRATOS (A) 50 GL GLUCOSA (B) 50 GL SACAROSA
110
GRAacuteFICO 27 CROMATOGRAMAS DEL DIacuteA 12 PARA EL P CUBENSIS CULTIVADO EN MEDIO SUMERGIDO
FANG-ZHONG CON DOS DIFERENTES TIPOS DE SUSTRATOS (A) 50 GL GLUCOSA (B) 50 GL SACAROSA
111
GRAacuteFICO 28 CROMATOGRAMA DEL DIacuteA 12 PARA EL P CUBENSIS CULTIVADO EN MEDIO SUMERGIDO
FANG-ZHONG CON FUENTE DE CARBONO GLUCOSA Y ADICIOacuteN DE FENILALANINA EN TRES
CONCENTRACIONES (A) 05 GL FA (B) 1 GL FA (C) 15GL FA 112
GRAacuteFICO 29 CROMATOGRAMAS DEL DIacuteA 13 PARA EL P CUBENSIS CULTIVADO EN MEDIO SUMERGIDO
FANG-ZHONG CON DOS DIFERENTES TIPOS DE SUSTRATOS (A) 30 GL GLUCOSA (B) 30 GL SACAROSA
113
GRAacuteFICO 30 CROMATOGRAMAS DEL DIacuteA 13 PARA EL P CUBENSIS CULTIVADO EN MEDIO SUMERGIDO
FANG-ZHONG CON DOS DIFERENTES TIPOS DE SUSTRATOS (A) 50 GL GLUCOSA (B) 50 GL SACAROSA
114
GRAacuteFICO 31 CROMATOGRAMAS DEL DIacuteA 13 PARA EL P CUBENSIS CULTIVADO EN MEDIO SUMERGIDO
FANG-ZHONG CON DOS DIFERENTES TIPOS DE SUSTRATOS (A) 70 GL GLUCOSA (B) 70 GL SACAROSA
115
GRAacuteFICO 32 CROMATOGRAMAS DEL DIacuteA 12 PARA EL P CUBENSIS CULTIVADO EN MEDIO SUMERGIDO
FANG-ZHONG CON FUENTE DE CARBONO GLUCOSA Y ADICIOacuteN DE FENILALANINA EN TRES
CONCENTRACIONES (A) 05 GL FA (B) 1 GL FA (C) 15GL FA 116
GRAacuteFICO 33 CROMATOGRAMAS DEL DIacuteA 14 PARA EL P CUBENSIS CULTIVADO EN MEDIO SUMERGIDO
FANG-ZHONG CON DOS DIFERENTES TIPOS DE SUSTRATOS (A) 30 GL GLUCOSA (B) 30 GL SACAROSA
117
GRAacuteFICO 34 CROMATOGRAMAS DEL DIacuteA 14 PARA EL P CUBENSIS CULTIVADO EN MEDIO SUMERGIDO
FANG-ZHONG CON DOS DIFERENTES TIPOS DE SUSTRATOS (A) 50 GL GLUCOSA (B) 50 GL SACAROSA
118
xiv
GRAacuteFICO 35 CROMATOGRAMAS DEL DIacuteA 14 PARA EL P CUBENSIS CULTIVADO EN MEDIO SUMERGIDO
FANG-ZHONG CON DOS DIFERENTES TIPOS DE SUSTRATOS (A) 70 GL GLUCOSA (B) 70 GL SACAROSA
119
GRAacuteFICO 36 CROMATOGRAMAS DEL DIacuteA 12 PARA EL P CUBENSIS CULTIVADO EN MEDIO SUMERGIDO
FANG-ZHONG CON FUENTE DE CARBONO GLUCOSA Y ADICIOacuteN DE FENILALANINA EN TRES
CONCENTRACIONES (A) 05 GL FA (B) 1 GL FA (C) 15GL FA (A) 05 GL FA (B) 1 GL FA (C)
15GL FA 120
xv
LISTA DE ECUACIONES
ECUACIOacuteN 1 ECUACIOacuteN LINEALIZADA DEL MODELO LOGIacuteSTICO 38
ECUACIOacuteN 2 VALORES TEOacuteRICOS DE BIOMASA EN EL TIEMPO 39
xvi
LISTAS DE ANEXOS
ANEXO 1 ANAacuteLISIS DE VARIANZA (ANOVA) PARA EL CRECIMIENTO DE BIOMASA DE LAS
FERMENTACIONES CON GLUCOSA _____________________________________________________ 90
ANEXO 2 ANAacuteLISIS DE VARIANZA (ANOVA) PARA EL CRECIMIENTO DE BIOMASA DE LAS
FERMENTACIONES CON SACAROSA ____________________________________________________ 91
ANEXO 3 ANAacuteLISIS DE VARIANZA (ANOVA) PARA EL CRECIMIENTO DE BIOMASA DE LAS
FERMENTACIONES CON GLUCOSA Y SACAROSA __________________________________________ 92
ANEXO 4 ANAacuteLISIS DE VARIANZA (ANOVA) PARA EL CRECIMIENTO DE BIOMASA DE LAS
FERMENTACIONES CON GLUCOSA 50 GL Y FA ___________________________________________ 93
ANEXO 5 ANAacuteLISIS DE VARIANZA (ANOVA) PARA EL CONSUMO DE SUSTRATO EN LAS FERMENTACIONES
SIN FA ____________________________________________________________________________ 94
ANEXO 6 ANAacuteLISIS DE VARIANZA (ANOVA) PARA EL CONSUMO DE SUSTRATO EN LAS FERMENTACIONES
CON FA ___________________________________________________________________________ 95
ANEXO 7 ANAacuteLISIS DE VARIANZA (ANOVA) PARA EL CONSUMO DE PROTEIacuteNA EN LAS FERMENTACIONES
SIN FA ____________________________________________________________________________ 96
ANEXO 8 ANAacuteLISIS DE VARIANZA (ANOVA) PARA EL CONSUMO DE PROTEIacuteNA EN LAS FERMENTACIONES
CON FA ___________________________________________________________________________ 97
ANEXO 9 ANAacuteLISIS DE VARIANZA (ANOVA) PARA LA PRODUCCIOacuteN DE PSILOCIBINA EN LAS
FERMENTACIONES SIN FA ____________________________________________________________ 98
ANEXO 10 ANAacuteLISIS DE VARIANZA (ANOVA) PARA LA PRODUCCIOacuteN DE PSILOCIBINA EN LAS
FERMENTACIONES CON FA ___________________________________________________________ 99
ANEXO 11 ANAacuteLISIS DE VARIANZA (ANOVA) PARA LA CUANTIFICACIOacuteN PORCENTUAL DE PSILOCIBINA EN
LAS FERMENTACIONES SIN FA _______________________________________________________ 100
ANEXO 12 ANAacuteLISIS DE VARIANZA (ANOVA) PARA LA CUANTIFICACIOacuteN PORCENTUAL DE PSILOCIBINA EN
LAS FERMENTACIONES CON FA ______________________________________________________ 101
ANEXO 13 DETERMINACIOacuteN DE CONSUMO DE AZUacuteCARES POR EL MEacuteTODO DE DNS (AacuteCIDO
DINITROSALICIacuteLICO) ________________________________________________________________ 102
ANEXO 14 CINEacuteTICA DE CONSUMO DE SUSTRATO ___________________________________________ 104
ANEXO 15 DETERMINACIOacuteN DE CONSUMO DE PROTEIacuteNAS POR EL MEacuteTODO DE LOWRY ____________ 105
ANEXO 16 CINEacuteTICA CONSUMO DE PROTEIacuteNA ______________________________________________ 106
ANEXO 17 PRUEBA DE REACTIVO DE DRAGENDORFF _________________________________________ 107
ANEXO 18 BARRIDO ESPECTRAL PARA EL PSILOCYBE CUBENSIS _________________________________ 108
ANEXO 19 CROMATOGRAMAS (HPLC) DEL DIacuteA 12 DE FERMENTACIOacuteN ___________________________ 109
ANEXO 20 CROMATOGRAMAS (HPLC) DEL DIacuteA 13 DE FERMENTACIOacuteN __________________________ 113
ANEXO 21 CROMATOGRAMAS (HPLC) DEL DIacuteA 14 DE FERMENTACIOacuteN __________________________ 117
xvii
RESUMEN
El Psilocybe cubensis es un hongo de gran importancia a nivel industrial gracias a
la presencia de una sustancia llamada Psilocibina en su cuerpo fructiacutefero
Dicho alcaloide derivado de la triptamina es muy similar al neurotransmisor
serotonina el cual es responsable de la percepcioacuten sensorial la regulacioacuten de la
temperatura el inicio del reposo nocturno del hiacutegado y los rintildeones Por tal motivo
este estudio se enfocoacute en la produccioacuten de la Psilocibina mediante el cultivo del P
cubensis en medio sumergido (Fang-Zhong)
Se evaluaron los efectos de dos fuentes de carbono (glucosa y sacarosa) a tres
concentraciones diferentes en cultivo sumergido para Psilocybe cubensis con el
fin de determinar la incidencia de eacutestas en la produccioacuten de biomasa y en la
produccioacuten y presencia de Psilocibina alcaloide de intereacutes Para las
concentraciones de glucosa de 30 gL 50 gL y 70 gL se presentoacute un crecimiento
maacuteximo de biomasa de 048 gL 055 gL y 062 gL y un porcentaje de alcaloide
de 6065 wv 7396 wv y 6733 wv respectivamente Esto uacuteltimo si se
asume que el tiempo de retencioacuten oscila entre 62 y 72 minutos contaacutendose con
una fase moacutevil de HCOONH4 en una columna C18 Mientras que para las mismas
concentraciones de sacarosa se presentoacute un crecimiento maacuteximo de biomasa de
026 gL 045 gL y 057 gL con porcentajes del compuesto presente entre el
rango de 62 y 72 minutos de 3664 wv 5857 wv y 5583 wv
respectivamente
Una vez realizada la investigacioacuten se encontroacute que las diferencias existentes en
cuanto a la cantidad de biomasa generada con respecto al tipo de sustrato
utilizado no fueron significativas es decir era irrelevante si se utilizaba glucosa o
sacarosa como principal fuente de carbono para la fermentacioacuten del P cubensis
xviii
en medio sumergido con el fin de obtener biomasa sin embargo se hallaron
diferencias significativas con respecto a las diferentes concentraciones empleadas
de dichas fuentes de carbono
Al analizar las muestras mediante cromatografiacutea liacutequida de alta eficiencia (HPLC)
se determinoacute que el medio que conteniacutea 50 gL de glucosa era el deseado debido
a que fue en eacuteste donde se presentaron picos maacutes definidos mostrando una mejor
resolucioacuten del compuesto Adicionalmente presentoacute un buen crecimiento micelial
Una vez elegido dicho criterio se evaluoacute el efecto que teniacutea la adicioacuten de un
aminoaacutecido llamado Fenilalanina (FA) al medio que conteniacutea 50 gL de glucosa
con el fin de determinar si eacuteste teniacutea alguna incidencia positiva en la produccioacuten de
biomasa y en la generacioacuten del alcaloide de intereacutes cabe resaltar que se utilizaron
diferentes concentraciones de FA correspondientes a 05 gL 10 gL y 15 gL
Finalizados dichos ensayos se obtuvieron valores de crecimiento de biomasa
maacutexima de 106 gL 108 gL y 101 gL y un porcentaje de aacuterea de 7549 wv
6236 wv y 2721 wv respectivamente
Es necesario hacer hincapieacute en que las diferencias obtenidas mediante el anaacutelisis
estadiacutestico entre cada una de las concentraciones de FA con respecto a la
generacioacuten de biomasa y la produccioacuten del compuesto no fueron significativas lo
que llevoacute a elegir una concentracioacuten de 05 gL de FA debido a que fue la menor
cantidad utilizada de este compuesto durante la investigacioacuten suponieacutendose asiacute
una disminucioacuten en los costos de materia prima
Palabras claves
Psilocybe cubensis Psilocibina Alcaloide HPLC Cultivo Sumergido Fuentes de
Carbono Fenilalanina
19
INTRODUCCIOacuteN
Los hongos son una rica fuente de productos naturales con una alta actividad
bioloacutegica Desafortunadamente el cultivo de eacutestos en cuerpo fructiacutefero toma
varios meses disminuyendo su calidad debido a los cambios climaacuteticos y plagas
por tal razoacuten se implementoacute la metodologiacutea de medio sumergido la cual es
prometedora gracias a una alta productividad de compuestos bioactivos (Arora
1986)
El Geacutenero Psilocybe pertenece al Reino Fungiacute con un Phylum Basidiomicota
una Clase Homobasidiomicetes un Orden Agaricales una Familia Strofariaceae
(Paris y Hurabielle 1981)
Dicho geacutenero es considerado de gran importancia a nivel mundial debido a que su
cuerpo fructiacutefero y biomasa micelial contienen Psilocibina la cual posee un alto
valor para la industria farmaceacuteutica por su uso en la elaboracioacuten de productos
antidepresivos Este alcaloide derivado de FA cuenta con una estructura muy
similar al neurotransmisor segregado por el cerebro llamado serotonina que
controla el estado de aacutenimo el suentildeo el hiacutegado y los rintildeones (Mandrile et al
1984) esta caracteriacutestica le otorga la gran importancia a la Psilocibina en el
mercado puesto que tiene un alto impacto en la sociedad como ayudante
antidepresivo debido a que no todas las personas segregan la cantidad necesaria
(10 mg con liacutemites que variacutean desde 5 a 20 mg) de serotonina (Mandrile et al
1984) Adicionalmente se estaacute empleando como una gran ayuda para la
disminucioacuten de la adiccioacuten a sustancias como heroiacutena y cocaiacutena gracias a que
este alcaloide no genera dependencia (Lee et al 2004)
Debido a que su consumo puede generar alucinaciones era consumido por las
culturas aboriacutegenes centroamericanas con el fin de realizar manifestaciones
20
religiosas Su uso se remonta a maacutes de 3500 antildeos y era nombrado por los
aztecas como ―Teonunaltl que significa ―carne de dioses (Mandrile et al 1984)
La alternativa que se utilizoacute durante esta investigacioacuten fue el cultivo del P
cubensis mediante medio sumergido debido principalmente a las notables
ventajas frente a los sistemas convencionales que eacuteste posee entre las cuales se
destacan la disminucioacuten del tiempo para la obtencioacuten de la biomasa (14 diacuteas) y la
reduccioacuten de los costos de obtencioacuten (Lee et al 2004) De acuerdo a lo
dimensionado anteriormente este estudio estaba orientado primordialmente a la
buacutesqueda de alternativas que permitieran la produccioacuten de biomasa de forma
raacutepida y confiable
Con el fin de llevar a cabo lo dicho anteriormente se pretendioacute evaluar el efecto
del uso de dos diferentes fuentes de carbono en este caso glucosa y sacarosa en
el crecimiento micelial de la cepa P cubensis
21
OBJETIVOS
GENERAL
Evaluar el efecto de la fuente de carbono en el crecimiento micelial de una
cepa Psilocybe sp
ESPECIacuteFICOS
Evaluar la cineacutetica de crecimiento de la cepa Psilocybe cubensis en los
diferentes medios de cultivo sumergido mediante la cuantificacioacuten de
biomasa por medio de la metodologiacutea de peso seco
Evaluar el consumo de sustrato para los diferentes ensayos por medio de
teacutecnicas espectrofotomeacutetricas
Determinar la presencia de Psilocibina mediante el uso del reactivo de
Dragendorff
22
1 MARCO TEOacuteRICO
11 CONCEPTOS GENERALES DE HONGOS
Los hongos son organismos eucariotas que no contienen clorofila con nutricioacuten
por absorcioacuten generalmente con reproduccioacuten sexual y asexual el cuerpo
consiste generalmente de filamentos ramificados con pared celular quitinosa
(Miles y Chang 1999)
Constituyen uno de los grupos de organismos maacutes importantes para la vida del
hombre ya que son los responsables de gran parte de la descomposicioacuten de la
materia orgaacutenica aumentando su disponibilidad en el suelo pueden ser
comestibles venenosos o psicotroacutepicos muchos son patoacutegenos otros producen
ciertas sustancias beneficiosas o intervienen en procesos de elaboracioacuten de
algunos comestibles (Miles y Chang 1999)
111 Hongos laminares (Agaricales)
El orden Agaricales tambieacuten conocido como Euagaricales es el mayor orden de
setas y hongos que incluye maacutes de la mitad de todas las especies conocidas de la
clase Homobasidiomycetes (Hibbett et al 1997 Hibbett y Thorn 2001) Maacutes de
9000 especies y alrededor de 350 geacuteneros se han atribuido a este orden que
contiene 26 familias (Kirk et al 2001) Un consenso de mayor nivel de
clasificacioacuten de los Agaricales ha sido difiacutecil de lograr debido a la competencia de
sistemas que restringen geacuteneros y familias (o incluso orden) de diferentes
maneras (Bas 1998 Juumllich 1981 Kirk et al 2001 Kuumlhner 1980 Singer 1986)
23
La base para la clasificacioacuten de los hongos fue construida por Fries (1874) quien
hizo hincapieacute en las caracteriacutesticas macroscoacutepicas como la textura del tallo la
separacioacuten de los filamentos (laminas) presencia o ausencia de velo y color de las
esporas
Posteriormente dividioacute los hongos Agaricales en varias especies de acuerdo al
color de las esporas depositadas las cuales pueden ser de color blanco rosado
marroacuten puacuterpura ndash marroacuten y negro El sistema macroscoacutepico de Fries que
reconocioacute inicialmente 12 geacuteneros de hongos carnosos que forman los hongos es
taxonoacutemicamente praacutectico Eacuteste fue relativamente invariable hasta que Fayod
(1989) estudioacute la anatomiacutea y las caracteriacutesticas microscoacutepicas de muchos
Agaricales reconociendo 108 geacuteneros (Arora 1986)
Al igual que todas las setas los hongos laminares son faacutebricas de esporas
creados con el uacutenico propoacutesito de fabricar esporas microscoacutepicas para dejarse
llevar por las corrientes de aire y con suerte caer en un lugar adecuado en la
tierra para germinar y comenzar un nuevo organismo Las probabilidades de que
cualquier individuo que tiene esporas de este tipo tenga suerte son tan bajas que
el hongo produce millones de esporas para compensar esto En las laacuteminas se
encuentran numerosas esporas las cuales aumentan considerablemente el
nuacutemero de esporas que el hongo puede producir Ambos lados de cada laacutemina
estaacute cubierta con esporas microscoacutepicas (Kuo 2007) A continuacioacuten se muestra
de manera ilustrativa en la figura 1 las laacuteminas que poseen los hongos Agaricales
en las cuales se da la formacioacuten de las esporas
Figura 1 Hongo Agaricales (Laminar) (Kuo 2007)
24
12 MEDIOS DE CULTIVO
Uno de los sistemas maacutes importantes para la identificacioacuten de microorganismos es
observar su crecimiento en sustancias alimenticias artificiales preparadas en el
laboratorio El material alimenticio en el que crecen los microorganismos es el
medio de cultivo (Garciacutea 1995)
Para que los microorganismos crezcan adecuadamente en un medio de cultivo
artificial eacuteste debe reunir una serie de condiciones como lo son temperatura
grado de humedad y presioacuten asiacute como un grado correcto de acidez o alcalinidad
Un medio de cultivo contiene los nutrientes y factores de crecimiento necesarios
para que el microorganismo se desarrolle correctamente y debe estar exento de
cualquier tipo de microorganismo que pueda generar contaminacioacuten (Garciacutea
1995)
121 Tipos de medios de cultivo
En la actualidad existen diversos tipos de medio de cultivo si se centra en la
composicioacuten eacutestos pueden ser medios sinteacuteticos que contienen fuente de
carbono fuente de nitroacutegeno sales que suplan los iones y demaacutes elementos tales
como estimuladores del crecimiento medios complejos que contienen ingredientes
tales como extracto de levadura peptona infusioacuten de cerebro etc ricos en
nutrientes medios de enriquecimiento siendo estos complejos con aditivos
adicionales para favorecer asiacute al crecimiento y desarrollo de determinados
microorganismos medios selectivos los cuales son disentildeados para favorecer el
crecimiento especiacutefico de un microorganismo determinado o un grupo
microbiano medios diferenciales que proporcionan la distincioacuten microbiana de una
mezcla por sus propiedades diferenciales de crecimiento en dichos medios
medios de mantenimiento siendo disiacutemiles de los de crecimiento oacuteptimo por el
25
crecimiento raacutepido y proliacutefico que deriva en la muerte raacutepida de las ceacutelulas (Garciacutea
1995)
Atendiendo a su estado los medios de cultivo pueden presentarse como medios
sumergidos y medios soacutelidos que contienen agar que gelifica por debajo de 45
degC y cuya concentracioacuten en su uso es de 15 y medios semisoacutelidos que contiene
un agar a una concentracioacuten de 07 (Garciacutea 1995)
121 Medio sumergido
Debido a que cultivar el cuerpo fructiacutefero toma varios meses y se dificulta el control
de calidad del producto final porque se estaacute sujeto a los cambios permanentes del
clima y las plagas se ha empleado la metodologiacutea de medio sumergido la cual es
una alternativa muy prometedora para la produccioacuten eficiente del micelio y de los
metabolitos (Lindequist y Niedermeyer 2005)
Dicha forma es la mejor para producir extraer y purificar metabolitos de un cultivo
de hongo ya que facilita una mayor produccioacuten de biomasa en menor tiempo y
de mayor calidad que el cultivo en medio soacutelido ademaacutes facilita la dispersioacuten y
adaptacioacuten del hongo y reduce los vectores de contaminacioacuten De igual forma un
cultivo de esta iacutendole es la opcioacuten maacutes viable si se quiere escalar procesos
fermentativos en aras de desarrollar mercados como en este caso el de
metabolitos medicinales (Navarro et al 1998)
A su vez el uso de cultivo sumergido puede beneficiar la produccioacuten de muchos
metabolitos secundarios y disminuir los costos de produccioacuten por reducir las
labores que involucran los meacutetodos de etapas soacutelidas (Domiacutenguez y Webb 2003)
Los metabolitos bioactivos de los hongos pueden ser potencialmente producidos a
nivel industrial mediante el uso de la metodologiacutea de cultivo sumergido pero el
26
eacutexito a escala comercial depende del costo comparado con la tecnologiacutea existente
y la ventaja econoacutemica que la industria puede ver usando este meacutetodo El uso de
la tecnologiacutea puede ser facilitada por el aumento en el rendimiento de la
produccioacuten y el desarrollo del sistema (Hwang et al 2004)
El cultivo de hongos sumergidos se caracteriza por un aumento en la viscosidad
del caldo con el tiempo debido a uno o maacutes factores tales como el aumento de la
concentracioacuten de ceacutelulas los cambios de la morfologiacutea del crecimiento o la
produccioacuten de productos extracelulares que alteran el caraacutecter reoloacutegico de la
cultura del liacutequido El aumento en la viscosidad puede ser visto como un fenoacutemeno
indeseable pero inevitable ya que causan dificultades en el suministro de oxiacutegeno
en la eliminacioacuten de dioacutexido de carbono y en posibles problemas de agitacioacuten
(Hwang et al 2004)
13 ALCALOIDES
131 Generalidades
La diversidad estructural y la variedad en la actividad bioloacutegica hacen de los
alcaloides como tambieacuten de los antibioacuteticos los grupos maacutes importantes entre las
sustancias naturales de intereacutes terapeacuteutico (Paris y Hurabielle 1981)
Se han aislado principalmente en plantas superiores y se han encontrado en maacutes
de 100 familias de Faneroacutegamas (aquellas plantas que se reproducen por semillas
producidas en sus inflorescencias) Su actividad bioloacutegica a nivel del sistema
nervioso dio pie a las primeras investigaciones siendo los alcaloides las primeras
sustancias naturales estudiadas (Paris y Hurabielle 1981)
El teacutermino alcaloide propuesto por el farmaceacuteutico W Meissner en 1819 se aplicoacute
a los compuestos de origen vegetal con propiedades alcalinas este caraacutecter
baacutesico es debido a la presencia de nitroacutegeno amiacutenico en su estructura Los
27
alcaloides se pueden considerar como ―Un compuesto orgaacutenico de origen natural
nitrogenado derivados generalmente de aminoaacutecidos maacutes o menos baacutesico de
distribucioacuten restringida con propiedades farmacoloacutegicas importantes a dosis bajas
y que responden a reacciones comunes de precipitacioacuten (Paris y Hurabielle
1981)
132 Propiedades fisicoquiacutemicas
Los alcaloides tienen masas moleculares que variacutean entre 100 y 9000 gmol son
casi siempre incoloros son normalmente soacutelidos a temperatura ambiente a
excepcioacuten de los alcaloides no oxigenados Los alcaloides son poco solubles en
agua gracias a su caraacutecter baacutesico dicho caraacutecter se debe al par de electrones
libres del nitroacutegeno (Paris y Hurabielle 1981)
En la naturaleza se encuentran en forma de sales generalmente En las plantas
se consideraba que eran productos obtenidos durante la extraccioacuten y poco
solubles en disolventes tiacutepicos de extraccioacuten por su polaridad Son solubles en
disolventes orgaacutenicos como cloroformo etanol metanol acetato de etilo eacuteter
benceno En forma de sales son solubles en agua excepto las sales de berberina
(Paris y Hurabielle 1981)
Todos los alcaloides son activos a la luz polarizada Presentan una fluorescencia
caracteriacutestica bajo la luz UV o IR dando lugar a espectros caracteriacutesticos (Paris y
Hurabielle 1981)
133 Reconocimiento de los alcaloides
Las teacutecnicas de reconocimiento son basadas en la capacidad que tienen los
alcaloides en estado de sal (extractos aacutecidos) de combinarse con el yodo y
metales pesados como bismuto mercurio tungsteno formando precipitados se
28
utilizan reactivos generales para detectar alcaloides como reactivo de Wagner
reactivo de Mayer reactivo de Dragendorff reactivo de Hager reactivo de
Bertrand reactivo de Ehrlich y reactivo de Vitali-Morin (Paris y Hurabielle 1981)
134 Clasificacioacuten de los alcaloides
Habitualmente los alcaloides se han clasificado en funcioacuten de su estructura
distinguieacutendose principalmente los compuestos heterociacuteclicos de los no
heterociacuteclicos Actualmente existen varias formas de clasificarlos (Bruneton
1987) entre ellas se pueden distinguir
1341 Alcaloides alifaacuteticos
a Derivados de la ornitina (pirrolidinas tropaacutenicos pirrolizidiacutenicos)
b Derivados de la lisina (piperidinas quinolizidiacutenicos)
1342 Alcaloides de origen diverso
a Alcaloides terpeacutenicos y esteroidales
b Alcaloides diversos (purinas macrociclos etc)
1343 Alcaloides aromaacuteticos
a Derivados del aacutecido nicotiacutenico (piridinas)
b Derivados de la fenilalanina y tirosina (isoquinoleinas)
c Derivados del triptofano (indoacutelicos quinoleinas)
d Derivados de la histidina (imidazoles)
29
Alcaloides derivados del triptofano (Alcaloides Indoacutelicos)
Desde el punto de vista farmacoloacutegico ha habido mucho intereacutes sobre las bases
que contienen el nuacutecleo indoacutelico a raiacutez del descubrimiento de la actividad
alucinoacutegena del LSD asiacute como la actividad sedante de la reserpina aislada del
geacutenero Rauwolfia El auge del estudio fitoquiacutemico ocurrioacute en la deacutecada de los 60 y
se dirigiacutea principalmente a la familia Apocynaceae (Mercano y Hasegawa 1991)
Existen unos 800 alcaloides de este tipo distribuidos principalmente en la familia
Apocynaceae (geacuteneros Rauwolfia Aspidos-perma Strychnos y Vinca) menos
frecuentes en hongos y familias como Leguminoseae Malphigiaceae Rubiaceae y
Rutaceae donde los alcaloides presentan el grupo indoacutelico sencillo (Mercano y
Hasegawa 1991)
El triptofano es el precursor de estos alcaloides los cuales se clasifican en
triptaminas y en no triptaminas las triptaminas a su vez se subdividen en b-
carbolinas y en indoleninas y pueden ser triptaminas simples o triptaminas
complejas y estas pueden ser isopreacutenicas o no isopreacutenicas (Mercano y Hasegawa
1991) La figura 2 muestra la estructura quiacutemica del triptofano triptamina y sus
divisiones
Figura 2 Alcaloides derivados del Triptofano (Mercano y Hasegawa 1991)
30
Triptaminas simples
Las triptaminas simples juegan un importante papel en la cultura indiacutegena de
Ameacuterica por sus efectos alucinoacutegenos y extaacuteticos en sus ceremonias maacutegico
religiosas (Furst 1994) Se han encontrado en hongos alucinoacutegenos de
Mesoameacuterica del geacutenero Psilocybe Stropharia y Conocybe (―teonacatl o ―carne
de los dioses) usados por los indios Aztecas en sus ceremonias religiosas desde
hace maacutes de 1700 antildeos Se han encontrado en estos hongos los alcaloides
alucinoacutegenos la Psilocina y la Psilocibina que al ingerirlos produce diferentes
sensaciones auditivas y visuales relajacioacuten muscular depresiones y euforias
alternadas (Mercano y Hasegawa 1991)
La serotonina que juega un importante papel en la actividad neuronal se
encuentra tambieacuten en vegetales Se ha aislado en el pericarpio del banano el cual
seco cuando es fumado actuacutea como un alucinoacutegeno ligero (Seigler 1981)
De las glaacutendulas paroacutetidas del sapo comuacuten Bufo vulgaris se aiacutesla la bufotenina
derivado N-dimetilado de la serotonina que tambieacuten es el principio activo del Yopoacute
polvo de las semillas de Anadenanthera peregrina (Piptadenia peregrina)
Leguminoseae y especies del geacutenero Virola (Myristicaceae) que contiene tambieacuten
triptaminas son mezclados con cenizas e inhalados por medio de tubos de bambuacute
por los indiacutegenas del Orinoco en ceremonias maacutegico religiosas produciendo
alucinacioacuten e incoordinacioacuten motriz (Seigler 1981)
En la figura 3 se observan las estructuras de aquellos compuestos que estaacuten
clasificados como triptaminas simples
31
Figura 3 Triptaminas simples (Seigler 1981)
13 PSILOCIBINA Y PSILOCINA
La Psilocibina y la Psilocina son bioloacutegicamente sintetizadas en los hongos
pertenecientes a los geacuteneros de Psilocybe (Bigwood y Beug 1982 Wurst et al
1984)
La Psilocibina y la Psilocina se han identificado en todo el mundo en una variedad
de setas que son llamados hongos maacutegicos La ingestioacuten de pequentildeas
cantidades de alucinoacutegenos provoca el eacutextasis La actividad alucinoacutegena de la
Psilocibina es relativamente maacutes baja que la de la Psilocina Sin embargo la
Psilocibina se convierte faacutecilmente en Psilocina (componente activo principal) en
los sistemas bioloacutegicos Asiacute el desarrollo de un meacutetodo de determinacioacuten de la
Psilocibina es importante lo misma que la de la Psilocina (Kimie et al 2005)
La hidroacutelisis de la Psilocibina se consigue saturando con anhiacutedido carboacutenico una
solucioacuten acuosa de Psilocibina (para eliminar el oxiacutegeno del aire y calentaacutendola)
obteniendo asiacute una moleacutecula de 4hidroxi-dimetiltriptamina y una moleacutecula de aacutecido
fosfoacuterico (Mandrile et al 1984)
Como todos los faacutermacos derivados del indol estas sustancias han despertado
intereacutes porque se sospechoacute la posibilidad de que algunas de ellas se formen en el
32
organismo y que en ciertas psicosis especialmente en la esquizofrenia se
produzcan elevados niveles sanguiacuteneos que ocasionan algunos de los siacutentomas
(Mandrile et al 1984)
La figura 4 muestra la estructura quiacutemica de alcaloides como la Psilocibina y
Psilocina
Figura 4 Psilocibina y Psilocina (Mandrile et al 1984)
131 Antecedentes acerca de la obtencioacuten de Psilocibina y Psilocina
Una gran variedad de meacutetodos cromatograacuteficos para la determinacioacuten de
Psilocibina y Psilocina presentes en las incautaciones de hongos se han
publicado La cromatografiacutea de capa fina es utilizada debido a que eacutesta es muy
apropiada para la deteccioacuten de sustancias derivadas del triptofano (Brown et al
1972 Tanimukai 1967 Beug y Bigwood 1981) Aun asiacute meacutetodos que involucran
tanto la cromatografiacutea de alta eficiencia (HPLC) como la deteccioacuten fotomeacutetrica de
UV (Beug y Bigwood 1981 Wurst et al 1984 Borner y Brenneisen 1987 Perkal
et al 1980 Vanhaelen-Faestreacute y Vanhaelen 1984 Thomson 1980 White 1979
Sottolano y Lurie 1983) fueron establecidas y optimizadas para la cuantificacioacuten
de Psilocibina
Durante los uacuteltimos antildeos se han venido utilizando diferentes tipos de columna y
fase moacutevil con el fin de obtener la mayor cantidad posible de la sustancia de
intereacutes (Psilocibina)
33
En el antildeo 1981 en el instituto farmaceacuteutico de la Universidad de Oslo realizaron
una investigacioacuten con una columna de siacutelice con una fase moacutevil de metanol-nitrato
de amonio en donde no soacutelo se logroacute obtener Psilocibina y Psilocina sino tambieacuten
un nuevo producto conocido como beocistiacuten Se logroacute un porcentaje de separacioacuten
maacutexima de 75 ww (Christiansen et al 1981)
Asimismo en el antildeo 1984 en el instituto de microbiologiacutea de Amsterdam se
realizoacute un estudio con una columna C18 de siacutelice y una fase moacutevil de agua-etanol-
aacutecido aceacutetico de forma isocraacutetica en donde se obtuvo un porcentaje 025-115
y 002-016 de Psilocibina y Psilocina respectivamente en el hongo (Wurst
1984)
De igual manera en el antildeo 2003 en el instituto de ciencia policiaca en Japoacuten se
ejecutoacute la cromatografiacutea de alta eficiencia utilizando una columna C18 con una
fase moacutevil de aacutecido foacutermico de forma isocraacutetica y un detector de 220 nm un rango
de porcentaje de Psilocibina 014-042 wv en la capa mientras un 009-03
wv en el tallo (Tsujikawa et al 2003)
34
2 MATERIALES Y MEacuteTODOS
21 LOCALIZACIOacuteN
Las fermentaciones la medicioacuten del crecimiento micelial y la cuantificacioacuten del
consumo del sustrato y de proteiacutena se llevaron a cabo en el laboratorio de
Biotecnologiacutea de la Universidad EAFIT mientras que los anaacutelisis de cromatografiacutea
liacutequida de alta eficiencia (HPLC) se realizaron en el laboratorio de Quiacutemica
Instrumental de dicha Universidad
22 MICROORGANISMO DE ESTUDIO
La cepa del hongo Psilocybe cubensis (EAH01) con la cual se trabajoacute fue donada
por Joseacute Rodrigo Moreno Ingeniero del laboratorio de la Universidad Catoacutelica de
Oriente (UCO) La EAH01 permanece auacuten en el laboratorio de Biotecnologiacutea de la
Universidad EAFIT
Dicha cepa se cultivoacute en una caja Petri que conteniacutea Agar Extracto de Malta
(MEA) y se incuboacute a 30ordmC en una incubadora digital del laboratorio de
Biotecnologiacutea de la Universidad EAFIT La figura 5 representa una cepa de P
cubensis cultivada en medio soacutelido MEA
Figura 5 Psilocybe cubensis (EAH01) cultivada en medio soacutelido Agar Malta
35
23 COMPONENTES DEL MEDIO DE CULTIVO (FANG-ZHONG)
El medio sumergido utilizado para llevar a cabo las diferentes fermentaciones de
P cubensis fue el descrito por Fang-Zhong (2002) La tabla 1 muestra los
componentes de dicho medio y la concentracioacuten de cada uno de ellos Se destaca
que las fuentes de carbono utilizadas fueron glucosa y sacarosa usaacutendolas cada
una por separado para cada experimento y haciendo variaciones de
concentraciones de las mismas para los distintos ensayos
Tabla 1 Composicioacuten del medio de cultivo sumergido para evaluar el crecimiento micelial del P cubensis
Componentes Cantidad (gL)
Fuente de Carbono 30 ndash 50 - 70
Peptona 5
Extracto de levadura 5
KH2PO4 1
MgSO47H2O 05
Vitamina B1 005
24 PREPARACIOacuteN DE LOS DIFERENTES PREINOacuteCULOS DE P cubensis
EMPLEADOS PARA LAS FERMENTACIONES SUMERGIDAS
Con el propoacutesito de llevar a cabo cada uno de los ensayos fue necesario realizar
la preparacioacuten de un preinoacuteculo eacutesto con el fin de realizar un proceso de
adaptacioacuten del P cubensis al medio favoreciendo la disminucioacuten en cuanto a
tiempo (preferiblemente la eliminacioacuten de la aparicioacuten de un fase de latencia una
vez comenzada la fermentacioacuten)
La preparacioacuten de cada uno de los preinoacuteculos se realizoacute en 6 erlenmeyers de
1000 mL con 200 mL de medio cada uno los cuales fueron esterilizados a 120degC
por 15 minutos e inoculados con 4 discos de 5 mm aproximadamente de P
36
cubensis provenientes de la cepa previamente activada en Agar Malta durante 6
diacuteas Los erlenmeyers se llevaron a un agitador orbital por 6 diacuteas a 30ordmC y 100
rpm
25 PREPARACIOacuteN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO Y LOS INOacuteCULOS DE P
cubensis UTILIZADOS PARA LAS FERMENTACIONES SUMERGIDAS
Una vez realizado el preinoacuteculo se procedioacute a preparar los medios de cultivo
utilizados para realizar los distintos experimentos de la siguiente manera se
prepararon medios que diferiacutean en la fuente de carbono (glucosa o sacarosa) y en
la concentracioacuten de la misma (30 gL 50 gL y 70 gL) teniendo asiacute un total de
seis fermentaciones Las demaacutes cantidades de los componentes del medio de
Fang-Zhong fueron las mismas que las usadas en el preinoacuteculo descritas en la
Tabla 1
En primer lugar se llevaron a cabo las tres fermentaciones de glucosa
preparando un total de 90 erlenmeyers (30 por cada concentracioacuten de azuacutecar por
duplicado) cada uno de los frascos conteniacutea 50 mL del medio en erlenmeyers de
250 mL e inoculados con 01 g de peso huacutemedo del preinoacuteculo aproximadamente
Los 90 frascos se llevaron durante 14 diacuteas a un agitador orbital a 100 rpm con una
temperatura de 30 degC
Posteriormente se llevaron a cabo las tres fermentaciones de sacarosa siguiendo
el mismo proceso descrito anteriormente para la glucosa
Una vez terminadas las fermentaciones de glucosa y sacarosa y realizados todos
los anaacutelisis correspondientes (generacioacuten de biomasa consumo de sustrato
consumo de proteiacutena y evaluacioacuten de la presencia de Psilocibina por medio de
cromatografiacutea liacutequida de alta eficiencia (HPLC)) se procedioacute a elegir la fuente de
carbono y concentracioacuten que mejores resultados arrojoacute tanto para la generacioacuten
37
de biomasa como para la produccioacuten del alcaloide con el fin de evaluarla
nuevamente adicionaacutendole un precursor (FA)
Para finalizar se procedioacute a preparar los medios con la fuente de carbono y la
concentracioacuten de la misma que arrojoacute mejores resultados es decir los ensayos
realizados con una concentracioacuten de 50 gL de glucosa adicionaacutendole al medio
FA a diferentes concentraciones correspondiente a valores de 05 gL 10 gL y
15 gL las demaacutes cantidades de los componentes remanentes del medio fueron
las mismas que las descritas anteriormente en la tabla 1
26 CUANTIFICACIOacuteN DEL CRECIMIENTO DE BIOMASA MEDIANTE LOS
MEacuteTODOS DE PESO HUacuteMEDO Y PESO SECO PARA CULTIVO
SUMERGIDO DE P cubensis
La cuantificacioacuten de biomasa para cada uno de los tratamientos se realizoacute usando
la metodologiacutea de peso huacutemedo y peso seco Para la cuantificacioacuten de biomasa
mediante el meacutetodo de peso huacutemedo se tomaron dos muestras provenientes de
cada erlenmeyer cada 24 horas las cuales fueron filtradas y pesadas con el fin de
obtener el valor de peso huacutemedo para cada tratamiento del P cubensis
Posteriormente la biomasa retenida en el papel filtro fue llevada a un secador que
se encontraba a una temperatura de 50ordmC durante 24 horas transcurrido el
tiempo la biomasa seca fue pesada con el fin de obtener datos de peso seco
Durante los 14 diacuteas de la fermentacioacuten se obtuvieron datos de peso huacutemedo y
peso seco por duplicado para cada una de las fermentaciones
27 AJUSTE DE LA CINEacuteTICA DE CRECIMIENTO DE P cubensis AL
MODELO CINEacuteTICO LOGIacuteSTICO
Una vez realizada la recoleccioacuten de muestras para cada uno de los ensayos y su
posterior anaacutelisis se decidioacute modelar dichos datos mediante el modelo logiacutestico
38
(ecuacioacuten 1) el cual permite obtener variables cineacuteticas tales como la cantidad de
biomasa inicial (Xo) y la velocidad maacutexima de crecimiento (micromaacutex) para cada uno de
los tratamientos
Se decidioacute emplear el modelo logiacutestico ya que eacuteste muestra resultados maacutes reales
cuando se cultivan hongos debido a que su morfologiacutea es muy diferente a otros
microorganismos (pellets) dificultando la transferencia de masa (Bailey et al
1986)
Una vez linealizada la ecuacioacuten que describe dicho modelos se llega a la siguiente
expresioacuten
Ecuacioacuten 1 Ecuacioacuten linealizada del modelo logiacutestico
Posterior a la linealizacioacuten de la ecuacioacuten se procedioacute a graficar Ln ((XmaacutexX)-1)
vs tiempo con el fin de obtener como pendiente la velocidad maacutexima de
crecimiento (micromaacutex) y como intercepto el Ln ((XmaacutexXo)-1) el cual permitioacute la
obtencioacuten de la concentracioacuten inicial de biomasa
Obtenieacutendose asiacute los paraacutemetros cineacuteticos para cada ensayo correspondientes a
micromax y Xo
Se debe definir la concentracioacuten maacutexima de biomasa (Xmaacutex) para poder hallar los
paraacutemetros cineacuteticos mediante dicho modelo cabe aclarar que dicho valor se toma
de los resultados de biomasa adquiridos para cada uno de los ensayos mediante
la metodologiacutea de peso seco este valor variacutea para cada fermentacioacuten
Una vez ajustados los datos de cada tratamiento al modelo logiacutestico se procedioacute a
calcular de manera teoacuterica los valores de X (biomasa) que variacutea con el tiempo
39
teniendo en cuenta los paraacutemetros cineacuteticos arrojados mediante el modelo
logiacutestico utilizando la siguiente ecuacioacuten
Ecuacioacuten 2 Valores teoacutericos de biomasa en el tiempo
Estos valores de X teoacutericos obtenidos mediante la foacutermula anterior se grafican con
respecto a los valores de X obtenidos de manera experimental con el fin de
observar el ajuste del modelo logiacutestico a cada uno de los datos experimentales
28 EVALUACIOacuteN DEL CONSUMO DE SUSTRATO Y DEL CONSUMO DE
PROTEIacuteNA POR PARTE DEL P cubensis CULTIVADO EN MEDIO
SUMERGIDO
Con el fin de evaluar el consumo de sustrato y proteiacutena por parte del P cubensis
durante las fermentaciones que conteniacutean glucosa en el medio se recolectaron
muestras cada 24 horas del liacutequido obtenido despueacutes de realizada la filtracioacuten de
la muestra que se utilizoacute para efectos de caacutelculo de peso seo dicho liacutequido
denominado sobrenadante fue almacenado a -4 degC Finalizadas cada una de las
fermentaciones se procedioacute a realizar el protocolo para evaluar el consumo de
sustrato para cada medio (Miller 1959) mediante el meacutetodo de DNS (Aacutecido
Dinitrosaliciacutelico) (Anexo 13) y el consumo de proteiacutenas mediante el meacutetodo de
LOWRY para cada fermentacioacuten (Anexo 15)
Para llevar a cabo la cuantificacioacuten de sustrato y proteiacutena en los distintos ensayos
fue necesario realizar las curvas de calibracioacuten correspondientes dichas curvas
con sus respectivos valores de concentracioacuten se muestran en los anexos 14 y 16
40
29 MEacuteTODO CUALITATIVO PARA DETERMINAR LA PRESENCIA DE
ALCALOIDES (PSILOCIBINA) MEDIANTE EL USO DEL REACTIVO DE
DRAGENDORFF
Como se mencionoacute anteriormente el reactivo de Dragendorff es usado para
determinar de manera cualitativa la ausencia o presencia de alcaloides en una
muestra determinada Para llevar a cabo dicha prueba se recolectaron muestras
de la biomasa seca correspondientes a los diacuteas 12 13 y 14 de cada fermentacioacuten
las cuales fueron almacenadas a -4degC
Para determinar la presencia de Psilocibina se realizoacute el proceso descrito seguacuten
Musshoff et al (2000) el cual consistioacute en macerar cada una de las muestras de
biomasa hasta obtener un polvo fino luego se pesaron 10 mg de dicho polvo y a
esta cantidad se le agregoacute 1 mL de metanol Posteriormente una pequentildea
cantidad de esta mezcla se esparcioacute en un papel filtro en donde se le adicionoacute una
gota del reactivo de Dragendorff
Una vez realizada la prueba se dice que la muestra contiene presencia de
alcaloides si eacutesta presenta una coloracioacuten rojizo-amarilla
210 MEacuteTODO PARA DETERMINAR LA PRESENCIA DE PSILOCIBINA
MEDIANTE CROMATOGRAFIacuteA LIacuteQUIDA DE ALTA EFICIENCIA (HPLC)
Una vez evaluada la presencia del alcaloide mediante el reactivo de Dragendorff
se procedioacute a determinar mediante el uso de cromatografiacutea liacutequida de alta
eficiencia (HPLC) la presencia de los alcaloides en la mezcla con sus respectivos
tiempos de retencioacuten para llevar a cabo la extraccioacuten de la Psilocibina se siguioacute el
meacutetodo descrito por Musshoff et al (2000) Para ello la muestra de biomasa
seca fue macera en un mortero hasta convertirla en un polvo fino Diez miligramos
41
de la muestra en polvo se extrajeron dos veces con 1 mL de metanol en un bantildeo
de ultrasonido durante 30 minutos Posterior a eacutesto se centrifugaron las muestras
a 3000 rpm durante 2 minutos el sobrenadante se depositoacute en un vial
independiente
El sobrenadante fue evaporado hasta sequedad bajo una corriente de nitroacutegeno
gaseoso Una parte de los residuos se disolvioacute en 200 microL de la fase moacutevil que
contiene HCOONH4 con una concentracioacuten 10 microM y un pH de 35
El equipo utilizado para realizar todos los anaacutelisis correspondientes a HPLC
cuenta con las siguientes caracteriacutesticas equipo Agient Technologies que consta
de una columna C18 de 46 mm 250 mm 5 mm con una fase moacutevil de
HCOONH4 con un flujo de 1 mLminuto un detector UV de 214 nm y una inyeccioacuten
de 20 μL y una temperatura de 25degC El experimento se corrioacute de modo isocraacutetico
con una fase moacutevil de agua 70 y HCOONH4 de 30
211 DETERMINACIOacuteN CUALITATIVA DE LA RESOLUCIOacuteN DEL
ALCALOIDE DE INTEREacuteS PARA LOS DIFERENTES ENSAYOS
Con el fin de determinar de manera cualitativa cuaacutel de los cromatogramas
arrojados mediante la teacutecnica de HPLC presentoacute mejor resolucioacuten del alcaloide
fue necesario realizar un supuesto acerca del tiempo de retencioacuten de la Psilocibina
durante la cromatografiacutea puesto que a pesar de haber contado con un
cromatograma (Tsujikawa et al 2003) (Anexo 18) y haber trabajado en las
mismas condiciones de eacuteste no se utilizoacute la misma fase moacutevil lo que puedo
generar variaciones en dicho tiempo Se asumioacute que el tiempo de retencioacuten varioacute
entre 62 y 72 minutos es decir entre este tiempo se encontroacute el pico de intereacutes
de la investigacioacuten
42
La eleccioacuten del criterio de pureza del compuesto de intereacutes se realizoacute observando
cuaacutel de los picos obtenidos muestra menor ruido es decir que a su alrededor no
tenga presencia de otros compuestos (Anexos 19 20 y 21)
212 DETERMINACIOacuteN PORCENTUAL DE COMPUESTOS PARA LOS
DIFERENTES ENSAYOS
La cuantificacioacuten de los compuestos se hizo mediante un porcentaje de aacuterea bajo
la curva debido a que no se contoacute con un estaacutendar interno
Para realizar dicho porcentaje se obtuvo la totalidad de las aacutereas presentes en el
perfil cromatograacutefico obtenido para las muestras de los diacuteas 12 13 y 14 de cada
fermentacioacuten y el porcentaje del aacuterea del metabolito de intereacutes la cual oscilaba
entre un tiempo de retencioacuten entre 62 y 72 minutos
En el momento de analizar los cromatogramas y de elegir el medio que mejor
resultados arrojoacute en cuanto a la produccioacuten de alcaloide se observoacute la resolucioacuten
del metabolito en cada una de las fermentaciones
213 CULTIVO SUMERGIDO DE P cubensis EN PRESENCIA DE FA
Despueacutes de haber elegido la fuente de carbono (glucosa) y su respectiva
concentracioacuten (50 gL) que mejores resultados arrojaron durante la investigacioacuten
se realizaron nuevamente fermentaciones del P cubensis en medio sumergido
(Fang-Zhong) donde la diferencia de estos medios con respecto a los
anteriormente utilizados radicoacute en la presencia de FA aminoaacutecido
Para dichas fermentaciones se contoacute con tres concentraciones diferentes de FA
(05 gL 1 gL 15 gL) realizadas por duplicado adicionalmente se montoacute
43
simultaacuteneamente con dichos ensayos las muestras correspondientes a los uacuteltimos
tres diacuteas de fermentacioacuten sin FA en el medio para efectos de comparacioacuten y asiacute
poder llevar a cabo un anaacutelisis estadiacutestico apropiado
Los datos obtenidos fueron analizados por medio de una ANOVA con el fin de
observar si existiacutean o no diferencias significativas en cuanto al crecimiento micelial
(concentracioacuten de biomasa) del P cubensis y asiacute poder determinar el medio que
mejores resultados arrojoacute durante la investigacioacuten
214 DISENtildeO DE EXPERIMENTOS Y ANAacuteLISIS ESTADIacuteSTICO
El disentildeo estadiacutestico utilizado para realizar los anaacutelisis correspondientes a las
diferentes fermentaciones es un disentildeo factorial 23 Este estudio se basoacute en dos
factores que fueron las dos fuentes de carbono (glucosa y sacarosa) a su vez se
apoyoacute en tres niveles que fueron la variacioacuten en la concentracioacuten de las mismas
(30 gL 50 gL y 70 gL) De igual manera se fundamentoacute en dos variables de
respuesta el crecimiento micelial de P cubensis y el porcentaje de Psilocibina
presente en el microorganismo
Por medio del Software Statgraphics plus 51 se realizoacute un anaacutelisis estadiacutestico
basado en una ANOVA factorial Con ello se pretendioacute comparar estadiacutesticamente
los resultados de crecimiento micelial de biomasa (concentracioacuten) y produccioacuten de
Psilocibina para cada uno de los medios durante los 14 diacuteas de fermentacioacuten y en
especial en los uacuteltimos tres diacuteas de la misma puesto que durante este periacuteodo fue
evaluada la presencia del alcaloide
Es necesario hacer hincapieacute que para realizar dicha estadiacutestica fue necesario
ejecutar un estudio de normalidad el cual se comproboacute utilizando la graacutefica de
probabilidad normal a su vez se requirioacute un anaacutelisis de igualdad de varianza por
medio de una graacutefica de residuos Vs previsto con el fin de ver visualmente la
44
hipoacutetesis de la homocedasticidad todo ello con el fin de garantizar que la
investigacioacuten se comportoacute de forma normal Adicionalmente se contoacute con una
hipoacutetesis nula (Ho) y una Hipoacutetesis alterna (Ha) las cuales permitieron realizar las
conclusiones respectivas A continuacioacuten se enunciaraacuten cada una de eacutestas y los
paraacutemetros necesarios para dicho estudio
Ho Todas las medias son iguales es decir no existen diferencias
significativas entre los datos analizados
Ha Alguna de las medias es diferente lo que quiere decir que siacute existen
diferencias significativas
Paraacutemetro
Pvalor gt 005 Se acepta Ho
Pvalor le 005 Se rechaza Ho
45
3 RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN
31 CINEacuteTICA DE CRECIMIENTO MICELIAL DE P cubensis EN CULTIVO
SUMERGIDO (FANG-ZHONG) UTILIZANDO DIFERENTES FUENTES DE
CARBONO
Con el propoacutesito de evaluar el crecimiento micelial del P cubensis en medio
sumergido durante los 14 diacuteas de la fermentacioacuten se recurrioacute al uso de
metodologiacuteas conocidas como peso huacutemedo y peso seco en dicho trabajo soacutelo se
exponen los datos arrojados por el meacutetodo de peso seco
A continuacioacuten se presentan cada una de las fermentaciones de acuerdo al tipo de
sustrato empleado en las mismas los respectivos valores de peso seco obtenidos
y los anaacutelisis pertinentes para cada uno de los casos
311 Crecimiento micelial de P cubensis en medio sumergido utilizando
diferentes concentraciones de glucosa
Inicialmente se evaluaron tres concentraciones de glucosa en el cultivo de P
cubensis en medio sumergido (Fang-Zhong) correspondientes a 30 gL 50 gL y
70 gL siendo en este caso la glucosa la principal fuente de carbono del P
cubensis
A continuacioacuten se muestran los valores de peso seco obtenidos para cada una de
las concentraciones de glucosa utilizadas durante los 14 diacuteas de la fermentacioacuten
46
0
01
02
03
04
05
06
07
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Bio
ma
sa (g
L)
Tiempo (diacuteas)30gL 50gL 70gL
Graacutefico 1 Cineacutetica de crecimiento micelial de P cubensis en medio sumergido (Fang-Zhong) utilizando tres diferentes concentraciones de
glucosa como fuente de carbono (Peso seco)
Del graacutefico 1 se puede observar que no hubo evidencia de fase de latencia para
ninguno de los ensayos posteriormente se aprecia que el crecimiento de biomasa
aumentoacute con el tiempo para las diferentes concentraciones de glucosa empleadas
Analizando las fermentaciones que conteniacutean 50 gL y 70 gL de glucosa se
puede afirmar que ambas presentan un comportamiento similar mostrando una
fase exponencial hasta el diacutea 11 y una fase estacionaria hasta el diacutea 14 de la
fermentacioacuten mientras que la fermentacioacuten que conteniacutea 30 gL de glucosa no
presentoacute fase estacionaria la fermentacioacuten durante los 14 diacuteas se encontraba en
fase exponencial a pesar de que entre los diacuteas 8 y 11 el crecimiento de P
cubensis se mantuvo constante
Asimismo se puede observar que el crecimiento maacutes bajo en cuanto a
concentracioacuten de biomasa se generoacute en la concentracioacuten de 30 gL siendo eacuteste
de 048 gL mientras que en las concentraciones de 50 gL y 70 gL de glucosa
los crecimientos maacuteximos fueron muy similares 055 gL y 062 gL
respectivamente
47
Lo dicho anteriormente se ratifica una vez analizados los resultados obtenidos
estadiacutesticamente donde se obtuvo un P-valor igual a cero indicando que existen
diferencias significativas en cuanto al crecimiento micelial de biomasa
(concentracioacuten de biomasa durante los 14 diacuteas de la fermentacioacuten) El graacutefico 2
ilustra la presencia de dos grupos homogeacuteneos lo que indica que las
concentraciones de 50 gL y 70 gL no tienen diferencias significativas del
crecimiento micelial entre cada una de ellas mientras que la concentracioacuten de 30
gL siacute presenta dichas diferencias significativas con respecto a las dos
concentraciones anteriores (Anexo 1)
Con todo eacutesto se expone que la concentracioacuten de glucosa de 50 gL es la que se
eligioacute debido a que es maacutes econoacutemico utilizar 50 gL de glucosa que 70 gL
Tratamientos con diferentes concentraciones de glucosa
Media 30 gL glucosa (a) 022
Media 50 gL glucosa (b) 032
Media 70 gL glucosa (b) 034
a
bb
0
005
01
015
02
025
03
035
04
045
Co
nce
ntr
acioacute
n b
iom
asa
(gL
)
Letras diferentes denotan diferencias significativas (prueba LSD)
Graacutefico 2 Crecimiento micelial de P cubensis en cultivo sumergido bajo tres concentraciones de glucosa
48
Modelo logiacutestico para las fermentaciones donde se utilizoacute glucosa
como fuente de carbono
Una vez realizada la cineacutetica de crecimiento del P cubensis en medio sumergido
(Fang-Zhong) usando diferentes concentraciones de glucosa se procedioacute a
ajustar los datos obtenidos al modelo logiacutestico Los crecimientos maacuteximos de
biomasa obtenidos mediante el meacutetodo de peso seco para cada uno de los
ensayos fueron 048 gL 065 gL y 062 gL para concentraciones de 30 gL 50
gL y 70 gL de glucosa respectivamente La tabla 2 muestra los paraacutemetros
cineacuteticos obtenidos mediante el modelo para cada una de las concentraciones
Tabla 2 Paraacutemetros cineacuteticos obtenidos mediante el modelo logiacutestico para las diferentes fermentaciones de P cubensis utilizando glucosa como fuente
de carbono
30gL 50gL 70gL
microx (diacutea-sup1) 016 microx (diacutea-sup1) 017 microx (diacutea-sup1) 015
micromax (diacutea-sup1) 027 micromax (diacutea-sup1) 035 micromax (diacutea-sup1) 034
X0 (gL) 005 X0 (gL) 008 X0 (gL) 008
R2 096 R2
092 R2 085
De la tabla 2 se puede observar que la concentracioacuten inicial de biomasa (Xo)
estuvo muy cercana para cada una de las concentraciones de glucosa utilizadas
Para 30 gL de glucosa la velocidad maacutexima de crecimiento (micromax) fue mucho
menor que la obtenida para 50 gL y 70 gL eacutesto pudo ser debido a que fue el
medio que menor cantidad de glucosa conteniacutea mientras que para las otras dos
concentraciones de glucosa la velocidad maacutexima de crecimiento fue similar
Al comparar las velocidades maacuteximas de las tres concentraciones de glucosa
utilizadas se evidencia que la fermentacioacuten que conteniacutea 50 gL presentoacute una
micromaacutex mayor correspondiente a 035 diacutea-1 esto sugiere que a mayores
concentracioacuten de glucosa (70 gL) puede ocurrir una inhibicioacuten por sustrato otro
49
criterio que afirma que dicha concentracioacuten fue la que mejores resultados arrojoacute de
las tres concentraciones de glucosa utilizadas para el crecimiento del P cubensis
en el medio de Fang-Zhong Ademaacutes se observa que este experimento fue el que
mayor velocidad especiacutefica de crecimiento presento siendo esta de 017 diacutea-1
Finalmente se calcularon los valores de biomasa teoacutericos utilizando la ecuacioacuten
descrita anteriormente en la metodologiacutea con el propoacutesito de observar que tanto
se ajustaron los valores de biomasa hallados experimentalmente con los valores
de biomasa teoacutericos arrojados por el modelo logiacutestico El graacutefico 3 muestra los
valores de biomasa (X) tanto teoacutericos como experimentales con respecto al
tiempo
0
01
02
03
04
05
06
07
0 2 4 6 8 10 12 14
Biom
asa
(gL
)
Tiempo (diacutea)
X exp (30 gL) X exp (50 gL) X exp (70 gL)
X teoacuterico (30 gL) X teoacuterico (50 gL) X teoacuterico (70 gL)
Graacutefico 3 Valores de concentracioacuten de biomasa experimental y teoacuterico
graficados con respecto al tiempo para las fermentaciones con diferentes concentraciones de glucosa
Al observar el graacutefico 3 se puede notar que para los ensayos de 50 gL y 70 gL
de glucosa los valores de biomasa teoacutericos se encuentran un poco desfasados de
los valores de biomasa hallados de manera experimental mientras que para el
ensayo que conteniacutea 30 gL de glucosa se observa un buen ajuste de los datos
50
obtenidos experimentalmente al modelo logiacutestico La tabla 2 reitera lo dicho
anteriormente al exponer los valores de R2 los cuales explican la relacioacuten que
tienen los datos teoacutericos con los experimentales
312 Crecimiento micelial del P cubensis en medio sumergido utilizando
diferentes concentraciones de sacarosa
Una vez evaluado el crecimiento de biomasa usando glucosa como fuente de
carbono se procedioacute a evaluar el efecto que teniacutea el cambio de la fuente de
carbono por sacarosa en el crecimiento micelial del P cubensis en medio
sumergido
El graacutefico 4 muestra de manera ilustrativa como fue el crecimiento micelial del P
cubensis para cada una de las concentraciones de sacarosa utilizadas durante los
14 diacuteas mediante el meacutetodo de peso seco
0
01
02
03
04
05
06
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Biom
asa (
gL)
Tiempo (diacuteas)
30 gL 50 gL 70 gL
Graacutefico 4 Cineacutetica de crecimiento micelial de P cubensis en medio sumergido (Fang-Zhong) utilizando diferentes concentraciones de sacarosa
como fuente de carbono (Peso seco)
51
En el graacutefico 4 se puede observar que tanto para una concentracioacuten de 30 gL
como para 70 gL de sacarosa el hongo llega a su fase estacionaria cerca del
quinto diacutea de la fermentacioacuten mientras que para una concentracioacuten de 50 gL se
observa un comportamiento diferente puesto que el microorganismo tiene un
crecimiento exponencial hasta el diacutea 5 en donde entra a una etapa de transicioacuten o
estacionaria durante 3 diacuteas aproximadamente luego de la cual inicia nuevamente
su crecimiento de forma exponencial hasta llegar al diacutea 11 en donde siacute empieza
su fase estacionaria
Al igual que en las tres fermentaciones que conteniacutean glucosa en estas
fermentaciones de sacarosa se observa mediante el graacutefico anterior que no hubo
presencia de fase de latencia
El crecimiento maacuteximo de biomasa en cuanto a concentracioacuten lo presentoacute aquella
fermentacioacuten que conteniacutea 70 gL de sacarosa el cual fue de 057 gL seguida de
la de 50 gL con un crecimiento maacuteximo de biomasa de 045 gL y posteriormente
la concentracioacuten de 30 gL obtuvo un crecimiento maacuteximo de 026 gL
De acuerdo al anaacutelisis estadiacutestico que se realizoacute para cada una de las
fermentaciones se dedujo que las diferencias en cuanto al crecimiento micelial de
biomasa con respecto a la concentracioacuten de la misma son significativas entre
cada una de las fermentaciones es decir fue diferente la concentracioacuten de
biomasa obtenida cuando se trabajoacute con cada una de distintas concentraciones de
sacarosa Lo dicho anteriormente se muestra a traveacutes del graacutefico 5 (Anexo 2)
52
Tratamientos con diferentes concentraciones de sacarosa
Media 30 gL sacarosa (a) 02
Media 50 gL sacarosa (b) 032
Media 70 gL sacarosa (c) 043
a
b
c
0
02
04
Co
nce
ntr
acioacute
n b
iom
asa
(gL
)
Letras diferentes denotan diferencias significativas (prueba LSD)
Graacutefico 5 Crecimiento micelial para tres diferentes concentraciones de sacarosa
Modelo logiacutestico para las fermentaciones donde se utilizoacute sacarosa
como fuente de carbono
Una vez realizadas las cineacuteticas de crecimiento del P cubensis para cada
concentracioacuten de sacarosa empleada se procedioacute a ajustar los datos obtenidos al
modelo logiacutestico cabe recalcar que es necesario establecer los crecimientos
maacuteximos de biomasa obtenidos para cada uno de los ensayos los cuales fueron
026 gL 045 gL y 057 gL para concentraciones de 30 gL 50 gL y 70 gL de
sacarosa respectivamente
Una vez aplicado el modelo logiacutestico para cada tratamiento se obtuvieron valores
de velocidad maacutexima de crecimiento y biomasa inicial para cada concentracioacuten de
sacarosa utilizada en el medio los cuales se muestran en la tabla 3
53
Tabla 3 Paraacutemetros cineacuteticos obtenidos mediante el modelo logiacutestico para las diferentes fermentaciones de P cubensis utilizando sacarosa como
fuente de carbono
30gL 50gL 70gL
microx (diacutea-sup1) 030 microx (diacutea-sup1) 014 microx (diacutea-sup1) 041
micromax (diacutea-sup1) 037 micromax (diacutea-sup1) 042 micromax (diacutea-sup1) 067
X0 (gL) 01 X0(gL) 01 X0 (gL) 011
R2 061 R2 089 R2 095
De la tabla 3 se ratifica que se utilizoacute una concentracioacuten inicial de biomasa igual
para cada una de las fermentaciones aproximadamente 01 gL ademaacutes se
observa un aumento en la velocidad maacutexima de crecimiento con respecto a la
cantidad de sacarosa empleada es decir que el hecho de haber aumentado la
concentracioacuten de sacarosa en el medio favorecioacute el aumento en la velocidad
maacutexima de crecimiento del P cubensis siendo eacutesta mayor cuando se trabajoacute a una
concentracioacuten de 70 gL de sacarosa De igual manera se aprecia que el
tratamiento que conteniacutea 70 gL de sacarosa presentoacute una velocidad especiacutefica de
crecimiento mayor que los demaacutes siendo eacutesta de 041 diacutea-1
Finalmente se calcularon los valores de biomasa teoacutericos el graacutefico 6 ilustra los
valores de biomasa (X) tanto teoacutericos como experimentales graficados con
respecto al tiempo
54
0
01
02
03
04
05
06
0 2 4 6 8 10 12 14
Bio
mas
a (g
L)
Tiempo (Diacutea)
X exp (30 gL) X exp (50 gL) X exp (70 gL)
X teoacuterico (30 gL) X teoacuterico (50 gL) X teoacuterico (70 gL)
Graacutefico 6 Valores de concentracioacuten de biomasa experimental y teoacuterico graficados con respecto al tiempo para las fermentaciones con diferentes
concentraciones de sacarosa
Del graacutefico 6 se puede observar como los valores de biomasa experimentales se
ajustaron a los valores de biomasa teoacutericos arrojados por el modelo logiacutestico lo
que quiere decir la cineacutetica de crecimiento del P cubensis en medio sumergido
cuando se utilizoacute 70 gL se ajustoacute correctamente al modelo logiacutestico lo que se
corrobora en la tabla 2 gracias al valor obtenido para el R2 que indica la relacioacuten
de los datos teoacutericos con respecto a los experimentales Por otro lado para las
fermentaciones de 30 gL y 50 gL de sacarosa a pesar de parecer que
presentaron un buen ajuste al calcular la relacioacuten de los datos teoacutericos con
respecto a los experimentales (R2) se concluye que el ajuste no fue tan bueno
55
313 Comparacioacuten entre el crecimiento micelial de P cubensis en los
cultivos sumergidos utilizando glucosa y sacarosa como fuente de
carbono
Ahora bien es igualmente importante realizar un anaacutelisis comparativo entre ambas
fuentes de carbono empleadas con el fin de determinar si existen o no diferencias
significativas entre dichas fuentes de carbono
De acuerdo al anaacutelisis estadiacutestico se dice que existen diferencias significativas del
crecimiento micelial del P cubensis en cuanto al diacutea y la concentracioacuten de
sustrato empleado es decir concentracioacuten de glucosa y sacarosa (Anexo 3) pero
se observa claramente que no hay diferencias significativas de dicho crecimiento
con respecto al tipo de sustrato utilizado debido a que el P-valor arrojado por la
estadiacutestica fue de 01217 lo que sugiere que se debe utilizar la sacarosa gracias
a la disminucioacuten de costos que se generariacutean durante el proceso todo ello gracias
al costo de la sacarosa es inferior al de glucosa Sin embargo para elegir la fuente
de carbono que mejores resultados arrojoacute no soacutelo se basoacute en la cantidad de
biomasa producida sino que se procedioacute a examinar los barridos espectrales
arrojados por el anaacutelisis de HPLC con el fin de determinar la fuente de carbono
que mejor resolucioacuten mostroacute del alcaloide que en esta investigacioacuten fue glucosa a
una concentracioacuten de 50 gL
De igual manera el graacutefico 7 muestra las medias obtenidas mediante el anaacutelisis
estadiacutestico para las fermentaciones trabajadas con glucosa y sacarosa Aun asiacute
es necesario hacer hincapieacute que eacuteste no es el criterio principal para la obtencioacuten
del medio que mejores resultados arrojoacute durante la investigacioacuten por lo tanto se
deben seguir realizando los diferentes anaacutelisis descritos anteriormente en este
trabajo
56
Tratamientos de las dos fuentes de carbono usadas sin FA (glucosa y
sacarosa)
Media para glucosa (a) 029
Media para sacarosa (a) 032
aa
0
01
02
03
Conc
entr
acioacute
n bi
omas
a (g
L)
Letras diferentes denotan diferencias significativas (Prueba LSD)
Graacutefico 7 Crecimiento micelial para dos diferentes fuentes de carbono (glucosa y sacarosa)
314 Crecimiento micelial del P cubensis en cultivo sumergido utilizando
glucosa y fenilalanina en el medio
Se decidioacute realizar un uacuteltimo ensayo acerca del efecto que teniacutea la adicioacuten de un
aminoaacutecido llamado Fenilalanina (FA) al medio Fang-Zhong sobre la produccioacuten
del alcaloide y por ende sobre la generacioacuten de biomasa
Debido a los anaacutelisis realizados anteriormente se concluyoacute que la mejor fuente de
carbono fue la glucosa a una concentracioacuten de 50 gL De la misma manera que
en los numerales anteriores se evaluoacute la cineacutetica del crecimiento micelial del P
cubensis mediante los meacutetodos de peso huacutemedo y peso seco Las mediciones
fueron realizadas por duplicado y promediadas para la fuente de carbono elegida
(glucosa 50 gL) y las diferentes concentraciones de FA en el medio
correspondientes a 05 gL 1 gL 15 gL con el fin de encontrar el medio que
mejores resultados arrojoacute en cuanto a crecimiento micelial y generacioacuten del
57
alcaloide de intereacutes Los datos obtenidos mediante el meacutetodo de peso seco se
muestran en el graacutefico 8
Cabe resaltar que junto con las tres fermentaciones de 05 gL 10 gL y 15 gL
de FA se montaron a su vez seis muestras correspondientes a los diacuteas 12 13 y
14 de la fermentacioacuten que conteniacutea 0 gL de FA eacutesto con el propoacutesito de analizar
los datos de manera estadiacutestica y poder hacer comparaciones con respecto a la
generacioacuten de biomasa y a la produccioacuten del alcaloide de intereacutes ambas medidas
con respecto a la concentracioacuten
0
01
02
03
04
05
06
07
08
09
1
11
12
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Biom
asa
(gL
)
Tiempo (diacuteas)
05 gL 1 gL 15 gL
Graacutefico 8 Cineacutetica de crecimiento micelial de P cubensis en medio sumergido (Fang-Zhong) utilizando diferentes concentraciones de FA y 50
gL de glucosa como fuente de carbono (Peso seco)
Al analizar el graacutefico 8 es decir el crecimiento micelial (concentracioacuten de
biomasa) seguacuten la concentracioacuten de FA en el tiempo se puede notar que no hubo
presencia de fase de latencia para ninguna de las concentraciones de FA
utilizadas ademaacutes el crecimiento de biomasa en cada caso se aprecia de manera
58
muy similar llegando los tres ensayos a la fase estacionaria el diacutea 12 de la
fermentacioacuten
Observando el graacutefico 8 se puede identificar que el mayor contenido de biomasa
fue de 108 gL obtenida el diacutea 13 para una concentracioacuten 10 gL de FA para
concentraciones de 05 gL y 15 gL de FA la concentracioacuten maacutexima de biomasa
fue 106 gL y 101 gL respectivamente Auacuten asiacute al considerar los resultados
obtenidos se puede ratificar que es indiferente la cantidad de FA necesaria para
obtener concentracioacuten de biomasa por ende se decide que el medio que mejores
resultados arrojoacute fue el que conteniacutea 05 gL FA debido a que fue la
concentracioacuten de FA que mejor resolucioacuten del alcaloide presentoacute paraacutemetro
observado mediante los cromatogramas obtenidos del anaacutelisis de HPLC (Anexos
19 20 y 21) y ademaacutes porque con dicha cantidad los costos de la materia prima
seriacutean menores Cabe resaltar que el uso de FA generoacute un aumento significativo
duplicando la produccioacuten de biomasa por lo tanto se testifica que siacute hubo
duplicacioacuten en cuanto a la concentracioacuten de biomasa en los medios que conteniacutea
FA con respecto a los medios que no conteniacutean FA se dice entonces que a su
vez se podriacutea haber generado mayor cantidad de Psilocibina en los medios que
teniacutean FA ya que dicho alcaloide se produce de manera intracelular por tal
razoacuten al aumentar la cantidad de biomasa en el medio se aumenta la cantidad de
dicho alcaloide
De igual manera se analizaron los datos estadiacutesticamente y se llegoacute a apreciar
que no existen diferencias significativas en cuanto a la produccioacuten de biomasa y la
cantidad de FA utilizada en el medio Del mismo modo al analizar la tabla de
contrastes muacuteltiple de rangos se reitera que siacute existen diferencias significativas
entre el crecimiento micelial de biomasa (concentracioacuten de biomasa) en el tiempo
cuando se trabajoacute con FA o sin eacuteste Eacutesto se puede observar en el graacutefico 9
(Anexo 4)
59
Tratamientos con y sin FA
Media 0 gL FA (a) 032
Media 05 gL FA (b) 065
Media 10 gL FA (b) 066
Media 15 gL FA (b) 069
a
b b b
0
01
02
03
04
05
06
07
08
09
Conc
entr
acioacute
n bi
omas
a (g
L)
Letras diferentes denotan diferencias significativas (Prueba LSD)
Graacutefico 9 Crecimiento micelial para glucosa a una concentracioacuten de 50 gL y tres diferentes concentraciones de FA
Modelo logiacutestico para las fermentaciones donde se utilizoacute 50 gL de
glucosa como fuente de carbono y diferentes concentraciones de FA
En primer lugar se fijaron los valores de crecimiento maacuteximo de biomasa para
cada una de las concentraciones obtenidos mediante el meacutetodo de peso seco con
el fin de hallar los paraacutemetros cineacuteticos mediante el modelo logiacutestico Los
crecimientos maacuteximos de biomasa obtenidos fueron los siguientes 106 gL 108
gL y 101 gL para concentraciones de 05 gL 10 gL y 15 gL de FA
respectivamente y 50 gL de glucosa
Una vez realizado el modelo logiacutestico para cada tratamiento se obtuvieron los
valores de velocidad maacutexima de crecimiento y concentracioacuten de biomasa inicial
para cada ensayo los cuales se muestran en la tabla 4
60
Tabla 4 Paraacutemetros cineacuteticos obtenidos mediante el modelo logiacutestico para las diferentes fermentaciones de P cubensis utilizando 50 gL de glucosa
como fuente de carbono y diferentes concentraciones de FA
05gL 10gL 15gL
microx (diacutea-sup1) 018 microx (diacutea-sup1) 012 microx (diacutea-sup1) 012
micromax (diacutea-sup1) 045 micromax (diacutea-sup1) 035 micromax (diacutea-sup1) 044
X0 (gL) 01 X0 (gL) 017 X0 (gL) 016
R2 095 R2 082 R2 088
Seguacuten los valores arrojados por el modelo logiacutestico que se encuentran
presentados en la tabla 4 se puede decir que se presentoacute una valor de biomasa
inicial similar para los tratamientos de 1 gL y 15 gL de FA mientras que para las
fermentaciones que conteniacutean 05 gL de FA se tiene una diferencia de un 50
aproximadamente Ademaacutes se puede observar que a la concentracioacuten de 05 gL
de FA es la que mayor velocidad maacutexima de crecimiento presenta siendo esta
045 diacuteamacrsup1 a su vez dicha concentracioacuten presentaacute la microx mayor correspondiente a
018 diacutea-1 Debido a eacutesto y al criterio de mejor resolucioacuten del alcaloide observado
en los anaacutelisis de HPLC (Anexos 19 20 y 21) se concluye que el medio que
mejores resultados arrojoacute durante la investigacioacuten para la generacioacuten de biomasa
y la produccioacuten de la Psilocibina es 05 gL de FA y 50 gL de glucosa
Finalmente se calcularon los valores de biomasa teoacutericos el graacutefico 10 muestra
los valores de biomasa (X) tanto teoacutericos como experimentales graficados con
respecto al tiempo
61
0
02
04
06
08
1
12
0 2 4 6 8 10 12 14 16
Bio
mas
a (g
L)
Tiempo (Diacutea)
X exp (05 gL) X exp (10 gL) X exp (15 gL)
X teoacuterico (05 gL) X teoacuterico (10 gL) X teoacuterico (15 gL)
Graacutefico 10 Valores de concentracioacuten de biomasa experimental y teoacuterico graficados con respecto al tiempo para las fermentaciones con diferentes
concentraciones de FA y 50 gL de glucosa
Se puede decir gracias al graacutefico 10 que los valores de biomasa experimentales
se ajustaron a los valores de biomasa teoacutericos hallados mediante el modelo
logiacutestico es decir la cineacutetica de crecimiento del P cubensis en medio sumergido
cuando se usaron diferentes concentraciones de FA en el medio se ajustoacute
correctamente al modelo logiacutestico esto se reitera con los valores de R2 mostrados
anteriormente en la tabla 4
32 ESTUDIO DE LA CINEacuteTICA DE CONSUMO DE SUSTRATO POR PARTE
DEL P cubensis CULTIVADO EN MEDIO SUMERGIDO (FANG-ZHONG)
La evaluacioacuten del consumo de sustrato durante la fermentacioacuten con respecto al
tiempo es de suma importancia puesto que eacuteste es el principal componente
limitante del crecimiento presente en el medio de cultivo
62
A continuacioacuten se analizaraacuten dichos consumos para los diferentes ensayos
321 Consumo de sustrato por parte del P cubensis en medio sumergido
utilizando diferentes concentraciones de glucosa
Una vez halladas las concentraciones de sustrato para cada una de las
fermentaciones que conteniacutean glucosa en el medio se procedioacute a graficar dichos
valores con respecto al tiempo
El graacutefico 11 ilustra los datos obtenidos sobre el consumo de sustrato de las tres
fermentaciones que conteniacutean glucosa y a su vez como se comportoacute el
crecimiento de biomasa para cada ensayo durante los 14 diacuteas de fermentacioacuten
0
01
02
03
04
05
06
07
0
10
20
30
40
50
60
70
80
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14B
iom
asa
(gL
)
Glu
cosa
(gL
)
Tiempo (diacuteas)
30 GL 50GL 70 GL 30gL 50gL 70gL
Graacutefico 11 Cineacutetica de consumo de sustrato por parte del P cubensis en medio sumergido utilizando diferentes concentraciones de glucosa como
fuente de carbono
Al observar el graacutefico 11 se expone que el P cubensis consumioacute mayor cantidad
de glucosa cuando esta estaba a una concentracioacuten de 70 gL correspondiendo a
63
un porcentaje de 62 mientras que para 50 gL y 30 gL fue de 23 y 30
respectivamente
Comparando el consumo de glucosa en sus diferentes concentraciones con el
crecimiento micelial del hongo se puede observar que a una concentracioacuten de
glucosa de 30 gL no soacutelo se tuvo un menor consumo de sustrato sino que
tambieacuten se generoacute un menor crecimiento de biomasa Mientras que a
concentraciones de 50 gL y 70 gL de glucosa a pesar de presentar diferencias
en cuanto al porcentaje de sustrato consumido el crecimiento micelial es similar
(no presenta diferencias significativas) lo que indica que el hongo no requiere
tanta concentracioacuten de glucosa para su crecimiento eacutesto se puede afirmar soacutelo
para este ensayo a estas condiciones
De igual manera en el graacutefico 11 al analizar la tendencia del consumo de
sustrato las concentraciones de glucosa de 50 gL y 70 gL presentan una
disminucioacuten notoria hasta el diacutea 11 para dicho consumo Esto se debe a que en
ese diacutea inicioacute la fase estacionaria del hongo en ambas fermentaciones en donde
el P cubensis requeriacutea alimento uacutenicamente para mantenerse y producir
metabolitos secundarios Mientras que para la concentracioacuten de glucosa de 30 gL
el consumo de glucosa fue muy poco a partir del quinto diacutea de la fermentacioacuten
esto se atribuye a que la cineacutetica de crecimiento micelial del P cubensis presentoacute
una fase estacionaria temprana entre los diacuteas 8 y 11 indicando que no necesitaba
consumir casi glucosa puesto que no estaba creciendo
322 Consumo de sustrato por parte del P cubensis en medio sumergido
utilizando diferentes concentraciones de sacarosa
Los datos obtenidos sobre el consumo de sacarosa para cada una de las
concentraciones utilizadas (30 gL 50 gL y 70 gL de sacarosa) durante los 14
diacuteas de la fermentacioacuten se muestran en el graacutefico 12 a su vez se ilustran en dicho
64
graacutefico el comportamiento del crecimiento micelial para cada ensayo durante los
14 diacuteas de fermentacioacuten para efectos de anaacutelisis
0
01
02
03
04
05
06
0
10
20
30
40
50
60
70
80
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Bio
mas
a (g
L)
Sac
aro
sa (g
L)
Tiempo (diacuteas)
30gL 50gL 70gL 30 gL 50 gL 70 gL
Graacutefico 12 Cineacutetica de consumo de sustrato por parte del P cubensis en medio sumergido utilizando diferentes concentraciones de sacarosa como
fuente de carbono
Al observar el graacutefico 12 se puede decir que el P cubensis consumioacute mayor
cantidad de sacarosa cuando eacutesta estaba a una concentracioacuten de 70 gL en el
medio presentando un porcentaje de consumo del 49 mientras que para las
concentraciones de 50 gL y 30 gL de sacarosa se tuvo un porcentaje de
consumo de 24 y 37 Esto igual que en el consumo de glucosa se puede
deber a que al tener mayor concentracioacuten de sustrato en el medio el P cubensis
genera mayor afinidad por el mismo haciendo que dicho hongo se consuma
grandes cantidades de sacarosa durante el tiempo
Igualmente se observa que aproximadamente en el noveno diacutea de la
fermentacioacuten las tres diferentes concentraciones de glucosa (30 gL 50 gL y 70
65
gL) se mantienen casi constantes en el tiempo ello gracias a que en este diacutea el
hongo se encontraba en fase estacionaria en los tres ensayos
323 Comparacioacuten entre el consumo de sustrato de P cubensis en los
cultivos sumergidos con diferentes fuentes de carbono
Con el fin de identificar cuaacutel de las dos fuentes de carbono fue consumida en
mayor proporcioacuten por parte del P cubensis se procedioacute a realizar un anaacutelisis
estadiacutestico donde comparamos las dos fuentes de carbono empleados con
respecto al consumo de sustrato obtenido (concentracioacuten de glucosa y sacarosa
en cada uno de los medios) donde se consiguioacute un P-valor de 00811 con
respecto al tipo de sustrato lo que indica que no existen diferencias en cuanto al
consumo de sustrato y el tipo del mismo es decir es indiferente cuaacutel de los dos
sustratos (glucosa o sacarosa) se utilice para que se del consumo del mismo por
parte del P cubensis Observacioacuten que se reitera en la tabla de contraste muacuteltiple
que muestra que se trabajoacute como un grupo homogeacuteneo Igualmente el graacutefico 13
muestra las medias de consumo de sustrato (concentracioacuten durante los 14 diacuteas)
obtenidas mediante el anaacutelisis estadiacutestico y reitera que no existen diferencias
significativas con respecto al tipo de sustrato utilizado para el cultivo del P
cubensis en medio sumergido (Anexo 5)
66
Tratamientos de las dos fuentes de carbono usadas sin FA (glucosa y sacarosa)
Media glucosa (a) 3431
Media sacarosa (a) 3678
a
a
32
34
36
38
Co
nce
ntr
acioacute
n s
ust
rato
(g
L)
Letras diferentes denotan diferencias significativas (Prueba LSD)
Graacutefico 13 Consumo de sustrato para cada una de las fuentes de carbono utilizadas
Aun asiacute al comparar los graacuteficos 11 y 12 se puede observar un mayor consumo
de glucosa que de sacarosa lo que lleva a concluir que es mejor emplear la
primera (glucosa)
324 Consumo de sustrato por parte del P cubensis en medio sumergido
utilizando glucosa y fenilalanina en el medio
Los datos obtenidos acerca del consumo de sustrato durante los 14 diacuteas de la
fermentacioacuten para cada uno de los medios que conteniacutean 50 gL de glucosa y
diferentes concentraciones de FA (05 gL 1 gL y 15 gL) se muestran en el
graacutefico 14 De igual manera se ilustran en dicho graacutefico las cineacuteticas de
crecimiento micelial para cada una de las fermentaciones que teniacutean 50 gL de
glucosa y diferentes concentraciones de FA con el fin de realizar los anaacutelisis
pertinentes
67
0
02
04
06
08
1
12
0
10
20
30
40
50
60
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Bio
mas
a (g
L)
Glu
cosa
50
gL
+ F
A (g
L)
Tiempo (diacuteas)
05gL 10gL 15gL 05 gL 1 gL 15 gL
Graacutefico 14 Cineacutetica de consumo de sustrato por parte del P cubensis en medio sumergido utilizando 50 gL de glucosa como fuente de carbono y
diferentes concentraciones de FA
Analizando el graacutefico 14 se puede decir que el consumo de glucosa durante el
tiempo fue igual para las fermentaciones que conteniacutea concentraciones de 1 gL y
15 gL de FA dichos consumos corresponde a valores de 23 mientras que
para el ensayo que teniacutea una concentracioacuten de 05 gL de FA el porcentaje de
consumo fue del 18 Asimismo se presentaron diferencias significativas en
cuanto al consumo de sustrato entre los diferentes ensayos
El graacutefico 15 expone las medias del consumo de sustrato (concentracioacuten) de cada
una de las muestras y las diferencias existentes entre ellas se evidencia que la
adicioacuten de FA disminuyoacute el consumo de glucosa ademaacutes que en los ensayos se
presentaron tres grupos homogeacuteneos diferentes En el primer grupo (a) que
contiene las fermentaciones del P cubensis con una concentracioacuten de 50 gL de
glucosa y en ausencia de FA se obtuvo una media de 356 gL la cual indica un
mayor consumo de sustrato Luego el segundo grupo (c) se compone de las
concentraciones de 1 gL y 15 gL de FA presentando una media de 413 gL y
de 426 gL respectivamente y el uacuteltimo grupo (b) corresponde a una
68
concentracioacuten de 05 gL de FA el cual presenta el menor consumo de glucosa al
exponer una media 466 gL
Seguacuten lo anterior y el graacutefico 15 se dice que siacute existieron diferencias significativas
en cuanto al consumo de sustrato (concentracioacuten durante los 14 diacuteas) en los
uacuteltimos tres diacuteas cuando se trabajo con FA y sin FA y a su vez se encontraron
diferencias significativas de la concentracioacuten de sustrato en el medio cuando se
teniacutea una concentracioacuten de FA correspondiente a 05 gL con relacioacuten a las otras
dos concentraciones de FA (10 gL y 15 gL) mientras que entre estas dos
uacuteltimas concentraciones de FA (10 gL y 15 gL) no se encontraron diferencias
significativas (Anexo 6)
Tratamientos con y sin FA
Media 0 gL FA (a) 3564
Media 05 gL FA (b) 466
Media 10 gL FA (c) 4131
Media 15 gL FA (c) 426
a
b c c
0
10
20
30
40
50
60
Conc
entr
acioacute
n su
stra
to (g
L)
Letras diferentes denotan diferencias significativas (prueba LSD)
Graacutefico 15 Consumo de sustrato para cada una de las concentraciones de FA utilizadas
69
33 ESTUDIO DE LA CINEacuteTICA DE CONSUMO DE PROTEIacuteNA POR PARTE
DEL P cubensis CULTIVADO EN MEDIO SUMERGIDO (FANG-ZHONG)
Las fuentes de proteiacutena que posee el medio de Fang-Zhong son extracto de
levadura y peptona que representan una cantidad de 10 gL para cada ensayo
eacutesta cantidad se mantuvo constante para cada fermentacioacuten
Se evaluoacute el consumo de proteiacutena por parte del P cubensis durante los 14 diacuteas
de la fermentacioacuten para cada uno de los ensayos
A continuacioacuten se analizan los resultados obtenidos para cada uno de los
tratamientos
331 Consumo de proteiacutena por P cubensis en medio sumergido utilizando
diferentes concentraciones de glucosa
Una vez se calcularon las concentraciones de proteiacutena en el medio para cada
ensayo se graficaron dichos valores con respecto al tiempo
El graacutefico 16 muestra como se comportoacute el consumo de proteiacutena con respecto al
tiempo para cada una de las tres concentraciones de glucosa utilizadas y a su vez
como se comportoacute el crecimiento de biomasa para cada ensayo durante los 14
diacuteas de fermentacioacuten
70
0
01
02
03
04
05
06
07
0
5
10
15
20
25
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Bio
mas
a (g
L)
Pro
tein
a (g
L)
Tiempo (diacuteas)
30 GL 50 GL 70 GL 30 gL Biomasa 50 gL Biomasa 70 gL Biomasa
Graacutefico 16 Cineacutetica de consumo de proteiacutena por parte del P cubensis en medio sumergido utilizando diferentes concentraciones de glucosa como
fuente de carbono
Analizando el graacutefico 16 se puede observar que el consumo de proteiacutena se dio
casi en su totalidad El ensayo que mayor consumo de proteiacutena presentoacute fue el
que conteniacutea 30 gL de glucosa arrojando un porcentaje de consumo del 98
mientras que las fermentaciones realizadas a concentraciones de 50 gL y 70 gL
de glucosa presentaron un porcentaje de consumo de proteiacutena del 91 y 90
respectivamente
Al enfocarnos en la relacioacuten existente entre el consumo de proteiacutena y el
crecimiento micelial del P cubensis se puede notar gracias al graacutefico 16 que la
relacioacuten es directamente proporcional debido a que el consumo de proteiacutena fue
permanente mientras el hongo se encontraba en fase exponencial es decir el P
cubensis necesitaba de la proteiacutena para aumentar su crecimiento mientras que en
el momento en que el microorganismo comenzoacute su fase estacionaria la
concentracioacuten de proteiacutena en el medio se mantuvo constante esto uacuteltimo soacutelo es
vaacutelido para concentraciones de 50 gL y 70 gL de glucosa puesto que ambas
llegaron a la fase estacionaria
71
332 Consumo de proteiacutena por P cubensis en medio sumergido utilizando
diferentes concentraciones de sacarosa
Una vez obtenidos los valores de consumo de proteiacutena para cada concentracioacuten
de sacarosa utilizada se precedioacute a graficarlos con respecto al tiempo dichos
datos se encuentran en el graacutefico 17 De igual manera en este graacutefico se
representa la cineacutetica de crecimiento de biomasa para el P cubensis de acuerdo a
las distintas concentraciones de sacarosa utilizadas
0
01
02
03
04
05
06
0
2
4
6
8
10
12
14
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Bio
mas
a (g
L)
Prot
eiacutena
(gL
)
Tiempo (diacuteas)
30 GL 50 GL 70 GL 30 gL 50 gL 70 gL
Graacutefico 17 Cineacutetica de consumo de proteiacutena por parte del P cubensis en medio sumergido utilizando diferentes concentraciones de sacarosa como
fuente de carbono
El graacutefico 17 ilustra el consumo casi en su totalidad de la proteiacutena para cada uno
de los tratamientos El ensayo que mayor consumo de proteiacutena presentoacute fue el
que conteniacutea 30 gL de sacarosa exponiendo un porcentaje de consumo del 89
mientras que las concentraciones de 50 gL y 70 gL de sacarosa arrojaron
porcentajes de consumo del 86 y 57 respectivamente
Ahora bien al analizar el crecimiento del P cubensis con respecto al consumo de
proteiacutena se evidencia claramente que el consumo disminuyoacute permanentemente
72
en el tiempo mientras el hongo se encontraban en estado exponencial indicando
el intereacutes del P cubensis por la proteiacutena siendo eacutesta utilizada por el mismo para
aumentar su tamantildeo y biomasa
Durante los diacuteas 4 y 10 las fermentaciones que conteniacutean concentraciones de 30
gL y 70 gL de sacarosa presentaron un alto consumo de proteiacutena a pesar de
que el P cubensis se encontraba en estos dos ensayos en fase estacionaria fase
en la cual no se requiere consumir grandes cantidades de sustrato puesto que el
hongo soacutelo necesitaba alimentarse para mantenerse o para producir productos no
ligados al crecimiento maacutes no para cambiar la cantidad de biomasa presente en el
medio Asimismo la concentracioacuten de 50 gL de sacarosa tambieacuten presentoacute un
alto consumo de proteiacutena durante los diacuteas 4 y 8 en donde se creiacutea estar en una
fase estacionaria temprana lo dicho anteriormente reitera una vez maacutes la afinidad
que el P cubensis presentoacute con respecto a las fuentes de proteiacutena usadas
333 Comparacioacuten entre el consumo de proteiacutena de P cubensis en los
cultivos sumergidos con diferentes fuentes de carbono
Con el fin de conocer cuaacutel de los dos tipos de sustrato empleado fue mayormente
consumido se realizoacute un anaacutelisis estadiacutestico
En el graacutefico 18 se ilustran las medias de consumo de proteiacutena (concentracioacuten)
arrojadas mediante el anaacutelisis estadiacutestico sobre el consumo de proteiacutena cuando se
utilizoacute glucosa o sacarosa en el medio y se evidencia que existen diferencias
significativas en cuanto a la concentracioacuten de proteiacutena en el tiempo en el medio
cuando se realizoacute el experimento con glucosa y cuando se utilizoacute sacarosa
arrojando asiacute dos grupos homogeacuteneos el primero (a) presenta una media de 465
gL mientras que el grupo dos (b) arroja un valor de media de 609 gL indicando
un menor consumo de proteiacutena por parte del P cubensis en el medio sumergido
73
de Fang-Zhong cuando se utilizoacute sacarosa como principal fuente de carbono
(Anexo 7)
Tratamientos de las dos fuentes de carbono usadas sin FA (glucosa y sacarosa)
Media glucosa (a) 465
Media sacarosa (b) 609
a
b
0
1
2
3
4
5
6
7
8
Conc
entr
acioacute
n pr
oteiacute
na (g
L)
Letras diferentes denotan diferencias significativas (prueba LSD)
Graacutefico 18 Consumo de proteiacutena para cada una de las fuentes de carbono utilizadas
334 Consumo de proteiacutena por P cubensis en medio sumergido utilizando
glucosa y FA en el medio
Una vez se obtuvo la concentracioacuten de proteiacutena en el medio para cada
concentracioacuten de FA utilizada se precedioacute a graficar dichos valores con respecto
al tiempo los cuales se ilustran en el graacutefico 19 ademaacutes se muestran en dicho
graacutefico las cineacuteticas de crecimiento de biomasa para cada ensayo
74
0
02
04
06
08
1
12
0
2
4
6
8
10
12
14
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Bio
mas
a (g
L)
Pro
teiacuten
a (g
L)
Tiempo (diacuteas)
05 gL 1 gL 15 gL 05 gL 1 gL 15 gL
Graacutefico 19 Cineacutetica de consumo de proteiacutena por parte del P cubensis en medio sumergido utilizando 50 gL de glucosa como fuente de carbono y
diferentes concentraciones de FA
De igual forma que para la fermentacioacuten que teniacutea 50 gL de glucosa en el medio
realizada anteriormente para dichos ensayos el consumo de proteiacutena fue
permanente y se dio casi en su totalidad El ensayo que mayor consumo de
proteiacutena presentoacute fue el que conteniacutea 05 gL de FA arrojando un porcentaje de
consumo del 86 aun asiacute el porcentaje de consumo arrojado por la fermentacioacuten
de 1 gL de FA fue del 84 indicando que no existen diferencias con respecto al
consumo de proteiacutena entre dichas cantidades de FA utilizadas Mientras que el
porcentaje de consumo para 15 gL de FA fue inferior presentando un valor del
72 De acuerdo a los resultados mencionados anteriormente se puede decir que
a mayor concentracioacuten de FA en el medio se presenta menor consumo de
proteiacutena por parte del P cubensis esto se puede afirmar uacutenicamente para los
resultados obtenidos durante esta investigacioacuten a ciertas condiciones
Analizando ahora la relacioacuten entre el consumo de proteiacutena y el crecimiento
micelial se puede ver que al igual que para los ensayos con glucosa a 50 gL se
75
tiene un consumo permanente mientras se estaacute en fase exponencial y una vez se
llega a la fase estacionario alrededor del diacutea 12 la concentracioacuten de proteiacutena en
el medio se estabilizoacute
A la hora de indagar los datos estadiacutesticamente se puede observar que no existen
diferencias significativas sobre el consumo de proteiacutena (concentracioacuten) en el
tiempo con respecto al tipo de sustrato pero al comparar los resultados con los
ensayos donde se antildeadioacute FA al medio se encontroacute que siacute existen diferencias
significativas Se crearon dos grupos homogeacuteneos el primero cuenta con glucosa
y sacarosa presentando medias (cantidad de proteiacutena en el medio) de 468 gL y
473 gL respectivamente mientras que el ensayo con FA se encuentra en otro
grupo en donde su consumo de proteiacutena fue menor presentando una media
(cantidad de proteiacutena en el medio) de 614 gL (Anexo 8)
Tratamientos con y sin FA
Media glucosa (a) 468
Media sacarosa Proteiacutena (a) 473
Media fenilalanina (b) 614
a a
b
0
1
2
3
4
5
6
7
8
Co
nce
ntr
acioacute
n p
rote
iacutena
(gL
)
Letras diferentes denotan diferencias significativas (prueba LSD)
Graacutefico 20 Consumo de proteiacutena para los ensayos con y sin FA
76
34 ESTUDIO CUALITATIVO DE LA PRESENCIA DEL ALCALOIDE
Posterior a las fermentaciones de glucosa sacarosa y glucosa 50 gL con FA y
los respectivos anaacutelisis se realizoacute un uacuteltimo anaacutelisis que a la vez fue el de mayor
relevancia a la hora de determinar cuaacutel de los medios fue el que mejores
resultados arrojoacute En primera instancia se utilizoacute el reactivo de Dragendorff como
indicador de alcaloide para analizar las muestras de los diacuteas 12 13 y 14 con el fin
de esclarecer la presencia de alcaloides (Anexo 17)
Una vez detectada la presencia de alcaloides gracias a la coloracioacuten naranja
presentada en las muestras se procedioacute a realizar la teacutecnica de HPLC con el fin
de hallar un porcentaje del compuesto de intereacutes basado en las aacutereas obtenidas
de los cromatogramas (asumiendo un tiempo de retencioacuten entre 62 y 72
minutos)
341 Produccioacuten de compuestos producidos por P cubensis cuando el
medio no conteniacutea FA
A la hora de analizar y confirmar cuaacutel fue el mejor ensayo de los experimentos
realizados se tuvo como criterio base determinar la fuente de carbono y su
respectiva concentracioacuten que mejor presencia del compuesto de intereacutes arrojoacute
supuesto a un tiempo de retencioacuten entre 62 y 72 minutos
Inicialmente al obtener los anaacutelisis estadiacutesticos se deduce que no existieron
diferencias significativas entre el aacuterea del pico de intereacutes con respecto a todos los
picos arrojados por el cromatograma y los factores estudiados (tipo de sustrato
diacutea de fermentacioacuten y concentracioacuten) puesto que se obtuvieron valores de P-valor
77
de 03310 09580 y 08336 respectivamente es decir no importa queacute tipo de
sustrato se utilice la produccioacuten de alcaloide no tendraacute variaciones (Anexo 9)
Al analizar el graacutefico 21 se puede observar que las medias de las aacutereas halladas
para los diferentes ensayos con glucosa y sacarosa no presentaron diferencias
significativas es decir pertenecen al mismo grupo homogeacuteneo (a) lo que ratifica
lo dicho anteriormente
Tratamiento de las dos fuentes de carbono usadas sin FA (glucosa y sacarosa)
Media glucosa (a) 235916
Media sacarosa (a) 337147
a
a
0
7000
14000
21000
28000
35000
42000
Aacutere
a de
Com
pues
to
Letras diferentes denotan diferencias significativas (prueba LSD)
Graacutefico 21 Aacuterea del compuesto obtenido de P cubensis en tiempo de retencioacuten entre 62 y 72 minutos para las dos fuentes de carbono
Por tal razoacuten fue necesario hacer un anaacutelisis cualitativo de los cromatogramas
obtenidos mediante HPLC el cual se basoacute en la forma del pico arrojado por la
teacutecnica La figura 6 ilustra dicho anaacutelisis
78
Buena resolucioacuten de pico Mala resolucioacuten de pico
(a) (b)
Figura 6 Cromatogramas de dos diferentes fermentaciones de P cubensis que ilustran el criterio de escogencia del mejor ensayo realizado (a) 50 gL
glucosa (b) 50 gL sacarosa
Primero fue necesario observar el tamantildeo del pico y posterior a eacutesto determinar
su resolucioacuten La figura 6 ilustra dos ejemplos el de 50 gL de glucosa el diacutea 13 y
50 gL de sacarosa el diacutea 14 mientras el primero muestra un pico grande y
definido la segunda fermentacioacuten ilustra un pico grande pero poco definido
indicando que en este caso no se resolvioacute correctamente el alcaloide es decir no
se logroacute una buena separacioacuten De esta manera se analizaron los diferentes
cromatogramas para los diacuteas 12 (Anexo 19) 13 (Anexo 20) y 14 (Anexo 21) de
cada fermentacioacuten arrojando diferencias entre los ensayos y llevando a la
conclusioacuten de que la fermentacioacuten que mejores resultados arrojoacute fue la que
conteniacutea 50 gL de glucosa
79
342 Produccioacuten de compuestos producidos por P cubensis cuando el
medio conteniacutea FA
Despueacutes de realizada la fermentacioacuten con glucosa 50 gL y concentraciones de
FA de 05 gL 10 gL y 15 gL se procedioacute de igual manera que en el estudio sin
FA a evaluar cuaacutel de estas tres concentraciones de FA exhibioacute mejor resolucioacuten
del alcaloide
Inicialmente se realizoacute un anaacutelisis estadiacutestico el cual arrojoacute que no existen
diferencias significativas con respecto al aacuterea de pico que en este caso debido al
supuesto representa la Psilocibina y los diacuteas 12 13 y 14 de la fermentacioacuten
Mediante el graacutefico 22 se puede decir que en los uacuteltimos tres diacuteas de las
fermentaciones que conteniacutean FA en el medio no existen diferencias significativas
con respecto al alcaloide de intereacutes obtenido es decir en los tres se produjo el
alcaloide (Anexo 10)
Tratamientos de los uacuteltimos tres diacuteas de fermentacioacuten usando FA
Media diacutea 12 (a) 411758
Media diacutea 13 (a) 413401
Media diacutea 14 (a) 44860
a a a
0
10000
20000
30000
40000
50000
Aacutere
a Co
mpu
esto
Letras diferentes denotan diferencias significativas
Graacutefico 22 Aacuterea del compuesto obtenido de P cubensis en tiempo de retencioacuten entre 62 y 72 minutos en los uacuteltimos tres diacuteas de la fermentacioacuten
con FA y glucosa
80
Igual que en numeral anterior fue necesario realizar anaacutelisis cualitativo para los
cromatogramas por ende se requirioacute observar el tamantildeo del pico y posterior a
eacutesto determinar su resolucioacuten
Buena resolucioacuten de pico Mala resolucioacuten de pico
(a) (b)
Figura 7 Cromatogramas de dos diferentes fermentaciones de P cubensis que ilustran el criterio de escogencia del mejor ensayo realizado (a) 05 gL
FA (b) 15 gL FA
La figura 7 ejemplifica el anaacutelisis realizado para la seleccioacuten del mejor ensayo
ejecutado Se tienen dos cromatogramas el de 05 gL de FA en el diacutea 13 y el de
15 gL de FA para el mismo diacutea
A todos los cromatogramas obtenidos para los diacuteas 12 (Anexo 19) 13 (Anexo 20)
y 14 (Anexo 21) se realizoacute el mismo anaacutelisis y se concluyoacute que la concentracioacuten
maacutes apropiada para la obtencioacuten de la los compuestos producidos por P cubensis
fue de 05 gL de FA debido a que eacuteste generariacutea una disminucioacuten en los costos
81
35 ESTUDIO PORCENTUAL (AacuteREA) DEL ALCALOIDE REALIZADO PARA
LOS DIFERENTES ENSAYOS
Se calculoacute el porcentaje de aacuterea correspondiente al pico que identificoacute que se
asumioacute como el correspondiente a la Psilocibina gracias a la suposicioacuten realizada
del tiempo de retencioacuten
A continuacioacuten se presentan los valores obtenidos y sus respectivos anaacutelisis para
cada tratamiento
351 Porcentaje de la Psilocibina (suposicioacuten) cuando el medio no conteniacutea
FA
Debido a que no se contaba con un estaacutendar de Psilocibina los resultados
mostrados en la tabla 5 se obtuvieron realizando un porcentaje con respecto a las
aacutereas bajo la curva arrojadas mediante el anaacutelisis de cromatografiacutea de alta
eficiencia (Anexos 19 20 y 21) En dichos anexos se encuentran resaltadas en
negrilla aquellas aeacutereas utilizadas
Tabla 5 Porcentaje de aacuterea hallado mediante HPLC para los uacuteltimos tres diacuteas de la fermentacioacuten con concentraciones de 30 gL 50 gL y 70 gL de glucosa
y sacarosa con un tiempo de retencioacuten de 62 y 72 minutos
Diacutea Glucosa
(gL)
Aacuterea
(compuesto
Tr= 62-72)
Sacarosa
(gL)
Aacuterea
(compuesto
Tr= 62-72)
12 30 60650 30 3664
12 50 7396 50 5857
12 70 4816 70 3415
13 30 702 30 2876
13 50 6815 50 4113
13 70 6733 70 5583
14 30 4824 30 2756
14 50 4821 50 2792
14 70 017 70 1429
82
A la hora de analizar los datos de la tabla 5 se puede observar que el mayor
porcentaje de aacuterea se obtuvo cuando se trabajoacute con glucosa como fuente de
carbono y concretamente a una concentracioacuten de 50 gL
Analizando los datos estadiacutesticamente no se obtuvieron diferencias significativas
en cuanto a la produccioacuten del compuesto (aacuterea) con respecto al tipo de sustrato
utilizado durante las fermentaciones es decir es indiferente si se utiliza glucosa o
sacarosa en el cultivo de P cubensis en medio sumergido de Fang-Zhong
El graacutefico 23 ilustra las medias (aacuterea) obtenidas para la produccioacuten de alcaloide en
las dos diferentes fuentes de carbono es decir glucosa y sacarosa exponiendo
un uacutenico grupo homogeacuteneo con medias (produccioacuten de alcaloide) de aacutereas de
219635 y 234391 para glucosa y sacarosa respectivamente (Anexo 11)
Tratamientos de las dos fuentes de carbono usadas sin FA (glucosa y sacarosa)
Media glucosa (a) 219635
Media sacarosa (a) 234391
a
a
2000
2100
2200
2300
2400
Aacuterea
Com
pues
to
Letras diferentes denotan diferencias significativas (prueba LSD)
Graacutefico 23 Aacuterea del compuesto obtenido de P cubensis en tiempo de retencioacuten entre 62 y 72 minutos para cada una de las fuentes de carbono
utilizadas
Aun asiacute estudiando los graacuteficos de HPLC con el criterio mencionado
anteriormente es decir observando el tamantildeo del pico y su resolucioacuten del mismo
83
se observoacute claramente que la presencia del alcaloide (tiempo de retencioacuten
supuesto entre 62 y 72 minutos) fue mejor cuando se trabajoacute con glucosa a una
concentracioacuten de 50 gL debido que presenta el mejor pico
352 Porcentaje de aacuterea de compuestos presentes en P cubensis cuando
el medio conteniacutea FA
Con el fin de observar si la adicioacuten de FA al medio si arrojoacute mejores resultados en
cuanto a la produccioacuten del compuesto presente entre un rango de 62 y 72
minutos como tiempo de retencioacuten se procedioacute a calcular el porcentaje del aacuterea
de intereacutes de acuerdo a las aacutereas arrojadas para cada ensayo por medio del
anaacutelisis de HPLC Los datos obtenidos se ilustran a continuacioacuten en la tabla 6
Tabla 6 Porcentaje hallado mediante HPLC para los uacuteltimos tres diacuteas de la fermentacioacuten con concentraciones de 05 gL 10 gL y 15 gL de FA y 50 gL
de glucosa con un tiempo de retencioacuten entre 62 y 72 minutos
Diacutea
Glucosa
50 gL +
FA
Aacuterea
(compuesto
Tr=62-72)
12 0 4315
12 05 2931
12 1 6236
12 15 847
13 0 3257
13 05 7549
13 1 4790
13 15 2721
14 0 4822
14 05 3863
14 1 5801
14 15 2102
84
Al detallar la tabla 6 puede observarse que el ensayo que mayor porcentaje de
aacuterea arrojoacute fue el que conteniacutea 05 gL de FA arrojando su maacuteximo porcentaje
correspondiente a 755 el diacutea 13 Aun asiacute las diferencias existentes entre ellos
no fueron significativas
Ahora bien al analizarlos estadiacutesticamente se encontroacute que la produccioacuten del
alcaloide en presencia de FA presentoacute la misma tendencia que los ensayos
analizados anteriormente sin eacutesta pero gracias a que este aminoaacutecido duplico la
cantidad de biomasa y debido a que el compuesto de intereacutes se produce
intracelularmente se afirma que el uso de FA aumentoacute la generacioacuten del
compuesto evaluado (Anexo 12)
El graacutefico 24 presenta las diferentes medias en cuanto al porcentaje de aacuterea del
compuesto presente entre 62 y 72 minutos para los diferentes tratamientos de
glucosa a una concentracioacuten de 50 gL y sus concentraciones respectivas de FA
Claramente se ve que soacutelo existe un grupo homogeacuteneo lo que reafirma que no
existen diferencias significativas de la produccioacuten con respecto a las
concentraciones de FA
85
Tratamientos con y sin FA
Media 0 gL FA (a) 3122
Media 05 gL FA (a) 2391
Media 10 gL FA (a) 2823
Media 15 gL FA (a) 2113
a
aa
a
0
5
10
15
20
25
30
35
40
Aacutere
a Co
mpu
esto
Letras diferentes denotan diferencias significativas (prueba LSD)
Graacutefico 24 Aacuterea del compuesto obtenido de P cubensis en tiempo de retencioacuten entre 62 y 72 minutos para cada una de las concentraciones de
FA utilizadas
Debido a que no se encontraron diferencias significativas en cuanto al porcentaje
de aacuterea obtenido mediante los cromatogramas se concluye que el mejor medio es
el que tiene como fuente de carbono glucosa a una concentracioacuten de 50 gL y una
adicioacuten de 05 gL de FA puesto que genera una disminucioacuten en costos
86
CONCLUSIONES
No existen diferencias significativas en el crecimiento micelial de P
cubensis en medio sumergido Fang-Zhong cuando se trabaja con fuentes
de carbono glucosa y sacarosa sin embargo se decide trabajar con 50 gL
de glucosa puesto que eacuteste tiene una buena presencia de alcaloide y a su
vez una mejor produccioacuten de biomasa
La concentracioacuten de glucosa utilizada para el crecimiento de P cubensis
influye en el crecimiento micelial obteniendo concentraciones de biomasa
de 062 gL 055 gL y 048 gL para concentraciones de sustrato de 70 50
y 30 gL de glucosa siendo las dos primeras significativamente diferentes
con respecto a la de 30 gL
La concentracioacuten de sacarosa utilizada para el crecimiento de P cubensis
influye en el crecimiento micelial obteniendo concentraciones de biomasa
de 057 gL 045 gL y 026 gL para concentraciones de sustrato de 70 50
y 30 gL de sacarosa siendo significativamente diferentes entre ellas
La resolucioacuten de los picos obtenidos por RP-HPLC del extracto de P
cubensis fue mayor para las fermentaciones realizadas con una
concentracioacuten de 50 gL de glucosa lo que conllevoacute a utilizarlo al realizar
los ensayos que conteniacutean en el medio FA
La concentracioacuten de biomasa de P cubensis obtenida en cultivo sumergido
en medio Fang-Zhong con glucosa se duplicoacute con la adicioacuten de FA No
obstante no existen diferencias significativas entre las concentraciones de
FA utilizadas
87
El consumo de proteiacutena presentada por P cubensis en medio Fang-Zhong
fue casi del 100 mientras que el consumo de sustrato para el mismo
medio estuvo alrededor del 40
El consumo de sustrato durante el transcurso de las fermentaciones que no
conteniacutean FA en el medio no presentoacute diferencias significativas con
respecto a las dos fuentes de carbono utilizadas Mientras que en aquellas
fermentaciones donde se agregoacute FA al medio siacute existieron diferencias
significativas entre las fermentaciones de 15 y 1 gL de FA con respecto a
los ensayos realizados con 05 gL FA Sin embargo el P cubensis
consumioacute mayor cantidad de sustrato cuando el medio no conteniacutea FA
Se evidencioacute que el P cubensis consumioacute mayor cantidad de proteiacutena
cuando el sustrato utilizado en el medio fue glucosa y a su vez se detecto
que la adicioacuten de FA al medio tuvo como efecto la disminucioacuten en el
consumo de sustrato por parte del microorganismo
El consumo de sustrato y de proteiacutena tuvo un comportamiento similar
puesto que fue consumido permanentemente durante la fase exponencial
para cada uno de los tratamientos realizados es decir las concentraciones
de 30 gL 50 gL y 70 gL de glucosa y sacarosa como fuente de carbono y
de 05 gL 1 gL y 15 gL de FA teniendo como fuente de carbono glucosa
a una concentracioacuten de 50 gL mientras que en la fase estacionaria su
consumo se disminuyoacute permaneciendo casi constante
Despueacutes de realizados los estudios en cuanto a la produccioacuten del
compuesto presente entre 62 y 72 minutos para cada uno de los ensayos
no se evidenciaron diferencias significativas entre las dos fuentes de
carbono utilizadas (glucosa y sacarosa)
88
La adicioacuten del precursor llamado Fenilalanina (FA) al medio sumergido
Fang-Zhong para llevar a cabo el cultivo del P cubensis tuvo influencia en
cuanto a la produccioacuten de compuesto presente entre tiempo de retencioacuten de
62 y 72 minutos debido a que eacuteste duplicoacute la concentracioacuten de biomasa
en el medio se dice entonces que la produccioacuten aumentoacute al ser eacuteste de
produccioacuten intracelular
La resolucioacuten del compuesto presente entre el tiempo de retencioacuten de 62 a
72 minutos se obtuvo mejor en el ensayo que conteniacutea 05 gL de FA y al
saber que no existieron diferencias significativas en la produccioacuten en cuanto
al porcentaje de aacutereas obtenido con respecto a las demaacutes concentraciones
de FA se afirma que eacuteste es el medio que mejores resultados arrojoacute para
el crecimiento de P cubensis y la produccioacuten de Psilocibina
89
RECOMENDACIONES
Se sugiere observar el efecto que tiene la variacioacuten de las revoluciones a
las cuales se realizaron las fermentaciones para ver como variacutea el
crecimiento del P cubensis en medio sumergido Fang-Zhong con respecto
a dicho factor
Debido a que soacutelo se realizaron anaacutelisis sobre el crecimiento del P
cubensis en medio sumergido haciendo uso de dos sustratos diferentes
(glucosa y sacarosa) seriacutea recomendable realizar el mismo anaacutelisis para
otro tipo de sustrato como por ejemplo melaza por su bajo costo
Del mismo modo seriacutea apropiado realizar el estudio con otro tipo de
precursor y en otras concentraciones para ver la incidencia de eacuteste en el
comportamiento del hongo
Se recomienda realizar un escalamiento de dicho proceso en un biorreactor
con el fin de evaluar a mayor escala el crecimiento del P cubensis y la
produccioacuten del alcaloide
Debido a que la proteiacutena se comportoacute como el principal nutriente se sugiere
para una proacutexima investigacioacuten evaluar diferentes concentraciones de
proteiacutena en el medio
90
ANEXOS
Anexo 1 Anaacutelisis de varianza (ANOVA) para el crecimiento de biomasa de
las fermentaciones con glucosa
Tabla 7 Anaacutelisis de Varianza para el crecimiento micelial (glucosa)
Tabla 8 Anaacutelisis Muacuteltiple de Rangos para el crecimiento micelial (glucosa)
91
Anexo 2 Anaacutelisis de Varianza (ANOVA) para el crecimiento de biomasa de
las fermentaciones con sacarosa
Tabla 9 Anaacutelisis de Varianza para el crecimiento micelial (sacarosa)
Tabla 10 Anaacutelisis Muacuteltiple de Rangos para el crecimiento micelial (sacarosa)
92
Anexo 3 Anaacutelisis de Varianza (ANOVA) para el crecimiento de biomasa de
las fermentaciones con glucosa y sacarosa
Tabla 11 Anaacutelisis de Varianza para el crecimiento micelial (glucosa y
sacarosa)
Tabla 12 Anaacutelisis Muacuteltiple de Rangos para el crecimiento micelial (glucosa y
sacarosa)
93
Anexo 4 Anaacutelisis de Varianza (ANOVA) para el crecimiento de biomasa de
las fermentaciones con glucosa 50 gL y FA
Tabla 13 Anaacutelisis de Varianza para el crecimiento micelial (glucosa 50 gL y
FA)
Tabla 14 Anaacutelisis Muacuteltiple de Rangos para el crecimiento micelial (glucosa
50 gL y FA)
94
Anexo 5 Anaacutelisis de varianza (ANOVA) para el consumo de sustrato en las
fermentaciones sin FA
Tabla 15 Anaacutelisis de Varianza para el consumo de Sustrato sin FA
Tabla 16 Anaacutelisis Muacuteltiple de Rangos para el consumo de Sustrato sin FA
95
Anexo 6 Anaacutelisis de Varianza (ANOVA) para el consumo de sustrato en las
fermentaciones con FA
Tabla 17 Anaacutelisis de Varianza para el consumo de Sustrato con FA
Tabla 18 Anaacutelisis Muacuteltiple de Rangos para el consumo de Sustrato con FA
96
Anexo 7 Anaacutelisis de Varianza (ANOVA) para el consumo de proteiacutena en las
fermentaciones sin FA
Tabla 19 Anaacutelisis de Varianza para el consumo de Proteiacutena sin FA
Tabla 20 Anaacutelisis Muacuteltiple de Rangos para el consumo de Proteiacutena sin FA
97
Anexo 8 Anaacutelisis de Varianza (ANOVA) para el consumo de proteiacutena en las
fermentaciones con FA
Tabla 21Anaacutelisis de Varianza para el consumo de Proteiacutena con FA
Tabla 22 Anaacutelisis Muacuteltiple de Rangos para el consumo de Proteiacutena con FA
98
Anexo 9 Anaacutelisis de Varianza (ANOVA) para la produccioacuten de Psilocibina en
las fermentaciones sin FA
Tabla 23 Anaacutelisis de Varianza para la produccioacuten de Psilocibina sin FA
Tabla 24 Anaacutelisis Muacuteltiple de Rangos para la produccioacuten de Psilocibina
seguacuten el Sustrato sin FA
99
Anexo 10 Anaacutelisis de Varianza (ANOVA) para la produccioacuten de Psilocibina en las fermentaciones con FA
Tabla 25 Anaacutelisis de Varianza para la produccioacuten de Psilocibina con FA
Tabla 26 Anaacutelisis Muacuteltiple de Rangos para la produccioacuten de Psilocibina
seguacuten el diacutea con FA
100
Anexo 11 Anaacutelisis de Varianza (ANOVA) para la cuantificacioacuten porcentual de
Psilocibina en las fermentaciones sin FA
Tabla 27 Anaacutelisis de Varianza para la cuantificacioacuten de Psilocibina sin FA
Tabla 28 Anaacutelisis Muacuteltiple de Rangos para la cuantificacioacuten de Psilocibina
seguacuten el tipo de sustrato sin FA
101
Anexo 12 Anaacutelisis de Varianza (ANOVA) para la cuantificacioacuten porcentual de
Psilocibina en las fermentaciones con FA
Tabla 29 Anaacutelisis de Varianza para la cuantificacioacuten de Psilocibina con FA
Tabla 30 Anaacutelisis Muacuteltiple de Rangos para la cuantificacioacuten de Psilocibina
seguacuten la concentracioacuten con FA
102
Anexo 13 Determinacioacuten de consumo de azuacutecares por el meacutetodo de DNS
(Aacutecido Dinitrosaliciacutelico)
a DNS para glucosa
Pasos para preparar DNS
Disolver 16 gr de NaOH en agua destilada
Adicionar 30 gr de tartrato de Na y K
Aforar a 100 ml con agua destilada
Almacenar en frascos aacutembar a 4degC
Se debe mantener un stock de glucosa 4mgml y almacenarlo a 4degC A partir
de la solucioacuten de glucosa se preparan las soluciones para hacer la curva
patroacuten con las siguientes concentraciones (gL) 025 050 100 200 y 400
Procedimiento
Tomar 05 ml de cada dilucioacuten y agregar 05 ml de reactivo DNS
Preparar una muestra blanco por dilucioacuten de 05 ml de agua destilada a 05
ml de reactivo de DNS
Agitar todas las muestras
Colocar a ebullir las muestras en bantildeo mariacutea por cinco minutos
Enfriar con hielo
Adicionar 5 ml de agua destilada
Agitar y dejar en reposo 15 minutos
Leer en espectrofotoacutemetro a 540 nm
Realizar la curva Absorbancia Vs Concentracioacuten Debe tener un coeficiente
de correlacioacuten de 0991 a 0999
b DNS para sacarosa
Pasos para preparar DNS sacarosa
Preparacioacuten de la solucioacuten Standard stock de sacarosa (30 gL) tomar 30
gr de sacarosa anhiacutedrida grado reactivo con exactitud hasta la deacutecima de
mg disolver ajustar a aforo de 100 ml con agua desionizada empacar en
viales y almacenar en congelador
Preparacioacuten DNS pesar 16 gr de hidroacutexido de sodio grado reactivo 30 gr
de tartrato de sodio y potasio y disolverlos juntos con 50 ml de agua
103
desionizada aparte pesar 10 gr del DNS disolver con 30 ml de agua
desionizada agregar lentamente y con agitacioacuten la solucioacuten del DNS a la
solucioacuten de tartrato y NaOH anteriormente preparadas ajustar a 100 ml
filtrar envasar en frasco aacutembar y rotular con fecha de vencimiento incluida
(3 meses maacuteximo) mantener a la temperatura del laboratorio
Preparacioacuten del reactivo NaOH 10 N (500 ml) pesar con exactitud hasta
la deacutecima de mg 20 gr de NaOH grado reactivo por cada 500 ml de
solucioacuten disolver primero con 300 ml de agua desionizada y luego aforar a
500 ml envasar y rotular correctamente y mantener a la temperatura del
laboratorio
Preparacioacuten de HCL 10 (100 ml) tomar 27 ml de aacutecido clorhiacutedrico al
37 grado reactivo y aforar hasta 100 ml con agua desionizada envasar
rotular correctamente de acuerdo a la norma del laboratorio y almacenar a
la temperatura del laboratorio
Se debe mantener un stock de glucosa 30 gL y almacenarlo a 4degC A partir
de la solucioacuten de glucosa se preparan las soluciones para hacer la curva
patroacuten con las siguientes concentraciones (gL) 3 6 12 18 24 y 30
Procedimiento
Preparar en cada tubo (las soluciones de la curva patroacuten de sacarosa las
muestras problemas diluidas si es necesario y como blanco agua
desionizada) 100microl de solucioacuten
Adicionar 200 microl de HCL 10 a cada tubo y agitar todos los tubos en vortex
Llevar a ebullicioacuten por 10 minutos en bantildeo mariacutea precalentado a 95degC
Enfriar hasta temperatura ambiente raacutepidamente
Adicionar a cada tubo 1 ml de NaOH 10 N y agitar los tubos en vortex
Aparte tomar 05 ml de cada tubo en otros tubos rotulados y agregar 05 ml
del DNS
Agitar todas las muestras en vortex
Llevar a ebullicioacuten por 5 minutos en bantildeo mariacutea precalentado a 96degC
Enfriar hasta temperatura ambiente raacutepidamente
Adicionar 5 ml de H2O desionizada agitar en vortex y dejar reposar por 15
minutos
Leer en espectrofotoacutemetro a 540 nm
Realizar la curva Absorbancia Vs Concentracioacuten Debe tener un coeficiente
de correlacioacuten de 0991 a 0999
104
Anexo 14 Cineacutetica de Consumo de Sustrato
La cineacutetica de consumo de sustrato se realizoacute por el meacutetodo de Aacutecido
Dinitrosaliciacutelico (DNS) Los rangos de concentracioacuten y absorbancia para cada caso
se citan a continuacioacuten
Rangos de concentraciones y absorbancias para las fermentaciones que
usaron glucosa (30 gL 50 gL y 70 gL) como sustrato
Concentracioacuten de 02 a 12 gL
Absorbancia de 01234 a 06612
Ecuacioacuten Y = 19174x -00517 R2 = 09923
Rangos de concentraciones y absorbancias para las fermentaciones que
usaron sacarosa (30 gL 50 gL y 70 gL) como sustrato
Concentracioacuten de 3 a 30 gL
Absorbancia de 00822 a 11112
Ecuacioacuten Y = 25983x + 04857 R2 = 09978
Rangos de concentraciones y absorbancias para las fermentaciones que
usaron glucosa 50 gL como sustrato y FA
Concentracioacuten de 02 a 12 gL
Absorbancia de 0097 a 063
Ecuacioacuten Y = 18785x + 00019 R2 = 09986
105
Anexo 15 Determinacioacuten de consumo de proteiacutenas por el meacutetodo de LOWRY
Pasos para la preparacioacuten de LOWRY
Para obtener la curva estaacutendar de Albuacutemina se preparan 5 soluciones
patrones de Albuacutemina en NaCL al 09 (PV) de las siguientes
concentraciones 152 80 200 300 400 Pgml Si la concentracioacuten de
Proteiacutena total es menor de 500 Pgml se lee la absorbancia a 750 nm si
estaacute entre 1000 y 2000 Pgml se lee a 550nm
Se prepara un blanco que no lleva Albuacutemina y en su reemplazo se adiciona
0-5 ml de solucioacuten salina (NaCL) al 09 (PV) Se aplica el mismo
procedimiento que a las demaacutes muestras
Procedimiento
Servir en tubos de ensayo 05 ml de las soluciones patroacuten de Albuacutemina las
muestras problema y NaCL al 09 como blanco Deben estar marcados
para conservar el orden de concentraciones para la curva
Adicionar a cada tubo 05 ml de NaOH 2N y llevar al bantildeo Mariacutea
precalentado a 100degC por un tiempo de 10 minutos
Dejar enfriar hasta que alcance la Temperatura Ambiente
Agregar a cada tubo 5 ml de la solucioacuten complejante mezclar y dejar
reposar por 10 minutos
Adicionar 05 ml del reactivo de Folin-Ciocalteu 11 vortexiar durante 20
segundos
Reposar en un cuarto oscuro durante 30 minutos
Leer la absorbancia a 750 nm y con las soluciones patroacuten construir la
graacutefica Absorbancia Vs Concentracioacuten de Albuacutemina Seacuterica de Bovina
(BSA) con eacutesta se puede determinar la concentracioacuten de las muestras
problema interpolando el valor de la Absorbancia La curva estaacutendar debe
tener un coeficiente de correlacioacuten de 0991 a 0999
106
Anexo 16 Cineacutetica consumo de Proteiacutena
La cineacutetica de consumo de proteiacutena se realizoacute por el meacutetodo LOWRY Los rangos
de concentracioacuten y absorbancia para cada caso se citan a continuacioacuten
Rangos de concentraciones y absorbancias para las fermentaciones que
usaron glucosa (30 gL 50 gL y 70 gL) como sustrato
Concentracioacuten de 0016 a 04 gL
Absorbancia de 00094 a 05382
Ecuacioacuten Y = 07427x ndash 00021 R2 = 09955
Rangos de concentraciones y absorbancias para las fermentaciones que
usaron sacarosa (30 gL 50 gL y 70 gL) como sustrato
Concentracioacuten de 0016 a 04 gL
Absorbancia de 00374 a 06178
Ecuacioacuten Y = 06567x ndash 00166 R2 = 09968
Rangos de concentraciones y absorbancias para las fermentaciones que
usaron glucosa 50 gL como sustrato y FA
Concentracioacuten de 0016 a 04 gL
Absorbancia de 00708 a 04647
Ecuacioacuten Y = 09814x ndash 00581 R2 = 09992
107
Anexo 17 Prueba de reactivo de Dragendorff
Preparacioacuten de reactivo de Dragendorff para alcaloides
Reactivo de Dragendorff se prepara mezclando 8 gr de nitrato de bismuto
pentahidratado en 20 ml de aacutecido niacutetrico al 30 con una solucioacuten de 272 g de
yoduro de potasio en 50 ml de agua Se deja en reposo por 24 horas se decanta y
se afora a 100 ml La presencia de alcaloides se detecta por la formacioacuten de un
precipitado naranja rojizo cuando se le adiciona esta reactivo a una solucioacuten aacutecida
de alcaloides De los precipitados lavados se puede recuperar los alcaloides con
una solucioacuten saturada de carbonato de sodio (Mercano y Hasegawa 1991)
La figura mostrada a continuacioacuten refleja la presencia del alcaloide debido a la
coloracioacuten amarillo-rojiza que eacutesta sufrioacute
Figura 8 Muestra de biomasa una vez analizada mediante el reactivo de Dragendorff
108
Anexo 18 Barrido Espectral para el Psilocybe cubensis
La metodologiacutea mencionada a continuacioacuten estaacute basada en artiacuteculo base
(Tsujikawa et al 2003)
El Sistema de HPLC consiste en un Shimadzu LC-10ordf Series Cromatografiacutea
Liacutequida equipada con un diodo SPD-M10A detector de red fija en 220nm La
separacioacuten cromatograacutefica ser realizoacute con una columna simeacutetrica C18 (21 mm a
150 mm 5mm Waters Assoc Milford EEUU
La fase moacutevil utilizada fue de 10 mm de formato de amonio-aacutecido foacutermico (955
VV) a un pH de 35 y bombeado a un caudal de 02 mlminuto
El perfil cromatograacutefico obtenido durante la investigacioacuten de Tsujikawa et al
(2003) se muestra en le figura 6 que aparece a continuacioacuten
Figura 9 Perfil cromatograacutefico (Tsujikawa et al 2003)
109
Anexo 19 Cromatogramas (HPLC) del diacutea 12 de fermentacioacuten
Tabla 31 Aacutereas obtenidas de los cromatogramas para el P cubensis en
medio Fang-Zhong en el diacutea 12 para concentraciones de 30gL glucosa y
30gL sacarosa
SustratoConcentracioacuten
(gL)
Tiempo
(s)Aacuterea
Glucosa 30 2957 3837
Glucosa 30 6838 474753
Glucosa 30 9144 47256
Glucosa 30 9489 16822
Glucosa 30 10124 224349
Sacarosa 30 6538 143772
Sacarosa 30 7234 269458
Sacarosa 30 9721 33646
Sacarosa 30 11845 24384
(a) (b)
Graacutefico 25 Cromatogramas del diacutea 12 para el P cubensis cultivado en medio
sumergido Fang-Zhong con dos diferentes tipos de sustratos (a) 30 gL
glucosa (b) 30 gL sacarosa
110
Tabla 32 Aacutereas obtenidas de los cromatogramas para el P cubensis en
medio Fang-Zhong en el diacutea 12 para concentraciones de 50gL glucosa y
50gL sacarosa
SustratoConcentracioacuten
(gL)
Tiempo
(s)Aacuterea
Glucosa 50 0524 319
Glucosa 50 6298 5991
Glucosa 50 7172 237042
Glucosa 50 9144 16387
Glucosa 50 10009 6077
Sacarosa 50 169 24011
Sacarosa 50 3105 28573
Sacarosa 50 6916 112166
Sacarosa 50 9136 4057
Sacarosa 50 9933 8821
Sacarosa 50 10398 13872
(a) (b)
Graacutefico 26 Cromatogramas del diacutea 12 para el P cubensis cultivado en medio
sumergido Fang-Zhong con dos diferentes tipos de sustratos (a) 50 gL
glucosa (b) 50 gL sacarosa
111
Tabla 33 Aacutereas obtenidas de los cromatogramas para el P cubensis en
medio Fang-Zhong en el diacutea 12 para concentraciones de 50gL glucosa y
50gL sacarosa
SustratoConcentracioacuten
(gL)
Tiempo
(s)Aacuterea
Glucosa 70 7217 168598
Glucosa 70 9145 9977
Glucosa 70 997 80558
Sacarosa 70 6803 287387
Sacarosa 70 7517 131049
Sacarosa 70 7775 4434
Sacarosa 70 7871 77109
Sacarosa 70 823 96239
Sacarosa 70 9039 5114
Sacarosa 70 9778 25394
(a) (b)
Graacutefico 27 Cromatogramas del diacutea 12 para el P cubensis cultivado en medio
sumergido Fang-Zhong con dos diferentes tipos de sustratos (a) 50 gL
glucosa (b) 50 gL sacarosa
112
Tabla 34 Aacutereas obtenidas de los cromatogramas para el P cubensis en
medio Fang-Zhong en el diacutea 12 para concentraciones de 50gL y glucosa
50gL sacarosa
SustratoConcentracioacuten
(gL)
Tiempo
(s)Aacuterea
Glucosa 50 05 0818 4722
Glucosa 50 05 2423 52579
Glucosa 50 05 3502 88765
Glucosa 50 05 6137 16009
Glucosa 50 05 6722 275258
Glucosa 50 05 733 226399
Glucosa 50 05 8339 65139
Glucosa 50 05 9101 36797
Glucosa 50 05 9815 130883
Glucosa 50 1 1105 743
Glucosa 50 1 2746 2701
Glucosa 50 1 4304 80304
Glucosa 50 1 6167 19649
Glucosa 50 1 6794 51753
Glucosa 50 1 8282 82997
Glucosa 50 1 9116 38659
Glucosa 50 1 9899 136953
Glucosa 50 15 1198 3313
Glucosa 50 15 2937 37875
Glucosa 50 15 4332 51079
Glucosa 50 15 614 25602
Glucosa 50 15 6737 668905
Glucosa 50 15 8209 107332
Glucosa 50 15 9602 38902
Glucosa 50 15 9752 139613
Diacutea 12
(a) (b)
(c)
Graacutefico 28 Cromatograma del diacutea 12 para el P cubensis cultivado en medio
sumergido Fang-Zhong con fuente de carbono glucosa y adicioacuten de
fenilalanina en tres concentraciones (a) 05 gL FA (b) 1 gL FA (c) 15gL
FA
113
Anexo 20 Cromatogramas (HPLC) del diacutea 13 de fermentacioacuten
Tabla 35 Aacutereas obtenidas de los cromatogramas para el P cubensis en
medio Fang-Zhong en el diacutea 13 para concentraciones de 30gL glucosa y
30gL sacarosa
SustratoConcentracioacuten
(gL)
Tiempo
(s)Aacuterea
Glucosa 30 0225 1155
Glucosa 30 2847 699
Glucosa 30 4043 1038
Glucosa 30 6231 4994
Glucosa 30 6787 295182
Glucosa 30 7462 241146
Glucosa 30 9066 51836
Glucosa 30 10004 158746
Sacarosa 30 1734 135
Sacarosa 30 5838 1857
Sacarosa 30 6803 147867
Sacarosa 30 7305 30464
Sacarosa 30 7599 174643
Sacarosa 30 9107 8564
Sacarosa 30 9897 104278
(a) (b)
Graacutefico 29 Cromatogramas del diacutea 13 para el P cubensis cultivado en medio
sumergido Fang-Zhong con dos diferentes tipos de sustratos (a) 30 gL
glucosa (b) 30 gL sacarosa
114
Tabla 36 Aacutereas obtenidas de los cromatogramas para el P cubensis en
medio Fang-Zhong en el diacutea 13 para concentraciones de 50gL glucosa y
50gL sacarosa
SustratoConcentracioacuten
(gL)
Tiempo
(s)Aacuterea
Glucosa 50 1408 13982
Glucosa 50 6949 331449
Glucosa 50 9012 25201
Glucosa 50 9936 27216
Sacarosa 50 1543 7293
Sacarosa 50 6813 437765
Sacarosa 50 9085 35897
Sacarosa 50 10049 184461
(a) (b)
Graacutefico 30 Cromatogramas del diacutea 13 para el P cubensis cultivado en medio
sumergido Fang-Zhong con dos diferentes tipos de sustratos (a) 50 gL
glucosa (b) 50 gL sacarosa
115
Tabla 37 Aacutereas obtenidas de los cromatogramas para el P cubensis en
medio Fang-Zhong en el diacutea 13 para concentraciones de 70gL glucosa y
70gL sacarosa
SustratoConcentracioacuten
(gL)
Tiempo
(s)Aacuterea
Glucosa 70 1456 3223
Glucosa 70 2985 2423
Glucosa 70 54 7586
Glucosa 70 6262 5149
Glucosa 70 7151 248331
Glucosa 70 9039 19346
Glucosa 70 9929 4906
Glucosa 70 11051 33698
Sacarosa 70 0437 342
Sacarosa 70 1428 812
Sacarosa 70 2948 2191
Sacarosa 70 5473 4854
Sacarosa 70 6286 5336
Sacarosa 70 6848 3649
Sacarosa 70 733 11383
Sacarosa 70 9073 1018
Sacarosa 70 9878 11072
Sacarosa 70 10267 18797
(a) (b)
Graacutefico 31 Cromatogramas del diacutea 13 para el P cubensis cultivado en medio
sumergido Fang-Zhong con dos diferentes tipos de sustratos (a) 70 gL
glucosa (b) 70 gL sacarosa
116
Tabla 38 Aacutereas obtenidas de los cromatogramas para el P cubensis en
medio Fang-Zhong en el diacutea 13 para concentraciones de 50gL y glucosa
50gL sacarosa
SustratoConcentracioacuten
(gL)
Tiempo
(s)Aacuterea
Glucosa 50 05 4067 22222
Glucosa 50 05 7379 55573
Glucosa 50 05 902 19513
Glucosa 50 05 9716 119261
Glucosa 50 05 1173 19427
Glucosa 50 1 0793 14776
Glucosa 50 1 2868 28537
Glucosa 50 1 6224 1206
Glucosa 50 1 6782 571299
Glucosa 50 1 8303 92665
Glucosa 50 1 9081 30371
Glucosa 50 1 9738 168959
Glucosa 50 1 11813 27921
Glucosa 50 15 0412 269
Glucosa 50 15 2482 14692
Glucosa 50 15 3486 91059
Glucosa 50 15 6039 6892
Glucosa 50 15 6627 216986
Glucosa 50 15 7216 260795
Glucosa 50 15 8112 65776
Glucosa 50 15 8888 19083
Glucosa 50 15 9497 37812
Glucosa 50 15 9839 65922
Glucosa 50 15 11655 7331
(a) (b)
(c)
Graacutefico 32 Cromatogramas del diacutea 12 para el P cubensis cultivado en medio
sumergido Fang-Zhong con fuente de carbono glucosa y adicioacuten de
fenilalanina en tres concentraciones (a) 05 gL FA (b) 1 gL FA (c) 15gL
FA
117
Anexo 21 Cromatogramas (HPLC) del diacutea 14 de fermentacioacuten
Tabla 39 Aacutereas obtenidas de los cromatogramas para el P cubensis en
medio Fang-Zhong en el diacutea 14 para concentraciones de 30gL glucosa y 30
gL sacarosa
SustratoConcentracioacuten
(gL)
Tiempo
(s)Aacuterea
Glucosa 30 1054 181
Glucosa 30 2553 8939
Glucosa 30 6219 7557
Glucosa 30 6585 77083
Glucosa 30 7158 285069
Glucosa 30 8987 33875
Glucosa 30 9848 87461
Glucosa 30 10694 52151
Glucosa 30 12482 7992
Glucosa 30 12943 23064
Glucosa 30 1493 5948
Sacarosa 30 7309 7075
Sacarosa 30 9984 1680
Sacarosa 30 10442 15395
Sacarosa 30 11211 8511
Sacarosa 30 13405 3398
(a) (b)
Graacutefico 33 Cromatogramas del diacutea 14 para el P cubensis cultivado en medio
sumergido Fang-Zhong con dos diferentes tipos de sustratos (a) 30 gL
glucosa (b) 30 gL sacarosa
118
Tabla 40 Aacutereas obtenidas de los cromatogramas para el P cubensis en
medio Fang-Zhong en el diacutea 14 para concentraciones de 50gL glucosa y
50gL sacarosa
SustratoConcentracioacuten
(gL)
Tiempo
(s)Aacuterea
Glucosa 50 2029 8318
Glucosa 50 6257 5782
Glucosa 50 6875 306684
Glucosa 50 9068 22819
Glucosa 50 9808 92492
Glucosa 50 12113 8823
Glucosa 50 12752 23988
Sacarosa 50 1036 3783
Sacarosa 50 2356 7005
Sacarosa 50 653 44831
Sacarosa 50 6657 127617
Sacarosa 50 7264 66908
Sacarosa 50 7464 255141
Sacarosa 50 9035 26172
Sacarosa 50 9458 28427
Sacarosa 50 9889 37574
Sacarosa 50 10312 140881
Sacarosa 50 12335 13391
Sacarosa 50 1292 17066
(a) (b)
Graacutefico 34 Cromatogramas del diacutea 14 para el P cubensis cultivado en medio
sumergido Fang-Zhong con dos diferentes tipos de sustratos (a) 50 gL
glucosa (b) 50 gL sacarosa
119
Tabla 41 Aacutereas obtenidas de los cromatogramas para el P cubensis en
medio Fang-Zhong en el diacutea 14 para concentraciones de 70gL glucosa y
70gL sacarosa
SustratoConcentracioacuten
(gL)
Tiempo
(s)Aacuterea
Glucosa 70 6257 5879
Glucosa 70 6373 145551
Glucosa 70 7015 68223
Glucosa 70 7199 9085
Glucosa 70 735 265755
Glucosa 70 9014 4642
Glucosa 70 9877 97804
Glucosa 70 107 67421
Glucosa 70 12625 26231
Glucosa 70 1305 65607
Sacarosa 70 2283 4683
Sacarosa 70 5191 93
Sacarosa 70 6304 3719
Sacarosa 70 6795 136542
Sacarosa 70 726 29869
Sacarosa 70 7515 75545
Sacarosa 70 7872 119563
Sacarosa 70 9166 1244
Sacarosa 70 9658 23096
Sacarosa 70 9871 25866
Sacarosa 70 10421 105108
Sacarosa 70 12347 11115
Sacarosa 70 12861 35503
Sacarosa 70 14272 3676
(a) (b)
Graacutefico 35 Cromatogramas del diacutea 14 para el P cubensis cultivado en medio
sumergido Fang-Zhong con dos diferentes tipos de sustratos (a) 70 gL
glucosa (b) 70 gL sacarosa
120
Tabla 42 Aacutereas obtenidas de los cromatogramas para el P cubensis en medio Fang-Zhong en el diacutea 13 para concentraciones de 50gL glucosa y
50gL sacarosa
SustratoConcentracioacuten
(gL)
Tiempo
(s)Aacuterea
Glucosa 50 05 0123 173
Glucosa 50 05 0699 7584
Glucosa 50 05 2594 2742
Glucosa 50 05 6104 11663
Glucosa 50 05 6616 487848
Glucosa 50 05 7235 287918
Glucosa 50 05 8183 135793
Glucosa 50 05 8903 5143
Glucosa 50 05 9484 66817
Glucosa 50 05 9679 168855
Glucosa 50 05 11671 4216
Glucosa 50 1 0345 295
Glucosa 50 1 2654 11981
Glucosa 50 1 412 45301
Glucosa 50 1 6111 12626
Glucosa 50 1 6757 526655
Glucosa 50 1 8093 104277
Glucosa 50 1 894 25251
Glucosa 50 1 9643 158685
Glucosa 50 1 11666 22779
Glucosa 50 15 0353 283
Glucosa 50 15 2522 15272
Glucosa 50 15 3577 83963
Glucosa 50 15 6668 47137
Glucosa 50 15 7304 371442
Glucosa 50 15 8226 117611
Glucosa 50 15 8923 61949
Glucosa 50 15 9657 19618
Glucosa 50 15 11668 35606
(a) (b)
(c)
Graacutefico 36 Cromatogramas del diacutea 12 para el P cubensis cultivado en medio sumergido Fang-Zhong con fuente de carbono glucosa y adicioacuten de
fenilalanina en tres concentraciones (a) 05 gL FA (b) 1 gL FA (c) 15gL FA (a) 05 gL FA (b) 1 gL FA (c) 15gL FA
121
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vii
28 EVALUACIOacuteN DEL CONSUMO DE SUSTRATO Y DEL CONSUMO DE PROTEIacuteNA POR PARTE DEL P
CUBENSIS CULTIVADO EN MEDIO SUMERGIDO ________________________________________________ 39
29 MEacuteTODO CUALITATIVO PARA DETERMINAR LA PRESENCIA DE ALCALOIDES (PSILOCIBINA)
MEDIANTE EL USO DEL REACTIVO DE DRAGENDORFF _________________________________________ 40
210 MEacuteTODO PARA DETERMINAR LA PRESENCIA DE PSILOCIBINA MEDIANTE CROMATOGRAFIacuteA
LIacuteQUIDA DE ALTA EFICIENCIA (HPLC) _______________________________________________________ 40
211 DETERMINACIOacuteN CUALITATIVA DE LA RESOLUCIOacuteN DEL ALCALOIDE DE INTEREacuteS PARA LOS
DIFERENTES ENSAYOS __________________________________________________________________ 41
212 DETERMINACIOacuteN PORCENTUAL DE COMPUESTOS PARA LOS DIFERENTES ENSAYOS __________ 42
213 CULTIVO SUMERGIDO DE P CUBENSIS EN PRESENCIA DE FA ______________________________ 42
214 DISENtildeO DE EXPERIMENTOS Y ANAacuteLISIS ESTADIacuteSTICO ___________________________________ 43
3 RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN ___________________________________________________________ 45
31 CINEacuteTICA DE CRECIMIENTO MICELIAL DE P CUBENSIS EN CULTIVO SUMERGIDO (FANG-ZHONG)
UTILIZANDO DIFERENTES FUENTES DE CARBONO ____________________________________________ 45
311 Crecimiento micelial de P cubensis en medio sumergido utilizando diferentes concentraciones
de glucosa _________________________________________________________________________ 45
312 Crecimiento micelial del P cubensis en medio sumergido utilizando diferentes concentraciones
de sacarosa ________________________________________________________________________ 50
313 Comparacioacuten entre el crecimiento micelial de P cubensis en los cultivos sumergidos utilizando
glucosa y sacarosa como fuente de carbono ______________________________________________ 55
314 Crecimiento micelial del P cubensis en cultivo sumergido utilizando glucosa y fenilalanina en el
medio 56
32 ESTUDIO DE LA CINEacuteTICA DE CONSUMO DE SUSTRATO POR PARTE DEL P CUBENSIS CULTIVADO EN
MEDIO SUMERGIDO (FANG-ZHONG) ______________________________________________________ 61
321 Consumo de sustrato por parte del P cubensis en medio sumergido utilizando diferentes
concentraciones de glucosa ___________________________________________________________ 62
322 Consumo de sustrato por parte del P cubensis en medio sumergido utilizando diferentes
concentraciones de sacarosa __________________________________________________________ 63
323 Comparacioacuten entre el consumo de sustrato de P cubensis en los cultivos sumergidos con
diferentes fuentes de carbono _________________________________________________________ 65
324 Consumo de sustrato por parte del P cubensis en medio sumergido utilizando glucosa y
fenilalanina en el medio ______________________________________________________________ 66
33 ESTUDIO DE LA CINEacuteTICA DE CONSUMO DE PROTEIacuteNA POR PARTE DEL P CUBENSIS CULTIVADO EN
MEDIO SUMERGIDO (FANG-ZHONG) ______________________________________________________ 69
331 Consumo de proteiacutena por P cubensis en medio sumergido utilizando diferentes
concentraciones de glucosa ___________________________________________________________ 69
332 Consumo de proteiacutena por P cubensis en medio sumergido utilizando diferentes
concentraciones de sacarosa __________________________________________________________ 71
333 Comparacioacuten entre el consumo de proteiacutena de P cubensis en los cultivos sumergidos con
diferentes fuentes de carbono _________________________________________________________ 72
334 Consumo de proteiacutena por P cubensis en medio sumergido utilizando glucosa y FA en el medio
73
34 ESTUDIO CUALITATIVO DE LA PRESENCIA DEL ALCALOIDE _______________________________ 76
viii
341 Produccioacuten de compuestos producidos por P cubensis cuando el medio no conteniacutea FA ____ 76
342 Produccioacuten de compuestos producidos por P cubensis cuando el medio conteniacutea FA ______ 79
35 ESTUDIO PORCENTUAL (AacuteREA) DEL ALCALOIDE REALIZADO PARA LOS DIFERENTES ENSAYOS ___ 81
351 Porcentaje de la Psilocibina (suposicioacuten) cuando el medio no conteniacutea FA _______________ 81
352 Porcentaje de aacuterea de compuestos presentes en P cubensis cuando el medio conteniacutea FA _ 83
CONCLUSIONES _________________________________________________________________________ 86
RECOMENDACIONES _____________________________________________________________________ 89
ANEXOS _______________________________________________________________________________ 90
BIBLIOGRAFIacuteA _________________________________________________________________________ 121
ix
LISTA DE TABLAS
TABLA 1 COMPOSICIOacuteN DEL MEDIO DE CULTIVO SUMERGIDO PARA EVALUAR EL CRECIMIENTO MICELIAL
DEL P CUBENSIS 35
TABLA 2 PARAacuteMETROS CINEacuteTICOS OBTENIDOS MEDIANTE EL MODELO LOGIacuteSTICO PARA LAS DIFERENTES
FERMENTACIONES DE P CUBENSIS UTILIZANDO GLUCOSA COMO FUENTE DE CARBONO 48
TABLA 3 PARAacuteMETROS CINEacuteTICOS OBTENIDOS MEDIANTE EL MODELO LOGIacuteSTICO PARA LAS DIFERENTES
FERMENTACIONES DE P CUBENSIS UTILIZANDO SACAROSA COMO FUENTE DE CARBONO 53
TABLA 4 PARAacuteMETROS CINEacuteTICOS OBTENIDOS MEDIANTE EL MODELO LOGIacuteSTICO PARA LAS DIFERENTES
FERMENTACIONES DE P CUBENSIS UTILIZANDO 50 GL DE GLUCOSA COMO FUENTE DE CARBONO Y
DIFERENTES CONCENTRACIONES DE FA 60
TABLA 5 PORCENTAJE DE AacuteREA HALLADO MEDIANTE HPLC PARA LOS UacuteLTIMOS TRES DIacuteAS DE LA
FERMENTACIOacuteN CON CONCENTRACIONES DE 30 GL 50 GL Y 70 GL DE GLUCOSA Y SACAROSA CON
UN TIEMPO DE RETENCIOacuteN DE 62 Y 72 MINUTOS 81
TABLA 6 PORCENTAJE HALLADO MEDIANTE HPLC PARA LOS UacuteLTIMOS TRES DIacuteAS DE LA FERMENTACIOacuteN
CON CONCENTRACIONES DE 05 GL 10 GL Y 15 GL DE FA Y 50 GL DE GLUCOSA CON UN TIEMPO
DE RETENCIOacuteN ENTRE 62 Y 72 MINUTOS 83
TABLA 7 ANAacuteLISIS DE VARIANZA PARA EL CRECIMIENTO MICELIAL (GLUCOSA) 90
TABLA 8 ANAacuteLISIS MUacuteLTIPLE DE RANGOS PARA EL CRECIMIENTO MICELIAL (GLUCOSA) 90
TABLA 9 ANAacuteLISIS DE VARIANZA PARA EL CRECIMIENTO MICELIAL (SACAROSA) 91
TABLA 10 ANAacuteLISIS MUacuteLTIPLE DE RANGOS PARA EL CRECIMIENTO MICELIAL (SACAROSA) 91
TABLA 11 ANAacuteLISIS DE VARIANZA PARA EL CRECIMIENTO MICELIAL (GLUCOSA Y SACAROSA) 92
TABLA 12 ANAacuteLISIS MUacuteLTIPLE DE RANGOS PARA EL CRECIMIENTO MICELIAL (GLUCOSA Y SACAROSA) 92
TABLA 13 ANAacuteLISIS DE VARIANZA PARA EL CRECIMIENTO MICELIAL (GLUCOSA 50 GL Y FA) 93
TABLA 14 ANAacuteLISIS MUacuteLTIPLE DE RANGOS PARA EL CRECIMIENTO MICELIAL (GLUCOSA 50 GL Y FA) 93
TABLA 15 ANAacuteLISIS DE VARIANZA PARA EL CONSUMO DE SUSTRATO SIN FA 94
TABLA 16 ANAacuteLISIS MUacuteLTIPLE DE RANGOS PARA EL CONSUMO DE SUSTRATO SIN FA 94
TABLA 17 ANAacuteLISIS DE VARIANZA PARA EL CONSUMO DE SUSTRATO CON FA 95
TABLA 18 ANAacuteLISIS MUacuteLTIPLE DE RANGOS PARA EL CONSUMO DE SUSTRATO CON FA 95
TABLA 19 ANAacuteLISIS DE VARIANZA PARA EL CONSUMO DE PROTEIacuteNA SIN FA 96
TABLA 20 ANAacuteLISIS MUacuteLTIPLE DE RANGOS PARA EL CONSUMO DE PROTEIacuteNA SIN FA 96
TABLA 21ANAacuteLISIS DE VARIANZA PARA EL CONSUMO DE PROTEIacuteNA CON FA 97
TABLA 22 ANAacuteLISIS MUacuteLTIPLE DE RANGOS PARA EL CONSUMO DE PROTEIacuteNA CON FA 97
TABLA 23 ANAacuteLISIS DE VARIANZA PARA LA PRODUCCIOacuteN DE PSILOCIBINA SIN FA 98
TABLA 24 ANAacuteLISIS MUacuteLTIPLE DE RANGOS PARA LA PRODUCCIOacuteN DE PSILOCIBINA SEGUacuteN EL SUSTRATO
SIN FA 98
TABLA 25 ANAacuteLISIS DE VARIANZA PARA LA PRODUCCIOacuteN DE PSILOCIBINA CON FA 99
TABLA 26 ANAacuteLISIS MUacuteLTIPLE DE RANGOS PARA LA PRODUCCIOacuteN DE PSILOCIBINA SEGUacuteN EL DIacuteA CON FA
99
TABLA 27 ANAacuteLISIS DE VARIANZA PARA LA CUANTIFICACIOacuteN DE PSILOCIBINA SIN FA 100
TABLA 28 ANAacuteLISIS MUacuteLTIPLE DE RANGOS PARA LA CUANTIFICACIOacuteN DE PSILOCIBINA SEGUacuteN EL TIPO DE
SUSTRATO SIN FA 100
TABLA 29 ANAacuteLISIS DE VARIANZA PARA LA CUANTIFICACIOacuteN DE PSILOCIBINA CON FA 101
x
TABLA 30 ANAacuteLISIS MUacuteLTIPLE DE RANGOS PARA LA CUANTIFICACIOacuteN DE PSILOCIBINA SEGUacuteN LA
CONCENTRACIOacuteN CON FA 101
TABLA 31 AacuteREAS OBTENIDAS DE LOS CROMATOGRAMAS PARA EL P CUBENSIS EN MEDIO FANG-ZHONG
EN EL DIacuteA 12 PARA CONCENTRACIONES DE 30GL GLUCOSA Y 30GL SACAROSA 109
TABLA 32 AacuteREAS OBTENIDAS DE LOS CROMATOGRAMAS PARA EL P CUBENSIS EN MEDIO FANG-ZHONG
EN EL DIacuteA 12 PARA CONCENTRACIONES DE 50GL GLUCOSA Y 50GL SACAROSA 110
TABLA 33 AacuteREAS OBTENIDAS DE LOS CROMATOGRAMAS PARA EL P CUBENSIS EN MEDIO FANG-ZHONG
EN EL DIacuteA 12 PARA CONCENTRACIONES DE 50GL GLUCOSA Y 50GL SACAROSA 111
TABLA 34 AacuteREAS OBTENIDAS DE LOS CROMATOGRAMAS PARA EL P CUBENSIS EN MEDIO FANG-ZHONG
EN EL DIacuteA 12 PARA CONCENTRACIONES DE 50GL Y GLUCOSA 50GL SACAROSA 112
TABLA 35 AacuteREAS OBTENIDAS DE LOS CROMATOGRAMAS PARA EL P CUBENSIS EN MEDIO FANG-ZHONG
EN EL DIacuteA 13 PARA CONCENTRACIONES DE 30GL GLUCOSA Y 30GL SACAROSA 113
TABLA 36 AacuteREAS OBTENIDAS DE LOS CROMATOGRAMAS PARA EL P CUBENSIS EN MEDIO FANG-ZHONG
EN EL DIacuteA 13 PARA CONCENTRACIONES DE 50GL GLUCOSA Y 50GL SACAROSA 114
TABLA 37 AacuteREAS OBTENIDAS DE LOS CROMATOGRAMAS PARA EL P CUBENSIS EN MEDIO FANG-ZHONG
EN EL DIacuteA 13 PARA CONCENTRACIONES DE 70GL GLUCOSA Y 70GL SACAROSA 115
TABLA 38 AacuteREAS OBTENIDAS DE LOS CROMATOGRAMAS PARA EL P CUBENSIS EN MEDIO FANG-ZHONG
EN EL DIacuteA 13 PARA CONCENTRACIONES DE 50GL Y GLUCOSA 50GL SACAROSA 116
TABLA 39 AacuteREAS OBTENIDAS DE LOS CROMATOGRAMAS PARA EL P CUBENSIS EN MEDIO FANG-ZHONG
EN EL DIacuteA 14 PARA CONCENTRACIONES DE 30GL GLUCOSA Y 30 GL SACAROSA 117
TABLA 40 AacuteREAS OBTENIDAS DE LOS CROMATOGRAMAS PARA EL P CUBENSIS EN MEDIO FANG-ZHONG
EN EL DIacuteA 14 PARA CONCENTRACIONES DE 50GL GLUCOSA Y 50GL SACAROSA 118
TABLA 41 AacuteREAS OBTENIDAS DE LOS CROMATOGRAMAS PARA EL P CUBENSIS EN MEDIO FANG-ZHONG
EN EL DIacuteA 14 PARA CONCENTRACIONES DE 70GL GLUCOSA Y 70GL SACAROSA 119
TABLA 42 AacuteREAS OBTENIDAS DE LOS CROMATOGRAMAS PARA EL P CUBENSIS EN MEDIO FANG-ZHONG
EN EL DIacuteA 13 PARA CONCENTRACIONES DE 50GL GLUCOSA Y 50GL SACAROSA 120
xi
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1 HONGO AGARICALES (LAMINAR) (KUO 2007) 23
FIGURA 2 ALCALOIDES DERIVADOS DEL TRIPTOFANO (MERCANO Y HASEGAWA 1991) 29
FIGURA 3 TRIPTAMINAS SIMPLES (SEIGLER 1981) 31
FIGURA 4 PSILOCIBINA Y PSILOCINA (MANDRILE ET AL 1984) 32
FIGURA 5 PSILOCYBE CUBENSIS (EAH01) CULTIVADA EN MEDIO SOacuteLIDO AGAR MALTA 34
FIGURA 6 CROMATOGRAMAS DE DOS DIFERENTES FERMENTACIONES DE P CUBENSIS QUE ILUSTRAN EL
CRITERIO DE ESCOGENCIA DEL MEJOR ENSAYO REALIZADO (A) 50 GL GLUCOSA (B) 50 GL
SACAROSA 78
FIGURA 7 CROMATOGRAMAS DE DOS DIFERENTES FERMENTACIONES DE P CUBENSIS QUE ILUSTRAN EL
CRITERIO DE ESCOGENCIA DEL MEJOR ENSAYO REALIZADO (A) 05 GL FA (B) 15 GL FA 80
FIGURA 8 MUESTRA DE BIOMASA UNA VEZ ANALIZADA MEDIANTE EL REACTIVO DE DRAGENDORFF 107
FIGURA 9 PERFIL CROMATOGRAacuteFICO (TSUJIKAWA ET AL 2003) 108
xii
LISTA DE GRAacuteFICOS
GRAacuteFICO 1 CINEacuteTICA DE CRECIMIENTO MICELIAL DE P CUBENSIS EN MEDIO SUMERGIDO (FANG-ZHONG)
UTILIZANDO TRES DIFERENTES CONCENTRACIONES DE GLUCOSA COMO FUENTE DE CARBONO (PESO
SECO) 46
GRAacuteFICO 2 CRECIMIENTO MICELIAL DE P CUBENSIS EN CULTIVO SUMERGIDO BAJO TRES
CONCENTRACIONES DE GLUCOSA 47
GRAacuteFICO 3 VALORES DE CONCENTRACIOacuteN DE BIOMASA EXPERIMENTAL Y TEOacuteRICO GRAFICADOS CON
RESPECTO AL TIEMPO PARA LAS FERMENTACIONES CON DIFERENTES CONCENTRACIONES DE
GLUCOSA 49
GRAacuteFICO 4 CINEacuteTICA DE CRECIMIENTO MICELIAL DE P CUBENSIS EN MEDIO SUMERGIDO (FANG-ZHONG)
UTILIZANDO DIFERENTES CONCENTRACIONES DE SACAROSA COMO FUENTE DE CARBONO (PESO
SECO) 50
GRAacuteFICO 5 CRECIMIENTO MICELIAL PARA TRES DIFERENTES CONCENTRACIONES DE SACAROSA 52
GRAacuteFICO 6 VALORES DE CONCENTRACIOacuteN DE BIOMASA EXPERIMENTAL Y TEOacuteRICO GRAFICADOS CON
RESPECTO AL TIEMPO PARA LAS FERMENTACIONES CON DIFERENTES CONCENTRACIONES DE
SACAROSA 54
GRAacuteFICO 7 CRECIMIENTO MICELIAL PARA DOS DIFERENTES FUENTES DE CARBONO (GLUCOSA Y
SACAROSA) 56
GRAacuteFICO 8 CINEacuteTICA DE CRECIMIENTO MICELIAL DE P CUBENSIS EN MEDIO SUMERGIDO (FANG-ZHONG)
UTILIZANDO DIFERENTES CONCENTRACIONES DE FA Y 50 GL DE GLUCOSA COMO FUENTE DE
CARBONO (PESO SECO) 57
GRAacuteFICO 9 CRECIMIENTO MICELIAL PARA GLUCOSA A UNA CONCENTRACIOacuteN DE 50 GL Y TRES
DIFERENTES CONCENTRACIONES DE FA 59
GRAacuteFICO 10 VALORES DE CONCENTRACIOacuteN DE BIOMASA EXPERIMENTAL Y TEOacuteRICO GRAFICADOS CON
RESPECTO AL TIEMPO PARA LAS FERMENTACIONES CON DIFERENTES CONCENTRACIONES DE FA Y
50 GL DE GLUCOSA 61
GRAacuteFICO 11 CINEacuteTICA DE CONSUMO DE SUSTRATO POR PARTE DEL P CUBENSIS EN MEDIO SUMERGIDO
UTILIZANDO DIFERENTES CONCENTRACIONES DE GLUCOSA COMO FUENTE DE CARBONO 62
GRAacuteFICO 12 CINEacuteTICA DE CONSUMO DE SUSTRATO POR PARTE DEL P CUBENSIS EN MEDIO SUMERGIDO
UTILIZANDO DIFERENTES CONCENTRACIONES DE SACAROSA COMO FUENTE DE CARBONO 64
GRAacuteFICO 13 CONSUMO DE SUSTRATO PARA CADA UNA DE LAS FUENTES DE CARBONO UTILIZADAS 66
GRAacuteFICO 14 CINEacuteTICA DE CONSUMO DE SUSTRATO POR PARTE DEL P CUBENSIS EN MEDIO SUMERGIDO
UTILIZANDO 50 GL DE GLUCOSA COMO FUENTE DE CARBONO Y DIFERENTES CONCENTRACIONES DE
FA 67
GRAacuteFICO 15 CONSUMO DE SUSTRATO PARA CADA UNA DE LAS CONCENTRACIONES DE FA UTILIZADAS 68
GRAacuteFICO 16 CINEacuteTICA DE CONSUMO DE PROTEIacuteNA POR PARTE DEL P CUBENSIS EN MEDIO SUMERGIDO
UTILIZANDO DIFERENTES CONCENTRACIONES DE GLUCOSA COMO FUENTE DE CARBONO 70
GRAacuteFICO 17 CINEacuteTICA DE CONSUMO DE PROTEIacuteNA POR PARTE DEL P CUBENSIS EN MEDIO SUMERGIDO
UTILIZANDO DIFERENTES CONCENTRACIONES DE SACAROSA COMO FUENTE DE CARBONO 71
GRAacuteFICO 18 CONSUMO DE PROTEIacuteNA PARA CADA UNA DE LAS FUENTES DE CARBONO UTILIZADAS 73
xiii
GRAacuteFICO 19 CINEacuteTICA DE CONSUMO DE PROTEIacuteNA POR PARTE DEL P CUBENSIS EN MEDIO SUMERGIDO
UTILIZANDO 50 GL DE GLUCOSA COMO FUENTE DE CARBONO Y DIFERENTES CONCENTRACIONES DE
FA 74
GRAacuteFICO 20 CONSUMO DE PROTEIacuteNA PARA LOS ENSAYOS CON Y SIN FA 75
GRAacuteFICO 21 AacuteREA DEL COMPUESTO OBTENIDO DE P CUBENSIS EN TIEMPO DE RETENCIOacuteN ENTRE 62 Y
72 MINUTOS PARA LAS DOS FUENTES DE CARBONO 77
GRAacuteFICO 22 AacuteREA DEL COMPUESTO OBTENIDO DE P CUBENSIS EN TIEMPO DE RETENCIOacuteN ENTRE 62 Y
72 MINUTOS EN LOS UacuteLTIMOS TRES DIacuteAS DE LA FERMENTACIOacuteN CON FA Y GLUCOSA 79
GRAacuteFICO 23 AacuteREA DEL COMPUESTO OBTENIDO DE P CUBENSIS EN TIEMPO DE RETENCIOacuteN ENTRE 62 Y
72 MINUTOS PARA CADA UNA DE LAS FUENTES DE CARBONO UTILIZADAS 82
GRAacuteFICO 24 AacuteREA DEL COMPUESTO OBTENIDO DE P CUBENSIS EN TIEMPO DE RETENCIOacuteN ENTRE 62 Y
72 MINUTOS PARA CADA UNA DE LAS CONCENTRACIONES DE FA UTILIZADAS 85
GRAacuteFICO 25 CROMATOGRAMAS DEL DIacuteA 12 PARA EL P CUBENSIS CULTIVADO EN MEDIO SUMERGIDO
FANG-ZHONG CON DOS DIFERENTES TIPOS DE SUSTRATOS (A) 30 GL GLUCOSA (B) 30 GL SACAROSA
109
GRAacuteFICO 26 CROMATOGRAMAS DEL DIacuteA 12 PARA EL P CUBENSIS CULTIVADO EN MEDIO SUMERGIDO
FANG-ZHONG CON DOS DIFERENTES TIPOS DE SUSTRATOS (A) 50 GL GLUCOSA (B) 50 GL SACAROSA
110
GRAacuteFICO 27 CROMATOGRAMAS DEL DIacuteA 12 PARA EL P CUBENSIS CULTIVADO EN MEDIO SUMERGIDO
FANG-ZHONG CON DOS DIFERENTES TIPOS DE SUSTRATOS (A) 50 GL GLUCOSA (B) 50 GL SACAROSA
111
GRAacuteFICO 28 CROMATOGRAMA DEL DIacuteA 12 PARA EL P CUBENSIS CULTIVADO EN MEDIO SUMERGIDO
FANG-ZHONG CON FUENTE DE CARBONO GLUCOSA Y ADICIOacuteN DE FENILALANINA EN TRES
CONCENTRACIONES (A) 05 GL FA (B) 1 GL FA (C) 15GL FA 112
GRAacuteFICO 29 CROMATOGRAMAS DEL DIacuteA 13 PARA EL P CUBENSIS CULTIVADO EN MEDIO SUMERGIDO
FANG-ZHONG CON DOS DIFERENTES TIPOS DE SUSTRATOS (A) 30 GL GLUCOSA (B) 30 GL SACAROSA
113
GRAacuteFICO 30 CROMATOGRAMAS DEL DIacuteA 13 PARA EL P CUBENSIS CULTIVADO EN MEDIO SUMERGIDO
FANG-ZHONG CON DOS DIFERENTES TIPOS DE SUSTRATOS (A) 50 GL GLUCOSA (B) 50 GL SACAROSA
114
GRAacuteFICO 31 CROMATOGRAMAS DEL DIacuteA 13 PARA EL P CUBENSIS CULTIVADO EN MEDIO SUMERGIDO
FANG-ZHONG CON DOS DIFERENTES TIPOS DE SUSTRATOS (A) 70 GL GLUCOSA (B) 70 GL SACAROSA
115
GRAacuteFICO 32 CROMATOGRAMAS DEL DIacuteA 12 PARA EL P CUBENSIS CULTIVADO EN MEDIO SUMERGIDO
FANG-ZHONG CON FUENTE DE CARBONO GLUCOSA Y ADICIOacuteN DE FENILALANINA EN TRES
CONCENTRACIONES (A) 05 GL FA (B) 1 GL FA (C) 15GL FA 116
GRAacuteFICO 33 CROMATOGRAMAS DEL DIacuteA 14 PARA EL P CUBENSIS CULTIVADO EN MEDIO SUMERGIDO
FANG-ZHONG CON DOS DIFERENTES TIPOS DE SUSTRATOS (A) 30 GL GLUCOSA (B) 30 GL SACAROSA
117
GRAacuteFICO 34 CROMATOGRAMAS DEL DIacuteA 14 PARA EL P CUBENSIS CULTIVADO EN MEDIO SUMERGIDO
FANG-ZHONG CON DOS DIFERENTES TIPOS DE SUSTRATOS (A) 50 GL GLUCOSA (B) 50 GL SACAROSA
118
xiv
GRAacuteFICO 35 CROMATOGRAMAS DEL DIacuteA 14 PARA EL P CUBENSIS CULTIVADO EN MEDIO SUMERGIDO
FANG-ZHONG CON DOS DIFERENTES TIPOS DE SUSTRATOS (A) 70 GL GLUCOSA (B) 70 GL SACAROSA
119
GRAacuteFICO 36 CROMATOGRAMAS DEL DIacuteA 12 PARA EL P CUBENSIS CULTIVADO EN MEDIO SUMERGIDO
FANG-ZHONG CON FUENTE DE CARBONO GLUCOSA Y ADICIOacuteN DE FENILALANINA EN TRES
CONCENTRACIONES (A) 05 GL FA (B) 1 GL FA (C) 15GL FA (A) 05 GL FA (B) 1 GL FA (C)
15GL FA 120
xv
LISTA DE ECUACIONES
ECUACIOacuteN 1 ECUACIOacuteN LINEALIZADA DEL MODELO LOGIacuteSTICO 38
ECUACIOacuteN 2 VALORES TEOacuteRICOS DE BIOMASA EN EL TIEMPO 39
xvi
LISTAS DE ANEXOS
ANEXO 1 ANAacuteLISIS DE VARIANZA (ANOVA) PARA EL CRECIMIENTO DE BIOMASA DE LAS
FERMENTACIONES CON GLUCOSA _____________________________________________________ 90
ANEXO 2 ANAacuteLISIS DE VARIANZA (ANOVA) PARA EL CRECIMIENTO DE BIOMASA DE LAS
FERMENTACIONES CON SACAROSA ____________________________________________________ 91
ANEXO 3 ANAacuteLISIS DE VARIANZA (ANOVA) PARA EL CRECIMIENTO DE BIOMASA DE LAS
FERMENTACIONES CON GLUCOSA Y SACAROSA __________________________________________ 92
ANEXO 4 ANAacuteLISIS DE VARIANZA (ANOVA) PARA EL CRECIMIENTO DE BIOMASA DE LAS
FERMENTACIONES CON GLUCOSA 50 GL Y FA ___________________________________________ 93
ANEXO 5 ANAacuteLISIS DE VARIANZA (ANOVA) PARA EL CONSUMO DE SUSTRATO EN LAS FERMENTACIONES
SIN FA ____________________________________________________________________________ 94
ANEXO 6 ANAacuteLISIS DE VARIANZA (ANOVA) PARA EL CONSUMO DE SUSTRATO EN LAS FERMENTACIONES
CON FA ___________________________________________________________________________ 95
ANEXO 7 ANAacuteLISIS DE VARIANZA (ANOVA) PARA EL CONSUMO DE PROTEIacuteNA EN LAS FERMENTACIONES
SIN FA ____________________________________________________________________________ 96
ANEXO 8 ANAacuteLISIS DE VARIANZA (ANOVA) PARA EL CONSUMO DE PROTEIacuteNA EN LAS FERMENTACIONES
CON FA ___________________________________________________________________________ 97
ANEXO 9 ANAacuteLISIS DE VARIANZA (ANOVA) PARA LA PRODUCCIOacuteN DE PSILOCIBINA EN LAS
FERMENTACIONES SIN FA ____________________________________________________________ 98
ANEXO 10 ANAacuteLISIS DE VARIANZA (ANOVA) PARA LA PRODUCCIOacuteN DE PSILOCIBINA EN LAS
FERMENTACIONES CON FA ___________________________________________________________ 99
ANEXO 11 ANAacuteLISIS DE VARIANZA (ANOVA) PARA LA CUANTIFICACIOacuteN PORCENTUAL DE PSILOCIBINA EN
LAS FERMENTACIONES SIN FA _______________________________________________________ 100
ANEXO 12 ANAacuteLISIS DE VARIANZA (ANOVA) PARA LA CUANTIFICACIOacuteN PORCENTUAL DE PSILOCIBINA EN
LAS FERMENTACIONES CON FA ______________________________________________________ 101
ANEXO 13 DETERMINACIOacuteN DE CONSUMO DE AZUacuteCARES POR EL MEacuteTODO DE DNS (AacuteCIDO
DINITROSALICIacuteLICO) ________________________________________________________________ 102
ANEXO 14 CINEacuteTICA DE CONSUMO DE SUSTRATO ___________________________________________ 104
ANEXO 15 DETERMINACIOacuteN DE CONSUMO DE PROTEIacuteNAS POR EL MEacuteTODO DE LOWRY ____________ 105
ANEXO 16 CINEacuteTICA CONSUMO DE PROTEIacuteNA ______________________________________________ 106
ANEXO 17 PRUEBA DE REACTIVO DE DRAGENDORFF _________________________________________ 107
ANEXO 18 BARRIDO ESPECTRAL PARA EL PSILOCYBE CUBENSIS _________________________________ 108
ANEXO 19 CROMATOGRAMAS (HPLC) DEL DIacuteA 12 DE FERMENTACIOacuteN ___________________________ 109
ANEXO 20 CROMATOGRAMAS (HPLC) DEL DIacuteA 13 DE FERMENTACIOacuteN __________________________ 113
ANEXO 21 CROMATOGRAMAS (HPLC) DEL DIacuteA 14 DE FERMENTACIOacuteN __________________________ 117
xvii
RESUMEN
El Psilocybe cubensis es un hongo de gran importancia a nivel industrial gracias a
la presencia de una sustancia llamada Psilocibina en su cuerpo fructiacutefero
Dicho alcaloide derivado de la triptamina es muy similar al neurotransmisor
serotonina el cual es responsable de la percepcioacuten sensorial la regulacioacuten de la
temperatura el inicio del reposo nocturno del hiacutegado y los rintildeones Por tal motivo
este estudio se enfocoacute en la produccioacuten de la Psilocibina mediante el cultivo del P
cubensis en medio sumergido (Fang-Zhong)
Se evaluaron los efectos de dos fuentes de carbono (glucosa y sacarosa) a tres
concentraciones diferentes en cultivo sumergido para Psilocybe cubensis con el
fin de determinar la incidencia de eacutestas en la produccioacuten de biomasa y en la
produccioacuten y presencia de Psilocibina alcaloide de intereacutes Para las
concentraciones de glucosa de 30 gL 50 gL y 70 gL se presentoacute un crecimiento
maacuteximo de biomasa de 048 gL 055 gL y 062 gL y un porcentaje de alcaloide
de 6065 wv 7396 wv y 6733 wv respectivamente Esto uacuteltimo si se
asume que el tiempo de retencioacuten oscila entre 62 y 72 minutos contaacutendose con
una fase moacutevil de HCOONH4 en una columna C18 Mientras que para las mismas
concentraciones de sacarosa se presentoacute un crecimiento maacuteximo de biomasa de
026 gL 045 gL y 057 gL con porcentajes del compuesto presente entre el
rango de 62 y 72 minutos de 3664 wv 5857 wv y 5583 wv
respectivamente
Una vez realizada la investigacioacuten se encontroacute que las diferencias existentes en
cuanto a la cantidad de biomasa generada con respecto al tipo de sustrato
utilizado no fueron significativas es decir era irrelevante si se utilizaba glucosa o
sacarosa como principal fuente de carbono para la fermentacioacuten del P cubensis
xviii
en medio sumergido con el fin de obtener biomasa sin embargo se hallaron
diferencias significativas con respecto a las diferentes concentraciones empleadas
de dichas fuentes de carbono
Al analizar las muestras mediante cromatografiacutea liacutequida de alta eficiencia (HPLC)
se determinoacute que el medio que conteniacutea 50 gL de glucosa era el deseado debido
a que fue en eacuteste donde se presentaron picos maacutes definidos mostrando una mejor
resolucioacuten del compuesto Adicionalmente presentoacute un buen crecimiento micelial
Una vez elegido dicho criterio se evaluoacute el efecto que teniacutea la adicioacuten de un
aminoaacutecido llamado Fenilalanina (FA) al medio que conteniacutea 50 gL de glucosa
con el fin de determinar si eacuteste teniacutea alguna incidencia positiva en la produccioacuten de
biomasa y en la generacioacuten del alcaloide de intereacutes cabe resaltar que se utilizaron
diferentes concentraciones de FA correspondientes a 05 gL 10 gL y 15 gL
Finalizados dichos ensayos se obtuvieron valores de crecimiento de biomasa
maacutexima de 106 gL 108 gL y 101 gL y un porcentaje de aacuterea de 7549 wv
6236 wv y 2721 wv respectivamente
Es necesario hacer hincapieacute en que las diferencias obtenidas mediante el anaacutelisis
estadiacutestico entre cada una de las concentraciones de FA con respecto a la
generacioacuten de biomasa y la produccioacuten del compuesto no fueron significativas lo
que llevoacute a elegir una concentracioacuten de 05 gL de FA debido a que fue la menor
cantidad utilizada de este compuesto durante la investigacioacuten suponieacutendose asiacute
una disminucioacuten en los costos de materia prima
Palabras claves
Psilocybe cubensis Psilocibina Alcaloide HPLC Cultivo Sumergido Fuentes de
Carbono Fenilalanina
19
INTRODUCCIOacuteN
Los hongos son una rica fuente de productos naturales con una alta actividad
bioloacutegica Desafortunadamente el cultivo de eacutestos en cuerpo fructiacutefero toma
varios meses disminuyendo su calidad debido a los cambios climaacuteticos y plagas
por tal razoacuten se implementoacute la metodologiacutea de medio sumergido la cual es
prometedora gracias a una alta productividad de compuestos bioactivos (Arora
1986)
El Geacutenero Psilocybe pertenece al Reino Fungiacute con un Phylum Basidiomicota
una Clase Homobasidiomicetes un Orden Agaricales una Familia Strofariaceae
(Paris y Hurabielle 1981)
Dicho geacutenero es considerado de gran importancia a nivel mundial debido a que su
cuerpo fructiacutefero y biomasa micelial contienen Psilocibina la cual posee un alto
valor para la industria farmaceacuteutica por su uso en la elaboracioacuten de productos
antidepresivos Este alcaloide derivado de FA cuenta con una estructura muy
similar al neurotransmisor segregado por el cerebro llamado serotonina que
controla el estado de aacutenimo el suentildeo el hiacutegado y los rintildeones (Mandrile et al
1984) esta caracteriacutestica le otorga la gran importancia a la Psilocibina en el
mercado puesto que tiene un alto impacto en la sociedad como ayudante
antidepresivo debido a que no todas las personas segregan la cantidad necesaria
(10 mg con liacutemites que variacutean desde 5 a 20 mg) de serotonina (Mandrile et al
1984) Adicionalmente se estaacute empleando como una gran ayuda para la
disminucioacuten de la adiccioacuten a sustancias como heroiacutena y cocaiacutena gracias a que
este alcaloide no genera dependencia (Lee et al 2004)
Debido a que su consumo puede generar alucinaciones era consumido por las
culturas aboriacutegenes centroamericanas con el fin de realizar manifestaciones
20
religiosas Su uso se remonta a maacutes de 3500 antildeos y era nombrado por los
aztecas como ―Teonunaltl que significa ―carne de dioses (Mandrile et al 1984)
La alternativa que se utilizoacute durante esta investigacioacuten fue el cultivo del P
cubensis mediante medio sumergido debido principalmente a las notables
ventajas frente a los sistemas convencionales que eacuteste posee entre las cuales se
destacan la disminucioacuten del tiempo para la obtencioacuten de la biomasa (14 diacuteas) y la
reduccioacuten de los costos de obtencioacuten (Lee et al 2004) De acuerdo a lo
dimensionado anteriormente este estudio estaba orientado primordialmente a la
buacutesqueda de alternativas que permitieran la produccioacuten de biomasa de forma
raacutepida y confiable
Con el fin de llevar a cabo lo dicho anteriormente se pretendioacute evaluar el efecto
del uso de dos diferentes fuentes de carbono en este caso glucosa y sacarosa en
el crecimiento micelial de la cepa P cubensis
21
OBJETIVOS
GENERAL
Evaluar el efecto de la fuente de carbono en el crecimiento micelial de una
cepa Psilocybe sp
ESPECIacuteFICOS
Evaluar la cineacutetica de crecimiento de la cepa Psilocybe cubensis en los
diferentes medios de cultivo sumergido mediante la cuantificacioacuten de
biomasa por medio de la metodologiacutea de peso seco
Evaluar el consumo de sustrato para los diferentes ensayos por medio de
teacutecnicas espectrofotomeacutetricas
Determinar la presencia de Psilocibina mediante el uso del reactivo de
Dragendorff
22
1 MARCO TEOacuteRICO
11 CONCEPTOS GENERALES DE HONGOS
Los hongos son organismos eucariotas que no contienen clorofila con nutricioacuten
por absorcioacuten generalmente con reproduccioacuten sexual y asexual el cuerpo
consiste generalmente de filamentos ramificados con pared celular quitinosa
(Miles y Chang 1999)
Constituyen uno de los grupos de organismos maacutes importantes para la vida del
hombre ya que son los responsables de gran parte de la descomposicioacuten de la
materia orgaacutenica aumentando su disponibilidad en el suelo pueden ser
comestibles venenosos o psicotroacutepicos muchos son patoacutegenos otros producen
ciertas sustancias beneficiosas o intervienen en procesos de elaboracioacuten de
algunos comestibles (Miles y Chang 1999)
111 Hongos laminares (Agaricales)
El orden Agaricales tambieacuten conocido como Euagaricales es el mayor orden de
setas y hongos que incluye maacutes de la mitad de todas las especies conocidas de la
clase Homobasidiomycetes (Hibbett et al 1997 Hibbett y Thorn 2001) Maacutes de
9000 especies y alrededor de 350 geacuteneros se han atribuido a este orden que
contiene 26 familias (Kirk et al 2001) Un consenso de mayor nivel de
clasificacioacuten de los Agaricales ha sido difiacutecil de lograr debido a la competencia de
sistemas que restringen geacuteneros y familias (o incluso orden) de diferentes
maneras (Bas 1998 Juumllich 1981 Kirk et al 2001 Kuumlhner 1980 Singer 1986)
23
La base para la clasificacioacuten de los hongos fue construida por Fries (1874) quien
hizo hincapieacute en las caracteriacutesticas macroscoacutepicas como la textura del tallo la
separacioacuten de los filamentos (laminas) presencia o ausencia de velo y color de las
esporas
Posteriormente dividioacute los hongos Agaricales en varias especies de acuerdo al
color de las esporas depositadas las cuales pueden ser de color blanco rosado
marroacuten puacuterpura ndash marroacuten y negro El sistema macroscoacutepico de Fries que
reconocioacute inicialmente 12 geacuteneros de hongos carnosos que forman los hongos es
taxonoacutemicamente praacutectico Eacuteste fue relativamente invariable hasta que Fayod
(1989) estudioacute la anatomiacutea y las caracteriacutesticas microscoacutepicas de muchos
Agaricales reconociendo 108 geacuteneros (Arora 1986)
Al igual que todas las setas los hongos laminares son faacutebricas de esporas
creados con el uacutenico propoacutesito de fabricar esporas microscoacutepicas para dejarse
llevar por las corrientes de aire y con suerte caer en un lugar adecuado en la
tierra para germinar y comenzar un nuevo organismo Las probabilidades de que
cualquier individuo que tiene esporas de este tipo tenga suerte son tan bajas que
el hongo produce millones de esporas para compensar esto En las laacuteminas se
encuentran numerosas esporas las cuales aumentan considerablemente el
nuacutemero de esporas que el hongo puede producir Ambos lados de cada laacutemina
estaacute cubierta con esporas microscoacutepicas (Kuo 2007) A continuacioacuten se muestra
de manera ilustrativa en la figura 1 las laacuteminas que poseen los hongos Agaricales
en las cuales se da la formacioacuten de las esporas
Figura 1 Hongo Agaricales (Laminar) (Kuo 2007)
24
12 MEDIOS DE CULTIVO
Uno de los sistemas maacutes importantes para la identificacioacuten de microorganismos es
observar su crecimiento en sustancias alimenticias artificiales preparadas en el
laboratorio El material alimenticio en el que crecen los microorganismos es el
medio de cultivo (Garciacutea 1995)
Para que los microorganismos crezcan adecuadamente en un medio de cultivo
artificial eacuteste debe reunir una serie de condiciones como lo son temperatura
grado de humedad y presioacuten asiacute como un grado correcto de acidez o alcalinidad
Un medio de cultivo contiene los nutrientes y factores de crecimiento necesarios
para que el microorganismo se desarrolle correctamente y debe estar exento de
cualquier tipo de microorganismo que pueda generar contaminacioacuten (Garciacutea
1995)
121 Tipos de medios de cultivo
En la actualidad existen diversos tipos de medio de cultivo si se centra en la
composicioacuten eacutestos pueden ser medios sinteacuteticos que contienen fuente de
carbono fuente de nitroacutegeno sales que suplan los iones y demaacutes elementos tales
como estimuladores del crecimiento medios complejos que contienen ingredientes
tales como extracto de levadura peptona infusioacuten de cerebro etc ricos en
nutrientes medios de enriquecimiento siendo estos complejos con aditivos
adicionales para favorecer asiacute al crecimiento y desarrollo de determinados
microorganismos medios selectivos los cuales son disentildeados para favorecer el
crecimiento especiacutefico de un microorganismo determinado o un grupo
microbiano medios diferenciales que proporcionan la distincioacuten microbiana de una
mezcla por sus propiedades diferenciales de crecimiento en dichos medios
medios de mantenimiento siendo disiacutemiles de los de crecimiento oacuteptimo por el
25
crecimiento raacutepido y proliacutefico que deriva en la muerte raacutepida de las ceacutelulas (Garciacutea
1995)
Atendiendo a su estado los medios de cultivo pueden presentarse como medios
sumergidos y medios soacutelidos que contienen agar que gelifica por debajo de 45
degC y cuya concentracioacuten en su uso es de 15 y medios semisoacutelidos que contiene
un agar a una concentracioacuten de 07 (Garciacutea 1995)
121 Medio sumergido
Debido a que cultivar el cuerpo fructiacutefero toma varios meses y se dificulta el control
de calidad del producto final porque se estaacute sujeto a los cambios permanentes del
clima y las plagas se ha empleado la metodologiacutea de medio sumergido la cual es
una alternativa muy prometedora para la produccioacuten eficiente del micelio y de los
metabolitos (Lindequist y Niedermeyer 2005)
Dicha forma es la mejor para producir extraer y purificar metabolitos de un cultivo
de hongo ya que facilita una mayor produccioacuten de biomasa en menor tiempo y
de mayor calidad que el cultivo en medio soacutelido ademaacutes facilita la dispersioacuten y
adaptacioacuten del hongo y reduce los vectores de contaminacioacuten De igual forma un
cultivo de esta iacutendole es la opcioacuten maacutes viable si se quiere escalar procesos
fermentativos en aras de desarrollar mercados como en este caso el de
metabolitos medicinales (Navarro et al 1998)
A su vez el uso de cultivo sumergido puede beneficiar la produccioacuten de muchos
metabolitos secundarios y disminuir los costos de produccioacuten por reducir las
labores que involucran los meacutetodos de etapas soacutelidas (Domiacutenguez y Webb 2003)
Los metabolitos bioactivos de los hongos pueden ser potencialmente producidos a
nivel industrial mediante el uso de la metodologiacutea de cultivo sumergido pero el
26
eacutexito a escala comercial depende del costo comparado con la tecnologiacutea existente
y la ventaja econoacutemica que la industria puede ver usando este meacutetodo El uso de
la tecnologiacutea puede ser facilitada por el aumento en el rendimiento de la
produccioacuten y el desarrollo del sistema (Hwang et al 2004)
El cultivo de hongos sumergidos se caracteriza por un aumento en la viscosidad
del caldo con el tiempo debido a uno o maacutes factores tales como el aumento de la
concentracioacuten de ceacutelulas los cambios de la morfologiacutea del crecimiento o la
produccioacuten de productos extracelulares que alteran el caraacutecter reoloacutegico de la
cultura del liacutequido El aumento en la viscosidad puede ser visto como un fenoacutemeno
indeseable pero inevitable ya que causan dificultades en el suministro de oxiacutegeno
en la eliminacioacuten de dioacutexido de carbono y en posibles problemas de agitacioacuten
(Hwang et al 2004)
13 ALCALOIDES
131 Generalidades
La diversidad estructural y la variedad en la actividad bioloacutegica hacen de los
alcaloides como tambieacuten de los antibioacuteticos los grupos maacutes importantes entre las
sustancias naturales de intereacutes terapeacuteutico (Paris y Hurabielle 1981)
Se han aislado principalmente en plantas superiores y se han encontrado en maacutes
de 100 familias de Faneroacutegamas (aquellas plantas que se reproducen por semillas
producidas en sus inflorescencias) Su actividad bioloacutegica a nivel del sistema
nervioso dio pie a las primeras investigaciones siendo los alcaloides las primeras
sustancias naturales estudiadas (Paris y Hurabielle 1981)
El teacutermino alcaloide propuesto por el farmaceacuteutico W Meissner en 1819 se aplicoacute
a los compuestos de origen vegetal con propiedades alcalinas este caraacutecter
baacutesico es debido a la presencia de nitroacutegeno amiacutenico en su estructura Los
27
alcaloides se pueden considerar como ―Un compuesto orgaacutenico de origen natural
nitrogenado derivados generalmente de aminoaacutecidos maacutes o menos baacutesico de
distribucioacuten restringida con propiedades farmacoloacutegicas importantes a dosis bajas
y que responden a reacciones comunes de precipitacioacuten (Paris y Hurabielle
1981)
132 Propiedades fisicoquiacutemicas
Los alcaloides tienen masas moleculares que variacutean entre 100 y 9000 gmol son
casi siempre incoloros son normalmente soacutelidos a temperatura ambiente a
excepcioacuten de los alcaloides no oxigenados Los alcaloides son poco solubles en
agua gracias a su caraacutecter baacutesico dicho caraacutecter se debe al par de electrones
libres del nitroacutegeno (Paris y Hurabielle 1981)
En la naturaleza se encuentran en forma de sales generalmente En las plantas
se consideraba que eran productos obtenidos durante la extraccioacuten y poco
solubles en disolventes tiacutepicos de extraccioacuten por su polaridad Son solubles en
disolventes orgaacutenicos como cloroformo etanol metanol acetato de etilo eacuteter
benceno En forma de sales son solubles en agua excepto las sales de berberina
(Paris y Hurabielle 1981)
Todos los alcaloides son activos a la luz polarizada Presentan una fluorescencia
caracteriacutestica bajo la luz UV o IR dando lugar a espectros caracteriacutesticos (Paris y
Hurabielle 1981)
133 Reconocimiento de los alcaloides
Las teacutecnicas de reconocimiento son basadas en la capacidad que tienen los
alcaloides en estado de sal (extractos aacutecidos) de combinarse con el yodo y
metales pesados como bismuto mercurio tungsteno formando precipitados se
28
utilizan reactivos generales para detectar alcaloides como reactivo de Wagner
reactivo de Mayer reactivo de Dragendorff reactivo de Hager reactivo de
Bertrand reactivo de Ehrlich y reactivo de Vitali-Morin (Paris y Hurabielle 1981)
134 Clasificacioacuten de los alcaloides
Habitualmente los alcaloides se han clasificado en funcioacuten de su estructura
distinguieacutendose principalmente los compuestos heterociacuteclicos de los no
heterociacuteclicos Actualmente existen varias formas de clasificarlos (Bruneton
1987) entre ellas se pueden distinguir
1341 Alcaloides alifaacuteticos
a Derivados de la ornitina (pirrolidinas tropaacutenicos pirrolizidiacutenicos)
b Derivados de la lisina (piperidinas quinolizidiacutenicos)
1342 Alcaloides de origen diverso
a Alcaloides terpeacutenicos y esteroidales
b Alcaloides diversos (purinas macrociclos etc)
1343 Alcaloides aromaacuteticos
a Derivados del aacutecido nicotiacutenico (piridinas)
b Derivados de la fenilalanina y tirosina (isoquinoleinas)
c Derivados del triptofano (indoacutelicos quinoleinas)
d Derivados de la histidina (imidazoles)
29
Alcaloides derivados del triptofano (Alcaloides Indoacutelicos)
Desde el punto de vista farmacoloacutegico ha habido mucho intereacutes sobre las bases
que contienen el nuacutecleo indoacutelico a raiacutez del descubrimiento de la actividad
alucinoacutegena del LSD asiacute como la actividad sedante de la reserpina aislada del
geacutenero Rauwolfia El auge del estudio fitoquiacutemico ocurrioacute en la deacutecada de los 60 y
se dirigiacutea principalmente a la familia Apocynaceae (Mercano y Hasegawa 1991)
Existen unos 800 alcaloides de este tipo distribuidos principalmente en la familia
Apocynaceae (geacuteneros Rauwolfia Aspidos-perma Strychnos y Vinca) menos
frecuentes en hongos y familias como Leguminoseae Malphigiaceae Rubiaceae y
Rutaceae donde los alcaloides presentan el grupo indoacutelico sencillo (Mercano y
Hasegawa 1991)
El triptofano es el precursor de estos alcaloides los cuales se clasifican en
triptaminas y en no triptaminas las triptaminas a su vez se subdividen en b-
carbolinas y en indoleninas y pueden ser triptaminas simples o triptaminas
complejas y estas pueden ser isopreacutenicas o no isopreacutenicas (Mercano y Hasegawa
1991) La figura 2 muestra la estructura quiacutemica del triptofano triptamina y sus
divisiones
Figura 2 Alcaloides derivados del Triptofano (Mercano y Hasegawa 1991)
30
Triptaminas simples
Las triptaminas simples juegan un importante papel en la cultura indiacutegena de
Ameacuterica por sus efectos alucinoacutegenos y extaacuteticos en sus ceremonias maacutegico
religiosas (Furst 1994) Se han encontrado en hongos alucinoacutegenos de
Mesoameacuterica del geacutenero Psilocybe Stropharia y Conocybe (―teonacatl o ―carne
de los dioses) usados por los indios Aztecas en sus ceremonias religiosas desde
hace maacutes de 1700 antildeos Se han encontrado en estos hongos los alcaloides
alucinoacutegenos la Psilocina y la Psilocibina que al ingerirlos produce diferentes
sensaciones auditivas y visuales relajacioacuten muscular depresiones y euforias
alternadas (Mercano y Hasegawa 1991)
La serotonina que juega un importante papel en la actividad neuronal se
encuentra tambieacuten en vegetales Se ha aislado en el pericarpio del banano el cual
seco cuando es fumado actuacutea como un alucinoacutegeno ligero (Seigler 1981)
De las glaacutendulas paroacutetidas del sapo comuacuten Bufo vulgaris se aiacutesla la bufotenina
derivado N-dimetilado de la serotonina que tambieacuten es el principio activo del Yopoacute
polvo de las semillas de Anadenanthera peregrina (Piptadenia peregrina)
Leguminoseae y especies del geacutenero Virola (Myristicaceae) que contiene tambieacuten
triptaminas son mezclados con cenizas e inhalados por medio de tubos de bambuacute
por los indiacutegenas del Orinoco en ceremonias maacutegico religiosas produciendo
alucinacioacuten e incoordinacioacuten motriz (Seigler 1981)
En la figura 3 se observan las estructuras de aquellos compuestos que estaacuten
clasificados como triptaminas simples
31
Figura 3 Triptaminas simples (Seigler 1981)
13 PSILOCIBINA Y PSILOCINA
La Psilocibina y la Psilocina son bioloacutegicamente sintetizadas en los hongos
pertenecientes a los geacuteneros de Psilocybe (Bigwood y Beug 1982 Wurst et al
1984)
La Psilocibina y la Psilocina se han identificado en todo el mundo en una variedad
de setas que son llamados hongos maacutegicos La ingestioacuten de pequentildeas
cantidades de alucinoacutegenos provoca el eacutextasis La actividad alucinoacutegena de la
Psilocibina es relativamente maacutes baja que la de la Psilocina Sin embargo la
Psilocibina se convierte faacutecilmente en Psilocina (componente activo principal) en
los sistemas bioloacutegicos Asiacute el desarrollo de un meacutetodo de determinacioacuten de la
Psilocibina es importante lo misma que la de la Psilocina (Kimie et al 2005)
La hidroacutelisis de la Psilocibina se consigue saturando con anhiacutedido carboacutenico una
solucioacuten acuosa de Psilocibina (para eliminar el oxiacutegeno del aire y calentaacutendola)
obteniendo asiacute una moleacutecula de 4hidroxi-dimetiltriptamina y una moleacutecula de aacutecido
fosfoacuterico (Mandrile et al 1984)
Como todos los faacutermacos derivados del indol estas sustancias han despertado
intereacutes porque se sospechoacute la posibilidad de que algunas de ellas se formen en el
32
organismo y que en ciertas psicosis especialmente en la esquizofrenia se
produzcan elevados niveles sanguiacuteneos que ocasionan algunos de los siacutentomas
(Mandrile et al 1984)
La figura 4 muestra la estructura quiacutemica de alcaloides como la Psilocibina y
Psilocina
Figura 4 Psilocibina y Psilocina (Mandrile et al 1984)
131 Antecedentes acerca de la obtencioacuten de Psilocibina y Psilocina
Una gran variedad de meacutetodos cromatograacuteficos para la determinacioacuten de
Psilocibina y Psilocina presentes en las incautaciones de hongos se han
publicado La cromatografiacutea de capa fina es utilizada debido a que eacutesta es muy
apropiada para la deteccioacuten de sustancias derivadas del triptofano (Brown et al
1972 Tanimukai 1967 Beug y Bigwood 1981) Aun asiacute meacutetodos que involucran
tanto la cromatografiacutea de alta eficiencia (HPLC) como la deteccioacuten fotomeacutetrica de
UV (Beug y Bigwood 1981 Wurst et al 1984 Borner y Brenneisen 1987 Perkal
et al 1980 Vanhaelen-Faestreacute y Vanhaelen 1984 Thomson 1980 White 1979
Sottolano y Lurie 1983) fueron establecidas y optimizadas para la cuantificacioacuten
de Psilocibina
Durante los uacuteltimos antildeos se han venido utilizando diferentes tipos de columna y
fase moacutevil con el fin de obtener la mayor cantidad posible de la sustancia de
intereacutes (Psilocibina)
33
En el antildeo 1981 en el instituto farmaceacuteutico de la Universidad de Oslo realizaron
una investigacioacuten con una columna de siacutelice con una fase moacutevil de metanol-nitrato
de amonio en donde no soacutelo se logroacute obtener Psilocibina y Psilocina sino tambieacuten
un nuevo producto conocido como beocistiacuten Se logroacute un porcentaje de separacioacuten
maacutexima de 75 ww (Christiansen et al 1981)
Asimismo en el antildeo 1984 en el instituto de microbiologiacutea de Amsterdam se
realizoacute un estudio con una columna C18 de siacutelice y una fase moacutevil de agua-etanol-
aacutecido aceacutetico de forma isocraacutetica en donde se obtuvo un porcentaje 025-115
y 002-016 de Psilocibina y Psilocina respectivamente en el hongo (Wurst
1984)
De igual manera en el antildeo 2003 en el instituto de ciencia policiaca en Japoacuten se
ejecutoacute la cromatografiacutea de alta eficiencia utilizando una columna C18 con una
fase moacutevil de aacutecido foacutermico de forma isocraacutetica y un detector de 220 nm un rango
de porcentaje de Psilocibina 014-042 wv en la capa mientras un 009-03
wv en el tallo (Tsujikawa et al 2003)
34
2 MATERIALES Y MEacuteTODOS
21 LOCALIZACIOacuteN
Las fermentaciones la medicioacuten del crecimiento micelial y la cuantificacioacuten del
consumo del sustrato y de proteiacutena se llevaron a cabo en el laboratorio de
Biotecnologiacutea de la Universidad EAFIT mientras que los anaacutelisis de cromatografiacutea
liacutequida de alta eficiencia (HPLC) se realizaron en el laboratorio de Quiacutemica
Instrumental de dicha Universidad
22 MICROORGANISMO DE ESTUDIO
La cepa del hongo Psilocybe cubensis (EAH01) con la cual se trabajoacute fue donada
por Joseacute Rodrigo Moreno Ingeniero del laboratorio de la Universidad Catoacutelica de
Oriente (UCO) La EAH01 permanece auacuten en el laboratorio de Biotecnologiacutea de la
Universidad EAFIT
Dicha cepa se cultivoacute en una caja Petri que conteniacutea Agar Extracto de Malta
(MEA) y se incuboacute a 30ordmC en una incubadora digital del laboratorio de
Biotecnologiacutea de la Universidad EAFIT La figura 5 representa una cepa de P
cubensis cultivada en medio soacutelido MEA
Figura 5 Psilocybe cubensis (EAH01) cultivada en medio soacutelido Agar Malta
35
23 COMPONENTES DEL MEDIO DE CULTIVO (FANG-ZHONG)
El medio sumergido utilizado para llevar a cabo las diferentes fermentaciones de
P cubensis fue el descrito por Fang-Zhong (2002) La tabla 1 muestra los
componentes de dicho medio y la concentracioacuten de cada uno de ellos Se destaca
que las fuentes de carbono utilizadas fueron glucosa y sacarosa usaacutendolas cada
una por separado para cada experimento y haciendo variaciones de
concentraciones de las mismas para los distintos ensayos
Tabla 1 Composicioacuten del medio de cultivo sumergido para evaluar el crecimiento micelial del P cubensis
Componentes Cantidad (gL)
Fuente de Carbono 30 ndash 50 - 70
Peptona 5
Extracto de levadura 5
KH2PO4 1
MgSO47H2O 05
Vitamina B1 005
24 PREPARACIOacuteN DE LOS DIFERENTES PREINOacuteCULOS DE P cubensis
EMPLEADOS PARA LAS FERMENTACIONES SUMERGIDAS
Con el propoacutesito de llevar a cabo cada uno de los ensayos fue necesario realizar
la preparacioacuten de un preinoacuteculo eacutesto con el fin de realizar un proceso de
adaptacioacuten del P cubensis al medio favoreciendo la disminucioacuten en cuanto a
tiempo (preferiblemente la eliminacioacuten de la aparicioacuten de un fase de latencia una
vez comenzada la fermentacioacuten)
La preparacioacuten de cada uno de los preinoacuteculos se realizoacute en 6 erlenmeyers de
1000 mL con 200 mL de medio cada uno los cuales fueron esterilizados a 120degC
por 15 minutos e inoculados con 4 discos de 5 mm aproximadamente de P
36
cubensis provenientes de la cepa previamente activada en Agar Malta durante 6
diacuteas Los erlenmeyers se llevaron a un agitador orbital por 6 diacuteas a 30ordmC y 100
rpm
25 PREPARACIOacuteN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO Y LOS INOacuteCULOS DE P
cubensis UTILIZADOS PARA LAS FERMENTACIONES SUMERGIDAS
Una vez realizado el preinoacuteculo se procedioacute a preparar los medios de cultivo
utilizados para realizar los distintos experimentos de la siguiente manera se
prepararon medios que diferiacutean en la fuente de carbono (glucosa o sacarosa) y en
la concentracioacuten de la misma (30 gL 50 gL y 70 gL) teniendo asiacute un total de
seis fermentaciones Las demaacutes cantidades de los componentes del medio de
Fang-Zhong fueron las mismas que las usadas en el preinoacuteculo descritas en la
Tabla 1
En primer lugar se llevaron a cabo las tres fermentaciones de glucosa
preparando un total de 90 erlenmeyers (30 por cada concentracioacuten de azuacutecar por
duplicado) cada uno de los frascos conteniacutea 50 mL del medio en erlenmeyers de
250 mL e inoculados con 01 g de peso huacutemedo del preinoacuteculo aproximadamente
Los 90 frascos se llevaron durante 14 diacuteas a un agitador orbital a 100 rpm con una
temperatura de 30 degC
Posteriormente se llevaron a cabo las tres fermentaciones de sacarosa siguiendo
el mismo proceso descrito anteriormente para la glucosa
Una vez terminadas las fermentaciones de glucosa y sacarosa y realizados todos
los anaacutelisis correspondientes (generacioacuten de biomasa consumo de sustrato
consumo de proteiacutena y evaluacioacuten de la presencia de Psilocibina por medio de
cromatografiacutea liacutequida de alta eficiencia (HPLC)) se procedioacute a elegir la fuente de
carbono y concentracioacuten que mejores resultados arrojoacute tanto para la generacioacuten
37
de biomasa como para la produccioacuten del alcaloide con el fin de evaluarla
nuevamente adicionaacutendole un precursor (FA)
Para finalizar se procedioacute a preparar los medios con la fuente de carbono y la
concentracioacuten de la misma que arrojoacute mejores resultados es decir los ensayos
realizados con una concentracioacuten de 50 gL de glucosa adicionaacutendole al medio
FA a diferentes concentraciones correspondiente a valores de 05 gL 10 gL y
15 gL las demaacutes cantidades de los componentes remanentes del medio fueron
las mismas que las descritas anteriormente en la tabla 1
26 CUANTIFICACIOacuteN DEL CRECIMIENTO DE BIOMASA MEDIANTE LOS
MEacuteTODOS DE PESO HUacuteMEDO Y PESO SECO PARA CULTIVO
SUMERGIDO DE P cubensis
La cuantificacioacuten de biomasa para cada uno de los tratamientos se realizoacute usando
la metodologiacutea de peso huacutemedo y peso seco Para la cuantificacioacuten de biomasa
mediante el meacutetodo de peso huacutemedo se tomaron dos muestras provenientes de
cada erlenmeyer cada 24 horas las cuales fueron filtradas y pesadas con el fin de
obtener el valor de peso huacutemedo para cada tratamiento del P cubensis
Posteriormente la biomasa retenida en el papel filtro fue llevada a un secador que
se encontraba a una temperatura de 50ordmC durante 24 horas transcurrido el
tiempo la biomasa seca fue pesada con el fin de obtener datos de peso seco
Durante los 14 diacuteas de la fermentacioacuten se obtuvieron datos de peso huacutemedo y
peso seco por duplicado para cada una de las fermentaciones
27 AJUSTE DE LA CINEacuteTICA DE CRECIMIENTO DE P cubensis AL
MODELO CINEacuteTICO LOGIacuteSTICO
Una vez realizada la recoleccioacuten de muestras para cada uno de los ensayos y su
posterior anaacutelisis se decidioacute modelar dichos datos mediante el modelo logiacutestico
38
(ecuacioacuten 1) el cual permite obtener variables cineacuteticas tales como la cantidad de
biomasa inicial (Xo) y la velocidad maacutexima de crecimiento (micromaacutex) para cada uno de
los tratamientos
Se decidioacute emplear el modelo logiacutestico ya que eacuteste muestra resultados maacutes reales
cuando se cultivan hongos debido a que su morfologiacutea es muy diferente a otros
microorganismos (pellets) dificultando la transferencia de masa (Bailey et al
1986)
Una vez linealizada la ecuacioacuten que describe dicho modelos se llega a la siguiente
expresioacuten
Ecuacioacuten 1 Ecuacioacuten linealizada del modelo logiacutestico
Posterior a la linealizacioacuten de la ecuacioacuten se procedioacute a graficar Ln ((XmaacutexX)-1)
vs tiempo con el fin de obtener como pendiente la velocidad maacutexima de
crecimiento (micromaacutex) y como intercepto el Ln ((XmaacutexXo)-1) el cual permitioacute la
obtencioacuten de la concentracioacuten inicial de biomasa
Obtenieacutendose asiacute los paraacutemetros cineacuteticos para cada ensayo correspondientes a
micromax y Xo
Se debe definir la concentracioacuten maacutexima de biomasa (Xmaacutex) para poder hallar los
paraacutemetros cineacuteticos mediante dicho modelo cabe aclarar que dicho valor se toma
de los resultados de biomasa adquiridos para cada uno de los ensayos mediante
la metodologiacutea de peso seco este valor variacutea para cada fermentacioacuten
Una vez ajustados los datos de cada tratamiento al modelo logiacutestico se procedioacute a
calcular de manera teoacuterica los valores de X (biomasa) que variacutea con el tiempo
39
teniendo en cuenta los paraacutemetros cineacuteticos arrojados mediante el modelo
logiacutestico utilizando la siguiente ecuacioacuten
Ecuacioacuten 2 Valores teoacutericos de biomasa en el tiempo
Estos valores de X teoacutericos obtenidos mediante la foacutermula anterior se grafican con
respecto a los valores de X obtenidos de manera experimental con el fin de
observar el ajuste del modelo logiacutestico a cada uno de los datos experimentales
28 EVALUACIOacuteN DEL CONSUMO DE SUSTRATO Y DEL CONSUMO DE
PROTEIacuteNA POR PARTE DEL P cubensis CULTIVADO EN MEDIO
SUMERGIDO
Con el fin de evaluar el consumo de sustrato y proteiacutena por parte del P cubensis
durante las fermentaciones que conteniacutean glucosa en el medio se recolectaron
muestras cada 24 horas del liacutequido obtenido despueacutes de realizada la filtracioacuten de
la muestra que se utilizoacute para efectos de caacutelculo de peso seo dicho liacutequido
denominado sobrenadante fue almacenado a -4 degC Finalizadas cada una de las
fermentaciones se procedioacute a realizar el protocolo para evaluar el consumo de
sustrato para cada medio (Miller 1959) mediante el meacutetodo de DNS (Aacutecido
Dinitrosaliciacutelico) (Anexo 13) y el consumo de proteiacutenas mediante el meacutetodo de
LOWRY para cada fermentacioacuten (Anexo 15)
Para llevar a cabo la cuantificacioacuten de sustrato y proteiacutena en los distintos ensayos
fue necesario realizar las curvas de calibracioacuten correspondientes dichas curvas
con sus respectivos valores de concentracioacuten se muestran en los anexos 14 y 16
40
29 MEacuteTODO CUALITATIVO PARA DETERMINAR LA PRESENCIA DE
ALCALOIDES (PSILOCIBINA) MEDIANTE EL USO DEL REACTIVO DE
DRAGENDORFF
Como se mencionoacute anteriormente el reactivo de Dragendorff es usado para
determinar de manera cualitativa la ausencia o presencia de alcaloides en una
muestra determinada Para llevar a cabo dicha prueba se recolectaron muestras
de la biomasa seca correspondientes a los diacuteas 12 13 y 14 de cada fermentacioacuten
las cuales fueron almacenadas a -4degC
Para determinar la presencia de Psilocibina se realizoacute el proceso descrito seguacuten
Musshoff et al (2000) el cual consistioacute en macerar cada una de las muestras de
biomasa hasta obtener un polvo fino luego se pesaron 10 mg de dicho polvo y a
esta cantidad se le agregoacute 1 mL de metanol Posteriormente una pequentildea
cantidad de esta mezcla se esparcioacute en un papel filtro en donde se le adicionoacute una
gota del reactivo de Dragendorff
Una vez realizada la prueba se dice que la muestra contiene presencia de
alcaloides si eacutesta presenta una coloracioacuten rojizo-amarilla
210 MEacuteTODO PARA DETERMINAR LA PRESENCIA DE PSILOCIBINA
MEDIANTE CROMATOGRAFIacuteA LIacuteQUIDA DE ALTA EFICIENCIA (HPLC)
Una vez evaluada la presencia del alcaloide mediante el reactivo de Dragendorff
se procedioacute a determinar mediante el uso de cromatografiacutea liacutequida de alta
eficiencia (HPLC) la presencia de los alcaloides en la mezcla con sus respectivos
tiempos de retencioacuten para llevar a cabo la extraccioacuten de la Psilocibina se siguioacute el
meacutetodo descrito por Musshoff et al (2000) Para ello la muestra de biomasa
seca fue macera en un mortero hasta convertirla en un polvo fino Diez miligramos
41
de la muestra en polvo se extrajeron dos veces con 1 mL de metanol en un bantildeo
de ultrasonido durante 30 minutos Posterior a eacutesto se centrifugaron las muestras
a 3000 rpm durante 2 minutos el sobrenadante se depositoacute en un vial
independiente
El sobrenadante fue evaporado hasta sequedad bajo una corriente de nitroacutegeno
gaseoso Una parte de los residuos se disolvioacute en 200 microL de la fase moacutevil que
contiene HCOONH4 con una concentracioacuten 10 microM y un pH de 35
El equipo utilizado para realizar todos los anaacutelisis correspondientes a HPLC
cuenta con las siguientes caracteriacutesticas equipo Agient Technologies que consta
de una columna C18 de 46 mm 250 mm 5 mm con una fase moacutevil de
HCOONH4 con un flujo de 1 mLminuto un detector UV de 214 nm y una inyeccioacuten
de 20 μL y una temperatura de 25degC El experimento se corrioacute de modo isocraacutetico
con una fase moacutevil de agua 70 y HCOONH4 de 30
211 DETERMINACIOacuteN CUALITATIVA DE LA RESOLUCIOacuteN DEL
ALCALOIDE DE INTEREacuteS PARA LOS DIFERENTES ENSAYOS
Con el fin de determinar de manera cualitativa cuaacutel de los cromatogramas
arrojados mediante la teacutecnica de HPLC presentoacute mejor resolucioacuten del alcaloide
fue necesario realizar un supuesto acerca del tiempo de retencioacuten de la Psilocibina
durante la cromatografiacutea puesto que a pesar de haber contado con un
cromatograma (Tsujikawa et al 2003) (Anexo 18) y haber trabajado en las
mismas condiciones de eacuteste no se utilizoacute la misma fase moacutevil lo que puedo
generar variaciones en dicho tiempo Se asumioacute que el tiempo de retencioacuten varioacute
entre 62 y 72 minutos es decir entre este tiempo se encontroacute el pico de intereacutes
de la investigacioacuten
42
La eleccioacuten del criterio de pureza del compuesto de intereacutes se realizoacute observando
cuaacutel de los picos obtenidos muestra menor ruido es decir que a su alrededor no
tenga presencia de otros compuestos (Anexos 19 20 y 21)
212 DETERMINACIOacuteN PORCENTUAL DE COMPUESTOS PARA LOS
DIFERENTES ENSAYOS
La cuantificacioacuten de los compuestos se hizo mediante un porcentaje de aacuterea bajo
la curva debido a que no se contoacute con un estaacutendar interno
Para realizar dicho porcentaje se obtuvo la totalidad de las aacutereas presentes en el
perfil cromatograacutefico obtenido para las muestras de los diacuteas 12 13 y 14 de cada
fermentacioacuten y el porcentaje del aacuterea del metabolito de intereacutes la cual oscilaba
entre un tiempo de retencioacuten entre 62 y 72 minutos
En el momento de analizar los cromatogramas y de elegir el medio que mejor
resultados arrojoacute en cuanto a la produccioacuten de alcaloide se observoacute la resolucioacuten
del metabolito en cada una de las fermentaciones
213 CULTIVO SUMERGIDO DE P cubensis EN PRESENCIA DE FA
Despueacutes de haber elegido la fuente de carbono (glucosa) y su respectiva
concentracioacuten (50 gL) que mejores resultados arrojaron durante la investigacioacuten
se realizaron nuevamente fermentaciones del P cubensis en medio sumergido
(Fang-Zhong) donde la diferencia de estos medios con respecto a los
anteriormente utilizados radicoacute en la presencia de FA aminoaacutecido
Para dichas fermentaciones se contoacute con tres concentraciones diferentes de FA
(05 gL 1 gL 15 gL) realizadas por duplicado adicionalmente se montoacute
43
simultaacuteneamente con dichos ensayos las muestras correspondientes a los uacuteltimos
tres diacuteas de fermentacioacuten sin FA en el medio para efectos de comparacioacuten y asiacute
poder llevar a cabo un anaacutelisis estadiacutestico apropiado
Los datos obtenidos fueron analizados por medio de una ANOVA con el fin de
observar si existiacutean o no diferencias significativas en cuanto al crecimiento micelial
(concentracioacuten de biomasa) del P cubensis y asiacute poder determinar el medio que
mejores resultados arrojoacute durante la investigacioacuten
214 DISENtildeO DE EXPERIMENTOS Y ANAacuteLISIS ESTADIacuteSTICO
El disentildeo estadiacutestico utilizado para realizar los anaacutelisis correspondientes a las
diferentes fermentaciones es un disentildeo factorial 23 Este estudio se basoacute en dos
factores que fueron las dos fuentes de carbono (glucosa y sacarosa) a su vez se
apoyoacute en tres niveles que fueron la variacioacuten en la concentracioacuten de las mismas
(30 gL 50 gL y 70 gL) De igual manera se fundamentoacute en dos variables de
respuesta el crecimiento micelial de P cubensis y el porcentaje de Psilocibina
presente en el microorganismo
Por medio del Software Statgraphics plus 51 se realizoacute un anaacutelisis estadiacutestico
basado en una ANOVA factorial Con ello se pretendioacute comparar estadiacutesticamente
los resultados de crecimiento micelial de biomasa (concentracioacuten) y produccioacuten de
Psilocibina para cada uno de los medios durante los 14 diacuteas de fermentacioacuten y en
especial en los uacuteltimos tres diacuteas de la misma puesto que durante este periacuteodo fue
evaluada la presencia del alcaloide
Es necesario hacer hincapieacute que para realizar dicha estadiacutestica fue necesario
ejecutar un estudio de normalidad el cual se comproboacute utilizando la graacutefica de
probabilidad normal a su vez se requirioacute un anaacutelisis de igualdad de varianza por
medio de una graacutefica de residuos Vs previsto con el fin de ver visualmente la
44
hipoacutetesis de la homocedasticidad todo ello con el fin de garantizar que la
investigacioacuten se comportoacute de forma normal Adicionalmente se contoacute con una
hipoacutetesis nula (Ho) y una Hipoacutetesis alterna (Ha) las cuales permitieron realizar las
conclusiones respectivas A continuacioacuten se enunciaraacuten cada una de eacutestas y los
paraacutemetros necesarios para dicho estudio
Ho Todas las medias son iguales es decir no existen diferencias
significativas entre los datos analizados
Ha Alguna de las medias es diferente lo que quiere decir que siacute existen
diferencias significativas
Paraacutemetro
Pvalor gt 005 Se acepta Ho
Pvalor le 005 Se rechaza Ho
45
3 RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN
31 CINEacuteTICA DE CRECIMIENTO MICELIAL DE P cubensis EN CULTIVO
SUMERGIDO (FANG-ZHONG) UTILIZANDO DIFERENTES FUENTES DE
CARBONO
Con el propoacutesito de evaluar el crecimiento micelial del P cubensis en medio
sumergido durante los 14 diacuteas de la fermentacioacuten se recurrioacute al uso de
metodologiacuteas conocidas como peso huacutemedo y peso seco en dicho trabajo soacutelo se
exponen los datos arrojados por el meacutetodo de peso seco
A continuacioacuten se presentan cada una de las fermentaciones de acuerdo al tipo de
sustrato empleado en las mismas los respectivos valores de peso seco obtenidos
y los anaacutelisis pertinentes para cada uno de los casos
311 Crecimiento micelial de P cubensis en medio sumergido utilizando
diferentes concentraciones de glucosa
Inicialmente se evaluaron tres concentraciones de glucosa en el cultivo de P
cubensis en medio sumergido (Fang-Zhong) correspondientes a 30 gL 50 gL y
70 gL siendo en este caso la glucosa la principal fuente de carbono del P
cubensis
A continuacioacuten se muestran los valores de peso seco obtenidos para cada una de
las concentraciones de glucosa utilizadas durante los 14 diacuteas de la fermentacioacuten
46
0
01
02
03
04
05
06
07
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Bio
ma
sa (g
L)
Tiempo (diacuteas)30gL 50gL 70gL
Graacutefico 1 Cineacutetica de crecimiento micelial de P cubensis en medio sumergido (Fang-Zhong) utilizando tres diferentes concentraciones de
glucosa como fuente de carbono (Peso seco)
Del graacutefico 1 se puede observar que no hubo evidencia de fase de latencia para
ninguno de los ensayos posteriormente se aprecia que el crecimiento de biomasa
aumentoacute con el tiempo para las diferentes concentraciones de glucosa empleadas
Analizando las fermentaciones que conteniacutean 50 gL y 70 gL de glucosa se
puede afirmar que ambas presentan un comportamiento similar mostrando una
fase exponencial hasta el diacutea 11 y una fase estacionaria hasta el diacutea 14 de la
fermentacioacuten mientras que la fermentacioacuten que conteniacutea 30 gL de glucosa no
presentoacute fase estacionaria la fermentacioacuten durante los 14 diacuteas se encontraba en
fase exponencial a pesar de que entre los diacuteas 8 y 11 el crecimiento de P
cubensis se mantuvo constante
Asimismo se puede observar que el crecimiento maacutes bajo en cuanto a
concentracioacuten de biomasa se generoacute en la concentracioacuten de 30 gL siendo eacuteste
de 048 gL mientras que en las concentraciones de 50 gL y 70 gL de glucosa
los crecimientos maacuteximos fueron muy similares 055 gL y 062 gL
respectivamente
47
Lo dicho anteriormente se ratifica una vez analizados los resultados obtenidos
estadiacutesticamente donde se obtuvo un P-valor igual a cero indicando que existen
diferencias significativas en cuanto al crecimiento micelial de biomasa
(concentracioacuten de biomasa durante los 14 diacuteas de la fermentacioacuten) El graacutefico 2
ilustra la presencia de dos grupos homogeacuteneos lo que indica que las
concentraciones de 50 gL y 70 gL no tienen diferencias significativas del
crecimiento micelial entre cada una de ellas mientras que la concentracioacuten de 30
gL siacute presenta dichas diferencias significativas con respecto a las dos
concentraciones anteriores (Anexo 1)
Con todo eacutesto se expone que la concentracioacuten de glucosa de 50 gL es la que se
eligioacute debido a que es maacutes econoacutemico utilizar 50 gL de glucosa que 70 gL
Tratamientos con diferentes concentraciones de glucosa
Media 30 gL glucosa (a) 022
Media 50 gL glucosa (b) 032
Media 70 gL glucosa (b) 034
a
bb
0
005
01
015
02
025
03
035
04
045
Co
nce
ntr
acioacute
n b
iom
asa
(gL
)
Letras diferentes denotan diferencias significativas (prueba LSD)
Graacutefico 2 Crecimiento micelial de P cubensis en cultivo sumergido bajo tres concentraciones de glucosa
48
Modelo logiacutestico para las fermentaciones donde se utilizoacute glucosa
como fuente de carbono
Una vez realizada la cineacutetica de crecimiento del P cubensis en medio sumergido
(Fang-Zhong) usando diferentes concentraciones de glucosa se procedioacute a
ajustar los datos obtenidos al modelo logiacutestico Los crecimientos maacuteximos de
biomasa obtenidos mediante el meacutetodo de peso seco para cada uno de los
ensayos fueron 048 gL 065 gL y 062 gL para concentraciones de 30 gL 50
gL y 70 gL de glucosa respectivamente La tabla 2 muestra los paraacutemetros
cineacuteticos obtenidos mediante el modelo para cada una de las concentraciones
Tabla 2 Paraacutemetros cineacuteticos obtenidos mediante el modelo logiacutestico para las diferentes fermentaciones de P cubensis utilizando glucosa como fuente
de carbono
30gL 50gL 70gL
microx (diacutea-sup1) 016 microx (diacutea-sup1) 017 microx (diacutea-sup1) 015
micromax (diacutea-sup1) 027 micromax (diacutea-sup1) 035 micromax (diacutea-sup1) 034
X0 (gL) 005 X0 (gL) 008 X0 (gL) 008
R2 096 R2
092 R2 085
De la tabla 2 se puede observar que la concentracioacuten inicial de biomasa (Xo)
estuvo muy cercana para cada una de las concentraciones de glucosa utilizadas
Para 30 gL de glucosa la velocidad maacutexima de crecimiento (micromax) fue mucho
menor que la obtenida para 50 gL y 70 gL eacutesto pudo ser debido a que fue el
medio que menor cantidad de glucosa conteniacutea mientras que para las otras dos
concentraciones de glucosa la velocidad maacutexima de crecimiento fue similar
Al comparar las velocidades maacuteximas de las tres concentraciones de glucosa
utilizadas se evidencia que la fermentacioacuten que conteniacutea 50 gL presentoacute una
micromaacutex mayor correspondiente a 035 diacutea-1 esto sugiere que a mayores
concentracioacuten de glucosa (70 gL) puede ocurrir una inhibicioacuten por sustrato otro
49
criterio que afirma que dicha concentracioacuten fue la que mejores resultados arrojoacute de
las tres concentraciones de glucosa utilizadas para el crecimiento del P cubensis
en el medio de Fang-Zhong Ademaacutes se observa que este experimento fue el que
mayor velocidad especiacutefica de crecimiento presento siendo esta de 017 diacutea-1
Finalmente se calcularon los valores de biomasa teoacutericos utilizando la ecuacioacuten
descrita anteriormente en la metodologiacutea con el propoacutesito de observar que tanto
se ajustaron los valores de biomasa hallados experimentalmente con los valores
de biomasa teoacutericos arrojados por el modelo logiacutestico El graacutefico 3 muestra los
valores de biomasa (X) tanto teoacutericos como experimentales con respecto al
tiempo
0
01
02
03
04
05
06
07
0 2 4 6 8 10 12 14
Biom
asa
(gL
)
Tiempo (diacutea)
X exp (30 gL) X exp (50 gL) X exp (70 gL)
X teoacuterico (30 gL) X teoacuterico (50 gL) X teoacuterico (70 gL)
Graacutefico 3 Valores de concentracioacuten de biomasa experimental y teoacuterico
graficados con respecto al tiempo para las fermentaciones con diferentes concentraciones de glucosa
Al observar el graacutefico 3 se puede notar que para los ensayos de 50 gL y 70 gL
de glucosa los valores de biomasa teoacutericos se encuentran un poco desfasados de
los valores de biomasa hallados de manera experimental mientras que para el
ensayo que conteniacutea 30 gL de glucosa se observa un buen ajuste de los datos
50
obtenidos experimentalmente al modelo logiacutestico La tabla 2 reitera lo dicho
anteriormente al exponer los valores de R2 los cuales explican la relacioacuten que
tienen los datos teoacutericos con los experimentales
312 Crecimiento micelial del P cubensis en medio sumergido utilizando
diferentes concentraciones de sacarosa
Una vez evaluado el crecimiento de biomasa usando glucosa como fuente de
carbono se procedioacute a evaluar el efecto que teniacutea el cambio de la fuente de
carbono por sacarosa en el crecimiento micelial del P cubensis en medio
sumergido
El graacutefico 4 muestra de manera ilustrativa como fue el crecimiento micelial del P
cubensis para cada una de las concentraciones de sacarosa utilizadas durante los
14 diacuteas mediante el meacutetodo de peso seco
0
01
02
03
04
05
06
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Biom
asa (
gL)
Tiempo (diacuteas)
30 gL 50 gL 70 gL
Graacutefico 4 Cineacutetica de crecimiento micelial de P cubensis en medio sumergido (Fang-Zhong) utilizando diferentes concentraciones de sacarosa
como fuente de carbono (Peso seco)
51
En el graacutefico 4 se puede observar que tanto para una concentracioacuten de 30 gL
como para 70 gL de sacarosa el hongo llega a su fase estacionaria cerca del
quinto diacutea de la fermentacioacuten mientras que para una concentracioacuten de 50 gL se
observa un comportamiento diferente puesto que el microorganismo tiene un
crecimiento exponencial hasta el diacutea 5 en donde entra a una etapa de transicioacuten o
estacionaria durante 3 diacuteas aproximadamente luego de la cual inicia nuevamente
su crecimiento de forma exponencial hasta llegar al diacutea 11 en donde siacute empieza
su fase estacionaria
Al igual que en las tres fermentaciones que conteniacutean glucosa en estas
fermentaciones de sacarosa se observa mediante el graacutefico anterior que no hubo
presencia de fase de latencia
El crecimiento maacuteximo de biomasa en cuanto a concentracioacuten lo presentoacute aquella
fermentacioacuten que conteniacutea 70 gL de sacarosa el cual fue de 057 gL seguida de
la de 50 gL con un crecimiento maacuteximo de biomasa de 045 gL y posteriormente
la concentracioacuten de 30 gL obtuvo un crecimiento maacuteximo de 026 gL
De acuerdo al anaacutelisis estadiacutestico que se realizoacute para cada una de las
fermentaciones se dedujo que las diferencias en cuanto al crecimiento micelial de
biomasa con respecto a la concentracioacuten de la misma son significativas entre
cada una de las fermentaciones es decir fue diferente la concentracioacuten de
biomasa obtenida cuando se trabajoacute con cada una de distintas concentraciones de
sacarosa Lo dicho anteriormente se muestra a traveacutes del graacutefico 5 (Anexo 2)
52
Tratamientos con diferentes concentraciones de sacarosa
Media 30 gL sacarosa (a) 02
Media 50 gL sacarosa (b) 032
Media 70 gL sacarosa (c) 043
a
b
c
0
02
04
Co
nce
ntr
acioacute
n b
iom
asa
(gL
)
Letras diferentes denotan diferencias significativas (prueba LSD)
Graacutefico 5 Crecimiento micelial para tres diferentes concentraciones de sacarosa
Modelo logiacutestico para las fermentaciones donde se utilizoacute sacarosa
como fuente de carbono
Una vez realizadas las cineacuteticas de crecimiento del P cubensis para cada
concentracioacuten de sacarosa empleada se procedioacute a ajustar los datos obtenidos al
modelo logiacutestico cabe recalcar que es necesario establecer los crecimientos
maacuteximos de biomasa obtenidos para cada uno de los ensayos los cuales fueron
026 gL 045 gL y 057 gL para concentraciones de 30 gL 50 gL y 70 gL de
sacarosa respectivamente
Una vez aplicado el modelo logiacutestico para cada tratamiento se obtuvieron valores
de velocidad maacutexima de crecimiento y biomasa inicial para cada concentracioacuten de
sacarosa utilizada en el medio los cuales se muestran en la tabla 3
53
Tabla 3 Paraacutemetros cineacuteticos obtenidos mediante el modelo logiacutestico para las diferentes fermentaciones de P cubensis utilizando sacarosa como
fuente de carbono
30gL 50gL 70gL
microx (diacutea-sup1) 030 microx (diacutea-sup1) 014 microx (diacutea-sup1) 041
micromax (diacutea-sup1) 037 micromax (diacutea-sup1) 042 micromax (diacutea-sup1) 067
X0 (gL) 01 X0(gL) 01 X0 (gL) 011
R2 061 R2 089 R2 095
De la tabla 3 se ratifica que se utilizoacute una concentracioacuten inicial de biomasa igual
para cada una de las fermentaciones aproximadamente 01 gL ademaacutes se
observa un aumento en la velocidad maacutexima de crecimiento con respecto a la
cantidad de sacarosa empleada es decir que el hecho de haber aumentado la
concentracioacuten de sacarosa en el medio favorecioacute el aumento en la velocidad
maacutexima de crecimiento del P cubensis siendo eacutesta mayor cuando se trabajoacute a una
concentracioacuten de 70 gL de sacarosa De igual manera se aprecia que el
tratamiento que conteniacutea 70 gL de sacarosa presentoacute una velocidad especiacutefica de
crecimiento mayor que los demaacutes siendo eacutesta de 041 diacutea-1
Finalmente se calcularon los valores de biomasa teoacutericos el graacutefico 6 ilustra los
valores de biomasa (X) tanto teoacutericos como experimentales graficados con
respecto al tiempo
54
0
01
02
03
04
05
06
0 2 4 6 8 10 12 14
Bio
mas
a (g
L)
Tiempo (Diacutea)
X exp (30 gL) X exp (50 gL) X exp (70 gL)
X teoacuterico (30 gL) X teoacuterico (50 gL) X teoacuterico (70 gL)
Graacutefico 6 Valores de concentracioacuten de biomasa experimental y teoacuterico graficados con respecto al tiempo para las fermentaciones con diferentes
concentraciones de sacarosa
Del graacutefico 6 se puede observar como los valores de biomasa experimentales se
ajustaron a los valores de biomasa teoacutericos arrojados por el modelo logiacutestico lo
que quiere decir la cineacutetica de crecimiento del P cubensis en medio sumergido
cuando se utilizoacute 70 gL se ajustoacute correctamente al modelo logiacutestico lo que se
corrobora en la tabla 2 gracias al valor obtenido para el R2 que indica la relacioacuten
de los datos teoacutericos con respecto a los experimentales Por otro lado para las
fermentaciones de 30 gL y 50 gL de sacarosa a pesar de parecer que
presentaron un buen ajuste al calcular la relacioacuten de los datos teoacutericos con
respecto a los experimentales (R2) se concluye que el ajuste no fue tan bueno
55
313 Comparacioacuten entre el crecimiento micelial de P cubensis en los
cultivos sumergidos utilizando glucosa y sacarosa como fuente de
carbono
Ahora bien es igualmente importante realizar un anaacutelisis comparativo entre ambas
fuentes de carbono empleadas con el fin de determinar si existen o no diferencias
significativas entre dichas fuentes de carbono
De acuerdo al anaacutelisis estadiacutestico se dice que existen diferencias significativas del
crecimiento micelial del P cubensis en cuanto al diacutea y la concentracioacuten de
sustrato empleado es decir concentracioacuten de glucosa y sacarosa (Anexo 3) pero
se observa claramente que no hay diferencias significativas de dicho crecimiento
con respecto al tipo de sustrato utilizado debido a que el P-valor arrojado por la
estadiacutestica fue de 01217 lo que sugiere que se debe utilizar la sacarosa gracias
a la disminucioacuten de costos que se generariacutean durante el proceso todo ello gracias
al costo de la sacarosa es inferior al de glucosa Sin embargo para elegir la fuente
de carbono que mejores resultados arrojoacute no soacutelo se basoacute en la cantidad de
biomasa producida sino que se procedioacute a examinar los barridos espectrales
arrojados por el anaacutelisis de HPLC con el fin de determinar la fuente de carbono
que mejor resolucioacuten mostroacute del alcaloide que en esta investigacioacuten fue glucosa a
una concentracioacuten de 50 gL
De igual manera el graacutefico 7 muestra las medias obtenidas mediante el anaacutelisis
estadiacutestico para las fermentaciones trabajadas con glucosa y sacarosa Aun asiacute
es necesario hacer hincapieacute que eacuteste no es el criterio principal para la obtencioacuten
del medio que mejores resultados arrojoacute durante la investigacioacuten por lo tanto se
deben seguir realizando los diferentes anaacutelisis descritos anteriormente en este
trabajo
56
Tratamientos de las dos fuentes de carbono usadas sin FA (glucosa y
sacarosa)
Media para glucosa (a) 029
Media para sacarosa (a) 032
aa
0
01
02
03
Conc
entr
acioacute
n bi
omas
a (g
L)
Letras diferentes denotan diferencias significativas (Prueba LSD)
Graacutefico 7 Crecimiento micelial para dos diferentes fuentes de carbono (glucosa y sacarosa)
314 Crecimiento micelial del P cubensis en cultivo sumergido utilizando
glucosa y fenilalanina en el medio
Se decidioacute realizar un uacuteltimo ensayo acerca del efecto que teniacutea la adicioacuten de un
aminoaacutecido llamado Fenilalanina (FA) al medio Fang-Zhong sobre la produccioacuten
del alcaloide y por ende sobre la generacioacuten de biomasa
Debido a los anaacutelisis realizados anteriormente se concluyoacute que la mejor fuente de
carbono fue la glucosa a una concentracioacuten de 50 gL De la misma manera que
en los numerales anteriores se evaluoacute la cineacutetica del crecimiento micelial del P
cubensis mediante los meacutetodos de peso huacutemedo y peso seco Las mediciones
fueron realizadas por duplicado y promediadas para la fuente de carbono elegida
(glucosa 50 gL) y las diferentes concentraciones de FA en el medio
correspondientes a 05 gL 1 gL 15 gL con el fin de encontrar el medio que
mejores resultados arrojoacute en cuanto a crecimiento micelial y generacioacuten del
57
alcaloide de intereacutes Los datos obtenidos mediante el meacutetodo de peso seco se
muestran en el graacutefico 8
Cabe resaltar que junto con las tres fermentaciones de 05 gL 10 gL y 15 gL
de FA se montaron a su vez seis muestras correspondientes a los diacuteas 12 13 y
14 de la fermentacioacuten que conteniacutea 0 gL de FA eacutesto con el propoacutesito de analizar
los datos de manera estadiacutestica y poder hacer comparaciones con respecto a la
generacioacuten de biomasa y a la produccioacuten del alcaloide de intereacutes ambas medidas
con respecto a la concentracioacuten
0
01
02
03
04
05
06
07
08
09
1
11
12
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Biom
asa
(gL
)
Tiempo (diacuteas)
05 gL 1 gL 15 gL
Graacutefico 8 Cineacutetica de crecimiento micelial de P cubensis en medio sumergido (Fang-Zhong) utilizando diferentes concentraciones de FA y 50
gL de glucosa como fuente de carbono (Peso seco)
Al analizar el graacutefico 8 es decir el crecimiento micelial (concentracioacuten de
biomasa) seguacuten la concentracioacuten de FA en el tiempo se puede notar que no hubo
presencia de fase de latencia para ninguna de las concentraciones de FA
utilizadas ademaacutes el crecimiento de biomasa en cada caso se aprecia de manera
58
muy similar llegando los tres ensayos a la fase estacionaria el diacutea 12 de la
fermentacioacuten
Observando el graacutefico 8 se puede identificar que el mayor contenido de biomasa
fue de 108 gL obtenida el diacutea 13 para una concentracioacuten 10 gL de FA para
concentraciones de 05 gL y 15 gL de FA la concentracioacuten maacutexima de biomasa
fue 106 gL y 101 gL respectivamente Auacuten asiacute al considerar los resultados
obtenidos se puede ratificar que es indiferente la cantidad de FA necesaria para
obtener concentracioacuten de biomasa por ende se decide que el medio que mejores
resultados arrojoacute fue el que conteniacutea 05 gL FA debido a que fue la
concentracioacuten de FA que mejor resolucioacuten del alcaloide presentoacute paraacutemetro
observado mediante los cromatogramas obtenidos del anaacutelisis de HPLC (Anexos
19 20 y 21) y ademaacutes porque con dicha cantidad los costos de la materia prima
seriacutean menores Cabe resaltar que el uso de FA generoacute un aumento significativo
duplicando la produccioacuten de biomasa por lo tanto se testifica que siacute hubo
duplicacioacuten en cuanto a la concentracioacuten de biomasa en los medios que conteniacutea
FA con respecto a los medios que no conteniacutean FA se dice entonces que a su
vez se podriacutea haber generado mayor cantidad de Psilocibina en los medios que
teniacutean FA ya que dicho alcaloide se produce de manera intracelular por tal
razoacuten al aumentar la cantidad de biomasa en el medio se aumenta la cantidad de
dicho alcaloide
De igual manera se analizaron los datos estadiacutesticamente y se llegoacute a apreciar
que no existen diferencias significativas en cuanto a la produccioacuten de biomasa y la
cantidad de FA utilizada en el medio Del mismo modo al analizar la tabla de
contrastes muacuteltiple de rangos se reitera que siacute existen diferencias significativas
entre el crecimiento micelial de biomasa (concentracioacuten de biomasa) en el tiempo
cuando se trabajoacute con FA o sin eacuteste Eacutesto se puede observar en el graacutefico 9
(Anexo 4)
59
Tratamientos con y sin FA
Media 0 gL FA (a) 032
Media 05 gL FA (b) 065
Media 10 gL FA (b) 066
Media 15 gL FA (b) 069
a
b b b
0
01
02
03
04
05
06
07
08
09
Conc
entr
acioacute
n bi
omas
a (g
L)
Letras diferentes denotan diferencias significativas (Prueba LSD)
Graacutefico 9 Crecimiento micelial para glucosa a una concentracioacuten de 50 gL y tres diferentes concentraciones de FA
Modelo logiacutestico para las fermentaciones donde se utilizoacute 50 gL de
glucosa como fuente de carbono y diferentes concentraciones de FA
En primer lugar se fijaron los valores de crecimiento maacuteximo de biomasa para
cada una de las concentraciones obtenidos mediante el meacutetodo de peso seco con
el fin de hallar los paraacutemetros cineacuteticos mediante el modelo logiacutestico Los
crecimientos maacuteximos de biomasa obtenidos fueron los siguientes 106 gL 108
gL y 101 gL para concentraciones de 05 gL 10 gL y 15 gL de FA
respectivamente y 50 gL de glucosa
Una vez realizado el modelo logiacutestico para cada tratamiento se obtuvieron los
valores de velocidad maacutexima de crecimiento y concentracioacuten de biomasa inicial
para cada ensayo los cuales se muestran en la tabla 4
60
Tabla 4 Paraacutemetros cineacuteticos obtenidos mediante el modelo logiacutestico para las diferentes fermentaciones de P cubensis utilizando 50 gL de glucosa
como fuente de carbono y diferentes concentraciones de FA
05gL 10gL 15gL
microx (diacutea-sup1) 018 microx (diacutea-sup1) 012 microx (diacutea-sup1) 012
micromax (diacutea-sup1) 045 micromax (diacutea-sup1) 035 micromax (diacutea-sup1) 044
X0 (gL) 01 X0 (gL) 017 X0 (gL) 016
R2 095 R2 082 R2 088
Seguacuten los valores arrojados por el modelo logiacutestico que se encuentran
presentados en la tabla 4 se puede decir que se presentoacute una valor de biomasa
inicial similar para los tratamientos de 1 gL y 15 gL de FA mientras que para las
fermentaciones que conteniacutean 05 gL de FA se tiene una diferencia de un 50
aproximadamente Ademaacutes se puede observar que a la concentracioacuten de 05 gL
de FA es la que mayor velocidad maacutexima de crecimiento presenta siendo esta
045 diacuteamacrsup1 a su vez dicha concentracioacuten presentaacute la microx mayor correspondiente a
018 diacutea-1 Debido a eacutesto y al criterio de mejor resolucioacuten del alcaloide observado
en los anaacutelisis de HPLC (Anexos 19 20 y 21) se concluye que el medio que
mejores resultados arrojoacute durante la investigacioacuten para la generacioacuten de biomasa
y la produccioacuten de la Psilocibina es 05 gL de FA y 50 gL de glucosa
Finalmente se calcularon los valores de biomasa teoacutericos el graacutefico 10 muestra
los valores de biomasa (X) tanto teoacutericos como experimentales graficados con
respecto al tiempo
61
0
02
04
06
08
1
12
0 2 4 6 8 10 12 14 16
Bio
mas
a (g
L)
Tiempo (Diacutea)
X exp (05 gL) X exp (10 gL) X exp (15 gL)
X teoacuterico (05 gL) X teoacuterico (10 gL) X teoacuterico (15 gL)
Graacutefico 10 Valores de concentracioacuten de biomasa experimental y teoacuterico graficados con respecto al tiempo para las fermentaciones con diferentes
concentraciones de FA y 50 gL de glucosa
Se puede decir gracias al graacutefico 10 que los valores de biomasa experimentales
se ajustaron a los valores de biomasa teoacutericos hallados mediante el modelo
logiacutestico es decir la cineacutetica de crecimiento del P cubensis en medio sumergido
cuando se usaron diferentes concentraciones de FA en el medio se ajustoacute
correctamente al modelo logiacutestico esto se reitera con los valores de R2 mostrados
anteriormente en la tabla 4
32 ESTUDIO DE LA CINEacuteTICA DE CONSUMO DE SUSTRATO POR PARTE
DEL P cubensis CULTIVADO EN MEDIO SUMERGIDO (FANG-ZHONG)
La evaluacioacuten del consumo de sustrato durante la fermentacioacuten con respecto al
tiempo es de suma importancia puesto que eacuteste es el principal componente
limitante del crecimiento presente en el medio de cultivo
62
A continuacioacuten se analizaraacuten dichos consumos para los diferentes ensayos
321 Consumo de sustrato por parte del P cubensis en medio sumergido
utilizando diferentes concentraciones de glucosa
Una vez halladas las concentraciones de sustrato para cada una de las
fermentaciones que conteniacutean glucosa en el medio se procedioacute a graficar dichos
valores con respecto al tiempo
El graacutefico 11 ilustra los datos obtenidos sobre el consumo de sustrato de las tres
fermentaciones que conteniacutean glucosa y a su vez como se comportoacute el
crecimiento de biomasa para cada ensayo durante los 14 diacuteas de fermentacioacuten
0
01
02
03
04
05
06
07
0
10
20
30
40
50
60
70
80
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14B
iom
asa
(gL
)
Glu
cosa
(gL
)
Tiempo (diacuteas)
30 GL 50GL 70 GL 30gL 50gL 70gL
Graacutefico 11 Cineacutetica de consumo de sustrato por parte del P cubensis en medio sumergido utilizando diferentes concentraciones de glucosa como
fuente de carbono
Al observar el graacutefico 11 se expone que el P cubensis consumioacute mayor cantidad
de glucosa cuando esta estaba a una concentracioacuten de 70 gL correspondiendo a
63
un porcentaje de 62 mientras que para 50 gL y 30 gL fue de 23 y 30
respectivamente
Comparando el consumo de glucosa en sus diferentes concentraciones con el
crecimiento micelial del hongo se puede observar que a una concentracioacuten de
glucosa de 30 gL no soacutelo se tuvo un menor consumo de sustrato sino que
tambieacuten se generoacute un menor crecimiento de biomasa Mientras que a
concentraciones de 50 gL y 70 gL de glucosa a pesar de presentar diferencias
en cuanto al porcentaje de sustrato consumido el crecimiento micelial es similar
(no presenta diferencias significativas) lo que indica que el hongo no requiere
tanta concentracioacuten de glucosa para su crecimiento eacutesto se puede afirmar soacutelo
para este ensayo a estas condiciones
De igual manera en el graacutefico 11 al analizar la tendencia del consumo de
sustrato las concentraciones de glucosa de 50 gL y 70 gL presentan una
disminucioacuten notoria hasta el diacutea 11 para dicho consumo Esto se debe a que en
ese diacutea inicioacute la fase estacionaria del hongo en ambas fermentaciones en donde
el P cubensis requeriacutea alimento uacutenicamente para mantenerse y producir
metabolitos secundarios Mientras que para la concentracioacuten de glucosa de 30 gL
el consumo de glucosa fue muy poco a partir del quinto diacutea de la fermentacioacuten
esto se atribuye a que la cineacutetica de crecimiento micelial del P cubensis presentoacute
una fase estacionaria temprana entre los diacuteas 8 y 11 indicando que no necesitaba
consumir casi glucosa puesto que no estaba creciendo
322 Consumo de sustrato por parte del P cubensis en medio sumergido
utilizando diferentes concentraciones de sacarosa
Los datos obtenidos sobre el consumo de sacarosa para cada una de las
concentraciones utilizadas (30 gL 50 gL y 70 gL de sacarosa) durante los 14
diacuteas de la fermentacioacuten se muestran en el graacutefico 12 a su vez se ilustran en dicho
64
graacutefico el comportamiento del crecimiento micelial para cada ensayo durante los
14 diacuteas de fermentacioacuten para efectos de anaacutelisis
0
01
02
03
04
05
06
0
10
20
30
40
50
60
70
80
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Bio
mas
a (g
L)
Sac
aro
sa (g
L)
Tiempo (diacuteas)
30gL 50gL 70gL 30 gL 50 gL 70 gL
Graacutefico 12 Cineacutetica de consumo de sustrato por parte del P cubensis en medio sumergido utilizando diferentes concentraciones de sacarosa como
fuente de carbono
Al observar el graacutefico 12 se puede decir que el P cubensis consumioacute mayor
cantidad de sacarosa cuando eacutesta estaba a una concentracioacuten de 70 gL en el
medio presentando un porcentaje de consumo del 49 mientras que para las
concentraciones de 50 gL y 30 gL de sacarosa se tuvo un porcentaje de
consumo de 24 y 37 Esto igual que en el consumo de glucosa se puede
deber a que al tener mayor concentracioacuten de sustrato en el medio el P cubensis
genera mayor afinidad por el mismo haciendo que dicho hongo se consuma
grandes cantidades de sacarosa durante el tiempo
Igualmente se observa que aproximadamente en el noveno diacutea de la
fermentacioacuten las tres diferentes concentraciones de glucosa (30 gL 50 gL y 70
65
gL) se mantienen casi constantes en el tiempo ello gracias a que en este diacutea el
hongo se encontraba en fase estacionaria en los tres ensayos
323 Comparacioacuten entre el consumo de sustrato de P cubensis en los
cultivos sumergidos con diferentes fuentes de carbono
Con el fin de identificar cuaacutel de las dos fuentes de carbono fue consumida en
mayor proporcioacuten por parte del P cubensis se procedioacute a realizar un anaacutelisis
estadiacutestico donde comparamos las dos fuentes de carbono empleados con
respecto al consumo de sustrato obtenido (concentracioacuten de glucosa y sacarosa
en cada uno de los medios) donde se consiguioacute un P-valor de 00811 con
respecto al tipo de sustrato lo que indica que no existen diferencias en cuanto al
consumo de sustrato y el tipo del mismo es decir es indiferente cuaacutel de los dos
sustratos (glucosa o sacarosa) se utilice para que se del consumo del mismo por
parte del P cubensis Observacioacuten que se reitera en la tabla de contraste muacuteltiple
que muestra que se trabajoacute como un grupo homogeacuteneo Igualmente el graacutefico 13
muestra las medias de consumo de sustrato (concentracioacuten durante los 14 diacuteas)
obtenidas mediante el anaacutelisis estadiacutestico y reitera que no existen diferencias
significativas con respecto al tipo de sustrato utilizado para el cultivo del P
cubensis en medio sumergido (Anexo 5)
66
Tratamientos de las dos fuentes de carbono usadas sin FA (glucosa y sacarosa)
Media glucosa (a) 3431
Media sacarosa (a) 3678
a
a
32
34
36
38
Co
nce
ntr
acioacute
n s
ust
rato
(g
L)
Letras diferentes denotan diferencias significativas (Prueba LSD)
Graacutefico 13 Consumo de sustrato para cada una de las fuentes de carbono utilizadas
Aun asiacute al comparar los graacuteficos 11 y 12 se puede observar un mayor consumo
de glucosa que de sacarosa lo que lleva a concluir que es mejor emplear la
primera (glucosa)
324 Consumo de sustrato por parte del P cubensis en medio sumergido
utilizando glucosa y fenilalanina en el medio
Los datos obtenidos acerca del consumo de sustrato durante los 14 diacuteas de la
fermentacioacuten para cada uno de los medios que conteniacutean 50 gL de glucosa y
diferentes concentraciones de FA (05 gL 1 gL y 15 gL) se muestran en el
graacutefico 14 De igual manera se ilustran en dicho graacutefico las cineacuteticas de
crecimiento micelial para cada una de las fermentaciones que teniacutean 50 gL de
glucosa y diferentes concentraciones de FA con el fin de realizar los anaacutelisis
pertinentes
67
0
02
04
06
08
1
12
0
10
20
30
40
50
60
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Bio
mas
a (g
L)
Glu
cosa
50
gL
+ F
A (g
L)
Tiempo (diacuteas)
05gL 10gL 15gL 05 gL 1 gL 15 gL
Graacutefico 14 Cineacutetica de consumo de sustrato por parte del P cubensis en medio sumergido utilizando 50 gL de glucosa como fuente de carbono y
diferentes concentraciones de FA
Analizando el graacutefico 14 se puede decir que el consumo de glucosa durante el
tiempo fue igual para las fermentaciones que conteniacutea concentraciones de 1 gL y
15 gL de FA dichos consumos corresponde a valores de 23 mientras que
para el ensayo que teniacutea una concentracioacuten de 05 gL de FA el porcentaje de
consumo fue del 18 Asimismo se presentaron diferencias significativas en
cuanto al consumo de sustrato entre los diferentes ensayos
El graacutefico 15 expone las medias del consumo de sustrato (concentracioacuten) de cada
una de las muestras y las diferencias existentes entre ellas se evidencia que la
adicioacuten de FA disminuyoacute el consumo de glucosa ademaacutes que en los ensayos se
presentaron tres grupos homogeacuteneos diferentes En el primer grupo (a) que
contiene las fermentaciones del P cubensis con una concentracioacuten de 50 gL de
glucosa y en ausencia de FA se obtuvo una media de 356 gL la cual indica un
mayor consumo de sustrato Luego el segundo grupo (c) se compone de las
concentraciones de 1 gL y 15 gL de FA presentando una media de 413 gL y
de 426 gL respectivamente y el uacuteltimo grupo (b) corresponde a una
68
concentracioacuten de 05 gL de FA el cual presenta el menor consumo de glucosa al
exponer una media 466 gL
Seguacuten lo anterior y el graacutefico 15 se dice que siacute existieron diferencias significativas
en cuanto al consumo de sustrato (concentracioacuten durante los 14 diacuteas) en los
uacuteltimos tres diacuteas cuando se trabajo con FA y sin FA y a su vez se encontraron
diferencias significativas de la concentracioacuten de sustrato en el medio cuando se
teniacutea una concentracioacuten de FA correspondiente a 05 gL con relacioacuten a las otras
dos concentraciones de FA (10 gL y 15 gL) mientras que entre estas dos
uacuteltimas concentraciones de FA (10 gL y 15 gL) no se encontraron diferencias
significativas (Anexo 6)
Tratamientos con y sin FA
Media 0 gL FA (a) 3564
Media 05 gL FA (b) 466
Media 10 gL FA (c) 4131
Media 15 gL FA (c) 426
a
b c c
0
10
20
30
40
50
60
Conc
entr
acioacute
n su
stra
to (g
L)
Letras diferentes denotan diferencias significativas (prueba LSD)
Graacutefico 15 Consumo de sustrato para cada una de las concentraciones de FA utilizadas
69
33 ESTUDIO DE LA CINEacuteTICA DE CONSUMO DE PROTEIacuteNA POR PARTE
DEL P cubensis CULTIVADO EN MEDIO SUMERGIDO (FANG-ZHONG)
Las fuentes de proteiacutena que posee el medio de Fang-Zhong son extracto de
levadura y peptona que representan una cantidad de 10 gL para cada ensayo
eacutesta cantidad se mantuvo constante para cada fermentacioacuten
Se evaluoacute el consumo de proteiacutena por parte del P cubensis durante los 14 diacuteas
de la fermentacioacuten para cada uno de los ensayos
A continuacioacuten se analizan los resultados obtenidos para cada uno de los
tratamientos
331 Consumo de proteiacutena por P cubensis en medio sumergido utilizando
diferentes concentraciones de glucosa
Una vez se calcularon las concentraciones de proteiacutena en el medio para cada
ensayo se graficaron dichos valores con respecto al tiempo
El graacutefico 16 muestra como se comportoacute el consumo de proteiacutena con respecto al
tiempo para cada una de las tres concentraciones de glucosa utilizadas y a su vez
como se comportoacute el crecimiento de biomasa para cada ensayo durante los 14
diacuteas de fermentacioacuten
70
0
01
02
03
04
05
06
07
0
5
10
15
20
25
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Bio
mas
a (g
L)
Pro
tein
a (g
L)
Tiempo (diacuteas)
30 GL 50 GL 70 GL 30 gL Biomasa 50 gL Biomasa 70 gL Biomasa
Graacutefico 16 Cineacutetica de consumo de proteiacutena por parte del P cubensis en medio sumergido utilizando diferentes concentraciones de glucosa como
fuente de carbono
Analizando el graacutefico 16 se puede observar que el consumo de proteiacutena se dio
casi en su totalidad El ensayo que mayor consumo de proteiacutena presentoacute fue el
que conteniacutea 30 gL de glucosa arrojando un porcentaje de consumo del 98
mientras que las fermentaciones realizadas a concentraciones de 50 gL y 70 gL
de glucosa presentaron un porcentaje de consumo de proteiacutena del 91 y 90
respectivamente
Al enfocarnos en la relacioacuten existente entre el consumo de proteiacutena y el
crecimiento micelial del P cubensis se puede notar gracias al graacutefico 16 que la
relacioacuten es directamente proporcional debido a que el consumo de proteiacutena fue
permanente mientras el hongo se encontraba en fase exponencial es decir el P
cubensis necesitaba de la proteiacutena para aumentar su crecimiento mientras que en
el momento en que el microorganismo comenzoacute su fase estacionaria la
concentracioacuten de proteiacutena en el medio se mantuvo constante esto uacuteltimo soacutelo es
vaacutelido para concentraciones de 50 gL y 70 gL de glucosa puesto que ambas
llegaron a la fase estacionaria
71
332 Consumo de proteiacutena por P cubensis en medio sumergido utilizando
diferentes concentraciones de sacarosa
Una vez obtenidos los valores de consumo de proteiacutena para cada concentracioacuten
de sacarosa utilizada se precedioacute a graficarlos con respecto al tiempo dichos
datos se encuentran en el graacutefico 17 De igual manera en este graacutefico se
representa la cineacutetica de crecimiento de biomasa para el P cubensis de acuerdo a
las distintas concentraciones de sacarosa utilizadas
0
01
02
03
04
05
06
0
2
4
6
8
10
12
14
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Bio
mas
a (g
L)
Prot
eiacutena
(gL
)
Tiempo (diacuteas)
30 GL 50 GL 70 GL 30 gL 50 gL 70 gL
Graacutefico 17 Cineacutetica de consumo de proteiacutena por parte del P cubensis en medio sumergido utilizando diferentes concentraciones de sacarosa como
fuente de carbono
El graacutefico 17 ilustra el consumo casi en su totalidad de la proteiacutena para cada uno
de los tratamientos El ensayo que mayor consumo de proteiacutena presentoacute fue el
que conteniacutea 30 gL de sacarosa exponiendo un porcentaje de consumo del 89
mientras que las concentraciones de 50 gL y 70 gL de sacarosa arrojaron
porcentajes de consumo del 86 y 57 respectivamente
Ahora bien al analizar el crecimiento del P cubensis con respecto al consumo de
proteiacutena se evidencia claramente que el consumo disminuyoacute permanentemente
72
en el tiempo mientras el hongo se encontraban en estado exponencial indicando
el intereacutes del P cubensis por la proteiacutena siendo eacutesta utilizada por el mismo para
aumentar su tamantildeo y biomasa
Durante los diacuteas 4 y 10 las fermentaciones que conteniacutean concentraciones de 30
gL y 70 gL de sacarosa presentaron un alto consumo de proteiacutena a pesar de
que el P cubensis se encontraba en estos dos ensayos en fase estacionaria fase
en la cual no se requiere consumir grandes cantidades de sustrato puesto que el
hongo soacutelo necesitaba alimentarse para mantenerse o para producir productos no
ligados al crecimiento maacutes no para cambiar la cantidad de biomasa presente en el
medio Asimismo la concentracioacuten de 50 gL de sacarosa tambieacuten presentoacute un
alto consumo de proteiacutena durante los diacuteas 4 y 8 en donde se creiacutea estar en una
fase estacionaria temprana lo dicho anteriormente reitera una vez maacutes la afinidad
que el P cubensis presentoacute con respecto a las fuentes de proteiacutena usadas
333 Comparacioacuten entre el consumo de proteiacutena de P cubensis en los
cultivos sumergidos con diferentes fuentes de carbono
Con el fin de conocer cuaacutel de los dos tipos de sustrato empleado fue mayormente
consumido se realizoacute un anaacutelisis estadiacutestico
En el graacutefico 18 se ilustran las medias de consumo de proteiacutena (concentracioacuten)
arrojadas mediante el anaacutelisis estadiacutestico sobre el consumo de proteiacutena cuando se
utilizoacute glucosa o sacarosa en el medio y se evidencia que existen diferencias
significativas en cuanto a la concentracioacuten de proteiacutena en el tiempo en el medio
cuando se realizoacute el experimento con glucosa y cuando se utilizoacute sacarosa
arrojando asiacute dos grupos homogeacuteneos el primero (a) presenta una media de 465
gL mientras que el grupo dos (b) arroja un valor de media de 609 gL indicando
un menor consumo de proteiacutena por parte del P cubensis en el medio sumergido
73
de Fang-Zhong cuando se utilizoacute sacarosa como principal fuente de carbono
(Anexo 7)
Tratamientos de las dos fuentes de carbono usadas sin FA (glucosa y sacarosa)
Media glucosa (a) 465
Media sacarosa (b) 609
a
b
0
1
2
3
4
5
6
7
8
Conc
entr
acioacute
n pr
oteiacute
na (g
L)
Letras diferentes denotan diferencias significativas (prueba LSD)
Graacutefico 18 Consumo de proteiacutena para cada una de las fuentes de carbono utilizadas
334 Consumo de proteiacutena por P cubensis en medio sumergido utilizando
glucosa y FA en el medio
Una vez se obtuvo la concentracioacuten de proteiacutena en el medio para cada
concentracioacuten de FA utilizada se precedioacute a graficar dichos valores con respecto
al tiempo los cuales se ilustran en el graacutefico 19 ademaacutes se muestran en dicho
graacutefico las cineacuteticas de crecimiento de biomasa para cada ensayo
74
0
02
04
06
08
1
12
0
2
4
6
8
10
12
14
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Bio
mas
a (g
L)
Pro
teiacuten
a (g
L)
Tiempo (diacuteas)
05 gL 1 gL 15 gL 05 gL 1 gL 15 gL
Graacutefico 19 Cineacutetica de consumo de proteiacutena por parte del P cubensis en medio sumergido utilizando 50 gL de glucosa como fuente de carbono y
diferentes concentraciones de FA
De igual forma que para la fermentacioacuten que teniacutea 50 gL de glucosa en el medio
realizada anteriormente para dichos ensayos el consumo de proteiacutena fue
permanente y se dio casi en su totalidad El ensayo que mayor consumo de
proteiacutena presentoacute fue el que conteniacutea 05 gL de FA arrojando un porcentaje de
consumo del 86 aun asiacute el porcentaje de consumo arrojado por la fermentacioacuten
de 1 gL de FA fue del 84 indicando que no existen diferencias con respecto al
consumo de proteiacutena entre dichas cantidades de FA utilizadas Mientras que el
porcentaje de consumo para 15 gL de FA fue inferior presentando un valor del
72 De acuerdo a los resultados mencionados anteriormente se puede decir que
a mayor concentracioacuten de FA en el medio se presenta menor consumo de
proteiacutena por parte del P cubensis esto se puede afirmar uacutenicamente para los
resultados obtenidos durante esta investigacioacuten a ciertas condiciones
Analizando ahora la relacioacuten entre el consumo de proteiacutena y el crecimiento
micelial se puede ver que al igual que para los ensayos con glucosa a 50 gL se
75
tiene un consumo permanente mientras se estaacute en fase exponencial y una vez se
llega a la fase estacionario alrededor del diacutea 12 la concentracioacuten de proteiacutena en
el medio se estabilizoacute
A la hora de indagar los datos estadiacutesticamente se puede observar que no existen
diferencias significativas sobre el consumo de proteiacutena (concentracioacuten) en el
tiempo con respecto al tipo de sustrato pero al comparar los resultados con los
ensayos donde se antildeadioacute FA al medio se encontroacute que siacute existen diferencias
significativas Se crearon dos grupos homogeacuteneos el primero cuenta con glucosa
y sacarosa presentando medias (cantidad de proteiacutena en el medio) de 468 gL y
473 gL respectivamente mientras que el ensayo con FA se encuentra en otro
grupo en donde su consumo de proteiacutena fue menor presentando una media
(cantidad de proteiacutena en el medio) de 614 gL (Anexo 8)
Tratamientos con y sin FA
Media glucosa (a) 468
Media sacarosa Proteiacutena (a) 473
Media fenilalanina (b) 614
a a
b
0
1
2
3
4
5
6
7
8
Co
nce
ntr
acioacute
n p
rote
iacutena
(gL
)
Letras diferentes denotan diferencias significativas (prueba LSD)
Graacutefico 20 Consumo de proteiacutena para los ensayos con y sin FA
76
34 ESTUDIO CUALITATIVO DE LA PRESENCIA DEL ALCALOIDE
Posterior a las fermentaciones de glucosa sacarosa y glucosa 50 gL con FA y
los respectivos anaacutelisis se realizoacute un uacuteltimo anaacutelisis que a la vez fue el de mayor
relevancia a la hora de determinar cuaacutel de los medios fue el que mejores
resultados arrojoacute En primera instancia se utilizoacute el reactivo de Dragendorff como
indicador de alcaloide para analizar las muestras de los diacuteas 12 13 y 14 con el fin
de esclarecer la presencia de alcaloides (Anexo 17)
Una vez detectada la presencia de alcaloides gracias a la coloracioacuten naranja
presentada en las muestras se procedioacute a realizar la teacutecnica de HPLC con el fin
de hallar un porcentaje del compuesto de intereacutes basado en las aacutereas obtenidas
de los cromatogramas (asumiendo un tiempo de retencioacuten entre 62 y 72
minutos)
341 Produccioacuten de compuestos producidos por P cubensis cuando el
medio no conteniacutea FA
A la hora de analizar y confirmar cuaacutel fue el mejor ensayo de los experimentos
realizados se tuvo como criterio base determinar la fuente de carbono y su
respectiva concentracioacuten que mejor presencia del compuesto de intereacutes arrojoacute
supuesto a un tiempo de retencioacuten entre 62 y 72 minutos
Inicialmente al obtener los anaacutelisis estadiacutesticos se deduce que no existieron
diferencias significativas entre el aacuterea del pico de intereacutes con respecto a todos los
picos arrojados por el cromatograma y los factores estudiados (tipo de sustrato
diacutea de fermentacioacuten y concentracioacuten) puesto que se obtuvieron valores de P-valor
77
de 03310 09580 y 08336 respectivamente es decir no importa queacute tipo de
sustrato se utilice la produccioacuten de alcaloide no tendraacute variaciones (Anexo 9)
Al analizar el graacutefico 21 se puede observar que las medias de las aacutereas halladas
para los diferentes ensayos con glucosa y sacarosa no presentaron diferencias
significativas es decir pertenecen al mismo grupo homogeacuteneo (a) lo que ratifica
lo dicho anteriormente
Tratamiento de las dos fuentes de carbono usadas sin FA (glucosa y sacarosa)
Media glucosa (a) 235916
Media sacarosa (a) 337147
a
a
0
7000
14000
21000
28000
35000
42000
Aacutere
a de
Com
pues
to
Letras diferentes denotan diferencias significativas (prueba LSD)
Graacutefico 21 Aacuterea del compuesto obtenido de P cubensis en tiempo de retencioacuten entre 62 y 72 minutos para las dos fuentes de carbono
Por tal razoacuten fue necesario hacer un anaacutelisis cualitativo de los cromatogramas
obtenidos mediante HPLC el cual se basoacute en la forma del pico arrojado por la
teacutecnica La figura 6 ilustra dicho anaacutelisis
78
Buena resolucioacuten de pico Mala resolucioacuten de pico
(a) (b)
Figura 6 Cromatogramas de dos diferentes fermentaciones de P cubensis que ilustran el criterio de escogencia del mejor ensayo realizado (a) 50 gL
glucosa (b) 50 gL sacarosa
Primero fue necesario observar el tamantildeo del pico y posterior a eacutesto determinar
su resolucioacuten La figura 6 ilustra dos ejemplos el de 50 gL de glucosa el diacutea 13 y
50 gL de sacarosa el diacutea 14 mientras el primero muestra un pico grande y
definido la segunda fermentacioacuten ilustra un pico grande pero poco definido
indicando que en este caso no se resolvioacute correctamente el alcaloide es decir no
se logroacute una buena separacioacuten De esta manera se analizaron los diferentes
cromatogramas para los diacuteas 12 (Anexo 19) 13 (Anexo 20) y 14 (Anexo 21) de
cada fermentacioacuten arrojando diferencias entre los ensayos y llevando a la
conclusioacuten de que la fermentacioacuten que mejores resultados arrojoacute fue la que
conteniacutea 50 gL de glucosa
79
342 Produccioacuten de compuestos producidos por P cubensis cuando el
medio conteniacutea FA
Despueacutes de realizada la fermentacioacuten con glucosa 50 gL y concentraciones de
FA de 05 gL 10 gL y 15 gL se procedioacute de igual manera que en el estudio sin
FA a evaluar cuaacutel de estas tres concentraciones de FA exhibioacute mejor resolucioacuten
del alcaloide
Inicialmente se realizoacute un anaacutelisis estadiacutestico el cual arrojoacute que no existen
diferencias significativas con respecto al aacuterea de pico que en este caso debido al
supuesto representa la Psilocibina y los diacuteas 12 13 y 14 de la fermentacioacuten
Mediante el graacutefico 22 se puede decir que en los uacuteltimos tres diacuteas de las
fermentaciones que conteniacutean FA en el medio no existen diferencias significativas
con respecto al alcaloide de intereacutes obtenido es decir en los tres se produjo el
alcaloide (Anexo 10)
Tratamientos de los uacuteltimos tres diacuteas de fermentacioacuten usando FA
Media diacutea 12 (a) 411758
Media diacutea 13 (a) 413401
Media diacutea 14 (a) 44860
a a a
0
10000
20000
30000
40000
50000
Aacutere
a Co
mpu
esto
Letras diferentes denotan diferencias significativas
Graacutefico 22 Aacuterea del compuesto obtenido de P cubensis en tiempo de retencioacuten entre 62 y 72 minutos en los uacuteltimos tres diacuteas de la fermentacioacuten
con FA y glucosa
80
Igual que en numeral anterior fue necesario realizar anaacutelisis cualitativo para los
cromatogramas por ende se requirioacute observar el tamantildeo del pico y posterior a
eacutesto determinar su resolucioacuten
Buena resolucioacuten de pico Mala resolucioacuten de pico
(a) (b)
Figura 7 Cromatogramas de dos diferentes fermentaciones de P cubensis que ilustran el criterio de escogencia del mejor ensayo realizado (a) 05 gL
FA (b) 15 gL FA
La figura 7 ejemplifica el anaacutelisis realizado para la seleccioacuten del mejor ensayo
ejecutado Se tienen dos cromatogramas el de 05 gL de FA en el diacutea 13 y el de
15 gL de FA para el mismo diacutea
A todos los cromatogramas obtenidos para los diacuteas 12 (Anexo 19) 13 (Anexo 20)
y 14 (Anexo 21) se realizoacute el mismo anaacutelisis y se concluyoacute que la concentracioacuten
maacutes apropiada para la obtencioacuten de la los compuestos producidos por P cubensis
fue de 05 gL de FA debido a que eacuteste generariacutea una disminucioacuten en los costos
81
35 ESTUDIO PORCENTUAL (AacuteREA) DEL ALCALOIDE REALIZADO PARA
LOS DIFERENTES ENSAYOS
Se calculoacute el porcentaje de aacuterea correspondiente al pico que identificoacute que se
asumioacute como el correspondiente a la Psilocibina gracias a la suposicioacuten realizada
del tiempo de retencioacuten
A continuacioacuten se presentan los valores obtenidos y sus respectivos anaacutelisis para
cada tratamiento
351 Porcentaje de la Psilocibina (suposicioacuten) cuando el medio no conteniacutea
FA
Debido a que no se contaba con un estaacutendar de Psilocibina los resultados
mostrados en la tabla 5 se obtuvieron realizando un porcentaje con respecto a las
aacutereas bajo la curva arrojadas mediante el anaacutelisis de cromatografiacutea de alta
eficiencia (Anexos 19 20 y 21) En dichos anexos se encuentran resaltadas en
negrilla aquellas aeacutereas utilizadas
Tabla 5 Porcentaje de aacuterea hallado mediante HPLC para los uacuteltimos tres diacuteas de la fermentacioacuten con concentraciones de 30 gL 50 gL y 70 gL de glucosa
y sacarosa con un tiempo de retencioacuten de 62 y 72 minutos
Diacutea Glucosa
(gL)
Aacuterea
(compuesto
Tr= 62-72)
Sacarosa
(gL)
Aacuterea
(compuesto
Tr= 62-72)
12 30 60650 30 3664
12 50 7396 50 5857
12 70 4816 70 3415
13 30 702 30 2876
13 50 6815 50 4113
13 70 6733 70 5583
14 30 4824 30 2756
14 50 4821 50 2792
14 70 017 70 1429
82
A la hora de analizar los datos de la tabla 5 se puede observar que el mayor
porcentaje de aacuterea se obtuvo cuando se trabajoacute con glucosa como fuente de
carbono y concretamente a una concentracioacuten de 50 gL
Analizando los datos estadiacutesticamente no se obtuvieron diferencias significativas
en cuanto a la produccioacuten del compuesto (aacuterea) con respecto al tipo de sustrato
utilizado durante las fermentaciones es decir es indiferente si se utiliza glucosa o
sacarosa en el cultivo de P cubensis en medio sumergido de Fang-Zhong
El graacutefico 23 ilustra las medias (aacuterea) obtenidas para la produccioacuten de alcaloide en
las dos diferentes fuentes de carbono es decir glucosa y sacarosa exponiendo
un uacutenico grupo homogeacuteneo con medias (produccioacuten de alcaloide) de aacutereas de
219635 y 234391 para glucosa y sacarosa respectivamente (Anexo 11)
Tratamientos de las dos fuentes de carbono usadas sin FA (glucosa y sacarosa)
Media glucosa (a) 219635
Media sacarosa (a) 234391
a
a
2000
2100
2200
2300
2400
Aacuterea
Com
pues
to
Letras diferentes denotan diferencias significativas (prueba LSD)
Graacutefico 23 Aacuterea del compuesto obtenido de P cubensis en tiempo de retencioacuten entre 62 y 72 minutos para cada una de las fuentes de carbono
utilizadas
Aun asiacute estudiando los graacuteficos de HPLC con el criterio mencionado
anteriormente es decir observando el tamantildeo del pico y su resolucioacuten del mismo
83
se observoacute claramente que la presencia del alcaloide (tiempo de retencioacuten
supuesto entre 62 y 72 minutos) fue mejor cuando se trabajoacute con glucosa a una
concentracioacuten de 50 gL debido que presenta el mejor pico
352 Porcentaje de aacuterea de compuestos presentes en P cubensis cuando
el medio conteniacutea FA
Con el fin de observar si la adicioacuten de FA al medio si arrojoacute mejores resultados en
cuanto a la produccioacuten del compuesto presente entre un rango de 62 y 72
minutos como tiempo de retencioacuten se procedioacute a calcular el porcentaje del aacuterea
de intereacutes de acuerdo a las aacutereas arrojadas para cada ensayo por medio del
anaacutelisis de HPLC Los datos obtenidos se ilustran a continuacioacuten en la tabla 6
Tabla 6 Porcentaje hallado mediante HPLC para los uacuteltimos tres diacuteas de la fermentacioacuten con concentraciones de 05 gL 10 gL y 15 gL de FA y 50 gL
de glucosa con un tiempo de retencioacuten entre 62 y 72 minutos
Diacutea
Glucosa
50 gL +
FA
Aacuterea
(compuesto
Tr=62-72)
12 0 4315
12 05 2931
12 1 6236
12 15 847
13 0 3257
13 05 7549
13 1 4790
13 15 2721
14 0 4822
14 05 3863
14 1 5801
14 15 2102
84
Al detallar la tabla 6 puede observarse que el ensayo que mayor porcentaje de
aacuterea arrojoacute fue el que conteniacutea 05 gL de FA arrojando su maacuteximo porcentaje
correspondiente a 755 el diacutea 13 Aun asiacute las diferencias existentes entre ellos
no fueron significativas
Ahora bien al analizarlos estadiacutesticamente se encontroacute que la produccioacuten del
alcaloide en presencia de FA presentoacute la misma tendencia que los ensayos
analizados anteriormente sin eacutesta pero gracias a que este aminoaacutecido duplico la
cantidad de biomasa y debido a que el compuesto de intereacutes se produce
intracelularmente se afirma que el uso de FA aumentoacute la generacioacuten del
compuesto evaluado (Anexo 12)
El graacutefico 24 presenta las diferentes medias en cuanto al porcentaje de aacuterea del
compuesto presente entre 62 y 72 minutos para los diferentes tratamientos de
glucosa a una concentracioacuten de 50 gL y sus concentraciones respectivas de FA
Claramente se ve que soacutelo existe un grupo homogeacuteneo lo que reafirma que no
existen diferencias significativas de la produccioacuten con respecto a las
concentraciones de FA
85
Tratamientos con y sin FA
Media 0 gL FA (a) 3122
Media 05 gL FA (a) 2391
Media 10 gL FA (a) 2823
Media 15 gL FA (a) 2113
a
aa
a
0
5
10
15
20
25
30
35
40
Aacutere
a Co
mpu
esto
Letras diferentes denotan diferencias significativas (prueba LSD)
Graacutefico 24 Aacuterea del compuesto obtenido de P cubensis en tiempo de retencioacuten entre 62 y 72 minutos para cada una de las concentraciones de
FA utilizadas
Debido a que no se encontraron diferencias significativas en cuanto al porcentaje
de aacuterea obtenido mediante los cromatogramas se concluye que el mejor medio es
el que tiene como fuente de carbono glucosa a una concentracioacuten de 50 gL y una
adicioacuten de 05 gL de FA puesto que genera una disminucioacuten en costos
86
CONCLUSIONES
No existen diferencias significativas en el crecimiento micelial de P
cubensis en medio sumergido Fang-Zhong cuando se trabaja con fuentes
de carbono glucosa y sacarosa sin embargo se decide trabajar con 50 gL
de glucosa puesto que eacuteste tiene una buena presencia de alcaloide y a su
vez una mejor produccioacuten de biomasa
La concentracioacuten de glucosa utilizada para el crecimiento de P cubensis
influye en el crecimiento micelial obteniendo concentraciones de biomasa
de 062 gL 055 gL y 048 gL para concentraciones de sustrato de 70 50
y 30 gL de glucosa siendo las dos primeras significativamente diferentes
con respecto a la de 30 gL
La concentracioacuten de sacarosa utilizada para el crecimiento de P cubensis
influye en el crecimiento micelial obteniendo concentraciones de biomasa
de 057 gL 045 gL y 026 gL para concentraciones de sustrato de 70 50
y 30 gL de sacarosa siendo significativamente diferentes entre ellas
La resolucioacuten de los picos obtenidos por RP-HPLC del extracto de P
cubensis fue mayor para las fermentaciones realizadas con una
concentracioacuten de 50 gL de glucosa lo que conllevoacute a utilizarlo al realizar
los ensayos que conteniacutean en el medio FA
La concentracioacuten de biomasa de P cubensis obtenida en cultivo sumergido
en medio Fang-Zhong con glucosa se duplicoacute con la adicioacuten de FA No
obstante no existen diferencias significativas entre las concentraciones de
FA utilizadas
87
El consumo de proteiacutena presentada por P cubensis en medio Fang-Zhong
fue casi del 100 mientras que el consumo de sustrato para el mismo
medio estuvo alrededor del 40
El consumo de sustrato durante el transcurso de las fermentaciones que no
conteniacutean FA en el medio no presentoacute diferencias significativas con
respecto a las dos fuentes de carbono utilizadas Mientras que en aquellas
fermentaciones donde se agregoacute FA al medio siacute existieron diferencias
significativas entre las fermentaciones de 15 y 1 gL de FA con respecto a
los ensayos realizados con 05 gL FA Sin embargo el P cubensis
consumioacute mayor cantidad de sustrato cuando el medio no conteniacutea FA
Se evidencioacute que el P cubensis consumioacute mayor cantidad de proteiacutena
cuando el sustrato utilizado en el medio fue glucosa y a su vez se detecto
que la adicioacuten de FA al medio tuvo como efecto la disminucioacuten en el
consumo de sustrato por parte del microorganismo
El consumo de sustrato y de proteiacutena tuvo un comportamiento similar
puesto que fue consumido permanentemente durante la fase exponencial
para cada uno de los tratamientos realizados es decir las concentraciones
de 30 gL 50 gL y 70 gL de glucosa y sacarosa como fuente de carbono y
de 05 gL 1 gL y 15 gL de FA teniendo como fuente de carbono glucosa
a una concentracioacuten de 50 gL mientras que en la fase estacionaria su
consumo se disminuyoacute permaneciendo casi constante
Despueacutes de realizados los estudios en cuanto a la produccioacuten del
compuesto presente entre 62 y 72 minutos para cada uno de los ensayos
no se evidenciaron diferencias significativas entre las dos fuentes de
carbono utilizadas (glucosa y sacarosa)
88
La adicioacuten del precursor llamado Fenilalanina (FA) al medio sumergido
Fang-Zhong para llevar a cabo el cultivo del P cubensis tuvo influencia en
cuanto a la produccioacuten de compuesto presente entre tiempo de retencioacuten de
62 y 72 minutos debido a que eacuteste duplicoacute la concentracioacuten de biomasa
en el medio se dice entonces que la produccioacuten aumentoacute al ser eacuteste de
produccioacuten intracelular
La resolucioacuten del compuesto presente entre el tiempo de retencioacuten de 62 a
72 minutos se obtuvo mejor en el ensayo que conteniacutea 05 gL de FA y al
saber que no existieron diferencias significativas en la produccioacuten en cuanto
al porcentaje de aacutereas obtenido con respecto a las demaacutes concentraciones
de FA se afirma que eacuteste es el medio que mejores resultados arrojoacute para
el crecimiento de P cubensis y la produccioacuten de Psilocibina
89
RECOMENDACIONES
Se sugiere observar el efecto que tiene la variacioacuten de las revoluciones a
las cuales se realizaron las fermentaciones para ver como variacutea el
crecimiento del P cubensis en medio sumergido Fang-Zhong con respecto
a dicho factor
Debido a que soacutelo se realizaron anaacutelisis sobre el crecimiento del P
cubensis en medio sumergido haciendo uso de dos sustratos diferentes
(glucosa y sacarosa) seriacutea recomendable realizar el mismo anaacutelisis para
otro tipo de sustrato como por ejemplo melaza por su bajo costo
Del mismo modo seriacutea apropiado realizar el estudio con otro tipo de
precursor y en otras concentraciones para ver la incidencia de eacuteste en el
comportamiento del hongo
Se recomienda realizar un escalamiento de dicho proceso en un biorreactor
con el fin de evaluar a mayor escala el crecimiento del P cubensis y la
produccioacuten del alcaloide
Debido a que la proteiacutena se comportoacute como el principal nutriente se sugiere
para una proacutexima investigacioacuten evaluar diferentes concentraciones de
proteiacutena en el medio
90
ANEXOS
Anexo 1 Anaacutelisis de varianza (ANOVA) para el crecimiento de biomasa de
las fermentaciones con glucosa
Tabla 7 Anaacutelisis de Varianza para el crecimiento micelial (glucosa)
Tabla 8 Anaacutelisis Muacuteltiple de Rangos para el crecimiento micelial (glucosa)
91
Anexo 2 Anaacutelisis de Varianza (ANOVA) para el crecimiento de biomasa de
las fermentaciones con sacarosa
Tabla 9 Anaacutelisis de Varianza para el crecimiento micelial (sacarosa)
Tabla 10 Anaacutelisis Muacuteltiple de Rangos para el crecimiento micelial (sacarosa)
92
Anexo 3 Anaacutelisis de Varianza (ANOVA) para el crecimiento de biomasa de
las fermentaciones con glucosa y sacarosa
Tabla 11 Anaacutelisis de Varianza para el crecimiento micelial (glucosa y
sacarosa)
Tabla 12 Anaacutelisis Muacuteltiple de Rangos para el crecimiento micelial (glucosa y
sacarosa)
93
Anexo 4 Anaacutelisis de Varianza (ANOVA) para el crecimiento de biomasa de
las fermentaciones con glucosa 50 gL y FA
Tabla 13 Anaacutelisis de Varianza para el crecimiento micelial (glucosa 50 gL y
FA)
Tabla 14 Anaacutelisis Muacuteltiple de Rangos para el crecimiento micelial (glucosa
50 gL y FA)
94
Anexo 5 Anaacutelisis de varianza (ANOVA) para el consumo de sustrato en las
fermentaciones sin FA
Tabla 15 Anaacutelisis de Varianza para el consumo de Sustrato sin FA
Tabla 16 Anaacutelisis Muacuteltiple de Rangos para el consumo de Sustrato sin FA
95
Anexo 6 Anaacutelisis de Varianza (ANOVA) para el consumo de sustrato en las
fermentaciones con FA
Tabla 17 Anaacutelisis de Varianza para el consumo de Sustrato con FA
Tabla 18 Anaacutelisis Muacuteltiple de Rangos para el consumo de Sustrato con FA
96
Anexo 7 Anaacutelisis de Varianza (ANOVA) para el consumo de proteiacutena en las
fermentaciones sin FA
Tabla 19 Anaacutelisis de Varianza para el consumo de Proteiacutena sin FA
Tabla 20 Anaacutelisis Muacuteltiple de Rangos para el consumo de Proteiacutena sin FA
97
Anexo 8 Anaacutelisis de Varianza (ANOVA) para el consumo de proteiacutena en las
fermentaciones con FA
Tabla 21Anaacutelisis de Varianza para el consumo de Proteiacutena con FA
Tabla 22 Anaacutelisis Muacuteltiple de Rangos para el consumo de Proteiacutena con FA
98
Anexo 9 Anaacutelisis de Varianza (ANOVA) para la produccioacuten de Psilocibina en
las fermentaciones sin FA
Tabla 23 Anaacutelisis de Varianza para la produccioacuten de Psilocibina sin FA
Tabla 24 Anaacutelisis Muacuteltiple de Rangos para la produccioacuten de Psilocibina
seguacuten el Sustrato sin FA
99
Anexo 10 Anaacutelisis de Varianza (ANOVA) para la produccioacuten de Psilocibina en las fermentaciones con FA
Tabla 25 Anaacutelisis de Varianza para la produccioacuten de Psilocibina con FA
Tabla 26 Anaacutelisis Muacuteltiple de Rangos para la produccioacuten de Psilocibina
seguacuten el diacutea con FA
100
Anexo 11 Anaacutelisis de Varianza (ANOVA) para la cuantificacioacuten porcentual de
Psilocibina en las fermentaciones sin FA
Tabla 27 Anaacutelisis de Varianza para la cuantificacioacuten de Psilocibina sin FA
Tabla 28 Anaacutelisis Muacuteltiple de Rangos para la cuantificacioacuten de Psilocibina
seguacuten el tipo de sustrato sin FA
101
Anexo 12 Anaacutelisis de Varianza (ANOVA) para la cuantificacioacuten porcentual de
Psilocibina en las fermentaciones con FA
Tabla 29 Anaacutelisis de Varianza para la cuantificacioacuten de Psilocibina con FA
Tabla 30 Anaacutelisis Muacuteltiple de Rangos para la cuantificacioacuten de Psilocibina
seguacuten la concentracioacuten con FA
102
Anexo 13 Determinacioacuten de consumo de azuacutecares por el meacutetodo de DNS
(Aacutecido Dinitrosaliciacutelico)
a DNS para glucosa
Pasos para preparar DNS
Disolver 16 gr de NaOH en agua destilada
Adicionar 30 gr de tartrato de Na y K
Aforar a 100 ml con agua destilada
Almacenar en frascos aacutembar a 4degC
Se debe mantener un stock de glucosa 4mgml y almacenarlo a 4degC A partir
de la solucioacuten de glucosa se preparan las soluciones para hacer la curva
patroacuten con las siguientes concentraciones (gL) 025 050 100 200 y 400
Procedimiento
Tomar 05 ml de cada dilucioacuten y agregar 05 ml de reactivo DNS
Preparar una muestra blanco por dilucioacuten de 05 ml de agua destilada a 05
ml de reactivo de DNS
Agitar todas las muestras
Colocar a ebullir las muestras en bantildeo mariacutea por cinco minutos
Enfriar con hielo
Adicionar 5 ml de agua destilada
Agitar y dejar en reposo 15 minutos
Leer en espectrofotoacutemetro a 540 nm
Realizar la curva Absorbancia Vs Concentracioacuten Debe tener un coeficiente
de correlacioacuten de 0991 a 0999
b DNS para sacarosa
Pasos para preparar DNS sacarosa
Preparacioacuten de la solucioacuten Standard stock de sacarosa (30 gL) tomar 30
gr de sacarosa anhiacutedrida grado reactivo con exactitud hasta la deacutecima de
mg disolver ajustar a aforo de 100 ml con agua desionizada empacar en
viales y almacenar en congelador
Preparacioacuten DNS pesar 16 gr de hidroacutexido de sodio grado reactivo 30 gr
de tartrato de sodio y potasio y disolverlos juntos con 50 ml de agua
103
desionizada aparte pesar 10 gr del DNS disolver con 30 ml de agua
desionizada agregar lentamente y con agitacioacuten la solucioacuten del DNS a la
solucioacuten de tartrato y NaOH anteriormente preparadas ajustar a 100 ml
filtrar envasar en frasco aacutembar y rotular con fecha de vencimiento incluida
(3 meses maacuteximo) mantener a la temperatura del laboratorio
Preparacioacuten del reactivo NaOH 10 N (500 ml) pesar con exactitud hasta
la deacutecima de mg 20 gr de NaOH grado reactivo por cada 500 ml de
solucioacuten disolver primero con 300 ml de agua desionizada y luego aforar a
500 ml envasar y rotular correctamente y mantener a la temperatura del
laboratorio
Preparacioacuten de HCL 10 (100 ml) tomar 27 ml de aacutecido clorhiacutedrico al
37 grado reactivo y aforar hasta 100 ml con agua desionizada envasar
rotular correctamente de acuerdo a la norma del laboratorio y almacenar a
la temperatura del laboratorio
Se debe mantener un stock de glucosa 30 gL y almacenarlo a 4degC A partir
de la solucioacuten de glucosa se preparan las soluciones para hacer la curva
patroacuten con las siguientes concentraciones (gL) 3 6 12 18 24 y 30
Procedimiento
Preparar en cada tubo (las soluciones de la curva patroacuten de sacarosa las
muestras problemas diluidas si es necesario y como blanco agua
desionizada) 100microl de solucioacuten
Adicionar 200 microl de HCL 10 a cada tubo y agitar todos los tubos en vortex
Llevar a ebullicioacuten por 10 minutos en bantildeo mariacutea precalentado a 95degC
Enfriar hasta temperatura ambiente raacutepidamente
Adicionar a cada tubo 1 ml de NaOH 10 N y agitar los tubos en vortex
Aparte tomar 05 ml de cada tubo en otros tubos rotulados y agregar 05 ml
del DNS
Agitar todas las muestras en vortex
Llevar a ebullicioacuten por 5 minutos en bantildeo mariacutea precalentado a 96degC
Enfriar hasta temperatura ambiente raacutepidamente
Adicionar 5 ml de H2O desionizada agitar en vortex y dejar reposar por 15
minutos
Leer en espectrofotoacutemetro a 540 nm
Realizar la curva Absorbancia Vs Concentracioacuten Debe tener un coeficiente
de correlacioacuten de 0991 a 0999
104
Anexo 14 Cineacutetica de Consumo de Sustrato
La cineacutetica de consumo de sustrato se realizoacute por el meacutetodo de Aacutecido
Dinitrosaliciacutelico (DNS) Los rangos de concentracioacuten y absorbancia para cada caso
se citan a continuacioacuten
Rangos de concentraciones y absorbancias para las fermentaciones que
usaron glucosa (30 gL 50 gL y 70 gL) como sustrato
Concentracioacuten de 02 a 12 gL
Absorbancia de 01234 a 06612
Ecuacioacuten Y = 19174x -00517 R2 = 09923
Rangos de concentraciones y absorbancias para las fermentaciones que
usaron sacarosa (30 gL 50 gL y 70 gL) como sustrato
Concentracioacuten de 3 a 30 gL
Absorbancia de 00822 a 11112
Ecuacioacuten Y = 25983x + 04857 R2 = 09978
Rangos de concentraciones y absorbancias para las fermentaciones que
usaron glucosa 50 gL como sustrato y FA
Concentracioacuten de 02 a 12 gL
Absorbancia de 0097 a 063
Ecuacioacuten Y = 18785x + 00019 R2 = 09986
105
Anexo 15 Determinacioacuten de consumo de proteiacutenas por el meacutetodo de LOWRY
Pasos para la preparacioacuten de LOWRY
Para obtener la curva estaacutendar de Albuacutemina se preparan 5 soluciones
patrones de Albuacutemina en NaCL al 09 (PV) de las siguientes
concentraciones 152 80 200 300 400 Pgml Si la concentracioacuten de
Proteiacutena total es menor de 500 Pgml se lee la absorbancia a 750 nm si
estaacute entre 1000 y 2000 Pgml se lee a 550nm
Se prepara un blanco que no lleva Albuacutemina y en su reemplazo se adiciona
0-5 ml de solucioacuten salina (NaCL) al 09 (PV) Se aplica el mismo
procedimiento que a las demaacutes muestras
Procedimiento
Servir en tubos de ensayo 05 ml de las soluciones patroacuten de Albuacutemina las
muestras problema y NaCL al 09 como blanco Deben estar marcados
para conservar el orden de concentraciones para la curva
Adicionar a cada tubo 05 ml de NaOH 2N y llevar al bantildeo Mariacutea
precalentado a 100degC por un tiempo de 10 minutos
Dejar enfriar hasta que alcance la Temperatura Ambiente
Agregar a cada tubo 5 ml de la solucioacuten complejante mezclar y dejar
reposar por 10 minutos
Adicionar 05 ml del reactivo de Folin-Ciocalteu 11 vortexiar durante 20
segundos
Reposar en un cuarto oscuro durante 30 minutos
Leer la absorbancia a 750 nm y con las soluciones patroacuten construir la
graacutefica Absorbancia Vs Concentracioacuten de Albuacutemina Seacuterica de Bovina
(BSA) con eacutesta se puede determinar la concentracioacuten de las muestras
problema interpolando el valor de la Absorbancia La curva estaacutendar debe
tener un coeficiente de correlacioacuten de 0991 a 0999
106
Anexo 16 Cineacutetica consumo de Proteiacutena
La cineacutetica de consumo de proteiacutena se realizoacute por el meacutetodo LOWRY Los rangos
de concentracioacuten y absorbancia para cada caso se citan a continuacioacuten
Rangos de concentraciones y absorbancias para las fermentaciones que
usaron glucosa (30 gL 50 gL y 70 gL) como sustrato
Concentracioacuten de 0016 a 04 gL
Absorbancia de 00094 a 05382
Ecuacioacuten Y = 07427x ndash 00021 R2 = 09955
Rangos de concentraciones y absorbancias para las fermentaciones que
usaron sacarosa (30 gL 50 gL y 70 gL) como sustrato
Concentracioacuten de 0016 a 04 gL
Absorbancia de 00374 a 06178
Ecuacioacuten Y = 06567x ndash 00166 R2 = 09968
Rangos de concentraciones y absorbancias para las fermentaciones que
usaron glucosa 50 gL como sustrato y FA
Concentracioacuten de 0016 a 04 gL
Absorbancia de 00708 a 04647
Ecuacioacuten Y = 09814x ndash 00581 R2 = 09992
107
Anexo 17 Prueba de reactivo de Dragendorff
Preparacioacuten de reactivo de Dragendorff para alcaloides
Reactivo de Dragendorff se prepara mezclando 8 gr de nitrato de bismuto
pentahidratado en 20 ml de aacutecido niacutetrico al 30 con una solucioacuten de 272 g de
yoduro de potasio en 50 ml de agua Se deja en reposo por 24 horas se decanta y
se afora a 100 ml La presencia de alcaloides se detecta por la formacioacuten de un
precipitado naranja rojizo cuando se le adiciona esta reactivo a una solucioacuten aacutecida
de alcaloides De los precipitados lavados se puede recuperar los alcaloides con
una solucioacuten saturada de carbonato de sodio (Mercano y Hasegawa 1991)
La figura mostrada a continuacioacuten refleja la presencia del alcaloide debido a la
coloracioacuten amarillo-rojiza que eacutesta sufrioacute
Figura 8 Muestra de biomasa una vez analizada mediante el reactivo de Dragendorff
108
Anexo 18 Barrido Espectral para el Psilocybe cubensis
La metodologiacutea mencionada a continuacioacuten estaacute basada en artiacuteculo base
(Tsujikawa et al 2003)
El Sistema de HPLC consiste en un Shimadzu LC-10ordf Series Cromatografiacutea
Liacutequida equipada con un diodo SPD-M10A detector de red fija en 220nm La
separacioacuten cromatograacutefica ser realizoacute con una columna simeacutetrica C18 (21 mm a
150 mm 5mm Waters Assoc Milford EEUU
La fase moacutevil utilizada fue de 10 mm de formato de amonio-aacutecido foacutermico (955
VV) a un pH de 35 y bombeado a un caudal de 02 mlminuto
El perfil cromatograacutefico obtenido durante la investigacioacuten de Tsujikawa et al
(2003) se muestra en le figura 6 que aparece a continuacioacuten
Figura 9 Perfil cromatograacutefico (Tsujikawa et al 2003)
109
Anexo 19 Cromatogramas (HPLC) del diacutea 12 de fermentacioacuten
Tabla 31 Aacutereas obtenidas de los cromatogramas para el P cubensis en
medio Fang-Zhong en el diacutea 12 para concentraciones de 30gL glucosa y
30gL sacarosa
SustratoConcentracioacuten
(gL)
Tiempo
(s)Aacuterea
Glucosa 30 2957 3837
Glucosa 30 6838 474753
Glucosa 30 9144 47256
Glucosa 30 9489 16822
Glucosa 30 10124 224349
Sacarosa 30 6538 143772
Sacarosa 30 7234 269458
Sacarosa 30 9721 33646
Sacarosa 30 11845 24384
(a) (b)
Graacutefico 25 Cromatogramas del diacutea 12 para el P cubensis cultivado en medio
sumergido Fang-Zhong con dos diferentes tipos de sustratos (a) 30 gL
glucosa (b) 30 gL sacarosa
110
Tabla 32 Aacutereas obtenidas de los cromatogramas para el P cubensis en
medio Fang-Zhong en el diacutea 12 para concentraciones de 50gL glucosa y
50gL sacarosa
SustratoConcentracioacuten
(gL)
Tiempo
(s)Aacuterea
Glucosa 50 0524 319
Glucosa 50 6298 5991
Glucosa 50 7172 237042
Glucosa 50 9144 16387
Glucosa 50 10009 6077
Sacarosa 50 169 24011
Sacarosa 50 3105 28573
Sacarosa 50 6916 112166
Sacarosa 50 9136 4057
Sacarosa 50 9933 8821
Sacarosa 50 10398 13872
(a) (b)
Graacutefico 26 Cromatogramas del diacutea 12 para el P cubensis cultivado en medio
sumergido Fang-Zhong con dos diferentes tipos de sustratos (a) 50 gL
glucosa (b) 50 gL sacarosa
111
Tabla 33 Aacutereas obtenidas de los cromatogramas para el P cubensis en
medio Fang-Zhong en el diacutea 12 para concentraciones de 50gL glucosa y
50gL sacarosa
SustratoConcentracioacuten
(gL)
Tiempo
(s)Aacuterea
Glucosa 70 7217 168598
Glucosa 70 9145 9977
Glucosa 70 997 80558
Sacarosa 70 6803 287387
Sacarosa 70 7517 131049
Sacarosa 70 7775 4434
Sacarosa 70 7871 77109
Sacarosa 70 823 96239
Sacarosa 70 9039 5114
Sacarosa 70 9778 25394
(a) (b)
Graacutefico 27 Cromatogramas del diacutea 12 para el P cubensis cultivado en medio
sumergido Fang-Zhong con dos diferentes tipos de sustratos (a) 50 gL
glucosa (b) 50 gL sacarosa
112
Tabla 34 Aacutereas obtenidas de los cromatogramas para el P cubensis en
medio Fang-Zhong en el diacutea 12 para concentraciones de 50gL y glucosa
50gL sacarosa
SustratoConcentracioacuten
(gL)
Tiempo
(s)Aacuterea
Glucosa 50 05 0818 4722
Glucosa 50 05 2423 52579
Glucosa 50 05 3502 88765
Glucosa 50 05 6137 16009
Glucosa 50 05 6722 275258
Glucosa 50 05 733 226399
Glucosa 50 05 8339 65139
Glucosa 50 05 9101 36797
Glucosa 50 05 9815 130883
Glucosa 50 1 1105 743
Glucosa 50 1 2746 2701
Glucosa 50 1 4304 80304
Glucosa 50 1 6167 19649
Glucosa 50 1 6794 51753
Glucosa 50 1 8282 82997
Glucosa 50 1 9116 38659
Glucosa 50 1 9899 136953
Glucosa 50 15 1198 3313
Glucosa 50 15 2937 37875
Glucosa 50 15 4332 51079
Glucosa 50 15 614 25602
Glucosa 50 15 6737 668905
Glucosa 50 15 8209 107332
Glucosa 50 15 9602 38902
Glucosa 50 15 9752 139613
Diacutea 12
(a) (b)
(c)
Graacutefico 28 Cromatograma del diacutea 12 para el P cubensis cultivado en medio
sumergido Fang-Zhong con fuente de carbono glucosa y adicioacuten de
fenilalanina en tres concentraciones (a) 05 gL FA (b) 1 gL FA (c) 15gL
FA
113
Anexo 20 Cromatogramas (HPLC) del diacutea 13 de fermentacioacuten
Tabla 35 Aacutereas obtenidas de los cromatogramas para el P cubensis en
medio Fang-Zhong en el diacutea 13 para concentraciones de 30gL glucosa y
30gL sacarosa
SustratoConcentracioacuten
(gL)
Tiempo
(s)Aacuterea
Glucosa 30 0225 1155
Glucosa 30 2847 699
Glucosa 30 4043 1038
Glucosa 30 6231 4994
Glucosa 30 6787 295182
Glucosa 30 7462 241146
Glucosa 30 9066 51836
Glucosa 30 10004 158746
Sacarosa 30 1734 135
Sacarosa 30 5838 1857
Sacarosa 30 6803 147867
Sacarosa 30 7305 30464
Sacarosa 30 7599 174643
Sacarosa 30 9107 8564
Sacarosa 30 9897 104278
(a) (b)
Graacutefico 29 Cromatogramas del diacutea 13 para el P cubensis cultivado en medio
sumergido Fang-Zhong con dos diferentes tipos de sustratos (a) 30 gL
glucosa (b) 30 gL sacarosa
114
Tabla 36 Aacutereas obtenidas de los cromatogramas para el P cubensis en
medio Fang-Zhong en el diacutea 13 para concentraciones de 50gL glucosa y
50gL sacarosa
SustratoConcentracioacuten
(gL)
Tiempo
(s)Aacuterea
Glucosa 50 1408 13982
Glucosa 50 6949 331449
Glucosa 50 9012 25201
Glucosa 50 9936 27216
Sacarosa 50 1543 7293
Sacarosa 50 6813 437765
Sacarosa 50 9085 35897
Sacarosa 50 10049 184461
(a) (b)
Graacutefico 30 Cromatogramas del diacutea 13 para el P cubensis cultivado en medio
sumergido Fang-Zhong con dos diferentes tipos de sustratos (a) 50 gL
glucosa (b) 50 gL sacarosa
115
Tabla 37 Aacutereas obtenidas de los cromatogramas para el P cubensis en
medio Fang-Zhong en el diacutea 13 para concentraciones de 70gL glucosa y
70gL sacarosa
SustratoConcentracioacuten
(gL)
Tiempo
(s)Aacuterea
Glucosa 70 1456 3223
Glucosa 70 2985 2423
Glucosa 70 54 7586
Glucosa 70 6262 5149
Glucosa 70 7151 248331
Glucosa 70 9039 19346
Glucosa 70 9929 4906
Glucosa 70 11051 33698
Sacarosa 70 0437 342
Sacarosa 70 1428 812
Sacarosa 70 2948 2191
Sacarosa 70 5473 4854
Sacarosa 70 6286 5336
Sacarosa 70 6848 3649
Sacarosa 70 733 11383
Sacarosa 70 9073 1018
Sacarosa 70 9878 11072
Sacarosa 70 10267 18797
(a) (b)
Graacutefico 31 Cromatogramas del diacutea 13 para el P cubensis cultivado en medio
sumergido Fang-Zhong con dos diferentes tipos de sustratos (a) 70 gL
glucosa (b) 70 gL sacarosa
116
Tabla 38 Aacutereas obtenidas de los cromatogramas para el P cubensis en
medio Fang-Zhong en el diacutea 13 para concentraciones de 50gL y glucosa
50gL sacarosa
SustratoConcentracioacuten
(gL)
Tiempo
(s)Aacuterea
Glucosa 50 05 4067 22222
Glucosa 50 05 7379 55573
Glucosa 50 05 902 19513
Glucosa 50 05 9716 119261
Glucosa 50 05 1173 19427
Glucosa 50 1 0793 14776
Glucosa 50 1 2868 28537
Glucosa 50 1 6224 1206
Glucosa 50 1 6782 571299
Glucosa 50 1 8303 92665
Glucosa 50 1 9081 30371
Glucosa 50 1 9738 168959
Glucosa 50 1 11813 27921
Glucosa 50 15 0412 269
Glucosa 50 15 2482 14692
Glucosa 50 15 3486 91059
Glucosa 50 15 6039 6892
Glucosa 50 15 6627 216986
Glucosa 50 15 7216 260795
Glucosa 50 15 8112 65776
Glucosa 50 15 8888 19083
Glucosa 50 15 9497 37812
Glucosa 50 15 9839 65922
Glucosa 50 15 11655 7331
(a) (b)
(c)
Graacutefico 32 Cromatogramas del diacutea 12 para el P cubensis cultivado en medio
sumergido Fang-Zhong con fuente de carbono glucosa y adicioacuten de
fenilalanina en tres concentraciones (a) 05 gL FA (b) 1 gL FA (c) 15gL
FA
117
Anexo 21 Cromatogramas (HPLC) del diacutea 14 de fermentacioacuten
Tabla 39 Aacutereas obtenidas de los cromatogramas para el P cubensis en
medio Fang-Zhong en el diacutea 14 para concentraciones de 30gL glucosa y 30
gL sacarosa
SustratoConcentracioacuten
(gL)
Tiempo
(s)Aacuterea
Glucosa 30 1054 181
Glucosa 30 2553 8939
Glucosa 30 6219 7557
Glucosa 30 6585 77083
Glucosa 30 7158 285069
Glucosa 30 8987 33875
Glucosa 30 9848 87461
Glucosa 30 10694 52151
Glucosa 30 12482 7992
Glucosa 30 12943 23064
Glucosa 30 1493 5948
Sacarosa 30 7309 7075
Sacarosa 30 9984 1680
Sacarosa 30 10442 15395
Sacarosa 30 11211 8511
Sacarosa 30 13405 3398
(a) (b)
Graacutefico 33 Cromatogramas del diacutea 14 para el P cubensis cultivado en medio
sumergido Fang-Zhong con dos diferentes tipos de sustratos (a) 30 gL
glucosa (b) 30 gL sacarosa
118
Tabla 40 Aacutereas obtenidas de los cromatogramas para el P cubensis en
medio Fang-Zhong en el diacutea 14 para concentraciones de 50gL glucosa y
50gL sacarosa
SustratoConcentracioacuten
(gL)
Tiempo
(s)Aacuterea
Glucosa 50 2029 8318
Glucosa 50 6257 5782
Glucosa 50 6875 306684
Glucosa 50 9068 22819
Glucosa 50 9808 92492
Glucosa 50 12113 8823
Glucosa 50 12752 23988
Sacarosa 50 1036 3783
Sacarosa 50 2356 7005
Sacarosa 50 653 44831
Sacarosa 50 6657 127617
Sacarosa 50 7264 66908
Sacarosa 50 7464 255141
Sacarosa 50 9035 26172
Sacarosa 50 9458 28427
Sacarosa 50 9889 37574
Sacarosa 50 10312 140881
Sacarosa 50 12335 13391
Sacarosa 50 1292 17066
(a) (b)
Graacutefico 34 Cromatogramas del diacutea 14 para el P cubensis cultivado en medio
sumergido Fang-Zhong con dos diferentes tipos de sustratos (a) 50 gL
glucosa (b) 50 gL sacarosa
119
Tabla 41 Aacutereas obtenidas de los cromatogramas para el P cubensis en
medio Fang-Zhong en el diacutea 14 para concentraciones de 70gL glucosa y
70gL sacarosa
SustratoConcentracioacuten
(gL)
Tiempo
(s)Aacuterea
Glucosa 70 6257 5879
Glucosa 70 6373 145551
Glucosa 70 7015 68223
Glucosa 70 7199 9085
Glucosa 70 735 265755
Glucosa 70 9014 4642
Glucosa 70 9877 97804
Glucosa 70 107 67421
Glucosa 70 12625 26231
Glucosa 70 1305 65607
Sacarosa 70 2283 4683
Sacarosa 70 5191 93
Sacarosa 70 6304 3719
Sacarosa 70 6795 136542
Sacarosa 70 726 29869
Sacarosa 70 7515 75545
Sacarosa 70 7872 119563
Sacarosa 70 9166 1244
Sacarosa 70 9658 23096
Sacarosa 70 9871 25866
Sacarosa 70 10421 105108
Sacarosa 70 12347 11115
Sacarosa 70 12861 35503
Sacarosa 70 14272 3676
(a) (b)
Graacutefico 35 Cromatogramas del diacutea 14 para el P cubensis cultivado en medio
sumergido Fang-Zhong con dos diferentes tipos de sustratos (a) 70 gL
glucosa (b) 70 gL sacarosa
120
Tabla 42 Aacutereas obtenidas de los cromatogramas para el P cubensis en medio Fang-Zhong en el diacutea 13 para concentraciones de 50gL glucosa y
50gL sacarosa
SustratoConcentracioacuten
(gL)
Tiempo
(s)Aacuterea
Glucosa 50 05 0123 173
Glucosa 50 05 0699 7584
Glucosa 50 05 2594 2742
Glucosa 50 05 6104 11663
Glucosa 50 05 6616 487848
Glucosa 50 05 7235 287918
Glucosa 50 05 8183 135793
Glucosa 50 05 8903 5143
Glucosa 50 05 9484 66817
Glucosa 50 05 9679 168855
Glucosa 50 05 11671 4216
Glucosa 50 1 0345 295
Glucosa 50 1 2654 11981
Glucosa 50 1 412 45301
Glucosa 50 1 6111 12626
Glucosa 50 1 6757 526655
Glucosa 50 1 8093 104277
Glucosa 50 1 894 25251
Glucosa 50 1 9643 158685
Glucosa 50 1 11666 22779
Glucosa 50 15 0353 283
Glucosa 50 15 2522 15272
Glucosa 50 15 3577 83963
Glucosa 50 15 6668 47137
Glucosa 50 15 7304 371442
Glucosa 50 15 8226 117611
Glucosa 50 15 8923 61949
Glucosa 50 15 9657 19618
Glucosa 50 15 11668 35606
(a) (b)
(c)
Graacutefico 36 Cromatogramas del diacutea 12 para el P cubensis cultivado en medio sumergido Fang-Zhong con fuente de carbono glucosa y adicioacuten de
fenilalanina en tres concentraciones (a) 05 gL FA (b) 1 gL FA (c) 15gL FA (a) 05 gL FA (b) 1 gL FA (c) 15gL FA
121
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viii
341 Produccioacuten de compuestos producidos por P cubensis cuando el medio no conteniacutea FA ____ 76
342 Produccioacuten de compuestos producidos por P cubensis cuando el medio conteniacutea FA ______ 79
35 ESTUDIO PORCENTUAL (AacuteREA) DEL ALCALOIDE REALIZADO PARA LOS DIFERENTES ENSAYOS ___ 81
351 Porcentaje de la Psilocibina (suposicioacuten) cuando el medio no conteniacutea FA _______________ 81
352 Porcentaje de aacuterea de compuestos presentes en P cubensis cuando el medio conteniacutea FA _ 83
CONCLUSIONES _________________________________________________________________________ 86
RECOMENDACIONES _____________________________________________________________________ 89
ANEXOS _______________________________________________________________________________ 90
BIBLIOGRAFIacuteA _________________________________________________________________________ 121
ix
LISTA DE TABLAS
TABLA 1 COMPOSICIOacuteN DEL MEDIO DE CULTIVO SUMERGIDO PARA EVALUAR EL CRECIMIENTO MICELIAL
DEL P CUBENSIS 35
TABLA 2 PARAacuteMETROS CINEacuteTICOS OBTENIDOS MEDIANTE EL MODELO LOGIacuteSTICO PARA LAS DIFERENTES
FERMENTACIONES DE P CUBENSIS UTILIZANDO GLUCOSA COMO FUENTE DE CARBONO 48
TABLA 3 PARAacuteMETROS CINEacuteTICOS OBTENIDOS MEDIANTE EL MODELO LOGIacuteSTICO PARA LAS DIFERENTES
FERMENTACIONES DE P CUBENSIS UTILIZANDO SACAROSA COMO FUENTE DE CARBONO 53
TABLA 4 PARAacuteMETROS CINEacuteTICOS OBTENIDOS MEDIANTE EL MODELO LOGIacuteSTICO PARA LAS DIFERENTES
FERMENTACIONES DE P CUBENSIS UTILIZANDO 50 GL DE GLUCOSA COMO FUENTE DE CARBONO Y
DIFERENTES CONCENTRACIONES DE FA 60
TABLA 5 PORCENTAJE DE AacuteREA HALLADO MEDIANTE HPLC PARA LOS UacuteLTIMOS TRES DIacuteAS DE LA
FERMENTACIOacuteN CON CONCENTRACIONES DE 30 GL 50 GL Y 70 GL DE GLUCOSA Y SACAROSA CON
UN TIEMPO DE RETENCIOacuteN DE 62 Y 72 MINUTOS 81
TABLA 6 PORCENTAJE HALLADO MEDIANTE HPLC PARA LOS UacuteLTIMOS TRES DIacuteAS DE LA FERMENTACIOacuteN
CON CONCENTRACIONES DE 05 GL 10 GL Y 15 GL DE FA Y 50 GL DE GLUCOSA CON UN TIEMPO
DE RETENCIOacuteN ENTRE 62 Y 72 MINUTOS 83
TABLA 7 ANAacuteLISIS DE VARIANZA PARA EL CRECIMIENTO MICELIAL (GLUCOSA) 90
TABLA 8 ANAacuteLISIS MUacuteLTIPLE DE RANGOS PARA EL CRECIMIENTO MICELIAL (GLUCOSA) 90
TABLA 9 ANAacuteLISIS DE VARIANZA PARA EL CRECIMIENTO MICELIAL (SACAROSA) 91
TABLA 10 ANAacuteLISIS MUacuteLTIPLE DE RANGOS PARA EL CRECIMIENTO MICELIAL (SACAROSA) 91
TABLA 11 ANAacuteLISIS DE VARIANZA PARA EL CRECIMIENTO MICELIAL (GLUCOSA Y SACAROSA) 92
TABLA 12 ANAacuteLISIS MUacuteLTIPLE DE RANGOS PARA EL CRECIMIENTO MICELIAL (GLUCOSA Y SACAROSA) 92
TABLA 13 ANAacuteLISIS DE VARIANZA PARA EL CRECIMIENTO MICELIAL (GLUCOSA 50 GL Y FA) 93
TABLA 14 ANAacuteLISIS MUacuteLTIPLE DE RANGOS PARA EL CRECIMIENTO MICELIAL (GLUCOSA 50 GL Y FA) 93
TABLA 15 ANAacuteLISIS DE VARIANZA PARA EL CONSUMO DE SUSTRATO SIN FA 94
TABLA 16 ANAacuteLISIS MUacuteLTIPLE DE RANGOS PARA EL CONSUMO DE SUSTRATO SIN FA 94
TABLA 17 ANAacuteLISIS DE VARIANZA PARA EL CONSUMO DE SUSTRATO CON FA 95
TABLA 18 ANAacuteLISIS MUacuteLTIPLE DE RANGOS PARA EL CONSUMO DE SUSTRATO CON FA 95
TABLA 19 ANAacuteLISIS DE VARIANZA PARA EL CONSUMO DE PROTEIacuteNA SIN FA 96
TABLA 20 ANAacuteLISIS MUacuteLTIPLE DE RANGOS PARA EL CONSUMO DE PROTEIacuteNA SIN FA 96
TABLA 21ANAacuteLISIS DE VARIANZA PARA EL CONSUMO DE PROTEIacuteNA CON FA 97
TABLA 22 ANAacuteLISIS MUacuteLTIPLE DE RANGOS PARA EL CONSUMO DE PROTEIacuteNA CON FA 97
TABLA 23 ANAacuteLISIS DE VARIANZA PARA LA PRODUCCIOacuteN DE PSILOCIBINA SIN FA 98
TABLA 24 ANAacuteLISIS MUacuteLTIPLE DE RANGOS PARA LA PRODUCCIOacuteN DE PSILOCIBINA SEGUacuteN EL SUSTRATO
SIN FA 98
TABLA 25 ANAacuteLISIS DE VARIANZA PARA LA PRODUCCIOacuteN DE PSILOCIBINA CON FA 99
TABLA 26 ANAacuteLISIS MUacuteLTIPLE DE RANGOS PARA LA PRODUCCIOacuteN DE PSILOCIBINA SEGUacuteN EL DIacuteA CON FA
99
TABLA 27 ANAacuteLISIS DE VARIANZA PARA LA CUANTIFICACIOacuteN DE PSILOCIBINA SIN FA 100
TABLA 28 ANAacuteLISIS MUacuteLTIPLE DE RANGOS PARA LA CUANTIFICACIOacuteN DE PSILOCIBINA SEGUacuteN EL TIPO DE
SUSTRATO SIN FA 100
TABLA 29 ANAacuteLISIS DE VARIANZA PARA LA CUANTIFICACIOacuteN DE PSILOCIBINA CON FA 101
x
TABLA 30 ANAacuteLISIS MUacuteLTIPLE DE RANGOS PARA LA CUANTIFICACIOacuteN DE PSILOCIBINA SEGUacuteN LA
CONCENTRACIOacuteN CON FA 101
TABLA 31 AacuteREAS OBTENIDAS DE LOS CROMATOGRAMAS PARA EL P CUBENSIS EN MEDIO FANG-ZHONG
EN EL DIacuteA 12 PARA CONCENTRACIONES DE 30GL GLUCOSA Y 30GL SACAROSA 109
TABLA 32 AacuteREAS OBTENIDAS DE LOS CROMATOGRAMAS PARA EL P CUBENSIS EN MEDIO FANG-ZHONG
EN EL DIacuteA 12 PARA CONCENTRACIONES DE 50GL GLUCOSA Y 50GL SACAROSA 110
TABLA 33 AacuteREAS OBTENIDAS DE LOS CROMATOGRAMAS PARA EL P CUBENSIS EN MEDIO FANG-ZHONG
EN EL DIacuteA 12 PARA CONCENTRACIONES DE 50GL GLUCOSA Y 50GL SACAROSA 111
TABLA 34 AacuteREAS OBTENIDAS DE LOS CROMATOGRAMAS PARA EL P CUBENSIS EN MEDIO FANG-ZHONG
EN EL DIacuteA 12 PARA CONCENTRACIONES DE 50GL Y GLUCOSA 50GL SACAROSA 112
TABLA 35 AacuteREAS OBTENIDAS DE LOS CROMATOGRAMAS PARA EL P CUBENSIS EN MEDIO FANG-ZHONG
EN EL DIacuteA 13 PARA CONCENTRACIONES DE 30GL GLUCOSA Y 30GL SACAROSA 113
TABLA 36 AacuteREAS OBTENIDAS DE LOS CROMATOGRAMAS PARA EL P CUBENSIS EN MEDIO FANG-ZHONG
EN EL DIacuteA 13 PARA CONCENTRACIONES DE 50GL GLUCOSA Y 50GL SACAROSA 114
TABLA 37 AacuteREAS OBTENIDAS DE LOS CROMATOGRAMAS PARA EL P CUBENSIS EN MEDIO FANG-ZHONG
EN EL DIacuteA 13 PARA CONCENTRACIONES DE 70GL GLUCOSA Y 70GL SACAROSA 115
TABLA 38 AacuteREAS OBTENIDAS DE LOS CROMATOGRAMAS PARA EL P CUBENSIS EN MEDIO FANG-ZHONG
EN EL DIacuteA 13 PARA CONCENTRACIONES DE 50GL Y GLUCOSA 50GL SACAROSA 116
TABLA 39 AacuteREAS OBTENIDAS DE LOS CROMATOGRAMAS PARA EL P CUBENSIS EN MEDIO FANG-ZHONG
EN EL DIacuteA 14 PARA CONCENTRACIONES DE 30GL GLUCOSA Y 30 GL SACAROSA 117
TABLA 40 AacuteREAS OBTENIDAS DE LOS CROMATOGRAMAS PARA EL P CUBENSIS EN MEDIO FANG-ZHONG
EN EL DIacuteA 14 PARA CONCENTRACIONES DE 50GL GLUCOSA Y 50GL SACAROSA 118
TABLA 41 AacuteREAS OBTENIDAS DE LOS CROMATOGRAMAS PARA EL P CUBENSIS EN MEDIO FANG-ZHONG
EN EL DIacuteA 14 PARA CONCENTRACIONES DE 70GL GLUCOSA Y 70GL SACAROSA 119
TABLA 42 AacuteREAS OBTENIDAS DE LOS CROMATOGRAMAS PARA EL P CUBENSIS EN MEDIO FANG-ZHONG
EN EL DIacuteA 13 PARA CONCENTRACIONES DE 50GL GLUCOSA Y 50GL SACAROSA 120
xi
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1 HONGO AGARICALES (LAMINAR) (KUO 2007) 23
FIGURA 2 ALCALOIDES DERIVADOS DEL TRIPTOFANO (MERCANO Y HASEGAWA 1991) 29
FIGURA 3 TRIPTAMINAS SIMPLES (SEIGLER 1981) 31
FIGURA 4 PSILOCIBINA Y PSILOCINA (MANDRILE ET AL 1984) 32
FIGURA 5 PSILOCYBE CUBENSIS (EAH01) CULTIVADA EN MEDIO SOacuteLIDO AGAR MALTA 34
FIGURA 6 CROMATOGRAMAS DE DOS DIFERENTES FERMENTACIONES DE P CUBENSIS QUE ILUSTRAN EL
CRITERIO DE ESCOGENCIA DEL MEJOR ENSAYO REALIZADO (A) 50 GL GLUCOSA (B) 50 GL
SACAROSA 78
FIGURA 7 CROMATOGRAMAS DE DOS DIFERENTES FERMENTACIONES DE P CUBENSIS QUE ILUSTRAN EL
CRITERIO DE ESCOGENCIA DEL MEJOR ENSAYO REALIZADO (A) 05 GL FA (B) 15 GL FA 80
FIGURA 8 MUESTRA DE BIOMASA UNA VEZ ANALIZADA MEDIANTE EL REACTIVO DE DRAGENDORFF 107
FIGURA 9 PERFIL CROMATOGRAacuteFICO (TSUJIKAWA ET AL 2003) 108
xii
LISTA DE GRAacuteFICOS
GRAacuteFICO 1 CINEacuteTICA DE CRECIMIENTO MICELIAL DE P CUBENSIS EN MEDIO SUMERGIDO (FANG-ZHONG)
UTILIZANDO TRES DIFERENTES CONCENTRACIONES DE GLUCOSA COMO FUENTE DE CARBONO (PESO
SECO) 46
GRAacuteFICO 2 CRECIMIENTO MICELIAL DE P CUBENSIS EN CULTIVO SUMERGIDO BAJO TRES
CONCENTRACIONES DE GLUCOSA 47
GRAacuteFICO 3 VALORES DE CONCENTRACIOacuteN DE BIOMASA EXPERIMENTAL Y TEOacuteRICO GRAFICADOS CON
RESPECTO AL TIEMPO PARA LAS FERMENTACIONES CON DIFERENTES CONCENTRACIONES DE
GLUCOSA 49
GRAacuteFICO 4 CINEacuteTICA DE CRECIMIENTO MICELIAL DE P CUBENSIS EN MEDIO SUMERGIDO (FANG-ZHONG)
UTILIZANDO DIFERENTES CONCENTRACIONES DE SACAROSA COMO FUENTE DE CARBONO (PESO
SECO) 50
GRAacuteFICO 5 CRECIMIENTO MICELIAL PARA TRES DIFERENTES CONCENTRACIONES DE SACAROSA 52
GRAacuteFICO 6 VALORES DE CONCENTRACIOacuteN DE BIOMASA EXPERIMENTAL Y TEOacuteRICO GRAFICADOS CON
RESPECTO AL TIEMPO PARA LAS FERMENTACIONES CON DIFERENTES CONCENTRACIONES DE
SACAROSA 54
GRAacuteFICO 7 CRECIMIENTO MICELIAL PARA DOS DIFERENTES FUENTES DE CARBONO (GLUCOSA Y
SACAROSA) 56
GRAacuteFICO 8 CINEacuteTICA DE CRECIMIENTO MICELIAL DE P CUBENSIS EN MEDIO SUMERGIDO (FANG-ZHONG)
UTILIZANDO DIFERENTES CONCENTRACIONES DE FA Y 50 GL DE GLUCOSA COMO FUENTE DE
CARBONO (PESO SECO) 57
GRAacuteFICO 9 CRECIMIENTO MICELIAL PARA GLUCOSA A UNA CONCENTRACIOacuteN DE 50 GL Y TRES
DIFERENTES CONCENTRACIONES DE FA 59
GRAacuteFICO 10 VALORES DE CONCENTRACIOacuteN DE BIOMASA EXPERIMENTAL Y TEOacuteRICO GRAFICADOS CON
RESPECTO AL TIEMPO PARA LAS FERMENTACIONES CON DIFERENTES CONCENTRACIONES DE FA Y
50 GL DE GLUCOSA 61
GRAacuteFICO 11 CINEacuteTICA DE CONSUMO DE SUSTRATO POR PARTE DEL P CUBENSIS EN MEDIO SUMERGIDO
UTILIZANDO DIFERENTES CONCENTRACIONES DE GLUCOSA COMO FUENTE DE CARBONO 62
GRAacuteFICO 12 CINEacuteTICA DE CONSUMO DE SUSTRATO POR PARTE DEL P CUBENSIS EN MEDIO SUMERGIDO
UTILIZANDO DIFERENTES CONCENTRACIONES DE SACAROSA COMO FUENTE DE CARBONO 64
GRAacuteFICO 13 CONSUMO DE SUSTRATO PARA CADA UNA DE LAS FUENTES DE CARBONO UTILIZADAS 66
GRAacuteFICO 14 CINEacuteTICA DE CONSUMO DE SUSTRATO POR PARTE DEL P CUBENSIS EN MEDIO SUMERGIDO
UTILIZANDO 50 GL DE GLUCOSA COMO FUENTE DE CARBONO Y DIFERENTES CONCENTRACIONES DE
FA 67
GRAacuteFICO 15 CONSUMO DE SUSTRATO PARA CADA UNA DE LAS CONCENTRACIONES DE FA UTILIZADAS 68
GRAacuteFICO 16 CINEacuteTICA DE CONSUMO DE PROTEIacuteNA POR PARTE DEL P CUBENSIS EN MEDIO SUMERGIDO
UTILIZANDO DIFERENTES CONCENTRACIONES DE GLUCOSA COMO FUENTE DE CARBONO 70
GRAacuteFICO 17 CINEacuteTICA DE CONSUMO DE PROTEIacuteNA POR PARTE DEL P CUBENSIS EN MEDIO SUMERGIDO
UTILIZANDO DIFERENTES CONCENTRACIONES DE SACAROSA COMO FUENTE DE CARBONO 71
GRAacuteFICO 18 CONSUMO DE PROTEIacuteNA PARA CADA UNA DE LAS FUENTES DE CARBONO UTILIZADAS 73
xiii
GRAacuteFICO 19 CINEacuteTICA DE CONSUMO DE PROTEIacuteNA POR PARTE DEL P CUBENSIS EN MEDIO SUMERGIDO
UTILIZANDO 50 GL DE GLUCOSA COMO FUENTE DE CARBONO Y DIFERENTES CONCENTRACIONES DE
FA 74
GRAacuteFICO 20 CONSUMO DE PROTEIacuteNA PARA LOS ENSAYOS CON Y SIN FA 75
GRAacuteFICO 21 AacuteREA DEL COMPUESTO OBTENIDO DE P CUBENSIS EN TIEMPO DE RETENCIOacuteN ENTRE 62 Y
72 MINUTOS PARA LAS DOS FUENTES DE CARBONO 77
GRAacuteFICO 22 AacuteREA DEL COMPUESTO OBTENIDO DE P CUBENSIS EN TIEMPO DE RETENCIOacuteN ENTRE 62 Y
72 MINUTOS EN LOS UacuteLTIMOS TRES DIacuteAS DE LA FERMENTACIOacuteN CON FA Y GLUCOSA 79
GRAacuteFICO 23 AacuteREA DEL COMPUESTO OBTENIDO DE P CUBENSIS EN TIEMPO DE RETENCIOacuteN ENTRE 62 Y
72 MINUTOS PARA CADA UNA DE LAS FUENTES DE CARBONO UTILIZADAS 82
GRAacuteFICO 24 AacuteREA DEL COMPUESTO OBTENIDO DE P CUBENSIS EN TIEMPO DE RETENCIOacuteN ENTRE 62 Y
72 MINUTOS PARA CADA UNA DE LAS CONCENTRACIONES DE FA UTILIZADAS 85
GRAacuteFICO 25 CROMATOGRAMAS DEL DIacuteA 12 PARA EL P CUBENSIS CULTIVADO EN MEDIO SUMERGIDO
FANG-ZHONG CON DOS DIFERENTES TIPOS DE SUSTRATOS (A) 30 GL GLUCOSA (B) 30 GL SACAROSA
109
GRAacuteFICO 26 CROMATOGRAMAS DEL DIacuteA 12 PARA EL P CUBENSIS CULTIVADO EN MEDIO SUMERGIDO
FANG-ZHONG CON DOS DIFERENTES TIPOS DE SUSTRATOS (A) 50 GL GLUCOSA (B) 50 GL SACAROSA
110
GRAacuteFICO 27 CROMATOGRAMAS DEL DIacuteA 12 PARA EL P CUBENSIS CULTIVADO EN MEDIO SUMERGIDO
FANG-ZHONG CON DOS DIFERENTES TIPOS DE SUSTRATOS (A) 50 GL GLUCOSA (B) 50 GL SACAROSA
111
GRAacuteFICO 28 CROMATOGRAMA DEL DIacuteA 12 PARA EL P CUBENSIS CULTIVADO EN MEDIO SUMERGIDO
FANG-ZHONG CON FUENTE DE CARBONO GLUCOSA Y ADICIOacuteN DE FENILALANINA EN TRES
CONCENTRACIONES (A) 05 GL FA (B) 1 GL FA (C) 15GL FA 112
GRAacuteFICO 29 CROMATOGRAMAS DEL DIacuteA 13 PARA EL P CUBENSIS CULTIVADO EN MEDIO SUMERGIDO
FANG-ZHONG CON DOS DIFERENTES TIPOS DE SUSTRATOS (A) 30 GL GLUCOSA (B) 30 GL SACAROSA
113
GRAacuteFICO 30 CROMATOGRAMAS DEL DIacuteA 13 PARA EL P CUBENSIS CULTIVADO EN MEDIO SUMERGIDO
FANG-ZHONG CON DOS DIFERENTES TIPOS DE SUSTRATOS (A) 50 GL GLUCOSA (B) 50 GL SACAROSA
114
GRAacuteFICO 31 CROMATOGRAMAS DEL DIacuteA 13 PARA EL P CUBENSIS CULTIVADO EN MEDIO SUMERGIDO
FANG-ZHONG CON DOS DIFERENTES TIPOS DE SUSTRATOS (A) 70 GL GLUCOSA (B) 70 GL SACAROSA
115
GRAacuteFICO 32 CROMATOGRAMAS DEL DIacuteA 12 PARA EL P CUBENSIS CULTIVADO EN MEDIO SUMERGIDO
FANG-ZHONG CON FUENTE DE CARBONO GLUCOSA Y ADICIOacuteN DE FENILALANINA EN TRES
CONCENTRACIONES (A) 05 GL FA (B) 1 GL FA (C) 15GL FA 116
GRAacuteFICO 33 CROMATOGRAMAS DEL DIacuteA 14 PARA EL P CUBENSIS CULTIVADO EN MEDIO SUMERGIDO
FANG-ZHONG CON DOS DIFERENTES TIPOS DE SUSTRATOS (A) 30 GL GLUCOSA (B) 30 GL SACAROSA
117
GRAacuteFICO 34 CROMATOGRAMAS DEL DIacuteA 14 PARA EL P CUBENSIS CULTIVADO EN MEDIO SUMERGIDO
FANG-ZHONG CON DOS DIFERENTES TIPOS DE SUSTRATOS (A) 50 GL GLUCOSA (B) 50 GL SACAROSA
118
xiv
GRAacuteFICO 35 CROMATOGRAMAS DEL DIacuteA 14 PARA EL P CUBENSIS CULTIVADO EN MEDIO SUMERGIDO
FANG-ZHONG CON DOS DIFERENTES TIPOS DE SUSTRATOS (A) 70 GL GLUCOSA (B) 70 GL SACAROSA
119
GRAacuteFICO 36 CROMATOGRAMAS DEL DIacuteA 12 PARA EL P CUBENSIS CULTIVADO EN MEDIO SUMERGIDO
FANG-ZHONG CON FUENTE DE CARBONO GLUCOSA Y ADICIOacuteN DE FENILALANINA EN TRES
CONCENTRACIONES (A) 05 GL FA (B) 1 GL FA (C) 15GL FA (A) 05 GL FA (B) 1 GL FA (C)
15GL FA 120
xv
LISTA DE ECUACIONES
ECUACIOacuteN 1 ECUACIOacuteN LINEALIZADA DEL MODELO LOGIacuteSTICO 38
ECUACIOacuteN 2 VALORES TEOacuteRICOS DE BIOMASA EN EL TIEMPO 39
xvi
LISTAS DE ANEXOS
ANEXO 1 ANAacuteLISIS DE VARIANZA (ANOVA) PARA EL CRECIMIENTO DE BIOMASA DE LAS
FERMENTACIONES CON GLUCOSA _____________________________________________________ 90
ANEXO 2 ANAacuteLISIS DE VARIANZA (ANOVA) PARA EL CRECIMIENTO DE BIOMASA DE LAS
FERMENTACIONES CON SACAROSA ____________________________________________________ 91
ANEXO 3 ANAacuteLISIS DE VARIANZA (ANOVA) PARA EL CRECIMIENTO DE BIOMASA DE LAS
FERMENTACIONES CON GLUCOSA Y SACAROSA __________________________________________ 92
ANEXO 4 ANAacuteLISIS DE VARIANZA (ANOVA) PARA EL CRECIMIENTO DE BIOMASA DE LAS
FERMENTACIONES CON GLUCOSA 50 GL Y FA ___________________________________________ 93
ANEXO 5 ANAacuteLISIS DE VARIANZA (ANOVA) PARA EL CONSUMO DE SUSTRATO EN LAS FERMENTACIONES
SIN FA ____________________________________________________________________________ 94
ANEXO 6 ANAacuteLISIS DE VARIANZA (ANOVA) PARA EL CONSUMO DE SUSTRATO EN LAS FERMENTACIONES
CON FA ___________________________________________________________________________ 95
ANEXO 7 ANAacuteLISIS DE VARIANZA (ANOVA) PARA EL CONSUMO DE PROTEIacuteNA EN LAS FERMENTACIONES
SIN FA ____________________________________________________________________________ 96
ANEXO 8 ANAacuteLISIS DE VARIANZA (ANOVA) PARA EL CONSUMO DE PROTEIacuteNA EN LAS FERMENTACIONES
CON FA ___________________________________________________________________________ 97
ANEXO 9 ANAacuteLISIS DE VARIANZA (ANOVA) PARA LA PRODUCCIOacuteN DE PSILOCIBINA EN LAS
FERMENTACIONES SIN FA ____________________________________________________________ 98
ANEXO 10 ANAacuteLISIS DE VARIANZA (ANOVA) PARA LA PRODUCCIOacuteN DE PSILOCIBINA EN LAS
FERMENTACIONES CON FA ___________________________________________________________ 99
ANEXO 11 ANAacuteLISIS DE VARIANZA (ANOVA) PARA LA CUANTIFICACIOacuteN PORCENTUAL DE PSILOCIBINA EN
LAS FERMENTACIONES SIN FA _______________________________________________________ 100
ANEXO 12 ANAacuteLISIS DE VARIANZA (ANOVA) PARA LA CUANTIFICACIOacuteN PORCENTUAL DE PSILOCIBINA EN
LAS FERMENTACIONES CON FA ______________________________________________________ 101
ANEXO 13 DETERMINACIOacuteN DE CONSUMO DE AZUacuteCARES POR EL MEacuteTODO DE DNS (AacuteCIDO
DINITROSALICIacuteLICO) ________________________________________________________________ 102
ANEXO 14 CINEacuteTICA DE CONSUMO DE SUSTRATO ___________________________________________ 104
ANEXO 15 DETERMINACIOacuteN DE CONSUMO DE PROTEIacuteNAS POR EL MEacuteTODO DE LOWRY ____________ 105
ANEXO 16 CINEacuteTICA CONSUMO DE PROTEIacuteNA ______________________________________________ 106
ANEXO 17 PRUEBA DE REACTIVO DE DRAGENDORFF _________________________________________ 107
ANEXO 18 BARRIDO ESPECTRAL PARA EL PSILOCYBE CUBENSIS _________________________________ 108
ANEXO 19 CROMATOGRAMAS (HPLC) DEL DIacuteA 12 DE FERMENTACIOacuteN ___________________________ 109
ANEXO 20 CROMATOGRAMAS (HPLC) DEL DIacuteA 13 DE FERMENTACIOacuteN __________________________ 113
ANEXO 21 CROMATOGRAMAS (HPLC) DEL DIacuteA 14 DE FERMENTACIOacuteN __________________________ 117
xvii
RESUMEN
El Psilocybe cubensis es un hongo de gran importancia a nivel industrial gracias a
la presencia de una sustancia llamada Psilocibina en su cuerpo fructiacutefero
Dicho alcaloide derivado de la triptamina es muy similar al neurotransmisor
serotonina el cual es responsable de la percepcioacuten sensorial la regulacioacuten de la
temperatura el inicio del reposo nocturno del hiacutegado y los rintildeones Por tal motivo
este estudio se enfocoacute en la produccioacuten de la Psilocibina mediante el cultivo del P
cubensis en medio sumergido (Fang-Zhong)
Se evaluaron los efectos de dos fuentes de carbono (glucosa y sacarosa) a tres
concentraciones diferentes en cultivo sumergido para Psilocybe cubensis con el
fin de determinar la incidencia de eacutestas en la produccioacuten de biomasa y en la
produccioacuten y presencia de Psilocibina alcaloide de intereacutes Para las
concentraciones de glucosa de 30 gL 50 gL y 70 gL se presentoacute un crecimiento
maacuteximo de biomasa de 048 gL 055 gL y 062 gL y un porcentaje de alcaloide
de 6065 wv 7396 wv y 6733 wv respectivamente Esto uacuteltimo si se
asume que el tiempo de retencioacuten oscila entre 62 y 72 minutos contaacutendose con
una fase moacutevil de HCOONH4 en una columna C18 Mientras que para las mismas
concentraciones de sacarosa se presentoacute un crecimiento maacuteximo de biomasa de
026 gL 045 gL y 057 gL con porcentajes del compuesto presente entre el
rango de 62 y 72 minutos de 3664 wv 5857 wv y 5583 wv
respectivamente
Una vez realizada la investigacioacuten se encontroacute que las diferencias existentes en
cuanto a la cantidad de biomasa generada con respecto al tipo de sustrato
utilizado no fueron significativas es decir era irrelevante si se utilizaba glucosa o
sacarosa como principal fuente de carbono para la fermentacioacuten del P cubensis
xviii
en medio sumergido con el fin de obtener biomasa sin embargo se hallaron
diferencias significativas con respecto a las diferentes concentraciones empleadas
de dichas fuentes de carbono
Al analizar las muestras mediante cromatografiacutea liacutequida de alta eficiencia (HPLC)
se determinoacute que el medio que conteniacutea 50 gL de glucosa era el deseado debido
a que fue en eacuteste donde se presentaron picos maacutes definidos mostrando una mejor
resolucioacuten del compuesto Adicionalmente presentoacute un buen crecimiento micelial
Una vez elegido dicho criterio se evaluoacute el efecto que teniacutea la adicioacuten de un
aminoaacutecido llamado Fenilalanina (FA) al medio que conteniacutea 50 gL de glucosa
con el fin de determinar si eacuteste teniacutea alguna incidencia positiva en la produccioacuten de
biomasa y en la generacioacuten del alcaloide de intereacutes cabe resaltar que se utilizaron
diferentes concentraciones de FA correspondientes a 05 gL 10 gL y 15 gL
Finalizados dichos ensayos se obtuvieron valores de crecimiento de biomasa
maacutexima de 106 gL 108 gL y 101 gL y un porcentaje de aacuterea de 7549 wv
6236 wv y 2721 wv respectivamente
Es necesario hacer hincapieacute en que las diferencias obtenidas mediante el anaacutelisis
estadiacutestico entre cada una de las concentraciones de FA con respecto a la
generacioacuten de biomasa y la produccioacuten del compuesto no fueron significativas lo
que llevoacute a elegir una concentracioacuten de 05 gL de FA debido a que fue la menor
cantidad utilizada de este compuesto durante la investigacioacuten suponieacutendose asiacute
una disminucioacuten en los costos de materia prima
Palabras claves
Psilocybe cubensis Psilocibina Alcaloide HPLC Cultivo Sumergido Fuentes de
Carbono Fenilalanina
19
INTRODUCCIOacuteN
Los hongos son una rica fuente de productos naturales con una alta actividad
bioloacutegica Desafortunadamente el cultivo de eacutestos en cuerpo fructiacutefero toma
varios meses disminuyendo su calidad debido a los cambios climaacuteticos y plagas
por tal razoacuten se implementoacute la metodologiacutea de medio sumergido la cual es
prometedora gracias a una alta productividad de compuestos bioactivos (Arora
1986)
El Geacutenero Psilocybe pertenece al Reino Fungiacute con un Phylum Basidiomicota
una Clase Homobasidiomicetes un Orden Agaricales una Familia Strofariaceae
(Paris y Hurabielle 1981)
Dicho geacutenero es considerado de gran importancia a nivel mundial debido a que su
cuerpo fructiacutefero y biomasa micelial contienen Psilocibina la cual posee un alto
valor para la industria farmaceacuteutica por su uso en la elaboracioacuten de productos
antidepresivos Este alcaloide derivado de FA cuenta con una estructura muy
similar al neurotransmisor segregado por el cerebro llamado serotonina que
controla el estado de aacutenimo el suentildeo el hiacutegado y los rintildeones (Mandrile et al
1984) esta caracteriacutestica le otorga la gran importancia a la Psilocibina en el
mercado puesto que tiene un alto impacto en la sociedad como ayudante
antidepresivo debido a que no todas las personas segregan la cantidad necesaria
(10 mg con liacutemites que variacutean desde 5 a 20 mg) de serotonina (Mandrile et al
1984) Adicionalmente se estaacute empleando como una gran ayuda para la
disminucioacuten de la adiccioacuten a sustancias como heroiacutena y cocaiacutena gracias a que
este alcaloide no genera dependencia (Lee et al 2004)
Debido a que su consumo puede generar alucinaciones era consumido por las
culturas aboriacutegenes centroamericanas con el fin de realizar manifestaciones
20
religiosas Su uso se remonta a maacutes de 3500 antildeos y era nombrado por los
aztecas como ―Teonunaltl que significa ―carne de dioses (Mandrile et al 1984)
La alternativa que se utilizoacute durante esta investigacioacuten fue el cultivo del P
cubensis mediante medio sumergido debido principalmente a las notables
ventajas frente a los sistemas convencionales que eacuteste posee entre las cuales se
destacan la disminucioacuten del tiempo para la obtencioacuten de la biomasa (14 diacuteas) y la
reduccioacuten de los costos de obtencioacuten (Lee et al 2004) De acuerdo a lo
dimensionado anteriormente este estudio estaba orientado primordialmente a la
buacutesqueda de alternativas que permitieran la produccioacuten de biomasa de forma
raacutepida y confiable
Con el fin de llevar a cabo lo dicho anteriormente se pretendioacute evaluar el efecto
del uso de dos diferentes fuentes de carbono en este caso glucosa y sacarosa en
el crecimiento micelial de la cepa P cubensis
21
OBJETIVOS
GENERAL
Evaluar el efecto de la fuente de carbono en el crecimiento micelial de una
cepa Psilocybe sp
ESPECIacuteFICOS
Evaluar la cineacutetica de crecimiento de la cepa Psilocybe cubensis en los
diferentes medios de cultivo sumergido mediante la cuantificacioacuten de
biomasa por medio de la metodologiacutea de peso seco
Evaluar el consumo de sustrato para los diferentes ensayos por medio de
teacutecnicas espectrofotomeacutetricas
Determinar la presencia de Psilocibina mediante el uso del reactivo de
Dragendorff
22
1 MARCO TEOacuteRICO
11 CONCEPTOS GENERALES DE HONGOS
Los hongos son organismos eucariotas que no contienen clorofila con nutricioacuten
por absorcioacuten generalmente con reproduccioacuten sexual y asexual el cuerpo
consiste generalmente de filamentos ramificados con pared celular quitinosa
(Miles y Chang 1999)
Constituyen uno de los grupos de organismos maacutes importantes para la vida del
hombre ya que son los responsables de gran parte de la descomposicioacuten de la
materia orgaacutenica aumentando su disponibilidad en el suelo pueden ser
comestibles venenosos o psicotroacutepicos muchos son patoacutegenos otros producen
ciertas sustancias beneficiosas o intervienen en procesos de elaboracioacuten de
algunos comestibles (Miles y Chang 1999)
111 Hongos laminares (Agaricales)
El orden Agaricales tambieacuten conocido como Euagaricales es el mayor orden de
setas y hongos que incluye maacutes de la mitad de todas las especies conocidas de la
clase Homobasidiomycetes (Hibbett et al 1997 Hibbett y Thorn 2001) Maacutes de
9000 especies y alrededor de 350 geacuteneros se han atribuido a este orden que
contiene 26 familias (Kirk et al 2001) Un consenso de mayor nivel de
clasificacioacuten de los Agaricales ha sido difiacutecil de lograr debido a la competencia de
sistemas que restringen geacuteneros y familias (o incluso orden) de diferentes
maneras (Bas 1998 Juumllich 1981 Kirk et al 2001 Kuumlhner 1980 Singer 1986)
23
La base para la clasificacioacuten de los hongos fue construida por Fries (1874) quien
hizo hincapieacute en las caracteriacutesticas macroscoacutepicas como la textura del tallo la
separacioacuten de los filamentos (laminas) presencia o ausencia de velo y color de las
esporas
Posteriormente dividioacute los hongos Agaricales en varias especies de acuerdo al
color de las esporas depositadas las cuales pueden ser de color blanco rosado
marroacuten puacuterpura ndash marroacuten y negro El sistema macroscoacutepico de Fries que
reconocioacute inicialmente 12 geacuteneros de hongos carnosos que forman los hongos es
taxonoacutemicamente praacutectico Eacuteste fue relativamente invariable hasta que Fayod
(1989) estudioacute la anatomiacutea y las caracteriacutesticas microscoacutepicas de muchos
Agaricales reconociendo 108 geacuteneros (Arora 1986)
Al igual que todas las setas los hongos laminares son faacutebricas de esporas
creados con el uacutenico propoacutesito de fabricar esporas microscoacutepicas para dejarse
llevar por las corrientes de aire y con suerte caer en un lugar adecuado en la
tierra para germinar y comenzar un nuevo organismo Las probabilidades de que
cualquier individuo que tiene esporas de este tipo tenga suerte son tan bajas que
el hongo produce millones de esporas para compensar esto En las laacuteminas se
encuentran numerosas esporas las cuales aumentan considerablemente el
nuacutemero de esporas que el hongo puede producir Ambos lados de cada laacutemina
estaacute cubierta con esporas microscoacutepicas (Kuo 2007) A continuacioacuten se muestra
de manera ilustrativa en la figura 1 las laacuteminas que poseen los hongos Agaricales
en las cuales se da la formacioacuten de las esporas
Figura 1 Hongo Agaricales (Laminar) (Kuo 2007)
24
12 MEDIOS DE CULTIVO
Uno de los sistemas maacutes importantes para la identificacioacuten de microorganismos es
observar su crecimiento en sustancias alimenticias artificiales preparadas en el
laboratorio El material alimenticio en el que crecen los microorganismos es el
medio de cultivo (Garciacutea 1995)
Para que los microorganismos crezcan adecuadamente en un medio de cultivo
artificial eacuteste debe reunir una serie de condiciones como lo son temperatura
grado de humedad y presioacuten asiacute como un grado correcto de acidez o alcalinidad
Un medio de cultivo contiene los nutrientes y factores de crecimiento necesarios
para que el microorganismo se desarrolle correctamente y debe estar exento de
cualquier tipo de microorganismo que pueda generar contaminacioacuten (Garciacutea
1995)
121 Tipos de medios de cultivo
En la actualidad existen diversos tipos de medio de cultivo si se centra en la
composicioacuten eacutestos pueden ser medios sinteacuteticos que contienen fuente de
carbono fuente de nitroacutegeno sales que suplan los iones y demaacutes elementos tales
como estimuladores del crecimiento medios complejos que contienen ingredientes
tales como extracto de levadura peptona infusioacuten de cerebro etc ricos en
nutrientes medios de enriquecimiento siendo estos complejos con aditivos
adicionales para favorecer asiacute al crecimiento y desarrollo de determinados
microorganismos medios selectivos los cuales son disentildeados para favorecer el
crecimiento especiacutefico de un microorganismo determinado o un grupo
microbiano medios diferenciales que proporcionan la distincioacuten microbiana de una
mezcla por sus propiedades diferenciales de crecimiento en dichos medios
medios de mantenimiento siendo disiacutemiles de los de crecimiento oacuteptimo por el
25
crecimiento raacutepido y proliacutefico que deriva en la muerte raacutepida de las ceacutelulas (Garciacutea
1995)
Atendiendo a su estado los medios de cultivo pueden presentarse como medios
sumergidos y medios soacutelidos que contienen agar que gelifica por debajo de 45
degC y cuya concentracioacuten en su uso es de 15 y medios semisoacutelidos que contiene
un agar a una concentracioacuten de 07 (Garciacutea 1995)
121 Medio sumergido
Debido a que cultivar el cuerpo fructiacutefero toma varios meses y se dificulta el control
de calidad del producto final porque se estaacute sujeto a los cambios permanentes del
clima y las plagas se ha empleado la metodologiacutea de medio sumergido la cual es
una alternativa muy prometedora para la produccioacuten eficiente del micelio y de los
metabolitos (Lindequist y Niedermeyer 2005)
Dicha forma es la mejor para producir extraer y purificar metabolitos de un cultivo
de hongo ya que facilita una mayor produccioacuten de biomasa en menor tiempo y
de mayor calidad que el cultivo en medio soacutelido ademaacutes facilita la dispersioacuten y
adaptacioacuten del hongo y reduce los vectores de contaminacioacuten De igual forma un
cultivo de esta iacutendole es la opcioacuten maacutes viable si se quiere escalar procesos
fermentativos en aras de desarrollar mercados como en este caso el de
metabolitos medicinales (Navarro et al 1998)
A su vez el uso de cultivo sumergido puede beneficiar la produccioacuten de muchos
metabolitos secundarios y disminuir los costos de produccioacuten por reducir las
labores que involucran los meacutetodos de etapas soacutelidas (Domiacutenguez y Webb 2003)
Los metabolitos bioactivos de los hongos pueden ser potencialmente producidos a
nivel industrial mediante el uso de la metodologiacutea de cultivo sumergido pero el
26
eacutexito a escala comercial depende del costo comparado con la tecnologiacutea existente
y la ventaja econoacutemica que la industria puede ver usando este meacutetodo El uso de
la tecnologiacutea puede ser facilitada por el aumento en el rendimiento de la
produccioacuten y el desarrollo del sistema (Hwang et al 2004)
El cultivo de hongos sumergidos se caracteriza por un aumento en la viscosidad
del caldo con el tiempo debido a uno o maacutes factores tales como el aumento de la
concentracioacuten de ceacutelulas los cambios de la morfologiacutea del crecimiento o la
produccioacuten de productos extracelulares que alteran el caraacutecter reoloacutegico de la
cultura del liacutequido El aumento en la viscosidad puede ser visto como un fenoacutemeno
indeseable pero inevitable ya que causan dificultades en el suministro de oxiacutegeno
en la eliminacioacuten de dioacutexido de carbono y en posibles problemas de agitacioacuten
(Hwang et al 2004)
13 ALCALOIDES
131 Generalidades
La diversidad estructural y la variedad en la actividad bioloacutegica hacen de los
alcaloides como tambieacuten de los antibioacuteticos los grupos maacutes importantes entre las
sustancias naturales de intereacutes terapeacuteutico (Paris y Hurabielle 1981)
Se han aislado principalmente en plantas superiores y se han encontrado en maacutes
de 100 familias de Faneroacutegamas (aquellas plantas que se reproducen por semillas
producidas en sus inflorescencias) Su actividad bioloacutegica a nivel del sistema
nervioso dio pie a las primeras investigaciones siendo los alcaloides las primeras
sustancias naturales estudiadas (Paris y Hurabielle 1981)
El teacutermino alcaloide propuesto por el farmaceacuteutico W Meissner en 1819 se aplicoacute
a los compuestos de origen vegetal con propiedades alcalinas este caraacutecter
baacutesico es debido a la presencia de nitroacutegeno amiacutenico en su estructura Los
27
alcaloides se pueden considerar como ―Un compuesto orgaacutenico de origen natural
nitrogenado derivados generalmente de aminoaacutecidos maacutes o menos baacutesico de
distribucioacuten restringida con propiedades farmacoloacutegicas importantes a dosis bajas
y que responden a reacciones comunes de precipitacioacuten (Paris y Hurabielle
1981)
132 Propiedades fisicoquiacutemicas
Los alcaloides tienen masas moleculares que variacutean entre 100 y 9000 gmol son
casi siempre incoloros son normalmente soacutelidos a temperatura ambiente a
excepcioacuten de los alcaloides no oxigenados Los alcaloides son poco solubles en
agua gracias a su caraacutecter baacutesico dicho caraacutecter se debe al par de electrones
libres del nitroacutegeno (Paris y Hurabielle 1981)
En la naturaleza se encuentran en forma de sales generalmente En las plantas
se consideraba que eran productos obtenidos durante la extraccioacuten y poco
solubles en disolventes tiacutepicos de extraccioacuten por su polaridad Son solubles en
disolventes orgaacutenicos como cloroformo etanol metanol acetato de etilo eacuteter
benceno En forma de sales son solubles en agua excepto las sales de berberina
(Paris y Hurabielle 1981)
Todos los alcaloides son activos a la luz polarizada Presentan una fluorescencia
caracteriacutestica bajo la luz UV o IR dando lugar a espectros caracteriacutesticos (Paris y
Hurabielle 1981)
133 Reconocimiento de los alcaloides
Las teacutecnicas de reconocimiento son basadas en la capacidad que tienen los
alcaloides en estado de sal (extractos aacutecidos) de combinarse con el yodo y
metales pesados como bismuto mercurio tungsteno formando precipitados se
28
utilizan reactivos generales para detectar alcaloides como reactivo de Wagner
reactivo de Mayer reactivo de Dragendorff reactivo de Hager reactivo de
Bertrand reactivo de Ehrlich y reactivo de Vitali-Morin (Paris y Hurabielle 1981)
134 Clasificacioacuten de los alcaloides
Habitualmente los alcaloides se han clasificado en funcioacuten de su estructura
distinguieacutendose principalmente los compuestos heterociacuteclicos de los no
heterociacuteclicos Actualmente existen varias formas de clasificarlos (Bruneton
1987) entre ellas se pueden distinguir
1341 Alcaloides alifaacuteticos
a Derivados de la ornitina (pirrolidinas tropaacutenicos pirrolizidiacutenicos)
b Derivados de la lisina (piperidinas quinolizidiacutenicos)
1342 Alcaloides de origen diverso
a Alcaloides terpeacutenicos y esteroidales
b Alcaloides diversos (purinas macrociclos etc)
1343 Alcaloides aromaacuteticos
a Derivados del aacutecido nicotiacutenico (piridinas)
b Derivados de la fenilalanina y tirosina (isoquinoleinas)
c Derivados del triptofano (indoacutelicos quinoleinas)
d Derivados de la histidina (imidazoles)
29
Alcaloides derivados del triptofano (Alcaloides Indoacutelicos)
Desde el punto de vista farmacoloacutegico ha habido mucho intereacutes sobre las bases
que contienen el nuacutecleo indoacutelico a raiacutez del descubrimiento de la actividad
alucinoacutegena del LSD asiacute como la actividad sedante de la reserpina aislada del
geacutenero Rauwolfia El auge del estudio fitoquiacutemico ocurrioacute en la deacutecada de los 60 y
se dirigiacutea principalmente a la familia Apocynaceae (Mercano y Hasegawa 1991)
Existen unos 800 alcaloides de este tipo distribuidos principalmente en la familia
Apocynaceae (geacuteneros Rauwolfia Aspidos-perma Strychnos y Vinca) menos
frecuentes en hongos y familias como Leguminoseae Malphigiaceae Rubiaceae y
Rutaceae donde los alcaloides presentan el grupo indoacutelico sencillo (Mercano y
Hasegawa 1991)
El triptofano es el precursor de estos alcaloides los cuales se clasifican en
triptaminas y en no triptaminas las triptaminas a su vez se subdividen en b-
carbolinas y en indoleninas y pueden ser triptaminas simples o triptaminas
complejas y estas pueden ser isopreacutenicas o no isopreacutenicas (Mercano y Hasegawa
1991) La figura 2 muestra la estructura quiacutemica del triptofano triptamina y sus
divisiones
Figura 2 Alcaloides derivados del Triptofano (Mercano y Hasegawa 1991)
30
Triptaminas simples
Las triptaminas simples juegan un importante papel en la cultura indiacutegena de
Ameacuterica por sus efectos alucinoacutegenos y extaacuteticos en sus ceremonias maacutegico
religiosas (Furst 1994) Se han encontrado en hongos alucinoacutegenos de
Mesoameacuterica del geacutenero Psilocybe Stropharia y Conocybe (―teonacatl o ―carne
de los dioses) usados por los indios Aztecas en sus ceremonias religiosas desde
hace maacutes de 1700 antildeos Se han encontrado en estos hongos los alcaloides
alucinoacutegenos la Psilocina y la Psilocibina que al ingerirlos produce diferentes
sensaciones auditivas y visuales relajacioacuten muscular depresiones y euforias
alternadas (Mercano y Hasegawa 1991)
La serotonina que juega un importante papel en la actividad neuronal se
encuentra tambieacuten en vegetales Se ha aislado en el pericarpio del banano el cual
seco cuando es fumado actuacutea como un alucinoacutegeno ligero (Seigler 1981)
De las glaacutendulas paroacutetidas del sapo comuacuten Bufo vulgaris se aiacutesla la bufotenina
derivado N-dimetilado de la serotonina que tambieacuten es el principio activo del Yopoacute
polvo de las semillas de Anadenanthera peregrina (Piptadenia peregrina)
Leguminoseae y especies del geacutenero Virola (Myristicaceae) que contiene tambieacuten
triptaminas son mezclados con cenizas e inhalados por medio de tubos de bambuacute
por los indiacutegenas del Orinoco en ceremonias maacutegico religiosas produciendo
alucinacioacuten e incoordinacioacuten motriz (Seigler 1981)
En la figura 3 se observan las estructuras de aquellos compuestos que estaacuten
clasificados como triptaminas simples
31
Figura 3 Triptaminas simples (Seigler 1981)
13 PSILOCIBINA Y PSILOCINA
La Psilocibina y la Psilocina son bioloacutegicamente sintetizadas en los hongos
pertenecientes a los geacuteneros de Psilocybe (Bigwood y Beug 1982 Wurst et al
1984)
La Psilocibina y la Psilocina se han identificado en todo el mundo en una variedad
de setas que son llamados hongos maacutegicos La ingestioacuten de pequentildeas
cantidades de alucinoacutegenos provoca el eacutextasis La actividad alucinoacutegena de la
Psilocibina es relativamente maacutes baja que la de la Psilocina Sin embargo la
Psilocibina se convierte faacutecilmente en Psilocina (componente activo principal) en
los sistemas bioloacutegicos Asiacute el desarrollo de un meacutetodo de determinacioacuten de la
Psilocibina es importante lo misma que la de la Psilocina (Kimie et al 2005)
La hidroacutelisis de la Psilocibina se consigue saturando con anhiacutedido carboacutenico una
solucioacuten acuosa de Psilocibina (para eliminar el oxiacutegeno del aire y calentaacutendola)
obteniendo asiacute una moleacutecula de 4hidroxi-dimetiltriptamina y una moleacutecula de aacutecido
fosfoacuterico (Mandrile et al 1984)
Como todos los faacutermacos derivados del indol estas sustancias han despertado
intereacutes porque se sospechoacute la posibilidad de que algunas de ellas se formen en el
32
organismo y que en ciertas psicosis especialmente en la esquizofrenia se
produzcan elevados niveles sanguiacuteneos que ocasionan algunos de los siacutentomas
(Mandrile et al 1984)
La figura 4 muestra la estructura quiacutemica de alcaloides como la Psilocibina y
Psilocina
Figura 4 Psilocibina y Psilocina (Mandrile et al 1984)
131 Antecedentes acerca de la obtencioacuten de Psilocibina y Psilocina
Una gran variedad de meacutetodos cromatograacuteficos para la determinacioacuten de
Psilocibina y Psilocina presentes en las incautaciones de hongos se han
publicado La cromatografiacutea de capa fina es utilizada debido a que eacutesta es muy
apropiada para la deteccioacuten de sustancias derivadas del triptofano (Brown et al
1972 Tanimukai 1967 Beug y Bigwood 1981) Aun asiacute meacutetodos que involucran
tanto la cromatografiacutea de alta eficiencia (HPLC) como la deteccioacuten fotomeacutetrica de
UV (Beug y Bigwood 1981 Wurst et al 1984 Borner y Brenneisen 1987 Perkal
et al 1980 Vanhaelen-Faestreacute y Vanhaelen 1984 Thomson 1980 White 1979
Sottolano y Lurie 1983) fueron establecidas y optimizadas para la cuantificacioacuten
de Psilocibina
Durante los uacuteltimos antildeos se han venido utilizando diferentes tipos de columna y
fase moacutevil con el fin de obtener la mayor cantidad posible de la sustancia de
intereacutes (Psilocibina)
33
En el antildeo 1981 en el instituto farmaceacuteutico de la Universidad de Oslo realizaron
una investigacioacuten con una columna de siacutelice con una fase moacutevil de metanol-nitrato
de amonio en donde no soacutelo se logroacute obtener Psilocibina y Psilocina sino tambieacuten
un nuevo producto conocido como beocistiacuten Se logroacute un porcentaje de separacioacuten
maacutexima de 75 ww (Christiansen et al 1981)
Asimismo en el antildeo 1984 en el instituto de microbiologiacutea de Amsterdam se
realizoacute un estudio con una columna C18 de siacutelice y una fase moacutevil de agua-etanol-
aacutecido aceacutetico de forma isocraacutetica en donde se obtuvo un porcentaje 025-115
y 002-016 de Psilocibina y Psilocina respectivamente en el hongo (Wurst
1984)
De igual manera en el antildeo 2003 en el instituto de ciencia policiaca en Japoacuten se
ejecutoacute la cromatografiacutea de alta eficiencia utilizando una columna C18 con una
fase moacutevil de aacutecido foacutermico de forma isocraacutetica y un detector de 220 nm un rango
de porcentaje de Psilocibina 014-042 wv en la capa mientras un 009-03
wv en el tallo (Tsujikawa et al 2003)
34
2 MATERIALES Y MEacuteTODOS
21 LOCALIZACIOacuteN
Las fermentaciones la medicioacuten del crecimiento micelial y la cuantificacioacuten del
consumo del sustrato y de proteiacutena se llevaron a cabo en el laboratorio de
Biotecnologiacutea de la Universidad EAFIT mientras que los anaacutelisis de cromatografiacutea
liacutequida de alta eficiencia (HPLC) se realizaron en el laboratorio de Quiacutemica
Instrumental de dicha Universidad
22 MICROORGANISMO DE ESTUDIO
La cepa del hongo Psilocybe cubensis (EAH01) con la cual se trabajoacute fue donada
por Joseacute Rodrigo Moreno Ingeniero del laboratorio de la Universidad Catoacutelica de
Oriente (UCO) La EAH01 permanece auacuten en el laboratorio de Biotecnologiacutea de la
Universidad EAFIT
Dicha cepa se cultivoacute en una caja Petri que conteniacutea Agar Extracto de Malta
(MEA) y se incuboacute a 30ordmC en una incubadora digital del laboratorio de
Biotecnologiacutea de la Universidad EAFIT La figura 5 representa una cepa de P
cubensis cultivada en medio soacutelido MEA
Figura 5 Psilocybe cubensis (EAH01) cultivada en medio soacutelido Agar Malta
35
23 COMPONENTES DEL MEDIO DE CULTIVO (FANG-ZHONG)
El medio sumergido utilizado para llevar a cabo las diferentes fermentaciones de
P cubensis fue el descrito por Fang-Zhong (2002) La tabla 1 muestra los
componentes de dicho medio y la concentracioacuten de cada uno de ellos Se destaca
que las fuentes de carbono utilizadas fueron glucosa y sacarosa usaacutendolas cada
una por separado para cada experimento y haciendo variaciones de
concentraciones de las mismas para los distintos ensayos
Tabla 1 Composicioacuten del medio de cultivo sumergido para evaluar el crecimiento micelial del P cubensis
Componentes Cantidad (gL)
Fuente de Carbono 30 ndash 50 - 70
Peptona 5
Extracto de levadura 5
KH2PO4 1
MgSO47H2O 05
Vitamina B1 005
24 PREPARACIOacuteN DE LOS DIFERENTES PREINOacuteCULOS DE P cubensis
EMPLEADOS PARA LAS FERMENTACIONES SUMERGIDAS
Con el propoacutesito de llevar a cabo cada uno de los ensayos fue necesario realizar
la preparacioacuten de un preinoacuteculo eacutesto con el fin de realizar un proceso de
adaptacioacuten del P cubensis al medio favoreciendo la disminucioacuten en cuanto a
tiempo (preferiblemente la eliminacioacuten de la aparicioacuten de un fase de latencia una
vez comenzada la fermentacioacuten)
La preparacioacuten de cada uno de los preinoacuteculos se realizoacute en 6 erlenmeyers de
1000 mL con 200 mL de medio cada uno los cuales fueron esterilizados a 120degC
por 15 minutos e inoculados con 4 discos de 5 mm aproximadamente de P
36
cubensis provenientes de la cepa previamente activada en Agar Malta durante 6
diacuteas Los erlenmeyers se llevaron a un agitador orbital por 6 diacuteas a 30ordmC y 100
rpm
25 PREPARACIOacuteN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO Y LOS INOacuteCULOS DE P
cubensis UTILIZADOS PARA LAS FERMENTACIONES SUMERGIDAS
Una vez realizado el preinoacuteculo se procedioacute a preparar los medios de cultivo
utilizados para realizar los distintos experimentos de la siguiente manera se
prepararon medios que diferiacutean en la fuente de carbono (glucosa o sacarosa) y en
la concentracioacuten de la misma (30 gL 50 gL y 70 gL) teniendo asiacute un total de
seis fermentaciones Las demaacutes cantidades de los componentes del medio de
Fang-Zhong fueron las mismas que las usadas en el preinoacuteculo descritas en la
Tabla 1
En primer lugar se llevaron a cabo las tres fermentaciones de glucosa
preparando un total de 90 erlenmeyers (30 por cada concentracioacuten de azuacutecar por
duplicado) cada uno de los frascos conteniacutea 50 mL del medio en erlenmeyers de
250 mL e inoculados con 01 g de peso huacutemedo del preinoacuteculo aproximadamente
Los 90 frascos se llevaron durante 14 diacuteas a un agitador orbital a 100 rpm con una
temperatura de 30 degC
Posteriormente se llevaron a cabo las tres fermentaciones de sacarosa siguiendo
el mismo proceso descrito anteriormente para la glucosa
Una vez terminadas las fermentaciones de glucosa y sacarosa y realizados todos
los anaacutelisis correspondientes (generacioacuten de biomasa consumo de sustrato
consumo de proteiacutena y evaluacioacuten de la presencia de Psilocibina por medio de
cromatografiacutea liacutequida de alta eficiencia (HPLC)) se procedioacute a elegir la fuente de
carbono y concentracioacuten que mejores resultados arrojoacute tanto para la generacioacuten
37
de biomasa como para la produccioacuten del alcaloide con el fin de evaluarla
nuevamente adicionaacutendole un precursor (FA)
Para finalizar se procedioacute a preparar los medios con la fuente de carbono y la
concentracioacuten de la misma que arrojoacute mejores resultados es decir los ensayos
realizados con una concentracioacuten de 50 gL de glucosa adicionaacutendole al medio
FA a diferentes concentraciones correspondiente a valores de 05 gL 10 gL y
15 gL las demaacutes cantidades de los componentes remanentes del medio fueron
las mismas que las descritas anteriormente en la tabla 1
26 CUANTIFICACIOacuteN DEL CRECIMIENTO DE BIOMASA MEDIANTE LOS
MEacuteTODOS DE PESO HUacuteMEDO Y PESO SECO PARA CULTIVO
SUMERGIDO DE P cubensis
La cuantificacioacuten de biomasa para cada uno de los tratamientos se realizoacute usando
la metodologiacutea de peso huacutemedo y peso seco Para la cuantificacioacuten de biomasa
mediante el meacutetodo de peso huacutemedo se tomaron dos muestras provenientes de
cada erlenmeyer cada 24 horas las cuales fueron filtradas y pesadas con el fin de
obtener el valor de peso huacutemedo para cada tratamiento del P cubensis
Posteriormente la biomasa retenida en el papel filtro fue llevada a un secador que
se encontraba a una temperatura de 50ordmC durante 24 horas transcurrido el
tiempo la biomasa seca fue pesada con el fin de obtener datos de peso seco
Durante los 14 diacuteas de la fermentacioacuten se obtuvieron datos de peso huacutemedo y
peso seco por duplicado para cada una de las fermentaciones
27 AJUSTE DE LA CINEacuteTICA DE CRECIMIENTO DE P cubensis AL
MODELO CINEacuteTICO LOGIacuteSTICO
Una vez realizada la recoleccioacuten de muestras para cada uno de los ensayos y su
posterior anaacutelisis se decidioacute modelar dichos datos mediante el modelo logiacutestico
38
(ecuacioacuten 1) el cual permite obtener variables cineacuteticas tales como la cantidad de
biomasa inicial (Xo) y la velocidad maacutexima de crecimiento (micromaacutex) para cada uno de
los tratamientos
Se decidioacute emplear el modelo logiacutestico ya que eacuteste muestra resultados maacutes reales
cuando se cultivan hongos debido a que su morfologiacutea es muy diferente a otros
microorganismos (pellets) dificultando la transferencia de masa (Bailey et al
1986)
Una vez linealizada la ecuacioacuten que describe dicho modelos se llega a la siguiente
expresioacuten
Ecuacioacuten 1 Ecuacioacuten linealizada del modelo logiacutestico
Posterior a la linealizacioacuten de la ecuacioacuten se procedioacute a graficar Ln ((XmaacutexX)-1)
vs tiempo con el fin de obtener como pendiente la velocidad maacutexima de
crecimiento (micromaacutex) y como intercepto el Ln ((XmaacutexXo)-1) el cual permitioacute la
obtencioacuten de la concentracioacuten inicial de biomasa
Obtenieacutendose asiacute los paraacutemetros cineacuteticos para cada ensayo correspondientes a
micromax y Xo
Se debe definir la concentracioacuten maacutexima de biomasa (Xmaacutex) para poder hallar los
paraacutemetros cineacuteticos mediante dicho modelo cabe aclarar que dicho valor se toma
de los resultados de biomasa adquiridos para cada uno de los ensayos mediante
la metodologiacutea de peso seco este valor variacutea para cada fermentacioacuten
Una vez ajustados los datos de cada tratamiento al modelo logiacutestico se procedioacute a
calcular de manera teoacuterica los valores de X (biomasa) que variacutea con el tiempo
39
teniendo en cuenta los paraacutemetros cineacuteticos arrojados mediante el modelo
logiacutestico utilizando la siguiente ecuacioacuten
Ecuacioacuten 2 Valores teoacutericos de biomasa en el tiempo
Estos valores de X teoacutericos obtenidos mediante la foacutermula anterior se grafican con
respecto a los valores de X obtenidos de manera experimental con el fin de
observar el ajuste del modelo logiacutestico a cada uno de los datos experimentales
28 EVALUACIOacuteN DEL CONSUMO DE SUSTRATO Y DEL CONSUMO DE
PROTEIacuteNA POR PARTE DEL P cubensis CULTIVADO EN MEDIO
SUMERGIDO
Con el fin de evaluar el consumo de sustrato y proteiacutena por parte del P cubensis
durante las fermentaciones que conteniacutean glucosa en el medio se recolectaron
muestras cada 24 horas del liacutequido obtenido despueacutes de realizada la filtracioacuten de
la muestra que se utilizoacute para efectos de caacutelculo de peso seo dicho liacutequido
denominado sobrenadante fue almacenado a -4 degC Finalizadas cada una de las
fermentaciones se procedioacute a realizar el protocolo para evaluar el consumo de
sustrato para cada medio (Miller 1959) mediante el meacutetodo de DNS (Aacutecido
Dinitrosaliciacutelico) (Anexo 13) y el consumo de proteiacutenas mediante el meacutetodo de
LOWRY para cada fermentacioacuten (Anexo 15)
Para llevar a cabo la cuantificacioacuten de sustrato y proteiacutena en los distintos ensayos
fue necesario realizar las curvas de calibracioacuten correspondientes dichas curvas
con sus respectivos valores de concentracioacuten se muestran en los anexos 14 y 16
40
29 MEacuteTODO CUALITATIVO PARA DETERMINAR LA PRESENCIA DE
ALCALOIDES (PSILOCIBINA) MEDIANTE EL USO DEL REACTIVO DE
DRAGENDORFF
Como se mencionoacute anteriormente el reactivo de Dragendorff es usado para
determinar de manera cualitativa la ausencia o presencia de alcaloides en una
muestra determinada Para llevar a cabo dicha prueba se recolectaron muestras
de la biomasa seca correspondientes a los diacuteas 12 13 y 14 de cada fermentacioacuten
las cuales fueron almacenadas a -4degC
Para determinar la presencia de Psilocibina se realizoacute el proceso descrito seguacuten
Musshoff et al (2000) el cual consistioacute en macerar cada una de las muestras de
biomasa hasta obtener un polvo fino luego se pesaron 10 mg de dicho polvo y a
esta cantidad se le agregoacute 1 mL de metanol Posteriormente una pequentildea
cantidad de esta mezcla se esparcioacute en un papel filtro en donde se le adicionoacute una
gota del reactivo de Dragendorff
Una vez realizada la prueba se dice que la muestra contiene presencia de
alcaloides si eacutesta presenta una coloracioacuten rojizo-amarilla
210 MEacuteTODO PARA DETERMINAR LA PRESENCIA DE PSILOCIBINA
MEDIANTE CROMATOGRAFIacuteA LIacuteQUIDA DE ALTA EFICIENCIA (HPLC)
Una vez evaluada la presencia del alcaloide mediante el reactivo de Dragendorff
se procedioacute a determinar mediante el uso de cromatografiacutea liacutequida de alta
eficiencia (HPLC) la presencia de los alcaloides en la mezcla con sus respectivos
tiempos de retencioacuten para llevar a cabo la extraccioacuten de la Psilocibina se siguioacute el
meacutetodo descrito por Musshoff et al (2000) Para ello la muestra de biomasa
seca fue macera en un mortero hasta convertirla en un polvo fino Diez miligramos
41
de la muestra en polvo se extrajeron dos veces con 1 mL de metanol en un bantildeo
de ultrasonido durante 30 minutos Posterior a eacutesto se centrifugaron las muestras
a 3000 rpm durante 2 minutos el sobrenadante se depositoacute en un vial
independiente
El sobrenadante fue evaporado hasta sequedad bajo una corriente de nitroacutegeno
gaseoso Una parte de los residuos se disolvioacute en 200 microL de la fase moacutevil que
contiene HCOONH4 con una concentracioacuten 10 microM y un pH de 35
El equipo utilizado para realizar todos los anaacutelisis correspondientes a HPLC
cuenta con las siguientes caracteriacutesticas equipo Agient Technologies que consta
de una columna C18 de 46 mm 250 mm 5 mm con una fase moacutevil de
HCOONH4 con un flujo de 1 mLminuto un detector UV de 214 nm y una inyeccioacuten
de 20 μL y una temperatura de 25degC El experimento se corrioacute de modo isocraacutetico
con una fase moacutevil de agua 70 y HCOONH4 de 30
211 DETERMINACIOacuteN CUALITATIVA DE LA RESOLUCIOacuteN DEL
ALCALOIDE DE INTEREacuteS PARA LOS DIFERENTES ENSAYOS
Con el fin de determinar de manera cualitativa cuaacutel de los cromatogramas
arrojados mediante la teacutecnica de HPLC presentoacute mejor resolucioacuten del alcaloide
fue necesario realizar un supuesto acerca del tiempo de retencioacuten de la Psilocibina
durante la cromatografiacutea puesto que a pesar de haber contado con un
cromatograma (Tsujikawa et al 2003) (Anexo 18) y haber trabajado en las
mismas condiciones de eacuteste no se utilizoacute la misma fase moacutevil lo que puedo
generar variaciones en dicho tiempo Se asumioacute que el tiempo de retencioacuten varioacute
entre 62 y 72 minutos es decir entre este tiempo se encontroacute el pico de intereacutes
de la investigacioacuten
42
La eleccioacuten del criterio de pureza del compuesto de intereacutes se realizoacute observando
cuaacutel de los picos obtenidos muestra menor ruido es decir que a su alrededor no
tenga presencia de otros compuestos (Anexos 19 20 y 21)
212 DETERMINACIOacuteN PORCENTUAL DE COMPUESTOS PARA LOS
DIFERENTES ENSAYOS
La cuantificacioacuten de los compuestos se hizo mediante un porcentaje de aacuterea bajo
la curva debido a que no se contoacute con un estaacutendar interno
Para realizar dicho porcentaje se obtuvo la totalidad de las aacutereas presentes en el
perfil cromatograacutefico obtenido para las muestras de los diacuteas 12 13 y 14 de cada
fermentacioacuten y el porcentaje del aacuterea del metabolito de intereacutes la cual oscilaba
entre un tiempo de retencioacuten entre 62 y 72 minutos
En el momento de analizar los cromatogramas y de elegir el medio que mejor
resultados arrojoacute en cuanto a la produccioacuten de alcaloide se observoacute la resolucioacuten
del metabolito en cada una de las fermentaciones
213 CULTIVO SUMERGIDO DE P cubensis EN PRESENCIA DE FA
Despueacutes de haber elegido la fuente de carbono (glucosa) y su respectiva
concentracioacuten (50 gL) que mejores resultados arrojaron durante la investigacioacuten
se realizaron nuevamente fermentaciones del P cubensis en medio sumergido
(Fang-Zhong) donde la diferencia de estos medios con respecto a los
anteriormente utilizados radicoacute en la presencia de FA aminoaacutecido
Para dichas fermentaciones se contoacute con tres concentraciones diferentes de FA
(05 gL 1 gL 15 gL) realizadas por duplicado adicionalmente se montoacute
43
simultaacuteneamente con dichos ensayos las muestras correspondientes a los uacuteltimos
tres diacuteas de fermentacioacuten sin FA en el medio para efectos de comparacioacuten y asiacute
poder llevar a cabo un anaacutelisis estadiacutestico apropiado
Los datos obtenidos fueron analizados por medio de una ANOVA con el fin de
observar si existiacutean o no diferencias significativas en cuanto al crecimiento micelial
(concentracioacuten de biomasa) del P cubensis y asiacute poder determinar el medio que
mejores resultados arrojoacute durante la investigacioacuten
214 DISENtildeO DE EXPERIMENTOS Y ANAacuteLISIS ESTADIacuteSTICO
El disentildeo estadiacutestico utilizado para realizar los anaacutelisis correspondientes a las
diferentes fermentaciones es un disentildeo factorial 23 Este estudio se basoacute en dos
factores que fueron las dos fuentes de carbono (glucosa y sacarosa) a su vez se
apoyoacute en tres niveles que fueron la variacioacuten en la concentracioacuten de las mismas
(30 gL 50 gL y 70 gL) De igual manera se fundamentoacute en dos variables de
respuesta el crecimiento micelial de P cubensis y el porcentaje de Psilocibina
presente en el microorganismo
Por medio del Software Statgraphics plus 51 se realizoacute un anaacutelisis estadiacutestico
basado en una ANOVA factorial Con ello se pretendioacute comparar estadiacutesticamente
los resultados de crecimiento micelial de biomasa (concentracioacuten) y produccioacuten de
Psilocibina para cada uno de los medios durante los 14 diacuteas de fermentacioacuten y en
especial en los uacuteltimos tres diacuteas de la misma puesto que durante este periacuteodo fue
evaluada la presencia del alcaloide
Es necesario hacer hincapieacute que para realizar dicha estadiacutestica fue necesario
ejecutar un estudio de normalidad el cual se comproboacute utilizando la graacutefica de
probabilidad normal a su vez se requirioacute un anaacutelisis de igualdad de varianza por
medio de una graacutefica de residuos Vs previsto con el fin de ver visualmente la
44
hipoacutetesis de la homocedasticidad todo ello con el fin de garantizar que la
investigacioacuten se comportoacute de forma normal Adicionalmente se contoacute con una
hipoacutetesis nula (Ho) y una Hipoacutetesis alterna (Ha) las cuales permitieron realizar las
conclusiones respectivas A continuacioacuten se enunciaraacuten cada una de eacutestas y los
paraacutemetros necesarios para dicho estudio
Ho Todas las medias son iguales es decir no existen diferencias
significativas entre los datos analizados
Ha Alguna de las medias es diferente lo que quiere decir que siacute existen
diferencias significativas
Paraacutemetro
Pvalor gt 005 Se acepta Ho
Pvalor le 005 Se rechaza Ho
45
3 RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN
31 CINEacuteTICA DE CRECIMIENTO MICELIAL DE P cubensis EN CULTIVO
SUMERGIDO (FANG-ZHONG) UTILIZANDO DIFERENTES FUENTES DE
CARBONO
Con el propoacutesito de evaluar el crecimiento micelial del P cubensis en medio
sumergido durante los 14 diacuteas de la fermentacioacuten se recurrioacute al uso de
metodologiacuteas conocidas como peso huacutemedo y peso seco en dicho trabajo soacutelo se
exponen los datos arrojados por el meacutetodo de peso seco
A continuacioacuten se presentan cada una de las fermentaciones de acuerdo al tipo de
sustrato empleado en las mismas los respectivos valores de peso seco obtenidos
y los anaacutelisis pertinentes para cada uno de los casos
311 Crecimiento micelial de P cubensis en medio sumergido utilizando
diferentes concentraciones de glucosa
Inicialmente se evaluaron tres concentraciones de glucosa en el cultivo de P
cubensis en medio sumergido (Fang-Zhong) correspondientes a 30 gL 50 gL y
70 gL siendo en este caso la glucosa la principal fuente de carbono del P
cubensis
A continuacioacuten se muestran los valores de peso seco obtenidos para cada una de
las concentraciones de glucosa utilizadas durante los 14 diacuteas de la fermentacioacuten
46
0
01
02
03
04
05
06
07
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Bio
ma
sa (g
L)
Tiempo (diacuteas)30gL 50gL 70gL
Graacutefico 1 Cineacutetica de crecimiento micelial de P cubensis en medio sumergido (Fang-Zhong) utilizando tres diferentes concentraciones de
glucosa como fuente de carbono (Peso seco)
Del graacutefico 1 se puede observar que no hubo evidencia de fase de latencia para
ninguno de los ensayos posteriormente se aprecia que el crecimiento de biomasa
aumentoacute con el tiempo para las diferentes concentraciones de glucosa empleadas
Analizando las fermentaciones que conteniacutean 50 gL y 70 gL de glucosa se
puede afirmar que ambas presentan un comportamiento similar mostrando una
fase exponencial hasta el diacutea 11 y una fase estacionaria hasta el diacutea 14 de la
fermentacioacuten mientras que la fermentacioacuten que conteniacutea 30 gL de glucosa no
presentoacute fase estacionaria la fermentacioacuten durante los 14 diacuteas se encontraba en
fase exponencial a pesar de que entre los diacuteas 8 y 11 el crecimiento de P
cubensis se mantuvo constante
Asimismo se puede observar que el crecimiento maacutes bajo en cuanto a
concentracioacuten de biomasa se generoacute en la concentracioacuten de 30 gL siendo eacuteste
de 048 gL mientras que en las concentraciones de 50 gL y 70 gL de glucosa
los crecimientos maacuteximos fueron muy similares 055 gL y 062 gL
respectivamente
47
Lo dicho anteriormente se ratifica una vez analizados los resultados obtenidos
estadiacutesticamente donde se obtuvo un P-valor igual a cero indicando que existen
diferencias significativas en cuanto al crecimiento micelial de biomasa
(concentracioacuten de biomasa durante los 14 diacuteas de la fermentacioacuten) El graacutefico 2
ilustra la presencia de dos grupos homogeacuteneos lo que indica que las
concentraciones de 50 gL y 70 gL no tienen diferencias significativas del
crecimiento micelial entre cada una de ellas mientras que la concentracioacuten de 30
gL siacute presenta dichas diferencias significativas con respecto a las dos
concentraciones anteriores (Anexo 1)
Con todo eacutesto se expone que la concentracioacuten de glucosa de 50 gL es la que se
eligioacute debido a que es maacutes econoacutemico utilizar 50 gL de glucosa que 70 gL
Tratamientos con diferentes concentraciones de glucosa
Media 30 gL glucosa (a) 022
Media 50 gL glucosa (b) 032
Media 70 gL glucosa (b) 034
a
bb
0
005
01
015
02
025
03
035
04
045
Co
nce
ntr
acioacute
n b
iom
asa
(gL
)
Letras diferentes denotan diferencias significativas (prueba LSD)
Graacutefico 2 Crecimiento micelial de P cubensis en cultivo sumergido bajo tres concentraciones de glucosa
48
Modelo logiacutestico para las fermentaciones donde se utilizoacute glucosa
como fuente de carbono
Una vez realizada la cineacutetica de crecimiento del P cubensis en medio sumergido
(Fang-Zhong) usando diferentes concentraciones de glucosa se procedioacute a
ajustar los datos obtenidos al modelo logiacutestico Los crecimientos maacuteximos de
biomasa obtenidos mediante el meacutetodo de peso seco para cada uno de los
ensayos fueron 048 gL 065 gL y 062 gL para concentraciones de 30 gL 50
gL y 70 gL de glucosa respectivamente La tabla 2 muestra los paraacutemetros
cineacuteticos obtenidos mediante el modelo para cada una de las concentraciones
Tabla 2 Paraacutemetros cineacuteticos obtenidos mediante el modelo logiacutestico para las diferentes fermentaciones de P cubensis utilizando glucosa como fuente
de carbono
30gL 50gL 70gL
microx (diacutea-sup1) 016 microx (diacutea-sup1) 017 microx (diacutea-sup1) 015
micromax (diacutea-sup1) 027 micromax (diacutea-sup1) 035 micromax (diacutea-sup1) 034
X0 (gL) 005 X0 (gL) 008 X0 (gL) 008
R2 096 R2
092 R2 085
De la tabla 2 se puede observar que la concentracioacuten inicial de biomasa (Xo)
estuvo muy cercana para cada una de las concentraciones de glucosa utilizadas
Para 30 gL de glucosa la velocidad maacutexima de crecimiento (micromax) fue mucho
menor que la obtenida para 50 gL y 70 gL eacutesto pudo ser debido a que fue el
medio que menor cantidad de glucosa conteniacutea mientras que para las otras dos
concentraciones de glucosa la velocidad maacutexima de crecimiento fue similar
Al comparar las velocidades maacuteximas de las tres concentraciones de glucosa
utilizadas se evidencia que la fermentacioacuten que conteniacutea 50 gL presentoacute una
micromaacutex mayor correspondiente a 035 diacutea-1 esto sugiere que a mayores
concentracioacuten de glucosa (70 gL) puede ocurrir una inhibicioacuten por sustrato otro
49
criterio que afirma que dicha concentracioacuten fue la que mejores resultados arrojoacute de
las tres concentraciones de glucosa utilizadas para el crecimiento del P cubensis
en el medio de Fang-Zhong Ademaacutes se observa que este experimento fue el que
mayor velocidad especiacutefica de crecimiento presento siendo esta de 017 diacutea-1
Finalmente se calcularon los valores de biomasa teoacutericos utilizando la ecuacioacuten
descrita anteriormente en la metodologiacutea con el propoacutesito de observar que tanto
se ajustaron los valores de biomasa hallados experimentalmente con los valores
de biomasa teoacutericos arrojados por el modelo logiacutestico El graacutefico 3 muestra los
valores de biomasa (X) tanto teoacutericos como experimentales con respecto al
tiempo
0
01
02
03
04
05
06
07
0 2 4 6 8 10 12 14
Biom
asa
(gL
)
Tiempo (diacutea)
X exp (30 gL) X exp (50 gL) X exp (70 gL)
X teoacuterico (30 gL) X teoacuterico (50 gL) X teoacuterico (70 gL)
Graacutefico 3 Valores de concentracioacuten de biomasa experimental y teoacuterico
graficados con respecto al tiempo para las fermentaciones con diferentes concentraciones de glucosa
Al observar el graacutefico 3 se puede notar que para los ensayos de 50 gL y 70 gL
de glucosa los valores de biomasa teoacutericos se encuentran un poco desfasados de
los valores de biomasa hallados de manera experimental mientras que para el
ensayo que conteniacutea 30 gL de glucosa se observa un buen ajuste de los datos
50
obtenidos experimentalmente al modelo logiacutestico La tabla 2 reitera lo dicho
anteriormente al exponer los valores de R2 los cuales explican la relacioacuten que
tienen los datos teoacutericos con los experimentales
312 Crecimiento micelial del P cubensis en medio sumergido utilizando
diferentes concentraciones de sacarosa
Una vez evaluado el crecimiento de biomasa usando glucosa como fuente de
carbono se procedioacute a evaluar el efecto que teniacutea el cambio de la fuente de
carbono por sacarosa en el crecimiento micelial del P cubensis en medio
sumergido
El graacutefico 4 muestra de manera ilustrativa como fue el crecimiento micelial del P
cubensis para cada una de las concentraciones de sacarosa utilizadas durante los
14 diacuteas mediante el meacutetodo de peso seco
0
01
02
03
04
05
06
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Biom
asa (
gL)
Tiempo (diacuteas)
30 gL 50 gL 70 gL
Graacutefico 4 Cineacutetica de crecimiento micelial de P cubensis en medio sumergido (Fang-Zhong) utilizando diferentes concentraciones de sacarosa
como fuente de carbono (Peso seco)
51
En el graacutefico 4 se puede observar que tanto para una concentracioacuten de 30 gL
como para 70 gL de sacarosa el hongo llega a su fase estacionaria cerca del
quinto diacutea de la fermentacioacuten mientras que para una concentracioacuten de 50 gL se
observa un comportamiento diferente puesto que el microorganismo tiene un
crecimiento exponencial hasta el diacutea 5 en donde entra a una etapa de transicioacuten o
estacionaria durante 3 diacuteas aproximadamente luego de la cual inicia nuevamente
su crecimiento de forma exponencial hasta llegar al diacutea 11 en donde siacute empieza
su fase estacionaria
Al igual que en las tres fermentaciones que conteniacutean glucosa en estas
fermentaciones de sacarosa se observa mediante el graacutefico anterior que no hubo
presencia de fase de latencia
El crecimiento maacuteximo de biomasa en cuanto a concentracioacuten lo presentoacute aquella
fermentacioacuten que conteniacutea 70 gL de sacarosa el cual fue de 057 gL seguida de
la de 50 gL con un crecimiento maacuteximo de biomasa de 045 gL y posteriormente
la concentracioacuten de 30 gL obtuvo un crecimiento maacuteximo de 026 gL
De acuerdo al anaacutelisis estadiacutestico que se realizoacute para cada una de las
fermentaciones se dedujo que las diferencias en cuanto al crecimiento micelial de
biomasa con respecto a la concentracioacuten de la misma son significativas entre
cada una de las fermentaciones es decir fue diferente la concentracioacuten de
biomasa obtenida cuando se trabajoacute con cada una de distintas concentraciones de
sacarosa Lo dicho anteriormente se muestra a traveacutes del graacutefico 5 (Anexo 2)
52
Tratamientos con diferentes concentraciones de sacarosa
Media 30 gL sacarosa (a) 02
Media 50 gL sacarosa (b) 032
Media 70 gL sacarosa (c) 043
a
b
c
0
02
04
Co
nce
ntr
acioacute
n b
iom
asa
(gL
)
Letras diferentes denotan diferencias significativas (prueba LSD)
Graacutefico 5 Crecimiento micelial para tres diferentes concentraciones de sacarosa
Modelo logiacutestico para las fermentaciones donde se utilizoacute sacarosa
como fuente de carbono
Una vez realizadas las cineacuteticas de crecimiento del P cubensis para cada
concentracioacuten de sacarosa empleada se procedioacute a ajustar los datos obtenidos al
modelo logiacutestico cabe recalcar que es necesario establecer los crecimientos
maacuteximos de biomasa obtenidos para cada uno de los ensayos los cuales fueron
026 gL 045 gL y 057 gL para concentraciones de 30 gL 50 gL y 70 gL de
sacarosa respectivamente
Una vez aplicado el modelo logiacutestico para cada tratamiento se obtuvieron valores
de velocidad maacutexima de crecimiento y biomasa inicial para cada concentracioacuten de
sacarosa utilizada en el medio los cuales se muestran en la tabla 3
53
Tabla 3 Paraacutemetros cineacuteticos obtenidos mediante el modelo logiacutestico para las diferentes fermentaciones de P cubensis utilizando sacarosa como
fuente de carbono
30gL 50gL 70gL
microx (diacutea-sup1) 030 microx (diacutea-sup1) 014 microx (diacutea-sup1) 041
micromax (diacutea-sup1) 037 micromax (diacutea-sup1) 042 micromax (diacutea-sup1) 067
X0 (gL) 01 X0(gL) 01 X0 (gL) 011
R2 061 R2 089 R2 095
De la tabla 3 se ratifica que se utilizoacute una concentracioacuten inicial de biomasa igual
para cada una de las fermentaciones aproximadamente 01 gL ademaacutes se
observa un aumento en la velocidad maacutexima de crecimiento con respecto a la
cantidad de sacarosa empleada es decir que el hecho de haber aumentado la
concentracioacuten de sacarosa en el medio favorecioacute el aumento en la velocidad
maacutexima de crecimiento del P cubensis siendo eacutesta mayor cuando se trabajoacute a una
concentracioacuten de 70 gL de sacarosa De igual manera se aprecia que el
tratamiento que conteniacutea 70 gL de sacarosa presentoacute una velocidad especiacutefica de
crecimiento mayor que los demaacutes siendo eacutesta de 041 diacutea-1
Finalmente se calcularon los valores de biomasa teoacutericos el graacutefico 6 ilustra los
valores de biomasa (X) tanto teoacutericos como experimentales graficados con
respecto al tiempo
54
0
01
02
03
04
05
06
0 2 4 6 8 10 12 14
Bio
mas
a (g
L)
Tiempo (Diacutea)
X exp (30 gL) X exp (50 gL) X exp (70 gL)
X teoacuterico (30 gL) X teoacuterico (50 gL) X teoacuterico (70 gL)
Graacutefico 6 Valores de concentracioacuten de biomasa experimental y teoacuterico graficados con respecto al tiempo para las fermentaciones con diferentes
concentraciones de sacarosa
Del graacutefico 6 se puede observar como los valores de biomasa experimentales se
ajustaron a los valores de biomasa teoacutericos arrojados por el modelo logiacutestico lo
que quiere decir la cineacutetica de crecimiento del P cubensis en medio sumergido
cuando se utilizoacute 70 gL se ajustoacute correctamente al modelo logiacutestico lo que se
corrobora en la tabla 2 gracias al valor obtenido para el R2 que indica la relacioacuten
de los datos teoacutericos con respecto a los experimentales Por otro lado para las
fermentaciones de 30 gL y 50 gL de sacarosa a pesar de parecer que
presentaron un buen ajuste al calcular la relacioacuten de los datos teoacutericos con
respecto a los experimentales (R2) se concluye que el ajuste no fue tan bueno
55
313 Comparacioacuten entre el crecimiento micelial de P cubensis en los
cultivos sumergidos utilizando glucosa y sacarosa como fuente de
carbono
Ahora bien es igualmente importante realizar un anaacutelisis comparativo entre ambas
fuentes de carbono empleadas con el fin de determinar si existen o no diferencias
significativas entre dichas fuentes de carbono
De acuerdo al anaacutelisis estadiacutestico se dice que existen diferencias significativas del
crecimiento micelial del P cubensis en cuanto al diacutea y la concentracioacuten de
sustrato empleado es decir concentracioacuten de glucosa y sacarosa (Anexo 3) pero
se observa claramente que no hay diferencias significativas de dicho crecimiento
con respecto al tipo de sustrato utilizado debido a que el P-valor arrojado por la
estadiacutestica fue de 01217 lo que sugiere que se debe utilizar la sacarosa gracias
a la disminucioacuten de costos que se generariacutean durante el proceso todo ello gracias
al costo de la sacarosa es inferior al de glucosa Sin embargo para elegir la fuente
de carbono que mejores resultados arrojoacute no soacutelo se basoacute en la cantidad de
biomasa producida sino que se procedioacute a examinar los barridos espectrales
arrojados por el anaacutelisis de HPLC con el fin de determinar la fuente de carbono
que mejor resolucioacuten mostroacute del alcaloide que en esta investigacioacuten fue glucosa a
una concentracioacuten de 50 gL
De igual manera el graacutefico 7 muestra las medias obtenidas mediante el anaacutelisis
estadiacutestico para las fermentaciones trabajadas con glucosa y sacarosa Aun asiacute
es necesario hacer hincapieacute que eacuteste no es el criterio principal para la obtencioacuten
del medio que mejores resultados arrojoacute durante la investigacioacuten por lo tanto se
deben seguir realizando los diferentes anaacutelisis descritos anteriormente en este
trabajo
56
Tratamientos de las dos fuentes de carbono usadas sin FA (glucosa y
sacarosa)
Media para glucosa (a) 029
Media para sacarosa (a) 032
aa
0
01
02
03
Conc
entr
acioacute
n bi
omas
a (g
L)
Letras diferentes denotan diferencias significativas (Prueba LSD)
Graacutefico 7 Crecimiento micelial para dos diferentes fuentes de carbono (glucosa y sacarosa)
314 Crecimiento micelial del P cubensis en cultivo sumergido utilizando
glucosa y fenilalanina en el medio
Se decidioacute realizar un uacuteltimo ensayo acerca del efecto que teniacutea la adicioacuten de un
aminoaacutecido llamado Fenilalanina (FA) al medio Fang-Zhong sobre la produccioacuten
del alcaloide y por ende sobre la generacioacuten de biomasa
Debido a los anaacutelisis realizados anteriormente se concluyoacute que la mejor fuente de
carbono fue la glucosa a una concentracioacuten de 50 gL De la misma manera que
en los numerales anteriores se evaluoacute la cineacutetica del crecimiento micelial del P
cubensis mediante los meacutetodos de peso huacutemedo y peso seco Las mediciones
fueron realizadas por duplicado y promediadas para la fuente de carbono elegida
(glucosa 50 gL) y las diferentes concentraciones de FA en el medio
correspondientes a 05 gL 1 gL 15 gL con el fin de encontrar el medio que
mejores resultados arrojoacute en cuanto a crecimiento micelial y generacioacuten del
57
alcaloide de intereacutes Los datos obtenidos mediante el meacutetodo de peso seco se
muestran en el graacutefico 8
Cabe resaltar que junto con las tres fermentaciones de 05 gL 10 gL y 15 gL
de FA se montaron a su vez seis muestras correspondientes a los diacuteas 12 13 y
14 de la fermentacioacuten que conteniacutea 0 gL de FA eacutesto con el propoacutesito de analizar
los datos de manera estadiacutestica y poder hacer comparaciones con respecto a la
generacioacuten de biomasa y a la produccioacuten del alcaloide de intereacutes ambas medidas
con respecto a la concentracioacuten
0
01
02
03
04
05
06
07
08
09
1
11
12
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Biom
asa
(gL
)
Tiempo (diacuteas)
05 gL 1 gL 15 gL
Graacutefico 8 Cineacutetica de crecimiento micelial de P cubensis en medio sumergido (Fang-Zhong) utilizando diferentes concentraciones de FA y 50
gL de glucosa como fuente de carbono (Peso seco)
Al analizar el graacutefico 8 es decir el crecimiento micelial (concentracioacuten de
biomasa) seguacuten la concentracioacuten de FA en el tiempo se puede notar que no hubo
presencia de fase de latencia para ninguna de las concentraciones de FA
utilizadas ademaacutes el crecimiento de biomasa en cada caso se aprecia de manera
58
muy similar llegando los tres ensayos a la fase estacionaria el diacutea 12 de la
fermentacioacuten
Observando el graacutefico 8 se puede identificar que el mayor contenido de biomasa
fue de 108 gL obtenida el diacutea 13 para una concentracioacuten 10 gL de FA para
concentraciones de 05 gL y 15 gL de FA la concentracioacuten maacutexima de biomasa
fue 106 gL y 101 gL respectivamente Auacuten asiacute al considerar los resultados
obtenidos se puede ratificar que es indiferente la cantidad de FA necesaria para
obtener concentracioacuten de biomasa por ende se decide que el medio que mejores
resultados arrojoacute fue el que conteniacutea 05 gL FA debido a que fue la
concentracioacuten de FA que mejor resolucioacuten del alcaloide presentoacute paraacutemetro
observado mediante los cromatogramas obtenidos del anaacutelisis de HPLC (Anexos
19 20 y 21) y ademaacutes porque con dicha cantidad los costos de la materia prima
seriacutean menores Cabe resaltar que el uso de FA generoacute un aumento significativo
duplicando la produccioacuten de biomasa por lo tanto se testifica que siacute hubo
duplicacioacuten en cuanto a la concentracioacuten de biomasa en los medios que conteniacutea
FA con respecto a los medios que no conteniacutean FA se dice entonces que a su
vez se podriacutea haber generado mayor cantidad de Psilocibina en los medios que
teniacutean FA ya que dicho alcaloide se produce de manera intracelular por tal
razoacuten al aumentar la cantidad de biomasa en el medio se aumenta la cantidad de
dicho alcaloide
De igual manera se analizaron los datos estadiacutesticamente y se llegoacute a apreciar
que no existen diferencias significativas en cuanto a la produccioacuten de biomasa y la
cantidad de FA utilizada en el medio Del mismo modo al analizar la tabla de
contrastes muacuteltiple de rangos se reitera que siacute existen diferencias significativas
entre el crecimiento micelial de biomasa (concentracioacuten de biomasa) en el tiempo
cuando se trabajoacute con FA o sin eacuteste Eacutesto se puede observar en el graacutefico 9
(Anexo 4)
59
Tratamientos con y sin FA
Media 0 gL FA (a) 032
Media 05 gL FA (b) 065
Media 10 gL FA (b) 066
Media 15 gL FA (b) 069
a
b b b
0
01
02
03
04
05
06
07
08
09
Conc
entr
acioacute
n bi
omas
a (g
L)
Letras diferentes denotan diferencias significativas (Prueba LSD)
Graacutefico 9 Crecimiento micelial para glucosa a una concentracioacuten de 50 gL y tres diferentes concentraciones de FA
Modelo logiacutestico para las fermentaciones donde se utilizoacute 50 gL de
glucosa como fuente de carbono y diferentes concentraciones de FA
En primer lugar se fijaron los valores de crecimiento maacuteximo de biomasa para
cada una de las concentraciones obtenidos mediante el meacutetodo de peso seco con
el fin de hallar los paraacutemetros cineacuteticos mediante el modelo logiacutestico Los
crecimientos maacuteximos de biomasa obtenidos fueron los siguientes 106 gL 108
gL y 101 gL para concentraciones de 05 gL 10 gL y 15 gL de FA
respectivamente y 50 gL de glucosa
Una vez realizado el modelo logiacutestico para cada tratamiento se obtuvieron los
valores de velocidad maacutexima de crecimiento y concentracioacuten de biomasa inicial
para cada ensayo los cuales se muestran en la tabla 4
60
Tabla 4 Paraacutemetros cineacuteticos obtenidos mediante el modelo logiacutestico para las diferentes fermentaciones de P cubensis utilizando 50 gL de glucosa
como fuente de carbono y diferentes concentraciones de FA
05gL 10gL 15gL
microx (diacutea-sup1) 018 microx (diacutea-sup1) 012 microx (diacutea-sup1) 012
micromax (diacutea-sup1) 045 micromax (diacutea-sup1) 035 micromax (diacutea-sup1) 044
X0 (gL) 01 X0 (gL) 017 X0 (gL) 016
R2 095 R2 082 R2 088
Seguacuten los valores arrojados por el modelo logiacutestico que se encuentran
presentados en la tabla 4 se puede decir que se presentoacute una valor de biomasa
inicial similar para los tratamientos de 1 gL y 15 gL de FA mientras que para las
fermentaciones que conteniacutean 05 gL de FA se tiene una diferencia de un 50
aproximadamente Ademaacutes se puede observar que a la concentracioacuten de 05 gL
de FA es la que mayor velocidad maacutexima de crecimiento presenta siendo esta
045 diacuteamacrsup1 a su vez dicha concentracioacuten presentaacute la microx mayor correspondiente a
018 diacutea-1 Debido a eacutesto y al criterio de mejor resolucioacuten del alcaloide observado
en los anaacutelisis de HPLC (Anexos 19 20 y 21) se concluye que el medio que
mejores resultados arrojoacute durante la investigacioacuten para la generacioacuten de biomasa
y la produccioacuten de la Psilocibina es 05 gL de FA y 50 gL de glucosa
Finalmente se calcularon los valores de biomasa teoacutericos el graacutefico 10 muestra
los valores de biomasa (X) tanto teoacutericos como experimentales graficados con
respecto al tiempo
61
0
02
04
06
08
1
12
0 2 4 6 8 10 12 14 16
Bio
mas
a (g
L)
Tiempo (Diacutea)
X exp (05 gL) X exp (10 gL) X exp (15 gL)
X teoacuterico (05 gL) X teoacuterico (10 gL) X teoacuterico (15 gL)
Graacutefico 10 Valores de concentracioacuten de biomasa experimental y teoacuterico graficados con respecto al tiempo para las fermentaciones con diferentes
concentraciones de FA y 50 gL de glucosa
Se puede decir gracias al graacutefico 10 que los valores de biomasa experimentales
se ajustaron a los valores de biomasa teoacutericos hallados mediante el modelo
logiacutestico es decir la cineacutetica de crecimiento del P cubensis en medio sumergido
cuando se usaron diferentes concentraciones de FA en el medio se ajustoacute
correctamente al modelo logiacutestico esto se reitera con los valores de R2 mostrados
anteriormente en la tabla 4
32 ESTUDIO DE LA CINEacuteTICA DE CONSUMO DE SUSTRATO POR PARTE
DEL P cubensis CULTIVADO EN MEDIO SUMERGIDO (FANG-ZHONG)
La evaluacioacuten del consumo de sustrato durante la fermentacioacuten con respecto al
tiempo es de suma importancia puesto que eacuteste es el principal componente
limitante del crecimiento presente en el medio de cultivo
62
A continuacioacuten se analizaraacuten dichos consumos para los diferentes ensayos
321 Consumo de sustrato por parte del P cubensis en medio sumergido
utilizando diferentes concentraciones de glucosa
Una vez halladas las concentraciones de sustrato para cada una de las
fermentaciones que conteniacutean glucosa en el medio se procedioacute a graficar dichos
valores con respecto al tiempo
El graacutefico 11 ilustra los datos obtenidos sobre el consumo de sustrato de las tres
fermentaciones que conteniacutean glucosa y a su vez como se comportoacute el
crecimiento de biomasa para cada ensayo durante los 14 diacuteas de fermentacioacuten
0
01
02
03
04
05
06
07
0
10
20
30
40
50
60
70
80
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14B
iom
asa
(gL
)
Glu
cosa
(gL
)
Tiempo (diacuteas)
30 GL 50GL 70 GL 30gL 50gL 70gL
Graacutefico 11 Cineacutetica de consumo de sustrato por parte del P cubensis en medio sumergido utilizando diferentes concentraciones de glucosa como
fuente de carbono
Al observar el graacutefico 11 se expone que el P cubensis consumioacute mayor cantidad
de glucosa cuando esta estaba a una concentracioacuten de 70 gL correspondiendo a
63
un porcentaje de 62 mientras que para 50 gL y 30 gL fue de 23 y 30
respectivamente
Comparando el consumo de glucosa en sus diferentes concentraciones con el
crecimiento micelial del hongo se puede observar que a una concentracioacuten de
glucosa de 30 gL no soacutelo se tuvo un menor consumo de sustrato sino que
tambieacuten se generoacute un menor crecimiento de biomasa Mientras que a
concentraciones de 50 gL y 70 gL de glucosa a pesar de presentar diferencias
en cuanto al porcentaje de sustrato consumido el crecimiento micelial es similar
(no presenta diferencias significativas) lo que indica que el hongo no requiere
tanta concentracioacuten de glucosa para su crecimiento eacutesto se puede afirmar soacutelo
para este ensayo a estas condiciones
De igual manera en el graacutefico 11 al analizar la tendencia del consumo de
sustrato las concentraciones de glucosa de 50 gL y 70 gL presentan una
disminucioacuten notoria hasta el diacutea 11 para dicho consumo Esto se debe a que en
ese diacutea inicioacute la fase estacionaria del hongo en ambas fermentaciones en donde
el P cubensis requeriacutea alimento uacutenicamente para mantenerse y producir
metabolitos secundarios Mientras que para la concentracioacuten de glucosa de 30 gL
el consumo de glucosa fue muy poco a partir del quinto diacutea de la fermentacioacuten
esto se atribuye a que la cineacutetica de crecimiento micelial del P cubensis presentoacute
una fase estacionaria temprana entre los diacuteas 8 y 11 indicando que no necesitaba
consumir casi glucosa puesto que no estaba creciendo
322 Consumo de sustrato por parte del P cubensis en medio sumergido
utilizando diferentes concentraciones de sacarosa
Los datos obtenidos sobre el consumo de sacarosa para cada una de las
concentraciones utilizadas (30 gL 50 gL y 70 gL de sacarosa) durante los 14
diacuteas de la fermentacioacuten se muestran en el graacutefico 12 a su vez se ilustran en dicho
64
graacutefico el comportamiento del crecimiento micelial para cada ensayo durante los
14 diacuteas de fermentacioacuten para efectos de anaacutelisis
0
01
02
03
04
05
06
0
10
20
30
40
50
60
70
80
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Bio
mas
a (g
L)
Sac
aro
sa (g
L)
Tiempo (diacuteas)
30gL 50gL 70gL 30 gL 50 gL 70 gL
Graacutefico 12 Cineacutetica de consumo de sustrato por parte del P cubensis en medio sumergido utilizando diferentes concentraciones de sacarosa como
fuente de carbono
Al observar el graacutefico 12 se puede decir que el P cubensis consumioacute mayor
cantidad de sacarosa cuando eacutesta estaba a una concentracioacuten de 70 gL en el
medio presentando un porcentaje de consumo del 49 mientras que para las
concentraciones de 50 gL y 30 gL de sacarosa se tuvo un porcentaje de
consumo de 24 y 37 Esto igual que en el consumo de glucosa se puede
deber a que al tener mayor concentracioacuten de sustrato en el medio el P cubensis
genera mayor afinidad por el mismo haciendo que dicho hongo se consuma
grandes cantidades de sacarosa durante el tiempo
Igualmente se observa que aproximadamente en el noveno diacutea de la
fermentacioacuten las tres diferentes concentraciones de glucosa (30 gL 50 gL y 70
65
gL) se mantienen casi constantes en el tiempo ello gracias a que en este diacutea el
hongo se encontraba en fase estacionaria en los tres ensayos
323 Comparacioacuten entre el consumo de sustrato de P cubensis en los
cultivos sumergidos con diferentes fuentes de carbono
Con el fin de identificar cuaacutel de las dos fuentes de carbono fue consumida en
mayor proporcioacuten por parte del P cubensis se procedioacute a realizar un anaacutelisis
estadiacutestico donde comparamos las dos fuentes de carbono empleados con
respecto al consumo de sustrato obtenido (concentracioacuten de glucosa y sacarosa
en cada uno de los medios) donde se consiguioacute un P-valor de 00811 con
respecto al tipo de sustrato lo que indica que no existen diferencias en cuanto al
consumo de sustrato y el tipo del mismo es decir es indiferente cuaacutel de los dos
sustratos (glucosa o sacarosa) se utilice para que se del consumo del mismo por
parte del P cubensis Observacioacuten que se reitera en la tabla de contraste muacuteltiple
que muestra que se trabajoacute como un grupo homogeacuteneo Igualmente el graacutefico 13
muestra las medias de consumo de sustrato (concentracioacuten durante los 14 diacuteas)
obtenidas mediante el anaacutelisis estadiacutestico y reitera que no existen diferencias
significativas con respecto al tipo de sustrato utilizado para el cultivo del P
cubensis en medio sumergido (Anexo 5)
66
Tratamientos de las dos fuentes de carbono usadas sin FA (glucosa y sacarosa)
Media glucosa (a) 3431
Media sacarosa (a) 3678
a
a
32
34
36
38
Co
nce
ntr
acioacute
n s
ust
rato
(g
L)
Letras diferentes denotan diferencias significativas (Prueba LSD)
Graacutefico 13 Consumo de sustrato para cada una de las fuentes de carbono utilizadas
Aun asiacute al comparar los graacuteficos 11 y 12 se puede observar un mayor consumo
de glucosa que de sacarosa lo que lleva a concluir que es mejor emplear la
primera (glucosa)
324 Consumo de sustrato por parte del P cubensis en medio sumergido
utilizando glucosa y fenilalanina en el medio
Los datos obtenidos acerca del consumo de sustrato durante los 14 diacuteas de la
fermentacioacuten para cada uno de los medios que conteniacutean 50 gL de glucosa y
diferentes concentraciones de FA (05 gL 1 gL y 15 gL) se muestran en el
graacutefico 14 De igual manera se ilustran en dicho graacutefico las cineacuteticas de
crecimiento micelial para cada una de las fermentaciones que teniacutean 50 gL de
glucosa y diferentes concentraciones de FA con el fin de realizar los anaacutelisis
pertinentes
67
0
02
04
06
08
1
12
0
10
20
30
40
50
60
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Bio
mas
a (g
L)
Glu
cosa
50
gL
+ F
A (g
L)
Tiempo (diacuteas)
05gL 10gL 15gL 05 gL 1 gL 15 gL
Graacutefico 14 Cineacutetica de consumo de sustrato por parte del P cubensis en medio sumergido utilizando 50 gL de glucosa como fuente de carbono y
diferentes concentraciones de FA
Analizando el graacutefico 14 se puede decir que el consumo de glucosa durante el
tiempo fue igual para las fermentaciones que conteniacutea concentraciones de 1 gL y
15 gL de FA dichos consumos corresponde a valores de 23 mientras que
para el ensayo que teniacutea una concentracioacuten de 05 gL de FA el porcentaje de
consumo fue del 18 Asimismo se presentaron diferencias significativas en
cuanto al consumo de sustrato entre los diferentes ensayos
El graacutefico 15 expone las medias del consumo de sustrato (concentracioacuten) de cada
una de las muestras y las diferencias existentes entre ellas se evidencia que la
adicioacuten de FA disminuyoacute el consumo de glucosa ademaacutes que en los ensayos se
presentaron tres grupos homogeacuteneos diferentes En el primer grupo (a) que
contiene las fermentaciones del P cubensis con una concentracioacuten de 50 gL de
glucosa y en ausencia de FA se obtuvo una media de 356 gL la cual indica un
mayor consumo de sustrato Luego el segundo grupo (c) se compone de las
concentraciones de 1 gL y 15 gL de FA presentando una media de 413 gL y
de 426 gL respectivamente y el uacuteltimo grupo (b) corresponde a una
68
concentracioacuten de 05 gL de FA el cual presenta el menor consumo de glucosa al
exponer una media 466 gL
Seguacuten lo anterior y el graacutefico 15 se dice que siacute existieron diferencias significativas
en cuanto al consumo de sustrato (concentracioacuten durante los 14 diacuteas) en los
uacuteltimos tres diacuteas cuando se trabajo con FA y sin FA y a su vez se encontraron
diferencias significativas de la concentracioacuten de sustrato en el medio cuando se
teniacutea una concentracioacuten de FA correspondiente a 05 gL con relacioacuten a las otras
dos concentraciones de FA (10 gL y 15 gL) mientras que entre estas dos
uacuteltimas concentraciones de FA (10 gL y 15 gL) no se encontraron diferencias
significativas (Anexo 6)
Tratamientos con y sin FA
Media 0 gL FA (a) 3564
Media 05 gL FA (b) 466
Media 10 gL FA (c) 4131
Media 15 gL FA (c) 426
a
b c c
0
10
20
30
40
50
60
Conc
entr
acioacute
n su
stra
to (g
L)
Letras diferentes denotan diferencias significativas (prueba LSD)
Graacutefico 15 Consumo de sustrato para cada una de las concentraciones de FA utilizadas
69
33 ESTUDIO DE LA CINEacuteTICA DE CONSUMO DE PROTEIacuteNA POR PARTE
DEL P cubensis CULTIVADO EN MEDIO SUMERGIDO (FANG-ZHONG)
Las fuentes de proteiacutena que posee el medio de Fang-Zhong son extracto de
levadura y peptona que representan una cantidad de 10 gL para cada ensayo
eacutesta cantidad se mantuvo constante para cada fermentacioacuten
Se evaluoacute el consumo de proteiacutena por parte del P cubensis durante los 14 diacuteas
de la fermentacioacuten para cada uno de los ensayos
A continuacioacuten se analizan los resultados obtenidos para cada uno de los
tratamientos
331 Consumo de proteiacutena por P cubensis en medio sumergido utilizando
diferentes concentraciones de glucosa
Una vez se calcularon las concentraciones de proteiacutena en el medio para cada
ensayo se graficaron dichos valores con respecto al tiempo
El graacutefico 16 muestra como se comportoacute el consumo de proteiacutena con respecto al
tiempo para cada una de las tres concentraciones de glucosa utilizadas y a su vez
como se comportoacute el crecimiento de biomasa para cada ensayo durante los 14
diacuteas de fermentacioacuten
70
0
01
02
03
04
05
06
07
0
5
10
15
20
25
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Bio
mas
a (g
L)
Pro
tein
a (g
L)
Tiempo (diacuteas)
30 GL 50 GL 70 GL 30 gL Biomasa 50 gL Biomasa 70 gL Biomasa
Graacutefico 16 Cineacutetica de consumo de proteiacutena por parte del P cubensis en medio sumergido utilizando diferentes concentraciones de glucosa como
fuente de carbono
Analizando el graacutefico 16 se puede observar que el consumo de proteiacutena se dio
casi en su totalidad El ensayo que mayor consumo de proteiacutena presentoacute fue el
que conteniacutea 30 gL de glucosa arrojando un porcentaje de consumo del 98
mientras que las fermentaciones realizadas a concentraciones de 50 gL y 70 gL
de glucosa presentaron un porcentaje de consumo de proteiacutena del 91 y 90
respectivamente
Al enfocarnos en la relacioacuten existente entre el consumo de proteiacutena y el
crecimiento micelial del P cubensis se puede notar gracias al graacutefico 16 que la
relacioacuten es directamente proporcional debido a que el consumo de proteiacutena fue
permanente mientras el hongo se encontraba en fase exponencial es decir el P
cubensis necesitaba de la proteiacutena para aumentar su crecimiento mientras que en
el momento en que el microorganismo comenzoacute su fase estacionaria la
concentracioacuten de proteiacutena en el medio se mantuvo constante esto uacuteltimo soacutelo es
vaacutelido para concentraciones de 50 gL y 70 gL de glucosa puesto que ambas
llegaron a la fase estacionaria
71
332 Consumo de proteiacutena por P cubensis en medio sumergido utilizando
diferentes concentraciones de sacarosa
Una vez obtenidos los valores de consumo de proteiacutena para cada concentracioacuten
de sacarosa utilizada se precedioacute a graficarlos con respecto al tiempo dichos
datos se encuentran en el graacutefico 17 De igual manera en este graacutefico se
representa la cineacutetica de crecimiento de biomasa para el P cubensis de acuerdo a
las distintas concentraciones de sacarosa utilizadas
0
01
02
03
04
05
06
0
2
4
6
8
10
12
14
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Bio
mas
a (g
L)
Prot
eiacutena
(gL
)
Tiempo (diacuteas)
30 GL 50 GL 70 GL 30 gL 50 gL 70 gL
Graacutefico 17 Cineacutetica de consumo de proteiacutena por parte del P cubensis en medio sumergido utilizando diferentes concentraciones de sacarosa como
fuente de carbono
El graacutefico 17 ilustra el consumo casi en su totalidad de la proteiacutena para cada uno
de los tratamientos El ensayo que mayor consumo de proteiacutena presentoacute fue el
que conteniacutea 30 gL de sacarosa exponiendo un porcentaje de consumo del 89
mientras que las concentraciones de 50 gL y 70 gL de sacarosa arrojaron
porcentajes de consumo del 86 y 57 respectivamente
Ahora bien al analizar el crecimiento del P cubensis con respecto al consumo de
proteiacutena se evidencia claramente que el consumo disminuyoacute permanentemente
72
en el tiempo mientras el hongo se encontraban en estado exponencial indicando
el intereacutes del P cubensis por la proteiacutena siendo eacutesta utilizada por el mismo para
aumentar su tamantildeo y biomasa
Durante los diacuteas 4 y 10 las fermentaciones que conteniacutean concentraciones de 30
gL y 70 gL de sacarosa presentaron un alto consumo de proteiacutena a pesar de
que el P cubensis se encontraba en estos dos ensayos en fase estacionaria fase
en la cual no se requiere consumir grandes cantidades de sustrato puesto que el
hongo soacutelo necesitaba alimentarse para mantenerse o para producir productos no
ligados al crecimiento maacutes no para cambiar la cantidad de biomasa presente en el
medio Asimismo la concentracioacuten de 50 gL de sacarosa tambieacuten presentoacute un
alto consumo de proteiacutena durante los diacuteas 4 y 8 en donde se creiacutea estar en una
fase estacionaria temprana lo dicho anteriormente reitera una vez maacutes la afinidad
que el P cubensis presentoacute con respecto a las fuentes de proteiacutena usadas
333 Comparacioacuten entre el consumo de proteiacutena de P cubensis en los
cultivos sumergidos con diferentes fuentes de carbono
Con el fin de conocer cuaacutel de los dos tipos de sustrato empleado fue mayormente
consumido se realizoacute un anaacutelisis estadiacutestico
En el graacutefico 18 se ilustran las medias de consumo de proteiacutena (concentracioacuten)
arrojadas mediante el anaacutelisis estadiacutestico sobre el consumo de proteiacutena cuando se
utilizoacute glucosa o sacarosa en el medio y se evidencia que existen diferencias
significativas en cuanto a la concentracioacuten de proteiacutena en el tiempo en el medio
cuando se realizoacute el experimento con glucosa y cuando se utilizoacute sacarosa
arrojando asiacute dos grupos homogeacuteneos el primero (a) presenta una media de 465
gL mientras que el grupo dos (b) arroja un valor de media de 609 gL indicando
un menor consumo de proteiacutena por parte del P cubensis en el medio sumergido
73
de Fang-Zhong cuando se utilizoacute sacarosa como principal fuente de carbono
(Anexo 7)
Tratamientos de las dos fuentes de carbono usadas sin FA (glucosa y sacarosa)
Media glucosa (a) 465
Media sacarosa (b) 609
a
b
0
1
2
3
4
5
6
7
8
Conc
entr
acioacute
n pr
oteiacute
na (g
L)
Letras diferentes denotan diferencias significativas (prueba LSD)
Graacutefico 18 Consumo de proteiacutena para cada una de las fuentes de carbono utilizadas
334 Consumo de proteiacutena por P cubensis en medio sumergido utilizando
glucosa y FA en el medio
Una vez se obtuvo la concentracioacuten de proteiacutena en el medio para cada
concentracioacuten de FA utilizada se precedioacute a graficar dichos valores con respecto
al tiempo los cuales se ilustran en el graacutefico 19 ademaacutes se muestran en dicho
graacutefico las cineacuteticas de crecimiento de biomasa para cada ensayo
74
0
02
04
06
08
1
12
0
2
4
6
8
10
12
14
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Bio
mas
a (g
L)
Pro
teiacuten
a (g
L)
Tiempo (diacuteas)
05 gL 1 gL 15 gL 05 gL 1 gL 15 gL
Graacutefico 19 Cineacutetica de consumo de proteiacutena por parte del P cubensis en medio sumergido utilizando 50 gL de glucosa como fuente de carbono y
diferentes concentraciones de FA
De igual forma que para la fermentacioacuten que teniacutea 50 gL de glucosa en el medio
realizada anteriormente para dichos ensayos el consumo de proteiacutena fue
permanente y se dio casi en su totalidad El ensayo que mayor consumo de
proteiacutena presentoacute fue el que conteniacutea 05 gL de FA arrojando un porcentaje de
consumo del 86 aun asiacute el porcentaje de consumo arrojado por la fermentacioacuten
de 1 gL de FA fue del 84 indicando que no existen diferencias con respecto al
consumo de proteiacutena entre dichas cantidades de FA utilizadas Mientras que el
porcentaje de consumo para 15 gL de FA fue inferior presentando un valor del
72 De acuerdo a los resultados mencionados anteriormente se puede decir que
a mayor concentracioacuten de FA en el medio se presenta menor consumo de
proteiacutena por parte del P cubensis esto se puede afirmar uacutenicamente para los
resultados obtenidos durante esta investigacioacuten a ciertas condiciones
Analizando ahora la relacioacuten entre el consumo de proteiacutena y el crecimiento
micelial se puede ver que al igual que para los ensayos con glucosa a 50 gL se
75
tiene un consumo permanente mientras se estaacute en fase exponencial y una vez se
llega a la fase estacionario alrededor del diacutea 12 la concentracioacuten de proteiacutena en
el medio se estabilizoacute
A la hora de indagar los datos estadiacutesticamente se puede observar que no existen
diferencias significativas sobre el consumo de proteiacutena (concentracioacuten) en el
tiempo con respecto al tipo de sustrato pero al comparar los resultados con los
ensayos donde se antildeadioacute FA al medio se encontroacute que siacute existen diferencias
significativas Se crearon dos grupos homogeacuteneos el primero cuenta con glucosa
y sacarosa presentando medias (cantidad de proteiacutena en el medio) de 468 gL y
473 gL respectivamente mientras que el ensayo con FA se encuentra en otro
grupo en donde su consumo de proteiacutena fue menor presentando una media
(cantidad de proteiacutena en el medio) de 614 gL (Anexo 8)
Tratamientos con y sin FA
Media glucosa (a) 468
Media sacarosa Proteiacutena (a) 473
Media fenilalanina (b) 614
a a
b
0
1
2
3
4
5
6
7
8
Co
nce
ntr
acioacute
n p
rote
iacutena
(gL
)
Letras diferentes denotan diferencias significativas (prueba LSD)
Graacutefico 20 Consumo de proteiacutena para los ensayos con y sin FA
76
34 ESTUDIO CUALITATIVO DE LA PRESENCIA DEL ALCALOIDE
Posterior a las fermentaciones de glucosa sacarosa y glucosa 50 gL con FA y
los respectivos anaacutelisis se realizoacute un uacuteltimo anaacutelisis que a la vez fue el de mayor
relevancia a la hora de determinar cuaacutel de los medios fue el que mejores
resultados arrojoacute En primera instancia se utilizoacute el reactivo de Dragendorff como
indicador de alcaloide para analizar las muestras de los diacuteas 12 13 y 14 con el fin
de esclarecer la presencia de alcaloides (Anexo 17)
Una vez detectada la presencia de alcaloides gracias a la coloracioacuten naranja
presentada en las muestras se procedioacute a realizar la teacutecnica de HPLC con el fin
de hallar un porcentaje del compuesto de intereacutes basado en las aacutereas obtenidas
de los cromatogramas (asumiendo un tiempo de retencioacuten entre 62 y 72
minutos)
341 Produccioacuten de compuestos producidos por P cubensis cuando el
medio no conteniacutea FA
A la hora de analizar y confirmar cuaacutel fue el mejor ensayo de los experimentos
realizados se tuvo como criterio base determinar la fuente de carbono y su
respectiva concentracioacuten que mejor presencia del compuesto de intereacutes arrojoacute
supuesto a un tiempo de retencioacuten entre 62 y 72 minutos
Inicialmente al obtener los anaacutelisis estadiacutesticos se deduce que no existieron
diferencias significativas entre el aacuterea del pico de intereacutes con respecto a todos los
picos arrojados por el cromatograma y los factores estudiados (tipo de sustrato
diacutea de fermentacioacuten y concentracioacuten) puesto que se obtuvieron valores de P-valor
77
de 03310 09580 y 08336 respectivamente es decir no importa queacute tipo de
sustrato se utilice la produccioacuten de alcaloide no tendraacute variaciones (Anexo 9)
Al analizar el graacutefico 21 se puede observar que las medias de las aacutereas halladas
para los diferentes ensayos con glucosa y sacarosa no presentaron diferencias
significativas es decir pertenecen al mismo grupo homogeacuteneo (a) lo que ratifica
lo dicho anteriormente
Tratamiento de las dos fuentes de carbono usadas sin FA (glucosa y sacarosa)
Media glucosa (a) 235916
Media sacarosa (a) 337147
a
a
0
7000
14000
21000
28000
35000
42000
Aacutere
a de
Com
pues
to
Letras diferentes denotan diferencias significativas (prueba LSD)
Graacutefico 21 Aacuterea del compuesto obtenido de P cubensis en tiempo de retencioacuten entre 62 y 72 minutos para las dos fuentes de carbono
Por tal razoacuten fue necesario hacer un anaacutelisis cualitativo de los cromatogramas
obtenidos mediante HPLC el cual se basoacute en la forma del pico arrojado por la
teacutecnica La figura 6 ilustra dicho anaacutelisis
78
Buena resolucioacuten de pico Mala resolucioacuten de pico
(a) (b)
Figura 6 Cromatogramas de dos diferentes fermentaciones de P cubensis que ilustran el criterio de escogencia del mejor ensayo realizado (a) 50 gL
glucosa (b) 50 gL sacarosa
Primero fue necesario observar el tamantildeo del pico y posterior a eacutesto determinar
su resolucioacuten La figura 6 ilustra dos ejemplos el de 50 gL de glucosa el diacutea 13 y
50 gL de sacarosa el diacutea 14 mientras el primero muestra un pico grande y
definido la segunda fermentacioacuten ilustra un pico grande pero poco definido
indicando que en este caso no se resolvioacute correctamente el alcaloide es decir no
se logroacute una buena separacioacuten De esta manera se analizaron los diferentes
cromatogramas para los diacuteas 12 (Anexo 19) 13 (Anexo 20) y 14 (Anexo 21) de
cada fermentacioacuten arrojando diferencias entre los ensayos y llevando a la
conclusioacuten de que la fermentacioacuten que mejores resultados arrojoacute fue la que
conteniacutea 50 gL de glucosa
79
342 Produccioacuten de compuestos producidos por P cubensis cuando el
medio conteniacutea FA
Despueacutes de realizada la fermentacioacuten con glucosa 50 gL y concentraciones de
FA de 05 gL 10 gL y 15 gL se procedioacute de igual manera que en el estudio sin
FA a evaluar cuaacutel de estas tres concentraciones de FA exhibioacute mejor resolucioacuten
del alcaloide
Inicialmente se realizoacute un anaacutelisis estadiacutestico el cual arrojoacute que no existen
diferencias significativas con respecto al aacuterea de pico que en este caso debido al
supuesto representa la Psilocibina y los diacuteas 12 13 y 14 de la fermentacioacuten
Mediante el graacutefico 22 se puede decir que en los uacuteltimos tres diacuteas de las
fermentaciones que conteniacutean FA en el medio no existen diferencias significativas
con respecto al alcaloide de intereacutes obtenido es decir en los tres se produjo el
alcaloide (Anexo 10)
Tratamientos de los uacuteltimos tres diacuteas de fermentacioacuten usando FA
Media diacutea 12 (a) 411758
Media diacutea 13 (a) 413401
Media diacutea 14 (a) 44860
a a a
0
10000
20000
30000
40000
50000
Aacutere
a Co
mpu
esto
Letras diferentes denotan diferencias significativas
Graacutefico 22 Aacuterea del compuesto obtenido de P cubensis en tiempo de retencioacuten entre 62 y 72 minutos en los uacuteltimos tres diacuteas de la fermentacioacuten
con FA y glucosa
80
Igual que en numeral anterior fue necesario realizar anaacutelisis cualitativo para los
cromatogramas por ende se requirioacute observar el tamantildeo del pico y posterior a
eacutesto determinar su resolucioacuten
Buena resolucioacuten de pico Mala resolucioacuten de pico
(a) (b)
Figura 7 Cromatogramas de dos diferentes fermentaciones de P cubensis que ilustran el criterio de escogencia del mejor ensayo realizado (a) 05 gL
FA (b) 15 gL FA
La figura 7 ejemplifica el anaacutelisis realizado para la seleccioacuten del mejor ensayo
ejecutado Se tienen dos cromatogramas el de 05 gL de FA en el diacutea 13 y el de
15 gL de FA para el mismo diacutea
A todos los cromatogramas obtenidos para los diacuteas 12 (Anexo 19) 13 (Anexo 20)
y 14 (Anexo 21) se realizoacute el mismo anaacutelisis y se concluyoacute que la concentracioacuten
maacutes apropiada para la obtencioacuten de la los compuestos producidos por P cubensis
fue de 05 gL de FA debido a que eacuteste generariacutea una disminucioacuten en los costos
81
35 ESTUDIO PORCENTUAL (AacuteREA) DEL ALCALOIDE REALIZADO PARA
LOS DIFERENTES ENSAYOS
Se calculoacute el porcentaje de aacuterea correspondiente al pico que identificoacute que se
asumioacute como el correspondiente a la Psilocibina gracias a la suposicioacuten realizada
del tiempo de retencioacuten
A continuacioacuten se presentan los valores obtenidos y sus respectivos anaacutelisis para
cada tratamiento
351 Porcentaje de la Psilocibina (suposicioacuten) cuando el medio no conteniacutea
FA
Debido a que no se contaba con un estaacutendar de Psilocibina los resultados
mostrados en la tabla 5 se obtuvieron realizando un porcentaje con respecto a las
aacutereas bajo la curva arrojadas mediante el anaacutelisis de cromatografiacutea de alta
eficiencia (Anexos 19 20 y 21) En dichos anexos se encuentran resaltadas en
negrilla aquellas aeacutereas utilizadas
Tabla 5 Porcentaje de aacuterea hallado mediante HPLC para los uacuteltimos tres diacuteas de la fermentacioacuten con concentraciones de 30 gL 50 gL y 70 gL de glucosa
y sacarosa con un tiempo de retencioacuten de 62 y 72 minutos
Diacutea Glucosa
(gL)
Aacuterea
(compuesto
Tr= 62-72)
Sacarosa
(gL)
Aacuterea
(compuesto
Tr= 62-72)
12 30 60650 30 3664
12 50 7396 50 5857
12 70 4816 70 3415
13 30 702 30 2876
13 50 6815 50 4113
13 70 6733 70 5583
14 30 4824 30 2756
14 50 4821 50 2792
14 70 017 70 1429
82
A la hora de analizar los datos de la tabla 5 se puede observar que el mayor
porcentaje de aacuterea se obtuvo cuando se trabajoacute con glucosa como fuente de
carbono y concretamente a una concentracioacuten de 50 gL
Analizando los datos estadiacutesticamente no se obtuvieron diferencias significativas
en cuanto a la produccioacuten del compuesto (aacuterea) con respecto al tipo de sustrato
utilizado durante las fermentaciones es decir es indiferente si se utiliza glucosa o
sacarosa en el cultivo de P cubensis en medio sumergido de Fang-Zhong
El graacutefico 23 ilustra las medias (aacuterea) obtenidas para la produccioacuten de alcaloide en
las dos diferentes fuentes de carbono es decir glucosa y sacarosa exponiendo
un uacutenico grupo homogeacuteneo con medias (produccioacuten de alcaloide) de aacutereas de
219635 y 234391 para glucosa y sacarosa respectivamente (Anexo 11)
Tratamientos de las dos fuentes de carbono usadas sin FA (glucosa y sacarosa)
Media glucosa (a) 219635
Media sacarosa (a) 234391
a
a
2000
2100
2200
2300
2400
Aacuterea
Com
pues
to
Letras diferentes denotan diferencias significativas (prueba LSD)
Graacutefico 23 Aacuterea del compuesto obtenido de P cubensis en tiempo de retencioacuten entre 62 y 72 minutos para cada una de las fuentes de carbono
utilizadas
Aun asiacute estudiando los graacuteficos de HPLC con el criterio mencionado
anteriormente es decir observando el tamantildeo del pico y su resolucioacuten del mismo
83
se observoacute claramente que la presencia del alcaloide (tiempo de retencioacuten
supuesto entre 62 y 72 minutos) fue mejor cuando se trabajoacute con glucosa a una
concentracioacuten de 50 gL debido que presenta el mejor pico
352 Porcentaje de aacuterea de compuestos presentes en P cubensis cuando
el medio conteniacutea FA
Con el fin de observar si la adicioacuten de FA al medio si arrojoacute mejores resultados en
cuanto a la produccioacuten del compuesto presente entre un rango de 62 y 72
minutos como tiempo de retencioacuten se procedioacute a calcular el porcentaje del aacuterea
de intereacutes de acuerdo a las aacutereas arrojadas para cada ensayo por medio del
anaacutelisis de HPLC Los datos obtenidos se ilustran a continuacioacuten en la tabla 6
Tabla 6 Porcentaje hallado mediante HPLC para los uacuteltimos tres diacuteas de la fermentacioacuten con concentraciones de 05 gL 10 gL y 15 gL de FA y 50 gL
de glucosa con un tiempo de retencioacuten entre 62 y 72 minutos
Diacutea
Glucosa
50 gL +
FA
Aacuterea
(compuesto
Tr=62-72)
12 0 4315
12 05 2931
12 1 6236
12 15 847
13 0 3257
13 05 7549
13 1 4790
13 15 2721
14 0 4822
14 05 3863
14 1 5801
14 15 2102
84
Al detallar la tabla 6 puede observarse que el ensayo que mayor porcentaje de
aacuterea arrojoacute fue el que conteniacutea 05 gL de FA arrojando su maacuteximo porcentaje
correspondiente a 755 el diacutea 13 Aun asiacute las diferencias existentes entre ellos
no fueron significativas
Ahora bien al analizarlos estadiacutesticamente se encontroacute que la produccioacuten del
alcaloide en presencia de FA presentoacute la misma tendencia que los ensayos
analizados anteriormente sin eacutesta pero gracias a que este aminoaacutecido duplico la
cantidad de biomasa y debido a que el compuesto de intereacutes se produce
intracelularmente se afirma que el uso de FA aumentoacute la generacioacuten del
compuesto evaluado (Anexo 12)
El graacutefico 24 presenta las diferentes medias en cuanto al porcentaje de aacuterea del
compuesto presente entre 62 y 72 minutos para los diferentes tratamientos de
glucosa a una concentracioacuten de 50 gL y sus concentraciones respectivas de FA
Claramente se ve que soacutelo existe un grupo homogeacuteneo lo que reafirma que no
existen diferencias significativas de la produccioacuten con respecto a las
concentraciones de FA
85
Tratamientos con y sin FA
Media 0 gL FA (a) 3122
Media 05 gL FA (a) 2391
Media 10 gL FA (a) 2823
Media 15 gL FA (a) 2113
a
aa
a
0
5
10
15
20
25
30
35
40
Aacutere
a Co
mpu
esto
Letras diferentes denotan diferencias significativas (prueba LSD)
Graacutefico 24 Aacuterea del compuesto obtenido de P cubensis en tiempo de retencioacuten entre 62 y 72 minutos para cada una de las concentraciones de
FA utilizadas
Debido a que no se encontraron diferencias significativas en cuanto al porcentaje
de aacuterea obtenido mediante los cromatogramas se concluye que el mejor medio es
el que tiene como fuente de carbono glucosa a una concentracioacuten de 50 gL y una
adicioacuten de 05 gL de FA puesto que genera una disminucioacuten en costos
86
CONCLUSIONES
No existen diferencias significativas en el crecimiento micelial de P
cubensis en medio sumergido Fang-Zhong cuando se trabaja con fuentes
de carbono glucosa y sacarosa sin embargo se decide trabajar con 50 gL
de glucosa puesto que eacuteste tiene una buena presencia de alcaloide y a su
vez una mejor produccioacuten de biomasa
La concentracioacuten de glucosa utilizada para el crecimiento de P cubensis
influye en el crecimiento micelial obteniendo concentraciones de biomasa
de 062 gL 055 gL y 048 gL para concentraciones de sustrato de 70 50
y 30 gL de glucosa siendo las dos primeras significativamente diferentes
con respecto a la de 30 gL
La concentracioacuten de sacarosa utilizada para el crecimiento de P cubensis
influye en el crecimiento micelial obteniendo concentraciones de biomasa
de 057 gL 045 gL y 026 gL para concentraciones de sustrato de 70 50
y 30 gL de sacarosa siendo significativamente diferentes entre ellas
La resolucioacuten de los picos obtenidos por RP-HPLC del extracto de P
cubensis fue mayor para las fermentaciones realizadas con una
concentracioacuten de 50 gL de glucosa lo que conllevoacute a utilizarlo al realizar
los ensayos que conteniacutean en el medio FA
La concentracioacuten de biomasa de P cubensis obtenida en cultivo sumergido
en medio Fang-Zhong con glucosa se duplicoacute con la adicioacuten de FA No
obstante no existen diferencias significativas entre las concentraciones de
FA utilizadas
87
El consumo de proteiacutena presentada por P cubensis en medio Fang-Zhong
fue casi del 100 mientras que el consumo de sustrato para el mismo
medio estuvo alrededor del 40
El consumo de sustrato durante el transcurso de las fermentaciones que no
conteniacutean FA en el medio no presentoacute diferencias significativas con
respecto a las dos fuentes de carbono utilizadas Mientras que en aquellas
fermentaciones donde se agregoacute FA al medio siacute existieron diferencias
significativas entre las fermentaciones de 15 y 1 gL de FA con respecto a
los ensayos realizados con 05 gL FA Sin embargo el P cubensis
consumioacute mayor cantidad de sustrato cuando el medio no conteniacutea FA
Se evidencioacute que el P cubensis consumioacute mayor cantidad de proteiacutena
cuando el sustrato utilizado en el medio fue glucosa y a su vez se detecto
que la adicioacuten de FA al medio tuvo como efecto la disminucioacuten en el
consumo de sustrato por parte del microorganismo
El consumo de sustrato y de proteiacutena tuvo un comportamiento similar
puesto que fue consumido permanentemente durante la fase exponencial
para cada uno de los tratamientos realizados es decir las concentraciones
de 30 gL 50 gL y 70 gL de glucosa y sacarosa como fuente de carbono y
de 05 gL 1 gL y 15 gL de FA teniendo como fuente de carbono glucosa
a una concentracioacuten de 50 gL mientras que en la fase estacionaria su
consumo se disminuyoacute permaneciendo casi constante
Despueacutes de realizados los estudios en cuanto a la produccioacuten del
compuesto presente entre 62 y 72 minutos para cada uno de los ensayos
no se evidenciaron diferencias significativas entre las dos fuentes de
carbono utilizadas (glucosa y sacarosa)
88
La adicioacuten del precursor llamado Fenilalanina (FA) al medio sumergido
Fang-Zhong para llevar a cabo el cultivo del P cubensis tuvo influencia en
cuanto a la produccioacuten de compuesto presente entre tiempo de retencioacuten de
62 y 72 minutos debido a que eacuteste duplicoacute la concentracioacuten de biomasa
en el medio se dice entonces que la produccioacuten aumentoacute al ser eacuteste de
produccioacuten intracelular
La resolucioacuten del compuesto presente entre el tiempo de retencioacuten de 62 a
72 minutos se obtuvo mejor en el ensayo que conteniacutea 05 gL de FA y al
saber que no existieron diferencias significativas en la produccioacuten en cuanto
al porcentaje de aacutereas obtenido con respecto a las demaacutes concentraciones
de FA se afirma que eacuteste es el medio que mejores resultados arrojoacute para
el crecimiento de P cubensis y la produccioacuten de Psilocibina
89
RECOMENDACIONES
Se sugiere observar el efecto que tiene la variacioacuten de las revoluciones a
las cuales se realizaron las fermentaciones para ver como variacutea el
crecimiento del P cubensis en medio sumergido Fang-Zhong con respecto
a dicho factor
Debido a que soacutelo se realizaron anaacutelisis sobre el crecimiento del P
cubensis en medio sumergido haciendo uso de dos sustratos diferentes
(glucosa y sacarosa) seriacutea recomendable realizar el mismo anaacutelisis para
otro tipo de sustrato como por ejemplo melaza por su bajo costo
Del mismo modo seriacutea apropiado realizar el estudio con otro tipo de
precursor y en otras concentraciones para ver la incidencia de eacuteste en el
comportamiento del hongo
Se recomienda realizar un escalamiento de dicho proceso en un biorreactor
con el fin de evaluar a mayor escala el crecimiento del P cubensis y la
produccioacuten del alcaloide
Debido a que la proteiacutena se comportoacute como el principal nutriente se sugiere
para una proacutexima investigacioacuten evaluar diferentes concentraciones de
proteiacutena en el medio
90
ANEXOS
Anexo 1 Anaacutelisis de varianza (ANOVA) para el crecimiento de biomasa de
las fermentaciones con glucosa
Tabla 7 Anaacutelisis de Varianza para el crecimiento micelial (glucosa)
Tabla 8 Anaacutelisis Muacuteltiple de Rangos para el crecimiento micelial (glucosa)
91
Anexo 2 Anaacutelisis de Varianza (ANOVA) para el crecimiento de biomasa de
las fermentaciones con sacarosa
Tabla 9 Anaacutelisis de Varianza para el crecimiento micelial (sacarosa)
Tabla 10 Anaacutelisis Muacuteltiple de Rangos para el crecimiento micelial (sacarosa)
92
Anexo 3 Anaacutelisis de Varianza (ANOVA) para el crecimiento de biomasa de
las fermentaciones con glucosa y sacarosa
Tabla 11 Anaacutelisis de Varianza para el crecimiento micelial (glucosa y
sacarosa)
Tabla 12 Anaacutelisis Muacuteltiple de Rangos para el crecimiento micelial (glucosa y
sacarosa)
93
Anexo 4 Anaacutelisis de Varianza (ANOVA) para el crecimiento de biomasa de
las fermentaciones con glucosa 50 gL y FA
Tabla 13 Anaacutelisis de Varianza para el crecimiento micelial (glucosa 50 gL y
FA)
Tabla 14 Anaacutelisis Muacuteltiple de Rangos para el crecimiento micelial (glucosa
50 gL y FA)
94
Anexo 5 Anaacutelisis de varianza (ANOVA) para el consumo de sustrato en las
fermentaciones sin FA
Tabla 15 Anaacutelisis de Varianza para el consumo de Sustrato sin FA
Tabla 16 Anaacutelisis Muacuteltiple de Rangos para el consumo de Sustrato sin FA
95
Anexo 6 Anaacutelisis de Varianza (ANOVA) para el consumo de sustrato en las
fermentaciones con FA
Tabla 17 Anaacutelisis de Varianza para el consumo de Sustrato con FA
Tabla 18 Anaacutelisis Muacuteltiple de Rangos para el consumo de Sustrato con FA
96
Anexo 7 Anaacutelisis de Varianza (ANOVA) para el consumo de proteiacutena en las
fermentaciones sin FA
Tabla 19 Anaacutelisis de Varianza para el consumo de Proteiacutena sin FA
Tabla 20 Anaacutelisis Muacuteltiple de Rangos para el consumo de Proteiacutena sin FA
97
Anexo 8 Anaacutelisis de Varianza (ANOVA) para el consumo de proteiacutena en las
fermentaciones con FA
Tabla 21Anaacutelisis de Varianza para el consumo de Proteiacutena con FA
Tabla 22 Anaacutelisis Muacuteltiple de Rangos para el consumo de Proteiacutena con FA
98
Anexo 9 Anaacutelisis de Varianza (ANOVA) para la produccioacuten de Psilocibina en
las fermentaciones sin FA
Tabla 23 Anaacutelisis de Varianza para la produccioacuten de Psilocibina sin FA
Tabla 24 Anaacutelisis Muacuteltiple de Rangos para la produccioacuten de Psilocibina
seguacuten el Sustrato sin FA
99
Anexo 10 Anaacutelisis de Varianza (ANOVA) para la produccioacuten de Psilocibina en las fermentaciones con FA
Tabla 25 Anaacutelisis de Varianza para la produccioacuten de Psilocibina con FA
Tabla 26 Anaacutelisis Muacuteltiple de Rangos para la produccioacuten de Psilocibina
seguacuten el diacutea con FA
100
Anexo 11 Anaacutelisis de Varianza (ANOVA) para la cuantificacioacuten porcentual de
Psilocibina en las fermentaciones sin FA
Tabla 27 Anaacutelisis de Varianza para la cuantificacioacuten de Psilocibina sin FA
Tabla 28 Anaacutelisis Muacuteltiple de Rangos para la cuantificacioacuten de Psilocibina
seguacuten el tipo de sustrato sin FA
101
Anexo 12 Anaacutelisis de Varianza (ANOVA) para la cuantificacioacuten porcentual de
Psilocibina en las fermentaciones con FA
Tabla 29 Anaacutelisis de Varianza para la cuantificacioacuten de Psilocibina con FA
Tabla 30 Anaacutelisis Muacuteltiple de Rangos para la cuantificacioacuten de Psilocibina
seguacuten la concentracioacuten con FA
102
Anexo 13 Determinacioacuten de consumo de azuacutecares por el meacutetodo de DNS
(Aacutecido Dinitrosaliciacutelico)
a DNS para glucosa
Pasos para preparar DNS
Disolver 16 gr de NaOH en agua destilada
Adicionar 30 gr de tartrato de Na y K
Aforar a 100 ml con agua destilada
Almacenar en frascos aacutembar a 4degC
Se debe mantener un stock de glucosa 4mgml y almacenarlo a 4degC A partir
de la solucioacuten de glucosa se preparan las soluciones para hacer la curva
patroacuten con las siguientes concentraciones (gL) 025 050 100 200 y 400
Procedimiento
Tomar 05 ml de cada dilucioacuten y agregar 05 ml de reactivo DNS
Preparar una muestra blanco por dilucioacuten de 05 ml de agua destilada a 05
ml de reactivo de DNS
Agitar todas las muestras
Colocar a ebullir las muestras en bantildeo mariacutea por cinco minutos
Enfriar con hielo
Adicionar 5 ml de agua destilada
Agitar y dejar en reposo 15 minutos
Leer en espectrofotoacutemetro a 540 nm
Realizar la curva Absorbancia Vs Concentracioacuten Debe tener un coeficiente
de correlacioacuten de 0991 a 0999
b DNS para sacarosa
Pasos para preparar DNS sacarosa
Preparacioacuten de la solucioacuten Standard stock de sacarosa (30 gL) tomar 30
gr de sacarosa anhiacutedrida grado reactivo con exactitud hasta la deacutecima de
mg disolver ajustar a aforo de 100 ml con agua desionizada empacar en
viales y almacenar en congelador
Preparacioacuten DNS pesar 16 gr de hidroacutexido de sodio grado reactivo 30 gr
de tartrato de sodio y potasio y disolverlos juntos con 50 ml de agua
103
desionizada aparte pesar 10 gr del DNS disolver con 30 ml de agua
desionizada agregar lentamente y con agitacioacuten la solucioacuten del DNS a la
solucioacuten de tartrato y NaOH anteriormente preparadas ajustar a 100 ml
filtrar envasar en frasco aacutembar y rotular con fecha de vencimiento incluida
(3 meses maacuteximo) mantener a la temperatura del laboratorio
Preparacioacuten del reactivo NaOH 10 N (500 ml) pesar con exactitud hasta
la deacutecima de mg 20 gr de NaOH grado reactivo por cada 500 ml de
solucioacuten disolver primero con 300 ml de agua desionizada y luego aforar a
500 ml envasar y rotular correctamente y mantener a la temperatura del
laboratorio
Preparacioacuten de HCL 10 (100 ml) tomar 27 ml de aacutecido clorhiacutedrico al
37 grado reactivo y aforar hasta 100 ml con agua desionizada envasar
rotular correctamente de acuerdo a la norma del laboratorio y almacenar a
la temperatura del laboratorio
Se debe mantener un stock de glucosa 30 gL y almacenarlo a 4degC A partir
de la solucioacuten de glucosa se preparan las soluciones para hacer la curva
patroacuten con las siguientes concentraciones (gL) 3 6 12 18 24 y 30
Procedimiento
Preparar en cada tubo (las soluciones de la curva patroacuten de sacarosa las
muestras problemas diluidas si es necesario y como blanco agua
desionizada) 100microl de solucioacuten
Adicionar 200 microl de HCL 10 a cada tubo y agitar todos los tubos en vortex
Llevar a ebullicioacuten por 10 minutos en bantildeo mariacutea precalentado a 95degC
Enfriar hasta temperatura ambiente raacutepidamente
Adicionar a cada tubo 1 ml de NaOH 10 N y agitar los tubos en vortex
Aparte tomar 05 ml de cada tubo en otros tubos rotulados y agregar 05 ml
del DNS
Agitar todas las muestras en vortex
Llevar a ebullicioacuten por 5 minutos en bantildeo mariacutea precalentado a 96degC
Enfriar hasta temperatura ambiente raacutepidamente
Adicionar 5 ml de H2O desionizada agitar en vortex y dejar reposar por 15
minutos
Leer en espectrofotoacutemetro a 540 nm
Realizar la curva Absorbancia Vs Concentracioacuten Debe tener un coeficiente
de correlacioacuten de 0991 a 0999
104
Anexo 14 Cineacutetica de Consumo de Sustrato
La cineacutetica de consumo de sustrato se realizoacute por el meacutetodo de Aacutecido
Dinitrosaliciacutelico (DNS) Los rangos de concentracioacuten y absorbancia para cada caso
se citan a continuacioacuten
Rangos de concentraciones y absorbancias para las fermentaciones que
usaron glucosa (30 gL 50 gL y 70 gL) como sustrato
Concentracioacuten de 02 a 12 gL
Absorbancia de 01234 a 06612
Ecuacioacuten Y = 19174x -00517 R2 = 09923
Rangos de concentraciones y absorbancias para las fermentaciones que
usaron sacarosa (30 gL 50 gL y 70 gL) como sustrato
Concentracioacuten de 3 a 30 gL
Absorbancia de 00822 a 11112
Ecuacioacuten Y = 25983x + 04857 R2 = 09978
Rangos de concentraciones y absorbancias para las fermentaciones que
usaron glucosa 50 gL como sustrato y FA
Concentracioacuten de 02 a 12 gL
Absorbancia de 0097 a 063
Ecuacioacuten Y = 18785x + 00019 R2 = 09986
105
Anexo 15 Determinacioacuten de consumo de proteiacutenas por el meacutetodo de LOWRY
Pasos para la preparacioacuten de LOWRY
Para obtener la curva estaacutendar de Albuacutemina se preparan 5 soluciones
patrones de Albuacutemina en NaCL al 09 (PV) de las siguientes
concentraciones 152 80 200 300 400 Pgml Si la concentracioacuten de
Proteiacutena total es menor de 500 Pgml se lee la absorbancia a 750 nm si
estaacute entre 1000 y 2000 Pgml se lee a 550nm
Se prepara un blanco que no lleva Albuacutemina y en su reemplazo se adiciona
0-5 ml de solucioacuten salina (NaCL) al 09 (PV) Se aplica el mismo
procedimiento que a las demaacutes muestras
Procedimiento
Servir en tubos de ensayo 05 ml de las soluciones patroacuten de Albuacutemina las
muestras problema y NaCL al 09 como blanco Deben estar marcados
para conservar el orden de concentraciones para la curva
Adicionar a cada tubo 05 ml de NaOH 2N y llevar al bantildeo Mariacutea
precalentado a 100degC por un tiempo de 10 minutos
Dejar enfriar hasta que alcance la Temperatura Ambiente
Agregar a cada tubo 5 ml de la solucioacuten complejante mezclar y dejar
reposar por 10 minutos
Adicionar 05 ml del reactivo de Folin-Ciocalteu 11 vortexiar durante 20
segundos
Reposar en un cuarto oscuro durante 30 minutos
Leer la absorbancia a 750 nm y con las soluciones patroacuten construir la
graacutefica Absorbancia Vs Concentracioacuten de Albuacutemina Seacuterica de Bovina
(BSA) con eacutesta se puede determinar la concentracioacuten de las muestras
problema interpolando el valor de la Absorbancia La curva estaacutendar debe
tener un coeficiente de correlacioacuten de 0991 a 0999
106
Anexo 16 Cineacutetica consumo de Proteiacutena
La cineacutetica de consumo de proteiacutena se realizoacute por el meacutetodo LOWRY Los rangos
de concentracioacuten y absorbancia para cada caso se citan a continuacioacuten
Rangos de concentraciones y absorbancias para las fermentaciones que
usaron glucosa (30 gL 50 gL y 70 gL) como sustrato
Concentracioacuten de 0016 a 04 gL
Absorbancia de 00094 a 05382
Ecuacioacuten Y = 07427x ndash 00021 R2 = 09955
Rangos de concentraciones y absorbancias para las fermentaciones que
usaron sacarosa (30 gL 50 gL y 70 gL) como sustrato
Concentracioacuten de 0016 a 04 gL
Absorbancia de 00374 a 06178
Ecuacioacuten Y = 06567x ndash 00166 R2 = 09968
Rangos de concentraciones y absorbancias para las fermentaciones que
usaron glucosa 50 gL como sustrato y FA
Concentracioacuten de 0016 a 04 gL
Absorbancia de 00708 a 04647
Ecuacioacuten Y = 09814x ndash 00581 R2 = 09992
107
Anexo 17 Prueba de reactivo de Dragendorff
Preparacioacuten de reactivo de Dragendorff para alcaloides
Reactivo de Dragendorff se prepara mezclando 8 gr de nitrato de bismuto
pentahidratado en 20 ml de aacutecido niacutetrico al 30 con una solucioacuten de 272 g de
yoduro de potasio en 50 ml de agua Se deja en reposo por 24 horas se decanta y
se afora a 100 ml La presencia de alcaloides se detecta por la formacioacuten de un
precipitado naranja rojizo cuando se le adiciona esta reactivo a una solucioacuten aacutecida
de alcaloides De los precipitados lavados se puede recuperar los alcaloides con
una solucioacuten saturada de carbonato de sodio (Mercano y Hasegawa 1991)
La figura mostrada a continuacioacuten refleja la presencia del alcaloide debido a la
coloracioacuten amarillo-rojiza que eacutesta sufrioacute
Figura 8 Muestra de biomasa una vez analizada mediante el reactivo de Dragendorff
108
Anexo 18 Barrido Espectral para el Psilocybe cubensis
La metodologiacutea mencionada a continuacioacuten estaacute basada en artiacuteculo base
(Tsujikawa et al 2003)
El Sistema de HPLC consiste en un Shimadzu LC-10ordf Series Cromatografiacutea
Liacutequida equipada con un diodo SPD-M10A detector de red fija en 220nm La
separacioacuten cromatograacutefica ser realizoacute con una columna simeacutetrica C18 (21 mm a
150 mm 5mm Waters Assoc Milford EEUU
La fase moacutevil utilizada fue de 10 mm de formato de amonio-aacutecido foacutermico (955
VV) a un pH de 35 y bombeado a un caudal de 02 mlminuto
El perfil cromatograacutefico obtenido durante la investigacioacuten de Tsujikawa et al
(2003) se muestra en le figura 6 que aparece a continuacioacuten
Figura 9 Perfil cromatograacutefico (Tsujikawa et al 2003)
109
Anexo 19 Cromatogramas (HPLC) del diacutea 12 de fermentacioacuten
Tabla 31 Aacutereas obtenidas de los cromatogramas para el P cubensis en
medio Fang-Zhong en el diacutea 12 para concentraciones de 30gL glucosa y
30gL sacarosa
SustratoConcentracioacuten
(gL)
Tiempo
(s)Aacuterea
Glucosa 30 2957 3837
Glucosa 30 6838 474753
Glucosa 30 9144 47256
Glucosa 30 9489 16822
Glucosa 30 10124 224349
Sacarosa 30 6538 143772
Sacarosa 30 7234 269458
Sacarosa 30 9721 33646
Sacarosa 30 11845 24384
(a) (b)
Graacutefico 25 Cromatogramas del diacutea 12 para el P cubensis cultivado en medio
sumergido Fang-Zhong con dos diferentes tipos de sustratos (a) 30 gL
glucosa (b) 30 gL sacarosa
110
Tabla 32 Aacutereas obtenidas de los cromatogramas para el P cubensis en
medio Fang-Zhong en el diacutea 12 para concentraciones de 50gL glucosa y
50gL sacarosa
SustratoConcentracioacuten
(gL)
Tiempo
(s)Aacuterea
Glucosa 50 0524 319
Glucosa 50 6298 5991
Glucosa 50 7172 237042
Glucosa 50 9144 16387
Glucosa 50 10009 6077
Sacarosa 50 169 24011
Sacarosa 50 3105 28573
Sacarosa 50 6916 112166
Sacarosa 50 9136 4057
Sacarosa 50 9933 8821
Sacarosa 50 10398 13872
(a) (b)
Graacutefico 26 Cromatogramas del diacutea 12 para el P cubensis cultivado en medio
sumergido Fang-Zhong con dos diferentes tipos de sustratos (a) 50 gL
glucosa (b) 50 gL sacarosa
111
Tabla 33 Aacutereas obtenidas de los cromatogramas para el P cubensis en
medio Fang-Zhong en el diacutea 12 para concentraciones de 50gL glucosa y
50gL sacarosa
SustratoConcentracioacuten
(gL)
Tiempo
(s)Aacuterea
Glucosa 70 7217 168598
Glucosa 70 9145 9977
Glucosa 70 997 80558
Sacarosa 70 6803 287387
Sacarosa 70 7517 131049
Sacarosa 70 7775 4434
Sacarosa 70 7871 77109
Sacarosa 70 823 96239
Sacarosa 70 9039 5114
Sacarosa 70 9778 25394
(a) (b)
Graacutefico 27 Cromatogramas del diacutea 12 para el P cubensis cultivado en medio
sumergido Fang-Zhong con dos diferentes tipos de sustratos (a) 50 gL
glucosa (b) 50 gL sacarosa
112
Tabla 34 Aacutereas obtenidas de los cromatogramas para el P cubensis en
medio Fang-Zhong en el diacutea 12 para concentraciones de 50gL y glucosa
50gL sacarosa
SustratoConcentracioacuten
(gL)
Tiempo
(s)Aacuterea
Glucosa 50 05 0818 4722
Glucosa 50 05 2423 52579
Glucosa 50 05 3502 88765
Glucosa 50 05 6137 16009
Glucosa 50 05 6722 275258
Glucosa 50 05 733 226399
Glucosa 50 05 8339 65139
Glucosa 50 05 9101 36797
Glucosa 50 05 9815 130883
Glucosa 50 1 1105 743
Glucosa 50 1 2746 2701
Glucosa 50 1 4304 80304
Glucosa 50 1 6167 19649
Glucosa 50 1 6794 51753
Glucosa 50 1 8282 82997
Glucosa 50 1 9116 38659
Glucosa 50 1 9899 136953
Glucosa 50 15 1198 3313
Glucosa 50 15 2937 37875
Glucosa 50 15 4332 51079
Glucosa 50 15 614 25602
Glucosa 50 15 6737 668905
Glucosa 50 15 8209 107332
Glucosa 50 15 9602 38902
Glucosa 50 15 9752 139613
Diacutea 12
(a) (b)
(c)
Graacutefico 28 Cromatograma del diacutea 12 para el P cubensis cultivado en medio
sumergido Fang-Zhong con fuente de carbono glucosa y adicioacuten de
fenilalanina en tres concentraciones (a) 05 gL FA (b) 1 gL FA (c) 15gL
FA
113
Anexo 20 Cromatogramas (HPLC) del diacutea 13 de fermentacioacuten
Tabla 35 Aacutereas obtenidas de los cromatogramas para el P cubensis en
medio Fang-Zhong en el diacutea 13 para concentraciones de 30gL glucosa y
30gL sacarosa
SustratoConcentracioacuten
(gL)
Tiempo
(s)Aacuterea
Glucosa 30 0225 1155
Glucosa 30 2847 699
Glucosa 30 4043 1038
Glucosa 30 6231 4994
Glucosa 30 6787 295182
Glucosa 30 7462 241146
Glucosa 30 9066 51836
Glucosa 30 10004 158746
Sacarosa 30 1734 135
Sacarosa 30 5838 1857
Sacarosa 30 6803 147867
Sacarosa 30 7305 30464
Sacarosa 30 7599 174643
Sacarosa 30 9107 8564
Sacarosa 30 9897 104278
(a) (b)
Graacutefico 29 Cromatogramas del diacutea 13 para el P cubensis cultivado en medio
sumergido Fang-Zhong con dos diferentes tipos de sustratos (a) 30 gL
glucosa (b) 30 gL sacarosa
114
Tabla 36 Aacutereas obtenidas de los cromatogramas para el P cubensis en
medio Fang-Zhong en el diacutea 13 para concentraciones de 50gL glucosa y
50gL sacarosa
SustratoConcentracioacuten
(gL)
Tiempo
(s)Aacuterea
Glucosa 50 1408 13982
Glucosa 50 6949 331449
Glucosa 50 9012 25201
Glucosa 50 9936 27216
Sacarosa 50 1543 7293
Sacarosa 50 6813 437765
Sacarosa 50 9085 35897
Sacarosa 50 10049 184461
(a) (b)
Graacutefico 30 Cromatogramas del diacutea 13 para el P cubensis cultivado en medio
sumergido Fang-Zhong con dos diferentes tipos de sustratos (a) 50 gL
glucosa (b) 50 gL sacarosa
115
Tabla 37 Aacutereas obtenidas de los cromatogramas para el P cubensis en
medio Fang-Zhong en el diacutea 13 para concentraciones de 70gL glucosa y
70gL sacarosa
SustratoConcentracioacuten
(gL)
Tiempo
(s)Aacuterea
Glucosa 70 1456 3223
Glucosa 70 2985 2423
Glucosa 70 54 7586
Glucosa 70 6262 5149
Glucosa 70 7151 248331
Glucosa 70 9039 19346
Glucosa 70 9929 4906
Glucosa 70 11051 33698
Sacarosa 70 0437 342
Sacarosa 70 1428 812
Sacarosa 70 2948 2191
Sacarosa 70 5473 4854
Sacarosa 70 6286 5336
Sacarosa 70 6848 3649
Sacarosa 70 733 11383
Sacarosa 70 9073 1018
Sacarosa 70 9878 11072
Sacarosa 70 10267 18797
(a) (b)
Graacutefico 31 Cromatogramas del diacutea 13 para el P cubensis cultivado en medio
sumergido Fang-Zhong con dos diferentes tipos de sustratos (a) 70 gL
glucosa (b) 70 gL sacarosa
116
Tabla 38 Aacutereas obtenidas de los cromatogramas para el P cubensis en
medio Fang-Zhong en el diacutea 13 para concentraciones de 50gL y glucosa
50gL sacarosa
SustratoConcentracioacuten
(gL)
Tiempo
(s)Aacuterea
Glucosa 50 05 4067 22222
Glucosa 50 05 7379 55573
Glucosa 50 05 902 19513
Glucosa 50 05 9716 119261
Glucosa 50 05 1173 19427
Glucosa 50 1 0793 14776
Glucosa 50 1 2868 28537
Glucosa 50 1 6224 1206
Glucosa 50 1 6782 571299
Glucosa 50 1 8303 92665
Glucosa 50 1 9081 30371
Glucosa 50 1 9738 168959
Glucosa 50 1 11813 27921
Glucosa 50 15 0412 269
Glucosa 50 15 2482 14692
Glucosa 50 15 3486 91059
Glucosa 50 15 6039 6892
Glucosa 50 15 6627 216986
Glucosa 50 15 7216 260795
Glucosa 50 15 8112 65776
Glucosa 50 15 8888 19083
Glucosa 50 15 9497 37812
Glucosa 50 15 9839 65922
Glucosa 50 15 11655 7331
(a) (b)
(c)
Graacutefico 32 Cromatogramas del diacutea 12 para el P cubensis cultivado en medio
sumergido Fang-Zhong con fuente de carbono glucosa y adicioacuten de
fenilalanina en tres concentraciones (a) 05 gL FA (b) 1 gL FA (c) 15gL
FA
117
Anexo 21 Cromatogramas (HPLC) del diacutea 14 de fermentacioacuten
Tabla 39 Aacutereas obtenidas de los cromatogramas para el P cubensis en
medio Fang-Zhong en el diacutea 14 para concentraciones de 30gL glucosa y 30
gL sacarosa
SustratoConcentracioacuten
(gL)
Tiempo
(s)Aacuterea
Glucosa 30 1054 181
Glucosa 30 2553 8939
Glucosa 30 6219 7557
Glucosa 30 6585 77083
Glucosa 30 7158 285069
Glucosa 30 8987 33875
Glucosa 30 9848 87461
Glucosa 30 10694 52151
Glucosa 30 12482 7992
Glucosa 30 12943 23064
Glucosa 30 1493 5948
Sacarosa 30 7309 7075
Sacarosa 30 9984 1680
Sacarosa 30 10442 15395
Sacarosa 30 11211 8511
Sacarosa 30 13405 3398
(a) (b)
Graacutefico 33 Cromatogramas del diacutea 14 para el P cubensis cultivado en medio
sumergido Fang-Zhong con dos diferentes tipos de sustratos (a) 30 gL
glucosa (b) 30 gL sacarosa
118
Tabla 40 Aacutereas obtenidas de los cromatogramas para el P cubensis en
medio Fang-Zhong en el diacutea 14 para concentraciones de 50gL glucosa y
50gL sacarosa
SustratoConcentracioacuten
(gL)
Tiempo
(s)Aacuterea
Glucosa 50 2029 8318
Glucosa 50 6257 5782
Glucosa 50 6875 306684
Glucosa 50 9068 22819
Glucosa 50 9808 92492
Glucosa 50 12113 8823
Glucosa 50 12752 23988
Sacarosa 50 1036 3783
Sacarosa 50 2356 7005
Sacarosa 50 653 44831
Sacarosa 50 6657 127617
Sacarosa 50 7264 66908
Sacarosa 50 7464 255141
Sacarosa 50 9035 26172
Sacarosa 50 9458 28427
Sacarosa 50 9889 37574
Sacarosa 50 10312 140881
Sacarosa 50 12335 13391
Sacarosa 50 1292 17066
(a) (b)
Graacutefico 34 Cromatogramas del diacutea 14 para el P cubensis cultivado en medio
sumergido Fang-Zhong con dos diferentes tipos de sustratos (a) 50 gL
glucosa (b) 50 gL sacarosa
119
Tabla 41 Aacutereas obtenidas de los cromatogramas para el P cubensis en
medio Fang-Zhong en el diacutea 14 para concentraciones de 70gL glucosa y
70gL sacarosa
SustratoConcentracioacuten
(gL)
Tiempo
(s)Aacuterea
Glucosa 70 6257 5879
Glucosa 70 6373 145551
Glucosa 70 7015 68223
Glucosa 70 7199 9085
Glucosa 70 735 265755
Glucosa 70 9014 4642
Glucosa 70 9877 97804
Glucosa 70 107 67421
Glucosa 70 12625 26231
Glucosa 70 1305 65607
Sacarosa 70 2283 4683
Sacarosa 70 5191 93
Sacarosa 70 6304 3719
Sacarosa 70 6795 136542
Sacarosa 70 726 29869
Sacarosa 70 7515 75545
Sacarosa 70 7872 119563
Sacarosa 70 9166 1244
Sacarosa 70 9658 23096
Sacarosa 70 9871 25866
Sacarosa 70 10421 105108
Sacarosa 70 12347 11115
Sacarosa 70 12861 35503
Sacarosa 70 14272 3676
(a) (b)
Graacutefico 35 Cromatogramas del diacutea 14 para el P cubensis cultivado en medio
sumergido Fang-Zhong con dos diferentes tipos de sustratos (a) 70 gL
glucosa (b) 70 gL sacarosa
120
Tabla 42 Aacutereas obtenidas de los cromatogramas para el P cubensis en medio Fang-Zhong en el diacutea 13 para concentraciones de 50gL glucosa y
50gL sacarosa
SustratoConcentracioacuten
(gL)
Tiempo
(s)Aacuterea
Glucosa 50 05 0123 173
Glucosa 50 05 0699 7584
Glucosa 50 05 2594 2742
Glucosa 50 05 6104 11663
Glucosa 50 05 6616 487848
Glucosa 50 05 7235 287918
Glucosa 50 05 8183 135793
Glucosa 50 05 8903 5143
Glucosa 50 05 9484 66817
Glucosa 50 05 9679 168855
Glucosa 50 05 11671 4216
Glucosa 50 1 0345 295
Glucosa 50 1 2654 11981
Glucosa 50 1 412 45301
Glucosa 50 1 6111 12626
Glucosa 50 1 6757 526655
Glucosa 50 1 8093 104277
Glucosa 50 1 894 25251
Glucosa 50 1 9643 158685
Glucosa 50 1 11666 22779
Glucosa 50 15 0353 283
Glucosa 50 15 2522 15272
Glucosa 50 15 3577 83963
Glucosa 50 15 6668 47137
Glucosa 50 15 7304 371442
Glucosa 50 15 8226 117611
Glucosa 50 15 8923 61949
Glucosa 50 15 9657 19618
Glucosa 50 15 11668 35606
(a) (b)
(c)
Graacutefico 36 Cromatogramas del diacutea 12 para el P cubensis cultivado en medio sumergido Fang-Zhong con fuente de carbono glucosa y adicioacuten de
fenilalanina en tres concentraciones (a) 05 gL FA (b) 1 gL FA (c) 15gL FA (a) 05 gL FA (b) 1 gL FA (c) 15gL FA
121
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ix
LISTA DE TABLAS
TABLA 1 COMPOSICIOacuteN DEL MEDIO DE CULTIVO SUMERGIDO PARA EVALUAR EL CRECIMIENTO MICELIAL
DEL P CUBENSIS 35
TABLA 2 PARAacuteMETROS CINEacuteTICOS OBTENIDOS MEDIANTE EL MODELO LOGIacuteSTICO PARA LAS DIFERENTES
FERMENTACIONES DE P CUBENSIS UTILIZANDO GLUCOSA COMO FUENTE DE CARBONO 48
TABLA 3 PARAacuteMETROS CINEacuteTICOS OBTENIDOS MEDIANTE EL MODELO LOGIacuteSTICO PARA LAS DIFERENTES
FERMENTACIONES DE P CUBENSIS UTILIZANDO SACAROSA COMO FUENTE DE CARBONO 53
TABLA 4 PARAacuteMETROS CINEacuteTICOS OBTENIDOS MEDIANTE EL MODELO LOGIacuteSTICO PARA LAS DIFERENTES
FERMENTACIONES DE P CUBENSIS UTILIZANDO 50 GL DE GLUCOSA COMO FUENTE DE CARBONO Y
DIFERENTES CONCENTRACIONES DE FA 60
TABLA 5 PORCENTAJE DE AacuteREA HALLADO MEDIANTE HPLC PARA LOS UacuteLTIMOS TRES DIacuteAS DE LA
FERMENTACIOacuteN CON CONCENTRACIONES DE 30 GL 50 GL Y 70 GL DE GLUCOSA Y SACAROSA CON
UN TIEMPO DE RETENCIOacuteN DE 62 Y 72 MINUTOS 81
TABLA 6 PORCENTAJE HALLADO MEDIANTE HPLC PARA LOS UacuteLTIMOS TRES DIacuteAS DE LA FERMENTACIOacuteN
CON CONCENTRACIONES DE 05 GL 10 GL Y 15 GL DE FA Y 50 GL DE GLUCOSA CON UN TIEMPO
DE RETENCIOacuteN ENTRE 62 Y 72 MINUTOS 83
TABLA 7 ANAacuteLISIS DE VARIANZA PARA EL CRECIMIENTO MICELIAL (GLUCOSA) 90
TABLA 8 ANAacuteLISIS MUacuteLTIPLE DE RANGOS PARA EL CRECIMIENTO MICELIAL (GLUCOSA) 90
TABLA 9 ANAacuteLISIS DE VARIANZA PARA EL CRECIMIENTO MICELIAL (SACAROSA) 91
TABLA 10 ANAacuteLISIS MUacuteLTIPLE DE RANGOS PARA EL CRECIMIENTO MICELIAL (SACAROSA) 91
TABLA 11 ANAacuteLISIS DE VARIANZA PARA EL CRECIMIENTO MICELIAL (GLUCOSA Y SACAROSA) 92
TABLA 12 ANAacuteLISIS MUacuteLTIPLE DE RANGOS PARA EL CRECIMIENTO MICELIAL (GLUCOSA Y SACAROSA) 92
TABLA 13 ANAacuteLISIS DE VARIANZA PARA EL CRECIMIENTO MICELIAL (GLUCOSA 50 GL Y FA) 93
TABLA 14 ANAacuteLISIS MUacuteLTIPLE DE RANGOS PARA EL CRECIMIENTO MICELIAL (GLUCOSA 50 GL Y FA) 93
TABLA 15 ANAacuteLISIS DE VARIANZA PARA EL CONSUMO DE SUSTRATO SIN FA 94
TABLA 16 ANAacuteLISIS MUacuteLTIPLE DE RANGOS PARA EL CONSUMO DE SUSTRATO SIN FA 94
TABLA 17 ANAacuteLISIS DE VARIANZA PARA EL CONSUMO DE SUSTRATO CON FA 95
TABLA 18 ANAacuteLISIS MUacuteLTIPLE DE RANGOS PARA EL CONSUMO DE SUSTRATO CON FA 95
TABLA 19 ANAacuteLISIS DE VARIANZA PARA EL CONSUMO DE PROTEIacuteNA SIN FA 96
TABLA 20 ANAacuteLISIS MUacuteLTIPLE DE RANGOS PARA EL CONSUMO DE PROTEIacuteNA SIN FA 96
TABLA 21ANAacuteLISIS DE VARIANZA PARA EL CONSUMO DE PROTEIacuteNA CON FA 97
TABLA 22 ANAacuteLISIS MUacuteLTIPLE DE RANGOS PARA EL CONSUMO DE PROTEIacuteNA CON FA 97
TABLA 23 ANAacuteLISIS DE VARIANZA PARA LA PRODUCCIOacuteN DE PSILOCIBINA SIN FA 98
TABLA 24 ANAacuteLISIS MUacuteLTIPLE DE RANGOS PARA LA PRODUCCIOacuteN DE PSILOCIBINA SEGUacuteN EL SUSTRATO
SIN FA 98
TABLA 25 ANAacuteLISIS DE VARIANZA PARA LA PRODUCCIOacuteN DE PSILOCIBINA CON FA 99
TABLA 26 ANAacuteLISIS MUacuteLTIPLE DE RANGOS PARA LA PRODUCCIOacuteN DE PSILOCIBINA SEGUacuteN EL DIacuteA CON FA
99
TABLA 27 ANAacuteLISIS DE VARIANZA PARA LA CUANTIFICACIOacuteN DE PSILOCIBINA SIN FA 100
TABLA 28 ANAacuteLISIS MUacuteLTIPLE DE RANGOS PARA LA CUANTIFICACIOacuteN DE PSILOCIBINA SEGUacuteN EL TIPO DE
SUSTRATO SIN FA 100
TABLA 29 ANAacuteLISIS DE VARIANZA PARA LA CUANTIFICACIOacuteN DE PSILOCIBINA CON FA 101
x
TABLA 30 ANAacuteLISIS MUacuteLTIPLE DE RANGOS PARA LA CUANTIFICACIOacuteN DE PSILOCIBINA SEGUacuteN LA
CONCENTRACIOacuteN CON FA 101
TABLA 31 AacuteREAS OBTENIDAS DE LOS CROMATOGRAMAS PARA EL P CUBENSIS EN MEDIO FANG-ZHONG
EN EL DIacuteA 12 PARA CONCENTRACIONES DE 30GL GLUCOSA Y 30GL SACAROSA 109
TABLA 32 AacuteREAS OBTENIDAS DE LOS CROMATOGRAMAS PARA EL P CUBENSIS EN MEDIO FANG-ZHONG
EN EL DIacuteA 12 PARA CONCENTRACIONES DE 50GL GLUCOSA Y 50GL SACAROSA 110
TABLA 33 AacuteREAS OBTENIDAS DE LOS CROMATOGRAMAS PARA EL P CUBENSIS EN MEDIO FANG-ZHONG
EN EL DIacuteA 12 PARA CONCENTRACIONES DE 50GL GLUCOSA Y 50GL SACAROSA 111
TABLA 34 AacuteREAS OBTENIDAS DE LOS CROMATOGRAMAS PARA EL P CUBENSIS EN MEDIO FANG-ZHONG
EN EL DIacuteA 12 PARA CONCENTRACIONES DE 50GL Y GLUCOSA 50GL SACAROSA 112
TABLA 35 AacuteREAS OBTENIDAS DE LOS CROMATOGRAMAS PARA EL P CUBENSIS EN MEDIO FANG-ZHONG
EN EL DIacuteA 13 PARA CONCENTRACIONES DE 30GL GLUCOSA Y 30GL SACAROSA 113
TABLA 36 AacuteREAS OBTENIDAS DE LOS CROMATOGRAMAS PARA EL P CUBENSIS EN MEDIO FANG-ZHONG
EN EL DIacuteA 13 PARA CONCENTRACIONES DE 50GL GLUCOSA Y 50GL SACAROSA 114
TABLA 37 AacuteREAS OBTENIDAS DE LOS CROMATOGRAMAS PARA EL P CUBENSIS EN MEDIO FANG-ZHONG
EN EL DIacuteA 13 PARA CONCENTRACIONES DE 70GL GLUCOSA Y 70GL SACAROSA 115
TABLA 38 AacuteREAS OBTENIDAS DE LOS CROMATOGRAMAS PARA EL P CUBENSIS EN MEDIO FANG-ZHONG
EN EL DIacuteA 13 PARA CONCENTRACIONES DE 50GL Y GLUCOSA 50GL SACAROSA 116
TABLA 39 AacuteREAS OBTENIDAS DE LOS CROMATOGRAMAS PARA EL P CUBENSIS EN MEDIO FANG-ZHONG
EN EL DIacuteA 14 PARA CONCENTRACIONES DE 30GL GLUCOSA Y 30 GL SACAROSA 117
TABLA 40 AacuteREAS OBTENIDAS DE LOS CROMATOGRAMAS PARA EL P CUBENSIS EN MEDIO FANG-ZHONG
EN EL DIacuteA 14 PARA CONCENTRACIONES DE 50GL GLUCOSA Y 50GL SACAROSA 118
TABLA 41 AacuteREAS OBTENIDAS DE LOS CROMATOGRAMAS PARA EL P CUBENSIS EN MEDIO FANG-ZHONG
EN EL DIacuteA 14 PARA CONCENTRACIONES DE 70GL GLUCOSA Y 70GL SACAROSA 119
TABLA 42 AacuteREAS OBTENIDAS DE LOS CROMATOGRAMAS PARA EL P CUBENSIS EN MEDIO FANG-ZHONG
EN EL DIacuteA 13 PARA CONCENTRACIONES DE 50GL GLUCOSA Y 50GL SACAROSA 120
xi
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1 HONGO AGARICALES (LAMINAR) (KUO 2007) 23
FIGURA 2 ALCALOIDES DERIVADOS DEL TRIPTOFANO (MERCANO Y HASEGAWA 1991) 29
FIGURA 3 TRIPTAMINAS SIMPLES (SEIGLER 1981) 31
FIGURA 4 PSILOCIBINA Y PSILOCINA (MANDRILE ET AL 1984) 32
FIGURA 5 PSILOCYBE CUBENSIS (EAH01) CULTIVADA EN MEDIO SOacuteLIDO AGAR MALTA 34
FIGURA 6 CROMATOGRAMAS DE DOS DIFERENTES FERMENTACIONES DE P CUBENSIS QUE ILUSTRAN EL
CRITERIO DE ESCOGENCIA DEL MEJOR ENSAYO REALIZADO (A) 50 GL GLUCOSA (B) 50 GL
SACAROSA 78
FIGURA 7 CROMATOGRAMAS DE DOS DIFERENTES FERMENTACIONES DE P CUBENSIS QUE ILUSTRAN EL
CRITERIO DE ESCOGENCIA DEL MEJOR ENSAYO REALIZADO (A) 05 GL FA (B) 15 GL FA 80
FIGURA 8 MUESTRA DE BIOMASA UNA VEZ ANALIZADA MEDIANTE EL REACTIVO DE DRAGENDORFF 107
FIGURA 9 PERFIL CROMATOGRAacuteFICO (TSUJIKAWA ET AL 2003) 108
xii
LISTA DE GRAacuteFICOS
GRAacuteFICO 1 CINEacuteTICA DE CRECIMIENTO MICELIAL DE P CUBENSIS EN MEDIO SUMERGIDO (FANG-ZHONG)
UTILIZANDO TRES DIFERENTES CONCENTRACIONES DE GLUCOSA COMO FUENTE DE CARBONO (PESO
SECO) 46
GRAacuteFICO 2 CRECIMIENTO MICELIAL DE P CUBENSIS EN CULTIVO SUMERGIDO BAJO TRES
CONCENTRACIONES DE GLUCOSA 47
GRAacuteFICO 3 VALORES DE CONCENTRACIOacuteN DE BIOMASA EXPERIMENTAL Y TEOacuteRICO GRAFICADOS CON
RESPECTO AL TIEMPO PARA LAS FERMENTACIONES CON DIFERENTES CONCENTRACIONES DE
GLUCOSA 49
GRAacuteFICO 4 CINEacuteTICA DE CRECIMIENTO MICELIAL DE P CUBENSIS EN MEDIO SUMERGIDO (FANG-ZHONG)
UTILIZANDO DIFERENTES CONCENTRACIONES DE SACAROSA COMO FUENTE DE CARBONO (PESO
SECO) 50
GRAacuteFICO 5 CRECIMIENTO MICELIAL PARA TRES DIFERENTES CONCENTRACIONES DE SACAROSA 52
GRAacuteFICO 6 VALORES DE CONCENTRACIOacuteN DE BIOMASA EXPERIMENTAL Y TEOacuteRICO GRAFICADOS CON
RESPECTO AL TIEMPO PARA LAS FERMENTACIONES CON DIFERENTES CONCENTRACIONES DE
SACAROSA 54
GRAacuteFICO 7 CRECIMIENTO MICELIAL PARA DOS DIFERENTES FUENTES DE CARBONO (GLUCOSA Y
SACAROSA) 56
GRAacuteFICO 8 CINEacuteTICA DE CRECIMIENTO MICELIAL DE P CUBENSIS EN MEDIO SUMERGIDO (FANG-ZHONG)
UTILIZANDO DIFERENTES CONCENTRACIONES DE FA Y 50 GL DE GLUCOSA COMO FUENTE DE
CARBONO (PESO SECO) 57
GRAacuteFICO 9 CRECIMIENTO MICELIAL PARA GLUCOSA A UNA CONCENTRACIOacuteN DE 50 GL Y TRES
DIFERENTES CONCENTRACIONES DE FA 59
GRAacuteFICO 10 VALORES DE CONCENTRACIOacuteN DE BIOMASA EXPERIMENTAL Y TEOacuteRICO GRAFICADOS CON
RESPECTO AL TIEMPO PARA LAS FERMENTACIONES CON DIFERENTES CONCENTRACIONES DE FA Y
50 GL DE GLUCOSA 61
GRAacuteFICO 11 CINEacuteTICA DE CONSUMO DE SUSTRATO POR PARTE DEL P CUBENSIS EN MEDIO SUMERGIDO
UTILIZANDO DIFERENTES CONCENTRACIONES DE GLUCOSA COMO FUENTE DE CARBONO 62
GRAacuteFICO 12 CINEacuteTICA DE CONSUMO DE SUSTRATO POR PARTE DEL P CUBENSIS EN MEDIO SUMERGIDO
UTILIZANDO DIFERENTES CONCENTRACIONES DE SACAROSA COMO FUENTE DE CARBONO 64
GRAacuteFICO 13 CONSUMO DE SUSTRATO PARA CADA UNA DE LAS FUENTES DE CARBONO UTILIZADAS 66
GRAacuteFICO 14 CINEacuteTICA DE CONSUMO DE SUSTRATO POR PARTE DEL P CUBENSIS EN MEDIO SUMERGIDO
UTILIZANDO 50 GL DE GLUCOSA COMO FUENTE DE CARBONO Y DIFERENTES CONCENTRACIONES DE
FA 67
GRAacuteFICO 15 CONSUMO DE SUSTRATO PARA CADA UNA DE LAS CONCENTRACIONES DE FA UTILIZADAS 68
GRAacuteFICO 16 CINEacuteTICA DE CONSUMO DE PROTEIacuteNA POR PARTE DEL P CUBENSIS EN MEDIO SUMERGIDO
UTILIZANDO DIFERENTES CONCENTRACIONES DE GLUCOSA COMO FUENTE DE CARBONO 70
GRAacuteFICO 17 CINEacuteTICA DE CONSUMO DE PROTEIacuteNA POR PARTE DEL P CUBENSIS EN MEDIO SUMERGIDO
UTILIZANDO DIFERENTES CONCENTRACIONES DE SACAROSA COMO FUENTE DE CARBONO 71
GRAacuteFICO 18 CONSUMO DE PROTEIacuteNA PARA CADA UNA DE LAS FUENTES DE CARBONO UTILIZADAS 73
xiii
GRAacuteFICO 19 CINEacuteTICA DE CONSUMO DE PROTEIacuteNA POR PARTE DEL P CUBENSIS EN MEDIO SUMERGIDO
UTILIZANDO 50 GL DE GLUCOSA COMO FUENTE DE CARBONO Y DIFERENTES CONCENTRACIONES DE
FA 74
GRAacuteFICO 20 CONSUMO DE PROTEIacuteNA PARA LOS ENSAYOS CON Y SIN FA 75
GRAacuteFICO 21 AacuteREA DEL COMPUESTO OBTENIDO DE P CUBENSIS EN TIEMPO DE RETENCIOacuteN ENTRE 62 Y
72 MINUTOS PARA LAS DOS FUENTES DE CARBONO 77
GRAacuteFICO 22 AacuteREA DEL COMPUESTO OBTENIDO DE P CUBENSIS EN TIEMPO DE RETENCIOacuteN ENTRE 62 Y
72 MINUTOS EN LOS UacuteLTIMOS TRES DIacuteAS DE LA FERMENTACIOacuteN CON FA Y GLUCOSA 79
GRAacuteFICO 23 AacuteREA DEL COMPUESTO OBTENIDO DE P CUBENSIS EN TIEMPO DE RETENCIOacuteN ENTRE 62 Y
72 MINUTOS PARA CADA UNA DE LAS FUENTES DE CARBONO UTILIZADAS 82
GRAacuteFICO 24 AacuteREA DEL COMPUESTO OBTENIDO DE P CUBENSIS EN TIEMPO DE RETENCIOacuteN ENTRE 62 Y
72 MINUTOS PARA CADA UNA DE LAS CONCENTRACIONES DE FA UTILIZADAS 85
GRAacuteFICO 25 CROMATOGRAMAS DEL DIacuteA 12 PARA EL P CUBENSIS CULTIVADO EN MEDIO SUMERGIDO
FANG-ZHONG CON DOS DIFERENTES TIPOS DE SUSTRATOS (A) 30 GL GLUCOSA (B) 30 GL SACAROSA
109
GRAacuteFICO 26 CROMATOGRAMAS DEL DIacuteA 12 PARA EL P CUBENSIS CULTIVADO EN MEDIO SUMERGIDO
FANG-ZHONG CON DOS DIFERENTES TIPOS DE SUSTRATOS (A) 50 GL GLUCOSA (B) 50 GL SACAROSA
110
GRAacuteFICO 27 CROMATOGRAMAS DEL DIacuteA 12 PARA EL P CUBENSIS CULTIVADO EN MEDIO SUMERGIDO
FANG-ZHONG CON DOS DIFERENTES TIPOS DE SUSTRATOS (A) 50 GL GLUCOSA (B) 50 GL SACAROSA
111
GRAacuteFICO 28 CROMATOGRAMA DEL DIacuteA 12 PARA EL P CUBENSIS CULTIVADO EN MEDIO SUMERGIDO
FANG-ZHONG CON FUENTE DE CARBONO GLUCOSA Y ADICIOacuteN DE FENILALANINA EN TRES
CONCENTRACIONES (A) 05 GL FA (B) 1 GL FA (C) 15GL FA 112
GRAacuteFICO 29 CROMATOGRAMAS DEL DIacuteA 13 PARA EL P CUBENSIS CULTIVADO EN MEDIO SUMERGIDO
FANG-ZHONG CON DOS DIFERENTES TIPOS DE SUSTRATOS (A) 30 GL GLUCOSA (B) 30 GL SACAROSA
113
GRAacuteFICO 30 CROMATOGRAMAS DEL DIacuteA 13 PARA EL P CUBENSIS CULTIVADO EN MEDIO SUMERGIDO
FANG-ZHONG CON DOS DIFERENTES TIPOS DE SUSTRATOS (A) 50 GL GLUCOSA (B) 50 GL SACAROSA
114
GRAacuteFICO 31 CROMATOGRAMAS DEL DIacuteA 13 PARA EL P CUBENSIS CULTIVADO EN MEDIO SUMERGIDO
FANG-ZHONG CON DOS DIFERENTES TIPOS DE SUSTRATOS (A) 70 GL GLUCOSA (B) 70 GL SACAROSA
115
GRAacuteFICO 32 CROMATOGRAMAS DEL DIacuteA 12 PARA EL P CUBENSIS CULTIVADO EN MEDIO SUMERGIDO
FANG-ZHONG CON FUENTE DE CARBONO GLUCOSA Y ADICIOacuteN DE FENILALANINA EN TRES
CONCENTRACIONES (A) 05 GL FA (B) 1 GL FA (C) 15GL FA 116
GRAacuteFICO 33 CROMATOGRAMAS DEL DIacuteA 14 PARA EL P CUBENSIS CULTIVADO EN MEDIO SUMERGIDO
FANG-ZHONG CON DOS DIFERENTES TIPOS DE SUSTRATOS (A) 30 GL GLUCOSA (B) 30 GL SACAROSA
117
GRAacuteFICO 34 CROMATOGRAMAS DEL DIacuteA 14 PARA EL P CUBENSIS CULTIVADO EN MEDIO SUMERGIDO
FANG-ZHONG CON DOS DIFERENTES TIPOS DE SUSTRATOS (A) 50 GL GLUCOSA (B) 50 GL SACAROSA
118
xiv
GRAacuteFICO 35 CROMATOGRAMAS DEL DIacuteA 14 PARA EL P CUBENSIS CULTIVADO EN MEDIO SUMERGIDO
FANG-ZHONG CON DOS DIFERENTES TIPOS DE SUSTRATOS (A) 70 GL GLUCOSA (B) 70 GL SACAROSA
119
GRAacuteFICO 36 CROMATOGRAMAS DEL DIacuteA 12 PARA EL P CUBENSIS CULTIVADO EN MEDIO SUMERGIDO
FANG-ZHONG CON FUENTE DE CARBONO GLUCOSA Y ADICIOacuteN DE FENILALANINA EN TRES
CONCENTRACIONES (A) 05 GL FA (B) 1 GL FA (C) 15GL FA (A) 05 GL FA (B) 1 GL FA (C)
15GL FA 120
xv
LISTA DE ECUACIONES
ECUACIOacuteN 1 ECUACIOacuteN LINEALIZADA DEL MODELO LOGIacuteSTICO 38
ECUACIOacuteN 2 VALORES TEOacuteRICOS DE BIOMASA EN EL TIEMPO 39
xvi
LISTAS DE ANEXOS
ANEXO 1 ANAacuteLISIS DE VARIANZA (ANOVA) PARA EL CRECIMIENTO DE BIOMASA DE LAS
FERMENTACIONES CON GLUCOSA _____________________________________________________ 90
ANEXO 2 ANAacuteLISIS DE VARIANZA (ANOVA) PARA EL CRECIMIENTO DE BIOMASA DE LAS
FERMENTACIONES CON SACAROSA ____________________________________________________ 91
ANEXO 3 ANAacuteLISIS DE VARIANZA (ANOVA) PARA EL CRECIMIENTO DE BIOMASA DE LAS
FERMENTACIONES CON GLUCOSA Y SACAROSA __________________________________________ 92
ANEXO 4 ANAacuteLISIS DE VARIANZA (ANOVA) PARA EL CRECIMIENTO DE BIOMASA DE LAS
FERMENTACIONES CON GLUCOSA 50 GL Y FA ___________________________________________ 93
ANEXO 5 ANAacuteLISIS DE VARIANZA (ANOVA) PARA EL CONSUMO DE SUSTRATO EN LAS FERMENTACIONES
SIN FA ____________________________________________________________________________ 94
ANEXO 6 ANAacuteLISIS DE VARIANZA (ANOVA) PARA EL CONSUMO DE SUSTRATO EN LAS FERMENTACIONES
CON FA ___________________________________________________________________________ 95
ANEXO 7 ANAacuteLISIS DE VARIANZA (ANOVA) PARA EL CONSUMO DE PROTEIacuteNA EN LAS FERMENTACIONES
SIN FA ____________________________________________________________________________ 96
ANEXO 8 ANAacuteLISIS DE VARIANZA (ANOVA) PARA EL CONSUMO DE PROTEIacuteNA EN LAS FERMENTACIONES
CON FA ___________________________________________________________________________ 97
ANEXO 9 ANAacuteLISIS DE VARIANZA (ANOVA) PARA LA PRODUCCIOacuteN DE PSILOCIBINA EN LAS
FERMENTACIONES SIN FA ____________________________________________________________ 98
ANEXO 10 ANAacuteLISIS DE VARIANZA (ANOVA) PARA LA PRODUCCIOacuteN DE PSILOCIBINA EN LAS
FERMENTACIONES CON FA ___________________________________________________________ 99
ANEXO 11 ANAacuteLISIS DE VARIANZA (ANOVA) PARA LA CUANTIFICACIOacuteN PORCENTUAL DE PSILOCIBINA EN
LAS FERMENTACIONES SIN FA _______________________________________________________ 100
ANEXO 12 ANAacuteLISIS DE VARIANZA (ANOVA) PARA LA CUANTIFICACIOacuteN PORCENTUAL DE PSILOCIBINA EN
LAS FERMENTACIONES CON FA ______________________________________________________ 101
ANEXO 13 DETERMINACIOacuteN DE CONSUMO DE AZUacuteCARES POR EL MEacuteTODO DE DNS (AacuteCIDO
DINITROSALICIacuteLICO) ________________________________________________________________ 102
ANEXO 14 CINEacuteTICA DE CONSUMO DE SUSTRATO ___________________________________________ 104
ANEXO 15 DETERMINACIOacuteN DE CONSUMO DE PROTEIacuteNAS POR EL MEacuteTODO DE LOWRY ____________ 105
ANEXO 16 CINEacuteTICA CONSUMO DE PROTEIacuteNA ______________________________________________ 106
ANEXO 17 PRUEBA DE REACTIVO DE DRAGENDORFF _________________________________________ 107
ANEXO 18 BARRIDO ESPECTRAL PARA EL PSILOCYBE CUBENSIS _________________________________ 108
ANEXO 19 CROMATOGRAMAS (HPLC) DEL DIacuteA 12 DE FERMENTACIOacuteN ___________________________ 109
ANEXO 20 CROMATOGRAMAS (HPLC) DEL DIacuteA 13 DE FERMENTACIOacuteN __________________________ 113
ANEXO 21 CROMATOGRAMAS (HPLC) DEL DIacuteA 14 DE FERMENTACIOacuteN __________________________ 117
xvii
RESUMEN
El Psilocybe cubensis es un hongo de gran importancia a nivel industrial gracias a
la presencia de una sustancia llamada Psilocibina en su cuerpo fructiacutefero
Dicho alcaloide derivado de la triptamina es muy similar al neurotransmisor
serotonina el cual es responsable de la percepcioacuten sensorial la regulacioacuten de la
temperatura el inicio del reposo nocturno del hiacutegado y los rintildeones Por tal motivo
este estudio se enfocoacute en la produccioacuten de la Psilocibina mediante el cultivo del P
cubensis en medio sumergido (Fang-Zhong)
Se evaluaron los efectos de dos fuentes de carbono (glucosa y sacarosa) a tres
concentraciones diferentes en cultivo sumergido para Psilocybe cubensis con el
fin de determinar la incidencia de eacutestas en la produccioacuten de biomasa y en la
produccioacuten y presencia de Psilocibina alcaloide de intereacutes Para las
concentraciones de glucosa de 30 gL 50 gL y 70 gL se presentoacute un crecimiento
maacuteximo de biomasa de 048 gL 055 gL y 062 gL y un porcentaje de alcaloide
de 6065 wv 7396 wv y 6733 wv respectivamente Esto uacuteltimo si se
asume que el tiempo de retencioacuten oscila entre 62 y 72 minutos contaacutendose con
una fase moacutevil de HCOONH4 en una columna C18 Mientras que para las mismas
concentraciones de sacarosa se presentoacute un crecimiento maacuteximo de biomasa de
026 gL 045 gL y 057 gL con porcentajes del compuesto presente entre el
rango de 62 y 72 minutos de 3664 wv 5857 wv y 5583 wv
respectivamente
Una vez realizada la investigacioacuten se encontroacute que las diferencias existentes en
cuanto a la cantidad de biomasa generada con respecto al tipo de sustrato
utilizado no fueron significativas es decir era irrelevante si se utilizaba glucosa o
sacarosa como principal fuente de carbono para la fermentacioacuten del P cubensis
xviii
en medio sumergido con el fin de obtener biomasa sin embargo se hallaron
diferencias significativas con respecto a las diferentes concentraciones empleadas
de dichas fuentes de carbono
Al analizar las muestras mediante cromatografiacutea liacutequida de alta eficiencia (HPLC)
se determinoacute que el medio que conteniacutea 50 gL de glucosa era el deseado debido
a que fue en eacuteste donde se presentaron picos maacutes definidos mostrando una mejor
resolucioacuten del compuesto Adicionalmente presentoacute un buen crecimiento micelial
Una vez elegido dicho criterio se evaluoacute el efecto que teniacutea la adicioacuten de un
aminoaacutecido llamado Fenilalanina (FA) al medio que conteniacutea 50 gL de glucosa
con el fin de determinar si eacuteste teniacutea alguna incidencia positiva en la produccioacuten de
biomasa y en la generacioacuten del alcaloide de intereacutes cabe resaltar que se utilizaron
diferentes concentraciones de FA correspondientes a 05 gL 10 gL y 15 gL
Finalizados dichos ensayos se obtuvieron valores de crecimiento de biomasa
maacutexima de 106 gL 108 gL y 101 gL y un porcentaje de aacuterea de 7549 wv
6236 wv y 2721 wv respectivamente
Es necesario hacer hincapieacute en que las diferencias obtenidas mediante el anaacutelisis
estadiacutestico entre cada una de las concentraciones de FA con respecto a la
generacioacuten de biomasa y la produccioacuten del compuesto no fueron significativas lo
que llevoacute a elegir una concentracioacuten de 05 gL de FA debido a que fue la menor
cantidad utilizada de este compuesto durante la investigacioacuten suponieacutendose asiacute
una disminucioacuten en los costos de materia prima
Palabras claves
Psilocybe cubensis Psilocibina Alcaloide HPLC Cultivo Sumergido Fuentes de
Carbono Fenilalanina
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INTRODUCCIOacuteN
Los hongos son una rica fuente de productos naturales con una alta actividad
bioloacutegica Desafortunadamente el cultivo de eacutestos en cuerpo fructiacutefero toma
varios meses disminuyendo su calidad debido a los cambios climaacuteticos y plagas
por tal razoacuten se implementoacute la metodologiacutea de medio sumergido la cual es
prometedora gracias a una alta productividad de compuestos bioactivos (Arora
1986)
El Geacutenero Psilocybe pertenece al Reino Fungiacute con un Phylum Basidiomicota
una Clase Homobasidiomicetes un Orden Agaricales una Familia Strofariaceae
(Paris y Hurabielle 1981)
Dicho geacutenero es considerado de gran importancia a nivel mundial debido a que su
cuerpo fructiacutefero y biomasa micelial contienen Psilocibina la cual posee un alto
valor para la industria farmaceacuteutica por su uso en la elaboracioacuten de productos
antidepresivos Este alcaloide derivado de FA cuenta con una estructura muy
similar al neurotransmisor segregado por el cerebro llamado serotonina que
controla el estado de aacutenimo el suentildeo el hiacutegado y los rintildeones (Mandrile et al
1984) esta caracteriacutestica le otorga la gran importancia a la Psilocibina en el
mercado puesto que tiene un alto impacto en la sociedad como ayudante
antidepresivo debido a que no todas las personas segregan la cantidad necesaria
(10 mg con liacutemites que variacutean desde 5 a 20 mg) de serotonina (Mandrile et al
1984) Adicionalmente se estaacute empleando como una gran ayuda para la
disminucioacuten de la adiccioacuten a sustancias como heroiacutena y cocaiacutena gracias a que
este alcaloide no genera dependencia (Lee et al 2004)
Debido a que su consumo puede generar alucinaciones era consumido por las
culturas aboriacutegenes centroamericanas con el fin de realizar manifestaciones
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religiosas Su uso se remonta a maacutes de 3500 antildeos y era nombrado por los
aztecas como ―Teonunaltl que significa ―carne de dioses (Mandrile et al 1984)
La alternativa que se utilizoacute durante esta investigacioacuten fue el cultivo del P
cubensis mediante medio sumergido debido principalmente a las notables
ventajas frente a los sistemas convencionales que eacuteste posee entre las cuales se
destacan la disminucioacuten del tiempo para la obtencioacuten de la biomasa (14 diacuteas) y la
reduccioacuten de los costos de obtencioacuten (Lee et al 2004) De acuerdo a lo
dimensionado anteriormente este estudio estaba orientado primordialmente a la
buacutesqueda de alternativas que permitieran la produccioacuten de biomasa de forma
raacutepida y confiable
Con el fin de llevar a cabo lo dicho anteriormente se pretendioacute evaluar el efecto
del uso de dos diferentes fuentes de carbono en este caso glucosa y sacarosa en
el crecimiento micelial de la cepa P cubensis
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OBJETIVOS
GENERAL
Evaluar el efecto de la fuente de carbono en el crecimiento micelial de una
cepa Psilocybe sp
ESPECIacuteFICOS
Evaluar la cineacutetica de crecimiento de la cepa Psilocybe cubensis en los
diferentes medios de cultivo sumergido mediante la cuantificacioacuten de
biomasa por medio de la metodologiacutea de peso seco
Evaluar el consumo de sustrato para los diferentes ensayos por medio de
teacutecnicas espectrofotomeacutetricas
Determinar la presencia de Psilocibina mediante el uso del reactivo de
Dragendorff
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1 MARCO TEOacuteRICO
11 CONCEPTOS GENERALES DE HONGOS
Los hongos son organismos eucariotas que no contienen clorofila con nutricioacuten
por absorcioacuten generalmente con reproduccioacuten sexual y asexual el cuerpo
consiste generalmente de filamentos ramificados con pared celular quitinosa
(Miles y Chang 1999)
Constituyen uno de los grupos de organismos maacutes importantes para la vida del
hombre ya que son los responsables de gran parte de la descomposicioacuten de la
materia orgaacutenica aumentando su disponibilidad en el suelo pueden ser
comestibles venenosos o psicotroacutepicos muchos son patoacutegenos otros producen
ciertas sustancias beneficiosas o intervienen en procesos de elaboracioacuten de
algunos comestibles (Miles y Chang 1999)
111 Hongos laminares (Agaricales)
El orden Agaricales tambieacuten conocido como Euagaricales es el mayor orden de
setas y hongos que incluye maacutes de la mitad de todas las especies conocidas de la
clase Homobasidiomycetes (Hibbett et al 1997 Hibbett y Thorn 2001) Maacutes de
9000 especies y alrededor de 350 geacuteneros se han atribuido a este orden que
contiene 26 familias (Kirk et al 2001) Un consenso de mayor nivel de
clasificacioacuten de los Agaricales ha sido difiacutecil de lograr debido a la competencia de
sistemas que restringen geacuteneros y familias (o incluso orden) de diferentes
maneras (Bas 1998 Juumllich 1981 Kirk et al 2001 Kuumlhner 1980 Singer 1986)
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La base para la clasificacioacuten de los hongos fue construida por Fries (1874) quien
hizo hincapieacute en las caracteriacutesticas macroscoacutepicas como la textura del tallo la
separacioacuten de los filamentos (laminas) presencia o ausencia de velo y color de las
esporas
Posteriormente dividioacute los hongos Agaricales en varias especies de acuerdo al
color de las esporas depositadas las cuales pueden ser de color blanco rosado
marroacuten puacuterpura ndash marroacuten y negro El sistema macroscoacutepico de Fries que
reconocioacute inicialmente 12 geacuteneros de hongos carnosos que forman los hongos es
taxonoacutemicamente praacutectico Eacuteste fue relativamente invariable hasta que Fayod
(1989) estudioacute la anatomiacutea y las caracteriacutesticas microscoacutepicas de muchos
Agaricales reconociendo 108 geacuteneros (Arora 1986)
Al igual que todas las setas los hongos laminares son faacutebricas de esporas
creados con el uacutenico propoacutesito de fabricar esporas microscoacutepicas para dejarse
llevar por las corrientes de aire y con suerte caer en un lugar adecuado en la
tierra para germinar y comenzar un nuevo organismo Las probabilidades de que
cualquier individuo que tiene esporas de este tipo tenga suerte son tan bajas que
el hongo produce millones de esporas para compensar esto En las laacuteminas se
encuentran numerosas esporas las cuales aumentan considerablemente el
nuacutemero de esporas que el hongo puede producir Ambos lados de cada laacutemina
estaacute cubierta con esporas microscoacutepicas (Kuo 2007) A continuacioacuten se muestra
de manera ilustrativa en la figura 1 las laacuteminas que poseen los hongos Agaricales
en las cuales se da la formacioacuten de las esporas
Figura 1 Hongo Agaricales (Laminar) (Kuo 2007)
24
12 MEDIOS DE CULTIVO
Uno de los sistemas maacutes importantes para la identificacioacuten de microorganismos es
observar su crecimiento en sustancias alimenticias artificiales preparadas en el
laboratorio El material alimenticio en el que crecen los microorganismos es el
medio de cultivo (Garciacutea 1995)
Para que los microorganismos crezcan adecuadamente en un medio de cultivo
artificial eacuteste debe reunir una serie de condiciones como lo son temperatura
grado de humedad y presioacuten asiacute como un grado correcto de acidez o alcalinidad
Un medio de cultivo contiene los nutrientes y factores de crecimiento necesarios
para que el microorganismo se desarrolle correctamente y debe estar exento de
cualquier tipo de microorganismo que pueda generar contaminacioacuten (Garciacutea
1995)
121 Tipos de medios de cultivo
En la actualidad existen diversos tipos de medio de cultivo si se centra en la
composicioacuten eacutestos pueden ser medios sinteacuteticos que contienen fuente de
carbono fuente de nitroacutegeno sales que suplan los iones y demaacutes elementos tales
como estimuladores del crecimiento medios complejos que contienen ingredientes
tales como extracto de levadura peptona infusioacuten de cerebro etc ricos en
nutrientes medios de enriquecimiento siendo estos complejos con aditivos
adicionales para favorecer asiacute al crecimiento y desarrollo de determinados
microorganismos medios selectivos los cuales son disentildeados para favorecer el
crecimiento especiacutefico de un microorganismo determinado o un grupo
microbiano medios diferenciales que proporcionan la distincioacuten microbiana de una
mezcla por sus propiedades diferenciales de crecimiento en dichos medios
medios de mantenimiento siendo disiacutemiles de los de crecimiento oacuteptimo por el
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crecimiento raacutepido y proliacutefico que deriva en la muerte raacutepida de las ceacutelulas (Garciacutea
1995)
Atendiendo a su estado los medios de cultivo pueden presentarse como medios
sumergidos y medios soacutelidos que contienen agar que gelifica por debajo de 45
degC y cuya concentracioacuten en su uso es de 15 y medios semisoacutelidos que contiene
un agar a una concentracioacuten de 07 (Garciacutea 1995)
121 Medio sumergido
Debido a que cultivar el cuerpo fructiacutefero toma varios meses y se dificulta el control
de calidad del producto final porque se estaacute sujeto a los cambios permanentes del
clima y las plagas se ha empleado la metodologiacutea de medio sumergido la cual es
una alternativa muy prometedora para la produccioacuten eficiente del micelio y de los
metabolitos (Lindequist y Niedermeyer 2005)
Dicha forma es la mejor para producir extraer y purificar metabolitos de un cultivo
de hongo ya que facilita una mayor produccioacuten de biomasa en menor tiempo y
de mayor calidad que el cultivo en medio soacutelido ademaacutes facilita la dispersioacuten y
adaptacioacuten del hongo y reduce los vectores de contaminacioacuten De igual forma un
cultivo de esta iacutendole es la opcioacuten maacutes viable si se quiere escalar procesos
fermentativos en aras de desarrollar mercados como en este caso el de
metabolitos medicinales (Navarro et al 1998)
A su vez el uso de cultivo sumergido puede beneficiar la produccioacuten de muchos
metabolitos secundarios y disminuir los costos de produccioacuten por reducir las
labores que involucran los meacutetodos de etapas soacutelidas (Domiacutenguez y Webb 2003)
Los metabolitos bioactivos de los hongos pueden ser potencialmente producidos a
nivel industrial mediante el uso de la metodologiacutea de cultivo sumergido pero el
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eacutexito a escala comercial depende del costo comparado con la tecnologiacutea existente
y la ventaja econoacutemica que la industria puede ver usando este meacutetodo El uso de
la tecnologiacutea puede ser facilitada por el aumento en el rendimiento de la
produccioacuten y el desarrollo del sistema (Hwang et al 2004)
El cultivo de hongos sumergidos se caracteriza por un aumento en la viscosidad
del caldo con el tiempo debido a uno o maacutes factores tales como el aumento de la
concentracioacuten de ceacutelulas los cambios de la morfologiacutea del crecimiento o la
produccioacuten de productos extracelulares que alteran el caraacutecter reoloacutegico de la
cultura del liacutequido El aumento en la viscosidad puede ser visto como un fenoacutemeno
indeseable pero inevitable ya que causan dificultades en el suministro de oxiacutegeno
en la eliminacioacuten de dioacutexido de carbono y en posibles problemas de agitacioacuten
(Hwang et al 2004)
13 ALCALOIDES
131 Generalidades
La diversidad estructural y la variedad en la actividad bioloacutegica hacen de los
alcaloides como tambieacuten de los antibioacuteticos los grupos maacutes importantes entre las
sustancias naturales de intereacutes terapeacuteutico (Paris y Hurabielle 1981)
Se han aislado principalmente en plantas superiores y se han encontrado en maacutes
de 100 familias de Faneroacutegamas (aquellas plantas que se reproducen por semillas
producidas en sus inflorescencias) Su actividad bioloacutegica a nivel del sistema
nervioso dio pie a las primeras investigaciones siendo los alcaloides las primeras
sustancias naturales estudiadas (Paris y Hurabielle 1981)
El teacutermino alcaloide propuesto por el farmaceacuteutico W Meissner en 1819 se aplicoacute
a los compuestos de origen vegetal con propiedades alcalinas este caraacutecter
baacutesico es debido a la presencia de nitroacutegeno amiacutenico en su estructura Los
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alcaloides se pueden considerar como ―Un compuesto orgaacutenico de origen natural
nitrogenado derivados generalmente de aminoaacutecidos maacutes o menos baacutesico de
distribucioacuten restringida con propiedades farmacoloacutegicas importantes a dosis bajas
y que responden a reacciones comunes de precipitacioacuten (Paris y Hurabielle
1981)
132 Propiedades fisicoquiacutemicas
Los alcaloides tienen masas moleculares que variacutean entre 100 y 9000 gmol son
casi siempre incoloros son normalmente soacutelidos a temperatura ambiente a
excepcioacuten de los alcaloides no oxigenados Los alcaloides son poco solubles en
agua gracias a su caraacutecter baacutesico dicho caraacutecter se debe al par de electrones
libres del nitroacutegeno (Paris y Hurabielle 1981)
En la naturaleza se encuentran en forma de sales generalmente En las plantas
se consideraba que eran productos obtenidos durante la extraccioacuten y poco
solubles en disolventes tiacutepicos de extraccioacuten por su polaridad Son solubles en
disolventes orgaacutenicos como cloroformo etanol metanol acetato de etilo eacuteter
benceno En forma de sales son solubles en agua excepto las sales de berberina
(Paris y Hurabielle 1981)
Todos los alcaloides son activos a la luz polarizada Presentan una fluorescencia
caracteriacutestica bajo la luz UV o IR dando lugar a espectros caracteriacutesticos (Paris y
Hurabielle 1981)
133 Reconocimiento de los alcaloides
Las teacutecnicas de reconocimiento son basadas en la capacidad que tienen los
alcaloides en estado de sal (extractos aacutecidos) de combinarse con el yodo y
metales pesados como bismuto mercurio tungsteno formando precipitados se
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utilizan reactivos generales para detectar alcaloides como reactivo de Wagner
reactivo de Mayer reactivo de Dragendorff reactivo de Hager reactivo de
Bertrand reactivo de Ehrlich y reactivo de Vitali-Morin (Paris y Hurabielle 1981)
134 Clasificacioacuten de los alcaloides
Habitualmente los alcaloides se han clasificado en funcioacuten de su estructura
distinguieacutendose principalmente los compuestos heterociacuteclicos de los no
heterociacuteclicos Actualmente existen varias formas de clasificarlos (Bruneton
1987) entre ellas se pueden distinguir
1341 Alcaloides alifaacuteticos
a Derivados de la ornitina (pirrolidinas tropaacutenicos pirrolizidiacutenicos)
b Derivados de la lisina (piperidinas quinolizidiacutenicos)
1342 Alcaloides de origen diverso
a Alcaloides terpeacutenicos y esteroidales
b Alcaloides diversos (purinas macrociclos etc)
1343 Alcaloides aromaacuteticos
a Derivados del aacutecido nicotiacutenico (piridinas)
b Derivados de la fenilalanina y tirosina (isoquinoleinas)
c Derivados del triptofano (indoacutelicos quinoleinas)
d Derivados de la histidina (imidazoles)
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Alcaloides derivados del triptofano (Alcaloides Indoacutelicos)
Desde el punto de vista farmacoloacutegico ha habido mucho intereacutes sobre las bases
que contienen el nuacutecleo indoacutelico a raiacutez del descubrimiento de la actividad
alucinoacutegena del LSD asiacute como la actividad sedante de la reserpina aislada del
geacutenero Rauwolfia El auge del estudio fitoquiacutemico ocurrioacute en la deacutecada de los 60 y
se dirigiacutea principalmente a la familia Apocynaceae (Mercano y Hasegawa 1991)
Existen unos 800 alcaloides de este tipo distribuidos principalmente en la familia
Apocynaceae (geacuteneros Rauwolfia Aspidos-perma Strychnos y Vinca) menos
frecuentes en hongos y familias como Leguminoseae Malphigiaceae Rubiaceae y
Rutaceae donde los alcaloides presentan el grupo indoacutelico sencillo (Mercano y
Hasegawa 1991)
El triptofano es el precursor de estos alcaloides los cuales se clasifican en
triptaminas y en no triptaminas las triptaminas a su vez se subdividen en b-
carbolinas y en indoleninas y pueden ser triptaminas simples o triptaminas
complejas y estas pueden ser isopreacutenicas o no isopreacutenicas (Mercano y Hasegawa
1991) La figura 2 muestra la estructura quiacutemica del triptofano triptamina y sus
divisiones
Figura 2 Alcaloides derivados del Triptofano (Mercano y Hasegawa 1991)
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Triptaminas simples
Las triptaminas simples juegan un importante papel en la cultura indiacutegena de
Ameacuterica por sus efectos alucinoacutegenos y extaacuteticos en sus ceremonias maacutegico
religiosas (Furst 1994) Se han encontrado en hongos alucinoacutegenos de
Mesoameacuterica del geacutenero Psilocybe Stropharia y Conocybe (―teonacatl o ―carne
de los dioses) usados por los indios Aztecas en sus ceremonias religiosas desde
hace maacutes de 1700 antildeos Se han encontrado en estos hongos los alcaloides
alucinoacutegenos la Psilocina y la Psilocibina que al ingerirlos produce diferentes
sensaciones auditivas y visuales relajacioacuten muscular depresiones y euforias
alternadas (Mercano y Hasegawa 1991)
La serotonina que juega un importante papel en la actividad neuronal se
encuentra tambieacuten en vegetales Se ha aislado en el pericarpio del banano el cual
seco cuando es fumado actuacutea como un alucinoacutegeno ligero (Seigler 1981)
De las glaacutendulas paroacutetidas del sapo comuacuten Bufo vulgaris se aiacutesla la bufotenina
derivado N-dimetilado de la serotonina que tambieacuten es el principio activo del Yopoacute
polvo de las semillas de Anadenanthera peregrina (Piptadenia peregrina)
Leguminoseae y especies del geacutenero Virola (Myristicaceae) que contiene tambieacuten
triptaminas son mezclados con cenizas e inhalados por medio de tubos de bambuacute
por los indiacutegenas del Orinoco en ceremonias maacutegico religiosas produciendo
alucinacioacuten e incoordinacioacuten motriz (Seigler 1981)
En la figura 3 se observan las estructuras de aquellos compuestos que estaacuten
clasificados como triptaminas simples
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Figura 3 Triptaminas simples (Seigler 1981)
13 PSILOCIBINA Y PSILOCINA
La Psilocibina y la Psilocina son bioloacutegicamente sintetizadas en los hongos
pertenecientes a los geacuteneros de Psilocybe (Bigwood y Beug 1982 Wurst et al
1984)
La Psilocibina y la Psilocina se han identificado en todo el mundo en una variedad
de setas que son llamados hongos maacutegicos La ingestioacuten de pequentildeas
cantidades de alucinoacutegenos provoca el eacutextasis La actividad alucinoacutegena de la
Psilocibina es relativamente maacutes baja que la de la Psilocina Sin embargo la
Psilocibina se convierte faacutecilmente en Psilocina (componente activo principal) en
los sistemas bioloacutegicos Asiacute el desarrollo de un meacutetodo de determinacioacuten de la
Psilocibina es importante lo misma que la de la Psilocina (Kimie et al 2005)
La hidroacutelisis de la Psilocibina se consigue saturando con anhiacutedido carboacutenico una
solucioacuten acuosa de Psilocibina (para eliminar el oxiacutegeno del aire y calentaacutendola)
obteniendo asiacute una moleacutecula de 4hidroxi-dimetiltriptamina y una moleacutecula de aacutecido
fosfoacuterico (Mandrile et al 1984)
Como todos los faacutermacos derivados del indol estas sustancias han despertado
intereacutes porque se sospechoacute la posibilidad de que algunas de ellas se formen en el
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organismo y que en ciertas psicosis especialmente en la esquizofrenia se
produzcan elevados niveles sanguiacuteneos que ocasionan algunos de los siacutentomas
(Mandrile et al 1984)
La figura 4 muestra la estructura quiacutemica de alcaloides como la Psilocibina y
Psilocina
Figura 4 Psilocibina y Psilocina (Mandrile et al 1984)
131 Antecedentes acerca de la obtencioacuten de Psilocibina y Psilocina
Una gran variedad de meacutetodos cromatograacuteficos para la determinacioacuten de
Psilocibina y Psilocina presentes en las incautaciones de hongos se han
publicado La cromatografiacutea de capa fina es utilizada debido a que eacutesta es muy
apropiada para la deteccioacuten de sustancias derivadas del triptofano (Brown et al
1972 Tanimukai 1967 Beug y Bigwood 1981) Aun asiacute meacutetodos que involucran
tanto la cromatografiacutea de alta eficiencia (HPLC) como la deteccioacuten fotomeacutetrica de
UV (Beug y Bigwood 1981 Wurst et al 1984 Borner y Brenneisen 1987 Perkal
et al 1980 Vanhaelen-Faestreacute y Vanhaelen 1984 Thomson 1980 White 1979
Sottolano y Lurie 1983) fueron establecidas y optimizadas para la cuantificacioacuten
de Psilocibina
Durante los uacuteltimos antildeos se han venido utilizando diferentes tipos de columna y
fase moacutevil con el fin de obtener la mayor cantidad posible de la sustancia de
intereacutes (Psilocibina)
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En el antildeo 1981 en el instituto farmaceacuteutico de la Universidad de Oslo realizaron
una investigacioacuten con una columna de siacutelice con una fase moacutevil de metanol-nitrato
de amonio en donde no soacutelo se logroacute obtener Psilocibina y Psilocina sino tambieacuten
un nuevo producto conocido como beocistiacuten Se logroacute un porcentaje de separacioacuten
maacutexima de 75 ww (Christiansen et al 1981)
Asimismo en el antildeo 1984 en el instituto de microbiologiacutea de Amsterdam se
realizoacute un estudio con una columna C18 de siacutelice y una fase moacutevil de agua-etanol-
aacutecido aceacutetico de forma isocraacutetica en donde se obtuvo un porcentaje 025-115
y 002-016 de Psilocibina y Psilocina respectivamente en el hongo (Wurst
1984)
De igual manera en el antildeo 2003 en el instituto de ciencia policiaca en Japoacuten se
ejecutoacute la cromatografiacutea de alta eficiencia utilizando una columna C18 con una
fase moacutevil de aacutecido foacutermico de forma isocraacutetica y un detector de 220 nm un rango
de porcentaje de Psilocibina 014-042 wv en la capa mientras un 009-03
wv en el tallo (Tsujikawa et al 2003)
34
2 MATERIALES Y MEacuteTODOS
21 LOCALIZACIOacuteN
Las fermentaciones la medicioacuten del crecimiento micelial y la cuantificacioacuten del
consumo del sustrato y de proteiacutena se llevaron a cabo en el laboratorio de
Biotecnologiacutea de la Universidad EAFIT mientras que los anaacutelisis de cromatografiacutea
liacutequida de alta eficiencia (HPLC) se realizaron en el laboratorio de Quiacutemica
Instrumental de dicha Universidad
22 MICROORGANISMO DE ESTUDIO
La cepa del hongo Psilocybe cubensis (EAH01) con la cual se trabajoacute fue donada
por Joseacute Rodrigo Moreno Ingeniero del laboratorio de la Universidad Catoacutelica de
Oriente (UCO) La EAH01 permanece auacuten en el laboratorio de Biotecnologiacutea de la
Universidad EAFIT
Dicha cepa se cultivoacute en una caja Petri que conteniacutea Agar Extracto de Malta
(MEA) y se incuboacute a 30ordmC en una incubadora digital del laboratorio de
Biotecnologiacutea de la Universidad EAFIT La figura 5 representa una cepa de P
cubensis cultivada en medio soacutelido MEA
Figura 5 Psilocybe cubensis (EAH01) cultivada en medio soacutelido Agar Malta
35
23 COMPONENTES DEL MEDIO DE CULTIVO (FANG-ZHONG)
El medio sumergido utilizado para llevar a cabo las diferentes fermentaciones de
P cubensis fue el descrito por Fang-Zhong (2002) La tabla 1 muestra los
componentes de dicho medio y la concentracioacuten de cada uno de ellos Se destaca
que las fuentes de carbono utilizadas fueron glucosa y sacarosa usaacutendolas cada
una por separado para cada experimento y haciendo variaciones de
concentraciones de las mismas para los distintos ensayos
Tabla 1 Composicioacuten del medio de cultivo sumergido para evaluar el crecimiento micelial del P cubensis
Componentes Cantidad (gL)
Fuente de Carbono 30 ndash 50 - 70
Peptona 5
Extracto de levadura 5
KH2PO4 1
MgSO47H2O 05
Vitamina B1 005
24 PREPARACIOacuteN DE LOS DIFERENTES PREINOacuteCULOS DE P cubensis
EMPLEADOS PARA LAS FERMENTACIONES SUMERGIDAS
Con el propoacutesito de llevar a cabo cada uno de los ensayos fue necesario realizar
la preparacioacuten de un preinoacuteculo eacutesto con el fin de realizar un proceso de
adaptacioacuten del P cubensis al medio favoreciendo la disminucioacuten en cuanto a
tiempo (preferiblemente la eliminacioacuten de la aparicioacuten de un fase de latencia una
vez comenzada la fermentacioacuten)
La preparacioacuten de cada uno de los preinoacuteculos se realizoacute en 6 erlenmeyers de
1000 mL con 200 mL de medio cada uno los cuales fueron esterilizados a 120degC
por 15 minutos e inoculados con 4 discos de 5 mm aproximadamente de P
36
cubensis provenientes de la cepa previamente activada en Agar Malta durante 6
diacuteas Los erlenmeyers se llevaron a un agitador orbital por 6 diacuteas a 30ordmC y 100
rpm
25 PREPARACIOacuteN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO Y LOS INOacuteCULOS DE P
cubensis UTILIZADOS PARA LAS FERMENTACIONES SUMERGIDAS
Una vez realizado el preinoacuteculo se procedioacute a preparar los medios de cultivo
utilizados para realizar los distintos experimentos de la siguiente manera se
prepararon medios que diferiacutean en la fuente de carbono (glucosa o sacarosa) y en
la concentracioacuten de la misma (30 gL 50 gL y 70 gL) teniendo asiacute un total de
seis fermentaciones Las demaacutes cantidades de los componentes del medio de
Fang-Zhong fueron las mismas que las usadas en el preinoacuteculo descritas en la
Tabla 1
En primer lugar se llevaron a cabo las tres fermentaciones de glucosa
preparando un total de 90 erlenmeyers (30 por cada concentracioacuten de azuacutecar por
duplicado) cada uno de los frascos conteniacutea 50 mL del medio en erlenmeyers de
250 mL e inoculados con 01 g de peso huacutemedo del preinoacuteculo aproximadamente
Los 90 frascos se llevaron durante 14 diacuteas a un agitador orbital a 100 rpm con una
temperatura de 30 degC
Posteriormente se llevaron a cabo las tres fermentaciones de sacarosa siguiendo
el mismo proceso descrito anteriormente para la glucosa
Una vez terminadas las fermentaciones de glucosa y sacarosa y realizados todos
los anaacutelisis correspondientes (generacioacuten de biomasa consumo de sustrato
consumo de proteiacutena y evaluacioacuten de la presencia de Psilocibina por medio de
cromatografiacutea liacutequida de alta eficiencia (HPLC)) se procedioacute a elegir la fuente de
carbono y concentracioacuten que mejores resultados arrojoacute tanto para la generacioacuten
37
de biomasa como para la produccioacuten del alcaloide con el fin de evaluarla
nuevamente adicionaacutendole un precursor (FA)
Para finalizar se procedioacute a preparar los medios con la fuente de carbono y la
concentracioacuten de la misma que arrojoacute mejores resultados es decir los ensayos
realizados con una concentracioacuten de 50 gL de glucosa adicionaacutendole al medio
FA a diferentes concentraciones correspondiente a valores de 05 gL 10 gL y
15 gL las demaacutes cantidades de los componentes remanentes del medio fueron
las mismas que las descritas anteriormente en la tabla 1
26 CUANTIFICACIOacuteN DEL CRECIMIENTO DE BIOMASA MEDIANTE LOS
MEacuteTODOS DE PESO HUacuteMEDO Y PESO SECO PARA CULTIVO
SUMERGIDO DE P cubensis
La cuantificacioacuten de biomasa para cada uno de los tratamientos se realizoacute usando
la metodologiacutea de peso huacutemedo y peso seco Para la cuantificacioacuten de biomasa
mediante el meacutetodo de peso huacutemedo se tomaron dos muestras provenientes de
cada erlenmeyer cada 24 horas las cuales fueron filtradas y pesadas con el fin de
obtener el valor de peso huacutemedo para cada tratamiento del P cubensis
Posteriormente la biomasa retenida en el papel filtro fue llevada a un secador que
se encontraba a una temperatura de 50ordmC durante 24 horas transcurrido el
tiempo la biomasa seca fue pesada con el fin de obtener datos de peso seco
Durante los 14 diacuteas de la fermentacioacuten se obtuvieron datos de peso huacutemedo y
peso seco por duplicado para cada una de las fermentaciones
27 AJUSTE DE LA CINEacuteTICA DE CRECIMIENTO DE P cubensis AL
MODELO CINEacuteTICO LOGIacuteSTICO
Una vez realizada la recoleccioacuten de muestras para cada uno de los ensayos y su
posterior anaacutelisis se decidioacute modelar dichos datos mediante el modelo logiacutestico
38
(ecuacioacuten 1) el cual permite obtener variables cineacuteticas tales como la cantidad de
biomasa inicial (Xo) y la velocidad maacutexima de crecimiento (micromaacutex) para cada uno de
los tratamientos
Se decidioacute emplear el modelo logiacutestico ya que eacuteste muestra resultados maacutes reales
cuando se cultivan hongos debido a que su morfologiacutea es muy diferente a otros
microorganismos (pellets) dificultando la transferencia de masa (Bailey et al
1986)
Una vez linealizada la ecuacioacuten que describe dicho modelos se llega a la siguiente
expresioacuten
Ecuacioacuten 1 Ecuacioacuten linealizada del modelo logiacutestico
Posterior a la linealizacioacuten de la ecuacioacuten se procedioacute a graficar Ln ((XmaacutexX)-1)
vs tiempo con el fin de obtener como pendiente la velocidad maacutexima de
crecimiento (micromaacutex) y como intercepto el Ln ((XmaacutexXo)-1) el cual permitioacute la
obtencioacuten de la concentracioacuten inicial de biomasa
Obtenieacutendose asiacute los paraacutemetros cineacuteticos para cada ensayo correspondientes a
micromax y Xo
Se debe definir la concentracioacuten maacutexima de biomasa (Xmaacutex) para poder hallar los
paraacutemetros cineacuteticos mediante dicho modelo cabe aclarar que dicho valor se toma
de los resultados de biomasa adquiridos para cada uno de los ensayos mediante
la metodologiacutea de peso seco este valor variacutea para cada fermentacioacuten
Una vez ajustados los datos de cada tratamiento al modelo logiacutestico se procedioacute a
calcular de manera teoacuterica los valores de X (biomasa) que variacutea con el tiempo
39
teniendo en cuenta los paraacutemetros cineacuteticos arrojados mediante el modelo
logiacutestico utilizando la siguiente ecuacioacuten
Ecuacioacuten 2 Valores teoacutericos de biomasa en el tiempo
Estos valores de X teoacutericos obtenidos mediante la foacutermula anterior se grafican con
respecto a los valores de X obtenidos de manera experimental con el fin de
observar el ajuste del modelo logiacutestico a cada uno de los datos experimentales
28 EVALUACIOacuteN DEL CONSUMO DE SUSTRATO Y DEL CONSUMO DE
PROTEIacuteNA POR PARTE DEL P cubensis CULTIVADO EN MEDIO
SUMERGIDO
Con el fin de evaluar el consumo de sustrato y proteiacutena por parte del P cubensis
durante las fermentaciones que conteniacutean glucosa en el medio se recolectaron
muestras cada 24 horas del liacutequido obtenido despueacutes de realizada la filtracioacuten de
la muestra que se utilizoacute para efectos de caacutelculo de peso seo dicho liacutequido
denominado sobrenadante fue almacenado a -4 degC Finalizadas cada una de las
fermentaciones se procedioacute a realizar el protocolo para evaluar el consumo de
sustrato para cada medio (Miller 1959) mediante el meacutetodo de DNS (Aacutecido
Dinitrosaliciacutelico) (Anexo 13) y el consumo de proteiacutenas mediante el meacutetodo de
LOWRY para cada fermentacioacuten (Anexo 15)
Para llevar a cabo la cuantificacioacuten de sustrato y proteiacutena en los distintos ensayos
fue necesario realizar las curvas de calibracioacuten correspondientes dichas curvas
con sus respectivos valores de concentracioacuten se muestran en los anexos 14 y 16
40
29 MEacuteTODO CUALITATIVO PARA DETERMINAR LA PRESENCIA DE
ALCALOIDES (PSILOCIBINA) MEDIANTE EL USO DEL REACTIVO DE
DRAGENDORFF
Como se mencionoacute anteriormente el reactivo de Dragendorff es usado para
determinar de manera cualitativa la ausencia o presencia de alcaloides en una
muestra determinada Para llevar a cabo dicha prueba se recolectaron muestras
de la biomasa seca correspondientes a los diacuteas 12 13 y 14 de cada fermentacioacuten
las cuales fueron almacenadas a -4degC
Para determinar la presencia de Psilocibina se realizoacute el proceso descrito seguacuten
Musshoff et al (2000) el cual consistioacute en macerar cada una de las muestras de
biomasa hasta obtener un polvo fino luego se pesaron 10 mg de dicho polvo y a
esta cantidad se le agregoacute 1 mL de metanol Posteriormente una pequentildea
cantidad de esta mezcla se esparcioacute en un papel filtro en donde se le adicionoacute una
gota del reactivo de Dragendorff
Una vez realizada la prueba se dice que la muestra contiene presencia de
alcaloides si eacutesta presenta una coloracioacuten rojizo-amarilla
210 MEacuteTODO PARA DETERMINAR LA PRESENCIA DE PSILOCIBINA
MEDIANTE CROMATOGRAFIacuteA LIacuteQUIDA DE ALTA EFICIENCIA (HPLC)
Una vez evaluada la presencia del alcaloide mediante el reactivo de Dragendorff
se procedioacute a determinar mediante el uso de cromatografiacutea liacutequida de alta
eficiencia (HPLC) la presencia de los alcaloides en la mezcla con sus respectivos
tiempos de retencioacuten para llevar a cabo la extraccioacuten de la Psilocibina se siguioacute el
meacutetodo descrito por Musshoff et al (2000) Para ello la muestra de biomasa
seca fue macera en un mortero hasta convertirla en un polvo fino Diez miligramos
41
de la muestra en polvo se extrajeron dos veces con 1 mL de metanol en un bantildeo
de ultrasonido durante 30 minutos Posterior a eacutesto se centrifugaron las muestras
a 3000 rpm durante 2 minutos el sobrenadante se depositoacute en un vial
independiente
El sobrenadante fue evaporado hasta sequedad bajo una corriente de nitroacutegeno
gaseoso Una parte de los residuos se disolvioacute en 200 microL de la fase moacutevil que
contiene HCOONH4 con una concentracioacuten 10 microM y un pH de 35
El equipo utilizado para realizar todos los anaacutelisis correspondientes a HPLC
cuenta con las siguientes caracteriacutesticas equipo Agient Technologies que consta
de una columna C18 de 46 mm 250 mm 5 mm con una fase moacutevil de
HCOONH4 con un flujo de 1 mLminuto un detector UV de 214 nm y una inyeccioacuten
de 20 μL y una temperatura de 25degC El experimento se corrioacute de modo isocraacutetico
con una fase moacutevil de agua 70 y HCOONH4 de 30
211 DETERMINACIOacuteN CUALITATIVA DE LA RESOLUCIOacuteN DEL
ALCALOIDE DE INTEREacuteS PARA LOS DIFERENTES ENSAYOS
Con el fin de determinar de manera cualitativa cuaacutel de los cromatogramas
arrojados mediante la teacutecnica de HPLC presentoacute mejor resolucioacuten del alcaloide
fue necesario realizar un supuesto acerca del tiempo de retencioacuten de la Psilocibina
durante la cromatografiacutea puesto que a pesar de haber contado con un
cromatograma (Tsujikawa et al 2003) (Anexo 18) y haber trabajado en las
mismas condiciones de eacuteste no se utilizoacute la misma fase moacutevil lo que puedo
generar variaciones en dicho tiempo Se asumioacute que el tiempo de retencioacuten varioacute
entre 62 y 72 minutos es decir entre este tiempo se encontroacute el pico de intereacutes
de la investigacioacuten
42
La eleccioacuten del criterio de pureza del compuesto de intereacutes se realizoacute observando
cuaacutel de los picos obtenidos muestra menor ruido es decir que a su alrededor no
tenga presencia de otros compuestos (Anexos 19 20 y 21)
212 DETERMINACIOacuteN PORCENTUAL DE COMPUESTOS PARA LOS
DIFERENTES ENSAYOS
La cuantificacioacuten de los compuestos se hizo mediante un porcentaje de aacuterea bajo
la curva debido a que no se contoacute con un estaacutendar interno
Para realizar dicho porcentaje se obtuvo la totalidad de las aacutereas presentes en el
perfil cromatograacutefico obtenido para las muestras de los diacuteas 12 13 y 14 de cada
fermentacioacuten y el porcentaje del aacuterea del metabolito de intereacutes la cual oscilaba
entre un tiempo de retencioacuten entre 62 y 72 minutos
En el momento de analizar los cromatogramas y de elegir el medio que mejor
resultados arrojoacute en cuanto a la produccioacuten de alcaloide se observoacute la resolucioacuten
del metabolito en cada una de las fermentaciones
213 CULTIVO SUMERGIDO DE P cubensis EN PRESENCIA DE FA
Despueacutes de haber elegido la fuente de carbono (glucosa) y su respectiva
concentracioacuten (50 gL) que mejores resultados arrojaron durante la investigacioacuten
se realizaron nuevamente fermentaciones del P cubensis en medio sumergido
(Fang-Zhong) donde la diferencia de estos medios con respecto a los
anteriormente utilizados radicoacute en la presencia de FA aminoaacutecido
Para dichas fermentaciones se contoacute con tres concentraciones diferentes de FA
(05 gL 1 gL 15 gL) realizadas por duplicado adicionalmente se montoacute
43
simultaacuteneamente con dichos ensayos las muestras correspondientes a los uacuteltimos
tres diacuteas de fermentacioacuten sin FA en el medio para efectos de comparacioacuten y asiacute
poder llevar a cabo un anaacutelisis estadiacutestico apropiado
Los datos obtenidos fueron analizados por medio de una ANOVA con el fin de
observar si existiacutean o no diferencias significativas en cuanto al crecimiento micelial
(concentracioacuten de biomasa) del P cubensis y asiacute poder determinar el medio que
mejores resultados arrojoacute durante la investigacioacuten
214 DISENtildeO DE EXPERIMENTOS Y ANAacuteLISIS ESTADIacuteSTICO
El disentildeo estadiacutestico utilizado para realizar los anaacutelisis correspondientes a las
diferentes fermentaciones es un disentildeo factorial 23 Este estudio se basoacute en dos
factores que fueron las dos fuentes de carbono (glucosa y sacarosa) a su vez se
apoyoacute en tres niveles que fueron la variacioacuten en la concentracioacuten de las mismas
(30 gL 50 gL y 70 gL) De igual manera se fundamentoacute en dos variables de
respuesta el crecimiento micelial de P cubensis y el porcentaje de Psilocibina
presente en el microorganismo
Por medio del Software Statgraphics plus 51 se realizoacute un anaacutelisis estadiacutestico
basado en una ANOVA factorial Con ello se pretendioacute comparar estadiacutesticamente
los resultados de crecimiento micelial de biomasa (concentracioacuten) y produccioacuten de
Psilocibina para cada uno de los medios durante los 14 diacuteas de fermentacioacuten y en
especial en los uacuteltimos tres diacuteas de la misma puesto que durante este periacuteodo fue
evaluada la presencia del alcaloide
Es necesario hacer hincapieacute que para realizar dicha estadiacutestica fue necesario
ejecutar un estudio de normalidad el cual se comproboacute utilizando la graacutefica de
probabilidad normal a su vez se requirioacute un anaacutelisis de igualdad de varianza por
medio de una graacutefica de residuos Vs previsto con el fin de ver visualmente la
44
hipoacutetesis de la homocedasticidad todo ello con el fin de garantizar que la
investigacioacuten se comportoacute de forma normal Adicionalmente se contoacute con una
hipoacutetesis nula (Ho) y una Hipoacutetesis alterna (Ha) las cuales permitieron realizar las
conclusiones respectivas A continuacioacuten se enunciaraacuten cada una de eacutestas y los
paraacutemetros necesarios para dicho estudio
Ho Todas las medias son iguales es decir no existen diferencias
significativas entre los datos analizados
Ha Alguna de las medias es diferente lo que quiere decir que siacute existen
diferencias significativas
Paraacutemetro
Pvalor gt 005 Se acepta Ho
Pvalor le 005 Se rechaza Ho
45
3 RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN
31 CINEacuteTICA DE CRECIMIENTO MICELIAL DE P cubensis EN CULTIVO
SUMERGIDO (FANG-ZHONG) UTILIZANDO DIFERENTES FUENTES DE
CARBONO
Con el propoacutesito de evaluar el crecimiento micelial del P cubensis en medio
sumergido durante los 14 diacuteas de la fermentacioacuten se recurrioacute al uso de
metodologiacuteas conocidas como peso huacutemedo y peso seco en dicho trabajo soacutelo se
exponen los datos arrojados por el meacutetodo de peso seco
A continuacioacuten se presentan cada una de las fermentaciones de acuerdo al tipo de
sustrato empleado en las mismas los respectivos valores de peso seco obtenidos
y los anaacutelisis pertinentes para cada uno de los casos
311 Crecimiento micelial de P cubensis en medio sumergido utilizando
diferentes concentraciones de glucosa
Inicialmente se evaluaron tres concentraciones de glucosa en el cultivo de P
cubensis en medio sumergido (Fang-Zhong) correspondientes a 30 gL 50 gL y
70 gL siendo en este caso la glucosa la principal fuente de carbono del P
cubensis
A continuacioacuten se muestran los valores de peso seco obtenidos para cada una de
las concentraciones de glucosa utilizadas durante los 14 diacuteas de la fermentacioacuten
46
0
01
02
03
04
05
06
07
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Bio
ma
sa (g
L)
Tiempo (diacuteas)30gL 50gL 70gL
Graacutefico 1 Cineacutetica de crecimiento micelial de P cubensis en medio sumergido (Fang-Zhong) utilizando tres diferentes concentraciones de
glucosa como fuente de carbono (Peso seco)
Del graacutefico 1 se puede observar que no hubo evidencia de fase de latencia para
ninguno de los ensayos posteriormente se aprecia que el crecimiento de biomasa
aumentoacute con el tiempo para las diferentes concentraciones de glucosa empleadas
Analizando las fermentaciones que conteniacutean 50 gL y 70 gL de glucosa se
puede afirmar que ambas presentan un comportamiento similar mostrando una
fase exponencial hasta el diacutea 11 y una fase estacionaria hasta el diacutea 14 de la
fermentacioacuten mientras que la fermentacioacuten que conteniacutea 30 gL de glucosa no
presentoacute fase estacionaria la fermentacioacuten durante los 14 diacuteas se encontraba en
fase exponencial a pesar de que entre los diacuteas 8 y 11 el crecimiento de P
cubensis se mantuvo constante
Asimismo se puede observar que el crecimiento maacutes bajo en cuanto a
concentracioacuten de biomasa se generoacute en la concentracioacuten de 30 gL siendo eacuteste
de 048 gL mientras que en las concentraciones de 50 gL y 70 gL de glucosa
los crecimientos maacuteximos fueron muy similares 055 gL y 062 gL
respectivamente
47
Lo dicho anteriormente se ratifica una vez analizados los resultados obtenidos
estadiacutesticamente donde se obtuvo un P-valor igual a cero indicando que existen
diferencias significativas en cuanto al crecimiento micelial de biomasa
(concentracioacuten de biomasa durante los 14 diacuteas de la fermentacioacuten) El graacutefico 2
ilustra la presencia de dos grupos homogeacuteneos lo que indica que las
concentraciones de 50 gL y 70 gL no tienen diferencias significativas del
crecimiento micelial entre cada una de ellas mientras que la concentracioacuten de 30
gL siacute presenta dichas diferencias significativas con respecto a las dos
concentraciones anteriores (Anexo 1)
Con todo eacutesto se expone que la concentracioacuten de glucosa de 50 gL es la que se
eligioacute debido a que es maacutes econoacutemico utilizar 50 gL de glucosa que 70 gL
Tratamientos con diferentes concentraciones de glucosa
Media 30 gL glucosa (a) 022
Media 50 gL glucosa (b) 032
Media 70 gL glucosa (b) 034
a
bb
0
005
01
015
02
025
03
035
04
045
Co
nce
ntr
acioacute
n b
iom
asa
(gL
)
Letras diferentes denotan diferencias significativas (prueba LSD)
Graacutefico 2 Crecimiento micelial de P cubensis en cultivo sumergido bajo tres concentraciones de glucosa
48
Modelo logiacutestico para las fermentaciones donde se utilizoacute glucosa
como fuente de carbono
Una vez realizada la cineacutetica de crecimiento del P cubensis en medio sumergido
(Fang-Zhong) usando diferentes concentraciones de glucosa se procedioacute a
ajustar los datos obtenidos al modelo logiacutestico Los crecimientos maacuteximos de
biomasa obtenidos mediante el meacutetodo de peso seco para cada uno de los
ensayos fueron 048 gL 065 gL y 062 gL para concentraciones de 30 gL 50
gL y 70 gL de glucosa respectivamente La tabla 2 muestra los paraacutemetros
cineacuteticos obtenidos mediante el modelo para cada una de las concentraciones
Tabla 2 Paraacutemetros cineacuteticos obtenidos mediante el modelo logiacutestico para las diferentes fermentaciones de P cubensis utilizando glucosa como fuente
de carbono
30gL 50gL 70gL
microx (diacutea-sup1) 016 microx (diacutea-sup1) 017 microx (diacutea-sup1) 015
micromax (diacutea-sup1) 027 micromax (diacutea-sup1) 035 micromax (diacutea-sup1) 034
X0 (gL) 005 X0 (gL) 008 X0 (gL) 008
R2 096 R2
092 R2 085
De la tabla 2 se puede observar que la concentracioacuten inicial de biomasa (Xo)
estuvo muy cercana para cada una de las concentraciones de glucosa utilizadas
Para 30 gL de glucosa la velocidad maacutexima de crecimiento (micromax) fue mucho
menor que la obtenida para 50 gL y 70 gL eacutesto pudo ser debido a que fue el
medio que menor cantidad de glucosa conteniacutea mientras que para las otras dos
concentraciones de glucosa la velocidad maacutexima de crecimiento fue similar
Al comparar las velocidades maacuteximas de las tres concentraciones de glucosa
utilizadas se evidencia que la fermentacioacuten que conteniacutea 50 gL presentoacute una
micromaacutex mayor correspondiente a 035 diacutea-1 esto sugiere que a mayores
concentracioacuten de glucosa (70 gL) puede ocurrir una inhibicioacuten por sustrato otro
49
criterio que afirma que dicha concentracioacuten fue la que mejores resultados arrojoacute de
las tres concentraciones de glucosa utilizadas para el crecimiento del P cubensis
en el medio de Fang-Zhong Ademaacutes se observa que este experimento fue el que
mayor velocidad especiacutefica de crecimiento presento siendo esta de 017 diacutea-1
Finalmente se calcularon los valores de biomasa teoacutericos utilizando la ecuacioacuten
descrita anteriormente en la metodologiacutea con el propoacutesito de observar que tanto
se ajustaron los valores de biomasa hallados experimentalmente con los valores
de biomasa teoacutericos arrojados por el modelo logiacutestico El graacutefico 3 muestra los
valores de biomasa (X) tanto teoacutericos como experimentales con respecto al
tiempo
0
01
02
03
04
05
06
07
0 2 4 6 8 10 12 14
Biom
asa
(gL
)
Tiempo (diacutea)
X exp (30 gL) X exp (50 gL) X exp (70 gL)
X teoacuterico (30 gL) X teoacuterico (50 gL) X teoacuterico (70 gL)
Graacutefico 3 Valores de concentracioacuten de biomasa experimental y teoacuterico
graficados con respecto al tiempo para las fermentaciones con diferentes concentraciones de glucosa
Al observar el graacutefico 3 se puede notar que para los ensayos de 50 gL y 70 gL
de glucosa los valores de biomasa teoacutericos se encuentran un poco desfasados de
los valores de biomasa hallados de manera experimental mientras que para el
ensayo que conteniacutea 30 gL de glucosa se observa un buen ajuste de los datos
50
obtenidos experimentalmente al modelo logiacutestico La tabla 2 reitera lo dicho
anteriormente al exponer los valores de R2 los cuales explican la relacioacuten que
tienen los datos teoacutericos con los experimentales
312 Crecimiento micelial del P cubensis en medio sumergido utilizando
diferentes concentraciones de sacarosa
Una vez evaluado el crecimiento de biomasa usando glucosa como fuente de
carbono se procedioacute a evaluar el efecto que teniacutea el cambio de la fuente de
carbono por sacarosa en el crecimiento micelial del P cubensis en medio
sumergido
El graacutefico 4 muestra de manera ilustrativa como fue el crecimiento micelial del P
cubensis para cada una de las concentraciones de sacarosa utilizadas durante los
14 diacuteas mediante el meacutetodo de peso seco
0
01
02
03
04
05
06
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Biom
asa (
gL)
Tiempo (diacuteas)
30 gL 50 gL 70 gL
Graacutefico 4 Cineacutetica de crecimiento micelial de P cubensis en medio sumergido (Fang-Zhong) utilizando diferentes concentraciones de sacarosa
como fuente de carbono (Peso seco)
51
En el graacutefico 4 se puede observar que tanto para una concentracioacuten de 30 gL
como para 70 gL de sacarosa el hongo llega a su fase estacionaria cerca del
quinto diacutea de la fermentacioacuten mientras que para una concentracioacuten de 50 gL se
observa un comportamiento diferente puesto que el microorganismo tiene un
crecimiento exponencial hasta el diacutea 5 en donde entra a una etapa de transicioacuten o
estacionaria durante 3 diacuteas aproximadamente luego de la cual inicia nuevamente
su crecimiento de forma exponencial hasta llegar al diacutea 11 en donde siacute empieza
su fase estacionaria
Al igual que en las tres fermentaciones que conteniacutean glucosa en estas
fermentaciones de sacarosa se observa mediante el graacutefico anterior que no hubo
presencia de fase de latencia
El crecimiento maacuteximo de biomasa en cuanto a concentracioacuten lo presentoacute aquella
fermentacioacuten que conteniacutea 70 gL de sacarosa el cual fue de 057 gL seguida de
la de 50 gL con un crecimiento maacuteximo de biomasa de 045 gL y posteriormente
la concentracioacuten de 30 gL obtuvo un crecimiento maacuteximo de 026 gL
De acuerdo al anaacutelisis estadiacutestico que se realizoacute para cada una de las
fermentaciones se dedujo que las diferencias en cuanto al crecimiento micelial de
biomasa con respecto a la concentracioacuten de la misma son significativas entre
cada una de las fermentaciones es decir fue diferente la concentracioacuten de
biomasa obtenida cuando se trabajoacute con cada una de distintas concentraciones de
sacarosa Lo dicho anteriormente se muestra a traveacutes del graacutefico 5 (Anexo 2)
52
Tratamientos con diferentes concentraciones de sacarosa
Media 30 gL sacarosa (a) 02
Media 50 gL sacarosa (b) 032
Media 70 gL sacarosa (c) 043
a
b
c
0
02
04
Co
nce
ntr
acioacute
n b
iom
asa
(gL
)
Letras diferentes denotan diferencias significativas (prueba LSD)
Graacutefico 5 Crecimiento micelial para tres diferentes concentraciones de sacarosa
Modelo logiacutestico para las fermentaciones donde se utilizoacute sacarosa
como fuente de carbono
Una vez realizadas las cineacuteticas de crecimiento del P cubensis para cada
concentracioacuten de sacarosa empleada se procedioacute a ajustar los datos obtenidos al
modelo logiacutestico cabe recalcar que es necesario establecer los crecimientos
maacuteximos de biomasa obtenidos para cada uno de los ensayos los cuales fueron
026 gL 045 gL y 057 gL para concentraciones de 30 gL 50 gL y 70 gL de
sacarosa respectivamente
Una vez aplicado el modelo logiacutestico para cada tratamiento se obtuvieron valores
de velocidad maacutexima de crecimiento y biomasa inicial para cada concentracioacuten de
sacarosa utilizada en el medio los cuales se muestran en la tabla 3
53
Tabla 3 Paraacutemetros cineacuteticos obtenidos mediante el modelo logiacutestico para las diferentes fermentaciones de P cubensis utilizando sacarosa como
fuente de carbono
30gL 50gL 70gL
microx (diacutea-sup1) 030 microx (diacutea-sup1) 014 microx (diacutea-sup1) 041
micromax (diacutea-sup1) 037 micromax (diacutea-sup1) 042 micromax (diacutea-sup1) 067
X0 (gL) 01 X0(gL) 01 X0 (gL) 011
R2 061 R2 089 R2 095
De la tabla 3 se ratifica que se utilizoacute una concentracioacuten inicial de biomasa igual
para cada una de las fermentaciones aproximadamente 01 gL ademaacutes se
observa un aumento en la velocidad maacutexima de crecimiento con respecto a la
cantidad de sacarosa empleada es decir que el hecho de haber aumentado la
concentracioacuten de sacarosa en el medio favorecioacute el aumento en la velocidad
maacutexima de crecimiento del P cubensis siendo eacutesta mayor cuando se trabajoacute a una
concentracioacuten de 70 gL de sacarosa De igual manera se aprecia que el
tratamiento que conteniacutea 70 gL de sacarosa presentoacute una velocidad especiacutefica de
crecimiento mayor que los demaacutes siendo eacutesta de 041 diacutea-1
Finalmente se calcularon los valores de biomasa teoacutericos el graacutefico 6 ilustra los
valores de biomasa (X) tanto teoacutericos como experimentales graficados con
respecto al tiempo
54
0
01
02
03
04
05
06
0 2 4 6 8 10 12 14
Bio
mas
a (g
L)
Tiempo (Diacutea)
X exp (30 gL) X exp (50 gL) X exp (70 gL)
X teoacuterico (30 gL) X teoacuterico (50 gL) X teoacuterico (70 gL)
Graacutefico 6 Valores de concentracioacuten de biomasa experimental y teoacuterico graficados con respecto al tiempo para las fermentaciones con diferentes
concentraciones de sacarosa
Del graacutefico 6 se puede observar como los valores de biomasa experimentales se
ajustaron a los valores de biomasa teoacutericos arrojados por el modelo logiacutestico lo
que quiere decir la cineacutetica de crecimiento del P cubensis en medio sumergido
cuando se utilizoacute 70 gL se ajustoacute correctamente al modelo logiacutestico lo que se
corrobora en la tabla 2 gracias al valor obtenido para el R2 que indica la relacioacuten
de los datos teoacutericos con respecto a los experimentales Por otro lado para las
fermentaciones de 30 gL y 50 gL de sacarosa a pesar de parecer que
presentaron un buen ajuste al calcular la relacioacuten de los datos teoacutericos con
respecto a los experimentales (R2) se concluye que el ajuste no fue tan bueno
55
313 Comparacioacuten entre el crecimiento micelial de P cubensis en los
cultivos sumergidos utilizando glucosa y sacarosa como fuente de
carbono
Ahora bien es igualmente importante realizar un anaacutelisis comparativo entre ambas
fuentes de carbono empleadas con el fin de determinar si existen o no diferencias
significativas entre dichas fuentes de carbono
De acuerdo al anaacutelisis estadiacutestico se dice que existen diferencias significativas del
crecimiento micelial del P cubensis en cuanto al diacutea y la concentracioacuten de
sustrato empleado es decir concentracioacuten de glucosa y sacarosa (Anexo 3) pero
se observa claramente que no hay diferencias significativas de dicho crecimiento
con respecto al tipo de sustrato utilizado debido a que el P-valor arrojado por la
estadiacutestica fue de 01217 lo que sugiere que se debe utilizar la sacarosa gracias
a la disminucioacuten de costos que se generariacutean durante el proceso todo ello gracias
al costo de la sacarosa es inferior al de glucosa Sin embargo para elegir la fuente
de carbono que mejores resultados arrojoacute no soacutelo se basoacute en la cantidad de
biomasa producida sino que se procedioacute a examinar los barridos espectrales
arrojados por el anaacutelisis de HPLC con el fin de determinar la fuente de carbono
que mejor resolucioacuten mostroacute del alcaloide que en esta investigacioacuten fue glucosa a
una concentracioacuten de 50 gL
De igual manera el graacutefico 7 muestra las medias obtenidas mediante el anaacutelisis
estadiacutestico para las fermentaciones trabajadas con glucosa y sacarosa Aun asiacute
es necesario hacer hincapieacute que eacuteste no es el criterio principal para la obtencioacuten
del medio que mejores resultados arrojoacute durante la investigacioacuten por lo tanto se
deben seguir realizando los diferentes anaacutelisis descritos anteriormente en este
trabajo
56
Tratamientos de las dos fuentes de carbono usadas sin FA (glucosa y
sacarosa)
Media para glucosa (a) 029
Media para sacarosa (a) 032
aa
0
01
02
03
Conc
entr
acioacute
n bi
omas
a (g
L)
Letras diferentes denotan diferencias significativas (Prueba LSD)
Graacutefico 7 Crecimiento micelial para dos diferentes fuentes de carbono (glucosa y sacarosa)
314 Crecimiento micelial del P cubensis en cultivo sumergido utilizando
glucosa y fenilalanina en el medio
Se decidioacute realizar un uacuteltimo ensayo acerca del efecto que teniacutea la adicioacuten de un
aminoaacutecido llamado Fenilalanina (FA) al medio Fang-Zhong sobre la produccioacuten
del alcaloide y por ende sobre la generacioacuten de biomasa
Debido a los anaacutelisis realizados anteriormente se concluyoacute que la mejor fuente de
carbono fue la glucosa a una concentracioacuten de 50 gL De la misma manera que
en los numerales anteriores se evaluoacute la cineacutetica del crecimiento micelial del P
cubensis mediante los meacutetodos de peso huacutemedo y peso seco Las mediciones
fueron realizadas por duplicado y promediadas para la fuente de carbono elegida
(glucosa 50 gL) y las diferentes concentraciones de FA en el medio
correspondientes a 05 gL 1 gL 15 gL con el fin de encontrar el medio que
mejores resultados arrojoacute en cuanto a crecimiento micelial y generacioacuten del
57
alcaloide de intereacutes Los datos obtenidos mediante el meacutetodo de peso seco se
muestran en el graacutefico 8
Cabe resaltar que junto con las tres fermentaciones de 05 gL 10 gL y 15 gL
de FA se montaron a su vez seis muestras correspondientes a los diacuteas 12 13 y
14 de la fermentacioacuten que conteniacutea 0 gL de FA eacutesto con el propoacutesito de analizar
los datos de manera estadiacutestica y poder hacer comparaciones con respecto a la
generacioacuten de biomasa y a la produccioacuten del alcaloide de intereacutes ambas medidas
con respecto a la concentracioacuten
0
01
02
03
04
05
06
07
08
09
1
11
12
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Biom
asa
(gL
)
Tiempo (diacuteas)
05 gL 1 gL 15 gL
Graacutefico 8 Cineacutetica de crecimiento micelial de P cubensis en medio sumergido (Fang-Zhong) utilizando diferentes concentraciones de FA y 50
gL de glucosa como fuente de carbono (Peso seco)
Al analizar el graacutefico 8 es decir el crecimiento micelial (concentracioacuten de
biomasa) seguacuten la concentracioacuten de FA en el tiempo se puede notar que no hubo
presencia de fase de latencia para ninguna de las concentraciones de FA
utilizadas ademaacutes el crecimiento de biomasa en cada caso se aprecia de manera
58
muy similar llegando los tres ensayos a la fase estacionaria el diacutea 12 de la
fermentacioacuten
Observando el graacutefico 8 se puede identificar que el mayor contenido de biomasa
fue de 108 gL obtenida el diacutea 13 para una concentracioacuten 10 gL de FA para
concentraciones de 05 gL y 15 gL de FA la concentracioacuten maacutexima de biomasa
fue 106 gL y 101 gL respectivamente Auacuten asiacute al considerar los resultados
obtenidos se puede ratificar que es indiferente la cantidad de FA necesaria para
obtener concentracioacuten de biomasa por ende se decide que el medio que mejores
resultados arrojoacute fue el que conteniacutea 05 gL FA debido a que fue la
concentracioacuten de FA que mejor resolucioacuten del alcaloide presentoacute paraacutemetro
observado mediante los cromatogramas obtenidos del anaacutelisis de HPLC (Anexos
19 20 y 21) y ademaacutes porque con dicha cantidad los costos de la materia prima
seriacutean menores Cabe resaltar que el uso de FA generoacute un aumento significativo
duplicando la produccioacuten de biomasa por lo tanto se testifica que siacute hubo
duplicacioacuten en cuanto a la concentracioacuten de biomasa en los medios que conteniacutea
FA con respecto a los medios que no conteniacutean FA se dice entonces que a su
vez se podriacutea haber generado mayor cantidad de Psilocibina en los medios que
teniacutean FA ya que dicho alcaloide se produce de manera intracelular por tal
razoacuten al aumentar la cantidad de biomasa en el medio se aumenta la cantidad de
dicho alcaloide
De igual manera se analizaron los datos estadiacutesticamente y se llegoacute a apreciar
que no existen diferencias significativas en cuanto a la produccioacuten de biomasa y la
cantidad de FA utilizada en el medio Del mismo modo al analizar la tabla de
contrastes muacuteltiple de rangos se reitera que siacute existen diferencias significativas
entre el crecimiento micelial de biomasa (concentracioacuten de biomasa) en el tiempo
cuando se trabajoacute con FA o sin eacuteste Eacutesto se puede observar en el graacutefico 9
(Anexo 4)
59
Tratamientos con y sin FA
Media 0 gL FA (a) 032
Media 05 gL FA (b) 065
Media 10 gL FA (b) 066
Media 15 gL FA (b) 069
a
b b b
0
01
02
03
04
05
06
07
08
09
Conc
entr
acioacute
n bi
omas
a (g
L)
Letras diferentes denotan diferencias significativas (Prueba LSD)
Graacutefico 9 Crecimiento micelial para glucosa a una concentracioacuten de 50 gL y tres diferentes concentraciones de FA
Modelo logiacutestico para las fermentaciones donde se utilizoacute 50 gL de
glucosa como fuente de carbono y diferentes concentraciones de FA
En primer lugar se fijaron los valores de crecimiento maacuteximo de biomasa para
cada una de las concentraciones obtenidos mediante el meacutetodo de peso seco con
el fin de hallar los paraacutemetros cineacuteticos mediante el modelo logiacutestico Los
crecimientos maacuteximos de biomasa obtenidos fueron los siguientes 106 gL 108
gL y 101 gL para concentraciones de 05 gL 10 gL y 15 gL de FA
respectivamente y 50 gL de glucosa
Una vez realizado el modelo logiacutestico para cada tratamiento se obtuvieron los
valores de velocidad maacutexima de crecimiento y concentracioacuten de biomasa inicial
para cada ensayo los cuales se muestran en la tabla 4
60
Tabla 4 Paraacutemetros cineacuteticos obtenidos mediante el modelo logiacutestico para las diferentes fermentaciones de P cubensis utilizando 50 gL de glucosa
como fuente de carbono y diferentes concentraciones de FA
05gL 10gL 15gL
microx (diacutea-sup1) 018 microx (diacutea-sup1) 012 microx (diacutea-sup1) 012
micromax (diacutea-sup1) 045 micromax (diacutea-sup1) 035 micromax (diacutea-sup1) 044
X0 (gL) 01 X0 (gL) 017 X0 (gL) 016
R2 095 R2 082 R2 088
Seguacuten los valores arrojados por el modelo logiacutestico que se encuentran
presentados en la tabla 4 se puede decir que se presentoacute una valor de biomasa
inicial similar para los tratamientos de 1 gL y 15 gL de FA mientras que para las
fermentaciones que conteniacutean 05 gL de FA se tiene una diferencia de un 50
aproximadamente Ademaacutes se puede observar que a la concentracioacuten de 05 gL
de FA es la que mayor velocidad maacutexima de crecimiento presenta siendo esta
045 diacuteamacrsup1 a su vez dicha concentracioacuten presentaacute la microx mayor correspondiente a
018 diacutea-1 Debido a eacutesto y al criterio de mejor resolucioacuten del alcaloide observado
en los anaacutelisis de HPLC (Anexos 19 20 y 21) se concluye que el medio que
mejores resultados arrojoacute durante la investigacioacuten para la generacioacuten de biomasa
y la produccioacuten de la Psilocibina es 05 gL de FA y 50 gL de glucosa
Finalmente se calcularon los valores de biomasa teoacutericos el graacutefico 10 muestra
los valores de biomasa (X) tanto teoacutericos como experimentales graficados con
respecto al tiempo
61
0
02
04
06
08
1
12
0 2 4 6 8 10 12 14 16
Bio
mas
a (g
L)
Tiempo (Diacutea)
X exp (05 gL) X exp (10 gL) X exp (15 gL)
X teoacuterico (05 gL) X teoacuterico (10 gL) X teoacuterico (15 gL)
Graacutefico 10 Valores de concentracioacuten de biomasa experimental y teoacuterico graficados con respecto al tiempo para las fermentaciones con diferentes
concentraciones de FA y 50 gL de glucosa
Se puede decir gracias al graacutefico 10 que los valores de biomasa experimentales
se ajustaron a los valores de biomasa teoacutericos hallados mediante el modelo
logiacutestico es decir la cineacutetica de crecimiento del P cubensis en medio sumergido
cuando se usaron diferentes concentraciones de FA en el medio se ajustoacute
correctamente al modelo logiacutestico esto se reitera con los valores de R2 mostrados
anteriormente en la tabla 4
32 ESTUDIO DE LA CINEacuteTICA DE CONSUMO DE SUSTRATO POR PARTE
DEL P cubensis CULTIVADO EN MEDIO SUMERGIDO (FANG-ZHONG)
La evaluacioacuten del consumo de sustrato durante la fermentacioacuten con respecto al
tiempo es de suma importancia puesto que eacuteste es el principal componente
limitante del crecimiento presente en el medio de cultivo
62
A continuacioacuten se analizaraacuten dichos consumos para los diferentes ensayos
321 Consumo de sustrato por parte del P cubensis en medio sumergido
utilizando diferentes concentraciones de glucosa
Una vez halladas las concentraciones de sustrato para cada una de las
fermentaciones que conteniacutean glucosa en el medio se procedioacute a graficar dichos
valores con respecto al tiempo
El graacutefico 11 ilustra los datos obtenidos sobre el consumo de sustrato de las tres
fermentaciones que conteniacutean glucosa y a su vez como se comportoacute el
crecimiento de biomasa para cada ensayo durante los 14 diacuteas de fermentacioacuten
0
01
02
03
04
05
06
07
0
10
20
30
40
50
60
70
80
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14B
iom
asa
(gL
)
Glu
cosa
(gL
)
Tiempo (diacuteas)
30 GL 50GL 70 GL 30gL 50gL 70gL
Graacutefico 11 Cineacutetica de consumo de sustrato por parte del P cubensis en medio sumergido utilizando diferentes concentraciones de glucosa como
fuente de carbono
Al observar el graacutefico 11 se expone que el P cubensis consumioacute mayor cantidad
de glucosa cuando esta estaba a una concentracioacuten de 70 gL correspondiendo a
63
un porcentaje de 62 mientras que para 50 gL y 30 gL fue de 23 y 30
respectivamente
Comparando el consumo de glucosa en sus diferentes concentraciones con el
crecimiento micelial del hongo se puede observar que a una concentracioacuten de
glucosa de 30 gL no soacutelo se tuvo un menor consumo de sustrato sino que
tambieacuten se generoacute un menor crecimiento de biomasa Mientras que a
concentraciones de 50 gL y 70 gL de glucosa a pesar de presentar diferencias
en cuanto al porcentaje de sustrato consumido el crecimiento micelial es similar
(no presenta diferencias significativas) lo que indica que el hongo no requiere
tanta concentracioacuten de glucosa para su crecimiento eacutesto se puede afirmar soacutelo
para este ensayo a estas condiciones
De igual manera en el graacutefico 11 al analizar la tendencia del consumo de
sustrato las concentraciones de glucosa de 50 gL y 70 gL presentan una
disminucioacuten notoria hasta el diacutea 11 para dicho consumo Esto se debe a que en
ese diacutea inicioacute la fase estacionaria del hongo en ambas fermentaciones en donde
el P cubensis requeriacutea alimento uacutenicamente para mantenerse y producir
metabolitos secundarios Mientras que para la concentracioacuten de glucosa de 30 gL
el consumo de glucosa fue muy poco a partir del quinto diacutea de la fermentacioacuten
esto se atribuye a que la cineacutetica de crecimiento micelial del P cubensis presentoacute
una fase estacionaria temprana entre los diacuteas 8 y 11 indicando que no necesitaba
consumir casi glucosa puesto que no estaba creciendo
322 Consumo de sustrato por parte del P cubensis en medio sumergido
utilizando diferentes concentraciones de sacarosa
Los datos obtenidos sobre el consumo de sacarosa para cada una de las
concentraciones utilizadas (30 gL 50 gL y 70 gL de sacarosa) durante los 14
diacuteas de la fermentacioacuten se muestran en el graacutefico 12 a su vez se ilustran en dicho
64
graacutefico el comportamiento del crecimiento micelial para cada ensayo durante los
14 diacuteas de fermentacioacuten para efectos de anaacutelisis
0
01
02
03
04
05
06
0
10
20
30
40
50
60
70
80
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Bio
mas
a (g
L)
Sac
aro
sa (g
L)
Tiempo (diacuteas)
30gL 50gL 70gL 30 gL 50 gL 70 gL
Graacutefico 12 Cineacutetica de consumo de sustrato por parte del P cubensis en medio sumergido utilizando diferentes concentraciones de sacarosa como
fuente de carbono
Al observar el graacutefico 12 se puede decir que el P cubensis consumioacute mayor
cantidad de sacarosa cuando eacutesta estaba a una concentracioacuten de 70 gL en el
medio presentando un porcentaje de consumo del 49 mientras que para las
concentraciones de 50 gL y 30 gL de sacarosa se tuvo un porcentaje de
consumo de 24 y 37 Esto igual que en el consumo de glucosa se puede
deber a que al tener mayor concentracioacuten de sustrato en el medio el P cubensis
genera mayor afinidad por el mismo haciendo que dicho hongo se consuma
grandes cantidades de sacarosa durante el tiempo
Igualmente se observa que aproximadamente en el noveno diacutea de la
fermentacioacuten las tres diferentes concentraciones de glucosa (30 gL 50 gL y 70
65
gL) se mantienen casi constantes en el tiempo ello gracias a que en este diacutea el
hongo se encontraba en fase estacionaria en los tres ensayos
323 Comparacioacuten entre el consumo de sustrato de P cubensis en los
cultivos sumergidos con diferentes fuentes de carbono
Con el fin de identificar cuaacutel de las dos fuentes de carbono fue consumida en
mayor proporcioacuten por parte del P cubensis se procedioacute a realizar un anaacutelisis
estadiacutestico donde comparamos las dos fuentes de carbono empleados con
respecto al consumo de sustrato obtenido (concentracioacuten de glucosa y sacarosa
en cada uno de los medios) donde se consiguioacute un P-valor de 00811 con
respecto al tipo de sustrato lo que indica que no existen diferencias en cuanto al
consumo de sustrato y el tipo del mismo es decir es indiferente cuaacutel de los dos
sustratos (glucosa o sacarosa) se utilice para que se del consumo del mismo por
parte del P cubensis Observacioacuten que se reitera en la tabla de contraste muacuteltiple
que muestra que se trabajoacute como un grupo homogeacuteneo Igualmente el graacutefico 13
muestra las medias de consumo de sustrato (concentracioacuten durante los 14 diacuteas)
obtenidas mediante el anaacutelisis estadiacutestico y reitera que no existen diferencias
significativas con respecto al tipo de sustrato utilizado para el cultivo del P
cubensis en medio sumergido (Anexo 5)
66
Tratamientos de las dos fuentes de carbono usadas sin FA (glucosa y sacarosa)
Media glucosa (a) 3431
Media sacarosa (a) 3678
a
a
32
34
36
38
Co
nce
ntr
acioacute
n s
ust
rato
(g
L)
Letras diferentes denotan diferencias significativas (Prueba LSD)
Graacutefico 13 Consumo de sustrato para cada una de las fuentes de carbono utilizadas
Aun asiacute al comparar los graacuteficos 11 y 12 se puede observar un mayor consumo
de glucosa que de sacarosa lo que lleva a concluir que es mejor emplear la
primera (glucosa)
324 Consumo de sustrato por parte del P cubensis en medio sumergido
utilizando glucosa y fenilalanina en el medio
Los datos obtenidos acerca del consumo de sustrato durante los 14 diacuteas de la
fermentacioacuten para cada uno de los medios que conteniacutean 50 gL de glucosa y
diferentes concentraciones de FA (05 gL 1 gL y 15 gL) se muestran en el
graacutefico 14 De igual manera se ilustran en dicho graacutefico las cineacuteticas de
crecimiento micelial para cada una de las fermentaciones que teniacutean 50 gL de
glucosa y diferentes concentraciones de FA con el fin de realizar los anaacutelisis
pertinentes
67
0
02
04
06
08
1
12
0
10
20
30
40
50
60
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Bio
mas
a (g
L)
Glu
cosa
50
gL
+ F
A (g
L)
Tiempo (diacuteas)
05gL 10gL 15gL 05 gL 1 gL 15 gL
Graacutefico 14 Cineacutetica de consumo de sustrato por parte del P cubensis en medio sumergido utilizando 50 gL de glucosa como fuente de carbono y
diferentes concentraciones de FA
Analizando el graacutefico 14 se puede decir que el consumo de glucosa durante el
tiempo fue igual para las fermentaciones que conteniacutea concentraciones de 1 gL y
15 gL de FA dichos consumos corresponde a valores de 23 mientras que
para el ensayo que teniacutea una concentracioacuten de 05 gL de FA el porcentaje de
consumo fue del 18 Asimismo se presentaron diferencias significativas en
cuanto al consumo de sustrato entre los diferentes ensayos
El graacutefico 15 expone las medias del consumo de sustrato (concentracioacuten) de cada
una de las muestras y las diferencias existentes entre ellas se evidencia que la
adicioacuten de FA disminuyoacute el consumo de glucosa ademaacutes que en los ensayos se
presentaron tres grupos homogeacuteneos diferentes En el primer grupo (a) que
contiene las fermentaciones del P cubensis con una concentracioacuten de 50 gL de
glucosa y en ausencia de FA se obtuvo una media de 356 gL la cual indica un
mayor consumo de sustrato Luego el segundo grupo (c) se compone de las
concentraciones de 1 gL y 15 gL de FA presentando una media de 413 gL y
de 426 gL respectivamente y el uacuteltimo grupo (b) corresponde a una
68
concentracioacuten de 05 gL de FA el cual presenta el menor consumo de glucosa al
exponer una media 466 gL
Seguacuten lo anterior y el graacutefico 15 se dice que siacute existieron diferencias significativas
en cuanto al consumo de sustrato (concentracioacuten durante los 14 diacuteas) en los
uacuteltimos tres diacuteas cuando se trabajo con FA y sin FA y a su vez se encontraron
diferencias significativas de la concentracioacuten de sustrato en el medio cuando se
teniacutea una concentracioacuten de FA correspondiente a 05 gL con relacioacuten a las otras
dos concentraciones de FA (10 gL y 15 gL) mientras que entre estas dos
uacuteltimas concentraciones de FA (10 gL y 15 gL) no se encontraron diferencias
significativas (Anexo 6)
Tratamientos con y sin FA
Media 0 gL FA (a) 3564
Media 05 gL FA (b) 466
Media 10 gL FA (c) 4131
Media 15 gL FA (c) 426
a
b c c
0
10
20
30
40
50
60
Conc
entr
acioacute
n su
stra
to (g
L)
Letras diferentes denotan diferencias significativas (prueba LSD)
Graacutefico 15 Consumo de sustrato para cada una de las concentraciones de FA utilizadas
69
33 ESTUDIO DE LA CINEacuteTICA DE CONSUMO DE PROTEIacuteNA POR PARTE
DEL P cubensis CULTIVADO EN MEDIO SUMERGIDO (FANG-ZHONG)
Las fuentes de proteiacutena que posee el medio de Fang-Zhong son extracto de
levadura y peptona que representan una cantidad de 10 gL para cada ensayo
eacutesta cantidad se mantuvo constante para cada fermentacioacuten
Se evaluoacute el consumo de proteiacutena por parte del P cubensis durante los 14 diacuteas
de la fermentacioacuten para cada uno de los ensayos
A continuacioacuten se analizan los resultados obtenidos para cada uno de los
tratamientos
331 Consumo de proteiacutena por P cubensis en medio sumergido utilizando
diferentes concentraciones de glucosa
Una vez se calcularon las concentraciones de proteiacutena en el medio para cada
ensayo se graficaron dichos valores con respecto al tiempo
El graacutefico 16 muestra como se comportoacute el consumo de proteiacutena con respecto al
tiempo para cada una de las tres concentraciones de glucosa utilizadas y a su vez
como se comportoacute el crecimiento de biomasa para cada ensayo durante los 14
diacuteas de fermentacioacuten
70
0
01
02
03
04
05
06
07
0
5
10
15
20
25
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Bio
mas
a (g
L)
Pro
tein
a (g
L)
Tiempo (diacuteas)
30 GL 50 GL 70 GL 30 gL Biomasa 50 gL Biomasa 70 gL Biomasa
Graacutefico 16 Cineacutetica de consumo de proteiacutena por parte del P cubensis en medio sumergido utilizando diferentes concentraciones de glucosa como
fuente de carbono
Analizando el graacutefico 16 se puede observar que el consumo de proteiacutena se dio
casi en su totalidad El ensayo que mayor consumo de proteiacutena presentoacute fue el
que conteniacutea 30 gL de glucosa arrojando un porcentaje de consumo del 98
mientras que las fermentaciones realizadas a concentraciones de 50 gL y 70 gL
de glucosa presentaron un porcentaje de consumo de proteiacutena del 91 y 90
respectivamente
Al enfocarnos en la relacioacuten existente entre el consumo de proteiacutena y el
crecimiento micelial del P cubensis se puede notar gracias al graacutefico 16 que la
relacioacuten es directamente proporcional debido a que el consumo de proteiacutena fue
permanente mientras el hongo se encontraba en fase exponencial es decir el P
cubensis necesitaba de la proteiacutena para aumentar su crecimiento mientras que en
el momento en que el microorganismo comenzoacute su fase estacionaria la
concentracioacuten de proteiacutena en el medio se mantuvo constante esto uacuteltimo soacutelo es
vaacutelido para concentraciones de 50 gL y 70 gL de glucosa puesto que ambas
llegaron a la fase estacionaria
71
332 Consumo de proteiacutena por P cubensis en medio sumergido utilizando
diferentes concentraciones de sacarosa
Una vez obtenidos los valores de consumo de proteiacutena para cada concentracioacuten
de sacarosa utilizada se precedioacute a graficarlos con respecto al tiempo dichos
datos se encuentran en el graacutefico 17 De igual manera en este graacutefico se
representa la cineacutetica de crecimiento de biomasa para el P cubensis de acuerdo a
las distintas concentraciones de sacarosa utilizadas
0
01
02
03
04
05
06
0
2
4
6
8
10
12
14
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Bio
mas
a (g
L)
Prot
eiacutena
(gL
)
Tiempo (diacuteas)
30 GL 50 GL 70 GL 30 gL 50 gL 70 gL
Graacutefico 17 Cineacutetica de consumo de proteiacutena por parte del P cubensis en medio sumergido utilizando diferentes concentraciones de sacarosa como
fuente de carbono
El graacutefico 17 ilustra el consumo casi en su totalidad de la proteiacutena para cada uno
de los tratamientos El ensayo que mayor consumo de proteiacutena presentoacute fue el
que conteniacutea 30 gL de sacarosa exponiendo un porcentaje de consumo del 89
mientras que las concentraciones de 50 gL y 70 gL de sacarosa arrojaron
porcentajes de consumo del 86 y 57 respectivamente
Ahora bien al analizar el crecimiento del P cubensis con respecto al consumo de
proteiacutena se evidencia claramente que el consumo disminuyoacute permanentemente
72
en el tiempo mientras el hongo se encontraban en estado exponencial indicando
el intereacutes del P cubensis por la proteiacutena siendo eacutesta utilizada por el mismo para
aumentar su tamantildeo y biomasa
Durante los diacuteas 4 y 10 las fermentaciones que conteniacutean concentraciones de 30
gL y 70 gL de sacarosa presentaron un alto consumo de proteiacutena a pesar de
que el P cubensis se encontraba en estos dos ensayos en fase estacionaria fase
en la cual no se requiere consumir grandes cantidades de sustrato puesto que el
hongo soacutelo necesitaba alimentarse para mantenerse o para producir productos no
ligados al crecimiento maacutes no para cambiar la cantidad de biomasa presente en el
medio Asimismo la concentracioacuten de 50 gL de sacarosa tambieacuten presentoacute un
alto consumo de proteiacutena durante los diacuteas 4 y 8 en donde se creiacutea estar en una
fase estacionaria temprana lo dicho anteriormente reitera una vez maacutes la afinidad
que el P cubensis presentoacute con respecto a las fuentes de proteiacutena usadas
333 Comparacioacuten entre el consumo de proteiacutena de P cubensis en los
cultivos sumergidos con diferentes fuentes de carbono
Con el fin de conocer cuaacutel de los dos tipos de sustrato empleado fue mayormente
consumido se realizoacute un anaacutelisis estadiacutestico
En el graacutefico 18 se ilustran las medias de consumo de proteiacutena (concentracioacuten)
arrojadas mediante el anaacutelisis estadiacutestico sobre el consumo de proteiacutena cuando se
utilizoacute glucosa o sacarosa en el medio y se evidencia que existen diferencias
significativas en cuanto a la concentracioacuten de proteiacutena en el tiempo en el medio
cuando se realizoacute el experimento con glucosa y cuando se utilizoacute sacarosa
arrojando asiacute dos grupos homogeacuteneos el primero (a) presenta una media de 465
gL mientras que el grupo dos (b) arroja un valor de media de 609 gL indicando
un menor consumo de proteiacutena por parte del P cubensis en el medio sumergido
73
de Fang-Zhong cuando se utilizoacute sacarosa como principal fuente de carbono
(Anexo 7)
Tratamientos de las dos fuentes de carbono usadas sin FA (glucosa y sacarosa)
Media glucosa (a) 465
Media sacarosa (b) 609
a
b
0
1
2
3
4
5
6
7
8
Conc
entr
acioacute
n pr
oteiacute
na (g
L)
Letras diferentes denotan diferencias significativas (prueba LSD)
Graacutefico 18 Consumo de proteiacutena para cada una de las fuentes de carbono utilizadas
334 Consumo de proteiacutena por P cubensis en medio sumergido utilizando
glucosa y FA en el medio
Una vez se obtuvo la concentracioacuten de proteiacutena en el medio para cada
concentracioacuten de FA utilizada se precedioacute a graficar dichos valores con respecto
al tiempo los cuales se ilustran en el graacutefico 19 ademaacutes se muestran en dicho
graacutefico las cineacuteticas de crecimiento de biomasa para cada ensayo
74
0
02
04
06
08
1
12
0
2
4
6
8
10
12
14
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Bio
mas
a (g
L)
Pro
teiacuten
a (g
L)
Tiempo (diacuteas)
05 gL 1 gL 15 gL 05 gL 1 gL 15 gL
Graacutefico 19 Cineacutetica de consumo de proteiacutena por parte del P cubensis en medio sumergido utilizando 50 gL de glucosa como fuente de carbono y
diferentes concentraciones de FA
De igual forma que para la fermentacioacuten que teniacutea 50 gL de glucosa en el medio
realizada anteriormente para dichos ensayos el consumo de proteiacutena fue
permanente y se dio casi en su totalidad El ensayo que mayor consumo de
proteiacutena presentoacute fue el que conteniacutea 05 gL de FA arrojando un porcentaje de
consumo del 86 aun asiacute el porcentaje de consumo arrojado por la fermentacioacuten
de 1 gL de FA fue del 84 indicando que no existen diferencias con respecto al
consumo de proteiacutena entre dichas cantidades de FA utilizadas Mientras que el
porcentaje de consumo para 15 gL de FA fue inferior presentando un valor del
72 De acuerdo a los resultados mencionados anteriormente se puede decir que
a mayor concentracioacuten de FA en el medio se presenta menor consumo de
proteiacutena por parte del P cubensis esto se puede afirmar uacutenicamente para los
resultados obtenidos durante esta investigacioacuten a ciertas condiciones
Analizando ahora la relacioacuten entre el consumo de proteiacutena y el crecimiento
micelial se puede ver que al igual que para los ensayos con glucosa a 50 gL se
75
tiene un consumo permanente mientras se estaacute en fase exponencial y una vez se
llega a la fase estacionario alrededor del diacutea 12 la concentracioacuten de proteiacutena en
el medio se estabilizoacute
A la hora de indagar los datos estadiacutesticamente se puede observar que no existen
diferencias significativas sobre el consumo de proteiacutena (concentracioacuten) en el
tiempo con respecto al tipo de sustrato pero al comparar los resultados con los
ensayos donde se antildeadioacute FA al medio se encontroacute que siacute existen diferencias
significativas Se crearon dos grupos homogeacuteneos el primero cuenta con glucosa
y sacarosa presentando medias (cantidad de proteiacutena en el medio) de 468 gL y
473 gL respectivamente mientras que el ensayo con FA se encuentra en otro
grupo en donde su consumo de proteiacutena fue menor presentando una media
(cantidad de proteiacutena en el medio) de 614 gL (Anexo 8)
Tratamientos con y sin FA
Media glucosa (a) 468
Media sacarosa Proteiacutena (a) 473
Media fenilalanina (b) 614
a a
b
0
1
2
3
4
5
6
7
8
Co
nce
ntr
acioacute
n p
rote
iacutena
(gL
)
Letras diferentes denotan diferencias significativas (prueba LSD)
Graacutefico 20 Consumo de proteiacutena para los ensayos con y sin FA
76
34 ESTUDIO CUALITATIVO DE LA PRESENCIA DEL ALCALOIDE
Posterior a las fermentaciones de glucosa sacarosa y glucosa 50 gL con FA y
los respectivos anaacutelisis se realizoacute un uacuteltimo anaacutelisis que a la vez fue el de mayor
relevancia a la hora de determinar cuaacutel de los medios fue el que mejores
resultados arrojoacute En primera instancia se utilizoacute el reactivo de Dragendorff como
indicador de alcaloide para analizar las muestras de los diacuteas 12 13 y 14 con el fin
de esclarecer la presencia de alcaloides (Anexo 17)
Una vez detectada la presencia de alcaloides gracias a la coloracioacuten naranja
presentada en las muestras se procedioacute a realizar la teacutecnica de HPLC con el fin
de hallar un porcentaje del compuesto de intereacutes basado en las aacutereas obtenidas
de los cromatogramas (asumiendo un tiempo de retencioacuten entre 62 y 72
minutos)
341 Produccioacuten de compuestos producidos por P cubensis cuando el
medio no conteniacutea FA
A la hora de analizar y confirmar cuaacutel fue el mejor ensayo de los experimentos
realizados se tuvo como criterio base determinar la fuente de carbono y su
respectiva concentracioacuten que mejor presencia del compuesto de intereacutes arrojoacute
supuesto a un tiempo de retencioacuten entre 62 y 72 minutos
Inicialmente al obtener los anaacutelisis estadiacutesticos se deduce que no existieron
diferencias significativas entre el aacuterea del pico de intereacutes con respecto a todos los
picos arrojados por el cromatograma y los factores estudiados (tipo de sustrato
diacutea de fermentacioacuten y concentracioacuten) puesto que se obtuvieron valores de P-valor
77
de 03310 09580 y 08336 respectivamente es decir no importa queacute tipo de
sustrato se utilice la produccioacuten de alcaloide no tendraacute variaciones (Anexo 9)
Al analizar el graacutefico 21 se puede observar que las medias de las aacutereas halladas
para los diferentes ensayos con glucosa y sacarosa no presentaron diferencias
significativas es decir pertenecen al mismo grupo homogeacuteneo (a) lo que ratifica
lo dicho anteriormente
Tratamiento de las dos fuentes de carbono usadas sin FA (glucosa y sacarosa)
Media glucosa (a) 235916
Media sacarosa (a) 337147
a
a
0
7000
14000
21000
28000
35000
42000
Aacutere
a de
Com
pues
to
Letras diferentes denotan diferencias significativas (prueba LSD)
Graacutefico 21 Aacuterea del compuesto obtenido de P cubensis en tiempo de retencioacuten entre 62 y 72 minutos para las dos fuentes de carbono
Por tal razoacuten fue necesario hacer un anaacutelisis cualitativo de los cromatogramas
obtenidos mediante HPLC el cual se basoacute en la forma del pico arrojado por la
teacutecnica La figura 6 ilustra dicho anaacutelisis
78
Buena resolucioacuten de pico Mala resolucioacuten de pico
(a) (b)
Figura 6 Cromatogramas de dos diferentes fermentaciones de P cubensis que ilustran el criterio de escogencia del mejor ensayo realizado (a) 50 gL
glucosa (b) 50 gL sacarosa
Primero fue necesario observar el tamantildeo del pico y posterior a eacutesto determinar
su resolucioacuten La figura 6 ilustra dos ejemplos el de 50 gL de glucosa el diacutea 13 y
50 gL de sacarosa el diacutea 14 mientras el primero muestra un pico grande y
definido la segunda fermentacioacuten ilustra un pico grande pero poco definido
indicando que en este caso no se resolvioacute correctamente el alcaloide es decir no
se logroacute una buena separacioacuten De esta manera se analizaron los diferentes
cromatogramas para los diacuteas 12 (Anexo 19) 13 (Anexo 20) y 14 (Anexo 21) de
cada fermentacioacuten arrojando diferencias entre los ensayos y llevando a la
conclusioacuten de que la fermentacioacuten que mejores resultados arrojoacute fue la que
conteniacutea 50 gL de glucosa
79
342 Produccioacuten de compuestos producidos por P cubensis cuando el
medio conteniacutea FA
Despueacutes de realizada la fermentacioacuten con glucosa 50 gL y concentraciones de
FA de 05 gL 10 gL y 15 gL se procedioacute de igual manera que en el estudio sin
FA a evaluar cuaacutel de estas tres concentraciones de FA exhibioacute mejor resolucioacuten
del alcaloide
Inicialmente se realizoacute un anaacutelisis estadiacutestico el cual arrojoacute que no existen
diferencias significativas con respecto al aacuterea de pico que en este caso debido al
supuesto representa la Psilocibina y los diacuteas 12 13 y 14 de la fermentacioacuten
Mediante el graacutefico 22 se puede decir que en los uacuteltimos tres diacuteas de las
fermentaciones que conteniacutean FA en el medio no existen diferencias significativas
con respecto al alcaloide de intereacutes obtenido es decir en los tres se produjo el
alcaloide (Anexo 10)
Tratamientos de los uacuteltimos tres diacuteas de fermentacioacuten usando FA
Media diacutea 12 (a) 411758
Media diacutea 13 (a) 413401
Media diacutea 14 (a) 44860
a a a
0
10000
20000
30000
40000
50000
Aacutere
a Co
mpu
esto
Letras diferentes denotan diferencias significativas
Graacutefico 22 Aacuterea del compuesto obtenido de P cubensis en tiempo de retencioacuten entre 62 y 72 minutos en los uacuteltimos tres diacuteas de la fermentacioacuten
con FA y glucosa
80
Igual que en numeral anterior fue necesario realizar anaacutelisis cualitativo para los
cromatogramas por ende se requirioacute observar el tamantildeo del pico y posterior a
eacutesto determinar su resolucioacuten
Buena resolucioacuten de pico Mala resolucioacuten de pico
(a) (b)
Figura 7 Cromatogramas de dos diferentes fermentaciones de P cubensis que ilustran el criterio de escogencia del mejor ensayo realizado (a) 05 gL
FA (b) 15 gL FA
La figura 7 ejemplifica el anaacutelisis realizado para la seleccioacuten del mejor ensayo
ejecutado Se tienen dos cromatogramas el de 05 gL de FA en el diacutea 13 y el de
15 gL de FA para el mismo diacutea
A todos los cromatogramas obtenidos para los diacuteas 12 (Anexo 19) 13 (Anexo 20)
y 14 (Anexo 21) se realizoacute el mismo anaacutelisis y se concluyoacute que la concentracioacuten
maacutes apropiada para la obtencioacuten de la los compuestos producidos por P cubensis
fue de 05 gL de FA debido a que eacuteste generariacutea una disminucioacuten en los costos
81
35 ESTUDIO PORCENTUAL (AacuteREA) DEL ALCALOIDE REALIZADO PARA
LOS DIFERENTES ENSAYOS
Se calculoacute el porcentaje de aacuterea correspondiente al pico que identificoacute que se
asumioacute como el correspondiente a la Psilocibina gracias a la suposicioacuten realizada
del tiempo de retencioacuten
A continuacioacuten se presentan los valores obtenidos y sus respectivos anaacutelisis para
cada tratamiento
351 Porcentaje de la Psilocibina (suposicioacuten) cuando el medio no conteniacutea
FA
Debido a que no se contaba con un estaacutendar de Psilocibina los resultados
mostrados en la tabla 5 se obtuvieron realizando un porcentaje con respecto a las
aacutereas bajo la curva arrojadas mediante el anaacutelisis de cromatografiacutea de alta
eficiencia (Anexos 19 20 y 21) En dichos anexos se encuentran resaltadas en
negrilla aquellas aeacutereas utilizadas
Tabla 5 Porcentaje de aacuterea hallado mediante HPLC para los uacuteltimos tres diacuteas de la fermentacioacuten con concentraciones de 30 gL 50 gL y 70 gL de glucosa
y sacarosa con un tiempo de retencioacuten de 62 y 72 minutos
Diacutea Glucosa
(gL)
Aacuterea
(compuesto
Tr= 62-72)
Sacarosa
(gL)
Aacuterea
(compuesto
Tr= 62-72)
12 30 60650 30 3664
12 50 7396 50 5857
12 70 4816 70 3415
13 30 702 30 2876
13 50 6815 50 4113
13 70 6733 70 5583
14 30 4824 30 2756
14 50 4821 50 2792
14 70 017 70 1429
82
A la hora de analizar los datos de la tabla 5 se puede observar que el mayor
porcentaje de aacuterea se obtuvo cuando se trabajoacute con glucosa como fuente de
carbono y concretamente a una concentracioacuten de 50 gL
Analizando los datos estadiacutesticamente no se obtuvieron diferencias significativas
en cuanto a la produccioacuten del compuesto (aacuterea) con respecto al tipo de sustrato
utilizado durante las fermentaciones es decir es indiferente si se utiliza glucosa o
sacarosa en el cultivo de P cubensis en medio sumergido de Fang-Zhong
El graacutefico 23 ilustra las medias (aacuterea) obtenidas para la produccioacuten de alcaloide en
las dos diferentes fuentes de carbono es decir glucosa y sacarosa exponiendo
un uacutenico grupo homogeacuteneo con medias (produccioacuten de alcaloide) de aacutereas de
219635 y 234391 para glucosa y sacarosa respectivamente (Anexo 11)
Tratamientos de las dos fuentes de carbono usadas sin FA (glucosa y sacarosa)
Media glucosa (a) 219635
Media sacarosa (a) 234391
a
a
2000
2100
2200
2300
2400
Aacuterea
Com
pues
to
Letras diferentes denotan diferencias significativas (prueba LSD)
Graacutefico 23 Aacuterea del compuesto obtenido de P cubensis en tiempo de retencioacuten entre 62 y 72 minutos para cada una de las fuentes de carbono
utilizadas
Aun asiacute estudiando los graacuteficos de HPLC con el criterio mencionado
anteriormente es decir observando el tamantildeo del pico y su resolucioacuten del mismo
83
se observoacute claramente que la presencia del alcaloide (tiempo de retencioacuten
supuesto entre 62 y 72 minutos) fue mejor cuando se trabajoacute con glucosa a una
concentracioacuten de 50 gL debido que presenta el mejor pico
352 Porcentaje de aacuterea de compuestos presentes en P cubensis cuando
el medio conteniacutea FA
Con el fin de observar si la adicioacuten de FA al medio si arrojoacute mejores resultados en
cuanto a la produccioacuten del compuesto presente entre un rango de 62 y 72
minutos como tiempo de retencioacuten se procedioacute a calcular el porcentaje del aacuterea
de intereacutes de acuerdo a las aacutereas arrojadas para cada ensayo por medio del
anaacutelisis de HPLC Los datos obtenidos se ilustran a continuacioacuten en la tabla 6
Tabla 6 Porcentaje hallado mediante HPLC para los uacuteltimos tres diacuteas de la fermentacioacuten con concentraciones de 05 gL 10 gL y 15 gL de FA y 50 gL
de glucosa con un tiempo de retencioacuten entre 62 y 72 minutos
Diacutea
Glucosa
50 gL +
FA
Aacuterea
(compuesto
Tr=62-72)
12 0 4315
12 05 2931
12 1 6236
12 15 847
13 0 3257
13 05 7549
13 1 4790
13 15 2721
14 0 4822
14 05 3863
14 1 5801
14 15 2102
84
Al detallar la tabla 6 puede observarse que el ensayo que mayor porcentaje de
aacuterea arrojoacute fue el que conteniacutea 05 gL de FA arrojando su maacuteximo porcentaje
correspondiente a 755 el diacutea 13 Aun asiacute las diferencias existentes entre ellos
no fueron significativas
Ahora bien al analizarlos estadiacutesticamente se encontroacute que la produccioacuten del
alcaloide en presencia de FA presentoacute la misma tendencia que los ensayos
analizados anteriormente sin eacutesta pero gracias a que este aminoaacutecido duplico la
cantidad de biomasa y debido a que el compuesto de intereacutes se produce
intracelularmente se afirma que el uso de FA aumentoacute la generacioacuten del
compuesto evaluado (Anexo 12)
El graacutefico 24 presenta las diferentes medias en cuanto al porcentaje de aacuterea del
compuesto presente entre 62 y 72 minutos para los diferentes tratamientos de
glucosa a una concentracioacuten de 50 gL y sus concentraciones respectivas de FA
Claramente se ve que soacutelo existe un grupo homogeacuteneo lo que reafirma que no
existen diferencias significativas de la produccioacuten con respecto a las
concentraciones de FA
85
Tratamientos con y sin FA
Media 0 gL FA (a) 3122
Media 05 gL FA (a) 2391
Media 10 gL FA (a) 2823
Media 15 gL FA (a) 2113
a
aa
a
0
5
10
15
20
25
30
35
40
Aacutere
a Co
mpu
esto
Letras diferentes denotan diferencias significativas (prueba LSD)
Graacutefico 24 Aacuterea del compuesto obtenido de P cubensis en tiempo de retencioacuten entre 62 y 72 minutos para cada una de las concentraciones de
FA utilizadas
Debido a que no se encontraron diferencias significativas en cuanto al porcentaje
de aacuterea obtenido mediante los cromatogramas se concluye que el mejor medio es
el que tiene como fuente de carbono glucosa a una concentracioacuten de 50 gL y una
adicioacuten de 05 gL de FA puesto que genera una disminucioacuten en costos
86
CONCLUSIONES
No existen diferencias significativas en el crecimiento micelial de P
cubensis en medio sumergido Fang-Zhong cuando se trabaja con fuentes
de carbono glucosa y sacarosa sin embargo se decide trabajar con 50 gL
de glucosa puesto que eacuteste tiene una buena presencia de alcaloide y a su
vez una mejor produccioacuten de biomasa
La concentracioacuten de glucosa utilizada para el crecimiento de P cubensis
influye en el crecimiento micelial obteniendo concentraciones de biomasa
de 062 gL 055 gL y 048 gL para concentraciones de sustrato de 70 50
y 30 gL de glucosa siendo las dos primeras significativamente diferentes
con respecto a la de 30 gL
La concentracioacuten de sacarosa utilizada para el crecimiento de P cubensis
influye en el crecimiento micelial obteniendo concentraciones de biomasa
de 057 gL 045 gL y 026 gL para concentraciones de sustrato de 70 50
y 30 gL de sacarosa siendo significativamente diferentes entre ellas
La resolucioacuten de los picos obtenidos por RP-HPLC del extracto de P
cubensis fue mayor para las fermentaciones realizadas con una
concentracioacuten de 50 gL de glucosa lo que conllevoacute a utilizarlo al realizar
los ensayos que conteniacutean en el medio FA
La concentracioacuten de biomasa de P cubensis obtenida en cultivo sumergido
en medio Fang-Zhong con glucosa se duplicoacute con la adicioacuten de FA No
obstante no existen diferencias significativas entre las concentraciones de
FA utilizadas
87
El consumo de proteiacutena presentada por P cubensis en medio Fang-Zhong
fue casi del 100 mientras que el consumo de sustrato para el mismo
medio estuvo alrededor del 40
El consumo de sustrato durante el transcurso de las fermentaciones que no
conteniacutean FA en el medio no presentoacute diferencias significativas con
respecto a las dos fuentes de carbono utilizadas Mientras que en aquellas
fermentaciones donde se agregoacute FA al medio siacute existieron diferencias
significativas entre las fermentaciones de 15 y 1 gL de FA con respecto a
los ensayos realizados con 05 gL FA Sin embargo el P cubensis
consumioacute mayor cantidad de sustrato cuando el medio no conteniacutea FA
Se evidencioacute que el P cubensis consumioacute mayor cantidad de proteiacutena
cuando el sustrato utilizado en el medio fue glucosa y a su vez se detecto
que la adicioacuten de FA al medio tuvo como efecto la disminucioacuten en el
consumo de sustrato por parte del microorganismo
El consumo de sustrato y de proteiacutena tuvo un comportamiento similar
puesto que fue consumido permanentemente durante la fase exponencial
para cada uno de los tratamientos realizados es decir las concentraciones
de 30 gL 50 gL y 70 gL de glucosa y sacarosa como fuente de carbono y
de 05 gL 1 gL y 15 gL de FA teniendo como fuente de carbono glucosa
a una concentracioacuten de 50 gL mientras que en la fase estacionaria su
consumo se disminuyoacute permaneciendo casi constante
Despueacutes de realizados los estudios en cuanto a la produccioacuten del
compuesto presente entre 62 y 72 minutos para cada uno de los ensayos
no se evidenciaron diferencias significativas entre las dos fuentes de
carbono utilizadas (glucosa y sacarosa)
88
La adicioacuten del precursor llamado Fenilalanina (FA) al medio sumergido
Fang-Zhong para llevar a cabo el cultivo del P cubensis tuvo influencia en
cuanto a la produccioacuten de compuesto presente entre tiempo de retencioacuten de
62 y 72 minutos debido a que eacuteste duplicoacute la concentracioacuten de biomasa
en el medio se dice entonces que la produccioacuten aumentoacute al ser eacuteste de
produccioacuten intracelular
La resolucioacuten del compuesto presente entre el tiempo de retencioacuten de 62 a
72 minutos se obtuvo mejor en el ensayo que conteniacutea 05 gL de FA y al
saber que no existieron diferencias significativas en la produccioacuten en cuanto
al porcentaje de aacutereas obtenido con respecto a las demaacutes concentraciones
de FA se afirma que eacuteste es el medio que mejores resultados arrojoacute para
el crecimiento de P cubensis y la produccioacuten de Psilocibina
89
RECOMENDACIONES
Se sugiere observar el efecto que tiene la variacioacuten de las revoluciones a
las cuales se realizaron las fermentaciones para ver como variacutea el
crecimiento del P cubensis en medio sumergido Fang-Zhong con respecto
a dicho factor
Debido a que soacutelo se realizaron anaacutelisis sobre el crecimiento del P
cubensis en medio sumergido haciendo uso de dos sustratos diferentes
(glucosa y sacarosa) seriacutea recomendable realizar el mismo anaacutelisis para
otro tipo de sustrato como por ejemplo melaza por su bajo costo
Del mismo modo seriacutea apropiado realizar el estudio con otro tipo de
precursor y en otras concentraciones para ver la incidencia de eacuteste en el
comportamiento del hongo
Se recomienda realizar un escalamiento de dicho proceso en un biorreactor
con el fin de evaluar a mayor escala el crecimiento del P cubensis y la
produccioacuten del alcaloide
Debido a que la proteiacutena se comportoacute como el principal nutriente se sugiere
para una proacutexima investigacioacuten evaluar diferentes concentraciones de
proteiacutena en el medio
90
ANEXOS
Anexo 1 Anaacutelisis de varianza (ANOVA) para el crecimiento de biomasa de
las fermentaciones con glucosa
Tabla 7 Anaacutelisis de Varianza para el crecimiento micelial (glucosa)
Tabla 8 Anaacutelisis Muacuteltiple de Rangos para el crecimiento micelial (glucosa)
91
Anexo 2 Anaacutelisis de Varianza (ANOVA) para el crecimiento de biomasa de
las fermentaciones con sacarosa
Tabla 9 Anaacutelisis de Varianza para el crecimiento micelial (sacarosa)
Tabla 10 Anaacutelisis Muacuteltiple de Rangos para el crecimiento micelial (sacarosa)
92
Anexo 3 Anaacutelisis de Varianza (ANOVA) para el crecimiento de biomasa de
las fermentaciones con glucosa y sacarosa
Tabla 11 Anaacutelisis de Varianza para el crecimiento micelial (glucosa y
sacarosa)
Tabla 12 Anaacutelisis Muacuteltiple de Rangos para el crecimiento micelial (glucosa y
sacarosa)
93
Anexo 4 Anaacutelisis de Varianza (ANOVA) para el crecimiento de biomasa de
las fermentaciones con glucosa 50 gL y FA
Tabla 13 Anaacutelisis de Varianza para el crecimiento micelial (glucosa 50 gL y
FA)
Tabla 14 Anaacutelisis Muacuteltiple de Rangos para el crecimiento micelial (glucosa
50 gL y FA)
94
Anexo 5 Anaacutelisis de varianza (ANOVA) para el consumo de sustrato en las
fermentaciones sin FA
Tabla 15 Anaacutelisis de Varianza para el consumo de Sustrato sin FA
Tabla 16 Anaacutelisis Muacuteltiple de Rangos para el consumo de Sustrato sin FA
95
Anexo 6 Anaacutelisis de Varianza (ANOVA) para el consumo de sustrato en las
fermentaciones con FA
Tabla 17 Anaacutelisis de Varianza para el consumo de Sustrato con FA
Tabla 18 Anaacutelisis Muacuteltiple de Rangos para el consumo de Sustrato con FA
96
Anexo 7 Anaacutelisis de Varianza (ANOVA) para el consumo de proteiacutena en las
fermentaciones sin FA
Tabla 19 Anaacutelisis de Varianza para el consumo de Proteiacutena sin FA
Tabla 20 Anaacutelisis Muacuteltiple de Rangos para el consumo de Proteiacutena sin FA
97
Anexo 8 Anaacutelisis de Varianza (ANOVA) para el consumo de proteiacutena en las
fermentaciones con FA
Tabla 21Anaacutelisis de Varianza para el consumo de Proteiacutena con FA
Tabla 22 Anaacutelisis Muacuteltiple de Rangos para el consumo de Proteiacutena con FA
98
Anexo 9 Anaacutelisis de Varianza (ANOVA) para la produccioacuten de Psilocibina en
las fermentaciones sin FA
Tabla 23 Anaacutelisis de Varianza para la produccioacuten de Psilocibina sin FA
Tabla 24 Anaacutelisis Muacuteltiple de Rangos para la produccioacuten de Psilocibina
seguacuten el Sustrato sin FA
99
Anexo 10 Anaacutelisis de Varianza (ANOVA) para la produccioacuten de Psilocibina en las fermentaciones con FA
Tabla 25 Anaacutelisis de Varianza para la produccioacuten de Psilocibina con FA
Tabla 26 Anaacutelisis Muacuteltiple de Rangos para la produccioacuten de Psilocibina
seguacuten el diacutea con FA
100
Anexo 11 Anaacutelisis de Varianza (ANOVA) para la cuantificacioacuten porcentual de
Psilocibina en las fermentaciones sin FA
Tabla 27 Anaacutelisis de Varianza para la cuantificacioacuten de Psilocibina sin FA
Tabla 28 Anaacutelisis Muacuteltiple de Rangos para la cuantificacioacuten de Psilocibina
seguacuten el tipo de sustrato sin FA
101
Anexo 12 Anaacutelisis de Varianza (ANOVA) para la cuantificacioacuten porcentual de
Psilocibina en las fermentaciones con FA
Tabla 29 Anaacutelisis de Varianza para la cuantificacioacuten de Psilocibina con FA
Tabla 30 Anaacutelisis Muacuteltiple de Rangos para la cuantificacioacuten de Psilocibina
seguacuten la concentracioacuten con FA
102
Anexo 13 Determinacioacuten de consumo de azuacutecares por el meacutetodo de DNS
(Aacutecido Dinitrosaliciacutelico)
a DNS para glucosa
Pasos para preparar DNS
Disolver 16 gr de NaOH en agua destilada
Adicionar 30 gr de tartrato de Na y K
Aforar a 100 ml con agua destilada
Almacenar en frascos aacutembar a 4degC
Se debe mantener un stock de glucosa 4mgml y almacenarlo a 4degC A partir
de la solucioacuten de glucosa se preparan las soluciones para hacer la curva
patroacuten con las siguientes concentraciones (gL) 025 050 100 200 y 400
Procedimiento
Tomar 05 ml de cada dilucioacuten y agregar 05 ml de reactivo DNS
Preparar una muestra blanco por dilucioacuten de 05 ml de agua destilada a 05
ml de reactivo de DNS
Agitar todas las muestras
Colocar a ebullir las muestras en bantildeo mariacutea por cinco minutos
Enfriar con hielo
Adicionar 5 ml de agua destilada
Agitar y dejar en reposo 15 minutos
Leer en espectrofotoacutemetro a 540 nm
Realizar la curva Absorbancia Vs Concentracioacuten Debe tener un coeficiente
de correlacioacuten de 0991 a 0999
b DNS para sacarosa
Pasos para preparar DNS sacarosa
Preparacioacuten de la solucioacuten Standard stock de sacarosa (30 gL) tomar 30
gr de sacarosa anhiacutedrida grado reactivo con exactitud hasta la deacutecima de
mg disolver ajustar a aforo de 100 ml con agua desionizada empacar en
viales y almacenar en congelador
Preparacioacuten DNS pesar 16 gr de hidroacutexido de sodio grado reactivo 30 gr
de tartrato de sodio y potasio y disolverlos juntos con 50 ml de agua
103
desionizada aparte pesar 10 gr del DNS disolver con 30 ml de agua
desionizada agregar lentamente y con agitacioacuten la solucioacuten del DNS a la
solucioacuten de tartrato y NaOH anteriormente preparadas ajustar a 100 ml
filtrar envasar en frasco aacutembar y rotular con fecha de vencimiento incluida
(3 meses maacuteximo) mantener a la temperatura del laboratorio
Preparacioacuten del reactivo NaOH 10 N (500 ml) pesar con exactitud hasta
la deacutecima de mg 20 gr de NaOH grado reactivo por cada 500 ml de
solucioacuten disolver primero con 300 ml de agua desionizada y luego aforar a
500 ml envasar y rotular correctamente y mantener a la temperatura del
laboratorio
Preparacioacuten de HCL 10 (100 ml) tomar 27 ml de aacutecido clorhiacutedrico al
37 grado reactivo y aforar hasta 100 ml con agua desionizada envasar
rotular correctamente de acuerdo a la norma del laboratorio y almacenar a
la temperatura del laboratorio
Se debe mantener un stock de glucosa 30 gL y almacenarlo a 4degC A partir
de la solucioacuten de glucosa se preparan las soluciones para hacer la curva
patroacuten con las siguientes concentraciones (gL) 3 6 12 18 24 y 30
Procedimiento
Preparar en cada tubo (las soluciones de la curva patroacuten de sacarosa las
muestras problemas diluidas si es necesario y como blanco agua
desionizada) 100microl de solucioacuten
Adicionar 200 microl de HCL 10 a cada tubo y agitar todos los tubos en vortex
Llevar a ebullicioacuten por 10 minutos en bantildeo mariacutea precalentado a 95degC
Enfriar hasta temperatura ambiente raacutepidamente
Adicionar a cada tubo 1 ml de NaOH 10 N y agitar los tubos en vortex
Aparte tomar 05 ml de cada tubo en otros tubos rotulados y agregar 05 ml
del DNS
Agitar todas las muestras en vortex
Llevar a ebullicioacuten por 5 minutos en bantildeo mariacutea precalentado a 96degC
Enfriar hasta temperatura ambiente raacutepidamente
Adicionar 5 ml de H2O desionizada agitar en vortex y dejar reposar por 15
minutos
Leer en espectrofotoacutemetro a 540 nm
Realizar la curva Absorbancia Vs Concentracioacuten Debe tener un coeficiente
de correlacioacuten de 0991 a 0999
104
Anexo 14 Cineacutetica de Consumo de Sustrato
La cineacutetica de consumo de sustrato se realizoacute por el meacutetodo de Aacutecido
Dinitrosaliciacutelico (DNS) Los rangos de concentracioacuten y absorbancia para cada caso
se citan a continuacioacuten
Rangos de concentraciones y absorbancias para las fermentaciones que
usaron glucosa (30 gL 50 gL y 70 gL) como sustrato
Concentracioacuten de 02 a 12 gL
Absorbancia de 01234 a 06612
Ecuacioacuten Y = 19174x -00517 R2 = 09923
Rangos de concentraciones y absorbancias para las fermentaciones que
usaron sacarosa (30 gL 50 gL y 70 gL) como sustrato
Concentracioacuten de 3 a 30 gL
Absorbancia de 00822 a 11112
Ecuacioacuten Y = 25983x + 04857 R2 = 09978
Rangos de concentraciones y absorbancias para las fermentaciones que
usaron glucosa 50 gL como sustrato y FA
Concentracioacuten de 02 a 12 gL
Absorbancia de 0097 a 063
Ecuacioacuten Y = 18785x + 00019 R2 = 09986
105
Anexo 15 Determinacioacuten de consumo de proteiacutenas por el meacutetodo de LOWRY
Pasos para la preparacioacuten de LOWRY
Para obtener la curva estaacutendar de Albuacutemina se preparan 5 soluciones
patrones de Albuacutemina en NaCL al 09 (PV) de las siguientes
concentraciones 152 80 200 300 400 Pgml Si la concentracioacuten de
Proteiacutena total es menor de 500 Pgml se lee la absorbancia a 750 nm si
estaacute entre 1000 y 2000 Pgml se lee a 550nm
Se prepara un blanco que no lleva Albuacutemina y en su reemplazo se adiciona
0-5 ml de solucioacuten salina (NaCL) al 09 (PV) Se aplica el mismo
procedimiento que a las demaacutes muestras
Procedimiento
Servir en tubos de ensayo 05 ml de las soluciones patroacuten de Albuacutemina las
muestras problema y NaCL al 09 como blanco Deben estar marcados
para conservar el orden de concentraciones para la curva
Adicionar a cada tubo 05 ml de NaOH 2N y llevar al bantildeo Mariacutea
precalentado a 100degC por un tiempo de 10 minutos
Dejar enfriar hasta que alcance la Temperatura Ambiente
Agregar a cada tubo 5 ml de la solucioacuten complejante mezclar y dejar
reposar por 10 minutos
Adicionar 05 ml del reactivo de Folin-Ciocalteu 11 vortexiar durante 20
segundos
Reposar en un cuarto oscuro durante 30 minutos
Leer la absorbancia a 750 nm y con las soluciones patroacuten construir la
graacutefica Absorbancia Vs Concentracioacuten de Albuacutemina Seacuterica de Bovina
(BSA) con eacutesta se puede determinar la concentracioacuten de las muestras
problema interpolando el valor de la Absorbancia La curva estaacutendar debe
tener un coeficiente de correlacioacuten de 0991 a 0999
106
Anexo 16 Cineacutetica consumo de Proteiacutena
La cineacutetica de consumo de proteiacutena se realizoacute por el meacutetodo LOWRY Los rangos
de concentracioacuten y absorbancia para cada caso se citan a continuacioacuten
Rangos de concentraciones y absorbancias para las fermentaciones que
usaron glucosa (30 gL 50 gL y 70 gL) como sustrato
Concentracioacuten de 0016 a 04 gL
Absorbancia de 00094 a 05382
Ecuacioacuten Y = 07427x ndash 00021 R2 = 09955
Rangos de concentraciones y absorbancias para las fermentaciones que
usaron sacarosa (30 gL 50 gL y 70 gL) como sustrato
Concentracioacuten de 0016 a 04 gL
Absorbancia de 00374 a 06178
Ecuacioacuten Y = 06567x ndash 00166 R2 = 09968
Rangos de concentraciones y absorbancias para las fermentaciones que
usaron glucosa 50 gL como sustrato y FA
Concentracioacuten de 0016 a 04 gL
Absorbancia de 00708 a 04647
Ecuacioacuten Y = 09814x ndash 00581 R2 = 09992
107
Anexo 17 Prueba de reactivo de Dragendorff
Preparacioacuten de reactivo de Dragendorff para alcaloides
Reactivo de Dragendorff se prepara mezclando 8 gr de nitrato de bismuto
pentahidratado en 20 ml de aacutecido niacutetrico al 30 con una solucioacuten de 272 g de
yoduro de potasio en 50 ml de agua Se deja en reposo por 24 horas se decanta y
se afora a 100 ml La presencia de alcaloides se detecta por la formacioacuten de un
precipitado naranja rojizo cuando se le adiciona esta reactivo a una solucioacuten aacutecida
de alcaloides De los precipitados lavados se puede recuperar los alcaloides con
una solucioacuten saturada de carbonato de sodio (Mercano y Hasegawa 1991)
La figura mostrada a continuacioacuten refleja la presencia del alcaloide debido a la
coloracioacuten amarillo-rojiza que eacutesta sufrioacute
Figura 8 Muestra de biomasa una vez analizada mediante el reactivo de Dragendorff
108
Anexo 18 Barrido Espectral para el Psilocybe cubensis
La metodologiacutea mencionada a continuacioacuten estaacute basada en artiacuteculo base
(Tsujikawa et al 2003)
El Sistema de HPLC consiste en un Shimadzu LC-10ordf Series Cromatografiacutea
Liacutequida equipada con un diodo SPD-M10A detector de red fija en 220nm La
separacioacuten cromatograacutefica ser realizoacute con una columna simeacutetrica C18 (21 mm a
150 mm 5mm Waters Assoc Milford EEUU
La fase moacutevil utilizada fue de 10 mm de formato de amonio-aacutecido foacutermico (955
VV) a un pH de 35 y bombeado a un caudal de 02 mlminuto
El perfil cromatograacutefico obtenido durante la investigacioacuten de Tsujikawa et al
(2003) se muestra en le figura 6 que aparece a continuacioacuten
Figura 9 Perfil cromatograacutefico (Tsujikawa et al 2003)
109
Anexo 19 Cromatogramas (HPLC) del diacutea 12 de fermentacioacuten
Tabla 31 Aacutereas obtenidas de los cromatogramas para el P cubensis en
medio Fang-Zhong en el diacutea 12 para concentraciones de 30gL glucosa y
30gL sacarosa
SustratoConcentracioacuten
(gL)
Tiempo
(s)Aacuterea
Glucosa 30 2957 3837
Glucosa 30 6838 474753
Glucosa 30 9144 47256
Glucosa 30 9489 16822
Glucosa 30 10124 224349
Sacarosa 30 6538 143772
Sacarosa 30 7234 269458
Sacarosa 30 9721 33646
Sacarosa 30 11845 24384
(a) (b)
Graacutefico 25 Cromatogramas del diacutea 12 para el P cubensis cultivado en medio
sumergido Fang-Zhong con dos diferentes tipos de sustratos (a) 30 gL
glucosa (b) 30 gL sacarosa
110
Tabla 32 Aacutereas obtenidas de los cromatogramas para el P cubensis en
medio Fang-Zhong en el diacutea 12 para concentraciones de 50gL glucosa y
50gL sacarosa
SustratoConcentracioacuten
(gL)
Tiempo
(s)Aacuterea
Glucosa 50 0524 319
Glucosa 50 6298 5991
Glucosa 50 7172 237042
Glucosa 50 9144 16387
Glucosa 50 10009 6077
Sacarosa 50 169 24011
Sacarosa 50 3105 28573
Sacarosa 50 6916 112166
Sacarosa 50 9136 4057
Sacarosa 50 9933 8821
Sacarosa 50 10398 13872
(a) (b)
Graacutefico 26 Cromatogramas del diacutea 12 para el P cubensis cultivado en medio
sumergido Fang-Zhong con dos diferentes tipos de sustratos (a) 50 gL
glucosa (b) 50 gL sacarosa
111
Tabla 33 Aacutereas obtenidas de los cromatogramas para el P cubensis en
medio Fang-Zhong en el diacutea 12 para concentraciones de 50gL glucosa y
50gL sacarosa
SustratoConcentracioacuten
(gL)
Tiempo
(s)Aacuterea
Glucosa 70 7217 168598
Glucosa 70 9145 9977
Glucosa 70 997 80558
Sacarosa 70 6803 287387
Sacarosa 70 7517 131049
Sacarosa 70 7775 4434
Sacarosa 70 7871 77109
Sacarosa 70 823 96239
Sacarosa 70 9039 5114
Sacarosa 70 9778 25394
(a) (b)
Graacutefico 27 Cromatogramas del diacutea 12 para el P cubensis cultivado en medio
sumergido Fang-Zhong con dos diferentes tipos de sustratos (a) 50 gL
glucosa (b) 50 gL sacarosa
112
Tabla 34 Aacutereas obtenidas de los cromatogramas para el P cubensis en
medio Fang-Zhong en el diacutea 12 para concentraciones de 50gL y glucosa
50gL sacarosa
SustratoConcentracioacuten
(gL)
Tiempo
(s)Aacuterea
Glucosa 50 05 0818 4722
Glucosa 50 05 2423 52579
Glucosa 50 05 3502 88765
Glucosa 50 05 6137 16009
Glucosa 50 05 6722 275258
Glucosa 50 05 733 226399
Glucosa 50 05 8339 65139
Glucosa 50 05 9101 36797
Glucosa 50 05 9815 130883
Glucosa 50 1 1105 743
Glucosa 50 1 2746 2701
Glucosa 50 1 4304 80304
Glucosa 50 1 6167 19649
Glucosa 50 1 6794 51753
Glucosa 50 1 8282 82997
Glucosa 50 1 9116 38659
Glucosa 50 1 9899 136953
Glucosa 50 15 1198 3313
Glucosa 50 15 2937 37875
Glucosa 50 15 4332 51079
Glucosa 50 15 614 25602
Glucosa 50 15 6737 668905
Glucosa 50 15 8209 107332
Glucosa 50 15 9602 38902
Glucosa 50 15 9752 139613
Diacutea 12
(a) (b)
(c)
Graacutefico 28 Cromatograma del diacutea 12 para el P cubensis cultivado en medio
sumergido Fang-Zhong con fuente de carbono glucosa y adicioacuten de
fenilalanina en tres concentraciones (a) 05 gL FA (b) 1 gL FA (c) 15gL
FA
113
Anexo 20 Cromatogramas (HPLC) del diacutea 13 de fermentacioacuten
Tabla 35 Aacutereas obtenidas de los cromatogramas para el P cubensis en
medio Fang-Zhong en el diacutea 13 para concentraciones de 30gL glucosa y
30gL sacarosa
SustratoConcentracioacuten
(gL)
Tiempo
(s)Aacuterea
Glucosa 30 0225 1155
Glucosa 30 2847 699
Glucosa 30 4043 1038
Glucosa 30 6231 4994
Glucosa 30 6787 295182
Glucosa 30 7462 241146
Glucosa 30 9066 51836
Glucosa 30 10004 158746
Sacarosa 30 1734 135
Sacarosa 30 5838 1857
Sacarosa 30 6803 147867
Sacarosa 30 7305 30464
Sacarosa 30 7599 174643
Sacarosa 30 9107 8564
Sacarosa 30 9897 104278
(a) (b)
Graacutefico 29 Cromatogramas del diacutea 13 para el P cubensis cultivado en medio
sumergido Fang-Zhong con dos diferentes tipos de sustratos (a) 30 gL
glucosa (b) 30 gL sacarosa
114
Tabla 36 Aacutereas obtenidas de los cromatogramas para el P cubensis en
medio Fang-Zhong en el diacutea 13 para concentraciones de 50gL glucosa y
50gL sacarosa
SustratoConcentracioacuten
(gL)
Tiempo
(s)Aacuterea
Glucosa 50 1408 13982
Glucosa 50 6949 331449
Glucosa 50 9012 25201
Glucosa 50 9936 27216
Sacarosa 50 1543 7293
Sacarosa 50 6813 437765
Sacarosa 50 9085 35897
Sacarosa 50 10049 184461
(a) (b)
Graacutefico 30 Cromatogramas del diacutea 13 para el P cubensis cultivado en medio
sumergido Fang-Zhong con dos diferentes tipos de sustratos (a) 50 gL
glucosa (b) 50 gL sacarosa
115
Tabla 37 Aacutereas obtenidas de los cromatogramas para el P cubensis en
medio Fang-Zhong en el diacutea 13 para concentraciones de 70gL glucosa y
70gL sacarosa
SustratoConcentracioacuten
(gL)
Tiempo
(s)Aacuterea
Glucosa 70 1456 3223
Glucosa 70 2985 2423
Glucosa 70 54 7586
Glucosa 70 6262 5149
Glucosa 70 7151 248331
Glucosa 70 9039 19346
Glucosa 70 9929 4906
Glucosa 70 11051 33698
Sacarosa 70 0437 342
Sacarosa 70 1428 812
Sacarosa 70 2948 2191
Sacarosa 70 5473 4854
Sacarosa 70 6286 5336
Sacarosa 70 6848 3649
Sacarosa 70 733 11383
Sacarosa 70 9073 1018
Sacarosa 70 9878 11072
Sacarosa 70 10267 18797
(a) (b)
Graacutefico 31 Cromatogramas del diacutea 13 para el P cubensis cultivado en medio
sumergido Fang-Zhong con dos diferentes tipos de sustratos (a) 70 gL
glucosa (b) 70 gL sacarosa
116
Tabla 38 Aacutereas obtenidas de los cromatogramas para el P cubensis en
medio Fang-Zhong en el diacutea 13 para concentraciones de 50gL y glucosa
50gL sacarosa
SustratoConcentracioacuten
(gL)
Tiempo
(s)Aacuterea
Glucosa 50 05 4067 22222
Glucosa 50 05 7379 55573
Glucosa 50 05 902 19513
Glucosa 50 05 9716 119261
Glucosa 50 05 1173 19427
Glucosa 50 1 0793 14776
Glucosa 50 1 2868 28537
Glucosa 50 1 6224 1206
Glucosa 50 1 6782 571299
Glucosa 50 1 8303 92665
Glucosa 50 1 9081 30371
Glucosa 50 1 9738 168959
Glucosa 50 1 11813 27921
Glucosa 50 15 0412 269
Glucosa 50 15 2482 14692
Glucosa 50 15 3486 91059
Glucosa 50 15 6039 6892
Glucosa 50 15 6627 216986
Glucosa 50 15 7216 260795
Glucosa 50 15 8112 65776
Glucosa 50 15 8888 19083
Glucosa 50 15 9497 37812
Glucosa 50 15 9839 65922
Glucosa 50 15 11655 7331
(a) (b)
(c)
Graacutefico 32 Cromatogramas del diacutea 12 para el P cubensis cultivado en medio
sumergido Fang-Zhong con fuente de carbono glucosa y adicioacuten de
fenilalanina en tres concentraciones (a) 05 gL FA (b) 1 gL FA (c) 15gL
FA
117
Anexo 21 Cromatogramas (HPLC) del diacutea 14 de fermentacioacuten
Tabla 39 Aacutereas obtenidas de los cromatogramas para el P cubensis en
medio Fang-Zhong en el diacutea 14 para concentraciones de 30gL glucosa y 30
gL sacarosa
SustratoConcentracioacuten
(gL)
Tiempo
(s)Aacuterea
Glucosa 30 1054 181
Glucosa 30 2553 8939
Glucosa 30 6219 7557
Glucosa 30 6585 77083
Glucosa 30 7158 285069
Glucosa 30 8987 33875
Glucosa 30 9848 87461
Glucosa 30 10694 52151
Glucosa 30 12482 7992
Glucosa 30 12943 23064
Glucosa 30 1493 5948
Sacarosa 30 7309 7075
Sacarosa 30 9984 1680
Sacarosa 30 10442 15395
Sacarosa 30 11211 8511
Sacarosa 30 13405 3398
(a) (b)
Graacutefico 33 Cromatogramas del diacutea 14 para el P cubensis cultivado en medio
sumergido Fang-Zhong con dos diferentes tipos de sustratos (a) 30 gL
glucosa (b) 30 gL sacarosa
118
Tabla 40 Aacutereas obtenidas de los cromatogramas para el P cubensis en
medio Fang-Zhong en el diacutea 14 para concentraciones de 50gL glucosa y
50gL sacarosa
SustratoConcentracioacuten
(gL)
Tiempo
(s)Aacuterea
Glucosa 50 2029 8318
Glucosa 50 6257 5782
Glucosa 50 6875 306684
Glucosa 50 9068 22819
Glucosa 50 9808 92492
Glucosa 50 12113 8823
Glucosa 50 12752 23988
Sacarosa 50 1036 3783
Sacarosa 50 2356 7005
Sacarosa 50 653 44831
Sacarosa 50 6657 127617
Sacarosa 50 7264 66908
Sacarosa 50 7464 255141
Sacarosa 50 9035 26172
Sacarosa 50 9458 28427
Sacarosa 50 9889 37574
Sacarosa 50 10312 140881
Sacarosa 50 12335 13391
Sacarosa 50 1292 17066
(a) (b)
Graacutefico 34 Cromatogramas del diacutea 14 para el P cubensis cultivado en medio
sumergido Fang-Zhong con dos diferentes tipos de sustratos (a) 50 gL
glucosa (b) 50 gL sacarosa
119
Tabla 41 Aacutereas obtenidas de los cromatogramas para el P cubensis en
medio Fang-Zhong en el diacutea 14 para concentraciones de 70gL glucosa y
70gL sacarosa
SustratoConcentracioacuten
(gL)
Tiempo
(s)Aacuterea
Glucosa 70 6257 5879
Glucosa 70 6373 145551
Glucosa 70 7015 68223
Glucosa 70 7199 9085
Glucosa 70 735 265755
Glucosa 70 9014 4642
Glucosa 70 9877 97804
Glucosa 70 107 67421
Glucosa 70 12625 26231
Glucosa 70 1305 65607
Sacarosa 70 2283 4683
Sacarosa 70 5191 93
Sacarosa 70 6304 3719
Sacarosa 70 6795 136542
Sacarosa 70 726 29869
Sacarosa 70 7515 75545
Sacarosa 70 7872 119563
Sacarosa 70 9166 1244
Sacarosa 70 9658 23096
Sacarosa 70 9871 25866
Sacarosa 70 10421 105108
Sacarosa 70 12347 11115
Sacarosa 70 12861 35503
Sacarosa 70 14272 3676
(a) (b)
Graacutefico 35 Cromatogramas del diacutea 14 para el P cubensis cultivado en medio
sumergido Fang-Zhong con dos diferentes tipos de sustratos (a) 70 gL
glucosa (b) 70 gL sacarosa
120
Tabla 42 Aacutereas obtenidas de los cromatogramas para el P cubensis en medio Fang-Zhong en el diacutea 13 para concentraciones de 50gL glucosa y
50gL sacarosa
SustratoConcentracioacuten
(gL)
Tiempo
(s)Aacuterea
Glucosa 50 05 0123 173
Glucosa 50 05 0699 7584
Glucosa 50 05 2594 2742
Glucosa 50 05 6104 11663
Glucosa 50 05 6616 487848
Glucosa 50 05 7235 287918
Glucosa 50 05 8183 135793
Glucosa 50 05 8903 5143
Glucosa 50 05 9484 66817
Glucosa 50 05 9679 168855
Glucosa 50 05 11671 4216
Glucosa 50 1 0345 295
Glucosa 50 1 2654 11981
Glucosa 50 1 412 45301
Glucosa 50 1 6111 12626
Glucosa 50 1 6757 526655
Glucosa 50 1 8093 104277
Glucosa 50 1 894 25251
Glucosa 50 1 9643 158685
Glucosa 50 1 11666 22779
Glucosa 50 15 0353 283
Glucosa 50 15 2522 15272
Glucosa 50 15 3577 83963
Glucosa 50 15 6668 47137
Glucosa 50 15 7304 371442
Glucosa 50 15 8226 117611
Glucosa 50 15 8923 61949
Glucosa 50 15 9657 19618
Glucosa 50 15 11668 35606
(a) (b)
(c)
Graacutefico 36 Cromatogramas del diacutea 12 para el P cubensis cultivado en medio sumergido Fang-Zhong con fuente de carbono glucosa y adicioacuten de
fenilalanina en tres concentraciones (a) 05 gL FA (b) 1 gL FA (c) 15gL FA (a) 05 gL FA (b) 1 gL FA (c) 15gL FA
121
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x
TABLA 30 ANAacuteLISIS MUacuteLTIPLE DE RANGOS PARA LA CUANTIFICACIOacuteN DE PSILOCIBINA SEGUacuteN LA
CONCENTRACIOacuteN CON FA 101
TABLA 31 AacuteREAS OBTENIDAS DE LOS CROMATOGRAMAS PARA EL P CUBENSIS EN MEDIO FANG-ZHONG
EN EL DIacuteA 12 PARA CONCENTRACIONES DE 30GL GLUCOSA Y 30GL SACAROSA 109
TABLA 32 AacuteREAS OBTENIDAS DE LOS CROMATOGRAMAS PARA EL P CUBENSIS EN MEDIO FANG-ZHONG
EN EL DIacuteA 12 PARA CONCENTRACIONES DE 50GL GLUCOSA Y 50GL SACAROSA 110
TABLA 33 AacuteREAS OBTENIDAS DE LOS CROMATOGRAMAS PARA EL P CUBENSIS EN MEDIO FANG-ZHONG
EN EL DIacuteA 12 PARA CONCENTRACIONES DE 50GL GLUCOSA Y 50GL SACAROSA 111
TABLA 34 AacuteREAS OBTENIDAS DE LOS CROMATOGRAMAS PARA EL P CUBENSIS EN MEDIO FANG-ZHONG
EN EL DIacuteA 12 PARA CONCENTRACIONES DE 50GL Y GLUCOSA 50GL SACAROSA 112
TABLA 35 AacuteREAS OBTENIDAS DE LOS CROMATOGRAMAS PARA EL P CUBENSIS EN MEDIO FANG-ZHONG
EN EL DIacuteA 13 PARA CONCENTRACIONES DE 30GL GLUCOSA Y 30GL SACAROSA 113
TABLA 36 AacuteREAS OBTENIDAS DE LOS CROMATOGRAMAS PARA EL P CUBENSIS EN MEDIO FANG-ZHONG
EN EL DIacuteA 13 PARA CONCENTRACIONES DE 50GL GLUCOSA Y 50GL SACAROSA 114
TABLA 37 AacuteREAS OBTENIDAS DE LOS CROMATOGRAMAS PARA EL P CUBENSIS EN MEDIO FANG-ZHONG
EN EL DIacuteA 13 PARA CONCENTRACIONES DE 70GL GLUCOSA Y 70GL SACAROSA 115
TABLA 38 AacuteREAS OBTENIDAS DE LOS CROMATOGRAMAS PARA EL P CUBENSIS EN MEDIO FANG-ZHONG
EN EL DIacuteA 13 PARA CONCENTRACIONES DE 50GL Y GLUCOSA 50GL SACAROSA 116
TABLA 39 AacuteREAS OBTENIDAS DE LOS CROMATOGRAMAS PARA EL P CUBENSIS EN MEDIO FANG-ZHONG
EN EL DIacuteA 14 PARA CONCENTRACIONES DE 30GL GLUCOSA Y 30 GL SACAROSA 117
TABLA 40 AacuteREAS OBTENIDAS DE LOS CROMATOGRAMAS PARA EL P CUBENSIS EN MEDIO FANG-ZHONG
EN EL DIacuteA 14 PARA CONCENTRACIONES DE 50GL GLUCOSA Y 50GL SACAROSA 118
TABLA 41 AacuteREAS OBTENIDAS DE LOS CROMATOGRAMAS PARA EL P CUBENSIS EN MEDIO FANG-ZHONG
EN EL DIacuteA 14 PARA CONCENTRACIONES DE 70GL GLUCOSA Y 70GL SACAROSA 119
TABLA 42 AacuteREAS OBTENIDAS DE LOS CROMATOGRAMAS PARA EL P CUBENSIS EN MEDIO FANG-ZHONG
EN EL DIacuteA 13 PARA CONCENTRACIONES DE 50GL GLUCOSA Y 50GL SACAROSA 120
xi
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1 HONGO AGARICALES (LAMINAR) (KUO 2007) 23
FIGURA 2 ALCALOIDES DERIVADOS DEL TRIPTOFANO (MERCANO Y HASEGAWA 1991) 29
FIGURA 3 TRIPTAMINAS SIMPLES (SEIGLER 1981) 31
FIGURA 4 PSILOCIBINA Y PSILOCINA (MANDRILE ET AL 1984) 32
FIGURA 5 PSILOCYBE CUBENSIS (EAH01) CULTIVADA EN MEDIO SOacuteLIDO AGAR MALTA 34
FIGURA 6 CROMATOGRAMAS DE DOS DIFERENTES FERMENTACIONES DE P CUBENSIS QUE ILUSTRAN EL
CRITERIO DE ESCOGENCIA DEL MEJOR ENSAYO REALIZADO (A) 50 GL GLUCOSA (B) 50 GL
SACAROSA 78
FIGURA 7 CROMATOGRAMAS DE DOS DIFERENTES FERMENTACIONES DE P CUBENSIS QUE ILUSTRAN EL
CRITERIO DE ESCOGENCIA DEL MEJOR ENSAYO REALIZADO (A) 05 GL FA (B) 15 GL FA 80
FIGURA 8 MUESTRA DE BIOMASA UNA VEZ ANALIZADA MEDIANTE EL REACTIVO DE DRAGENDORFF 107
FIGURA 9 PERFIL CROMATOGRAacuteFICO (TSUJIKAWA ET AL 2003) 108
xii
LISTA DE GRAacuteFICOS
GRAacuteFICO 1 CINEacuteTICA DE CRECIMIENTO MICELIAL DE P CUBENSIS EN MEDIO SUMERGIDO (FANG-ZHONG)
UTILIZANDO TRES DIFERENTES CONCENTRACIONES DE GLUCOSA COMO FUENTE DE CARBONO (PESO
SECO) 46
GRAacuteFICO 2 CRECIMIENTO MICELIAL DE P CUBENSIS EN CULTIVO SUMERGIDO BAJO TRES
CONCENTRACIONES DE GLUCOSA 47
GRAacuteFICO 3 VALORES DE CONCENTRACIOacuteN DE BIOMASA EXPERIMENTAL Y TEOacuteRICO GRAFICADOS CON
RESPECTO AL TIEMPO PARA LAS FERMENTACIONES CON DIFERENTES CONCENTRACIONES DE
GLUCOSA 49
GRAacuteFICO 4 CINEacuteTICA DE CRECIMIENTO MICELIAL DE P CUBENSIS EN MEDIO SUMERGIDO (FANG-ZHONG)
UTILIZANDO DIFERENTES CONCENTRACIONES DE SACAROSA COMO FUENTE DE CARBONO (PESO
SECO) 50
GRAacuteFICO 5 CRECIMIENTO MICELIAL PARA TRES DIFERENTES CONCENTRACIONES DE SACAROSA 52
GRAacuteFICO 6 VALORES DE CONCENTRACIOacuteN DE BIOMASA EXPERIMENTAL Y TEOacuteRICO GRAFICADOS CON
RESPECTO AL TIEMPO PARA LAS FERMENTACIONES CON DIFERENTES CONCENTRACIONES DE
SACAROSA 54
GRAacuteFICO 7 CRECIMIENTO MICELIAL PARA DOS DIFERENTES FUENTES DE CARBONO (GLUCOSA Y
SACAROSA) 56
GRAacuteFICO 8 CINEacuteTICA DE CRECIMIENTO MICELIAL DE P CUBENSIS EN MEDIO SUMERGIDO (FANG-ZHONG)
UTILIZANDO DIFERENTES CONCENTRACIONES DE FA Y 50 GL DE GLUCOSA COMO FUENTE DE
CARBONO (PESO SECO) 57
GRAacuteFICO 9 CRECIMIENTO MICELIAL PARA GLUCOSA A UNA CONCENTRACIOacuteN DE 50 GL Y TRES
DIFERENTES CONCENTRACIONES DE FA 59
GRAacuteFICO 10 VALORES DE CONCENTRACIOacuteN DE BIOMASA EXPERIMENTAL Y TEOacuteRICO GRAFICADOS CON
RESPECTO AL TIEMPO PARA LAS FERMENTACIONES CON DIFERENTES CONCENTRACIONES DE FA Y
50 GL DE GLUCOSA 61
GRAacuteFICO 11 CINEacuteTICA DE CONSUMO DE SUSTRATO POR PARTE DEL P CUBENSIS EN MEDIO SUMERGIDO
UTILIZANDO DIFERENTES CONCENTRACIONES DE GLUCOSA COMO FUENTE DE CARBONO 62
GRAacuteFICO 12 CINEacuteTICA DE CONSUMO DE SUSTRATO POR PARTE DEL P CUBENSIS EN MEDIO SUMERGIDO
UTILIZANDO DIFERENTES CONCENTRACIONES DE SACAROSA COMO FUENTE DE CARBONO 64
GRAacuteFICO 13 CONSUMO DE SUSTRATO PARA CADA UNA DE LAS FUENTES DE CARBONO UTILIZADAS 66
GRAacuteFICO 14 CINEacuteTICA DE CONSUMO DE SUSTRATO POR PARTE DEL P CUBENSIS EN MEDIO SUMERGIDO
UTILIZANDO 50 GL DE GLUCOSA COMO FUENTE DE CARBONO Y DIFERENTES CONCENTRACIONES DE
FA 67
GRAacuteFICO 15 CONSUMO DE SUSTRATO PARA CADA UNA DE LAS CONCENTRACIONES DE FA UTILIZADAS 68
GRAacuteFICO 16 CINEacuteTICA DE CONSUMO DE PROTEIacuteNA POR PARTE DEL P CUBENSIS EN MEDIO SUMERGIDO
UTILIZANDO DIFERENTES CONCENTRACIONES DE GLUCOSA COMO FUENTE DE CARBONO 70
GRAacuteFICO 17 CINEacuteTICA DE CONSUMO DE PROTEIacuteNA POR PARTE DEL P CUBENSIS EN MEDIO SUMERGIDO
UTILIZANDO DIFERENTES CONCENTRACIONES DE SACAROSA COMO FUENTE DE CARBONO 71
GRAacuteFICO 18 CONSUMO DE PROTEIacuteNA PARA CADA UNA DE LAS FUENTES DE CARBONO UTILIZADAS 73
xiii
GRAacuteFICO 19 CINEacuteTICA DE CONSUMO DE PROTEIacuteNA POR PARTE DEL P CUBENSIS EN MEDIO SUMERGIDO
UTILIZANDO 50 GL DE GLUCOSA COMO FUENTE DE CARBONO Y DIFERENTES CONCENTRACIONES DE
FA 74
GRAacuteFICO 20 CONSUMO DE PROTEIacuteNA PARA LOS ENSAYOS CON Y SIN FA 75
GRAacuteFICO 21 AacuteREA DEL COMPUESTO OBTENIDO DE P CUBENSIS EN TIEMPO DE RETENCIOacuteN ENTRE 62 Y
72 MINUTOS PARA LAS DOS FUENTES DE CARBONO 77
GRAacuteFICO 22 AacuteREA DEL COMPUESTO OBTENIDO DE P CUBENSIS EN TIEMPO DE RETENCIOacuteN ENTRE 62 Y
72 MINUTOS EN LOS UacuteLTIMOS TRES DIacuteAS DE LA FERMENTACIOacuteN CON FA Y GLUCOSA 79
GRAacuteFICO 23 AacuteREA DEL COMPUESTO OBTENIDO DE P CUBENSIS EN TIEMPO DE RETENCIOacuteN ENTRE 62 Y
72 MINUTOS PARA CADA UNA DE LAS FUENTES DE CARBONO UTILIZADAS 82
GRAacuteFICO 24 AacuteREA DEL COMPUESTO OBTENIDO DE P CUBENSIS EN TIEMPO DE RETENCIOacuteN ENTRE 62 Y
72 MINUTOS PARA CADA UNA DE LAS CONCENTRACIONES DE FA UTILIZADAS 85
GRAacuteFICO 25 CROMATOGRAMAS DEL DIacuteA 12 PARA EL P CUBENSIS CULTIVADO EN MEDIO SUMERGIDO
FANG-ZHONG CON DOS DIFERENTES TIPOS DE SUSTRATOS (A) 30 GL GLUCOSA (B) 30 GL SACAROSA
109
GRAacuteFICO 26 CROMATOGRAMAS DEL DIacuteA 12 PARA EL P CUBENSIS CULTIVADO EN MEDIO SUMERGIDO
FANG-ZHONG CON DOS DIFERENTES TIPOS DE SUSTRATOS (A) 50 GL GLUCOSA (B) 50 GL SACAROSA
110
GRAacuteFICO 27 CROMATOGRAMAS DEL DIacuteA 12 PARA EL P CUBENSIS CULTIVADO EN MEDIO SUMERGIDO
FANG-ZHONG CON DOS DIFERENTES TIPOS DE SUSTRATOS (A) 50 GL GLUCOSA (B) 50 GL SACAROSA
111
GRAacuteFICO 28 CROMATOGRAMA DEL DIacuteA 12 PARA EL P CUBENSIS CULTIVADO EN MEDIO SUMERGIDO
FANG-ZHONG CON FUENTE DE CARBONO GLUCOSA Y ADICIOacuteN DE FENILALANINA EN TRES
CONCENTRACIONES (A) 05 GL FA (B) 1 GL FA (C) 15GL FA 112
GRAacuteFICO 29 CROMATOGRAMAS DEL DIacuteA 13 PARA EL P CUBENSIS CULTIVADO EN MEDIO SUMERGIDO
FANG-ZHONG CON DOS DIFERENTES TIPOS DE SUSTRATOS (A) 30 GL GLUCOSA (B) 30 GL SACAROSA
113
GRAacuteFICO 30 CROMATOGRAMAS DEL DIacuteA 13 PARA EL P CUBENSIS CULTIVADO EN MEDIO SUMERGIDO
FANG-ZHONG CON DOS DIFERENTES TIPOS DE SUSTRATOS (A) 50 GL GLUCOSA (B) 50 GL SACAROSA
114
GRAacuteFICO 31 CROMATOGRAMAS DEL DIacuteA 13 PARA EL P CUBENSIS CULTIVADO EN MEDIO SUMERGIDO
FANG-ZHONG CON DOS DIFERENTES TIPOS DE SUSTRATOS (A) 70 GL GLUCOSA (B) 70 GL SACAROSA
115
GRAacuteFICO 32 CROMATOGRAMAS DEL DIacuteA 12 PARA EL P CUBENSIS CULTIVADO EN MEDIO SUMERGIDO
FANG-ZHONG CON FUENTE DE CARBONO GLUCOSA Y ADICIOacuteN DE FENILALANINA EN TRES
CONCENTRACIONES (A) 05 GL FA (B) 1 GL FA (C) 15GL FA 116
GRAacuteFICO 33 CROMATOGRAMAS DEL DIacuteA 14 PARA EL P CUBENSIS CULTIVADO EN MEDIO SUMERGIDO
FANG-ZHONG CON DOS DIFERENTES TIPOS DE SUSTRATOS (A) 30 GL GLUCOSA (B) 30 GL SACAROSA
117
GRAacuteFICO 34 CROMATOGRAMAS DEL DIacuteA 14 PARA EL P CUBENSIS CULTIVADO EN MEDIO SUMERGIDO
FANG-ZHONG CON DOS DIFERENTES TIPOS DE SUSTRATOS (A) 50 GL GLUCOSA (B) 50 GL SACAROSA
118
xiv
GRAacuteFICO 35 CROMATOGRAMAS DEL DIacuteA 14 PARA EL P CUBENSIS CULTIVADO EN MEDIO SUMERGIDO
FANG-ZHONG CON DOS DIFERENTES TIPOS DE SUSTRATOS (A) 70 GL GLUCOSA (B) 70 GL SACAROSA
119
GRAacuteFICO 36 CROMATOGRAMAS DEL DIacuteA 12 PARA EL P CUBENSIS CULTIVADO EN MEDIO SUMERGIDO
FANG-ZHONG CON FUENTE DE CARBONO GLUCOSA Y ADICIOacuteN DE FENILALANINA EN TRES
CONCENTRACIONES (A) 05 GL FA (B) 1 GL FA (C) 15GL FA (A) 05 GL FA (B) 1 GL FA (C)
15GL FA 120
xv
LISTA DE ECUACIONES
ECUACIOacuteN 1 ECUACIOacuteN LINEALIZADA DEL MODELO LOGIacuteSTICO 38
ECUACIOacuteN 2 VALORES TEOacuteRICOS DE BIOMASA EN EL TIEMPO 39
xvi
LISTAS DE ANEXOS
ANEXO 1 ANAacuteLISIS DE VARIANZA (ANOVA) PARA EL CRECIMIENTO DE BIOMASA DE LAS
FERMENTACIONES CON GLUCOSA _____________________________________________________ 90
ANEXO 2 ANAacuteLISIS DE VARIANZA (ANOVA) PARA EL CRECIMIENTO DE BIOMASA DE LAS
FERMENTACIONES CON SACAROSA ____________________________________________________ 91
ANEXO 3 ANAacuteLISIS DE VARIANZA (ANOVA) PARA EL CRECIMIENTO DE BIOMASA DE LAS
FERMENTACIONES CON GLUCOSA Y SACAROSA __________________________________________ 92
ANEXO 4 ANAacuteLISIS DE VARIANZA (ANOVA) PARA EL CRECIMIENTO DE BIOMASA DE LAS
FERMENTACIONES CON GLUCOSA 50 GL Y FA ___________________________________________ 93
ANEXO 5 ANAacuteLISIS DE VARIANZA (ANOVA) PARA EL CONSUMO DE SUSTRATO EN LAS FERMENTACIONES
SIN FA ____________________________________________________________________________ 94
ANEXO 6 ANAacuteLISIS DE VARIANZA (ANOVA) PARA EL CONSUMO DE SUSTRATO EN LAS FERMENTACIONES
CON FA ___________________________________________________________________________ 95
ANEXO 7 ANAacuteLISIS DE VARIANZA (ANOVA) PARA EL CONSUMO DE PROTEIacuteNA EN LAS FERMENTACIONES
SIN FA ____________________________________________________________________________ 96
ANEXO 8 ANAacuteLISIS DE VARIANZA (ANOVA) PARA EL CONSUMO DE PROTEIacuteNA EN LAS FERMENTACIONES
CON FA ___________________________________________________________________________ 97
ANEXO 9 ANAacuteLISIS DE VARIANZA (ANOVA) PARA LA PRODUCCIOacuteN DE PSILOCIBINA EN LAS
FERMENTACIONES SIN FA ____________________________________________________________ 98
ANEXO 10 ANAacuteLISIS DE VARIANZA (ANOVA) PARA LA PRODUCCIOacuteN DE PSILOCIBINA EN LAS
FERMENTACIONES CON FA ___________________________________________________________ 99
ANEXO 11 ANAacuteLISIS DE VARIANZA (ANOVA) PARA LA CUANTIFICACIOacuteN PORCENTUAL DE PSILOCIBINA EN
LAS FERMENTACIONES SIN FA _______________________________________________________ 100
ANEXO 12 ANAacuteLISIS DE VARIANZA (ANOVA) PARA LA CUANTIFICACIOacuteN PORCENTUAL DE PSILOCIBINA EN
LAS FERMENTACIONES CON FA ______________________________________________________ 101
ANEXO 13 DETERMINACIOacuteN DE CONSUMO DE AZUacuteCARES POR EL MEacuteTODO DE DNS (AacuteCIDO
DINITROSALICIacuteLICO) ________________________________________________________________ 102
ANEXO 14 CINEacuteTICA DE CONSUMO DE SUSTRATO ___________________________________________ 104
ANEXO 15 DETERMINACIOacuteN DE CONSUMO DE PROTEIacuteNAS POR EL MEacuteTODO DE LOWRY ____________ 105
ANEXO 16 CINEacuteTICA CONSUMO DE PROTEIacuteNA ______________________________________________ 106
ANEXO 17 PRUEBA DE REACTIVO DE DRAGENDORFF _________________________________________ 107
ANEXO 18 BARRIDO ESPECTRAL PARA EL PSILOCYBE CUBENSIS _________________________________ 108
ANEXO 19 CROMATOGRAMAS (HPLC) DEL DIacuteA 12 DE FERMENTACIOacuteN ___________________________ 109
ANEXO 20 CROMATOGRAMAS (HPLC) DEL DIacuteA 13 DE FERMENTACIOacuteN __________________________ 113
ANEXO 21 CROMATOGRAMAS (HPLC) DEL DIacuteA 14 DE FERMENTACIOacuteN __________________________ 117
xvii
RESUMEN
El Psilocybe cubensis es un hongo de gran importancia a nivel industrial gracias a
la presencia de una sustancia llamada Psilocibina en su cuerpo fructiacutefero
Dicho alcaloide derivado de la triptamina es muy similar al neurotransmisor
serotonina el cual es responsable de la percepcioacuten sensorial la regulacioacuten de la
temperatura el inicio del reposo nocturno del hiacutegado y los rintildeones Por tal motivo
este estudio se enfocoacute en la produccioacuten de la Psilocibina mediante el cultivo del P
cubensis en medio sumergido (Fang-Zhong)
Se evaluaron los efectos de dos fuentes de carbono (glucosa y sacarosa) a tres
concentraciones diferentes en cultivo sumergido para Psilocybe cubensis con el
fin de determinar la incidencia de eacutestas en la produccioacuten de biomasa y en la
produccioacuten y presencia de Psilocibina alcaloide de intereacutes Para las
concentraciones de glucosa de 30 gL 50 gL y 70 gL se presentoacute un crecimiento
maacuteximo de biomasa de 048 gL 055 gL y 062 gL y un porcentaje de alcaloide
de 6065 wv 7396 wv y 6733 wv respectivamente Esto uacuteltimo si se
asume que el tiempo de retencioacuten oscila entre 62 y 72 minutos contaacutendose con
una fase moacutevil de HCOONH4 en una columna C18 Mientras que para las mismas
concentraciones de sacarosa se presentoacute un crecimiento maacuteximo de biomasa de
026 gL 045 gL y 057 gL con porcentajes del compuesto presente entre el
rango de 62 y 72 minutos de 3664 wv 5857 wv y 5583 wv
respectivamente
Una vez realizada la investigacioacuten se encontroacute que las diferencias existentes en
cuanto a la cantidad de biomasa generada con respecto al tipo de sustrato
utilizado no fueron significativas es decir era irrelevante si se utilizaba glucosa o
sacarosa como principal fuente de carbono para la fermentacioacuten del P cubensis
xviii
en medio sumergido con el fin de obtener biomasa sin embargo se hallaron
diferencias significativas con respecto a las diferentes concentraciones empleadas
de dichas fuentes de carbono
Al analizar las muestras mediante cromatografiacutea liacutequida de alta eficiencia (HPLC)
se determinoacute que el medio que conteniacutea 50 gL de glucosa era el deseado debido
a que fue en eacuteste donde se presentaron picos maacutes definidos mostrando una mejor
resolucioacuten del compuesto Adicionalmente presentoacute un buen crecimiento micelial
Una vez elegido dicho criterio se evaluoacute el efecto que teniacutea la adicioacuten de un
aminoaacutecido llamado Fenilalanina (FA) al medio que conteniacutea 50 gL de glucosa
con el fin de determinar si eacuteste teniacutea alguna incidencia positiva en la produccioacuten de
biomasa y en la generacioacuten del alcaloide de intereacutes cabe resaltar que se utilizaron
diferentes concentraciones de FA correspondientes a 05 gL 10 gL y 15 gL
Finalizados dichos ensayos se obtuvieron valores de crecimiento de biomasa
maacutexima de 106 gL 108 gL y 101 gL y un porcentaje de aacuterea de 7549 wv
6236 wv y 2721 wv respectivamente
Es necesario hacer hincapieacute en que las diferencias obtenidas mediante el anaacutelisis
estadiacutestico entre cada una de las concentraciones de FA con respecto a la
generacioacuten de biomasa y la produccioacuten del compuesto no fueron significativas lo
que llevoacute a elegir una concentracioacuten de 05 gL de FA debido a que fue la menor
cantidad utilizada de este compuesto durante la investigacioacuten suponieacutendose asiacute
una disminucioacuten en los costos de materia prima
Palabras claves
Psilocybe cubensis Psilocibina Alcaloide HPLC Cultivo Sumergido Fuentes de
Carbono Fenilalanina
19
INTRODUCCIOacuteN
Los hongos son una rica fuente de productos naturales con una alta actividad
bioloacutegica Desafortunadamente el cultivo de eacutestos en cuerpo fructiacutefero toma
varios meses disminuyendo su calidad debido a los cambios climaacuteticos y plagas
por tal razoacuten se implementoacute la metodologiacutea de medio sumergido la cual es
prometedora gracias a una alta productividad de compuestos bioactivos (Arora
1986)
El Geacutenero Psilocybe pertenece al Reino Fungiacute con un Phylum Basidiomicota
una Clase Homobasidiomicetes un Orden Agaricales una Familia Strofariaceae
(Paris y Hurabielle 1981)
Dicho geacutenero es considerado de gran importancia a nivel mundial debido a que su
cuerpo fructiacutefero y biomasa micelial contienen Psilocibina la cual posee un alto
valor para la industria farmaceacuteutica por su uso en la elaboracioacuten de productos
antidepresivos Este alcaloide derivado de FA cuenta con una estructura muy
similar al neurotransmisor segregado por el cerebro llamado serotonina que
controla el estado de aacutenimo el suentildeo el hiacutegado y los rintildeones (Mandrile et al
1984) esta caracteriacutestica le otorga la gran importancia a la Psilocibina en el
mercado puesto que tiene un alto impacto en la sociedad como ayudante
antidepresivo debido a que no todas las personas segregan la cantidad necesaria
(10 mg con liacutemites que variacutean desde 5 a 20 mg) de serotonina (Mandrile et al
1984) Adicionalmente se estaacute empleando como una gran ayuda para la
disminucioacuten de la adiccioacuten a sustancias como heroiacutena y cocaiacutena gracias a que
este alcaloide no genera dependencia (Lee et al 2004)
Debido a que su consumo puede generar alucinaciones era consumido por las
culturas aboriacutegenes centroamericanas con el fin de realizar manifestaciones
20
religiosas Su uso se remonta a maacutes de 3500 antildeos y era nombrado por los
aztecas como ―Teonunaltl que significa ―carne de dioses (Mandrile et al 1984)
La alternativa que se utilizoacute durante esta investigacioacuten fue el cultivo del P
cubensis mediante medio sumergido debido principalmente a las notables
ventajas frente a los sistemas convencionales que eacuteste posee entre las cuales se
destacan la disminucioacuten del tiempo para la obtencioacuten de la biomasa (14 diacuteas) y la
reduccioacuten de los costos de obtencioacuten (Lee et al 2004) De acuerdo a lo
dimensionado anteriormente este estudio estaba orientado primordialmente a la
buacutesqueda de alternativas que permitieran la produccioacuten de biomasa de forma
raacutepida y confiable
Con el fin de llevar a cabo lo dicho anteriormente se pretendioacute evaluar el efecto
del uso de dos diferentes fuentes de carbono en este caso glucosa y sacarosa en
el crecimiento micelial de la cepa P cubensis
21
OBJETIVOS
GENERAL
Evaluar el efecto de la fuente de carbono en el crecimiento micelial de una
cepa Psilocybe sp
ESPECIacuteFICOS
Evaluar la cineacutetica de crecimiento de la cepa Psilocybe cubensis en los
diferentes medios de cultivo sumergido mediante la cuantificacioacuten de
biomasa por medio de la metodologiacutea de peso seco
Evaluar el consumo de sustrato para los diferentes ensayos por medio de
teacutecnicas espectrofotomeacutetricas
Determinar la presencia de Psilocibina mediante el uso del reactivo de
Dragendorff
22
1 MARCO TEOacuteRICO
11 CONCEPTOS GENERALES DE HONGOS
Los hongos son organismos eucariotas que no contienen clorofila con nutricioacuten
por absorcioacuten generalmente con reproduccioacuten sexual y asexual el cuerpo
consiste generalmente de filamentos ramificados con pared celular quitinosa
(Miles y Chang 1999)
Constituyen uno de los grupos de organismos maacutes importantes para la vida del
hombre ya que son los responsables de gran parte de la descomposicioacuten de la
materia orgaacutenica aumentando su disponibilidad en el suelo pueden ser
comestibles venenosos o psicotroacutepicos muchos son patoacutegenos otros producen
ciertas sustancias beneficiosas o intervienen en procesos de elaboracioacuten de
algunos comestibles (Miles y Chang 1999)
111 Hongos laminares (Agaricales)
El orden Agaricales tambieacuten conocido como Euagaricales es el mayor orden de
setas y hongos que incluye maacutes de la mitad de todas las especies conocidas de la
clase Homobasidiomycetes (Hibbett et al 1997 Hibbett y Thorn 2001) Maacutes de
9000 especies y alrededor de 350 geacuteneros se han atribuido a este orden que
contiene 26 familias (Kirk et al 2001) Un consenso de mayor nivel de
clasificacioacuten de los Agaricales ha sido difiacutecil de lograr debido a la competencia de
sistemas que restringen geacuteneros y familias (o incluso orden) de diferentes
maneras (Bas 1998 Juumllich 1981 Kirk et al 2001 Kuumlhner 1980 Singer 1986)
23
La base para la clasificacioacuten de los hongos fue construida por Fries (1874) quien
hizo hincapieacute en las caracteriacutesticas macroscoacutepicas como la textura del tallo la
separacioacuten de los filamentos (laminas) presencia o ausencia de velo y color de las
esporas
Posteriormente dividioacute los hongos Agaricales en varias especies de acuerdo al
color de las esporas depositadas las cuales pueden ser de color blanco rosado
marroacuten puacuterpura ndash marroacuten y negro El sistema macroscoacutepico de Fries que
reconocioacute inicialmente 12 geacuteneros de hongos carnosos que forman los hongos es
taxonoacutemicamente praacutectico Eacuteste fue relativamente invariable hasta que Fayod
(1989) estudioacute la anatomiacutea y las caracteriacutesticas microscoacutepicas de muchos
Agaricales reconociendo 108 geacuteneros (Arora 1986)
Al igual que todas las setas los hongos laminares son faacutebricas de esporas
creados con el uacutenico propoacutesito de fabricar esporas microscoacutepicas para dejarse
llevar por las corrientes de aire y con suerte caer en un lugar adecuado en la
tierra para germinar y comenzar un nuevo organismo Las probabilidades de que
cualquier individuo que tiene esporas de este tipo tenga suerte son tan bajas que
el hongo produce millones de esporas para compensar esto En las laacuteminas se
encuentran numerosas esporas las cuales aumentan considerablemente el
nuacutemero de esporas que el hongo puede producir Ambos lados de cada laacutemina
estaacute cubierta con esporas microscoacutepicas (Kuo 2007) A continuacioacuten se muestra
de manera ilustrativa en la figura 1 las laacuteminas que poseen los hongos Agaricales
en las cuales se da la formacioacuten de las esporas
Figura 1 Hongo Agaricales (Laminar) (Kuo 2007)
24
12 MEDIOS DE CULTIVO
Uno de los sistemas maacutes importantes para la identificacioacuten de microorganismos es
observar su crecimiento en sustancias alimenticias artificiales preparadas en el
laboratorio El material alimenticio en el que crecen los microorganismos es el
medio de cultivo (Garciacutea 1995)
Para que los microorganismos crezcan adecuadamente en un medio de cultivo
artificial eacuteste debe reunir una serie de condiciones como lo son temperatura
grado de humedad y presioacuten asiacute como un grado correcto de acidez o alcalinidad
Un medio de cultivo contiene los nutrientes y factores de crecimiento necesarios
para que el microorganismo se desarrolle correctamente y debe estar exento de
cualquier tipo de microorganismo que pueda generar contaminacioacuten (Garciacutea
1995)
121 Tipos de medios de cultivo
En la actualidad existen diversos tipos de medio de cultivo si se centra en la
composicioacuten eacutestos pueden ser medios sinteacuteticos que contienen fuente de
carbono fuente de nitroacutegeno sales que suplan los iones y demaacutes elementos tales
como estimuladores del crecimiento medios complejos que contienen ingredientes
tales como extracto de levadura peptona infusioacuten de cerebro etc ricos en
nutrientes medios de enriquecimiento siendo estos complejos con aditivos
adicionales para favorecer asiacute al crecimiento y desarrollo de determinados
microorganismos medios selectivos los cuales son disentildeados para favorecer el
crecimiento especiacutefico de un microorganismo determinado o un grupo
microbiano medios diferenciales que proporcionan la distincioacuten microbiana de una
mezcla por sus propiedades diferenciales de crecimiento en dichos medios
medios de mantenimiento siendo disiacutemiles de los de crecimiento oacuteptimo por el
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crecimiento raacutepido y proliacutefico que deriva en la muerte raacutepida de las ceacutelulas (Garciacutea
1995)
Atendiendo a su estado los medios de cultivo pueden presentarse como medios
sumergidos y medios soacutelidos que contienen agar que gelifica por debajo de 45
degC y cuya concentracioacuten en su uso es de 15 y medios semisoacutelidos que contiene
un agar a una concentracioacuten de 07 (Garciacutea 1995)
121 Medio sumergido
Debido a que cultivar el cuerpo fructiacutefero toma varios meses y se dificulta el control
de calidad del producto final porque se estaacute sujeto a los cambios permanentes del
clima y las plagas se ha empleado la metodologiacutea de medio sumergido la cual es
una alternativa muy prometedora para la produccioacuten eficiente del micelio y de los
metabolitos (Lindequist y Niedermeyer 2005)
Dicha forma es la mejor para producir extraer y purificar metabolitos de un cultivo
de hongo ya que facilita una mayor produccioacuten de biomasa en menor tiempo y
de mayor calidad que el cultivo en medio soacutelido ademaacutes facilita la dispersioacuten y
adaptacioacuten del hongo y reduce los vectores de contaminacioacuten De igual forma un
cultivo de esta iacutendole es la opcioacuten maacutes viable si se quiere escalar procesos
fermentativos en aras de desarrollar mercados como en este caso el de
metabolitos medicinales (Navarro et al 1998)
A su vez el uso de cultivo sumergido puede beneficiar la produccioacuten de muchos
metabolitos secundarios y disminuir los costos de produccioacuten por reducir las
labores que involucran los meacutetodos de etapas soacutelidas (Domiacutenguez y Webb 2003)
Los metabolitos bioactivos de los hongos pueden ser potencialmente producidos a
nivel industrial mediante el uso de la metodologiacutea de cultivo sumergido pero el
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eacutexito a escala comercial depende del costo comparado con la tecnologiacutea existente
y la ventaja econoacutemica que la industria puede ver usando este meacutetodo El uso de
la tecnologiacutea puede ser facilitada por el aumento en el rendimiento de la
produccioacuten y el desarrollo del sistema (Hwang et al 2004)
El cultivo de hongos sumergidos se caracteriza por un aumento en la viscosidad
del caldo con el tiempo debido a uno o maacutes factores tales como el aumento de la
concentracioacuten de ceacutelulas los cambios de la morfologiacutea del crecimiento o la
produccioacuten de productos extracelulares que alteran el caraacutecter reoloacutegico de la
cultura del liacutequido El aumento en la viscosidad puede ser visto como un fenoacutemeno
indeseable pero inevitable ya que causan dificultades en el suministro de oxiacutegeno
en la eliminacioacuten de dioacutexido de carbono y en posibles problemas de agitacioacuten
(Hwang et al 2004)
13 ALCALOIDES
131 Generalidades
La diversidad estructural y la variedad en la actividad bioloacutegica hacen de los
alcaloides como tambieacuten de los antibioacuteticos los grupos maacutes importantes entre las
sustancias naturales de intereacutes terapeacuteutico (Paris y Hurabielle 1981)
Se han aislado principalmente en plantas superiores y se han encontrado en maacutes
de 100 familias de Faneroacutegamas (aquellas plantas que se reproducen por semillas
producidas en sus inflorescencias) Su actividad bioloacutegica a nivel del sistema
nervioso dio pie a las primeras investigaciones siendo los alcaloides las primeras
sustancias naturales estudiadas (Paris y Hurabielle 1981)
El teacutermino alcaloide propuesto por el farmaceacuteutico W Meissner en 1819 se aplicoacute
a los compuestos de origen vegetal con propiedades alcalinas este caraacutecter
baacutesico es debido a la presencia de nitroacutegeno amiacutenico en su estructura Los
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alcaloides se pueden considerar como ―Un compuesto orgaacutenico de origen natural
nitrogenado derivados generalmente de aminoaacutecidos maacutes o menos baacutesico de
distribucioacuten restringida con propiedades farmacoloacutegicas importantes a dosis bajas
y que responden a reacciones comunes de precipitacioacuten (Paris y Hurabielle
1981)
132 Propiedades fisicoquiacutemicas
Los alcaloides tienen masas moleculares que variacutean entre 100 y 9000 gmol son
casi siempre incoloros son normalmente soacutelidos a temperatura ambiente a
excepcioacuten de los alcaloides no oxigenados Los alcaloides son poco solubles en
agua gracias a su caraacutecter baacutesico dicho caraacutecter se debe al par de electrones
libres del nitroacutegeno (Paris y Hurabielle 1981)
En la naturaleza se encuentran en forma de sales generalmente En las plantas
se consideraba que eran productos obtenidos durante la extraccioacuten y poco
solubles en disolventes tiacutepicos de extraccioacuten por su polaridad Son solubles en
disolventes orgaacutenicos como cloroformo etanol metanol acetato de etilo eacuteter
benceno En forma de sales son solubles en agua excepto las sales de berberina
(Paris y Hurabielle 1981)
Todos los alcaloides son activos a la luz polarizada Presentan una fluorescencia
caracteriacutestica bajo la luz UV o IR dando lugar a espectros caracteriacutesticos (Paris y
Hurabielle 1981)
133 Reconocimiento de los alcaloides
Las teacutecnicas de reconocimiento son basadas en la capacidad que tienen los
alcaloides en estado de sal (extractos aacutecidos) de combinarse con el yodo y
metales pesados como bismuto mercurio tungsteno formando precipitados se
28
utilizan reactivos generales para detectar alcaloides como reactivo de Wagner
reactivo de Mayer reactivo de Dragendorff reactivo de Hager reactivo de
Bertrand reactivo de Ehrlich y reactivo de Vitali-Morin (Paris y Hurabielle 1981)
134 Clasificacioacuten de los alcaloides
Habitualmente los alcaloides se han clasificado en funcioacuten de su estructura
distinguieacutendose principalmente los compuestos heterociacuteclicos de los no
heterociacuteclicos Actualmente existen varias formas de clasificarlos (Bruneton
1987) entre ellas se pueden distinguir
1341 Alcaloides alifaacuteticos
a Derivados de la ornitina (pirrolidinas tropaacutenicos pirrolizidiacutenicos)
b Derivados de la lisina (piperidinas quinolizidiacutenicos)
1342 Alcaloides de origen diverso
a Alcaloides terpeacutenicos y esteroidales
b Alcaloides diversos (purinas macrociclos etc)
1343 Alcaloides aromaacuteticos
a Derivados del aacutecido nicotiacutenico (piridinas)
b Derivados de la fenilalanina y tirosina (isoquinoleinas)
c Derivados del triptofano (indoacutelicos quinoleinas)
d Derivados de la histidina (imidazoles)
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Alcaloides derivados del triptofano (Alcaloides Indoacutelicos)
Desde el punto de vista farmacoloacutegico ha habido mucho intereacutes sobre las bases
que contienen el nuacutecleo indoacutelico a raiacutez del descubrimiento de la actividad
alucinoacutegena del LSD asiacute como la actividad sedante de la reserpina aislada del
geacutenero Rauwolfia El auge del estudio fitoquiacutemico ocurrioacute en la deacutecada de los 60 y
se dirigiacutea principalmente a la familia Apocynaceae (Mercano y Hasegawa 1991)
Existen unos 800 alcaloides de este tipo distribuidos principalmente en la familia
Apocynaceae (geacuteneros Rauwolfia Aspidos-perma Strychnos y Vinca) menos
frecuentes en hongos y familias como Leguminoseae Malphigiaceae Rubiaceae y
Rutaceae donde los alcaloides presentan el grupo indoacutelico sencillo (Mercano y
Hasegawa 1991)
El triptofano es el precursor de estos alcaloides los cuales se clasifican en
triptaminas y en no triptaminas las triptaminas a su vez se subdividen en b-
carbolinas y en indoleninas y pueden ser triptaminas simples o triptaminas
complejas y estas pueden ser isopreacutenicas o no isopreacutenicas (Mercano y Hasegawa
1991) La figura 2 muestra la estructura quiacutemica del triptofano triptamina y sus
divisiones
Figura 2 Alcaloides derivados del Triptofano (Mercano y Hasegawa 1991)
30
Triptaminas simples
Las triptaminas simples juegan un importante papel en la cultura indiacutegena de
Ameacuterica por sus efectos alucinoacutegenos y extaacuteticos en sus ceremonias maacutegico
religiosas (Furst 1994) Se han encontrado en hongos alucinoacutegenos de
Mesoameacuterica del geacutenero Psilocybe Stropharia y Conocybe (―teonacatl o ―carne
de los dioses) usados por los indios Aztecas en sus ceremonias religiosas desde
hace maacutes de 1700 antildeos Se han encontrado en estos hongos los alcaloides
alucinoacutegenos la Psilocina y la Psilocibina que al ingerirlos produce diferentes
sensaciones auditivas y visuales relajacioacuten muscular depresiones y euforias
alternadas (Mercano y Hasegawa 1991)
La serotonina que juega un importante papel en la actividad neuronal se
encuentra tambieacuten en vegetales Se ha aislado en el pericarpio del banano el cual
seco cuando es fumado actuacutea como un alucinoacutegeno ligero (Seigler 1981)
De las glaacutendulas paroacutetidas del sapo comuacuten Bufo vulgaris se aiacutesla la bufotenina
derivado N-dimetilado de la serotonina que tambieacuten es el principio activo del Yopoacute
polvo de las semillas de Anadenanthera peregrina (Piptadenia peregrina)
Leguminoseae y especies del geacutenero Virola (Myristicaceae) que contiene tambieacuten
triptaminas son mezclados con cenizas e inhalados por medio de tubos de bambuacute
por los indiacutegenas del Orinoco en ceremonias maacutegico religiosas produciendo
alucinacioacuten e incoordinacioacuten motriz (Seigler 1981)
En la figura 3 se observan las estructuras de aquellos compuestos que estaacuten
clasificados como triptaminas simples
31
Figura 3 Triptaminas simples (Seigler 1981)
13 PSILOCIBINA Y PSILOCINA
La Psilocibina y la Psilocina son bioloacutegicamente sintetizadas en los hongos
pertenecientes a los geacuteneros de Psilocybe (Bigwood y Beug 1982 Wurst et al
1984)
La Psilocibina y la Psilocina se han identificado en todo el mundo en una variedad
de setas que son llamados hongos maacutegicos La ingestioacuten de pequentildeas
cantidades de alucinoacutegenos provoca el eacutextasis La actividad alucinoacutegena de la
Psilocibina es relativamente maacutes baja que la de la Psilocina Sin embargo la
Psilocibina se convierte faacutecilmente en Psilocina (componente activo principal) en
los sistemas bioloacutegicos Asiacute el desarrollo de un meacutetodo de determinacioacuten de la
Psilocibina es importante lo misma que la de la Psilocina (Kimie et al 2005)
La hidroacutelisis de la Psilocibina se consigue saturando con anhiacutedido carboacutenico una
solucioacuten acuosa de Psilocibina (para eliminar el oxiacutegeno del aire y calentaacutendola)
obteniendo asiacute una moleacutecula de 4hidroxi-dimetiltriptamina y una moleacutecula de aacutecido
fosfoacuterico (Mandrile et al 1984)
Como todos los faacutermacos derivados del indol estas sustancias han despertado
intereacutes porque se sospechoacute la posibilidad de que algunas de ellas se formen en el
32
organismo y que en ciertas psicosis especialmente en la esquizofrenia se
produzcan elevados niveles sanguiacuteneos que ocasionan algunos de los siacutentomas
(Mandrile et al 1984)
La figura 4 muestra la estructura quiacutemica de alcaloides como la Psilocibina y
Psilocina
Figura 4 Psilocibina y Psilocina (Mandrile et al 1984)
131 Antecedentes acerca de la obtencioacuten de Psilocibina y Psilocina
Una gran variedad de meacutetodos cromatograacuteficos para la determinacioacuten de
Psilocibina y Psilocina presentes en las incautaciones de hongos se han
publicado La cromatografiacutea de capa fina es utilizada debido a que eacutesta es muy
apropiada para la deteccioacuten de sustancias derivadas del triptofano (Brown et al
1972 Tanimukai 1967 Beug y Bigwood 1981) Aun asiacute meacutetodos que involucran
tanto la cromatografiacutea de alta eficiencia (HPLC) como la deteccioacuten fotomeacutetrica de
UV (Beug y Bigwood 1981 Wurst et al 1984 Borner y Brenneisen 1987 Perkal
et al 1980 Vanhaelen-Faestreacute y Vanhaelen 1984 Thomson 1980 White 1979
Sottolano y Lurie 1983) fueron establecidas y optimizadas para la cuantificacioacuten
de Psilocibina
Durante los uacuteltimos antildeos se han venido utilizando diferentes tipos de columna y
fase moacutevil con el fin de obtener la mayor cantidad posible de la sustancia de
intereacutes (Psilocibina)
33
En el antildeo 1981 en el instituto farmaceacuteutico de la Universidad de Oslo realizaron
una investigacioacuten con una columna de siacutelice con una fase moacutevil de metanol-nitrato
de amonio en donde no soacutelo se logroacute obtener Psilocibina y Psilocina sino tambieacuten
un nuevo producto conocido como beocistiacuten Se logroacute un porcentaje de separacioacuten
maacutexima de 75 ww (Christiansen et al 1981)
Asimismo en el antildeo 1984 en el instituto de microbiologiacutea de Amsterdam se
realizoacute un estudio con una columna C18 de siacutelice y una fase moacutevil de agua-etanol-
aacutecido aceacutetico de forma isocraacutetica en donde se obtuvo un porcentaje 025-115
y 002-016 de Psilocibina y Psilocina respectivamente en el hongo (Wurst
1984)
De igual manera en el antildeo 2003 en el instituto de ciencia policiaca en Japoacuten se
ejecutoacute la cromatografiacutea de alta eficiencia utilizando una columna C18 con una
fase moacutevil de aacutecido foacutermico de forma isocraacutetica y un detector de 220 nm un rango
de porcentaje de Psilocibina 014-042 wv en la capa mientras un 009-03
wv en el tallo (Tsujikawa et al 2003)
34
2 MATERIALES Y MEacuteTODOS
21 LOCALIZACIOacuteN
Las fermentaciones la medicioacuten del crecimiento micelial y la cuantificacioacuten del
consumo del sustrato y de proteiacutena se llevaron a cabo en el laboratorio de
Biotecnologiacutea de la Universidad EAFIT mientras que los anaacutelisis de cromatografiacutea
liacutequida de alta eficiencia (HPLC) se realizaron en el laboratorio de Quiacutemica
Instrumental de dicha Universidad
22 MICROORGANISMO DE ESTUDIO
La cepa del hongo Psilocybe cubensis (EAH01) con la cual se trabajoacute fue donada
por Joseacute Rodrigo Moreno Ingeniero del laboratorio de la Universidad Catoacutelica de
Oriente (UCO) La EAH01 permanece auacuten en el laboratorio de Biotecnologiacutea de la
Universidad EAFIT
Dicha cepa se cultivoacute en una caja Petri que conteniacutea Agar Extracto de Malta
(MEA) y se incuboacute a 30ordmC en una incubadora digital del laboratorio de
Biotecnologiacutea de la Universidad EAFIT La figura 5 representa una cepa de P
cubensis cultivada en medio soacutelido MEA
Figura 5 Psilocybe cubensis (EAH01) cultivada en medio soacutelido Agar Malta
35
23 COMPONENTES DEL MEDIO DE CULTIVO (FANG-ZHONG)
El medio sumergido utilizado para llevar a cabo las diferentes fermentaciones de
P cubensis fue el descrito por Fang-Zhong (2002) La tabla 1 muestra los
componentes de dicho medio y la concentracioacuten de cada uno de ellos Se destaca
que las fuentes de carbono utilizadas fueron glucosa y sacarosa usaacutendolas cada
una por separado para cada experimento y haciendo variaciones de
concentraciones de las mismas para los distintos ensayos
Tabla 1 Composicioacuten del medio de cultivo sumergido para evaluar el crecimiento micelial del P cubensis
Componentes Cantidad (gL)
Fuente de Carbono 30 ndash 50 - 70
Peptona 5
Extracto de levadura 5
KH2PO4 1
MgSO47H2O 05
Vitamina B1 005
24 PREPARACIOacuteN DE LOS DIFERENTES PREINOacuteCULOS DE P cubensis
EMPLEADOS PARA LAS FERMENTACIONES SUMERGIDAS
Con el propoacutesito de llevar a cabo cada uno de los ensayos fue necesario realizar
la preparacioacuten de un preinoacuteculo eacutesto con el fin de realizar un proceso de
adaptacioacuten del P cubensis al medio favoreciendo la disminucioacuten en cuanto a
tiempo (preferiblemente la eliminacioacuten de la aparicioacuten de un fase de latencia una
vez comenzada la fermentacioacuten)
La preparacioacuten de cada uno de los preinoacuteculos se realizoacute en 6 erlenmeyers de
1000 mL con 200 mL de medio cada uno los cuales fueron esterilizados a 120degC
por 15 minutos e inoculados con 4 discos de 5 mm aproximadamente de P
36
cubensis provenientes de la cepa previamente activada en Agar Malta durante 6
diacuteas Los erlenmeyers se llevaron a un agitador orbital por 6 diacuteas a 30ordmC y 100
rpm
25 PREPARACIOacuteN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO Y LOS INOacuteCULOS DE P
cubensis UTILIZADOS PARA LAS FERMENTACIONES SUMERGIDAS
Una vez realizado el preinoacuteculo se procedioacute a preparar los medios de cultivo
utilizados para realizar los distintos experimentos de la siguiente manera se
prepararon medios que diferiacutean en la fuente de carbono (glucosa o sacarosa) y en
la concentracioacuten de la misma (30 gL 50 gL y 70 gL) teniendo asiacute un total de
seis fermentaciones Las demaacutes cantidades de los componentes del medio de
Fang-Zhong fueron las mismas que las usadas en el preinoacuteculo descritas en la
Tabla 1
En primer lugar se llevaron a cabo las tres fermentaciones de glucosa
preparando un total de 90 erlenmeyers (30 por cada concentracioacuten de azuacutecar por
duplicado) cada uno de los frascos conteniacutea 50 mL del medio en erlenmeyers de
250 mL e inoculados con 01 g de peso huacutemedo del preinoacuteculo aproximadamente
Los 90 frascos se llevaron durante 14 diacuteas a un agitador orbital a 100 rpm con una
temperatura de 30 degC
Posteriormente se llevaron a cabo las tres fermentaciones de sacarosa siguiendo
el mismo proceso descrito anteriormente para la glucosa
Una vez terminadas las fermentaciones de glucosa y sacarosa y realizados todos
los anaacutelisis correspondientes (generacioacuten de biomasa consumo de sustrato
consumo de proteiacutena y evaluacioacuten de la presencia de Psilocibina por medio de
cromatografiacutea liacutequida de alta eficiencia (HPLC)) se procedioacute a elegir la fuente de
carbono y concentracioacuten que mejores resultados arrojoacute tanto para la generacioacuten
37
de biomasa como para la produccioacuten del alcaloide con el fin de evaluarla
nuevamente adicionaacutendole un precursor (FA)
Para finalizar se procedioacute a preparar los medios con la fuente de carbono y la
concentracioacuten de la misma que arrojoacute mejores resultados es decir los ensayos
realizados con una concentracioacuten de 50 gL de glucosa adicionaacutendole al medio
FA a diferentes concentraciones correspondiente a valores de 05 gL 10 gL y
15 gL las demaacutes cantidades de los componentes remanentes del medio fueron
las mismas que las descritas anteriormente en la tabla 1
26 CUANTIFICACIOacuteN DEL CRECIMIENTO DE BIOMASA MEDIANTE LOS
MEacuteTODOS DE PESO HUacuteMEDO Y PESO SECO PARA CULTIVO
SUMERGIDO DE P cubensis
La cuantificacioacuten de biomasa para cada uno de los tratamientos se realizoacute usando
la metodologiacutea de peso huacutemedo y peso seco Para la cuantificacioacuten de biomasa
mediante el meacutetodo de peso huacutemedo se tomaron dos muestras provenientes de
cada erlenmeyer cada 24 horas las cuales fueron filtradas y pesadas con el fin de
obtener el valor de peso huacutemedo para cada tratamiento del P cubensis
Posteriormente la biomasa retenida en el papel filtro fue llevada a un secador que
se encontraba a una temperatura de 50ordmC durante 24 horas transcurrido el
tiempo la biomasa seca fue pesada con el fin de obtener datos de peso seco
Durante los 14 diacuteas de la fermentacioacuten se obtuvieron datos de peso huacutemedo y
peso seco por duplicado para cada una de las fermentaciones
27 AJUSTE DE LA CINEacuteTICA DE CRECIMIENTO DE P cubensis AL
MODELO CINEacuteTICO LOGIacuteSTICO
Una vez realizada la recoleccioacuten de muestras para cada uno de los ensayos y su
posterior anaacutelisis se decidioacute modelar dichos datos mediante el modelo logiacutestico
38
(ecuacioacuten 1) el cual permite obtener variables cineacuteticas tales como la cantidad de
biomasa inicial (Xo) y la velocidad maacutexima de crecimiento (micromaacutex) para cada uno de
los tratamientos
Se decidioacute emplear el modelo logiacutestico ya que eacuteste muestra resultados maacutes reales
cuando se cultivan hongos debido a que su morfologiacutea es muy diferente a otros
microorganismos (pellets) dificultando la transferencia de masa (Bailey et al
1986)
Una vez linealizada la ecuacioacuten que describe dicho modelos se llega a la siguiente
expresioacuten
Ecuacioacuten 1 Ecuacioacuten linealizada del modelo logiacutestico
Posterior a la linealizacioacuten de la ecuacioacuten se procedioacute a graficar Ln ((XmaacutexX)-1)
vs tiempo con el fin de obtener como pendiente la velocidad maacutexima de
crecimiento (micromaacutex) y como intercepto el Ln ((XmaacutexXo)-1) el cual permitioacute la
obtencioacuten de la concentracioacuten inicial de biomasa
Obtenieacutendose asiacute los paraacutemetros cineacuteticos para cada ensayo correspondientes a
micromax y Xo
Se debe definir la concentracioacuten maacutexima de biomasa (Xmaacutex) para poder hallar los
paraacutemetros cineacuteticos mediante dicho modelo cabe aclarar que dicho valor se toma
de los resultados de biomasa adquiridos para cada uno de los ensayos mediante
la metodologiacutea de peso seco este valor variacutea para cada fermentacioacuten
Una vez ajustados los datos de cada tratamiento al modelo logiacutestico se procedioacute a
calcular de manera teoacuterica los valores de X (biomasa) que variacutea con el tiempo
39
teniendo en cuenta los paraacutemetros cineacuteticos arrojados mediante el modelo
logiacutestico utilizando la siguiente ecuacioacuten
Ecuacioacuten 2 Valores teoacutericos de biomasa en el tiempo
Estos valores de X teoacutericos obtenidos mediante la foacutermula anterior se grafican con
respecto a los valores de X obtenidos de manera experimental con el fin de
observar el ajuste del modelo logiacutestico a cada uno de los datos experimentales
28 EVALUACIOacuteN DEL CONSUMO DE SUSTRATO Y DEL CONSUMO DE
PROTEIacuteNA POR PARTE DEL P cubensis CULTIVADO EN MEDIO
SUMERGIDO
Con el fin de evaluar el consumo de sustrato y proteiacutena por parte del P cubensis
durante las fermentaciones que conteniacutean glucosa en el medio se recolectaron
muestras cada 24 horas del liacutequido obtenido despueacutes de realizada la filtracioacuten de
la muestra que se utilizoacute para efectos de caacutelculo de peso seo dicho liacutequido
denominado sobrenadante fue almacenado a -4 degC Finalizadas cada una de las
fermentaciones se procedioacute a realizar el protocolo para evaluar el consumo de
sustrato para cada medio (Miller 1959) mediante el meacutetodo de DNS (Aacutecido
Dinitrosaliciacutelico) (Anexo 13) y el consumo de proteiacutenas mediante el meacutetodo de
LOWRY para cada fermentacioacuten (Anexo 15)
Para llevar a cabo la cuantificacioacuten de sustrato y proteiacutena en los distintos ensayos
fue necesario realizar las curvas de calibracioacuten correspondientes dichas curvas
con sus respectivos valores de concentracioacuten se muestran en los anexos 14 y 16
40
29 MEacuteTODO CUALITATIVO PARA DETERMINAR LA PRESENCIA DE
ALCALOIDES (PSILOCIBINA) MEDIANTE EL USO DEL REACTIVO DE
DRAGENDORFF
Como se mencionoacute anteriormente el reactivo de Dragendorff es usado para
determinar de manera cualitativa la ausencia o presencia de alcaloides en una
muestra determinada Para llevar a cabo dicha prueba se recolectaron muestras
de la biomasa seca correspondientes a los diacuteas 12 13 y 14 de cada fermentacioacuten
las cuales fueron almacenadas a -4degC
Para determinar la presencia de Psilocibina se realizoacute el proceso descrito seguacuten
Musshoff et al (2000) el cual consistioacute en macerar cada una de las muestras de
biomasa hasta obtener un polvo fino luego se pesaron 10 mg de dicho polvo y a
esta cantidad se le agregoacute 1 mL de metanol Posteriormente una pequentildea
cantidad de esta mezcla se esparcioacute en un papel filtro en donde se le adicionoacute una
gota del reactivo de Dragendorff
Una vez realizada la prueba se dice que la muestra contiene presencia de
alcaloides si eacutesta presenta una coloracioacuten rojizo-amarilla
210 MEacuteTODO PARA DETERMINAR LA PRESENCIA DE PSILOCIBINA
MEDIANTE CROMATOGRAFIacuteA LIacuteQUIDA DE ALTA EFICIENCIA (HPLC)
Una vez evaluada la presencia del alcaloide mediante el reactivo de Dragendorff
se procedioacute a determinar mediante el uso de cromatografiacutea liacutequida de alta
eficiencia (HPLC) la presencia de los alcaloides en la mezcla con sus respectivos
tiempos de retencioacuten para llevar a cabo la extraccioacuten de la Psilocibina se siguioacute el
meacutetodo descrito por Musshoff et al (2000) Para ello la muestra de biomasa
seca fue macera en un mortero hasta convertirla en un polvo fino Diez miligramos
41
de la muestra en polvo se extrajeron dos veces con 1 mL de metanol en un bantildeo
de ultrasonido durante 30 minutos Posterior a eacutesto se centrifugaron las muestras
a 3000 rpm durante 2 minutos el sobrenadante se depositoacute en un vial
independiente
El sobrenadante fue evaporado hasta sequedad bajo una corriente de nitroacutegeno
gaseoso Una parte de los residuos se disolvioacute en 200 microL de la fase moacutevil que
contiene HCOONH4 con una concentracioacuten 10 microM y un pH de 35
El equipo utilizado para realizar todos los anaacutelisis correspondientes a HPLC
cuenta con las siguientes caracteriacutesticas equipo Agient Technologies que consta
de una columna C18 de 46 mm 250 mm 5 mm con una fase moacutevil de
HCOONH4 con un flujo de 1 mLminuto un detector UV de 214 nm y una inyeccioacuten
de 20 μL y una temperatura de 25degC El experimento se corrioacute de modo isocraacutetico
con una fase moacutevil de agua 70 y HCOONH4 de 30
211 DETERMINACIOacuteN CUALITATIVA DE LA RESOLUCIOacuteN DEL
ALCALOIDE DE INTEREacuteS PARA LOS DIFERENTES ENSAYOS
Con el fin de determinar de manera cualitativa cuaacutel de los cromatogramas
arrojados mediante la teacutecnica de HPLC presentoacute mejor resolucioacuten del alcaloide
fue necesario realizar un supuesto acerca del tiempo de retencioacuten de la Psilocibina
durante la cromatografiacutea puesto que a pesar de haber contado con un
cromatograma (Tsujikawa et al 2003) (Anexo 18) y haber trabajado en las
mismas condiciones de eacuteste no se utilizoacute la misma fase moacutevil lo que puedo
generar variaciones en dicho tiempo Se asumioacute que el tiempo de retencioacuten varioacute
entre 62 y 72 minutos es decir entre este tiempo se encontroacute el pico de intereacutes
de la investigacioacuten
42
La eleccioacuten del criterio de pureza del compuesto de intereacutes se realizoacute observando
cuaacutel de los picos obtenidos muestra menor ruido es decir que a su alrededor no
tenga presencia de otros compuestos (Anexos 19 20 y 21)
212 DETERMINACIOacuteN PORCENTUAL DE COMPUESTOS PARA LOS
DIFERENTES ENSAYOS
La cuantificacioacuten de los compuestos se hizo mediante un porcentaje de aacuterea bajo
la curva debido a que no se contoacute con un estaacutendar interno
Para realizar dicho porcentaje se obtuvo la totalidad de las aacutereas presentes en el
perfil cromatograacutefico obtenido para las muestras de los diacuteas 12 13 y 14 de cada
fermentacioacuten y el porcentaje del aacuterea del metabolito de intereacutes la cual oscilaba
entre un tiempo de retencioacuten entre 62 y 72 minutos
En el momento de analizar los cromatogramas y de elegir el medio que mejor
resultados arrojoacute en cuanto a la produccioacuten de alcaloide se observoacute la resolucioacuten
del metabolito en cada una de las fermentaciones
213 CULTIVO SUMERGIDO DE P cubensis EN PRESENCIA DE FA
Despueacutes de haber elegido la fuente de carbono (glucosa) y su respectiva
concentracioacuten (50 gL) que mejores resultados arrojaron durante la investigacioacuten
se realizaron nuevamente fermentaciones del P cubensis en medio sumergido
(Fang-Zhong) donde la diferencia de estos medios con respecto a los
anteriormente utilizados radicoacute en la presencia de FA aminoaacutecido
Para dichas fermentaciones se contoacute con tres concentraciones diferentes de FA
(05 gL 1 gL 15 gL) realizadas por duplicado adicionalmente se montoacute
43
simultaacuteneamente con dichos ensayos las muestras correspondientes a los uacuteltimos
tres diacuteas de fermentacioacuten sin FA en el medio para efectos de comparacioacuten y asiacute
poder llevar a cabo un anaacutelisis estadiacutestico apropiado
Los datos obtenidos fueron analizados por medio de una ANOVA con el fin de
observar si existiacutean o no diferencias significativas en cuanto al crecimiento micelial
(concentracioacuten de biomasa) del P cubensis y asiacute poder determinar el medio que
mejores resultados arrojoacute durante la investigacioacuten
214 DISENtildeO DE EXPERIMENTOS Y ANAacuteLISIS ESTADIacuteSTICO
El disentildeo estadiacutestico utilizado para realizar los anaacutelisis correspondientes a las
diferentes fermentaciones es un disentildeo factorial 23 Este estudio se basoacute en dos
factores que fueron las dos fuentes de carbono (glucosa y sacarosa) a su vez se
apoyoacute en tres niveles que fueron la variacioacuten en la concentracioacuten de las mismas
(30 gL 50 gL y 70 gL) De igual manera se fundamentoacute en dos variables de
respuesta el crecimiento micelial de P cubensis y el porcentaje de Psilocibina
presente en el microorganismo
Por medio del Software Statgraphics plus 51 se realizoacute un anaacutelisis estadiacutestico
basado en una ANOVA factorial Con ello se pretendioacute comparar estadiacutesticamente
los resultados de crecimiento micelial de biomasa (concentracioacuten) y produccioacuten de
Psilocibina para cada uno de los medios durante los 14 diacuteas de fermentacioacuten y en
especial en los uacuteltimos tres diacuteas de la misma puesto que durante este periacuteodo fue
evaluada la presencia del alcaloide
Es necesario hacer hincapieacute que para realizar dicha estadiacutestica fue necesario
ejecutar un estudio de normalidad el cual se comproboacute utilizando la graacutefica de
probabilidad normal a su vez se requirioacute un anaacutelisis de igualdad de varianza por
medio de una graacutefica de residuos Vs previsto con el fin de ver visualmente la
44
hipoacutetesis de la homocedasticidad todo ello con el fin de garantizar que la
investigacioacuten se comportoacute de forma normal Adicionalmente se contoacute con una
hipoacutetesis nula (Ho) y una Hipoacutetesis alterna (Ha) las cuales permitieron realizar las
conclusiones respectivas A continuacioacuten se enunciaraacuten cada una de eacutestas y los
paraacutemetros necesarios para dicho estudio
Ho Todas las medias son iguales es decir no existen diferencias
significativas entre los datos analizados
Ha Alguna de las medias es diferente lo que quiere decir que siacute existen
diferencias significativas
Paraacutemetro
Pvalor gt 005 Se acepta Ho
Pvalor le 005 Se rechaza Ho
45
3 RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN
31 CINEacuteTICA DE CRECIMIENTO MICELIAL DE P cubensis EN CULTIVO
SUMERGIDO (FANG-ZHONG) UTILIZANDO DIFERENTES FUENTES DE
CARBONO
Con el propoacutesito de evaluar el crecimiento micelial del P cubensis en medio
sumergido durante los 14 diacuteas de la fermentacioacuten se recurrioacute al uso de
metodologiacuteas conocidas como peso huacutemedo y peso seco en dicho trabajo soacutelo se
exponen los datos arrojados por el meacutetodo de peso seco
A continuacioacuten se presentan cada una de las fermentaciones de acuerdo al tipo de
sustrato empleado en las mismas los respectivos valores de peso seco obtenidos
y los anaacutelisis pertinentes para cada uno de los casos
311 Crecimiento micelial de P cubensis en medio sumergido utilizando
diferentes concentraciones de glucosa
Inicialmente se evaluaron tres concentraciones de glucosa en el cultivo de P
cubensis en medio sumergido (Fang-Zhong) correspondientes a 30 gL 50 gL y
70 gL siendo en este caso la glucosa la principal fuente de carbono del P
cubensis
A continuacioacuten se muestran los valores de peso seco obtenidos para cada una de
las concentraciones de glucosa utilizadas durante los 14 diacuteas de la fermentacioacuten
46
0
01
02
03
04
05
06
07
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Bio
ma
sa (g
L)
Tiempo (diacuteas)30gL 50gL 70gL
Graacutefico 1 Cineacutetica de crecimiento micelial de P cubensis en medio sumergido (Fang-Zhong) utilizando tres diferentes concentraciones de
glucosa como fuente de carbono (Peso seco)
Del graacutefico 1 se puede observar que no hubo evidencia de fase de latencia para
ninguno de los ensayos posteriormente se aprecia que el crecimiento de biomasa
aumentoacute con el tiempo para las diferentes concentraciones de glucosa empleadas
Analizando las fermentaciones que conteniacutean 50 gL y 70 gL de glucosa se
puede afirmar que ambas presentan un comportamiento similar mostrando una
fase exponencial hasta el diacutea 11 y una fase estacionaria hasta el diacutea 14 de la
fermentacioacuten mientras que la fermentacioacuten que conteniacutea 30 gL de glucosa no
presentoacute fase estacionaria la fermentacioacuten durante los 14 diacuteas se encontraba en
fase exponencial a pesar de que entre los diacuteas 8 y 11 el crecimiento de P
cubensis se mantuvo constante
Asimismo se puede observar que el crecimiento maacutes bajo en cuanto a
concentracioacuten de biomasa se generoacute en la concentracioacuten de 30 gL siendo eacuteste
de 048 gL mientras que en las concentraciones de 50 gL y 70 gL de glucosa
los crecimientos maacuteximos fueron muy similares 055 gL y 062 gL
respectivamente
47
Lo dicho anteriormente se ratifica una vez analizados los resultados obtenidos
estadiacutesticamente donde se obtuvo un P-valor igual a cero indicando que existen
diferencias significativas en cuanto al crecimiento micelial de biomasa
(concentracioacuten de biomasa durante los 14 diacuteas de la fermentacioacuten) El graacutefico 2
ilustra la presencia de dos grupos homogeacuteneos lo que indica que las
concentraciones de 50 gL y 70 gL no tienen diferencias significativas del
crecimiento micelial entre cada una de ellas mientras que la concentracioacuten de 30
gL siacute presenta dichas diferencias significativas con respecto a las dos
concentraciones anteriores (Anexo 1)
Con todo eacutesto se expone que la concentracioacuten de glucosa de 50 gL es la que se
eligioacute debido a que es maacutes econoacutemico utilizar 50 gL de glucosa que 70 gL
Tratamientos con diferentes concentraciones de glucosa
Media 30 gL glucosa (a) 022
Media 50 gL glucosa (b) 032
Media 70 gL glucosa (b) 034
a
bb
0
005
01
015
02
025
03
035
04
045
Co
nce
ntr
acioacute
n b
iom
asa
(gL
)
Letras diferentes denotan diferencias significativas (prueba LSD)
Graacutefico 2 Crecimiento micelial de P cubensis en cultivo sumergido bajo tres concentraciones de glucosa
48
Modelo logiacutestico para las fermentaciones donde se utilizoacute glucosa
como fuente de carbono
Una vez realizada la cineacutetica de crecimiento del P cubensis en medio sumergido
(Fang-Zhong) usando diferentes concentraciones de glucosa se procedioacute a
ajustar los datos obtenidos al modelo logiacutestico Los crecimientos maacuteximos de
biomasa obtenidos mediante el meacutetodo de peso seco para cada uno de los
ensayos fueron 048 gL 065 gL y 062 gL para concentraciones de 30 gL 50
gL y 70 gL de glucosa respectivamente La tabla 2 muestra los paraacutemetros
cineacuteticos obtenidos mediante el modelo para cada una de las concentraciones
Tabla 2 Paraacutemetros cineacuteticos obtenidos mediante el modelo logiacutestico para las diferentes fermentaciones de P cubensis utilizando glucosa como fuente
de carbono
30gL 50gL 70gL
microx (diacutea-sup1) 016 microx (diacutea-sup1) 017 microx (diacutea-sup1) 015
micromax (diacutea-sup1) 027 micromax (diacutea-sup1) 035 micromax (diacutea-sup1) 034
X0 (gL) 005 X0 (gL) 008 X0 (gL) 008
R2 096 R2
092 R2 085
De la tabla 2 se puede observar que la concentracioacuten inicial de biomasa (Xo)
estuvo muy cercana para cada una de las concentraciones de glucosa utilizadas
Para 30 gL de glucosa la velocidad maacutexima de crecimiento (micromax) fue mucho
menor que la obtenida para 50 gL y 70 gL eacutesto pudo ser debido a que fue el
medio que menor cantidad de glucosa conteniacutea mientras que para las otras dos
concentraciones de glucosa la velocidad maacutexima de crecimiento fue similar
Al comparar las velocidades maacuteximas de las tres concentraciones de glucosa
utilizadas se evidencia que la fermentacioacuten que conteniacutea 50 gL presentoacute una
micromaacutex mayor correspondiente a 035 diacutea-1 esto sugiere que a mayores
concentracioacuten de glucosa (70 gL) puede ocurrir una inhibicioacuten por sustrato otro
49
criterio que afirma que dicha concentracioacuten fue la que mejores resultados arrojoacute de
las tres concentraciones de glucosa utilizadas para el crecimiento del P cubensis
en el medio de Fang-Zhong Ademaacutes se observa que este experimento fue el que
mayor velocidad especiacutefica de crecimiento presento siendo esta de 017 diacutea-1
Finalmente se calcularon los valores de biomasa teoacutericos utilizando la ecuacioacuten
descrita anteriormente en la metodologiacutea con el propoacutesito de observar que tanto
se ajustaron los valores de biomasa hallados experimentalmente con los valores
de biomasa teoacutericos arrojados por el modelo logiacutestico El graacutefico 3 muestra los
valores de biomasa (X) tanto teoacutericos como experimentales con respecto al
tiempo
0
01
02
03
04
05
06
07
0 2 4 6 8 10 12 14
Biom
asa
(gL
)
Tiempo (diacutea)
X exp (30 gL) X exp (50 gL) X exp (70 gL)
X teoacuterico (30 gL) X teoacuterico (50 gL) X teoacuterico (70 gL)
Graacutefico 3 Valores de concentracioacuten de biomasa experimental y teoacuterico
graficados con respecto al tiempo para las fermentaciones con diferentes concentraciones de glucosa
Al observar el graacutefico 3 se puede notar que para los ensayos de 50 gL y 70 gL
de glucosa los valores de biomasa teoacutericos se encuentran un poco desfasados de
los valores de biomasa hallados de manera experimental mientras que para el
ensayo que conteniacutea 30 gL de glucosa se observa un buen ajuste de los datos
50
obtenidos experimentalmente al modelo logiacutestico La tabla 2 reitera lo dicho
anteriormente al exponer los valores de R2 los cuales explican la relacioacuten que
tienen los datos teoacutericos con los experimentales
312 Crecimiento micelial del P cubensis en medio sumergido utilizando
diferentes concentraciones de sacarosa
Una vez evaluado el crecimiento de biomasa usando glucosa como fuente de
carbono se procedioacute a evaluar el efecto que teniacutea el cambio de la fuente de
carbono por sacarosa en el crecimiento micelial del P cubensis en medio
sumergido
El graacutefico 4 muestra de manera ilustrativa como fue el crecimiento micelial del P
cubensis para cada una de las concentraciones de sacarosa utilizadas durante los
14 diacuteas mediante el meacutetodo de peso seco
0
01
02
03
04
05
06
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Biom
asa (
gL)
Tiempo (diacuteas)
30 gL 50 gL 70 gL
Graacutefico 4 Cineacutetica de crecimiento micelial de P cubensis en medio sumergido (Fang-Zhong) utilizando diferentes concentraciones de sacarosa
como fuente de carbono (Peso seco)
51
En el graacutefico 4 se puede observar que tanto para una concentracioacuten de 30 gL
como para 70 gL de sacarosa el hongo llega a su fase estacionaria cerca del
quinto diacutea de la fermentacioacuten mientras que para una concentracioacuten de 50 gL se
observa un comportamiento diferente puesto que el microorganismo tiene un
crecimiento exponencial hasta el diacutea 5 en donde entra a una etapa de transicioacuten o
estacionaria durante 3 diacuteas aproximadamente luego de la cual inicia nuevamente
su crecimiento de forma exponencial hasta llegar al diacutea 11 en donde siacute empieza
su fase estacionaria
Al igual que en las tres fermentaciones que conteniacutean glucosa en estas
fermentaciones de sacarosa se observa mediante el graacutefico anterior que no hubo
presencia de fase de latencia
El crecimiento maacuteximo de biomasa en cuanto a concentracioacuten lo presentoacute aquella
fermentacioacuten que conteniacutea 70 gL de sacarosa el cual fue de 057 gL seguida de
la de 50 gL con un crecimiento maacuteximo de biomasa de 045 gL y posteriormente
la concentracioacuten de 30 gL obtuvo un crecimiento maacuteximo de 026 gL
De acuerdo al anaacutelisis estadiacutestico que se realizoacute para cada una de las
fermentaciones se dedujo que las diferencias en cuanto al crecimiento micelial de
biomasa con respecto a la concentracioacuten de la misma son significativas entre
cada una de las fermentaciones es decir fue diferente la concentracioacuten de
biomasa obtenida cuando se trabajoacute con cada una de distintas concentraciones de
sacarosa Lo dicho anteriormente se muestra a traveacutes del graacutefico 5 (Anexo 2)
52
Tratamientos con diferentes concentraciones de sacarosa
Media 30 gL sacarosa (a) 02
Media 50 gL sacarosa (b) 032
Media 70 gL sacarosa (c) 043
a
b
c
0
02
04
Co
nce
ntr
acioacute
n b
iom
asa
(gL
)
Letras diferentes denotan diferencias significativas (prueba LSD)
Graacutefico 5 Crecimiento micelial para tres diferentes concentraciones de sacarosa
Modelo logiacutestico para las fermentaciones donde se utilizoacute sacarosa
como fuente de carbono
Una vez realizadas las cineacuteticas de crecimiento del P cubensis para cada
concentracioacuten de sacarosa empleada se procedioacute a ajustar los datos obtenidos al
modelo logiacutestico cabe recalcar que es necesario establecer los crecimientos
maacuteximos de biomasa obtenidos para cada uno de los ensayos los cuales fueron
026 gL 045 gL y 057 gL para concentraciones de 30 gL 50 gL y 70 gL de
sacarosa respectivamente
Una vez aplicado el modelo logiacutestico para cada tratamiento se obtuvieron valores
de velocidad maacutexima de crecimiento y biomasa inicial para cada concentracioacuten de
sacarosa utilizada en el medio los cuales se muestran en la tabla 3
53
Tabla 3 Paraacutemetros cineacuteticos obtenidos mediante el modelo logiacutestico para las diferentes fermentaciones de P cubensis utilizando sacarosa como
fuente de carbono
30gL 50gL 70gL
microx (diacutea-sup1) 030 microx (diacutea-sup1) 014 microx (diacutea-sup1) 041
micromax (diacutea-sup1) 037 micromax (diacutea-sup1) 042 micromax (diacutea-sup1) 067
X0 (gL) 01 X0(gL) 01 X0 (gL) 011
R2 061 R2 089 R2 095
De la tabla 3 se ratifica que se utilizoacute una concentracioacuten inicial de biomasa igual
para cada una de las fermentaciones aproximadamente 01 gL ademaacutes se
observa un aumento en la velocidad maacutexima de crecimiento con respecto a la
cantidad de sacarosa empleada es decir que el hecho de haber aumentado la
concentracioacuten de sacarosa en el medio favorecioacute el aumento en la velocidad
maacutexima de crecimiento del P cubensis siendo eacutesta mayor cuando se trabajoacute a una
concentracioacuten de 70 gL de sacarosa De igual manera se aprecia que el
tratamiento que conteniacutea 70 gL de sacarosa presentoacute una velocidad especiacutefica de
crecimiento mayor que los demaacutes siendo eacutesta de 041 diacutea-1
Finalmente se calcularon los valores de biomasa teoacutericos el graacutefico 6 ilustra los
valores de biomasa (X) tanto teoacutericos como experimentales graficados con
respecto al tiempo
54
0
01
02
03
04
05
06
0 2 4 6 8 10 12 14
Bio
mas
a (g
L)
Tiempo (Diacutea)
X exp (30 gL) X exp (50 gL) X exp (70 gL)
X teoacuterico (30 gL) X teoacuterico (50 gL) X teoacuterico (70 gL)
Graacutefico 6 Valores de concentracioacuten de biomasa experimental y teoacuterico graficados con respecto al tiempo para las fermentaciones con diferentes
concentraciones de sacarosa
Del graacutefico 6 se puede observar como los valores de biomasa experimentales se
ajustaron a los valores de biomasa teoacutericos arrojados por el modelo logiacutestico lo
que quiere decir la cineacutetica de crecimiento del P cubensis en medio sumergido
cuando se utilizoacute 70 gL se ajustoacute correctamente al modelo logiacutestico lo que se
corrobora en la tabla 2 gracias al valor obtenido para el R2 que indica la relacioacuten
de los datos teoacutericos con respecto a los experimentales Por otro lado para las
fermentaciones de 30 gL y 50 gL de sacarosa a pesar de parecer que
presentaron un buen ajuste al calcular la relacioacuten de los datos teoacutericos con
respecto a los experimentales (R2) se concluye que el ajuste no fue tan bueno
55
313 Comparacioacuten entre el crecimiento micelial de P cubensis en los
cultivos sumergidos utilizando glucosa y sacarosa como fuente de
carbono
Ahora bien es igualmente importante realizar un anaacutelisis comparativo entre ambas
fuentes de carbono empleadas con el fin de determinar si existen o no diferencias
significativas entre dichas fuentes de carbono
De acuerdo al anaacutelisis estadiacutestico se dice que existen diferencias significativas del
crecimiento micelial del P cubensis en cuanto al diacutea y la concentracioacuten de
sustrato empleado es decir concentracioacuten de glucosa y sacarosa (Anexo 3) pero
se observa claramente que no hay diferencias significativas de dicho crecimiento
con respecto al tipo de sustrato utilizado debido a que el P-valor arrojado por la
estadiacutestica fue de 01217 lo que sugiere que se debe utilizar la sacarosa gracias
a la disminucioacuten de costos que se generariacutean durante el proceso todo ello gracias
al costo de la sacarosa es inferior al de glucosa Sin embargo para elegir la fuente
de carbono que mejores resultados arrojoacute no soacutelo se basoacute en la cantidad de
biomasa producida sino que se procedioacute a examinar los barridos espectrales
arrojados por el anaacutelisis de HPLC con el fin de determinar la fuente de carbono
que mejor resolucioacuten mostroacute del alcaloide que en esta investigacioacuten fue glucosa a
una concentracioacuten de 50 gL
De igual manera el graacutefico 7 muestra las medias obtenidas mediante el anaacutelisis
estadiacutestico para las fermentaciones trabajadas con glucosa y sacarosa Aun asiacute
es necesario hacer hincapieacute que eacuteste no es el criterio principal para la obtencioacuten
del medio que mejores resultados arrojoacute durante la investigacioacuten por lo tanto se
deben seguir realizando los diferentes anaacutelisis descritos anteriormente en este
trabajo
56
Tratamientos de las dos fuentes de carbono usadas sin FA (glucosa y
sacarosa)
Media para glucosa (a) 029
Media para sacarosa (a) 032
aa
0
01
02
03
Conc
entr
acioacute
n bi
omas
a (g
L)
Letras diferentes denotan diferencias significativas (Prueba LSD)
Graacutefico 7 Crecimiento micelial para dos diferentes fuentes de carbono (glucosa y sacarosa)
314 Crecimiento micelial del P cubensis en cultivo sumergido utilizando
glucosa y fenilalanina en el medio
Se decidioacute realizar un uacuteltimo ensayo acerca del efecto que teniacutea la adicioacuten de un
aminoaacutecido llamado Fenilalanina (FA) al medio Fang-Zhong sobre la produccioacuten
del alcaloide y por ende sobre la generacioacuten de biomasa
Debido a los anaacutelisis realizados anteriormente se concluyoacute que la mejor fuente de
carbono fue la glucosa a una concentracioacuten de 50 gL De la misma manera que
en los numerales anteriores se evaluoacute la cineacutetica del crecimiento micelial del P
cubensis mediante los meacutetodos de peso huacutemedo y peso seco Las mediciones
fueron realizadas por duplicado y promediadas para la fuente de carbono elegida
(glucosa 50 gL) y las diferentes concentraciones de FA en el medio
correspondientes a 05 gL 1 gL 15 gL con el fin de encontrar el medio que
mejores resultados arrojoacute en cuanto a crecimiento micelial y generacioacuten del
57
alcaloide de intereacutes Los datos obtenidos mediante el meacutetodo de peso seco se
muestran en el graacutefico 8
Cabe resaltar que junto con las tres fermentaciones de 05 gL 10 gL y 15 gL
de FA se montaron a su vez seis muestras correspondientes a los diacuteas 12 13 y
14 de la fermentacioacuten que conteniacutea 0 gL de FA eacutesto con el propoacutesito de analizar
los datos de manera estadiacutestica y poder hacer comparaciones con respecto a la
generacioacuten de biomasa y a la produccioacuten del alcaloide de intereacutes ambas medidas
con respecto a la concentracioacuten
0
01
02
03
04
05
06
07
08
09
1
11
12
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Biom
asa
(gL
)
Tiempo (diacuteas)
05 gL 1 gL 15 gL
Graacutefico 8 Cineacutetica de crecimiento micelial de P cubensis en medio sumergido (Fang-Zhong) utilizando diferentes concentraciones de FA y 50
gL de glucosa como fuente de carbono (Peso seco)
Al analizar el graacutefico 8 es decir el crecimiento micelial (concentracioacuten de
biomasa) seguacuten la concentracioacuten de FA en el tiempo se puede notar que no hubo
presencia de fase de latencia para ninguna de las concentraciones de FA
utilizadas ademaacutes el crecimiento de biomasa en cada caso se aprecia de manera
58
muy similar llegando los tres ensayos a la fase estacionaria el diacutea 12 de la
fermentacioacuten
Observando el graacutefico 8 se puede identificar que el mayor contenido de biomasa
fue de 108 gL obtenida el diacutea 13 para una concentracioacuten 10 gL de FA para
concentraciones de 05 gL y 15 gL de FA la concentracioacuten maacutexima de biomasa
fue 106 gL y 101 gL respectivamente Auacuten asiacute al considerar los resultados
obtenidos se puede ratificar que es indiferente la cantidad de FA necesaria para
obtener concentracioacuten de biomasa por ende se decide que el medio que mejores
resultados arrojoacute fue el que conteniacutea 05 gL FA debido a que fue la
concentracioacuten de FA que mejor resolucioacuten del alcaloide presentoacute paraacutemetro
observado mediante los cromatogramas obtenidos del anaacutelisis de HPLC (Anexos
19 20 y 21) y ademaacutes porque con dicha cantidad los costos de la materia prima
seriacutean menores Cabe resaltar que el uso de FA generoacute un aumento significativo
duplicando la produccioacuten de biomasa por lo tanto se testifica que siacute hubo
duplicacioacuten en cuanto a la concentracioacuten de biomasa en los medios que conteniacutea
FA con respecto a los medios que no conteniacutean FA se dice entonces que a su
vez se podriacutea haber generado mayor cantidad de Psilocibina en los medios que
teniacutean FA ya que dicho alcaloide se produce de manera intracelular por tal
razoacuten al aumentar la cantidad de biomasa en el medio se aumenta la cantidad de
dicho alcaloide
De igual manera se analizaron los datos estadiacutesticamente y se llegoacute a apreciar
que no existen diferencias significativas en cuanto a la produccioacuten de biomasa y la
cantidad de FA utilizada en el medio Del mismo modo al analizar la tabla de
contrastes muacuteltiple de rangos se reitera que siacute existen diferencias significativas
entre el crecimiento micelial de biomasa (concentracioacuten de biomasa) en el tiempo
cuando se trabajoacute con FA o sin eacuteste Eacutesto se puede observar en el graacutefico 9
(Anexo 4)
59
Tratamientos con y sin FA
Media 0 gL FA (a) 032
Media 05 gL FA (b) 065
Media 10 gL FA (b) 066
Media 15 gL FA (b) 069
a
b b b
0
01
02
03
04
05
06
07
08
09
Conc
entr
acioacute
n bi
omas
a (g
L)
Letras diferentes denotan diferencias significativas (Prueba LSD)
Graacutefico 9 Crecimiento micelial para glucosa a una concentracioacuten de 50 gL y tres diferentes concentraciones de FA
Modelo logiacutestico para las fermentaciones donde se utilizoacute 50 gL de
glucosa como fuente de carbono y diferentes concentraciones de FA
En primer lugar se fijaron los valores de crecimiento maacuteximo de biomasa para
cada una de las concentraciones obtenidos mediante el meacutetodo de peso seco con
el fin de hallar los paraacutemetros cineacuteticos mediante el modelo logiacutestico Los
crecimientos maacuteximos de biomasa obtenidos fueron los siguientes 106 gL 108
gL y 101 gL para concentraciones de 05 gL 10 gL y 15 gL de FA
respectivamente y 50 gL de glucosa
Una vez realizado el modelo logiacutestico para cada tratamiento se obtuvieron los
valores de velocidad maacutexima de crecimiento y concentracioacuten de biomasa inicial
para cada ensayo los cuales se muestran en la tabla 4
60
Tabla 4 Paraacutemetros cineacuteticos obtenidos mediante el modelo logiacutestico para las diferentes fermentaciones de P cubensis utilizando 50 gL de glucosa
como fuente de carbono y diferentes concentraciones de FA
05gL 10gL 15gL
microx (diacutea-sup1) 018 microx (diacutea-sup1) 012 microx (diacutea-sup1) 012
micromax (diacutea-sup1) 045 micromax (diacutea-sup1) 035 micromax (diacutea-sup1) 044
X0 (gL) 01 X0 (gL) 017 X0 (gL) 016
R2 095 R2 082 R2 088
Seguacuten los valores arrojados por el modelo logiacutestico que se encuentran
presentados en la tabla 4 se puede decir que se presentoacute una valor de biomasa
inicial similar para los tratamientos de 1 gL y 15 gL de FA mientras que para las
fermentaciones que conteniacutean 05 gL de FA se tiene una diferencia de un 50
aproximadamente Ademaacutes se puede observar que a la concentracioacuten de 05 gL
de FA es la que mayor velocidad maacutexima de crecimiento presenta siendo esta
045 diacuteamacrsup1 a su vez dicha concentracioacuten presentaacute la microx mayor correspondiente a
018 diacutea-1 Debido a eacutesto y al criterio de mejor resolucioacuten del alcaloide observado
en los anaacutelisis de HPLC (Anexos 19 20 y 21) se concluye que el medio que
mejores resultados arrojoacute durante la investigacioacuten para la generacioacuten de biomasa
y la produccioacuten de la Psilocibina es 05 gL de FA y 50 gL de glucosa
Finalmente se calcularon los valores de biomasa teoacutericos el graacutefico 10 muestra
los valores de biomasa (X) tanto teoacutericos como experimentales graficados con
respecto al tiempo
61
0
02
04
06
08
1
12
0 2 4 6 8 10 12 14 16
Bio
mas
a (g
L)
Tiempo (Diacutea)
X exp (05 gL) X exp (10 gL) X exp (15 gL)
X teoacuterico (05 gL) X teoacuterico (10 gL) X teoacuterico (15 gL)
Graacutefico 10 Valores de concentracioacuten de biomasa experimental y teoacuterico graficados con respecto al tiempo para las fermentaciones con diferentes
concentraciones de FA y 50 gL de glucosa
Se puede decir gracias al graacutefico 10 que los valores de biomasa experimentales
se ajustaron a los valores de biomasa teoacutericos hallados mediante el modelo
logiacutestico es decir la cineacutetica de crecimiento del P cubensis en medio sumergido
cuando se usaron diferentes concentraciones de FA en el medio se ajustoacute
correctamente al modelo logiacutestico esto se reitera con los valores de R2 mostrados
anteriormente en la tabla 4
32 ESTUDIO DE LA CINEacuteTICA DE CONSUMO DE SUSTRATO POR PARTE
DEL P cubensis CULTIVADO EN MEDIO SUMERGIDO (FANG-ZHONG)
La evaluacioacuten del consumo de sustrato durante la fermentacioacuten con respecto al
tiempo es de suma importancia puesto que eacuteste es el principal componente
limitante del crecimiento presente en el medio de cultivo
62
A continuacioacuten se analizaraacuten dichos consumos para los diferentes ensayos
321 Consumo de sustrato por parte del P cubensis en medio sumergido
utilizando diferentes concentraciones de glucosa
Una vez halladas las concentraciones de sustrato para cada una de las
fermentaciones que conteniacutean glucosa en el medio se procedioacute a graficar dichos
valores con respecto al tiempo
El graacutefico 11 ilustra los datos obtenidos sobre el consumo de sustrato de las tres
fermentaciones que conteniacutean glucosa y a su vez como se comportoacute el
crecimiento de biomasa para cada ensayo durante los 14 diacuteas de fermentacioacuten
0
01
02
03
04
05
06
07
0
10
20
30
40
50
60
70
80
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14B
iom
asa
(gL
)
Glu
cosa
(gL
)
Tiempo (diacuteas)
30 GL 50GL 70 GL 30gL 50gL 70gL
Graacutefico 11 Cineacutetica de consumo de sustrato por parte del P cubensis en medio sumergido utilizando diferentes concentraciones de glucosa como
fuente de carbono
Al observar el graacutefico 11 se expone que el P cubensis consumioacute mayor cantidad
de glucosa cuando esta estaba a una concentracioacuten de 70 gL correspondiendo a
63
un porcentaje de 62 mientras que para 50 gL y 30 gL fue de 23 y 30
respectivamente
Comparando el consumo de glucosa en sus diferentes concentraciones con el
crecimiento micelial del hongo se puede observar que a una concentracioacuten de
glucosa de 30 gL no soacutelo se tuvo un menor consumo de sustrato sino que
tambieacuten se generoacute un menor crecimiento de biomasa Mientras que a
concentraciones de 50 gL y 70 gL de glucosa a pesar de presentar diferencias
en cuanto al porcentaje de sustrato consumido el crecimiento micelial es similar
(no presenta diferencias significativas) lo que indica que el hongo no requiere
tanta concentracioacuten de glucosa para su crecimiento eacutesto se puede afirmar soacutelo
para este ensayo a estas condiciones
De igual manera en el graacutefico 11 al analizar la tendencia del consumo de
sustrato las concentraciones de glucosa de 50 gL y 70 gL presentan una
disminucioacuten notoria hasta el diacutea 11 para dicho consumo Esto se debe a que en
ese diacutea inicioacute la fase estacionaria del hongo en ambas fermentaciones en donde
el P cubensis requeriacutea alimento uacutenicamente para mantenerse y producir
metabolitos secundarios Mientras que para la concentracioacuten de glucosa de 30 gL
el consumo de glucosa fue muy poco a partir del quinto diacutea de la fermentacioacuten
esto se atribuye a que la cineacutetica de crecimiento micelial del P cubensis presentoacute
una fase estacionaria temprana entre los diacuteas 8 y 11 indicando que no necesitaba
consumir casi glucosa puesto que no estaba creciendo
322 Consumo de sustrato por parte del P cubensis en medio sumergido
utilizando diferentes concentraciones de sacarosa
Los datos obtenidos sobre el consumo de sacarosa para cada una de las
concentraciones utilizadas (30 gL 50 gL y 70 gL de sacarosa) durante los 14
diacuteas de la fermentacioacuten se muestran en el graacutefico 12 a su vez se ilustran en dicho
64
graacutefico el comportamiento del crecimiento micelial para cada ensayo durante los
14 diacuteas de fermentacioacuten para efectos de anaacutelisis
0
01
02
03
04
05
06
0
10
20
30
40
50
60
70
80
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Bio
mas
a (g
L)
Sac
aro
sa (g
L)
Tiempo (diacuteas)
30gL 50gL 70gL 30 gL 50 gL 70 gL
Graacutefico 12 Cineacutetica de consumo de sustrato por parte del P cubensis en medio sumergido utilizando diferentes concentraciones de sacarosa como
fuente de carbono
Al observar el graacutefico 12 se puede decir que el P cubensis consumioacute mayor
cantidad de sacarosa cuando eacutesta estaba a una concentracioacuten de 70 gL en el
medio presentando un porcentaje de consumo del 49 mientras que para las
concentraciones de 50 gL y 30 gL de sacarosa se tuvo un porcentaje de
consumo de 24 y 37 Esto igual que en el consumo de glucosa se puede
deber a que al tener mayor concentracioacuten de sustrato en el medio el P cubensis
genera mayor afinidad por el mismo haciendo que dicho hongo se consuma
grandes cantidades de sacarosa durante el tiempo
Igualmente se observa que aproximadamente en el noveno diacutea de la
fermentacioacuten las tres diferentes concentraciones de glucosa (30 gL 50 gL y 70
65
gL) se mantienen casi constantes en el tiempo ello gracias a que en este diacutea el
hongo se encontraba en fase estacionaria en los tres ensayos
323 Comparacioacuten entre el consumo de sustrato de P cubensis en los
cultivos sumergidos con diferentes fuentes de carbono
Con el fin de identificar cuaacutel de las dos fuentes de carbono fue consumida en
mayor proporcioacuten por parte del P cubensis se procedioacute a realizar un anaacutelisis
estadiacutestico donde comparamos las dos fuentes de carbono empleados con
respecto al consumo de sustrato obtenido (concentracioacuten de glucosa y sacarosa
en cada uno de los medios) donde se consiguioacute un P-valor de 00811 con
respecto al tipo de sustrato lo que indica que no existen diferencias en cuanto al
consumo de sustrato y el tipo del mismo es decir es indiferente cuaacutel de los dos
sustratos (glucosa o sacarosa) se utilice para que se del consumo del mismo por
parte del P cubensis Observacioacuten que se reitera en la tabla de contraste muacuteltiple
que muestra que se trabajoacute como un grupo homogeacuteneo Igualmente el graacutefico 13
muestra las medias de consumo de sustrato (concentracioacuten durante los 14 diacuteas)
obtenidas mediante el anaacutelisis estadiacutestico y reitera que no existen diferencias
significativas con respecto al tipo de sustrato utilizado para el cultivo del P
cubensis en medio sumergido (Anexo 5)
66
Tratamientos de las dos fuentes de carbono usadas sin FA (glucosa y sacarosa)
Media glucosa (a) 3431
Media sacarosa (a) 3678
a
a
32
34
36
38
Co
nce
ntr
acioacute
n s
ust
rato
(g
L)
Letras diferentes denotan diferencias significativas (Prueba LSD)
Graacutefico 13 Consumo de sustrato para cada una de las fuentes de carbono utilizadas
Aun asiacute al comparar los graacuteficos 11 y 12 se puede observar un mayor consumo
de glucosa que de sacarosa lo que lleva a concluir que es mejor emplear la
primera (glucosa)
324 Consumo de sustrato por parte del P cubensis en medio sumergido
utilizando glucosa y fenilalanina en el medio
Los datos obtenidos acerca del consumo de sustrato durante los 14 diacuteas de la
fermentacioacuten para cada uno de los medios que conteniacutean 50 gL de glucosa y
diferentes concentraciones de FA (05 gL 1 gL y 15 gL) se muestran en el
graacutefico 14 De igual manera se ilustran en dicho graacutefico las cineacuteticas de
crecimiento micelial para cada una de las fermentaciones que teniacutean 50 gL de
glucosa y diferentes concentraciones de FA con el fin de realizar los anaacutelisis
pertinentes
67
0
02
04
06
08
1
12
0
10
20
30
40
50
60
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Bio
mas
a (g
L)
Glu
cosa
50
gL
+ F
A (g
L)
Tiempo (diacuteas)
05gL 10gL 15gL 05 gL 1 gL 15 gL
Graacutefico 14 Cineacutetica de consumo de sustrato por parte del P cubensis en medio sumergido utilizando 50 gL de glucosa como fuente de carbono y
diferentes concentraciones de FA
Analizando el graacutefico 14 se puede decir que el consumo de glucosa durante el
tiempo fue igual para las fermentaciones que conteniacutea concentraciones de 1 gL y
15 gL de FA dichos consumos corresponde a valores de 23 mientras que
para el ensayo que teniacutea una concentracioacuten de 05 gL de FA el porcentaje de
consumo fue del 18 Asimismo se presentaron diferencias significativas en
cuanto al consumo de sustrato entre los diferentes ensayos
El graacutefico 15 expone las medias del consumo de sustrato (concentracioacuten) de cada
una de las muestras y las diferencias existentes entre ellas se evidencia que la
adicioacuten de FA disminuyoacute el consumo de glucosa ademaacutes que en los ensayos se
presentaron tres grupos homogeacuteneos diferentes En el primer grupo (a) que
contiene las fermentaciones del P cubensis con una concentracioacuten de 50 gL de
glucosa y en ausencia de FA se obtuvo una media de 356 gL la cual indica un
mayor consumo de sustrato Luego el segundo grupo (c) se compone de las
concentraciones de 1 gL y 15 gL de FA presentando una media de 413 gL y
de 426 gL respectivamente y el uacuteltimo grupo (b) corresponde a una
68
concentracioacuten de 05 gL de FA el cual presenta el menor consumo de glucosa al
exponer una media 466 gL
Seguacuten lo anterior y el graacutefico 15 se dice que siacute existieron diferencias significativas
en cuanto al consumo de sustrato (concentracioacuten durante los 14 diacuteas) en los
uacuteltimos tres diacuteas cuando se trabajo con FA y sin FA y a su vez se encontraron
diferencias significativas de la concentracioacuten de sustrato en el medio cuando se
teniacutea una concentracioacuten de FA correspondiente a 05 gL con relacioacuten a las otras
dos concentraciones de FA (10 gL y 15 gL) mientras que entre estas dos
uacuteltimas concentraciones de FA (10 gL y 15 gL) no se encontraron diferencias
significativas (Anexo 6)
Tratamientos con y sin FA
Media 0 gL FA (a) 3564
Media 05 gL FA (b) 466
Media 10 gL FA (c) 4131
Media 15 gL FA (c) 426
a
b c c
0
10
20
30
40
50
60
Conc
entr
acioacute
n su
stra
to (g
L)
Letras diferentes denotan diferencias significativas (prueba LSD)
Graacutefico 15 Consumo de sustrato para cada una de las concentraciones de FA utilizadas
69
33 ESTUDIO DE LA CINEacuteTICA DE CONSUMO DE PROTEIacuteNA POR PARTE
DEL P cubensis CULTIVADO EN MEDIO SUMERGIDO (FANG-ZHONG)
Las fuentes de proteiacutena que posee el medio de Fang-Zhong son extracto de
levadura y peptona que representan una cantidad de 10 gL para cada ensayo
eacutesta cantidad se mantuvo constante para cada fermentacioacuten
Se evaluoacute el consumo de proteiacutena por parte del P cubensis durante los 14 diacuteas
de la fermentacioacuten para cada uno de los ensayos
A continuacioacuten se analizan los resultados obtenidos para cada uno de los
tratamientos
331 Consumo de proteiacutena por P cubensis en medio sumergido utilizando
diferentes concentraciones de glucosa
Una vez se calcularon las concentraciones de proteiacutena en el medio para cada
ensayo se graficaron dichos valores con respecto al tiempo
El graacutefico 16 muestra como se comportoacute el consumo de proteiacutena con respecto al
tiempo para cada una de las tres concentraciones de glucosa utilizadas y a su vez
como se comportoacute el crecimiento de biomasa para cada ensayo durante los 14
diacuteas de fermentacioacuten
70
0
01
02
03
04
05
06
07
0
5
10
15
20
25
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Bio
mas
a (g
L)
Pro
tein
a (g
L)
Tiempo (diacuteas)
30 GL 50 GL 70 GL 30 gL Biomasa 50 gL Biomasa 70 gL Biomasa
Graacutefico 16 Cineacutetica de consumo de proteiacutena por parte del P cubensis en medio sumergido utilizando diferentes concentraciones de glucosa como
fuente de carbono
Analizando el graacutefico 16 se puede observar que el consumo de proteiacutena se dio
casi en su totalidad El ensayo que mayor consumo de proteiacutena presentoacute fue el
que conteniacutea 30 gL de glucosa arrojando un porcentaje de consumo del 98
mientras que las fermentaciones realizadas a concentraciones de 50 gL y 70 gL
de glucosa presentaron un porcentaje de consumo de proteiacutena del 91 y 90
respectivamente
Al enfocarnos en la relacioacuten existente entre el consumo de proteiacutena y el
crecimiento micelial del P cubensis se puede notar gracias al graacutefico 16 que la
relacioacuten es directamente proporcional debido a que el consumo de proteiacutena fue
permanente mientras el hongo se encontraba en fase exponencial es decir el P
cubensis necesitaba de la proteiacutena para aumentar su crecimiento mientras que en
el momento en que el microorganismo comenzoacute su fase estacionaria la
concentracioacuten de proteiacutena en el medio se mantuvo constante esto uacuteltimo soacutelo es
vaacutelido para concentraciones de 50 gL y 70 gL de glucosa puesto que ambas
llegaron a la fase estacionaria
71
332 Consumo de proteiacutena por P cubensis en medio sumergido utilizando
diferentes concentraciones de sacarosa
Una vez obtenidos los valores de consumo de proteiacutena para cada concentracioacuten
de sacarosa utilizada se precedioacute a graficarlos con respecto al tiempo dichos
datos se encuentran en el graacutefico 17 De igual manera en este graacutefico se
representa la cineacutetica de crecimiento de biomasa para el P cubensis de acuerdo a
las distintas concentraciones de sacarosa utilizadas
0
01
02
03
04
05
06
0
2
4
6
8
10
12
14
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Bio
mas
a (g
L)
Prot
eiacutena
(gL
)
Tiempo (diacuteas)
30 GL 50 GL 70 GL 30 gL 50 gL 70 gL
Graacutefico 17 Cineacutetica de consumo de proteiacutena por parte del P cubensis en medio sumergido utilizando diferentes concentraciones de sacarosa como
fuente de carbono
El graacutefico 17 ilustra el consumo casi en su totalidad de la proteiacutena para cada uno
de los tratamientos El ensayo que mayor consumo de proteiacutena presentoacute fue el
que conteniacutea 30 gL de sacarosa exponiendo un porcentaje de consumo del 89
mientras que las concentraciones de 50 gL y 70 gL de sacarosa arrojaron
porcentajes de consumo del 86 y 57 respectivamente
Ahora bien al analizar el crecimiento del P cubensis con respecto al consumo de
proteiacutena se evidencia claramente que el consumo disminuyoacute permanentemente
72
en el tiempo mientras el hongo se encontraban en estado exponencial indicando
el intereacutes del P cubensis por la proteiacutena siendo eacutesta utilizada por el mismo para
aumentar su tamantildeo y biomasa
Durante los diacuteas 4 y 10 las fermentaciones que conteniacutean concentraciones de 30
gL y 70 gL de sacarosa presentaron un alto consumo de proteiacutena a pesar de
que el P cubensis se encontraba en estos dos ensayos en fase estacionaria fase
en la cual no se requiere consumir grandes cantidades de sustrato puesto que el
hongo soacutelo necesitaba alimentarse para mantenerse o para producir productos no
ligados al crecimiento maacutes no para cambiar la cantidad de biomasa presente en el
medio Asimismo la concentracioacuten de 50 gL de sacarosa tambieacuten presentoacute un
alto consumo de proteiacutena durante los diacuteas 4 y 8 en donde se creiacutea estar en una
fase estacionaria temprana lo dicho anteriormente reitera una vez maacutes la afinidad
que el P cubensis presentoacute con respecto a las fuentes de proteiacutena usadas
333 Comparacioacuten entre el consumo de proteiacutena de P cubensis en los
cultivos sumergidos con diferentes fuentes de carbono
Con el fin de conocer cuaacutel de los dos tipos de sustrato empleado fue mayormente
consumido se realizoacute un anaacutelisis estadiacutestico
En el graacutefico 18 se ilustran las medias de consumo de proteiacutena (concentracioacuten)
arrojadas mediante el anaacutelisis estadiacutestico sobre el consumo de proteiacutena cuando se
utilizoacute glucosa o sacarosa en el medio y se evidencia que existen diferencias
significativas en cuanto a la concentracioacuten de proteiacutena en el tiempo en el medio
cuando se realizoacute el experimento con glucosa y cuando se utilizoacute sacarosa
arrojando asiacute dos grupos homogeacuteneos el primero (a) presenta una media de 465
gL mientras que el grupo dos (b) arroja un valor de media de 609 gL indicando
un menor consumo de proteiacutena por parte del P cubensis en el medio sumergido
73
de Fang-Zhong cuando se utilizoacute sacarosa como principal fuente de carbono
(Anexo 7)
Tratamientos de las dos fuentes de carbono usadas sin FA (glucosa y sacarosa)
Media glucosa (a) 465
Media sacarosa (b) 609
a
b
0
1
2
3
4
5
6
7
8
Conc
entr
acioacute
n pr
oteiacute
na (g
L)
Letras diferentes denotan diferencias significativas (prueba LSD)
Graacutefico 18 Consumo de proteiacutena para cada una de las fuentes de carbono utilizadas
334 Consumo de proteiacutena por P cubensis en medio sumergido utilizando
glucosa y FA en el medio
Una vez se obtuvo la concentracioacuten de proteiacutena en el medio para cada
concentracioacuten de FA utilizada se precedioacute a graficar dichos valores con respecto
al tiempo los cuales se ilustran en el graacutefico 19 ademaacutes se muestran en dicho
graacutefico las cineacuteticas de crecimiento de biomasa para cada ensayo
74
0
02
04
06
08
1
12
0
2
4
6
8
10
12
14
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Bio
mas
a (g
L)
Pro
teiacuten
a (g
L)
Tiempo (diacuteas)
05 gL 1 gL 15 gL 05 gL 1 gL 15 gL
Graacutefico 19 Cineacutetica de consumo de proteiacutena por parte del P cubensis en medio sumergido utilizando 50 gL de glucosa como fuente de carbono y
diferentes concentraciones de FA
De igual forma que para la fermentacioacuten que teniacutea 50 gL de glucosa en el medio
realizada anteriormente para dichos ensayos el consumo de proteiacutena fue
permanente y se dio casi en su totalidad El ensayo que mayor consumo de
proteiacutena presentoacute fue el que conteniacutea 05 gL de FA arrojando un porcentaje de
consumo del 86 aun asiacute el porcentaje de consumo arrojado por la fermentacioacuten
de 1 gL de FA fue del 84 indicando que no existen diferencias con respecto al
consumo de proteiacutena entre dichas cantidades de FA utilizadas Mientras que el
porcentaje de consumo para 15 gL de FA fue inferior presentando un valor del
72 De acuerdo a los resultados mencionados anteriormente se puede decir que
a mayor concentracioacuten de FA en el medio se presenta menor consumo de
proteiacutena por parte del P cubensis esto se puede afirmar uacutenicamente para los
resultados obtenidos durante esta investigacioacuten a ciertas condiciones
Analizando ahora la relacioacuten entre el consumo de proteiacutena y el crecimiento
micelial se puede ver que al igual que para los ensayos con glucosa a 50 gL se
75
tiene un consumo permanente mientras se estaacute en fase exponencial y una vez se
llega a la fase estacionario alrededor del diacutea 12 la concentracioacuten de proteiacutena en
el medio se estabilizoacute
A la hora de indagar los datos estadiacutesticamente se puede observar que no existen
diferencias significativas sobre el consumo de proteiacutena (concentracioacuten) en el
tiempo con respecto al tipo de sustrato pero al comparar los resultados con los
ensayos donde se antildeadioacute FA al medio se encontroacute que siacute existen diferencias
significativas Se crearon dos grupos homogeacuteneos el primero cuenta con glucosa
y sacarosa presentando medias (cantidad de proteiacutena en el medio) de 468 gL y
473 gL respectivamente mientras que el ensayo con FA se encuentra en otro
grupo en donde su consumo de proteiacutena fue menor presentando una media
(cantidad de proteiacutena en el medio) de 614 gL (Anexo 8)
Tratamientos con y sin FA
Media glucosa (a) 468
Media sacarosa Proteiacutena (a) 473
Media fenilalanina (b) 614
a a
b
0
1
2
3
4
5
6
7
8
Co
nce
ntr
acioacute
n p
rote
iacutena
(gL
)
Letras diferentes denotan diferencias significativas (prueba LSD)
Graacutefico 20 Consumo de proteiacutena para los ensayos con y sin FA
76
34 ESTUDIO CUALITATIVO DE LA PRESENCIA DEL ALCALOIDE
Posterior a las fermentaciones de glucosa sacarosa y glucosa 50 gL con FA y
los respectivos anaacutelisis se realizoacute un uacuteltimo anaacutelisis que a la vez fue el de mayor
relevancia a la hora de determinar cuaacutel de los medios fue el que mejores
resultados arrojoacute En primera instancia se utilizoacute el reactivo de Dragendorff como
indicador de alcaloide para analizar las muestras de los diacuteas 12 13 y 14 con el fin
de esclarecer la presencia de alcaloides (Anexo 17)
Una vez detectada la presencia de alcaloides gracias a la coloracioacuten naranja
presentada en las muestras se procedioacute a realizar la teacutecnica de HPLC con el fin
de hallar un porcentaje del compuesto de intereacutes basado en las aacutereas obtenidas
de los cromatogramas (asumiendo un tiempo de retencioacuten entre 62 y 72
minutos)
341 Produccioacuten de compuestos producidos por P cubensis cuando el
medio no conteniacutea FA
A la hora de analizar y confirmar cuaacutel fue el mejor ensayo de los experimentos
realizados se tuvo como criterio base determinar la fuente de carbono y su
respectiva concentracioacuten que mejor presencia del compuesto de intereacutes arrojoacute
supuesto a un tiempo de retencioacuten entre 62 y 72 minutos
Inicialmente al obtener los anaacutelisis estadiacutesticos se deduce que no existieron
diferencias significativas entre el aacuterea del pico de intereacutes con respecto a todos los
picos arrojados por el cromatograma y los factores estudiados (tipo de sustrato
diacutea de fermentacioacuten y concentracioacuten) puesto que se obtuvieron valores de P-valor
77
de 03310 09580 y 08336 respectivamente es decir no importa queacute tipo de
sustrato se utilice la produccioacuten de alcaloide no tendraacute variaciones (Anexo 9)
Al analizar el graacutefico 21 se puede observar que las medias de las aacutereas halladas
para los diferentes ensayos con glucosa y sacarosa no presentaron diferencias
significativas es decir pertenecen al mismo grupo homogeacuteneo (a) lo que ratifica
lo dicho anteriormente
Tratamiento de las dos fuentes de carbono usadas sin FA (glucosa y sacarosa)
Media glucosa (a) 235916
Media sacarosa (a) 337147
a
a
0
7000
14000
21000
28000
35000
42000
Aacutere
a de
Com
pues
to
Letras diferentes denotan diferencias significativas (prueba LSD)
Graacutefico 21 Aacuterea del compuesto obtenido de P cubensis en tiempo de retencioacuten entre 62 y 72 minutos para las dos fuentes de carbono
Por tal razoacuten fue necesario hacer un anaacutelisis cualitativo de los cromatogramas
obtenidos mediante HPLC el cual se basoacute en la forma del pico arrojado por la
teacutecnica La figura 6 ilustra dicho anaacutelisis
78
Buena resolucioacuten de pico Mala resolucioacuten de pico
(a) (b)
Figura 6 Cromatogramas de dos diferentes fermentaciones de P cubensis que ilustran el criterio de escogencia del mejor ensayo realizado (a) 50 gL
glucosa (b) 50 gL sacarosa
Primero fue necesario observar el tamantildeo del pico y posterior a eacutesto determinar
su resolucioacuten La figura 6 ilustra dos ejemplos el de 50 gL de glucosa el diacutea 13 y
50 gL de sacarosa el diacutea 14 mientras el primero muestra un pico grande y
definido la segunda fermentacioacuten ilustra un pico grande pero poco definido
indicando que en este caso no se resolvioacute correctamente el alcaloide es decir no
se logroacute una buena separacioacuten De esta manera se analizaron los diferentes
cromatogramas para los diacuteas 12 (Anexo 19) 13 (Anexo 20) y 14 (Anexo 21) de
cada fermentacioacuten arrojando diferencias entre los ensayos y llevando a la
conclusioacuten de que la fermentacioacuten que mejores resultados arrojoacute fue la que
conteniacutea 50 gL de glucosa
79
342 Produccioacuten de compuestos producidos por P cubensis cuando el
medio conteniacutea FA
Despueacutes de realizada la fermentacioacuten con glucosa 50 gL y concentraciones de
FA de 05 gL 10 gL y 15 gL se procedioacute de igual manera que en el estudio sin
FA a evaluar cuaacutel de estas tres concentraciones de FA exhibioacute mejor resolucioacuten
del alcaloide
Inicialmente se realizoacute un anaacutelisis estadiacutestico el cual arrojoacute que no existen
diferencias significativas con respecto al aacuterea de pico que en este caso debido al
supuesto representa la Psilocibina y los diacuteas 12 13 y 14 de la fermentacioacuten
Mediante el graacutefico 22 se puede decir que en los uacuteltimos tres diacuteas de las
fermentaciones que conteniacutean FA en el medio no existen diferencias significativas
con respecto al alcaloide de intereacutes obtenido es decir en los tres se produjo el
alcaloide (Anexo 10)
Tratamientos de los uacuteltimos tres diacuteas de fermentacioacuten usando FA
Media diacutea 12 (a) 411758
Media diacutea 13 (a) 413401
Media diacutea 14 (a) 44860
a a a
0
10000
20000
30000
40000
50000
Aacutere
a Co
mpu
esto
Letras diferentes denotan diferencias significativas
Graacutefico 22 Aacuterea del compuesto obtenido de P cubensis en tiempo de retencioacuten entre 62 y 72 minutos en los uacuteltimos tres diacuteas de la fermentacioacuten
con FA y glucosa
80
Igual que en numeral anterior fue necesario realizar anaacutelisis cualitativo para los
cromatogramas por ende se requirioacute observar el tamantildeo del pico y posterior a
eacutesto determinar su resolucioacuten
Buena resolucioacuten de pico Mala resolucioacuten de pico
(a) (b)
Figura 7 Cromatogramas de dos diferentes fermentaciones de P cubensis que ilustran el criterio de escogencia del mejor ensayo realizado (a) 05 gL
FA (b) 15 gL FA
La figura 7 ejemplifica el anaacutelisis realizado para la seleccioacuten del mejor ensayo
ejecutado Se tienen dos cromatogramas el de 05 gL de FA en el diacutea 13 y el de
15 gL de FA para el mismo diacutea
A todos los cromatogramas obtenidos para los diacuteas 12 (Anexo 19) 13 (Anexo 20)
y 14 (Anexo 21) se realizoacute el mismo anaacutelisis y se concluyoacute que la concentracioacuten
maacutes apropiada para la obtencioacuten de la los compuestos producidos por P cubensis
fue de 05 gL de FA debido a que eacuteste generariacutea una disminucioacuten en los costos
81
35 ESTUDIO PORCENTUAL (AacuteREA) DEL ALCALOIDE REALIZADO PARA
LOS DIFERENTES ENSAYOS
Se calculoacute el porcentaje de aacuterea correspondiente al pico que identificoacute que se
asumioacute como el correspondiente a la Psilocibina gracias a la suposicioacuten realizada
del tiempo de retencioacuten
A continuacioacuten se presentan los valores obtenidos y sus respectivos anaacutelisis para
cada tratamiento
351 Porcentaje de la Psilocibina (suposicioacuten) cuando el medio no conteniacutea
FA
Debido a que no se contaba con un estaacutendar de Psilocibina los resultados
mostrados en la tabla 5 se obtuvieron realizando un porcentaje con respecto a las
aacutereas bajo la curva arrojadas mediante el anaacutelisis de cromatografiacutea de alta
eficiencia (Anexos 19 20 y 21) En dichos anexos se encuentran resaltadas en
negrilla aquellas aeacutereas utilizadas
Tabla 5 Porcentaje de aacuterea hallado mediante HPLC para los uacuteltimos tres diacuteas de la fermentacioacuten con concentraciones de 30 gL 50 gL y 70 gL de glucosa
y sacarosa con un tiempo de retencioacuten de 62 y 72 minutos
Diacutea Glucosa
(gL)
Aacuterea
(compuesto
Tr= 62-72)
Sacarosa
(gL)
Aacuterea
(compuesto
Tr= 62-72)
12 30 60650 30 3664
12 50 7396 50 5857
12 70 4816 70 3415
13 30 702 30 2876
13 50 6815 50 4113
13 70 6733 70 5583
14 30 4824 30 2756
14 50 4821 50 2792
14 70 017 70 1429
82
A la hora de analizar los datos de la tabla 5 se puede observar que el mayor
porcentaje de aacuterea se obtuvo cuando se trabajoacute con glucosa como fuente de
carbono y concretamente a una concentracioacuten de 50 gL
Analizando los datos estadiacutesticamente no se obtuvieron diferencias significativas
en cuanto a la produccioacuten del compuesto (aacuterea) con respecto al tipo de sustrato
utilizado durante las fermentaciones es decir es indiferente si se utiliza glucosa o
sacarosa en el cultivo de P cubensis en medio sumergido de Fang-Zhong
El graacutefico 23 ilustra las medias (aacuterea) obtenidas para la produccioacuten de alcaloide en
las dos diferentes fuentes de carbono es decir glucosa y sacarosa exponiendo
un uacutenico grupo homogeacuteneo con medias (produccioacuten de alcaloide) de aacutereas de
219635 y 234391 para glucosa y sacarosa respectivamente (Anexo 11)
Tratamientos de las dos fuentes de carbono usadas sin FA (glucosa y sacarosa)
Media glucosa (a) 219635
Media sacarosa (a) 234391
a
a
2000
2100
2200
2300
2400
Aacuterea
Com
pues
to
Letras diferentes denotan diferencias significativas (prueba LSD)
Graacutefico 23 Aacuterea del compuesto obtenido de P cubensis en tiempo de retencioacuten entre 62 y 72 minutos para cada una de las fuentes de carbono
utilizadas
Aun asiacute estudiando los graacuteficos de HPLC con el criterio mencionado
anteriormente es decir observando el tamantildeo del pico y su resolucioacuten del mismo
83
se observoacute claramente que la presencia del alcaloide (tiempo de retencioacuten
supuesto entre 62 y 72 minutos) fue mejor cuando se trabajoacute con glucosa a una
concentracioacuten de 50 gL debido que presenta el mejor pico
352 Porcentaje de aacuterea de compuestos presentes en P cubensis cuando
el medio conteniacutea FA
Con el fin de observar si la adicioacuten de FA al medio si arrojoacute mejores resultados en
cuanto a la produccioacuten del compuesto presente entre un rango de 62 y 72
minutos como tiempo de retencioacuten se procedioacute a calcular el porcentaje del aacuterea
de intereacutes de acuerdo a las aacutereas arrojadas para cada ensayo por medio del
anaacutelisis de HPLC Los datos obtenidos se ilustran a continuacioacuten en la tabla 6
Tabla 6 Porcentaje hallado mediante HPLC para los uacuteltimos tres diacuteas de la fermentacioacuten con concentraciones de 05 gL 10 gL y 15 gL de FA y 50 gL
de glucosa con un tiempo de retencioacuten entre 62 y 72 minutos
Diacutea
Glucosa
50 gL +
FA
Aacuterea
(compuesto
Tr=62-72)
12 0 4315
12 05 2931
12 1 6236
12 15 847
13 0 3257
13 05 7549
13 1 4790
13 15 2721
14 0 4822
14 05 3863
14 1 5801
14 15 2102
84
Al detallar la tabla 6 puede observarse que el ensayo que mayor porcentaje de
aacuterea arrojoacute fue el que conteniacutea 05 gL de FA arrojando su maacuteximo porcentaje
correspondiente a 755 el diacutea 13 Aun asiacute las diferencias existentes entre ellos
no fueron significativas
Ahora bien al analizarlos estadiacutesticamente se encontroacute que la produccioacuten del
alcaloide en presencia de FA presentoacute la misma tendencia que los ensayos
analizados anteriormente sin eacutesta pero gracias a que este aminoaacutecido duplico la
cantidad de biomasa y debido a que el compuesto de intereacutes se produce
intracelularmente se afirma que el uso de FA aumentoacute la generacioacuten del
compuesto evaluado (Anexo 12)
El graacutefico 24 presenta las diferentes medias en cuanto al porcentaje de aacuterea del
compuesto presente entre 62 y 72 minutos para los diferentes tratamientos de
glucosa a una concentracioacuten de 50 gL y sus concentraciones respectivas de FA
Claramente se ve que soacutelo existe un grupo homogeacuteneo lo que reafirma que no
existen diferencias significativas de la produccioacuten con respecto a las
concentraciones de FA
85
Tratamientos con y sin FA
Media 0 gL FA (a) 3122
Media 05 gL FA (a) 2391
Media 10 gL FA (a) 2823
Media 15 gL FA (a) 2113
a
aa
a
0
5
10
15
20
25
30
35
40
Aacutere
a Co
mpu
esto
Letras diferentes denotan diferencias significativas (prueba LSD)
Graacutefico 24 Aacuterea del compuesto obtenido de P cubensis en tiempo de retencioacuten entre 62 y 72 minutos para cada una de las concentraciones de
FA utilizadas
Debido a que no se encontraron diferencias significativas en cuanto al porcentaje
de aacuterea obtenido mediante los cromatogramas se concluye que el mejor medio es
el que tiene como fuente de carbono glucosa a una concentracioacuten de 50 gL y una
adicioacuten de 05 gL de FA puesto que genera una disminucioacuten en costos
86
CONCLUSIONES
No existen diferencias significativas en el crecimiento micelial de P
cubensis en medio sumergido Fang-Zhong cuando se trabaja con fuentes
de carbono glucosa y sacarosa sin embargo se decide trabajar con 50 gL
de glucosa puesto que eacuteste tiene una buena presencia de alcaloide y a su
vez una mejor produccioacuten de biomasa
La concentracioacuten de glucosa utilizada para el crecimiento de P cubensis
influye en el crecimiento micelial obteniendo concentraciones de biomasa
de 062 gL 055 gL y 048 gL para concentraciones de sustrato de 70 50
y 30 gL de glucosa siendo las dos primeras significativamente diferentes
con respecto a la de 30 gL
La concentracioacuten de sacarosa utilizada para el crecimiento de P cubensis
influye en el crecimiento micelial obteniendo concentraciones de biomasa
de 057 gL 045 gL y 026 gL para concentraciones de sustrato de 70 50
y 30 gL de sacarosa siendo significativamente diferentes entre ellas
La resolucioacuten de los picos obtenidos por RP-HPLC del extracto de P
cubensis fue mayor para las fermentaciones realizadas con una
concentracioacuten de 50 gL de glucosa lo que conllevoacute a utilizarlo al realizar
los ensayos que conteniacutean en el medio FA
La concentracioacuten de biomasa de P cubensis obtenida en cultivo sumergido
en medio Fang-Zhong con glucosa se duplicoacute con la adicioacuten de FA No
obstante no existen diferencias significativas entre las concentraciones de
FA utilizadas
87
El consumo de proteiacutena presentada por P cubensis en medio Fang-Zhong
fue casi del 100 mientras que el consumo de sustrato para el mismo
medio estuvo alrededor del 40
El consumo de sustrato durante el transcurso de las fermentaciones que no
conteniacutean FA en el medio no presentoacute diferencias significativas con
respecto a las dos fuentes de carbono utilizadas Mientras que en aquellas
fermentaciones donde se agregoacute FA al medio siacute existieron diferencias
significativas entre las fermentaciones de 15 y 1 gL de FA con respecto a
los ensayos realizados con 05 gL FA Sin embargo el P cubensis
consumioacute mayor cantidad de sustrato cuando el medio no conteniacutea FA
Se evidencioacute que el P cubensis consumioacute mayor cantidad de proteiacutena
cuando el sustrato utilizado en el medio fue glucosa y a su vez se detecto
que la adicioacuten de FA al medio tuvo como efecto la disminucioacuten en el
consumo de sustrato por parte del microorganismo
El consumo de sustrato y de proteiacutena tuvo un comportamiento similar
puesto que fue consumido permanentemente durante la fase exponencial
para cada uno de los tratamientos realizados es decir las concentraciones
de 30 gL 50 gL y 70 gL de glucosa y sacarosa como fuente de carbono y
de 05 gL 1 gL y 15 gL de FA teniendo como fuente de carbono glucosa
a una concentracioacuten de 50 gL mientras que en la fase estacionaria su
consumo se disminuyoacute permaneciendo casi constante
Despueacutes de realizados los estudios en cuanto a la produccioacuten del
compuesto presente entre 62 y 72 minutos para cada uno de los ensayos
no se evidenciaron diferencias significativas entre las dos fuentes de
carbono utilizadas (glucosa y sacarosa)
88
La adicioacuten del precursor llamado Fenilalanina (FA) al medio sumergido
Fang-Zhong para llevar a cabo el cultivo del P cubensis tuvo influencia en
cuanto a la produccioacuten de compuesto presente entre tiempo de retencioacuten de
62 y 72 minutos debido a que eacuteste duplicoacute la concentracioacuten de biomasa
en el medio se dice entonces que la produccioacuten aumentoacute al ser eacuteste de
produccioacuten intracelular
La resolucioacuten del compuesto presente entre el tiempo de retencioacuten de 62 a
72 minutos se obtuvo mejor en el ensayo que conteniacutea 05 gL de FA y al
saber que no existieron diferencias significativas en la produccioacuten en cuanto
al porcentaje de aacutereas obtenido con respecto a las demaacutes concentraciones
de FA se afirma que eacuteste es el medio que mejores resultados arrojoacute para
el crecimiento de P cubensis y la produccioacuten de Psilocibina
89
RECOMENDACIONES
Se sugiere observar el efecto que tiene la variacioacuten de las revoluciones a
las cuales se realizaron las fermentaciones para ver como variacutea el
crecimiento del P cubensis en medio sumergido Fang-Zhong con respecto
a dicho factor
Debido a que soacutelo se realizaron anaacutelisis sobre el crecimiento del P
cubensis en medio sumergido haciendo uso de dos sustratos diferentes
(glucosa y sacarosa) seriacutea recomendable realizar el mismo anaacutelisis para
otro tipo de sustrato como por ejemplo melaza por su bajo costo
Del mismo modo seriacutea apropiado realizar el estudio con otro tipo de
precursor y en otras concentraciones para ver la incidencia de eacuteste en el
comportamiento del hongo
Se recomienda realizar un escalamiento de dicho proceso en un biorreactor
con el fin de evaluar a mayor escala el crecimiento del P cubensis y la
produccioacuten del alcaloide
Debido a que la proteiacutena se comportoacute como el principal nutriente se sugiere
para una proacutexima investigacioacuten evaluar diferentes concentraciones de
proteiacutena en el medio
90
ANEXOS
Anexo 1 Anaacutelisis de varianza (ANOVA) para el crecimiento de biomasa de
las fermentaciones con glucosa
Tabla 7 Anaacutelisis de Varianza para el crecimiento micelial (glucosa)
Tabla 8 Anaacutelisis Muacuteltiple de Rangos para el crecimiento micelial (glucosa)
91
Anexo 2 Anaacutelisis de Varianza (ANOVA) para el crecimiento de biomasa de
las fermentaciones con sacarosa
Tabla 9 Anaacutelisis de Varianza para el crecimiento micelial (sacarosa)
Tabla 10 Anaacutelisis Muacuteltiple de Rangos para el crecimiento micelial (sacarosa)
92
Anexo 3 Anaacutelisis de Varianza (ANOVA) para el crecimiento de biomasa de
las fermentaciones con glucosa y sacarosa
Tabla 11 Anaacutelisis de Varianza para el crecimiento micelial (glucosa y
sacarosa)
Tabla 12 Anaacutelisis Muacuteltiple de Rangos para el crecimiento micelial (glucosa y
sacarosa)
93
Anexo 4 Anaacutelisis de Varianza (ANOVA) para el crecimiento de biomasa de
las fermentaciones con glucosa 50 gL y FA
Tabla 13 Anaacutelisis de Varianza para el crecimiento micelial (glucosa 50 gL y
FA)
Tabla 14 Anaacutelisis Muacuteltiple de Rangos para el crecimiento micelial (glucosa
50 gL y FA)
94
Anexo 5 Anaacutelisis de varianza (ANOVA) para el consumo de sustrato en las
fermentaciones sin FA
Tabla 15 Anaacutelisis de Varianza para el consumo de Sustrato sin FA
Tabla 16 Anaacutelisis Muacuteltiple de Rangos para el consumo de Sustrato sin FA
95
Anexo 6 Anaacutelisis de Varianza (ANOVA) para el consumo de sustrato en las
fermentaciones con FA
Tabla 17 Anaacutelisis de Varianza para el consumo de Sustrato con FA
Tabla 18 Anaacutelisis Muacuteltiple de Rangos para el consumo de Sustrato con FA
96
Anexo 7 Anaacutelisis de Varianza (ANOVA) para el consumo de proteiacutena en las
fermentaciones sin FA
Tabla 19 Anaacutelisis de Varianza para el consumo de Proteiacutena sin FA
Tabla 20 Anaacutelisis Muacuteltiple de Rangos para el consumo de Proteiacutena sin FA
97
Anexo 8 Anaacutelisis de Varianza (ANOVA) para el consumo de proteiacutena en las
fermentaciones con FA
Tabla 21Anaacutelisis de Varianza para el consumo de Proteiacutena con FA
Tabla 22 Anaacutelisis Muacuteltiple de Rangos para el consumo de Proteiacutena con FA
98
Anexo 9 Anaacutelisis de Varianza (ANOVA) para la produccioacuten de Psilocibina en
las fermentaciones sin FA
Tabla 23 Anaacutelisis de Varianza para la produccioacuten de Psilocibina sin FA
Tabla 24 Anaacutelisis Muacuteltiple de Rangos para la produccioacuten de Psilocibina
seguacuten el Sustrato sin FA
99
Anexo 10 Anaacutelisis de Varianza (ANOVA) para la produccioacuten de Psilocibina en las fermentaciones con FA
Tabla 25 Anaacutelisis de Varianza para la produccioacuten de Psilocibina con FA
Tabla 26 Anaacutelisis Muacuteltiple de Rangos para la produccioacuten de Psilocibina
seguacuten el diacutea con FA
100
Anexo 11 Anaacutelisis de Varianza (ANOVA) para la cuantificacioacuten porcentual de
Psilocibina en las fermentaciones sin FA
Tabla 27 Anaacutelisis de Varianza para la cuantificacioacuten de Psilocibina sin FA
Tabla 28 Anaacutelisis Muacuteltiple de Rangos para la cuantificacioacuten de Psilocibina
seguacuten el tipo de sustrato sin FA
101
Anexo 12 Anaacutelisis de Varianza (ANOVA) para la cuantificacioacuten porcentual de
Psilocibina en las fermentaciones con FA
Tabla 29 Anaacutelisis de Varianza para la cuantificacioacuten de Psilocibina con FA
Tabla 30 Anaacutelisis Muacuteltiple de Rangos para la cuantificacioacuten de Psilocibina
seguacuten la concentracioacuten con FA
102
Anexo 13 Determinacioacuten de consumo de azuacutecares por el meacutetodo de DNS
(Aacutecido Dinitrosaliciacutelico)
a DNS para glucosa
Pasos para preparar DNS
Disolver 16 gr de NaOH en agua destilada
Adicionar 30 gr de tartrato de Na y K
Aforar a 100 ml con agua destilada
Almacenar en frascos aacutembar a 4degC
Se debe mantener un stock de glucosa 4mgml y almacenarlo a 4degC A partir
de la solucioacuten de glucosa se preparan las soluciones para hacer la curva
patroacuten con las siguientes concentraciones (gL) 025 050 100 200 y 400
Procedimiento
Tomar 05 ml de cada dilucioacuten y agregar 05 ml de reactivo DNS
Preparar una muestra blanco por dilucioacuten de 05 ml de agua destilada a 05
ml de reactivo de DNS
Agitar todas las muestras
Colocar a ebullir las muestras en bantildeo mariacutea por cinco minutos
Enfriar con hielo
Adicionar 5 ml de agua destilada
Agitar y dejar en reposo 15 minutos
Leer en espectrofotoacutemetro a 540 nm
Realizar la curva Absorbancia Vs Concentracioacuten Debe tener un coeficiente
de correlacioacuten de 0991 a 0999
b DNS para sacarosa
Pasos para preparar DNS sacarosa
Preparacioacuten de la solucioacuten Standard stock de sacarosa (30 gL) tomar 30
gr de sacarosa anhiacutedrida grado reactivo con exactitud hasta la deacutecima de
mg disolver ajustar a aforo de 100 ml con agua desionizada empacar en
viales y almacenar en congelador
Preparacioacuten DNS pesar 16 gr de hidroacutexido de sodio grado reactivo 30 gr
de tartrato de sodio y potasio y disolverlos juntos con 50 ml de agua
103
desionizada aparte pesar 10 gr del DNS disolver con 30 ml de agua
desionizada agregar lentamente y con agitacioacuten la solucioacuten del DNS a la
solucioacuten de tartrato y NaOH anteriormente preparadas ajustar a 100 ml
filtrar envasar en frasco aacutembar y rotular con fecha de vencimiento incluida
(3 meses maacuteximo) mantener a la temperatura del laboratorio
Preparacioacuten del reactivo NaOH 10 N (500 ml) pesar con exactitud hasta
la deacutecima de mg 20 gr de NaOH grado reactivo por cada 500 ml de
solucioacuten disolver primero con 300 ml de agua desionizada y luego aforar a
500 ml envasar y rotular correctamente y mantener a la temperatura del
laboratorio
Preparacioacuten de HCL 10 (100 ml) tomar 27 ml de aacutecido clorhiacutedrico al
37 grado reactivo y aforar hasta 100 ml con agua desionizada envasar
rotular correctamente de acuerdo a la norma del laboratorio y almacenar a
la temperatura del laboratorio
Se debe mantener un stock de glucosa 30 gL y almacenarlo a 4degC A partir
de la solucioacuten de glucosa se preparan las soluciones para hacer la curva
patroacuten con las siguientes concentraciones (gL) 3 6 12 18 24 y 30
Procedimiento
Preparar en cada tubo (las soluciones de la curva patroacuten de sacarosa las
muestras problemas diluidas si es necesario y como blanco agua
desionizada) 100microl de solucioacuten
Adicionar 200 microl de HCL 10 a cada tubo y agitar todos los tubos en vortex
Llevar a ebullicioacuten por 10 minutos en bantildeo mariacutea precalentado a 95degC
Enfriar hasta temperatura ambiente raacutepidamente
Adicionar a cada tubo 1 ml de NaOH 10 N y agitar los tubos en vortex
Aparte tomar 05 ml de cada tubo en otros tubos rotulados y agregar 05 ml
del DNS
Agitar todas las muestras en vortex
Llevar a ebullicioacuten por 5 minutos en bantildeo mariacutea precalentado a 96degC
Enfriar hasta temperatura ambiente raacutepidamente
Adicionar 5 ml de H2O desionizada agitar en vortex y dejar reposar por 15
minutos
Leer en espectrofotoacutemetro a 540 nm
Realizar la curva Absorbancia Vs Concentracioacuten Debe tener un coeficiente
de correlacioacuten de 0991 a 0999
104
Anexo 14 Cineacutetica de Consumo de Sustrato
La cineacutetica de consumo de sustrato se realizoacute por el meacutetodo de Aacutecido
Dinitrosaliciacutelico (DNS) Los rangos de concentracioacuten y absorbancia para cada caso
se citan a continuacioacuten
Rangos de concentraciones y absorbancias para las fermentaciones que
usaron glucosa (30 gL 50 gL y 70 gL) como sustrato
Concentracioacuten de 02 a 12 gL
Absorbancia de 01234 a 06612
Ecuacioacuten Y = 19174x -00517 R2 = 09923
Rangos de concentraciones y absorbancias para las fermentaciones que
usaron sacarosa (30 gL 50 gL y 70 gL) como sustrato
Concentracioacuten de 3 a 30 gL
Absorbancia de 00822 a 11112
Ecuacioacuten Y = 25983x + 04857 R2 = 09978
Rangos de concentraciones y absorbancias para las fermentaciones que
usaron glucosa 50 gL como sustrato y FA
Concentracioacuten de 02 a 12 gL
Absorbancia de 0097 a 063
Ecuacioacuten Y = 18785x + 00019 R2 = 09986
105
Anexo 15 Determinacioacuten de consumo de proteiacutenas por el meacutetodo de LOWRY
Pasos para la preparacioacuten de LOWRY
Para obtener la curva estaacutendar de Albuacutemina se preparan 5 soluciones
patrones de Albuacutemina en NaCL al 09 (PV) de las siguientes
concentraciones 152 80 200 300 400 Pgml Si la concentracioacuten de
Proteiacutena total es menor de 500 Pgml se lee la absorbancia a 750 nm si
estaacute entre 1000 y 2000 Pgml se lee a 550nm
Se prepara un blanco que no lleva Albuacutemina y en su reemplazo se adiciona
0-5 ml de solucioacuten salina (NaCL) al 09 (PV) Se aplica el mismo
procedimiento que a las demaacutes muestras
Procedimiento
Servir en tubos de ensayo 05 ml de las soluciones patroacuten de Albuacutemina las
muestras problema y NaCL al 09 como blanco Deben estar marcados
para conservar el orden de concentraciones para la curva
Adicionar a cada tubo 05 ml de NaOH 2N y llevar al bantildeo Mariacutea
precalentado a 100degC por un tiempo de 10 minutos
Dejar enfriar hasta que alcance la Temperatura Ambiente
Agregar a cada tubo 5 ml de la solucioacuten complejante mezclar y dejar
reposar por 10 minutos
Adicionar 05 ml del reactivo de Folin-Ciocalteu 11 vortexiar durante 20
segundos
Reposar en un cuarto oscuro durante 30 minutos
Leer la absorbancia a 750 nm y con las soluciones patroacuten construir la
graacutefica Absorbancia Vs Concentracioacuten de Albuacutemina Seacuterica de Bovina
(BSA) con eacutesta se puede determinar la concentracioacuten de las muestras
problema interpolando el valor de la Absorbancia La curva estaacutendar debe
tener un coeficiente de correlacioacuten de 0991 a 0999
106
Anexo 16 Cineacutetica consumo de Proteiacutena
La cineacutetica de consumo de proteiacutena se realizoacute por el meacutetodo LOWRY Los rangos
de concentracioacuten y absorbancia para cada caso se citan a continuacioacuten
Rangos de concentraciones y absorbancias para las fermentaciones que
usaron glucosa (30 gL 50 gL y 70 gL) como sustrato
Concentracioacuten de 0016 a 04 gL
Absorbancia de 00094 a 05382
Ecuacioacuten Y = 07427x ndash 00021 R2 = 09955
Rangos de concentraciones y absorbancias para las fermentaciones que
usaron sacarosa (30 gL 50 gL y 70 gL) como sustrato
Concentracioacuten de 0016 a 04 gL
Absorbancia de 00374 a 06178
Ecuacioacuten Y = 06567x ndash 00166 R2 = 09968
Rangos de concentraciones y absorbancias para las fermentaciones que
usaron glucosa 50 gL como sustrato y FA
Concentracioacuten de 0016 a 04 gL
Absorbancia de 00708 a 04647
Ecuacioacuten Y = 09814x ndash 00581 R2 = 09992
107
Anexo 17 Prueba de reactivo de Dragendorff
Preparacioacuten de reactivo de Dragendorff para alcaloides
Reactivo de Dragendorff se prepara mezclando 8 gr de nitrato de bismuto
pentahidratado en 20 ml de aacutecido niacutetrico al 30 con una solucioacuten de 272 g de
yoduro de potasio en 50 ml de agua Se deja en reposo por 24 horas se decanta y
se afora a 100 ml La presencia de alcaloides se detecta por la formacioacuten de un
precipitado naranja rojizo cuando se le adiciona esta reactivo a una solucioacuten aacutecida
de alcaloides De los precipitados lavados se puede recuperar los alcaloides con
una solucioacuten saturada de carbonato de sodio (Mercano y Hasegawa 1991)
La figura mostrada a continuacioacuten refleja la presencia del alcaloide debido a la
coloracioacuten amarillo-rojiza que eacutesta sufrioacute
Figura 8 Muestra de biomasa una vez analizada mediante el reactivo de Dragendorff
108
Anexo 18 Barrido Espectral para el Psilocybe cubensis
La metodologiacutea mencionada a continuacioacuten estaacute basada en artiacuteculo base
(Tsujikawa et al 2003)
El Sistema de HPLC consiste en un Shimadzu LC-10ordf Series Cromatografiacutea
Liacutequida equipada con un diodo SPD-M10A detector de red fija en 220nm La
separacioacuten cromatograacutefica ser realizoacute con una columna simeacutetrica C18 (21 mm a
150 mm 5mm Waters Assoc Milford EEUU
La fase moacutevil utilizada fue de 10 mm de formato de amonio-aacutecido foacutermico (955
VV) a un pH de 35 y bombeado a un caudal de 02 mlminuto
El perfil cromatograacutefico obtenido durante la investigacioacuten de Tsujikawa et al
(2003) se muestra en le figura 6 que aparece a continuacioacuten
Figura 9 Perfil cromatograacutefico (Tsujikawa et al 2003)
109
Anexo 19 Cromatogramas (HPLC) del diacutea 12 de fermentacioacuten
Tabla 31 Aacutereas obtenidas de los cromatogramas para el P cubensis en
medio Fang-Zhong en el diacutea 12 para concentraciones de 30gL glucosa y
30gL sacarosa
SustratoConcentracioacuten
(gL)
Tiempo
(s)Aacuterea
Glucosa 30 2957 3837
Glucosa 30 6838 474753
Glucosa 30 9144 47256
Glucosa 30 9489 16822
Glucosa 30 10124 224349
Sacarosa 30 6538 143772
Sacarosa 30 7234 269458
Sacarosa 30 9721 33646
Sacarosa 30 11845 24384
(a) (b)
Graacutefico 25 Cromatogramas del diacutea 12 para el P cubensis cultivado en medio
sumergido Fang-Zhong con dos diferentes tipos de sustratos (a) 30 gL
glucosa (b) 30 gL sacarosa
110
Tabla 32 Aacutereas obtenidas de los cromatogramas para el P cubensis en
medio Fang-Zhong en el diacutea 12 para concentraciones de 50gL glucosa y
50gL sacarosa
SustratoConcentracioacuten
(gL)
Tiempo
(s)Aacuterea
Glucosa 50 0524 319
Glucosa 50 6298 5991
Glucosa 50 7172 237042
Glucosa 50 9144 16387
Glucosa 50 10009 6077
Sacarosa 50 169 24011
Sacarosa 50 3105 28573
Sacarosa 50 6916 112166
Sacarosa 50 9136 4057
Sacarosa 50 9933 8821
Sacarosa 50 10398 13872
(a) (b)
Graacutefico 26 Cromatogramas del diacutea 12 para el P cubensis cultivado en medio
sumergido Fang-Zhong con dos diferentes tipos de sustratos (a) 50 gL
glucosa (b) 50 gL sacarosa
111
Tabla 33 Aacutereas obtenidas de los cromatogramas para el P cubensis en
medio Fang-Zhong en el diacutea 12 para concentraciones de 50gL glucosa y
50gL sacarosa
SustratoConcentracioacuten
(gL)
Tiempo
(s)Aacuterea
Glucosa 70 7217 168598
Glucosa 70 9145 9977
Glucosa 70 997 80558
Sacarosa 70 6803 287387
Sacarosa 70 7517 131049
Sacarosa 70 7775 4434
Sacarosa 70 7871 77109
Sacarosa 70 823 96239
Sacarosa 70 9039 5114
Sacarosa 70 9778 25394
(a) (b)
Graacutefico 27 Cromatogramas del diacutea 12 para el P cubensis cultivado en medio
sumergido Fang-Zhong con dos diferentes tipos de sustratos (a) 50 gL
glucosa (b) 50 gL sacarosa
112
Tabla 34 Aacutereas obtenidas de los cromatogramas para el P cubensis en
medio Fang-Zhong en el diacutea 12 para concentraciones de 50gL y glucosa
50gL sacarosa
SustratoConcentracioacuten
(gL)
Tiempo
(s)Aacuterea
Glucosa 50 05 0818 4722
Glucosa 50 05 2423 52579
Glucosa 50 05 3502 88765
Glucosa 50 05 6137 16009
Glucosa 50 05 6722 275258
Glucosa 50 05 733 226399
Glucosa 50 05 8339 65139
Glucosa 50 05 9101 36797
Glucosa 50 05 9815 130883
Glucosa 50 1 1105 743
Glucosa 50 1 2746 2701
Glucosa 50 1 4304 80304
Glucosa 50 1 6167 19649
Glucosa 50 1 6794 51753
Glucosa 50 1 8282 82997
Glucosa 50 1 9116 38659
Glucosa 50 1 9899 136953
Glucosa 50 15 1198 3313
Glucosa 50 15 2937 37875
Glucosa 50 15 4332 51079
Glucosa 50 15 614 25602
Glucosa 50 15 6737 668905
Glucosa 50 15 8209 107332
Glucosa 50 15 9602 38902
Glucosa 50 15 9752 139613
Diacutea 12
(a) (b)
(c)
Graacutefico 28 Cromatograma del diacutea 12 para el P cubensis cultivado en medio
sumergido Fang-Zhong con fuente de carbono glucosa y adicioacuten de
fenilalanina en tres concentraciones (a) 05 gL FA (b) 1 gL FA (c) 15gL
FA
113
Anexo 20 Cromatogramas (HPLC) del diacutea 13 de fermentacioacuten
Tabla 35 Aacutereas obtenidas de los cromatogramas para el P cubensis en
medio Fang-Zhong en el diacutea 13 para concentraciones de 30gL glucosa y
30gL sacarosa
SustratoConcentracioacuten
(gL)
Tiempo
(s)Aacuterea
Glucosa 30 0225 1155
Glucosa 30 2847 699
Glucosa 30 4043 1038
Glucosa 30 6231 4994
Glucosa 30 6787 295182
Glucosa 30 7462 241146
Glucosa 30 9066 51836
Glucosa 30 10004 158746
Sacarosa 30 1734 135
Sacarosa 30 5838 1857
Sacarosa 30 6803 147867
Sacarosa 30 7305 30464
Sacarosa 30 7599 174643
Sacarosa 30 9107 8564
Sacarosa 30 9897 104278
(a) (b)
Graacutefico 29 Cromatogramas del diacutea 13 para el P cubensis cultivado en medio
sumergido Fang-Zhong con dos diferentes tipos de sustratos (a) 30 gL
glucosa (b) 30 gL sacarosa
114
Tabla 36 Aacutereas obtenidas de los cromatogramas para el P cubensis en
medio Fang-Zhong en el diacutea 13 para concentraciones de 50gL glucosa y
50gL sacarosa
SustratoConcentracioacuten
(gL)
Tiempo
(s)Aacuterea
Glucosa 50 1408 13982
Glucosa 50 6949 331449
Glucosa 50 9012 25201
Glucosa 50 9936 27216
Sacarosa 50 1543 7293
Sacarosa 50 6813 437765
Sacarosa 50 9085 35897
Sacarosa 50 10049 184461
(a) (b)
Graacutefico 30 Cromatogramas del diacutea 13 para el P cubensis cultivado en medio
sumergido Fang-Zhong con dos diferentes tipos de sustratos (a) 50 gL
glucosa (b) 50 gL sacarosa
115
Tabla 37 Aacutereas obtenidas de los cromatogramas para el P cubensis en
medio Fang-Zhong en el diacutea 13 para concentraciones de 70gL glucosa y
70gL sacarosa
SustratoConcentracioacuten
(gL)
Tiempo
(s)Aacuterea
Glucosa 70 1456 3223
Glucosa 70 2985 2423
Glucosa 70 54 7586
Glucosa 70 6262 5149
Glucosa 70 7151 248331
Glucosa 70 9039 19346
Glucosa 70 9929 4906
Glucosa 70 11051 33698
Sacarosa 70 0437 342
Sacarosa 70 1428 812
Sacarosa 70 2948 2191
Sacarosa 70 5473 4854
Sacarosa 70 6286 5336
Sacarosa 70 6848 3649
Sacarosa 70 733 11383
Sacarosa 70 9073 1018
Sacarosa 70 9878 11072
Sacarosa 70 10267 18797
(a) (b)
Graacutefico 31 Cromatogramas del diacutea 13 para el P cubensis cultivado en medio
sumergido Fang-Zhong con dos diferentes tipos de sustratos (a) 70 gL
glucosa (b) 70 gL sacarosa
116
Tabla 38 Aacutereas obtenidas de los cromatogramas para el P cubensis en
medio Fang-Zhong en el diacutea 13 para concentraciones de 50gL y glucosa
50gL sacarosa
SustratoConcentracioacuten
(gL)
Tiempo
(s)Aacuterea
Glucosa 50 05 4067 22222
Glucosa 50 05 7379 55573
Glucosa 50 05 902 19513
Glucosa 50 05 9716 119261
Glucosa 50 05 1173 19427
Glucosa 50 1 0793 14776
Glucosa 50 1 2868 28537
Glucosa 50 1 6224 1206
Glucosa 50 1 6782 571299
Glucosa 50 1 8303 92665
Glucosa 50 1 9081 30371
Glucosa 50 1 9738 168959
Glucosa 50 1 11813 27921
Glucosa 50 15 0412 269
Glucosa 50 15 2482 14692
Glucosa 50 15 3486 91059
Glucosa 50 15 6039 6892
Glucosa 50 15 6627 216986
Glucosa 50 15 7216 260795
Glucosa 50 15 8112 65776
Glucosa 50 15 8888 19083
Glucosa 50 15 9497 37812
Glucosa 50 15 9839 65922
Glucosa 50 15 11655 7331
(a) (b)
(c)
Graacutefico 32 Cromatogramas del diacutea 12 para el P cubensis cultivado en medio
sumergido Fang-Zhong con fuente de carbono glucosa y adicioacuten de
fenilalanina en tres concentraciones (a) 05 gL FA (b) 1 gL FA (c) 15gL
FA
117
Anexo 21 Cromatogramas (HPLC) del diacutea 14 de fermentacioacuten
Tabla 39 Aacutereas obtenidas de los cromatogramas para el P cubensis en
medio Fang-Zhong en el diacutea 14 para concentraciones de 30gL glucosa y 30
gL sacarosa
SustratoConcentracioacuten
(gL)
Tiempo
(s)Aacuterea
Glucosa 30 1054 181
Glucosa 30 2553 8939
Glucosa 30 6219 7557
Glucosa 30 6585 77083
Glucosa 30 7158 285069
Glucosa 30 8987 33875
Glucosa 30 9848 87461
Glucosa 30 10694 52151
Glucosa 30 12482 7992
Glucosa 30 12943 23064
Glucosa 30 1493 5948
Sacarosa 30 7309 7075
Sacarosa 30 9984 1680
Sacarosa 30 10442 15395
Sacarosa 30 11211 8511
Sacarosa 30 13405 3398
(a) (b)
Graacutefico 33 Cromatogramas del diacutea 14 para el P cubensis cultivado en medio
sumergido Fang-Zhong con dos diferentes tipos de sustratos (a) 30 gL
glucosa (b) 30 gL sacarosa
118
Tabla 40 Aacutereas obtenidas de los cromatogramas para el P cubensis en
medio Fang-Zhong en el diacutea 14 para concentraciones de 50gL glucosa y
50gL sacarosa
SustratoConcentracioacuten
(gL)
Tiempo
(s)Aacuterea
Glucosa 50 2029 8318
Glucosa 50 6257 5782
Glucosa 50 6875 306684
Glucosa 50 9068 22819
Glucosa 50 9808 92492
Glucosa 50 12113 8823
Glucosa 50 12752 23988
Sacarosa 50 1036 3783
Sacarosa 50 2356 7005
Sacarosa 50 653 44831
Sacarosa 50 6657 127617
Sacarosa 50 7264 66908
Sacarosa 50 7464 255141
Sacarosa 50 9035 26172
Sacarosa 50 9458 28427
Sacarosa 50 9889 37574
Sacarosa 50 10312 140881
Sacarosa 50 12335 13391
Sacarosa 50 1292 17066
(a) (b)
Graacutefico 34 Cromatogramas del diacutea 14 para el P cubensis cultivado en medio
sumergido Fang-Zhong con dos diferentes tipos de sustratos (a) 50 gL
glucosa (b) 50 gL sacarosa
119
Tabla 41 Aacutereas obtenidas de los cromatogramas para el P cubensis en
medio Fang-Zhong en el diacutea 14 para concentraciones de 70gL glucosa y
70gL sacarosa
SustratoConcentracioacuten
(gL)
Tiempo
(s)Aacuterea
Glucosa 70 6257 5879
Glucosa 70 6373 145551
Glucosa 70 7015 68223
Glucosa 70 7199 9085
Glucosa 70 735 265755
Glucosa 70 9014 4642
Glucosa 70 9877 97804
Glucosa 70 107 67421
Glucosa 70 12625 26231
Glucosa 70 1305 65607
Sacarosa 70 2283 4683
Sacarosa 70 5191 93
Sacarosa 70 6304 3719
Sacarosa 70 6795 136542
Sacarosa 70 726 29869
Sacarosa 70 7515 75545
Sacarosa 70 7872 119563
Sacarosa 70 9166 1244
Sacarosa 70 9658 23096
Sacarosa 70 9871 25866
Sacarosa 70 10421 105108
Sacarosa 70 12347 11115
Sacarosa 70 12861 35503
Sacarosa 70 14272 3676
(a) (b)
Graacutefico 35 Cromatogramas del diacutea 14 para el P cubensis cultivado en medio
sumergido Fang-Zhong con dos diferentes tipos de sustratos (a) 70 gL
glucosa (b) 70 gL sacarosa
120
Tabla 42 Aacutereas obtenidas de los cromatogramas para el P cubensis en medio Fang-Zhong en el diacutea 13 para concentraciones de 50gL glucosa y
50gL sacarosa
SustratoConcentracioacuten
(gL)
Tiempo
(s)Aacuterea
Glucosa 50 05 0123 173
Glucosa 50 05 0699 7584
Glucosa 50 05 2594 2742
Glucosa 50 05 6104 11663
Glucosa 50 05 6616 487848
Glucosa 50 05 7235 287918
Glucosa 50 05 8183 135793
Glucosa 50 05 8903 5143
Glucosa 50 05 9484 66817
Glucosa 50 05 9679 168855
Glucosa 50 05 11671 4216
Glucosa 50 1 0345 295
Glucosa 50 1 2654 11981
Glucosa 50 1 412 45301
Glucosa 50 1 6111 12626
Glucosa 50 1 6757 526655
Glucosa 50 1 8093 104277
Glucosa 50 1 894 25251
Glucosa 50 1 9643 158685
Glucosa 50 1 11666 22779
Glucosa 50 15 0353 283
Glucosa 50 15 2522 15272
Glucosa 50 15 3577 83963
Glucosa 50 15 6668 47137
Glucosa 50 15 7304 371442
Glucosa 50 15 8226 117611
Glucosa 50 15 8923 61949
Glucosa 50 15 9657 19618
Glucosa 50 15 11668 35606
(a) (b)
(c)
Graacutefico 36 Cromatogramas del diacutea 12 para el P cubensis cultivado en medio sumergido Fang-Zhong con fuente de carbono glucosa y adicioacuten de
fenilalanina en tres concentraciones (a) 05 gL FA (b) 1 gL FA (c) 15gL FA (a) 05 gL FA (b) 1 gL FA (c) 15gL FA
121
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xi
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1 HONGO AGARICALES (LAMINAR) (KUO 2007) 23
FIGURA 2 ALCALOIDES DERIVADOS DEL TRIPTOFANO (MERCANO Y HASEGAWA 1991) 29
FIGURA 3 TRIPTAMINAS SIMPLES (SEIGLER 1981) 31
FIGURA 4 PSILOCIBINA Y PSILOCINA (MANDRILE ET AL 1984) 32
FIGURA 5 PSILOCYBE CUBENSIS (EAH01) CULTIVADA EN MEDIO SOacuteLIDO AGAR MALTA 34
FIGURA 6 CROMATOGRAMAS DE DOS DIFERENTES FERMENTACIONES DE P CUBENSIS QUE ILUSTRAN EL
CRITERIO DE ESCOGENCIA DEL MEJOR ENSAYO REALIZADO (A) 50 GL GLUCOSA (B) 50 GL
SACAROSA 78
FIGURA 7 CROMATOGRAMAS DE DOS DIFERENTES FERMENTACIONES DE P CUBENSIS QUE ILUSTRAN EL
CRITERIO DE ESCOGENCIA DEL MEJOR ENSAYO REALIZADO (A) 05 GL FA (B) 15 GL FA 80
FIGURA 8 MUESTRA DE BIOMASA UNA VEZ ANALIZADA MEDIANTE EL REACTIVO DE DRAGENDORFF 107
FIGURA 9 PERFIL CROMATOGRAacuteFICO (TSUJIKAWA ET AL 2003) 108
xii
LISTA DE GRAacuteFICOS
GRAacuteFICO 1 CINEacuteTICA DE CRECIMIENTO MICELIAL DE P CUBENSIS EN MEDIO SUMERGIDO (FANG-ZHONG)
UTILIZANDO TRES DIFERENTES CONCENTRACIONES DE GLUCOSA COMO FUENTE DE CARBONO (PESO
SECO) 46
GRAacuteFICO 2 CRECIMIENTO MICELIAL DE P CUBENSIS EN CULTIVO SUMERGIDO BAJO TRES
CONCENTRACIONES DE GLUCOSA 47
GRAacuteFICO 3 VALORES DE CONCENTRACIOacuteN DE BIOMASA EXPERIMENTAL Y TEOacuteRICO GRAFICADOS CON
RESPECTO AL TIEMPO PARA LAS FERMENTACIONES CON DIFERENTES CONCENTRACIONES DE
GLUCOSA 49
GRAacuteFICO 4 CINEacuteTICA DE CRECIMIENTO MICELIAL DE P CUBENSIS EN MEDIO SUMERGIDO (FANG-ZHONG)
UTILIZANDO DIFERENTES CONCENTRACIONES DE SACAROSA COMO FUENTE DE CARBONO (PESO
SECO) 50
GRAacuteFICO 5 CRECIMIENTO MICELIAL PARA TRES DIFERENTES CONCENTRACIONES DE SACAROSA 52
GRAacuteFICO 6 VALORES DE CONCENTRACIOacuteN DE BIOMASA EXPERIMENTAL Y TEOacuteRICO GRAFICADOS CON
RESPECTO AL TIEMPO PARA LAS FERMENTACIONES CON DIFERENTES CONCENTRACIONES DE
SACAROSA 54
GRAacuteFICO 7 CRECIMIENTO MICELIAL PARA DOS DIFERENTES FUENTES DE CARBONO (GLUCOSA Y
SACAROSA) 56
GRAacuteFICO 8 CINEacuteTICA DE CRECIMIENTO MICELIAL DE P CUBENSIS EN MEDIO SUMERGIDO (FANG-ZHONG)
UTILIZANDO DIFERENTES CONCENTRACIONES DE FA Y 50 GL DE GLUCOSA COMO FUENTE DE
CARBONO (PESO SECO) 57
GRAacuteFICO 9 CRECIMIENTO MICELIAL PARA GLUCOSA A UNA CONCENTRACIOacuteN DE 50 GL Y TRES
DIFERENTES CONCENTRACIONES DE FA 59
GRAacuteFICO 10 VALORES DE CONCENTRACIOacuteN DE BIOMASA EXPERIMENTAL Y TEOacuteRICO GRAFICADOS CON
RESPECTO AL TIEMPO PARA LAS FERMENTACIONES CON DIFERENTES CONCENTRACIONES DE FA Y
50 GL DE GLUCOSA 61
GRAacuteFICO 11 CINEacuteTICA DE CONSUMO DE SUSTRATO POR PARTE DEL P CUBENSIS EN MEDIO SUMERGIDO
UTILIZANDO DIFERENTES CONCENTRACIONES DE GLUCOSA COMO FUENTE DE CARBONO 62
GRAacuteFICO 12 CINEacuteTICA DE CONSUMO DE SUSTRATO POR PARTE DEL P CUBENSIS EN MEDIO SUMERGIDO
UTILIZANDO DIFERENTES CONCENTRACIONES DE SACAROSA COMO FUENTE DE CARBONO 64
GRAacuteFICO 13 CONSUMO DE SUSTRATO PARA CADA UNA DE LAS FUENTES DE CARBONO UTILIZADAS 66
GRAacuteFICO 14 CINEacuteTICA DE CONSUMO DE SUSTRATO POR PARTE DEL P CUBENSIS EN MEDIO SUMERGIDO
UTILIZANDO 50 GL DE GLUCOSA COMO FUENTE DE CARBONO Y DIFERENTES CONCENTRACIONES DE
FA 67
GRAacuteFICO 15 CONSUMO DE SUSTRATO PARA CADA UNA DE LAS CONCENTRACIONES DE FA UTILIZADAS 68
GRAacuteFICO 16 CINEacuteTICA DE CONSUMO DE PROTEIacuteNA POR PARTE DEL P CUBENSIS EN MEDIO SUMERGIDO
UTILIZANDO DIFERENTES CONCENTRACIONES DE GLUCOSA COMO FUENTE DE CARBONO 70
GRAacuteFICO 17 CINEacuteTICA DE CONSUMO DE PROTEIacuteNA POR PARTE DEL P CUBENSIS EN MEDIO SUMERGIDO
UTILIZANDO DIFERENTES CONCENTRACIONES DE SACAROSA COMO FUENTE DE CARBONO 71
GRAacuteFICO 18 CONSUMO DE PROTEIacuteNA PARA CADA UNA DE LAS FUENTES DE CARBONO UTILIZADAS 73
xiii
GRAacuteFICO 19 CINEacuteTICA DE CONSUMO DE PROTEIacuteNA POR PARTE DEL P CUBENSIS EN MEDIO SUMERGIDO
UTILIZANDO 50 GL DE GLUCOSA COMO FUENTE DE CARBONO Y DIFERENTES CONCENTRACIONES DE
FA 74
GRAacuteFICO 20 CONSUMO DE PROTEIacuteNA PARA LOS ENSAYOS CON Y SIN FA 75
GRAacuteFICO 21 AacuteREA DEL COMPUESTO OBTENIDO DE P CUBENSIS EN TIEMPO DE RETENCIOacuteN ENTRE 62 Y
72 MINUTOS PARA LAS DOS FUENTES DE CARBONO 77
GRAacuteFICO 22 AacuteREA DEL COMPUESTO OBTENIDO DE P CUBENSIS EN TIEMPO DE RETENCIOacuteN ENTRE 62 Y
72 MINUTOS EN LOS UacuteLTIMOS TRES DIacuteAS DE LA FERMENTACIOacuteN CON FA Y GLUCOSA 79
GRAacuteFICO 23 AacuteREA DEL COMPUESTO OBTENIDO DE P CUBENSIS EN TIEMPO DE RETENCIOacuteN ENTRE 62 Y
72 MINUTOS PARA CADA UNA DE LAS FUENTES DE CARBONO UTILIZADAS 82
GRAacuteFICO 24 AacuteREA DEL COMPUESTO OBTENIDO DE P CUBENSIS EN TIEMPO DE RETENCIOacuteN ENTRE 62 Y
72 MINUTOS PARA CADA UNA DE LAS CONCENTRACIONES DE FA UTILIZADAS 85
GRAacuteFICO 25 CROMATOGRAMAS DEL DIacuteA 12 PARA EL P CUBENSIS CULTIVADO EN MEDIO SUMERGIDO
FANG-ZHONG CON DOS DIFERENTES TIPOS DE SUSTRATOS (A) 30 GL GLUCOSA (B) 30 GL SACAROSA
109
GRAacuteFICO 26 CROMATOGRAMAS DEL DIacuteA 12 PARA EL P CUBENSIS CULTIVADO EN MEDIO SUMERGIDO
FANG-ZHONG CON DOS DIFERENTES TIPOS DE SUSTRATOS (A) 50 GL GLUCOSA (B) 50 GL SACAROSA
110
GRAacuteFICO 27 CROMATOGRAMAS DEL DIacuteA 12 PARA EL P CUBENSIS CULTIVADO EN MEDIO SUMERGIDO
FANG-ZHONG CON DOS DIFERENTES TIPOS DE SUSTRATOS (A) 50 GL GLUCOSA (B) 50 GL SACAROSA
111
GRAacuteFICO 28 CROMATOGRAMA DEL DIacuteA 12 PARA EL P CUBENSIS CULTIVADO EN MEDIO SUMERGIDO
FANG-ZHONG CON FUENTE DE CARBONO GLUCOSA Y ADICIOacuteN DE FENILALANINA EN TRES
CONCENTRACIONES (A) 05 GL FA (B) 1 GL FA (C) 15GL FA 112
GRAacuteFICO 29 CROMATOGRAMAS DEL DIacuteA 13 PARA EL P CUBENSIS CULTIVADO EN MEDIO SUMERGIDO
FANG-ZHONG CON DOS DIFERENTES TIPOS DE SUSTRATOS (A) 30 GL GLUCOSA (B) 30 GL SACAROSA
113
GRAacuteFICO 30 CROMATOGRAMAS DEL DIacuteA 13 PARA EL P CUBENSIS CULTIVADO EN MEDIO SUMERGIDO
FANG-ZHONG CON DOS DIFERENTES TIPOS DE SUSTRATOS (A) 50 GL GLUCOSA (B) 50 GL SACAROSA
114
GRAacuteFICO 31 CROMATOGRAMAS DEL DIacuteA 13 PARA EL P CUBENSIS CULTIVADO EN MEDIO SUMERGIDO
FANG-ZHONG CON DOS DIFERENTES TIPOS DE SUSTRATOS (A) 70 GL GLUCOSA (B) 70 GL SACAROSA
115
GRAacuteFICO 32 CROMATOGRAMAS DEL DIacuteA 12 PARA EL P CUBENSIS CULTIVADO EN MEDIO SUMERGIDO
FANG-ZHONG CON FUENTE DE CARBONO GLUCOSA Y ADICIOacuteN DE FENILALANINA EN TRES
CONCENTRACIONES (A) 05 GL FA (B) 1 GL FA (C) 15GL FA 116
GRAacuteFICO 33 CROMATOGRAMAS DEL DIacuteA 14 PARA EL P CUBENSIS CULTIVADO EN MEDIO SUMERGIDO
FANG-ZHONG CON DOS DIFERENTES TIPOS DE SUSTRATOS (A) 30 GL GLUCOSA (B) 30 GL SACAROSA
117
GRAacuteFICO 34 CROMATOGRAMAS DEL DIacuteA 14 PARA EL P CUBENSIS CULTIVADO EN MEDIO SUMERGIDO
FANG-ZHONG CON DOS DIFERENTES TIPOS DE SUSTRATOS (A) 50 GL GLUCOSA (B) 50 GL SACAROSA
118
xiv
GRAacuteFICO 35 CROMATOGRAMAS DEL DIacuteA 14 PARA EL P CUBENSIS CULTIVADO EN MEDIO SUMERGIDO
FANG-ZHONG CON DOS DIFERENTES TIPOS DE SUSTRATOS (A) 70 GL GLUCOSA (B) 70 GL SACAROSA
119
GRAacuteFICO 36 CROMATOGRAMAS DEL DIacuteA 12 PARA EL P CUBENSIS CULTIVADO EN MEDIO SUMERGIDO
FANG-ZHONG CON FUENTE DE CARBONO GLUCOSA Y ADICIOacuteN DE FENILALANINA EN TRES
CONCENTRACIONES (A) 05 GL FA (B) 1 GL FA (C) 15GL FA (A) 05 GL FA (B) 1 GL FA (C)
15GL FA 120
xv
LISTA DE ECUACIONES
ECUACIOacuteN 1 ECUACIOacuteN LINEALIZADA DEL MODELO LOGIacuteSTICO 38
ECUACIOacuteN 2 VALORES TEOacuteRICOS DE BIOMASA EN EL TIEMPO 39
xvi
LISTAS DE ANEXOS
ANEXO 1 ANAacuteLISIS DE VARIANZA (ANOVA) PARA EL CRECIMIENTO DE BIOMASA DE LAS
FERMENTACIONES CON GLUCOSA _____________________________________________________ 90
ANEXO 2 ANAacuteLISIS DE VARIANZA (ANOVA) PARA EL CRECIMIENTO DE BIOMASA DE LAS
FERMENTACIONES CON SACAROSA ____________________________________________________ 91
ANEXO 3 ANAacuteLISIS DE VARIANZA (ANOVA) PARA EL CRECIMIENTO DE BIOMASA DE LAS
FERMENTACIONES CON GLUCOSA Y SACAROSA __________________________________________ 92
ANEXO 4 ANAacuteLISIS DE VARIANZA (ANOVA) PARA EL CRECIMIENTO DE BIOMASA DE LAS
FERMENTACIONES CON GLUCOSA 50 GL Y FA ___________________________________________ 93
ANEXO 5 ANAacuteLISIS DE VARIANZA (ANOVA) PARA EL CONSUMO DE SUSTRATO EN LAS FERMENTACIONES
SIN FA ____________________________________________________________________________ 94
ANEXO 6 ANAacuteLISIS DE VARIANZA (ANOVA) PARA EL CONSUMO DE SUSTRATO EN LAS FERMENTACIONES
CON FA ___________________________________________________________________________ 95
ANEXO 7 ANAacuteLISIS DE VARIANZA (ANOVA) PARA EL CONSUMO DE PROTEIacuteNA EN LAS FERMENTACIONES
SIN FA ____________________________________________________________________________ 96
ANEXO 8 ANAacuteLISIS DE VARIANZA (ANOVA) PARA EL CONSUMO DE PROTEIacuteNA EN LAS FERMENTACIONES
CON FA ___________________________________________________________________________ 97
ANEXO 9 ANAacuteLISIS DE VARIANZA (ANOVA) PARA LA PRODUCCIOacuteN DE PSILOCIBINA EN LAS
FERMENTACIONES SIN FA ____________________________________________________________ 98
ANEXO 10 ANAacuteLISIS DE VARIANZA (ANOVA) PARA LA PRODUCCIOacuteN DE PSILOCIBINA EN LAS
FERMENTACIONES CON FA ___________________________________________________________ 99
ANEXO 11 ANAacuteLISIS DE VARIANZA (ANOVA) PARA LA CUANTIFICACIOacuteN PORCENTUAL DE PSILOCIBINA EN
LAS FERMENTACIONES SIN FA _______________________________________________________ 100
ANEXO 12 ANAacuteLISIS DE VARIANZA (ANOVA) PARA LA CUANTIFICACIOacuteN PORCENTUAL DE PSILOCIBINA EN
LAS FERMENTACIONES CON FA ______________________________________________________ 101
ANEXO 13 DETERMINACIOacuteN DE CONSUMO DE AZUacuteCARES POR EL MEacuteTODO DE DNS (AacuteCIDO
DINITROSALICIacuteLICO) ________________________________________________________________ 102
ANEXO 14 CINEacuteTICA DE CONSUMO DE SUSTRATO ___________________________________________ 104
ANEXO 15 DETERMINACIOacuteN DE CONSUMO DE PROTEIacuteNAS POR EL MEacuteTODO DE LOWRY ____________ 105
ANEXO 16 CINEacuteTICA CONSUMO DE PROTEIacuteNA ______________________________________________ 106
ANEXO 17 PRUEBA DE REACTIVO DE DRAGENDORFF _________________________________________ 107
ANEXO 18 BARRIDO ESPECTRAL PARA EL PSILOCYBE CUBENSIS _________________________________ 108
ANEXO 19 CROMATOGRAMAS (HPLC) DEL DIacuteA 12 DE FERMENTACIOacuteN ___________________________ 109
ANEXO 20 CROMATOGRAMAS (HPLC) DEL DIacuteA 13 DE FERMENTACIOacuteN __________________________ 113
ANEXO 21 CROMATOGRAMAS (HPLC) DEL DIacuteA 14 DE FERMENTACIOacuteN __________________________ 117
xvii
RESUMEN
El Psilocybe cubensis es un hongo de gran importancia a nivel industrial gracias a
la presencia de una sustancia llamada Psilocibina en su cuerpo fructiacutefero
Dicho alcaloide derivado de la triptamina es muy similar al neurotransmisor
serotonina el cual es responsable de la percepcioacuten sensorial la regulacioacuten de la
temperatura el inicio del reposo nocturno del hiacutegado y los rintildeones Por tal motivo
este estudio se enfocoacute en la produccioacuten de la Psilocibina mediante el cultivo del P
cubensis en medio sumergido (Fang-Zhong)
Se evaluaron los efectos de dos fuentes de carbono (glucosa y sacarosa) a tres
concentraciones diferentes en cultivo sumergido para Psilocybe cubensis con el
fin de determinar la incidencia de eacutestas en la produccioacuten de biomasa y en la
produccioacuten y presencia de Psilocibina alcaloide de intereacutes Para las
concentraciones de glucosa de 30 gL 50 gL y 70 gL se presentoacute un crecimiento
maacuteximo de biomasa de 048 gL 055 gL y 062 gL y un porcentaje de alcaloide
de 6065 wv 7396 wv y 6733 wv respectivamente Esto uacuteltimo si se
asume que el tiempo de retencioacuten oscila entre 62 y 72 minutos contaacutendose con
una fase moacutevil de HCOONH4 en una columna C18 Mientras que para las mismas
concentraciones de sacarosa se presentoacute un crecimiento maacuteximo de biomasa de
026 gL 045 gL y 057 gL con porcentajes del compuesto presente entre el
rango de 62 y 72 minutos de 3664 wv 5857 wv y 5583 wv
respectivamente
Una vez realizada la investigacioacuten se encontroacute que las diferencias existentes en
cuanto a la cantidad de biomasa generada con respecto al tipo de sustrato
utilizado no fueron significativas es decir era irrelevante si se utilizaba glucosa o
sacarosa como principal fuente de carbono para la fermentacioacuten del P cubensis
xviii
en medio sumergido con el fin de obtener biomasa sin embargo se hallaron
diferencias significativas con respecto a las diferentes concentraciones empleadas
de dichas fuentes de carbono
Al analizar las muestras mediante cromatografiacutea liacutequida de alta eficiencia (HPLC)
se determinoacute que el medio que conteniacutea 50 gL de glucosa era el deseado debido
a que fue en eacuteste donde se presentaron picos maacutes definidos mostrando una mejor
resolucioacuten del compuesto Adicionalmente presentoacute un buen crecimiento micelial
Una vez elegido dicho criterio se evaluoacute el efecto que teniacutea la adicioacuten de un
aminoaacutecido llamado Fenilalanina (FA) al medio que conteniacutea 50 gL de glucosa
con el fin de determinar si eacuteste teniacutea alguna incidencia positiva en la produccioacuten de
biomasa y en la generacioacuten del alcaloide de intereacutes cabe resaltar que se utilizaron
diferentes concentraciones de FA correspondientes a 05 gL 10 gL y 15 gL
Finalizados dichos ensayos se obtuvieron valores de crecimiento de biomasa
maacutexima de 106 gL 108 gL y 101 gL y un porcentaje de aacuterea de 7549 wv
6236 wv y 2721 wv respectivamente
Es necesario hacer hincapieacute en que las diferencias obtenidas mediante el anaacutelisis
estadiacutestico entre cada una de las concentraciones de FA con respecto a la
generacioacuten de biomasa y la produccioacuten del compuesto no fueron significativas lo
que llevoacute a elegir una concentracioacuten de 05 gL de FA debido a que fue la menor
cantidad utilizada de este compuesto durante la investigacioacuten suponieacutendose asiacute
una disminucioacuten en los costos de materia prima
Palabras claves
Psilocybe cubensis Psilocibina Alcaloide HPLC Cultivo Sumergido Fuentes de
Carbono Fenilalanina
19
INTRODUCCIOacuteN
Los hongos son una rica fuente de productos naturales con una alta actividad
bioloacutegica Desafortunadamente el cultivo de eacutestos en cuerpo fructiacutefero toma
varios meses disminuyendo su calidad debido a los cambios climaacuteticos y plagas
por tal razoacuten se implementoacute la metodologiacutea de medio sumergido la cual es
prometedora gracias a una alta productividad de compuestos bioactivos (Arora
1986)
El Geacutenero Psilocybe pertenece al Reino Fungiacute con un Phylum Basidiomicota
una Clase Homobasidiomicetes un Orden Agaricales una Familia Strofariaceae
(Paris y Hurabielle 1981)
Dicho geacutenero es considerado de gran importancia a nivel mundial debido a que su
cuerpo fructiacutefero y biomasa micelial contienen Psilocibina la cual posee un alto
valor para la industria farmaceacuteutica por su uso en la elaboracioacuten de productos
antidepresivos Este alcaloide derivado de FA cuenta con una estructura muy
similar al neurotransmisor segregado por el cerebro llamado serotonina que
controla el estado de aacutenimo el suentildeo el hiacutegado y los rintildeones (Mandrile et al
1984) esta caracteriacutestica le otorga la gran importancia a la Psilocibina en el
mercado puesto que tiene un alto impacto en la sociedad como ayudante
antidepresivo debido a que no todas las personas segregan la cantidad necesaria
(10 mg con liacutemites que variacutean desde 5 a 20 mg) de serotonina (Mandrile et al
1984) Adicionalmente se estaacute empleando como una gran ayuda para la
disminucioacuten de la adiccioacuten a sustancias como heroiacutena y cocaiacutena gracias a que
este alcaloide no genera dependencia (Lee et al 2004)
Debido a que su consumo puede generar alucinaciones era consumido por las
culturas aboriacutegenes centroamericanas con el fin de realizar manifestaciones
20
religiosas Su uso se remonta a maacutes de 3500 antildeos y era nombrado por los
aztecas como ―Teonunaltl que significa ―carne de dioses (Mandrile et al 1984)
La alternativa que se utilizoacute durante esta investigacioacuten fue el cultivo del P
cubensis mediante medio sumergido debido principalmente a las notables
ventajas frente a los sistemas convencionales que eacuteste posee entre las cuales se
destacan la disminucioacuten del tiempo para la obtencioacuten de la biomasa (14 diacuteas) y la
reduccioacuten de los costos de obtencioacuten (Lee et al 2004) De acuerdo a lo
dimensionado anteriormente este estudio estaba orientado primordialmente a la
buacutesqueda de alternativas que permitieran la produccioacuten de biomasa de forma
raacutepida y confiable
Con el fin de llevar a cabo lo dicho anteriormente se pretendioacute evaluar el efecto
del uso de dos diferentes fuentes de carbono en este caso glucosa y sacarosa en
el crecimiento micelial de la cepa P cubensis
21
OBJETIVOS
GENERAL
Evaluar el efecto de la fuente de carbono en el crecimiento micelial de una
cepa Psilocybe sp
ESPECIacuteFICOS
Evaluar la cineacutetica de crecimiento de la cepa Psilocybe cubensis en los
diferentes medios de cultivo sumergido mediante la cuantificacioacuten de
biomasa por medio de la metodologiacutea de peso seco
Evaluar el consumo de sustrato para los diferentes ensayos por medio de
teacutecnicas espectrofotomeacutetricas
Determinar la presencia de Psilocibina mediante el uso del reactivo de
Dragendorff
22
1 MARCO TEOacuteRICO
11 CONCEPTOS GENERALES DE HONGOS
Los hongos son organismos eucariotas que no contienen clorofila con nutricioacuten
por absorcioacuten generalmente con reproduccioacuten sexual y asexual el cuerpo
consiste generalmente de filamentos ramificados con pared celular quitinosa
(Miles y Chang 1999)
Constituyen uno de los grupos de organismos maacutes importantes para la vida del
hombre ya que son los responsables de gran parte de la descomposicioacuten de la
materia orgaacutenica aumentando su disponibilidad en el suelo pueden ser
comestibles venenosos o psicotroacutepicos muchos son patoacutegenos otros producen
ciertas sustancias beneficiosas o intervienen en procesos de elaboracioacuten de
algunos comestibles (Miles y Chang 1999)
111 Hongos laminares (Agaricales)
El orden Agaricales tambieacuten conocido como Euagaricales es el mayor orden de
setas y hongos que incluye maacutes de la mitad de todas las especies conocidas de la
clase Homobasidiomycetes (Hibbett et al 1997 Hibbett y Thorn 2001) Maacutes de
9000 especies y alrededor de 350 geacuteneros se han atribuido a este orden que
contiene 26 familias (Kirk et al 2001) Un consenso de mayor nivel de
clasificacioacuten de los Agaricales ha sido difiacutecil de lograr debido a la competencia de
sistemas que restringen geacuteneros y familias (o incluso orden) de diferentes
maneras (Bas 1998 Juumllich 1981 Kirk et al 2001 Kuumlhner 1980 Singer 1986)
23
La base para la clasificacioacuten de los hongos fue construida por Fries (1874) quien
hizo hincapieacute en las caracteriacutesticas macroscoacutepicas como la textura del tallo la
separacioacuten de los filamentos (laminas) presencia o ausencia de velo y color de las
esporas
Posteriormente dividioacute los hongos Agaricales en varias especies de acuerdo al
color de las esporas depositadas las cuales pueden ser de color blanco rosado
marroacuten puacuterpura ndash marroacuten y negro El sistema macroscoacutepico de Fries que
reconocioacute inicialmente 12 geacuteneros de hongos carnosos que forman los hongos es
taxonoacutemicamente praacutectico Eacuteste fue relativamente invariable hasta que Fayod
(1989) estudioacute la anatomiacutea y las caracteriacutesticas microscoacutepicas de muchos
Agaricales reconociendo 108 geacuteneros (Arora 1986)
Al igual que todas las setas los hongos laminares son faacutebricas de esporas
creados con el uacutenico propoacutesito de fabricar esporas microscoacutepicas para dejarse
llevar por las corrientes de aire y con suerte caer en un lugar adecuado en la
tierra para germinar y comenzar un nuevo organismo Las probabilidades de que
cualquier individuo que tiene esporas de este tipo tenga suerte son tan bajas que
el hongo produce millones de esporas para compensar esto En las laacuteminas se
encuentran numerosas esporas las cuales aumentan considerablemente el
nuacutemero de esporas que el hongo puede producir Ambos lados de cada laacutemina
estaacute cubierta con esporas microscoacutepicas (Kuo 2007) A continuacioacuten se muestra
de manera ilustrativa en la figura 1 las laacuteminas que poseen los hongos Agaricales
en las cuales se da la formacioacuten de las esporas
Figura 1 Hongo Agaricales (Laminar) (Kuo 2007)
24
12 MEDIOS DE CULTIVO
Uno de los sistemas maacutes importantes para la identificacioacuten de microorganismos es
observar su crecimiento en sustancias alimenticias artificiales preparadas en el
laboratorio El material alimenticio en el que crecen los microorganismos es el
medio de cultivo (Garciacutea 1995)
Para que los microorganismos crezcan adecuadamente en un medio de cultivo
artificial eacuteste debe reunir una serie de condiciones como lo son temperatura
grado de humedad y presioacuten asiacute como un grado correcto de acidez o alcalinidad
Un medio de cultivo contiene los nutrientes y factores de crecimiento necesarios
para que el microorganismo se desarrolle correctamente y debe estar exento de
cualquier tipo de microorganismo que pueda generar contaminacioacuten (Garciacutea
1995)
121 Tipos de medios de cultivo
En la actualidad existen diversos tipos de medio de cultivo si se centra en la
composicioacuten eacutestos pueden ser medios sinteacuteticos que contienen fuente de
carbono fuente de nitroacutegeno sales que suplan los iones y demaacutes elementos tales
como estimuladores del crecimiento medios complejos que contienen ingredientes
tales como extracto de levadura peptona infusioacuten de cerebro etc ricos en
nutrientes medios de enriquecimiento siendo estos complejos con aditivos
adicionales para favorecer asiacute al crecimiento y desarrollo de determinados
microorganismos medios selectivos los cuales son disentildeados para favorecer el
crecimiento especiacutefico de un microorganismo determinado o un grupo
microbiano medios diferenciales que proporcionan la distincioacuten microbiana de una
mezcla por sus propiedades diferenciales de crecimiento en dichos medios
medios de mantenimiento siendo disiacutemiles de los de crecimiento oacuteptimo por el
25
crecimiento raacutepido y proliacutefico que deriva en la muerte raacutepida de las ceacutelulas (Garciacutea
1995)
Atendiendo a su estado los medios de cultivo pueden presentarse como medios
sumergidos y medios soacutelidos que contienen agar que gelifica por debajo de 45
degC y cuya concentracioacuten en su uso es de 15 y medios semisoacutelidos que contiene
un agar a una concentracioacuten de 07 (Garciacutea 1995)
121 Medio sumergido
Debido a que cultivar el cuerpo fructiacutefero toma varios meses y se dificulta el control
de calidad del producto final porque se estaacute sujeto a los cambios permanentes del
clima y las plagas se ha empleado la metodologiacutea de medio sumergido la cual es
una alternativa muy prometedora para la produccioacuten eficiente del micelio y de los
metabolitos (Lindequist y Niedermeyer 2005)
Dicha forma es la mejor para producir extraer y purificar metabolitos de un cultivo
de hongo ya que facilita una mayor produccioacuten de biomasa en menor tiempo y
de mayor calidad que el cultivo en medio soacutelido ademaacutes facilita la dispersioacuten y
adaptacioacuten del hongo y reduce los vectores de contaminacioacuten De igual forma un
cultivo de esta iacutendole es la opcioacuten maacutes viable si se quiere escalar procesos
fermentativos en aras de desarrollar mercados como en este caso el de
metabolitos medicinales (Navarro et al 1998)
A su vez el uso de cultivo sumergido puede beneficiar la produccioacuten de muchos
metabolitos secundarios y disminuir los costos de produccioacuten por reducir las
labores que involucran los meacutetodos de etapas soacutelidas (Domiacutenguez y Webb 2003)
Los metabolitos bioactivos de los hongos pueden ser potencialmente producidos a
nivel industrial mediante el uso de la metodologiacutea de cultivo sumergido pero el
26
eacutexito a escala comercial depende del costo comparado con la tecnologiacutea existente
y la ventaja econoacutemica que la industria puede ver usando este meacutetodo El uso de
la tecnologiacutea puede ser facilitada por el aumento en el rendimiento de la
produccioacuten y el desarrollo del sistema (Hwang et al 2004)
El cultivo de hongos sumergidos se caracteriza por un aumento en la viscosidad
del caldo con el tiempo debido a uno o maacutes factores tales como el aumento de la
concentracioacuten de ceacutelulas los cambios de la morfologiacutea del crecimiento o la
produccioacuten de productos extracelulares que alteran el caraacutecter reoloacutegico de la
cultura del liacutequido El aumento en la viscosidad puede ser visto como un fenoacutemeno
indeseable pero inevitable ya que causan dificultades en el suministro de oxiacutegeno
en la eliminacioacuten de dioacutexido de carbono y en posibles problemas de agitacioacuten
(Hwang et al 2004)
13 ALCALOIDES
131 Generalidades
La diversidad estructural y la variedad en la actividad bioloacutegica hacen de los
alcaloides como tambieacuten de los antibioacuteticos los grupos maacutes importantes entre las
sustancias naturales de intereacutes terapeacuteutico (Paris y Hurabielle 1981)
Se han aislado principalmente en plantas superiores y se han encontrado en maacutes
de 100 familias de Faneroacutegamas (aquellas plantas que se reproducen por semillas
producidas en sus inflorescencias) Su actividad bioloacutegica a nivel del sistema
nervioso dio pie a las primeras investigaciones siendo los alcaloides las primeras
sustancias naturales estudiadas (Paris y Hurabielle 1981)
El teacutermino alcaloide propuesto por el farmaceacuteutico W Meissner en 1819 se aplicoacute
a los compuestos de origen vegetal con propiedades alcalinas este caraacutecter
baacutesico es debido a la presencia de nitroacutegeno amiacutenico en su estructura Los
27
alcaloides se pueden considerar como ―Un compuesto orgaacutenico de origen natural
nitrogenado derivados generalmente de aminoaacutecidos maacutes o menos baacutesico de
distribucioacuten restringida con propiedades farmacoloacutegicas importantes a dosis bajas
y que responden a reacciones comunes de precipitacioacuten (Paris y Hurabielle
1981)
132 Propiedades fisicoquiacutemicas
Los alcaloides tienen masas moleculares que variacutean entre 100 y 9000 gmol son
casi siempre incoloros son normalmente soacutelidos a temperatura ambiente a
excepcioacuten de los alcaloides no oxigenados Los alcaloides son poco solubles en
agua gracias a su caraacutecter baacutesico dicho caraacutecter se debe al par de electrones
libres del nitroacutegeno (Paris y Hurabielle 1981)
En la naturaleza se encuentran en forma de sales generalmente En las plantas
se consideraba que eran productos obtenidos durante la extraccioacuten y poco
solubles en disolventes tiacutepicos de extraccioacuten por su polaridad Son solubles en
disolventes orgaacutenicos como cloroformo etanol metanol acetato de etilo eacuteter
benceno En forma de sales son solubles en agua excepto las sales de berberina
(Paris y Hurabielle 1981)
Todos los alcaloides son activos a la luz polarizada Presentan una fluorescencia
caracteriacutestica bajo la luz UV o IR dando lugar a espectros caracteriacutesticos (Paris y
Hurabielle 1981)
133 Reconocimiento de los alcaloides
Las teacutecnicas de reconocimiento son basadas en la capacidad que tienen los
alcaloides en estado de sal (extractos aacutecidos) de combinarse con el yodo y
metales pesados como bismuto mercurio tungsteno formando precipitados se
28
utilizan reactivos generales para detectar alcaloides como reactivo de Wagner
reactivo de Mayer reactivo de Dragendorff reactivo de Hager reactivo de
Bertrand reactivo de Ehrlich y reactivo de Vitali-Morin (Paris y Hurabielle 1981)
134 Clasificacioacuten de los alcaloides
Habitualmente los alcaloides se han clasificado en funcioacuten de su estructura
distinguieacutendose principalmente los compuestos heterociacuteclicos de los no
heterociacuteclicos Actualmente existen varias formas de clasificarlos (Bruneton
1987) entre ellas se pueden distinguir
1341 Alcaloides alifaacuteticos
a Derivados de la ornitina (pirrolidinas tropaacutenicos pirrolizidiacutenicos)
b Derivados de la lisina (piperidinas quinolizidiacutenicos)
1342 Alcaloides de origen diverso
a Alcaloides terpeacutenicos y esteroidales
b Alcaloides diversos (purinas macrociclos etc)
1343 Alcaloides aromaacuteticos
a Derivados del aacutecido nicotiacutenico (piridinas)
b Derivados de la fenilalanina y tirosina (isoquinoleinas)
c Derivados del triptofano (indoacutelicos quinoleinas)
d Derivados de la histidina (imidazoles)
29
Alcaloides derivados del triptofano (Alcaloides Indoacutelicos)
Desde el punto de vista farmacoloacutegico ha habido mucho intereacutes sobre las bases
que contienen el nuacutecleo indoacutelico a raiacutez del descubrimiento de la actividad
alucinoacutegena del LSD asiacute como la actividad sedante de la reserpina aislada del
geacutenero Rauwolfia El auge del estudio fitoquiacutemico ocurrioacute en la deacutecada de los 60 y
se dirigiacutea principalmente a la familia Apocynaceae (Mercano y Hasegawa 1991)
Existen unos 800 alcaloides de este tipo distribuidos principalmente en la familia
Apocynaceae (geacuteneros Rauwolfia Aspidos-perma Strychnos y Vinca) menos
frecuentes en hongos y familias como Leguminoseae Malphigiaceae Rubiaceae y
Rutaceae donde los alcaloides presentan el grupo indoacutelico sencillo (Mercano y
Hasegawa 1991)
El triptofano es el precursor de estos alcaloides los cuales se clasifican en
triptaminas y en no triptaminas las triptaminas a su vez se subdividen en b-
carbolinas y en indoleninas y pueden ser triptaminas simples o triptaminas
complejas y estas pueden ser isopreacutenicas o no isopreacutenicas (Mercano y Hasegawa
1991) La figura 2 muestra la estructura quiacutemica del triptofano triptamina y sus
divisiones
Figura 2 Alcaloides derivados del Triptofano (Mercano y Hasegawa 1991)
30
Triptaminas simples
Las triptaminas simples juegan un importante papel en la cultura indiacutegena de
Ameacuterica por sus efectos alucinoacutegenos y extaacuteticos en sus ceremonias maacutegico
religiosas (Furst 1994) Se han encontrado en hongos alucinoacutegenos de
Mesoameacuterica del geacutenero Psilocybe Stropharia y Conocybe (―teonacatl o ―carne
de los dioses) usados por los indios Aztecas en sus ceremonias religiosas desde
hace maacutes de 1700 antildeos Se han encontrado en estos hongos los alcaloides
alucinoacutegenos la Psilocina y la Psilocibina que al ingerirlos produce diferentes
sensaciones auditivas y visuales relajacioacuten muscular depresiones y euforias
alternadas (Mercano y Hasegawa 1991)
La serotonina que juega un importante papel en la actividad neuronal se
encuentra tambieacuten en vegetales Se ha aislado en el pericarpio del banano el cual
seco cuando es fumado actuacutea como un alucinoacutegeno ligero (Seigler 1981)
De las glaacutendulas paroacutetidas del sapo comuacuten Bufo vulgaris se aiacutesla la bufotenina
derivado N-dimetilado de la serotonina que tambieacuten es el principio activo del Yopoacute
polvo de las semillas de Anadenanthera peregrina (Piptadenia peregrina)
Leguminoseae y especies del geacutenero Virola (Myristicaceae) que contiene tambieacuten
triptaminas son mezclados con cenizas e inhalados por medio de tubos de bambuacute
por los indiacutegenas del Orinoco en ceremonias maacutegico religiosas produciendo
alucinacioacuten e incoordinacioacuten motriz (Seigler 1981)
En la figura 3 se observan las estructuras de aquellos compuestos que estaacuten
clasificados como triptaminas simples
31
Figura 3 Triptaminas simples (Seigler 1981)
13 PSILOCIBINA Y PSILOCINA
La Psilocibina y la Psilocina son bioloacutegicamente sintetizadas en los hongos
pertenecientes a los geacuteneros de Psilocybe (Bigwood y Beug 1982 Wurst et al
1984)
La Psilocibina y la Psilocina se han identificado en todo el mundo en una variedad
de setas que son llamados hongos maacutegicos La ingestioacuten de pequentildeas
cantidades de alucinoacutegenos provoca el eacutextasis La actividad alucinoacutegena de la
Psilocibina es relativamente maacutes baja que la de la Psilocina Sin embargo la
Psilocibina se convierte faacutecilmente en Psilocina (componente activo principal) en
los sistemas bioloacutegicos Asiacute el desarrollo de un meacutetodo de determinacioacuten de la
Psilocibina es importante lo misma que la de la Psilocina (Kimie et al 2005)
La hidroacutelisis de la Psilocibina se consigue saturando con anhiacutedido carboacutenico una
solucioacuten acuosa de Psilocibina (para eliminar el oxiacutegeno del aire y calentaacutendola)
obteniendo asiacute una moleacutecula de 4hidroxi-dimetiltriptamina y una moleacutecula de aacutecido
fosfoacuterico (Mandrile et al 1984)
Como todos los faacutermacos derivados del indol estas sustancias han despertado
intereacutes porque se sospechoacute la posibilidad de que algunas de ellas se formen en el
32
organismo y que en ciertas psicosis especialmente en la esquizofrenia se
produzcan elevados niveles sanguiacuteneos que ocasionan algunos de los siacutentomas
(Mandrile et al 1984)
La figura 4 muestra la estructura quiacutemica de alcaloides como la Psilocibina y
Psilocina
Figura 4 Psilocibina y Psilocina (Mandrile et al 1984)
131 Antecedentes acerca de la obtencioacuten de Psilocibina y Psilocina
Una gran variedad de meacutetodos cromatograacuteficos para la determinacioacuten de
Psilocibina y Psilocina presentes en las incautaciones de hongos se han
publicado La cromatografiacutea de capa fina es utilizada debido a que eacutesta es muy
apropiada para la deteccioacuten de sustancias derivadas del triptofano (Brown et al
1972 Tanimukai 1967 Beug y Bigwood 1981) Aun asiacute meacutetodos que involucran
tanto la cromatografiacutea de alta eficiencia (HPLC) como la deteccioacuten fotomeacutetrica de
UV (Beug y Bigwood 1981 Wurst et al 1984 Borner y Brenneisen 1987 Perkal
et al 1980 Vanhaelen-Faestreacute y Vanhaelen 1984 Thomson 1980 White 1979
Sottolano y Lurie 1983) fueron establecidas y optimizadas para la cuantificacioacuten
de Psilocibina
Durante los uacuteltimos antildeos se han venido utilizando diferentes tipos de columna y
fase moacutevil con el fin de obtener la mayor cantidad posible de la sustancia de
intereacutes (Psilocibina)
33
En el antildeo 1981 en el instituto farmaceacuteutico de la Universidad de Oslo realizaron
una investigacioacuten con una columna de siacutelice con una fase moacutevil de metanol-nitrato
de amonio en donde no soacutelo se logroacute obtener Psilocibina y Psilocina sino tambieacuten
un nuevo producto conocido como beocistiacuten Se logroacute un porcentaje de separacioacuten
maacutexima de 75 ww (Christiansen et al 1981)
Asimismo en el antildeo 1984 en el instituto de microbiologiacutea de Amsterdam se
realizoacute un estudio con una columna C18 de siacutelice y una fase moacutevil de agua-etanol-
aacutecido aceacutetico de forma isocraacutetica en donde se obtuvo un porcentaje 025-115
y 002-016 de Psilocibina y Psilocina respectivamente en el hongo (Wurst
1984)
De igual manera en el antildeo 2003 en el instituto de ciencia policiaca en Japoacuten se
ejecutoacute la cromatografiacutea de alta eficiencia utilizando una columna C18 con una
fase moacutevil de aacutecido foacutermico de forma isocraacutetica y un detector de 220 nm un rango
de porcentaje de Psilocibina 014-042 wv en la capa mientras un 009-03
wv en el tallo (Tsujikawa et al 2003)
34
2 MATERIALES Y MEacuteTODOS
21 LOCALIZACIOacuteN
Las fermentaciones la medicioacuten del crecimiento micelial y la cuantificacioacuten del
consumo del sustrato y de proteiacutena se llevaron a cabo en el laboratorio de
Biotecnologiacutea de la Universidad EAFIT mientras que los anaacutelisis de cromatografiacutea
liacutequida de alta eficiencia (HPLC) se realizaron en el laboratorio de Quiacutemica
Instrumental de dicha Universidad
22 MICROORGANISMO DE ESTUDIO
La cepa del hongo Psilocybe cubensis (EAH01) con la cual se trabajoacute fue donada
por Joseacute Rodrigo Moreno Ingeniero del laboratorio de la Universidad Catoacutelica de
Oriente (UCO) La EAH01 permanece auacuten en el laboratorio de Biotecnologiacutea de la
Universidad EAFIT
Dicha cepa se cultivoacute en una caja Petri que conteniacutea Agar Extracto de Malta
(MEA) y se incuboacute a 30ordmC en una incubadora digital del laboratorio de
Biotecnologiacutea de la Universidad EAFIT La figura 5 representa una cepa de P
cubensis cultivada en medio soacutelido MEA
Figura 5 Psilocybe cubensis (EAH01) cultivada en medio soacutelido Agar Malta
35
23 COMPONENTES DEL MEDIO DE CULTIVO (FANG-ZHONG)
El medio sumergido utilizado para llevar a cabo las diferentes fermentaciones de
P cubensis fue el descrito por Fang-Zhong (2002) La tabla 1 muestra los
componentes de dicho medio y la concentracioacuten de cada uno de ellos Se destaca
que las fuentes de carbono utilizadas fueron glucosa y sacarosa usaacutendolas cada
una por separado para cada experimento y haciendo variaciones de
concentraciones de las mismas para los distintos ensayos
Tabla 1 Composicioacuten del medio de cultivo sumergido para evaluar el crecimiento micelial del P cubensis
Componentes Cantidad (gL)
Fuente de Carbono 30 ndash 50 - 70
Peptona 5
Extracto de levadura 5
KH2PO4 1
MgSO47H2O 05
Vitamina B1 005
24 PREPARACIOacuteN DE LOS DIFERENTES PREINOacuteCULOS DE P cubensis
EMPLEADOS PARA LAS FERMENTACIONES SUMERGIDAS
Con el propoacutesito de llevar a cabo cada uno de los ensayos fue necesario realizar
la preparacioacuten de un preinoacuteculo eacutesto con el fin de realizar un proceso de
adaptacioacuten del P cubensis al medio favoreciendo la disminucioacuten en cuanto a
tiempo (preferiblemente la eliminacioacuten de la aparicioacuten de un fase de latencia una
vez comenzada la fermentacioacuten)
La preparacioacuten de cada uno de los preinoacuteculos se realizoacute en 6 erlenmeyers de
1000 mL con 200 mL de medio cada uno los cuales fueron esterilizados a 120degC
por 15 minutos e inoculados con 4 discos de 5 mm aproximadamente de P
36
cubensis provenientes de la cepa previamente activada en Agar Malta durante 6
diacuteas Los erlenmeyers se llevaron a un agitador orbital por 6 diacuteas a 30ordmC y 100
rpm
25 PREPARACIOacuteN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO Y LOS INOacuteCULOS DE P
cubensis UTILIZADOS PARA LAS FERMENTACIONES SUMERGIDAS
Una vez realizado el preinoacuteculo se procedioacute a preparar los medios de cultivo
utilizados para realizar los distintos experimentos de la siguiente manera se
prepararon medios que diferiacutean en la fuente de carbono (glucosa o sacarosa) y en
la concentracioacuten de la misma (30 gL 50 gL y 70 gL) teniendo asiacute un total de
seis fermentaciones Las demaacutes cantidades de los componentes del medio de
Fang-Zhong fueron las mismas que las usadas en el preinoacuteculo descritas en la
Tabla 1
En primer lugar se llevaron a cabo las tres fermentaciones de glucosa
preparando un total de 90 erlenmeyers (30 por cada concentracioacuten de azuacutecar por
duplicado) cada uno de los frascos conteniacutea 50 mL del medio en erlenmeyers de
250 mL e inoculados con 01 g de peso huacutemedo del preinoacuteculo aproximadamente
Los 90 frascos se llevaron durante 14 diacuteas a un agitador orbital a 100 rpm con una
temperatura de 30 degC
Posteriormente se llevaron a cabo las tres fermentaciones de sacarosa siguiendo
el mismo proceso descrito anteriormente para la glucosa
Una vez terminadas las fermentaciones de glucosa y sacarosa y realizados todos
los anaacutelisis correspondientes (generacioacuten de biomasa consumo de sustrato
consumo de proteiacutena y evaluacioacuten de la presencia de Psilocibina por medio de
cromatografiacutea liacutequida de alta eficiencia (HPLC)) se procedioacute a elegir la fuente de
carbono y concentracioacuten que mejores resultados arrojoacute tanto para la generacioacuten
37
de biomasa como para la produccioacuten del alcaloide con el fin de evaluarla
nuevamente adicionaacutendole un precursor (FA)
Para finalizar se procedioacute a preparar los medios con la fuente de carbono y la
concentracioacuten de la misma que arrojoacute mejores resultados es decir los ensayos
realizados con una concentracioacuten de 50 gL de glucosa adicionaacutendole al medio
FA a diferentes concentraciones correspondiente a valores de 05 gL 10 gL y
15 gL las demaacutes cantidades de los componentes remanentes del medio fueron
las mismas que las descritas anteriormente en la tabla 1
26 CUANTIFICACIOacuteN DEL CRECIMIENTO DE BIOMASA MEDIANTE LOS
MEacuteTODOS DE PESO HUacuteMEDO Y PESO SECO PARA CULTIVO
SUMERGIDO DE P cubensis
La cuantificacioacuten de biomasa para cada uno de los tratamientos se realizoacute usando
la metodologiacutea de peso huacutemedo y peso seco Para la cuantificacioacuten de biomasa
mediante el meacutetodo de peso huacutemedo se tomaron dos muestras provenientes de
cada erlenmeyer cada 24 horas las cuales fueron filtradas y pesadas con el fin de
obtener el valor de peso huacutemedo para cada tratamiento del P cubensis
Posteriormente la biomasa retenida en el papel filtro fue llevada a un secador que
se encontraba a una temperatura de 50ordmC durante 24 horas transcurrido el
tiempo la biomasa seca fue pesada con el fin de obtener datos de peso seco
Durante los 14 diacuteas de la fermentacioacuten se obtuvieron datos de peso huacutemedo y
peso seco por duplicado para cada una de las fermentaciones
27 AJUSTE DE LA CINEacuteTICA DE CRECIMIENTO DE P cubensis AL
MODELO CINEacuteTICO LOGIacuteSTICO
Una vez realizada la recoleccioacuten de muestras para cada uno de los ensayos y su
posterior anaacutelisis se decidioacute modelar dichos datos mediante el modelo logiacutestico
38
(ecuacioacuten 1) el cual permite obtener variables cineacuteticas tales como la cantidad de
biomasa inicial (Xo) y la velocidad maacutexima de crecimiento (micromaacutex) para cada uno de
los tratamientos
Se decidioacute emplear el modelo logiacutestico ya que eacuteste muestra resultados maacutes reales
cuando se cultivan hongos debido a que su morfologiacutea es muy diferente a otros
microorganismos (pellets) dificultando la transferencia de masa (Bailey et al
1986)
Una vez linealizada la ecuacioacuten que describe dicho modelos se llega a la siguiente
expresioacuten
Ecuacioacuten 1 Ecuacioacuten linealizada del modelo logiacutestico
Posterior a la linealizacioacuten de la ecuacioacuten se procedioacute a graficar Ln ((XmaacutexX)-1)
vs tiempo con el fin de obtener como pendiente la velocidad maacutexima de
crecimiento (micromaacutex) y como intercepto el Ln ((XmaacutexXo)-1) el cual permitioacute la
obtencioacuten de la concentracioacuten inicial de biomasa
Obtenieacutendose asiacute los paraacutemetros cineacuteticos para cada ensayo correspondientes a
micromax y Xo
Se debe definir la concentracioacuten maacutexima de biomasa (Xmaacutex) para poder hallar los
paraacutemetros cineacuteticos mediante dicho modelo cabe aclarar que dicho valor se toma
de los resultados de biomasa adquiridos para cada uno de los ensayos mediante
la metodologiacutea de peso seco este valor variacutea para cada fermentacioacuten
Una vez ajustados los datos de cada tratamiento al modelo logiacutestico se procedioacute a
calcular de manera teoacuterica los valores de X (biomasa) que variacutea con el tiempo
39
teniendo en cuenta los paraacutemetros cineacuteticos arrojados mediante el modelo
logiacutestico utilizando la siguiente ecuacioacuten
Ecuacioacuten 2 Valores teoacutericos de biomasa en el tiempo
Estos valores de X teoacutericos obtenidos mediante la foacutermula anterior se grafican con
respecto a los valores de X obtenidos de manera experimental con el fin de
observar el ajuste del modelo logiacutestico a cada uno de los datos experimentales
28 EVALUACIOacuteN DEL CONSUMO DE SUSTRATO Y DEL CONSUMO DE
PROTEIacuteNA POR PARTE DEL P cubensis CULTIVADO EN MEDIO
SUMERGIDO
Con el fin de evaluar el consumo de sustrato y proteiacutena por parte del P cubensis
durante las fermentaciones que conteniacutean glucosa en el medio se recolectaron
muestras cada 24 horas del liacutequido obtenido despueacutes de realizada la filtracioacuten de
la muestra que se utilizoacute para efectos de caacutelculo de peso seo dicho liacutequido
denominado sobrenadante fue almacenado a -4 degC Finalizadas cada una de las
fermentaciones se procedioacute a realizar el protocolo para evaluar el consumo de
sustrato para cada medio (Miller 1959) mediante el meacutetodo de DNS (Aacutecido
Dinitrosaliciacutelico) (Anexo 13) y el consumo de proteiacutenas mediante el meacutetodo de
LOWRY para cada fermentacioacuten (Anexo 15)
Para llevar a cabo la cuantificacioacuten de sustrato y proteiacutena en los distintos ensayos
fue necesario realizar las curvas de calibracioacuten correspondientes dichas curvas
con sus respectivos valores de concentracioacuten se muestran en los anexos 14 y 16
40
29 MEacuteTODO CUALITATIVO PARA DETERMINAR LA PRESENCIA DE
ALCALOIDES (PSILOCIBINA) MEDIANTE EL USO DEL REACTIVO DE
DRAGENDORFF
Como se mencionoacute anteriormente el reactivo de Dragendorff es usado para
determinar de manera cualitativa la ausencia o presencia de alcaloides en una
muestra determinada Para llevar a cabo dicha prueba se recolectaron muestras
de la biomasa seca correspondientes a los diacuteas 12 13 y 14 de cada fermentacioacuten
las cuales fueron almacenadas a -4degC
Para determinar la presencia de Psilocibina se realizoacute el proceso descrito seguacuten
Musshoff et al (2000) el cual consistioacute en macerar cada una de las muestras de
biomasa hasta obtener un polvo fino luego se pesaron 10 mg de dicho polvo y a
esta cantidad se le agregoacute 1 mL de metanol Posteriormente una pequentildea
cantidad de esta mezcla se esparcioacute en un papel filtro en donde se le adicionoacute una
gota del reactivo de Dragendorff
Una vez realizada la prueba se dice que la muestra contiene presencia de
alcaloides si eacutesta presenta una coloracioacuten rojizo-amarilla
210 MEacuteTODO PARA DETERMINAR LA PRESENCIA DE PSILOCIBINA
MEDIANTE CROMATOGRAFIacuteA LIacuteQUIDA DE ALTA EFICIENCIA (HPLC)
Una vez evaluada la presencia del alcaloide mediante el reactivo de Dragendorff
se procedioacute a determinar mediante el uso de cromatografiacutea liacutequida de alta
eficiencia (HPLC) la presencia de los alcaloides en la mezcla con sus respectivos
tiempos de retencioacuten para llevar a cabo la extraccioacuten de la Psilocibina se siguioacute el
meacutetodo descrito por Musshoff et al (2000) Para ello la muestra de biomasa
seca fue macera en un mortero hasta convertirla en un polvo fino Diez miligramos
41
de la muestra en polvo se extrajeron dos veces con 1 mL de metanol en un bantildeo
de ultrasonido durante 30 minutos Posterior a eacutesto se centrifugaron las muestras
a 3000 rpm durante 2 minutos el sobrenadante se depositoacute en un vial
independiente
El sobrenadante fue evaporado hasta sequedad bajo una corriente de nitroacutegeno
gaseoso Una parte de los residuos se disolvioacute en 200 microL de la fase moacutevil que
contiene HCOONH4 con una concentracioacuten 10 microM y un pH de 35
El equipo utilizado para realizar todos los anaacutelisis correspondientes a HPLC
cuenta con las siguientes caracteriacutesticas equipo Agient Technologies que consta
de una columna C18 de 46 mm 250 mm 5 mm con una fase moacutevil de
HCOONH4 con un flujo de 1 mLminuto un detector UV de 214 nm y una inyeccioacuten
de 20 μL y una temperatura de 25degC El experimento se corrioacute de modo isocraacutetico
con una fase moacutevil de agua 70 y HCOONH4 de 30
211 DETERMINACIOacuteN CUALITATIVA DE LA RESOLUCIOacuteN DEL
ALCALOIDE DE INTEREacuteS PARA LOS DIFERENTES ENSAYOS
Con el fin de determinar de manera cualitativa cuaacutel de los cromatogramas
arrojados mediante la teacutecnica de HPLC presentoacute mejor resolucioacuten del alcaloide
fue necesario realizar un supuesto acerca del tiempo de retencioacuten de la Psilocibina
durante la cromatografiacutea puesto que a pesar de haber contado con un
cromatograma (Tsujikawa et al 2003) (Anexo 18) y haber trabajado en las
mismas condiciones de eacuteste no se utilizoacute la misma fase moacutevil lo que puedo
generar variaciones en dicho tiempo Se asumioacute que el tiempo de retencioacuten varioacute
entre 62 y 72 minutos es decir entre este tiempo se encontroacute el pico de intereacutes
de la investigacioacuten
42
La eleccioacuten del criterio de pureza del compuesto de intereacutes se realizoacute observando
cuaacutel de los picos obtenidos muestra menor ruido es decir que a su alrededor no
tenga presencia de otros compuestos (Anexos 19 20 y 21)
212 DETERMINACIOacuteN PORCENTUAL DE COMPUESTOS PARA LOS
DIFERENTES ENSAYOS
La cuantificacioacuten de los compuestos se hizo mediante un porcentaje de aacuterea bajo
la curva debido a que no se contoacute con un estaacutendar interno
Para realizar dicho porcentaje se obtuvo la totalidad de las aacutereas presentes en el
perfil cromatograacutefico obtenido para las muestras de los diacuteas 12 13 y 14 de cada
fermentacioacuten y el porcentaje del aacuterea del metabolito de intereacutes la cual oscilaba
entre un tiempo de retencioacuten entre 62 y 72 minutos
En el momento de analizar los cromatogramas y de elegir el medio que mejor
resultados arrojoacute en cuanto a la produccioacuten de alcaloide se observoacute la resolucioacuten
del metabolito en cada una de las fermentaciones
213 CULTIVO SUMERGIDO DE P cubensis EN PRESENCIA DE FA
Despueacutes de haber elegido la fuente de carbono (glucosa) y su respectiva
concentracioacuten (50 gL) que mejores resultados arrojaron durante la investigacioacuten
se realizaron nuevamente fermentaciones del P cubensis en medio sumergido
(Fang-Zhong) donde la diferencia de estos medios con respecto a los
anteriormente utilizados radicoacute en la presencia de FA aminoaacutecido
Para dichas fermentaciones se contoacute con tres concentraciones diferentes de FA
(05 gL 1 gL 15 gL) realizadas por duplicado adicionalmente se montoacute
43
simultaacuteneamente con dichos ensayos las muestras correspondientes a los uacuteltimos
tres diacuteas de fermentacioacuten sin FA en el medio para efectos de comparacioacuten y asiacute
poder llevar a cabo un anaacutelisis estadiacutestico apropiado
Los datos obtenidos fueron analizados por medio de una ANOVA con el fin de
observar si existiacutean o no diferencias significativas en cuanto al crecimiento micelial
(concentracioacuten de biomasa) del P cubensis y asiacute poder determinar el medio que
mejores resultados arrojoacute durante la investigacioacuten
214 DISENtildeO DE EXPERIMENTOS Y ANAacuteLISIS ESTADIacuteSTICO
El disentildeo estadiacutestico utilizado para realizar los anaacutelisis correspondientes a las
diferentes fermentaciones es un disentildeo factorial 23 Este estudio se basoacute en dos
factores que fueron las dos fuentes de carbono (glucosa y sacarosa) a su vez se
apoyoacute en tres niveles que fueron la variacioacuten en la concentracioacuten de las mismas
(30 gL 50 gL y 70 gL) De igual manera se fundamentoacute en dos variables de
respuesta el crecimiento micelial de P cubensis y el porcentaje de Psilocibina
presente en el microorganismo
Por medio del Software Statgraphics plus 51 se realizoacute un anaacutelisis estadiacutestico
basado en una ANOVA factorial Con ello se pretendioacute comparar estadiacutesticamente
los resultados de crecimiento micelial de biomasa (concentracioacuten) y produccioacuten de
Psilocibina para cada uno de los medios durante los 14 diacuteas de fermentacioacuten y en
especial en los uacuteltimos tres diacuteas de la misma puesto que durante este periacuteodo fue
evaluada la presencia del alcaloide
Es necesario hacer hincapieacute que para realizar dicha estadiacutestica fue necesario
ejecutar un estudio de normalidad el cual se comproboacute utilizando la graacutefica de
probabilidad normal a su vez se requirioacute un anaacutelisis de igualdad de varianza por
medio de una graacutefica de residuos Vs previsto con el fin de ver visualmente la
44
hipoacutetesis de la homocedasticidad todo ello con el fin de garantizar que la
investigacioacuten se comportoacute de forma normal Adicionalmente se contoacute con una
hipoacutetesis nula (Ho) y una Hipoacutetesis alterna (Ha) las cuales permitieron realizar las
conclusiones respectivas A continuacioacuten se enunciaraacuten cada una de eacutestas y los
paraacutemetros necesarios para dicho estudio
Ho Todas las medias son iguales es decir no existen diferencias
significativas entre los datos analizados
Ha Alguna de las medias es diferente lo que quiere decir que siacute existen
diferencias significativas
Paraacutemetro
Pvalor gt 005 Se acepta Ho
Pvalor le 005 Se rechaza Ho
45
3 RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN
31 CINEacuteTICA DE CRECIMIENTO MICELIAL DE P cubensis EN CULTIVO
SUMERGIDO (FANG-ZHONG) UTILIZANDO DIFERENTES FUENTES DE
CARBONO
Con el propoacutesito de evaluar el crecimiento micelial del P cubensis en medio
sumergido durante los 14 diacuteas de la fermentacioacuten se recurrioacute al uso de
metodologiacuteas conocidas como peso huacutemedo y peso seco en dicho trabajo soacutelo se
exponen los datos arrojados por el meacutetodo de peso seco
A continuacioacuten se presentan cada una de las fermentaciones de acuerdo al tipo de
sustrato empleado en las mismas los respectivos valores de peso seco obtenidos
y los anaacutelisis pertinentes para cada uno de los casos
311 Crecimiento micelial de P cubensis en medio sumergido utilizando
diferentes concentraciones de glucosa
Inicialmente se evaluaron tres concentraciones de glucosa en el cultivo de P
cubensis en medio sumergido (Fang-Zhong) correspondientes a 30 gL 50 gL y
70 gL siendo en este caso la glucosa la principal fuente de carbono del P
cubensis
A continuacioacuten se muestran los valores de peso seco obtenidos para cada una de
las concentraciones de glucosa utilizadas durante los 14 diacuteas de la fermentacioacuten
46
0
01
02
03
04
05
06
07
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Bio
ma
sa (g
L)
Tiempo (diacuteas)30gL 50gL 70gL
Graacutefico 1 Cineacutetica de crecimiento micelial de P cubensis en medio sumergido (Fang-Zhong) utilizando tres diferentes concentraciones de
glucosa como fuente de carbono (Peso seco)
Del graacutefico 1 se puede observar que no hubo evidencia de fase de latencia para
ninguno de los ensayos posteriormente se aprecia que el crecimiento de biomasa
aumentoacute con el tiempo para las diferentes concentraciones de glucosa empleadas
Analizando las fermentaciones que conteniacutean 50 gL y 70 gL de glucosa se
puede afirmar que ambas presentan un comportamiento similar mostrando una
fase exponencial hasta el diacutea 11 y una fase estacionaria hasta el diacutea 14 de la
fermentacioacuten mientras que la fermentacioacuten que conteniacutea 30 gL de glucosa no
presentoacute fase estacionaria la fermentacioacuten durante los 14 diacuteas se encontraba en
fase exponencial a pesar de que entre los diacuteas 8 y 11 el crecimiento de P
cubensis se mantuvo constante
Asimismo se puede observar que el crecimiento maacutes bajo en cuanto a
concentracioacuten de biomasa se generoacute en la concentracioacuten de 30 gL siendo eacuteste
de 048 gL mientras que en las concentraciones de 50 gL y 70 gL de glucosa
los crecimientos maacuteximos fueron muy similares 055 gL y 062 gL
respectivamente
47
Lo dicho anteriormente se ratifica una vez analizados los resultados obtenidos
estadiacutesticamente donde se obtuvo un P-valor igual a cero indicando que existen
diferencias significativas en cuanto al crecimiento micelial de biomasa
(concentracioacuten de biomasa durante los 14 diacuteas de la fermentacioacuten) El graacutefico 2
ilustra la presencia de dos grupos homogeacuteneos lo que indica que las
concentraciones de 50 gL y 70 gL no tienen diferencias significativas del
crecimiento micelial entre cada una de ellas mientras que la concentracioacuten de 30
gL siacute presenta dichas diferencias significativas con respecto a las dos
concentraciones anteriores (Anexo 1)
Con todo eacutesto se expone que la concentracioacuten de glucosa de 50 gL es la que se
eligioacute debido a que es maacutes econoacutemico utilizar 50 gL de glucosa que 70 gL
Tratamientos con diferentes concentraciones de glucosa
Media 30 gL glucosa (a) 022
Media 50 gL glucosa (b) 032
Media 70 gL glucosa (b) 034
a
bb
0
005
01
015
02
025
03
035
04
045
Co
nce
ntr
acioacute
n b
iom
asa
(gL
)
Letras diferentes denotan diferencias significativas (prueba LSD)
Graacutefico 2 Crecimiento micelial de P cubensis en cultivo sumergido bajo tres concentraciones de glucosa
48
Modelo logiacutestico para las fermentaciones donde se utilizoacute glucosa
como fuente de carbono
Una vez realizada la cineacutetica de crecimiento del P cubensis en medio sumergido
(Fang-Zhong) usando diferentes concentraciones de glucosa se procedioacute a
ajustar los datos obtenidos al modelo logiacutestico Los crecimientos maacuteximos de
biomasa obtenidos mediante el meacutetodo de peso seco para cada uno de los
ensayos fueron 048 gL 065 gL y 062 gL para concentraciones de 30 gL 50
gL y 70 gL de glucosa respectivamente La tabla 2 muestra los paraacutemetros
cineacuteticos obtenidos mediante el modelo para cada una de las concentraciones
Tabla 2 Paraacutemetros cineacuteticos obtenidos mediante el modelo logiacutestico para las diferentes fermentaciones de P cubensis utilizando glucosa como fuente
de carbono
30gL 50gL 70gL
microx (diacutea-sup1) 016 microx (diacutea-sup1) 017 microx (diacutea-sup1) 015
micromax (diacutea-sup1) 027 micromax (diacutea-sup1) 035 micromax (diacutea-sup1) 034
X0 (gL) 005 X0 (gL) 008 X0 (gL) 008
R2 096 R2
092 R2 085
De la tabla 2 se puede observar que la concentracioacuten inicial de biomasa (Xo)
estuvo muy cercana para cada una de las concentraciones de glucosa utilizadas
Para 30 gL de glucosa la velocidad maacutexima de crecimiento (micromax) fue mucho
menor que la obtenida para 50 gL y 70 gL eacutesto pudo ser debido a que fue el
medio que menor cantidad de glucosa conteniacutea mientras que para las otras dos
concentraciones de glucosa la velocidad maacutexima de crecimiento fue similar
Al comparar las velocidades maacuteximas de las tres concentraciones de glucosa
utilizadas se evidencia que la fermentacioacuten que conteniacutea 50 gL presentoacute una
micromaacutex mayor correspondiente a 035 diacutea-1 esto sugiere que a mayores
concentracioacuten de glucosa (70 gL) puede ocurrir una inhibicioacuten por sustrato otro
49
criterio que afirma que dicha concentracioacuten fue la que mejores resultados arrojoacute de
las tres concentraciones de glucosa utilizadas para el crecimiento del P cubensis
en el medio de Fang-Zhong Ademaacutes se observa que este experimento fue el que
mayor velocidad especiacutefica de crecimiento presento siendo esta de 017 diacutea-1
Finalmente se calcularon los valores de biomasa teoacutericos utilizando la ecuacioacuten
descrita anteriormente en la metodologiacutea con el propoacutesito de observar que tanto
se ajustaron los valores de biomasa hallados experimentalmente con los valores
de biomasa teoacutericos arrojados por el modelo logiacutestico El graacutefico 3 muestra los
valores de biomasa (X) tanto teoacutericos como experimentales con respecto al
tiempo
0
01
02
03
04
05
06
07
0 2 4 6 8 10 12 14
Biom
asa
(gL
)
Tiempo (diacutea)
X exp (30 gL) X exp (50 gL) X exp (70 gL)
X teoacuterico (30 gL) X teoacuterico (50 gL) X teoacuterico (70 gL)
Graacutefico 3 Valores de concentracioacuten de biomasa experimental y teoacuterico
graficados con respecto al tiempo para las fermentaciones con diferentes concentraciones de glucosa
Al observar el graacutefico 3 se puede notar que para los ensayos de 50 gL y 70 gL
de glucosa los valores de biomasa teoacutericos se encuentran un poco desfasados de
los valores de biomasa hallados de manera experimental mientras que para el
ensayo que conteniacutea 30 gL de glucosa se observa un buen ajuste de los datos
50
obtenidos experimentalmente al modelo logiacutestico La tabla 2 reitera lo dicho
anteriormente al exponer los valores de R2 los cuales explican la relacioacuten que
tienen los datos teoacutericos con los experimentales
312 Crecimiento micelial del P cubensis en medio sumergido utilizando
diferentes concentraciones de sacarosa
Una vez evaluado el crecimiento de biomasa usando glucosa como fuente de
carbono se procedioacute a evaluar el efecto que teniacutea el cambio de la fuente de
carbono por sacarosa en el crecimiento micelial del P cubensis en medio
sumergido
El graacutefico 4 muestra de manera ilustrativa como fue el crecimiento micelial del P
cubensis para cada una de las concentraciones de sacarosa utilizadas durante los
14 diacuteas mediante el meacutetodo de peso seco
0
01
02
03
04
05
06
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Biom
asa (
gL)
Tiempo (diacuteas)
30 gL 50 gL 70 gL
Graacutefico 4 Cineacutetica de crecimiento micelial de P cubensis en medio sumergido (Fang-Zhong) utilizando diferentes concentraciones de sacarosa
como fuente de carbono (Peso seco)
51
En el graacutefico 4 se puede observar que tanto para una concentracioacuten de 30 gL
como para 70 gL de sacarosa el hongo llega a su fase estacionaria cerca del
quinto diacutea de la fermentacioacuten mientras que para una concentracioacuten de 50 gL se
observa un comportamiento diferente puesto que el microorganismo tiene un
crecimiento exponencial hasta el diacutea 5 en donde entra a una etapa de transicioacuten o
estacionaria durante 3 diacuteas aproximadamente luego de la cual inicia nuevamente
su crecimiento de forma exponencial hasta llegar al diacutea 11 en donde siacute empieza
su fase estacionaria
Al igual que en las tres fermentaciones que conteniacutean glucosa en estas
fermentaciones de sacarosa se observa mediante el graacutefico anterior que no hubo
presencia de fase de latencia
El crecimiento maacuteximo de biomasa en cuanto a concentracioacuten lo presentoacute aquella
fermentacioacuten que conteniacutea 70 gL de sacarosa el cual fue de 057 gL seguida de
la de 50 gL con un crecimiento maacuteximo de biomasa de 045 gL y posteriormente
la concentracioacuten de 30 gL obtuvo un crecimiento maacuteximo de 026 gL
De acuerdo al anaacutelisis estadiacutestico que se realizoacute para cada una de las
fermentaciones se dedujo que las diferencias en cuanto al crecimiento micelial de
biomasa con respecto a la concentracioacuten de la misma son significativas entre
cada una de las fermentaciones es decir fue diferente la concentracioacuten de
biomasa obtenida cuando se trabajoacute con cada una de distintas concentraciones de
sacarosa Lo dicho anteriormente se muestra a traveacutes del graacutefico 5 (Anexo 2)
52
Tratamientos con diferentes concentraciones de sacarosa
Media 30 gL sacarosa (a) 02
Media 50 gL sacarosa (b) 032
Media 70 gL sacarosa (c) 043
a
b
c
0
02
04
Co
nce
ntr
acioacute
n b
iom
asa
(gL
)
Letras diferentes denotan diferencias significativas (prueba LSD)
Graacutefico 5 Crecimiento micelial para tres diferentes concentraciones de sacarosa
Modelo logiacutestico para las fermentaciones donde se utilizoacute sacarosa
como fuente de carbono
Una vez realizadas las cineacuteticas de crecimiento del P cubensis para cada
concentracioacuten de sacarosa empleada se procedioacute a ajustar los datos obtenidos al
modelo logiacutestico cabe recalcar que es necesario establecer los crecimientos
maacuteximos de biomasa obtenidos para cada uno de los ensayos los cuales fueron
026 gL 045 gL y 057 gL para concentraciones de 30 gL 50 gL y 70 gL de
sacarosa respectivamente
Una vez aplicado el modelo logiacutestico para cada tratamiento se obtuvieron valores
de velocidad maacutexima de crecimiento y biomasa inicial para cada concentracioacuten de
sacarosa utilizada en el medio los cuales se muestran en la tabla 3
53
Tabla 3 Paraacutemetros cineacuteticos obtenidos mediante el modelo logiacutestico para las diferentes fermentaciones de P cubensis utilizando sacarosa como
fuente de carbono
30gL 50gL 70gL
microx (diacutea-sup1) 030 microx (diacutea-sup1) 014 microx (diacutea-sup1) 041
micromax (diacutea-sup1) 037 micromax (diacutea-sup1) 042 micromax (diacutea-sup1) 067
X0 (gL) 01 X0(gL) 01 X0 (gL) 011
R2 061 R2 089 R2 095
De la tabla 3 se ratifica que se utilizoacute una concentracioacuten inicial de biomasa igual
para cada una de las fermentaciones aproximadamente 01 gL ademaacutes se
observa un aumento en la velocidad maacutexima de crecimiento con respecto a la
cantidad de sacarosa empleada es decir que el hecho de haber aumentado la
concentracioacuten de sacarosa en el medio favorecioacute el aumento en la velocidad
maacutexima de crecimiento del P cubensis siendo eacutesta mayor cuando se trabajoacute a una
concentracioacuten de 70 gL de sacarosa De igual manera se aprecia que el
tratamiento que conteniacutea 70 gL de sacarosa presentoacute una velocidad especiacutefica de
crecimiento mayor que los demaacutes siendo eacutesta de 041 diacutea-1
Finalmente se calcularon los valores de biomasa teoacutericos el graacutefico 6 ilustra los
valores de biomasa (X) tanto teoacutericos como experimentales graficados con
respecto al tiempo
54
0
01
02
03
04
05
06
0 2 4 6 8 10 12 14
Bio
mas
a (g
L)
Tiempo (Diacutea)
X exp (30 gL) X exp (50 gL) X exp (70 gL)
X teoacuterico (30 gL) X teoacuterico (50 gL) X teoacuterico (70 gL)
Graacutefico 6 Valores de concentracioacuten de biomasa experimental y teoacuterico graficados con respecto al tiempo para las fermentaciones con diferentes
concentraciones de sacarosa
Del graacutefico 6 se puede observar como los valores de biomasa experimentales se
ajustaron a los valores de biomasa teoacutericos arrojados por el modelo logiacutestico lo
que quiere decir la cineacutetica de crecimiento del P cubensis en medio sumergido
cuando se utilizoacute 70 gL se ajustoacute correctamente al modelo logiacutestico lo que se
corrobora en la tabla 2 gracias al valor obtenido para el R2 que indica la relacioacuten
de los datos teoacutericos con respecto a los experimentales Por otro lado para las
fermentaciones de 30 gL y 50 gL de sacarosa a pesar de parecer que
presentaron un buen ajuste al calcular la relacioacuten de los datos teoacutericos con
respecto a los experimentales (R2) se concluye que el ajuste no fue tan bueno
55
313 Comparacioacuten entre el crecimiento micelial de P cubensis en los
cultivos sumergidos utilizando glucosa y sacarosa como fuente de
carbono
Ahora bien es igualmente importante realizar un anaacutelisis comparativo entre ambas
fuentes de carbono empleadas con el fin de determinar si existen o no diferencias
significativas entre dichas fuentes de carbono
De acuerdo al anaacutelisis estadiacutestico se dice que existen diferencias significativas del
crecimiento micelial del P cubensis en cuanto al diacutea y la concentracioacuten de
sustrato empleado es decir concentracioacuten de glucosa y sacarosa (Anexo 3) pero
se observa claramente que no hay diferencias significativas de dicho crecimiento
con respecto al tipo de sustrato utilizado debido a que el P-valor arrojado por la
estadiacutestica fue de 01217 lo que sugiere que se debe utilizar la sacarosa gracias
a la disminucioacuten de costos que se generariacutean durante el proceso todo ello gracias
al costo de la sacarosa es inferior al de glucosa Sin embargo para elegir la fuente
de carbono que mejores resultados arrojoacute no soacutelo se basoacute en la cantidad de
biomasa producida sino que se procedioacute a examinar los barridos espectrales
arrojados por el anaacutelisis de HPLC con el fin de determinar la fuente de carbono
que mejor resolucioacuten mostroacute del alcaloide que en esta investigacioacuten fue glucosa a
una concentracioacuten de 50 gL
De igual manera el graacutefico 7 muestra las medias obtenidas mediante el anaacutelisis
estadiacutestico para las fermentaciones trabajadas con glucosa y sacarosa Aun asiacute
es necesario hacer hincapieacute que eacuteste no es el criterio principal para la obtencioacuten
del medio que mejores resultados arrojoacute durante la investigacioacuten por lo tanto se
deben seguir realizando los diferentes anaacutelisis descritos anteriormente en este
trabajo
56
Tratamientos de las dos fuentes de carbono usadas sin FA (glucosa y
sacarosa)
Media para glucosa (a) 029
Media para sacarosa (a) 032
aa
0
01
02
03
Conc
entr
acioacute
n bi
omas
a (g
L)
Letras diferentes denotan diferencias significativas (Prueba LSD)
Graacutefico 7 Crecimiento micelial para dos diferentes fuentes de carbono (glucosa y sacarosa)
314 Crecimiento micelial del P cubensis en cultivo sumergido utilizando
glucosa y fenilalanina en el medio
Se decidioacute realizar un uacuteltimo ensayo acerca del efecto que teniacutea la adicioacuten de un
aminoaacutecido llamado Fenilalanina (FA) al medio Fang-Zhong sobre la produccioacuten
del alcaloide y por ende sobre la generacioacuten de biomasa
Debido a los anaacutelisis realizados anteriormente se concluyoacute que la mejor fuente de
carbono fue la glucosa a una concentracioacuten de 50 gL De la misma manera que
en los numerales anteriores se evaluoacute la cineacutetica del crecimiento micelial del P
cubensis mediante los meacutetodos de peso huacutemedo y peso seco Las mediciones
fueron realizadas por duplicado y promediadas para la fuente de carbono elegida
(glucosa 50 gL) y las diferentes concentraciones de FA en el medio
correspondientes a 05 gL 1 gL 15 gL con el fin de encontrar el medio que
mejores resultados arrojoacute en cuanto a crecimiento micelial y generacioacuten del
57
alcaloide de intereacutes Los datos obtenidos mediante el meacutetodo de peso seco se
muestran en el graacutefico 8
Cabe resaltar que junto con las tres fermentaciones de 05 gL 10 gL y 15 gL
de FA se montaron a su vez seis muestras correspondientes a los diacuteas 12 13 y
14 de la fermentacioacuten que conteniacutea 0 gL de FA eacutesto con el propoacutesito de analizar
los datos de manera estadiacutestica y poder hacer comparaciones con respecto a la
generacioacuten de biomasa y a la produccioacuten del alcaloide de intereacutes ambas medidas
con respecto a la concentracioacuten
0
01
02
03
04
05
06
07
08
09
1
11
12
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Biom
asa
(gL
)
Tiempo (diacuteas)
05 gL 1 gL 15 gL
Graacutefico 8 Cineacutetica de crecimiento micelial de P cubensis en medio sumergido (Fang-Zhong) utilizando diferentes concentraciones de FA y 50
gL de glucosa como fuente de carbono (Peso seco)
Al analizar el graacutefico 8 es decir el crecimiento micelial (concentracioacuten de
biomasa) seguacuten la concentracioacuten de FA en el tiempo se puede notar que no hubo
presencia de fase de latencia para ninguna de las concentraciones de FA
utilizadas ademaacutes el crecimiento de biomasa en cada caso se aprecia de manera
58
muy similar llegando los tres ensayos a la fase estacionaria el diacutea 12 de la
fermentacioacuten
Observando el graacutefico 8 se puede identificar que el mayor contenido de biomasa
fue de 108 gL obtenida el diacutea 13 para una concentracioacuten 10 gL de FA para
concentraciones de 05 gL y 15 gL de FA la concentracioacuten maacutexima de biomasa
fue 106 gL y 101 gL respectivamente Auacuten asiacute al considerar los resultados
obtenidos se puede ratificar que es indiferente la cantidad de FA necesaria para
obtener concentracioacuten de biomasa por ende se decide que el medio que mejores
resultados arrojoacute fue el que conteniacutea 05 gL FA debido a que fue la
concentracioacuten de FA que mejor resolucioacuten del alcaloide presentoacute paraacutemetro
observado mediante los cromatogramas obtenidos del anaacutelisis de HPLC (Anexos
19 20 y 21) y ademaacutes porque con dicha cantidad los costos de la materia prima
seriacutean menores Cabe resaltar que el uso de FA generoacute un aumento significativo
duplicando la produccioacuten de biomasa por lo tanto se testifica que siacute hubo
duplicacioacuten en cuanto a la concentracioacuten de biomasa en los medios que conteniacutea
FA con respecto a los medios que no conteniacutean FA se dice entonces que a su
vez se podriacutea haber generado mayor cantidad de Psilocibina en los medios que
teniacutean FA ya que dicho alcaloide se produce de manera intracelular por tal
razoacuten al aumentar la cantidad de biomasa en el medio se aumenta la cantidad de
dicho alcaloide
De igual manera se analizaron los datos estadiacutesticamente y se llegoacute a apreciar
que no existen diferencias significativas en cuanto a la produccioacuten de biomasa y la
cantidad de FA utilizada en el medio Del mismo modo al analizar la tabla de
contrastes muacuteltiple de rangos se reitera que siacute existen diferencias significativas
entre el crecimiento micelial de biomasa (concentracioacuten de biomasa) en el tiempo
cuando se trabajoacute con FA o sin eacuteste Eacutesto se puede observar en el graacutefico 9
(Anexo 4)
59
Tratamientos con y sin FA
Media 0 gL FA (a) 032
Media 05 gL FA (b) 065
Media 10 gL FA (b) 066
Media 15 gL FA (b) 069
a
b b b
0
01
02
03
04
05
06
07
08
09
Conc
entr
acioacute
n bi
omas
a (g
L)
Letras diferentes denotan diferencias significativas (Prueba LSD)
Graacutefico 9 Crecimiento micelial para glucosa a una concentracioacuten de 50 gL y tres diferentes concentraciones de FA
Modelo logiacutestico para las fermentaciones donde se utilizoacute 50 gL de
glucosa como fuente de carbono y diferentes concentraciones de FA
En primer lugar se fijaron los valores de crecimiento maacuteximo de biomasa para
cada una de las concentraciones obtenidos mediante el meacutetodo de peso seco con
el fin de hallar los paraacutemetros cineacuteticos mediante el modelo logiacutestico Los
crecimientos maacuteximos de biomasa obtenidos fueron los siguientes 106 gL 108
gL y 101 gL para concentraciones de 05 gL 10 gL y 15 gL de FA
respectivamente y 50 gL de glucosa
Una vez realizado el modelo logiacutestico para cada tratamiento se obtuvieron los
valores de velocidad maacutexima de crecimiento y concentracioacuten de biomasa inicial
para cada ensayo los cuales se muestran en la tabla 4
60
Tabla 4 Paraacutemetros cineacuteticos obtenidos mediante el modelo logiacutestico para las diferentes fermentaciones de P cubensis utilizando 50 gL de glucosa
como fuente de carbono y diferentes concentraciones de FA
05gL 10gL 15gL
microx (diacutea-sup1) 018 microx (diacutea-sup1) 012 microx (diacutea-sup1) 012
micromax (diacutea-sup1) 045 micromax (diacutea-sup1) 035 micromax (diacutea-sup1) 044
X0 (gL) 01 X0 (gL) 017 X0 (gL) 016
R2 095 R2 082 R2 088
Seguacuten los valores arrojados por el modelo logiacutestico que se encuentran
presentados en la tabla 4 se puede decir que se presentoacute una valor de biomasa
inicial similar para los tratamientos de 1 gL y 15 gL de FA mientras que para las
fermentaciones que conteniacutean 05 gL de FA se tiene una diferencia de un 50
aproximadamente Ademaacutes se puede observar que a la concentracioacuten de 05 gL
de FA es la que mayor velocidad maacutexima de crecimiento presenta siendo esta
045 diacuteamacrsup1 a su vez dicha concentracioacuten presentaacute la microx mayor correspondiente a
018 diacutea-1 Debido a eacutesto y al criterio de mejor resolucioacuten del alcaloide observado
en los anaacutelisis de HPLC (Anexos 19 20 y 21) se concluye que el medio que
mejores resultados arrojoacute durante la investigacioacuten para la generacioacuten de biomasa
y la produccioacuten de la Psilocibina es 05 gL de FA y 50 gL de glucosa
Finalmente se calcularon los valores de biomasa teoacutericos el graacutefico 10 muestra
los valores de biomasa (X) tanto teoacutericos como experimentales graficados con
respecto al tiempo
61
0
02
04
06
08
1
12
0 2 4 6 8 10 12 14 16
Bio
mas
a (g
L)
Tiempo (Diacutea)
X exp (05 gL) X exp (10 gL) X exp (15 gL)
X teoacuterico (05 gL) X teoacuterico (10 gL) X teoacuterico (15 gL)
Graacutefico 10 Valores de concentracioacuten de biomasa experimental y teoacuterico graficados con respecto al tiempo para las fermentaciones con diferentes
concentraciones de FA y 50 gL de glucosa
Se puede decir gracias al graacutefico 10 que los valores de biomasa experimentales
se ajustaron a los valores de biomasa teoacutericos hallados mediante el modelo
logiacutestico es decir la cineacutetica de crecimiento del P cubensis en medio sumergido
cuando se usaron diferentes concentraciones de FA en el medio se ajustoacute
correctamente al modelo logiacutestico esto se reitera con los valores de R2 mostrados
anteriormente en la tabla 4
32 ESTUDIO DE LA CINEacuteTICA DE CONSUMO DE SUSTRATO POR PARTE
DEL P cubensis CULTIVADO EN MEDIO SUMERGIDO (FANG-ZHONG)
La evaluacioacuten del consumo de sustrato durante la fermentacioacuten con respecto al
tiempo es de suma importancia puesto que eacuteste es el principal componente
limitante del crecimiento presente en el medio de cultivo
62
A continuacioacuten se analizaraacuten dichos consumos para los diferentes ensayos
321 Consumo de sustrato por parte del P cubensis en medio sumergido
utilizando diferentes concentraciones de glucosa
Una vez halladas las concentraciones de sustrato para cada una de las
fermentaciones que conteniacutean glucosa en el medio se procedioacute a graficar dichos
valores con respecto al tiempo
El graacutefico 11 ilustra los datos obtenidos sobre el consumo de sustrato de las tres
fermentaciones que conteniacutean glucosa y a su vez como se comportoacute el
crecimiento de biomasa para cada ensayo durante los 14 diacuteas de fermentacioacuten
0
01
02
03
04
05
06
07
0
10
20
30
40
50
60
70
80
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14B
iom
asa
(gL
)
Glu
cosa
(gL
)
Tiempo (diacuteas)
30 GL 50GL 70 GL 30gL 50gL 70gL
Graacutefico 11 Cineacutetica de consumo de sustrato por parte del P cubensis en medio sumergido utilizando diferentes concentraciones de glucosa como
fuente de carbono
Al observar el graacutefico 11 se expone que el P cubensis consumioacute mayor cantidad
de glucosa cuando esta estaba a una concentracioacuten de 70 gL correspondiendo a
63
un porcentaje de 62 mientras que para 50 gL y 30 gL fue de 23 y 30
respectivamente
Comparando el consumo de glucosa en sus diferentes concentraciones con el
crecimiento micelial del hongo se puede observar que a una concentracioacuten de
glucosa de 30 gL no soacutelo se tuvo un menor consumo de sustrato sino que
tambieacuten se generoacute un menor crecimiento de biomasa Mientras que a
concentraciones de 50 gL y 70 gL de glucosa a pesar de presentar diferencias
en cuanto al porcentaje de sustrato consumido el crecimiento micelial es similar
(no presenta diferencias significativas) lo que indica que el hongo no requiere
tanta concentracioacuten de glucosa para su crecimiento eacutesto se puede afirmar soacutelo
para este ensayo a estas condiciones
De igual manera en el graacutefico 11 al analizar la tendencia del consumo de
sustrato las concentraciones de glucosa de 50 gL y 70 gL presentan una
disminucioacuten notoria hasta el diacutea 11 para dicho consumo Esto se debe a que en
ese diacutea inicioacute la fase estacionaria del hongo en ambas fermentaciones en donde
el P cubensis requeriacutea alimento uacutenicamente para mantenerse y producir
metabolitos secundarios Mientras que para la concentracioacuten de glucosa de 30 gL
el consumo de glucosa fue muy poco a partir del quinto diacutea de la fermentacioacuten
esto se atribuye a que la cineacutetica de crecimiento micelial del P cubensis presentoacute
una fase estacionaria temprana entre los diacuteas 8 y 11 indicando que no necesitaba
consumir casi glucosa puesto que no estaba creciendo
322 Consumo de sustrato por parte del P cubensis en medio sumergido
utilizando diferentes concentraciones de sacarosa
Los datos obtenidos sobre el consumo de sacarosa para cada una de las
concentraciones utilizadas (30 gL 50 gL y 70 gL de sacarosa) durante los 14
diacuteas de la fermentacioacuten se muestran en el graacutefico 12 a su vez se ilustran en dicho
64
graacutefico el comportamiento del crecimiento micelial para cada ensayo durante los
14 diacuteas de fermentacioacuten para efectos de anaacutelisis
0
01
02
03
04
05
06
0
10
20
30
40
50
60
70
80
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Bio
mas
a (g
L)
Sac
aro
sa (g
L)
Tiempo (diacuteas)
30gL 50gL 70gL 30 gL 50 gL 70 gL
Graacutefico 12 Cineacutetica de consumo de sustrato por parte del P cubensis en medio sumergido utilizando diferentes concentraciones de sacarosa como
fuente de carbono
Al observar el graacutefico 12 se puede decir que el P cubensis consumioacute mayor
cantidad de sacarosa cuando eacutesta estaba a una concentracioacuten de 70 gL en el
medio presentando un porcentaje de consumo del 49 mientras que para las
concentraciones de 50 gL y 30 gL de sacarosa se tuvo un porcentaje de
consumo de 24 y 37 Esto igual que en el consumo de glucosa se puede
deber a que al tener mayor concentracioacuten de sustrato en el medio el P cubensis
genera mayor afinidad por el mismo haciendo que dicho hongo se consuma
grandes cantidades de sacarosa durante el tiempo
Igualmente se observa que aproximadamente en el noveno diacutea de la
fermentacioacuten las tres diferentes concentraciones de glucosa (30 gL 50 gL y 70
65
gL) se mantienen casi constantes en el tiempo ello gracias a que en este diacutea el
hongo se encontraba en fase estacionaria en los tres ensayos
323 Comparacioacuten entre el consumo de sustrato de P cubensis en los
cultivos sumergidos con diferentes fuentes de carbono
Con el fin de identificar cuaacutel de las dos fuentes de carbono fue consumida en
mayor proporcioacuten por parte del P cubensis se procedioacute a realizar un anaacutelisis
estadiacutestico donde comparamos las dos fuentes de carbono empleados con
respecto al consumo de sustrato obtenido (concentracioacuten de glucosa y sacarosa
en cada uno de los medios) donde se consiguioacute un P-valor de 00811 con
respecto al tipo de sustrato lo que indica que no existen diferencias en cuanto al
consumo de sustrato y el tipo del mismo es decir es indiferente cuaacutel de los dos
sustratos (glucosa o sacarosa) se utilice para que se del consumo del mismo por
parte del P cubensis Observacioacuten que se reitera en la tabla de contraste muacuteltiple
que muestra que se trabajoacute como un grupo homogeacuteneo Igualmente el graacutefico 13
muestra las medias de consumo de sustrato (concentracioacuten durante los 14 diacuteas)
obtenidas mediante el anaacutelisis estadiacutestico y reitera que no existen diferencias
significativas con respecto al tipo de sustrato utilizado para el cultivo del P
cubensis en medio sumergido (Anexo 5)
66
Tratamientos de las dos fuentes de carbono usadas sin FA (glucosa y sacarosa)
Media glucosa (a) 3431
Media sacarosa (a) 3678
a
a
32
34
36
38
Co
nce
ntr
acioacute
n s
ust
rato
(g
L)
Letras diferentes denotan diferencias significativas (Prueba LSD)
Graacutefico 13 Consumo de sustrato para cada una de las fuentes de carbono utilizadas
Aun asiacute al comparar los graacuteficos 11 y 12 se puede observar un mayor consumo
de glucosa que de sacarosa lo que lleva a concluir que es mejor emplear la
primera (glucosa)
324 Consumo de sustrato por parte del P cubensis en medio sumergido
utilizando glucosa y fenilalanina en el medio
Los datos obtenidos acerca del consumo de sustrato durante los 14 diacuteas de la
fermentacioacuten para cada uno de los medios que conteniacutean 50 gL de glucosa y
diferentes concentraciones de FA (05 gL 1 gL y 15 gL) se muestran en el
graacutefico 14 De igual manera se ilustran en dicho graacutefico las cineacuteticas de
crecimiento micelial para cada una de las fermentaciones que teniacutean 50 gL de
glucosa y diferentes concentraciones de FA con el fin de realizar los anaacutelisis
pertinentes
67
0
02
04
06
08
1
12
0
10
20
30
40
50
60
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Bio
mas
a (g
L)
Glu
cosa
50
gL
+ F
A (g
L)
Tiempo (diacuteas)
05gL 10gL 15gL 05 gL 1 gL 15 gL
Graacutefico 14 Cineacutetica de consumo de sustrato por parte del P cubensis en medio sumergido utilizando 50 gL de glucosa como fuente de carbono y
diferentes concentraciones de FA
Analizando el graacutefico 14 se puede decir que el consumo de glucosa durante el
tiempo fue igual para las fermentaciones que conteniacutea concentraciones de 1 gL y
15 gL de FA dichos consumos corresponde a valores de 23 mientras que
para el ensayo que teniacutea una concentracioacuten de 05 gL de FA el porcentaje de
consumo fue del 18 Asimismo se presentaron diferencias significativas en
cuanto al consumo de sustrato entre los diferentes ensayos
El graacutefico 15 expone las medias del consumo de sustrato (concentracioacuten) de cada
una de las muestras y las diferencias existentes entre ellas se evidencia que la
adicioacuten de FA disminuyoacute el consumo de glucosa ademaacutes que en los ensayos se
presentaron tres grupos homogeacuteneos diferentes En el primer grupo (a) que
contiene las fermentaciones del P cubensis con una concentracioacuten de 50 gL de
glucosa y en ausencia de FA se obtuvo una media de 356 gL la cual indica un
mayor consumo de sustrato Luego el segundo grupo (c) se compone de las
concentraciones de 1 gL y 15 gL de FA presentando una media de 413 gL y
de 426 gL respectivamente y el uacuteltimo grupo (b) corresponde a una
68
concentracioacuten de 05 gL de FA el cual presenta el menor consumo de glucosa al
exponer una media 466 gL
Seguacuten lo anterior y el graacutefico 15 se dice que siacute existieron diferencias significativas
en cuanto al consumo de sustrato (concentracioacuten durante los 14 diacuteas) en los
uacuteltimos tres diacuteas cuando se trabajo con FA y sin FA y a su vez se encontraron
diferencias significativas de la concentracioacuten de sustrato en el medio cuando se
teniacutea una concentracioacuten de FA correspondiente a 05 gL con relacioacuten a las otras
dos concentraciones de FA (10 gL y 15 gL) mientras que entre estas dos
uacuteltimas concentraciones de FA (10 gL y 15 gL) no se encontraron diferencias
significativas (Anexo 6)
Tratamientos con y sin FA
Media 0 gL FA (a) 3564
Media 05 gL FA (b) 466
Media 10 gL FA (c) 4131
Media 15 gL FA (c) 426
a
b c c
0
10
20
30
40
50
60
Conc
entr
acioacute
n su
stra
to (g
L)
Letras diferentes denotan diferencias significativas (prueba LSD)
Graacutefico 15 Consumo de sustrato para cada una de las concentraciones de FA utilizadas
69
33 ESTUDIO DE LA CINEacuteTICA DE CONSUMO DE PROTEIacuteNA POR PARTE
DEL P cubensis CULTIVADO EN MEDIO SUMERGIDO (FANG-ZHONG)
Las fuentes de proteiacutena que posee el medio de Fang-Zhong son extracto de
levadura y peptona que representan una cantidad de 10 gL para cada ensayo
eacutesta cantidad se mantuvo constante para cada fermentacioacuten
Se evaluoacute el consumo de proteiacutena por parte del P cubensis durante los 14 diacuteas
de la fermentacioacuten para cada uno de los ensayos
A continuacioacuten se analizan los resultados obtenidos para cada uno de los
tratamientos
331 Consumo de proteiacutena por P cubensis en medio sumergido utilizando
diferentes concentraciones de glucosa
Una vez se calcularon las concentraciones de proteiacutena en el medio para cada
ensayo se graficaron dichos valores con respecto al tiempo
El graacutefico 16 muestra como se comportoacute el consumo de proteiacutena con respecto al
tiempo para cada una de las tres concentraciones de glucosa utilizadas y a su vez
como se comportoacute el crecimiento de biomasa para cada ensayo durante los 14
diacuteas de fermentacioacuten
70
0
01
02
03
04
05
06
07
0
5
10
15
20
25
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Bio
mas
a (g
L)
Pro
tein
a (g
L)
Tiempo (diacuteas)
30 GL 50 GL 70 GL 30 gL Biomasa 50 gL Biomasa 70 gL Biomasa
Graacutefico 16 Cineacutetica de consumo de proteiacutena por parte del P cubensis en medio sumergido utilizando diferentes concentraciones de glucosa como
fuente de carbono
Analizando el graacutefico 16 se puede observar que el consumo de proteiacutena se dio
casi en su totalidad El ensayo que mayor consumo de proteiacutena presentoacute fue el
que conteniacutea 30 gL de glucosa arrojando un porcentaje de consumo del 98
mientras que las fermentaciones realizadas a concentraciones de 50 gL y 70 gL
de glucosa presentaron un porcentaje de consumo de proteiacutena del 91 y 90
respectivamente
Al enfocarnos en la relacioacuten existente entre el consumo de proteiacutena y el
crecimiento micelial del P cubensis se puede notar gracias al graacutefico 16 que la
relacioacuten es directamente proporcional debido a que el consumo de proteiacutena fue
permanente mientras el hongo se encontraba en fase exponencial es decir el P
cubensis necesitaba de la proteiacutena para aumentar su crecimiento mientras que en
el momento en que el microorganismo comenzoacute su fase estacionaria la
concentracioacuten de proteiacutena en el medio se mantuvo constante esto uacuteltimo soacutelo es
vaacutelido para concentraciones de 50 gL y 70 gL de glucosa puesto que ambas
llegaron a la fase estacionaria
71
332 Consumo de proteiacutena por P cubensis en medio sumergido utilizando
diferentes concentraciones de sacarosa
Una vez obtenidos los valores de consumo de proteiacutena para cada concentracioacuten
de sacarosa utilizada se precedioacute a graficarlos con respecto al tiempo dichos
datos se encuentran en el graacutefico 17 De igual manera en este graacutefico se
representa la cineacutetica de crecimiento de biomasa para el P cubensis de acuerdo a
las distintas concentraciones de sacarosa utilizadas
0
01
02
03
04
05
06
0
2
4
6
8
10
12
14
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Bio
mas
a (g
L)
Prot
eiacutena
(gL
)
Tiempo (diacuteas)
30 GL 50 GL 70 GL 30 gL 50 gL 70 gL
Graacutefico 17 Cineacutetica de consumo de proteiacutena por parte del P cubensis en medio sumergido utilizando diferentes concentraciones de sacarosa como
fuente de carbono
El graacutefico 17 ilustra el consumo casi en su totalidad de la proteiacutena para cada uno
de los tratamientos El ensayo que mayor consumo de proteiacutena presentoacute fue el
que conteniacutea 30 gL de sacarosa exponiendo un porcentaje de consumo del 89
mientras que las concentraciones de 50 gL y 70 gL de sacarosa arrojaron
porcentajes de consumo del 86 y 57 respectivamente
Ahora bien al analizar el crecimiento del P cubensis con respecto al consumo de
proteiacutena se evidencia claramente que el consumo disminuyoacute permanentemente
72
en el tiempo mientras el hongo se encontraban en estado exponencial indicando
el intereacutes del P cubensis por la proteiacutena siendo eacutesta utilizada por el mismo para
aumentar su tamantildeo y biomasa
Durante los diacuteas 4 y 10 las fermentaciones que conteniacutean concentraciones de 30
gL y 70 gL de sacarosa presentaron un alto consumo de proteiacutena a pesar de
que el P cubensis se encontraba en estos dos ensayos en fase estacionaria fase
en la cual no se requiere consumir grandes cantidades de sustrato puesto que el
hongo soacutelo necesitaba alimentarse para mantenerse o para producir productos no
ligados al crecimiento maacutes no para cambiar la cantidad de biomasa presente en el
medio Asimismo la concentracioacuten de 50 gL de sacarosa tambieacuten presentoacute un
alto consumo de proteiacutena durante los diacuteas 4 y 8 en donde se creiacutea estar en una
fase estacionaria temprana lo dicho anteriormente reitera una vez maacutes la afinidad
que el P cubensis presentoacute con respecto a las fuentes de proteiacutena usadas
333 Comparacioacuten entre el consumo de proteiacutena de P cubensis en los
cultivos sumergidos con diferentes fuentes de carbono
Con el fin de conocer cuaacutel de los dos tipos de sustrato empleado fue mayormente
consumido se realizoacute un anaacutelisis estadiacutestico
En el graacutefico 18 se ilustran las medias de consumo de proteiacutena (concentracioacuten)
arrojadas mediante el anaacutelisis estadiacutestico sobre el consumo de proteiacutena cuando se
utilizoacute glucosa o sacarosa en el medio y se evidencia que existen diferencias
significativas en cuanto a la concentracioacuten de proteiacutena en el tiempo en el medio
cuando se realizoacute el experimento con glucosa y cuando se utilizoacute sacarosa
arrojando asiacute dos grupos homogeacuteneos el primero (a) presenta una media de 465
gL mientras que el grupo dos (b) arroja un valor de media de 609 gL indicando
un menor consumo de proteiacutena por parte del P cubensis en el medio sumergido
73
de Fang-Zhong cuando se utilizoacute sacarosa como principal fuente de carbono
(Anexo 7)
Tratamientos de las dos fuentes de carbono usadas sin FA (glucosa y sacarosa)
Media glucosa (a) 465
Media sacarosa (b) 609
a
b
0
1
2
3
4
5
6
7
8
Conc
entr
acioacute
n pr
oteiacute
na (g
L)
Letras diferentes denotan diferencias significativas (prueba LSD)
Graacutefico 18 Consumo de proteiacutena para cada una de las fuentes de carbono utilizadas
334 Consumo de proteiacutena por P cubensis en medio sumergido utilizando
glucosa y FA en el medio
Una vez se obtuvo la concentracioacuten de proteiacutena en el medio para cada
concentracioacuten de FA utilizada se precedioacute a graficar dichos valores con respecto
al tiempo los cuales se ilustran en el graacutefico 19 ademaacutes se muestran en dicho
graacutefico las cineacuteticas de crecimiento de biomasa para cada ensayo
74
0
02
04
06
08
1
12
0
2
4
6
8
10
12
14
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Bio
mas
a (g
L)
Pro
teiacuten
a (g
L)
Tiempo (diacuteas)
05 gL 1 gL 15 gL 05 gL 1 gL 15 gL
Graacutefico 19 Cineacutetica de consumo de proteiacutena por parte del P cubensis en medio sumergido utilizando 50 gL de glucosa como fuente de carbono y
diferentes concentraciones de FA
De igual forma que para la fermentacioacuten que teniacutea 50 gL de glucosa en el medio
realizada anteriormente para dichos ensayos el consumo de proteiacutena fue
permanente y se dio casi en su totalidad El ensayo que mayor consumo de
proteiacutena presentoacute fue el que conteniacutea 05 gL de FA arrojando un porcentaje de
consumo del 86 aun asiacute el porcentaje de consumo arrojado por la fermentacioacuten
de 1 gL de FA fue del 84 indicando que no existen diferencias con respecto al
consumo de proteiacutena entre dichas cantidades de FA utilizadas Mientras que el
porcentaje de consumo para 15 gL de FA fue inferior presentando un valor del
72 De acuerdo a los resultados mencionados anteriormente se puede decir que
a mayor concentracioacuten de FA en el medio se presenta menor consumo de
proteiacutena por parte del P cubensis esto se puede afirmar uacutenicamente para los
resultados obtenidos durante esta investigacioacuten a ciertas condiciones
Analizando ahora la relacioacuten entre el consumo de proteiacutena y el crecimiento
micelial se puede ver que al igual que para los ensayos con glucosa a 50 gL se
75
tiene un consumo permanente mientras se estaacute en fase exponencial y una vez se
llega a la fase estacionario alrededor del diacutea 12 la concentracioacuten de proteiacutena en
el medio se estabilizoacute
A la hora de indagar los datos estadiacutesticamente se puede observar que no existen
diferencias significativas sobre el consumo de proteiacutena (concentracioacuten) en el
tiempo con respecto al tipo de sustrato pero al comparar los resultados con los
ensayos donde se antildeadioacute FA al medio se encontroacute que siacute existen diferencias
significativas Se crearon dos grupos homogeacuteneos el primero cuenta con glucosa
y sacarosa presentando medias (cantidad de proteiacutena en el medio) de 468 gL y
473 gL respectivamente mientras que el ensayo con FA se encuentra en otro
grupo en donde su consumo de proteiacutena fue menor presentando una media
(cantidad de proteiacutena en el medio) de 614 gL (Anexo 8)
Tratamientos con y sin FA
Media glucosa (a) 468
Media sacarosa Proteiacutena (a) 473
Media fenilalanina (b) 614
a a
b
0
1
2
3
4
5
6
7
8
Co
nce
ntr
acioacute
n p
rote
iacutena
(gL
)
Letras diferentes denotan diferencias significativas (prueba LSD)
Graacutefico 20 Consumo de proteiacutena para los ensayos con y sin FA
76
34 ESTUDIO CUALITATIVO DE LA PRESENCIA DEL ALCALOIDE
Posterior a las fermentaciones de glucosa sacarosa y glucosa 50 gL con FA y
los respectivos anaacutelisis se realizoacute un uacuteltimo anaacutelisis que a la vez fue el de mayor
relevancia a la hora de determinar cuaacutel de los medios fue el que mejores
resultados arrojoacute En primera instancia se utilizoacute el reactivo de Dragendorff como
indicador de alcaloide para analizar las muestras de los diacuteas 12 13 y 14 con el fin
de esclarecer la presencia de alcaloides (Anexo 17)
Una vez detectada la presencia de alcaloides gracias a la coloracioacuten naranja
presentada en las muestras se procedioacute a realizar la teacutecnica de HPLC con el fin
de hallar un porcentaje del compuesto de intereacutes basado en las aacutereas obtenidas
de los cromatogramas (asumiendo un tiempo de retencioacuten entre 62 y 72
minutos)
341 Produccioacuten de compuestos producidos por P cubensis cuando el
medio no conteniacutea FA
A la hora de analizar y confirmar cuaacutel fue el mejor ensayo de los experimentos
realizados se tuvo como criterio base determinar la fuente de carbono y su
respectiva concentracioacuten que mejor presencia del compuesto de intereacutes arrojoacute
supuesto a un tiempo de retencioacuten entre 62 y 72 minutos
Inicialmente al obtener los anaacutelisis estadiacutesticos se deduce que no existieron
diferencias significativas entre el aacuterea del pico de intereacutes con respecto a todos los
picos arrojados por el cromatograma y los factores estudiados (tipo de sustrato
diacutea de fermentacioacuten y concentracioacuten) puesto que se obtuvieron valores de P-valor
77
de 03310 09580 y 08336 respectivamente es decir no importa queacute tipo de
sustrato se utilice la produccioacuten de alcaloide no tendraacute variaciones (Anexo 9)
Al analizar el graacutefico 21 se puede observar que las medias de las aacutereas halladas
para los diferentes ensayos con glucosa y sacarosa no presentaron diferencias
significativas es decir pertenecen al mismo grupo homogeacuteneo (a) lo que ratifica
lo dicho anteriormente
Tratamiento de las dos fuentes de carbono usadas sin FA (glucosa y sacarosa)
Media glucosa (a) 235916
Media sacarosa (a) 337147
a
a
0
7000
14000
21000
28000
35000
42000
Aacutere
a de
Com
pues
to
Letras diferentes denotan diferencias significativas (prueba LSD)
Graacutefico 21 Aacuterea del compuesto obtenido de P cubensis en tiempo de retencioacuten entre 62 y 72 minutos para las dos fuentes de carbono
Por tal razoacuten fue necesario hacer un anaacutelisis cualitativo de los cromatogramas
obtenidos mediante HPLC el cual se basoacute en la forma del pico arrojado por la
teacutecnica La figura 6 ilustra dicho anaacutelisis
78
Buena resolucioacuten de pico Mala resolucioacuten de pico
(a) (b)
Figura 6 Cromatogramas de dos diferentes fermentaciones de P cubensis que ilustran el criterio de escogencia del mejor ensayo realizado (a) 50 gL
glucosa (b) 50 gL sacarosa
Primero fue necesario observar el tamantildeo del pico y posterior a eacutesto determinar
su resolucioacuten La figura 6 ilustra dos ejemplos el de 50 gL de glucosa el diacutea 13 y
50 gL de sacarosa el diacutea 14 mientras el primero muestra un pico grande y
definido la segunda fermentacioacuten ilustra un pico grande pero poco definido
indicando que en este caso no se resolvioacute correctamente el alcaloide es decir no
se logroacute una buena separacioacuten De esta manera se analizaron los diferentes
cromatogramas para los diacuteas 12 (Anexo 19) 13 (Anexo 20) y 14 (Anexo 21) de
cada fermentacioacuten arrojando diferencias entre los ensayos y llevando a la
conclusioacuten de que la fermentacioacuten que mejores resultados arrojoacute fue la que
conteniacutea 50 gL de glucosa
79
342 Produccioacuten de compuestos producidos por P cubensis cuando el
medio conteniacutea FA
Despueacutes de realizada la fermentacioacuten con glucosa 50 gL y concentraciones de
FA de 05 gL 10 gL y 15 gL se procedioacute de igual manera que en el estudio sin
FA a evaluar cuaacutel de estas tres concentraciones de FA exhibioacute mejor resolucioacuten
del alcaloide
Inicialmente se realizoacute un anaacutelisis estadiacutestico el cual arrojoacute que no existen
diferencias significativas con respecto al aacuterea de pico que en este caso debido al
supuesto representa la Psilocibina y los diacuteas 12 13 y 14 de la fermentacioacuten
Mediante el graacutefico 22 se puede decir que en los uacuteltimos tres diacuteas de las
fermentaciones que conteniacutean FA en el medio no existen diferencias significativas
con respecto al alcaloide de intereacutes obtenido es decir en los tres se produjo el
alcaloide (Anexo 10)
Tratamientos de los uacuteltimos tres diacuteas de fermentacioacuten usando FA
Media diacutea 12 (a) 411758
Media diacutea 13 (a) 413401
Media diacutea 14 (a) 44860
a a a
0
10000
20000
30000
40000
50000
Aacutere
a Co
mpu
esto
Letras diferentes denotan diferencias significativas
Graacutefico 22 Aacuterea del compuesto obtenido de P cubensis en tiempo de retencioacuten entre 62 y 72 minutos en los uacuteltimos tres diacuteas de la fermentacioacuten
con FA y glucosa
80
Igual que en numeral anterior fue necesario realizar anaacutelisis cualitativo para los
cromatogramas por ende se requirioacute observar el tamantildeo del pico y posterior a
eacutesto determinar su resolucioacuten
Buena resolucioacuten de pico Mala resolucioacuten de pico
(a) (b)
Figura 7 Cromatogramas de dos diferentes fermentaciones de P cubensis que ilustran el criterio de escogencia del mejor ensayo realizado (a) 05 gL
FA (b) 15 gL FA
La figura 7 ejemplifica el anaacutelisis realizado para la seleccioacuten del mejor ensayo
ejecutado Se tienen dos cromatogramas el de 05 gL de FA en el diacutea 13 y el de
15 gL de FA para el mismo diacutea
A todos los cromatogramas obtenidos para los diacuteas 12 (Anexo 19) 13 (Anexo 20)
y 14 (Anexo 21) se realizoacute el mismo anaacutelisis y se concluyoacute que la concentracioacuten
maacutes apropiada para la obtencioacuten de la los compuestos producidos por P cubensis
fue de 05 gL de FA debido a que eacuteste generariacutea una disminucioacuten en los costos
81
35 ESTUDIO PORCENTUAL (AacuteREA) DEL ALCALOIDE REALIZADO PARA
LOS DIFERENTES ENSAYOS
Se calculoacute el porcentaje de aacuterea correspondiente al pico que identificoacute que se
asumioacute como el correspondiente a la Psilocibina gracias a la suposicioacuten realizada
del tiempo de retencioacuten
A continuacioacuten se presentan los valores obtenidos y sus respectivos anaacutelisis para
cada tratamiento
351 Porcentaje de la Psilocibina (suposicioacuten) cuando el medio no conteniacutea
FA
Debido a que no se contaba con un estaacutendar de Psilocibina los resultados
mostrados en la tabla 5 se obtuvieron realizando un porcentaje con respecto a las
aacutereas bajo la curva arrojadas mediante el anaacutelisis de cromatografiacutea de alta
eficiencia (Anexos 19 20 y 21) En dichos anexos se encuentran resaltadas en
negrilla aquellas aeacutereas utilizadas
Tabla 5 Porcentaje de aacuterea hallado mediante HPLC para los uacuteltimos tres diacuteas de la fermentacioacuten con concentraciones de 30 gL 50 gL y 70 gL de glucosa
y sacarosa con un tiempo de retencioacuten de 62 y 72 minutos
Diacutea Glucosa
(gL)
Aacuterea
(compuesto
Tr= 62-72)
Sacarosa
(gL)
Aacuterea
(compuesto
Tr= 62-72)
12 30 60650 30 3664
12 50 7396 50 5857
12 70 4816 70 3415
13 30 702 30 2876
13 50 6815 50 4113
13 70 6733 70 5583
14 30 4824 30 2756
14 50 4821 50 2792
14 70 017 70 1429
82
A la hora de analizar los datos de la tabla 5 se puede observar que el mayor
porcentaje de aacuterea se obtuvo cuando se trabajoacute con glucosa como fuente de
carbono y concretamente a una concentracioacuten de 50 gL
Analizando los datos estadiacutesticamente no se obtuvieron diferencias significativas
en cuanto a la produccioacuten del compuesto (aacuterea) con respecto al tipo de sustrato
utilizado durante las fermentaciones es decir es indiferente si se utiliza glucosa o
sacarosa en el cultivo de P cubensis en medio sumergido de Fang-Zhong
El graacutefico 23 ilustra las medias (aacuterea) obtenidas para la produccioacuten de alcaloide en
las dos diferentes fuentes de carbono es decir glucosa y sacarosa exponiendo
un uacutenico grupo homogeacuteneo con medias (produccioacuten de alcaloide) de aacutereas de
219635 y 234391 para glucosa y sacarosa respectivamente (Anexo 11)
Tratamientos de las dos fuentes de carbono usadas sin FA (glucosa y sacarosa)
Media glucosa (a) 219635
Media sacarosa (a) 234391
a
a
2000
2100
2200
2300
2400
Aacuterea
Com
pues
to
Letras diferentes denotan diferencias significativas (prueba LSD)
Graacutefico 23 Aacuterea del compuesto obtenido de P cubensis en tiempo de retencioacuten entre 62 y 72 minutos para cada una de las fuentes de carbono
utilizadas
Aun asiacute estudiando los graacuteficos de HPLC con el criterio mencionado
anteriormente es decir observando el tamantildeo del pico y su resolucioacuten del mismo
83
se observoacute claramente que la presencia del alcaloide (tiempo de retencioacuten
supuesto entre 62 y 72 minutos) fue mejor cuando se trabajoacute con glucosa a una
concentracioacuten de 50 gL debido que presenta el mejor pico
352 Porcentaje de aacuterea de compuestos presentes en P cubensis cuando
el medio conteniacutea FA
Con el fin de observar si la adicioacuten de FA al medio si arrojoacute mejores resultados en
cuanto a la produccioacuten del compuesto presente entre un rango de 62 y 72
minutos como tiempo de retencioacuten se procedioacute a calcular el porcentaje del aacuterea
de intereacutes de acuerdo a las aacutereas arrojadas para cada ensayo por medio del
anaacutelisis de HPLC Los datos obtenidos se ilustran a continuacioacuten en la tabla 6
Tabla 6 Porcentaje hallado mediante HPLC para los uacuteltimos tres diacuteas de la fermentacioacuten con concentraciones de 05 gL 10 gL y 15 gL de FA y 50 gL
de glucosa con un tiempo de retencioacuten entre 62 y 72 minutos
Diacutea
Glucosa
50 gL +
FA
Aacuterea
(compuesto
Tr=62-72)
12 0 4315
12 05 2931
12 1 6236
12 15 847
13 0 3257
13 05 7549
13 1 4790
13 15 2721
14 0 4822
14 05 3863
14 1 5801
14 15 2102
84
Al detallar la tabla 6 puede observarse que el ensayo que mayor porcentaje de
aacuterea arrojoacute fue el que conteniacutea 05 gL de FA arrojando su maacuteximo porcentaje
correspondiente a 755 el diacutea 13 Aun asiacute las diferencias existentes entre ellos
no fueron significativas
Ahora bien al analizarlos estadiacutesticamente se encontroacute que la produccioacuten del
alcaloide en presencia de FA presentoacute la misma tendencia que los ensayos
analizados anteriormente sin eacutesta pero gracias a que este aminoaacutecido duplico la
cantidad de biomasa y debido a que el compuesto de intereacutes se produce
intracelularmente se afirma que el uso de FA aumentoacute la generacioacuten del
compuesto evaluado (Anexo 12)
El graacutefico 24 presenta las diferentes medias en cuanto al porcentaje de aacuterea del
compuesto presente entre 62 y 72 minutos para los diferentes tratamientos de
glucosa a una concentracioacuten de 50 gL y sus concentraciones respectivas de FA
Claramente se ve que soacutelo existe un grupo homogeacuteneo lo que reafirma que no
existen diferencias significativas de la produccioacuten con respecto a las
concentraciones de FA
85
Tratamientos con y sin FA
Media 0 gL FA (a) 3122
Media 05 gL FA (a) 2391
Media 10 gL FA (a) 2823
Media 15 gL FA (a) 2113
a
aa
a
0
5
10
15
20
25
30
35
40
Aacutere
a Co
mpu
esto
Letras diferentes denotan diferencias significativas (prueba LSD)
Graacutefico 24 Aacuterea del compuesto obtenido de P cubensis en tiempo de retencioacuten entre 62 y 72 minutos para cada una de las concentraciones de
FA utilizadas
Debido a que no se encontraron diferencias significativas en cuanto al porcentaje
de aacuterea obtenido mediante los cromatogramas se concluye que el mejor medio es
el que tiene como fuente de carbono glucosa a una concentracioacuten de 50 gL y una
adicioacuten de 05 gL de FA puesto que genera una disminucioacuten en costos
86
CONCLUSIONES
No existen diferencias significativas en el crecimiento micelial de P
cubensis en medio sumergido Fang-Zhong cuando se trabaja con fuentes
de carbono glucosa y sacarosa sin embargo se decide trabajar con 50 gL
de glucosa puesto que eacuteste tiene una buena presencia de alcaloide y a su
vez una mejor produccioacuten de biomasa
La concentracioacuten de glucosa utilizada para el crecimiento de P cubensis
influye en el crecimiento micelial obteniendo concentraciones de biomasa
de 062 gL 055 gL y 048 gL para concentraciones de sustrato de 70 50
y 30 gL de glucosa siendo las dos primeras significativamente diferentes
con respecto a la de 30 gL
La concentracioacuten de sacarosa utilizada para el crecimiento de P cubensis
influye en el crecimiento micelial obteniendo concentraciones de biomasa
de 057 gL 045 gL y 026 gL para concentraciones de sustrato de 70 50
y 30 gL de sacarosa siendo significativamente diferentes entre ellas
La resolucioacuten de los picos obtenidos por RP-HPLC del extracto de P
cubensis fue mayor para las fermentaciones realizadas con una
concentracioacuten de 50 gL de glucosa lo que conllevoacute a utilizarlo al realizar
los ensayos que conteniacutean en el medio FA
La concentracioacuten de biomasa de P cubensis obtenida en cultivo sumergido
en medio Fang-Zhong con glucosa se duplicoacute con la adicioacuten de FA No
obstante no existen diferencias significativas entre las concentraciones de
FA utilizadas
87
El consumo de proteiacutena presentada por P cubensis en medio Fang-Zhong
fue casi del 100 mientras que el consumo de sustrato para el mismo
medio estuvo alrededor del 40
El consumo de sustrato durante el transcurso de las fermentaciones que no
conteniacutean FA en el medio no presentoacute diferencias significativas con
respecto a las dos fuentes de carbono utilizadas Mientras que en aquellas
fermentaciones donde se agregoacute FA al medio siacute existieron diferencias
significativas entre las fermentaciones de 15 y 1 gL de FA con respecto a
los ensayos realizados con 05 gL FA Sin embargo el P cubensis
consumioacute mayor cantidad de sustrato cuando el medio no conteniacutea FA
Se evidencioacute que el P cubensis consumioacute mayor cantidad de proteiacutena
cuando el sustrato utilizado en el medio fue glucosa y a su vez se detecto
que la adicioacuten de FA al medio tuvo como efecto la disminucioacuten en el
consumo de sustrato por parte del microorganismo
El consumo de sustrato y de proteiacutena tuvo un comportamiento similar
puesto que fue consumido permanentemente durante la fase exponencial
para cada uno de los tratamientos realizados es decir las concentraciones
de 30 gL 50 gL y 70 gL de glucosa y sacarosa como fuente de carbono y
de 05 gL 1 gL y 15 gL de FA teniendo como fuente de carbono glucosa
a una concentracioacuten de 50 gL mientras que en la fase estacionaria su
consumo se disminuyoacute permaneciendo casi constante
Despueacutes de realizados los estudios en cuanto a la produccioacuten del
compuesto presente entre 62 y 72 minutos para cada uno de los ensayos
no se evidenciaron diferencias significativas entre las dos fuentes de
carbono utilizadas (glucosa y sacarosa)
88
La adicioacuten del precursor llamado Fenilalanina (FA) al medio sumergido
Fang-Zhong para llevar a cabo el cultivo del P cubensis tuvo influencia en
cuanto a la produccioacuten de compuesto presente entre tiempo de retencioacuten de
62 y 72 minutos debido a que eacuteste duplicoacute la concentracioacuten de biomasa
en el medio se dice entonces que la produccioacuten aumentoacute al ser eacuteste de
produccioacuten intracelular
La resolucioacuten del compuesto presente entre el tiempo de retencioacuten de 62 a
72 minutos se obtuvo mejor en el ensayo que conteniacutea 05 gL de FA y al
saber que no existieron diferencias significativas en la produccioacuten en cuanto
al porcentaje de aacutereas obtenido con respecto a las demaacutes concentraciones
de FA se afirma que eacuteste es el medio que mejores resultados arrojoacute para
el crecimiento de P cubensis y la produccioacuten de Psilocibina
89
RECOMENDACIONES
Se sugiere observar el efecto que tiene la variacioacuten de las revoluciones a
las cuales se realizaron las fermentaciones para ver como variacutea el
crecimiento del P cubensis en medio sumergido Fang-Zhong con respecto
a dicho factor
Debido a que soacutelo se realizaron anaacutelisis sobre el crecimiento del P
cubensis en medio sumergido haciendo uso de dos sustratos diferentes
(glucosa y sacarosa) seriacutea recomendable realizar el mismo anaacutelisis para
otro tipo de sustrato como por ejemplo melaza por su bajo costo
Del mismo modo seriacutea apropiado realizar el estudio con otro tipo de
precursor y en otras concentraciones para ver la incidencia de eacuteste en el
comportamiento del hongo
Se recomienda realizar un escalamiento de dicho proceso en un biorreactor
con el fin de evaluar a mayor escala el crecimiento del P cubensis y la
produccioacuten del alcaloide
Debido a que la proteiacutena se comportoacute como el principal nutriente se sugiere
para una proacutexima investigacioacuten evaluar diferentes concentraciones de
proteiacutena en el medio
90
ANEXOS
Anexo 1 Anaacutelisis de varianza (ANOVA) para el crecimiento de biomasa de
las fermentaciones con glucosa
Tabla 7 Anaacutelisis de Varianza para el crecimiento micelial (glucosa)
Tabla 8 Anaacutelisis Muacuteltiple de Rangos para el crecimiento micelial (glucosa)
91
Anexo 2 Anaacutelisis de Varianza (ANOVA) para el crecimiento de biomasa de
las fermentaciones con sacarosa
Tabla 9 Anaacutelisis de Varianza para el crecimiento micelial (sacarosa)
Tabla 10 Anaacutelisis Muacuteltiple de Rangos para el crecimiento micelial (sacarosa)
92
Anexo 3 Anaacutelisis de Varianza (ANOVA) para el crecimiento de biomasa de
las fermentaciones con glucosa y sacarosa
Tabla 11 Anaacutelisis de Varianza para el crecimiento micelial (glucosa y
sacarosa)
Tabla 12 Anaacutelisis Muacuteltiple de Rangos para el crecimiento micelial (glucosa y
sacarosa)
93
Anexo 4 Anaacutelisis de Varianza (ANOVA) para el crecimiento de biomasa de
las fermentaciones con glucosa 50 gL y FA
Tabla 13 Anaacutelisis de Varianza para el crecimiento micelial (glucosa 50 gL y
FA)
Tabla 14 Anaacutelisis Muacuteltiple de Rangos para el crecimiento micelial (glucosa
50 gL y FA)
94
Anexo 5 Anaacutelisis de varianza (ANOVA) para el consumo de sustrato en las
fermentaciones sin FA
Tabla 15 Anaacutelisis de Varianza para el consumo de Sustrato sin FA
Tabla 16 Anaacutelisis Muacuteltiple de Rangos para el consumo de Sustrato sin FA
95
Anexo 6 Anaacutelisis de Varianza (ANOVA) para el consumo de sustrato en las
fermentaciones con FA
Tabla 17 Anaacutelisis de Varianza para el consumo de Sustrato con FA
Tabla 18 Anaacutelisis Muacuteltiple de Rangos para el consumo de Sustrato con FA
96
Anexo 7 Anaacutelisis de Varianza (ANOVA) para el consumo de proteiacutena en las
fermentaciones sin FA
Tabla 19 Anaacutelisis de Varianza para el consumo de Proteiacutena sin FA
Tabla 20 Anaacutelisis Muacuteltiple de Rangos para el consumo de Proteiacutena sin FA
97
Anexo 8 Anaacutelisis de Varianza (ANOVA) para el consumo de proteiacutena en las
fermentaciones con FA
Tabla 21Anaacutelisis de Varianza para el consumo de Proteiacutena con FA
Tabla 22 Anaacutelisis Muacuteltiple de Rangos para el consumo de Proteiacutena con FA
98
Anexo 9 Anaacutelisis de Varianza (ANOVA) para la produccioacuten de Psilocibina en
las fermentaciones sin FA
Tabla 23 Anaacutelisis de Varianza para la produccioacuten de Psilocibina sin FA
Tabla 24 Anaacutelisis Muacuteltiple de Rangos para la produccioacuten de Psilocibina
seguacuten el Sustrato sin FA
99
Anexo 10 Anaacutelisis de Varianza (ANOVA) para la produccioacuten de Psilocibina en las fermentaciones con FA
Tabla 25 Anaacutelisis de Varianza para la produccioacuten de Psilocibina con FA
Tabla 26 Anaacutelisis Muacuteltiple de Rangos para la produccioacuten de Psilocibina
seguacuten el diacutea con FA
100
Anexo 11 Anaacutelisis de Varianza (ANOVA) para la cuantificacioacuten porcentual de
Psilocibina en las fermentaciones sin FA
Tabla 27 Anaacutelisis de Varianza para la cuantificacioacuten de Psilocibina sin FA
Tabla 28 Anaacutelisis Muacuteltiple de Rangos para la cuantificacioacuten de Psilocibina
seguacuten el tipo de sustrato sin FA
101
Anexo 12 Anaacutelisis de Varianza (ANOVA) para la cuantificacioacuten porcentual de
Psilocibina en las fermentaciones con FA
Tabla 29 Anaacutelisis de Varianza para la cuantificacioacuten de Psilocibina con FA
Tabla 30 Anaacutelisis Muacuteltiple de Rangos para la cuantificacioacuten de Psilocibina
seguacuten la concentracioacuten con FA
102
Anexo 13 Determinacioacuten de consumo de azuacutecares por el meacutetodo de DNS
(Aacutecido Dinitrosaliciacutelico)
a DNS para glucosa
Pasos para preparar DNS
Disolver 16 gr de NaOH en agua destilada
Adicionar 30 gr de tartrato de Na y K
Aforar a 100 ml con agua destilada
Almacenar en frascos aacutembar a 4degC
Se debe mantener un stock de glucosa 4mgml y almacenarlo a 4degC A partir
de la solucioacuten de glucosa se preparan las soluciones para hacer la curva
patroacuten con las siguientes concentraciones (gL) 025 050 100 200 y 400
Procedimiento
Tomar 05 ml de cada dilucioacuten y agregar 05 ml de reactivo DNS
Preparar una muestra blanco por dilucioacuten de 05 ml de agua destilada a 05
ml de reactivo de DNS
Agitar todas las muestras
Colocar a ebullir las muestras en bantildeo mariacutea por cinco minutos
Enfriar con hielo
Adicionar 5 ml de agua destilada
Agitar y dejar en reposo 15 minutos
Leer en espectrofotoacutemetro a 540 nm
Realizar la curva Absorbancia Vs Concentracioacuten Debe tener un coeficiente
de correlacioacuten de 0991 a 0999
b DNS para sacarosa
Pasos para preparar DNS sacarosa
Preparacioacuten de la solucioacuten Standard stock de sacarosa (30 gL) tomar 30
gr de sacarosa anhiacutedrida grado reactivo con exactitud hasta la deacutecima de
mg disolver ajustar a aforo de 100 ml con agua desionizada empacar en
viales y almacenar en congelador
Preparacioacuten DNS pesar 16 gr de hidroacutexido de sodio grado reactivo 30 gr
de tartrato de sodio y potasio y disolverlos juntos con 50 ml de agua
103
desionizada aparte pesar 10 gr del DNS disolver con 30 ml de agua
desionizada agregar lentamente y con agitacioacuten la solucioacuten del DNS a la
solucioacuten de tartrato y NaOH anteriormente preparadas ajustar a 100 ml
filtrar envasar en frasco aacutembar y rotular con fecha de vencimiento incluida
(3 meses maacuteximo) mantener a la temperatura del laboratorio
Preparacioacuten del reactivo NaOH 10 N (500 ml) pesar con exactitud hasta
la deacutecima de mg 20 gr de NaOH grado reactivo por cada 500 ml de
solucioacuten disolver primero con 300 ml de agua desionizada y luego aforar a
500 ml envasar y rotular correctamente y mantener a la temperatura del
laboratorio
Preparacioacuten de HCL 10 (100 ml) tomar 27 ml de aacutecido clorhiacutedrico al
37 grado reactivo y aforar hasta 100 ml con agua desionizada envasar
rotular correctamente de acuerdo a la norma del laboratorio y almacenar a
la temperatura del laboratorio
Se debe mantener un stock de glucosa 30 gL y almacenarlo a 4degC A partir
de la solucioacuten de glucosa se preparan las soluciones para hacer la curva
patroacuten con las siguientes concentraciones (gL) 3 6 12 18 24 y 30
Procedimiento
Preparar en cada tubo (las soluciones de la curva patroacuten de sacarosa las
muestras problemas diluidas si es necesario y como blanco agua
desionizada) 100microl de solucioacuten
Adicionar 200 microl de HCL 10 a cada tubo y agitar todos los tubos en vortex
Llevar a ebullicioacuten por 10 minutos en bantildeo mariacutea precalentado a 95degC
Enfriar hasta temperatura ambiente raacutepidamente
Adicionar a cada tubo 1 ml de NaOH 10 N y agitar los tubos en vortex
Aparte tomar 05 ml de cada tubo en otros tubos rotulados y agregar 05 ml
del DNS
Agitar todas las muestras en vortex
Llevar a ebullicioacuten por 5 minutos en bantildeo mariacutea precalentado a 96degC
Enfriar hasta temperatura ambiente raacutepidamente
Adicionar 5 ml de H2O desionizada agitar en vortex y dejar reposar por 15
minutos
Leer en espectrofotoacutemetro a 540 nm
Realizar la curva Absorbancia Vs Concentracioacuten Debe tener un coeficiente
de correlacioacuten de 0991 a 0999
104
Anexo 14 Cineacutetica de Consumo de Sustrato
La cineacutetica de consumo de sustrato se realizoacute por el meacutetodo de Aacutecido
Dinitrosaliciacutelico (DNS) Los rangos de concentracioacuten y absorbancia para cada caso
se citan a continuacioacuten
Rangos de concentraciones y absorbancias para las fermentaciones que
usaron glucosa (30 gL 50 gL y 70 gL) como sustrato
Concentracioacuten de 02 a 12 gL
Absorbancia de 01234 a 06612
Ecuacioacuten Y = 19174x -00517 R2 = 09923
Rangos de concentraciones y absorbancias para las fermentaciones que
usaron sacarosa (30 gL 50 gL y 70 gL) como sustrato
Concentracioacuten de 3 a 30 gL
Absorbancia de 00822 a 11112
Ecuacioacuten Y = 25983x + 04857 R2 = 09978
Rangos de concentraciones y absorbancias para las fermentaciones que
usaron glucosa 50 gL como sustrato y FA
Concentracioacuten de 02 a 12 gL
Absorbancia de 0097 a 063
Ecuacioacuten Y = 18785x + 00019 R2 = 09986
105
Anexo 15 Determinacioacuten de consumo de proteiacutenas por el meacutetodo de LOWRY
Pasos para la preparacioacuten de LOWRY
Para obtener la curva estaacutendar de Albuacutemina se preparan 5 soluciones
patrones de Albuacutemina en NaCL al 09 (PV) de las siguientes
concentraciones 152 80 200 300 400 Pgml Si la concentracioacuten de
Proteiacutena total es menor de 500 Pgml se lee la absorbancia a 750 nm si
estaacute entre 1000 y 2000 Pgml se lee a 550nm
Se prepara un blanco que no lleva Albuacutemina y en su reemplazo se adiciona
0-5 ml de solucioacuten salina (NaCL) al 09 (PV) Se aplica el mismo
procedimiento que a las demaacutes muestras
Procedimiento
Servir en tubos de ensayo 05 ml de las soluciones patroacuten de Albuacutemina las
muestras problema y NaCL al 09 como blanco Deben estar marcados
para conservar el orden de concentraciones para la curva
Adicionar a cada tubo 05 ml de NaOH 2N y llevar al bantildeo Mariacutea
precalentado a 100degC por un tiempo de 10 minutos
Dejar enfriar hasta que alcance la Temperatura Ambiente
Agregar a cada tubo 5 ml de la solucioacuten complejante mezclar y dejar
reposar por 10 minutos
Adicionar 05 ml del reactivo de Folin-Ciocalteu 11 vortexiar durante 20
segundos
Reposar en un cuarto oscuro durante 30 minutos
Leer la absorbancia a 750 nm y con las soluciones patroacuten construir la
graacutefica Absorbancia Vs Concentracioacuten de Albuacutemina Seacuterica de Bovina
(BSA) con eacutesta se puede determinar la concentracioacuten de las muestras
problema interpolando el valor de la Absorbancia La curva estaacutendar debe
tener un coeficiente de correlacioacuten de 0991 a 0999
106
Anexo 16 Cineacutetica consumo de Proteiacutena
La cineacutetica de consumo de proteiacutena se realizoacute por el meacutetodo LOWRY Los rangos
de concentracioacuten y absorbancia para cada caso se citan a continuacioacuten
Rangos de concentraciones y absorbancias para las fermentaciones que
usaron glucosa (30 gL 50 gL y 70 gL) como sustrato
Concentracioacuten de 0016 a 04 gL
Absorbancia de 00094 a 05382
Ecuacioacuten Y = 07427x ndash 00021 R2 = 09955
Rangos de concentraciones y absorbancias para las fermentaciones que
usaron sacarosa (30 gL 50 gL y 70 gL) como sustrato
Concentracioacuten de 0016 a 04 gL
Absorbancia de 00374 a 06178
Ecuacioacuten Y = 06567x ndash 00166 R2 = 09968
Rangos de concentraciones y absorbancias para las fermentaciones que
usaron glucosa 50 gL como sustrato y FA
Concentracioacuten de 0016 a 04 gL
Absorbancia de 00708 a 04647
Ecuacioacuten Y = 09814x ndash 00581 R2 = 09992
107
Anexo 17 Prueba de reactivo de Dragendorff
Preparacioacuten de reactivo de Dragendorff para alcaloides
Reactivo de Dragendorff se prepara mezclando 8 gr de nitrato de bismuto
pentahidratado en 20 ml de aacutecido niacutetrico al 30 con una solucioacuten de 272 g de
yoduro de potasio en 50 ml de agua Se deja en reposo por 24 horas se decanta y
se afora a 100 ml La presencia de alcaloides se detecta por la formacioacuten de un
precipitado naranja rojizo cuando se le adiciona esta reactivo a una solucioacuten aacutecida
de alcaloides De los precipitados lavados se puede recuperar los alcaloides con
una solucioacuten saturada de carbonato de sodio (Mercano y Hasegawa 1991)
La figura mostrada a continuacioacuten refleja la presencia del alcaloide debido a la
coloracioacuten amarillo-rojiza que eacutesta sufrioacute
Figura 8 Muestra de biomasa una vez analizada mediante el reactivo de Dragendorff
108
Anexo 18 Barrido Espectral para el Psilocybe cubensis
La metodologiacutea mencionada a continuacioacuten estaacute basada en artiacuteculo base
(Tsujikawa et al 2003)
El Sistema de HPLC consiste en un Shimadzu LC-10ordf Series Cromatografiacutea
Liacutequida equipada con un diodo SPD-M10A detector de red fija en 220nm La
separacioacuten cromatograacutefica ser realizoacute con una columna simeacutetrica C18 (21 mm a
150 mm 5mm Waters Assoc Milford EEUU
La fase moacutevil utilizada fue de 10 mm de formato de amonio-aacutecido foacutermico (955
VV) a un pH de 35 y bombeado a un caudal de 02 mlminuto
El perfil cromatograacutefico obtenido durante la investigacioacuten de Tsujikawa et al
(2003) se muestra en le figura 6 que aparece a continuacioacuten
Figura 9 Perfil cromatograacutefico (Tsujikawa et al 2003)
109
Anexo 19 Cromatogramas (HPLC) del diacutea 12 de fermentacioacuten
Tabla 31 Aacutereas obtenidas de los cromatogramas para el P cubensis en
medio Fang-Zhong en el diacutea 12 para concentraciones de 30gL glucosa y
30gL sacarosa
SustratoConcentracioacuten
(gL)
Tiempo
(s)Aacuterea
Glucosa 30 2957 3837
Glucosa 30 6838 474753
Glucosa 30 9144 47256
Glucosa 30 9489 16822
Glucosa 30 10124 224349
Sacarosa 30 6538 143772
Sacarosa 30 7234 269458
Sacarosa 30 9721 33646
Sacarosa 30 11845 24384
(a) (b)
Graacutefico 25 Cromatogramas del diacutea 12 para el P cubensis cultivado en medio
sumergido Fang-Zhong con dos diferentes tipos de sustratos (a) 30 gL
glucosa (b) 30 gL sacarosa
110
Tabla 32 Aacutereas obtenidas de los cromatogramas para el P cubensis en
medio Fang-Zhong en el diacutea 12 para concentraciones de 50gL glucosa y
50gL sacarosa
SustratoConcentracioacuten
(gL)
Tiempo
(s)Aacuterea
Glucosa 50 0524 319
Glucosa 50 6298 5991
Glucosa 50 7172 237042
Glucosa 50 9144 16387
Glucosa 50 10009 6077
Sacarosa 50 169 24011
Sacarosa 50 3105 28573
Sacarosa 50 6916 112166
Sacarosa 50 9136 4057
Sacarosa 50 9933 8821
Sacarosa 50 10398 13872
(a) (b)
Graacutefico 26 Cromatogramas del diacutea 12 para el P cubensis cultivado en medio
sumergido Fang-Zhong con dos diferentes tipos de sustratos (a) 50 gL
glucosa (b) 50 gL sacarosa
111
Tabla 33 Aacutereas obtenidas de los cromatogramas para el P cubensis en
medio Fang-Zhong en el diacutea 12 para concentraciones de 50gL glucosa y
50gL sacarosa
SustratoConcentracioacuten
(gL)
Tiempo
(s)Aacuterea
Glucosa 70 7217 168598
Glucosa 70 9145 9977
Glucosa 70 997 80558
Sacarosa 70 6803 287387
Sacarosa 70 7517 131049
Sacarosa 70 7775 4434
Sacarosa 70 7871 77109
Sacarosa 70 823 96239
Sacarosa 70 9039 5114
Sacarosa 70 9778 25394
(a) (b)
Graacutefico 27 Cromatogramas del diacutea 12 para el P cubensis cultivado en medio
sumergido Fang-Zhong con dos diferentes tipos de sustratos (a) 50 gL
glucosa (b) 50 gL sacarosa
112
Tabla 34 Aacutereas obtenidas de los cromatogramas para el P cubensis en
medio Fang-Zhong en el diacutea 12 para concentraciones de 50gL y glucosa
50gL sacarosa
SustratoConcentracioacuten
(gL)
Tiempo
(s)Aacuterea
Glucosa 50 05 0818 4722
Glucosa 50 05 2423 52579
Glucosa 50 05 3502 88765
Glucosa 50 05 6137 16009
Glucosa 50 05 6722 275258
Glucosa 50 05 733 226399
Glucosa 50 05 8339 65139
Glucosa 50 05 9101 36797
Glucosa 50 05 9815 130883
Glucosa 50 1 1105 743
Glucosa 50 1 2746 2701
Glucosa 50 1 4304 80304
Glucosa 50 1 6167 19649
Glucosa 50 1 6794 51753
Glucosa 50 1 8282 82997
Glucosa 50 1 9116 38659
Glucosa 50 1 9899 136953
Glucosa 50 15 1198 3313
Glucosa 50 15 2937 37875
Glucosa 50 15 4332 51079
Glucosa 50 15 614 25602
Glucosa 50 15 6737 668905
Glucosa 50 15 8209 107332
Glucosa 50 15 9602 38902
Glucosa 50 15 9752 139613
Diacutea 12
(a) (b)
(c)
Graacutefico 28 Cromatograma del diacutea 12 para el P cubensis cultivado en medio
sumergido Fang-Zhong con fuente de carbono glucosa y adicioacuten de
fenilalanina en tres concentraciones (a) 05 gL FA (b) 1 gL FA (c) 15gL
FA
113
Anexo 20 Cromatogramas (HPLC) del diacutea 13 de fermentacioacuten
Tabla 35 Aacutereas obtenidas de los cromatogramas para el P cubensis en
medio Fang-Zhong en el diacutea 13 para concentraciones de 30gL glucosa y
30gL sacarosa
SustratoConcentracioacuten
(gL)
Tiempo
(s)Aacuterea
Glucosa 30 0225 1155
Glucosa 30 2847 699
Glucosa 30 4043 1038
Glucosa 30 6231 4994
Glucosa 30 6787 295182
Glucosa 30 7462 241146
Glucosa 30 9066 51836
Glucosa 30 10004 158746
Sacarosa 30 1734 135
Sacarosa 30 5838 1857
Sacarosa 30 6803 147867
Sacarosa 30 7305 30464
Sacarosa 30 7599 174643
Sacarosa 30 9107 8564
Sacarosa 30 9897 104278
(a) (b)
Graacutefico 29 Cromatogramas del diacutea 13 para el P cubensis cultivado en medio
sumergido Fang-Zhong con dos diferentes tipos de sustratos (a) 30 gL
glucosa (b) 30 gL sacarosa
114
Tabla 36 Aacutereas obtenidas de los cromatogramas para el P cubensis en
medio Fang-Zhong en el diacutea 13 para concentraciones de 50gL glucosa y
50gL sacarosa
SustratoConcentracioacuten
(gL)
Tiempo
(s)Aacuterea
Glucosa 50 1408 13982
Glucosa 50 6949 331449
Glucosa 50 9012 25201
Glucosa 50 9936 27216
Sacarosa 50 1543 7293
Sacarosa 50 6813 437765
Sacarosa 50 9085 35897
Sacarosa 50 10049 184461
(a) (b)
Graacutefico 30 Cromatogramas del diacutea 13 para el P cubensis cultivado en medio
sumergido Fang-Zhong con dos diferentes tipos de sustratos (a) 50 gL
glucosa (b) 50 gL sacarosa
115
Tabla 37 Aacutereas obtenidas de los cromatogramas para el P cubensis en
medio Fang-Zhong en el diacutea 13 para concentraciones de 70gL glucosa y
70gL sacarosa
SustratoConcentracioacuten
(gL)
Tiempo
(s)Aacuterea
Glucosa 70 1456 3223
Glucosa 70 2985 2423
Glucosa 70 54 7586
Glucosa 70 6262 5149
Glucosa 70 7151 248331
Glucosa 70 9039 19346
Glucosa 70 9929 4906
Glucosa 70 11051 33698
Sacarosa 70 0437 342
Sacarosa 70 1428 812
Sacarosa 70 2948 2191
Sacarosa 70 5473 4854
Sacarosa 70 6286 5336
Sacarosa 70 6848 3649
Sacarosa 70 733 11383
Sacarosa 70 9073 1018
Sacarosa 70 9878 11072
Sacarosa 70 10267 18797
(a) (b)
Graacutefico 31 Cromatogramas del diacutea 13 para el P cubensis cultivado en medio
sumergido Fang-Zhong con dos diferentes tipos de sustratos (a) 70 gL
glucosa (b) 70 gL sacarosa
116
Tabla 38 Aacutereas obtenidas de los cromatogramas para el P cubensis en
medio Fang-Zhong en el diacutea 13 para concentraciones de 50gL y glucosa
50gL sacarosa
SustratoConcentracioacuten
(gL)
Tiempo
(s)Aacuterea
Glucosa 50 05 4067 22222
Glucosa 50 05 7379 55573
Glucosa 50 05 902 19513
Glucosa 50 05 9716 119261
Glucosa 50 05 1173 19427
Glucosa 50 1 0793 14776
Glucosa 50 1 2868 28537
Glucosa 50 1 6224 1206
Glucosa 50 1 6782 571299
Glucosa 50 1 8303 92665
Glucosa 50 1 9081 30371
Glucosa 50 1 9738 168959
Glucosa 50 1 11813 27921
Glucosa 50 15 0412 269
Glucosa 50 15 2482 14692
Glucosa 50 15 3486 91059
Glucosa 50 15 6039 6892
Glucosa 50 15 6627 216986
Glucosa 50 15 7216 260795
Glucosa 50 15 8112 65776
Glucosa 50 15 8888 19083
Glucosa 50 15 9497 37812
Glucosa 50 15 9839 65922
Glucosa 50 15 11655 7331
(a) (b)
(c)
Graacutefico 32 Cromatogramas del diacutea 12 para el P cubensis cultivado en medio
sumergido Fang-Zhong con fuente de carbono glucosa y adicioacuten de
fenilalanina en tres concentraciones (a) 05 gL FA (b) 1 gL FA (c) 15gL
FA
117
Anexo 21 Cromatogramas (HPLC) del diacutea 14 de fermentacioacuten
Tabla 39 Aacutereas obtenidas de los cromatogramas para el P cubensis en
medio Fang-Zhong en el diacutea 14 para concentraciones de 30gL glucosa y 30
gL sacarosa
SustratoConcentracioacuten
(gL)
Tiempo
(s)Aacuterea
Glucosa 30 1054 181
Glucosa 30 2553 8939
Glucosa 30 6219 7557
Glucosa 30 6585 77083
Glucosa 30 7158 285069
Glucosa 30 8987 33875
Glucosa 30 9848 87461
Glucosa 30 10694 52151
Glucosa 30 12482 7992
Glucosa 30 12943 23064
Glucosa 30 1493 5948
Sacarosa 30 7309 7075
Sacarosa 30 9984 1680
Sacarosa 30 10442 15395
Sacarosa 30 11211 8511
Sacarosa 30 13405 3398
(a) (b)
Graacutefico 33 Cromatogramas del diacutea 14 para el P cubensis cultivado en medio
sumergido Fang-Zhong con dos diferentes tipos de sustratos (a) 30 gL
glucosa (b) 30 gL sacarosa
118
Tabla 40 Aacutereas obtenidas de los cromatogramas para el P cubensis en
medio Fang-Zhong en el diacutea 14 para concentraciones de 50gL glucosa y
50gL sacarosa
SustratoConcentracioacuten
(gL)
Tiempo
(s)Aacuterea
Glucosa 50 2029 8318
Glucosa 50 6257 5782
Glucosa 50 6875 306684
Glucosa 50 9068 22819
Glucosa 50 9808 92492
Glucosa 50 12113 8823
Glucosa 50 12752 23988
Sacarosa 50 1036 3783
Sacarosa 50 2356 7005
Sacarosa 50 653 44831
Sacarosa 50 6657 127617
Sacarosa 50 7264 66908
Sacarosa 50 7464 255141
Sacarosa 50 9035 26172
Sacarosa 50 9458 28427
Sacarosa 50 9889 37574
Sacarosa 50 10312 140881
Sacarosa 50 12335 13391
Sacarosa 50 1292 17066
(a) (b)
Graacutefico 34 Cromatogramas del diacutea 14 para el P cubensis cultivado en medio
sumergido Fang-Zhong con dos diferentes tipos de sustratos (a) 50 gL
glucosa (b) 50 gL sacarosa
119
Tabla 41 Aacutereas obtenidas de los cromatogramas para el P cubensis en
medio Fang-Zhong en el diacutea 14 para concentraciones de 70gL glucosa y
70gL sacarosa
SustratoConcentracioacuten
(gL)
Tiempo
(s)Aacuterea
Glucosa 70 6257 5879
Glucosa 70 6373 145551
Glucosa 70 7015 68223
Glucosa 70 7199 9085
Glucosa 70 735 265755
Glucosa 70 9014 4642
Glucosa 70 9877 97804
Glucosa 70 107 67421
Glucosa 70 12625 26231
Glucosa 70 1305 65607
Sacarosa 70 2283 4683
Sacarosa 70 5191 93
Sacarosa 70 6304 3719
Sacarosa 70 6795 136542
Sacarosa 70 726 29869
Sacarosa 70 7515 75545
Sacarosa 70 7872 119563
Sacarosa 70 9166 1244
Sacarosa 70 9658 23096
Sacarosa 70 9871 25866
Sacarosa 70 10421 105108
Sacarosa 70 12347 11115
Sacarosa 70 12861 35503
Sacarosa 70 14272 3676
(a) (b)
Graacutefico 35 Cromatogramas del diacutea 14 para el P cubensis cultivado en medio
sumergido Fang-Zhong con dos diferentes tipos de sustratos (a) 70 gL
glucosa (b) 70 gL sacarosa
120
Tabla 42 Aacutereas obtenidas de los cromatogramas para el P cubensis en medio Fang-Zhong en el diacutea 13 para concentraciones de 50gL glucosa y
50gL sacarosa
SustratoConcentracioacuten
(gL)
Tiempo
(s)Aacuterea
Glucosa 50 05 0123 173
Glucosa 50 05 0699 7584
Glucosa 50 05 2594 2742
Glucosa 50 05 6104 11663
Glucosa 50 05 6616 487848
Glucosa 50 05 7235 287918
Glucosa 50 05 8183 135793
Glucosa 50 05 8903 5143
Glucosa 50 05 9484 66817
Glucosa 50 05 9679 168855
Glucosa 50 05 11671 4216
Glucosa 50 1 0345 295
Glucosa 50 1 2654 11981
Glucosa 50 1 412 45301
Glucosa 50 1 6111 12626
Glucosa 50 1 6757 526655
Glucosa 50 1 8093 104277
Glucosa 50 1 894 25251
Glucosa 50 1 9643 158685
Glucosa 50 1 11666 22779
Glucosa 50 15 0353 283
Glucosa 50 15 2522 15272
Glucosa 50 15 3577 83963
Glucosa 50 15 6668 47137
Glucosa 50 15 7304 371442
Glucosa 50 15 8226 117611
Glucosa 50 15 8923 61949
Glucosa 50 15 9657 19618
Glucosa 50 15 11668 35606
(a) (b)
(c)
Graacutefico 36 Cromatogramas del diacutea 12 para el P cubensis cultivado en medio sumergido Fang-Zhong con fuente de carbono glucosa y adicioacuten de
fenilalanina en tres concentraciones (a) 05 gL FA (b) 1 gL FA (c) 15gL FA (a) 05 gL FA (b) 1 gL FA (c) 15gL FA
121
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xii
LISTA DE GRAacuteFICOS
GRAacuteFICO 1 CINEacuteTICA DE CRECIMIENTO MICELIAL DE P CUBENSIS EN MEDIO SUMERGIDO (FANG-ZHONG)
UTILIZANDO TRES DIFERENTES CONCENTRACIONES DE GLUCOSA COMO FUENTE DE CARBONO (PESO
SECO) 46
GRAacuteFICO 2 CRECIMIENTO MICELIAL DE P CUBENSIS EN CULTIVO SUMERGIDO BAJO TRES
CONCENTRACIONES DE GLUCOSA 47
GRAacuteFICO 3 VALORES DE CONCENTRACIOacuteN DE BIOMASA EXPERIMENTAL Y TEOacuteRICO GRAFICADOS CON
RESPECTO AL TIEMPO PARA LAS FERMENTACIONES CON DIFERENTES CONCENTRACIONES DE
GLUCOSA 49
GRAacuteFICO 4 CINEacuteTICA DE CRECIMIENTO MICELIAL DE P CUBENSIS EN MEDIO SUMERGIDO (FANG-ZHONG)
UTILIZANDO DIFERENTES CONCENTRACIONES DE SACAROSA COMO FUENTE DE CARBONO (PESO
SECO) 50
GRAacuteFICO 5 CRECIMIENTO MICELIAL PARA TRES DIFERENTES CONCENTRACIONES DE SACAROSA 52
GRAacuteFICO 6 VALORES DE CONCENTRACIOacuteN DE BIOMASA EXPERIMENTAL Y TEOacuteRICO GRAFICADOS CON
RESPECTO AL TIEMPO PARA LAS FERMENTACIONES CON DIFERENTES CONCENTRACIONES DE
SACAROSA 54
GRAacuteFICO 7 CRECIMIENTO MICELIAL PARA DOS DIFERENTES FUENTES DE CARBONO (GLUCOSA Y
SACAROSA) 56
GRAacuteFICO 8 CINEacuteTICA DE CRECIMIENTO MICELIAL DE P CUBENSIS EN MEDIO SUMERGIDO (FANG-ZHONG)
UTILIZANDO DIFERENTES CONCENTRACIONES DE FA Y 50 GL DE GLUCOSA COMO FUENTE DE
CARBONO (PESO SECO) 57
GRAacuteFICO 9 CRECIMIENTO MICELIAL PARA GLUCOSA A UNA CONCENTRACIOacuteN DE 50 GL Y TRES
DIFERENTES CONCENTRACIONES DE FA 59
GRAacuteFICO 10 VALORES DE CONCENTRACIOacuteN DE BIOMASA EXPERIMENTAL Y TEOacuteRICO GRAFICADOS CON
RESPECTO AL TIEMPO PARA LAS FERMENTACIONES CON DIFERENTES CONCENTRACIONES DE FA Y
50 GL DE GLUCOSA 61
GRAacuteFICO 11 CINEacuteTICA DE CONSUMO DE SUSTRATO POR PARTE DEL P CUBENSIS EN MEDIO SUMERGIDO
UTILIZANDO DIFERENTES CONCENTRACIONES DE GLUCOSA COMO FUENTE DE CARBONO 62
GRAacuteFICO 12 CINEacuteTICA DE CONSUMO DE SUSTRATO POR PARTE DEL P CUBENSIS EN MEDIO SUMERGIDO
UTILIZANDO DIFERENTES CONCENTRACIONES DE SACAROSA COMO FUENTE DE CARBONO 64
GRAacuteFICO 13 CONSUMO DE SUSTRATO PARA CADA UNA DE LAS FUENTES DE CARBONO UTILIZADAS 66
GRAacuteFICO 14 CINEacuteTICA DE CONSUMO DE SUSTRATO POR PARTE DEL P CUBENSIS EN MEDIO SUMERGIDO
UTILIZANDO 50 GL DE GLUCOSA COMO FUENTE DE CARBONO Y DIFERENTES CONCENTRACIONES DE
FA 67
GRAacuteFICO 15 CONSUMO DE SUSTRATO PARA CADA UNA DE LAS CONCENTRACIONES DE FA UTILIZADAS 68
GRAacuteFICO 16 CINEacuteTICA DE CONSUMO DE PROTEIacuteNA POR PARTE DEL P CUBENSIS EN MEDIO SUMERGIDO
UTILIZANDO DIFERENTES CONCENTRACIONES DE GLUCOSA COMO FUENTE DE CARBONO 70
GRAacuteFICO 17 CINEacuteTICA DE CONSUMO DE PROTEIacuteNA POR PARTE DEL P CUBENSIS EN MEDIO SUMERGIDO
UTILIZANDO DIFERENTES CONCENTRACIONES DE SACAROSA COMO FUENTE DE CARBONO 71
GRAacuteFICO 18 CONSUMO DE PROTEIacuteNA PARA CADA UNA DE LAS FUENTES DE CARBONO UTILIZADAS 73
xiii
GRAacuteFICO 19 CINEacuteTICA DE CONSUMO DE PROTEIacuteNA POR PARTE DEL P CUBENSIS EN MEDIO SUMERGIDO
UTILIZANDO 50 GL DE GLUCOSA COMO FUENTE DE CARBONO Y DIFERENTES CONCENTRACIONES DE
FA 74
GRAacuteFICO 20 CONSUMO DE PROTEIacuteNA PARA LOS ENSAYOS CON Y SIN FA 75
GRAacuteFICO 21 AacuteREA DEL COMPUESTO OBTENIDO DE P CUBENSIS EN TIEMPO DE RETENCIOacuteN ENTRE 62 Y
72 MINUTOS PARA LAS DOS FUENTES DE CARBONO 77
GRAacuteFICO 22 AacuteREA DEL COMPUESTO OBTENIDO DE P CUBENSIS EN TIEMPO DE RETENCIOacuteN ENTRE 62 Y
72 MINUTOS EN LOS UacuteLTIMOS TRES DIacuteAS DE LA FERMENTACIOacuteN CON FA Y GLUCOSA 79
GRAacuteFICO 23 AacuteREA DEL COMPUESTO OBTENIDO DE P CUBENSIS EN TIEMPO DE RETENCIOacuteN ENTRE 62 Y
72 MINUTOS PARA CADA UNA DE LAS FUENTES DE CARBONO UTILIZADAS 82
GRAacuteFICO 24 AacuteREA DEL COMPUESTO OBTENIDO DE P CUBENSIS EN TIEMPO DE RETENCIOacuteN ENTRE 62 Y
72 MINUTOS PARA CADA UNA DE LAS CONCENTRACIONES DE FA UTILIZADAS 85
GRAacuteFICO 25 CROMATOGRAMAS DEL DIacuteA 12 PARA EL P CUBENSIS CULTIVADO EN MEDIO SUMERGIDO
FANG-ZHONG CON DOS DIFERENTES TIPOS DE SUSTRATOS (A) 30 GL GLUCOSA (B) 30 GL SACAROSA
109
GRAacuteFICO 26 CROMATOGRAMAS DEL DIacuteA 12 PARA EL P CUBENSIS CULTIVADO EN MEDIO SUMERGIDO
FANG-ZHONG CON DOS DIFERENTES TIPOS DE SUSTRATOS (A) 50 GL GLUCOSA (B) 50 GL SACAROSA
110
GRAacuteFICO 27 CROMATOGRAMAS DEL DIacuteA 12 PARA EL P CUBENSIS CULTIVADO EN MEDIO SUMERGIDO
FANG-ZHONG CON DOS DIFERENTES TIPOS DE SUSTRATOS (A) 50 GL GLUCOSA (B) 50 GL SACAROSA
111
GRAacuteFICO 28 CROMATOGRAMA DEL DIacuteA 12 PARA EL P CUBENSIS CULTIVADO EN MEDIO SUMERGIDO
FANG-ZHONG CON FUENTE DE CARBONO GLUCOSA Y ADICIOacuteN DE FENILALANINA EN TRES
CONCENTRACIONES (A) 05 GL FA (B) 1 GL FA (C) 15GL FA 112
GRAacuteFICO 29 CROMATOGRAMAS DEL DIacuteA 13 PARA EL P CUBENSIS CULTIVADO EN MEDIO SUMERGIDO
FANG-ZHONG CON DOS DIFERENTES TIPOS DE SUSTRATOS (A) 30 GL GLUCOSA (B) 30 GL SACAROSA
113
GRAacuteFICO 30 CROMATOGRAMAS DEL DIacuteA 13 PARA EL P CUBENSIS CULTIVADO EN MEDIO SUMERGIDO
FANG-ZHONG CON DOS DIFERENTES TIPOS DE SUSTRATOS (A) 50 GL GLUCOSA (B) 50 GL SACAROSA
114
GRAacuteFICO 31 CROMATOGRAMAS DEL DIacuteA 13 PARA EL P CUBENSIS CULTIVADO EN MEDIO SUMERGIDO
FANG-ZHONG CON DOS DIFERENTES TIPOS DE SUSTRATOS (A) 70 GL GLUCOSA (B) 70 GL SACAROSA
115
GRAacuteFICO 32 CROMATOGRAMAS DEL DIacuteA 12 PARA EL P CUBENSIS CULTIVADO EN MEDIO SUMERGIDO
FANG-ZHONG CON FUENTE DE CARBONO GLUCOSA Y ADICIOacuteN DE FENILALANINA EN TRES
CONCENTRACIONES (A) 05 GL FA (B) 1 GL FA (C) 15GL FA 116
GRAacuteFICO 33 CROMATOGRAMAS DEL DIacuteA 14 PARA EL P CUBENSIS CULTIVADO EN MEDIO SUMERGIDO
FANG-ZHONG CON DOS DIFERENTES TIPOS DE SUSTRATOS (A) 30 GL GLUCOSA (B) 30 GL SACAROSA
117
GRAacuteFICO 34 CROMATOGRAMAS DEL DIacuteA 14 PARA EL P CUBENSIS CULTIVADO EN MEDIO SUMERGIDO
FANG-ZHONG CON DOS DIFERENTES TIPOS DE SUSTRATOS (A) 50 GL GLUCOSA (B) 50 GL SACAROSA
118
xiv
GRAacuteFICO 35 CROMATOGRAMAS DEL DIacuteA 14 PARA EL P CUBENSIS CULTIVADO EN MEDIO SUMERGIDO
FANG-ZHONG CON DOS DIFERENTES TIPOS DE SUSTRATOS (A) 70 GL GLUCOSA (B) 70 GL SACAROSA
119
GRAacuteFICO 36 CROMATOGRAMAS DEL DIacuteA 12 PARA EL P CUBENSIS CULTIVADO EN MEDIO SUMERGIDO
FANG-ZHONG CON FUENTE DE CARBONO GLUCOSA Y ADICIOacuteN DE FENILALANINA EN TRES
CONCENTRACIONES (A) 05 GL FA (B) 1 GL FA (C) 15GL FA (A) 05 GL FA (B) 1 GL FA (C)
15GL FA 120
xv
LISTA DE ECUACIONES
ECUACIOacuteN 1 ECUACIOacuteN LINEALIZADA DEL MODELO LOGIacuteSTICO 38
ECUACIOacuteN 2 VALORES TEOacuteRICOS DE BIOMASA EN EL TIEMPO 39
xvi
LISTAS DE ANEXOS
ANEXO 1 ANAacuteLISIS DE VARIANZA (ANOVA) PARA EL CRECIMIENTO DE BIOMASA DE LAS
FERMENTACIONES CON GLUCOSA _____________________________________________________ 90
ANEXO 2 ANAacuteLISIS DE VARIANZA (ANOVA) PARA EL CRECIMIENTO DE BIOMASA DE LAS
FERMENTACIONES CON SACAROSA ____________________________________________________ 91
ANEXO 3 ANAacuteLISIS DE VARIANZA (ANOVA) PARA EL CRECIMIENTO DE BIOMASA DE LAS
FERMENTACIONES CON GLUCOSA Y SACAROSA __________________________________________ 92
ANEXO 4 ANAacuteLISIS DE VARIANZA (ANOVA) PARA EL CRECIMIENTO DE BIOMASA DE LAS
FERMENTACIONES CON GLUCOSA 50 GL Y FA ___________________________________________ 93
ANEXO 5 ANAacuteLISIS DE VARIANZA (ANOVA) PARA EL CONSUMO DE SUSTRATO EN LAS FERMENTACIONES
SIN FA ____________________________________________________________________________ 94
ANEXO 6 ANAacuteLISIS DE VARIANZA (ANOVA) PARA EL CONSUMO DE SUSTRATO EN LAS FERMENTACIONES
CON FA ___________________________________________________________________________ 95
ANEXO 7 ANAacuteLISIS DE VARIANZA (ANOVA) PARA EL CONSUMO DE PROTEIacuteNA EN LAS FERMENTACIONES
SIN FA ____________________________________________________________________________ 96
ANEXO 8 ANAacuteLISIS DE VARIANZA (ANOVA) PARA EL CONSUMO DE PROTEIacuteNA EN LAS FERMENTACIONES
CON FA ___________________________________________________________________________ 97
ANEXO 9 ANAacuteLISIS DE VARIANZA (ANOVA) PARA LA PRODUCCIOacuteN DE PSILOCIBINA EN LAS
FERMENTACIONES SIN FA ____________________________________________________________ 98
ANEXO 10 ANAacuteLISIS DE VARIANZA (ANOVA) PARA LA PRODUCCIOacuteN DE PSILOCIBINA EN LAS
FERMENTACIONES CON FA ___________________________________________________________ 99
ANEXO 11 ANAacuteLISIS DE VARIANZA (ANOVA) PARA LA CUANTIFICACIOacuteN PORCENTUAL DE PSILOCIBINA EN
LAS FERMENTACIONES SIN FA _______________________________________________________ 100
ANEXO 12 ANAacuteLISIS DE VARIANZA (ANOVA) PARA LA CUANTIFICACIOacuteN PORCENTUAL DE PSILOCIBINA EN
LAS FERMENTACIONES CON FA ______________________________________________________ 101
ANEXO 13 DETERMINACIOacuteN DE CONSUMO DE AZUacuteCARES POR EL MEacuteTODO DE DNS (AacuteCIDO
DINITROSALICIacuteLICO) ________________________________________________________________ 102
ANEXO 14 CINEacuteTICA DE CONSUMO DE SUSTRATO ___________________________________________ 104
ANEXO 15 DETERMINACIOacuteN DE CONSUMO DE PROTEIacuteNAS POR EL MEacuteTODO DE LOWRY ____________ 105
ANEXO 16 CINEacuteTICA CONSUMO DE PROTEIacuteNA ______________________________________________ 106
ANEXO 17 PRUEBA DE REACTIVO DE DRAGENDORFF _________________________________________ 107
ANEXO 18 BARRIDO ESPECTRAL PARA EL PSILOCYBE CUBENSIS _________________________________ 108
ANEXO 19 CROMATOGRAMAS (HPLC) DEL DIacuteA 12 DE FERMENTACIOacuteN ___________________________ 109
ANEXO 20 CROMATOGRAMAS (HPLC) DEL DIacuteA 13 DE FERMENTACIOacuteN __________________________ 113
ANEXO 21 CROMATOGRAMAS (HPLC) DEL DIacuteA 14 DE FERMENTACIOacuteN __________________________ 117
xvii
RESUMEN
El Psilocybe cubensis es un hongo de gran importancia a nivel industrial gracias a
la presencia de una sustancia llamada Psilocibina en su cuerpo fructiacutefero
Dicho alcaloide derivado de la triptamina es muy similar al neurotransmisor
serotonina el cual es responsable de la percepcioacuten sensorial la regulacioacuten de la
temperatura el inicio del reposo nocturno del hiacutegado y los rintildeones Por tal motivo
este estudio se enfocoacute en la produccioacuten de la Psilocibina mediante el cultivo del P
cubensis en medio sumergido (Fang-Zhong)
Se evaluaron los efectos de dos fuentes de carbono (glucosa y sacarosa) a tres
concentraciones diferentes en cultivo sumergido para Psilocybe cubensis con el
fin de determinar la incidencia de eacutestas en la produccioacuten de biomasa y en la
produccioacuten y presencia de Psilocibina alcaloide de intereacutes Para las
concentraciones de glucosa de 30 gL 50 gL y 70 gL se presentoacute un crecimiento
maacuteximo de biomasa de 048 gL 055 gL y 062 gL y un porcentaje de alcaloide
de 6065 wv 7396 wv y 6733 wv respectivamente Esto uacuteltimo si se
asume que el tiempo de retencioacuten oscila entre 62 y 72 minutos contaacutendose con
una fase moacutevil de HCOONH4 en una columna C18 Mientras que para las mismas
concentraciones de sacarosa se presentoacute un crecimiento maacuteximo de biomasa de
026 gL 045 gL y 057 gL con porcentajes del compuesto presente entre el
rango de 62 y 72 minutos de 3664 wv 5857 wv y 5583 wv
respectivamente
Una vez realizada la investigacioacuten se encontroacute que las diferencias existentes en
cuanto a la cantidad de biomasa generada con respecto al tipo de sustrato
utilizado no fueron significativas es decir era irrelevante si se utilizaba glucosa o
sacarosa como principal fuente de carbono para la fermentacioacuten del P cubensis
xviii
en medio sumergido con el fin de obtener biomasa sin embargo se hallaron
diferencias significativas con respecto a las diferentes concentraciones empleadas
de dichas fuentes de carbono
Al analizar las muestras mediante cromatografiacutea liacutequida de alta eficiencia (HPLC)
se determinoacute que el medio que conteniacutea 50 gL de glucosa era el deseado debido
a que fue en eacuteste donde se presentaron picos maacutes definidos mostrando una mejor
resolucioacuten del compuesto Adicionalmente presentoacute un buen crecimiento micelial
Una vez elegido dicho criterio se evaluoacute el efecto que teniacutea la adicioacuten de un
aminoaacutecido llamado Fenilalanina (FA) al medio que conteniacutea 50 gL de glucosa
con el fin de determinar si eacuteste teniacutea alguna incidencia positiva en la produccioacuten de
biomasa y en la generacioacuten del alcaloide de intereacutes cabe resaltar que se utilizaron
diferentes concentraciones de FA correspondientes a 05 gL 10 gL y 15 gL
Finalizados dichos ensayos se obtuvieron valores de crecimiento de biomasa
maacutexima de 106 gL 108 gL y 101 gL y un porcentaje de aacuterea de 7549 wv
6236 wv y 2721 wv respectivamente
Es necesario hacer hincapieacute en que las diferencias obtenidas mediante el anaacutelisis
estadiacutestico entre cada una de las concentraciones de FA con respecto a la
generacioacuten de biomasa y la produccioacuten del compuesto no fueron significativas lo
que llevoacute a elegir una concentracioacuten de 05 gL de FA debido a que fue la menor
cantidad utilizada de este compuesto durante la investigacioacuten suponieacutendose asiacute
una disminucioacuten en los costos de materia prima
Palabras claves
Psilocybe cubensis Psilocibina Alcaloide HPLC Cultivo Sumergido Fuentes de
Carbono Fenilalanina
19
INTRODUCCIOacuteN
Los hongos son una rica fuente de productos naturales con una alta actividad
bioloacutegica Desafortunadamente el cultivo de eacutestos en cuerpo fructiacutefero toma
varios meses disminuyendo su calidad debido a los cambios climaacuteticos y plagas
por tal razoacuten se implementoacute la metodologiacutea de medio sumergido la cual es
prometedora gracias a una alta productividad de compuestos bioactivos (Arora
1986)
El Geacutenero Psilocybe pertenece al Reino Fungiacute con un Phylum Basidiomicota
una Clase Homobasidiomicetes un Orden Agaricales una Familia Strofariaceae
(Paris y Hurabielle 1981)
Dicho geacutenero es considerado de gran importancia a nivel mundial debido a que su
cuerpo fructiacutefero y biomasa micelial contienen Psilocibina la cual posee un alto
valor para la industria farmaceacuteutica por su uso en la elaboracioacuten de productos
antidepresivos Este alcaloide derivado de FA cuenta con una estructura muy
similar al neurotransmisor segregado por el cerebro llamado serotonina que
controla el estado de aacutenimo el suentildeo el hiacutegado y los rintildeones (Mandrile et al
1984) esta caracteriacutestica le otorga la gran importancia a la Psilocibina en el
mercado puesto que tiene un alto impacto en la sociedad como ayudante
antidepresivo debido a que no todas las personas segregan la cantidad necesaria
(10 mg con liacutemites que variacutean desde 5 a 20 mg) de serotonina (Mandrile et al
1984) Adicionalmente se estaacute empleando como una gran ayuda para la
disminucioacuten de la adiccioacuten a sustancias como heroiacutena y cocaiacutena gracias a que
este alcaloide no genera dependencia (Lee et al 2004)
Debido a que su consumo puede generar alucinaciones era consumido por las
culturas aboriacutegenes centroamericanas con el fin de realizar manifestaciones
20
religiosas Su uso se remonta a maacutes de 3500 antildeos y era nombrado por los
aztecas como ―Teonunaltl que significa ―carne de dioses (Mandrile et al 1984)
La alternativa que se utilizoacute durante esta investigacioacuten fue el cultivo del P
cubensis mediante medio sumergido debido principalmente a las notables
ventajas frente a los sistemas convencionales que eacuteste posee entre las cuales se
destacan la disminucioacuten del tiempo para la obtencioacuten de la biomasa (14 diacuteas) y la
reduccioacuten de los costos de obtencioacuten (Lee et al 2004) De acuerdo a lo
dimensionado anteriormente este estudio estaba orientado primordialmente a la
buacutesqueda de alternativas que permitieran la produccioacuten de biomasa de forma
raacutepida y confiable
Con el fin de llevar a cabo lo dicho anteriormente se pretendioacute evaluar el efecto
del uso de dos diferentes fuentes de carbono en este caso glucosa y sacarosa en
el crecimiento micelial de la cepa P cubensis
21
OBJETIVOS
GENERAL
Evaluar el efecto de la fuente de carbono en el crecimiento micelial de una
cepa Psilocybe sp
ESPECIacuteFICOS
Evaluar la cineacutetica de crecimiento de la cepa Psilocybe cubensis en los
diferentes medios de cultivo sumergido mediante la cuantificacioacuten de
biomasa por medio de la metodologiacutea de peso seco
Evaluar el consumo de sustrato para los diferentes ensayos por medio de
teacutecnicas espectrofotomeacutetricas
Determinar la presencia de Psilocibina mediante el uso del reactivo de
Dragendorff
22
1 MARCO TEOacuteRICO
11 CONCEPTOS GENERALES DE HONGOS
Los hongos son organismos eucariotas que no contienen clorofila con nutricioacuten
por absorcioacuten generalmente con reproduccioacuten sexual y asexual el cuerpo
consiste generalmente de filamentos ramificados con pared celular quitinosa
(Miles y Chang 1999)
Constituyen uno de los grupos de organismos maacutes importantes para la vida del
hombre ya que son los responsables de gran parte de la descomposicioacuten de la
materia orgaacutenica aumentando su disponibilidad en el suelo pueden ser
comestibles venenosos o psicotroacutepicos muchos son patoacutegenos otros producen
ciertas sustancias beneficiosas o intervienen en procesos de elaboracioacuten de
algunos comestibles (Miles y Chang 1999)
111 Hongos laminares (Agaricales)
El orden Agaricales tambieacuten conocido como Euagaricales es el mayor orden de
setas y hongos que incluye maacutes de la mitad de todas las especies conocidas de la
clase Homobasidiomycetes (Hibbett et al 1997 Hibbett y Thorn 2001) Maacutes de
9000 especies y alrededor de 350 geacuteneros se han atribuido a este orden que
contiene 26 familias (Kirk et al 2001) Un consenso de mayor nivel de
clasificacioacuten de los Agaricales ha sido difiacutecil de lograr debido a la competencia de
sistemas que restringen geacuteneros y familias (o incluso orden) de diferentes
maneras (Bas 1998 Juumllich 1981 Kirk et al 2001 Kuumlhner 1980 Singer 1986)
23
La base para la clasificacioacuten de los hongos fue construida por Fries (1874) quien
hizo hincapieacute en las caracteriacutesticas macroscoacutepicas como la textura del tallo la
separacioacuten de los filamentos (laminas) presencia o ausencia de velo y color de las
esporas
Posteriormente dividioacute los hongos Agaricales en varias especies de acuerdo al
color de las esporas depositadas las cuales pueden ser de color blanco rosado
marroacuten puacuterpura ndash marroacuten y negro El sistema macroscoacutepico de Fries que
reconocioacute inicialmente 12 geacuteneros de hongos carnosos que forman los hongos es
taxonoacutemicamente praacutectico Eacuteste fue relativamente invariable hasta que Fayod
(1989) estudioacute la anatomiacutea y las caracteriacutesticas microscoacutepicas de muchos
Agaricales reconociendo 108 geacuteneros (Arora 1986)
Al igual que todas las setas los hongos laminares son faacutebricas de esporas
creados con el uacutenico propoacutesito de fabricar esporas microscoacutepicas para dejarse
llevar por las corrientes de aire y con suerte caer en un lugar adecuado en la
tierra para germinar y comenzar un nuevo organismo Las probabilidades de que
cualquier individuo que tiene esporas de este tipo tenga suerte son tan bajas que
el hongo produce millones de esporas para compensar esto En las laacuteminas se
encuentran numerosas esporas las cuales aumentan considerablemente el
nuacutemero de esporas que el hongo puede producir Ambos lados de cada laacutemina
estaacute cubierta con esporas microscoacutepicas (Kuo 2007) A continuacioacuten se muestra
de manera ilustrativa en la figura 1 las laacuteminas que poseen los hongos Agaricales
en las cuales se da la formacioacuten de las esporas
Figura 1 Hongo Agaricales (Laminar) (Kuo 2007)
24
12 MEDIOS DE CULTIVO
Uno de los sistemas maacutes importantes para la identificacioacuten de microorganismos es
observar su crecimiento en sustancias alimenticias artificiales preparadas en el
laboratorio El material alimenticio en el que crecen los microorganismos es el
medio de cultivo (Garciacutea 1995)
Para que los microorganismos crezcan adecuadamente en un medio de cultivo
artificial eacuteste debe reunir una serie de condiciones como lo son temperatura
grado de humedad y presioacuten asiacute como un grado correcto de acidez o alcalinidad
Un medio de cultivo contiene los nutrientes y factores de crecimiento necesarios
para que el microorganismo se desarrolle correctamente y debe estar exento de
cualquier tipo de microorganismo que pueda generar contaminacioacuten (Garciacutea
1995)
121 Tipos de medios de cultivo
En la actualidad existen diversos tipos de medio de cultivo si se centra en la
composicioacuten eacutestos pueden ser medios sinteacuteticos que contienen fuente de
carbono fuente de nitroacutegeno sales que suplan los iones y demaacutes elementos tales
como estimuladores del crecimiento medios complejos que contienen ingredientes
tales como extracto de levadura peptona infusioacuten de cerebro etc ricos en
nutrientes medios de enriquecimiento siendo estos complejos con aditivos
adicionales para favorecer asiacute al crecimiento y desarrollo de determinados
microorganismos medios selectivos los cuales son disentildeados para favorecer el
crecimiento especiacutefico de un microorganismo determinado o un grupo
microbiano medios diferenciales que proporcionan la distincioacuten microbiana de una
mezcla por sus propiedades diferenciales de crecimiento en dichos medios
medios de mantenimiento siendo disiacutemiles de los de crecimiento oacuteptimo por el
25
crecimiento raacutepido y proliacutefico que deriva en la muerte raacutepida de las ceacutelulas (Garciacutea
1995)
Atendiendo a su estado los medios de cultivo pueden presentarse como medios
sumergidos y medios soacutelidos que contienen agar que gelifica por debajo de 45
degC y cuya concentracioacuten en su uso es de 15 y medios semisoacutelidos que contiene
un agar a una concentracioacuten de 07 (Garciacutea 1995)
121 Medio sumergido
Debido a que cultivar el cuerpo fructiacutefero toma varios meses y se dificulta el control
de calidad del producto final porque se estaacute sujeto a los cambios permanentes del
clima y las plagas se ha empleado la metodologiacutea de medio sumergido la cual es
una alternativa muy prometedora para la produccioacuten eficiente del micelio y de los
metabolitos (Lindequist y Niedermeyer 2005)
Dicha forma es la mejor para producir extraer y purificar metabolitos de un cultivo
de hongo ya que facilita una mayor produccioacuten de biomasa en menor tiempo y
de mayor calidad que el cultivo en medio soacutelido ademaacutes facilita la dispersioacuten y
adaptacioacuten del hongo y reduce los vectores de contaminacioacuten De igual forma un
cultivo de esta iacutendole es la opcioacuten maacutes viable si se quiere escalar procesos
fermentativos en aras de desarrollar mercados como en este caso el de
metabolitos medicinales (Navarro et al 1998)
A su vez el uso de cultivo sumergido puede beneficiar la produccioacuten de muchos
metabolitos secundarios y disminuir los costos de produccioacuten por reducir las
labores que involucran los meacutetodos de etapas soacutelidas (Domiacutenguez y Webb 2003)
Los metabolitos bioactivos de los hongos pueden ser potencialmente producidos a
nivel industrial mediante el uso de la metodologiacutea de cultivo sumergido pero el
26
eacutexito a escala comercial depende del costo comparado con la tecnologiacutea existente
y la ventaja econoacutemica que la industria puede ver usando este meacutetodo El uso de
la tecnologiacutea puede ser facilitada por el aumento en el rendimiento de la
produccioacuten y el desarrollo del sistema (Hwang et al 2004)
El cultivo de hongos sumergidos se caracteriza por un aumento en la viscosidad
del caldo con el tiempo debido a uno o maacutes factores tales como el aumento de la
concentracioacuten de ceacutelulas los cambios de la morfologiacutea del crecimiento o la
produccioacuten de productos extracelulares que alteran el caraacutecter reoloacutegico de la
cultura del liacutequido El aumento en la viscosidad puede ser visto como un fenoacutemeno
indeseable pero inevitable ya que causan dificultades en el suministro de oxiacutegeno
en la eliminacioacuten de dioacutexido de carbono y en posibles problemas de agitacioacuten
(Hwang et al 2004)
13 ALCALOIDES
131 Generalidades
La diversidad estructural y la variedad en la actividad bioloacutegica hacen de los
alcaloides como tambieacuten de los antibioacuteticos los grupos maacutes importantes entre las
sustancias naturales de intereacutes terapeacuteutico (Paris y Hurabielle 1981)
Se han aislado principalmente en plantas superiores y se han encontrado en maacutes
de 100 familias de Faneroacutegamas (aquellas plantas que se reproducen por semillas
producidas en sus inflorescencias) Su actividad bioloacutegica a nivel del sistema
nervioso dio pie a las primeras investigaciones siendo los alcaloides las primeras
sustancias naturales estudiadas (Paris y Hurabielle 1981)
El teacutermino alcaloide propuesto por el farmaceacuteutico W Meissner en 1819 se aplicoacute
a los compuestos de origen vegetal con propiedades alcalinas este caraacutecter
baacutesico es debido a la presencia de nitroacutegeno amiacutenico en su estructura Los
27
alcaloides se pueden considerar como ―Un compuesto orgaacutenico de origen natural
nitrogenado derivados generalmente de aminoaacutecidos maacutes o menos baacutesico de
distribucioacuten restringida con propiedades farmacoloacutegicas importantes a dosis bajas
y que responden a reacciones comunes de precipitacioacuten (Paris y Hurabielle
1981)
132 Propiedades fisicoquiacutemicas
Los alcaloides tienen masas moleculares que variacutean entre 100 y 9000 gmol son
casi siempre incoloros son normalmente soacutelidos a temperatura ambiente a
excepcioacuten de los alcaloides no oxigenados Los alcaloides son poco solubles en
agua gracias a su caraacutecter baacutesico dicho caraacutecter se debe al par de electrones
libres del nitroacutegeno (Paris y Hurabielle 1981)
En la naturaleza se encuentran en forma de sales generalmente En las plantas
se consideraba que eran productos obtenidos durante la extraccioacuten y poco
solubles en disolventes tiacutepicos de extraccioacuten por su polaridad Son solubles en
disolventes orgaacutenicos como cloroformo etanol metanol acetato de etilo eacuteter
benceno En forma de sales son solubles en agua excepto las sales de berberina
(Paris y Hurabielle 1981)
Todos los alcaloides son activos a la luz polarizada Presentan una fluorescencia
caracteriacutestica bajo la luz UV o IR dando lugar a espectros caracteriacutesticos (Paris y
Hurabielle 1981)
133 Reconocimiento de los alcaloides
Las teacutecnicas de reconocimiento son basadas en la capacidad que tienen los
alcaloides en estado de sal (extractos aacutecidos) de combinarse con el yodo y
metales pesados como bismuto mercurio tungsteno formando precipitados se
28
utilizan reactivos generales para detectar alcaloides como reactivo de Wagner
reactivo de Mayer reactivo de Dragendorff reactivo de Hager reactivo de
Bertrand reactivo de Ehrlich y reactivo de Vitali-Morin (Paris y Hurabielle 1981)
134 Clasificacioacuten de los alcaloides
Habitualmente los alcaloides se han clasificado en funcioacuten de su estructura
distinguieacutendose principalmente los compuestos heterociacuteclicos de los no
heterociacuteclicos Actualmente existen varias formas de clasificarlos (Bruneton
1987) entre ellas se pueden distinguir
1341 Alcaloides alifaacuteticos
a Derivados de la ornitina (pirrolidinas tropaacutenicos pirrolizidiacutenicos)
b Derivados de la lisina (piperidinas quinolizidiacutenicos)
1342 Alcaloides de origen diverso
a Alcaloides terpeacutenicos y esteroidales
b Alcaloides diversos (purinas macrociclos etc)
1343 Alcaloides aromaacuteticos
a Derivados del aacutecido nicotiacutenico (piridinas)
b Derivados de la fenilalanina y tirosina (isoquinoleinas)
c Derivados del triptofano (indoacutelicos quinoleinas)
d Derivados de la histidina (imidazoles)
29
Alcaloides derivados del triptofano (Alcaloides Indoacutelicos)
Desde el punto de vista farmacoloacutegico ha habido mucho intereacutes sobre las bases
que contienen el nuacutecleo indoacutelico a raiacutez del descubrimiento de la actividad
alucinoacutegena del LSD asiacute como la actividad sedante de la reserpina aislada del
geacutenero Rauwolfia El auge del estudio fitoquiacutemico ocurrioacute en la deacutecada de los 60 y
se dirigiacutea principalmente a la familia Apocynaceae (Mercano y Hasegawa 1991)
Existen unos 800 alcaloides de este tipo distribuidos principalmente en la familia
Apocynaceae (geacuteneros Rauwolfia Aspidos-perma Strychnos y Vinca) menos
frecuentes en hongos y familias como Leguminoseae Malphigiaceae Rubiaceae y
Rutaceae donde los alcaloides presentan el grupo indoacutelico sencillo (Mercano y
Hasegawa 1991)
El triptofano es el precursor de estos alcaloides los cuales se clasifican en
triptaminas y en no triptaminas las triptaminas a su vez se subdividen en b-
carbolinas y en indoleninas y pueden ser triptaminas simples o triptaminas
complejas y estas pueden ser isopreacutenicas o no isopreacutenicas (Mercano y Hasegawa
1991) La figura 2 muestra la estructura quiacutemica del triptofano triptamina y sus
divisiones
Figura 2 Alcaloides derivados del Triptofano (Mercano y Hasegawa 1991)
30
Triptaminas simples
Las triptaminas simples juegan un importante papel en la cultura indiacutegena de
Ameacuterica por sus efectos alucinoacutegenos y extaacuteticos en sus ceremonias maacutegico
religiosas (Furst 1994) Se han encontrado en hongos alucinoacutegenos de
Mesoameacuterica del geacutenero Psilocybe Stropharia y Conocybe (―teonacatl o ―carne
de los dioses) usados por los indios Aztecas en sus ceremonias religiosas desde
hace maacutes de 1700 antildeos Se han encontrado en estos hongos los alcaloides
alucinoacutegenos la Psilocina y la Psilocibina que al ingerirlos produce diferentes
sensaciones auditivas y visuales relajacioacuten muscular depresiones y euforias
alternadas (Mercano y Hasegawa 1991)
La serotonina que juega un importante papel en la actividad neuronal se
encuentra tambieacuten en vegetales Se ha aislado en el pericarpio del banano el cual
seco cuando es fumado actuacutea como un alucinoacutegeno ligero (Seigler 1981)
De las glaacutendulas paroacutetidas del sapo comuacuten Bufo vulgaris se aiacutesla la bufotenina
derivado N-dimetilado de la serotonina que tambieacuten es el principio activo del Yopoacute
polvo de las semillas de Anadenanthera peregrina (Piptadenia peregrina)
Leguminoseae y especies del geacutenero Virola (Myristicaceae) que contiene tambieacuten
triptaminas son mezclados con cenizas e inhalados por medio de tubos de bambuacute
por los indiacutegenas del Orinoco en ceremonias maacutegico religiosas produciendo
alucinacioacuten e incoordinacioacuten motriz (Seigler 1981)
En la figura 3 se observan las estructuras de aquellos compuestos que estaacuten
clasificados como triptaminas simples
31
Figura 3 Triptaminas simples (Seigler 1981)
13 PSILOCIBINA Y PSILOCINA
La Psilocibina y la Psilocina son bioloacutegicamente sintetizadas en los hongos
pertenecientes a los geacuteneros de Psilocybe (Bigwood y Beug 1982 Wurst et al
1984)
La Psilocibina y la Psilocina se han identificado en todo el mundo en una variedad
de setas que son llamados hongos maacutegicos La ingestioacuten de pequentildeas
cantidades de alucinoacutegenos provoca el eacutextasis La actividad alucinoacutegena de la
Psilocibina es relativamente maacutes baja que la de la Psilocina Sin embargo la
Psilocibina se convierte faacutecilmente en Psilocina (componente activo principal) en
los sistemas bioloacutegicos Asiacute el desarrollo de un meacutetodo de determinacioacuten de la
Psilocibina es importante lo misma que la de la Psilocina (Kimie et al 2005)
La hidroacutelisis de la Psilocibina se consigue saturando con anhiacutedido carboacutenico una
solucioacuten acuosa de Psilocibina (para eliminar el oxiacutegeno del aire y calentaacutendola)
obteniendo asiacute una moleacutecula de 4hidroxi-dimetiltriptamina y una moleacutecula de aacutecido
fosfoacuterico (Mandrile et al 1984)
Como todos los faacutermacos derivados del indol estas sustancias han despertado
intereacutes porque se sospechoacute la posibilidad de que algunas de ellas se formen en el
32
organismo y que en ciertas psicosis especialmente en la esquizofrenia se
produzcan elevados niveles sanguiacuteneos que ocasionan algunos de los siacutentomas
(Mandrile et al 1984)
La figura 4 muestra la estructura quiacutemica de alcaloides como la Psilocibina y
Psilocina
Figura 4 Psilocibina y Psilocina (Mandrile et al 1984)
131 Antecedentes acerca de la obtencioacuten de Psilocibina y Psilocina
Una gran variedad de meacutetodos cromatograacuteficos para la determinacioacuten de
Psilocibina y Psilocina presentes en las incautaciones de hongos se han
publicado La cromatografiacutea de capa fina es utilizada debido a que eacutesta es muy
apropiada para la deteccioacuten de sustancias derivadas del triptofano (Brown et al
1972 Tanimukai 1967 Beug y Bigwood 1981) Aun asiacute meacutetodos que involucran
tanto la cromatografiacutea de alta eficiencia (HPLC) como la deteccioacuten fotomeacutetrica de
UV (Beug y Bigwood 1981 Wurst et al 1984 Borner y Brenneisen 1987 Perkal
et al 1980 Vanhaelen-Faestreacute y Vanhaelen 1984 Thomson 1980 White 1979
Sottolano y Lurie 1983) fueron establecidas y optimizadas para la cuantificacioacuten
de Psilocibina
Durante los uacuteltimos antildeos se han venido utilizando diferentes tipos de columna y
fase moacutevil con el fin de obtener la mayor cantidad posible de la sustancia de
intereacutes (Psilocibina)
33
En el antildeo 1981 en el instituto farmaceacuteutico de la Universidad de Oslo realizaron
una investigacioacuten con una columna de siacutelice con una fase moacutevil de metanol-nitrato
de amonio en donde no soacutelo se logroacute obtener Psilocibina y Psilocina sino tambieacuten
un nuevo producto conocido como beocistiacuten Se logroacute un porcentaje de separacioacuten
maacutexima de 75 ww (Christiansen et al 1981)
Asimismo en el antildeo 1984 en el instituto de microbiologiacutea de Amsterdam se
realizoacute un estudio con una columna C18 de siacutelice y una fase moacutevil de agua-etanol-
aacutecido aceacutetico de forma isocraacutetica en donde se obtuvo un porcentaje 025-115
y 002-016 de Psilocibina y Psilocina respectivamente en el hongo (Wurst
1984)
De igual manera en el antildeo 2003 en el instituto de ciencia policiaca en Japoacuten se
ejecutoacute la cromatografiacutea de alta eficiencia utilizando una columna C18 con una
fase moacutevil de aacutecido foacutermico de forma isocraacutetica y un detector de 220 nm un rango
de porcentaje de Psilocibina 014-042 wv en la capa mientras un 009-03
wv en el tallo (Tsujikawa et al 2003)
34
2 MATERIALES Y MEacuteTODOS
21 LOCALIZACIOacuteN
Las fermentaciones la medicioacuten del crecimiento micelial y la cuantificacioacuten del
consumo del sustrato y de proteiacutena se llevaron a cabo en el laboratorio de
Biotecnologiacutea de la Universidad EAFIT mientras que los anaacutelisis de cromatografiacutea
liacutequida de alta eficiencia (HPLC) se realizaron en el laboratorio de Quiacutemica
Instrumental de dicha Universidad
22 MICROORGANISMO DE ESTUDIO
La cepa del hongo Psilocybe cubensis (EAH01) con la cual se trabajoacute fue donada
por Joseacute Rodrigo Moreno Ingeniero del laboratorio de la Universidad Catoacutelica de
Oriente (UCO) La EAH01 permanece auacuten en el laboratorio de Biotecnologiacutea de la
Universidad EAFIT
Dicha cepa se cultivoacute en una caja Petri que conteniacutea Agar Extracto de Malta
(MEA) y se incuboacute a 30ordmC en una incubadora digital del laboratorio de
Biotecnologiacutea de la Universidad EAFIT La figura 5 representa una cepa de P
cubensis cultivada en medio soacutelido MEA
Figura 5 Psilocybe cubensis (EAH01) cultivada en medio soacutelido Agar Malta
35
23 COMPONENTES DEL MEDIO DE CULTIVO (FANG-ZHONG)
El medio sumergido utilizado para llevar a cabo las diferentes fermentaciones de
P cubensis fue el descrito por Fang-Zhong (2002) La tabla 1 muestra los
componentes de dicho medio y la concentracioacuten de cada uno de ellos Se destaca
que las fuentes de carbono utilizadas fueron glucosa y sacarosa usaacutendolas cada
una por separado para cada experimento y haciendo variaciones de
concentraciones de las mismas para los distintos ensayos
Tabla 1 Composicioacuten del medio de cultivo sumergido para evaluar el crecimiento micelial del P cubensis
Componentes Cantidad (gL)
Fuente de Carbono 30 ndash 50 - 70
Peptona 5
Extracto de levadura 5
KH2PO4 1
MgSO47H2O 05
Vitamina B1 005
24 PREPARACIOacuteN DE LOS DIFERENTES PREINOacuteCULOS DE P cubensis
EMPLEADOS PARA LAS FERMENTACIONES SUMERGIDAS
Con el propoacutesito de llevar a cabo cada uno de los ensayos fue necesario realizar
la preparacioacuten de un preinoacuteculo eacutesto con el fin de realizar un proceso de
adaptacioacuten del P cubensis al medio favoreciendo la disminucioacuten en cuanto a
tiempo (preferiblemente la eliminacioacuten de la aparicioacuten de un fase de latencia una
vez comenzada la fermentacioacuten)
La preparacioacuten de cada uno de los preinoacuteculos se realizoacute en 6 erlenmeyers de
1000 mL con 200 mL de medio cada uno los cuales fueron esterilizados a 120degC
por 15 minutos e inoculados con 4 discos de 5 mm aproximadamente de P
36
cubensis provenientes de la cepa previamente activada en Agar Malta durante 6
diacuteas Los erlenmeyers se llevaron a un agitador orbital por 6 diacuteas a 30ordmC y 100
rpm
25 PREPARACIOacuteN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO Y LOS INOacuteCULOS DE P
cubensis UTILIZADOS PARA LAS FERMENTACIONES SUMERGIDAS
Una vez realizado el preinoacuteculo se procedioacute a preparar los medios de cultivo
utilizados para realizar los distintos experimentos de la siguiente manera se
prepararon medios que diferiacutean en la fuente de carbono (glucosa o sacarosa) y en
la concentracioacuten de la misma (30 gL 50 gL y 70 gL) teniendo asiacute un total de
seis fermentaciones Las demaacutes cantidades de los componentes del medio de
Fang-Zhong fueron las mismas que las usadas en el preinoacuteculo descritas en la
Tabla 1
En primer lugar se llevaron a cabo las tres fermentaciones de glucosa
preparando un total de 90 erlenmeyers (30 por cada concentracioacuten de azuacutecar por
duplicado) cada uno de los frascos conteniacutea 50 mL del medio en erlenmeyers de
250 mL e inoculados con 01 g de peso huacutemedo del preinoacuteculo aproximadamente
Los 90 frascos se llevaron durante 14 diacuteas a un agitador orbital a 100 rpm con una
temperatura de 30 degC
Posteriormente se llevaron a cabo las tres fermentaciones de sacarosa siguiendo
el mismo proceso descrito anteriormente para la glucosa
Una vez terminadas las fermentaciones de glucosa y sacarosa y realizados todos
los anaacutelisis correspondientes (generacioacuten de biomasa consumo de sustrato
consumo de proteiacutena y evaluacioacuten de la presencia de Psilocibina por medio de
cromatografiacutea liacutequida de alta eficiencia (HPLC)) se procedioacute a elegir la fuente de
carbono y concentracioacuten que mejores resultados arrojoacute tanto para la generacioacuten
37
de biomasa como para la produccioacuten del alcaloide con el fin de evaluarla
nuevamente adicionaacutendole un precursor (FA)
Para finalizar se procedioacute a preparar los medios con la fuente de carbono y la
concentracioacuten de la misma que arrojoacute mejores resultados es decir los ensayos
realizados con una concentracioacuten de 50 gL de glucosa adicionaacutendole al medio
FA a diferentes concentraciones correspondiente a valores de 05 gL 10 gL y
15 gL las demaacutes cantidades de los componentes remanentes del medio fueron
las mismas que las descritas anteriormente en la tabla 1
26 CUANTIFICACIOacuteN DEL CRECIMIENTO DE BIOMASA MEDIANTE LOS
MEacuteTODOS DE PESO HUacuteMEDO Y PESO SECO PARA CULTIVO
SUMERGIDO DE P cubensis
La cuantificacioacuten de biomasa para cada uno de los tratamientos se realizoacute usando
la metodologiacutea de peso huacutemedo y peso seco Para la cuantificacioacuten de biomasa
mediante el meacutetodo de peso huacutemedo se tomaron dos muestras provenientes de
cada erlenmeyer cada 24 horas las cuales fueron filtradas y pesadas con el fin de
obtener el valor de peso huacutemedo para cada tratamiento del P cubensis
Posteriormente la biomasa retenida en el papel filtro fue llevada a un secador que
se encontraba a una temperatura de 50ordmC durante 24 horas transcurrido el
tiempo la biomasa seca fue pesada con el fin de obtener datos de peso seco
Durante los 14 diacuteas de la fermentacioacuten se obtuvieron datos de peso huacutemedo y
peso seco por duplicado para cada una de las fermentaciones
27 AJUSTE DE LA CINEacuteTICA DE CRECIMIENTO DE P cubensis AL
MODELO CINEacuteTICO LOGIacuteSTICO
Una vez realizada la recoleccioacuten de muestras para cada uno de los ensayos y su
posterior anaacutelisis se decidioacute modelar dichos datos mediante el modelo logiacutestico
38
(ecuacioacuten 1) el cual permite obtener variables cineacuteticas tales como la cantidad de
biomasa inicial (Xo) y la velocidad maacutexima de crecimiento (micromaacutex) para cada uno de
los tratamientos
Se decidioacute emplear el modelo logiacutestico ya que eacuteste muestra resultados maacutes reales
cuando se cultivan hongos debido a que su morfologiacutea es muy diferente a otros
microorganismos (pellets) dificultando la transferencia de masa (Bailey et al
1986)
Una vez linealizada la ecuacioacuten que describe dicho modelos se llega a la siguiente
expresioacuten
Ecuacioacuten 1 Ecuacioacuten linealizada del modelo logiacutestico
Posterior a la linealizacioacuten de la ecuacioacuten se procedioacute a graficar Ln ((XmaacutexX)-1)
vs tiempo con el fin de obtener como pendiente la velocidad maacutexima de
crecimiento (micromaacutex) y como intercepto el Ln ((XmaacutexXo)-1) el cual permitioacute la
obtencioacuten de la concentracioacuten inicial de biomasa
Obtenieacutendose asiacute los paraacutemetros cineacuteticos para cada ensayo correspondientes a
micromax y Xo
Se debe definir la concentracioacuten maacutexima de biomasa (Xmaacutex) para poder hallar los
paraacutemetros cineacuteticos mediante dicho modelo cabe aclarar que dicho valor se toma
de los resultados de biomasa adquiridos para cada uno de los ensayos mediante
la metodologiacutea de peso seco este valor variacutea para cada fermentacioacuten
Una vez ajustados los datos de cada tratamiento al modelo logiacutestico se procedioacute a
calcular de manera teoacuterica los valores de X (biomasa) que variacutea con el tiempo
39
teniendo en cuenta los paraacutemetros cineacuteticos arrojados mediante el modelo
logiacutestico utilizando la siguiente ecuacioacuten
Ecuacioacuten 2 Valores teoacutericos de biomasa en el tiempo
Estos valores de X teoacutericos obtenidos mediante la foacutermula anterior se grafican con
respecto a los valores de X obtenidos de manera experimental con el fin de
observar el ajuste del modelo logiacutestico a cada uno de los datos experimentales
28 EVALUACIOacuteN DEL CONSUMO DE SUSTRATO Y DEL CONSUMO DE
PROTEIacuteNA POR PARTE DEL P cubensis CULTIVADO EN MEDIO
SUMERGIDO
Con el fin de evaluar el consumo de sustrato y proteiacutena por parte del P cubensis
durante las fermentaciones que conteniacutean glucosa en el medio se recolectaron
muestras cada 24 horas del liacutequido obtenido despueacutes de realizada la filtracioacuten de
la muestra que se utilizoacute para efectos de caacutelculo de peso seo dicho liacutequido
denominado sobrenadante fue almacenado a -4 degC Finalizadas cada una de las
fermentaciones se procedioacute a realizar el protocolo para evaluar el consumo de
sustrato para cada medio (Miller 1959) mediante el meacutetodo de DNS (Aacutecido
Dinitrosaliciacutelico) (Anexo 13) y el consumo de proteiacutenas mediante el meacutetodo de
LOWRY para cada fermentacioacuten (Anexo 15)
Para llevar a cabo la cuantificacioacuten de sustrato y proteiacutena en los distintos ensayos
fue necesario realizar las curvas de calibracioacuten correspondientes dichas curvas
con sus respectivos valores de concentracioacuten se muestran en los anexos 14 y 16
40
29 MEacuteTODO CUALITATIVO PARA DETERMINAR LA PRESENCIA DE
ALCALOIDES (PSILOCIBINA) MEDIANTE EL USO DEL REACTIVO DE
DRAGENDORFF
Como se mencionoacute anteriormente el reactivo de Dragendorff es usado para
determinar de manera cualitativa la ausencia o presencia de alcaloides en una
muestra determinada Para llevar a cabo dicha prueba se recolectaron muestras
de la biomasa seca correspondientes a los diacuteas 12 13 y 14 de cada fermentacioacuten
las cuales fueron almacenadas a -4degC
Para determinar la presencia de Psilocibina se realizoacute el proceso descrito seguacuten
Musshoff et al (2000) el cual consistioacute en macerar cada una de las muestras de
biomasa hasta obtener un polvo fino luego se pesaron 10 mg de dicho polvo y a
esta cantidad se le agregoacute 1 mL de metanol Posteriormente una pequentildea
cantidad de esta mezcla se esparcioacute en un papel filtro en donde se le adicionoacute una
gota del reactivo de Dragendorff
Una vez realizada la prueba se dice que la muestra contiene presencia de
alcaloides si eacutesta presenta una coloracioacuten rojizo-amarilla
210 MEacuteTODO PARA DETERMINAR LA PRESENCIA DE PSILOCIBINA
MEDIANTE CROMATOGRAFIacuteA LIacuteQUIDA DE ALTA EFICIENCIA (HPLC)
Una vez evaluada la presencia del alcaloide mediante el reactivo de Dragendorff
se procedioacute a determinar mediante el uso de cromatografiacutea liacutequida de alta
eficiencia (HPLC) la presencia de los alcaloides en la mezcla con sus respectivos
tiempos de retencioacuten para llevar a cabo la extraccioacuten de la Psilocibina se siguioacute el
meacutetodo descrito por Musshoff et al (2000) Para ello la muestra de biomasa
seca fue macera en un mortero hasta convertirla en un polvo fino Diez miligramos
41
de la muestra en polvo se extrajeron dos veces con 1 mL de metanol en un bantildeo
de ultrasonido durante 30 minutos Posterior a eacutesto se centrifugaron las muestras
a 3000 rpm durante 2 minutos el sobrenadante se depositoacute en un vial
independiente
El sobrenadante fue evaporado hasta sequedad bajo una corriente de nitroacutegeno
gaseoso Una parte de los residuos se disolvioacute en 200 microL de la fase moacutevil que
contiene HCOONH4 con una concentracioacuten 10 microM y un pH de 35
El equipo utilizado para realizar todos los anaacutelisis correspondientes a HPLC
cuenta con las siguientes caracteriacutesticas equipo Agient Technologies que consta
de una columna C18 de 46 mm 250 mm 5 mm con una fase moacutevil de
HCOONH4 con un flujo de 1 mLminuto un detector UV de 214 nm y una inyeccioacuten
de 20 μL y una temperatura de 25degC El experimento se corrioacute de modo isocraacutetico
con una fase moacutevil de agua 70 y HCOONH4 de 30
211 DETERMINACIOacuteN CUALITATIVA DE LA RESOLUCIOacuteN DEL
ALCALOIDE DE INTEREacuteS PARA LOS DIFERENTES ENSAYOS
Con el fin de determinar de manera cualitativa cuaacutel de los cromatogramas
arrojados mediante la teacutecnica de HPLC presentoacute mejor resolucioacuten del alcaloide
fue necesario realizar un supuesto acerca del tiempo de retencioacuten de la Psilocibina
durante la cromatografiacutea puesto que a pesar de haber contado con un
cromatograma (Tsujikawa et al 2003) (Anexo 18) y haber trabajado en las
mismas condiciones de eacuteste no se utilizoacute la misma fase moacutevil lo que puedo
generar variaciones en dicho tiempo Se asumioacute que el tiempo de retencioacuten varioacute
entre 62 y 72 minutos es decir entre este tiempo se encontroacute el pico de intereacutes
de la investigacioacuten
42
La eleccioacuten del criterio de pureza del compuesto de intereacutes se realizoacute observando
cuaacutel de los picos obtenidos muestra menor ruido es decir que a su alrededor no
tenga presencia de otros compuestos (Anexos 19 20 y 21)
212 DETERMINACIOacuteN PORCENTUAL DE COMPUESTOS PARA LOS
DIFERENTES ENSAYOS
La cuantificacioacuten de los compuestos se hizo mediante un porcentaje de aacuterea bajo
la curva debido a que no se contoacute con un estaacutendar interno
Para realizar dicho porcentaje se obtuvo la totalidad de las aacutereas presentes en el
perfil cromatograacutefico obtenido para las muestras de los diacuteas 12 13 y 14 de cada
fermentacioacuten y el porcentaje del aacuterea del metabolito de intereacutes la cual oscilaba
entre un tiempo de retencioacuten entre 62 y 72 minutos
En el momento de analizar los cromatogramas y de elegir el medio que mejor
resultados arrojoacute en cuanto a la produccioacuten de alcaloide se observoacute la resolucioacuten
del metabolito en cada una de las fermentaciones
213 CULTIVO SUMERGIDO DE P cubensis EN PRESENCIA DE FA
Despueacutes de haber elegido la fuente de carbono (glucosa) y su respectiva
concentracioacuten (50 gL) que mejores resultados arrojaron durante la investigacioacuten
se realizaron nuevamente fermentaciones del P cubensis en medio sumergido
(Fang-Zhong) donde la diferencia de estos medios con respecto a los
anteriormente utilizados radicoacute en la presencia de FA aminoaacutecido
Para dichas fermentaciones se contoacute con tres concentraciones diferentes de FA
(05 gL 1 gL 15 gL) realizadas por duplicado adicionalmente se montoacute
43
simultaacuteneamente con dichos ensayos las muestras correspondientes a los uacuteltimos
tres diacuteas de fermentacioacuten sin FA en el medio para efectos de comparacioacuten y asiacute
poder llevar a cabo un anaacutelisis estadiacutestico apropiado
Los datos obtenidos fueron analizados por medio de una ANOVA con el fin de
observar si existiacutean o no diferencias significativas en cuanto al crecimiento micelial
(concentracioacuten de biomasa) del P cubensis y asiacute poder determinar el medio que
mejores resultados arrojoacute durante la investigacioacuten
214 DISENtildeO DE EXPERIMENTOS Y ANAacuteLISIS ESTADIacuteSTICO
El disentildeo estadiacutestico utilizado para realizar los anaacutelisis correspondientes a las
diferentes fermentaciones es un disentildeo factorial 23 Este estudio se basoacute en dos
factores que fueron las dos fuentes de carbono (glucosa y sacarosa) a su vez se
apoyoacute en tres niveles que fueron la variacioacuten en la concentracioacuten de las mismas
(30 gL 50 gL y 70 gL) De igual manera se fundamentoacute en dos variables de
respuesta el crecimiento micelial de P cubensis y el porcentaje de Psilocibina
presente en el microorganismo
Por medio del Software Statgraphics plus 51 se realizoacute un anaacutelisis estadiacutestico
basado en una ANOVA factorial Con ello se pretendioacute comparar estadiacutesticamente
los resultados de crecimiento micelial de biomasa (concentracioacuten) y produccioacuten de
Psilocibina para cada uno de los medios durante los 14 diacuteas de fermentacioacuten y en
especial en los uacuteltimos tres diacuteas de la misma puesto que durante este periacuteodo fue
evaluada la presencia del alcaloide
Es necesario hacer hincapieacute que para realizar dicha estadiacutestica fue necesario
ejecutar un estudio de normalidad el cual se comproboacute utilizando la graacutefica de
probabilidad normal a su vez se requirioacute un anaacutelisis de igualdad de varianza por
medio de una graacutefica de residuos Vs previsto con el fin de ver visualmente la
44
hipoacutetesis de la homocedasticidad todo ello con el fin de garantizar que la
investigacioacuten se comportoacute de forma normal Adicionalmente se contoacute con una
hipoacutetesis nula (Ho) y una Hipoacutetesis alterna (Ha) las cuales permitieron realizar las
conclusiones respectivas A continuacioacuten se enunciaraacuten cada una de eacutestas y los
paraacutemetros necesarios para dicho estudio
Ho Todas las medias son iguales es decir no existen diferencias
significativas entre los datos analizados
Ha Alguna de las medias es diferente lo que quiere decir que siacute existen
diferencias significativas
Paraacutemetro
Pvalor gt 005 Se acepta Ho
Pvalor le 005 Se rechaza Ho
45
3 RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN
31 CINEacuteTICA DE CRECIMIENTO MICELIAL DE P cubensis EN CULTIVO
SUMERGIDO (FANG-ZHONG) UTILIZANDO DIFERENTES FUENTES DE
CARBONO
Con el propoacutesito de evaluar el crecimiento micelial del P cubensis en medio
sumergido durante los 14 diacuteas de la fermentacioacuten se recurrioacute al uso de
metodologiacuteas conocidas como peso huacutemedo y peso seco en dicho trabajo soacutelo se
exponen los datos arrojados por el meacutetodo de peso seco
A continuacioacuten se presentan cada una de las fermentaciones de acuerdo al tipo de
sustrato empleado en las mismas los respectivos valores de peso seco obtenidos
y los anaacutelisis pertinentes para cada uno de los casos
311 Crecimiento micelial de P cubensis en medio sumergido utilizando
diferentes concentraciones de glucosa
Inicialmente se evaluaron tres concentraciones de glucosa en el cultivo de P
cubensis en medio sumergido (Fang-Zhong) correspondientes a 30 gL 50 gL y
70 gL siendo en este caso la glucosa la principal fuente de carbono del P
cubensis
A continuacioacuten se muestran los valores de peso seco obtenidos para cada una de
las concentraciones de glucosa utilizadas durante los 14 diacuteas de la fermentacioacuten
46
0
01
02
03
04
05
06
07
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Bio
ma
sa (g
L)
Tiempo (diacuteas)30gL 50gL 70gL
Graacutefico 1 Cineacutetica de crecimiento micelial de P cubensis en medio sumergido (Fang-Zhong) utilizando tres diferentes concentraciones de
glucosa como fuente de carbono (Peso seco)
Del graacutefico 1 se puede observar que no hubo evidencia de fase de latencia para
ninguno de los ensayos posteriormente se aprecia que el crecimiento de biomasa
aumentoacute con el tiempo para las diferentes concentraciones de glucosa empleadas
Analizando las fermentaciones que conteniacutean 50 gL y 70 gL de glucosa se
puede afirmar que ambas presentan un comportamiento similar mostrando una
fase exponencial hasta el diacutea 11 y una fase estacionaria hasta el diacutea 14 de la
fermentacioacuten mientras que la fermentacioacuten que conteniacutea 30 gL de glucosa no
presentoacute fase estacionaria la fermentacioacuten durante los 14 diacuteas se encontraba en
fase exponencial a pesar de que entre los diacuteas 8 y 11 el crecimiento de P
cubensis se mantuvo constante
Asimismo se puede observar que el crecimiento maacutes bajo en cuanto a
concentracioacuten de biomasa se generoacute en la concentracioacuten de 30 gL siendo eacuteste
de 048 gL mientras que en las concentraciones de 50 gL y 70 gL de glucosa
los crecimientos maacuteximos fueron muy similares 055 gL y 062 gL
respectivamente
47
Lo dicho anteriormente se ratifica una vez analizados los resultados obtenidos
estadiacutesticamente donde se obtuvo un P-valor igual a cero indicando que existen
diferencias significativas en cuanto al crecimiento micelial de biomasa
(concentracioacuten de biomasa durante los 14 diacuteas de la fermentacioacuten) El graacutefico 2
ilustra la presencia de dos grupos homogeacuteneos lo que indica que las
concentraciones de 50 gL y 70 gL no tienen diferencias significativas del
crecimiento micelial entre cada una de ellas mientras que la concentracioacuten de 30
gL siacute presenta dichas diferencias significativas con respecto a las dos
concentraciones anteriores (Anexo 1)
Con todo eacutesto se expone que la concentracioacuten de glucosa de 50 gL es la que se
eligioacute debido a que es maacutes econoacutemico utilizar 50 gL de glucosa que 70 gL
Tratamientos con diferentes concentraciones de glucosa
Media 30 gL glucosa (a) 022
Media 50 gL glucosa (b) 032
Media 70 gL glucosa (b) 034
a
bb
0
005
01
015
02
025
03
035
04
045
Co
nce
ntr
acioacute
n b
iom
asa
(gL
)
Letras diferentes denotan diferencias significativas (prueba LSD)
Graacutefico 2 Crecimiento micelial de P cubensis en cultivo sumergido bajo tres concentraciones de glucosa
48
Modelo logiacutestico para las fermentaciones donde se utilizoacute glucosa
como fuente de carbono
Una vez realizada la cineacutetica de crecimiento del P cubensis en medio sumergido
(Fang-Zhong) usando diferentes concentraciones de glucosa se procedioacute a
ajustar los datos obtenidos al modelo logiacutestico Los crecimientos maacuteximos de
biomasa obtenidos mediante el meacutetodo de peso seco para cada uno de los
ensayos fueron 048 gL 065 gL y 062 gL para concentraciones de 30 gL 50
gL y 70 gL de glucosa respectivamente La tabla 2 muestra los paraacutemetros
cineacuteticos obtenidos mediante el modelo para cada una de las concentraciones
Tabla 2 Paraacutemetros cineacuteticos obtenidos mediante el modelo logiacutestico para las diferentes fermentaciones de P cubensis utilizando glucosa como fuente
de carbono
30gL 50gL 70gL
microx (diacutea-sup1) 016 microx (diacutea-sup1) 017 microx (diacutea-sup1) 015
micromax (diacutea-sup1) 027 micromax (diacutea-sup1) 035 micromax (diacutea-sup1) 034
X0 (gL) 005 X0 (gL) 008 X0 (gL) 008
R2 096 R2
092 R2 085
De la tabla 2 se puede observar que la concentracioacuten inicial de biomasa (Xo)
estuvo muy cercana para cada una de las concentraciones de glucosa utilizadas
Para 30 gL de glucosa la velocidad maacutexima de crecimiento (micromax) fue mucho
menor que la obtenida para 50 gL y 70 gL eacutesto pudo ser debido a que fue el
medio que menor cantidad de glucosa conteniacutea mientras que para las otras dos
concentraciones de glucosa la velocidad maacutexima de crecimiento fue similar
Al comparar las velocidades maacuteximas de las tres concentraciones de glucosa
utilizadas se evidencia que la fermentacioacuten que conteniacutea 50 gL presentoacute una
micromaacutex mayor correspondiente a 035 diacutea-1 esto sugiere que a mayores
concentracioacuten de glucosa (70 gL) puede ocurrir una inhibicioacuten por sustrato otro
49
criterio que afirma que dicha concentracioacuten fue la que mejores resultados arrojoacute de
las tres concentraciones de glucosa utilizadas para el crecimiento del P cubensis
en el medio de Fang-Zhong Ademaacutes se observa que este experimento fue el que
mayor velocidad especiacutefica de crecimiento presento siendo esta de 017 diacutea-1
Finalmente se calcularon los valores de biomasa teoacutericos utilizando la ecuacioacuten
descrita anteriormente en la metodologiacutea con el propoacutesito de observar que tanto
se ajustaron los valores de biomasa hallados experimentalmente con los valores
de biomasa teoacutericos arrojados por el modelo logiacutestico El graacutefico 3 muestra los
valores de biomasa (X) tanto teoacutericos como experimentales con respecto al
tiempo
0
01
02
03
04
05
06
07
0 2 4 6 8 10 12 14
Biom
asa
(gL
)
Tiempo (diacutea)
X exp (30 gL) X exp (50 gL) X exp (70 gL)
X teoacuterico (30 gL) X teoacuterico (50 gL) X teoacuterico (70 gL)
Graacutefico 3 Valores de concentracioacuten de biomasa experimental y teoacuterico
graficados con respecto al tiempo para las fermentaciones con diferentes concentraciones de glucosa
Al observar el graacutefico 3 se puede notar que para los ensayos de 50 gL y 70 gL
de glucosa los valores de biomasa teoacutericos se encuentran un poco desfasados de
los valores de biomasa hallados de manera experimental mientras que para el
ensayo que conteniacutea 30 gL de glucosa se observa un buen ajuste de los datos
50
obtenidos experimentalmente al modelo logiacutestico La tabla 2 reitera lo dicho
anteriormente al exponer los valores de R2 los cuales explican la relacioacuten que
tienen los datos teoacutericos con los experimentales
312 Crecimiento micelial del P cubensis en medio sumergido utilizando
diferentes concentraciones de sacarosa
Una vez evaluado el crecimiento de biomasa usando glucosa como fuente de
carbono se procedioacute a evaluar el efecto que teniacutea el cambio de la fuente de
carbono por sacarosa en el crecimiento micelial del P cubensis en medio
sumergido
El graacutefico 4 muestra de manera ilustrativa como fue el crecimiento micelial del P
cubensis para cada una de las concentraciones de sacarosa utilizadas durante los
14 diacuteas mediante el meacutetodo de peso seco
0
01
02
03
04
05
06
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Biom
asa (
gL)
Tiempo (diacuteas)
30 gL 50 gL 70 gL
Graacutefico 4 Cineacutetica de crecimiento micelial de P cubensis en medio sumergido (Fang-Zhong) utilizando diferentes concentraciones de sacarosa
como fuente de carbono (Peso seco)
51
En el graacutefico 4 se puede observar que tanto para una concentracioacuten de 30 gL
como para 70 gL de sacarosa el hongo llega a su fase estacionaria cerca del
quinto diacutea de la fermentacioacuten mientras que para una concentracioacuten de 50 gL se
observa un comportamiento diferente puesto que el microorganismo tiene un
crecimiento exponencial hasta el diacutea 5 en donde entra a una etapa de transicioacuten o
estacionaria durante 3 diacuteas aproximadamente luego de la cual inicia nuevamente
su crecimiento de forma exponencial hasta llegar al diacutea 11 en donde siacute empieza
su fase estacionaria
Al igual que en las tres fermentaciones que conteniacutean glucosa en estas
fermentaciones de sacarosa se observa mediante el graacutefico anterior que no hubo
presencia de fase de latencia
El crecimiento maacuteximo de biomasa en cuanto a concentracioacuten lo presentoacute aquella
fermentacioacuten que conteniacutea 70 gL de sacarosa el cual fue de 057 gL seguida de
la de 50 gL con un crecimiento maacuteximo de biomasa de 045 gL y posteriormente
la concentracioacuten de 30 gL obtuvo un crecimiento maacuteximo de 026 gL
De acuerdo al anaacutelisis estadiacutestico que se realizoacute para cada una de las
fermentaciones se dedujo que las diferencias en cuanto al crecimiento micelial de
biomasa con respecto a la concentracioacuten de la misma son significativas entre
cada una de las fermentaciones es decir fue diferente la concentracioacuten de
biomasa obtenida cuando se trabajoacute con cada una de distintas concentraciones de
sacarosa Lo dicho anteriormente se muestra a traveacutes del graacutefico 5 (Anexo 2)
52
Tratamientos con diferentes concentraciones de sacarosa
Media 30 gL sacarosa (a) 02
Media 50 gL sacarosa (b) 032
Media 70 gL sacarosa (c) 043
a
b
c
0
02
04
Co
nce
ntr
acioacute
n b
iom
asa
(gL
)
Letras diferentes denotan diferencias significativas (prueba LSD)
Graacutefico 5 Crecimiento micelial para tres diferentes concentraciones de sacarosa
Modelo logiacutestico para las fermentaciones donde se utilizoacute sacarosa
como fuente de carbono
Una vez realizadas las cineacuteticas de crecimiento del P cubensis para cada
concentracioacuten de sacarosa empleada se procedioacute a ajustar los datos obtenidos al
modelo logiacutestico cabe recalcar que es necesario establecer los crecimientos
maacuteximos de biomasa obtenidos para cada uno de los ensayos los cuales fueron
026 gL 045 gL y 057 gL para concentraciones de 30 gL 50 gL y 70 gL de
sacarosa respectivamente
Una vez aplicado el modelo logiacutestico para cada tratamiento se obtuvieron valores
de velocidad maacutexima de crecimiento y biomasa inicial para cada concentracioacuten de
sacarosa utilizada en el medio los cuales se muestran en la tabla 3
53
Tabla 3 Paraacutemetros cineacuteticos obtenidos mediante el modelo logiacutestico para las diferentes fermentaciones de P cubensis utilizando sacarosa como
fuente de carbono
30gL 50gL 70gL
microx (diacutea-sup1) 030 microx (diacutea-sup1) 014 microx (diacutea-sup1) 041
micromax (diacutea-sup1) 037 micromax (diacutea-sup1) 042 micromax (diacutea-sup1) 067
X0 (gL) 01 X0(gL) 01 X0 (gL) 011
R2 061 R2 089 R2 095
De la tabla 3 se ratifica que se utilizoacute una concentracioacuten inicial de biomasa igual
para cada una de las fermentaciones aproximadamente 01 gL ademaacutes se
observa un aumento en la velocidad maacutexima de crecimiento con respecto a la
cantidad de sacarosa empleada es decir que el hecho de haber aumentado la
concentracioacuten de sacarosa en el medio favorecioacute el aumento en la velocidad
maacutexima de crecimiento del P cubensis siendo eacutesta mayor cuando se trabajoacute a una
concentracioacuten de 70 gL de sacarosa De igual manera se aprecia que el
tratamiento que conteniacutea 70 gL de sacarosa presentoacute una velocidad especiacutefica de
crecimiento mayor que los demaacutes siendo eacutesta de 041 diacutea-1
Finalmente se calcularon los valores de biomasa teoacutericos el graacutefico 6 ilustra los
valores de biomasa (X) tanto teoacutericos como experimentales graficados con
respecto al tiempo
54
0
01
02
03
04
05
06
0 2 4 6 8 10 12 14
Bio
mas
a (g
L)
Tiempo (Diacutea)
X exp (30 gL) X exp (50 gL) X exp (70 gL)
X teoacuterico (30 gL) X teoacuterico (50 gL) X teoacuterico (70 gL)
Graacutefico 6 Valores de concentracioacuten de biomasa experimental y teoacuterico graficados con respecto al tiempo para las fermentaciones con diferentes
concentraciones de sacarosa
Del graacutefico 6 se puede observar como los valores de biomasa experimentales se
ajustaron a los valores de biomasa teoacutericos arrojados por el modelo logiacutestico lo
que quiere decir la cineacutetica de crecimiento del P cubensis en medio sumergido
cuando se utilizoacute 70 gL se ajustoacute correctamente al modelo logiacutestico lo que se
corrobora en la tabla 2 gracias al valor obtenido para el R2 que indica la relacioacuten
de los datos teoacutericos con respecto a los experimentales Por otro lado para las
fermentaciones de 30 gL y 50 gL de sacarosa a pesar de parecer que
presentaron un buen ajuste al calcular la relacioacuten de los datos teoacutericos con
respecto a los experimentales (R2) se concluye que el ajuste no fue tan bueno
55
313 Comparacioacuten entre el crecimiento micelial de P cubensis en los
cultivos sumergidos utilizando glucosa y sacarosa como fuente de
carbono
Ahora bien es igualmente importante realizar un anaacutelisis comparativo entre ambas
fuentes de carbono empleadas con el fin de determinar si existen o no diferencias
significativas entre dichas fuentes de carbono
De acuerdo al anaacutelisis estadiacutestico se dice que existen diferencias significativas del
crecimiento micelial del P cubensis en cuanto al diacutea y la concentracioacuten de
sustrato empleado es decir concentracioacuten de glucosa y sacarosa (Anexo 3) pero
se observa claramente que no hay diferencias significativas de dicho crecimiento
con respecto al tipo de sustrato utilizado debido a que el P-valor arrojado por la
estadiacutestica fue de 01217 lo que sugiere que se debe utilizar la sacarosa gracias
a la disminucioacuten de costos que se generariacutean durante el proceso todo ello gracias
al costo de la sacarosa es inferior al de glucosa Sin embargo para elegir la fuente
de carbono que mejores resultados arrojoacute no soacutelo se basoacute en la cantidad de
biomasa producida sino que se procedioacute a examinar los barridos espectrales
arrojados por el anaacutelisis de HPLC con el fin de determinar la fuente de carbono
que mejor resolucioacuten mostroacute del alcaloide que en esta investigacioacuten fue glucosa a
una concentracioacuten de 50 gL
De igual manera el graacutefico 7 muestra las medias obtenidas mediante el anaacutelisis
estadiacutestico para las fermentaciones trabajadas con glucosa y sacarosa Aun asiacute
es necesario hacer hincapieacute que eacuteste no es el criterio principal para la obtencioacuten
del medio que mejores resultados arrojoacute durante la investigacioacuten por lo tanto se
deben seguir realizando los diferentes anaacutelisis descritos anteriormente en este
trabajo
56
Tratamientos de las dos fuentes de carbono usadas sin FA (glucosa y
sacarosa)
Media para glucosa (a) 029
Media para sacarosa (a) 032
aa
0
01
02
03
Conc
entr
acioacute
n bi
omas
a (g
L)
Letras diferentes denotan diferencias significativas (Prueba LSD)
Graacutefico 7 Crecimiento micelial para dos diferentes fuentes de carbono (glucosa y sacarosa)
314 Crecimiento micelial del P cubensis en cultivo sumergido utilizando
glucosa y fenilalanina en el medio
Se decidioacute realizar un uacuteltimo ensayo acerca del efecto que teniacutea la adicioacuten de un
aminoaacutecido llamado Fenilalanina (FA) al medio Fang-Zhong sobre la produccioacuten
del alcaloide y por ende sobre la generacioacuten de biomasa
Debido a los anaacutelisis realizados anteriormente se concluyoacute que la mejor fuente de
carbono fue la glucosa a una concentracioacuten de 50 gL De la misma manera que
en los numerales anteriores se evaluoacute la cineacutetica del crecimiento micelial del P
cubensis mediante los meacutetodos de peso huacutemedo y peso seco Las mediciones
fueron realizadas por duplicado y promediadas para la fuente de carbono elegida
(glucosa 50 gL) y las diferentes concentraciones de FA en el medio
correspondientes a 05 gL 1 gL 15 gL con el fin de encontrar el medio que
mejores resultados arrojoacute en cuanto a crecimiento micelial y generacioacuten del
57
alcaloide de intereacutes Los datos obtenidos mediante el meacutetodo de peso seco se
muestran en el graacutefico 8
Cabe resaltar que junto con las tres fermentaciones de 05 gL 10 gL y 15 gL
de FA se montaron a su vez seis muestras correspondientes a los diacuteas 12 13 y
14 de la fermentacioacuten que conteniacutea 0 gL de FA eacutesto con el propoacutesito de analizar
los datos de manera estadiacutestica y poder hacer comparaciones con respecto a la
generacioacuten de biomasa y a la produccioacuten del alcaloide de intereacutes ambas medidas
con respecto a la concentracioacuten
0
01
02
03
04
05
06
07
08
09
1
11
12
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Biom
asa
(gL
)
Tiempo (diacuteas)
05 gL 1 gL 15 gL
Graacutefico 8 Cineacutetica de crecimiento micelial de P cubensis en medio sumergido (Fang-Zhong) utilizando diferentes concentraciones de FA y 50
gL de glucosa como fuente de carbono (Peso seco)
Al analizar el graacutefico 8 es decir el crecimiento micelial (concentracioacuten de
biomasa) seguacuten la concentracioacuten de FA en el tiempo se puede notar que no hubo
presencia de fase de latencia para ninguna de las concentraciones de FA
utilizadas ademaacutes el crecimiento de biomasa en cada caso se aprecia de manera
58
muy similar llegando los tres ensayos a la fase estacionaria el diacutea 12 de la
fermentacioacuten
Observando el graacutefico 8 se puede identificar que el mayor contenido de biomasa
fue de 108 gL obtenida el diacutea 13 para una concentracioacuten 10 gL de FA para
concentraciones de 05 gL y 15 gL de FA la concentracioacuten maacutexima de biomasa
fue 106 gL y 101 gL respectivamente Auacuten asiacute al considerar los resultados
obtenidos se puede ratificar que es indiferente la cantidad de FA necesaria para
obtener concentracioacuten de biomasa por ende se decide que el medio que mejores
resultados arrojoacute fue el que conteniacutea 05 gL FA debido a que fue la
concentracioacuten de FA que mejor resolucioacuten del alcaloide presentoacute paraacutemetro
observado mediante los cromatogramas obtenidos del anaacutelisis de HPLC (Anexos
19 20 y 21) y ademaacutes porque con dicha cantidad los costos de la materia prima
seriacutean menores Cabe resaltar que el uso de FA generoacute un aumento significativo
duplicando la produccioacuten de biomasa por lo tanto se testifica que siacute hubo
duplicacioacuten en cuanto a la concentracioacuten de biomasa en los medios que conteniacutea
FA con respecto a los medios que no conteniacutean FA se dice entonces que a su
vez se podriacutea haber generado mayor cantidad de Psilocibina en los medios que
teniacutean FA ya que dicho alcaloide se produce de manera intracelular por tal
razoacuten al aumentar la cantidad de biomasa en el medio se aumenta la cantidad de
dicho alcaloide
De igual manera se analizaron los datos estadiacutesticamente y se llegoacute a apreciar
que no existen diferencias significativas en cuanto a la produccioacuten de biomasa y la
cantidad de FA utilizada en el medio Del mismo modo al analizar la tabla de
contrastes muacuteltiple de rangos se reitera que siacute existen diferencias significativas
entre el crecimiento micelial de biomasa (concentracioacuten de biomasa) en el tiempo
cuando se trabajoacute con FA o sin eacuteste Eacutesto se puede observar en el graacutefico 9
(Anexo 4)
59
Tratamientos con y sin FA
Media 0 gL FA (a) 032
Media 05 gL FA (b) 065
Media 10 gL FA (b) 066
Media 15 gL FA (b) 069
a
b b b
0
01
02
03
04
05
06
07
08
09
Conc
entr
acioacute
n bi
omas
a (g
L)
Letras diferentes denotan diferencias significativas (Prueba LSD)
Graacutefico 9 Crecimiento micelial para glucosa a una concentracioacuten de 50 gL y tres diferentes concentraciones de FA
Modelo logiacutestico para las fermentaciones donde se utilizoacute 50 gL de
glucosa como fuente de carbono y diferentes concentraciones de FA
En primer lugar se fijaron los valores de crecimiento maacuteximo de biomasa para
cada una de las concentraciones obtenidos mediante el meacutetodo de peso seco con
el fin de hallar los paraacutemetros cineacuteticos mediante el modelo logiacutestico Los
crecimientos maacuteximos de biomasa obtenidos fueron los siguientes 106 gL 108
gL y 101 gL para concentraciones de 05 gL 10 gL y 15 gL de FA
respectivamente y 50 gL de glucosa
Una vez realizado el modelo logiacutestico para cada tratamiento se obtuvieron los
valores de velocidad maacutexima de crecimiento y concentracioacuten de biomasa inicial
para cada ensayo los cuales se muestran en la tabla 4
60
Tabla 4 Paraacutemetros cineacuteticos obtenidos mediante el modelo logiacutestico para las diferentes fermentaciones de P cubensis utilizando 50 gL de glucosa
como fuente de carbono y diferentes concentraciones de FA
05gL 10gL 15gL
microx (diacutea-sup1) 018 microx (diacutea-sup1) 012 microx (diacutea-sup1) 012
micromax (diacutea-sup1) 045 micromax (diacutea-sup1) 035 micromax (diacutea-sup1) 044
X0 (gL) 01 X0 (gL) 017 X0 (gL) 016
R2 095 R2 082 R2 088
Seguacuten los valores arrojados por el modelo logiacutestico que se encuentran
presentados en la tabla 4 se puede decir que se presentoacute una valor de biomasa
inicial similar para los tratamientos de 1 gL y 15 gL de FA mientras que para las
fermentaciones que conteniacutean 05 gL de FA se tiene una diferencia de un 50
aproximadamente Ademaacutes se puede observar que a la concentracioacuten de 05 gL
de FA es la que mayor velocidad maacutexima de crecimiento presenta siendo esta
045 diacuteamacrsup1 a su vez dicha concentracioacuten presentaacute la microx mayor correspondiente a
018 diacutea-1 Debido a eacutesto y al criterio de mejor resolucioacuten del alcaloide observado
en los anaacutelisis de HPLC (Anexos 19 20 y 21) se concluye que el medio que
mejores resultados arrojoacute durante la investigacioacuten para la generacioacuten de biomasa
y la produccioacuten de la Psilocibina es 05 gL de FA y 50 gL de glucosa
Finalmente se calcularon los valores de biomasa teoacutericos el graacutefico 10 muestra
los valores de biomasa (X) tanto teoacutericos como experimentales graficados con
respecto al tiempo
61
0
02
04
06
08
1
12
0 2 4 6 8 10 12 14 16
Bio
mas
a (g
L)
Tiempo (Diacutea)
X exp (05 gL) X exp (10 gL) X exp (15 gL)
X teoacuterico (05 gL) X teoacuterico (10 gL) X teoacuterico (15 gL)
Graacutefico 10 Valores de concentracioacuten de biomasa experimental y teoacuterico graficados con respecto al tiempo para las fermentaciones con diferentes
concentraciones de FA y 50 gL de glucosa
Se puede decir gracias al graacutefico 10 que los valores de biomasa experimentales
se ajustaron a los valores de biomasa teoacutericos hallados mediante el modelo
logiacutestico es decir la cineacutetica de crecimiento del P cubensis en medio sumergido
cuando se usaron diferentes concentraciones de FA en el medio se ajustoacute
correctamente al modelo logiacutestico esto se reitera con los valores de R2 mostrados
anteriormente en la tabla 4
32 ESTUDIO DE LA CINEacuteTICA DE CONSUMO DE SUSTRATO POR PARTE
DEL P cubensis CULTIVADO EN MEDIO SUMERGIDO (FANG-ZHONG)
La evaluacioacuten del consumo de sustrato durante la fermentacioacuten con respecto al
tiempo es de suma importancia puesto que eacuteste es el principal componente
limitante del crecimiento presente en el medio de cultivo
62
A continuacioacuten se analizaraacuten dichos consumos para los diferentes ensayos
321 Consumo de sustrato por parte del P cubensis en medio sumergido
utilizando diferentes concentraciones de glucosa
Una vez halladas las concentraciones de sustrato para cada una de las
fermentaciones que conteniacutean glucosa en el medio se procedioacute a graficar dichos
valores con respecto al tiempo
El graacutefico 11 ilustra los datos obtenidos sobre el consumo de sustrato de las tres
fermentaciones que conteniacutean glucosa y a su vez como se comportoacute el
crecimiento de biomasa para cada ensayo durante los 14 diacuteas de fermentacioacuten
0
01
02
03
04
05
06
07
0
10
20
30
40
50
60
70
80
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14B
iom
asa
(gL
)
Glu
cosa
(gL
)
Tiempo (diacuteas)
30 GL 50GL 70 GL 30gL 50gL 70gL
Graacutefico 11 Cineacutetica de consumo de sustrato por parte del P cubensis en medio sumergido utilizando diferentes concentraciones de glucosa como
fuente de carbono
Al observar el graacutefico 11 se expone que el P cubensis consumioacute mayor cantidad
de glucosa cuando esta estaba a una concentracioacuten de 70 gL correspondiendo a
63
un porcentaje de 62 mientras que para 50 gL y 30 gL fue de 23 y 30
respectivamente
Comparando el consumo de glucosa en sus diferentes concentraciones con el
crecimiento micelial del hongo se puede observar que a una concentracioacuten de
glucosa de 30 gL no soacutelo se tuvo un menor consumo de sustrato sino que
tambieacuten se generoacute un menor crecimiento de biomasa Mientras que a
concentraciones de 50 gL y 70 gL de glucosa a pesar de presentar diferencias
en cuanto al porcentaje de sustrato consumido el crecimiento micelial es similar
(no presenta diferencias significativas) lo que indica que el hongo no requiere
tanta concentracioacuten de glucosa para su crecimiento eacutesto se puede afirmar soacutelo
para este ensayo a estas condiciones
De igual manera en el graacutefico 11 al analizar la tendencia del consumo de
sustrato las concentraciones de glucosa de 50 gL y 70 gL presentan una
disminucioacuten notoria hasta el diacutea 11 para dicho consumo Esto se debe a que en
ese diacutea inicioacute la fase estacionaria del hongo en ambas fermentaciones en donde
el P cubensis requeriacutea alimento uacutenicamente para mantenerse y producir
metabolitos secundarios Mientras que para la concentracioacuten de glucosa de 30 gL
el consumo de glucosa fue muy poco a partir del quinto diacutea de la fermentacioacuten
esto se atribuye a que la cineacutetica de crecimiento micelial del P cubensis presentoacute
una fase estacionaria temprana entre los diacuteas 8 y 11 indicando que no necesitaba
consumir casi glucosa puesto que no estaba creciendo
322 Consumo de sustrato por parte del P cubensis en medio sumergido
utilizando diferentes concentraciones de sacarosa
Los datos obtenidos sobre el consumo de sacarosa para cada una de las
concentraciones utilizadas (30 gL 50 gL y 70 gL de sacarosa) durante los 14
diacuteas de la fermentacioacuten se muestran en el graacutefico 12 a su vez se ilustran en dicho
64
graacutefico el comportamiento del crecimiento micelial para cada ensayo durante los
14 diacuteas de fermentacioacuten para efectos de anaacutelisis
0
01
02
03
04
05
06
0
10
20
30
40
50
60
70
80
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Bio
mas
a (g
L)
Sac
aro
sa (g
L)
Tiempo (diacuteas)
30gL 50gL 70gL 30 gL 50 gL 70 gL
Graacutefico 12 Cineacutetica de consumo de sustrato por parte del P cubensis en medio sumergido utilizando diferentes concentraciones de sacarosa como
fuente de carbono
Al observar el graacutefico 12 se puede decir que el P cubensis consumioacute mayor
cantidad de sacarosa cuando eacutesta estaba a una concentracioacuten de 70 gL en el
medio presentando un porcentaje de consumo del 49 mientras que para las
concentraciones de 50 gL y 30 gL de sacarosa se tuvo un porcentaje de
consumo de 24 y 37 Esto igual que en el consumo de glucosa se puede
deber a que al tener mayor concentracioacuten de sustrato en el medio el P cubensis
genera mayor afinidad por el mismo haciendo que dicho hongo se consuma
grandes cantidades de sacarosa durante el tiempo
Igualmente se observa que aproximadamente en el noveno diacutea de la
fermentacioacuten las tres diferentes concentraciones de glucosa (30 gL 50 gL y 70
65
gL) se mantienen casi constantes en el tiempo ello gracias a que en este diacutea el
hongo se encontraba en fase estacionaria en los tres ensayos
323 Comparacioacuten entre el consumo de sustrato de P cubensis en los
cultivos sumergidos con diferentes fuentes de carbono
Con el fin de identificar cuaacutel de las dos fuentes de carbono fue consumida en
mayor proporcioacuten por parte del P cubensis se procedioacute a realizar un anaacutelisis
estadiacutestico donde comparamos las dos fuentes de carbono empleados con
respecto al consumo de sustrato obtenido (concentracioacuten de glucosa y sacarosa
en cada uno de los medios) donde se consiguioacute un P-valor de 00811 con
respecto al tipo de sustrato lo que indica que no existen diferencias en cuanto al
consumo de sustrato y el tipo del mismo es decir es indiferente cuaacutel de los dos
sustratos (glucosa o sacarosa) se utilice para que se del consumo del mismo por
parte del P cubensis Observacioacuten que se reitera en la tabla de contraste muacuteltiple
que muestra que se trabajoacute como un grupo homogeacuteneo Igualmente el graacutefico 13
muestra las medias de consumo de sustrato (concentracioacuten durante los 14 diacuteas)
obtenidas mediante el anaacutelisis estadiacutestico y reitera que no existen diferencias
significativas con respecto al tipo de sustrato utilizado para el cultivo del P
cubensis en medio sumergido (Anexo 5)
66
Tratamientos de las dos fuentes de carbono usadas sin FA (glucosa y sacarosa)
Media glucosa (a) 3431
Media sacarosa (a) 3678
a
a
32
34
36
38
Co
nce
ntr
acioacute
n s
ust
rato
(g
L)
Letras diferentes denotan diferencias significativas (Prueba LSD)
Graacutefico 13 Consumo de sustrato para cada una de las fuentes de carbono utilizadas
Aun asiacute al comparar los graacuteficos 11 y 12 se puede observar un mayor consumo
de glucosa que de sacarosa lo que lleva a concluir que es mejor emplear la
primera (glucosa)
324 Consumo de sustrato por parte del P cubensis en medio sumergido
utilizando glucosa y fenilalanina en el medio
Los datos obtenidos acerca del consumo de sustrato durante los 14 diacuteas de la
fermentacioacuten para cada uno de los medios que conteniacutean 50 gL de glucosa y
diferentes concentraciones de FA (05 gL 1 gL y 15 gL) se muestran en el
graacutefico 14 De igual manera se ilustran en dicho graacutefico las cineacuteticas de
crecimiento micelial para cada una de las fermentaciones que teniacutean 50 gL de
glucosa y diferentes concentraciones de FA con el fin de realizar los anaacutelisis
pertinentes
67
0
02
04
06
08
1
12
0
10
20
30
40
50
60
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Bio
mas
a (g
L)
Glu
cosa
50
gL
+ F
A (g
L)
Tiempo (diacuteas)
05gL 10gL 15gL 05 gL 1 gL 15 gL
Graacutefico 14 Cineacutetica de consumo de sustrato por parte del P cubensis en medio sumergido utilizando 50 gL de glucosa como fuente de carbono y
diferentes concentraciones de FA
Analizando el graacutefico 14 se puede decir que el consumo de glucosa durante el
tiempo fue igual para las fermentaciones que conteniacutea concentraciones de 1 gL y
15 gL de FA dichos consumos corresponde a valores de 23 mientras que
para el ensayo que teniacutea una concentracioacuten de 05 gL de FA el porcentaje de
consumo fue del 18 Asimismo se presentaron diferencias significativas en
cuanto al consumo de sustrato entre los diferentes ensayos
El graacutefico 15 expone las medias del consumo de sustrato (concentracioacuten) de cada
una de las muestras y las diferencias existentes entre ellas se evidencia que la
adicioacuten de FA disminuyoacute el consumo de glucosa ademaacutes que en los ensayos se
presentaron tres grupos homogeacuteneos diferentes En el primer grupo (a) que
contiene las fermentaciones del P cubensis con una concentracioacuten de 50 gL de
glucosa y en ausencia de FA se obtuvo una media de 356 gL la cual indica un
mayor consumo de sustrato Luego el segundo grupo (c) se compone de las
concentraciones de 1 gL y 15 gL de FA presentando una media de 413 gL y
de 426 gL respectivamente y el uacuteltimo grupo (b) corresponde a una
68
concentracioacuten de 05 gL de FA el cual presenta el menor consumo de glucosa al
exponer una media 466 gL
Seguacuten lo anterior y el graacutefico 15 se dice que siacute existieron diferencias significativas
en cuanto al consumo de sustrato (concentracioacuten durante los 14 diacuteas) en los
uacuteltimos tres diacuteas cuando se trabajo con FA y sin FA y a su vez se encontraron
diferencias significativas de la concentracioacuten de sustrato en el medio cuando se
teniacutea una concentracioacuten de FA correspondiente a 05 gL con relacioacuten a las otras
dos concentraciones de FA (10 gL y 15 gL) mientras que entre estas dos
uacuteltimas concentraciones de FA (10 gL y 15 gL) no se encontraron diferencias
significativas (Anexo 6)
Tratamientos con y sin FA
Media 0 gL FA (a) 3564
Media 05 gL FA (b) 466
Media 10 gL FA (c) 4131
Media 15 gL FA (c) 426
a
b c c
0
10
20
30
40
50
60
Conc
entr
acioacute
n su
stra
to (g
L)
Letras diferentes denotan diferencias significativas (prueba LSD)
Graacutefico 15 Consumo de sustrato para cada una de las concentraciones de FA utilizadas
69
33 ESTUDIO DE LA CINEacuteTICA DE CONSUMO DE PROTEIacuteNA POR PARTE
DEL P cubensis CULTIVADO EN MEDIO SUMERGIDO (FANG-ZHONG)
Las fuentes de proteiacutena que posee el medio de Fang-Zhong son extracto de
levadura y peptona que representan una cantidad de 10 gL para cada ensayo
eacutesta cantidad se mantuvo constante para cada fermentacioacuten
Se evaluoacute el consumo de proteiacutena por parte del P cubensis durante los 14 diacuteas
de la fermentacioacuten para cada uno de los ensayos
A continuacioacuten se analizan los resultados obtenidos para cada uno de los
tratamientos
331 Consumo de proteiacutena por P cubensis en medio sumergido utilizando
diferentes concentraciones de glucosa
Una vez se calcularon las concentraciones de proteiacutena en el medio para cada
ensayo se graficaron dichos valores con respecto al tiempo
El graacutefico 16 muestra como se comportoacute el consumo de proteiacutena con respecto al
tiempo para cada una de las tres concentraciones de glucosa utilizadas y a su vez
como se comportoacute el crecimiento de biomasa para cada ensayo durante los 14
diacuteas de fermentacioacuten
70
0
01
02
03
04
05
06
07
0
5
10
15
20
25
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Bio
mas
a (g
L)
Pro
tein
a (g
L)
Tiempo (diacuteas)
30 GL 50 GL 70 GL 30 gL Biomasa 50 gL Biomasa 70 gL Biomasa
Graacutefico 16 Cineacutetica de consumo de proteiacutena por parte del P cubensis en medio sumergido utilizando diferentes concentraciones de glucosa como
fuente de carbono
Analizando el graacutefico 16 se puede observar que el consumo de proteiacutena se dio
casi en su totalidad El ensayo que mayor consumo de proteiacutena presentoacute fue el
que conteniacutea 30 gL de glucosa arrojando un porcentaje de consumo del 98
mientras que las fermentaciones realizadas a concentraciones de 50 gL y 70 gL
de glucosa presentaron un porcentaje de consumo de proteiacutena del 91 y 90
respectivamente
Al enfocarnos en la relacioacuten existente entre el consumo de proteiacutena y el
crecimiento micelial del P cubensis se puede notar gracias al graacutefico 16 que la
relacioacuten es directamente proporcional debido a que el consumo de proteiacutena fue
permanente mientras el hongo se encontraba en fase exponencial es decir el P
cubensis necesitaba de la proteiacutena para aumentar su crecimiento mientras que en
el momento en que el microorganismo comenzoacute su fase estacionaria la
concentracioacuten de proteiacutena en el medio se mantuvo constante esto uacuteltimo soacutelo es
vaacutelido para concentraciones de 50 gL y 70 gL de glucosa puesto que ambas
llegaron a la fase estacionaria
71
332 Consumo de proteiacutena por P cubensis en medio sumergido utilizando
diferentes concentraciones de sacarosa
Una vez obtenidos los valores de consumo de proteiacutena para cada concentracioacuten
de sacarosa utilizada se precedioacute a graficarlos con respecto al tiempo dichos
datos se encuentran en el graacutefico 17 De igual manera en este graacutefico se
representa la cineacutetica de crecimiento de biomasa para el P cubensis de acuerdo a
las distintas concentraciones de sacarosa utilizadas
0
01
02
03
04
05
06
0
2
4
6
8
10
12
14
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Bio
mas
a (g
L)
Prot
eiacutena
(gL
)
Tiempo (diacuteas)
30 GL 50 GL 70 GL 30 gL 50 gL 70 gL
Graacutefico 17 Cineacutetica de consumo de proteiacutena por parte del P cubensis en medio sumergido utilizando diferentes concentraciones de sacarosa como
fuente de carbono
El graacutefico 17 ilustra el consumo casi en su totalidad de la proteiacutena para cada uno
de los tratamientos El ensayo que mayor consumo de proteiacutena presentoacute fue el
que conteniacutea 30 gL de sacarosa exponiendo un porcentaje de consumo del 89
mientras que las concentraciones de 50 gL y 70 gL de sacarosa arrojaron
porcentajes de consumo del 86 y 57 respectivamente
Ahora bien al analizar el crecimiento del P cubensis con respecto al consumo de
proteiacutena se evidencia claramente que el consumo disminuyoacute permanentemente
72
en el tiempo mientras el hongo se encontraban en estado exponencial indicando
el intereacutes del P cubensis por la proteiacutena siendo eacutesta utilizada por el mismo para
aumentar su tamantildeo y biomasa
Durante los diacuteas 4 y 10 las fermentaciones que conteniacutean concentraciones de 30
gL y 70 gL de sacarosa presentaron un alto consumo de proteiacutena a pesar de
que el P cubensis se encontraba en estos dos ensayos en fase estacionaria fase
en la cual no se requiere consumir grandes cantidades de sustrato puesto que el
hongo soacutelo necesitaba alimentarse para mantenerse o para producir productos no
ligados al crecimiento maacutes no para cambiar la cantidad de biomasa presente en el
medio Asimismo la concentracioacuten de 50 gL de sacarosa tambieacuten presentoacute un
alto consumo de proteiacutena durante los diacuteas 4 y 8 en donde se creiacutea estar en una
fase estacionaria temprana lo dicho anteriormente reitera una vez maacutes la afinidad
que el P cubensis presentoacute con respecto a las fuentes de proteiacutena usadas
333 Comparacioacuten entre el consumo de proteiacutena de P cubensis en los
cultivos sumergidos con diferentes fuentes de carbono
Con el fin de conocer cuaacutel de los dos tipos de sustrato empleado fue mayormente
consumido se realizoacute un anaacutelisis estadiacutestico
En el graacutefico 18 se ilustran las medias de consumo de proteiacutena (concentracioacuten)
arrojadas mediante el anaacutelisis estadiacutestico sobre el consumo de proteiacutena cuando se
utilizoacute glucosa o sacarosa en el medio y se evidencia que existen diferencias
significativas en cuanto a la concentracioacuten de proteiacutena en el tiempo en el medio
cuando se realizoacute el experimento con glucosa y cuando se utilizoacute sacarosa
arrojando asiacute dos grupos homogeacuteneos el primero (a) presenta una media de 465
gL mientras que el grupo dos (b) arroja un valor de media de 609 gL indicando
un menor consumo de proteiacutena por parte del P cubensis en el medio sumergido
73
de Fang-Zhong cuando se utilizoacute sacarosa como principal fuente de carbono
(Anexo 7)
Tratamientos de las dos fuentes de carbono usadas sin FA (glucosa y sacarosa)
Media glucosa (a) 465
Media sacarosa (b) 609
a
b
0
1
2
3
4
5
6
7
8
Conc
entr
acioacute
n pr
oteiacute
na (g
L)
Letras diferentes denotan diferencias significativas (prueba LSD)
Graacutefico 18 Consumo de proteiacutena para cada una de las fuentes de carbono utilizadas
334 Consumo de proteiacutena por P cubensis en medio sumergido utilizando
glucosa y FA en el medio
Una vez se obtuvo la concentracioacuten de proteiacutena en el medio para cada
concentracioacuten de FA utilizada se precedioacute a graficar dichos valores con respecto
al tiempo los cuales se ilustran en el graacutefico 19 ademaacutes se muestran en dicho
graacutefico las cineacuteticas de crecimiento de biomasa para cada ensayo
74
0
02
04
06
08
1
12
0
2
4
6
8
10
12
14
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Bio
mas
a (g
L)
Pro
teiacuten
a (g
L)
Tiempo (diacuteas)
05 gL 1 gL 15 gL 05 gL 1 gL 15 gL
Graacutefico 19 Cineacutetica de consumo de proteiacutena por parte del P cubensis en medio sumergido utilizando 50 gL de glucosa como fuente de carbono y
diferentes concentraciones de FA
De igual forma que para la fermentacioacuten que teniacutea 50 gL de glucosa en el medio
realizada anteriormente para dichos ensayos el consumo de proteiacutena fue
permanente y se dio casi en su totalidad El ensayo que mayor consumo de
proteiacutena presentoacute fue el que conteniacutea 05 gL de FA arrojando un porcentaje de
consumo del 86 aun asiacute el porcentaje de consumo arrojado por la fermentacioacuten
de 1 gL de FA fue del 84 indicando que no existen diferencias con respecto al
consumo de proteiacutena entre dichas cantidades de FA utilizadas Mientras que el
porcentaje de consumo para 15 gL de FA fue inferior presentando un valor del
72 De acuerdo a los resultados mencionados anteriormente se puede decir que
a mayor concentracioacuten de FA en el medio se presenta menor consumo de
proteiacutena por parte del P cubensis esto se puede afirmar uacutenicamente para los
resultados obtenidos durante esta investigacioacuten a ciertas condiciones
Analizando ahora la relacioacuten entre el consumo de proteiacutena y el crecimiento
micelial se puede ver que al igual que para los ensayos con glucosa a 50 gL se
75
tiene un consumo permanente mientras se estaacute en fase exponencial y una vez se
llega a la fase estacionario alrededor del diacutea 12 la concentracioacuten de proteiacutena en
el medio se estabilizoacute
A la hora de indagar los datos estadiacutesticamente se puede observar que no existen
diferencias significativas sobre el consumo de proteiacutena (concentracioacuten) en el
tiempo con respecto al tipo de sustrato pero al comparar los resultados con los
ensayos donde se antildeadioacute FA al medio se encontroacute que siacute existen diferencias
significativas Se crearon dos grupos homogeacuteneos el primero cuenta con glucosa
y sacarosa presentando medias (cantidad de proteiacutena en el medio) de 468 gL y
473 gL respectivamente mientras que el ensayo con FA se encuentra en otro
grupo en donde su consumo de proteiacutena fue menor presentando una media
(cantidad de proteiacutena en el medio) de 614 gL (Anexo 8)
Tratamientos con y sin FA
Media glucosa (a) 468
Media sacarosa Proteiacutena (a) 473
Media fenilalanina (b) 614
a a
b
0
1
2
3
4
5
6
7
8
Co
nce
ntr
acioacute
n p
rote
iacutena
(gL
)
Letras diferentes denotan diferencias significativas (prueba LSD)
Graacutefico 20 Consumo de proteiacutena para los ensayos con y sin FA
76
34 ESTUDIO CUALITATIVO DE LA PRESENCIA DEL ALCALOIDE
Posterior a las fermentaciones de glucosa sacarosa y glucosa 50 gL con FA y
los respectivos anaacutelisis se realizoacute un uacuteltimo anaacutelisis que a la vez fue el de mayor
relevancia a la hora de determinar cuaacutel de los medios fue el que mejores
resultados arrojoacute En primera instancia se utilizoacute el reactivo de Dragendorff como
indicador de alcaloide para analizar las muestras de los diacuteas 12 13 y 14 con el fin
de esclarecer la presencia de alcaloides (Anexo 17)
Una vez detectada la presencia de alcaloides gracias a la coloracioacuten naranja
presentada en las muestras se procedioacute a realizar la teacutecnica de HPLC con el fin
de hallar un porcentaje del compuesto de intereacutes basado en las aacutereas obtenidas
de los cromatogramas (asumiendo un tiempo de retencioacuten entre 62 y 72
minutos)
341 Produccioacuten de compuestos producidos por P cubensis cuando el
medio no conteniacutea FA
A la hora de analizar y confirmar cuaacutel fue el mejor ensayo de los experimentos
realizados se tuvo como criterio base determinar la fuente de carbono y su
respectiva concentracioacuten que mejor presencia del compuesto de intereacutes arrojoacute
supuesto a un tiempo de retencioacuten entre 62 y 72 minutos
Inicialmente al obtener los anaacutelisis estadiacutesticos se deduce que no existieron
diferencias significativas entre el aacuterea del pico de intereacutes con respecto a todos los
picos arrojados por el cromatograma y los factores estudiados (tipo de sustrato
diacutea de fermentacioacuten y concentracioacuten) puesto que se obtuvieron valores de P-valor
77
de 03310 09580 y 08336 respectivamente es decir no importa queacute tipo de
sustrato se utilice la produccioacuten de alcaloide no tendraacute variaciones (Anexo 9)
Al analizar el graacutefico 21 se puede observar que las medias de las aacutereas halladas
para los diferentes ensayos con glucosa y sacarosa no presentaron diferencias
significativas es decir pertenecen al mismo grupo homogeacuteneo (a) lo que ratifica
lo dicho anteriormente
Tratamiento de las dos fuentes de carbono usadas sin FA (glucosa y sacarosa)
Media glucosa (a) 235916
Media sacarosa (a) 337147
a
a
0
7000
14000
21000
28000
35000
42000
Aacutere
a de
Com
pues
to
Letras diferentes denotan diferencias significativas (prueba LSD)
Graacutefico 21 Aacuterea del compuesto obtenido de P cubensis en tiempo de retencioacuten entre 62 y 72 minutos para las dos fuentes de carbono
Por tal razoacuten fue necesario hacer un anaacutelisis cualitativo de los cromatogramas
obtenidos mediante HPLC el cual se basoacute en la forma del pico arrojado por la
teacutecnica La figura 6 ilustra dicho anaacutelisis
78
Buena resolucioacuten de pico Mala resolucioacuten de pico
(a) (b)
Figura 6 Cromatogramas de dos diferentes fermentaciones de P cubensis que ilustran el criterio de escogencia del mejor ensayo realizado (a) 50 gL
glucosa (b) 50 gL sacarosa
Primero fue necesario observar el tamantildeo del pico y posterior a eacutesto determinar
su resolucioacuten La figura 6 ilustra dos ejemplos el de 50 gL de glucosa el diacutea 13 y
50 gL de sacarosa el diacutea 14 mientras el primero muestra un pico grande y
definido la segunda fermentacioacuten ilustra un pico grande pero poco definido
indicando que en este caso no se resolvioacute correctamente el alcaloide es decir no
se logroacute una buena separacioacuten De esta manera se analizaron los diferentes
cromatogramas para los diacuteas 12 (Anexo 19) 13 (Anexo 20) y 14 (Anexo 21) de
cada fermentacioacuten arrojando diferencias entre los ensayos y llevando a la
conclusioacuten de que la fermentacioacuten que mejores resultados arrojoacute fue la que
conteniacutea 50 gL de glucosa
79
342 Produccioacuten de compuestos producidos por P cubensis cuando el
medio conteniacutea FA
Despueacutes de realizada la fermentacioacuten con glucosa 50 gL y concentraciones de
FA de 05 gL 10 gL y 15 gL se procedioacute de igual manera que en el estudio sin
FA a evaluar cuaacutel de estas tres concentraciones de FA exhibioacute mejor resolucioacuten
del alcaloide
Inicialmente se realizoacute un anaacutelisis estadiacutestico el cual arrojoacute que no existen
diferencias significativas con respecto al aacuterea de pico que en este caso debido al
supuesto representa la Psilocibina y los diacuteas 12 13 y 14 de la fermentacioacuten
Mediante el graacutefico 22 se puede decir que en los uacuteltimos tres diacuteas de las
fermentaciones que conteniacutean FA en el medio no existen diferencias significativas
con respecto al alcaloide de intereacutes obtenido es decir en los tres se produjo el
alcaloide (Anexo 10)
Tratamientos de los uacuteltimos tres diacuteas de fermentacioacuten usando FA
Media diacutea 12 (a) 411758
Media diacutea 13 (a) 413401
Media diacutea 14 (a) 44860
a a a
0
10000
20000
30000
40000
50000
Aacutere
a Co
mpu
esto
Letras diferentes denotan diferencias significativas
Graacutefico 22 Aacuterea del compuesto obtenido de P cubensis en tiempo de retencioacuten entre 62 y 72 minutos en los uacuteltimos tres diacuteas de la fermentacioacuten
con FA y glucosa
80
Igual que en numeral anterior fue necesario realizar anaacutelisis cualitativo para los
cromatogramas por ende se requirioacute observar el tamantildeo del pico y posterior a
eacutesto determinar su resolucioacuten
Buena resolucioacuten de pico Mala resolucioacuten de pico
(a) (b)
Figura 7 Cromatogramas de dos diferentes fermentaciones de P cubensis que ilustran el criterio de escogencia del mejor ensayo realizado (a) 05 gL
FA (b) 15 gL FA
La figura 7 ejemplifica el anaacutelisis realizado para la seleccioacuten del mejor ensayo
ejecutado Se tienen dos cromatogramas el de 05 gL de FA en el diacutea 13 y el de
15 gL de FA para el mismo diacutea
A todos los cromatogramas obtenidos para los diacuteas 12 (Anexo 19) 13 (Anexo 20)
y 14 (Anexo 21) se realizoacute el mismo anaacutelisis y se concluyoacute que la concentracioacuten
maacutes apropiada para la obtencioacuten de la los compuestos producidos por P cubensis
fue de 05 gL de FA debido a que eacuteste generariacutea una disminucioacuten en los costos
81
35 ESTUDIO PORCENTUAL (AacuteREA) DEL ALCALOIDE REALIZADO PARA
LOS DIFERENTES ENSAYOS
Se calculoacute el porcentaje de aacuterea correspondiente al pico que identificoacute que se
asumioacute como el correspondiente a la Psilocibina gracias a la suposicioacuten realizada
del tiempo de retencioacuten
A continuacioacuten se presentan los valores obtenidos y sus respectivos anaacutelisis para
cada tratamiento
351 Porcentaje de la Psilocibina (suposicioacuten) cuando el medio no conteniacutea
FA
Debido a que no se contaba con un estaacutendar de Psilocibina los resultados
mostrados en la tabla 5 se obtuvieron realizando un porcentaje con respecto a las
aacutereas bajo la curva arrojadas mediante el anaacutelisis de cromatografiacutea de alta
eficiencia (Anexos 19 20 y 21) En dichos anexos se encuentran resaltadas en
negrilla aquellas aeacutereas utilizadas
Tabla 5 Porcentaje de aacuterea hallado mediante HPLC para los uacuteltimos tres diacuteas de la fermentacioacuten con concentraciones de 30 gL 50 gL y 70 gL de glucosa
y sacarosa con un tiempo de retencioacuten de 62 y 72 minutos
Diacutea Glucosa
(gL)
Aacuterea
(compuesto
Tr= 62-72)
Sacarosa
(gL)
Aacuterea
(compuesto
Tr= 62-72)
12 30 60650 30 3664
12 50 7396 50 5857
12 70 4816 70 3415
13 30 702 30 2876
13 50 6815 50 4113
13 70 6733 70 5583
14 30 4824 30 2756
14 50 4821 50 2792
14 70 017 70 1429
82
A la hora de analizar los datos de la tabla 5 se puede observar que el mayor
porcentaje de aacuterea se obtuvo cuando se trabajoacute con glucosa como fuente de
carbono y concretamente a una concentracioacuten de 50 gL
Analizando los datos estadiacutesticamente no se obtuvieron diferencias significativas
en cuanto a la produccioacuten del compuesto (aacuterea) con respecto al tipo de sustrato
utilizado durante las fermentaciones es decir es indiferente si se utiliza glucosa o
sacarosa en el cultivo de P cubensis en medio sumergido de Fang-Zhong
El graacutefico 23 ilustra las medias (aacuterea) obtenidas para la produccioacuten de alcaloide en
las dos diferentes fuentes de carbono es decir glucosa y sacarosa exponiendo
un uacutenico grupo homogeacuteneo con medias (produccioacuten de alcaloide) de aacutereas de
219635 y 234391 para glucosa y sacarosa respectivamente (Anexo 11)
Tratamientos de las dos fuentes de carbono usadas sin FA (glucosa y sacarosa)
Media glucosa (a) 219635
Media sacarosa (a) 234391
a
a
2000
2100
2200
2300
2400
Aacuterea
Com
pues
to
Letras diferentes denotan diferencias significativas (prueba LSD)
Graacutefico 23 Aacuterea del compuesto obtenido de P cubensis en tiempo de retencioacuten entre 62 y 72 minutos para cada una de las fuentes de carbono
utilizadas
Aun asiacute estudiando los graacuteficos de HPLC con el criterio mencionado
anteriormente es decir observando el tamantildeo del pico y su resolucioacuten del mismo
83
se observoacute claramente que la presencia del alcaloide (tiempo de retencioacuten
supuesto entre 62 y 72 minutos) fue mejor cuando se trabajoacute con glucosa a una
concentracioacuten de 50 gL debido que presenta el mejor pico
352 Porcentaje de aacuterea de compuestos presentes en P cubensis cuando
el medio conteniacutea FA
Con el fin de observar si la adicioacuten de FA al medio si arrojoacute mejores resultados en
cuanto a la produccioacuten del compuesto presente entre un rango de 62 y 72
minutos como tiempo de retencioacuten se procedioacute a calcular el porcentaje del aacuterea
de intereacutes de acuerdo a las aacutereas arrojadas para cada ensayo por medio del
anaacutelisis de HPLC Los datos obtenidos se ilustran a continuacioacuten en la tabla 6
Tabla 6 Porcentaje hallado mediante HPLC para los uacuteltimos tres diacuteas de la fermentacioacuten con concentraciones de 05 gL 10 gL y 15 gL de FA y 50 gL
de glucosa con un tiempo de retencioacuten entre 62 y 72 minutos
Diacutea
Glucosa
50 gL +
FA
Aacuterea
(compuesto
Tr=62-72)
12 0 4315
12 05 2931
12 1 6236
12 15 847
13 0 3257
13 05 7549
13 1 4790
13 15 2721
14 0 4822
14 05 3863
14 1 5801
14 15 2102
84
Al detallar la tabla 6 puede observarse que el ensayo que mayor porcentaje de
aacuterea arrojoacute fue el que conteniacutea 05 gL de FA arrojando su maacuteximo porcentaje
correspondiente a 755 el diacutea 13 Aun asiacute las diferencias existentes entre ellos
no fueron significativas
Ahora bien al analizarlos estadiacutesticamente se encontroacute que la produccioacuten del
alcaloide en presencia de FA presentoacute la misma tendencia que los ensayos
analizados anteriormente sin eacutesta pero gracias a que este aminoaacutecido duplico la
cantidad de biomasa y debido a que el compuesto de intereacutes se produce
intracelularmente se afirma que el uso de FA aumentoacute la generacioacuten del
compuesto evaluado (Anexo 12)
El graacutefico 24 presenta las diferentes medias en cuanto al porcentaje de aacuterea del
compuesto presente entre 62 y 72 minutos para los diferentes tratamientos de
glucosa a una concentracioacuten de 50 gL y sus concentraciones respectivas de FA
Claramente se ve que soacutelo existe un grupo homogeacuteneo lo que reafirma que no
existen diferencias significativas de la produccioacuten con respecto a las
concentraciones de FA
85
Tratamientos con y sin FA
Media 0 gL FA (a) 3122
Media 05 gL FA (a) 2391
Media 10 gL FA (a) 2823
Media 15 gL FA (a) 2113
a
aa
a
0
5
10
15
20
25
30
35
40
Aacutere
a Co
mpu
esto
Letras diferentes denotan diferencias significativas (prueba LSD)
Graacutefico 24 Aacuterea del compuesto obtenido de P cubensis en tiempo de retencioacuten entre 62 y 72 minutos para cada una de las concentraciones de
FA utilizadas
Debido a que no se encontraron diferencias significativas en cuanto al porcentaje
de aacuterea obtenido mediante los cromatogramas se concluye que el mejor medio es
el que tiene como fuente de carbono glucosa a una concentracioacuten de 50 gL y una
adicioacuten de 05 gL de FA puesto que genera una disminucioacuten en costos
86
CONCLUSIONES
No existen diferencias significativas en el crecimiento micelial de P
cubensis en medio sumergido Fang-Zhong cuando se trabaja con fuentes
de carbono glucosa y sacarosa sin embargo se decide trabajar con 50 gL
de glucosa puesto que eacuteste tiene una buena presencia de alcaloide y a su
vez una mejor produccioacuten de biomasa
La concentracioacuten de glucosa utilizada para el crecimiento de P cubensis
influye en el crecimiento micelial obteniendo concentraciones de biomasa
de 062 gL 055 gL y 048 gL para concentraciones de sustrato de 70 50
y 30 gL de glucosa siendo las dos primeras significativamente diferentes
con respecto a la de 30 gL
La concentracioacuten de sacarosa utilizada para el crecimiento de P cubensis
influye en el crecimiento micelial obteniendo concentraciones de biomasa
de 057 gL 045 gL y 026 gL para concentraciones de sustrato de 70 50
y 30 gL de sacarosa siendo significativamente diferentes entre ellas
La resolucioacuten de los picos obtenidos por RP-HPLC del extracto de P
cubensis fue mayor para las fermentaciones realizadas con una
concentracioacuten de 50 gL de glucosa lo que conllevoacute a utilizarlo al realizar
los ensayos que conteniacutean en el medio FA
La concentracioacuten de biomasa de P cubensis obtenida en cultivo sumergido
en medio Fang-Zhong con glucosa se duplicoacute con la adicioacuten de FA No
obstante no existen diferencias significativas entre las concentraciones de
FA utilizadas
87
El consumo de proteiacutena presentada por P cubensis en medio Fang-Zhong
fue casi del 100 mientras que el consumo de sustrato para el mismo
medio estuvo alrededor del 40
El consumo de sustrato durante el transcurso de las fermentaciones que no
conteniacutean FA en el medio no presentoacute diferencias significativas con
respecto a las dos fuentes de carbono utilizadas Mientras que en aquellas
fermentaciones donde se agregoacute FA al medio siacute existieron diferencias
significativas entre las fermentaciones de 15 y 1 gL de FA con respecto a
los ensayos realizados con 05 gL FA Sin embargo el P cubensis
consumioacute mayor cantidad de sustrato cuando el medio no conteniacutea FA
Se evidencioacute que el P cubensis consumioacute mayor cantidad de proteiacutena
cuando el sustrato utilizado en el medio fue glucosa y a su vez se detecto
que la adicioacuten de FA al medio tuvo como efecto la disminucioacuten en el
consumo de sustrato por parte del microorganismo
El consumo de sustrato y de proteiacutena tuvo un comportamiento similar
puesto que fue consumido permanentemente durante la fase exponencial
para cada uno de los tratamientos realizados es decir las concentraciones
de 30 gL 50 gL y 70 gL de glucosa y sacarosa como fuente de carbono y
de 05 gL 1 gL y 15 gL de FA teniendo como fuente de carbono glucosa
a una concentracioacuten de 50 gL mientras que en la fase estacionaria su
consumo se disminuyoacute permaneciendo casi constante
Despueacutes de realizados los estudios en cuanto a la produccioacuten del
compuesto presente entre 62 y 72 minutos para cada uno de los ensayos
no se evidenciaron diferencias significativas entre las dos fuentes de
carbono utilizadas (glucosa y sacarosa)
88
La adicioacuten del precursor llamado Fenilalanina (FA) al medio sumergido
Fang-Zhong para llevar a cabo el cultivo del P cubensis tuvo influencia en
cuanto a la produccioacuten de compuesto presente entre tiempo de retencioacuten de
62 y 72 minutos debido a que eacuteste duplicoacute la concentracioacuten de biomasa
en el medio se dice entonces que la produccioacuten aumentoacute al ser eacuteste de
produccioacuten intracelular
La resolucioacuten del compuesto presente entre el tiempo de retencioacuten de 62 a
72 minutos se obtuvo mejor en el ensayo que conteniacutea 05 gL de FA y al
saber que no existieron diferencias significativas en la produccioacuten en cuanto
al porcentaje de aacutereas obtenido con respecto a las demaacutes concentraciones
de FA se afirma que eacuteste es el medio que mejores resultados arrojoacute para
el crecimiento de P cubensis y la produccioacuten de Psilocibina
89
RECOMENDACIONES
Se sugiere observar el efecto que tiene la variacioacuten de las revoluciones a
las cuales se realizaron las fermentaciones para ver como variacutea el
crecimiento del P cubensis en medio sumergido Fang-Zhong con respecto
a dicho factor
Debido a que soacutelo se realizaron anaacutelisis sobre el crecimiento del P
cubensis en medio sumergido haciendo uso de dos sustratos diferentes
(glucosa y sacarosa) seriacutea recomendable realizar el mismo anaacutelisis para
otro tipo de sustrato como por ejemplo melaza por su bajo costo
Del mismo modo seriacutea apropiado realizar el estudio con otro tipo de
precursor y en otras concentraciones para ver la incidencia de eacuteste en el
comportamiento del hongo
Se recomienda realizar un escalamiento de dicho proceso en un biorreactor
con el fin de evaluar a mayor escala el crecimiento del P cubensis y la
produccioacuten del alcaloide
Debido a que la proteiacutena se comportoacute como el principal nutriente se sugiere
para una proacutexima investigacioacuten evaluar diferentes concentraciones de
proteiacutena en el medio
90
ANEXOS
Anexo 1 Anaacutelisis de varianza (ANOVA) para el crecimiento de biomasa de
las fermentaciones con glucosa
Tabla 7 Anaacutelisis de Varianza para el crecimiento micelial (glucosa)
Tabla 8 Anaacutelisis Muacuteltiple de Rangos para el crecimiento micelial (glucosa)
91
Anexo 2 Anaacutelisis de Varianza (ANOVA) para el crecimiento de biomasa de
las fermentaciones con sacarosa
Tabla 9 Anaacutelisis de Varianza para el crecimiento micelial (sacarosa)
Tabla 10 Anaacutelisis Muacuteltiple de Rangos para el crecimiento micelial (sacarosa)
92
Anexo 3 Anaacutelisis de Varianza (ANOVA) para el crecimiento de biomasa de
las fermentaciones con glucosa y sacarosa
Tabla 11 Anaacutelisis de Varianza para el crecimiento micelial (glucosa y
sacarosa)
Tabla 12 Anaacutelisis Muacuteltiple de Rangos para el crecimiento micelial (glucosa y
sacarosa)
93
Anexo 4 Anaacutelisis de Varianza (ANOVA) para el crecimiento de biomasa de
las fermentaciones con glucosa 50 gL y FA
Tabla 13 Anaacutelisis de Varianza para el crecimiento micelial (glucosa 50 gL y
FA)
Tabla 14 Anaacutelisis Muacuteltiple de Rangos para el crecimiento micelial (glucosa
50 gL y FA)
94
Anexo 5 Anaacutelisis de varianza (ANOVA) para el consumo de sustrato en las
fermentaciones sin FA
Tabla 15 Anaacutelisis de Varianza para el consumo de Sustrato sin FA
Tabla 16 Anaacutelisis Muacuteltiple de Rangos para el consumo de Sustrato sin FA
95
Anexo 6 Anaacutelisis de Varianza (ANOVA) para el consumo de sustrato en las
fermentaciones con FA
Tabla 17 Anaacutelisis de Varianza para el consumo de Sustrato con FA
Tabla 18 Anaacutelisis Muacuteltiple de Rangos para el consumo de Sustrato con FA
96
Anexo 7 Anaacutelisis de Varianza (ANOVA) para el consumo de proteiacutena en las
fermentaciones sin FA
Tabla 19 Anaacutelisis de Varianza para el consumo de Proteiacutena sin FA
Tabla 20 Anaacutelisis Muacuteltiple de Rangos para el consumo de Proteiacutena sin FA
97
Anexo 8 Anaacutelisis de Varianza (ANOVA) para el consumo de proteiacutena en las
fermentaciones con FA
Tabla 21Anaacutelisis de Varianza para el consumo de Proteiacutena con FA
Tabla 22 Anaacutelisis Muacuteltiple de Rangos para el consumo de Proteiacutena con FA
98
Anexo 9 Anaacutelisis de Varianza (ANOVA) para la produccioacuten de Psilocibina en
las fermentaciones sin FA
Tabla 23 Anaacutelisis de Varianza para la produccioacuten de Psilocibina sin FA
Tabla 24 Anaacutelisis Muacuteltiple de Rangos para la produccioacuten de Psilocibina
seguacuten el Sustrato sin FA
99
Anexo 10 Anaacutelisis de Varianza (ANOVA) para la produccioacuten de Psilocibina en las fermentaciones con FA
Tabla 25 Anaacutelisis de Varianza para la produccioacuten de Psilocibina con FA
Tabla 26 Anaacutelisis Muacuteltiple de Rangos para la produccioacuten de Psilocibina
seguacuten el diacutea con FA
100
Anexo 11 Anaacutelisis de Varianza (ANOVA) para la cuantificacioacuten porcentual de
Psilocibina en las fermentaciones sin FA
Tabla 27 Anaacutelisis de Varianza para la cuantificacioacuten de Psilocibina sin FA
Tabla 28 Anaacutelisis Muacuteltiple de Rangos para la cuantificacioacuten de Psilocibina
seguacuten el tipo de sustrato sin FA
101
Anexo 12 Anaacutelisis de Varianza (ANOVA) para la cuantificacioacuten porcentual de
Psilocibina en las fermentaciones con FA
Tabla 29 Anaacutelisis de Varianza para la cuantificacioacuten de Psilocibina con FA
Tabla 30 Anaacutelisis Muacuteltiple de Rangos para la cuantificacioacuten de Psilocibina
seguacuten la concentracioacuten con FA
102
Anexo 13 Determinacioacuten de consumo de azuacutecares por el meacutetodo de DNS
(Aacutecido Dinitrosaliciacutelico)
a DNS para glucosa
Pasos para preparar DNS
Disolver 16 gr de NaOH en agua destilada
Adicionar 30 gr de tartrato de Na y K
Aforar a 100 ml con agua destilada
Almacenar en frascos aacutembar a 4degC
Se debe mantener un stock de glucosa 4mgml y almacenarlo a 4degC A partir
de la solucioacuten de glucosa se preparan las soluciones para hacer la curva
patroacuten con las siguientes concentraciones (gL) 025 050 100 200 y 400
Procedimiento
Tomar 05 ml de cada dilucioacuten y agregar 05 ml de reactivo DNS
Preparar una muestra blanco por dilucioacuten de 05 ml de agua destilada a 05
ml de reactivo de DNS
Agitar todas las muestras
Colocar a ebullir las muestras en bantildeo mariacutea por cinco minutos
Enfriar con hielo
Adicionar 5 ml de agua destilada
Agitar y dejar en reposo 15 minutos
Leer en espectrofotoacutemetro a 540 nm
Realizar la curva Absorbancia Vs Concentracioacuten Debe tener un coeficiente
de correlacioacuten de 0991 a 0999
b DNS para sacarosa
Pasos para preparar DNS sacarosa
Preparacioacuten de la solucioacuten Standard stock de sacarosa (30 gL) tomar 30
gr de sacarosa anhiacutedrida grado reactivo con exactitud hasta la deacutecima de
mg disolver ajustar a aforo de 100 ml con agua desionizada empacar en
viales y almacenar en congelador
Preparacioacuten DNS pesar 16 gr de hidroacutexido de sodio grado reactivo 30 gr
de tartrato de sodio y potasio y disolverlos juntos con 50 ml de agua
103
desionizada aparte pesar 10 gr del DNS disolver con 30 ml de agua
desionizada agregar lentamente y con agitacioacuten la solucioacuten del DNS a la
solucioacuten de tartrato y NaOH anteriormente preparadas ajustar a 100 ml
filtrar envasar en frasco aacutembar y rotular con fecha de vencimiento incluida
(3 meses maacuteximo) mantener a la temperatura del laboratorio
Preparacioacuten del reactivo NaOH 10 N (500 ml) pesar con exactitud hasta
la deacutecima de mg 20 gr de NaOH grado reactivo por cada 500 ml de
solucioacuten disolver primero con 300 ml de agua desionizada y luego aforar a
500 ml envasar y rotular correctamente y mantener a la temperatura del
laboratorio
Preparacioacuten de HCL 10 (100 ml) tomar 27 ml de aacutecido clorhiacutedrico al
37 grado reactivo y aforar hasta 100 ml con agua desionizada envasar
rotular correctamente de acuerdo a la norma del laboratorio y almacenar a
la temperatura del laboratorio
Se debe mantener un stock de glucosa 30 gL y almacenarlo a 4degC A partir
de la solucioacuten de glucosa se preparan las soluciones para hacer la curva
patroacuten con las siguientes concentraciones (gL) 3 6 12 18 24 y 30
Procedimiento
Preparar en cada tubo (las soluciones de la curva patroacuten de sacarosa las
muestras problemas diluidas si es necesario y como blanco agua
desionizada) 100microl de solucioacuten
Adicionar 200 microl de HCL 10 a cada tubo y agitar todos los tubos en vortex
Llevar a ebullicioacuten por 10 minutos en bantildeo mariacutea precalentado a 95degC
Enfriar hasta temperatura ambiente raacutepidamente
Adicionar a cada tubo 1 ml de NaOH 10 N y agitar los tubos en vortex
Aparte tomar 05 ml de cada tubo en otros tubos rotulados y agregar 05 ml
del DNS
Agitar todas las muestras en vortex
Llevar a ebullicioacuten por 5 minutos en bantildeo mariacutea precalentado a 96degC
Enfriar hasta temperatura ambiente raacutepidamente
Adicionar 5 ml de H2O desionizada agitar en vortex y dejar reposar por 15
minutos
Leer en espectrofotoacutemetro a 540 nm
Realizar la curva Absorbancia Vs Concentracioacuten Debe tener un coeficiente
de correlacioacuten de 0991 a 0999
104
Anexo 14 Cineacutetica de Consumo de Sustrato
La cineacutetica de consumo de sustrato se realizoacute por el meacutetodo de Aacutecido
Dinitrosaliciacutelico (DNS) Los rangos de concentracioacuten y absorbancia para cada caso
se citan a continuacioacuten
Rangos de concentraciones y absorbancias para las fermentaciones que
usaron glucosa (30 gL 50 gL y 70 gL) como sustrato
Concentracioacuten de 02 a 12 gL
Absorbancia de 01234 a 06612
Ecuacioacuten Y = 19174x -00517 R2 = 09923
Rangos de concentraciones y absorbancias para las fermentaciones que
usaron sacarosa (30 gL 50 gL y 70 gL) como sustrato
Concentracioacuten de 3 a 30 gL
Absorbancia de 00822 a 11112
Ecuacioacuten Y = 25983x + 04857 R2 = 09978
Rangos de concentraciones y absorbancias para las fermentaciones que
usaron glucosa 50 gL como sustrato y FA
Concentracioacuten de 02 a 12 gL
Absorbancia de 0097 a 063
Ecuacioacuten Y = 18785x + 00019 R2 = 09986
105
Anexo 15 Determinacioacuten de consumo de proteiacutenas por el meacutetodo de LOWRY
Pasos para la preparacioacuten de LOWRY
Para obtener la curva estaacutendar de Albuacutemina se preparan 5 soluciones
patrones de Albuacutemina en NaCL al 09 (PV) de las siguientes
concentraciones 152 80 200 300 400 Pgml Si la concentracioacuten de
Proteiacutena total es menor de 500 Pgml se lee la absorbancia a 750 nm si
estaacute entre 1000 y 2000 Pgml se lee a 550nm
Se prepara un blanco que no lleva Albuacutemina y en su reemplazo se adiciona
0-5 ml de solucioacuten salina (NaCL) al 09 (PV) Se aplica el mismo
procedimiento que a las demaacutes muestras
Procedimiento
Servir en tubos de ensayo 05 ml de las soluciones patroacuten de Albuacutemina las
muestras problema y NaCL al 09 como blanco Deben estar marcados
para conservar el orden de concentraciones para la curva
Adicionar a cada tubo 05 ml de NaOH 2N y llevar al bantildeo Mariacutea
precalentado a 100degC por un tiempo de 10 minutos
Dejar enfriar hasta que alcance la Temperatura Ambiente
Agregar a cada tubo 5 ml de la solucioacuten complejante mezclar y dejar
reposar por 10 minutos
Adicionar 05 ml del reactivo de Folin-Ciocalteu 11 vortexiar durante 20
segundos
Reposar en un cuarto oscuro durante 30 minutos
Leer la absorbancia a 750 nm y con las soluciones patroacuten construir la
graacutefica Absorbancia Vs Concentracioacuten de Albuacutemina Seacuterica de Bovina
(BSA) con eacutesta se puede determinar la concentracioacuten de las muestras
problema interpolando el valor de la Absorbancia La curva estaacutendar debe
tener un coeficiente de correlacioacuten de 0991 a 0999
106
Anexo 16 Cineacutetica consumo de Proteiacutena
La cineacutetica de consumo de proteiacutena se realizoacute por el meacutetodo LOWRY Los rangos
de concentracioacuten y absorbancia para cada caso se citan a continuacioacuten
Rangos de concentraciones y absorbancias para las fermentaciones que
usaron glucosa (30 gL 50 gL y 70 gL) como sustrato
Concentracioacuten de 0016 a 04 gL
Absorbancia de 00094 a 05382
Ecuacioacuten Y = 07427x ndash 00021 R2 = 09955
Rangos de concentraciones y absorbancias para las fermentaciones que
usaron sacarosa (30 gL 50 gL y 70 gL) como sustrato
Concentracioacuten de 0016 a 04 gL
Absorbancia de 00374 a 06178
Ecuacioacuten Y = 06567x ndash 00166 R2 = 09968
Rangos de concentraciones y absorbancias para las fermentaciones que
usaron glucosa 50 gL como sustrato y FA
Concentracioacuten de 0016 a 04 gL
Absorbancia de 00708 a 04647
Ecuacioacuten Y = 09814x ndash 00581 R2 = 09992
107
Anexo 17 Prueba de reactivo de Dragendorff
Preparacioacuten de reactivo de Dragendorff para alcaloides
Reactivo de Dragendorff se prepara mezclando 8 gr de nitrato de bismuto
pentahidratado en 20 ml de aacutecido niacutetrico al 30 con una solucioacuten de 272 g de
yoduro de potasio en 50 ml de agua Se deja en reposo por 24 horas se decanta y
se afora a 100 ml La presencia de alcaloides se detecta por la formacioacuten de un
precipitado naranja rojizo cuando se le adiciona esta reactivo a una solucioacuten aacutecida
de alcaloides De los precipitados lavados se puede recuperar los alcaloides con
una solucioacuten saturada de carbonato de sodio (Mercano y Hasegawa 1991)
La figura mostrada a continuacioacuten refleja la presencia del alcaloide debido a la
coloracioacuten amarillo-rojiza que eacutesta sufrioacute
Figura 8 Muestra de biomasa una vez analizada mediante el reactivo de Dragendorff
108
Anexo 18 Barrido Espectral para el Psilocybe cubensis
La metodologiacutea mencionada a continuacioacuten estaacute basada en artiacuteculo base
(Tsujikawa et al 2003)
El Sistema de HPLC consiste en un Shimadzu LC-10ordf Series Cromatografiacutea
Liacutequida equipada con un diodo SPD-M10A detector de red fija en 220nm La
separacioacuten cromatograacutefica ser realizoacute con una columna simeacutetrica C18 (21 mm a
150 mm 5mm Waters Assoc Milford EEUU
La fase moacutevil utilizada fue de 10 mm de formato de amonio-aacutecido foacutermico (955
VV) a un pH de 35 y bombeado a un caudal de 02 mlminuto
El perfil cromatograacutefico obtenido durante la investigacioacuten de Tsujikawa et al
(2003) se muestra en le figura 6 que aparece a continuacioacuten
Figura 9 Perfil cromatograacutefico (Tsujikawa et al 2003)
109
Anexo 19 Cromatogramas (HPLC) del diacutea 12 de fermentacioacuten
Tabla 31 Aacutereas obtenidas de los cromatogramas para el P cubensis en
medio Fang-Zhong en el diacutea 12 para concentraciones de 30gL glucosa y
30gL sacarosa
SustratoConcentracioacuten
(gL)
Tiempo
(s)Aacuterea
Glucosa 30 2957 3837
Glucosa 30 6838 474753
Glucosa 30 9144 47256
Glucosa 30 9489 16822
Glucosa 30 10124 224349
Sacarosa 30 6538 143772
Sacarosa 30 7234 269458
Sacarosa 30 9721 33646
Sacarosa 30 11845 24384
(a) (b)
Graacutefico 25 Cromatogramas del diacutea 12 para el P cubensis cultivado en medio
sumergido Fang-Zhong con dos diferentes tipos de sustratos (a) 30 gL
glucosa (b) 30 gL sacarosa
110
Tabla 32 Aacutereas obtenidas de los cromatogramas para el P cubensis en
medio Fang-Zhong en el diacutea 12 para concentraciones de 50gL glucosa y
50gL sacarosa
SustratoConcentracioacuten
(gL)
Tiempo
(s)Aacuterea
Glucosa 50 0524 319
Glucosa 50 6298 5991
Glucosa 50 7172 237042
Glucosa 50 9144 16387
Glucosa 50 10009 6077
Sacarosa 50 169 24011
Sacarosa 50 3105 28573
Sacarosa 50 6916 112166
Sacarosa 50 9136 4057
Sacarosa 50 9933 8821
Sacarosa 50 10398 13872
(a) (b)
Graacutefico 26 Cromatogramas del diacutea 12 para el P cubensis cultivado en medio
sumergido Fang-Zhong con dos diferentes tipos de sustratos (a) 50 gL
glucosa (b) 50 gL sacarosa
111
Tabla 33 Aacutereas obtenidas de los cromatogramas para el P cubensis en
medio Fang-Zhong en el diacutea 12 para concentraciones de 50gL glucosa y
50gL sacarosa
SustratoConcentracioacuten
(gL)
Tiempo
(s)Aacuterea
Glucosa 70 7217 168598
Glucosa 70 9145 9977
Glucosa 70 997 80558
Sacarosa 70 6803 287387
Sacarosa 70 7517 131049
Sacarosa 70 7775 4434
Sacarosa 70 7871 77109
Sacarosa 70 823 96239
Sacarosa 70 9039 5114
Sacarosa 70 9778 25394
(a) (b)
Graacutefico 27 Cromatogramas del diacutea 12 para el P cubensis cultivado en medio
sumergido Fang-Zhong con dos diferentes tipos de sustratos (a) 50 gL
glucosa (b) 50 gL sacarosa
112
Tabla 34 Aacutereas obtenidas de los cromatogramas para el P cubensis en
medio Fang-Zhong en el diacutea 12 para concentraciones de 50gL y glucosa
50gL sacarosa
SustratoConcentracioacuten
(gL)
Tiempo
(s)Aacuterea
Glucosa 50 05 0818 4722
Glucosa 50 05 2423 52579
Glucosa 50 05 3502 88765
Glucosa 50 05 6137 16009
Glucosa 50 05 6722 275258
Glucosa 50 05 733 226399
Glucosa 50 05 8339 65139
Glucosa 50 05 9101 36797
Glucosa 50 05 9815 130883
Glucosa 50 1 1105 743
Glucosa 50 1 2746 2701
Glucosa 50 1 4304 80304
Glucosa 50 1 6167 19649
Glucosa 50 1 6794 51753
Glucosa 50 1 8282 82997
Glucosa 50 1 9116 38659
Glucosa 50 1 9899 136953
Glucosa 50 15 1198 3313
Glucosa 50 15 2937 37875
Glucosa 50 15 4332 51079
Glucosa 50 15 614 25602
Glucosa 50 15 6737 668905
Glucosa 50 15 8209 107332
Glucosa 50 15 9602 38902
Glucosa 50 15 9752 139613
Diacutea 12
(a) (b)
(c)
Graacutefico 28 Cromatograma del diacutea 12 para el P cubensis cultivado en medio
sumergido Fang-Zhong con fuente de carbono glucosa y adicioacuten de
fenilalanina en tres concentraciones (a) 05 gL FA (b) 1 gL FA (c) 15gL
FA
113
Anexo 20 Cromatogramas (HPLC) del diacutea 13 de fermentacioacuten
Tabla 35 Aacutereas obtenidas de los cromatogramas para el P cubensis en
medio Fang-Zhong en el diacutea 13 para concentraciones de 30gL glucosa y
30gL sacarosa
SustratoConcentracioacuten
(gL)
Tiempo
(s)Aacuterea
Glucosa 30 0225 1155
Glucosa 30 2847 699
Glucosa 30 4043 1038
Glucosa 30 6231 4994
Glucosa 30 6787 295182
Glucosa 30 7462 241146
Glucosa 30 9066 51836
Glucosa 30 10004 158746
Sacarosa 30 1734 135
Sacarosa 30 5838 1857
Sacarosa 30 6803 147867
Sacarosa 30 7305 30464
Sacarosa 30 7599 174643
Sacarosa 30 9107 8564
Sacarosa 30 9897 104278
(a) (b)
Graacutefico 29 Cromatogramas del diacutea 13 para el P cubensis cultivado en medio
sumergido Fang-Zhong con dos diferentes tipos de sustratos (a) 30 gL
glucosa (b) 30 gL sacarosa
114
Tabla 36 Aacutereas obtenidas de los cromatogramas para el P cubensis en
medio Fang-Zhong en el diacutea 13 para concentraciones de 50gL glucosa y
50gL sacarosa
SustratoConcentracioacuten
(gL)
Tiempo
(s)Aacuterea
Glucosa 50 1408 13982
Glucosa 50 6949 331449
Glucosa 50 9012 25201
Glucosa 50 9936 27216
Sacarosa 50 1543 7293
Sacarosa 50 6813 437765
Sacarosa 50 9085 35897
Sacarosa 50 10049 184461
(a) (b)
Graacutefico 30 Cromatogramas del diacutea 13 para el P cubensis cultivado en medio
sumergido Fang-Zhong con dos diferentes tipos de sustratos (a) 50 gL
glucosa (b) 50 gL sacarosa
115
Tabla 37 Aacutereas obtenidas de los cromatogramas para el P cubensis en
medio Fang-Zhong en el diacutea 13 para concentraciones de 70gL glucosa y
70gL sacarosa
SustratoConcentracioacuten
(gL)
Tiempo
(s)Aacuterea
Glucosa 70 1456 3223
Glucosa 70 2985 2423
Glucosa 70 54 7586
Glucosa 70 6262 5149
Glucosa 70 7151 248331
Glucosa 70 9039 19346
Glucosa 70 9929 4906
Glucosa 70 11051 33698
Sacarosa 70 0437 342
Sacarosa 70 1428 812
Sacarosa 70 2948 2191
Sacarosa 70 5473 4854
Sacarosa 70 6286 5336
Sacarosa 70 6848 3649
Sacarosa 70 733 11383
Sacarosa 70 9073 1018
Sacarosa 70 9878 11072
Sacarosa 70 10267 18797
(a) (b)
Graacutefico 31 Cromatogramas del diacutea 13 para el P cubensis cultivado en medio
sumergido Fang-Zhong con dos diferentes tipos de sustratos (a) 70 gL
glucosa (b) 70 gL sacarosa
116
Tabla 38 Aacutereas obtenidas de los cromatogramas para el P cubensis en
medio Fang-Zhong en el diacutea 13 para concentraciones de 50gL y glucosa
50gL sacarosa
SustratoConcentracioacuten
(gL)
Tiempo
(s)Aacuterea
Glucosa 50 05 4067 22222
Glucosa 50 05 7379 55573
Glucosa 50 05 902 19513
Glucosa 50 05 9716 119261
Glucosa 50 05 1173 19427
Glucosa 50 1 0793 14776
Glucosa 50 1 2868 28537
Glucosa 50 1 6224 1206
Glucosa 50 1 6782 571299
Glucosa 50 1 8303 92665
Glucosa 50 1 9081 30371
Glucosa 50 1 9738 168959
Glucosa 50 1 11813 27921
Glucosa 50 15 0412 269
Glucosa 50 15 2482 14692
Glucosa 50 15 3486 91059
Glucosa 50 15 6039 6892
Glucosa 50 15 6627 216986
Glucosa 50 15 7216 260795
Glucosa 50 15 8112 65776
Glucosa 50 15 8888 19083
Glucosa 50 15 9497 37812
Glucosa 50 15 9839 65922
Glucosa 50 15 11655 7331
(a) (b)
(c)
Graacutefico 32 Cromatogramas del diacutea 12 para el P cubensis cultivado en medio
sumergido Fang-Zhong con fuente de carbono glucosa y adicioacuten de
fenilalanina en tres concentraciones (a) 05 gL FA (b) 1 gL FA (c) 15gL
FA
117
Anexo 21 Cromatogramas (HPLC) del diacutea 14 de fermentacioacuten
Tabla 39 Aacutereas obtenidas de los cromatogramas para el P cubensis en
medio Fang-Zhong en el diacutea 14 para concentraciones de 30gL glucosa y 30
gL sacarosa
SustratoConcentracioacuten
(gL)
Tiempo
(s)Aacuterea
Glucosa 30 1054 181
Glucosa 30 2553 8939
Glucosa 30 6219 7557
Glucosa 30 6585 77083
Glucosa 30 7158 285069
Glucosa 30 8987 33875
Glucosa 30 9848 87461
Glucosa 30 10694 52151
Glucosa 30 12482 7992
Glucosa 30 12943 23064
Glucosa 30 1493 5948
Sacarosa 30 7309 7075
Sacarosa 30 9984 1680
Sacarosa 30 10442 15395
Sacarosa 30 11211 8511
Sacarosa 30 13405 3398
(a) (b)
Graacutefico 33 Cromatogramas del diacutea 14 para el P cubensis cultivado en medio
sumergido Fang-Zhong con dos diferentes tipos de sustratos (a) 30 gL
glucosa (b) 30 gL sacarosa
118
Tabla 40 Aacutereas obtenidas de los cromatogramas para el P cubensis en
medio Fang-Zhong en el diacutea 14 para concentraciones de 50gL glucosa y
50gL sacarosa
SustratoConcentracioacuten
(gL)
Tiempo
(s)Aacuterea
Glucosa 50 2029 8318
Glucosa 50 6257 5782
Glucosa 50 6875 306684
Glucosa 50 9068 22819
Glucosa 50 9808 92492
Glucosa 50 12113 8823
Glucosa 50 12752 23988
Sacarosa 50 1036 3783
Sacarosa 50 2356 7005
Sacarosa 50 653 44831
Sacarosa 50 6657 127617
Sacarosa 50 7264 66908
Sacarosa 50 7464 255141
Sacarosa 50 9035 26172
Sacarosa 50 9458 28427
Sacarosa 50 9889 37574
Sacarosa 50 10312 140881
Sacarosa 50 12335 13391
Sacarosa 50 1292 17066
(a) (b)
Graacutefico 34 Cromatogramas del diacutea 14 para el P cubensis cultivado en medio
sumergido Fang-Zhong con dos diferentes tipos de sustratos (a) 50 gL
glucosa (b) 50 gL sacarosa
119
Tabla 41 Aacutereas obtenidas de los cromatogramas para el P cubensis en
medio Fang-Zhong en el diacutea 14 para concentraciones de 70gL glucosa y
70gL sacarosa
SustratoConcentracioacuten
(gL)
Tiempo
(s)Aacuterea
Glucosa 70 6257 5879
Glucosa 70 6373 145551
Glucosa 70 7015 68223
Glucosa 70 7199 9085
Glucosa 70 735 265755
Glucosa 70 9014 4642
Glucosa 70 9877 97804
Glucosa 70 107 67421
Glucosa 70 12625 26231
Glucosa 70 1305 65607
Sacarosa 70 2283 4683
Sacarosa 70 5191 93
Sacarosa 70 6304 3719
Sacarosa 70 6795 136542
Sacarosa 70 726 29869
Sacarosa 70 7515 75545
Sacarosa 70 7872 119563
Sacarosa 70 9166 1244
Sacarosa 70 9658 23096
Sacarosa 70 9871 25866
Sacarosa 70 10421 105108
Sacarosa 70 12347 11115
Sacarosa 70 12861 35503
Sacarosa 70 14272 3676
(a) (b)
Graacutefico 35 Cromatogramas del diacutea 14 para el P cubensis cultivado en medio
sumergido Fang-Zhong con dos diferentes tipos de sustratos (a) 70 gL
glucosa (b) 70 gL sacarosa
120
Tabla 42 Aacutereas obtenidas de los cromatogramas para el P cubensis en medio Fang-Zhong en el diacutea 13 para concentraciones de 50gL glucosa y
50gL sacarosa
SustratoConcentracioacuten
(gL)
Tiempo
(s)Aacuterea
Glucosa 50 05 0123 173
Glucosa 50 05 0699 7584
Glucosa 50 05 2594 2742
Glucosa 50 05 6104 11663
Glucosa 50 05 6616 487848
Glucosa 50 05 7235 287918
Glucosa 50 05 8183 135793
Glucosa 50 05 8903 5143
Glucosa 50 05 9484 66817
Glucosa 50 05 9679 168855
Glucosa 50 05 11671 4216
Glucosa 50 1 0345 295
Glucosa 50 1 2654 11981
Glucosa 50 1 412 45301
Glucosa 50 1 6111 12626
Glucosa 50 1 6757 526655
Glucosa 50 1 8093 104277
Glucosa 50 1 894 25251
Glucosa 50 1 9643 158685
Glucosa 50 1 11666 22779
Glucosa 50 15 0353 283
Glucosa 50 15 2522 15272
Glucosa 50 15 3577 83963
Glucosa 50 15 6668 47137
Glucosa 50 15 7304 371442
Glucosa 50 15 8226 117611
Glucosa 50 15 8923 61949
Glucosa 50 15 9657 19618
Glucosa 50 15 11668 35606
(a) (b)
(c)
Graacutefico 36 Cromatogramas del diacutea 12 para el P cubensis cultivado en medio sumergido Fang-Zhong con fuente de carbono glucosa y adicioacuten de
fenilalanina en tres concentraciones (a) 05 gL FA (b) 1 gL FA (c) 15gL FA (a) 05 gL FA (b) 1 gL FA (c) 15gL FA
121
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