errores en la valoración de la testosterona en la mujer · errores en la valoración de la...
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Errores en la valoración de la
Testosterona en la mujer
Mesa Redonda:
”Endocrinología del Envejecimiento”
2do Congreso Bioquímico2do Congreso Bioquímico
Córdoba 2013
Hugo E Scaglia
e-mail info@iabe.com.ar
Andrógenos y crecimiento del pelo
Andrógenos
Son el principal regulador del crecimiento del pelo
Edad másavanzada
Testosterona
Pubertad y edadreproductiva
DHT
Pequeños folículosvello, virtualmente
invisible
Inhiben
ALOPECIA
Somani y col Dermatologic therapy 21: 376-391, 2008
Estimulan
Grandes folículosintermediosterminales y pigmentados
HIRSUTISMO
Hiperandrogenismo
clínico
Hiperandrogenismo Bioquímico
(Hiperandroginemia)
Alguno o todos de los siguientes niveles
TT > 0.50 ng/ml
T bio > 0.30 ng/ml
TL > 10 pg/ml
DHEAs <3000 ng/ml
A4: < 4.0 ng/ml
Frecuencia de diferentes patología
en mujeres hirsutas
Neoplasmas productores andrógenos (NPA): 0.23 %
Hiperplasia suprarrenal clásica (HAC): 0.69 %
Hiperplasia suprarrenal no clásica (HSNC): 2.06 %
HAIRAN: 3.78 %
SOP: 82.02 %
Hiperandrogenismo-Hirsutismo/ Ovulatorias: 6.75 %
Hirsutismo Idiopático: 4.47 %
Hirsutismo Idiopático
CRITERIOS DIAGNOSTICOS
1) Hirsutismo sin disfunción ovárica
(Verificada por temperatura basal y/o P4 en fase lútea)
y andrógenos normales
(Testosterona libre y DHEAs)2) Excluir patologías relacionadas
(HSNC, patologías tiroideas e ingestión de andrógenos)
DEFINICION
Hirsutismo ovulatoria
y andrógenos normales
Hirsutismo Idiopático
Azzis, R. Y col: Idiopathic Hirsutism. Endocrine Reviews
21 (4): 347-362, 2000
Hirsutismo Idiopático
( T/DHT normales – ciclos ovulatorios – sin imágenes de OP)
Hiperactividad del Receptor Conversión
periféricaReconocimiento del ERA Estabilidad
CAG
Cys
Cys
Cys
Cys
COOHNH2 AF2
Glutamina
Cys
Cys
Cys
Cys
AF1
HSPs
DHT
ZnZn
Otros factores
activan el receptor
PTHrP – TGF β - IL6
DHT5α R
Aumento de
la actividad
T
Sumamente
dificultosa
de evaluar
Hiperandrogenismo
oculto
T normal
Test de ACTH
Hiper respuesta
ORIGEN ADRENAL
Proteína
RNA Pol II
TATA
box
FAT’s
FGT’s
ERA
CBP
pCAF
AF1
AF2
AF1
AF2
Remodela
Cromatina
Actividad- Histona
acetil transferasa
Modifica el
complejo Histona
RNAm
Aumento de
la actividad
IGF 1
folículo
piloso
ACCION
LOCAL
Test de GnRH (a)
Hiper respuesta
ORIGEN OVARICO
Ovarios Poliquísticos
Ecografía: Criterios
Progesterona < 5.0 ng/ml
Sangrado ≥ 35 días
Sangrado < 10/año Polimenorrea ≤ 25 días
Algunos o todas de las
siguientes características
Oligo anovulaciónHiperandrogenismo
Bioquímico
Alguno o todos de
lossiguientes niveles
TT > 0.50 ng/ml
T bio > 0.30 ng/ml
TL > 10 pg/ml
DHEAs <3000 ng/ml
A4: < 4.0 ng/ml
Hiperandrogenismo
clínico
Parámetros clínicos y bioquímicos para defiinir el SOP
Ovarios Poliquísticos
Ecografía: Criterios
Equipo en condiciones y personal
entrenado
En lo posible transvaginal
12 o más folículos de 2-9 mm de
diámetro en uno o ambos ovario
y/o Aumento del volumen ovárico
(> 10ml)
Fórmula de vol. del elipsoide oblongo: 0.5 x largo x ancho x espesorMomento de la realización:
a) Menstruación regular: día 3-5
b) Oligo/amenorrea día 3-5 luego
de sangrado inducido con P4
Androgen Excess Society PCOS
Posibles fenotipos del Síndrome de Ovario Poliquístico
según tres diferentes consensos internacionales
Criterio: Hiperandrogenismo clínico o bioquímico (HC / HB)
más Oligoanovulación (OA) y/o Imagen de ovarios poliquísticos (OP)
Alguno o todos de los
siguientes niveles
TT > 0.50 ng/ml
T bio > 0.30 ng/ml
TL > 10 pg/ml
Alguno o todos de los
siguientes niveles
TT > 0.50 ng/ml
T bio > 0.30 ng/ml
TL > 10 pg/ml
Azziz R, Carmina E, Dewailly D, Diamanti-Kandarakis E, Escobar-Morreale HF, Futterweit W, Janssen OE, Legro RS, Norman RJ, Taylor AE, Witchel SF. The Androgen Excess and PCOS Society criteria for the POCS: the complete task force report. Fert Steril 91: 456-488, 2009
T bio > 0.30 ng/ml
TL > 10 pg/ml
DHEAs <3000 ng/ml
A4: < 4.0 ng/ml
TL > 10 pg/ml
DHEAs <3000 ng/ml
A4: < 4.0 ng/ml
Progesterona < 5.0 ng/ml
y /o Sangrado ≥35 días
Sangrado < 10/año y/o Polimenorrea≤ 25 días
HC y/o HB + OA HC y/o HB + OP
Parámetros
B
+
+
+
A
+
+
+
D
+
-
+
C
+
+
-
F
+
-
-
E
+
-
+
H
-
+
+
G
-
+
+
I
-
+
-
Hiperandrogenismo
Clínico (HC)Hirsutismo, acné, alopecia
Hiperandrogenismo
Bioquímico (HB)TT y/o TL, y/o DHEAs y/o A4
Oligo-anovulación (OA)Sangrado ≥35 dias< 10/año Polim ≤ 25 días
Posibles fenotipos
J
-
-
+
-+ ++ +- -+ +
< 10/año Polim ≤ 25 días
Poliquistosis Ovarica
NIH ▲ ▲ ▲ ▲ ▲▲
▲ ▲ ▲ ▲ ▲ ▲ ▲ ▲ ▲Róterdam
+
NO▲ ▲ ▲ ▲ ▲ ▲ ▲ ▲ ▲AES-PCOS
Consenso AES – PCOS - 2009
Criterio: HC / HB
más OA y/o OPResultados falsos negativos no permite
el diagnóstico de SOP
▲
Conclusiones
La exactitud en la determinación de TT
resulta de significativa relevancia en elresulta de significativa relevancia en el
diagnóstico de Hirsutismo Idiopático o en
el subtipo de SOP sin hirsutismo pero con
ovarios poliquísticos y/o alteraciones del ciclo
Introduccion
Diagnóstico de hiperandroginemia en la mujer
requiere la demostración del incremento de los
niveles en suero de Testosterona.
Sin embargo ha sido demostrado por numerosos Sin embargo ha sido demostrado por numerosos
estudios que los inmunoensayos comerciales
han mostrado una gran disparidad en los resultados
cuando los niveles son bajos, por ejemplo en las
mujeres y niños
Principales recomendaciones
POSITION STATEMENT: Utility, limitations and pitfalls
in measuring Testosterone: An Endocrine Society position
statement
W Rosner, RJ Auchus, R Azziz, PM Sluss and H Raff J Clin Endocrinol Metab 92:405-413, 2007
The Endocrine Society reached a consensus
as to TT determination.
Los ensayos directos como el RIAELISA o CLIA son técnicamentesimples, rápidos y baratos. Puedenser automatizados.
Pero♦ La T frecuentemente es sobre o
subvalorada♦ Susceptible de efecto matriz♦ No están convalidadas♦ Límite de exactitud > a 3.0 ng/ml
El RIE seguido de extracción ypurificación cromatográfica del extracto permite usar mayor volumen de suero, aumentando la sensibilidad
Pero:Susceptible de efecto matrizMuy laboriosoInsume mucho tiempoRequiere un alto grado de entrenamiento técnico
A falta de otra información, los ensayos directos tiene
muy pobre exactitud a bajas concentraciones y
y deben tratar de no ser empleados en la práctica
RESUMEN DE LOS PRINCIPALES
RESULTADOS Y RECOMENDACIONES
Los inmunoensayos realizados con el extracto del suero
purificado cromatográficamente han mostrado mayor
probabilidad de obtener resultados de mayor exactitud y
deberían ser preferidos
QUANTIFICATION OF TESTOSTERONE (T)
BY 8 IMMUNOASSAYS, AND BY
LIQUID CHROMATOGRAPHY IN TANDEM WITH
MASS SPECTROMETRY (LC-MSMS)
IN NORMAL AND HIRSUTE WOMEN.
A MULTICENTER STUDY.
PART 2: HIRSUTE WOMEN
Scaglia HE*, Aquilano DR, Buccini G; Chichizola C, Corazza N,
Corthey C, Fuillerat S, Guevel L; Ibañez G, Lacoste E, Mohr A,
Nosetto S, Orsi M, Piaggio R, Riesco O, Sandoz S, Scaglia J,
Laboratory of hormonal assay
Hospital Italiano, La Plata, ARGENTINA
Corthey C, Fuillerat S, Guevel L; Ibañez G, Lacoste E, Mohr A,
Nosetto S, Orsi M, Piaggio R, Riesco O, Sandoz S, Scaglia J,
Viola AM, Wolfthal D, Zylbersztein CC
* e mail: info@iabe.com.ar
MétodosProtocolo
Alícuotas de muestras de
sueros obtenidas de:
24 mujeres normales
15 mujeres hirsutas
En cada alícuota se
Axsym
Electroquimio
luminiscencia
(EQL)
Immulite (IMM)
Architect (arch)
Vidas
Número de
laboratorios
3
4
2
2
1En cada alícuota se
determinó TT en 18
laboratorios empleando:
kit comerciales
RIA desarrollado
LC MSMS
(Quest Diagnostic)
Vidas
RIA:
Siemens
DSL
DiaSource
Desarrollado
LC MSMS
1
3
1
1
1
1
Column set up and ether extraction of sera
Wash:Ethanol
MethanolCl2CH2: Methanol
Cl2CH2Transfer solvent layer
to alumina column
PasteurPipette
Extract purificación - Elution:
1) Ethanol 1.2 % in Hexane5 fraction of 1 ml
2) Etanol 3.0 % in Hexane5 fraccion of 5 ml
Pipette
Neutral alumina
3 cm80-200 mesh
(Fisher Sci Co)
Discard
Hexano:ether(4:1) 2 mlExtract
Serum +~8000dpm3H-T
0.5 ml ♂1.0 ml ♀
0.2 ml de every tube for measuring radioactivityRecovery:cpm supernartant x 5 / added dpm x 100
tubes 1 -5 Androstenedionetubes 5 – 10: Testosterone
3 4 5 6 8 9 101 2 7
Tube dpm Final % Extraction
Mean ± SD
n: 20 assay
10 ♀ 10 ♂
Recovery
Eligible for RIA
Evaporate
0.8 ml
Resuspend
in 0.8 ml Buffer
0.2 and 0.4 ml
to RIA ( ♂ )
100-200 µ of
serum
0.2 and 0.4 ml
to RIA ( ♀ )
200-400 µ of
serum
7 7
1
2
3
4
5
6
7
8
9
15
12
7
10
12
44
950
230
116
-
-
-
-
-
2.7
59.3
14.4
7.2
89.4%
serum serum
a) Policlonal antibody (Antigen = 6-oxime : T : BSA)
b) Tracer: 3HT ~30000dpm /0 0.1 ml
c) Standard curve: Dilution of a mixture of sera pre – measured by LC-MSMS
with values from 0.15 to 9.6 ng/ml
d) Free / bound separation: charcoal / dextran
The method allow to work in a curve zone with a coefficient of variation
lower than 6 % for T values between 0.6 – 7.2 with the following features:
a) The dilution employed show paralellism to the standard curve
b) It is possible to reliably measure TT levels from 0.3 ng / ml in men and
from 0.15 ng / ml in women
9
10
116
90
7.2
4.5
Resultados de TT por LC MSMS en Mujeres
Normales e Hirsutas con o sin acné o alteraciones
del ciclo (Quest Diagnostics, USA)
1.5
2.0
Conclusiones
1) Las mujeres consideradas
normales tenían niveles de
TT normal por LC MSMS
0 3 6 9 12 15Mujeres Hirsutas
(Número de muestras)
0 10 200.0
0.5
1.0
1.5
Mujeres normales
TT
LC
MS
MS
(ng
/ml)
(Número de muestras)
TT normal por LC MSMS
2) Dos de las 15 pacientes
con hirsutismo tuvieron
niveles normales de TT
Resultados similares han
sido publicados en el
Hirsutismo idiopático
Axs
ym (
ng
/ml)
1.2
1.4
1.6
1.8
2.0
2.2
2.4
upperlimit
upper limit
1.2
1.4
1.6
1.8
2.0
2.2
2.4
EQ
L
Ro
che
(ng
/ml)
upper limit
upperlimit
Valoración de TT por diferentes métodos y por
LC- MSMS en el suero de 15 pacientes hirsutas
TT – LC MSMS (ng/ml)
TT
–A
xsym
(n
g/m
l)
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2limit
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
TT – LC MSMS (ng/ml)
TT
–E
QL
R
och
e (n
g/m
l)
limit
1.2
1.4
1.6
1.8
2.0
2.2
2.4Immulite
Immulite
Architect
Architect
Vidas Bio M
upperlimit
upper limit
TT
(n
g/m
l)
Valoración de TT por diferentes métodos y por
LC- MSMS en el suero de 15 pacientes hirsutas
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
TT – LC MSMS (ng/ml)
TT
(n
g/m
l)
1.2
1.4
1.6
1.8
2.0
2.2
2.4RIA - DPCRIA - DSL
RIA Dia Source
TT
Co
mm
erci
al R
IA (
ng
/ml)
upperlimit
upper limit
1.2
1.4
1.6
1.8
2.0
2.2
2.4
TT
in
ho
use
RIA
(n
g/m
l)
upper
upper limit
Valoración de TT por diferentes métodos y por
LC- MSMS en el suero de 15 pacientes hirsutas
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
TT
Co
mm
erci
al R
IA (
ng
/ml)
TT – LC MSMS (ng/ml)
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
TT
in
ho
use
RIA
(n
g/m
l)TT – LC MSMS (ng/ml)
upperlimit
The table shows the number of laboratories for every method
and the percentage of samples from hirsute women with
normal T values that were actually high by LC-MS
Method 1 2 3 4 5 6 7 8 9
(# of labs) 3 4 2 2 3 1 1 1 1
Samples with
normal T (%) 85 52 42 70 64 31 31 14 69
References:1: Axsym; 2: Elecsys; 3: Immulite; 4: Architect; 5: RIA Siemmens;
In all these cases the methods understimated TT values
1: Axsym; 2: Elecsys; 3: Immulite; 4: Architect; 5: RIA Siemmens;
6: RIA DSL; 7: RIA DIASource; 8: Developed RIA; 9: Vidas BioMerieux
Conclusiones
Ninguno de los métodos utilizados con mayor frecuencia en
nuestro País están convalidados con LC MSMS cuando los
niveles circulantes de TT son menores a 1.5 ng/ml
Todos los métodos subvaloran los niveles de TT en mujeres
hirsutas en un promedio de 58.1%.
12141618
# o
f p
ati
en
ts w
ith
no
rm
al T
T l
eve
ls
TT por LC MSMS
Results obtained by other methods from different
labs underestimated TT levels compared with those
of LC MSMS by 31 to 85 % and overestimated
TT levels in 16.7 % of cases
These difference become more
moticeable with lower
TT concentrations
0.0 0.3 0.6 0.9 1.2 1.502468
1012
upper limit# o
f p
ati
en
ts w
ith
no
rm
al T
T l
eve
ls
TT - LC MSMS ( ng/ml)
TT por LC MSMS
(ng/ml)
>0.90.47 -0.74
71.0 38.5% of discordant
results (average)
Posibles soluciones temporarias
Algunas consideraciones:
1) Si bien es importante la determinación de TT, si la
paciente tiene hirsutismo es posible definir el SOP
con la positividad de algunos de los parámetros
diagnósticos
2) El problema lo constituyen las pacientes sin
hirsutismos con algunos de los parámetros
diagnósticos positivos. donde los niveles de TTdiagnósticos positivos. donde los niveles de TT
hacen el diagnóstico diferencial entre alteraciones
del ciclo menstrual y SOP, con el consiguiente
sub diagnósticos de posibles factores de riesgo
3) Como ha sido visto si la TT en el hirsutismo por
cualquiera de los métodos empleados está
aumentada, también lo está por LC MSMS.
Los casos en que los niveles de TT sean normales,
con parámetros positivos la confirmación de la TT
debería realizarse por métodos gold standard
150
200
250
Tes
tost
eron
a lib
re (
pg /
ml)
R
IA L
ab. D
PC
9
12
15
Tes
tost
eron
a lib
re (
pg /
ml)
RIA
Lab
. DP
C
150
200 7.5
Testosterona libre (pg / ml)
HOMBRES MUJERES
Métodos para la determinación de Testosterona libre
0 50 1001502002500
50
100
150
Tes
tost
eron
a lib
re (
pg /
ml)
R
IA L
ab. D
PC
Testosterona libre (pg / ml) Cálculada por el programaDunn, Nisula y Roadbard (21)
0 3 6 9 12 150
3
6
9
Tes
tost
eron
a lib
re (
pg /
ml)
RIA
Lab
. DP
C
Testosterona libre (pg / ml) Cálculada por el programaDunn, Nisula y Roadbard (21)
0
50
100
150
Calculada RIA Lab. ICN
0.0
2.5
5.0
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