dr. juan pablo damián Área de bioquímica facultad de veterinaria, montevideo, uruguay. udelar...

Dr. Juan Pablo DamiánÁrea de Bioquímica

Facultad de Veterinaria, Montevideo, Uruguay. UdelaR

Ciclo de Krebs(Ciclo del ácido cítrico)

Hans Adolf Krebs

Alemania

Inglaterra

En 1932, se traslada a laUniversidad de Friburgo, y en conjunto con el bioquímicoKurt Henseleit, descubre las reacciones involucradas en el

ciclo de la úrea

Urea synthesis in mammalian liver [5], Krebs, H.A. 1943 . Nature 151 (3818), pp. 23

Premio Nobel de Fisiología y Medicina, 1953Krebs y Lipmann

THE INTERMEDIATE METABOLISM OF CARBOHYDRATES Krebs, H.A. 1937 The Lancet 230 (5952), pp. 736-738

Citedby

1) Introducción- Fuentes de acetato.- Ubicación del ciclo en el mapa metabólico y en la célula. - Condiciones energéticas 2) Reacciones del ciclo 3) Balance global4) Regulación5) Funciones anabólicas6) Reacciones anapleróticas

Objetivos:

Comprender la importancia del Ciclo de Krebs en el metabolismo.Conocer las reacciones del Ciclo de Krebs y su regulación.

1) Producción de

Acetil-CoA

3) Transferencia e-

y fosforilación oxidativa

2) Oxidación de

Acetil-CoA

Modificado Fig. 16-1 de Lehninger

Ubicación del Ciclo de Krebs Ubicación del Ciclo de Krebs en la respiración celularen la respiración celular

Ciclo de Krebs (ciclo del ácido cítrico) es una ruta cíclica constituida por una secuencia de 8 reacciones.

O

CH3-C-S-CoA

Acetil-CoA:

La entrada de casi todos los “combustible” al Ciclo de Krebs es como Acetil-CoA (grupo acetilo activado).

¿En que ruta se oxida Acetil-CoA?

O

CH3-C-S-CoA

que es el Acetil-CoA?

1) producto de la degradación de los carbohidratos, lípidos y aminoácidos.

2) compuesto de “alta energía”, ∆G’o = -31.5 kJ/mol (hidrólisis del enlace tioester, más exergónica que la del ATP que es -30.5 KJ/mol).

3) Es el principal combustible del ciclo de Krebs.

Es en la mitocondria donde se realizan todas las reacciones del Ciclo de Krebs

Lehninger (1917-1986)

¿Donde se realiza el ciclo de Krebs?

Fases o Etapas de la respiración

Mitocondria

Ciclo de Krebs

Ciclo de Krebs (ciclo del ácido cítrico): es una ruta cíclica constituida por una secuencia de 8 reacciones, mediante el cual se oxida el AcetilCoA y se conserva la energía de oxidación en forma de coenzimas reducidos.

Localización: mitocondriaLocalización: mitocondriaCiclo de Krebs

Lehninger (1917-1986)

1948 - Kennedy & Lehninger;1948 - Kennedy & Lehninger; Todas las reacciones del ciclo de Krebs se ubican en la mitocondriaTodas las reacciones del ciclo de Krebs se ubican en la mitocondria

Membrana externa

Membrana interna

Matriz

Crestas

Complejo de la Piruvato Deshidrogenasa

Enzimas del Ciclo de Krebs (7 matriz y 1 membrana

interna)

Citosol

Membrana externa

Membrana interna

Matriz

Cara externa

Cara externa

Cara interna

Cara interna

Donde se producen la mayor parte de las reacciones oxidativas que liberan energía y se acoplan a la síntesis de ATP.

Cte- y FOx

AG a AcetilCoADegradación Ox de aas

Membrana externa

Membrana interna

mitocondria

Matriz

Membrana interna

Membrana externa

Es en la mitocondria donde se realizan todas las reacciones del Ciclo de Krebs

Lehninger (1917-1986)

1948 - Kennedy & LehningerEN LA MITOCONDRIA, ¿DONDE SE LOCALIZAN LAS ENZIMAS DEL CICLO DE KREBS?

1 en membrana mitocondrial interna

7 en matriz mitocondrial

Complejo Piruvato Deshidrogena también en matriz mitocondrial

Reacciones

del Ciclo de Krebs

O C

COO-

CH2

COO-

H

CH2 COO-

CH COO-

C COO-

H

HO

CH2 COO-

CH2

C COO-

OCH2

COO-

CH2

C SCoA

O

CH3 C SCoA

O

COO-

CH2

CH2

COO-

COO-

CH

CH

COO-

COO-

C ―H

HC ―H

COO-

HO

CO2

CO2

Acetil CoA

Condensación

Isomerización

DescarboxilaciónOxidativa

Descarboxilaciónoxidativa

Fosforilación a nivel de sustrato

Deshidrogenación

Hidratación

Deshidrogenación

oxalacetato HO

CH2 C

C COO-

C COO-

O

O-

H

H

Panorámica del ciclo de Krebs

Forma abierta Forma cerrada

Unión al OA

Enzima homodiméricacada subunidad tiene 2 dominios, Grande y rígidoY otro pequeño y flexible, el sitio activo se sitúa entre los dos.

CH3 C S-CoA

O

HO

CH2 C

C COO-

O C COO-

CH2 COO-

CH2 COO-

O

O-

Citrato sintasaOxalacetato

Citrato

CoA-SHH2OAcetil CoA

1

∆G’o = -32.2 kJ/molGrupo carbonílico C2

Condensación

Citrato sintasa: se cristalizo y se dedujo su estructura por difracción con rayos X

Forma abierta

Forma cerrada

Cada subunidad: dos dominios 1 rígido y otro mas pequeño flexible, SA situado entre los dos

Unión de OA induce cambio conformación en el flexible, aparición de sitio de unión para Acetil coA

1er sustrato

El oxalacetato, primer sustrato que se une al enzima, induce un cambio conformacional en el dominio flexible, que provoca la aparición de un sitio de unión para el segundo sustrato, el acetil-CoA.

El AcetilCoA al perder o ceder un protón al Asp 375 seConvierte en un intermediario enolato, este interm. se estabiliza por formación de puentes de hidrógeno conla His274.

El enolato se reordena para atacar el carbono carbonílico del oxalacetato, la Hist 320 actúa comoUn ácido gral.La condensación restante genera citril-CoA

El tioéster se hidroliza a continuación, regenerando CoA-SH y produciendo citrato.

Se forma “citril-CoA” (intermediario) cuya hidrolisis hace que la reacción sea muy exergonica.

unión tioéster del Acetil-CoA activa los H metilicos y Asp capta protón del grupo metilo dando un intermediarioEnolato estabilizado por puentes de H y/o protonización de His

El enolato se reordena y ataca el C carbonilo del oxalacetato con la His en posición de captar el protón que había cedido (His actúa como un ácido general) La condensación resultante genera citril CoA

3 cadenas laterales se orientan p/catalisis

flechas=movimiento de e-

Hidrólisis del tioéster regenerando CoA-SH y dando citrato

Unión al OA

CH3 C S-CoA

O

HO

CH2 C

C COO-

O C COO-

CH2 COO-

CH2 COO-

O

O-

Citrato sintasaOxalacetato

(OA) Citrato

CoA-SHH2OAcetil CoA

1

∆G’o = -32.2 kJ/mol

Unión de OA induce cambio conformacional, provoca aparición del sitio de unión para acetil-CoA. Se forma “citril-CoA” (intermediario) cuya hidrolisis hace que la reaccion sea muy exergonica.

Reacción fundamental para el funcionamiento global del ciclo debido a la baja concentración de oxalacetato (<10-6M).

1) Condensación de OA (4 C) y acetil-CoA (2 C) para dar citrato (6 C).

O C

COO-

CH2

COO-

H

CH2 COO-

CH COO-

C COO-

H

HO

CH3 C SCoA

O

Acetil CoA

Condensación

Isomerización

oxalacetato HO

CH2 C

C COO-

C COO-

O

O-

H

H

Panorámica del ciclo de Krebs

Citrato

Isocitrato

Aconitasa (aconitato hidratasa)

H

CH2 COO-

CH COO-

C COO-

H

HO

Isomerización

CH2 C

C COO-

C COO-

O-

H

H

Citrato Isocitrato

O

HO

CH2 COO-

C COO-

C COO-

H

cis-Aconitato

H2O

aconitasa aconitasa

2

La aconitasa hidratasa cataliza la transformación reversible del citrato en isocitrato a través de la formación intermedia de ác tricarboxílico cis-aconitato. Que normalmente no se disocia del centro activo

∆G’o = 13.3 kJ/mol

En la célula la reacción transcurre a la derecha gracias a la rapidez del consumo de isocitrato en el siguiente paso del ciclo, entonces disminuye su concentración

Aconitasa cambia OH del C2 al C3 (se forma el intermediario “Cis-aconitato”que no se desprende de la enzima).

H

CH2 COO-

CH COO-

C COO-

H

HO

Isomerización

CH2 C

C COO-

C COO-

O-

H

H

Citrato Isocitrato

O

HO

CH2 COO-

C COO-

C COO-

H

cis-Aconitato

H2O

aconitasa aconitasa

2

∆G’o = 13.3 kJ/mol

La aconitasa contiene unCentro ferro-sulfurado que actúa como centro de fijación de sustratos en el centroactivo, catalítico y como en la adición o eliminación de agua.

Centro ferro-sulfurado

Aconitasa

Residuo básico de Ecolabora (posiciona Citrato en sitio activo)

3 Residuos de Cys unidos a Fe, 1 al carboxilo (también interactúa con OH) del citrato

O C

COO-

CH2

COO-

H

CH2 COO-

CH COO-

C COO-

H

HO

CH2 COO-

CH2

C COO-

O

CH3 C SCoA

O

CO2

Acetil CoA

Condensación

Isomerización

DescarboxilaciónOxidativa

oxalacetato HO

CH2 C

C COO-

C COO-

O

O-

H

H

Panorámica del ciclo de Krebs

Citrato

Isocitrato

α-cetoglutarato

NAD+

Isocitrato deshidrogenasa

se oxida el isocitrato y se reduce el NAD+, un grupo carboxilo sale como CO2.

3) Descarboxilacion oxidativa

3. Oxidación del isocitrato a -cetoglutarato y CO2

Existen dos formas diferentes de isocitrato deshidrogenasa:• NAD dependiente (matriz mitocondrial)• NADP dependiente (matriz mitocondrial y citosol)

Isocitrato deshigrogenasa

Mn2+

H

CH2 COO-

CH COO-

C HHO

Isocitrato

CH2 COO-

C COO-

C O

C

∆G’o = -20,9 kJ/mol

H

O-O

Mn2+

CH2 COO-

C H+

C O-

C

H

O-O

CH2 COO-

C H

C O-

C

H

O-O

NAD+ NADH + H+

O-O

C

CO2

Descarboxilación oxidativa del isocitrato

Oxalosuccinato -cetoglutarato

1 2 3

intermediario enol

OxidaciónTransferencia deIon hidruro

Eliminación de e- por Mn2+ unido facilita descarboxilación

Reordenamiento del intermediario enol genera α-cetoglutarato

O C

COO-

CH2

COO-

H

CH2 COO-

CH COO-

C COO-

H

HO

CH2 COO-

CH2

C COO-

O

CH3 C SCoA

O

CO2

Acetil CoA

Condensación

Isomerización

DescarboxilaciónOxidativa

oxalacetato HO

CH2 C

C COO-

C COO-

O

O-

H

H

Panorámica del ciclo de Krebs

Citrato

Isocitrato

α-cetoglutarato

NAD+

CH2

COO-

CH2

C SCoA

O

4

NAD+

CH2

COO-

CH2

C SCoA

O Succinil-CoA

CoA-SHCO2

4. Oxidación de -cetoglutarato a succinil-CoA y CO2

CH2 COO-

C H

C O-

C

H

O-O

-cetoglutarato

CH2 COO-

C H

C S-CoA

O

H CO2+

NAD+ NADH + H+CoA-SH

Succinil-CoA

Descarboxilación oxidativa del -cetoglutarato

∆G’o = -33.5 kJ/mol

Complejo multienzimático de la “α-cetoglutarato deshidrogenasa”

Paso 4: Descarboxilación oxidativa

Posee 3 enzimas homólogos a (E1, E2, E3) de la piruvato desh

5 Cofactores (TPP, lipoato, FAD, CoA y NAD)

El complejo de la α-cetoglutaratodeshidrogenasa es muy parecido alcomplejo piruvato deshidrogenasa,tanto en estructura como en función

O C

COO-

CH2

COO-

H

CH2 COO-

CH COO-

C COO-

H

HO

CH2 COO-

CH2

C COO-

O

CH3 C SCoA

O

CO2

Acetil CoA

Condensación

Isomerización

DescarboxilaciónOxidativa

oxalacetato HO

CH2 C

C COO-

C COO-

O

O-

H

H

Panorámica del ciclo de Krebs

Citrato

Isocitrato

α-cetoglutarato

NAD+

CH2

COO-

CH2

C SCoA

O

4

NAD+

CH2

COO-

CH2

C SCoA

O

COO-

CH2

CH2

COO-

Fosforilación a nivel de sustrato

Succinil-CoASuccinato

CoA-SHCO2

GDP

5Succinil-CoA sintetasa

5. Conversión del Succinil-CoA e Succinato

Succinil-CoA sintetasa

La formación acoplada de GTP (o ATP) aexpensas de la energía liberada por la decarboxilación oxidativa del α-ceto ceto-glutarato glutarato es otro ejemplo de fosforilación a nivel del sustrato

CH2 COO-

C H

C S-CoA

O

H

Succinil-CoA

COO-

C H

C H2

H

COO-

GTPGDP + Pi CoA-SH

∆G’o = -2,9 kJ/mol

Fosforilación a nivel de sustrato

Succinato

5. Conversión del Succinil-CoA en Succinato

Succinil-CoA sintetasa

La formación acoplada de GTP (o ATP) aexpensas de la energía liberada por la decarboxilación oxidativa del α-ceto ceto-glutarato glutarato es otro ejemplo de fosforilación a nivel del sustrato

CH2 COO-

C H

C S-CoA

O

H

Succinil-CoA

GTPGDP + Pi CoA-SH

∆G’o = -2,9 kJ/mol

El succinil-CoA tiene un enlace tioéster con una energía libre de estándar de Hidrólisis que es altamente negativa (∆G’o = -36 kJ/mol). La energía liberada enLa rotura de este enlace se utiliza para promover la síntesis de un enlace Fosfoanhídrido del GTP o del ATP con una variación neta de ∆G’o = -2,9 kJ/mol

Succinato

COO-

C H

C H2

H

COO-

Succinil-CoA sintetasa

En tres pasos:1)El sucinil-CoA se une al enzima, y un grupo fosforilo

sustituye al CoA del succinil-CoA, y se forma un acil fosfato de alta energía.

2)El succinil fosfato dona el grupo fosforilo a un residuo de His del enzima, y se forma un fosfohistidil enzima de elevada energía

2)El grupo fosforilo es transferido desde el res His al fosfato terminal de GDP formando GTP.

5. Conversión del Succinil-CoA e Succinato

Succinil-CoA sintetasa

CH2 COO-

C H

C S-CoA

O

H

Succinil-CoA

GTPGDP + Pi CoA-SH

∆G’o = -2,9 kJ/mol

Fosforilación a nivel de sustrato

Nucleosido difosfatasa quinasa

GTP + ADP GDP + ATP ΔG´°= 0 kJ/mo

Succinato

COO-

C H

C H2

H

COO-

O C

COO-

CH2

COO-

H

CH2 COO-

CH COO-

C COO-

H

HO

CH2 COO-

CH2

C COO-

O

CH3 C SCoA

O

CO2

Acetil CoA

Condensación

Isomerización

DescarboxilaciónOxidativa

oxalacetato HO

CH2 C

C COO-

C COO-

O

O-

H

H

Panorámica del ciclo de Krebs

Citrato

Isocitrato

α-cetoglutarato

NAD+

CH2

COO-

CH2

C SCoA

O

4

NAD+

CH2

COO-

CH2

C SCoA

O

COO-

CH2

CH2

COO-

Fosforilación a nivel de sustrato

Succinil-CoASuccinato

CoA-SHCO2

GDP

COO-

CH

CH

COO-

5

6Fumarato

Succinato deshidrogenasa membrana mitocondrial interna

6) Oxido-reducción.

6. Oxidación del Succinato a Fumarato

Succinatodeshidrogenasa

Succinato Fumarato

COO-

C H2

C H2

COO-

FAD FADH2

∆G’o = 0 kJ/mol

COO-

C H

CH

COO-

6. Oxidación del Succinato a Fumarato

Succinatodeshidrogenasa

Succinato Fumarato

COO-

C H2

C H2

COO-

FAD FADH2

∆G’o = 0 kJ/mol

Citosol

Membrana externa

Matriz

Cara externa

Cara externa

Cara interna

Cara interna

COO-

C H

CH

COO-

Complejo II: Succinato Deshidrogenasa

Ciclo de Krebs

Complejo II: Succinato Deshidrogenasa

FumaratoSuccinato

FADH2 + Q FAD + QH2

6. Oxidación del Succinato a Fumarato

Succinatodeshidrogenasa

Succinato

CH2 COO-

C H

CH

COO-

Fumarato

COO-

C H2

C H2

COO-

FAD FADH2

O C

COO-

CH2

COO-

H

CH2 COO-

CH COO-

C COO-

H

HO

CH2 COO-

CH2

C COO-

O

CH3 C SCoA

O

CO2

Acetil CoA

Condensación

Isomerización

DescarboxilaciónOxidativa

oxalacetato HO

CH2 C

C COO-

C COO-

O

O-

H

H

Panorámica del ciclo de Krebs

Citrato

Isocitrato

α-cetoglutarato

NAD+

CH2

COO-

CH2

C SCoA

O

4

NAD+

CH2

COO-

CH2

C SCoA

O

COO-

CH2

CH2

COO-

Fosforilación a nivel de sustrato

Succinil-CoASuccinato

CoA-SHCO2

GDP

COO-

CH

CH

COO-

5

6Fumarato

Succinato deshidrogenasa

COO-

COO-

Malonato (análogo succinato) CH2 inhibidor competitivo

O C

COO-

CH2

COO-

H

CH2 COO-

CH COO-

C COO-

H

HO

CH2 COO-

CH2

C COO-

O

CH3 C SCoA

O

CO2

Acetil CoA

Condensación

Isomerización

DescarboxilaciónOxidativa

oxalacetato HO

CH2 C

C COO-

C COO-

O

O-

H

H

Panorámica del ciclo de Krebs

Citrato

Isocitrato

α-cetoglutarato

NAD+

CH2

COO-

CH2

C SCoA

O

4

NAD+

CH2

COO-

CH2

C SCoA

O

COO-

CH2

CH2

COO-

Fosforilación a nivel de sustrato

Succinil-CoASuccinato

CoA-SHCO2

GDP

COO-

CH

CH

COO-

5

6

COO-

C ―H

HC ―H

COO-

HO

Hidratación

7

Fumarato

L-Malato

Fumarasa (fumarato hidratasa),estereoespecífica

7. Hidratación del Fumarato a Malato.

Esta enzima es específica para el fumarato y el L-malato

COO-

C H

CH

COO-

Fumarato

COO-

C H

CH

COO-

HO

H

L-Malato

H2O

∆G’o = -3,8 kJ/mol

Fumarasa

Cataliza la hidratación del doble enlace en trans del fumarato

CisTrans

7. Hidratación del Fumarato a Malato.

Esta enzima es específica para el fumarato y el L-malato

COO-

C H

CH

COO-

Fumarato

COO-

C H

CH

COO-

HO

H

L-Malato

H2O

∆G’o = -3,8 kJ/mol

Fumarasa

COO-

C H

CH

COO-

Fumarato

COO-

C H

CH

COO-

HO

H

L-Malato

OH-

Fumarasa

COO-

C H

CH

COO-

HO

H+

Estado de transicióncarbanión

O C

COO-

CH2

COO-

H

CH2 COO-

CH COO-

C COO-

H

HO

CH2 COO-

CH2

C COO-

O

CH3 C SCoA

O

CO2

Acetil CoA

Condensación

Isomerización

DescarboxilaciónOxidativa

oxalacetato HO

CH2 C

C COO-

C COO-

O

O-

H

H

Panorámica del ciclo de Krebs

Citrato

Isocitrato

α-cetoglutarato

NAD+

CH2

COO-

CH2

C SCoA

O

4

NAD+

CH2

COO-

CH2

C SCoA

O

COO-

CH2

CH2

COO-

Fosforilación a nivel de sustrato

Succinil-CoASuccinato

CoA-SHCO2

GDP

COO-

CH

CH

COO-

5

6

COO-

C ―H

HC ―H

COO-

HO

Hidratación

7

Deshidrogenación

8

L-Malato

Fumarato

NAD+

8. Oxidación del malato a oxalacetato

COO-

C

CH

COO-

Oxalacetato

COO-

C H

CH

COO-

HO

H

L-MalatoL- Malato deshidrogenasa

O

H

∆G’o = 29,7 kJ/mol

NAD+ NADH + H+

El Oxalacetato es eliminado continuamente por la reacción altamente exergónica de la citrato sintasa. Esto mantiene la concentración de oxalacetato relativamente baja <106M, lo que empuja la reacción de la malato deshidrogenasa hacia la formación de oxalacetato

1 sola molécula de Oxalacetato es usada para catalizar un gran número de Acetil

CoA

O C

COO-

CH2

COO-

H

CH2 COO-

CH COO-

C COO-

H

HO

CH2 COO-

CH2

C COO-

O

CH3 C SCoA

O

CO2

Acetil CoA

Condensación

Isomerización

DescarboxilaciónOxidativa

oxalacetato HO

CH2 C

C COO-

C COO-

O

O-

H

H

Panorámica del ciclo de Krebs

Citrato

Isocitrato

α-cetoglutarato

NAD+

CH2

COO-

CH2

C SCoA

O

4

NAD+

CH2

COO-

CH2

C SCoA

O

COO-

CH2

CH2

COO-

Fosforilación a nivel de sustrato

Succinil-CoASuccinato

CoA-SHCO2

GDP

COO-

CH

CH

COO-

5

6

COO-

C ―H

HC ―H

COO-

HO

Hidratación

7

Deshidrogenación

8

L-Malato

Fumarato

NAD+ ∆G’o = -32.2 kJ/mol

∆G’o = 29,7 kJ/mol

• equilibrio de reacción desplazado a la formación de malato• [oxalacetato] (<10-6M) si es utilizado continuamente (citrato sintasa) • empuja la reacción a la formación de oxalacetato

1) Introducción- Fuentes de acetato.- Ubicación del ciclo en el mapa metabólico y en la célula. - Condiciones energéticas 2) Reacciones del ciclo 3) Balance global4) Regulación5) Funciones anabólicas6) Reacciones anapleróticas

Objetivos:

Comprender la importancia del Ciclo de Krebs en el metabolismo.Conocer las reacciones del Ciclo de Krebs y su regulación.

proteínas

aminoácidos

glucógeno

glucosa

triacilglicéridos

ácidos grasos

Acetil CoA

piruvato

Ciclo de Krebs

CO2

CO2

Descarboxilación oxidativadel Piruvato

4C +2C6 C4 C

1 sola molécula de Oxalacetato es usada para catalizar un gran número de Acetil-CoA

O C

COO-

CH2

COO-

H

CH2 COO-

CH COO-

C COO-

H

HO

CH2 COO-

CH2

C COO-

O

CH3 C SCoA

O

CO2

Acetil CoA

Condensación

Isomerización

DescarboxilaciónOxidativa

oxalacetato HO

CH2 C

C COO-

C COO-

O

O-

H

H

Panorámica del ciclo de Krebs

Citrato

Isocitrato

α-cetoglutarato

NAD+

CH2

COO-

CH2

C SCoA

O

4

NAD+

CH2

COO-

CH2

C SCoA

O

COO-

CH2

CH2

COO-

Fosforilación a nivel de sustrato

Succinil-CoASuccinato

CoA-SHCO2

GDP

COO-

CH

CH

COO-

5

6

COO-

C ―H

HC ―H

COO-

HO

Hidratación

7

Deshidrogenación

8

L-Malato

Fumarato

NAD+

O C

COO-

CH2

COO-

H

CH2 COO-

CH COO-

C COO-

H

HO

CH2 COO-

CH2

C COO-

O

CH3 C SCoA

O

CO2

Acetil CoA

Condensación

Isomerización

DescarboxilaciónOxidativa

oxalacetato HO

CH2 C

C COO-

C COO-

O

O-

H

H

Panorámica del ciclo de Krebs

Citrato

Isocitrato

α-cetoglutarato

NAD+

CH2

COO-

CH2

C SCoA

O

4

NAD+

CH2

COO-

CH2

C SCoA

O

COO-

CH2

CH2

COO-

Fosforilación a nivel de sustrato

Succinil-CoASuccinato

CoA-SHCO2

GDP

COO-

CH

CH

COO-

5

6

COO-

C ―H

HC ―H

COO-

HO

Hidratación

7

Deshidrogenación

8

L-Malato

Fumarato

NAD+

Balance global

del Ciclo de Krebs

O C

COO-

CH2

COO-

H

CH2 COO-

CH COO-

C COO-

H

HO

CH2 COO-

CH2

C COO-

O

CH3 C SCoA

O

CO2

Acetil CoA

Condensación

Isomerización

DescarboxilaciónOxidativa

oxalacetato HO

CH2 C

C COO-

C COO-

O

O-

H

H

Panorámica del ciclo de Krebs

Citrato

Isocitrato

α-cetoglutarato

NAD+

CH2

COO-

CH2

C SCoA

O

4

NAD+

CH2

COO-

CH2

C SCoA

O

COO-

CH2

CH2

COO-

Fosforilación a nivel de sustrato

Succinil-CoASuccinato

CoA-SHCO2

GDP

COO-

CH

CH

COO-

5

6

COO-

C ―H

HC ―H

COO-

HO

Hidratación

7

Deshidrogenación

8

L-Malato

Fumarato

NAD+

Entradas salidas

1) Oxalacetato + Acetil-CoA + H2O

Citrato + CoA

2) Citrato + H2O Isocitrato + H2O

3) Isocitrato + NAD+ α-cetoglutarato + NADH + H+ + CO2

4) α-cetoglutarato

+ NAD+ + CoA

Succinil-CoA + CO2

+ NADH + H+

5) Succinil-CoA + GDP + Pi Succinato + GTP + CoA

6) Succinato + FAD Fumarato + FADH2

7) Fumarato + H2O L-malato

8) L-malato + NAD+ Oxalacetato + NADH + H+

Ecuaciones igualadas para cada reacción del Ciclo de Krebs

Entradas salidas

1) Oxalacetato + Acetil-CoA + H2O

Citrato + CoA

2) Citrato + H2O Isocitrato + H2O

3) Isocitrato + NAD+ α-cetoglutarato + NADH + H+ + CO2

4) α-cetoglutarato

+ NAD+ + CoA

Succinil-CoA + CO2

+ NADH + H+

5) Succinil-CoA + GDP + Pi Succinato + GTP + CoA

6) Succinato + FAD Fumarato + FADH2

7) Fumarato + H2O L-malato

8) L-malato + NAD+ Oxalacetato + NADH + H+

Ecuaciones igualadas para cada reacción del Ciclo de Krebs

Entradas: Acetil-CoA + 3 NAD+ + FAD + GDP + Pi + 2 H2OSalidas: 3 NADH + 3 H+ + FADH2 + 2 CO2 + GTP + CoA

Isocitrato (6 C)

-cetoglutarato(5 C)

Succinil CoA (4 C)

Succinato (4 C)

Fumarato (4 C)

L-Malato (4 C)

Oxalacetato(4 C)

Citrato (6 C)

Acetil CoA (2 C)

Balance Global

CoA + 2 CO2 + 3 NADH + FADH2 + GTP NAD+

NADH +H+

CO2

CO2

CoASHNAD+

NADH +H+

H2O

GTP GDP + Pi

CoASH

NADH +H+

NAD+

Acetil CoA + 3 NAD+ + FAD + GDP + Pi + 2 H2O

FADH2

FAD

Energía3 NADH + FADH2 + GTP

O C

COO-

CH2

COO-

H

CH2 COO-

CH COO-

C COO-

H

HO

CH2 COO-

CH2

C COO-

O

CH3 C SCoA

O

CO2

Acetil CoA

oxalacetato HO

CH2 C

C COO-

C COO-

O

O-

H

H

Panorámica del ciclo de Krebs

Citrato

Isocitrato

α-cetoglutaratoCH2

COO-

CH2

C SCoA

O

4CH2

COO-

CH2

C SCoA

O

COO-

CH2

CH2

COO- Succinil-CoASuccinato

CO2

COO-

CH

CH

COO-

5

6

COO-

C ―H

HC ―H

COO-

HO

7

8

L-Malato

Fumarato

Destino de los Carbonos del Acetil CoA

Los 2 C del Acetil CoA salen en una vuelta del ciclo?

3) Transferencia e-

y fosforilación oxidativa

2) Oxidación de

Acetil-CoA

Modificado Fig. 16-1 de Lehninger

Respiración celularRespiración celular

produceNADH FADH2

¿Donde se reoxidan?

Cadena de transporte de e-

produce ATP

Modelo quimiosmótico: e- del NADH, FADH2 y otros sustratos oxidables se reoxidan en la CT e-

e-e-

Rendimiento energético en cada vueltadel Cilo de Krebs

3 x 2.5 ATP + 1 x 1.5 ATP +1 ATP

10 ATP

3 NADH + 1 FADH2 +1 GTP

En la Fosforilación Oxidativa:

1 NADH 2,5 ATP

1 FADH2 1,5 ATP

Reducción de CoE y formación de ATP en oxidación aeróbica de la glucosa (glucólisis, descarboxilación oxidativa del pir., CK, Cte y FO)

Reacción ATP/Co E ATP

Glucosa a G-6-P - 1 ATP -1

F-6-P a F1,6BP - 1 ATP -1

2) GAP a 2) 1,3BPG 2 NADH 5 (3)

2) 1,3BPG a 2) 3PG 2 ATP 2

2) Fosfoenolpiruvato a 2) piruvato 2 ATP 2

2) Piruvato a 2) acetil-CoA 2 NADH 5

2) Isocitrato a 2) α-cetoglutarato 2 NADH 5

2) α-cetoglutarato a 2) succinil-CoA 2 NADH 5

2) succinil-CoA a 2) succinato 2 ATP (2GTP) 2

2) Succinato a 2) fumarato 2 FADH2 3

2) Malato a 2) oxalacetato 2 NADH 5

Total 30-32

10 ATP/vuelta

C. K.

X 2=20 ATP

PDH

Glucólisis

5 o 7 ATP

Fases o Etapas de la respiración

Mitocondria

Lactato

Sin Oxígeno, el piruvato no entra en la mitocondriaOxidándose de forma incompleta a lactato.

ATP ATP

Fases o Etapas de la respiración

ATPATP

ATP

ATPATP

ATP

ATPATP

ATPATP

ATPATP

ATPATP

ATPATP

ATPATP

ATPATP

ATP

ATPATP

ATPATP

ATPATP

ATPATP

ATPATP

ATPATP

En presencia de Oxígeno….

Partiendo de glucosa se generan 32-30 ATP

¿Qué porcentaje de la “energía de la glucosa” se conserva en forma de ATP?

Datos: glucosa a CO2 y H2O en calorímetro ∆G’o = - 2840 kJ/mol

Hidrólisis de ATP a ADP + Pi ∆G’o = - 30.5 kJ/mol

34 % en condiciones estándar

Síntesis de 1 ATP ….. 30.5 kJ/mol 32 ATP …… X = 976 kJ/mol 2840 kJ/mol ….. 100%

976 kJ/mol …... X = 34 %

65 % en condiciones fisiológicas

energía de oxidaciones de C K se conserva eficientemente!!

Regulación

del Ciclo de Krebs

Variaciones de energía libre (kJ/mol)en condiciones estándar y fisiológicas de las reacciones

del Ciclo de Krebs Enzima ∆G’o ∆G’

1 citrato sintasa -31.5 negativo

2 aconitasa +5 0

3 isocitrato deshidrogenasa -21 negativo

4 complejo α-cetoglutarato deshidrogenasa

-33 negativo

5 succinil-CoA sintetasa -2.1 0

6 succinato dehidrogenasa +6 0

7 fumarasa -3.4 0

8 malato deshidrogenasa +29.7 0

Reacciones 1, 3 y 4 son irreversibles reacciones de control del flujo

Isocitrato (6 C)

-cetoglutarato(5 C)

Succinil CoA (4 C)

Succinato (4 C)

Fumarato (4 C)

L-Malato (4 C)

Oxalacetato(4 C)

Citrato (6 C)

Acetil CoA (2 C)

CO2

CO2

NADH

NADH

NADH

FADH2

GTP

1

2

3

4

5

6

7

8

Citrato Sintasa

Aconitasa

Isocitrato desidrogenasa

Complejo de la Cetoglutaratodeshidrogenasa

Succinil CoA Sintetasa

Succinato Deshidrogenasa

MalatoDeshidrogenasa

Fumarasa

Reacciones alejadas del equilibrio

3 reacciones irreversibles

5 reacciones reversibles

∆G’ negativo

Regulación estricta pero sencilla

• Consumo de O2• reoxidación del NADH están acopladas • producción de ATPMecanismo de regulación por retroalimentación quecoordina producción de NADH con consumo energético.

• Regulación por:- disponibilidad de sustrato

- inhibición por producto - inhibición competitiva por intermediarios del ciclo

Acetil-CoA y oxalacetatoNADHNADH

Citrato, succinil-CoA, ATP

[acetil-Coa] y [oxalacetato][acetil-Coa] y [oxalacetato] normalmente normalmente no saturan la citrato sintasa

Reacción 1, E Citrato sintasa: inhibida por: alta [NADH], [ATP], [citrato], [succinil-CoA]

inhibidores competitivos: citrato de oxalacetato succinil-CoA de CoA

aumenta actividad por: [acetil-CoA] y [ oxalacetato] (sustratos, no saturan E)

Reacción 3, E Isocitrato deshidrogenasa: inhibida por: alta [NADH], [ATP] (- producto)activada por: alta [ADP], [Ca2+]

Reacción 4, E Complejo α-cetoglutarato deshidrogenasainhibida por: alta [NADH] y [succinil-CoA] (- producto) activada por: alta [ADP], [Ca2+].

Estas enzimas constituyen puntos en los que se regula el flujo a través del ciclo

E2E1 E3

PI

II

Protein kinasa

Protein fosfatasa

-cetoglutarato

Succinil CoA

L-Malato

Oxalacetato Citrato

Acetil CoA

NADHNADH

FADH2

Isocitrato

Succinato

Fumarato

GTP

ATPCoA,NAD+, AMP, Ca2+

NADH, ATP,Succinil CoA, citrato

ATP,

Succinil CoA, NADH

Citrato sintasa

Isocitrato deshidrogenasa

cetoglutarato deshidrogenasa

Regulación covalente

Regulación alostérica Piruvato

Complejo de la PiruvatoDeshidrogenasa

NADH, Acetil CoA

ADP, Acetil CoA, Oxalacetato

ADP, Ca2+

ADP, Ca2+

NADH

E2E1 E3

OH

I

II

Protein kinasa

Protein fosfatasa

Inactiva E1Activa E1

Canalización de sustratos contribuye a la catálisis

Elevada concentración de E favorece su asociación

Extracto de células rotas la dilución en buffer disminuye la 100 a 1000 veces

En C de K Puede darse canalizaciónde sustratos

Por que es tan complicada la oxidación del Acetato a CO2?

• Ciclo de Krebs es el núcleo del metabolismo intermediario.

No representa la vía más corta de Acetato a CO2 pero es la que a través del tiempo ha conferido mayores ventajas selectivas.

• Productos de muchos procesos catabólicos alimentan el Ciclo.

• Intermediarios del ciclo son utilizados como precursores en distintas vías metabólicas!!!!

Ciclo de Krebs• Involucra procesos de degradación y conservación de

energía

• Intermediarios del ciclo solo se requieren en concentraciones catalíticas para mantener la función degradativa del Ciclo

• Varias vías biosintéticas utilizan intermediarios del ciclo como material de inicio en la biosíntesis

Sin embargo…

(anabolismo)

(catabolismo)

Vía Anfibólica

tiene funciones catabólicas y anabólicas

Ciclo de KrebsLas reacciones que utilizan (“agotan”) intermediarios del ciclo se denominan catapletoricas (del griego “cata” = descendente “pletorikos”= llenar)

• Gluconeogénesis (OA): biosíntesis de glucosa implica la conversión de OA en

malato o aspartato para transportarse al citosol

Citrato liasa

•Biosíntesis de porfirinas (succinil-CoA):succinil-CoA es intermediario en síntesis del anillo de porfirina de los grupos hemo, importantes en transporte de O2 y electrones

• Biosíntesis de amino ácidos (α-cetoglutarato y OA):son iniciadores de la síntesis, desaminación de

α-cetoglutarato+NADH+H + +NH4+

Glu+NAD +

+H2OGlu deshidrogenasa

OA + Ala Asp. + Piruvatotransaminación

Reacciones Anapleróticas

Los intermediarios que “salen” del ciclo de Krebs, se deben reponer!!!!Las reacciones que reponen intermediarios del ciclo se denominan anapleróticas

ReacciónReacción Tejido/organismoTejido/organismo

Piruvato Piruvato carboxilasacarboxilasa

Hígado, RiñonHígado, Riñon

Entrada Entrada PropionatoPropionato

Hígado (rumiantes)Hígado (rumiantes)

PEP PEP CarboxiquinasaCarboxiquinasa

Corazón, Músc. Corazón, Músc. esqueléticoesquelético

Enzima MálicoEnzima Málico Todos,hepatocitos, Todos,hepatocitos, adipocitosadipocitos

HCO3-

ATP

ADP Pi

+

4 subunidades idénticasCada una tiene Biotina (vit) como grupo prostético

Biotina: transportadorespecializado de grupos monocarbonados en su forma más oxidada

La PC tiene 4 subunidades idénticas, cada una tiene una molécula de biotina unida covalentemente a través de un enlace amida al grupo e-amino de un residuo específio de Lys en el sitio activo del enzima.

biotina (grupo prostetico de la E, transporta CO2)

Bicarbonato es activado por ATPformandoCarboxifosfato

Anclaje de Biotina a E

Los grupos carboxilo son activados en una reacción que rompe el ATP y une CO2 (del bicarbonato) a la biotina ligada al enzima

La carboxilación del piruvato tiene lugar en dos pasos: 1) un grupo carboxilo proveniente del bicarbonato se une a la biotina

Este CO2 (activado) se transfiere entonces al aceptor (piruvato) en un a reacción de carboxilación.

Y 2) a continuación el grupo carboxilo se transfiere al piruvato para formar oxalacetato. Estos dos pasos tienen lugar en sitios activos diferentes.

.

Se formar oxalacetato.

Glucosa

Neoglucogénesis

RUMENGlucosa

PiruvatoGlucólisis

LactatoLactato deshidrogenasa

Lactil-CoA

Acrilil-CoA

Propionil-CoA

Propionato

oxalacetato

malato

fumarato

succinato

Hígado

Propionato

Propionato

Propionil-CoACoASH

ATP

AMP

D-Metilmalonil-CoA

CO2ATP

AMP

Succinil-CoA

Reorganización C.K.

oxalacetato

Glucosa

sangre

sangre

1

1Tiocianasa, o Acil-CoA sintetasa2

2Propionil-CoA carboxilasa-Metilmalonil-CoA 3

3

Metilmalonil-CoA racemasa4Metilmalonil-CoA mutasa4

Vía malato

Otrostejidos

L-Malato

Todos,hepatocitos, adipocitos

TAGTAG

AGAG

OH

CH2 C

C COO-O C

COO-

CH2

COO-

C COO-

O

O-

H

H

H

CH2 COO-

CH COO-

C COO-

H

HO

Isocitrato

-cetoglutarato

CH2 COO-

CH2

C COO-

O

Succinil CoA

CH2

COO-

CH2

C SCoA

O

CH3 C SCoA

O

Succinato

COO-

CH2

CH2

COO-

COO-

CH

CH

COO-

Fumarato

COO-

C ―H

HC ―H

COO-

HO

L-Malato

OxalacetatoCitrato

CO2

CO2

Ciclo de Krebs

Hepatocito

Gotas de lípidos

C de Krebs

Ácidos grasos Acetil-CoA

Oxalacetato

Glucosa

Exportada: combustible para cerebro y otros tejidos

Formación de cuerpos cetónicos

AcetoacetatoΒ-hidroxibutiratoAcetona

ExportadosFuente de energía: CorazónMúsculo esqueléticoRiñóncerebro

Alta [CC] en:InaniciónDiabetesOveja gestación múltipleVaca posparto(gran demanda energética)

Si el Acetil CoA no es utilizado en el ciclo de Krebs

Glucosa

Glucosa-6-P

Fructuosa-6-P

Fructuosa -1,6-BP

Gliceraldehído-3-PDHAP

1,3-B-P

3-PG

2-PG

PEP

PiruvatoOXA

PC

PEPCK

F16Pasa

G6Pasa

Proteínas

aminoácidos

aminoácidos

Intermediarios del C. K.

Propionato

Lactato

TAGTAG

AGAG

GlicerolGlicerol

Músculo

Lactato

Producto

-cetoglutarato

Succinil CoAL-Malato

Oxalacetato

Citrato

Acetil CoA

Piruvato

PiruvatoCarboxilasa

Aminoácidos

Glutamato

Aminoácidos

Fumarato

Aminoácidos

Aminoácidos

Propionato

LeucinaLeucinaLisinaLisinaTirosina Tirosina FenilalaninaFenilalaninaTriptófanoTriptófano

Leucina Leucina Isoleucina Isoleucina TriptófanoTriptófano

Acetoacetil-CoAAcetoacetil-CoA

Ciclo Ciclo de de

KrebsKrebs

GlucosGlucosaa

IsocitratoIsocitratoFumaratoFumarato

AlaninaAlaninaCisteínaCisteínaGlicinaGlicinaSerinaSerinaTriptófanoTriptófano

-Cetoglutarato-Cetoglutarato

Piruvato Acetil-CoAAcetil-CoA

Oxaloacetato Oxaloacetato AsparaginaAsparaginaAspartatoAspartato

AspartatoAspartatoTirosinaTirosinaFenilalaninaFenilalanina

Succinil-CoASuccinil-CoA

MetioninaMetioninaValinaValinaTreonina Treonina IsoleucinaIsoleucina

ArgininaArgininaHistidinaHistidinaGlutaminaGlutaminaProlinaProlina

CitratoCitrato

GlutamatoGlutamato

Cuerpos Cuerpos cetónicocetónico

ss

El ayuno conduce al catabolismo de aminoácidos glucogénicos.El ayuno conduce al catabolismo de aminoácidos glucogénicos.

CO2

CO2

Los aminoácidos estándar entran al ciclo de Los aminoácidos estándar entran al ciclo de Krebs para ser oxidados.Krebs para ser oxidados.

El piruvato para ser oxidado en el ciclo de Krebs.

•Debe ser convertido primero a oxaloacetato.•Es convertido primero a acetil-CoA por descarboxilación oxidativa.•Requiere bajos niveles de NAD porque este compuesto va inhibir el proceso.•Es realizado por una enzima que lo convierte a Acetil CoA•Requiere solamente TPP como cofactor•Requiere de un Complejo Multienzimatico ubicado en la matriz mitocondrial•Debe ser transportado desde el citosol a la mitocondria•Requiere el “Complejo de la Piruvato Deshidrogenasa” que tiene TPP, Lipoato, FAD, NAD y CoA como cofactores.•Debe ser descarboxilado en una reacción que en condiciones fisiológicas es reversible

El ciclo de Krebs:

•produce acetil-CoA•consume GTP•produce ATP indirectamente•es catalizado por un único complejo multienzimático•se realiza por E mitocondriales y citosolicas•produce 3 NADH por cada vuelta del ciclo•Salen 2 CO2 por vuelta del ciclo•la conversión de succinato a fumarato es la única reacción catalizada por una enzima unida a la MMI•Produce un GTP por fosforilación oxidativa•es inhibido por altas concentraciones de NADH y de ATP•Solo tiene funciones catabólicas•Es una vía Anfibólica •Es estimulado por altas concentraciones de Acetil-CoA, ADP y OA

El ciclo de Krebs:

•produce intermediarios biosintéticos•no requiere reposición de los intermediarios biosintéticos•la conversión de piruvato en oxalacetato es catalizada por la piruvato deshidrogenasa•la principal forma de reponer intermediarios es transaminación de aa•La piruvato carboxilasa es estimulada por altas concentraciones de acetil-CoA•la piruvato carboxilasa no requiere cofactores

Síntesis

• Se realiza en la mitocondria (7 E matriz, 1 MMI).• Oxida intermediarios para dar coenzimas reducidas

necesarias para la síntesis de ATP.• Por cada vuelta del ciclo se producen 3 NADH, 1

FADH2 y 1 GTP (ATP) por fosforilación a nível de sustrato.

• Por cada vuelta del ciclo salen 2 carbonos como CO2.

• 3 (de 8) reacciones son irreversibles, 3 puntos de control de flujo a través del ciclo.

El ciclo de Krebs es el centro del metabolismo

Síntesis

• altas [acetil-CoA] y [ oxalacetato] [ADP], [Ca2+] son estimuladoras del ciclo

• Altas [NADH], [ATP], [citrato], [succinil-CoA] son inhibidoras del ciclo

• Intermediarios son utilizados en la biosíntesis de constituyentes vitales para la célula: vía anfibólica.

• Reacciones anapleróticas reponen intermediarios.• Principal reacción anaplerótica: Piruvato carboxilasa.

El ciclo de Krebs es el centro del metabolismo