diagnóstico de laboratorio por citometría de flujo
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La Plata 13 de Noviembre de 2010La Plata 13 de Noviembre de 2010
Diagnóstico de Diagnóstico de Laboratorio por Laboratorio por Citometría de Citometría de
FlujoFlujoLuis Pistaccio. Hospital de Niños “Sor María Ludovica”.Luis Pistaccio. Hospital de Niños “Sor María Ludovica”.
La Plata.La Plata.
Diagnóstico desde el Laboratorio de Diagnóstico desde el Laboratorio de LALA
Morfología.Morfología.
Citoquímica.Citoquímica.
Citogenético.Citogenético.
Biología Molecular.Biología Molecular.
Citometría de Flujo.Citometría de Flujo.
MorfologíaPte: con palidez, dolor articular, hematomas, Pte: con palidez, dolor articular, hematomas, fiebre, decaimiento y hepato esplenomegalia.fiebre, decaimiento y hepato esplenomegalia.Hemograma : GB: 100.000 /mmHemograma : GB: 100.000 /mm33 , Hto: 16 %, , Hto: 16 %, Plaq: 15.000 /mmPlaq: 15.000 /mm33 . Fla dif 100% linfocitos tipo . Fla dif 100% linfocitos tipo L1L1
Consulta hematológicaConsulta hematológica
MorfologíaPte: dolor articular, fiebre y hepato Pte: dolor articular, fiebre y hepato esplenomegalia.esplenomegalia.Hemograma : GB: 8.000 /mmHemograma : GB: 8.000 /mm33 , Hto: 27 %, Plaq: , Hto: 27 %, Plaq: 150.000 /mm150.000 /mm33 . Fla dif 52% linfocitos tipo L1, . Fla dif 52% linfocitos tipo L1, 38% neutrófilos y 10% monocitos38% neutrófilos y 10% monocitos
Consulta hematológicaConsulta hematológica
Observación, conocimientoObservación, conocimiento
Citometría de FlujoCitometría de Flujo
Esquema de ComponentesEsquema de ComponentesMuestraMuestra
Fluido isotónicoFluido isotónico
LáserLáser Sistema Sistema de de
detectordetectoreses
Celda de conteoCelda de conteo
Dispersión de luzLa dispersión de la luz. Parámetros físicos, La dispersión de la luz. Parámetros físicos, (morfométricos). Propiedades intrínsecas.(morfométricos). Propiedades intrínsecas.
Forward Scatter (FSC). Desde 0.5-1° a 10-20°.Forward Scatter (FSC). Desde 0.5-1° a 10-20°.
Side Scatter (SSC). Aprox. 90° a la derecha del haz Side Scatter (SSC). Aprox. 90° a la derecha del haz incidente. incidente.
Absorción de luz por fluorocromos pegados a las células y Absorción de luz por fluorocromos pegados a las células y emisión de luz fluorescente. Propiedades extrínsecas ya emisión de luz fluorescente. Propiedades extrínsecas ya que es necesario el agregado de un compuesto exógeno.que es necesario el agregado de un compuesto exógeno.
Fluorocromos unidos a Ac Mo.Fluorocromos unidos a Ac Mo.
Fluorocromos que se unen a componentes Fluorocromos que se unen a componentes celulares.celulares.
Citometría de FlujoCitometría de Flujo
1 láser 3 colores1 láser 3 colores
Time
Time
FL1
Time
FL3
Data Processor
SSC
FSC FL2
3 lásers 8 colores3 lásers 8 colores
FL8
Data Data ProcessingProcessing
SSC
FSC FL1
FL3
FL2
FL5
FL6
FL7
FL4
Histograma de dos parámetros (Quad-stat)
FL2
FL1
B3B3
B1B1 B2B2
B4B4
B1 positivo para FL1B1 positivo para FL1B2 Doble positivoB2 Doble positivoB3 Doble negativoB3 Doble negativoB4 Positivo para FL2B4 Positivo para FL2
APLICACIONES DE LA CITOMETRIA DE APLICACIONES DE LA CITOMETRIA DE FLUJO PARA EL ESTUDIO DE L.A.FLUJO PARA EL ESTUDIO DE L.A.
Diagnóstico de línea: linfoide-mieloide.Diagnóstico de línea: linfoide-mieloide.Subclasificación inmunológica de LLA B y T.Subclasificación inmunológica de LLA B y T. Diagnóstico de línea de LMA.Diagnóstico de línea de LMA. Detección de LLA hiperdiploides.Detección de LLA hiperdiploides. Detección de proteinas de fusión.Detección de proteinas de fusión. Detección de EMR.Detección de EMR.
Diagnóstico: M.O. normal
LinfocitosLinfocitos MonocitosMonocitos
Mieloide madura Mieloide madura Mieloide inmadura Mieloide inmadura
EritroideEritroide
Diagnóstico Diagnóstico
En general la población a estudiar es un En general la población a estudiar es un porcentaje considerable (20 %). porcentaje considerable (20 %). Alteración de la distribución normal de los Alteración de la distribución normal de los componentes de la MO. componentes de la MO. Aparición de una población con Aparición de una población con inmunofenotipo anómalo.inmunofenotipo anómalo. Asignación de linaje según inmunofenotipo Asignación de linaje según inmunofenotipo obtenido.obtenido.
APLICACIONES DE LA CITOMETRIA DE APLICACIONES DE LA CITOMETRIA DE FLUJO PARA EL ESTUDIO DE L.A.FLUJO PARA EL ESTUDIO DE L.A.
Diagnóstico de línea: linfoide-mieloide.Diagnóstico de línea: linfoide-mieloide.
Diagnóstico de línea de LMA.Diagnóstico de línea de LMA. Detección de LLA hiperdiploides.Detección de LLA hiperdiploides. Detección de proteinas de fusión.Detección de proteinas de fusión. Detección de EMR.Detección de EMR.
Subclas. Inmunológica de LLA B y T Subclas. Inmunológica de LLA B y T
cCD22+, cCD79a+, CD19+, HLA-DR+
Clasificación LLA de precursores Clasificación LLA de precursores BB
Pro B: CD10 -
Común: CD10+, cad -
Pre B: CD10+/-, cad +, Ig Sup -
B madura: CD10+/-, Ig Sup+ ( ó )
Clasificación EGIL Clasificación EGIL
cCD3+, CD7+, TCR+/-, HLA-DR-
Clasificación LLA de precursores Clasificación LLA de precursores TT
Pro T: CD2 -, CD5 - , CD8 -
Pre T: CD2+,y/o CD5+ y/o CD8+
Intermedia: CD1a+,CD4+/CD8+,CD3+/-
T madura: CD1a-, CD3+ , TCR
Clasificación EGIL Clasificación EGIL
APLICACIONES DE LA CITOMETRIA DE APLICACIONES DE LA CITOMETRIA DE FLUJO PARA EL ESTUDIO DE L.A.FLUJO PARA EL ESTUDIO DE L.A.
Diagnóstico de línea: linfoide-mieloide.Diagnóstico de línea: linfoide-mieloide.
Detección de LLA hiperdiploides.Detección de LLA hiperdiploides. Detección de proteinas de fusión.Detección de proteinas de fusión. Detección de EMR.Detección de EMR.
Subclas. Inmunológica de LLA B y T Subclas. Inmunológica de LLA B y T
Diagnóstico de línea de LMA.Diagnóstico de línea de LMA.
Diagnóstico de Linaje en LMADiagnóstico de Linaje en LMA
La correlación con la clasificación FAB es La correlación con la clasificación FAB es limitada.limitada.
Hasta hace unos años sólo diagnóstico en M0 y Hasta hace unos años sólo diagnóstico en M0 y M7.M7.
Al aumentar el número de fluorocromos y los Ac Al aumentar el número de fluorocromos y los Ac Mo disponibles mayor capacidad diagnóstica.Mo disponibles mayor capacidad diagnóstica.
Correlación inmunofenotipo-genotipo.Correlación inmunofenotipo-genotipo.
Score EGIL Puntuación Score EGIL Puntuación BifenotípicasBifenotípicas
Linaje B Linaje T Linaje mieloide Puntos
cCD79a cCD3 aMPO 2
cIgM TCR 2
cCD22 TCR 2
CD19 CD2 CD13 1
CD20 CD5 CD33 1
CD10 CD8 CD117 1
Tdt Tdt CD14 0.5
CD7 CD15 0.5
CD1a CD64 0.5
Para asignar un linaje determinado a los blastos, el score debe ser >2Para asignar un linaje determinado a los blastos, el score debe ser >2Una LA se define como bifenotípica si el puntaje resulta >2 para más de un linajeUna LA se define como bifenotípica si el puntaje resulta >2 para más de un linaje
APLICACIONES DE LA CITOMETRIA DE APLICACIONES DE LA CITOMETRIA DE FLUJO PARA EL ESTUDIO DE L.A.FLUJO PARA EL ESTUDIO DE L.A.
Diagnóstico de línea: linfoide-mieloide.Diagnóstico de línea: linfoide-mieloide.
Detección de proteinas de fusión.Detección de proteinas de fusión. Detección de EMR.Detección de EMR.
Subclas. Inmunológica de LLA B y T Subclas. Inmunológica de LLA B y T
Diagnóstico de línea de LMA.Diagnóstico de línea de LMA.
Diagnóstico de LLA hiperdiploidesDiagnóstico de LLA hiperdiploides
APLICACIONES DE LA CITOMETRIA DE APLICACIONES DE LA CITOMETRIA DE FLUJO PARA EL ESTUDIO DE L.A.FLUJO PARA EL ESTUDIO DE L.A.
Diagnóstico de línea: linfoide-mieloide.Diagnóstico de línea: linfoide-mieloide.
Detección de proteinas de fusión.Detección de proteinas de fusión.
Subclas. Inmunológica de LLA B y T Subclas. Inmunológica de LLA B y T
Diagnóstico de línea de LMA.Diagnóstico de línea de LMA.
Diagnóstico de LLA hiperdiploidesDiagnóstico de LLA hiperdiploides
Detección de EMR.Detección de EMR.
APLICACIONES DE LA CITOMETRIA DE APLICACIONES DE LA CITOMETRIA DE FLUJO PARA EL ESTUDIO DE L.A.FLUJO PARA EL ESTUDIO DE L.A.
Diagnóstico de línea: linfoide-mieloide.Diagnóstico de línea: linfoide-mieloide.
Detección de proteinas de fusión.Detección de proteinas de fusión.
Subclas. Inmunológica de LLA B y T Subclas. Inmunológica de LLA B y T
Diagnóstico de línea de LMA.Diagnóstico de línea de LMA.
Diagnóstico de LLA hiperdiploidesDiagnóstico de LLA hiperdiploides
Detección de EMR.Detección de EMR.
EMR: DEFINICIONEMR: DEFINICION
Enfermedad indetectable a la microscopía óptica, Enfermedad indetectable a la microscopía óptica, que puede expandirse en cualquier momento, que puede expandirse en cualquier momento, haciéndose evidente como una recaída de la haciéndose evidente como una recaída de la enfermedad. (enfermedad. (Foroni et al. 2002).Foroni et al. 2002).
Consiste en la permanencia de un clon anormal, en Consiste en la permanencia de un clon anormal, en cantidades indetectables para la microscopía óptica, cantidades indetectables para la microscopía óptica, durante o al finalizar el tratamiento.durante o al finalizar el tratamiento.
Actualmente es un pilar básico para:Actualmente es un pilar básico para:
• Seguimiento de la enfermedad.Seguimiento de la enfermedad.
• Diagnóstico precoz de recaída.Diagnóstico precoz de recaída.
• Conducta pretransplante. Conducta pretransplante.
ALLIC BFM 20ALLIC BFM 201010: C: Clasificaciónlasificación
DIAGNÓSTICO
DIA 8
DÍA 15
DÍA 33
GRUPOS DE RE RI RA
RIESGO 13% 66% 21%
RECAÍDAS 5% 22% 40%
EDAD 1-5aGB <20 x 109/L
BLASTOS D8 <1000
EDAD <1 ≥6aGB ≥20 x 109/L
BLASTOS D8 <1000
t(9;22) t(4;11)BLASTOS D8 ≥1000
HIPODIPLOIDIA
M1/M2 M3 M1/M2 M3 M1/M2/M3
M1 M2/M3 M1 M2/M3 M1/M2/M3
<0.1% >01- <10% >10%ERM Día 15 >01- <10% >10% TODAS
EMR: Métodos de DetecciónEMR: Métodos de Detección
SensibilidadSensibilidad
10-1 a 10 –2
10-2
10-1 a 10-2
10-1 a 10-4
10-3 a 10-5
Citogenética convencionalCitogenética convencional
FISHFISH
Southern BlotSouthern Blot
Citometría de FlujoCitometría de Flujo
Biología Molecular: PCRBiología Molecular: PCR
Citometría de Flujo: Caracterización de Citometría de Flujo: Caracterización de blastos en EMRblastos en EMR
FSC- SSC particular.FSC- SSC particular.
Antígenos: Antígenos:
Aumento de expresión (over expression)Aumento de expresión (over expression)
Disminución de la expresión (under expression).Disminución de la expresión (under expression).
Asincronismo madurativo.Asincronismo madurativo.
Infidelidad de linaje.Infidelidad de linaje.
LAIP Inmunofenotipo asociado a Leucemia aguda.LAIP Inmunofenotipo asociado a Leucemia aguda.
LLA- B LLA-T
AAsincroníasincronía
MMadurativaadurativaCD34+CD34+//CD10+d CD10+d
CD34+ CD20+CD34+ CD20+
CDCD7+7+/CD/CD34+ 34+ (ectópico)(ectópico)
SobreexpresSobreexpresiónión CD10CD10; CD58; CD34; ; CD58; CD34; CD11a;CD11a; CD19 etc.CD19 etc.
CD7CD7; CD99; CD99
Disminución de Disminución de la expresiónla expresión
CD45CD45; CD38; CD20; ; CD38; CD20; CD11a; CD19 etc.CD11a; CD19 etc.
CD3 superfCD3 superf; CD45; ; CD45;
Infidelidad de Infidelidad de linajeslinajes
LLA-My+LLA-My+
CD13 CD13
CD33 CD33
LLA-My+LLA-My+
CD13 CD13
CD33 CD33
CF: LLA Fenotipos aberrantesCF: LLA Fenotipos aberrantes
EMR por CF: conceptos EMR por CF: conceptos importantesimportantes
Panel completoPanel completo de marcación al diagnóstico para de marcación al diagnóstico para caracterizar al blasto con el fin de optimizar el caracterizar al blasto con el fin de optimizar el seguimiento. (LAIP)seguimiento. (LAIP)
Conocimiento de la expresión de los marcadores en Conocimiento de la expresión de los marcadores en MO normales y en MO en regeneración. (MO normales y en MO en regeneración. (Caminos Caminos madurativosmadurativos))
Evaluación de posibles Evaluación de posibles cambios fenotipícos en cambios fenotipícos en cada casocada caso..
Evaluación de cambios en la intensidad de Evaluación de cambios en la intensidad de expresión por el expresión por el tratamientotratamiento..
EMR por CF: ¿Qué paneles EMR por CF: ¿Qué paneles utilizar? utilizar?
Los distintos grupos usan paneles de marcación y de EMR Los distintos grupos usan paneles de marcación y de EMR según su experiencia, conocimiento y posibilidades.según su experiencia, conocimiento y posibilidades.
La mayoría utiliza una columna (“backbone”) de 2, 3 o 4 La mayoría utiliza una columna (“backbone”) de 2, 3 o 4 marcadores con el mismo fluorocromo (CD45, 19 , 34 y CD10 marcadores con el mismo fluorocromo (CD45, 19 , 34 y CD10 en LLA B y CD45, CD7, CD3 y/o CD5 en LLA T) que se en LLA B y CD45, CD7, CD3 y/o CD5 en LLA T) que se repite en los distintos tubos.repite en los distintos tubos.
Los paneles de los distintos grupos son muy similares Los paneles de los distintos grupos son muy similares entre sí.entre sí.
EMR por CF: conceptos EMR por CF: conceptos importantesimportantes
Conocimiento de la expresión de los marcadores Conocimiento de la expresión de los marcadores en MO normales y en MO en regeneración. en MO normales y en MO en regeneración. ((Caminos madurativosCaminos madurativos))
Evaluación de posibles Evaluación de posibles cambios fenotipícos en cambios fenotipícos en cada casocada caso..
Evaluación de cambios en la intensidad de Evaluación de cambios en la intensidad de expresión por el expresión por el tratamientotratamiento..
Panel completoPanel completo de marcación al diagnóstico de marcación al diagnóstico para caracterizar al blasto con el fin de optimizar el para caracterizar al blasto con el fin de optimizar el seguimiento. (LAIP)seguimiento. (LAIP)
CD10
Diferenciación normal
Blastos B Blastos B
Blastos B
Blastos B
CD20
Caminos madurativos y blastosCaminos madurativos y blastos
CD20CD20
CD10CD10
DiagnósticoDiagnóstico
Día 15Día 15 Recaída postTtoRecaída postTto
Cambios Fenotípicos
10100 0 10101 1 10102 2 10103 3
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•Considerar Considerar cambios cambios fenotípicos en las fenotípicos en las recaídasrecaídas
Modulación con el tratamientoModulación con el tratamiento
Typical but not uniformpatterns (“normalization”):up: CD11a, CD20, CD45down: CD10, CD34, TdTCD99~ stable: CD19, CD58
Gaipa et al., Leukemia 19: 49 (2005)
DiagnósticoDiagnóstico
SeguimientoSeguimiento Día 33Día 33
CD19 PC5CD19 PC5
CD10 PECD10 PE
MOMO SPSP
•ALL: drug-induced antigen expression modulationby steroid-containing induction therapy
10100 0 10101 1 10102 2 10103 3 10104410100 0 10101 1 10102 2 10103 3 101044
10100 0 10101 1 10102 2 10103 3 101044 10100 0 10101 1 10102 2 10103 3 101044
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Modulación con el tratamientoModulación con el tratamiento
DiagnósticoDiagnóstico
Día 33Día 33
CD 10CD 10
CD 20CD 20
CD 20CD 20
CD 34CD 34
CD 34CD 34
CD 66cCD 66c
CD 66cCD 66c
10100 0 10101 1 10102 2 10103 3
101044
10100 0 10101 1 10102 2 10103 3
101044
10100 0 10101 1 10102 2 10103 3
101044
10100 0 10101 1 10102 2 10103 3
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10100 0 10101 1 10102 2 10103 3
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Resumiendo...Resumiendo...
1.1.Actualmente imprescindible Citómetros de al Actualmente imprescindible Citómetros de al menos 4 colores.menos 4 colores.
2.2.Estudio de inmunofenotipo de M.O. Normales y Estudio de inmunofenotipo de M.O. Normales y regenerativas. regenerativas.
3.3. Diseñar paneles de tubos que determinen una Diseñar paneles de tubos que determinen una óptima sensibilidad diagnóstica. óptima sensibilidad diagnóstica.
4.4.Utilizar paneles de marcación lo más completos Utilizar paneles de marcación lo más completos posibles.posibles.
Resumiendo...Resumiendo...
5.5.Búsqueda de EMR en días preestablecidos del Búsqueda de EMR en días preestablecidos del tratamiento. Considerar cambios por el Tto.tratamiento. Considerar cambios por el Tto.
6.6.Considerar sobreexpresiones, subexpresiones Considerar sobreexpresiones, subexpresiones expresión aberrantes e infidelidades de linaje expresión aberrantes e infidelidades de linaje que nos faciliten la tarea en la búsqueda de EMR. que nos faciliten la tarea en la búsqueda de EMR.
7.7. Evaluar posibles cambios fenotípicos en Evaluar posibles cambios fenotípicos en recaídas.recaídas.
8.8.Estandarización del protocolo para el Estandarización del protocolo para el procesamiento de las muestras, el uso de procesamiento de las muestras, el uso de monoclonales, marcas comerciales de Ac Mo y monoclonales, marcas comerciales de Ac Mo y análisis de datos.análisis de datos.
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