desarrollo de técnicas de clustering en datos de
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TRABAJO FIN DE GRADO
INGENIERIA EN TELECOMUNICACIONES
Desarrollo de técnicas de clustering en datos de
espectrometría de masas orientadas a la detección
automática de compuestos
Autor Miguel Ángel Bellido Manganell
Director
Ángel De La Torre Vega
Escuela técnica superior de Ingenierías Informática y de
Telecomunicación
—
Granada, Junio de 2014
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Desarrollo de técnicas de clustering en datos de
espectrometría de masas orientadas a la detección
automática de compuestos
Autor Miguel Ángel Bellido Manganell
Director
Ángel De La Torre Vega
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Desarrollo de técnicas de clustering en datos de espectrometría de masas orientadas a la detección automática de compuestos
Miguel Ángel Bellido Manganell
Palabras clave: espectrometría de masas, detección automática de compuestos,
cromatografía líquida, HPLC, ESI, MS, TOF.
Resumen
En este trabajo se ha desarrollado un método automático para la detección de compuestos químicos en datos proporcionados por instrumentos de cromatografía acoplada a espectrometría de masas. A partir de los datos espectrométricos correspondientes a una muestra química compleja (por ejemplo, un extracto vegetal o una muestra biológica), el método proporciona una valoración cuantitativa y una caracterización (en términos de perfil cromatográfico y huella espectrométrica) de cada compuesto químico detectado en la muestra. El método propuesto se ha aplicado a datos de cromatografía líquida de alta resolución acoplada a un espectrómetro de masas por tiempo de vuelo mediante una interfaz de ionización por electro-spray (HPLC-ESI-TOFMS) usando colecciones de muestras simples (matrices resultantes de mezclar en laboratorio estándares de compuestos fenólicos disponibles comercialmente) y de muestras complejas (extractos fenólicos de aceite de oliva virgen extra).
El objetivo del trabajo se ha centrado en el diseño e implementación del método de detección automática de compuestos químicos, así como la evaluación cuando es aplicado a muestras simples (donde el número de compuestos es pequeño y éstos se conocen a priori) o a muestras complejas (donde hay presente un gran número de compuestos, algunos de ellos con concentraciones bajas, próximas al límite de detección instrumental o al fondo de ruido).
Frente a los procedimientos convencionales de detección de compuestos (basados en la detección de picos de las señales cromatográficas), el método propuesto analiza simultáneamente las características cromatográficas y espectrométricas. La identificación de compuestos se realiza comparando de forma automática los cromatogramas de ion extraído para cada intervalo de tiempo de retención mediante una distancia basada en la proyección funcional de las señales cromatográficas. Este criterio permite asociar las distintas especies iónicas generadas por cada compuesto en los procesos de ionización que tienen lugar en el equipo de espectrometría de masas. De este modo, el método proporciona los compuestos detectados en la muestra, así como una cuantificación de cada uno de ellos y su caracterización cromatográfica (tiempo de retención y perfil cromatográfico) y espectrométrica (relaciones m/z de los distintos iones asociados al compuesto correspondientes al ion principal, fragmentos, clusters de iones y sus variantes isotópicas asociadas, junto con las intensidades relativas para cada ion).
En esta memoria se describe el trabajo realizado para desarrollar el método propuesto, y el resultado de aplicarlo tanto a muestras simples como a muestras complejas. En el caso de las muestras simples (donde se conocen a priori los resultados esperables) se ha comprobado el correcto funcionamiento del método. En el caso de las muestras complejas se demuestra el potencial del método para detectar
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compuestos que difícilmente serían detectables mediante un análisis manual de los datos realizado por un experto. El análisis manual de datos resulta poco eficaz para detectar compuestos en situaciones de coelución (esto es, cuando el perfil cromatográfico de dos o más compuestos está solapado), bastante frecuentes en muestras complejas. El método propuesto se ha mostrado muy útil para la detección de compuestos en los casos de coelución. El estudio de los resultados permite además identificar las limitaciones del método desarrollado en su actual fase, así como las mejoras necesarias para optimizarlo.
La implementación del método propuesto ha requerido, además, desarrollar algoritmos rápidos de pre-procesado de los datos para eliminar ruido (iónico y electrónico) y artefactos químicos (asociados a la fase fija o la fase móvil en la columna cromatográfica). La aplicación de los algoritmos de pre-procesamiento antes de aplicar el método de detección de compuestos hace que su ejecución sea más rápida y que se obtengan resultados con menor número de falsos positivos.
Finalmente, se ha implementado un algoritmo de pos-procesamiento para comparar las identificaciones de compuestos en las distintas muestras de una colección y de este modo unificar la lista de compuestos identificados sobre la colección de muestras (y no sobre cada una de las muestras por separado). De esta forma, la información HPLC-ESI-TOFMS de la colección de muestras quedaría compactada en dos tablas: una de ellas donde se especifica la presencia de cada compuesto en cada muestra de la colección, y la segunda donde se caracteriza (en términos de perfil cromatográfico y huella espectrométrica) cada compuesto detectado en las muestras de la colección. Esta representación de los compuestos presentes en la colección de muestras resulta de gran utilidad para el estudio estadístico de las muestras en ensayos biológicos orientados a identificar compuestos bioactivos o con utilidad diagnóstica.
Los resultados experimentales presentados en este trabajo revelan el potencial del método propuesto para el procesamiento automático de datos de cromatografía acoplada a espectrometría de masa, y sugieren líneas de trabajo futuro para incorporar mejoras, permitiendo el análisis apropiado de los datos para muestras complejas y colecciones de muestras complejas.
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Development of clustering techniques oriented to automatic compounds detection in mass spectrometry data
Miguel Ángel Bellido-Manganell
Keywords: mass spectrometry, automatic compound detection, liquid chromatography,
HPLC, ESI, MS, TOF.
Abstract
In this work we have developed an automatic method for the detection of
chemical compounds in data provided by chromatography coupled to mass spectrometry instruments. From the spectrometric data corresponding to a complex chemical sample (for example, a plant extract or a biological sample), the method provides a quantitative estimation and a characterization (in terms of chromatographic profile and spectrometric finger-print) for each chemical compound detected in the sample. The proposed method has been applied to data from High Performance Liquid Chromatography coupled to a Time-Of-Flight Mass Spectrometer through an Electro-Spray Ionization interface (HPLC-ESI-TOFMS) using collections of simple samples (i.e. matrices resulting from mixing commercially available standard phenolic compounds at laboratory), and complex samples (phenolic extracts from extra virgin olive oil).
The objective of this work is focused on the design and implementation of the
automatic method for detection of chemical compounds, as well as the evaluation when it is applied to both simple samples (where the number of compounds is small and they are a priori known) and complex samples (where there is a high number of compounds, some of them at low concentration, close to the instrumental limit of detection or to the noise background).
In contrast to the conventional procedures for compound detection (those based
on peak detection from chromatographic signals), the proposed method analyzes the chromatographic and spectrometric profiles jointly. The compound identification is carried out by automatically comparing the extracted ion chromatograms for each retention time interval by means of a distance based on the function projection of the chromatographic signals. This criterion provides an association of the different ionic species generated by each compound during the ionization processes that take place in the mass spectrometry instrument. This way, the method provides the compounds detected in the sample, as well as a quantification of each one, its chromatographic characterization (retention time and chromatographic profile), and its spectrometric characterization (m/z ratios for the ions associated to the compound, corresponding to the main ion, ion fragments, ion clusters and their respective isotopic variants, and the relative intensities for each ion).
In this report we describe the work carried out to develop the proposed method
and the results obtained when it is applied to both simple and complex samples. In the case of the simple samples (where the expectable results are known a priori) the proper performance of the method has been verified. In the case of complex samples, the results show that the method is able to detect compounds which would hardly be
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detectable with a manual analysis carried out by an expert. The manual analysis is not able to detect compounds under co-elution situations (i.e. when the chromatographic profile from two or more compounds is overlapped), a very common situation in the case of complex samples. The proposed method is shown as a very useful method for the detection of compounds in co-elution situations. The analysis of the experimental results also allows the identification of the limitations in the proposed method in the current development stage, as well as the improvements required for its optimization. The implementation of the proposed method has required the development of fast pre-processing algorithms to be applied to the data in order to remove noise (both ionic and electronic) and chemical artifacts (associated to the stationary phase and the mobile phase in the chromatographic column). The application of the pre-processing algorithms before applying the method for compound detection makes the execution faster and provide better results (with a lower number of false positives).
Finally, a post-processing algorithm has been implemented in order to compare the compound identification along the different samples in a collection, and this way, providing a unified list of identified compound for the collection (and not and independent list for each sample). With this post-processing, the HPLC-ESI-TOFMS information from the collection of samples would be compacted with two tables: the first one specifies the abundance of each compound in each sample in the collection, and the second table characterizes each compound detected in the sample collection (in terms of the chromatographic profile and spectrometric finger-print). This compact representation of the compounds identified in the sample collection is very useful for the statistical study of the samples in biological assays oriented to the identification of bioactive compounds or compounds with potential interest for diagnostic.
The experimental results presented in this work reveal the potential of the
proposed method for the automatic processing of the data from chromatography coupled to mass spectrometry, and also suggest lines for future work oriented to improve the method in order to provide an appropriate analysis of the data from complex samples and from collection of complex samples.
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Yo, Miguel Ángel Bellido Manganell, alumno de la titulación de
Grado en Ingeniería de Tecnologías de Telecomunicación de la
Escuela Técnica Superior de Ingenierías Informática y de
Telecomunicación de la Universidad de Granada, con DNI
77138344-R, autorizo la ubicación de la siguiente copia de mi
Trabajo Fin de Grado en la biblioteca del centro para que pueda ser
consultada por las personas que lo deseen.
Fdo: Miguel Ángel Bellido Manganell
Granada a 1 de Julio de 2014.
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D. Ángel De La Torre Vega, Profesor del Grado en Ingeniería de Tecnologías de Telecomunicación del Departamento de Teoría de la Señal, Telemática y Comunicaciones de la Universidad de Granada.
Informa:
Que el presente trabajo, titulado Desarrollo de técnicas de
clustering en datos de espectrometría de masas orientadas a la
detección automática de compuestos, ha sido realizado bajo su
supervisión por Miguel Ángel Bellido Manganell, y autorizo la defensa
de dicho trabajo ante el tribunal que corresponda.
Y para que conste, expide y firma el presente informe en Granada a 1
de Julio de 2014.
El director:
Ángel De La Torre Vega
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Agradecimientos
Me gustaría agradecer a mi familia su apoyo a lo largo de todo el transcurso del trabajo, ya que me han motivado para trabajar de forma constante y para compatibilizar este trabajo con otros aspectos de la vida no menos importantes. A mis compañeros y amigos me gustaría agradecerles todo el tiempo que han dedicado a escuchar mis dudas y problemas.
A mi tutor, Ángel De La Torre, me gustaría agradecerle la dedicación y paciencia que ha tenido para explicarme cualquier cosa relacionada con el trabajo, así como su rápida disposición para tener tutorías y todo el tiempo que me ha reservado para éstas.
También me gustaría agradecer a la Universidad de Granada todos los
acuerdos que tiene con revistas y organizaciones científicas, ya que me han permitido
consultar artículos y libros que, de otra forma, hubiesen resultado muy difíciles de
obtener.
Cada una de las personas que se sientan identificadas con estos
agradecimientos ha de saber que, en un momento u otro del trabajo, me ha dado
fuerzas para continuar, cada uno/a de una forma diferente pero todas
complementarias.
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Índice Resumen ..................................................................................................................... vii
Abstract ....................................................................................................................... ix
Agradecimientos ......................................................................................................... xvi
Índice ............................................................................................................................ 1
1. Contexto del trabajo fin de grado. .......................................................................... 3
1.1. Análisis químico de muestras mediante espectrometría de masas y técnicas cromatográficas. ........................................................................................................ 7
1.1.1. Cromatografía. ......................................................................................... 7
1.1.2. Interfaz entre cromatografía líquida y espectrómetro de masas. .............. 9
1.1.3. Espectrómetro de masas. ...................................................................... 10
1.2. Caracterización de compuestos en una muestra. ......................................... 18
2. Objetivos y metodología. ..................................................................................... 19
2.1. Objetivo principal. ......................................................................................... 19
2.2. Objetivos secundarios. ................................................................................. 20
2.3. Metodología. ................................................................................................. 23
2.3.1. Identificación del problema y solución propuesta. .................................. 23
2.3.2. Validación y evaluación del método. ...................................................... 24
2.3.3. Formas de mostrar los datos. ................................................................ 25
2.3.4. Colecciones de muestras utilizadas. ...................................................... 34
2.3.5. Estudio de la respuesta instrumental a los compuestos. ........................ 41
2.4. Consecuencias del paso de espectro suma a espectro de línea. .................. 56
2.5. Análisis del ruido........................................................................................... 57
2.6. Preprocesamiento de las muestras. .............................................................. 66
2.6.1. Manipulación de datos obtenidos por el espectrómetro de masas. ........ 66
2.6.2. Aplicación de un umbral de intensidad................................................... 67
2.6.3. Algoritmo de reducción de ruido. ........................................................... 68
2.6.4. Limitación del tiempo de retención. ........................................................ 71
3. Realización. ......................................................................................................... 76
3.1. Implementación de la herramienta para detección y caracterización de compuestos en muestras obtenidas mediante HPLC-ESI-TOF. .............................. 76
3.1.1. Primer paso. Búsqueda de los iones más abundantes. ......................... 78
3.1.2. Segundo paso. Detección de ion principal de cada compuesto. ............ 83
3.1.3. Tercer paso. Búsqueda de iones secundarios para cada ion principal. .. 86
3.1.4. Cuarto paso. Cálculo de características de las especies iónicas asociadas a cada compuesto. .............................................................................. 87
3.1.5. Quinto paso. Almacenar y mostrar resultados en forma de tablas. ........ 88
3.2. Método de identificación y eliminación de artefactos químicos. .................... 90
3.3. Método de agrupación de compuestos de una colección de muestras. ........ 98
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4. Resultados y comprobación. .............................................................................. 100
4.1. Identificación de artefactos químicos en ambas colecciones. ..................... 100
4.2. Aplicación del método de detección y caracterización de compuestos a una muestra simple sin eliminar artefactos químicos. .................................................. 104
4.3. Aplicación del método de detección y caracterización de compuestos a una muestra simple preprocesando los artefactos químicos. ....................................... 110
4.4. Resultados obtenidos para una muestra de la colección de aceites. .......... 113
4.5. Resultados obtenidos al aplicar el método de agrupación de compuestos a una colección de muestras. ................................................................................... 129
5. Conclusiones y líneas futuras. ........................................................................... 131
5.1. Trabajo general realizado. .......................................................................... 131
5.2. Método principal. Detección y caracterización de compuestos en una muestra HPLC-TOF/MS. ..................................................................................................... 133
5.3. Método secundario. Identificación y supresión de artefactos químicos. ...... 135
5.4. Método secundario. Comparación y agrupación de compuestos para una colección de muestras. .......................................................................................... 136
5.5. Conclusiones académicas. ......................................................................... 136
6. Bibliografía. ........................................................................................................ 139
7. Apéndices. ......................................................................................................... 141
7.1. Apéndice 1. Compuestos detectados y caracterizados sobre la muestra 15 de la colección de matrices de estándares sin artefactos químicos. ........................... 141
7.2. Apéndice 2. Cromatogramas de ion extraído de las masas en las que se ha detectado la presencia de un artefacto químico. ................................................... 145
7.3. Apéndice 3. Picos cromatográficos principales de cada compuesto detectado en la muestra 1 de la colección de aceites de oliva. .............................................. 160
7.4. Apéndice 4. Compuestos encontrados en las 22 muestras de aceites de oliva, sin incluir las huellas espectrométricas. ................................................................. 174
7.5. Apéndice 5. Resultados de la agrupación de compuestos de todas las muestras de la colección de matrices de estándares. ........................................... 197
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1. Contexto del trabajo fin de grado.
Este trabajo de fin de grado se ha realizado en el contexto de una colaboración iniciada en el 2008 entre el Departamento de Teoría de la Señal, Telemática y Comunicaciones, el Departamento de Química Analítica y el Centro de Investigación y Desarrollo del Alimento Funcional (CIDAF). Esta colaboración ha visto sus frutos en el desarrollo de numerosos proyectos y contratos de investigación, estudios, publicaciones, congresos, tesis doctorales y trabajos de fin de carrera.
Las técnicas de cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas
tienen un gran interés a la hora de estudiar muestras químicas complejas para diferentes tipos de investigaciones. Por ejemplo, en los extractos vegetales se pueden requerir análisis para caracterizar los extractos (qué compuestos forman el extracto), para buscar en ellos compuestos con propiedades específicas (por ejemplo compuestos bioactivos) o simplemente para clasificar distintos tipos de extractos. Las muestras biológicas también son comúnmente analizadas utilizando estas técnicas para estudios de farmacocinética, metabolómica (cómo se metaboliza un determinado compuesto) o búsqueda de biomarcados.
El análisis químico de una muestra mediante cromatografía acoplada a
espectrometría de masas (en adelante MS, por sus siglas en inglés Mass Spectrometry) permite separar los compuestos de una muestra en varias dimensiones, lo que permite saber qué compuestos y en qué proporción aparecen en la muestra. La cromatografía proporciona una separación de los compuestos de la muestra en función del tiempo y la espectrometría de masas los separa en función de su relación masa/carga (usualmente simbolizada como m/z). La técnica cromatográfica hace pasar la muestra por un sistema que provoca que los compuestos se separen según su naturaleza y la del sistema, mientras que la técnica de espectrometría de masas ioniza los compuestos para poder calcular su relación masa/carga. La abundancia con la que aparece cada compuesto se mide en función del número de iones que llegan en el tiempo de retención del compuesto, lo que se conoce como intensidad iónica.
En la figura 1 se observa la separación temporal proporcionada por la técnica cromatográfica, concretamente un tipo de cromatografía denominada cromatografía líquida (en adelante LC, por sus siglas en inglés Liquid Chromatography). Como se puede observar en la figura, la cromatografía proporciona una salida que varía en función del tiempo, debido a que los compuestos de la muestra son separados y aparecen, cada uno, en distintos instantes de tiempo (conocidos como tiempos de retención).
Figura 1. Separación de los compuestos de la muestra en función del tiempo.
300 400 500 600 700 800 9000
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
4
4.5x 10
5
Tiempo de retención (s)
Inte
nsid
ad
Cromatograma de ion total
4
La espectrometría de masas proporciona una segunda separación en función de las relaciones masa/carga de cada compuesto. La ionización de cada compuesto provoca que éste se descomponga en iones con distintas relaciones masa/carga (conocidas como especies iónicas del compuesto) que forman, junto con algunas variantes del compuesto de las que se hablará más adelante, lo que se conoce como su huella espectrométrica. En la figura 2 se observa la respuesta instrumental de un sistema de cromatografía acoplada a espectrometría de masas (LS-MS) cuando la entrada es una muestra simple. Se han remarcado varios compuestos con un rectángulo para que se pueda observar el tiempo de retención en el que aparece cada compuesto y la huella espectrométrica que forma.
Figura 2. Respuesta instrumental de un sistema de cromatografía acoplada a MS.
La técnica LC-MS aplicada a una muestra provoca una respuesta instrumental que depende de cada compuesto que aparezca en ella, por lo que el objetivo será partir de las señales discretas LC-MS y conocer qué compuestos había en la muestra, así como su abundancia. Para ello, en primer lugar se tiene que detectar la presencia de cada compuesto. Una vez detectada su presencia, se caracteriza de acuerdo a su perfil cromatográfico (intensidad iónica en función del tiempo de retención) y su huella espectrométrica (distribución del compuesto en las distintas relaciones masa/carga para un tiempo de retención concreto). Consultando bases de datos de compuestos químicos o haciendo pruebas más específicas del compuesto caracterizado, se puede identificar al compuesto. Finalmente, se puede cuantificar la concentración del compuesto en la muestra en función de las intensidades que presentan las señales LC-MS que lo caracterizan.
El proceso de detección es sencillo cuando los compuestos están muy
separados entre sí en el tiempo de retención, que es lo que ocurre en las muestras simples (ejemplo en la figura 1). En las muestras complejas el proceso se complica drásticamente al ser habitual que varios compuestos estén presentes en el mismo tiempo de retención (situación conocida como coelución), al no haber sido capaz la técnica cromatográfica de separarlos lo suficiente. Esta coelución entre compuestos provoca que sea más difícil (en ocasiones imposible) diferenciarlos en la respuesta instrumental, ya que sus huellas espectrométricas aparecen mezcladas o enmascaradas (la más abundante enmascara a la menos abundante). Además, la presencia de ruido iónico, electrónico, estadístico y artefactos químicos, añade más dificultad a la detección de los compuestos conforme la relación señal a ruido (en adelante SNR, por sus siglas en inglés Signal to Noise Ratio) disminuye.
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Actualmente, la detección de compuestos se realiza de forma manual o automática, obteniendo resultados adecuados únicamente para muestras simples. Para muestras complejas la detección manual de compuestos no es viable si hay coelución entre ellos, por lo que es necesario un método automático que detecte y caracterice los compuestos incluso cuando haya coelución.
En este trabajo se ha implementado y evaluado, utilizando la herramienta
Matlab, un método automático para la detección y caracterización de compuestos de una muestra analizada mediante LC-MS. La diferencia entre este método y los implementados hasta el momento, es el enfoque desde el que se han caracterizado los compuestos, ya que se van a caracterizar mediante técnicas de tratamiento de señales digitales.
Como se observa en la figura 1, cada compuesto tiene una forma
cromatográfica (también conocida como perfil cromatográfico) aproximadamente gaussiana. Esta forma cromatográfica depende de la molécula que forma el compuesto y del proceso cromatográfico. Por lo tanto, la forma cromatográfica será igual para todos los iones de la huella espectrométrica del compuesto, ya que al provenir del mismo compuesto, se han visto afectados de igual forma por la técnica cromatográfica. Teniendo esto en cuenta, una especie iónica pertenecerá a un compuesto si su forma cromatográfica es igual que la del compuesto (o la de las especies iónicas que lo caracterizan). El método implementado utiliza esta información para caracterizar un compuesto según las especies iónicas que forman su huella espectrométrica, lo que será complicado ya que, en la práctica, el ruido y las no linealidades provocan que las formas cromatográficas no sean exactamente iguales para las especies iónicas del mismo compuesto. Para comparar los perfiles cromatográficos se ha establecido una medida de distancia entre ellos basada en proyección de vectores. Utilizando esta distancia entre formas cromatográficas, se detectan los compuestos de la muestra y se caracterizan agrupando la huella espectrométrica de cada uno de ellos.
En el trabajo se realiza un estudio de las señales LC-MS para obtener
propiedades de éstas que ayuden a representarlas adecuadamente, a distinguirlas del ruido y a establecer cánones de los perfiles cromatográficos. Tras realizar el estudio, se implementa el método y se evalúa con muestras reales obtenidas mediante LC-MS, obteniendo conclusiones en base a los resultados obtenidos.
Para complementar al método desarrollado, se han implementado y evaluado
dos métodos más a lo largo del trabajo; uno para identificar artefactos químicos de alta intensidad y otro para agrupar los distintos compuestos que aparecen en una colección de muestras. La identificación de artefactos químicos será necesaria para obtener buenos resultados con el método principal, mientras que la agrupación de los compuestos detectados en una serie de muestras, para caracterizar a la colección completa, es una extensión directa del método principal ya que se puede llevar a cabo gracias a sus resultados.
El trabajo se estructura en los siguientes apartados:
Contexto del trabajo fin de grado. En este apartado se realiza una introducción al contexto en el que se desarrolla el
trabajo fin de grado, así como el contenido del mismo.
Objetivos y metodología. En primer lugar se establecen los objetivos del trabajo, tanto principales como
secundarios. Una vez asentados los objetivos, se realiza un estudio de las señales LC-
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MS y de la respuesta instrumental a los compuestos, para introducir posteriormente la metodología que se ha utilizado a lo largo del trabajo.
Realización. En este apartado se discute la implementación del método de detección y
caracterización de compuestos, así como el desarrollo de los otros métodos desarrollados a lo largo del trabajo.
Resultados y comprobaciones. Tras implementar los métodos, se realizan pruebas que ajusten los parámetros del
método principal, para obtener finalmente los resultados al aplicarlo en muestras de colecciones diferentes. Los resultados son comprobados de varias formas para observar las mejoras que presenta nuestro método frente a los métodos tradicionales, además de analizar sus limitaciones y cómo se pueden superar.
Conclusiones y líneas futuras. En base al trabajo realizado, a los resultados obtenidos y las comprobaciones
realizadas, se expondrán una serie de conclusiones sobre los métodos implementados y sobre las líneas futuras de mejora de dichos métodos, además de conclusiones académicas sobre la aportación del trabajo.
Bibliografía. A lo largo de todo el trabajo se ha usado una serie de fuentes bibliográficas
variadas, que están presentes en este apartado y que se pueden dividir en varios
grupos según la utilidad que han tenido; algunas han servido para comprender los
fundamentos del análisis de compuestos usando técnicas cromatográficas y
espectrometría de masas [1-4, 18-20], otras para comprender problemas que se
presentan y algunas soluciones actuales que se plantean [9-14, 21], algunos artículos
que aportan evidencias de los beneficios de algunos compuestos aquí analizados [15-
17] y artículos que describen los datos que se han manejado en este trabajo [5-8].
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1.1. Análisis químico de muestras mediante espectrometría de masas y técnicas cromatográficas. La importancia del análisis de muestras mediante espectrometría de masas y
técnicas cromatográficas radica en la necesidad de caracterizar una muestra no sólo por el efecto que pueda tener (por ejemplo un fármaco sobre una persona), sino por la composición que tiene cada muestra (los compuestos que la forman) y que hace que tenga unas propiedades u otras. El estudio de muestras vegetales o biológicas tiene un interés creciente, ya que algunos vegetales presentan propiedades muy beneficiosas para el ser humano y su análisis LC-MS ayuda a identificar qué compuestos presentes en dichos vegetales provocan las propiedades de interés. Además, tiene muchas más aplicaciones que hacen que este campo esté en continuo desarrollo.
A continuación se expondrán una serie de técnicas utilizadas en el análisis de
compuestos, haciendo especial énfasis en el análisis de compuestos mediante el acoplamiento de una técnica cromatográfica líquida acoplada a un espectrómetro de masas por tiempo de vuelo con reflectrón, utilizando como interfaz un proceso de ionización por electrospray.
1.1.1. Cromatografía.
Para realizar la caracterización de una muestra compleja mediante
espectrometría de masas, en primer lugar tenemos que usar una técnica separativa
que permita separar los distintos compuestos que hay en la muestra para poder
diferenciarlos, en la medida de lo posible, entre sí. Si no se realizase este proceso
sería imposible diferenciar entre sí a los compuestos, ya que sus huellas
espectrométricas se mezclarían y solaparían.
Las técnicas cromatográficas se basan en el proceso de que una sustancia
líquida o gaseosa, conocida como fase móvil, haga fluir la muestra por otra sustancia,
generalmente sólida (aunque puede ser líquida), conocida como fase estacionaria,
consiguiendo que los compuestos de la muestra se separen los unos de los otros
según su afinidad a cada una de las fases. El paso de la muestra por la columna
separativa se conoce como elución, y el tiempo que tarda cada compuesto en recorrer
la columna se conoce como tiempo de retención o tiempo de elución.
El proceso separativo se realiza inyectando la fase móvil y la muestra en el
dispositivo que contiene la fase estacionaria, que generalmente es un tubo metálico. Al
conjunto de este dispositivo con la fase estacionaria, se le conoce como columna
separativa. La separación se produce con el flujo de la muestra a través de la columna
separativa, cuando los distintos compuestos de la muestra se ven retenidos en mayor
o menor magnitud por la fase estacionaria, o “atraídos” en mayor o menor magnitud
por la fase móvil. Por lo tanto, si un compuesto tiene mucha afinidad con la fase móvil
y muy poca con la fase estacionaria, el compuesto recorrerá la columna separativa
rápidamente y saldrá del proceso separativo muy rápido. Si, por el contrario, un
compuesto tiene mucha afinidad con la fase estacionaria pero muy poca con la fase
móvil, el compuesto tardará mucho en salir de la columna separativa. En conjunto,
según la fase móvil y la fase estacionaria que se use en el proceso, los compuestos se
separarán más o menos los unos de los otros en función de, entre otras cosas, su
polaridad.
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Sin embargo, hay que tener en cuenta que la retención de los compuestos en
la columna separativa es un proceso mecano-estadístico dependiente de la
temperatura, lo que provoca que los compuestos no se muevan como un “punto”
discreto, sino que las moléculas de cada compuesto tiendan a distribuirse a lo largo
del volumen que pueda ocupar de la columna cromatográfica, por lo que habrá una
parte del compuesto que irá un poco más rápida del resto y otra parte del compuesto
que irá un poco más lenta que el grueso del compuesto, saliendo en conjunto de la
columna separativa con una forma aproximadamente gaussiana.
El hecho de que los compuestos recorran más rápido o más lento la columna
cromatográfica según las fases móviles y estacionarias que se usen, deja de
manifiesto que, si dos compuestos se ven igualmente afectados por ambas fases,
entonces saldrán de la columna separativa en tiempos parecidos. Teniendo esto en
cuenta y que cada compuesto sale con una forma aproximadamente gaussiana, se
hablará de coelución de varios compuestos cuando, por haberse visto afectados de
igual forma por el proceso cromatográfico, dichos compuestos salgan de la columna
separativa en tiempos parecidos y sus perfiles cromatográficos se solapen entre sí.
A continuación se describen las características más importantes de técnicas
cromatográficas distintas en función del estado en el que se encuentre la fase móvil
(gas o líquido); cromatografía de gases y cromatografía líquida.
Cromatografía de gases (GC).
Esta técnica se utiliza habitualmente para separar muestras volátiles (ya que se
pueden pasar a estado gaseoso fácilmente). En este caso la fase móvil es un gas de
baja densidad que transporta la muestra por una fase estacionaria compuesta por un
líquido adherido a un compuesto sólido. La fase móvil se podrá inyectar a distinto flujo
y presión, mientras que la cantidad de muestra inyectada será regulada por un divisor
de flujo. La columna separativa estará sometida a temperaturas altas para asegurar
que los compuestos están en estado gaseoso.
Cromatografía líquida (LC).
En este caso la fase móvil es un disolvente (o mezcla de varios) elegidos y
manipulados convenientemente para adaptarlos al tipo de muestra que se desea
separar. La fase móvil se puede mantener igual e inyectar de forma continua durante
toda la separación, o bien variar su concentración de distintos disolventes para
optimizar el proceso de separación, lo que se conoce como fase móvil con gradiente.
La fase estacionaria puede ser de dos tipos: sólido poroso o una película adherida a
un soporte sólido. Los rellenos porosos están formados por partículas porosas de un
tamaño de unas pocas micras de diámetro, y compuestas habitualmente por sílice.
En la figura 3 se puede observar un esquema simplificado de un equipo de
cromatografía líquida junto a uno comercial.
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Figura 3. Esquema simplificado de un equipo de cromatografía líquida junto a uno comercial [18].
La cromatografía líquida se considera de alta resolución (HPLC, por sus siglas en
inglés High Performance Liquid Chromatography) cuando la columna separativa tiene
un diámetro de unos pocos milímetros. Cuando la fase estacionaria está formada por
partículas de diámetro inferior a 2 µm, entonces se conoce generalmente como
cromatografía líquida de resolución rápida (RRLC, por sus siglas en inglés Rapid
Resolution Liquid Chromatography).
1.1.2. Interfaz entre cromatografía líquida y espectrómetro de masas. Para acoplar un dispositivo de cromatografía líquida con un espectrómetro de
masas, hay que tener en cuenta que el espectrómetro de masas ha de recibir una
nube de iones en estado gaseoso, mientras que del dispositivo de cromatografía
líquida sale un flujo líquido continuo durante todo el tiempo de elución de la muestra.
Además, la cromatografía se realiza a presión superior a la atmosférica mientras que
en el espectrómetro de masas se trabaja con varias cámaras a una presión de alto
vacío (para conducir los iones de forma más uniforme). Por lo tanto, se necesita una
interfaz entre el dispositivo de cromatografía líquida y el espectrómetro de masas que
adapte tanto el estado de la muestra (de líquido a nube de iones) como la presión
entre los dispositivos.
A pesar de haberse desarrollado varias interfaces con este objetivo, la técnica
adecuada para muestras como las que se van utilizar en este estudio (muestras con
compuestos fenólicos) es la de ionización por electrospray (ESI, por sus siglas en
inglés ElectroSpray Ionization) que, entre sus características interesantes, se puede
destacar que se realiza a presión atmosférica y que provoca poca fragmentación de
los compuestos (más adelante se explicará en qué consiste la fragmentación).
En la ionización por electrospray, la muestra procedente del cromatógrafo se
conduce a través de un capilar de acero inoxidable sometido a un potencial eléctrico
muy elevado (habitualmente entre 2 y 6 kV) entre su extremo y la entrada del
espectrómetro de masas (situado a continuación). De esta forma, la muestra sale del
capilar en forma de pequeñas gotas sometidas a un gran campo eléctrico y dirigidas
10
por éste hacia la entrada del espectrómetro de masas. Al mismo tiempo las gotas se
ven afectadas por un gas nebulizador que evapora el disolvente presente en la
superficie de la gota (desovaltación), reduciendo su tamaño y provocando que la
densidad de carga eléctrica de la gota aumente. Finalmente, la repulsión de iones de
la misma gota producida por el campo eléctrico supera la tensión superficial de la gota,
alcanzando el límite de Rayleigh, con lo que la gota “explota” (fenómeno conocido
como explosiones de Coulomb) formando otras gotas más pequeñas y también
cargadas que sufrirán el mismo proceso que la anterior hasta que finalmente tan solo
quede una nube de iones, que serán los que entren en el espectrómetro de masas. En
la figura 4 se puede observar un ejemplo del proceso explicado.
Figura 4. Ejemplo de interfaz ESI (ionización por electrospray) [2].
Hay que tener en cuenta que la ionización no determina de forma exacta el
número de cargas con las que será ionizada cada molécula, por lo que el valor de la
relación masa/carga (que es el que calcula el espectrómetro de masas como se verá
más adelante) variará en función del número de cargas que tenga la molécula y de si
la ionización se ha realizado en el modo positivo o negativo. En el modo positivo se
forma el ion quitando uno o más electrones, mientras que en el modo negativo se
forma el ion quitando uno o más protones.
1.1.3. Espectrómetro de masas. El espectrómetro de masas es el instrumento que se usará para obtener la
caracterización de una muestra mediante su espectro de masas. Realmente el
espectrómetro de masas dará un valor de corriente iónica (que será proporcional a la
concentración del compuesto en la muestra) en función de la masa, aunque realmente
no mide la masa de la molécula, sino su relación masa/carga. Es importante
diferenciar entre la masa de una molécula y la relación masa/carga, ya que no es lo
mismo ni tienen las mismas unidades. La masa de una molécula se mide en unidades
de masa atómica (uma) y la relación masa/carga se mide en Daltons (Da). En este
trabajo se hablará siempre de relación masa/carga, ya que los valores que mide el
analizador de masas serán siempre relaciones masa/carga, por lo que, aunque se diga
“masa” en vez de “relación masa/carga”, siempre se estará haciendo referencia a la
relación masa/carga, a no ser que se especifique lo contrario.
Independientemente del tipo de espectrómetro de masas, su estructura viene
compuesta por los siguientes elementos:
11
Sistema de entrada.
Sistema de ionización de la muestra. En el caso que se ha visto, este
proceso se hace mediante la ionización por electrospray.
Acelerador de iones mediante campos eléctricos.
Dispersor de iones según su relación m/z. Esta parte también se
denomina analizador de masas.
Detector de iones que convierta el haz de iones en una señal eléctrica y
acoplado a un sistema de adquisición y pre-procesamiento de datos.
En la figura 5 se puede observar un esquema del espectrómetro de masas,
incluyendo la interfaz ESI inicial. La muestra entra al espectrómetro por el sistema de
entrada, que en este caso (cromatografía líquida de alta resolución acoplada a
espectrómetro de masas por tiempo de vuelo con interfaz de electrospray ionizante, en
adelante HPLC-ESI-MS/TOF) sería la muestra proveniente del sistema de
cromatografía líquida HPLC, y pasa a un sistema de ionización, que está
implementado en la interfaz ESI como se ha explicado. Una vez que la muestra ha
sido ionizada, ha de ser conducida a través de diversas cámaras, cada una de ellas a
una presión más cercana al vacío que la anterior. La conducción de los iones a través
de estas cámaras se realiza por medio de campos eléctricos y, gracias a que la
presión es cada vez más baja, los iones se mueven de forma más uniforme entre sí, lo
que será de interés cuando lleguen al analizador de masas propiamente dicho.
Figura 5. Esquema de espectrómetro de masas con analizador por tiempo de vuelo [18].
Tras recorrer las cámaras con los distintos niveles de vacío, se llega al
analizador de masas, donde se analizará la relación masa/carga de los iones. Hay
diversas técnicas y dispositivos destinados a este fin, pero aquí se explicará de forma
detallada el que se ha usado para obtener los datos que se procesarán, para poder así
comprender el ruido que se observa en los datos de salida. En concreto, la técnica que
12
ha sido usada y que nos permite medir la relación masa/carga de los iones, es la de
tiempo de vuelo (TOF, por sus siglas en inglés Time Of Flight).
El analizador de masas por tiempo de vuelo se basa, fundamentalmente, en
medir el tiempo que tarda cada ion en viajar una distancia conocida, con una energía
determinada, pudiendo estimar así la relación m/z que tiene cada ion.
En líneas generales, los iones habrán sido conducidos al analizador TOF y
agrupados en una zona conocida como “zona de aceleración ortogonal”, donde un
campo eléctrico intermitente los impulsará por una cavidad conocida como “tubo de
vuelo” y, tras reflejarse en un elemento conocido como reflectrón, recorrerán el resto
del tubo de vuelo y llegarán a un detector de iones. En la figura 6 se puede observar
un ejemplo de la estructura de un analizador por tiempo de vuelo con reflectrón.
Figura 6. Estructura de un analizador por tiempo de vuelo con reflectrón [4].
En primer lugar, en la zona de aceleración ortogonal se aplica un campo
eléctrico intermitente, que hace que los iones sean acelerados hacia el tubo de vuelo
con una energía cinética aproximadamente uniforme para todos sus iones. Al recorrer
el tubo de vuelo, los iones más pesados irán más despacio mientras que los menos
pesados lo recorrerán más rápido, separándose los unos de los otros para llegar en
tiempos distintos al detector. Este hecho ya nos pone de relieve que, cuanto mayor
sea el tubo de vuelo, mayor será la diferencia de tiempos de llegada entre los iones
pesados y los iones ligeros, por lo que se aumentará la resolución del analizador.
Sin embargo, hay que tener en cuenta que los iones tienen distinta energía
cinética inicial cuando están en la zona de aceleración ortogonal (antes de que se
aplique el campo eléctrico), por lo que su energía cinética inicial puede estar “a favor”
o “en contra” de la aceleración provocada por el campo eléctrico cuando éste actúe.
Esta energía cinética inicial está asociada a una temperatura no uniforme de los iones,
que provoca una dispersión de velocidades entre ellos y, por tanto, una dispersión de
energía cinética. Además, los iones no se encuentran exactamente en la misma
posición, sino que están dispersos en un volumen que puede hacer que recorran
mayor o menor distancia en el proceso. Por lo tanto, mientras que el grueso de los
iones acelerados tendrá una energía cinética aproximadamente igual, habrá una
porción de iones que tengan más energía cinética que los otros (al tener una energía
cinética inicial constructiva con la provocada por el campo eléctrico), por lo que
tardarán menos en recorrer el tubo de vuelo, y otra porción de iones que, por la razón
13
opuesta, tardarán más en recorrer el tubo de vuelo. Este fenómeno se atenúa
parcialmente colocando el reflectrón, que consiste en un dispositivo que contrarresta la
energía cinética de cada ion por medio de un campo eléctrico variable (mayor cuanto
más nos adentramos en el reflectrón), de forma que cuando los iones llegan al
reflectrón, se ven reflejados antes o después según la energía cinética con la que
llegasen. Por lo tanto, los iones que tenían demasiada energía cinética, tardan más en
reflejarse que los que tenían menos energía cinética, por lo que se compensan esa
dispersión (en parte) haciendo que los iones con la misma m/z lleguen de forma más
uniforme al detector, reduciendo así la problemática dispersión de los tiempos de vuelo
de los iones. Este fenómeno se puede observar en la figura 7, donde se observan
iones de igual masa con mayor o menor velocidad inicial reflejándose de forma
diferente en el reflectrón.
Figura 7. Utilidad del reflectrón en el analizador de masas [1].
Asumiendo que la energía cinética sea uniforme para todos los iones, que
dicha energía es producida por un potencial eléctrico y teniendo en cuenta que la
energía que provoca dicho potencial en una partícula de carga será , entonces se
puede hacer la siguiente relación:
, donde es la masa del ion y es la velocidad final producida por la aceleración.
Si el recorrido total del ion en el tubo de vuelo es (este valor tendrá en cuenta
tanto el doble recorrido que hacen los iones, como la profundidad media a la que
entran en el reflectrón), entonces se puede decir que el tiempo que tarda el ion en
recorrer el tubo de vuelo (tiempo de vuelo, TOF) sería el siguiente:
Si se despeja la velocidad en la primera ecuación, se obtiene:
14
√
√
Esta ecuación confirma la idea intuitiva de que un ion con más masa tardará
más tiempo en recorrer el tubo de vuelo pues irá a una velocidad menor.
Si se relacionan las expresiones anteriores, se puede llegar al siguiente
resultado:
√
Relacionando la carga del ion ( ) con el número de cargas del ion ( ) y la carga
de un electrón ( ), se puede concluir que la carga del ion es igual al producto del
número de cargas, por la carga del electrón. Es decir:
Finalmente, se puede obtener la siguiente relación:
√
Llegado este punto se observa que los valores que se conocen son la distancia
que recorren los iones ( ), el potencial eléctrico aplicado ( ) y la carga de un electrón
( ). Sin embargo, se desconoce el número de cargas que tiene el ion, porque como se
dijo anteriormente la ionización por electrospray puede ionizar la molécula con una o
varias cargas y no se puede saber a priori cuántas cargas tiene. Por lo tanto, si se
incluyen los valores conocidos en una constante , se desprende que el valor que se
puede obtener con el analizador por tiempo de vuelo no es la masa del ion, sino la
relación masa/carga de dicho ion.
√
√
√
Por lo tanto, si llega un ion tras un tiempo de vuelo , la relación masa carga
del ion se calculará de la forma:
(
)
Esto permite hacer una equivalencia directa entre tiempo de vuelo y relación
masa/carga que hará que los resultados que da el espectrómetro de masas estén
directamente en valores de masa/carga. Realmente las cuentas mostradas contienen
muchas suposiciones, por lo que en el cálculo real se usan coeficientes obtenidos
experimentalmente que obtienen un resultado mucho más preciso.
Teniendo en cuenta los valores típicos de los parámetros en este experimento
(potencial de miles de voltios y longitud del tubo de vuelo de aproximadamente un
15
metro), resolvemos que el tiempo de vuelo de los iones está en el rango de los
microsegundos, por lo que se necesita un detector muy rápido que sea capaz de
aportar precisión suficiente para distinguir relaciones masa/carga cercanas (o
equivalentemente tiempos de vuelo parecidos). Además, las corrientes de iones a la
salida del analizador son muy pequeñas (en el orden de los nanoamperios a decenas
de femtoamperios), por lo que se necesita un amplificador que sea capaz de amplificar
la señal para que pueda ser procesable.
El detector utilizado en la obtención de los datos de esta memoria es un
detector de impacto electrónico, que registra la carga inducida por un ion en una serie
de placas de alto voltaje, transformando la energía del impacto de los iones en señales
eléctricas que pueden ser medibles. Sin embargo, esta detección necesita de una
amplificación previa para tener suficientes impactos y generar una señal eléctrica lo
suficientemente grande, lo que se consigue con el multiplicador de electrones, o
electromultiplicador. El multiplicador de electrones utiliza el principio de emisión de
electrones secundarios, que consiste en hacer incidir el haz de iones en una placa de
cobre y berilio (tradicionalmente), con lo que la placa emite una cantidad de electrones
en proporción directa con el número de iones que recibe. Este haz de electrones
emitido vuelve a incidir sobre otra placa repitiendo el mismo proceso, de forma que al
final de una serie de placas (normalmente entre 10 y 16), el pequeño haz de iones ha
desencadenado un haz de electrones mucho mayor al original, que sí se puede
transformar en una señal de suficiente amplitud por el detector de impacto electrónico.
Finalmente, esta señal eléctrica es amplificada y procesada, con lo que ya tenemos
una intensidad de iones (habitualmente se mide en número de cuentas) para cada
relación masa/carga. Un esquema del multiplicador de electrones se puede observar
en la figura 8.
Figura 8. Multiplicador de electrones [1].
Una vez que el detector convierte el haz de iones en una señal eléctrica
continua en amplitud y tiempo (analógica), se amplifica y pasa al conversor A/D. En el
conversor A/D se tiene que tener en cuenta que hay que cuantizar las corrientes
aunque el compuesto sea poco abundante (ya que limitaría mucho la sensibilidad del
analizador de masas), pero también hay que cuantizar de forma lo más precisa posible
el valor de intensidad producido por una abundancia muy grande de un compuesto.
Por lo tanto, esto obliga a tener un rango dinámico muy grande en el detector, lo que
provoca mucho error de cuantización si no se usan muchos bits para cuantizar. Una
posible solución sería aumentar la cantidad de bits que se utilizan, pero hay que tener
16
en cuenta que la frecuencia de muestreo requerida será muy alta, para tener una
resolución de masa (o tiempo de vuelo) suficiente. Dado que es necesario diferenciar
tiempos de vuelo del orden de microsegundos, las frecuencias de muestreo han de ser
del orden de GHz, por lo que los cuantizadores de la conversión A/D, a una frecuencia
tan alta, requieren un comparador por cada nivel de cuantización, resultando
prohibitivo el uso de conversores A/D de muchos bits. La solución que se implementa
en la práctica es, en vez de medir la corriente iónica producida por muchos iones (que
es lo que satura nuestra conversión A/D), se va a diseñar el sistema para que se
hagan las medidas mucho más rápido pero con muchos menos iones. La idea es la
siguiente:
El campo eléctrico intermitente, que está controlado por un sistema de control para
saber el tiempo que ha pasado desde que se “activa” el campo hasta que se
detecta el ion (para medir la masa), tiene una frecuencia muy rápida para que
únicamente unos pocos iones estuviesen en la zona de aceleración ortogonal y,
por tanto, sean acelerados al tubo de vuelo.
Al ser pocos iones los que viajan por el tubo de vuelo, es menos probable que
interfieran entre sí, por lo que la medida de sus tiempos será mucho más uniforme
si tienen la misma masa y, por tanto, se reducirá la dispersión en el tiempo de
vuelo (por tanto en la masa iónica) de los iones, obteniendo así una mayor
precisión.
Dado que muy pocos iones llegan al detector, la corriente que producen también
es muy pequeña, por lo que se puede usar un número pequeño de bits
(habitualmente se usan 8) para cuantizar la corriente, reduciendo mucho el error
de cuantización.
Cada una de estas pequeñas “tandas de medidas” se conoce como micro-
scan. Una vez que se tiene un número grande de micro-scans, se suman las
intensidades encontradas para cada masa en cada micro-scan, obteniendo así un
valor de intensidad para cada masa que se ha recibido (es decir, para cada tiempo de
vuelo que se ha detectado). El resultado de la suma de los micro-scans (de miles de
ellos) se conoce como espectro de suma (scan spectrum) y se suele obtener un
espectro de suma cada segundo (realmente no será exactamente un segundo como
se verá a lo largo del trabajo).
Una vez llegados a este punto tendremos, para cada tiempo de retención, un
espectro de suma que indicará la intensidad iónica que se ha detectado para cada
valor de relación masa/carga (una señal discreta de intensidad en función de la masa).
Sin embargo, dado que los espectrómetros de masas actuales tienen una precisión del
orden de los miliDaltons (en adelante mDa), y el rango de masas puede ser muy
grande (desde cientos hasta miles de Daltons), guardar la información de todo el
espectro de suma para cada scan requeriría un espacio de almacenamiento enorme,
lo que se ha considerado inviable y ha llevado a una solución que, aunque necesaria,
nos dará problemas a lo largo del trabajo.
El procesado de los espectros suma se realiza en varias etapas. En primer
lugar se eliminan cambios bruscos de intensidad en función de la masa filtrando paso
baja. Con este filtrado se consigue tanto suavizar la forma de los picos
correspondientes a una especie iónica, como alisar el fondo de ruido, atenuando el
17
ruido estadístico asociado a la distribución de velocidades iniciales de los iones que
constituyen cada paquete iónico y atenuando el ruido electrónico asociado a los
distintos elementos del detector, electromultiplicador y amplificador.
Una vez filtradas, se recorren las intensidades para cada relación m/z y se
detectan las duplas intensidad-m/z cuyas intensidades sean máximos locales. A partir
de los valores de masa-intensidad alrededor de un máximo local se obtiene el valor
esperado de la masa y de la intensidad iónica. De este modo se obtiene un valor
esperado de masa que tiene mejor resolución que la proporcionada por la frecuencia
de muestreo en la conversión A/D.
El resultado de realizar este procesamiento sobre el espectro de suma, se
conoce como espectro de línea (o line spectrum), donde tendremos una intensidad y
un valor de masa exacta para cada máximo local identificado en el espectro suma, en
vez de una intensidad para cada muestra de la señal digital del conversor A/D, con lo
que se consigue reducir significativamente el volumen de datos a almacenar o
procesar. Por lo tanto, esta ha sido la forma en la que se han manipulado los datos en
este trabajo. Los espectros de línea se almacenan como valores float de 32 bits en
ficheros de codificación propia de cada fabricante. Por ejemplo, los ficheros de los que
se parte en este trabajo son ficheros .baf generados por el espectrómetro de masas de
la empresa Bruker. Los ficheros de cada fabricante pueden ser leídos utilizando
software propio de dicho fabricante, o bien usar dicho software para convertirlos al
formato XML.
Aunque cada valor del espectro de línea se obtiene como contribución de todos
los iones que llegan en un tiempo de retención con un tiempo de vuelo aproximado, a
lo largo de todo el trabajo se llamará “entrada” o “punto” de un espectro de línea, a
cada triplete tiempo-masa/carga-intensidad que indica un valor de intensidad iónica en
una relación masa/carga concreta, para un tiempo de retención determinado. Por lo
tanto, al hablar de “entrada” de datos HPLC-ESI-TOF ya estará patente el hecho de
que esa entrada ha sido obtenida como contribución de múltiples iones en analizador
de masas.
Hay que tener en cuenta que el uso de una técnica cromatográfica para
separar inicialmente la muestra nos permite diferenciar los compuestos (según su
tiempo de retención y las características concretas de las fases de la cromatografía) al
poder realizar el análisis de masa para dichos compuestos en instantes distintos de
tiempo. Es decir, los compuestos de la muestra se separan unos de otros en el paso
por la columna separativa, llegando unos antes y otros después al analizador de
espectros, de forma que tomando medidas cada cierto tiempo (normalmente se
obtiene un espectro suma por segundo), se podrá caracterizar la muestra tanto en
función de la intensidad que llega para cada relación masa/carga, como en el tiempo
de retención en el que se realiza el scan.
Por lo tanto, gracias a la cromatografía acoplada a la espectrometría de masas,
se puede caracterizar una muestra según la intensidad que presente para cada tiempo
de retención y cada relación masa/carga.
18
1.2. Caracterización de compuestos en una muestra. Hasta el momento las técnicas utilizadas para la detección y caracterización de
compuestos en las muestras (búsqueda de la huella espectrométrica de cada
compuesto) se ha realizado de forma manual o automática.
La forma manual consiste en observar el cromatograma de pico base y ver los
picos que aparecen en él, para saber en qué tiempos de retención buscar cada
compuesto de la muestra. Esta forma es muy sencilla pero para que sea útil es
necesario que los picos cromatográficos de los iones abundantes de los compuestos,
se vean muy diferenciados entre sí, para poder saber dónde está cada compuesto.
Como se ha visto anteriormente, esto no ocurre con las muestras complejas, e incluso
con las muestras simples (sin coelución entre los compuestos), no tiene por qué
observarse el total de los compuestos de la muestra, ya que habrá algunos cuyas
intensidades no superen las de los artefactos químicos asociados a las fases móvil y
estacionaria, y por tanto no se verán en el cromatograma de pico base. La forma
manual es muy laboriosa y requiere el análisis de un experto para distinguir los
compuestos que puedan coeluir (para lo que habrá que mirar cientos de
cromatogramas de ion extraído), pero nos servirá para comprobar los resultados que
obtengamos con nuestra herramienta, como veremos en la metodología del trabajo.
La forma automática consiste en algoritmos que procesen los datos para
obtener la información que haya en ellos. Actualmente estos algoritmos hacen
agrupaciones de entradas de masas y tiempos similares, para después unirlas entre sí
si están en tiempos de retención parecidos, formando la huella espectrométrica del
compuesto. Estos métodos serán útiles en casos sencillos, ya que agruparan la huella
espectrométrica juntando todas las líneas de ésta. Sin embargo, estos métodos no
servirán para diferenciar compuestos que coeluyen, ya que se incluirán en la misma
huella espectrométrica por considerarse el mismo compuesto. Esto deja patente la
necesidad de implementar una herramienta que afronte la caracterización de
compuestos incluso cuando haya coelución entre ellos.
19
2. Objetivos y metodología.
Una vez asentados sobre una base teórica, se pueden explicar de forma detallada los objetivos que se perseguirán en este trabajo.
2.1. Objetivo principal. La búsqueda general de componentes en una muestra se ha hecho
tradicionalmente observando en qué masa se encuentra la intensidad máxima para un tiempo determinado (observando el cromatograma de pico base), identificando así únicamente aquellos compuestos más abundantes en cada rango de tiempos de retención. Esta forma es tremendamente simple y únicamente es necesario un procesamiento básico de los datos, pero únicamente sirve cuando los compuestos están separados en tiempo de retención (es decir, no coeluyen). Sin embargo, cuando hay que analizar muestras complejas que contienen compuestos de distinta masa que coeluyen, no conseguiríamos distinguir ambos compuestos ya que el compuesto más abundante ocultaría a los menos abundantes.
Para analizar muestras más complejas, el proceso ha de ser distinto, ya que seguramente se encontrarán compuestos coeluyendo y habrá que caracterizarlos por separado. Además, este proceso tiene que ser lo más automático y rápido posible, ya que resultaría imposible identificar manualmente todos los compuestos pues habría que recorrer cada masa con precisión de miliDaltons en un rango de cientos de daltons.
El objetivo principal de este estudio será el siguiente:
Implementación de una herramienta para la detección y caracterización automática de compuestos en muestras obtenidas mediante LC-MS.
La idea general es buscar primero los picos de mayor abundancia en el espectro de masas y compararlos entre sí para ver cuáles son el ion principal de un compuesto y cuáles forman parte de la huella espectrométrica de otro compuesto (o de ese mismo). Una vez tenemos el pico correspondiente a la masa más abundante de cada compuesto, se agrupará su huella espectrométrica comparando el pico cromatográfico principal del compuesto, con los picos cromatográficos candidatos a formar parte de su huella espectrométrica (y por tanto formar parte de dicho compuesto).
Con este método no solo se consigue agrupar huellas espectrométricas
caracterizando así cada compuesto, sino que se extrae toda la información importante de un fichero de datos con un volumen elevado, y se compacta en una serie de tablas con la información de los compuestos, de forma que el espacio requerido para su almacenamiento y procesamiento es mucho menor.
Para la implementación se ha usado Matlab y se ha prestado especial
atención a la eficiencia computacional, de forma que tarde lo menos posible (máxima eficiencia), incluso con muestras complejas.
Este objetivo se ha alcanzado en este trabajo y su comprobación tanto en
20
muestras simples como en muestras complejas da buenos resultados, demostrando que esta herramienta es muy útil y muy potente en la caracterización automática de compuestos en muestras obtenidas mediante LC-MS (por sus siglas en inglés, Liquid Chromatography – Mass Spectrometry).
2.2. Objetivos secundarios. Además del objetivo principal de este trabajo, hay varios objetivos secundarios
que se plantearon al inicio del trabajo, y otros objetivos que surgieron para intentar solucionar resultados poco deseables del objetivo principal.
Los objetivos secundarios planteados inicialmente en el trabajo son los
siguientes:
Conocer las fuentes de ruido en los datos de espectrometría de masas y ser manipular convenientemente este tipo de ruido, paliándolo cuando sea necesario y sabiendo explicar salidas incoherentes basándose en la caracterización del ruido y en las posibles fuentes de error.
Este objetivo se ha alcanzado a lo largo del trabajo y ha permitido que se
tomen decisiones de compromiso para alcanzar el objetivo principal, en base a la información que se tiene de las fuentes de ruido y de los problemas del preprocesamiento de datos.
Relacionar los compuestos detectados en varias muestras de una colección. Conseguir este objetivo resultaría muy interesante, ya que habitualmente no se
trabaja con una única muestra para realizar un estudio, sino que se trabaja con una colección de muestras. Por lo tanto, desarrollar un método que relacione los compuestos detectados en una colección de muestras es realmente muy útil para compactar la información de toda la colección y para poder observar rápidamente qué compuestos de la colección aparecen en cada muestra. Sin embargo, este objetivo está íntimamente ligado con el objetivo principal de la práctica, ya que para llegar a comparar los resultados de todo un conjunto de muestras, primero hay que poder obtener los resultados del análisis de cada muestra de forma correcta y eficiente.
En la práctica este objetivo se ha logrado de forma parcial, ya que se ha
implementado un método que realice el objetivo y se ha evaluado con la colección de muestras simples, comprobando que los resultados son correctos para esa colección. No se ha comprobado para la colección de muestras complejas ya que salen muchos resultados y haría falta muchísimo tiempo para comprobarlos todos, por lo que se ha preferido no añadir ese resultado en este trabajo e incluir únicamente los resultados y las comprobaciones para la colección de muestras simples.
A continuación se exponen otros objetivos secundarios que han surgido en el transcurso del trabajo:
Identificación y eliminación de las señales correspondientes a artefactos químicos. Cuando implementemos el método para alcanzar el objetivo principal, veremos
que hay ciertas masas que aparecen de forma continua durante todo el rango de
21
tiempos de retención. Estas señales son debidas a la fase fija o móvil que llega a la interfaz ESI, por lo que se ioniza y se analiza su masa. A pesar de que estos artefactos químicos no son propiamente ruido, ya que mantienen una intensidad muy elevada en todo el tiempo del análisis, son compuestos que no nos interesa analizar, ya que únicamente nos dará problemas en nuestra búsqueda de compuestos de interés.
Este objetivo se logra con resultados muy satisfactorios, consiguiendo identificar y suprimir los artefactos químicos en un procesamiento de los datos muy rápido y previo a la identificación de los compuestos, de forma que el análisis posterior obtenga mejores resultados y sea más rápido, al eliminar una cantidad importante de datos de alta intensidad
Objetivos académicos.
En lo referente a los objetivos de interés académico y al uso de conceptos multidisciplinares para analizar y tratar de resolver un problema de un aplicación real, a continuación se pueden observar objetivos propuestos, campos investigados y conceptos utilizados a lo largo del trabajo.
Modelado de sistemas.
A lo largo del trabajo se han usado conceptos relativos al modelado de
sistemas, ya que se puede considerar el análisis LC-MS como un sistema
cuya salida (datos LC-MS) viene determinada por su entrada (compuesto) y
su respuesta impulsiva (separación cromatográfica, ionización, detección
de iones, cálculo de tiempos de vuelo, etc.).
Instrumentación.
El análisis del sistema HPLC-ESI-TOF/MS ha requerido un análisis de
los instrumentos que se utilizan en él, consolidando conceptos aprendidos
en la carrera (ruido electrónico, fluctuación de medidas por temperatura de
los elementos, etc.) y descubriendo nuevos elementos de interés
(electromultiplicador, eficacia de la ionización, etc.).
Aplicación de técnicas de procesado de señal básicas a datos reales.
En el trabajo se han usado muchos conceptos de tratamiento digital y
analógico de señales, lo que ha permitido desarrollar los métodos deseados
con una base sólida de procesado de señal. Por ejemplo, el método de
detección y caracterización de compuestos se ha basado en conceptos
básicos de procesado de señal (distancia entre perfiles cromatográficos
como una correlación entre señales).
Uso y adquisición de habilidades de programación. Este objetivo es tanto personal como necesario para una correcta
implementación de los métodos que se proponen en este trabajo. En primer lugar, hay que tener en cuenta que en los métodos implementados se trabajará con vectores con muchísimas entradas y matrices de dimensiones realmente altas, por lo que es necesario adquirir habilidad en la manipulación de vectores y matrices en el entorno Matlab que no requieran
22
del uso de bucles, pues una implementación incorrecta de un método puede hacer que tarde varios minutos (si se hace con bucles), a que tarde unos pocos segundos (si se hace por indexación, por ejemplo).
Conocimientos de problemas en HPLC-ESI-TOF/MS.
A lo largo del trabajo se ha realizado un estudio de los datos obtenidos
mediante HPLC-ESI-TOF/MS, por lo que se han introducido conceptos
completamente nuevos que no se habían visto a lo largo de la carrera (por
ejemplo la cromatografía) y que han formado una base para poder
comprender y manipular este tipo de datos.
Metodología científica y elaboración de reportajes científicos.
En el desarrollo de los métodos de este trabajo se ha aprendido a tener
una actitud científica basada en investigar, desarrollar, evaluar y discutir los
resultados obtenidos, aprendiendo las pautas que es conveniente seguir
para implementar y comprobar un método.
También se ha realizado la memoria de este trabajo teniendo en cuenta
que es un trabajo científico, por lo que se han adquirido conceptos sobre el
tipo de estructura usada en este tipo de trabajos y cómo se distribuye la
información en éstos.
Integración de conocimientos multidisciplinares.
A lo largo del trabajo se han usado conceptos relativos a muchas
disciplinas, aprendidas o no a lo largo de la carrera, para desarrollar
métodos orientados a datos reales en una disciplina hasta ahora
desconocida para el alumno. Entre las muchas disciplinas que se han
integrado en este trabajo, se pueden destacar las siguientes: física (por
ejemplo el movimiento de iones por campos electrónicos), química (por
ejemplo la ionización de una molécula), instrumentación electrónica (por
ejemplo el análisis del detector por tiempo de vuelo, conversor A/D, etc.),
electrónica de control (osciladores utilizados y su variación en función de la
temperatura), teoría de la señal (filtrados, correlaciones, etc.), matemáticas
(proyección de vectores), estadística (valores esperados, histogramas,
etc.), programación (habilidades de programación en Matlab) y búsquedas
bibliográficas (búsqueda en webs de investigación e incluso búsquedas
para adecuar el lenguaje a la redacción de un texto científico).
23
2.3. Metodología. En este apartado se muestra el problema que se intenta solucionar con la
herramienta implementada en este trabajo y cómo se ha abordado e implementado. Se muestra también cómo se comprueban los resultados que se obtienen con la herramienta implementada y las distintas formas de representar los datos. Además, se realiza un estudio de la respuesta instrumental que presenta el sistema HPLC-ESI-TOF/MS ante la entrada de uno o varios compuestos, con el objetivo de comprender las distribuciones de ruido y los problemas que nos podemos encontrar. También se explican las colecciones de muestras se han usado a lo largo de todo el trabajo y el preprocesamiento que se ha realizado en las muestras para reducir su volumen y obtener resultados con más rapidez.
El estudio de las características de los datos HPLC-MS se ha apoyado en
ejemplos correspondientes a muestras analizadas en el Departamento de Química Analítica de la Universidad de Granada, con el que mantiene una colaboración el Departamento de Teoría de la Señal, Telemática y Comunicaciones, en el que se ha realizado este trabajo. Se han usado dos muestras como ejemplos; la primera de ellas es una muestra simple obtenida disolviendo en metanol 5 compuestos fenólicos conocidos y disponibles comercialmente (usados como estándares para calibración), en cantidades conocidas. La segunda muestra es un extracto fenólico de un aceite de oliva virgen extra, y contiene un número muy elevado de compuestos en concentraciones, a priori, desconocidas, siendo por tanto una muestra mucho más compleja. 2.3.1. Identificación del problema y solución propuesta.
Como se ha comentado anteriormente, el problema que se va a intentar
superar con esta herramienta es la ausencia de métodos automáticos que detecten y caractericen los compuestos de una muestra cuando hay coelución entre ellos, ya que la orientación que siguen se basa en una agrupación según tiempo de retención y relación masa/carga, sin tener en cuenta nunca la forma del pico cromatográfico.
La solución que se ha implementado en la herramienta es utilizar algo no
utilizado hasta el momento; la agrupación de la huella espectrométrica de cada compuesto basándose en la forma cromatográfica del ion más abundante del compuesto. Esta idea consiste en buscar primero los posibles iones principales (entendiendo como principales los más abundantes) de cada compuesto, para luego saber cuáles de ellos pertenecen al mismo compuesto, y cuáles de ellos pertenecen a compuestos distintos. Esta comparación se realiza considerando un espacio vectorial de funciones que describen los picos cromatográficos. Para comparar dos picos cromatográficos se proyecta una función sobre la otra normalizadas. Una vez que se tienen únicamente los iones principales de cada compuesto, se agrupa la huella espectrométrica de cada uno de ellos realizando la misma comparación (proyección de vectores) con todos los picos cromatográficos que salen en tiempos de retención parecidos, pasando un pico cromatográfico a formar parte de la huella espectrométrica si es lo suficientemente parecido al pico cromatográfico principal.
Agrupando la huella espectrométrica según comparación entre picos
cromatográficos, los compuestos que coeluyan parcialmente (coeluyen pero los máximos de intensidad están en tiempos distintos) darán una similitud muy baja, ya que las proyecciones de sus vectores serán muy pequeñas por estar desplazados ambos picos cromatográficos. Si la coelución de ambos picos es total (coeluyen con el máximo de intensidad prácticamente en el mismo instante de tiempo), entonces se podrán separar si la forma cromatográfica es distinta (más adelante se dirá qué umbral
24
se aplica para decir que una similitud es lo suficientemente grande). El objetivo de este trabajo ha sido implementar esta herramienta y evaluarla para poder comprobar que la agrupación de huella espectrométrica por similitud de pico cromatográfico es un proceso adecuado. 2.3.2. Validación y evaluación del método.
Una vez que se tengan los resultados de aplicar la herramienta a una muestra,
habrá que comprobarlos para verificar que son correctos. Para la comprobación se siguen dos procedimientos, uno basado en comparar los resultados con los que se obtienen con una búsqueda exhaustiva manual realizada por un experto en química analítica, y otro basado en comprobar los resultados de un compuesto con los que se obtienen de ese mismo compuesto en varias muestras de la misma colección.
Cuando queramos comprobar si los compuestos que ha detectado la
herramienta son los correctos, se usará la información que se dispone del análisis realizado manualmente. En esta comprobación tenemos que tener en cuenta que habrá algunos compuestos que un experto identifique rápidamente, pero que la herramienta no pueda identificar de momento (en una implementación básica de la misma), a la vez que habrá compuestos que la persona no logrará identificar pero la herramienta sí (quizás por coeluir con otro compuesto más abundante). El número de compuestos detectados depende del umbral de intensidad que se use, ya que un umbral bajo hará que el método automático detecte más compuestos pero a riesgo de proporcionar detección de que no corresponden a compuestos (falsos positivos) y que son debidos al ruido. De la misma forma, reducir falsos positivos supondrá también reducir el número de compuestos correctamente identificados, por lo que se tendrá que buscar una solución de compromiso que demuestre que el método presenta buenos resultados y que tiene potencial para conseguir resultados mucho mejores.
Figura 9. Diagrama de las posibilidades al comprobar los resultados.
En la figura 9 se ha intentado esquematizar el hecho de que con la herramienta automática (elipse negra) se cogerán más compuestos presentes en la muestra (rectángulo rojo) que de forma manual (círculo azul). Sin embargo, con la herramienta automática también se generarán falsos positivos debidos a ruido o artefactos (fondo amarillo), lo que no ocurrirá con la forma manual. Si se reduce el tamaño de la elipse negra (se usan umbrales más restrictivos) se tendrán menos falsos positivos pero también se encontrarán menos compuestos de la muestra y reduciendo el número de compuestos que se encuentran por ambos métodos (intersección entre círculo y elipse). Por otra parte, aumentar el tamaño de la elipse (condiciones más relajadas) hará que se detecten más compuestos de la muestra, y prácticamente todos los que
25
se han encontrado manualmente, pero también añadirá falsos positivos. Los resultados se considerarán buenos si se detectan muchos compuestos, con un número reducido de falsos positivos y la mayoría de los compuestos encontrados manualmente, se encuentran también con la herramienta (y justificando los que no se encuentran para entender qué mejoras haría falta implementar para que sí se encontrasen).
Cuando el interés radique en comprobar si la huella espectrométrica de un
compuesto se ha agrupado de forma correcta, lo que se va a hacer es comprobar que la huella espectrométrica sea la misma para el compuesto en muestras distintas, lo que dará validez a la comprobación ya que superará los desalineamientos temporales y descalibraciones de masa que hay entre distintas muestras.
2.3.3. Formas de mostrar los datos.
En este apartado se explicarán las distintas formas que tenemos de
representar los datos, viendo las ventajas de cada una y sus limitaciones. Recordemos que tenemos 3 dimensiones; el tiempo de retención (o tiempo en el que se separan los compuestos de la muestra gracias a la cromatografía), la relación masa/carga (m/z) y la intensidad iónica de cada relación masa/carga en cada tiempo de retención.
2.3.3.1. Cromatogramas. Generalmente la información se suele representar en cromatogramas, que
consisten en una representación de la intensidad en función del tiempo de retención. La forma en la que se agrupan las masas es la que hace variar entre un tipo de cromatograma u otro.
Cromatograma de ion total (total ion chromatogram).
Este cromatograma representa la intensidad iónica en función del tiempo de retención sumando todas las intensidades que hay en cada tiempo de retención (es decir las intensidades que tenemos para todas las m/z en ese tiempo de retención). Un ejemplo de este tipo de cromatograma en una muestra simple (mezcla de estándares comerciales) se puede observar en la figura 10.
Figura 10. Ejemplo de cromatograma de ion total con una muestra simple.
300 400 500 600 700 800 9000
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5x 10
5
Tiempo (s)
Inte
nsid
ad
Cromatograma de ion total
26
En el cromatograma se pueden observar varios picos, conocidos como picos cromatográficos, correspondientes a todas las intensidades que han salido en esos tiempos de retención. Cada pico del cromatograma se corresponde con un compuesto (o con varios si hay coelución), aunque ya veremos que un compuesto viene determinado por mucha más información que un pico cromatográfico. Realmente la muestra representada es muy sencilla y sin coelución, por lo que aquí se pueden distinguir fácilmente los compuestos más abundantes que hay, aunque el fondo de ruido provoca que la intensidad sea muy alta cuando no hay compuestos saliendo de la columna cromatográfica. Si se realiza esta representación para la muestra compleja (extracto fenólico de aceite) se observa un cromatograma mucho más complejo (con más picos y con picos superpuestos que indican coelución), como puede observarse en la figura 11.
Figura 11. Ejemplo de cromatograma de ion total con una muestra de aceite.
Es inmediato observar que esta muestra es mucho más compleja que la anterior, ya que se observan picos muy juntos entre sí y, en este caso, hay coelución de los compuestos, por ejemplo entre los 750 y los 950 segundos. Además, se puede ver que el fondo de ruido se hace cada vez más grande, lo que tiene su explicación cuando se observan los datos desde otra perspectiva, pero que no se puede explicar con esta representación. Otra cosa importante de este tipo de representación, es que si hay varios compuestos coeluyendo en el mismo tiempo de retención, la intensidad de ion total será muy superior a la del máximo de cada compuesto, pero su suma hará que parezca que es un único compuesto con una abundancia muy grande. Este último caso se puede observar en los primeros segundos del cromatograma de ion total, donde tenemos un pico correspondiente a la inyección de un calibrante (formiato sódico) con una huella espectrométrica muy extensa. Realmente este calibrante provoca muchos clusters (se explicará más adelante su significado) que formarán una huella espectrométrica muy extensa en masa, por lo que el pico que se observa es la suma de todos los clusters de dicha huella. En conclusión, este cromatograma tiene varios problemas; en primer lugar no sirve para observar los compuestos que coeluyen y, en segundo lugar, el hecho de
0 200 400 600 800 1000 1200 1400 16000
0.5
1
1.5
2
2.5x 10
6
Tiempo (s)
Inte
nsid
ad
Cromatograma de ion total
27
sumar las intensidades de todas las relaciones masa/carga para cada tiempo de retención, hace que el ruido contribuya mucho a dicha suma y algunos picos queden parcialmente enmascarados. Como se ha podido observar en la muestra compleja, este cromatograma puede dar a entender que hay compuestos muy abundantes, cuando realmente pueden ser muchos compuestos relativamente poco abundantes que están coeluyendo. Sin embargo, su facilidad tanto de comprensión como de implementación, hace que resulte una opción sencilla para hacerse una idea general de los compuestos que hay en una muestra simple.
Cromatograma de pico base (base peak chromatogram).
Este cromatograma representa, para cada tiempo de retención, la intensidad máxima en ese tiempo de retención para todas las masas. Es decir, representa la intensidad del ion más abundante en ese tiempo de retención.
Figura 12. Ejemplo de cromatograma de pico base de la muestra simple.
En la figura 12 se presenta el cromatograma de pico base de la muestra simple. Como se puede notar en dicha figura, el cromatograma de pico base es realmente parecido al cromatograma de ion total, con la diferencia de que el fondo de ruido no se suma a los valores de intensidades dados, de forma que se observa de forma más objetiva la abundancia iónica del compuesto en la muestra. Sin embargo, existe también el problema de no poder observar compuestos que coeluyen, ni tampoco se pueden observar compuestos que están por debajo del umbral de intensidad que marcan los artefactos químicos asociados a fase fija o fase móvil (se analizarán más adelante). En la figura 13 se presenta el cromatograma de pico base de la muestra compleja. Como se puede observar en dicha figura, la diferencia entre esta representación y la de ion total es mayor para una muestra compleja, ya que se puede observar realmente la abundancia iónica de cada compuesto que sobresalga por encima del resto (por ejemplo, el pico de los primeros segundos se ha reducido al valor de la intensidad de su especie iónica más abundante). Sin embargo, esta representación mantiene los mismos problemas básicos para distinguir compuestos que el cromatograma de ion total, ya que no consigue distinguir los compuestos que coeluyen y enmascara aquellos compuestos que tienen una intensidad por debajo del umbral de intensidad marcado por los compuestos que aparecen de forma continua.
300 400 500 600 700 800 9000
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
1.4
1.6
1.8
2x 10
5
Tiempo (s)
Inte
nsid
ad
Cromatograma de pico base
28
Figura 13. Ejemplo de cromatograma de pico base de la muestra compleja.
Por lo tanto, de estas representaciones se puede concluir que presentan limitaciones importantes a la hora de caracterizar los compuestos de la muestra, pero son muy útiles para hacerse una idea general de la distribución de los compuestos en la muestra.
Cromatograma de ion extraído (extracted ion chromatogram).
Este cromatograma se basa en representar la intensidad en función del tiempo para un rango determinado (generalmente pequeño) de masas, de forma que las intensidades de las masas que estén en el mismo tiempo de retención se suman. Realmente es una extensión del cromatograma de ion total, pero en vez de representar (y sumar) todo el rango de masas, únicamente nos quedamos con una pequeña porción de él. El nombre de “ion extraído” viene por la idea de que, si sabemos que hay un compuesto que sale en una masa concreta (por ejemplo en la masa 463,091 Da, que es el ion más abundante de la muestra simple), podemos coger un pequeño rango de masas alrededor de esa masa para observar, en todo el tiempo de retención, cómo sale ese ion o sus isómeros (aquellos que tienen igual relación masa/carga). Por ejemplo, si usamos la muestra simple y representamos la relación masa/carga 463,091 Da con un intervalo de masas de 25 mDa alrededor de la masa central, obtenemos el cromatograma de ion extraído que se observa en la figura 14.
0 200 400 600 800 1000 1200 1400 16000
1
2
3
4
5
6
7x 10
5
Tiempo (s)
Inte
nsid
ad
Cromatograma de pico base
29
Figura 14. Ejemplo de cromatograma de ion extraído.
Con esta representación somos capaces de observar con claridad los dos picos cromatográficos que hay en esta muestra con esa relación masa/carga, observando también uno que quedaba enmascarado y no se podía ver en las anteriores representaciones. En la figura 15 se puede observar el cromatograma de ion extraído centrado en la masa del ion más abundante de la muestra compleja.
Figura 15. Ejemplo de cromatograma de ion extraído.
En la figura 15 se observa de forma evidente la gran utilidad de este tipo de cromatograma, ya que nos permite distinguir perfectamente todos los isómeros que aparecen en un rango de masas pequeño, evitando así que queden enmascarados por otros iones más abundantes pero que estén en otras masas más lejanas. Se puede concluir que el cromatograma de ion extraído es una representación muy útil para observar en detalle una relación masa/carga concreta (en un rango pequeño de masas), y será muy utilizada a lo largo del trabajo tanto para comprobar resultados, como para obtener información sobre la forma de los picos de los
300 400 500 600 700 800 9000
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
1.4
1.6
1.8
2x 10
5
Tiempo (s)
inte
nsid
ad
Cromatograma de ion extraído en el rango de masas (463.091 +- 0.0125) Da
0 200 400 600 800 1000 1200 1400 16000
1
2
3
4
5
6
7x 10
5
Tiempo (s)
inte
nsid
ad
Cromatograma de ion extraído en el rango de masas (377.129 +- 0.0125) Da
30
compuestos y de los artefactos.
2.3.3.2. Espectrogramas.
Una vez que hemos analizado las formas de representar una muestra con cromatogramas, vemos que hace falta una forma de representar los datos que aporte información mucho más general de la muestra, y que nos permita distinguir los compuestos no solo por el tiempo de retención, sino también por la relación masa/carga que tienen sus iones.
La forma más adecuada de representar las tres dimensiones en este tipo de
datos es representando el tiempo de retención y la relación masa/carga en dos ejes perpendiculares, y representar, para cada pareja tiempo-masa/carga, la intensidad en una escala de color. Sin embargo, el rango de intensidades iónicas de los datos es muy grande, por lo el mapa de colores tiene que abarcar un rango muy grande de valores, siendo más difícil observar los cambios suaves entre intensidades. Una solución a este problema es representar la intensidad en escala logarítmica, reduciendo así el reducir el rango de intensidades que se muestra con el mapa de colores.
Algo que hay que tener en cuenta también es que los tiempos de retención no
dan saltos exactos de un segundo, sino que suelen tener una variación ligeramente mayor a un segundo. Si calculamos la diferencia que hay en los tiempos en los que se producen los scans (es decir, cada vez que el espectrómetro obtiene un espectro suma), veremos que ni es exactamente un segundo, ni es igual para todo el proceso. Por ejemplo, en la figura 16 se representa el histograma de la diferencia en los tiempos de retención de la muestra compleja. En dicho histograma se puede observar que la gran mayoría de los tiempos de retención tienen una diferencia de entre 1,003 y 1,004 segundos, por lo que llegará un momento en el que, si redondeamos cada tiempo de retención a su entero más cercano, habría algunos tiempos de retención que no tendrían asociado ningún scan. Por ejemplo, si tenemos un tiempo de retención en 4,499 segundos, y el siguiente en 5,502 segundos (4,499 + 1,003), al redondear tendremos un tiempo de retención en 4 segundos, y el siguiente en 6 segundos, quedando entre medias un segundo sin ninguna información.
Figura 16. Histograma de los saltos en el tiempo de retención.
Ante esta situación tenemos varias opciones si queremos representar un espectrograma; la primera es no representar tiempo de retención y representar en cambio scans. Esta opción asegura que no habrá scans vacíos pero hará que no podamos observar claramente los segundos en los que eluyen los compuestos (tendremos que ver qué segundo corresponde a ese scan). Otra opción es asumir que habrá segundos huecos y redondear cada tiempo de retención a su entero más
1.002 1.003 1.004 1.005 1.006 1.007 1.008 1.009 1.01 1.0110
200
400
600
800
1000
1200Histograma de los saltos en el tiempo de retención
31
cercano. Esta opción es adecuada para ver exactamente los tiempos de elución de cada compuesto, pero generará incómodos tiempos de retención vacíos que hacen que se pueda pensar que hay un error. Por último, podemos compensar la diferencias en el eje de tiempo dividiendo cada valor de retención por la media de las diferencias de tiempos (en este caso sería aproximadamente 1,003) y estaríamos realmente mostrando los índices del scan. Esta solución es bastante buena ya que permite representar las muestras sin que haya tiempos de retención vacíos, aunque el hecho de compensar el tiempo de retención hace que poco a poco haya valores de tiempo en el espectrograma que varíen con los valores reales en los que aparece ese compuesto. En la figura 17 se observan las dos soluciones para representar el espectrograma, representándose la misma zona de la muestra compleja con un espectrograma con ambos casos; compensando el tiempo con las diferencias entre los tiempos de retención (imagen izquierda), y sin compensar el tiempo pero observando un vacío entre dos tiempos de retención (imagen derecha). Además, se ha marcado un punto en el espectrograma que corresponde exactamente a la misma entrada de la muestra, pero que debida a la compensación aparece 3 segundos antes (aunque ya hemos dicho que no son exactamente segundos, sino tiempo compensado o índices de scan) de lo que debería, cosa que sí hace de forma correcta en la representación de la derecha.
Figura 17. Ejemplos de espectrogramas.
Realmente esta situación no es problemática en este trabajo, ya que se usará para hacernos una idea de la distribución de los compuestos en la muestra y, dado que ambas formas de representar el espectrograma nos aportan esa información, en este trabajo no se especificará qué tipo de espectrograma se representa en cada ocasión.
Una vez que se ha analizado esta cuestión sobre el eje de tiempos del espectrograma, volvamos a cómo hacer el espectrograma en sí. Lo interesante sería poner exactamente la información que tenemos para cada una de las masas distintas que tenemos, pero realmente no podríamos representar la precisión de un espectrómetro de masas (del orden de mDa) en una imagen, ya que el rango de masas es demasiado grande para cubrir todas las masas discretas (del orden de 1000 Da). Por lo tanto, la solución que se sigue es agrupar las masas en intervalos grandes o pequeños, según se quiera abarcar un rango de masas mayor o menor. Los dos tipos de espectrogramas que usaremos varían en la precisión que dan a las masas (es decir, cómo las agrupan) y el rango total de masas que muestran.
En ambos tipos de espectrogramas se tiene una resolución de tiempo de
retención de prácticamente un segundo, mientras que la resolución en masa varía
X: 1254 Y: 756
Index: 4.809
RGB: 1, 0.313, 0
Tiempo(s)
Masa ion (
Da)
Espectrograma de baja resolucion (1 Da)
1230 1240 1250 1260 1270 1280
300
350
400
450
500
550
600
650
700
750
1
1.5
2
2.5
3
3.5
4
4.5
5
5.5
X: 1251 Y: 756
Index: 4.809
RGB: 1, 0.313, 0
Tiempo compensado
Masa ion (
Da)
Espectrograma de baja resolución (1 Da)
1230 1240 1250 1260 1270 1280
300
350
400
450
500
550
600
650
700
750
1
1.5
2
2.5
3
3.5
4
4.5
5
5.5
32
entre una resolución baja (espectrograma de baja resolución) y una resolución alta (espectrograma de alta resolución).
Espectrograma de baja resolución.
Este espectrograma muestra todo el rango de relaciones masa/carga, y está pensado para hacernos una idea general de los compuestos sin preocuparnos por saber las variaciones pequeñas de masa. Al abarcar un rango de masas tan grande, es necesario agrupar las masas en grupos también grandes, usándose habitualmente grupos de masas de 1 Da.
En la figura 18 se representa el espectrograma de baja resolución (1 Da) para
la muestra simple. Como se puede observar en dicha figura, el espectrograma nos da una idea más general de toda la muestra que la que nos aportaban los cromatogramas. Para empezar, podemos observar los compuestos más abundantes de la muestra, observando fácilmente 5 de ellos (los que están en aproximadamente los tiempos de retención 390, 500, 640, 750 y 800 segundos), y si se observa la figura con más detenimiento, veremos que hay otro compuesto alrededor de los 411 segundos y otro alrededor de los 600 segundos. Estos compuestos coinciden con los que observamos en el cromatograma, pero aquí hemos podido observar en qué masas se distribuyen y podemos distinguir perfectamente el que está en el tiempo de retención 411 segundos, mientras que antes no conseguiríamos diferenciarlo fácilmente.
Figura 18. Ejemplo de espectrograma de baja resolución (1 Da).
Este espectrograma nos permitirá también, si hacemos zoom sobre el ion más abundante de un compuesto, ver cómo se distribuye su intensidad en función del tiempo de retención. Por ejemplo, en la figura 19 se puede ver el ion más abundante de toda la muestra, que es del compuesto que sale aproximadamente a los 800 segundos de tiempo de retención.
Tiempo(s)
Masa ion (
Da)
Espectrograma de baja resolucion (1 Da)
100 200 300 400 500 600 700 800
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
1
1.5
2
2.5
3
3.5
4
4.5
5
33
Figura 19. Ejemplo de zoom en un espectrograma de baja resolución (1 Da).
Esta representación es muy útil para observar la distribución de los compuestos en todo el rango de tiempos de retención y de relaciones masa/carga. Sin embargo, si el objetivo es observar la distribución de las masas de forma más precisa, interesará tener un rango de masas mucho menor pero que permita una mayor precisión. Esta representación se consigue con el espectrograma de alta resolución.
Espectrograma de alta resolución.
En este tipo de espectrograma cogeremos un rango de masas mucho más pequeño (de varios Daltons) y agruparemos las masas en grupos de anchura también muy pequeña (de varios miliDaltons). Para hacer más cómoda la representación, aquí se ha optado por representar las masas con grupos de 10 mDa.
La figura 20 muestra un espectrograma de alta resolución (resolución de 10
mDa) para un rango de masas de 5 Da alrededor de la masa/carga 463 Da de la muestra simple. En la figura se observa el aumento de la resolución, lo que permite diferenciar masas separadas poco entre sí.
Figura 20. Ejemplo de espectrograma de alta resolución (10 mDa).
Si hacemos zoom en los rangos de tiempo de retención que nos interesan (en
Tiempo(s)
Masa ion (
Da)
Espectrograma de baja resolucion (1 Da)
785 790 795 800 805 810 815 820460
462
464
466
468
470
1
1.5
2
2.5
3
3.5
4
4.5
5
Tiempo(s)
Masa ion (
Da)
Espectrograma de alta resolucion (10 mDa) centrado en 4.630906e+02 +- 2.50 Da
100 200 300 400 500 600 700 800
461
461.5
462
462.5
463
463.5
464
464.5
465
465.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
4
4.5
5
34
los que sale el ion principal), veremos la gran diferencia que tenemos en este espectrograma con respecto al de baja resolución. Esto se puede observar en la figura 21, donde es inmediato observar que, mientras que antes no sabríamos decir dónde estaba cada masa dentro del rango de 1 Da que teníamos de resolución, ahora sí podemos distinguir cómo se distribuyen las masas alrededor de la masa central de cada ion. Esta información nos será muy útil en la caracterización de los compuestos que haremos más adelante, por lo que este espectrograma nos será también de gran utilidad.
Figura 21. Ejemplo de zoom en un espectrograma de alta resolución (10 mDa).
2.3.4. Colecciones de muestras utilizadas.
En este trabajo se han utilizado dos conjuntos de muestras analizadas por el
Departamento de Química Analítica de la Universidad de Granada.
El primer conjunto es una colección de 30 muestras simples obtenidas
disolviendo en metanol 5 compuestos fenólicos conocidos y disponibles
comercialmente, en cantidades distintas pero conocidas para cada una de las
muestras. El segundo conjunto es una colección de 22 muestras de extractos fenólicos
de aceites de oliva virgen extra, que contienen un número muy elevado de
compuestos en concentraciones, a priori, desconocidas, siendo esta colección de
muestras mucho más compleja que la anterior.
Como anotación se dirá que se usan estos datos pues el estudio de los
polifenoles es muy interesante ya que hay estudios que demuestran que los
polifenoles presentan características muy beneficiosas para la prevención y/o
tratamiento de algunas enfermedades. Entre esas características se encuentran la
actividad antioxidante, antiinflamatoria y anticancerígena (aparte de muchas otras) [15-
17].
Tiempo(s)
Masa ion (
Da)
Espectrograma de alta resolucion (10 mDa) centrado en 4.630906e+02 +- 2.50 Da
760 770 780 790 800 810 820 830 840
463
463.5
464
464.5
465
1
1.5
2
2.5
3
3.5
4
4.5
5
35
2.3.4.1. Colección de muestras de estándares comerciales de polifenoles.
Este conjunto se ha elaborado de forma artificial en el laboratorio y consiste en
30 muestras en las que se diluyen, en metanol (en total habrá 2 mL de metanol por
muestra), 5 estándares distintos de polifenoles. Cada muestra contiene algunos
(excepto la primera que no tiene ninguno) de los estándares en diferentes
concentraciones, de forma que conocemos a priori los compuestos que deberíamos
identificar en cada muestra [7].
Las muestras preparadas en el laboratorio se analizaron mediante
cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas por tiempo de vuelo (LC-
MS/TOF) y los parámetros más importantes del proceso se pueden ver a continuación:
- La cromatografía líquida se ejecutó con un equipo RRLC Agilent 1200 y una
columna Zorbax Eclipse con un diámetro de 4,6 mm, una longitud de 15 cm
y un tamaño de partícula de 1,8 µm. La fase móvil fue inicialmente agua y
acetonitrilo (en una proporción 90:10) y finalmente solo acetonitrilo.
- La interfaz utilizada fue la ionización por electrospray, que ya estaba
equipado en el espectrómetro de masas utilizado. El modo de ionización fue
negativo (se quita un protón), con un capilar de ionización a 4.500 V, una
temperatura de 190ºC, a una presión del gas de 1,5 bar y un flujo de gas de
secado de 7 L/min.
- El espectrómetro de masas usado era el microTOFTM de la empresa Bruker
Daltonik GmbH, que se hizo operar a 1 espectro de línea por segundo. La
calibración inicial de masa se realizó inyectando clusters de formiato de
sodio.
Los estándares de polifenoles usados se pueden ver en la tabla 1.
Identificador Compuesto Fórmula
molecular Masa teórica (Da)
c1 Delfinidina-3-O-
sambubiósido C26H28O16 596,1384
c2 Ácido clorogénico C16H18O9 354,0957
c3 Ácido caféico C9H8O4 180,0429
c4 Quercetina-3-O-
rutinósido C27H30O16 610,1540
c5 Quercetina-3-O-
glucósido C21H20O12 464,0961
Tabla 1. Estándares de polifenoles mezclados en las muestras la colección.
De la tabla 1 cabe destacar que los valores de masa (Da) se refieren a la
molécula del compuesto, sin ionizar. Por lo tanto, dado que la ionización que se aplica
para obtener estos datos es negativa, se perderá un protón de la molécula para
36
ionizarla, lo que conllevará una pérdida de masa igual a la masa del protón
(aproximadamente 1 Da). Por lo tanto, los resultados de masa que obtendremos para
los compuestos que aparecen en la tabla superior, tendrán 1 Dalton menos
(aproximadamente). La concentración de cada compuesto en cada muestra se puede
observar en la tabla 2.
Muestra
Concentración (µg/mL)
c1 c2 c3 c4 c5
1 0 0 0 0 0
2 0 0 1.0 0 0
3 2.0 0 1.0 0 0
4 0 2.0 0 2.0 2.0
5 2.4 1.6 0.4 2.0 0.8
6 4.0 1.6 0.8 1.2 0.4
7 0 0 0 1.0 1.0
8 1.6 1.0 0.6 1.2 1.4
9 2.4 1.0 1.4 0.8 0.6
10 4.0 0 2.0 1.0 1.0
11 2.0 2.0 1.0 0 2.0
12 2.0 2.0 0.8 1.6 1.0
13 0 2.0 0 2.0 2.0
14 4.0 2.0 2.0 2.0 0.4
15 4.0 2.0 2.0 2.0 2.0
16 4.0 2.0 3.0 0 2.0
17 6.0 2.8 2.0 0 3.2
18 6.0 2.0 4.0 1.0 0
19 4.0 3.0 0 4.0 4.0
20 0 3.0 0 4.0 2.0
21 0 0 0 0.4 4.0
22 0 4.0 0 4.0 0.4
23 6.0 3.0 3.0 3.0 3.0
24 6.0 0 3.0 0 0
37
25 4.8 2.0 3.6 3.0 3.0
26 4.8 2.8 2.0 3.2 3.6
27 4.0 0 2.0 4.0 4.0
28 8.0 2.0 4.0 0 0
29 8.0 3.0 4.0 3.0 2.0
30 8.0 4.0 4.0 2.0 2.0
Tabla 2. Concentración de los compuestos en cada muestra.
Para hacernos una idea de cómo es el conjunto de datos, vamos a mostrar el
espectrograma de baja intensidad para varias de ellas.
En la figura 22 se puede ver el espectrograma de la muestra 1, que no contiene
ninguno de los compuestos (ha sido usada como control). Como se puede observar en
dicha figura, no vemos huellas espectrométricas en el espectro pero sí vemos
artefactos químicos durante todo el tiempo de retención. Por lo tanto, ya sabemos lo
que nos encontraremos en las demás muestras aparte de los compuestos que
diluyamos en el metanol.
Figura 22. Espectrograma de baja resolución de la muestra nº 1.
En la figura 23 se puede ver la muestra 4, que tiene los compuestos c2, c4 y c5
en la misma concentración. En esta ocasión observamos perfectamente los 3
compuestos que contiene la muestra, e incluso se puede observar un cuarto
compuesto con 600 segundos de tiempo retención, que puede ser cualquier impureza
debida a uno de los compuestos o un isómero de éstos (misma fórmula molecular pero
distinta estructura y, por tanto, distinto tiempo de retención).
Tiempo(s)
Masa ion (
Da)
Espectrograma de baja resolucion (1 Da)
400 500 600 700 800
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
1
1.5
2
2.5
3
3.5
38
Figura 23. Espectrograma de baja resolución de la muestra nº 4.
Por último, en la figura 24 se observa una muestra que tiene los 5 compuestos
presentes, la muestra 15. En este espectrograma observamos también claramente los
5 compuestos y sus huellas espectrométricas. Además, podemos observar el mismo
compuesto que veíamos en la muestra 3 (el del tiempo de retención de 600 segundos)
y uno bastante más abundante y que tampoco esperábamos, el compuesto que sale a
los, aproximadamente, 411 segundos de tiempo de retención.
Figura 24. Espectrograma de baja resolución de la muestra nº 15.
Tiempo(s)
Masa ion (
Da)
Espectrograma de baja resolucion (1 Da)
400 500 600 700 800
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
1
1.5
2
2.5
3
3.5
4
4.5
5
Tiempo(s)
Masa ion (
Da)
Espectrograma de baja resolucion (1 Da)
400 500 600 700 800
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
1
1.5
2
2.5
3
3.5
4
4.5
5
39
Una vez descrito el conjunto de muestras y observado algunas de ellas,
podemos concluir en que este conjunto de muestras es muy sencillo ya que no hay
coelución entre los compuestos que aparecen, pero nos será muy útil para ir
comprobando que los resultados del método implementado son correctos, y también
nos aportará información muy útil sobre las características de los artefactos químicos.
2.3.4.2. Conjunto de muestras de extractos fenólicos de aceites de oliva virgen extra.
El segundo conjunto que usaremos para este trabajo consistirá en 22 muestras
de extractos fenólicos de aceite de oliva virgen extra, de 5 variedades distintas;
Hojiblanca, Picual, Cornezuelo, Manzanilla y Arbequina. El proceso LC-MS utilizado
fue el mismo que para la muestra anterior (HPLC-ESI-MS/TOF) con las siguientes
especificaciones:
- La cromatografía líquida se ha realizado con un equipo Agilent 1200-RRLC
con una columna Zorbax Eclipse Plus de 4,6 mm de diámetro, 15 cm de
largo y un tamaño de partícula de 1,8 µm. En este caso se usó una fase
móvil inicial de agua ácida con acético (0,25%) y una final de metanol.
- La interfaz ESI operó en modo negativo con una presión del gas
nebulizador de 2 bar con un flujo de 9 L/min. La temperatura del gas de
secado era de 190ºC y se aplicó un potencial de 4.500 V entre la cámara de
nebulización y el capilar.
- El analizador TOF utilizó clusters de formiato sódico para realizar la
calibración inicial de masa antes de analizar cada muestra.
De las 22 muestras, 14 son muestras de extractos fenólicos de aceites de oliva
de alta calidad con un elevado contenido polifenólico, de una sola variedad y de
homogeneidad garantizada, obtenidas en distintas zonas geográficas de la península
ibérica (muestras numeradas de la 1 a la 14). Las otras 8 muestras (numeradas de la
15 a la 22) son extractos fenólicos de aceites de oliva comerciales de las variedades
Picual, Hojiblanca y Arbequina. En la tabla 3 se observan las variedades de cada una
de las muestras [7].
Muestra Variedad
1 Hojiblanca
2 Picual
3 Cornezuelo
4 Picual
5 Picual
6 Picual
7 Picual
40
8 Manzanilla
9 Hojiblanca
10 Picual
11 Picual
12 Arbequina
13 Arbequina
14 Arbequina
15 Picual
16 Picual
17 Arbequina
18 Arbequina
19 Hojiblanca
20 Hojiblanca
21 Hojiblanca
22 Picual
Tabla 3. Variedades de las muestras de aceite de oliva.
En la figura 25 se puede ver el espectrograma de baja resolución (1 Da) de la
muestra 1 de aceite.
Figura 25. Espectrograma de baja resolución de la muestra nº 1.
Tiempo(s)
Masa ion (
Da)
Espectrograma de baja resolucion (1 Da)
200 400 600 800 1000 1200 1400
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
1
1.5
2
2.5
3
3.5
4
4.5
5
5.5
41
Cabe destacar que, como comentaremos en la sección “Preprocesado de los
datos”, todas las imágenes mostradas hasta el momento (ésta incluida) han sido
preprocesadas (quitado ruido y acotado rango de tiempos) para que se vean más
“limpias”.
En cuanto al espectrograma de la muestra, podemos observar que esta
muestra es mucho más compleja que las que hay en el conjunto de matrices de
estándares, ya que tiene muchos más compuestos que salen muy próximos los unos
de los otros. Por lo tanto, para hacernos una idea más general de esta muestra,
podemos observar el cromatograma de ion total en la figura 26. Al principio del tiempo
de retención apenas salen compuestos (aparte de la calibración inicial de masa),
mientras que pasados los, aproximadamente, 700 segundos, empiezan a salir muchos
compuestos y algunos coeluyen con los otros.
Figura 26. Cromatograma de ion total de la muestra 1 de la colección de aceites.
2.3.5. Estudio de la respuesta instrumental a los compuestos.
Anteriormente se dijo que los compuestos salen de la columna cromatográfica formando una distribución aproximadamente gaussiana, ya que el propio compuesto se dispersa en el transcurso del proceso cromatográfico. Sin embargo, sería un error pensar que un compuesto se caracteriza únicamente por un pico cromatográfico en la masa del ion de dicho compuesto, ya que la estructura de la molécula del compuesto y la forma de ionizarlo, hace que un compuesto se vea representado por multitud de picos cromatográficos correspondientes a los iones asociados al compuesto (o especies iónicas del compuesto), pero siempre en el mismo rango de tiempos de retención. Las variantes isotópicas, fragmentos y clusters del ion principal (ion de la molécula que forma el compuesto), forman un conjunto de picos cromatográficos provenientes del mismo compuesto (de la misma molécula) conocido como huella espectrométrica del compuesto, y cada uno de dichos picos cromatográficos a distintas masas, se puede denominar como línea de la huella espectrométrica o especie iónica del compuesto.
2.3.5.1. Huella espectrométrica de un compuesto.
A continuación se van a explicar los distintos procesos que forman la huella espectrométrica de un compuesto.
0 200 400 600 800 1000 1200 1400 16000
0.5
1
1.5
2
2.5x 10
6
Tiempo (s)
Inte
nsid
ad
Cromatograma de ion total
42
Patrón de fragmentación.
En primer lugar pensemos en una molécula, que estará formada por átomos
con una serie de enlaces entre ellos. Por ejemplo, la estructura que observamos en la
figura 27 es de un compuesto polifenólico presente en el aceite de oliva (y por tanto en
muestras que analizaremos en este trabajo), la oleuropeína aglicona.
Figura 27. Estructura molecular de la oleuropeína aglicona.
Cuando ionizamos los compuestos que salen de la columna separativa (en el
caso de los datos de este trabajo ha sido ionización por electrospray), estamos
aplicando un potencial eléctrico suficiente, para que la ionización sea eficiente, al
compuesto y a las moléculas que lo componen, lo que hace que no sólo se ionice, sino
que también se puedan romper enlaces de los iones que den lugar a otros iones
resultantes de la fragmentación de la molécula. Este proceso se conoce como
fragmentación y los iones obtenidos por rotura de enlaces de un ion se conocen como
fragmentos, siendo siempre de masa menor el ion original (sin fragmentar).
Por lo tanto, cuanto mayor sea el potencial eléctrico que usemos para ionizar
un compuesto, mayor será el número de fragmentos que nos encontraremos en el
espectrograma.
Sin embargo, el proceso de ionización usado (ESI) está dentro de los que se
conocen como “blandos”, pues no provoca demasiadas fragmentaciones, en el
espectrograma de la muestra podemos observar varios iones que podrían ser
fragmentos del ion principal. Para mostrar de forma experimental este suceso, se va a
representar la intensidad en función de la relación masa/carga para un periodo de
tiempo estrecho, con lo que veremos qué intensidades hay en cada masa y nos
servirán para identificar posibles fragmentos. Si se usa una muestra compleja de
aceite, podemos representar la intensidad que hay para cada masa en un intervalo de
tiempos pequeño alrededor del ion más abundante de la muestra, como se observa en
la figura 28. Considerando que el ion más abundante tiene una masa de 377,1 Da
(redondeando a la primera cifra decimal), entonces podemos considerar que alguna de
las agrupaciones iónicas (picos debidos a los iones de una misma especie iónica) que
tienen menor masa sean fragmentos de este ion más abundante, aunque a priori no
habría forma de saberlo porque también pueden ser artefactos químicos asociados a
las fases fija o móvil de la columna separativa, u otros iones que coeluyen con el más
abundante. Sin embargo, este ejemplo permite observar la idea de que un ion tendrá
siempre un conjunto de iones de masas menores asociados a dicho ion por ser
fragmentos de su molécula.
43
Figura 28. Intensidad en función de la masa para un rango de tiempos concretos.
Algo interesante a tener en cuenta es que, si la molécula se rompe fácilmente
con la ionización y se aplican condiciones duras de ionización, es posible que el ion
más abundante de un compuesto sea un fragmento del ion principal, y que el ion
principal sea mucho menos abundante que sus fragmentos.
De los fragmentos nos interesará que, si analizamos un compuesto varias
veces bajo las mismas condiciones de análisis, posiblemente el compuesto salga en
instantes distintos de tiempos de retención (desalineamiento de tiempo de retención) o
se calcule un valor de masa ligeramente distinto (desalineamiento de relación
masa/carga), pero lo que se mantendrá aproximadamente será la forma en la que un
ion se fragmenta. A la forma de fragmentarse de un compuesto, es decir qué masa
tienen sus los fragmentos y qué abundancia relativa tienen en comparación con el ion
principal, es lo que se conoce como patrón de fragmentación, y puede ser usado para
identificar compuestos iguales en muestras distintas.
Formación de clusters.
En algunas ocasiones los fragmentos se pueden enlazar entre sí o con el ion
del que provienen, creando un nuevo ion que puede ser de tamaño mayor que el ion
original y que también aparecerá en el espectro de masas. Estos nuevos iones
formados por otros iones (ya sean fragmentos o el ion original) se conocen como
clusters, ya que se entienden como una “agrupación” de iones. También sería un
cluster la unión entre dos o más iones principales (sin fragmentar), como es
precisamente el caso del cluster que se observa en la figura 21 en la masa,
aproximadamente, 755,25 Da. Estos últimos clusters se conocen como dímeros (unión
de dos iones principales), trímeros (unión de tres iones principales), etc.
Variantes isotópicas.
Una molécula está formada por distintos átomos de varios elementos (carbono,
hidrógeno, oxígeno, etc.). Cada átomo (por ejemplo, cada hidrógeno de la molécula)
0 100 200 300 400 500 600 700 800 9000
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
1.4
1.6
1.8
2x 10
6
X: 377.1
Y: 1.816e+06
Masa (Da)
Inte
nsid
ad
Cromatograma centrado en tiempo (1253.398 +- 2.0000) segundos
X: 307.1
Y: 5.334e+05X: 275.1
Y: 4.74e+05
X: 195.1
Y: 7.693e+04
X: 345.1
Y: 2.034e+05
X: 149
Y: 2.057e+05
44
puede ser cualquiera de los isótopos de elemento (por ejemplo, si es hidrógeno, puede
ser protio o deuterio) de acuerdo con las abundancias isotópicas del elemento. La
masa de cada isótopo es distinta (por ejemplo, el protio tiene una masa de 1,007825
umas y el deuterio una masa de 2,0141018 umas) de modo que la masa del ion
depende de la masa de los átomos que lo forman y de las formas isotópicas en las que
se presenten estos átomos.
Los átomos de un elemento pueden ser un isótopo u otro según una
probabilidad de abundancia de cada isótopo. Por ejemplo, el carbono-12
(representado como 12C) es el más abundante de los isótopos del carbono, pues tiene
una abundancia del 98,93% en la naturaleza, mientras que el carbono-13 (13C)
únicamente tiene una abundancia del 1,07%. Es decir, el 98,93% de los átomos de
carbono encontrados en la naturaleza son isótopos 12C mientras que el 1,07% de los
átomos de carbono en la naturaleza son isótopos 13C.
A partir de las abundancias relativas de los isótopos y la fórmula molecular, se
puede calcular la probabilidad de encontrar una cantidad determinada de isótopos en
la molécula (por ejemplo, la probabilidad de encontrar un deuterio en vez de un protio
en una molécula con 15 átomos de hidrógeno).
Para comprender este hecho se puede observar un ejemplo; la molécula
oleuropeína, un tipo de compuesto fenólico, tiene la siguiente fórmula molecular:
Es decir, está formada por 25 átomos de carbono, 32 átomos de hidrógeno y
13 átomos de oxígeno. Podríamos calcular la masa atómica de la molécula, pero para
ello habría que suponer que todos los átomos presentes en la molécula corresponden
al isótopo principal de ese elemento, lo que posiblemente no sea cierto. Si suponemos
que cada átomo es el isótopo más abundante de su elemento, entonces el cálculo
sería (aproximadamente):
Sin embargo, hay que tener en cuenta la probabilidad de que alguno de los
átomos sea un isótopo poco abundante, por lo que cambiaría la masa. Teniendo en
cuenta que la probabilidad de tener un número determinado de isótopos en un número
determinado de átomos del elemento, depende del número de átomos, isótopos y la
probabilidad del isótopo, entonces se puede calcular la probabilidad binomial como
sigue:
(
) ( )
, donde M es el número de átomos del elemento, N es el número de isótopos en los M
átomos y p es la probabilidad de encontrar el isótopo en un átomo (abundancia del
isótopo en la naturaleza).
Por lo tanto, se puede calcular la probabilidad de tener algún átomo de un
isótopo poco abundante. Por ejemplo, si tenemos 25 carbonos, la probabilidad de que
un carbono sea 12C es 98,93% y la probabilidad de que sea 13C es 1,07%, entonces la
45
probabilidad de encontrar un isótopo 13C en los 25 carbonos, se puede calcular como
sigue:
(
) ( )
Cabe destacar que la probabilidad no es despreciable, ya que es prácticamente
del 21%. En el caso de un número de átomos mayor, por ejemplo 100, podemos
calcular la probabilidad de que ninguno de los átomos sea un isótopo poco abundante:
(
) ( )
En este caso, es poco probable que todos los átomos sean el isótopo principal,
por lo que encontraríamos más abundancia de la variante isotópica, que de la
molécula formada por los isótopos principales de cada elemento. Por lo tanto, cuanto
mayor sea el número de átomos de una molécula, más probabilidad habrá de que
alguno de los átomos sea un isótopo poco abundante, por lo que será más probable
que la relación masa/carga más abundante que mida el espectrómetro de masas, sea
la de una variante isotópica de la molécula principal. Esto no ocurrirá en este trabajo,
ya que las moléculas ionizadas son ligeras, pero sí ocurre habitualmente en el estudio
de proteínas (proteómica).
Las variantes isotópicas se diferencian entre sí por una masa de,
aproximadamente, 1 uma, pero este valor realmente varía en función del isótopo de
cada elemento (por ejemplo entre 12C y 13C hay diferencia de 1,003355 uma, mientras
que entre 16O y 17O hay una diferencia de 1,0042 uma). Sin embargo, la diferencia está
en unos pocos mDa, por lo que el analizador de masas no tendrá resolución suficiente
para resolver esas masas, por lo que aparecen esas variantes isotópicas en la misma
masa.
Por lo tanto, cuando hablamos de variantes isotópicas de una molécula,
estamos referenciando el hecho de que alguno de sus átomos sea un isótopo poco
abundante, por lo que la masa de la variante isotópica será distinta de la masa de la
molécula original. Teniendo en cuenta que las variantes isotópicas tienen una
diferencia de masa de, aproximadamente, 1 uma, la diferencia de relación masa/carga
será también de 1 Da (cuando la ionización sea simple, únicamente arrancando un
protón de la molécula). Por lo tanto, en el espectrograma veremos especies isotópicas
que se distancian entre sí, aproximadamente, 1 Da (o menos si la ionización es
múltiple, como se explicará más adelante). En la figura 29 se puede observar las
variantes isotópicas asociadas a un ion con masa 463,1 Da. Si nos fijamos en el eje Y
(la relación masa/carga en Daltons) podemos observar que los isótopos están
separados aproximadamente 1 Dalton entre sí, lo que coincide con lo que hemos
explicado anteriormente. El número de variantes isotópicas que se pueden observar
en todo el espectrograma, para cada ion principal, depende de su abundancia y de la
probabilidad de aparición de variantes isotópicas.
46
Figura 29. Ejemplo de variantes isotópicas en un espectrograma de alta resolución (10 mDa).
En este trabajo no se tendrá en cuenta si el ion más abundante de un
compuesto es el ion principal, sino que simplemente se obtendrán las variantes
isotópicas al obtener la huella espectrométrica de un compuesto.
Llegados a este punto ya podemos concluir en que, cuando observemos iones
saliendo en el mismo instante de tiempo y que estén separados por una relación
masa/carga de aproximadamente 1 Dalton (dado que la ionización usada produce
pocas ionizaciones múltiples), es prácticamente seguro que ambos iones sean
variantes isotópicas del mismo ion. Además, hay que tener en cuenta que habrá
variantes isotópicas tanto del ion principal, como de sus fragmentos y clusters.
Ionización múltiple.
En el proceso de ionización se dijo que el número de cargas que adquiría un
ion no es un proceso determinista, sino que dependía de las condiciones de ionización
(más concretamente de los potenciales eléctricos aplicados y condiciones del
electrospray) y de la propia naturaleza del compuesto. Por lo tanto, los iones podrán
estar cargados con una o varias cargas. Siendo así, recordemos que lo que se mide
en el espectrómetro de masas no es la masa del ion, sino la relación masa/carga
(m/z), que depende del número de cargas que tenga el ion. Así pues, un ion con masa
200 Da, si únicamente tiene una carga seguirá teniendo 200 Da al medirlo en el
espectrómetro de masas. Sin embargo, si ese ion está doblemente ionizado (dos
cargas), entonces la relación masa/carga se reducirá a la mitad. Es decir, cuanto
mayor sea el número de cargas del ion, menor será la relación masa/carga que
registramos en el espectrómetro.
Por lo tanto, si lo más habitual es que la molécula sea ionizada con una sola
carga, entonces tendremos más abundancia en la relación masa/carga del ion
principal, pero encontraremos también cierta abundancia en el resto de posibilidades.
X: 799 Y: 465.1
Index: 4.035
RGB: 1, 0.625, 0
Tiempo(s)
Masa ion (
Da)
Espectrograma de alta resolucion (10 mDa) centrado en 4.630906e+02 +- 2.50 Da
X: 799 Y: 464.1
Index: 4.701
RGB: 1, 0, 0
X: 799 Y: 463.1
Index: 5.257
RGB: 0.5, 0, 0
780 790 800 810 820 830 840
463
463.5
464
464.5
465
1
1.5
2
2.5
3
3.5
4
4.5
5
47
Cuanto más duras sean las condiciones de ionización, más iones con múltiple
ionización aparecerán, por lo que cuanto más abundante sea el ion principal, más
abundantes serán los iones debidos a múltiples ionizaciones.
Anteriormente dijimos que las variantes isotópicas de un ion suelen estar
separadas por, aproximadamente, 1 Da, lo cual es cierto siempre que el ion tenga
únicamente una carga. Si el ion tiene más de una carga, entonces la variante isotópica
estará separada por menos de 1 Da, en proporción al número de cargas. Esto se
puede observar en la tabla 4.
Número de cargas (z) Relación m/z (Da) del ion principal
según el número de cargas
Relación m/z (Da) de la variante
isotópica a 1 uma
(aproximadamente).
1
2
k
Tabla 4. Ejemplo de las masas de los iones al producirse ionización múltiple.
Es decir, la ionización múltiple con k cargas, da lugar a un ion con relación
masa/carga igual a , donde “m” sería la masa del ion con una sola carga. A su
vez, los isótopos de una ionización múltiple con k cargas, están separados entre sí a
una distancia de, aproximadamente, 1/k Da, siendo “1 Da” la separación más habitual
entre isótopos de un elemento (es decir, la separación con la ionización con una
carga).
En la figura 30 se pueden ver las huellas espectrométricas de los siete
compuestos que se pueden apreciar en el espectrograma de baja resolución de la
muestra simple. Cada rectángulo amarillo delimita de forma aproximada la parte más
importante de la huella espectrométrica, aunque sabemos que dicha huella se forma
por procesos estadísticos, por lo que seguramente alguna parte menos visible o
tapada por otro compuesto (o ruido), también formará parte de la huella
espectrométrica. En el espectrograma también se pueden observar iones que salen de
forma continua en una determinada relación masa/carga, y que se “cruzan” en la
mayoría de las ocasiones con las huella espectrométricas de los compuestos. Estos
iones están asociados a lo que hemos conocido como artefactos químicos, que se
deben a las fases móvil o estacionaria de la columna separativa. El motivo de que
salgan de forma continua es que la fase móvil saldrá de la columna separativa de
forma continua, por lo que sus iones también serán analizados. También hay que tener
en cuenta que la fase móvil y la propia muestra pueden arrastrar partículas de la fase
estacionaria, por lo que salen de forma continua en varias masas. Aunque estos
artefactos químicos realmente son compuestos, nosotros los consideraremos como
ruido, ya que no nos aportan ninguna información y únicamente nos ocultan
información de interés.
48
Figura 30. Espectrograma de baja resolución (1 Da) de una muestra de la colección de matrices de estándares de polifenoles. Las huellas espectrométricas están marcadas con un rectángulo.
Una vez analizados los componentes que podemos observar en la huella
espectrométrica de un compuesto (ion principal, fragmentos, clusters y las variantes
isotópicas de todos ellos), cabe destacar que la importancia de una huella
espectrométrica es que, si un compuesto se analiza con los mismos parámetros
(mismas fases de cromatografía, potenciales eléctricos aplicados, etc.) en
experimentos separados, generalmente ocurrirá un problema de difícil solución, que es
el desalineamiento temporal (el mismo compuesto sale en distintos tiempos de
retención en las distintas muestras) y de masa (el mismo ion aparece con una masa
ligeramente distinta). Sin embargo, si nosotros sabemos la huella espectrométrica de
un compuesto, y vemos que en una muestra encontramos un compuesto con
prácticamente la misma huella espectrométrica (a pesar del desalineamiento en masa
y en tiempo), entonces podemos identificar ambos compuestos y cuantificar el
desalineamiento temporal y de masas que hay entre las muestras. Esta idea se utiliza
en uno de los métodos propuestos en este trabajo, que consiste en agrupar los
compuestos de varias muestras comparando sus huellas espectrométricas.
2.3.5.2. Pico cromatográfico asociado a la salida de un ion.
Anteriormente se analizó por qué se produce y cómo es la huella
espectrométrica que aparece por un compuesto, por lo que ahora nos vamos a fijar en
cómo sale de la columna cromatográfica cada compuesto, lo que nos será de gran
ayuda más adelante. Por lo tanto, en este apartado se va a analizar la forma
cromatográfica (intensidad en función del tiempo de retención) que tiene un ion de un
compuesto (entiéndase que forme parte de la huella espectrométrica de un
compuesto). Esto nos servirá para poder generalizar cómo deben ser los picos
cromatográficos del ion de un compuesto, lo que será muy útil para utilizar distintos
umbrales a la hora de caracterizar los compuestos presentes en una muestra.
49
En primer lugar pensemos en el paso de la muestra por la columna
cromatográfica, donde sus compuestos se separan los unos de los otros ya que unos
son retenidos más por la fase estacionaria, y otros tienden a ser arrastrados por la
fase móvil, por afinidad hacia ella. Sin embargo, un mismo compuesto no va a salir de
la columna cromatográfica exactamente en el mismo segundo, ya que hay que tener
en cuenta que las moléculas del compuesto se irán separando las unas de las otras a
medida que pasa el compuesto por la columna separativa, ya que tienden a
distribuirse de forma uniforme por todo el volumen que puedan. Finalmente, la
concentración de cada compuesto en función del tiempo de retención seguirá
aproximadamente una distribución gaussiana, ya que habrá una pequeña porción de la
muestra que recorrerá más rápido la columna separativa, y otra porción de la muestra
que recorrerá más despacio dicha columna. La anchura de la gaussiana vendrá dada
por la dispersión que se produce en las moléculas del mismo compuesto al atravesar
la columna separativa, que será únicamente variable según algunos parámetros con
los que se configure la columna cromatográfica, como son las fases usadas (móvil y
estacionaria), la longitud y diámetro de la columna separativa, el tratamiento previo de
la muestra, temperatura, presiones y flujos de la fase móvil.
En cualquier estudio interesará siempre que el compuesto salga con la menor
anchura posible (para optimizar la resolución cromatográfica y minimizar la
probabilidad de coelución), con lo que se conseguirá además la mayor altura posible
(siendo así fácilmente diferenciable del resto). Sin embargo, dado que la anchura de la
gaussiana dependerá únicamente del proceso cromatográfico, no podemos saber a
priori la anchura ni altura que tendrá un compuesto, tenga la concentración que tenga,
aunque sí podemos estimar unos rangos lógicos en los que estará comprendida la
anchura de la gaussiana.
Algo que será clave en este trabajo, es que la forma en la que sale cada línea
de la huella espectrométrica de un compuesto (entendiendo como “línea” a una
variante isotópica, fragmento o clúster del ion principal) ha de ser idéntica a la del resto
del compuesto. Es fácil llegar a esta conclusión ya que la abundancia de cada línea de
la huella espectrométrica depende directamente de la abundancia del ion principal del
compuesto, por lo que normalizando su abundancia, veremos que obtenemos la
misma forma cromatográfica en todos los iones que forman la huella espectrométrica
del compuesto. Idealmente serán iguales, pero en la práctica la presencia de ruido
estadístico, iónico e instrumental, hará que el perfil cromatográfico varíe entre las
especies iónicas del mismo compuesto, lo que conllevará el establecimiento de
umbrales de distancia entre perfiles cromatográficos, lo que se discutirá en la
implementación del método.
En la figura 31 se muestra cómo sale de la columna cromatográfica el ion más
abundante de una muestra simple (mezcla de estándares). Para ver cómo sale, no hay
más que hacer un cromatograma de ion extraído alrededor de su relación masa/carga.
En primer lugar hay que fijarse en la gran altura que tiene el pico cromatográfico
principal y la rapidez con la que sale de la columna cromatográfica, ya que la anchura
del pico es de, aproximadamente, 18 segundos.
50
Figura 31. Cromatograma de ion extraído de la muestra 15 de la colección de matrices alrededor de la masa 463,091 Da.
Si se representa ahora el compuesto que sale aproximadamente en 191 Da, se
obtiene la representación de la figura 32. En este caso se puede observar que la
anchura del pico más grande es de aproximadamente 24 segundos, y el pico pequeño
tiene una anchura aproximada de 13,1 segundos. Sin embargo, al realizar estas
“medidas” de tiempo, hay que tener en cuenta que estoy cogiendo el punto en el que
el pico sobresale del fondo de ruido, por lo que esto será únicamente una
aproximación intuitiva a la forma y anchura de los picos.
300 400 500 600 700 800 9000
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
1.4
1.6
1.8
2x 10
5
X: 791.9
Y: 5556
Tiempo (s)
inte
nsid
ad
Cromatograma de ion extraído en el rango de masas (463.091 +- 0.0125) Da
X: 809.9
Y: 4688
X: 798.9
Y: 1.809e+05
51
Figura 32. Cromatograma de ion extraído de la muestra 15 de la colección de matrices alrededor de la masa 191 Da.
En la figura 33 se puede observar una línea de la huella espectrométrica del
compuesto que sale en 498,8 segundos del tiempo de retención y la del compuesto
que sale en el tiempo de retención 600 segundos. Las líneas estás situadas alrededor
de la masa 375 Da. En este caso la anchura del pico más grande es de,
aproximadamente, 24 segundos (al igual que ocurría con el ion principal del
compuesto), y el del pico menos abundante es de, aproximadamente, 14,1 segundos.
Figura 33. Cromatograma de ion extraído de la muestra 15 de la colección de matrices alrededor de la masa 375 Da.
Algo que interesa notar de las figuras 32 y 33, es que los dos picos centrados
en 498,9 segundos, tienen una forma prácticamente igual, lo que ocurre también con
los picos dos centrados en 598 segundos. Esto ocurre porque son iones que
pertenecen a la huella espectrométrica del mismo compuesto, por lo que tienen una
forma cromatográfica prácticamente igual (ya que no dependen del proceso de
300 400 500 600 700 800 9000
1
2
3
4
5
6
7x 10
4
X: 486.9
Y: 2568
Tiempo (s)
inte
nsid
ad
Cromatograma de ion extraído en el rango de masas (191.000 +- 0.2500) Da
X: 510.9
Y: 2316X: 592.2
Y: 2068X: 605.3
Y: 1800
X: 498.9
Y: 6.901e+04
300 400 500 600 700 800 9000
2000
4000
6000
8000
10000
12000
14000
16000
18000
X: 486.9
Y: 896
Tiempo (s)
inte
nsid
ad
Cromatograma de ion extraído en el rango de masas (375.000 +- 0.2500) Da
X: 510.9
Y: 652
X: 591.2
Y: 720X: 605.3
Y: 552
52
ionización, sino del proceso cromatográfico). Sin embargo podemos observar, sobre
todo en el pico centrado en 598 segundos, que el pico del ion más abundante (el de la
primera figura) está menos afectado por el ruido (al ser su intensidad mayor, su SNR
es también mayor) que el ion menos abundante. Esto se debe a que el pico
correspondiente al ion menos abundante tiene una intensidad media muchísimo menor
que la que tiene el ion más abundante, por lo que el fondo de ruido que hay en ambos
casos se hace mucho más comparable con el pico más pequeño (baja SNR) que con
el pico más grande (alta SNR), provocando los cambios de alta frecuencia que
observamos en la forma del pico de menor altura.
El perfil cromatográfico depende de las condiciones cromatográficas y de los
procesos de retención (que son procesos mecano-estadísticos). Variaciones en las
condiciones cromatográficas causan variaciones en los perfiles cromatográficos.
Cuando se analiza una colección de muestras, las fluctuaciones en las condiciones
cromatográficas dan lugar a desalineamientos entre los mismos compuestos en las
distintas muestras. Un ejemplo del desalineamiento temporal entre muestras de la
colección de matrices de estándares se puede observar en la figura 34, donde se
observa los cromatogramas de pico base (de ambas muestras) alrededor del mismo
compuesto y se puede observar que está desplazado dos scans. Una de las
aplicaciones potencial de la herramienta implementada en este trabajo será realizar el
alineamiento temporal entre compuestos de la misma muestra, ya que la forma de
caracterizar cada compuesto que se usa en esta herramienta, permite realizar el
alineamiento temporal entre los compuestos de una forma relativamente sencilla en
comparación con los métodos que se usan actualmente.
Figura 34. Cromatogramas de pico base acotado entre 470 y 530 segundos para dos muestras simples.
2.3.5.3. Masas asociadas a un pico cromatográfico y dispersión de las masas.
Una vez que se ha observado la forma típica de los picos cromatográficos y se
ha comentado el problema de los cambios de alta frecuencia debidos al ruido, se va a
470 480 490 500 510 520 5300
2
4
6
8x 10
4
X: 498.9
Y: 6.881e+04
Tiempo (s)
Inte
nsid
ad
Cromatograma de pico base
470 480 490 500 510 520 5300
5
10
15x 10
4
X: 500.9
Y: 1.161e+05
Tiempo (s)
Inte
nsid
ad
Cromatograma de pico base
53
pasar a analizar la dispersión de las masas asociadas a un mismo ion, lo que será de
gran ayuda en las implementaciones posteriores. Para ello, en la figura 35 se observa
un espectrograma de alta resolución (10 mDa) centrado en la masa del ion más
abundante de una muestra simple (mezcla de estándares).
Figura 35. Espectrograma de alta resolución (10 mDa) centrado en la masa 463,09 Da.
Teniendo en cuenta que la escala de colores indica que las zonas de rojo
intenso presentan mayor intensidad iónica, y conforme el color tienda al azul se indica
una menor intensidad iónica, podemos observar que la zona con gran intensidad
iónica tiene las masas más agrupadas (con menos diferencia entre ellas), mientras
que conforme la intensidad iónica baja, las masas presentan una mayor dispersión.
Esto se puede observar mejor representando la relación masa/carga en función del
tiempo de retención, y viendo el mismo rango pero con mucha más precisión, como se
observa en la figura 36.
Figura 36. Entradas de masa en función del tiempo.
Tiempo(s)
Masa ion (
Da)
Espectrograma de alta resolucion (10 mDa) centrado en 4.630906e+02 +- 0.50 Da
760 770 780 790 800 810 820 830 840
463.05
463.06
463.07
463.08
463.09
463.1
463.11
463.12
463.13
1
1.5
2
2.5
3
3.5
4
4.5
5
780 790 800 810 820 830 840
463.06
463.07
463.08
463.09
463.1
463.11
463.12
X: 798.9
Y: 463.1
Tiempo(s)
Masa/c
arg
a (
Da)
54
En la imagen observamos que los valores más intensos, es decir los que están
más cerca de la entrada que indica el marcador (donde está el máximo de intensidad),
están muy cerca en masa al valor de m/z que marca el máximo, mientras que
conforme la intensidad disminuye, las relaciones m/z presentan fluctuaciones bruscas.
Esto se debe a que, como se dijo en el fundamento teórico del analizador por tiempo
de vuelo, la relación masa/carga se calcula en función del tiempo de vuelo del ion en el
tubo de vacío, lo que será un proceso estadístico ya que los iones sufrirán una serie
de perturbaciones (velocidad inicial, choque con otros iones, etc.) que harán que el
tiempo de vuelo medido varíe un poco, variando con él la relación masa/carga que se
calcula. Al ser el tiempo de vuelo un proceso estadístico, cuando muchos iones
contribuyen a la medida de la masa, la incertidumbre es menor y el valor promedio de
la m/z se aproxima más al valor exacto y fluctúa poco. Sin embargo, si son pocos los
iones que contribuyen a la medida de la masa, la incertidumbre es mayor y el valor
experimental de m/z fluctúa más, desviándose algunos mDa del valor teórico exacto.
Este tipo de fluctuaciones asociadas al número de partículas que intervienen en una
medida, constituyen lo que se conoce como ruido estadístico.
Observando los datos que tenemos, vemos que cuando el pico cromatográfico
tiene mucha intensidad iónica (y por tanto la varianza de sus relaciones m/z es muy
pequeña), la diferencia máxima entre los picos es aproximadamente la resolución del
detector por tiempo de vuelo, es decir de unos pocos miliDaltons (aprox. 3 mDa). Sin
embargo, cuando la intensidad decrece (y la varianza de las relaciones m/z aumenta),
los cambios máximos entre masas que encontramos rondan los 15-20 mDa. Cuando la
intensidad es muy pequeña y nos acercamos al límite de detección (la varianza de las
relaciones m/z es muy grande), encontramos saltos mucho mayores de masas, que
pueden rondar los 50 mDa.
Una vez que se ha observado la forma de las masas en un pico cromatográfico,
se van a comentar los procesos más importantes que provocan esta dispersión,
aunque algunos ya han sido mencionados anteriormente:
Condiciones iniciales distintas antes de recorrer el tubo de vuelo.
Como se comentó cuando se explicó el espectrómetro de masas por tiempo de
vuelo, cada ion tiene una condición inicial (velocidad y posición) distinta del resto, lo
que hace que tarden tiempos distintos en recorrer el tiempo de vuelo aunque tengan
exactamente la misma masa. Esta dispersión se reduce con la incorporación del
reflectrón, pero sigue siendo un motivo importante de dispersión en la medida de la
masa.
Otra solución que se plantea es aumentar mucho el campo eléctrico que los
impulsa a recorrer el tubo de vuelo, ya que de esa forma las diferencias relativas de
las energías iniciales con la provoca por el campo, es mucho mayor, de forma que la
diferencia en los tiempos de vuelo se reduce también disminuyendo, por tanto, la
dispersión entre las masas de los iones de igual masa. Sin embargo, aumentar el
potencial eléctrico implicará un tiempo de vuelo menor por lo que, aunque la dispersión
de tiempos de vuelo también sería menor, se necesitaría una frecuencia de muestreo
muy alta que haría que la respuesta impulsiva del detector empeorase, por lo que se
implementa una solución de compromiso entre ambas situaciones.
55
Interacción entre los iones al recorrer el tubo de vuelo.
Una vez que los iones están recorriendo el tubo de vuelo, las interacciones entre
ellos mismos hacen que algunos vayan más rápidos o más lentos, o incluso que
algunos de ellos no lleguen nunca al detector. Con el uso de micro-scans se reduce
bastante este problema, ya que habría pocos iones recorriendo el tubo de vuelo al
mismo tiempo y, por tanto, interferirán menos los unos con los otros.
Ancho de banda del detector.
También hay que tener en cuenta que el ancho de banda del detector no es
infinito, por lo que la llegada de un ion al detector supondrá una medida que no será
una delta de Dirac y, por tanto, no se medirá un único valor discreto de tiempo de
vuelo (o masa), sino que será una medida analógica de la intensidad en función del
tiempo de vuelo con una anchura determinada. Además, si llegan varios iones al
detector al mismo tiempo de retención y con tiempos de vuelo muy cercanos (por la
dispersión que haya ocurrido antes), sus salidas se sumarán y se obtendrá una mayor
dispersión de masa. Por lo tanto, el ancho de banda del detector también provoca que
la medida de la masa de un ion tenga más dispersión.
Cambio de presión y temperatura en el sistema de control.
Hay que tener en cuenta que el análisis de la muestra puede durar muchos
minutos o incluso horas, por lo que es normal que la temperatura de la habitación
donde se realiza el análisis cambie y lógicamente que cambie la temperatura de los
instrumentos de medida y de control. Si consideramos además que el proceso y la
medida de tiempo de vuelo viene proporcionada por un sistema de control que
gestiona todo el proceso de forma síncrona, es lógico comprender que, con los
cambios de presión y temperatura, los relojes que tenga el sistema de control sufrirán
desviaciones de precisión a lo largo del proceso, por lo que es habitual que las
medidas de masa no sean igual de precisas al principio y al final del proceso.
Para solucionar el problema de la dispersión inicial de masa, se introduce al
principio del análisis un conjunto de compuestos de masa conocida que calibren la
medida de masa. Sin embargo, los cambios de temperatura y presión a lo largo del
proceso harán que las medidas de masa no sean las mismas al final del análisis. Por
ejemplo, si se detecta una masa de 201,001 Da de un ion al principio del análisis (tras
la calibración), puede que al final del análisis se obtenga una masa de 201,005 Da
(varios miliDaltons de diferencia). Tanto esta variación de las medidas en el mismo
análisis, como la variación con otro análisis distinto, hace que dos compuestos no
tengan por qué tener exactamente la misma masa en ambos análisis (o en momento
distintos del mismo), lo que se conoce como descalibración en masa.
2.3.5.4. Supresión iónica.
La supresión iónica consiste en que la abundancia de un compuesto apantalle la ionización sobre otro compuesto menos abundante. Es decir, cuando un compuesto sale de forma muy abundante (mucha intensidad iónica) en un tiempo de retención, otros compuestos menos abundantes tendrán mucha menos intensidad de lo que deberían tener, lo que se conoce como supresión iónica. La supresión iónica se produce en el proceso de ionización (en este caso ha sido el ESI), ya que cuando la
56
muestra sale del capilar (que viene de la cromatografía líquida) y forma una nebulosa, esta nebulosa se ioniza gracias a la presencia del gas seco y del potencial eléctrico aplicado, como se explicó en su momento. Sin embargo, si hay dos compuestos ionizándose al mismo tiempo, el más abundante de los compuestos recibirá la mayor parte de la energía para ionizarse, por lo que el otro compuesto tendrá menos probabilidad de ionizarse y, por tanto, su intensidad iónica se reducirá mucho.
En el cromatograma de ion extraído que se muestra en la parte superior de la
figura 37 se pueden observar 5 sustracciones iónicas muy evidentes, en los tiempos de retención siguientes: 376 segundos, 500 segundos, 634 segundos, 742,7 segundos y 798,9 segundos. Si nos fijamos en la parte inferior de la misma figura, vemos un cromatograma de pico base donde se observa claramente que las supresiones iónicas coinciden con compuestos muy abundantes.
Figura 37. Cromatograma de ion extraído (imagen superior) y de pico base (imagen inferior).
2.4. Consecuencias del paso de espectro suma a espectro de línea. Debido a la gran cantidad de datos que proporciona cada micro-scan, una vez
sumados todos los micro-scans en un espectro suma se hace absolutamente
necesario reducir el volumen de datos, por lo que, tras filtrar paso baja para suavizar
cambios bruscos, se cogen únicamente las entradas que, representando la intensidad
en función del tiempo de vuelo del ion (o de la relación masa/carga), sean máximos
locales. Esto conlleva el problema de que habrá entradas de masa que quizás tengan
información importante y que se eliminarán por haber quedado a la sombra de un
máximo local.
Este fenómeno es muy interesante de observar en algunas situaciones, ya que
el hecho de que una masa a una intensidad muy grande oculte otras masas con
intensidades más pequeñas, hace que veamos zonas del espectro que, por la
aparición de masas con intensidad muy grande, el resto de las masas cercanas no
presentan ninguna entrada, ya que se encontrarán siempre a la sombra de esta masa
muy abundante. Por lo tanto, cuando un ion sea muy abundante, podremos observar
claramente en el espectro que no hay entradas de masa cercanas a las que tiene el
300 400 500 600 700 800 9002
2.5
3
3.5
4
Tiempo (s)
Inte
nsid
ad iónic
a e
n e
scala
logarí
tmic
a Cromatograma de ion extraído en el rango de masas (206.973 +- 0.0250) Da
300 400 500 600 700 800 9003
3.5
4
4.5
5
5.5
Tiempo (s)
Inte
nsid
ad iónic
a e
n e
scala
logarí
tmic
a Cromatograma de pico base
57
ion cuando sale de forma abundante, ya que todas esas entradas, aunque las hay,
quedan ocultas por el máximo local que representa la intensidad de la masa del ion
abundante. Un ejemplo en el que se observa esta situación se puede ver en la figura
38, donde hay representado un espectrograma de alta resolución (10 mDa) centrado a
una masa concreta donde hay entradas de mucha intensidad. Como se puede
observar en la imagen, hay un intervalo muy grande de relaciones masa/carga
alrededor de la del ion principal, donde no hay otras entradas aparte de las del ion
principal. Sin embargo, cuando la intensidad es más baja vemos que sí aparecen las
entradas de masa con intensidad más pequeña correspondientes a otros compuestos
o a ruido (como es el caso de la imagen).
Figura 38. Espectrograma de alta resolución.
A pesar del inconveniente de la pérdida de información, el paso de espectro suma a espectro de línea tiene también resultados muy beneficiosos, como la compactación de la información que permite su almacenamiento y un procesamiento eficiente. Además, los valores del espectro de línea son valores esperados, por lo que tienen más precisión que los valores que se obtienen del espectro suma. Es decir, se obtiene más precisión en los valores que la aportada por la frecuencia de muestreo en la señal de tiempo de vuelo.
2.5. Análisis del ruido.
En los datos de espectrometría de masas podemos encontrar tres fuentes
distintas de ruido; ruido electrónico o instrumental, ruido iónico y ruido estadístico.
Además, se considerarán también como ruido los artefactos químicos.
Ruido electrónico. Este ruido es inherente a cualquier sistema electrónico, por lo que también
afectará aquí por todo el sistema que hay desde el detector (amplificador,
electromultiplicador, conversor A/D, sistema de control, etc.). Además, hay que tener
Tiempo(s)
Masa ion (
Da)
Espectrograma de alta resolucion (10 mDa) centrado en 4.630906e+02 +- 0.50 Da
720 740 760 780 800 820 840
462.95
463
463.05
463.1
463.15
463.2
1
1.5
2
2.5
3
3.5
4
4.5
5
58
en cuenta que las señales eléctricas que se consiguen crear con el detector de iones
son muy pequeñas (a pesar de la amplificación por el multiplicador de electrones), por
lo que la fase de amplificación posterior también puede hacer que el ruido electrónico
sea comparable a la intensidad del detector de iones. Dentro de este ruido se puede
considerar el ruido término y la corriente de oscuridad (corriente que produce el
detector incluso en ausencia de iones).
Ruido iónico. El ruido iónico se observa en todas las entradas aisladas de intensidad que, a
pesar de tener una intensidad notable, no parecen tener relación con ninguna especie iónica. Este ruido tiene su explicación en todos los procesos que ocurren a lo largo del vuelo de los iones en el tubo de vacío. Este tipo de ruido se corresponde con todas las medidas de masa/carga que, por la dispersión de masa que se comentó anteriormente, tengan un valor completamente anormal, provocando medidas de masa completamente incoherentes con las demás. Si bien el paso de espectro suma a espectro de línea hace que únicamente se quede con aquellas relaciones masa/carga cuya intensidad sea un máximo local, encontramos muchísimas entradas relacionadas con ruido iónico por todo el espectro.
Ruido estadístico.
El ruido estadístico se produce por la medida de masa que devuelve el analizador de masas, ya que puede ser más o menos sólida estadísticamente si se han usado más o menos medidas para determinarla. Estas medidas se producen con la llegada de iones de una determinada masa, que provocan una medida de intensidad en función del número de iones que llegan. Si llegan muchos iones, la medida de masa es mucho más precisa ya que, en conjunto, tendrán un valor medio más preciso, ya que se reducirá la incertidumbre de la medida. Sin embargo, si son pocos los iones que contribuyen a la medida de la masa, el promedio de éstos puede oscilar bruscamente ya que la incertidumbre de la medida es mayor. Este es el motivo de las fluctuaciones grandes y pequeñas de masa que se pueden observar en la figura 38.
Análisis del fondo de ruido (ruido iónico más ruido electrónico).
Una vez explicada la proveniencia tanto del ruido iónico como del ruido electrónico, vamos a ver qué consecuencias tienen en los datos, lo que hará que más adelante podamos establecer umbrales lógicos para diferenciar el fondo de ruido de los datos interesantes de un compuesto.
En primer lugar, se va a mostrar un espectrograma de baja resolución (1 Da)
de una muestra simple, en la figura 39. Sin embargo, esta muestra se ha mostrado hasta ahora con un preprocesamiento de los datos para reducir su volumen, eliminando ruido según un filtrado y un umbral que se explicarán más adelante. Sin embargo, ya que lo que nos interesa es ver el ruido de fondo, vamos a observar la muestra (acotando los límites de tiempo para que se vean los compuestos que nos interesan) con todo el ruido presente. Es inmediato observar que ahora hay muchísimo más ruido del que se mostraba antes, aunque eso se discutirá más adelante.
59
Figura 39. Espectrograma de baja resolución (1 Da).
A pesar de que la figura 39 nos muestra todo el ruido presente en los datos, el espectrograma no nos aporta mucha más información sobre él, por lo que vamos a realizar un histograma de los valores de intensidad que hay en los datos, para observar qué intensidad media tiene el fondo de ruido y a partir de qué intensidad podemos obtener información de los compuestos. En la figura 40 se muestra el histograma para las intensidades menores de 1000 (ya que si se abarca más rango de intensidades no se observa bien el fenómeno que hay que apreciar).
Figura 40. Histograma de intensidades inferiores a 1000 cuentas.
Como se podía esperar, el histograma nos muestra que hay muchas entradas debidas a una intensidad baja (menor a 100) y conforme aumenta la intensidad el número de entradas decrece. Sin embargo, lo importante está en el detalle de la forma que tiene el número de entradas en función de la intensidad, ya que se pueden diferenciar dos distribuciones estadísticas de intensidad distintas, lo que nos servirá para distinguir el ruido de la información de interés. Para observar las dos distribuciones, se ha dibujado sobre el histograma una forma aproximada de dónde estaría la distribución, ya que no es fácil verlas si no se indican explícitamente. Ambas distribuciones se pueden observar en la figura 41.
Tiempo(s)
Masa ion (
Da)
Espectrograma de baja resolucion (1 Da)
100 200 300 400 500 600 700 800
200
400
600
800
1000
1
1.5
2
2.5
3
3.5
4
4.5
5
0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 10000
1
2
3
4
5
6x 10
4 Histograma de intensidades menores a 1000
Intensidad
Núm
ero
de e
ntr
adas
60
Figura 41. Histograma de intensidades inferiores a 1000 cuentas con distribuciones separadas.
Cada uno de los dos modos en el histograma estaría asociado a un proceso estadístico independiente, pudiéndose asociar la distribución de menor intensidad a los procesos de ruido electrónico y ruido iónico, mientras que la distribución de mayor intensidad se correspondería con la señal química de interés (debida a especies iónicas de los compuestos).
Teniendo en cuenta las dos distribuciones, podemos concluir en que las entradas que estén en la primera distribución (color rojo) serán, con mucha probabilidad, indistinguibles con el ruido, por lo que formarán parte del fondo de ruido, mientras que las que están en la segunda distribución (color verde) sí podrán dar información útil de los compuestos. Por lo tanto, el primer criterio que se utilizará será que todas las entradas que tengan una intensidad por debajo de donde se cruzan las dos distribuciones (que en esta muestra es una intensidad iónica de 80 cuentas), podrán ser eliminadas pues formarán parte del fondo de ruido. Conforme aumentemos el umbral de intensidad, también eliminaremos más ruido, aunque conforme lo aumentemos nos arriesgaremos a perder algún ion poco abundante que podría formar parte de la huella espectrométrica de algún compuesto y darnos información sobre los datos, por lo que podremos ser conservadores (umbral de intensidad de 80) para no perder información, o agresivos (umbral de intensidad alto, por ejemplo de 500) y eliminar mucho ruido a costa de perder información interesante. Utilizando la muestra simple, a continuación se va a analizar el efecto de varios umbrales de intensidad, tanto en volumen de datos como en aspecto del espectrograma. En primer lugar vamos a ver el volumen de datos originales y reducidos para cada umbral (notar que cada entrada es un triplete tiempo-m/z-intensidad). Como se desprende de los valores de la tabla 5, con un umbral de 80 no perdemos ninguna información distinguible del ruido y conseguimos reducir el volumen de datos a prácticamente la mitad. Si aumentamos el umbral, reduciremos drásticamente el volumen de datos pero, como se verá más adelante, se eliminará información que puede resultar de interés.
61
Umbral de intensidad
0 (sin umbral)
80 150 500 1000
Número de entradas
1.359.724 721.212 256.230 5.982 2.696
Porcentaje
con el original (%)
100 53.04 18.84 0.44 0.20
Tabla 5. Reducción del volumen de datos con el aumento del umbral de intensidad.
En la figura 42 se muestran los espectrogramas de baja resolución (1 Da) para la muestra original (sin umbral) y con la aplicación del umbral de 80 cuentas. Como se puede observar en el espectrograma de la derecha (umbral 80), hay muchas más zonas de baja intensidad (azul oscuro) de las que había antes.
Figura 42. Espectrogramas de baja resolución a distintos umbrales.
Si representamos los cromatograma de ion total en la figura 43, veremos que siguen siendo prácticamente iguales.
Figura 43. Cromatogramas de ion total a distintos umbrales.
Tiempo(s)
Masa ion (
Da)
Espectrograma de baja resolución (1 Da) sin umbral
200 400 600 800
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
1
1.5
2
2.5
3
3.5
4
4.5
5
Tiempo(s)
Masa ion (
Da)
Espectrograma de baja resolución (1 Da) con umbral 80
200 400 600 800
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
1
1.5
2
2.5
3
3.5
4
4.5
5
300 400 500 600 700 800 9001.5
2
2.5
3
3.5
4
4.5
5
5.5
6
6.5x 10
5
Tiempo (s)
Inte
nsid
ad
Cromatograma de ion total con umbral 80
Original
Con umbral 80
62
En la figura 44 observamos el espectrograma original y el que tiene aplicado un umbral de 150. Como se puede observar, en este caso se aprecia mucho mejor la eliminación de ruido, aunque también se habrá eliminado alguna información que tuviese poca intensidad.
Figura 44. Espectrogramas de baja resolución a distintos umbrales.
En los cromatogramas de ion total representados en la figura 45 se observa otro punto de vista.
Figura 45. Cromatogramas de ion total a distintos umbrales.
Aplicando un umbral más agresivo, de 500 muestras, se obtienen los resultados que se observan en la figura 46. En este caso el cambio es muy drástico, ya que hemos eliminado una gran parte del ruido y únicamente tenemos una pequeña parte de los compuestos, aparte de algunos artefactos químicos de alta intensidad.
Tiempo(s)
Mas
a io
n (D
a)
Espectrograma de baja resolución (1 Da) sin umbral
200 400 600 800
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
1
1.5
2
2.5
3
3.5
4
4.5
5
Tiempo(s)
Mas
a io
n (D
a)
Espectrograma de baja resolución (1 Da) con umbral 150
200 400 600 800
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
1
1.5
2
2.5
3
3.5
4
4.5
5
300 400 500 600 700 800 9000
1
2
3
4
5
6
7x 10
5
Tiempo (s)
Inte
nsid
ad
Cromatograma de ion total con umbral 150
Original
Con umbral 150
63
Figura 46. Espectrogramas de baja resolución a distintos umbrales.
En la figura 47 se observan los cromatogramas de ion total con umbral 500, donde es inmediato observar que el fondo de ruido se ha reducido mucho, quedando únicamente los compuestos más abundantes. Sin embargo, se puede observar que los compuestos abundantes aún se distinguen (se distinguen mejor en la figura 46), por lo que aumentar mucho el umbral es de utilidad para observar las especies iónicas más abundantes de los distintos compuestos, aunque no se podrá usar un umbral tan alto para observar la huella espectrométrica completa.
Figura 47. Cromatogramas de ion total a distintos umbrales.
Por último, vamos a observar qué ocurre con un umbral 1000. En la figura 48 se observan los espectrogramas de baja resolución (1 Da) y en la figura 49 los cromatogramas de ion total. Este caso es más agresivo aún, por lo que únicamente se ven las especies iónicas más abundantes y el ruido (principalmente artefactos químicos) de muy alta intensidad.
Tiempo(s)
Masa ion (
Da)
Espectrograma de baja resolución (1 Da) sin umbral
200 400 600 800
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
1
1.5
2
2.5
3
3.5
4
4.5
5
Tiempo(s)
Masa ion (
Da)
Espectrograma de baja resolución (1 Da) con umbral 500
200 400 600 800
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1
1.5
2
2.5
3
3.5
4
4.5
5
300 400 500 600 700 800 9000
1
2
3
4
5
6
7x 10
5
Tiempo (s)
Inte
nsid
ad
Cromatograma de ion total con umbral 500
Original
Con umbral 500
64
Figura 48. Espectrogramas de baja resolución a distintos umbrales.
Figura 49. Cromatogramas de ion total a distintos umbrales.
Tras este análisis se puede concluir en que, si fijamos un umbral muy grande, perderemos mucha información pero se mantendrán los picos de mayor intensidad (especies iónicas más abundantes), pudiendo así encontrar fácilmente los iones principales de los compuestos, y una vez que sabemos dónde están esos iones, buscar a partir de ellos la huella espectrométrica completa del compuesto, que es, en líneas generales, lo que se hará en el método que se implemente en este trabajo.
Artefactos químicos.
Aunque no son propiamente ruido, los artefactos químicos que aparecen en los datos nos afectarán como si lo fuesen, por lo que se van a considerar como tal y se va a realizar un método para identificarlos y suprimirlos.
Tiempo(s)
Masa ion (
Da)
Espectrograma de baja resolución (1 Da) sin umbral
200 400 600 800
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
1
1.5
2
2.5
3
3.5
4
4.5
5
Tiempo(s)
Masa ion (
Da)
Espectrograma de baja resolución (1 Da) con umbral 1000
200 400 600 800
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1
1.5
2
2.5
3
3.5
4
4.5
5
300 400 500 600 700 800 9000
1
2
3
4
5
6
7x 10
5
Tiempo (s)
Inte
nsid
ad
Cromatograma de ion total con umbral 1000
Original
Con umbral 1000
65
Los artefactos químicos se caracterizan por salir de forma continua (durante
todo el análisis de la muestra) en una relación masa/carga constante y con una intensidad elevada. En la figura 50 se observa un espectrograma de una muestra simple en el que se han recuadrado los artefactos químicos más abundantes que se pueden observar en la muestra, aunque realmente hay muchos más.
Figura 50. Espectrograma de baja resolución (1 Da) donde se han resaltado los artefactos
químicos de mayor intensidad.
Estos artefactos se pueden deber a la fase móvil o a la fase estacionaria usadas en el proceso separativo, ya que salen de forma continua con una intensidad muy elevado y se mantienen prácticamente constante durante el tiempo que dura el análisis, con cambios muy lentos a lo largo del tiempo de retención. La fase móvil hace fluir la muestra por la columna separativa, por lo que también sale de ésta y se puede ionizar y aparecer en los datos en todo el análisis. Además, tanto la fase móvil como la propia muestra, pueden arrastrar partículas de la fase fija (o estacionaria) y hacer que lleguen a la interfaz de ionización, haciendo que el espectrómetro de masas detecte iones con la masa correspondiente a dichas partículas a lo largo de todo el análisis. Es habitual que los artefactos se mantengan con una intensidad prácticamente constante (ejemplo en la imagen superior de la figura 37) y se verá altamente afectada por la supresión iónica, ya que estará siempre saliendo y se verá afectada por cada compuesto que salga a lo largo del análisis. También es posible que la intensidad del artefacto químico aumente a lo largo del análisis, lo que puede ser debido a un mayor arrastre de la fase fija, o a un aumento del flujo inyectado en la columna separativa. Este caso se puede observar en la figura 51.
66
Figura 51. Espectrograma de baja resolución donde se observa un artefacto químico.
2.6. Preprocesamiento de las muestras. En este apartado se va a estudiar cómo pasar de los ficheros que obtenemos
del espectrómetro de masas, a los datos que podemos utilizar con Matlab, y qué preprocesamiento realizaremos en ellos para obtener un volumen de datos más manejable, eliminando ruido y acotando el tiempo del análisis de la muestra.
2.6.1. Manipulación de datos obtenidos por el espectrómetro de masas.
Como se comentó en la sección del analizador de masas, cada espectro de línea se almacena en ficheros propios del fabricante del analizador de masas, codificando cada dato como un float de 32 bits. En el caso de este trabajo, se disponen de datos obtenidos con un analizador de tiempo de vuelo microTOFTM de la empresa Bruker Daltonik, que almacena la salida en ficheros de extensión “.baf”. Estos ficheros se pueden procesar y exportar a ficheros XML (eXtesible Markup Language) mediante el uso del software que proporciona la propia empresa.
Una vez que se tienen los ficheros en formato XML, podemos observar qué
estructura tienen. En primer lugar, el fichero XML contiene una cabecera que muestra detalles del analizador de masas con el que se obtuvieron los datos, así como el método de ionización que se usó. Además, da diferentes datos como el operador que obtuvo los datos, con qué programa se pasaron a XML, etc. Esto se puede observar en la figura 52.
Figura 52. Cabecera de fichero XML.
Tiempo(s)
Masa ion (
Da)
Espectrograma de baja resolucion (1 Da)
300 400 500 600 700 800
183.5
184
184.5
185
185.5
186
186.5
187
1
1.5
2
2.5
3
3.5
4
4.5
5
67
Después de esta cabecera, en la figura 53 se observa que el fichero muestra los datos obtenidos separados por espectros de línea (en este caso aproximadamente un espectro de línea por segundo). De cada espectro de línea muestra algunas características (tiempo de retención, número de picos, polaridad, etc.) que pueden ayudar a obtener e interpretar los datos del fichero XML y, tras mostrar la precisión con la que se almacenan los datos, se muestran las parejas m/z – intensidad iónica. En la figura 53 se muestran las entradas del fichero relativas a los 4 primeros espectros de línea (recortadas por la derecha ya que la línea de las entradas se extiende mucho más). Algo importante a tener en cuenta es que los datos binarios de cada espectro de línea se codifican en base 64 para no tener problemas de portabilidad al usar otros sistemas, a pesar de que se aumenta el tamaño en el que son almacenados (cada 3 bytes se codifican en base 64 utilizando 4 bytes).
Figura 53. Algunas entradas del fichero XML.
Finalmente, el fichero muestra la suma acumulativa de las entradas para cada espectro de línea, lo que hace que sea más fácil su posterior manipulación. Por ejemplo, en la figura 54 se observa sus entradas para los diez primeros espectros de línea.
Figura 54. Cantidades acumuladas de las entradas de cada espectro de línea.
Una vez comentada la estructura del fichero XML, únicamente habría que implementar un script que leyese los valores de cada espectro de línea del fichero XML, y los pasase al formato que nos interesa, que en nuestro caso será un fichero de extensión “.bin” por comodidad para operar con él desde Matlab, aunque previamente tendremos que decodificar los datos, que están en base 64 como se ha comentado.
Una vez convertidos los ficheros de XML a formato binario (extensión .bin),
podemos leerlos fácilmente y hacer un preprocesamiento de ellos para eliminar ruido y reducir con ello el volumen de datos. 2.6.2. Aplicación de un umbral de intensidad.
En primer lugar aplicaremos un umbral conservador de intensidad y
eliminaremos todas las entradas que estén por debajo de ese umbral. Para establecer el umbral, hace falta recordar lo que se explicó de las distribuciones del ruido, donde dijimos que para la colección de muestras de las matrices de estándares de polifenoles, aplicar un umbral de intensidad de 80 cuentas no provocaría pérdida de información, y en cambio reduciría prácticamente a la mitad el volumen de datos. En la figura 55 se observa el histograma de la primera muestra del conjunto de muestras de extractos fenólicos de aceites, para determinar el punto en el que se pasa de una
68
distribución a otra, que como dijimos nos indica de forma aproximada el umbral de intensidad a partir de cuál la información está por encima del ruido y, por tanto, es diferenciable de éste.
Figura 55. Histograma de la intensidad para una muestra de extracto fenólico de aceite.
En esta muestra resulta más difícil observar el cambio de una distribución a otra, aunque se puede observar que es, aproximadamente, para una intensidad de 120 cuentas. Por lo tanto, de este conjunto de muestra eliminaremos automáticamente todas las muestras por debajo de este umbral, ya que no aportarán más que ruido. Como se ha podido observar, en ambas colecciones se ha tenido que hacer la elección del umbral de forma manual, por lo que una línea futura de desarrollo podría ser la búsqueda de un umbral mínimo de intensidad. Esta posibilidad se añadirá en la sección “líneas futuras” para dejar constancia de ella. Aplicando un umbral de intensidad de 120 cuentas a la muestra 1 del conjunto de aceites, pasamos de tener 6.717.788 entradas de datos (cada una de ellas sería a su vez tres datos; tiempo, masa/carga e intensidad) a 2.528.862 entradas de datos, reduciendo así el volumen de datos a manejar al 37,64%. 2.6.3. Algoritmo de reducción de ruido.
Sin embargo, aún vamos a aplicar una reducción de volumen de datos mayor a los dos conjuntos de muestras, ya que podemos aplicar también una condición sencilla para eliminar ruido; esta reducción de ruido se basa en que un compuesto sale de la columna separativa de forma aproximadamente gaussiana, por lo que una entrada de datos asociada a un compuesto deberá tener siempre entradas asociadas a su compuesto tanto antes de ella (menos tiempo de retención), como después (más tiempo de retención). Sin embargo, también hay que tener en cuenta que, para que las entradas estén asociadas al mismo ion, han de tener aproximadamente la misma masa. Como vimos anteriormente, cuando hay poca intensidad las masas tienden a dispersarse más, llegando a dar saltos del orden de 50 mDa. Por lo tanto, ya que no se debe eliminar ninguna información relevante, vamos a poner una ventana de masa lo suficientemente grande para hacer una eliminación conservativa del ruido. En este
0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 10000
0.5
1
1.5
2
2.5x 10
5
Bin Count: 1.28e+05
Bin Center: 120
Bin Edges: [120, 121]
Histograma de las intensidades menores de 1000
Intensidad
Núm
ero
de c
uenta
s
69
trabajo se impondrá como condición para conservar una entrada que en el espectro anterior y posterior (ventana de 3 segundos) tiene que observarse una entrada con una masa que se diferencie menos de 50 mDa. Si esa condición no se cumple, se interpreta que la entrada es debida a ruido (iónico o electrónico) y se elimina. Por lo tanto, para el preprocesamiento de las muestras, se aplica este filtrado a los datos originales aplicando además un umbral de intensidad de 80 cuentas, en el caso de la colección de muestras de matrices de polifenoles, y 120 cuentas para la colección de muestras de aceites. Para observar los resultados generales, mostramos en la tabla 6, la reducción en volumen de datos (número de entradas, donde cada entrada es un triplete de datos tiempo-masa/carga-intensidad) para la muestra 15 de la colección de matrices de estándares, y la muestra 1 de la colección de aceites de oliva. Como podemos observar en la tabla 6, hemos reducido el número de entradas en la muestra 15 de la colección de matrices al 5,91% del volumen original (aplicando únicamente el umbral se conseguía un 53,04% del volumen original) y el de la muestra 1 de la colección de aceites se ha reducido al 9,85% del volumen original (aplicando únicamente el umbral se conseguía un 37,64% del volumen original), por lo que podemos concluir en que se ha reducido mucho más el volumen de datos, lo que ayudará a que los métodos implementados sean más rápidos.
Umbral de intensidad aplicado
Número de entradas originales
Número de entradas
tras filtrado y umbral
Porcentaje (final/original)
Muestra 15 de la colección de
matrices de estándares
80 5.606.026 331.333 5,91 %
Muestra 1 de la
colección de aceites de oliva
120 6.717.788 661.560 9,85 %
Tabla 6. Reducción del número de entradas tras el filtrado de ruido.
Para obtener más información, se pueden representar los espectrogramas de baja resolución (1 Da) y los cromatogramas de ion total de ambas muestras antes y después del filtrado y de la aplicación del umbral. En la figura 56 observamos los espectrograma de baja resolución (1 Da) de la muestra 15 de la colección de matrices de estándares. A simple vista se puede observar que se ha eliminado una cantidad enorme de ruido, manteniendo los compuestos interesantes que había en la muestra, y los artefactos químicos que salen en continua.
70
Figura 56. Espectrogramas de baja resolución (1 Da) antes y después del filtrado.
En la figura 57 se representan los cromatogramas de ion total y se puede observar que los picos relativos a compuestos se mantienen abundantes, aunque el que está en 411 segundos sigue viéndose poco (aunque es normal ya que los artefactos químicos hacen que no se le dé mucha importancia a este compuesto en un cromatograma).
Figura 57. Cromatogramas de ion total antes y después del filtrado.
En la figura 58 observamos el espectrograma de baja resolución (1 Da) y el cromatograma de ion total (figura 59) de la muestra 1 de la colección de aceites de oliva, antes y después del filtrado. Como se puede observar en los espectrogramas, se ha reducido drásticamente el ruido, sobre todo en zonas donde no hay compuestos saliendo de la columna separativa. En el cromatograma observamos los mismos picos que antes, pero con mucha menos intensidad por la ausencia de tanto ruido.
Tiempo(s)
Masa ion (
Da)
Espectrograma de baja resolución (1 Da) de la muestra original
200 400 600 800
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
1
1.5
2
2.5
3
3.5
4
4.5
5
Tiempo(s)
Masa ion (
Da)
Espectrograma de baja resolución (1 Da) tras filtrado y umbral 80
200 400 600 800
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
1
1.5
2
2.5
3
3.5
4
4.5
5
300 400 500 600 700 800 9000
1
2
3
4
5
6
7x 10
5
Tiempo (s)
Inte
nsid
ad
Cromatograma de ion total
Original
Filtrado y con umbral 80
71
Figura 58. Espectrogramas de baja resolución (1 Da) antes y después del filtrado.
Figura 59. Cromatogramas de ion total antes y después del filtrado.
2.6.4. Limitación del tiempo de retención.
Llegados a este punto se ha eliminado ruido poniendo un umbral que se justificó con el histograma y realizando un filtrado según un criterio basado en la forma en la que sale el compuesto de la columna cromatográfica. Sin embargo, algunas imágenes mostradas hasta ahora (en concreto las relativas a las muestras del conjunto de matrices de estándares) habían sido ya manipuladas para poder observar de forma clara los compuestos que había en ellas, ya que realmente el tiempo en el que se desarrollaba el análisis era mucho mayor de lo que se mostraba. Por ejemplo, en la figura 60 se muestra el espectrograma de baja resolución de la muestra 15 de la colección de matrices de estándares, sin limitar el tiempo de retención que se muestra (y sin realizar ningún tipo de preprocesamiento, ni filtrado ni umbral de intensidad).
Tiempo(s)
Masa ion (
Da)
Espectrograma de baja resolución (1 Da) de la muestra original
500 1000 1500
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
1
1.5
2
2.5
3
3.5
4
4.5
5
5.5
Tiempo(s)
Masa ion (
Da)
Espectrograma de baja resolución (1 Da) tras filtrado y umbral 120
500 1000 1500
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
1
1.5
2
2.5
3
3.5
4
4.5
5
5.5
0 200 400 600 800 1000 1200 1400 16000
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5x 10
6
Tiempo (s)
Inte
nsid
ad
Cromatograma de ion total
Original
Filtrado y con umbral 120
72
Figura 60. Espectrograma de baja resolución (1 Da) complete.
Como se puede observar en la figura 60, el análisis dura mucho más de lo que se mostraba inicialmente (300 a 850 segundos), durando aproximadamente 2.100 segundos. Sin embargo se puede observar con claridad la presencia de compuestos que salen prácticamente para todas las masas en los primeros tiempos de retención (en la imagen desde 0 hasta 50 segundos aproximadamente), lo que se corresponde con una calibración inicial del analizador de masas para la precisión de las medidas de masa. Al final del análisis podemos observar que ocurre algo parecido (entre los 1.200 y los 1.800 segundos), ya que súbitamente aparecen compuestos en un rango de masas enorme, lo que se debe al lavado de la columna separativa que realiza el técnico tras pasar el tiempo de retención en el que se piensa que salen los compuestos interesantes de la muestra. La aparición de compuestos en esta zona de lavado tiene un rango de masas tan grande ya que la idea del lavado es introducir un líquido que arrastre todo lo que no haya salido de la columna separativa, para dejarla lo más limpia posible, por lo que algunos de los compuestos que hayan ido saliendo a lo largo del análisis (incluidos los artefactos químicos), saldrán en pequeñas dosis arrastrados por el flujo de lavado (ya que parte de esos compuestos se pueden haber quedado retenidos en parte por la fase estacionaria).
Esta parte de calibración y lavado no interesa que esté presente en la
búsqueda de compuestos y sus huellas espectrométricas, ya que únicamente introducirán muchísimos resultados de compuestos que no interesan. En un principio se usaron los métodos sobre las muestras sin limitar los tiempos del análisis y, aunque el método seguía agrupando los compuestos en su huella espectrométrica correctamente, aparecían muchísimos compuestos en las zonas de calibración y de lavado (sobre todo en esta última), haciendo mucho mayor el volumen de resultados y más difícil la búsqueda de los compuestos de interés entre todos los que se encontraban.
Lo ideal para solventar este problema es que el calibrado no aparezca en los
datos de salida (es decir, se realice la calibración pero no se muestre su salida), ni tampoco la salida debida al lavado. Además, el lavado ha de realizarse mucho después de que salga el último compuesto interesante de la columna separativa, ya que en caso contrario se puede dar el caso de que un compuesto esté saliendo al mismo tiempo que se ha comenzado el proceso de lavado. Para buscar los límites del análisis, se puede mirar el espectrograma de baja resolución y el cromatograma de ion total para determinar cuándo empieza a
Tiempo(s)
Masa ion (
Da)
Espectrograma de baja resolucion (1 Da)
200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
1
1.5
2
2.5
3
3.5
4
4.5
5
73
interesarnos el análisis y cuando deja de hacerlo.
Para la colección de matrices de estándares.
En la figura 61 se representa el cromatograma de ion total de una muestra de la colección de matrices de estándares.
Figura 61. Cromatograma de ion total completo.
La cota de tiempo superior es evidente dónde podemos marcarla, ya que tanto el espectrograma que se enseñó antes, como el cromatograma que se observa ahora, muestran que a partir del compuesto que aparece en 798,9 segundos, no hay ningún compuesto de interés, por lo que podemos quitar las entradas a partir de, por ejemplo 840 segundos, con lo que habremos dado tiempo más que suficiente ion principal de ese compuesto a terminar de salir. La cota de tiempo inferior es un poco más difícil de elegir, ya que realmente vemos que hay varios compuestos entre los 80 y los 300 segundos que antes no se han tenido en cuenta a la hora de hablar de esta muestra. En cualquier aplicación del método implementado en este trabajo, esos compuestos se deberían analizar por lo que la cota inferior sería de 80 segundos (aproximadamente). Sin embargo, la idea de tener dos colecciones de muestras es tener una colección para realizar comprobaciones generales y explicaciones, que sería la fácil (la de las matrices de estándares), y otra colección más complicada cuyo objetivo sería ver el método en una aplicación menos idealizada. Por lo tanto, dado que esta colección nos sirve para explicaciones y comprobaciones, vamos a dejar fuera del rango los compuestos que hay por debajo de 300 segundos, ya que el resto de compuestos están muy bien documentados y podremos realizar las comprobaciones que deseamos con ellos. Dicho esto, la cota de tiempo inferior sería de 300 segundos.
Para la colección de extractos fenólicos de aceites de oliva.
En las figuras 62 y 63 se puede observar, respectivamente, el espectrograma de baja resolución (1 Da) y el cromatograma de ion total de una muestra de la colección de extractos fenólicos de aceites de oliva.
0 500 1000 1500 2000 25000
0.5
1
1.5
2
2.5x 10
6
X: 841.1
Y: 2.468e+05
Tiempo (s)
Inte
nsid
ad
Cromatograma de ion total
X: 798.9
Y: 6.275e+05
X: 78.46
Y: 2.205e+05
X: 300.2
Y: 2.296e+05
74
Figura 62. Espectrograma de baja resolución (1 Da) completo.
Figura 63. Cromatograma de ion total completo.
Como se puede observar en las figuras 62 y 63, la cota inferior de tiempo es ahora más sencilla, ya que antes de 200 segundos únicamente encontramos la parte de calibración y unos picos provocados por un aumento brusco de la intensidad de un compuesto que aparece en una masa/carga de forma continua, lo que provoca que se vean esos pequeños picos. Para la cota superior de tiempo, en el espectrograma se observa muy claramente que, cuando se pasan de los 1.300 segundos, empiezan a salir muchos compuestos en todo el rango de masas, correspondientes a todos los compuestos que arrastra el lavado en la columna separativa. En esta situación podríamos poner dos cotas superiores lógicas, una más restrictiva que elimina todo lo que sale después de los 1.350 segundos, y otra más conservativa que elimina la parte más abundante del flujo de lavado, que se produce a partir de los 1.410 segundos (aproximadamente). En este caso vamos a coger la cota más restrictiva (1.350 segundos) ya que no queremos que el lavado afecte a los resultados interesantes. Además, hay que tener en cuenta que, si el técnico ha comenzado el lavado “tan pronto”, seguramente será porque sabe que los compuestos que está buscando (o que quiere encontrar) salen en unos tiempos de retención determinados (aproximados) y muy inferiores al tiempo en el que empieza a lavar la columna separativa. Por lo tanto, poner una cota superior de 1.350
Tiempo(s)
Masa ion (
Da)
Espectrograma de baja resolucion (1 Da)
200 400 600 800 1000 1200 1400
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
1
1.5
2
2.5
3
3.5
4
4.5
5
5.5
0 200 400 600 800 1000 1200 1400 16000
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5x 10
6
X: 1409
Y: 1.713e+06
Tiempo (s)
Inte
nsid
ad
Cromatograma de ion total
X: 199.8
Y: 4.728e+05
X: 1351
Y: 1.218e+06
75
segundos (o incluso 1.300) no sería demasiado agresivo ya que los compuestos que busca el técnico deberían haber salido ya. Una vez más se observa el beneficio de que se incluyesen los tiempos de calibración y de lavado en los resultados de un análisis, ya que harían que esta evaluación manual fuese innecesaria y con menos posibilidad de error. En la tabla 7 se muestran las cotas de tiempos de retención inferiores y superiores que se aplicarán a cada colección de muestras.
Cota inferior (segundos)
Cota superior (segundos)
Colección de muestras
de matrices de estándares
300 841
Colección de muestras
de aceite de oliva 200 1350
Tabla 7. Cotas de tiempo superiores e inferiores para cada colección de muestras.
76
3. Realización.
En este apartado se va a describir qué pasos realiza la herramienta para obtener la caracterización de los compuestos. Una vez implementada, se afinarán algunos umbrales de forma experimental, observando el resultado en una muestra simple y comentando las distintas soluciones de compromiso que se han tenido que ir adoptando para llegar a un resultado adecuado. Dado que será evidente la necesidad de un método que identifique y suprima los artefactos químicos, se explicarán los pasos que han llevado a desarrollar dicho método, del que no se tiene constancia de que haya sido implementado hasta el momento. Tras su desarrollo se implementa el último método de este trabajo con el objetivo de agrupar automáticamente todos los compuestos que resultan de aplicar la detección y caracterización de compuestos a cada una de las muestras de una colección.
3.1. Implementación de la herramienta para detección y caracterización de compuestos en muestras obtenidas mediante HPLC-ESI-TOF. El objetivo del método implementado es detectar cada compuesto de la
muestra y, partiendo de él, agrupar su huella espectrométrica. Una vez hecho esto, se
calculan aspectos importantes de cada compuesto y de las líneas presentes en su
huella espectrométrica (entendiendo por línea cada especie iónica que provengan de
la molécula principal del compuesto).
La novedad de este método es que realiza primero una búsqueda muy rápida
por los datos para localizar las especies iónicas más abundantes de la muestra,
comparándolas entre sí para identificar las especies iónicas que correspondan al ion
más abundante de cada compuesto. Una vez identificado el ion más abundante de
cada compuesto, se compara su forma cromatográfica con el resto de especies iónicas
que haya en un tiempo de retención aproximadamente igual al suyo, esta vez con un
umbral bajo para no perder información.
La comparación entre formas cromatográficas (o picos cromatográficos) se
hace por proyección de funciones en el espacio vectorial de funciones que representan
los perfiles cromatográficos. Esta comparación se basa en la idea de que los iones que
se formen a partir de una molécula principal (por ser una variante isotópica, un
fragmento o un cluster), tendrán el mismo perfil cromatográfico salvo por una
constante multiplicativa, por lo que normalizando ambas agrupaciones, la forma
cromatográfica de ambas debería ser prácticamente la misma (realmente debería ser
exactamente la misma si no hubiese ruido ni efectos no lineales). Las agrupaciones
con poca intensidad iónica que tengan una similitud alta con el ion principal, se
asignarán al compuesto de ese ion principal y formarán parte de su huella
espectrométrica. Una vez se tienen agrupados todos los compuestos con sus huellas
espectrométricas, se calculan parámetros de cada pico cromatográfico para que
podamos cuantificar la abundancia de los compuestos y de sus iones secundarios
asociados. Estos parámetros serán las áreas cromatográficas, que darán una idea de
la abundancia iónica el compuesto en la muestra, y las desviaciones estándar de masa
y tiempo, que darán una idea de cómo de ancho es el pico, tanto a nivel de relación
masa/carga como a nivel de tiempo de retención.
77
Por lo tanto, el método se puede resumir en los siguientes pasos:
Búsqueda de agrupaciones de entradas (tripletes de valores tiempo-
masa/carga-intensidad) muy abundantes con un umbral de intensidad alto.
Comparación de las agrupaciones entre sí para determinar cuál es la principal
de cada compuesto de la muestra.
Para cada agrupación principal de un compuesto, se buscan agrupaciones de
iones poco abundantes con un umbral bajo que salgan aproximadamente en el
mismo tiempo de retención. Si la comparación entre la agrupación poco
abundante y la agrupación debida al ion principal presenta una correlación alta,
entonces se asignará a la huella espectrométrica de ese compuesto.
Por último se guardan los datos más importantes de los iones principales de
cada compuesto, y las huellas espectrométricas de cada compuesto, en tablas,
de forma que la información relevante queda representada de forma muy
compacta.
El desarrollo de este método permite también simplificar soluciones a
problemas actuales en el campo del análisis LC-MS. Por ejemplo, la alineación de
compuestos en tiempo de retención entre varias muestras sería algo mucho menos
complicado, ya que si en ambas muestras tenemos el mismo compuesto (aparece en
ambas tablas con una huella espectrométrica lo suficientemente parecida), entonces
podremos realizar la calibración de tiempo de retención entre ambas muestras
fijándonos únicamente en la diferencia de tiempos que hay entre ese compuesto en las
dos muestras distintas. Por el mismo motivo, la calibración en relación masa/carga
entre muestras distintas sería también un proceso también mucho más sencillo.
Otra ventaja que tiene el conseguir agrupar los compuestos y sus huellas
espectrométricas en tablas, es que podemos comparar entre sí todas las muestras de
una colección y obtener una tabla de todos los compuestos que hay en la colección,
diciendo qué compuesto aparece en cada tabla, de forma que finalmente reduciríamos
todas las muestras de una colección, a una serie de tablas donde tendríamos los
compuestos que hay en esa colección. Este proceso de agrupación de compuestos de
una colección de muestras se ha realizado también en este trabajo tras implementar el
método principal.
También hay que tener en cuenta que este método reduce una cantidad
enorme de información a unas tablas donde se compacta la información más
importante. El método es también útil cuando se quiere realizar una búsqueda ciega
(no se sepa lo que hay) en una muestra. Por ejemplo, si se tiene una muestra de
composición desconocida y se quiere caracterizar a la perfección, el proceso será
mucho más sencillo ya que, mientras que antes había que ir cromatograma a
cromatograma buscando de forma manual los picos (recorriendo miles de
cromatogramas), ahora se puede aplicar la herramienta para que aporte la información
que se necesita y, en caso de que se quiera hacer alguna comprobación (porque un
compuesto encontrado no está documentado en ninguna base de datos y se quiera
comprobar si es un nuevo compuesto, por ejemplo), las comprobaciones se reducirían
a observar unos pocos cromatogramas, con lo que el resultado se simplifica
significativamente.
78
A continuación se van a exponer los pasos en los que se divide el método, y
cómo se ha realizado la implementación. La forma de implementar cada paso es muy
importante ya que supone tomar decisiones importantes muy variadas, que afectarán
directamente a los resultados (sobre todo a la eficiencia) y que tendrán que tener
coherencia para que el resultado sea adecuado.
3.1.1. Primer paso. Búsqueda de los iones más abundantes. En primer lugar se van a buscar las agrupaciones de entradas con una
intensidad iónica mayor (mayor abundancia) ya que entre ellos estarán los iones
principales de cada compuesto. Para realizar esta búsqueda, vamos a establecer un
umbral de intensidad alto para que únicamente encontremos agrupaciones de
entradas más abundantes. Sin embargo, si fijamos un umbral demasiado alto, nos
arriesgamos a que algún ion principal de un compuesto quede debajo del umbral, con
lo que no detectaríamos dicho compuesto. Por otra parte, si fijamos un umbral
demasiado bajo, nos arriesgaremos a coger iones que únicamente se deben a ruido y
obtendremos falsos positivos, aparte de que el proceso será mucho más lento. Esta
parte es crítica ya que cada agrupación principal que se determine que es el ion
principal de una compuesto, provocará una búsqueda de agrupaciones secundarias
que coincidan con su pico cromatográfico para formar su huella espectrométrica, por lo
que el hecho de bajar este umbral de intensidad hace que haya más falsos positivos,
provocando que se realicen más agrupaciones de huellas espectrométricas y, por
tanto, tardando mucho más innecesariamente.
Cuando se ejecute el método, se dirá qué umbral se ha usado, ya que se usará
uno distinto para la colección de aceites y otro para la colección de matrices de
estándares. Sería interesante disponer de un algoritmo que calculase
automáticamente el umbral alto que se debe usar para cada muestra, lo que se
comentará en las posibles mejoras del método pero que no se podrá abordar en este
trabajo por falta de tiempo. Además, como se comentará en el apartado de “líneas
futuras”, el uso de umbrales de intensidad adaptativos (que dependen del contexto de
cada zona donde se apliquen) es una buena vía de mejora del método implementado.
Para realizar este paso, se realizarán varios procedimientos.
Agrupación de las entradas según ventanas de tiempo de retención y
relación masa/carga, para un umbral de intensidad alto.
Para buscar los picos cromatográficos más abundantes, en primer lugar hay
que agrupar las entradas que pueden contener dichos picos, por lo que se aplica un
umbral de intensidad alto a la muestra. Aplicando un umbral alto (2.000 cuentas) a la
muestra 15 de la colección de matrices de estándares, y eliminando previamente los
artefactos químicos para que los datos sean más limpios, en la figura 64 se observan
las entradas que han superado el umbral. Como se puede observar, hay entradas de
cada uno de los compuestos de la muestra, por lo que se identificarán todos si el
proceso se hace de forma correcta.
79
Figura 64. Entradas por encima del umbral de intensidad alto.
Los picos cromatográficos que nos interesan tendrán todas sus entradas con
una alta intensidad, por lo que podemos basarnos en el estudio que hicimos del tiempo
de retención y de la relación masa/carga para agrupar las entradas en grupos con
tiempos de retención contiguos (las entradas se distancian en pocos segundos) y
relaciones masa/carga próximas. Sabiendo que las entradas a alta intensidad se ven
afectadas en menor medida por cualquier tipo de ruido (electrónico, iónico o
estadístico), podemos establecer gaps de tiempos de retención y de relación
masa/carga para agrupar las entradas en un mismo cluster (entendiendo, en este
contexto, un cluster como una ventana de tiempo de retención y de relación
masa/carga). En la implementación se agrupan entradas si tienen una diferencia de
unos pocos segundos (o scans) y de menos de 25 mDa, ya que a estas intensidades
las fluctuaciones en masa/carga son muy pequeñas por una menor presencia de ruido
estadístico.
Tiempo(s)
Masa ion (
Da)
Espectrograma de baja resolucion (1 Da)
400 450 500 550 600 650 700 750 800
100
200
300
400
500
600
1
1.5
2
2.5
3
3.5
4
4.5
5
80
Figura 65. Agrupaciones realizadas.
Realizando la agrupación de las entradas en clusters, se obtienen las
agrupaciones que pueden verse en la figura 65. Sin embargo, para observar mejor las
agrupaciones, se va a hacer zoom en un intervalo menor de tiempo de retención y
relación masa/carga, como se puede observar en la figura 66. En esta figura se
observa con mucha más claridad las agrupaciones que se han hecho de las entradas.
Figura 66. Agrupaciones realizadas en el rango de 590 a 645 segundos y 130 a 191 Da.
Tiempo(s)
Masa ion (
Da)
Espectrograma de baja resolucion (1 Da)
400 450 500 550 600 650 700 750 800
100
200
300
400
500
600
1
1.5
2
2.5
3
3.5
4
4.5
5
Tiempo(s)
Masa ion (
Da)
Espectrograma de baja resolucion (1 Da)
600 610 620 630 640
140
150
160
170
180
190
1
1.5
2
2.5
3
3.5
4
4.5
5
81
Una vez realizada la agrupación, realmente no podemos estar seguros de que
cada agrupación tenga contenido un único pico cromatográfico, por lo que habrá que
analizar cada una de las agrupaciones para distinguir los picos cromatográficos que
estén en el mismo grupo. Por ejemplo, para el mismo análisis pero usando la muestra
1 de la colección de extractos de aceites de oliva, en la figura 67 se observan tres
agrupaciones completas de entradas (y una parte de otra) correspondientes a dos
isómeros de la oleuropeína aglicona y a la variante isotópica principal de cada uno de
ellos.
Figura 67. Agrupaciones realizadas en el rango de 590 a 645 segundos y 130 a 191 Da.
Si se representa el cromatograma de ion extraído correspondiente a la
agrupación más abundante de la figura 67 (la de masa 377 Da), se puede observar
que realmente agrupa tres picos cromatográficos, como queda reflejado en la figura
68. De los tres picos cromatográficos, dos son muy evidentes y se pueden distinguir
perfectamente entre sí, mientras que el menos abundante coeluye con uno de los
abundantes, solapándose sus perfiles cromatográficos. Por lo tanto, queda patente la
necesidad de separar los picos cromatográficos dentro de agrupación, que será el
siguiente paso a realizar en el método.
Tiempo(s)
Masa ion (
Da)
Espectrograma de baja resolucion (1 Da)
750 800 850 900 950
375.5
376
376.5
377
377.5
378
378.5
379
379.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
4
4.5
5
5.5
82
Figura 68. Cromatograma de ion extraído para observar isómeros de la oleuropeína aglicona.
Separación de picos cromatográficos de cada agrupación de entradas.
Para separar los picos cromatográficos que haya en la misma agrupación, se
van a realizar varios pasos:
- Filtrado paso baja del perfil cromatográfico.
Este paso es fundamental ya que los picos cromatográficos se ven
afectados por ruido. Realizando el filtrado, la delimitación del pico será mucho
más precisa, ya que no delimitaremos un pico antes de tiempo únicamente por
tener algún salto brusco o ilógico en alguna de sus colas cromatográficas.
Para filtrar paso bajo se ha usado una ventana de Hamming de 5 muestras
(equivalentemente 5 segundos), con la que se realiza un filtrado de fase cero
en ambas direcciones para obtener resultados más suavizados y sin introducir
retardo de grupo. Si se usase una ventana mayor, el filtrado sería demasiado
fuerte y el pico se suavizaría demasiado, por lo que hay que elegir un valor de
ventana ni muy grande (para que no se “destruyan” picos) ni muy chico (para
que se realice un filtrado suficiente).
- Detecto máximos y mínimos locales.
La búsqueda de máximos y mínimos locales se realiza con una ventana
temporal de anchura pequeña, de forma que se localizan los máximos del
cromatograma (máximos de cada pico cromatográfico) y se delimitan con los
mínimos locales encontrados (mínimos a los lados de los picos
cromatográficos).
780 800 820 840 860 880 900 920 940 960
0
0.5
1
1.5
2
x 105
Tiempo (s)
Inte
nsid
ad
Cromatograma de ion extraído en el rango de masas (377.100 +- 0.2500) Da
83
En la figura 69 se observa la misma agrupación de entradas que aparece en la
figura 68, indicando en cada color los picos cromatográficos delimitados (excepto el
color azul que se corresponde con las entradas dibujadas por el cromatograma de ion
extraído). Por lo tanto, en la figura se observa la correcta separación de los tres picos
cromatográficos (colores amarillo, negro y violeta), incluso cuando hay coelución entre
los dos primeros.
Figura 69. Delimitación de picos cromatográficos para una agrupación de entradas.
Hay que tener en cuenta que la formación de agrupaciones de entradas se ha
hecho únicamente con las entradas que están por encima del umbral, pero la
delimitación se ha de realizar siempre para todas las entradas que superen un umbral
mínimo de intensidad (120 cuentas en el caso de las muestras complejas), para que
no falten entradas a la hora de delimitar el pico cromatográfico.
3.1.2. Segundo paso. Detección de ion principal de cada compuesto. Tras el paso anterior del método, las agrupaciones de entradas se habrán
separado en picos cromatográficos de alta intensidad, como puede observarse en la figura 69. Sin embargo, no se puede decir que cada pico cromatográfico separado corresponda a la especie iónica principal de cada compuesto, ya que habrá compuestos que, por ser muy abundantes, tengan muchos picos cromatográficos de alta intensidad detectados (fragmentos, clusters, variantes isotópicas, etc.), y otros compuestos que, por la razón contraria, tendrán pocos picos cromatográficos detectados (como mínimo han de tener uno para que el método detecte y caracterice el compuesto).
Para identificar al ion principal de cada compuesto (o pico cromatográfico
principal del compuesto) se compararán entre sí todos los picos cromatográficos de alta intensidad encontrados, para determinar cuáles pertenecen a la misma huella
850 860 870 880 890 900
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
1.4
1.6
1.8
2
x 105
Tiempo (s)
Inte
nsid
ad
Cromatograma de ion extraído en el rango de masas (377.100 +- 0.2500) Da
84
espectrométrica (mismo compuesto) y cuáles forman otra huella espectrométrica (otro compuesto detectado).
La comparación entre picos cromatográficos requiere la definición de una distancia entre ellos, que ha de cumplir una serie de condiciones:
- La primera condición es que los picos cromatográficos asociados al mismo compuesto han de tener su máximo de intensidad en el mismo instante temporal, aunque habrá que usar umbrales ya que algunos picos estarán más afectados por el ruido estadístico y pueden tener el máximo desplazado unos segundos.
- La segunda condición será que los picos han de tener la misma forma
cromatográfica, ya que como se ha explicado a lo largo de todo el trabajo, sus formas cromatográficas han de ser iguales ya que sólo dependen del proceso de cromatografía y del compuesto del que provienen.
Por lo tanto, de forma idílica, para asociar dos picos cromatográficos al mismo
compuesto, su forma cromatográfica ha de ser la misma (normalizando la intensidad) en los mismos tiempos de retención.
La distancia se va a implementar, para cumplir las condiciones anteriores, por
proyección de funciones. Cada forma cromatográfica la vamos a considerar un vector de valores dados por su intensidad para cada tiempo de retención, donde la dimensión del vector será todo el rango de tiempos de retención (en la práctica no se harán vectores tan grandes para aumentar la eficiencia). Por lo tanto, si consideramos que los picos cromatográficos son vectores y realizamos una proyección de uno sobre otro, cuanto mayor sea la magnitud, más parecidos serán los vectores y, por tanto, los picos cromatográficos. Esta magnitud tendrá que ser normalizada para normalizar las intensidades, por lo que realmente lo que será calcular el coseno del ángulo que forman los dos vectores, que será de 90º (coseno nulo) si los picos cromatográficos no se parecen en absoluto y 0º (coseno máximo) si los picos cromatográficos son idénticos (tras normalizar).
Por lo tanto, en la siguiente ecuación se puede observar la fórmula de la
distancia entre picos cromatográficos que se usará en el trabajo, que es realmente la fórmula del coseno del ángulo que forman dos vectores:
( )
, donde el numerador es el producto escalar entre ambos vectores, el denominador el
producto de las normas de ambos vectores y los vectores “x” e “y” representan las
señales cromatográficas (picos cromatográficos).
Por lo tanto, la similitud entre las agrupaciones irá desde 0 (ninguna similitud),
ya que el coseno del ángulo no será negativo por no haber intensidades negativas,
hasta 1 (forma cromatográfica igual provoca magnitud máxima de la proyección).
En la práctica, debido al ruido que afecta a los picos cromatográficos, habrá
que establecer umbrales de distancia (o similitud) entre picos cromatográficos, para
decidir si se corresponden (supera el umbral de distancia), o no (no alcanza el umbral
de distancia), con el mismo compuesto. Aunque aquí no se indicarán los umbrales
utilizados, ya que dichos umbrales se han cogido de forma experimental, hay que
85
tener en cuenta que un umbral demasiado bajo puede hacer que varios compuestos
con sus huellas espectrométricas mezcladas, se asignen a la misma huella
espectrométrica (por ser tener siempre una distancia entre picos cromatográficos que
supera el umbral), mientras que un umbral de distancia demasiado alto, hará que cada
pico cromatográfico forme su propia huella espectrométrica (ya que ningún pico sea lo
suficientemente parecido para superar el umbral). Por lo tanto, habrá que establecer
soluciones de compromiso entre la probabilidad de que se creen compuestos que no
están (umbral demasiado alto) y que varios compuestos se asignen a la misma huella
espectrométrica (umbral demasiado bajo).
En la figura 65 se observaban las agrupaciones de entradas realizadas en un
primer momento para la muestra 15 de la colección de matrices de estándares. Una
vez realizado todo el proceso de separación de picos cromatográficos y comparación
de los picos entre sí, en la figura 70 se observan las entradas de los picos
cromatográficos que se han considerado los principales de su huella espectrométrica
(es decir, los más representativos de cada compuesto). Como se puede observar, se
encuentran 7 compuestos distintos, lo que en esta muestra significa que se ha
realizado el proceso de forma correcta.
Figura 70. Picos cromatográficos principales de los 7 compuestos detectados de la muestra.
Una vía interesante de mejora de esta comparación es que, como los picos
cromatográficos más abundantes se ven menos afectados por el ruido, su similitud
debería ser mayor en caso de que pertenezcan al mismo compuesto, por lo que sería
interesante desarrollar un algoritmo que establezca el umbral de similitud adecuado
para cada pareja de picos cromatográficos. Esto se comentará en el apartado de
líneas futuras del trabajo.
Tiempo(s)
Masa ion (
Da)
Espectrograma de baja resolucion (1 Da)
350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 85050
100
150
200
250
300
350
400
450
500
1
1.5
2
2.5
3
3.5
4
4.5
5
86
3.1.3. Tercer paso. Búsqueda de iones secundarios para cada ion principal. Llegados a este punto, tendremos una lista de picos cromatográficos
principales (ion principal) de cada compuesto, y una lista de picos cromatográficos de
alta intensidad asociados a la huella espectrométrica de cada compuesto detectado
(representado por los picos cromatográficos principales). Lo que se va a realizar en
este apartado será la caracterización de cada compuesto, completando su huella
espectrométrica con sus especies iónicas.
Para cada ion principal (pico cromatográfico principal) se buscan, con un
umbral de intensidad bajo (por ejemplo, para la muestra simple se usa un umbral de
80 cuentas), agrupaciones de entradas con el mismo rango temporal que tiene el pico
cromatográfico principal. Cada agrupación de entradas (de un ion secundario) que
esté en su rango temporal tendrá un perfil cromatográfico, por lo que se calculará su
distancia con el perfil cromatográfico del ion principal. En caso de que la distancia sea
lo suficientemente pequeña (mucha similitud), entonces la agrupación de entradas del
ion secundario se asociarán al compuesto del ion principal, pasando a formar parte de
su huella espectrométrica. En la figura 71 se observa la huella espectrométrica
agrupada para el compuesto más abundante de la muestra 15 de matrices de
estándares, cuyos iones principales se observaron en la figura 70. Esta huella
espectrométrica ha sido formada por 43 especies iónicas, una es la especie iónica
principales (pico cromatográfico principal de este compuesto) y las otras 42 son
especies iónicas que se han asignado a esta huella espectrométrica por similitud de
sus perfiles cromatográficos con el de la especie iónica principal del compuesto.
Figura 71. Huella espectrométrica detectada para un compuesto de la muestra.
Tiempo(s)
Masa ion (
Da)
Espectrograma de baja resolucion (1 Da)
680 700 720 740 760 780
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1
1.5
2
2.5
3
3.5
4
4.5
5
87
Al igual que ocurría antes, los umbrales de similitud que hay que utilizar deben
depender de la intensidad, ya que las especies iónicas menos abundantes se verán
más afectadas por el ruido y, por tanto, la similitud de su perfil cromatográfico con el
del ion principal del compuesto será menor.
3.1.4. Cuarto paso. Cálculo de características de las especies iónicas asociadas a cada compuesto. Para el pico cromatográfico de cada especie iónica detectada y asociada a
cada compuesto detectado, se calculará su área cromatográfica, que es la forma de
cuantificar la abundancia iónica de un compuesto en una muestra, lo que dará idea
más delante de qué concentración de compuesto había en la muestra (aunque esto
requiere estudios que no se realizan en este trabajo). Actualmente hay muchas formas
de calcular el área cromatográfica de una agrupación, como por ejemplo:
Sumar las intensidades de cada entrada de la agrupación, sin preocuparnos
de la forma del pico cromatográfico en absoluto.
Sumar las intensidades igual que en la posibilidad anterior, pero restando
un factor de corrección que se conoce como “línea base” y que consiste en
restar, al área total, el área que hay por debajo de los mínimos de la
agrupación a ambos lados del tiempo central.
Sumar las intensidades que estén por encima de un porcentaje de la
intensidad del máximo de la agrupación.
Esta solución es la que se implementará, calculando el área
cromatográfica como la suma de las intensidades que estén por encima del
80% de la intensidad máxima del pico. Para tener más solidez estadística,
el porcentaje de intensidad no se hará sobre el máximo absoluto de la
agrupación, sino que se cogerá sobre su valor filtrado con sus entradas
anterior y posterior (un segundo más y un segundo menos).
La ecuación para el cálculo del área sería simplemente la suma de las
intensidades de las entradas que cumplan la condición de umbral:
∑
, donde sería la intensidad de cada entrada que esté por encima del 80%
de la intensidad pesada del pico.
También se calculará el valor esperado de la relación masa/carga de los
valores de masa de la especie iónica, así como el valor esperado del tiempo de
retención. De esta forma se tendrán dos valores muy sólidos estadísticamente que nos
permitirán tener una idea más precisa de en qué masa/carga y en qué tiempo de
retención está centrada la agrupación.
El valor esperado de la relación masa/carga se calcula como sigue:
88
∑ ∑
El valor esperado del tiempo de retención se calcula también usando la
intensidad de cada entrada como peso del tiempo de esa entrada. Es decir, sería la
misma ecuación que se usa para el valor esperado de la masa/carga, pero cambiando
las masas por los tiempos de retención:
∑ ∑
Otro parámetro a calcular será, para los iones principales de cada compuesto,
la desviación estándar de tiempo de retención y de masa. Sin embargo, para tener
más solidez estadística y que no influyan demasiado aquellos valores con gran
varianza estadística (es decir, los de baja intensidad), el cálculo será también pesado
(valor esperado) en función de la intensidad de cada entrada.
La desviación estándar de tiempo de retención será:
√∑ ( )
∑
, donde es el valor esperado del tiempo de retención que se calculó anteriormente.
La desviación estándar de la relación masa/carga será:
√∑ ( )
∑
, donde es el valor esperado de la relación masa/carga que se calculó
anteriormente.
Cabe destacar que, como se ha dicho, la abundancia iónica de un compuesto
se observa en el área cromatográfica. Sin embargo, para el área de las especies
iónicas secundarias de un compuesto lo interesante no es el valor del área en sí, sino
el valor del área relativa al área de su especie iónica principal, por lo que será el valor
que se muestre para las especies iónicas secundarias.
3.1.5. Quinto paso. Almacenar y mostrar resultados en forma de tablas. Una vez que se han calculado los valores de las especies iónicas, se van a
guardar en forma de tablas muy compactas que permitan observar rápidamente los
compuestos que hay en una muestra y, si se desea, ver las especies iónicas
secundarias asociadas a cada compuesto.
Los resultados se almacenarán en dos tablas distintas; una contendrá las
características de los iones principales de cada muestra, y la otra las características
básicas de los iones secundarios de un ion principal. Por lo tanto, tendremos una tabla
89
con N agrupaciones principales descritas en ella, y N tablas describiendo las
agrupaciones secundarias de cada una de las N agrupaciones principales.
La tabla que describe las agrupaciones principales nos dará realmente una
idea de qué hay en la muestra, mientras que la otra nos dará una idea de la huella
espectrométrica de cada compuesto de la muestra.
La tabla de las agrupaciones principales tendrá la siguiente información para
cada agrupación principal:
Valor esperado del tiempo de retención.
Valor esperado de la relación masa/carga.
Desviación estándar del tiempo de retención.
Desviación estándar de la relación masa/carga.
Área cromatográfica.
Número de líneas secundarias asociadas a la huella espectrométrica del
compuesto.
La tabla de agrupaciones secundarias será mucho más sencilla, ya que lo que
interesa es su abundancia respecto de su agrupación principal, y la masa en la que
estén. Las características que aparecen en ella son las siguientes:
Valor esperado de la relación masa/carga.
Área cromatográfica relativa al área cromatográfica de la especie iónica
más abundante del compuesto (la que consideramos especie iónica
principal).
90
3.2. Método de identificación y eliminación de artefactos químicos.
Para poder detectar y eliminar los artefactos químicos, en primer lugar se han
analizado sus características para intentar encontrar alguna propiedad que tengan todos ellos en común pero que no se cumpla para los compuestos de interés de la muestra, de forma que se puedan distinguir del resto de compuestos según esa propiedad.
En primer lugar vamos a observar algunos artefactos químicos que se
observan en la muestra simple (mezcla de estándares). En la figura 72 se observa el espectrograma de alta resolución (10 mDa) centrado en la masa 206,973 Da, que es la que tiene el artefacto químico observado. Como se puede observar, la intensidad (que aquí se ha representado en escala logarítmica de base 10) se mantiene prácticamente constante durante todo el tiempo de análisis (de 300 a 841 segundos), y las masas no varían mucho más de 10 mDa entre sí, lo que es lógico ya que una intensidad grande hace que las masas tengan poca dispersión si se trata del mismo ion.
Figura 72. Espectrograma de alta resolución (10 mDa) centrado en la masa 206,973 Da.
Representando su cromatograma de ion extraído en la figura 73, se puede
observar que la intensidad se mantiene prácticamente constante durante todo el análisis, excepto en algunos momentos donde se producen picos de intensidad mínima (al contrario de lo que se ha visto siempre en los compuestos) que son debidos a la supresión iónica.
Tiempo(s)
Masa ion (
Da)
Espectrograma de alta resolucion (10 mDa) centrado en 2.069729e+02 +- 0.03 Da
350 400 450 500 550 600 650 700 750 800
206.95
206.96
206.97
206.98
206.99
207
1.5
2
2.5
3
3.5
91
Figura 73. Cromatograma de ion extraído centrado en la masa 206,973 Da.
En la figura 74 está representado el espectrograma de la masa 185,027 Da, con la intensidad en escala logarítmica. En este caso vemos una situación un poco diferente, ya que la intensidad no se mantiene tan uniforme durante todo el análisis, sino que cada vez tenemos más corriente iónica conforme avanza el tiempo de retención. Esto lo observamos mejor en el cromatograma de ion extraído, que se puede ver en la figura 75. En este caso no observamos la presencia evidente de sustracción iónica. Sin embargo, ver la diferencia entre ambos artefactos nos permite descartar la idea de que la intensidad vaya a mantenerse prácticamente igual durante todo el experimento, ya que vemos que no tiene por qué ser así (ya que depende de la fase móvil o estacionaria de la columna cromatográfica, como se explicó anteriormente).
Figura 74. Espectrograma de alta resolución (10 mDa) centrado en la masa 185,027 Da.
300 400 500 600 700 800 9002.2
2.4
2.6
2.8
3
3.2
3.4
3.6
3.8
Tiempo (s)
Inte
nsid
ad e
n e
scala
logarí
tmic
a b
ase 1
0
Cromatograma de ion extraído en el rango de masas (206.973 +- 0.0125) Da
Tiempo(s)
Masa ion (
Da)
Espectrograma de alta resolucion (10 mDa) centrado en 1.850270e+02 +- 0.03 Da
350 400 450 500 550 600 650 700 750 800
185
185.01
185.02
185.03
185.04
185.05
1
1.5
2
2.5
3
3.5
92
Figura 75. Cromatograma de ion extraído centrado en la masa 185,027 Da.
Viendo estos artefactos (y otros que presentan una forma muy parecida a estos pero que no se han introducido aquí porque sería demasiado redundante) hay algo que sí tienen en común, y es que presentan una intensidad bastante grande (generalmente superior a las 500 muestras) durante todo el tiempo de retención del análisis, y prácticamente tienen una entrada con intensidad alta en la masa de su ion y para cada tiempo de retención. Por lo tanto, una primera condición para identificar un posible artefacto químico, es que los artefactos tendrán entradas de alta intensidad en prácticamente todos los tiempos de retención. En los compuestos interesantes (entiéndase los que no son artefactos) que tienen entradas de alta intensidad en todos los tiempos de retención de una masa, sus picos cromatográficos de intensidad siempre son muy grandes en comparación con el fondo de ruido que se puede observar en su cromatograma de ion extraído. Por lo tanto, la detección de los artefactos químicos pasará por ver cómo se distribuyen sus intensidades (histograma), ya que los compuestos interesantes van a tener siempre un gran número de intensidades en su fondo de ruido, y muchas menos intensidades que lleguen hasta una altura muy grande, mientras que los artefactos químicos van a tener un rango mucho menor de intensidades, y sus entradas estarán repartidas uniformemente entre las intensidades. Por lo tanto, lo que interesará será observar el histograma de las intensidades para distinguir los artefactos químicos de los compuestos de interés.
En primer lugar vamos a observar el histograma de varios iones principales, de las muestras de aceite y de las muestras de matrices de estándares.
Masa/carga 377,129 daltons de la muestra 1 de aceites. En la figura 76 mostramos su cromatograma de ion extraído para que se vea que es un ion de interés y en la figura 77 representamos su histograma, para observa la distribución que presenta. Como deja patente el histograma de la figura 77, la mayoría de las entradas tienen intensidades muy pequeñas, y la presencia de picos muy grandes hacen que el rango de intensidades sea significativamente extenso y apenas observemos entradas a partir de la mitad de dicho rango de intensidad.
300 400 500 600 700 800 9002.2
2.4
2.6
2.8
3
3.2
3.4
3.6
3.8
4
Tiempo (s)
Inte
nsid
ad e
n e
scala
logarí
tmic
a b
ase 1
0
Cromatograma de ion extraído en el rango de masas (185.027 +- 0.0250) Da
93
Figura 76. Cromatograma de ion extraído centrado en la masa 377,129 Da.
Figura 77. Histograma de las intensidades alrededor de la masa 377,129 Da.
Masa/carga 213,1 daltons de la muestra 1 de aceites. En la figura 78 se observa su cromatograma de ion extraído, que muestra que hay varios picos cromatográficos interesantes. En la figura 79 se observa su histograma de intensidades, donde una vez más se observa que la gran mayoría de las entradas tiene una intensidad pequeña, y que el rango de intensidades es muy grande ya que va desde intensidades pequeñas hasta intensidades muy grandes.
200 400 600 800 1000 1200 1400 16000
1
2
3
4
5
6
7x 10
5
Tiempo (s)
inte
nsid
ad
Cromatograma de ion extraído en el rango de masas (377.129 +- 0.1250) Da
0 1 2 3 4 5 6 7
x 105
0
10
20
30
40
50
60Histograma
Intensidad
Núm
ero
de e
ntr
adas
94
Figura 78. Cromatograma de ion extraído centrado en la masa 213,1 Da.
Figura 79. Histograma de intensidades para entradas alrededor de la masa 213,1 Da.
Masa/carga 463,089 daltons de la muestra 15 de matrices de estándares. En la figura 80 se observa el cromatograma de ion extraído, mucho más sencillo que los antes vistos ya que únicamente tiene dos picos cromatográficos. La figura 81 se representa el histograma de sus intensidades.
200 400 600 800 1000 1200 1400 16000
1
2
3
4
5
6x 10
4
Tiempo (s)
inte
nsid
ad
Cromatograma de ion extraído en el rango de masas (213.100 +- 0.1250) Da
0 1 2 3 4 5 6
x 104
0
10
20
30
40
50
60
70Histograma
Intensidad
Núm
ero
de e
ntr
adas
95
Figura 80. Cromatograma de ion extraído centrado en la masa 463,089 Da.
Figura 81. Histograma de intensidades para entradas alrededor de la masa 463,089 Da.
Observando podemos concluir que los iones (relaciones masa/carga) que tengan compuestos interesantes, tendrán un histograma con un rango de intensidades muy grande, y la mayoría de sus entradas están en la zona de intensidades bajas. Además, algo que será de utilidad es filtrar paso baja primero la forma cromatográfica del ion, y después representar el histograma de la intensidad en escala logarítmica, lo que permitirá definir un criterio para las diferencias entre los histogramas. Por ejemplo, para el histograma anterior, su representación con la intensidad en escala logarítmica se puede observar en la figura 82, donde queda patente que la gran parte de las entradas de intensidad están en la mitad inferior del rango de intensidades.
300 400 500 600 700 800 9000
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
1.4
1.6
1.8
2x 10
5
Tiempo (s)
Inte
nsid
ad
Cromatograma de ion extraído en el rango de masas (463.089 +- 0.1250) Da
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 1.8 2
x 105
0
5
10
15
20
25
30Histograma
Intensidad
Núm
ero
de e
ntr
adas
96
Figura 82. Histograma de intensidades en escala logarítmica para entradas alrededor de la masa
463,089 Da.
A continuación vamos a observar varios histogramas de compuestos continuos.
Masa/carga 206,973 daltons de la muestra de matrices de estándares. El cromatograma de ion extraído se mostró en la figura 73 y cabe destacar que era prácticamente continuo pero presentaba mucha supresión iónica. Si obtenemos el histograma con la intensidad en escala logarítmica, que se ha representado en la figura 83, observamos que el rango de intensidades es menor ya que empieza a una intensidad mínima mayor y acaba a una intensidad máxima menos (que los valores observados, por ejemplo, en la figura 82), y que la gran mayoría de entradas están repartidas en el rango de las intensidades altas.
Figura 83. Histograma de intensidades para entradas alrededor de la masa 206,976 Da.
1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 5 5.50
0.5
1
1.5
2
2.5
3Histograma
Intensidad en escala logarítmica
Núm
ero
de e
ntr
adas
2.2 2.4 2.6 2.8 3 3.2 3.4 3.6 3.80
1
2
3
4
5
6
7
8
9Histograma
Intensidad en escala logarítmica
Núm
ero
de e
ntr
adas
97
Masa/carga 185,027 daltons de la muestra de matrices de estándares. El cromatograma de ion extraído se mostró en la figura 75. Si representamos el histograma con la intensidad en escala logarítmica, como puede observarse en la figura 84, observamos que en este caso se obtiene una distribución bastante homogénea de las intensidades para las entradas de este ion, lo que es inherente a cualquier artefacto que salga de forma continua. Además, vemos que tiene más entradas a alta intensidad que a baja intensidad, lo que parece ser típico en los artefactos químicos por lo que se ha observado en todas las figuras representadas.
Figura 84. Histograma de intensidades para entradas alrededor de la masa 185,027 Da.
Una vez observados los cromatogramas de los compuestos interesantes y de los artefactos químicos, podemos establecer una serie de condiciones para decidir si en una masa/carga está saliendo un artefacto químico. Las dos condiciones siguientes, cuando ambas se cumplan, identificarán la presencia de un artefacto químico en una relación masa/carga, lo que permitirá eliminarla a continuación para obtener mejores resultados en el método de detección y caracterización de compuestos de una muestra, además de tener un volumen de datos a procesar menor.
El ion (masa/carga con una pequeña variación) tendrá una entrada de valor de intensidad alto para la mayoría de tiempos de retención. En la práctica se ha establecido que, al menos, el 85% de los tiempos de retención han de ser superiores a una intensidad umbral, que se ha cogido de 500 cuentas en ambas colecciones de muestras, ya que es una intensidad bastante grande como para que se considere como un artefacto químico.
El histograma de las intensidades en base logarítmica (previo filtrado paso baja para evitar cambios bruscos) tendrá la mayoría de sus entradas en la parte alta del rango de intensidades. En la implementación se ha dicho que ha de tener más entradas desde el 40% del rango de intensidad, hasta el final del rango de intensidad.
Este método se ha comprobado en muestras de ambas colecciones y sus
resultados (que son altamente satisfactorios) se mostrarán en el apartado de los resultados.
2.2 2.4 2.6 2.8 3 3.2 3.4 3.6 3.8 40
1
2
3
4
5
6
7
8
9Histograma
Intensidad en escala logarítmica
Núm
ero
de e
ntr
adas
98
3.3. Método de agrupación de compuestos de una colección de muestras.
Una vez implementada la herramienta de detección y caracterización de
compuestos en una muestra y el método de identificación y supresión de artefactos químicos, se va a desarrollar un método para la agrupación de compuestos de una colección entera (no sólo de una muestra). Este método es interesante ya que la mayoría de los estudios se realizan sobre una colección de muestras, no sobre una muestra particular, por lo que es interesante tener el resultado conjunto para toda la colección.
La idea de este método es detectar y caracterizar los compuestos de cada una
de las muestras (utilizando el método desarrollado en este trabajo con ese objetivo), para luego comparar los compuestos de las distintas muestras entre sí para ver cuáles son iguales (mismo compuesto en distintas muestras) y cuáles son particulares de una muestra (únicamente detectados en una muestra).
La comparación entre compuestos no se puede hacer únicamente en función
de la masa/carga y el tiempo de retención de su ion principal, ya que no tiene por qué ser el mismo ion, el más abundante en todas las muestras. Por lo tanto, dado que los compuestos han de tener, si las condiciones de ionización son las mismas y la abundancia iónica en las distintas muestras también la misma, la misma huella espectrométrica (sin tener en cuenta ruidos, supresiones iónicas y efectos no lineales). Por lo tanto, dado que la huella espectrométrica más pequeña (con menos líneas) será la del compuesto en la muestra menos abundante (porque será más probable que sus líneas estén por debajo del umbral de detección del método), lo que se va a hacer es establecer una distancia entre huellas espectrométricas. Esta distancia será, en la práctica, el número de líneas espectrométricas que sean iguales (aproximadamente mismo tiempo de retención y misma relación masa/carga) en ambas huellas espectrométricas. Además, para dar más solidez aún a la equivalencia entre compuestos, también han de ser parecidas las áreas relativas de las líneas espectrométricas con el área del ion principal, de forma que también se usará esa información para establecer la distancia entre dos compuestos. El método implementado con este fin partirá de las tablas resultantes de la aplicación del método principal para cada muestra, y buscará compuestos iguales entre las tablas, decidiendo si son los mismos compuestos si la distancia entre ellos es lo suficientemente pequeña. La condición para que dos compuestos se consideren el mismo, es la siguiente:
- Tengan un número suficiente de líneas espectrométricas iguales. Dos líneas espectrométricas se considerarán iguales si sus tiempos de
retención se diferencian menos de un umbral y si la diferencia entre sus relaciones masa/carga también es menor que un umbral. El umbral de masa/carga debería depender realmente de la abundancia iónica de cada línea espectrométrica, ya que las líneas de menor intensidad se verán afectadas en mayor medida por el ruido estadístico, lo que hará fluctuar más su valor esperado de relación masa/carga.
Además, se tendrá que cumplir que las áreas relativas de las líneas
espectrométricas sean también parecidas, aunque este criterio ha de ser mucho más flexible en la implementación ya que las áreas cromatográficas se han calculado de una forma que puede dar variaciones significativas. Por lo tanto, este método podrá ser más o menos restrictivo según si el método
99
de detección y caracterización de compuestos es más o menos preciso, y mejorará con cualquier mejora realizada sobre el método principal.
En la práctica, si de las 5 líneas más abundantes, 3 eran iguales (según
el criterio anterior), entonces los dos compuestos se han considerado el mismo.
De cada dos compuestos que compare y detecte que son iguales, me quedaré con el que sea más abundante en su muestra (mayor área cromatográfica) ya que será el que tenga una huella espectrométrica más completa y unos valores esperados más precisos. Sin embargo, cuando compare un compuesto con todos los que he encontrado en la colección, y no sea equivalente a ninguno de ellos, entonces el compuesto será un nuevo compuesto de la colección. Para completar los resultados de este método, también se indicarán en qué muestra se ha visto cada compuesto y con qué abundancia iónica (área), lo que facilitará mucho cualquier estudio químico (o simplemente estadístico) sobre la colección de muestras.
100
4. Resultados y comprobación.
En este apartado se mostrarán y comprobarán los resultados obtenidos para cada uno de los métodos en las colecciones de muestras, comparándolos con los resultados obtenidos mediante un análisis manual y discutiendo la comparación. Sin embargo, dado que el volumen de resultados es muy grande, únicamente se van a poner los más significativos o relevantes y se dejarán otros en el apéndice, para que el lector pueda analizar con detalle los resultados que desee.
4.1. Identificación de artefactos químicos en ambas colecciones.
Muestra de la colección de matrices de estándares.
Aplicando el método implementado para identificar artefactos químicos en la muestra 15 de la colección de matrices de estándares, se han obtenido cuatro valores de masa en los que hay un artefacto químico: 174,9560, 185,0279, 206,9729 y 304,9132 Da. A continuación se verán los cromatogramas de ion extraído para cada una de estas masas, comprobando así si efectivamente son artefactos químicos (el método ha funcionado).
Los valores 185,028 Da y 206.973 Da coinciden con los que evaluamos antes
(figuras 75 y 73, respectivamente), lo que es lógico ya que el método se diseñó, en parte, en base a ellos.
En la figura 85 podemos a observar el espectrograma de ion extraído alrededor
de la masa 174,956 Da, donde se observa que, efectivamente, en esta masa/carga sale un artefacto químico, por lo que el método ha funcionado correctamente al identificarlo.
Figura 85. Cromatograma de ion extraído centrado en la masa 174,956 Da.
300 400 500 600 700 800 9000
500
1000
1500
2000
2500
3000
Tiempo (s)
inte
nsid
ad
Cromatograma de ion extraído en el rango de masas (174.956 +- 0.1250) Da
101
Observando en la figura 86 el cromatograma de ion extraído centrado en la masa/carga 304,913 Da, se observa que también es una masa en la que sale un artefacto químico.
Figura 86. Cromatograma de ion extraído centrado en la masa 304,913 Da.
Según estos resultados, el método ha identificado 4 artefactos químicos en la muestra 15 de la colección de matrices de estándares, estando los 4 correctamente identificados.
Muestra de la colección de extractos fenólicos de aceites de oliva.
Una vez hemos probado el método con la muestra de la colección de matrices de estándares, vamos a usar el método en la muestra 1 de la colección de extractos fenólicos de aceites de oliva para ver en qué masas indica la presencia de artefactos químicos.
Masa/carga (Da) de iones identificados como artefactos químicos en la muestra analizada
59,012 89,023 96,962 116,931 128,037 188,956
157,018 173,015 174,994 186,993 194,929 201,028
202,028 203,018 217,005 218,009 218,923 221,024
223,024 232,038 232,991 240,971 242,969 247,016
255,234 263,037 291,991 359,018 374,994
Tabla 8. Artefactos químicos detectados en la muestra 1 de la colección de aceites.
Las masas en las que el método ha determinado que salen artefactos químicos, son las que aparecen en la tabla 8. En este caso se han detectado muchos más artefactos químicos que antes (en total 29 artefactos frente a los 4 anteriores), lo que es lógico ya que es una muestra más compleja. Sin embargo, para asegurarnos de que el método no ha seleccionado por error compuestos interesantes, vamos a comprobar cada uno de ellos. En la figura 87 se puede observar uno de ellos, correspondiente a la masa 59,012 Da y se observa perfectamente que es un artefacto químico, de mucha intensidad además (una media de 4.500 cuentas).
300 400 500 600 700 800 9000
500
1000
1500
2000
2500
Tiempo (s)
inte
nsid
ad
Cromatograma de ion extraído en el rango de masas (304.913 +- 0.1250) Da
102
Figura 87. Cromatograma de ion extraído centrado en la masa 59,012 Da.
En la figura 88 se observa otra masa/carga detectada por el método, la de valor 174,994 Da. El cromatograma de ion extraído muestra que, para esta masa, la intensidad baja a lo largo de todo el análisis y, como en el caso anterior, las entradas de esta masa corresponden a un artefacto químico que se ha hecho bien en detectar.
Figura 88. Cromatograma de ion extraído centrado en la masa 174,994 Da.
Para no llenar este apartado de figuras muy parecidas, todos los cromatogramas de ion extraído de las masas detectadas por el método de identificación de artefactos químicos, se pueden consultar en el apéndice 2. Tras comprobar cada uno de los 29 cromatogramas de ion extraído para las masas detectadas como artefacto químico, se puede concluir en que todos corresponden a un artefacto químico, por lo que las 29 relaciones masa/carga son correctas.
200 400 600 800 1000 1200 1400 16002000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
9000
Tiempo (s)
Inte
nsid
ad
Cromatograma de ion extraído en el rango de masas (59.012 +- 0.0250) Da
200 400 600 800 1000 1200 1400 16000
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
Tiempo (s)
Inte
nsid
ad
Cromatograma de ion extraído en el rango de masas (174.994 +- 0.0250) Da
103
Como conclusión, este método ha identificado y suprimido 4 artefactos químicos en una muestra de la colección de matrices de estándares, y 29 artefactos químicos en una muestra de la colección de extractos fenólicos de aceite de oliva. De los 33 artefactos químicos identificados en ambas muestras, el 100% son realmente artefactos químicos, por lo que el método ha dado unos resultados muy buenos.
La gran novedad de este método frente a otros implementados en este campo
es que detecta los artefactos químicos en un preprocesamiento de los datos (antes de obtener los resultados), cuando hasta el momento únicamente se había conseguido realizar esa identificación tras obtener los resultados, lo que hace que el volumen de datos a procesar sea mucho mayor.
104
4.2. Aplicación del método de detección y caracterización de compuestos a una muestra simple sin eliminar artefactos químicos. En este apartado se va a realizar una primera prueba del método
implementado para la detección y caracterización de compuestos, para ver algunos resultados interesantes y observar la gran utilidad
La muestra con la que se va a realizar la prueba va a ser la número 15 de la
colección de muestras simples (matrices de estándares), ya que como vimos en la
descripción de esta colección, esta muestra tiene presentes los 5 compuestos
polifenólicos que se mezclaron en el laboratorio. En la figura 30 se observó su
espectrograma de baja resolución (1 Da), donde se podían ver 7 compuestos distintos
(los 5 mezclados y 2 contaminantes debidos a los anteriores).
Para la ejecución del método, el umbral alto de intensidad se sitúa en 2.000
cuentas (cualquier pico principal debería superarlas) y el umbral bajo de intensidad en
80 muestras.
A continuación mostramos los datos de interés:
La búsqueda de candidatos a iones principales (umbral alto) ha tardado
0,111 segundos, encontrando un total de 91 candidatos. Sus picos
cromatográficos se han delimitado en 0,179 segundos.
De los 91 candidatos a iones principales, se han distinguido 67 como iones
principales (compuestos distintos) y 24 como iones secundarias de otro
compuesto, tardando 0,131 segundos en comparar las agrupaciones.
La búsqueda de iones secundarios con poca abundancia y su asignación a
su ion principal ha tardado 1,552 segundos, encontrando 1.192 nuevas
agrupaciones secundarias (aparte de las 24 encontradas en un principio).
El cálculo de características de los picos cromatográficos de cada especie
iónica encontrada se ha hecho en 0,349 segundos.
En total, incluyendo lectura de fichero de datos, se ha tardado
aproximadamente 2,5 segundos, con un procesador de 4 núcleos a 2,5
GHz.
En estos resultados podemos decir que el método es muy rápido, pero en
absoluto podemos decir que tenga resultados lógicos, porque esta muestra tiene,
como se dijo anteriormente, 7 compuestos y nosotros hemos encontrado 67. Sin
embargo, en la tabla 9 se pueden observar los compuestos detectados ordenados por
área cromatográfica. Se han destacado en color verde aquellos compuestos que, por
su masa/carga, sabemos que el método de identificación de artefactos químicos los
detecta como artefactos químicos (apartado 4.1), por lo que todos esos compuestos
serán eliminados al aplicar dicho método, quedando finalmente los 7 compuestos que
deben detectarse y caracterizarse.
Compuesto Tiempo (s) Masa/carga (Da)
1 799,5 463,089
2 744,0 609,148
3 498,8 191,056
105
4 373,5 595,133
5 634,9 179,035
6 354,7 206,973
7 615,7 206,972
8 599,2 191,056
9 412,2 463,088
10 586,9 206,972
11 755,6 206,974
12 680,4 206,973
13 452,5 206,973
14 422,2 206,973
15 788,1 206,974
16 538,7 185,026
17 363,1 174,956
18 690,6 185,028
19 833,0 185,028
20 748,4 185,028
21 822,0 185,028
22 708,6 185,028
23 724,1 185,028
24 759,9 185,028
25 778,7 185,029
26 735,3 185,028
27 735,3 185,028
28 806,4 185,028
29 775,5 185,029
30 793,4 185,029
31 811,9 185,028
32 772,4 185,029
33 668,3 185,028
34 646,1 185,028
35 656,0 185,028
36 675,0 185,028
37 829,4 206,973
38 583,5 185,027
39 560,3 185,027
40 631,4 185,028
41 571,1 185,028
42 601,7 185,028
43 305,7 206,974
44 550,2 206,972
45 617,3 185,027
46 523,4 206,971
47 436,6 206,973
48 472,2 206,971
106
49 810,0 206,974
50 768,4 206,973
51 537,1 206,971
52 659,9 206,972
53 593,1 206,972
54 707,9 206,973
55 718,2 206,973
56 562,5 206,972
57 458,1 206,974
58 605,3 206,974
59 669,4 206,974
60 608,5 185,028
61 510,4 206,971
62 837,6 206,974
63 488,8 206,972
64 647,3 206,973
65 329,0 206,973
66 395,2 206,973
67 512,5 185,027
Tabla 9. Iones principales obtenidos con la aplicación del método a la muestra 15 de la colección de matrices. Se destacan en verde los iones correspondientes a artefactos químicos identificados.
Es evidente que, si no se hubiese implementado el método de identificación de
artefactos químicos, el resultado de la aplicación del método de detección de
compuestos sería correcto, ya que detecta los 7 compuestos de la muestra, pero
también detecta muchos compuestos falsos debidos a las fluctuaciones de alta
intensidad que hay en los artefactos químicos, que hacen que el método los pueda
confundir con compuestos de interés.
Una vez que se ha observado la utilidad tan grande del método de
identificación de artefactos químicos para obtener resultados más limpios y en menos
tiempo con el método de detección y caracterización de compuestos, se va a pasar a
observar la huella espectrométrica con la que ha caracterizado el método a cada
compuesto detectado. Debido al elevado número líneas espectrométricas de la huella
espectrométrica de cada compuesto, únicamente se analizará la huella de un
compuesto y el resto se dejarán en el apéndice 1 por si quieren consultarse sus datos
individualmente. El compuesto que se va a analizar es el más abundante de la
muestra (compuesto número 1 de la tabla 9), ya que es el que más agrupaciones
secundarias tiene. En la tabla 10 se muestra la masa/carga de la especie iónica
principal (línea espectrométrica principal, número 1 en la tabla) y las de las 44
especies iónicas asociadas al compuesto. Además, se muestra el área cromatográfica
relativa (área de la línea secundaria relativa al área de la línea principal).
Línea espectrométrica Masa/carga (Da) Área relativa
1 463,089 100,00
2 464,092 25,9
3 465,094 4,33
4 531,073 3,45
107
5 300,026 2,07
6 563,013 1,29
7 547,042 1,13
8 301,034 1,13
9 533,059 0,94
10 593,045 0,87
11 521,043 0,84
12 548,052 0,82
13 553,046 0,78
14 615,029 0,67
15 562,007 0,66
16 466,097 0,57
17 928,19 0,51
18 599,052 0,50
19 532,073 0,40
20 384,988 0,37
21 579,06 0,37
22 565,007 0,36
23 583,033 0,36
24 523,044 0,34
25 564,02 0,33
26 575,099 0,33
27 616,029 0,33
28 621,052 0,30
29 646,973 0,28
30 927,183 0,26
31 601,046 0,24
32 630,997 0,24
33 617,025 0,23
34 585,011 0,22
35 467,099 0,21
36 605,013 0,21
37 534,061 0,20
38 549,049 0,18
39 517,012 0,17
40 551,053 0,15
41 667,043 0,15
42 671,106 0,15
43 561,047 0,10
44 302,037 0,09
45 522,051 0,02
Tabla 10. Líneas de la huella espectrométrica del compuesto 1 (el más abundante) de la tabla 9.
Para ver si realmente las líneas espectrométricas detectadas coinciden en forma cromatográfica con la línea espectrométrica principal, se pueden representar unas y otras en la misma figura. Sin embargo, al ser 45 figuras no se van a poner aquí todas, sino que se van a observar unas pocas para observar algunos detalles y comprobar que distancia utilizada es correcta.
En primer lugar, en la figura 89 observamos el pico cromatográfico del ion
108
principal del compuesto 1 (tabla 9) junto con el pico cromatográfico asociado a una especie iónica detectada (que está en la masa/carga 464,09 Da, por lo que es una variante isotópica del ion principal). En la figura 89 se puede observar que ambas formas cromatográficas (con la intensidad en escala logarítmica) son prácticamente iguales salvo un factor de escala, lo que hace que la distancia entre ellas sea muy pequeña (similitud muy elevada, del 99,7%). En este caso las formas cromatográficas son prácticamente iguales dado que la alta intensidad de sus entradas hace que sus picos se vean poco afectados por el ruido estadístico.
Figura 89. Formas cromatográficas de iones principal y secundario con intensidad en escala
logarítmica.
Siguiendo con la misma huella espectrométrica, podemos observar también algunas agrupaciones de mucha menor intensidad, pero que siguen manteniendo la forma cromatográfica de la agrupación principal, lo que les aporta una alta similitud. Un ejemplo de esta situación se observa en la figura 90, donde se mantiene una similitud alta a pesar de que el pico cromatográfico secundario se ve bastante más afectado por el ruido estadístico que el de la figura 89.
Figura 90. Formas cromatográficas de iones principal y secundario con intensidad en escala
logarítmica.
Sin embargo, aquí es donde observamos problemas en esta búsqueda, ya que mientras que las líneas secundarias de moderada intensidad están bien formadas y
780 785 790 795 800 805 810 815 820 825 8302
2.5
3
3.5
4
4.5
5
5.5Agrupaciones secundaria y principal
Tiempo (s)
Inte
nsid
ad e
n e
scala
logarí
tmic
a
Principal con:
Tiempo: 799.5
Masa pesada: 463.089
Secundaria con:
Similitud al 99.7
Masa pesada de 464.092
780 785 790 795 800 805 810 815 820 825 8302
2.5
3
3.5
4
4.5
5
5.5Agrupaciones secundaria y principal
Tiempo (s)
Inte
nsid
ad e
n e
scala
logarí
tmic
a
Principal con:
Tiempo: 799.5
Masa pesada: 463.089
Secundaria con:
Similitud al 98.4
Masa pesada de 300.026
109
tienen un coeficiente de similitud generalmente superior al 97%, las agrupaciones de baja intensidad (entiéndase 400 cuentas, por ejemplo), no tienen bien formada la forma cromatográfica del pico, y usualmente les faltan algunas entradas por el motivo que sea (sustracción iónica, dispersión elevada, ruido estadístico, etc.), lo que hace muy difícil establecer un umbral de similitud. Conforme baja la abundancia del pico cromatográfico de la línea espectrométrica, aparecen algunos picos que, aunque sigue siendo evidente que se corresponden con el compuesto por su forma cromatográfica, ésta se presenta bastante afectada por el ruido. Un ejemplo de este tipo de picos se puede observar en la figura 91.
Figura 91. . Formas cromatográficas de iones principal y secundario con intensidad en escala
logarítmica.
Tras observar la comparación entre las formas cromatográficas de las especies iónicas principal y secundaria asociadas al mismo compuesto, se puede concluir en que el umbral de similitud será un valor muy complicado de establecer, ya que deberá incluir el mayor número de líneas espectrométricas en la huella espectrométrica del compuesto, sin incluir ninguna que corresponda a ruido o a la huella espectrométrica de otro compuesto. También se concluirá en que la correlación de formas cromatográficas es una forma adecuada para asociar especies iónicas del mismo compuesto entre sí, ya que se asocian perfectamente cuando la intensidad de la secundaria es grande (pico muy poco afectado por ruido estadístico) y también se asociarán cuando su intensidad sea menor, aunque aumentará la probabilidad de que la presencia de efectos nocivos afecte al pico cromatográfico y la correlación se reduzca drásticamente. Sin embargo, el hecho de observar que se obtienen resultados adecuados es lo realmente valioso de este trabajo, ya que nuestro objetivo no es hacer una herramienta óptima para la detección de compuestos y caracterización de su huella espectrométrica, sino comprobar que la idea de desarrollar una herramienta profesional detectando y caracterizando compuestos en base a su forma cromatográfica por correlación, tiene potencial, lo que sí se consigue con estas comprobaciones.
780 785 790 795 800 805 810 815 820 825 8302
2.5
3
3.5
4
4.5
5
5.5Agrupaciones secundaria y principal
Tiempo (s)
Inte
nsid
ad e
n e
scala
logarí
tmic
a
Principal con:
Tiempo: 799.5
Masa pesada: 463.089
Secundaria con:
Similitud al 96.4
Masa pesada de 466.097
110
4.3. Aplicación del método de detección y caracterización de compuestos a una muestra simple preprocesando los artefactos químicos. En este apartado se aplica el método de detección y caracterización de
compuestos en la muestra 15 de la colección de matrices de estándares. Previamente a su aplicación, se aplica el método de identificación y supresión de artefactos químicos.
El método de identificación y supresión de artefactos químicos se ejecuta en
0,140 segundos y detecta los 4 artefactos que se dijeron en el apartado 4.1. Con el descarte de las entradas que corresponden a artefactos químicos, el
tiempo de ejecución del método se reduce, tardando únicamente 0,41 segundos (casi 2 segundos menos de antes de quitar los artefactos químicos). En la tabla 11 se observan los compuestos detectados y caracterizados en la muestra. Como se puede observar en la tabla, ahora sí se han encontrado exactamente los compuestos que hay en la muestra que estamos analizando y el tiempo de ejecución ha sido de poco más de medio segundo, por lo que hemos conseguido una mejora drástica al eliminar los artefactos químicos. Los resultados completos (incluyendo la huella espectrométrica de cada compuesto) están en el apéndice 1.
Compuesto Tiempo de
retención (s) Masa/carga (Da) (s) (mDa) Área (80%)
Nº de agrupaciones secundarias
1 373,5 595,133 5,168 1,254 160.384 10
2 412,2 463,088 4,896 2,134 30.544 3
3 498,8 191,056 2,309 0,688 246.900 41
4 599,2 191,056 1,847 0,640 47.660 9
5 634,9 179,035 2,084 0,441 200.556 42
6 744,0 609,148 2,201 0,627 350.664 27
7 799,5 463,089 1,991 0,648 677.852 42
Tabla 11. Agrupaciones principales tras los nuevos umbrales y condiciones.
Una vez que hemos obtenido los resultados para esta muestra, vamos a realizar una pequeña prueba para ver cómo se comporta el método cuando no se preprocesa tanto como se ha preprocesado ésta. En concreto vamos a analizar la muestra sin preprocesado de ruido (sin aplicar umbrales de intensidad ni filtrado de entradas aisladas) y sin identificación de artefactos químicos, únicamente acotando los tiempos exactamente igual a como hicimos antes. La aplicación del método de detección y caracterización de compuestos en la muestra ha tardado un total de 5 segundos (4,5 segundos más que antes) y obtiene los mismos compuestos (teniendo en cuenta los artefactos químicos), variando un poco el número de agrupaciones secundarias encontradas, lo que deja palpable el hecho de que es mejor utilizar el filtrado de ruido previo, un umbral de intensidad que elimine la distribución de entradas debidas a ruido iónico y el método que identifica y suprime los artefactos químicos, ya que hace que el volumen de datos sea significativamente inferior y se tarde mucho menos en analizar la muestra (sin filtrar el ruido se ha tardado 10 veces más), lo que será especialmente importante para muestras más complejas que esta. En este caso la comprobación de que el método ha funcionado es bastante sencilla, ya que no hay más que observar el espectrograma de baja resolución de la muestra para darse cuenta de los siete compuestos que hay en los tiempos de retención acotados. Además, dado que sabemos que no hay coelución ya que ha sido preparada específicamente en el laboratorio con este fin, se puede identificar cada
111
compuesto y su huella espectrométrica de forma directa, como puede observarse en la figura 92. En la figura queda patente que los compuestos coinciden con los encontrados en la tabla de resultados (tabla 11), por lo que hemos comprobado que el método funciona correctamente en esta muestra.
Figura 92. Espectrograma de baja resolución (1 Da) con los 7 compuestos identificados con un
rectángulo amarillo.
Representando el cromatograma de pico base de la muestra con la intensidad en escala logarítmica en la figura 93, observamos que los siete compuestos se pueden detectar también por el método de detección manual, aunque el segundo se podría confundir con ruido ya que queda enmascarado parcialmente por éste.
Figura 93. Cromatograma pico base con los compuestos encontrados marcados.
300 400 500 600 700 800 9003
3.5
4
4.5
5
5.5
X: 374.5
Y: 4.435
Tiempo (s)
Inte
nsid
ad e
n e
scala
logarí
tmic
a
Cromatograma de pico base
X: 411.6
Y: 3.653
X: 498.9
Y: 4.838
X: 600.2
Y: 4.005
X: 634.3
Y: 4.745
X: 742.7
Y: 5.001
X: 798.9
Y: 5.257
Compuesto1.
Masa 595,133 Da
Compuesto 2.
Masa 463,088 Da
Compuesto 4.
Masa 191,056 Da
Compuesto 3.
Masa 191,056 Da
Compuesto 5.
Masa 179,035 Da
Compuesto 6.
Masa 609,148 Da
Compuesto 7.
Masa 463,089
Da
112
Como conclusión de estos resultados se puede decir que, para muestras simples (sin coelución de compuestos), el método obtiene los mismos resultados que un método manual (7 compuestos detectados y ningún falso positivo), pero además caracterizando cada compuesto con su huella espectrométrica y con el proceso completamente automático, mejorando así las búsquedas manuales en muestras simples con el método implementado. Aunque estos resultados son buenos, la comprobación más importante del método se hará con las muestras de la colección de aceites, ya que será ahí donde el método se enfrentará a una situación mucho más compleja al haber muchos más compuestos y coelución de muchos de ellos.
113
4.4. Resultados obtenidos para una muestra de la colección de aceites. En este apartado se va a obtener el resultado de aplicar el método de
detección y caracterización de compuestos en la muestra 1 de la colección de extractos fenólicos de aceites de oliva.
El espectrograma de baja resolución de la muestra completa (sin preprocesado
de ruido, limitación temporal ni supresión de artefactos químicos) se puede observar en la figura 62. Para notar la importancia del preprocesado de la muestra, en la tabla 12 se muestra el número de entradas de la muestra en los distintos pasos del preprocesado. De los datos se desprende que el último paso (identificación y eliminación de los artefactos químicos) es el que menos entradas suprime del total, pero hay que tener en cuenta que todas las entradas que suprime tienen una intensidad muy elevada, por lo que hará que los métodos que se usen tras este preprocesado tarden mucho menos al no haber tantas entradas de alta intensidad. Por ejemplo, el número de entradas con una intensidad superior a 1.000 cuentas es de 75.388 antes de eliminar artefactos químicos (tras realizar el resto del preprocesado) y se reduce a 50.371 tras eliminar los artefactos químicos, por lo que se han reducido a un 66,82% las entradas de alta intensidad, lo que es realmente muy beneficioso para cualquier procesamiento posterior de los datos.
Número de entradas
Antes del
preprocesado
Tras filtrado y umbral de 120 cuentas
Tras filtrado, umbral y limitación temporal
Tras filtrado, umbral de 120 cuentas,
eliminación de los 29 artefactos químicos
Porcentaje (final/original)
Muestra 1
de la colección
de extractos de aceites
de oliva
6.717.788 661.560 475.864 443.965 6,61 %
Tabla 12. Número de entradas según el grado de preprocesado realizado.
Para la detección y caracterización de compuestos por el método
implementado en este trabajo, se utilizará un umbral alto de intensidad de 8.000
cuentas, ya que la muestra es mucho más abundante que en el caso anterior, y un
umbral bajo de intensidad de 120 cuentas, como se defendió en el análisis del ruido.
Para la búsqueda de artefactos químicos se ha usado un umbral de intensidad de 500
cuentas.
A continuación se pueden observar los tiempos que ha tardado en ejecutarse
(siempre se ha usado un procesador de 4 núcleos a 2,5 GHz cada uno):
La búsqueda de artefactos químicos y su eliminación ha tardado 1,845
segundos, encontrando los 29 artefactos químicos que ya analizamos en el
apartado de resultados dedicado a la aplicación de su método (todos son
artefactos químicos).
La búsqueda de candidatos a ion principal de compuesto ha tardado 0,223
segundos y ha encontrado 217 candidatos, delimitándolos en 2,90 segundos.
114
Los candidatos se han comparado en 1,177 segundos y se ha encontrado que
83 son principales y 134 son secundarias.
La búsqueda de iones secundarios ha tardado 25,56 segundos, encontrando
5.013 especies iónicas nuevas.
Los cálculos de las características de las especies iónicas han tardado 4,76
segundos.
El método ha tardado un total de 34,4 segundos en delimitar y caracterizar la
muestra compleja, por lo que se puede concluir que es rápido pero mejorable.
Comprobar los resultados no es fácil, ya que hay muchos compuestos y cada
uno tiene una huella espectrométrica muy extensa. Sin embargo, podemos comprobar
juntos los que tengan la misma masa para asegurarnos de que están bien delimitados
entre sí y correctamente reconocidos. Por ejemplo, en la figura 94 se puede observar
el cromatograma de ion extraído centrado en la masa 377,128 Da, con todas los picos
cromatográficos principales (ion principal de cada compuesto) resaltados en un color
distinto para que se diferencien entre sí. Si nos fijamos en la imagen, podemos
observar que todos los isómeros de la oleuropeína aglicona se han diferenciado del
resto formando compuestos independientes.
Figura 94. Cromatograma de ion extraído centrado en la masa 377,128 Da. Se pueden observar los picos cromatográficos principales en distintos colores.
Si observamos cada uno de los cromatogramas de ion extraídos que contienen uno o más picos cromatográficos principales detectados en la muestra (uno por compuesto), llegaremos a la conclusión que, de los 83 picos principales obtenidos, 19 serán falsos positivos (debidos principalmente al lavado final) y 64 restantes sí podrán ser picos cromatográficos principales de un compuesto distinto, lo que tendrá que comprobarse más adelante. En el apéndice 3 se han incluido las representaciones cromatográficas de los 83 supuestos compuestos detectados por el método.
Para realizar la comprobación de estos resultados se comprobará tanto la
detección correcta de los compuestos, como su caracterización. En primer lugar se va
0 5 10 15 20 250
1
2
3
4
5
6
7x 10
5
Tiempo (s)
Inte
nsid
ad
Cromatograma de ion extraído en el rango de masas (377.128 +- 0.0250) Da
Cromatograma ion extraído
Tiempo: 1245.770 s (20.76 min) Masa: 377.128 (Da)
Tiempo: 1133.145 s (18.89 min) Masa: 377.127 (Da)
Tiempo: 889.115 s (14.82 min) Masa: 377.127 (Da)
Tiempo: 1074.869 s (17.91 min) Masa: 377.127 (Da)
Tiempo: 1294.581 s (21.58 min) Masa: 377.127 (Da)
Tiempo: 1047.044 s (17.45 min) Masa: 377.128 (Da)
Tiempo: 975.558 s (16.26 min) Masa: 377.127 (Da)
Tiempo: 848.365 s (14.14 min) Masa: 377.127 (Da)
Tiempo: 1315.032 s (21.92 min) Masa: 377.127 (Da)
Tiempo: 861.613 s (14.36 min) Masa: 377.126 (Da)
Tiempo: 760.632 s (12.68 min) Masa: 377.126 (Da)
Tiempo: 757.462 s (12.62 min) Masa: 377.126 (Da)
Tiempo: 1148.099 s (19.13 min) Masa: 377.127 (Da)
Tiempo: 1026.004 s (17.10 min) Masa: 377.128 (Da)
115
a comprobar que se hayan encontrado, al menos, los compuestos que se pueden
encontrar a mano tras un arduo análisis manual llevado a cabo por un experto. Para
ello, y dado que hemos manejado hasta el momento la muestra 1 de la colección de
aceites de oliva, vamos a seguir utilizándola ya que encontramos la información que
deseamos en uno de los artículos de la bibliografía [5]. En la tabla 13 se observa la
lista de compuestos encontrados manualmente en la muestra por un experto, en los
rangos temporales analizados, con la masa de su ion principal.
Número Tiempo de retención
(minutos) Relación masa/carga
experimental (Da) Posibles compuestos
1 6,47 153,0555 Hidroxitirosol
2 8,15 137,0605 Tirosol
3 14,53 319,1177 Deacetoxi oleuropeína aglicona
4 15,94 285,0399 Luteolina
5 16,69 357,1339 Pinoresinol
6 17,33 415,1381 Acetoxipinoresinol
7 18,68 269,0468 Apigenina
8 17,71 303,1237 Deacetoxi ligustrósido aglicona
9 14,12 377,1231 Oleuropeína aglicona isómero 1
10 14,78 377,1246 Oleuropeína aglicona isómero2
11 16,22 377,1236 Oleuropeína aglicona isómero 3
12 17,41 377,1260 Oleuropeína aglicona isómero 4
13 17,88 377,1253 Oleuropeína aglicona isómero 5
14 18,88 377,1264 Oleuropeína aglicona isómero 6
15 19,05 377,1268 Oleuropeína aglicona isómero 7
16 20,89 377,1271 Oleuropeína aglicona isómero 8
17 21,02 377,1267 Oleuropeína aglicona isómero 9
18 21,59 377,1269 Oleuropeína aglicona isómero 10
19 21,87 377,1259 Oleuropeína aglicona isómero 11
20 13,15 187,0975 Ácido azeláico
21 13,88 335,1145 Deacetoxi 10-hidroxi-oleuropeína
aglicona
22 15,72 417,1530 Siringaresinol
23 16,99 391,1387 Metil oleuropeína aglicona isómero 1
24 19,30 299,0577 Crisoeriol
25 16,47 361,1286 Ligustrósido aglicona isómero 1
26 16,64 361,1284 Ligustrósido aglicona isómero 2
27 17,48 361,1299 Ligustrósido aglicona isómero 3
28 19,10 361,1312 Ligustrósido aglicona isómero 4
29 20,74 361,1315 Ligustrósido aglicona isómero 5
30 20,99 361,1316 Ligustrósido aglicona isómero 6
31 21,89 361,1305 Ligustrósido aglicona isómero 7
Tabla 13. Compuestos presentes en la muestra 1 de extractos de aceites tras una búsqueda manual realizada por un experto en química analítica.
Como se puede observar en la tabla 13, tenemos 31 compuestos de masas
experimentales conocidas (de su ion principal) y tiempos de retención conocidos, por
116
lo que vamos a buscarlos en la tabla de compuestos que hemos encontrado en
nuestro método y así descubriremos cuántos hemos encontrado. La lista de
agrupaciones principales encontradas en la muestra 1, ordenadas según salen de la
columna separativa, se puede observar en la tabla 14. En la tabla se han remarcado
en verde los compuestos que deberían salir según la tabla 13 y que los detecta
nuestro método de detección.
Compuesto Tiempo de
retención (s) Masa/carga
(Da) ( ) ( )
Área (80%)
Nº agrupaciones secundarias
1 6,46 153,058 2,20 0,21 521116 26
2 8,17 137,062 1,87 0,59 78920 7
3 12,37 139,007 5,22 0,63 74384 69
4 12,62 377,126 3,87 1,40 64584 12
5 12,68 377,126 5,50 1,44 97872 18
6 12,75 213,078 8,55 0,78 187400 22
7 12,77 139,007 5,29 0,45 161620 75
8 12,84 241,073 4,01 0,90 49596 31
9 13,08 349,132 19,94 0,86 520236 11
10 13,21 187,099 3,37 0,37 113260 7
11 13,23 95,049 4,57 0,53 112532 143
12 13,42 139,007 8,17 0,38 452504 41
13 13,51 213,078 7,95 0,96 124860 114
14 13,82 275,092 4,40 1,29 79396 101
15 13,88 335,116 1,64 0,87 146704 7
16 13,91 183,068 8,19 0,29 546232 39
17 14,04 195,068 5,60 0,98 81096 78
18 14,14 377,127 1,91 0,58 191656 41
19 14,17 95,049 7,44 0,40 241368 45
20 14,20 275,093 4,47 0,79 110872 25
21 14,36 377,126 4,55 0,90 170412 61
22 14,48 319,121 11,59 0,42 2516948 71
23 14,68 195,067 16,75 0,54 540280 64
24 14,68 185,118 1,31 1,28 27864 27
25 14,77 95,049 5,48 0,46 129556 50
26 14,82 377,127 2,22 0,74 752980 60
27 14,82 393,122 4,74 1,28 63240 20
28 14,85 320,124 22,02 0,72 673952 4
29 15,20 319,121 12,69 0,43 1788304 11
30 15,21 393,122 3,22 0,88 102412 58
31 15,25 95,049 8,92 0,38 124940 129
32 15,43 185,048 3,24 1,99 77332 9
33 15,48 195,068 10,11 0,61 104672 8
34 15,73 417,157 1,95 1,27 43152 13
35 15,97 285,043 1,95 0,45 879488 22
36 16,00 391,143 3,38 0,75 54108 33
37 16,19 319,120 1,96 0,71 51024 16
38 16,26 377,127 3,06 0,81 271696 28
39 16,34 241,073 1,74 0,62 135720 1
40 16,49 361,132 2,08 0,59 121084 75
41 16,69 275,092 3,37 0,72 71172 127
42 16,71 357,137 1,78 0,53 133212 7
43 17,01 391,143 2,35 0,44 91176 21
44 17,10 377,128 4,55 0,95 114320 138
45 17,20 307,084 4,53 0,74 145948 38
46 17,34 415,142 2,08 0,55 625536 35
117
47 17,45 377,128 6,33 0,69 306052 115
48 17,48 213,078 2,73 0,37 310524 34
49 17,86 183,068 31,13 0,65 631608 21
50 17,91 377,127 2,66 0,46 456260 62
51 18,35 325,185 18,34 1,26 335368 76
52 18,43 275,090 8,16 0,99 247556 136
53 18,70 269,046 2,21 0,26 350044 6
54 18,89 377,127 2,09 0,57 737884 61
55 18,93 275,092 3,11 0,66 229428 48
56 19,13 377,127 4,85 0,67 539236 149
57 19,16 242,177 2,92 0,34 56000 5
58 19,17 361,132 4,49 1,03 59668 25
59 19,29 241,073 2,23 0,83 37992 3
60 19,32 299,057 1,67 1,15 36888 6
61 19,57 311,170 23,66 0,76 646700 51
62 19,58 149,026 10,02 0,62 194444 62
63 19,66 275,092 10,94 0,89 436996 93
64 20,19 391,142 3,46 0,97 48932 23
65 20,23 275,092 8,86 0,88 529840 131
66 20,63 361,133 6,08 0,65 209412 12
67 20,75 339,203 10,81 0,70 318380 82
68 20,76 377,128 7,85 0,74 3410852 47
69 20,88 375,113 2,53 1,27 181820 24
70 21,01 361,132 3,67 1,26 67548 82
71 21,09 265,150 7,47 0,69 273144 21
72 21,25 325,186 11,33 0,90 476648 16
73 21,30 291,089 7,09 0,86 86064 41
74 21,34 311,171 10,86 0,61 577940 52
75 21,47 339,203 12,91 0,54 451260 27
76 21,58 377,127 2,04 0,45 405100 53
77 21,67 391,143 3,39 0,88 69752 4
78 21,80 253,218 6,79 0,68 285032 78
79 21,84 297,155 8,33 1,00 162160 78
80 21,92 377,127 2,48 0,61 190216 31
81 22,24 343,263 2,12 0,38 76616 3
82 22,25 253,219 9,15 0,64 408940 146
83 22,39 315,127 1,58 0,64 54216 9
Tabla 14. Compuestos encontrados en la muestra 1 de aceites por el método implementado. En verde están marcados lo que coinciden con la tabla 13.
El número de compuestos encontrados por el experto (tabla 13) es de 31
compuestos y, de esos 31 compuestos, 27 compuestos se han detectado también con
el método de detección implementado, lo que es un buen resultado teniendo en cuenta
que este método está implementado de forma básica y que tiene muchas líneas
futuras de mejora.
El análisis de los 4 compuestos no detectados automáticamente pero sí
detectados de forma manual ayuda a determinar que líneas futuras de mejora del
método que harán que el método detecte, al menos, tantos compuestos como lo
pueda hacer un experto en una muestra compleja con coelución. Vamos a observar
sus cromatogramas de ion extraído.
Compuesto de masa/carga 303,1237 Da que sale en el tiempo de retención
17,17 minutos. Su cromatograma de ion extraído se puede observar en la
figura 95. Gracias al cromatograma podemos concluir que este compuesto no
118
se ha detectado ya que no tiene intensidad suficiente como para pasar por el
umbral de intensidad alto que marcamos para la búsqueda de iones principales
de compuestos. Como se comentará en el apartado de vías futuras, sería una
buena mejora el implementar un algoritmo para la estimación del umbral de
intensidad alto cuyo valor dependa del fondo de ruido que haya en cada rango
pequeño de tiempo de retención, ya que en algunos tiempos de retención el
fondo de ruido es muy pequeño (por ejemplo entre 400 y 800 segundos), y en
otros tiempos de retención el fondo de ruido es enorme (por ejemplo entre
1.200 y 1.400 segundos), por lo que no es lógico que se busquen picos
cromatográficos en todo el espectro aplicando el mismo umbral de intensidad.
Figura 95. Cromatograma de ion extraído centrado en la masa 303,124 Da.
Compuesto de masa/carga 377,1267 Da que sale en el tiempo de retención
21,02 minutos. Su cromatograma de ion extraído se puede observar en la
figura 96 donde queda patente que este es un claro ejemplo de la dificultad de
establecer condiciones para que un pico cromatográfico sea bueno o malo, ya
que en este caso es muy difícil implementar un algoritmo genérico que consiga
distinguir que en ese punto (marcador de la imagen) puede haber un
compuesto de interés. Es decir, manualmente sí se puede observar que el pico
marcado es un pico distinto del superior de su izquierda, pero el problema es
que hay coelución entre los isómeros, lo que hace que la búsqueda de
máximos y mínimos para delimitar los picos dé lugar a situaciones como esta,
donde un pico poco abundante es solapado por un pico más abundante y no
hay mínimo local entre ellos (por lo que es normal que el método implementado
no lo resuelva).
700 800 900 1000 1100 1200 1300
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
Tiempo (s)
Inte
nsid
ad
Cromatograma de ion extraído en el rango de masas (303.124 +- 0.0250) Da
119
Figura 96. Cromatograma de ion extraído centrado en la masa 377,127 Da.
Isómeros de masa/carga 361,1299, 361,1305, que salen en los tiempos de
retención 17,48 y 21,89 minutos, respectivamente. En la figura 97 se observa el
primer isómero (17,48 minutos).
Figura 97. Cromatograma de ion extraído centrado en la masa 361,130 Da.
Como se puede observar en la figura 97, esta especie iónica tiene una
abundante muy elevada (máximo de intensidad de más de 50.000 cuentas), por lo que
debería haber sido catalogada como especie iónica principal. Sin embargo, como se
puede observar en las huellas espectrométricas de los compuestos encontrados, esta
especie iónica se ha asociado a la especie iónica principal de masa 213,1 Da, que
sale de forma muy abundante en ese tiempo de retención, como se puede observar en
la figura 98.
20.2 20.4 20.6 20.8 21 21.2 21.4 21.6
1
2
3
4
5
6
x 105
X: 21.02
Y: 2.895e+05
Tiempo (s)
Inte
nsid
ad
Cromatograma de ion extraído en el rango de masas (377.127 +- 0.0250) Da
16.5 17 17.5 18 18.5 190
1
2
3
4
5
6x 10
4
X: 17.48
Y: 4.524e+04
Tiempo (s)
Inte
nsid
ad
Cromatograma de ion extraído en el rango de masas (361.130 +- 0.0250) Da
120
Figura 98. Intensidad en función de la masa para un tiempo de 1.048 segundos.
En la figura 99 se observan los cromatogramas de ion extraído de ambas
especies iónicas (imagen superior de la figura 99 será la especie iónica principal en
213,079 Da, y la imagen inferior será la especie iónica secundaria que estamos
analizando), ya que han sido asociadas entre sí, e interesa saber por qué. Viendo en
detalle ambos picos cromatográficos, se puede observar que las formas
cromatográficas son muy parecidas ya que en la masa 213,079 Da se pueden
observar realmente dos picos cromatográficos que están coeluyendo prácticamente en
todo el tiempo de retención (se observa un cambio significativo en la parte izquierda de
la señal, provocado por la coelución de dos compuestos). Si nos fijamos, la parte
izquierda de ambas gaussianas es prácticamente igual, pero en la subida la
distribución de la señal de masa 213,079 Da cambia a un forma cromatográfica
significativamente distinta (momento marcado con una línea roja), donde se aprecia
que hay coelución no resuelta entre varios compuesto. Lo más probable es que, dado
que la subida de intensidad inicial es prácticamente igual que la de la imagen inferior,
en la imagen superior esté coeluyendo un cluster o fragmento del ion de masa 361,13
Da con el ion de masa 213,079 Da.
Este caso es interesante ya que presenta una nueva línea futura de mejora del
método, que consistirá en que, si vemos una posible coelución entre dos compuestos,
buscamos picos cromatográficos en ese tiempo de retención que tengan una
correlación alta con las distintas partes del pico que coeluyen, de forma que se podrá
distinguir la coelución de compuestos por correlación del pico cromatográfico con
coelución, con los picos cromatográficas bien delimitados en otra masa y que pueden
ser responsables de dicha coelución (por un cluster, fragmento, etc.).
0 200 400 600 800 1000 12000
1
2
3
4
5
6x 10
4
X: 361.1
Y: 4.524e+04
Masa (Da)
Inte
nsid
ad
Intensidad en función de la masa para el tiempo 1048 segundos
X: 213.1
Y: 5.484e+04
121
Figura 99. Cromatogramas de ion extraído centrados en las masas 213,079 Da (superior) y 361,130 Da (inferior).
El isómero restante no detectado por el proceso automático puede verse en la
figura 100. Al igual que antes, esta agrupación ha sido asignada como una especie
iónica secundaria de la oleuropeína aglicona, que coeluye exactamente en este tiempo
con este compuesto.
Figura 100. Cromatograma de ion extraído centrado en la masa 361,130 Da.
1290 1300 1310 1320 1330 1340 13500.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
1.4
1.6
1.8
2
2.2
x 104
X: 1314
Y: 1.955e+04
Tiempo (s)
Inte
nsid
ad
Cromatograma de ion extraído en el rango de masas (361.100 +- 0.2500) Da
122
Por lo tanto, de los 4 compuestos que encontraba el método manual pero no
llegaba a encontrar el método automático, uno de ellos no se detectaba por estar por
debajo del umbral de intensidad alto, lo que se solucionaría con un umbral de
intensidad adaptable, dos de ellos no se detectan por haber una coelución entre
compuestos que se podía distinguir de forma manual pero no de forma automática
(mejora mediante una línea futura de modelado de casos de coelución) y el último se
asocia a un compuesto de más abundancia (se podría solucionar con umbrales de
distancia entre picos cromatográficos que dependan de la intensidad de dicho pico y
del fondo de ruido).
Si de las 83 agrupaciones principales encontradas, 27 coinciden con
compuestos que se han encontrado en esta muestra (según el análisis manual de un
experto) y 19 son debidas a artefactos y lavado, las 37 restantes podrían ser debidas a
compuestos detectados por la herramienta automática pero no por el método manual,
lo que sería una gran mejora con respecto a dichos métodos (aunque ya se podría
considerar que se han mejorado al detectar correctamente el 87,1% de los
compuestos que detecta, habiéndolo hecho de forma automática con una
implementación básica del método).
Comprobar los 37 candidatos a compuestos es realmente difícil, ya que hay
que observar con qué especies iónicas coeluye y, en caso de que lo haga (que en
estas muestras casi siempre pasará), comprobar que los picos cromatográficos de las
especies iónicas con las que coeluyen no son debidas al mismo compuesto (es decir,
tienen una forma cromatográfica muy distinta), por lo que habrá que observar varios
cromatogramas de ion extraído para cada candidato a compuesto nuevo, e incluso
cuando se observen todos los cromatogramas, no se puede estar seguro de si uno de
ellos coeluye con la suficiente similitud cromatográfica (no es un nuevo compuesto) o
no (sí sería un nuevo compuesto). Por lo tanto, dado que el interés de este trabajo es
demostrar que se pueden obtener resultados tan buenos como los obtenidos
manualmente y detectando más compuestos que no se detectaban anteriormente, lo
que se va a hacer es ver los compuestos restantes y mostrar aquí los que son
evidentemente un nuevo compuesto (los más evidentes, ya que hay más pero se
necesitaría realizar un estudio químico en profundidad para demostrar que son
compuestos nuevos). A continuación se puede observar los casos más evidentes.
- Compuesto 3 de la tabla 13, con tiempo de retención 12,37 minutos (748,7
segundos siendo más precisos) y masa/carga 139,007 Da. El
espectrograma de ion extraído para observar este pico y las intensidades
que hay en el tiempo de retención donde está el máximo del pico
cromatográfico, se pueden observar en la figura 101. Teniendo en cuenta
que, aunque el pico cromatográfico que se observa no destaca mucho por
encima del fondo de ruido (ya que tiene una subida y bajada lentas), se
encuentran mínimos locales a ambos lados a un 67% de intensidad del
máximo, por lo que realmente la diferencia es muy grande y se debe a un
compuesto que está saliendo en este tiempo de retención y con esta
masa/carga. La evidencia de que este es un compuestos nuevo es que no
hay otro pico cromatográfico de intensidad mayor saliendo alrededor de su
tiempo de retención, ni tampoco detecta el experto ningún compuesto
eluyendo en este tiempo de retención, por lo que este es un caso en el que
123
se ha encontrado un compuesto que no se ha detectado por el método
manual pero sí lo detecta el método automático implementado en este
trabajo.
Figura 101. Cromatograma de ion extraído (superior) e intensidades para cada masa en el tiempo de retención (inferior).
- Compuesto 83 de la tabla 14 que sale en el tiempo de retención 22,39
minutos y con una masa de ion principal de 315,127 Da. Su cromatograma
de ion extraído se ha representado en la figura 102, donde se puede
observar que es un pico poco abundante pero perfectamente formado, por
lo que puede ser un compuesto independiente. Si observamos los
compuestos detectados de forma manual de la tabla 13 veremos que no
hay ningún compuesto en este tiempo de retención, por lo que este pico
cromatográfico se corresponde realmente a la salida de un compuesto
detectado por el método automático implementado y no detectado por el
método manual. Hay que destacar que el método manual no lo detecta por
su coelución con el lavado final del análisis, por lo que este es un ejemplo
claro de que el método implementado en el trabajo consigue detectar
compuestos que coeluyen con otros más abundantes.
740 742 744 746 748 750
7000
8000
9000
10000
11000
12000
13000 X: 748.7
Y: 1.194e+04
Tiempo (s)
Inte
nsid
ad
Cromatograma de ion extraído en el rango de masas (139.007 +- 0.0250) Da
X: 742.7
Y: 7596 X: 751.7
Y: 8632
0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 10000
1
2
3
4
5
6x 10
4
X= 139.01
Y= 54592
Masa (Da)
Inte
nsid
ad
Cromatograma centrado en tiempo (748.700 +- 2.5000) segundos
X= 127.04
Y= 20516
X= 149.03
Y= 12324
124
-
- Figura 102. Cromatograma de ion extraído centrado en la masa 315,130 Da.
- Compuesto 39 de la tabla 13, con tiempo de retención 16,32 minutos y
masa/carga 241,07 Da. En la figura 103 se puede observar el
cromatograma de ion extraído y la intensidad para las distintas masas en
ese tiempo de retención.
Figura 103. Cromatograma de ion extraído (superior) e intensidades para cada masa en el tiempo de retención (inferior).
Este caso es especialmente interesante ya que, si se representa el
cromatograma de ion extraído de la oleuropeína aglicona (que es la única que podría
ser una especie iónica superior a la encontrada por ser más abundante), se observa
que el pico cromatográfico observado en la masa 241,07 Da es el pico principal de un
compuesto que tiene un cluster en la masa 377,13 Da y que coeluye con un isómero
de la oleuropeína aglicona, como puede observarse en la figura 104, donde se ha
marcado la coelución con una raya roja. Por lo tanto, el compuesto encontrado en la
masa/carga 241,07 Da es realmente un compuesto no detectado de forma manual
1320 1330 1340 1350 1360 1370
0
5000
10000
15000
Tiempo (s)
Inte
nsid
ad
Cromatograma de ion extraído en el rango de masas (315.130 +- 0.0250) Da
960 970 980 990 1000 1010 10200
1
2
3
4x 10
4
X: 979.5
Y: 3.836e+04
Tiempo (s)
Inte
nsid
ad
Cromatograma de ion extraído en el rango de masas (241.000 +- 0.2500) Da
0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 10000
0.5
1
1.5
2
2.5x 10
5
X= 377.13
Y= 217928
Masa (Da)
Inte
nsid
ad
Cromatograma centrado en tiempo (979.500 +- 2.5000) segundos
X= 241.07
Y= 159768
125
pero sí detectado con nuestro método, y además se ha conseguido distinguir cuando
presentaba una fuerte coelución con uno de los compuestos más abundantes de la
muestra; un isómero de oleuropeína aglicona, lo que aporta una evaluación muy
positiva al método implementado.
Figura 104. Cromatograma de ion extraído centrado en la masa 377,13 Da.
En base a las comprobaciones llevadas a cabo, se puede concluir lo siguiente:
- De los 31 compuestos detectados manualmente, el método automático
detecta 27. Los 4 compuestos restantes no son detectados por ausencia de
modelado de la coelución y necesidad de umbrales adaptativos en función
del fondo de ruido, por lo que se detectarán los 4 compuestos aplicando
mejoras en el método implementado.
- De los 83 candidatos a compuestos encontrados automáticamente, 27 son
compuestos con certeza (porque son los encontrados manualmente) y 19
son falsos positivos provocados por el lavado, que también se podrá
eliminar como una línea futura de mejora del método. De los 37 candidatos
restantes, se ha comprobado que algunos de ellos sí representan
compuestos nuevos de forma evidente, mientras que otros necesitarían de
un análisis químico en profundidad para determinar si son compuestos
nuevos o son falsos positivos.
Es decir, el método automático ha obtenido el 87,1% de los compuestos que se
encuentran por el método manual exhaustivo y se prevé que los restantes compuestos
no detectados se detectarían implementando una serie de mejoras. Además, el
método automático ha obtenido una serie de candidatos a compuestos (37) de los que
algunos se han comprobado que, efectivamente, se corresponden con compuestos
nuevos no descubiertos en la búsqueda manual. A costa de la detección de
compuestos que no se observan en el método manual, se han introducido algunos
falsos positivos debidos, principalmente, al lavado de la columna separativa. Por lo
tanto, se ha probado que, incluso con una implementación básica del método de
detección automática y caracterización de compuestos, se consiguen encontrar casi
todos los compuestos que se encuentran manualmente y algunos que únicamente se
126
encuentran de forma automática con este método, incluso cuando tienen una fuerte
coelución con otro compuesto, lo que es un gran avance y aporta una evaluación muy
positiva del método implementado.
A continuación vamos a realizar la otra comprobación del método de detección
y caracterización de compuestos, que consiste en comprobar que la huella
espectrométrica de los compuestos se ha obtenido de forma adecuada.
Para realizar esta comprobación se va a considerar que, el mismo compuesto
en muestras distintas, deberá tener prácticamente la misma huella espectrométrica si
ésta se ha cogido con un criterio adecuado. Esta consideración se basa en el
fundamento de que los iones principales en ambas muestras variarán en tiempo
(desalineamiento temporal) y en masa (descalibración en masa) pero ese mismo
desalineamiento debería afectarle también a toda la huella espectrométrica y, por
tanto, debería agruparse la misma huella espectrométrica en ambos casos (con las
mismas especies iónicas más abundantes). Es decir, si el criterio de agrupamiento de
huella espectrométrica (correlación de formas cromatográficas) es bueno, las huellas
espectrométricas del mismo compuesto han de ser iguales (teniendo en cuenta que la
abundancia del compuesto en la muestra será también un factor determinante) en las
distintas muestras.
Para realizar la comprobación, lo primero que se ha realizado es elegir un
compuesto, que en este caso ha sido el más abundante, el isómero principal (o más
abundante) de la oleuropeína aglicona, que sale en un tiempo de retención de,
aproximadamente, 20,76 minutos (1.245,8 segundos) con una masa de 377,128 Da.
Se ha utilizado la herramienta de detección y caracterización con cada una de las 22
muestras de la colección, obteniendo unos resultados que no se pondrán
completamente en esta memoria, ya que son demasiado largos. La parte que se va a
poner de los resultados, por si se quiere comprobar que se han realizado las
simulaciones sobre cada uno de ellos y se han tenido todos en cuenta, es la tabla de
los compuestos que se han identificado en cada uno de ellos, que se puede observar
en el apéndice 4 (aunque lo importante se va a poner a continuación).
Una vez que se han obtenido los resultados para cada una de las 22 muestras
de la colección, se localizan y comparan las huellas espectrométricas del compuesto
elegido. Para realizar la comprobación se van a comparar para cada muestra,
únicamente las 20 líneas espectrométricas más abundantes de la huella
espectrométrica. Si se realiza esta comparación y se ve el número de veces que se ha
encontrado cada línea entre las 20 más abundantes de cada huella espectrométrica,
obtenemos el resultado que se observa en la tabla 15.
Masa/carga (Da) Área cromatográfica
relativa Repeticiones
Proporción del total (%)
377,128 100,00 22 100
307,084 47,18 22 100
275,092 33,36 22 100
378,132 24,38 22 100
345,101 16,05 22 100
149,026 18,09 22 100
127
95,049 9,36 22 100
111,010 6,73 22 100
139,038 13,74 21 95
308,088 7,46 21 95
755,260 26,59 20 91
399,110 14,51 20 91
276,095 5,96 20 91
756,263 11,33 19 86
379,133 4,61 18 82
127,041 4,72 18 82
121,032 3,38 17 77
757,265 3,87 14 64
327,090 3,37 13 59
413,105 3,89 13 59
101,024 5,22 11 50
346,104 3,25 11 50
415,091 3,01 7 32
96,052 0,93 5 23
140,041 1,05 5 23
116,929 4,64 4 18
147,047 1,35 3 14
150,029 0,97 3 14
209,053 1,95 2 9
68,995 0,37 2 9
195,067 4,34 2 9
112,013 0,40 2 9
138,030 0,16 1 5
143,036 0,21 1 5
309,092 0,43 1 5
441,102 0,30 1 5
519,120 0,26 1 5
689,303 0,23 1 5
690,311 0,17 1 5
717,336 0,27 1 5
779,238 0,12 1 5
153,057 1,17 1 5
196,068 0,55 1 5
239,057 2,23 1 5
191,037 1,40 1 5
375,113 5,20 1 5
137,036 0,51 1 5
Tabla 15. Líneas espectrométricas más abundantes de la oleuropeína aglicona en el minuto 20,76 para las 22 muestras de aceite de oliva.
128
En la tabla se puede observar que hay 8 líneas espectrométricas que están en
todas de las huellas espectrométricas que corresponden al compuesto en las 22
muestras. Cabe destacar que hay 17 líneas que se repiten en más del 75% de las
muestras, por lo que estas líneas podrían caracterizar perfectamente al compuesto, ya
que son líneas (fragmentos, variantes isotópicas y clusters) que aparecen en casi
todas las muestras. También se puede observar que 22 líneas espectrométricas
aparecen en, al menos, la mitad de las muestras.
Un hecho interesante que hay que tener en cuenta es que hay muchas líneas
(15) que únicamente aparecen en una muestra. Esto no se debe a un error, sino a que
hay algunas muestras de extractos fenólicos de aceites de oliva (principalmente las de
la variedad Picual) que tienen mucha más abundancia iónica de oleuropeína aglicona
que las demás muestras, por lo que la huella espectrométrica que se forma a partir de
la molécula de la oleuropeína aglicona, es mucho mayor (con más líneas) en dichas
muestras.
También interesa tener en cuenta la alta correlación que hay entre el área
relativa de la línea secundaria y el número de muestras en las que aparece cada línea,
ya que cuando el área es grande, la línea se repite en prácticamente todos los
compuestos, mientras que cuando el área es pequeña, la línea se repite en muy
pocos. Esto se debe a que, cuanto menor sea la abundancia del ion principal, menor
será la abundancia de sus líneas espectrométricas y habrá muchas que se queden por
debajo del fondo de ruido en algunas muestras, pero sí se puedan detectar en otras.
Por lo tanto, las líneas que se detectan en algunas muestras pero no en otras,
evidencian el hecho de que, en las muestras donde no aparecen, el ion principal del
compuesto no es tan abundante como en las otras muestras, lo que hace que esa
línea secundaria no se consiga detectar por quedar oculta por el fondo de ruido.
Por lo tanto, la caracterización de la huella espectrométrica se puede
considerar correcta, ya que se han obtenido los mismos resultados (teniendo en
cuenta que algunas huellas espectrométricas estarán más completas que otras) para
el mismo compuesto en 22 variantes de extractos fenólicos de aceites de oliva.
Como conclusión a estos resultados y teniendo en cuenta que las muestras de
extractos fenólicos de aceite analizadas son muy complejas, podemos concluir en que
el método ha dado unos resultados muy buenos para ser una implementación “básica”
del mismo, y es inmediato notar el gran potencial que tiene este método, por la gran
cantidad de aspectos que se pueden optimizar y sistematizar.
129
4.5. Resultados obtenidos al aplicar el método de agrupación de compuestos a una colección de muestras.
En este apartado se va a aplicar el método de agrupación de compuestos a las
30 muestras de la colección de matrices de estándares, para observar sus resultados.
Tras ejecutar este método, tendremos como resultado una tabla de compuestos presentes en alguna de las 30 muestras de la colección, así como una tabla que muestre la huella espectrométrica más abundante de cada uno de los compuestos. Además, tendremos una tabla que nos indica el área cromatográfica de cada compuesto del conjunto en cada una de las muestras analizadas, lo que da idea de su abundancia en la muestra. No tiene sentido mostrar aquí la salida de cada una de las muestras ya que sería demasiado extenso, ni tampoco la huella espectrométrica de los compuestos que hay en el conjunto, por lo que nos vamos a limitar a mostrar los compuestos encontrados en las muestras analizadas.
En primer lugar se va a recordar que en estas muestras se mezclaban 5
estándares de polifenoles, apareciendo en algunas de ellas alguno de los 5 polifenoles (según se añadiese a esa muestra o no), además de algún compuesto contaminante o algún isómero de los 5 polifenoles. En la tabla 16 se puede observar dónde encontramos los iones relativos a cada compuesto polifenólico.
Compuesto Tiempo de retención (s) Masa/carga (Da)
C1 373,5 595,133
C2 498,8 191,056
C3 634,9 179,035
C4 744,0 609,148
C5 799,5 463,089
Tabla 16. Compuestos mezclados en la colección de matrices de estándares.
Una vez se han observado de nuevo los compuestos que deben aparecer, vamos a usar los métodos implementados. Tras 13,68 segundos de ejecución del método, que incluyen tanto la obtención de datos de las muestras como su análisis por separado y conjuntamente, obtenemos los resultados. En la tabla 17 se pueden observan los compuestos que se han encontrado para el conjunto de las 30 muestras de la colección, ordenados según su tiempo de retención.
Compuesto Tiempo de
retención (s) Masa/carga
(Da) ( ) ( )
Área (50%)
Área (80%)
Nº agrupaciones secundarias
1 359,75 191,056 9,10 1,60 94108 58984 13
2 375,87 595,128 5,51 0,63 642432 431176 20
3 413,40 463,087 6,18 1,77 121740 61564 4
4 501,22 191,056 2,60 0,39 882612 615776 58
5 600,63 191,057 2,40 0,58 121124 64428 20
6 635,79 179,035 2,11 0,26 836616 585476 57
7 744,46 609,148 2,07 0,57 1059376 816620 33
8 800,28 463,090 2,43 1,61 3211992 2079824 58
Tabla 17. Compuestos encontrados en las 30 muestras de la colección de matrices de estándares.
Como se puede observar, se han encontrado 8 compuestos distintos en la colección de matrices, que serán los 5 compuestos polifénolicos mezclados y 3 contaminantes o isómeros de esos 5. En el apéndice 5 se puede observar una tabla donde se muestra la presencia de cada uno de los 8 compuestos encontrados, en
130
cada una de las 30 muestras analizadas.
La forma de comprobar que la agrupación de compuestos de todas las muestras se ha hecho bien, es que si se sabe qué polifenoles se han añadido a cada muestra (por la tabla que se mostró cuando se documentaron los datos), entonces no hay más que comprobar si el resultado del método coincide con dichos resultados. Los polifenoles que se mezclaron son los que aparecen en la tabla anterior con los números 2, 4, 5, 7, 8. Observando la presencia de cada uno de estos compuestos en las distintas muestras que indica el método (apéndice 5), y comparándolo con los que se han mezclado en cada muestra en el laboratorio (tabla 2), se observa que todos los resultados obtenidos para esos compuestos son correctos, ya que todas las presencias encontradas por nuestro método coinciden con la información que viene documentada sobre esta colección de muestras. Además, se puede observar una gran correlación entre el área cromatográfica obtenida y la concentración teórica del compuesto en la muestra, lo que es lógico ya que, cuanta más concentración de compuesto haya, más abundante será el compuesto en la ionización y más corriente iónica tendrá, aumentando su área cromatográfica (se puede observar en el apéndice 5).
Habiendo demostrado que la agrupación de compuestos de una colección de muestras da resultados muy buenos para una colección de muestras simples (la de matrices de estándares), el método se podría optimizar para asegurar unos resultados adecuados tanto para esta colección (lo que ya se ha hecho), como para colecciones más complejas (como la de las muestras de extractos fenólicos de aceites). Sin embargo, dado que comprobar que las muestras de aceite se agrupan de forma correcta sería muy largo de llevar a cabo, no se van a poner sus resultados ya que no tiene sentido ponerlos si no se van a poder comprobar. Además, hay que tener en cuenta que este último método depende de lo bien agrupada que esté la huella espectrométrica en el paso anterior, así como de la precisión en el cálculo de las áreas cromatográficas, por lo que mejorando el método principal de este trabajo se obtendrán mejores resultados en una muestra compleja.
Por lo tanto, se puede concluir en que esta forma de agrupar los compuestos de una colección es muy adecuada, ya que reduce la información de muchas muestras de una colección a tan solo tres tablas (compuestos, huellas espectrométricas de cada compuesto y áreas de los compuestos en las muestras), consiguiendo una reducción máxima del volumen de información y permitiendo que se puedan analizar un conjunto de muestras como si fuesen una única muestra, reduciendo así la varianza estadística de las medidas que se obtengan para cada compuesto.
131
5. Conclusiones y líneas futuras.
En los siguientes apartados se expondrán las conclusiones que se han sacado tras observar objetivamente el trabajo realizado a lo largo de este proyecto, los resultados de la implementación de los métodos propuestos. También se expondrán las líneas futuras en las que se debería trabajar para mejorar y optimizar los métodos implementados, en base a la evaluación de los resultados obtenidos. Además, también se expondrán las conclusiones de ámbito académico que se han sacado en el transcurso de este trabajo.
5.1. Trabajo general realizado.
En líneas generales, a lo largo de este trabajo se han realizado una serie de tareas, que se resumen a continuación:
Familiarización con datos HPLC-MS.
En este trabajo ha sido necesario introducirse en el análisis químico de muestras
mediante técnicas cromatográficas acopladas a espectrometría de masas, para comprender y dar explicación a los fenómenos observados en las señales obtenidas. También se han aprendido diversas formas de manipular los datos HPLC-MS y las ventajas e inconvenientes de cada una de ellas (por ejemplo, de las formas de representar los datos HPLC-MS). Toda esta tarea se ha llevado a cabo, principalmente, al principio del trabajo, ya que es necesaria para poder realizar cualquier tarea posterior, y ha sido muy útil para adquirir una gran destreza y fluidez en el manejo de este tipo de datos.
Entender los datos y señales HPLC-MS y su relación con los compuestos
químicos de una muestra. Tras comprender los fundamentos generales del análisis HPLC-ESI-TOF/MS, se
llevó a cabo un estudio mucho más detallado de los procesos que afectan directamente al procesamiento de datos HPLC-MS, analizando las fuentes de ruido presentes y profundizando en la detección, conversión, almacenamiento de entradas (de espectro suma a espectro de línea, por ejemplo), etc., además de comprender procesos muy variados que provocan salidas anómalas del sistema (por ejemplo, la supresión iónica).
También ha sido necesaria la adquisición de conceptos de muchas disciplinas,
por ejemplo la estructura molecular y cómo afecta a las señales de salida del sistema (por ejemplo, los isómeros son moléculas de igual fórmula pero distinta estructura, lo que hace que se retengan de forma distinta en la columna separativa pero presenten un patrón de fragmentación parecido), y muchos más conceptos interdisciplinares que se han ido adquiriendo a lo largo del trabajo y que ha servido para introducir al graduando no sólo en el análisis químico de compuestos, sino también en conceptos muy variados de la ingeniería que serán aplicables a cualquier campo de estudio y de trabajo, por ejemplo la redacción de artículos científicos, la estructuración de un trabajo, etc.
Implementación de varios métodos, algunos desarrollados anteriormente y
otros ideados y desarrollados en este trabajo. En este trabajo se han implementado diversos métodos, algunos desarrollados
132
anteriormente en otros trabajos (artículos, tesis, congresos, etc.) y otros ideados, desarrollados y evaluados en este trabajo. A continuación se pueden observar los más usados en la realización del trabajo:
Métodos para mostrar los datos HPLC-MS.
La implementación manual de cromatogramas y
espectrogramas, basándose en su desarrollo en trabajos previos, ha resultado de gran utilidad a lo largo de todo el trabajo y se han usado de forma implícita en la realización de cualquier tarea a lo largo de éste.
Algoritmo de reducción de ruido iónico/electrónico.
Este algoritmo se ha implementado de acuerdo a su desarrollo en un trabajo anterior y ha sido muy útil para procesar los datos de forma más rápida. También ha ayudado a comprender, que conceptos sencillos (el compuesto sale en una forma gaussiana, por lo que ha de tener muestras contiguas en tiempo de retención), pueden ayudar significativamente en situaciones complejas, lo que ha de tenerse claro cuando se busque solucionar problemas en el ámbito de la ingeniería o en cualquier otro.
Identificación y supresión de artefactos químicos.
Este método ha sido ideado, desarrollado, implementado y
evaluado e este trabajo, consiguiendo unos resultados muy interesantes con un procedimiento novedoso y viendo que resulta muy útil para cualquier procesamiento posterior de las muestras.
Detección y caracterización de compuestos por comparación
cromatográfica. Este método también ha sido ideado, desarrollado,
implementado y evaluado en este trabajo, consiguiendo unos resultados satisfactorios que muestran esta vía de detección y caracterización, como un método con mucho potencial.
Comparación de compuestos detectados en colecciones de muestras.
Este método se ha ideado y desarrollado como una extensión
del método anterior, aplicando las ventajas que presenta. Sin embargo, a pesar de la gran cantidad de horas dedicadas al conjunto del trabajo de fin de grado (muchas más de las estipuladas según los créditos que le corresponden), este método no se ha podido evaluar en la colección de muestras de aceites, lo que hubiese sido una prueba mucho más sólida de que este método funciona adecuadamente en situaciones complejas y no solo en situaciones simples (colección de muestras de matrices de estándares).
Evaluación de métodos implementados.
A lo largo del trabajo se han evaluado todos los métodos implementados, tanto
ideados como implementados según un desarrollo previo. En el apartado con las conclusiones de cada método se comentan los resultados. Sin embargo, las evaluaciones realizadas en el trabajo han contribuido a comprender mejor cómo se ha
133
de realizar y documentar una evaluación en un texto científico, así como la formación de una actitud crítica con los resultados.
Análisis de líneas futuras a partir de las limitaciones observadas.
En cada método propuesto se han encontrado líneas futuras de mejora del método que harán que obtenga mejores resultados, que se comentarán más adelante en las conclusiones específicas de cada método. A lo largo del trabajo se ha comprendido la necesidad de especificar una serie de objetivos iniciales sólidos al inicio del trabajo o proyecto, ya que continuamente se encuentran líneas que podrían ser investigadas pero que hay que saber distinguir entre las que son imprescindibles para poder cumplir los objetivos iniciales, y las que suponen una línea de investigación a largo plazo y no han de ser abordadas (al menos completamente) en ese trabajo o proyecto.
5.2. Método principal. Detección y caracterización de compuestos en una muestra HPLC-TOF/MS.
La implementación de este método ha permitido comprobar que la detección y
caracterización completa de los compuestos de una muestra, partiendo de la localización rápida de estos compuestos mediante el uso de un umbral alto y la posterior agrupación de compuestos según las correlaciones de sus picos cromatográficos, es viable. Además, la aplicación de técnicas de tratamiento de la señal como el filtrado paso-baja o la consideración de los picos cromatográficos de un compuesto como un espacio vectorial, ha permitido comparar picos cromatográficos entre sí mediante la proyección de sus vectores. Este último proceso ha permitido formar la huella espectrométrica de cada compuesto al considerar que, independientemente de la intensidad, la forma cromatográfica de las líneas de la huella espectrométrica de un compuesto, debe ser igual a la forma cromatográfica del ion principal de dicho compuesto (salvo ruido), y distinta de otro compuesto que esté saliendo de la columna separativa en el mismo instante de tiempo de retención.
Teniendo en cuenta los resultados obtenidos tanto para la colección de
matrices de estándares como para la colección de extractos fenólicos de aceites (esta última es la que más fuerza aporta a las comprobaciones por ser mucho más complicada), se ha demostrado que el potencial de este método es muy alto, ya que se ha conseguido automatizar un proceso que, hasta el momento, sólo podía realizarse de forma manual por haber coelución de compuestos. Se ha comprobado que, con una implementación básica de este método, ya se consiguen encontrar casi los mismos compuestos que se encuentran manualmente y además se encuentran varios compuestos presentes que no han sido encontrados a mano (además se han encontrado en situaciones de alta coelución, por lo que es muy buen resultado), por lo que ha quedado demostrado el gran potencial que tiene el método de detección y caracterización de compuestos basado en correlaciones entre picos cromatográficos. También se han encontrado líneas claras de mejora del método, que harán que se aumente el número de compuestos detectados correctamente y se reduzcan los falsos positivos. Estas líneas se pueden ver a continuación:
Posibilidad de automatizar el cálculo de un umbral mínimo de intensidad para eliminar el ruido básico que hay en los datos. En este trabajo se ha explicado el criterio a seguir para buscar ese mínimo,
buscando el cambio de distribuciones de intensidades en el histograma de
134
intensidad. Por lo tanto, se puede desarrollar un algoritmo que busque ese umbral de intensidad por debajo del cual no vamos a distinguir la información del ruido, basándose en la idea aportada del cambio de distribución en el histograma de las intensidades.
Necesidad de implementar un algoritmo que calcule el umbral alto de intensidad que usa el método principal. En este trabajo se ha usado un umbral de 2.000 para las muestras de matrices,
y uno de 8.000 para las muestras de aceites, cogiéndose en ambos casos de forma manual según las intensidades observadas experimentalmente en cada colección de muestras. Sin embargo, en primer lugar sería necesario que su cálculo fuese automático para aumentar la independencia del método.
En segundo lugar se ha observado varias veces que el umbral alto de
intensidad debería depender del fondo de ruido de cada zona del espectrograma, ya que había ventanas de tiempo de retención y de masa/carga donde el fondo de ruido tenía muy poca intensidad y algunos compuestos quedaban por debajo del umbral alto de intensidad por estar éste demasiado elevado (a pesar de tener una SNR alta), mientras que en otros casos ocurría lo contrario; el fondo de ruido estaba muy por encima del umbral de intensidad alto, por lo que nuestro método los reconocía como compuestos (falsos positivos) haciendo que tardase muchísimo más en analizar la muestra y perdiendo la gran ventaja que aporta este método.
Esta mejora interesaría que fuese lo más óptima posible ya que de ella
depende encontrar un mayor número de compuestos en la muestra y reducir el número de falsos positivos.
Modelado de un mayor número de situaciones para la delimitación de los picos cromatográficos. El hecho de tener que comparar las formas cromatográficas entre sí, hace que
sea muy importante realizar una buena delimitación de los picos cromatográficos. Sin embargo, también es muy importante que, al delimitarlos, se tengan en cuenta los casos excepcionales que ocurren, como por ejemplo que un pico esté parcialmente oculto por otro más abundante (coelución), o que un pico sea realmente ruido y tengamos la necesidad de usar criterios para identificarlo como ruido (o si es debido al lavado de la columna cromatográfica) y que no sea delimitado.
Para delimitar el pico cromatográfico, en este trabajo se han usado ventanas de
búsqueda de mínimos de tamaño fijo, cuando realmente sería necesario utilizar una ventana que dependa de la anchura del propio pico cromatográfico. Esto último es un factor clave ya que en los picos muy estrechos se puede usar una ventana de búsqueda también estrecha, ya que seguramente se encontrará rápido el mínimo. Por el contrario, en los picos muy anchos se tendrá que usar una ventana más grande, ya que es más posible que haya rizado en la cresta del pico (al durar más) y el uso de una ventana más grande reducirá el número de saltos para mover la ventana, reduciendo así el tiempo de cómputo de la delimitación.
Esta mejora será bastante difícil de llevar a cabo ya que los picos
cromatográficos pueden presentar multitud de variantes posibles, por lo que habrá que limitar la mejora a un compromiso entre velocidad (pocas comprobaciones
135
pero más probabilidad de mala delimitación o falso positivo por ruido) y minimización de la probabilidad de error (más comprobaciones para una menor probabilidad de error a costa de un aumento en el tiempo de cómputo).
También se puede intentar contrarrestar el hecho de que varios compuestos
coeluyan en la misma masa, lo que provocaba que viésemos un pico cromatográfico parcialmente solapado con el otro, por lo que tenía problemas para ser delimitado. Una posibilidad para solucionar este problema es que, dado que los picos cromatográficos han de tener una forma aproximadamente gaussiana, se puede hacer un algoritmo que, en los casos en los que parezca que hay solapamiento entre dos picos, compare cada uno de los picos solapados con una gaussiana, de forma que si el algoritmo indica que es muy posible que el pico sea realmente dos picos solapados y con formas gaussianas distintas, entonces ya sabríamos cómo hacer la delimitación pues sabríamos que hay dos picos distintos ahí y en qué tiempo de retención coeluyen exactamente.
Cálculo del área cromatográfica más preciso.
La comparación entre áreas cromatográficas relativas para agrupar compuestos y el posible interés posterior para cuantificar la concentración de un compuesto en una muestra, hace que sea necesario obtener áreas lo más precisas posible, ya que en el cálculo actual el fondo de ruido contribuye al valor del área, lo que no es realmente correcto (aunque teniendo en cuenta el objetivo de este trabajo, se optó por un cálculo sencillo antes que un cálculo muy preciso).
Integrar los procesos entre sí para reducir el tiempo de computación. La implementación del método en código se ha realizado en varias partes muy
separadas entre sí, para poder corregir y cambiar cosas durante la implementación. Sin embargo, aunque didácticamente conviene separar los pasos para que queden lo más claros posibles y sean fácilmente actualizables, a la hora de implementar una herramienta definitiva, sería interesante integrar los procesos de realizar para aumentar la eficiencia computacional.
5.3. Método secundario. Identificación y supresión de artefactos químicos.
Este método se ha tenido que desarrollar al descubrirse la problemática de los
artefactos químicos en los resultados de la aplicación del método de detección y caracterización de compuestos en una muestra, por lo que no estaba previsto inicialmente en el trabajo. Sin embargo, se ha visto que los resultados son muy satisfactorios para ambas colecciones de muestras, ya que elimina artefactos químicos de muy alta intensidad en ambas colecciones de muestras sin ningún falso positivo. Uno de los grandes beneficios de este método, como se ha comentado, es que realiza la identificación y supresión de los artefactos químicos en un preprocesamiento rápido de los datos, lo que permite utilizar posteriormente los datos sin este ruido de muy alta intensidad, siendo una implementación novedosa y con unos resultados muy buenos.
Como línea futura de mejora, hay que tener en cuenta que únicamente se ha
comprobado con estas colecciones de muestras, por lo que hay que mejorarlo para darle un fundamento teórico más sólido y probarlo con otro tipo de muestras para darle más generalidad, comprobando también sus límites.
136
5.4. Método secundario. Comparación y agrupación de compuestos para una colección de muestras.
Este método se desarrolló como una extensión del método de detección y
caracterización de compuestos en una muestra, ya que agrupar los compuestos y las huellas espectrométricas de una muestra en una tabla, nos permitía realizar operaciones de comparación entre muestras de una colección de una forma relativamente sencilla. Como se ha podido observar, los resultados de esta aplicación son buenos, aunque dependen directamente de lo bien que funcione el método de detección y caracterización de compuestos en cada muestra, por lo que cualquier mejora en dicho método contribuirá a mejorar esta aplicación. Por ejemplo, un cálculo más preciso del área cromatográfica hará que esta aplicación funcione directamente mejor.
El aspecto más importante de esta aplicación es la comparación entre dos
compuestos, cada uno de una muestra distinta, para averiguar si son equivalentes (mismo compuesto en distinta muestra), o no. A pesar de que se ha implementado esta comparación y ha dado unos resultados adecuados, para mejorar la aplicación habría que modelar muchos más casos de situaciones concretas, como el caso en que una huella espectrométrica tenga muy pocas entradas porque el compuesto sea poco abundante, o implementar un umbral de similitud de área cromatográfica que sea variable en función de la abundancia del pico cromatográfico.
Como se ha dicho, los resultados de este método dependen directamente del
método de detección y caracterización de compuestos, por lo que es más interesante optimizar primero dicho método y luego hacer los cambios necesarios en esta aplicación.
5.5. Conclusiones académicas. En esta sección se van a comentar las aportaciones que ha realizado este
trabajo a la formación académica del graduando.
Método científico.
El desarrollo e implementación de técnicas novedosas ha requerido un aprendizaje y compresión de la forma adecuada de documentar un problema, proponer posibles soluciones, implementarlas de forma práctica y evaluar los resultados, documentándolos adecuadamente e identificando las vías interesantes de mejora. Este aprendizaje ha contribuido positivamente a la formación académica, ya que puede ser aplicable a cualquier trabajo futuro.
Aplicación de conocimientos multidisciplinares. A lo largo del trabajo ha sido necesaria la aplicación de conocimientos de muchas
disciplinas distintas, algunos que ya habían sido adquiridos en la formación universitaria previa (tratamiento de señales digitales, sistemas LTI, instrumentación electrónica, programación, matemáticas, etc.) y otros que han tenido que ser adquiridos a lo largo del proyecto para poder comprender los procesos multidisciplinares que ocurrían (física y química de moléculas y fluidos, técnicas cromatográficas, etc.).
Este trabajo ha permitido adquirir perspectiva a la hora de enfrentarse a un
problema, para tratar de relacionar los conceptos multidisciplinares e intentar plasmar
137
un problema de una disciplina desconocida (o que no se ha estudiado anteriormente) al campo de especialización propio, para poder utilizar técnicas previamente adquiridas para solucionar un problema.
Elaboración de documentos extensos, así como la planificación y
estructuración de los mismos. La realización de trabajos tan extensos como el que se ha realizado no se lleva a
cabo en ninguna asignatura de la carrera por el simple hecho de que no es viable, por lo que este trabajo ha servido como introducción a la estructuración y planificación de trabajos extensos. La mejora en este aspecto se ha observado de forma objetiva en la forma de redactar y estructurar las distintas partes del trabajo, por lo que se han adquirido destrezas y habilidades para enfrentarse a una redacción larga, formal y bien estructurada.
En cuanto a la planificación temporal, la estructura que se ha seguido en el trabajo
ha sido, en líneas generales, la siguiente: - Familiarizarse con el campo del análisis de compuesto mediante cromatografía
y espectrometría de masas, así como con los datos que se obtenían,
adquiriendo fluidez a la hora de manejarlos e implementado las formas de
representarlos, para comprenderlas y ver sus ventajas e inconvenientes. Este
paso se prolongó, aproximadamente, durante varias semanas del primer mes
del trabajo y ayudó significativamente a adquirir habilidades en el manejo de
las señales químicas HPLC-MS y a caracterizar dichas señales.
- Implementación del método principal. Esta parte ha sido la más difícil de
compatibilizar con las asignaturas cursadas, ya que al mismo tiempo que se
hacía este trabajo, había que dedicar muchas horas a otras asignaturas que,
en algunos casos, requerían demasiado trabajo autónomo, siendo muy difícil
mantener cierta continuidad a la hora de implementar el método. Incluyendo
todos los métodos desarrollados, las simulaciones experimentales,
evaluaciones y comprobaciones, además de la búsqueda de información de los
problemas que se presentaban conforme se desarrollaba el método, se podría
estimar el tiempo dedicado a esta parte como más de dos meses (casi tres), lo
que hace un total de más de tres meses entre esta parte y la anterior.
- Aunque la memoria se ha intentado desarrollar durante el transcurso del
trabajo, la mayor parte de la misma se ha completado en las últimas semanas,
incluyendo la documentación y contrastación de los resultados de los métodos,
lo que ha completado los, aproximadamente, cuatro meses que ha durado este
trabajo.
El transcurso del trabajo ha ayudado no sólo a estructurar el trabajo y a
planificarlo en el tiempo del que se dispone, sino también a compatibilizar la
ejecución concurrente de este trabajo con otros que se tenían que desarrollar al
mismo tiempo (por ejemplo, las asignaturas). Todo este proceso ha ayudado a
adquirir habilidades que servirán para cualquier actividad futura (estudio, trabajo,
etc.).
138
Búsqueda bibliográfica.
A lo largo de este trabajo se han tenido que adquirir muchos conocimientos de
química analítica que han obligado a la búsqueda de bibliografía, tanto básica
como específica, de los campos de interés para el desarrollo del trabajo. La
variedad de la búsqueda ha generado en el alumno mayor habilidad a la hora de
buscar artículos, libros y documentos de interés, aprendiendo la importancia de
realizar “rastreos” bibliográficos para poder buscar información específica sobre
algunos temas.
Desarrollo personal y actitud crítica.
En el ámbito personal, este trabajo ha aportado una actitud mucho más crítica que la que se tenía antes de iniciar el trabajo, ya que se ha comprendido que, a la hora de enfrentarse a un problema de difícil solución, hay que buscar siempre soluciones evaluando el problema desde distintas perspectivas, no buscando únicamente la perspectiva sencilla, sino comparando siempre las distintas posibilidades para quedarse con la mejor solución posible. Por lo tanto, se ha comprendido que siempre es mejor evaluar detenidamente un problema antes de abordarlo, ya que es más importante que se aborde el problema de la forma adecuada en vez de dedicar mucho tiempo a abordarlo desde una forma que puede que no sea la más adecuada.
Además, se ha visto la importancia de hacer siempre una evaluación lo más
objetiva de los resultados y con una actitud siempre crítica, buscando siempre mejorar los métodos para obtener un mejor resultado pero sin perder de vista el objetivo que se persigue.
Se puede concluir en que este trabajo ha aportado muchas habilidades nuevas
tanto a nivel profesional como personal, que han contribuido muy positivamente a la
formación profesional y podrán ser aplicables en cualquier desempeño laboral futuro.
139
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Instrumentation, Applications, and Strategies for Data Interpretation. 4 th. J. Wiley & Sons, ed., New York.
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12. A. de la Torre, et al. Alineamiento automático de datos en espectrometría de
masas basado en descenso de gradiente. VII Colloquim Chemiometricum Mediterraneum. Departamento de Teoría de la Señal, Telemática y
140
Comunicaciones, Universidad de Granada. 13. S. Mota, et al. Procesamiento comparativo de datos HPLC-MS orientado a la
identificación de compuestos bioactivos en muestras complejas. VII Colloquim Chemiometricum Mediterraneum. Departamento de Teoría de la Señal, Telemática y Comunicaciones, Universidad de Granada.
14. A. de la Torre, et al. Desreplicación basada en la correlación entre datos
espectrométricos y bioactividad para la identificación de compuestos bioactivos en extractos vegetales. VII Colloquim Chemiometricum Mediterraneum. Departamento de Teoría de la Señal, Telemática y Comunicaciones, Universidad de Granada.
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19. Ihsam Iswaldi. (2012). Caracterización de compuestos fenólicos mediante técnicas
separativas acopladas a espectrometría de masas de extractos vegetales con bioactividad demostrada. Tesis doctoral. Departamento de Química Analítica. Universidad de Granada.
20. Mª Isabel Borrás Linares. (2013). Uso de técnicas separativas acopladas a
espectrometría de masas de alta resolución para estudios metabolómicos de nutracéuticos y matrices vegetales. Tesis doctoral. Departamento de Química Analítica. Universidad de Granada.
21. Chao Yang, Zengyou He, Weichuan Yu. (2009). Comparison of public peak
detection algorithms for MALDI mass spectrometry data analysis. BMC Bioinformatics, 10:4.
141
7. Apéndices. 7.1. Apéndice 1. Compuestos detectados y caracterizados sobre la
muestra 15 de la colección de matrices de estándares sin artefactos químicos. Los siguientes resultados han sido obtenidos con un umbral alto de intensidad
de 2000 cuentas, y el bajo de 80 cuentas. El umbral de intensidad utilizado en la búsqueda de compuestos continuos ha sido de 500 muestras. ---------------------------- COMPUESTOS DE LA MUESTRA ---------------------------- - Compuesto --- Tiempo de retención (s) --- Masa/carga (Da) --- Área (50%) --Área(80%) 1 799.5 463.089 1035012 677852 2 744.0 609.148 533564 350664 3 498.8 191.056 441100 246900 4 373.5 595.133 349856 160384 5 634.9 179.035 341868 200556 6 599.2 191.056 60144 47660 7 412.2 463.088 49368 30544
................... Compuesto 1 .......................
+++++ Características Ion principal +++++ - Tiempo - Masa - Desviación estándar tiempo (s) - Desviación estándar masa (mDa) - 799.543 463.089 1.991 0.65 - Área al 50% - Área al 80% - Número de secundarias - 1035012 677852 42 +++++ Iones principal y secundarios +++++ ----- Número ----- Masa --- Área relativa (%) al 50% --- Área relativa (%) al 80% --- 1 463.089 100.00 100.00 2 464.092 26.25 25.90 3 465.094 4.75 4.33 4 531.073 3.87 3.45 5 300.026 2.25 2.07 6 547.042 2.49 1.13 7 301.034 1.44 1.13 8 302.037 0.25 0.09 9 384.988 -1.00 0.37 10 466.097 0.99 0.57 11 467.101 0.25 0.21 12 517.013 -1.00 0.17 13 521.043 0.80 0.84 14 523.044 0.36 0.34 15 532.073 1.13 0.40 16 533.059 1.14 0.94 17 534.060 0.28 0.20 18 548.051 0.68 0.82 19 549.049 0.15 0.18 20 553.046 0.76 0.78 21 561.049 0.17 0.10 22 562.007 0.52 0.66 23 563.014 1.42 1.29 24 564.020 0.46 0.33 25 565.008 0.29 0.36 26 575.099 0.42 0.33 27 579.060 0.51 0.37 28 583.033 0.40 0.36 29 585.017 0.19 0.22 30 593.045 0.92 0.87 31 599.053 0.46 0.50 32 601.048 -1.00 0.24 33 605.013 0.21 0.21 34 615.029 1.03 0.67 35 616.029 -1.00 0.33 36 617.025 0.20 0.23 37 621.052 0.37 0.30 38 630.998 -1.00 0.24 39 646.973 0.21 0.28 40 667.043 -1.00 0.15 41 671.106 0.19 0.15 42 927.183 0.49 0.26 43 928.190 0.39 0.51
................... Compuesto 2 .......................
+++++ Características Ion principal +++++ - Tiempo - Masa - Desviación estándar tiempo (s) - Desviación estándar masa (mDa) - 744.046 609.148 2.201 0.63 - Área al 50% - Área al 80% - Número de secundarias - 533564 350664 27
142
+++++ Iones principal y secundarios +++++ ----- Número ----- Masa --- Área relativa (%) al 50% --- Área relativa (%) al 80% --- 1 609.148 100.00 100.00 2 610.152 28.91 38.84 3 611.154 7.84 7.12 4 677.134 7.92 5.55 5 612.156 1.75 2.02 6 663.071 -1.00 1.31 7 664.070 -1.00 -1.00 8 667.105 0.86 1.19 9 669.109 -1.00 0.30 10 678.138 3.15 2.14 11 679.123 1.88 1.55 12 680.121 0.46 0.57 13 681.122 -1.00 0.27 14 693.106 1.42 1.71 15 694.110 0.46 0.32 16 699.109 0.80 0.74 17 704.069 -1.00 0.29 18 707.117 0.73 0.91 19 708.079 0.71 0.86 20 709.078 0.60 0.55 21 729.097 0.44 0.54 22 731.059 0.43 0.28 23 739.108 1.59 1.37 24 740.117 -1.00 0.70 25 745.116 0.66 0.62 26 761.092 0.29 0.44 27 762.076 0.48 0.56 28 795.184 0.66 0.79
................... Compuesto 3 .......................
+++++ Características Ion principal +++++ - Tiempo - Masa - Desviación estándar tiempo (s) - Desviación estándar masa (mDa) - 498.837 191.056 2.309 0.69 - Área al 50% - Área al 80% - Número de secundarias - 441100 246900 41 +++++ Iones principal y secundarios +++++ ----- Número ----- Masa --- Área relativa (%) al 50% --- Área relativa (%) al 80% --- 1 191.056 100.00 100.00 2 375.068 28.75 33.35 3 353.086 14.14 12.62 4 376.071 6.36 8.79 5 192.059 8.50 8.51 6 437.039 6.89 7.37 7 443.052 3.67 2.47 8 161.023 2.83 2.86 9 173.045 0.42 0.40 10 193.061 1.43 1.75 11 354.089 2.32 2.10 12 355.092 0.71 0.85 13 377.073 1.57 1.02 14 391.043 2.56 1.25 15 407.006 2.36 1.72 16 408.012 0.97 0.63 17 411.041 1.25 2.05 18 413.019 -1.00 0.90 19 421.063 2.20 1.96 20 422.064 0.72 0.73 21 423.049 2.97 2.30 22 424.055 0.87 0.97 23 427.013 0.64 0.48 24 433.021 0.44 0.49 25 438.047 2.57 3.25 26 444.052 0.97 1.22 27 452.002 0.89 0.76 28 454.026 0.33 0.30 29 459.019 1.22 1.10 30 460.033 -1.00 0.65 31 473.033 1.36 1.30 32 474.993 1.19 1.79 33 481.062 0.48 0.55 34 489.016 0.42 0.64 35 505.022 2.81 3.16 36 511.032 0.87 1.06 37 520.990 0.84 0.78 38 542.977 0.66 0.44 39 573.011 1.05 1.01 40 707.183 2.37 2.63 41 708.181 1.12 0.74 42 729.160 2.47 3.08
................... Compuesto 4 .......................
+++++ Características Ion principal +++++ - Tiempo - Masa - Desviación estándar tiempo (s) - Desviación estándar masa (mDa) -
143
373.502 595.133 5.168 1.25 - Área al 50% - Área al 80% - Número de secundarias - 349856 160384 10 +++++ Iones principal y secundarios +++++ ----- Número ----- Masa --- Área relativa (%) al 50% --- Área relativa (%) al 80% --- 1 595.133 100.00 100.00 2 596.136 32.67 33.91 3 613.143 16.61 21.32 4 597.138 8.67 6.98 5 598.142 2.19 2.86 6 614.149 4.51 4.16 7 663.116 6.82 7.25 8 664.121 2.74 1.96 9 665.110 1.56 1.45 10 679.087 1.38 0.92 11 694.051 1.34 1.46
................... Compuesto 5 .......................
+++++ Características Ion principal +++++ - Tiempo - Masa - Desviación estándar tiempo (s) - Desviación estándar masa (mDa) - 634.884 179.035 2.084 0.44 - Área al 50% - Área al 80% - Número de secundarias - 341868 200556 42 +++++ Iones principal y secundarios +++++ ----- Número ----- Masa --- Área relativa (%) al 50% --- Área relativa (%) al 80% --- 1 179.035 100.00 100.00 2 135.046 22.89 25.34 3 262.986 12.32 11.33 4 180.039 9.94 10.30 5 134.038 2.05 2.16 6 136.050 1.89 1.76 7 181.039 1.91 1.47 8 201.013 1.06 1.37 9 203.019 1.01 0.68 10 216.997 0.47 0.62 11 232.971 0.55 0.47 12 233.962 1.21 0.31 13 234.972 4.58 4.35 14 236.980 1.00 0.80 15 247.012 4.30 2.00 16 248.009 1.27 1.22 17 263.991 1.75 1.01 18 268.933 1.61 1.37 19 278.956 1.96 1.25 20 295.002 3.18 3.42 21 298.973 0.60 0.54 22 330.971 1.52 1.23 23 341.008 1.30 1.22 24 359.077 2.22 2.71 25 376.968 0.73 0.78 26 381.053 4.24 6.25 27 382.055 0.87 0.90 28 383.034 4.41 5.13 29 384.036 1.05 0.43 30 397.022 2.36 2.72 31 403.021 0.45 0.42 32 411.988 3.21 2.09 33 412.993 3.74 2.90 34 413.997 1.07 0.98 35 414.986 -1.00 0.29 36 425.018 -1.00 0.61 37 443.027 1.96 2.40 38 449.040 0.74 0.96 39 465.011 1.04 1.07 40 466.010 0.42 0.50 41 502.967 0.58 0.77 42 526.979 0.51 0.66 43 577.064 0.54 0.38
................... Compuesto 6 .......................
+++++ Características Ion principal +++++ - Tiempo - Masa - Desviación estándar tiempo (s) - Desviación estándar masa (mDa) - 599.203 191.056 1.847 0.64 - Área al 50% - Área al 80% - Número de secundarias - 60144 47660 9 +++++ Iones principal y secundarios +++++ ----- Número ----- Masa --- Área relativa (%) al 50% --- Área relativa (%) al 80% --- 1 191.056 100.00 100.00 2 375.070 40.44 22.56 3 192.058 12.29 7.81 4 193.063 -1.00 1.62 5 353.086 12.88 10.79 6 376.070 7.96 5.06 7 421.061 3.70 3.63 8 423.048 -1.00 3.64
144
9 437.040 13.30 10.05 10 443.054 4.91 5.40
................... Compuesto 7 .......................
+++++ Características Ion principal +++++ - Tiempo - Masa - Desviación estándar tiempo (s) - Desviación estándar masa (mDa) - 412.183 463.088 4.896 2.13 - Área al 50% - Área al 80% - Número de secundarias - 49368 30544 3 +++++ Iones principal y secundarios +++++ ----- Número ----- Masa --- Área relativa (%) al 50% --- Área relativa (%) al 80% --- 1 463.088 100.00 100.00 2 464.091 36.02 21.05 3 465.098 9.76 8.81 4 481.098 23.37 15.79
145
7.2. Apéndice 2. Cromatogramas de ion extraído de las masas en las que se ha detectado la presencia de un artefacto químico.
- Iones en la masa/carga 59,012 Da.
- Ion en la masa/carga 89,023 Da.
200 400 600 800 1000 1200 1400 16002000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
9000
Tiempo (s)
Inte
nsid
ad
Cromatograma de ion extraído en el rango de masas (59.012 +- 0.0250) Da
200 400 600 800 1000 1200 1400 16000
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
9000
Tiempo (s)
Inte
nsid
ad
Cromatograma de ion extraído en el rango de masas (89.023 +- 0.0250) Da
146
- Ion en la masa/carga 96,962 Da.
- Ion en la masa/carga 116,931 Da.
200 400 600 800 1000 1200 1400 16000
0.5
1
1.5
2
2.5
3x 10
4
Tiempo (s)
Inte
nsid
ad
Cromatograma de ion extraído en el rango de masas (96.962 +- 0.0250) Da
200 400 600 800 1000 1200 1400 16000
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5x 10
4
Tiempo (s)
Inte
nsid
ad
Cromatograma de ion extraído en el rango de masas (116.931 +- 0.0250) Da
147
- Ion en la masa/carga 128,037 Da.
- Ion en la masa/carga 188,956 Da.
200 400 600 800 1000 1200 1400 16000
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
4000
Tiempo (s)
Inte
nsid
ad
Cromatograma de ion extraído en el rango de masas (128.037 +- 0.0250) Da
200 400 600 800 1000 1200 14000
500
1000
1500
2000
2500
3000
Tiempo (s)
inte
nsid
ad
Cromatograma de ion extraído en el rango de masas (188.956 +- 0.1250) Da
148
- Ion en la masa/carga 157,018 Da.
- Ion en la masa/carga 173,015 Da.
200 400 600 800 1000 1200 1400 16000
500
1000
1500
2000
2500
Tiempo (s)
Inte
nsid
ad
Cromatograma de ion extraído en el rango de masas (157.018 +- 0.0250) Da
200 400 600 800 1000 1200 1400 16000
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
4000
4500
Tiempo (s)
Inte
nsid
ad
Cromatograma de ion extraído en el rango de masas (173.015 +- 0.0250) Da
149
- Ion en la masa/carga 174,994 Da.
- Ion en la masa/carga 186,993 Da.
200 400 600 800 1000 1200 1400 16000
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
Tiempo (s)
Inte
nsid
ad
Cromatograma de ion extraído en el rango de masas (174.994 +- 0.0250) Da
200 400 600 800 1000 1200 1400 16000
500
1000
1500
2000
2500
3000
Tiempo (s)
Inte
nsid
ad
Cromatograma de ion extraído en el rango de masas (186.993 +- 0.0250) Da
150
- Ion en la masa/carga 194,929 Da.
- Ion en la masa/carga 201,028 Da.
200 400 600 800 1000 1200 1400 16000
500
1000
1500
2000
2500
3000
Tiempo (s)
Inte
nsid
ad
Cromatograma de ion extraído en el rango de masas (194.929 +- 0.0250) Da
200 400 600 800 1000 1200 1400 16001000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
Tiempo (s)
Inte
nsid
ad
Cromatograma de ion extraído en el rango de masas (201.028 +- 0.0250) Da
151
- Ion en la masa/carga 202,028 Da.
- Ion en la masa/carga 203,018 Da.
200 400 600 800 1000 1200 1400 16000
500
1000
1500
2000
2500
3000
Tiempo (s)
Inte
nsid
ad
Cromatograma de ion extraído en el rango de masas (202.028 +- 0.0250) Da
200 400 600 800 1000 1200 1400 16000
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
4000
Tiempo (s)
Inte
nsid
ad
Cromatograma de ion extraído en el rango de masas (203.018 +- 0.0250) Da
152
- Ion en la masa/carga 217,005 Da.
- Ion en la masa/carga 218,009 Da.
200 400 600 800 1000 1200 1400 16000.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
1.4
1.6
1.8
2x 10
4
Tiempo (s)
Inte
nsid
ad
Cromatograma de ion extraído en el rango de masas (217.005 +- 0.0250) Da
200 400 600 800 1000 1200 1400 16000
500
1000
1500
2000
2500
Tiempo (s)
Inte
nsid
ad
Cromatograma de ion extraído en el rango de masas (218.009 +- 0.0250) Da
153
- Ion en la masa/carga 218,923 Da.
- Ion en la masa/carga 221,024 Da.
200 400 600 800 1000 1200 1400 16000
500
1000
1500
2000
2500
Tiempo (s)
Inte
nsid
ad
Cromatograma de ion extraído en el rango de masas (218.923 +- 0.0250) Da
200 400 600 800 1000 1200 1400 16000
1000
2000
3000
4000
5000
6000
Tiempo (s)
Inte
nsid
ad
Cromatograma de ion extraído en el rango de masas (221.024 +- 0.0250) Da
154
- Ion en la masa/carga 223,024 Da.
- Ion en la masa/carga 232,038 Da.
200 400 600 800 1000 1200 14000
500
1000
1500
2000
2500
3000
Tiempo (s)
inte
nsid
ad
Cromatograma de ion extraído en el rango de masas (223.024 +- 0.1250) Da
200 400 600 800 1000 1200 1400 16000
500
1000
1500
2000
2500
Tiempo (s)
Inte
nsid
ad
Cromatograma de ion extraído en el rango de masas (232.038 +- 0.0250) Da
155
- Ion en la masa/carga 232,991 Da.
- Ion en la masa/carga 240,971Da.
200 400 600 800 1000 1200 1400 16000
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
Tiempo (s)
Inte
nsid
ad
Cromatograma de ion extraído en el rango de masas (232.991 +- 0.0250) Da
200 400 600 800 1000 1200 1400 16000
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
Tiempo (s)
Inte
nsid
ad
Cromatograma de ion extraído en el rango de masas (240.971 +- 0.0250) Da
156
- Ion en la masa/carga 242,969 Da.
- Ion en la masa/carga 247,016 Da.
200 400 600 800 1000 1200 1400 16000
500
1000
1500
2000
2500
Tiempo (s)
Inte
nsid
ad
Cromatograma de ion extraído en el rango de masas (242.969 +- 0.0250) Da
200 400 600 800 1000 1200 1400 16000
1000
2000
3000
4000
5000
6000
Tiempo (s)
Inte
nsid
ad
Cromatograma de ion extraído en el rango de masas (247.016 +- 0.0250) Da
157
- Ion en la masa/carga 255,234 Da.
- Ion en la masa/carga 263,037 Da.
200 400 600 800 1000 1200 14000
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
Tiempo (s)
inte
nsid
ad
Cromatograma de ion extraído en el rango de masas (255.234 +- 0.1250) Da
200 400 600 800 1000 1200 1400 16000
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
Tiempo (s)
Inte
nsid
ad
Cromatograma de ion extraído en el rango de masas (263.037 +- 0.0250) Da
158
- Ion en la masa/carga 291,991 Da.
- Ion en la masa/carga 359,018 Da.
200 400 600 800 1000 1200 1400 16000
1000
2000
3000
4000
5000
6000
Tiempo (s)
Inte
nsid
ad
Cromatograma de ion extraído en el rango de masas (291.991 +- 0.0250) Da
200 400 600 800 1000 1200 1400 16000
500
1000
1500
2000
2500
3000
Tiempo (s)
Inte
nsid
ad
Cromatograma de ion extraído en el rango de masas (359.018 +- 0.0250) Da
159
- Ion en la masa/carga 374,994 Da.
200 400 600 800 1000 1200 1400 16000
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
4000
4500
Tiempo (s)
Inte
nsid
ad
Cromatograma de ion extraído en el rango de masas (374.994 +- 0.0250) Da
160
7.3. Apéndice 3. Picos cromatográficos principales de cada compuesto detectado en la muestra 1 de la colección de aceites de oliva. Los compuestos han sido detectados y caracterizados con un umbral de
intensidad alto de 8.000 cuentas. Para ocupar menos espacio y que se vean mejor los picos cromatográficos, éstos se han representado en un cromatograma de ion extraído centrado en su masa, introduciendo en ese cromatograma todos los picos cromatográficos que tuviesen una masa parecida. Cada pico cromatográfico principal detectado se distingue del resto por tener un color diferente, mientras que lo que se vea de color azul, serán las entradas del cromatograma que no corresponden a ningún pico principal, ya sea porque se considera ruido, o porque se ha considerado como una especie isotópica secundaria de una de las especies isotópicas principales.
0 5 10 15 20 250
1
2
3
4
5
6
7x 10
5
Tiempo (s)
Inte
nsid
ad
Cromatograma de ion extraído en el rango de masas (377.128 +- 0.0250) Da
Cromatograma ion extraído
Tiempo: 1245.770 s (20.76 min) Masa: 377.128 (Da)
Tiempo: 1133.145 s (18.89 min) Masa: 377.127 (Da)
Tiempo: 889.115 s (14.82 min) Masa: 377.127 (Da)
Tiempo: 1074.869 s (17.91 min) Masa: 377.127 (Da)
Tiempo: 1294.581 s (21.58 min) Masa: 377.127 (Da)
Tiempo: 1047.044 s (17.45 min) Masa: 377.128 (Da)
Tiempo: 975.558 s (16.26 min) Masa: 377.127 (Da)
Tiempo: 848.365 s (14.14 min) Masa: 377.127 (Da)
Tiempo: 1315.032 s (21.92 min) Masa: 377.127 (Da)
Tiempo: 861.613 s (14.36 min) Masa: 377.126 (Da)
Tiempo: 760.632 s (12.68 min) Masa: 377.126 (Da)
Tiempo: 757.462 s (12.62 min) Masa: 377.126 (Da)
Tiempo: 1148.099 s (19.13 min) Masa: 377.127 (Da)
Tiempo: 1026.004 s (17.10 min) Masa: 377.128 (Da)
0 5 10 15 20 250
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10x 10
4
Tiempo (s)
Inte
nsid
ad
Cromatograma de ion extraído en el rango de masas (319.121 +- 0.0250) Da
Cromatograma ion extraído
Tiempo: 912.081 s (15.20 min) Masa: 319.121 (Da)
Tiempo: 971.240 s (16.19 min) Masa: 319.120 (Da)
Tiempo: 868.618 s (14.48 min) Masa: 319.121 (Da)
161
0 5 10 15 20 250
1
2
3
4
5
6
7x 10
4
Tiempo (s)
Inte
nsid
ad
Cromatograma de ion extraído en el rango de masas (183.068 +- 0.0250) Da
Cromatograma ion extraído
Tiempo: 1071.542 s (17.86 min) Masa: 183.068 (Da)
Tiempo: 834.428 s (13.91 min) Masa: 183.068 (Da)
0 5 10 15 20 250
0.5
1
1.5
2
2.5x 10
5
Tiempo (s)
Inte
nsid
ad
Cromatograma de ion extraído en el rango de masas (285.043 +- 0.0250) Da
Cromatograma ion extraído
Tiempo: 957.982 s (15.97 min) Masa: 285.043 (Da)
0 5 10 15 20 250
1
2
3
4
5
6
7
8x 10
4
Tiempo (s)
Inte
nsid
ad
Cromatograma de ion extraído en el rango de masas (139.007 +- 0.0250) Da
Cromatograma ion extraído
Tiempo: 805.116 s (13.42 min) Masa: 139.007 (Da)
Tiempo: 766.244 s (12.77 min) Masa: 139.007 (Da)
Tiempo: 742.355 s (12.37 min) Masa: 139.007 (Da)
162
0 5 10 15 20 250
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
1.4
1.6
1.8
2x 10
4
Tiempo (s)
Inte
nsid
ad
Cromatograma de ion extraído en el rango de masas (320.124 +- 0.0250) Da
Cromatograma ion extraído
Tiempo: 890.731 s (14.85 min) Masa: 320.124 (Da)
0 5 10 15 20 250
2
4
6
8
10
12
14
16
18x 10
4
Tiempo (s)
Inte
nsid
ad
Cromatograma de ion extraído en el rango de masas (415.142 +- 0.0250) Da
Cromatograma ion extraído
Tiempo: 1040.690 s (17.34 min) Masa: 415.142 (Da)
0 5 10 15 20 250
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
4
4.5x 10
4
Tiempo (s)
Inte
nsid
ad
Cromatograma de ion extraído en el rango de masas (339.203 +- 0.0250) Da
Cromatograma ion extraído
Tiempo: 1288.406 s (21.47 min) Masa: 339.203 (Da)
Tiempo: 1244.805 s (20.75 min) Masa: 339.203 (Da)
163
0 5 10 15 20 250
5
10
15x 10
4
Tiempo (s)
Inte
nsid
ad
Cromatograma de ion extraído en el rango de masas (153.058 +- 0.0250) Da
Cromatograma ion extraído
Tiempo: 387.684 s (6.46 min) Masa: 153.058 (Da)
0 5 10 15 20 250
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
4
4.5x 10
4
Tiempo (s)
Inte
nsid
ad
Cromatograma de ion extraído en el rango de masas (325.186 +- 0.0250) Da
Cromatograma ion extraído
Tiempo: 1275.184 s (21.25 min) Masa: 325.186 (Da)
Tiempo: 1101.261 s (18.35 min) Masa: 325.185 (Da)
0 5 10 15 20 250
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
4x 10
4
Tiempo (s)
Inte
nsid
ad
Cromatograma de ion extraído en el rango de masas (349.132 +- 0.0250) Da
Cromatograma ion extraído
Tiempo: 784.619 s (13.08 min) Masa: 349.132 (Da)
164
0 5 10 15 20 250
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10x 10
4
Tiempo (s)
Inte
nsid
ad
Cromatograma de ion extraído en el rango de masas (269.046 +- 0.0250) Da
Cromatograma ion extraído
Tiempo: 1122.183 s (18.70 min) Masa: 269.046 (Da)
0 5 10 15 20 250
1
2
3
4
5
6x 10
4
Tiempo (s)
Inte
nsid
ad
Cromatograma de ion extraído en el rango de masas (213.078 +- 0.0250) Da
Cromatograma ion extraído
Tiempo: 1048.903 s (17.48 min) Masa: 213.078 (Da)
Tiempo: 765.115 s (12.75 min) Masa: 213.078 (Da)
Tiempo: 810.875 s (13.51 min) Masa: 213.078 (Da)
0 5 10 15 20 250
2
4
6
8
10
12
14
16
18x 10
4
Tiempo (s)
Inte
nsid
ad
Cromatograma de ion extraído en el rango de masas (275.092 +- 0.0250) Da
Cromatograma ion extraído
Tiempo: 1135.762 s (18.93 min) Masa: 275.092 (Da)
Tiempo: 851.780 s (14.20 min) Masa: 275.093 (Da)
Tiempo: 1001.424 s (16.69 min) Masa: 275.092 (Da)
Tiempo: 1213.623 s (20.23 min) Masa: 275.092 (Da)
Tiempo: 1179.744 s (19.66 min) Masa: 275.092 (Da)
Tiempo: 1105.533 s (18.43 min) Masa: 275.090 (Da)
Tiempo: 828.998 s (13.82 min) Masa: 275.092 (Da)
165
0 5 10 15 20 250
1
2
3
4
5
6x 10
4
Tiempo (s)
Inte
nsid
ad
Cromatograma de ion extraído en el rango de masas (361.133 +- 0.0250) Da
Cromatograma ion extraído
Tiempo: 1237.723 s (20.63 min) Masa: 361.133 (Da)
Tiempo: 989.663 s (16.49 min) Masa: 361.132 (Da)
Tiempo: 1150.278 s (19.17 min) Masa: 361.132 (Da)
Tiempo: 1260.718 s (21.01 min) Masa: 361.132 (Da)
0 5 10 15 20 250
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
4
4.5x 10
4
Tiempo (s)
Inte
nsid
ad
Cromatograma de ion extraído en el rango de masas (95.049 +- 0.0250) Da
Cromatograma ion extraído
Tiempo: 914.925 s (15.25 min) Masa: 95.049 (Da)
Tiempo: 886.070 s (14.77 min) Masa: 95.049 (Da)
Tiempo: 793.553 s (13.23 min) Masa: 95.049 (Da)
Tiempo: 849.936 s (14.17 min) Masa: 95.049 (Da)
0 5 10 15 20 250
1
2
3
4
5
6x 10
4
Tiempo (s)
Inte
nsid
ad
Cromatograma de ion extraído en el rango de masas (375.113 +- 0.0250) Da
Cromatograma ion extraído
Tiempo: 1252.908 s (20.88 min) Masa: 375.113 (Da)
166
0 5 10 15 20 250
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
1.4
1.6
1.8
2x 10
5
Tiempo (s)
Inte
nsid
ad
Cromatograma de ion extraído en el rango de masas (307.084 +- 0.0250) Da
Cromatograma ion extraído
Tiempo: 1031.751 s (17.20 min) Masa: 307.084 (Da)
0 5 10 15 20 250
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5x 10
4
Tiempo (s)
Inte
nsid
ad
Cromatograma de ion extraído en el rango de masas (195.068 +- 0.0250) Da
Cromatograma ion extraído
Tiempo: 928.519 s (15.48 min) Masa: 195.068 (Da)
Tiempo: 880.752 s (14.68 min) Masa: 195.067 (Da)
Tiempo: 842.187 s (14.04 min) Masa: 195.068 (Da)
0 5 10 15 20 250
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
4
4.5x 10
4
Tiempo (s)
Inte
nsid
ad
Cromatograma de ion extraído en el rango de masas (335.116 +- 0.0250) Da
Cromatograma ion extraído
Tiempo: 832.983 s (13.88 min) Masa: 335.116 (Da)
167
0 5 10 15 20 250
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
4x 10
4
Tiempo (s)
Inte
nsid
ad
Cromatograma de ion extraído en el rango de masas (241.073 +- 0.0250) Da
Cromatograma ion extraído
Tiempo: 980.661 s (16.34 min) Masa: 241.073 (Da)
Tiempo: 770.609 s (12.84 min) Masa: 241.073 (Da)
Tiempo: 1157.355 s (19.29 min) Masa: 241.073 (Da)
0 5 10 15 20 250
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
4x 10
4
Tiempo (s)
Inte
nsid
ad
Cromatograma de ion extraído en el rango de masas (291.089 +- 0.0250) Da
Cromatograma ion extraído
Tiempo: 1278.216 s (21.30 min) Masa: 291.089 (Da)
0 5 10 15 20 250
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
4x 10
4
Tiempo (s)
Inte
nsid
ad
Cromatograma de ion extraído en el rango de masas (357.137 +- 0.0250) Da
Cromatograma ion extraído
Tiempo: 1002.750 s (16.71 min) Masa: 357.137 (Da)
168
0 5 10 15 20 250
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
4x 10
4
Tiempo (s)
Inte
nsid
ad
Cromatograma de ion extraído en el rango de masas (393.122 +- 0.0250) Da
Cromatograma ion extraído
Tiempo: 912.361 s (15.21 min) Masa: 393.122 (Da)
Tiempo: 889.446 s (14.82 min) Masa: 393.122 (Da)
0 5 10 15 20 250
0.5
1
1.5
2
2.5
3x 10
4
Tiempo (s)
Inte
nsid
ad
Cromatograma de ion extraído en el rango de masas (137.062 +- 0.0250) Da
Cromatograma ion extraído
Tiempo: 490.253 s (8.17 min) Masa: 137.062 (Da)
0 5 10 15 20 250
0.5
1
1.5
2
2.5x 10
4
Tiempo (s)
Inte
nsid
ad
Cromatograma de ion extraído en el rango de masas (187.099 +- 0.0250) Da
Cromatograma ion extraído
Tiempo: 792.562 s (13.21 min) Masa: 187.099 (Da)
169
0 5 10 15 20 250
0.5
1
1.5
2
2.5
3x 10
4
Tiempo (s)
Inte
nsid
ad
Cromatograma de ion extraído en el rango de masas (391.143 +- 0.0250) Da
Cromatograma ion extraído
Tiempo: 1020.846 s (17.01 min) Masa: 391.143 (Da)
Tiempo: 1300.225 s (21.67 min) Masa: 391.143 (Da)
Tiempo: 960.279 s (16.00 min) Masa: 391.143 (Da)
Tiempo: 1211.474 s (20.19 min) Masa: 391.142 (Da)
0 5 10 15 20 250
5000
10000
15000
Tiempo (s)
Inte
nsid
ad
Cromatograma de ion extraído en el rango de masas (185.048 +- 0.0250) Da
Cromatograma ion extraído
Tiempo: 925.684 s (15.43 min) Masa: 185.048 (Da)
0 5 10 15 20 250
0.5
1
1.5
2
2.5
3x 10
4
Tiempo (s)
Inte
nsid
ad
Cromatograma de ion extraído en el rango de masas (343.263 +- 0.0250) Da
Cromatograma ion extraído
Tiempo: 1334.202 s (22.24 min) Masa: 343.263 (Da)
170
0 5 10 15 20 250
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
1.4
1.6
1.8
2x 10
4
Tiempo (s)
Inte
nsid
ad
Cromatograma de ion extraído en el rango de masas (242.177 +- 0.0250) Da
Cromatograma ion extraído
Tiempo: 1149.320 s (19.16 min) Masa: 242.177 (Da)
0 5 10 15 20 250
2000
4000
6000
8000
10000
12000
14000
16000
18000
Tiempo (s)
Inte
nsid
ad
Cromatograma de ion extraído en el rango de masas (417.157 +- 0.0250) Da
Cromatograma ion extraído
Tiempo: 944.077 s (15.73 min) Masa: 417.157 (Da)
0 5 10 15 20 250
5000
10000
15000
Tiempo (s)
Inte
nsid
ad
Cromatograma de ion extraído en el rango de masas (315.127 +- 0.0250) Da
Cromatograma ion extraído
Tiempo: 1343.125 s (22.39 min) Masa: 315.127 (Da)
171
0 5 10 15 20 250
2000
4000
6000
8000
10000
12000
14000
Tiempo (s)
Inte
nsid
ad
Cromatograma de ion extraído en el rango de masas (299.057 +- 0.0250) Da
Cromatograma ion extraído
Tiempo: 1159.049 s (19.32 min) Masa: 299.057 (Da)
0 5 10 15 20 250
2000
4000
6000
8000
10000
12000
14000
16000
Tiempo (s)
Inte
nsid
ad
Cromatograma de ion extraído en el rango de masas (185.118 +- 0.0250) Da
Cromatograma ion extraído
Tiempo: 880.923 s (14.68 min) Masa: 185.118 (Da)
0 5 10 15 20 250
0.5
1
1.5
2
2.5
3x 10
4
Tiempo (s)
Inte
nsid
ad
Cromatograma de ion extraído en el rango de masas (253.219 +- 0.0250) Da
Cromatograma ion extraído
Tiempo: 1335.231 s (22.25 min) Masa: 253.219 (Da)
Tiempo: 1307.854 s (21.80 min) Masa: 253.218 (Da)
172
0 5 10 15 20 250
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
4
4.5x 10
4
Tiempo (s)
Inte
nsid
ad
Cromatograma de ion extraído en el rango de masas (311.171 +- 0.0250) Da
Cromatograma ion extraído
Tiempo: 1280.269 s (21.34 min) Masa: 311.171 (Da)
Tiempo: 1174.402 s (19.57 min) Masa: 311.170 (Da)
0 5 10 15 20 250
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5x 10
4
Tiempo (s)
Inte
nsid
ad
Cromatograma de ion extraído en el rango de masas (265.150 +- 0.0250) Da
Cromatograma ion extraído
Tiempo: 1265.637 s (21.09 min) Masa: 265.150 (Da)
0 5 10 15 20 250
1
2
3
4
5
6
7
8x 10
4
Tiempo (s)
Inte
nsid
ad
Cromatograma de ion extraído en el rango de masas (149.026 +- 0.0250) Da
Cromatograma ion extraído
Tiempo: 1174.998 s (19.58 min) Masa: 149.026 (Da)
173
0 5 10 15 20 250
2000
4000
6000
8000
10000
12000
14000
Tiempo (s)
Inte
nsid
ad
Cromatograma de ion extraído en el rango de masas (297.155 +- 0.0250) Da
Cromatograma ion extraído
Tiempo: 1310.184 s (21.84 min) Masa: 297.155 (Da)
174
7.4. Apéndice 4. Compuestos encontrados en las 22 muestras de aceites de oliva, sin incluir las huellas espectrométricas.
Para obtener los compuestos en cada una de las muestras, se ha usado un
umbral alto de intensidad de 8000 cuentas y uno bajo de 120 cuentas. Los compuestos se han ordenado por tiempo de retención.
-------------- Fichero gg1.bin --------------- ..................................... Compuestos encontrados....................................... Nº RT(s) M/z(mDa) Desv.Est.T.(s) Desv.Est.M.(mDa) Área(50%) Área(80%) Nº sec - 1 387.7 153.058 2.20 0.21 878884 521116 26 2 490.3 137.062 1.87 0.59 149684 78920 7 3 742.4 139.007 5.22 0.63 147428 74384 69 4 757.5 377.126 3.87 1.40 120100 64584 12 5 760.6 377.126 5.50 1.44 179268 97872 18 6 765.1 213.078 8.55 0.78 270160 187400 22 7 766.2 139.007 5.29 0.45 315952 161620 75 8 770.6 241.073 4.01 0.90 137548 49596 31 9 784.6 349.132 19.94 0.86 688948 520236 11 10 792.6 187.099 3.37 0.37 136324 113260 7 11 793.6 95.049 4.57 0.53 200304 112532 143 12 805.1 139.007 8.17 0.38 1134816 452504 41 13 810.9 213.078 7.95 0.96 -1 124860 114 14 829.0 275.092 4.40 1.29 -1 79396 101 15 833.0 335.116 1.64 0.87 190788 146704 7 16 834.4 183.068 8.19 0.29 -1 546232 39 17 842.2 195.068 5.60 0.98 -1 81096 78 18 848.4 377.127 1.91 0.58 367124 191656 41 19 849.9 95.049 7.44 0.40 -1 241368 45 20 851.8 275.093 4.47 0.79 283164 110872 25 21 861.6 377.126 4.55 0.90 239144 170412 61 22 868.6 319.121 11.59 0.42 -1 2516948 71 23 880.8 195.067 16.75 0.54 -1 540280 64 24 880.9 185.118 1.31 1.28 55672 27864 27 25 886.1 95.049 5.48 0.46 317616 129556 50 26 889.1 377.127 2.22 0.74 1020308 752980 60 27 889.4 393.122 4.74 1.28 119932 63240 20 28 890.7 320.124 22.02 0.72 1077156 673952 4 29 912.1 319.121 12.69 0.43 2721184 1788304 11 30 912.4 393.122 3.22 0.88 153384 102412 58 31 914.9 95.049 8.92 0.38 321684 124940 129 32 925.7 185.048 3.24 1.99 121448 77332 9 33 928.5 195.068 10.11 0.61 197572 104672 8 34 944.1 417.157 1.95 1.27 83856 43152 13 35 958.0 285.043 1.95 0.45 1169240 879488 22 36 960.3 391.143 3.38 0.75 106920 54108 33 37 971.2 319.120 1.96 0.71 87540 51024 16 38 975.6 377.127 3.06 0.81 588048 271696 28 39 980.7 241.073 1.74 0.62 183580 135720 1 40 989.7 361.132 2.08 0.59 202568 121084 75 41 1001.4 275.092 3.37 0.72 142656 71172 127 42 1002.7 357.137 1.78 0.53 178492 133212 7 43 1020.8 391.143 2.35 0.44 123020 91176 21 44 1026.0 377.128 4.55 0.95 -1 114320 138 45 1031.8 307.084 4.53 0.74 249716 145948 38 46 1040.7 415.142 2.08 0.55 932424 625536 35 47 1047.0 377.128 6.33 0.69 617840 306052 115 48 1048.9 213.078 2.73 0.37 462896 310524 34 49 1071.5 183.068 31.13 0.65 1228704 631608 21 50 1074.9 377.127 2.66 0.46 841052 456260 62 51 1101.3 325.185 18.34 1.26 -1 335368 76 52 1105.5 275.090 8.16 0.99 -1 247556 136 53 1122.2 269.046 2.21 0.26 531204 350044 6 54 1133.1 377.127 2.09 0.57 1232572 737884 61 55 1135.8 275.092 3.11 0.66 437504 229428 48 56 1148.1 377.127 4.85 0.67 -1 539236 149 57 1149.3 242.177 2.92 0.34 106768 56000 5 58 1150.3 361.132 4.49 1.03 147012 59668 25 59 1157.4 241.073 2.23 0.83 73712 37992 3 60 1159.0 299.057 1.67 1.15 62736 36888 6 61 1174.4 311.170 23.66 0.76 -1 646700 51 62 1175.0 149.026 10.02 0.62 -1 194444 62 63 1179.7 275.092 10.94 0.89 -1 436996 93 64 1211.5 391.142 3.46 0.97 91932 48932 23 65 1213.6 275.092 8.86 0.88 -1 529840 131 66 1237.7 361.133 6.08 0.65 359708 209412 12 67 1244.8 339.203 10.81 0.70 -1 318380 82 68 1245.8 377.128 7.85 0.74 5716396 3410852 47 69 1252.9 375.113 2.53 1.27 271520 181820 24 70 1260.7 361.132 3.67 1.26 -1 67548 82 71 1265.6 265.150 7.47 0.69 -1 273144 21 72 1275.2 325.186 11.33 0.90 778588 476648 16 73 1278.2 291.089 7.09 0.86 180864 86064 41
175
74 1280.3 311.171 10.86 0.61 -1 577940 52 75 1288.4 339.203 12.91 0.54 920456 451260 27 76 1294.6 377.127 2.04 0.45 621692 405100 53 77 1300.2 391.143 3.39 0.88 117684 69752 4 78 1307.9 253.218 6.79 0.68 -1 285032 78 79 1310.2 297.155 8.33 1.00 -1 162160 78 80 1315.0 377.127 2.48 0.61 252760 190216 31 81 1334.2 343.263 2.12 0.38 112852 76616 3 82 1335.2 253.219 9.15 0.64 -1 408940 146 83 1343.1 315.127 1.58 0.64 72840 54216 9
-------------- Fichero gg2.bin --------------- ..................................... Compuestos encontrados....................................... Nº RT(s) M/z(mDa) Desv.Est.T.(s) Desv.Est.M.(mDa) Área(50%) Área(80%) Nº sec - 1 387.5 153.057 1.83 0.20 554812 296796 24 2 490.6 137.061 2.00 0.82 154480 113268 9 3 769.5 139.008 2.62 0.59 132016 71684 108 4 792.2 187.099 2.91 0.41 125840 91496 8 5 792.9 139.007 3.95 0.71 -1 134644 132 6 800.7 95.049 6.15 0.55 171564 64700 98 7 805.9 319.121 9.92 0.66 387236 183020 9 8 811.1 139.007 5.07 0.55 505024 216720 55 9 833.2 335.116 1.70 0.81 123112 77092 7 10 834.6 319.121 6.86 0.50 -1 456324 134 11 841.8 639.248 11.89 1.39 318084 167068 10 12 848.1 377.127 1.82 0.81 291056 149984 56 13 849.3 183.068 20.18 0.38 2229904 1351236 1 14 853.8 275.093 5.03 1.20 195016 66276 57 15 862.3 377.126 5.15 0.73 182584 111760 56 16 865.6 393.122 2.58 1.50 69232 52628 30 17 880.8 195.068 15.38 0.61 -1 384704 97 18 888.4 377.128 1.75 0.59 787048 586096 48 19 889.9 393.122 4.20 0.90 128876 56228 25 20 889.9 95.049 4.34 0.24 220836 103124 85 21 890.2 319.121 22.71 0.50 4487340 3083672 5 22 909.9 291.088 9.32 1.44 -1 86576 102 23 910.8 393.122 3.71 1.13 178304 138148 56 24 911.4 151.042 3.76 0.48 124596 68028 10 25 914.5 183.068 14.57 0.37 1651412 1035608 13 26 922.7 320.124 10.38 1.12 215448 109988 12 27 944.0 417.156 1.54 1.31 77264 50160 11 28 957.7 361.131 10.12 0.96 -1 214616 105 29 957.9 285.041 1.91 0.38 580328 436860 9 30 962.0 391.141 4.24 1.49 85752 42836 6 31 971.3 319.120 1.69 0.41 93924 77868 24 32 976.2 377.126 2.80 0.52 563440 333464 31 33 980.6 241.072 1.72 0.41 148196 108812 3 34 988.3 361.131 2.19 0.81 253092 167820 38 35 999.8 183.067 7.34 0.69 -1 192828 115 36 1000.2 275.091 4.88 0.91 141020 69364 23 37 1001.9 361.131 3.49 0.94 181872 115916 90 38 1002.5 357.136 1.67 0.50 298576 224328 8 39 1020.3 391.141 2.04 0.85 117604 78352 25 40 1025.3 377.126 5.33 0.74 -1 185564 119 41 1029.1 307.083 5.03 0.75 -1 119644 77 42 1033.4 183.067 12.18 0.61 -1 554104 65 43 1040.5 415.137 1.60 1.48 184396 88300 16 44 1046.7 181.051 4.48 0.69 154308 140652 6 45 1048.1 377.125 7.46 0.83 722380 297432 102 46 1049.6 213.077 2.98 0.32 697964 444004 41 47 1071.1 95.048 5.73 0.49 192440 82280 128 48 1074.3 377.126 2.83 0.33 1011204 649192 44 49 1112.2 183.067 5.91 0.62 -1 217652 180 50 1122.4 269.046 2.28 0.32 156452 103656 1 51 1128.2 183.067 3.63 0.59 -1 65248 120 52 1132.9 377.127 2.18 0.58 1777088 1046060 61 53 1136.3 307.083 3.53 0.48 562136 397624 23 54 1148.8 377.126 4.58 0.54 -1 506824 171 55 1149.3 242.177 2.46 0.29 94044 54260 5 56 1153.1 291.088 5.89 0.95 142008 65236 69 57 1157.1 241.073 2.14 0.79 101520 79340 6 58 1184.3 377.127 10.74 0.53 -1 1430928 123 59 1204.4 275.091 6.93 0.75 -1 542400 123 60 1208.0 378.130 10.48 0.87 755848 233208 90 61 1218.8 333.135 1.90 0.62 69348 36484 4 62 1225.2 345.098 7.19 0.49 -1 275236 94 63 1230.9 149.025 4.90 0.32 -1 254912 116 64 1239.5 361.131 4.68 0.58 498540 375588 7 65 1244.8 377.127 9.24 1.29 7509948 4794380 44 66 1251.9 375.111 1.94 0.97 319008 185964 30 67 1261.6 361.130 2.61 0.62 167964 91600 109 68 1266.4 253.217 5.37 0.94 155616 84488 12 69 1271.2 325.184 8.32 0.76 525612 251048 27 70 1280.2 311.169 10.71 0.57 -1 589836 61 71 1280.2 291.087 8.25 0.76 271908 166544 35 72 1290.1 265.148 13.95 0.72 -1 812468 81
176
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-------------- Fichero gg3.bin --------------- ..................................... Compuestos encontrados....................................... Nº RT(s) M/z(mDa) Desv.Est.T.(s) Desv.Est.M.(mDa) Área(50%) Área(80%) Nº sec - 1 387.0 123.045 2.12 0.27 143620 85660 9 2 491.4 137.060 2.09 1.12 92224 77116 7 3 640.2 151.043 14.02 0.54 458572 236144 26 4 770.3 139.008 4.24 0.93 131648 62048 94 5 792.0 183.068 10.47 0.64 326864 168584 3 6 792.1 187.100 3.06 0.41 122536 93156 10 7 809.9 139.008 5.40 0.79 317764 117852 128 8 822.8 319.121 13.33 0.39 1898972 902928 28 9 832.9 335.117 1.65 0.31 195144 147384 9 10 843.2 195.068 8.16 0.73 -1 131856 102 11 851.6 377.126 3.64 0.89 236064 136516 21 12 857.5 95.048 10.75 0.47 -1 469048 95 13 860.3 361.132 4.57 1.34 118912 86744 21 14 877.9 361.131 5.63 1.09 -1 95588 119 15 881.1 185.117 1.36 0.91 56124 47952 17 16 887.5 95.048 7.02 0.36 -1 207348 83 17 888.8 377.127 2.09 0.58 768052 563632 47 18 890.7 319.121 22.39 0.36 8150836 5564204 3 19 893.9 183.068 24.53 0.30 5686628 4148648 4 20 913.1 95.048 8.28 0.39 -1 214068 103 21 914.8 151.042 3.11 0.71 97972 62536 11 22 917.6 377.126 7.06 1.64 -1 114576 79 23 917.7 640.253 8.28 1.46 236760 160376 8 24 922.9 195.068 7.85 0.74 259428 151364 19 25 923.6 255.089 2.94 0.77 120964 77444 4 26 923.8 361.132 19.65 1.22 -1 362588 59 27 925.7 185.049 2.87 1.80 166012 81260 11 28 937.7 185.079 2.98 3.52 89244 64604 14 29 937.8 95.048 6.05 0.57 178732 71156 140 30 957.7 285.042 1.80 0.41 678852 511660 9 31 970.8 95.048 6.68 0.59 172000 69816 108 32 971.7 319.120 1.94 0.36 210660 126424 22 33 976.8 377.126 3.03 0.87 367680 223556 18 34 980.0 241.073 1.84 0.69 95640 64820 2 35 983.0 183.068 8.58 0.46 -1 312032 89 36 989.1 361.131 2.18 0.47 410020 195772 30 37 991.9 291.088 2.96 0.50 360376 175476 5 38 996.9 303.124 5.74 0.74 -1 84080 60 39 999.4 233.082 6.22 0.87 174128 136380 47 40 1001.1 275.090 2.35 1.03 79044 43340 32 41 1002.8 357.136 1.78 0.77 200028 150924 3 42 1002.8 361.131 3.72 0.68 210148 157556 40 43 1008.0 285.114 4.73 1.43 -1 89388 75 44 1011.6 285.114 6.71 1.27 -1 136444 81 45 1020.6 391.142 2.20 0.73 94012 61284 14 46 1022.9 183.068 14.23 0.46 -1 1302976 26 47 1025.2 377.127 4.89 1.00 -1 35064 113 48 1029.2 179.072 3.76 0.89 93184 51244 35 49 1032.0 255.088 1.89 0.53 131664 76624 10 50 1041.0 415.141 1.88 1.35 198616 85052 7 51 1047.7 377.128 5.88 0.80 315048 147872 86 52 1051.8 361.133 4.37 0.47 1069920 852612 46 53 1071.1 139.045 5.35 2.48 222872 95964 39 54 1075.1 377.129 2.38 0.40 536708 418308 28 55 1077.5 165.058 16.39 0.59 -1 640332 37 56 1079.6 303.127 17.24 1.02 -1 1017960 25 57 1083.2 233.084 19.81 0.89 -1 583832 20 58 1091.2 183.069 23.23 0.56 3185232 1867204 2 59 1094.2 259.101 12.98 0.72 -1 302156 60 60 1107.3 139.048 7.67 1.33 203260 113972 58 61 1114.2 165.059 5.40 0.48 -1 167272 151 62 1122.3 269.049 1.90 0.29 174844 129008 1 63 1128.4 303.128 3.60 1.08 -1 83832 152 64 1132.6 377.130 2.16 0.52 624500 410308 69 65 1146.3 377.130 3.44 0.42 561088 382160 155 66 1149.1 242.179 2.40 0.51 101120 76344 4 67 1149.7 165.059 8.06 0.92 128668 54660 33 68 1151.4 361.135 4.91 1.02 244420 107288 80 69 1156.6 241.075 1.95 1.34 88992 34056 2 70 1159.0 299.059 1.88 0.77 70908 48044 2 71 1210.9 275.094 6.58 0.57 -1 272072 95 72 1215.2 149.028 6.13 0.48 -1 166852 47 73 1218.3 339.205 8.66 0.76 -1 203128 50 74 1218.6 378.134 6.90 0.93 -1 83700 48 75 1225.2 227.096 1.87 0.87 63364 41572 9 76 1230.3 139.039 4.97 0.63 185420 108696 86 77 1233.6 265.152 14.56 0.86 -1 454152 27
177
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-------------- Fichero gg5.bin --------------- ..................................... Compuestos encontrados....................................... Nº RT(s) M/z(mDa) Desv.Est.T.(s) Desv.Est.M.(mDa) Área(50%) Área(80%) Nº sec - 1 312.3 125.997 2.63 0.37 221240 160924 46 2 387.4 123.046 2.42 0.19 903864 606484 27 3 472.6 191.056 2.13 1.01 137404 84552 2 4 490.8 137.061 2.03 0.64 210148 137604 9 5 535.6 367.104 1.86 1.21 76636 60884 2 6 604.3 151.042 3.85 0.61 -1 78856 69 7 627.9 151.041 9.75 0.55 -1 302360 68 8 631.7 367.104 1.73 0.75 71904 31224 3 9 638.2 335.089 2.70 4.47 153248 92852 23 10 659.1 151.041 8.55 0.42 200340 120256 11 11 756.7 349.129 4.07 1.50 90296 43628 17 12 766.6 139.006 5.20 0.48 205692 98380 86 13 787.8 377.124 19.55 1.13 591248 374348 18 14 792.2 187.097 3.24 0.66 98812 63572 6 15 796.5 241.071 4.79 1.15 -1 78284 82 16 799.2 127.040 6.68 0.50 216236 61908 67 17 805.1 111.009 8.78 0.48 237164 66004 39 18 807.7 139.006 6.26 0.42 643404 267408 33 19 809.3 185.081 2.46 1.12 70368 46616 5 20 822.6 183.067 13.67 0.34 1604504 789480 11 21 833.2 335.114 1.74 0.68 186688 112184 6 22 835.3 195.067 11.00 0.84 366216 217460 81 23 854.9 377.123 6.50 1.30 273304 180448 19 24 861.9 275.091 5.17 0.92 -1 110904 145 25 874.7 249.076 15.36 1.01 -1 350760 101 26 881.5 319.118 25.15 0.52 9160696 5602756 7 27 887.5 95.048 5.85 0.30 396788 164728 102 28 888.4 377.123 1.78 0.57 715448 533352 47 29 892.7 183.067 23.95 0.34 5923488 4329512 9 30 910.4 393.119 4.05 0.92 204852 91632 91 31 936.9 185.080 2.81 1.32 84224 48680 12 32 944.1 417.152 1.61 0.60 63140 29768 9 33 957.9 285.040 1.95 0.29 978424 728228 20 34 971.2 319.117 1.65 0.23 127708 76772 18 35 971.6 139.037 4.19 2.21 94856 42684 137 36 975.5 377.124 3.04 0.41 621412 277304 17 37 981.0 241.071 1.89 0.28 187908 146240 2 38 989.2 291.086 2.13 0.31 237840 114512 71 39 993.4 213.077 4.53 0.49 194400 129628 2 40 1001.6 361.130 3.42 0.61 145604 94140 71 41 1001.8 275.090 3.34 0.52 140052 74328 91 42 1002.9 357.134 1.80 0.32 313592 238428 11 43 1019.1 139.043 4.89 1.67 -1 61696 117 44 1021.1 391.140 2.56 0.35 154440 140140 11 45 1025.6 165.056 12.58 0.76 -1 314692 53 46 1028.2 183.067 12.91 0.37 -1 822992 56 47 1041.0 415.137 1.86 1.13 262156 191800 13 48 1045.8 181.051 4.27 0.91 122876 78460 5 49 1047.2 377.124 7.87 0.57 -1 397468 123 50 1050.3 213.077 2.91 0.26 499396 286732 22 51 1074.7 377.124 2.97 0.53 1076972 648992 64 52 1079.2 183.067 17.22 0.42 -1 1233200 76 53 1088.9 165.056 10.06 0.64 -1 186920 65 54 1094.1 303.123 14.65 1.01 -1 395464 50 55 1119.3 165.056 7.84 1.00 -1 161756 98 56 1122.4 269.044 1.90 0.37 366476 272860 3 57 1126.8 183.066 3.51 0.63 181096 91396 84 58 1131.3 391.138 2.40 1.31 64512 45336 24 59 1133.3 377.124 2.11 0.40 1762104 1248256 55 60 1136.4 275.090 3.52 0.38 619244 399592 40 61 1144.8 291.086 5.17 1.16 157868 84652 56 62 1147.6 183.067 7.59 0.81 208720 107272 91 63 1150.7 242.176 3.66 0.57 88920 53988 3 64 1151.0 361.130 4.45 0.73 182676 112132 60 65 1157.5 241.072 2.35 0.80 107604 70676 7 66 1159.5 299.055 1.94 0.83 104312 68272 4 67 1191.9 378.128 10.35 0.77 -1 349588 91 68 1201.2 345.098 8.92 0.85 -1 329732 86 69 1208.2 275.090 8.31 0.51 -1 881200 96 70 1212.5 391.139 3.44 1.27 112592 73980 20 71 1218.8 333.134 1.98 1.26 69176 45492 1 72 1225.2 227.093 1.94 0.53 58540 47256 9 73 1234.9 377.125 18.26 1.39 7513508 4479744 27 74 1236.6 361.130 5.99 0.49 443228 263112 11 75 1246.2 391.138 2.15 0.71 78768 51144 43
179
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-------------- Fichero gg6.bin --------------- ..................................... Compuestos encontrados....................................... Nº RT(s) M/z(mDa) Desv.Est.T.(s) Desv.Est.M.(mDa) Área(50%) Área(80%) Nº sec - 1 388.1 153.057 2.29 0.13 863360 513708 28 2 491.5 137.060 2.40 0.68 195412 155240 10 3 609.7 151.041 9.88 0.75 235164 130468 55 4 756.9 349.129 4.06 1.18 172652 121060 55 5 769.7 139.006 3.29 0.35 215344 115512 75 6 775.0 377.124 6.29 0.77 -1 280528 84 7 782.9 213.076 19.77 0.83 762356 405148 35 8 784.2 377.124 11.72 0.81 -1 559236 88 9 791.4 187.097 2.66 0.88 102420 67072 10 10 805.5 319.118 11.02 0.69 705064 445500 14 11 805.5 139.006 7.52 0.46 717220 221208 58 12 821.8 183.067 14.24 0.35 1207096 524768 1 13 822.0 349.129 10.05 1.05 -1 224624 48 14 830.2 275.090 6.72 1.03 -1 112260 45 15 831.5 377.124 5.28 0.82 -1 252140 80 16 833.3 335.114 1.76 0.67 189412 115192 5 17 837.0 319.119 7.03 0.40 -1 913240 76 18 848.0 377.125 1.67 0.40 449424 255480 47 19 852.1 307.082 4.33 0.40 259376 144552 19 20 853.8 639.245 3.68 0.52 -1 167564 58 21 854.9 195.066 7.68 0.49 -1 224264 66 22 858.0 95.048 9.31 0.42 -1 245248 44 23 863.2 377.124 6.03 0.65 320748 206804 41 24 868.8 319.119 11.05 0.26 -1 2240124 75 25 869.7 361.128 9.08 1.39 255756 116416 33 26 887.0 393.121 4.68 1.00 96620 49568 37 27 889.0 95.048 2.98 0.28 243524 101340 101 28 889.2 377.126 2.25 0.52 1174516 859832 41 29 912.0 319.119 12.96 0.46 3095936 2012716 18 30 913.2 361.128 13.82 1.72 -1 302992 71 31 913.5 393.120 3.87 0.98 164336 111344 8 32 915.9 151.041 3.13 0.34 142384 80756 2 33 916.3 361.128 15.55 1.86 -1 357908 45 34 922.8 95.048 4.76 0.42 -1 67292 142 35 925.8 185.049 3.15 6.61 90304 45396 8 36 926.7 195.067 10.55 0.89 258264 128864 35 37 937.2 185.078 2.69 3.19 66644 45888 9 38 956.9 291.087 9.38 0.91 -1 232412 54 39 958.1 361.130 9.14 0.72 -1 260176 51 40 958.3 285.041 2.05 0.09 990824 743528 16 41 962.1 391.141 4.24 1.08 117124 42196 10 42 971.2 95.048 3.79 0.76 94740 32196 67 43 971.4 319.119 2.02 0.77 121936 83828 12 44 974.2 377.126 2.55 0.43 711076 388336 23 45 980.9 241.072 1.84 0.50 152212 92448 4 46 985.3 183.067 7.65 0.58 -1 166388 106 47 988.2 361.131 2.68 0.49 357992 213028 35 48 993.5 213.078 4.45 0.41 236140 127320 4 49 1001.5 275.091 3.88 0.69 196084 119908 84 50 1002.8 357.135 1.77 0.38 323132 240880 8 51 1003.8 361.131 4.95 0.37 231680 157252 56 52 1017.3 275.090 3.88 0.88 -1 77636 73 53 1019.8 391.141 1.90 0.29 117472 82568 15 54 1023.8 183.067 14.03 0.52 -1 637376 46 55 1024.0 139.041 6.82 1.16 198308 162084 56 56 1026.7 377.126 5.83 0.69 -1 322556 96 57 1028.6 303.124 10.35 1.19 -1 179656 47 58 1041.3 393.120 1.64 0.79 212364 122232 17 59 1047.0 377.125 6.04 0.59 -1 343368 119 60 1049.8 139.040 7.90 1.70 -1 115856 34 61 1050.5 213.077 2.94 0.36 700600 481204 31 62 1059.7 303.123 7.78 0.70 -1 136328 108 63 1074.5 377.124 2.49 0.19 1247136 804012 72 64 1100.0 183.066 15.78 0.47 1088092 535364 124
180
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-------------- Fichero gg7.bin --------------- ..................................... Compuestos encontrados....................................... Nº RT(s) M/z(mDa) Desv.Est.T.(s) Desv.Est.M.(mDa) Área(50%) Área(80%) Nº sec - 1 388.2 123.046 2.34 0.20 839848 492324 29 2 491.1 137.061 1.74 0.74 135232 103900 6 3 632.6 151.041 16.16 0.55 910232 481720 21 4 747.4 139.007 3.59 1.45 -1 77300 77 5 752.4 319.119 3.09 0.85 113012 61052 16 6 766.4 377.126 8.61 0.87 756444 514268 22 7 766.6 139.008 5.28 1.03 270232 129864 58 8 770.8 377.126 10.88 0.83 985304 743128 18 9 774.7 349.131 14.12 0.72 1165524 992924 21 10 775.1 95.048 5.81 0.40 266988 191364 115 11 777.0 213.077 15.89 0.66 1060964 751168 9 12 779.9 111.009 15.28 0.55 637844 290208 26 13 786.3 307.083 19.63 0.95 937676 555652 18 14 791.1 187.099 2.65 0.45 101364 55380 5 15 806.8 149.026 9.71 0.86 -1 183368 54 16 808.0 139.008 6.43 0.61 764240 289120 65 17 809.6 321.131 2.58 2.82 76224 34744 41 18 812.9 95.048 8.13 0.32 769540 203604 47 19 813.8 165.057 12.14 0.67 374268 198032 17 20 816.7 184.071 6.73 0.65 -1 112308 61 21 822.6 319.120 13.63 0.38 6586032 3210916 11 22 833.3 335.116 1.75 0.49 497932 378136 12 23 835.8 195.067 7.96 0.54 -1 352524 80 24 837.8 301.109 9.13 1.37 -1 127868 58 25 841.5 265.148 15.18 0.87 -1 436248 30 26 851.7 377.125 3.57 0.53 925316 680656 40 27 855.7 95.048 10.38 0.29 -1 818440 48 28 859.6 123.045 15.63 0.53 514480 266692 48 29 862.4 307.083 5.42 0.68 247688 162584 29 30 867.8 319.120 11.27 0.44 -1 9623160 41 31 868.0 183.067 11.03 0.29 -1 5326248 49 32 868.7 661.229 9.92 1.96 309248 184948 29 33 869.2 361.130 8.43 1.08 271928 176916 9 34 882.2 165.057 19.17 0.57 -1 674080 29 35 890.7 377.127 3.71 0.76 3048876 1857112 57 36 892.1 95.048 8.81 0.29 1201000 290516 36 37 892.8 195.067 23.56 0.57 2559812 1755596 0 38 907.3 321.124 4.96 1.30 -1 62260 122 39 911.1 393.122 4.74 1.28 134092 92784 10 40 912.8 319.121 13.33 0.37 11596804 7003908 7 41 913.3 291.088 7.79 1.16 -1 174696 97 42 915.5 151.041 1.91 0.59 75396 59244 19 43 915.7 183.068 15.01 0.30 6957008 4002760 8 44 919.3 361.130 6.68 1.68 -1 201024 99
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-------------- Fichero gg8.bin --------------- ..................................... Compuestos encontrados....................................... Nº RT(s) M/z(mDa) Desv.Est.T.(s) Desv.Est.M.(mDa) Área(50%) Área(80%) Nº sec - 1 388.4 123.046 2.19 0.18 762584 536336 22 2 491.6 137.061 1.97 0.55 240140 178864 10 3 524.1 139.005 1.87 0.28 69188 35560 39 4 671.3 119.051 1.74 0.52 74456 33516 3 5 703.5 225.079 3.44 0.63 307388 195528 10
182
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184
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-------------- Fichero gg10.bin --------------- ..................................... Compuestos encontrados....................................... Nº RT(s) M/z(mDa) Desv.Est.T.(s) Desv.Est.M.(mDa) Área(50%) Área(80%) Nº sec - 1 388.5 123.046 2.02 0.27 624840 417184 18 2 490.5 137.062 1.62 0.56 174172 102800 11 3 628.8 151.041 16.68 0.55 892396 580248 10 4 763.9 139.008 7.29 1.19 188956 103076 49 5 766.7 377.127 9.32 0.70 686348 561076 21 6 769.9 377.127 11.00 0.74 826028 700756 25 7 775.8 213.078 15.47 0.48 875432 474476 24 8 784.7 349.132 20.48 0.74 1387788 1144280 37 9 792.8 187.099 4.18 0.80 108248 76124 5 10 806.8 139.008 6.16 0.63 543264 270256 58 11 812.3 320.125 5.32 0.78 134700 55176 72 12 812.4 225.080 1.44 0.69 56492 36936 6 13 821.7 319.120 13.67 0.63 1977012 924152 9 14 828.5 195.067 4.40 0.85 156944 117144 162 15 832.0 335.116 1.33 0.41 205880 137424 10 16 851.2 377.127 3.86 0.37 814120 530464 47 17 855.3 640.252 4.54 1.42 -1 116492 59 18 855.4 195.067 10.52 0.72 -1 238280 69 19 858.0 149.025 2.88 0.59 76668 53436 47 20 862.8 345.100 6.87 1.65 83148 43864 35 21 867.3 291.088 8.37 1.10 236040 95672 45 22 867.7 319.121 11.37 0.39 -1 2665044 45 23 867.9 361.131 7.79 1.14 273852 225416 4 24 880.7 185.119 1.42 0.82 70140 48552 52 25 883.6 95.048 4.91 0.23 368956 198868 62 26 887.8 377.128 2.03 0.47 2011292 1319300 63 27 889.2 393.122 5.54 1.23 169784 58004 43 28 908.1 291.088 6.02 0.92 -1 142928 151 29 910.8 393.122 3.51 0.64 232504 143600 27 30 911.7 319.121 12.73 0.48 3489092 2101824 12 31 913.4 183.068 13.74 0.29 3006784 1506020 17
185
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-------------- Fichero gg11.bin --------------- ..................................... Compuestos encontrados....................................... Nº RT(s) M/z(mDa) Desv.Est.T.(s) Desv.Est.M.(mDa) Área(50%) Área(80%) Nº sec - 1 388.7 123.046 2.22 0.20 1310436 929508 33 2 491.4 137.061 1.90 0.60 269328 202772 12 3 633.5 151.041 9.02 0.55 -1 148248 73 4 766.1 139.009 4.29 1.86 153428 84468 37 5 771.8 377.127 12.11 0.75 1307456 1097444 61 6 779.8 307.083 16.77 0.88 955536 754324 41 7 785.8 349.131 21.56 0.71 2114212 1344080 9 8 788.4 213.077 23.26 0.50 1798784 1429172 9 9 791.4 187.098 2.53 0.55 99628 64088 10 10 796.1 307.083 25.55 0.84 1525684 1134408 29 11 802.4 319.120 11.12 0.45 435656 255124 13 12 808.3 139.007 6.39 0.61 599624 277472 72 13 810.1 95.047 9.57 0.42 399412 144652 63 14 815.5 393.121 1.64 0.59 81992 59192 20 15 824.8 183.067 11.95 0.46 1115888 599000 5
186
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187
-------------- Fichero gg12.bin --------------- ..................................... Compuestos encontrados....................................... Nº RT(s) M/z(mDa) Desv.Est.T.(s) Desv.Est.M.(mDa) Área(50%) Área(80%) Nº sec - 1 386.7 123.045 2.32 0.31 148916 99408 9 2 458.5 151.041 1.93 0.60 141324 96156 5 3 627.6 151.041 15.11 0.67 632228 318220 35 4 763.2 195.066 1.39 0.54 114240 77888 26 5 769.2 139.005 3.76 1.04 99800 47296 78 6 791.4 187.098 3.42 0.63 128752 70944 8 7 806.0 139.005 7.11 0.49 298308 114948 68 8 822.9 183.066 13.70 0.56 720036 230720 31 9 832.2 335.113 1.66 1.03 120784 71592 6 10 838.5 639.244 9.48 1.51 167280 72352 33 11 876.4 320.122 12.01 1.01 -1 281768 126 12 889.1 319.118 22.36 0.48 3543984 2228692 5 13 890.1 639.244 17.98 1.58 725460 429836 2 14 905.3 320.122 5.02 1.17 -1 101068 121 15 925.3 183.066 9.39 0.48 730112 448816 14 16 929.2 183.066 8.46 0.49 529972 248676 16 17 943.6 417.155 1.77 0.63 200552 149428 8 18 957.9 285.040 2.45 0.41 1431656 1072140 32 19 971.4 387.146 1.70 0.67 134264 100116 14 20 980.7 241.072 1.91 0.91 74576 49828 6 21 1001.9 357.136 1.84 0.39 431300 317168 13 22 1016.9 337.109 1.89 1.18 77584 67744 15 23 1040.1 415.141 1.90 0.27 2276512 1664944 73 24 1083.0 357.135 1.72 0.77 71580 52800 3 25 1121.8 269.046 2.09 0.53 532200 353800 5 26 1131.3 271.061 1.92 0.93 111080 74540 2 27 1146.5 377.126 3.56 1.16 102872 84820 33 28 1148.2 242.177 2.65 0.65 115504 69564 6 29 1159.0 299.057 2.10 0.58 535484 350656 10 30 1224.0 325.185 8.30 1.00 -1 263576 113 31 1246.8 377.126 3.77 0.39 695132 484744 51 32 1264.5 253.217 7.68 0.63 -1 176252 65 33 1271.7 311.169 12.28 0.64 -1 568348 47 34 1288.0 325.184 10.35 0.62 -1 567464 53 35 1289.4 297.153 11.68 0.96 -1 300712 45 36 1293.8 377.125 1.97 0.61 287908 188988 31 37 1310.2 253.217 10.29 0.71 704284 434844 46 38 1314.8 377.126 2.88 0.59 137588 92588 16 39 1314.9 311.169 12.90 0.59 -1 804144 59 40 1324.9 309.174 11.08 1.23 -1 318896 113 41 1334.1 343.261 2.47 0.35 168204 103236 4 42 1342.8 315.124 1.34 0.56 107304 70428 7
-------------- Fichero gg13.bin --------------- ..................................... Compuestos encontrados....................................... Nº RT(s) M/z(mDa) Desv.Est.T.(s) Desv.Est.M.(mDa) Área(50%) Área(80%) Nº sec - 1 387.9 123.046 2.36 0.24 369736 200956 14 2 458.2 151.040 1.86 0.24 75544 59768 5 3 489.6 137.061 1.61 0.40 74764 55464 6 4 632.5 151.041 15.38 0.64 506932 257648 14 5 763.8 195.068 1.69 0.52 183428 121908 27 6 768.0 139.006 3.48 0.48 103816 67148 78 7 790.9 187.099 3.07 0.43 120940 90680 7 8 806.8 139.007 6.35 0.70 322620 131376 82 9 832.2 335.116 1.69 0.38 222524 168236 10 10 842.1 320.124 7.10 0.81 -1 206032 67 11 843.1 195.067 7.45 0.80 271104 156776 68 12 859.8 249.078 7.88 0.99 219268 168524 118 13 873.4 319.120 25.41 0.46 8075140 5479220 4 14 877.4 639.248 20.95 1.12 2293220 1564768 1 15 900.2 249.077 8.75 1.03 -1 166568 108 16 906.0 249.077 5.68 1.01 -1 59612 114 17 929.7 195.067 8.87 0.99 178476 121332 48 18 943.3 417.156 1.68 0.78 203988 122544 6 19 957.6 285.040 2.22 0.19 1683952 1137152 35 20 970.1 183.067 7.05 1.07 -1 120584 97 21 971.6 387.147 1.77 0.58 177688 104876 21 22 980.4 241.073 2.12 0.59 255404 168616 13 23 992.7 183.067 6.20 0.68 -1 215916 111 24 1002.1 357.136 1.90 0.30 454244 337868 20 25 1017.0 183.067 7.94 0.75 -1 266264 117 26 1040.1 415.143 2.24 0.51 2926248 1933084 69 27 1058.5 303.124 25.07 1.95 688252 409596 28 28 1063.9 165.057 9.52 0.62 -1 186908 94 29 1075.3 307.083 3.83 0.84 133080 79532 14 30 1077.2 183.067 27.39 0.62 1909740 1269480 26 31 1083.0 357.136 1.76 0.46 99692 72208 4 32 1121.7 269.046 2.00 0.34 547604 367784 6 33 1125.2 311.169 25.40 0.93 -1 526832 64 34 1132.7 271.061 1.96 0.31 120952 80600 3 35 1144.1 183.066 4.44 0.95 119088 40808 113 36 1145.4 377.125 2.77 0.63 200540 96524 22
188
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-------------- Fichero gg14.bin --------------- ..................................... Compuestos encontrados....................................... Nº RT(s) M/z(mDa) Desv.Est.T.(s) Desv.Est.M.(mDa) Área(50%) Área(80%) Nº sec - 1 387.0 123.046 2.48 0.32 503952 335912 17 2 457.1 151.042 1.74 0.55 71420 43676 4 3 489.8 137.060 2.01 1.12 97544 64792 5 4 599.1 151.041 10.42 0.79 249944 141256 4 5 630.8 151.042 8.01 0.59 -1 321996 61 6 659.5 151.041 8.73 0.72 158780 62108 13 7 763.7 195.068 1.72 0.41 280312 169072 36 8 766.8 139.007 5.82 0.57 223408 126304 64 9 791.3 187.100 3.44 0.76 121360 78108 5 10 810.2 139.007 4.27 0.39 603908 298976 94 11 811.2 320.125 9.53 0.84 239436 159120 43 12 828.9 195.068 3.84 0.62 -1 107932 133 13 832.4 335.117 1.86 0.44 184380 141184 5 14 849.4 195.068 7.98 0.56 -1 280608 126 15 873.1 319.121 24.70 0.47 11462520 6684976 3 16 873.1 183.068 28.67 0.32 8892784 5651944 1 17 881.9 249.078 20.86 0.96 806980 466856 60 18 881.9 139.070 7.26 1.16 243388 200192 53 19 883.5 184.071 18.75 0.80 629144 343960 63 20 914.0 95.048 8.36 0.45 320348 167928 93 21 923.3 320.125 8.97 0.69 415848 228748 12 22 930.8 195.068 3.60 0.76 -1 77412 109 23 943.2 417.159 1.71 0.89 273432 246648 12 24 957.3 285.042 2.11 0.39 1773772 1336916 33 25 971.2 387.148 1.68 0.45 233040 173596 23 26 980.2 241.073 2.02 0.33 331376 246640 16 27 998.5 183.067 11.68 0.64 -1 378508 112 28 1001.9 357.136 1.83 0.42 571428 428924 11 29 1039.9 415.143 2.24 0.67 3321164 2622984 79 30 1067.7 183.067 29.01 0.52 -1 2306652 70 31 1068.4 303.124 25.00 0.95 -1 686528 59 32 1077.1 307.082 4.31 1.02 153228 101700 13 33 1082.9 357.136 1.72 0.49 129240 76236 4 34 1121.5 269.046 1.97 0.29 605952 402032 7 35 1132.5 271.061 1.93 0.53 151608 102288 4 36 1132.7 183.067 6.89 0.68 352792 186552 100 37 1145.4 377.126 2.86 0.54 258660 185800 50 38 1147.9 242.177 2.15 0.76 93440 66980 6 39 1156.2 241.073 1.79 0.90 67572 40440 7 40 1158.8 299.057 2.05 0.34 575880 378064 9 41 1166.9 311.169 29.97 0.85 -1 805380 42 42 1171.3 377.126 7.42 0.73 -1 166776 81 43 1240.8 377.127 9.22 0.68 1521304 1239288 71 44 1259.3 321.100 3.55 0.55 129440 70784 4 45 1265.3 253.218 8.17 0.87 324860 179960 36 46 1268.8 265.149 9.77 0.68 -1 492512 44 47 1277.9 339.201 9.70 0.64 -1 424540 46 48 1282.1 325.185 11.46 0.72 -1 604560 34 49 1292.8 377.126 2.45 0.22 607492 397468 53 50 1296.7 321.100 4.28 1.04 146848 56880 7 51 1301.1 309.174 8.30 1.07 -1 121176 50 52 1305.1 311.169 14.06 0.65 -1 752588 30 53 1306.7 253.217 8.81 0.63 -1 360764 26 54 1314.1 377.126 2.55 0.64 251512 149036 23 55 1324.6 265.148 15.84 0.52 -1 796032 73 56 1333.6 343.261 2.20 0.51 176996 108256 7 57 1342.7 315.125 1.33 0.36 230164 199164 11
-------------- Fichero gg15.bin --------------- ..................................... Compuestos encontrados....................................... Nº RT(s) M/z(mDa) Desv.Est.T.(s) Desv.Est.M.(mDa) Área(50%) Área(80%) Nº sec - 1 387.6 153.058 2.17 0.27 1047000 498744 29 2 490.0 137.062 1.69 0.33 369796 220276 22 3 747.3 139.007 8.02 0.80 213084 112136 75 4 761.9 95.049 8.92 0.57 100268 33844 16 5 769.3 139.007 3.16 0.44 267364 104048 109 6 789.8 95.049 4.48 0.57 -1 100596 124
189
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-------------- Fichero gg16.bin --------------- ..................................... Compuestos encontrados....................................... Nº RT(s) M/z(mDa) Desv.Est.T.(s) Desv.Est.M.(mDa) Área(50%) Área(80%) Nº sec - 1 387.4 153.058 2.47 0.24 2464376 1296160 47 2 443.0 199.063 2.21 0.66 78300 36696 22 3 490.6 137.062 1.95 0.48 482832 366284 24 4 726.6 181.053 1.64 0.15 134092 93492 35 5 758.4 139.007 12.69 0.44 373436 169144 20 6 768.8 241.074 5.04 0.84 149540 65228 51 7 773.7 111.010 7.83 0.47 217904 112524 98 8 792.3 187.099 3.46 0.58 136504 89584 7 9 806.0 139.007 7.06 0.27 1255584 623952 90 10 815.3 393.122 1.54 0.70 155896 120564 19
190
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-------------- Fichero gg17.bin --------------- ..................................... Compuestos encontrados....................................... Nº RT(s) M/z(mDa) Desv.Est.T.(s) Desv.Est.M.(mDa) Área(50%) Área(80%) Nº sec - 1 387.4 153.058 1.85 0.30 463184 306028 21 2 490.3 137.061 1.59 0.59 153548 90856 12 3 767.8 139.007 3.66 0.49 99184 62988 76 4 792.7 187.100 3.47 0.38 132168 77976 7 5 804.9 139.007 8.52 0.51 336420 147036 40 6 820.9 319.121 12.70 0.87 253508 67768 4 7 829.5 183.069 5.35 0.78 -1 113012 99 8 833.0 335.117 1.74 0.72 118952 90004 8 9 888.4 377.128 1.85 1.15 125420 92072 30 10 890.8 319.122 22.36 0.63 1441612 1070476 28 11 928.5 183.070 5.47 0.98 170184 114204 100
191
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-------------- Fichero gg18.bin --------------- ..................................... Compuestos encontrados....................................... Nº RT(s) M/z(mDa) Desv.Est.T.(s) Desv.Est.M.(mDa) Área(50%) Área(80%) Nº sec - 1 387.5 153.058 1.85 0.28 535016 347992 25 2 490.8 137.062 1.67 0.89 162720 96284 9 3 768.5 139.007 3.73 0.66 143948 85544 91 4 792.7 187.100 3.61 0.34 146844 94460 8 5 806.3 139.007 7.36 0.41 532084 231144 51 6 812.5 183.068 8.57 0.93 182432 50128 46 7 825.2 319.120 9.59 0.76 394252 84084 29 8 833.0 335.116 1.63 0.47 117028 70480 9 9 837.9 183.068 5.94 0.54 -1 153588 113 10 847.4 377.126 2.10 0.70 85628 59460 46 11 868.5 319.120 11.11 0.56 -1 738700 64 12 869.0 183.068 12.00 0.39 -1 595604 50 13 886.0 95.048 5.89 0.63 135124 43424 45 14 888.6 377.127 2.28 0.88 416792 202108 46 15 901.3 319.121 8.64 0.61 -1 553584 102 16 930.3 183.068 9.05 0.72 372556 178288 75 17 931.2 319.121 7.95 0.58 328588 134112 19 18 944.3 417.159 1.69 0.31 285672 168032 12 19 958.6 285.043 2.27 0.30 1461396 1094868 31 20 972.3 387.149 1.57 0.41 154880 102228 23 21 976.6 377.128 3.29 0.82 226588 202360 12 22 981.1 241.074 1.92 0.61 112220 83472 3 23 988.7 361.134 2.08 1.24 95820 64636 39 24 1002.8 357.139 1.80 0.51 420044 306484 16 25 1040.8 415.145 2.13 0.54 2286168 1499280 64 26 1044.2 181.053 4.04 0.88 133724 58700 8 27 1048.7 377.129 6.04 1.51 173212 85904 89 28 1048.9 213.079 2.73 0.41 412352 317308 43 29 1075.3 377.128 2.86 0.50 241204 167740 31 30 1075.9 183.069 25.01 0.77 811372 398988 58 31 1083.8 357.138 2.00 0.48 141616 93928 5 32 1122.4 269.047 2.27 0.45 682648 540892 9 33 1132.7 377.129 2.22 0.61 382628 246180 49 34 1132.9 265.150 35.48 0.98 -1 972604 69 35 1146.4 377.128 3.57 0.44 336656 199764 141 36 1148.7 242.178 2.31 0.81 104488 56016 8 37 1157.3 241.074 2.03 0.50 64740 43556 1 38 1159.6 299.058 1.90 0.42 393712 286340 8 39 1178.4 329.236 2.36 0.86 95748 62792 5 40 1188.1 377.128 8.32 1.00 -1 375608 116 41 1208.5 307.084 6.26 0.79 -1 174288 85 42 1225.4 311.171 11.15 0.72 -1 432292 83 43 1240.3 361.133 4.19 0.62 176936 113400 18 44 1248.1 377.128 5.25 0.29 2595428 1656756 61 45 1252.4 375.112 2.13 0.86 144284 95412 25 46 1263.5 265.150 9.38 0.65 -1 396092 62 47 1282.4 325.186 8.36 0.77 -1 445860 87
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-------------- Fichero gg19.bin --------------- ..................................... Compuestos encontrados....................................... Nº RT(s) M/z(mDa) Desv.Est.T.(s) Desv.Est.M.(mDa) Área(50%) Área(80%) Nº sec - 1 387.5 153.058 2.15 0.27 1560324 930904 40 2 490.4 137.062 1.88 0.33 449504 237652 23 3 671.2 119.052 1.94 0.36 68032 41108 4 4 744.3 139.008 6.59 0.80 200860 106388 74 5 763.5 95.049 7.36 0.40 124016 60496 17 6 766.8 139.008 4.49 0.54 271408 146184 94 7 789.4 349.134 22.46 1.10 597272 292804 46 8 791.6 187.100 2.63 0.57 138868 107564 10 9 806.1 139.007 7.27 0.24 1020652 454368 76 10 806.3 319.122 9.98 0.66 419836 270488 25 11 815.7 393.123 1.58 0.57 146024 113484 36 12 828.1 183.069 15.11 0.39 963696 480336 6 13 833.2 335.118 1.78 0.57 404124 242008 13 14 836.2 319.122 7.15 0.46 -1 413576 103 15 850.5 377.128 3.10 0.95 262896 137208 20 16 856.7 95.049 9.70 0.58 313684 221976 75 17 861.4 275.093 5.44 0.80 158380 46828 73 18 864.6 393.123 1.59 0.94 108200 64948 5 19 868.5 319.122 11.59 0.44 -1 1481780 70 20 879.7 195.069 15.64 0.79 -1 252040 55 21 885.1 95.049 3.08 0.19 186164 118152 62 22 888.6 377.129 2.32 0.30 1126484 581788 52 23 894.6 320.125 20.34 1.08 675136 452384 11 24 912.2 377.128 4.36 0.90 -1 86176 161 25 912.6 319.122 13.04 0.74 1890980 1190404 8 26 914.0 393.123 5.22 0.96 146240 81588 14 27 929.5 183.068 9.22 0.49 589704 304548 20 28 943.9 417.158 1.61 0.79 161572 121004 10 29 944.5 377.127 6.64 1.31 -1 161144 133 30 955.6 287.053 2.23 2.23 72320 57168 2 31 957.9 285.043 1.99 0.20 1361240 801348 18 32 971.7 319.121 1.90 0.42 223584 148856 35 33 973.7 275.093 2.08 1.00 111048 51860 74 34 976.5 377.127 3.34 0.68 632512 361400 12 35 977.5 229.073 1.72 1.24 55340 49116 5 36 980.7 241.073 1.79 0.26 357144 213516 3 37 988.7 361.132 2.36 0.54 264484 157532 37 38 990.9 183.068 6.38 0.98 -1 33860 84 39 992.3 333.136 3.22 0.79 67440 55508 1 40 997.0 183.068 9.37 0.84 -1 204908 68 41 998.2 379.141 3.57 1.40 56420 41084 11 42 999.8 275.091 3.86 1.10 106404 45544 50 43 1001.7 361.132 3.49 0.89 167488 106096 83 44 1002.7 357.137 1.76 0.52 446124 333624 13 45 1018.7 393.124 2.19 1.07 72192 47548 26 46 1040.9 393.122 1.70 0.47 583916 439288 42 47 1045.4 181.052 4.33 0.63 268572 114344 6 48 1047.5 377.127 6.83 1.04 563696 251992 102 49 1049.2 361.133 2.95 0.60 899740 613208 56 50 1052.4 257.068 1.83 1.00 120844 80616 4 51 1072.8 265.149 27.53 0.96 853828 466576 21 52 1075.2 377.127 3.34 0.55 748568 452732 47 53 1077.4 183.068 16.90 0.55 -1 747352 46 54 1077.9 393.122 1.73 0.72 106132 61668 15 55 1079.2 325.185 18.77 0.93 -1 409572 20 56 1084.3 357.136 2.29 1.50 57328 46640 2 57 1085.4 325.185 22.27 1.07 -1 515528 20 58 1099.5 311.170 14.69 1.03 -1 304836 57 59 1106.9 311.170 18.75 0.98 -1 410620 26 60 1110.7 291.088 13.08 0.86 -1 243744 42 61 1116.0 183.067 3.15 0.56 133900 79792 137 62 1122.3 269.046 2.24 0.38 715016 471172 10 63 1127.0 183.067 3.00 0.75 97228 60456 68 64 1132.7 377.126 2.18 0.50 1345136 802180 84 65 1144.5 361.132 3.83 1.06 146412 96012 33 66 1145.7 291.089 5.62 0.82 180712 86744 76 67 1148.4 377.127 5.06 0.70 1055524 546228 115 68 1148.7 242.177 2.47 0.55 106676 69612 2 69 1156.7 241.073 1.54 0.37 127048 105692 2 70 1159.4 299.057 1.86 0.48 146164 103972 4 71 1176.4 149.026 9.99 0.73 -1 180948 104 72 1190.0 139.038 8.29 0.94 -1 193600 111 73 1199.8 363.147 1.78 1.13 63904 55580 15
193
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-------------- Fichero gg20.bin --------------- ..................................... Compuestos encontrados....................................... Nº RT(s) M/z(mDa) Desv.Est.T.(s) Desv.Est.M.(mDa) Área(50%) Área(80%) Nº sec - 1 387.6 153.058 2.49 0.43 797920 434856 24 2 490.6 137.062 1.92 0.49 289256 159388 13 3 523.1 139.005 2.19 0.41 73132 51780 26 4 756.0 377.127 3.66 1.24 124208 109472 23 5 763.2 139.007 8.32 0.46 325208 156640 44 6 764.9 127.042 8.38 0.40 191804 89964 47 7 786.8 349.132 20.92 0.78 879912 708568 44 8 787.8 183.069 5.13 1.65 114348 68196 66 9 792.3 187.100 3.16 0.59 122528 79612 7 10 806.6 139.007 6.97 0.28 1240212 498296 90 11 808.9 225.079 4.28 0.71 78256 52384 4 12 815.9 393.122 1.31 0.60 104648 71524 22 13 828.3 183.068 11.50 0.49 1041444 458140 17 14 832.6 335.117 1.55 0.51 377832 228032 11 15 834.7 319.121 7.41 0.41 -1 517560 109 16 851.6 95.049 8.04 0.50 331632 206148 59 17 853.2 377.127 4.76 0.62 447452 217004 22 18 855.6 95.049 10.32 0.51 428436 271064 53 19 861.2 275.093 4.92 0.85 -1 53540 74 20 862.3 139.047 1.51 1.13 43792 11200 31 21 865.4 393.123 1.82 0.57 91124 39048 10 22 867.8 319.121 11.55 0.42 -1 1715420 24 23 868.8 183.068 10.78 0.40 -1 1248296 55 24 881.1 185.119 1.28 0.68 105908 74772 24 25 888.0 195.068 20.92 0.75 708576 495752 48 26 888.3 95.049 2.67 0.20 257876 132216 57 27 888.8 377.127 2.36 0.48 1795156 938560 65 28 911.4 307.083 4.31 0.73 -1 72416 73 29 911.5 377.126 3.21 0.80 -1 120332 59 30 912.2 319.120 12.86 0.44 2348992 1261920 7 31 913.6 95.048 5.33 0.54 -1 119412 116 32 923.5 255.088 2.25 0.99 76088 41080 9 33 929.3 320.124 8.58 0.79 168108 86220 18 34 944.2 417.157 1.64 0.82 140728 105028 9 35 946.0 307.083 5.31 1.08 133172 60232 117 36 953.1 377.126 2.25 1.22 91812 82656 132 37 958.3 285.041 2.14 0.14 1517292 1134028 34 38 971.7 319.120 1.81 0.61 221380 128920 25 39 973.0 307.083 2.26 0.61 131864 78644 85 40 977.1 377.127 3.30 0.61 709652 347752 12 41 981.1 241.073 1.89 0.75 372724 279300 3 42 988.1 361.131 2.77 0.40 271332 197600 35 43 993.0 333.135 3.73 0.81 71552 60276 0 44 994.5 183.067 8.94 0.87 257532 100792 79 45 999.2 275.091 3.40 1.31 115584 59708 69 46 1000.7 361.131 2.81 0.72 177676 103208 80 47 1002.8 357.136 1.75 0.66 191572 113944 4 48 1004.4 213.077 4.86 0.81 111876 79424 17 49 1011.2 377.125 5.22 1.16 -1 141832 146 50 1028.8 183.067 11.14 0.64 -1 302024 64 51 1029.6 307.083 5.48 0.90 225212 163720 56 52 1031.3 255.087 1.92 0.72 139144 92844 14 53 1040.5 415.141 2.01 0.57 1607700 1078244 48 54 1043.3 377.125 5.87 0.67 556844 231220 40 55 1044.7 181.051 3.95 0.69 225448 112632 11 56 1049.0 361.131 2.81 0.38 881080 513436 59 57 1053.4 257.067 1.90 1.09 99360 53108 7 58 1059.8 183.067 6.61 0.55 -1 194576 103 59 1074.9 377.126 3.06 0.69 722176 465312 62 60 1078.0 393.122 1.76 0.82 99176 73228 15 61 1110.5 183.067 6.69 0.67 -1 203292 130 62 1113.7 183.067 5.04 0.60 -1 125368 124
194
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-------------- Fichero gg21.bin --------------- ..................................... Compuestos encontrados....................................... Nº RT(s) M/z(mDa) Desv.Est.T.(s) Desv.Est.M.(mDa) Área(50%) Área(80%) Nº sec - 1 387.7 153.058 2.34 0.27 1275248 554848 35 2 490.8 137.061 1.74 0.47 275740 163208 14 3 756.8 349.133 4.11 0.81 139368 97592 26 4 763.2 139.008 8.00 0.42 365212 181356 45 5 773.0 213.079 13.06 0.77 436780 313204 19 6 776.7 111.010 8.41 0.60 246384 131456 49 7 785.2 377.128 11.50 1.10 -1 365080 89 8 788.8 95.049 7.22 0.47 -1 143152 104 9 792.1 187.100 2.87 0.45 120000 77500 10 10 806.2 319.122 10.46 0.43 477768 280776 12 11 807.2 139.008 6.43 0.38 1013832 432672 58 12 811.4 225.080 2.00 0.93 66032 59276 7 13 815.5 393.123 1.54 1.02 108892 65780 25 14 823.3 183.069 14.74 0.46 831952 390256 3 15 832.4 335.117 1.54 0.44 300232 181916 9 16 836.5 319.122 6.82 0.62 -1 475856 125 17 851.6 377.128 3.99 0.62 369932 196284 35 18 862.5 307.085 5.41 0.47 125208 87264 45 19 864.7 257.069 1.42 1.02 66580 20104 4 20 868.5 319.122 11.56 0.45 -1 1451532 40 21 868.7 183.069 10.75 0.42 -1 1107816 77 22 868.7 361.132 8.52 1.53 268208 190224 14 23 881.3 185.118 1.35 0.80 79112 54188 17 24 887.2 393.123 4.53 0.91 100032 56176 45 25 888.6 377.128 1.91 0.48 1455064 844728 50 26 888.7 95.049 2.85 0.29 217244 143920 71 27 909.7 291.089 7.42 0.89 -1 144640 90 28 912.8 377.127 4.72 1.12 -1 133156 113 29 912.9 319.121 13.02 0.67 1988264 1105824 4 30 913.7 393.122 4.29 0.82 187512 106648 10 31 919.8 320.124 6.00 0.77 154120 70828 68 32 931.3 361.130 24.44 1.88 754652 542420 34 33 936.9 183.068 7.09 0.56 448864 245148 22 34 939.2 377.126 10.56 1.15 -1 238460 83 35 944.1 417.157 1.65 0.71 153432 90080 8 36 946.5 377.126 6.35 1.23 -1 147204 81 37 956.5 287.050 2.58 3.34 82804 62156 4 38 958.1 285.041 2.06 0.29 1794560 1324300 27 39 971.8 319.119 1.91 0.45 203684 119976 28 40 972.6 307.082 2.46 0.57 149128 88288 40 41 976.1 377.126 3.67 0.56 680752 520644 11 42 976.6 378.129 3.43 0.70 141928 111020 8 43 980.5 241.072 1.73 0.55 264372 192676 2 44 989.3 361.131 1.88 0.42 332452 213988 88 45 991.2 333.135 3.25 0.62 99552 47688 7 46 1002.6 357.136 1.73 0.35 307104 178124 5 47 1003.0 275.091 5.41 1.27 160004 55176 76 48 1003.0 361.131 4.39 0.44 218568 89532 51 49 1006.4 291.088 6.91 0.53 237184 160376 19 50 1010.1 307.083 4.82 0.65 -1 78596 107
195
51 1025.1 213.077 3.42 1.63 90160 62580 48 52 1027.0 377.126 5.61 0.62 -1 206420 111 53 1029.9 307.083 4.89 0.82 209904 140964 48 54 1031.2 255.087 1.94 0.49 83340 55612 10 55 1040.5 415.141 1.99 0.95 993892 533704 30 56 1043.1 151.042 2.71 0.56 75620 39772 15 57 1043.2 275.091 5.46 0.83 217480 80464 8 58 1046.3 181.051 4.49 0.71 282536 194176 2 59 1046.6 363.120 2.75 5.05 62092 47112 11 60 1048.8 377.126 4.96 0.86 532440 233788 89 61 1050.1 361.132 3.39 0.55 1136228 869708 53 62 1053.5 257.068 1.96 0.97 92968 50300 7 63 1075.7 377.127 3.64 0.45 797124 520272 55 64 1077.9 393.123 1.72 1.14 92756 68300 11 65 1083.1 183.068 19.35 0.60 -1 785116 80 66 1109.5 311.170 19.44 1.02 -1 407696 28 67 1115.9 311.170 22.97 0.99 -1 529416 38 68 1122.7 269.047 2.44 0.26 872616 577936 9 69 1125.8 183.068 4.48 0.60 -1 98112 86 70 1133.1 377.128 2.03 0.30 1288956 834772 48 71 1137.6 307.084 4.38 0.63 497196 380848 36 72 1145.4 361.132 3.48 0.72 197764 134488 49 73 1148.1 377.126 4.79 0.55 -1 564412 94 74 1148.9 242.177 2.08 0.43 93824 69604 5 75 1149.7 291.088 8.15 0.76 -1 125336 63 76 1157.4 241.073 2.21 0.61 139416 93504 2 77 1158.5 361.132 4.17 0.90 -1 126092 97 78 1159.7 299.057 1.97 0.44 198840 146832 3 79 1186.4 377.127 12.71 0.55 -1 1400252 136 80 1213.1 149.026 7.13 0.60 -1 185780 77 81 1219.2 333.136 1.97 0.65 119212 72428 3 82 1220.5 399.109 5.56 1.38 -1 143764 58 83 1221.0 139.038 7.52 0.73 -1 142492 36 84 1226.5 345.101 5.73 0.82 -1 178452 83 85 1235.3 399.111 3.37 1.11 -1 49040 112 86 1236.9 325.187 11.93 1.02 -1 447944 97 87 1237.0 361.134 7.04 0.58 684608 455788 7 88 1246.5 377.129 7.26 1.05 6084932 4085104 50 89 1253.0 375.113 2.51 0.66 294820 194348 34 90 1262.2 361.134 2.95 0.77 190560 87644 66 91 1271.5 253.219 7.93 0.89 273920 172384 17 92 1274.4 265.151 11.61 0.45 -1 2291212 18 93 1278.0 291.090 6.62 0.87 263656 143368 41 94 1278.8 325.187 11.65 0.91 927476 535988 35 95 1278.9 311.172 14.16 0.60 1160260 731940 12 96 1279.9 339.204 13.23 0.74 837044 558504 11 97 1282.2 311.172 15.81 0.60 1329312 900992 15 98 1294.4 377.129 2.59 0.38 766880 502812 64 99 1300.3 253.220 8.27 0.69 -1 300580 73 100 1314.0 377.129 1.79 0.75 264412 196344 35 101 1316.1 361.133 3.21 0.49 241392 118576 7 102 1319.3 266.153 9.73 0.64 -1 444572 31 103 1323.8 291.090 3.15 0.70 119252 89116 58 104 1325.1 297.156 9.73 1.02 -1 378028 74 105 1327.7 339.204 13.94 0.74 -1 770972 38 106 1334.2 343.263 2.01 0.29 120212 82628 7 107 1343.2 315.128 1.40 0.45 145336 97496 6
-------------- Fichero gg22.bin --------------- ..................................... Compuestos encontrados....................................... Nº RT(s) M/z(mDa) Desv.Est.T.(s) Desv.Est.M.(mDa) Área(50%) Área(80%) Nº sec - 1 387.3 153.058 2.12 0.25 896040 640440 29 2 490.4 137.061 1.82 0.57 307920 188444 18 3 757.1 139.007 2.81 0.51 100628 74592 108 4 769.6 139.007 3.29 0.43 236856 101428 116 5 792.0 187.100 2.98 0.49 127132 65548 9 6 807.0 139.007 6.93 0.39 683412 344860 68 7 812.6 319.122 9.05 0.77 269800 155968 12 8 815.2 393.124 1.60 0.92 70016 52644 17 9 819.3 183.069 9.51 0.73 282604 107472 69 10 833.5 335.118 1.86 0.40 148928 89156 9 11 847.5 377.128 1.91 0.59 135792 71056 29 12 853.0 307.085 4.80 0.95 80080 40908 35 13 862.7 377.128 5.19 0.98 112232 52932 79 14 862.8 393.124 2.33 1.44 72732 38484 16 15 880.3 319.122 21.19 0.67 -1 1376664 53 16 886.9 95.049 3.09 0.47 125652 71624 66 17 888.7 377.129 2.00 0.56 510640 379392 34 18 889.2 393.124 5.37 1.04 132952 64492 25 19 905.2 183.068 10.34 0.47 -1 504016 65 20 911.0 393.123 3.83 1.08 176620 91484 41 21 932.2 319.121 7.98 0.66 301588 188216 3 22 933.6 183.068 5.74 0.67 241848 151400 136 23 944.1 417.158 1.63 0.84 87568 52212 5 24 957.8 285.042 1.91 0.36 640912 379052 11 25 971.5 319.120 1.78 0.63 168728 100284 25
196
26 976.3 377.127 2.65 0.64 279164 162296 25 27 980.0 241.073 1.55 0.48 87168 54116 3 28 988.4 361.131 2.47 0.96 211864 129668 46 29 1000.5 275.091 2.91 1.39 84500 50436 39 30 1002.0 361.132 3.55 0.93 140584 79996 85 31 1002.5 357.136 1.70 0.68 334356 196844 10 32 1004.4 183.068 8.24 0.65 273340 150808 116 33 1022.1 391.142 3.80 0.64 64936 39556 12 34 1041.1 393.122 1.87 0.57 370068 248612 26 35 1041.1 307.083 9.38 1.01 219592 79720 40 36 1045.5 181.052 4.40 0.72 206040 154200 3 37 1046.4 377.127 5.25 0.89 313828 140792 129 38 1048.6 213.078 2.73 0.34 761616 583308 52 39 1074.8 377.127 3.13 0.45 621464 403916 61 40 1122.4 269.046 2.27 0.34 276892 224628 1 41 1123.0 183.067 5.75 0.68 181244 114276 132 42 1137.5 377.127 4.62 0.36 1246168 747424 47 43 1147.1 361.132 3.08 0.96 148652 82624 40 44 1148.6 378.130 5.15 1.20 -1 101424 136 45 1149.4 242.177 2.88 0.53 110540 74924 3 46 1156.3 241.073 1.66 0.39 68628 59188 1 47 1159.4 299.057 1.78 0.84 76372 57128 7 48 1165.1 361.132 3.23 0.87 78328 26648 95 49 1181.8 275.092 9.77 0.81 -1 407300 111 50 1196.5 139.038 8.63 1.12 -1 192860 85 51 1207.5 149.026 9.29 0.69 408160 229372 59 52 1216.5 399.110 7.27 1.19 221408 153512 90 53 1216.7 378.131 3.65 0.63 -1 170732 123 54 1218.5 333.137 1.76 0.37 133652 97956 5 55 1240.0 361.133 4.73 0.73 394116 246204 19 56 1241.4 377.128 12.00 0.73 5641776 3360968 45 57 1253.0 375.112 2.61 1.35 346096 230740 25 58 1262.8 311.170 7.41 0.76 -1 292644 37 59 1263.3 361.132 3.30 0.62 142576 104000 52 60 1273.2 253.219 4.71 0.59 -1 124784 46 61 1275.9 339.203 11.23 0.82 -1 485248 35 62 1281.0 325.186 9.62 0.67 -1 584120 59 63 1294.4 377.128 2.16 0.48 458448 278264 48 64 1303.7 391.144 2.19 1.42 96068 56844 12 65 1315.5 361.133 2.66 0.49 242964 165548 17 66 1324.0 291.089 2.58 0.83 81256 41648 79 67 1329.0 339.203 11.82 0.63 -1 677688 115 68 1334.1 343.263 2.05 0.65 122704 59488 6 69 1343.2 315.126 1.38 0.44 73064 52140 6
197
7.5. Apéndice 5. Resultados de la agrupación de compuestos de todas las muestras de la colección de matrices de estándares.
En primer lugar se obtienen los compuestos para cada muestra y luego se
agrupan para saber qué compuestos corresponden a qué muestras, obteniendo finalmente los siguientes compuestos que aparecen, al menos, en una muestra de la colección:
Compuesto Tiempo de
retención (s) Masa/carga
(Da) ( ) ( )
Área (50%)
Área (80%)
Nº agrupaciones secundarias
1 359,75 191,056 9,10 1,60 94108 58984 13
2 375,87 595,128 5,51 0,63 642432 431176 20
3 413,40 463,087 6,18 1,77 121740 61564 4
4 501,22 191,056 2,60 0,39 882612 615776 58
5 600,63 191,057 2,40 0,58 121124 64428 20
6 635,79 179,035 2,11 0,26 836616 585476 57
7 744,46 609,148 2,07 0,57 1059376 816620 33
8 800,28 463,090 2,43 1,61 3211992 2079824 58
A continuación se puede observar la tabla de presencia de cada compuesto en cada muestra, donde un 1 indica que se ha encontrado un compuesto en esa muestra y un 0 indica lo contrario. Los compuestos marcados en verde son los correspondientes a los estándares de polifenoles mezclados: c1(2), c2(4), c3(6), c4(7) y c5(8).
Compuesto
Muestra 1 2 (c1) 3 4 (c2) 5 6 (c3) 7 (c4) 8 (c5)
1 0 0 0 0 0 0 0 0
2 0 0 0 0 0 1 0 0
3 0 1 0 0 0 1 0 0
4 0 0 0 1 1 0 1 1
5 0 1 0 1 1 1 1 1
6 0 1 0 1 1 1 1 1
7 0 0 0 0 0 0 1 1
8 0 1 0 1 1 1 1 1
9 0 1 0 1 1 1 1 1
10 0 1 1 0 0 1 1 1
11 0 1 0 1 1 1 0 1
12 0 1 0 1 1 1 1 1
13 0 0 0 1 1 0 1 1
14 0 1 1 1 1 1 1 1
15 0 1 1 1 1 1 1 1
16 0 1 1 1 1 1 0 1
17 0 1 1 1 1 1 0 1
18 0 1 1 1 1 1 1 0
19 0 1 0 1 1 0 1 1
20 0 0 0 1 1 0 1 1
198
21 0 0 0 0 0 0 1 1
22 1 0 0 1 1 0 1 1
23 0 1 1 1 1 1 1 1
24 0 1 1 0 0 1 0 0
25 0 1 1 1 1 1 1 1
26 1 1 1 1 1 1 1 1
27 0 1 1 0 0 1 1 1
28 0 1 1 1 1 1 0 0
29 0 1 1 1 1 1 1 1
30 0 1 1 1 1 1 1 1
A continuación se observa la concentración teórica en la que se han mezclado
los compuestos en el laboratorio y el área cromatográfica experimental. Se puede observar una gran correlación entre los valores, notándose que el aumento de concentración de un compuesto en la muestra, aumenta el área cromatográfica obtenida experimtalmente.
Concentración (µg/mL) Área cromatográfica experimental
Muestra c1 c2 c3 c4 c5 c1(2) c2(4) c3(6) c4(7) c5(8)
1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
2 0 0 1.0 0 0 0 0 146872 0 0
3 2.0 0 1.0 0 0 171660 0 127576 0 0
4 0 2.0 0 2.0 2.0 0 364272 0 577552 1022272
5 2.4 1.6 0.4 2.0 0.8 202552 339680 42000 535972 452384
6 4.0 1.6 0.8 1.2 0.4 46060 334748 96416 360400 225736
7 0 0 0 1.0 1.0 0 0 0 308560 606388
8 1.6 1.0 0.6 1.2 1.4 131028 231468 71148 401512 721560
9 2.4 1.0 1.4 0.8 0.6 70200 231000 187452 236268 327652
10 4.0 0 2.0 1.0 1.0 99380 0 363544 347372 608044
11 2.0 2.0 1.0 0 2.0 163812 459484 135952 0 1072084
12 2.0 2.0 0.8 1.6 1.0 186468 440792 85936 507404 568400
13 0 2.0 0 2.0 2.0 0 348552 0 545480 1146784
14 4.0 2.0 2.0 2.0 0.4 105948 382420 383212 556820 26808
15 4.0 2.0 2.0 2.0 2.0 349856 441100 341868 533564 1035012
16 4.0 2.0 3.0 0 2.0 97992 432860 493868 0 1053828
17 6.0 2.8 2.0 0 3.2 598460 682828 365840 0 1626644
18 6.0 2.0 4.0 1.0 0 501648 425512 836616 294764 0
19 4.0 3.0 0 4.0 4.0 275168 539696 0 1031400 1641656
20 0 3.0 0 4.0 2.0 0 628308 0 1047188 985376
21 0 0 0 0.4 4.0 0 0 0 39160 3211992
22 0 4.0 0 4.0 0.4 0 805248 0 1050840 50224
23 6.0 3.0 3.0 3.0 3.0 499236 702496 517296 816828 1323544
24 6.0 0 3.0 0 0 501368 0 537044 0 0
25 4.8 2.0 3.6 3.0 3.0 47936 452324 565244 816312 1521964
26 4.8 2.8 2.0 3.2 3.6 414232 605768 305844 877252 1794444
199
27 4.0 0 2.0 4.0 4.0 350260 0 308172 1059376 1885424
28 8.0 2.0 4.0 0 0 590192 421912 733940 0 0
29 8.0 3.0 4.0 3.0 2.0 642432 610824 760948 776460 1187944
30 8.0 4.0 4.0 2.0 2.0 614868 882612 742892 530108 1070624
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