detección y cuantificación de la resistencia a los...

"Detección y cuantificación de la resistencia a los antihelmínticos"

María Martínez Valladares 1,2

Investigador post-doctoral, Ramón y Cajal

1. Instituto de Ganadería de Montaña (CSIC-Universidad de León)2. Departamento de Sanidad Animal, Facultad de Veterinaria, Universidad de León

mmarva@unileon.es

Benzimidazol-carbamatos

Albendazol

Lactonasmacrocíclicas

Avermectinas (ivermectina)

Milbemicinas (moxidectina)

Imidazotiazoles

Levamisol

Derivados aminoacetonitrilos

Espiroindoles

Derquantel Monepantel

1960 → 1964

1981 → 1988

1970 → 1979

1991 → 1995

2009 → 2013 2010 → 2016

ResistenciaAntihelmíntica

Fármacos antihelmínticos

¿Porqué se desarrolla la resistencia antihelmíntica?

Frecuencia del tratamiento

SubdosificaciónEspecies de helmintos

Falta de alternancia de los tratamientos

Importación de las resistencias

INADECUADA UTILIZACIÓNFÁRMACOS

¿Cuáles son los niveles de resistencias a las diferentes familias de antihelmínticos en España?

FÁRMACO % REBAÑOS RESISTENTES

ABZ 23,6%IV 27,3%

2006-2011

63,6 % rebaños resistentes

27,2% resistencia múltiples

(7% 1999-2003)

2014-2016

34 %

2006-2011

In vivoEnsayo de reducción de huevos en heces (FECRT)

¿Qué técnicas in vivo e in vitro existen para detectarlos?

¿Qué técnicas in vivo e in vitro existen para detectarlos?

In vitro Ensayo de eclosión de huevos (BZ)Ensayo de la inhibición de la ingestión larvaria (LM y LEV)Ensayo de motilidad larvaria (LM y LEV)

In vivo en in vitro (Fasciola hepatica)Ensayo de reducción de huevos en heces (FECRT)Ensayo de eclosión de huevos (BZ)

¿Qué técnicas in vivo e in vitro existen para detectarlos?

Mecanismo de acción de los fármacos Benzimidazoles

Mecanismo de acción de los fármacos Benzimidazoles

Resistencia Antihelmíntica: F167Y, E198A and F200Y

Mecanismo de acción de los fármacos Benzimidazoles

¿Diseño de un test diagnóstico?

BETA TUBULINA ISOTIPO 1

Teladorsagia circumcinctaTrichostrongylus colubriformisHaemonchus contortusCyathostomin speciesHookworms

SNPs en los codones

200, 198, 167

Benzimidazoles

Phe167Tyr, Glu198Ala, Phe200Tyr

Base molecular de la resistencia a los fármacos Benzimidazoles

Técnicas moleculares, detección BZDetección molecular alelos resistentes en el gen que codifica al isotipo 1 la beta tubulina

¿Qué técnicas in vivo e in vitro existen para detectarlos?

Codón 200: Phe (TTC) Tyr (TAC)

Codón 167: Phe (TTC) Tyr (TAC)

Codón 198: Glu (GAA) Ala (GCA)

Haemonchus sppTeladorsagia spp. Trichostrongylus spp.

Frecuencia alelos resistentes después del tratamiento con albendazol

Frecuencia alelos resistentes antes del tratamiento

Técnicas molecularesDetección molecular del porcentaje de alelos resistentes en el gen que codifica al isotipo 1 de la beta tubulina(Lactonas macrocíclicas)

¿Qué técnicas in vivo e in vitro existen para detectarlos?

Codón 200: Phe (TTC) Tyr (TAC)

Codón 167: Phe (TTC) Tyr (TAC)

Codón 198: Glu (GAA) Ala (GCA)

Freeman A, Nghiem C, Li J, Ashton F, Guerrero J, Shoop W, Schad G. Amphidial structure of ivermectin resistantand susceptible laboratory and field strains of Haemonchus contortus. Vet Parasitol 2003; 110:217–226

Frecuencia alelos resistentes después del tratamiento con Ivermectina

Frecuencia alelos resistentes antes del tratamiento

Frecuencia alelos resistentes después del tratamiento con albendazol

Frecuencia alelos resistentes antes del tratamiento

¿Ausencia de mutaciones en Teladorsagia circumcincta?

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1 2 3 6 8 9 10 11 12 13 14 15 16 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 3 31 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43

%T. circumcincta %Haemonchus %Trichostrongylus spp %C. ovina %Oesophagostomum %Cooperia

Especies de nematodos gastrointestinales, antes del tratamiento

¿Ausencia de mutaciones en Teladorsagia circumcincta?

Especies de nematodos gastrointestinales, después del tratamiento

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1 2 3 6 8 9 10 11 12 13 14 15 16 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43

%T. circumcincta %Haemonchus %Trichostrongylus spp %C. ovina %Oesophagostomum %Cooperia

¿Ausencia de mutaciones en Teladorsagia circumcincta?

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1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41 43

T. circumcincta. Pre-treatment.

% SNP 200 % SNP 198

0

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1 2 3 4 5 6 7 8 9 10111213141516171819202122232425262728293031323334353637383940414243

T. circumcincta. Post-treatment.

% SNP 200 % SNP 198

¿Ausencia de mutaciones en Teladorsagia circumcincta?

198 199 200

Pre-tratamiento

GAA CAAGTACTA

GLUGLNVALLEU

198 199 200

Post-tratamiento

CTA LEU

¿Ausencia de mutaciones en Teladorsagia circumcincta?

Nuevo ensayo de pirosecuenciación para determinar la frecuencia del nuevo polimorfismo: Glu 198 Leu

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40

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1 2 3 6 8 9 10 11 12 13 14 15 16 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43

%C %T

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1 2 3 6 8 9 10 11 12 13 14 15 16 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43

%C %T

Codon 198 GAA (GLU) CTA (LEU)

T. circumcincta. Pre-tratamiento

T. circumcincta. Post-tratamiento.

¿Ausencia de mutaciones en Teladorsagia circumcincta?

¿Ausencia de mutaciones en Teladorsagia circumcincta?

0,0

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26 27 28 29 30 32 33 34 35 36 37 38 40 41 43

%C Pre

%T Pre

%C Post

%T Post

Codon 198 GAA (GLU) CTA (LEU)

% In vivo % In vitro %SNP198 Tc% In vivo 1 -0,559** -0,567**% In vitro 1 0,765**

%SNP198 Tc 1

Flock ID %FECRT % Hatching (DD) % SNP198 (mean C and T) Flock ID %FECRT % Hatching (DD) % SNP198 (mean C and T)1 100,0 11,3 16,50 23 100,0 23,5 11,172 100,0 2,5 11,17 24 96,1 43,7 13,003 100,0 4,0 25,50 25 100,0 48,3 9,334 100,0 11,8 26 34,0 76,1 77,175 100,0 12,9 27 -110,0 44,9 58,336 100,0 6,2 18,50 28 58,5 59,3 71,677 100,0 15,1 29 100,0 43,6 32,838 100,0 1,5 14,50 30 17,0 72,3 37,509 100,0 4,0 10,83 31 60,0 71,3 73,33

10 100,0 1,7 25,33 32 87,9 34,5 46,5011 100,0 18,9 12,00 33 7,2 79,5012 91,6 57,83 34 69,4 41,0 56,0013 98,6 32,9 26,17 35 97,9 42,6 50,5014 22,4 17,67 36 42,1 54,4 61,0015 17,1 17,67 37 88,1 40,3 65,3316 100,0 24,3 16,00 38 91,3 61,6 76,3318 100,0 33,3 20,17 39 -100,0 89,6 78,3319 19,6 14,33 40 100,0 35,8 52,1720 96,8 30,9 17,83 41 100,0 40,2 49,8321 97,1 23,5 19,67 42 97,5 71,7 57,8322 12,2 18,33 43 100,0 19,7 33,83

¿Ausencia de mutaciones en Teladorsagia circumcincta?

• La única presencia de LEU en lugar de GLU en el codón 198 del gen β-tubulinisotipo 1 en Teladorsagia circumcincta está asociada con la resistencia a BZ.

• Se describieron correlaciones significativas entre las frecuencias de este polimorfismo y los resultados de los ensayos in vivo e in vitro.

• El estudio de la frecuencia de este nuevo polimorfismo debería incluirse como marcador de resistencia a los benzimidazoles.

¿Ausencia de mutaciones en Teladorsagia circumcincta?

Muchas gracias por su atenciónMaría Martínez Valladaresmmarva@unileon.es