electroforesis de dna. dna topoisomerasas izquierda derecha

Electroforesis de DNA

DNA Topoisomerasas

Izquierda Derecha

Enzimas de restricciónClasificadas en 3 tipos, donde la mayoría pertenece al grupo II (proteínas monoméricas, poseen simetria rotacional y generalmente requieren Mg2+

Secuencias palindrómicas

Isosquisomeros: Varias enzimas diferentes que reconocen la misma secuencia, donde, algunas cortan sec blanco en diferentes posiciones.Sma I / Xma I

Secuencias metiladas:A*: N6-metiladenina

C*: 5-metilcitosina : Hpa II y Msp IReconocen la secuencia CC*GGHpa II: no digiere DNA metiladoMsp I: Digiere met o no-metilado*90% de las metilaciones en genomas ocurren en 5.metilcitosina en C*G

Clonamiento de DNA

Desfosforilación de vectores(para evitar asociación intramolecular)

DNA Ligasa

68 kDa

Actividad se mide en Unidase Weiss (Weiss, 1968)

Ligación de extremos cohesivos

Southern y Northern blot

Southern, E. M. (1975) J.Mol. Biol. 98, 503-517

Southern blot

Generación de cDNA

Fabricación de replicas en Nitrocelulosa e hibridación in situ (en placa)

Screening: Rastreo, Escrutinio

Fago Lambda como vector de clonamiento

Clonamiento de DNA en plasmidos

DNA plasmidal

PBR322

Clonamiento de DNA en plasmidos

Clonamiento de DNA en plasmidos

Eliminación de fragmentos de Okazaki

Eliminación de fragmentos de Okazaki

(Reacción de Nick translation)

Alternativamente: Marcaje por random Primer o incorporación en reacción de PCR

DNA pol I (E. coli) Holoenzima (monómerica) de 109 kDa.5’ 3’ Polimerasa5’ 3’ exonucleasa3’ 5’ exonucleasa

+ Mg2+

SINTESIS de DNA in vitro

Reacción de polimerización en cadena = polymerase chain reaccion (PCR)

- Un fragmento de DNA (copia de una parte del DNA templado)- Múltiples copias (de una molécula templado 1 millon de copias)- DNA polimerasa (termoestable, de Termophilus aquaticus, Taq Pol)- Partidores, un par (los partidores dan la especificidad de la reacción)- dNTPs- Tampón (Mg2+, tampón) 30 ciclos de amplificacion: denaturacion 94ºC, 30seg apareamiento, 40-60ºC, 30seg extensión, 72ºC, 30seg

ESPECIFICIDADVELOCIDAD SENSIBILIDAD

CONTROLES!

SINTESIS DE DNA in vitro PCR

- Iniciacion, elongacion, terminacion

- par de partidores sentido y antisentido secuencia especifica

- in vitro

- multiples veces un fragmento de DNA

- DNA polimerasa termoestable TaqPol (Thermophylus aquaticus)

-ciclos de denaturacion, apareamiento, extension

INICIACION cuando y donde

ELONGACION

TERMINACION-Extension final y guardar a 4ºC

PCR

Taq DNA pol (Thermus aquaticus) MW 65 kDa

GATCGGATAACTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGCGGTA

PCR de MICROSATELITES

GTGGACTATAGACCAT ACACACACACACACAC GCTGTGATGGTCTAC

3’

MICROSATELITE

5’

3’ 5’

CGACACTACCAGATGCACCTGATATCTGGTA TGTGTGTGTGTGTGTG

CACCTGATATCTGGTA 3’5’

Partidor 2

llllllllllllllll

5´3’ GCTGTGATGGTCTAC

Partidor 1

lll111111111111

Marcadores genéticos: Identidad, medico legal, paternidad, etc

120

130

140

150

160

170

180

190200210

pb1 2 3 4 5 6 7

120 – 140 HTG4

170 – 188 HMS7

Análisis de microsatélites de caballos

140

150

160

170

180

190

200210220230

pb1 2 3 4 5 6 7

149 – 172 HMS3

218 – 238 HMS2240250

Sistema manual en geles de poliacrilamida modificada, Spreadex® en geles de 10 cm y tinción con bromuro de etidio.

R-Loops

Microscopía Electrónica, Tinción Negativa

Metodología alternativa: Ensayos de digestion con nucleasa S1, Degrada preferencialmente ssDNA o RNA. También para generar extremos romos y apertura del hairpin generado en la segunda hebra del cDNA

R-Loops

Replicación Viral: Circulo rodante y desplazamiento de hebra. (MET)

Tinción negativa

Denaturación y Renaturación del DNA

Construcción de bibliotecas de secuencias únicas

Denaturación del DNA e Hipercromicidad

Marcaje de DNA satélite en cromosomas

FISH

Separación de DNA por Ultracentrifugación

Secuenciación de DNA(Sanger,1977)

Enzima/

Propiedades

Procesividad Velocidad de Polimerización

Frag. Klenow

(DNA pol I)

10-50 nt 45 nt/seg

Sequenasa 2000-3000 nt 300 nt/seg

Taq DNA pol >7600 nt 35-100 nt/seg

Klenow: MW 76 kDa, carece de actividad 5’ 3’ exonucleasa por remoción proteolítica (Klenow, 1970).

Sequenasa: DNA pol T7 modificada químicamente (sin activ. 3’ 5’ exonucleasa)

Secuenciación de DNA (Sanger,1977)

Secuenciación Automatizada de DNA

DNA Fingerprinting

•AFLPAmplified Fragment polymorphism

•RFLPRestriction Fragment Length polymorphism

•RAPDRandom Amplified polymorphic DNA

•DAFDNA Amplification Fingerprinting

•SSCPSingle Strand Confirmational polymorphism

•Microsatellite

AFLP

Análisis de Microarreglos de DNA

Microarreglos de DNA

Síntesis in situ y análisis in silico

Microarreglos de DNA

Microarreglos de DNA

Expresión Génica Temporal por

microarreglos de DNA