desarrollo de pruebas moleculares isotérmicas para la
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Desarrollo de pruebas moleculares isotérmicas para la detección del SARS-
CoV-2
Mónica Pajuelo TravezañoLaboratorio Microbiología Molecular
Laboratorios de Investigación y Desarrollo – FACIE – UPCH
1
COVID-19
Enfermedad producida por la infección con SARS-Cov-2
2
Toma de muestra
Extracción de material genético
PCR- “Real time”(cuantitativo)
Diagnóstico de COVID-19: Método de detección molecular
3
Extracción del material genético
Método molecular
4
Reacción en Cadena de la Polimerasa(PCR)
Retrotranscripción
Método molecular
5
PCR- “Real time” (cuantitativo)
Lisis
RPA – Prueba isotérmica30 minutos
Lectura de resultados
Detección de SARS-CoV-2 por un método molecular
Toma de muestra
6
Diseño de primers para la identificación de SARS-CoV-2Selección de región viral
7
S
qPCR Primer NIID(N) 29133-29290nt
“Japón”qPCR Primer CDC(N1) 28295-28366nt
“USA”
qPCR Primer Corman, 2020. (RdRp) 15352-
15451nt
“Europa y China”
RT-RPA
8
ARN
M-MLV Trascriptasa reversa
Cebadores
Cebadores
Recombinasa Proteina SSB Polimerasa
Nucleótidos
RT-RPA
9
RT-RPA
10
RT-RPA
11
RT-RPA
12
RT-RPA
13
RT-RPA
14
Cebadores
Cebadores
Recombinasa Proteina SS Polimerasa
Nucleótidos
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Especificidad analítica
16
PC: SARS-CoV-2 (104 copies/µL), HMPV: Human metapneumovirus, A/H1N pdm: Influenzavirus A H1 pandemic, HRSV: Human respiratory syncytial virus, HPIV-2: Human parainfluenza virus 2, HPIV-4: Human parainfluenza virus 4, HPIV-1: Human parainfluenza virus 1, HPIV-3: Human parainfluenza virus 3, IVB: Influenza B virus, IVC: Influenza C virus, SARS-1: SARS coronavirus 1, MERS-CoV: MERS coronavirus, NTC: Non template control.
Límite de detección del RT-RPA-LF
17
Figura 6. Límite de detección de SARS-CoV-2 RPA-LF con diluciones seriadas 1/10 del plásmido control
positivo, equivalentes a 105, 104, 103, 102, 10, 1, 10-1 copia/µL, con RPA-LF. Se realizaron 3 repeticiones.
Detección por flujo lateral
18
Biotina 6-FAM
Detección por flujo lateral
19
Detección por flujo lateral
20
Detección por flujo lateral
21
Detección por flujo lateral
22
Detección por flujo lateral
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Agradecimientos - Financiamiento
• Instituto Nacional de Salud - INS• Fondo Nacional de Desarrollo Científico, Tecnológico y de Innovación
Tecnológica (FONDECYT), Contrato 045-2020.• Fondo de la Sociedad Japonesa para la Promoción de la Ciencia (JSPS),
KAKENHI JP19K24679.• Ministerio de Educación, Cultura, Deportes, Ciencia y Tecnología del Japón
(MEXT).
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