desarrollo de métodos (bio)electroquímicos que faciliten
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Universidad Nacional de Rosario
Facultad de Ciencias Bioquiacutemicas y Farmaceacuteuticas
Desarrollo de meacutetodos (bio)electroquiacutemicos que
faciliten la determinacioacuten de analitos de intereacutes en el
campo de la Salud y las fuentes de energiacutea renovables
Tesis para optar por el tiacutetulo de
DOCTOR EN CIENCIAS QUIacuteMICAS
Presentada por
Lic Pablo Luis Faccendini
Directora de Tesis
Dra Claudia M Lagier
2014
Desarrollo de meacutetodos (bio)electroquiacutemicos que
faciliten la determinacioacuten de analitos de intereacutes en el
campo de la Salud y las fuentes de energiacutea renovables
Licenciado en Biotecnologiacutea Pablo Luis Faccendini
Universidad Nacional de Rosario
Esta Tesis es presentada como parte de los requisitos para optar al grado
acadeacutemico de Doctor en Ciencias Quiacutemicas de la Universidad Nacional de Rosario y
no ha sido presentada previamente para la obtencioacuten de otro tiacutetulo en esta u otra
Universidad La misma contiene los resultados obtenidos en investigaciones llevadas a
cabo en Instituto de Quiacutemica Rosario dependiente de la Facultad de Cs Bioquiacutemicas y
Farmaceacuteuticas durante el periacuteodo comprendido entre el 1 de abril de 2009 y el 18 de
febrero de 2014 bajo la direccioacuten de la Dra Claudia Marina Lagier
Iacutendice
i
Iacutendice
1 Resumen vi
1 Summary viii
Publicaciones x
Abreviaturas y Siacutembolos xii
2 Introduccioacuten 1
21 Toxoplasmosis 1
211 Generalidades 1
212 Toxoplasma gondii 2
213 Diagnoacutestico 4
2131 Meacutetodos de diagnoacutestico 4
2132 Importancia del correcto diagnoacutestico en la embarazada 6
2133 Diagnoacutestico en la embarazada 6
2134 Ensayo de inmunoadsorcioacuten ligado a enzima 7
21341 Esquema de captura o tipo ―Sandwich 7
2135 Obtencioacuten de antiacutegenos para diagnoacutestico 9
214 Prediccioacuten de epiacutetopes reconocidos por ceacutelulas B 10
22 Tuberculosis 13
221 Generalidades 13
222 Mycobacterium tuberculosis 13
223 Diagnoacutestico 14
23 Biodiesel 16
231 Determinacioacuten de glicerol libre en biodiesel 16
24 Marco teoacuterico de las teacutecnicas electroquiacutemicas utilizadas 18
241 Cronoampreometriacutea 20
242 Teacutecnicas voltameacutetricas 21
2421 Voltametriacutea de barrido lineal 22
2422 Voltametriacutea ciacuteclica 23
Iacutendice
ii
243 Teacutecnicas de pulso 24
2431 Voltamperometriacutea onda cuadrada VOC 24
25 Biosensores 27
251 Superficie de bioreconocimiento en biosensores 28
252 Biosensores amperomeacutetricos 29
253 Biosensores de uso cliacutenico 29
2531 Biosensores para evaluacioacuten de infeccioacuten toxoplaacutesmica 32
254 Biosensores para cuantificacioacuten de glicerol 32
3 Objetivos 37
31 Objetivos generales 37
32 Objetivos Particulares 37
4 Materiales y meacutetodos 39
41 Reactivos y medios de cultivos 39
411 Reactivos 39
412 Medios de cultivos 40
42 Cepas bacterianas 40
43 Bacterioacutefagos 41
44 Plaacutesmidos 41
45 Reaccioacuten en cadena de la polimerasa 41
46 Electroforesis de ADN en geles de agarosa 42
47 Minipreparacioacuten de ADN plasmiacutedico 42
48 Purificacioacuten del producto de amplificacioacuten 43
49 Prueba de expresioacuten de proteiacutenas de fusioacuten a TRX y a ―cola
de histidinas 43
410 Expresioacuten y purificacioacuten preparativas de antiacutegenos recombinantes 43
411 Separacioacuten de proteiacutenas mediante SDS-PAGE 44
412 Cuantificacioacuten de proteiacutenas 44
413 Reaccioacuten de conjugacioacuten biotina-antiacutegeno 44
Iacutendice
iii
414 Revelado cromogeacutenico de la reaccioacuten de conjugacioacuten 45
415 Mediciones espectrofotomeacutetricas 45
416 Ensayos de inmunoabsorcioacuten ligados a enzima con deteccioacuten
fotomeacutetrica 45
4161 Esquema A 46
4162 Esquema B 46
417 Reaccioacuten de color para determinacioacuten cuantitativa de glicerol por meacutetodo
espectrofotomeacutetrico 47
418 Determinacioacuten de glicerol remanente en cultivos de micobacterias 47
4181 Determinacioacuten de glicerol remanente en cultivos de micobacterias
con y sin fago D29 y ensayos controles respectivos 48
419 Instrumental electroquiacutemico 48
4191 Electrodos de trabajo 48
41911 Bioelectrodo para evaluacioacuten de infeccioacuten toxoplaacutesmica 48
41912 Electrodos para cuantificacioacuten de glicerol 49
4192 Limpieza de electrodos 50
4193 Determinacioacuten del aacuterea real del electrodo 50
41931 Medicioacuten de la adsorcioacuten de oxiacutegeno 50
41932 Voltametriacutea ciacuteclica de ferricianuro de potasio 51
420 Medidas electroquiacutemicas 51
4201 Mediciones amperomeacutetricas para evaluacioacuten de infeccioacuten
toxoplaacutesmica 51
4202 Mediciones amperomeacutetricas para cuantificacioacuten de glicerol 52
42021 Amperometriacuteas con tip de oro 52
42022 Amperometriacuteas con electrodos de pasta de C 52
4203 Voltamperometriacutea de onda cuadrada 53
421 Funcionalizacioacuten de nanotubos de carbono 53
422 Programas de prediccioacuten de epiacutetopes lineales reconocidos por ceacutelulas B 54
Iacutendice
iv
4221 Base de datos de proteiacutenas 54
4222 Programas utilizados 54
423 Anaacutelisis de Datos 54
424 Caacutelculos estadiacutesticos y disentildeo experimental 55
5 Resultados y discusioacuten 57
51 Evaluacioacuten de antiacutegenos recombinantes de T gondii 57
511 Antiacutegeno P30 57
512 Antiacutegeno P22 58
513 Antiacutegeno P35 59
52 Marcado de antiacutegenos recombinantes de T gondii 60
53 Inmunoensayos 61
531 Inmunoensayos con deteccioacuten fotomeacutetrica 61
5311 Evaluacioacuten del esquema A 61
5312 Esquema B 62
532 Inmunoensayos con deteccioacuten amperomeacutetrica utilizando los antiacutegenos
recombinantes 66
54 Determinacioacuten de la actividad electroquiacutemica del glicerol en medio
acuoso 67
55 Cuantificacioacuten de glicerol en medios acuosos complejos 71
551 Evaluacioacuten del modelo propuesto por medio de lecturas
espectrofotomeacutetricas 72
5511 Evaluacioacuten de la sentildeal con la concentracioacuten de glicerol 76
5512 Optimizacioacuten de condiciones para disminuir el costo operativo 78
552 Determinacioacuten de glicerol remanente en cultivos de micobacterias 79
5521 Evaluacioacuten de glicerol remanente en cultivos axeacutenicos de M
smegmatis 79
5522 Determinacioacuten de glicerol remanente en cultivos de micobacterias
con y sin fago D29 y ensayos controles respectivos 80
Iacutendice
v
553 Biosensor amperomeacutetrico a base de pasta de carbono viacutetreo
modificada 81
554 Desarrollo de un biosensor a base de pasta de carbono viacutetreo y
nanotubos de carbono 83
5541 Ensayos de cuantificacioacuten de glicerol con el bioelectrodo
desarrollado utilizando teacutecnicas de pulso 86
56 Validacioacuten de meacutetodos 88
6 Experimentos Auxiliares 94
61 Comparacioacuten de programas de prediccioacuten de epiacutetopes lineales reconocidos
por ceacutelulas B 94
62 Puesta a punto de ensayos de inmunoabsorcioacuten ligados a enzima con
deteccioacuten fotomeacutetrica 95
621 Bloqueante a utilizar 96
622 Esquema A 97
623 Esquema B 98
63 Ensayos electroquiacutemicos 99
631 Determinacioacuten del aacuterea real de un electrodo 99
6311 Meacutetodo de la adsorcioacuten de O2 99
6312 Voltametriacutea ciacuteclica a distintas velocidades 99
632 Cubierta del biosensor selectivo para glicerol y soluciones
amortiguadoras 100
633 Ensayos preliminares de voltametriacuteas de onda cuadrada 100
6331 Seleccioacuten de un meacutetodo apropiado para establecer la liacutenea
de base 101
7 Conclusiones 104
8 Bibliografiacutea 106
Resumen
vi
1 Resumen
Este trabajo de Tesis se orientoacute al desarrollo de meacutetodos analiacuteticos alternativos a los
hoy vigentes que faciliten la determinacioacuten de compuestos de intereacutes tanto para
diagnoacutestico cliacutenico como para la industria de combustibles alternativos Se realizaron
aportes para tres situaciones de relevancia diagnoacutestico de toxoplasmosis tuberculosis y
evaluacioacuten de calidad de biodiesel
La toxoplasmosis es una parasitosis causada por Toxoplasma gondii que afecta a
humanos sin generar complicaciones excepto cuando los infectados son
inmunodeprimidos o mujeres embarazadas que no cursaron previamente la enfermedad
En este caso el paraacutesito puede atravesar placenta generando infeccioacuten congeacutenita del
feto pudiendo producirle graves consecuencias que pueden llegar a la muerte Una de
las teacutecnicas de diagnoacutestico utiliza el ensayo de inmunoadsorcioacuten ligado a enzima
permitiendo la deteccioacuten de anticuerpos especiacuteficos contra el paraacutesito los cuales son
indicadores de existencia de infeccioacuten No obstante para detectar toxoplasmosis aguda
al diacutea de hoy se carece de una estandarizacioacuten confiable principalmente en la
preparacioacuten del antiacutegeno Por ello en este trabajo se procuroacute identificar regiones donde
se codificaraacuten algunos marcadores de fase aguda que concentraraacuten una alta proporcioacuten
de determinantes antigeacutenicos para luego clonarlas expresarlas como proteiacutenas
recombinantes marcarlas con biotina y asiacute utilizarlas como sistema de revelado de
anticuerpos especiacuteficos contra proteiacutenas de T gondii Los inmunoensayos aquiacute
presentados proponen una metodologiacutea que permitiraacute en un futuro distinguir sueros
provenientes de individuos con infeccioacuten aguda de aquellos con infeccioacuten croacutenica o no
infectados
La tuberculosis es una enfermedad infecto-contagiosa causada por la bacteria
Mycobacterium tuberculosis Su diagnoacutestico se basa en una serie de estudios que
finaliza con la identificacioacuten del agente etioloacutegico en cultivos obtenidos a partir de
esputo Esta identificacioacuten puede demorar aproximadamente dos meses debido al
prolongado tiempo de replicacioacuten de la micobacteria Esto conlleva la potencialidad de
contagio a individuos sanos y un compromiso importante de la salud del infectado
Uacuteltimamente se han desarrollado teacutecnicas indirectas de deteccioacuten de M tuberculosis
utilizando el bacterioacutefago D29 capaz de infectar especiacuteficamente micobacterias Es una
metodologiacutea donde se facilita la replicacioacuten del fago en la muestra proveniente del
paciente para luego evaluar el tiacutetulo de fagos liberados infectando un cultivo testigo de
Resumen
vii
Micobacterium smegmatis micobacteria de replicacioacuten raacutepida Siendo el glicerol fuente
de carbono en cultivos de micobacterias se planteoacute determinar su concentracioacuten
remanente como meacutetodo de evaluar integridad de M smegmatis establecieacutendose asiacute una
medida indirecta de la previa presencia de M tuberculosis en la muestra problema
Ademaacutes el glicerol es el principal subproducto en la elaboracioacuten del biodiesel y su
concentracioacuten es indicativa de la calidad del combustible transformaacutendose en analito
relevante para la industria de energiacuteas alternativas a la derivada del petroacuteleo
Se desarrollaron y validaron dos meacutetodos amperomeacutetricos de cuantificacioacuten de
glicerol a) Con electrodo de oro en NaOH 01 M aplicable a medios acuosos (LD 10
microM intervalo lineal 0024 a 200 mM) b) Con bioelectrodo de pasta de C modificada
con glicerol deshidrogenasa aplicable a medios complejos como cultivos bacterianos
(LD 20 M intervalo lineal 0060 a 175 mM)
Resumen
viii
1 Summary
This Thesis work was oriented to the development of analytical methods alternative
to those currently used to facilitate the identification of compounds of interest for both
clinical diagnosis and the alternative fuel industry Contributions of relevance to three
situations were performed Diagnosis of toxoplasmosis tuberculosis and the assessment
of biodiesel quality
Toxoplasmosis is a parasitic disease caused by Toxoplasma gondii which does not
bring complications in people except when the infected individual is an
immunocompromised patient or pregnant women who have not previously suffered
from the illness In this case the parasite can cross the placenta producing congenital
infection of the fetus and potentially causing serious consequences including death
One of the techniques used to its diagnosis is the enzyme-linked immunosorbent assay
allowing the detection of parasite-specific antibodies which are indicators of the
infection However this technique aimed to detect acute toxoplasmosis nowadays lacks
of reliable standardization particularly in the preparation of the antigen Therefore this
study focused on identifying regions encoding several markers of acute phase which
highly concentrated antigenic determinants to clone and express them as recombinant
proteins subsequently label them with biotin and thus use them as developing system of
specific antibodies against T gondii proteins The immunoassays presented here
propose a methodology which will allow in the future distinguishing sera from
individuals with acute infection of those with chronic infection or uninfected
Tuberculosis is an infectious and contagious disease caused by the bacterium
Mycobacterium tuberculosis Its diagnosis is based on a series of studies which
eventually identify the etiologic agent in cultures obtained from sputum This
identification can take about two months due to the extensive mycobacteria replication
time This leads to the potential contagion of healthy individuals and a major
commitment to the health of the infected patient Recently indirect M tuberculosis
detection techniques have been developed They use D29 bacteriophage which is able
to specifically infect mycobacteria The methodology allows phage replication in the
patientrsquos sample and then evaluates the number of released phages by infecting a
control culture of Mycobacterium smegmatis a short-term replicable mycobacteria As
glycerol is the carbon source commonly used in mycobacteria culture this work
proposes determining its residual concentration as a method of evaluating integrity of
Resumen
ix
M smegmatis thus establishing an indirect measurement of the previous presence of M
tuberculosis in the sample
Furthermore glycerol is the main by-product in biodiesel production and its
concentration is an indicator of the fuel quality becoming a relevant analyte to the
energy industry alternative to that derived of petroleum
Two amperometric methods for glycerol quantitation were developed and
validated a) Using a gold electrode in 01 M NaOH medium useful for simple aqueous
solutions (LD 10 microM linear range from 0024 to 200 mM) b) using a carbon paste
bioelectrode modified with glycerol dehydrogenase useful for complex media such as
bacterial cultures (LD 20 microM linear range 0060 to 175 mM)
Publicaciones
x
Publicaciones
Los resultados parciales del presente trabajo de Tesis han dado lugar a las
siguientes publicaciones
Trabajos en revistas internacionales
1- Costa J G Faccendini P L Sferco S J Lagier C M Marcipar I S
Evaluation and comparison of the ability of online available prediction programs to
predict true linear B-cell epitopes Protein amp Peptide Letters (2013) 20(6)724-30
2- Faccendini P L Ribone M E Lagier C M Selective application of two
rapid low-cost electrochemical methods to quantify glycerol according to the sample
nature Sensors and Actuators B (2014) 193 142ndash 148
Trabajos en congresos
1- Muntildeoz A Faccendini P L Ribone M E Lagier C M Oxidacioacuten
electroquiacutemica de polialcoholes sustrato de sistemas enzimaacuteticos bacterianos Estudio
de las condiciones para su cuantificacioacuten V Congreso Argentino de Quiacutemica Analiacutetica
Bahiacutea Blanca Noviembre de 2009
2- Costa J G Faccendini P L Carral L Kaufer F Lagier C M Marcipar I
S Evaluacioacuten de dos regiones de la Proteiacutena P35 de Toxoplasmama gondii para el
diagnostico de fase aguda de la toxoplasmosis Ascochinga Coacuterdoba Octubre de 2010
3- Costa J G Faccendini P L Lagier C M Marcipar I S Modelado y
prediccioacuten de los epiacutetopes del antigeno P22 de Toxoplasma gondii 2do Congreso de
Bioinformaacutetica y Biologiacutea Computacional Coacuterdoba Mayo de 2011
4- Faccendini P L Costa J G Ribone M E Marcipar I S Lagier C M
Ensamblado de un bioelectrodo econoacutemico para la deteccioacuten de glicerol en medios
altamente complejos 6deg Congreso Argentino de Quiacutemica Analiacutetica Santa Fe
Septiembre de 2011
5- Faccendini P L Costa J G Ribone M E Marcipar I S Lagier C M
Desarrollo y optimizacioacuten de un meacutetodo para la cuantificacioacuten de glicerol en matrices
complejas 6deg Congreso Argentino de Quiacutemica Analiacutetica Santa Fe Septiembre de 2011
Publicaciones
xi
6- Costa J G Perotti J Faccendini P L Lagier C M Mancipar I S
Optimization of the acute toxoplasmosis immunodiagnostic during the pregnancy
Workshop Fronteras en Biociencias Ministerio de Ciencia Tecnologiacutea e Innovacioacuten
Productiva Embajada Alemana Ciudad Autoacutenoma de Buenos Aires Abril de 2012
7- Costa J G Perotti J Faccendini P L Dure A Carral L Kaufer F Lagier
C M Mancipar I S Evaluacioacuten de diferentes regiones de las proteiacutenas p22 p30 y p35
para diagnoacutestico de la fase aguda de la toxoplasmosis XXV Reunioacuten Anual de la
Sociedad Argentina Protozoologiacutea 2012 Ciudad Autoacutenoma de Buenos Aires Agosto
de 2012
8- Costa J G Faccendini P L Sferco S J Lagier C M Mancipar I S
Comparison of the ability to predict true linear B-cell epitopes by on-line available
prediction programs 3er congreso de la sociedad argentina de bioinformaacutetica y biologiacutea
computacional Paranaacute Septiembre de 2012
9- Faccendini P L Costa J G Ribone M E Marcipar I S Lagier C M
Desarrollo de un sistema electroquiacutemico para evaluar infeccioacuten toxoplaacutesmica 7deg
Congreso Argentino de Quiacutemica Analiacutetica Mendoza Octubre de 2013
Abreviaturas y Siacutembolos
xii
Abreviaturas y Siacutembolos
AD Aglutinacioacuten Directa
ADN Aacutecido desoxiribonucleico
Ac(s) Anticuerpo(s)
Ang(s) Antiacutegeno(s)
D Coeficiente de difusioacuten
DHA 13 dihidroxiacetona
DMSO Dimetil sulfoacutexido
DO Densidad oacuteptica
DT Dye Test con azul de metileno (Reaccioacuten de Sabiacuten Feldman)
EDTA Aacutecido etilendiaminotetraaceacutetico
ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay (Ensayo de inmunoadsorcioacuten ligado
a enzima)
F Constante de Faraday
Frecuencia
GlDH Glicerol deshidrogenasa
HAI Hemoaglutinacioacuten indirecta
HEPES Aacutecido 4-(2-hydroxietil)-1-piperazina etano sulfoacutenico
HRP Horse radish peroxidase (Peroxidasa de raacutebano picante)
I Corriente eleacutectrica
IFI Inmunofluorescencia indirecta
IgA Inmunoglobulina A
IgG Inmunoglobulina G
IgE Inmunoglobulina E
IgM Inmunoglobulina M
IgM-IFI Inmunofluorescencia indirecta de IgM (Prueba de Remington)
IPTG Isopropil- -D-tiogalactopiranoacutesido
ISAGA Ensayo aglutinante de inmunoabsorcioacuten
LB Medio Luria-Bertani
LC Liacutemite de cuantificacioacuten
LD Liacutemite de deteccioacuten
MWCNT Multi-walled carboacuten nanotubes (Nanotubos de carbono de paredes
muacuteltiples)
Abreviaturas y Siacutembolos
xiii
N nuacutemero de moles de especie reducida u oxidada
OMS Organizacioacuten Mundial de la Salud
P35 Antiacutegeno de superficie de T gondii de 35 kDa de peso
PBS Phosphate buffer salin (Solucioacuten tampoacuten fosfato salino)
PCR Polimerasa chain reaction (Reaccioacuten en cadena de la polimerasa)
pET32a Vector plasmiacutedico
Q Carga eleacutectrica circulante
SAG1 Surface antigen 1 (Antiacutegeno de superficie 1 o antiacutegeno P30 de T gondii)
SAG2 Surface antigen 2 (Antiacutegeno de superficie 2 o antiacutegeno P22 de T gondii)
SDS Dodecil sulfato de sodio
TB Tuberculosis
TRX Tioredoxina
VBL Voltametriacutea de barrido lineal
VC Voltametriacutea ciacuteclica
VPD Voltametriacutea de pulso diferencial
Introduccioacuten
Introduccioacuten
1
2 Introduccioacuten
21 Toxoplasmosis
211 Generalidades
La toxoplasmosis es una enfermedad causada por el paraacutesito protozoario
Toxoplasma gondii que infecta animales herbiacutevoros carniacutevoros y omniacutevoros dentro de
los cuales se encuentra el hombre Estaacute ampliamente extendida por todo el mundo y su
incidencia y prevalencia variacutean mucho seguacuten las zonas geograacuteficas los haacutebitos
alimentarios el tipo de trabajo la higiene ambiental y la presencia o no de gatos
infectados (Atias 1998 Martiacuten-Hernaacutendez 2004) Es una zoonosis que afecta a los
humanos a traveacutes de formas infectivas producidas durante el ciclo bioloacutegico que se
desarrolla uacutenicamente en gatos y otros feacutelidos Dependiendo de la localizacioacuten
geograacutefica entre 15 y 85 de la poblacioacuten adulta mundial presenta infeccioacuten croacutenica
(Fuentes y col 2001)
Usualmente la principal viacutea de transmisioacuten de esta parasitosis es la oral por
ingestioacuten de carnes crudas o poco cocidas contaminadas con quistes o por la ingestioacuten
de ooquistes presentes en agua o alimentos contaminados con heces de gato Son menos
frecuentes las viacuteas de transmisioacuten parenteral respiratorias mucosal (conjuntival)
cutaacutenea y por transfusioacuten de sangre o trasplante de oacuterganos La transmisioacuten por viacutea
transplacentaria puede ocurrir cuando la embarazada padece la primoinfeccioacuten durante
el curso del embarazo aunque se han descripto casos raros de infeccioacuten congeacutenita por
toxoplasmosis materna anterior al embarazo (Martiacuten-Hernaacutendez 2004 Centers of
Diseases Control and Prevention (CDC) paacutegina web a)
Durante la infeccioacuten pueden distinguirse dos etapas A) Aguda Al breve tiempo de
ingerir ooquistes esporulados eacutestos se transforman en taquizoiacutetos ingresan a la ceacutelula
del hueacutesped y comienzan a dividirse en forma asexual hasta que la ceacutelula se lisa
liberando asiacute la progenie y ocasionando la parasitemia Posteriormente el taquizoiacuteto
evoluciona a bradizoiacuteto cuya multiplicacioacuten es lenta Se produce la invasioacuten de los
oacuterganos por viacutea linfaacutetica o hemaacutetica siendo los oacuterganos maacutes comprometidos los
muacutesculos esqueleacutetico y cardiacuteaco asiacute como cerebro y ojos B) Croacutenica En la medida que
evoluciona la defensa del hueacutesped desaparecen los paraacutesitos extracelulares limitaacutendose
la divisioacuten intracelular y quedando las formas resistentes principalmente en el sistema
nervioso central y muacutesculo esqueleacutetico Por lo general esta etapa es latente pero puede
Introduccioacuten
2
activarse por la ruptura de los quistes tisulares (Fuentes y col 2001 Trabattoni y col
2008)
212 Toxoplasma gondii
El Toxoplasma gondii es un paraacutesito intracelular obligado Su ubicacioacuten
taxonoacutemica se detalla en la Tabla 21
Tabla 21 Ubicacioacuten taxonoacutemica del T gondii
Reino Protista
Sub-reino Protozoa
Phylum Apicomplexa
Clase Sporozoea
Sub-clase Coccidea
Orden Eucoccidiia
Sub-orden Eimeriina
Familia Sarcocystidae
Sub-familia Toxoplasmatinae
Geacutenero Toxoplasma
Especie gondii
Durante el ciclo de vida del T gondii se distinguen tres formas a) los taquizoiacutetos
b) los bradizoiacutetos (o quistes tisulares) y c) los ooquistes Los taquizoiacutetos (o trofozoiacutetos)
son la forma proliferativa y de reproduccioacuten raacutepida dentro de la ceacutelula del hueacutesped
durante la fase aguda que posteriormente deviene en la formacioacuten de un pseudoquiste
Tiene forma de medialuna y mide de 4 a 7 μm de ancho Estaacute recubierto por un sistema
de membranas constituido por una membrana doble interna y una externa interrumpida
en dos puntos El taquizoiacuteto es afectado por anticuerpos (Acs) especiacuteficos y faacutermacos y
se destruye en condiciones ambientales adversas como congelamiento-
descongelamiento desecacioacuten y bajo pH (por ejemplo el de los jugos gaacutestricos) Los
quistes tisulares son redondeados de pared elaacutestica miden de 10 a 200 μm y pueden
contener hasta 3000 paraacutesitos denominados bradizoiacutetos Estas formas no son afectadas
por Acs ni faacutermacos pero pueden ser destruidos por calentamiento congelamiento-
descongelamiento y por desecacioacuten Cuando estos quistes son ingeridos los bradizoiacutetos
resistentes son liberados por la accioacuten gaacutestrica y pueden invadir la mucosa
gastrointestinal Los ooquistes son estructuras ovoides de 10 a 12 μm de diaacutemetro y son
eliminadas en la materia fecal del gato Recieacuten emitidos no son infectivos pero bajo
condiciones de temperatura humedad y presencia de oxiacutegeno esporulan tornaacutendose
Introduccioacuten
3
infectivos y resistentes por maacutes de un antildeo en el suelo y dos antildeos en el agua (Atias
1998 Perotti 2007)
La Fig 21 describe el ciclo de vida del paraacutesito Los uacutenicos hueacutespedes definitivos
conocidos de T gondii son miembros de la familia Felidae (por ejemplo gatos
domeacutesticos) Los ooquistes no esporulados son liberados en las heces del felino Los
ooquistes tardan entre 1 y 5 diacuteas en esporular en el ambiente y volverse infectivos Los
hueacutespedes intermediarios se infectan al ingerir tierra agua o plantas contaminadas con
los ooquistes Los ooquistes se transforman en taquizoiacutetos al breve tiempo de ser
ingeridos Estos taquizoiacutetos se localizan en los tejidos musculares y el sistema nervioso
y evolucionan a bradizoiacutetos formando los quistes tisulares (hiacutesticos) Los felinos se
infectan luego de ingerir la carne de hueacutespedes intermediarios que poseen quistes
tisulares o por ingestioacuten de los ooquistes esporulados Los animales de caza y los
criados para consumo humano tambieacuten pueden infectarse por ingestioacuten de ooquistes
esporulados En el hueacutesped humano los paraacutesitos forman quistes en los tejidos y suele
encontrarse generalmente en el muacutesculo esqueleacutetico el miocardio cerebro y ojos donde
pueden permanecer durante toda la vida del hueacutesped (Paacutegina web del CDC)
Figura 21 Ciclo de vida de T gondii El hueacutesped definitivo son miembros de la familia Felidae los
demaacutes hueacutespedes (incluido el hombre) se infectan accidentalmente y no son necesarios para completar el
ciclo de vida del paraacutesito Adaptado de httpwwwdpdcdcgovdpdxHTMLToxoplasmosishtm
Introduccioacuten
4
213 Diagnoacutestico
Puesto que las infecciones por T gondii en individuos inmunocompetentes son por
lo general asintomaacuteticas o presentan siacutentomas imperceptibles su diagnoacutestico se basa
principalmente en pruebas de laboratorio La toxoplasmosis no suele generar
complicaciones excepto en 2 situaciones cuando se infectan individuos
inmunodeprimidos y cuando se infectan por primera vez mujeres embarazadas En este
uacuteltimo caso el paraacutesito puede infectar al feto atravesando la placenta y generando la
infeccioacuten congeacutenita Las probabilidades de dantildear al feto o al nintildeo luego de nacer
dependeraacuten del trimestre en que suceda la infeccioacuten (Atias 1998 Martiacuten-Hernaacutendez
2005) Tanto en inmunocomprometidos como en el recieacuten nacido la infeccioacuten puede
producir graves consecuencias Es por ello que en estos casos asiacute como en la
embarazada el diagnoacutestico cobra particular relevancia (Remington y col 1995)
2131 Meacutetodos de diagnoacutestico
La infeccioacuten puede diagnosticarse por meacutetodos directos que consisten en la
identificacioacuten de las estructuras parasitarias (por un estudio histopatoloacutegico para lo cual
es necesario realizar biopsias puncioacuten de ganglios o cortes histoloacutegicos) o la
identificacioacuten de ADN del paraacutesito (a traveacutes de una reaccioacuten en cadena de la
polimerasa PCR) Tambieacuten se pueden realizar cultivos tisulares e inoculacioacuten al
peritoneo de ratoacuten pero este meacutetodo presenta la desventaja de involucrar el manejo de
paraacutesitos vivos y el uso de animales de laboratorio (Perotti 2007)
Los meacutetodos alternativos son las pruebas indirectas a saber
Intradermoreaccioacuten de Frenkel Evaluacutea la inmunidad celular Es una reaccioacuten
cualitativa tardiacutea y presenta resultado positivo a partir de la cuarta semana de infeccioacuten
aunque se han reportado casos de pacientes en los que llevoacute varios meses hasta dar
positiva Se utiliza con fines epidemioloacutegicos (Jirovec amp Jindrich 1961 Rodriacuteguez
Acar y col 2008)
Reaccioacuten de Sabiacuten Feldman o dye test con azul de metileno (DT) Es el meacutetodo
de referencia de la OMS Evaluacutea la inmunidad humoral y mide la cantidad total de Acs
que es capaz de destruir taquizoiacutetos viacutea activacioacuten del complemento Es un meacutetodo
cuantitativo y presenta valores positivos a partir de la primera o segunda semana de
infeccioacuten Tiene la desventaja de requerir taquizoiacutetos vivos y animales para su cultivo
por lo que soacutelo laboratorios de referencia llevan adelante este meacutetodo (Perotti 2007
Durlach y col 2008)
Introduccioacuten
5
Reaccioacuten de inmunofluorescencia indirecta (IFI) Evaluacutea la cantidad de Acs que
se unen a toxoplasmas inactivados La reaccioacuten se evidencia con Acs anti-IgG humana
marcados con isocianato de fluoresceiacutena y observando al microscopio de fluorescencia
Si bien no se trabaja con organismos vivos la necesidad de un microscopio de
fluorescencia y la subjetividad del operador limitan el uso de este meacutetodo Se han
informado resultados falso-positivos debidos a Acs anti-nucleares (Durlach y col
2008)
Aglutinacioacuten directa (AD) En este ensayo se produce una aglutinacioacuten visible con
toxoplasmas tratados con formol Se detecta fundamentalmente IgMs especiacuteficas
Hemoaglutinacioacuten indirecta (HAI) Se utilizan antiacutegenos (Angs) de T gondii con
los que se sensibiliza gloacutebulos rojos que en presencia de Acs especiacuteficos producen una
aglutinacioacuten visible como un botoacuten rojo En general es utilizado para determinar
incidencia o seroprevalencia en una regioacuten pero no se recomienda para la deteccioacuten de
la infeccioacuten aguda (Durlach y col 2008)
Fijacioacuten del complemento Se detectan Acs que activan el sistema del
complemento en presencia de Angs de T gondii La reaccioacuten se evidencia con el
sistema hemoliacutetico hemolisina-gloacutebulos rojos de carnero Resultados positivos aparecen
en forma maacutes tardiacutea que en el DT (Perotti 2007)
Western blot Se evaluacutea la presencia de Acs especiacuteficos a Angs que han sido
separados por electroforesis en un gel de poliacrilamida y transferidos a una membrana
Generalmente no es utilizada como teacutecnica de diagnoacutestico debido a su difiacutecil
estandarizacioacuten (Durlach y col 2008)
Prueba de Remington (IgM-IFI) Se sigue el mismo esquema que en IFI pero se
sustituyen el conjugado anti-IgG por uno anti-IgM lo que permite detectar infeccioacuten
aguda Acs anti-nucleares y el factor reumatoide pueden producir resultados falso-
positivos y los Acs tipo IgG pueden producir resultados falso-negativos (Perotti 2007)
Ensayo aglutinante de inmunoabsorcioacuten (ISAGA) Permite la deteccioacuten y dosaje
de Acs IgA IgE IgG e IgM especiacuteficos contra el paraacutesito Este meacutetodo posee mayor
sensibilidad en relacioacuten al IgM-IFI y al ensayo de inmunoadsorcioacuten ligado a enzima
(ELISA) de IgM para la deteccioacuten de infecciones congeacutenitas pero tiene la desventaja
que pueden detectarse IgM especiacuteficas luego de un antildeo de la primoinfeccioacuten Esto
dificulta la interpretacioacuten de un resultado positivo si se desea determinar la antiguumledad
de la infeccioacuten (Durlach y col 2008)
Introduccioacuten
6
Ensayo de inmunoadsorcioacuten ligado a enzima (ELISA) Permite la deteccioacuten de
Acs especiacuteficos contra el paraacutesito Se evidencia la reaccioacuten con una enzima ligada a Acs
o Angs (dependiendo del disentildeo del inmunoensayo ver maacutes adelante en punto 2134)
que transforma un reactivo auxiliar en un producto coloreado o fluorescente Es un
meacutetodo cuantitativo que utiliza un espectrofotoacutemetro o fluoroacutemetro lo que permite
hacer medidas maacutes objetivas y raacutepidas (Perotti 2007) Auacuten asiacute este meacutetodo aplicado a
la deteccioacuten de la toxoplasmosis de fase aguda carece de una estandarizacioacuten confiable
principalmente en la preparacioacuten del Ang
2132 Importancia del correcto diagnoacutestico en la embarazada
A pesar de toda la bateriacutea de ensayos arriba descritos disponibles para el
diagnoacutestico de la toxoplasmosis el de la infeccioacuten aguda en la mujer embarazada sigue
siendo problemaacutetico porque este diagnoacutestico se deduce a partir de los datos de las
concentraciones relativas de los distintos isotipos de las inmunoglobulinas especiacuteficas
En efecto la existencia y concentracioacuten de IgM IgA e IgG especiacuteficas contra T gondii
es muy dependiente de la respuesta inmune del individuo infectado Considerando que
el tratamiento para prevenir la transmisioacuten al feto consiste en administrar drogas
antiparasitarias que tienen efectos nocivos sobre el nonato auacuten en estos diacuteas se trabaja
en mejorar este diagnoacutestico ya que no se cuenta con un meacutetodo confiable como para
prevenir por un lado los dantildeos que suelen sufrir los recieacuten nacidos de madres con
primoinfeccioacuten no diagnosticada y por otra parte los efectos perjudiciales en los fetos
de las embarazadas incorrectamente diagnosticadas y medicadas Por ello es que en este
trabajo se intentoacute desarrollar nuevas metodologiacuteas de diagnoacutestico de la infeccioacuten
toxoplaacutesmica aguda utilizando teacutecnicas electroquiacutemicas
2133 Diagnoacutestico en la embarazada
El correcto diagnoacutestico de la infeccioacuten aguda en la embarazada incluye la
utilizacioacuten de teacutecnicas especiacuteficas y sensibles asiacute como tambieacuten la aplicacioacuten de un
esquema de seguimiento adecuado El diagnoacutestico generalmente es realizado por
serologiacutea Para determinar si la paciente cursa una infeccioacuten aguda se determinan los
tiacutetulos de los anticuerpos IgG IgA e IgM (Arcavi y col 1997) y se interpretan prima-
facie seguacuten
1 IgG IgA IgM negativas ausencia de infeccioacuten
2 IgG e IgA positivas IgM negativa infeccioacuten croacutenica
3 IgG IgA e IgM positivas posible infeccioacuten aguda
Introduccioacuten
7
2134 Ensayo de inmunoadsorcioacuten ligado a enzima
Los ensayos del tipo ELISA consisten en la deteccioacuten de un antiacutegeno o un
anticuerpo inmovilizado sobre un soporte soacutelido y mediante anticuerpos que directa o
indirectamente producen una reaccioacuten La prueba recurre al empleo de antiacutegenos o
anticuerpos conjugados a una enzima (marcados) que por reaccioacuten con su sustrato
producen una especie coloreada cuya concentracioacuten puede ser medida
fotomeacutetricamente Este ensayo tiene las ventajas de ser versaacutetil robusto simple en su
realizacioacuten y emplear reactivos relativamente econoacutemicos El uso de una fase soacutelida que
retiene el analito de intereacutes proporciona una elevada sensibilidad mientras que la
elevada especificidad del ensayo viene dada por la gran selectividad de los anticuerpos
por su antiacutegeno Las configuraciones maacutes sencillas para estos ensayos son el directo y el
indirecto ambas esquematizadas en la Fig 22
Antiacutegeno IgG conjugada a enzima
Bloqueante IgG humana Reactivo de color
Directo Indirecto
Figura 22 Esquemas que representan los ELISA directo (izquierda) e indirecto (derecha)
21341 Esquema de captura o tipo ldquoSandwichrdquo
Cuando los anticuerpos que desean detectarse son del isotipo IgM suele tenerse el
inconveniente que el isotipo IgG frecuentemente estaacute en mayor concentracioacuten que el
IgM y presenta una mayor afinidad por el antiacutegeno Por lo tanto las IgG suelen
dificultar la deteccioacuten de las IgM en suero cuando se sigue un esquema de ELISA
indirecto con anticuerpos anti-IgM humana (Ac-a-IgMh) marcados Es por esto que
suele optarse por un esquema de captura o tipo saacutendwich en el cual se aumenta la
sensibilidad del ensayo incorporando un eslaboacuten maacutes en el inmunocomplejo adsorbido
En este trabajo se ensayaron dos alternativas de captura o tipo saacutendwich En la
primera alternativa que sigue un esquema claacutesico (A) se adsorbieron los Ac-a-IgMh
Introduccioacuten
8
sobre la superficie de la placa de poliestireno Las placas asiacute sensibilizadas se
enfrentaron al suero a ensayar capturando selectivamente una porcioacuten de las IgM de la
muestra Luego se los enfrentoacute al antiacutegeno de intereacutes ligado a biotina que se une a las
IgMh especiacuteficas para dicho Ang previamente capturado Finalmente se buscoacute revelar
con enzima peroxidasa de raacutebano picante (HRP) conjugada a streptavidina esta uacuteltima
forma un complejo estable con biotina De esta forma se aumenta la cantidad de Ac que
se desean detectar adsorbido sobre la placa seleccionando el tipo de anticuerpo que se
adsorbe En la Fig 23 se muestra el esquema del ensayo tipo A
IgM Antiacutegeno ligado a biotina streptavidina conjugada a HRP
Bloqueante IgG anti-IgM Reactivo de color
Figura 23 Esquema de ensayo ELISA tipo captura claacutesico A Un anticuerpo anti IgMh captura una
porcioacuten de las IgM presentes en el suero humano una porcioacuten de estas IgM capturadas son especiacuteficas
para antiacutegeno de T gondii y se revela su presencia por medio del antiacutegeno recombinante ligado a biotina
streptavidina ligada a HRP adicionando el sustrato de la enzima y un cromoacutegeno actuando como
cosustrato
La segunda alternativa que denominamos tipo B sale del esquema tradicional de
los ELISA Se adsorbe el antiacutegeno recombinante sobre la superficie de la placa de
poliestireno enfrentaacutendola luego al suero a ensayar Asiacute se captura selectivamente las
inmunoglobulinas que reconocen al antiacutegeno Luego se expone la placa al mismo
antiacutegeno recombinante pero ligado a biotina que se uniraacute a los anticuerpos especiacuteficos
para dicho Ang previamente capturados Finalmente se revela con HRP conjugada a
streptavidina que forma un complejo estable con biotina De esta forma se aumenta la
cantidad de Ang marcado en mayor proporcioacuten para IgM que para IgG dada la
Introduccioacuten
9
multivalencia de este isotipo de inmunoglobulina En la Fig 24 se muestra el segundo
esquema que fue el que brindoacute los resultados maacutes promisorios
Antiacutegeno (Ang) Bloqueante Ang ligado a biotina Reactivo de color
IgM a-Ang IgG a-Ang streptavidina conjugada a HRP
Figura 24 Esquema de ensayo ELISA de captura tipo B El antiacutegeno expuesto en la placa captura la
porcioacuten de las IgM e IgG especiacuteficas presentes en el suero humano Haciendo uso de la polivalencia de
las IgM su presencia se revela con el antiacutegeno conjugado a biotina streptavidina ligada a HRP
adicionando el sustrato de la enzima y un cromoacutegeno actuando como cosustrato
2135 Obtencioacuten de antiacutegenos para diagnoacutestico
El diagnoacutestico de rutina de la toxoplasmosis se basa en la deteccioacuten seroloacutegica de
anticuerpos en el paciente Los antiacutegenos utilizados en estas pruebas seroloacutegicas son
generalmente proteiacutenas derivadas de ceacutelulas T gondii que se propagan en el ratoacuten o el
cultivo de ceacutelulas El cultivo y el mantenimiento de este paraacutesito es laborioso lento y
caro (Lau amp Fong 2006) El uso de antiacutegenos nativos de taquizoitos es difiacutecil de
estandarizar y con frecuencia produce reacciones positivas falsas (Hiszczyntildeska-Sawicka
y col 2005) Por lo tanto ha habido intentos de producir antiacutegenos a traveacutes de medios
maacutes seguros tales como tecnologiacutea de ADN recombinante La mayoriacutea de estos
esfuerzos se han centrado en los principales antiacutegenos de superficie del paraacutesito como el
antiacutegeno de superficie 1 (SAG1 del ingleacutes Surface antigen 1) y el antiacutegeno de superficie
2 (SAG2 del ingleacutes Surface antigen 2) (Lau amp Fong 2006) En estudios recientes se ha
estado evaluando que la presencia de IgM e IgG anti P35 seriacutea un mejor indicador de
infeccioacuten reciente que la evaluacioacuten de IgM utilizando taquizoitos enteros en ensayos
del tipo ELISA (Lu y col 2006) En efecto con la nueva tecnologiacutea de ADN
Introduccioacuten
10
recombinante es posible obtener cualquier proteiacutena contaacutendose ademaacutes con ventajas
como la posibilidad de seleccionar porciones especiacuteficas de un Ang para evitar
reacciones inespeciacuteficas ligar distintas porciones que naturalmente corresponden a otras
proteiacutenas para aumentar la sensibilidad del ensayo agregar secuencias aminoaciacutedicas
que faciliten la posterior purificacioacuten y estandarizacioacuten de la proteiacutena a utilizar
(Hiszczyntildeska-Sawicka y col 2005) A la postre todo el proceso resulta maacutes
econoacutemico seguro y confiable que la purificacioacuten de Angs a partir del microorganismo
nativo puesto que no requiere la manipulacioacuten de microorganismos patoacutegenos ya que
la expresioacuten de las proteiacutenas recombinantes se lleva adelante en microorganismos no
infectivos de raacutepido crecimiento (Babaie y col 2013)
Por lo arriba expresado debe seguirse un esquema para seleccionar cuales deben de
ser las proteiacutenas que conviene utilizar acorde al diagnoacutestico que se pretende abordar y
ello demanda un trabajo racional de seleccioacuten de antiacutegenos generalmente
inmunodominantes No obstante escoger tales proteiacutenas no es tarea sencilla por cuanto
la verificacioacuten del grado de bondad del Ang seleccionado exige una ardua tarea
experimental siendo conveniente acotar el nuacutemero de Angs alternativos a evaluar Un
modo de encarar esto es procurar predecir el grado de antigenicidad en base a la
secuencia aminoaciacutedica lo cual puede realizarse computacionalmente
214 Prediccioacuten de epiacutetopes reconocidos por ceacutelulas B
Los programas de prediccioacuten definen el grado de antigenicidad por medio de una
puntuacioacuten (score) en algunos casos para cada epiacutetope y en otros para cada residuo
amino aciacutedico En este uacuteltimo se puede definir una regioacuten antigeacutenica cuando varios
residuos con alta puntuacioacuten son adyacentes en la estructura primaria Por otra parte el
nuacutemero de epiacutetopes o regiones antigeacutenicas que los programas de prediccioacuten encuentran
depende de un umbral que es configurado por el usuario
En la actualidad los inmunoensayos para determinar anticuerpos son realizados
utilizando regiones antigeacutenicas definidas ya sea como moleacuteculas uacutenicas mezcla de
varios componentes o como antiacutegenos de fusioacuten multiepiacutetope (Camussone 2009) El
desarrollo de herramientas informaacuteticas para predecir de forma fiable la antigenicidad
de los epiacutetopes puede reducir el costoso y prolongado trabajo experimental requerido
para identificar las regiones de intereacutes (Namrata amp Rajat 2010) Al momento de
identificar estas regiones antigeacutenicas suele contarse soacutelo con la estructura primaria de
las proteiacutenas en estudio desconocieacutendose su estructura terciaria en la mayoriacutea de los
Introduccioacuten
11
casos De aquiacute que la prediccioacuten de epiacutetopes lineales es el meacutetodo maacutes utilizado para
seleccionar epiacutetopes putativos
Desde el informe inicial de Hopp y Woods en 1981 (Hopp amp Woods 1981) varios
procedimientos se han hecho populares para detectar epiacutetopes lineales reconocidos por
ceacutelulas B a partir de la estructura primaria de una proteiacutena El rendimiento de estos
programas auacuten no ha logrado una eficiencia oacuteptima seguacuten lo declarado por sus propios
autores (Kolaskar amp Tongaonkar 1990 Saha y col 2005 Saha amp Raghava 2006
Larsen y col 2006 Davydov amp Tonevitskii 2009)
La literatura sobre las aplicaciones de estos programas estaacute orientada
principalmente a identificar posibles vacunas (Namrata amp Rajat 2010) Por lo tanto la
sensibilidad (probabilidad de obtener un positivo entre los verdaderos positivos) y la
especificidad (probabilidad de obtener un negativo entre aquellos negativos verdaderos)
son los indicadores maacutes utilizados para evaluar la calidad de estos programas ya que un
uacutenico epiacutetope puede ser crucial para lograr una respuesta inmunoprotectora Al mismo
tiempo suele omitirse el valor predictivo positivo (VPP) que es la proporcioacuten de
muestras que dan positivo el ensayo siendo verdaderos positivos o sea es la capacidad
para encontrar los epiacutetopes reales de una proteiacutena (ver el recuadro 1) Sin embargo la
fiabilidad del epiacutetope predicho es maacutes importante que su sensibilidad para reducir el
nuacutemero de experimentos confirmatorios de su utilidad diagnoacutestica Es entonces
importante diferenciar ambos paraacutemetros ya que los programas de prediccioacuten pueden
realizar predicciones de baja sensibilidad pero al mismo tiempo si los epiacutetopes reales
fueron predichos la prediccioacuten presenta un alto VPP
Recuadro 1
Los casos posibles en un ensayo son
Verdaderos
positivos
Verdaderos
negativos
Ensayo
positivo A B
Ensayo
negativo C D
BA
A positivo predictivoValor
DB
D dadEspecifici
CA
A adSensibilid
Introduccioacuten
12
La falta de estudios comparativos entre los programas de prediccioacuten en la literatura
actual impide que los usuarios hagan la mejor eleccioacuten Por ello como trabajo inicial se
intentoacute evaluar los distintos programas disponibles en la red en cuanto a su capacidad
para predecir positivamente epiacutetopes
Introduccioacuten
13
22 Tuberculosis
221 Generalidades
La tuberculosis (TB) humana es una enfermedad infecto-contagiosa causada por la
bacteria Mycobacterium tuberculosis La infeccioacuten por M tuberculosis suele ser
asintomaacutetica en personas sanas dado que su sistema inmune es capaz de controlar la
bacteria No obstante en condiciones de desnutricioacuten o inmunocompromiso la
enfermedad suele ser grave La TB es una enfermedad vinculada a la pobreza que
puede afectar a adultos joacutevenes en edad productiva
La enfermedad se transmite por el aire de una persona a otra a traveacutes de gotiacuteculas
que portan bacterias Cuando una persona con infeccioacuten activa en pulmones o garganta
tose estornuda habla o canta las personas cercanas pueden respirar las bacterias
liberadas e infectarse
La enfermedad suele afectar los pulmones pero tambieacuten puede involucrar otros
oacuterganos como rintildeones columna vertebral y cerebro Los siacutentomas de la TB pulmonar
activa son tos a veces con esputo sanguinolento dolor toraacutecico debilidad peacuterdida de
peso fiebre y sudoracioacuten nocturna Si no se trata adecuadamente puede ser mortal La
mayoriacutea de las muertes por TB se producen en los paiacuteses en viacuteas de desarrollo (Paacutegina
web del CDC b)
La Organizacioacuten Mundial de la Salud (OMS) estima en 2000 millones a los
infectados por M tuberculosis que anualmente hay 9 millones de nuevos infectados y
que mueren casi 2 millones de personas al antildeo por causa de esta enfermedad (Paacutegina
web de la OMS)
222 Mycobacterium tuberculosis
Esta micobacteria tambieacuten conocida como Bacilo de Koch es una bacteria aacutecido-
alcohol resistente frecuentemente incolora y es aeroacutebica estricta Es muy resistente al
friacuteo la congelacioacuten y la desecacioacuten y por el contrario es muy sensible al calor la luz
solar y la luz ultravioleta Su replicacioacuten es muy lenta (una divisioacuten cada 16 a 20 horas)
y ante circunstancias adversas puede entrar en estado latente pudiendo retrasar su
multiplicacioacuten desde algunos diacuteas hasta varios antildeos El reservorio natural de M
tuberculosis es el hombre tanto el individuo infectado asintomaacutetico como el enfermo
con infeccioacuten activa Su clasificacioacuten taxonoacutemica se detalla en la Tabla 22
Introduccioacuten
14
Tabla 22 Ubicacioacuten taxonoacutemica de M tuberculosis
Reino Bacteria
Phylum Actinobacteria
Clase Actinobacteria
Sub-clase Actinobacteridae
Orden Actinomycetales
Sub-orden Corynebacterineae
Familia Mycobacteriaceae
Geacutenero Mycobacterium
Especie tuberculosis
223 Diagnoacutestico
El diagnoacutestico de la infeccioacuten tuberculosa se basa en una serie de estudios que se
inicia con placas radiograacuteficas pulmonares y la prueba de la tuberculina que pone de
manifiesto un estado de hipersensibilidad del hueacutesped frente a proteiacutenas de M
tuberculosis Esta sensibilidad se adquiere o bien por infeccioacuten con el bacilo o por
vacunacioacuten con cepas no infectivas (vacuna BCG) En una segunda etapa la infeccioacuten
activa es confirmada por identificacioacuten del agente etioloacutegico en cultivos obtenidos a
partir de la muestra bioloacutegica remitida al laboratorio Auacuten cuando la conjuncioacuten de los
meacutetodos de anaacutelisis vigentes permite un diagnoacutestico certero de la TB humana es
frecuente que se requiera de un prolongado tiempo de espera hasta la confirmacioacuten de la
infeccioacuten activa por cuanto ello depende del lento proceso de replicacioacuten del bacilo
Esto conlleva que exista potencialidad de contagio a individuos sanos y se comprometa
maacutes la salud del infectado
En los uacuteltimos antildeos se han desarrollado teacutecnicas de deteccioacuten de M tuberculosis
que involucran al bacterioacutefago D29 (en adelante fago) capaz de infectar
especiacuteficamente micobacterias (Park y col 2003 Mc Nerney y col 2004) Esta
metodologiacutea se basa en procesar la muestra del paciente sospechada de contener M
tuberculosis ponerla en contacto con el fago e incubarla para permitir su replicacioacuten
Finalmente se evaluacutea el tiacutetulo de los fagos liberados infectando un cultivo testigo de M
smegmatis (micobacterias de raacutepido crecimiento susceptibles al fago) y contando las
placas de lisis que se obtienen Esta novedosa metodologiacutea si bien indirecta y
preliminar permite reducir considerablemente los tiempos de diagnoacutestico puesto que se
trabaja con especies de crecimiento raacutepido Sin embargo al utilizar el conteo de placas
de lisis como eje central para el diagnoacutestico de infeccioacuten activa se recae en largos
Introduccioacuten
15
periacuteodos de incubaciones que podriacutean evitarse si se contase con otro meacutetodo de evaluar
la integridad celular de M smegmatis
Por lo arriba expuesto es que en este trabajo se intento desarrollar una nueva
metodologiacutea de verificacioacuten de lisis de micobacterias utilizando teacutecnicas
intriacutensecamente raacutepidas como son las electroquiacutemicas que en un futuro podriacutean
facilitar el diagnoacutestico de infeccioacuten tuberculosa
Introduccioacuten
16
23 Biodiesel
El grave impacto de la utilizacioacuten de combustibles derivados del petroacuteleo en el
medio ambiente la limitada disponibilidad de petroacuteleo crudo y sobre todo la
inestabilidad de los mercados del petroacuteleo han estimulado actualmente la propagacioacuten
de combustibles liacutequidos alternativos (Monteiro y col 2008) La organizacioacuten
American Society for Testing and Materials ASTM define biodiesel como una mezcla
de eacutesteres monoalquiacutelicos de aacutecidos grasos de cadena larga derivados de aceites
vegetales o grasas animales (American Society for Testing and Materials paacutegina web)
El biodiesel puro generalmente no se utiliza como combustible sino que suele
encontrase en mezcla con diesel de petroacuteleo El biodiesel es clasificado utilizando la
notacioacuten Bxx donde xx indica el porcentaje en volumen de contenido de biodiesel en el
liacutequido Asiacute B100 es biodiesel puro B50 contiene 50 en volumen de biodiesel B5
contiene 5 en volumen etc Las mezclas comerciales maacutes comunes son B2 B5 y B20
El biodiesel se obtiene a partir de la transesterificacioacuten de gliceroliacutepidos con
alcoholes de cadena corta como el etanol o el metanol siendo el glicerol el principal
subproducto en la elaboracioacuten de este combustible junto a productos menores como
mono y diacil gliceroles o aacutecidos grasos libres La masa de glicerol generada equivale
aproximadamente al 10 en peso del total del combustible producido siendo eacuteste uno
de los contaminantes frecuentes
231 Determinacioacuten de glicerol libre en biodiesel
La presencia de glicerol es indicativa de la calidad del biodiesel transformaacutendose
en un analito de intereacutes para la creciente industria de energiacuteas alternativas a la derivada
del refinamiento del petroacuteleo
Los meacutetodos quiacutemicos maacutes simples para cuantificar glicerol se basan en su
oxidacioacuten a formaldehiacutedo utilizando peryodato Luego el formaldehiacutedo formado se
determina cuantitativamente por diversos meacutetodos ya sea basados en reacciones
especiacuteficas evaluando los productos por diferentes metodologiacuteas o por titulacioacuten con
NaOH valorado (Lapenaite y col 2007)
La norma ASTM-D 6584 establece un meacutetodo basado en cromatografiacutea gaseosa
que permite la determinacioacuten en simultaacuteneo de glicerina libre y total (glicerol maacutes
mono di y trigliceacuteridos) No obstante este procedimiento no es aplicable a los eacutesteres
metiacutelicos de aceites vegetales obtenidos a partir de aceites laacuteuricos tales como aceite de
Introduccioacuten
17
coco o de palma quedando restringido el meacutetodo soacutelo para un grupo de biodiesels
particulares
En cuanto a los meacutetodos cromatograacuteficos tienen la desventaja de ser poco
amigables con el medio ambiente dado el profuso uso de solventes orgaacutenicos que son
potencialmente contaminantes a veces se tornan laboriosos y utilizan instrumental e
insumos caros
Considerando lo expresado arriba en este trabajo se ha planteado cuantificar
glicerol utilizando una metodologiacutea esencialmente econoacutemica simple y no
contaminante como lo son las teacutecnicas electroquiacutemicas convencionales
Introduccioacuten
18
24 Marco teoacuterico de las teacutecnicas electroquiacutemicas utilizadas
Los meacutetodos electroquiacutemicos de anaacutelisis estudian el analito de intereacutes mediante la
medicioacuten de los paraacutemetros fiacutesicos como potencial eleacutectrico yo corriente en una celda
electroquiacutemica El proceso fundamental en las teacutecnicas electroquiacutemicas es la
transferencia de electrones entre especies redox y la superficie del electrodo (Bard amp
Faulkner 2001) Este puede describirse con la siguiente reaccioacuten
O + ne- R [21]
Para reacciones reversibles y raacutepidas el potencial sigue la ley de Nernst
[22]
siendo y las actividades de las especies reducida y oxidada en la interfaz
electrodosolucioacuten respectivamente
La corriente que circula por la celda es la carga transportada por unidad de tiempo y
puede expresarse como
[23]
De acuerdo a las leyes de Faraday la carga circulante (Q) es proporcional a los
moles de especie reducida u oxidada (N) El factor de proporcionalidad es la carga del
electroacuten (n) por la constante de Faraday (F)
[24]
Combinando las Ecs 23 y 24 obtenemos
[25]
A medida que avanza la reaccioacuten se consume la especie electroactiva esto
produce un gradiente de concentracioacuten entre el seno de la solucioacuten y las inmediaciones
del electrodo donde la especie es electrotransformada y consecuentemente asociado se
Introduccioacuten
19
generaraacute un transporte de masa por difusioacuten Si el proceso estaacute bajo control difusional
la primera ley de Fick permite describir el flujo de partiacuteculas en funcioacuten de la posicioacuten
ec 26 y la segunda ley de Fick lo describe en funcioacuten de la variacioacuten de la
concentracioacuten de la especie electroactiva en funcioacuten del tiempo ec 27
[26]
[27]
donde D es el coeficiente de difusioacuten de la especie en estudio El gradiente de
concentracioacuten se generaraacute soacutelo para la especie electroactiva que se transforma en la
superficie del electrodo y su transporte de masa se verificaraacute en direccioacuten ndashx es decir
hacia el electrodo si se define x = 0 en la superficie Luego considerando la reaccioacuten de
reduccioacuten ec 21 el flujo J corresponderaacute al nuacutemero de partiacuteculas de O que cambian de
posicioacuten en direccioacuten -x con el tiempo por unidad de aacuterea y puede expresarse como
[28]
Combinando las ecs 26 27 y 28 obtenemos la expresioacuten combinada de las leyes
de Fick para una especie que estaacute reaccionando sobre un electrodo de aacuterea A
[29]
o directamente
[210]
Reemplazando en la ec 25 obtenemos una expresioacuten para la corriente (I) que
circula por la celda en la que se lleva a cabo la reaccioacuten ec 21 sobre un electrodo
uniformemente accesible de aacuterea A y cuando el transporte de masa es exclusivamente
controlado por difusioacuten
[211]
expresioacuten que indica que la corriente es directamente proporcional al gradiente de
concentracioacuten generado por efecto de la reaccioacuten electroacutedica
Introduccioacuten
20
Para un sistema en estado estacionario en el cual la velocidad de transformacioacuten de
la especie electroactiva es igual a la de transferencia de masa y suponiendo que la
reaccioacuten cumple las condiciones de rapidez y reversibilidad (Ec de Nernst) podemos
llegar a describir la relacioacuten entre la corriente circulante por la celda y el potencial al
cual se lleva adelante la reaccioacuten por
[212]
donde KR y KO son constantes que dependen del aacuterea del electrodo de trabajo y los
coeficientes de difusioacuten de las especies reducida y oxidada respectivamente e Il es la
corriente liacutemite
Se define como potencial de media onda al potencial al cual el valor de corriente es
la mitad del valor de corriente liacutemite y queda expresado por la siguiente ecuacioacuten
[213]
Tomando esta definicioacuten y operando en la ec 212 se arriba a la expresioacuten que
describe la corriente como funcioacuten del potencial de electrodo
ndash [214]
ecuacioacuten que corresponde a una funcioacuten sigmoidea por lo tanto al realizar un barrido
de potencial desde un potencial al cual no existe reaccioacuten electroacutedica hacia un potencial
al cual es posible reducir la especie electroactiva hasta alcanzar el estado estacionario la
corriente variaraacute con el potencial siguiendo la forma de una curva sigmoidea
Durante la ejecucioacuten del presente trabajo se utilizaron diversas teacutecnicas
voltamperomeacutetricas cronoamperometriacutea voltametriacutea de barrido lineal voltametriacutea
ciacuteclica y voltametriacutea de onda cuadrada Se pasa a comentar brevemente cada una de
ellas
241 Cronoampreometriacutea
En esta teacutecnica se estudia como variacutea la corriente que circula por la celda en
funcioacuten del tiempo transcurrido mientras el electrodo de trabajo es sometido a un
Introduccioacuten
21
determinado potencial Al aplicar un pulso de potencial se modifica el equilibrio de la
reaccioacuten redox ec 21 se pasa de un potencial inicial donde no ocurre reaccioacuten
electroacutedica a un potencial donde las especies pueden intercambiar electrones en la
interfaz electrodosolucioacuten favoreciendo la reaccioacuten en uno u otro sentido dependiendo
del potencial aplicado Esto da lugar a una corriente liacutemite difusional que variacutea en
funcioacuten del tiempo Para un electrodo uniformemente accesible esta corriente estaacute
descripta por la ec 211 Fijando las condiciones de contorno correspondientes al
experimento en cuestioacuten
t = 0 C0 = Cinfin (no hay reaccioacuten en el electrodo)
t ge0 lim C = Cinfin
t ge0 C0 = 0
donde C0 y Cinfin son las concentraciones de la especie electroactiva en la interfaz
electrodosolucioacuten y en el seno de la solucioacuten respectivamente Es posible entonces
resolver la ecuacioacuten diferencial de la segunda ley de Fick donde la solucioacuten viene dada
por la denominada ecuacioacuten de Cottrell
[215]
donde Id(t) es la corriente controlada por difusioacuten
En este trabajo se utilizoacute esta teacutecnica porque permite cuantificar glicerol utilizando
diferentes electrodos de trabajo seguacuten el medio especiacutefico donde se encuentre disuelto
242 Teacutecnicas voltameacutetricas
Todas las teacutecnicas voltameacutetricas tienen en comuacuten que el potencial eleacutectrico al que
se somete el electrodo de trabajo variacutea en funcioacuten del tiempo En todos los casos se
realiza un barrido lineal de potencial que va desde el potencial inicial (Ei) hasta un
potencial final (Ef) Este barrido se realiza a una velocidad constante que es el cociente
entre el salto (discreto) de potencial y el tiempo de duracioacuten de ese salto La forma en
que se realiza el barrido de potencial es lo que diferencia a una teacutecnica voltameacutetrica de
otra
Introduccioacuten
22
2421 Voltametriacutea de barrido lineal
En esta teacutecnica se realiza un barrido desde un potencial inicial (Ei) al cual no existe
proceso de transferencia de electrones en la interfaz electrodosolucioacuten y soacutelo podraacute
apreciarse corriente debida a procesos no faraacutedicos hasta un potencial final (Ef) En la
medida que el potencial aumenta alcanza un valor al cual ocurre la reaccioacuten electroacutedica
comenzando un flujo de carga debido a procesos faraacutedicos En la Fig 25 se muestra el
perfil del potencial en funcioacuten del tiempo utilizando el modo normal (en peldantildeos) para
el caso de los experimentos realizados con el instrumento utilizado en el presente
trabajo (Eco Chemie 2000)
Figura 25 Perfil de potencial en funcioacuten del tiempo Si bien el potencial es una variable continua un
potenciostato real solo puede establecer variaciones discretas de potencial de aquiacute que en lugar de
observar una ―rampa se observe una escalera
Para una reaccioacuten de reduccioacuten reversible ec 21 a medida que el potencial
aumenta se incrementaraacute la corriente siguiendo la forma de una sigmoidea (seguacuten la ec
21) Sin embargo cuando la velocidad de transporte de masa por difusioacuten de la especie
O sea menor que la velocidad de consumo por la reaccioacuten electroacutedica no seraacute posible
alcanzar el estado estacionario y la corriente llegaraacute a un maacuteximo Ip De aquiacute en maacutes la
corriente comenzaraacute a decaer con t12
tal como lo describe la ecuacioacuten de Cottrell ec
215 En la Fig 26 se muestra el perfil de corriente que se obtienen en experimentos
voltameacutetricos claacutesicos
t
Salto de potencial
Duracioacuten del salto
E
Introduccioacuten
23
Figura 26 Perfiles de corriente en funcioacuten del potencial para experimentos voltameacutetricos de barrido
lineal Liacutenea azul la velocidad de barrido es lo suficientemente baja establecieacutendose un estado
estacionario Liacuteneas verde negra y roja la velocidad de barrido es alta y se origina un pico de corriente
La corriente de pico crece proporcionalmente a la raiacutez cuadrada de la velocidad de barrido
El maacuteximo de corriente tambieacuten denominado corriente de pico se puede obtener a
partir de la ecuacioacuten de Randles-Sevcik (Bard amp Faulkner 2001)
[216]
siendo la temperatura 25 degC y donde A estaacute en cm2 D en cm
2 s
-1 C en mol cm
-3 y en
V s-1
2422 Voltametriacutea ciacuteclica
En esta teacutecnica se realiza un barrido desde un potencial inicial (Ei) a un primer
veacutertice de potencial (Ev1) y a partir de alliacute se invierte la direccioacuten de barrido hasta
llegar a un segundo veacutertice de potencial (Ev2) el cual puede coincidir con el Ei El perfil
de potencial en funcioacuten del tiempo que se obtiene utilizando el instrumento con el que
se trabajoacute y de acuerdo a lo indicado por el fabricante se esquematiza en la Fig 27
(izquierda) y el perfil de corriente en funcioacuten del potencial para una reaccioacuten reversible
se esquematiza en la Fig 27 (derecha)
Idif
IP
Introduccioacuten
24
Fig 27 Perfil de potencial en funcioacuten del tiempo (izquierda) Perfil de corriente en funcioacuten del
potencial para una reaccioacuten redox reversible (derecha)
En este trabajo se realizaron experimentos de voltametriacutea ciacuteclica para identificar la
presencia de mediadores redox que presentando reacciones electroacutedicas reversibles
permitieran la regeneracioacuten del cofactor de la enzima glicerol deshidrogenasa (GlDH)
Esta teacutecnica tambieacuten se utilizoacute para calcular las aacutereas de los electrodos de trabajo de
modo tal de normalizar la sentildeal obtenida con la superficie del electrodo utilizado
Ademaacutes se utilizoacute para cuantificar glicerol e identificar los potenciales de oxidacioacuten del
mismo
243 Teacutecnicas de pulso
Las teacutecnicas de pulso surgieron vinculadas a la polarografiacutea de corriente continua
la teacutecnica voltameacutetrica cuya particularidad es utilizar un electrodo de goteo de mercurio
Este grupo de teacutecnicas se ha ido diversificando a medida que se fueron haciendo maacutes
complejos tanto los esquemas de potenciales aplicados a los electrodos de trabajo
como las medidas de intensidades de corrientes (Bard amp Faulkner 2001)
2431 Voltamperometriacutea onda cuadrada VOC
Esta teacutecnica tiene varias ventajas entre las que se encuentran su excelente
sensibilidad (se han registrado liacutemites de deteccioacuten directa del orden de 10-8
M) la
eliminacioacuten de las corrientes de fondo y la rapidez con que se lleva a cabo el
experimento completo ya que se puede trabajar a velocidades de barrido de potencial
auacuten superiores a 1 V s-1
(Bard amp Faulkner 2001)
El perfil de potencial aplicado al electrodo de trabajo en funcioacuten del tiempo en la
VOC se presenta en la Fig 28 Consta de una onda cuadrada simeacutetrica con una
amplitud Ep superpuesta a una escalera de potencial con escalones o saltos de
potencial Es (Fig29) donde el pulso hacia adelante de la onda cuadrada coincide con
el escaloacuten de potencial de la escalera
E
I
Introduccioacuten
25
La utilizacioacuten de la teacutecnicas voltamperomeacutetricas de pulso presentan la ventaja de
permitir realizar un barrido de potencial donde la especie electroactiva se oxida
raacutepidamente produciendo una sentildeal analiacutetica No es necesario trabajar durante periacuteodos
prolongados de tiempo a los elevados potenciales donde se establece la corriente liacutemite
controlada por difusioacuten como lo requiere la teacutecnica amperomeacutetrica
Figura 28 Perfil de potencial aplicado al electrodo de trabajo en la VOC en funcioacuten del tiempo En
liacutenea cortada se indica cual es la escalera de potencial a la cual se le sobreimprime la onda cuadrada Se
indican resaltados ( ) los tiempos durante los que se realizan las lecturas de corriente En un ciclo se
realizan las lecturas de corrientes alta y baja Adaptado de Bard amp Faulkner 2001
Figura 29 a) Onda cuadrada simeacutetrica b) Perfil de potencial en funcioacuten del tiempo de una escalera
de potencial
a)
b)
E
E
E
t
Amplitud de la
onda cuadrada EP
Periacuteodo de la onda
Salto o escaloacuten
de potencial ES
Medida
alta
Medida
baja
t
Salto o escaloacuten
de potencial ES
t
Amplitud de la
onda cuadrada
EP
Periacuteodo de la onda
Introduccioacuten
26
El potensiostato registra la corriente durante la medida alta y la medida baja de un
ciclo La diferencia de estas corrientes es la corriente neta Ineta que se grafica en
funcioacuten del potencial de la escalera de potencial correspondiente a ese ciclo (liacutenea
cortada Fig 28) Para sistemas reversibles se obtiene una curva como se observa en la
Fig 210 donde se indican las corrientes de la medida alta de la medida baja y neta
que resulta en un pico de corriente La corriente de pico neta IP n observada en la VOC
es proporcional a la concentracioacuten de la especie electroactiva en el seno de la solucioacuten y
se centra alredewdor del potencial de la cupla redox
Figura 210 Voltamperograma de onda cuadrada tiacutepico para un sistema reversible la corriente neta
Ineta se obtiene por la diferencia entre la corriente registrada al finalizar el pulso I medida alta y la
corriente registrada previamente al nuevo pulso I medida baja
La frecuencia ( f ) de la onda cuadrada medida en Hz se define como
1f [217]
Siendo el periacuteodo de la onda cuadrada medido en segundos que a su vez es dos
veces el tiempo del pulso Pt por lo tanto tenemos que
P2
1
tf [218]
Luego
ft
2
1P [219]
Los valores de frecuencia pueden variar desde unos pocos Hz hasta varios miles
dependiendo de las condiciones particulares del caso La velocidad de barrido v queda
definida como el producto del salto de potencial ES por la frecuencia f
fSEv [220]
Introduccioacuten
27
Las velocidades de barrido en los experimentos de VOC se obtienen modificando la
frecuencia de la onda cuadrada ya que el salto de potencial suele ser un valor fijo
Se demostroacute que para cuplas redox controladas por difusioacuten los paraacutemetros de la
VOC maacutes adecuados son E = 50n mV y Es = 10n mV (Osteryoung y Osteryoung
1985)
Cuando se aplica un pulso de potencial en las cercaniacuteas del potencial de la cupla
redox las corrientes faradaicas aumentan significativamente conforme se oxida o se
reduce la especie electroactiva Estas corrientes decaen con el tiempo seguacuten la ecuacioacuten
de Cottrel ya expresada anteriormente como ec [215]
Si consideramos t como tP se observa que la disminucioacuten del tiempo del pulso
implica mayor corriente Luego a medida que se aumenta la frecuencia aumenta la
velocidad de barrido y disminuye el tiempo del pulso Para sistemas reversibles se
predice que la intensidad tiene una dependencia lineal con la raiacutez cuadrada de la
frecuencia (Osteryoung y Osteryoung 1985)
21 fBAnIp [221]
La eleccioacuten de la frecuencia adecuada es de suma importancia A frecuencias muy
altas aumentan significativamente las corrientes capacitivas perdiendose resolucioacuten lo
que impone un liacutemite al aumento de la frecuencia
25 Biosensores
En muchas determinaciones de analitos en muestras bioloacutegicas se necesitan pasos
previos a la evaluacioacuten propiamente dicha que permiten eliminar o enmascarar las
potenciales interferencias Sin embargo el pretratamiento de la muestra puede llevar a
una disminucioacuten de la concentracioacuten del analito ya sea por peacuterdidas en las etapas
consecutivas del anaacutelisis o por transformacioacuten del analito provocando errores por
defecto en la determinacioacuten (Lagier amp Verdini 2000) Cuando la evaluacioacuten de la
concentracioacuten del analito se utiliza con fines cliacutenicos tal resultado erroacuteneo puede
conducir a un diagnoacutestico incorrecto Es por ello que en la actualidad el desarrollo de
nuevas metodologiacuteas analiacuteticas tiende no soacutelo a acortar los tiempos de anaacutelisis
previnieacutendose asiacute las peacuterdidas por degradacioacuten del analito sino que ademaacutes procura
permitir la ejecucioacuten del anaacutelisis sin pasos separativos previos
En los uacuteltimos antildeos se ha avanzado en el desarrollo de biosensores ya que estos
dispositivos presentan ventajosas caracteriacutesticas que los convierten en herramientas
Introduccioacuten
28
prometedoras de anaacutelisis (Belluzo y col 2008) Los biosensores se pueden definir como
dispositivos analiacuteticos compuestos por dos componentes principales
1- Una superficie selectiva denominada bioreceptor o superficie bioreactiva (SBR)
generalmente de origen bioloacutegico o sinteacutetica biomimeacutetica la cual en contacto con la
muestra es capaz de interaccionar de manera especiacutefica con el analito (Vo-Dinh amp
Allain 2003) Este elemento es el que aporta la especificidad del dispositivo
2- Un transductor fiacutesico-quiacutemico encargado de producir una sentildeal que es funcioacuten
de la interaccioacuten entre el analito y la SBR (Vo-Dinh amp Allain 2003) Eacuteste es el
elemento que aporta la sensibilidad al dispositivo
Los biosensores pueden ser clasificados de acuerdo a la sentildeal fiacutesico-quiacutemica que
produce el transductor de acuerdo a
Sentildeal Biosensor
Cambio de temperatura Termomeacutetrico
Cambio en paraacutemetro eleacutectrico Electroquiacutemico
Cambio en propiedades de la luz Oacuteptico
Cambio de masa Piezoeleacutectrico Acuacutestico
(Adaptado de Vo-Dinh amp Allain 2003)
De los distintos tipos de biosensores los electroquiacutemicos han sido tradicionalmente
los maacutes desarrollados y usados debido a sus ventajas con respecto a otros biosensores
tales como la generacioacuten de una respuesta electroacutenica directa que permite una raacutepida
respuesta mayor simplicidad operativa versatilidad para la miniaturizacioacuten y bajo
costo Actualmente gracias al avance de la tecnologiacutea de los semiconductores y la
serigrafiacutea pueden ser producidos masivamente Dependiendo del paraacutemetro fiacutesico
medido por el detector los biosensores electroquiacutemicos pueden a su vez subdividirse en
conductimeacutetricos potenciomeacutetricos y amperomeacutetricos (Vo-Dinh amp Allain 2003)
251 Superficie de bioreconocimiento en biosensores
La SBR es un sistema bioloacutegico o biomimeacutetico que reacciona bioquiacutemica o
quiacutemicamente con el analito En la actualidad existe una gran diversidad de elementos
bioloacutegicos o derivados de ellos que son utilizados como SBR
Los mismos van desde moleacuteculas simples a sistemas complejos (Vo-Dinh amp Allain
2003) Asiacute la SBR puede contener antiacutegenos anticuerpos aacutecidos desoxiribonucleicos
(ADN) aacutecidos ribonueleicos (ARN) enzimas receptores de membrana tejidos
Introduccioacuten
29
microorganismos completos o compuestos sintetizados ―ad-hoc que emulan especies
bioloacutegicas como pueden ser estructuras biomimeacuteticas y poliacutemeros molecularmente
impresos (Vo-Dinh amp Allain 2003)
252 Biosensores amperomeacutetricos
De los biosensores electroquiacutemicos los amperomeacutetricos suelen presentar mayores
sensibilidades (Iost y col 2011)
En la Fig 211 se esquematiza un biosensor amperomeacutetrico El analito presente en
la muestra compleja reacciona selectivamente con la SBR lo que desencadena la sentildeal
analiacutetica en el transductor fiacutesico-quiacutemico
En este caso particular el transductor es un electrodo de trabajo que integra una
celda de tres electrodos El mismo estaacute sometido a un potencial eleacutectrico (con respecto a
un electrodo de referencia) y la sentildeal analiacutetica es la corriente eleacutectrica que circula por la
celda utilizando un contraelectrodo de gran aacuterea En estas condiciones la maacutexima
intensidad de corriente eleacutectrica que se observa estaacute limitada exclusivamente por la
reaccioacuten de oacutexido-reduccioacuten que ocurre en la superficie del electrodo de trabajo
Figura 211 El electrodo de trabajo es sometido a un potencial eleacutectrico en su superficie tiene lugar
la reaccioacuten de oacutexido-reduccioacuten Dicha reaccioacuten ocurre o no o bien transcurre a velocidades diferentes en
presencia o ausencia del analito de intereacutes
253 Biosensores de uso cliacutenico
En el caso de muestras para el diagnoacutestico cliacutenico de infecciones el analito a
determinar puede ser alguna de las moleacuteculas generadas por el individuo infectado
como respuesta a la presencia del agente infeccioso por ej los anticuerpos (Acs)
especiacuteficos o el agente infeccioso iacutentegro o partes del mismo En muchos casos la sola
presencia de Acs especiacuteficos es por siacute misma indicativa de infeccioacuten Hay casos en que
Introduccioacuten
30
la presencia de Acs no es per-seacute indicativa de infeccioacuten riesgosa Dos ejemplos de esta
situacioacuten son el de la toxoplasmosis y la tuberculosis
En el caso de la toxoplasmosis la deteccioacuten de Acs anti-T gondii es soacutelo de
trascendental importancia en embarazadas porque si la infeccioacuten ha sido adquirida
durante el embarazo el feto estaacute en riesgo de contagiarse y puede padecer lesiones
severas (Dunn y col 1999 Montoya amp Liesenfeld 2004) Por el contrario si se trata
de infeccioacuten croacutenica no es necesario exponer a la embarazada (y al feto) a medicacioacuten
innecesaria evitaacutendose con ello los riesgos que devienen del uso de los faacutermacos
especiacuteficos utilizados durante el tratamiento de la infeccioacuten (Freij amp Sever 1999)
Debido a la incertidumbre que acompantildea la deteccioacuten de los anticuerpos hasta hoy
utilizados con este fin se ha propuesto realizar pruebas utilizando antiacutegenos
recombinantes del paraacutesito Se ha evaluado el desempentildeo de antiacutegenos recombinantes
sintetizados por teacutecnicas de biologiacutea molecular en forma individual o mezclados para
evaluar la avidez de Acs IgG (Beghetto y col 2003) Se observoacute que utilizando el
fragmento del antiacutegeno MIC3 en este ensayo los iacutendices de avidez permitieron
determinar la antiguumledad de la infeccioacuten con mayor grado de certeza que empleando
homogenado total de paraacutesito resultando MIC3 un buen marcador para el diagnoacutestico
de infecciones agudas (Beghetto y col 2003) La proteiacutena recombinante P35 tambieacuten
fue propuesta como marcador seroloacutegico para diferenciar infeccioacuten aguda de croacutenica ya
que evidencioacute sensibilidades del 853 para sueros agudos y una especificidad del 98
respecto de sueros croacutenicos (Parmley y col 2000) No obstante y a pesar de haberse
descrito moleacuteculas para el diagnoacutestico de toxoplasmosis aguda no existe un acuerdo
sobre su efectividad por lo que se requiere de la evaluacioacuten de nuevos antiacutegenos para
este fin En general el uso de una sola moleacutecula recombinante no brinda suficiente
sensibilidad habieacutendose demostrado que el empleo de varios antiacutegenos recombinantes
la mejora (Pinon y col 2003) Se ha observado tambieacuten que una mezcla de moleacuteculas
no produce los mismos resultados que cuando se utilizan en forma separada (Silveira y
col 2001) Se ha postulado que esta diferencia se debe a las distintas caracteriacutesticas
fisicoquiacutemicas entre las moleacuteculas de una mezcla que impide la inmovilizacioacuten
homogeacutenea en las superficies de captura utilizadas en los inmunoensayos Por lo tanto
resulta muy factible que un ensayo que utilice una combinacioacuten o fusioacuten en una sola
moleacutecula de estos antiacutegenos recombinantes marcadores de infeccioacuten reciente pueda
mejorar el diagnoacutestico diferencial tal como ha sido demostrado para el diagnoacutestico de
otras infecciones (Camussone y col 2009)
Introduccioacuten
31
En el caso de la tuberculosis la mayoriacutea de los individuos de la poblacioacuten han
recibido la vacunacioacuten reglamentaria por inoculacioacuten de una cepa de micobacterias
inofensivas generando Acs anti-Mycobacterium tuberculosis (M tuberculosis) Por
ello estos Acs suelen estar presentes en casi toda la poblacioacuten De aquiacute que la deteccioacuten
de Acs anti-M tuberculosis no demuestra infeccioacuten activa de riesgo Por tal motivo el
indicador por excelencia de infeccioacuten activa es la evidenciacioacuten del patoacutegeno en la
muestra No obstante las muestras suelen poseer una extremadamente baja cantidad de
M tuberculosis lo que dificulta su deteccioacuten directa Por ello es preciso utilizar alguacuten
paso amplificador del analito a censar Dado el largo tiempo de replicacioacuten del
microorganismo los cultivos realizados para su replicacioacuten insumen periacuteodos
prolongados Siguiendo los trabajos de Park y col y McNerney y col (Park y col
2003 McNerney y col 2004) se formuloacute la siguiente hipoacutetesis de trabajo Sistemas
enzimaacuteticos presentes en M smegmatis permitiriacutean metabolizar sustratos electroactivos
a distintas velocidades de reaccioacuten dependiendo de la integridad del microorganismo
Siendo este el caso seriacutea posible distinguir entre cultivos de M smegmatis que han sido
lisados por el fago especiacutefico D29 de aquellos cultivos en que dichas micobacterias
estaacuten iacutentegras Si soacutelo existiera lisis cuando la muestra ensayada contiene organismos
filogeneacuteticamente emparentados como M tuberculosis que permitiesen la
amplificacioacuten selectiva del fago D29 previamente a la infeccioacuten del cultivo testigo de
M smegmatis la evaluacioacuten electroquiacutemica del sustrato metabolizable por el
microorganismo deberiacutea permitir evidenciar presencia o ausencia de M tuberculosis La
seleccioacuten del fago D29 se justifica porque es capaz de infectar micobacterias de
crecimiento raacutepido como M smegmatis y las de crecimiento lento como M tuberculosis
(Park y col 2003)
El glicerol es corrientemente utilizado como principal fuente de carbono en cultivos
de micobacterias siendo degradado eficientemente por sus sistemas enzimaacuteticos que
utilizan mecanismos redox En este trabajo nos hemos planteado detectar este
polialcohol como analito de intereacutes ya que su consumo estaraacute preferencialmente
vinculado a la presencia de micobacterias aptas para tal degradacioacuten Por este motivo
proponemos utilizar un bioelectrodo con una SBR que contenga una enzima cuyo
sustrato sea glicerol
Introduccioacuten
32
2531 Biosensores para evaluacioacuten de infeccioacuten toxoplaacutesmica
En el presente trabajo se propuso un biosensor para evaluacioacuten de infeccioacuten
toxoplaacutesmica utilizando un electrodo de oro policristalino macizo sobre el cual se
adsorbioacute un antiacutegeno recombinante y se siguioacute un esquema ELISA del tipo indirecto
con deteccioacuten de IgGh En la Fig 212 se muestra el esquema que se siguioacute para este
inmunoensayo
Proteiacutena recombinante IgG a-IgGh conjugada a HRP
Bloqueante IgG humana ferrocenometanol
Figura 212 Sobre la superficie del electrodo se fija la proteiacutena recombinante que capturaraacute los
anticuerpos especiacuteficos si estaacuten presentes en el suero El revelado se realiza con un segundo anticuerpo
especiacutefico para IgG humana marcado con HRP que en presencia de H2O2 oxida el mediador FcMe que
se reduce sobre la superficie del electrodo generando la sentildeal analiacutetica
254 Biosensores para cuantificacioacuten de glicerol
La determinacioacuten de glicerol ha ido ganando importancia en las uacuteltimas deacutecadas
debido al uso del mismo en varias industrias como la farmaceacuteutica automotriz
alimenticia y textil entre otros El compuesto es un producto importante de la
fermentacioacuten en la mayoriacutea de las bebidas alcohoacutelicas y su concentracioacuten es un
paraacutemetro uacutetil para el seguimiento del proceso fermentativo (Goriushkina y col 2010)
Tambieacuten es un componente no deseable del biodiesel y su concentracioacuten es un indicador
de la calidad del combustible (Monteiro y col 2008)
Se han desarrollado numerosas metodologiacuteas para llevar adelante la cuantificacioacuten
del glicerol que incluyen teacutecnicas espectrofotomeacutetricas yo espectrofluoromeacutetricas
(Bondioli amp Bella 2005 Silva amp Rocha 2010 Lima y col 2012) incluidos los basados
Introduccioacuten
33
en enzimas (Kronka y col 2001 Li y col 2001) los electroquiacutemicos (Tehrani amp
Ghani 2012 Gamella y col 2008 Wu amp Cheng 2005) y los cromatograacuteficos estos
uacuteltimos han sido oficialmente recomendado por la AOAC como los meacutetodos 96809
97210 (AOAC 2005) Sin embargo a pesar de que estos meacutetodos permiten determinar
con eficacia de glicerol en presencia de muchos compuestos que interfieren esta teacutecnica
se considera que es ecoloacutegicamente desfavorable debido a la utilizacioacuten de solventes
nocivos para el medio ambiente e intriacutensecamente onerosa debido a los altos costos de
los mismos (Gamella y col 2008)
Por un lado las propuestas espectrofotomeacutetricas que utilizan enzimas se basan en el
uso de sistemas o bien de una o varias enzimas relativamente caras que se eliminan
despueacutes de que se han utilizado en una uacutenica determinacioacuten En estos casos a menudo
son consumidos las enzimas yo cofactores caros como nicotinamida adenina
dinucleoacutetido (NAD+) o adenosina 5-trifosfato (ATP) a menudo son consumidos
(Kronka y col 2001 Li y col 2001 Wu amp Cheng 2005) Como un ejemplo la
propuesta de Li para determinar glicerol en matrices complejas se basa en el uso de tres
enzimas a saber glicerol quinasa (GK) piruvato quinasa (PK) y lactato
deshidrogenasa (LDH) ademaacutes de utilizar ATP y NAD+ (Li y col 2001) Este meacutetodo
produce buenos resultados en teacuterminos de sensibilidad y especificidad pero consume 1
U de GK 15 U de PK 22 U de LDH 2x10-6
moles de ATP y 33x10-7
moles de
NAD+ por determinacioacuten Por lo tanto el costo derivado por anaacutelisis es considerado
caro sobre todo cuando se debe analizar un elevado nuacutemero de muestras
Por otro lado se han propuesto herramientas versaacutetiles notables para cuantificar
glicerol como ser la basada en tecnologiacutea de biosensores en particular los basados en
meacutetodos amperomeacutetricos (Ghica amp Brett 2006 Gamella y col 2008) De hecho los
biosensores amperomeacutetricos proporcionan suficiente sensibilidad y selectividad para
permitir la determinacioacuten del analito junto con una velocidad apropiada para completar
el anaacutelisis En efecto los biosensores amperomeacutetricos que utilizan enzimas como
componente bioloacutegico para el reconocimiento dan lugar a una selectividad significativa
debido a su capacidad de reaccionar especiacuteficamente con su sustrato Este uacuteltimo es a
menudo el analito de intereacutes por lo que puede ser cuantificado de manera eficiente auacuten
ante la presencia de otros componentes similares estructuralmente que pueden hallarse
en la muestra (Belluzo y col 2008) Los dispositivos construidos con enzimas a
menudo pueden ser reutilizados y por lo tanto el costo por determinacioacuten puede ser
Introduccioacuten
34
reducido significativamente en comparacioacuten con los meacutetodos espectrofotomeacutetricos
mencionados anteriormente
Se han desarrollado varios biosensores utilizando enzimas que tienen como sustrato
al glicerol (Gamella y col 2008) En los disentildeos utilizados se utilizan diversas enzimas
que reaccionan especiacuteficamente con el glicerol en un primer paso y se censa un
producto de esta reaccioacuten En otros disentildeos se encuentran involucradas maacutes de una
enzima donde la segunda o tercer enzima utiliza como sustrato algunos de los
productos de la primera o segunda reaccioacuten y finalmente se censa un producto de la
uacuteltima reaccioacuten enzimaacutetica Algunos disentildeos que aparecieron en literatura al momento
de iniciar este trabajo de tesis fueron detallados por Pingarroacuten y colaboradores (Gamella
y col 2008) y se encuentran resumidos en la Tabla 23 al final de este capiacutetulo y se
corresponden a los esquemas evaluados al momento de iniciar este trabajo de tesis
Todos los disentildeos descriptos al momento presentan la desventaja de ser onerosos
tanto por el disentildeo en siacute como por el costo operativo devenido del consumo de elevadas
cantidades de reactivos caros
Sobre la base del modelo propuesto por Tuntildeoacuten-Blanco y colaboradores (Aacutelvarez-
Gonzaacutelez y col 2000) se comenzaron los ensayos para construir un bioelectrodo
selectivo para glicerol La propuesta contempla en primer lugar disminuir la cantidad
de enzima Glicerol deshidrogenasa En segundo lugar proponemos utilizar la coenzima
NAD(H) en forma soluble e introducir un mediador electroquiacutemico distinto al utilizado
previamente En el trabajo citado se generaba una cupla cataliacutetica por oxidacioacuten
electroacutedica del NAD+ presente en un electrodo de trabajo de pasta de C modificada En
nuestro caso el mediador soluble permite reoxidar la coenzima para cerrar el ciclo
cataliacutetico siguiendo el esquema de la Fig 213
Figura 213 Esquema de reacciones que ocurren en la celda DHA 13 dihidroxiacetona GlDH
gliceroldeshidrogenasa NAD(H) nicotinadenina dinucleoacutetido
glicerol
DHA
GlDHox
GlDHred NAD+
NADH Mediador ox
Mediador red
e- Electrodo
Introduccioacuten
35
Tabla 23 Biosensores selectivos para gicerol Las filas 1 a 10 son un extracto parcial del trabajo de
Gamella y col 2008 En las filas 11 y 12 se incluyen los disentildeos propuestos por Šefčovičovaacute y col
2008 y Goriushkina y col 2010
Electrodo Enzima Mediador Potencial
1 Pt GKGPOx - + 650 mV vs AgAgCl
2 Al GlDH Fe(CN)6 + 400mV vs ECS
3 Barras de grafito
espectroscoacutepico GlDH Complejo de Os + 200 mV vs AgAgCl
4 Serigraacutefico (SPE) pGlyDH N-(4-hidroxibenzilideno)-
4-ferrocenilanilina + 400 mV vs AgAgCl
5 Carboacuten Viacutetreo a) GlDHDP
b) GKGPOxHRP
a)Fe(CN)63-
b)Fe(CN)64-
a) + 350 mV vs AgAgCl
b) - 300 mV vs AgAgCl
6 SPE modificado con
ZrO2 y azul meldola GlDH Azul meldola + 100 mV vs AgAgCl
7 SPE modificado azul
de Prusia
GlDH Tt NADH
Ox Azul de Prusia - 50 mV vs AgAgCl
8 Pasta de carbono GlDH Producto de la electro-
oxidacioacuten del NAD+ + 150 mV vs AgAgCl
9 Flim de carbono a) GPOx
b)GKGPOx Poli (rojo neutro) - 350 mV vs ECS
10 Au a)GlDHDP
b) GKGPOxHRP Tetra thiafulvaleno
a) + 150 mV vs AgAgCl
b) 0 mV vs AgAgCl
11 Carboacuten Viacutetreo GlDHDP Fe(CN)63- + 350 mV vs AgAgCl
12 Platino serigraacutefico Gox - + 300 mV vs electrodo
intriacutenseco
Tabla 23 Continuacioacuten
Muestra
Rango dinaacutemico
Lineal (M) Sensibilidad
(mA M-1
cm-2
)
Liacutemite de
deteccioacuten (M) Estabilidad
Desde Hasta
1 Mosto de uva 2 10-6
10-3 - 5 10
-7 Hasta 1 mes
2 Jugo de uva 10-6
2 10-3
- 10-6 -
3 Vino 1 10-6
2 10-4
32 1 10-6
80 actividad inicial luego
de 20 horas
4 Vino - - - - actividad enzimaacutetica decae
rapidamente
5 Fermento
anaeroacutebico
1 10-5
1 10-5
10-3
1 10-3
a) 620
b) 142 -
sentildeal inicial luego de
uso continuo a) 60 a 90
hs b) 70 16 hs
6 Fermento de
jugo de uva 10
-51 10
-4 - 10
-6 -
7 - 10-5
1 10-3
- 10-6 -
8 Jarabe 997 10-7
10-4
162 cm2 43 10-7
80 actividad inicial luego
de 3 diacuteas
9 Vino 10-5
147 10-4
a) 101
b) 079
a) 4 10-6
b) 15 10-5
sentildeal inicial luego de
uso continuo a) 87 a 8
diacuteas b) 62 8 diacuteas
10 Vino 10
-6
4 10-7
2 10-5
1 10-5
a) 207
b) 250
a) 4 10-7
b) 31
sentildeal inicial luego de
uso continuo a) 87 a 51
diacuteas b) 46 8 diacuteas
11 Fermento - - - 11 10-6
-
12 Vino 10
-5
2 10-6
25 10-2
64 10-3
-
10-5
2 10-6 -
Objetivos
Objetivos
37
3 Objetivos
31 Objetivos generales
Desarrollar metodologiacuteas electroquiacutemicas que permitan identificar analitos de
intereacutes tanto para el diagnoacutestico cliacutenico como para la industria de combustibles
alternativos
32 Objetivos particulares
a) Obtener bioelectrodos que exhiban una corriente cataliacutetica diferencial al efectuar
inmunoensayos con muestras confirmadas positivas o negativas para infeccioacuten aguda
por T gondii
b) Desarrollar un meacutetodo electroquiacutemico que permita la cuantificacioacuten de glicerol
en medio acuoso para determinarlo por ejemplo luego de su extraccioacuten en
combustibles alternativos
c) Evidenciar electroquiacutemicamente la ocurrencia de lisis de M smegmatis por fagos
D29 indicadores de la presencia de micobacterias patoacutegenas emparentadas
provenientes de individuos padeciendo infeccioacuten tuberculosa
Materiales y Meacutetodos
Materiales y Meacutetodos
39
4 Materiales y meacutetodos
41 Reactivos y medios de cultivos
411 Reactivos
Todos los reactivos utilizados fueron de grado analiacutetico salvo que se indique lo
contrario Los aacutecidos aceacutetico sulfuacuterico niacutetrico clorhiacutedrico y percloacuterico las sales KCl
Na2HPO4 KH2PO4 NiSO4 CuSO45H2O y la sal disoacutedica del aacutecido etilen diamino tetra
aceacutetico (EDTA) dimetilsulfoacutexido (DMSO) imidazol tris base las enzimas peroxidasa
de raacutebano picante EC 11117 (tipo VI) (HRP) y glicerol deshidrogenasa de
cellulomonas EC 1116 (GlDH) acrilamida (adecuada para electroforesis) NNprime-(12-
dihidroxietilen) bisacrylamide (97) ditiotreitol (DTT) Coomasie blue G-250 alcohol
isopropiacutelico β-mercaptoetanol 33-diaminobenzidina tetrahidrocloruro (DAB)
nicotina adenina dinucleoacutetico (NAD) los desoxinucleoacutetidos trifosfato dATP dGTP
dCTP y dTTP reactivo de Folin-Ciocalteu glicina albuacutemina seacuterica bovina (ASB)
peptona de carne extracto de levadura fueron suministrados por Sigma-Aldrich El
polvo de carbono viacutetreo (esfeacuterico diaacutemetro de partiacutecula entre 2 y 12 microm pureza
9999+) fue suministrado por Aldrich El polvo de carbono grafito (pureza gt 99) fue
provisto por Fisher Scientific Dimetilformamida (DMF) 1 1rsquo-carbonil-diimidazol las
sales tartrato de sodio y potasio MgCl2 CaCl2 NaCl Na2CO3 NaHCO3 K2CO3
KHCO3 K3Fe(CN)6 K4Fe(CN)6 (NH4)2SO4 (NH4)2S2O8 (gt98) dodecil sulfato de
sodio (Farmacopea Unioacuten Europea) (SDS) NaOH KOH NNNprimeNprime-
tetrametiletilendiamino (Temed) azul de bromofenol (Farmacopea Unioacuten Europea)
xilencianol (para electroforesis) etanol absoluto fueron suministrados por Merck El
H2O2 y el glicerol fueron provistos por Cicareli El isopropil-β-D-1-
tiogalactopiranoacutesido (IPTG) fue suministrado por Promega La enzima ADN polimerasa
de Thermus aquaticus EC 2777 (polimerasa Taq) y los oligonucleoacutetidos fueron
suministrados por InvitrogenTM
Argentina La enzima peroxidasa de raacutebano picante
ligada a estreptavidina (HRP-EAV) fue provista por Abcam El ester biotin n-
hidroxisuccinimida fue provisto por Thermo Scientific La ampicilina (Farmacopea
Argentina) fue provista por laboratorios Klonal La aluacutemina para pulido (tamantildeo de
partiacutecula 03 microm) fue provista por Metrohm El anticuerpo de cabra anti IgG humana
ligado a HRP fue provisto por Zymed El Tween-20 fue provisto por Anhedra
No se detallan los reactivos contenidos en los equipos comerciales utilizados
disponibles en las paacuteginas web de los respectivos proveedores
Materiales y Meacutetodos
40
412 Medios de cultivos
Para el crecimiento de cepas de Escherichia coli (E coli) se utilizoacute el medio de
cultivo Luria-Bertani (LB) compuesto por 10 g L-1
peptona de carne 5 g L-1
extracto de
levadura y 10 g L-1
NaCl En los casos requeridos se suplementoacute este medio con el
antibioacutetico ampicilina (100 g mL-1
) Para la preparacioacuten de medios soacutelidos se agregoacute
agar en concentracioacuten final de 15 g L-1
Para el crecimiento de ceacutelulas de M smegmatis se utilizoacute el medio de cultivo
Middlebrook 7H9 provisto en forma anhidra por Difco y fue suplementado con NaCl
CaCl2 yo glicerol en concentraciones variables de acuerdo a los requerimientos del
ensayo analiacutetico ulterior la composicioacuten del medio provisto por Difco se detalla en la
siguiente tabla
Tabla 41 Caldo Middlebrook 7H9 (Difco) composicioacuten en g L-1
del medio liacutequido recieacuten preparado
(NH4)2SO4 050
Na2(HPO4) 250
K(H2PO4) 100
Citrato de sodio 010
MgSO4 005
CaCl2 0005
ZnSO4 0001
CuSO4 0001
Citrato feacuterrico amoacutenico 004
Aacutecido l-glutaacutemico 050
Piridoxina 0001
Biotina 00005
42 Cepas bacterianas
Las cepas bacterianas utilizadas y sus caracteriacutesticas relevantes se detallan en la
siguiente tabla
Materiales y Meacutetodos
41
Tabla 42 Cepas bacterianas utilizadas
Cepa Caracteriacutesticas
Escherichia
coli (E coli)
BL21 (DE3)
E F- ompT hsdS (rB-mB-) [lon] (DE3 immP21 int- lacI+
lacUV5lacZT7 ARN polimerasa) Contiene el gen de la T7
ARN polimerasa bajo el control del promotor lacUV5 El gen de
la ARN polimerasa estaacute integrado en el cromosoma bacteriano
desde (DE3) y su expresioacuten se induce por IPTG (Stratagene)
M smegmatis
mc2155
Mycobacterium smegmatis MC2155 es un organismo
aerobio quimioorganotrofo en forma de barra no moacutevil
patoacutegeno de humanos Esta bacteria fue inicialmente aislada de
esmegma humano Esta cepa es un mutante de M smegmatis Es
faacutecilmente transformable con vectores plasmiacutedicos usando
electroporacioacuten
43 Bacterioacutefagos
Se utilizoacute el bacterioacutefago D29 que infecta especiacuteficamente micobacterias Los
trabajos especiacuteficos de infeccioacuten de micobacterias fueron realizados en el Departamento
de Microbiologiacutea de la Facultad de Ciencias Meacutedicas (UNR) bajo la supervisioacuten del Dr
Ricardo Morbidoni
44 Plaacutesmidos
El plaacutesmido utilizado y sus caracteriacutesticas relevantes se detallan en la siguiente tabla
Tabla 43 Plaacutesmido utilizado
Plaacutesmido Caracteriacutesticas
pET32a
5900 pares de bases resistencia ampicilina promotor T7lac Produce
proteiacutenas fusionadas a 6 histidinas y a la proteiacutena tiorredoxina (TRX)
de 204 kDa lo que permite su purificacioacuten en columna de NTA-Ni2+
Este vector fue utilizado como sistema de expresioacuten en la cepa BL21
(DE3) de E coli
45 Reaccioacuten en cadena de la polimerasa
Las reacciones se llevaron a cabo en un volumen total de 25 μL conteniendo
solucioacuten de amplificacioacuten comercial suplementada con MgCl2 para alcanzar una
concentracioacuten final de MgCl2 25 mM y 02 mM de cada uno de los desoxinucleoacutetidos
trifosfato dATP dGTP dCTP y dTTP 20 pmoles de cebador directo y reverso y 1 UI
de polimerasa Taq Se empleoacute un termociclador BOECO (Germany) y se inicioacute la
reaccioacuten con un paso de desnaturalizacioacuten a 95 ordmC durante 5 min La amplificacioacuten de
los fragmentos se realizoacute en 30 ciclos de a) desnaturalizacioacuten 1 min a 95degC b)
Materiales y Meacutetodos
42
hibridizacioacuten 1 min a la temperatura oacuteptima para cada par de cebadores c) extensioacuten
72degC 15 min por cada Kpb amplificado finalmente se realizoacute un paso de extensioacuten
durante 10 min
Para la reaccioacuten de amplificacioacuten de la secuencia codificante de la proteiacutena se
disentildearon oligonucleoacutetidos cebadores especiacuteficos (ver maacutes adelante) En el disentildeo de los
mismos se introdujeron sitios de restriccioacuten apropiados para el posterior clonado del
fragmento en vectores de clonado o expresioacuten
Como molde se utilizoacute aproximadamente 003 g de ADN plasmiacutedico
Como cebadores se utilizaron los oligonucleoacutetidos (provistos por Invitrogen)
P22C directo 5- GGATCCACCACCGAGACGCCAGC -3
P22C reverso 5- GAATTCTTGCCCGTGAGAGACACAG -3
46 Electroforesis de ADN en geles de agarosa
Los fragmentos de ADN (ADN plasmiacutedico productos de PCR) fueron separados
mediante electroforesis en geles de agarosa de distinta concentracioacuten (08 a 2) seguacuten
el tamantildeo de los fragmentos a separar Se utilizoacute el sistema de tipo submarino La
solucioacuten reguladora tris-aceacutetico-EDTA (TAE) 05 X se utilizoacute como solucioacuten de
electroforesis y para la preparacioacuten de geles A estos uacuteltimos se les agregoacute el agente
intercalante bromuro de etidio en una concentracioacuten final de 03 g mL-1
antes de su
gelificacioacuten Previo a la siembra las muestras se mezclaron con solucioacuten de siembra
compuesta por 0025 (mv) azul de bromofenol 0025 (mv) xilencianol y 30
(vv) glicerol en una proporcioacuten 51 en volumen de muestra solucioacuten de siembra
Como marcadores de peso molecular se utilizaron Ladder 100 pb PB-L (Productos Bio-
Loacutegicos) La corrida electroforeacutetica se realizoacute a un potencial constante de 100 V con
una fuente BIO-RAD modelo 3000xi Luego de la electroforesis el ADN se visualizoacute
por fluorescencia en un transiluminador de luz ultravioleta Fotodyne y las imaacutegenes se
digitalizaron con una caacutemara FUJIFILM modelo FinePix A120
47 Minipreparacioacuten de ADN plasmiacutedico
El ADN plasmiacutedico se preparoacute a partir de cultivos celulares de E coli conteniendo
los plaacutesmidos de intereacutes seguacuten el meacutetodo de lisis alcalina o bien utilizando los equipos
comerciales ―WIZARDreg
PLUS SV Minipreps DNA purification system (Promega) El
resultado de la preparacioacuten se evaluoacute realizando una electroforesis en gel de agarosa de
una aliacutecuota de la misma
Materiales y Meacutetodos
43
48 Purificacioacuten del producto de amplificacioacuten
La purificacioacuten de aacutecidos nucleicos a partir de geles de agarosa se realizoacute utilizando
el equipo comercial ―GFXTM Gel Band Purification Kit (Amersham GE Healthcare)
seguacuten las especificaciones del fabricante El resultado de la purificacioacuten se evaluoacute
realizando una electroforesis en gel de agarosa de una aliacutecuota de la elusioacuten obtenida
49 Prueba de expresioacuten de proteiacutenas de fusioacuten a TRX y a ldquocolardquo de histidinas
Se cultivaron clones de las cepas de E coli BL21 (DE3) transformadas con el
vector pET32a (con el inserto correspondiente) haciendo distintas diluciones 175
1100 y 1200 de un cultivo saturado en 2 mL de LB fresco (suplementado con
ampicilina a 100 μg mL-1
) y cultivando a 37 ordmC con agitacioacuten vigorosa (180 rpm) hasta
una densidad oacuteptica a 630 nm (DO630nm) aproximada de 05 unidades Se indujo la
expresioacuten de la proteiacutena recombinante con IPTG (concentracioacuten final 1 o 01 mM)
durante 3 4 o 12 hs a 37 ordmC y con agitacioacuten vigorosa Posteriormente se cosecharon las
ceacutelulas centrifugando a 3000 rpm durante 10 min Finalmente se lisaron las ceacutelulas con
pulsos de ultrasonido utilizando un sonicador analoacutegico Sonifierreg S450A y se
separaron las fracciones soluble e insoluble del extracto por centrifugacioacuten a 18000 g
durante 20 min
410 Expresioacuten y purificacioacuten preparativas de antiacutegenos recombinantes
Se cultivoacute la cepa de E coli transformada con el vector pET32a con el inserto
correspondiente haciendo una dilucioacuten 1100 de un cultivo saturado en dos porciones
de 150 mL de LB suplementado con ampicilina (100 microg mL-1
) y cultivando a 37ordm C
hasta una DO630nm 05 Se agregoacute IPTG hasta concentracioacuten final oacuteptima 1 mM para
el Ang P35B o 01 mM para el Ang P22C y se indujo el tiempo oacuteptimo 4 h para el Ang
P35B o 12 h para el Ang P22C a 37ordm De esta manera se obtuvo la proteiacutena de fusioacuten
en forma soluble Se cosecharon las ceacutelulas por centrifugacioacuten y se lavaron con solucioacuten
tampoacuten fosfato (Na2HPO4 10 mM NaCl 05 M pH 8) Luego se las resuspendioacute en 20
mL de solucioacuten de lisis (Na2HPO4 50 mM NaCl 05 M pH 8) Las ceacutelulas se lisaron
por sonicado aplicando pulsos de 30 s de duracioacuten hasta clarificacioacuten del medio en
hielo Se separoacute la fraccioacuten soluble de la insoluble por centrifugacioacuten a 18000 g y 4 ordmC
La fraccioacuten soluble se congeloacute durante 24 h a -20 ordmC y se descongeloacute en hielo luego se
centrifugoacute nuevamente a 18000 g y 4 ordmC Este paso se repitioacute dos veces
Posteriormente se realizoacute una separacioacuten cromatograacutefica de afinidad con una columna
Materiales y Meacutetodos
44
de 5 mL empacada manualmente con resina Ni Sepharosetrade High Performance en
condiciones nativas elusioacuten con imidazol 250 mM seguacuten las especificaciones del
proveedor (GE Healthcare) En los sucesivos pasos se recogieron aliacutecuotas y se verificoacute
la purificacioacuten visualizando por electroforesis en gel desnaturalizante de poliacrilamida
(SDS-PAGE)
411 Separacioacuten de proteiacutenas mediante SDS-PAGE
Se utilizaron geles de 12 y de 15 de acrilamidabisacrilamida 291 Las
muestras se sembraron en geles desnaturalizantes mezclaacutendolas 21 con solucioacuten de
siembra 2 X compuesta por Tris-HCl pH 68 125 mM SDS 4 β-mercapto etanol 5
vv(alternativamente se usoacute DTT 200 mM) glicerol 20 y azul de bromofenol 02
Las corridas electroforeacuteticas se hicieron en solucioacuten Tris-glicina-SDS (Tris base 302
g L-1
glicina 144 g L-l SDS 1 g L
-1) Los geles fueron tentildeidos con azul brillante de
Coomasie G-250
412 Cuantificacioacuten de proteiacutenas
Se utilizoacute el meacutetodo propuesto por Lowry (Lowry y col1951) seguacuten el siguiente
protocolo un volumen de muestra cuya concentracioacuten de proteiacutena se desea determinar y
uno o dos testigos de albuacutemina (conteniendo tiacutepicamente de 5 a 25 microg de proteiacutenas
totales) se disolvieron en 040 mL de agua destilada y se mezclaron con 150 mL de
reactivo C preparado inmediatamente antes de usar El reactivo C se preparoacute mezclando
una parte de tartrato de sodio y potasio 2 mv una parte de CuSO4 1 mv y 100
partes de solucioacuten tampoacuten carbonato 2 mv e hidroacutexido de sodio 01 N Se dejoacute
reaccionar la mezcla durante 15 min a temperatura ambiente y luego se adicionoacute 0150
mL de reactivo de Folin-Ciocalteu diluido 13 con agua destilada inmediatamente antes
de usar Se dejoacute reposar durante 45 min y se leyoacute la absorbancia a 660 nm
413 Reaccioacuten de conjugacioacuten biotina-antiacutegeno
Previo a la reaccioacuten de conjugacioacuten el antiacutegeno P35B purificado se llevoacute a una
concentracioacuten final de 2 mg mL-1
(como miacutenimo) en solucioacuten tampoacuten carbonato de
sodio 01 M (pH 85) usando las membranas de poro controlado Amicon Ultra-4
(Millipore Co) seguacuten las instrucciones del proveedor Se disolvieron 20 mg del eacutester
biotinil-n-hidroxisuccinimida (BNHS) en 590 microL de DMSO e inmediatamente despueacutes
se mezclaron 80 microL de esta solucioacuten con 800 microL de solucioacuten de Ang
Materiales y Meacutetodos
45
Al antiacutegeno P22C purificado se lo llevoacute a una concentracioacuten final de 20 mg mL-1
(como miacutenimo) en solucioacuten tampoacuten carbonato de sodio 01 M (pH 85) usando las
membranas de poro controlado mencionadas Se disolvieron 25 mg BNHS en 590 microL
de DMSO e inmediatamente despueacutes se mezclaron 120 microL de esta solucioacuten con 100
mL de solucioacuten de Ang Se incuboacute 4 h a temperatura ambiente con agitacioacuten suave Se
eliminaron los restos de eacutester hidrolizado y se cambioacute la solucioacuten tampoacuten carbonato por
PBS 1 X pH 74 haciendo lavados reiterados y reteniendo el Ang en las membranas de
poro controlado
414 Revelado cromogeacutenico de la reaccioacuten de conjugacioacuten
El antiacutegeno marcado con biotina respectivo fue retenido en membrana de
nitrocelulosa sembrando 1 L del mismo sobre la membrana Se procedioacute a bloquear
los sitios activos de la membrana con leche descremada disuelta al 5 mv en PBS pH
74 durante 1 h Se realizaron 3 lavados con PBS pH 74 de 1 min cada uno Se incuboacute
la membrana con la enzima peroxidasa de raacutebano picante ligada a streptavidina (HRP-
EAV) disuelta en PBS pH 74-leche descremada al 1 mv Posteriormente se
realizaron 3 lavados con PBS pH 74 de 1 min cada uno Finalmente se reveloacute la
presencia de la enzima HRP con el reactivo de color recieacuten preparado seguacuten 5 mg de
33-diaminobenzidina tetrahidrocloruro (DAB) se disolvieron en 500 microL de DMSO y se
llevoacute a 100 mL de volumen final con PBS pH 74 A esta solucioacuten se le agregaron 100
microL de H2O2 10 voluacutemenes inmediatamente previo a su utilizacioacuten
415 Mediciones espectrofotomeacutetricas
Para las medidas de absorbancia (Abs) a longitudes de onda especiacuteficas o la
realizacioacuten de espectros de absorcioacuten ultravioleta-visible se utilizoacute el espectrofotoacutemetro
Beckman DU 640 Como celda se utilizoacute una cubeta de cuarzo de 1 cm de paso oacuteptico
416 Ensayos de inmunoabsorcioacuten ligados a enzima con deteccioacuten fotomeacutetrica
Como soporte soacutelido se utilizaron microplacas Microlon 600 high binding Greiner
Bio One provistas por GBO Argentina Para las lecturas de Abs se utilizoacute un lector de
microplacas PowerWave XS (BioTek) o alternativamente se utilizoacute el lector ELx808
Absorbance Microplate Reader (BioTek) Los ensayos preliminares se detallan en la
secioacuten 6 Experimentos Auxiliares
Materiales y Meacutetodos
46
4161 Esquema A
Sobre las microplacas de ELISA Microlon 600 high binding Greiner Bio One se
depositaron 100 microL de anticuerpo de captura (IgG de conejo anti IgM humana) provisto
por Dakko diluido 11000 en PBS pH 74 Se incubaron 48 h a 37 degC Luego se
realizaron 3 lavados con PBS Tween 20 al 005 (PBS-T) de 1 min cada uno Se
procedioacute al bloqueo de los sitios libres de la placa con 100 microL leche descremada
comercial (marca Milkaut) al 1 mv en PBS durante 30 min a 37 degC y se realizaron 3
lavados con PBS-T de 1 min cada uno Luego se incubaron con suero humano (muestra
incoacutegnita) 1100 en PBS con leche descremada al 1 mv durante 1 h a 37 degC y se
realizaron 3 lavados con PBS-T de 1 min cada uno Se realizaron distintas incubaciones
con los antiacutegenos P22C y P35B conjugados a biotina Luego de tres lavados con PBS-T
se incubaron con la enzima HRP-EAV en una dilucioacuten 12000 durante 1 h a 37degC
Posteriormente se realizaron 3 lavados con PBS-T para finalmente revelar utilizando
50 microL de solucioacuten comercial de 33prime55prime-tetrametilbenzidina (TMB) sustrato de la
enzima HRP que da coloracioacuten azul en el medio de reaccioacuten pasando a amarillo y
permaneciendo estable el color cuando se detiene la reaccioacuten acidificando el medio con
H2SO4 05 M
4162 Esquema B
Sobre las microplacas de ELISA comerciales se depositaron 500 ng de Ang P22C
disueltos en 100 L de solucioacuten carbonato pH 96 incubando 1 h a 37 degC Se realizaron
3 lavados con PBS Tween 20 al 005 (PBS-T) de 1 min cada uno Se bloquearon los
sitios libres de la placa con 100 microL leche descremada 1 mv en PBS durante 30 min a
37 degC Luego se realizaron 3 lavados con PBS-T de 1 min cada uno Se incubaron con
suero humano (muestra incoacutegnita) 1100 en PBS con leche descremada al 1 mv
durante 1 h a 37 degC Luego se realizaron 3 lavados con PBS-T de 1 min cada uno Se
realizoacute una incubacioacuten con el antiacutegeno P22C conjugado a biotina Luego de tres lavados
con PBS-T se incubaron con la enzima HRP-EAV en una dilucioacuten 12000 durante 1 h
a 37degC Posteriormente se realizaron 3 lavados con PBS-T Finalmente se reveloacute con
50 microL de solucioacuten comercial de TMB y se detuvo la reaccioacuten acidificando el medio con
50 microL H2SO4 05 M
Materiales y Meacutetodos
47
417 Reaccioacuten de color para determinacioacuten cuantitativa de glicerol por meacutetodo
espectrofotomeacutetrico
Se llevaron a cabo dos tipos de ensayos diferentes Por un lado se utilizoacute el meacutetodo
enzimaacutetico con un equipo comercial provisto por Wiener Lab TG GPO PAP AA (liacutenea
liacutequida) ensayando muestras de aliacutecuotas del medio Middlebrook 7H9 suplementadas
con glicerol en lugar de suero humano Por otro lado se realizaron reacciones de color
que se llevaron a cabo en un volumen final de 100 mL que resultoacute de la mezcla de 950
microL de reactivo A y 50 microL de muestra la cual consistioacute en medio de cultivo de
micobacterias Middlebrook 7H9 suplementado con distintas cantidades de glicerol En
los blancos de reaccioacuten se realizoacute un agregado de medio de cultivo Middlebrook 7H9
sin glicerol de igual volumen que en los otros dos casos para mantener las mismas
condiciones que en las otras reacciones
El reactivo A se preparoacute inmediatamente antes de ser usado mezclando los
reactivos necesarios seguacuten se indica en la siguiente tabla
Tabla 44 Mezcla de reactivos necesaria para preparar 950 microL de reactivo A (necesario para 1 reaccioacuten)
Los voluacutemenes necesarios para un nuacutemero n de reacciones se obtuvieron multiplicando por n
los voluacutemenes de esta tabla
Reactivo Volumen para una
reaccioacuten ( L)
Solucioacuten Tampoacuten carbonato
0125 M pH 105 815
K3Fe(NC)6 10-2
M 100
(NH4)2SO4 10 M 10
NAD+ 10
-2 M 25
Enzima GlDH 2 mg mL-1
1
Las reacciones se llevaron a cabo en tubos de Khan cerrados con parafilm para
evitar evaporacioacuten de liacutequido y en bantildeo termostatizado a 37 ordmC La lectura de
absorbancia se realizoacute cuando se cumplioacute una o dos h de iniciada la reaccioacuten seguacuten la
necesidad del ensayo Los experimentos se realizaron por triplicado
418 Determinacioacuten de glicerol remanente en cultivos de micobacterias
Procedimiento seguido a medios de cultivos Middlebrook 7H9 se los suplementoacute
con glicerol a concentracioacuten 0025 mv y se cultivaron cantidades iguales de ceacutelulas
de M smegmatis algunos medios se conservaron sin adicionar micobacterias en
Materiales y Meacutetodos
48
condiciones de esterilidad Se tomaron aliacutecuotas de estos cultivos a distintos tiempos Se
centrifugaron a 12500 rpm durante 5 min para separar las ceacutelulas del sobrenadante y a
estos uacuteltimos se los congeloacute a -20ordmC para su posterior anaacutelisis
Se realizaron determinaciones de glicerol con la teacutecnica fotomeacutetrica propuesta Se
realizaron reacciones de color por triplicado a las muestras e independientemente se
hizo un blanco de reaccioacuten y 2 testigos cuyas concentraciones fueron de 001 y 004
mv
4181 Determinacioacuten de glicerol remanente en cultivos de micobacterias con y sin
fago D29 y ensayos controles respectivos
Procedimiento seguido a medios de cultivos Middlebrook 7H9 se los suplementoacute
con glicerol a 0025 mv y se cultivaron cantidades iguales de a) ceacutelulas de M
smegmatis b) ceacutelulas de M smegmatis infectadas con fago D29 c) fagos D29 d)
algunos medios se conservaron sin adicionar micobacterias ni fagos en condiciones de
esterilidad Se tomaron aliacutecuotas de estos medios inmediatamente despueacutes de realizados
los inoacuteculos (tiempo 0) a las 2 h y a las 4 h de iniciados los cultivos Se centrifugaron a
12500 rpm durante 5 min para separar las ceacutelulas del sobrenadante y a estos uacuteltimos se
los congeloacute a -20 ordmC para su posterior anaacutelisis A estas muestras se les realizaron
determinaciones del glicerol remanente con la teacutecnica fotomeacutetrica propuesta Se
realizaron reacciones de color por triplicado a cada muestra utilizaacutendose como testigos
los medios en condiciones de esterilidad
419 Instrumental electroquiacutemico
Para los experimentos electroquiacutemicos se utilizoacute un analizador electroquiacutemico
Autolab (Eco Chemie) con amplificador electromeacutetrico diferencial PGSTAT 30 Se
utilizoacute una celda convencional de tres electrodos
4191 Electrodos de trabajo
41911 Bioelectrodo para evaluacioacuten de infeccioacuten toxoplaacutesmica
Se utilizaron electrodos macizos tipo ―banderita de oro de aproximadamente 1
cm2 de aacuterea geomeacutetrica El ensamblado se realizoacute de acuerdo al siguiente protocolo los
electrodos limpios se sumergieron durante 14 h en una solucioacuten de aacutecido 3 mercapto
propanosulfoacutenico preparada inmediatamente antes de usar disolviendo 22 mg en 12 mL
de H2SO4 0021 M (desoxigenenada con burbujeo de N2) en atmoacutesfera de N2 a
Materiales y Meacutetodos
49
temperatura ambiente (TA) Luego de enjuagar con agua destilada se sumergieron en
una solucioacuten de Ang recombinante P22C 02 mg mL-1
(PBS pH 74) durante 1 h a TA
Luego de un lavado con PBS se bloquearon los sitios libres no modificados con el Ang
sumergiendo los electrodos en solucioacuten de caseinato de sodio 01 mg mL-1
(preparada
inmediatamente antes de usar) 30 min a 37 degC Los electrodos se lavaron con PBS
Tween-20 05 mv y se sumergieron en una dilucioacuten 1200 de suero humano (muestra
incoacutegnita) en PBS durante 30 min a 37 degC Se lavaron con PBS Tween-20 05 y
finalmente se incubaron en una dilucioacuten 11500 de anticuerpos de conejo anti IgGh-
HRP Los biosensores asiacute ensamblados se guardaron en PBS pH 74 a 4degC hasta su
utilizacioacuten
41912 Electrodos para cuantificacioacuten de glicerol
Como electrodos de trabajo se utilizaron oro platino plata carbono viacutetreo pasta
de carbono (viacutetreo y grafito) y pastas de carbono modificadas
Los electrodos metaacutelicos y de carbono viacutetreo fueron provistos por Metrohm
(numero de cataacutelogo 612043XX) consistentes en barras del material de 3 mm de
diaacutemetro embutidas en un armazoacuten aislante
Las pastas de carbono utilizadas se enumeran a continuacioacuten indicando los
porcentajes en masa de cada componente respectivamente
a) Pasta A carbono viacutetreo aceite mineral (7030)
b) Pasta B carbono viacutetreo aceite mineral GLDH (68302)
c) Pasta C carbono viacutetreo aceite mineral GLDH MWCNT (5830210)
Las pastas se prepararon mezclando los componentes en mortero de aacutegata durante
15 a 20 min hasta obtener una mezcla homogeacutenea a la vista Cuando se utilizoacute enzima
GlDH se dispersoacute en aceite mineral primero y luego se mezcloacute con el polvo de carbono
viacutetreo Cuando se utilizaron NTC (MWCNT nanotubos de carbono de pared multiple)
se dispersoacute primero la enzima luego los NTC y finalmente el polvo de carbono viacutetreo
Asiacute preparadas se empaquetaron firmemente en un armazoacuten de tefloacuten (diaacutemetro 3 mm)
y se friccionoacute firmemente sobre un papel liso apoyado en un vidrio para eliminar el
exceso de pasta y pulir la superficie expuesta del electrodo
Cuando se utilizaron electrodos de pasta de carbono con las pastas B se realizoacute una
cubierta de poli-(o-fenilendiamino) que inmovilizara la enzima Una vez empaquetada
la pasta en el armazoacuten de Teflon se sumergioacute en una solucioacuten de o-fenilendiamino 5 x
10-4
M en solucioacuten tampoacuten carbonato 01 M (pH 10) Se burbujeoacute N2(g) para eliminar el
Materiales y Meacutetodos
50
O2(g) de la solucioacuten y dejar una atmoacutesfera libre de O2(g) Para electropolimerizar se
realizoacute un barrido de potencial ciacuteclico desde -051 V a + 069 V a 50 mV s-1
Finalmente se enjuagoacute con solucioacuten amortiguadora carbonato 01 M (pH 10)
4192 Limpieza de electrodos
Los electrodos de oro macizo policristalino tipo ―banderita se sumergieron en
solucioacuten ―pirantildea (H2SO4 concentrado peroacutexido de hidroacutegeno 30 en una relacioacuten 31)
durante 30 min a 80ordmC Luego se los enjuagoacute con abundante agua destilada En caso de
limpieza maacutes rigurosa previo al tratamiento con solucioacuten ―pirantildea se los colocoacute a la
llama directa hasta rojo vivo (Ribone y col 2006)
Los electrodos de oro policristalino macizo insertos en una barra de tefloacuten (Tips de
Au) se limpiaron siguiendo el siguiente protocolo desengrase frotaacutendolo sobre tela de
pulido humedecida con DMSO Lavado con abundante agua destilada Pulido con
suspensioacuten acuosa de aluacutemina (diaacutemetro promedio de partiacutecula 03 microm) sobre tela de
pulido Lavado con abundante agua destilada Sonicado durante 5 min en sonicador
Cole-Palmer 8890 Luego de un enjuague con abundante agua destilada se sumergieron
en HNO3 9 M durante 1 min a 60 ordmC Finalmente se lavaron con abundante agua
destilada
4193 Determinacioacuten del aacuterea real del electrodo
Para la determinacioacuten del aacuterea real de los electrodos metaacutelicos se utilizaron dos
metodologiacuteas in-situ
41931 Medicioacuten de la adsorcioacuten de oxiacutegeno
Se asume que el oxiacutegeno se quimioadsorbe en una capa monoatoacutemica antes de la
evolucioacuten de 02 con una correspondencia de uno-a-uno con los aacutetomos metaacutelicos de la
superficie El valor de la carga asociada a la reduccioacuten de la monocapa de oacutexido en
superficies de oro policristalino que se utilizoacute fue de 390plusmn10 microC cm-2
(Trasatti amp Petrii
1991)
Se realizaron VCs en H2SO4 a 50 mVs-1
y se midioacute la carga correspondiente al pico
de desorcioacuten de O2 sobre la superficie del electrodo y este valor se dividioacute por el valor
de referencia
Materiales y Meacutetodos
51
41932 Voltametriacutea ciacuteclica de ferricianuro de potasio
Registrando VCs a varias velocidades de barrido de potencial conociendo el
coeficiente de difusioacuten del ioacuten su concentracioacuten en la celda y midiendo la corriente de
pico a cada velocidad de barrido es posible determinar el aacuterea real del electrodo de
trabajo utilizando la ecuacioacuten de Randles Sevcik ec[216] (Belluzo y col 2008)
[216]
siendo la temperatura 25 degC y donde A estaacute en cm2 D en cm
2 s
-1 C en mol cm
-3 y
en V s-1
420 Medidas electroquiacutemicas
Todos los potenciales fueron medidos y referidos al electrodo de AgAgCl (KCl
300 M) que se utilizoacute como electrodo de referencia Como contraelectrodos se
utilizaron dos tipos uno de oro de superficie mayor a 5 veces la superficie del electrodo
de trabajo cuando se utilizaron electrodos metaacutelicos como electrodos de trabajo y una
barra de carbono viacutetreo cuando se utilizaron electrodos de pasta de C como electrodos
de trabajo En todos los casos las soluciones se burbujearon con N2 durante 1 min para
desplazar el O2 disuelto y se mantuvieron en atmoacutesfera de N2 durante las
determinaciones
Las voltametriacuteas ciacuteclicas se realizaron equilibrando el sistema al potencial de inicio
Para muestras conteniendo glicerol y utilizando electrodos de oro se realizaron
barridos desde -030 V hasta 060 V a distintas velocidades de barrido Cuando se
utilizaron electrodos de platino se realizaron barridos desde -080 V hasta 020 V a
distintas velocidades de barrido Cuando se utilizaron electrodos de pasta de carbono o
pasta de carbono modificada se realizaron barridos de potencial desde -040 V hasta
100 V Las corrientes que se informan son las intensidades de pico obtenidas trazando
una liacutenea de base recta desde los extremos del pico de corriente utilizando algoritmos
propios del programa General Purpose Electrochemical System (GPES)
4201 Mediciones amperomeacutetricas para evaluacioacuten de infeccioacuten toxoplaacutesmica
Las amperometriacuteas realizadas con el bioelectrodo para evaluacioacuten de infeccioacuten
toxoplaacutesmica se llevaron adelante en solucioacuten PBS (pH 74) FeMe 3 mM El potencial
de trabajo fue de 008V Se registroacute la corriente de base hasta que se estabilizoacute y una
Materiales y Meacutetodos
52
vez estable (usualmente a los 250 s) se adicionoacute el sustrato de la enzima (H2O2)
concentracioacuten en celda 18 mM y se registroacute la corriente final (500 s) La corriente
cataliacutetica se evaluoacute como la diferencia entre la corriente final y la de base
4202 Mediciones amperomeacutetricas para cuantificacioacuten de glicerol
42021 Amperometriacuteas con tip de oro
Las amperometriacuteas con tip de oro se realizaron en medio NaOH 01 M a potencial
constante (01 V) y a temperatura ambiente (20 a 25 ordmC) El sistema se preacondicionoacute
aplicando un potencial de 05 V se dejoacute equilibrar y se registroacute la corriente de base en
esas condiciones (generalmente a los 50 s) Luego se adicionoacute la muestra de forma de
lograr la concentracioacuten final de analito deseada La corriente fue registrada y se midioacute
una vez que se estabilizoacute (aproximadamente a los 400 s) La corriente cataliacutetica se
evaluoacute como la diferencia entre la corriente final y la de base
42022 Amperometriacuteas con electrodos de pasta de C
Las amperometriacuteas donde se utilizoacute la pasta de carbono B se realizaron en solucioacuten
tampoacuten carbonatobicarbonato de potasio 100 mM (NH4)2SO4 25 mM K3Fe(CN)6
1mM NAD+ 05 mM pH 105 Se trabajoacute a potencial constante 038 V y a temperatura
ambiente (25 ordmC) El sistema se preacondicionoacute aplicando el potencial de trabajo
correspondiente durante 50 s una vez iniciada la lectura de corriente se dejoacute equilibrar
y se registroacute la corriente de base en esas condiciones usualmente a los 300 s Luego se
adicionoacute la cantidad necesaria de muestra de forma de lograr la concentracioacuten final de
analito deseada La corriente fue registrada y se midioacute una vez que se estabilizoacute
(aproximadamente a los 500 s) La corriente cataliacutetica se evaluoacute como la diferencia
entre la corriente final y la de base
Las amperometriacuteas donde se utilizoacute la pasta de carbono C se realizaron en solucioacuten
tampoacuten carbonatobicarbonato de potasio 100 mM (NH4)2SO4 25 mM NAD+ 05 mM
pH 105 a potencial constante 051 V y a 25 ordmC El sistema se preacondicionoacute aplicando
el potencial de trabajo correspondiente durante 50 s una vez iniciada la lectura de
corriente se dejoacute equilibrar y se registroacute la corriente de base en esas condiciones
usualmente a los 300 s Luego se adicionoacute la cantidad necesaria de muestra de forma
de lograr la concentracioacuten final de analito deseada La corriente fue registrada y se
midioacute una vez que se estabilizoacute (aproximadamente a los 200 s del agregado) La
corriente cataliacutetica se evaluoacute como la diferencia entre la corriente final y la de base
Materiales y Meacutetodos
53
Cuando el tiempo de equilibrado no fue suficiente para que la corriente de base se
estabilizara se recurrioacute a realizar correcciones de liacutenea de base A tal fin se llevaron a
cero las corrientes de base aplicando los algoritmos que ofrece el programa GPES
versioacuten 49 provisto por Eco Chemie BV
4203 Voltamperometriacutea de onda cuadrada
Los experimentos de voltamperometriacutea de onda cuadrada se realizaron en solucioacuten
tampoacuten carbonatobicarbonato de potasio 100 mM (NH4)2SO4 25 mM NAD+ 05 mM
pH 105 y a 25 ordmC Los valores de escaloacuten de potencial utilizados fueron de 5 y 10 mV
Los valores de amplitud de pulso fueron de 25 y 50 mV Las frecuencias utilizadas
fueron de 8 10 20 30 40 60 y 70 Hz Especiacuteficamente se evitoacute utilizar 50 Hz
(frecuencia de la tensioacuten alterna de la liacutenea de alimentacioacuten) Los barridos de potencial
se realizaron desde -03 V hasta 10 V
Una vez registrado el blanco con medio Middlebrook 7H9 y se hicieron dos
agregados secuenciales de solucioacuten estaacutendar de glicerol 100 M obtenieacutendose una
concentracioacuten final de 25 y 50 mM respectivamente en la celda
421 Funcionalizacioacuten de nanotubos de carbono
Previo a la utilizacioacuten de los nanotubos de carbono se procedioacute a funcionalizarlos
realizando una carboxilacioacuten oxidativa Se siguioacute una comunicacioacuten personal del Dr
Joseacute Manuel Pingarroacuten del Departamento de Quiacutemica Analiacutetica Facultad de Ciencias
Quiacutemicas Universidad Complutense de Madrid A saber se pesaron aproximadamente
2 mg de MWCNT y se dispersaron en 2 mL en una mezcla de aacutecido sulfuacuterico aacutecido
niacutetrico 31 con agitacioacuten ultrasoacutenica durante 5 h Luego se diluyoacute la mezcla al 110
vertieacutendola suavemente en agua destilada enfriada en bantildeo de hielo para evitar
proyecciones Se eliminoacute el exceso de aacutecido centrifugando a 14000 rpm durante 30
min descartando el sobrenadante y dispersando el precipitado en agua destilada con
agitacioacuten ultrasoacutenica durante 30 min Esta operatoria se repitioacute 9 veces hasta que la
dispersioacuten de MWCNT en agua tuvo un pH cercano a la neutralidad (70 05) Los
MWCNT se secaron en desecador con sulfato de cobre anhidro y aplicando vaciacuteo al
sistema
Materiales y Meacutetodos
54
422 Programas de prediccioacuten de epiacutetopes lineales reconocidos por ceacutelulas B
4221 Base de datos de proteiacutenas
Se creo manualmente una base de datos para mejorar la exactitud de los resultados
Las proteiacutenas fueron seleccionadas de la base de datos de BciPep (Saha y col 2005)
HIV Molecular Immunology Database (disponible en httpwwwhivlanlgovcontent
immunologyindexhtml) o tomadas de la literatura VP1 (Wang y col 2011) proteiacutena
N (El-Manzalawy y col 2008) y Gliadina (Sweredoski amp Baldi 2009) El criterio de
seleccioacuten fue la confirmacioacuten experimental previa mediante ensayos de puntos de
inmunoadsorcioacuten ligado a enzima (ELIspot) o mediante el uso de paneles
multiespeciacuteficos de anticuerpos monoclonales que reconocen epiacutetopes lineales (Shin y
col 2005) Como resultado se seleccionaron 11 proteiacutenas de las que se obtuvieron un
total de 65 epiacutetopes lineales reconocidos por ceacutelulas linfociacuteticas tipo B
4222 Programas utilizados
Se utilizaron algunos programas para predecir los epiacutetopes lineales disponibles en
liacutenea gratuitamente Todos estos programas utilizan algoritmos matemaacuteticos con escalas
de propensioacuten yo datos experimentales de antigenicidad A menos que se indique lo
contrario cada programa se ejecutoacute utilizando los paraacutemetros por defecto Los
programas utilizados fueron AAPPred (Davydov amp Tonevitskii 2009) ABCpred
(Saha S amp Raghava 2006) BcePred (Saha y col 2005) BepiPred (Larsen y col
2006) y Antigenic (Kolaskar amp Tongaonkar 1990)
Los programas de prediccioacuten definen el grado de antigenicidad por medio de una
puntuacioacuten (score) en algunos casos para cada epiacutetope y en otros para cada residuo
amino aciacutedico En este uacuteltimo se puede definir una regioacuten antigeacutenica cuando varios
residuos con alta puntuacioacuten son adyacentes en la estructura primaria Por otra parte el
nuacutemero de epiacutetopes o regiones antigeacutenicas que los programas de prediccioacuten encuentran
depende de un umbral que es configurado por el usuario
423 Anaacutelisis de Datos
Los liacutemites de deteccioacuten (LD) y cuantificacioacuten (LC) se calcularon siguiendo las
sugerencias de Armbruster amp Pry (Armbruster amp Pry 2008) modificando la cantidad
de replicados utilizados para la obtencioacuten de los desviacuteos estaacutendar habieacutendose utilizado
10 reacuteplicas El caacutelculo del LD se realizoacute a partir del valor de corriente del blanco IB maacutes
Materiales y Meacutetodos
55
33 veces el valor del desviacuteo estaacutendar de la corriente leiacuteda (DSn1) de la muestra con
menor concentracioacuten de glicerol medida seguacuten
[41]
El valor del LC se calculoacute como
[42]
siendo m la pendiente de la curva de calibracioacuten
La capacidad de discriminacioacuten entre dos concentraciones diferentes de los
meacutetodos propuestos se evaluoacute como el error asociado a la estimacioacuten de la
concentracioacuten Ec calculada como
Nm
EE r
c
1
[43]
siendo Er el error relativo
424 Caacutelculos estadiacutesticos y disentildeo experimental
Para los caacutelculos estadiacutesticos se utilizaron los programas SigmaStat 32 (Sigma Plot
90 u 110) o Microcal Origin 80 en forma indistinta Para los caacutelculos de EJCR (regioacuten
eliacuteptica de confianza conjunta) se utilizoacute el programa Matlab con rutinas disentildeadas ―ad-
hoc
Resultados y Discusioacuten
Resultados y Discusioacuten
57
5 Resultados y discusioacuten
Para la obtencioacuten de antiacutegenos especiacuteficos de fase aguda de la toxoplasmosis se
comenzoacute seleccionando un conjunto de proteiacutenas denominadas P30 P22 y P35
mencionadas en la literatura como antiacutegenos de fase aguda (Harning y col 1996
Parmley y col 2000 Lu y col 2006) Sobre la base de estos estudios iniciales se
intentoacute identificar por medio de caacutelculos teoacutericos que regiones de estas proteiacutenas
conteniacutean mayor nuacutemero de epiacutetopes De este modo en la etapa siguiente se procurariacutea
expresarlos en forma soluble para su posterior utilizacioacuten en inmunoensayos Al
momento de seleccionar un programa de todos los disponibles ―on line verificamos
que eacutestos no informaban el valor predictivo positivo VPP Por ello se inicioacute un trabajo
de identificacioacuten del programa que predijera maacutes fidedignamente los epiacutetopes La
buacutesqueda se realizoacute comparando los resultados arrojados por 5 programas a los que se
solicitoacute prediccioacuten de epiacutetopes pertenecientes a 11 proteiacutenas cuyos epiacutetopes lineales
habiacutean sido perfectamente establecidos experimentalmente (Costa y col 2013) Se
analizoacute cuaacutel de ellos presentaba el mayor VPP (ver punto 61 seccioacuten Experimentos
Auxiliares) y para predecir epiacutetopes lineales se trabajoacute con este programa que resultoacute
ser AAPred
El anaacutelisis de los Ang seleccionados permitioacute identificar en P35 dos regiones que
concentraban los determinantes antigeacutenicos a las cuales se las denominoacute P35A y P35B
Los Ang P30 y P22 presentaban los determinantes antigeacutenicos distribuidos
homogeacuteneamente por lo tanto al momento de disentildear su clonado se tuvieron en cuenta
criterios que faciliten la expresioacuten y solubilidad mas allaacute de la antigenicidad
51 Evaluacioacuten de antiacutegenos recombinantes de T gondii
511 Antiacutegeno P30
El antiacutegeno de superficie 1 de T gondii SAG1 tambieacuten denominado proteiacutena P30
se ha identificado como antiacutegeno de fase aguda (Harning y col 1996) por lo cual se
procuroacute obtenerlo en forma soluble Sobre la base de ensayos previos realizados en el
LTI se continuoacute con la obtencioacuten y purificacioacuten de dos porciones del antiacutegeno P30
denominadas P30L y P30C (seccioacuten 410 Materiales y Meacutetodos) Luego de la cosecha
y lisis de las bacterias se separaron las fracciones soluble e insoluble del extracto se
tomaron aliacutecuotas de ambas y se analizaron por SDS-PAGE Los Angs buscados soacutelo se
Resultados y Discusioacuten
58
obtuvieron como proteiacutenas precipitadas en cuerpos de inclusioacuten en la fraccioacuten insoluble
Por ello se discontinuoacute el trabajo con las fracciones de P30
512 Antiacutegeno P22
El antiacutegeno de superficie 2 o antiacutegeno P22 de T gondii (Gen Bank ndeg M33572) ha
sido tambieacuten identificado como antiacutegeno de fase aguda (Parmley y col 1992 Lau amp
Fong 2006) En el presente trabajo se procuroacute amplificar la regioacuten del gen que
permitiese expresar la proteiacutena recombinante en forma soluble El producto de
amplificacioacuten se resolvioacute en un gel de agarosa tentildeido con bromuro de etidio como se
observa en la Fig 51
Figura 51 Gel de agarosa tentildeido con bromuro de etidio en transiluminador UV En PCR1 se observan los
productos de amplificacioacuten obtenidos utilizando cebadores especiacuteficos para la regioacuten P22C donde se
sentildeala el fragmento de tamantildeo esperado Control (-) muestra la misma mezcla de reaccioacuten pero sin ADN
molde MPM indica el marcador de peso molecular y el tamantildeo de los fragmentos se indica sobre la
derecha
Se aisloacute y purificoacute el fragmento de intereacutes utilizando un equipo comercial detallado
en el punto 48 seccioacuten Materiales y Meacutetodos En un paso posterior se ligoacute al vector
pET32a y con la construccioacuten resultante se transformaron ceacutelulas competentes de E
coli Las ceacutelulas transformadas se seleccionaron crecieacutendolas en medio LB con
ampicilina Se verificaron las condiciones para la expresioacuten en forma soluble (punto
410 seccioacuten Materiales y Meacutetodos) encontraacutendose que las condiciones oacuteptimas eran
01 mM IPTG y 12 h de incubacioacuten con agitacioacuten vigorosa
Para la induccioacuten preparativa se siguioacute el protocolo detallado en la seccioacuten 410 de
Materiales y Meacutetodos La Fig 52 muestra la fotografiacutea de un gel de poliacrilamida
luego de la tincioacuten donde se analizaron aliacutecuotas de todos los extractos obtenidos en los
distintos pasos separativos de la proteiacutena P22C
Resultados y Discusioacuten
59
Figura 52 Gel de poliacrilamida tentildeido con azul brillante de Coomassie En cada calle se sembraron 1
microL de muestra EC indica el extracto crudo P1 muestra la fraccioacuten insoluble del lisado celular P2 la
fraccioacuten insoluble luego del congelamiento-descongelamiento del extracto centrifugado FT muestra el
extracto que pasoacute por la columna Con L se indican las calles con las fracciones de lavados sucesivos con
tampoacuten imidazol 0 mM 20 mM 50 mM y 100 mM respectivamente E muestra las fracciones de
elucioacuten con solucioacuten imidazol 250 mM Las fracciones de elucioacuten recolectadas fueron de 15 mL cada
una
513 Antiacutegeno P35
El antiacutegeno de superficie P35 de T gondii (Gen Bank ndeg AF01275) se ha
identificado como antiacutegeno de fase aguda y distintas porciones del mismo presentan
diferentes desempentildeos en su uso diagnoacutestico (Lu y col 2006) Sobre la base de
ensayos previos realizados en el LTI se continuoacute con la obtencioacuten y purificacioacuten de las
dos porciones del antiacutegeno P35 denominadas P35A y P35B
Se ensayoacute la expresioacuten del antiacutegeno P35A (punto 49 seccioacuten Materiales y
meacutetodos) y soacutelo se obtuvo como cuerpos de inclusioacuten en la fraccioacuten insoluble Si bien
fue posible disolver las proteiacutenas recombinantes en urea 8 M al dializar volviacutean a
precipitar
El antiacutegeno P35B se pudo obtener en forma soluble y las condiciones oacuteptimas
encontradas para la induccioacuten del mismo fueron IPTG 1 mM y 4 h con agitacioacuten
vigorosa La Fig 53 muestra una imagen del gel de poliacrilamida luego de la corrida
electroforeacutetica y su tincioacuten Se observoacute que una banda de la fraccioacuten soluble estaba
sobreexpresada en los cultivos inducidos
Resultados y Discusioacuten
60
Figura 53 Gel de poliacrilamida al 12 en condiciones desnaturalizantes Se muestra lo obtenido para
aliacutecuotas de dos cultivos no inducidos 1 y 2 y dos inducidos 3 y 4 Con P se designan las fracciones
insolubles en la solucioacuten de lisis y con SN las fracciones solubles Las bandas que se observan del MPM
corresponden a fragmentos de 19445 KDa 28829 KDa 36545 KDa 49491 KDa 80664 KDa
103035 KDa Se indica la banda sobreexpresada de tamantildeo esperado
Para la induccioacuten preparativa del antiacutegeno P35B se siguioacute el protocolo descripto en
el punto 410 seccioacuten Materiales y Meacutetodos En la Fig 54 se muestra un gel de
poliacrilamida luego de la tincioacuten donde se analizaron aliacutecuotas de todos los extractos
obtenidos en los distintos pasos separativos
Figura 54 Gel de poliacrilamida tentildeido con azul brillante de Coomassie En cada calle se sembraron 7
microL de muestra P1 fraccioacuten insoluble del lisado celular P2 fraccioacuten insoluble luego del congelamiento-
descongelamiento del extracto centrifugado FT muestra el extracto que pasoacute por columna L calles con
las fracciones de lavados sucesivos con tampoacuten imidazol 20 mM 50 mM y 100 mM respectivamente E
fracciones de elucioacuten con solucioacuten imidazol 250 mM Las fracciones recolectadas fueron de 15 mL cada
una
En consecuencia se continuoacute el trabajo con P35B y se descartoacute transitoriamente la
utilizacioacuten del Ang P35A
52 Marcado de antiacutegenos recombinantes de T gondii
Para los ensayos tipo ELISA de captura especiacuteficos para IgM se propuso utilizar
como sistema revelador la enzima HRP-EAV que se une especiacuteficamente a biotina En
consecuencia se procedioacute a marcar los Ang solubles obtenidos con biotina
P35B
P1 P2 P3 P4 MPM
Inducido No Inducido
SN1
Inducido No Inducido
SN2 SN3 SN4
Resultados y Discusioacuten
61
La reaccioacuten de conjugacioacuten se realizoacute siguiendo el protocolo mencionado en el
punto 413 seccioacuten Materiales y Meacutetodos La conjugacioacuten se evidencioacute con la reaccioacuten
de color indicada en el inciso 413 En la Fig 55 se muestra la membrana de
nitrocelulosa sobre la que se fijaron las proteiacutenas P22 y P35B luego del revelado
cromogeacutenico con la enzima HRP conjugada a streptavidina Las reacciones de
conjugacioacuten se llevaron adelante por separado
Figura 55 Membranas de nitrocelulosa evidenciando las proteiacutenas P35B conjugada (izquierda) y P22C
conjugada (derecha)
53 Inmunoensayos
Estudios preliminares (ver punto 62 seccioacuten Experimentos Auxiliares) con los
antiacutegenos recombinantes obtenidos permitieron verificar por ELISA indirecto que sueros
confirmados positivos arrojaban resultados positivos mientras que los sueros negativos
daban el ensayo negativo Se procedioacute entonces a evaluar la capacidad de los antiacutegenos
obtenidos para discriminar sueros de pacientes con infeccioacuten aguda de sueros provenientes
de pacientes con infeccioacuten croacutenica
531 Inmunoensayos con deteccioacuten fotomeacutetrica
Como se anticipoacute en la introduccioacuten se realizaron ELISA siguiendo dos
alternativas de captura En la primera alternativa que denominamos A se procuroacute
capturar selectivamente la maacutexima cantidad de Ac del isotipo que se deseaba detectar
(IgMh) adsorbiendo sobre la placa un anticuerpo ―ad-hoc (Ac-a-IgMh) En la segunda
alternativa que denominamos B se buscoacute capturar con el Ang recombinante la maacutexima
cantidad de Ac especiacuteficos independientemente del isotipo que se tratara En el paso
siguiente del esquema B se tomoacute ventaja de la mayor valencia de las IgM respecto de
las IgG para el revelado
5311 Evaluacioacuten del esquema A
Sobre placas de ELISA se capturaron los Acs IgMh revelaacutendose la presencia de los
especiacuteficos con los antiacutegenos obtenidos marcados con biotina y uniendo a estos uacuteltimos la
enzima HRP-EAV En los ensayos preliminares (ver punto 622 seccioacuten Experimentos
Auxiliares) se identificoacute la cantidad de antiacutegeno marcado y las diluciones de HRP-EAV
oacuteptimas a utilizar para revelar la presencia de IgM especiacutefica capturada En la Tabla 51 se
Resultados y Discusioacuten
62
muestran los valores de absorbancia a 450 nm obtenidos para el panel de 9 sueros
ensayados Se utilizaron 5 g de P22C-biotina por pocillo y 100 L de HRP-EAV en
dilucioacuten 12000
Tabla 51 Absorbancias a 450 nm obtenidas en los ELISA siguiendo el esquema de captura A descrito
maacutes arriba
Placa 1 Placa 2
Agudos
0100 0158
0311 0273
0140 0165
Croacutenicos
0281 0322
0256 0278
0260 0226
Negativos
0217 0168
0235 0179
0409 0354
Sin suero
0135 0134
0143 0114
0126 0100
Sin suero
Sin
P22cBiotina
0071 0050
0070 0037
0047 0040
Los resultados obtenidos con ambos antiacutegenos fueron desalentadores (los resultados
obtenidos con P35B biotina no se informan) ya que no se hallaron diferencias
significativas entre los valores de absorbancia obtenidos con sueros de pacientes
agudos croacutenicos y negativos
5312 Esquema B
En base a los resultados obtenidos en la seccioacuten anterior se orientaron los ensayos
realizando los ELISA siguiendo un esquema no claacutesico al que denominamos B
Debido a la baja sensibilidad que presentaron los Angs conjugados a biotina para
detectar los Acs especiacuteficos pensamos en hacer una primera etapa de concentracioacuten de
los Acs especiacuteficos en la placa para luego revelar con el Ang conjugado a biotina Esto
se hizo adsorbiendo antiacutegeno recombinante sobre la superficie de la placa de
poliestireno enfrentaacutendola luego al suero a ensayar Asiacute se captura selectivamente las
inmunoglobulinas que reconocen al antiacutegeno ya sean IgM o IgG Luego se expone la
placa al mismo antiacutegeno recombinante pero ligado a biotina que se uniraacute a los
anticuerpos especiacuteficos para dicho Ang previamente capturados Finalmente se revela
Resultados y Discusioacuten
63
con HRP conjugada a streptavidina que forma un complejo estable con biotina De esta
forma se aumenta la cantidad de Ang marcado en mayor proporcioacuten para IgM que para
IgG dada la multivalencia de este isotipo de inmunoglobulina En la Fig 56 se
reproduce el esquema B que fue el que brindoacute los resultados maacutes promisorios
Antiacutegeno (Ang) Bloqueante Ang ligado a biotina Reactivo de color
IgM a-Ang IgG a-Ang streptavidina conjugada a HRP
Figura 56 Esquema de ensayo ELISA de captura tipo B El antiacutegeno expuesto en la placa captura la
porcioacuten de las IgM e IgG especiacuteficas presentes en el suero humano Haciendo uso de la polivalencia de
las IgM su presencia se revela con el antiacutegeno conjugado a biotina streptavidina ligada a HRP
adicionando el sustrato de la enzima y un cromoacutegeno actuando como cosustrato
Buscando diferenciar sueros de pacientes en fase de infeccioacuten aguda (agudos) de
sueros provenientes de pacientes sin infeccioacuten (negativos) En la Tabla 52 se muestran los
valores de absorbancia a 450 nm obtenidos
Tabla 52 Absorbancias a 450 nm obtenidas en los ELISA siguiendo el esquema de captura B
Ang
Sueros P35B 05ug P35B 001ug P22C 05ug P22C 001ug
Agudos 2131 1567 0335 0296
1849 1311 065 0413
Negativos 176 1350 0282 0327
1025 1676 0262 0325
Sin suero 1658 1658 0174 0149
1812 1504 0130 0144
Sin Ang
conjugado
0055 004 0041 0045
0057 0042 0039 004
Resultados y Discusioacuten
64
Este ensayo exploratorio demostroacute que los antiacutegenos P22C y P35B pueden ser usados
potencialmente en la deteccioacuten de toxoplasmosis aguda realizando inmunoensayos con el
esquema B propuesto en el presente trabajo Por ello siguiendo este esquema de trabajo se
exploraron cuales eran las condiciones oacuteptimas (ver punto 623 seccioacuten Experimentos
Auxiliares) Asiacute se establecioacute la dilucioacuten de la enzima HRP-EAV (12000) la cantidad de
P22C biotina (5 microg por pocillo) y se acotaron los valores de P22C adsorbidos inicialmente
en la placa entre 500 y 50 ng Finalmente se realizaron tres ensayos en paralelo donde se
evaluoacute la cantidad de antiacutegeno adsorbido inicialmente en la placa y se amplioacute el panel de
sueros Los resultados obtenidos se muestran en la Fig57
Figura 57 Absorbancias a 450 nm para los ELISA realizados con el esquema B (A) 50 ng de Ang P22C
(B) 200 ng de Ang P22C (C) 500 ng de Ang P22C Con se indican los sueros provenientes de
pacientes con infeccioacuten aguda (Agudos) con los provenientes de pacientes con infeccioacuten croacutenica
(Croacutenicos) y con los de pacientes sin infeccioacuten (Negativos) Con la liacutenea roja ( ) se indica el valor
de media menos tres desviacuteos estaacutendares de los agudos (AbsA ndash 3 DSA) y con la liacutenea verde ( ) el valor
de media maacutes tres desviacuteos estaacutendares de los croacutenicos (AbsC +3 DSC)
Resultados y Discusioacuten
65
En las tres condiciones evaluadas se obtiene una separacioacuten de las sentildeales obtenidas al
ensayar sueros provenientes de los pacientes con infeccioacuten aguda (Agudos) de los sueros
provenientes de pacientes con infeccioacuten croacutenica (Croacutenicos) y los pacientes sin infeccioacuten
(Negativos)
Los resultados obtenidos con P35B no resultaron alentadores debido al elevado ruido
de fondo (altos valores de absorbancia de los blancos) Por lo tanto los ensayos
electroquiacutemicos se iniciaron soacutelo con P22C
Mijak y colaboradores (Hiszczyntildeska-Sawicka y col 2005) sentildealan que ya se ha
demostrado la utilidad del Ang SAG2 para detectar IgG en el suero de pacientes con
toxoplasmosis aguda y croacutenica (Parmley y col 1992) destacando que en los resultados
presentados por ese mismo grupo en otra publicacioacuten (Li y col 2000a) soacutelo se examinaron
un reducido nuacutemero de sueros provenientes de pacientes con infeccioacuten aguda con
resultados tanto positivos como negativos Tambieacuten sentildeala que Maine y colaboradores
(Aubert y col 2000) no obtuvieron resultados satisfactorios con este antiacutegeno
recombinante realizando ELISA indirecto Los resultados obtenidos en este trabajo con
ELISA utilizando el esquema A han confirmado lo sentildealado por Mijak y col sobre el
desempentildeo de este Ang El anaacutelisis que estos autores hacen se orienta a que el uso de estos
antiacutegenos recombinantes debe contemplar necesariamente el uso combinado de otros Angs
Por otro lado en el presente trabajo se han presentado resultados que permitiriacutean
complementar esta visioacuten incorporando otro esquema para la deteccioacuten de sueros de
infectados agudos Si bien es necesario ampliar el nuacutemero de sueros para validar el ensayo
los resultados son promisorios Hemos propuesto que las diferencias obtenidas en los
ELISA de captura siguiendo el esquema B pueden deberse a dos mecanismos no
excluyentes entre si y que podriacutean estar actuando en conjunto Por un lado estaacute la
multivalencia que presentan las IgM respecto de las IgG que generariacutea una amplificacioacuten
selectiva de acuerdo al isotipo Por otro lado independientemente del isotipo capturado el
Ang de fase aguda brindariacutea la sensibilidad y especificidad necesaria al ensayo
identificando Acs de fase aguda Resta pues esclarecer si esto es asiacute fehacientemente o si
hay alguacuten otro mecanismo actuando concomitante que permita explicar las diferencias
observadas aquiacute entre sueros de fase aguda y de infectados croacutenicos
Resultados y Discusioacuten
66
532 Inmunoensayos con deteccioacuten amperomeacutetrica utilizando los antiacutegenos
recombinantes
Los bioelectrodos se ensamblaron como se describe en el inciso 41911 de
Materiales y Meacutetodos Al realizar los inmunoensayos con las diluciones pertinentes de
suero humano (muestra incoacutegnita) en caso de suero de paciente infectado (+) estaraacuten
presentes los anticuerpos IgG anti-P22 (analito de intereacutes) Cuando se sumergen en una
dilucioacuten de anticuerpos anti-IgG h conjugado con HRP (segundo anticuerpo marcado) eacuteste
quedaraacute retenido en el electrodo y frente al agregado del sustrato de la enzima (H2O2)
sobre PBS conteniendo el mediador FcMe se genera la especie que seraacute electro-reducida
sobre el electrodo al potencial de trabajo 008 V (vs AgAgCl ver inciso 420 2) A los
fines de claridad en la Fig 58 se reformula el esquema de funcionamiento del biosensor
previamente esquematizado (Fig 212) para el caso particular aquiacute detallado donde el
Ang es la proteiacutena P22C
Proteiacutena recombinante IgG a-IgGh conjugada a HRP
Bloqueante IgG humana ferrocenometanol
Figura 58 Sobre la superficie del electrodo se fija la proteiacutena P22C que capturaraacute los anticuerpos especiacuteficos
si estaacuten presentes en el suero El revelado se realiza con un segundo anticuerpo especiacutefico para IgG humana
marcado con HRP que en presencia de H2O2 oxida el mediador FcMe que se reduce sobre la superficie del
electrodo generando la sentildeal analiacutetica
En la Fig 59 se muestran tres amperogramas representativos obtenidos cuando se
ensayaron sueros confirmados (+) sueros confirmados (-) y blancos (sin suero alguno)
Los valores de corrientes se corrigieron por los valores de aacuterea reales determinados
mediante voltametriacutea ciacuteclica a distintas velocidades de soluciones de ioacuten ferricianuro
(punto 41932 seccioacuten Materiales y Meacutetodos)
Resultados y Discusioacuten
67
Figura 59 Amperometriacuteas comparativas con bioelectrodos ensamblados con la proteiacutena P22C
En la Tabla 54 se resumen los resultados de los ensayos sobre muestras confirmadas
positivas negativas y blanco
Tabla 54 Valores promedios de la corriente cataliacutetica diferencial obtenidas utilizando bioelectrodos
ensamblados con el antiacutegeno P22C
DS desviacioacuten estaacutendar
Las diferencias en las sentildeales registradas fueron estadiacutesticamente significativas
verificaacutendose la potencialidad del uso de esta metodologiacutea para discriminar entre sueros de
pacientes infectados con T gondii de sueros de pacientes no infectados Los ensayos
electroquiacutemicos preliminares informados permiten pensar en el desarrollo de un biosensor
amperomeacutetrico A futuro seriacutea deseable poder establecer un biosensor electroquiacutemico
basaacutendonos en el esquema B de los ELISA presentados en este trabajo de Tesis que
permita la discriminacioacuten entre sueros de pacientes cursando infeccioacuten aguda de sueros de
pacientes con infeccioacuten croacutenica
54 Determinacioacuten de la actividad electroquiacutemica del glicerol en medio acuoso
Si bien desde hace varios antildeos se ha estudiado la oxidacioacuten electrocataliacutetica de
polialcoholes auacuten no existe acuerdo acerca del procedimiento maacutes conveniente para su
cuantificacioacuten electroquiacutemica asiacute como tampoco ha sido posible identificar un uacutenico
mecanismo que deacute cuenta de los productos obtenidos luego de la reaccioacuten electroacutenica
(Kahyaoglu et al 1984 Kwon amp Koper 2010)
Muestra j = Icaacuterea
( A cm-2
)
DS
( A cm-2
)
Positivos -0455 0026
Negativos -0150 0021
Sin suero -0052 004
Resultados y Discusioacuten
68
Con el fin de encontrar el electrodo y las condiciones maacutes convenientes para
realizar la cuantificacioacuten del glicerol se realizaron ensayos exploratorios de
voltametriacuteas ciacuteclicas utilizando electrodos de carbono viacutetreo pasta de C (grafito y
viacutetreo) Au Pt y Ag Los medios ensayados fueron HClO4 01 M solucioacuten tampoacuten de
fosfato salino (PBS) pH 72 90 120 NaCl al 08 mv y NaOH 01 M El intervalo
de concentracioacuten de glicerol utilizado fue de 100 x 10-5
M hasta 01 M
En estos ensayos iniciales las maacuteximas sentildeales se obtuvieron con electrodos de Au
en medio alcalino (NaOH 01 M) coincidiendo con lo descripto por Lamy (Kahyaoglu
et al 1984) A modo ilustrativo en la Fig 510 se observan dos voltametriacuteas ciacuteclicas
para electrodos de oro y de platino en medio alcalino
Figura 510 Voltamperogramas tiacutepicos para soluciones de glicerol 10-2
M en soluciones de base fuerte
(NaOH 01M) utilizando electrodos de trabajo de Au (izquierda) y Pt (derecha)
En una etapa posterior se verificoacute que las sentildeales obtenidas Ip respondiacutean
proporcionalmente a la concentracioacuten de glicerol Se realizoacute una curva de calibracioacuten en
el intervalo de concentraciones de 50 x 10-4
a 10 x 10-2
M Todas las mediciones se
hicieron por triplicado La Tabla 55 muestra las medias de las corrientes de pico
obtenidas para cada concentracioacuten ensayada con su correspondiente desviacuteo estaacutendar La
corriente de pico se midioacute tomando una liacutenea de base recta a un valor de potencial de
010 V plusmn 005 V usando algoritmos propios del programa GPES 49
Tabla 55 Valores medios de corriente obtenidos por voltametriacutea ciacuteclica para la oxidacioacuten del
glicerol en medio alcalino (NaOH 01 M) sobre electrodos de oro
[Glicerol]
(mM)
Ip
(microA cm-2
)
DS Ip
(microA cm-2
)
050 18 032
100 28 038
200 74 041
500 17 035
750 262 055
100 347 053
-50E-05
00E+00
50E-05
10E-04
15E-04
20E-04
25E-04
-0400 -0200 0000 0200 0400 0600 0800
E(V)
i(A
)
-40E-06
00E+00
40E-06
80E-06
12E-05
16E-05
-1000 -0800 -0600 -0400 -0200 0000 0200 0400
E(V)
i(A
)
Resultados y Discusioacuten
69
En la Fig 511 se presenta la dependencia de la corriente de pico
voltamperomeacutetrica con la concentracioacuten de glicerol Las barras de error corresponden a
las desviaciones estaacutendar de cada medida realizada por triplicados independientes Se
ajustaron estos valores a una recta con el meacutetodo de los miacutenimos cuadrados y se obtuvo
la siguiente ecuacioacuten
[51]
donde IpA estaacute en microA cm-2
y [glicerol] en mM El valor de coeficiente de regresioacuten
(R2) obtenido fue de 09980
Figura 511 Dependencia de la corriente de pico voltamperomeacutetrica con la concentracioacuten de glicerol en
medio alcalino (NaOH 01 M) Se muestran los valores promedios de tres medidas independientes Las
barras de error se corresponden a los desviacuteos estaacutendares
En estas condiciones de trabajo el pico de corriente oxidativa tiene dependencia
lineal con la concentracioacuten de glicerol En funcioacuten de estos resultados se orientoacute la
buacutesqueda hacia una metodologiacutea que permitiese determinar al glicerol en
concentraciones de 10-5
M o menores Para esto iniciamos ensayos con teacutecnica
amperomeacutetrica
Se realizaron los ensayos amperomeacutetricos como se describe en el punto 4202 de la
seccioacuten Materiales y Meacutetodos La Fig 512 muestra el resultado de una amperometriacutea
tiacutepica para una solucioacuten de glicerol
Resultados y Discusioacuten
70
t s
0 50 100 150 200 250 300 350 400 450
I A
0
2
4
6
Figura 512 Amperometriacutea tiacutepica de una muestra con glicerol (concentracioacuten en celda 1 mM) Se dejoacute
estabilizar la corriente para una solucioacuten de NaOH 01 M y a los 50 segundos se realizoacute el agregado de la
muestra con glicerol y se midioacute la corriente hasta los 400 segundos
Se ensayaron soluciones de glicerol cuya concentracioacuten en la celda electroliacutetica
fueron desde 001 mM hasta 5 mM Como blanco se utilizoacute solucioacuten de NaOH 01 M
La corriente cataliacutetica se midioacute como la diferencia entre la corriente final y la inicial
(punto 4202 seccioacuten Materiales y Meacutetodos) A este valor de corriente se lo dividioacute
por el valor de aacuterea real del electrodo medida anteriormente esta densidad de corriente
(IcA) se tomoacute como la sentildeal analiacutetica En la Tabla 56 se muestran las medias de las
sentildeales obtenidas para cada concentracioacuten de glicerol ensayada con su correspondiente
desviacuteo estaacutendar
Tabla 56 Valores medios de densidades de corriente obtenidos por amperometriacutea para la oxidacioacuten de
glicerol en medio alcalino (NaOH 01 M)
[Glicerol]
(mM)
Ic A
( A cm-2
)
DS
( A cm-2
)
0000 0447 0029
0010 0763 0016
0025 1098 0068
0050 1510 0055
0100 285 049
0250 609 036
0500 1245 033
0750 1730 0097
100 2361 0099
150 3445 033
175 3997 020
200 4613 045
Resultados y Discusioacuten
71
En la Fig 513 se presenta la recta de regresioacuten lineal obtenida a partir de los
valores promedio de densidades de corriente para soluciones de glicerol en el intervalo
de concentraciones de 0025 mM y 2 mM Las barras de error corresponden a las
desviaciones estaacutendares de cada medida La ecuacioacuten de la recta obtenida por el meacutetodo
de miacutenimos cuadrados fue
[52]
Donde IcA estaacute en microA cm-2
y [Glicerol] en mM el valor del coeficiente de
regresioacuten (R2) obtenido fue de 09950
[Glicerol] mM
000 025 050 075 100 125 150 175 200
I cA
m
A c
m-2
0
10
20
30
40
50
Figura 513 Curva de calibracioacuten obtenida para glicerol en medio alcalino (NaOH 01 M) con la teacutecnica
amperomeacutetrica Se muestran los valores promedios de tres medidas independientes para cada solucioacuten
Las barras de error que se muestran corresponden al DS de cada punto
Las cifras de meacuterito para esta teacutecnica resultaron ser
Liacutemite de deteccioacuten 10 M
Liacutemite de cuantificacioacuten 24 M
Liacutemite de discriminacioacuten 10 M
Intervalo de linealidad 0024 mM ndash 200 mM
55 Cuantificacioacuten de glicerol en medios acuosos complejos
El glicerol es corrientemente utilizado como principal fuente de carbono en cultivos
bacterianos siendo degradado eficientemente por sistemas enzimaacuteticos que utilizan
mecanismos redox Por lo tanto se comenzoacute a estudiar la posible cuantificacioacuten
electroquiacutemica de este alcohol intentando detectar concentraciones del orden 10-5
M o
Resultados y Discusioacuten
72
menores para poder asiacute evidenciar su consumo en medios de cultivos bacterianos que
contienen glicerol como nutriente El meacutetodo amperomeacutetrico con electrodo de oro no
fue lo suficientemente selectivo para glicerol cuando este se encontraba en matrices
complejas (no se muestran los resultados) por lo tanto al momento de cuantificarlo en
medios de cultivos bacterianos tuvimos que optar por otra metodologiacutea
Sobre la base del trabajo de Tuntildeoacuten-Blanco y col (Aacutelvarez-Gonzaacutelez et al 2000)
se busco desarrollar un biosensor selectivo para este analito
Para verificar la funcionalidad del modelo propuesto se realizaron ensayos
espectrofotomeacutetricos La coenzima NAD(H) en su forma reducida (NADH) presenta un
maacuteximo de absorcioacuten a 340 nm ausente en la forma oxidada (NAD+) Puede apreciarse
en la Fig 514 que el mediador electroquiacutemico Fe(CN)63-
presenta un maacuteximo de
absorcioacuten a 420 nm ausente en la forma reducida Fe(CN)64-
En un primer ensayo se
verificoacute espectrofotomeacutetricamente que la longitud de onda escogida podiacutea utilizarse
para el seguimiento de la reaccioacuten En una serie de ensayos posteriores se monitoreoacute la
reaccioacuten enzimaacutetica en presencia y ausencia del mediador electroquiacutemico haciendo uso
de estas propiedades espectrales
Figura 514 Espectros de absorcioacuten UV-visible para las especies Fe(CN)33-
1 mM y Fe(CN)34-
1 mM
Ambas especies fueron disueltas en solucioacuten tampoacuten carbonato pH 105 Puede apreciarse claramente que
el maacuteximo de absorcioacuten a 420 nm presente en el Fe(CN)63-
se encuentra ausente en el Fe(CN)64-
La
velocidad de barrido fue 1200 nm min-1
551 Evaluacioacuten del modelo propuesto por medio de lecturas
espectrofotomeacutetricas
El primer ensayo para validar el modelo propuesto fue seleccionar la longitud de
onda oacuteptima para el seguimiento espectrofotomeacutetrico A tal fin se llevaron adelante dos
0
025
05
075
1
125
15
175
2
225
25
275
260 280 300 320 340 360 380 400 420 440 460 480 500
Longitud de onda (nm)
Ab
sorb
an
cia
Ferricianuro 1 mM
Ferrocianuro 1 mM
Resultados y Discusioacuten
73
reacciones a) glicerol disuelto en medio 7H9 coenzima Fe(CN)63-
y enzima GlDH y
b) glicerol disuelto en medio 7H9 coenzima Fe(CN)63-
pero sin la enzima GlDH En
ambos casos se realizoacute un barrido espectral de 320 a 480 nm registraacutendose la
absorbancia a una velocidad de barrido de 1200 nm min-1
cada 10 min Ambas
reacciones se llevaron a cabo en solucioacuten tampoacuten carbonato pH 105 En la Fig 515 se
muestran los barridos espectrales obtenidos para cada reaccioacuten y en ella puede
apreciarse que la mayor diferencia se presenta a la longitud de onda prevista (420 nm)
Figura 515 Espectros de absorcioacuten UV-visible para mezclas de reaccioacuten (A) En presencia de enzima
GlDH (B) Sin enzima GlDH Barrido espectral cada 10 min
Para elucidar si el consumo de Fe(CN)63-
observado se correspondiacutea
cuantitativamente con el NADH generado y en consecuencia con el glicerol
consumido se tuvieron en cuenta las siguientes reacciones
glicerol + Fe(CN)63-
DHA + Fe(CN)64-
(1)
glicerol + NAD+ NADH + DHA (2)
Se realizaron series de 3 reacciones en paralelo a saber a) blanco de reaccioacuten (BR)
con enzima GlDH NAD+ y Fe(CN)6
3- en ausencia de glicerol donde se siguioacute la
absorbancia a 420 nm b) reaccioacuten (1) con enzima GlDH NAD+ Fe(CN)6
3- y glicerol
donde se siguioacute la desaparicioacuten de Fe(CN)63-
a 420 nm c) reaccioacuten (2) con enzima
GlDH NAD+ y glicerol donde se siguioacute la aparicioacuten de NADH a 340 nm Debe tenerse
en cuenta por un lado que el NAD+ es reducido a NADH en la reaccioacuten (2) no se
regenera mientras que en la reaccioacuten (1) se regenera por la presencia del anioacuten
Fe(CN)63-
Esto implica que si bien ambas reacciones se lentifican con el paso del
tiempo a causa del consumo de glicerol (y acumulacioacuten de DHA) la reaccioacuten (2) se
lentifica maacutes que la (1) porque se consumen tanto el glicerol como el NAD+
y se
acumulan ambos productos de reaccioacuten (DHA y NADH) Los resultados pueden verse
en la Fig 516
A
0
015
03
045
06
075
09
105
12
135
15
320 340 360 380 400 420 440 460 480
Longitud de onda (nm)
Ab
sorb
an
cia
t = 0
t = 10 min
t = 20 min
t =30 min
t = 40 min
t = 50 min
t = 60 min
B
0
015
03
045
06
075
09
105
12
135
15
320 340 360 380 400 420 440 460 480
Longitud de onda (nm)
Ab
sorb
an
cia
t = 0 min
t = 10 min
t = 20 min
t = 30 min
t = 40 min
t = 50 min
t = 60 min
GlDHNAD+
GlDH
Resultados y Discusioacuten
74
Figura 516 Absorbancias registradas a 420 nm durante las reacciones descriptas en el texto A) Blanco
de reaccioacuten (BR) y reaccioacuten (1) B) Reaccioacuten (2) C) Segmento inicial de la curva representada en
B) a partir de la cual se calculoacute el valor liacutemite de la velocidad inicial de reaccioacuten Se muestra un
experimento representativo de un original y replicado
Se asumioacute que la reaccioacuten (1) transcurre a una velocidad constante en las
condiciones en que se llevoacute a cabo El anaacutelisis estadiacutestico demuestra que hay una ligera
tendencia a la no linealidad evidenciada por la distribucioacuten de los residuos No
obstante siendo las variancias iguales se consideroacute que no hay un alejamiento
significativo de la linealidad Por ello en los caacutelculos de variacioacuten de la concentracioacuten
de coenzima a lo largo del tiempo de reaccioacuten se tuvo en cuenta el cambio que se
produciriacutea si la velocidad de reaccioacuten se mantuviera constante e igual a la velocidad
inicial Para el caso del NAD+ consumido (o NADH generado) en la reaccioacuten (2)
tenemos
[53]
Asumiendo que en el intervalo de concentraciones de trabajo se cumple la ley de
Beer la ec [53] puede reescribirse como
[54]
Si la velocidad de la reaccioacuten enzimaacutetica se mantiene aproximadamente igual a la
velocidad inicial por la regeneracioacuten de la coenzima se puede admitir que la velocidad
A
05
056
062
068
074
08
086
092
098
104
11
0 600 1200 1800 2400 3000 3600
tiempo (s)
Ab
s 4
20
nm
B
0
004
008
012
016
02
024
028
032
036
04
044
048
0 600 1200 1800 2400 3000 3600tiempo (s)
Ab
s 3
40
nm
C
y = 00004405x
R2 = 09983921
0
0035
007
0105
014
0175
021
0 60 120 180 240 300 360 420 480
tiempo (s)
Ab
s 3
40
nm R
2 = 09984
Resultados y Discusioacuten
75
de reaccioacuten es constante (reaccioacuten de orden cero para los reactivos) pudieacutendose expresar
la ec [54] en la siguiente forma
b
k
tb
tk
tb
Abs
nmNADHnmNADHnmNADH
nm
340340340
340 [55]
donde k es la constante de velocidad para esa reaccioacuten en unidades de absorbancia por
unidad de tiempo (s-1
) y se obtiene como la pendiente del segmento lineal de la curva de
la Fig 516 B presentado en la Fig 516 C
La variacioacuten de concentracioacuten total de coenzima se obtiene multiplicando el valor
de velocidad por la variacioacuten de tiempo total
[56]
siendo los valores de los paraacutemetros y variables en cuestioacuten
εNADH 340nm = 6220 M-1
cm-1
Δt = 3600 s
b = 1 cm
k = 44 x 10-4
s-1
resultando
[57]
La variacioacuten de concentracioacuten del mediador seraacute
[58]
nmCNFe 420)( 36
= 1080 M-1
cm-1
ΔAbs420nm = 052
que reemplazando en la ec [58] arroja
M [59]
La variacioacuten de absorbancia observada en el blanco de reaccioacuten a lo largo de una
hora fue de 00046 unidades de absorbancia que representa menos del 1 de la
variacioacuten total observada en la reaccioacuten (1) Estos resultados permiten verificar que en
las condiciones de reaccioacuten el Fe(CN)63-
reducido a Fe(CN)64-
equivale
cuantitativamente al NADH generado en la reaccioacuten enzimaacutetica de acuerdo a la
siguiente estequiometriacutea
Resultados y Discusioacuten
76
2 Fe(CN)63-
+ NADH 2 Fe(CN)64-
+ NAD+ [510]
Lo mostrado corrobora la factibilidad del disentildeo de un biosensor de una sola
enzima con un mediador soluble econoacutemico
5511 Evaluacioacuten de la sentildeal con la concentracioacuten de glicerol
Para verificar si la sentildeal analiacutetica muestra dependencia con la concentracioacuten de
glicerol se realizaron 6 reacciones en paralelo registraacutendose la absorbancia a 420 nm
cada un minuto durante dos horas Se realizoacute un blanco de reaccioacuten sin glicerol y cinco
reacciones con concentraciones crecientes de glicerol Como muestras se utilizaron el
medio de cultivo de micobacterias Middlebrook 7H9 suplementado con glicerol a
distintas concentraciones En la Tabla 57 se presentan las concentraciones de glicerol
en las mezclas de reaccioacuten y en las muestras La Fig 517 muestra la absorbancia a 420
nm para las seis reacciones
Tabla 57 Concentraciones de glicerol en las mezclas de reaccioacuten
Reaccioacuten [glicerol] en mezcla
de reaccioacuten (mM) [glicerol] en muestra
(mM)
Blanco 0 0
Muestra 1 11 22
Muestra 2 082 16
Muestra 3 055 11
Muestra 4 027 55
Muestra 5 011 22
Resultados y Discusioacuten
77
Figura 517 Absorbancia a 420 nm de las mezclas de reaccioacuten descriptas en el texto ( ) 11 mM de
glicerol ( ) 082 mM de glicerol ( ) 055 mM de glicerol (o) 027 mM de glicerol (-) 011 mM de
ccedilglicerol ( ) blanco de reaccioacuten
Habiendo verificado la dependencia de la sentildeal analiacutetica con el analito de intereacutes se
procedioacute a determinar el intervalo dinaacutemico lineal Para ello se realizaron las reacciones
de color como se describe en el apartado 417 de la seccioacuten Materiales y meacutetodos Cada
reaccioacuten se hizo por triplicado En la Fig 518 se muestran resumidos los resultados
obtenidos
[Glicerol] mM
000 005 010 015 020 025 030 035 040
Ab
s 42
0 n
m
00
02
04
06
08
10
Figura 518 Curva de calibracioacuten para glicerol utilizando el meacutetodo colorimeacutetrico Se muestran los
valores promedios de tres medidas independientes Las barras de error corresponden a los desviacuteos
estaacutendares
La recta de regresioacuten que se obtuvo a partir de estos valores fue
Abs420nm = 0946 ndash 238 [glicerol] [511]
02
03
04
05
06
07
08
09
1
0 1200 2400 3600 4800 6000 7200
tiempo (s)
Ab
s 4
20
nm
Resultados y Discusioacuten
78
cuyo coeficiente de regresioacuten (R2) fue 09980 En el intervalo de concentraciones de
0025 a 027 mM la respuesta fue lineal
5512 Optimizacioacuten de condiciones para disminuir el costo operativo
Se verificoacute la posibilidad de cuantificar glicerol en medio Middlebrook 7H9
optimizando las concentraciones de reactivos y los tiempos de reaccioacuten para obtener la
maacutexima sentildeal con la mezcla maacutes econoacutemica posible Se ensayaron distintas
concentraciones de cofactor NAD+ a utilizar y 2 tiempos de reaccioacuten para una curva de
calibrado de 6 puntos consistente en un blanco y cinco estaacutendares de glicerol todos por
triplicado
Para verificar la factibilidad de disminuir la concentracioacuten de cofactor soluble sin
alterar significativamente la sensibilidad del meacutetodo se utilizoacute un disentildeo experimental
con un modelo de superficie de respuesta Como factores se tomaron la concentracioacuten
de cofactor y el tiempo de reaccioacuten Los niveles seleccionados en base a ensayos
previos fueron concentracioacuten de cofactor (NAD+) 01 mM 023 mM 037 mM y 05
mM tiempo 1 y 2 h Las respuestas que se evaluaron fueron la pendiente de una recta
de regresioacuten calculada a partir del meacutetodo de miacutenimos cuadrados y el coeficiente de
regresioacuten lineal correspondiente En la Tabla 58 se muestran los niveles parametrizados
y los valores de las respuestas obtenidas
Tabla 58 Disentildeo experimental factores parametrizados y respuestas obtenidas
Cada uno de los estaacutendares indicados en la Tabla 58 se correlaciona con una curva
de calibrado realizada En la Tabla 59 se informan los valores de concentracioacuten de
glicerol de las soluciones utilizadas para las reacciones de color y la concentracioacuten
correspondiente en la mezcla de reaccioacuten
Estaacutendar [NAD+] Tiempo Pendiente R2
4 1 -1 068 08790
7 03333 1 227 09962
8 1 1 184 09621
5 -1 1 159 09931
3 03333 -1 083 09590
2 -03333 -1 1 09850
6 -03333 1 244 09863
1 -1 -1 071 09914
Resultados y Discusioacuten
79
Tabla 59 Valores de concentracioacuten de los estaacutendares utilizados para los ensayos de optimizacioacuten
Reaccioacuten [glicerol] en mezcla
de reaccioacuten (mM) [glicerol] en muestra
(mM)
Blanco 0 0
Muestra 1 0010 02
Muestra 2 0025 05
Muestra 3 0050 10
Muestra 4 0075 15
Muestra 5 010 20
La ecuacioacuten de ajuste propuesta por el modelo de superficie de respuesta para la
pendiente fue
tBNADAm ][421 [512]
donde A y B son los coeficientes del modelo que se calculan a partir de la forma de la
superficie de respuesta e indican la dependencia de la pendiente (m) con la
concentracioacuten de cofactor ([NAD+]) y el tiempo de reaccioacuten (t) respectivamente El
anaacutelisis de los resultados indica que de los dos coeficientes solo B es significativo y su
valor es 062 mientras que A es un coeficiente no significativo Esto significa que la
pendiente de la recta de calibrado no muestra dependencia con la concentracioacuten de
cofactor NAD+ utilizado
Por otra parte el coeficiente de correlacioacuten no mostroacute dependencia con ninguno de
los factores elegidos Esto indica que el modelado de la funcioacuten deseabilidad global
queda reducido al de una sola respuesta la pendiente de la recta de calibrado y a un
uacutenico factor significativo que es el tiempo de reaccioacuten En base a estos resultados
pudimos establecer un uso miacutenimo de cofactor soluble
552 Determinacioacuten de glicerol remanente en cultivos de micobacterias
5521 Evaluacioacuten de glicerol remanente en cultivos axeacutenicos de M smegmatis
Primeramente se evaluoacute si podiacutea evidenciarse el consumo de glicerol por parte de
M smegmatis en un cultivo axeacutenico es decir conteniendo soacutelo este microorganismo
Para ello se realizaron cultivos de la micobacteria como se describe en el punto 418 de
la seccioacuten Materiales y Meacutetodos y se determinoacute el glicerol remanente haciendo uso del
meacutetodo fotomeacutetrico presentado previamente El anaacutelisis de la variancia de los valores de
absorbancia registrados y posteriormente se realizoacute un ensayo de comparaciones
muacuteltiples utilizando las pruebas de Tukey y de Bonferroni Se detectaron diferencias
estadiacutesticamente significativas en las absorbancias de las muestras del medio con M
Resultados y Discusioacuten
80
smegmatis a las 2 y 3 h de iniciados los cultivos respecto de aquellos medios
conservados en esterilidad
5522 Determinacioacuten de glicerol remanente en cultivos de micobacterias con y
sin fago D29 y ensayos controles respectivos
En una segunda serie de ensayos nos propusimos ver si habiacutea consumo diferencial
de glicerol entre cultivos de M smegmatis y cultivos de la micobacteria infectados con
el fago D29 siguiendo el protocolo descripto en el punto 4181 de la seccioacuten Materiales
y Meacutetodos En la Fig 519 se muestran los valores de absorbancia a 420 nm de las
muestras mencionadas Sobre este conjunto de datos nuevamente se realizoacute un anaacutelisis
de la variancia y ensayos de comparaciones muacuteltiples utilizando las pruebas de Tukey y
de Bonferroni
Los resultados obtenidos indican que todos los medios de cultivo a los cuales no se
le inoculoacute bacterias y aquellos medios donde se inoculoacute bacterias pero fueron
centrifugados inmediatamente despueacutes del inoacuteculo (muestras a t= 0) no mostraron
diferencias estadiacutesticamente significativas en los ensayos de comparaciones muacuteltiple
realizados Esto permite concluir que el agregado de fago y la incubacioacuten a 37 ordmC no
producen modificaciones significativas per se en las reacciones de color Por ello es
posible afirmar que en el futuro podraacuten simplificarse los controles a un uacutenico testigo
de concentracioacuten inicial conocida sin necesidad de tomar una muestra del cultivo
inmediatamente despueacutes del inoacuteculo o de la adicioacuten de fagos a los controles negativos
del ensayo
En este ensayo preliminar pudimos observar que las diferencias de absorbancia
resultaron estadiacutesticamente significativas entre los medios de cultivo donde crecieron
ceacutelulas de M smegmatis y los medios donde crecieron ceacutelulas de M smegmatis
infectadas con fago D29 tanto a las 2 como a las 4 h de iniciados los cultivos Este
resultado indicoacute que la hipoacutetesis de trabajo planteada era apropiada y en consecuencia
seriacutea factible desarrollar un meacutetodo para verificar la integridad de micobacterias en un
cultivo de las mismas
Resultados y Discusioacuten
81
Bla
nco
Med
io 0
025
00
25
+ F
ago t
= 0
00
25
C
eacutelula
s t
= 0
00
25
Ceacutel
ula
s +
Fag
o t
= 0
00
25
+ F
ago t
= 2
00
25
Ceacutel
ula
s t
= 2
00
25
Ceacutel
ula
s +
fag
o t
= 2
00
25
fa
go t
= 4
00
25
Ceacutel
ula
s t
= 4
00
25
Ceacutel
ula
s +
fag
o t
= 4
Abs
420 n
m
03
04
05
08
Figura 519 Absorbancias a 420 nm registradas para las muestras descritas Se indica concentracioacuten
inicial de glicerol en mv y tiempo de incubacioacuten a 37 ordmC El blanco corresponde al de la reaccioacuten de
color sin glicerol
553 Biosensor amperomeacutetrico a base de pasta de carbono viacutetreo modificada
En funcioacuten de los resultados previos se procedioacute al ensamblado de un biosensor
amperomeacutetrico siguiendo el esquema de reaccioacuten presentado previamente que se
reproduce en la figura 520
Figura 520 Esquema de reaccioacuten propuesto para biosensor amperomeacutetrico selectivo para glicerol La
coenzima reducida NADH se regenera a su forma oxidada NAD+ reaccionando con el Fe(CN)6
3- que se
reduce a Fe(CN)64-
Este uacuteltimo se reoxida electroquiacutemicamente sobre la superficie del electrodo
completando el ciclo cataliacutetico
Utilizando electrodos de pasta de carbono B (punto 41912 seccioacuten Materiales y
Meacutetodos) se realizaron amperometriacuteas siguiendo el protocolo descrito en el punto 4202
glicerol
DHA
GlDHox
GlDHred NAD+
NADH Mediador ox
Mediador red
e- Electrodo
Resultados y Discusioacuten
82
de la seccioacuten Materiales y Meacutetodos En la Fig 521 se muestra un amperograma tiacutepico
obtenido
Tiempo s
100 200 300 400 500
I
nA
0
20
40
60
80
100
Figura 521 A) Amperograma tiacutepico obtenido con un electrodo de trabajo de pasta de carbono B
trabajando a un potencial de 038 V Se agregaron 50 L de medio 7H9 suplementado con glicerol
usualmente a los 300 s de iniciada la lectura de corriente cuando eacutesta se estabilizoacute B) Agregados
sucesivos de 50 microL de medio 7H9 suplementado con glicerol 20 mM sobre 200 mL de la misma
solucioacuten
En la Fig 522 se presenta la recta de regresioacuten obtenida a partir de los valores
promedios de corrientes para soluciones de glicerol en el intervalo de concentraciones
de 0062 mM y 175 mM Las barras de error corresponden a las desviaciones estaacutendar
de cada medida La ecuacioacuten de la recta obtenida por el meacutetodo de miacutenimos cuadrados
fue
[513]
donde Ic estaacute en nA y [Glicerol] en mM el valor del coeficiente de regresioacuten (R2)
obtenido fue de 09982
Las cifras de meacuterito para esta teacutecnica resultaron ser
Liacutemite de deteccioacuten 20 M
Liacutemite de cuantificacioacuten 60 M
Liacutemite de discriminacioacuten 15 M
Intervalo de linealidad 0060 mM ndash 175 mM
Tiempo s
0 500 1000 1500 2000
I
nA
0
50
100
150
200
Resultados y Discusioacuten
83
[Glicerol] mM
000 025 050 075 100 125 150 175 200
Ic
nA
0
50
100
150
200
Figura 522 Recta de calibracioacuten para glicerol utilizando el meacutetodo amperomeacutetrico descrito en el texto
Se muestran los valores promedios de corrientes liacutemite corregidas y las desviaciones estaacutendares de 3
lecturas independientes
Una vez que se preparoacute la pasta de carbono viacutetreo modificada con la enzima esta
resultoacute estable durante 10 semanas sin peacuterdida de actividad enzimaacutetica siempre que se
mantuviese seca a 4 degC Una vez que se ensambloacute el biosensor con el poliacutemero
electrodepositado pudo utilizarse durante al menos 8 horas consecutivas con una
peacuterdida de sensibilidad insignificante En efecto los cambios observados en las sentildeales
registradas de forma consecutiva se encontraron dentro del error intriacutenseco del meacutetodo
propuesto La estabilidad de un mismo biosensor durante diacuteas sucesivos se evaluoacute
realizando medidas de la misma solucioacuten y evaluando la relacioacuten sentildealruido la cuaacutel
disminuyoacute un 15 del valor original al tercer diacutea y un 50 al quinto diacutea de uso
554 Desarrollo de un biosensor a base de pasta de carbono viacutetreo y
nanotubos de carbono
Para reducir los tiempos de anaacutelisis se procuroacute disminuir el periacuteodo de
estabilizacioacuten de la corriente modificando el esquema original propuesto para el sensor
Para esto se modificoacute la pasta de carbono con nanotubos de carbono de paredes
muacuteltiples (Rubianes amp Rivas 2003) Seguacuten trabajos previos esta estrategia permite
disminuir el sobrepotencial asociado a la electrooxidacioacuten de la coenzima NADH
evitaacutendose el uso de un mediador soluble (Musameh 2002) Previo a su utilizacioacuten los
NTC fueron funcionarizados por carboxilacioacuten oxidativa siguiendo el protocolo
especificado en el punto 421 de la seccioacuten Materiales y Meacutetodos
Resultados y Discusioacuten
84
En la Fig 523 (derecha) se muestran las voltametriacuteas que se obtuvieron utilizando
un electrodo de trabajo relleno con pasta B (pasta de carbono viacutetreo modificada con
enzima GlDH al 2 en masa)
Figura 523 Voltamperogramas ciacuteclicos utilizando bioelectrodos de pasa de carbono B con GlDH
(derecha) y pasta C con GlDH y MWCNT (izquierda) En liacutenea puntuada se muestran las voltametriacuteas de
la solucioacuten NAD+ 05 mM (NH4)2SO4 25mM K2CO3 KHCO3 01 M pH 105 (blanco) En liacutenea
continua las voltametriacuteas de las mismas soluciones con el agregado de glicerol en concentracioacuten final 25
mM La velocidad de barrido fue 50 mV s-1
Se marcan los picos de corriente observados y el potencial de
pico
El sobrepotencial asociado a la electroxidacioacuten de la coenzima NADH en el
electrodo de pasta de carbono B es 70 mV menor que el informado por Wang y col Ep
= 082V sobre electrodos de carbono viacutetreo (Musameh 2002) Esta diferencia podriacutea
deberse a los distintos pH de trabajo o bien a alguna diferencia en las cualidades de la
superficie del electrodo
En la Fig 523 (izquierda) se muestran los resultados obtenidos con los electrodos
de pasta C pasta de carbono modificada con GlDH al 2 y con MWCNT al 10 en
masa En este caso vemos que el sobrepotencial asociado a la electroxidacioacuten de NADH
es 0180 V menor Ep = 057 V que el observado para la pasta B Esta diferencia
podemos atribuirla a las cualidades diferentes de las superficies del electrodo debida a la
presencia de los MWCNT Es de destacar que Wang y col en la oxidacioacuten del NADH
sobre la superficie de carbono viacutetreo modificado con MWCNT observaron dos
procesos oxidativos uno principal con un Ep de 033 V y otro secundario con Ep de
057 V que aparece como hombro del primero (ver Fig 524 reproducida de Wang y
col)
Ep = 075 V
Resultados y Discusioacuten
85
Figura 524 Reproducido de Musameh y col 2002 Voltamperogramas correspondientes a una solucioacuten 5
mM de coenzima NADH en solucioacuten tampoacuten fosfato 005 M pH 74 utilizando electrodos de trabajo de
pasta de carbono viacutetreo sin modificar (A) y modificado con MWCNT (B) Velocidad de barrido 50 mV s-1
En el voltagrama B puede apreciarse el pico principal y el secundario que aparecen como hombro del
primero
En este trabajo soacutelo se pudo identificar un uacutenico proceso oxidativo a 057 V Si bien
auacuten estamos investigando posibles causas que hayan originado esta diferencia es de
esperar que el pH sea un factor determinante ya que la oxidacioacuten de NADH a NAD+
involucra la perdida de un H+ Por otra parte en los voltagramas realizados con pasta C
se registroacute un importante aumento de las corrientes capacitivas (18 μA) en relacioacuten a
las voltametriacuteas donde se utilizaron electrodos de pasta sin MWCNT Este mismo
efecto pero en menor magnitud (55 μA) tambieacuten fue registrado por Wang y
colaboradores al trabajar con electrodo de carbono viacutetreo modificado con MWCNT
(Musameh 2002) Los resultados obtenidos por Wang y colaboradores y los de este
trabajo de Tesis se muestran comparativamente en la Tabla 510
Tabla 510 Resultados obtenidos por Musameh y col 2002 y los correspondientes a este trabajo
Musameh y col
2002 Este trabajo
Electrodo de
trabajo Cv
C v +
MWCNT Pasta B Pasta C
V barrido 50 mV s-1 50 mV s
-1
pH 74 105
Ep (V) 082 033
057 075 057
Aumento de la
I cap (μA) - 55 - 18
Resultados y Discusioacuten
86
Con estos resultados preliminares comenzamos los ensayos amperomeacutetricos para
cuantificar el glicerol remanente en los medios de cultivos de micobacterias Se llevaron
adelante distintos ensayos y nuevamente el inconveniente principal al que nos
enfrentamos fue que la respuesta no era estable en el tiempo En la Fig 525 se muestra
un amperograma obtenido con un bioelectrodo de pasta C y realizando agregados
sucesivos de un estaacutendar de glicerol 20 mM disuelto en medio Middelbrook 7H9
Con este nuevo esquema de trabajo no se logroacute acortar los tiempos de estabilizacioacuten
de la corriente Los algoritmos de correccioacuten de corriente de base que estaacuten
incorporados al programa GPES tampoco permitieron solucionar este inconveniente
Por este motivo se optoacute por utilizar teacutecnicas voltameacutetricas de pulso que en principio
permitiriacutean evitar este inconveniente
Tiempo s
0 100 200 300 400 500 600 700 800 900
I A
0
1
2
3
4
Figura 525 Amperograma obtenido con un bioelectrodo de pasta de carbono C trabajando a 05 V vs
AgAgCl A t=200 s de iniciada la lectura se agregaron 50 L de medio 7H9 y posteriormente se
realizaron agregados sucesivos de 50 L de medio 7H9 suplementado con glicerol 20 mM
5541 Ensayos de cuantificacioacuten de glicerol con el bioelectrodo desarrollado
utilizando teacutecnicas de pulso
Las teacutecnicas voltameacutetricas de pulso presentan la ventaja de permitir trabajar durante
tiempos muy reducidos en la zona de potencial donde la especie electroactiva cambia
su estado de oxidacioacuten produciendo la sentildeal analiacutetica
Se optoacute por ensayar la voltametriacutea de onda cuadrada para los futuros ensayos de
cuantificacioacuten y los experimentos preliminares procuraron establecer los valores maacutes
convenientes de los paraacutemetros relevantes de la teacutecnica como la amplitud de pulso el
escaloacuten de potencial y la frecuencia (punto 633 seccioacuten Experimentos Auxiliares)
Resultados y Discusioacuten
87
En una segunda serie de ensayos se buscoacute observar la dependencia de la corriente
de pico con la concentracioacuten de glicerol Para esto se realizaron ensayos
independientes En este esquema de trabajo surgioacute un inconveniente respecto del criterio
de medida de la corriente de pico ya que en ensayos independientes no se pudo
establecer una liacutenea de base comuacuten a todos los voltamperogramas
Se ensayaron distintos criterios para determinar una liacutenea de base apropiada como
se detalla en el punto 6331 de la seccioacuten Experimentos Auxiliares y en la Fig 526 se
muestran los voltamperogramas corregidos siguiendo el criterio elegido
Figura 526 Voltamperogramas de onda cuadrada (corregidos) obtenidos utilizando electrodos de pasta
de carbono viacutetreo modificada con GlDH y MWCNT Se muestran los voltagramas de las soluciones
blanco (helliphelliphelliphellip
) glicerol 5 mM (mdash mdash) 125 mM (mdashmdash) 25 mM (diamsdiamsdiams) 36 mM (- - -) y 50 mM (mdash bull mdash)
En la Fig 527 se muestran la dependencia de la corriente de pico con la
concentracioacuten de glicerol obtenida a partir de experimentos exploratorios uacutenicos para
cada concentracioacuten Resta a futuro repetir los experimentos para establecer el error
asociado a la metodologiacutea el intervalo dinaacutemico lineal y el liacutemite de deteccioacuten
Resultados y Discusioacuten
88
Figura 527 Dependencia de la corriente de pico registrada en la VOC en funcioacuten de la concentracioacuten de
glicerol en la celda electroquiacutemica
56 Validacioacuten de meacutetodos
De los meacutetodos desarrollados se seleccionaron aquellos dos que dieron resultados
maacutes fiables meacutetodo amperomeacutetrico utilizando un electrodo de trabajo de oro y el
meacutetodo amperomeacutetrico utilizando el biosensor con GlDH con mediador soluble Se
realizaron ensayos en paralelo con un meacutetodo alternativo ampliamente utilizado en
particular se utilizoacute un equipo comercial que utiliza tres enzimas y deteccioacuten
espectrofotomeacutetrica (Wiener lab) La Fig 528 muestra la concentracioacuten nominal versus
concentracioacuten predicha obtenida por las tres metodologiacuteas ensayando diferentes
diluciones de muestra y graficaacutendose el valor medio de 3 medidas independientes
Nominal mM
00 02 04 06 08 10
Pre
dic
ho
mM
00
02
04
06
08
10
Equipo comercial
Tip Au
Biosensor
Recta identidad
Figura 528 Concentracioacuten nominal vs predicha para las dos metodologiacuteas propuestas en este trabajo de
tesis y un meacutetodo enzimaacutetico disponible comercialmente
0
05
1
15
2
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
[Glicerol] (mM)
Ip (
uA
)
Resultados y Discusioacuten
89
Es evidente que los meacutetodos propuestos se correlacionan adecuadamente con la
recta identidad En la Fig 529 se muestran las tres regiones eliacutepticas de confianza
conjuntas (EJCR) para la pendiente y ordenada al origen En este caso puede apreciarse
que las tres elipses contienen el punto (0 1) lo que indica una buena correlacioacuten entre
los meacutetodos propuestos en el presente trabajo y un meacutetodo disponible comercialmente
Pendiente
08 09 10 11 12
Ord
enad
a al
ori
gen
-06
-04
-02
00
02
04
06
Equipo comercial
Tip Au
Biosensor
Punto (1 0)
Figura 529 Regiones eliacutepticas de confianza conjuntas para dos metodologiacuteas presentadas en este trabajo
de Tesis y un meacutetodo enzimaacutetico disponible comercialmente
En la Tabla 511 se presentan distintas metodologiacuteas publicadas en la literatura
actual en las que se referencia la cuantificacioacuten de glicerol ya sean biosensores
electroquiacutemicos u otra metodologiacutea El anaacutelisis de la Tabla 511 permite ver que la
determinacioacuten de glicerol en medios alcalinos sin presencia de interferentes puede ser
llevada a delante con metodologiacuteas econoacutemicas Debe ser considerado que cuando se
realiza la determinacioacuten de glicerol en muestras de biodiesel dicha cuantificacioacuten
requiere extraer el analito de la matriz como puede verse en los meacutetodos maacutes
recientemente propuestos (Bondioli amp Bella 2005 Silva amp Rocha 2010 Lima y col
2012 Tehrani amp Ghani 2012 Maruta amp Paixao 2012 Lourenccedilo amp Stradiotto 2009
Stradiotto y col 2009) Ya sea que se utilice deteccioacuten espectroscoacutepica o
electroquiacutemica siempre se requiere la extraccioacuten previa a la determinacioacuten del analito
Incluso la propuesta de Fernaacutendez Band y col que es el uacutenico meacutetodo que hace una
diferencia notable al comparar las cifras de meacuterito (LD 04 microM tiempo de anaacutelisis 4
min) implica un pretratamiento de la muestra (Lima y col 2012)
Resultados y Discusioacuten
90
Tabla 511 Comparacioacuten de meacutetodos para cuantificar glicerol propuestos recientemente Adaptado de
Faccendini y col 2014
Meacutetodo (Tratamientos
previos) LD
(microM)
Rango de
linealidad
(M)
Muestra
ensayada
Tiempo de
anaacutelisis
(min)
Reactivos o
accesorios
onerosos Referencia
Espectrofotomeacutetrico
(Extraccioacuten del analito) 22
4 times 10-5
a
2 times10-4
Biodiesel 20 - Bondioli amp
Bella 2005 Espectrofotomeacutetrico
(Extraccioacuten del analito) 10
5 times 10minus5
a
5 times 10minus4
Biodiesel 20 a 30 - Silva amp Rocha
2010
Espectrofluoromeacutetrico
(Extraccioacuten del analito) 04
1 times 10minus6
a
5 times 10minus4
Biodiesel 4 - Lima y
col2012
Espectrofotomeacutetrico
multienzimaacutetico No
informa 2 times 10
minus2 a
1 times 10minus1
Jugo de cantildea 5 GK GPO
ATP Kronka y col
2001
Espectrofotomeacutetrico
multienzimaacutetico 8
8 times 10minus6
a
25 times 10minus4
Suero
Humano 10
GK PK
LDH ATP
NAD+
Li y col 2001
Electroquiacutemico VPD
(Extraccioacuten del analito) 33
5 times 10minus4
a
12 times 10minus2
Biodiesel 15 - Tehrani y
Ghani 2012 Electroquiacutemico VC
(Extraccioacuten del analito) 3
33 times 10minus5
a
17 times 10minus3
Biodiesel 30 FIA Maruta y
Paixao 2012
Electroquiacutemico VC
(Extraccioacuten del analito) 25
33 times 10minus5
a
17 times 10minus3
Biodiesel 20 Cartucho de
C18
Lourenccedilo amp
Stradiotto
2009 Electroquiacutemico
amperomeacutetrico
(Extraccioacuten del analito)
No
informa 16 times 10
minus4 a
16 times 10minus3
Biodiesel 60 - Stradiotto y
col 2009
Electroquiacutemico VL
VPD amperomeacutetrico
(Extraccioacuten del analito) 10
23 times 10minus5
a
23 times 10minus4
Solucioacuten
Acuosa
pH=13 5
MWCNT
funcionalizad
os con Ag
Pop y col 2011
Electroquiacutemico
amperomeacutetrico
(Extraccioacuten del analito) 10
25 times 10minus5
a
20 times 10minus3
Solucioacuten
Acuosa
pH=13 8 -
Este Trabajo
de Tesis
Electroquiacutemico
amperomeacutetrico
(Extraccioacuten del analito) 50
5 times 10minus5
a
23 times 10minus2
Solucioacuten
Tampoacuten
Fosfato
5
(estimados) GO
Goriushnika y
col 2010
Biosensor
amperomeacutetrico 04
10 times 10minus6
a
10 times 10minus4
Jarabe de
cantildea 15
(estimados) GlDH NAD+
Aacutelvarez-
Gonzalez y
col 2000
Biosensor
amperomeacutetrico 04
1 times 10minus6
a
2 times 10minus5
Vino 3 GlDH DP
NAD+ Gamella y
col 2008
Biosensor
amperomeacutetrico 03
1 times 10minus6
a
1 times 10minus5
Vino 3 GK GPO
HRP ATP Gamella y
col 2008 Biosensor
amperomeacutetrico 4
5 times 10minus6
a
1 times 10minus4
Vino 5 GK GPO
ATP Ghica amp Brett
2006
Biosensor
amperomeacutetrico 20
70 times 10minus5
a
18 times 10minus3
Caldo
Middlebrook 10
GlDHb
NAD+ Este Trabajo
de Tesis
Del mismo modo el enfoque de Tehrani y Ghani que utilizan un electrodo de grafito
modificado con nanopartiacuteculas de nickel trabajando a pH = 13 realizan una extraccioacuten
previa de glicerol a partir de muestras de biodiesel (Tehrani amp Ghani 2012) En este
Resultados y Discusioacuten
91
caso el LD fue de 33 microM mientras que en este trabajo de Tesis utilizando el mismo
medio hemos conseguido un LD de 10 microM empleando electrodos de oro policristalino
Maruta y Paixao han propuesto recientemente un meacutetodo amperomeacutetrico usando un
electrodo de cobre que trabaja a 065 V vs AgAgCl adaptado en un sistema de FIA
(Maruta amp Paixao 2012) mientras que Lourenccedilo y Stradiotto informaron sobre un
meacutetodo electroquiacutemico que requiere la extraccioacuten acuosa del glicerol a partir de la
muestra y la purificacioacuten adicional por elucioacuten a traveacutes de un cartucho de C18 seguida
de una concentracioacuten por evaporacioacuten y finalmente un anaacutelisis mediante VC (Lourenccedilo
amp Stradiotto 2009) Tambieacuten otras propuestas informan sobre la determinacioacuten de
glicerol por amperometriacutea haciendo uso de electrodos modificados tales como
electrodos de diamante dopados con boro y modificados con nanopartiacuteculas de niacutequel
(Stradiotto y col 2009) y electrodos compuestos de nanotubos de carbono de pared
muacuteltiple funcionalizados con plata (Pop y col 2011) Si bien ambos meacutetodos se
presentan como uacutetiles se requieren diferentes pasos operativos para eliminar posibles
interferencias tales como otros alcoholes que podriacutean ser oxidados a los potenciales de
trabajo 065 V o 130 V (vs AgAgCl) respectivamente En este sentido nuestros
resultados obtenidos por amperometriacutea usando electrodos de oro en medio alcalino
acuoso (pH = 13) estaacuten en el mismo orden que los obtenidos por Pop y colaboradores
utilizando LSV (Pop y col 2011) sobre electrodos compuestos de nanotubos de
carbono de pared muacuteltiple funcionalizados con plata Efectivamente este uacuteltimo y
nuestra metodologiacutea mostraron las mejores cifras de meacuterito entre los meacutetodos
electroquiacutemicos de bajo costo que no consumen enzimas
Los meacutetodos enzimaacuteticos espectrofotomeacutetricos aunque no son laboriosos presentan
la desventaja del consumo relativamente elevado de enzima cada muestra necesita la
adicioacuten del costoso reactivo bioloacutegico ya que no puede ser reutilizado Tambieacuten los LD
de los meacutetodos espectrofotomeacutetricos enzimaacuteticos informados son generalmente
superiores a los que presentan los biosensores Puede antildeadirse que estos uacuteltimos
presentan generalmente el intervalo dinaacutemico lineal maacutes amplio en comparacioacuten con
otros enfoques ya sean electroquiacutemicos o espectrofotomeacutetricos Soacutelo la metodologiacutea de
flujo discontinuo con deteccioacuten fluoromeacutetrica propuesta por Fernaacutendez Band y col
(Lima y col 2012) muestra una sensibilidad en el mismo orden que el maacutes bajo de los
biosensores
En el anaacutelisis de los biosensores que se muestran en la Tabla 511 hay que destacar
que el propuesto por Pingarroacuten y col (Gamella y col 2008) muestra el LD y tiempo de
Resultados y Discusioacuten
92
anaacutelisis total maacutes bajo Para evaluar costos operativos se presenta en la Tabla 512 un
resumen comparativo de la cantidad y concentracioacuten de los reactivos onerosos
consumidos por biosensor o por anaacutelisis entre la propuesta de Pingarroacuten y col y la del
biosensor aquiacute propuesto
Tabla 512 Comparacioacuten entre el meacutetodo enzimaacutetico que mejores cifras de meacuterito presenta y el propuesto
en el presente trabajo de Tesis Adaptado de Faccendini y col 2014
GlDH
bisosensor Diaforasa
biosensor tetratiofulvaleno
biosensor NAD
+ por
anaacutelisis
Gamella y
col 2008 75 U 162 U 15x10-6
M 5x10-3
M Este Trabajo
de Tesis 23 U - - 5x10-4
M
Podemos afirmar que nuestra propuesta es menos costosa hecho importante a ser
evaluado cuando se va a analizar un gran nuacutemero de muestras Mediante la reduccioacuten de
la cantidad de GlDH el LD se elevoacute desde 04 hasta 20 microM aunque es adecuado auacuten
para detectar cambios de concentracioacuten de glicerol en el orden de 15 microM Al mismo
tiempo evitando el uso de diaforasas el tiempo total de anaacutelisis se extendioacute de 3 a 10
min En conjunto los resultados presentados confirman que los cambios introducidos a
los biosensores informados previamente en la literatura tales como el uso de soacutelo una
enzima en baja proporcioacuten la sustitucioacuten del mediador redox por el ferricianuro soluble
y trabajar con el cofactor NAD+ soluble proporciona un sistema fiable de bajo costo
para cuantificar el glicerol
Experimentos Auxiliares
Experimentos Auxiliares
94
6 Experimentos Auxiliares
61 Comparacioacuten de programas de prediccioacuten de epiacutetopes lineales reconocidos
por ceacutelulas B
AAPPred BcePred ABCPred BepiPred y Antigenic se ejecutaron en liacutenea En la
Tabla 61 se muestran los VPP medios (ver definicioacuten en seccioacuten Materiales y Meacutetodos
pag 11) que se obtuvieron al predecir epiacutetopes lineales reconocidos por ceacutelulas B de
todas las proteiacutenas enumeradas en la Tabla 62
Los resultados obtenidos indican que BcePred es el uacutenico programa de los
evaluados que muestra un VPP inferior al obtenido con la prediccioacuten al azar Tambieacuten
se obtuvo que soacutelo dos de los programas estudiados AAPPred y ABCpred predijeron
epiacutetopes con un VPP significativamente mayor al valor de VPP de un procedimiento de
identificacioacuten aleatoria Estos dos programas produjeron predicciones con valores
maacuteximos de 862 y 786 de VPP respectivamente
Tabla 61 Valores predictivos positivos promedio que se obtuvieron con cada uno de los programas
predictores con los que se trabajoacute
Programa
VPP
promedio
AAPPred 691
ABCPred 628
BcePred 309
BepiPred 453
Antigenic 419
Aleatorio 382
En base a estos resultados se trabajoacute con el programa AAPPred y se identificaron
las regiones que concentraban el mayor nuacutemero de epiacutetopes reconocidos por ceacutelulas B
de las proteiacutenas P22 P30 y P35 con el fin de expresar estos Angs como proteiacutenas
recombinantes y utilizarlos en el desarrollo de meacutetodos de diagnoacutestico de la
toxoplasmosis aguda
Experimentos Auxiliares
95
Tabla 62 Base de datos experimental proteiacutenas seleccionadas para este estudio Se indican el nombre de
la proteiacutena el coacutedigo de acceso NCBI la longitud total (en residuos de amino aacutecidos) el
nuacutemero de epiacutetopes reales determinados experimentalmente y la localizacioacuten de los epiacutetopes o
regiones antigeacutenicas Proteiacutenas tomadas de base de datos (A) BciPep (B) VIH Inmunologiacutea
Molecular base de datos o tomado de la literatura (veacutease el nuacutemero de referencia 17 para VP1
16 para la proteiacutena N y 18 para gliadina)
Proteiacutena
Coacutedigo
NCBI
Nordm de
residuos
Cantidad de
epiacutetopes
Localizacioacuten de los epiacutetopes o regiones
antigeacutenicas
MPT70 (A) NP_217391 193 2 31-70 100-120
MSP-1 (A) BAF622801 1693 3 29-39 1594-1611 1644-1662
Exotoxina
A (A) NP_249839 638 8
297-313 324-333 354-387 412-421 510-522
528-539 557-593 596-638
GAG1 (A) P20873 504 10
11-25 113-122 142-156 176-214 216-268
280-308 312-321 330-367 406-416 428-448
Gp160 (A) NP_057856 856 13
30-141 161-191 211-231 252-281 294-344
346-413 424-511 525-558 561-615 639-701
724-747 761-778 822-855
Pr55 (B) NP_579876 132 2 11-38 51-78
Rev (B) NP_057854 116 4 5-15 32-51 70-91 96-116
VP1 (17) ABC87248 781 12
31-41 55-65 85-95 151-161 292-392 316-326
493-500 529-539 547-554 571-578 667-707
712-722
Gliadin
(18) A27319 296 3 31-72 165-176 237-264
Proteiacutena N
(16) AAP13445 422 6 1-6 45-61 153-192 211-223 225-235 354-412
Proteasa
(B) CAB66012 99 2 1-7 36-47
62 Puesta a punto de ensayos de inmunoabsorcioacuten ligados a enzima con
deteccioacuten fotomeacutetrica
Previo al inicio de los ELISA de captura iniciamos una serie de pruebas preliminares
con el propoacutesito de
a) Diferenciar sueros de pacientes infectados de sueros de individuos sin infeccioacuten De
este modo se pretende verificar la potencial utilidad en diagnoacutestico de los antiacutegenos
propuestos corroborando que los procesos quiacutemicos llevados a cabo como por ej la
conjugacioacuten no eliminaron epiacutetopes claves
Experimentos Auxiliares
96
b) Minimizar la sentildeal en los ensayos sin suero (blanco de reactivos) es decir
disminuir el ruido de fondo asociado a interacciones inespeciacuteficas
A tales fines se realizaron ELISA indirectos utilizando los antiacutegenos recombinantes
obtenidos (marcados y sin marcar) adsorbidos sobre la placa se utilizaron sueros
tipificados y se reveloacute la presencia de IgG humana revelando con anticuerpos de cabra anti
IgG humana Los resultados obtenidos se detallan en la siguiente tabla
Tabla 63 Valores de absorbancia a 450 nm obtenidos en ELISA indirectos con deteccioacuten de IgGh con
conjugado anti IgG humana-HRP
Sueros P22C P22C-
biotina P35B
P35B -
biotina
Positivos
2 gt3 26 1900
3 2900 2 gt3
gt3 gt3 26 gt3
Negativos
13 1000 11 0800
06 0500 09 0700
11 1600 1 1000
Si bien los valores de absorbancia leiacutedos en todos los pocillos resultaron elevados
los sueros confirmados positivos dieron los valores maacutes altos de absorbancia mientras
que los sueros negativos dieron los valores maacutes bajos Las diferencias observadas entre
sueros confirmados positivos y sueros confirmados negativos permitieron asumir que
los antiacutegenos obtenidos son de posible utilidad en diagnoacutestico Ademaacutes no se
detectaron diferencias significativas entre los valores de absorbancia obtenidos
utilizando antiacutegenos marcados de aquellos obtenidos con los no marcados
permitieacutendonos pensar que la conjugacioacuten llevada a cabo no eliminoacute epiacutetopes claves
Los elevados valores de absorbancia obtenidos en este ensayo junto a otros estudios
preliminares sugieren que existe una elevada adsorcioacuten inespeciacutefica
621 Bloqueante a utilizar
Se ensayaron diversos agentes bloqueantes para minimizar las interacciones
inespeciacuteficas encontradas durante los experimentos preliminares y asiacute evitar las altas
sentildeales obtenidas en los ensayos control realizados sin suero (blanco de reactivos) y con
sueros confirmados negativos (blancos de muestra) Sobre placas comerciales de
poliestireno se procedioacute al bloqueo total con el agente bloqueante a ensayar y
posteriormente se realizoacute una incubacioacuten con y sin antiacutegeno P22C por duplicado
Finalmente se reveloacute con la enzima HPR-EAV que se une especiacuteficamente a biotina En
la Tabla 64 se muestran los valores de absorbancia a 450 nm
Experimentos Auxiliares
97
Tabla 64 Valores promedio de absorbancia a 450 nm obtenidos en los ensayos de bloqueo
450 nm Sin P22cBiot Con P22cBiot
Sin Bloqueante ------- 1162
Leche 1 0066 01445
Caseinato 1 00725 02425
Gelatina 1 00725 03925
BSA 1 00625 0192
BSA 1 Tween 002 00615 01515
En base a estos resultados se continuoacute con el uso de leche descremada como agente
bloqueante
622 Esquema A
Cuando se realizaron ELISA siguiendo el esquema A se ensayaron dos diluciones
de la HRP-EAV 12000 y 15000 Por otro lado se ensayaron distintas masas de
antiacutegenos P22C y P35B conjugados a biotina con los que se intentoacute revelar presencia
de IgM especiacuteficas Especiacuteficamente se ensayaron 2 02 y 002 g por pocillo de P35B
biotina y 5 2 02 y 002 g por pocillo de P22C biotina Con esto se buscoacute encontrar
las cantidades oacuteptimas de reactivos para poder llevar adelante estos ensayos A modo
ilustrativo en la Tabla 65 se muestra un ensayo representativo siguiendo el esquema A
Se informan solamente los valores de absorbancia a 450 nm obtenidos para sueros
provenientes de pacientes con infeccioacuten croacutenica (croacutenicos) aguda (agudos) y de
pacientes sin infeccioacuten (negativos)
Tabla 65 Valores de absorbancia a 450 nm obtenidos en ELISA siguiendo el esquema A Se muestran 3
cantidades de antiacutegeno revelador utilizadas 2 02 y 002 microg En este ensayo la dilucioacuten de la
enzima HRP-EAV fue 15000 y se utilizaron 100 microL por pocillo
Antiacutegenos
Sueros
P22C biotina ( g) P35B biotina ( g)
2 02 002 2 02 002
Negativos 0576 0294 0155 1071 0681 0566
0543 0335 0176 1079 0769 023
Croacutenicos 0469 0246 0135 103 069 0299
0514 0215 0111 0914 0567 0196
Agudos 0331 0181 0109 081 0574 0168
0555 0254 0139 0789 0391 0169
Experimentos Auxiliares
98
623 Esquema B
Cuando se realizaron ELISAs siguiendo el esquema B se ensayaron distintas masas
de antiacutegeno P22C y P35B absorbidas sobre las microplacas comerciales a saber 500
200 50 10 o 5 ng (disueltos en 100 L de solucioacuten tampoacuten carbonato pH 96) En todos
los casos se incuboacute 1h a 37 degC
Para la incubacioacuten con la proteiacutena conjugada a biotina se ensayaron 2 y 5 ug por
pocillo En la Tabla 66 se resumen los resultados obtenidos
Tabla 66 Valores de absorbancia a 450 nm obtenidos en ELISA siguiendo el esquema B Se muestran
los resultados obtenidos para dos cantidades distintas de antiacutegeno de captura (P22C) 10 y 50
ng junto a 2 cantidades de antiacutegeno revelador (P22C-biotina) utilizadas 2 y 5 microg En este
ensayo la dilucioacuten de la enzima HRP-EAV fue 12000 y se utilizaron 100 microL por pocillo
2 microg P22C biotina 5 microg P22C biotina
Masa de P22C
(ng)
Muestras
50 10 50 10
Agudos 0393 0303 0553 0450
0273 0335 0793 0367
Croacutenicos 0230 0398 0316 0345
0284 0291 0444 0493
Negativos 0392 0210 0380 0380
0286 0292 0314 0350
Sin suero 0367 0468 0415 0411
0327 0358 0468 0536
Sin Prot conjugada a
biotina ni sueros
0102 0087 0128 0079
0131 0095 0116 0104
Los resultados obtenidos indicaron que para lograr una mejor discriminacioacuten de las
muestras es conveniente utilizar mayor cantidad de masa de antiacutegeno de captura (P22C)
depositada en el pocillo Por otro lado 5 microg de antiacutegeno revelador (P22C-biotina) por
pocillo contribuyoacute a aumentar la discriminacioacuten entre las muestras sin incrementar
significativamente el ruido de fondo
Experimentos Auxiliares
99
63 Ensayos electroquiacutemicos
631 Determinacioacuten del aacuterea real de un electrodo
6311 Meacutetodo de la adsorcioacuten de O2
Se realizaron barridos de potencial como se indica en el punto 41931 de la
seccioacuten Materiales y Meacutetodos La Fig 61 muestra un voltamperograma tiacutepico obtenido
Con el valor de la carga asociada a la desorcioacuten del oacutexido de oro pudo determinarse el
valor de aacuterea electroactiva del electrodo de trabajo utilizado como se indica en el punto
41931
E V
04 06 08 10 12 14 16
I
A
-15e-5
-10e-5
-50e-6
00
50e-6
Figura 61 Voltamperograma ciacuteclico tiacutepico obtenido con electrododos de oro en medio H2SO4 05 M
velocidad de barrido 50 mV s-1
Se indica en color turquesa el pico de desorcioacuten del oacutexido de oro la carga
(Q) obtenida del aacuterea encerrada en la curva se utilizoacute para determinar el aacuterea real de los electrodos de oro
previamente a los ensayos
6312 Voltametriacutea ciacuteclica a distintas velocidades
Se realizaron barridos de potencial a distintas velocidades como se indica en el
punto 41932 de la seccioacuten Materiales y Meacutetodos La Fig 62 muestra los voltagramas
tiacutepicos obtenidos en (A) y en (B) la dependencia de la corriente de pico Ip con la raiacutez
cuadrada de la velocidad de barrido Con el valor de la pendiente de la recta obtenida
por regresioacuten lineal pudo determinarse el valor de aacuterea electroactiva del electrodo de
trabajo utilizado como se indica en el punto 41932 habieacutendose utilizado un
coeficiente de difusioacuten del Fe(CN)63-
de 0762 cm2 s
-1 (Sawyer amp Roberts 1974)
Experimentos Auxiliares
100
E V
-02 -01 00 01 02 03 04 05 06
I
A
-20e-4
-10e-4
00
10e-4
20e-4
Figura 62 A) Voltametriacuteas ciacuteclicas de Fe(CN)63 1 mM en medio KCl 01 M a distintas velocidades de
barrido utilizando como electrodo de trabajo el biosensor amperomeacutetrico para evaluacioacuten de infeccioacuten
toxoplaacutesmica La flecha indica la direccioacuten de barrido B) Dependencia de Ip (en valores absolutos) con la
raiacutez de la velocidad de barrido el valor de pendiente de la recta de regresioacuten se utilizoacute para determinar el
aacuterea real del electrodo de trabajo
632 Cubierta del biosensor selectivo para glicerol y soluciones amortiguadoras
Se ensayaron distintos poliacutemeros para cubrir el biosensor de pasta de carbono B
utilizamos poliacutemeros de 4-vinilbenzilimine copolimerizados con cloruro de 4-
vinilbencil-trietilamonio y sulfonato de vinilfenilo (portadores de carga neta positiva y
negativa respectivamente) Si bien los poliacutemeros permitiacutean operar con complejos de
hierro utilizados como mediadores redox (Fe(CN)63-
y ferrocenometanol) no resultaron
uacutetiles en el ensamblado del biosensor por el elevado ruido de fondo que generaron
Se evaluaron distintas soluciones amortiguadoras de pH como fosfatos y
amoniacuteacoamonio Se optoacute por las soluciones de carbonato porque estas resultaron maacutes
sencillas de preparar y manipular que las amoniacales y presentaron mayor capacidad
reguladora en el pH oacuteptimo de la enzima GlDH que las de fosfato
633 Ensayos preliminares de voltametriacuteas de onda cuadrada
Los ensayos preliminares de voltametriacutea de onda cuadrada consistieron en
establecer los valores maacutes convenientes de la amplitud de pulso el escaloacuten de potencial
y la frecuencia para los futuros ensayos de cuantificacioacuten Se realizaron los voltagramas
en tres series de ensayos a seis valores de frecuencia 10 20 30 40 60 y 70 Hz
Los valores de salto de potencial ( ES) y amplitud de pulso ( E) utilizados en las
tres series de ensayos realizados se resumen en la siguiente tabla
(velocidad barrido)12 V12 s-12
006 008 010 012 014 016 018 020 022 024
Ip
A
40e-5
60e-5
80e-5
10e-4
12e-4
14e-4
16e-4
18e-4
20e-4
Experimentos Auxiliares
101
Tabla 67 Valores de salto de potencial y amplitud de onda cuadrada utilizados en los ensayos
voltameacutetricos
Serie 1 Serie 2 Serie 3
ES (mV) 5 5 10
E (mV) 25 50 50
En las 3 series de ensayos se observoacute que al aumentar la frecuencia la corriente de
pico no se incrementaba y el pico de corriente se deformaba aumentando
considerablemente el ruido Las mejores relaciones sentildealruido en las tres series de
ensayos se obtuvieron trabajando a 10 Hz Por su parte cuando se utilizoacute un escaloacuten de
potencial de 10 mV el pico de corriente se deformoacute levemente por lo que se optoacute por
trabajar con un ES = 5 mV Cuando la amplitud del pulso fue 50 mV se obtuvieron
mayores intensidades de corriente sin deformacioacuten de pico escogieacutendose en
consecuencia este valor En la Fig 63 se muestran los voltamperogramas obtenidos en
los ensayos de la serie 2 a una frecuencia de 10 Hz
Figura 63 Voltagramas de onda cuadrada obtenidos utilizando bioelectrodos de pasta de carbono viacutetreo
modificada con GlDH y MWCNT En liacutenea clara se muestra el voltagrama de la solucioacuten NAD+ 05 mM
(NH4)2SO4 25 mM K2CO3 KHCO3 100 mM pH 105 con medio Middelbrook 7H9 Superpuestos se
detallan los voltagramas de la misma solucioacuten luego del agregado de glicerol 100 M para llevar a
concentracioacuten final 25 mM (- - -) y 50 mM (____
)
6331 Seleccioacuten de un meacutetodo apropiado para establecer la liacutenea de base
Se buscoacute establecer una liacutenea de base para corregir los voltagramas obtenidos
utilizando algoritmos presentes en el programa GPES Se intentoacute con algoritmos de
correccioacuten que permiten establecer una liacutenea polinoacutemica ad-hoc para cada voltagrama
utilizando entre 2 y 5 puntos de la curva experimental Sin embargo las sentildeales
corregidas presentaban picos de corrientes con valores de ancho a la altura media Wfrac12
entre 0180 y 0220 V valores que resultan elevados comparados con 0123 Vn el valor
de referencia para este paraacutemetro en VOC donde n es el nuacutemero de electrones
Experimentos Auxiliares
102
intercambiados en la reaccioacuten Finalmente a cada VOC se les restoacute la VOC del blanco
buscaacutendose el pico de corriente con un algoritmo de buacutesqueda semiautomaacutetica del
programa GPES con una liacutenea de base recta y marcando manualmente el inicio y final
del pico establecieacutendose los mismos valores de potencial de inicio y finalizacioacuten del
pico de corriente en todos los voltamperogramas De este modo se obtuvieron picos
cuyos Wfrac12 eran proacuteximos al valor teoacutericamente predicho
Conclusiones
Conclusiones
104
7 Conclusiones
1- Se pudo encontrar cual de los programas de libre acceso para predecir epiacutetopes
lineales reconocidos por ceacutelulas B es el maacutes conveniente al momento de seleccionar
antiacutegenos con fines diagnoacutesticos
2- Se pudieron clonar expresar en forma soluble y marcar con biotina fragmentos
de antiacutegenos de toxoplasmosis de fase aguda que presentan alta concentracioacuten de
determinantes antigeacutenicos
3- Se verificoacute la utilidad de los antiacutegenos obtenidos para su posterior uso en el
ensamblado de bioelectrodos para diagnoacutestico de infeccioacuten aguda de toxoplasmosis
4- Se pudo cuantificar glicerol en muestras sencillas con un electrodo versaacutetil de
oro policristalino por medio de una metodologiacutea amperomeacutetrica a 01 V en medio
NaOH 01 M y con un tiempo de anaacutelisis de 8 min liacutemite de deteccioacuten 10 microM y un
intervalo de linealidad de 0024 a 200 mM
5- Se pudo cuantificar glicerol en medios de cultivo de micobacterias El meacutetodo
consiste en una amperometriacutea que emplea un bioelectrodo selectivo para glicerol
compuesto de pasta de C modificada con glicerol deshidrogenasa y lleva un tiempo de
anaacutelisis de 10 min liacutemite de deteccioacuten 20 microM y un rango de linealidad de 0060 a 175
mM Este meacutetodo podriacutea en un futuro ser uacutetil para identificar muestras de pacientes con
tuberculosis activa en un menor tiempo de anaacutelisis al actualmente empleado
6- Los meacutetodos para cuantificar glicerol aquiacute presentados fueron validados frente
a un equipo enzimaacutetico disponible comercialmente
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faciliten la determinacioacuten de analitos de intereacutes en el
campo de la Salud y las fuentes de energiacutea renovables
Licenciado en Biotecnologiacutea Pablo Luis Faccendini
Universidad Nacional de Rosario
Esta Tesis es presentada como parte de los requisitos para optar al grado
acadeacutemico de Doctor en Ciencias Quiacutemicas de la Universidad Nacional de Rosario y
no ha sido presentada previamente para la obtencioacuten de otro tiacutetulo en esta u otra
Universidad La misma contiene los resultados obtenidos en investigaciones llevadas a
cabo en Instituto de Quiacutemica Rosario dependiente de la Facultad de Cs Bioquiacutemicas y
Farmaceacuteuticas durante el periacuteodo comprendido entre el 1 de abril de 2009 y el 18 de
febrero de 2014 bajo la direccioacuten de la Dra Claudia Marina Lagier
Iacutendice
i
Iacutendice
1 Resumen vi
1 Summary viii
Publicaciones x
Abreviaturas y Siacutembolos xii
2 Introduccioacuten 1
21 Toxoplasmosis 1
211 Generalidades 1
212 Toxoplasma gondii 2
213 Diagnoacutestico 4
2131 Meacutetodos de diagnoacutestico 4
2132 Importancia del correcto diagnoacutestico en la embarazada 6
2133 Diagnoacutestico en la embarazada 6
2134 Ensayo de inmunoadsorcioacuten ligado a enzima 7
21341 Esquema de captura o tipo ―Sandwich 7
2135 Obtencioacuten de antiacutegenos para diagnoacutestico 9
214 Prediccioacuten de epiacutetopes reconocidos por ceacutelulas B 10
22 Tuberculosis 13
221 Generalidades 13
222 Mycobacterium tuberculosis 13
223 Diagnoacutestico 14
23 Biodiesel 16
231 Determinacioacuten de glicerol libre en biodiesel 16
24 Marco teoacuterico de las teacutecnicas electroquiacutemicas utilizadas 18
241 Cronoampreometriacutea 20
242 Teacutecnicas voltameacutetricas 21
2421 Voltametriacutea de barrido lineal 22
2422 Voltametriacutea ciacuteclica 23
Iacutendice
ii
243 Teacutecnicas de pulso 24
2431 Voltamperometriacutea onda cuadrada VOC 24
25 Biosensores 27
251 Superficie de bioreconocimiento en biosensores 28
252 Biosensores amperomeacutetricos 29
253 Biosensores de uso cliacutenico 29
2531 Biosensores para evaluacioacuten de infeccioacuten toxoplaacutesmica 32
254 Biosensores para cuantificacioacuten de glicerol 32
3 Objetivos 37
31 Objetivos generales 37
32 Objetivos Particulares 37
4 Materiales y meacutetodos 39
41 Reactivos y medios de cultivos 39
411 Reactivos 39
412 Medios de cultivos 40
42 Cepas bacterianas 40
43 Bacterioacutefagos 41
44 Plaacutesmidos 41
45 Reaccioacuten en cadena de la polimerasa 41
46 Electroforesis de ADN en geles de agarosa 42
47 Minipreparacioacuten de ADN plasmiacutedico 42
48 Purificacioacuten del producto de amplificacioacuten 43
49 Prueba de expresioacuten de proteiacutenas de fusioacuten a TRX y a ―cola
de histidinas 43
410 Expresioacuten y purificacioacuten preparativas de antiacutegenos recombinantes 43
411 Separacioacuten de proteiacutenas mediante SDS-PAGE 44
412 Cuantificacioacuten de proteiacutenas 44
413 Reaccioacuten de conjugacioacuten biotina-antiacutegeno 44
Iacutendice
iii
414 Revelado cromogeacutenico de la reaccioacuten de conjugacioacuten 45
415 Mediciones espectrofotomeacutetricas 45
416 Ensayos de inmunoabsorcioacuten ligados a enzima con deteccioacuten
fotomeacutetrica 45
4161 Esquema A 46
4162 Esquema B 46
417 Reaccioacuten de color para determinacioacuten cuantitativa de glicerol por meacutetodo
espectrofotomeacutetrico 47
418 Determinacioacuten de glicerol remanente en cultivos de micobacterias 47
4181 Determinacioacuten de glicerol remanente en cultivos de micobacterias
con y sin fago D29 y ensayos controles respectivos 48
419 Instrumental electroquiacutemico 48
4191 Electrodos de trabajo 48
41911 Bioelectrodo para evaluacioacuten de infeccioacuten toxoplaacutesmica 48
41912 Electrodos para cuantificacioacuten de glicerol 49
4192 Limpieza de electrodos 50
4193 Determinacioacuten del aacuterea real del electrodo 50
41931 Medicioacuten de la adsorcioacuten de oxiacutegeno 50
41932 Voltametriacutea ciacuteclica de ferricianuro de potasio 51
420 Medidas electroquiacutemicas 51
4201 Mediciones amperomeacutetricas para evaluacioacuten de infeccioacuten
toxoplaacutesmica 51
4202 Mediciones amperomeacutetricas para cuantificacioacuten de glicerol 52
42021 Amperometriacuteas con tip de oro 52
42022 Amperometriacuteas con electrodos de pasta de C 52
4203 Voltamperometriacutea de onda cuadrada 53
421 Funcionalizacioacuten de nanotubos de carbono 53
422 Programas de prediccioacuten de epiacutetopes lineales reconocidos por ceacutelulas B 54
Iacutendice
iv
4221 Base de datos de proteiacutenas 54
4222 Programas utilizados 54
423 Anaacutelisis de Datos 54
424 Caacutelculos estadiacutesticos y disentildeo experimental 55
5 Resultados y discusioacuten 57
51 Evaluacioacuten de antiacutegenos recombinantes de T gondii 57
511 Antiacutegeno P30 57
512 Antiacutegeno P22 58
513 Antiacutegeno P35 59
52 Marcado de antiacutegenos recombinantes de T gondii 60
53 Inmunoensayos 61
531 Inmunoensayos con deteccioacuten fotomeacutetrica 61
5311 Evaluacioacuten del esquema A 61
5312 Esquema B 62
532 Inmunoensayos con deteccioacuten amperomeacutetrica utilizando los antiacutegenos
recombinantes 66
54 Determinacioacuten de la actividad electroquiacutemica del glicerol en medio
acuoso 67
55 Cuantificacioacuten de glicerol en medios acuosos complejos 71
551 Evaluacioacuten del modelo propuesto por medio de lecturas
espectrofotomeacutetricas 72
5511 Evaluacioacuten de la sentildeal con la concentracioacuten de glicerol 76
5512 Optimizacioacuten de condiciones para disminuir el costo operativo 78
552 Determinacioacuten de glicerol remanente en cultivos de micobacterias 79
5521 Evaluacioacuten de glicerol remanente en cultivos axeacutenicos de M
smegmatis 79
5522 Determinacioacuten de glicerol remanente en cultivos de micobacterias
con y sin fago D29 y ensayos controles respectivos 80
Iacutendice
v
553 Biosensor amperomeacutetrico a base de pasta de carbono viacutetreo
modificada 81
554 Desarrollo de un biosensor a base de pasta de carbono viacutetreo y
nanotubos de carbono 83
5541 Ensayos de cuantificacioacuten de glicerol con el bioelectrodo
desarrollado utilizando teacutecnicas de pulso 86
56 Validacioacuten de meacutetodos 88
6 Experimentos Auxiliares 94
61 Comparacioacuten de programas de prediccioacuten de epiacutetopes lineales reconocidos
por ceacutelulas B 94
62 Puesta a punto de ensayos de inmunoabsorcioacuten ligados a enzima con
deteccioacuten fotomeacutetrica 95
621 Bloqueante a utilizar 96
622 Esquema A 97
623 Esquema B 98
63 Ensayos electroquiacutemicos 99
631 Determinacioacuten del aacuterea real de un electrodo 99
6311 Meacutetodo de la adsorcioacuten de O2 99
6312 Voltametriacutea ciacuteclica a distintas velocidades 99
632 Cubierta del biosensor selectivo para glicerol y soluciones
amortiguadoras 100
633 Ensayos preliminares de voltametriacuteas de onda cuadrada 100
6331 Seleccioacuten de un meacutetodo apropiado para establecer la liacutenea
de base 101
7 Conclusiones 104
8 Bibliografiacutea 106
Resumen
vi
1 Resumen
Este trabajo de Tesis se orientoacute al desarrollo de meacutetodos analiacuteticos alternativos a los
hoy vigentes que faciliten la determinacioacuten de compuestos de intereacutes tanto para
diagnoacutestico cliacutenico como para la industria de combustibles alternativos Se realizaron
aportes para tres situaciones de relevancia diagnoacutestico de toxoplasmosis tuberculosis y
evaluacioacuten de calidad de biodiesel
La toxoplasmosis es una parasitosis causada por Toxoplasma gondii que afecta a
humanos sin generar complicaciones excepto cuando los infectados son
inmunodeprimidos o mujeres embarazadas que no cursaron previamente la enfermedad
En este caso el paraacutesito puede atravesar placenta generando infeccioacuten congeacutenita del
feto pudiendo producirle graves consecuencias que pueden llegar a la muerte Una de
las teacutecnicas de diagnoacutestico utiliza el ensayo de inmunoadsorcioacuten ligado a enzima
permitiendo la deteccioacuten de anticuerpos especiacuteficos contra el paraacutesito los cuales son
indicadores de existencia de infeccioacuten No obstante para detectar toxoplasmosis aguda
al diacutea de hoy se carece de una estandarizacioacuten confiable principalmente en la
preparacioacuten del antiacutegeno Por ello en este trabajo se procuroacute identificar regiones donde
se codificaraacuten algunos marcadores de fase aguda que concentraraacuten una alta proporcioacuten
de determinantes antigeacutenicos para luego clonarlas expresarlas como proteiacutenas
recombinantes marcarlas con biotina y asiacute utilizarlas como sistema de revelado de
anticuerpos especiacuteficos contra proteiacutenas de T gondii Los inmunoensayos aquiacute
presentados proponen una metodologiacutea que permitiraacute en un futuro distinguir sueros
provenientes de individuos con infeccioacuten aguda de aquellos con infeccioacuten croacutenica o no
infectados
La tuberculosis es una enfermedad infecto-contagiosa causada por la bacteria
Mycobacterium tuberculosis Su diagnoacutestico se basa en una serie de estudios que
finaliza con la identificacioacuten del agente etioloacutegico en cultivos obtenidos a partir de
esputo Esta identificacioacuten puede demorar aproximadamente dos meses debido al
prolongado tiempo de replicacioacuten de la micobacteria Esto conlleva la potencialidad de
contagio a individuos sanos y un compromiso importante de la salud del infectado
Uacuteltimamente se han desarrollado teacutecnicas indirectas de deteccioacuten de M tuberculosis
utilizando el bacterioacutefago D29 capaz de infectar especiacuteficamente micobacterias Es una
metodologiacutea donde se facilita la replicacioacuten del fago en la muestra proveniente del
paciente para luego evaluar el tiacutetulo de fagos liberados infectando un cultivo testigo de
Resumen
vii
Micobacterium smegmatis micobacteria de replicacioacuten raacutepida Siendo el glicerol fuente
de carbono en cultivos de micobacterias se planteoacute determinar su concentracioacuten
remanente como meacutetodo de evaluar integridad de M smegmatis establecieacutendose asiacute una
medida indirecta de la previa presencia de M tuberculosis en la muestra problema
Ademaacutes el glicerol es el principal subproducto en la elaboracioacuten del biodiesel y su
concentracioacuten es indicativa de la calidad del combustible transformaacutendose en analito
relevante para la industria de energiacuteas alternativas a la derivada del petroacuteleo
Se desarrollaron y validaron dos meacutetodos amperomeacutetricos de cuantificacioacuten de
glicerol a) Con electrodo de oro en NaOH 01 M aplicable a medios acuosos (LD 10
microM intervalo lineal 0024 a 200 mM) b) Con bioelectrodo de pasta de C modificada
con glicerol deshidrogenasa aplicable a medios complejos como cultivos bacterianos
(LD 20 M intervalo lineal 0060 a 175 mM)
Resumen
viii
1 Summary
This Thesis work was oriented to the development of analytical methods alternative
to those currently used to facilitate the identification of compounds of interest for both
clinical diagnosis and the alternative fuel industry Contributions of relevance to three
situations were performed Diagnosis of toxoplasmosis tuberculosis and the assessment
of biodiesel quality
Toxoplasmosis is a parasitic disease caused by Toxoplasma gondii which does not
bring complications in people except when the infected individual is an
immunocompromised patient or pregnant women who have not previously suffered
from the illness In this case the parasite can cross the placenta producing congenital
infection of the fetus and potentially causing serious consequences including death
One of the techniques used to its diagnosis is the enzyme-linked immunosorbent assay
allowing the detection of parasite-specific antibodies which are indicators of the
infection However this technique aimed to detect acute toxoplasmosis nowadays lacks
of reliable standardization particularly in the preparation of the antigen Therefore this
study focused on identifying regions encoding several markers of acute phase which
highly concentrated antigenic determinants to clone and express them as recombinant
proteins subsequently label them with biotin and thus use them as developing system of
specific antibodies against T gondii proteins The immunoassays presented here
propose a methodology which will allow in the future distinguishing sera from
individuals with acute infection of those with chronic infection or uninfected
Tuberculosis is an infectious and contagious disease caused by the bacterium
Mycobacterium tuberculosis Its diagnosis is based on a series of studies which
eventually identify the etiologic agent in cultures obtained from sputum This
identification can take about two months due to the extensive mycobacteria replication
time This leads to the potential contagion of healthy individuals and a major
commitment to the health of the infected patient Recently indirect M tuberculosis
detection techniques have been developed They use D29 bacteriophage which is able
to specifically infect mycobacteria The methodology allows phage replication in the
patientrsquos sample and then evaluates the number of released phages by infecting a
control culture of Mycobacterium smegmatis a short-term replicable mycobacteria As
glycerol is the carbon source commonly used in mycobacteria culture this work
proposes determining its residual concentration as a method of evaluating integrity of
Resumen
ix
M smegmatis thus establishing an indirect measurement of the previous presence of M
tuberculosis in the sample
Furthermore glycerol is the main by-product in biodiesel production and its
concentration is an indicator of the fuel quality becoming a relevant analyte to the
energy industry alternative to that derived of petroleum
Two amperometric methods for glycerol quantitation were developed and
validated a) Using a gold electrode in 01 M NaOH medium useful for simple aqueous
solutions (LD 10 microM linear range from 0024 to 200 mM) b) using a carbon paste
bioelectrode modified with glycerol dehydrogenase useful for complex media such as
bacterial cultures (LD 20 microM linear range 0060 to 175 mM)
Publicaciones
x
Publicaciones
Los resultados parciales del presente trabajo de Tesis han dado lugar a las
siguientes publicaciones
Trabajos en revistas internacionales
1- Costa J G Faccendini P L Sferco S J Lagier C M Marcipar I S
Evaluation and comparison of the ability of online available prediction programs to
predict true linear B-cell epitopes Protein amp Peptide Letters (2013) 20(6)724-30
2- Faccendini P L Ribone M E Lagier C M Selective application of two
rapid low-cost electrochemical methods to quantify glycerol according to the sample
nature Sensors and Actuators B (2014) 193 142ndash 148
Trabajos en congresos
1- Muntildeoz A Faccendini P L Ribone M E Lagier C M Oxidacioacuten
electroquiacutemica de polialcoholes sustrato de sistemas enzimaacuteticos bacterianos Estudio
de las condiciones para su cuantificacioacuten V Congreso Argentino de Quiacutemica Analiacutetica
Bahiacutea Blanca Noviembre de 2009
2- Costa J G Faccendini P L Carral L Kaufer F Lagier C M Marcipar I
S Evaluacioacuten de dos regiones de la Proteiacutena P35 de Toxoplasmama gondii para el
diagnostico de fase aguda de la toxoplasmosis Ascochinga Coacuterdoba Octubre de 2010
3- Costa J G Faccendini P L Lagier C M Marcipar I S Modelado y
prediccioacuten de los epiacutetopes del antigeno P22 de Toxoplasma gondii 2do Congreso de
Bioinformaacutetica y Biologiacutea Computacional Coacuterdoba Mayo de 2011
4- Faccendini P L Costa J G Ribone M E Marcipar I S Lagier C M
Ensamblado de un bioelectrodo econoacutemico para la deteccioacuten de glicerol en medios
altamente complejos 6deg Congreso Argentino de Quiacutemica Analiacutetica Santa Fe
Septiembre de 2011
5- Faccendini P L Costa J G Ribone M E Marcipar I S Lagier C M
Desarrollo y optimizacioacuten de un meacutetodo para la cuantificacioacuten de glicerol en matrices
complejas 6deg Congreso Argentino de Quiacutemica Analiacutetica Santa Fe Septiembre de 2011
Publicaciones
xi
6- Costa J G Perotti J Faccendini P L Lagier C M Mancipar I S
Optimization of the acute toxoplasmosis immunodiagnostic during the pregnancy
Workshop Fronteras en Biociencias Ministerio de Ciencia Tecnologiacutea e Innovacioacuten
Productiva Embajada Alemana Ciudad Autoacutenoma de Buenos Aires Abril de 2012
7- Costa J G Perotti J Faccendini P L Dure A Carral L Kaufer F Lagier
C M Mancipar I S Evaluacioacuten de diferentes regiones de las proteiacutenas p22 p30 y p35
para diagnoacutestico de la fase aguda de la toxoplasmosis XXV Reunioacuten Anual de la
Sociedad Argentina Protozoologiacutea 2012 Ciudad Autoacutenoma de Buenos Aires Agosto
de 2012
8- Costa J G Faccendini P L Sferco S J Lagier C M Mancipar I S
Comparison of the ability to predict true linear B-cell epitopes by on-line available
prediction programs 3er congreso de la sociedad argentina de bioinformaacutetica y biologiacutea
computacional Paranaacute Septiembre de 2012
9- Faccendini P L Costa J G Ribone M E Marcipar I S Lagier C M
Desarrollo de un sistema electroquiacutemico para evaluar infeccioacuten toxoplaacutesmica 7deg
Congreso Argentino de Quiacutemica Analiacutetica Mendoza Octubre de 2013
Abreviaturas y Siacutembolos
xii
Abreviaturas y Siacutembolos
AD Aglutinacioacuten Directa
ADN Aacutecido desoxiribonucleico
Ac(s) Anticuerpo(s)
Ang(s) Antiacutegeno(s)
D Coeficiente de difusioacuten
DHA 13 dihidroxiacetona
DMSO Dimetil sulfoacutexido
DO Densidad oacuteptica
DT Dye Test con azul de metileno (Reaccioacuten de Sabiacuten Feldman)
EDTA Aacutecido etilendiaminotetraaceacutetico
ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay (Ensayo de inmunoadsorcioacuten ligado
a enzima)
F Constante de Faraday
Frecuencia
GlDH Glicerol deshidrogenasa
HAI Hemoaglutinacioacuten indirecta
HEPES Aacutecido 4-(2-hydroxietil)-1-piperazina etano sulfoacutenico
HRP Horse radish peroxidase (Peroxidasa de raacutebano picante)
I Corriente eleacutectrica
IFI Inmunofluorescencia indirecta
IgA Inmunoglobulina A
IgG Inmunoglobulina G
IgE Inmunoglobulina E
IgM Inmunoglobulina M
IgM-IFI Inmunofluorescencia indirecta de IgM (Prueba de Remington)
IPTG Isopropil- -D-tiogalactopiranoacutesido
ISAGA Ensayo aglutinante de inmunoabsorcioacuten
LB Medio Luria-Bertani
LC Liacutemite de cuantificacioacuten
LD Liacutemite de deteccioacuten
MWCNT Multi-walled carboacuten nanotubes (Nanotubos de carbono de paredes
muacuteltiples)
Abreviaturas y Siacutembolos
xiii
N nuacutemero de moles de especie reducida u oxidada
OMS Organizacioacuten Mundial de la Salud
P35 Antiacutegeno de superficie de T gondii de 35 kDa de peso
PBS Phosphate buffer salin (Solucioacuten tampoacuten fosfato salino)
PCR Polimerasa chain reaction (Reaccioacuten en cadena de la polimerasa)
pET32a Vector plasmiacutedico
Q Carga eleacutectrica circulante
SAG1 Surface antigen 1 (Antiacutegeno de superficie 1 o antiacutegeno P30 de T gondii)
SAG2 Surface antigen 2 (Antiacutegeno de superficie 2 o antiacutegeno P22 de T gondii)
SDS Dodecil sulfato de sodio
TB Tuberculosis
TRX Tioredoxina
VBL Voltametriacutea de barrido lineal
VC Voltametriacutea ciacuteclica
VPD Voltametriacutea de pulso diferencial
Introduccioacuten
Introduccioacuten
1
2 Introduccioacuten
21 Toxoplasmosis
211 Generalidades
La toxoplasmosis es una enfermedad causada por el paraacutesito protozoario
Toxoplasma gondii que infecta animales herbiacutevoros carniacutevoros y omniacutevoros dentro de
los cuales se encuentra el hombre Estaacute ampliamente extendida por todo el mundo y su
incidencia y prevalencia variacutean mucho seguacuten las zonas geograacuteficas los haacutebitos
alimentarios el tipo de trabajo la higiene ambiental y la presencia o no de gatos
infectados (Atias 1998 Martiacuten-Hernaacutendez 2004) Es una zoonosis que afecta a los
humanos a traveacutes de formas infectivas producidas durante el ciclo bioloacutegico que se
desarrolla uacutenicamente en gatos y otros feacutelidos Dependiendo de la localizacioacuten
geograacutefica entre 15 y 85 de la poblacioacuten adulta mundial presenta infeccioacuten croacutenica
(Fuentes y col 2001)
Usualmente la principal viacutea de transmisioacuten de esta parasitosis es la oral por
ingestioacuten de carnes crudas o poco cocidas contaminadas con quistes o por la ingestioacuten
de ooquistes presentes en agua o alimentos contaminados con heces de gato Son menos
frecuentes las viacuteas de transmisioacuten parenteral respiratorias mucosal (conjuntival)
cutaacutenea y por transfusioacuten de sangre o trasplante de oacuterganos La transmisioacuten por viacutea
transplacentaria puede ocurrir cuando la embarazada padece la primoinfeccioacuten durante
el curso del embarazo aunque se han descripto casos raros de infeccioacuten congeacutenita por
toxoplasmosis materna anterior al embarazo (Martiacuten-Hernaacutendez 2004 Centers of
Diseases Control and Prevention (CDC) paacutegina web a)
Durante la infeccioacuten pueden distinguirse dos etapas A) Aguda Al breve tiempo de
ingerir ooquistes esporulados eacutestos se transforman en taquizoiacutetos ingresan a la ceacutelula
del hueacutesped y comienzan a dividirse en forma asexual hasta que la ceacutelula se lisa
liberando asiacute la progenie y ocasionando la parasitemia Posteriormente el taquizoiacuteto
evoluciona a bradizoiacuteto cuya multiplicacioacuten es lenta Se produce la invasioacuten de los
oacuterganos por viacutea linfaacutetica o hemaacutetica siendo los oacuterganos maacutes comprometidos los
muacutesculos esqueleacutetico y cardiacuteaco asiacute como cerebro y ojos B) Croacutenica En la medida que
evoluciona la defensa del hueacutesped desaparecen los paraacutesitos extracelulares limitaacutendose
la divisioacuten intracelular y quedando las formas resistentes principalmente en el sistema
nervioso central y muacutesculo esqueleacutetico Por lo general esta etapa es latente pero puede
Introduccioacuten
2
activarse por la ruptura de los quistes tisulares (Fuentes y col 2001 Trabattoni y col
2008)
212 Toxoplasma gondii
El Toxoplasma gondii es un paraacutesito intracelular obligado Su ubicacioacuten
taxonoacutemica se detalla en la Tabla 21
Tabla 21 Ubicacioacuten taxonoacutemica del T gondii
Reino Protista
Sub-reino Protozoa
Phylum Apicomplexa
Clase Sporozoea
Sub-clase Coccidea
Orden Eucoccidiia
Sub-orden Eimeriina
Familia Sarcocystidae
Sub-familia Toxoplasmatinae
Geacutenero Toxoplasma
Especie gondii
Durante el ciclo de vida del T gondii se distinguen tres formas a) los taquizoiacutetos
b) los bradizoiacutetos (o quistes tisulares) y c) los ooquistes Los taquizoiacutetos (o trofozoiacutetos)
son la forma proliferativa y de reproduccioacuten raacutepida dentro de la ceacutelula del hueacutesped
durante la fase aguda que posteriormente deviene en la formacioacuten de un pseudoquiste
Tiene forma de medialuna y mide de 4 a 7 μm de ancho Estaacute recubierto por un sistema
de membranas constituido por una membrana doble interna y una externa interrumpida
en dos puntos El taquizoiacuteto es afectado por anticuerpos (Acs) especiacuteficos y faacutermacos y
se destruye en condiciones ambientales adversas como congelamiento-
descongelamiento desecacioacuten y bajo pH (por ejemplo el de los jugos gaacutestricos) Los
quistes tisulares son redondeados de pared elaacutestica miden de 10 a 200 μm y pueden
contener hasta 3000 paraacutesitos denominados bradizoiacutetos Estas formas no son afectadas
por Acs ni faacutermacos pero pueden ser destruidos por calentamiento congelamiento-
descongelamiento y por desecacioacuten Cuando estos quistes son ingeridos los bradizoiacutetos
resistentes son liberados por la accioacuten gaacutestrica y pueden invadir la mucosa
gastrointestinal Los ooquistes son estructuras ovoides de 10 a 12 μm de diaacutemetro y son
eliminadas en la materia fecal del gato Recieacuten emitidos no son infectivos pero bajo
condiciones de temperatura humedad y presencia de oxiacutegeno esporulan tornaacutendose
Introduccioacuten
3
infectivos y resistentes por maacutes de un antildeo en el suelo y dos antildeos en el agua (Atias
1998 Perotti 2007)
La Fig 21 describe el ciclo de vida del paraacutesito Los uacutenicos hueacutespedes definitivos
conocidos de T gondii son miembros de la familia Felidae (por ejemplo gatos
domeacutesticos) Los ooquistes no esporulados son liberados en las heces del felino Los
ooquistes tardan entre 1 y 5 diacuteas en esporular en el ambiente y volverse infectivos Los
hueacutespedes intermediarios se infectan al ingerir tierra agua o plantas contaminadas con
los ooquistes Los ooquistes se transforman en taquizoiacutetos al breve tiempo de ser
ingeridos Estos taquizoiacutetos se localizan en los tejidos musculares y el sistema nervioso
y evolucionan a bradizoiacutetos formando los quistes tisulares (hiacutesticos) Los felinos se
infectan luego de ingerir la carne de hueacutespedes intermediarios que poseen quistes
tisulares o por ingestioacuten de los ooquistes esporulados Los animales de caza y los
criados para consumo humano tambieacuten pueden infectarse por ingestioacuten de ooquistes
esporulados En el hueacutesped humano los paraacutesitos forman quistes en los tejidos y suele
encontrarse generalmente en el muacutesculo esqueleacutetico el miocardio cerebro y ojos donde
pueden permanecer durante toda la vida del hueacutesped (Paacutegina web del CDC)
Figura 21 Ciclo de vida de T gondii El hueacutesped definitivo son miembros de la familia Felidae los
demaacutes hueacutespedes (incluido el hombre) se infectan accidentalmente y no son necesarios para completar el
ciclo de vida del paraacutesito Adaptado de httpwwwdpdcdcgovdpdxHTMLToxoplasmosishtm
Introduccioacuten
4
213 Diagnoacutestico
Puesto que las infecciones por T gondii en individuos inmunocompetentes son por
lo general asintomaacuteticas o presentan siacutentomas imperceptibles su diagnoacutestico se basa
principalmente en pruebas de laboratorio La toxoplasmosis no suele generar
complicaciones excepto en 2 situaciones cuando se infectan individuos
inmunodeprimidos y cuando se infectan por primera vez mujeres embarazadas En este
uacuteltimo caso el paraacutesito puede infectar al feto atravesando la placenta y generando la
infeccioacuten congeacutenita Las probabilidades de dantildear al feto o al nintildeo luego de nacer
dependeraacuten del trimestre en que suceda la infeccioacuten (Atias 1998 Martiacuten-Hernaacutendez
2005) Tanto en inmunocomprometidos como en el recieacuten nacido la infeccioacuten puede
producir graves consecuencias Es por ello que en estos casos asiacute como en la
embarazada el diagnoacutestico cobra particular relevancia (Remington y col 1995)
2131 Meacutetodos de diagnoacutestico
La infeccioacuten puede diagnosticarse por meacutetodos directos que consisten en la
identificacioacuten de las estructuras parasitarias (por un estudio histopatoloacutegico para lo cual
es necesario realizar biopsias puncioacuten de ganglios o cortes histoloacutegicos) o la
identificacioacuten de ADN del paraacutesito (a traveacutes de una reaccioacuten en cadena de la
polimerasa PCR) Tambieacuten se pueden realizar cultivos tisulares e inoculacioacuten al
peritoneo de ratoacuten pero este meacutetodo presenta la desventaja de involucrar el manejo de
paraacutesitos vivos y el uso de animales de laboratorio (Perotti 2007)
Los meacutetodos alternativos son las pruebas indirectas a saber
Intradermoreaccioacuten de Frenkel Evaluacutea la inmunidad celular Es una reaccioacuten
cualitativa tardiacutea y presenta resultado positivo a partir de la cuarta semana de infeccioacuten
aunque se han reportado casos de pacientes en los que llevoacute varios meses hasta dar
positiva Se utiliza con fines epidemioloacutegicos (Jirovec amp Jindrich 1961 Rodriacuteguez
Acar y col 2008)
Reaccioacuten de Sabiacuten Feldman o dye test con azul de metileno (DT) Es el meacutetodo
de referencia de la OMS Evaluacutea la inmunidad humoral y mide la cantidad total de Acs
que es capaz de destruir taquizoiacutetos viacutea activacioacuten del complemento Es un meacutetodo
cuantitativo y presenta valores positivos a partir de la primera o segunda semana de
infeccioacuten Tiene la desventaja de requerir taquizoiacutetos vivos y animales para su cultivo
por lo que soacutelo laboratorios de referencia llevan adelante este meacutetodo (Perotti 2007
Durlach y col 2008)
Introduccioacuten
5
Reaccioacuten de inmunofluorescencia indirecta (IFI) Evaluacutea la cantidad de Acs que
se unen a toxoplasmas inactivados La reaccioacuten se evidencia con Acs anti-IgG humana
marcados con isocianato de fluoresceiacutena y observando al microscopio de fluorescencia
Si bien no se trabaja con organismos vivos la necesidad de un microscopio de
fluorescencia y la subjetividad del operador limitan el uso de este meacutetodo Se han
informado resultados falso-positivos debidos a Acs anti-nucleares (Durlach y col
2008)
Aglutinacioacuten directa (AD) En este ensayo se produce una aglutinacioacuten visible con
toxoplasmas tratados con formol Se detecta fundamentalmente IgMs especiacuteficas
Hemoaglutinacioacuten indirecta (HAI) Se utilizan antiacutegenos (Angs) de T gondii con
los que se sensibiliza gloacutebulos rojos que en presencia de Acs especiacuteficos producen una
aglutinacioacuten visible como un botoacuten rojo En general es utilizado para determinar
incidencia o seroprevalencia en una regioacuten pero no se recomienda para la deteccioacuten de
la infeccioacuten aguda (Durlach y col 2008)
Fijacioacuten del complemento Se detectan Acs que activan el sistema del
complemento en presencia de Angs de T gondii La reaccioacuten se evidencia con el
sistema hemoliacutetico hemolisina-gloacutebulos rojos de carnero Resultados positivos aparecen
en forma maacutes tardiacutea que en el DT (Perotti 2007)
Western blot Se evaluacutea la presencia de Acs especiacuteficos a Angs que han sido
separados por electroforesis en un gel de poliacrilamida y transferidos a una membrana
Generalmente no es utilizada como teacutecnica de diagnoacutestico debido a su difiacutecil
estandarizacioacuten (Durlach y col 2008)
Prueba de Remington (IgM-IFI) Se sigue el mismo esquema que en IFI pero se
sustituyen el conjugado anti-IgG por uno anti-IgM lo que permite detectar infeccioacuten
aguda Acs anti-nucleares y el factor reumatoide pueden producir resultados falso-
positivos y los Acs tipo IgG pueden producir resultados falso-negativos (Perotti 2007)
Ensayo aglutinante de inmunoabsorcioacuten (ISAGA) Permite la deteccioacuten y dosaje
de Acs IgA IgE IgG e IgM especiacuteficos contra el paraacutesito Este meacutetodo posee mayor
sensibilidad en relacioacuten al IgM-IFI y al ensayo de inmunoadsorcioacuten ligado a enzima
(ELISA) de IgM para la deteccioacuten de infecciones congeacutenitas pero tiene la desventaja
que pueden detectarse IgM especiacuteficas luego de un antildeo de la primoinfeccioacuten Esto
dificulta la interpretacioacuten de un resultado positivo si se desea determinar la antiguumledad
de la infeccioacuten (Durlach y col 2008)
Introduccioacuten
6
Ensayo de inmunoadsorcioacuten ligado a enzima (ELISA) Permite la deteccioacuten de
Acs especiacuteficos contra el paraacutesito Se evidencia la reaccioacuten con una enzima ligada a Acs
o Angs (dependiendo del disentildeo del inmunoensayo ver maacutes adelante en punto 2134)
que transforma un reactivo auxiliar en un producto coloreado o fluorescente Es un
meacutetodo cuantitativo que utiliza un espectrofotoacutemetro o fluoroacutemetro lo que permite
hacer medidas maacutes objetivas y raacutepidas (Perotti 2007) Auacuten asiacute este meacutetodo aplicado a
la deteccioacuten de la toxoplasmosis de fase aguda carece de una estandarizacioacuten confiable
principalmente en la preparacioacuten del Ang
2132 Importancia del correcto diagnoacutestico en la embarazada
A pesar de toda la bateriacutea de ensayos arriba descritos disponibles para el
diagnoacutestico de la toxoplasmosis el de la infeccioacuten aguda en la mujer embarazada sigue
siendo problemaacutetico porque este diagnoacutestico se deduce a partir de los datos de las
concentraciones relativas de los distintos isotipos de las inmunoglobulinas especiacuteficas
En efecto la existencia y concentracioacuten de IgM IgA e IgG especiacuteficas contra T gondii
es muy dependiente de la respuesta inmune del individuo infectado Considerando que
el tratamiento para prevenir la transmisioacuten al feto consiste en administrar drogas
antiparasitarias que tienen efectos nocivos sobre el nonato auacuten en estos diacuteas se trabaja
en mejorar este diagnoacutestico ya que no se cuenta con un meacutetodo confiable como para
prevenir por un lado los dantildeos que suelen sufrir los recieacuten nacidos de madres con
primoinfeccioacuten no diagnosticada y por otra parte los efectos perjudiciales en los fetos
de las embarazadas incorrectamente diagnosticadas y medicadas Por ello es que en este
trabajo se intentoacute desarrollar nuevas metodologiacuteas de diagnoacutestico de la infeccioacuten
toxoplaacutesmica aguda utilizando teacutecnicas electroquiacutemicas
2133 Diagnoacutestico en la embarazada
El correcto diagnoacutestico de la infeccioacuten aguda en la embarazada incluye la
utilizacioacuten de teacutecnicas especiacuteficas y sensibles asiacute como tambieacuten la aplicacioacuten de un
esquema de seguimiento adecuado El diagnoacutestico generalmente es realizado por
serologiacutea Para determinar si la paciente cursa una infeccioacuten aguda se determinan los
tiacutetulos de los anticuerpos IgG IgA e IgM (Arcavi y col 1997) y se interpretan prima-
facie seguacuten
1 IgG IgA IgM negativas ausencia de infeccioacuten
2 IgG e IgA positivas IgM negativa infeccioacuten croacutenica
3 IgG IgA e IgM positivas posible infeccioacuten aguda
Introduccioacuten
7
2134 Ensayo de inmunoadsorcioacuten ligado a enzima
Los ensayos del tipo ELISA consisten en la deteccioacuten de un antiacutegeno o un
anticuerpo inmovilizado sobre un soporte soacutelido y mediante anticuerpos que directa o
indirectamente producen una reaccioacuten La prueba recurre al empleo de antiacutegenos o
anticuerpos conjugados a una enzima (marcados) que por reaccioacuten con su sustrato
producen una especie coloreada cuya concentracioacuten puede ser medida
fotomeacutetricamente Este ensayo tiene las ventajas de ser versaacutetil robusto simple en su
realizacioacuten y emplear reactivos relativamente econoacutemicos El uso de una fase soacutelida que
retiene el analito de intereacutes proporciona una elevada sensibilidad mientras que la
elevada especificidad del ensayo viene dada por la gran selectividad de los anticuerpos
por su antiacutegeno Las configuraciones maacutes sencillas para estos ensayos son el directo y el
indirecto ambas esquematizadas en la Fig 22
Antiacutegeno IgG conjugada a enzima
Bloqueante IgG humana Reactivo de color
Directo Indirecto
Figura 22 Esquemas que representan los ELISA directo (izquierda) e indirecto (derecha)
21341 Esquema de captura o tipo ldquoSandwichrdquo
Cuando los anticuerpos que desean detectarse son del isotipo IgM suele tenerse el
inconveniente que el isotipo IgG frecuentemente estaacute en mayor concentracioacuten que el
IgM y presenta una mayor afinidad por el antiacutegeno Por lo tanto las IgG suelen
dificultar la deteccioacuten de las IgM en suero cuando se sigue un esquema de ELISA
indirecto con anticuerpos anti-IgM humana (Ac-a-IgMh) marcados Es por esto que
suele optarse por un esquema de captura o tipo saacutendwich en el cual se aumenta la
sensibilidad del ensayo incorporando un eslaboacuten maacutes en el inmunocomplejo adsorbido
En este trabajo se ensayaron dos alternativas de captura o tipo saacutendwich En la
primera alternativa que sigue un esquema claacutesico (A) se adsorbieron los Ac-a-IgMh
Introduccioacuten
8
sobre la superficie de la placa de poliestireno Las placas asiacute sensibilizadas se
enfrentaron al suero a ensayar capturando selectivamente una porcioacuten de las IgM de la
muestra Luego se los enfrentoacute al antiacutegeno de intereacutes ligado a biotina que se une a las
IgMh especiacuteficas para dicho Ang previamente capturado Finalmente se buscoacute revelar
con enzima peroxidasa de raacutebano picante (HRP) conjugada a streptavidina esta uacuteltima
forma un complejo estable con biotina De esta forma se aumenta la cantidad de Ac que
se desean detectar adsorbido sobre la placa seleccionando el tipo de anticuerpo que se
adsorbe En la Fig 23 se muestra el esquema del ensayo tipo A
IgM Antiacutegeno ligado a biotina streptavidina conjugada a HRP
Bloqueante IgG anti-IgM Reactivo de color
Figura 23 Esquema de ensayo ELISA tipo captura claacutesico A Un anticuerpo anti IgMh captura una
porcioacuten de las IgM presentes en el suero humano una porcioacuten de estas IgM capturadas son especiacuteficas
para antiacutegeno de T gondii y se revela su presencia por medio del antiacutegeno recombinante ligado a biotina
streptavidina ligada a HRP adicionando el sustrato de la enzima y un cromoacutegeno actuando como
cosustrato
La segunda alternativa que denominamos tipo B sale del esquema tradicional de
los ELISA Se adsorbe el antiacutegeno recombinante sobre la superficie de la placa de
poliestireno enfrentaacutendola luego al suero a ensayar Asiacute se captura selectivamente las
inmunoglobulinas que reconocen al antiacutegeno Luego se expone la placa al mismo
antiacutegeno recombinante pero ligado a biotina que se uniraacute a los anticuerpos especiacuteficos
para dicho Ang previamente capturados Finalmente se revela con HRP conjugada a
streptavidina que forma un complejo estable con biotina De esta forma se aumenta la
cantidad de Ang marcado en mayor proporcioacuten para IgM que para IgG dada la
Introduccioacuten
9
multivalencia de este isotipo de inmunoglobulina En la Fig 24 se muestra el segundo
esquema que fue el que brindoacute los resultados maacutes promisorios
Antiacutegeno (Ang) Bloqueante Ang ligado a biotina Reactivo de color
IgM a-Ang IgG a-Ang streptavidina conjugada a HRP
Figura 24 Esquema de ensayo ELISA de captura tipo B El antiacutegeno expuesto en la placa captura la
porcioacuten de las IgM e IgG especiacuteficas presentes en el suero humano Haciendo uso de la polivalencia de
las IgM su presencia se revela con el antiacutegeno conjugado a biotina streptavidina ligada a HRP
adicionando el sustrato de la enzima y un cromoacutegeno actuando como cosustrato
2135 Obtencioacuten de antiacutegenos para diagnoacutestico
El diagnoacutestico de rutina de la toxoplasmosis se basa en la deteccioacuten seroloacutegica de
anticuerpos en el paciente Los antiacutegenos utilizados en estas pruebas seroloacutegicas son
generalmente proteiacutenas derivadas de ceacutelulas T gondii que se propagan en el ratoacuten o el
cultivo de ceacutelulas El cultivo y el mantenimiento de este paraacutesito es laborioso lento y
caro (Lau amp Fong 2006) El uso de antiacutegenos nativos de taquizoitos es difiacutecil de
estandarizar y con frecuencia produce reacciones positivas falsas (Hiszczyntildeska-Sawicka
y col 2005) Por lo tanto ha habido intentos de producir antiacutegenos a traveacutes de medios
maacutes seguros tales como tecnologiacutea de ADN recombinante La mayoriacutea de estos
esfuerzos se han centrado en los principales antiacutegenos de superficie del paraacutesito como el
antiacutegeno de superficie 1 (SAG1 del ingleacutes Surface antigen 1) y el antiacutegeno de superficie
2 (SAG2 del ingleacutes Surface antigen 2) (Lau amp Fong 2006) En estudios recientes se ha
estado evaluando que la presencia de IgM e IgG anti P35 seriacutea un mejor indicador de
infeccioacuten reciente que la evaluacioacuten de IgM utilizando taquizoitos enteros en ensayos
del tipo ELISA (Lu y col 2006) En efecto con la nueva tecnologiacutea de ADN
Introduccioacuten
10
recombinante es posible obtener cualquier proteiacutena contaacutendose ademaacutes con ventajas
como la posibilidad de seleccionar porciones especiacuteficas de un Ang para evitar
reacciones inespeciacuteficas ligar distintas porciones que naturalmente corresponden a otras
proteiacutenas para aumentar la sensibilidad del ensayo agregar secuencias aminoaciacutedicas
que faciliten la posterior purificacioacuten y estandarizacioacuten de la proteiacutena a utilizar
(Hiszczyntildeska-Sawicka y col 2005) A la postre todo el proceso resulta maacutes
econoacutemico seguro y confiable que la purificacioacuten de Angs a partir del microorganismo
nativo puesto que no requiere la manipulacioacuten de microorganismos patoacutegenos ya que
la expresioacuten de las proteiacutenas recombinantes se lleva adelante en microorganismos no
infectivos de raacutepido crecimiento (Babaie y col 2013)
Por lo arriba expresado debe seguirse un esquema para seleccionar cuales deben de
ser las proteiacutenas que conviene utilizar acorde al diagnoacutestico que se pretende abordar y
ello demanda un trabajo racional de seleccioacuten de antiacutegenos generalmente
inmunodominantes No obstante escoger tales proteiacutenas no es tarea sencilla por cuanto
la verificacioacuten del grado de bondad del Ang seleccionado exige una ardua tarea
experimental siendo conveniente acotar el nuacutemero de Angs alternativos a evaluar Un
modo de encarar esto es procurar predecir el grado de antigenicidad en base a la
secuencia aminoaciacutedica lo cual puede realizarse computacionalmente
214 Prediccioacuten de epiacutetopes reconocidos por ceacutelulas B
Los programas de prediccioacuten definen el grado de antigenicidad por medio de una
puntuacioacuten (score) en algunos casos para cada epiacutetope y en otros para cada residuo
amino aciacutedico En este uacuteltimo se puede definir una regioacuten antigeacutenica cuando varios
residuos con alta puntuacioacuten son adyacentes en la estructura primaria Por otra parte el
nuacutemero de epiacutetopes o regiones antigeacutenicas que los programas de prediccioacuten encuentran
depende de un umbral que es configurado por el usuario
En la actualidad los inmunoensayos para determinar anticuerpos son realizados
utilizando regiones antigeacutenicas definidas ya sea como moleacuteculas uacutenicas mezcla de
varios componentes o como antiacutegenos de fusioacuten multiepiacutetope (Camussone 2009) El
desarrollo de herramientas informaacuteticas para predecir de forma fiable la antigenicidad
de los epiacutetopes puede reducir el costoso y prolongado trabajo experimental requerido
para identificar las regiones de intereacutes (Namrata amp Rajat 2010) Al momento de
identificar estas regiones antigeacutenicas suele contarse soacutelo con la estructura primaria de
las proteiacutenas en estudio desconocieacutendose su estructura terciaria en la mayoriacutea de los
Introduccioacuten
11
casos De aquiacute que la prediccioacuten de epiacutetopes lineales es el meacutetodo maacutes utilizado para
seleccionar epiacutetopes putativos
Desde el informe inicial de Hopp y Woods en 1981 (Hopp amp Woods 1981) varios
procedimientos se han hecho populares para detectar epiacutetopes lineales reconocidos por
ceacutelulas B a partir de la estructura primaria de una proteiacutena El rendimiento de estos
programas auacuten no ha logrado una eficiencia oacuteptima seguacuten lo declarado por sus propios
autores (Kolaskar amp Tongaonkar 1990 Saha y col 2005 Saha amp Raghava 2006
Larsen y col 2006 Davydov amp Tonevitskii 2009)
La literatura sobre las aplicaciones de estos programas estaacute orientada
principalmente a identificar posibles vacunas (Namrata amp Rajat 2010) Por lo tanto la
sensibilidad (probabilidad de obtener un positivo entre los verdaderos positivos) y la
especificidad (probabilidad de obtener un negativo entre aquellos negativos verdaderos)
son los indicadores maacutes utilizados para evaluar la calidad de estos programas ya que un
uacutenico epiacutetope puede ser crucial para lograr una respuesta inmunoprotectora Al mismo
tiempo suele omitirse el valor predictivo positivo (VPP) que es la proporcioacuten de
muestras que dan positivo el ensayo siendo verdaderos positivos o sea es la capacidad
para encontrar los epiacutetopes reales de una proteiacutena (ver el recuadro 1) Sin embargo la
fiabilidad del epiacutetope predicho es maacutes importante que su sensibilidad para reducir el
nuacutemero de experimentos confirmatorios de su utilidad diagnoacutestica Es entonces
importante diferenciar ambos paraacutemetros ya que los programas de prediccioacuten pueden
realizar predicciones de baja sensibilidad pero al mismo tiempo si los epiacutetopes reales
fueron predichos la prediccioacuten presenta un alto VPP
Recuadro 1
Los casos posibles en un ensayo son
Verdaderos
positivos
Verdaderos
negativos
Ensayo
positivo A B
Ensayo
negativo C D
BA
A positivo predictivoValor
DB
D dadEspecifici
CA
A adSensibilid
Introduccioacuten
12
La falta de estudios comparativos entre los programas de prediccioacuten en la literatura
actual impide que los usuarios hagan la mejor eleccioacuten Por ello como trabajo inicial se
intentoacute evaluar los distintos programas disponibles en la red en cuanto a su capacidad
para predecir positivamente epiacutetopes
Introduccioacuten
13
22 Tuberculosis
221 Generalidades
La tuberculosis (TB) humana es una enfermedad infecto-contagiosa causada por la
bacteria Mycobacterium tuberculosis La infeccioacuten por M tuberculosis suele ser
asintomaacutetica en personas sanas dado que su sistema inmune es capaz de controlar la
bacteria No obstante en condiciones de desnutricioacuten o inmunocompromiso la
enfermedad suele ser grave La TB es una enfermedad vinculada a la pobreza que
puede afectar a adultos joacutevenes en edad productiva
La enfermedad se transmite por el aire de una persona a otra a traveacutes de gotiacuteculas
que portan bacterias Cuando una persona con infeccioacuten activa en pulmones o garganta
tose estornuda habla o canta las personas cercanas pueden respirar las bacterias
liberadas e infectarse
La enfermedad suele afectar los pulmones pero tambieacuten puede involucrar otros
oacuterganos como rintildeones columna vertebral y cerebro Los siacutentomas de la TB pulmonar
activa son tos a veces con esputo sanguinolento dolor toraacutecico debilidad peacuterdida de
peso fiebre y sudoracioacuten nocturna Si no se trata adecuadamente puede ser mortal La
mayoriacutea de las muertes por TB se producen en los paiacuteses en viacuteas de desarrollo (Paacutegina
web del CDC b)
La Organizacioacuten Mundial de la Salud (OMS) estima en 2000 millones a los
infectados por M tuberculosis que anualmente hay 9 millones de nuevos infectados y
que mueren casi 2 millones de personas al antildeo por causa de esta enfermedad (Paacutegina
web de la OMS)
222 Mycobacterium tuberculosis
Esta micobacteria tambieacuten conocida como Bacilo de Koch es una bacteria aacutecido-
alcohol resistente frecuentemente incolora y es aeroacutebica estricta Es muy resistente al
friacuteo la congelacioacuten y la desecacioacuten y por el contrario es muy sensible al calor la luz
solar y la luz ultravioleta Su replicacioacuten es muy lenta (una divisioacuten cada 16 a 20 horas)
y ante circunstancias adversas puede entrar en estado latente pudiendo retrasar su
multiplicacioacuten desde algunos diacuteas hasta varios antildeos El reservorio natural de M
tuberculosis es el hombre tanto el individuo infectado asintomaacutetico como el enfermo
con infeccioacuten activa Su clasificacioacuten taxonoacutemica se detalla en la Tabla 22
Introduccioacuten
14
Tabla 22 Ubicacioacuten taxonoacutemica de M tuberculosis
Reino Bacteria
Phylum Actinobacteria
Clase Actinobacteria
Sub-clase Actinobacteridae
Orden Actinomycetales
Sub-orden Corynebacterineae
Familia Mycobacteriaceae
Geacutenero Mycobacterium
Especie tuberculosis
223 Diagnoacutestico
El diagnoacutestico de la infeccioacuten tuberculosa se basa en una serie de estudios que se
inicia con placas radiograacuteficas pulmonares y la prueba de la tuberculina que pone de
manifiesto un estado de hipersensibilidad del hueacutesped frente a proteiacutenas de M
tuberculosis Esta sensibilidad se adquiere o bien por infeccioacuten con el bacilo o por
vacunacioacuten con cepas no infectivas (vacuna BCG) En una segunda etapa la infeccioacuten
activa es confirmada por identificacioacuten del agente etioloacutegico en cultivos obtenidos a
partir de la muestra bioloacutegica remitida al laboratorio Auacuten cuando la conjuncioacuten de los
meacutetodos de anaacutelisis vigentes permite un diagnoacutestico certero de la TB humana es
frecuente que se requiera de un prolongado tiempo de espera hasta la confirmacioacuten de la
infeccioacuten activa por cuanto ello depende del lento proceso de replicacioacuten del bacilo
Esto conlleva que exista potencialidad de contagio a individuos sanos y se comprometa
maacutes la salud del infectado
En los uacuteltimos antildeos se han desarrollado teacutecnicas de deteccioacuten de M tuberculosis
que involucran al bacterioacutefago D29 (en adelante fago) capaz de infectar
especiacuteficamente micobacterias (Park y col 2003 Mc Nerney y col 2004) Esta
metodologiacutea se basa en procesar la muestra del paciente sospechada de contener M
tuberculosis ponerla en contacto con el fago e incubarla para permitir su replicacioacuten
Finalmente se evaluacutea el tiacutetulo de los fagos liberados infectando un cultivo testigo de M
smegmatis (micobacterias de raacutepido crecimiento susceptibles al fago) y contando las
placas de lisis que se obtienen Esta novedosa metodologiacutea si bien indirecta y
preliminar permite reducir considerablemente los tiempos de diagnoacutestico puesto que se
trabaja con especies de crecimiento raacutepido Sin embargo al utilizar el conteo de placas
de lisis como eje central para el diagnoacutestico de infeccioacuten activa se recae en largos
Introduccioacuten
15
periacuteodos de incubaciones que podriacutean evitarse si se contase con otro meacutetodo de evaluar
la integridad celular de M smegmatis
Por lo arriba expuesto es que en este trabajo se intento desarrollar una nueva
metodologiacutea de verificacioacuten de lisis de micobacterias utilizando teacutecnicas
intriacutensecamente raacutepidas como son las electroquiacutemicas que en un futuro podriacutean
facilitar el diagnoacutestico de infeccioacuten tuberculosa
Introduccioacuten
16
23 Biodiesel
El grave impacto de la utilizacioacuten de combustibles derivados del petroacuteleo en el
medio ambiente la limitada disponibilidad de petroacuteleo crudo y sobre todo la
inestabilidad de los mercados del petroacuteleo han estimulado actualmente la propagacioacuten
de combustibles liacutequidos alternativos (Monteiro y col 2008) La organizacioacuten
American Society for Testing and Materials ASTM define biodiesel como una mezcla
de eacutesteres monoalquiacutelicos de aacutecidos grasos de cadena larga derivados de aceites
vegetales o grasas animales (American Society for Testing and Materials paacutegina web)
El biodiesel puro generalmente no se utiliza como combustible sino que suele
encontrase en mezcla con diesel de petroacuteleo El biodiesel es clasificado utilizando la
notacioacuten Bxx donde xx indica el porcentaje en volumen de contenido de biodiesel en el
liacutequido Asiacute B100 es biodiesel puro B50 contiene 50 en volumen de biodiesel B5
contiene 5 en volumen etc Las mezclas comerciales maacutes comunes son B2 B5 y B20
El biodiesel se obtiene a partir de la transesterificacioacuten de gliceroliacutepidos con
alcoholes de cadena corta como el etanol o el metanol siendo el glicerol el principal
subproducto en la elaboracioacuten de este combustible junto a productos menores como
mono y diacil gliceroles o aacutecidos grasos libres La masa de glicerol generada equivale
aproximadamente al 10 en peso del total del combustible producido siendo eacuteste uno
de los contaminantes frecuentes
231 Determinacioacuten de glicerol libre en biodiesel
La presencia de glicerol es indicativa de la calidad del biodiesel transformaacutendose
en un analito de intereacutes para la creciente industria de energiacuteas alternativas a la derivada
del refinamiento del petroacuteleo
Los meacutetodos quiacutemicos maacutes simples para cuantificar glicerol se basan en su
oxidacioacuten a formaldehiacutedo utilizando peryodato Luego el formaldehiacutedo formado se
determina cuantitativamente por diversos meacutetodos ya sea basados en reacciones
especiacuteficas evaluando los productos por diferentes metodologiacuteas o por titulacioacuten con
NaOH valorado (Lapenaite y col 2007)
La norma ASTM-D 6584 establece un meacutetodo basado en cromatografiacutea gaseosa
que permite la determinacioacuten en simultaacuteneo de glicerina libre y total (glicerol maacutes
mono di y trigliceacuteridos) No obstante este procedimiento no es aplicable a los eacutesteres
metiacutelicos de aceites vegetales obtenidos a partir de aceites laacuteuricos tales como aceite de
Introduccioacuten
17
coco o de palma quedando restringido el meacutetodo soacutelo para un grupo de biodiesels
particulares
En cuanto a los meacutetodos cromatograacuteficos tienen la desventaja de ser poco
amigables con el medio ambiente dado el profuso uso de solventes orgaacutenicos que son
potencialmente contaminantes a veces se tornan laboriosos y utilizan instrumental e
insumos caros
Considerando lo expresado arriba en este trabajo se ha planteado cuantificar
glicerol utilizando una metodologiacutea esencialmente econoacutemica simple y no
contaminante como lo son las teacutecnicas electroquiacutemicas convencionales
Introduccioacuten
18
24 Marco teoacuterico de las teacutecnicas electroquiacutemicas utilizadas
Los meacutetodos electroquiacutemicos de anaacutelisis estudian el analito de intereacutes mediante la
medicioacuten de los paraacutemetros fiacutesicos como potencial eleacutectrico yo corriente en una celda
electroquiacutemica El proceso fundamental en las teacutecnicas electroquiacutemicas es la
transferencia de electrones entre especies redox y la superficie del electrodo (Bard amp
Faulkner 2001) Este puede describirse con la siguiente reaccioacuten
O + ne- R [21]
Para reacciones reversibles y raacutepidas el potencial sigue la ley de Nernst
[22]
siendo y las actividades de las especies reducida y oxidada en la interfaz
electrodosolucioacuten respectivamente
La corriente que circula por la celda es la carga transportada por unidad de tiempo y
puede expresarse como
[23]
De acuerdo a las leyes de Faraday la carga circulante (Q) es proporcional a los
moles de especie reducida u oxidada (N) El factor de proporcionalidad es la carga del
electroacuten (n) por la constante de Faraday (F)
[24]
Combinando las Ecs 23 y 24 obtenemos
[25]
A medida que avanza la reaccioacuten se consume la especie electroactiva esto
produce un gradiente de concentracioacuten entre el seno de la solucioacuten y las inmediaciones
del electrodo donde la especie es electrotransformada y consecuentemente asociado se
Introduccioacuten
19
generaraacute un transporte de masa por difusioacuten Si el proceso estaacute bajo control difusional
la primera ley de Fick permite describir el flujo de partiacuteculas en funcioacuten de la posicioacuten
ec 26 y la segunda ley de Fick lo describe en funcioacuten de la variacioacuten de la
concentracioacuten de la especie electroactiva en funcioacuten del tiempo ec 27
[26]
[27]
donde D es el coeficiente de difusioacuten de la especie en estudio El gradiente de
concentracioacuten se generaraacute soacutelo para la especie electroactiva que se transforma en la
superficie del electrodo y su transporte de masa se verificaraacute en direccioacuten ndashx es decir
hacia el electrodo si se define x = 0 en la superficie Luego considerando la reaccioacuten de
reduccioacuten ec 21 el flujo J corresponderaacute al nuacutemero de partiacuteculas de O que cambian de
posicioacuten en direccioacuten -x con el tiempo por unidad de aacuterea y puede expresarse como
[28]
Combinando las ecs 26 27 y 28 obtenemos la expresioacuten combinada de las leyes
de Fick para una especie que estaacute reaccionando sobre un electrodo de aacuterea A
[29]
o directamente
[210]
Reemplazando en la ec 25 obtenemos una expresioacuten para la corriente (I) que
circula por la celda en la que se lleva a cabo la reaccioacuten ec 21 sobre un electrodo
uniformemente accesible de aacuterea A y cuando el transporte de masa es exclusivamente
controlado por difusioacuten
[211]
expresioacuten que indica que la corriente es directamente proporcional al gradiente de
concentracioacuten generado por efecto de la reaccioacuten electroacutedica
Introduccioacuten
20
Para un sistema en estado estacionario en el cual la velocidad de transformacioacuten de
la especie electroactiva es igual a la de transferencia de masa y suponiendo que la
reaccioacuten cumple las condiciones de rapidez y reversibilidad (Ec de Nernst) podemos
llegar a describir la relacioacuten entre la corriente circulante por la celda y el potencial al
cual se lleva adelante la reaccioacuten por
[212]
donde KR y KO son constantes que dependen del aacuterea del electrodo de trabajo y los
coeficientes de difusioacuten de las especies reducida y oxidada respectivamente e Il es la
corriente liacutemite
Se define como potencial de media onda al potencial al cual el valor de corriente es
la mitad del valor de corriente liacutemite y queda expresado por la siguiente ecuacioacuten
[213]
Tomando esta definicioacuten y operando en la ec 212 se arriba a la expresioacuten que
describe la corriente como funcioacuten del potencial de electrodo
ndash [214]
ecuacioacuten que corresponde a una funcioacuten sigmoidea por lo tanto al realizar un barrido
de potencial desde un potencial al cual no existe reaccioacuten electroacutedica hacia un potencial
al cual es posible reducir la especie electroactiva hasta alcanzar el estado estacionario la
corriente variaraacute con el potencial siguiendo la forma de una curva sigmoidea
Durante la ejecucioacuten del presente trabajo se utilizaron diversas teacutecnicas
voltamperomeacutetricas cronoamperometriacutea voltametriacutea de barrido lineal voltametriacutea
ciacuteclica y voltametriacutea de onda cuadrada Se pasa a comentar brevemente cada una de
ellas
241 Cronoampreometriacutea
En esta teacutecnica se estudia como variacutea la corriente que circula por la celda en
funcioacuten del tiempo transcurrido mientras el electrodo de trabajo es sometido a un
Introduccioacuten
21
determinado potencial Al aplicar un pulso de potencial se modifica el equilibrio de la
reaccioacuten redox ec 21 se pasa de un potencial inicial donde no ocurre reaccioacuten
electroacutedica a un potencial donde las especies pueden intercambiar electrones en la
interfaz electrodosolucioacuten favoreciendo la reaccioacuten en uno u otro sentido dependiendo
del potencial aplicado Esto da lugar a una corriente liacutemite difusional que variacutea en
funcioacuten del tiempo Para un electrodo uniformemente accesible esta corriente estaacute
descripta por la ec 211 Fijando las condiciones de contorno correspondientes al
experimento en cuestioacuten
t = 0 C0 = Cinfin (no hay reaccioacuten en el electrodo)
t ge0 lim C = Cinfin
t ge0 C0 = 0
donde C0 y Cinfin son las concentraciones de la especie electroactiva en la interfaz
electrodosolucioacuten y en el seno de la solucioacuten respectivamente Es posible entonces
resolver la ecuacioacuten diferencial de la segunda ley de Fick donde la solucioacuten viene dada
por la denominada ecuacioacuten de Cottrell
[215]
donde Id(t) es la corriente controlada por difusioacuten
En este trabajo se utilizoacute esta teacutecnica porque permite cuantificar glicerol utilizando
diferentes electrodos de trabajo seguacuten el medio especiacutefico donde se encuentre disuelto
242 Teacutecnicas voltameacutetricas
Todas las teacutecnicas voltameacutetricas tienen en comuacuten que el potencial eleacutectrico al que
se somete el electrodo de trabajo variacutea en funcioacuten del tiempo En todos los casos se
realiza un barrido lineal de potencial que va desde el potencial inicial (Ei) hasta un
potencial final (Ef) Este barrido se realiza a una velocidad constante que es el cociente
entre el salto (discreto) de potencial y el tiempo de duracioacuten de ese salto La forma en
que se realiza el barrido de potencial es lo que diferencia a una teacutecnica voltameacutetrica de
otra
Introduccioacuten
22
2421 Voltametriacutea de barrido lineal
En esta teacutecnica se realiza un barrido desde un potencial inicial (Ei) al cual no existe
proceso de transferencia de electrones en la interfaz electrodosolucioacuten y soacutelo podraacute
apreciarse corriente debida a procesos no faraacutedicos hasta un potencial final (Ef) En la
medida que el potencial aumenta alcanza un valor al cual ocurre la reaccioacuten electroacutedica
comenzando un flujo de carga debido a procesos faraacutedicos En la Fig 25 se muestra el
perfil del potencial en funcioacuten del tiempo utilizando el modo normal (en peldantildeos) para
el caso de los experimentos realizados con el instrumento utilizado en el presente
trabajo (Eco Chemie 2000)
Figura 25 Perfil de potencial en funcioacuten del tiempo Si bien el potencial es una variable continua un
potenciostato real solo puede establecer variaciones discretas de potencial de aquiacute que en lugar de
observar una ―rampa se observe una escalera
Para una reaccioacuten de reduccioacuten reversible ec 21 a medida que el potencial
aumenta se incrementaraacute la corriente siguiendo la forma de una sigmoidea (seguacuten la ec
21) Sin embargo cuando la velocidad de transporte de masa por difusioacuten de la especie
O sea menor que la velocidad de consumo por la reaccioacuten electroacutedica no seraacute posible
alcanzar el estado estacionario y la corriente llegaraacute a un maacuteximo Ip De aquiacute en maacutes la
corriente comenzaraacute a decaer con t12
tal como lo describe la ecuacioacuten de Cottrell ec
215 En la Fig 26 se muestra el perfil de corriente que se obtienen en experimentos
voltameacutetricos claacutesicos
t
Salto de potencial
Duracioacuten del salto
E
Introduccioacuten
23
Figura 26 Perfiles de corriente en funcioacuten del potencial para experimentos voltameacutetricos de barrido
lineal Liacutenea azul la velocidad de barrido es lo suficientemente baja establecieacutendose un estado
estacionario Liacuteneas verde negra y roja la velocidad de barrido es alta y se origina un pico de corriente
La corriente de pico crece proporcionalmente a la raiacutez cuadrada de la velocidad de barrido
El maacuteximo de corriente tambieacuten denominado corriente de pico se puede obtener a
partir de la ecuacioacuten de Randles-Sevcik (Bard amp Faulkner 2001)
[216]
siendo la temperatura 25 degC y donde A estaacute en cm2 D en cm
2 s
-1 C en mol cm
-3 y en
V s-1
2422 Voltametriacutea ciacuteclica
En esta teacutecnica se realiza un barrido desde un potencial inicial (Ei) a un primer
veacutertice de potencial (Ev1) y a partir de alliacute se invierte la direccioacuten de barrido hasta
llegar a un segundo veacutertice de potencial (Ev2) el cual puede coincidir con el Ei El perfil
de potencial en funcioacuten del tiempo que se obtiene utilizando el instrumento con el que
se trabajoacute y de acuerdo a lo indicado por el fabricante se esquematiza en la Fig 27
(izquierda) y el perfil de corriente en funcioacuten del potencial para una reaccioacuten reversible
se esquematiza en la Fig 27 (derecha)
Idif
IP
Introduccioacuten
24
Fig 27 Perfil de potencial en funcioacuten del tiempo (izquierda) Perfil de corriente en funcioacuten del
potencial para una reaccioacuten redox reversible (derecha)
En este trabajo se realizaron experimentos de voltametriacutea ciacuteclica para identificar la
presencia de mediadores redox que presentando reacciones electroacutedicas reversibles
permitieran la regeneracioacuten del cofactor de la enzima glicerol deshidrogenasa (GlDH)
Esta teacutecnica tambieacuten se utilizoacute para calcular las aacutereas de los electrodos de trabajo de
modo tal de normalizar la sentildeal obtenida con la superficie del electrodo utilizado
Ademaacutes se utilizoacute para cuantificar glicerol e identificar los potenciales de oxidacioacuten del
mismo
243 Teacutecnicas de pulso
Las teacutecnicas de pulso surgieron vinculadas a la polarografiacutea de corriente continua
la teacutecnica voltameacutetrica cuya particularidad es utilizar un electrodo de goteo de mercurio
Este grupo de teacutecnicas se ha ido diversificando a medida que se fueron haciendo maacutes
complejos tanto los esquemas de potenciales aplicados a los electrodos de trabajo
como las medidas de intensidades de corrientes (Bard amp Faulkner 2001)
2431 Voltamperometriacutea onda cuadrada VOC
Esta teacutecnica tiene varias ventajas entre las que se encuentran su excelente
sensibilidad (se han registrado liacutemites de deteccioacuten directa del orden de 10-8
M) la
eliminacioacuten de las corrientes de fondo y la rapidez con que se lleva a cabo el
experimento completo ya que se puede trabajar a velocidades de barrido de potencial
auacuten superiores a 1 V s-1
(Bard amp Faulkner 2001)
El perfil de potencial aplicado al electrodo de trabajo en funcioacuten del tiempo en la
VOC se presenta en la Fig 28 Consta de una onda cuadrada simeacutetrica con una
amplitud Ep superpuesta a una escalera de potencial con escalones o saltos de
potencial Es (Fig29) donde el pulso hacia adelante de la onda cuadrada coincide con
el escaloacuten de potencial de la escalera
E
I
Introduccioacuten
25
La utilizacioacuten de la teacutecnicas voltamperomeacutetricas de pulso presentan la ventaja de
permitir realizar un barrido de potencial donde la especie electroactiva se oxida
raacutepidamente produciendo una sentildeal analiacutetica No es necesario trabajar durante periacuteodos
prolongados de tiempo a los elevados potenciales donde se establece la corriente liacutemite
controlada por difusioacuten como lo requiere la teacutecnica amperomeacutetrica
Figura 28 Perfil de potencial aplicado al electrodo de trabajo en la VOC en funcioacuten del tiempo En
liacutenea cortada se indica cual es la escalera de potencial a la cual se le sobreimprime la onda cuadrada Se
indican resaltados ( ) los tiempos durante los que se realizan las lecturas de corriente En un ciclo se
realizan las lecturas de corrientes alta y baja Adaptado de Bard amp Faulkner 2001
Figura 29 a) Onda cuadrada simeacutetrica b) Perfil de potencial en funcioacuten del tiempo de una escalera
de potencial
a)
b)
E
E
E
t
Amplitud de la
onda cuadrada EP
Periacuteodo de la onda
Salto o escaloacuten
de potencial ES
Medida
alta
Medida
baja
t
Salto o escaloacuten
de potencial ES
t
Amplitud de la
onda cuadrada
EP
Periacuteodo de la onda
Introduccioacuten
26
El potensiostato registra la corriente durante la medida alta y la medida baja de un
ciclo La diferencia de estas corrientes es la corriente neta Ineta que se grafica en
funcioacuten del potencial de la escalera de potencial correspondiente a ese ciclo (liacutenea
cortada Fig 28) Para sistemas reversibles se obtiene una curva como se observa en la
Fig 210 donde se indican las corrientes de la medida alta de la medida baja y neta
que resulta en un pico de corriente La corriente de pico neta IP n observada en la VOC
es proporcional a la concentracioacuten de la especie electroactiva en el seno de la solucioacuten y
se centra alredewdor del potencial de la cupla redox
Figura 210 Voltamperograma de onda cuadrada tiacutepico para un sistema reversible la corriente neta
Ineta se obtiene por la diferencia entre la corriente registrada al finalizar el pulso I medida alta y la
corriente registrada previamente al nuevo pulso I medida baja
La frecuencia ( f ) de la onda cuadrada medida en Hz se define como
1f [217]
Siendo el periacuteodo de la onda cuadrada medido en segundos que a su vez es dos
veces el tiempo del pulso Pt por lo tanto tenemos que
P2
1
tf [218]
Luego
ft
2
1P [219]
Los valores de frecuencia pueden variar desde unos pocos Hz hasta varios miles
dependiendo de las condiciones particulares del caso La velocidad de barrido v queda
definida como el producto del salto de potencial ES por la frecuencia f
fSEv [220]
Introduccioacuten
27
Las velocidades de barrido en los experimentos de VOC se obtienen modificando la
frecuencia de la onda cuadrada ya que el salto de potencial suele ser un valor fijo
Se demostroacute que para cuplas redox controladas por difusioacuten los paraacutemetros de la
VOC maacutes adecuados son E = 50n mV y Es = 10n mV (Osteryoung y Osteryoung
1985)
Cuando se aplica un pulso de potencial en las cercaniacuteas del potencial de la cupla
redox las corrientes faradaicas aumentan significativamente conforme se oxida o se
reduce la especie electroactiva Estas corrientes decaen con el tiempo seguacuten la ecuacioacuten
de Cottrel ya expresada anteriormente como ec [215]
Si consideramos t como tP se observa que la disminucioacuten del tiempo del pulso
implica mayor corriente Luego a medida que se aumenta la frecuencia aumenta la
velocidad de barrido y disminuye el tiempo del pulso Para sistemas reversibles se
predice que la intensidad tiene una dependencia lineal con la raiacutez cuadrada de la
frecuencia (Osteryoung y Osteryoung 1985)
21 fBAnIp [221]
La eleccioacuten de la frecuencia adecuada es de suma importancia A frecuencias muy
altas aumentan significativamente las corrientes capacitivas perdiendose resolucioacuten lo
que impone un liacutemite al aumento de la frecuencia
25 Biosensores
En muchas determinaciones de analitos en muestras bioloacutegicas se necesitan pasos
previos a la evaluacioacuten propiamente dicha que permiten eliminar o enmascarar las
potenciales interferencias Sin embargo el pretratamiento de la muestra puede llevar a
una disminucioacuten de la concentracioacuten del analito ya sea por peacuterdidas en las etapas
consecutivas del anaacutelisis o por transformacioacuten del analito provocando errores por
defecto en la determinacioacuten (Lagier amp Verdini 2000) Cuando la evaluacioacuten de la
concentracioacuten del analito se utiliza con fines cliacutenicos tal resultado erroacuteneo puede
conducir a un diagnoacutestico incorrecto Es por ello que en la actualidad el desarrollo de
nuevas metodologiacuteas analiacuteticas tiende no soacutelo a acortar los tiempos de anaacutelisis
previnieacutendose asiacute las peacuterdidas por degradacioacuten del analito sino que ademaacutes procura
permitir la ejecucioacuten del anaacutelisis sin pasos separativos previos
En los uacuteltimos antildeos se ha avanzado en el desarrollo de biosensores ya que estos
dispositivos presentan ventajosas caracteriacutesticas que los convierten en herramientas
Introduccioacuten
28
prometedoras de anaacutelisis (Belluzo y col 2008) Los biosensores se pueden definir como
dispositivos analiacuteticos compuestos por dos componentes principales
1- Una superficie selectiva denominada bioreceptor o superficie bioreactiva (SBR)
generalmente de origen bioloacutegico o sinteacutetica biomimeacutetica la cual en contacto con la
muestra es capaz de interaccionar de manera especiacutefica con el analito (Vo-Dinh amp
Allain 2003) Este elemento es el que aporta la especificidad del dispositivo
2- Un transductor fiacutesico-quiacutemico encargado de producir una sentildeal que es funcioacuten
de la interaccioacuten entre el analito y la SBR (Vo-Dinh amp Allain 2003) Eacuteste es el
elemento que aporta la sensibilidad al dispositivo
Los biosensores pueden ser clasificados de acuerdo a la sentildeal fiacutesico-quiacutemica que
produce el transductor de acuerdo a
Sentildeal Biosensor
Cambio de temperatura Termomeacutetrico
Cambio en paraacutemetro eleacutectrico Electroquiacutemico
Cambio en propiedades de la luz Oacuteptico
Cambio de masa Piezoeleacutectrico Acuacutestico
(Adaptado de Vo-Dinh amp Allain 2003)
De los distintos tipos de biosensores los electroquiacutemicos han sido tradicionalmente
los maacutes desarrollados y usados debido a sus ventajas con respecto a otros biosensores
tales como la generacioacuten de una respuesta electroacutenica directa que permite una raacutepida
respuesta mayor simplicidad operativa versatilidad para la miniaturizacioacuten y bajo
costo Actualmente gracias al avance de la tecnologiacutea de los semiconductores y la
serigrafiacutea pueden ser producidos masivamente Dependiendo del paraacutemetro fiacutesico
medido por el detector los biosensores electroquiacutemicos pueden a su vez subdividirse en
conductimeacutetricos potenciomeacutetricos y amperomeacutetricos (Vo-Dinh amp Allain 2003)
251 Superficie de bioreconocimiento en biosensores
La SBR es un sistema bioloacutegico o biomimeacutetico que reacciona bioquiacutemica o
quiacutemicamente con el analito En la actualidad existe una gran diversidad de elementos
bioloacutegicos o derivados de ellos que son utilizados como SBR
Los mismos van desde moleacuteculas simples a sistemas complejos (Vo-Dinh amp Allain
2003) Asiacute la SBR puede contener antiacutegenos anticuerpos aacutecidos desoxiribonucleicos
(ADN) aacutecidos ribonueleicos (ARN) enzimas receptores de membrana tejidos
Introduccioacuten
29
microorganismos completos o compuestos sintetizados ―ad-hoc que emulan especies
bioloacutegicas como pueden ser estructuras biomimeacuteticas y poliacutemeros molecularmente
impresos (Vo-Dinh amp Allain 2003)
252 Biosensores amperomeacutetricos
De los biosensores electroquiacutemicos los amperomeacutetricos suelen presentar mayores
sensibilidades (Iost y col 2011)
En la Fig 211 se esquematiza un biosensor amperomeacutetrico El analito presente en
la muestra compleja reacciona selectivamente con la SBR lo que desencadena la sentildeal
analiacutetica en el transductor fiacutesico-quiacutemico
En este caso particular el transductor es un electrodo de trabajo que integra una
celda de tres electrodos El mismo estaacute sometido a un potencial eleacutectrico (con respecto a
un electrodo de referencia) y la sentildeal analiacutetica es la corriente eleacutectrica que circula por la
celda utilizando un contraelectrodo de gran aacuterea En estas condiciones la maacutexima
intensidad de corriente eleacutectrica que se observa estaacute limitada exclusivamente por la
reaccioacuten de oacutexido-reduccioacuten que ocurre en la superficie del electrodo de trabajo
Figura 211 El electrodo de trabajo es sometido a un potencial eleacutectrico en su superficie tiene lugar
la reaccioacuten de oacutexido-reduccioacuten Dicha reaccioacuten ocurre o no o bien transcurre a velocidades diferentes en
presencia o ausencia del analito de intereacutes
253 Biosensores de uso cliacutenico
En el caso de muestras para el diagnoacutestico cliacutenico de infecciones el analito a
determinar puede ser alguna de las moleacuteculas generadas por el individuo infectado
como respuesta a la presencia del agente infeccioso por ej los anticuerpos (Acs)
especiacuteficos o el agente infeccioso iacutentegro o partes del mismo En muchos casos la sola
presencia de Acs especiacuteficos es por siacute misma indicativa de infeccioacuten Hay casos en que
Introduccioacuten
30
la presencia de Acs no es per-seacute indicativa de infeccioacuten riesgosa Dos ejemplos de esta
situacioacuten son el de la toxoplasmosis y la tuberculosis
En el caso de la toxoplasmosis la deteccioacuten de Acs anti-T gondii es soacutelo de
trascendental importancia en embarazadas porque si la infeccioacuten ha sido adquirida
durante el embarazo el feto estaacute en riesgo de contagiarse y puede padecer lesiones
severas (Dunn y col 1999 Montoya amp Liesenfeld 2004) Por el contrario si se trata
de infeccioacuten croacutenica no es necesario exponer a la embarazada (y al feto) a medicacioacuten
innecesaria evitaacutendose con ello los riesgos que devienen del uso de los faacutermacos
especiacuteficos utilizados durante el tratamiento de la infeccioacuten (Freij amp Sever 1999)
Debido a la incertidumbre que acompantildea la deteccioacuten de los anticuerpos hasta hoy
utilizados con este fin se ha propuesto realizar pruebas utilizando antiacutegenos
recombinantes del paraacutesito Se ha evaluado el desempentildeo de antiacutegenos recombinantes
sintetizados por teacutecnicas de biologiacutea molecular en forma individual o mezclados para
evaluar la avidez de Acs IgG (Beghetto y col 2003) Se observoacute que utilizando el
fragmento del antiacutegeno MIC3 en este ensayo los iacutendices de avidez permitieron
determinar la antiguumledad de la infeccioacuten con mayor grado de certeza que empleando
homogenado total de paraacutesito resultando MIC3 un buen marcador para el diagnoacutestico
de infecciones agudas (Beghetto y col 2003) La proteiacutena recombinante P35 tambieacuten
fue propuesta como marcador seroloacutegico para diferenciar infeccioacuten aguda de croacutenica ya
que evidencioacute sensibilidades del 853 para sueros agudos y una especificidad del 98
respecto de sueros croacutenicos (Parmley y col 2000) No obstante y a pesar de haberse
descrito moleacuteculas para el diagnoacutestico de toxoplasmosis aguda no existe un acuerdo
sobre su efectividad por lo que se requiere de la evaluacioacuten de nuevos antiacutegenos para
este fin En general el uso de una sola moleacutecula recombinante no brinda suficiente
sensibilidad habieacutendose demostrado que el empleo de varios antiacutegenos recombinantes
la mejora (Pinon y col 2003) Se ha observado tambieacuten que una mezcla de moleacuteculas
no produce los mismos resultados que cuando se utilizan en forma separada (Silveira y
col 2001) Se ha postulado que esta diferencia se debe a las distintas caracteriacutesticas
fisicoquiacutemicas entre las moleacuteculas de una mezcla que impide la inmovilizacioacuten
homogeacutenea en las superficies de captura utilizadas en los inmunoensayos Por lo tanto
resulta muy factible que un ensayo que utilice una combinacioacuten o fusioacuten en una sola
moleacutecula de estos antiacutegenos recombinantes marcadores de infeccioacuten reciente pueda
mejorar el diagnoacutestico diferencial tal como ha sido demostrado para el diagnoacutestico de
otras infecciones (Camussone y col 2009)
Introduccioacuten
31
En el caso de la tuberculosis la mayoriacutea de los individuos de la poblacioacuten han
recibido la vacunacioacuten reglamentaria por inoculacioacuten de una cepa de micobacterias
inofensivas generando Acs anti-Mycobacterium tuberculosis (M tuberculosis) Por
ello estos Acs suelen estar presentes en casi toda la poblacioacuten De aquiacute que la deteccioacuten
de Acs anti-M tuberculosis no demuestra infeccioacuten activa de riesgo Por tal motivo el
indicador por excelencia de infeccioacuten activa es la evidenciacioacuten del patoacutegeno en la
muestra No obstante las muestras suelen poseer una extremadamente baja cantidad de
M tuberculosis lo que dificulta su deteccioacuten directa Por ello es preciso utilizar alguacuten
paso amplificador del analito a censar Dado el largo tiempo de replicacioacuten del
microorganismo los cultivos realizados para su replicacioacuten insumen periacuteodos
prolongados Siguiendo los trabajos de Park y col y McNerney y col (Park y col
2003 McNerney y col 2004) se formuloacute la siguiente hipoacutetesis de trabajo Sistemas
enzimaacuteticos presentes en M smegmatis permitiriacutean metabolizar sustratos electroactivos
a distintas velocidades de reaccioacuten dependiendo de la integridad del microorganismo
Siendo este el caso seriacutea posible distinguir entre cultivos de M smegmatis que han sido
lisados por el fago especiacutefico D29 de aquellos cultivos en que dichas micobacterias
estaacuten iacutentegras Si soacutelo existiera lisis cuando la muestra ensayada contiene organismos
filogeneacuteticamente emparentados como M tuberculosis que permitiesen la
amplificacioacuten selectiva del fago D29 previamente a la infeccioacuten del cultivo testigo de
M smegmatis la evaluacioacuten electroquiacutemica del sustrato metabolizable por el
microorganismo deberiacutea permitir evidenciar presencia o ausencia de M tuberculosis La
seleccioacuten del fago D29 se justifica porque es capaz de infectar micobacterias de
crecimiento raacutepido como M smegmatis y las de crecimiento lento como M tuberculosis
(Park y col 2003)
El glicerol es corrientemente utilizado como principal fuente de carbono en cultivos
de micobacterias siendo degradado eficientemente por sus sistemas enzimaacuteticos que
utilizan mecanismos redox En este trabajo nos hemos planteado detectar este
polialcohol como analito de intereacutes ya que su consumo estaraacute preferencialmente
vinculado a la presencia de micobacterias aptas para tal degradacioacuten Por este motivo
proponemos utilizar un bioelectrodo con una SBR que contenga una enzima cuyo
sustrato sea glicerol
Introduccioacuten
32
2531 Biosensores para evaluacioacuten de infeccioacuten toxoplaacutesmica
En el presente trabajo se propuso un biosensor para evaluacioacuten de infeccioacuten
toxoplaacutesmica utilizando un electrodo de oro policristalino macizo sobre el cual se
adsorbioacute un antiacutegeno recombinante y se siguioacute un esquema ELISA del tipo indirecto
con deteccioacuten de IgGh En la Fig 212 se muestra el esquema que se siguioacute para este
inmunoensayo
Proteiacutena recombinante IgG a-IgGh conjugada a HRP
Bloqueante IgG humana ferrocenometanol
Figura 212 Sobre la superficie del electrodo se fija la proteiacutena recombinante que capturaraacute los
anticuerpos especiacuteficos si estaacuten presentes en el suero El revelado se realiza con un segundo anticuerpo
especiacutefico para IgG humana marcado con HRP que en presencia de H2O2 oxida el mediador FcMe que
se reduce sobre la superficie del electrodo generando la sentildeal analiacutetica
254 Biosensores para cuantificacioacuten de glicerol
La determinacioacuten de glicerol ha ido ganando importancia en las uacuteltimas deacutecadas
debido al uso del mismo en varias industrias como la farmaceacuteutica automotriz
alimenticia y textil entre otros El compuesto es un producto importante de la
fermentacioacuten en la mayoriacutea de las bebidas alcohoacutelicas y su concentracioacuten es un
paraacutemetro uacutetil para el seguimiento del proceso fermentativo (Goriushkina y col 2010)
Tambieacuten es un componente no deseable del biodiesel y su concentracioacuten es un indicador
de la calidad del combustible (Monteiro y col 2008)
Se han desarrollado numerosas metodologiacuteas para llevar adelante la cuantificacioacuten
del glicerol que incluyen teacutecnicas espectrofotomeacutetricas yo espectrofluoromeacutetricas
(Bondioli amp Bella 2005 Silva amp Rocha 2010 Lima y col 2012) incluidos los basados
Introduccioacuten
33
en enzimas (Kronka y col 2001 Li y col 2001) los electroquiacutemicos (Tehrani amp
Ghani 2012 Gamella y col 2008 Wu amp Cheng 2005) y los cromatograacuteficos estos
uacuteltimos han sido oficialmente recomendado por la AOAC como los meacutetodos 96809
97210 (AOAC 2005) Sin embargo a pesar de que estos meacutetodos permiten determinar
con eficacia de glicerol en presencia de muchos compuestos que interfieren esta teacutecnica
se considera que es ecoloacutegicamente desfavorable debido a la utilizacioacuten de solventes
nocivos para el medio ambiente e intriacutensecamente onerosa debido a los altos costos de
los mismos (Gamella y col 2008)
Por un lado las propuestas espectrofotomeacutetricas que utilizan enzimas se basan en el
uso de sistemas o bien de una o varias enzimas relativamente caras que se eliminan
despueacutes de que se han utilizado en una uacutenica determinacioacuten En estos casos a menudo
son consumidos las enzimas yo cofactores caros como nicotinamida adenina
dinucleoacutetido (NAD+) o adenosina 5-trifosfato (ATP) a menudo son consumidos
(Kronka y col 2001 Li y col 2001 Wu amp Cheng 2005) Como un ejemplo la
propuesta de Li para determinar glicerol en matrices complejas se basa en el uso de tres
enzimas a saber glicerol quinasa (GK) piruvato quinasa (PK) y lactato
deshidrogenasa (LDH) ademaacutes de utilizar ATP y NAD+ (Li y col 2001) Este meacutetodo
produce buenos resultados en teacuterminos de sensibilidad y especificidad pero consume 1
U de GK 15 U de PK 22 U de LDH 2x10-6
moles de ATP y 33x10-7
moles de
NAD+ por determinacioacuten Por lo tanto el costo derivado por anaacutelisis es considerado
caro sobre todo cuando se debe analizar un elevado nuacutemero de muestras
Por otro lado se han propuesto herramientas versaacutetiles notables para cuantificar
glicerol como ser la basada en tecnologiacutea de biosensores en particular los basados en
meacutetodos amperomeacutetricos (Ghica amp Brett 2006 Gamella y col 2008) De hecho los
biosensores amperomeacutetricos proporcionan suficiente sensibilidad y selectividad para
permitir la determinacioacuten del analito junto con una velocidad apropiada para completar
el anaacutelisis En efecto los biosensores amperomeacutetricos que utilizan enzimas como
componente bioloacutegico para el reconocimiento dan lugar a una selectividad significativa
debido a su capacidad de reaccionar especiacuteficamente con su sustrato Este uacuteltimo es a
menudo el analito de intereacutes por lo que puede ser cuantificado de manera eficiente auacuten
ante la presencia de otros componentes similares estructuralmente que pueden hallarse
en la muestra (Belluzo y col 2008) Los dispositivos construidos con enzimas a
menudo pueden ser reutilizados y por lo tanto el costo por determinacioacuten puede ser
Introduccioacuten
34
reducido significativamente en comparacioacuten con los meacutetodos espectrofotomeacutetricos
mencionados anteriormente
Se han desarrollado varios biosensores utilizando enzimas que tienen como sustrato
al glicerol (Gamella y col 2008) En los disentildeos utilizados se utilizan diversas enzimas
que reaccionan especiacuteficamente con el glicerol en un primer paso y se censa un
producto de esta reaccioacuten En otros disentildeos se encuentran involucradas maacutes de una
enzima donde la segunda o tercer enzima utiliza como sustrato algunos de los
productos de la primera o segunda reaccioacuten y finalmente se censa un producto de la
uacuteltima reaccioacuten enzimaacutetica Algunos disentildeos que aparecieron en literatura al momento
de iniciar este trabajo de tesis fueron detallados por Pingarroacuten y colaboradores (Gamella
y col 2008) y se encuentran resumidos en la Tabla 23 al final de este capiacutetulo y se
corresponden a los esquemas evaluados al momento de iniciar este trabajo de tesis
Todos los disentildeos descriptos al momento presentan la desventaja de ser onerosos
tanto por el disentildeo en siacute como por el costo operativo devenido del consumo de elevadas
cantidades de reactivos caros
Sobre la base del modelo propuesto por Tuntildeoacuten-Blanco y colaboradores (Aacutelvarez-
Gonzaacutelez y col 2000) se comenzaron los ensayos para construir un bioelectrodo
selectivo para glicerol La propuesta contempla en primer lugar disminuir la cantidad
de enzima Glicerol deshidrogenasa En segundo lugar proponemos utilizar la coenzima
NAD(H) en forma soluble e introducir un mediador electroquiacutemico distinto al utilizado
previamente En el trabajo citado se generaba una cupla cataliacutetica por oxidacioacuten
electroacutedica del NAD+ presente en un electrodo de trabajo de pasta de C modificada En
nuestro caso el mediador soluble permite reoxidar la coenzima para cerrar el ciclo
cataliacutetico siguiendo el esquema de la Fig 213
Figura 213 Esquema de reacciones que ocurren en la celda DHA 13 dihidroxiacetona GlDH
gliceroldeshidrogenasa NAD(H) nicotinadenina dinucleoacutetido
glicerol
DHA
GlDHox
GlDHred NAD+
NADH Mediador ox
Mediador red
e- Electrodo
Introduccioacuten
35
Tabla 23 Biosensores selectivos para gicerol Las filas 1 a 10 son un extracto parcial del trabajo de
Gamella y col 2008 En las filas 11 y 12 se incluyen los disentildeos propuestos por Šefčovičovaacute y col
2008 y Goriushkina y col 2010
Electrodo Enzima Mediador Potencial
1 Pt GKGPOx - + 650 mV vs AgAgCl
2 Al GlDH Fe(CN)6 + 400mV vs ECS
3 Barras de grafito
espectroscoacutepico GlDH Complejo de Os + 200 mV vs AgAgCl
4 Serigraacutefico (SPE) pGlyDH N-(4-hidroxibenzilideno)-
4-ferrocenilanilina + 400 mV vs AgAgCl
5 Carboacuten Viacutetreo a) GlDHDP
b) GKGPOxHRP
a)Fe(CN)63-
b)Fe(CN)64-
a) + 350 mV vs AgAgCl
b) - 300 mV vs AgAgCl
6 SPE modificado con
ZrO2 y azul meldola GlDH Azul meldola + 100 mV vs AgAgCl
7 SPE modificado azul
de Prusia
GlDH Tt NADH
Ox Azul de Prusia - 50 mV vs AgAgCl
8 Pasta de carbono GlDH Producto de la electro-
oxidacioacuten del NAD+ + 150 mV vs AgAgCl
9 Flim de carbono a) GPOx
b)GKGPOx Poli (rojo neutro) - 350 mV vs ECS
10 Au a)GlDHDP
b) GKGPOxHRP Tetra thiafulvaleno
a) + 150 mV vs AgAgCl
b) 0 mV vs AgAgCl
11 Carboacuten Viacutetreo GlDHDP Fe(CN)63- + 350 mV vs AgAgCl
12 Platino serigraacutefico Gox - + 300 mV vs electrodo
intriacutenseco
Tabla 23 Continuacioacuten
Muestra
Rango dinaacutemico
Lineal (M) Sensibilidad
(mA M-1
cm-2
)
Liacutemite de
deteccioacuten (M) Estabilidad
Desde Hasta
1 Mosto de uva 2 10-6
10-3 - 5 10
-7 Hasta 1 mes
2 Jugo de uva 10-6
2 10-3
- 10-6 -
3 Vino 1 10-6
2 10-4
32 1 10-6
80 actividad inicial luego
de 20 horas
4 Vino - - - - actividad enzimaacutetica decae
rapidamente
5 Fermento
anaeroacutebico
1 10-5
1 10-5
10-3
1 10-3
a) 620
b) 142 -
sentildeal inicial luego de
uso continuo a) 60 a 90
hs b) 70 16 hs
6 Fermento de
jugo de uva 10
-51 10
-4 - 10
-6 -
7 - 10-5
1 10-3
- 10-6 -
8 Jarabe 997 10-7
10-4
162 cm2 43 10-7
80 actividad inicial luego
de 3 diacuteas
9 Vino 10-5
147 10-4
a) 101
b) 079
a) 4 10-6
b) 15 10-5
sentildeal inicial luego de
uso continuo a) 87 a 8
diacuteas b) 62 8 diacuteas
10 Vino 10
-6
4 10-7
2 10-5
1 10-5
a) 207
b) 250
a) 4 10-7
b) 31
sentildeal inicial luego de
uso continuo a) 87 a 51
diacuteas b) 46 8 diacuteas
11 Fermento - - - 11 10-6
-
12 Vino 10
-5
2 10-6
25 10-2
64 10-3
-
10-5
2 10-6 -
Objetivos
Objetivos
37
3 Objetivos
31 Objetivos generales
Desarrollar metodologiacuteas electroquiacutemicas que permitan identificar analitos de
intereacutes tanto para el diagnoacutestico cliacutenico como para la industria de combustibles
alternativos
32 Objetivos particulares
a) Obtener bioelectrodos que exhiban una corriente cataliacutetica diferencial al efectuar
inmunoensayos con muestras confirmadas positivas o negativas para infeccioacuten aguda
por T gondii
b) Desarrollar un meacutetodo electroquiacutemico que permita la cuantificacioacuten de glicerol
en medio acuoso para determinarlo por ejemplo luego de su extraccioacuten en
combustibles alternativos
c) Evidenciar electroquiacutemicamente la ocurrencia de lisis de M smegmatis por fagos
D29 indicadores de la presencia de micobacterias patoacutegenas emparentadas
provenientes de individuos padeciendo infeccioacuten tuberculosa
Materiales y Meacutetodos
Materiales y Meacutetodos
39
4 Materiales y meacutetodos
41 Reactivos y medios de cultivos
411 Reactivos
Todos los reactivos utilizados fueron de grado analiacutetico salvo que se indique lo
contrario Los aacutecidos aceacutetico sulfuacuterico niacutetrico clorhiacutedrico y percloacuterico las sales KCl
Na2HPO4 KH2PO4 NiSO4 CuSO45H2O y la sal disoacutedica del aacutecido etilen diamino tetra
aceacutetico (EDTA) dimetilsulfoacutexido (DMSO) imidazol tris base las enzimas peroxidasa
de raacutebano picante EC 11117 (tipo VI) (HRP) y glicerol deshidrogenasa de
cellulomonas EC 1116 (GlDH) acrilamida (adecuada para electroforesis) NNprime-(12-
dihidroxietilen) bisacrylamide (97) ditiotreitol (DTT) Coomasie blue G-250 alcohol
isopropiacutelico β-mercaptoetanol 33-diaminobenzidina tetrahidrocloruro (DAB)
nicotina adenina dinucleoacutetico (NAD) los desoxinucleoacutetidos trifosfato dATP dGTP
dCTP y dTTP reactivo de Folin-Ciocalteu glicina albuacutemina seacuterica bovina (ASB)
peptona de carne extracto de levadura fueron suministrados por Sigma-Aldrich El
polvo de carbono viacutetreo (esfeacuterico diaacutemetro de partiacutecula entre 2 y 12 microm pureza
9999+) fue suministrado por Aldrich El polvo de carbono grafito (pureza gt 99) fue
provisto por Fisher Scientific Dimetilformamida (DMF) 1 1rsquo-carbonil-diimidazol las
sales tartrato de sodio y potasio MgCl2 CaCl2 NaCl Na2CO3 NaHCO3 K2CO3
KHCO3 K3Fe(CN)6 K4Fe(CN)6 (NH4)2SO4 (NH4)2S2O8 (gt98) dodecil sulfato de
sodio (Farmacopea Unioacuten Europea) (SDS) NaOH KOH NNNprimeNprime-
tetrametiletilendiamino (Temed) azul de bromofenol (Farmacopea Unioacuten Europea)
xilencianol (para electroforesis) etanol absoluto fueron suministrados por Merck El
H2O2 y el glicerol fueron provistos por Cicareli El isopropil-β-D-1-
tiogalactopiranoacutesido (IPTG) fue suministrado por Promega La enzima ADN polimerasa
de Thermus aquaticus EC 2777 (polimerasa Taq) y los oligonucleoacutetidos fueron
suministrados por InvitrogenTM
Argentina La enzima peroxidasa de raacutebano picante
ligada a estreptavidina (HRP-EAV) fue provista por Abcam El ester biotin n-
hidroxisuccinimida fue provisto por Thermo Scientific La ampicilina (Farmacopea
Argentina) fue provista por laboratorios Klonal La aluacutemina para pulido (tamantildeo de
partiacutecula 03 microm) fue provista por Metrohm El anticuerpo de cabra anti IgG humana
ligado a HRP fue provisto por Zymed El Tween-20 fue provisto por Anhedra
No se detallan los reactivos contenidos en los equipos comerciales utilizados
disponibles en las paacuteginas web de los respectivos proveedores
Materiales y Meacutetodos
40
412 Medios de cultivos
Para el crecimiento de cepas de Escherichia coli (E coli) se utilizoacute el medio de
cultivo Luria-Bertani (LB) compuesto por 10 g L-1
peptona de carne 5 g L-1
extracto de
levadura y 10 g L-1
NaCl En los casos requeridos se suplementoacute este medio con el
antibioacutetico ampicilina (100 g mL-1
) Para la preparacioacuten de medios soacutelidos se agregoacute
agar en concentracioacuten final de 15 g L-1
Para el crecimiento de ceacutelulas de M smegmatis se utilizoacute el medio de cultivo
Middlebrook 7H9 provisto en forma anhidra por Difco y fue suplementado con NaCl
CaCl2 yo glicerol en concentraciones variables de acuerdo a los requerimientos del
ensayo analiacutetico ulterior la composicioacuten del medio provisto por Difco se detalla en la
siguiente tabla
Tabla 41 Caldo Middlebrook 7H9 (Difco) composicioacuten en g L-1
del medio liacutequido recieacuten preparado
(NH4)2SO4 050
Na2(HPO4) 250
K(H2PO4) 100
Citrato de sodio 010
MgSO4 005
CaCl2 0005
ZnSO4 0001
CuSO4 0001
Citrato feacuterrico amoacutenico 004
Aacutecido l-glutaacutemico 050
Piridoxina 0001
Biotina 00005
42 Cepas bacterianas
Las cepas bacterianas utilizadas y sus caracteriacutesticas relevantes se detallan en la
siguiente tabla
Materiales y Meacutetodos
41
Tabla 42 Cepas bacterianas utilizadas
Cepa Caracteriacutesticas
Escherichia
coli (E coli)
BL21 (DE3)
E F- ompT hsdS (rB-mB-) [lon] (DE3 immP21 int- lacI+
lacUV5lacZT7 ARN polimerasa) Contiene el gen de la T7
ARN polimerasa bajo el control del promotor lacUV5 El gen de
la ARN polimerasa estaacute integrado en el cromosoma bacteriano
desde (DE3) y su expresioacuten se induce por IPTG (Stratagene)
M smegmatis
mc2155
Mycobacterium smegmatis MC2155 es un organismo
aerobio quimioorganotrofo en forma de barra no moacutevil
patoacutegeno de humanos Esta bacteria fue inicialmente aislada de
esmegma humano Esta cepa es un mutante de M smegmatis Es
faacutecilmente transformable con vectores plasmiacutedicos usando
electroporacioacuten
43 Bacterioacutefagos
Se utilizoacute el bacterioacutefago D29 que infecta especiacuteficamente micobacterias Los
trabajos especiacuteficos de infeccioacuten de micobacterias fueron realizados en el Departamento
de Microbiologiacutea de la Facultad de Ciencias Meacutedicas (UNR) bajo la supervisioacuten del Dr
Ricardo Morbidoni
44 Plaacutesmidos
El plaacutesmido utilizado y sus caracteriacutesticas relevantes se detallan en la siguiente tabla
Tabla 43 Plaacutesmido utilizado
Plaacutesmido Caracteriacutesticas
pET32a
5900 pares de bases resistencia ampicilina promotor T7lac Produce
proteiacutenas fusionadas a 6 histidinas y a la proteiacutena tiorredoxina (TRX)
de 204 kDa lo que permite su purificacioacuten en columna de NTA-Ni2+
Este vector fue utilizado como sistema de expresioacuten en la cepa BL21
(DE3) de E coli
45 Reaccioacuten en cadena de la polimerasa
Las reacciones se llevaron a cabo en un volumen total de 25 μL conteniendo
solucioacuten de amplificacioacuten comercial suplementada con MgCl2 para alcanzar una
concentracioacuten final de MgCl2 25 mM y 02 mM de cada uno de los desoxinucleoacutetidos
trifosfato dATP dGTP dCTP y dTTP 20 pmoles de cebador directo y reverso y 1 UI
de polimerasa Taq Se empleoacute un termociclador BOECO (Germany) y se inicioacute la
reaccioacuten con un paso de desnaturalizacioacuten a 95 ordmC durante 5 min La amplificacioacuten de
los fragmentos se realizoacute en 30 ciclos de a) desnaturalizacioacuten 1 min a 95degC b)
Materiales y Meacutetodos
42
hibridizacioacuten 1 min a la temperatura oacuteptima para cada par de cebadores c) extensioacuten
72degC 15 min por cada Kpb amplificado finalmente se realizoacute un paso de extensioacuten
durante 10 min
Para la reaccioacuten de amplificacioacuten de la secuencia codificante de la proteiacutena se
disentildearon oligonucleoacutetidos cebadores especiacuteficos (ver maacutes adelante) En el disentildeo de los
mismos se introdujeron sitios de restriccioacuten apropiados para el posterior clonado del
fragmento en vectores de clonado o expresioacuten
Como molde se utilizoacute aproximadamente 003 g de ADN plasmiacutedico
Como cebadores se utilizaron los oligonucleoacutetidos (provistos por Invitrogen)
P22C directo 5- GGATCCACCACCGAGACGCCAGC -3
P22C reverso 5- GAATTCTTGCCCGTGAGAGACACAG -3
46 Electroforesis de ADN en geles de agarosa
Los fragmentos de ADN (ADN plasmiacutedico productos de PCR) fueron separados
mediante electroforesis en geles de agarosa de distinta concentracioacuten (08 a 2) seguacuten
el tamantildeo de los fragmentos a separar Se utilizoacute el sistema de tipo submarino La
solucioacuten reguladora tris-aceacutetico-EDTA (TAE) 05 X se utilizoacute como solucioacuten de
electroforesis y para la preparacioacuten de geles A estos uacuteltimos se les agregoacute el agente
intercalante bromuro de etidio en una concentracioacuten final de 03 g mL-1
antes de su
gelificacioacuten Previo a la siembra las muestras se mezclaron con solucioacuten de siembra
compuesta por 0025 (mv) azul de bromofenol 0025 (mv) xilencianol y 30
(vv) glicerol en una proporcioacuten 51 en volumen de muestra solucioacuten de siembra
Como marcadores de peso molecular se utilizaron Ladder 100 pb PB-L (Productos Bio-
Loacutegicos) La corrida electroforeacutetica se realizoacute a un potencial constante de 100 V con
una fuente BIO-RAD modelo 3000xi Luego de la electroforesis el ADN se visualizoacute
por fluorescencia en un transiluminador de luz ultravioleta Fotodyne y las imaacutegenes se
digitalizaron con una caacutemara FUJIFILM modelo FinePix A120
47 Minipreparacioacuten de ADN plasmiacutedico
El ADN plasmiacutedico se preparoacute a partir de cultivos celulares de E coli conteniendo
los plaacutesmidos de intereacutes seguacuten el meacutetodo de lisis alcalina o bien utilizando los equipos
comerciales ―WIZARDreg
PLUS SV Minipreps DNA purification system (Promega) El
resultado de la preparacioacuten se evaluoacute realizando una electroforesis en gel de agarosa de
una aliacutecuota de la misma
Materiales y Meacutetodos
43
48 Purificacioacuten del producto de amplificacioacuten
La purificacioacuten de aacutecidos nucleicos a partir de geles de agarosa se realizoacute utilizando
el equipo comercial ―GFXTM Gel Band Purification Kit (Amersham GE Healthcare)
seguacuten las especificaciones del fabricante El resultado de la purificacioacuten se evaluoacute
realizando una electroforesis en gel de agarosa de una aliacutecuota de la elusioacuten obtenida
49 Prueba de expresioacuten de proteiacutenas de fusioacuten a TRX y a ldquocolardquo de histidinas
Se cultivaron clones de las cepas de E coli BL21 (DE3) transformadas con el
vector pET32a (con el inserto correspondiente) haciendo distintas diluciones 175
1100 y 1200 de un cultivo saturado en 2 mL de LB fresco (suplementado con
ampicilina a 100 μg mL-1
) y cultivando a 37 ordmC con agitacioacuten vigorosa (180 rpm) hasta
una densidad oacuteptica a 630 nm (DO630nm) aproximada de 05 unidades Se indujo la
expresioacuten de la proteiacutena recombinante con IPTG (concentracioacuten final 1 o 01 mM)
durante 3 4 o 12 hs a 37 ordmC y con agitacioacuten vigorosa Posteriormente se cosecharon las
ceacutelulas centrifugando a 3000 rpm durante 10 min Finalmente se lisaron las ceacutelulas con
pulsos de ultrasonido utilizando un sonicador analoacutegico Sonifierreg S450A y se
separaron las fracciones soluble e insoluble del extracto por centrifugacioacuten a 18000 g
durante 20 min
410 Expresioacuten y purificacioacuten preparativas de antiacutegenos recombinantes
Se cultivoacute la cepa de E coli transformada con el vector pET32a con el inserto
correspondiente haciendo una dilucioacuten 1100 de un cultivo saturado en dos porciones
de 150 mL de LB suplementado con ampicilina (100 microg mL-1
) y cultivando a 37ordm C
hasta una DO630nm 05 Se agregoacute IPTG hasta concentracioacuten final oacuteptima 1 mM para
el Ang P35B o 01 mM para el Ang P22C y se indujo el tiempo oacuteptimo 4 h para el Ang
P35B o 12 h para el Ang P22C a 37ordm De esta manera se obtuvo la proteiacutena de fusioacuten
en forma soluble Se cosecharon las ceacutelulas por centrifugacioacuten y se lavaron con solucioacuten
tampoacuten fosfato (Na2HPO4 10 mM NaCl 05 M pH 8) Luego se las resuspendioacute en 20
mL de solucioacuten de lisis (Na2HPO4 50 mM NaCl 05 M pH 8) Las ceacutelulas se lisaron
por sonicado aplicando pulsos de 30 s de duracioacuten hasta clarificacioacuten del medio en
hielo Se separoacute la fraccioacuten soluble de la insoluble por centrifugacioacuten a 18000 g y 4 ordmC
La fraccioacuten soluble se congeloacute durante 24 h a -20 ordmC y se descongeloacute en hielo luego se
centrifugoacute nuevamente a 18000 g y 4 ordmC Este paso se repitioacute dos veces
Posteriormente se realizoacute una separacioacuten cromatograacutefica de afinidad con una columna
Materiales y Meacutetodos
44
de 5 mL empacada manualmente con resina Ni Sepharosetrade High Performance en
condiciones nativas elusioacuten con imidazol 250 mM seguacuten las especificaciones del
proveedor (GE Healthcare) En los sucesivos pasos se recogieron aliacutecuotas y se verificoacute
la purificacioacuten visualizando por electroforesis en gel desnaturalizante de poliacrilamida
(SDS-PAGE)
411 Separacioacuten de proteiacutenas mediante SDS-PAGE
Se utilizaron geles de 12 y de 15 de acrilamidabisacrilamida 291 Las
muestras se sembraron en geles desnaturalizantes mezclaacutendolas 21 con solucioacuten de
siembra 2 X compuesta por Tris-HCl pH 68 125 mM SDS 4 β-mercapto etanol 5
vv(alternativamente se usoacute DTT 200 mM) glicerol 20 y azul de bromofenol 02
Las corridas electroforeacuteticas se hicieron en solucioacuten Tris-glicina-SDS (Tris base 302
g L-1
glicina 144 g L-l SDS 1 g L
-1) Los geles fueron tentildeidos con azul brillante de
Coomasie G-250
412 Cuantificacioacuten de proteiacutenas
Se utilizoacute el meacutetodo propuesto por Lowry (Lowry y col1951) seguacuten el siguiente
protocolo un volumen de muestra cuya concentracioacuten de proteiacutena se desea determinar y
uno o dos testigos de albuacutemina (conteniendo tiacutepicamente de 5 a 25 microg de proteiacutenas
totales) se disolvieron en 040 mL de agua destilada y se mezclaron con 150 mL de
reactivo C preparado inmediatamente antes de usar El reactivo C se preparoacute mezclando
una parte de tartrato de sodio y potasio 2 mv una parte de CuSO4 1 mv y 100
partes de solucioacuten tampoacuten carbonato 2 mv e hidroacutexido de sodio 01 N Se dejoacute
reaccionar la mezcla durante 15 min a temperatura ambiente y luego se adicionoacute 0150
mL de reactivo de Folin-Ciocalteu diluido 13 con agua destilada inmediatamente antes
de usar Se dejoacute reposar durante 45 min y se leyoacute la absorbancia a 660 nm
413 Reaccioacuten de conjugacioacuten biotina-antiacutegeno
Previo a la reaccioacuten de conjugacioacuten el antiacutegeno P35B purificado se llevoacute a una
concentracioacuten final de 2 mg mL-1
(como miacutenimo) en solucioacuten tampoacuten carbonato de
sodio 01 M (pH 85) usando las membranas de poro controlado Amicon Ultra-4
(Millipore Co) seguacuten las instrucciones del proveedor Se disolvieron 20 mg del eacutester
biotinil-n-hidroxisuccinimida (BNHS) en 590 microL de DMSO e inmediatamente despueacutes
se mezclaron 80 microL de esta solucioacuten con 800 microL de solucioacuten de Ang
Materiales y Meacutetodos
45
Al antiacutegeno P22C purificado se lo llevoacute a una concentracioacuten final de 20 mg mL-1
(como miacutenimo) en solucioacuten tampoacuten carbonato de sodio 01 M (pH 85) usando las
membranas de poro controlado mencionadas Se disolvieron 25 mg BNHS en 590 microL
de DMSO e inmediatamente despueacutes se mezclaron 120 microL de esta solucioacuten con 100
mL de solucioacuten de Ang Se incuboacute 4 h a temperatura ambiente con agitacioacuten suave Se
eliminaron los restos de eacutester hidrolizado y se cambioacute la solucioacuten tampoacuten carbonato por
PBS 1 X pH 74 haciendo lavados reiterados y reteniendo el Ang en las membranas de
poro controlado
414 Revelado cromogeacutenico de la reaccioacuten de conjugacioacuten
El antiacutegeno marcado con biotina respectivo fue retenido en membrana de
nitrocelulosa sembrando 1 L del mismo sobre la membrana Se procedioacute a bloquear
los sitios activos de la membrana con leche descremada disuelta al 5 mv en PBS pH
74 durante 1 h Se realizaron 3 lavados con PBS pH 74 de 1 min cada uno Se incuboacute
la membrana con la enzima peroxidasa de raacutebano picante ligada a streptavidina (HRP-
EAV) disuelta en PBS pH 74-leche descremada al 1 mv Posteriormente se
realizaron 3 lavados con PBS pH 74 de 1 min cada uno Finalmente se reveloacute la
presencia de la enzima HRP con el reactivo de color recieacuten preparado seguacuten 5 mg de
33-diaminobenzidina tetrahidrocloruro (DAB) se disolvieron en 500 microL de DMSO y se
llevoacute a 100 mL de volumen final con PBS pH 74 A esta solucioacuten se le agregaron 100
microL de H2O2 10 voluacutemenes inmediatamente previo a su utilizacioacuten
415 Mediciones espectrofotomeacutetricas
Para las medidas de absorbancia (Abs) a longitudes de onda especiacuteficas o la
realizacioacuten de espectros de absorcioacuten ultravioleta-visible se utilizoacute el espectrofotoacutemetro
Beckman DU 640 Como celda se utilizoacute una cubeta de cuarzo de 1 cm de paso oacuteptico
416 Ensayos de inmunoabsorcioacuten ligados a enzima con deteccioacuten fotomeacutetrica
Como soporte soacutelido se utilizaron microplacas Microlon 600 high binding Greiner
Bio One provistas por GBO Argentina Para las lecturas de Abs se utilizoacute un lector de
microplacas PowerWave XS (BioTek) o alternativamente se utilizoacute el lector ELx808
Absorbance Microplate Reader (BioTek) Los ensayos preliminares se detallan en la
secioacuten 6 Experimentos Auxiliares
Materiales y Meacutetodos
46
4161 Esquema A
Sobre las microplacas de ELISA Microlon 600 high binding Greiner Bio One se
depositaron 100 microL de anticuerpo de captura (IgG de conejo anti IgM humana) provisto
por Dakko diluido 11000 en PBS pH 74 Se incubaron 48 h a 37 degC Luego se
realizaron 3 lavados con PBS Tween 20 al 005 (PBS-T) de 1 min cada uno Se
procedioacute al bloqueo de los sitios libres de la placa con 100 microL leche descremada
comercial (marca Milkaut) al 1 mv en PBS durante 30 min a 37 degC y se realizaron 3
lavados con PBS-T de 1 min cada uno Luego se incubaron con suero humano (muestra
incoacutegnita) 1100 en PBS con leche descremada al 1 mv durante 1 h a 37 degC y se
realizaron 3 lavados con PBS-T de 1 min cada uno Se realizaron distintas incubaciones
con los antiacutegenos P22C y P35B conjugados a biotina Luego de tres lavados con PBS-T
se incubaron con la enzima HRP-EAV en una dilucioacuten 12000 durante 1 h a 37degC
Posteriormente se realizaron 3 lavados con PBS-T para finalmente revelar utilizando
50 microL de solucioacuten comercial de 33prime55prime-tetrametilbenzidina (TMB) sustrato de la
enzima HRP que da coloracioacuten azul en el medio de reaccioacuten pasando a amarillo y
permaneciendo estable el color cuando se detiene la reaccioacuten acidificando el medio con
H2SO4 05 M
4162 Esquema B
Sobre las microplacas de ELISA comerciales se depositaron 500 ng de Ang P22C
disueltos en 100 L de solucioacuten carbonato pH 96 incubando 1 h a 37 degC Se realizaron
3 lavados con PBS Tween 20 al 005 (PBS-T) de 1 min cada uno Se bloquearon los
sitios libres de la placa con 100 microL leche descremada 1 mv en PBS durante 30 min a
37 degC Luego se realizaron 3 lavados con PBS-T de 1 min cada uno Se incubaron con
suero humano (muestra incoacutegnita) 1100 en PBS con leche descremada al 1 mv
durante 1 h a 37 degC Luego se realizaron 3 lavados con PBS-T de 1 min cada uno Se
realizoacute una incubacioacuten con el antiacutegeno P22C conjugado a biotina Luego de tres lavados
con PBS-T se incubaron con la enzima HRP-EAV en una dilucioacuten 12000 durante 1 h
a 37degC Posteriormente se realizaron 3 lavados con PBS-T Finalmente se reveloacute con
50 microL de solucioacuten comercial de TMB y se detuvo la reaccioacuten acidificando el medio con
50 microL H2SO4 05 M
Materiales y Meacutetodos
47
417 Reaccioacuten de color para determinacioacuten cuantitativa de glicerol por meacutetodo
espectrofotomeacutetrico
Se llevaron a cabo dos tipos de ensayos diferentes Por un lado se utilizoacute el meacutetodo
enzimaacutetico con un equipo comercial provisto por Wiener Lab TG GPO PAP AA (liacutenea
liacutequida) ensayando muestras de aliacutecuotas del medio Middlebrook 7H9 suplementadas
con glicerol en lugar de suero humano Por otro lado se realizaron reacciones de color
que se llevaron a cabo en un volumen final de 100 mL que resultoacute de la mezcla de 950
microL de reactivo A y 50 microL de muestra la cual consistioacute en medio de cultivo de
micobacterias Middlebrook 7H9 suplementado con distintas cantidades de glicerol En
los blancos de reaccioacuten se realizoacute un agregado de medio de cultivo Middlebrook 7H9
sin glicerol de igual volumen que en los otros dos casos para mantener las mismas
condiciones que en las otras reacciones
El reactivo A se preparoacute inmediatamente antes de ser usado mezclando los
reactivos necesarios seguacuten se indica en la siguiente tabla
Tabla 44 Mezcla de reactivos necesaria para preparar 950 microL de reactivo A (necesario para 1 reaccioacuten)
Los voluacutemenes necesarios para un nuacutemero n de reacciones se obtuvieron multiplicando por n
los voluacutemenes de esta tabla
Reactivo Volumen para una
reaccioacuten ( L)
Solucioacuten Tampoacuten carbonato
0125 M pH 105 815
K3Fe(NC)6 10-2
M 100
(NH4)2SO4 10 M 10
NAD+ 10
-2 M 25
Enzima GlDH 2 mg mL-1
1
Las reacciones se llevaron a cabo en tubos de Khan cerrados con parafilm para
evitar evaporacioacuten de liacutequido y en bantildeo termostatizado a 37 ordmC La lectura de
absorbancia se realizoacute cuando se cumplioacute una o dos h de iniciada la reaccioacuten seguacuten la
necesidad del ensayo Los experimentos se realizaron por triplicado
418 Determinacioacuten de glicerol remanente en cultivos de micobacterias
Procedimiento seguido a medios de cultivos Middlebrook 7H9 se los suplementoacute
con glicerol a concentracioacuten 0025 mv y se cultivaron cantidades iguales de ceacutelulas
de M smegmatis algunos medios se conservaron sin adicionar micobacterias en
Materiales y Meacutetodos
48
condiciones de esterilidad Se tomaron aliacutecuotas de estos cultivos a distintos tiempos Se
centrifugaron a 12500 rpm durante 5 min para separar las ceacutelulas del sobrenadante y a
estos uacuteltimos se los congeloacute a -20ordmC para su posterior anaacutelisis
Se realizaron determinaciones de glicerol con la teacutecnica fotomeacutetrica propuesta Se
realizaron reacciones de color por triplicado a las muestras e independientemente se
hizo un blanco de reaccioacuten y 2 testigos cuyas concentraciones fueron de 001 y 004
mv
4181 Determinacioacuten de glicerol remanente en cultivos de micobacterias con y sin
fago D29 y ensayos controles respectivos
Procedimiento seguido a medios de cultivos Middlebrook 7H9 se los suplementoacute
con glicerol a 0025 mv y se cultivaron cantidades iguales de a) ceacutelulas de M
smegmatis b) ceacutelulas de M smegmatis infectadas con fago D29 c) fagos D29 d)
algunos medios se conservaron sin adicionar micobacterias ni fagos en condiciones de
esterilidad Se tomaron aliacutecuotas de estos medios inmediatamente despueacutes de realizados
los inoacuteculos (tiempo 0) a las 2 h y a las 4 h de iniciados los cultivos Se centrifugaron a
12500 rpm durante 5 min para separar las ceacutelulas del sobrenadante y a estos uacuteltimos se
los congeloacute a -20 ordmC para su posterior anaacutelisis A estas muestras se les realizaron
determinaciones del glicerol remanente con la teacutecnica fotomeacutetrica propuesta Se
realizaron reacciones de color por triplicado a cada muestra utilizaacutendose como testigos
los medios en condiciones de esterilidad
419 Instrumental electroquiacutemico
Para los experimentos electroquiacutemicos se utilizoacute un analizador electroquiacutemico
Autolab (Eco Chemie) con amplificador electromeacutetrico diferencial PGSTAT 30 Se
utilizoacute una celda convencional de tres electrodos
4191 Electrodos de trabajo
41911 Bioelectrodo para evaluacioacuten de infeccioacuten toxoplaacutesmica
Se utilizaron electrodos macizos tipo ―banderita de oro de aproximadamente 1
cm2 de aacuterea geomeacutetrica El ensamblado se realizoacute de acuerdo al siguiente protocolo los
electrodos limpios se sumergieron durante 14 h en una solucioacuten de aacutecido 3 mercapto
propanosulfoacutenico preparada inmediatamente antes de usar disolviendo 22 mg en 12 mL
de H2SO4 0021 M (desoxigenenada con burbujeo de N2) en atmoacutesfera de N2 a
Materiales y Meacutetodos
49
temperatura ambiente (TA) Luego de enjuagar con agua destilada se sumergieron en
una solucioacuten de Ang recombinante P22C 02 mg mL-1
(PBS pH 74) durante 1 h a TA
Luego de un lavado con PBS se bloquearon los sitios libres no modificados con el Ang
sumergiendo los electrodos en solucioacuten de caseinato de sodio 01 mg mL-1
(preparada
inmediatamente antes de usar) 30 min a 37 degC Los electrodos se lavaron con PBS
Tween-20 05 mv y se sumergieron en una dilucioacuten 1200 de suero humano (muestra
incoacutegnita) en PBS durante 30 min a 37 degC Se lavaron con PBS Tween-20 05 y
finalmente se incubaron en una dilucioacuten 11500 de anticuerpos de conejo anti IgGh-
HRP Los biosensores asiacute ensamblados se guardaron en PBS pH 74 a 4degC hasta su
utilizacioacuten
41912 Electrodos para cuantificacioacuten de glicerol
Como electrodos de trabajo se utilizaron oro platino plata carbono viacutetreo pasta
de carbono (viacutetreo y grafito) y pastas de carbono modificadas
Los electrodos metaacutelicos y de carbono viacutetreo fueron provistos por Metrohm
(numero de cataacutelogo 612043XX) consistentes en barras del material de 3 mm de
diaacutemetro embutidas en un armazoacuten aislante
Las pastas de carbono utilizadas se enumeran a continuacioacuten indicando los
porcentajes en masa de cada componente respectivamente
a) Pasta A carbono viacutetreo aceite mineral (7030)
b) Pasta B carbono viacutetreo aceite mineral GLDH (68302)
c) Pasta C carbono viacutetreo aceite mineral GLDH MWCNT (5830210)
Las pastas se prepararon mezclando los componentes en mortero de aacutegata durante
15 a 20 min hasta obtener una mezcla homogeacutenea a la vista Cuando se utilizoacute enzima
GlDH se dispersoacute en aceite mineral primero y luego se mezcloacute con el polvo de carbono
viacutetreo Cuando se utilizaron NTC (MWCNT nanotubos de carbono de pared multiple)
se dispersoacute primero la enzima luego los NTC y finalmente el polvo de carbono viacutetreo
Asiacute preparadas se empaquetaron firmemente en un armazoacuten de tefloacuten (diaacutemetro 3 mm)
y se friccionoacute firmemente sobre un papel liso apoyado en un vidrio para eliminar el
exceso de pasta y pulir la superficie expuesta del electrodo
Cuando se utilizaron electrodos de pasta de carbono con las pastas B se realizoacute una
cubierta de poli-(o-fenilendiamino) que inmovilizara la enzima Una vez empaquetada
la pasta en el armazoacuten de Teflon se sumergioacute en una solucioacuten de o-fenilendiamino 5 x
10-4
M en solucioacuten tampoacuten carbonato 01 M (pH 10) Se burbujeoacute N2(g) para eliminar el
Materiales y Meacutetodos
50
O2(g) de la solucioacuten y dejar una atmoacutesfera libre de O2(g) Para electropolimerizar se
realizoacute un barrido de potencial ciacuteclico desde -051 V a + 069 V a 50 mV s-1
Finalmente se enjuagoacute con solucioacuten amortiguadora carbonato 01 M (pH 10)
4192 Limpieza de electrodos
Los electrodos de oro macizo policristalino tipo ―banderita se sumergieron en
solucioacuten ―pirantildea (H2SO4 concentrado peroacutexido de hidroacutegeno 30 en una relacioacuten 31)
durante 30 min a 80ordmC Luego se los enjuagoacute con abundante agua destilada En caso de
limpieza maacutes rigurosa previo al tratamiento con solucioacuten ―pirantildea se los colocoacute a la
llama directa hasta rojo vivo (Ribone y col 2006)
Los electrodos de oro policristalino macizo insertos en una barra de tefloacuten (Tips de
Au) se limpiaron siguiendo el siguiente protocolo desengrase frotaacutendolo sobre tela de
pulido humedecida con DMSO Lavado con abundante agua destilada Pulido con
suspensioacuten acuosa de aluacutemina (diaacutemetro promedio de partiacutecula 03 microm) sobre tela de
pulido Lavado con abundante agua destilada Sonicado durante 5 min en sonicador
Cole-Palmer 8890 Luego de un enjuague con abundante agua destilada se sumergieron
en HNO3 9 M durante 1 min a 60 ordmC Finalmente se lavaron con abundante agua
destilada
4193 Determinacioacuten del aacuterea real del electrodo
Para la determinacioacuten del aacuterea real de los electrodos metaacutelicos se utilizaron dos
metodologiacuteas in-situ
41931 Medicioacuten de la adsorcioacuten de oxiacutegeno
Se asume que el oxiacutegeno se quimioadsorbe en una capa monoatoacutemica antes de la
evolucioacuten de 02 con una correspondencia de uno-a-uno con los aacutetomos metaacutelicos de la
superficie El valor de la carga asociada a la reduccioacuten de la monocapa de oacutexido en
superficies de oro policristalino que se utilizoacute fue de 390plusmn10 microC cm-2
(Trasatti amp Petrii
1991)
Se realizaron VCs en H2SO4 a 50 mVs-1
y se midioacute la carga correspondiente al pico
de desorcioacuten de O2 sobre la superficie del electrodo y este valor se dividioacute por el valor
de referencia
Materiales y Meacutetodos
51
41932 Voltametriacutea ciacuteclica de ferricianuro de potasio
Registrando VCs a varias velocidades de barrido de potencial conociendo el
coeficiente de difusioacuten del ioacuten su concentracioacuten en la celda y midiendo la corriente de
pico a cada velocidad de barrido es posible determinar el aacuterea real del electrodo de
trabajo utilizando la ecuacioacuten de Randles Sevcik ec[216] (Belluzo y col 2008)
[216]
siendo la temperatura 25 degC y donde A estaacute en cm2 D en cm
2 s
-1 C en mol cm
-3 y
en V s-1
420 Medidas electroquiacutemicas
Todos los potenciales fueron medidos y referidos al electrodo de AgAgCl (KCl
300 M) que se utilizoacute como electrodo de referencia Como contraelectrodos se
utilizaron dos tipos uno de oro de superficie mayor a 5 veces la superficie del electrodo
de trabajo cuando se utilizaron electrodos metaacutelicos como electrodos de trabajo y una
barra de carbono viacutetreo cuando se utilizaron electrodos de pasta de C como electrodos
de trabajo En todos los casos las soluciones se burbujearon con N2 durante 1 min para
desplazar el O2 disuelto y se mantuvieron en atmoacutesfera de N2 durante las
determinaciones
Las voltametriacuteas ciacuteclicas se realizaron equilibrando el sistema al potencial de inicio
Para muestras conteniendo glicerol y utilizando electrodos de oro se realizaron
barridos desde -030 V hasta 060 V a distintas velocidades de barrido Cuando se
utilizaron electrodos de platino se realizaron barridos desde -080 V hasta 020 V a
distintas velocidades de barrido Cuando se utilizaron electrodos de pasta de carbono o
pasta de carbono modificada se realizaron barridos de potencial desde -040 V hasta
100 V Las corrientes que se informan son las intensidades de pico obtenidas trazando
una liacutenea de base recta desde los extremos del pico de corriente utilizando algoritmos
propios del programa General Purpose Electrochemical System (GPES)
4201 Mediciones amperomeacutetricas para evaluacioacuten de infeccioacuten toxoplaacutesmica
Las amperometriacuteas realizadas con el bioelectrodo para evaluacioacuten de infeccioacuten
toxoplaacutesmica se llevaron adelante en solucioacuten PBS (pH 74) FeMe 3 mM El potencial
de trabajo fue de 008V Se registroacute la corriente de base hasta que se estabilizoacute y una
Materiales y Meacutetodos
52
vez estable (usualmente a los 250 s) se adicionoacute el sustrato de la enzima (H2O2)
concentracioacuten en celda 18 mM y se registroacute la corriente final (500 s) La corriente
cataliacutetica se evaluoacute como la diferencia entre la corriente final y la de base
4202 Mediciones amperomeacutetricas para cuantificacioacuten de glicerol
42021 Amperometriacuteas con tip de oro
Las amperometriacuteas con tip de oro se realizaron en medio NaOH 01 M a potencial
constante (01 V) y a temperatura ambiente (20 a 25 ordmC) El sistema se preacondicionoacute
aplicando un potencial de 05 V se dejoacute equilibrar y se registroacute la corriente de base en
esas condiciones (generalmente a los 50 s) Luego se adicionoacute la muestra de forma de
lograr la concentracioacuten final de analito deseada La corriente fue registrada y se midioacute
una vez que se estabilizoacute (aproximadamente a los 400 s) La corriente cataliacutetica se
evaluoacute como la diferencia entre la corriente final y la de base
42022 Amperometriacuteas con electrodos de pasta de C
Las amperometriacuteas donde se utilizoacute la pasta de carbono B se realizaron en solucioacuten
tampoacuten carbonatobicarbonato de potasio 100 mM (NH4)2SO4 25 mM K3Fe(CN)6
1mM NAD+ 05 mM pH 105 Se trabajoacute a potencial constante 038 V y a temperatura
ambiente (25 ordmC) El sistema se preacondicionoacute aplicando el potencial de trabajo
correspondiente durante 50 s una vez iniciada la lectura de corriente se dejoacute equilibrar
y se registroacute la corriente de base en esas condiciones usualmente a los 300 s Luego se
adicionoacute la cantidad necesaria de muestra de forma de lograr la concentracioacuten final de
analito deseada La corriente fue registrada y se midioacute una vez que se estabilizoacute
(aproximadamente a los 500 s) La corriente cataliacutetica se evaluoacute como la diferencia
entre la corriente final y la de base
Las amperometriacuteas donde se utilizoacute la pasta de carbono C se realizaron en solucioacuten
tampoacuten carbonatobicarbonato de potasio 100 mM (NH4)2SO4 25 mM NAD+ 05 mM
pH 105 a potencial constante 051 V y a 25 ordmC El sistema se preacondicionoacute aplicando
el potencial de trabajo correspondiente durante 50 s una vez iniciada la lectura de
corriente se dejoacute equilibrar y se registroacute la corriente de base en esas condiciones
usualmente a los 300 s Luego se adicionoacute la cantidad necesaria de muestra de forma
de lograr la concentracioacuten final de analito deseada La corriente fue registrada y se
midioacute una vez que se estabilizoacute (aproximadamente a los 200 s del agregado) La
corriente cataliacutetica se evaluoacute como la diferencia entre la corriente final y la de base
Materiales y Meacutetodos
53
Cuando el tiempo de equilibrado no fue suficiente para que la corriente de base se
estabilizara se recurrioacute a realizar correcciones de liacutenea de base A tal fin se llevaron a
cero las corrientes de base aplicando los algoritmos que ofrece el programa GPES
versioacuten 49 provisto por Eco Chemie BV
4203 Voltamperometriacutea de onda cuadrada
Los experimentos de voltamperometriacutea de onda cuadrada se realizaron en solucioacuten
tampoacuten carbonatobicarbonato de potasio 100 mM (NH4)2SO4 25 mM NAD+ 05 mM
pH 105 y a 25 ordmC Los valores de escaloacuten de potencial utilizados fueron de 5 y 10 mV
Los valores de amplitud de pulso fueron de 25 y 50 mV Las frecuencias utilizadas
fueron de 8 10 20 30 40 60 y 70 Hz Especiacuteficamente se evitoacute utilizar 50 Hz
(frecuencia de la tensioacuten alterna de la liacutenea de alimentacioacuten) Los barridos de potencial
se realizaron desde -03 V hasta 10 V
Una vez registrado el blanco con medio Middlebrook 7H9 y se hicieron dos
agregados secuenciales de solucioacuten estaacutendar de glicerol 100 M obtenieacutendose una
concentracioacuten final de 25 y 50 mM respectivamente en la celda
421 Funcionalizacioacuten de nanotubos de carbono
Previo a la utilizacioacuten de los nanotubos de carbono se procedioacute a funcionalizarlos
realizando una carboxilacioacuten oxidativa Se siguioacute una comunicacioacuten personal del Dr
Joseacute Manuel Pingarroacuten del Departamento de Quiacutemica Analiacutetica Facultad de Ciencias
Quiacutemicas Universidad Complutense de Madrid A saber se pesaron aproximadamente
2 mg de MWCNT y se dispersaron en 2 mL en una mezcla de aacutecido sulfuacuterico aacutecido
niacutetrico 31 con agitacioacuten ultrasoacutenica durante 5 h Luego se diluyoacute la mezcla al 110
vertieacutendola suavemente en agua destilada enfriada en bantildeo de hielo para evitar
proyecciones Se eliminoacute el exceso de aacutecido centrifugando a 14000 rpm durante 30
min descartando el sobrenadante y dispersando el precipitado en agua destilada con
agitacioacuten ultrasoacutenica durante 30 min Esta operatoria se repitioacute 9 veces hasta que la
dispersioacuten de MWCNT en agua tuvo un pH cercano a la neutralidad (70 05) Los
MWCNT se secaron en desecador con sulfato de cobre anhidro y aplicando vaciacuteo al
sistema
Materiales y Meacutetodos
54
422 Programas de prediccioacuten de epiacutetopes lineales reconocidos por ceacutelulas B
4221 Base de datos de proteiacutenas
Se creo manualmente una base de datos para mejorar la exactitud de los resultados
Las proteiacutenas fueron seleccionadas de la base de datos de BciPep (Saha y col 2005)
HIV Molecular Immunology Database (disponible en httpwwwhivlanlgovcontent
immunologyindexhtml) o tomadas de la literatura VP1 (Wang y col 2011) proteiacutena
N (El-Manzalawy y col 2008) y Gliadina (Sweredoski amp Baldi 2009) El criterio de
seleccioacuten fue la confirmacioacuten experimental previa mediante ensayos de puntos de
inmunoadsorcioacuten ligado a enzima (ELIspot) o mediante el uso de paneles
multiespeciacuteficos de anticuerpos monoclonales que reconocen epiacutetopes lineales (Shin y
col 2005) Como resultado se seleccionaron 11 proteiacutenas de las que se obtuvieron un
total de 65 epiacutetopes lineales reconocidos por ceacutelulas linfociacuteticas tipo B
4222 Programas utilizados
Se utilizaron algunos programas para predecir los epiacutetopes lineales disponibles en
liacutenea gratuitamente Todos estos programas utilizan algoritmos matemaacuteticos con escalas
de propensioacuten yo datos experimentales de antigenicidad A menos que se indique lo
contrario cada programa se ejecutoacute utilizando los paraacutemetros por defecto Los
programas utilizados fueron AAPPred (Davydov amp Tonevitskii 2009) ABCpred
(Saha S amp Raghava 2006) BcePred (Saha y col 2005) BepiPred (Larsen y col
2006) y Antigenic (Kolaskar amp Tongaonkar 1990)
Los programas de prediccioacuten definen el grado de antigenicidad por medio de una
puntuacioacuten (score) en algunos casos para cada epiacutetope y en otros para cada residuo
amino aciacutedico En este uacuteltimo se puede definir una regioacuten antigeacutenica cuando varios
residuos con alta puntuacioacuten son adyacentes en la estructura primaria Por otra parte el
nuacutemero de epiacutetopes o regiones antigeacutenicas que los programas de prediccioacuten encuentran
depende de un umbral que es configurado por el usuario
423 Anaacutelisis de Datos
Los liacutemites de deteccioacuten (LD) y cuantificacioacuten (LC) se calcularon siguiendo las
sugerencias de Armbruster amp Pry (Armbruster amp Pry 2008) modificando la cantidad
de replicados utilizados para la obtencioacuten de los desviacuteos estaacutendar habieacutendose utilizado
10 reacuteplicas El caacutelculo del LD se realizoacute a partir del valor de corriente del blanco IB maacutes
Materiales y Meacutetodos
55
33 veces el valor del desviacuteo estaacutendar de la corriente leiacuteda (DSn1) de la muestra con
menor concentracioacuten de glicerol medida seguacuten
[41]
El valor del LC se calculoacute como
[42]
siendo m la pendiente de la curva de calibracioacuten
La capacidad de discriminacioacuten entre dos concentraciones diferentes de los
meacutetodos propuestos se evaluoacute como el error asociado a la estimacioacuten de la
concentracioacuten Ec calculada como
Nm
EE r
c
1
[43]
siendo Er el error relativo
424 Caacutelculos estadiacutesticos y disentildeo experimental
Para los caacutelculos estadiacutesticos se utilizaron los programas SigmaStat 32 (Sigma Plot
90 u 110) o Microcal Origin 80 en forma indistinta Para los caacutelculos de EJCR (regioacuten
eliacuteptica de confianza conjunta) se utilizoacute el programa Matlab con rutinas disentildeadas ―ad-
hoc
Resultados y Discusioacuten
Resultados y Discusioacuten
57
5 Resultados y discusioacuten
Para la obtencioacuten de antiacutegenos especiacuteficos de fase aguda de la toxoplasmosis se
comenzoacute seleccionando un conjunto de proteiacutenas denominadas P30 P22 y P35
mencionadas en la literatura como antiacutegenos de fase aguda (Harning y col 1996
Parmley y col 2000 Lu y col 2006) Sobre la base de estos estudios iniciales se
intentoacute identificar por medio de caacutelculos teoacutericos que regiones de estas proteiacutenas
conteniacutean mayor nuacutemero de epiacutetopes De este modo en la etapa siguiente se procurariacutea
expresarlos en forma soluble para su posterior utilizacioacuten en inmunoensayos Al
momento de seleccionar un programa de todos los disponibles ―on line verificamos
que eacutestos no informaban el valor predictivo positivo VPP Por ello se inicioacute un trabajo
de identificacioacuten del programa que predijera maacutes fidedignamente los epiacutetopes La
buacutesqueda se realizoacute comparando los resultados arrojados por 5 programas a los que se
solicitoacute prediccioacuten de epiacutetopes pertenecientes a 11 proteiacutenas cuyos epiacutetopes lineales
habiacutean sido perfectamente establecidos experimentalmente (Costa y col 2013) Se
analizoacute cuaacutel de ellos presentaba el mayor VPP (ver punto 61 seccioacuten Experimentos
Auxiliares) y para predecir epiacutetopes lineales se trabajoacute con este programa que resultoacute
ser AAPred
El anaacutelisis de los Ang seleccionados permitioacute identificar en P35 dos regiones que
concentraban los determinantes antigeacutenicos a las cuales se las denominoacute P35A y P35B
Los Ang P30 y P22 presentaban los determinantes antigeacutenicos distribuidos
homogeacuteneamente por lo tanto al momento de disentildear su clonado se tuvieron en cuenta
criterios que faciliten la expresioacuten y solubilidad mas allaacute de la antigenicidad
51 Evaluacioacuten de antiacutegenos recombinantes de T gondii
511 Antiacutegeno P30
El antiacutegeno de superficie 1 de T gondii SAG1 tambieacuten denominado proteiacutena P30
se ha identificado como antiacutegeno de fase aguda (Harning y col 1996) por lo cual se
procuroacute obtenerlo en forma soluble Sobre la base de ensayos previos realizados en el
LTI se continuoacute con la obtencioacuten y purificacioacuten de dos porciones del antiacutegeno P30
denominadas P30L y P30C (seccioacuten 410 Materiales y Meacutetodos) Luego de la cosecha
y lisis de las bacterias se separaron las fracciones soluble e insoluble del extracto se
tomaron aliacutecuotas de ambas y se analizaron por SDS-PAGE Los Angs buscados soacutelo se
Resultados y Discusioacuten
58
obtuvieron como proteiacutenas precipitadas en cuerpos de inclusioacuten en la fraccioacuten insoluble
Por ello se discontinuoacute el trabajo con las fracciones de P30
512 Antiacutegeno P22
El antiacutegeno de superficie 2 o antiacutegeno P22 de T gondii (Gen Bank ndeg M33572) ha
sido tambieacuten identificado como antiacutegeno de fase aguda (Parmley y col 1992 Lau amp
Fong 2006) En el presente trabajo se procuroacute amplificar la regioacuten del gen que
permitiese expresar la proteiacutena recombinante en forma soluble El producto de
amplificacioacuten se resolvioacute en un gel de agarosa tentildeido con bromuro de etidio como se
observa en la Fig 51
Figura 51 Gel de agarosa tentildeido con bromuro de etidio en transiluminador UV En PCR1 se observan los
productos de amplificacioacuten obtenidos utilizando cebadores especiacuteficos para la regioacuten P22C donde se
sentildeala el fragmento de tamantildeo esperado Control (-) muestra la misma mezcla de reaccioacuten pero sin ADN
molde MPM indica el marcador de peso molecular y el tamantildeo de los fragmentos se indica sobre la
derecha
Se aisloacute y purificoacute el fragmento de intereacutes utilizando un equipo comercial detallado
en el punto 48 seccioacuten Materiales y Meacutetodos En un paso posterior se ligoacute al vector
pET32a y con la construccioacuten resultante se transformaron ceacutelulas competentes de E
coli Las ceacutelulas transformadas se seleccionaron crecieacutendolas en medio LB con
ampicilina Se verificaron las condiciones para la expresioacuten en forma soluble (punto
410 seccioacuten Materiales y Meacutetodos) encontraacutendose que las condiciones oacuteptimas eran
01 mM IPTG y 12 h de incubacioacuten con agitacioacuten vigorosa
Para la induccioacuten preparativa se siguioacute el protocolo detallado en la seccioacuten 410 de
Materiales y Meacutetodos La Fig 52 muestra la fotografiacutea de un gel de poliacrilamida
luego de la tincioacuten donde se analizaron aliacutecuotas de todos los extractos obtenidos en los
distintos pasos separativos de la proteiacutena P22C
Resultados y Discusioacuten
59
Figura 52 Gel de poliacrilamida tentildeido con azul brillante de Coomassie En cada calle se sembraron 1
microL de muestra EC indica el extracto crudo P1 muestra la fraccioacuten insoluble del lisado celular P2 la
fraccioacuten insoluble luego del congelamiento-descongelamiento del extracto centrifugado FT muestra el
extracto que pasoacute por la columna Con L se indican las calles con las fracciones de lavados sucesivos con
tampoacuten imidazol 0 mM 20 mM 50 mM y 100 mM respectivamente E muestra las fracciones de
elucioacuten con solucioacuten imidazol 250 mM Las fracciones de elucioacuten recolectadas fueron de 15 mL cada
una
513 Antiacutegeno P35
El antiacutegeno de superficie P35 de T gondii (Gen Bank ndeg AF01275) se ha
identificado como antiacutegeno de fase aguda y distintas porciones del mismo presentan
diferentes desempentildeos en su uso diagnoacutestico (Lu y col 2006) Sobre la base de
ensayos previos realizados en el LTI se continuoacute con la obtencioacuten y purificacioacuten de las
dos porciones del antiacutegeno P35 denominadas P35A y P35B
Se ensayoacute la expresioacuten del antiacutegeno P35A (punto 49 seccioacuten Materiales y
meacutetodos) y soacutelo se obtuvo como cuerpos de inclusioacuten en la fraccioacuten insoluble Si bien
fue posible disolver las proteiacutenas recombinantes en urea 8 M al dializar volviacutean a
precipitar
El antiacutegeno P35B se pudo obtener en forma soluble y las condiciones oacuteptimas
encontradas para la induccioacuten del mismo fueron IPTG 1 mM y 4 h con agitacioacuten
vigorosa La Fig 53 muestra una imagen del gel de poliacrilamida luego de la corrida
electroforeacutetica y su tincioacuten Se observoacute que una banda de la fraccioacuten soluble estaba
sobreexpresada en los cultivos inducidos
Resultados y Discusioacuten
60
Figura 53 Gel de poliacrilamida al 12 en condiciones desnaturalizantes Se muestra lo obtenido para
aliacutecuotas de dos cultivos no inducidos 1 y 2 y dos inducidos 3 y 4 Con P se designan las fracciones
insolubles en la solucioacuten de lisis y con SN las fracciones solubles Las bandas que se observan del MPM
corresponden a fragmentos de 19445 KDa 28829 KDa 36545 KDa 49491 KDa 80664 KDa
103035 KDa Se indica la banda sobreexpresada de tamantildeo esperado
Para la induccioacuten preparativa del antiacutegeno P35B se siguioacute el protocolo descripto en
el punto 410 seccioacuten Materiales y Meacutetodos En la Fig 54 se muestra un gel de
poliacrilamida luego de la tincioacuten donde se analizaron aliacutecuotas de todos los extractos
obtenidos en los distintos pasos separativos
Figura 54 Gel de poliacrilamida tentildeido con azul brillante de Coomassie En cada calle se sembraron 7
microL de muestra P1 fraccioacuten insoluble del lisado celular P2 fraccioacuten insoluble luego del congelamiento-
descongelamiento del extracto centrifugado FT muestra el extracto que pasoacute por columna L calles con
las fracciones de lavados sucesivos con tampoacuten imidazol 20 mM 50 mM y 100 mM respectivamente E
fracciones de elucioacuten con solucioacuten imidazol 250 mM Las fracciones recolectadas fueron de 15 mL cada
una
En consecuencia se continuoacute el trabajo con P35B y se descartoacute transitoriamente la
utilizacioacuten del Ang P35A
52 Marcado de antiacutegenos recombinantes de T gondii
Para los ensayos tipo ELISA de captura especiacuteficos para IgM se propuso utilizar
como sistema revelador la enzima HRP-EAV que se une especiacuteficamente a biotina En
consecuencia se procedioacute a marcar los Ang solubles obtenidos con biotina
P35B
P1 P2 P3 P4 MPM
Inducido No Inducido
SN1
Inducido No Inducido
SN2 SN3 SN4
Resultados y Discusioacuten
61
La reaccioacuten de conjugacioacuten se realizoacute siguiendo el protocolo mencionado en el
punto 413 seccioacuten Materiales y Meacutetodos La conjugacioacuten se evidencioacute con la reaccioacuten
de color indicada en el inciso 413 En la Fig 55 se muestra la membrana de
nitrocelulosa sobre la que se fijaron las proteiacutenas P22 y P35B luego del revelado
cromogeacutenico con la enzima HRP conjugada a streptavidina Las reacciones de
conjugacioacuten se llevaron adelante por separado
Figura 55 Membranas de nitrocelulosa evidenciando las proteiacutenas P35B conjugada (izquierda) y P22C
conjugada (derecha)
53 Inmunoensayos
Estudios preliminares (ver punto 62 seccioacuten Experimentos Auxiliares) con los
antiacutegenos recombinantes obtenidos permitieron verificar por ELISA indirecto que sueros
confirmados positivos arrojaban resultados positivos mientras que los sueros negativos
daban el ensayo negativo Se procedioacute entonces a evaluar la capacidad de los antiacutegenos
obtenidos para discriminar sueros de pacientes con infeccioacuten aguda de sueros provenientes
de pacientes con infeccioacuten croacutenica
531 Inmunoensayos con deteccioacuten fotomeacutetrica
Como se anticipoacute en la introduccioacuten se realizaron ELISA siguiendo dos
alternativas de captura En la primera alternativa que denominamos A se procuroacute
capturar selectivamente la maacutexima cantidad de Ac del isotipo que se deseaba detectar
(IgMh) adsorbiendo sobre la placa un anticuerpo ―ad-hoc (Ac-a-IgMh) En la segunda
alternativa que denominamos B se buscoacute capturar con el Ang recombinante la maacutexima
cantidad de Ac especiacuteficos independientemente del isotipo que se tratara En el paso
siguiente del esquema B se tomoacute ventaja de la mayor valencia de las IgM respecto de
las IgG para el revelado
5311 Evaluacioacuten del esquema A
Sobre placas de ELISA se capturaron los Acs IgMh revelaacutendose la presencia de los
especiacuteficos con los antiacutegenos obtenidos marcados con biotina y uniendo a estos uacuteltimos la
enzima HRP-EAV En los ensayos preliminares (ver punto 622 seccioacuten Experimentos
Auxiliares) se identificoacute la cantidad de antiacutegeno marcado y las diluciones de HRP-EAV
oacuteptimas a utilizar para revelar la presencia de IgM especiacutefica capturada En la Tabla 51 se
Resultados y Discusioacuten
62
muestran los valores de absorbancia a 450 nm obtenidos para el panel de 9 sueros
ensayados Se utilizaron 5 g de P22C-biotina por pocillo y 100 L de HRP-EAV en
dilucioacuten 12000
Tabla 51 Absorbancias a 450 nm obtenidas en los ELISA siguiendo el esquema de captura A descrito
maacutes arriba
Placa 1 Placa 2
Agudos
0100 0158
0311 0273
0140 0165
Croacutenicos
0281 0322
0256 0278
0260 0226
Negativos
0217 0168
0235 0179
0409 0354
Sin suero
0135 0134
0143 0114
0126 0100
Sin suero
Sin
P22cBiotina
0071 0050
0070 0037
0047 0040
Los resultados obtenidos con ambos antiacutegenos fueron desalentadores (los resultados
obtenidos con P35B biotina no se informan) ya que no se hallaron diferencias
significativas entre los valores de absorbancia obtenidos con sueros de pacientes
agudos croacutenicos y negativos
5312 Esquema B
En base a los resultados obtenidos en la seccioacuten anterior se orientaron los ensayos
realizando los ELISA siguiendo un esquema no claacutesico al que denominamos B
Debido a la baja sensibilidad que presentaron los Angs conjugados a biotina para
detectar los Acs especiacuteficos pensamos en hacer una primera etapa de concentracioacuten de
los Acs especiacuteficos en la placa para luego revelar con el Ang conjugado a biotina Esto
se hizo adsorbiendo antiacutegeno recombinante sobre la superficie de la placa de
poliestireno enfrentaacutendola luego al suero a ensayar Asiacute se captura selectivamente las
inmunoglobulinas que reconocen al antiacutegeno ya sean IgM o IgG Luego se expone la
placa al mismo antiacutegeno recombinante pero ligado a biotina que se uniraacute a los
anticuerpos especiacuteficos para dicho Ang previamente capturados Finalmente se revela
Resultados y Discusioacuten
63
con HRP conjugada a streptavidina que forma un complejo estable con biotina De esta
forma se aumenta la cantidad de Ang marcado en mayor proporcioacuten para IgM que para
IgG dada la multivalencia de este isotipo de inmunoglobulina En la Fig 56 se
reproduce el esquema B que fue el que brindoacute los resultados maacutes promisorios
Antiacutegeno (Ang) Bloqueante Ang ligado a biotina Reactivo de color
IgM a-Ang IgG a-Ang streptavidina conjugada a HRP
Figura 56 Esquema de ensayo ELISA de captura tipo B El antiacutegeno expuesto en la placa captura la
porcioacuten de las IgM e IgG especiacuteficas presentes en el suero humano Haciendo uso de la polivalencia de
las IgM su presencia se revela con el antiacutegeno conjugado a biotina streptavidina ligada a HRP
adicionando el sustrato de la enzima y un cromoacutegeno actuando como cosustrato
Buscando diferenciar sueros de pacientes en fase de infeccioacuten aguda (agudos) de
sueros provenientes de pacientes sin infeccioacuten (negativos) En la Tabla 52 se muestran los
valores de absorbancia a 450 nm obtenidos
Tabla 52 Absorbancias a 450 nm obtenidas en los ELISA siguiendo el esquema de captura B
Ang
Sueros P35B 05ug P35B 001ug P22C 05ug P22C 001ug
Agudos 2131 1567 0335 0296
1849 1311 065 0413
Negativos 176 1350 0282 0327
1025 1676 0262 0325
Sin suero 1658 1658 0174 0149
1812 1504 0130 0144
Sin Ang
conjugado
0055 004 0041 0045
0057 0042 0039 004
Resultados y Discusioacuten
64
Este ensayo exploratorio demostroacute que los antiacutegenos P22C y P35B pueden ser usados
potencialmente en la deteccioacuten de toxoplasmosis aguda realizando inmunoensayos con el
esquema B propuesto en el presente trabajo Por ello siguiendo este esquema de trabajo se
exploraron cuales eran las condiciones oacuteptimas (ver punto 623 seccioacuten Experimentos
Auxiliares) Asiacute se establecioacute la dilucioacuten de la enzima HRP-EAV (12000) la cantidad de
P22C biotina (5 microg por pocillo) y se acotaron los valores de P22C adsorbidos inicialmente
en la placa entre 500 y 50 ng Finalmente se realizaron tres ensayos en paralelo donde se
evaluoacute la cantidad de antiacutegeno adsorbido inicialmente en la placa y se amplioacute el panel de
sueros Los resultados obtenidos se muestran en la Fig57
Figura 57 Absorbancias a 450 nm para los ELISA realizados con el esquema B (A) 50 ng de Ang P22C
(B) 200 ng de Ang P22C (C) 500 ng de Ang P22C Con se indican los sueros provenientes de
pacientes con infeccioacuten aguda (Agudos) con los provenientes de pacientes con infeccioacuten croacutenica
(Croacutenicos) y con los de pacientes sin infeccioacuten (Negativos) Con la liacutenea roja ( ) se indica el valor
de media menos tres desviacuteos estaacutendares de los agudos (AbsA ndash 3 DSA) y con la liacutenea verde ( ) el valor
de media maacutes tres desviacuteos estaacutendares de los croacutenicos (AbsC +3 DSC)
Resultados y Discusioacuten
65
En las tres condiciones evaluadas se obtiene una separacioacuten de las sentildeales obtenidas al
ensayar sueros provenientes de los pacientes con infeccioacuten aguda (Agudos) de los sueros
provenientes de pacientes con infeccioacuten croacutenica (Croacutenicos) y los pacientes sin infeccioacuten
(Negativos)
Los resultados obtenidos con P35B no resultaron alentadores debido al elevado ruido
de fondo (altos valores de absorbancia de los blancos) Por lo tanto los ensayos
electroquiacutemicos se iniciaron soacutelo con P22C
Mijak y colaboradores (Hiszczyntildeska-Sawicka y col 2005) sentildealan que ya se ha
demostrado la utilidad del Ang SAG2 para detectar IgG en el suero de pacientes con
toxoplasmosis aguda y croacutenica (Parmley y col 1992) destacando que en los resultados
presentados por ese mismo grupo en otra publicacioacuten (Li y col 2000a) soacutelo se examinaron
un reducido nuacutemero de sueros provenientes de pacientes con infeccioacuten aguda con
resultados tanto positivos como negativos Tambieacuten sentildeala que Maine y colaboradores
(Aubert y col 2000) no obtuvieron resultados satisfactorios con este antiacutegeno
recombinante realizando ELISA indirecto Los resultados obtenidos en este trabajo con
ELISA utilizando el esquema A han confirmado lo sentildealado por Mijak y col sobre el
desempentildeo de este Ang El anaacutelisis que estos autores hacen se orienta a que el uso de estos
antiacutegenos recombinantes debe contemplar necesariamente el uso combinado de otros Angs
Por otro lado en el presente trabajo se han presentado resultados que permitiriacutean
complementar esta visioacuten incorporando otro esquema para la deteccioacuten de sueros de
infectados agudos Si bien es necesario ampliar el nuacutemero de sueros para validar el ensayo
los resultados son promisorios Hemos propuesto que las diferencias obtenidas en los
ELISA de captura siguiendo el esquema B pueden deberse a dos mecanismos no
excluyentes entre si y que podriacutean estar actuando en conjunto Por un lado estaacute la
multivalencia que presentan las IgM respecto de las IgG que generariacutea una amplificacioacuten
selectiva de acuerdo al isotipo Por otro lado independientemente del isotipo capturado el
Ang de fase aguda brindariacutea la sensibilidad y especificidad necesaria al ensayo
identificando Acs de fase aguda Resta pues esclarecer si esto es asiacute fehacientemente o si
hay alguacuten otro mecanismo actuando concomitante que permita explicar las diferencias
observadas aquiacute entre sueros de fase aguda y de infectados croacutenicos
Resultados y Discusioacuten
66
532 Inmunoensayos con deteccioacuten amperomeacutetrica utilizando los antiacutegenos
recombinantes
Los bioelectrodos se ensamblaron como se describe en el inciso 41911 de
Materiales y Meacutetodos Al realizar los inmunoensayos con las diluciones pertinentes de
suero humano (muestra incoacutegnita) en caso de suero de paciente infectado (+) estaraacuten
presentes los anticuerpos IgG anti-P22 (analito de intereacutes) Cuando se sumergen en una
dilucioacuten de anticuerpos anti-IgG h conjugado con HRP (segundo anticuerpo marcado) eacuteste
quedaraacute retenido en el electrodo y frente al agregado del sustrato de la enzima (H2O2)
sobre PBS conteniendo el mediador FcMe se genera la especie que seraacute electro-reducida
sobre el electrodo al potencial de trabajo 008 V (vs AgAgCl ver inciso 420 2) A los
fines de claridad en la Fig 58 se reformula el esquema de funcionamiento del biosensor
previamente esquematizado (Fig 212) para el caso particular aquiacute detallado donde el
Ang es la proteiacutena P22C
Proteiacutena recombinante IgG a-IgGh conjugada a HRP
Bloqueante IgG humana ferrocenometanol
Figura 58 Sobre la superficie del electrodo se fija la proteiacutena P22C que capturaraacute los anticuerpos especiacuteficos
si estaacuten presentes en el suero El revelado se realiza con un segundo anticuerpo especiacutefico para IgG humana
marcado con HRP que en presencia de H2O2 oxida el mediador FcMe que se reduce sobre la superficie del
electrodo generando la sentildeal analiacutetica
En la Fig 59 se muestran tres amperogramas representativos obtenidos cuando se
ensayaron sueros confirmados (+) sueros confirmados (-) y blancos (sin suero alguno)
Los valores de corrientes se corrigieron por los valores de aacuterea reales determinados
mediante voltametriacutea ciacuteclica a distintas velocidades de soluciones de ioacuten ferricianuro
(punto 41932 seccioacuten Materiales y Meacutetodos)
Resultados y Discusioacuten
67
Figura 59 Amperometriacuteas comparativas con bioelectrodos ensamblados con la proteiacutena P22C
En la Tabla 54 se resumen los resultados de los ensayos sobre muestras confirmadas
positivas negativas y blanco
Tabla 54 Valores promedios de la corriente cataliacutetica diferencial obtenidas utilizando bioelectrodos
ensamblados con el antiacutegeno P22C
DS desviacioacuten estaacutendar
Las diferencias en las sentildeales registradas fueron estadiacutesticamente significativas
verificaacutendose la potencialidad del uso de esta metodologiacutea para discriminar entre sueros de
pacientes infectados con T gondii de sueros de pacientes no infectados Los ensayos
electroquiacutemicos preliminares informados permiten pensar en el desarrollo de un biosensor
amperomeacutetrico A futuro seriacutea deseable poder establecer un biosensor electroquiacutemico
basaacutendonos en el esquema B de los ELISA presentados en este trabajo de Tesis que
permita la discriminacioacuten entre sueros de pacientes cursando infeccioacuten aguda de sueros de
pacientes con infeccioacuten croacutenica
54 Determinacioacuten de la actividad electroquiacutemica del glicerol en medio acuoso
Si bien desde hace varios antildeos se ha estudiado la oxidacioacuten electrocataliacutetica de
polialcoholes auacuten no existe acuerdo acerca del procedimiento maacutes conveniente para su
cuantificacioacuten electroquiacutemica asiacute como tampoco ha sido posible identificar un uacutenico
mecanismo que deacute cuenta de los productos obtenidos luego de la reaccioacuten electroacutenica
(Kahyaoglu et al 1984 Kwon amp Koper 2010)
Muestra j = Icaacuterea
( A cm-2
)
DS
( A cm-2
)
Positivos -0455 0026
Negativos -0150 0021
Sin suero -0052 004
Resultados y Discusioacuten
68
Con el fin de encontrar el electrodo y las condiciones maacutes convenientes para
realizar la cuantificacioacuten del glicerol se realizaron ensayos exploratorios de
voltametriacuteas ciacuteclicas utilizando electrodos de carbono viacutetreo pasta de C (grafito y
viacutetreo) Au Pt y Ag Los medios ensayados fueron HClO4 01 M solucioacuten tampoacuten de
fosfato salino (PBS) pH 72 90 120 NaCl al 08 mv y NaOH 01 M El intervalo
de concentracioacuten de glicerol utilizado fue de 100 x 10-5
M hasta 01 M
En estos ensayos iniciales las maacuteximas sentildeales se obtuvieron con electrodos de Au
en medio alcalino (NaOH 01 M) coincidiendo con lo descripto por Lamy (Kahyaoglu
et al 1984) A modo ilustrativo en la Fig 510 se observan dos voltametriacuteas ciacuteclicas
para electrodos de oro y de platino en medio alcalino
Figura 510 Voltamperogramas tiacutepicos para soluciones de glicerol 10-2
M en soluciones de base fuerte
(NaOH 01M) utilizando electrodos de trabajo de Au (izquierda) y Pt (derecha)
En una etapa posterior se verificoacute que las sentildeales obtenidas Ip respondiacutean
proporcionalmente a la concentracioacuten de glicerol Se realizoacute una curva de calibracioacuten en
el intervalo de concentraciones de 50 x 10-4
a 10 x 10-2
M Todas las mediciones se
hicieron por triplicado La Tabla 55 muestra las medias de las corrientes de pico
obtenidas para cada concentracioacuten ensayada con su correspondiente desviacuteo estaacutendar La
corriente de pico se midioacute tomando una liacutenea de base recta a un valor de potencial de
010 V plusmn 005 V usando algoritmos propios del programa GPES 49
Tabla 55 Valores medios de corriente obtenidos por voltametriacutea ciacuteclica para la oxidacioacuten del
glicerol en medio alcalino (NaOH 01 M) sobre electrodos de oro
[Glicerol]
(mM)
Ip
(microA cm-2
)
DS Ip
(microA cm-2
)
050 18 032
100 28 038
200 74 041
500 17 035
750 262 055
100 347 053
-50E-05
00E+00
50E-05
10E-04
15E-04
20E-04
25E-04
-0400 -0200 0000 0200 0400 0600 0800
E(V)
i(A
)
-40E-06
00E+00
40E-06
80E-06
12E-05
16E-05
-1000 -0800 -0600 -0400 -0200 0000 0200 0400
E(V)
i(A
)
Resultados y Discusioacuten
69
En la Fig 511 se presenta la dependencia de la corriente de pico
voltamperomeacutetrica con la concentracioacuten de glicerol Las barras de error corresponden a
las desviaciones estaacutendar de cada medida realizada por triplicados independientes Se
ajustaron estos valores a una recta con el meacutetodo de los miacutenimos cuadrados y se obtuvo
la siguiente ecuacioacuten
[51]
donde IpA estaacute en microA cm-2
y [glicerol] en mM El valor de coeficiente de regresioacuten
(R2) obtenido fue de 09980
Figura 511 Dependencia de la corriente de pico voltamperomeacutetrica con la concentracioacuten de glicerol en
medio alcalino (NaOH 01 M) Se muestran los valores promedios de tres medidas independientes Las
barras de error se corresponden a los desviacuteos estaacutendares
En estas condiciones de trabajo el pico de corriente oxidativa tiene dependencia
lineal con la concentracioacuten de glicerol En funcioacuten de estos resultados se orientoacute la
buacutesqueda hacia una metodologiacutea que permitiese determinar al glicerol en
concentraciones de 10-5
M o menores Para esto iniciamos ensayos con teacutecnica
amperomeacutetrica
Se realizaron los ensayos amperomeacutetricos como se describe en el punto 4202 de la
seccioacuten Materiales y Meacutetodos La Fig 512 muestra el resultado de una amperometriacutea
tiacutepica para una solucioacuten de glicerol
Resultados y Discusioacuten
70
t s
0 50 100 150 200 250 300 350 400 450
I A
0
2
4
6
Figura 512 Amperometriacutea tiacutepica de una muestra con glicerol (concentracioacuten en celda 1 mM) Se dejoacute
estabilizar la corriente para una solucioacuten de NaOH 01 M y a los 50 segundos se realizoacute el agregado de la
muestra con glicerol y se midioacute la corriente hasta los 400 segundos
Se ensayaron soluciones de glicerol cuya concentracioacuten en la celda electroliacutetica
fueron desde 001 mM hasta 5 mM Como blanco se utilizoacute solucioacuten de NaOH 01 M
La corriente cataliacutetica se midioacute como la diferencia entre la corriente final y la inicial
(punto 4202 seccioacuten Materiales y Meacutetodos) A este valor de corriente se lo dividioacute
por el valor de aacuterea real del electrodo medida anteriormente esta densidad de corriente
(IcA) se tomoacute como la sentildeal analiacutetica En la Tabla 56 se muestran las medias de las
sentildeales obtenidas para cada concentracioacuten de glicerol ensayada con su correspondiente
desviacuteo estaacutendar
Tabla 56 Valores medios de densidades de corriente obtenidos por amperometriacutea para la oxidacioacuten de
glicerol en medio alcalino (NaOH 01 M)
[Glicerol]
(mM)
Ic A
( A cm-2
)
DS
( A cm-2
)
0000 0447 0029
0010 0763 0016
0025 1098 0068
0050 1510 0055
0100 285 049
0250 609 036
0500 1245 033
0750 1730 0097
100 2361 0099
150 3445 033
175 3997 020
200 4613 045
Resultados y Discusioacuten
71
En la Fig 513 se presenta la recta de regresioacuten lineal obtenida a partir de los
valores promedio de densidades de corriente para soluciones de glicerol en el intervalo
de concentraciones de 0025 mM y 2 mM Las barras de error corresponden a las
desviaciones estaacutendares de cada medida La ecuacioacuten de la recta obtenida por el meacutetodo
de miacutenimos cuadrados fue
[52]
Donde IcA estaacute en microA cm-2
y [Glicerol] en mM el valor del coeficiente de
regresioacuten (R2) obtenido fue de 09950
[Glicerol] mM
000 025 050 075 100 125 150 175 200
I cA
m
A c
m-2
0
10
20
30
40
50
Figura 513 Curva de calibracioacuten obtenida para glicerol en medio alcalino (NaOH 01 M) con la teacutecnica
amperomeacutetrica Se muestran los valores promedios de tres medidas independientes para cada solucioacuten
Las barras de error que se muestran corresponden al DS de cada punto
Las cifras de meacuterito para esta teacutecnica resultaron ser
Liacutemite de deteccioacuten 10 M
Liacutemite de cuantificacioacuten 24 M
Liacutemite de discriminacioacuten 10 M
Intervalo de linealidad 0024 mM ndash 200 mM
55 Cuantificacioacuten de glicerol en medios acuosos complejos
El glicerol es corrientemente utilizado como principal fuente de carbono en cultivos
bacterianos siendo degradado eficientemente por sistemas enzimaacuteticos que utilizan
mecanismos redox Por lo tanto se comenzoacute a estudiar la posible cuantificacioacuten
electroquiacutemica de este alcohol intentando detectar concentraciones del orden 10-5
M o
Resultados y Discusioacuten
72
menores para poder asiacute evidenciar su consumo en medios de cultivos bacterianos que
contienen glicerol como nutriente El meacutetodo amperomeacutetrico con electrodo de oro no
fue lo suficientemente selectivo para glicerol cuando este se encontraba en matrices
complejas (no se muestran los resultados) por lo tanto al momento de cuantificarlo en
medios de cultivos bacterianos tuvimos que optar por otra metodologiacutea
Sobre la base del trabajo de Tuntildeoacuten-Blanco y col (Aacutelvarez-Gonzaacutelez et al 2000)
se busco desarrollar un biosensor selectivo para este analito
Para verificar la funcionalidad del modelo propuesto se realizaron ensayos
espectrofotomeacutetricos La coenzima NAD(H) en su forma reducida (NADH) presenta un
maacuteximo de absorcioacuten a 340 nm ausente en la forma oxidada (NAD+) Puede apreciarse
en la Fig 514 que el mediador electroquiacutemico Fe(CN)63-
presenta un maacuteximo de
absorcioacuten a 420 nm ausente en la forma reducida Fe(CN)64-
En un primer ensayo se
verificoacute espectrofotomeacutetricamente que la longitud de onda escogida podiacutea utilizarse
para el seguimiento de la reaccioacuten En una serie de ensayos posteriores se monitoreoacute la
reaccioacuten enzimaacutetica en presencia y ausencia del mediador electroquiacutemico haciendo uso
de estas propiedades espectrales
Figura 514 Espectros de absorcioacuten UV-visible para las especies Fe(CN)33-
1 mM y Fe(CN)34-
1 mM
Ambas especies fueron disueltas en solucioacuten tampoacuten carbonato pH 105 Puede apreciarse claramente que
el maacuteximo de absorcioacuten a 420 nm presente en el Fe(CN)63-
se encuentra ausente en el Fe(CN)64-
La
velocidad de barrido fue 1200 nm min-1
551 Evaluacioacuten del modelo propuesto por medio de lecturas
espectrofotomeacutetricas
El primer ensayo para validar el modelo propuesto fue seleccionar la longitud de
onda oacuteptima para el seguimiento espectrofotomeacutetrico A tal fin se llevaron adelante dos
0
025
05
075
1
125
15
175
2
225
25
275
260 280 300 320 340 360 380 400 420 440 460 480 500
Longitud de onda (nm)
Ab
sorb
an
cia
Ferricianuro 1 mM
Ferrocianuro 1 mM
Resultados y Discusioacuten
73
reacciones a) glicerol disuelto en medio 7H9 coenzima Fe(CN)63-
y enzima GlDH y
b) glicerol disuelto en medio 7H9 coenzima Fe(CN)63-
pero sin la enzima GlDH En
ambos casos se realizoacute un barrido espectral de 320 a 480 nm registraacutendose la
absorbancia a una velocidad de barrido de 1200 nm min-1
cada 10 min Ambas
reacciones se llevaron a cabo en solucioacuten tampoacuten carbonato pH 105 En la Fig 515 se
muestran los barridos espectrales obtenidos para cada reaccioacuten y en ella puede
apreciarse que la mayor diferencia se presenta a la longitud de onda prevista (420 nm)
Figura 515 Espectros de absorcioacuten UV-visible para mezclas de reaccioacuten (A) En presencia de enzima
GlDH (B) Sin enzima GlDH Barrido espectral cada 10 min
Para elucidar si el consumo de Fe(CN)63-
observado se correspondiacutea
cuantitativamente con el NADH generado y en consecuencia con el glicerol
consumido se tuvieron en cuenta las siguientes reacciones
glicerol + Fe(CN)63-
DHA + Fe(CN)64-
(1)
glicerol + NAD+ NADH + DHA (2)
Se realizaron series de 3 reacciones en paralelo a saber a) blanco de reaccioacuten (BR)
con enzima GlDH NAD+ y Fe(CN)6
3- en ausencia de glicerol donde se siguioacute la
absorbancia a 420 nm b) reaccioacuten (1) con enzima GlDH NAD+ Fe(CN)6
3- y glicerol
donde se siguioacute la desaparicioacuten de Fe(CN)63-
a 420 nm c) reaccioacuten (2) con enzima
GlDH NAD+ y glicerol donde se siguioacute la aparicioacuten de NADH a 340 nm Debe tenerse
en cuenta por un lado que el NAD+ es reducido a NADH en la reaccioacuten (2) no se
regenera mientras que en la reaccioacuten (1) se regenera por la presencia del anioacuten
Fe(CN)63-
Esto implica que si bien ambas reacciones se lentifican con el paso del
tiempo a causa del consumo de glicerol (y acumulacioacuten de DHA) la reaccioacuten (2) se
lentifica maacutes que la (1) porque se consumen tanto el glicerol como el NAD+
y se
acumulan ambos productos de reaccioacuten (DHA y NADH) Los resultados pueden verse
en la Fig 516
A
0
015
03
045
06
075
09
105
12
135
15
320 340 360 380 400 420 440 460 480
Longitud de onda (nm)
Ab
sorb
an
cia
t = 0
t = 10 min
t = 20 min
t =30 min
t = 40 min
t = 50 min
t = 60 min
B
0
015
03
045
06
075
09
105
12
135
15
320 340 360 380 400 420 440 460 480
Longitud de onda (nm)
Ab
sorb
an
cia
t = 0 min
t = 10 min
t = 20 min
t = 30 min
t = 40 min
t = 50 min
t = 60 min
GlDHNAD+
GlDH
Resultados y Discusioacuten
74
Figura 516 Absorbancias registradas a 420 nm durante las reacciones descriptas en el texto A) Blanco
de reaccioacuten (BR) y reaccioacuten (1) B) Reaccioacuten (2) C) Segmento inicial de la curva representada en
B) a partir de la cual se calculoacute el valor liacutemite de la velocidad inicial de reaccioacuten Se muestra un
experimento representativo de un original y replicado
Se asumioacute que la reaccioacuten (1) transcurre a una velocidad constante en las
condiciones en que se llevoacute a cabo El anaacutelisis estadiacutestico demuestra que hay una ligera
tendencia a la no linealidad evidenciada por la distribucioacuten de los residuos No
obstante siendo las variancias iguales se consideroacute que no hay un alejamiento
significativo de la linealidad Por ello en los caacutelculos de variacioacuten de la concentracioacuten
de coenzima a lo largo del tiempo de reaccioacuten se tuvo en cuenta el cambio que se
produciriacutea si la velocidad de reaccioacuten se mantuviera constante e igual a la velocidad
inicial Para el caso del NAD+ consumido (o NADH generado) en la reaccioacuten (2)
tenemos
[53]
Asumiendo que en el intervalo de concentraciones de trabajo se cumple la ley de
Beer la ec [53] puede reescribirse como
[54]
Si la velocidad de la reaccioacuten enzimaacutetica se mantiene aproximadamente igual a la
velocidad inicial por la regeneracioacuten de la coenzima se puede admitir que la velocidad
A
05
056
062
068
074
08
086
092
098
104
11
0 600 1200 1800 2400 3000 3600
tiempo (s)
Ab
s 4
20
nm
B
0
004
008
012
016
02
024
028
032
036
04
044
048
0 600 1200 1800 2400 3000 3600tiempo (s)
Ab
s 3
40
nm
C
y = 00004405x
R2 = 09983921
0
0035
007
0105
014
0175
021
0 60 120 180 240 300 360 420 480
tiempo (s)
Ab
s 3
40
nm R
2 = 09984
Resultados y Discusioacuten
75
de reaccioacuten es constante (reaccioacuten de orden cero para los reactivos) pudieacutendose expresar
la ec [54] en la siguiente forma
b
k
tb
tk
tb
Abs
nmNADHnmNADHnmNADH
nm
340340340
340 [55]
donde k es la constante de velocidad para esa reaccioacuten en unidades de absorbancia por
unidad de tiempo (s-1
) y se obtiene como la pendiente del segmento lineal de la curva de
la Fig 516 B presentado en la Fig 516 C
La variacioacuten de concentracioacuten total de coenzima se obtiene multiplicando el valor
de velocidad por la variacioacuten de tiempo total
[56]
siendo los valores de los paraacutemetros y variables en cuestioacuten
εNADH 340nm = 6220 M-1
cm-1
Δt = 3600 s
b = 1 cm
k = 44 x 10-4
s-1
resultando
[57]
La variacioacuten de concentracioacuten del mediador seraacute
[58]
nmCNFe 420)( 36
= 1080 M-1
cm-1
ΔAbs420nm = 052
que reemplazando en la ec [58] arroja
M [59]
La variacioacuten de absorbancia observada en el blanco de reaccioacuten a lo largo de una
hora fue de 00046 unidades de absorbancia que representa menos del 1 de la
variacioacuten total observada en la reaccioacuten (1) Estos resultados permiten verificar que en
las condiciones de reaccioacuten el Fe(CN)63-
reducido a Fe(CN)64-
equivale
cuantitativamente al NADH generado en la reaccioacuten enzimaacutetica de acuerdo a la
siguiente estequiometriacutea
Resultados y Discusioacuten
76
2 Fe(CN)63-
+ NADH 2 Fe(CN)64-
+ NAD+ [510]
Lo mostrado corrobora la factibilidad del disentildeo de un biosensor de una sola
enzima con un mediador soluble econoacutemico
5511 Evaluacioacuten de la sentildeal con la concentracioacuten de glicerol
Para verificar si la sentildeal analiacutetica muestra dependencia con la concentracioacuten de
glicerol se realizaron 6 reacciones en paralelo registraacutendose la absorbancia a 420 nm
cada un minuto durante dos horas Se realizoacute un blanco de reaccioacuten sin glicerol y cinco
reacciones con concentraciones crecientes de glicerol Como muestras se utilizaron el
medio de cultivo de micobacterias Middlebrook 7H9 suplementado con glicerol a
distintas concentraciones En la Tabla 57 se presentan las concentraciones de glicerol
en las mezclas de reaccioacuten y en las muestras La Fig 517 muestra la absorbancia a 420
nm para las seis reacciones
Tabla 57 Concentraciones de glicerol en las mezclas de reaccioacuten
Reaccioacuten [glicerol] en mezcla
de reaccioacuten (mM) [glicerol] en muestra
(mM)
Blanco 0 0
Muestra 1 11 22
Muestra 2 082 16
Muestra 3 055 11
Muestra 4 027 55
Muestra 5 011 22
Resultados y Discusioacuten
77
Figura 517 Absorbancia a 420 nm de las mezclas de reaccioacuten descriptas en el texto ( ) 11 mM de
glicerol ( ) 082 mM de glicerol ( ) 055 mM de glicerol (o) 027 mM de glicerol (-) 011 mM de
ccedilglicerol ( ) blanco de reaccioacuten
Habiendo verificado la dependencia de la sentildeal analiacutetica con el analito de intereacutes se
procedioacute a determinar el intervalo dinaacutemico lineal Para ello se realizaron las reacciones
de color como se describe en el apartado 417 de la seccioacuten Materiales y meacutetodos Cada
reaccioacuten se hizo por triplicado En la Fig 518 se muestran resumidos los resultados
obtenidos
[Glicerol] mM
000 005 010 015 020 025 030 035 040
Ab
s 42
0 n
m
00
02
04
06
08
10
Figura 518 Curva de calibracioacuten para glicerol utilizando el meacutetodo colorimeacutetrico Se muestran los
valores promedios de tres medidas independientes Las barras de error corresponden a los desviacuteos
estaacutendares
La recta de regresioacuten que se obtuvo a partir de estos valores fue
Abs420nm = 0946 ndash 238 [glicerol] [511]
02
03
04
05
06
07
08
09
1
0 1200 2400 3600 4800 6000 7200
tiempo (s)
Ab
s 4
20
nm
Resultados y Discusioacuten
78
cuyo coeficiente de regresioacuten (R2) fue 09980 En el intervalo de concentraciones de
0025 a 027 mM la respuesta fue lineal
5512 Optimizacioacuten de condiciones para disminuir el costo operativo
Se verificoacute la posibilidad de cuantificar glicerol en medio Middlebrook 7H9
optimizando las concentraciones de reactivos y los tiempos de reaccioacuten para obtener la
maacutexima sentildeal con la mezcla maacutes econoacutemica posible Se ensayaron distintas
concentraciones de cofactor NAD+ a utilizar y 2 tiempos de reaccioacuten para una curva de
calibrado de 6 puntos consistente en un blanco y cinco estaacutendares de glicerol todos por
triplicado
Para verificar la factibilidad de disminuir la concentracioacuten de cofactor soluble sin
alterar significativamente la sensibilidad del meacutetodo se utilizoacute un disentildeo experimental
con un modelo de superficie de respuesta Como factores se tomaron la concentracioacuten
de cofactor y el tiempo de reaccioacuten Los niveles seleccionados en base a ensayos
previos fueron concentracioacuten de cofactor (NAD+) 01 mM 023 mM 037 mM y 05
mM tiempo 1 y 2 h Las respuestas que se evaluaron fueron la pendiente de una recta
de regresioacuten calculada a partir del meacutetodo de miacutenimos cuadrados y el coeficiente de
regresioacuten lineal correspondiente En la Tabla 58 se muestran los niveles parametrizados
y los valores de las respuestas obtenidas
Tabla 58 Disentildeo experimental factores parametrizados y respuestas obtenidas
Cada uno de los estaacutendares indicados en la Tabla 58 se correlaciona con una curva
de calibrado realizada En la Tabla 59 se informan los valores de concentracioacuten de
glicerol de las soluciones utilizadas para las reacciones de color y la concentracioacuten
correspondiente en la mezcla de reaccioacuten
Estaacutendar [NAD+] Tiempo Pendiente R2
4 1 -1 068 08790
7 03333 1 227 09962
8 1 1 184 09621
5 -1 1 159 09931
3 03333 -1 083 09590
2 -03333 -1 1 09850
6 -03333 1 244 09863
1 -1 -1 071 09914
Resultados y Discusioacuten
79
Tabla 59 Valores de concentracioacuten de los estaacutendares utilizados para los ensayos de optimizacioacuten
Reaccioacuten [glicerol] en mezcla
de reaccioacuten (mM) [glicerol] en muestra
(mM)
Blanco 0 0
Muestra 1 0010 02
Muestra 2 0025 05
Muestra 3 0050 10
Muestra 4 0075 15
Muestra 5 010 20
La ecuacioacuten de ajuste propuesta por el modelo de superficie de respuesta para la
pendiente fue
tBNADAm ][421 [512]
donde A y B son los coeficientes del modelo que se calculan a partir de la forma de la
superficie de respuesta e indican la dependencia de la pendiente (m) con la
concentracioacuten de cofactor ([NAD+]) y el tiempo de reaccioacuten (t) respectivamente El
anaacutelisis de los resultados indica que de los dos coeficientes solo B es significativo y su
valor es 062 mientras que A es un coeficiente no significativo Esto significa que la
pendiente de la recta de calibrado no muestra dependencia con la concentracioacuten de
cofactor NAD+ utilizado
Por otra parte el coeficiente de correlacioacuten no mostroacute dependencia con ninguno de
los factores elegidos Esto indica que el modelado de la funcioacuten deseabilidad global
queda reducido al de una sola respuesta la pendiente de la recta de calibrado y a un
uacutenico factor significativo que es el tiempo de reaccioacuten En base a estos resultados
pudimos establecer un uso miacutenimo de cofactor soluble
552 Determinacioacuten de glicerol remanente en cultivos de micobacterias
5521 Evaluacioacuten de glicerol remanente en cultivos axeacutenicos de M smegmatis
Primeramente se evaluoacute si podiacutea evidenciarse el consumo de glicerol por parte de
M smegmatis en un cultivo axeacutenico es decir conteniendo soacutelo este microorganismo
Para ello se realizaron cultivos de la micobacteria como se describe en el punto 418 de
la seccioacuten Materiales y Meacutetodos y se determinoacute el glicerol remanente haciendo uso del
meacutetodo fotomeacutetrico presentado previamente El anaacutelisis de la variancia de los valores de
absorbancia registrados y posteriormente se realizoacute un ensayo de comparaciones
muacuteltiples utilizando las pruebas de Tukey y de Bonferroni Se detectaron diferencias
estadiacutesticamente significativas en las absorbancias de las muestras del medio con M
Resultados y Discusioacuten
80
smegmatis a las 2 y 3 h de iniciados los cultivos respecto de aquellos medios
conservados en esterilidad
5522 Determinacioacuten de glicerol remanente en cultivos de micobacterias con y
sin fago D29 y ensayos controles respectivos
En una segunda serie de ensayos nos propusimos ver si habiacutea consumo diferencial
de glicerol entre cultivos de M smegmatis y cultivos de la micobacteria infectados con
el fago D29 siguiendo el protocolo descripto en el punto 4181 de la seccioacuten Materiales
y Meacutetodos En la Fig 519 se muestran los valores de absorbancia a 420 nm de las
muestras mencionadas Sobre este conjunto de datos nuevamente se realizoacute un anaacutelisis
de la variancia y ensayos de comparaciones muacuteltiples utilizando las pruebas de Tukey y
de Bonferroni
Los resultados obtenidos indican que todos los medios de cultivo a los cuales no se
le inoculoacute bacterias y aquellos medios donde se inoculoacute bacterias pero fueron
centrifugados inmediatamente despueacutes del inoacuteculo (muestras a t= 0) no mostraron
diferencias estadiacutesticamente significativas en los ensayos de comparaciones muacuteltiple
realizados Esto permite concluir que el agregado de fago y la incubacioacuten a 37 ordmC no
producen modificaciones significativas per se en las reacciones de color Por ello es
posible afirmar que en el futuro podraacuten simplificarse los controles a un uacutenico testigo
de concentracioacuten inicial conocida sin necesidad de tomar una muestra del cultivo
inmediatamente despueacutes del inoacuteculo o de la adicioacuten de fagos a los controles negativos
del ensayo
En este ensayo preliminar pudimos observar que las diferencias de absorbancia
resultaron estadiacutesticamente significativas entre los medios de cultivo donde crecieron
ceacutelulas de M smegmatis y los medios donde crecieron ceacutelulas de M smegmatis
infectadas con fago D29 tanto a las 2 como a las 4 h de iniciados los cultivos Este
resultado indicoacute que la hipoacutetesis de trabajo planteada era apropiada y en consecuencia
seriacutea factible desarrollar un meacutetodo para verificar la integridad de micobacterias en un
cultivo de las mismas
Resultados y Discusioacuten
81
Bla
nco
Med
io 0
025
00
25
+ F
ago t
= 0
00
25
C
eacutelula
s t
= 0
00
25
Ceacutel
ula
s +
Fag
o t
= 0
00
25
+ F
ago t
= 2
00
25
Ceacutel
ula
s t
= 2
00
25
Ceacutel
ula
s +
fag
o t
= 2
00
25
fa
go t
= 4
00
25
Ceacutel
ula
s t
= 4
00
25
Ceacutel
ula
s +
fag
o t
= 4
Abs
420 n
m
03
04
05
08
Figura 519 Absorbancias a 420 nm registradas para las muestras descritas Se indica concentracioacuten
inicial de glicerol en mv y tiempo de incubacioacuten a 37 ordmC El blanco corresponde al de la reaccioacuten de
color sin glicerol
553 Biosensor amperomeacutetrico a base de pasta de carbono viacutetreo modificada
En funcioacuten de los resultados previos se procedioacute al ensamblado de un biosensor
amperomeacutetrico siguiendo el esquema de reaccioacuten presentado previamente que se
reproduce en la figura 520
Figura 520 Esquema de reaccioacuten propuesto para biosensor amperomeacutetrico selectivo para glicerol La
coenzima reducida NADH se regenera a su forma oxidada NAD+ reaccionando con el Fe(CN)6
3- que se
reduce a Fe(CN)64-
Este uacuteltimo se reoxida electroquiacutemicamente sobre la superficie del electrodo
completando el ciclo cataliacutetico
Utilizando electrodos de pasta de carbono B (punto 41912 seccioacuten Materiales y
Meacutetodos) se realizaron amperometriacuteas siguiendo el protocolo descrito en el punto 4202
glicerol
DHA
GlDHox
GlDHred NAD+
NADH Mediador ox
Mediador red
e- Electrodo
Resultados y Discusioacuten
82
de la seccioacuten Materiales y Meacutetodos En la Fig 521 se muestra un amperograma tiacutepico
obtenido
Tiempo s
100 200 300 400 500
I
nA
0
20
40
60
80
100
Figura 521 A) Amperograma tiacutepico obtenido con un electrodo de trabajo de pasta de carbono B
trabajando a un potencial de 038 V Se agregaron 50 L de medio 7H9 suplementado con glicerol
usualmente a los 300 s de iniciada la lectura de corriente cuando eacutesta se estabilizoacute B) Agregados
sucesivos de 50 microL de medio 7H9 suplementado con glicerol 20 mM sobre 200 mL de la misma
solucioacuten
En la Fig 522 se presenta la recta de regresioacuten obtenida a partir de los valores
promedios de corrientes para soluciones de glicerol en el intervalo de concentraciones
de 0062 mM y 175 mM Las barras de error corresponden a las desviaciones estaacutendar
de cada medida La ecuacioacuten de la recta obtenida por el meacutetodo de miacutenimos cuadrados
fue
[513]
donde Ic estaacute en nA y [Glicerol] en mM el valor del coeficiente de regresioacuten (R2)
obtenido fue de 09982
Las cifras de meacuterito para esta teacutecnica resultaron ser
Liacutemite de deteccioacuten 20 M
Liacutemite de cuantificacioacuten 60 M
Liacutemite de discriminacioacuten 15 M
Intervalo de linealidad 0060 mM ndash 175 mM
Tiempo s
0 500 1000 1500 2000
I
nA
0
50
100
150
200
Resultados y Discusioacuten
83
[Glicerol] mM
000 025 050 075 100 125 150 175 200
Ic
nA
0
50
100
150
200
Figura 522 Recta de calibracioacuten para glicerol utilizando el meacutetodo amperomeacutetrico descrito en el texto
Se muestran los valores promedios de corrientes liacutemite corregidas y las desviaciones estaacutendares de 3
lecturas independientes
Una vez que se preparoacute la pasta de carbono viacutetreo modificada con la enzima esta
resultoacute estable durante 10 semanas sin peacuterdida de actividad enzimaacutetica siempre que se
mantuviese seca a 4 degC Una vez que se ensambloacute el biosensor con el poliacutemero
electrodepositado pudo utilizarse durante al menos 8 horas consecutivas con una
peacuterdida de sensibilidad insignificante En efecto los cambios observados en las sentildeales
registradas de forma consecutiva se encontraron dentro del error intriacutenseco del meacutetodo
propuesto La estabilidad de un mismo biosensor durante diacuteas sucesivos se evaluoacute
realizando medidas de la misma solucioacuten y evaluando la relacioacuten sentildealruido la cuaacutel
disminuyoacute un 15 del valor original al tercer diacutea y un 50 al quinto diacutea de uso
554 Desarrollo de un biosensor a base de pasta de carbono viacutetreo y
nanotubos de carbono
Para reducir los tiempos de anaacutelisis se procuroacute disminuir el periacuteodo de
estabilizacioacuten de la corriente modificando el esquema original propuesto para el sensor
Para esto se modificoacute la pasta de carbono con nanotubos de carbono de paredes
muacuteltiples (Rubianes amp Rivas 2003) Seguacuten trabajos previos esta estrategia permite
disminuir el sobrepotencial asociado a la electrooxidacioacuten de la coenzima NADH
evitaacutendose el uso de un mediador soluble (Musameh 2002) Previo a su utilizacioacuten los
NTC fueron funcionarizados por carboxilacioacuten oxidativa siguiendo el protocolo
especificado en el punto 421 de la seccioacuten Materiales y Meacutetodos
Resultados y Discusioacuten
84
En la Fig 523 (derecha) se muestran las voltametriacuteas que se obtuvieron utilizando
un electrodo de trabajo relleno con pasta B (pasta de carbono viacutetreo modificada con
enzima GlDH al 2 en masa)
Figura 523 Voltamperogramas ciacuteclicos utilizando bioelectrodos de pasa de carbono B con GlDH
(derecha) y pasta C con GlDH y MWCNT (izquierda) En liacutenea puntuada se muestran las voltametriacuteas de
la solucioacuten NAD+ 05 mM (NH4)2SO4 25mM K2CO3 KHCO3 01 M pH 105 (blanco) En liacutenea
continua las voltametriacuteas de las mismas soluciones con el agregado de glicerol en concentracioacuten final 25
mM La velocidad de barrido fue 50 mV s-1
Se marcan los picos de corriente observados y el potencial de
pico
El sobrepotencial asociado a la electroxidacioacuten de la coenzima NADH en el
electrodo de pasta de carbono B es 70 mV menor que el informado por Wang y col Ep
= 082V sobre electrodos de carbono viacutetreo (Musameh 2002) Esta diferencia podriacutea
deberse a los distintos pH de trabajo o bien a alguna diferencia en las cualidades de la
superficie del electrodo
En la Fig 523 (izquierda) se muestran los resultados obtenidos con los electrodos
de pasta C pasta de carbono modificada con GlDH al 2 y con MWCNT al 10 en
masa En este caso vemos que el sobrepotencial asociado a la electroxidacioacuten de NADH
es 0180 V menor Ep = 057 V que el observado para la pasta B Esta diferencia
podemos atribuirla a las cualidades diferentes de las superficies del electrodo debida a la
presencia de los MWCNT Es de destacar que Wang y col en la oxidacioacuten del NADH
sobre la superficie de carbono viacutetreo modificado con MWCNT observaron dos
procesos oxidativos uno principal con un Ep de 033 V y otro secundario con Ep de
057 V que aparece como hombro del primero (ver Fig 524 reproducida de Wang y
col)
Ep = 075 V
Resultados y Discusioacuten
85
Figura 524 Reproducido de Musameh y col 2002 Voltamperogramas correspondientes a una solucioacuten 5
mM de coenzima NADH en solucioacuten tampoacuten fosfato 005 M pH 74 utilizando electrodos de trabajo de
pasta de carbono viacutetreo sin modificar (A) y modificado con MWCNT (B) Velocidad de barrido 50 mV s-1
En el voltagrama B puede apreciarse el pico principal y el secundario que aparecen como hombro del
primero
En este trabajo soacutelo se pudo identificar un uacutenico proceso oxidativo a 057 V Si bien
auacuten estamos investigando posibles causas que hayan originado esta diferencia es de
esperar que el pH sea un factor determinante ya que la oxidacioacuten de NADH a NAD+
involucra la perdida de un H+ Por otra parte en los voltagramas realizados con pasta C
se registroacute un importante aumento de las corrientes capacitivas (18 μA) en relacioacuten a
las voltametriacuteas donde se utilizaron electrodos de pasta sin MWCNT Este mismo
efecto pero en menor magnitud (55 μA) tambieacuten fue registrado por Wang y
colaboradores al trabajar con electrodo de carbono viacutetreo modificado con MWCNT
(Musameh 2002) Los resultados obtenidos por Wang y colaboradores y los de este
trabajo de Tesis se muestran comparativamente en la Tabla 510
Tabla 510 Resultados obtenidos por Musameh y col 2002 y los correspondientes a este trabajo
Musameh y col
2002 Este trabajo
Electrodo de
trabajo Cv
C v +
MWCNT Pasta B Pasta C
V barrido 50 mV s-1 50 mV s
-1
pH 74 105
Ep (V) 082 033
057 075 057
Aumento de la
I cap (μA) - 55 - 18
Resultados y Discusioacuten
86
Con estos resultados preliminares comenzamos los ensayos amperomeacutetricos para
cuantificar el glicerol remanente en los medios de cultivos de micobacterias Se llevaron
adelante distintos ensayos y nuevamente el inconveniente principal al que nos
enfrentamos fue que la respuesta no era estable en el tiempo En la Fig 525 se muestra
un amperograma obtenido con un bioelectrodo de pasta C y realizando agregados
sucesivos de un estaacutendar de glicerol 20 mM disuelto en medio Middelbrook 7H9
Con este nuevo esquema de trabajo no se logroacute acortar los tiempos de estabilizacioacuten
de la corriente Los algoritmos de correccioacuten de corriente de base que estaacuten
incorporados al programa GPES tampoco permitieron solucionar este inconveniente
Por este motivo se optoacute por utilizar teacutecnicas voltameacutetricas de pulso que en principio
permitiriacutean evitar este inconveniente
Tiempo s
0 100 200 300 400 500 600 700 800 900
I A
0
1
2
3
4
Figura 525 Amperograma obtenido con un bioelectrodo de pasta de carbono C trabajando a 05 V vs
AgAgCl A t=200 s de iniciada la lectura se agregaron 50 L de medio 7H9 y posteriormente se
realizaron agregados sucesivos de 50 L de medio 7H9 suplementado con glicerol 20 mM
5541 Ensayos de cuantificacioacuten de glicerol con el bioelectrodo desarrollado
utilizando teacutecnicas de pulso
Las teacutecnicas voltameacutetricas de pulso presentan la ventaja de permitir trabajar durante
tiempos muy reducidos en la zona de potencial donde la especie electroactiva cambia
su estado de oxidacioacuten produciendo la sentildeal analiacutetica
Se optoacute por ensayar la voltametriacutea de onda cuadrada para los futuros ensayos de
cuantificacioacuten y los experimentos preliminares procuraron establecer los valores maacutes
convenientes de los paraacutemetros relevantes de la teacutecnica como la amplitud de pulso el
escaloacuten de potencial y la frecuencia (punto 633 seccioacuten Experimentos Auxiliares)
Resultados y Discusioacuten
87
En una segunda serie de ensayos se buscoacute observar la dependencia de la corriente
de pico con la concentracioacuten de glicerol Para esto se realizaron ensayos
independientes En este esquema de trabajo surgioacute un inconveniente respecto del criterio
de medida de la corriente de pico ya que en ensayos independientes no se pudo
establecer una liacutenea de base comuacuten a todos los voltamperogramas
Se ensayaron distintos criterios para determinar una liacutenea de base apropiada como
se detalla en el punto 6331 de la seccioacuten Experimentos Auxiliares y en la Fig 526 se
muestran los voltamperogramas corregidos siguiendo el criterio elegido
Figura 526 Voltamperogramas de onda cuadrada (corregidos) obtenidos utilizando electrodos de pasta
de carbono viacutetreo modificada con GlDH y MWCNT Se muestran los voltagramas de las soluciones
blanco (helliphelliphelliphellip
) glicerol 5 mM (mdash mdash) 125 mM (mdashmdash) 25 mM (diamsdiamsdiams) 36 mM (- - -) y 50 mM (mdash bull mdash)
En la Fig 527 se muestran la dependencia de la corriente de pico con la
concentracioacuten de glicerol obtenida a partir de experimentos exploratorios uacutenicos para
cada concentracioacuten Resta a futuro repetir los experimentos para establecer el error
asociado a la metodologiacutea el intervalo dinaacutemico lineal y el liacutemite de deteccioacuten
Resultados y Discusioacuten
88
Figura 527 Dependencia de la corriente de pico registrada en la VOC en funcioacuten de la concentracioacuten de
glicerol en la celda electroquiacutemica
56 Validacioacuten de meacutetodos
De los meacutetodos desarrollados se seleccionaron aquellos dos que dieron resultados
maacutes fiables meacutetodo amperomeacutetrico utilizando un electrodo de trabajo de oro y el
meacutetodo amperomeacutetrico utilizando el biosensor con GlDH con mediador soluble Se
realizaron ensayos en paralelo con un meacutetodo alternativo ampliamente utilizado en
particular se utilizoacute un equipo comercial que utiliza tres enzimas y deteccioacuten
espectrofotomeacutetrica (Wiener lab) La Fig 528 muestra la concentracioacuten nominal versus
concentracioacuten predicha obtenida por las tres metodologiacuteas ensayando diferentes
diluciones de muestra y graficaacutendose el valor medio de 3 medidas independientes
Nominal mM
00 02 04 06 08 10
Pre
dic
ho
mM
00
02
04
06
08
10
Equipo comercial
Tip Au
Biosensor
Recta identidad
Figura 528 Concentracioacuten nominal vs predicha para las dos metodologiacuteas propuestas en este trabajo de
tesis y un meacutetodo enzimaacutetico disponible comercialmente
0
05
1
15
2
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
[Glicerol] (mM)
Ip (
uA
)
Resultados y Discusioacuten
89
Es evidente que los meacutetodos propuestos se correlacionan adecuadamente con la
recta identidad En la Fig 529 se muestran las tres regiones eliacutepticas de confianza
conjuntas (EJCR) para la pendiente y ordenada al origen En este caso puede apreciarse
que las tres elipses contienen el punto (0 1) lo que indica una buena correlacioacuten entre
los meacutetodos propuestos en el presente trabajo y un meacutetodo disponible comercialmente
Pendiente
08 09 10 11 12
Ord
enad
a al
ori
gen
-06
-04
-02
00
02
04
06
Equipo comercial
Tip Au
Biosensor
Punto (1 0)
Figura 529 Regiones eliacutepticas de confianza conjuntas para dos metodologiacuteas presentadas en este trabajo
de Tesis y un meacutetodo enzimaacutetico disponible comercialmente
En la Tabla 511 se presentan distintas metodologiacuteas publicadas en la literatura
actual en las que se referencia la cuantificacioacuten de glicerol ya sean biosensores
electroquiacutemicos u otra metodologiacutea El anaacutelisis de la Tabla 511 permite ver que la
determinacioacuten de glicerol en medios alcalinos sin presencia de interferentes puede ser
llevada a delante con metodologiacuteas econoacutemicas Debe ser considerado que cuando se
realiza la determinacioacuten de glicerol en muestras de biodiesel dicha cuantificacioacuten
requiere extraer el analito de la matriz como puede verse en los meacutetodos maacutes
recientemente propuestos (Bondioli amp Bella 2005 Silva amp Rocha 2010 Lima y col
2012 Tehrani amp Ghani 2012 Maruta amp Paixao 2012 Lourenccedilo amp Stradiotto 2009
Stradiotto y col 2009) Ya sea que se utilice deteccioacuten espectroscoacutepica o
electroquiacutemica siempre se requiere la extraccioacuten previa a la determinacioacuten del analito
Incluso la propuesta de Fernaacutendez Band y col que es el uacutenico meacutetodo que hace una
diferencia notable al comparar las cifras de meacuterito (LD 04 microM tiempo de anaacutelisis 4
min) implica un pretratamiento de la muestra (Lima y col 2012)
Resultados y Discusioacuten
90
Tabla 511 Comparacioacuten de meacutetodos para cuantificar glicerol propuestos recientemente Adaptado de
Faccendini y col 2014
Meacutetodo (Tratamientos
previos) LD
(microM)
Rango de
linealidad
(M)
Muestra
ensayada
Tiempo de
anaacutelisis
(min)
Reactivos o
accesorios
onerosos Referencia
Espectrofotomeacutetrico
(Extraccioacuten del analito) 22
4 times 10-5
a
2 times10-4
Biodiesel 20 - Bondioli amp
Bella 2005 Espectrofotomeacutetrico
(Extraccioacuten del analito) 10
5 times 10minus5
a
5 times 10minus4
Biodiesel 20 a 30 - Silva amp Rocha
2010
Espectrofluoromeacutetrico
(Extraccioacuten del analito) 04
1 times 10minus6
a
5 times 10minus4
Biodiesel 4 - Lima y
col2012
Espectrofotomeacutetrico
multienzimaacutetico No
informa 2 times 10
minus2 a
1 times 10minus1
Jugo de cantildea 5 GK GPO
ATP Kronka y col
2001
Espectrofotomeacutetrico
multienzimaacutetico 8
8 times 10minus6
a
25 times 10minus4
Suero
Humano 10
GK PK
LDH ATP
NAD+
Li y col 2001
Electroquiacutemico VPD
(Extraccioacuten del analito) 33
5 times 10minus4
a
12 times 10minus2
Biodiesel 15 - Tehrani y
Ghani 2012 Electroquiacutemico VC
(Extraccioacuten del analito) 3
33 times 10minus5
a
17 times 10minus3
Biodiesel 30 FIA Maruta y
Paixao 2012
Electroquiacutemico VC
(Extraccioacuten del analito) 25
33 times 10minus5
a
17 times 10minus3
Biodiesel 20 Cartucho de
C18
Lourenccedilo amp
Stradiotto
2009 Electroquiacutemico
amperomeacutetrico
(Extraccioacuten del analito)
No
informa 16 times 10
minus4 a
16 times 10minus3
Biodiesel 60 - Stradiotto y
col 2009
Electroquiacutemico VL
VPD amperomeacutetrico
(Extraccioacuten del analito) 10
23 times 10minus5
a
23 times 10minus4
Solucioacuten
Acuosa
pH=13 5
MWCNT
funcionalizad
os con Ag
Pop y col 2011
Electroquiacutemico
amperomeacutetrico
(Extraccioacuten del analito) 10
25 times 10minus5
a
20 times 10minus3
Solucioacuten
Acuosa
pH=13 8 -
Este Trabajo
de Tesis
Electroquiacutemico
amperomeacutetrico
(Extraccioacuten del analito) 50
5 times 10minus5
a
23 times 10minus2
Solucioacuten
Tampoacuten
Fosfato
5
(estimados) GO
Goriushnika y
col 2010
Biosensor
amperomeacutetrico 04
10 times 10minus6
a
10 times 10minus4
Jarabe de
cantildea 15
(estimados) GlDH NAD+
Aacutelvarez-
Gonzalez y
col 2000
Biosensor
amperomeacutetrico 04
1 times 10minus6
a
2 times 10minus5
Vino 3 GlDH DP
NAD+ Gamella y
col 2008
Biosensor
amperomeacutetrico 03
1 times 10minus6
a
1 times 10minus5
Vino 3 GK GPO
HRP ATP Gamella y
col 2008 Biosensor
amperomeacutetrico 4
5 times 10minus6
a
1 times 10minus4
Vino 5 GK GPO
ATP Ghica amp Brett
2006
Biosensor
amperomeacutetrico 20
70 times 10minus5
a
18 times 10minus3
Caldo
Middlebrook 10
GlDHb
NAD+ Este Trabajo
de Tesis
Del mismo modo el enfoque de Tehrani y Ghani que utilizan un electrodo de grafito
modificado con nanopartiacuteculas de nickel trabajando a pH = 13 realizan una extraccioacuten
previa de glicerol a partir de muestras de biodiesel (Tehrani amp Ghani 2012) En este
Resultados y Discusioacuten
91
caso el LD fue de 33 microM mientras que en este trabajo de Tesis utilizando el mismo
medio hemos conseguido un LD de 10 microM empleando electrodos de oro policristalino
Maruta y Paixao han propuesto recientemente un meacutetodo amperomeacutetrico usando un
electrodo de cobre que trabaja a 065 V vs AgAgCl adaptado en un sistema de FIA
(Maruta amp Paixao 2012) mientras que Lourenccedilo y Stradiotto informaron sobre un
meacutetodo electroquiacutemico que requiere la extraccioacuten acuosa del glicerol a partir de la
muestra y la purificacioacuten adicional por elucioacuten a traveacutes de un cartucho de C18 seguida
de una concentracioacuten por evaporacioacuten y finalmente un anaacutelisis mediante VC (Lourenccedilo
amp Stradiotto 2009) Tambieacuten otras propuestas informan sobre la determinacioacuten de
glicerol por amperometriacutea haciendo uso de electrodos modificados tales como
electrodos de diamante dopados con boro y modificados con nanopartiacuteculas de niacutequel
(Stradiotto y col 2009) y electrodos compuestos de nanotubos de carbono de pared
muacuteltiple funcionalizados con plata (Pop y col 2011) Si bien ambos meacutetodos se
presentan como uacutetiles se requieren diferentes pasos operativos para eliminar posibles
interferencias tales como otros alcoholes que podriacutean ser oxidados a los potenciales de
trabajo 065 V o 130 V (vs AgAgCl) respectivamente En este sentido nuestros
resultados obtenidos por amperometriacutea usando electrodos de oro en medio alcalino
acuoso (pH = 13) estaacuten en el mismo orden que los obtenidos por Pop y colaboradores
utilizando LSV (Pop y col 2011) sobre electrodos compuestos de nanotubos de
carbono de pared muacuteltiple funcionalizados con plata Efectivamente este uacuteltimo y
nuestra metodologiacutea mostraron las mejores cifras de meacuterito entre los meacutetodos
electroquiacutemicos de bajo costo que no consumen enzimas
Los meacutetodos enzimaacuteticos espectrofotomeacutetricos aunque no son laboriosos presentan
la desventaja del consumo relativamente elevado de enzima cada muestra necesita la
adicioacuten del costoso reactivo bioloacutegico ya que no puede ser reutilizado Tambieacuten los LD
de los meacutetodos espectrofotomeacutetricos enzimaacuteticos informados son generalmente
superiores a los que presentan los biosensores Puede antildeadirse que estos uacuteltimos
presentan generalmente el intervalo dinaacutemico lineal maacutes amplio en comparacioacuten con
otros enfoques ya sean electroquiacutemicos o espectrofotomeacutetricos Soacutelo la metodologiacutea de
flujo discontinuo con deteccioacuten fluoromeacutetrica propuesta por Fernaacutendez Band y col
(Lima y col 2012) muestra una sensibilidad en el mismo orden que el maacutes bajo de los
biosensores
En el anaacutelisis de los biosensores que se muestran en la Tabla 511 hay que destacar
que el propuesto por Pingarroacuten y col (Gamella y col 2008) muestra el LD y tiempo de
Resultados y Discusioacuten
92
anaacutelisis total maacutes bajo Para evaluar costos operativos se presenta en la Tabla 512 un
resumen comparativo de la cantidad y concentracioacuten de los reactivos onerosos
consumidos por biosensor o por anaacutelisis entre la propuesta de Pingarroacuten y col y la del
biosensor aquiacute propuesto
Tabla 512 Comparacioacuten entre el meacutetodo enzimaacutetico que mejores cifras de meacuterito presenta y el propuesto
en el presente trabajo de Tesis Adaptado de Faccendini y col 2014
GlDH
bisosensor Diaforasa
biosensor tetratiofulvaleno
biosensor NAD
+ por
anaacutelisis
Gamella y
col 2008 75 U 162 U 15x10-6
M 5x10-3
M Este Trabajo
de Tesis 23 U - - 5x10-4
M
Podemos afirmar que nuestra propuesta es menos costosa hecho importante a ser
evaluado cuando se va a analizar un gran nuacutemero de muestras Mediante la reduccioacuten de
la cantidad de GlDH el LD se elevoacute desde 04 hasta 20 microM aunque es adecuado auacuten
para detectar cambios de concentracioacuten de glicerol en el orden de 15 microM Al mismo
tiempo evitando el uso de diaforasas el tiempo total de anaacutelisis se extendioacute de 3 a 10
min En conjunto los resultados presentados confirman que los cambios introducidos a
los biosensores informados previamente en la literatura tales como el uso de soacutelo una
enzima en baja proporcioacuten la sustitucioacuten del mediador redox por el ferricianuro soluble
y trabajar con el cofactor NAD+ soluble proporciona un sistema fiable de bajo costo
para cuantificar el glicerol
Experimentos Auxiliares
Experimentos Auxiliares
94
6 Experimentos Auxiliares
61 Comparacioacuten de programas de prediccioacuten de epiacutetopes lineales reconocidos
por ceacutelulas B
AAPPred BcePred ABCPred BepiPred y Antigenic se ejecutaron en liacutenea En la
Tabla 61 se muestran los VPP medios (ver definicioacuten en seccioacuten Materiales y Meacutetodos
pag 11) que se obtuvieron al predecir epiacutetopes lineales reconocidos por ceacutelulas B de
todas las proteiacutenas enumeradas en la Tabla 62
Los resultados obtenidos indican que BcePred es el uacutenico programa de los
evaluados que muestra un VPP inferior al obtenido con la prediccioacuten al azar Tambieacuten
se obtuvo que soacutelo dos de los programas estudiados AAPPred y ABCpred predijeron
epiacutetopes con un VPP significativamente mayor al valor de VPP de un procedimiento de
identificacioacuten aleatoria Estos dos programas produjeron predicciones con valores
maacuteximos de 862 y 786 de VPP respectivamente
Tabla 61 Valores predictivos positivos promedio que se obtuvieron con cada uno de los programas
predictores con los que se trabajoacute
Programa
VPP
promedio
AAPPred 691
ABCPred 628
BcePred 309
BepiPred 453
Antigenic 419
Aleatorio 382
En base a estos resultados se trabajoacute con el programa AAPPred y se identificaron
las regiones que concentraban el mayor nuacutemero de epiacutetopes reconocidos por ceacutelulas B
de las proteiacutenas P22 P30 y P35 con el fin de expresar estos Angs como proteiacutenas
recombinantes y utilizarlos en el desarrollo de meacutetodos de diagnoacutestico de la
toxoplasmosis aguda
Experimentos Auxiliares
95
Tabla 62 Base de datos experimental proteiacutenas seleccionadas para este estudio Se indican el nombre de
la proteiacutena el coacutedigo de acceso NCBI la longitud total (en residuos de amino aacutecidos) el
nuacutemero de epiacutetopes reales determinados experimentalmente y la localizacioacuten de los epiacutetopes o
regiones antigeacutenicas Proteiacutenas tomadas de base de datos (A) BciPep (B) VIH Inmunologiacutea
Molecular base de datos o tomado de la literatura (veacutease el nuacutemero de referencia 17 para VP1
16 para la proteiacutena N y 18 para gliadina)
Proteiacutena
Coacutedigo
NCBI
Nordm de
residuos
Cantidad de
epiacutetopes
Localizacioacuten de los epiacutetopes o regiones
antigeacutenicas
MPT70 (A) NP_217391 193 2 31-70 100-120
MSP-1 (A) BAF622801 1693 3 29-39 1594-1611 1644-1662
Exotoxina
A (A) NP_249839 638 8
297-313 324-333 354-387 412-421 510-522
528-539 557-593 596-638
GAG1 (A) P20873 504 10
11-25 113-122 142-156 176-214 216-268
280-308 312-321 330-367 406-416 428-448
Gp160 (A) NP_057856 856 13
30-141 161-191 211-231 252-281 294-344
346-413 424-511 525-558 561-615 639-701
724-747 761-778 822-855
Pr55 (B) NP_579876 132 2 11-38 51-78
Rev (B) NP_057854 116 4 5-15 32-51 70-91 96-116
VP1 (17) ABC87248 781 12
31-41 55-65 85-95 151-161 292-392 316-326
493-500 529-539 547-554 571-578 667-707
712-722
Gliadin
(18) A27319 296 3 31-72 165-176 237-264
Proteiacutena N
(16) AAP13445 422 6 1-6 45-61 153-192 211-223 225-235 354-412
Proteasa
(B) CAB66012 99 2 1-7 36-47
62 Puesta a punto de ensayos de inmunoabsorcioacuten ligados a enzima con
deteccioacuten fotomeacutetrica
Previo al inicio de los ELISA de captura iniciamos una serie de pruebas preliminares
con el propoacutesito de
a) Diferenciar sueros de pacientes infectados de sueros de individuos sin infeccioacuten De
este modo se pretende verificar la potencial utilidad en diagnoacutestico de los antiacutegenos
propuestos corroborando que los procesos quiacutemicos llevados a cabo como por ej la
conjugacioacuten no eliminaron epiacutetopes claves
Experimentos Auxiliares
96
b) Minimizar la sentildeal en los ensayos sin suero (blanco de reactivos) es decir
disminuir el ruido de fondo asociado a interacciones inespeciacuteficas
A tales fines se realizaron ELISA indirectos utilizando los antiacutegenos recombinantes
obtenidos (marcados y sin marcar) adsorbidos sobre la placa se utilizaron sueros
tipificados y se reveloacute la presencia de IgG humana revelando con anticuerpos de cabra anti
IgG humana Los resultados obtenidos se detallan en la siguiente tabla
Tabla 63 Valores de absorbancia a 450 nm obtenidos en ELISA indirectos con deteccioacuten de IgGh con
conjugado anti IgG humana-HRP
Sueros P22C P22C-
biotina P35B
P35B -
biotina
Positivos
2 gt3 26 1900
3 2900 2 gt3
gt3 gt3 26 gt3
Negativos
13 1000 11 0800
06 0500 09 0700
11 1600 1 1000
Si bien los valores de absorbancia leiacutedos en todos los pocillos resultaron elevados
los sueros confirmados positivos dieron los valores maacutes altos de absorbancia mientras
que los sueros negativos dieron los valores maacutes bajos Las diferencias observadas entre
sueros confirmados positivos y sueros confirmados negativos permitieron asumir que
los antiacutegenos obtenidos son de posible utilidad en diagnoacutestico Ademaacutes no se
detectaron diferencias significativas entre los valores de absorbancia obtenidos
utilizando antiacutegenos marcados de aquellos obtenidos con los no marcados
permitieacutendonos pensar que la conjugacioacuten llevada a cabo no eliminoacute epiacutetopes claves
Los elevados valores de absorbancia obtenidos en este ensayo junto a otros estudios
preliminares sugieren que existe una elevada adsorcioacuten inespeciacutefica
621 Bloqueante a utilizar
Se ensayaron diversos agentes bloqueantes para minimizar las interacciones
inespeciacuteficas encontradas durante los experimentos preliminares y asiacute evitar las altas
sentildeales obtenidas en los ensayos control realizados sin suero (blanco de reactivos) y con
sueros confirmados negativos (blancos de muestra) Sobre placas comerciales de
poliestireno se procedioacute al bloqueo total con el agente bloqueante a ensayar y
posteriormente se realizoacute una incubacioacuten con y sin antiacutegeno P22C por duplicado
Finalmente se reveloacute con la enzima HPR-EAV que se une especiacuteficamente a biotina En
la Tabla 64 se muestran los valores de absorbancia a 450 nm
Experimentos Auxiliares
97
Tabla 64 Valores promedio de absorbancia a 450 nm obtenidos en los ensayos de bloqueo
450 nm Sin P22cBiot Con P22cBiot
Sin Bloqueante ------- 1162
Leche 1 0066 01445
Caseinato 1 00725 02425
Gelatina 1 00725 03925
BSA 1 00625 0192
BSA 1 Tween 002 00615 01515
En base a estos resultados se continuoacute con el uso de leche descremada como agente
bloqueante
622 Esquema A
Cuando se realizaron ELISA siguiendo el esquema A se ensayaron dos diluciones
de la HRP-EAV 12000 y 15000 Por otro lado se ensayaron distintas masas de
antiacutegenos P22C y P35B conjugados a biotina con los que se intentoacute revelar presencia
de IgM especiacuteficas Especiacuteficamente se ensayaron 2 02 y 002 g por pocillo de P35B
biotina y 5 2 02 y 002 g por pocillo de P22C biotina Con esto se buscoacute encontrar
las cantidades oacuteptimas de reactivos para poder llevar adelante estos ensayos A modo
ilustrativo en la Tabla 65 se muestra un ensayo representativo siguiendo el esquema A
Se informan solamente los valores de absorbancia a 450 nm obtenidos para sueros
provenientes de pacientes con infeccioacuten croacutenica (croacutenicos) aguda (agudos) y de
pacientes sin infeccioacuten (negativos)
Tabla 65 Valores de absorbancia a 450 nm obtenidos en ELISA siguiendo el esquema A Se muestran 3
cantidades de antiacutegeno revelador utilizadas 2 02 y 002 microg En este ensayo la dilucioacuten de la
enzima HRP-EAV fue 15000 y se utilizaron 100 microL por pocillo
Antiacutegenos
Sueros
P22C biotina ( g) P35B biotina ( g)
2 02 002 2 02 002
Negativos 0576 0294 0155 1071 0681 0566
0543 0335 0176 1079 0769 023
Croacutenicos 0469 0246 0135 103 069 0299
0514 0215 0111 0914 0567 0196
Agudos 0331 0181 0109 081 0574 0168
0555 0254 0139 0789 0391 0169
Experimentos Auxiliares
98
623 Esquema B
Cuando se realizaron ELISAs siguiendo el esquema B se ensayaron distintas masas
de antiacutegeno P22C y P35B absorbidas sobre las microplacas comerciales a saber 500
200 50 10 o 5 ng (disueltos en 100 L de solucioacuten tampoacuten carbonato pH 96) En todos
los casos se incuboacute 1h a 37 degC
Para la incubacioacuten con la proteiacutena conjugada a biotina se ensayaron 2 y 5 ug por
pocillo En la Tabla 66 se resumen los resultados obtenidos
Tabla 66 Valores de absorbancia a 450 nm obtenidos en ELISA siguiendo el esquema B Se muestran
los resultados obtenidos para dos cantidades distintas de antiacutegeno de captura (P22C) 10 y 50
ng junto a 2 cantidades de antiacutegeno revelador (P22C-biotina) utilizadas 2 y 5 microg En este
ensayo la dilucioacuten de la enzima HRP-EAV fue 12000 y se utilizaron 100 microL por pocillo
2 microg P22C biotina 5 microg P22C biotina
Masa de P22C
(ng)
Muestras
50 10 50 10
Agudos 0393 0303 0553 0450
0273 0335 0793 0367
Croacutenicos 0230 0398 0316 0345
0284 0291 0444 0493
Negativos 0392 0210 0380 0380
0286 0292 0314 0350
Sin suero 0367 0468 0415 0411
0327 0358 0468 0536
Sin Prot conjugada a
biotina ni sueros
0102 0087 0128 0079
0131 0095 0116 0104
Los resultados obtenidos indicaron que para lograr una mejor discriminacioacuten de las
muestras es conveniente utilizar mayor cantidad de masa de antiacutegeno de captura (P22C)
depositada en el pocillo Por otro lado 5 microg de antiacutegeno revelador (P22C-biotina) por
pocillo contribuyoacute a aumentar la discriminacioacuten entre las muestras sin incrementar
significativamente el ruido de fondo
Experimentos Auxiliares
99
63 Ensayos electroquiacutemicos
631 Determinacioacuten del aacuterea real de un electrodo
6311 Meacutetodo de la adsorcioacuten de O2
Se realizaron barridos de potencial como se indica en el punto 41931 de la
seccioacuten Materiales y Meacutetodos La Fig 61 muestra un voltamperograma tiacutepico obtenido
Con el valor de la carga asociada a la desorcioacuten del oacutexido de oro pudo determinarse el
valor de aacuterea electroactiva del electrodo de trabajo utilizado como se indica en el punto
41931
E V
04 06 08 10 12 14 16
I
A
-15e-5
-10e-5
-50e-6
00
50e-6
Figura 61 Voltamperograma ciacuteclico tiacutepico obtenido con electrododos de oro en medio H2SO4 05 M
velocidad de barrido 50 mV s-1
Se indica en color turquesa el pico de desorcioacuten del oacutexido de oro la carga
(Q) obtenida del aacuterea encerrada en la curva se utilizoacute para determinar el aacuterea real de los electrodos de oro
previamente a los ensayos
6312 Voltametriacutea ciacuteclica a distintas velocidades
Se realizaron barridos de potencial a distintas velocidades como se indica en el
punto 41932 de la seccioacuten Materiales y Meacutetodos La Fig 62 muestra los voltagramas
tiacutepicos obtenidos en (A) y en (B) la dependencia de la corriente de pico Ip con la raiacutez
cuadrada de la velocidad de barrido Con el valor de la pendiente de la recta obtenida
por regresioacuten lineal pudo determinarse el valor de aacuterea electroactiva del electrodo de
trabajo utilizado como se indica en el punto 41932 habieacutendose utilizado un
coeficiente de difusioacuten del Fe(CN)63-
de 0762 cm2 s
-1 (Sawyer amp Roberts 1974)
Experimentos Auxiliares
100
E V
-02 -01 00 01 02 03 04 05 06
I
A
-20e-4
-10e-4
00
10e-4
20e-4
Figura 62 A) Voltametriacuteas ciacuteclicas de Fe(CN)63 1 mM en medio KCl 01 M a distintas velocidades de
barrido utilizando como electrodo de trabajo el biosensor amperomeacutetrico para evaluacioacuten de infeccioacuten
toxoplaacutesmica La flecha indica la direccioacuten de barrido B) Dependencia de Ip (en valores absolutos) con la
raiacutez de la velocidad de barrido el valor de pendiente de la recta de regresioacuten se utilizoacute para determinar el
aacuterea real del electrodo de trabajo
632 Cubierta del biosensor selectivo para glicerol y soluciones amortiguadoras
Se ensayaron distintos poliacutemeros para cubrir el biosensor de pasta de carbono B
utilizamos poliacutemeros de 4-vinilbenzilimine copolimerizados con cloruro de 4-
vinilbencil-trietilamonio y sulfonato de vinilfenilo (portadores de carga neta positiva y
negativa respectivamente) Si bien los poliacutemeros permitiacutean operar con complejos de
hierro utilizados como mediadores redox (Fe(CN)63-
y ferrocenometanol) no resultaron
uacutetiles en el ensamblado del biosensor por el elevado ruido de fondo que generaron
Se evaluaron distintas soluciones amortiguadoras de pH como fosfatos y
amoniacuteacoamonio Se optoacute por las soluciones de carbonato porque estas resultaron maacutes
sencillas de preparar y manipular que las amoniacales y presentaron mayor capacidad
reguladora en el pH oacuteptimo de la enzima GlDH que las de fosfato
633 Ensayos preliminares de voltametriacuteas de onda cuadrada
Los ensayos preliminares de voltametriacutea de onda cuadrada consistieron en
establecer los valores maacutes convenientes de la amplitud de pulso el escaloacuten de potencial
y la frecuencia para los futuros ensayos de cuantificacioacuten Se realizaron los voltagramas
en tres series de ensayos a seis valores de frecuencia 10 20 30 40 60 y 70 Hz
Los valores de salto de potencial ( ES) y amplitud de pulso ( E) utilizados en las
tres series de ensayos realizados se resumen en la siguiente tabla
(velocidad barrido)12 V12 s-12
006 008 010 012 014 016 018 020 022 024
Ip
A
40e-5
60e-5
80e-5
10e-4
12e-4
14e-4
16e-4
18e-4
20e-4
Experimentos Auxiliares
101
Tabla 67 Valores de salto de potencial y amplitud de onda cuadrada utilizados en los ensayos
voltameacutetricos
Serie 1 Serie 2 Serie 3
ES (mV) 5 5 10
E (mV) 25 50 50
En las 3 series de ensayos se observoacute que al aumentar la frecuencia la corriente de
pico no se incrementaba y el pico de corriente se deformaba aumentando
considerablemente el ruido Las mejores relaciones sentildealruido en las tres series de
ensayos se obtuvieron trabajando a 10 Hz Por su parte cuando se utilizoacute un escaloacuten de
potencial de 10 mV el pico de corriente se deformoacute levemente por lo que se optoacute por
trabajar con un ES = 5 mV Cuando la amplitud del pulso fue 50 mV se obtuvieron
mayores intensidades de corriente sin deformacioacuten de pico escogieacutendose en
consecuencia este valor En la Fig 63 se muestran los voltamperogramas obtenidos en
los ensayos de la serie 2 a una frecuencia de 10 Hz
Figura 63 Voltagramas de onda cuadrada obtenidos utilizando bioelectrodos de pasta de carbono viacutetreo
modificada con GlDH y MWCNT En liacutenea clara se muestra el voltagrama de la solucioacuten NAD+ 05 mM
(NH4)2SO4 25 mM K2CO3 KHCO3 100 mM pH 105 con medio Middelbrook 7H9 Superpuestos se
detallan los voltagramas de la misma solucioacuten luego del agregado de glicerol 100 M para llevar a
concentracioacuten final 25 mM (- - -) y 50 mM (____
)
6331 Seleccioacuten de un meacutetodo apropiado para establecer la liacutenea de base
Se buscoacute establecer una liacutenea de base para corregir los voltagramas obtenidos
utilizando algoritmos presentes en el programa GPES Se intentoacute con algoritmos de
correccioacuten que permiten establecer una liacutenea polinoacutemica ad-hoc para cada voltagrama
utilizando entre 2 y 5 puntos de la curva experimental Sin embargo las sentildeales
corregidas presentaban picos de corrientes con valores de ancho a la altura media Wfrac12
entre 0180 y 0220 V valores que resultan elevados comparados con 0123 Vn el valor
de referencia para este paraacutemetro en VOC donde n es el nuacutemero de electrones
Experimentos Auxiliares
102
intercambiados en la reaccioacuten Finalmente a cada VOC se les restoacute la VOC del blanco
buscaacutendose el pico de corriente con un algoritmo de buacutesqueda semiautomaacutetica del
programa GPES con una liacutenea de base recta y marcando manualmente el inicio y final
del pico establecieacutendose los mismos valores de potencial de inicio y finalizacioacuten del
pico de corriente en todos los voltamperogramas De este modo se obtuvieron picos
cuyos Wfrac12 eran proacuteximos al valor teoacutericamente predicho
Conclusiones
Conclusiones
104
7 Conclusiones
1- Se pudo encontrar cual de los programas de libre acceso para predecir epiacutetopes
lineales reconocidos por ceacutelulas B es el maacutes conveniente al momento de seleccionar
antiacutegenos con fines diagnoacutesticos
2- Se pudieron clonar expresar en forma soluble y marcar con biotina fragmentos
de antiacutegenos de toxoplasmosis de fase aguda que presentan alta concentracioacuten de
determinantes antigeacutenicos
3- Se verificoacute la utilidad de los antiacutegenos obtenidos para su posterior uso en el
ensamblado de bioelectrodos para diagnoacutestico de infeccioacuten aguda de toxoplasmosis
4- Se pudo cuantificar glicerol en muestras sencillas con un electrodo versaacutetil de
oro policristalino por medio de una metodologiacutea amperomeacutetrica a 01 V en medio
NaOH 01 M y con un tiempo de anaacutelisis de 8 min liacutemite de deteccioacuten 10 microM y un
intervalo de linealidad de 0024 a 200 mM
5- Se pudo cuantificar glicerol en medios de cultivo de micobacterias El meacutetodo
consiste en una amperometriacutea que emplea un bioelectrodo selectivo para glicerol
compuesto de pasta de C modificada con glicerol deshidrogenasa y lleva un tiempo de
anaacutelisis de 10 min liacutemite de deteccioacuten 20 microM y un rango de linealidad de 0060 a 175
mM Este meacutetodo podriacutea en un futuro ser uacutetil para identificar muestras de pacientes con
tuberculosis activa en un menor tiempo de anaacutelisis al actualmente empleado
6- Los meacutetodos para cuantificar glicerol aquiacute presentados fueron validados frente
a un equipo enzimaacutetico disponible comercialmente
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Iacutendice
i
Iacutendice
1 Resumen vi
1 Summary viii
Publicaciones x
Abreviaturas y Siacutembolos xii
2 Introduccioacuten 1
21 Toxoplasmosis 1
211 Generalidades 1
212 Toxoplasma gondii 2
213 Diagnoacutestico 4
2131 Meacutetodos de diagnoacutestico 4
2132 Importancia del correcto diagnoacutestico en la embarazada 6
2133 Diagnoacutestico en la embarazada 6
2134 Ensayo de inmunoadsorcioacuten ligado a enzima 7
21341 Esquema de captura o tipo ―Sandwich 7
2135 Obtencioacuten de antiacutegenos para diagnoacutestico 9
214 Prediccioacuten de epiacutetopes reconocidos por ceacutelulas B 10
22 Tuberculosis 13
221 Generalidades 13
222 Mycobacterium tuberculosis 13
223 Diagnoacutestico 14
23 Biodiesel 16
231 Determinacioacuten de glicerol libre en biodiesel 16
24 Marco teoacuterico de las teacutecnicas electroquiacutemicas utilizadas 18
241 Cronoampreometriacutea 20
242 Teacutecnicas voltameacutetricas 21
2421 Voltametriacutea de barrido lineal 22
2422 Voltametriacutea ciacuteclica 23
Iacutendice
ii
243 Teacutecnicas de pulso 24
2431 Voltamperometriacutea onda cuadrada VOC 24
25 Biosensores 27
251 Superficie de bioreconocimiento en biosensores 28
252 Biosensores amperomeacutetricos 29
253 Biosensores de uso cliacutenico 29
2531 Biosensores para evaluacioacuten de infeccioacuten toxoplaacutesmica 32
254 Biosensores para cuantificacioacuten de glicerol 32
3 Objetivos 37
31 Objetivos generales 37
32 Objetivos Particulares 37
4 Materiales y meacutetodos 39
41 Reactivos y medios de cultivos 39
411 Reactivos 39
412 Medios de cultivos 40
42 Cepas bacterianas 40
43 Bacterioacutefagos 41
44 Plaacutesmidos 41
45 Reaccioacuten en cadena de la polimerasa 41
46 Electroforesis de ADN en geles de agarosa 42
47 Minipreparacioacuten de ADN plasmiacutedico 42
48 Purificacioacuten del producto de amplificacioacuten 43
49 Prueba de expresioacuten de proteiacutenas de fusioacuten a TRX y a ―cola
de histidinas 43
410 Expresioacuten y purificacioacuten preparativas de antiacutegenos recombinantes 43
411 Separacioacuten de proteiacutenas mediante SDS-PAGE 44
412 Cuantificacioacuten de proteiacutenas 44
413 Reaccioacuten de conjugacioacuten biotina-antiacutegeno 44
Iacutendice
iii
414 Revelado cromogeacutenico de la reaccioacuten de conjugacioacuten 45
415 Mediciones espectrofotomeacutetricas 45
416 Ensayos de inmunoabsorcioacuten ligados a enzima con deteccioacuten
fotomeacutetrica 45
4161 Esquema A 46
4162 Esquema B 46
417 Reaccioacuten de color para determinacioacuten cuantitativa de glicerol por meacutetodo
espectrofotomeacutetrico 47
418 Determinacioacuten de glicerol remanente en cultivos de micobacterias 47
4181 Determinacioacuten de glicerol remanente en cultivos de micobacterias
con y sin fago D29 y ensayos controles respectivos 48
419 Instrumental electroquiacutemico 48
4191 Electrodos de trabajo 48
41911 Bioelectrodo para evaluacioacuten de infeccioacuten toxoplaacutesmica 48
41912 Electrodos para cuantificacioacuten de glicerol 49
4192 Limpieza de electrodos 50
4193 Determinacioacuten del aacuterea real del electrodo 50
41931 Medicioacuten de la adsorcioacuten de oxiacutegeno 50
41932 Voltametriacutea ciacuteclica de ferricianuro de potasio 51
420 Medidas electroquiacutemicas 51
4201 Mediciones amperomeacutetricas para evaluacioacuten de infeccioacuten
toxoplaacutesmica 51
4202 Mediciones amperomeacutetricas para cuantificacioacuten de glicerol 52
42021 Amperometriacuteas con tip de oro 52
42022 Amperometriacuteas con electrodos de pasta de C 52
4203 Voltamperometriacutea de onda cuadrada 53
421 Funcionalizacioacuten de nanotubos de carbono 53
422 Programas de prediccioacuten de epiacutetopes lineales reconocidos por ceacutelulas B 54
Iacutendice
iv
4221 Base de datos de proteiacutenas 54
4222 Programas utilizados 54
423 Anaacutelisis de Datos 54
424 Caacutelculos estadiacutesticos y disentildeo experimental 55
5 Resultados y discusioacuten 57
51 Evaluacioacuten de antiacutegenos recombinantes de T gondii 57
511 Antiacutegeno P30 57
512 Antiacutegeno P22 58
513 Antiacutegeno P35 59
52 Marcado de antiacutegenos recombinantes de T gondii 60
53 Inmunoensayos 61
531 Inmunoensayos con deteccioacuten fotomeacutetrica 61
5311 Evaluacioacuten del esquema A 61
5312 Esquema B 62
532 Inmunoensayos con deteccioacuten amperomeacutetrica utilizando los antiacutegenos
recombinantes 66
54 Determinacioacuten de la actividad electroquiacutemica del glicerol en medio
acuoso 67
55 Cuantificacioacuten de glicerol en medios acuosos complejos 71
551 Evaluacioacuten del modelo propuesto por medio de lecturas
espectrofotomeacutetricas 72
5511 Evaluacioacuten de la sentildeal con la concentracioacuten de glicerol 76
5512 Optimizacioacuten de condiciones para disminuir el costo operativo 78
552 Determinacioacuten de glicerol remanente en cultivos de micobacterias 79
5521 Evaluacioacuten de glicerol remanente en cultivos axeacutenicos de M
smegmatis 79
5522 Determinacioacuten de glicerol remanente en cultivos de micobacterias
con y sin fago D29 y ensayos controles respectivos 80
Iacutendice
v
553 Biosensor amperomeacutetrico a base de pasta de carbono viacutetreo
modificada 81
554 Desarrollo de un biosensor a base de pasta de carbono viacutetreo y
nanotubos de carbono 83
5541 Ensayos de cuantificacioacuten de glicerol con el bioelectrodo
desarrollado utilizando teacutecnicas de pulso 86
56 Validacioacuten de meacutetodos 88
6 Experimentos Auxiliares 94
61 Comparacioacuten de programas de prediccioacuten de epiacutetopes lineales reconocidos
por ceacutelulas B 94
62 Puesta a punto de ensayos de inmunoabsorcioacuten ligados a enzima con
deteccioacuten fotomeacutetrica 95
621 Bloqueante a utilizar 96
622 Esquema A 97
623 Esquema B 98
63 Ensayos electroquiacutemicos 99
631 Determinacioacuten del aacuterea real de un electrodo 99
6311 Meacutetodo de la adsorcioacuten de O2 99
6312 Voltametriacutea ciacuteclica a distintas velocidades 99
632 Cubierta del biosensor selectivo para glicerol y soluciones
amortiguadoras 100
633 Ensayos preliminares de voltametriacuteas de onda cuadrada 100
6331 Seleccioacuten de un meacutetodo apropiado para establecer la liacutenea
de base 101
7 Conclusiones 104
8 Bibliografiacutea 106
Resumen
vi
1 Resumen
Este trabajo de Tesis se orientoacute al desarrollo de meacutetodos analiacuteticos alternativos a los
hoy vigentes que faciliten la determinacioacuten de compuestos de intereacutes tanto para
diagnoacutestico cliacutenico como para la industria de combustibles alternativos Se realizaron
aportes para tres situaciones de relevancia diagnoacutestico de toxoplasmosis tuberculosis y
evaluacioacuten de calidad de biodiesel
La toxoplasmosis es una parasitosis causada por Toxoplasma gondii que afecta a
humanos sin generar complicaciones excepto cuando los infectados son
inmunodeprimidos o mujeres embarazadas que no cursaron previamente la enfermedad
En este caso el paraacutesito puede atravesar placenta generando infeccioacuten congeacutenita del
feto pudiendo producirle graves consecuencias que pueden llegar a la muerte Una de
las teacutecnicas de diagnoacutestico utiliza el ensayo de inmunoadsorcioacuten ligado a enzima
permitiendo la deteccioacuten de anticuerpos especiacuteficos contra el paraacutesito los cuales son
indicadores de existencia de infeccioacuten No obstante para detectar toxoplasmosis aguda
al diacutea de hoy se carece de una estandarizacioacuten confiable principalmente en la
preparacioacuten del antiacutegeno Por ello en este trabajo se procuroacute identificar regiones donde
se codificaraacuten algunos marcadores de fase aguda que concentraraacuten una alta proporcioacuten
de determinantes antigeacutenicos para luego clonarlas expresarlas como proteiacutenas
recombinantes marcarlas con biotina y asiacute utilizarlas como sistema de revelado de
anticuerpos especiacuteficos contra proteiacutenas de T gondii Los inmunoensayos aquiacute
presentados proponen una metodologiacutea que permitiraacute en un futuro distinguir sueros
provenientes de individuos con infeccioacuten aguda de aquellos con infeccioacuten croacutenica o no
infectados
La tuberculosis es una enfermedad infecto-contagiosa causada por la bacteria
Mycobacterium tuberculosis Su diagnoacutestico se basa en una serie de estudios que
finaliza con la identificacioacuten del agente etioloacutegico en cultivos obtenidos a partir de
esputo Esta identificacioacuten puede demorar aproximadamente dos meses debido al
prolongado tiempo de replicacioacuten de la micobacteria Esto conlleva la potencialidad de
contagio a individuos sanos y un compromiso importante de la salud del infectado
Uacuteltimamente se han desarrollado teacutecnicas indirectas de deteccioacuten de M tuberculosis
utilizando el bacterioacutefago D29 capaz de infectar especiacuteficamente micobacterias Es una
metodologiacutea donde se facilita la replicacioacuten del fago en la muestra proveniente del
paciente para luego evaluar el tiacutetulo de fagos liberados infectando un cultivo testigo de
Resumen
vii
Micobacterium smegmatis micobacteria de replicacioacuten raacutepida Siendo el glicerol fuente
de carbono en cultivos de micobacterias se planteoacute determinar su concentracioacuten
remanente como meacutetodo de evaluar integridad de M smegmatis establecieacutendose asiacute una
medida indirecta de la previa presencia de M tuberculosis en la muestra problema
Ademaacutes el glicerol es el principal subproducto en la elaboracioacuten del biodiesel y su
concentracioacuten es indicativa de la calidad del combustible transformaacutendose en analito
relevante para la industria de energiacuteas alternativas a la derivada del petroacuteleo
Se desarrollaron y validaron dos meacutetodos amperomeacutetricos de cuantificacioacuten de
glicerol a) Con electrodo de oro en NaOH 01 M aplicable a medios acuosos (LD 10
microM intervalo lineal 0024 a 200 mM) b) Con bioelectrodo de pasta de C modificada
con glicerol deshidrogenasa aplicable a medios complejos como cultivos bacterianos
(LD 20 M intervalo lineal 0060 a 175 mM)
Resumen
viii
1 Summary
This Thesis work was oriented to the development of analytical methods alternative
to those currently used to facilitate the identification of compounds of interest for both
clinical diagnosis and the alternative fuel industry Contributions of relevance to three
situations were performed Diagnosis of toxoplasmosis tuberculosis and the assessment
of biodiesel quality
Toxoplasmosis is a parasitic disease caused by Toxoplasma gondii which does not
bring complications in people except when the infected individual is an
immunocompromised patient or pregnant women who have not previously suffered
from the illness In this case the parasite can cross the placenta producing congenital
infection of the fetus and potentially causing serious consequences including death
One of the techniques used to its diagnosis is the enzyme-linked immunosorbent assay
allowing the detection of parasite-specific antibodies which are indicators of the
infection However this technique aimed to detect acute toxoplasmosis nowadays lacks
of reliable standardization particularly in the preparation of the antigen Therefore this
study focused on identifying regions encoding several markers of acute phase which
highly concentrated antigenic determinants to clone and express them as recombinant
proteins subsequently label them with biotin and thus use them as developing system of
specific antibodies against T gondii proteins The immunoassays presented here
propose a methodology which will allow in the future distinguishing sera from
individuals with acute infection of those with chronic infection or uninfected
Tuberculosis is an infectious and contagious disease caused by the bacterium
Mycobacterium tuberculosis Its diagnosis is based on a series of studies which
eventually identify the etiologic agent in cultures obtained from sputum This
identification can take about two months due to the extensive mycobacteria replication
time This leads to the potential contagion of healthy individuals and a major
commitment to the health of the infected patient Recently indirect M tuberculosis
detection techniques have been developed They use D29 bacteriophage which is able
to specifically infect mycobacteria The methodology allows phage replication in the
patientrsquos sample and then evaluates the number of released phages by infecting a
control culture of Mycobacterium smegmatis a short-term replicable mycobacteria As
glycerol is the carbon source commonly used in mycobacteria culture this work
proposes determining its residual concentration as a method of evaluating integrity of
Resumen
ix
M smegmatis thus establishing an indirect measurement of the previous presence of M
tuberculosis in the sample
Furthermore glycerol is the main by-product in biodiesel production and its
concentration is an indicator of the fuel quality becoming a relevant analyte to the
energy industry alternative to that derived of petroleum
Two amperometric methods for glycerol quantitation were developed and
validated a) Using a gold electrode in 01 M NaOH medium useful for simple aqueous
solutions (LD 10 microM linear range from 0024 to 200 mM) b) using a carbon paste
bioelectrode modified with glycerol dehydrogenase useful for complex media such as
bacterial cultures (LD 20 microM linear range 0060 to 175 mM)
Publicaciones
x
Publicaciones
Los resultados parciales del presente trabajo de Tesis han dado lugar a las
siguientes publicaciones
Trabajos en revistas internacionales
1- Costa J G Faccendini P L Sferco S J Lagier C M Marcipar I S
Evaluation and comparison of the ability of online available prediction programs to
predict true linear B-cell epitopes Protein amp Peptide Letters (2013) 20(6)724-30
2- Faccendini P L Ribone M E Lagier C M Selective application of two
rapid low-cost electrochemical methods to quantify glycerol according to the sample
nature Sensors and Actuators B (2014) 193 142ndash 148
Trabajos en congresos
1- Muntildeoz A Faccendini P L Ribone M E Lagier C M Oxidacioacuten
electroquiacutemica de polialcoholes sustrato de sistemas enzimaacuteticos bacterianos Estudio
de las condiciones para su cuantificacioacuten V Congreso Argentino de Quiacutemica Analiacutetica
Bahiacutea Blanca Noviembre de 2009
2- Costa J G Faccendini P L Carral L Kaufer F Lagier C M Marcipar I
S Evaluacioacuten de dos regiones de la Proteiacutena P35 de Toxoplasmama gondii para el
diagnostico de fase aguda de la toxoplasmosis Ascochinga Coacuterdoba Octubre de 2010
3- Costa J G Faccendini P L Lagier C M Marcipar I S Modelado y
prediccioacuten de los epiacutetopes del antigeno P22 de Toxoplasma gondii 2do Congreso de
Bioinformaacutetica y Biologiacutea Computacional Coacuterdoba Mayo de 2011
4- Faccendini P L Costa J G Ribone M E Marcipar I S Lagier C M
Ensamblado de un bioelectrodo econoacutemico para la deteccioacuten de glicerol en medios
altamente complejos 6deg Congreso Argentino de Quiacutemica Analiacutetica Santa Fe
Septiembre de 2011
5- Faccendini P L Costa J G Ribone M E Marcipar I S Lagier C M
Desarrollo y optimizacioacuten de un meacutetodo para la cuantificacioacuten de glicerol en matrices
complejas 6deg Congreso Argentino de Quiacutemica Analiacutetica Santa Fe Septiembre de 2011
Publicaciones
xi
6- Costa J G Perotti J Faccendini P L Lagier C M Mancipar I S
Optimization of the acute toxoplasmosis immunodiagnostic during the pregnancy
Workshop Fronteras en Biociencias Ministerio de Ciencia Tecnologiacutea e Innovacioacuten
Productiva Embajada Alemana Ciudad Autoacutenoma de Buenos Aires Abril de 2012
7- Costa J G Perotti J Faccendini P L Dure A Carral L Kaufer F Lagier
C M Mancipar I S Evaluacioacuten de diferentes regiones de las proteiacutenas p22 p30 y p35
para diagnoacutestico de la fase aguda de la toxoplasmosis XXV Reunioacuten Anual de la
Sociedad Argentina Protozoologiacutea 2012 Ciudad Autoacutenoma de Buenos Aires Agosto
de 2012
8- Costa J G Faccendini P L Sferco S J Lagier C M Mancipar I S
Comparison of the ability to predict true linear B-cell epitopes by on-line available
prediction programs 3er congreso de la sociedad argentina de bioinformaacutetica y biologiacutea
computacional Paranaacute Septiembre de 2012
9- Faccendini P L Costa J G Ribone M E Marcipar I S Lagier C M
Desarrollo de un sistema electroquiacutemico para evaluar infeccioacuten toxoplaacutesmica 7deg
Congreso Argentino de Quiacutemica Analiacutetica Mendoza Octubre de 2013
Abreviaturas y Siacutembolos
xii
Abreviaturas y Siacutembolos
AD Aglutinacioacuten Directa
ADN Aacutecido desoxiribonucleico
Ac(s) Anticuerpo(s)
Ang(s) Antiacutegeno(s)
D Coeficiente de difusioacuten
DHA 13 dihidroxiacetona
DMSO Dimetil sulfoacutexido
DO Densidad oacuteptica
DT Dye Test con azul de metileno (Reaccioacuten de Sabiacuten Feldman)
EDTA Aacutecido etilendiaminotetraaceacutetico
ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay (Ensayo de inmunoadsorcioacuten ligado
a enzima)
F Constante de Faraday
Frecuencia
GlDH Glicerol deshidrogenasa
HAI Hemoaglutinacioacuten indirecta
HEPES Aacutecido 4-(2-hydroxietil)-1-piperazina etano sulfoacutenico
HRP Horse radish peroxidase (Peroxidasa de raacutebano picante)
I Corriente eleacutectrica
IFI Inmunofluorescencia indirecta
IgA Inmunoglobulina A
IgG Inmunoglobulina G
IgE Inmunoglobulina E
IgM Inmunoglobulina M
IgM-IFI Inmunofluorescencia indirecta de IgM (Prueba de Remington)
IPTG Isopropil- -D-tiogalactopiranoacutesido
ISAGA Ensayo aglutinante de inmunoabsorcioacuten
LB Medio Luria-Bertani
LC Liacutemite de cuantificacioacuten
LD Liacutemite de deteccioacuten
MWCNT Multi-walled carboacuten nanotubes (Nanotubos de carbono de paredes
muacuteltiples)
Abreviaturas y Siacutembolos
xiii
N nuacutemero de moles de especie reducida u oxidada
OMS Organizacioacuten Mundial de la Salud
P35 Antiacutegeno de superficie de T gondii de 35 kDa de peso
PBS Phosphate buffer salin (Solucioacuten tampoacuten fosfato salino)
PCR Polimerasa chain reaction (Reaccioacuten en cadena de la polimerasa)
pET32a Vector plasmiacutedico
Q Carga eleacutectrica circulante
SAG1 Surface antigen 1 (Antiacutegeno de superficie 1 o antiacutegeno P30 de T gondii)
SAG2 Surface antigen 2 (Antiacutegeno de superficie 2 o antiacutegeno P22 de T gondii)
SDS Dodecil sulfato de sodio
TB Tuberculosis
TRX Tioredoxina
VBL Voltametriacutea de barrido lineal
VC Voltametriacutea ciacuteclica
VPD Voltametriacutea de pulso diferencial
Introduccioacuten
Introduccioacuten
1
2 Introduccioacuten
21 Toxoplasmosis
211 Generalidades
La toxoplasmosis es una enfermedad causada por el paraacutesito protozoario
Toxoplasma gondii que infecta animales herbiacutevoros carniacutevoros y omniacutevoros dentro de
los cuales se encuentra el hombre Estaacute ampliamente extendida por todo el mundo y su
incidencia y prevalencia variacutean mucho seguacuten las zonas geograacuteficas los haacutebitos
alimentarios el tipo de trabajo la higiene ambiental y la presencia o no de gatos
infectados (Atias 1998 Martiacuten-Hernaacutendez 2004) Es una zoonosis que afecta a los
humanos a traveacutes de formas infectivas producidas durante el ciclo bioloacutegico que se
desarrolla uacutenicamente en gatos y otros feacutelidos Dependiendo de la localizacioacuten
geograacutefica entre 15 y 85 de la poblacioacuten adulta mundial presenta infeccioacuten croacutenica
(Fuentes y col 2001)
Usualmente la principal viacutea de transmisioacuten de esta parasitosis es la oral por
ingestioacuten de carnes crudas o poco cocidas contaminadas con quistes o por la ingestioacuten
de ooquistes presentes en agua o alimentos contaminados con heces de gato Son menos
frecuentes las viacuteas de transmisioacuten parenteral respiratorias mucosal (conjuntival)
cutaacutenea y por transfusioacuten de sangre o trasplante de oacuterganos La transmisioacuten por viacutea
transplacentaria puede ocurrir cuando la embarazada padece la primoinfeccioacuten durante
el curso del embarazo aunque se han descripto casos raros de infeccioacuten congeacutenita por
toxoplasmosis materna anterior al embarazo (Martiacuten-Hernaacutendez 2004 Centers of
Diseases Control and Prevention (CDC) paacutegina web a)
Durante la infeccioacuten pueden distinguirse dos etapas A) Aguda Al breve tiempo de
ingerir ooquistes esporulados eacutestos se transforman en taquizoiacutetos ingresan a la ceacutelula
del hueacutesped y comienzan a dividirse en forma asexual hasta que la ceacutelula se lisa
liberando asiacute la progenie y ocasionando la parasitemia Posteriormente el taquizoiacuteto
evoluciona a bradizoiacuteto cuya multiplicacioacuten es lenta Se produce la invasioacuten de los
oacuterganos por viacutea linfaacutetica o hemaacutetica siendo los oacuterganos maacutes comprometidos los
muacutesculos esqueleacutetico y cardiacuteaco asiacute como cerebro y ojos B) Croacutenica En la medida que
evoluciona la defensa del hueacutesped desaparecen los paraacutesitos extracelulares limitaacutendose
la divisioacuten intracelular y quedando las formas resistentes principalmente en el sistema
nervioso central y muacutesculo esqueleacutetico Por lo general esta etapa es latente pero puede
Introduccioacuten
2
activarse por la ruptura de los quistes tisulares (Fuentes y col 2001 Trabattoni y col
2008)
212 Toxoplasma gondii
El Toxoplasma gondii es un paraacutesito intracelular obligado Su ubicacioacuten
taxonoacutemica se detalla en la Tabla 21
Tabla 21 Ubicacioacuten taxonoacutemica del T gondii
Reino Protista
Sub-reino Protozoa
Phylum Apicomplexa
Clase Sporozoea
Sub-clase Coccidea
Orden Eucoccidiia
Sub-orden Eimeriina
Familia Sarcocystidae
Sub-familia Toxoplasmatinae
Geacutenero Toxoplasma
Especie gondii
Durante el ciclo de vida del T gondii se distinguen tres formas a) los taquizoiacutetos
b) los bradizoiacutetos (o quistes tisulares) y c) los ooquistes Los taquizoiacutetos (o trofozoiacutetos)
son la forma proliferativa y de reproduccioacuten raacutepida dentro de la ceacutelula del hueacutesped
durante la fase aguda que posteriormente deviene en la formacioacuten de un pseudoquiste
Tiene forma de medialuna y mide de 4 a 7 μm de ancho Estaacute recubierto por un sistema
de membranas constituido por una membrana doble interna y una externa interrumpida
en dos puntos El taquizoiacuteto es afectado por anticuerpos (Acs) especiacuteficos y faacutermacos y
se destruye en condiciones ambientales adversas como congelamiento-
descongelamiento desecacioacuten y bajo pH (por ejemplo el de los jugos gaacutestricos) Los
quistes tisulares son redondeados de pared elaacutestica miden de 10 a 200 μm y pueden
contener hasta 3000 paraacutesitos denominados bradizoiacutetos Estas formas no son afectadas
por Acs ni faacutermacos pero pueden ser destruidos por calentamiento congelamiento-
descongelamiento y por desecacioacuten Cuando estos quistes son ingeridos los bradizoiacutetos
resistentes son liberados por la accioacuten gaacutestrica y pueden invadir la mucosa
gastrointestinal Los ooquistes son estructuras ovoides de 10 a 12 μm de diaacutemetro y son
eliminadas en la materia fecal del gato Recieacuten emitidos no son infectivos pero bajo
condiciones de temperatura humedad y presencia de oxiacutegeno esporulan tornaacutendose
Introduccioacuten
3
infectivos y resistentes por maacutes de un antildeo en el suelo y dos antildeos en el agua (Atias
1998 Perotti 2007)
La Fig 21 describe el ciclo de vida del paraacutesito Los uacutenicos hueacutespedes definitivos
conocidos de T gondii son miembros de la familia Felidae (por ejemplo gatos
domeacutesticos) Los ooquistes no esporulados son liberados en las heces del felino Los
ooquistes tardan entre 1 y 5 diacuteas en esporular en el ambiente y volverse infectivos Los
hueacutespedes intermediarios se infectan al ingerir tierra agua o plantas contaminadas con
los ooquistes Los ooquistes se transforman en taquizoiacutetos al breve tiempo de ser
ingeridos Estos taquizoiacutetos se localizan en los tejidos musculares y el sistema nervioso
y evolucionan a bradizoiacutetos formando los quistes tisulares (hiacutesticos) Los felinos se
infectan luego de ingerir la carne de hueacutespedes intermediarios que poseen quistes
tisulares o por ingestioacuten de los ooquistes esporulados Los animales de caza y los
criados para consumo humano tambieacuten pueden infectarse por ingestioacuten de ooquistes
esporulados En el hueacutesped humano los paraacutesitos forman quistes en los tejidos y suele
encontrarse generalmente en el muacutesculo esqueleacutetico el miocardio cerebro y ojos donde
pueden permanecer durante toda la vida del hueacutesped (Paacutegina web del CDC)
Figura 21 Ciclo de vida de T gondii El hueacutesped definitivo son miembros de la familia Felidae los
demaacutes hueacutespedes (incluido el hombre) se infectan accidentalmente y no son necesarios para completar el
ciclo de vida del paraacutesito Adaptado de httpwwwdpdcdcgovdpdxHTMLToxoplasmosishtm
Introduccioacuten
4
213 Diagnoacutestico
Puesto que las infecciones por T gondii en individuos inmunocompetentes son por
lo general asintomaacuteticas o presentan siacutentomas imperceptibles su diagnoacutestico se basa
principalmente en pruebas de laboratorio La toxoplasmosis no suele generar
complicaciones excepto en 2 situaciones cuando se infectan individuos
inmunodeprimidos y cuando se infectan por primera vez mujeres embarazadas En este
uacuteltimo caso el paraacutesito puede infectar al feto atravesando la placenta y generando la
infeccioacuten congeacutenita Las probabilidades de dantildear al feto o al nintildeo luego de nacer
dependeraacuten del trimestre en que suceda la infeccioacuten (Atias 1998 Martiacuten-Hernaacutendez
2005) Tanto en inmunocomprometidos como en el recieacuten nacido la infeccioacuten puede
producir graves consecuencias Es por ello que en estos casos asiacute como en la
embarazada el diagnoacutestico cobra particular relevancia (Remington y col 1995)
2131 Meacutetodos de diagnoacutestico
La infeccioacuten puede diagnosticarse por meacutetodos directos que consisten en la
identificacioacuten de las estructuras parasitarias (por un estudio histopatoloacutegico para lo cual
es necesario realizar biopsias puncioacuten de ganglios o cortes histoloacutegicos) o la
identificacioacuten de ADN del paraacutesito (a traveacutes de una reaccioacuten en cadena de la
polimerasa PCR) Tambieacuten se pueden realizar cultivos tisulares e inoculacioacuten al
peritoneo de ratoacuten pero este meacutetodo presenta la desventaja de involucrar el manejo de
paraacutesitos vivos y el uso de animales de laboratorio (Perotti 2007)
Los meacutetodos alternativos son las pruebas indirectas a saber
Intradermoreaccioacuten de Frenkel Evaluacutea la inmunidad celular Es una reaccioacuten
cualitativa tardiacutea y presenta resultado positivo a partir de la cuarta semana de infeccioacuten
aunque se han reportado casos de pacientes en los que llevoacute varios meses hasta dar
positiva Se utiliza con fines epidemioloacutegicos (Jirovec amp Jindrich 1961 Rodriacuteguez
Acar y col 2008)
Reaccioacuten de Sabiacuten Feldman o dye test con azul de metileno (DT) Es el meacutetodo
de referencia de la OMS Evaluacutea la inmunidad humoral y mide la cantidad total de Acs
que es capaz de destruir taquizoiacutetos viacutea activacioacuten del complemento Es un meacutetodo
cuantitativo y presenta valores positivos a partir de la primera o segunda semana de
infeccioacuten Tiene la desventaja de requerir taquizoiacutetos vivos y animales para su cultivo
por lo que soacutelo laboratorios de referencia llevan adelante este meacutetodo (Perotti 2007
Durlach y col 2008)
Introduccioacuten
5
Reaccioacuten de inmunofluorescencia indirecta (IFI) Evaluacutea la cantidad de Acs que
se unen a toxoplasmas inactivados La reaccioacuten se evidencia con Acs anti-IgG humana
marcados con isocianato de fluoresceiacutena y observando al microscopio de fluorescencia
Si bien no se trabaja con organismos vivos la necesidad de un microscopio de
fluorescencia y la subjetividad del operador limitan el uso de este meacutetodo Se han
informado resultados falso-positivos debidos a Acs anti-nucleares (Durlach y col
2008)
Aglutinacioacuten directa (AD) En este ensayo se produce una aglutinacioacuten visible con
toxoplasmas tratados con formol Se detecta fundamentalmente IgMs especiacuteficas
Hemoaglutinacioacuten indirecta (HAI) Se utilizan antiacutegenos (Angs) de T gondii con
los que se sensibiliza gloacutebulos rojos que en presencia de Acs especiacuteficos producen una
aglutinacioacuten visible como un botoacuten rojo En general es utilizado para determinar
incidencia o seroprevalencia en una regioacuten pero no se recomienda para la deteccioacuten de
la infeccioacuten aguda (Durlach y col 2008)
Fijacioacuten del complemento Se detectan Acs que activan el sistema del
complemento en presencia de Angs de T gondii La reaccioacuten se evidencia con el
sistema hemoliacutetico hemolisina-gloacutebulos rojos de carnero Resultados positivos aparecen
en forma maacutes tardiacutea que en el DT (Perotti 2007)
Western blot Se evaluacutea la presencia de Acs especiacuteficos a Angs que han sido
separados por electroforesis en un gel de poliacrilamida y transferidos a una membrana
Generalmente no es utilizada como teacutecnica de diagnoacutestico debido a su difiacutecil
estandarizacioacuten (Durlach y col 2008)
Prueba de Remington (IgM-IFI) Se sigue el mismo esquema que en IFI pero se
sustituyen el conjugado anti-IgG por uno anti-IgM lo que permite detectar infeccioacuten
aguda Acs anti-nucleares y el factor reumatoide pueden producir resultados falso-
positivos y los Acs tipo IgG pueden producir resultados falso-negativos (Perotti 2007)
Ensayo aglutinante de inmunoabsorcioacuten (ISAGA) Permite la deteccioacuten y dosaje
de Acs IgA IgE IgG e IgM especiacuteficos contra el paraacutesito Este meacutetodo posee mayor
sensibilidad en relacioacuten al IgM-IFI y al ensayo de inmunoadsorcioacuten ligado a enzima
(ELISA) de IgM para la deteccioacuten de infecciones congeacutenitas pero tiene la desventaja
que pueden detectarse IgM especiacuteficas luego de un antildeo de la primoinfeccioacuten Esto
dificulta la interpretacioacuten de un resultado positivo si se desea determinar la antiguumledad
de la infeccioacuten (Durlach y col 2008)
Introduccioacuten
6
Ensayo de inmunoadsorcioacuten ligado a enzima (ELISA) Permite la deteccioacuten de
Acs especiacuteficos contra el paraacutesito Se evidencia la reaccioacuten con una enzima ligada a Acs
o Angs (dependiendo del disentildeo del inmunoensayo ver maacutes adelante en punto 2134)
que transforma un reactivo auxiliar en un producto coloreado o fluorescente Es un
meacutetodo cuantitativo que utiliza un espectrofotoacutemetro o fluoroacutemetro lo que permite
hacer medidas maacutes objetivas y raacutepidas (Perotti 2007) Auacuten asiacute este meacutetodo aplicado a
la deteccioacuten de la toxoplasmosis de fase aguda carece de una estandarizacioacuten confiable
principalmente en la preparacioacuten del Ang
2132 Importancia del correcto diagnoacutestico en la embarazada
A pesar de toda la bateriacutea de ensayos arriba descritos disponibles para el
diagnoacutestico de la toxoplasmosis el de la infeccioacuten aguda en la mujer embarazada sigue
siendo problemaacutetico porque este diagnoacutestico se deduce a partir de los datos de las
concentraciones relativas de los distintos isotipos de las inmunoglobulinas especiacuteficas
En efecto la existencia y concentracioacuten de IgM IgA e IgG especiacuteficas contra T gondii
es muy dependiente de la respuesta inmune del individuo infectado Considerando que
el tratamiento para prevenir la transmisioacuten al feto consiste en administrar drogas
antiparasitarias que tienen efectos nocivos sobre el nonato auacuten en estos diacuteas se trabaja
en mejorar este diagnoacutestico ya que no se cuenta con un meacutetodo confiable como para
prevenir por un lado los dantildeos que suelen sufrir los recieacuten nacidos de madres con
primoinfeccioacuten no diagnosticada y por otra parte los efectos perjudiciales en los fetos
de las embarazadas incorrectamente diagnosticadas y medicadas Por ello es que en este
trabajo se intentoacute desarrollar nuevas metodologiacuteas de diagnoacutestico de la infeccioacuten
toxoplaacutesmica aguda utilizando teacutecnicas electroquiacutemicas
2133 Diagnoacutestico en la embarazada
El correcto diagnoacutestico de la infeccioacuten aguda en la embarazada incluye la
utilizacioacuten de teacutecnicas especiacuteficas y sensibles asiacute como tambieacuten la aplicacioacuten de un
esquema de seguimiento adecuado El diagnoacutestico generalmente es realizado por
serologiacutea Para determinar si la paciente cursa una infeccioacuten aguda se determinan los
tiacutetulos de los anticuerpos IgG IgA e IgM (Arcavi y col 1997) y se interpretan prima-
facie seguacuten
1 IgG IgA IgM negativas ausencia de infeccioacuten
2 IgG e IgA positivas IgM negativa infeccioacuten croacutenica
3 IgG IgA e IgM positivas posible infeccioacuten aguda
Introduccioacuten
7
2134 Ensayo de inmunoadsorcioacuten ligado a enzima
Los ensayos del tipo ELISA consisten en la deteccioacuten de un antiacutegeno o un
anticuerpo inmovilizado sobre un soporte soacutelido y mediante anticuerpos que directa o
indirectamente producen una reaccioacuten La prueba recurre al empleo de antiacutegenos o
anticuerpos conjugados a una enzima (marcados) que por reaccioacuten con su sustrato
producen una especie coloreada cuya concentracioacuten puede ser medida
fotomeacutetricamente Este ensayo tiene las ventajas de ser versaacutetil robusto simple en su
realizacioacuten y emplear reactivos relativamente econoacutemicos El uso de una fase soacutelida que
retiene el analito de intereacutes proporciona una elevada sensibilidad mientras que la
elevada especificidad del ensayo viene dada por la gran selectividad de los anticuerpos
por su antiacutegeno Las configuraciones maacutes sencillas para estos ensayos son el directo y el
indirecto ambas esquematizadas en la Fig 22
Antiacutegeno IgG conjugada a enzima
Bloqueante IgG humana Reactivo de color
Directo Indirecto
Figura 22 Esquemas que representan los ELISA directo (izquierda) e indirecto (derecha)
21341 Esquema de captura o tipo ldquoSandwichrdquo
Cuando los anticuerpos que desean detectarse son del isotipo IgM suele tenerse el
inconveniente que el isotipo IgG frecuentemente estaacute en mayor concentracioacuten que el
IgM y presenta una mayor afinidad por el antiacutegeno Por lo tanto las IgG suelen
dificultar la deteccioacuten de las IgM en suero cuando se sigue un esquema de ELISA
indirecto con anticuerpos anti-IgM humana (Ac-a-IgMh) marcados Es por esto que
suele optarse por un esquema de captura o tipo saacutendwich en el cual se aumenta la
sensibilidad del ensayo incorporando un eslaboacuten maacutes en el inmunocomplejo adsorbido
En este trabajo se ensayaron dos alternativas de captura o tipo saacutendwich En la
primera alternativa que sigue un esquema claacutesico (A) se adsorbieron los Ac-a-IgMh
Introduccioacuten
8
sobre la superficie de la placa de poliestireno Las placas asiacute sensibilizadas se
enfrentaron al suero a ensayar capturando selectivamente una porcioacuten de las IgM de la
muestra Luego se los enfrentoacute al antiacutegeno de intereacutes ligado a biotina que se une a las
IgMh especiacuteficas para dicho Ang previamente capturado Finalmente se buscoacute revelar
con enzima peroxidasa de raacutebano picante (HRP) conjugada a streptavidina esta uacuteltima
forma un complejo estable con biotina De esta forma se aumenta la cantidad de Ac que
se desean detectar adsorbido sobre la placa seleccionando el tipo de anticuerpo que se
adsorbe En la Fig 23 se muestra el esquema del ensayo tipo A
IgM Antiacutegeno ligado a biotina streptavidina conjugada a HRP
Bloqueante IgG anti-IgM Reactivo de color
Figura 23 Esquema de ensayo ELISA tipo captura claacutesico A Un anticuerpo anti IgMh captura una
porcioacuten de las IgM presentes en el suero humano una porcioacuten de estas IgM capturadas son especiacuteficas
para antiacutegeno de T gondii y se revela su presencia por medio del antiacutegeno recombinante ligado a biotina
streptavidina ligada a HRP adicionando el sustrato de la enzima y un cromoacutegeno actuando como
cosustrato
La segunda alternativa que denominamos tipo B sale del esquema tradicional de
los ELISA Se adsorbe el antiacutegeno recombinante sobre la superficie de la placa de
poliestireno enfrentaacutendola luego al suero a ensayar Asiacute se captura selectivamente las
inmunoglobulinas que reconocen al antiacutegeno Luego se expone la placa al mismo
antiacutegeno recombinante pero ligado a biotina que se uniraacute a los anticuerpos especiacuteficos
para dicho Ang previamente capturados Finalmente se revela con HRP conjugada a
streptavidina que forma un complejo estable con biotina De esta forma se aumenta la
cantidad de Ang marcado en mayor proporcioacuten para IgM que para IgG dada la
Introduccioacuten
9
multivalencia de este isotipo de inmunoglobulina En la Fig 24 se muestra el segundo
esquema que fue el que brindoacute los resultados maacutes promisorios
Antiacutegeno (Ang) Bloqueante Ang ligado a biotina Reactivo de color
IgM a-Ang IgG a-Ang streptavidina conjugada a HRP
Figura 24 Esquema de ensayo ELISA de captura tipo B El antiacutegeno expuesto en la placa captura la
porcioacuten de las IgM e IgG especiacuteficas presentes en el suero humano Haciendo uso de la polivalencia de
las IgM su presencia se revela con el antiacutegeno conjugado a biotina streptavidina ligada a HRP
adicionando el sustrato de la enzima y un cromoacutegeno actuando como cosustrato
2135 Obtencioacuten de antiacutegenos para diagnoacutestico
El diagnoacutestico de rutina de la toxoplasmosis se basa en la deteccioacuten seroloacutegica de
anticuerpos en el paciente Los antiacutegenos utilizados en estas pruebas seroloacutegicas son
generalmente proteiacutenas derivadas de ceacutelulas T gondii que se propagan en el ratoacuten o el
cultivo de ceacutelulas El cultivo y el mantenimiento de este paraacutesito es laborioso lento y
caro (Lau amp Fong 2006) El uso de antiacutegenos nativos de taquizoitos es difiacutecil de
estandarizar y con frecuencia produce reacciones positivas falsas (Hiszczyntildeska-Sawicka
y col 2005) Por lo tanto ha habido intentos de producir antiacutegenos a traveacutes de medios
maacutes seguros tales como tecnologiacutea de ADN recombinante La mayoriacutea de estos
esfuerzos se han centrado en los principales antiacutegenos de superficie del paraacutesito como el
antiacutegeno de superficie 1 (SAG1 del ingleacutes Surface antigen 1) y el antiacutegeno de superficie
2 (SAG2 del ingleacutes Surface antigen 2) (Lau amp Fong 2006) En estudios recientes se ha
estado evaluando que la presencia de IgM e IgG anti P35 seriacutea un mejor indicador de
infeccioacuten reciente que la evaluacioacuten de IgM utilizando taquizoitos enteros en ensayos
del tipo ELISA (Lu y col 2006) En efecto con la nueva tecnologiacutea de ADN
Introduccioacuten
10
recombinante es posible obtener cualquier proteiacutena contaacutendose ademaacutes con ventajas
como la posibilidad de seleccionar porciones especiacuteficas de un Ang para evitar
reacciones inespeciacuteficas ligar distintas porciones que naturalmente corresponden a otras
proteiacutenas para aumentar la sensibilidad del ensayo agregar secuencias aminoaciacutedicas
que faciliten la posterior purificacioacuten y estandarizacioacuten de la proteiacutena a utilizar
(Hiszczyntildeska-Sawicka y col 2005) A la postre todo el proceso resulta maacutes
econoacutemico seguro y confiable que la purificacioacuten de Angs a partir del microorganismo
nativo puesto que no requiere la manipulacioacuten de microorganismos patoacutegenos ya que
la expresioacuten de las proteiacutenas recombinantes se lleva adelante en microorganismos no
infectivos de raacutepido crecimiento (Babaie y col 2013)
Por lo arriba expresado debe seguirse un esquema para seleccionar cuales deben de
ser las proteiacutenas que conviene utilizar acorde al diagnoacutestico que se pretende abordar y
ello demanda un trabajo racional de seleccioacuten de antiacutegenos generalmente
inmunodominantes No obstante escoger tales proteiacutenas no es tarea sencilla por cuanto
la verificacioacuten del grado de bondad del Ang seleccionado exige una ardua tarea
experimental siendo conveniente acotar el nuacutemero de Angs alternativos a evaluar Un
modo de encarar esto es procurar predecir el grado de antigenicidad en base a la
secuencia aminoaciacutedica lo cual puede realizarse computacionalmente
214 Prediccioacuten de epiacutetopes reconocidos por ceacutelulas B
Los programas de prediccioacuten definen el grado de antigenicidad por medio de una
puntuacioacuten (score) en algunos casos para cada epiacutetope y en otros para cada residuo
amino aciacutedico En este uacuteltimo se puede definir una regioacuten antigeacutenica cuando varios
residuos con alta puntuacioacuten son adyacentes en la estructura primaria Por otra parte el
nuacutemero de epiacutetopes o regiones antigeacutenicas que los programas de prediccioacuten encuentran
depende de un umbral que es configurado por el usuario
En la actualidad los inmunoensayos para determinar anticuerpos son realizados
utilizando regiones antigeacutenicas definidas ya sea como moleacuteculas uacutenicas mezcla de
varios componentes o como antiacutegenos de fusioacuten multiepiacutetope (Camussone 2009) El
desarrollo de herramientas informaacuteticas para predecir de forma fiable la antigenicidad
de los epiacutetopes puede reducir el costoso y prolongado trabajo experimental requerido
para identificar las regiones de intereacutes (Namrata amp Rajat 2010) Al momento de
identificar estas regiones antigeacutenicas suele contarse soacutelo con la estructura primaria de
las proteiacutenas en estudio desconocieacutendose su estructura terciaria en la mayoriacutea de los
Introduccioacuten
11
casos De aquiacute que la prediccioacuten de epiacutetopes lineales es el meacutetodo maacutes utilizado para
seleccionar epiacutetopes putativos
Desde el informe inicial de Hopp y Woods en 1981 (Hopp amp Woods 1981) varios
procedimientos se han hecho populares para detectar epiacutetopes lineales reconocidos por
ceacutelulas B a partir de la estructura primaria de una proteiacutena El rendimiento de estos
programas auacuten no ha logrado una eficiencia oacuteptima seguacuten lo declarado por sus propios
autores (Kolaskar amp Tongaonkar 1990 Saha y col 2005 Saha amp Raghava 2006
Larsen y col 2006 Davydov amp Tonevitskii 2009)
La literatura sobre las aplicaciones de estos programas estaacute orientada
principalmente a identificar posibles vacunas (Namrata amp Rajat 2010) Por lo tanto la
sensibilidad (probabilidad de obtener un positivo entre los verdaderos positivos) y la
especificidad (probabilidad de obtener un negativo entre aquellos negativos verdaderos)
son los indicadores maacutes utilizados para evaluar la calidad de estos programas ya que un
uacutenico epiacutetope puede ser crucial para lograr una respuesta inmunoprotectora Al mismo
tiempo suele omitirse el valor predictivo positivo (VPP) que es la proporcioacuten de
muestras que dan positivo el ensayo siendo verdaderos positivos o sea es la capacidad
para encontrar los epiacutetopes reales de una proteiacutena (ver el recuadro 1) Sin embargo la
fiabilidad del epiacutetope predicho es maacutes importante que su sensibilidad para reducir el
nuacutemero de experimentos confirmatorios de su utilidad diagnoacutestica Es entonces
importante diferenciar ambos paraacutemetros ya que los programas de prediccioacuten pueden
realizar predicciones de baja sensibilidad pero al mismo tiempo si los epiacutetopes reales
fueron predichos la prediccioacuten presenta un alto VPP
Recuadro 1
Los casos posibles en un ensayo son
Verdaderos
positivos
Verdaderos
negativos
Ensayo
positivo A B
Ensayo
negativo C D
BA
A positivo predictivoValor
DB
D dadEspecifici
CA
A adSensibilid
Introduccioacuten
12
La falta de estudios comparativos entre los programas de prediccioacuten en la literatura
actual impide que los usuarios hagan la mejor eleccioacuten Por ello como trabajo inicial se
intentoacute evaluar los distintos programas disponibles en la red en cuanto a su capacidad
para predecir positivamente epiacutetopes
Introduccioacuten
13
22 Tuberculosis
221 Generalidades
La tuberculosis (TB) humana es una enfermedad infecto-contagiosa causada por la
bacteria Mycobacterium tuberculosis La infeccioacuten por M tuberculosis suele ser
asintomaacutetica en personas sanas dado que su sistema inmune es capaz de controlar la
bacteria No obstante en condiciones de desnutricioacuten o inmunocompromiso la
enfermedad suele ser grave La TB es una enfermedad vinculada a la pobreza que
puede afectar a adultos joacutevenes en edad productiva
La enfermedad se transmite por el aire de una persona a otra a traveacutes de gotiacuteculas
que portan bacterias Cuando una persona con infeccioacuten activa en pulmones o garganta
tose estornuda habla o canta las personas cercanas pueden respirar las bacterias
liberadas e infectarse
La enfermedad suele afectar los pulmones pero tambieacuten puede involucrar otros
oacuterganos como rintildeones columna vertebral y cerebro Los siacutentomas de la TB pulmonar
activa son tos a veces con esputo sanguinolento dolor toraacutecico debilidad peacuterdida de
peso fiebre y sudoracioacuten nocturna Si no se trata adecuadamente puede ser mortal La
mayoriacutea de las muertes por TB se producen en los paiacuteses en viacuteas de desarrollo (Paacutegina
web del CDC b)
La Organizacioacuten Mundial de la Salud (OMS) estima en 2000 millones a los
infectados por M tuberculosis que anualmente hay 9 millones de nuevos infectados y
que mueren casi 2 millones de personas al antildeo por causa de esta enfermedad (Paacutegina
web de la OMS)
222 Mycobacterium tuberculosis
Esta micobacteria tambieacuten conocida como Bacilo de Koch es una bacteria aacutecido-
alcohol resistente frecuentemente incolora y es aeroacutebica estricta Es muy resistente al
friacuteo la congelacioacuten y la desecacioacuten y por el contrario es muy sensible al calor la luz
solar y la luz ultravioleta Su replicacioacuten es muy lenta (una divisioacuten cada 16 a 20 horas)
y ante circunstancias adversas puede entrar en estado latente pudiendo retrasar su
multiplicacioacuten desde algunos diacuteas hasta varios antildeos El reservorio natural de M
tuberculosis es el hombre tanto el individuo infectado asintomaacutetico como el enfermo
con infeccioacuten activa Su clasificacioacuten taxonoacutemica se detalla en la Tabla 22
Introduccioacuten
14
Tabla 22 Ubicacioacuten taxonoacutemica de M tuberculosis
Reino Bacteria
Phylum Actinobacteria
Clase Actinobacteria
Sub-clase Actinobacteridae
Orden Actinomycetales
Sub-orden Corynebacterineae
Familia Mycobacteriaceae
Geacutenero Mycobacterium
Especie tuberculosis
223 Diagnoacutestico
El diagnoacutestico de la infeccioacuten tuberculosa se basa en una serie de estudios que se
inicia con placas radiograacuteficas pulmonares y la prueba de la tuberculina que pone de
manifiesto un estado de hipersensibilidad del hueacutesped frente a proteiacutenas de M
tuberculosis Esta sensibilidad se adquiere o bien por infeccioacuten con el bacilo o por
vacunacioacuten con cepas no infectivas (vacuna BCG) En una segunda etapa la infeccioacuten
activa es confirmada por identificacioacuten del agente etioloacutegico en cultivos obtenidos a
partir de la muestra bioloacutegica remitida al laboratorio Auacuten cuando la conjuncioacuten de los
meacutetodos de anaacutelisis vigentes permite un diagnoacutestico certero de la TB humana es
frecuente que se requiera de un prolongado tiempo de espera hasta la confirmacioacuten de la
infeccioacuten activa por cuanto ello depende del lento proceso de replicacioacuten del bacilo
Esto conlleva que exista potencialidad de contagio a individuos sanos y se comprometa
maacutes la salud del infectado
En los uacuteltimos antildeos se han desarrollado teacutecnicas de deteccioacuten de M tuberculosis
que involucran al bacterioacutefago D29 (en adelante fago) capaz de infectar
especiacuteficamente micobacterias (Park y col 2003 Mc Nerney y col 2004) Esta
metodologiacutea se basa en procesar la muestra del paciente sospechada de contener M
tuberculosis ponerla en contacto con el fago e incubarla para permitir su replicacioacuten
Finalmente se evaluacutea el tiacutetulo de los fagos liberados infectando un cultivo testigo de M
smegmatis (micobacterias de raacutepido crecimiento susceptibles al fago) y contando las
placas de lisis que se obtienen Esta novedosa metodologiacutea si bien indirecta y
preliminar permite reducir considerablemente los tiempos de diagnoacutestico puesto que se
trabaja con especies de crecimiento raacutepido Sin embargo al utilizar el conteo de placas
de lisis como eje central para el diagnoacutestico de infeccioacuten activa se recae en largos
Introduccioacuten
15
periacuteodos de incubaciones que podriacutean evitarse si se contase con otro meacutetodo de evaluar
la integridad celular de M smegmatis
Por lo arriba expuesto es que en este trabajo se intento desarrollar una nueva
metodologiacutea de verificacioacuten de lisis de micobacterias utilizando teacutecnicas
intriacutensecamente raacutepidas como son las electroquiacutemicas que en un futuro podriacutean
facilitar el diagnoacutestico de infeccioacuten tuberculosa
Introduccioacuten
16
23 Biodiesel
El grave impacto de la utilizacioacuten de combustibles derivados del petroacuteleo en el
medio ambiente la limitada disponibilidad de petroacuteleo crudo y sobre todo la
inestabilidad de los mercados del petroacuteleo han estimulado actualmente la propagacioacuten
de combustibles liacutequidos alternativos (Monteiro y col 2008) La organizacioacuten
American Society for Testing and Materials ASTM define biodiesel como una mezcla
de eacutesteres monoalquiacutelicos de aacutecidos grasos de cadena larga derivados de aceites
vegetales o grasas animales (American Society for Testing and Materials paacutegina web)
El biodiesel puro generalmente no se utiliza como combustible sino que suele
encontrase en mezcla con diesel de petroacuteleo El biodiesel es clasificado utilizando la
notacioacuten Bxx donde xx indica el porcentaje en volumen de contenido de biodiesel en el
liacutequido Asiacute B100 es biodiesel puro B50 contiene 50 en volumen de biodiesel B5
contiene 5 en volumen etc Las mezclas comerciales maacutes comunes son B2 B5 y B20
El biodiesel se obtiene a partir de la transesterificacioacuten de gliceroliacutepidos con
alcoholes de cadena corta como el etanol o el metanol siendo el glicerol el principal
subproducto en la elaboracioacuten de este combustible junto a productos menores como
mono y diacil gliceroles o aacutecidos grasos libres La masa de glicerol generada equivale
aproximadamente al 10 en peso del total del combustible producido siendo eacuteste uno
de los contaminantes frecuentes
231 Determinacioacuten de glicerol libre en biodiesel
La presencia de glicerol es indicativa de la calidad del biodiesel transformaacutendose
en un analito de intereacutes para la creciente industria de energiacuteas alternativas a la derivada
del refinamiento del petroacuteleo
Los meacutetodos quiacutemicos maacutes simples para cuantificar glicerol se basan en su
oxidacioacuten a formaldehiacutedo utilizando peryodato Luego el formaldehiacutedo formado se
determina cuantitativamente por diversos meacutetodos ya sea basados en reacciones
especiacuteficas evaluando los productos por diferentes metodologiacuteas o por titulacioacuten con
NaOH valorado (Lapenaite y col 2007)
La norma ASTM-D 6584 establece un meacutetodo basado en cromatografiacutea gaseosa
que permite la determinacioacuten en simultaacuteneo de glicerina libre y total (glicerol maacutes
mono di y trigliceacuteridos) No obstante este procedimiento no es aplicable a los eacutesteres
metiacutelicos de aceites vegetales obtenidos a partir de aceites laacuteuricos tales como aceite de
Introduccioacuten
17
coco o de palma quedando restringido el meacutetodo soacutelo para un grupo de biodiesels
particulares
En cuanto a los meacutetodos cromatograacuteficos tienen la desventaja de ser poco
amigables con el medio ambiente dado el profuso uso de solventes orgaacutenicos que son
potencialmente contaminantes a veces se tornan laboriosos y utilizan instrumental e
insumos caros
Considerando lo expresado arriba en este trabajo se ha planteado cuantificar
glicerol utilizando una metodologiacutea esencialmente econoacutemica simple y no
contaminante como lo son las teacutecnicas electroquiacutemicas convencionales
Introduccioacuten
18
24 Marco teoacuterico de las teacutecnicas electroquiacutemicas utilizadas
Los meacutetodos electroquiacutemicos de anaacutelisis estudian el analito de intereacutes mediante la
medicioacuten de los paraacutemetros fiacutesicos como potencial eleacutectrico yo corriente en una celda
electroquiacutemica El proceso fundamental en las teacutecnicas electroquiacutemicas es la
transferencia de electrones entre especies redox y la superficie del electrodo (Bard amp
Faulkner 2001) Este puede describirse con la siguiente reaccioacuten
O + ne- R [21]
Para reacciones reversibles y raacutepidas el potencial sigue la ley de Nernst
[22]
siendo y las actividades de las especies reducida y oxidada en la interfaz
electrodosolucioacuten respectivamente
La corriente que circula por la celda es la carga transportada por unidad de tiempo y
puede expresarse como
[23]
De acuerdo a las leyes de Faraday la carga circulante (Q) es proporcional a los
moles de especie reducida u oxidada (N) El factor de proporcionalidad es la carga del
electroacuten (n) por la constante de Faraday (F)
[24]
Combinando las Ecs 23 y 24 obtenemos
[25]
A medida que avanza la reaccioacuten se consume la especie electroactiva esto
produce un gradiente de concentracioacuten entre el seno de la solucioacuten y las inmediaciones
del electrodo donde la especie es electrotransformada y consecuentemente asociado se
Introduccioacuten
19
generaraacute un transporte de masa por difusioacuten Si el proceso estaacute bajo control difusional
la primera ley de Fick permite describir el flujo de partiacuteculas en funcioacuten de la posicioacuten
ec 26 y la segunda ley de Fick lo describe en funcioacuten de la variacioacuten de la
concentracioacuten de la especie electroactiva en funcioacuten del tiempo ec 27
[26]
[27]
donde D es el coeficiente de difusioacuten de la especie en estudio El gradiente de
concentracioacuten se generaraacute soacutelo para la especie electroactiva que se transforma en la
superficie del electrodo y su transporte de masa se verificaraacute en direccioacuten ndashx es decir
hacia el electrodo si se define x = 0 en la superficie Luego considerando la reaccioacuten de
reduccioacuten ec 21 el flujo J corresponderaacute al nuacutemero de partiacuteculas de O que cambian de
posicioacuten en direccioacuten -x con el tiempo por unidad de aacuterea y puede expresarse como
[28]
Combinando las ecs 26 27 y 28 obtenemos la expresioacuten combinada de las leyes
de Fick para una especie que estaacute reaccionando sobre un electrodo de aacuterea A
[29]
o directamente
[210]
Reemplazando en la ec 25 obtenemos una expresioacuten para la corriente (I) que
circula por la celda en la que se lleva a cabo la reaccioacuten ec 21 sobre un electrodo
uniformemente accesible de aacuterea A y cuando el transporte de masa es exclusivamente
controlado por difusioacuten
[211]
expresioacuten que indica que la corriente es directamente proporcional al gradiente de
concentracioacuten generado por efecto de la reaccioacuten electroacutedica
Introduccioacuten
20
Para un sistema en estado estacionario en el cual la velocidad de transformacioacuten de
la especie electroactiva es igual a la de transferencia de masa y suponiendo que la
reaccioacuten cumple las condiciones de rapidez y reversibilidad (Ec de Nernst) podemos
llegar a describir la relacioacuten entre la corriente circulante por la celda y el potencial al
cual se lleva adelante la reaccioacuten por
[212]
donde KR y KO son constantes que dependen del aacuterea del electrodo de trabajo y los
coeficientes de difusioacuten de las especies reducida y oxidada respectivamente e Il es la
corriente liacutemite
Se define como potencial de media onda al potencial al cual el valor de corriente es
la mitad del valor de corriente liacutemite y queda expresado por la siguiente ecuacioacuten
[213]
Tomando esta definicioacuten y operando en la ec 212 se arriba a la expresioacuten que
describe la corriente como funcioacuten del potencial de electrodo
ndash [214]
ecuacioacuten que corresponde a una funcioacuten sigmoidea por lo tanto al realizar un barrido
de potencial desde un potencial al cual no existe reaccioacuten electroacutedica hacia un potencial
al cual es posible reducir la especie electroactiva hasta alcanzar el estado estacionario la
corriente variaraacute con el potencial siguiendo la forma de una curva sigmoidea
Durante la ejecucioacuten del presente trabajo se utilizaron diversas teacutecnicas
voltamperomeacutetricas cronoamperometriacutea voltametriacutea de barrido lineal voltametriacutea
ciacuteclica y voltametriacutea de onda cuadrada Se pasa a comentar brevemente cada una de
ellas
241 Cronoampreometriacutea
En esta teacutecnica se estudia como variacutea la corriente que circula por la celda en
funcioacuten del tiempo transcurrido mientras el electrodo de trabajo es sometido a un
Introduccioacuten
21
determinado potencial Al aplicar un pulso de potencial se modifica el equilibrio de la
reaccioacuten redox ec 21 se pasa de un potencial inicial donde no ocurre reaccioacuten
electroacutedica a un potencial donde las especies pueden intercambiar electrones en la
interfaz electrodosolucioacuten favoreciendo la reaccioacuten en uno u otro sentido dependiendo
del potencial aplicado Esto da lugar a una corriente liacutemite difusional que variacutea en
funcioacuten del tiempo Para un electrodo uniformemente accesible esta corriente estaacute
descripta por la ec 211 Fijando las condiciones de contorno correspondientes al
experimento en cuestioacuten
t = 0 C0 = Cinfin (no hay reaccioacuten en el electrodo)
t ge0 lim C = Cinfin
t ge0 C0 = 0
donde C0 y Cinfin son las concentraciones de la especie electroactiva en la interfaz
electrodosolucioacuten y en el seno de la solucioacuten respectivamente Es posible entonces
resolver la ecuacioacuten diferencial de la segunda ley de Fick donde la solucioacuten viene dada
por la denominada ecuacioacuten de Cottrell
[215]
donde Id(t) es la corriente controlada por difusioacuten
En este trabajo se utilizoacute esta teacutecnica porque permite cuantificar glicerol utilizando
diferentes electrodos de trabajo seguacuten el medio especiacutefico donde se encuentre disuelto
242 Teacutecnicas voltameacutetricas
Todas las teacutecnicas voltameacutetricas tienen en comuacuten que el potencial eleacutectrico al que
se somete el electrodo de trabajo variacutea en funcioacuten del tiempo En todos los casos se
realiza un barrido lineal de potencial que va desde el potencial inicial (Ei) hasta un
potencial final (Ef) Este barrido se realiza a una velocidad constante que es el cociente
entre el salto (discreto) de potencial y el tiempo de duracioacuten de ese salto La forma en
que se realiza el barrido de potencial es lo que diferencia a una teacutecnica voltameacutetrica de
otra
Introduccioacuten
22
2421 Voltametriacutea de barrido lineal
En esta teacutecnica se realiza un barrido desde un potencial inicial (Ei) al cual no existe
proceso de transferencia de electrones en la interfaz electrodosolucioacuten y soacutelo podraacute
apreciarse corriente debida a procesos no faraacutedicos hasta un potencial final (Ef) En la
medida que el potencial aumenta alcanza un valor al cual ocurre la reaccioacuten electroacutedica
comenzando un flujo de carga debido a procesos faraacutedicos En la Fig 25 se muestra el
perfil del potencial en funcioacuten del tiempo utilizando el modo normal (en peldantildeos) para
el caso de los experimentos realizados con el instrumento utilizado en el presente
trabajo (Eco Chemie 2000)
Figura 25 Perfil de potencial en funcioacuten del tiempo Si bien el potencial es una variable continua un
potenciostato real solo puede establecer variaciones discretas de potencial de aquiacute que en lugar de
observar una ―rampa se observe una escalera
Para una reaccioacuten de reduccioacuten reversible ec 21 a medida que el potencial
aumenta se incrementaraacute la corriente siguiendo la forma de una sigmoidea (seguacuten la ec
21) Sin embargo cuando la velocidad de transporte de masa por difusioacuten de la especie
O sea menor que la velocidad de consumo por la reaccioacuten electroacutedica no seraacute posible
alcanzar el estado estacionario y la corriente llegaraacute a un maacuteximo Ip De aquiacute en maacutes la
corriente comenzaraacute a decaer con t12
tal como lo describe la ecuacioacuten de Cottrell ec
215 En la Fig 26 se muestra el perfil de corriente que se obtienen en experimentos
voltameacutetricos claacutesicos
t
Salto de potencial
Duracioacuten del salto
E
Introduccioacuten
23
Figura 26 Perfiles de corriente en funcioacuten del potencial para experimentos voltameacutetricos de barrido
lineal Liacutenea azul la velocidad de barrido es lo suficientemente baja establecieacutendose un estado
estacionario Liacuteneas verde negra y roja la velocidad de barrido es alta y se origina un pico de corriente
La corriente de pico crece proporcionalmente a la raiacutez cuadrada de la velocidad de barrido
El maacuteximo de corriente tambieacuten denominado corriente de pico se puede obtener a
partir de la ecuacioacuten de Randles-Sevcik (Bard amp Faulkner 2001)
[216]
siendo la temperatura 25 degC y donde A estaacute en cm2 D en cm
2 s
-1 C en mol cm
-3 y en
V s-1
2422 Voltametriacutea ciacuteclica
En esta teacutecnica se realiza un barrido desde un potencial inicial (Ei) a un primer
veacutertice de potencial (Ev1) y a partir de alliacute se invierte la direccioacuten de barrido hasta
llegar a un segundo veacutertice de potencial (Ev2) el cual puede coincidir con el Ei El perfil
de potencial en funcioacuten del tiempo que se obtiene utilizando el instrumento con el que
se trabajoacute y de acuerdo a lo indicado por el fabricante se esquematiza en la Fig 27
(izquierda) y el perfil de corriente en funcioacuten del potencial para una reaccioacuten reversible
se esquematiza en la Fig 27 (derecha)
Idif
IP
Introduccioacuten
24
Fig 27 Perfil de potencial en funcioacuten del tiempo (izquierda) Perfil de corriente en funcioacuten del
potencial para una reaccioacuten redox reversible (derecha)
En este trabajo se realizaron experimentos de voltametriacutea ciacuteclica para identificar la
presencia de mediadores redox que presentando reacciones electroacutedicas reversibles
permitieran la regeneracioacuten del cofactor de la enzima glicerol deshidrogenasa (GlDH)
Esta teacutecnica tambieacuten se utilizoacute para calcular las aacutereas de los electrodos de trabajo de
modo tal de normalizar la sentildeal obtenida con la superficie del electrodo utilizado
Ademaacutes se utilizoacute para cuantificar glicerol e identificar los potenciales de oxidacioacuten del
mismo
243 Teacutecnicas de pulso
Las teacutecnicas de pulso surgieron vinculadas a la polarografiacutea de corriente continua
la teacutecnica voltameacutetrica cuya particularidad es utilizar un electrodo de goteo de mercurio
Este grupo de teacutecnicas se ha ido diversificando a medida que se fueron haciendo maacutes
complejos tanto los esquemas de potenciales aplicados a los electrodos de trabajo
como las medidas de intensidades de corrientes (Bard amp Faulkner 2001)
2431 Voltamperometriacutea onda cuadrada VOC
Esta teacutecnica tiene varias ventajas entre las que se encuentran su excelente
sensibilidad (se han registrado liacutemites de deteccioacuten directa del orden de 10-8
M) la
eliminacioacuten de las corrientes de fondo y la rapidez con que se lleva a cabo el
experimento completo ya que se puede trabajar a velocidades de barrido de potencial
auacuten superiores a 1 V s-1
(Bard amp Faulkner 2001)
El perfil de potencial aplicado al electrodo de trabajo en funcioacuten del tiempo en la
VOC se presenta en la Fig 28 Consta de una onda cuadrada simeacutetrica con una
amplitud Ep superpuesta a una escalera de potencial con escalones o saltos de
potencial Es (Fig29) donde el pulso hacia adelante de la onda cuadrada coincide con
el escaloacuten de potencial de la escalera
E
I
Introduccioacuten
25
La utilizacioacuten de la teacutecnicas voltamperomeacutetricas de pulso presentan la ventaja de
permitir realizar un barrido de potencial donde la especie electroactiva se oxida
raacutepidamente produciendo una sentildeal analiacutetica No es necesario trabajar durante periacuteodos
prolongados de tiempo a los elevados potenciales donde se establece la corriente liacutemite
controlada por difusioacuten como lo requiere la teacutecnica amperomeacutetrica
Figura 28 Perfil de potencial aplicado al electrodo de trabajo en la VOC en funcioacuten del tiempo En
liacutenea cortada se indica cual es la escalera de potencial a la cual se le sobreimprime la onda cuadrada Se
indican resaltados ( ) los tiempos durante los que se realizan las lecturas de corriente En un ciclo se
realizan las lecturas de corrientes alta y baja Adaptado de Bard amp Faulkner 2001
Figura 29 a) Onda cuadrada simeacutetrica b) Perfil de potencial en funcioacuten del tiempo de una escalera
de potencial
a)
b)
E
E
E
t
Amplitud de la
onda cuadrada EP
Periacuteodo de la onda
Salto o escaloacuten
de potencial ES
Medida
alta
Medida
baja
t
Salto o escaloacuten
de potencial ES
t
Amplitud de la
onda cuadrada
EP
Periacuteodo de la onda
Introduccioacuten
26
El potensiostato registra la corriente durante la medida alta y la medida baja de un
ciclo La diferencia de estas corrientes es la corriente neta Ineta que se grafica en
funcioacuten del potencial de la escalera de potencial correspondiente a ese ciclo (liacutenea
cortada Fig 28) Para sistemas reversibles se obtiene una curva como se observa en la
Fig 210 donde se indican las corrientes de la medida alta de la medida baja y neta
que resulta en un pico de corriente La corriente de pico neta IP n observada en la VOC
es proporcional a la concentracioacuten de la especie electroactiva en el seno de la solucioacuten y
se centra alredewdor del potencial de la cupla redox
Figura 210 Voltamperograma de onda cuadrada tiacutepico para un sistema reversible la corriente neta
Ineta se obtiene por la diferencia entre la corriente registrada al finalizar el pulso I medida alta y la
corriente registrada previamente al nuevo pulso I medida baja
La frecuencia ( f ) de la onda cuadrada medida en Hz se define como
1f [217]
Siendo el periacuteodo de la onda cuadrada medido en segundos que a su vez es dos
veces el tiempo del pulso Pt por lo tanto tenemos que
P2
1
tf [218]
Luego
ft
2
1P [219]
Los valores de frecuencia pueden variar desde unos pocos Hz hasta varios miles
dependiendo de las condiciones particulares del caso La velocidad de barrido v queda
definida como el producto del salto de potencial ES por la frecuencia f
fSEv [220]
Introduccioacuten
27
Las velocidades de barrido en los experimentos de VOC se obtienen modificando la
frecuencia de la onda cuadrada ya que el salto de potencial suele ser un valor fijo
Se demostroacute que para cuplas redox controladas por difusioacuten los paraacutemetros de la
VOC maacutes adecuados son E = 50n mV y Es = 10n mV (Osteryoung y Osteryoung
1985)
Cuando se aplica un pulso de potencial en las cercaniacuteas del potencial de la cupla
redox las corrientes faradaicas aumentan significativamente conforme se oxida o se
reduce la especie electroactiva Estas corrientes decaen con el tiempo seguacuten la ecuacioacuten
de Cottrel ya expresada anteriormente como ec [215]
Si consideramos t como tP se observa que la disminucioacuten del tiempo del pulso
implica mayor corriente Luego a medida que se aumenta la frecuencia aumenta la
velocidad de barrido y disminuye el tiempo del pulso Para sistemas reversibles se
predice que la intensidad tiene una dependencia lineal con la raiacutez cuadrada de la
frecuencia (Osteryoung y Osteryoung 1985)
21 fBAnIp [221]
La eleccioacuten de la frecuencia adecuada es de suma importancia A frecuencias muy
altas aumentan significativamente las corrientes capacitivas perdiendose resolucioacuten lo
que impone un liacutemite al aumento de la frecuencia
25 Biosensores
En muchas determinaciones de analitos en muestras bioloacutegicas se necesitan pasos
previos a la evaluacioacuten propiamente dicha que permiten eliminar o enmascarar las
potenciales interferencias Sin embargo el pretratamiento de la muestra puede llevar a
una disminucioacuten de la concentracioacuten del analito ya sea por peacuterdidas en las etapas
consecutivas del anaacutelisis o por transformacioacuten del analito provocando errores por
defecto en la determinacioacuten (Lagier amp Verdini 2000) Cuando la evaluacioacuten de la
concentracioacuten del analito se utiliza con fines cliacutenicos tal resultado erroacuteneo puede
conducir a un diagnoacutestico incorrecto Es por ello que en la actualidad el desarrollo de
nuevas metodologiacuteas analiacuteticas tiende no soacutelo a acortar los tiempos de anaacutelisis
previnieacutendose asiacute las peacuterdidas por degradacioacuten del analito sino que ademaacutes procura
permitir la ejecucioacuten del anaacutelisis sin pasos separativos previos
En los uacuteltimos antildeos se ha avanzado en el desarrollo de biosensores ya que estos
dispositivos presentan ventajosas caracteriacutesticas que los convierten en herramientas
Introduccioacuten
28
prometedoras de anaacutelisis (Belluzo y col 2008) Los biosensores se pueden definir como
dispositivos analiacuteticos compuestos por dos componentes principales
1- Una superficie selectiva denominada bioreceptor o superficie bioreactiva (SBR)
generalmente de origen bioloacutegico o sinteacutetica biomimeacutetica la cual en contacto con la
muestra es capaz de interaccionar de manera especiacutefica con el analito (Vo-Dinh amp
Allain 2003) Este elemento es el que aporta la especificidad del dispositivo
2- Un transductor fiacutesico-quiacutemico encargado de producir una sentildeal que es funcioacuten
de la interaccioacuten entre el analito y la SBR (Vo-Dinh amp Allain 2003) Eacuteste es el
elemento que aporta la sensibilidad al dispositivo
Los biosensores pueden ser clasificados de acuerdo a la sentildeal fiacutesico-quiacutemica que
produce el transductor de acuerdo a
Sentildeal Biosensor
Cambio de temperatura Termomeacutetrico
Cambio en paraacutemetro eleacutectrico Electroquiacutemico
Cambio en propiedades de la luz Oacuteptico
Cambio de masa Piezoeleacutectrico Acuacutestico
(Adaptado de Vo-Dinh amp Allain 2003)
De los distintos tipos de biosensores los electroquiacutemicos han sido tradicionalmente
los maacutes desarrollados y usados debido a sus ventajas con respecto a otros biosensores
tales como la generacioacuten de una respuesta electroacutenica directa que permite una raacutepida
respuesta mayor simplicidad operativa versatilidad para la miniaturizacioacuten y bajo
costo Actualmente gracias al avance de la tecnologiacutea de los semiconductores y la
serigrafiacutea pueden ser producidos masivamente Dependiendo del paraacutemetro fiacutesico
medido por el detector los biosensores electroquiacutemicos pueden a su vez subdividirse en
conductimeacutetricos potenciomeacutetricos y amperomeacutetricos (Vo-Dinh amp Allain 2003)
251 Superficie de bioreconocimiento en biosensores
La SBR es un sistema bioloacutegico o biomimeacutetico que reacciona bioquiacutemica o
quiacutemicamente con el analito En la actualidad existe una gran diversidad de elementos
bioloacutegicos o derivados de ellos que son utilizados como SBR
Los mismos van desde moleacuteculas simples a sistemas complejos (Vo-Dinh amp Allain
2003) Asiacute la SBR puede contener antiacutegenos anticuerpos aacutecidos desoxiribonucleicos
(ADN) aacutecidos ribonueleicos (ARN) enzimas receptores de membrana tejidos
Introduccioacuten
29
microorganismos completos o compuestos sintetizados ―ad-hoc que emulan especies
bioloacutegicas como pueden ser estructuras biomimeacuteticas y poliacutemeros molecularmente
impresos (Vo-Dinh amp Allain 2003)
252 Biosensores amperomeacutetricos
De los biosensores electroquiacutemicos los amperomeacutetricos suelen presentar mayores
sensibilidades (Iost y col 2011)
En la Fig 211 se esquematiza un biosensor amperomeacutetrico El analito presente en
la muestra compleja reacciona selectivamente con la SBR lo que desencadena la sentildeal
analiacutetica en el transductor fiacutesico-quiacutemico
En este caso particular el transductor es un electrodo de trabajo que integra una
celda de tres electrodos El mismo estaacute sometido a un potencial eleacutectrico (con respecto a
un electrodo de referencia) y la sentildeal analiacutetica es la corriente eleacutectrica que circula por la
celda utilizando un contraelectrodo de gran aacuterea En estas condiciones la maacutexima
intensidad de corriente eleacutectrica que se observa estaacute limitada exclusivamente por la
reaccioacuten de oacutexido-reduccioacuten que ocurre en la superficie del electrodo de trabajo
Figura 211 El electrodo de trabajo es sometido a un potencial eleacutectrico en su superficie tiene lugar
la reaccioacuten de oacutexido-reduccioacuten Dicha reaccioacuten ocurre o no o bien transcurre a velocidades diferentes en
presencia o ausencia del analito de intereacutes
253 Biosensores de uso cliacutenico
En el caso de muestras para el diagnoacutestico cliacutenico de infecciones el analito a
determinar puede ser alguna de las moleacuteculas generadas por el individuo infectado
como respuesta a la presencia del agente infeccioso por ej los anticuerpos (Acs)
especiacuteficos o el agente infeccioso iacutentegro o partes del mismo En muchos casos la sola
presencia de Acs especiacuteficos es por siacute misma indicativa de infeccioacuten Hay casos en que
Introduccioacuten
30
la presencia de Acs no es per-seacute indicativa de infeccioacuten riesgosa Dos ejemplos de esta
situacioacuten son el de la toxoplasmosis y la tuberculosis
En el caso de la toxoplasmosis la deteccioacuten de Acs anti-T gondii es soacutelo de
trascendental importancia en embarazadas porque si la infeccioacuten ha sido adquirida
durante el embarazo el feto estaacute en riesgo de contagiarse y puede padecer lesiones
severas (Dunn y col 1999 Montoya amp Liesenfeld 2004) Por el contrario si se trata
de infeccioacuten croacutenica no es necesario exponer a la embarazada (y al feto) a medicacioacuten
innecesaria evitaacutendose con ello los riesgos que devienen del uso de los faacutermacos
especiacuteficos utilizados durante el tratamiento de la infeccioacuten (Freij amp Sever 1999)
Debido a la incertidumbre que acompantildea la deteccioacuten de los anticuerpos hasta hoy
utilizados con este fin se ha propuesto realizar pruebas utilizando antiacutegenos
recombinantes del paraacutesito Se ha evaluado el desempentildeo de antiacutegenos recombinantes
sintetizados por teacutecnicas de biologiacutea molecular en forma individual o mezclados para
evaluar la avidez de Acs IgG (Beghetto y col 2003) Se observoacute que utilizando el
fragmento del antiacutegeno MIC3 en este ensayo los iacutendices de avidez permitieron
determinar la antiguumledad de la infeccioacuten con mayor grado de certeza que empleando
homogenado total de paraacutesito resultando MIC3 un buen marcador para el diagnoacutestico
de infecciones agudas (Beghetto y col 2003) La proteiacutena recombinante P35 tambieacuten
fue propuesta como marcador seroloacutegico para diferenciar infeccioacuten aguda de croacutenica ya
que evidencioacute sensibilidades del 853 para sueros agudos y una especificidad del 98
respecto de sueros croacutenicos (Parmley y col 2000) No obstante y a pesar de haberse
descrito moleacuteculas para el diagnoacutestico de toxoplasmosis aguda no existe un acuerdo
sobre su efectividad por lo que se requiere de la evaluacioacuten de nuevos antiacutegenos para
este fin En general el uso de una sola moleacutecula recombinante no brinda suficiente
sensibilidad habieacutendose demostrado que el empleo de varios antiacutegenos recombinantes
la mejora (Pinon y col 2003) Se ha observado tambieacuten que una mezcla de moleacuteculas
no produce los mismos resultados que cuando se utilizan en forma separada (Silveira y
col 2001) Se ha postulado que esta diferencia se debe a las distintas caracteriacutesticas
fisicoquiacutemicas entre las moleacuteculas de una mezcla que impide la inmovilizacioacuten
homogeacutenea en las superficies de captura utilizadas en los inmunoensayos Por lo tanto
resulta muy factible que un ensayo que utilice una combinacioacuten o fusioacuten en una sola
moleacutecula de estos antiacutegenos recombinantes marcadores de infeccioacuten reciente pueda
mejorar el diagnoacutestico diferencial tal como ha sido demostrado para el diagnoacutestico de
otras infecciones (Camussone y col 2009)
Introduccioacuten
31
En el caso de la tuberculosis la mayoriacutea de los individuos de la poblacioacuten han
recibido la vacunacioacuten reglamentaria por inoculacioacuten de una cepa de micobacterias
inofensivas generando Acs anti-Mycobacterium tuberculosis (M tuberculosis) Por
ello estos Acs suelen estar presentes en casi toda la poblacioacuten De aquiacute que la deteccioacuten
de Acs anti-M tuberculosis no demuestra infeccioacuten activa de riesgo Por tal motivo el
indicador por excelencia de infeccioacuten activa es la evidenciacioacuten del patoacutegeno en la
muestra No obstante las muestras suelen poseer una extremadamente baja cantidad de
M tuberculosis lo que dificulta su deteccioacuten directa Por ello es preciso utilizar alguacuten
paso amplificador del analito a censar Dado el largo tiempo de replicacioacuten del
microorganismo los cultivos realizados para su replicacioacuten insumen periacuteodos
prolongados Siguiendo los trabajos de Park y col y McNerney y col (Park y col
2003 McNerney y col 2004) se formuloacute la siguiente hipoacutetesis de trabajo Sistemas
enzimaacuteticos presentes en M smegmatis permitiriacutean metabolizar sustratos electroactivos
a distintas velocidades de reaccioacuten dependiendo de la integridad del microorganismo
Siendo este el caso seriacutea posible distinguir entre cultivos de M smegmatis que han sido
lisados por el fago especiacutefico D29 de aquellos cultivos en que dichas micobacterias
estaacuten iacutentegras Si soacutelo existiera lisis cuando la muestra ensayada contiene organismos
filogeneacuteticamente emparentados como M tuberculosis que permitiesen la
amplificacioacuten selectiva del fago D29 previamente a la infeccioacuten del cultivo testigo de
M smegmatis la evaluacioacuten electroquiacutemica del sustrato metabolizable por el
microorganismo deberiacutea permitir evidenciar presencia o ausencia de M tuberculosis La
seleccioacuten del fago D29 se justifica porque es capaz de infectar micobacterias de
crecimiento raacutepido como M smegmatis y las de crecimiento lento como M tuberculosis
(Park y col 2003)
El glicerol es corrientemente utilizado como principal fuente de carbono en cultivos
de micobacterias siendo degradado eficientemente por sus sistemas enzimaacuteticos que
utilizan mecanismos redox En este trabajo nos hemos planteado detectar este
polialcohol como analito de intereacutes ya que su consumo estaraacute preferencialmente
vinculado a la presencia de micobacterias aptas para tal degradacioacuten Por este motivo
proponemos utilizar un bioelectrodo con una SBR que contenga una enzima cuyo
sustrato sea glicerol
Introduccioacuten
32
2531 Biosensores para evaluacioacuten de infeccioacuten toxoplaacutesmica
En el presente trabajo se propuso un biosensor para evaluacioacuten de infeccioacuten
toxoplaacutesmica utilizando un electrodo de oro policristalino macizo sobre el cual se
adsorbioacute un antiacutegeno recombinante y se siguioacute un esquema ELISA del tipo indirecto
con deteccioacuten de IgGh En la Fig 212 se muestra el esquema que se siguioacute para este
inmunoensayo
Proteiacutena recombinante IgG a-IgGh conjugada a HRP
Bloqueante IgG humana ferrocenometanol
Figura 212 Sobre la superficie del electrodo se fija la proteiacutena recombinante que capturaraacute los
anticuerpos especiacuteficos si estaacuten presentes en el suero El revelado se realiza con un segundo anticuerpo
especiacutefico para IgG humana marcado con HRP que en presencia de H2O2 oxida el mediador FcMe que
se reduce sobre la superficie del electrodo generando la sentildeal analiacutetica
254 Biosensores para cuantificacioacuten de glicerol
La determinacioacuten de glicerol ha ido ganando importancia en las uacuteltimas deacutecadas
debido al uso del mismo en varias industrias como la farmaceacuteutica automotriz
alimenticia y textil entre otros El compuesto es un producto importante de la
fermentacioacuten en la mayoriacutea de las bebidas alcohoacutelicas y su concentracioacuten es un
paraacutemetro uacutetil para el seguimiento del proceso fermentativo (Goriushkina y col 2010)
Tambieacuten es un componente no deseable del biodiesel y su concentracioacuten es un indicador
de la calidad del combustible (Monteiro y col 2008)
Se han desarrollado numerosas metodologiacuteas para llevar adelante la cuantificacioacuten
del glicerol que incluyen teacutecnicas espectrofotomeacutetricas yo espectrofluoromeacutetricas
(Bondioli amp Bella 2005 Silva amp Rocha 2010 Lima y col 2012) incluidos los basados
Introduccioacuten
33
en enzimas (Kronka y col 2001 Li y col 2001) los electroquiacutemicos (Tehrani amp
Ghani 2012 Gamella y col 2008 Wu amp Cheng 2005) y los cromatograacuteficos estos
uacuteltimos han sido oficialmente recomendado por la AOAC como los meacutetodos 96809
97210 (AOAC 2005) Sin embargo a pesar de que estos meacutetodos permiten determinar
con eficacia de glicerol en presencia de muchos compuestos que interfieren esta teacutecnica
se considera que es ecoloacutegicamente desfavorable debido a la utilizacioacuten de solventes
nocivos para el medio ambiente e intriacutensecamente onerosa debido a los altos costos de
los mismos (Gamella y col 2008)
Por un lado las propuestas espectrofotomeacutetricas que utilizan enzimas se basan en el
uso de sistemas o bien de una o varias enzimas relativamente caras que se eliminan
despueacutes de que se han utilizado en una uacutenica determinacioacuten En estos casos a menudo
son consumidos las enzimas yo cofactores caros como nicotinamida adenina
dinucleoacutetido (NAD+) o adenosina 5-trifosfato (ATP) a menudo son consumidos
(Kronka y col 2001 Li y col 2001 Wu amp Cheng 2005) Como un ejemplo la
propuesta de Li para determinar glicerol en matrices complejas se basa en el uso de tres
enzimas a saber glicerol quinasa (GK) piruvato quinasa (PK) y lactato
deshidrogenasa (LDH) ademaacutes de utilizar ATP y NAD+ (Li y col 2001) Este meacutetodo
produce buenos resultados en teacuterminos de sensibilidad y especificidad pero consume 1
U de GK 15 U de PK 22 U de LDH 2x10-6
moles de ATP y 33x10-7
moles de
NAD+ por determinacioacuten Por lo tanto el costo derivado por anaacutelisis es considerado
caro sobre todo cuando se debe analizar un elevado nuacutemero de muestras
Por otro lado se han propuesto herramientas versaacutetiles notables para cuantificar
glicerol como ser la basada en tecnologiacutea de biosensores en particular los basados en
meacutetodos amperomeacutetricos (Ghica amp Brett 2006 Gamella y col 2008) De hecho los
biosensores amperomeacutetricos proporcionan suficiente sensibilidad y selectividad para
permitir la determinacioacuten del analito junto con una velocidad apropiada para completar
el anaacutelisis En efecto los biosensores amperomeacutetricos que utilizan enzimas como
componente bioloacutegico para el reconocimiento dan lugar a una selectividad significativa
debido a su capacidad de reaccionar especiacuteficamente con su sustrato Este uacuteltimo es a
menudo el analito de intereacutes por lo que puede ser cuantificado de manera eficiente auacuten
ante la presencia de otros componentes similares estructuralmente que pueden hallarse
en la muestra (Belluzo y col 2008) Los dispositivos construidos con enzimas a
menudo pueden ser reutilizados y por lo tanto el costo por determinacioacuten puede ser
Introduccioacuten
34
reducido significativamente en comparacioacuten con los meacutetodos espectrofotomeacutetricos
mencionados anteriormente
Se han desarrollado varios biosensores utilizando enzimas que tienen como sustrato
al glicerol (Gamella y col 2008) En los disentildeos utilizados se utilizan diversas enzimas
que reaccionan especiacuteficamente con el glicerol en un primer paso y se censa un
producto de esta reaccioacuten En otros disentildeos se encuentran involucradas maacutes de una
enzima donde la segunda o tercer enzima utiliza como sustrato algunos de los
productos de la primera o segunda reaccioacuten y finalmente se censa un producto de la
uacuteltima reaccioacuten enzimaacutetica Algunos disentildeos que aparecieron en literatura al momento
de iniciar este trabajo de tesis fueron detallados por Pingarroacuten y colaboradores (Gamella
y col 2008) y se encuentran resumidos en la Tabla 23 al final de este capiacutetulo y se
corresponden a los esquemas evaluados al momento de iniciar este trabajo de tesis
Todos los disentildeos descriptos al momento presentan la desventaja de ser onerosos
tanto por el disentildeo en siacute como por el costo operativo devenido del consumo de elevadas
cantidades de reactivos caros
Sobre la base del modelo propuesto por Tuntildeoacuten-Blanco y colaboradores (Aacutelvarez-
Gonzaacutelez y col 2000) se comenzaron los ensayos para construir un bioelectrodo
selectivo para glicerol La propuesta contempla en primer lugar disminuir la cantidad
de enzima Glicerol deshidrogenasa En segundo lugar proponemos utilizar la coenzima
NAD(H) en forma soluble e introducir un mediador electroquiacutemico distinto al utilizado
previamente En el trabajo citado se generaba una cupla cataliacutetica por oxidacioacuten
electroacutedica del NAD+ presente en un electrodo de trabajo de pasta de C modificada En
nuestro caso el mediador soluble permite reoxidar la coenzima para cerrar el ciclo
cataliacutetico siguiendo el esquema de la Fig 213
Figura 213 Esquema de reacciones que ocurren en la celda DHA 13 dihidroxiacetona GlDH
gliceroldeshidrogenasa NAD(H) nicotinadenina dinucleoacutetido
glicerol
DHA
GlDHox
GlDHred NAD+
NADH Mediador ox
Mediador red
e- Electrodo
Introduccioacuten
35
Tabla 23 Biosensores selectivos para gicerol Las filas 1 a 10 son un extracto parcial del trabajo de
Gamella y col 2008 En las filas 11 y 12 se incluyen los disentildeos propuestos por Šefčovičovaacute y col
2008 y Goriushkina y col 2010
Electrodo Enzima Mediador Potencial
1 Pt GKGPOx - + 650 mV vs AgAgCl
2 Al GlDH Fe(CN)6 + 400mV vs ECS
3 Barras de grafito
espectroscoacutepico GlDH Complejo de Os + 200 mV vs AgAgCl
4 Serigraacutefico (SPE) pGlyDH N-(4-hidroxibenzilideno)-
4-ferrocenilanilina + 400 mV vs AgAgCl
5 Carboacuten Viacutetreo a) GlDHDP
b) GKGPOxHRP
a)Fe(CN)63-
b)Fe(CN)64-
a) + 350 mV vs AgAgCl
b) - 300 mV vs AgAgCl
6 SPE modificado con
ZrO2 y azul meldola GlDH Azul meldola + 100 mV vs AgAgCl
7 SPE modificado azul
de Prusia
GlDH Tt NADH
Ox Azul de Prusia - 50 mV vs AgAgCl
8 Pasta de carbono GlDH Producto de la electro-
oxidacioacuten del NAD+ + 150 mV vs AgAgCl
9 Flim de carbono a) GPOx
b)GKGPOx Poli (rojo neutro) - 350 mV vs ECS
10 Au a)GlDHDP
b) GKGPOxHRP Tetra thiafulvaleno
a) + 150 mV vs AgAgCl
b) 0 mV vs AgAgCl
11 Carboacuten Viacutetreo GlDHDP Fe(CN)63- + 350 mV vs AgAgCl
12 Platino serigraacutefico Gox - + 300 mV vs electrodo
intriacutenseco
Tabla 23 Continuacioacuten
Muestra
Rango dinaacutemico
Lineal (M) Sensibilidad
(mA M-1
cm-2
)
Liacutemite de
deteccioacuten (M) Estabilidad
Desde Hasta
1 Mosto de uva 2 10-6
10-3 - 5 10
-7 Hasta 1 mes
2 Jugo de uva 10-6
2 10-3
- 10-6 -
3 Vino 1 10-6
2 10-4
32 1 10-6
80 actividad inicial luego
de 20 horas
4 Vino - - - - actividad enzimaacutetica decae
rapidamente
5 Fermento
anaeroacutebico
1 10-5
1 10-5
10-3
1 10-3
a) 620
b) 142 -
sentildeal inicial luego de
uso continuo a) 60 a 90
hs b) 70 16 hs
6 Fermento de
jugo de uva 10
-51 10
-4 - 10
-6 -
7 - 10-5
1 10-3
- 10-6 -
8 Jarabe 997 10-7
10-4
162 cm2 43 10-7
80 actividad inicial luego
de 3 diacuteas
9 Vino 10-5
147 10-4
a) 101
b) 079
a) 4 10-6
b) 15 10-5
sentildeal inicial luego de
uso continuo a) 87 a 8
diacuteas b) 62 8 diacuteas
10 Vino 10
-6
4 10-7
2 10-5
1 10-5
a) 207
b) 250
a) 4 10-7
b) 31
sentildeal inicial luego de
uso continuo a) 87 a 51
diacuteas b) 46 8 diacuteas
11 Fermento - - - 11 10-6
-
12 Vino 10
-5
2 10-6
25 10-2
64 10-3
-
10-5
2 10-6 -
Objetivos
Objetivos
37
3 Objetivos
31 Objetivos generales
Desarrollar metodologiacuteas electroquiacutemicas que permitan identificar analitos de
intereacutes tanto para el diagnoacutestico cliacutenico como para la industria de combustibles
alternativos
32 Objetivos particulares
a) Obtener bioelectrodos que exhiban una corriente cataliacutetica diferencial al efectuar
inmunoensayos con muestras confirmadas positivas o negativas para infeccioacuten aguda
por T gondii
b) Desarrollar un meacutetodo electroquiacutemico que permita la cuantificacioacuten de glicerol
en medio acuoso para determinarlo por ejemplo luego de su extraccioacuten en
combustibles alternativos
c) Evidenciar electroquiacutemicamente la ocurrencia de lisis de M smegmatis por fagos
D29 indicadores de la presencia de micobacterias patoacutegenas emparentadas
provenientes de individuos padeciendo infeccioacuten tuberculosa
Materiales y Meacutetodos
Materiales y Meacutetodos
39
4 Materiales y meacutetodos
41 Reactivos y medios de cultivos
411 Reactivos
Todos los reactivos utilizados fueron de grado analiacutetico salvo que se indique lo
contrario Los aacutecidos aceacutetico sulfuacuterico niacutetrico clorhiacutedrico y percloacuterico las sales KCl
Na2HPO4 KH2PO4 NiSO4 CuSO45H2O y la sal disoacutedica del aacutecido etilen diamino tetra
aceacutetico (EDTA) dimetilsulfoacutexido (DMSO) imidazol tris base las enzimas peroxidasa
de raacutebano picante EC 11117 (tipo VI) (HRP) y glicerol deshidrogenasa de
cellulomonas EC 1116 (GlDH) acrilamida (adecuada para electroforesis) NNprime-(12-
dihidroxietilen) bisacrylamide (97) ditiotreitol (DTT) Coomasie blue G-250 alcohol
isopropiacutelico β-mercaptoetanol 33-diaminobenzidina tetrahidrocloruro (DAB)
nicotina adenina dinucleoacutetico (NAD) los desoxinucleoacutetidos trifosfato dATP dGTP
dCTP y dTTP reactivo de Folin-Ciocalteu glicina albuacutemina seacuterica bovina (ASB)
peptona de carne extracto de levadura fueron suministrados por Sigma-Aldrich El
polvo de carbono viacutetreo (esfeacuterico diaacutemetro de partiacutecula entre 2 y 12 microm pureza
9999+) fue suministrado por Aldrich El polvo de carbono grafito (pureza gt 99) fue
provisto por Fisher Scientific Dimetilformamida (DMF) 1 1rsquo-carbonil-diimidazol las
sales tartrato de sodio y potasio MgCl2 CaCl2 NaCl Na2CO3 NaHCO3 K2CO3
KHCO3 K3Fe(CN)6 K4Fe(CN)6 (NH4)2SO4 (NH4)2S2O8 (gt98) dodecil sulfato de
sodio (Farmacopea Unioacuten Europea) (SDS) NaOH KOH NNNprimeNprime-
tetrametiletilendiamino (Temed) azul de bromofenol (Farmacopea Unioacuten Europea)
xilencianol (para electroforesis) etanol absoluto fueron suministrados por Merck El
H2O2 y el glicerol fueron provistos por Cicareli El isopropil-β-D-1-
tiogalactopiranoacutesido (IPTG) fue suministrado por Promega La enzima ADN polimerasa
de Thermus aquaticus EC 2777 (polimerasa Taq) y los oligonucleoacutetidos fueron
suministrados por InvitrogenTM
Argentina La enzima peroxidasa de raacutebano picante
ligada a estreptavidina (HRP-EAV) fue provista por Abcam El ester biotin n-
hidroxisuccinimida fue provisto por Thermo Scientific La ampicilina (Farmacopea
Argentina) fue provista por laboratorios Klonal La aluacutemina para pulido (tamantildeo de
partiacutecula 03 microm) fue provista por Metrohm El anticuerpo de cabra anti IgG humana
ligado a HRP fue provisto por Zymed El Tween-20 fue provisto por Anhedra
No se detallan los reactivos contenidos en los equipos comerciales utilizados
disponibles en las paacuteginas web de los respectivos proveedores
Materiales y Meacutetodos
40
412 Medios de cultivos
Para el crecimiento de cepas de Escherichia coli (E coli) se utilizoacute el medio de
cultivo Luria-Bertani (LB) compuesto por 10 g L-1
peptona de carne 5 g L-1
extracto de
levadura y 10 g L-1
NaCl En los casos requeridos se suplementoacute este medio con el
antibioacutetico ampicilina (100 g mL-1
) Para la preparacioacuten de medios soacutelidos se agregoacute
agar en concentracioacuten final de 15 g L-1
Para el crecimiento de ceacutelulas de M smegmatis se utilizoacute el medio de cultivo
Middlebrook 7H9 provisto en forma anhidra por Difco y fue suplementado con NaCl
CaCl2 yo glicerol en concentraciones variables de acuerdo a los requerimientos del
ensayo analiacutetico ulterior la composicioacuten del medio provisto por Difco se detalla en la
siguiente tabla
Tabla 41 Caldo Middlebrook 7H9 (Difco) composicioacuten en g L-1
del medio liacutequido recieacuten preparado
(NH4)2SO4 050
Na2(HPO4) 250
K(H2PO4) 100
Citrato de sodio 010
MgSO4 005
CaCl2 0005
ZnSO4 0001
CuSO4 0001
Citrato feacuterrico amoacutenico 004
Aacutecido l-glutaacutemico 050
Piridoxina 0001
Biotina 00005
42 Cepas bacterianas
Las cepas bacterianas utilizadas y sus caracteriacutesticas relevantes se detallan en la
siguiente tabla
Materiales y Meacutetodos
41
Tabla 42 Cepas bacterianas utilizadas
Cepa Caracteriacutesticas
Escherichia
coli (E coli)
BL21 (DE3)
E F- ompT hsdS (rB-mB-) [lon] (DE3 immP21 int- lacI+
lacUV5lacZT7 ARN polimerasa) Contiene el gen de la T7
ARN polimerasa bajo el control del promotor lacUV5 El gen de
la ARN polimerasa estaacute integrado en el cromosoma bacteriano
desde (DE3) y su expresioacuten se induce por IPTG (Stratagene)
M smegmatis
mc2155
Mycobacterium smegmatis MC2155 es un organismo
aerobio quimioorganotrofo en forma de barra no moacutevil
patoacutegeno de humanos Esta bacteria fue inicialmente aislada de
esmegma humano Esta cepa es un mutante de M smegmatis Es
faacutecilmente transformable con vectores plasmiacutedicos usando
electroporacioacuten
43 Bacterioacutefagos
Se utilizoacute el bacterioacutefago D29 que infecta especiacuteficamente micobacterias Los
trabajos especiacuteficos de infeccioacuten de micobacterias fueron realizados en el Departamento
de Microbiologiacutea de la Facultad de Ciencias Meacutedicas (UNR) bajo la supervisioacuten del Dr
Ricardo Morbidoni
44 Plaacutesmidos
El plaacutesmido utilizado y sus caracteriacutesticas relevantes se detallan en la siguiente tabla
Tabla 43 Plaacutesmido utilizado
Plaacutesmido Caracteriacutesticas
pET32a
5900 pares de bases resistencia ampicilina promotor T7lac Produce
proteiacutenas fusionadas a 6 histidinas y a la proteiacutena tiorredoxina (TRX)
de 204 kDa lo que permite su purificacioacuten en columna de NTA-Ni2+
Este vector fue utilizado como sistema de expresioacuten en la cepa BL21
(DE3) de E coli
45 Reaccioacuten en cadena de la polimerasa
Las reacciones se llevaron a cabo en un volumen total de 25 μL conteniendo
solucioacuten de amplificacioacuten comercial suplementada con MgCl2 para alcanzar una
concentracioacuten final de MgCl2 25 mM y 02 mM de cada uno de los desoxinucleoacutetidos
trifosfato dATP dGTP dCTP y dTTP 20 pmoles de cebador directo y reverso y 1 UI
de polimerasa Taq Se empleoacute un termociclador BOECO (Germany) y se inicioacute la
reaccioacuten con un paso de desnaturalizacioacuten a 95 ordmC durante 5 min La amplificacioacuten de
los fragmentos se realizoacute en 30 ciclos de a) desnaturalizacioacuten 1 min a 95degC b)
Materiales y Meacutetodos
42
hibridizacioacuten 1 min a la temperatura oacuteptima para cada par de cebadores c) extensioacuten
72degC 15 min por cada Kpb amplificado finalmente se realizoacute un paso de extensioacuten
durante 10 min
Para la reaccioacuten de amplificacioacuten de la secuencia codificante de la proteiacutena se
disentildearon oligonucleoacutetidos cebadores especiacuteficos (ver maacutes adelante) En el disentildeo de los
mismos se introdujeron sitios de restriccioacuten apropiados para el posterior clonado del
fragmento en vectores de clonado o expresioacuten
Como molde se utilizoacute aproximadamente 003 g de ADN plasmiacutedico
Como cebadores se utilizaron los oligonucleoacutetidos (provistos por Invitrogen)
P22C directo 5- GGATCCACCACCGAGACGCCAGC -3
P22C reverso 5- GAATTCTTGCCCGTGAGAGACACAG -3
46 Electroforesis de ADN en geles de agarosa
Los fragmentos de ADN (ADN plasmiacutedico productos de PCR) fueron separados
mediante electroforesis en geles de agarosa de distinta concentracioacuten (08 a 2) seguacuten
el tamantildeo de los fragmentos a separar Se utilizoacute el sistema de tipo submarino La
solucioacuten reguladora tris-aceacutetico-EDTA (TAE) 05 X se utilizoacute como solucioacuten de
electroforesis y para la preparacioacuten de geles A estos uacuteltimos se les agregoacute el agente
intercalante bromuro de etidio en una concentracioacuten final de 03 g mL-1
antes de su
gelificacioacuten Previo a la siembra las muestras se mezclaron con solucioacuten de siembra
compuesta por 0025 (mv) azul de bromofenol 0025 (mv) xilencianol y 30
(vv) glicerol en una proporcioacuten 51 en volumen de muestra solucioacuten de siembra
Como marcadores de peso molecular se utilizaron Ladder 100 pb PB-L (Productos Bio-
Loacutegicos) La corrida electroforeacutetica se realizoacute a un potencial constante de 100 V con
una fuente BIO-RAD modelo 3000xi Luego de la electroforesis el ADN se visualizoacute
por fluorescencia en un transiluminador de luz ultravioleta Fotodyne y las imaacutegenes se
digitalizaron con una caacutemara FUJIFILM modelo FinePix A120
47 Minipreparacioacuten de ADN plasmiacutedico
El ADN plasmiacutedico se preparoacute a partir de cultivos celulares de E coli conteniendo
los plaacutesmidos de intereacutes seguacuten el meacutetodo de lisis alcalina o bien utilizando los equipos
comerciales ―WIZARDreg
PLUS SV Minipreps DNA purification system (Promega) El
resultado de la preparacioacuten se evaluoacute realizando una electroforesis en gel de agarosa de
una aliacutecuota de la misma
Materiales y Meacutetodos
43
48 Purificacioacuten del producto de amplificacioacuten
La purificacioacuten de aacutecidos nucleicos a partir de geles de agarosa se realizoacute utilizando
el equipo comercial ―GFXTM Gel Band Purification Kit (Amersham GE Healthcare)
seguacuten las especificaciones del fabricante El resultado de la purificacioacuten se evaluoacute
realizando una electroforesis en gel de agarosa de una aliacutecuota de la elusioacuten obtenida
49 Prueba de expresioacuten de proteiacutenas de fusioacuten a TRX y a ldquocolardquo de histidinas
Se cultivaron clones de las cepas de E coli BL21 (DE3) transformadas con el
vector pET32a (con el inserto correspondiente) haciendo distintas diluciones 175
1100 y 1200 de un cultivo saturado en 2 mL de LB fresco (suplementado con
ampicilina a 100 μg mL-1
) y cultivando a 37 ordmC con agitacioacuten vigorosa (180 rpm) hasta
una densidad oacuteptica a 630 nm (DO630nm) aproximada de 05 unidades Se indujo la
expresioacuten de la proteiacutena recombinante con IPTG (concentracioacuten final 1 o 01 mM)
durante 3 4 o 12 hs a 37 ordmC y con agitacioacuten vigorosa Posteriormente se cosecharon las
ceacutelulas centrifugando a 3000 rpm durante 10 min Finalmente se lisaron las ceacutelulas con
pulsos de ultrasonido utilizando un sonicador analoacutegico Sonifierreg S450A y se
separaron las fracciones soluble e insoluble del extracto por centrifugacioacuten a 18000 g
durante 20 min
410 Expresioacuten y purificacioacuten preparativas de antiacutegenos recombinantes
Se cultivoacute la cepa de E coli transformada con el vector pET32a con el inserto
correspondiente haciendo una dilucioacuten 1100 de un cultivo saturado en dos porciones
de 150 mL de LB suplementado con ampicilina (100 microg mL-1
) y cultivando a 37ordm C
hasta una DO630nm 05 Se agregoacute IPTG hasta concentracioacuten final oacuteptima 1 mM para
el Ang P35B o 01 mM para el Ang P22C y se indujo el tiempo oacuteptimo 4 h para el Ang
P35B o 12 h para el Ang P22C a 37ordm De esta manera se obtuvo la proteiacutena de fusioacuten
en forma soluble Se cosecharon las ceacutelulas por centrifugacioacuten y se lavaron con solucioacuten
tampoacuten fosfato (Na2HPO4 10 mM NaCl 05 M pH 8) Luego se las resuspendioacute en 20
mL de solucioacuten de lisis (Na2HPO4 50 mM NaCl 05 M pH 8) Las ceacutelulas se lisaron
por sonicado aplicando pulsos de 30 s de duracioacuten hasta clarificacioacuten del medio en
hielo Se separoacute la fraccioacuten soluble de la insoluble por centrifugacioacuten a 18000 g y 4 ordmC
La fraccioacuten soluble se congeloacute durante 24 h a -20 ordmC y se descongeloacute en hielo luego se
centrifugoacute nuevamente a 18000 g y 4 ordmC Este paso se repitioacute dos veces
Posteriormente se realizoacute una separacioacuten cromatograacutefica de afinidad con una columna
Materiales y Meacutetodos
44
de 5 mL empacada manualmente con resina Ni Sepharosetrade High Performance en
condiciones nativas elusioacuten con imidazol 250 mM seguacuten las especificaciones del
proveedor (GE Healthcare) En los sucesivos pasos se recogieron aliacutecuotas y se verificoacute
la purificacioacuten visualizando por electroforesis en gel desnaturalizante de poliacrilamida
(SDS-PAGE)
411 Separacioacuten de proteiacutenas mediante SDS-PAGE
Se utilizaron geles de 12 y de 15 de acrilamidabisacrilamida 291 Las
muestras se sembraron en geles desnaturalizantes mezclaacutendolas 21 con solucioacuten de
siembra 2 X compuesta por Tris-HCl pH 68 125 mM SDS 4 β-mercapto etanol 5
vv(alternativamente se usoacute DTT 200 mM) glicerol 20 y azul de bromofenol 02
Las corridas electroforeacuteticas se hicieron en solucioacuten Tris-glicina-SDS (Tris base 302
g L-1
glicina 144 g L-l SDS 1 g L
-1) Los geles fueron tentildeidos con azul brillante de
Coomasie G-250
412 Cuantificacioacuten de proteiacutenas
Se utilizoacute el meacutetodo propuesto por Lowry (Lowry y col1951) seguacuten el siguiente
protocolo un volumen de muestra cuya concentracioacuten de proteiacutena se desea determinar y
uno o dos testigos de albuacutemina (conteniendo tiacutepicamente de 5 a 25 microg de proteiacutenas
totales) se disolvieron en 040 mL de agua destilada y se mezclaron con 150 mL de
reactivo C preparado inmediatamente antes de usar El reactivo C se preparoacute mezclando
una parte de tartrato de sodio y potasio 2 mv una parte de CuSO4 1 mv y 100
partes de solucioacuten tampoacuten carbonato 2 mv e hidroacutexido de sodio 01 N Se dejoacute
reaccionar la mezcla durante 15 min a temperatura ambiente y luego se adicionoacute 0150
mL de reactivo de Folin-Ciocalteu diluido 13 con agua destilada inmediatamente antes
de usar Se dejoacute reposar durante 45 min y se leyoacute la absorbancia a 660 nm
413 Reaccioacuten de conjugacioacuten biotina-antiacutegeno
Previo a la reaccioacuten de conjugacioacuten el antiacutegeno P35B purificado se llevoacute a una
concentracioacuten final de 2 mg mL-1
(como miacutenimo) en solucioacuten tampoacuten carbonato de
sodio 01 M (pH 85) usando las membranas de poro controlado Amicon Ultra-4
(Millipore Co) seguacuten las instrucciones del proveedor Se disolvieron 20 mg del eacutester
biotinil-n-hidroxisuccinimida (BNHS) en 590 microL de DMSO e inmediatamente despueacutes
se mezclaron 80 microL de esta solucioacuten con 800 microL de solucioacuten de Ang
Materiales y Meacutetodos
45
Al antiacutegeno P22C purificado se lo llevoacute a una concentracioacuten final de 20 mg mL-1
(como miacutenimo) en solucioacuten tampoacuten carbonato de sodio 01 M (pH 85) usando las
membranas de poro controlado mencionadas Se disolvieron 25 mg BNHS en 590 microL
de DMSO e inmediatamente despueacutes se mezclaron 120 microL de esta solucioacuten con 100
mL de solucioacuten de Ang Se incuboacute 4 h a temperatura ambiente con agitacioacuten suave Se
eliminaron los restos de eacutester hidrolizado y se cambioacute la solucioacuten tampoacuten carbonato por
PBS 1 X pH 74 haciendo lavados reiterados y reteniendo el Ang en las membranas de
poro controlado
414 Revelado cromogeacutenico de la reaccioacuten de conjugacioacuten
El antiacutegeno marcado con biotina respectivo fue retenido en membrana de
nitrocelulosa sembrando 1 L del mismo sobre la membrana Se procedioacute a bloquear
los sitios activos de la membrana con leche descremada disuelta al 5 mv en PBS pH
74 durante 1 h Se realizaron 3 lavados con PBS pH 74 de 1 min cada uno Se incuboacute
la membrana con la enzima peroxidasa de raacutebano picante ligada a streptavidina (HRP-
EAV) disuelta en PBS pH 74-leche descremada al 1 mv Posteriormente se
realizaron 3 lavados con PBS pH 74 de 1 min cada uno Finalmente se reveloacute la
presencia de la enzima HRP con el reactivo de color recieacuten preparado seguacuten 5 mg de
33-diaminobenzidina tetrahidrocloruro (DAB) se disolvieron en 500 microL de DMSO y se
llevoacute a 100 mL de volumen final con PBS pH 74 A esta solucioacuten se le agregaron 100
microL de H2O2 10 voluacutemenes inmediatamente previo a su utilizacioacuten
415 Mediciones espectrofotomeacutetricas
Para las medidas de absorbancia (Abs) a longitudes de onda especiacuteficas o la
realizacioacuten de espectros de absorcioacuten ultravioleta-visible se utilizoacute el espectrofotoacutemetro
Beckman DU 640 Como celda se utilizoacute una cubeta de cuarzo de 1 cm de paso oacuteptico
416 Ensayos de inmunoabsorcioacuten ligados a enzima con deteccioacuten fotomeacutetrica
Como soporte soacutelido se utilizaron microplacas Microlon 600 high binding Greiner
Bio One provistas por GBO Argentina Para las lecturas de Abs se utilizoacute un lector de
microplacas PowerWave XS (BioTek) o alternativamente se utilizoacute el lector ELx808
Absorbance Microplate Reader (BioTek) Los ensayos preliminares se detallan en la
secioacuten 6 Experimentos Auxiliares
Materiales y Meacutetodos
46
4161 Esquema A
Sobre las microplacas de ELISA Microlon 600 high binding Greiner Bio One se
depositaron 100 microL de anticuerpo de captura (IgG de conejo anti IgM humana) provisto
por Dakko diluido 11000 en PBS pH 74 Se incubaron 48 h a 37 degC Luego se
realizaron 3 lavados con PBS Tween 20 al 005 (PBS-T) de 1 min cada uno Se
procedioacute al bloqueo de los sitios libres de la placa con 100 microL leche descremada
comercial (marca Milkaut) al 1 mv en PBS durante 30 min a 37 degC y se realizaron 3
lavados con PBS-T de 1 min cada uno Luego se incubaron con suero humano (muestra
incoacutegnita) 1100 en PBS con leche descremada al 1 mv durante 1 h a 37 degC y se
realizaron 3 lavados con PBS-T de 1 min cada uno Se realizaron distintas incubaciones
con los antiacutegenos P22C y P35B conjugados a biotina Luego de tres lavados con PBS-T
se incubaron con la enzima HRP-EAV en una dilucioacuten 12000 durante 1 h a 37degC
Posteriormente se realizaron 3 lavados con PBS-T para finalmente revelar utilizando
50 microL de solucioacuten comercial de 33prime55prime-tetrametilbenzidina (TMB) sustrato de la
enzima HRP que da coloracioacuten azul en el medio de reaccioacuten pasando a amarillo y
permaneciendo estable el color cuando se detiene la reaccioacuten acidificando el medio con
H2SO4 05 M
4162 Esquema B
Sobre las microplacas de ELISA comerciales se depositaron 500 ng de Ang P22C
disueltos en 100 L de solucioacuten carbonato pH 96 incubando 1 h a 37 degC Se realizaron
3 lavados con PBS Tween 20 al 005 (PBS-T) de 1 min cada uno Se bloquearon los
sitios libres de la placa con 100 microL leche descremada 1 mv en PBS durante 30 min a
37 degC Luego se realizaron 3 lavados con PBS-T de 1 min cada uno Se incubaron con
suero humano (muestra incoacutegnita) 1100 en PBS con leche descremada al 1 mv
durante 1 h a 37 degC Luego se realizaron 3 lavados con PBS-T de 1 min cada uno Se
realizoacute una incubacioacuten con el antiacutegeno P22C conjugado a biotina Luego de tres lavados
con PBS-T se incubaron con la enzima HRP-EAV en una dilucioacuten 12000 durante 1 h
a 37degC Posteriormente se realizaron 3 lavados con PBS-T Finalmente se reveloacute con
50 microL de solucioacuten comercial de TMB y se detuvo la reaccioacuten acidificando el medio con
50 microL H2SO4 05 M
Materiales y Meacutetodos
47
417 Reaccioacuten de color para determinacioacuten cuantitativa de glicerol por meacutetodo
espectrofotomeacutetrico
Se llevaron a cabo dos tipos de ensayos diferentes Por un lado se utilizoacute el meacutetodo
enzimaacutetico con un equipo comercial provisto por Wiener Lab TG GPO PAP AA (liacutenea
liacutequida) ensayando muestras de aliacutecuotas del medio Middlebrook 7H9 suplementadas
con glicerol en lugar de suero humano Por otro lado se realizaron reacciones de color
que se llevaron a cabo en un volumen final de 100 mL que resultoacute de la mezcla de 950
microL de reactivo A y 50 microL de muestra la cual consistioacute en medio de cultivo de
micobacterias Middlebrook 7H9 suplementado con distintas cantidades de glicerol En
los blancos de reaccioacuten se realizoacute un agregado de medio de cultivo Middlebrook 7H9
sin glicerol de igual volumen que en los otros dos casos para mantener las mismas
condiciones que en las otras reacciones
El reactivo A se preparoacute inmediatamente antes de ser usado mezclando los
reactivos necesarios seguacuten se indica en la siguiente tabla
Tabla 44 Mezcla de reactivos necesaria para preparar 950 microL de reactivo A (necesario para 1 reaccioacuten)
Los voluacutemenes necesarios para un nuacutemero n de reacciones se obtuvieron multiplicando por n
los voluacutemenes de esta tabla
Reactivo Volumen para una
reaccioacuten ( L)
Solucioacuten Tampoacuten carbonato
0125 M pH 105 815
K3Fe(NC)6 10-2
M 100
(NH4)2SO4 10 M 10
NAD+ 10
-2 M 25
Enzima GlDH 2 mg mL-1
1
Las reacciones se llevaron a cabo en tubos de Khan cerrados con parafilm para
evitar evaporacioacuten de liacutequido y en bantildeo termostatizado a 37 ordmC La lectura de
absorbancia se realizoacute cuando se cumplioacute una o dos h de iniciada la reaccioacuten seguacuten la
necesidad del ensayo Los experimentos se realizaron por triplicado
418 Determinacioacuten de glicerol remanente en cultivos de micobacterias
Procedimiento seguido a medios de cultivos Middlebrook 7H9 se los suplementoacute
con glicerol a concentracioacuten 0025 mv y se cultivaron cantidades iguales de ceacutelulas
de M smegmatis algunos medios se conservaron sin adicionar micobacterias en
Materiales y Meacutetodos
48
condiciones de esterilidad Se tomaron aliacutecuotas de estos cultivos a distintos tiempos Se
centrifugaron a 12500 rpm durante 5 min para separar las ceacutelulas del sobrenadante y a
estos uacuteltimos se los congeloacute a -20ordmC para su posterior anaacutelisis
Se realizaron determinaciones de glicerol con la teacutecnica fotomeacutetrica propuesta Se
realizaron reacciones de color por triplicado a las muestras e independientemente se
hizo un blanco de reaccioacuten y 2 testigos cuyas concentraciones fueron de 001 y 004
mv
4181 Determinacioacuten de glicerol remanente en cultivos de micobacterias con y sin
fago D29 y ensayos controles respectivos
Procedimiento seguido a medios de cultivos Middlebrook 7H9 se los suplementoacute
con glicerol a 0025 mv y se cultivaron cantidades iguales de a) ceacutelulas de M
smegmatis b) ceacutelulas de M smegmatis infectadas con fago D29 c) fagos D29 d)
algunos medios se conservaron sin adicionar micobacterias ni fagos en condiciones de
esterilidad Se tomaron aliacutecuotas de estos medios inmediatamente despueacutes de realizados
los inoacuteculos (tiempo 0) a las 2 h y a las 4 h de iniciados los cultivos Se centrifugaron a
12500 rpm durante 5 min para separar las ceacutelulas del sobrenadante y a estos uacuteltimos se
los congeloacute a -20 ordmC para su posterior anaacutelisis A estas muestras se les realizaron
determinaciones del glicerol remanente con la teacutecnica fotomeacutetrica propuesta Se
realizaron reacciones de color por triplicado a cada muestra utilizaacutendose como testigos
los medios en condiciones de esterilidad
419 Instrumental electroquiacutemico
Para los experimentos electroquiacutemicos se utilizoacute un analizador electroquiacutemico
Autolab (Eco Chemie) con amplificador electromeacutetrico diferencial PGSTAT 30 Se
utilizoacute una celda convencional de tres electrodos
4191 Electrodos de trabajo
41911 Bioelectrodo para evaluacioacuten de infeccioacuten toxoplaacutesmica
Se utilizaron electrodos macizos tipo ―banderita de oro de aproximadamente 1
cm2 de aacuterea geomeacutetrica El ensamblado se realizoacute de acuerdo al siguiente protocolo los
electrodos limpios se sumergieron durante 14 h en una solucioacuten de aacutecido 3 mercapto
propanosulfoacutenico preparada inmediatamente antes de usar disolviendo 22 mg en 12 mL
de H2SO4 0021 M (desoxigenenada con burbujeo de N2) en atmoacutesfera de N2 a
Materiales y Meacutetodos
49
temperatura ambiente (TA) Luego de enjuagar con agua destilada se sumergieron en
una solucioacuten de Ang recombinante P22C 02 mg mL-1
(PBS pH 74) durante 1 h a TA
Luego de un lavado con PBS se bloquearon los sitios libres no modificados con el Ang
sumergiendo los electrodos en solucioacuten de caseinato de sodio 01 mg mL-1
(preparada
inmediatamente antes de usar) 30 min a 37 degC Los electrodos se lavaron con PBS
Tween-20 05 mv y se sumergieron en una dilucioacuten 1200 de suero humano (muestra
incoacutegnita) en PBS durante 30 min a 37 degC Se lavaron con PBS Tween-20 05 y
finalmente se incubaron en una dilucioacuten 11500 de anticuerpos de conejo anti IgGh-
HRP Los biosensores asiacute ensamblados se guardaron en PBS pH 74 a 4degC hasta su
utilizacioacuten
41912 Electrodos para cuantificacioacuten de glicerol
Como electrodos de trabajo se utilizaron oro platino plata carbono viacutetreo pasta
de carbono (viacutetreo y grafito) y pastas de carbono modificadas
Los electrodos metaacutelicos y de carbono viacutetreo fueron provistos por Metrohm
(numero de cataacutelogo 612043XX) consistentes en barras del material de 3 mm de
diaacutemetro embutidas en un armazoacuten aislante
Las pastas de carbono utilizadas se enumeran a continuacioacuten indicando los
porcentajes en masa de cada componente respectivamente
a) Pasta A carbono viacutetreo aceite mineral (7030)
b) Pasta B carbono viacutetreo aceite mineral GLDH (68302)
c) Pasta C carbono viacutetreo aceite mineral GLDH MWCNT (5830210)
Las pastas se prepararon mezclando los componentes en mortero de aacutegata durante
15 a 20 min hasta obtener una mezcla homogeacutenea a la vista Cuando se utilizoacute enzima
GlDH se dispersoacute en aceite mineral primero y luego se mezcloacute con el polvo de carbono
viacutetreo Cuando se utilizaron NTC (MWCNT nanotubos de carbono de pared multiple)
se dispersoacute primero la enzima luego los NTC y finalmente el polvo de carbono viacutetreo
Asiacute preparadas se empaquetaron firmemente en un armazoacuten de tefloacuten (diaacutemetro 3 mm)
y se friccionoacute firmemente sobre un papel liso apoyado en un vidrio para eliminar el
exceso de pasta y pulir la superficie expuesta del electrodo
Cuando se utilizaron electrodos de pasta de carbono con las pastas B se realizoacute una
cubierta de poli-(o-fenilendiamino) que inmovilizara la enzima Una vez empaquetada
la pasta en el armazoacuten de Teflon se sumergioacute en una solucioacuten de o-fenilendiamino 5 x
10-4
M en solucioacuten tampoacuten carbonato 01 M (pH 10) Se burbujeoacute N2(g) para eliminar el
Materiales y Meacutetodos
50
O2(g) de la solucioacuten y dejar una atmoacutesfera libre de O2(g) Para electropolimerizar se
realizoacute un barrido de potencial ciacuteclico desde -051 V a + 069 V a 50 mV s-1
Finalmente se enjuagoacute con solucioacuten amortiguadora carbonato 01 M (pH 10)
4192 Limpieza de electrodos
Los electrodos de oro macizo policristalino tipo ―banderita se sumergieron en
solucioacuten ―pirantildea (H2SO4 concentrado peroacutexido de hidroacutegeno 30 en una relacioacuten 31)
durante 30 min a 80ordmC Luego se los enjuagoacute con abundante agua destilada En caso de
limpieza maacutes rigurosa previo al tratamiento con solucioacuten ―pirantildea se los colocoacute a la
llama directa hasta rojo vivo (Ribone y col 2006)
Los electrodos de oro policristalino macizo insertos en una barra de tefloacuten (Tips de
Au) se limpiaron siguiendo el siguiente protocolo desengrase frotaacutendolo sobre tela de
pulido humedecida con DMSO Lavado con abundante agua destilada Pulido con
suspensioacuten acuosa de aluacutemina (diaacutemetro promedio de partiacutecula 03 microm) sobre tela de
pulido Lavado con abundante agua destilada Sonicado durante 5 min en sonicador
Cole-Palmer 8890 Luego de un enjuague con abundante agua destilada se sumergieron
en HNO3 9 M durante 1 min a 60 ordmC Finalmente se lavaron con abundante agua
destilada
4193 Determinacioacuten del aacuterea real del electrodo
Para la determinacioacuten del aacuterea real de los electrodos metaacutelicos se utilizaron dos
metodologiacuteas in-situ
41931 Medicioacuten de la adsorcioacuten de oxiacutegeno
Se asume que el oxiacutegeno se quimioadsorbe en una capa monoatoacutemica antes de la
evolucioacuten de 02 con una correspondencia de uno-a-uno con los aacutetomos metaacutelicos de la
superficie El valor de la carga asociada a la reduccioacuten de la monocapa de oacutexido en
superficies de oro policristalino que se utilizoacute fue de 390plusmn10 microC cm-2
(Trasatti amp Petrii
1991)
Se realizaron VCs en H2SO4 a 50 mVs-1
y se midioacute la carga correspondiente al pico
de desorcioacuten de O2 sobre la superficie del electrodo y este valor se dividioacute por el valor
de referencia
Materiales y Meacutetodos
51
41932 Voltametriacutea ciacuteclica de ferricianuro de potasio
Registrando VCs a varias velocidades de barrido de potencial conociendo el
coeficiente de difusioacuten del ioacuten su concentracioacuten en la celda y midiendo la corriente de
pico a cada velocidad de barrido es posible determinar el aacuterea real del electrodo de
trabajo utilizando la ecuacioacuten de Randles Sevcik ec[216] (Belluzo y col 2008)
[216]
siendo la temperatura 25 degC y donde A estaacute en cm2 D en cm
2 s
-1 C en mol cm
-3 y
en V s-1
420 Medidas electroquiacutemicas
Todos los potenciales fueron medidos y referidos al electrodo de AgAgCl (KCl
300 M) que se utilizoacute como electrodo de referencia Como contraelectrodos se
utilizaron dos tipos uno de oro de superficie mayor a 5 veces la superficie del electrodo
de trabajo cuando se utilizaron electrodos metaacutelicos como electrodos de trabajo y una
barra de carbono viacutetreo cuando se utilizaron electrodos de pasta de C como electrodos
de trabajo En todos los casos las soluciones se burbujearon con N2 durante 1 min para
desplazar el O2 disuelto y se mantuvieron en atmoacutesfera de N2 durante las
determinaciones
Las voltametriacuteas ciacuteclicas se realizaron equilibrando el sistema al potencial de inicio
Para muestras conteniendo glicerol y utilizando electrodos de oro se realizaron
barridos desde -030 V hasta 060 V a distintas velocidades de barrido Cuando se
utilizaron electrodos de platino se realizaron barridos desde -080 V hasta 020 V a
distintas velocidades de barrido Cuando se utilizaron electrodos de pasta de carbono o
pasta de carbono modificada se realizaron barridos de potencial desde -040 V hasta
100 V Las corrientes que se informan son las intensidades de pico obtenidas trazando
una liacutenea de base recta desde los extremos del pico de corriente utilizando algoritmos
propios del programa General Purpose Electrochemical System (GPES)
4201 Mediciones amperomeacutetricas para evaluacioacuten de infeccioacuten toxoplaacutesmica
Las amperometriacuteas realizadas con el bioelectrodo para evaluacioacuten de infeccioacuten
toxoplaacutesmica se llevaron adelante en solucioacuten PBS (pH 74) FeMe 3 mM El potencial
de trabajo fue de 008V Se registroacute la corriente de base hasta que se estabilizoacute y una
Materiales y Meacutetodos
52
vez estable (usualmente a los 250 s) se adicionoacute el sustrato de la enzima (H2O2)
concentracioacuten en celda 18 mM y se registroacute la corriente final (500 s) La corriente
cataliacutetica se evaluoacute como la diferencia entre la corriente final y la de base
4202 Mediciones amperomeacutetricas para cuantificacioacuten de glicerol
42021 Amperometriacuteas con tip de oro
Las amperometriacuteas con tip de oro se realizaron en medio NaOH 01 M a potencial
constante (01 V) y a temperatura ambiente (20 a 25 ordmC) El sistema se preacondicionoacute
aplicando un potencial de 05 V se dejoacute equilibrar y se registroacute la corriente de base en
esas condiciones (generalmente a los 50 s) Luego se adicionoacute la muestra de forma de
lograr la concentracioacuten final de analito deseada La corriente fue registrada y se midioacute
una vez que se estabilizoacute (aproximadamente a los 400 s) La corriente cataliacutetica se
evaluoacute como la diferencia entre la corriente final y la de base
42022 Amperometriacuteas con electrodos de pasta de C
Las amperometriacuteas donde se utilizoacute la pasta de carbono B se realizaron en solucioacuten
tampoacuten carbonatobicarbonato de potasio 100 mM (NH4)2SO4 25 mM K3Fe(CN)6
1mM NAD+ 05 mM pH 105 Se trabajoacute a potencial constante 038 V y a temperatura
ambiente (25 ordmC) El sistema se preacondicionoacute aplicando el potencial de trabajo
correspondiente durante 50 s una vez iniciada la lectura de corriente se dejoacute equilibrar
y se registroacute la corriente de base en esas condiciones usualmente a los 300 s Luego se
adicionoacute la cantidad necesaria de muestra de forma de lograr la concentracioacuten final de
analito deseada La corriente fue registrada y se midioacute una vez que se estabilizoacute
(aproximadamente a los 500 s) La corriente cataliacutetica se evaluoacute como la diferencia
entre la corriente final y la de base
Las amperometriacuteas donde se utilizoacute la pasta de carbono C se realizaron en solucioacuten
tampoacuten carbonatobicarbonato de potasio 100 mM (NH4)2SO4 25 mM NAD+ 05 mM
pH 105 a potencial constante 051 V y a 25 ordmC El sistema se preacondicionoacute aplicando
el potencial de trabajo correspondiente durante 50 s una vez iniciada la lectura de
corriente se dejoacute equilibrar y se registroacute la corriente de base en esas condiciones
usualmente a los 300 s Luego se adicionoacute la cantidad necesaria de muestra de forma
de lograr la concentracioacuten final de analito deseada La corriente fue registrada y se
midioacute una vez que se estabilizoacute (aproximadamente a los 200 s del agregado) La
corriente cataliacutetica se evaluoacute como la diferencia entre la corriente final y la de base
Materiales y Meacutetodos
53
Cuando el tiempo de equilibrado no fue suficiente para que la corriente de base se
estabilizara se recurrioacute a realizar correcciones de liacutenea de base A tal fin se llevaron a
cero las corrientes de base aplicando los algoritmos que ofrece el programa GPES
versioacuten 49 provisto por Eco Chemie BV
4203 Voltamperometriacutea de onda cuadrada
Los experimentos de voltamperometriacutea de onda cuadrada se realizaron en solucioacuten
tampoacuten carbonatobicarbonato de potasio 100 mM (NH4)2SO4 25 mM NAD+ 05 mM
pH 105 y a 25 ordmC Los valores de escaloacuten de potencial utilizados fueron de 5 y 10 mV
Los valores de amplitud de pulso fueron de 25 y 50 mV Las frecuencias utilizadas
fueron de 8 10 20 30 40 60 y 70 Hz Especiacuteficamente se evitoacute utilizar 50 Hz
(frecuencia de la tensioacuten alterna de la liacutenea de alimentacioacuten) Los barridos de potencial
se realizaron desde -03 V hasta 10 V
Una vez registrado el blanco con medio Middlebrook 7H9 y se hicieron dos
agregados secuenciales de solucioacuten estaacutendar de glicerol 100 M obtenieacutendose una
concentracioacuten final de 25 y 50 mM respectivamente en la celda
421 Funcionalizacioacuten de nanotubos de carbono
Previo a la utilizacioacuten de los nanotubos de carbono se procedioacute a funcionalizarlos
realizando una carboxilacioacuten oxidativa Se siguioacute una comunicacioacuten personal del Dr
Joseacute Manuel Pingarroacuten del Departamento de Quiacutemica Analiacutetica Facultad de Ciencias
Quiacutemicas Universidad Complutense de Madrid A saber se pesaron aproximadamente
2 mg de MWCNT y se dispersaron en 2 mL en una mezcla de aacutecido sulfuacuterico aacutecido
niacutetrico 31 con agitacioacuten ultrasoacutenica durante 5 h Luego se diluyoacute la mezcla al 110
vertieacutendola suavemente en agua destilada enfriada en bantildeo de hielo para evitar
proyecciones Se eliminoacute el exceso de aacutecido centrifugando a 14000 rpm durante 30
min descartando el sobrenadante y dispersando el precipitado en agua destilada con
agitacioacuten ultrasoacutenica durante 30 min Esta operatoria se repitioacute 9 veces hasta que la
dispersioacuten de MWCNT en agua tuvo un pH cercano a la neutralidad (70 05) Los
MWCNT se secaron en desecador con sulfato de cobre anhidro y aplicando vaciacuteo al
sistema
Materiales y Meacutetodos
54
422 Programas de prediccioacuten de epiacutetopes lineales reconocidos por ceacutelulas B
4221 Base de datos de proteiacutenas
Se creo manualmente una base de datos para mejorar la exactitud de los resultados
Las proteiacutenas fueron seleccionadas de la base de datos de BciPep (Saha y col 2005)
HIV Molecular Immunology Database (disponible en httpwwwhivlanlgovcontent
immunologyindexhtml) o tomadas de la literatura VP1 (Wang y col 2011) proteiacutena
N (El-Manzalawy y col 2008) y Gliadina (Sweredoski amp Baldi 2009) El criterio de
seleccioacuten fue la confirmacioacuten experimental previa mediante ensayos de puntos de
inmunoadsorcioacuten ligado a enzima (ELIspot) o mediante el uso de paneles
multiespeciacuteficos de anticuerpos monoclonales que reconocen epiacutetopes lineales (Shin y
col 2005) Como resultado se seleccionaron 11 proteiacutenas de las que se obtuvieron un
total de 65 epiacutetopes lineales reconocidos por ceacutelulas linfociacuteticas tipo B
4222 Programas utilizados
Se utilizaron algunos programas para predecir los epiacutetopes lineales disponibles en
liacutenea gratuitamente Todos estos programas utilizan algoritmos matemaacuteticos con escalas
de propensioacuten yo datos experimentales de antigenicidad A menos que se indique lo
contrario cada programa se ejecutoacute utilizando los paraacutemetros por defecto Los
programas utilizados fueron AAPPred (Davydov amp Tonevitskii 2009) ABCpred
(Saha S amp Raghava 2006) BcePred (Saha y col 2005) BepiPred (Larsen y col
2006) y Antigenic (Kolaskar amp Tongaonkar 1990)
Los programas de prediccioacuten definen el grado de antigenicidad por medio de una
puntuacioacuten (score) en algunos casos para cada epiacutetope y en otros para cada residuo
amino aciacutedico En este uacuteltimo se puede definir una regioacuten antigeacutenica cuando varios
residuos con alta puntuacioacuten son adyacentes en la estructura primaria Por otra parte el
nuacutemero de epiacutetopes o regiones antigeacutenicas que los programas de prediccioacuten encuentran
depende de un umbral que es configurado por el usuario
423 Anaacutelisis de Datos
Los liacutemites de deteccioacuten (LD) y cuantificacioacuten (LC) se calcularon siguiendo las
sugerencias de Armbruster amp Pry (Armbruster amp Pry 2008) modificando la cantidad
de replicados utilizados para la obtencioacuten de los desviacuteos estaacutendar habieacutendose utilizado
10 reacuteplicas El caacutelculo del LD se realizoacute a partir del valor de corriente del blanco IB maacutes
Materiales y Meacutetodos
55
33 veces el valor del desviacuteo estaacutendar de la corriente leiacuteda (DSn1) de la muestra con
menor concentracioacuten de glicerol medida seguacuten
[41]
El valor del LC se calculoacute como
[42]
siendo m la pendiente de la curva de calibracioacuten
La capacidad de discriminacioacuten entre dos concentraciones diferentes de los
meacutetodos propuestos se evaluoacute como el error asociado a la estimacioacuten de la
concentracioacuten Ec calculada como
Nm
EE r
c
1
[43]
siendo Er el error relativo
424 Caacutelculos estadiacutesticos y disentildeo experimental
Para los caacutelculos estadiacutesticos se utilizaron los programas SigmaStat 32 (Sigma Plot
90 u 110) o Microcal Origin 80 en forma indistinta Para los caacutelculos de EJCR (regioacuten
eliacuteptica de confianza conjunta) se utilizoacute el programa Matlab con rutinas disentildeadas ―ad-
hoc
Resultados y Discusioacuten
Resultados y Discusioacuten
57
5 Resultados y discusioacuten
Para la obtencioacuten de antiacutegenos especiacuteficos de fase aguda de la toxoplasmosis se
comenzoacute seleccionando un conjunto de proteiacutenas denominadas P30 P22 y P35
mencionadas en la literatura como antiacutegenos de fase aguda (Harning y col 1996
Parmley y col 2000 Lu y col 2006) Sobre la base de estos estudios iniciales se
intentoacute identificar por medio de caacutelculos teoacutericos que regiones de estas proteiacutenas
conteniacutean mayor nuacutemero de epiacutetopes De este modo en la etapa siguiente se procurariacutea
expresarlos en forma soluble para su posterior utilizacioacuten en inmunoensayos Al
momento de seleccionar un programa de todos los disponibles ―on line verificamos
que eacutestos no informaban el valor predictivo positivo VPP Por ello se inicioacute un trabajo
de identificacioacuten del programa que predijera maacutes fidedignamente los epiacutetopes La
buacutesqueda se realizoacute comparando los resultados arrojados por 5 programas a los que se
solicitoacute prediccioacuten de epiacutetopes pertenecientes a 11 proteiacutenas cuyos epiacutetopes lineales
habiacutean sido perfectamente establecidos experimentalmente (Costa y col 2013) Se
analizoacute cuaacutel de ellos presentaba el mayor VPP (ver punto 61 seccioacuten Experimentos
Auxiliares) y para predecir epiacutetopes lineales se trabajoacute con este programa que resultoacute
ser AAPred
El anaacutelisis de los Ang seleccionados permitioacute identificar en P35 dos regiones que
concentraban los determinantes antigeacutenicos a las cuales se las denominoacute P35A y P35B
Los Ang P30 y P22 presentaban los determinantes antigeacutenicos distribuidos
homogeacuteneamente por lo tanto al momento de disentildear su clonado se tuvieron en cuenta
criterios que faciliten la expresioacuten y solubilidad mas allaacute de la antigenicidad
51 Evaluacioacuten de antiacutegenos recombinantes de T gondii
511 Antiacutegeno P30
El antiacutegeno de superficie 1 de T gondii SAG1 tambieacuten denominado proteiacutena P30
se ha identificado como antiacutegeno de fase aguda (Harning y col 1996) por lo cual se
procuroacute obtenerlo en forma soluble Sobre la base de ensayos previos realizados en el
LTI se continuoacute con la obtencioacuten y purificacioacuten de dos porciones del antiacutegeno P30
denominadas P30L y P30C (seccioacuten 410 Materiales y Meacutetodos) Luego de la cosecha
y lisis de las bacterias se separaron las fracciones soluble e insoluble del extracto se
tomaron aliacutecuotas de ambas y se analizaron por SDS-PAGE Los Angs buscados soacutelo se
Resultados y Discusioacuten
58
obtuvieron como proteiacutenas precipitadas en cuerpos de inclusioacuten en la fraccioacuten insoluble
Por ello se discontinuoacute el trabajo con las fracciones de P30
512 Antiacutegeno P22
El antiacutegeno de superficie 2 o antiacutegeno P22 de T gondii (Gen Bank ndeg M33572) ha
sido tambieacuten identificado como antiacutegeno de fase aguda (Parmley y col 1992 Lau amp
Fong 2006) En el presente trabajo se procuroacute amplificar la regioacuten del gen que
permitiese expresar la proteiacutena recombinante en forma soluble El producto de
amplificacioacuten se resolvioacute en un gel de agarosa tentildeido con bromuro de etidio como se
observa en la Fig 51
Figura 51 Gel de agarosa tentildeido con bromuro de etidio en transiluminador UV En PCR1 se observan los
productos de amplificacioacuten obtenidos utilizando cebadores especiacuteficos para la regioacuten P22C donde se
sentildeala el fragmento de tamantildeo esperado Control (-) muestra la misma mezcla de reaccioacuten pero sin ADN
molde MPM indica el marcador de peso molecular y el tamantildeo de los fragmentos se indica sobre la
derecha
Se aisloacute y purificoacute el fragmento de intereacutes utilizando un equipo comercial detallado
en el punto 48 seccioacuten Materiales y Meacutetodos En un paso posterior se ligoacute al vector
pET32a y con la construccioacuten resultante se transformaron ceacutelulas competentes de E
coli Las ceacutelulas transformadas se seleccionaron crecieacutendolas en medio LB con
ampicilina Se verificaron las condiciones para la expresioacuten en forma soluble (punto
410 seccioacuten Materiales y Meacutetodos) encontraacutendose que las condiciones oacuteptimas eran
01 mM IPTG y 12 h de incubacioacuten con agitacioacuten vigorosa
Para la induccioacuten preparativa se siguioacute el protocolo detallado en la seccioacuten 410 de
Materiales y Meacutetodos La Fig 52 muestra la fotografiacutea de un gel de poliacrilamida
luego de la tincioacuten donde se analizaron aliacutecuotas de todos los extractos obtenidos en los
distintos pasos separativos de la proteiacutena P22C
Resultados y Discusioacuten
59
Figura 52 Gel de poliacrilamida tentildeido con azul brillante de Coomassie En cada calle se sembraron 1
microL de muestra EC indica el extracto crudo P1 muestra la fraccioacuten insoluble del lisado celular P2 la
fraccioacuten insoluble luego del congelamiento-descongelamiento del extracto centrifugado FT muestra el
extracto que pasoacute por la columna Con L se indican las calles con las fracciones de lavados sucesivos con
tampoacuten imidazol 0 mM 20 mM 50 mM y 100 mM respectivamente E muestra las fracciones de
elucioacuten con solucioacuten imidazol 250 mM Las fracciones de elucioacuten recolectadas fueron de 15 mL cada
una
513 Antiacutegeno P35
El antiacutegeno de superficie P35 de T gondii (Gen Bank ndeg AF01275) se ha
identificado como antiacutegeno de fase aguda y distintas porciones del mismo presentan
diferentes desempentildeos en su uso diagnoacutestico (Lu y col 2006) Sobre la base de
ensayos previos realizados en el LTI se continuoacute con la obtencioacuten y purificacioacuten de las
dos porciones del antiacutegeno P35 denominadas P35A y P35B
Se ensayoacute la expresioacuten del antiacutegeno P35A (punto 49 seccioacuten Materiales y
meacutetodos) y soacutelo se obtuvo como cuerpos de inclusioacuten en la fraccioacuten insoluble Si bien
fue posible disolver las proteiacutenas recombinantes en urea 8 M al dializar volviacutean a
precipitar
El antiacutegeno P35B se pudo obtener en forma soluble y las condiciones oacuteptimas
encontradas para la induccioacuten del mismo fueron IPTG 1 mM y 4 h con agitacioacuten
vigorosa La Fig 53 muestra una imagen del gel de poliacrilamida luego de la corrida
electroforeacutetica y su tincioacuten Se observoacute que una banda de la fraccioacuten soluble estaba
sobreexpresada en los cultivos inducidos
Resultados y Discusioacuten
60
Figura 53 Gel de poliacrilamida al 12 en condiciones desnaturalizantes Se muestra lo obtenido para
aliacutecuotas de dos cultivos no inducidos 1 y 2 y dos inducidos 3 y 4 Con P se designan las fracciones
insolubles en la solucioacuten de lisis y con SN las fracciones solubles Las bandas que se observan del MPM
corresponden a fragmentos de 19445 KDa 28829 KDa 36545 KDa 49491 KDa 80664 KDa
103035 KDa Se indica la banda sobreexpresada de tamantildeo esperado
Para la induccioacuten preparativa del antiacutegeno P35B se siguioacute el protocolo descripto en
el punto 410 seccioacuten Materiales y Meacutetodos En la Fig 54 se muestra un gel de
poliacrilamida luego de la tincioacuten donde se analizaron aliacutecuotas de todos los extractos
obtenidos en los distintos pasos separativos
Figura 54 Gel de poliacrilamida tentildeido con azul brillante de Coomassie En cada calle se sembraron 7
microL de muestra P1 fraccioacuten insoluble del lisado celular P2 fraccioacuten insoluble luego del congelamiento-
descongelamiento del extracto centrifugado FT muestra el extracto que pasoacute por columna L calles con
las fracciones de lavados sucesivos con tampoacuten imidazol 20 mM 50 mM y 100 mM respectivamente E
fracciones de elucioacuten con solucioacuten imidazol 250 mM Las fracciones recolectadas fueron de 15 mL cada
una
En consecuencia se continuoacute el trabajo con P35B y se descartoacute transitoriamente la
utilizacioacuten del Ang P35A
52 Marcado de antiacutegenos recombinantes de T gondii
Para los ensayos tipo ELISA de captura especiacuteficos para IgM se propuso utilizar
como sistema revelador la enzima HRP-EAV que se une especiacuteficamente a biotina En
consecuencia se procedioacute a marcar los Ang solubles obtenidos con biotina
P35B
P1 P2 P3 P4 MPM
Inducido No Inducido
SN1
Inducido No Inducido
SN2 SN3 SN4
Resultados y Discusioacuten
61
La reaccioacuten de conjugacioacuten se realizoacute siguiendo el protocolo mencionado en el
punto 413 seccioacuten Materiales y Meacutetodos La conjugacioacuten se evidencioacute con la reaccioacuten
de color indicada en el inciso 413 En la Fig 55 se muestra la membrana de
nitrocelulosa sobre la que se fijaron las proteiacutenas P22 y P35B luego del revelado
cromogeacutenico con la enzima HRP conjugada a streptavidina Las reacciones de
conjugacioacuten se llevaron adelante por separado
Figura 55 Membranas de nitrocelulosa evidenciando las proteiacutenas P35B conjugada (izquierda) y P22C
conjugada (derecha)
53 Inmunoensayos
Estudios preliminares (ver punto 62 seccioacuten Experimentos Auxiliares) con los
antiacutegenos recombinantes obtenidos permitieron verificar por ELISA indirecto que sueros
confirmados positivos arrojaban resultados positivos mientras que los sueros negativos
daban el ensayo negativo Se procedioacute entonces a evaluar la capacidad de los antiacutegenos
obtenidos para discriminar sueros de pacientes con infeccioacuten aguda de sueros provenientes
de pacientes con infeccioacuten croacutenica
531 Inmunoensayos con deteccioacuten fotomeacutetrica
Como se anticipoacute en la introduccioacuten se realizaron ELISA siguiendo dos
alternativas de captura En la primera alternativa que denominamos A se procuroacute
capturar selectivamente la maacutexima cantidad de Ac del isotipo que se deseaba detectar
(IgMh) adsorbiendo sobre la placa un anticuerpo ―ad-hoc (Ac-a-IgMh) En la segunda
alternativa que denominamos B se buscoacute capturar con el Ang recombinante la maacutexima
cantidad de Ac especiacuteficos independientemente del isotipo que se tratara En el paso
siguiente del esquema B se tomoacute ventaja de la mayor valencia de las IgM respecto de
las IgG para el revelado
5311 Evaluacioacuten del esquema A
Sobre placas de ELISA se capturaron los Acs IgMh revelaacutendose la presencia de los
especiacuteficos con los antiacutegenos obtenidos marcados con biotina y uniendo a estos uacuteltimos la
enzima HRP-EAV En los ensayos preliminares (ver punto 622 seccioacuten Experimentos
Auxiliares) se identificoacute la cantidad de antiacutegeno marcado y las diluciones de HRP-EAV
oacuteptimas a utilizar para revelar la presencia de IgM especiacutefica capturada En la Tabla 51 se
Resultados y Discusioacuten
62
muestran los valores de absorbancia a 450 nm obtenidos para el panel de 9 sueros
ensayados Se utilizaron 5 g de P22C-biotina por pocillo y 100 L de HRP-EAV en
dilucioacuten 12000
Tabla 51 Absorbancias a 450 nm obtenidas en los ELISA siguiendo el esquema de captura A descrito
maacutes arriba
Placa 1 Placa 2
Agudos
0100 0158
0311 0273
0140 0165
Croacutenicos
0281 0322
0256 0278
0260 0226
Negativos
0217 0168
0235 0179
0409 0354
Sin suero
0135 0134
0143 0114
0126 0100
Sin suero
Sin
P22cBiotina
0071 0050
0070 0037
0047 0040
Los resultados obtenidos con ambos antiacutegenos fueron desalentadores (los resultados
obtenidos con P35B biotina no se informan) ya que no se hallaron diferencias
significativas entre los valores de absorbancia obtenidos con sueros de pacientes
agudos croacutenicos y negativos
5312 Esquema B
En base a los resultados obtenidos en la seccioacuten anterior se orientaron los ensayos
realizando los ELISA siguiendo un esquema no claacutesico al que denominamos B
Debido a la baja sensibilidad que presentaron los Angs conjugados a biotina para
detectar los Acs especiacuteficos pensamos en hacer una primera etapa de concentracioacuten de
los Acs especiacuteficos en la placa para luego revelar con el Ang conjugado a biotina Esto
se hizo adsorbiendo antiacutegeno recombinante sobre la superficie de la placa de
poliestireno enfrentaacutendola luego al suero a ensayar Asiacute se captura selectivamente las
inmunoglobulinas que reconocen al antiacutegeno ya sean IgM o IgG Luego se expone la
placa al mismo antiacutegeno recombinante pero ligado a biotina que se uniraacute a los
anticuerpos especiacuteficos para dicho Ang previamente capturados Finalmente se revela
Resultados y Discusioacuten
63
con HRP conjugada a streptavidina que forma un complejo estable con biotina De esta
forma se aumenta la cantidad de Ang marcado en mayor proporcioacuten para IgM que para
IgG dada la multivalencia de este isotipo de inmunoglobulina En la Fig 56 se
reproduce el esquema B que fue el que brindoacute los resultados maacutes promisorios
Antiacutegeno (Ang) Bloqueante Ang ligado a biotina Reactivo de color
IgM a-Ang IgG a-Ang streptavidina conjugada a HRP
Figura 56 Esquema de ensayo ELISA de captura tipo B El antiacutegeno expuesto en la placa captura la
porcioacuten de las IgM e IgG especiacuteficas presentes en el suero humano Haciendo uso de la polivalencia de
las IgM su presencia se revela con el antiacutegeno conjugado a biotina streptavidina ligada a HRP
adicionando el sustrato de la enzima y un cromoacutegeno actuando como cosustrato
Buscando diferenciar sueros de pacientes en fase de infeccioacuten aguda (agudos) de
sueros provenientes de pacientes sin infeccioacuten (negativos) En la Tabla 52 se muestran los
valores de absorbancia a 450 nm obtenidos
Tabla 52 Absorbancias a 450 nm obtenidas en los ELISA siguiendo el esquema de captura B
Ang
Sueros P35B 05ug P35B 001ug P22C 05ug P22C 001ug
Agudos 2131 1567 0335 0296
1849 1311 065 0413
Negativos 176 1350 0282 0327
1025 1676 0262 0325
Sin suero 1658 1658 0174 0149
1812 1504 0130 0144
Sin Ang
conjugado
0055 004 0041 0045
0057 0042 0039 004
Resultados y Discusioacuten
64
Este ensayo exploratorio demostroacute que los antiacutegenos P22C y P35B pueden ser usados
potencialmente en la deteccioacuten de toxoplasmosis aguda realizando inmunoensayos con el
esquema B propuesto en el presente trabajo Por ello siguiendo este esquema de trabajo se
exploraron cuales eran las condiciones oacuteptimas (ver punto 623 seccioacuten Experimentos
Auxiliares) Asiacute se establecioacute la dilucioacuten de la enzima HRP-EAV (12000) la cantidad de
P22C biotina (5 microg por pocillo) y se acotaron los valores de P22C adsorbidos inicialmente
en la placa entre 500 y 50 ng Finalmente se realizaron tres ensayos en paralelo donde se
evaluoacute la cantidad de antiacutegeno adsorbido inicialmente en la placa y se amplioacute el panel de
sueros Los resultados obtenidos se muestran en la Fig57
Figura 57 Absorbancias a 450 nm para los ELISA realizados con el esquema B (A) 50 ng de Ang P22C
(B) 200 ng de Ang P22C (C) 500 ng de Ang P22C Con se indican los sueros provenientes de
pacientes con infeccioacuten aguda (Agudos) con los provenientes de pacientes con infeccioacuten croacutenica
(Croacutenicos) y con los de pacientes sin infeccioacuten (Negativos) Con la liacutenea roja ( ) se indica el valor
de media menos tres desviacuteos estaacutendares de los agudos (AbsA ndash 3 DSA) y con la liacutenea verde ( ) el valor
de media maacutes tres desviacuteos estaacutendares de los croacutenicos (AbsC +3 DSC)
Resultados y Discusioacuten
65
En las tres condiciones evaluadas se obtiene una separacioacuten de las sentildeales obtenidas al
ensayar sueros provenientes de los pacientes con infeccioacuten aguda (Agudos) de los sueros
provenientes de pacientes con infeccioacuten croacutenica (Croacutenicos) y los pacientes sin infeccioacuten
(Negativos)
Los resultados obtenidos con P35B no resultaron alentadores debido al elevado ruido
de fondo (altos valores de absorbancia de los blancos) Por lo tanto los ensayos
electroquiacutemicos se iniciaron soacutelo con P22C
Mijak y colaboradores (Hiszczyntildeska-Sawicka y col 2005) sentildealan que ya se ha
demostrado la utilidad del Ang SAG2 para detectar IgG en el suero de pacientes con
toxoplasmosis aguda y croacutenica (Parmley y col 1992) destacando que en los resultados
presentados por ese mismo grupo en otra publicacioacuten (Li y col 2000a) soacutelo se examinaron
un reducido nuacutemero de sueros provenientes de pacientes con infeccioacuten aguda con
resultados tanto positivos como negativos Tambieacuten sentildeala que Maine y colaboradores
(Aubert y col 2000) no obtuvieron resultados satisfactorios con este antiacutegeno
recombinante realizando ELISA indirecto Los resultados obtenidos en este trabajo con
ELISA utilizando el esquema A han confirmado lo sentildealado por Mijak y col sobre el
desempentildeo de este Ang El anaacutelisis que estos autores hacen se orienta a que el uso de estos
antiacutegenos recombinantes debe contemplar necesariamente el uso combinado de otros Angs
Por otro lado en el presente trabajo se han presentado resultados que permitiriacutean
complementar esta visioacuten incorporando otro esquema para la deteccioacuten de sueros de
infectados agudos Si bien es necesario ampliar el nuacutemero de sueros para validar el ensayo
los resultados son promisorios Hemos propuesto que las diferencias obtenidas en los
ELISA de captura siguiendo el esquema B pueden deberse a dos mecanismos no
excluyentes entre si y que podriacutean estar actuando en conjunto Por un lado estaacute la
multivalencia que presentan las IgM respecto de las IgG que generariacutea una amplificacioacuten
selectiva de acuerdo al isotipo Por otro lado independientemente del isotipo capturado el
Ang de fase aguda brindariacutea la sensibilidad y especificidad necesaria al ensayo
identificando Acs de fase aguda Resta pues esclarecer si esto es asiacute fehacientemente o si
hay alguacuten otro mecanismo actuando concomitante que permita explicar las diferencias
observadas aquiacute entre sueros de fase aguda y de infectados croacutenicos
Resultados y Discusioacuten
66
532 Inmunoensayos con deteccioacuten amperomeacutetrica utilizando los antiacutegenos
recombinantes
Los bioelectrodos se ensamblaron como se describe en el inciso 41911 de
Materiales y Meacutetodos Al realizar los inmunoensayos con las diluciones pertinentes de
suero humano (muestra incoacutegnita) en caso de suero de paciente infectado (+) estaraacuten
presentes los anticuerpos IgG anti-P22 (analito de intereacutes) Cuando se sumergen en una
dilucioacuten de anticuerpos anti-IgG h conjugado con HRP (segundo anticuerpo marcado) eacuteste
quedaraacute retenido en el electrodo y frente al agregado del sustrato de la enzima (H2O2)
sobre PBS conteniendo el mediador FcMe se genera la especie que seraacute electro-reducida
sobre el electrodo al potencial de trabajo 008 V (vs AgAgCl ver inciso 420 2) A los
fines de claridad en la Fig 58 se reformula el esquema de funcionamiento del biosensor
previamente esquematizado (Fig 212) para el caso particular aquiacute detallado donde el
Ang es la proteiacutena P22C
Proteiacutena recombinante IgG a-IgGh conjugada a HRP
Bloqueante IgG humana ferrocenometanol
Figura 58 Sobre la superficie del electrodo se fija la proteiacutena P22C que capturaraacute los anticuerpos especiacuteficos
si estaacuten presentes en el suero El revelado se realiza con un segundo anticuerpo especiacutefico para IgG humana
marcado con HRP que en presencia de H2O2 oxida el mediador FcMe que se reduce sobre la superficie del
electrodo generando la sentildeal analiacutetica
En la Fig 59 se muestran tres amperogramas representativos obtenidos cuando se
ensayaron sueros confirmados (+) sueros confirmados (-) y blancos (sin suero alguno)
Los valores de corrientes se corrigieron por los valores de aacuterea reales determinados
mediante voltametriacutea ciacuteclica a distintas velocidades de soluciones de ioacuten ferricianuro
(punto 41932 seccioacuten Materiales y Meacutetodos)
Resultados y Discusioacuten
67
Figura 59 Amperometriacuteas comparativas con bioelectrodos ensamblados con la proteiacutena P22C
En la Tabla 54 se resumen los resultados de los ensayos sobre muestras confirmadas
positivas negativas y blanco
Tabla 54 Valores promedios de la corriente cataliacutetica diferencial obtenidas utilizando bioelectrodos
ensamblados con el antiacutegeno P22C
DS desviacioacuten estaacutendar
Las diferencias en las sentildeales registradas fueron estadiacutesticamente significativas
verificaacutendose la potencialidad del uso de esta metodologiacutea para discriminar entre sueros de
pacientes infectados con T gondii de sueros de pacientes no infectados Los ensayos
electroquiacutemicos preliminares informados permiten pensar en el desarrollo de un biosensor
amperomeacutetrico A futuro seriacutea deseable poder establecer un biosensor electroquiacutemico
basaacutendonos en el esquema B de los ELISA presentados en este trabajo de Tesis que
permita la discriminacioacuten entre sueros de pacientes cursando infeccioacuten aguda de sueros de
pacientes con infeccioacuten croacutenica
54 Determinacioacuten de la actividad electroquiacutemica del glicerol en medio acuoso
Si bien desde hace varios antildeos se ha estudiado la oxidacioacuten electrocataliacutetica de
polialcoholes auacuten no existe acuerdo acerca del procedimiento maacutes conveniente para su
cuantificacioacuten electroquiacutemica asiacute como tampoco ha sido posible identificar un uacutenico
mecanismo que deacute cuenta de los productos obtenidos luego de la reaccioacuten electroacutenica
(Kahyaoglu et al 1984 Kwon amp Koper 2010)
Muestra j = Icaacuterea
( A cm-2
)
DS
( A cm-2
)
Positivos -0455 0026
Negativos -0150 0021
Sin suero -0052 004
Resultados y Discusioacuten
68
Con el fin de encontrar el electrodo y las condiciones maacutes convenientes para
realizar la cuantificacioacuten del glicerol se realizaron ensayos exploratorios de
voltametriacuteas ciacuteclicas utilizando electrodos de carbono viacutetreo pasta de C (grafito y
viacutetreo) Au Pt y Ag Los medios ensayados fueron HClO4 01 M solucioacuten tampoacuten de
fosfato salino (PBS) pH 72 90 120 NaCl al 08 mv y NaOH 01 M El intervalo
de concentracioacuten de glicerol utilizado fue de 100 x 10-5
M hasta 01 M
En estos ensayos iniciales las maacuteximas sentildeales se obtuvieron con electrodos de Au
en medio alcalino (NaOH 01 M) coincidiendo con lo descripto por Lamy (Kahyaoglu
et al 1984) A modo ilustrativo en la Fig 510 se observan dos voltametriacuteas ciacuteclicas
para electrodos de oro y de platino en medio alcalino
Figura 510 Voltamperogramas tiacutepicos para soluciones de glicerol 10-2
M en soluciones de base fuerte
(NaOH 01M) utilizando electrodos de trabajo de Au (izquierda) y Pt (derecha)
En una etapa posterior se verificoacute que las sentildeales obtenidas Ip respondiacutean
proporcionalmente a la concentracioacuten de glicerol Se realizoacute una curva de calibracioacuten en
el intervalo de concentraciones de 50 x 10-4
a 10 x 10-2
M Todas las mediciones se
hicieron por triplicado La Tabla 55 muestra las medias de las corrientes de pico
obtenidas para cada concentracioacuten ensayada con su correspondiente desviacuteo estaacutendar La
corriente de pico se midioacute tomando una liacutenea de base recta a un valor de potencial de
010 V plusmn 005 V usando algoritmos propios del programa GPES 49
Tabla 55 Valores medios de corriente obtenidos por voltametriacutea ciacuteclica para la oxidacioacuten del
glicerol en medio alcalino (NaOH 01 M) sobre electrodos de oro
[Glicerol]
(mM)
Ip
(microA cm-2
)
DS Ip
(microA cm-2
)
050 18 032
100 28 038
200 74 041
500 17 035
750 262 055
100 347 053
-50E-05
00E+00
50E-05
10E-04
15E-04
20E-04
25E-04
-0400 -0200 0000 0200 0400 0600 0800
E(V)
i(A
)
-40E-06
00E+00
40E-06
80E-06
12E-05
16E-05
-1000 -0800 -0600 -0400 -0200 0000 0200 0400
E(V)
i(A
)
Resultados y Discusioacuten
69
En la Fig 511 se presenta la dependencia de la corriente de pico
voltamperomeacutetrica con la concentracioacuten de glicerol Las barras de error corresponden a
las desviaciones estaacutendar de cada medida realizada por triplicados independientes Se
ajustaron estos valores a una recta con el meacutetodo de los miacutenimos cuadrados y se obtuvo
la siguiente ecuacioacuten
[51]
donde IpA estaacute en microA cm-2
y [glicerol] en mM El valor de coeficiente de regresioacuten
(R2) obtenido fue de 09980
Figura 511 Dependencia de la corriente de pico voltamperomeacutetrica con la concentracioacuten de glicerol en
medio alcalino (NaOH 01 M) Se muestran los valores promedios de tres medidas independientes Las
barras de error se corresponden a los desviacuteos estaacutendares
En estas condiciones de trabajo el pico de corriente oxidativa tiene dependencia
lineal con la concentracioacuten de glicerol En funcioacuten de estos resultados se orientoacute la
buacutesqueda hacia una metodologiacutea que permitiese determinar al glicerol en
concentraciones de 10-5
M o menores Para esto iniciamos ensayos con teacutecnica
amperomeacutetrica
Se realizaron los ensayos amperomeacutetricos como se describe en el punto 4202 de la
seccioacuten Materiales y Meacutetodos La Fig 512 muestra el resultado de una amperometriacutea
tiacutepica para una solucioacuten de glicerol
Resultados y Discusioacuten
70
t s
0 50 100 150 200 250 300 350 400 450
I A
0
2
4
6
Figura 512 Amperometriacutea tiacutepica de una muestra con glicerol (concentracioacuten en celda 1 mM) Se dejoacute
estabilizar la corriente para una solucioacuten de NaOH 01 M y a los 50 segundos se realizoacute el agregado de la
muestra con glicerol y se midioacute la corriente hasta los 400 segundos
Se ensayaron soluciones de glicerol cuya concentracioacuten en la celda electroliacutetica
fueron desde 001 mM hasta 5 mM Como blanco se utilizoacute solucioacuten de NaOH 01 M
La corriente cataliacutetica se midioacute como la diferencia entre la corriente final y la inicial
(punto 4202 seccioacuten Materiales y Meacutetodos) A este valor de corriente se lo dividioacute
por el valor de aacuterea real del electrodo medida anteriormente esta densidad de corriente
(IcA) se tomoacute como la sentildeal analiacutetica En la Tabla 56 se muestran las medias de las
sentildeales obtenidas para cada concentracioacuten de glicerol ensayada con su correspondiente
desviacuteo estaacutendar
Tabla 56 Valores medios de densidades de corriente obtenidos por amperometriacutea para la oxidacioacuten de
glicerol en medio alcalino (NaOH 01 M)
[Glicerol]
(mM)
Ic A
( A cm-2
)
DS
( A cm-2
)
0000 0447 0029
0010 0763 0016
0025 1098 0068
0050 1510 0055
0100 285 049
0250 609 036
0500 1245 033
0750 1730 0097
100 2361 0099
150 3445 033
175 3997 020
200 4613 045
Resultados y Discusioacuten
71
En la Fig 513 se presenta la recta de regresioacuten lineal obtenida a partir de los
valores promedio de densidades de corriente para soluciones de glicerol en el intervalo
de concentraciones de 0025 mM y 2 mM Las barras de error corresponden a las
desviaciones estaacutendares de cada medida La ecuacioacuten de la recta obtenida por el meacutetodo
de miacutenimos cuadrados fue
[52]
Donde IcA estaacute en microA cm-2
y [Glicerol] en mM el valor del coeficiente de
regresioacuten (R2) obtenido fue de 09950
[Glicerol] mM
000 025 050 075 100 125 150 175 200
I cA
m
A c
m-2
0
10
20
30
40
50
Figura 513 Curva de calibracioacuten obtenida para glicerol en medio alcalino (NaOH 01 M) con la teacutecnica
amperomeacutetrica Se muestran los valores promedios de tres medidas independientes para cada solucioacuten
Las barras de error que se muestran corresponden al DS de cada punto
Las cifras de meacuterito para esta teacutecnica resultaron ser
Liacutemite de deteccioacuten 10 M
Liacutemite de cuantificacioacuten 24 M
Liacutemite de discriminacioacuten 10 M
Intervalo de linealidad 0024 mM ndash 200 mM
55 Cuantificacioacuten de glicerol en medios acuosos complejos
El glicerol es corrientemente utilizado como principal fuente de carbono en cultivos
bacterianos siendo degradado eficientemente por sistemas enzimaacuteticos que utilizan
mecanismos redox Por lo tanto se comenzoacute a estudiar la posible cuantificacioacuten
electroquiacutemica de este alcohol intentando detectar concentraciones del orden 10-5
M o
Resultados y Discusioacuten
72
menores para poder asiacute evidenciar su consumo en medios de cultivos bacterianos que
contienen glicerol como nutriente El meacutetodo amperomeacutetrico con electrodo de oro no
fue lo suficientemente selectivo para glicerol cuando este se encontraba en matrices
complejas (no se muestran los resultados) por lo tanto al momento de cuantificarlo en
medios de cultivos bacterianos tuvimos que optar por otra metodologiacutea
Sobre la base del trabajo de Tuntildeoacuten-Blanco y col (Aacutelvarez-Gonzaacutelez et al 2000)
se busco desarrollar un biosensor selectivo para este analito
Para verificar la funcionalidad del modelo propuesto se realizaron ensayos
espectrofotomeacutetricos La coenzima NAD(H) en su forma reducida (NADH) presenta un
maacuteximo de absorcioacuten a 340 nm ausente en la forma oxidada (NAD+) Puede apreciarse
en la Fig 514 que el mediador electroquiacutemico Fe(CN)63-
presenta un maacuteximo de
absorcioacuten a 420 nm ausente en la forma reducida Fe(CN)64-
En un primer ensayo se
verificoacute espectrofotomeacutetricamente que la longitud de onda escogida podiacutea utilizarse
para el seguimiento de la reaccioacuten En una serie de ensayos posteriores se monitoreoacute la
reaccioacuten enzimaacutetica en presencia y ausencia del mediador electroquiacutemico haciendo uso
de estas propiedades espectrales
Figura 514 Espectros de absorcioacuten UV-visible para las especies Fe(CN)33-
1 mM y Fe(CN)34-
1 mM
Ambas especies fueron disueltas en solucioacuten tampoacuten carbonato pH 105 Puede apreciarse claramente que
el maacuteximo de absorcioacuten a 420 nm presente en el Fe(CN)63-
se encuentra ausente en el Fe(CN)64-
La
velocidad de barrido fue 1200 nm min-1
551 Evaluacioacuten del modelo propuesto por medio de lecturas
espectrofotomeacutetricas
El primer ensayo para validar el modelo propuesto fue seleccionar la longitud de
onda oacuteptima para el seguimiento espectrofotomeacutetrico A tal fin se llevaron adelante dos
0
025
05
075
1
125
15
175
2
225
25
275
260 280 300 320 340 360 380 400 420 440 460 480 500
Longitud de onda (nm)
Ab
sorb
an
cia
Ferricianuro 1 mM
Ferrocianuro 1 mM
Resultados y Discusioacuten
73
reacciones a) glicerol disuelto en medio 7H9 coenzima Fe(CN)63-
y enzima GlDH y
b) glicerol disuelto en medio 7H9 coenzima Fe(CN)63-
pero sin la enzima GlDH En
ambos casos se realizoacute un barrido espectral de 320 a 480 nm registraacutendose la
absorbancia a una velocidad de barrido de 1200 nm min-1
cada 10 min Ambas
reacciones se llevaron a cabo en solucioacuten tampoacuten carbonato pH 105 En la Fig 515 se
muestran los barridos espectrales obtenidos para cada reaccioacuten y en ella puede
apreciarse que la mayor diferencia se presenta a la longitud de onda prevista (420 nm)
Figura 515 Espectros de absorcioacuten UV-visible para mezclas de reaccioacuten (A) En presencia de enzima
GlDH (B) Sin enzima GlDH Barrido espectral cada 10 min
Para elucidar si el consumo de Fe(CN)63-
observado se correspondiacutea
cuantitativamente con el NADH generado y en consecuencia con el glicerol
consumido se tuvieron en cuenta las siguientes reacciones
glicerol + Fe(CN)63-
DHA + Fe(CN)64-
(1)
glicerol + NAD+ NADH + DHA (2)
Se realizaron series de 3 reacciones en paralelo a saber a) blanco de reaccioacuten (BR)
con enzima GlDH NAD+ y Fe(CN)6
3- en ausencia de glicerol donde se siguioacute la
absorbancia a 420 nm b) reaccioacuten (1) con enzima GlDH NAD+ Fe(CN)6
3- y glicerol
donde se siguioacute la desaparicioacuten de Fe(CN)63-
a 420 nm c) reaccioacuten (2) con enzima
GlDH NAD+ y glicerol donde se siguioacute la aparicioacuten de NADH a 340 nm Debe tenerse
en cuenta por un lado que el NAD+ es reducido a NADH en la reaccioacuten (2) no se
regenera mientras que en la reaccioacuten (1) se regenera por la presencia del anioacuten
Fe(CN)63-
Esto implica que si bien ambas reacciones se lentifican con el paso del
tiempo a causa del consumo de glicerol (y acumulacioacuten de DHA) la reaccioacuten (2) se
lentifica maacutes que la (1) porque se consumen tanto el glicerol como el NAD+
y se
acumulan ambos productos de reaccioacuten (DHA y NADH) Los resultados pueden verse
en la Fig 516
A
0
015
03
045
06
075
09
105
12
135
15
320 340 360 380 400 420 440 460 480
Longitud de onda (nm)
Ab
sorb
an
cia
t = 0
t = 10 min
t = 20 min
t =30 min
t = 40 min
t = 50 min
t = 60 min
B
0
015
03
045
06
075
09
105
12
135
15
320 340 360 380 400 420 440 460 480
Longitud de onda (nm)
Ab
sorb
an
cia
t = 0 min
t = 10 min
t = 20 min
t = 30 min
t = 40 min
t = 50 min
t = 60 min
GlDHNAD+
GlDH
Resultados y Discusioacuten
74
Figura 516 Absorbancias registradas a 420 nm durante las reacciones descriptas en el texto A) Blanco
de reaccioacuten (BR) y reaccioacuten (1) B) Reaccioacuten (2) C) Segmento inicial de la curva representada en
B) a partir de la cual se calculoacute el valor liacutemite de la velocidad inicial de reaccioacuten Se muestra un
experimento representativo de un original y replicado
Se asumioacute que la reaccioacuten (1) transcurre a una velocidad constante en las
condiciones en que se llevoacute a cabo El anaacutelisis estadiacutestico demuestra que hay una ligera
tendencia a la no linealidad evidenciada por la distribucioacuten de los residuos No
obstante siendo las variancias iguales se consideroacute que no hay un alejamiento
significativo de la linealidad Por ello en los caacutelculos de variacioacuten de la concentracioacuten
de coenzima a lo largo del tiempo de reaccioacuten se tuvo en cuenta el cambio que se
produciriacutea si la velocidad de reaccioacuten se mantuviera constante e igual a la velocidad
inicial Para el caso del NAD+ consumido (o NADH generado) en la reaccioacuten (2)
tenemos
[53]
Asumiendo que en el intervalo de concentraciones de trabajo se cumple la ley de
Beer la ec [53] puede reescribirse como
[54]
Si la velocidad de la reaccioacuten enzimaacutetica se mantiene aproximadamente igual a la
velocidad inicial por la regeneracioacuten de la coenzima se puede admitir que la velocidad
A
05
056
062
068
074
08
086
092
098
104
11
0 600 1200 1800 2400 3000 3600
tiempo (s)
Ab
s 4
20
nm
B
0
004
008
012
016
02
024
028
032
036
04
044
048
0 600 1200 1800 2400 3000 3600tiempo (s)
Ab
s 3
40
nm
C
y = 00004405x
R2 = 09983921
0
0035
007
0105
014
0175
021
0 60 120 180 240 300 360 420 480
tiempo (s)
Ab
s 3
40
nm R
2 = 09984
Resultados y Discusioacuten
75
de reaccioacuten es constante (reaccioacuten de orden cero para los reactivos) pudieacutendose expresar
la ec [54] en la siguiente forma
b
k
tb
tk
tb
Abs
nmNADHnmNADHnmNADH
nm
340340340
340 [55]
donde k es la constante de velocidad para esa reaccioacuten en unidades de absorbancia por
unidad de tiempo (s-1
) y se obtiene como la pendiente del segmento lineal de la curva de
la Fig 516 B presentado en la Fig 516 C
La variacioacuten de concentracioacuten total de coenzima se obtiene multiplicando el valor
de velocidad por la variacioacuten de tiempo total
[56]
siendo los valores de los paraacutemetros y variables en cuestioacuten
εNADH 340nm = 6220 M-1
cm-1
Δt = 3600 s
b = 1 cm
k = 44 x 10-4
s-1
resultando
[57]
La variacioacuten de concentracioacuten del mediador seraacute
[58]
nmCNFe 420)( 36
= 1080 M-1
cm-1
ΔAbs420nm = 052
que reemplazando en la ec [58] arroja
M [59]
La variacioacuten de absorbancia observada en el blanco de reaccioacuten a lo largo de una
hora fue de 00046 unidades de absorbancia que representa menos del 1 de la
variacioacuten total observada en la reaccioacuten (1) Estos resultados permiten verificar que en
las condiciones de reaccioacuten el Fe(CN)63-
reducido a Fe(CN)64-
equivale
cuantitativamente al NADH generado en la reaccioacuten enzimaacutetica de acuerdo a la
siguiente estequiometriacutea
Resultados y Discusioacuten
76
2 Fe(CN)63-
+ NADH 2 Fe(CN)64-
+ NAD+ [510]
Lo mostrado corrobora la factibilidad del disentildeo de un biosensor de una sola
enzima con un mediador soluble econoacutemico
5511 Evaluacioacuten de la sentildeal con la concentracioacuten de glicerol
Para verificar si la sentildeal analiacutetica muestra dependencia con la concentracioacuten de
glicerol se realizaron 6 reacciones en paralelo registraacutendose la absorbancia a 420 nm
cada un minuto durante dos horas Se realizoacute un blanco de reaccioacuten sin glicerol y cinco
reacciones con concentraciones crecientes de glicerol Como muestras se utilizaron el
medio de cultivo de micobacterias Middlebrook 7H9 suplementado con glicerol a
distintas concentraciones En la Tabla 57 se presentan las concentraciones de glicerol
en las mezclas de reaccioacuten y en las muestras La Fig 517 muestra la absorbancia a 420
nm para las seis reacciones
Tabla 57 Concentraciones de glicerol en las mezclas de reaccioacuten
Reaccioacuten [glicerol] en mezcla
de reaccioacuten (mM) [glicerol] en muestra
(mM)
Blanco 0 0
Muestra 1 11 22
Muestra 2 082 16
Muestra 3 055 11
Muestra 4 027 55
Muestra 5 011 22
Resultados y Discusioacuten
77
Figura 517 Absorbancia a 420 nm de las mezclas de reaccioacuten descriptas en el texto ( ) 11 mM de
glicerol ( ) 082 mM de glicerol ( ) 055 mM de glicerol (o) 027 mM de glicerol (-) 011 mM de
ccedilglicerol ( ) blanco de reaccioacuten
Habiendo verificado la dependencia de la sentildeal analiacutetica con el analito de intereacutes se
procedioacute a determinar el intervalo dinaacutemico lineal Para ello se realizaron las reacciones
de color como se describe en el apartado 417 de la seccioacuten Materiales y meacutetodos Cada
reaccioacuten se hizo por triplicado En la Fig 518 se muestran resumidos los resultados
obtenidos
[Glicerol] mM
000 005 010 015 020 025 030 035 040
Ab
s 42
0 n
m
00
02
04
06
08
10
Figura 518 Curva de calibracioacuten para glicerol utilizando el meacutetodo colorimeacutetrico Se muestran los
valores promedios de tres medidas independientes Las barras de error corresponden a los desviacuteos
estaacutendares
La recta de regresioacuten que se obtuvo a partir de estos valores fue
Abs420nm = 0946 ndash 238 [glicerol] [511]
02
03
04
05
06
07
08
09
1
0 1200 2400 3600 4800 6000 7200
tiempo (s)
Ab
s 4
20
nm
Resultados y Discusioacuten
78
cuyo coeficiente de regresioacuten (R2) fue 09980 En el intervalo de concentraciones de
0025 a 027 mM la respuesta fue lineal
5512 Optimizacioacuten de condiciones para disminuir el costo operativo
Se verificoacute la posibilidad de cuantificar glicerol en medio Middlebrook 7H9
optimizando las concentraciones de reactivos y los tiempos de reaccioacuten para obtener la
maacutexima sentildeal con la mezcla maacutes econoacutemica posible Se ensayaron distintas
concentraciones de cofactor NAD+ a utilizar y 2 tiempos de reaccioacuten para una curva de
calibrado de 6 puntos consistente en un blanco y cinco estaacutendares de glicerol todos por
triplicado
Para verificar la factibilidad de disminuir la concentracioacuten de cofactor soluble sin
alterar significativamente la sensibilidad del meacutetodo se utilizoacute un disentildeo experimental
con un modelo de superficie de respuesta Como factores se tomaron la concentracioacuten
de cofactor y el tiempo de reaccioacuten Los niveles seleccionados en base a ensayos
previos fueron concentracioacuten de cofactor (NAD+) 01 mM 023 mM 037 mM y 05
mM tiempo 1 y 2 h Las respuestas que se evaluaron fueron la pendiente de una recta
de regresioacuten calculada a partir del meacutetodo de miacutenimos cuadrados y el coeficiente de
regresioacuten lineal correspondiente En la Tabla 58 se muestran los niveles parametrizados
y los valores de las respuestas obtenidas
Tabla 58 Disentildeo experimental factores parametrizados y respuestas obtenidas
Cada uno de los estaacutendares indicados en la Tabla 58 se correlaciona con una curva
de calibrado realizada En la Tabla 59 se informan los valores de concentracioacuten de
glicerol de las soluciones utilizadas para las reacciones de color y la concentracioacuten
correspondiente en la mezcla de reaccioacuten
Estaacutendar [NAD+] Tiempo Pendiente R2
4 1 -1 068 08790
7 03333 1 227 09962
8 1 1 184 09621
5 -1 1 159 09931
3 03333 -1 083 09590
2 -03333 -1 1 09850
6 -03333 1 244 09863
1 -1 -1 071 09914
Resultados y Discusioacuten
79
Tabla 59 Valores de concentracioacuten de los estaacutendares utilizados para los ensayos de optimizacioacuten
Reaccioacuten [glicerol] en mezcla
de reaccioacuten (mM) [glicerol] en muestra
(mM)
Blanco 0 0
Muestra 1 0010 02
Muestra 2 0025 05
Muestra 3 0050 10
Muestra 4 0075 15
Muestra 5 010 20
La ecuacioacuten de ajuste propuesta por el modelo de superficie de respuesta para la
pendiente fue
tBNADAm ][421 [512]
donde A y B son los coeficientes del modelo que se calculan a partir de la forma de la
superficie de respuesta e indican la dependencia de la pendiente (m) con la
concentracioacuten de cofactor ([NAD+]) y el tiempo de reaccioacuten (t) respectivamente El
anaacutelisis de los resultados indica que de los dos coeficientes solo B es significativo y su
valor es 062 mientras que A es un coeficiente no significativo Esto significa que la
pendiente de la recta de calibrado no muestra dependencia con la concentracioacuten de
cofactor NAD+ utilizado
Por otra parte el coeficiente de correlacioacuten no mostroacute dependencia con ninguno de
los factores elegidos Esto indica que el modelado de la funcioacuten deseabilidad global
queda reducido al de una sola respuesta la pendiente de la recta de calibrado y a un
uacutenico factor significativo que es el tiempo de reaccioacuten En base a estos resultados
pudimos establecer un uso miacutenimo de cofactor soluble
552 Determinacioacuten de glicerol remanente en cultivos de micobacterias
5521 Evaluacioacuten de glicerol remanente en cultivos axeacutenicos de M smegmatis
Primeramente se evaluoacute si podiacutea evidenciarse el consumo de glicerol por parte de
M smegmatis en un cultivo axeacutenico es decir conteniendo soacutelo este microorganismo
Para ello se realizaron cultivos de la micobacteria como se describe en el punto 418 de
la seccioacuten Materiales y Meacutetodos y se determinoacute el glicerol remanente haciendo uso del
meacutetodo fotomeacutetrico presentado previamente El anaacutelisis de la variancia de los valores de
absorbancia registrados y posteriormente se realizoacute un ensayo de comparaciones
muacuteltiples utilizando las pruebas de Tukey y de Bonferroni Se detectaron diferencias
estadiacutesticamente significativas en las absorbancias de las muestras del medio con M
Resultados y Discusioacuten
80
smegmatis a las 2 y 3 h de iniciados los cultivos respecto de aquellos medios
conservados en esterilidad
5522 Determinacioacuten de glicerol remanente en cultivos de micobacterias con y
sin fago D29 y ensayos controles respectivos
En una segunda serie de ensayos nos propusimos ver si habiacutea consumo diferencial
de glicerol entre cultivos de M smegmatis y cultivos de la micobacteria infectados con
el fago D29 siguiendo el protocolo descripto en el punto 4181 de la seccioacuten Materiales
y Meacutetodos En la Fig 519 se muestran los valores de absorbancia a 420 nm de las
muestras mencionadas Sobre este conjunto de datos nuevamente se realizoacute un anaacutelisis
de la variancia y ensayos de comparaciones muacuteltiples utilizando las pruebas de Tukey y
de Bonferroni
Los resultados obtenidos indican que todos los medios de cultivo a los cuales no se
le inoculoacute bacterias y aquellos medios donde se inoculoacute bacterias pero fueron
centrifugados inmediatamente despueacutes del inoacuteculo (muestras a t= 0) no mostraron
diferencias estadiacutesticamente significativas en los ensayos de comparaciones muacuteltiple
realizados Esto permite concluir que el agregado de fago y la incubacioacuten a 37 ordmC no
producen modificaciones significativas per se en las reacciones de color Por ello es
posible afirmar que en el futuro podraacuten simplificarse los controles a un uacutenico testigo
de concentracioacuten inicial conocida sin necesidad de tomar una muestra del cultivo
inmediatamente despueacutes del inoacuteculo o de la adicioacuten de fagos a los controles negativos
del ensayo
En este ensayo preliminar pudimos observar que las diferencias de absorbancia
resultaron estadiacutesticamente significativas entre los medios de cultivo donde crecieron
ceacutelulas de M smegmatis y los medios donde crecieron ceacutelulas de M smegmatis
infectadas con fago D29 tanto a las 2 como a las 4 h de iniciados los cultivos Este
resultado indicoacute que la hipoacutetesis de trabajo planteada era apropiada y en consecuencia
seriacutea factible desarrollar un meacutetodo para verificar la integridad de micobacterias en un
cultivo de las mismas
Resultados y Discusioacuten
81
Bla
nco
Med
io 0
025
00
25
+ F
ago t
= 0
00
25
C
eacutelula
s t
= 0
00
25
Ceacutel
ula
s +
Fag
o t
= 0
00
25
+ F
ago t
= 2
00
25
Ceacutel
ula
s t
= 2
00
25
Ceacutel
ula
s +
fag
o t
= 2
00
25
fa
go t
= 4
00
25
Ceacutel
ula
s t
= 4
00
25
Ceacutel
ula
s +
fag
o t
= 4
Abs
420 n
m
03
04
05
08
Figura 519 Absorbancias a 420 nm registradas para las muestras descritas Se indica concentracioacuten
inicial de glicerol en mv y tiempo de incubacioacuten a 37 ordmC El blanco corresponde al de la reaccioacuten de
color sin glicerol
553 Biosensor amperomeacutetrico a base de pasta de carbono viacutetreo modificada
En funcioacuten de los resultados previos se procedioacute al ensamblado de un biosensor
amperomeacutetrico siguiendo el esquema de reaccioacuten presentado previamente que se
reproduce en la figura 520
Figura 520 Esquema de reaccioacuten propuesto para biosensor amperomeacutetrico selectivo para glicerol La
coenzima reducida NADH se regenera a su forma oxidada NAD+ reaccionando con el Fe(CN)6
3- que se
reduce a Fe(CN)64-
Este uacuteltimo se reoxida electroquiacutemicamente sobre la superficie del electrodo
completando el ciclo cataliacutetico
Utilizando electrodos de pasta de carbono B (punto 41912 seccioacuten Materiales y
Meacutetodos) se realizaron amperometriacuteas siguiendo el protocolo descrito en el punto 4202
glicerol
DHA
GlDHox
GlDHred NAD+
NADH Mediador ox
Mediador red
e- Electrodo
Resultados y Discusioacuten
82
de la seccioacuten Materiales y Meacutetodos En la Fig 521 se muestra un amperograma tiacutepico
obtenido
Tiempo s
100 200 300 400 500
I
nA
0
20
40
60
80
100
Figura 521 A) Amperograma tiacutepico obtenido con un electrodo de trabajo de pasta de carbono B
trabajando a un potencial de 038 V Se agregaron 50 L de medio 7H9 suplementado con glicerol
usualmente a los 300 s de iniciada la lectura de corriente cuando eacutesta se estabilizoacute B) Agregados
sucesivos de 50 microL de medio 7H9 suplementado con glicerol 20 mM sobre 200 mL de la misma
solucioacuten
En la Fig 522 se presenta la recta de regresioacuten obtenida a partir de los valores
promedios de corrientes para soluciones de glicerol en el intervalo de concentraciones
de 0062 mM y 175 mM Las barras de error corresponden a las desviaciones estaacutendar
de cada medida La ecuacioacuten de la recta obtenida por el meacutetodo de miacutenimos cuadrados
fue
[513]
donde Ic estaacute en nA y [Glicerol] en mM el valor del coeficiente de regresioacuten (R2)
obtenido fue de 09982
Las cifras de meacuterito para esta teacutecnica resultaron ser
Liacutemite de deteccioacuten 20 M
Liacutemite de cuantificacioacuten 60 M
Liacutemite de discriminacioacuten 15 M
Intervalo de linealidad 0060 mM ndash 175 mM
Tiempo s
0 500 1000 1500 2000
I
nA
0
50
100
150
200
Resultados y Discusioacuten
83
[Glicerol] mM
000 025 050 075 100 125 150 175 200
Ic
nA
0
50
100
150
200
Figura 522 Recta de calibracioacuten para glicerol utilizando el meacutetodo amperomeacutetrico descrito en el texto
Se muestran los valores promedios de corrientes liacutemite corregidas y las desviaciones estaacutendares de 3
lecturas independientes
Una vez que se preparoacute la pasta de carbono viacutetreo modificada con la enzima esta
resultoacute estable durante 10 semanas sin peacuterdida de actividad enzimaacutetica siempre que se
mantuviese seca a 4 degC Una vez que se ensambloacute el biosensor con el poliacutemero
electrodepositado pudo utilizarse durante al menos 8 horas consecutivas con una
peacuterdida de sensibilidad insignificante En efecto los cambios observados en las sentildeales
registradas de forma consecutiva se encontraron dentro del error intriacutenseco del meacutetodo
propuesto La estabilidad de un mismo biosensor durante diacuteas sucesivos se evaluoacute
realizando medidas de la misma solucioacuten y evaluando la relacioacuten sentildealruido la cuaacutel
disminuyoacute un 15 del valor original al tercer diacutea y un 50 al quinto diacutea de uso
554 Desarrollo de un biosensor a base de pasta de carbono viacutetreo y
nanotubos de carbono
Para reducir los tiempos de anaacutelisis se procuroacute disminuir el periacuteodo de
estabilizacioacuten de la corriente modificando el esquema original propuesto para el sensor
Para esto se modificoacute la pasta de carbono con nanotubos de carbono de paredes
muacuteltiples (Rubianes amp Rivas 2003) Seguacuten trabajos previos esta estrategia permite
disminuir el sobrepotencial asociado a la electrooxidacioacuten de la coenzima NADH
evitaacutendose el uso de un mediador soluble (Musameh 2002) Previo a su utilizacioacuten los
NTC fueron funcionarizados por carboxilacioacuten oxidativa siguiendo el protocolo
especificado en el punto 421 de la seccioacuten Materiales y Meacutetodos
Resultados y Discusioacuten
84
En la Fig 523 (derecha) se muestran las voltametriacuteas que se obtuvieron utilizando
un electrodo de trabajo relleno con pasta B (pasta de carbono viacutetreo modificada con
enzima GlDH al 2 en masa)
Figura 523 Voltamperogramas ciacuteclicos utilizando bioelectrodos de pasa de carbono B con GlDH
(derecha) y pasta C con GlDH y MWCNT (izquierda) En liacutenea puntuada se muestran las voltametriacuteas de
la solucioacuten NAD+ 05 mM (NH4)2SO4 25mM K2CO3 KHCO3 01 M pH 105 (blanco) En liacutenea
continua las voltametriacuteas de las mismas soluciones con el agregado de glicerol en concentracioacuten final 25
mM La velocidad de barrido fue 50 mV s-1
Se marcan los picos de corriente observados y el potencial de
pico
El sobrepotencial asociado a la electroxidacioacuten de la coenzima NADH en el
electrodo de pasta de carbono B es 70 mV menor que el informado por Wang y col Ep
= 082V sobre electrodos de carbono viacutetreo (Musameh 2002) Esta diferencia podriacutea
deberse a los distintos pH de trabajo o bien a alguna diferencia en las cualidades de la
superficie del electrodo
En la Fig 523 (izquierda) se muestran los resultados obtenidos con los electrodos
de pasta C pasta de carbono modificada con GlDH al 2 y con MWCNT al 10 en
masa En este caso vemos que el sobrepotencial asociado a la electroxidacioacuten de NADH
es 0180 V menor Ep = 057 V que el observado para la pasta B Esta diferencia
podemos atribuirla a las cualidades diferentes de las superficies del electrodo debida a la
presencia de los MWCNT Es de destacar que Wang y col en la oxidacioacuten del NADH
sobre la superficie de carbono viacutetreo modificado con MWCNT observaron dos
procesos oxidativos uno principal con un Ep de 033 V y otro secundario con Ep de
057 V que aparece como hombro del primero (ver Fig 524 reproducida de Wang y
col)
Ep = 075 V
Resultados y Discusioacuten
85
Figura 524 Reproducido de Musameh y col 2002 Voltamperogramas correspondientes a una solucioacuten 5
mM de coenzima NADH en solucioacuten tampoacuten fosfato 005 M pH 74 utilizando electrodos de trabajo de
pasta de carbono viacutetreo sin modificar (A) y modificado con MWCNT (B) Velocidad de barrido 50 mV s-1
En el voltagrama B puede apreciarse el pico principal y el secundario que aparecen como hombro del
primero
En este trabajo soacutelo se pudo identificar un uacutenico proceso oxidativo a 057 V Si bien
auacuten estamos investigando posibles causas que hayan originado esta diferencia es de
esperar que el pH sea un factor determinante ya que la oxidacioacuten de NADH a NAD+
involucra la perdida de un H+ Por otra parte en los voltagramas realizados con pasta C
se registroacute un importante aumento de las corrientes capacitivas (18 μA) en relacioacuten a
las voltametriacuteas donde se utilizaron electrodos de pasta sin MWCNT Este mismo
efecto pero en menor magnitud (55 μA) tambieacuten fue registrado por Wang y
colaboradores al trabajar con electrodo de carbono viacutetreo modificado con MWCNT
(Musameh 2002) Los resultados obtenidos por Wang y colaboradores y los de este
trabajo de Tesis se muestran comparativamente en la Tabla 510
Tabla 510 Resultados obtenidos por Musameh y col 2002 y los correspondientes a este trabajo
Musameh y col
2002 Este trabajo
Electrodo de
trabajo Cv
C v +
MWCNT Pasta B Pasta C
V barrido 50 mV s-1 50 mV s
-1
pH 74 105
Ep (V) 082 033
057 075 057
Aumento de la
I cap (μA) - 55 - 18
Resultados y Discusioacuten
86
Con estos resultados preliminares comenzamos los ensayos amperomeacutetricos para
cuantificar el glicerol remanente en los medios de cultivos de micobacterias Se llevaron
adelante distintos ensayos y nuevamente el inconveniente principal al que nos
enfrentamos fue que la respuesta no era estable en el tiempo En la Fig 525 se muestra
un amperograma obtenido con un bioelectrodo de pasta C y realizando agregados
sucesivos de un estaacutendar de glicerol 20 mM disuelto en medio Middelbrook 7H9
Con este nuevo esquema de trabajo no se logroacute acortar los tiempos de estabilizacioacuten
de la corriente Los algoritmos de correccioacuten de corriente de base que estaacuten
incorporados al programa GPES tampoco permitieron solucionar este inconveniente
Por este motivo se optoacute por utilizar teacutecnicas voltameacutetricas de pulso que en principio
permitiriacutean evitar este inconveniente
Tiempo s
0 100 200 300 400 500 600 700 800 900
I A
0
1
2
3
4
Figura 525 Amperograma obtenido con un bioelectrodo de pasta de carbono C trabajando a 05 V vs
AgAgCl A t=200 s de iniciada la lectura se agregaron 50 L de medio 7H9 y posteriormente se
realizaron agregados sucesivos de 50 L de medio 7H9 suplementado con glicerol 20 mM
5541 Ensayos de cuantificacioacuten de glicerol con el bioelectrodo desarrollado
utilizando teacutecnicas de pulso
Las teacutecnicas voltameacutetricas de pulso presentan la ventaja de permitir trabajar durante
tiempos muy reducidos en la zona de potencial donde la especie electroactiva cambia
su estado de oxidacioacuten produciendo la sentildeal analiacutetica
Se optoacute por ensayar la voltametriacutea de onda cuadrada para los futuros ensayos de
cuantificacioacuten y los experimentos preliminares procuraron establecer los valores maacutes
convenientes de los paraacutemetros relevantes de la teacutecnica como la amplitud de pulso el
escaloacuten de potencial y la frecuencia (punto 633 seccioacuten Experimentos Auxiliares)
Resultados y Discusioacuten
87
En una segunda serie de ensayos se buscoacute observar la dependencia de la corriente
de pico con la concentracioacuten de glicerol Para esto se realizaron ensayos
independientes En este esquema de trabajo surgioacute un inconveniente respecto del criterio
de medida de la corriente de pico ya que en ensayos independientes no se pudo
establecer una liacutenea de base comuacuten a todos los voltamperogramas
Se ensayaron distintos criterios para determinar una liacutenea de base apropiada como
se detalla en el punto 6331 de la seccioacuten Experimentos Auxiliares y en la Fig 526 se
muestran los voltamperogramas corregidos siguiendo el criterio elegido
Figura 526 Voltamperogramas de onda cuadrada (corregidos) obtenidos utilizando electrodos de pasta
de carbono viacutetreo modificada con GlDH y MWCNT Se muestran los voltagramas de las soluciones
blanco (helliphelliphelliphellip
) glicerol 5 mM (mdash mdash) 125 mM (mdashmdash) 25 mM (diamsdiamsdiams) 36 mM (- - -) y 50 mM (mdash bull mdash)
En la Fig 527 se muestran la dependencia de la corriente de pico con la
concentracioacuten de glicerol obtenida a partir de experimentos exploratorios uacutenicos para
cada concentracioacuten Resta a futuro repetir los experimentos para establecer el error
asociado a la metodologiacutea el intervalo dinaacutemico lineal y el liacutemite de deteccioacuten
Resultados y Discusioacuten
88
Figura 527 Dependencia de la corriente de pico registrada en la VOC en funcioacuten de la concentracioacuten de
glicerol en la celda electroquiacutemica
56 Validacioacuten de meacutetodos
De los meacutetodos desarrollados se seleccionaron aquellos dos que dieron resultados
maacutes fiables meacutetodo amperomeacutetrico utilizando un electrodo de trabajo de oro y el
meacutetodo amperomeacutetrico utilizando el biosensor con GlDH con mediador soluble Se
realizaron ensayos en paralelo con un meacutetodo alternativo ampliamente utilizado en
particular se utilizoacute un equipo comercial que utiliza tres enzimas y deteccioacuten
espectrofotomeacutetrica (Wiener lab) La Fig 528 muestra la concentracioacuten nominal versus
concentracioacuten predicha obtenida por las tres metodologiacuteas ensayando diferentes
diluciones de muestra y graficaacutendose el valor medio de 3 medidas independientes
Nominal mM
00 02 04 06 08 10
Pre
dic
ho
mM
00
02
04
06
08
10
Equipo comercial
Tip Au
Biosensor
Recta identidad
Figura 528 Concentracioacuten nominal vs predicha para las dos metodologiacuteas propuestas en este trabajo de
tesis y un meacutetodo enzimaacutetico disponible comercialmente
0
05
1
15
2
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
[Glicerol] (mM)
Ip (
uA
)
Resultados y Discusioacuten
89
Es evidente que los meacutetodos propuestos se correlacionan adecuadamente con la
recta identidad En la Fig 529 se muestran las tres regiones eliacutepticas de confianza
conjuntas (EJCR) para la pendiente y ordenada al origen En este caso puede apreciarse
que las tres elipses contienen el punto (0 1) lo que indica una buena correlacioacuten entre
los meacutetodos propuestos en el presente trabajo y un meacutetodo disponible comercialmente
Pendiente
08 09 10 11 12
Ord
enad
a al
ori
gen
-06
-04
-02
00
02
04
06
Equipo comercial
Tip Au
Biosensor
Punto (1 0)
Figura 529 Regiones eliacutepticas de confianza conjuntas para dos metodologiacuteas presentadas en este trabajo
de Tesis y un meacutetodo enzimaacutetico disponible comercialmente
En la Tabla 511 se presentan distintas metodologiacuteas publicadas en la literatura
actual en las que se referencia la cuantificacioacuten de glicerol ya sean biosensores
electroquiacutemicos u otra metodologiacutea El anaacutelisis de la Tabla 511 permite ver que la
determinacioacuten de glicerol en medios alcalinos sin presencia de interferentes puede ser
llevada a delante con metodologiacuteas econoacutemicas Debe ser considerado que cuando se
realiza la determinacioacuten de glicerol en muestras de biodiesel dicha cuantificacioacuten
requiere extraer el analito de la matriz como puede verse en los meacutetodos maacutes
recientemente propuestos (Bondioli amp Bella 2005 Silva amp Rocha 2010 Lima y col
2012 Tehrani amp Ghani 2012 Maruta amp Paixao 2012 Lourenccedilo amp Stradiotto 2009
Stradiotto y col 2009) Ya sea que se utilice deteccioacuten espectroscoacutepica o
electroquiacutemica siempre se requiere la extraccioacuten previa a la determinacioacuten del analito
Incluso la propuesta de Fernaacutendez Band y col que es el uacutenico meacutetodo que hace una
diferencia notable al comparar las cifras de meacuterito (LD 04 microM tiempo de anaacutelisis 4
min) implica un pretratamiento de la muestra (Lima y col 2012)
Resultados y Discusioacuten
90
Tabla 511 Comparacioacuten de meacutetodos para cuantificar glicerol propuestos recientemente Adaptado de
Faccendini y col 2014
Meacutetodo (Tratamientos
previos) LD
(microM)
Rango de
linealidad
(M)
Muestra
ensayada
Tiempo de
anaacutelisis
(min)
Reactivos o
accesorios
onerosos Referencia
Espectrofotomeacutetrico
(Extraccioacuten del analito) 22
4 times 10-5
a
2 times10-4
Biodiesel 20 - Bondioli amp
Bella 2005 Espectrofotomeacutetrico
(Extraccioacuten del analito) 10
5 times 10minus5
a
5 times 10minus4
Biodiesel 20 a 30 - Silva amp Rocha
2010
Espectrofluoromeacutetrico
(Extraccioacuten del analito) 04
1 times 10minus6
a
5 times 10minus4
Biodiesel 4 - Lima y
col2012
Espectrofotomeacutetrico
multienzimaacutetico No
informa 2 times 10
minus2 a
1 times 10minus1
Jugo de cantildea 5 GK GPO
ATP Kronka y col
2001
Espectrofotomeacutetrico
multienzimaacutetico 8
8 times 10minus6
a
25 times 10minus4
Suero
Humano 10
GK PK
LDH ATP
NAD+
Li y col 2001
Electroquiacutemico VPD
(Extraccioacuten del analito) 33
5 times 10minus4
a
12 times 10minus2
Biodiesel 15 - Tehrani y
Ghani 2012 Electroquiacutemico VC
(Extraccioacuten del analito) 3
33 times 10minus5
a
17 times 10minus3
Biodiesel 30 FIA Maruta y
Paixao 2012
Electroquiacutemico VC
(Extraccioacuten del analito) 25
33 times 10minus5
a
17 times 10minus3
Biodiesel 20 Cartucho de
C18
Lourenccedilo amp
Stradiotto
2009 Electroquiacutemico
amperomeacutetrico
(Extraccioacuten del analito)
No
informa 16 times 10
minus4 a
16 times 10minus3
Biodiesel 60 - Stradiotto y
col 2009
Electroquiacutemico VL
VPD amperomeacutetrico
(Extraccioacuten del analito) 10
23 times 10minus5
a
23 times 10minus4
Solucioacuten
Acuosa
pH=13 5
MWCNT
funcionalizad
os con Ag
Pop y col 2011
Electroquiacutemico
amperomeacutetrico
(Extraccioacuten del analito) 10
25 times 10minus5
a
20 times 10minus3
Solucioacuten
Acuosa
pH=13 8 -
Este Trabajo
de Tesis
Electroquiacutemico
amperomeacutetrico
(Extraccioacuten del analito) 50
5 times 10minus5
a
23 times 10minus2
Solucioacuten
Tampoacuten
Fosfato
5
(estimados) GO
Goriushnika y
col 2010
Biosensor
amperomeacutetrico 04
10 times 10minus6
a
10 times 10minus4
Jarabe de
cantildea 15
(estimados) GlDH NAD+
Aacutelvarez-
Gonzalez y
col 2000
Biosensor
amperomeacutetrico 04
1 times 10minus6
a
2 times 10minus5
Vino 3 GlDH DP
NAD+ Gamella y
col 2008
Biosensor
amperomeacutetrico 03
1 times 10minus6
a
1 times 10minus5
Vino 3 GK GPO
HRP ATP Gamella y
col 2008 Biosensor
amperomeacutetrico 4
5 times 10minus6
a
1 times 10minus4
Vino 5 GK GPO
ATP Ghica amp Brett
2006
Biosensor
amperomeacutetrico 20
70 times 10minus5
a
18 times 10minus3
Caldo
Middlebrook 10
GlDHb
NAD+ Este Trabajo
de Tesis
Del mismo modo el enfoque de Tehrani y Ghani que utilizan un electrodo de grafito
modificado con nanopartiacuteculas de nickel trabajando a pH = 13 realizan una extraccioacuten
previa de glicerol a partir de muestras de biodiesel (Tehrani amp Ghani 2012) En este
Resultados y Discusioacuten
91
caso el LD fue de 33 microM mientras que en este trabajo de Tesis utilizando el mismo
medio hemos conseguido un LD de 10 microM empleando electrodos de oro policristalino
Maruta y Paixao han propuesto recientemente un meacutetodo amperomeacutetrico usando un
electrodo de cobre que trabaja a 065 V vs AgAgCl adaptado en un sistema de FIA
(Maruta amp Paixao 2012) mientras que Lourenccedilo y Stradiotto informaron sobre un
meacutetodo electroquiacutemico que requiere la extraccioacuten acuosa del glicerol a partir de la
muestra y la purificacioacuten adicional por elucioacuten a traveacutes de un cartucho de C18 seguida
de una concentracioacuten por evaporacioacuten y finalmente un anaacutelisis mediante VC (Lourenccedilo
amp Stradiotto 2009) Tambieacuten otras propuestas informan sobre la determinacioacuten de
glicerol por amperometriacutea haciendo uso de electrodos modificados tales como
electrodos de diamante dopados con boro y modificados con nanopartiacuteculas de niacutequel
(Stradiotto y col 2009) y electrodos compuestos de nanotubos de carbono de pared
muacuteltiple funcionalizados con plata (Pop y col 2011) Si bien ambos meacutetodos se
presentan como uacutetiles se requieren diferentes pasos operativos para eliminar posibles
interferencias tales como otros alcoholes que podriacutean ser oxidados a los potenciales de
trabajo 065 V o 130 V (vs AgAgCl) respectivamente En este sentido nuestros
resultados obtenidos por amperometriacutea usando electrodos de oro en medio alcalino
acuoso (pH = 13) estaacuten en el mismo orden que los obtenidos por Pop y colaboradores
utilizando LSV (Pop y col 2011) sobre electrodos compuestos de nanotubos de
carbono de pared muacuteltiple funcionalizados con plata Efectivamente este uacuteltimo y
nuestra metodologiacutea mostraron las mejores cifras de meacuterito entre los meacutetodos
electroquiacutemicos de bajo costo que no consumen enzimas
Los meacutetodos enzimaacuteticos espectrofotomeacutetricos aunque no son laboriosos presentan
la desventaja del consumo relativamente elevado de enzima cada muestra necesita la
adicioacuten del costoso reactivo bioloacutegico ya que no puede ser reutilizado Tambieacuten los LD
de los meacutetodos espectrofotomeacutetricos enzimaacuteticos informados son generalmente
superiores a los que presentan los biosensores Puede antildeadirse que estos uacuteltimos
presentan generalmente el intervalo dinaacutemico lineal maacutes amplio en comparacioacuten con
otros enfoques ya sean electroquiacutemicos o espectrofotomeacutetricos Soacutelo la metodologiacutea de
flujo discontinuo con deteccioacuten fluoromeacutetrica propuesta por Fernaacutendez Band y col
(Lima y col 2012) muestra una sensibilidad en el mismo orden que el maacutes bajo de los
biosensores
En el anaacutelisis de los biosensores que se muestran en la Tabla 511 hay que destacar
que el propuesto por Pingarroacuten y col (Gamella y col 2008) muestra el LD y tiempo de
Resultados y Discusioacuten
92
anaacutelisis total maacutes bajo Para evaluar costos operativos se presenta en la Tabla 512 un
resumen comparativo de la cantidad y concentracioacuten de los reactivos onerosos
consumidos por biosensor o por anaacutelisis entre la propuesta de Pingarroacuten y col y la del
biosensor aquiacute propuesto
Tabla 512 Comparacioacuten entre el meacutetodo enzimaacutetico que mejores cifras de meacuterito presenta y el propuesto
en el presente trabajo de Tesis Adaptado de Faccendini y col 2014
GlDH
bisosensor Diaforasa
biosensor tetratiofulvaleno
biosensor NAD
+ por
anaacutelisis
Gamella y
col 2008 75 U 162 U 15x10-6
M 5x10-3
M Este Trabajo
de Tesis 23 U - - 5x10-4
M
Podemos afirmar que nuestra propuesta es menos costosa hecho importante a ser
evaluado cuando se va a analizar un gran nuacutemero de muestras Mediante la reduccioacuten de
la cantidad de GlDH el LD se elevoacute desde 04 hasta 20 microM aunque es adecuado auacuten
para detectar cambios de concentracioacuten de glicerol en el orden de 15 microM Al mismo
tiempo evitando el uso de diaforasas el tiempo total de anaacutelisis se extendioacute de 3 a 10
min En conjunto los resultados presentados confirman que los cambios introducidos a
los biosensores informados previamente en la literatura tales como el uso de soacutelo una
enzima en baja proporcioacuten la sustitucioacuten del mediador redox por el ferricianuro soluble
y trabajar con el cofactor NAD+ soluble proporciona un sistema fiable de bajo costo
para cuantificar el glicerol
Experimentos Auxiliares
Experimentos Auxiliares
94
6 Experimentos Auxiliares
61 Comparacioacuten de programas de prediccioacuten de epiacutetopes lineales reconocidos
por ceacutelulas B
AAPPred BcePred ABCPred BepiPred y Antigenic se ejecutaron en liacutenea En la
Tabla 61 se muestran los VPP medios (ver definicioacuten en seccioacuten Materiales y Meacutetodos
pag 11) que se obtuvieron al predecir epiacutetopes lineales reconocidos por ceacutelulas B de
todas las proteiacutenas enumeradas en la Tabla 62
Los resultados obtenidos indican que BcePred es el uacutenico programa de los
evaluados que muestra un VPP inferior al obtenido con la prediccioacuten al azar Tambieacuten
se obtuvo que soacutelo dos de los programas estudiados AAPPred y ABCpred predijeron
epiacutetopes con un VPP significativamente mayor al valor de VPP de un procedimiento de
identificacioacuten aleatoria Estos dos programas produjeron predicciones con valores
maacuteximos de 862 y 786 de VPP respectivamente
Tabla 61 Valores predictivos positivos promedio que se obtuvieron con cada uno de los programas
predictores con los que se trabajoacute
Programa
VPP
promedio
AAPPred 691
ABCPred 628
BcePred 309
BepiPred 453
Antigenic 419
Aleatorio 382
En base a estos resultados se trabajoacute con el programa AAPPred y se identificaron
las regiones que concentraban el mayor nuacutemero de epiacutetopes reconocidos por ceacutelulas B
de las proteiacutenas P22 P30 y P35 con el fin de expresar estos Angs como proteiacutenas
recombinantes y utilizarlos en el desarrollo de meacutetodos de diagnoacutestico de la
toxoplasmosis aguda
Experimentos Auxiliares
95
Tabla 62 Base de datos experimental proteiacutenas seleccionadas para este estudio Se indican el nombre de
la proteiacutena el coacutedigo de acceso NCBI la longitud total (en residuos de amino aacutecidos) el
nuacutemero de epiacutetopes reales determinados experimentalmente y la localizacioacuten de los epiacutetopes o
regiones antigeacutenicas Proteiacutenas tomadas de base de datos (A) BciPep (B) VIH Inmunologiacutea
Molecular base de datos o tomado de la literatura (veacutease el nuacutemero de referencia 17 para VP1
16 para la proteiacutena N y 18 para gliadina)
Proteiacutena
Coacutedigo
NCBI
Nordm de
residuos
Cantidad de
epiacutetopes
Localizacioacuten de los epiacutetopes o regiones
antigeacutenicas
MPT70 (A) NP_217391 193 2 31-70 100-120
MSP-1 (A) BAF622801 1693 3 29-39 1594-1611 1644-1662
Exotoxina
A (A) NP_249839 638 8
297-313 324-333 354-387 412-421 510-522
528-539 557-593 596-638
GAG1 (A) P20873 504 10
11-25 113-122 142-156 176-214 216-268
280-308 312-321 330-367 406-416 428-448
Gp160 (A) NP_057856 856 13
30-141 161-191 211-231 252-281 294-344
346-413 424-511 525-558 561-615 639-701
724-747 761-778 822-855
Pr55 (B) NP_579876 132 2 11-38 51-78
Rev (B) NP_057854 116 4 5-15 32-51 70-91 96-116
VP1 (17) ABC87248 781 12
31-41 55-65 85-95 151-161 292-392 316-326
493-500 529-539 547-554 571-578 667-707
712-722
Gliadin
(18) A27319 296 3 31-72 165-176 237-264
Proteiacutena N
(16) AAP13445 422 6 1-6 45-61 153-192 211-223 225-235 354-412
Proteasa
(B) CAB66012 99 2 1-7 36-47
62 Puesta a punto de ensayos de inmunoabsorcioacuten ligados a enzima con
deteccioacuten fotomeacutetrica
Previo al inicio de los ELISA de captura iniciamos una serie de pruebas preliminares
con el propoacutesito de
a) Diferenciar sueros de pacientes infectados de sueros de individuos sin infeccioacuten De
este modo se pretende verificar la potencial utilidad en diagnoacutestico de los antiacutegenos
propuestos corroborando que los procesos quiacutemicos llevados a cabo como por ej la
conjugacioacuten no eliminaron epiacutetopes claves
Experimentos Auxiliares
96
b) Minimizar la sentildeal en los ensayos sin suero (blanco de reactivos) es decir
disminuir el ruido de fondo asociado a interacciones inespeciacuteficas
A tales fines se realizaron ELISA indirectos utilizando los antiacutegenos recombinantes
obtenidos (marcados y sin marcar) adsorbidos sobre la placa se utilizaron sueros
tipificados y se reveloacute la presencia de IgG humana revelando con anticuerpos de cabra anti
IgG humana Los resultados obtenidos se detallan en la siguiente tabla
Tabla 63 Valores de absorbancia a 450 nm obtenidos en ELISA indirectos con deteccioacuten de IgGh con
conjugado anti IgG humana-HRP
Sueros P22C P22C-
biotina P35B
P35B -
biotina
Positivos
2 gt3 26 1900
3 2900 2 gt3
gt3 gt3 26 gt3
Negativos
13 1000 11 0800
06 0500 09 0700
11 1600 1 1000
Si bien los valores de absorbancia leiacutedos en todos los pocillos resultaron elevados
los sueros confirmados positivos dieron los valores maacutes altos de absorbancia mientras
que los sueros negativos dieron los valores maacutes bajos Las diferencias observadas entre
sueros confirmados positivos y sueros confirmados negativos permitieron asumir que
los antiacutegenos obtenidos son de posible utilidad en diagnoacutestico Ademaacutes no se
detectaron diferencias significativas entre los valores de absorbancia obtenidos
utilizando antiacutegenos marcados de aquellos obtenidos con los no marcados
permitieacutendonos pensar que la conjugacioacuten llevada a cabo no eliminoacute epiacutetopes claves
Los elevados valores de absorbancia obtenidos en este ensayo junto a otros estudios
preliminares sugieren que existe una elevada adsorcioacuten inespeciacutefica
621 Bloqueante a utilizar
Se ensayaron diversos agentes bloqueantes para minimizar las interacciones
inespeciacuteficas encontradas durante los experimentos preliminares y asiacute evitar las altas
sentildeales obtenidas en los ensayos control realizados sin suero (blanco de reactivos) y con
sueros confirmados negativos (blancos de muestra) Sobre placas comerciales de
poliestireno se procedioacute al bloqueo total con el agente bloqueante a ensayar y
posteriormente se realizoacute una incubacioacuten con y sin antiacutegeno P22C por duplicado
Finalmente se reveloacute con la enzima HPR-EAV que se une especiacuteficamente a biotina En
la Tabla 64 se muestran los valores de absorbancia a 450 nm
Experimentos Auxiliares
97
Tabla 64 Valores promedio de absorbancia a 450 nm obtenidos en los ensayos de bloqueo
450 nm Sin P22cBiot Con P22cBiot
Sin Bloqueante ------- 1162
Leche 1 0066 01445
Caseinato 1 00725 02425
Gelatina 1 00725 03925
BSA 1 00625 0192
BSA 1 Tween 002 00615 01515
En base a estos resultados se continuoacute con el uso de leche descremada como agente
bloqueante
622 Esquema A
Cuando se realizaron ELISA siguiendo el esquema A se ensayaron dos diluciones
de la HRP-EAV 12000 y 15000 Por otro lado se ensayaron distintas masas de
antiacutegenos P22C y P35B conjugados a biotina con los que se intentoacute revelar presencia
de IgM especiacuteficas Especiacuteficamente se ensayaron 2 02 y 002 g por pocillo de P35B
biotina y 5 2 02 y 002 g por pocillo de P22C biotina Con esto se buscoacute encontrar
las cantidades oacuteptimas de reactivos para poder llevar adelante estos ensayos A modo
ilustrativo en la Tabla 65 se muestra un ensayo representativo siguiendo el esquema A
Se informan solamente los valores de absorbancia a 450 nm obtenidos para sueros
provenientes de pacientes con infeccioacuten croacutenica (croacutenicos) aguda (agudos) y de
pacientes sin infeccioacuten (negativos)
Tabla 65 Valores de absorbancia a 450 nm obtenidos en ELISA siguiendo el esquema A Se muestran 3
cantidades de antiacutegeno revelador utilizadas 2 02 y 002 microg En este ensayo la dilucioacuten de la
enzima HRP-EAV fue 15000 y se utilizaron 100 microL por pocillo
Antiacutegenos
Sueros
P22C biotina ( g) P35B biotina ( g)
2 02 002 2 02 002
Negativos 0576 0294 0155 1071 0681 0566
0543 0335 0176 1079 0769 023
Croacutenicos 0469 0246 0135 103 069 0299
0514 0215 0111 0914 0567 0196
Agudos 0331 0181 0109 081 0574 0168
0555 0254 0139 0789 0391 0169
Experimentos Auxiliares
98
623 Esquema B
Cuando se realizaron ELISAs siguiendo el esquema B se ensayaron distintas masas
de antiacutegeno P22C y P35B absorbidas sobre las microplacas comerciales a saber 500
200 50 10 o 5 ng (disueltos en 100 L de solucioacuten tampoacuten carbonato pH 96) En todos
los casos se incuboacute 1h a 37 degC
Para la incubacioacuten con la proteiacutena conjugada a biotina se ensayaron 2 y 5 ug por
pocillo En la Tabla 66 se resumen los resultados obtenidos
Tabla 66 Valores de absorbancia a 450 nm obtenidos en ELISA siguiendo el esquema B Se muestran
los resultados obtenidos para dos cantidades distintas de antiacutegeno de captura (P22C) 10 y 50
ng junto a 2 cantidades de antiacutegeno revelador (P22C-biotina) utilizadas 2 y 5 microg En este
ensayo la dilucioacuten de la enzima HRP-EAV fue 12000 y se utilizaron 100 microL por pocillo
2 microg P22C biotina 5 microg P22C biotina
Masa de P22C
(ng)
Muestras
50 10 50 10
Agudos 0393 0303 0553 0450
0273 0335 0793 0367
Croacutenicos 0230 0398 0316 0345
0284 0291 0444 0493
Negativos 0392 0210 0380 0380
0286 0292 0314 0350
Sin suero 0367 0468 0415 0411
0327 0358 0468 0536
Sin Prot conjugada a
biotina ni sueros
0102 0087 0128 0079
0131 0095 0116 0104
Los resultados obtenidos indicaron que para lograr una mejor discriminacioacuten de las
muestras es conveniente utilizar mayor cantidad de masa de antiacutegeno de captura (P22C)
depositada en el pocillo Por otro lado 5 microg de antiacutegeno revelador (P22C-biotina) por
pocillo contribuyoacute a aumentar la discriminacioacuten entre las muestras sin incrementar
significativamente el ruido de fondo
Experimentos Auxiliares
99
63 Ensayos electroquiacutemicos
631 Determinacioacuten del aacuterea real de un electrodo
6311 Meacutetodo de la adsorcioacuten de O2
Se realizaron barridos de potencial como se indica en el punto 41931 de la
seccioacuten Materiales y Meacutetodos La Fig 61 muestra un voltamperograma tiacutepico obtenido
Con el valor de la carga asociada a la desorcioacuten del oacutexido de oro pudo determinarse el
valor de aacuterea electroactiva del electrodo de trabajo utilizado como se indica en el punto
41931
E V
04 06 08 10 12 14 16
I
A
-15e-5
-10e-5
-50e-6
00
50e-6
Figura 61 Voltamperograma ciacuteclico tiacutepico obtenido con electrododos de oro en medio H2SO4 05 M
velocidad de barrido 50 mV s-1
Se indica en color turquesa el pico de desorcioacuten del oacutexido de oro la carga
(Q) obtenida del aacuterea encerrada en la curva se utilizoacute para determinar el aacuterea real de los electrodos de oro
previamente a los ensayos
6312 Voltametriacutea ciacuteclica a distintas velocidades
Se realizaron barridos de potencial a distintas velocidades como se indica en el
punto 41932 de la seccioacuten Materiales y Meacutetodos La Fig 62 muestra los voltagramas
tiacutepicos obtenidos en (A) y en (B) la dependencia de la corriente de pico Ip con la raiacutez
cuadrada de la velocidad de barrido Con el valor de la pendiente de la recta obtenida
por regresioacuten lineal pudo determinarse el valor de aacuterea electroactiva del electrodo de
trabajo utilizado como se indica en el punto 41932 habieacutendose utilizado un
coeficiente de difusioacuten del Fe(CN)63-
de 0762 cm2 s
-1 (Sawyer amp Roberts 1974)
Experimentos Auxiliares
100
E V
-02 -01 00 01 02 03 04 05 06
I
A
-20e-4
-10e-4
00
10e-4
20e-4
Figura 62 A) Voltametriacuteas ciacuteclicas de Fe(CN)63 1 mM en medio KCl 01 M a distintas velocidades de
barrido utilizando como electrodo de trabajo el biosensor amperomeacutetrico para evaluacioacuten de infeccioacuten
toxoplaacutesmica La flecha indica la direccioacuten de barrido B) Dependencia de Ip (en valores absolutos) con la
raiacutez de la velocidad de barrido el valor de pendiente de la recta de regresioacuten se utilizoacute para determinar el
aacuterea real del electrodo de trabajo
632 Cubierta del biosensor selectivo para glicerol y soluciones amortiguadoras
Se ensayaron distintos poliacutemeros para cubrir el biosensor de pasta de carbono B
utilizamos poliacutemeros de 4-vinilbenzilimine copolimerizados con cloruro de 4-
vinilbencil-trietilamonio y sulfonato de vinilfenilo (portadores de carga neta positiva y
negativa respectivamente) Si bien los poliacutemeros permitiacutean operar con complejos de
hierro utilizados como mediadores redox (Fe(CN)63-
y ferrocenometanol) no resultaron
uacutetiles en el ensamblado del biosensor por el elevado ruido de fondo que generaron
Se evaluaron distintas soluciones amortiguadoras de pH como fosfatos y
amoniacuteacoamonio Se optoacute por las soluciones de carbonato porque estas resultaron maacutes
sencillas de preparar y manipular que las amoniacales y presentaron mayor capacidad
reguladora en el pH oacuteptimo de la enzima GlDH que las de fosfato
633 Ensayos preliminares de voltametriacuteas de onda cuadrada
Los ensayos preliminares de voltametriacutea de onda cuadrada consistieron en
establecer los valores maacutes convenientes de la amplitud de pulso el escaloacuten de potencial
y la frecuencia para los futuros ensayos de cuantificacioacuten Se realizaron los voltagramas
en tres series de ensayos a seis valores de frecuencia 10 20 30 40 60 y 70 Hz
Los valores de salto de potencial ( ES) y amplitud de pulso ( E) utilizados en las
tres series de ensayos realizados se resumen en la siguiente tabla
(velocidad barrido)12 V12 s-12
006 008 010 012 014 016 018 020 022 024
Ip
A
40e-5
60e-5
80e-5
10e-4
12e-4
14e-4
16e-4
18e-4
20e-4
Experimentos Auxiliares
101
Tabla 67 Valores de salto de potencial y amplitud de onda cuadrada utilizados en los ensayos
voltameacutetricos
Serie 1 Serie 2 Serie 3
ES (mV) 5 5 10
E (mV) 25 50 50
En las 3 series de ensayos se observoacute que al aumentar la frecuencia la corriente de
pico no se incrementaba y el pico de corriente se deformaba aumentando
considerablemente el ruido Las mejores relaciones sentildealruido en las tres series de
ensayos se obtuvieron trabajando a 10 Hz Por su parte cuando se utilizoacute un escaloacuten de
potencial de 10 mV el pico de corriente se deformoacute levemente por lo que se optoacute por
trabajar con un ES = 5 mV Cuando la amplitud del pulso fue 50 mV se obtuvieron
mayores intensidades de corriente sin deformacioacuten de pico escogieacutendose en
consecuencia este valor En la Fig 63 se muestran los voltamperogramas obtenidos en
los ensayos de la serie 2 a una frecuencia de 10 Hz
Figura 63 Voltagramas de onda cuadrada obtenidos utilizando bioelectrodos de pasta de carbono viacutetreo
modificada con GlDH y MWCNT En liacutenea clara se muestra el voltagrama de la solucioacuten NAD+ 05 mM
(NH4)2SO4 25 mM K2CO3 KHCO3 100 mM pH 105 con medio Middelbrook 7H9 Superpuestos se
detallan los voltagramas de la misma solucioacuten luego del agregado de glicerol 100 M para llevar a
concentracioacuten final 25 mM (- - -) y 50 mM (____
)
6331 Seleccioacuten de un meacutetodo apropiado para establecer la liacutenea de base
Se buscoacute establecer una liacutenea de base para corregir los voltagramas obtenidos
utilizando algoritmos presentes en el programa GPES Se intentoacute con algoritmos de
correccioacuten que permiten establecer una liacutenea polinoacutemica ad-hoc para cada voltagrama
utilizando entre 2 y 5 puntos de la curva experimental Sin embargo las sentildeales
corregidas presentaban picos de corrientes con valores de ancho a la altura media Wfrac12
entre 0180 y 0220 V valores que resultan elevados comparados con 0123 Vn el valor
de referencia para este paraacutemetro en VOC donde n es el nuacutemero de electrones
Experimentos Auxiliares
102
intercambiados en la reaccioacuten Finalmente a cada VOC se les restoacute la VOC del blanco
buscaacutendose el pico de corriente con un algoritmo de buacutesqueda semiautomaacutetica del
programa GPES con una liacutenea de base recta y marcando manualmente el inicio y final
del pico establecieacutendose los mismos valores de potencial de inicio y finalizacioacuten del
pico de corriente en todos los voltamperogramas De este modo se obtuvieron picos
cuyos Wfrac12 eran proacuteximos al valor teoacutericamente predicho
Conclusiones
Conclusiones
104
7 Conclusiones
1- Se pudo encontrar cual de los programas de libre acceso para predecir epiacutetopes
lineales reconocidos por ceacutelulas B es el maacutes conveniente al momento de seleccionar
antiacutegenos con fines diagnoacutesticos
2- Se pudieron clonar expresar en forma soluble y marcar con biotina fragmentos
de antiacutegenos de toxoplasmosis de fase aguda que presentan alta concentracioacuten de
determinantes antigeacutenicos
3- Se verificoacute la utilidad de los antiacutegenos obtenidos para su posterior uso en el
ensamblado de bioelectrodos para diagnoacutestico de infeccioacuten aguda de toxoplasmosis
4- Se pudo cuantificar glicerol en muestras sencillas con un electrodo versaacutetil de
oro policristalino por medio de una metodologiacutea amperomeacutetrica a 01 V en medio
NaOH 01 M y con un tiempo de anaacutelisis de 8 min liacutemite de deteccioacuten 10 microM y un
intervalo de linealidad de 0024 a 200 mM
5- Se pudo cuantificar glicerol en medios de cultivo de micobacterias El meacutetodo
consiste en una amperometriacutea que emplea un bioelectrodo selectivo para glicerol
compuesto de pasta de C modificada con glicerol deshidrogenasa y lleva un tiempo de
anaacutelisis de 10 min liacutemite de deteccioacuten 20 microM y un rango de linealidad de 0060 a 175
mM Este meacutetodo podriacutea en un futuro ser uacutetil para identificar muestras de pacientes con
tuberculosis activa en un menor tiempo de anaacutelisis al actualmente empleado
6- Los meacutetodos para cuantificar glicerol aquiacute presentados fueron validados frente
a un equipo enzimaacutetico disponible comercialmente
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Iacutendice
ii
243 Teacutecnicas de pulso 24
2431 Voltamperometriacutea onda cuadrada VOC 24
25 Biosensores 27
251 Superficie de bioreconocimiento en biosensores 28
252 Biosensores amperomeacutetricos 29
253 Biosensores de uso cliacutenico 29
2531 Biosensores para evaluacioacuten de infeccioacuten toxoplaacutesmica 32
254 Biosensores para cuantificacioacuten de glicerol 32
3 Objetivos 37
31 Objetivos generales 37
32 Objetivos Particulares 37
4 Materiales y meacutetodos 39
41 Reactivos y medios de cultivos 39
411 Reactivos 39
412 Medios de cultivos 40
42 Cepas bacterianas 40
43 Bacterioacutefagos 41
44 Plaacutesmidos 41
45 Reaccioacuten en cadena de la polimerasa 41
46 Electroforesis de ADN en geles de agarosa 42
47 Minipreparacioacuten de ADN plasmiacutedico 42
48 Purificacioacuten del producto de amplificacioacuten 43
49 Prueba de expresioacuten de proteiacutenas de fusioacuten a TRX y a ―cola
de histidinas 43
410 Expresioacuten y purificacioacuten preparativas de antiacutegenos recombinantes 43
411 Separacioacuten de proteiacutenas mediante SDS-PAGE 44
412 Cuantificacioacuten de proteiacutenas 44
413 Reaccioacuten de conjugacioacuten biotina-antiacutegeno 44
Iacutendice
iii
414 Revelado cromogeacutenico de la reaccioacuten de conjugacioacuten 45
415 Mediciones espectrofotomeacutetricas 45
416 Ensayos de inmunoabsorcioacuten ligados a enzima con deteccioacuten
fotomeacutetrica 45
4161 Esquema A 46
4162 Esquema B 46
417 Reaccioacuten de color para determinacioacuten cuantitativa de glicerol por meacutetodo
espectrofotomeacutetrico 47
418 Determinacioacuten de glicerol remanente en cultivos de micobacterias 47
4181 Determinacioacuten de glicerol remanente en cultivos de micobacterias
con y sin fago D29 y ensayos controles respectivos 48
419 Instrumental electroquiacutemico 48
4191 Electrodos de trabajo 48
41911 Bioelectrodo para evaluacioacuten de infeccioacuten toxoplaacutesmica 48
41912 Electrodos para cuantificacioacuten de glicerol 49
4192 Limpieza de electrodos 50
4193 Determinacioacuten del aacuterea real del electrodo 50
41931 Medicioacuten de la adsorcioacuten de oxiacutegeno 50
41932 Voltametriacutea ciacuteclica de ferricianuro de potasio 51
420 Medidas electroquiacutemicas 51
4201 Mediciones amperomeacutetricas para evaluacioacuten de infeccioacuten
toxoplaacutesmica 51
4202 Mediciones amperomeacutetricas para cuantificacioacuten de glicerol 52
42021 Amperometriacuteas con tip de oro 52
42022 Amperometriacuteas con electrodos de pasta de C 52
4203 Voltamperometriacutea de onda cuadrada 53
421 Funcionalizacioacuten de nanotubos de carbono 53
422 Programas de prediccioacuten de epiacutetopes lineales reconocidos por ceacutelulas B 54
Iacutendice
iv
4221 Base de datos de proteiacutenas 54
4222 Programas utilizados 54
423 Anaacutelisis de Datos 54
424 Caacutelculos estadiacutesticos y disentildeo experimental 55
5 Resultados y discusioacuten 57
51 Evaluacioacuten de antiacutegenos recombinantes de T gondii 57
511 Antiacutegeno P30 57
512 Antiacutegeno P22 58
513 Antiacutegeno P35 59
52 Marcado de antiacutegenos recombinantes de T gondii 60
53 Inmunoensayos 61
531 Inmunoensayos con deteccioacuten fotomeacutetrica 61
5311 Evaluacioacuten del esquema A 61
5312 Esquema B 62
532 Inmunoensayos con deteccioacuten amperomeacutetrica utilizando los antiacutegenos
recombinantes 66
54 Determinacioacuten de la actividad electroquiacutemica del glicerol en medio
acuoso 67
55 Cuantificacioacuten de glicerol en medios acuosos complejos 71
551 Evaluacioacuten del modelo propuesto por medio de lecturas
espectrofotomeacutetricas 72
5511 Evaluacioacuten de la sentildeal con la concentracioacuten de glicerol 76
5512 Optimizacioacuten de condiciones para disminuir el costo operativo 78
552 Determinacioacuten de glicerol remanente en cultivos de micobacterias 79
5521 Evaluacioacuten de glicerol remanente en cultivos axeacutenicos de M
smegmatis 79
5522 Determinacioacuten de glicerol remanente en cultivos de micobacterias
con y sin fago D29 y ensayos controles respectivos 80
Iacutendice
v
553 Biosensor amperomeacutetrico a base de pasta de carbono viacutetreo
modificada 81
554 Desarrollo de un biosensor a base de pasta de carbono viacutetreo y
nanotubos de carbono 83
5541 Ensayos de cuantificacioacuten de glicerol con el bioelectrodo
desarrollado utilizando teacutecnicas de pulso 86
56 Validacioacuten de meacutetodos 88
6 Experimentos Auxiliares 94
61 Comparacioacuten de programas de prediccioacuten de epiacutetopes lineales reconocidos
por ceacutelulas B 94
62 Puesta a punto de ensayos de inmunoabsorcioacuten ligados a enzima con
deteccioacuten fotomeacutetrica 95
621 Bloqueante a utilizar 96
622 Esquema A 97
623 Esquema B 98
63 Ensayos electroquiacutemicos 99
631 Determinacioacuten del aacuterea real de un electrodo 99
6311 Meacutetodo de la adsorcioacuten de O2 99
6312 Voltametriacutea ciacuteclica a distintas velocidades 99
632 Cubierta del biosensor selectivo para glicerol y soluciones
amortiguadoras 100
633 Ensayos preliminares de voltametriacuteas de onda cuadrada 100
6331 Seleccioacuten de un meacutetodo apropiado para establecer la liacutenea
de base 101
7 Conclusiones 104
8 Bibliografiacutea 106
Resumen
vi
1 Resumen
Este trabajo de Tesis se orientoacute al desarrollo de meacutetodos analiacuteticos alternativos a los
hoy vigentes que faciliten la determinacioacuten de compuestos de intereacutes tanto para
diagnoacutestico cliacutenico como para la industria de combustibles alternativos Se realizaron
aportes para tres situaciones de relevancia diagnoacutestico de toxoplasmosis tuberculosis y
evaluacioacuten de calidad de biodiesel
La toxoplasmosis es una parasitosis causada por Toxoplasma gondii que afecta a
humanos sin generar complicaciones excepto cuando los infectados son
inmunodeprimidos o mujeres embarazadas que no cursaron previamente la enfermedad
En este caso el paraacutesito puede atravesar placenta generando infeccioacuten congeacutenita del
feto pudiendo producirle graves consecuencias que pueden llegar a la muerte Una de
las teacutecnicas de diagnoacutestico utiliza el ensayo de inmunoadsorcioacuten ligado a enzima
permitiendo la deteccioacuten de anticuerpos especiacuteficos contra el paraacutesito los cuales son
indicadores de existencia de infeccioacuten No obstante para detectar toxoplasmosis aguda
al diacutea de hoy se carece de una estandarizacioacuten confiable principalmente en la
preparacioacuten del antiacutegeno Por ello en este trabajo se procuroacute identificar regiones donde
se codificaraacuten algunos marcadores de fase aguda que concentraraacuten una alta proporcioacuten
de determinantes antigeacutenicos para luego clonarlas expresarlas como proteiacutenas
recombinantes marcarlas con biotina y asiacute utilizarlas como sistema de revelado de
anticuerpos especiacuteficos contra proteiacutenas de T gondii Los inmunoensayos aquiacute
presentados proponen una metodologiacutea que permitiraacute en un futuro distinguir sueros
provenientes de individuos con infeccioacuten aguda de aquellos con infeccioacuten croacutenica o no
infectados
La tuberculosis es una enfermedad infecto-contagiosa causada por la bacteria
Mycobacterium tuberculosis Su diagnoacutestico se basa en una serie de estudios que
finaliza con la identificacioacuten del agente etioloacutegico en cultivos obtenidos a partir de
esputo Esta identificacioacuten puede demorar aproximadamente dos meses debido al
prolongado tiempo de replicacioacuten de la micobacteria Esto conlleva la potencialidad de
contagio a individuos sanos y un compromiso importante de la salud del infectado
Uacuteltimamente se han desarrollado teacutecnicas indirectas de deteccioacuten de M tuberculosis
utilizando el bacterioacutefago D29 capaz de infectar especiacuteficamente micobacterias Es una
metodologiacutea donde se facilita la replicacioacuten del fago en la muestra proveniente del
paciente para luego evaluar el tiacutetulo de fagos liberados infectando un cultivo testigo de
Resumen
vii
Micobacterium smegmatis micobacteria de replicacioacuten raacutepida Siendo el glicerol fuente
de carbono en cultivos de micobacterias se planteoacute determinar su concentracioacuten
remanente como meacutetodo de evaluar integridad de M smegmatis establecieacutendose asiacute una
medida indirecta de la previa presencia de M tuberculosis en la muestra problema
Ademaacutes el glicerol es el principal subproducto en la elaboracioacuten del biodiesel y su
concentracioacuten es indicativa de la calidad del combustible transformaacutendose en analito
relevante para la industria de energiacuteas alternativas a la derivada del petroacuteleo
Se desarrollaron y validaron dos meacutetodos amperomeacutetricos de cuantificacioacuten de
glicerol a) Con electrodo de oro en NaOH 01 M aplicable a medios acuosos (LD 10
microM intervalo lineal 0024 a 200 mM) b) Con bioelectrodo de pasta de C modificada
con glicerol deshidrogenasa aplicable a medios complejos como cultivos bacterianos
(LD 20 M intervalo lineal 0060 a 175 mM)
Resumen
viii
1 Summary
This Thesis work was oriented to the development of analytical methods alternative
to those currently used to facilitate the identification of compounds of interest for both
clinical diagnosis and the alternative fuel industry Contributions of relevance to three
situations were performed Diagnosis of toxoplasmosis tuberculosis and the assessment
of biodiesel quality
Toxoplasmosis is a parasitic disease caused by Toxoplasma gondii which does not
bring complications in people except when the infected individual is an
immunocompromised patient or pregnant women who have not previously suffered
from the illness In this case the parasite can cross the placenta producing congenital
infection of the fetus and potentially causing serious consequences including death
One of the techniques used to its diagnosis is the enzyme-linked immunosorbent assay
allowing the detection of parasite-specific antibodies which are indicators of the
infection However this technique aimed to detect acute toxoplasmosis nowadays lacks
of reliable standardization particularly in the preparation of the antigen Therefore this
study focused on identifying regions encoding several markers of acute phase which
highly concentrated antigenic determinants to clone and express them as recombinant
proteins subsequently label them with biotin and thus use them as developing system of
specific antibodies against T gondii proteins The immunoassays presented here
propose a methodology which will allow in the future distinguishing sera from
individuals with acute infection of those with chronic infection or uninfected
Tuberculosis is an infectious and contagious disease caused by the bacterium
Mycobacterium tuberculosis Its diagnosis is based on a series of studies which
eventually identify the etiologic agent in cultures obtained from sputum This
identification can take about two months due to the extensive mycobacteria replication
time This leads to the potential contagion of healthy individuals and a major
commitment to the health of the infected patient Recently indirect M tuberculosis
detection techniques have been developed They use D29 bacteriophage which is able
to specifically infect mycobacteria The methodology allows phage replication in the
patientrsquos sample and then evaluates the number of released phages by infecting a
control culture of Mycobacterium smegmatis a short-term replicable mycobacteria As
glycerol is the carbon source commonly used in mycobacteria culture this work
proposes determining its residual concentration as a method of evaluating integrity of
Resumen
ix
M smegmatis thus establishing an indirect measurement of the previous presence of M
tuberculosis in the sample
Furthermore glycerol is the main by-product in biodiesel production and its
concentration is an indicator of the fuel quality becoming a relevant analyte to the
energy industry alternative to that derived of petroleum
Two amperometric methods for glycerol quantitation were developed and
validated a) Using a gold electrode in 01 M NaOH medium useful for simple aqueous
solutions (LD 10 microM linear range from 0024 to 200 mM) b) using a carbon paste
bioelectrode modified with glycerol dehydrogenase useful for complex media such as
bacterial cultures (LD 20 microM linear range 0060 to 175 mM)
Publicaciones
x
Publicaciones
Los resultados parciales del presente trabajo de Tesis han dado lugar a las
siguientes publicaciones
Trabajos en revistas internacionales
1- Costa J G Faccendini P L Sferco S J Lagier C M Marcipar I S
Evaluation and comparison of the ability of online available prediction programs to
predict true linear B-cell epitopes Protein amp Peptide Letters (2013) 20(6)724-30
2- Faccendini P L Ribone M E Lagier C M Selective application of two
rapid low-cost electrochemical methods to quantify glycerol according to the sample
nature Sensors and Actuators B (2014) 193 142ndash 148
Trabajos en congresos
1- Muntildeoz A Faccendini P L Ribone M E Lagier C M Oxidacioacuten
electroquiacutemica de polialcoholes sustrato de sistemas enzimaacuteticos bacterianos Estudio
de las condiciones para su cuantificacioacuten V Congreso Argentino de Quiacutemica Analiacutetica
Bahiacutea Blanca Noviembre de 2009
2- Costa J G Faccendini P L Carral L Kaufer F Lagier C M Marcipar I
S Evaluacioacuten de dos regiones de la Proteiacutena P35 de Toxoplasmama gondii para el
diagnostico de fase aguda de la toxoplasmosis Ascochinga Coacuterdoba Octubre de 2010
3- Costa J G Faccendini P L Lagier C M Marcipar I S Modelado y
prediccioacuten de los epiacutetopes del antigeno P22 de Toxoplasma gondii 2do Congreso de
Bioinformaacutetica y Biologiacutea Computacional Coacuterdoba Mayo de 2011
4- Faccendini P L Costa J G Ribone M E Marcipar I S Lagier C M
Ensamblado de un bioelectrodo econoacutemico para la deteccioacuten de glicerol en medios
altamente complejos 6deg Congreso Argentino de Quiacutemica Analiacutetica Santa Fe
Septiembre de 2011
5- Faccendini P L Costa J G Ribone M E Marcipar I S Lagier C M
Desarrollo y optimizacioacuten de un meacutetodo para la cuantificacioacuten de glicerol en matrices
complejas 6deg Congreso Argentino de Quiacutemica Analiacutetica Santa Fe Septiembre de 2011
Publicaciones
xi
6- Costa J G Perotti J Faccendini P L Lagier C M Mancipar I S
Optimization of the acute toxoplasmosis immunodiagnostic during the pregnancy
Workshop Fronteras en Biociencias Ministerio de Ciencia Tecnologiacutea e Innovacioacuten
Productiva Embajada Alemana Ciudad Autoacutenoma de Buenos Aires Abril de 2012
7- Costa J G Perotti J Faccendini P L Dure A Carral L Kaufer F Lagier
C M Mancipar I S Evaluacioacuten de diferentes regiones de las proteiacutenas p22 p30 y p35
para diagnoacutestico de la fase aguda de la toxoplasmosis XXV Reunioacuten Anual de la
Sociedad Argentina Protozoologiacutea 2012 Ciudad Autoacutenoma de Buenos Aires Agosto
de 2012
8- Costa J G Faccendini P L Sferco S J Lagier C M Mancipar I S
Comparison of the ability to predict true linear B-cell epitopes by on-line available
prediction programs 3er congreso de la sociedad argentina de bioinformaacutetica y biologiacutea
computacional Paranaacute Septiembre de 2012
9- Faccendini P L Costa J G Ribone M E Marcipar I S Lagier C M
Desarrollo de un sistema electroquiacutemico para evaluar infeccioacuten toxoplaacutesmica 7deg
Congreso Argentino de Quiacutemica Analiacutetica Mendoza Octubre de 2013
Abreviaturas y Siacutembolos
xii
Abreviaturas y Siacutembolos
AD Aglutinacioacuten Directa
ADN Aacutecido desoxiribonucleico
Ac(s) Anticuerpo(s)
Ang(s) Antiacutegeno(s)
D Coeficiente de difusioacuten
DHA 13 dihidroxiacetona
DMSO Dimetil sulfoacutexido
DO Densidad oacuteptica
DT Dye Test con azul de metileno (Reaccioacuten de Sabiacuten Feldman)
EDTA Aacutecido etilendiaminotetraaceacutetico
ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay (Ensayo de inmunoadsorcioacuten ligado
a enzima)
F Constante de Faraday
Frecuencia
GlDH Glicerol deshidrogenasa
HAI Hemoaglutinacioacuten indirecta
HEPES Aacutecido 4-(2-hydroxietil)-1-piperazina etano sulfoacutenico
HRP Horse radish peroxidase (Peroxidasa de raacutebano picante)
I Corriente eleacutectrica
IFI Inmunofluorescencia indirecta
IgA Inmunoglobulina A
IgG Inmunoglobulina G
IgE Inmunoglobulina E
IgM Inmunoglobulina M
IgM-IFI Inmunofluorescencia indirecta de IgM (Prueba de Remington)
IPTG Isopropil- -D-tiogalactopiranoacutesido
ISAGA Ensayo aglutinante de inmunoabsorcioacuten
LB Medio Luria-Bertani
LC Liacutemite de cuantificacioacuten
LD Liacutemite de deteccioacuten
MWCNT Multi-walled carboacuten nanotubes (Nanotubos de carbono de paredes
muacuteltiples)
Abreviaturas y Siacutembolos
xiii
N nuacutemero de moles de especie reducida u oxidada
OMS Organizacioacuten Mundial de la Salud
P35 Antiacutegeno de superficie de T gondii de 35 kDa de peso
PBS Phosphate buffer salin (Solucioacuten tampoacuten fosfato salino)
PCR Polimerasa chain reaction (Reaccioacuten en cadena de la polimerasa)
pET32a Vector plasmiacutedico
Q Carga eleacutectrica circulante
SAG1 Surface antigen 1 (Antiacutegeno de superficie 1 o antiacutegeno P30 de T gondii)
SAG2 Surface antigen 2 (Antiacutegeno de superficie 2 o antiacutegeno P22 de T gondii)
SDS Dodecil sulfato de sodio
TB Tuberculosis
TRX Tioredoxina
VBL Voltametriacutea de barrido lineal
VC Voltametriacutea ciacuteclica
VPD Voltametriacutea de pulso diferencial
Introduccioacuten
Introduccioacuten
1
2 Introduccioacuten
21 Toxoplasmosis
211 Generalidades
La toxoplasmosis es una enfermedad causada por el paraacutesito protozoario
Toxoplasma gondii que infecta animales herbiacutevoros carniacutevoros y omniacutevoros dentro de
los cuales se encuentra el hombre Estaacute ampliamente extendida por todo el mundo y su
incidencia y prevalencia variacutean mucho seguacuten las zonas geograacuteficas los haacutebitos
alimentarios el tipo de trabajo la higiene ambiental y la presencia o no de gatos
infectados (Atias 1998 Martiacuten-Hernaacutendez 2004) Es una zoonosis que afecta a los
humanos a traveacutes de formas infectivas producidas durante el ciclo bioloacutegico que se
desarrolla uacutenicamente en gatos y otros feacutelidos Dependiendo de la localizacioacuten
geograacutefica entre 15 y 85 de la poblacioacuten adulta mundial presenta infeccioacuten croacutenica
(Fuentes y col 2001)
Usualmente la principal viacutea de transmisioacuten de esta parasitosis es la oral por
ingestioacuten de carnes crudas o poco cocidas contaminadas con quistes o por la ingestioacuten
de ooquistes presentes en agua o alimentos contaminados con heces de gato Son menos
frecuentes las viacuteas de transmisioacuten parenteral respiratorias mucosal (conjuntival)
cutaacutenea y por transfusioacuten de sangre o trasplante de oacuterganos La transmisioacuten por viacutea
transplacentaria puede ocurrir cuando la embarazada padece la primoinfeccioacuten durante
el curso del embarazo aunque se han descripto casos raros de infeccioacuten congeacutenita por
toxoplasmosis materna anterior al embarazo (Martiacuten-Hernaacutendez 2004 Centers of
Diseases Control and Prevention (CDC) paacutegina web a)
Durante la infeccioacuten pueden distinguirse dos etapas A) Aguda Al breve tiempo de
ingerir ooquistes esporulados eacutestos se transforman en taquizoiacutetos ingresan a la ceacutelula
del hueacutesped y comienzan a dividirse en forma asexual hasta que la ceacutelula se lisa
liberando asiacute la progenie y ocasionando la parasitemia Posteriormente el taquizoiacuteto
evoluciona a bradizoiacuteto cuya multiplicacioacuten es lenta Se produce la invasioacuten de los
oacuterganos por viacutea linfaacutetica o hemaacutetica siendo los oacuterganos maacutes comprometidos los
muacutesculos esqueleacutetico y cardiacuteaco asiacute como cerebro y ojos B) Croacutenica En la medida que
evoluciona la defensa del hueacutesped desaparecen los paraacutesitos extracelulares limitaacutendose
la divisioacuten intracelular y quedando las formas resistentes principalmente en el sistema
nervioso central y muacutesculo esqueleacutetico Por lo general esta etapa es latente pero puede
Introduccioacuten
2
activarse por la ruptura de los quistes tisulares (Fuentes y col 2001 Trabattoni y col
2008)
212 Toxoplasma gondii
El Toxoplasma gondii es un paraacutesito intracelular obligado Su ubicacioacuten
taxonoacutemica se detalla en la Tabla 21
Tabla 21 Ubicacioacuten taxonoacutemica del T gondii
Reino Protista
Sub-reino Protozoa
Phylum Apicomplexa
Clase Sporozoea
Sub-clase Coccidea
Orden Eucoccidiia
Sub-orden Eimeriina
Familia Sarcocystidae
Sub-familia Toxoplasmatinae
Geacutenero Toxoplasma
Especie gondii
Durante el ciclo de vida del T gondii se distinguen tres formas a) los taquizoiacutetos
b) los bradizoiacutetos (o quistes tisulares) y c) los ooquistes Los taquizoiacutetos (o trofozoiacutetos)
son la forma proliferativa y de reproduccioacuten raacutepida dentro de la ceacutelula del hueacutesped
durante la fase aguda que posteriormente deviene en la formacioacuten de un pseudoquiste
Tiene forma de medialuna y mide de 4 a 7 μm de ancho Estaacute recubierto por un sistema
de membranas constituido por una membrana doble interna y una externa interrumpida
en dos puntos El taquizoiacuteto es afectado por anticuerpos (Acs) especiacuteficos y faacutermacos y
se destruye en condiciones ambientales adversas como congelamiento-
descongelamiento desecacioacuten y bajo pH (por ejemplo el de los jugos gaacutestricos) Los
quistes tisulares son redondeados de pared elaacutestica miden de 10 a 200 μm y pueden
contener hasta 3000 paraacutesitos denominados bradizoiacutetos Estas formas no son afectadas
por Acs ni faacutermacos pero pueden ser destruidos por calentamiento congelamiento-
descongelamiento y por desecacioacuten Cuando estos quistes son ingeridos los bradizoiacutetos
resistentes son liberados por la accioacuten gaacutestrica y pueden invadir la mucosa
gastrointestinal Los ooquistes son estructuras ovoides de 10 a 12 μm de diaacutemetro y son
eliminadas en la materia fecal del gato Recieacuten emitidos no son infectivos pero bajo
condiciones de temperatura humedad y presencia de oxiacutegeno esporulan tornaacutendose
Introduccioacuten
3
infectivos y resistentes por maacutes de un antildeo en el suelo y dos antildeos en el agua (Atias
1998 Perotti 2007)
La Fig 21 describe el ciclo de vida del paraacutesito Los uacutenicos hueacutespedes definitivos
conocidos de T gondii son miembros de la familia Felidae (por ejemplo gatos
domeacutesticos) Los ooquistes no esporulados son liberados en las heces del felino Los
ooquistes tardan entre 1 y 5 diacuteas en esporular en el ambiente y volverse infectivos Los
hueacutespedes intermediarios se infectan al ingerir tierra agua o plantas contaminadas con
los ooquistes Los ooquistes se transforman en taquizoiacutetos al breve tiempo de ser
ingeridos Estos taquizoiacutetos se localizan en los tejidos musculares y el sistema nervioso
y evolucionan a bradizoiacutetos formando los quistes tisulares (hiacutesticos) Los felinos se
infectan luego de ingerir la carne de hueacutespedes intermediarios que poseen quistes
tisulares o por ingestioacuten de los ooquistes esporulados Los animales de caza y los
criados para consumo humano tambieacuten pueden infectarse por ingestioacuten de ooquistes
esporulados En el hueacutesped humano los paraacutesitos forman quistes en los tejidos y suele
encontrarse generalmente en el muacutesculo esqueleacutetico el miocardio cerebro y ojos donde
pueden permanecer durante toda la vida del hueacutesped (Paacutegina web del CDC)
Figura 21 Ciclo de vida de T gondii El hueacutesped definitivo son miembros de la familia Felidae los
demaacutes hueacutespedes (incluido el hombre) se infectan accidentalmente y no son necesarios para completar el
ciclo de vida del paraacutesito Adaptado de httpwwwdpdcdcgovdpdxHTMLToxoplasmosishtm
Introduccioacuten
4
213 Diagnoacutestico
Puesto que las infecciones por T gondii en individuos inmunocompetentes son por
lo general asintomaacuteticas o presentan siacutentomas imperceptibles su diagnoacutestico se basa
principalmente en pruebas de laboratorio La toxoplasmosis no suele generar
complicaciones excepto en 2 situaciones cuando se infectan individuos
inmunodeprimidos y cuando se infectan por primera vez mujeres embarazadas En este
uacuteltimo caso el paraacutesito puede infectar al feto atravesando la placenta y generando la
infeccioacuten congeacutenita Las probabilidades de dantildear al feto o al nintildeo luego de nacer
dependeraacuten del trimestre en que suceda la infeccioacuten (Atias 1998 Martiacuten-Hernaacutendez
2005) Tanto en inmunocomprometidos como en el recieacuten nacido la infeccioacuten puede
producir graves consecuencias Es por ello que en estos casos asiacute como en la
embarazada el diagnoacutestico cobra particular relevancia (Remington y col 1995)
2131 Meacutetodos de diagnoacutestico
La infeccioacuten puede diagnosticarse por meacutetodos directos que consisten en la
identificacioacuten de las estructuras parasitarias (por un estudio histopatoloacutegico para lo cual
es necesario realizar biopsias puncioacuten de ganglios o cortes histoloacutegicos) o la
identificacioacuten de ADN del paraacutesito (a traveacutes de una reaccioacuten en cadena de la
polimerasa PCR) Tambieacuten se pueden realizar cultivos tisulares e inoculacioacuten al
peritoneo de ratoacuten pero este meacutetodo presenta la desventaja de involucrar el manejo de
paraacutesitos vivos y el uso de animales de laboratorio (Perotti 2007)
Los meacutetodos alternativos son las pruebas indirectas a saber
Intradermoreaccioacuten de Frenkel Evaluacutea la inmunidad celular Es una reaccioacuten
cualitativa tardiacutea y presenta resultado positivo a partir de la cuarta semana de infeccioacuten
aunque se han reportado casos de pacientes en los que llevoacute varios meses hasta dar
positiva Se utiliza con fines epidemioloacutegicos (Jirovec amp Jindrich 1961 Rodriacuteguez
Acar y col 2008)
Reaccioacuten de Sabiacuten Feldman o dye test con azul de metileno (DT) Es el meacutetodo
de referencia de la OMS Evaluacutea la inmunidad humoral y mide la cantidad total de Acs
que es capaz de destruir taquizoiacutetos viacutea activacioacuten del complemento Es un meacutetodo
cuantitativo y presenta valores positivos a partir de la primera o segunda semana de
infeccioacuten Tiene la desventaja de requerir taquizoiacutetos vivos y animales para su cultivo
por lo que soacutelo laboratorios de referencia llevan adelante este meacutetodo (Perotti 2007
Durlach y col 2008)
Introduccioacuten
5
Reaccioacuten de inmunofluorescencia indirecta (IFI) Evaluacutea la cantidad de Acs que
se unen a toxoplasmas inactivados La reaccioacuten se evidencia con Acs anti-IgG humana
marcados con isocianato de fluoresceiacutena y observando al microscopio de fluorescencia
Si bien no se trabaja con organismos vivos la necesidad de un microscopio de
fluorescencia y la subjetividad del operador limitan el uso de este meacutetodo Se han
informado resultados falso-positivos debidos a Acs anti-nucleares (Durlach y col
2008)
Aglutinacioacuten directa (AD) En este ensayo se produce una aglutinacioacuten visible con
toxoplasmas tratados con formol Se detecta fundamentalmente IgMs especiacuteficas
Hemoaglutinacioacuten indirecta (HAI) Se utilizan antiacutegenos (Angs) de T gondii con
los que se sensibiliza gloacutebulos rojos que en presencia de Acs especiacuteficos producen una
aglutinacioacuten visible como un botoacuten rojo En general es utilizado para determinar
incidencia o seroprevalencia en una regioacuten pero no se recomienda para la deteccioacuten de
la infeccioacuten aguda (Durlach y col 2008)
Fijacioacuten del complemento Se detectan Acs que activan el sistema del
complemento en presencia de Angs de T gondii La reaccioacuten se evidencia con el
sistema hemoliacutetico hemolisina-gloacutebulos rojos de carnero Resultados positivos aparecen
en forma maacutes tardiacutea que en el DT (Perotti 2007)
Western blot Se evaluacutea la presencia de Acs especiacuteficos a Angs que han sido
separados por electroforesis en un gel de poliacrilamida y transferidos a una membrana
Generalmente no es utilizada como teacutecnica de diagnoacutestico debido a su difiacutecil
estandarizacioacuten (Durlach y col 2008)
Prueba de Remington (IgM-IFI) Se sigue el mismo esquema que en IFI pero se
sustituyen el conjugado anti-IgG por uno anti-IgM lo que permite detectar infeccioacuten
aguda Acs anti-nucleares y el factor reumatoide pueden producir resultados falso-
positivos y los Acs tipo IgG pueden producir resultados falso-negativos (Perotti 2007)
Ensayo aglutinante de inmunoabsorcioacuten (ISAGA) Permite la deteccioacuten y dosaje
de Acs IgA IgE IgG e IgM especiacuteficos contra el paraacutesito Este meacutetodo posee mayor
sensibilidad en relacioacuten al IgM-IFI y al ensayo de inmunoadsorcioacuten ligado a enzima
(ELISA) de IgM para la deteccioacuten de infecciones congeacutenitas pero tiene la desventaja
que pueden detectarse IgM especiacuteficas luego de un antildeo de la primoinfeccioacuten Esto
dificulta la interpretacioacuten de un resultado positivo si se desea determinar la antiguumledad
de la infeccioacuten (Durlach y col 2008)
Introduccioacuten
6
Ensayo de inmunoadsorcioacuten ligado a enzima (ELISA) Permite la deteccioacuten de
Acs especiacuteficos contra el paraacutesito Se evidencia la reaccioacuten con una enzima ligada a Acs
o Angs (dependiendo del disentildeo del inmunoensayo ver maacutes adelante en punto 2134)
que transforma un reactivo auxiliar en un producto coloreado o fluorescente Es un
meacutetodo cuantitativo que utiliza un espectrofotoacutemetro o fluoroacutemetro lo que permite
hacer medidas maacutes objetivas y raacutepidas (Perotti 2007) Auacuten asiacute este meacutetodo aplicado a
la deteccioacuten de la toxoplasmosis de fase aguda carece de una estandarizacioacuten confiable
principalmente en la preparacioacuten del Ang
2132 Importancia del correcto diagnoacutestico en la embarazada
A pesar de toda la bateriacutea de ensayos arriba descritos disponibles para el
diagnoacutestico de la toxoplasmosis el de la infeccioacuten aguda en la mujer embarazada sigue
siendo problemaacutetico porque este diagnoacutestico se deduce a partir de los datos de las
concentraciones relativas de los distintos isotipos de las inmunoglobulinas especiacuteficas
En efecto la existencia y concentracioacuten de IgM IgA e IgG especiacuteficas contra T gondii
es muy dependiente de la respuesta inmune del individuo infectado Considerando que
el tratamiento para prevenir la transmisioacuten al feto consiste en administrar drogas
antiparasitarias que tienen efectos nocivos sobre el nonato auacuten en estos diacuteas se trabaja
en mejorar este diagnoacutestico ya que no se cuenta con un meacutetodo confiable como para
prevenir por un lado los dantildeos que suelen sufrir los recieacuten nacidos de madres con
primoinfeccioacuten no diagnosticada y por otra parte los efectos perjudiciales en los fetos
de las embarazadas incorrectamente diagnosticadas y medicadas Por ello es que en este
trabajo se intentoacute desarrollar nuevas metodologiacuteas de diagnoacutestico de la infeccioacuten
toxoplaacutesmica aguda utilizando teacutecnicas electroquiacutemicas
2133 Diagnoacutestico en la embarazada
El correcto diagnoacutestico de la infeccioacuten aguda en la embarazada incluye la
utilizacioacuten de teacutecnicas especiacuteficas y sensibles asiacute como tambieacuten la aplicacioacuten de un
esquema de seguimiento adecuado El diagnoacutestico generalmente es realizado por
serologiacutea Para determinar si la paciente cursa una infeccioacuten aguda se determinan los
tiacutetulos de los anticuerpos IgG IgA e IgM (Arcavi y col 1997) y se interpretan prima-
facie seguacuten
1 IgG IgA IgM negativas ausencia de infeccioacuten
2 IgG e IgA positivas IgM negativa infeccioacuten croacutenica
3 IgG IgA e IgM positivas posible infeccioacuten aguda
Introduccioacuten
7
2134 Ensayo de inmunoadsorcioacuten ligado a enzima
Los ensayos del tipo ELISA consisten en la deteccioacuten de un antiacutegeno o un
anticuerpo inmovilizado sobre un soporte soacutelido y mediante anticuerpos que directa o
indirectamente producen una reaccioacuten La prueba recurre al empleo de antiacutegenos o
anticuerpos conjugados a una enzima (marcados) que por reaccioacuten con su sustrato
producen una especie coloreada cuya concentracioacuten puede ser medida
fotomeacutetricamente Este ensayo tiene las ventajas de ser versaacutetil robusto simple en su
realizacioacuten y emplear reactivos relativamente econoacutemicos El uso de una fase soacutelida que
retiene el analito de intereacutes proporciona una elevada sensibilidad mientras que la
elevada especificidad del ensayo viene dada por la gran selectividad de los anticuerpos
por su antiacutegeno Las configuraciones maacutes sencillas para estos ensayos son el directo y el
indirecto ambas esquematizadas en la Fig 22
Antiacutegeno IgG conjugada a enzima
Bloqueante IgG humana Reactivo de color
Directo Indirecto
Figura 22 Esquemas que representan los ELISA directo (izquierda) e indirecto (derecha)
21341 Esquema de captura o tipo ldquoSandwichrdquo
Cuando los anticuerpos que desean detectarse son del isotipo IgM suele tenerse el
inconveniente que el isotipo IgG frecuentemente estaacute en mayor concentracioacuten que el
IgM y presenta una mayor afinidad por el antiacutegeno Por lo tanto las IgG suelen
dificultar la deteccioacuten de las IgM en suero cuando se sigue un esquema de ELISA
indirecto con anticuerpos anti-IgM humana (Ac-a-IgMh) marcados Es por esto que
suele optarse por un esquema de captura o tipo saacutendwich en el cual se aumenta la
sensibilidad del ensayo incorporando un eslaboacuten maacutes en el inmunocomplejo adsorbido
En este trabajo se ensayaron dos alternativas de captura o tipo saacutendwich En la
primera alternativa que sigue un esquema claacutesico (A) se adsorbieron los Ac-a-IgMh
Introduccioacuten
8
sobre la superficie de la placa de poliestireno Las placas asiacute sensibilizadas se
enfrentaron al suero a ensayar capturando selectivamente una porcioacuten de las IgM de la
muestra Luego se los enfrentoacute al antiacutegeno de intereacutes ligado a biotina que se une a las
IgMh especiacuteficas para dicho Ang previamente capturado Finalmente se buscoacute revelar
con enzima peroxidasa de raacutebano picante (HRP) conjugada a streptavidina esta uacuteltima
forma un complejo estable con biotina De esta forma se aumenta la cantidad de Ac que
se desean detectar adsorbido sobre la placa seleccionando el tipo de anticuerpo que se
adsorbe En la Fig 23 se muestra el esquema del ensayo tipo A
IgM Antiacutegeno ligado a biotina streptavidina conjugada a HRP
Bloqueante IgG anti-IgM Reactivo de color
Figura 23 Esquema de ensayo ELISA tipo captura claacutesico A Un anticuerpo anti IgMh captura una
porcioacuten de las IgM presentes en el suero humano una porcioacuten de estas IgM capturadas son especiacuteficas
para antiacutegeno de T gondii y se revela su presencia por medio del antiacutegeno recombinante ligado a biotina
streptavidina ligada a HRP adicionando el sustrato de la enzima y un cromoacutegeno actuando como
cosustrato
La segunda alternativa que denominamos tipo B sale del esquema tradicional de
los ELISA Se adsorbe el antiacutegeno recombinante sobre la superficie de la placa de
poliestireno enfrentaacutendola luego al suero a ensayar Asiacute se captura selectivamente las
inmunoglobulinas que reconocen al antiacutegeno Luego se expone la placa al mismo
antiacutegeno recombinante pero ligado a biotina que se uniraacute a los anticuerpos especiacuteficos
para dicho Ang previamente capturados Finalmente se revela con HRP conjugada a
streptavidina que forma un complejo estable con biotina De esta forma se aumenta la
cantidad de Ang marcado en mayor proporcioacuten para IgM que para IgG dada la
Introduccioacuten
9
multivalencia de este isotipo de inmunoglobulina En la Fig 24 se muestra el segundo
esquema que fue el que brindoacute los resultados maacutes promisorios
Antiacutegeno (Ang) Bloqueante Ang ligado a biotina Reactivo de color
IgM a-Ang IgG a-Ang streptavidina conjugada a HRP
Figura 24 Esquema de ensayo ELISA de captura tipo B El antiacutegeno expuesto en la placa captura la
porcioacuten de las IgM e IgG especiacuteficas presentes en el suero humano Haciendo uso de la polivalencia de
las IgM su presencia se revela con el antiacutegeno conjugado a biotina streptavidina ligada a HRP
adicionando el sustrato de la enzima y un cromoacutegeno actuando como cosustrato
2135 Obtencioacuten de antiacutegenos para diagnoacutestico
El diagnoacutestico de rutina de la toxoplasmosis se basa en la deteccioacuten seroloacutegica de
anticuerpos en el paciente Los antiacutegenos utilizados en estas pruebas seroloacutegicas son
generalmente proteiacutenas derivadas de ceacutelulas T gondii que se propagan en el ratoacuten o el
cultivo de ceacutelulas El cultivo y el mantenimiento de este paraacutesito es laborioso lento y
caro (Lau amp Fong 2006) El uso de antiacutegenos nativos de taquizoitos es difiacutecil de
estandarizar y con frecuencia produce reacciones positivas falsas (Hiszczyntildeska-Sawicka
y col 2005) Por lo tanto ha habido intentos de producir antiacutegenos a traveacutes de medios
maacutes seguros tales como tecnologiacutea de ADN recombinante La mayoriacutea de estos
esfuerzos se han centrado en los principales antiacutegenos de superficie del paraacutesito como el
antiacutegeno de superficie 1 (SAG1 del ingleacutes Surface antigen 1) y el antiacutegeno de superficie
2 (SAG2 del ingleacutes Surface antigen 2) (Lau amp Fong 2006) En estudios recientes se ha
estado evaluando que la presencia de IgM e IgG anti P35 seriacutea un mejor indicador de
infeccioacuten reciente que la evaluacioacuten de IgM utilizando taquizoitos enteros en ensayos
del tipo ELISA (Lu y col 2006) En efecto con la nueva tecnologiacutea de ADN
Introduccioacuten
10
recombinante es posible obtener cualquier proteiacutena contaacutendose ademaacutes con ventajas
como la posibilidad de seleccionar porciones especiacuteficas de un Ang para evitar
reacciones inespeciacuteficas ligar distintas porciones que naturalmente corresponden a otras
proteiacutenas para aumentar la sensibilidad del ensayo agregar secuencias aminoaciacutedicas
que faciliten la posterior purificacioacuten y estandarizacioacuten de la proteiacutena a utilizar
(Hiszczyntildeska-Sawicka y col 2005) A la postre todo el proceso resulta maacutes
econoacutemico seguro y confiable que la purificacioacuten de Angs a partir del microorganismo
nativo puesto que no requiere la manipulacioacuten de microorganismos patoacutegenos ya que
la expresioacuten de las proteiacutenas recombinantes se lleva adelante en microorganismos no
infectivos de raacutepido crecimiento (Babaie y col 2013)
Por lo arriba expresado debe seguirse un esquema para seleccionar cuales deben de
ser las proteiacutenas que conviene utilizar acorde al diagnoacutestico que se pretende abordar y
ello demanda un trabajo racional de seleccioacuten de antiacutegenos generalmente
inmunodominantes No obstante escoger tales proteiacutenas no es tarea sencilla por cuanto
la verificacioacuten del grado de bondad del Ang seleccionado exige una ardua tarea
experimental siendo conveniente acotar el nuacutemero de Angs alternativos a evaluar Un
modo de encarar esto es procurar predecir el grado de antigenicidad en base a la
secuencia aminoaciacutedica lo cual puede realizarse computacionalmente
214 Prediccioacuten de epiacutetopes reconocidos por ceacutelulas B
Los programas de prediccioacuten definen el grado de antigenicidad por medio de una
puntuacioacuten (score) en algunos casos para cada epiacutetope y en otros para cada residuo
amino aciacutedico En este uacuteltimo se puede definir una regioacuten antigeacutenica cuando varios
residuos con alta puntuacioacuten son adyacentes en la estructura primaria Por otra parte el
nuacutemero de epiacutetopes o regiones antigeacutenicas que los programas de prediccioacuten encuentran
depende de un umbral que es configurado por el usuario
En la actualidad los inmunoensayos para determinar anticuerpos son realizados
utilizando regiones antigeacutenicas definidas ya sea como moleacuteculas uacutenicas mezcla de
varios componentes o como antiacutegenos de fusioacuten multiepiacutetope (Camussone 2009) El
desarrollo de herramientas informaacuteticas para predecir de forma fiable la antigenicidad
de los epiacutetopes puede reducir el costoso y prolongado trabajo experimental requerido
para identificar las regiones de intereacutes (Namrata amp Rajat 2010) Al momento de
identificar estas regiones antigeacutenicas suele contarse soacutelo con la estructura primaria de
las proteiacutenas en estudio desconocieacutendose su estructura terciaria en la mayoriacutea de los
Introduccioacuten
11
casos De aquiacute que la prediccioacuten de epiacutetopes lineales es el meacutetodo maacutes utilizado para
seleccionar epiacutetopes putativos
Desde el informe inicial de Hopp y Woods en 1981 (Hopp amp Woods 1981) varios
procedimientos se han hecho populares para detectar epiacutetopes lineales reconocidos por
ceacutelulas B a partir de la estructura primaria de una proteiacutena El rendimiento de estos
programas auacuten no ha logrado una eficiencia oacuteptima seguacuten lo declarado por sus propios
autores (Kolaskar amp Tongaonkar 1990 Saha y col 2005 Saha amp Raghava 2006
Larsen y col 2006 Davydov amp Tonevitskii 2009)
La literatura sobre las aplicaciones de estos programas estaacute orientada
principalmente a identificar posibles vacunas (Namrata amp Rajat 2010) Por lo tanto la
sensibilidad (probabilidad de obtener un positivo entre los verdaderos positivos) y la
especificidad (probabilidad de obtener un negativo entre aquellos negativos verdaderos)
son los indicadores maacutes utilizados para evaluar la calidad de estos programas ya que un
uacutenico epiacutetope puede ser crucial para lograr una respuesta inmunoprotectora Al mismo
tiempo suele omitirse el valor predictivo positivo (VPP) que es la proporcioacuten de
muestras que dan positivo el ensayo siendo verdaderos positivos o sea es la capacidad
para encontrar los epiacutetopes reales de una proteiacutena (ver el recuadro 1) Sin embargo la
fiabilidad del epiacutetope predicho es maacutes importante que su sensibilidad para reducir el
nuacutemero de experimentos confirmatorios de su utilidad diagnoacutestica Es entonces
importante diferenciar ambos paraacutemetros ya que los programas de prediccioacuten pueden
realizar predicciones de baja sensibilidad pero al mismo tiempo si los epiacutetopes reales
fueron predichos la prediccioacuten presenta un alto VPP
Recuadro 1
Los casos posibles en un ensayo son
Verdaderos
positivos
Verdaderos
negativos
Ensayo
positivo A B
Ensayo
negativo C D
BA
A positivo predictivoValor
DB
D dadEspecifici
CA
A adSensibilid
Introduccioacuten
12
La falta de estudios comparativos entre los programas de prediccioacuten en la literatura
actual impide que los usuarios hagan la mejor eleccioacuten Por ello como trabajo inicial se
intentoacute evaluar los distintos programas disponibles en la red en cuanto a su capacidad
para predecir positivamente epiacutetopes
Introduccioacuten
13
22 Tuberculosis
221 Generalidades
La tuberculosis (TB) humana es una enfermedad infecto-contagiosa causada por la
bacteria Mycobacterium tuberculosis La infeccioacuten por M tuberculosis suele ser
asintomaacutetica en personas sanas dado que su sistema inmune es capaz de controlar la
bacteria No obstante en condiciones de desnutricioacuten o inmunocompromiso la
enfermedad suele ser grave La TB es una enfermedad vinculada a la pobreza que
puede afectar a adultos joacutevenes en edad productiva
La enfermedad se transmite por el aire de una persona a otra a traveacutes de gotiacuteculas
que portan bacterias Cuando una persona con infeccioacuten activa en pulmones o garganta
tose estornuda habla o canta las personas cercanas pueden respirar las bacterias
liberadas e infectarse
La enfermedad suele afectar los pulmones pero tambieacuten puede involucrar otros
oacuterganos como rintildeones columna vertebral y cerebro Los siacutentomas de la TB pulmonar
activa son tos a veces con esputo sanguinolento dolor toraacutecico debilidad peacuterdida de
peso fiebre y sudoracioacuten nocturna Si no se trata adecuadamente puede ser mortal La
mayoriacutea de las muertes por TB se producen en los paiacuteses en viacuteas de desarrollo (Paacutegina
web del CDC b)
La Organizacioacuten Mundial de la Salud (OMS) estima en 2000 millones a los
infectados por M tuberculosis que anualmente hay 9 millones de nuevos infectados y
que mueren casi 2 millones de personas al antildeo por causa de esta enfermedad (Paacutegina
web de la OMS)
222 Mycobacterium tuberculosis
Esta micobacteria tambieacuten conocida como Bacilo de Koch es una bacteria aacutecido-
alcohol resistente frecuentemente incolora y es aeroacutebica estricta Es muy resistente al
friacuteo la congelacioacuten y la desecacioacuten y por el contrario es muy sensible al calor la luz
solar y la luz ultravioleta Su replicacioacuten es muy lenta (una divisioacuten cada 16 a 20 horas)
y ante circunstancias adversas puede entrar en estado latente pudiendo retrasar su
multiplicacioacuten desde algunos diacuteas hasta varios antildeos El reservorio natural de M
tuberculosis es el hombre tanto el individuo infectado asintomaacutetico como el enfermo
con infeccioacuten activa Su clasificacioacuten taxonoacutemica se detalla en la Tabla 22
Introduccioacuten
14
Tabla 22 Ubicacioacuten taxonoacutemica de M tuberculosis
Reino Bacteria
Phylum Actinobacteria
Clase Actinobacteria
Sub-clase Actinobacteridae
Orden Actinomycetales
Sub-orden Corynebacterineae
Familia Mycobacteriaceae
Geacutenero Mycobacterium
Especie tuberculosis
223 Diagnoacutestico
El diagnoacutestico de la infeccioacuten tuberculosa se basa en una serie de estudios que se
inicia con placas radiograacuteficas pulmonares y la prueba de la tuberculina que pone de
manifiesto un estado de hipersensibilidad del hueacutesped frente a proteiacutenas de M
tuberculosis Esta sensibilidad se adquiere o bien por infeccioacuten con el bacilo o por
vacunacioacuten con cepas no infectivas (vacuna BCG) En una segunda etapa la infeccioacuten
activa es confirmada por identificacioacuten del agente etioloacutegico en cultivos obtenidos a
partir de la muestra bioloacutegica remitida al laboratorio Auacuten cuando la conjuncioacuten de los
meacutetodos de anaacutelisis vigentes permite un diagnoacutestico certero de la TB humana es
frecuente que se requiera de un prolongado tiempo de espera hasta la confirmacioacuten de la
infeccioacuten activa por cuanto ello depende del lento proceso de replicacioacuten del bacilo
Esto conlleva que exista potencialidad de contagio a individuos sanos y se comprometa
maacutes la salud del infectado
En los uacuteltimos antildeos se han desarrollado teacutecnicas de deteccioacuten de M tuberculosis
que involucran al bacterioacutefago D29 (en adelante fago) capaz de infectar
especiacuteficamente micobacterias (Park y col 2003 Mc Nerney y col 2004) Esta
metodologiacutea se basa en procesar la muestra del paciente sospechada de contener M
tuberculosis ponerla en contacto con el fago e incubarla para permitir su replicacioacuten
Finalmente se evaluacutea el tiacutetulo de los fagos liberados infectando un cultivo testigo de M
smegmatis (micobacterias de raacutepido crecimiento susceptibles al fago) y contando las
placas de lisis que se obtienen Esta novedosa metodologiacutea si bien indirecta y
preliminar permite reducir considerablemente los tiempos de diagnoacutestico puesto que se
trabaja con especies de crecimiento raacutepido Sin embargo al utilizar el conteo de placas
de lisis como eje central para el diagnoacutestico de infeccioacuten activa se recae en largos
Introduccioacuten
15
periacuteodos de incubaciones que podriacutean evitarse si se contase con otro meacutetodo de evaluar
la integridad celular de M smegmatis
Por lo arriba expuesto es que en este trabajo se intento desarrollar una nueva
metodologiacutea de verificacioacuten de lisis de micobacterias utilizando teacutecnicas
intriacutensecamente raacutepidas como son las electroquiacutemicas que en un futuro podriacutean
facilitar el diagnoacutestico de infeccioacuten tuberculosa
Introduccioacuten
16
23 Biodiesel
El grave impacto de la utilizacioacuten de combustibles derivados del petroacuteleo en el
medio ambiente la limitada disponibilidad de petroacuteleo crudo y sobre todo la
inestabilidad de los mercados del petroacuteleo han estimulado actualmente la propagacioacuten
de combustibles liacutequidos alternativos (Monteiro y col 2008) La organizacioacuten
American Society for Testing and Materials ASTM define biodiesel como una mezcla
de eacutesteres monoalquiacutelicos de aacutecidos grasos de cadena larga derivados de aceites
vegetales o grasas animales (American Society for Testing and Materials paacutegina web)
El biodiesel puro generalmente no se utiliza como combustible sino que suele
encontrase en mezcla con diesel de petroacuteleo El biodiesel es clasificado utilizando la
notacioacuten Bxx donde xx indica el porcentaje en volumen de contenido de biodiesel en el
liacutequido Asiacute B100 es biodiesel puro B50 contiene 50 en volumen de biodiesel B5
contiene 5 en volumen etc Las mezclas comerciales maacutes comunes son B2 B5 y B20
El biodiesel se obtiene a partir de la transesterificacioacuten de gliceroliacutepidos con
alcoholes de cadena corta como el etanol o el metanol siendo el glicerol el principal
subproducto en la elaboracioacuten de este combustible junto a productos menores como
mono y diacil gliceroles o aacutecidos grasos libres La masa de glicerol generada equivale
aproximadamente al 10 en peso del total del combustible producido siendo eacuteste uno
de los contaminantes frecuentes
231 Determinacioacuten de glicerol libre en biodiesel
La presencia de glicerol es indicativa de la calidad del biodiesel transformaacutendose
en un analito de intereacutes para la creciente industria de energiacuteas alternativas a la derivada
del refinamiento del petroacuteleo
Los meacutetodos quiacutemicos maacutes simples para cuantificar glicerol se basan en su
oxidacioacuten a formaldehiacutedo utilizando peryodato Luego el formaldehiacutedo formado se
determina cuantitativamente por diversos meacutetodos ya sea basados en reacciones
especiacuteficas evaluando los productos por diferentes metodologiacuteas o por titulacioacuten con
NaOH valorado (Lapenaite y col 2007)
La norma ASTM-D 6584 establece un meacutetodo basado en cromatografiacutea gaseosa
que permite la determinacioacuten en simultaacuteneo de glicerina libre y total (glicerol maacutes
mono di y trigliceacuteridos) No obstante este procedimiento no es aplicable a los eacutesteres
metiacutelicos de aceites vegetales obtenidos a partir de aceites laacuteuricos tales como aceite de
Introduccioacuten
17
coco o de palma quedando restringido el meacutetodo soacutelo para un grupo de biodiesels
particulares
En cuanto a los meacutetodos cromatograacuteficos tienen la desventaja de ser poco
amigables con el medio ambiente dado el profuso uso de solventes orgaacutenicos que son
potencialmente contaminantes a veces se tornan laboriosos y utilizan instrumental e
insumos caros
Considerando lo expresado arriba en este trabajo se ha planteado cuantificar
glicerol utilizando una metodologiacutea esencialmente econoacutemica simple y no
contaminante como lo son las teacutecnicas electroquiacutemicas convencionales
Introduccioacuten
18
24 Marco teoacuterico de las teacutecnicas electroquiacutemicas utilizadas
Los meacutetodos electroquiacutemicos de anaacutelisis estudian el analito de intereacutes mediante la
medicioacuten de los paraacutemetros fiacutesicos como potencial eleacutectrico yo corriente en una celda
electroquiacutemica El proceso fundamental en las teacutecnicas electroquiacutemicas es la
transferencia de electrones entre especies redox y la superficie del electrodo (Bard amp
Faulkner 2001) Este puede describirse con la siguiente reaccioacuten
O + ne- R [21]
Para reacciones reversibles y raacutepidas el potencial sigue la ley de Nernst
[22]
siendo y las actividades de las especies reducida y oxidada en la interfaz
electrodosolucioacuten respectivamente
La corriente que circula por la celda es la carga transportada por unidad de tiempo y
puede expresarse como
[23]
De acuerdo a las leyes de Faraday la carga circulante (Q) es proporcional a los
moles de especie reducida u oxidada (N) El factor de proporcionalidad es la carga del
electroacuten (n) por la constante de Faraday (F)
[24]
Combinando las Ecs 23 y 24 obtenemos
[25]
A medida que avanza la reaccioacuten se consume la especie electroactiva esto
produce un gradiente de concentracioacuten entre el seno de la solucioacuten y las inmediaciones
del electrodo donde la especie es electrotransformada y consecuentemente asociado se
Introduccioacuten
19
generaraacute un transporte de masa por difusioacuten Si el proceso estaacute bajo control difusional
la primera ley de Fick permite describir el flujo de partiacuteculas en funcioacuten de la posicioacuten
ec 26 y la segunda ley de Fick lo describe en funcioacuten de la variacioacuten de la
concentracioacuten de la especie electroactiva en funcioacuten del tiempo ec 27
[26]
[27]
donde D es el coeficiente de difusioacuten de la especie en estudio El gradiente de
concentracioacuten se generaraacute soacutelo para la especie electroactiva que se transforma en la
superficie del electrodo y su transporte de masa se verificaraacute en direccioacuten ndashx es decir
hacia el electrodo si se define x = 0 en la superficie Luego considerando la reaccioacuten de
reduccioacuten ec 21 el flujo J corresponderaacute al nuacutemero de partiacuteculas de O que cambian de
posicioacuten en direccioacuten -x con el tiempo por unidad de aacuterea y puede expresarse como
[28]
Combinando las ecs 26 27 y 28 obtenemos la expresioacuten combinada de las leyes
de Fick para una especie que estaacute reaccionando sobre un electrodo de aacuterea A
[29]
o directamente
[210]
Reemplazando en la ec 25 obtenemos una expresioacuten para la corriente (I) que
circula por la celda en la que se lleva a cabo la reaccioacuten ec 21 sobre un electrodo
uniformemente accesible de aacuterea A y cuando el transporte de masa es exclusivamente
controlado por difusioacuten
[211]
expresioacuten que indica que la corriente es directamente proporcional al gradiente de
concentracioacuten generado por efecto de la reaccioacuten electroacutedica
Introduccioacuten
20
Para un sistema en estado estacionario en el cual la velocidad de transformacioacuten de
la especie electroactiva es igual a la de transferencia de masa y suponiendo que la
reaccioacuten cumple las condiciones de rapidez y reversibilidad (Ec de Nernst) podemos
llegar a describir la relacioacuten entre la corriente circulante por la celda y el potencial al
cual se lleva adelante la reaccioacuten por
[212]
donde KR y KO son constantes que dependen del aacuterea del electrodo de trabajo y los
coeficientes de difusioacuten de las especies reducida y oxidada respectivamente e Il es la
corriente liacutemite
Se define como potencial de media onda al potencial al cual el valor de corriente es
la mitad del valor de corriente liacutemite y queda expresado por la siguiente ecuacioacuten
[213]
Tomando esta definicioacuten y operando en la ec 212 se arriba a la expresioacuten que
describe la corriente como funcioacuten del potencial de electrodo
ndash [214]
ecuacioacuten que corresponde a una funcioacuten sigmoidea por lo tanto al realizar un barrido
de potencial desde un potencial al cual no existe reaccioacuten electroacutedica hacia un potencial
al cual es posible reducir la especie electroactiva hasta alcanzar el estado estacionario la
corriente variaraacute con el potencial siguiendo la forma de una curva sigmoidea
Durante la ejecucioacuten del presente trabajo se utilizaron diversas teacutecnicas
voltamperomeacutetricas cronoamperometriacutea voltametriacutea de barrido lineal voltametriacutea
ciacuteclica y voltametriacutea de onda cuadrada Se pasa a comentar brevemente cada una de
ellas
241 Cronoampreometriacutea
En esta teacutecnica se estudia como variacutea la corriente que circula por la celda en
funcioacuten del tiempo transcurrido mientras el electrodo de trabajo es sometido a un
Introduccioacuten
21
determinado potencial Al aplicar un pulso de potencial se modifica el equilibrio de la
reaccioacuten redox ec 21 se pasa de un potencial inicial donde no ocurre reaccioacuten
electroacutedica a un potencial donde las especies pueden intercambiar electrones en la
interfaz electrodosolucioacuten favoreciendo la reaccioacuten en uno u otro sentido dependiendo
del potencial aplicado Esto da lugar a una corriente liacutemite difusional que variacutea en
funcioacuten del tiempo Para un electrodo uniformemente accesible esta corriente estaacute
descripta por la ec 211 Fijando las condiciones de contorno correspondientes al
experimento en cuestioacuten
t = 0 C0 = Cinfin (no hay reaccioacuten en el electrodo)
t ge0 lim C = Cinfin
t ge0 C0 = 0
donde C0 y Cinfin son las concentraciones de la especie electroactiva en la interfaz
electrodosolucioacuten y en el seno de la solucioacuten respectivamente Es posible entonces
resolver la ecuacioacuten diferencial de la segunda ley de Fick donde la solucioacuten viene dada
por la denominada ecuacioacuten de Cottrell
[215]
donde Id(t) es la corriente controlada por difusioacuten
En este trabajo se utilizoacute esta teacutecnica porque permite cuantificar glicerol utilizando
diferentes electrodos de trabajo seguacuten el medio especiacutefico donde se encuentre disuelto
242 Teacutecnicas voltameacutetricas
Todas las teacutecnicas voltameacutetricas tienen en comuacuten que el potencial eleacutectrico al que
se somete el electrodo de trabajo variacutea en funcioacuten del tiempo En todos los casos se
realiza un barrido lineal de potencial que va desde el potencial inicial (Ei) hasta un
potencial final (Ef) Este barrido se realiza a una velocidad constante que es el cociente
entre el salto (discreto) de potencial y el tiempo de duracioacuten de ese salto La forma en
que se realiza el barrido de potencial es lo que diferencia a una teacutecnica voltameacutetrica de
otra
Introduccioacuten
22
2421 Voltametriacutea de barrido lineal
En esta teacutecnica se realiza un barrido desde un potencial inicial (Ei) al cual no existe
proceso de transferencia de electrones en la interfaz electrodosolucioacuten y soacutelo podraacute
apreciarse corriente debida a procesos no faraacutedicos hasta un potencial final (Ef) En la
medida que el potencial aumenta alcanza un valor al cual ocurre la reaccioacuten electroacutedica
comenzando un flujo de carga debido a procesos faraacutedicos En la Fig 25 se muestra el
perfil del potencial en funcioacuten del tiempo utilizando el modo normal (en peldantildeos) para
el caso de los experimentos realizados con el instrumento utilizado en el presente
trabajo (Eco Chemie 2000)
Figura 25 Perfil de potencial en funcioacuten del tiempo Si bien el potencial es una variable continua un
potenciostato real solo puede establecer variaciones discretas de potencial de aquiacute que en lugar de
observar una ―rampa se observe una escalera
Para una reaccioacuten de reduccioacuten reversible ec 21 a medida que el potencial
aumenta se incrementaraacute la corriente siguiendo la forma de una sigmoidea (seguacuten la ec
21) Sin embargo cuando la velocidad de transporte de masa por difusioacuten de la especie
O sea menor que la velocidad de consumo por la reaccioacuten electroacutedica no seraacute posible
alcanzar el estado estacionario y la corriente llegaraacute a un maacuteximo Ip De aquiacute en maacutes la
corriente comenzaraacute a decaer con t12
tal como lo describe la ecuacioacuten de Cottrell ec
215 En la Fig 26 se muestra el perfil de corriente que se obtienen en experimentos
voltameacutetricos claacutesicos
t
Salto de potencial
Duracioacuten del salto
E
Introduccioacuten
23
Figura 26 Perfiles de corriente en funcioacuten del potencial para experimentos voltameacutetricos de barrido
lineal Liacutenea azul la velocidad de barrido es lo suficientemente baja establecieacutendose un estado
estacionario Liacuteneas verde negra y roja la velocidad de barrido es alta y se origina un pico de corriente
La corriente de pico crece proporcionalmente a la raiacutez cuadrada de la velocidad de barrido
El maacuteximo de corriente tambieacuten denominado corriente de pico se puede obtener a
partir de la ecuacioacuten de Randles-Sevcik (Bard amp Faulkner 2001)
[216]
siendo la temperatura 25 degC y donde A estaacute en cm2 D en cm
2 s
-1 C en mol cm
-3 y en
V s-1
2422 Voltametriacutea ciacuteclica
En esta teacutecnica se realiza un barrido desde un potencial inicial (Ei) a un primer
veacutertice de potencial (Ev1) y a partir de alliacute se invierte la direccioacuten de barrido hasta
llegar a un segundo veacutertice de potencial (Ev2) el cual puede coincidir con el Ei El perfil
de potencial en funcioacuten del tiempo que se obtiene utilizando el instrumento con el que
se trabajoacute y de acuerdo a lo indicado por el fabricante se esquematiza en la Fig 27
(izquierda) y el perfil de corriente en funcioacuten del potencial para una reaccioacuten reversible
se esquematiza en la Fig 27 (derecha)
Idif
IP
Introduccioacuten
24
Fig 27 Perfil de potencial en funcioacuten del tiempo (izquierda) Perfil de corriente en funcioacuten del
potencial para una reaccioacuten redox reversible (derecha)
En este trabajo se realizaron experimentos de voltametriacutea ciacuteclica para identificar la
presencia de mediadores redox que presentando reacciones electroacutedicas reversibles
permitieran la regeneracioacuten del cofactor de la enzima glicerol deshidrogenasa (GlDH)
Esta teacutecnica tambieacuten se utilizoacute para calcular las aacutereas de los electrodos de trabajo de
modo tal de normalizar la sentildeal obtenida con la superficie del electrodo utilizado
Ademaacutes se utilizoacute para cuantificar glicerol e identificar los potenciales de oxidacioacuten del
mismo
243 Teacutecnicas de pulso
Las teacutecnicas de pulso surgieron vinculadas a la polarografiacutea de corriente continua
la teacutecnica voltameacutetrica cuya particularidad es utilizar un electrodo de goteo de mercurio
Este grupo de teacutecnicas se ha ido diversificando a medida que se fueron haciendo maacutes
complejos tanto los esquemas de potenciales aplicados a los electrodos de trabajo
como las medidas de intensidades de corrientes (Bard amp Faulkner 2001)
2431 Voltamperometriacutea onda cuadrada VOC
Esta teacutecnica tiene varias ventajas entre las que se encuentran su excelente
sensibilidad (se han registrado liacutemites de deteccioacuten directa del orden de 10-8
M) la
eliminacioacuten de las corrientes de fondo y la rapidez con que se lleva a cabo el
experimento completo ya que se puede trabajar a velocidades de barrido de potencial
auacuten superiores a 1 V s-1
(Bard amp Faulkner 2001)
El perfil de potencial aplicado al electrodo de trabajo en funcioacuten del tiempo en la
VOC se presenta en la Fig 28 Consta de una onda cuadrada simeacutetrica con una
amplitud Ep superpuesta a una escalera de potencial con escalones o saltos de
potencial Es (Fig29) donde el pulso hacia adelante de la onda cuadrada coincide con
el escaloacuten de potencial de la escalera
E
I
Introduccioacuten
25
La utilizacioacuten de la teacutecnicas voltamperomeacutetricas de pulso presentan la ventaja de
permitir realizar un barrido de potencial donde la especie electroactiva se oxida
raacutepidamente produciendo una sentildeal analiacutetica No es necesario trabajar durante periacuteodos
prolongados de tiempo a los elevados potenciales donde se establece la corriente liacutemite
controlada por difusioacuten como lo requiere la teacutecnica amperomeacutetrica
Figura 28 Perfil de potencial aplicado al electrodo de trabajo en la VOC en funcioacuten del tiempo En
liacutenea cortada se indica cual es la escalera de potencial a la cual se le sobreimprime la onda cuadrada Se
indican resaltados ( ) los tiempos durante los que se realizan las lecturas de corriente En un ciclo se
realizan las lecturas de corrientes alta y baja Adaptado de Bard amp Faulkner 2001
Figura 29 a) Onda cuadrada simeacutetrica b) Perfil de potencial en funcioacuten del tiempo de una escalera
de potencial
a)
b)
E
E
E
t
Amplitud de la
onda cuadrada EP
Periacuteodo de la onda
Salto o escaloacuten
de potencial ES
Medida
alta
Medida
baja
t
Salto o escaloacuten
de potencial ES
t
Amplitud de la
onda cuadrada
EP
Periacuteodo de la onda
Introduccioacuten
26
El potensiostato registra la corriente durante la medida alta y la medida baja de un
ciclo La diferencia de estas corrientes es la corriente neta Ineta que se grafica en
funcioacuten del potencial de la escalera de potencial correspondiente a ese ciclo (liacutenea
cortada Fig 28) Para sistemas reversibles se obtiene una curva como se observa en la
Fig 210 donde se indican las corrientes de la medida alta de la medida baja y neta
que resulta en un pico de corriente La corriente de pico neta IP n observada en la VOC
es proporcional a la concentracioacuten de la especie electroactiva en el seno de la solucioacuten y
se centra alredewdor del potencial de la cupla redox
Figura 210 Voltamperograma de onda cuadrada tiacutepico para un sistema reversible la corriente neta
Ineta se obtiene por la diferencia entre la corriente registrada al finalizar el pulso I medida alta y la
corriente registrada previamente al nuevo pulso I medida baja
La frecuencia ( f ) de la onda cuadrada medida en Hz se define como
1f [217]
Siendo el periacuteodo de la onda cuadrada medido en segundos que a su vez es dos
veces el tiempo del pulso Pt por lo tanto tenemos que
P2
1
tf [218]
Luego
ft
2
1P [219]
Los valores de frecuencia pueden variar desde unos pocos Hz hasta varios miles
dependiendo de las condiciones particulares del caso La velocidad de barrido v queda
definida como el producto del salto de potencial ES por la frecuencia f
fSEv [220]
Introduccioacuten
27
Las velocidades de barrido en los experimentos de VOC se obtienen modificando la
frecuencia de la onda cuadrada ya que el salto de potencial suele ser un valor fijo
Se demostroacute que para cuplas redox controladas por difusioacuten los paraacutemetros de la
VOC maacutes adecuados son E = 50n mV y Es = 10n mV (Osteryoung y Osteryoung
1985)
Cuando se aplica un pulso de potencial en las cercaniacuteas del potencial de la cupla
redox las corrientes faradaicas aumentan significativamente conforme se oxida o se
reduce la especie electroactiva Estas corrientes decaen con el tiempo seguacuten la ecuacioacuten
de Cottrel ya expresada anteriormente como ec [215]
Si consideramos t como tP se observa que la disminucioacuten del tiempo del pulso
implica mayor corriente Luego a medida que se aumenta la frecuencia aumenta la
velocidad de barrido y disminuye el tiempo del pulso Para sistemas reversibles se
predice que la intensidad tiene una dependencia lineal con la raiacutez cuadrada de la
frecuencia (Osteryoung y Osteryoung 1985)
21 fBAnIp [221]
La eleccioacuten de la frecuencia adecuada es de suma importancia A frecuencias muy
altas aumentan significativamente las corrientes capacitivas perdiendose resolucioacuten lo
que impone un liacutemite al aumento de la frecuencia
25 Biosensores
En muchas determinaciones de analitos en muestras bioloacutegicas se necesitan pasos
previos a la evaluacioacuten propiamente dicha que permiten eliminar o enmascarar las
potenciales interferencias Sin embargo el pretratamiento de la muestra puede llevar a
una disminucioacuten de la concentracioacuten del analito ya sea por peacuterdidas en las etapas
consecutivas del anaacutelisis o por transformacioacuten del analito provocando errores por
defecto en la determinacioacuten (Lagier amp Verdini 2000) Cuando la evaluacioacuten de la
concentracioacuten del analito se utiliza con fines cliacutenicos tal resultado erroacuteneo puede
conducir a un diagnoacutestico incorrecto Es por ello que en la actualidad el desarrollo de
nuevas metodologiacuteas analiacuteticas tiende no soacutelo a acortar los tiempos de anaacutelisis
previnieacutendose asiacute las peacuterdidas por degradacioacuten del analito sino que ademaacutes procura
permitir la ejecucioacuten del anaacutelisis sin pasos separativos previos
En los uacuteltimos antildeos se ha avanzado en el desarrollo de biosensores ya que estos
dispositivos presentan ventajosas caracteriacutesticas que los convierten en herramientas
Introduccioacuten
28
prometedoras de anaacutelisis (Belluzo y col 2008) Los biosensores se pueden definir como
dispositivos analiacuteticos compuestos por dos componentes principales
1- Una superficie selectiva denominada bioreceptor o superficie bioreactiva (SBR)
generalmente de origen bioloacutegico o sinteacutetica biomimeacutetica la cual en contacto con la
muestra es capaz de interaccionar de manera especiacutefica con el analito (Vo-Dinh amp
Allain 2003) Este elemento es el que aporta la especificidad del dispositivo
2- Un transductor fiacutesico-quiacutemico encargado de producir una sentildeal que es funcioacuten
de la interaccioacuten entre el analito y la SBR (Vo-Dinh amp Allain 2003) Eacuteste es el
elemento que aporta la sensibilidad al dispositivo
Los biosensores pueden ser clasificados de acuerdo a la sentildeal fiacutesico-quiacutemica que
produce el transductor de acuerdo a
Sentildeal Biosensor
Cambio de temperatura Termomeacutetrico
Cambio en paraacutemetro eleacutectrico Electroquiacutemico
Cambio en propiedades de la luz Oacuteptico
Cambio de masa Piezoeleacutectrico Acuacutestico
(Adaptado de Vo-Dinh amp Allain 2003)
De los distintos tipos de biosensores los electroquiacutemicos han sido tradicionalmente
los maacutes desarrollados y usados debido a sus ventajas con respecto a otros biosensores
tales como la generacioacuten de una respuesta electroacutenica directa que permite una raacutepida
respuesta mayor simplicidad operativa versatilidad para la miniaturizacioacuten y bajo
costo Actualmente gracias al avance de la tecnologiacutea de los semiconductores y la
serigrafiacutea pueden ser producidos masivamente Dependiendo del paraacutemetro fiacutesico
medido por el detector los biosensores electroquiacutemicos pueden a su vez subdividirse en
conductimeacutetricos potenciomeacutetricos y amperomeacutetricos (Vo-Dinh amp Allain 2003)
251 Superficie de bioreconocimiento en biosensores
La SBR es un sistema bioloacutegico o biomimeacutetico que reacciona bioquiacutemica o
quiacutemicamente con el analito En la actualidad existe una gran diversidad de elementos
bioloacutegicos o derivados de ellos que son utilizados como SBR
Los mismos van desde moleacuteculas simples a sistemas complejos (Vo-Dinh amp Allain
2003) Asiacute la SBR puede contener antiacutegenos anticuerpos aacutecidos desoxiribonucleicos
(ADN) aacutecidos ribonueleicos (ARN) enzimas receptores de membrana tejidos
Introduccioacuten
29
microorganismos completos o compuestos sintetizados ―ad-hoc que emulan especies
bioloacutegicas como pueden ser estructuras biomimeacuteticas y poliacutemeros molecularmente
impresos (Vo-Dinh amp Allain 2003)
252 Biosensores amperomeacutetricos
De los biosensores electroquiacutemicos los amperomeacutetricos suelen presentar mayores
sensibilidades (Iost y col 2011)
En la Fig 211 se esquematiza un biosensor amperomeacutetrico El analito presente en
la muestra compleja reacciona selectivamente con la SBR lo que desencadena la sentildeal
analiacutetica en el transductor fiacutesico-quiacutemico
En este caso particular el transductor es un electrodo de trabajo que integra una
celda de tres electrodos El mismo estaacute sometido a un potencial eleacutectrico (con respecto a
un electrodo de referencia) y la sentildeal analiacutetica es la corriente eleacutectrica que circula por la
celda utilizando un contraelectrodo de gran aacuterea En estas condiciones la maacutexima
intensidad de corriente eleacutectrica que se observa estaacute limitada exclusivamente por la
reaccioacuten de oacutexido-reduccioacuten que ocurre en la superficie del electrodo de trabajo
Figura 211 El electrodo de trabajo es sometido a un potencial eleacutectrico en su superficie tiene lugar
la reaccioacuten de oacutexido-reduccioacuten Dicha reaccioacuten ocurre o no o bien transcurre a velocidades diferentes en
presencia o ausencia del analito de intereacutes
253 Biosensores de uso cliacutenico
En el caso de muestras para el diagnoacutestico cliacutenico de infecciones el analito a
determinar puede ser alguna de las moleacuteculas generadas por el individuo infectado
como respuesta a la presencia del agente infeccioso por ej los anticuerpos (Acs)
especiacuteficos o el agente infeccioso iacutentegro o partes del mismo En muchos casos la sola
presencia de Acs especiacuteficos es por siacute misma indicativa de infeccioacuten Hay casos en que
Introduccioacuten
30
la presencia de Acs no es per-seacute indicativa de infeccioacuten riesgosa Dos ejemplos de esta
situacioacuten son el de la toxoplasmosis y la tuberculosis
En el caso de la toxoplasmosis la deteccioacuten de Acs anti-T gondii es soacutelo de
trascendental importancia en embarazadas porque si la infeccioacuten ha sido adquirida
durante el embarazo el feto estaacute en riesgo de contagiarse y puede padecer lesiones
severas (Dunn y col 1999 Montoya amp Liesenfeld 2004) Por el contrario si se trata
de infeccioacuten croacutenica no es necesario exponer a la embarazada (y al feto) a medicacioacuten
innecesaria evitaacutendose con ello los riesgos que devienen del uso de los faacutermacos
especiacuteficos utilizados durante el tratamiento de la infeccioacuten (Freij amp Sever 1999)
Debido a la incertidumbre que acompantildea la deteccioacuten de los anticuerpos hasta hoy
utilizados con este fin se ha propuesto realizar pruebas utilizando antiacutegenos
recombinantes del paraacutesito Se ha evaluado el desempentildeo de antiacutegenos recombinantes
sintetizados por teacutecnicas de biologiacutea molecular en forma individual o mezclados para
evaluar la avidez de Acs IgG (Beghetto y col 2003) Se observoacute que utilizando el
fragmento del antiacutegeno MIC3 en este ensayo los iacutendices de avidez permitieron
determinar la antiguumledad de la infeccioacuten con mayor grado de certeza que empleando
homogenado total de paraacutesito resultando MIC3 un buen marcador para el diagnoacutestico
de infecciones agudas (Beghetto y col 2003) La proteiacutena recombinante P35 tambieacuten
fue propuesta como marcador seroloacutegico para diferenciar infeccioacuten aguda de croacutenica ya
que evidencioacute sensibilidades del 853 para sueros agudos y una especificidad del 98
respecto de sueros croacutenicos (Parmley y col 2000) No obstante y a pesar de haberse
descrito moleacuteculas para el diagnoacutestico de toxoplasmosis aguda no existe un acuerdo
sobre su efectividad por lo que se requiere de la evaluacioacuten de nuevos antiacutegenos para
este fin En general el uso de una sola moleacutecula recombinante no brinda suficiente
sensibilidad habieacutendose demostrado que el empleo de varios antiacutegenos recombinantes
la mejora (Pinon y col 2003) Se ha observado tambieacuten que una mezcla de moleacuteculas
no produce los mismos resultados que cuando se utilizan en forma separada (Silveira y
col 2001) Se ha postulado que esta diferencia se debe a las distintas caracteriacutesticas
fisicoquiacutemicas entre las moleacuteculas de una mezcla que impide la inmovilizacioacuten
homogeacutenea en las superficies de captura utilizadas en los inmunoensayos Por lo tanto
resulta muy factible que un ensayo que utilice una combinacioacuten o fusioacuten en una sola
moleacutecula de estos antiacutegenos recombinantes marcadores de infeccioacuten reciente pueda
mejorar el diagnoacutestico diferencial tal como ha sido demostrado para el diagnoacutestico de
otras infecciones (Camussone y col 2009)
Introduccioacuten
31
En el caso de la tuberculosis la mayoriacutea de los individuos de la poblacioacuten han
recibido la vacunacioacuten reglamentaria por inoculacioacuten de una cepa de micobacterias
inofensivas generando Acs anti-Mycobacterium tuberculosis (M tuberculosis) Por
ello estos Acs suelen estar presentes en casi toda la poblacioacuten De aquiacute que la deteccioacuten
de Acs anti-M tuberculosis no demuestra infeccioacuten activa de riesgo Por tal motivo el
indicador por excelencia de infeccioacuten activa es la evidenciacioacuten del patoacutegeno en la
muestra No obstante las muestras suelen poseer una extremadamente baja cantidad de
M tuberculosis lo que dificulta su deteccioacuten directa Por ello es preciso utilizar alguacuten
paso amplificador del analito a censar Dado el largo tiempo de replicacioacuten del
microorganismo los cultivos realizados para su replicacioacuten insumen periacuteodos
prolongados Siguiendo los trabajos de Park y col y McNerney y col (Park y col
2003 McNerney y col 2004) se formuloacute la siguiente hipoacutetesis de trabajo Sistemas
enzimaacuteticos presentes en M smegmatis permitiriacutean metabolizar sustratos electroactivos
a distintas velocidades de reaccioacuten dependiendo de la integridad del microorganismo
Siendo este el caso seriacutea posible distinguir entre cultivos de M smegmatis que han sido
lisados por el fago especiacutefico D29 de aquellos cultivos en que dichas micobacterias
estaacuten iacutentegras Si soacutelo existiera lisis cuando la muestra ensayada contiene organismos
filogeneacuteticamente emparentados como M tuberculosis que permitiesen la
amplificacioacuten selectiva del fago D29 previamente a la infeccioacuten del cultivo testigo de
M smegmatis la evaluacioacuten electroquiacutemica del sustrato metabolizable por el
microorganismo deberiacutea permitir evidenciar presencia o ausencia de M tuberculosis La
seleccioacuten del fago D29 se justifica porque es capaz de infectar micobacterias de
crecimiento raacutepido como M smegmatis y las de crecimiento lento como M tuberculosis
(Park y col 2003)
El glicerol es corrientemente utilizado como principal fuente de carbono en cultivos
de micobacterias siendo degradado eficientemente por sus sistemas enzimaacuteticos que
utilizan mecanismos redox En este trabajo nos hemos planteado detectar este
polialcohol como analito de intereacutes ya que su consumo estaraacute preferencialmente
vinculado a la presencia de micobacterias aptas para tal degradacioacuten Por este motivo
proponemos utilizar un bioelectrodo con una SBR que contenga una enzima cuyo
sustrato sea glicerol
Introduccioacuten
32
2531 Biosensores para evaluacioacuten de infeccioacuten toxoplaacutesmica
En el presente trabajo se propuso un biosensor para evaluacioacuten de infeccioacuten
toxoplaacutesmica utilizando un electrodo de oro policristalino macizo sobre el cual se
adsorbioacute un antiacutegeno recombinante y se siguioacute un esquema ELISA del tipo indirecto
con deteccioacuten de IgGh En la Fig 212 se muestra el esquema que se siguioacute para este
inmunoensayo
Proteiacutena recombinante IgG a-IgGh conjugada a HRP
Bloqueante IgG humana ferrocenometanol
Figura 212 Sobre la superficie del electrodo se fija la proteiacutena recombinante que capturaraacute los
anticuerpos especiacuteficos si estaacuten presentes en el suero El revelado se realiza con un segundo anticuerpo
especiacutefico para IgG humana marcado con HRP que en presencia de H2O2 oxida el mediador FcMe que
se reduce sobre la superficie del electrodo generando la sentildeal analiacutetica
254 Biosensores para cuantificacioacuten de glicerol
La determinacioacuten de glicerol ha ido ganando importancia en las uacuteltimas deacutecadas
debido al uso del mismo en varias industrias como la farmaceacuteutica automotriz
alimenticia y textil entre otros El compuesto es un producto importante de la
fermentacioacuten en la mayoriacutea de las bebidas alcohoacutelicas y su concentracioacuten es un
paraacutemetro uacutetil para el seguimiento del proceso fermentativo (Goriushkina y col 2010)
Tambieacuten es un componente no deseable del biodiesel y su concentracioacuten es un indicador
de la calidad del combustible (Monteiro y col 2008)
Se han desarrollado numerosas metodologiacuteas para llevar adelante la cuantificacioacuten
del glicerol que incluyen teacutecnicas espectrofotomeacutetricas yo espectrofluoromeacutetricas
(Bondioli amp Bella 2005 Silva amp Rocha 2010 Lima y col 2012) incluidos los basados
Introduccioacuten
33
en enzimas (Kronka y col 2001 Li y col 2001) los electroquiacutemicos (Tehrani amp
Ghani 2012 Gamella y col 2008 Wu amp Cheng 2005) y los cromatograacuteficos estos
uacuteltimos han sido oficialmente recomendado por la AOAC como los meacutetodos 96809
97210 (AOAC 2005) Sin embargo a pesar de que estos meacutetodos permiten determinar
con eficacia de glicerol en presencia de muchos compuestos que interfieren esta teacutecnica
se considera que es ecoloacutegicamente desfavorable debido a la utilizacioacuten de solventes
nocivos para el medio ambiente e intriacutensecamente onerosa debido a los altos costos de
los mismos (Gamella y col 2008)
Por un lado las propuestas espectrofotomeacutetricas que utilizan enzimas se basan en el
uso de sistemas o bien de una o varias enzimas relativamente caras que se eliminan
despueacutes de que se han utilizado en una uacutenica determinacioacuten En estos casos a menudo
son consumidos las enzimas yo cofactores caros como nicotinamida adenina
dinucleoacutetido (NAD+) o adenosina 5-trifosfato (ATP) a menudo son consumidos
(Kronka y col 2001 Li y col 2001 Wu amp Cheng 2005) Como un ejemplo la
propuesta de Li para determinar glicerol en matrices complejas se basa en el uso de tres
enzimas a saber glicerol quinasa (GK) piruvato quinasa (PK) y lactato
deshidrogenasa (LDH) ademaacutes de utilizar ATP y NAD+ (Li y col 2001) Este meacutetodo
produce buenos resultados en teacuterminos de sensibilidad y especificidad pero consume 1
U de GK 15 U de PK 22 U de LDH 2x10-6
moles de ATP y 33x10-7
moles de
NAD+ por determinacioacuten Por lo tanto el costo derivado por anaacutelisis es considerado
caro sobre todo cuando se debe analizar un elevado nuacutemero de muestras
Por otro lado se han propuesto herramientas versaacutetiles notables para cuantificar
glicerol como ser la basada en tecnologiacutea de biosensores en particular los basados en
meacutetodos amperomeacutetricos (Ghica amp Brett 2006 Gamella y col 2008) De hecho los
biosensores amperomeacutetricos proporcionan suficiente sensibilidad y selectividad para
permitir la determinacioacuten del analito junto con una velocidad apropiada para completar
el anaacutelisis En efecto los biosensores amperomeacutetricos que utilizan enzimas como
componente bioloacutegico para el reconocimiento dan lugar a una selectividad significativa
debido a su capacidad de reaccionar especiacuteficamente con su sustrato Este uacuteltimo es a
menudo el analito de intereacutes por lo que puede ser cuantificado de manera eficiente auacuten
ante la presencia de otros componentes similares estructuralmente que pueden hallarse
en la muestra (Belluzo y col 2008) Los dispositivos construidos con enzimas a
menudo pueden ser reutilizados y por lo tanto el costo por determinacioacuten puede ser
Introduccioacuten
34
reducido significativamente en comparacioacuten con los meacutetodos espectrofotomeacutetricos
mencionados anteriormente
Se han desarrollado varios biosensores utilizando enzimas que tienen como sustrato
al glicerol (Gamella y col 2008) En los disentildeos utilizados se utilizan diversas enzimas
que reaccionan especiacuteficamente con el glicerol en un primer paso y se censa un
producto de esta reaccioacuten En otros disentildeos se encuentran involucradas maacutes de una
enzima donde la segunda o tercer enzima utiliza como sustrato algunos de los
productos de la primera o segunda reaccioacuten y finalmente se censa un producto de la
uacuteltima reaccioacuten enzimaacutetica Algunos disentildeos que aparecieron en literatura al momento
de iniciar este trabajo de tesis fueron detallados por Pingarroacuten y colaboradores (Gamella
y col 2008) y se encuentran resumidos en la Tabla 23 al final de este capiacutetulo y se
corresponden a los esquemas evaluados al momento de iniciar este trabajo de tesis
Todos los disentildeos descriptos al momento presentan la desventaja de ser onerosos
tanto por el disentildeo en siacute como por el costo operativo devenido del consumo de elevadas
cantidades de reactivos caros
Sobre la base del modelo propuesto por Tuntildeoacuten-Blanco y colaboradores (Aacutelvarez-
Gonzaacutelez y col 2000) se comenzaron los ensayos para construir un bioelectrodo
selectivo para glicerol La propuesta contempla en primer lugar disminuir la cantidad
de enzima Glicerol deshidrogenasa En segundo lugar proponemos utilizar la coenzima
NAD(H) en forma soluble e introducir un mediador electroquiacutemico distinto al utilizado
previamente En el trabajo citado se generaba una cupla cataliacutetica por oxidacioacuten
electroacutedica del NAD+ presente en un electrodo de trabajo de pasta de C modificada En
nuestro caso el mediador soluble permite reoxidar la coenzima para cerrar el ciclo
cataliacutetico siguiendo el esquema de la Fig 213
Figura 213 Esquema de reacciones que ocurren en la celda DHA 13 dihidroxiacetona GlDH
gliceroldeshidrogenasa NAD(H) nicotinadenina dinucleoacutetido
glicerol
DHA
GlDHox
GlDHred NAD+
NADH Mediador ox
Mediador red
e- Electrodo
Introduccioacuten
35
Tabla 23 Biosensores selectivos para gicerol Las filas 1 a 10 son un extracto parcial del trabajo de
Gamella y col 2008 En las filas 11 y 12 se incluyen los disentildeos propuestos por Šefčovičovaacute y col
2008 y Goriushkina y col 2010
Electrodo Enzima Mediador Potencial
1 Pt GKGPOx - + 650 mV vs AgAgCl
2 Al GlDH Fe(CN)6 + 400mV vs ECS
3 Barras de grafito
espectroscoacutepico GlDH Complejo de Os + 200 mV vs AgAgCl
4 Serigraacutefico (SPE) pGlyDH N-(4-hidroxibenzilideno)-
4-ferrocenilanilina + 400 mV vs AgAgCl
5 Carboacuten Viacutetreo a) GlDHDP
b) GKGPOxHRP
a)Fe(CN)63-
b)Fe(CN)64-
a) + 350 mV vs AgAgCl
b) - 300 mV vs AgAgCl
6 SPE modificado con
ZrO2 y azul meldola GlDH Azul meldola + 100 mV vs AgAgCl
7 SPE modificado azul
de Prusia
GlDH Tt NADH
Ox Azul de Prusia - 50 mV vs AgAgCl
8 Pasta de carbono GlDH Producto de la electro-
oxidacioacuten del NAD+ + 150 mV vs AgAgCl
9 Flim de carbono a) GPOx
b)GKGPOx Poli (rojo neutro) - 350 mV vs ECS
10 Au a)GlDHDP
b) GKGPOxHRP Tetra thiafulvaleno
a) + 150 mV vs AgAgCl
b) 0 mV vs AgAgCl
11 Carboacuten Viacutetreo GlDHDP Fe(CN)63- + 350 mV vs AgAgCl
12 Platino serigraacutefico Gox - + 300 mV vs electrodo
intriacutenseco
Tabla 23 Continuacioacuten
Muestra
Rango dinaacutemico
Lineal (M) Sensibilidad
(mA M-1
cm-2
)
Liacutemite de
deteccioacuten (M) Estabilidad
Desde Hasta
1 Mosto de uva 2 10-6
10-3 - 5 10
-7 Hasta 1 mes
2 Jugo de uva 10-6
2 10-3
- 10-6 -
3 Vino 1 10-6
2 10-4
32 1 10-6
80 actividad inicial luego
de 20 horas
4 Vino - - - - actividad enzimaacutetica decae
rapidamente
5 Fermento
anaeroacutebico
1 10-5
1 10-5
10-3
1 10-3
a) 620
b) 142 -
sentildeal inicial luego de
uso continuo a) 60 a 90
hs b) 70 16 hs
6 Fermento de
jugo de uva 10
-51 10
-4 - 10
-6 -
7 - 10-5
1 10-3
- 10-6 -
8 Jarabe 997 10-7
10-4
162 cm2 43 10-7
80 actividad inicial luego
de 3 diacuteas
9 Vino 10-5
147 10-4
a) 101
b) 079
a) 4 10-6
b) 15 10-5
sentildeal inicial luego de
uso continuo a) 87 a 8
diacuteas b) 62 8 diacuteas
10 Vino 10
-6
4 10-7
2 10-5
1 10-5
a) 207
b) 250
a) 4 10-7
b) 31
sentildeal inicial luego de
uso continuo a) 87 a 51
diacuteas b) 46 8 diacuteas
11 Fermento - - - 11 10-6
-
12 Vino 10
-5
2 10-6
25 10-2
64 10-3
-
10-5
2 10-6 -
Objetivos
Objetivos
37
3 Objetivos
31 Objetivos generales
Desarrollar metodologiacuteas electroquiacutemicas que permitan identificar analitos de
intereacutes tanto para el diagnoacutestico cliacutenico como para la industria de combustibles
alternativos
32 Objetivos particulares
a) Obtener bioelectrodos que exhiban una corriente cataliacutetica diferencial al efectuar
inmunoensayos con muestras confirmadas positivas o negativas para infeccioacuten aguda
por T gondii
b) Desarrollar un meacutetodo electroquiacutemico que permita la cuantificacioacuten de glicerol
en medio acuoso para determinarlo por ejemplo luego de su extraccioacuten en
combustibles alternativos
c) Evidenciar electroquiacutemicamente la ocurrencia de lisis de M smegmatis por fagos
D29 indicadores de la presencia de micobacterias patoacutegenas emparentadas
provenientes de individuos padeciendo infeccioacuten tuberculosa
Materiales y Meacutetodos
Materiales y Meacutetodos
39
4 Materiales y meacutetodos
41 Reactivos y medios de cultivos
411 Reactivos
Todos los reactivos utilizados fueron de grado analiacutetico salvo que se indique lo
contrario Los aacutecidos aceacutetico sulfuacuterico niacutetrico clorhiacutedrico y percloacuterico las sales KCl
Na2HPO4 KH2PO4 NiSO4 CuSO45H2O y la sal disoacutedica del aacutecido etilen diamino tetra
aceacutetico (EDTA) dimetilsulfoacutexido (DMSO) imidazol tris base las enzimas peroxidasa
de raacutebano picante EC 11117 (tipo VI) (HRP) y glicerol deshidrogenasa de
cellulomonas EC 1116 (GlDH) acrilamida (adecuada para electroforesis) NNprime-(12-
dihidroxietilen) bisacrylamide (97) ditiotreitol (DTT) Coomasie blue G-250 alcohol
isopropiacutelico β-mercaptoetanol 33-diaminobenzidina tetrahidrocloruro (DAB)
nicotina adenina dinucleoacutetico (NAD) los desoxinucleoacutetidos trifosfato dATP dGTP
dCTP y dTTP reactivo de Folin-Ciocalteu glicina albuacutemina seacuterica bovina (ASB)
peptona de carne extracto de levadura fueron suministrados por Sigma-Aldrich El
polvo de carbono viacutetreo (esfeacuterico diaacutemetro de partiacutecula entre 2 y 12 microm pureza
9999+) fue suministrado por Aldrich El polvo de carbono grafito (pureza gt 99) fue
provisto por Fisher Scientific Dimetilformamida (DMF) 1 1rsquo-carbonil-diimidazol las
sales tartrato de sodio y potasio MgCl2 CaCl2 NaCl Na2CO3 NaHCO3 K2CO3
KHCO3 K3Fe(CN)6 K4Fe(CN)6 (NH4)2SO4 (NH4)2S2O8 (gt98) dodecil sulfato de
sodio (Farmacopea Unioacuten Europea) (SDS) NaOH KOH NNNprimeNprime-
tetrametiletilendiamino (Temed) azul de bromofenol (Farmacopea Unioacuten Europea)
xilencianol (para electroforesis) etanol absoluto fueron suministrados por Merck El
H2O2 y el glicerol fueron provistos por Cicareli El isopropil-β-D-1-
tiogalactopiranoacutesido (IPTG) fue suministrado por Promega La enzima ADN polimerasa
de Thermus aquaticus EC 2777 (polimerasa Taq) y los oligonucleoacutetidos fueron
suministrados por InvitrogenTM
Argentina La enzima peroxidasa de raacutebano picante
ligada a estreptavidina (HRP-EAV) fue provista por Abcam El ester biotin n-
hidroxisuccinimida fue provisto por Thermo Scientific La ampicilina (Farmacopea
Argentina) fue provista por laboratorios Klonal La aluacutemina para pulido (tamantildeo de
partiacutecula 03 microm) fue provista por Metrohm El anticuerpo de cabra anti IgG humana
ligado a HRP fue provisto por Zymed El Tween-20 fue provisto por Anhedra
No se detallan los reactivos contenidos en los equipos comerciales utilizados
disponibles en las paacuteginas web de los respectivos proveedores
Materiales y Meacutetodos
40
412 Medios de cultivos
Para el crecimiento de cepas de Escherichia coli (E coli) se utilizoacute el medio de
cultivo Luria-Bertani (LB) compuesto por 10 g L-1
peptona de carne 5 g L-1
extracto de
levadura y 10 g L-1
NaCl En los casos requeridos se suplementoacute este medio con el
antibioacutetico ampicilina (100 g mL-1
) Para la preparacioacuten de medios soacutelidos se agregoacute
agar en concentracioacuten final de 15 g L-1
Para el crecimiento de ceacutelulas de M smegmatis se utilizoacute el medio de cultivo
Middlebrook 7H9 provisto en forma anhidra por Difco y fue suplementado con NaCl
CaCl2 yo glicerol en concentraciones variables de acuerdo a los requerimientos del
ensayo analiacutetico ulterior la composicioacuten del medio provisto por Difco se detalla en la
siguiente tabla
Tabla 41 Caldo Middlebrook 7H9 (Difco) composicioacuten en g L-1
del medio liacutequido recieacuten preparado
(NH4)2SO4 050
Na2(HPO4) 250
K(H2PO4) 100
Citrato de sodio 010
MgSO4 005
CaCl2 0005
ZnSO4 0001
CuSO4 0001
Citrato feacuterrico amoacutenico 004
Aacutecido l-glutaacutemico 050
Piridoxina 0001
Biotina 00005
42 Cepas bacterianas
Las cepas bacterianas utilizadas y sus caracteriacutesticas relevantes se detallan en la
siguiente tabla
Materiales y Meacutetodos
41
Tabla 42 Cepas bacterianas utilizadas
Cepa Caracteriacutesticas
Escherichia
coli (E coli)
BL21 (DE3)
E F- ompT hsdS (rB-mB-) [lon] (DE3 immP21 int- lacI+
lacUV5lacZT7 ARN polimerasa) Contiene el gen de la T7
ARN polimerasa bajo el control del promotor lacUV5 El gen de
la ARN polimerasa estaacute integrado en el cromosoma bacteriano
desde (DE3) y su expresioacuten se induce por IPTG (Stratagene)
M smegmatis
mc2155
Mycobacterium smegmatis MC2155 es un organismo
aerobio quimioorganotrofo en forma de barra no moacutevil
patoacutegeno de humanos Esta bacteria fue inicialmente aislada de
esmegma humano Esta cepa es un mutante de M smegmatis Es
faacutecilmente transformable con vectores plasmiacutedicos usando
electroporacioacuten
43 Bacterioacutefagos
Se utilizoacute el bacterioacutefago D29 que infecta especiacuteficamente micobacterias Los
trabajos especiacuteficos de infeccioacuten de micobacterias fueron realizados en el Departamento
de Microbiologiacutea de la Facultad de Ciencias Meacutedicas (UNR) bajo la supervisioacuten del Dr
Ricardo Morbidoni
44 Plaacutesmidos
El plaacutesmido utilizado y sus caracteriacutesticas relevantes se detallan en la siguiente tabla
Tabla 43 Plaacutesmido utilizado
Plaacutesmido Caracteriacutesticas
pET32a
5900 pares de bases resistencia ampicilina promotor T7lac Produce
proteiacutenas fusionadas a 6 histidinas y a la proteiacutena tiorredoxina (TRX)
de 204 kDa lo que permite su purificacioacuten en columna de NTA-Ni2+
Este vector fue utilizado como sistema de expresioacuten en la cepa BL21
(DE3) de E coli
45 Reaccioacuten en cadena de la polimerasa
Las reacciones se llevaron a cabo en un volumen total de 25 μL conteniendo
solucioacuten de amplificacioacuten comercial suplementada con MgCl2 para alcanzar una
concentracioacuten final de MgCl2 25 mM y 02 mM de cada uno de los desoxinucleoacutetidos
trifosfato dATP dGTP dCTP y dTTP 20 pmoles de cebador directo y reverso y 1 UI
de polimerasa Taq Se empleoacute un termociclador BOECO (Germany) y se inicioacute la
reaccioacuten con un paso de desnaturalizacioacuten a 95 ordmC durante 5 min La amplificacioacuten de
los fragmentos se realizoacute en 30 ciclos de a) desnaturalizacioacuten 1 min a 95degC b)
Materiales y Meacutetodos
42
hibridizacioacuten 1 min a la temperatura oacuteptima para cada par de cebadores c) extensioacuten
72degC 15 min por cada Kpb amplificado finalmente se realizoacute un paso de extensioacuten
durante 10 min
Para la reaccioacuten de amplificacioacuten de la secuencia codificante de la proteiacutena se
disentildearon oligonucleoacutetidos cebadores especiacuteficos (ver maacutes adelante) En el disentildeo de los
mismos se introdujeron sitios de restriccioacuten apropiados para el posterior clonado del
fragmento en vectores de clonado o expresioacuten
Como molde se utilizoacute aproximadamente 003 g de ADN plasmiacutedico
Como cebadores se utilizaron los oligonucleoacutetidos (provistos por Invitrogen)
P22C directo 5- GGATCCACCACCGAGACGCCAGC -3
P22C reverso 5- GAATTCTTGCCCGTGAGAGACACAG -3
46 Electroforesis de ADN en geles de agarosa
Los fragmentos de ADN (ADN plasmiacutedico productos de PCR) fueron separados
mediante electroforesis en geles de agarosa de distinta concentracioacuten (08 a 2) seguacuten
el tamantildeo de los fragmentos a separar Se utilizoacute el sistema de tipo submarino La
solucioacuten reguladora tris-aceacutetico-EDTA (TAE) 05 X se utilizoacute como solucioacuten de
electroforesis y para la preparacioacuten de geles A estos uacuteltimos se les agregoacute el agente
intercalante bromuro de etidio en una concentracioacuten final de 03 g mL-1
antes de su
gelificacioacuten Previo a la siembra las muestras se mezclaron con solucioacuten de siembra
compuesta por 0025 (mv) azul de bromofenol 0025 (mv) xilencianol y 30
(vv) glicerol en una proporcioacuten 51 en volumen de muestra solucioacuten de siembra
Como marcadores de peso molecular se utilizaron Ladder 100 pb PB-L (Productos Bio-
Loacutegicos) La corrida electroforeacutetica se realizoacute a un potencial constante de 100 V con
una fuente BIO-RAD modelo 3000xi Luego de la electroforesis el ADN se visualizoacute
por fluorescencia en un transiluminador de luz ultravioleta Fotodyne y las imaacutegenes se
digitalizaron con una caacutemara FUJIFILM modelo FinePix A120
47 Minipreparacioacuten de ADN plasmiacutedico
El ADN plasmiacutedico se preparoacute a partir de cultivos celulares de E coli conteniendo
los plaacutesmidos de intereacutes seguacuten el meacutetodo de lisis alcalina o bien utilizando los equipos
comerciales ―WIZARDreg
PLUS SV Minipreps DNA purification system (Promega) El
resultado de la preparacioacuten se evaluoacute realizando una electroforesis en gel de agarosa de
una aliacutecuota de la misma
Materiales y Meacutetodos
43
48 Purificacioacuten del producto de amplificacioacuten
La purificacioacuten de aacutecidos nucleicos a partir de geles de agarosa se realizoacute utilizando
el equipo comercial ―GFXTM Gel Band Purification Kit (Amersham GE Healthcare)
seguacuten las especificaciones del fabricante El resultado de la purificacioacuten se evaluoacute
realizando una electroforesis en gel de agarosa de una aliacutecuota de la elusioacuten obtenida
49 Prueba de expresioacuten de proteiacutenas de fusioacuten a TRX y a ldquocolardquo de histidinas
Se cultivaron clones de las cepas de E coli BL21 (DE3) transformadas con el
vector pET32a (con el inserto correspondiente) haciendo distintas diluciones 175
1100 y 1200 de un cultivo saturado en 2 mL de LB fresco (suplementado con
ampicilina a 100 μg mL-1
) y cultivando a 37 ordmC con agitacioacuten vigorosa (180 rpm) hasta
una densidad oacuteptica a 630 nm (DO630nm) aproximada de 05 unidades Se indujo la
expresioacuten de la proteiacutena recombinante con IPTG (concentracioacuten final 1 o 01 mM)
durante 3 4 o 12 hs a 37 ordmC y con agitacioacuten vigorosa Posteriormente se cosecharon las
ceacutelulas centrifugando a 3000 rpm durante 10 min Finalmente se lisaron las ceacutelulas con
pulsos de ultrasonido utilizando un sonicador analoacutegico Sonifierreg S450A y se
separaron las fracciones soluble e insoluble del extracto por centrifugacioacuten a 18000 g
durante 20 min
410 Expresioacuten y purificacioacuten preparativas de antiacutegenos recombinantes
Se cultivoacute la cepa de E coli transformada con el vector pET32a con el inserto
correspondiente haciendo una dilucioacuten 1100 de un cultivo saturado en dos porciones
de 150 mL de LB suplementado con ampicilina (100 microg mL-1
) y cultivando a 37ordm C
hasta una DO630nm 05 Se agregoacute IPTG hasta concentracioacuten final oacuteptima 1 mM para
el Ang P35B o 01 mM para el Ang P22C y se indujo el tiempo oacuteptimo 4 h para el Ang
P35B o 12 h para el Ang P22C a 37ordm De esta manera se obtuvo la proteiacutena de fusioacuten
en forma soluble Se cosecharon las ceacutelulas por centrifugacioacuten y se lavaron con solucioacuten
tampoacuten fosfato (Na2HPO4 10 mM NaCl 05 M pH 8) Luego se las resuspendioacute en 20
mL de solucioacuten de lisis (Na2HPO4 50 mM NaCl 05 M pH 8) Las ceacutelulas se lisaron
por sonicado aplicando pulsos de 30 s de duracioacuten hasta clarificacioacuten del medio en
hielo Se separoacute la fraccioacuten soluble de la insoluble por centrifugacioacuten a 18000 g y 4 ordmC
La fraccioacuten soluble se congeloacute durante 24 h a -20 ordmC y se descongeloacute en hielo luego se
centrifugoacute nuevamente a 18000 g y 4 ordmC Este paso se repitioacute dos veces
Posteriormente se realizoacute una separacioacuten cromatograacutefica de afinidad con una columna
Materiales y Meacutetodos
44
de 5 mL empacada manualmente con resina Ni Sepharosetrade High Performance en
condiciones nativas elusioacuten con imidazol 250 mM seguacuten las especificaciones del
proveedor (GE Healthcare) En los sucesivos pasos se recogieron aliacutecuotas y se verificoacute
la purificacioacuten visualizando por electroforesis en gel desnaturalizante de poliacrilamida
(SDS-PAGE)
411 Separacioacuten de proteiacutenas mediante SDS-PAGE
Se utilizaron geles de 12 y de 15 de acrilamidabisacrilamida 291 Las
muestras se sembraron en geles desnaturalizantes mezclaacutendolas 21 con solucioacuten de
siembra 2 X compuesta por Tris-HCl pH 68 125 mM SDS 4 β-mercapto etanol 5
vv(alternativamente se usoacute DTT 200 mM) glicerol 20 y azul de bromofenol 02
Las corridas electroforeacuteticas se hicieron en solucioacuten Tris-glicina-SDS (Tris base 302
g L-1
glicina 144 g L-l SDS 1 g L
-1) Los geles fueron tentildeidos con azul brillante de
Coomasie G-250
412 Cuantificacioacuten de proteiacutenas
Se utilizoacute el meacutetodo propuesto por Lowry (Lowry y col1951) seguacuten el siguiente
protocolo un volumen de muestra cuya concentracioacuten de proteiacutena se desea determinar y
uno o dos testigos de albuacutemina (conteniendo tiacutepicamente de 5 a 25 microg de proteiacutenas
totales) se disolvieron en 040 mL de agua destilada y se mezclaron con 150 mL de
reactivo C preparado inmediatamente antes de usar El reactivo C se preparoacute mezclando
una parte de tartrato de sodio y potasio 2 mv una parte de CuSO4 1 mv y 100
partes de solucioacuten tampoacuten carbonato 2 mv e hidroacutexido de sodio 01 N Se dejoacute
reaccionar la mezcla durante 15 min a temperatura ambiente y luego se adicionoacute 0150
mL de reactivo de Folin-Ciocalteu diluido 13 con agua destilada inmediatamente antes
de usar Se dejoacute reposar durante 45 min y se leyoacute la absorbancia a 660 nm
413 Reaccioacuten de conjugacioacuten biotina-antiacutegeno
Previo a la reaccioacuten de conjugacioacuten el antiacutegeno P35B purificado se llevoacute a una
concentracioacuten final de 2 mg mL-1
(como miacutenimo) en solucioacuten tampoacuten carbonato de
sodio 01 M (pH 85) usando las membranas de poro controlado Amicon Ultra-4
(Millipore Co) seguacuten las instrucciones del proveedor Se disolvieron 20 mg del eacutester
biotinil-n-hidroxisuccinimida (BNHS) en 590 microL de DMSO e inmediatamente despueacutes
se mezclaron 80 microL de esta solucioacuten con 800 microL de solucioacuten de Ang
Materiales y Meacutetodos
45
Al antiacutegeno P22C purificado se lo llevoacute a una concentracioacuten final de 20 mg mL-1
(como miacutenimo) en solucioacuten tampoacuten carbonato de sodio 01 M (pH 85) usando las
membranas de poro controlado mencionadas Se disolvieron 25 mg BNHS en 590 microL
de DMSO e inmediatamente despueacutes se mezclaron 120 microL de esta solucioacuten con 100
mL de solucioacuten de Ang Se incuboacute 4 h a temperatura ambiente con agitacioacuten suave Se
eliminaron los restos de eacutester hidrolizado y se cambioacute la solucioacuten tampoacuten carbonato por
PBS 1 X pH 74 haciendo lavados reiterados y reteniendo el Ang en las membranas de
poro controlado
414 Revelado cromogeacutenico de la reaccioacuten de conjugacioacuten
El antiacutegeno marcado con biotina respectivo fue retenido en membrana de
nitrocelulosa sembrando 1 L del mismo sobre la membrana Se procedioacute a bloquear
los sitios activos de la membrana con leche descremada disuelta al 5 mv en PBS pH
74 durante 1 h Se realizaron 3 lavados con PBS pH 74 de 1 min cada uno Se incuboacute
la membrana con la enzima peroxidasa de raacutebano picante ligada a streptavidina (HRP-
EAV) disuelta en PBS pH 74-leche descremada al 1 mv Posteriormente se
realizaron 3 lavados con PBS pH 74 de 1 min cada uno Finalmente se reveloacute la
presencia de la enzima HRP con el reactivo de color recieacuten preparado seguacuten 5 mg de
33-diaminobenzidina tetrahidrocloruro (DAB) se disolvieron en 500 microL de DMSO y se
llevoacute a 100 mL de volumen final con PBS pH 74 A esta solucioacuten se le agregaron 100
microL de H2O2 10 voluacutemenes inmediatamente previo a su utilizacioacuten
415 Mediciones espectrofotomeacutetricas
Para las medidas de absorbancia (Abs) a longitudes de onda especiacuteficas o la
realizacioacuten de espectros de absorcioacuten ultravioleta-visible se utilizoacute el espectrofotoacutemetro
Beckman DU 640 Como celda se utilizoacute una cubeta de cuarzo de 1 cm de paso oacuteptico
416 Ensayos de inmunoabsorcioacuten ligados a enzima con deteccioacuten fotomeacutetrica
Como soporte soacutelido se utilizaron microplacas Microlon 600 high binding Greiner
Bio One provistas por GBO Argentina Para las lecturas de Abs se utilizoacute un lector de
microplacas PowerWave XS (BioTek) o alternativamente se utilizoacute el lector ELx808
Absorbance Microplate Reader (BioTek) Los ensayos preliminares se detallan en la
secioacuten 6 Experimentos Auxiliares
Materiales y Meacutetodos
46
4161 Esquema A
Sobre las microplacas de ELISA Microlon 600 high binding Greiner Bio One se
depositaron 100 microL de anticuerpo de captura (IgG de conejo anti IgM humana) provisto
por Dakko diluido 11000 en PBS pH 74 Se incubaron 48 h a 37 degC Luego se
realizaron 3 lavados con PBS Tween 20 al 005 (PBS-T) de 1 min cada uno Se
procedioacute al bloqueo de los sitios libres de la placa con 100 microL leche descremada
comercial (marca Milkaut) al 1 mv en PBS durante 30 min a 37 degC y se realizaron 3
lavados con PBS-T de 1 min cada uno Luego se incubaron con suero humano (muestra
incoacutegnita) 1100 en PBS con leche descremada al 1 mv durante 1 h a 37 degC y se
realizaron 3 lavados con PBS-T de 1 min cada uno Se realizaron distintas incubaciones
con los antiacutegenos P22C y P35B conjugados a biotina Luego de tres lavados con PBS-T
se incubaron con la enzima HRP-EAV en una dilucioacuten 12000 durante 1 h a 37degC
Posteriormente se realizaron 3 lavados con PBS-T para finalmente revelar utilizando
50 microL de solucioacuten comercial de 33prime55prime-tetrametilbenzidina (TMB) sustrato de la
enzima HRP que da coloracioacuten azul en el medio de reaccioacuten pasando a amarillo y
permaneciendo estable el color cuando se detiene la reaccioacuten acidificando el medio con
H2SO4 05 M
4162 Esquema B
Sobre las microplacas de ELISA comerciales se depositaron 500 ng de Ang P22C
disueltos en 100 L de solucioacuten carbonato pH 96 incubando 1 h a 37 degC Se realizaron
3 lavados con PBS Tween 20 al 005 (PBS-T) de 1 min cada uno Se bloquearon los
sitios libres de la placa con 100 microL leche descremada 1 mv en PBS durante 30 min a
37 degC Luego se realizaron 3 lavados con PBS-T de 1 min cada uno Se incubaron con
suero humano (muestra incoacutegnita) 1100 en PBS con leche descremada al 1 mv
durante 1 h a 37 degC Luego se realizaron 3 lavados con PBS-T de 1 min cada uno Se
realizoacute una incubacioacuten con el antiacutegeno P22C conjugado a biotina Luego de tres lavados
con PBS-T se incubaron con la enzima HRP-EAV en una dilucioacuten 12000 durante 1 h
a 37degC Posteriormente se realizaron 3 lavados con PBS-T Finalmente se reveloacute con
50 microL de solucioacuten comercial de TMB y se detuvo la reaccioacuten acidificando el medio con
50 microL H2SO4 05 M
Materiales y Meacutetodos
47
417 Reaccioacuten de color para determinacioacuten cuantitativa de glicerol por meacutetodo
espectrofotomeacutetrico
Se llevaron a cabo dos tipos de ensayos diferentes Por un lado se utilizoacute el meacutetodo
enzimaacutetico con un equipo comercial provisto por Wiener Lab TG GPO PAP AA (liacutenea
liacutequida) ensayando muestras de aliacutecuotas del medio Middlebrook 7H9 suplementadas
con glicerol en lugar de suero humano Por otro lado se realizaron reacciones de color
que se llevaron a cabo en un volumen final de 100 mL que resultoacute de la mezcla de 950
microL de reactivo A y 50 microL de muestra la cual consistioacute en medio de cultivo de
micobacterias Middlebrook 7H9 suplementado con distintas cantidades de glicerol En
los blancos de reaccioacuten se realizoacute un agregado de medio de cultivo Middlebrook 7H9
sin glicerol de igual volumen que en los otros dos casos para mantener las mismas
condiciones que en las otras reacciones
El reactivo A se preparoacute inmediatamente antes de ser usado mezclando los
reactivos necesarios seguacuten se indica en la siguiente tabla
Tabla 44 Mezcla de reactivos necesaria para preparar 950 microL de reactivo A (necesario para 1 reaccioacuten)
Los voluacutemenes necesarios para un nuacutemero n de reacciones se obtuvieron multiplicando por n
los voluacutemenes de esta tabla
Reactivo Volumen para una
reaccioacuten ( L)
Solucioacuten Tampoacuten carbonato
0125 M pH 105 815
K3Fe(NC)6 10-2
M 100
(NH4)2SO4 10 M 10
NAD+ 10
-2 M 25
Enzima GlDH 2 mg mL-1
1
Las reacciones se llevaron a cabo en tubos de Khan cerrados con parafilm para
evitar evaporacioacuten de liacutequido y en bantildeo termostatizado a 37 ordmC La lectura de
absorbancia se realizoacute cuando se cumplioacute una o dos h de iniciada la reaccioacuten seguacuten la
necesidad del ensayo Los experimentos se realizaron por triplicado
418 Determinacioacuten de glicerol remanente en cultivos de micobacterias
Procedimiento seguido a medios de cultivos Middlebrook 7H9 se los suplementoacute
con glicerol a concentracioacuten 0025 mv y se cultivaron cantidades iguales de ceacutelulas
de M smegmatis algunos medios se conservaron sin adicionar micobacterias en
Materiales y Meacutetodos
48
condiciones de esterilidad Se tomaron aliacutecuotas de estos cultivos a distintos tiempos Se
centrifugaron a 12500 rpm durante 5 min para separar las ceacutelulas del sobrenadante y a
estos uacuteltimos se los congeloacute a -20ordmC para su posterior anaacutelisis
Se realizaron determinaciones de glicerol con la teacutecnica fotomeacutetrica propuesta Se
realizaron reacciones de color por triplicado a las muestras e independientemente se
hizo un blanco de reaccioacuten y 2 testigos cuyas concentraciones fueron de 001 y 004
mv
4181 Determinacioacuten de glicerol remanente en cultivos de micobacterias con y sin
fago D29 y ensayos controles respectivos
Procedimiento seguido a medios de cultivos Middlebrook 7H9 se los suplementoacute
con glicerol a 0025 mv y se cultivaron cantidades iguales de a) ceacutelulas de M
smegmatis b) ceacutelulas de M smegmatis infectadas con fago D29 c) fagos D29 d)
algunos medios se conservaron sin adicionar micobacterias ni fagos en condiciones de
esterilidad Se tomaron aliacutecuotas de estos medios inmediatamente despueacutes de realizados
los inoacuteculos (tiempo 0) a las 2 h y a las 4 h de iniciados los cultivos Se centrifugaron a
12500 rpm durante 5 min para separar las ceacutelulas del sobrenadante y a estos uacuteltimos se
los congeloacute a -20 ordmC para su posterior anaacutelisis A estas muestras se les realizaron
determinaciones del glicerol remanente con la teacutecnica fotomeacutetrica propuesta Se
realizaron reacciones de color por triplicado a cada muestra utilizaacutendose como testigos
los medios en condiciones de esterilidad
419 Instrumental electroquiacutemico
Para los experimentos electroquiacutemicos se utilizoacute un analizador electroquiacutemico
Autolab (Eco Chemie) con amplificador electromeacutetrico diferencial PGSTAT 30 Se
utilizoacute una celda convencional de tres electrodos
4191 Electrodos de trabajo
41911 Bioelectrodo para evaluacioacuten de infeccioacuten toxoplaacutesmica
Se utilizaron electrodos macizos tipo ―banderita de oro de aproximadamente 1
cm2 de aacuterea geomeacutetrica El ensamblado se realizoacute de acuerdo al siguiente protocolo los
electrodos limpios se sumergieron durante 14 h en una solucioacuten de aacutecido 3 mercapto
propanosulfoacutenico preparada inmediatamente antes de usar disolviendo 22 mg en 12 mL
de H2SO4 0021 M (desoxigenenada con burbujeo de N2) en atmoacutesfera de N2 a
Materiales y Meacutetodos
49
temperatura ambiente (TA) Luego de enjuagar con agua destilada se sumergieron en
una solucioacuten de Ang recombinante P22C 02 mg mL-1
(PBS pH 74) durante 1 h a TA
Luego de un lavado con PBS se bloquearon los sitios libres no modificados con el Ang
sumergiendo los electrodos en solucioacuten de caseinato de sodio 01 mg mL-1
(preparada
inmediatamente antes de usar) 30 min a 37 degC Los electrodos se lavaron con PBS
Tween-20 05 mv y se sumergieron en una dilucioacuten 1200 de suero humano (muestra
incoacutegnita) en PBS durante 30 min a 37 degC Se lavaron con PBS Tween-20 05 y
finalmente se incubaron en una dilucioacuten 11500 de anticuerpos de conejo anti IgGh-
HRP Los biosensores asiacute ensamblados se guardaron en PBS pH 74 a 4degC hasta su
utilizacioacuten
41912 Electrodos para cuantificacioacuten de glicerol
Como electrodos de trabajo se utilizaron oro platino plata carbono viacutetreo pasta
de carbono (viacutetreo y grafito) y pastas de carbono modificadas
Los electrodos metaacutelicos y de carbono viacutetreo fueron provistos por Metrohm
(numero de cataacutelogo 612043XX) consistentes en barras del material de 3 mm de
diaacutemetro embutidas en un armazoacuten aislante
Las pastas de carbono utilizadas se enumeran a continuacioacuten indicando los
porcentajes en masa de cada componente respectivamente
a) Pasta A carbono viacutetreo aceite mineral (7030)
b) Pasta B carbono viacutetreo aceite mineral GLDH (68302)
c) Pasta C carbono viacutetreo aceite mineral GLDH MWCNT (5830210)
Las pastas se prepararon mezclando los componentes en mortero de aacutegata durante
15 a 20 min hasta obtener una mezcla homogeacutenea a la vista Cuando se utilizoacute enzima
GlDH se dispersoacute en aceite mineral primero y luego se mezcloacute con el polvo de carbono
viacutetreo Cuando se utilizaron NTC (MWCNT nanotubos de carbono de pared multiple)
se dispersoacute primero la enzima luego los NTC y finalmente el polvo de carbono viacutetreo
Asiacute preparadas se empaquetaron firmemente en un armazoacuten de tefloacuten (diaacutemetro 3 mm)
y se friccionoacute firmemente sobre un papel liso apoyado en un vidrio para eliminar el
exceso de pasta y pulir la superficie expuesta del electrodo
Cuando se utilizaron electrodos de pasta de carbono con las pastas B se realizoacute una
cubierta de poli-(o-fenilendiamino) que inmovilizara la enzima Una vez empaquetada
la pasta en el armazoacuten de Teflon se sumergioacute en una solucioacuten de o-fenilendiamino 5 x
10-4
M en solucioacuten tampoacuten carbonato 01 M (pH 10) Se burbujeoacute N2(g) para eliminar el
Materiales y Meacutetodos
50
O2(g) de la solucioacuten y dejar una atmoacutesfera libre de O2(g) Para electropolimerizar se
realizoacute un barrido de potencial ciacuteclico desde -051 V a + 069 V a 50 mV s-1
Finalmente se enjuagoacute con solucioacuten amortiguadora carbonato 01 M (pH 10)
4192 Limpieza de electrodos
Los electrodos de oro macizo policristalino tipo ―banderita se sumergieron en
solucioacuten ―pirantildea (H2SO4 concentrado peroacutexido de hidroacutegeno 30 en una relacioacuten 31)
durante 30 min a 80ordmC Luego se los enjuagoacute con abundante agua destilada En caso de
limpieza maacutes rigurosa previo al tratamiento con solucioacuten ―pirantildea se los colocoacute a la
llama directa hasta rojo vivo (Ribone y col 2006)
Los electrodos de oro policristalino macizo insertos en una barra de tefloacuten (Tips de
Au) se limpiaron siguiendo el siguiente protocolo desengrase frotaacutendolo sobre tela de
pulido humedecida con DMSO Lavado con abundante agua destilada Pulido con
suspensioacuten acuosa de aluacutemina (diaacutemetro promedio de partiacutecula 03 microm) sobre tela de
pulido Lavado con abundante agua destilada Sonicado durante 5 min en sonicador
Cole-Palmer 8890 Luego de un enjuague con abundante agua destilada se sumergieron
en HNO3 9 M durante 1 min a 60 ordmC Finalmente se lavaron con abundante agua
destilada
4193 Determinacioacuten del aacuterea real del electrodo
Para la determinacioacuten del aacuterea real de los electrodos metaacutelicos se utilizaron dos
metodologiacuteas in-situ
41931 Medicioacuten de la adsorcioacuten de oxiacutegeno
Se asume que el oxiacutegeno se quimioadsorbe en una capa monoatoacutemica antes de la
evolucioacuten de 02 con una correspondencia de uno-a-uno con los aacutetomos metaacutelicos de la
superficie El valor de la carga asociada a la reduccioacuten de la monocapa de oacutexido en
superficies de oro policristalino que se utilizoacute fue de 390plusmn10 microC cm-2
(Trasatti amp Petrii
1991)
Se realizaron VCs en H2SO4 a 50 mVs-1
y se midioacute la carga correspondiente al pico
de desorcioacuten de O2 sobre la superficie del electrodo y este valor se dividioacute por el valor
de referencia
Materiales y Meacutetodos
51
41932 Voltametriacutea ciacuteclica de ferricianuro de potasio
Registrando VCs a varias velocidades de barrido de potencial conociendo el
coeficiente de difusioacuten del ioacuten su concentracioacuten en la celda y midiendo la corriente de
pico a cada velocidad de barrido es posible determinar el aacuterea real del electrodo de
trabajo utilizando la ecuacioacuten de Randles Sevcik ec[216] (Belluzo y col 2008)
[216]
siendo la temperatura 25 degC y donde A estaacute en cm2 D en cm
2 s
-1 C en mol cm
-3 y
en V s-1
420 Medidas electroquiacutemicas
Todos los potenciales fueron medidos y referidos al electrodo de AgAgCl (KCl
300 M) que se utilizoacute como electrodo de referencia Como contraelectrodos se
utilizaron dos tipos uno de oro de superficie mayor a 5 veces la superficie del electrodo
de trabajo cuando se utilizaron electrodos metaacutelicos como electrodos de trabajo y una
barra de carbono viacutetreo cuando se utilizaron electrodos de pasta de C como electrodos
de trabajo En todos los casos las soluciones se burbujearon con N2 durante 1 min para
desplazar el O2 disuelto y se mantuvieron en atmoacutesfera de N2 durante las
determinaciones
Las voltametriacuteas ciacuteclicas se realizaron equilibrando el sistema al potencial de inicio
Para muestras conteniendo glicerol y utilizando electrodos de oro se realizaron
barridos desde -030 V hasta 060 V a distintas velocidades de barrido Cuando se
utilizaron electrodos de platino se realizaron barridos desde -080 V hasta 020 V a
distintas velocidades de barrido Cuando se utilizaron electrodos de pasta de carbono o
pasta de carbono modificada se realizaron barridos de potencial desde -040 V hasta
100 V Las corrientes que se informan son las intensidades de pico obtenidas trazando
una liacutenea de base recta desde los extremos del pico de corriente utilizando algoritmos
propios del programa General Purpose Electrochemical System (GPES)
4201 Mediciones amperomeacutetricas para evaluacioacuten de infeccioacuten toxoplaacutesmica
Las amperometriacuteas realizadas con el bioelectrodo para evaluacioacuten de infeccioacuten
toxoplaacutesmica se llevaron adelante en solucioacuten PBS (pH 74) FeMe 3 mM El potencial
de trabajo fue de 008V Se registroacute la corriente de base hasta que se estabilizoacute y una
Materiales y Meacutetodos
52
vez estable (usualmente a los 250 s) se adicionoacute el sustrato de la enzima (H2O2)
concentracioacuten en celda 18 mM y se registroacute la corriente final (500 s) La corriente
cataliacutetica se evaluoacute como la diferencia entre la corriente final y la de base
4202 Mediciones amperomeacutetricas para cuantificacioacuten de glicerol
42021 Amperometriacuteas con tip de oro
Las amperometriacuteas con tip de oro se realizaron en medio NaOH 01 M a potencial
constante (01 V) y a temperatura ambiente (20 a 25 ordmC) El sistema se preacondicionoacute
aplicando un potencial de 05 V se dejoacute equilibrar y se registroacute la corriente de base en
esas condiciones (generalmente a los 50 s) Luego se adicionoacute la muestra de forma de
lograr la concentracioacuten final de analito deseada La corriente fue registrada y se midioacute
una vez que se estabilizoacute (aproximadamente a los 400 s) La corriente cataliacutetica se
evaluoacute como la diferencia entre la corriente final y la de base
42022 Amperometriacuteas con electrodos de pasta de C
Las amperometriacuteas donde se utilizoacute la pasta de carbono B se realizaron en solucioacuten
tampoacuten carbonatobicarbonato de potasio 100 mM (NH4)2SO4 25 mM K3Fe(CN)6
1mM NAD+ 05 mM pH 105 Se trabajoacute a potencial constante 038 V y a temperatura
ambiente (25 ordmC) El sistema se preacondicionoacute aplicando el potencial de trabajo
correspondiente durante 50 s una vez iniciada la lectura de corriente se dejoacute equilibrar
y se registroacute la corriente de base en esas condiciones usualmente a los 300 s Luego se
adicionoacute la cantidad necesaria de muestra de forma de lograr la concentracioacuten final de
analito deseada La corriente fue registrada y se midioacute una vez que se estabilizoacute
(aproximadamente a los 500 s) La corriente cataliacutetica se evaluoacute como la diferencia
entre la corriente final y la de base
Las amperometriacuteas donde se utilizoacute la pasta de carbono C se realizaron en solucioacuten
tampoacuten carbonatobicarbonato de potasio 100 mM (NH4)2SO4 25 mM NAD+ 05 mM
pH 105 a potencial constante 051 V y a 25 ordmC El sistema se preacondicionoacute aplicando
el potencial de trabajo correspondiente durante 50 s una vez iniciada la lectura de
corriente se dejoacute equilibrar y se registroacute la corriente de base en esas condiciones
usualmente a los 300 s Luego se adicionoacute la cantidad necesaria de muestra de forma
de lograr la concentracioacuten final de analito deseada La corriente fue registrada y se
midioacute una vez que se estabilizoacute (aproximadamente a los 200 s del agregado) La
corriente cataliacutetica se evaluoacute como la diferencia entre la corriente final y la de base
Materiales y Meacutetodos
53
Cuando el tiempo de equilibrado no fue suficiente para que la corriente de base se
estabilizara se recurrioacute a realizar correcciones de liacutenea de base A tal fin se llevaron a
cero las corrientes de base aplicando los algoritmos que ofrece el programa GPES
versioacuten 49 provisto por Eco Chemie BV
4203 Voltamperometriacutea de onda cuadrada
Los experimentos de voltamperometriacutea de onda cuadrada se realizaron en solucioacuten
tampoacuten carbonatobicarbonato de potasio 100 mM (NH4)2SO4 25 mM NAD+ 05 mM
pH 105 y a 25 ordmC Los valores de escaloacuten de potencial utilizados fueron de 5 y 10 mV
Los valores de amplitud de pulso fueron de 25 y 50 mV Las frecuencias utilizadas
fueron de 8 10 20 30 40 60 y 70 Hz Especiacuteficamente se evitoacute utilizar 50 Hz
(frecuencia de la tensioacuten alterna de la liacutenea de alimentacioacuten) Los barridos de potencial
se realizaron desde -03 V hasta 10 V
Una vez registrado el blanco con medio Middlebrook 7H9 y se hicieron dos
agregados secuenciales de solucioacuten estaacutendar de glicerol 100 M obtenieacutendose una
concentracioacuten final de 25 y 50 mM respectivamente en la celda
421 Funcionalizacioacuten de nanotubos de carbono
Previo a la utilizacioacuten de los nanotubos de carbono se procedioacute a funcionalizarlos
realizando una carboxilacioacuten oxidativa Se siguioacute una comunicacioacuten personal del Dr
Joseacute Manuel Pingarroacuten del Departamento de Quiacutemica Analiacutetica Facultad de Ciencias
Quiacutemicas Universidad Complutense de Madrid A saber se pesaron aproximadamente
2 mg de MWCNT y se dispersaron en 2 mL en una mezcla de aacutecido sulfuacuterico aacutecido
niacutetrico 31 con agitacioacuten ultrasoacutenica durante 5 h Luego se diluyoacute la mezcla al 110
vertieacutendola suavemente en agua destilada enfriada en bantildeo de hielo para evitar
proyecciones Se eliminoacute el exceso de aacutecido centrifugando a 14000 rpm durante 30
min descartando el sobrenadante y dispersando el precipitado en agua destilada con
agitacioacuten ultrasoacutenica durante 30 min Esta operatoria se repitioacute 9 veces hasta que la
dispersioacuten de MWCNT en agua tuvo un pH cercano a la neutralidad (70 05) Los
MWCNT se secaron en desecador con sulfato de cobre anhidro y aplicando vaciacuteo al
sistema
Materiales y Meacutetodos
54
422 Programas de prediccioacuten de epiacutetopes lineales reconocidos por ceacutelulas B
4221 Base de datos de proteiacutenas
Se creo manualmente una base de datos para mejorar la exactitud de los resultados
Las proteiacutenas fueron seleccionadas de la base de datos de BciPep (Saha y col 2005)
HIV Molecular Immunology Database (disponible en httpwwwhivlanlgovcontent
immunologyindexhtml) o tomadas de la literatura VP1 (Wang y col 2011) proteiacutena
N (El-Manzalawy y col 2008) y Gliadina (Sweredoski amp Baldi 2009) El criterio de
seleccioacuten fue la confirmacioacuten experimental previa mediante ensayos de puntos de
inmunoadsorcioacuten ligado a enzima (ELIspot) o mediante el uso de paneles
multiespeciacuteficos de anticuerpos monoclonales que reconocen epiacutetopes lineales (Shin y
col 2005) Como resultado se seleccionaron 11 proteiacutenas de las que se obtuvieron un
total de 65 epiacutetopes lineales reconocidos por ceacutelulas linfociacuteticas tipo B
4222 Programas utilizados
Se utilizaron algunos programas para predecir los epiacutetopes lineales disponibles en
liacutenea gratuitamente Todos estos programas utilizan algoritmos matemaacuteticos con escalas
de propensioacuten yo datos experimentales de antigenicidad A menos que se indique lo
contrario cada programa se ejecutoacute utilizando los paraacutemetros por defecto Los
programas utilizados fueron AAPPred (Davydov amp Tonevitskii 2009) ABCpred
(Saha S amp Raghava 2006) BcePred (Saha y col 2005) BepiPred (Larsen y col
2006) y Antigenic (Kolaskar amp Tongaonkar 1990)
Los programas de prediccioacuten definen el grado de antigenicidad por medio de una
puntuacioacuten (score) en algunos casos para cada epiacutetope y en otros para cada residuo
amino aciacutedico En este uacuteltimo se puede definir una regioacuten antigeacutenica cuando varios
residuos con alta puntuacioacuten son adyacentes en la estructura primaria Por otra parte el
nuacutemero de epiacutetopes o regiones antigeacutenicas que los programas de prediccioacuten encuentran
depende de un umbral que es configurado por el usuario
423 Anaacutelisis de Datos
Los liacutemites de deteccioacuten (LD) y cuantificacioacuten (LC) se calcularon siguiendo las
sugerencias de Armbruster amp Pry (Armbruster amp Pry 2008) modificando la cantidad
de replicados utilizados para la obtencioacuten de los desviacuteos estaacutendar habieacutendose utilizado
10 reacuteplicas El caacutelculo del LD se realizoacute a partir del valor de corriente del blanco IB maacutes
Materiales y Meacutetodos
55
33 veces el valor del desviacuteo estaacutendar de la corriente leiacuteda (DSn1) de la muestra con
menor concentracioacuten de glicerol medida seguacuten
[41]
El valor del LC se calculoacute como
[42]
siendo m la pendiente de la curva de calibracioacuten
La capacidad de discriminacioacuten entre dos concentraciones diferentes de los
meacutetodos propuestos se evaluoacute como el error asociado a la estimacioacuten de la
concentracioacuten Ec calculada como
Nm
EE r
c
1
[43]
siendo Er el error relativo
424 Caacutelculos estadiacutesticos y disentildeo experimental
Para los caacutelculos estadiacutesticos se utilizaron los programas SigmaStat 32 (Sigma Plot
90 u 110) o Microcal Origin 80 en forma indistinta Para los caacutelculos de EJCR (regioacuten
eliacuteptica de confianza conjunta) se utilizoacute el programa Matlab con rutinas disentildeadas ―ad-
hoc
Resultados y Discusioacuten
Resultados y Discusioacuten
57
5 Resultados y discusioacuten
Para la obtencioacuten de antiacutegenos especiacuteficos de fase aguda de la toxoplasmosis se
comenzoacute seleccionando un conjunto de proteiacutenas denominadas P30 P22 y P35
mencionadas en la literatura como antiacutegenos de fase aguda (Harning y col 1996
Parmley y col 2000 Lu y col 2006) Sobre la base de estos estudios iniciales se
intentoacute identificar por medio de caacutelculos teoacutericos que regiones de estas proteiacutenas
conteniacutean mayor nuacutemero de epiacutetopes De este modo en la etapa siguiente se procurariacutea
expresarlos en forma soluble para su posterior utilizacioacuten en inmunoensayos Al
momento de seleccionar un programa de todos los disponibles ―on line verificamos
que eacutestos no informaban el valor predictivo positivo VPP Por ello se inicioacute un trabajo
de identificacioacuten del programa que predijera maacutes fidedignamente los epiacutetopes La
buacutesqueda se realizoacute comparando los resultados arrojados por 5 programas a los que se
solicitoacute prediccioacuten de epiacutetopes pertenecientes a 11 proteiacutenas cuyos epiacutetopes lineales
habiacutean sido perfectamente establecidos experimentalmente (Costa y col 2013) Se
analizoacute cuaacutel de ellos presentaba el mayor VPP (ver punto 61 seccioacuten Experimentos
Auxiliares) y para predecir epiacutetopes lineales se trabajoacute con este programa que resultoacute
ser AAPred
El anaacutelisis de los Ang seleccionados permitioacute identificar en P35 dos regiones que
concentraban los determinantes antigeacutenicos a las cuales se las denominoacute P35A y P35B
Los Ang P30 y P22 presentaban los determinantes antigeacutenicos distribuidos
homogeacuteneamente por lo tanto al momento de disentildear su clonado se tuvieron en cuenta
criterios que faciliten la expresioacuten y solubilidad mas allaacute de la antigenicidad
51 Evaluacioacuten de antiacutegenos recombinantes de T gondii
511 Antiacutegeno P30
El antiacutegeno de superficie 1 de T gondii SAG1 tambieacuten denominado proteiacutena P30
se ha identificado como antiacutegeno de fase aguda (Harning y col 1996) por lo cual se
procuroacute obtenerlo en forma soluble Sobre la base de ensayos previos realizados en el
LTI se continuoacute con la obtencioacuten y purificacioacuten de dos porciones del antiacutegeno P30
denominadas P30L y P30C (seccioacuten 410 Materiales y Meacutetodos) Luego de la cosecha
y lisis de las bacterias se separaron las fracciones soluble e insoluble del extracto se
tomaron aliacutecuotas de ambas y se analizaron por SDS-PAGE Los Angs buscados soacutelo se
Resultados y Discusioacuten
58
obtuvieron como proteiacutenas precipitadas en cuerpos de inclusioacuten en la fraccioacuten insoluble
Por ello se discontinuoacute el trabajo con las fracciones de P30
512 Antiacutegeno P22
El antiacutegeno de superficie 2 o antiacutegeno P22 de T gondii (Gen Bank ndeg M33572) ha
sido tambieacuten identificado como antiacutegeno de fase aguda (Parmley y col 1992 Lau amp
Fong 2006) En el presente trabajo se procuroacute amplificar la regioacuten del gen que
permitiese expresar la proteiacutena recombinante en forma soluble El producto de
amplificacioacuten se resolvioacute en un gel de agarosa tentildeido con bromuro de etidio como se
observa en la Fig 51
Figura 51 Gel de agarosa tentildeido con bromuro de etidio en transiluminador UV En PCR1 se observan los
productos de amplificacioacuten obtenidos utilizando cebadores especiacuteficos para la regioacuten P22C donde se
sentildeala el fragmento de tamantildeo esperado Control (-) muestra la misma mezcla de reaccioacuten pero sin ADN
molde MPM indica el marcador de peso molecular y el tamantildeo de los fragmentos se indica sobre la
derecha
Se aisloacute y purificoacute el fragmento de intereacutes utilizando un equipo comercial detallado
en el punto 48 seccioacuten Materiales y Meacutetodos En un paso posterior se ligoacute al vector
pET32a y con la construccioacuten resultante se transformaron ceacutelulas competentes de E
coli Las ceacutelulas transformadas se seleccionaron crecieacutendolas en medio LB con
ampicilina Se verificaron las condiciones para la expresioacuten en forma soluble (punto
410 seccioacuten Materiales y Meacutetodos) encontraacutendose que las condiciones oacuteptimas eran
01 mM IPTG y 12 h de incubacioacuten con agitacioacuten vigorosa
Para la induccioacuten preparativa se siguioacute el protocolo detallado en la seccioacuten 410 de
Materiales y Meacutetodos La Fig 52 muestra la fotografiacutea de un gel de poliacrilamida
luego de la tincioacuten donde se analizaron aliacutecuotas de todos los extractos obtenidos en los
distintos pasos separativos de la proteiacutena P22C
Resultados y Discusioacuten
59
Figura 52 Gel de poliacrilamida tentildeido con azul brillante de Coomassie En cada calle se sembraron 1
microL de muestra EC indica el extracto crudo P1 muestra la fraccioacuten insoluble del lisado celular P2 la
fraccioacuten insoluble luego del congelamiento-descongelamiento del extracto centrifugado FT muestra el
extracto que pasoacute por la columna Con L se indican las calles con las fracciones de lavados sucesivos con
tampoacuten imidazol 0 mM 20 mM 50 mM y 100 mM respectivamente E muestra las fracciones de
elucioacuten con solucioacuten imidazol 250 mM Las fracciones de elucioacuten recolectadas fueron de 15 mL cada
una
513 Antiacutegeno P35
El antiacutegeno de superficie P35 de T gondii (Gen Bank ndeg AF01275) se ha
identificado como antiacutegeno de fase aguda y distintas porciones del mismo presentan
diferentes desempentildeos en su uso diagnoacutestico (Lu y col 2006) Sobre la base de
ensayos previos realizados en el LTI se continuoacute con la obtencioacuten y purificacioacuten de las
dos porciones del antiacutegeno P35 denominadas P35A y P35B
Se ensayoacute la expresioacuten del antiacutegeno P35A (punto 49 seccioacuten Materiales y
meacutetodos) y soacutelo se obtuvo como cuerpos de inclusioacuten en la fraccioacuten insoluble Si bien
fue posible disolver las proteiacutenas recombinantes en urea 8 M al dializar volviacutean a
precipitar
El antiacutegeno P35B se pudo obtener en forma soluble y las condiciones oacuteptimas
encontradas para la induccioacuten del mismo fueron IPTG 1 mM y 4 h con agitacioacuten
vigorosa La Fig 53 muestra una imagen del gel de poliacrilamida luego de la corrida
electroforeacutetica y su tincioacuten Se observoacute que una banda de la fraccioacuten soluble estaba
sobreexpresada en los cultivos inducidos
Resultados y Discusioacuten
60
Figura 53 Gel de poliacrilamida al 12 en condiciones desnaturalizantes Se muestra lo obtenido para
aliacutecuotas de dos cultivos no inducidos 1 y 2 y dos inducidos 3 y 4 Con P se designan las fracciones
insolubles en la solucioacuten de lisis y con SN las fracciones solubles Las bandas que se observan del MPM
corresponden a fragmentos de 19445 KDa 28829 KDa 36545 KDa 49491 KDa 80664 KDa
103035 KDa Se indica la banda sobreexpresada de tamantildeo esperado
Para la induccioacuten preparativa del antiacutegeno P35B se siguioacute el protocolo descripto en
el punto 410 seccioacuten Materiales y Meacutetodos En la Fig 54 se muestra un gel de
poliacrilamida luego de la tincioacuten donde se analizaron aliacutecuotas de todos los extractos
obtenidos en los distintos pasos separativos
Figura 54 Gel de poliacrilamida tentildeido con azul brillante de Coomassie En cada calle se sembraron 7
microL de muestra P1 fraccioacuten insoluble del lisado celular P2 fraccioacuten insoluble luego del congelamiento-
descongelamiento del extracto centrifugado FT muestra el extracto que pasoacute por columna L calles con
las fracciones de lavados sucesivos con tampoacuten imidazol 20 mM 50 mM y 100 mM respectivamente E
fracciones de elucioacuten con solucioacuten imidazol 250 mM Las fracciones recolectadas fueron de 15 mL cada
una
En consecuencia se continuoacute el trabajo con P35B y se descartoacute transitoriamente la
utilizacioacuten del Ang P35A
52 Marcado de antiacutegenos recombinantes de T gondii
Para los ensayos tipo ELISA de captura especiacuteficos para IgM se propuso utilizar
como sistema revelador la enzima HRP-EAV que se une especiacuteficamente a biotina En
consecuencia se procedioacute a marcar los Ang solubles obtenidos con biotina
P35B
P1 P2 P3 P4 MPM
Inducido No Inducido
SN1
Inducido No Inducido
SN2 SN3 SN4
Resultados y Discusioacuten
61
La reaccioacuten de conjugacioacuten se realizoacute siguiendo el protocolo mencionado en el
punto 413 seccioacuten Materiales y Meacutetodos La conjugacioacuten se evidencioacute con la reaccioacuten
de color indicada en el inciso 413 En la Fig 55 se muestra la membrana de
nitrocelulosa sobre la que se fijaron las proteiacutenas P22 y P35B luego del revelado
cromogeacutenico con la enzima HRP conjugada a streptavidina Las reacciones de
conjugacioacuten se llevaron adelante por separado
Figura 55 Membranas de nitrocelulosa evidenciando las proteiacutenas P35B conjugada (izquierda) y P22C
conjugada (derecha)
53 Inmunoensayos
Estudios preliminares (ver punto 62 seccioacuten Experimentos Auxiliares) con los
antiacutegenos recombinantes obtenidos permitieron verificar por ELISA indirecto que sueros
confirmados positivos arrojaban resultados positivos mientras que los sueros negativos
daban el ensayo negativo Se procedioacute entonces a evaluar la capacidad de los antiacutegenos
obtenidos para discriminar sueros de pacientes con infeccioacuten aguda de sueros provenientes
de pacientes con infeccioacuten croacutenica
531 Inmunoensayos con deteccioacuten fotomeacutetrica
Como se anticipoacute en la introduccioacuten se realizaron ELISA siguiendo dos
alternativas de captura En la primera alternativa que denominamos A se procuroacute
capturar selectivamente la maacutexima cantidad de Ac del isotipo que se deseaba detectar
(IgMh) adsorbiendo sobre la placa un anticuerpo ―ad-hoc (Ac-a-IgMh) En la segunda
alternativa que denominamos B se buscoacute capturar con el Ang recombinante la maacutexima
cantidad de Ac especiacuteficos independientemente del isotipo que se tratara En el paso
siguiente del esquema B se tomoacute ventaja de la mayor valencia de las IgM respecto de
las IgG para el revelado
5311 Evaluacioacuten del esquema A
Sobre placas de ELISA se capturaron los Acs IgMh revelaacutendose la presencia de los
especiacuteficos con los antiacutegenos obtenidos marcados con biotina y uniendo a estos uacuteltimos la
enzima HRP-EAV En los ensayos preliminares (ver punto 622 seccioacuten Experimentos
Auxiliares) se identificoacute la cantidad de antiacutegeno marcado y las diluciones de HRP-EAV
oacuteptimas a utilizar para revelar la presencia de IgM especiacutefica capturada En la Tabla 51 se
Resultados y Discusioacuten
62
muestran los valores de absorbancia a 450 nm obtenidos para el panel de 9 sueros
ensayados Se utilizaron 5 g de P22C-biotina por pocillo y 100 L de HRP-EAV en
dilucioacuten 12000
Tabla 51 Absorbancias a 450 nm obtenidas en los ELISA siguiendo el esquema de captura A descrito
maacutes arriba
Placa 1 Placa 2
Agudos
0100 0158
0311 0273
0140 0165
Croacutenicos
0281 0322
0256 0278
0260 0226
Negativos
0217 0168
0235 0179
0409 0354
Sin suero
0135 0134
0143 0114
0126 0100
Sin suero
Sin
P22cBiotina
0071 0050
0070 0037
0047 0040
Los resultados obtenidos con ambos antiacutegenos fueron desalentadores (los resultados
obtenidos con P35B biotina no se informan) ya que no se hallaron diferencias
significativas entre los valores de absorbancia obtenidos con sueros de pacientes
agudos croacutenicos y negativos
5312 Esquema B
En base a los resultados obtenidos en la seccioacuten anterior se orientaron los ensayos
realizando los ELISA siguiendo un esquema no claacutesico al que denominamos B
Debido a la baja sensibilidad que presentaron los Angs conjugados a biotina para
detectar los Acs especiacuteficos pensamos en hacer una primera etapa de concentracioacuten de
los Acs especiacuteficos en la placa para luego revelar con el Ang conjugado a biotina Esto
se hizo adsorbiendo antiacutegeno recombinante sobre la superficie de la placa de
poliestireno enfrentaacutendola luego al suero a ensayar Asiacute se captura selectivamente las
inmunoglobulinas que reconocen al antiacutegeno ya sean IgM o IgG Luego se expone la
placa al mismo antiacutegeno recombinante pero ligado a biotina que se uniraacute a los
anticuerpos especiacuteficos para dicho Ang previamente capturados Finalmente se revela
Resultados y Discusioacuten
63
con HRP conjugada a streptavidina que forma un complejo estable con biotina De esta
forma se aumenta la cantidad de Ang marcado en mayor proporcioacuten para IgM que para
IgG dada la multivalencia de este isotipo de inmunoglobulina En la Fig 56 se
reproduce el esquema B que fue el que brindoacute los resultados maacutes promisorios
Antiacutegeno (Ang) Bloqueante Ang ligado a biotina Reactivo de color
IgM a-Ang IgG a-Ang streptavidina conjugada a HRP
Figura 56 Esquema de ensayo ELISA de captura tipo B El antiacutegeno expuesto en la placa captura la
porcioacuten de las IgM e IgG especiacuteficas presentes en el suero humano Haciendo uso de la polivalencia de
las IgM su presencia se revela con el antiacutegeno conjugado a biotina streptavidina ligada a HRP
adicionando el sustrato de la enzima y un cromoacutegeno actuando como cosustrato
Buscando diferenciar sueros de pacientes en fase de infeccioacuten aguda (agudos) de
sueros provenientes de pacientes sin infeccioacuten (negativos) En la Tabla 52 se muestran los
valores de absorbancia a 450 nm obtenidos
Tabla 52 Absorbancias a 450 nm obtenidas en los ELISA siguiendo el esquema de captura B
Ang
Sueros P35B 05ug P35B 001ug P22C 05ug P22C 001ug
Agudos 2131 1567 0335 0296
1849 1311 065 0413
Negativos 176 1350 0282 0327
1025 1676 0262 0325
Sin suero 1658 1658 0174 0149
1812 1504 0130 0144
Sin Ang
conjugado
0055 004 0041 0045
0057 0042 0039 004
Resultados y Discusioacuten
64
Este ensayo exploratorio demostroacute que los antiacutegenos P22C y P35B pueden ser usados
potencialmente en la deteccioacuten de toxoplasmosis aguda realizando inmunoensayos con el
esquema B propuesto en el presente trabajo Por ello siguiendo este esquema de trabajo se
exploraron cuales eran las condiciones oacuteptimas (ver punto 623 seccioacuten Experimentos
Auxiliares) Asiacute se establecioacute la dilucioacuten de la enzima HRP-EAV (12000) la cantidad de
P22C biotina (5 microg por pocillo) y se acotaron los valores de P22C adsorbidos inicialmente
en la placa entre 500 y 50 ng Finalmente se realizaron tres ensayos en paralelo donde se
evaluoacute la cantidad de antiacutegeno adsorbido inicialmente en la placa y se amplioacute el panel de
sueros Los resultados obtenidos se muestran en la Fig57
Figura 57 Absorbancias a 450 nm para los ELISA realizados con el esquema B (A) 50 ng de Ang P22C
(B) 200 ng de Ang P22C (C) 500 ng de Ang P22C Con se indican los sueros provenientes de
pacientes con infeccioacuten aguda (Agudos) con los provenientes de pacientes con infeccioacuten croacutenica
(Croacutenicos) y con los de pacientes sin infeccioacuten (Negativos) Con la liacutenea roja ( ) se indica el valor
de media menos tres desviacuteos estaacutendares de los agudos (AbsA ndash 3 DSA) y con la liacutenea verde ( ) el valor
de media maacutes tres desviacuteos estaacutendares de los croacutenicos (AbsC +3 DSC)
Resultados y Discusioacuten
65
En las tres condiciones evaluadas se obtiene una separacioacuten de las sentildeales obtenidas al
ensayar sueros provenientes de los pacientes con infeccioacuten aguda (Agudos) de los sueros
provenientes de pacientes con infeccioacuten croacutenica (Croacutenicos) y los pacientes sin infeccioacuten
(Negativos)
Los resultados obtenidos con P35B no resultaron alentadores debido al elevado ruido
de fondo (altos valores de absorbancia de los blancos) Por lo tanto los ensayos
electroquiacutemicos se iniciaron soacutelo con P22C
Mijak y colaboradores (Hiszczyntildeska-Sawicka y col 2005) sentildealan que ya se ha
demostrado la utilidad del Ang SAG2 para detectar IgG en el suero de pacientes con
toxoplasmosis aguda y croacutenica (Parmley y col 1992) destacando que en los resultados
presentados por ese mismo grupo en otra publicacioacuten (Li y col 2000a) soacutelo se examinaron
un reducido nuacutemero de sueros provenientes de pacientes con infeccioacuten aguda con
resultados tanto positivos como negativos Tambieacuten sentildeala que Maine y colaboradores
(Aubert y col 2000) no obtuvieron resultados satisfactorios con este antiacutegeno
recombinante realizando ELISA indirecto Los resultados obtenidos en este trabajo con
ELISA utilizando el esquema A han confirmado lo sentildealado por Mijak y col sobre el
desempentildeo de este Ang El anaacutelisis que estos autores hacen se orienta a que el uso de estos
antiacutegenos recombinantes debe contemplar necesariamente el uso combinado de otros Angs
Por otro lado en el presente trabajo se han presentado resultados que permitiriacutean
complementar esta visioacuten incorporando otro esquema para la deteccioacuten de sueros de
infectados agudos Si bien es necesario ampliar el nuacutemero de sueros para validar el ensayo
los resultados son promisorios Hemos propuesto que las diferencias obtenidas en los
ELISA de captura siguiendo el esquema B pueden deberse a dos mecanismos no
excluyentes entre si y que podriacutean estar actuando en conjunto Por un lado estaacute la
multivalencia que presentan las IgM respecto de las IgG que generariacutea una amplificacioacuten
selectiva de acuerdo al isotipo Por otro lado independientemente del isotipo capturado el
Ang de fase aguda brindariacutea la sensibilidad y especificidad necesaria al ensayo
identificando Acs de fase aguda Resta pues esclarecer si esto es asiacute fehacientemente o si
hay alguacuten otro mecanismo actuando concomitante que permita explicar las diferencias
observadas aquiacute entre sueros de fase aguda y de infectados croacutenicos
Resultados y Discusioacuten
66
532 Inmunoensayos con deteccioacuten amperomeacutetrica utilizando los antiacutegenos
recombinantes
Los bioelectrodos se ensamblaron como se describe en el inciso 41911 de
Materiales y Meacutetodos Al realizar los inmunoensayos con las diluciones pertinentes de
suero humano (muestra incoacutegnita) en caso de suero de paciente infectado (+) estaraacuten
presentes los anticuerpos IgG anti-P22 (analito de intereacutes) Cuando se sumergen en una
dilucioacuten de anticuerpos anti-IgG h conjugado con HRP (segundo anticuerpo marcado) eacuteste
quedaraacute retenido en el electrodo y frente al agregado del sustrato de la enzima (H2O2)
sobre PBS conteniendo el mediador FcMe se genera la especie que seraacute electro-reducida
sobre el electrodo al potencial de trabajo 008 V (vs AgAgCl ver inciso 420 2) A los
fines de claridad en la Fig 58 se reformula el esquema de funcionamiento del biosensor
previamente esquematizado (Fig 212) para el caso particular aquiacute detallado donde el
Ang es la proteiacutena P22C
Proteiacutena recombinante IgG a-IgGh conjugada a HRP
Bloqueante IgG humana ferrocenometanol
Figura 58 Sobre la superficie del electrodo se fija la proteiacutena P22C que capturaraacute los anticuerpos especiacuteficos
si estaacuten presentes en el suero El revelado se realiza con un segundo anticuerpo especiacutefico para IgG humana
marcado con HRP que en presencia de H2O2 oxida el mediador FcMe que se reduce sobre la superficie del
electrodo generando la sentildeal analiacutetica
En la Fig 59 se muestran tres amperogramas representativos obtenidos cuando se
ensayaron sueros confirmados (+) sueros confirmados (-) y blancos (sin suero alguno)
Los valores de corrientes se corrigieron por los valores de aacuterea reales determinados
mediante voltametriacutea ciacuteclica a distintas velocidades de soluciones de ioacuten ferricianuro
(punto 41932 seccioacuten Materiales y Meacutetodos)
Resultados y Discusioacuten
67
Figura 59 Amperometriacuteas comparativas con bioelectrodos ensamblados con la proteiacutena P22C
En la Tabla 54 se resumen los resultados de los ensayos sobre muestras confirmadas
positivas negativas y blanco
Tabla 54 Valores promedios de la corriente cataliacutetica diferencial obtenidas utilizando bioelectrodos
ensamblados con el antiacutegeno P22C
DS desviacioacuten estaacutendar
Las diferencias en las sentildeales registradas fueron estadiacutesticamente significativas
verificaacutendose la potencialidad del uso de esta metodologiacutea para discriminar entre sueros de
pacientes infectados con T gondii de sueros de pacientes no infectados Los ensayos
electroquiacutemicos preliminares informados permiten pensar en el desarrollo de un biosensor
amperomeacutetrico A futuro seriacutea deseable poder establecer un biosensor electroquiacutemico
basaacutendonos en el esquema B de los ELISA presentados en este trabajo de Tesis que
permita la discriminacioacuten entre sueros de pacientes cursando infeccioacuten aguda de sueros de
pacientes con infeccioacuten croacutenica
54 Determinacioacuten de la actividad electroquiacutemica del glicerol en medio acuoso
Si bien desde hace varios antildeos se ha estudiado la oxidacioacuten electrocataliacutetica de
polialcoholes auacuten no existe acuerdo acerca del procedimiento maacutes conveniente para su
cuantificacioacuten electroquiacutemica asiacute como tampoco ha sido posible identificar un uacutenico
mecanismo que deacute cuenta de los productos obtenidos luego de la reaccioacuten electroacutenica
(Kahyaoglu et al 1984 Kwon amp Koper 2010)
Muestra j = Icaacuterea
( A cm-2
)
DS
( A cm-2
)
Positivos -0455 0026
Negativos -0150 0021
Sin suero -0052 004
Resultados y Discusioacuten
68
Con el fin de encontrar el electrodo y las condiciones maacutes convenientes para
realizar la cuantificacioacuten del glicerol se realizaron ensayos exploratorios de
voltametriacuteas ciacuteclicas utilizando electrodos de carbono viacutetreo pasta de C (grafito y
viacutetreo) Au Pt y Ag Los medios ensayados fueron HClO4 01 M solucioacuten tampoacuten de
fosfato salino (PBS) pH 72 90 120 NaCl al 08 mv y NaOH 01 M El intervalo
de concentracioacuten de glicerol utilizado fue de 100 x 10-5
M hasta 01 M
En estos ensayos iniciales las maacuteximas sentildeales se obtuvieron con electrodos de Au
en medio alcalino (NaOH 01 M) coincidiendo con lo descripto por Lamy (Kahyaoglu
et al 1984) A modo ilustrativo en la Fig 510 se observan dos voltametriacuteas ciacuteclicas
para electrodos de oro y de platino en medio alcalino
Figura 510 Voltamperogramas tiacutepicos para soluciones de glicerol 10-2
M en soluciones de base fuerte
(NaOH 01M) utilizando electrodos de trabajo de Au (izquierda) y Pt (derecha)
En una etapa posterior se verificoacute que las sentildeales obtenidas Ip respondiacutean
proporcionalmente a la concentracioacuten de glicerol Se realizoacute una curva de calibracioacuten en
el intervalo de concentraciones de 50 x 10-4
a 10 x 10-2
M Todas las mediciones se
hicieron por triplicado La Tabla 55 muestra las medias de las corrientes de pico
obtenidas para cada concentracioacuten ensayada con su correspondiente desviacuteo estaacutendar La
corriente de pico se midioacute tomando una liacutenea de base recta a un valor de potencial de
010 V plusmn 005 V usando algoritmos propios del programa GPES 49
Tabla 55 Valores medios de corriente obtenidos por voltametriacutea ciacuteclica para la oxidacioacuten del
glicerol en medio alcalino (NaOH 01 M) sobre electrodos de oro
[Glicerol]
(mM)
Ip
(microA cm-2
)
DS Ip
(microA cm-2
)
050 18 032
100 28 038
200 74 041
500 17 035
750 262 055
100 347 053
-50E-05
00E+00
50E-05
10E-04
15E-04
20E-04
25E-04
-0400 -0200 0000 0200 0400 0600 0800
E(V)
i(A
)
-40E-06
00E+00
40E-06
80E-06
12E-05
16E-05
-1000 -0800 -0600 -0400 -0200 0000 0200 0400
E(V)
i(A
)
Resultados y Discusioacuten
69
En la Fig 511 se presenta la dependencia de la corriente de pico
voltamperomeacutetrica con la concentracioacuten de glicerol Las barras de error corresponden a
las desviaciones estaacutendar de cada medida realizada por triplicados independientes Se
ajustaron estos valores a una recta con el meacutetodo de los miacutenimos cuadrados y se obtuvo
la siguiente ecuacioacuten
[51]
donde IpA estaacute en microA cm-2
y [glicerol] en mM El valor de coeficiente de regresioacuten
(R2) obtenido fue de 09980
Figura 511 Dependencia de la corriente de pico voltamperomeacutetrica con la concentracioacuten de glicerol en
medio alcalino (NaOH 01 M) Se muestran los valores promedios de tres medidas independientes Las
barras de error se corresponden a los desviacuteos estaacutendares
En estas condiciones de trabajo el pico de corriente oxidativa tiene dependencia
lineal con la concentracioacuten de glicerol En funcioacuten de estos resultados se orientoacute la
buacutesqueda hacia una metodologiacutea que permitiese determinar al glicerol en
concentraciones de 10-5
M o menores Para esto iniciamos ensayos con teacutecnica
amperomeacutetrica
Se realizaron los ensayos amperomeacutetricos como se describe en el punto 4202 de la
seccioacuten Materiales y Meacutetodos La Fig 512 muestra el resultado de una amperometriacutea
tiacutepica para una solucioacuten de glicerol
Resultados y Discusioacuten
70
t s
0 50 100 150 200 250 300 350 400 450
I A
0
2
4
6
Figura 512 Amperometriacutea tiacutepica de una muestra con glicerol (concentracioacuten en celda 1 mM) Se dejoacute
estabilizar la corriente para una solucioacuten de NaOH 01 M y a los 50 segundos se realizoacute el agregado de la
muestra con glicerol y se midioacute la corriente hasta los 400 segundos
Se ensayaron soluciones de glicerol cuya concentracioacuten en la celda electroliacutetica
fueron desde 001 mM hasta 5 mM Como blanco se utilizoacute solucioacuten de NaOH 01 M
La corriente cataliacutetica se midioacute como la diferencia entre la corriente final y la inicial
(punto 4202 seccioacuten Materiales y Meacutetodos) A este valor de corriente se lo dividioacute
por el valor de aacuterea real del electrodo medida anteriormente esta densidad de corriente
(IcA) se tomoacute como la sentildeal analiacutetica En la Tabla 56 se muestran las medias de las
sentildeales obtenidas para cada concentracioacuten de glicerol ensayada con su correspondiente
desviacuteo estaacutendar
Tabla 56 Valores medios de densidades de corriente obtenidos por amperometriacutea para la oxidacioacuten de
glicerol en medio alcalino (NaOH 01 M)
[Glicerol]
(mM)
Ic A
( A cm-2
)
DS
( A cm-2
)
0000 0447 0029
0010 0763 0016
0025 1098 0068
0050 1510 0055
0100 285 049
0250 609 036
0500 1245 033
0750 1730 0097
100 2361 0099
150 3445 033
175 3997 020
200 4613 045
Resultados y Discusioacuten
71
En la Fig 513 se presenta la recta de regresioacuten lineal obtenida a partir de los
valores promedio de densidades de corriente para soluciones de glicerol en el intervalo
de concentraciones de 0025 mM y 2 mM Las barras de error corresponden a las
desviaciones estaacutendares de cada medida La ecuacioacuten de la recta obtenida por el meacutetodo
de miacutenimos cuadrados fue
[52]
Donde IcA estaacute en microA cm-2
y [Glicerol] en mM el valor del coeficiente de
regresioacuten (R2) obtenido fue de 09950
[Glicerol] mM
000 025 050 075 100 125 150 175 200
I cA
m
A c
m-2
0
10
20
30
40
50
Figura 513 Curva de calibracioacuten obtenida para glicerol en medio alcalino (NaOH 01 M) con la teacutecnica
amperomeacutetrica Se muestran los valores promedios de tres medidas independientes para cada solucioacuten
Las barras de error que se muestran corresponden al DS de cada punto
Las cifras de meacuterito para esta teacutecnica resultaron ser
Liacutemite de deteccioacuten 10 M
Liacutemite de cuantificacioacuten 24 M
Liacutemite de discriminacioacuten 10 M
Intervalo de linealidad 0024 mM ndash 200 mM
55 Cuantificacioacuten de glicerol en medios acuosos complejos
El glicerol es corrientemente utilizado como principal fuente de carbono en cultivos
bacterianos siendo degradado eficientemente por sistemas enzimaacuteticos que utilizan
mecanismos redox Por lo tanto se comenzoacute a estudiar la posible cuantificacioacuten
electroquiacutemica de este alcohol intentando detectar concentraciones del orden 10-5
M o
Resultados y Discusioacuten
72
menores para poder asiacute evidenciar su consumo en medios de cultivos bacterianos que
contienen glicerol como nutriente El meacutetodo amperomeacutetrico con electrodo de oro no
fue lo suficientemente selectivo para glicerol cuando este se encontraba en matrices
complejas (no se muestran los resultados) por lo tanto al momento de cuantificarlo en
medios de cultivos bacterianos tuvimos que optar por otra metodologiacutea
Sobre la base del trabajo de Tuntildeoacuten-Blanco y col (Aacutelvarez-Gonzaacutelez et al 2000)
se busco desarrollar un biosensor selectivo para este analito
Para verificar la funcionalidad del modelo propuesto se realizaron ensayos
espectrofotomeacutetricos La coenzima NAD(H) en su forma reducida (NADH) presenta un
maacuteximo de absorcioacuten a 340 nm ausente en la forma oxidada (NAD+) Puede apreciarse
en la Fig 514 que el mediador electroquiacutemico Fe(CN)63-
presenta un maacuteximo de
absorcioacuten a 420 nm ausente en la forma reducida Fe(CN)64-
En un primer ensayo se
verificoacute espectrofotomeacutetricamente que la longitud de onda escogida podiacutea utilizarse
para el seguimiento de la reaccioacuten En una serie de ensayos posteriores se monitoreoacute la
reaccioacuten enzimaacutetica en presencia y ausencia del mediador electroquiacutemico haciendo uso
de estas propiedades espectrales
Figura 514 Espectros de absorcioacuten UV-visible para las especies Fe(CN)33-
1 mM y Fe(CN)34-
1 mM
Ambas especies fueron disueltas en solucioacuten tampoacuten carbonato pH 105 Puede apreciarse claramente que
el maacuteximo de absorcioacuten a 420 nm presente en el Fe(CN)63-
se encuentra ausente en el Fe(CN)64-
La
velocidad de barrido fue 1200 nm min-1
551 Evaluacioacuten del modelo propuesto por medio de lecturas
espectrofotomeacutetricas
El primer ensayo para validar el modelo propuesto fue seleccionar la longitud de
onda oacuteptima para el seguimiento espectrofotomeacutetrico A tal fin se llevaron adelante dos
0
025
05
075
1
125
15
175
2
225
25
275
260 280 300 320 340 360 380 400 420 440 460 480 500
Longitud de onda (nm)
Ab
sorb
an
cia
Ferricianuro 1 mM
Ferrocianuro 1 mM
Resultados y Discusioacuten
73
reacciones a) glicerol disuelto en medio 7H9 coenzima Fe(CN)63-
y enzima GlDH y
b) glicerol disuelto en medio 7H9 coenzima Fe(CN)63-
pero sin la enzima GlDH En
ambos casos se realizoacute un barrido espectral de 320 a 480 nm registraacutendose la
absorbancia a una velocidad de barrido de 1200 nm min-1
cada 10 min Ambas
reacciones se llevaron a cabo en solucioacuten tampoacuten carbonato pH 105 En la Fig 515 se
muestran los barridos espectrales obtenidos para cada reaccioacuten y en ella puede
apreciarse que la mayor diferencia se presenta a la longitud de onda prevista (420 nm)
Figura 515 Espectros de absorcioacuten UV-visible para mezclas de reaccioacuten (A) En presencia de enzima
GlDH (B) Sin enzima GlDH Barrido espectral cada 10 min
Para elucidar si el consumo de Fe(CN)63-
observado se correspondiacutea
cuantitativamente con el NADH generado y en consecuencia con el glicerol
consumido se tuvieron en cuenta las siguientes reacciones
glicerol + Fe(CN)63-
DHA + Fe(CN)64-
(1)
glicerol + NAD+ NADH + DHA (2)
Se realizaron series de 3 reacciones en paralelo a saber a) blanco de reaccioacuten (BR)
con enzima GlDH NAD+ y Fe(CN)6
3- en ausencia de glicerol donde se siguioacute la
absorbancia a 420 nm b) reaccioacuten (1) con enzima GlDH NAD+ Fe(CN)6
3- y glicerol
donde se siguioacute la desaparicioacuten de Fe(CN)63-
a 420 nm c) reaccioacuten (2) con enzima
GlDH NAD+ y glicerol donde se siguioacute la aparicioacuten de NADH a 340 nm Debe tenerse
en cuenta por un lado que el NAD+ es reducido a NADH en la reaccioacuten (2) no se
regenera mientras que en la reaccioacuten (1) se regenera por la presencia del anioacuten
Fe(CN)63-
Esto implica que si bien ambas reacciones se lentifican con el paso del
tiempo a causa del consumo de glicerol (y acumulacioacuten de DHA) la reaccioacuten (2) se
lentifica maacutes que la (1) porque se consumen tanto el glicerol como el NAD+
y se
acumulan ambos productos de reaccioacuten (DHA y NADH) Los resultados pueden verse
en la Fig 516
A
0
015
03
045
06
075
09
105
12
135
15
320 340 360 380 400 420 440 460 480
Longitud de onda (nm)
Ab
sorb
an
cia
t = 0
t = 10 min
t = 20 min
t =30 min
t = 40 min
t = 50 min
t = 60 min
B
0
015
03
045
06
075
09
105
12
135
15
320 340 360 380 400 420 440 460 480
Longitud de onda (nm)
Ab
sorb
an
cia
t = 0 min
t = 10 min
t = 20 min
t = 30 min
t = 40 min
t = 50 min
t = 60 min
GlDHNAD+
GlDH
Resultados y Discusioacuten
74
Figura 516 Absorbancias registradas a 420 nm durante las reacciones descriptas en el texto A) Blanco
de reaccioacuten (BR) y reaccioacuten (1) B) Reaccioacuten (2) C) Segmento inicial de la curva representada en
B) a partir de la cual se calculoacute el valor liacutemite de la velocidad inicial de reaccioacuten Se muestra un
experimento representativo de un original y replicado
Se asumioacute que la reaccioacuten (1) transcurre a una velocidad constante en las
condiciones en que se llevoacute a cabo El anaacutelisis estadiacutestico demuestra que hay una ligera
tendencia a la no linealidad evidenciada por la distribucioacuten de los residuos No
obstante siendo las variancias iguales se consideroacute que no hay un alejamiento
significativo de la linealidad Por ello en los caacutelculos de variacioacuten de la concentracioacuten
de coenzima a lo largo del tiempo de reaccioacuten se tuvo en cuenta el cambio que se
produciriacutea si la velocidad de reaccioacuten se mantuviera constante e igual a la velocidad
inicial Para el caso del NAD+ consumido (o NADH generado) en la reaccioacuten (2)
tenemos
[53]
Asumiendo que en el intervalo de concentraciones de trabajo se cumple la ley de
Beer la ec [53] puede reescribirse como
[54]
Si la velocidad de la reaccioacuten enzimaacutetica se mantiene aproximadamente igual a la
velocidad inicial por la regeneracioacuten de la coenzima se puede admitir que la velocidad
A
05
056
062
068
074
08
086
092
098
104
11
0 600 1200 1800 2400 3000 3600
tiempo (s)
Ab
s 4
20
nm
B
0
004
008
012
016
02
024
028
032
036
04
044
048
0 600 1200 1800 2400 3000 3600tiempo (s)
Ab
s 3
40
nm
C
y = 00004405x
R2 = 09983921
0
0035
007
0105
014
0175
021
0 60 120 180 240 300 360 420 480
tiempo (s)
Ab
s 3
40
nm R
2 = 09984
Resultados y Discusioacuten
75
de reaccioacuten es constante (reaccioacuten de orden cero para los reactivos) pudieacutendose expresar
la ec [54] en la siguiente forma
b
k
tb
tk
tb
Abs
nmNADHnmNADHnmNADH
nm
340340340
340 [55]
donde k es la constante de velocidad para esa reaccioacuten en unidades de absorbancia por
unidad de tiempo (s-1
) y se obtiene como la pendiente del segmento lineal de la curva de
la Fig 516 B presentado en la Fig 516 C
La variacioacuten de concentracioacuten total de coenzima se obtiene multiplicando el valor
de velocidad por la variacioacuten de tiempo total
[56]
siendo los valores de los paraacutemetros y variables en cuestioacuten
εNADH 340nm = 6220 M-1
cm-1
Δt = 3600 s
b = 1 cm
k = 44 x 10-4
s-1
resultando
[57]
La variacioacuten de concentracioacuten del mediador seraacute
[58]
nmCNFe 420)( 36
= 1080 M-1
cm-1
ΔAbs420nm = 052
que reemplazando en la ec [58] arroja
M [59]
La variacioacuten de absorbancia observada en el blanco de reaccioacuten a lo largo de una
hora fue de 00046 unidades de absorbancia que representa menos del 1 de la
variacioacuten total observada en la reaccioacuten (1) Estos resultados permiten verificar que en
las condiciones de reaccioacuten el Fe(CN)63-
reducido a Fe(CN)64-
equivale
cuantitativamente al NADH generado en la reaccioacuten enzimaacutetica de acuerdo a la
siguiente estequiometriacutea
Resultados y Discusioacuten
76
2 Fe(CN)63-
+ NADH 2 Fe(CN)64-
+ NAD+ [510]
Lo mostrado corrobora la factibilidad del disentildeo de un biosensor de una sola
enzima con un mediador soluble econoacutemico
5511 Evaluacioacuten de la sentildeal con la concentracioacuten de glicerol
Para verificar si la sentildeal analiacutetica muestra dependencia con la concentracioacuten de
glicerol se realizaron 6 reacciones en paralelo registraacutendose la absorbancia a 420 nm
cada un minuto durante dos horas Se realizoacute un blanco de reaccioacuten sin glicerol y cinco
reacciones con concentraciones crecientes de glicerol Como muestras se utilizaron el
medio de cultivo de micobacterias Middlebrook 7H9 suplementado con glicerol a
distintas concentraciones En la Tabla 57 se presentan las concentraciones de glicerol
en las mezclas de reaccioacuten y en las muestras La Fig 517 muestra la absorbancia a 420
nm para las seis reacciones
Tabla 57 Concentraciones de glicerol en las mezclas de reaccioacuten
Reaccioacuten [glicerol] en mezcla
de reaccioacuten (mM) [glicerol] en muestra
(mM)
Blanco 0 0
Muestra 1 11 22
Muestra 2 082 16
Muestra 3 055 11
Muestra 4 027 55
Muestra 5 011 22
Resultados y Discusioacuten
77
Figura 517 Absorbancia a 420 nm de las mezclas de reaccioacuten descriptas en el texto ( ) 11 mM de
glicerol ( ) 082 mM de glicerol ( ) 055 mM de glicerol (o) 027 mM de glicerol (-) 011 mM de
ccedilglicerol ( ) blanco de reaccioacuten
Habiendo verificado la dependencia de la sentildeal analiacutetica con el analito de intereacutes se
procedioacute a determinar el intervalo dinaacutemico lineal Para ello se realizaron las reacciones
de color como se describe en el apartado 417 de la seccioacuten Materiales y meacutetodos Cada
reaccioacuten se hizo por triplicado En la Fig 518 se muestran resumidos los resultados
obtenidos
[Glicerol] mM
000 005 010 015 020 025 030 035 040
Ab
s 42
0 n
m
00
02
04
06
08
10
Figura 518 Curva de calibracioacuten para glicerol utilizando el meacutetodo colorimeacutetrico Se muestran los
valores promedios de tres medidas independientes Las barras de error corresponden a los desviacuteos
estaacutendares
La recta de regresioacuten que se obtuvo a partir de estos valores fue
Abs420nm = 0946 ndash 238 [glicerol] [511]
02
03
04
05
06
07
08
09
1
0 1200 2400 3600 4800 6000 7200
tiempo (s)
Ab
s 4
20
nm
Resultados y Discusioacuten
78
cuyo coeficiente de regresioacuten (R2) fue 09980 En el intervalo de concentraciones de
0025 a 027 mM la respuesta fue lineal
5512 Optimizacioacuten de condiciones para disminuir el costo operativo
Se verificoacute la posibilidad de cuantificar glicerol en medio Middlebrook 7H9
optimizando las concentraciones de reactivos y los tiempos de reaccioacuten para obtener la
maacutexima sentildeal con la mezcla maacutes econoacutemica posible Se ensayaron distintas
concentraciones de cofactor NAD+ a utilizar y 2 tiempos de reaccioacuten para una curva de
calibrado de 6 puntos consistente en un blanco y cinco estaacutendares de glicerol todos por
triplicado
Para verificar la factibilidad de disminuir la concentracioacuten de cofactor soluble sin
alterar significativamente la sensibilidad del meacutetodo se utilizoacute un disentildeo experimental
con un modelo de superficie de respuesta Como factores se tomaron la concentracioacuten
de cofactor y el tiempo de reaccioacuten Los niveles seleccionados en base a ensayos
previos fueron concentracioacuten de cofactor (NAD+) 01 mM 023 mM 037 mM y 05
mM tiempo 1 y 2 h Las respuestas que se evaluaron fueron la pendiente de una recta
de regresioacuten calculada a partir del meacutetodo de miacutenimos cuadrados y el coeficiente de
regresioacuten lineal correspondiente En la Tabla 58 se muestran los niveles parametrizados
y los valores de las respuestas obtenidas
Tabla 58 Disentildeo experimental factores parametrizados y respuestas obtenidas
Cada uno de los estaacutendares indicados en la Tabla 58 se correlaciona con una curva
de calibrado realizada En la Tabla 59 se informan los valores de concentracioacuten de
glicerol de las soluciones utilizadas para las reacciones de color y la concentracioacuten
correspondiente en la mezcla de reaccioacuten
Estaacutendar [NAD+] Tiempo Pendiente R2
4 1 -1 068 08790
7 03333 1 227 09962
8 1 1 184 09621
5 -1 1 159 09931
3 03333 -1 083 09590
2 -03333 -1 1 09850
6 -03333 1 244 09863
1 -1 -1 071 09914
Resultados y Discusioacuten
79
Tabla 59 Valores de concentracioacuten de los estaacutendares utilizados para los ensayos de optimizacioacuten
Reaccioacuten [glicerol] en mezcla
de reaccioacuten (mM) [glicerol] en muestra
(mM)
Blanco 0 0
Muestra 1 0010 02
Muestra 2 0025 05
Muestra 3 0050 10
Muestra 4 0075 15
Muestra 5 010 20
La ecuacioacuten de ajuste propuesta por el modelo de superficie de respuesta para la
pendiente fue
tBNADAm ][421 [512]
donde A y B son los coeficientes del modelo que se calculan a partir de la forma de la
superficie de respuesta e indican la dependencia de la pendiente (m) con la
concentracioacuten de cofactor ([NAD+]) y el tiempo de reaccioacuten (t) respectivamente El
anaacutelisis de los resultados indica que de los dos coeficientes solo B es significativo y su
valor es 062 mientras que A es un coeficiente no significativo Esto significa que la
pendiente de la recta de calibrado no muestra dependencia con la concentracioacuten de
cofactor NAD+ utilizado
Por otra parte el coeficiente de correlacioacuten no mostroacute dependencia con ninguno de
los factores elegidos Esto indica que el modelado de la funcioacuten deseabilidad global
queda reducido al de una sola respuesta la pendiente de la recta de calibrado y a un
uacutenico factor significativo que es el tiempo de reaccioacuten En base a estos resultados
pudimos establecer un uso miacutenimo de cofactor soluble
552 Determinacioacuten de glicerol remanente en cultivos de micobacterias
5521 Evaluacioacuten de glicerol remanente en cultivos axeacutenicos de M smegmatis
Primeramente se evaluoacute si podiacutea evidenciarse el consumo de glicerol por parte de
M smegmatis en un cultivo axeacutenico es decir conteniendo soacutelo este microorganismo
Para ello se realizaron cultivos de la micobacteria como se describe en el punto 418 de
la seccioacuten Materiales y Meacutetodos y se determinoacute el glicerol remanente haciendo uso del
meacutetodo fotomeacutetrico presentado previamente El anaacutelisis de la variancia de los valores de
absorbancia registrados y posteriormente se realizoacute un ensayo de comparaciones
muacuteltiples utilizando las pruebas de Tukey y de Bonferroni Se detectaron diferencias
estadiacutesticamente significativas en las absorbancias de las muestras del medio con M
Resultados y Discusioacuten
80
smegmatis a las 2 y 3 h de iniciados los cultivos respecto de aquellos medios
conservados en esterilidad
5522 Determinacioacuten de glicerol remanente en cultivos de micobacterias con y
sin fago D29 y ensayos controles respectivos
En una segunda serie de ensayos nos propusimos ver si habiacutea consumo diferencial
de glicerol entre cultivos de M smegmatis y cultivos de la micobacteria infectados con
el fago D29 siguiendo el protocolo descripto en el punto 4181 de la seccioacuten Materiales
y Meacutetodos En la Fig 519 se muestran los valores de absorbancia a 420 nm de las
muestras mencionadas Sobre este conjunto de datos nuevamente se realizoacute un anaacutelisis
de la variancia y ensayos de comparaciones muacuteltiples utilizando las pruebas de Tukey y
de Bonferroni
Los resultados obtenidos indican que todos los medios de cultivo a los cuales no se
le inoculoacute bacterias y aquellos medios donde se inoculoacute bacterias pero fueron
centrifugados inmediatamente despueacutes del inoacuteculo (muestras a t= 0) no mostraron
diferencias estadiacutesticamente significativas en los ensayos de comparaciones muacuteltiple
realizados Esto permite concluir que el agregado de fago y la incubacioacuten a 37 ordmC no
producen modificaciones significativas per se en las reacciones de color Por ello es
posible afirmar que en el futuro podraacuten simplificarse los controles a un uacutenico testigo
de concentracioacuten inicial conocida sin necesidad de tomar una muestra del cultivo
inmediatamente despueacutes del inoacuteculo o de la adicioacuten de fagos a los controles negativos
del ensayo
En este ensayo preliminar pudimos observar que las diferencias de absorbancia
resultaron estadiacutesticamente significativas entre los medios de cultivo donde crecieron
ceacutelulas de M smegmatis y los medios donde crecieron ceacutelulas de M smegmatis
infectadas con fago D29 tanto a las 2 como a las 4 h de iniciados los cultivos Este
resultado indicoacute que la hipoacutetesis de trabajo planteada era apropiada y en consecuencia
seriacutea factible desarrollar un meacutetodo para verificar la integridad de micobacterias en un
cultivo de las mismas
Resultados y Discusioacuten
81
Bla
nco
Med
io 0
025
00
25
+ F
ago t
= 0
00
25
C
eacutelula
s t
= 0
00
25
Ceacutel
ula
s +
Fag
o t
= 0
00
25
+ F
ago t
= 2
00
25
Ceacutel
ula
s t
= 2
00
25
Ceacutel
ula
s +
fag
o t
= 2
00
25
fa
go t
= 4
00
25
Ceacutel
ula
s t
= 4
00
25
Ceacutel
ula
s +
fag
o t
= 4
Abs
420 n
m
03
04
05
08
Figura 519 Absorbancias a 420 nm registradas para las muestras descritas Se indica concentracioacuten
inicial de glicerol en mv y tiempo de incubacioacuten a 37 ordmC El blanco corresponde al de la reaccioacuten de
color sin glicerol
553 Biosensor amperomeacutetrico a base de pasta de carbono viacutetreo modificada
En funcioacuten de los resultados previos se procedioacute al ensamblado de un biosensor
amperomeacutetrico siguiendo el esquema de reaccioacuten presentado previamente que se
reproduce en la figura 520
Figura 520 Esquema de reaccioacuten propuesto para biosensor amperomeacutetrico selectivo para glicerol La
coenzima reducida NADH se regenera a su forma oxidada NAD+ reaccionando con el Fe(CN)6
3- que se
reduce a Fe(CN)64-
Este uacuteltimo se reoxida electroquiacutemicamente sobre la superficie del electrodo
completando el ciclo cataliacutetico
Utilizando electrodos de pasta de carbono B (punto 41912 seccioacuten Materiales y
Meacutetodos) se realizaron amperometriacuteas siguiendo el protocolo descrito en el punto 4202
glicerol
DHA
GlDHox
GlDHred NAD+
NADH Mediador ox
Mediador red
e- Electrodo
Resultados y Discusioacuten
82
de la seccioacuten Materiales y Meacutetodos En la Fig 521 se muestra un amperograma tiacutepico
obtenido
Tiempo s
100 200 300 400 500
I
nA
0
20
40
60
80
100
Figura 521 A) Amperograma tiacutepico obtenido con un electrodo de trabajo de pasta de carbono B
trabajando a un potencial de 038 V Se agregaron 50 L de medio 7H9 suplementado con glicerol
usualmente a los 300 s de iniciada la lectura de corriente cuando eacutesta se estabilizoacute B) Agregados
sucesivos de 50 microL de medio 7H9 suplementado con glicerol 20 mM sobre 200 mL de la misma
solucioacuten
En la Fig 522 se presenta la recta de regresioacuten obtenida a partir de los valores
promedios de corrientes para soluciones de glicerol en el intervalo de concentraciones
de 0062 mM y 175 mM Las barras de error corresponden a las desviaciones estaacutendar
de cada medida La ecuacioacuten de la recta obtenida por el meacutetodo de miacutenimos cuadrados
fue
[513]
donde Ic estaacute en nA y [Glicerol] en mM el valor del coeficiente de regresioacuten (R2)
obtenido fue de 09982
Las cifras de meacuterito para esta teacutecnica resultaron ser
Liacutemite de deteccioacuten 20 M
Liacutemite de cuantificacioacuten 60 M
Liacutemite de discriminacioacuten 15 M
Intervalo de linealidad 0060 mM ndash 175 mM
Tiempo s
0 500 1000 1500 2000
I
nA
0
50
100
150
200
Resultados y Discusioacuten
83
[Glicerol] mM
000 025 050 075 100 125 150 175 200
Ic
nA
0
50
100
150
200
Figura 522 Recta de calibracioacuten para glicerol utilizando el meacutetodo amperomeacutetrico descrito en el texto
Se muestran los valores promedios de corrientes liacutemite corregidas y las desviaciones estaacutendares de 3
lecturas independientes
Una vez que se preparoacute la pasta de carbono viacutetreo modificada con la enzima esta
resultoacute estable durante 10 semanas sin peacuterdida de actividad enzimaacutetica siempre que se
mantuviese seca a 4 degC Una vez que se ensambloacute el biosensor con el poliacutemero
electrodepositado pudo utilizarse durante al menos 8 horas consecutivas con una
peacuterdida de sensibilidad insignificante En efecto los cambios observados en las sentildeales
registradas de forma consecutiva se encontraron dentro del error intriacutenseco del meacutetodo
propuesto La estabilidad de un mismo biosensor durante diacuteas sucesivos se evaluoacute
realizando medidas de la misma solucioacuten y evaluando la relacioacuten sentildealruido la cuaacutel
disminuyoacute un 15 del valor original al tercer diacutea y un 50 al quinto diacutea de uso
554 Desarrollo de un biosensor a base de pasta de carbono viacutetreo y
nanotubos de carbono
Para reducir los tiempos de anaacutelisis se procuroacute disminuir el periacuteodo de
estabilizacioacuten de la corriente modificando el esquema original propuesto para el sensor
Para esto se modificoacute la pasta de carbono con nanotubos de carbono de paredes
muacuteltiples (Rubianes amp Rivas 2003) Seguacuten trabajos previos esta estrategia permite
disminuir el sobrepotencial asociado a la electrooxidacioacuten de la coenzima NADH
evitaacutendose el uso de un mediador soluble (Musameh 2002) Previo a su utilizacioacuten los
NTC fueron funcionarizados por carboxilacioacuten oxidativa siguiendo el protocolo
especificado en el punto 421 de la seccioacuten Materiales y Meacutetodos
Resultados y Discusioacuten
84
En la Fig 523 (derecha) se muestran las voltametriacuteas que se obtuvieron utilizando
un electrodo de trabajo relleno con pasta B (pasta de carbono viacutetreo modificada con
enzima GlDH al 2 en masa)
Figura 523 Voltamperogramas ciacuteclicos utilizando bioelectrodos de pasa de carbono B con GlDH
(derecha) y pasta C con GlDH y MWCNT (izquierda) En liacutenea puntuada se muestran las voltametriacuteas de
la solucioacuten NAD+ 05 mM (NH4)2SO4 25mM K2CO3 KHCO3 01 M pH 105 (blanco) En liacutenea
continua las voltametriacuteas de las mismas soluciones con el agregado de glicerol en concentracioacuten final 25
mM La velocidad de barrido fue 50 mV s-1
Se marcan los picos de corriente observados y el potencial de
pico
El sobrepotencial asociado a la electroxidacioacuten de la coenzima NADH en el
electrodo de pasta de carbono B es 70 mV menor que el informado por Wang y col Ep
= 082V sobre electrodos de carbono viacutetreo (Musameh 2002) Esta diferencia podriacutea
deberse a los distintos pH de trabajo o bien a alguna diferencia en las cualidades de la
superficie del electrodo
En la Fig 523 (izquierda) se muestran los resultados obtenidos con los electrodos
de pasta C pasta de carbono modificada con GlDH al 2 y con MWCNT al 10 en
masa En este caso vemos que el sobrepotencial asociado a la electroxidacioacuten de NADH
es 0180 V menor Ep = 057 V que el observado para la pasta B Esta diferencia
podemos atribuirla a las cualidades diferentes de las superficies del electrodo debida a la
presencia de los MWCNT Es de destacar que Wang y col en la oxidacioacuten del NADH
sobre la superficie de carbono viacutetreo modificado con MWCNT observaron dos
procesos oxidativos uno principal con un Ep de 033 V y otro secundario con Ep de
057 V que aparece como hombro del primero (ver Fig 524 reproducida de Wang y
col)
Ep = 075 V
Resultados y Discusioacuten
85
Figura 524 Reproducido de Musameh y col 2002 Voltamperogramas correspondientes a una solucioacuten 5
mM de coenzima NADH en solucioacuten tampoacuten fosfato 005 M pH 74 utilizando electrodos de trabajo de
pasta de carbono viacutetreo sin modificar (A) y modificado con MWCNT (B) Velocidad de barrido 50 mV s-1
En el voltagrama B puede apreciarse el pico principal y el secundario que aparecen como hombro del
primero
En este trabajo soacutelo se pudo identificar un uacutenico proceso oxidativo a 057 V Si bien
auacuten estamos investigando posibles causas que hayan originado esta diferencia es de
esperar que el pH sea un factor determinante ya que la oxidacioacuten de NADH a NAD+
involucra la perdida de un H+ Por otra parte en los voltagramas realizados con pasta C
se registroacute un importante aumento de las corrientes capacitivas (18 μA) en relacioacuten a
las voltametriacuteas donde se utilizaron electrodos de pasta sin MWCNT Este mismo
efecto pero en menor magnitud (55 μA) tambieacuten fue registrado por Wang y
colaboradores al trabajar con electrodo de carbono viacutetreo modificado con MWCNT
(Musameh 2002) Los resultados obtenidos por Wang y colaboradores y los de este
trabajo de Tesis se muestran comparativamente en la Tabla 510
Tabla 510 Resultados obtenidos por Musameh y col 2002 y los correspondientes a este trabajo
Musameh y col
2002 Este trabajo
Electrodo de
trabajo Cv
C v +
MWCNT Pasta B Pasta C
V barrido 50 mV s-1 50 mV s
-1
pH 74 105
Ep (V) 082 033
057 075 057
Aumento de la
I cap (μA) - 55 - 18
Resultados y Discusioacuten
86
Con estos resultados preliminares comenzamos los ensayos amperomeacutetricos para
cuantificar el glicerol remanente en los medios de cultivos de micobacterias Se llevaron
adelante distintos ensayos y nuevamente el inconveniente principal al que nos
enfrentamos fue que la respuesta no era estable en el tiempo En la Fig 525 se muestra
un amperograma obtenido con un bioelectrodo de pasta C y realizando agregados
sucesivos de un estaacutendar de glicerol 20 mM disuelto en medio Middelbrook 7H9
Con este nuevo esquema de trabajo no se logroacute acortar los tiempos de estabilizacioacuten
de la corriente Los algoritmos de correccioacuten de corriente de base que estaacuten
incorporados al programa GPES tampoco permitieron solucionar este inconveniente
Por este motivo se optoacute por utilizar teacutecnicas voltameacutetricas de pulso que en principio
permitiriacutean evitar este inconveniente
Tiempo s
0 100 200 300 400 500 600 700 800 900
I A
0
1
2
3
4
Figura 525 Amperograma obtenido con un bioelectrodo de pasta de carbono C trabajando a 05 V vs
AgAgCl A t=200 s de iniciada la lectura se agregaron 50 L de medio 7H9 y posteriormente se
realizaron agregados sucesivos de 50 L de medio 7H9 suplementado con glicerol 20 mM
5541 Ensayos de cuantificacioacuten de glicerol con el bioelectrodo desarrollado
utilizando teacutecnicas de pulso
Las teacutecnicas voltameacutetricas de pulso presentan la ventaja de permitir trabajar durante
tiempos muy reducidos en la zona de potencial donde la especie electroactiva cambia
su estado de oxidacioacuten produciendo la sentildeal analiacutetica
Se optoacute por ensayar la voltametriacutea de onda cuadrada para los futuros ensayos de
cuantificacioacuten y los experimentos preliminares procuraron establecer los valores maacutes
convenientes de los paraacutemetros relevantes de la teacutecnica como la amplitud de pulso el
escaloacuten de potencial y la frecuencia (punto 633 seccioacuten Experimentos Auxiliares)
Resultados y Discusioacuten
87
En una segunda serie de ensayos se buscoacute observar la dependencia de la corriente
de pico con la concentracioacuten de glicerol Para esto se realizaron ensayos
independientes En este esquema de trabajo surgioacute un inconveniente respecto del criterio
de medida de la corriente de pico ya que en ensayos independientes no se pudo
establecer una liacutenea de base comuacuten a todos los voltamperogramas
Se ensayaron distintos criterios para determinar una liacutenea de base apropiada como
se detalla en el punto 6331 de la seccioacuten Experimentos Auxiliares y en la Fig 526 se
muestran los voltamperogramas corregidos siguiendo el criterio elegido
Figura 526 Voltamperogramas de onda cuadrada (corregidos) obtenidos utilizando electrodos de pasta
de carbono viacutetreo modificada con GlDH y MWCNT Se muestran los voltagramas de las soluciones
blanco (helliphelliphelliphellip
) glicerol 5 mM (mdash mdash) 125 mM (mdashmdash) 25 mM (diamsdiamsdiams) 36 mM (- - -) y 50 mM (mdash bull mdash)
En la Fig 527 se muestran la dependencia de la corriente de pico con la
concentracioacuten de glicerol obtenida a partir de experimentos exploratorios uacutenicos para
cada concentracioacuten Resta a futuro repetir los experimentos para establecer el error
asociado a la metodologiacutea el intervalo dinaacutemico lineal y el liacutemite de deteccioacuten
Resultados y Discusioacuten
88
Figura 527 Dependencia de la corriente de pico registrada en la VOC en funcioacuten de la concentracioacuten de
glicerol en la celda electroquiacutemica
56 Validacioacuten de meacutetodos
De los meacutetodos desarrollados se seleccionaron aquellos dos que dieron resultados
maacutes fiables meacutetodo amperomeacutetrico utilizando un electrodo de trabajo de oro y el
meacutetodo amperomeacutetrico utilizando el biosensor con GlDH con mediador soluble Se
realizaron ensayos en paralelo con un meacutetodo alternativo ampliamente utilizado en
particular se utilizoacute un equipo comercial que utiliza tres enzimas y deteccioacuten
espectrofotomeacutetrica (Wiener lab) La Fig 528 muestra la concentracioacuten nominal versus
concentracioacuten predicha obtenida por las tres metodologiacuteas ensayando diferentes
diluciones de muestra y graficaacutendose el valor medio de 3 medidas independientes
Nominal mM
00 02 04 06 08 10
Pre
dic
ho
mM
00
02
04
06
08
10
Equipo comercial
Tip Au
Biosensor
Recta identidad
Figura 528 Concentracioacuten nominal vs predicha para las dos metodologiacuteas propuestas en este trabajo de
tesis y un meacutetodo enzimaacutetico disponible comercialmente
0
05
1
15
2
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
[Glicerol] (mM)
Ip (
uA
)
Resultados y Discusioacuten
89
Es evidente que los meacutetodos propuestos se correlacionan adecuadamente con la
recta identidad En la Fig 529 se muestran las tres regiones eliacutepticas de confianza
conjuntas (EJCR) para la pendiente y ordenada al origen En este caso puede apreciarse
que las tres elipses contienen el punto (0 1) lo que indica una buena correlacioacuten entre
los meacutetodos propuestos en el presente trabajo y un meacutetodo disponible comercialmente
Pendiente
08 09 10 11 12
Ord
enad
a al
ori
gen
-06
-04
-02
00
02
04
06
Equipo comercial
Tip Au
Biosensor
Punto (1 0)
Figura 529 Regiones eliacutepticas de confianza conjuntas para dos metodologiacuteas presentadas en este trabajo
de Tesis y un meacutetodo enzimaacutetico disponible comercialmente
En la Tabla 511 se presentan distintas metodologiacuteas publicadas en la literatura
actual en las que se referencia la cuantificacioacuten de glicerol ya sean biosensores
electroquiacutemicos u otra metodologiacutea El anaacutelisis de la Tabla 511 permite ver que la
determinacioacuten de glicerol en medios alcalinos sin presencia de interferentes puede ser
llevada a delante con metodologiacuteas econoacutemicas Debe ser considerado que cuando se
realiza la determinacioacuten de glicerol en muestras de biodiesel dicha cuantificacioacuten
requiere extraer el analito de la matriz como puede verse en los meacutetodos maacutes
recientemente propuestos (Bondioli amp Bella 2005 Silva amp Rocha 2010 Lima y col
2012 Tehrani amp Ghani 2012 Maruta amp Paixao 2012 Lourenccedilo amp Stradiotto 2009
Stradiotto y col 2009) Ya sea que se utilice deteccioacuten espectroscoacutepica o
electroquiacutemica siempre se requiere la extraccioacuten previa a la determinacioacuten del analito
Incluso la propuesta de Fernaacutendez Band y col que es el uacutenico meacutetodo que hace una
diferencia notable al comparar las cifras de meacuterito (LD 04 microM tiempo de anaacutelisis 4
min) implica un pretratamiento de la muestra (Lima y col 2012)
Resultados y Discusioacuten
90
Tabla 511 Comparacioacuten de meacutetodos para cuantificar glicerol propuestos recientemente Adaptado de
Faccendini y col 2014
Meacutetodo (Tratamientos
previos) LD
(microM)
Rango de
linealidad
(M)
Muestra
ensayada
Tiempo de
anaacutelisis
(min)
Reactivos o
accesorios
onerosos Referencia
Espectrofotomeacutetrico
(Extraccioacuten del analito) 22
4 times 10-5
a
2 times10-4
Biodiesel 20 - Bondioli amp
Bella 2005 Espectrofotomeacutetrico
(Extraccioacuten del analito) 10
5 times 10minus5
a
5 times 10minus4
Biodiesel 20 a 30 - Silva amp Rocha
2010
Espectrofluoromeacutetrico
(Extraccioacuten del analito) 04
1 times 10minus6
a
5 times 10minus4
Biodiesel 4 - Lima y
col2012
Espectrofotomeacutetrico
multienzimaacutetico No
informa 2 times 10
minus2 a
1 times 10minus1
Jugo de cantildea 5 GK GPO
ATP Kronka y col
2001
Espectrofotomeacutetrico
multienzimaacutetico 8
8 times 10minus6
a
25 times 10minus4
Suero
Humano 10
GK PK
LDH ATP
NAD+
Li y col 2001
Electroquiacutemico VPD
(Extraccioacuten del analito) 33
5 times 10minus4
a
12 times 10minus2
Biodiesel 15 - Tehrani y
Ghani 2012 Electroquiacutemico VC
(Extraccioacuten del analito) 3
33 times 10minus5
a
17 times 10minus3
Biodiesel 30 FIA Maruta y
Paixao 2012
Electroquiacutemico VC
(Extraccioacuten del analito) 25
33 times 10minus5
a
17 times 10minus3
Biodiesel 20 Cartucho de
C18
Lourenccedilo amp
Stradiotto
2009 Electroquiacutemico
amperomeacutetrico
(Extraccioacuten del analito)
No
informa 16 times 10
minus4 a
16 times 10minus3
Biodiesel 60 - Stradiotto y
col 2009
Electroquiacutemico VL
VPD amperomeacutetrico
(Extraccioacuten del analito) 10
23 times 10minus5
a
23 times 10minus4
Solucioacuten
Acuosa
pH=13 5
MWCNT
funcionalizad
os con Ag
Pop y col 2011
Electroquiacutemico
amperomeacutetrico
(Extraccioacuten del analito) 10
25 times 10minus5
a
20 times 10minus3
Solucioacuten
Acuosa
pH=13 8 -
Este Trabajo
de Tesis
Electroquiacutemico
amperomeacutetrico
(Extraccioacuten del analito) 50
5 times 10minus5
a
23 times 10minus2
Solucioacuten
Tampoacuten
Fosfato
5
(estimados) GO
Goriushnika y
col 2010
Biosensor
amperomeacutetrico 04
10 times 10minus6
a
10 times 10minus4
Jarabe de
cantildea 15
(estimados) GlDH NAD+
Aacutelvarez-
Gonzalez y
col 2000
Biosensor
amperomeacutetrico 04
1 times 10minus6
a
2 times 10minus5
Vino 3 GlDH DP
NAD+ Gamella y
col 2008
Biosensor
amperomeacutetrico 03
1 times 10minus6
a
1 times 10minus5
Vino 3 GK GPO
HRP ATP Gamella y
col 2008 Biosensor
amperomeacutetrico 4
5 times 10minus6
a
1 times 10minus4
Vino 5 GK GPO
ATP Ghica amp Brett
2006
Biosensor
amperomeacutetrico 20
70 times 10minus5
a
18 times 10minus3
Caldo
Middlebrook 10
GlDHb
NAD+ Este Trabajo
de Tesis
Del mismo modo el enfoque de Tehrani y Ghani que utilizan un electrodo de grafito
modificado con nanopartiacuteculas de nickel trabajando a pH = 13 realizan una extraccioacuten
previa de glicerol a partir de muestras de biodiesel (Tehrani amp Ghani 2012) En este
Resultados y Discusioacuten
91
caso el LD fue de 33 microM mientras que en este trabajo de Tesis utilizando el mismo
medio hemos conseguido un LD de 10 microM empleando electrodos de oro policristalino
Maruta y Paixao han propuesto recientemente un meacutetodo amperomeacutetrico usando un
electrodo de cobre que trabaja a 065 V vs AgAgCl adaptado en un sistema de FIA
(Maruta amp Paixao 2012) mientras que Lourenccedilo y Stradiotto informaron sobre un
meacutetodo electroquiacutemico que requiere la extraccioacuten acuosa del glicerol a partir de la
muestra y la purificacioacuten adicional por elucioacuten a traveacutes de un cartucho de C18 seguida
de una concentracioacuten por evaporacioacuten y finalmente un anaacutelisis mediante VC (Lourenccedilo
amp Stradiotto 2009) Tambieacuten otras propuestas informan sobre la determinacioacuten de
glicerol por amperometriacutea haciendo uso de electrodos modificados tales como
electrodos de diamante dopados con boro y modificados con nanopartiacuteculas de niacutequel
(Stradiotto y col 2009) y electrodos compuestos de nanotubos de carbono de pared
muacuteltiple funcionalizados con plata (Pop y col 2011) Si bien ambos meacutetodos se
presentan como uacutetiles se requieren diferentes pasos operativos para eliminar posibles
interferencias tales como otros alcoholes que podriacutean ser oxidados a los potenciales de
trabajo 065 V o 130 V (vs AgAgCl) respectivamente En este sentido nuestros
resultados obtenidos por amperometriacutea usando electrodos de oro en medio alcalino
acuoso (pH = 13) estaacuten en el mismo orden que los obtenidos por Pop y colaboradores
utilizando LSV (Pop y col 2011) sobre electrodos compuestos de nanotubos de
carbono de pared muacuteltiple funcionalizados con plata Efectivamente este uacuteltimo y
nuestra metodologiacutea mostraron las mejores cifras de meacuterito entre los meacutetodos
electroquiacutemicos de bajo costo que no consumen enzimas
Los meacutetodos enzimaacuteticos espectrofotomeacutetricos aunque no son laboriosos presentan
la desventaja del consumo relativamente elevado de enzima cada muestra necesita la
adicioacuten del costoso reactivo bioloacutegico ya que no puede ser reutilizado Tambieacuten los LD
de los meacutetodos espectrofotomeacutetricos enzimaacuteticos informados son generalmente
superiores a los que presentan los biosensores Puede antildeadirse que estos uacuteltimos
presentan generalmente el intervalo dinaacutemico lineal maacutes amplio en comparacioacuten con
otros enfoques ya sean electroquiacutemicos o espectrofotomeacutetricos Soacutelo la metodologiacutea de
flujo discontinuo con deteccioacuten fluoromeacutetrica propuesta por Fernaacutendez Band y col
(Lima y col 2012) muestra una sensibilidad en el mismo orden que el maacutes bajo de los
biosensores
En el anaacutelisis de los biosensores que se muestran en la Tabla 511 hay que destacar
que el propuesto por Pingarroacuten y col (Gamella y col 2008) muestra el LD y tiempo de
Resultados y Discusioacuten
92
anaacutelisis total maacutes bajo Para evaluar costos operativos se presenta en la Tabla 512 un
resumen comparativo de la cantidad y concentracioacuten de los reactivos onerosos
consumidos por biosensor o por anaacutelisis entre la propuesta de Pingarroacuten y col y la del
biosensor aquiacute propuesto
Tabla 512 Comparacioacuten entre el meacutetodo enzimaacutetico que mejores cifras de meacuterito presenta y el propuesto
en el presente trabajo de Tesis Adaptado de Faccendini y col 2014
GlDH
bisosensor Diaforasa
biosensor tetratiofulvaleno
biosensor NAD
+ por
anaacutelisis
Gamella y
col 2008 75 U 162 U 15x10-6
M 5x10-3
M Este Trabajo
de Tesis 23 U - - 5x10-4
M
Podemos afirmar que nuestra propuesta es menos costosa hecho importante a ser
evaluado cuando se va a analizar un gran nuacutemero de muestras Mediante la reduccioacuten de
la cantidad de GlDH el LD se elevoacute desde 04 hasta 20 microM aunque es adecuado auacuten
para detectar cambios de concentracioacuten de glicerol en el orden de 15 microM Al mismo
tiempo evitando el uso de diaforasas el tiempo total de anaacutelisis se extendioacute de 3 a 10
min En conjunto los resultados presentados confirman que los cambios introducidos a
los biosensores informados previamente en la literatura tales como el uso de soacutelo una
enzima en baja proporcioacuten la sustitucioacuten del mediador redox por el ferricianuro soluble
y trabajar con el cofactor NAD+ soluble proporciona un sistema fiable de bajo costo
para cuantificar el glicerol
Experimentos Auxiliares
Experimentos Auxiliares
94
6 Experimentos Auxiliares
61 Comparacioacuten de programas de prediccioacuten de epiacutetopes lineales reconocidos
por ceacutelulas B
AAPPred BcePred ABCPred BepiPred y Antigenic se ejecutaron en liacutenea En la
Tabla 61 se muestran los VPP medios (ver definicioacuten en seccioacuten Materiales y Meacutetodos
pag 11) que se obtuvieron al predecir epiacutetopes lineales reconocidos por ceacutelulas B de
todas las proteiacutenas enumeradas en la Tabla 62
Los resultados obtenidos indican que BcePred es el uacutenico programa de los
evaluados que muestra un VPP inferior al obtenido con la prediccioacuten al azar Tambieacuten
se obtuvo que soacutelo dos de los programas estudiados AAPPred y ABCpred predijeron
epiacutetopes con un VPP significativamente mayor al valor de VPP de un procedimiento de
identificacioacuten aleatoria Estos dos programas produjeron predicciones con valores
maacuteximos de 862 y 786 de VPP respectivamente
Tabla 61 Valores predictivos positivos promedio que se obtuvieron con cada uno de los programas
predictores con los que se trabajoacute
Programa
VPP
promedio
AAPPred 691
ABCPred 628
BcePred 309
BepiPred 453
Antigenic 419
Aleatorio 382
En base a estos resultados se trabajoacute con el programa AAPPred y se identificaron
las regiones que concentraban el mayor nuacutemero de epiacutetopes reconocidos por ceacutelulas B
de las proteiacutenas P22 P30 y P35 con el fin de expresar estos Angs como proteiacutenas
recombinantes y utilizarlos en el desarrollo de meacutetodos de diagnoacutestico de la
toxoplasmosis aguda
Experimentos Auxiliares
95
Tabla 62 Base de datos experimental proteiacutenas seleccionadas para este estudio Se indican el nombre de
la proteiacutena el coacutedigo de acceso NCBI la longitud total (en residuos de amino aacutecidos) el
nuacutemero de epiacutetopes reales determinados experimentalmente y la localizacioacuten de los epiacutetopes o
regiones antigeacutenicas Proteiacutenas tomadas de base de datos (A) BciPep (B) VIH Inmunologiacutea
Molecular base de datos o tomado de la literatura (veacutease el nuacutemero de referencia 17 para VP1
16 para la proteiacutena N y 18 para gliadina)
Proteiacutena
Coacutedigo
NCBI
Nordm de
residuos
Cantidad de
epiacutetopes
Localizacioacuten de los epiacutetopes o regiones
antigeacutenicas
MPT70 (A) NP_217391 193 2 31-70 100-120
MSP-1 (A) BAF622801 1693 3 29-39 1594-1611 1644-1662
Exotoxina
A (A) NP_249839 638 8
297-313 324-333 354-387 412-421 510-522
528-539 557-593 596-638
GAG1 (A) P20873 504 10
11-25 113-122 142-156 176-214 216-268
280-308 312-321 330-367 406-416 428-448
Gp160 (A) NP_057856 856 13
30-141 161-191 211-231 252-281 294-344
346-413 424-511 525-558 561-615 639-701
724-747 761-778 822-855
Pr55 (B) NP_579876 132 2 11-38 51-78
Rev (B) NP_057854 116 4 5-15 32-51 70-91 96-116
VP1 (17) ABC87248 781 12
31-41 55-65 85-95 151-161 292-392 316-326
493-500 529-539 547-554 571-578 667-707
712-722
Gliadin
(18) A27319 296 3 31-72 165-176 237-264
Proteiacutena N
(16) AAP13445 422 6 1-6 45-61 153-192 211-223 225-235 354-412
Proteasa
(B) CAB66012 99 2 1-7 36-47
62 Puesta a punto de ensayos de inmunoabsorcioacuten ligados a enzima con
deteccioacuten fotomeacutetrica
Previo al inicio de los ELISA de captura iniciamos una serie de pruebas preliminares
con el propoacutesito de
a) Diferenciar sueros de pacientes infectados de sueros de individuos sin infeccioacuten De
este modo se pretende verificar la potencial utilidad en diagnoacutestico de los antiacutegenos
propuestos corroborando que los procesos quiacutemicos llevados a cabo como por ej la
conjugacioacuten no eliminaron epiacutetopes claves
Experimentos Auxiliares
96
b) Minimizar la sentildeal en los ensayos sin suero (blanco de reactivos) es decir
disminuir el ruido de fondo asociado a interacciones inespeciacuteficas
A tales fines se realizaron ELISA indirectos utilizando los antiacutegenos recombinantes
obtenidos (marcados y sin marcar) adsorbidos sobre la placa se utilizaron sueros
tipificados y se reveloacute la presencia de IgG humana revelando con anticuerpos de cabra anti
IgG humana Los resultados obtenidos se detallan en la siguiente tabla
Tabla 63 Valores de absorbancia a 450 nm obtenidos en ELISA indirectos con deteccioacuten de IgGh con
conjugado anti IgG humana-HRP
Sueros P22C P22C-
biotina P35B
P35B -
biotina
Positivos
2 gt3 26 1900
3 2900 2 gt3
gt3 gt3 26 gt3
Negativos
13 1000 11 0800
06 0500 09 0700
11 1600 1 1000
Si bien los valores de absorbancia leiacutedos en todos los pocillos resultaron elevados
los sueros confirmados positivos dieron los valores maacutes altos de absorbancia mientras
que los sueros negativos dieron los valores maacutes bajos Las diferencias observadas entre
sueros confirmados positivos y sueros confirmados negativos permitieron asumir que
los antiacutegenos obtenidos son de posible utilidad en diagnoacutestico Ademaacutes no se
detectaron diferencias significativas entre los valores de absorbancia obtenidos
utilizando antiacutegenos marcados de aquellos obtenidos con los no marcados
permitieacutendonos pensar que la conjugacioacuten llevada a cabo no eliminoacute epiacutetopes claves
Los elevados valores de absorbancia obtenidos en este ensayo junto a otros estudios
preliminares sugieren que existe una elevada adsorcioacuten inespeciacutefica
621 Bloqueante a utilizar
Se ensayaron diversos agentes bloqueantes para minimizar las interacciones
inespeciacuteficas encontradas durante los experimentos preliminares y asiacute evitar las altas
sentildeales obtenidas en los ensayos control realizados sin suero (blanco de reactivos) y con
sueros confirmados negativos (blancos de muestra) Sobre placas comerciales de
poliestireno se procedioacute al bloqueo total con el agente bloqueante a ensayar y
posteriormente se realizoacute una incubacioacuten con y sin antiacutegeno P22C por duplicado
Finalmente se reveloacute con la enzima HPR-EAV que se une especiacuteficamente a biotina En
la Tabla 64 se muestran los valores de absorbancia a 450 nm
Experimentos Auxiliares
97
Tabla 64 Valores promedio de absorbancia a 450 nm obtenidos en los ensayos de bloqueo
450 nm Sin P22cBiot Con P22cBiot
Sin Bloqueante ------- 1162
Leche 1 0066 01445
Caseinato 1 00725 02425
Gelatina 1 00725 03925
BSA 1 00625 0192
BSA 1 Tween 002 00615 01515
En base a estos resultados se continuoacute con el uso de leche descremada como agente
bloqueante
622 Esquema A
Cuando se realizaron ELISA siguiendo el esquema A se ensayaron dos diluciones
de la HRP-EAV 12000 y 15000 Por otro lado se ensayaron distintas masas de
antiacutegenos P22C y P35B conjugados a biotina con los que se intentoacute revelar presencia
de IgM especiacuteficas Especiacuteficamente se ensayaron 2 02 y 002 g por pocillo de P35B
biotina y 5 2 02 y 002 g por pocillo de P22C biotina Con esto se buscoacute encontrar
las cantidades oacuteptimas de reactivos para poder llevar adelante estos ensayos A modo
ilustrativo en la Tabla 65 se muestra un ensayo representativo siguiendo el esquema A
Se informan solamente los valores de absorbancia a 450 nm obtenidos para sueros
provenientes de pacientes con infeccioacuten croacutenica (croacutenicos) aguda (agudos) y de
pacientes sin infeccioacuten (negativos)
Tabla 65 Valores de absorbancia a 450 nm obtenidos en ELISA siguiendo el esquema A Se muestran 3
cantidades de antiacutegeno revelador utilizadas 2 02 y 002 microg En este ensayo la dilucioacuten de la
enzima HRP-EAV fue 15000 y se utilizaron 100 microL por pocillo
Antiacutegenos
Sueros
P22C biotina ( g) P35B biotina ( g)
2 02 002 2 02 002
Negativos 0576 0294 0155 1071 0681 0566
0543 0335 0176 1079 0769 023
Croacutenicos 0469 0246 0135 103 069 0299
0514 0215 0111 0914 0567 0196
Agudos 0331 0181 0109 081 0574 0168
0555 0254 0139 0789 0391 0169
Experimentos Auxiliares
98
623 Esquema B
Cuando se realizaron ELISAs siguiendo el esquema B se ensayaron distintas masas
de antiacutegeno P22C y P35B absorbidas sobre las microplacas comerciales a saber 500
200 50 10 o 5 ng (disueltos en 100 L de solucioacuten tampoacuten carbonato pH 96) En todos
los casos se incuboacute 1h a 37 degC
Para la incubacioacuten con la proteiacutena conjugada a biotina se ensayaron 2 y 5 ug por
pocillo En la Tabla 66 se resumen los resultados obtenidos
Tabla 66 Valores de absorbancia a 450 nm obtenidos en ELISA siguiendo el esquema B Se muestran
los resultados obtenidos para dos cantidades distintas de antiacutegeno de captura (P22C) 10 y 50
ng junto a 2 cantidades de antiacutegeno revelador (P22C-biotina) utilizadas 2 y 5 microg En este
ensayo la dilucioacuten de la enzima HRP-EAV fue 12000 y se utilizaron 100 microL por pocillo
2 microg P22C biotina 5 microg P22C biotina
Masa de P22C
(ng)
Muestras
50 10 50 10
Agudos 0393 0303 0553 0450
0273 0335 0793 0367
Croacutenicos 0230 0398 0316 0345
0284 0291 0444 0493
Negativos 0392 0210 0380 0380
0286 0292 0314 0350
Sin suero 0367 0468 0415 0411
0327 0358 0468 0536
Sin Prot conjugada a
biotina ni sueros
0102 0087 0128 0079
0131 0095 0116 0104
Los resultados obtenidos indicaron que para lograr una mejor discriminacioacuten de las
muestras es conveniente utilizar mayor cantidad de masa de antiacutegeno de captura (P22C)
depositada en el pocillo Por otro lado 5 microg de antiacutegeno revelador (P22C-biotina) por
pocillo contribuyoacute a aumentar la discriminacioacuten entre las muestras sin incrementar
significativamente el ruido de fondo
Experimentos Auxiliares
99
63 Ensayos electroquiacutemicos
631 Determinacioacuten del aacuterea real de un electrodo
6311 Meacutetodo de la adsorcioacuten de O2
Se realizaron barridos de potencial como se indica en el punto 41931 de la
seccioacuten Materiales y Meacutetodos La Fig 61 muestra un voltamperograma tiacutepico obtenido
Con el valor de la carga asociada a la desorcioacuten del oacutexido de oro pudo determinarse el
valor de aacuterea electroactiva del electrodo de trabajo utilizado como se indica en el punto
41931
E V
04 06 08 10 12 14 16
I
A
-15e-5
-10e-5
-50e-6
00
50e-6
Figura 61 Voltamperograma ciacuteclico tiacutepico obtenido con electrododos de oro en medio H2SO4 05 M
velocidad de barrido 50 mV s-1
Se indica en color turquesa el pico de desorcioacuten del oacutexido de oro la carga
(Q) obtenida del aacuterea encerrada en la curva se utilizoacute para determinar el aacuterea real de los electrodos de oro
previamente a los ensayos
6312 Voltametriacutea ciacuteclica a distintas velocidades
Se realizaron barridos de potencial a distintas velocidades como se indica en el
punto 41932 de la seccioacuten Materiales y Meacutetodos La Fig 62 muestra los voltagramas
tiacutepicos obtenidos en (A) y en (B) la dependencia de la corriente de pico Ip con la raiacutez
cuadrada de la velocidad de barrido Con el valor de la pendiente de la recta obtenida
por regresioacuten lineal pudo determinarse el valor de aacuterea electroactiva del electrodo de
trabajo utilizado como se indica en el punto 41932 habieacutendose utilizado un
coeficiente de difusioacuten del Fe(CN)63-
de 0762 cm2 s
-1 (Sawyer amp Roberts 1974)
Experimentos Auxiliares
100
E V
-02 -01 00 01 02 03 04 05 06
I
A
-20e-4
-10e-4
00
10e-4
20e-4
Figura 62 A) Voltametriacuteas ciacuteclicas de Fe(CN)63 1 mM en medio KCl 01 M a distintas velocidades de
barrido utilizando como electrodo de trabajo el biosensor amperomeacutetrico para evaluacioacuten de infeccioacuten
toxoplaacutesmica La flecha indica la direccioacuten de barrido B) Dependencia de Ip (en valores absolutos) con la
raiacutez de la velocidad de barrido el valor de pendiente de la recta de regresioacuten se utilizoacute para determinar el
aacuterea real del electrodo de trabajo
632 Cubierta del biosensor selectivo para glicerol y soluciones amortiguadoras
Se ensayaron distintos poliacutemeros para cubrir el biosensor de pasta de carbono B
utilizamos poliacutemeros de 4-vinilbenzilimine copolimerizados con cloruro de 4-
vinilbencil-trietilamonio y sulfonato de vinilfenilo (portadores de carga neta positiva y
negativa respectivamente) Si bien los poliacutemeros permitiacutean operar con complejos de
hierro utilizados como mediadores redox (Fe(CN)63-
y ferrocenometanol) no resultaron
uacutetiles en el ensamblado del biosensor por el elevado ruido de fondo que generaron
Se evaluaron distintas soluciones amortiguadoras de pH como fosfatos y
amoniacuteacoamonio Se optoacute por las soluciones de carbonato porque estas resultaron maacutes
sencillas de preparar y manipular que las amoniacales y presentaron mayor capacidad
reguladora en el pH oacuteptimo de la enzima GlDH que las de fosfato
633 Ensayos preliminares de voltametriacuteas de onda cuadrada
Los ensayos preliminares de voltametriacutea de onda cuadrada consistieron en
establecer los valores maacutes convenientes de la amplitud de pulso el escaloacuten de potencial
y la frecuencia para los futuros ensayos de cuantificacioacuten Se realizaron los voltagramas
en tres series de ensayos a seis valores de frecuencia 10 20 30 40 60 y 70 Hz
Los valores de salto de potencial ( ES) y amplitud de pulso ( E) utilizados en las
tres series de ensayos realizados se resumen en la siguiente tabla
(velocidad barrido)12 V12 s-12
006 008 010 012 014 016 018 020 022 024
Ip
A
40e-5
60e-5
80e-5
10e-4
12e-4
14e-4
16e-4
18e-4
20e-4
Experimentos Auxiliares
101
Tabla 67 Valores de salto de potencial y amplitud de onda cuadrada utilizados en los ensayos
voltameacutetricos
Serie 1 Serie 2 Serie 3
ES (mV) 5 5 10
E (mV) 25 50 50
En las 3 series de ensayos se observoacute que al aumentar la frecuencia la corriente de
pico no se incrementaba y el pico de corriente se deformaba aumentando
considerablemente el ruido Las mejores relaciones sentildealruido en las tres series de
ensayos se obtuvieron trabajando a 10 Hz Por su parte cuando se utilizoacute un escaloacuten de
potencial de 10 mV el pico de corriente se deformoacute levemente por lo que se optoacute por
trabajar con un ES = 5 mV Cuando la amplitud del pulso fue 50 mV se obtuvieron
mayores intensidades de corriente sin deformacioacuten de pico escogieacutendose en
consecuencia este valor En la Fig 63 se muestran los voltamperogramas obtenidos en
los ensayos de la serie 2 a una frecuencia de 10 Hz
Figura 63 Voltagramas de onda cuadrada obtenidos utilizando bioelectrodos de pasta de carbono viacutetreo
modificada con GlDH y MWCNT En liacutenea clara se muestra el voltagrama de la solucioacuten NAD+ 05 mM
(NH4)2SO4 25 mM K2CO3 KHCO3 100 mM pH 105 con medio Middelbrook 7H9 Superpuestos se
detallan los voltagramas de la misma solucioacuten luego del agregado de glicerol 100 M para llevar a
concentracioacuten final 25 mM (- - -) y 50 mM (____
)
6331 Seleccioacuten de un meacutetodo apropiado para establecer la liacutenea de base
Se buscoacute establecer una liacutenea de base para corregir los voltagramas obtenidos
utilizando algoritmos presentes en el programa GPES Se intentoacute con algoritmos de
correccioacuten que permiten establecer una liacutenea polinoacutemica ad-hoc para cada voltagrama
utilizando entre 2 y 5 puntos de la curva experimental Sin embargo las sentildeales
corregidas presentaban picos de corrientes con valores de ancho a la altura media Wfrac12
entre 0180 y 0220 V valores que resultan elevados comparados con 0123 Vn el valor
de referencia para este paraacutemetro en VOC donde n es el nuacutemero de electrones
Experimentos Auxiliares
102
intercambiados en la reaccioacuten Finalmente a cada VOC se les restoacute la VOC del blanco
buscaacutendose el pico de corriente con un algoritmo de buacutesqueda semiautomaacutetica del
programa GPES con una liacutenea de base recta y marcando manualmente el inicio y final
del pico establecieacutendose los mismos valores de potencial de inicio y finalizacioacuten del
pico de corriente en todos los voltamperogramas De este modo se obtuvieron picos
cuyos Wfrac12 eran proacuteximos al valor teoacutericamente predicho
Conclusiones
Conclusiones
104
7 Conclusiones
1- Se pudo encontrar cual de los programas de libre acceso para predecir epiacutetopes
lineales reconocidos por ceacutelulas B es el maacutes conveniente al momento de seleccionar
antiacutegenos con fines diagnoacutesticos
2- Se pudieron clonar expresar en forma soluble y marcar con biotina fragmentos
de antiacutegenos de toxoplasmosis de fase aguda que presentan alta concentracioacuten de
determinantes antigeacutenicos
3- Se verificoacute la utilidad de los antiacutegenos obtenidos para su posterior uso en el
ensamblado de bioelectrodos para diagnoacutestico de infeccioacuten aguda de toxoplasmosis
4- Se pudo cuantificar glicerol en muestras sencillas con un electrodo versaacutetil de
oro policristalino por medio de una metodologiacutea amperomeacutetrica a 01 V en medio
NaOH 01 M y con un tiempo de anaacutelisis de 8 min liacutemite de deteccioacuten 10 microM y un
intervalo de linealidad de 0024 a 200 mM
5- Se pudo cuantificar glicerol en medios de cultivo de micobacterias El meacutetodo
consiste en una amperometriacutea que emplea un bioelectrodo selectivo para glicerol
compuesto de pasta de C modificada con glicerol deshidrogenasa y lleva un tiempo de
anaacutelisis de 10 min liacutemite de deteccioacuten 20 microM y un rango de linealidad de 0060 a 175
mM Este meacutetodo podriacutea en un futuro ser uacutetil para identificar muestras de pacientes con
tuberculosis activa en un menor tiempo de anaacutelisis al actualmente empleado
6- Los meacutetodos para cuantificar glicerol aquiacute presentados fueron validados frente
a un equipo enzimaacutetico disponible comercialmente
Bibliografiacutea
Bibliografiacutea
106
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Iacutendice
iii
414 Revelado cromogeacutenico de la reaccioacuten de conjugacioacuten 45
415 Mediciones espectrofotomeacutetricas 45
416 Ensayos de inmunoabsorcioacuten ligados a enzima con deteccioacuten
fotomeacutetrica 45
4161 Esquema A 46
4162 Esquema B 46
417 Reaccioacuten de color para determinacioacuten cuantitativa de glicerol por meacutetodo
espectrofotomeacutetrico 47
418 Determinacioacuten de glicerol remanente en cultivos de micobacterias 47
4181 Determinacioacuten de glicerol remanente en cultivos de micobacterias
con y sin fago D29 y ensayos controles respectivos 48
419 Instrumental electroquiacutemico 48
4191 Electrodos de trabajo 48
41911 Bioelectrodo para evaluacioacuten de infeccioacuten toxoplaacutesmica 48
41912 Electrodos para cuantificacioacuten de glicerol 49
4192 Limpieza de electrodos 50
4193 Determinacioacuten del aacuterea real del electrodo 50
41931 Medicioacuten de la adsorcioacuten de oxiacutegeno 50
41932 Voltametriacutea ciacuteclica de ferricianuro de potasio 51
420 Medidas electroquiacutemicas 51
4201 Mediciones amperomeacutetricas para evaluacioacuten de infeccioacuten
toxoplaacutesmica 51
4202 Mediciones amperomeacutetricas para cuantificacioacuten de glicerol 52
42021 Amperometriacuteas con tip de oro 52
42022 Amperometriacuteas con electrodos de pasta de C 52
4203 Voltamperometriacutea de onda cuadrada 53
421 Funcionalizacioacuten de nanotubos de carbono 53
422 Programas de prediccioacuten de epiacutetopes lineales reconocidos por ceacutelulas B 54
Iacutendice
iv
4221 Base de datos de proteiacutenas 54
4222 Programas utilizados 54
423 Anaacutelisis de Datos 54
424 Caacutelculos estadiacutesticos y disentildeo experimental 55
5 Resultados y discusioacuten 57
51 Evaluacioacuten de antiacutegenos recombinantes de T gondii 57
511 Antiacutegeno P30 57
512 Antiacutegeno P22 58
513 Antiacutegeno P35 59
52 Marcado de antiacutegenos recombinantes de T gondii 60
53 Inmunoensayos 61
531 Inmunoensayos con deteccioacuten fotomeacutetrica 61
5311 Evaluacioacuten del esquema A 61
5312 Esquema B 62
532 Inmunoensayos con deteccioacuten amperomeacutetrica utilizando los antiacutegenos
recombinantes 66
54 Determinacioacuten de la actividad electroquiacutemica del glicerol en medio
acuoso 67
55 Cuantificacioacuten de glicerol en medios acuosos complejos 71
551 Evaluacioacuten del modelo propuesto por medio de lecturas
espectrofotomeacutetricas 72
5511 Evaluacioacuten de la sentildeal con la concentracioacuten de glicerol 76
5512 Optimizacioacuten de condiciones para disminuir el costo operativo 78
552 Determinacioacuten de glicerol remanente en cultivos de micobacterias 79
5521 Evaluacioacuten de glicerol remanente en cultivos axeacutenicos de M
smegmatis 79
5522 Determinacioacuten de glicerol remanente en cultivos de micobacterias
con y sin fago D29 y ensayos controles respectivos 80
Iacutendice
v
553 Biosensor amperomeacutetrico a base de pasta de carbono viacutetreo
modificada 81
554 Desarrollo de un biosensor a base de pasta de carbono viacutetreo y
nanotubos de carbono 83
5541 Ensayos de cuantificacioacuten de glicerol con el bioelectrodo
desarrollado utilizando teacutecnicas de pulso 86
56 Validacioacuten de meacutetodos 88
6 Experimentos Auxiliares 94
61 Comparacioacuten de programas de prediccioacuten de epiacutetopes lineales reconocidos
por ceacutelulas B 94
62 Puesta a punto de ensayos de inmunoabsorcioacuten ligados a enzima con
deteccioacuten fotomeacutetrica 95
621 Bloqueante a utilizar 96
622 Esquema A 97
623 Esquema B 98
63 Ensayos electroquiacutemicos 99
631 Determinacioacuten del aacuterea real de un electrodo 99
6311 Meacutetodo de la adsorcioacuten de O2 99
6312 Voltametriacutea ciacuteclica a distintas velocidades 99
632 Cubierta del biosensor selectivo para glicerol y soluciones
amortiguadoras 100
633 Ensayos preliminares de voltametriacuteas de onda cuadrada 100
6331 Seleccioacuten de un meacutetodo apropiado para establecer la liacutenea
de base 101
7 Conclusiones 104
8 Bibliografiacutea 106
Resumen
vi
1 Resumen
Este trabajo de Tesis se orientoacute al desarrollo de meacutetodos analiacuteticos alternativos a los
hoy vigentes que faciliten la determinacioacuten de compuestos de intereacutes tanto para
diagnoacutestico cliacutenico como para la industria de combustibles alternativos Se realizaron
aportes para tres situaciones de relevancia diagnoacutestico de toxoplasmosis tuberculosis y
evaluacioacuten de calidad de biodiesel
La toxoplasmosis es una parasitosis causada por Toxoplasma gondii que afecta a
humanos sin generar complicaciones excepto cuando los infectados son
inmunodeprimidos o mujeres embarazadas que no cursaron previamente la enfermedad
En este caso el paraacutesito puede atravesar placenta generando infeccioacuten congeacutenita del
feto pudiendo producirle graves consecuencias que pueden llegar a la muerte Una de
las teacutecnicas de diagnoacutestico utiliza el ensayo de inmunoadsorcioacuten ligado a enzima
permitiendo la deteccioacuten de anticuerpos especiacuteficos contra el paraacutesito los cuales son
indicadores de existencia de infeccioacuten No obstante para detectar toxoplasmosis aguda
al diacutea de hoy se carece de una estandarizacioacuten confiable principalmente en la
preparacioacuten del antiacutegeno Por ello en este trabajo se procuroacute identificar regiones donde
se codificaraacuten algunos marcadores de fase aguda que concentraraacuten una alta proporcioacuten
de determinantes antigeacutenicos para luego clonarlas expresarlas como proteiacutenas
recombinantes marcarlas con biotina y asiacute utilizarlas como sistema de revelado de
anticuerpos especiacuteficos contra proteiacutenas de T gondii Los inmunoensayos aquiacute
presentados proponen una metodologiacutea que permitiraacute en un futuro distinguir sueros
provenientes de individuos con infeccioacuten aguda de aquellos con infeccioacuten croacutenica o no
infectados
La tuberculosis es una enfermedad infecto-contagiosa causada por la bacteria
Mycobacterium tuberculosis Su diagnoacutestico se basa en una serie de estudios que
finaliza con la identificacioacuten del agente etioloacutegico en cultivos obtenidos a partir de
esputo Esta identificacioacuten puede demorar aproximadamente dos meses debido al
prolongado tiempo de replicacioacuten de la micobacteria Esto conlleva la potencialidad de
contagio a individuos sanos y un compromiso importante de la salud del infectado
Uacuteltimamente se han desarrollado teacutecnicas indirectas de deteccioacuten de M tuberculosis
utilizando el bacterioacutefago D29 capaz de infectar especiacuteficamente micobacterias Es una
metodologiacutea donde se facilita la replicacioacuten del fago en la muestra proveniente del
paciente para luego evaluar el tiacutetulo de fagos liberados infectando un cultivo testigo de
Resumen
vii
Micobacterium smegmatis micobacteria de replicacioacuten raacutepida Siendo el glicerol fuente
de carbono en cultivos de micobacterias se planteoacute determinar su concentracioacuten
remanente como meacutetodo de evaluar integridad de M smegmatis establecieacutendose asiacute una
medida indirecta de la previa presencia de M tuberculosis en la muestra problema
Ademaacutes el glicerol es el principal subproducto en la elaboracioacuten del biodiesel y su
concentracioacuten es indicativa de la calidad del combustible transformaacutendose en analito
relevante para la industria de energiacuteas alternativas a la derivada del petroacuteleo
Se desarrollaron y validaron dos meacutetodos amperomeacutetricos de cuantificacioacuten de
glicerol a) Con electrodo de oro en NaOH 01 M aplicable a medios acuosos (LD 10
microM intervalo lineal 0024 a 200 mM) b) Con bioelectrodo de pasta de C modificada
con glicerol deshidrogenasa aplicable a medios complejos como cultivos bacterianos
(LD 20 M intervalo lineal 0060 a 175 mM)
Resumen
viii
1 Summary
This Thesis work was oriented to the development of analytical methods alternative
to those currently used to facilitate the identification of compounds of interest for both
clinical diagnosis and the alternative fuel industry Contributions of relevance to three
situations were performed Diagnosis of toxoplasmosis tuberculosis and the assessment
of biodiesel quality
Toxoplasmosis is a parasitic disease caused by Toxoplasma gondii which does not
bring complications in people except when the infected individual is an
immunocompromised patient or pregnant women who have not previously suffered
from the illness In this case the parasite can cross the placenta producing congenital
infection of the fetus and potentially causing serious consequences including death
One of the techniques used to its diagnosis is the enzyme-linked immunosorbent assay
allowing the detection of parasite-specific antibodies which are indicators of the
infection However this technique aimed to detect acute toxoplasmosis nowadays lacks
of reliable standardization particularly in the preparation of the antigen Therefore this
study focused on identifying regions encoding several markers of acute phase which
highly concentrated antigenic determinants to clone and express them as recombinant
proteins subsequently label them with biotin and thus use them as developing system of
specific antibodies against T gondii proteins The immunoassays presented here
propose a methodology which will allow in the future distinguishing sera from
individuals with acute infection of those with chronic infection or uninfected
Tuberculosis is an infectious and contagious disease caused by the bacterium
Mycobacterium tuberculosis Its diagnosis is based on a series of studies which
eventually identify the etiologic agent in cultures obtained from sputum This
identification can take about two months due to the extensive mycobacteria replication
time This leads to the potential contagion of healthy individuals and a major
commitment to the health of the infected patient Recently indirect M tuberculosis
detection techniques have been developed They use D29 bacteriophage which is able
to specifically infect mycobacteria The methodology allows phage replication in the
patientrsquos sample and then evaluates the number of released phages by infecting a
control culture of Mycobacterium smegmatis a short-term replicable mycobacteria As
glycerol is the carbon source commonly used in mycobacteria culture this work
proposes determining its residual concentration as a method of evaluating integrity of
Resumen
ix
M smegmatis thus establishing an indirect measurement of the previous presence of M
tuberculosis in the sample
Furthermore glycerol is the main by-product in biodiesel production and its
concentration is an indicator of the fuel quality becoming a relevant analyte to the
energy industry alternative to that derived of petroleum
Two amperometric methods for glycerol quantitation were developed and
validated a) Using a gold electrode in 01 M NaOH medium useful for simple aqueous
solutions (LD 10 microM linear range from 0024 to 200 mM) b) using a carbon paste
bioelectrode modified with glycerol dehydrogenase useful for complex media such as
bacterial cultures (LD 20 microM linear range 0060 to 175 mM)
Publicaciones
x
Publicaciones
Los resultados parciales del presente trabajo de Tesis han dado lugar a las
siguientes publicaciones
Trabajos en revistas internacionales
1- Costa J G Faccendini P L Sferco S J Lagier C M Marcipar I S
Evaluation and comparison of the ability of online available prediction programs to
predict true linear B-cell epitopes Protein amp Peptide Letters (2013) 20(6)724-30
2- Faccendini P L Ribone M E Lagier C M Selective application of two
rapid low-cost electrochemical methods to quantify glycerol according to the sample
nature Sensors and Actuators B (2014) 193 142ndash 148
Trabajos en congresos
1- Muntildeoz A Faccendini P L Ribone M E Lagier C M Oxidacioacuten
electroquiacutemica de polialcoholes sustrato de sistemas enzimaacuteticos bacterianos Estudio
de las condiciones para su cuantificacioacuten V Congreso Argentino de Quiacutemica Analiacutetica
Bahiacutea Blanca Noviembre de 2009
2- Costa J G Faccendini P L Carral L Kaufer F Lagier C M Marcipar I
S Evaluacioacuten de dos regiones de la Proteiacutena P35 de Toxoplasmama gondii para el
diagnostico de fase aguda de la toxoplasmosis Ascochinga Coacuterdoba Octubre de 2010
3- Costa J G Faccendini P L Lagier C M Marcipar I S Modelado y
prediccioacuten de los epiacutetopes del antigeno P22 de Toxoplasma gondii 2do Congreso de
Bioinformaacutetica y Biologiacutea Computacional Coacuterdoba Mayo de 2011
4- Faccendini P L Costa J G Ribone M E Marcipar I S Lagier C M
Ensamblado de un bioelectrodo econoacutemico para la deteccioacuten de glicerol en medios
altamente complejos 6deg Congreso Argentino de Quiacutemica Analiacutetica Santa Fe
Septiembre de 2011
5- Faccendini P L Costa J G Ribone M E Marcipar I S Lagier C M
Desarrollo y optimizacioacuten de un meacutetodo para la cuantificacioacuten de glicerol en matrices
complejas 6deg Congreso Argentino de Quiacutemica Analiacutetica Santa Fe Septiembre de 2011
Publicaciones
xi
6- Costa J G Perotti J Faccendini P L Lagier C M Mancipar I S
Optimization of the acute toxoplasmosis immunodiagnostic during the pregnancy
Workshop Fronteras en Biociencias Ministerio de Ciencia Tecnologiacutea e Innovacioacuten
Productiva Embajada Alemana Ciudad Autoacutenoma de Buenos Aires Abril de 2012
7- Costa J G Perotti J Faccendini P L Dure A Carral L Kaufer F Lagier
C M Mancipar I S Evaluacioacuten de diferentes regiones de las proteiacutenas p22 p30 y p35
para diagnoacutestico de la fase aguda de la toxoplasmosis XXV Reunioacuten Anual de la
Sociedad Argentina Protozoologiacutea 2012 Ciudad Autoacutenoma de Buenos Aires Agosto
de 2012
8- Costa J G Faccendini P L Sferco S J Lagier C M Mancipar I S
Comparison of the ability to predict true linear B-cell epitopes by on-line available
prediction programs 3er congreso de la sociedad argentina de bioinformaacutetica y biologiacutea
computacional Paranaacute Septiembre de 2012
9- Faccendini P L Costa J G Ribone M E Marcipar I S Lagier C M
Desarrollo de un sistema electroquiacutemico para evaluar infeccioacuten toxoplaacutesmica 7deg
Congreso Argentino de Quiacutemica Analiacutetica Mendoza Octubre de 2013
Abreviaturas y Siacutembolos
xii
Abreviaturas y Siacutembolos
AD Aglutinacioacuten Directa
ADN Aacutecido desoxiribonucleico
Ac(s) Anticuerpo(s)
Ang(s) Antiacutegeno(s)
D Coeficiente de difusioacuten
DHA 13 dihidroxiacetona
DMSO Dimetil sulfoacutexido
DO Densidad oacuteptica
DT Dye Test con azul de metileno (Reaccioacuten de Sabiacuten Feldman)
EDTA Aacutecido etilendiaminotetraaceacutetico
ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay (Ensayo de inmunoadsorcioacuten ligado
a enzima)
F Constante de Faraday
Frecuencia
GlDH Glicerol deshidrogenasa
HAI Hemoaglutinacioacuten indirecta
HEPES Aacutecido 4-(2-hydroxietil)-1-piperazina etano sulfoacutenico
HRP Horse radish peroxidase (Peroxidasa de raacutebano picante)
I Corriente eleacutectrica
IFI Inmunofluorescencia indirecta
IgA Inmunoglobulina A
IgG Inmunoglobulina G
IgE Inmunoglobulina E
IgM Inmunoglobulina M
IgM-IFI Inmunofluorescencia indirecta de IgM (Prueba de Remington)
IPTG Isopropil- -D-tiogalactopiranoacutesido
ISAGA Ensayo aglutinante de inmunoabsorcioacuten
LB Medio Luria-Bertani
LC Liacutemite de cuantificacioacuten
LD Liacutemite de deteccioacuten
MWCNT Multi-walled carboacuten nanotubes (Nanotubos de carbono de paredes
muacuteltiples)
Abreviaturas y Siacutembolos
xiii
N nuacutemero de moles de especie reducida u oxidada
OMS Organizacioacuten Mundial de la Salud
P35 Antiacutegeno de superficie de T gondii de 35 kDa de peso
PBS Phosphate buffer salin (Solucioacuten tampoacuten fosfato salino)
PCR Polimerasa chain reaction (Reaccioacuten en cadena de la polimerasa)
pET32a Vector plasmiacutedico
Q Carga eleacutectrica circulante
SAG1 Surface antigen 1 (Antiacutegeno de superficie 1 o antiacutegeno P30 de T gondii)
SAG2 Surface antigen 2 (Antiacutegeno de superficie 2 o antiacutegeno P22 de T gondii)
SDS Dodecil sulfato de sodio
TB Tuberculosis
TRX Tioredoxina
VBL Voltametriacutea de barrido lineal
VC Voltametriacutea ciacuteclica
VPD Voltametriacutea de pulso diferencial
Introduccioacuten
Introduccioacuten
1
2 Introduccioacuten
21 Toxoplasmosis
211 Generalidades
La toxoplasmosis es una enfermedad causada por el paraacutesito protozoario
Toxoplasma gondii que infecta animales herbiacutevoros carniacutevoros y omniacutevoros dentro de
los cuales se encuentra el hombre Estaacute ampliamente extendida por todo el mundo y su
incidencia y prevalencia variacutean mucho seguacuten las zonas geograacuteficas los haacutebitos
alimentarios el tipo de trabajo la higiene ambiental y la presencia o no de gatos
infectados (Atias 1998 Martiacuten-Hernaacutendez 2004) Es una zoonosis que afecta a los
humanos a traveacutes de formas infectivas producidas durante el ciclo bioloacutegico que se
desarrolla uacutenicamente en gatos y otros feacutelidos Dependiendo de la localizacioacuten
geograacutefica entre 15 y 85 de la poblacioacuten adulta mundial presenta infeccioacuten croacutenica
(Fuentes y col 2001)
Usualmente la principal viacutea de transmisioacuten de esta parasitosis es la oral por
ingestioacuten de carnes crudas o poco cocidas contaminadas con quistes o por la ingestioacuten
de ooquistes presentes en agua o alimentos contaminados con heces de gato Son menos
frecuentes las viacuteas de transmisioacuten parenteral respiratorias mucosal (conjuntival)
cutaacutenea y por transfusioacuten de sangre o trasplante de oacuterganos La transmisioacuten por viacutea
transplacentaria puede ocurrir cuando la embarazada padece la primoinfeccioacuten durante
el curso del embarazo aunque se han descripto casos raros de infeccioacuten congeacutenita por
toxoplasmosis materna anterior al embarazo (Martiacuten-Hernaacutendez 2004 Centers of
Diseases Control and Prevention (CDC) paacutegina web a)
Durante la infeccioacuten pueden distinguirse dos etapas A) Aguda Al breve tiempo de
ingerir ooquistes esporulados eacutestos se transforman en taquizoiacutetos ingresan a la ceacutelula
del hueacutesped y comienzan a dividirse en forma asexual hasta que la ceacutelula se lisa
liberando asiacute la progenie y ocasionando la parasitemia Posteriormente el taquizoiacuteto
evoluciona a bradizoiacuteto cuya multiplicacioacuten es lenta Se produce la invasioacuten de los
oacuterganos por viacutea linfaacutetica o hemaacutetica siendo los oacuterganos maacutes comprometidos los
muacutesculos esqueleacutetico y cardiacuteaco asiacute como cerebro y ojos B) Croacutenica En la medida que
evoluciona la defensa del hueacutesped desaparecen los paraacutesitos extracelulares limitaacutendose
la divisioacuten intracelular y quedando las formas resistentes principalmente en el sistema
nervioso central y muacutesculo esqueleacutetico Por lo general esta etapa es latente pero puede
Introduccioacuten
2
activarse por la ruptura de los quistes tisulares (Fuentes y col 2001 Trabattoni y col
2008)
212 Toxoplasma gondii
El Toxoplasma gondii es un paraacutesito intracelular obligado Su ubicacioacuten
taxonoacutemica se detalla en la Tabla 21
Tabla 21 Ubicacioacuten taxonoacutemica del T gondii
Reino Protista
Sub-reino Protozoa
Phylum Apicomplexa
Clase Sporozoea
Sub-clase Coccidea
Orden Eucoccidiia
Sub-orden Eimeriina
Familia Sarcocystidae
Sub-familia Toxoplasmatinae
Geacutenero Toxoplasma
Especie gondii
Durante el ciclo de vida del T gondii se distinguen tres formas a) los taquizoiacutetos
b) los bradizoiacutetos (o quistes tisulares) y c) los ooquistes Los taquizoiacutetos (o trofozoiacutetos)
son la forma proliferativa y de reproduccioacuten raacutepida dentro de la ceacutelula del hueacutesped
durante la fase aguda que posteriormente deviene en la formacioacuten de un pseudoquiste
Tiene forma de medialuna y mide de 4 a 7 μm de ancho Estaacute recubierto por un sistema
de membranas constituido por una membrana doble interna y una externa interrumpida
en dos puntos El taquizoiacuteto es afectado por anticuerpos (Acs) especiacuteficos y faacutermacos y
se destruye en condiciones ambientales adversas como congelamiento-
descongelamiento desecacioacuten y bajo pH (por ejemplo el de los jugos gaacutestricos) Los
quistes tisulares son redondeados de pared elaacutestica miden de 10 a 200 μm y pueden
contener hasta 3000 paraacutesitos denominados bradizoiacutetos Estas formas no son afectadas
por Acs ni faacutermacos pero pueden ser destruidos por calentamiento congelamiento-
descongelamiento y por desecacioacuten Cuando estos quistes son ingeridos los bradizoiacutetos
resistentes son liberados por la accioacuten gaacutestrica y pueden invadir la mucosa
gastrointestinal Los ooquistes son estructuras ovoides de 10 a 12 μm de diaacutemetro y son
eliminadas en la materia fecal del gato Recieacuten emitidos no son infectivos pero bajo
condiciones de temperatura humedad y presencia de oxiacutegeno esporulan tornaacutendose
Introduccioacuten
3
infectivos y resistentes por maacutes de un antildeo en el suelo y dos antildeos en el agua (Atias
1998 Perotti 2007)
La Fig 21 describe el ciclo de vida del paraacutesito Los uacutenicos hueacutespedes definitivos
conocidos de T gondii son miembros de la familia Felidae (por ejemplo gatos
domeacutesticos) Los ooquistes no esporulados son liberados en las heces del felino Los
ooquistes tardan entre 1 y 5 diacuteas en esporular en el ambiente y volverse infectivos Los
hueacutespedes intermediarios se infectan al ingerir tierra agua o plantas contaminadas con
los ooquistes Los ooquistes se transforman en taquizoiacutetos al breve tiempo de ser
ingeridos Estos taquizoiacutetos se localizan en los tejidos musculares y el sistema nervioso
y evolucionan a bradizoiacutetos formando los quistes tisulares (hiacutesticos) Los felinos se
infectan luego de ingerir la carne de hueacutespedes intermediarios que poseen quistes
tisulares o por ingestioacuten de los ooquistes esporulados Los animales de caza y los
criados para consumo humano tambieacuten pueden infectarse por ingestioacuten de ooquistes
esporulados En el hueacutesped humano los paraacutesitos forman quistes en los tejidos y suele
encontrarse generalmente en el muacutesculo esqueleacutetico el miocardio cerebro y ojos donde
pueden permanecer durante toda la vida del hueacutesped (Paacutegina web del CDC)
Figura 21 Ciclo de vida de T gondii El hueacutesped definitivo son miembros de la familia Felidae los
demaacutes hueacutespedes (incluido el hombre) se infectan accidentalmente y no son necesarios para completar el
ciclo de vida del paraacutesito Adaptado de httpwwwdpdcdcgovdpdxHTMLToxoplasmosishtm
Introduccioacuten
4
213 Diagnoacutestico
Puesto que las infecciones por T gondii en individuos inmunocompetentes son por
lo general asintomaacuteticas o presentan siacutentomas imperceptibles su diagnoacutestico se basa
principalmente en pruebas de laboratorio La toxoplasmosis no suele generar
complicaciones excepto en 2 situaciones cuando se infectan individuos
inmunodeprimidos y cuando se infectan por primera vez mujeres embarazadas En este
uacuteltimo caso el paraacutesito puede infectar al feto atravesando la placenta y generando la
infeccioacuten congeacutenita Las probabilidades de dantildear al feto o al nintildeo luego de nacer
dependeraacuten del trimestre en que suceda la infeccioacuten (Atias 1998 Martiacuten-Hernaacutendez
2005) Tanto en inmunocomprometidos como en el recieacuten nacido la infeccioacuten puede
producir graves consecuencias Es por ello que en estos casos asiacute como en la
embarazada el diagnoacutestico cobra particular relevancia (Remington y col 1995)
2131 Meacutetodos de diagnoacutestico
La infeccioacuten puede diagnosticarse por meacutetodos directos que consisten en la
identificacioacuten de las estructuras parasitarias (por un estudio histopatoloacutegico para lo cual
es necesario realizar biopsias puncioacuten de ganglios o cortes histoloacutegicos) o la
identificacioacuten de ADN del paraacutesito (a traveacutes de una reaccioacuten en cadena de la
polimerasa PCR) Tambieacuten se pueden realizar cultivos tisulares e inoculacioacuten al
peritoneo de ratoacuten pero este meacutetodo presenta la desventaja de involucrar el manejo de
paraacutesitos vivos y el uso de animales de laboratorio (Perotti 2007)
Los meacutetodos alternativos son las pruebas indirectas a saber
Intradermoreaccioacuten de Frenkel Evaluacutea la inmunidad celular Es una reaccioacuten
cualitativa tardiacutea y presenta resultado positivo a partir de la cuarta semana de infeccioacuten
aunque se han reportado casos de pacientes en los que llevoacute varios meses hasta dar
positiva Se utiliza con fines epidemioloacutegicos (Jirovec amp Jindrich 1961 Rodriacuteguez
Acar y col 2008)
Reaccioacuten de Sabiacuten Feldman o dye test con azul de metileno (DT) Es el meacutetodo
de referencia de la OMS Evaluacutea la inmunidad humoral y mide la cantidad total de Acs
que es capaz de destruir taquizoiacutetos viacutea activacioacuten del complemento Es un meacutetodo
cuantitativo y presenta valores positivos a partir de la primera o segunda semana de
infeccioacuten Tiene la desventaja de requerir taquizoiacutetos vivos y animales para su cultivo
por lo que soacutelo laboratorios de referencia llevan adelante este meacutetodo (Perotti 2007
Durlach y col 2008)
Introduccioacuten
5
Reaccioacuten de inmunofluorescencia indirecta (IFI) Evaluacutea la cantidad de Acs que
se unen a toxoplasmas inactivados La reaccioacuten se evidencia con Acs anti-IgG humana
marcados con isocianato de fluoresceiacutena y observando al microscopio de fluorescencia
Si bien no se trabaja con organismos vivos la necesidad de un microscopio de
fluorescencia y la subjetividad del operador limitan el uso de este meacutetodo Se han
informado resultados falso-positivos debidos a Acs anti-nucleares (Durlach y col
2008)
Aglutinacioacuten directa (AD) En este ensayo se produce una aglutinacioacuten visible con
toxoplasmas tratados con formol Se detecta fundamentalmente IgMs especiacuteficas
Hemoaglutinacioacuten indirecta (HAI) Se utilizan antiacutegenos (Angs) de T gondii con
los que se sensibiliza gloacutebulos rojos que en presencia de Acs especiacuteficos producen una
aglutinacioacuten visible como un botoacuten rojo En general es utilizado para determinar
incidencia o seroprevalencia en una regioacuten pero no se recomienda para la deteccioacuten de
la infeccioacuten aguda (Durlach y col 2008)
Fijacioacuten del complemento Se detectan Acs que activan el sistema del
complemento en presencia de Angs de T gondii La reaccioacuten se evidencia con el
sistema hemoliacutetico hemolisina-gloacutebulos rojos de carnero Resultados positivos aparecen
en forma maacutes tardiacutea que en el DT (Perotti 2007)
Western blot Se evaluacutea la presencia de Acs especiacuteficos a Angs que han sido
separados por electroforesis en un gel de poliacrilamida y transferidos a una membrana
Generalmente no es utilizada como teacutecnica de diagnoacutestico debido a su difiacutecil
estandarizacioacuten (Durlach y col 2008)
Prueba de Remington (IgM-IFI) Se sigue el mismo esquema que en IFI pero se
sustituyen el conjugado anti-IgG por uno anti-IgM lo que permite detectar infeccioacuten
aguda Acs anti-nucleares y el factor reumatoide pueden producir resultados falso-
positivos y los Acs tipo IgG pueden producir resultados falso-negativos (Perotti 2007)
Ensayo aglutinante de inmunoabsorcioacuten (ISAGA) Permite la deteccioacuten y dosaje
de Acs IgA IgE IgG e IgM especiacuteficos contra el paraacutesito Este meacutetodo posee mayor
sensibilidad en relacioacuten al IgM-IFI y al ensayo de inmunoadsorcioacuten ligado a enzima
(ELISA) de IgM para la deteccioacuten de infecciones congeacutenitas pero tiene la desventaja
que pueden detectarse IgM especiacuteficas luego de un antildeo de la primoinfeccioacuten Esto
dificulta la interpretacioacuten de un resultado positivo si se desea determinar la antiguumledad
de la infeccioacuten (Durlach y col 2008)
Introduccioacuten
6
Ensayo de inmunoadsorcioacuten ligado a enzima (ELISA) Permite la deteccioacuten de
Acs especiacuteficos contra el paraacutesito Se evidencia la reaccioacuten con una enzima ligada a Acs
o Angs (dependiendo del disentildeo del inmunoensayo ver maacutes adelante en punto 2134)
que transforma un reactivo auxiliar en un producto coloreado o fluorescente Es un
meacutetodo cuantitativo que utiliza un espectrofotoacutemetro o fluoroacutemetro lo que permite
hacer medidas maacutes objetivas y raacutepidas (Perotti 2007) Auacuten asiacute este meacutetodo aplicado a
la deteccioacuten de la toxoplasmosis de fase aguda carece de una estandarizacioacuten confiable
principalmente en la preparacioacuten del Ang
2132 Importancia del correcto diagnoacutestico en la embarazada
A pesar de toda la bateriacutea de ensayos arriba descritos disponibles para el
diagnoacutestico de la toxoplasmosis el de la infeccioacuten aguda en la mujer embarazada sigue
siendo problemaacutetico porque este diagnoacutestico se deduce a partir de los datos de las
concentraciones relativas de los distintos isotipos de las inmunoglobulinas especiacuteficas
En efecto la existencia y concentracioacuten de IgM IgA e IgG especiacuteficas contra T gondii
es muy dependiente de la respuesta inmune del individuo infectado Considerando que
el tratamiento para prevenir la transmisioacuten al feto consiste en administrar drogas
antiparasitarias que tienen efectos nocivos sobre el nonato auacuten en estos diacuteas se trabaja
en mejorar este diagnoacutestico ya que no se cuenta con un meacutetodo confiable como para
prevenir por un lado los dantildeos que suelen sufrir los recieacuten nacidos de madres con
primoinfeccioacuten no diagnosticada y por otra parte los efectos perjudiciales en los fetos
de las embarazadas incorrectamente diagnosticadas y medicadas Por ello es que en este
trabajo se intentoacute desarrollar nuevas metodologiacuteas de diagnoacutestico de la infeccioacuten
toxoplaacutesmica aguda utilizando teacutecnicas electroquiacutemicas
2133 Diagnoacutestico en la embarazada
El correcto diagnoacutestico de la infeccioacuten aguda en la embarazada incluye la
utilizacioacuten de teacutecnicas especiacuteficas y sensibles asiacute como tambieacuten la aplicacioacuten de un
esquema de seguimiento adecuado El diagnoacutestico generalmente es realizado por
serologiacutea Para determinar si la paciente cursa una infeccioacuten aguda se determinan los
tiacutetulos de los anticuerpos IgG IgA e IgM (Arcavi y col 1997) y se interpretan prima-
facie seguacuten
1 IgG IgA IgM negativas ausencia de infeccioacuten
2 IgG e IgA positivas IgM negativa infeccioacuten croacutenica
3 IgG IgA e IgM positivas posible infeccioacuten aguda
Introduccioacuten
7
2134 Ensayo de inmunoadsorcioacuten ligado a enzima
Los ensayos del tipo ELISA consisten en la deteccioacuten de un antiacutegeno o un
anticuerpo inmovilizado sobre un soporte soacutelido y mediante anticuerpos que directa o
indirectamente producen una reaccioacuten La prueba recurre al empleo de antiacutegenos o
anticuerpos conjugados a una enzima (marcados) que por reaccioacuten con su sustrato
producen una especie coloreada cuya concentracioacuten puede ser medida
fotomeacutetricamente Este ensayo tiene las ventajas de ser versaacutetil robusto simple en su
realizacioacuten y emplear reactivos relativamente econoacutemicos El uso de una fase soacutelida que
retiene el analito de intereacutes proporciona una elevada sensibilidad mientras que la
elevada especificidad del ensayo viene dada por la gran selectividad de los anticuerpos
por su antiacutegeno Las configuraciones maacutes sencillas para estos ensayos son el directo y el
indirecto ambas esquematizadas en la Fig 22
Antiacutegeno IgG conjugada a enzima
Bloqueante IgG humana Reactivo de color
Directo Indirecto
Figura 22 Esquemas que representan los ELISA directo (izquierda) e indirecto (derecha)
21341 Esquema de captura o tipo ldquoSandwichrdquo
Cuando los anticuerpos que desean detectarse son del isotipo IgM suele tenerse el
inconveniente que el isotipo IgG frecuentemente estaacute en mayor concentracioacuten que el
IgM y presenta una mayor afinidad por el antiacutegeno Por lo tanto las IgG suelen
dificultar la deteccioacuten de las IgM en suero cuando se sigue un esquema de ELISA
indirecto con anticuerpos anti-IgM humana (Ac-a-IgMh) marcados Es por esto que
suele optarse por un esquema de captura o tipo saacutendwich en el cual se aumenta la
sensibilidad del ensayo incorporando un eslaboacuten maacutes en el inmunocomplejo adsorbido
En este trabajo se ensayaron dos alternativas de captura o tipo saacutendwich En la
primera alternativa que sigue un esquema claacutesico (A) se adsorbieron los Ac-a-IgMh
Introduccioacuten
8
sobre la superficie de la placa de poliestireno Las placas asiacute sensibilizadas se
enfrentaron al suero a ensayar capturando selectivamente una porcioacuten de las IgM de la
muestra Luego se los enfrentoacute al antiacutegeno de intereacutes ligado a biotina que se une a las
IgMh especiacuteficas para dicho Ang previamente capturado Finalmente se buscoacute revelar
con enzima peroxidasa de raacutebano picante (HRP) conjugada a streptavidina esta uacuteltima
forma un complejo estable con biotina De esta forma se aumenta la cantidad de Ac que
se desean detectar adsorbido sobre la placa seleccionando el tipo de anticuerpo que se
adsorbe En la Fig 23 se muestra el esquema del ensayo tipo A
IgM Antiacutegeno ligado a biotina streptavidina conjugada a HRP
Bloqueante IgG anti-IgM Reactivo de color
Figura 23 Esquema de ensayo ELISA tipo captura claacutesico A Un anticuerpo anti IgMh captura una
porcioacuten de las IgM presentes en el suero humano una porcioacuten de estas IgM capturadas son especiacuteficas
para antiacutegeno de T gondii y se revela su presencia por medio del antiacutegeno recombinante ligado a biotina
streptavidina ligada a HRP adicionando el sustrato de la enzima y un cromoacutegeno actuando como
cosustrato
La segunda alternativa que denominamos tipo B sale del esquema tradicional de
los ELISA Se adsorbe el antiacutegeno recombinante sobre la superficie de la placa de
poliestireno enfrentaacutendola luego al suero a ensayar Asiacute se captura selectivamente las
inmunoglobulinas que reconocen al antiacutegeno Luego se expone la placa al mismo
antiacutegeno recombinante pero ligado a biotina que se uniraacute a los anticuerpos especiacuteficos
para dicho Ang previamente capturados Finalmente se revela con HRP conjugada a
streptavidina que forma un complejo estable con biotina De esta forma se aumenta la
cantidad de Ang marcado en mayor proporcioacuten para IgM que para IgG dada la
Introduccioacuten
9
multivalencia de este isotipo de inmunoglobulina En la Fig 24 se muestra el segundo
esquema que fue el que brindoacute los resultados maacutes promisorios
Antiacutegeno (Ang) Bloqueante Ang ligado a biotina Reactivo de color
IgM a-Ang IgG a-Ang streptavidina conjugada a HRP
Figura 24 Esquema de ensayo ELISA de captura tipo B El antiacutegeno expuesto en la placa captura la
porcioacuten de las IgM e IgG especiacuteficas presentes en el suero humano Haciendo uso de la polivalencia de
las IgM su presencia se revela con el antiacutegeno conjugado a biotina streptavidina ligada a HRP
adicionando el sustrato de la enzima y un cromoacutegeno actuando como cosustrato
2135 Obtencioacuten de antiacutegenos para diagnoacutestico
El diagnoacutestico de rutina de la toxoplasmosis se basa en la deteccioacuten seroloacutegica de
anticuerpos en el paciente Los antiacutegenos utilizados en estas pruebas seroloacutegicas son
generalmente proteiacutenas derivadas de ceacutelulas T gondii que se propagan en el ratoacuten o el
cultivo de ceacutelulas El cultivo y el mantenimiento de este paraacutesito es laborioso lento y
caro (Lau amp Fong 2006) El uso de antiacutegenos nativos de taquizoitos es difiacutecil de
estandarizar y con frecuencia produce reacciones positivas falsas (Hiszczyntildeska-Sawicka
y col 2005) Por lo tanto ha habido intentos de producir antiacutegenos a traveacutes de medios
maacutes seguros tales como tecnologiacutea de ADN recombinante La mayoriacutea de estos
esfuerzos se han centrado en los principales antiacutegenos de superficie del paraacutesito como el
antiacutegeno de superficie 1 (SAG1 del ingleacutes Surface antigen 1) y el antiacutegeno de superficie
2 (SAG2 del ingleacutes Surface antigen 2) (Lau amp Fong 2006) En estudios recientes se ha
estado evaluando que la presencia de IgM e IgG anti P35 seriacutea un mejor indicador de
infeccioacuten reciente que la evaluacioacuten de IgM utilizando taquizoitos enteros en ensayos
del tipo ELISA (Lu y col 2006) En efecto con la nueva tecnologiacutea de ADN
Introduccioacuten
10
recombinante es posible obtener cualquier proteiacutena contaacutendose ademaacutes con ventajas
como la posibilidad de seleccionar porciones especiacuteficas de un Ang para evitar
reacciones inespeciacuteficas ligar distintas porciones que naturalmente corresponden a otras
proteiacutenas para aumentar la sensibilidad del ensayo agregar secuencias aminoaciacutedicas
que faciliten la posterior purificacioacuten y estandarizacioacuten de la proteiacutena a utilizar
(Hiszczyntildeska-Sawicka y col 2005) A la postre todo el proceso resulta maacutes
econoacutemico seguro y confiable que la purificacioacuten de Angs a partir del microorganismo
nativo puesto que no requiere la manipulacioacuten de microorganismos patoacutegenos ya que
la expresioacuten de las proteiacutenas recombinantes se lleva adelante en microorganismos no
infectivos de raacutepido crecimiento (Babaie y col 2013)
Por lo arriba expresado debe seguirse un esquema para seleccionar cuales deben de
ser las proteiacutenas que conviene utilizar acorde al diagnoacutestico que se pretende abordar y
ello demanda un trabajo racional de seleccioacuten de antiacutegenos generalmente
inmunodominantes No obstante escoger tales proteiacutenas no es tarea sencilla por cuanto
la verificacioacuten del grado de bondad del Ang seleccionado exige una ardua tarea
experimental siendo conveniente acotar el nuacutemero de Angs alternativos a evaluar Un
modo de encarar esto es procurar predecir el grado de antigenicidad en base a la
secuencia aminoaciacutedica lo cual puede realizarse computacionalmente
214 Prediccioacuten de epiacutetopes reconocidos por ceacutelulas B
Los programas de prediccioacuten definen el grado de antigenicidad por medio de una
puntuacioacuten (score) en algunos casos para cada epiacutetope y en otros para cada residuo
amino aciacutedico En este uacuteltimo se puede definir una regioacuten antigeacutenica cuando varios
residuos con alta puntuacioacuten son adyacentes en la estructura primaria Por otra parte el
nuacutemero de epiacutetopes o regiones antigeacutenicas que los programas de prediccioacuten encuentran
depende de un umbral que es configurado por el usuario
En la actualidad los inmunoensayos para determinar anticuerpos son realizados
utilizando regiones antigeacutenicas definidas ya sea como moleacuteculas uacutenicas mezcla de
varios componentes o como antiacutegenos de fusioacuten multiepiacutetope (Camussone 2009) El
desarrollo de herramientas informaacuteticas para predecir de forma fiable la antigenicidad
de los epiacutetopes puede reducir el costoso y prolongado trabajo experimental requerido
para identificar las regiones de intereacutes (Namrata amp Rajat 2010) Al momento de
identificar estas regiones antigeacutenicas suele contarse soacutelo con la estructura primaria de
las proteiacutenas en estudio desconocieacutendose su estructura terciaria en la mayoriacutea de los
Introduccioacuten
11
casos De aquiacute que la prediccioacuten de epiacutetopes lineales es el meacutetodo maacutes utilizado para
seleccionar epiacutetopes putativos
Desde el informe inicial de Hopp y Woods en 1981 (Hopp amp Woods 1981) varios
procedimientos se han hecho populares para detectar epiacutetopes lineales reconocidos por
ceacutelulas B a partir de la estructura primaria de una proteiacutena El rendimiento de estos
programas auacuten no ha logrado una eficiencia oacuteptima seguacuten lo declarado por sus propios
autores (Kolaskar amp Tongaonkar 1990 Saha y col 2005 Saha amp Raghava 2006
Larsen y col 2006 Davydov amp Tonevitskii 2009)
La literatura sobre las aplicaciones de estos programas estaacute orientada
principalmente a identificar posibles vacunas (Namrata amp Rajat 2010) Por lo tanto la
sensibilidad (probabilidad de obtener un positivo entre los verdaderos positivos) y la
especificidad (probabilidad de obtener un negativo entre aquellos negativos verdaderos)
son los indicadores maacutes utilizados para evaluar la calidad de estos programas ya que un
uacutenico epiacutetope puede ser crucial para lograr una respuesta inmunoprotectora Al mismo
tiempo suele omitirse el valor predictivo positivo (VPP) que es la proporcioacuten de
muestras que dan positivo el ensayo siendo verdaderos positivos o sea es la capacidad
para encontrar los epiacutetopes reales de una proteiacutena (ver el recuadro 1) Sin embargo la
fiabilidad del epiacutetope predicho es maacutes importante que su sensibilidad para reducir el
nuacutemero de experimentos confirmatorios de su utilidad diagnoacutestica Es entonces
importante diferenciar ambos paraacutemetros ya que los programas de prediccioacuten pueden
realizar predicciones de baja sensibilidad pero al mismo tiempo si los epiacutetopes reales
fueron predichos la prediccioacuten presenta un alto VPP
Recuadro 1
Los casos posibles en un ensayo son
Verdaderos
positivos
Verdaderos
negativos
Ensayo
positivo A B
Ensayo
negativo C D
BA
A positivo predictivoValor
DB
D dadEspecifici
CA
A adSensibilid
Introduccioacuten
12
La falta de estudios comparativos entre los programas de prediccioacuten en la literatura
actual impide que los usuarios hagan la mejor eleccioacuten Por ello como trabajo inicial se
intentoacute evaluar los distintos programas disponibles en la red en cuanto a su capacidad
para predecir positivamente epiacutetopes
Introduccioacuten
13
22 Tuberculosis
221 Generalidades
La tuberculosis (TB) humana es una enfermedad infecto-contagiosa causada por la
bacteria Mycobacterium tuberculosis La infeccioacuten por M tuberculosis suele ser
asintomaacutetica en personas sanas dado que su sistema inmune es capaz de controlar la
bacteria No obstante en condiciones de desnutricioacuten o inmunocompromiso la
enfermedad suele ser grave La TB es una enfermedad vinculada a la pobreza que
puede afectar a adultos joacutevenes en edad productiva
La enfermedad se transmite por el aire de una persona a otra a traveacutes de gotiacuteculas
que portan bacterias Cuando una persona con infeccioacuten activa en pulmones o garganta
tose estornuda habla o canta las personas cercanas pueden respirar las bacterias
liberadas e infectarse
La enfermedad suele afectar los pulmones pero tambieacuten puede involucrar otros
oacuterganos como rintildeones columna vertebral y cerebro Los siacutentomas de la TB pulmonar
activa son tos a veces con esputo sanguinolento dolor toraacutecico debilidad peacuterdida de
peso fiebre y sudoracioacuten nocturna Si no se trata adecuadamente puede ser mortal La
mayoriacutea de las muertes por TB se producen en los paiacuteses en viacuteas de desarrollo (Paacutegina
web del CDC b)
La Organizacioacuten Mundial de la Salud (OMS) estima en 2000 millones a los
infectados por M tuberculosis que anualmente hay 9 millones de nuevos infectados y
que mueren casi 2 millones de personas al antildeo por causa de esta enfermedad (Paacutegina
web de la OMS)
222 Mycobacterium tuberculosis
Esta micobacteria tambieacuten conocida como Bacilo de Koch es una bacteria aacutecido-
alcohol resistente frecuentemente incolora y es aeroacutebica estricta Es muy resistente al
friacuteo la congelacioacuten y la desecacioacuten y por el contrario es muy sensible al calor la luz
solar y la luz ultravioleta Su replicacioacuten es muy lenta (una divisioacuten cada 16 a 20 horas)
y ante circunstancias adversas puede entrar en estado latente pudiendo retrasar su
multiplicacioacuten desde algunos diacuteas hasta varios antildeos El reservorio natural de M
tuberculosis es el hombre tanto el individuo infectado asintomaacutetico como el enfermo
con infeccioacuten activa Su clasificacioacuten taxonoacutemica se detalla en la Tabla 22
Introduccioacuten
14
Tabla 22 Ubicacioacuten taxonoacutemica de M tuberculosis
Reino Bacteria
Phylum Actinobacteria
Clase Actinobacteria
Sub-clase Actinobacteridae
Orden Actinomycetales
Sub-orden Corynebacterineae
Familia Mycobacteriaceae
Geacutenero Mycobacterium
Especie tuberculosis
223 Diagnoacutestico
El diagnoacutestico de la infeccioacuten tuberculosa se basa en una serie de estudios que se
inicia con placas radiograacuteficas pulmonares y la prueba de la tuberculina que pone de
manifiesto un estado de hipersensibilidad del hueacutesped frente a proteiacutenas de M
tuberculosis Esta sensibilidad se adquiere o bien por infeccioacuten con el bacilo o por
vacunacioacuten con cepas no infectivas (vacuna BCG) En una segunda etapa la infeccioacuten
activa es confirmada por identificacioacuten del agente etioloacutegico en cultivos obtenidos a
partir de la muestra bioloacutegica remitida al laboratorio Auacuten cuando la conjuncioacuten de los
meacutetodos de anaacutelisis vigentes permite un diagnoacutestico certero de la TB humana es
frecuente que se requiera de un prolongado tiempo de espera hasta la confirmacioacuten de la
infeccioacuten activa por cuanto ello depende del lento proceso de replicacioacuten del bacilo
Esto conlleva que exista potencialidad de contagio a individuos sanos y se comprometa
maacutes la salud del infectado
En los uacuteltimos antildeos se han desarrollado teacutecnicas de deteccioacuten de M tuberculosis
que involucran al bacterioacutefago D29 (en adelante fago) capaz de infectar
especiacuteficamente micobacterias (Park y col 2003 Mc Nerney y col 2004) Esta
metodologiacutea se basa en procesar la muestra del paciente sospechada de contener M
tuberculosis ponerla en contacto con el fago e incubarla para permitir su replicacioacuten
Finalmente se evaluacutea el tiacutetulo de los fagos liberados infectando un cultivo testigo de M
smegmatis (micobacterias de raacutepido crecimiento susceptibles al fago) y contando las
placas de lisis que se obtienen Esta novedosa metodologiacutea si bien indirecta y
preliminar permite reducir considerablemente los tiempos de diagnoacutestico puesto que se
trabaja con especies de crecimiento raacutepido Sin embargo al utilizar el conteo de placas
de lisis como eje central para el diagnoacutestico de infeccioacuten activa se recae en largos
Introduccioacuten
15
periacuteodos de incubaciones que podriacutean evitarse si se contase con otro meacutetodo de evaluar
la integridad celular de M smegmatis
Por lo arriba expuesto es que en este trabajo se intento desarrollar una nueva
metodologiacutea de verificacioacuten de lisis de micobacterias utilizando teacutecnicas
intriacutensecamente raacutepidas como son las electroquiacutemicas que en un futuro podriacutean
facilitar el diagnoacutestico de infeccioacuten tuberculosa
Introduccioacuten
16
23 Biodiesel
El grave impacto de la utilizacioacuten de combustibles derivados del petroacuteleo en el
medio ambiente la limitada disponibilidad de petroacuteleo crudo y sobre todo la
inestabilidad de los mercados del petroacuteleo han estimulado actualmente la propagacioacuten
de combustibles liacutequidos alternativos (Monteiro y col 2008) La organizacioacuten
American Society for Testing and Materials ASTM define biodiesel como una mezcla
de eacutesteres monoalquiacutelicos de aacutecidos grasos de cadena larga derivados de aceites
vegetales o grasas animales (American Society for Testing and Materials paacutegina web)
El biodiesel puro generalmente no se utiliza como combustible sino que suele
encontrase en mezcla con diesel de petroacuteleo El biodiesel es clasificado utilizando la
notacioacuten Bxx donde xx indica el porcentaje en volumen de contenido de biodiesel en el
liacutequido Asiacute B100 es biodiesel puro B50 contiene 50 en volumen de biodiesel B5
contiene 5 en volumen etc Las mezclas comerciales maacutes comunes son B2 B5 y B20
El biodiesel se obtiene a partir de la transesterificacioacuten de gliceroliacutepidos con
alcoholes de cadena corta como el etanol o el metanol siendo el glicerol el principal
subproducto en la elaboracioacuten de este combustible junto a productos menores como
mono y diacil gliceroles o aacutecidos grasos libres La masa de glicerol generada equivale
aproximadamente al 10 en peso del total del combustible producido siendo eacuteste uno
de los contaminantes frecuentes
231 Determinacioacuten de glicerol libre en biodiesel
La presencia de glicerol es indicativa de la calidad del biodiesel transformaacutendose
en un analito de intereacutes para la creciente industria de energiacuteas alternativas a la derivada
del refinamiento del petroacuteleo
Los meacutetodos quiacutemicos maacutes simples para cuantificar glicerol se basan en su
oxidacioacuten a formaldehiacutedo utilizando peryodato Luego el formaldehiacutedo formado se
determina cuantitativamente por diversos meacutetodos ya sea basados en reacciones
especiacuteficas evaluando los productos por diferentes metodologiacuteas o por titulacioacuten con
NaOH valorado (Lapenaite y col 2007)
La norma ASTM-D 6584 establece un meacutetodo basado en cromatografiacutea gaseosa
que permite la determinacioacuten en simultaacuteneo de glicerina libre y total (glicerol maacutes
mono di y trigliceacuteridos) No obstante este procedimiento no es aplicable a los eacutesteres
metiacutelicos de aceites vegetales obtenidos a partir de aceites laacuteuricos tales como aceite de
Introduccioacuten
17
coco o de palma quedando restringido el meacutetodo soacutelo para un grupo de biodiesels
particulares
En cuanto a los meacutetodos cromatograacuteficos tienen la desventaja de ser poco
amigables con el medio ambiente dado el profuso uso de solventes orgaacutenicos que son
potencialmente contaminantes a veces se tornan laboriosos y utilizan instrumental e
insumos caros
Considerando lo expresado arriba en este trabajo se ha planteado cuantificar
glicerol utilizando una metodologiacutea esencialmente econoacutemica simple y no
contaminante como lo son las teacutecnicas electroquiacutemicas convencionales
Introduccioacuten
18
24 Marco teoacuterico de las teacutecnicas electroquiacutemicas utilizadas
Los meacutetodos electroquiacutemicos de anaacutelisis estudian el analito de intereacutes mediante la
medicioacuten de los paraacutemetros fiacutesicos como potencial eleacutectrico yo corriente en una celda
electroquiacutemica El proceso fundamental en las teacutecnicas electroquiacutemicas es la
transferencia de electrones entre especies redox y la superficie del electrodo (Bard amp
Faulkner 2001) Este puede describirse con la siguiente reaccioacuten
O + ne- R [21]
Para reacciones reversibles y raacutepidas el potencial sigue la ley de Nernst
[22]
siendo y las actividades de las especies reducida y oxidada en la interfaz
electrodosolucioacuten respectivamente
La corriente que circula por la celda es la carga transportada por unidad de tiempo y
puede expresarse como
[23]
De acuerdo a las leyes de Faraday la carga circulante (Q) es proporcional a los
moles de especie reducida u oxidada (N) El factor de proporcionalidad es la carga del
electroacuten (n) por la constante de Faraday (F)
[24]
Combinando las Ecs 23 y 24 obtenemos
[25]
A medida que avanza la reaccioacuten se consume la especie electroactiva esto
produce un gradiente de concentracioacuten entre el seno de la solucioacuten y las inmediaciones
del electrodo donde la especie es electrotransformada y consecuentemente asociado se
Introduccioacuten
19
generaraacute un transporte de masa por difusioacuten Si el proceso estaacute bajo control difusional
la primera ley de Fick permite describir el flujo de partiacuteculas en funcioacuten de la posicioacuten
ec 26 y la segunda ley de Fick lo describe en funcioacuten de la variacioacuten de la
concentracioacuten de la especie electroactiva en funcioacuten del tiempo ec 27
[26]
[27]
donde D es el coeficiente de difusioacuten de la especie en estudio El gradiente de
concentracioacuten se generaraacute soacutelo para la especie electroactiva que se transforma en la
superficie del electrodo y su transporte de masa se verificaraacute en direccioacuten ndashx es decir
hacia el electrodo si se define x = 0 en la superficie Luego considerando la reaccioacuten de
reduccioacuten ec 21 el flujo J corresponderaacute al nuacutemero de partiacuteculas de O que cambian de
posicioacuten en direccioacuten -x con el tiempo por unidad de aacuterea y puede expresarse como
[28]
Combinando las ecs 26 27 y 28 obtenemos la expresioacuten combinada de las leyes
de Fick para una especie que estaacute reaccionando sobre un electrodo de aacuterea A
[29]
o directamente
[210]
Reemplazando en la ec 25 obtenemos una expresioacuten para la corriente (I) que
circula por la celda en la que se lleva a cabo la reaccioacuten ec 21 sobre un electrodo
uniformemente accesible de aacuterea A y cuando el transporte de masa es exclusivamente
controlado por difusioacuten
[211]
expresioacuten que indica que la corriente es directamente proporcional al gradiente de
concentracioacuten generado por efecto de la reaccioacuten electroacutedica
Introduccioacuten
20
Para un sistema en estado estacionario en el cual la velocidad de transformacioacuten de
la especie electroactiva es igual a la de transferencia de masa y suponiendo que la
reaccioacuten cumple las condiciones de rapidez y reversibilidad (Ec de Nernst) podemos
llegar a describir la relacioacuten entre la corriente circulante por la celda y el potencial al
cual se lleva adelante la reaccioacuten por
[212]
donde KR y KO son constantes que dependen del aacuterea del electrodo de trabajo y los
coeficientes de difusioacuten de las especies reducida y oxidada respectivamente e Il es la
corriente liacutemite
Se define como potencial de media onda al potencial al cual el valor de corriente es
la mitad del valor de corriente liacutemite y queda expresado por la siguiente ecuacioacuten
[213]
Tomando esta definicioacuten y operando en la ec 212 se arriba a la expresioacuten que
describe la corriente como funcioacuten del potencial de electrodo
ndash [214]
ecuacioacuten que corresponde a una funcioacuten sigmoidea por lo tanto al realizar un barrido
de potencial desde un potencial al cual no existe reaccioacuten electroacutedica hacia un potencial
al cual es posible reducir la especie electroactiva hasta alcanzar el estado estacionario la
corriente variaraacute con el potencial siguiendo la forma de una curva sigmoidea
Durante la ejecucioacuten del presente trabajo se utilizaron diversas teacutecnicas
voltamperomeacutetricas cronoamperometriacutea voltametriacutea de barrido lineal voltametriacutea
ciacuteclica y voltametriacutea de onda cuadrada Se pasa a comentar brevemente cada una de
ellas
241 Cronoampreometriacutea
En esta teacutecnica se estudia como variacutea la corriente que circula por la celda en
funcioacuten del tiempo transcurrido mientras el electrodo de trabajo es sometido a un
Introduccioacuten
21
determinado potencial Al aplicar un pulso de potencial se modifica el equilibrio de la
reaccioacuten redox ec 21 se pasa de un potencial inicial donde no ocurre reaccioacuten
electroacutedica a un potencial donde las especies pueden intercambiar electrones en la
interfaz electrodosolucioacuten favoreciendo la reaccioacuten en uno u otro sentido dependiendo
del potencial aplicado Esto da lugar a una corriente liacutemite difusional que variacutea en
funcioacuten del tiempo Para un electrodo uniformemente accesible esta corriente estaacute
descripta por la ec 211 Fijando las condiciones de contorno correspondientes al
experimento en cuestioacuten
t = 0 C0 = Cinfin (no hay reaccioacuten en el electrodo)
t ge0 lim C = Cinfin
t ge0 C0 = 0
donde C0 y Cinfin son las concentraciones de la especie electroactiva en la interfaz
electrodosolucioacuten y en el seno de la solucioacuten respectivamente Es posible entonces
resolver la ecuacioacuten diferencial de la segunda ley de Fick donde la solucioacuten viene dada
por la denominada ecuacioacuten de Cottrell
[215]
donde Id(t) es la corriente controlada por difusioacuten
En este trabajo se utilizoacute esta teacutecnica porque permite cuantificar glicerol utilizando
diferentes electrodos de trabajo seguacuten el medio especiacutefico donde se encuentre disuelto
242 Teacutecnicas voltameacutetricas
Todas las teacutecnicas voltameacutetricas tienen en comuacuten que el potencial eleacutectrico al que
se somete el electrodo de trabajo variacutea en funcioacuten del tiempo En todos los casos se
realiza un barrido lineal de potencial que va desde el potencial inicial (Ei) hasta un
potencial final (Ef) Este barrido se realiza a una velocidad constante que es el cociente
entre el salto (discreto) de potencial y el tiempo de duracioacuten de ese salto La forma en
que se realiza el barrido de potencial es lo que diferencia a una teacutecnica voltameacutetrica de
otra
Introduccioacuten
22
2421 Voltametriacutea de barrido lineal
En esta teacutecnica se realiza un barrido desde un potencial inicial (Ei) al cual no existe
proceso de transferencia de electrones en la interfaz electrodosolucioacuten y soacutelo podraacute
apreciarse corriente debida a procesos no faraacutedicos hasta un potencial final (Ef) En la
medida que el potencial aumenta alcanza un valor al cual ocurre la reaccioacuten electroacutedica
comenzando un flujo de carga debido a procesos faraacutedicos En la Fig 25 se muestra el
perfil del potencial en funcioacuten del tiempo utilizando el modo normal (en peldantildeos) para
el caso de los experimentos realizados con el instrumento utilizado en el presente
trabajo (Eco Chemie 2000)
Figura 25 Perfil de potencial en funcioacuten del tiempo Si bien el potencial es una variable continua un
potenciostato real solo puede establecer variaciones discretas de potencial de aquiacute que en lugar de
observar una ―rampa se observe una escalera
Para una reaccioacuten de reduccioacuten reversible ec 21 a medida que el potencial
aumenta se incrementaraacute la corriente siguiendo la forma de una sigmoidea (seguacuten la ec
21) Sin embargo cuando la velocidad de transporte de masa por difusioacuten de la especie
O sea menor que la velocidad de consumo por la reaccioacuten electroacutedica no seraacute posible
alcanzar el estado estacionario y la corriente llegaraacute a un maacuteximo Ip De aquiacute en maacutes la
corriente comenzaraacute a decaer con t12
tal como lo describe la ecuacioacuten de Cottrell ec
215 En la Fig 26 se muestra el perfil de corriente que se obtienen en experimentos
voltameacutetricos claacutesicos
t
Salto de potencial
Duracioacuten del salto
E
Introduccioacuten
23
Figura 26 Perfiles de corriente en funcioacuten del potencial para experimentos voltameacutetricos de barrido
lineal Liacutenea azul la velocidad de barrido es lo suficientemente baja establecieacutendose un estado
estacionario Liacuteneas verde negra y roja la velocidad de barrido es alta y se origina un pico de corriente
La corriente de pico crece proporcionalmente a la raiacutez cuadrada de la velocidad de barrido
El maacuteximo de corriente tambieacuten denominado corriente de pico se puede obtener a
partir de la ecuacioacuten de Randles-Sevcik (Bard amp Faulkner 2001)
[216]
siendo la temperatura 25 degC y donde A estaacute en cm2 D en cm
2 s
-1 C en mol cm
-3 y en
V s-1
2422 Voltametriacutea ciacuteclica
En esta teacutecnica se realiza un barrido desde un potencial inicial (Ei) a un primer
veacutertice de potencial (Ev1) y a partir de alliacute se invierte la direccioacuten de barrido hasta
llegar a un segundo veacutertice de potencial (Ev2) el cual puede coincidir con el Ei El perfil
de potencial en funcioacuten del tiempo que se obtiene utilizando el instrumento con el que
se trabajoacute y de acuerdo a lo indicado por el fabricante se esquematiza en la Fig 27
(izquierda) y el perfil de corriente en funcioacuten del potencial para una reaccioacuten reversible
se esquematiza en la Fig 27 (derecha)
Idif
IP
Introduccioacuten
24
Fig 27 Perfil de potencial en funcioacuten del tiempo (izquierda) Perfil de corriente en funcioacuten del
potencial para una reaccioacuten redox reversible (derecha)
En este trabajo se realizaron experimentos de voltametriacutea ciacuteclica para identificar la
presencia de mediadores redox que presentando reacciones electroacutedicas reversibles
permitieran la regeneracioacuten del cofactor de la enzima glicerol deshidrogenasa (GlDH)
Esta teacutecnica tambieacuten se utilizoacute para calcular las aacutereas de los electrodos de trabajo de
modo tal de normalizar la sentildeal obtenida con la superficie del electrodo utilizado
Ademaacutes se utilizoacute para cuantificar glicerol e identificar los potenciales de oxidacioacuten del
mismo
243 Teacutecnicas de pulso
Las teacutecnicas de pulso surgieron vinculadas a la polarografiacutea de corriente continua
la teacutecnica voltameacutetrica cuya particularidad es utilizar un electrodo de goteo de mercurio
Este grupo de teacutecnicas se ha ido diversificando a medida que se fueron haciendo maacutes
complejos tanto los esquemas de potenciales aplicados a los electrodos de trabajo
como las medidas de intensidades de corrientes (Bard amp Faulkner 2001)
2431 Voltamperometriacutea onda cuadrada VOC
Esta teacutecnica tiene varias ventajas entre las que se encuentran su excelente
sensibilidad (se han registrado liacutemites de deteccioacuten directa del orden de 10-8
M) la
eliminacioacuten de las corrientes de fondo y la rapidez con que se lleva a cabo el
experimento completo ya que se puede trabajar a velocidades de barrido de potencial
auacuten superiores a 1 V s-1
(Bard amp Faulkner 2001)
El perfil de potencial aplicado al electrodo de trabajo en funcioacuten del tiempo en la
VOC se presenta en la Fig 28 Consta de una onda cuadrada simeacutetrica con una
amplitud Ep superpuesta a una escalera de potencial con escalones o saltos de
potencial Es (Fig29) donde el pulso hacia adelante de la onda cuadrada coincide con
el escaloacuten de potencial de la escalera
E
I
Introduccioacuten
25
La utilizacioacuten de la teacutecnicas voltamperomeacutetricas de pulso presentan la ventaja de
permitir realizar un barrido de potencial donde la especie electroactiva se oxida
raacutepidamente produciendo una sentildeal analiacutetica No es necesario trabajar durante periacuteodos
prolongados de tiempo a los elevados potenciales donde se establece la corriente liacutemite
controlada por difusioacuten como lo requiere la teacutecnica amperomeacutetrica
Figura 28 Perfil de potencial aplicado al electrodo de trabajo en la VOC en funcioacuten del tiempo En
liacutenea cortada se indica cual es la escalera de potencial a la cual se le sobreimprime la onda cuadrada Se
indican resaltados ( ) los tiempos durante los que se realizan las lecturas de corriente En un ciclo se
realizan las lecturas de corrientes alta y baja Adaptado de Bard amp Faulkner 2001
Figura 29 a) Onda cuadrada simeacutetrica b) Perfil de potencial en funcioacuten del tiempo de una escalera
de potencial
a)
b)
E
E
E
t
Amplitud de la
onda cuadrada EP
Periacuteodo de la onda
Salto o escaloacuten
de potencial ES
Medida
alta
Medida
baja
t
Salto o escaloacuten
de potencial ES
t
Amplitud de la
onda cuadrada
EP
Periacuteodo de la onda
Introduccioacuten
26
El potensiostato registra la corriente durante la medida alta y la medida baja de un
ciclo La diferencia de estas corrientes es la corriente neta Ineta que se grafica en
funcioacuten del potencial de la escalera de potencial correspondiente a ese ciclo (liacutenea
cortada Fig 28) Para sistemas reversibles se obtiene una curva como se observa en la
Fig 210 donde se indican las corrientes de la medida alta de la medida baja y neta
que resulta en un pico de corriente La corriente de pico neta IP n observada en la VOC
es proporcional a la concentracioacuten de la especie electroactiva en el seno de la solucioacuten y
se centra alredewdor del potencial de la cupla redox
Figura 210 Voltamperograma de onda cuadrada tiacutepico para un sistema reversible la corriente neta
Ineta se obtiene por la diferencia entre la corriente registrada al finalizar el pulso I medida alta y la
corriente registrada previamente al nuevo pulso I medida baja
La frecuencia ( f ) de la onda cuadrada medida en Hz se define como
1f [217]
Siendo el periacuteodo de la onda cuadrada medido en segundos que a su vez es dos
veces el tiempo del pulso Pt por lo tanto tenemos que
P2
1
tf [218]
Luego
ft
2
1P [219]
Los valores de frecuencia pueden variar desde unos pocos Hz hasta varios miles
dependiendo de las condiciones particulares del caso La velocidad de barrido v queda
definida como el producto del salto de potencial ES por la frecuencia f
fSEv [220]
Introduccioacuten
27
Las velocidades de barrido en los experimentos de VOC se obtienen modificando la
frecuencia de la onda cuadrada ya que el salto de potencial suele ser un valor fijo
Se demostroacute que para cuplas redox controladas por difusioacuten los paraacutemetros de la
VOC maacutes adecuados son E = 50n mV y Es = 10n mV (Osteryoung y Osteryoung
1985)
Cuando se aplica un pulso de potencial en las cercaniacuteas del potencial de la cupla
redox las corrientes faradaicas aumentan significativamente conforme se oxida o se
reduce la especie electroactiva Estas corrientes decaen con el tiempo seguacuten la ecuacioacuten
de Cottrel ya expresada anteriormente como ec [215]
Si consideramos t como tP se observa que la disminucioacuten del tiempo del pulso
implica mayor corriente Luego a medida que se aumenta la frecuencia aumenta la
velocidad de barrido y disminuye el tiempo del pulso Para sistemas reversibles se
predice que la intensidad tiene una dependencia lineal con la raiacutez cuadrada de la
frecuencia (Osteryoung y Osteryoung 1985)
21 fBAnIp [221]
La eleccioacuten de la frecuencia adecuada es de suma importancia A frecuencias muy
altas aumentan significativamente las corrientes capacitivas perdiendose resolucioacuten lo
que impone un liacutemite al aumento de la frecuencia
25 Biosensores
En muchas determinaciones de analitos en muestras bioloacutegicas se necesitan pasos
previos a la evaluacioacuten propiamente dicha que permiten eliminar o enmascarar las
potenciales interferencias Sin embargo el pretratamiento de la muestra puede llevar a
una disminucioacuten de la concentracioacuten del analito ya sea por peacuterdidas en las etapas
consecutivas del anaacutelisis o por transformacioacuten del analito provocando errores por
defecto en la determinacioacuten (Lagier amp Verdini 2000) Cuando la evaluacioacuten de la
concentracioacuten del analito se utiliza con fines cliacutenicos tal resultado erroacuteneo puede
conducir a un diagnoacutestico incorrecto Es por ello que en la actualidad el desarrollo de
nuevas metodologiacuteas analiacuteticas tiende no soacutelo a acortar los tiempos de anaacutelisis
previnieacutendose asiacute las peacuterdidas por degradacioacuten del analito sino que ademaacutes procura
permitir la ejecucioacuten del anaacutelisis sin pasos separativos previos
En los uacuteltimos antildeos se ha avanzado en el desarrollo de biosensores ya que estos
dispositivos presentan ventajosas caracteriacutesticas que los convierten en herramientas
Introduccioacuten
28
prometedoras de anaacutelisis (Belluzo y col 2008) Los biosensores se pueden definir como
dispositivos analiacuteticos compuestos por dos componentes principales
1- Una superficie selectiva denominada bioreceptor o superficie bioreactiva (SBR)
generalmente de origen bioloacutegico o sinteacutetica biomimeacutetica la cual en contacto con la
muestra es capaz de interaccionar de manera especiacutefica con el analito (Vo-Dinh amp
Allain 2003) Este elemento es el que aporta la especificidad del dispositivo
2- Un transductor fiacutesico-quiacutemico encargado de producir una sentildeal que es funcioacuten
de la interaccioacuten entre el analito y la SBR (Vo-Dinh amp Allain 2003) Eacuteste es el
elemento que aporta la sensibilidad al dispositivo
Los biosensores pueden ser clasificados de acuerdo a la sentildeal fiacutesico-quiacutemica que
produce el transductor de acuerdo a
Sentildeal Biosensor
Cambio de temperatura Termomeacutetrico
Cambio en paraacutemetro eleacutectrico Electroquiacutemico
Cambio en propiedades de la luz Oacuteptico
Cambio de masa Piezoeleacutectrico Acuacutestico
(Adaptado de Vo-Dinh amp Allain 2003)
De los distintos tipos de biosensores los electroquiacutemicos han sido tradicionalmente
los maacutes desarrollados y usados debido a sus ventajas con respecto a otros biosensores
tales como la generacioacuten de una respuesta electroacutenica directa que permite una raacutepida
respuesta mayor simplicidad operativa versatilidad para la miniaturizacioacuten y bajo
costo Actualmente gracias al avance de la tecnologiacutea de los semiconductores y la
serigrafiacutea pueden ser producidos masivamente Dependiendo del paraacutemetro fiacutesico
medido por el detector los biosensores electroquiacutemicos pueden a su vez subdividirse en
conductimeacutetricos potenciomeacutetricos y amperomeacutetricos (Vo-Dinh amp Allain 2003)
251 Superficie de bioreconocimiento en biosensores
La SBR es un sistema bioloacutegico o biomimeacutetico que reacciona bioquiacutemica o
quiacutemicamente con el analito En la actualidad existe una gran diversidad de elementos
bioloacutegicos o derivados de ellos que son utilizados como SBR
Los mismos van desde moleacuteculas simples a sistemas complejos (Vo-Dinh amp Allain
2003) Asiacute la SBR puede contener antiacutegenos anticuerpos aacutecidos desoxiribonucleicos
(ADN) aacutecidos ribonueleicos (ARN) enzimas receptores de membrana tejidos
Introduccioacuten
29
microorganismos completos o compuestos sintetizados ―ad-hoc que emulan especies
bioloacutegicas como pueden ser estructuras biomimeacuteticas y poliacutemeros molecularmente
impresos (Vo-Dinh amp Allain 2003)
252 Biosensores amperomeacutetricos
De los biosensores electroquiacutemicos los amperomeacutetricos suelen presentar mayores
sensibilidades (Iost y col 2011)
En la Fig 211 se esquematiza un biosensor amperomeacutetrico El analito presente en
la muestra compleja reacciona selectivamente con la SBR lo que desencadena la sentildeal
analiacutetica en el transductor fiacutesico-quiacutemico
En este caso particular el transductor es un electrodo de trabajo que integra una
celda de tres electrodos El mismo estaacute sometido a un potencial eleacutectrico (con respecto a
un electrodo de referencia) y la sentildeal analiacutetica es la corriente eleacutectrica que circula por la
celda utilizando un contraelectrodo de gran aacuterea En estas condiciones la maacutexima
intensidad de corriente eleacutectrica que se observa estaacute limitada exclusivamente por la
reaccioacuten de oacutexido-reduccioacuten que ocurre en la superficie del electrodo de trabajo
Figura 211 El electrodo de trabajo es sometido a un potencial eleacutectrico en su superficie tiene lugar
la reaccioacuten de oacutexido-reduccioacuten Dicha reaccioacuten ocurre o no o bien transcurre a velocidades diferentes en
presencia o ausencia del analito de intereacutes
253 Biosensores de uso cliacutenico
En el caso de muestras para el diagnoacutestico cliacutenico de infecciones el analito a
determinar puede ser alguna de las moleacuteculas generadas por el individuo infectado
como respuesta a la presencia del agente infeccioso por ej los anticuerpos (Acs)
especiacuteficos o el agente infeccioso iacutentegro o partes del mismo En muchos casos la sola
presencia de Acs especiacuteficos es por siacute misma indicativa de infeccioacuten Hay casos en que
Introduccioacuten
30
la presencia de Acs no es per-seacute indicativa de infeccioacuten riesgosa Dos ejemplos de esta
situacioacuten son el de la toxoplasmosis y la tuberculosis
En el caso de la toxoplasmosis la deteccioacuten de Acs anti-T gondii es soacutelo de
trascendental importancia en embarazadas porque si la infeccioacuten ha sido adquirida
durante el embarazo el feto estaacute en riesgo de contagiarse y puede padecer lesiones
severas (Dunn y col 1999 Montoya amp Liesenfeld 2004) Por el contrario si se trata
de infeccioacuten croacutenica no es necesario exponer a la embarazada (y al feto) a medicacioacuten
innecesaria evitaacutendose con ello los riesgos que devienen del uso de los faacutermacos
especiacuteficos utilizados durante el tratamiento de la infeccioacuten (Freij amp Sever 1999)
Debido a la incertidumbre que acompantildea la deteccioacuten de los anticuerpos hasta hoy
utilizados con este fin se ha propuesto realizar pruebas utilizando antiacutegenos
recombinantes del paraacutesito Se ha evaluado el desempentildeo de antiacutegenos recombinantes
sintetizados por teacutecnicas de biologiacutea molecular en forma individual o mezclados para
evaluar la avidez de Acs IgG (Beghetto y col 2003) Se observoacute que utilizando el
fragmento del antiacutegeno MIC3 en este ensayo los iacutendices de avidez permitieron
determinar la antiguumledad de la infeccioacuten con mayor grado de certeza que empleando
homogenado total de paraacutesito resultando MIC3 un buen marcador para el diagnoacutestico
de infecciones agudas (Beghetto y col 2003) La proteiacutena recombinante P35 tambieacuten
fue propuesta como marcador seroloacutegico para diferenciar infeccioacuten aguda de croacutenica ya
que evidencioacute sensibilidades del 853 para sueros agudos y una especificidad del 98
respecto de sueros croacutenicos (Parmley y col 2000) No obstante y a pesar de haberse
descrito moleacuteculas para el diagnoacutestico de toxoplasmosis aguda no existe un acuerdo
sobre su efectividad por lo que se requiere de la evaluacioacuten de nuevos antiacutegenos para
este fin En general el uso de una sola moleacutecula recombinante no brinda suficiente
sensibilidad habieacutendose demostrado que el empleo de varios antiacutegenos recombinantes
la mejora (Pinon y col 2003) Se ha observado tambieacuten que una mezcla de moleacuteculas
no produce los mismos resultados que cuando se utilizan en forma separada (Silveira y
col 2001) Se ha postulado que esta diferencia se debe a las distintas caracteriacutesticas
fisicoquiacutemicas entre las moleacuteculas de una mezcla que impide la inmovilizacioacuten
homogeacutenea en las superficies de captura utilizadas en los inmunoensayos Por lo tanto
resulta muy factible que un ensayo que utilice una combinacioacuten o fusioacuten en una sola
moleacutecula de estos antiacutegenos recombinantes marcadores de infeccioacuten reciente pueda
mejorar el diagnoacutestico diferencial tal como ha sido demostrado para el diagnoacutestico de
otras infecciones (Camussone y col 2009)
Introduccioacuten
31
En el caso de la tuberculosis la mayoriacutea de los individuos de la poblacioacuten han
recibido la vacunacioacuten reglamentaria por inoculacioacuten de una cepa de micobacterias
inofensivas generando Acs anti-Mycobacterium tuberculosis (M tuberculosis) Por
ello estos Acs suelen estar presentes en casi toda la poblacioacuten De aquiacute que la deteccioacuten
de Acs anti-M tuberculosis no demuestra infeccioacuten activa de riesgo Por tal motivo el
indicador por excelencia de infeccioacuten activa es la evidenciacioacuten del patoacutegeno en la
muestra No obstante las muestras suelen poseer una extremadamente baja cantidad de
M tuberculosis lo que dificulta su deteccioacuten directa Por ello es preciso utilizar alguacuten
paso amplificador del analito a censar Dado el largo tiempo de replicacioacuten del
microorganismo los cultivos realizados para su replicacioacuten insumen periacuteodos
prolongados Siguiendo los trabajos de Park y col y McNerney y col (Park y col
2003 McNerney y col 2004) se formuloacute la siguiente hipoacutetesis de trabajo Sistemas
enzimaacuteticos presentes en M smegmatis permitiriacutean metabolizar sustratos electroactivos
a distintas velocidades de reaccioacuten dependiendo de la integridad del microorganismo
Siendo este el caso seriacutea posible distinguir entre cultivos de M smegmatis que han sido
lisados por el fago especiacutefico D29 de aquellos cultivos en que dichas micobacterias
estaacuten iacutentegras Si soacutelo existiera lisis cuando la muestra ensayada contiene organismos
filogeneacuteticamente emparentados como M tuberculosis que permitiesen la
amplificacioacuten selectiva del fago D29 previamente a la infeccioacuten del cultivo testigo de
M smegmatis la evaluacioacuten electroquiacutemica del sustrato metabolizable por el
microorganismo deberiacutea permitir evidenciar presencia o ausencia de M tuberculosis La
seleccioacuten del fago D29 se justifica porque es capaz de infectar micobacterias de
crecimiento raacutepido como M smegmatis y las de crecimiento lento como M tuberculosis
(Park y col 2003)
El glicerol es corrientemente utilizado como principal fuente de carbono en cultivos
de micobacterias siendo degradado eficientemente por sus sistemas enzimaacuteticos que
utilizan mecanismos redox En este trabajo nos hemos planteado detectar este
polialcohol como analito de intereacutes ya que su consumo estaraacute preferencialmente
vinculado a la presencia de micobacterias aptas para tal degradacioacuten Por este motivo
proponemos utilizar un bioelectrodo con una SBR que contenga una enzima cuyo
sustrato sea glicerol
Introduccioacuten
32
2531 Biosensores para evaluacioacuten de infeccioacuten toxoplaacutesmica
En el presente trabajo se propuso un biosensor para evaluacioacuten de infeccioacuten
toxoplaacutesmica utilizando un electrodo de oro policristalino macizo sobre el cual se
adsorbioacute un antiacutegeno recombinante y se siguioacute un esquema ELISA del tipo indirecto
con deteccioacuten de IgGh En la Fig 212 se muestra el esquema que se siguioacute para este
inmunoensayo
Proteiacutena recombinante IgG a-IgGh conjugada a HRP
Bloqueante IgG humana ferrocenometanol
Figura 212 Sobre la superficie del electrodo se fija la proteiacutena recombinante que capturaraacute los
anticuerpos especiacuteficos si estaacuten presentes en el suero El revelado se realiza con un segundo anticuerpo
especiacutefico para IgG humana marcado con HRP que en presencia de H2O2 oxida el mediador FcMe que
se reduce sobre la superficie del electrodo generando la sentildeal analiacutetica
254 Biosensores para cuantificacioacuten de glicerol
La determinacioacuten de glicerol ha ido ganando importancia en las uacuteltimas deacutecadas
debido al uso del mismo en varias industrias como la farmaceacuteutica automotriz
alimenticia y textil entre otros El compuesto es un producto importante de la
fermentacioacuten en la mayoriacutea de las bebidas alcohoacutelicas y su concentracioacuten es un
paraacutemetro uacutetil para el seguimiento del proceso fermentativo (Goriushkina y col 2010)
Tambieacuten es un componente no deseable del biodiesel y su concentracioacuten es un indicador
de la calidad del combustible (Monteiro y col 2008)
Se han desarrollado numerosas metodologiacuteas para llevar adelante la cuantificacioacuten
del glicerol que incluyen teacutecnicas espectrofotomeacutetricas yo espectrofluoromeacutetricas
(Bondioli amp Bella 2005 Silva amp Rocha 2010 Lima y col 2012) incluidos los basados
Introduccioacuten
33
en enzimas (Kronka y col 2001 Li y col 2001) los electroquiacutemicos (Tehrani amp
Ghani 2012 Gamella y col 2008 Wu amp Cheng 2005) y los cromatograacuteficos estos
uacuteltimos han sido oficialmente recomendado por la AOAC como los meacutetodos 96809
97210 (AOAC 2005) Sin embargo a pesar de que estos meacutetodos permiten determinar
con eficacia de glicerol en presencia de muchos compuestos que interfieren esta teacutecnica
se considera que es ecoloacutegicamente desfavorable debido a la utilizacioacuten de solventes
nocivos para el medio ambiente e intriacutensecamente onerosa debido a los altos costos de
los mismos (Gamella y col 2008)
Por un lado las propuestas espectrofotomeacutetricas que utilizan enzimas se basan en el
uso de sistemas o bien de una o varias enzimas relativamente caras que se eliminan
despueacutes de que se han utilizado en una uacutenica determinacioacuten En estos casos a menudo
son consumidos las enzimas yo cofactores caros como nicotinamida adenina
dinucleoacutetido (NAD+) o adenosina 5-trifosfato (ATP) a menudo son consumidos
(Kronka y col 2001 Li y col 2001 Wu amp Cheng 2005) Como un ejemplo la
propuesta de Li para determinar glicerol en matrices complejas se basa en el uso de tres
enzimas a saber glicerol quinasa (GK) piruvato quinasa (PK) y lactato
deshidrogenasa (LDH) ademaacutes de utilizar ATP y NAD+ (Li y col 2001) Este meacutetodo
produce buenos resultados en teacuterminos de sensibilidad y especificidad pero consume 1
U de GK 15 U de PK 22 U de LDH 2x10-6
moles de ATP y 33x10-7
moles de
NAD+ por determinacioacuten Por lo tanto el costo derivado por anaacutelisis es considerado
caro sobre todo cuando se debe analizar un elevado nuacutemero de muestras
Por otro lado se han propuesto herramientas versaacutetiles notables para cuantificar
glicerol como ser la basada en tecnologiacutea de biosensores en particular los basados en
meacutetodos amperomeacutetricos (Ghica amp Brett 2006 Gamella y col 2008) De hecho los
biosensores amperomeacutetricos proporcionan suficiente sensibilidad y selectividad para
permitir la determinacioacuten del analito junto con una velocidad apropiada para completar
el anaacutelisis En efecto los biosensores amperomeacutetricos que utilizan enzimas como
componente bioloacutegico para el reconocimiento dan lugar a una selectividad significativa
debido a su capacidad de reaccionar especiacuteficamente con su sustrato Este uacuteltimo es a
menudo el analito de intereacutes por lo que puede ser cuantificado de manera eficiente auacuten
ante la presencia de otros componentes similares estructuralmente que pueden hallarse
en la muestra (Belluzo y col 2008) Los dispositivos construidos con enzimas a
menudo pueden ser reutilizados y por lo tanto el costo por determinacioacuten puede ser
Introduccioacuten
34
reducido significativamente en comparacioacuten con los meacutetodos espectrofotomeacutetricos
mencionados anteriormente
Se han desarrollado varios biosensores utilizando enzimas que tienen como sustrato
al glicerol (Gamella y col 2008) En los disentildeos utilizados se utilizan diversas enzimas
que reaccionan especiacuteficamente con el glicerol en un primer paso y se censa un
producto de esta reaccioacuten En otros disentildeos se encuentran involucradas maacutes de una
enzima donde la segunda o tercer enzima utiliza como sustrato algunos de los
productos de la primera o segunda reaccioacuten y finalmente se censa un producto de la
uacuteltima reaccioacuten enzimaacutetica Algunos disentildeos que aparecieron en literatura al momento
de iniciar este trabajo de tesis fueron detallados por Pingarroacuten y colaboradores (Gamella
y col 2008) y se encuentran resumidos en la Tabla 23 al final de este capiacutetulo y se
corresponden a los esquemas evaluados al momento de iniciar este trabajo de tesis
Todos los disentildeos descriptos al momento presentan la desventaja de ser onerosos
tanto por el disentildeo en siacute como por el costo operativo devenido del consumo de elevadas
cantidades de reactivos caros
Sobre la base del modelo propuesto por Tuntildeoacuten-Blanco y colaboradores (Aacutelvarez-
Gonzaacutelez y col 2000) se comenzaron los ensayos para construir un bioelectrodo
selectivo para glicerol La propuesta contempla en primer lugar disminuir la cantidad
de enzima Glicerol deshidrogenasa En segundo lugar proponemos utilizar la coenzima
NAD(H) en forma soluble e introducir un mediador electroquiacutemico distinto al utilizado
previamente En el trabajo citado se generaba una cupla cataliacutetica por oxidacioacuten
electroacutedica del NAD+ presente en un electrodo de trabajo de pasta de C modificada En
nuestro caso el mediador soluble permite reoxidar la coenzima para cerrar el ciclo
cataliacutetico siguiendo el esquema de la Fig 213
Figura 213 Esquema de reacciones que ocurren en la celda DHA 13 dihidroxiacetona GlDH
gliceroldeshidrogenasa NAD(H) nicotinadenina dinucleoacutetido
glicerol
DHA
GlDHox
GlDHred NAD+
NADH Mediador ox
Mediador red
e- Electrodo
Introduccioacuten
35
Tabla 23 Biosensores selectivos para gicerol Las filas 1 a 10 son un extracto parcial del trabajo de
Gamella y col 2008 En las filas 11 y 12 se incluyen los disentildeos propuestos por Šefčovičovaacute y col
2008 y Goriushkina y col 2010
Electrodo Enzima Mediador Potencial
1 Pt GKGPOx - + 650 mV vs AgAgCl
2 Al GlDH Fe(CN)6 + 400mV vs ECS
3 Barras de grafito
espectroscoacutepico GlDH Complejo de Os + 200 mV vs AgAgCl
4 Serigraacutefico (SPE) pGlyDH N-(4-hidroxibenzilideno)-
4-ferrocenilanilina + 400 mV vs AgAgCl
5 Carboacuten Viacutetreo a) GlDHDP
b) GKGPOxHRP
a)Fe(CN)63-
b)Fe(CN)64-
a) + 350 mV vs AgAgCl
b) - 300 mV vs AgAgCl
6 SPE modificado con
ZrO2 y azul meldola GlDH Azul meldola + 100 mV vs AgAgCl
7 SPE modificado azul
de Prusia
GlDH Tt NADH
Ox Azul de Prusia - 50 mV vs AgAgCl
8 Pasta de carbono GlDH Producto de la electro-
oxidacioacuten del NAD+ + 150 mV vs AgAgCl
9 Flim de carbono a) GPOx
b)GKGPOx Poli (rojo neutro) - 350 mV vs ECS
10 Au a)GlDHDP
b) GKGPOxHRP Tetra thiafulvaleno
a) + 150 mV vs AgAgCl
b) 0 mV vs AgAgCl
11 Carboacuten Viacutetreo GlDHDP Fe(CN)63- + 350 mV vs AgAgCl
12 Platino serigraacutefico Gox - + 300 mV vs electrodo
intriacutenseco
Tabla 23 Continuacioacuten
Muestra
Rango dinaacutemico
Lineal (M) Sensibilidad
(mA M-1
cm-2
)
Liacutemite de
deteccioacuten (M) Estabilidad
Desde Hasta
1 Mosto de uva 2 10-6
10-3 - 5 10
-7 Hasta 1 mes
2 Jugo de uva 10-6
2 10-3
- 10-6 -
3 Vino 1 10-6
2 10-4
32 1 10-6
80 actividad inicial luego
de 20 horas
4 Vino - - - - actividad enzimaacutetica decae
rapidamente
5 Fermento
anaeroacutebico
1 10-5
1 10-5
10-3
1 10-3
a) 620
b) 142 -
sentildeal inicial luego de
uso continuo a) 60 a 90
hs b) 70 16 hs
6 Fermento de
jugo de uva 10
-51 10
-4 - 10
-6 -
7 - 10-5
1 10-3
- 10-6 -
8 Jarabe 997 10-7
10-4
162 cm2 43 10-7
80 actividad inicial luego
de 3 diacuteas
9 Vino 10-5
147 10-4
a) 101
b) 079
a) 4 10-6
b) 15 10-5
sentildeal inicial luego de
uso continuo a) 87 a 8
diacuteas b) 62 8 diacuteas
10 Vino 10
-6
4 10-7
2 10-5
1 10-5
a) 207
b) 250
a) 4 10-7
b) 31
sentildeal inicial luego de
uso continuo a) 87 a 51
diacuteas b) 46 8 diacuteas
11 Fermento - - - 11 10-6
-
12 Vino 10
-5
2 10-6
25 10-2
64 10-3
-
10-5
2 10-6 -
Objetivos
Objetivos
37
3 Objetivos
31 Objetivos generales
Desarrollar metodologiacuteas electroquiacutemicas que permitan identificar analitos de
intereacutes tanto para el diagnoacutestico cliacutenico como para la industria de combustibles
alternativos
32 Objetivos particulares
a) Obtener bioelectrodos que exhiban una corriente cataliacutetica diferencial al efectuar
inmunoensayos con muestras confirmadas positivas o negativas para infeccioacuten aguda
por T gondii
b) Desarrollar un meacutetodo electroquiacutemico que permita la cuantificacioacuten de glicerol
en medio acuoso para determinarlo por ejemplo luego de su extraccioacuten en
combustibles alternativos
c) Evidenciar electroquiacutemicamente la ocurrencia de lisis de M smegmatis por fagos
D29 indicadores de la presencia de micobacterias patoacutegenas emparentadas
provenientes de individuos padeciendo infeccioacuten tuberculosa
Materiales y Meacutetodos
Materiales y Meacutetodos
39
4 Materiales y meacutetodos
41 Reactivos y medios de cultivos
411 Reactivos
Todos los reactivos utilizados fueron de grado analiacutetico salvo que se indique lo
contrario Los aacutecidos aceacutetico sulfuacuterico niacutetrico clorhiacutedrico y percloacuterico las sales KCl
Na2HPO4 KH2PO4 NiSO4 CuSO45H2O y la sal disoacutedica del aacutecido etilen diamino tetra
aceacutetico (EDTA) dimetilsulfoacutexido (DMSO) imidazol tris base las enzimas peroxidasa
de raacutebano picante EC 11117 (tipo VI) (HRP) y glicerol deshidrogenasa de
cellulomonas EC 1116 (GlDH) acrilamida (adecuada para electroforesis) NNprime-(12-
dihidroxietilen) bisacrylamide (97) ditiotreitol (DTT) Coomasie blue G-250 alcohol
isopropiacutelico β-mercaptoetanol 33-diaminobenzidina tetrahidrocloruro (DAB)
nicotina adenina dinucleoacutetico (NAD) los desoxinucleoacutetidos trifosfato dATP dGTP
dCTP y dTTP reactivo de Folin-Ciocalteu glicina albuacutemina seacuterica bovina (ASB)
peptona de carne extracto de levadura fueron suministrados por Sigma-Aldrich El
polvo de carbono viacutetreo (esfeacuterico diaacutemetro de partiacutecula entre 2 y 12 microm pureza
9999+) fue suministrado por Aldrich El polvo de carbono grafito (pureza gt 99) fue
provisto por Fisher Scientific Dimetilformamida (DMF) 1 1rsquo-carbonil-diimidazol las
sales tartrato de sodio y potasio MgCl2 CaCl2 NaCl Na2CO3 NaHCO3 K2CO3
KHCO3 K3Fe(CN)6 K4Fe(CN)6 (NH4)2SO4 (NH4)2S2O8 (gt98) dodecil sulfato de
sodio (Farmacopea Unioacuten Europea) (SDS) NaOH KOH NNNprimeNprime-
tetrametiletilendiamino (Temed) azul de bromofenol (Farmacopea Unioacuten Europea)
xilencianol (para electroforesis) etanol absoluto fueron suministrados por Merck El
H2O2 y el glicerol fueron provistos por Cicareli El isopropil-β-D-1-
tiogalactopiranoacutesido (IPTG) fue suministrado por Promega La enzima ADN polimerasa
de Thermus aquaticus EC 2777 (polimerasa Taq) y los oligonucleoacutetidos fueron
suministrados por InvitrogenTM
Argentina La enzima peroxidasa de raacutebano picante
ligada a estreptavidina (HRP-EAV) fue provista por Abcam El ester biotin n-
hidroxisuccinimida fue provisto por Thermo Scientific La ampicilina (Farmacopea
Argentina) fue provista por laboratorios Klonal La aluacutemina para pulido (tamantildeo de
partiacutecula 03 microm) fue provista por Metrohm El anticuerpo de cabra anti IgG humana
ligado a HRP fue provisto por Zymed El Tween-20 fue provisto por Anhedra
No se detallan los reactivos contenidos en los equipos comerciales utilizados
disponibles en las paacuteginas web de los respectivos proveedores
Materiales y Meacutetodos
40
412 Medios de cultivos
Para el crecimiento de cepas de Escherichia coli (E coli) se utilizoacute el medio de
cultivo Luria-Bertani (LB) compuesto por 10 g L-1
peptona de carne 5 g L-1
extracto de
levadura y 10 g L-1
NaCl En los casos requeridos se suplementoacute este medio con el
antibioacutetico ampicilina (100 g mL-1
) Para la preparacioacuten de medios soacutelidos se agregoacute
agar en concentracioacuten final de 15 g L-1
Para el crecimiento de ceacutelulas de M smegmatis se utilizoacute el medio de cultivo
Middlebrook 7H9 provisto en forma anhidra por Difco y fue suplementado con NaCl
CaCl2 yo glicerol en concentraciones variables de acuerdo a los requerimientos del
ensayo analiacutetico ulterior la composicioacuten del medio provisto por Difco se detalla en la
siguiente tabla
Tabla 41 Caldo Middlebrook 7H9 (Difco) composicioacuten en g L-1
del medio liacutequido recieacuten preparado
(NH4)2SO4 050
Na2(HPO4) 250
K(H2PO4) 100
Citrato de sodio 010
MgSO4 005
CaCl2 0005
ZnSO4 0001
CuSO4 0001
Citrato feacuterrico amoacutenico 004
Aacutecido l-glutaacutemico 050
Piridoxina 0001
Biotina 00005
42 Cepas bacterianas
Las cepas bacterianas utilizadas y sus caracteriacutesticas relevantes se detallan en la
siguiente tabla
Materiales y Meacutetodos
41
Tabla 42 Cepas bacterianas utilizadas
Cepa Caracteriacutesticas
Escherichia
coli (E coli)
BL21 (DE3)
E F- ompT hsdS (rB-mB-) [lon] (DE3 immP21 int- lacI+
lacUV5lacZT7 ARN polimerasa) Contiene el gen de la T7
ARN polimerasa bajo el control del promotor lacUV5 El gen de
la ARN polimerasa estaacute integrado en el cromosoma bacteriano
desde (DE3) y su expresioacuten se induce por IPTG (Stratagene)
M smegmatis
mc2155
Mycobacterium smegmatis MC2155 es un organismo
aerobio quimioorganotrofo en forma de barra no moacutevil
patoacutegeno de humanos Esta bacteria fue inicialmente aislada de
esmegma humano Esta cepa es un mutante de M smegmatis Es
faacutecilmente transformable con vectores plasmiacutedicos usando
electroporacioacuten
43 Bacterioacutefagos
Se utilizoacute el bacterioacutefago D29 que infecta especiacuteficamente micobacterias Los
trabajos especiacuteficos de infeccioacuten de micobacterias fueron realizados en el Departamento
de Microbiologiacutea de la Facultad de Ciencias Meacutedicas (UNR) bajo la supervisioacuten del Dr
Ricardo Morbidoni
44 Plaacutesmidos
El plaacutesmido utilizado y sus caracteriacutesticas relevantes se detallan en la siguiente tabla
Tabla 43 Plaacutesmido utilizado
Plaacutesmido Caracteriacutesticas
pET32a
5900 pares de bases resistencia ampicilina promotor T7lac Produce
proteiacutenas fusionadas a 6 histidinas y a la proteiacutena tiorredoxina (TRX)
de 204 kDa lo que permite su purificacioacuten en columna de NTA-Ni2+
Este vector fue utilizado como sistema de expresioacuten en la cepa BL21
(DE3) de E coli
45 Reaccioacuten en cadena de la polimerasa
Las reacciones se llevaron a cabo en un volumen total de 25 μL conteniendo
solucioacuten de amplificacioacuten comercial suplementada con MgCl2 para alcanzar una
concentracioacuten final de MgCl2 25 mM y 02 mM de cada uno de los desoxinucleoacutetidos
trifosfato dATP dGTP dCTP y dTTP 20 pmoles de cebador directo y reverso y 1 UI
de polimerasa Taq Se empleoacute un termociclador BOECO (Germany) y se inicioacute la
reaccioacuten con un paso de desnaturalizacioacuten a 95 ordmC durante 5 min La amplificacioacuten de
los fragmentos se realizoacute en 30 ciclos de a) desnaturalizacioacuten 1 min a 95degC b)
Materiales y Meacutetodos
42
hibridizacioacuten 1 min a la temperatura oacuteptima para cada par de cebadores c) extensioacuten
72degC 15 min por cada Kpb amplificado finalmente se realizoacute un paso de extensioacuten
durante 10 min
Para la reaccioacuten de amplificacioacuten de la secuencia codificante de la proteiacutena se
disentildearon oligonucleoacutetidos cebadores especiacuteficos (ver maacutes adelante) En el disentildeo de los
mismos se introdujeron sitios de restriccioacuten apropiados para el posterior clonado del
fragmento en vectores de clonado o expresioacuten
Como molde se utilizoacute aproximadamente 003 g de ADN plasmiacutedico
Como cebadores se utilizaron los oligonucleoacutetidos (provistos por Invitrogen)
P22C directo 5- GGATCCACCACCGAGACGCCAGC -3
P22C reverso 5- GAATTCTTGCCCGTGAGAGACACAG -3
46 Electroforesis de ADN en geles de agarosa
Los fragmentos de ADN (ADN plasmiacutedico productos de PCR) fueron separados
mediante electroforesis en geles de agarosa de distinta concentracioacuten (08 a 2) seguacuten
el tamantildeo de los fragmentos a separar Se utilizoacute el sistema de tipo submarino La
solucioacuten reguladora tris-aceacutetico-EDTA (TAE) 05 X se utilizoacute como solucioacuten de
electroforesis y para la preparacioacuten de geles A estos uacuteltimos se les agregoacute el agente
intercalante bromuro de etidio en una concentracioacuten final de 03 g mL-1
antes de su
gelificacioacuten Previo a la siembra las muestras se mezclaron con solucioacuten de siembra
compuesta por 0025 (mv) azul de bromofenol 0025 (mv) xilencianol y 30
(vv) glicerol en una proporcioacuten 51 en volumen de muestra solucioacuten de siembra
Como marcadores de peso molecular se utilizaron Ladder 100 pb PB-L (Productos Bio-
Loacutegicos) La corrida electroforeacutetica se realizoacute a un potencial constante de 100 V con
una fuente BIO-RAD modelo 3000xi Luego de la electroforesis el ADN se visualizoacute
por fluorescencia en un transiluminador de luz ultravioleta Fotodyne y las imaacutegenes se
digitalizaron con una caacutemara FUJIFILM modelo FinePix A120
47 Minipreparacioacuten de ADN plasmiacutedico
El ADN plasmiacutedico se preparoacute a partir de cultivos celulares de E coli conteniendo
los plaacutesmidos de intereacutes seguacuten el meacutetodo de lisis alcalina o bien utilizando los equipos
comerciales ―WIZARDreg
PLUS SV Minipreps DNA purification system (Promega) El
resultado de la preparacioacuten se evaluoacute realizando una electroforesis en gel de agarosa de
una aliacutecuota de la misma
Materiales y Meacutetodos
43
48 Purificacioacuten del producto de amplificacioacuten
La purificacioacuten de aacutecidos nucleicos a partir de geles de agarosa se realizoacute utilizando
el equipo comercial ―GFXTM Gel Band Purification Kit (Amersham GE Healthcare)
seguacuten las especificaciones del fabricante El resultado de la purificacioacuten se evaluoacute
realizando una electroforesis en gel de agarosa de una aliacutecuota de la elusioacuten obtenida
49 Prueba de expresioacuten de proteiacutenas de fusioacuten a TRX y a ldquocolardquo de histidinas
Se cultivaron clones de las cepas de E coli BL21 (DE3) transformadas con el
vector pET32a (con el inserto correspondiente) haciendo distintas diluciones 175
1100 y 1200 de un cultivo saturado en 2 mL de LB fresco (suplementado con
ampicilina a 100 μg mL-1
) y cultivando a 37 ordmC con agitacioacuten vigorosa (180 rpm) hasta
una densidad oacuteptica a 630 nm (DO630nm) aproximada de 05 unidades Se indujo la
expresioacuten de la proteiacutena recombinante con IPTG (concentracioacuten final 1 o 01 mM)
durante 3 4 o 12 hs a 37 ordmC y con agitacioacuten vigorosa Posteriormente se cosecharon las
ceacutelulas centrifugando a 3000 rpm durante 10 min Finalmente se lisaron las ceacutelulas con
pulsos de ultrasonido utilizando un sonicador analoacutegico Sonifierreg S450A y se
separaron las fracciones soluble e insoluble del extracto por centrifugacioacuten a 18000 g
durante 20 min
410 Expresioacuten y purificacioacuten preparativas de antiacutegenos recombinantes
Se cultivoacute la cepa de E coli transformada con el vector pET32a con el inserto
correspondiente haciendo una dilucioacuten 1100 de un cultivo saturado en dos porciones
de 150 mL de LB suplementado con ampicilina (100 microg mL-1
) y cultivando a 37ordm C
hasta una DO630nm 05 Se agregoacute IPTG hasta concentracioacuten final oacuteptima 1 mM para
el Ang P35B o 01 mM para el Ang P22C y se indujo el tiempo oacuteptimo 4 h para el Ang
P35B o 12 h para el Ang P22C a 37ordm De esta manera se obtuvo la proteiacutena de fusioacuten
en forma soluble Se cosecharon las ceacutelulas por centrifugacioacuten y se lavaron con solucioacuten
tampoacuten fosfato (Na2HPO4 10 mM NaCl 05 M pH 8) Luego se las resuspendioacute en 20
mL de solucioacuten de lisis (Na2HPO4 50 mM NaCl 05 M pH 8) Las ceacutelulas se lisaron
por sonicado aplicando pulsos de 30 s de duracioacuten hasta clarificacioacuten del medio en
hielo Se separoacute la fraccioacuten soluble de la insoluble por centrifugacioacuten a 18000 g y 4 ordmC
La fraccioacuten soluble se congeloacute durante 24 h a -20 ordmC y se descongeloacute en hielo luego se
centrifugoacute nuevamente a 18000 g y 4 ordmC Este paso se repitioacute dos veces
Posteriormente se realizoacute una separacioacuten cromatograacutefica de afinidad con una columna
Materiales y Meacutetodos
44
de 5 mL empacada manualmente con resina Ni Sepharosetrade High Performance en
condiciones nativas elusioacuten con imidazol 250 mM seguacuten las especificaciones del
proveedor (GE Healthcare) En los sucesivos pasos se recogieron aliacutecuotas y se verificoacute
la purificacioacuten visualizando por electroforesis en gel desnaturalizante de poliacrilamida
(SDS-PAGE)
411 Separacioacuten de proteiacutenas mediante SDS-PAGE
Se utilizaron geles de 12 y de 15 de acrilamidabisacrilamida 291 Las
muestras se sembraron en geles desnaturalizantes mezclaacutendolas 21 con solucioacuten de
siembra 2 X compuesta por Tris-HCl pH 68 125 mM SDS 4 β-mercapto etanol 5
vv(alternativamente se usoacute DTT 200 mM) glicerol 20 y azul de bromofenol 02
Las corridas electroforeacuteticas se hicieron en solucioacuten Tris-glicina-SDS (Tris base 302
g L-1
glicina 144 g L-l SDS 1 g L
-1) Los geles fueron tentildeidos con azul brillante de
Coomasie G-250
412 Cuantificacioacuten de proteiacutenas
Se utilizoacute el meacutetodo propuesto por Lowry (Lowry y col1951) seguacuten el siguiente
protocolo un volumen de muestra cuya concentracioacuten de proteiacutena se desea determinar y
uno o dos testigos de albuacutemina (conteniendo tiacutepicamente de 5 a 25 microg de proteiacutenas
totales) se disolvieron en 040 mL de agua destilada y se mezclaron con 150 mL de
reactivo C preparado inmediatamente antes de usar El reactivo C se preparoacute mezclando
una parte de tartrato de sodio y potasio 2 mv una parte de CuSO4 1 mv y 100
partes de solucioacuten tampoacuten carbonato 2 mv e hidroacutexido de sodio 01 N Se dejoacute
reaccionar la mezcla durante 15 min a temperatura ambiente y luego se adicionoacute 0150
mL de reactivo de Folin-Ciocalteu diluido 13 con agua destilada inmediatamente antes
de usar Se dejoacute reposar durante 45 min y se leyoacute la absorbancia a 660 nm
413 Reaccioacuten de conjugacioacuten biotina-antiacutegeno
Previo a la reaccioacuten de conjugacioacuten el antiacutegeno P35B purificado se llevoacute a una
concentracioacuten final de 2 mg mL-1
(como miacutenimo) en solucioacuten tampoacuten carbonato de
sodio 01 M (pH 85) usando las membranas de poro controlado Amicon Ultra-4
(Millipore Co) seguacuten las instrucciones del proveedor Se disolvieron 20 mg del eacutester
biotinil-n-hidroxisuccinimida (BNHS) en 590 microL de DMSO e inmediatamente despueacutes
se mezclaron 80 microL de esta solucioacuten con 800 microL de solucioacuten de Ang
Materiales y Meacutetodos
45
Al antiacutegeno P22C purificado se lo llevoacute a una concentracioacuten final de 20 mg mL-1
(como miacutenimo) en solucioacuten tampoacuten carbonato de sodio 01 M (pH 85) usando las
membranas de poro controlado mencionadas Se disolvieron 25 mg BNHS en 590 microL
de DMSO e inmediatamente despueacutes se mezclaron 120 microL de esta solucioacuten con 100
mL de solucioacuten de Ang Se incuboacute 4 h a temperatura ambiente con agitacioacuten suave Se
eliminaron los restos de eacutester hidrolizado y se cambioacute la solucioacuten tampoacuten carbonato por
PBS 1 X pH 74 haciendo lavados reiterados y reteniendo el Ang en las membranas de
poro controlado
414 Revelado cromogeacutenico de la reaccioacuten de conjugacioacuten
El antiacutegeno marcado con biotina respectivo fue retenido en membrana de
nitrocelulosa sembrando 1 L del mismo sobre la membrana Se procedioacute a bloquear
los sitios activos de la membrana con leche descremada disuelta al 5 mv en PBS pH
74 durante 1 h Se realizaron 3 lavados con PBS pH 74 de 1 min cada uno Se incuboacute
la membrana con la enzima peroxidasa de raacutebano picante ligada a streptavidina (HRP-
EAV) disuelta en PBS pH 74-leche descremada al 1 mv Posteriormente se
realizaron 3 lavados con PBS pH 74 de 1 min cada uno Finalmente se reveloacute la
presencia de la enzima HRP con el reactivo de color recieacuten preparado seguacuten 5 mg de
33-diaminobenzidina tetrahidrocloruro (DAB) se disolvieron en 500 microL de DMSO y se
llevoacute a 100 mL de volumen final con PBS pH 74 A esta solucioacuten se le agregaron 100
microL de H2O2 10 voluacutemenes inmediatamente previo a su utilizacioacuten
415 Mediciones espectrofotomeacutetricas
Para las medidas de absorbancia (Abs) a longitudes de onda especiacuteficas o la
realizacioacuten de espectros de absorcioacuten ultravioleta-visible se utilizoacute el espectrofotoacutemetro
Beckman DU 640 Como celda se utilizoacute una cubeta de cuarzo de 1 cm de paso oacuteptico
416 Ensayos de inmunoabsorcioacuten ligados a enzima con deteccioacuten fotomeacutetrica
Como soporte soacutelido se utilizaron microplacas Microlon 600 high binding Greiner
Bio One provistas por GBO Argentina Para las lecturas de Abs se utilizoacute un lector de
microplacas PowerWave XS (BioTek) o alternativamente se utilizoacute el lector ELx808
Absorbance Microplate Reader (BioTek) Los ensayos preliminares se detallan en la
secioacuten 6 Experimentos Auxiliares
Materiales y Meacutetodos
46
4161 Esquema A
Sobre las microplacas de ELISA Microlon 600 high binding Greiner Bio One se
depositaron 100 microL de anticuerpo de captura (IgG de conejo anti IgM humana) provisto
por Dakko diluido 11000 en PBS pH 74 Se incubaron 48 h a 37 degC Luego se
realizaron 3 lavados con PBS Tween 20 al 005 (PBS-T) de 1 min cada uno Se
procedioacute al bloqueo de los sitios libres de la placa con 100 microL leche descremada
comercial (marca Milkaut) al 1 mv en PBS durante 30 min a 37 degC y se realizaron 3
lavados con PBS-T de 1 min cada uno Luego se incubaron con suero humano (muestra
incoacutegnita) 1100 en PBS con leche descremada al 1 mv durante 1 h a 37 degC y se
realizaron 3 lavados con PBS-T de 1 min cada uno Se realizaron distintas incubaciones
con los antiacutegenos P22C y P35B conjugados a biotina Luego de tres lavados con PBS-T
se incubaron con la enzima HRP-EAV en una dilucioacuten 12000 durante 1 h a 37degC
Posteriormente se realizaron 3 lavados con PBS-T para finalmente revelar utilizando
50 microL de solucioacuten comercial de 33prime55prime-tetrametilbenzidina (TMB) sustrato de la
enzima HRP que da coloracioacuten azul en el medio de reaccioacuten pasando a amarillo y
permaneciendo estable el color cuando se detiene la reaccioacuten acidificando el medio con
H2SO4 05 M
4162 Esquema B
Sobre las microplacas de ELISA comerciales se depositaron 500 ng de Ang P22C
disueltos en 100 L de solucioacuten carbonato pH 96 incubando 1 h a 37 degC Se realizaron
3 lavados con PBS Tween 20 al 005 (PBS-T) de 1 min cada uno Se bloquearon los
sitios libres de la placa con 100 microL leche descremada 1 mv en PBS durante 30 min a
37 degC Luego se realizaron 3 lavados con PBS-T de 1 min cada uno Se incubaron con
suero humano (muestra incoacutegnita) 1100 en PBS con leche descremada al 1 mv
durante 1 h a 37 degC Luego se realizaron 3 lavados con PBS-T de 1 min cada uno Se
realizoacute una incubacioacuten con el antiacutegeno P22C conjugado a biotina Luego de tres lavados
con PBS-T se incubaron con la enzima HRP-EAV en una dilucioacuten 12000 durante 1 h
a 37degC Posteriormente se realizaron 3 lavados con PBS-T Finalmente se reveloacute con
50 microL de solucioacuten comercial de TMB y se detuvo la reaccioacuten acidificando el medio con
50 microL H2SO4 05 M
Materiales y Meacutetodos
47
417 Reaccioacuten de color para determinacioacuten cuantitativa de glicerol por meacutetodo
espectrofotomeacutetrico
Se llevaron a cabo dos tipos de ensayos diferentes Por un lado se utilizoacute el meacutetodo
enzimaacutetico con un equipo comercial provisto por Wiener Lab TG GPO PAP AA (liacutenea
liacutequida) ensayando muestras de aliacutecuotas del medio Middlebrook 7H9 suplementadas
con glicerol en lugar de suero humano Por otro lado se realizaron reacciones de color
que se llevaron a cabo en un volumen final de 100 mL que resultoacute de la mezcla de 950
microL de reactivo A y 50 microL de muestra la cual consistioacute en medio de cultivo de
micobacterias Middlebrook 7H9 suplementado con distintas cantidades de glicerol En
los blancos de reaccioacuten se realizoacute un agregado de medio de cultivo Middlebrook 7H9
sin glicerol de igual volumen que en los otros dos casos para mantener las mismas
condiciones que en las otras reacciones
El reactivo A se preparoacute inmediatamente antes de ser usado mezclando los
reactivos necesarios seguacuten se indica en la siguiente tabla
Tabla 44 Mezcla de reactivos necesaria para preparar 950 microL de reactivo A (necesario para 1 reaccioacuten)
Los voluacutemenes necesarios para un nuacutemero n de reacciones se obtuvieron multiplicando por n
los voluacutemenes de esta tabla
Reactivo Volumen para una
reaccioacuten ( L)
Solucioacuten Tampoacuten carbonato
0125 M pH 105 815
K3Fe(NC)6 10-2
M 100
(NH4)2SO4 10 M 10
NAD+ 10
-2 M 25
Enzima GlDH 2 mg mL-1
1
Las reacciones se llevaron a cabo en tubos de Khan cerrados con parafilm para
evitar evaporacioacuten de liacutequido y en bantildeo termostatizado a 37 ordmC La lectura de
absorbancia se realizoacute cuando se cumplioacute una o dos h de iniciada la reaccioacuten seguacuten la
necesidad del ensayo Los experimentos se realizaron por triplicado
418 Determinacioacuten de glicerol remanente en cultivos de micobacterias
Procedimiento seguido a medios de cultivos Middlebrook 7H9 se los suplementoacute
con glicerol a concentracioacuten 0025 mv y se cultivaron cantidades iguales de ceacutelulas
de M smegmatis algunos medios se conservaron sin adicionar micobacterias en
Materiales y Meacutetodos
48
condiciones de esterilidad Se tomaron aliacutecuotas de estos cultivos a distintos tiempos Se
centrifugaron a 12500 rpm durante 5 min para separar las ceacutelulas del sobrenadante y a
estos uacuteltimos se los congeloacute a -20ordmC para su posterior anaacutelisis
Se realizaron determinaciones de glicerol con la teacutecnica fotomeacutetrica propuesta Se
realizaron reacciones de color por triplicado a las muestras e independientemente se
hizo un blanco de reaccioacuten y 2 testigos cuyas concentraciones fueron de 001 y 004
mv
4181 Determinacioacuten de glicerol remanente en cultivos de micobacterias con y sin
fago D29 y ensayos controles respectivos
Procedimiento seguido a medios de cultivos Middlebrook 7H9 se los suplementoacute
con glicerol a 0025 mv y se cultivaron cantidades iguales de a) ceacutelulas de M
smegmatis b) ceacutelulas de M smegmatis infectadas con fago D29 c) fagos D29 d)
algunos medios se conservaron sin adicionar micobacterias ni fagos en condiciones de
esterilidad Se tomaron aliacutecuotas de estos medios inmediatamente despueacutes de realizados
los inoacuteculos (tiempo 0) a las 2 h y a las 4 h de iniciados los cultivos Se centrifugaron a
12500 rpm durante 5 min para separar las ceacutelulas del sobrenadante y a estos uacuteltimos se
los congeloacute a -20 ordmC para su posterior anaacutelisis A estas muestras se les realizaron
determinaciones del glicerol remanente con la teacutecnica fotomeacutetrica propuesta Se
realizaron reacciones de color por triplicado a cada muestra utilizaacutendose como testigos
los medios en condiciones de esterilidad
419 Instrumental electroquiacutemico
Para los experimentos electroquiacutemicos se utilizoacute un analizador electroquiacutemico
Autolab (Eco Chemie) con amplificador electromeacutetrico diferencial PGSTAT 30 Se
utilizoacute una celda convencional de tres electrodos
4191 Electrodos de trabajo
41911 Bioelectrodo para evaluacioacuten de infeccioacuten toxoplaacutesmica
Se utilizaron electrodos macizos tipo ―banderita de oro de aproximadamente 1
cm2 de aacuterea geomeacutetrica El ensamblado se realizoacute de acuerdo al siguiente protocolo los
electrodos limpios se sumergieron durante 14 h en una solucioacuten de aacutecido 3 mercapto
propanosulfoacutenico preparada inmediatamente antes de usar disolviendo 22 mg en 12 mL
de H2SO4 0021 M (desoxigenenada con burbujeo de N2) en atmoacutesfera de N2 a
Materiales y Meacutetodos
49
temperatura ambiente (TA) Luego de enjuagar con agua destilada se sumergieron en
una solucioacuten de Ang recombinante P22C 02 mg mL-1
(PBS pH 74) durante 1 h a TA
Luego de un lavado con PBS se bloquearon los sitios libres no modificados con el Ang
sumergiendo los electrodos en solucioacuten de caseinato de sodio 01 mg mL-1
(preparada
inmediatamente antes de usar) 30 min a 37 degC Los electrodos se lavaron con PBS
Tween-20 05 mv y se sumergieron en una dilucioacuten 1200 de suero humano (muestra
incoacutegnita) en PBS durante 30 min a 37 degC Se lavaron con PBS Tween-20 05 y
finalmente se incubaron en una dilucioacuten 11500 de anticuerpos de conejo anti IgGh-
HRP Los biosensores asiacute ensamblados se guardaron en PBS pH 74 a 4degC hasta su
utilizacioacuten
41912 Electrodos para cuantificacioacuten de glicerol
Como electrodos de trabajo se utilizaron oro platino plata carbono viacutetreo pasta
de carbono (viacutetreo y grafito) y pastas de carbono modificadas
Los electrodos metaacutelicos y de carbono viacutetreo fueron provistos por Metrohm
(numero de cataacutelogo 612043XX) consistentes en barras del material de 3 mm de
diaacutemetro embutidas en un armazoacuten aislante
Las pastas de carbono utilizadas se enumeran a continuacioacuten indicando los
porcentajes en masa de cada componente respectivamente
a) Pasta A carbono viacutetreo aceite mineral (7030)
b) Pasta B carbono viacutetreo aceite mineral GLDH (68302)
c) Pasta C carbono viacutetreo aceite mineral GLDH MWCNT (5830210)
Las pastas se prepararon mezclando los componentes en mortero de aacutegata durante
15 a 20 min hasta obtener una mezcla homogeacutenea a la vista Cuando se utilizoacute enzima
GlDH se dispersoacute en aceite mineral primero y luego se mezcloacute con el polvo de carbono
viacutetreo Cuando se utilizaron NTC (MWCNT nanotubos de carbono de pared multiple)
se dispersoacute primero la enzima luego los NTC y finalmente el polvo de carbono viacutetreo
Asiacute preparadas se empaquetaron firmemente en un armazoacuten de tefloacuten (diaacutemetro 3 mm)
y se friccionoacute firmemente sobre un papel liso apoyado en un vidrio para eliminar el
exceso de pasta y pulir la superficie expuesta del electrodo
Cuando se utilizaron electrodos de pasta de carbono con las pastas B se realizoacute una
cubierta de poli-(o-fenilendiamino) que inmovilizara la enzima Una vez empaquetada
la pasta en el armazoacuten de Teflon se sumergioacute en una solucioacuten de o-fenilendiamino 5 x
10-4
M en solucioacuten tampoacuten carbonato 01 M (pH 10) Se burbujeoacute N2(g) para eliminar el
Materiales y Meacutetodos
50
O2(g) de la solucioacuten y dejar una atmoacutesfera libre de O2(g) Para electropolimerizar se
realizoacute un barrido de potencial ciacuteclico desde -051 V a + 069 V a 50 mV s-1
Finalmente se enjuagoacute con solucioacuten amortiguadora carbonato 01 M (pH 10)
4192 Limpieza de electrodos
Los electrodos de oro macizo policristalino tipo ―banderita se sumergieron en
solucioacuten ―pirantildea (H2SO4 concentrado peroacutexido de hidroacutegeno 30 en una relacioacuten 31)
durante 30 min a 80ordmC Luego se los enjuagoacute con abundante agua destilada En caso de
limpieza maacutes rigurosa previo al tratamiento con solucioacuten ―pirantildea se los colocoacute a la
llama directa hasta rojo vivo (Ribone y col 2006)
Los electrodos de oro policristalino macizo insertos en una barra de tefloacuten (Tips de
Au) se limpiaron siguiendo el siguiente protocolo desengrase frotaacutendolo sobre tela de
pulido humedecida con DMSO Lavado con abundante agua destilada Pulido con
suspensioacuten acuosa de aluacutemina (diaacutemetro promedio de partiacutecula 03 microm) sobre tela de
pulido Lavado con abundante agua destilada Sonicado durante 5 min en sonicador
Cole-Palmer 8890 Luego de un enjuague con abundante agua destilada se sumergieron
en HNO3 9 M durante 1 min a 60 ordmC Finalmente se lavaron con abundante agua
destilada
4193 Determinacioacuten del aacuterea real del electrodo
Para la determinacioacuten del aacuterea real de los electrodos metaacutelicos se utilizaron dos
metodologiacuteas in-situ
41931 Medicioacuten de la adsorcioacuten de oxiacutegeno
Se asume que el oxiacutegeno se quimioadsorbe en una capa monoatoacutemica antes de la
evolucioacuten de 02 con una correspondencia de uno-a-uno con los aacutetomos metaacutelicos de la
superficie El valor de la carga asociada a la reduccioacuten de la monocapa de oacutexido en
superficies de oro policristalino que se utilizoacute fue de 390plusmn10 microC cm-2
(Trasatti amp Petrii
1991)
Se realizaron VCs en H2SO4 a 50 mVs-1
y se midioacute la carga correspondiente al pico
de desorcioacuten de O2 sobre la superficie del electrodo y este valor se dividioacute por el valor
de referencia
Materiales y Meacutetodos
51
41932 Voltametriacutea ciacuteclica de ferricianuro de potasio
Registrando VCs a varias velocidades de barrido de potencial conociendo el
coeficiente de difusioacuten del ioacuten su concentracioacuten en la celda y midiendo la corriente de
pico a cada velocidad de barrido es posible determinar el aacuterea real del electrodo de
trabajo utilizando la ecuacioacuten de Randles Sevcik ec[216] (Belluzo y col 2008)
[216]
siendo la temperatura 25 degC y donde A estaacute en cm2 D en cm
2 s
-1 C en mol cm
-3 y
en V s-1
420 Medidas electroquiacutemicas
Todos los potenciales fueron medidos y referidos al electrodo de AgAgCl (KCl
300 M) que se utilizoacute como electrodo de referencia Como contraelectrodos se
utilizaron dos tipos uno de oro de superficie mayor a 5 veces la superficie del electrodo
de trabajo cuando se utilizaron electrodos metaacutelicos como electrodos de trabajo y una
barra de carbono viacutetreo cuando se utilizaron electrodos de pasta de C como electrodos
de trabajo En todos los casos las soluciones se burbujearon con N2 durante 1 min para
desplazar el O2 disuelto y se mantuvieron en atmoacutesfera de N2 durante las
determinaciones
Las voltametriacuteas ciacuteclicas se realizaron equilibrando el sistema al potencial de inicio
Para muestras conteniendo glicerol y utilizando electrodos de oro se realizaron
barridos desde -030 V hasta 060 V a distintas velocidades de barrido Cuando se
utilizaron electrodos de platino se realizaron barridos desde -080 V hasta 020 V a
distintas velocidades de barrido Cuando se utilizaron electrodos de pasta de carbono o
pasta de carbono modificada se realizaron barridos de potencial desde -040 V hasta
100 V Las corrientes que se informan son las intensidades de pico obtenidas trazando
una liacutenea de base recta desde los extremos del pico de corriente utilizando algoritmos
propios del programa General Purpose Electrochemical System (GPES)
4201 Mediciones amperomeacutetricas para evaluacioacuten de infeccioacuten toxoplaacutesmica
Las amperometriacuteas realizadas con el bioelectrodo para evaluacioacuten de infeccioacuten
toxoplaacutesmica se llevaron adelante en solucioacuten PBS (pH 74) FeMe 3 mM El potencial
de trabajo fue de 008V Se registroacute la corriente de base hasta que se estabilizoacute y una
Materiales y Meacutetodos
52
vez estable (usualmente a los 250 s) se adicionoacute el sustrato de la enzima (H2O2)
concentracioacuten en celda 18 mM y se registroacute la corriente final (500 s) La corriente
cataliacutetica se evaluoacute como la diferencia entre la corriente final y la de base
4202 Mediciones amperomeacutetricas para cuantificacioacuten de glicerol
42021 Amperometriacuteas con tip de oro
Las amperometriacuteas con tip de oro se realizaron en medio NaOH 01 M a potencial
constante (01 V) y a temperatura ambiente (20 a 25 ordmC) El sistema se preacondicionoacute
aplicando un potencial de 05 V se dejoacute equilibrar y se registroacute la corriente de base en
esas condiciones (generalmente a los 50 s) Luego se adicionoacute la muestra de forma de
lograr la concentracioacuten final de analito deseada La corriente fue registrada y se midioacute
una vez que se estabilizoacute (aproximadamente a los 400 s) La corriente cataliacutetica se
evaluoacute como la diferencia entre la corriente final y la de base
42022 Amperometriacuteas con electrodos de pasta de C
Las amperometriacuteas donde se utilizoacute la pasta de carbono B se realizaron en solucioacuten
tampoacuten carbonatobicarbonato de potasio 100 mM (NH4)2SO4 25 mM K3Fe(CN)6
1mM NAD+ 05 mM pH 105 Se trabajoacute a potencial constante 038 V y a temperatura
ambiente (25 ordmC) El sistema se preacondicionoacute aplicando el potencial de trabajo
correspondiente durante 50 s una vez iniciada la lectura de corriente se dejoacute equilibrar
y se registroacute la corriente de base en esas condiciones usualmente a los 300 s Luego se
adicionoacute la cantidad necesaria de muestra de forma de lograr la concentracioacuten final de
analito deseada La corriente fue registrada y se midioacute una vez que se estabilizoacute
(aproximadamente a los 500 s) La corriente cataliacutetica se evaluoacute como la diferencia
entre la corriente final y la de base
Las amperometriacuteas donde se utilizoacute la pasta de carbono C se realizaron en solucioacuten
tampoacuten carbonatobicarbonato de potasio 100 mM (NH4)2SO4 25 mM NAD+ 05 mM
pH 105 a potencial constante 051 V y a 25 ordmC El sistema se preacondicionoacute aplicando
el potencial de trabajo correspondiente durante 50 s una vez iniciada la lectura de
corriente se dejoacute equilibrar y se registroacute la corriente de base en esas condiciones
usualmente a los 300 s Luego se adicionoacute la cantidad necesaria de muestra de forma
de lograr la concentracioacuten final de analito deseada La corriente fue registrada y se
midioacute una vez que se estabilizoacute (aproximadamente a los 200 s del agregado) La
corriente cataliacutetica se evaluoacute como la diferencia entre la corriente final y la de base
Materiales y Meacutetodos
53
Cuando el tiempo de equilibrado no fue suficiente para que la corriente de base se
estabilizara se recurrioacute a realizar correcciones de liacutenea de base A tal fin se llevaron a
cero las corrientes de base aplicando los algoritmos que ofrece el programa GPES
versioacuten 49 provisto por Eco Chemie BV
4203 Voltamperometriacutea de onda cuadrada
Los experimentos de voltamperometriacutea de onda cuadrada se realizaron en solucioacuten
tampoacuten carbonatobicarbonato de potasio 100 mM (NH4)2SO4 25 mM NAD+ 05 mM
pH 105 y a 25 ordmC Los valores de escaloacuten de potencial utilizados fueron de 5 y 10 mV
Los valores de amplitud de pulso fueron de 25 y 50 mV Las frecuencias utilizadas
fueron de 8 10 20 30 40 60 y 70 Hz Especiacuteficamente se evitoacute utilizar 50 Hz
(frecuencia de la tensioacuten alterna de la liacutenea de alimentacioacuten) Los barridos de potencial
se realizaron desde -03 V hasta 10 V
Una vez registrado el blanco con medio Middlebrook 7H9 y se hicieron dos
agregados secuenciales de solucioacuten estaacutendar de glicerol 100 M obtenieacutendose una
concentracioacuten final de 25 y 50 mM respectivamente en la celda
421 Funcionalizacioacuten de nanotubos de carbono
Previo a la utilizacioacuten de los nanotubos de carbono se procedioacute a funcionalizarlos
realizando una carboxilacioacuten oxidativa Se siguioacute una comunicacioacuten personal del Dr
Joseacute Manuel Pingarroacuten del Departamento de Quiacutemica Analiacutetica Facultad de Ciencias
Quiacutemicas Universidad Complutense de Madrid A saber se pesaron aproximadamente
2 mg de MWCNT y se dispersaron en 2 mL en una mezcla de aacutecido sulfuacuterico aacutecido
niacutetrico 31 con agitacioacuten ultrasoacutenica durante 5 h Luego se diluyoacute la mezcla al 110
vertieacutendola suavemente en agua destilada enfriada en bantildeo de hielo para evitar
proyecciones Se eliminoacute el exceso de aacutecido centrifugando a 14000 rpm durante 30
min descartando el sobrenadante y dispersando el precipitado en agua destilada con
agitacioacuten ultrasoacutenica durante 30 min Esta operatoria se repitioacute 9 veces hasta que la
dispersioacuten de MWCNT en agua tuvo un pH cercano a la neutralidad (70 05) Los
MWCNT se secaron en desecador con sulfato de cobre anhidro y aplicando vaciacuteo al
sistema
Materiales y Meacutetodos
54
422 Programas de prediccioacuten de epiacutetopes lineales reconocidos por ceacutelulas B
4221 Base de datos de proteiacutenas
Se creo manualmente una base de datos para mejorar la exactitud de los resultados
Las proteiacutenas fueron seleccionadas de la base de datos de BciPep (Saha y col 2005)
HIV Molecular Immunology Database (disponible en httpwwwhivlanlgovcontent
immunologyindexhtml) o tomadas de la literatura VP1 (Wang y col 2011) proteiacutena
N (El-Manzalawy y col 2008) y Gliadina (Sweredoski amp Baldi 2009) El criterio de
seleccioacuten fue la confirmacioacuten experimental previa mediante ensayos de puntos de
inmunoadsorcioacuten ligado a enzima (ELIspot) o mediante el uso de paneles
multiespeciacuteficos de anticuerpos monoclonales que reconocen epiacutetopes lineales (Shin y
col 2005) Como resultado se seleccionaron 11 proteiacutenas de las que se obtuvieron un
total de 65 epiacutetopes lineales reconocidos por ceacutelulas linfociacuteticas tipo B
4222 Programas utilizados
Se utilizaron algunos programas para predecir los epiacutetopes lineales disponibles en
liacutenea gratuitamente Todos estos programas utilizan algoritmos matemaacuteticos con escalas
de propensioacuten yo datos experimentales de antigenicidad A menos que se indique lo
contrario cada programa se ejecutoacute utilizando los paraacutemetros por defecto Los
programas utilizados fueron AAPPred (Davydov amp Tonevitskii 2009) ABCpred
(Saha S amp Raghava 2006) BcePred (Saha y col 2005) BepiPred (Larsen y col
2006) y Antigenic (Kolaskar amp Tongaonkar 1990)
Los programas de prediccioacuten definen el grado de antigenicidad por medio de una
puntuacioacuten (score) en algunos casos para cada epiacutetope y en otros para cada residuo
amino aciacutedico En este uacuteltimo se puede definir una regioacuten antigeacutenica cuando varios
residuos con alta puntuacioacuten son adyacentes en la estructura primaria Por otra parte el
nuacutemero de epiacutetopes o regiones antigeacutenicas que los programas de prediccioacuten encuentran
depende de un umbral que es configurado por el usuario
423 Anaacutelisis de Datos
Los liacutemites de deteccioacuten (LD) y cuantificacioacuten (LC) se calcularon siguiendo las
sugerencias de Armbruster amp Pry (Armbruster amp Pry 2008) modificando la cantidad
de replicados utilizados para la obtencioacuten de los desviacuteos estaacutendar habieacutendose utilizado
10 reacuteplicas El caacutelculo del LD se realizoacute a partir del valor de corriente del blanco IB maacutes
Materiales y Meacutetodos
55
33 veces el valor del desviacuteo estaacutendar de la corriente leiacuteda (DSn1) de la muestra con
menor concentracioacuten de glicerol medida seguacuten
[41]
El valor del LC se calculoacute como
[42]
siendo m la pendiente de la curva de calibracioacuten
La capacidad de discriminacioacuten entre dos concentraciones diferentes de los
meacutetodos propuestos se evaluoacute como el error asociado a la estimacioacuten de la
concentracioacuten Ec calculada como
Nm
EE r
c
1
[43]
siendo Er el error relativo
424 Caacutelculos estadiacutesticos y disentildeo experimental
Para los caacutelculos estadiacutesticos se utilizaron los programas SigmaStat 32 (Sigma Plot
90 u 110) o Microcal Origin 80 en forma indistinta Para los caacutelculos de EJCR (regioacuten
eliacuteptica de confianza conjunta) se utilizoacute el programa Matlab con rutinas disentildeadas ―ad-
hoc
Resultados y Discusioacuten
Resultados y Discusioacuten
57
5 Resultados y discusioacuten
Para la obtencioacuten de antiacutegenos especiacuteficos de fase aguda de la toxoplasmosis se
comenzoacute seleccionando un conjunto de proteiacutenas denominadas P30 P22 y P35
mencionadas en la literatura como antiacutegenos de fase aguda (Harning y col 1996
Parmley y col 2000 Lu y col 2006) Sobre la base de estos estudios iniciales se
intentoacute identificar por medio de caacutelculos teoacutericos que regiones de estas proteiacutenas
conteniacutean mayor nuacutemero de epiacutetopes De este modo en la etapa siguiente se procurariacutea
expresarlos en forma soluble para su posterior utilizacioacuten en inmunoensayos Al
momento de seleccionar un programa de todos los disponibles ―on line verificamos
que eacutestos no informaban el valor predictivo positivo VPP Por ello se inicioacute un trabajo
de identificacioacuten del programa que predijera maacutes fidedignamente los epiacutetopes La
buacutesqueda se realizoacute comparando los resultados arrojados por 5 programas a los que se
solicitoacute prediccioacuten de epiacutetopes pertenecientes a 11 proteiacutenas cuyos epiacutetopes lineales
habiacutean sido perfectamente establecidos experimentalmente (Costa y col 2013) Se
analizoacute cuaacutel de ellos presentaba el mayor VPP (ver punto 61 seccioacuten Experimentos
Auxiliares) y para predecir epiacutetopes lineales se trabajoacute con este programa que resultoacute
ser AAPred
El anaacutelisis de los Ang seleccionados permitioacute identificar en P35 dos regiones que
concentraban los determinantes antigeacutenicos a las cuales se las denominoacute P35A y P35B
Los Ang P30 y P22 presentaban los determinantes antigeacutenicos distribuidos
homogeacuteneamente por lo tanto al momento de disentildear su clonado se tuvieron en cuenta
criterios que faciliten la expresioacuten y solubilidad mas allaacute de la antigenicidad
51 Evaluacioacuten de antiacutegenos recombinantes de T gondii
511 Antiacutegeno P30
El antiacutegeno de superficie 1 de T gondii SAG1 tambieacuten denominado proteiacutena P30
se ha identificado como antiacutegeno de fase aguda (Harning y col 1996) por lo cual se
procuroacute obtenerlo en forma soluble Sobre la base de ensayos previos realizados en el
LTI se continuoacute con la obtencioacuten y purificacioacuten de dos porciones del antiacutegeno P30
denominadas P30L y P30C (seccioacuten 410 Materiales y Meacutetodos) Luego de la cosecha
y lisis de las bacterias se separaron las fracciones soluble e insoluble del extracto se
tomaron aliacutecuotas de ambas y se analizaron por SDS-PAGE Los Angs buscados soacutelo se
Resultados y Discusioacuten
58
obtuvieron como proteiacutenas precipitadas en cuerpos de inclusioacuten en la fraccioacuten insoluble
Por ello se discontinuoacute el trabajo con las fracciones de P30
512 Antiacutegeno P22
El antiacutegeno de superficie 2 o antiacutegeno P22 de T gondii (Gen Bank ndeg M33572) ha
sido tambieacuten identificado como antiacutegeno de fase aguda (Parmley y col 1992 Lau amp
Fong 2006) En el presente trabajo se procuroacute amplificar la regioacuten del gen que
permitiese expresar la proteiacutena recombinante en forma soluble El producto de
amplificacioacuten se resolvioacute en un gel de agarosa tentildeido con bromuro de etidio como se
observa en la Fig 51
Figura 51 Gel de agarosa tentildeido con bromuro de etidio en transiluminador UV En PCR1 se observan los
productos de amplificacioacuten obtenidos utilizando cebadores especiacuteficos para la regioacuten P22C donde se
sentildeala el fragmento de tamantildeo esperado Control (-) muestra la misma mezcla de reaccioacuten pero sin ADN
molde MPM indica el marcador de peso molecular y el tamantildeo de los fragmentos se indica sobre la
derecha
Se aisloacute y purificoacute el fragmento de intereacutes utilizando un equipo comercial detallado
en el punto 48 seccioacuten Materiales y Meacutetodos En un paso posterior se ligoacute al vector
pET32a y con la construccioacuten resultante se transformaron ceacutelulas competentes de E
coli Las ceacutelulas transformadas se seleccionaron crecieacutendolas en medio LB con
ampicilina Se verificaron las condiciones para la expresioacuten en forma soluble (punto
410 seccioacuten Materiales y Meacutetodos) encontraacutendose que las condiciones oacuteptimas eran
01 mM IPTG y 12 h de incubacioacuten con agitacioacuten vigorosa
Para la induccioacuten preparativa se siguioacute el protocolo detallado en la seccioacuten 410 de
Materiales y Meacutetodos La Fig 52 muestra la fotografiacutea de un gel de poliacrilamida
luego de la tincioacuten donde se analizaron aliacutecuotas de todos los extractos obtenidos en los
distintos pasos separativos de la proteiacutena P22C
Resultados y Discusioacuten
59
Figura 52 Gel de poliacrilamida tentildeido con azul brillante de Coomassie En cada calle se sembraron 1
microL de muestra EC indica el extracto crudo P1 muestra la fraccioacuten insoluble del lisado celular P2 la
fraccioacuten insoluble luego del congelamiento-descongelamiento del extracto centrifugado FT muestra el
extracto que pasoacute por la columna Con L se indican las calles con las fracciones de lavados sucesivos con
tampoacuten imidazol 0 mM 20 mM 50 mM y 100 mM respectivamente E muestra las fracciones de
elucioacuten con solucioacuten imidazol 250 mM Las fracciones de elucioacuten recolectadas fueron de 15 mL cada
una
513 Antiacutegeno P35
El antiacutegeno de superficie P35 de T gondii (Gen Bank ndeg AF01275) se ha
identificado como antiacutegeno de fase aguda y distintas porciones del mismo presentan
diferentes desempentildeos en su uso diagnoacutestico (Lu y col 2006) Sobre la base de
ensayos previos realizados en el LTI se continuoacute con la obtencioacuten y purificacioacuten de las
dos porciones del antiacutegeno P35 denominadas P35A y P35B
Se ensayoacute la expresioacuten del antiacutegeno P35A (punto 49 seccioacuten Materiales y
meacutetodos) y soacutelo se obtuvo como cuerpos de inclusioacuten en la fraccioacuten insoluble Si bien
fue posible disolver las proteiacutenas recombinantes en urea 8 M al dializar volviacutean a
precipitar
El antiacutegeno P35B se pudo obtener en forma soluble y las condiciones oacuteptimas
encontradas para la induccioacuten del mismo fueron IPTG 1 mM y 4 h con agitacioacuten
vigorosa La Fig 53 muestra una imagen del gel de poliacrilamida luego de la corrida
electroforeacutetica y su tincioacuten Se observoacute que una banda de la fraccioacuten soluble estaba
sobreexpresada en los cultivos inducidos
Resultados y Discusioacuten
60
Figura 53 Gel de poliacrilamida al 12 en condiciones desnaturalizantes Se muestra lo obtenido para
aliacutecuotas de dos cultivos no inducidos 1 y 2 y dos inducidos 3 y 4 Con P se designan las fracciones
insolubles en la solucioacuten de lisis y con SN las fracciones solubles Las bandas que se observan del MPM
corresponden a fragmentos de 19445 KDa 28829 KDa 36545 KDa 49491 KDa 80664 KDa
103035 KDa Se indica la banda sobreexpresada de tamantildeo esperado
Para la induccioacuten preparativa del antiacutegeno P35B se siguioacute el protocolo descripto en
el punto 410 seccioacuten Materiales y Meacutetodos En la Fig 54 se muestra un gel de
poliacrilamida luego de la tincioacuten donde se analizaron aliacutecuotas de todos los extractos
obtenidos en los distintos pasos separativos
Figura 54 Gel de poliacrilamida tentildeido con azul brillante de Coomassie En cada calle se sembraron 7
microL de muestra P1 fraccioacuten insoluble del lisado celular P2 fraccioacuten insoluble luego del congelamiento-
descongelamiento del extracto centrifugado FT muestra el extracto que pasoacute por columna L calles con
las fracciones de lavados sucesivos con tampoacuten imidazol 20 mM 50 mM y 100 mM respectivamente E
fracciones de elucioacuten con solucioacuten imidazol 250 mM Las fracciones recolectadas fueron de 15 mL cada
una
En consecuencia se continuoacute el trabajo con P35B y se descartoacute transitoriamente la
utilizacioacuten del Ang P35A
52 Marcado de antiacutegenos recombinantes de T gondii
Para los ensayos tipo ELISA de captura especiacuteficos para IgM se propuso utilizar
como sistema revelador la enzima HRP-EAV que se une especiacuteficamente a biotina En
consecuencia se procedioacute a marcar los Ang solubles obtenidos con biotina
P35B
P1 P2 P3 P4 MPM
Inducido No Inducido
SN1
Inducido No Inducido
SN2 SN3 SN4
Resultados y Discusioacuten
61
La reaccioacuten de conjugacioacuten se realizoacute siguiendo el protocolo mencionado en el
punto 413 seccioacuten Materiales y Meacutetodos La conjugacioacuten se evidencioacute con la reaccioacuten
de color indicada en el inciso 413 En la Fig 55 se muestra la membrana de
nitrocelulosa sobre la que se fijaron las proteiacutenas P22 y P35B luego del revelado
cromogeacutenico con la enzima HRP conjugada a streptavidina Las reacciones de
conjugacioacuten se llevaron adelante por separado
Figura 55 Membranas de nitrocelulosa evidenciando las proteiacutenas P35B conjugada (izquierda) y P22C
conjugada (derecha)
53 Inmunoensayos
Estudios preliminares (ver punto 62 seccioacuten Experimentos Auxiliares) con los
antiacutegenos recombinantes obtenidos permitieron verificar por ELISA indirecto que sueros
confirmados positivos arrojaban resultados positivos mientras que los sueros negativos
daban el ensayo negativo Se procedioacute entonces a evaluar la capacidad de los antiacutegenos
obtenidos para discriminar sueros de pacientes con infeccioacuten aguda de sueros provenientes
de pacientes con infeccioacuten croacutenica
531 Inmunoensayos con deteccioacuten fotomeacutetrica
Como se anticipoacute en la introduccioacuten se realizaron ELISA siguiendo dos
alternativas de captura En la primera alternativa que denominamos A se procuroacute
capturar selectivamente la maacutexima cantidad de Ac del isotipo que se deseaba detectar
(IgMh) adsorbiendo sobre la placa un anticuerpo ―ad-hoc (Ac-a-IgMh) En la segunda
alternativa que denominamos B se buscoacute capturar con el Ang recombinante la maacutexima
cantidad de Ac especiacuteficos independientemente del isotipo que se tratara En el paso
siguiente del esquema B se tomoacute ventaja de la mayor valencia de las IgM respecto de
las IgG para el revelado
5311 Evaluacioacuten del esquema A
Sobre placas de ELISA se capturaron los Acs IgMh revelaacutendose la presencia de los
especiacuteficos con los antiacutegenos obtenidos marcados con biotina y uniendo a estos uacuteltimos la
enzima HRP-EAV En los ensayos preliminares (ver punto 622 seccioacuten Experimentos
Auxiliares) se identificoacute la cantidad de antiacutegeno marcado y las diluciones de HRP-EAV
oacuteptimas a utilizar para revelar la presencia de IgM especiacutefica capturada En la Tabla 51 se
Resultados y Discusioacuten
62
muestran los valores de absorbancia a 450 nm obtenidos para el panel de 9 sueros
ensayados Se utilizaron 5 g de P22C-biotina por pocillo y 100 L de HRP-EAV en
dilucioacuten 12000
Tabla 51 Absorbancias a 450 nm obtenidas en los ELISA siguiendo el esquema de captura A descrito
maacutes arriba
Placa 1 Placa 2
Agudos
0100 0158
0311 0273
0140 0165
Croacutenicos
0281 0322
0256 0278
0260 0226
Negativos
0217 0168
0235 0179
0409 0354
Sin suero
0135 0134
0143 0114
0126 0100
Sin suero
Sin
P22cBiotina
0071 0050
0070 0037
0047 0040
Los resultados obtenidos con ambos antiacutegenos fueron desalentadores (los resultados
obtenidos con P35B biotina no se informan) ya que no se hallaron diferencias
significativas entre los valores de absorbancia obtenidos con sueros de pacientes
agudos croacutenicos y negativos
5312 Esquema B
En base a los resultados obtenidos en la seccioacuten anterior se orientaron los ensayos
realizando los ELISA siguiendo un esquema no claacutesico al que denominamos B
Debido a la baja sensibilidad que presentaron los Angs conjugados a biotina para
detectar los Acs especiacuteficos pensamos en hacer una primera etapa de concentracioacuten de
los Acs especiacuteficos en la placa para luego revelar con el Ang conjugado a biotina Esto
se hizo adsorbiendo antiacutegeno recombinante sobre la superficie de la placa de
poliestireno enfrentaacutendola luego al suero a ensayar Asiacute se captura selectivamente las
inmunoglobulinas que reconocen al antiacutegeno ya sean IgM o IgG Luego se expone la
placa al mismo antiacutegeno recombinante pero ligado a biotina que se uniraacute a los
anticuerpos especiacuteficos para dicho Ang previamente capturados Finalmente se revela
Resultados y Discusioacuten
63
con HRP conjugada a streptavidina que forma un complejo estable con biotina De esta
forma se aumenta la cantidad de Ang marcado en mayor proporcioacuten para IgM que para
IgG dada la multivalencia de este isotipo de inmunoglobulina En la Fig 56 se
reproduce el esquema B que fue el que brindoacute los resultados maacutes promisorios
Antiacutegeno (Ang) Bloqueante Ang ligado a biotina Reactivo de color
IgM a-Ang IgG a-Ang streptavidina conjugada a HRP
Figura 56 Esquema de ensayo ELISA de captura tipo B El antiacutegeno expuesto en la placa captura la
porcioacuten de las IgM e IgG especiacuteficas presentes en el suero humano Haciendo uso de la polivalencia de
las IgM su presencia se revela con el antiacutegeno conjugado a biotina streptavidina ligada a HRP
adicionando el sustrato de la enzima y un cromoacutegeno actuando como cosustrato
Buscando diferenciar sueros de pacientes en fase de infeccioacuten aguda (agudos) de
sueros provenientes de pacientes sin infeccioacuten (negativos) En la Tabla 52 se muestran los
valores de absorbancia a 450 nm obtenidos
Tabla 52 Absorbancias a 450 nm obtenidas en los ELISA siguiendo el esquema de captura B
Ang
Sueros P35B 05ug P35B 001ug P22C 05ug P22C 001ug
Agudos 2131 1567 0335 0296
1849 1311 065 0413
Negativos 176 1350 0282 0327
1025 1676 0262 0325
Sin suero 1658 1658 0174 0149
1812 1504 0130 0144
Sin Ang
conjugado
0055 004 0041 0045
0057 0042 0039 004
Resultados y Discusioacuten
64
Este ensayo exploratorio demostroacute que los antiacutegenos P22C y P35B pueden ser usados
potencialmente en la deteccioacuten de toxoplasmosis aguda realizando inmunoensayos con el
esquema B propuesto en el presente trabajo Por ello siguiendo este esquema de trabajo se
exploraron cuales eran las condiciones oacuteptimas (ver punto 623 seccioacuten Experimentos
Auxiliares) Asiacute se establecioacute la dilucioacuten de la enzima HRP-EAV (12000) la cantidad de
P22C biotina (5 microg por pocillo) y se acotaron los valores de P22C adsorbidos inicialmente
en la placa entre 500 y 50 ng Finalmente se realizaron tres ensayos en paralelo donde se
evaluoacute la cantidad de antiacutegeno adsorbido inicialmente en la placa y se amplioacute el panel de
sueros Los resultados obtenidos se muestran en la Fig57
Figura 57 Absorbancias a 450 nm para los ELISA realizados con el esquema B (A) 50 ng de Ang P22C
(B) 200 ng de Ang P22C (C) 500 ng de Ang P22C Con se indican los sueros provenientes de
pacientes con infeccioacuten aguda (Agudos) con los provenientes de pacientes con infeccioacuten croacutenica
(Croacutenicos) y con los de pacientes sin infeccioacuten (Negativos) Con la liacutenea roja ( ) se indica el valor
de media menos tres desviacuteos estaacutendares de los agudos (AbsA ndash 3 DSA) y con la liacutenea verde ( ) el valor
de media maacutes tres desviacuteos estaacutendares de los croacutenicos (AbsC +3 DSC)
Resultados y Discusioacuten
65
En las tres condiciones evaluadas se obtiene una separacioacuten de las sentildeales obtenidas al
ensayar sueros provenientes de los pacientes con infeccioacuten aguda (Agudos) de los sueros
provenientes de pacientes con infeccioacuten croacutenica (Croacutenicos) y los pacientes sin infeccioacuten
(Negativos)
Los resultados obtenidos con P35B no resultaron alentadores debido al elevado ruido
de fondo (altos valores de absorbancia de los blancos) Por lo tanto los ensayos
electroquiacutemicos se iniciaron soacutelo con P22C
Mijak y colaboradores (Hiszczyntildeska-Sawicka y col 2005) sentildealan que ya se ha
demostrado la utilidad del Ang SAG2 para detectar IgG en el suero de pacientes con
toxoplasmosis aguda y croacutenica (Parmley y col 1992) destacando que en los resultados
presentados por ese mismo grupo en otra publicacioacuten (Li y col 2000a) soacutelo se examinaron
un reducido nuacutemero de sueros provenientes de pacientes con infeccioacuten aguda con
resultados tanto positivos como negativos Tambieacuten sentildeala que Maine y colaboradores
(Aubert y col 2000) no obtuvieron resultados satisfactorios con este antiacutegeno
recombinante realizando ELISA indirecto Los resultados obtenidos en este trabajo con
ELISA utilizando el esquema A han confirmado lo sentildealado por Mijak y col sobre el
desempentildeo de este Ang El anaacutelisis que estos autores hacen se orienta a que el uso de estos
antiacutegenos recombinantes debe contemplar necesariamente el uso combinado de otros Angs
Por otro lado en el presente trabajo se han presentado resultados que permitiriacutean
complementar esta visioacuten incorporando otro esquema para la deteccioacuten de sueros de
infectados agudos Si bien es necesario ampliar el nuacutemero de sueros para validar el ensayo
los resultados son promisorios Hemos propuesto que las diferencias obtenidas en los
ELISA de captura siguiendo el esquema B pueden deberse a dos mecanismos no
excluyentes entre si y que podriacutean estar actuando en conjunto Por un lado estaacute la
multivalencia que presentan las IgM respecto de las IgG que generariacutea una amplificacioacuten
selectiva de acuerdo al isotipo Por otro lado independientemente del isotipo capturado el
Ang de fase aguda brindariacutea la sensibilidad y especificidad necesaria al ensayo
identificando Acs de fase aguda Resta pues esclarecer si esto es asiacute fehacientemente o si
hay alguacuten otro mecanismo actuando concomitante que permita explicar las diferencias
observadas aquiacute entre sueros de fase aguda y de infectados croacutenicos
Resultados y Discusioacuten
66
532 Inmunoensayos con deteccioacuten amperomeacutetrica utilizando los antiacutegenos
recombinantes
Los bioelectrodos se ensamblaron como se describe en el inciso 41911 de
Materiales y Meacutetodos Al realizar los inmunoensayos con las diluciones pertinentes de
suero humano (muestra incoacutegnita) en caso de suero de paciente infectado (+) estaraacuten
presentes los anticuerpos IgG anti-P22 (analito de intereacutes) Cuando se sumergen en una
dilucioacuten de anticuerpos anti-IgG h conjugado con HRP (segundo anticuerpo marcado) eacuteste
quedaraacute retenido en el electrodo y frente al agregado del sustrato de la enzima (H2O2)
sobre PBS conteniendo el mediador FcMe se genera la especie que seraacute electro-reducida
sobre el electrodo al potencial de trabajo 008 V (vs AgAgCl ver inciso 420 2) A los
fines de claridad en la Fig 58 se reformula el esquema de funcionamiento del biosensor
previamente esquematizado (Fig 212) para el caso particular aquiacute detallado donde el
Ang es la proteiacutena P22C
Proteiacutena recombinante IgG a-IgGh conjugada a HRP
Bloqueante IgG humana ferrocenometanol
Figura 58 Sobre la superficie del electrodo se fija la proteiacutena P22C que capturaraacute los anticuerpos especiacuteficos
si estaacuten presentes en el suero El revelado se realiza con un segundo anticuerpo especiacutefico para IgG humana
marcado con HRP que en presencia de H2O2 oxida el mediador FcMe que se reduce sobre la superficie del
electrodo generando la sentildeal analiacutetica
En la Fig 59 se muestran tres amperogramas representativos obtenidos cuando se
ensayaron sueros confirmados (+) sueros confirmados (-) y blancos (sin suero alguno)
Los valores de corrientes se corrigieron por los valores de aacuterea reales determinados
mediante voltametriacutea ciacuteclica a distintas velocidades de soluciones de ioacuten ferricianuro
(punto 41932 seccioacuten Materiales y Meacutetodos)
Resultados y Discusioacuten
67
Figura 59 Amperometriacuteas comparativas con bioelectrodos ensamblados con la proteiacutena P22C
En la Tabla 54 se resumen los resultados de los ensayos sobre muestras confirmadas
positivas negativas y blanco
Tabla 54 Valores promedios de la corriente cataliacutetica diferencial obtenidas utilizando bioelectrodos
ensamblados con el antiacutegeno P22C
DS desviacioacuten estaacutendar
Las diferencias en las sentildeales registradas fueron estadiacutesticamente significativas
verificaacutendose la potencialidad del uso de esta metodologiacutea para discriminar entre sueros de
pacientes infectados con T gondii de sueros de pacientes no infectados Los ensayos
electroquiacutemicos preliminares informados permiten pensar en el desarrollo de un biosensor
amperomeacutetrico A futuro seriacutea deseable poder establecer un biosensor electroquiacutemico
basaacutendonos en el esquema B de los ELISA presentados en este trabajo de Tesis que
permita la discriminacioacuten entre sueros de pacientes cursando infeccioacuten aguda de sueros de
pacientes con infeccioacuten croacutenica
54 Determinacioacuten de la actividad electroquiacutemica del glicerol en medio acuoso
Si bien desde hace varios antildeos se ha estudiado la oxidacioacuten electrocataliacutetica de
polialcoholes auacuten no existe acuerdo acerca del procedimiento maacutes conveniente para su
cuantificacioacuten electroquiacutemica asiacute como tampoco ha sido posible identificar un uacutenico
mecanismo que deacute cuenta de los productos obtenidos luego de la reaccioacuten electroacutenica
(Kahyaoglu et al 1984 Kwon amp Koper 2010)
Muestra j = Icaacuterea
( A cm-2
)
DS
( A cm-2
)
Positivos -0455 0026
Negativos -0150 0021
Sin suero -0052 004
Resultados y Discusioacuten
68
Con el fin de encontrar el electrodo y las condiciones maacutes convenientes para
realizar la cuantificacioacuten del glicerol se realizaron ensayos exploratorios de
voltametriacuteas ciacuteclicas utilizando electrodos de carbono viacutetreo pasta de C (grafito y
viacutetreo) Au Pt y Ag Los medios ensayados fueron HClO4 01 M solucioacuten tampoacuten de
fosfato salino (PBS) pH 72 90 120 NaCl al 08 mv y NaOH 01 M El intervalo
de concentracioacuten de glicerol utilizado fue de 100 x 10-5
M hasta 01 M
En estos ensayos iniciales las maacuteximas sentildeales se obtuvieron con electrodos de Au
en medio alcalino (NaOH 01 M) coincidiendo con lo descripto por Lamy (Kahyaoglu
et al 1984) A modo ilustrativo en la Fig 510 se observan dos voltametriacuteas ciacuteclicas
para electrodos de oro y de platino en medio alcalino
Figura 510 Voltamperogramas tiacutepicos para soluciones de glicerol 10-2
M en soluciones de base fuerte
(NaOH 01M) utilizando electrodos de trabajo de Au (izquierda) y Pt (derecha)
En una etapa posterior se verificoacute que las sentildeales obtenidas Ip respondiacutean
proporcionalmente a la concentracioacuten de glicerol Se realizoacute una curva de calibracioacuten en
el intervalo de concentraciones de 50 x 10-4
a 10 x 10-2
M Todas las mediciones se
hicieron por triplicado La Tabla 55 muestra las medias de las corrientes de pico
obtenidas para cada concentracioacuten ensayada con su correspondiente desviacuteo estaacutendar La
corriente de pico se midioacute tomando una liacutenea de base recta a un valor de potencial de
010 V plusmn 005 V usando algoritmos propios del programa GPES 49
Tabla 55 Valores medios de corriente obtenidos por voltametriacutea ciacuteclica para la oxidacioacuten del
glicerol en medio alcalino (NaOH 01 M) sobre electrodos de oro
[Glicerol]
(mM)
Ip
(microA cm-2
)
DS Ip
(microA cm-2
)
050 18 032
100 28 038
200 74 041
500 17 035
750 262 055
100 347 053
-50E-05
00E+00
50E-05
10E-04
15E-04
20E-04
25E-04
-0400 -0200 0000 0200 0400 0600 0800
E(V)
i(A
)
-40E-06
00E+00
40E-06
80E-06
12E-05
16E-05
-1000 -0800 -0600 -0400 -0200 0000 0200 0400
E(V)
i(A
)
Resultados y Discusioacuten
69
En la Fig 511 se presenta la dependencia de la corriente de pico
voltamperomeacutetrica con la concentracioacuten de glicerol Las barras de error corresponden a
las desviaciones estaacutendar de cada medida realizada por triplicados independientes Se
ajustaron estos valores a una recta con el meacutetodo de los miacutenimos cuadrados y se obtuvo
la siguiente ecuacioacuten
[51]
donde IpA estaacute en microA cm-2
y [glicerol] en mM El valor de coeficiente de regresioacuten
(R2) obtenido fue de 09980
Figura 511 Dependencia de la corriente de pico voltamperomeacutetrica con la concentracioacuten de glicerol en
medio alcalino (NaOH 01 M) Se muestran los valores promedios de tres medidas independientes Las
barras de error se corresponden a los desviacuteos estaacutendares
En estas condiciones de trabajo el pico de corriente oxidativa tiene dependencia
lineal con la concentracioacuten de glicerol En funcioacuten de estos resultados se orientoacute la
buacutesqueda hacia una metodologiacutea que permitiese determinar al glicerol en
concentraciones de 10-5
M o menores Para esto iniciamos ensayos con teacutecnica
amperomeacutetrica
Se realizaron los ensayos amperomeacutetricos como se describe en el punto 4202 de la
seccioacuten Materiales y Meacutetodos La Fig 512 muestra el resultado de una amperometriacutea
tiacutepica para una solucioacuten de glicerol
Resultados y Discusioacuten
70
t s
0 50 100 150 200 250 300 350 400 450
I A
0
2
4
6
Figura 512 Amperometriacutea tiacutepica de una muestra con glicerol (concentracioacuten en celda 1 mM) Se dejoacute
estabilizar la corriente para una solucioacuten de NaOH 01 M y a los 50 segundos se realizoacute el agregado de la
muestra con glicerol y se midioacute la corriente hasta los 400 segundos
Se ensayaron soluciones de glicerol cuya concentracioacuten en la celda electroliacutetica
fueron desde 001 mM hasta 5 mM Como blanco se utilizoacute solucioacuten de NaOH 01 M
La corriente cataliacutetica se midioacute como la diferencia entre la corriente final y la inicial
(punto 4202 seccioacuten Materiales y Meacutetodos) A este valor de corriente se lo dividioacute
por el valor de aacuterea real del electrodo medida anteriormente esta densidad de corriente
(IcA) se tomoacute como la sentildeal analiacutetica En la Tabla 56 se muestran las medias de las
sentildeales obtenidas para cada concentracioacuten de glicerol ensayada con su correspondiente
desviacuteo estaacutendar
Tabla 56 Valores medios de densidades de corriente obtenidos por amperometriacutea para la oxidacioacuten de
glicerol en medio alcalino (NaOH 01 M)
[Glicerol]
(mM)
Ic A
( A cm-2
)
DS
( A cm-2
)
0000 0447 0029
0010 0763 0016
0025 1098 0068
0050 1510 0055
0100 285 049
0250 609 036
0500 1245 033
0750 1730 0097
100 2361 0099
150 3445 033
175 3997 020
200 4613 045
Resultados y Discusioacuten
71
En la Fig 513 se presenta la recta de regresioacuten lineal obtenida a partir de los
valores promedio de densidades de corriente para soluciones de glicerol en el intervalo
de concentraciones de 0025 mM y 2 mM Las barras de error corresponden a las
desviaciones estaacutendares de cada medida La ecuacioacuten de la recta obtenida por el meacutetodo
de miacutenimos cuadrados fue
[52]
Donde IcA estaacute en microA cm-2
y [Glicerol] en mM el valor del coeficiente de
regresioacuten (R2) obtenido fue de 09950
[Glicerol] mM
000 025 050 075 100 125 150 175 200
I cA
m
A c
m-2
0
10
20
30
40
50
Figura 513 Curva de calibracioacuten obtenida para glicerol en medio alcalino (NaOH 01 M) con la teacutecnica
amperomeacutetrica Se muestran los valores promedios de tres medidas independientes para cada solucioacuten
Las barras de error que se muestran corresponden al DS de cada punto
Las cifras de meacuterito para esta teacutecnica resultaron ser
Liacutemite de deteccioacuten 10 M
Liacutemite de cuantificacioacuten 24 M
Liacutemite de discriminacioacuten 10 M
Intervalo de linealidad 0024 mM ndash 200 mM
55 Cuantificacioacuten de glicerol en medios acuosos complejos
El glicerol es corrientemente utilizado como principal fuente de carbono en cultivos
bacterianos siendo degradado eficientemente por sistemas enzimaacuteticos que utilizan
mecanismos redox Por lo tanto se comenzoacute a estudiar la posible cuantificacioacuten
electroquiacutemica de este alcohol intentando detectar concentraciones del orden 10-5
M o
Resultados y Discusioacuten
72
menores para poder asiacute evidenciar su consumo en medios de cultivos bacterianos que
contienen glicerol como nutriente El meacutetodo amperomeacutetrico con electrodo de oro no
fue lo suficientemente selectivo para glicerol cuando este se encontraba en matrices
complejas (no se muestran los resultados) por lo tanto al momento de cuantificarlo en
medios de cultivos bacterianos tuvimos que optar por otra metodologiacutea
Sobre la base del trabajo de Tuntildeoacuten-Blanco y col (Aacutelvarez-Gonzaacutelez et al 2000)
se busco desarrollar un biosensor selectivo para este analito
Para verificar la funcionalidad del modelo propuesto se realizaron ensayos
espectrofotomeacutetricos La coenzima NAD(H) en su forma reducida (NADH) presenta un
maacuteximo de absorcioacuten a 340 nm ausente en la forma oxidada (NAD+) Puede apreciarse
en la Fig 514 que el mediador electroquiacutemico Fe(CN)63-
presenta un maacuteximo de
absorcioacuten a 420 nm ausente en la forma reducida Fe(CN)64-
En un primer ensayo se
verificoacute espectrofotomeacutetricamente que la longitud de onda escogida podiacutea utilizarse
para el seguimiento de la reaccioacuten En una serie de ensayos posteriores se monitoreoacute la
reaccioacuten enzimaacutetica en presencia y ausencia del mediador electroquiacutemico haciendo uso
de estas propiedades espectrales
Figura 514 Espectros de absorcioacuten UV-visible para las especies Fe(CN)33-
1 mM y Fe(CN)34-
1 mM
Ambas especies fueron disueltas en solucioacuten tampoacuten carbonato pH 105 Puede apreciarse claramente que
el maacuteximo de absorcioacuten a 420 nm presente en el Fe(CN)63-
se encuentra ausente en el Fe(CN)64-
La
velocidad de barrido fue 1200 nm min-1
551 Evaluacioacuten del modelo propuesto por medio de lecturas
espectrofotomeacutetricas
El primer ensayo para validar el modelo propuesto fue seleccionar la longitud de
onda oacuteptima para el seguimiento espectrofotomeacutetrico A tal fin se llevaron adelante dos
0
025
05
075
1
125
15
175
2
225
25
275
260 280 300 320 340 360 380 400 420 440 460 480 500
Longitud de onda (nm)
Ab
sorb
an
cia
Ferricianuro 1 mM
Ferrocianuro 1 mM
Resultados y Discusioacuten
73
reacciones a) glicerol disuelto en medio 7H9 coenzima Fe(CN)63-
y enzima GlDH y
b) glicerol disuelto en medio 7H9 coenzima Fe(CN)63-
pero sin la enzima GlDH En
ambos casos se realizoacute un barrido espectral de 320 a 480 nm registraacutendose la
absorbancia a una velocidad de barrido de 1200 nm min-1
cada 10 min Ambas
reacciones se llevaron a cabo en solucioacuten tampoacuten carbonato pH 105 En la Fig 515 se
muestran los barridos espectrales obtenidos para cada reaccioacuten y en ella puede
apreciarse que la mayor diferencia se presenta a la longitud de onda prevista (420 nm)
Figura 515 Espectros de absorcioacuten UV-visible para mezclas de reaccioacuten (A) En presencia de enzima
GlDH (B) Sin enzima GlDH Barrido espectral cada 10 min
Para elucidar si el consumo de Fe(CN)63-
observado se correspondiacutea
cuantitativamente con el NADH generado y en consecuencia con el glicerol
consumido se tuvieron en cuenta las siguientes reacciones
glicerol + Fe(CN)63-
DHA + Fe(CN)64-
(1)
glicerol + NAD+ NADH + DHA (2)
Se realizaron series de 3 reacciones en paralelo a saber a) blanco de reaccioacuten (BR)
con enzima GlDH NAD+ y Fe(CN)6
3- en ausencia de glicerol donde se siguioacute la
absorbancia a 420 nm b) reaccioacuten (1) con enzima GlDH NAD+ Fe(CN)6
3- y glicerol
donde se siguioacute la desaparicioacuten de Fe(CN)63-
a 420 nm c) reaccioacuten (2) con enzima
GlDH NAD+ y glicerol donde se siguioacute la aparicioacuten de NADH a 340 nm Debe tenerse
en cuenta por un lado que el NAD+ es reducido a NADH en la reaccioacuten (2) no se
regenera mientras que en la reaccioacuten (1) se regenera por la presencia del anioacuten
Fe(CN)63-
Esto implica que si bien ambas reacciones se lentifican con el paso del
tiempo a causa del consumo de glicerol (y acumulacioacuten de DHA) la reaccioacuten (2) se
lentifica maacutes que la (1) porque se consumen tanto el glicerol como el NAD+
y se
acumulan ambos productos de reaccioacuten (DHA y NADH) Los resultados pueden verse
en la Fig 516
A
0
015
03
045
06
075
09
105
12
135
15
320 340 360 380 400 420 440 460 480
Longitud de onda (nm)
Ab
sorb
an
cia
t = 0
t = 10 min
t = 20 min
t =30 min
t = 40 min
t = 50 min
t = 60 min
B
0
015
03
045
06
075
09
105
12
135
15
320 340 360 380 400 420 440 460 480
Longitud de onda (nm)
Ab
sorb
an
cia
t = 0 min
t = 10 min
t = 20 min
t = 30 min
t = 40 min
t = 50 min
t = 60 min
GlDHNAD+
GlDH
Resultados y Discusioacuten
74
Figura 516 Absorbancias registradas a 420 nm durante las reacciones descriptas en el texto A) Blanco
de reaccioacuten (BR) y reaccioacuten (1) B) Reaccioacuten (2) C) Segmento inicial de la curva representada en
B) a partir de la cual se calculoacute el valor liacutemite de la velocidad inicial de reaccioacuten Se muestra un
experimento representativo de un original y replicado
Se asumioacute que la reaccioacuten (1) transcurre a una velocidad constante en las
condiciones en que se llevoacute a cabo El anaacutelisis estadiacutestico demuestra que hay una ligera
tendencia a la no linealidad evidenciada por la distribucioacuten de los residuos No
obstante siendo las variancias iguales se consideroacute que no hay un alejamiento
significativo de la linealidad Por ello en los caacutelculos de variacioacuten de la concentracioacuten
de coenzima a lo largo del tiempo de reaccioacuten se tuvo en cuenta el cambio que se
produciriacutea si la velocidad de reaccioacuten se mantuviera constante e igual a la velocidad
inicial Para el caso del NAD+ consumido (o NADH generado) en la reaccioacuten (2)
tenemos
[53]
Asumiendo que en el intervalo de concentraciones de trabajo se cumple la ley de
Beer la ec [53] puede reescribirse como
[54]
Si la velocidad de la reaccioacuten enzimaacutetica se mantiene aproximadamente igual a la
velocidad inicial por la regeneracioacuten de la coenzima se puede admitir que la velocidad
A
05
056
062
068
074
08
086
092
098
104
11
0 600 1200 1800 2400 3000 3600
tiempo (s)
Ab
s 4
20
nm
B
0
004
008
012
016
02
024
028
032
036
04
044
048
0 600 1200 1800 2400 3000 3600tiempo (s)
Ab
s 3
40
nm
C
y = 00004405x
R2 = 09983921
0
0035
007
0105
014
0175
021
0 60 120 180 240 300 360 420 480
tiempo (s)
Ab
s 3
40
nm R
2 = 09984
Resultados y Discusioacuten
75
de reaccioacuten es constante (reaccioacuten de orden cero para los reactivos) pudieacutendose expresar
la ec [54] en la siguiente forma
b
k
tb
tk
tb
Abs
nmNADHnmNADHnmNADH
nm
340340340
340 [55]
donde k es la constante de velocidad para esa reaccioacuten en unidades de absorbancia por
unidad de tiempo (s-1
) y se obtiene como la pendiente del segmento lineal de la curva de
la Fig 516 B presentado en la Fig 516 C
La variacioacuten de concentracioacuten total de coenzima se obtiene multiplicando el valor
de velocidad por la variacioacuten de tiempo total
[56]
siendo los valores de los paraacutemetros y variables en cuestioacuten
εNADH 340nm = 6220 M-1
cm-1
Δt = 3600 s
b = 1 cm
k = 44 x 10-4
s-1
resultando
[57]
La variacioacuten de concentracioacuten del mediador seraacute
[58]
nmCNFe 420)( 36
= 1080 M-1
cm-1
ΔAbs420nm = 052
que reemplazando en la ec [58] arroja
M [59]
La variacioacuten de absorbancia observada en el blanco de reaccioacuten a lo largo de una
hora fue de 00046 unidades de absorbancia que representa menos del 1 de la
variacioacuten total observada en la reaccioacuten (1) Estos resultados permiten verificar que en
las condiciones de reaccioacuten el Fe(CN)63-
reducido a Fe(CN)64-
equivale
cuantitativamente al NADH generado en la reaccioacuten enzimaacutetica de acuerdo a la
siguiente estequiometriacutea
Resultados y Discusioacuten
76
2 Fe(CN)63-
+ NADH 2 Fe(CN)64-
+ NAD+ [510]
Lo mostrado corrobora la factibilidad del disentildeo de un biosensor de una sola
enzima con un mediador soluble econoacutemico
5511 Evaluacioacuten de la sentildeal con la concentracioacuten de glicerol
Para verificar si la sentildeal analiacutetica muestra dependencia con la concentracioacuten de
glicerol se realizaron 6 reacciones en paralelo registraacutendose la absorbancia a 420 nm
cada un minuto durante dos horas Se realizoacute un blanco de reaccioacuten sin glicerol y cinco
reacciones con concentraciones crecientes de glicerol Como muestras se utilizaron el
medio de cultivo de micobacterias Middlebrook 7H9 suplementado con glicerol a
distintas concentraciones En la Tabla 57 se presentan las concentraciones de glicerol
en las mezclas de reaccioacuten y en las muestras La Fig 517 muestra la absorbancia a 420
nm para las seis reacciones
Tabla 57 Concentraciones de glicerol en las mezclas de reaccioacuten
Reaccioacuten [glicerol] en mezcla
de reaccioacuten (mM) [glicerol] en muestra
(mM)
Blanco 0 0
Muestra 1 11 22
Muestra 2 082 16
Muestra 3 055 11
Muestra 4 027 55
Muestra 5 011 22
Resultados y Discusioacuten
77
Figura 517 Absorbancia a 420 nm de las mezclas de reaccioacuten descriptas en el texto ( ) 11 mM de
glicerol ( ) 082 mM de glicerol ( ) 055 mM de glicerol (o) 027 mM de glicerol (-) 011 mM de
ccedilglicerol ( ) blanco de reaccioacuten
Habiendo verificado la dependencia de la sentildeal analiacutetica con el analito de intereacutes se
procedioacute a determinar el intervalo dinaacutemico lineal Para ello se realizaron las reacciones
de color como se describe en el apartado 417 de la seccioacuten Materiales y meacutetodos Cada
reaccioacuten se hizo por triplicado En la Fig 518 se muestran resumidos los resultados
obtenidos
[Glicerol] mM
000 005 010 015 020 025 030 035 040
Ab
s 42
0 n
m
00
02
04
06
08
10
Figura 518 Curva de calibracioacuten para glicerol utilizando el meacutetodo colorimeacutetrico Se muestran los
valores promedios de tres medidas independientes Las barras de error corresponden a los desviacuteos
estaacutendares
La recta de regresioacuten que se obtuvo a partir de estos valores fue
Abs420nm = 0946 ndash 238 [glicerol] [511]
02
03
04
05
06
07
08
09
1
0 1200 2400 3600 4800 6000 7200
tiempo (s)
Ab
s 4
20
nm
Resultados y Discusioacuten
78
cuyo coeficiente de regresioacuten (R2) fue 09980 En el intervalo de concentraciones de
0025 a 027 mM la respuesta fue lineal
5512 Optimizacioacuten de condiciones para disminuir el costo operativo
Se verificoacute la posibilidad de cuantificar glicerol en medio Middlebrook 7H9
optimizando las concentraciones de reactivos y los tiempos de reaccioacuten para obtener la
maacutexima sentildeal con la mezcla maacutes econoacutemica posible Se ensayaron distintas
concentraciones de cofactor NAD+ a utilizar y 2 tiempos de reaccioacuten para una curva de
calibrado de 6 puntos consistente en un blanco y cinco estaacutendares de glicerol todos por
triplicado
Para verificar la factibilidad de disminuir la concentracioacuten de cofactor soluble sin
alterar significativamente la sensibilidad del meacutetodo se utilizoacute un disentildeo experimental
con un modelo de superficie de respuesta Como factores se tomaron la concentracioacuten
de cofactor y el tiempo de reaccioacuten Los niveles seleccionados en base a ensayos
previos fueron concentracioacuten de cofactor (NAD+) 01 mM 023 mM 037 mM y 05
mM tiempo 1 y 2 h Las respuestas que se evaluaron fueron la pendiente de una recta
de regresioacuten calculada a partir del meacutetodo de miacutenimos cuadrados y el coeficiente de
regresioacuten lineal correspondiente En la Tabla 58 se muestran los niveles parametrizados
y los valores de las respuestas obtenidas
Tabla 58 Disentildeo experimental factores parametrizados y respuestas obtenidas
Cada uno de los estaacutendares indicados en la Tabla 58 se correlaciona con una curva
de calibrado realizada En la Tabla 59 se informan los valores de concentracioacuten de
glicerol de las soluciones utilizadas para las reacciones de color y la concentracioacuten
correspondiente en la mezcla de reaccioacuten
Estaacutendar [NAD+] Tiempo Pendiente R2
4 1 -1 068 08790
7 03333 1 227 09962
8 1 1 184 09621
5 -1 1 159 09931
3 03333 -1 083 09590
2 -03333 -1 1 09850
6 -03333 1 244 09863
1 -1 -1 071 09914
Resultados y Discusioacuten
79
Tabla 59 Valores de concentracioacuten de los estaacutendares utilizados para los ensayos de optimizacioacuten
Reaccioacuten [glicerol] en mezcla
de reaccioacuten (mM) [glicerol] en muestra
(mM)
Blanco 0 0
Muestra 1 0010 02
Muestra 2 0025 05
Muestra 3 0050 10
Muestra 4 0075 15
Muestra 5 010 20
La ecuacioacuten de ajuste propuesta por el modelo de superficie de respuesta para la
pendiente fue
tBNADAm ][421 [512]
donde A y B son los coeficientes del modelo que se calculan a partir de la forma de la
superficie de respuesta e indican la dependencia de la pendiente (m) con la
concentracioacuten de cofactor ([NAD+]) y el tiempo de reaccioacuten (t) respectivamente El
anaacutelisis de los resultados indica que de los dos coeficientes solo B es significativo y su
valor es 062 mientras que A es un coeficiente no significativo Esto significa que la
pendiente de la recta de calibrado no muestra dependencia con la concentracioacuten de
cofactor NAD+ utilizado
Por otra parte el coeficiente de correlacioacuten no mostroacute dependencia con ninguno de
los factores elegidos Esto indica que el modelado de la funcioacuten deseabilidad global
queda reducido al de una sola respuesta la pendiente de la recta de calibrado y a un
uacutenico factor significativo que es el tiempo de reaccioacuten En base a estos resultados
pudimos establecer un uso miacutenimo de cofactor soluble
552 Determinacioacuten de glicerol remanente en cultivos de micobacterias
5521 Evaluacioacuten de glicerol remanente en cultivos axeacutenicos de M smegmatis
Primeramente se evaluoacute si podiacutea evidenciarse el consumo de glicerol por parte de
M smegmatis en un cultivo axeacutenico es decir conteniendo soacutelo este microorganismo
Para ello se realizaron cultivos de la micobacteria como se describe en el punto 418 de
la seccioacuten Materiales y Meacutetodos y se determinoacute el glicerol remanente haciendo uso del
meacutetodo fotomeacutetrico presentado previamente El anaacutelisis de la variancia de los valores de
absorbancia registrados y posteriormente se realizoacute un ensayo de comparaciones
muacuteltiples utilizando las pruebas de Tukey y de Bonferroni Se detectaron diferencias
estadiacutesticamente significativas en las absorbancias de las muestras del medio con M
Resultados y Discusioacuten
80
smegmatis a las 2 y 3 h de iniciados los cultivos respecto de aquellos medios
conservados en esterilidad
5522 Determinacioacuten de glicerol remanente en cultivos de micobacterias con y
sin fago D29 y ensayos controles respectivos
En una segunda serie de ensayos nos propusimos ver si habiacutea consumo diferencial
de glicerol entre cultivos de M smegmatis y cultivos de la micobacteria infectados con
el fago D29 siguiendo el protocolo descripto en el punto 4181 de la seccioacuten Materiales
y Meacutetodos En la Fig 519 se muestran los valores de absorbancia a 420 nm de las
muestras mencionadas Sobre este conjunto de datos nuevamente se realizoacute un anaacutelisis
de la variancia y ensayos de comparaciones muacuteltiples utilizando las pruebas de Tukey y
de Bonferroni
Los resultados obtenidos indican que todos los medios de cultivo a los cuales no se
le inoculoacute bacterias y aquellos medios donde se inoculoacute bacterias pero fueron
centrifugados inmediatamente despueacutes del inoacuteculo (muestras a t= 0) no mostraron
diferencias estadiacutesticamente significativas en los ensayos de comparaciones muacuteltiple
realizados Esto permite concluir que el agregado de fago y la incubacioacuten a 37 ordmC no
producen modificaciones significativas per se en las reacciones de color Por ello es
posible afirmar que en el futuro podraacuten simplificarse los controles a un uacutenico testigo
de concentracioacuten inicial conocida sin necesidad de tomar una muestra del cultivo
inmediatamente despueacutes del inoacuteculo o de la adicioacuten de fagos a los controles negativos
del ensayo
En este ensayo preliminar pudimos observar que las diferencias de absorbancia
resultaron estadiacutesticamente significativas entre los medios de cultivo donde crecieron
ceacutelulas de M smegmatis y los medios donde crecieron ceacutelulas de M smegmatis
infectadas con fago D29 tanto a las 2 como a las 4 h de iniciados los cultivos Este
resultado indicoacute que la hipoacutetesis de trabajo planteada era apropiada y en consecuencia
seriacutea factible desarrollar un meacutetodo para verificar la integridad de micobacterias en un
cultivo de las mismas
Resultados y Discusioacuten
81
Bla
nco
Med
io 0
025
00
25
+ F
ago t
= 0
00
25
C
eacutelula
s t
= 0
00
25
Ceacutel
ula
s +
Fag
o t
= 0
00
25
+ F
ago t
= 2
00
25
Ceacutel
ula
s t
= 2
00
25
Ceacutel
ula
s +
fag
o t
= 2
00
25
fa
go t
= 4
00
25
Ceacutel
ula
s t
= 4
00
25
Ceacutel
ula
s +
fag
o t
= 4
Abs
420 n
m
03
04
05
08
Figura 519 Absorbancias a 420 nm registradas para las muestras descritas Se indica concentracioacuten
inicial de glicerol en mv y tiempo de incubacioacuten a 37 ordmC El blanco corresponde al de la reaccioacuten de
color sin glicerol
553 Biosensor amperomeacutetrico a base de pasta de carbono viacutetreo modificada
En funcioacuten de los resultados previos se procedioacute al ensamblado de un biosensor
amperomeacutetrico siguiendo el esquema de reaccioacuten presentado previamente que se
reproduce en la figura 520
Figura 520 Esquema de reaccioacuten propuesto para biosensor amperomeacutetrico selectivo para glicerol La
coenzima reducida NADH se regenera a su forma oxidada NAD+ reaccionando con el Fe(CN)6
3- que se
reduce a Fe(CN)64-
Este uacuteltimo se reoxida electroquiacutemicamente sobre la superficie del electrodo
completando el ciclo cataliacutetico
Utilizando electrodos de pasta de carbono B (punto 41912 seccioacuten Materiales y
Meacutetodos) se realizaron amperometriacuteas siguiendo el protocolo descrito en el punto 4202
glicerol
DHA
GlDHox
GlDHred NAD+
NADH Mediador ox
Mediador red
e- Electrodo
Resultados y Discusioacuten
82
de la seccioacuten Materiales y Meacutetodos En la Fig 521 se muestra un amperograma tiacutepico
obtenido
Tiempo s
100 200 300 400 500
I
nA
0
20
40
60
80
100
Figura 521 A) Amperograma tiacutepico obtenido con un electrodo de trabajo de pasta de carbono B
trabajando a un potencial de 038 V Se agregaron 50 L de medio 7H9 suplementado con glicerol
usualmente a los 300 s de iniciada la lectura de corriente cuando eacutesta se estabilizoacute B) Agregados
sucesivos de 50 microL de medio 7H9 suplementado con glicerol 20 mM sobre 200 mL de la misma
solucioacuten
En la Fig 522 se presenta la recta de regresioacuten obtenida a partir de los valores
promedios de corrientes para soluciones de glicerol en el intervalo de concentraciones
de 0062 mM y 175 mM Las barras de error corresponden a las desviaciones estaacutendar
de cada medida La ecuacioacuten de la recta obtenida por el meacutetodo de miacutenimos cuadrados
fue
[513]
donde Ic estaacute en nA y [Glicerol] en mM el valor del coeficiente de regresioacuten (R2)
obtenido fue de 09982
Las cifras de meacuterito para esta teacutecnica resultaron ser
Liacutemite de deteccioacuten 20 M
Liacutemite de cuantificacioacuten 60 M
Liacutemite de discriminacioacuten 15 M
Intervalo de linealidad 0060 mM ndash 175 mM
Tiempo s
0 500 1000 1500 2000
I
nA
0
50
100
150
200
Resultados y Discusioacuten
83
[Glicerol] mM
000 025 050 075 100 125 150 175 200
Ic
nA
0
50
100
150
200
Figura 522 Recta de calibracioacuten para glicerol utilizando el meacutetodo amperomeacutetrico descrito en el texto
Se muestran los valores promedios de corrientes liacutemite corregidas y las desviaciones estaacutendares de 3
lecturas independientes
Una vez que se preparoacute la pasta de carbono viacutetreo modificada con la enzima esta
resultoacute estable durante 10 semanas sin peacuterdida de actividad enzimaacutetica siempre que se
mantuviese seca a 4 degC Una vez que se ensambloacute el biosensor con el poliacutemero
electrodepositado pudo utilizarse durante al menos 8 horas consecutivas con una
peacuterdida de sensibilidad insignificante En efecto los cambios observados en las sentildeales
registradas de forma consecutiva se encontraron dentro del error intriacutenseco del meacutetodo
propuesto La estabilidad de un mismo biosensor durante diacuteas sucesivos se evaluoacute
realizando medidas de la misma solucioacuten y evaluando la relacioacuten sentildealruido la cuaacutel
disminuyoacute un 15 del valor original al tercer diacutea y un 50 al quinto diacutea de uso
554 Desarrollo de un biosensor a base de pasta de carbono viacutetreo y
nanotubos de carbono
Para reducir los tiempos de anaacutelisis se procuroacute disminuir el periacuteodo de
estabilizacioacuten de la corriente modificando el esquema original propuesto para el sensor
Para esto se modificoacute la pasta de carbono con nanotubos de carbono de paredes
muacuteltiples (Rubianes amp Rivas 2003) Seguacuten trabajos previos esta estrategia permite
disminuir el sobrepotencial asociado a la electrooxidacioacuten de la coenzima NADH
evitaacutendose el uso de un mediador soluble (Musameh 2002) Previo a su utilizacioacuten los
NTC fueron funcionarizados por carboxilacioacuten oxidativa siguiendo el protocolo
especificado en el punto 421 de la seccioacuten Materiales y Meacutetodos
Resultados y Discusioacuten
84
En la Fig 523 (derecha) se muestran las voltametriacuteas que se obtuvieron utilizando
un electrodo de trabajo relleno con pasta B (pasta de carbono viacutetreo modificada con
enzima GlDH al 2 en masa)
Figura 523 Voltamperogramas ciacuteclicos utilizando bioelectrodos de pasa de carbono B con GlDH
(derecha) y pasta C con GlDH y MWCNT (izquierda) En liacutenea puntuada se muestran las voltametriacuteas de
la solucioacuten NAD+ 05 mM (NH4)2SO4 25mM K2CO3 KHCO3 01 M pH 105 (blanco) En liacutenea
continua las voltametriacuteas de las mismas soluciones con el agregado de glicerol en concentracioacuten final 25
mM La velocidad de barrido fue 50 mV s-1
Se marcan los picos de corriente observados y el potencial de
pico
El sobrepotencial asociado a la electroxidacioacuten de la coenzima NADH en el
electrodo de pasta de carbono B es 70 mV menor que el informado por Wang y col Ep
= 082V sobre electrodos de carbono viacutetreo (Musameh 2002) Esta diferencia podriacutea
deberse a los distintos pH de trabajo o bien a alguna diferencia en las cualidades de la
superficie del electrodo
En la Fig 523 (izquierda) se muestran los resultados obtenidos con los electrodos
de pasta C pasta de carbono modificada con GlDH al 2 y con MWCNT al 10 en
masa En este caso vemos que el sobrepotencial asociado a la electroxidacioacuten de NADH
es 0180 V menor Ep = 057 V que el observado para la pasta B Esta diferencia
podemos atribuirla a las cualidades diferentes de las superficies del electrodo debida a la
presencia de los MWCNT Es de destacar que Wang y col en la oxidacioacuten del NADH
sobre la superficie de carbono viacutetreo modificado con MWCNT observaron dos
procesos oxidativos uno principal con un Ep de 033 V y otro secundario con Ep de
057 V que aparece como hombro del primero (ver Fig 524 reproducida de Wang y
col)
Ep = 075 V
Resultados y Discusioacuten
85
Figura 524 Reproducido de Musameh y col 2002 Voltamperogramas correspondientes a una solucioacuten 5
mM de coenzima NADH en solucioacuten tampoacuten fosfato 005 M pH 74 utilizando electrodos de trabajo de
pasta de carbono viacutetreo sin modificar (A) y modificado con MWCNT (B) Velocidad de barrido 50 mV s-1
En el voltagrama B puede apreciarse el pico principal y el secundario que aparecen como hombro del
primero
En este trabajo soacutelo se pudo identificar un uacutenico proceso oxidativo a 057 V Si bien
auacuten estamos investigando posibles causas que hayan originado esta diferencia es de
esperar que el pH sea un factor determinante ya que la oxidacioacuten de NADH a NAD+
involucra la perdida de un H+ Por otra parte en los voltagramas realizados con pasta C
se registroacute un importante aumento de las corrientes capacitivas (18 μA) en relacioacuten a
las voltametriacuteas donde se utilizaron electrodos de pasta sin MWCNT Este mismo
efecto pero en menor magnitud (55 μA) tambieacuten fue registrado por Wang y
colaboradores al trabajar con electrodo de carbono viacutetreo modificado con MWCNT
(Musameh 2002) Los resultados obtenidos por Wang y colaboradores y los de este
trabajo de Tesis se muestran comparativamente en la Tabla 510
Tabla 510 Resultados obtenidos por Musameh y col 2002 y los correspondientes a este trabajo
Musameh y col
2002 Este trabajo
Electrodo de
trabajo Cv
C v +
MWCNT Pasta B Pasta C
V barrido 50 mV s-1 50 mV s
-1
pH 74 105
Ep (V) 082 033
057 075 057
Aumento de la
I cap (μA) - 55 - 18
Resultados y Discusioacuten
86
Con estos resultados preliminares comenzamos los ensayos amperomeacutetricos para
cuantificar el glicerol remanente en los medios de cultivos de micobacterias Se llevaron
adelante distintos ensayos y nuevamente el inconveniente principal al que nos
enfrentamos fue que la respuesta no era estable en el tiempo En la Fig 525 se muestra
un amperograma obtenido con un bioelectrodo de pasta C y realizando agregados
sucesivos de un estaacutendar de glicerol 20 mM disuelto en medio Middelbrook 7H9
Con este nuevo esquema de trabajo no se logroacute acortar los tiempos de estabilizacioacuten
de la corriente Los algoritmos de correccioacuten de corriente de base que estaacuten
incorporados al programa GPES tampoco permitieron solucionar este inconveniente
Por este motivo se optoacute por utilizar teacutecnicas voltameacutetricas de pulso que en principio
permitiriacutean evitar este inconveniente
Tiempo s
0 100 200 300 400 500 600 700 800 900
I A
0
1
2
3
4
Figura 525 Amperograma obtenido con un bioelectrodo de pasta de carbono C trabajando a 05 V vs
AgAgCl A t=200 s de iniciada la lectura se agregaron 50 L de medio 7H9 y posteriormente se
realizaron agregados sucesivos de 50 L de medio 7H9 suplementado con glicerol 20 mM
5541 Ensayos de cuantificacioacuten de glicerol con el bioelectrodo desarrollado
utilizando teacutecnicas de pulso
Las teacutecnicas voltameacutetricas de pulso presentan la ventaja de permitir trabajar durante
tiempos muy reducidos en la zona de potencial donde la especie electroactiva cambia
su estado de oxidacioacuten produciendo la sentildeal analiacutetica
Se optoacute por ensayar la voltametriacutea de onda cuadrada para los futuros ensayos de
cuantificacioacuten y los experimentos preliminares procuraron establecer los valores maacutes
convenientes de los paraacutemetros relevantes de la teacutecnica como la amplitud de pulso el
escaloacuten de potencial y la frecuencia (punto 633 seccioacuten Experimentos Auxiliares)
Resultados y Discusioacuten
87
En una segunda serie de ensayos se buscoacute observar la dependencia de la corriente
de pico con la concentracioacuten de glicerol Para esto se realizaron ensayos
independientes En este esquema de trabajo surgioacute un inconveniente respecto del criterio
de medida de la corriente de pico ya que en ensayos independientes no se pudo
establecer una liacutenea de base comuacuten a todos los voltamperogramas
Se ensayaron distintos criterios para determinar una liacutenea de base apropiada como
se detalla en el punto 6331 de la seccioacuten Experimentos Auxiliares y en la Fig 526 se
muestran los voltamperogramas corregidos siguiendo el criterio elegido
Figura 526 Voltamperogramas de onda cuadrada (corregidos) obtenidos utilizando electrodos de pasta
de carbono viacutetreo modificada con GlDH y MWCNT Se muestran los voltagramas de las soluciones
blanco (helliphelliphelliphellip
) glicerol 5 mM (mdash mdash) 125 mM (mdashmdash) 25 mM (diamsdiamsdiams) 36 mM (- - -) y 50 mM (mdash bull mdash)
En la Fig 527 se muestran la dependencia de la corriente de pico con la
concentracioacuten de glicerol obtenida a partir de experimentos exploratorios uacutenicos para
cada concentracioacuten Resta a futuro repetir los experimentos para establecer el error
asociado a la metodologiacutea el intervalo dinaacutemico lineal y el liacutemite de deteccioacuten
Resultados y Discusioacuten
88
Figura 527 Dependencia de la corriente de pico registrada en la VOC en funcioacuten de la concentracioacuten de
glicerol en la celda electroquiacutemica
56 Validacioacuten de meacutetodos
De los meacutetodos desarrollados se seleccionaron aquellos dos que dieron resultados
maacutes fiables meacutetodo amperomeacutetrico utilizando un electrodo de trabajo de oro y el
meacutetodo amperomeacutetrico utilizando el biosensor con GlDH con mediador soluble Se
realizaron ensayos en paralelo con un meacutetodo alternativo ampliamente utilizado en
particular se utilizoacute un equipo comercial que utiliza tres enzimas y deteccioacuten
espectrofotomeacutetrica (Wiener lab) La Fig 528 muestra la concentracioacuten nominal versus
concentracioacuten predicha obtenida por las tres metodologiacuteas ensayando diferentes
diluciones de muestra y graficaacutendose el valor medio de 3 medidas independientes
Nominal mM
00 02 04 06 08 10
Pre
dic
ho
mM
00
02
04
06
08
10
Equipo comercial
Tip Au
Biosensor
Recta identidad
Figura 528 Concentracioacuten nominal vs predicha para las dos metodologiacuteas propuestas en este trabajo de
tesis y un meacutetodo enzimaacutetico disponible comercialmente
0
05
1
15
2
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
[Glicerol] (mM)
Ip (
uA
)
Resultados y Discusioacuten
89
Es evidente que los meacutetodos propuestos se correlacionan adecuadamente con la
recta identidad En la Fig 529 se muestran las tres regiones eliacutepticas de confianza
conjuntas (EJCR) para la pendiente y ordenada al origen En este caso puede apreciarse
que las tres elipses contienen el punto (0 1) lo que indica una buena correlacioacuten entre
los meacutetodos propuestos en el presente trabajo y un meacutetodo disponible comercialmente
Pendiente
08 09 10 11 12
Ord
enad
a al
ori
gen
-06
-04
-02
00
02
04
06
Equipo comercial
Tip Au
Biosensor
Punto (1 0)
Figura 529 Regiones eliacutepticas de confianza conjuntas para dos metodologiacuteas presentadas en este trabajo
de Tesis y un meacutetodo enzimaacutetico disponible comercialmente
En la Tabla 511 se presentan distintas metodologiacuteas publicadas en la literatura
actual en las que se referencia la cuantificacioacuten de glicerol ya sean biosensores
electroquiacutemicos u otra metodologiacutea El anaacutelisis de la Tabla 511 permite ver que la
determinacioacuten de glicerol en medios alcalinos sin presencia de interferentes puede ser
llevada a delante con metodologiacuteas econoacutemicas Debe ser considerado que cuando se
realiza la determinacioacuten de glicerol en muestras de biodiesel dicha cuantificacioacuten
requiere extraer el analito de la matriz como puede verse en los meacutetodos maacutes
recientemente propuestos (Bondioli amp Bella 2005 Silva amp Rocha 2010 Lima y col
2012 Tehrani amp Ghani 2012 Maruta amp Paixao 2012 Lourenccedilo amp Stradiotto 2009
Stradiotto y col 2009) Ya sea que se utilice deteccioacuten espectroscoacutepica o
electroquiacutemica siempre se requiere la extraccioacuten previa a la determinacioacuten del analito
Incluso la propuesta de Fernaacutendez Band y col que es el uacutenico meacutetodo que hace una
diferencia notable al comparar las cifras de meacuterito (LD 04 microM tiempo de anaacutelisis 4
min) implica un pretratamiento de la muestra (Lima y col 2012)
Resultados y Discusioacuten
90
Tabla 511 Comparacioacuten de meacutetodos para cuantificar glicerol propuestos recientemente Adaptado de
Faccendini y col 2014
Meacutetodo (Tratamientos
previos) LD
(microM)
Rango de
linealidad
(M)
Muestra
ensayada
Tiempo de
anaacutelisis
(min)
Reactivos o
accesorios
onerosos Referencia
Espectrofotomeacutetrico
(Extraccioacuten del analito) 22
4 times 10-5
a
2 times10-4
Biodiesel 20 - Bondioli amp
Bella 2005 Espectrofotomeacutetrico
(Extraccioacuten del analito) 10
5 times 10minus5
a
5 times 10minus4
Biodiesel 20 a 30 - Silva amp Rocha
2010
Espectrofluoromeacutetrico
(Extraccioacuten del analito) 04
1 times 10minus6
a
5 times 10minus4
Biodiesel 4 - Lima y
col2012
Espectrofotomeacutetrico
multienzimaacutetico No
informa 2 times 10
minus2 a
1 times 10minus1
Jugo de cantildea 5 GK GPO
ATP Kronka y col
2001
Espectrofotomeacutetrico
multienzimaacutetico 8
8 times 10minus6
a
25 times 10minus4
Suero
Humano 10
GK PK
LDH ATP
NAD+
Li y col 2001
Electroquiacutemico VPD
(Extraccioacuten del analito) 33
5 times 10minus4
a
12 times 10minus2
Biodiesel 15 - Tehrani y
Ghani 2012 Electroquiacutemico VC
(Extraccioacuten del analito) 3
33 times 10minus5
a
17 times 10minus3
Biodiesel 30 FIA Maruta y
Paixao 2012
Electroquiacutemico VC
(Extraccioacuten del analito) 25
33 times 10minus5
a
17 times 10minus3
Biodiesel 20 Cartucho de
C18
Lourenccedilo amp
Stradiotto
2009 Electroquiacutemico
amperomeacutetrico
(Extraccioacuten del analito)
No
informa 16 times 10
minus4 a
16 times 10minus3
Biodiesel 60 - Stradiotto y
col 2009
Electroquiacutemico VL
VPD amperomeacutetrico
(Extraccioacuten del analito) 10
23 times 10minus5
a
23 times 10minus4
Solucioacuten
Acuosa
pH=13 5
MWCNT
funcionalizad
os con Ag
Pop y col 2011
Electroquiacutemico
amperomeacutetrico
(Extraccioacuten del analito) 10
25 times 10minus5
a
20 times 10minus3
Solucioacuten
Acuosa
pH=13 8 -
Este Trabajo
de Tesis
Electroquiacutemico
amperomeacutetrico
(Extraccioacuten del analito) 50
5 times 10minus5
a
23 times 10minus2
Solucioacuten
Tampoacuten
Fosfato
5
(estimados) GO
Goriushnika y
col 2010
Biosensor
amperomeacutetrico 04
10 times 10minus6
a
10 times 10minus4
Jarabe de
cantildea 15
(estimados) GlDH NAD+
Aacutelvarez-
Gonzalez y
col 2000
Biosensor
amperomeacutetrico 04
1 times 10minus6
a
2 times 10minus5
Vino 3 GlDH DP
NAD+ Gamella y
col 2008
Biosensor
amperomeacutetrico 03
1 times 10minus6
a
1 times 10minus5
Vino 3 GK GPO
HRP ATP Gamella y
col 2008 Biosensor
amperomeacutetrico 4
5 times 10minus6
a
1 times 10minus4
Vino 5 GK GPO
ATP Ghica amp Brett
2006
Biosensor
amperomeacutetrico 20
70 times 10minus5
a
18 times 10minus3
Caldo
Middlebrook 10
GlDHb
NAD+ Este Trabajo
de Tesis
Del mismo modo el enfoque de Tehrani y Ghani que utilizan un electrodo de grafito
modificado con nanopartiacuteculas de nickel trabajando a pH = 13 realizan una extraccioacuten
previa de glicerol a partir de muestras de biodiesel (Tehrani amp Ghani 2012) En este
Resultados y Discusioacuten
91
caso el LD fue de 33 microM mientras que en este trabajo de Tesis utilizando el mismo
medio hemos conseguido un LD de 10 microM empleando electrodos de oro policristalino
Maruta y Paixao han propuesto recientemente un meacutetodo amperomeacutetrico usando un
electrodo de cobre que trabaja a 065 V vs AgAgCl adaptado en un sistema de FIA
(Maruta amp Paixao 2012) mientras que Lourenccedilo y Stradiotto informaron sobre un
meacutetodo electroquiacutemico que requiere la extraccioacuten acuosa del glicerol a partir de la
muestra y la purificacioacuten adicional por elucioacuten a traveacutes de un cartucho de C18 seguida
de una concentracioacuten por evaporacioacuten y finalmente un anaacutelisis mediante VC (Lourenccedilo
amp Stradiotto 2009) Tambieacuten otras propuestas informan sobre la determinacioacuten de
glicerol por amperometriacutea haciendo uso de electrodos modificados tales como
electrodos de diamante dopados con boro y modificados con nanopartiacuteculas de niacutequel
(Stradiotto y col 2009) y electrodos compuestos de nanotubos de carbono de pared
muacuteltiple funcionalizados con plata (Pop y col 2011) Si bien ambos meacutetodos se
presentan como uacutetiles se requieren diferentes pasos operativos para eliminar posibles
interferencias tales como otros alcoholes que podriacutean ser oxidados a los potenciales de
trabajo 065 V o 130 V (vs AgAgCl) respectivamente En este sentido nuestros
resultados obtenidos por amperometriacutea usando electrodos de oro en medio alcalino
acuoso (pH = 13) estaacuten en el mismo orden que los obtenidos por Pop y colaboradores
utilizando LSV (Pop y col 2011) sobre electrodos compuestos de nanotubos de
carbono de pared muacuteltiple funcionalizados con plata Efectivamente este uacuteltimo y
nuestra metodologiacutea mostraron las mejores cifras de meacuterito entre los meacutetodos
electroquiacutemicos de bajo costo que no consumen enzimas
Los meacutetodos enzimaacuteticos espectrofotomeacutetricos aunque no son laboriosos presentan
la desventaja del consumo relativamente elevado de enzima cada muestra necesita la
adicioacuten del costoso reactivo bioloacutegico ya que no puede ser reutilizado Tambieacuten los LD
de los meacutetodos espectrofotomeacutetricos enzimaacuteticos informados son generalmente
superiores a los que presentan los biosensores Puede antildeadirse que estos uacuteltimos
presentan generalmente el intervalo dinaacutemico lineal maacutes amplio en comparacioacuten con
otros enfoques ya sean electroquiacutemicos o espectrofotomeacutetricos Soacutelo la metodologiacutea de
flujo discontinuo con deteccioacuten fluoromeacutetrica propuesta por Fernaacutendez Band y col
(Lima y col 2012) muestra una sensibilidad en el mismo orden que el maacutes bajo de los
biosensores
En el anaacutelisis de los biosensores que se muestran en la Tabla 511 hay que destacar
que el propuesto por Pingarroacuten y col (Gamella y col 2008) muestra el LD y tiempo de
Resultados y Discusioacuten
92
anaacutelisis total maacutes bajo Para evaluar costos operativos se presenta en la Tabla 512 un
resumen comparativo de la cantidad y concentracioacuten de los reactivos onerosos
consumidos por biosensor o por anaacutelisis entre la propuesta de Pingarroacuten y col y la del
biosensor aquiacute propuesto
Tabla 512 Comparacioacuten entre el meacutetodo enzimaacutetico que mejores cifras de meacuterito presenta y el propuesto
en el presente trabajo de Tesis Adaptado de Faccendini y col 2014
GlDH
bisosensor Diaforasa
biosensor tetratiofulvaleno
biosensor NAD
+ por
anaacutelisis
Gamella y
col 2008 75 U 162 U 15x10-6
M 5x10-3
M Este Trabajo
de Tesis 23 U - - 5x10-4
M
Podemos afirmar que nuestra propuesta es menos costosa hecho importante a ser
evaluado cuando se va a analizar un gran nuacutemero de muestras Mediante la reduccioacuten de
la cantidad de GlDH el LD se elevoacute desde 04 hasta 20 microM aunque es adecuado auacuten
para detectar cambios de concentracioacuten de glicerol en el orden de 15 microM Al mismo
tiempo evitando el uso de diaforasas el tiempo total de anaacutelisis se extendioacute de 3 a 10
min En conjunto los resultados presentados confirman que los cambios introducidos a
los biosensores informados previamente en la literatura tales como el uso de soacutelo una
enzima en baja proporcioacuten la sustitucioacuten del mediador redox por el ferricianuro soluble
y trabajar con el cofactor NAD+ soluble proporciona un sistema fiable de bajo costo
para cuantificar el glicerol
Experimentos Auxiliares
Experimentos Auxiliares
94
6 Experimentos Auxiliares
61 Comparacioacuten de programas de prediccioacuten de epiacutetopes lineales reconocidos
por ceacutelulas B
AAPPred BcePred ABCPred BepiPred y Antigenic se ejecutaron en liacutenea En la
Tabla 61 se muestran los VPP medios (ver definicioacuten en seccioacuten Materiales y Meacutetodos
pag 11) que se obtuvieron al predecir epiacutetopes lineales reconocidos por ceacutelulas B de
todas las proteiacutenas enumeradas en la Tabla 62
Los resultados obtenidos indican que BcePred es el uacutenico programa de los
evaluados que muestra un VPP inferior al obtenido con la prediccioacuten al azar Tambieacuten
se obtuvo que soacutelo dos de los programas estudiados AAPPred y ABCpred predijeron
epiacutetopes con un VPP significativamente mayor al valor de VPP de un procedimiento de
identificacioacuten aleatoria Estos dos programas produjeron predicciones con valores
maacuteximos de 862 y 786 de VPP respectivamente
Tabla 61 Valores predictivos positivos promedio que se obtuvieron con cada uno de los programas
predictores con los que se trabajoacute
Programa
VPP
promedio
AAPPred 691
ABCPred 628
BcePred 309
BepiPred 453
Antigenic 419
Aleatorio 382
En base a estos resultados se trabajoacute con el programa AAPPred y se identificaron
las regiones que concentraban el mayor nuacutemero de epiacutetopes reconocidos por ceacutelulas B
de las proteiacutenas P22 P30 y P35 con el fin de expresar estos Angs como proteiacutenas
recombinantes y utilizarlos en el desarrollo de meacutetodos de diagnoacutestico de la
toxoplasmosis aguda
Experimentos Auxiliares
95
Tabla 62 Base de datos experimental proteiacutenas seleccionadas para este estudio Se indican el nombre de
la proteiacutena el coacutedigo de acceso NCBI la longitud total (en residuos de amino aacutecidos) el
nuacutemero de epiacutetopes reales determinados experimentalmente y la localizacioacuten de los epiacutetopes o
regiones antigeacutenicas Proteiacutenas tomadas de base de datos (A) BciPep (B) VIH Inmunologiacutea
Molecular base de datos o tomado de la literatura (veacutease el nuacutemero de referencia 17 para VP1
16 para la proteiacutena N y 18 para gliadina)
Proteiacutena
Coacutedigo
NCBI
Nordm de
residuos
Cantidad de
epiacutetopes
Localizacioacuten de los epiacutetopes o regiones
antigeacutenicas
MPT70 (A) NP_217391 193 2 31-70 100-120
MSP-1 (A) BAF622801 1693 3 29-39 1594-1611 1644-1662
Exotoxina
A (A) NP_249839 638 8
297-313 324-333 354-387 412-421 510-522
528-539 557-593 596-638
GAG1 (A) P20873 504 10
11-25 113-122 142-156 176-214 216-268
280-308 312-321 330-367 406-416 428-448
Gp160 (A) NP_057856 856 13
30-141 161-191 211-231 252-281 294-344
346-413 424-511 525-558 561-615 639-701
724-747 761-778 822-855
Pr55 (B) NP_579876 132 2 11-38 51-78
Rev (B) NP_057854 116 4 5-15 32-51 70-91 96-116
VP1 (17) ABC87248 781 12
31-41 55-65 85-95 151-161 292-392 316-326
493-500 529-539 547-554 571-578 667-707
712-722
Gliadin
(18) A27319 296 3 31-72 165-176 237-264
Proteiacutena N
(16) AAP13445 422 6 1-6 45-61 153-192 211-223 225-235 354-412
Proteasa
(B) CAB66012 99 2 1-7 36-47
62 Puesta a punto de ensayos de inmunoabsorcioacuten ligados a enzima con
deteccioacuten fotomeacutetrica
Previo al inicio de los ELISA de captura iniciamos una serie de pruebas preliminares
con el propoacutesito de
a) Diferenciar sueros de pacientes infectados de sueros de individuos sin infeccioacuten De
este modo se pretende verificar la potencial utilidad en diagnoacutestico de los antiacutegenos
propuestos corroborando que los procesos quiacutemicos llevados a cabo como por ej la
conjugacioacuten no eliminaron epiacutetopes claves
Experimentos Auxiliares
96
b) Minimizar la sentildeal en los ensayos sin suero (blanco de reactivos) es decir
disminuir el ruido de fondo asociado a interacciones inespeciacuteficas
A tales fines se realizaron ELISA indirectos utilizando los antiacutegenos recombinantes
obtenidos (marcados y sin marcar) adsorbidos sobre la placa se utilizaron sueros
tipificados y se reveloacute la presencia de IgG humana revelando con anticuerpos de cabra anti
IgG humana Los resultados obtenidos se detallan en la siguiente tabla
Tabla 63 Valores de absorbancia a 450 nm obtenidos en ELISA indirectos con deteccioacuten de IgGh con
conjugado anti IgG humana-HRP
Sueros P22C P22C-
biotina P35B
P35B -
biotina
Positivos
2 gt3 26 1900
3 2900 2 gt3
gt3 gt3 26 gt3
Negativos
13 1000 11 0800
06 0500 09 0700
11 1600 1 1000
Si bien los valores de absorbancia leiacutedos en todos los pocillos resultaron elevados
los sueros confirmados positivos dieron los valores maacutes altos de absorbancia mientras
que los sueros negativos dieron los valores maacutes bajos Las diferencias observadas entre
sueros confirmados positivos y sueros confirmados negativos permitieron asumir que
los antiacutegenos obtenidos son de posible utilidad en diagnoacutestico Ademaacutes no se
detectaron diferencias significativas entre los valores de absorbancia obtenidos
utilizando antiacutegenos marcados de aquellos obtenidos con los no marcados
permitieacutendonos pensar que la conjugacioacuten llevada a cabo no eliminoacute epiacutetopes claves
Los elevados valores de absorbancia obtenidos en este ensayo junto a otros estudios
preliminares sugieren que existe una elevada adsorcioacuten inespeciacutefica
621 Bloqueante a utilizar
Se ensayaron diversos agentes bloqueantes para minimizar las interacciones
inespeciacuteficas encontradas durante los experimentos preliminares y asiacute evitar las altas
sentildeales obtenidas en los ensayos control realizados sin suero (blanco de reactivos) y con
sueros confirmados negativos (blancos de muestra) Sobre placas comerciales de
poliestireno se procedioacute al bloqueo total con el agente bloqueante a ensayar y
posteriormente se realizoacute una incubacioacuten con y sin antiacutegeno P22C por duplicado
Finalmente se reveloacute con la enzima HPR-EAV que se une especiacuteficamente a biotina En
la Tabla 64 se muestran los valores de absorbancia a 450 nm
Experimentos Auxiliares
97
Tabla 64 Valores promedio de absorbancia a 450 nm obtenidos en los ensayos de bloqueo
450 nm Sin P22cBiot Con P22cBiot
Sin Bloqueante ------- 1162
Leche 1 0066 01445
Caseinato 1 00725 02425
Gelatina 1 00725 03925
BSA 1 00625 0192
BSA 1 Tween 002 00615 01515
En base a estos resultados se continuoacute con el uso de leche descremada como agente
bloqueante
622 Esquema A
Cuando se realizaron ELISA siguiendo el esquema A se ensayaron dos diluciones
de la HRP-EAV 12000 y 15000 Por otro lado se ensayaron distintas masas de
antiacutegenos P22C y P35B conjugados a biotina con los que se intentoacute revelar presencia
de IgM especiacuteficas Especiacuteficamente se ensayaron 2 02 y 002 g por pocillo de P35B
biotina y 5 2 02 y 002 g por pocillo de P22C biotina Con esto se buscoacute encontrar
las cantidades oacuteptimas de reactivos para poder llevar adelante estos ensayos A modo
ilustrativo en la Tabla 65 se muestra un ensayo representativo siguiendo el esquema A
Se informan solamente los valores de absorbancia a 450 nm obtenidos para sueros
provenientes de pacientes con infeccioacuten croacutenica (croacutenicos) aguda (agudos) y de
pacientes sin infeccioacuten (negativos)
Tabla 65 Valores de absorbancia a 450 nm obtenidos en ELISA siguiendo el esquema A Se muestran 3
cantidades de antiacutegeno revelador utilizadas 2 02 y 002 microg En este ensayo la dilucioacuten de la
enzima HRP-EAV fue 15000 y se utilizaron 100 microL por pocillo
Antiacutegenos
Sueros
P22C biotina ( g) P35B biotina ( g)
2 02 002 2 02 002
Negativos 0576 0294 0155 1071 0681 0566
0543 0335 0176 1079 0769 023
Croacutenicos 0469 0246 0135 103 069 0299
0514 0215 0111 0914 0567 0196
Agudos 0331 0181 0109 081 0574 0168
0555 0254 0139 0789 0391 0169
Experimentos Auxiliares
98
623 Esquema B
Cuando se realizaron ELISAs siguiendo el esquema B se ensayaron distintas masas
de antiacutegeno P22C y P35B absorbidas sobre las microplacas comerciales a saber 500
200 50 10 o 5 ng (disueltos en 100 L de solucioacuten tampoacuten carbonato pH 96) En todos
los casos se incuboacute 1h a 37 degC
Para la incubacioacuten con la proteiacutena conjugada a biotina se ensayaron 2 y 5 ug por
pocillo En la Tabla 66 se resumen los resultados obtenidos
Tabla 66 Valores de absorbancia a 450 nm obtenidos en ELISA siguiendo el esquema B Se muestran
los resultados obtenidos para dos cantidades distintas de antiacutegeno de captura (P22C) 10 y 50
ng junto a 2 cantidades de antiacutegeno revelador (P22C-biotina) utilizadas 2 y 5 microg En este
ensayo la dilucioacuten de la enzima HRP-EAV fue 12000 y se utilizaron 100 microL por pocillo
2 microg P22C biotina 5 microg P22C biotina
Masa de P22C
(ng)
Muestras
50 10 50 10
Agudos 0393 0303 0553 0450
0273 0335 0793 0367
Croacutenicos 0230 0398 0316 0345
0284 0291 0444 0493
Negativos 0392 0210 0380 0380
0286 0292 0314 0350
Sin suero 0367 0468 0415 0411
0327 0358 0468 0536
Sin Prot conjugada a
biotina ni sueros
0102 0087 0128 0079
0131 0095 0116 0104
Los resultados obtenidos indicaron que para lograr una mejor discriminacioacuten de las
muestras es conveniente utilizar mayor cantidad de masa de antiacutegeno de captura (P22C)
depositada en el pocillo Por otro lado 5 microg de antiacutegeno revelador (P22C-biotina) por
pocillo contribuyoacute a aumentar la discriminacioacuten entre las muestras sin incrementar
significativamente el ruido de fondo
Experimentos Auxiliares
99
63 Ensayos electroquiacutemicos
631 Determinacioacuten del aacuterea real de un electrodo
6311 Meacutetodo de la adsorcioacuten de O2
Se realizaron barridos de potencial como se indica en el punto 41931 de la
seccioacuten Materiales y Meacutetodos La Fig 61 muestra un voltamperograma tiacutepico obtenido
Con el valor de la carga asociada a la desorcioacuten del oacutexido de oro pudo determinarse el
valor de aacuterea electroactiva del electrodo de trabajo utilizado como se indica en el punto
41931
E V
04 06 08 10 12 14 16
I
A
-15e-5
-10e-5
-50e-6
00
50e-6
Figura 61 Voltamperograma ciacuteclico tiacutepico obtenido con electrododos de oro en medio H2SO4 05 M
velocidad de barrido 50 mV s-1
Se indica en color turquesa el pico de desorcioacuten del oacutexido de oro la carga
(Q) obtenida del aacuterea encerrada en la curva se utilizoacute para determinar el aacuterea real de los electrodos de oro
previamente a los ensayos
6312 Voltametriacutea ciacuteclica a distintas velocidades
Se realizaron barridos de potencial a distintas velocidades como se indica en el
punto 41932 de la seccioacuten Materiales y Meacutetodos La Fig 62 muestra los voltagramas
tiacutepicos obtenidos en (A) y en (B) la dependencia de la corriente de pico Ip con la raiacutez
cuadrada de la velocidad de barrido Con el valor de la pendiente de la recta obtenida
por regresioacuten lineal pudo determinarse el valor de aacuterea electroactiva del electrodo de
trabajo utilizado como se indica en el punto 41932 habieacutendose utilizado un
coeficiente de difusioacuten del Fe(CN)63-
de 0762 cm2 s
-1 (Sawyer amp Roberts 1974)
Experimentos Auxiliares
100
E V
-02 -01 00 01 02 03 04 05 06
I
A
-20e-4
-10e-4
00
10e-4
20e-4
Figura 62 A) Voltametriacuteas ciacuteclicas de Fe(CN)63 1 mM en medio KCl 01 M a distintas velocidades de
barrido utilizando como electrodo de trabajo el biosensor amperomeacutetrico para evaluacioacuten de infeccioacuten
toxoplaacutesmica La flecha indica la direccioacuten de barrido B) Dependencia de Ip (en valores absolutos) con la
raiacutez de la velocidad de barrido el valor de pendiente de la recta de regresioacuten se utilizoacute para determinar el
aacuterea real del electrodo de trabajo
632 Cubierta del biosensor selectivo para glicerol y soluciones amortiguadoras
Se ensayaron distintos poliacutemeros para cubrir el biosensor de pasta de carbono B
utilizamos poliacutemeros de 4-vinilbenzilimine copolimerizados con cloruro de 4-
vinilbencil-trietilamonio y sulfonato de vinilfenilo (portadores de carga neta positiva y
negativa respectivamente) Si bien los poliacutemeros permitiacutean operar con complejos de
hierro utilizados como mediadores redox (Fe(CN)63-
y ferrocenometanol) no resultaron
uacutetiles en el ensamblado del biosensor por el elevado ruido de fondo que generaron
Se evaluaron distintas soluciones amortiguadoras de pH como fosfatos y
amoniacuteacoamonio Se optoacute por las soluciones de carbonato porque estas resultaron maacutes
sencillas de preparar y manipular que las amoniacales y presentaron mayor capacidad
reguladora en el pH oacuteptimo de la enzima GlDH que las de fosfato
633 Ensayos preliminares de voltametriacuteas de onda cuadrada
Los ensayos preliminares de voltametriacutea de onda cuadrada consistieron en
establecer los valores maacutes convenientes de la amplitud de pulso el escaloacuten de potencial
y la frecuencia para los futuros ensayos de cuantificacioacuten Se realizaron los voltagramas
en tres series de ensayos a seis valores de frecuencia 10 20 30 40 60 y 70 Hz
Los valores de salto de potencial ( ES) y amplitud de pulso ( E) utilizados en las
tres series de ensayos realizados se resumen en la siguiente tabla
(velocidad barrido)12 V12 s-12
006 008 010 012 014 016 018 020 022 024
Ip
A
40e-5
60e-5
80e-5
10e-4
12e-4
14e-4
16e-4
18e-4
20e-4
Experimentos Auxiliares
101
Tabla 67 Valores de salto de potencial y amplitud de onda cuadrada utilizados en los ensayos
voltameacutetricos
Serie 1 Serie 2 Serie 3
ES (mV) 5 5 10
E (mV) 25 50 50
En las 3 series de ensayos se observoacute que al aumentar la frecuencia la corriente de
pico no se incrementaba y el pico de corriente se deformaba aumentando
considerablemente el ruido Las mejores relaciones sentildealruido en las tres series de
ensayos se obtuvieron trabajando a 10 Hz Por su parte cuando se utilizoacute un escaloacuten de
potencial de 10 mV el pico de corriente se deformoacute levemente por lo que se optoacute por
trabajar con un ES = 5 mV Cuando la amplitud del pulso fue 50 mV se obtuvieron
mayores intensidades de corriente sin deformacioacuten de pico escogieacutendose en
consecuencia este valor En la Fig 63 se muestran los voltamperogramas obtenidos en
los ensayos de la serie 2 a una frecuencia de 10 Hz
Figura 63 Voltagramas de onda cuadrada obtenidos utilizando bioelectrodos de pasta de carbono viacutetreo
modificada con GlDH y MWCNT En liacutenea clara se muestra el voltagrama de la solucioacuten NAD+ 05 mM
(NH4)2SO4 25 mM K2CO3 KHCO3 100 mM pH 105 con medio Middelbrook 7H9 Superpuestos se
detallan los voltagramas de la misma solucioacuten luego del agregado de glicerol 100 M para llevar a
concentracioacuten final 25 mM (- - -) y 50 mM (____
)
6331 Seleccioacuten de un meacutetodo apropiado para establecer la liacutenea de base
Se buscoacute establecer una liacutenea de base para corregir los voltagramas obtenidos
utilizando algoritmos presentes en el programa GPES Se intentoacute con algoritmos de
correccioacuten que permiten establecer una liacutenea polinoacutemica ad-hoc para cada voltagrama
utilizando entre 2 y 5 puntos de la curva experimental Sin embargo las sentildeales
corregidas presentaban picos de corrientes con valores de ancho a la altura media Wfrac12
entre 0180 y 0220 V valores que resultan elevados comparados con 0123 Vn el valor
de referencia para este paraacutemetro en VOC donde n es el nuacutemero de electrones
Experimentos Auxiliares
102
intercambiados en la reaccioacuten Finalmente a cada VOC se les restoacute la VOC del blanco
buscaacutendose el pico de corriente con un algoritmo de buacutesqueda semiautomaacutetica del
programa GPES con una liacutenea de base recta y marcando manualmente el inicio y final
del pico establecieacutendose los mismos valores de potencial de inicio y finalizacioacuten del
pico de corriente en todos los voltamperogramas De este modo se obtuvieron picos
cuyos Wfrac12 eran proacuteximos al valor teoacutericamente predicho
Conclusiones
Conclusiones
104
7 Conclusiones
1- Se pudo encontrar cual de los programas de libre acceso para predecir epiacutetopes
lineales reconocidos por ceacutelulas B es el maacutes conveniente al momento de seleccionar
antiacutegenos con fines diagnoacutesticos
2- Se pudieron clonar expresar en forma soluble y marcar con biotina fragmentos
de antiacutegenos de toxoplasmosis de fase aguda que presentan alta concentracioacuten de
determinantes antigeacutenicos
3- Se verificoacute la utilidad de los antiacutegenos obtenidos para su posterior uso en el
ensamblado de bioelectrodos para diagnoacutestico de infeccioacuten aguda de toxoplasmosis
4- Se pudo cuantificar glicerol en muestras sencillas con un electrodo versaacutetil de
oro policristalino por medio de una metodologiacutea amperomeacutetrica a 01 V en medio
NaOH 01 M y con un tiempo de anaacutelisis de 8 min liacutemite de deteccioacuten 10 microM y un
intervalo de linealidad de 0024 a 200 mM
5- Se pudo cuantificar glicerol en medios de cultivo de micobacterias El meacutetodo
consiste en una amperometriacutea que emplea un bioelectrodo selectivo para glicerol
compuesto de pasta de C modificada con glicerol deshidrogenasa y lleva un tiempo de
anaacutelisis de 10 min liacutemite de deteccioacuten 20 microM y un rango de linealidad de 0060 a 175
mM Este meacutetodo podriacutea en un futuro ser uacutetil para identificar muestras de pacientes con
tuberculosis activa en un menor tiempo de anaacutelisis al actualmente empleado
6- Los meacutetodos para cuantificar glicerol aquiacute presentados fueron validados frente
a un equipo enzimaacutetico disponible comercialmente
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4222 Programas utilizados 54
423 Anaacutelisis de Datos 54
424 Caacutelculos estadiacutesticos y disentildeo experimental 55
5 Resultados y discusioacuten 57
51 Evaluacioacuten de antiacutegenos recombinantes de T gondii 57
511 Antiacutegeno P30 57
512 Antiacutegeno P22 58
513 Antiacutegeno P35 59
52 Marcado de antiacutegenos recombinantes de T gondii 60
53 Inmunoensayos 61
531 Inmunoensayos con deteccioacuten fotomeacutetrica 61
5311 Evaluacioacuten del esquema A 61
5312 Esquema B 62
532 Inmunoensayos con deteccioacuten amperomeacutetrica utilizando los antiacutegenos
recombinantes 66
54 Determinacioacuten de la actividad electroquiacutemica del glicerol en medio
acuoso 67
55 Cuantificacioacuten de glicerol en medios acuosos complejos 71
551 Evaluacioacuten del modelo propuesto por medio de lecturas
espectrofotomeacutetricas 72
5511 Evaluacioacuten de la sentildeal con la concentracioacuten de glicerol 76
5512 Optimizacioacuten de condiciones para disminuir el costo operativo 78
552 Determinacioacuten de glicerol remanente en cultivos de micobacterias 79
5521 Evaluacioacuten de glicerol remanente en cultivos axeacutenicos de M
smegmatis 79
5522 Determinacioacuten de glicerol remanente en cultivos de micobacterias
con y sin fago D29 y ensayos controles respectivos 80
Iacutendice
v
553 Biosensor amperomeacutetrico a base de pasta de carbono viacutetreo
modificada 81
554 Desarrollo de un biosensor a base de pasta de carbono viacutetreo y
nanotubos de carbono 83
5541 Ensayos de cuantificacioacuten de glicerol con el bioelectrodo
desarrollado utilizando teacutecnicas de pulso 86
56 Validacioacuten de meacutetodos 88
6 Experimentos Auxiliares 94
61 Comparacioacuten de programas de prediccioacuten de epiacutetopes lineales reconocidos
por ceacutelulas B 94
62 Puesta a punto de ensayos de inmunoabsorcioacuten ligados a enzima con
deteccioacuten fotomeacutetrica 95
621 Bloqueante a utilizar 96
622 Esquema A 97
623 Esquema B 98
63 Ensayos electroquiacutemicos 99
631 Determinacioacuten del aacuterea real de un electrodo 99
6311 Meacutetodo de la adsorcioacuten de O2 99
6312 Voltametriacutea ciacuteclica a distintas velocidades 99
632 Cubierta del biosensor selectivo para glicerol y soluciones
amortiguadoras 100
633 Ensayos preliminares de voltametriacuteas de onda cuadrada 100
6331 Seleccioacuten de un meacutetodo apropiado para establecer la liacutenea
de base 101
7 Conclusiones 104
8 Bibliografiacutea 106
Resumen
vi
1 Resumen
Este trabajo de Tesis se orientoacute al desarrollo de meacutetodos analiacuteticos alternativos a los
hoy vigentes que faciliten la determinacioacuten de compuestos de intereacutes tanto para
diagnoacutestico cliacutenico como para la industria de combustibles alternativos Se realizaron
aportes para tres situaciones de relevancia diagnoacutestico de toxoplasmosis tuberculosis y
evaluacioacuten de calidad de biodiesel
La toxoplasmosis es una parasitosis causada por Toxoplasma gondii que afecta a
humanos sin generar complicaciones excepto cuando los infectados son
inmunodeprimidos o mujeres embarazadas que no cursaron previamente la enfermedad
En este caso el paraacutesito puede atravesar placenta generando infeccioacuten congeacutenita del
feto pudiendo producirle graves consecuencias que pueden llegar a la muerte Una de
las teacutecnicas de diagnoacutestico utiliza el ensayo de inmunoadsorcioacuten ligado a enzima
permitiendo la deteccioacuten de anticuerpos especiacuteficos contra el paraacutesito los cuales son
indicadores de existencia de infeccioacuten No obstante para detectar toxoplasmosis aguda
al diacutea de hoy se carece de una estandarizacioacuten confiable principalmente en la
preparacioacuten del antiacutegeno Por ello en este trabajo se procuroacute identificar regiones donde
se codificaraacuten algunos marcadores de fase aguda que concentraraacuten una alta proporcioacuten
de determinantes antigeacutenicos para luego clonarlas expresarlas como proteiacutenas
recombinantes marcarlas con biotina y asiacute utilizarlas como sistema de revelado de
anticuerpos especiacuteficos contra proteiacutenas de T gondii Los inmunoensayos aquiacute
presentados proponen una metodologiacutea que permitiraacute en un futuro distinguir sueros
provenientes de individuos con infeccioacuten aguda de aquellos con infeccioacuten croacutenica o no
infectados
La tuberculosis es una enfermedad infecto-contagiosa causada por la bacteria
Mycobacterium tuberculosis Su diagnoacutestico se basa en una serie de estudios que
finaliza con la identificacioacuten del agente etioloacutegico en cultivos obtenidos a partir de
esputo Esta identificacioacuten puede demorar aproximadamente dos meses debido al
prolongado tiempo de replicacioacuten de la micobacteria Esto conlleva la potencialidad de
contagio a individuos sanos y un compromiso importante de la salud del infectado
Uacuteltimamente se han desarrollado teacutecnicas indirectas de deteccioacuten de M tuberculosis
utilizando el bacterioacutefago D29 capaz de infectar especiacuteficamente micobacterias Es una
metodologiacutea donde se facilita la replicacioacuten del fago en la muestra proveniente del
paciente para luego evaluar el tiacutetulo de fagos liberados infectando un cultivo testigo de
Resumen
vii
Micobacterium smegmatis micobacteria de replicacioacuten raacutepida Siendo el glicerol fuente
de carbono en cultivos de micobacterias se planteoacute determinar su concentracioacuten
remanente como meacutetodo de evaluar integridad de M smegmatis establecieacutendose asiacute una
medida indirecta de la previa presencia de M tuberculosis en la muestra problema
Ademaacutes el glicerol es el principal subproducto en la elaboracioacuten del biodiesel y su
concentracioacuten es indicativa de la calidad del combustible transformaacutendose en analito
relevante para la industria de energiacuteas alternativas a la derivada del petroacuteleo
Se desarrollaron y validaron dos meacutetodos amperomeacutetricos de cuantificacioacuten de
glicerol a) Con electrodo de oro en NaOH 01 M aplicable a medios acuosos (LD 10
microM intervalo lineal 0024 a 200 mM) b) Con bioelectrodo de pasta de C modificada
con glicerol deshidrogenasa aplicable a medios complejos como cultivos bacterianos
(LD 20 M intervalo lineal 0060 a 175 mM)
Resumen
viii
1 Summary
This Thesis work was oriented to the development of analytical methods alternative
to those currently used to facilitate the identification of compounds of interest for both
clinical diagnosis and the alternative fuel industry Contributions of relevance to three
situations were performed Diagnosis of toxoplasmosis tuberculosis and the assessment
of biodiesel quality
Toxoplasmosis is a parasitic disease caused by Toxoplasma gondii which does not
bring complications in people except when the infected individual is an
immunocompromised patient or pregnant women who have not previously suffered
from the illness In this case the parasite can cross the placenta producing congenital
infection of the fetus and potentially causing serious consequences including death
One of the techniques used to its diagnosis is the enzyme-linked immunosorbent assay
allowing the detection of parasite-specific antibodies which are indicators of the
infection However this technique aimed to detect acute toxoplasmosis nowadays lacks
of reliable standardization particularly in the preparation of the antigen Therefore this
study focused on identifying regions encoding several markers of acute phase which
highly concentrated antigenic determinants to clone and express them as recombinant
proteins subsequently label them with biotin and thus use them as developing system of
specific antibodies against T gondii proteins The immunoassays presented here
propose a methodology which will allow in the future distinguishing sera from
individuals with acute infection of those with chronic infection or uninfected
Tuberculosis is an infectious and contagious disease caused by the bacterium
Mycobacterium tuberculosis Its diagnosis is based on a series of studies which
eventually identify the etiologic agent in cultures obtained from sputum This
identification can take about two months due to the extensive mycobacteria replication
time This leads to the potential contagion of healthy individuals and a major
commitment to the health of the infected patient Recently indirect M tuberculosis
detection techniques have been developed They use D29 bacteriophage which is able
to specifically infect mycobacteria The methodology allows phage replication in the
patientrsquos sample and then evaluates the number of released phages by infecting a
control culture of Mycobacterium smegmatis a short-term replicable mycobacteria As
glycerol is the carbon source commonly used in mycobacteria culture this work
proposes determining its residual concentration as a method of evaluating integrity of
Resumen
ix
M smegmatis thus establishing an indirect measurement of the previous presence of M
tuberculosis in the sample
Furthermore glycerol is the main by-product in biodiesel production and its
concentration is an indicator of the fuel quality becoming a relevant analyte to the
energy industry alternative to that derived of petroleum
Two amperometric methods for glycerol quantitation were developed and
validated a) Using a gold electrode in 01 M NaOH medium useful for simple aqueous
solutions (LD 10 microM linear range from 0024 to 200 mM) b) using a carbon paste
bioelectrode modified with glycerol dehydrogenase useful for complex media such as
bacterial cultures (LD 20 microM linear range 0060 to 175 mM)
Publicaciones
x
Publicaciones
Los resultados parciales del presente trabajo de Tesis han dado lugar a las
siguientes publicaciones
Trabajos en revistas internacionales
1- Costa J G Faccendini P L Sferco S J Lagier C M Marcipar I S
Evaluation and comparison of the ability of online available prediction programs to
predict true linear B-cell epitopes Protein amp Peptide Letters (2013) 20(6)724-30
2- Faccendini P L Ribone M E Lagier C M Selective application of two
rapid low-cost electrochemical methods to quantify glycerol according to the sample
nature Sensors and Actuators B (2014) 193 142ndash 148
Trabajos en congresos
1- Muntildeoz A Faccendini P L Ribone M E Lagier C M Oxidacioacuten
electroquiacutemica de polialcoholes sustrato de sistemas enzimaacuteticos bacterianos Estudio
de las condiciones para su cuantificacioacuten V Congreso Argentino de Quiacutemica Analiacutetica
Bahiacutea Blanca Noviembre de 2009
2- Costa J G Faccendini P L Carral L Kaufer F Lagier C M Marcipar I
S Evaluacioacuten de dos regiones de la Proteiacutena P35 de Toxoplasmama gondii para el
diagnostico de fase aguda de la toxoplasmosis Ascochinga Coacuterdoba Octubre de 2010
3- Costa J G Faccendini P L Lagier C M Marcipar I S Modelado y
prediccioacuten de los epiacutetopes del antigeno P22 de Toxoplasma gondii 2do Congreso de
Bioinformaacutetica y Biologiacutea Computacional Coacuterdoba Mayo de 2011
4- Faccendini P L Costa J G Ribone M E Marcipar I S Lagier C M
Ensamblado de un bioelectrodo econoacutemico para la deteccioacuten de glicerol en medios
altamente complejos 6deg Congreso Argentino de Quiacutemica Analiacutetica Santa Fe
Septiembre de 2011
5- Faccendini P L Costa J G Ribone M E Marcipar I S Lagier C M
Desarrollo y optimizacioacuten de un meacutetodo para la cuantificacioacuten de glicerol en matrices
complejas 6deg Congreso Argentino de Quiacutemica Analiacutetica Santa Fe Septiembre de 2011
Publicaciones
xi
6- Costa J G Perotti J Faccendini P L Lagier C M Mancipar I S
Optimization of the acute toxoplasmosis immunodiagnostic during the pregnancy
Workshop Fronteras en Biociencias Ministerio de Ciencia Tecnologiacutea e Innovacioacuten
Productiva Embajada Alemana Ciudad Autoacutenoma de Buenos Aires Abril de 2012
7- Costa J G Perotti J Faccendini P L Dure A Carral L Kaufer F Lagier
C M Mancipar I S Evaluacioacuten de diferentes regiones de las proteiacutenas p22 p30 y p35
para diagnoacutestico de la fase aguda de la toxoplasmosis XXV Reunioacuten Anual de la
Sociedad Argentina Protozoologiacutea 2012 Ciudad Autoacutenoma de Buenos Aires Agosto
de 2012
8- Costa J G Faccendini P L Sferco S J Lagier C M Mancipar I S
Comparison of the ability to predict true linear B-cell epitopes by on-line available
prediction programs 3er congreso de la sociedad argentina de bioinformaacutetica y biologiacutea
computacional Paranaacute Septiembre de 2012
9- Faccendini P L Costa J G Ribone M E Marcipar I S Lagier C M
Desarrollo de un sistema electroquiacutemico para evaluar infeccioacuten toxoplaacutesmica 7deg
Congreso Argentino de Quiacutemica Analiacutetica Mendoza Octubre de 2013
Abreviaturas y Siacutembolos
xii
Abreviaturas y Siacutembolos
AD Aglutinacioacuten Directa
ADN Aacutecido desoxiribonucleico
Ac(s) Anticuerpo(s)
Ang(s) Antiacutegeno(s)
D Coeficiente de difusioacuten
DHA 13 dihidroxiacetona
DMSO Dimetil sulfoacutexido
DO Densidad oacuteptica
DT Dye Test con azul de metileno (Reaccioacuten de Sabiacuten Feldman)
EDTA Aacutecido etilendiaminotetraaceacutetico
ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay (Ensayo de inmunoadsorcioacuten ligado
a enzima)
F Constante de Faraday
Frecuencia
GlDH Glicerol deshidrogenasa
HAI Hemoaglutinacioacuten indirecta
HEPES Aacutecido 4-(2-hydroxietil)-1-piperazina etano sulfoacutenico
HRP Horse radish peroxidase (Peroxidasa de raacutebano picante)
I Corriente eleacutectrica
IFI Inmunofluorescencia indirecta
IgA Inmunoglobulina A
IgG Inmunoglobulina G
IgE Inmunoglobulina E
IgM Inmunoglobulina M
IgM-IFI Inmunofluorescencia indirecta de IgM (Prueba de Remington)
IPTG Isopropil- -D-tiogalactopiranoacutesido
ISAGA Ensayo aglutinante de inmunoabsorcioacuten
LB Medio Luria-Bertani
LC Liacutemite de cuantificacioacuten
LD Liacutemite de deteccioacuten
MWCNT Multi-walled carboacuten nanotubes (Nanotubos de carbono de paredes
muacuteltiples)
Abreviaturas y Siacutembolos
xiii
N nuacutemero de moles de especie reducida u oxidada
OMS Organizacioacuten Mundial de la Salud
P35 Antiacutegeno de superficie de T gondii de 35 kDa de peso
PBS Phosphate buffer salin (Solucioacuten tampoacuten fosfato salino)
PCR Polimerasa chain reaction (Reaccioacuten en cadena de la polimerasa)
pET32a Vector plasmiacutedico
Q Carga eleacutectrica circulante
SAG1 Surface antigen 1 (Antiacutegeno de superficie 1 o antiacutegeno P30 de T gondii)
SAG2 Surface antigen 2 (Antiacutegeno de superficie 2 o antiacutegeno P22 de T gondii)
SDS Dodecil sulfato de sodio
TB Tuberculosis
TRX Tioredoxina
VBL Voltametriacutea de barrido lineal
VC Voltametriacutea ciacuteclica
VPD Voltametriacutea de pulso diferencial
Introduccioacuten
Introduccioacuten
1
2 Introduccioacuten
21 Toxoplasmosis
211 Generalidades
La toxoplasmosis es una enfermedad causada por el paraacutesito protozoario
Toxoplasma gondii que infecta animales herbiacutevoros carniacutevoros y omniacutevoros dentro de
los cuales se encuentra el hombre Estaacute ampliamente extendida por todo el mundo y su
incidencia y prevalencia variacutean mucho seguacuten las zonas geograacuteficas los haacutebitos
alimentarios el tipo de trabajo la higiene ambiental y la presencia o no de gatos
infectados (Atias 1998 Martiacuten-Hernaacutendez 2004) Es una zoonosis que afecta a los
humanos a traveacutes de formas infectivas producidas durante el ciclo bioloacutegico que se
desarrolla uacutenicamente en gatos y otros feacutelidos Dependiendo de la localizacioacuten
geograacutefica entre 15 y 85 de la poblacioacuten adulta mundial presenta infeccioacuten croacutenica
(Fuentes y col 2001)
Usualmente la principal viacutea de transmisioacuten de esta parasitosis es la oral por
ingestioacuten de carnes crudas o poco cocidas contaminadas con quistes o por la ingestioacuten
de ooquistes presentes en agua o alimentos contaminados con heces de gato Son menos
frecuentes las viacuteas de transmisioacuten parenteral respiratorias mucosal (conjuntival)
cutaacutenea y por transfusioacuten de sangre o trasplante de oacuterganos La transmisioacuten por viacutea
transplacentaria puede ocurrir cuando la embarazada padece la primoinfeccioacuten durante
el curso del embarazo aunque se han descripto casos raros de infeccioacuten congeacutenita por
toxoplasmosis materna anterior al embarazo (Martiacuten-Hernaacutendez 2004 Centers of
Diseases Control and Prevention (CDC) paacutegina web a)
Durante la infeccioacuten pueden distinguirse dos etapas A) Aguda Al breve tiempo de
ingerir ooquistes esporulados eacutestos se transforman en taquizoiacutetos ingresan a la ceacutelula
del hueacutesped y comienzan a dividirse en forma asexual hasta que la ceacutelula se lisa
liberando asiacute la progenie y ocasionando la parasitemia Posteriormente el taquizoiacuteto
evoluciona a bradizoiacuteto cuya multiplicacioacuten es lenta Se produce la invasioacuten de los
oacuterganos por viacutea linfaacutetica o hemaacutetica siendo los oacuterganos maacutes comprometidos los
muacutesculos esqueleacutetico y cardiacuteaco asiacute como cerebro y ojos B) Croacutenica En la medida que
evoluciona la defensa del hueacutesped desaparecen los paraacutesitos extracelulares limitaacutendose
la divisioacuten intracelular y quedando las formas resistentes principalmente en el sistema
nervioso central y muacutesculo esqueleacutetico Por lo general esta etapa es latente pero puede
Introduccioacuten
2
activarse por la ruptura de los quistes tisulares (Fuentes y col 2001 Trabattoni y col
2008)
212 Toxoplasma gondii
El Toxoplasma gondii es un paraacutesito intracelular obligado Su ubicacioacuten
taxonoacutemica se detalla en la Tabla 21
Tabla 21 Ubicacioacuten taxonoacutemica del T gondii
Reino Protista
Sub-reino Protozoa
Phylum Apicomplexa
Clase Sporozoea
Sub-clase Coccidea
Orden Eucoccidiia
Sub-orden Eimeriina
Familia Sarcocystidae
Sub-familia Toxoplasmatinae
Geacutenero Toxoplasma
Especie gondii
Durante el ciclo de vida del T gondii se distinguen tres formas a) los taquizoiacutetos
b) los bradizoiacutetos (o quistes tisulares) y c) los ooquistes Los taquizoiacutetos (o trofozoiacutetos)
son la forma proliferativa y de reproduccioacuten raacutepida dentro de la ceacutelula del hueacutesped
durante la fase aguda que posteriormente deviene en la formacioacuten de un pseudoquiste
Tiene forma de medialuna y mide de 4 a 7 μm de ancho Estaacute recubierto por un sistema
de membranas constituido por una membrana doble interna y una externa interrumpida
en dos puntos El taquizoiacuteto es afectado por anticuerpos (Acs) especiacuteficos y faacutermacos y
se destruye en condiciones ambientales adversas como congelamiento-
descongelamiento desecacioacuten y bajo pH (por ejemplo el de los jugos gaacutestricos) Los
quistes tisulares son redondeados de pared elaacutestica miden de 10 a 200 μm y pueden
contener hasta 3000 paraacutesitos denominados bradizoiacutetos Estas formas no son afectadas
por Acs ni faacutermacos pero pueden ser destruidos por calentamiento congelamiento-
descongelamiento y por desecacioacuten Cuando estos quistes son ingeridos los bradizoiacutetos
resistentes son liberados por la accioacuten gaacutestrica y pueden invadir la mucosa
gastrointestinal Los ooquistes son estructuras ovoides de 10 a 12 μm de diaacutemetro y son
eliminadas en la materia fecal del gato Recieacuten emitidos no son infectivos pero bajo
condiciones de temperatura humedad y presencia de oxiacutegeno esporulan tornaacutendose
Introduccioacuten
3
infectivos y resistentes por maacutes de un antildeo en el suelo y dos antildeos en el agua (Atias
1998 Perotti 2007)
La Fig 21 describe el ciclo de vida del paraacutesito Los uacutenicos hueacutespedes definitivos
conocidos de T gondii son miembros de la familia Felidae (por ejemplo gatos
domeacutesticos) Los ooquistes no esporulados son liberados en las heces del felino Los
ooquistes tardan entre 1 y 5 diacuteas en esporular en el ambiente y volverse infectivos Los
hueacutespedes intermediarios se infectan al ingerir tierra agua o plantas contaminadas con
los ooquistes Los ooquistes se transforman en taquizoiacutetos al breve tiempo de ser
ingeridos Estos taquizoiacutetos se localizan en los tejidos musculares y el sistema nervioso
y evolucionan a bradizoiacutetos formando los quistes tisulares (hiacutesticos) Los felinos se
infectan luego de ingerir la carne de hueacutespedes intermediarios que poseen quistes
tisulares o por ingestioacuten de los ooquistes esporulados Los animales de caza y los
criados para consumo humano tambieacuten pueden infectarse por ingestioacuten de ooquistes
esporulados En el hueacutesped humano los paraacutesitos forman quistes en los tejidos y suele
encontrarse generalmente en el muacutesculo esqueleacutetico el miocardio cerebro y ojos donde
pueden permanecer durante toda la vida del hueacutesped (Paacutegina web del CDC)
Figura 21 Ciclo de vida de T gondii El hueacutesped definitivo son miembros de la familia Felidae los
demaacutes hueacutespedes (incluido el hombre) se infectan accidentalmente y no son necesarios para completar el
ciclo de vida del paraacutesito Adaptado de httpwwwdpdcdcgovdpdxHTMLToxoplasmosishtm
Introduccioacuten
4
213 Diagnoacutestico
Puesto que las infecciones por T gondii en individuos inmunocompetentes son por
lo general asintomaacuteticas o presentan siacutentomas imperceptibles su diagnoacutestico se basa
principalmente en pruebas de laboratorio La toxoplasmosis no suele generar
complicaciones excepto en 2 situaciones cuando se infectan individuos
inmunodeprimidos y cuando se infectan por primera vez mujeres embarazadas En este
uacuteltimo caso el paraacutesito puede infectar al feto atravesando la placenta y generando la
infeccioacuten congeacutenita Las probabilidades de dantildear al feto o al nintildeo luego de nacer
dependeraacuten del trimestre en que suceda la infeccioacuten (Atias 1998 Martiacuten-Hernaacutendez
2005) Tanto en inmunocomprometidos como en el recieacuten nacido la infeccioacuten puede
producir graves consecuencias Es por ello que en estos casos asiacute como en la
embarazada el diagnoacutestico cobra particular relevancia (Remington y col 1995)
2131 Meacutetodos de diagnoacutestico
La infeccioacuten puede diagnosticarse por meacutetodos directos que consisten en la
identificacioacuten de las estructuras parasitarias (por un estudio histopatoloacutegico para lo cual
es necesario realizar biopsias puncioacuten de ganglios o cortes histoloacutegicos) o la
identificacioacuten de ADN del paraacutesito (a traveacutes de una reaccioacuten en cadena de la
polimerasa PCR) Tambieacuten se pueden realizar cultivos tisulares e inoculacioacuten al
peritoneo de ratoacuten pero este meacutetodo presenta la desventaja de involucrar el manejo de
paraacutesitos vivos y el uso de animales de laboratorio (Perotti 2007)
Los meacutetodos alternativos son las pruebas indirectas a saber
Intradermoreaccioacuten de Frenkel Evaluacutea la inmunidad celular Es una reaccioacuten
cualitativa tardiacutea y presenta resultado positivo a partir de la cuarta semana de infeccioacuten
aunque se han reportado casos de pacientes en los que llevoacute varios meses hasta dar
positiva Se utiliza con fines epidemioloacutegicos (Jirovec amp Jindrich 1961 Rodriacuteguez
Acar y col 2008)
Reaccioacuten de Sabiacuten Feldman o dye test con azul de metileno (DT) Es el meacutetodo
de referencia de la OMS Evaluacutea la inmunidad humoral y mide la cantidad total de Acs
que es capaz de destruir taquizoiacutetos viacutea activacioacuten del complemento Es un meacutetodo
cuantitativo y presenta valores positivos a partir de la primera o segunda semana de
infeccioacuten Tiene la desventaja de requerir taquizoiacutetos vivos y animales para su cultivo
por lo que soacutelo laboratorios de referencia llevan adelante este meacutetodo (Perotti 2007
Durlach y col 2008)
Introduccioacuten
5
Reaccioacuten de inmunofluorescencia indirecta (IFI) Evaluacutea la cantidad de Acs que
se unen a toxoplasmas inactivados La reaccioacuten se evidencia con Acs anti-IgG humana
marcados con isocianato de fluoresceiacutena y observando al microscopio de fluorescencia
Si bien no se trabaja con organismos vivos la necesidad de un microscopio de
fluorescencia y la subjetividad del operador limitan el uso de este meacutetodo Se han
informado resultados falso-positivos debidos a Acs anti-nucleares (Durlach y col
2008)
Aglutinacioacuten directa (AD) En este ensayo se produce una aglutinacioacuten visible con
toxoplasmas tratados con formol Se detecta fundamentalmente IgMs especiacuteficas
Hemoaglutinacioacuten indirecta (HAI) Se utilizan antiacutegenos (Angs) de T gondii con
los que se sensibiliza gloacutebulos rojos que en presencia de Acs especiacuteficos producen una
aglutinacioacuten visible como un botoacuten rojo En general es utilizado para determinar
incidencia o seroprevalencia en una regioacuten pero no se recomienda para la deteccioacuten de
la infeccioacuten aguda (Durlach y col 2008)
Fijacioacuten del complemento Se detectan Acs que activan el sistema del
complemento en presencia de Angs de T gondii La reaccioacuten se evidencia con el
sistema hemoliacutetico hemolisina-gloacutebulos rojos de carnero Resultados positivos aparecen
en forma maacutes tardiacutea que en el DT (Perotti 2007)
Western blot Se evaluacutea la presencia de Acs especiacuteficos a Angs que han sido
separados por electroforesis en un gel de poliacrilamida y transferidos a una membrana
Generalmente no es utilizada como teacutecnica de diagnoacutestico debido a su difiacutecil
estandarizacioacuten (Durlach y col 2008)
Prueba de Remington (IgM-IFI) Se sigue el mismo esquema que en IFI pero se
sustituyen el conjugado anti-IgG por uno anti-IgM lo que permite detectar infeccioacuten
aguda Acs anti-nucleares y el factor reumatoide pueden producir resultados falso-
positivos y los Acs tipo IgG pueden producir resultados falso-negativos (Perotti 2007)
Ensayo aglutinante de inmunoabsorcioacuten (ISAGA) Permite la deteccioacuten y dosaje
de Acs IgA IgE IgG e IgM especiacuteficos contra el paraacutesito Este meacutetodo posee mayor
sensibilidad en relacioacuten al IgM-IFI y al ensayo de inmunoadsorcioacuten ligado a enzima
(ELISA) de IgM para la deteccioacuten de infecciones congeacutenitas pero tiene la desventaja
que pueden detectarse IgM especiacuteficas luego de un antildeo de la primoinfeccioacuten Esto
dificulta la interpretacioacuten de un resultado positivo si se desea determinar la antiguumledad
de la infeccioacuten (Durlach y col 2008)
Introduccioacuten
6
Ensayo de inmunoadsorcioacuten ligado a enzima (ELISA) Permite la deteccioacuten de
Acs especiacuteficos contra el paraacutesito Se evidencia la reaccioacuten con una enzima ligada a Acs
o Angs (dependiendo del disentildeo del inmunoensayo ver maacutes adelante en punto 2134)
que transforma un reactivo auxiliar en un producto coloreado o fluorescente Es un
meacutetodo cuantitativo que utiliza un espectrofotoacutemetro o fluoroacutemetro lo que permite
hacer medidas maacutes objetivas y raacutepidas (Perotti 2007) Auacuten asiacute este meacutetodo aplicado a
la deteccioacuten de la toxoplasmosis de fase aguda carece de una estandarizacioacuten confiable
principalmente en la preparacioacuten del Ang
2132 Importancia del correcto diagnoacutestico en la embarazada
A pesar de toda la bateriacutea de ensayos arriba descritos disponibles para el
diagnoacutestico de la toxoplasmosis el de la infeccioacuten aguda en la mujer embarazada sigue
siendo problemaacutetico porque este diagnoacutestico se deduce a partir de los datos de las
concentraciones relativas de los distintos isotipos de las inmunoglobulinas especiacuteficas
En efecto la existencia y concentracioacuten de IgM IgA e IgG especiacuteficas contra T gondii
es muy dependiente de la respuesta inmune del individuo infectado Considerando que
el tratamiento para prevenir la transmisioacuten al feto consiste en administrar drogas
antiparasitarias que tienen efectos nocivos sobre el nonato auacuten en estos diacuteas se trabaja
en mejorar este diagnoacutestico ya que no se cuenta con un meacutetodo confiable como para
prevenir por un lado los dantildeos que suelen sufrir los recieacuten nacidos de madres con
primoinfeccioacuten no diagnosticada y por otra parte los efectos perjudiciales en los fetos
de las embarazadas incorrectamente diagnosticadas y medicadas Por ello es que en este
trabajo se intentoacute desarrollar nuevas metodologiacuteas de diagnoacutestico de la infeccioacuten
toxoplaacutesmica aguda utilizando teacutecnicas electroquiacutemicas
2133 Diagnoacutestico en la embarazada
El correcto diagnoacutestico de la infeccioacuten aguda en la embarazada incluye la
utilizacioacuten de teacutecnicas especiacuteficas y sensibles asiacute como tambieacuten la aplicacioacuten de un
esquema de seguimiento adecuado El diagnoacutestico generalmente es realizado por
serologiacutea Para determinar si la paciente cursa una infeccioacuten aguda se determinan los
tiacutetulos de los anticuerpos IgG IgA e IgM (Arcavi y col 1997) y se interpretan prima-
facie seguacuten
1 IgG IgA IgM negativas ausencia de infeccioacuten
2 IgG e IgA positivas IgM negativa infeccioacuten croacutenica
3 IgG IgA e IgM positivas posible infeccioacuten aguda
Introduccioacuten
7
2134 Ensayo de inmunoadsorcioacuten ligado a enzima
Los ensayos del tipo ELISA consisten en la deteccioacuten de un antiacutegeno o un
anticuerpo inmovilizado sobre un soporte soacutelido y mediante anticuerpos que directa o
indirectamente producen una reaccioacuten La prueba recurre al empleo de antiacutegenos o
anticuerpos conjugados a una enzima (marcados) que por reaccioacuten con su sustrato
producen una especie coloreada cuya concentracioacuten puede ser medida
fotomeacutetricamente Este ensayo tiene las ventajas de ser versaacutetil robusto simple en su
realizacioacuten y emplear reactivos relativamente econoacutemicos El uso de una fase soacutelida que
retiene el analito de intereacutes proporciona una elevada sensibilidad mientras que la
elevada especificidad del ensayo viene dada por la gran selectividad de los anticuerpos
por su antiacutegeno Las configuraciones maacutes sencillas para estos ensayos son el directo y el
indirecto ambas esquematizadas en la Fig 22
Antiacutegeno IgG conjugada a enzima
Bloqueante IgG humana Reactivo de color
Directo Indirecto
Figura 22 Esquemas que representan los ELISA directo (izquierda) e indirecto (derecha)
21341 Esquema de captura o tipo ldquoSandwichrdquo
Cuando los anticuerpos que desean detectarse son del isotipo IgM suele tenerse el
inconveniente que el isotipo IgG frecuentemente estaacute en mayor concentracioacuten que el
IgM y presenta una mayor afinidad por el antiacutegeno Por lo tanto las IgG suelen
dificultar la deteccioacuten de las IgM en suero cuando se sigue un esquema de ELISA
indirecto con anticuerpos anti-IgM humana (Ac-a-IgMh) marcados Es por esto que
suele optarse por un esquema de captura o tipo saacutendwich en el cual se aumenta la
sensibilidad del ensayo incorporando un eslaboacuten maacutes en el inmunocomplejo adsorbido
En este trabajo se ensayaron dos alternativas de captura o tipo saacutendwich En la
primera alternativa que sigue un esquema claacutesico (A) se adsorbieron los Ac-a-IgMh
Introduccioacuten
8
sobre la superficie de la placa de poliestireno Las placas asiacute sensibilizadas se
enfrentaron al suero a ensayar capturando selectivamente una porcioacuten de las IgM de la
muestra Luego se los enfrentoacute al antiacutegeno de intereacutes ligado a biotina que se une a las
IgMh especiacuteficas para dicho Ang previamente capturado Finalmente se buscoacute revelar
con enzima peroxidasa de raacutebano picante (HRP) conjugada a streptavidina esta uacuteltima
forma un complejo estable con biotina De esta forma se aumenta la cantidad de Ac que
se desean detectar adsorbido sobre la placa seleccionando el tipo de anticuerpo que se
adsorbe En la Fig 23 se muestra el esquema del ensayo tipo A
IgM Antiacutegeno ligado a biotina streptavidina conjugada a HRP
Bloqueante IgG anti-IgM Reactivo de color
Figura 23 Esquema de ensayo ELISA tipo captura claacutesico A Un anticuerpo anti IgMh captura una
porcioacuten de las IgM presentes en el suero humano una porcioacuten de estas IgM capturadas son especiacuteficas
para antiacutegeno de T gondii y se revela su presencia por medio del antiacutegeno recombinante ligado a biotina
streptavidina ligada a HRP adicionando el sustrato de la enzima y un cromoacutegeno actuando como
cosustrato
La segunda alternativa que denominamos tipo B sale del esquema tradicional de
los ELISA Se adsorbe el antiacutegeno recombinante sobre la superficie de la placa de
poliestireno enfrentaacutendola luego al suero a ensayar Asiacute se captura selectivamente las
inmunoglobulinas que reconocen al antiacutegeno Luego se expone la placa al mismo
antiacutegeno recombinante pero ligado a biotina que se uniraacute a los anticuerpos especiacuteficos
para dicho Ang previamente capturados Finalmente se revela con HRP conjugada a
streptavidina que forma un complejo estable con biotina De esta forma se aumenta la
cantidad de Ang marcado en mayor proporcioacuten para IgM que para IgG dada la
Introduccioacuten
9
multivalencia de este isotipo de inmunoglobulina En la Fig 24 se muestra el segundo
esquema que fue el que brindoacute los resultados maacutes promisorios
Antiacutegeno (Ang) Bloqueante Ang ligado a biotina Reactivo de color
IgM a-Ang IgG a-Ang streptavidina conjugada a HRP
Figura 24 Esquema de ensayo ELISA de captura tipo B El antiacutegeno expuesto en la placa captura la
porcioacuten de las IgM e IgG especiacuteficas presentes en el suero humano Haciendo uso de la polivalencia de
las IgM su presencia se revela con el antiacutegeno conjugado a biotina streptavidina ligada a HRP
adicionando el sustrato de la enzima y un cromoacutegeno actuando como cosustrato
2135 Obtencioacuten de antiacutegenos para diagnoacutestico
El diagnoacutestico de rutina de la toxoplasmosis se basa en la deteccioacuten seroloacutegica de
anticuerpos en el paciente Los antiacutegenos utilizados en estas pruebas seroloacutegicas son
generalmente proteiacutenas derivadas de ceacutelulas T gondii que se propagan en el ratoacuten o el
cultivo de ceacutelulas El cultivo y el mantenimiento de este paraacutesito es laborioso lento y
caro (Lau amp Fong 2006) El uso de antiacutegenos nativos de taquizoitos es difiacutecil de
estandarizar y con frecuencia produce reacciones positivas falsas (Hiszczyntildeska-Sawicka
y col 2005) Por lo tanto ha habido intentos de producir antiacutegenos a traveacutes de medios
maacutes seguros tales como tecnologiacutea de ADN recombinante La mayoriacutea de estos
esfuerzos se han centrado en los principales antiacutegenos de superficie del paraacutesito como el
antiacutegeno de superficie 1 (SAG1 del ingleacutes Surface antigen 1) y el antiacutegeno de superficie
2 (SAG2 del ingleacutes Surface antigen 2) (Lau amp Fong 2006) En estudios recientes se ha
estado evaluando que la presencia de IgM e IgG anti P35 seriacutea un mejor indicador de
infeccioacuten reciente que la evaluacioacuten de IgM utilizando taquizoitos enteros en ensayos
del tipo ELISA (Lu y col 2006) En efecto con la nueva tecnologiacutea de ADN
Introduccioacuten
10
recombinante es posible obtener cualquier proteiacutena contaacutendose ademaacutes con ventajas
como la posibilidad de seleccionar porciones especiacuteficas de un Ang para evitar
reacciones inespeciacuteficas ligar distintas porciones que naturalmente corresponden a otras
proteiacutenas para aumentar la sensibilidad del ensayo agregar secuencias aminoaciacutedicas
que faciliten la posterior purificacioacuten y estandarizacioacuten de la proteiacutena a utilizar
(Hiszczyntildeska-Sawicka y col 2005) A la postre todo el proceso resulta maacutes
econoacutemico seguro y confiable que la purificacioacuten de Angs a partir del microorganismo
nativo puesto que no requiere la manipulacioacuten de microorganismos patoacutegenos ya que
la expresioacuten de las proteiacutenas recombinantes se lleva adelante en microorganismos no
infectivos de raacutepido crecimiento (Babaie y col 2013)
Por lo arriba expresado debe seguirse un esquema para seleccionar cuales deben de
ser las proteiacutenas que conviene utilizar acorde al diagnoacutestico que se pretende abordar y
ello demanda un trabajo racional de seleccioacuten de antiacutegenos generalmente
inmunodominantes No obstante escoger tales proteiacutenas no es tarea sencilla por cuanto
la verificacioacuten del grado de bondad del Ang seleccionado exige una ardua tarea
experimental siendo conveniente acotar el nuacutemero de Angs alternativos a evaluar Un
modo de encarar esto es procurar predecir el grado de antigenicidad en base a la
secuencia aminoaciacutedica lo cual puede realizarse computacionalmente
214 Prediccioacuten de epiacutetopes reconocidos por ceacutelulas B
Los programas de prediccioacuten definen el grado de antigenicidad por medio de una
puntuacioacuten (score) en algunos casos para cada epiacutetope y en otros para cada residuo
amino aciacutedico En este uacuteltimo se puede definir una regioacuten antigeacutenica cuando varios
residuos con alta puntuacioacuten son adyacentes en la estructura primaria Por otra parte el
nuacutemero de epiacutetopes o regiones antigeacutenicas que los programas de prediccioacuten encuentran
depende de un umbral que es configurado por el usuario
En la actualidad los inmunoensayos para determinar anticuerpos son realizados
utilizando regiones antigeacutenicas definidas ya sea como moleacuteculas uacutenicas mezcla de
varios componentes o como antiacutegenos de fusioacuten multiepiacutetope (Camussone 2009) El
desarrollo de herramientas informaacuteticas para predecir de forma fiable la antigenicidad
de los epiacutetopes puede reducir el costoso y prolongado trabajo experimental requerido
para identificar las regiones de intereacutes (Namrata amp Rajat 2010) Al momento de
identificar estas regiones antigeacutenicas suele contarse soacutelo con la estructura primaria de
las proteiacutenas en estudio desconocieacutendose su estructura terciaria en la mayoriacutea de los
Introduccioacuten
11
casos De aquiacute que la prediccioacuten de epiacutetopes lineales es el meacutetodo maacutes utilizado para
seleccionar epiacutetopes putativos
Desde el informe inicial de Hopp y Woods en 1981 (Hopp amp Woods 1981) varios
procedimientos se han hecho populares para detectar epiacutetopes lineales reconocidos por
ceacutelulas B a partir de la estructura primaria de una proteiacutena El rendimiento de estos
programas auacuten no ha logrado una eficiencia oacuteptima seguacuten lo declarado por sus propios
autores (Kolaskar amp Tongaonkar 1990 Saha y col 2005 Saha amp Raghava 2006
Larsen y col 2006 Davydov amp Tonevitskii 2009)
La literatura sobre las aplicaciones de estos programas estaacute orientada
principalmente a identificar posibles vacunas (Namrata amp Rajat 2010) Por lo tanto la
sensibilidad (probabilidad de obtener un positivo entre los verdaderos positivos) y la
especificidad (probabilidad de obtener un negativo entre aquellos negativos verdaderos)
son los indicadores maacutes utilizados para evaluar la calidad de estos programas ya que un
uacutenico epiacutetope puede ser crucial para lograr una respuesta inmunoprotectora Al mismo
tiempo suele omitirse el valor predictivo positivo (VPP) que es la proporcioacuten de
muestras que dan positivo el ensayo siendo verdaderos positivos o sea es la capacidad
para encontrar los epiacutetopes reales de una proteiacutena (ver el recuadro 1) Sin embargo la
fiabilidad del epiacutetope predicho es maacutes importante que su sensibilidad para reducir el
nuacutemero de experimentos confirmatorios de su utilidad diagnoacutestica Es entonces
importante diferenciar ambos paraacutemetros ya que los programas de prediccioacuten pueden
realizar predicciones de baja sensibilidad pero al mismo tiempo si los epiacutetopes reales
fueron predichos la prediccioacuten presenta un alto VPP
Recuadro 1
Los casos posibles en un ensayo son
Verdaderos
positivos
Verdaderos
negativos
Ensayo
positivo A B
Ensayo
negativo C D
BA
A positivo predictivoValor
DB
D dadEspecifici
CA
A adSensibilid
Introduccioacuten
12
La falta de estudios comparativos entre los programas de prediccioacuten en la literatura
actual impide que los usuarios hagan la mejor eleccioacuten Por ello como trabajo inicial se
intentoacute evaluar los distintos programas disponibles en la red en cuanto a su capacidad
para predecir positivamente epiacutetopes
Introduccioacuten
13
22 Tuberculosis
221 Generalidades
La tuberculosis (TB) humana es una enfermedad infecto-contagiosa causada por la
bacteria Mycobacterium tuberculosis La infeccioacuten por M tuberculosis suele ser
asintomaacutetica en personas sanas dado que su sistema inmune es capaz de controlar la
bacteria No obstante en condiciones de desnutricioacuten o inmunocompromiso la
enfermedad suele ser grave La TB es una enfermedad vinculada a la pobreza que
puede afectar a adultos joacutevenes en edad productiva
La enfermedad se transmite por el aire de una persona a otra a traveacutes de gotiacuteculas
que portan bacterias Cuando una persona con infeccioacuten activa en pulmones o garganta
tose estornuda habla o canta las personas cercanas pueden respirar las bacterias
liberadas e infectarse
La enfermedad suele afectar los pulmones pero tambieacuten puede involucrar otros
oacuterganos como rintildeones columna vertebral y cerebro Los siacutentomas de la TB pulmonar
activa son tos a veces con esputo sanguinolento dolor toraacutecico debilidad peacuterdida de
peso fiebre y sudoracioacuten nocturna Si no se trata adecuadamente puede ser mortal La
mayoriacutea de las muertes por TB se producen en los paiacuteses en viacuteas de desarrollo (Paacutegina
web del CDC b)
La Organizacioacuten Mundial de la Salud (OMS) estima en 2000 millones a los
infectados por M tuberculosis que anualmente hay 9 millones de nuevos infectados y
que mueren casi 2 millones de personas al antildeo por causa de esta enfermedad (Paacutegina
web de la OMS)
222 Mycobacterium tuberculosis
Esta micobacteria tambieacuten conocida como Bacilo de Koch es una bacteria aacutecido-
alcohol resistente frecuentemente incolora y es aeroacutebica estricta Es muy resistente al
friacuteo la congelacioacuten y la desecacioacuten y por el contrario es muy sensible al calor la luz
solar y la luz ultravioleta Su replicacioacuten es muy lenta (una divisioacuten cada 16 a 20 horas)
y ante circunstancias adversas puede entrar en estado latente pudiendo retrasar su
multiplicacioacuten desde algunos diacuteas hasta varios antildeos El reservorio natural de M
tuberculosis es el hombre tanto el individuo infectado asintomaacutetico como el enfermo
con infeccioacuten activa Su clasificacioacuten taxonoacutemica se detalla en la Tabla 22
Introduccioacuten
14
Tabla 22 Ubicacioacuten taxonoacutemica de M tuberculosis
Reino Bacteria
Phylum Actinobacteria
Clase Actinobacteria
Sub-clase Actinobacteridae
Orden Actinomycetales
Sub-orden Corynebacterineae
Familia Mycobacteriaceae
Geacutenero Mycobacterium
Especie tuberculosis
223 Diagnoacutestico
El diagnoacutestico de la infeccioacuten tuberculosa se basa en una serie de estudios que se
inicia con placas radiograacuteficas pulmonares y la prueba de la tuberculina que pone de
manifiesto un estado de hipersensibilidad del hueacutesped frente a proteiacutenas de M
tuberculosis Esta sensibilidad se adquiere o bien por infeccioacuten con el bacilo o por
vacunacioacuten con cepas no infectivas (vacuna BCG) En una segunda etapa la infeccioacuten
activa es confirmada por identificacioacuten del agente etioloacutegico en cultivos obtenidos a
partir de la muestra bioloacutegica remitida al laboratorio Auacuten cuando la conjuncioacuten de los
meacutetodos de anaacutelisis vigentes permite un diagnoacutestico certero de la TB humana es
frecuente que se requiera de un prolongado tiempo de espera hasta la confirmacioacuten de la
infeccioacuten activa por cuanto ello depende del lento proceso de replicacioacuten del bacilo
Esto conlleva que exista potencialidad de contagio a individuos sanos y se comprometa
maacutes la salud del infectado
En los uacuteltimos antildeos se han desarrollado teacutecnicas de deteccioacuten de M tuberculosis
que involucran al bacterioacutefago D29 (en adelante fago) capaz de infectar
especiacuteficamente micobacterias (Park y col 2003 Mc Nerney y col 2004) Esta
metodologiacutea se basa en procesar la muestra del paciente sospechada de contener M
tuberculosis ponerla en contacto con el fago e incubarla para permitir su replicacioacuten
Finalmente se evaluacutea el tiacutetulo de los fagos liberados infectando un cultivo testigo de M
smegmatis (micobacterias de raacutepido crecimiento susceptibles al fago) y contando las
placas de lisis que se obtienen Esta novedosa metodologiacutea si bien indirecta y
preliminar permite reducir considerablemente los tiempos de diagnoacutestico puesto que se
trabaja con especies de crecimiento raacutepido Sin embargo al utilizar el conteo de placas
de lisis como eje central para el diagnoacutestico de infeccioacuten activa se recae en largos
Introduccioacuten
15
periacuteodos de incubaciones que podriacutean evitarse si se contase con otro meacutetodo de evaluar
la integridad celular de M smegmatis
Por lo arriba expuesto es que en este trabajo se intento desarrollar una nueva
metodologiacutea de verificacioacuten de lisis de micobacterias utilizando teacutecnicas
intriacutensecamente raacutepidas como son las electroquiacutemicas que en un futuro podriacutean
facilitar el diagnoacutestico de infeccioacuten tuberculosa
Introduccioacuten
16
23 Biodiesel
El grave impacto de la utilizacioacuten de combustibles derivados del petroacuteleo en el
medio ambiente la limitada disponibilidad de petroacuteleo crudo y sobre todo la
inestabilidad de los mercados del petroacuteleo han estimulado actualmente la propagacioacuten
de combustibles liacutequidos alternativos (Monteiro y col 2008) La organizacioacuten
American Society for Testing and Materials ASTM define biodiesel como una mezcla
de eacutesteres monoalquiacutelicos de aacutecidos grasos de cadena larga derivados de aceites
vegetales o grasas animales (American Society for Testing and Materials paacutegina web)
El biodiesel puro generalmente no se utiliza como combustible sino que suele
encontrase en mezcla con diesel de petroacuteleo El biodiesel es clasificado utilizando la
notacioacuten Bxx donde xx indica el porcentaje en volumen de contenido de biodiesel en el
liacutequido Asiacute B100 es biodiesel puro B50 contiene 50 en volumen de biodiesel B5
contiene 5 en volumen etc Las mezclas comerciales maacutes comunes son B2 B5 y B20
El biodiesel se obtiene a partir de la transesterificacioacuten de gliceroliacutepidos con
alcoholes de cadena corta como el etanol o el metanol siendo el glicerol el principal
subproducto en la elaboracioacuten de este combustible junto a productos menores como
mono y diacil gliceroles o aacutecidos grasos libres La masa de glicerol generada equivale
aproximadamente al 10 en peso del total del combustible producido siendo eacuteste uno
de los contaminantes frecuentes
231 Determinacioacuten de glicerol libre en biodiesel
La presencia de glicerol es indicativa de la calidad del biodiesel transformaacutendose
en un analito de intereacutes para la creciente industria de energiacuteas alternativas a la derivada
del refinamiento del petroacuteleo
Los meacutetodos quiacutemicos maacutes simples para cuantificar glicerol se basan en su
oxidacioacuten a formaldehiacutedo utilizando peryodato Luego el formaldehiacutedo formado se
determina cuantitativamente por diversos meacutetodos ya sea basados en reacciones
especiacuteficas evaluando los productos por diferentes metodologiacuteas o por titulacioacuten con
NaOH valorado (Lapenaite y col 2007)
La norma ASTM-D 6584 establece un meacutetodo basado en cromatografiacutea gaseosa
que permite la determinacioacuten en simultaacuteneo de glicerina libre y total (glicerol maacutes
mono di y trigliceacuteridos) No obstante este procedimiento no es aplicable a los eacutesteres
metiacutelicos de aceites vegetales obtenidos a partir de aceites laacuteuricos tales como aceite de
Introduccioacuten
17
coco o de palma quedando restringido el meacutetodo soacutelo para un grupo de biodiesels
particulares
En cuanto a los meacutetodos cromatograacuteficos tienen la desventaja de ser poco
amigables con el medio ambiente dado el profuso uso de solventes orgaacutenicos que son
potencialmente contaminantes a veces se tornan laboriosos y utilizan instrumental e
insumos caros
Considerando lo expresado arriba en este trabajo se ha planteado cuantificar
glicerol utilizando una metodologiacutea esencialmente econoacutemica simple y no
contaminante como lo son las teacutecnicas electroquiacutemicas convencionales
Introduccioacuten
18
24 Marco teoacuterico de las teacutecnicas electroquiacutemicas utilizadas
Los meacutetodos electroquiacutemicos de anaacutelisis estudian el analito de intereacutes mediante la
medicioacuten de los paraacutemetros fiacutesicos como potencial eleacutectrico yo corriente en una celda
electroquiacutemica El proceso fundamental en las teacutecnicas electroquiacutemicas es la
transferencia de electrones entre especies redox y la superficie del electrodo (Bard amp
Faulkner 2001) Este puede describirse con la siguiente reaccioacuten
O + ne- R [21]
Para reacciones reversibles y raacutepidas el potencial sigue la ley de Nernst
[22]
siendo y las actividades de las especies reducida y oxidada en la interfaz
electrodosolucioacuten respectivamente
La corriente que circula por la celda es la carga transportada por unidad de tiempo y
puede expresarse como
[23]
De acuerdo a las leyes de Faraday la carga circulante (Q) es proporcional a los
moles de especie reducida u oxidada (N) El factor de proporcionalidad es la carga del
electroacuten (n) por la constante de Faraday (F)
[24]
Combinando las Ecs 23 y 24 obtenemos
[25]
A medida que avanza la reaccioacuten se consume la especie electroactiva esto
produce un gradiente de concentracioacuten entre el seno de la solucioacuten y las inmediaciones
del electrodo donde la especie es electrotransformada y consecuentemente asociado se
Introduccioacuten
19
generaraacute un transporte de masa por difusioacuten Si el proceso estaacute bajo control difusional
la primera ley de Fick permite describir el flujo de partiacuteculas en funcioacuten de la posicioacuten
ec 26 y la segunda ley de Fick lo describe en funcioacuten de la variacioacuten de la
concentracioacuten de la especie electroactiva en funcioacuten del tiempo ec 27
[26]
[27]
donde D es el coeficiente de difusioacuten de la especie en estudio El gradiente de
concentracioacuten se generaraacute soacutelo para la especie electroactiva que se transforma en la
superficie del electrodo y su transporte de masa se verificaraacute en direccioacuten ndashx es decir
hacia el electrodo si se define x = 0 en la superficie Luego considerando la reaccioacuten de
reduccioacuten ec 21 el flujo J corresponderaacute al nuacutemero de partiacuteculas de O que cambian de
posicioacuten en direccioacuten -x con el tiempo por unidad de aacuterea y puede expresarse como
[28]
Combinando las ecs 26 27 y 28 obtenemos la expresioacuten combinada de las leyes
de Fick para una especie que estaacute reaccionando sobre un electrodo de aacuterea A
[29]
o directamente
[210]
Reemplazando en la ec 25 obtenemos una expresioacuten para la corriente (I) que
circula por la celda en la que se lleva a cabo la reaccioacuten ec 21 sobre un electrodo
uniformemente accesible de aacuterea A y cuando el transporte de masa es exclusivamente
controlado por difusioacuten
[211]
expresioacuten que indica que la corriente es directamente proporcional al gradiente de
concentracioacuten generado por efecto de la reaccioacuten electroacutedica
Introduccioacuten
20
Para un sistema en estado estacionario en el cual la velocidad de transformacioacuten de
la especie electroactiva es igual a la de transferencia de masa y suponiendo que la
reaccioacuten cumple las condiciones de rapidez y reversibilidad (Ec de Nernst) podemos
llegar a describir la relacioacuten entre la corriente circulante por la celda y el potencial al
cual se lleva adelante la reaccioacuten por
[212]
donde KR y KO son constantes que dependen del aacuterea del electrodo de trabajo y los
coeficientes de difusioacuten de las especies reducida y oxidada respectivamente e Il es la
corriente liacutemite
Se define como potencial de media onda al potencial al cual el valor de corriente es
la mitad del valor de corriente liacutemite y queda expresado por la siguiente ecuacioacuten
[213]
Tomando esta definicioacuten y operando en la ec 212 se arriba a la expresioacuten que
describe la corriente como funcioacuten del potencial de electrodo
ndash [214]
ecuacioacuten que corresponde a una funcioacuten sigmoidea por lo tanto al realizar un barrido
de potencial desde un potencial al cual no existe reaccioacuten electroacutedica hacia un potencial
al cual es posible reducir la especie electroactiva hasta alcanzar el estado estacionario la
corriente variaraacute con el potencial siguiendo la forma de una curva sigmoidea
Durante la ejecucioacuten del presente trabajo se utilizaron diversas teacutecnicas
voltamperomeacutetricas cronoamperometriacutea voltametriacutea de barrido lineal voltametriacutea
ciacuteclica y voltametriacutea de onda cuadrada Se pasa a comentar brevemente cada una de
ellas
241 Cronoampreometriacutea
En esta teacutecnica se estudia como variacutea la corriente que circula por la celda en
funcioacuten del tiempo transcurrido mientras el electrodo de trabajo es sometido a un
Introduccioacuten
21
determinado potencial Al aplicar un pulso de potencial se modifica el equilibrio de la
reaccioacuten redox ec 21 se pasa de un potencial inicial donde no ocurre reaccioacuten
electroacutedica a un potencial donde las especies pueden intercambiar electrones en la
interfaz electrodosolucioacuten favoreciendo la reaccioacuten en uno u otro sentido dependiendo
del potencial aplicado Esto da lugar a una corriente liacutemite difusional que variacutea en
funcioacuten del tiempo Para un electrodo uniformemente accesible esta corriente estaacute
descripta por la ec 211 Fijando las condiciones de contorno correspondientes al
experimento en cuestioacuten
t = 0 C0 = Cinfin (no hay reaccioacuten en el electrodo)
t ge0 lim C = Cinfin
t ge0 C0 = 0
donde C0 y Cinfin son las concentraciones de la especie electroactiva en la interfaz
electrodosolucioacuten y en el seno de la solucioacuten respectivamente Es posible entonces
resolver la ecuacioacuten diferencial de la segunda ley de Fick donde la solucioacuten viene dada
por la denominada ecuacioacuten de Cottrell
[215]
donde Id(t) es la corriente controlada por difusioacuten
En este trabajo se utilizoacute esta teacutecnica porque permite cuantificar glicerol utilizando
diferentes electrodos de trabajo seguacuten el medio especiacutefico donde se encuentre disuelto
242 Teacutecnicas voltameacutetricas
Todas las teacutecnicas voltameacutetricas tienen en comuacuten que el potencial eleacutectrico al que
se somete el electrodo de trabajo variacutea en funcioacuten del tiempo En todos los casos se
realiza un barrido lineal de potencial que va desde el potencial inicial (Ei) hasta un
potencial final (Ef) Este barrido se realiza a una velocidad constante que es el cociente
entre el salto (discreto) de potencial y el tiempo de duracioacuten de ese salto La forma en
que se realiza el barrido de potencial es lo que diferencia a una teacutecnica voltameacutetrica de
otra
Introduccioacuten
22
2421 Voltametriacutea de barrido lineal
En esta teacutecnica se realiza un barrido desde un potencial inicial (Ei) al cual no existe
proceso de transferencia de electrones en la interfaz electrodosolucioacuten y soacutelo podraacute
apreciarse corriente debida a procesos no faraacutedicos hasta un potencial final (Ef) En la
medida que el potencial aumenta alcanza un valor al cual ocurre la reaccioacuten electroacutedica
comenzando un flujo de carga debido a procesos faraacutedicos En la Fig 25 se muestra el
perfil del potencial en funcioacuten del tiempo utilizando el modo normal (en peldantildeos) para
el caso de los experimentos realizados con el instrumento utilizado en el presente
trabajo (Eco Chemie 2000)
Figura 25 Perfil de potencial en funcioacuten del tiempo Si bien el potencial es una variable continua un
potenciostato real solo puede establecer variaciones discretas de potencial de aquiacute que en lugar de
observar una ―rampa se observe una escalera
Para una reaccioacuten de reduccioacuten reversible ec 21 a medida que el potencial
aumenta se incrementaraacute la corriente siguiendo la forma de una sigmoidea (seguacuten la ec
21) Sin embargo cuando la velocidad de transporte de masa por difusioacuten de la especie
O sea menor que la velocidad de consumo por la reaccioacuten electroacutedica no seraacute posible
alcanzar el estado estacionario y la corriente llegaraacute a un maacuteximo Ip De aquiacute en maacutes la
corriente comenzaraacute a decaer con t12
tal como lo describe la ecuacioacuten de Cottrell ec
215 En la Fig 26 se muestra el perfil de corriente que se obtienen en experimentos
voltameacutetricos claacutesicos
t
Salto de potencial
Duracioacuten del salto
E
Introduccioacuten
23
Figura 26 Perfiles de corriente en funcioacuten del potencial para experimentos voltameacutetricos de barrido
lineal Liacutenea azul la velocidad de barrido es lo suficientemente baja establecieacutendose un estado
estacionario Liacuteneas verde negra y roja la velocidad de barrido es alta y se origina un pico de corriente
La corriente de pico crece proporcionalmente a la raiacutez cuadrada de la velocidad de barrido
El maacuteximo de corriente tambieacuten denominado corriente de pico se puede obtener a
partir de la ecuacioacuten de Randles-Sevcik (Bard amp Faulkner 2001)
[216]
siendo la temperatura 25 degC y donde A estaacute en cm2 D en cm
2 s
-1 C en mol cm
-3 y en
V s-1
2422 Voltametriacutea ciacuteclica
En esta teacutecnica se realiza un barrido desde un potencial inicial (Ei) a un primer
veacutertice de potencial (Ev1) y a partir de alliacute se invierte la direccioacuten de barrido hasta
llegar a un segundo veacutertice de potencial (Ev2) el cual puede coincidir con el Ei El perfil
de potencial en funcioacuten del tiempo que se obtiene utilizando el instrumento con el que
se trabajoacute y de acuerdo a lo indicado por el fabricante se esquematiza en la Fig 27
(izquierda) y el perfil de corriente en funcioacuten del potencial para una reaccioacuten reversible
se esquematiza en la Fig 27 (derecha)
Idif
IP
Introduccioacuten
24
Fig 27 Perfil de potencial en funcioacuten del tiempo (izquierda) Perfil de corriente en funcioacuten del
potencial para una reaccioacuten redox reversible (derecha)
En este trabajo se realizaron experimentos de voltametriacutea ciacuteclica para identificar la
presencia de mediadores redox que presentando reacciones electroacutedicas reversibles
permitieran la regeneracioacuten del cofactor de la enzima glicerol deshidrogenasa (GlDH)
Esta teacutecnica tambieacuten se utilizoacute para calcular las aacutereas de los electrodos de trabajo de
modo tal de normalizar la sentildeal obtenida con la superficie del electrodo utilizado
Ademaacutes se utilizoacute para cuantificar glicerol e identificar los potenciales de oxidacioacuten del
mismo
243 Teacutecnicas de pulso
Las teacutecnicas de pulso surgieron vinculadas a la polarografiacutea de corriente continua
la teacutecnica voltameacutetrica cuya particularidad es utilizar un electrodo de goteo de mercurio
Este grupo de teacutecnicas se ha ido diversificando a medida que se fueron haciendo maacutes
complejos tanto los esquemas de potenciales aplicados a los electrodos de trabajo
como las medidas de intensidades de corrientes (Bard amp Faulkner 2001)
2431 Voltamperometriacutea onda cuadrada VOC
Esta teacutecnica tiene varias ventajas entre las que se encuentran su excelente
sensibilidad (se han registrado liacutemites de deteccioacuten directa del orden de 10-8
M) la
eliminacioacuten de las corrientes de fondo y la rapidez con que se lleva a cabo el
experimento completo ya que se puede trabajar a velocidades de barrido de potencial
auacuten superiores a 1 V s-1
(Bard amp Faulkner 2001)
El perfil de potencial aplicado al electrodo de trabajo en funcioacuten del tiempo en la
VOC se presenta en la Fig 28 Consta de una onda cuadrada simeacutetrica con una
amplitud Ep superpuesta a una escalera de potencial con escalones o saltos de
potencial Es (Fig29) donde el pulso hacia adelante de la onda cuadrada coincide con
el escaloacuten de potencial de la escalera
E
I
Introduccioacuten
25
La utilizacioacuten de la teacutecnicas voltamperomeacutetricas de pulso presentan la ventaja de
permitir realizar un barrido de potencial donde la especie electroactiva se oxida
raacutepidamente produciendo una sentildeal analiacutetica No es necesario trabajar durante periacuteodos
prolongados de tiempo a los elevados potenciales donde se establece la corriente liacutemite
controlada por difusioacuten como lo requiere la teacutecnica amperomeacutetrica
Figura 28 Perfil de potencial aplicado al electrodo de trabajo en la VOC en funcioacuten del tiempo En
liacutenea cortada se indica cual es la escalera de potencial a la cual se le sobreimprime la onda cuadrada Se
indican resaltados ( ) los tiempos durante los que se realizan las lecturas de corriente En un ciclo se
realizan las lecturas de corrientes alta y baja Adaptado de Bard amp Faulkner 2001
Figura 29 a) Onda cuadrada simeacutetrica b) Perfil de potencial en funcioacuten del tiempo de una escalera
de potencial
a)
b)
E
E
E
t
Amplitud de la
onda cuadrada EP
Periacuteodo de la onda
Salto o escaloacuten
de potencial ES
Medida
alta
Medida
baja
t
Salto o escaloacuten
de potencial ES
t
Amplitud de la
onda cuadrada
EP
Periacuteodo de la onda
Introduccioacuten
26
El potensiostato registra la corriente durante la medida alta y la medida baja de un
ciclo La diferencia de estas corrientes es la corriente neta Ineta que se grafica en
funcioacuten del potencial de la escalera de potencial correspondiente a ese ciclo (liacutenea
cortada Fig 28) Para sistemas reversibles se obtiene una curva como se observa en la
Fig 210 donde se indican las corrientes de la medida alta de la medida baja y neta
que resulta en un pico de corriente La corriente de pico neta IP n observada en la VOC
es proporcional a la concentracioacuten de la especie electroactiva en el seno de la solucioacuten y
se centra alredewdor del potencial de la cupla redox
Figura 210 Voltamperograma de onda cuadrada tiacutepico para un sistema reversible la corriente neta
Ineta se obtiene por la diferencia entre la corriente registrada al finalizar el pulso I medida alta y la
corriente registrada previamente al nuevo pulso I medida baja
La frecuencia ( f ) de la onda cuadrada medida en Hz se define como
1f [217]
Siendo el periacuteodo de la onda cuadrada medido en segundos que a su vez es dos
veces el tiempo del pulso Pt por lo tanto tenemos que
P2
1
tf [218]
Luego
ft
2
1P [219]
Los valores de frecuencia pueden variar desde unos pocos Hz hasta varios miles
dependiendo de las condiciones particulares del caso La velocidad de barrido v queda
definida como el producto del salto de potencial ES por la frecuencia f
fSEv [220]
Introduccioacuten
27
Las velocidades de barrido en los experimentos de VOC se obtienen modificando la
frecuencia de la onda cuadrada ya que el salto de potencial suele ser un valor fijo
Se demostroacute que para cuplas redox controladas por difusioacuten los paraacutemetros de la
VOC maacutes adecuados son E = 50n mV y Es = 10n mV (Osteryoung y Osteryoung
1985)
Cuando se aplica un pulso de potencial en las cercaniacuteas del potencial de la cupla
redox las corrientes faradaicas aumentan significativamente conforme se oxida o se
reduce la especie electroactiva Estas corrientes decaen con el tiempo seguacuten la ecuacioacuten
de Cottrel ya expresada anteriormente como ec [215]
Si consideramos t como tP se observa que la disminucioacuten del tiempo del pulso
implica mayor corriente Luego a medida que se aumenta la frecuencia aumenta la
velocidad de barrido y disminuye el tiempo del pulso Para sistemas reversibles se
predice que la intensidad tiene una dependencia lineal con la raiacutez cuadrada de la
frecuencia (Osteryoung y Osteryoung 1985)
21 fBAnIp [221]
La eleccioacuten de la frecuencia adecuada es de suma importancia A frecuencias muy
altas aumentan significativamente las corrientes capacitivas perdiendose resolucioacuten lo
que impone un liacutemite al aumento de la frecuencia
25 Biosensores
En muchas determinaciones de analitos en muestras bioloacutegicas se necesitan pasos
previos a la evaluacioacuten propiamente dicha que permiten eliminar o enmascarar las
potenciales interferencias Sin embargo el pretratamiento de la muestra puede llevar a
una disminucioacuten de la concentracioacuten del analito ya sea por peacuterdidas en las etapas
consecutivas del anaacutelisis o por transformacioacuten del analito provocando errores por
defecto en la determinacioacuten (Lagier amp Verdini 2000) Cuando la evaluacioacuten de la
concentracioacuten del analito se utiliza con fines cliacutenicos tal resultado erroacuteneo puede
conducir a un diagnoacutestico incorrecto Es por ello que en la actualidad el desarrollo de
nuevas metodologiacuteas analiacuteticas tiende no soacutelo a acortar los tiempos de anaacutelisis
previnieacutendose asiacute las peacuterdidas por degradacioacuten del analito sino que ademaacutes procura
permitir la ejecucioacuten del anaacutelisis sin pasos separativos previos
En los uacuteltimos antildeos se ha avanzado en el desarrollo de biosensores ya que estos
dispositivos presentan ventajosas caracteriacutesticas que los convierten en herramientas
Introduccioacuten
28
prometedoras de anaacutelisis (Belluzo y col 2008) Los biosensores se pueden definir como
dispositivos analiacuteticos compuestos por dos componentes principales
1- Una superficie selectiva denominada bioreceptor o superficie bioreactiva (SBR)
generalmente de origen bioloacutegico o sinteacutetica biomimeacutetica la cual en contacto con la
muestra es capaz de interaccionar de manera especiacutefica con el analito (Vo-Dinh amp
Allain 2003) Este elemento es el que aporta la especificidad del dispositivo
2- Un transductor fiacutesico-quiacutemico encargado de producir una sentildeal que es funcioacuten
de la interaccioacuten entre el analito y la SBR (Vo-Dinh amp Allain 2003) Eacuteste es el
elemento que aporta la sensibilidad al dispositivo
Los biosensores pueden ser clasificados de acuerdo a la sentildeal fiacutesico-quiacutemica que
produce el transductor de acuerdo a
Sentildeal Biosensor
Cambio de temperatura Termomeacutetrico
Cambio en paraacutemetro eleacutectrico Electroquiacutemico
Cambio en propiedades de la luz Oacuteptico
Cambio de masa Piezoeleacutectrico Acuacutestico
(Adaptado de Vo-Dinh amp Allain 2003)
De los distintos tipos de biosensores los electroquiacutemicos han sido tradicionalmente
los maacutes desarrollados y usados debido a sus ventajas con respecto a otros biosensores
tales como la generacioacuten de una respuesta electroacutenica directa que permite una raacutepida
respuesta mayor simplicidad operativa versatilidad para la miniaturizacioacuten y bajo
costo Actualmente gracias al avance de la tecnologiacutea de los semiconductores y la
serigrafiacutea pueden ser producidos masivamente Dependiendo del paraacutemetro fiacutesico
medido por el detector los biosensores electroquiacutemicos pueden a su vez subdividirse en
conductimeacutetricos potenciomeacutetricos y amperomeacutetricos (Vo-Dinh amp Allain 2003)
251 Superficie de bioreconocimiento en biosensores
La SBR es un sistema bioloacutegico o biomimeacutetico que reacciona bioquiacutemica o
quiacutemicamente con el analito En la actualidad existe una gran diversidad de elementos
bioloacutegicos o derivados de ellos que son utilizados como SBR
Los mismos van desde moleacuteculas simples a sistemas complejos (Vo-Dinh amp Allain
2003) Asiacute la SBR puede contener antiacutegenos anticuerpos aacutecidos desoxiribonucleicos
(ADN) aacutecidos ribonueleicos (ARN) enzimas receptores de membrana tejidos
Introduccioacuten
29
microorganismos completos o compuestos sintetizados ―ad-hoc que emulan especies
bioloacutegicas como pueden ser estructuras biomimeacuteticas y poliacutemeros molecularmente
impresos (Vo-Dinh amp Allain 2003)
252 Biosensores amperomeacutetricos
De los biosensores electroquiacutemicos los amperomeacutetricos suelen presentar mayores
sensibilidades (Iost y col 2011)
En la Fig 211 se esquematiza un biosensor amperomeacutetrico El analito presente en
la muestra compleja reacciona selectivamente con la SBR lo que desencadena la sentildeal
analiacutetica en el transductor fiacutesico-quiacutemico
En este caso particular el transductor es un electrodo de trabajo que integra una
celda de tres electrodos El mismo estaacute sometido a un potencial eleacutectrico (con respecto a
un electrodo de referencia) y la sentildeal analiacutetica es la corriente eleacutectrica que circula por la
celda utilizando un contraelectrodo de gran aacuterea En estas condiciones la maacutexima
intensidad de corriente eleacutectrica que se observa estaacute limitada exclusivamente por la
reaccioacuten de oacutexido-reduccioacuten que ocurre en la superficie del electrodo de trabajo
Figura 211 El electrodo de trabajo es sometido a un potencial eleacutectrico en su superficie tiene lugar
la reaccioacuten de oacutexido-reduccioacuten Dicha reaccioacuten ocurre o no o bien transcurre a velocidades diferentes en
presencia o ausencia del analito de intereacutes
253 Biosensores de uso cliacutenico
En el caso de muestras para el diagnoacutestico cliacutenico de infecciones el analito a
determinar puede ser alguna de las moleacuteculas generadas por el individuo infectado
como respuesta a la presencia del agente infeccioso por ej los anticuerpos (Acs)
especiacuteficos o el agente infeccioso iacutentegro o partes del mismo En muchos casos la sola
presencia de Acs especiacuteficos es por siacute misma indicativa de infeccioacuten Hay casos en que
Introduccioacuten
30
la presencia de Acs no es per-seacute indicativa de infeccioacuten riesgosa Dos ejemplos de esta
situacioacuten son el de la toxoplasmosis y la tuberculosis
En el caso de la toxoplasmosis la deteccioacuten de Acs anti-T gondii es soacutelo de
trascendental importancia en embarazadas porque si la infeccioacuten ha sido adquirida
durante el embarazo el feto estaacute en riesgo de contagiarse y puede padecer lesiones
severas (Dunn y col 1999 Montoya amp Liesenfeld 2004) Por el contrario si se trata
de infeccioacuten croacutenica no es necesario exponer a la embarazada (y al feto) a medicacioacuten
innecesaria evitaacutendose con ello los riesgos que devienen del uso de los faacutermacos
especiacuteficos utilizados durante el tratamiento de la infeccioacuten (Freij amp Sever 1999)
Debido a la incertidumbre que acompantildea la deteccioacuten de los anticuerpos hasta hoy
utilizados con este fin se ha propuesto realizar pruebas utilizando antiacutegenos
recombinantes del paraacutesito Se ha evaluado el desempentildeo de antiacutegenos recombinantes
sintetizados por teacutecnicas de biologiacutea molecular en forma individual o mezclados para
evaluar la avidez de Acs IgG (Beghetto y col 2003) Se observoacute que utilizando el
fragmento del antiacutegeno MIC3 en este ensayo los iacutendices de avidez permitieron
determinar la antiguumledad de la infeccioacuten con mayor grado de certeza que empleando
homogenado total de paraacutesito resultando MIC3 un buen marcador para el diagnoacutestico
de infecciones agudas (Beghetto y col 2003) La proteiacutena recombinante P35 tambieacuten
fue propuesta como marcador seroloacutegico para diferenciar infeccioacuten aguda de croacutenica ya
que evidencioacute sensibilidades del 853 para sueros agudos y una especificidad del 98
respecto de sueros croacutenicos (Parmley y col 2000) No obstante y a pesar de haberse
descrito moleacuteculas para el diagnoacutestico de toxoplasmosis aguda no existe un acuerdo
sobre su efectividad por lo que se requiere de la evaluacioacuten de nuevos antiacutegenos para
este fin En general el uso de una sola moleacutecula recombinante no brinda suficiente
sensibilidad habieacutendose demostrado que el empleo de varios antiacutegenos recombinantes
la mejora (Pinon y col 2003) Se ha observado tambieacuten que una mezcla de moleacuteculas
no produce los mismos resultados que cuando se utilizan en forma separada (Silveira y
col 2001) Se ha postulado que esta diferencia se debe a las distintas caracteriacutesticas
fisicoquiacutemicas entre las moleacuteculas de una mezcla que impide la inmovilizacioacuten
homogeacutenea en las superficies de captura utilizadas en los inmunoensayos Por lo tanto
resulta muy factible que un ensayo que utilice una combinacioacuten o fusioacuten en una sola
moleacutecula de estos antiacutegenos recombinantes marcadores de infeccioacuten reciente pueda
mejorar el diagnoacutestico diferencial tal como ha sido demostrado para el diagnoacutestico de
otras infecciones (Camussone y col 2009)
Introduccioacuten
31
En el caso de la tuberculosis la mayoriacutea de los individuos de la poblacioacuten han
recibido la vacunacioacuten reglamentaria por inoculacioacuten de una cepa de micobacterias
inofensivas generando Acs anti-Mycobacterium tuberculosis (M tuberculosis) Por
ello estos Acs suelen estar presentes en casi toda la poblacioacuten De aquiacute que la deteccioacuten
de Acs anti-M tuberculosis no demuestra infeccioacuten activa de riesgo Por tal motivo el
indicador por excelencia de infeccioacuten activa es la evidenciacioacuten del patoacutegeno en la
muestra No obstante las muestras suelen poseer una extremadamente baja cantidad de
M tuberculosis lo que dificulta su deteccioacuten directa Por ello es preciso utilizar alguacuten
paso amplificador del analito a censar Dado el largo tiempo de replicacioacuten del
microorganismo los cultivos realizados para su replicacioacuten insumen periacuteodos
prolongados Siguiendo los trabajos de Park y col y McNerney y col (Park y col
2003 McNerney y col 2004) se formuloacute la siguiente hipoacutetesis de trabajo Sistemas
enzimaacuteticos presentes en M smegmatis permitiriacutean metabolizar sustratos electroactivos
a distintas velocidades de reaccioacuten dependiendo de la integridad del microorganismo
Siendo este el caso seriacutea posible distinguir entre cultivos de M smegmatis que han sido
lisados por el fago especiacutefico D29 de aquellos cultivos en que dichas micobacterias
estaacuten iacutentegras Si soacutelo existiera lisis cuando la muestra ensayada contiene organismos
filogeneacuteticamente emparentados como M tuberculosis que permitiesen la
amplificacioacuten selectiva del fago D29 previamente a la infeccioacuten del cultivo testigo de
M smegmatis la evaluacioacuten electroquiacutemica del sustrato metabolizable por el
microorganismo deberiacutea permitir evidenciar presencia o ausencia de M tuberculosis La
seleccioacuten del fago D29 se justifica porque es capaz de infectar micobacterias de
crecimiento raacutepido como M smegmatis y las de crecimiento lento como M tuberculosis
(Park y col 2003)
El glicerol es corrientemente utilizado como principal fuente de carbono en cultivos
de micobacterias siendo degradado eficientemente por sus sistemas enzimaacuteticos que
utilizan mecanismos redox En este trabajo nos hemos planteado detectar este
polialcohol como analito de intereacutes ya que su consumo estaraacute preferencialmente
vinculado a la presencia de micobacterias aptas para tal degradacioacuten Por este motivo
proponemos utilizar un bioelectrodo con una SBR que contenga una enzima cuyo
sustrato sea glicerol
Introduccioacuten
32
2531 Biosensores para evaluacioacuten de infeccioacuten toxoplaacutesmica
En el presente trabajo se propuso un biosensor para evaluacioacuten de infeccioacuten
toxoplaacutesmica utilizando un electrodo de oro policristalino macizo sobre el cual se
adsorbioacute un antiacutegeno recombinante y se siguioacute un esquema ELISA del tipo indirecto
con deteccioacuten de IgGh En la Fig 212 se muestra el esquema que se siguioacute para este
inmunoensayo
Proteiacutena recombinante IgG a-IgGh conjugada a HRP
Bloqueante IgG humana ferrocenometanol
Figura 212 Sobre la superficie del electrodo se fija la proteiacutena recombinante que capturaraacute los
anticuerpos especiacuteficos si estaacuten presentes en el suero El revelado se realiza con un segundo anticuerpo
especiacutefico para IgG humana marcado con HRP que en presencia de H2O2 oxida el mediador FcMe que
se reduce sobre la superficie del electrodo generando la sentildeal analiacutetica
254 Biosensores para cuantificacioacuten de glicerol
La determinacioacuten de glicerol ha ido ganando importancia en las uacuteltimas deacutecadas
debido al uso del mismo en varias industrias como la farmaceacuteutica automotriz
alimenticia y textil entre otros El compuesto es un producto importante de la
fermentacioacuten en la mayoriacutea de las bebidas alcohoacutelicas y su concentracioacuten es un
paraacutemetro uacutetil para el seguimiento del proceso fermentativo (Goriushkina y col 2010)
Tambieacuten es un componente no deseable del biodiesel y su concentracioacuten es un indicador
de la calidad del combustible (Monteiro y col 2008)
Se han desarrollado numerosas metodologiacuteas para llevar adelante la cuantificacioacuten
del glicerol que incluyen teacutecnicas espectrofotomeacutetricas yo espectrofluoromeacutetricas
(Bondioli amp Bella 2005 Silva amp Rocha 2010 Lima y col 2012) incluidos los basados
Introduccioacuten
33
en enzimas (Kronka y col 2001 Li y col 2001) los electroquiacutemicos (Tehrani amp
Ghani 2012 Gamella y col 2008 Wu amp Cheng 2005) y los cromatograacuteficos estos
uacuteltimos han sido oficialmente recomendado por la AOAC como los meacutetodos 96809
97210 (AOAC 2005) Sin embargo a pesar de que estos meacutetodos permiten determinar
con eficacia de glicerol en presencia de muchos compuestos que interfieren esta teacutecnica
se considera que es ecoloacutegicamente desfavorable debido a la utilizacioacuten de solventes
nocivos para el medio ambiente e intriacutensecamente onerosa debido a los altos costos de
los mismos (Gamella y col 2008)
Por un lado las propuestas espectrofotomeacutetricas que utilizan enzimas se basan en el
uso de sistemas o bien de una o varias enzimas relativamente caras que se eliminan
despueacutes de que se han utilizado en una uacutenica determinacioacuten En estos casos a menudo
son consumidos las enzimas yo cofactores caros como nicotinamida adenina
dinucleoacutetido (NAD+) o adenosina 5-trifosfato (ATP) a menudo son consumidos
(Kronka y col 2001 Li y col 2001 Wu amp Cheng 2005) Como un ejemplo la
propuesta de Li para determinar glicerol en matrices complejas se basa en el uso de tres
enzimas a saber glicerol quinasa (GK) piruvato quinasa (PK) y lactato
deshidrogenasa (LDH) ademaacutes de utilizar ATP y NAD+ (Li y col 2001) Este meacutetodo
produce buenos resultados en teacuterminos de sensibilidad y especificidad pero consume 1
U de GK 15 U de PK 22 U de LDH 2x10-6
moles de ATP y 33x10-7
moles de
NAD+ por determinacioacuten Por lo tanto el costo derivado por anaacutelisis es considerado
caro sobre todo cuando se debe analizar un elevado nuacutemero de muestras
Por otro lado se han propuesto herramientas versaacutetiles notables para cuantificar
glicerol como ser la basada en tecnologiacutea de biosensores en particular los basados en
meacutetodos amperomeacutetricos (Ghica amp Brett 2006 Gamella y col 2008) De hecho los
biosensores amperomeacutetricos proporcionan suficiente sensibilidad y selectividad para
permitir la determinacioacuten del analito junto con una velocidad apropiada para completar
el anaacutelisis En efecto los biosensores amperomeacutetricos que utilizan enzimas como
componente bioloacutegico para el reconocimiento dan lugar a una selectividad significativa
debido a su capacidad de reaccionar especiacuteficamente con su sustrato Este uacuteltimo es a
menudo el analito de intereacutes por lo que puede ser cuantificado de manera eficiente auacuten
ante la presencia de otros componentes similares estructuralmente que pueden hallarse
en la muestra (Belluzo y col 2008) Los dispositivos construidos con enzimas a
menudo pueden ser reutilizados y por lo tanto el costo por determinacioacuten puede ser
Introduccioacuten
34
reducido significativamente en comparacioacuten con los meacutetodos espectrofotomeacutetricos
mencionados anteriormente
Se han desarrollado varios biosensores utilizando enzimas que tienen como sustrato
al glicerol (Gamella y col 2008) En los disentildeos utilizados se utilizan diversas enzimas
que reaccionan especiacuteficamente con el glicerol en un primer paso y se censa un
producto de esta reaccioacuten En otros disentildeos se encuentran involucradas maacutes de una
enzima donde la segunda o tercer enzima utiliza como sustrato algunos de los
productos de la primera o segunda reaccioacuten y finalmente se censa un producto de la
uacuteltima reaccioacuten enzimaacutetica Algunos disentildeos que aparecieron en literatura al momento
de iniciar este trabajo de tesis fueron detallados por Pingarroacuten y colaboradores (Gamella
y col 2008) y se encuentran resumidos en la Tabla 23 al final de este capiacutetulo y se
corresponden a los esquemas evaluados al momento de iniciar este trabajo de tesis
Todos los disentildeos descriptos al momento presentan la desventaja de ser onerosos
tanto por el disentildeo en siacute como por el costo operativo devenido del consumo de elevadas
cantidades de reactivos caros
Sobre la base del modelo propuesto por Tuntildeoacuten-Blanco y colaboradores (Aacutelvarez-
Gonzaacutelez y col 2000) se comenzaron los ensayos para construir un bioelectrodo
selectivo para glicerol La propuesta contempla en primer lugar disminuir la cantidad
de enzima Glicerol deshidrogenasa En segundo lugar proponemos utilizar la coenzima
NAD(H) en forma soluble e introducir un mediador electroquiacutemico distinto al utilizado
previamente En el trabajo citado se generaba una cupla cataliacutetica por oxidacioacuten
electroacutedica del NAD+ presente en un electrodo de trabajo de pasta de C modificada En
nuestro caso el mediador soluble permite reoxidar la coenzima para cerrar el ciclo
cataliacutetico siguiendo el esquema de la Fig 213
Figura 213 Esquema de reacciones que ocurren en la celda DHA 13 dihidroxiacetona GlDH
gliceroldeshidrogenasa NAD(H) nicotinadenina dinucleoacutetido
glicerol
DHA
GlDHox
GlDHred NAD+
NADH Mediador ox
Mediador red
e- Electrodo
Introduccioacuten
35
Tabla 23 Biosensores selectivos para gicerol Las filas 1 a 10 son un extracto parcial del trabajo de
Gamella y col 2008 En las filas 11 y 12 se incluyen los disentildeos propuestos por Šefčovičovaacute y col
2008 y Goriushkina y col 2010
Electrodo Enzima Mediador Potencial
1 Pt GKGPOx - + 650 mV vs AgAgCl
2 Al GlDH Fe(CN)6 + 400mV vs ECS
3 Barras de grafito
espectroscoacutepico GlDH Complejo de Os + 200 mV vs AgAgCl
4 Serigraacutefico (SPE) pGlyDH N-(4-hidroxibenzilideno)-
4-ferrocenilanilina + 400 mV vs AgAgCl
5 Carboacuten Viacutetreo a) GlDHDP
b) GKGPOxHRP
a)Fe(CN)63-
b)Fe(CN)64-
a) + 350 mV vs AgAgCl
b) - 300 mV vs AgAgCl
6 SPE modificado con
ZrO2 y azul meldola GlDH Azul meldola + 100 mV vs AgAgCl
7 SPE modificado azul
de Prusia
GlDH Tt NADH
Ox Azul de Prusia - 50 mV vs AgAgCl
8 Pasta de carbono GlDH Producto de la electro-
oxidacioacuten del NAD+ + 150 mV vs AgAgCl
9 Flim de carbono a) GPOx
b)GKGPOx Poli (rojo neutro) - 350 mV vs ECS
10 Au a)GlDHDP
b) GKGPOxHRP Tetra thiafulvaleno
a) + 150 mV vs AgAgCl
b) 0 mV vs AgAgCl
11 Carboacuten Viacutetreo GlDHDP Fe(CN)63- + 350 mV vs AgAgCl
12 Platino serigraacutefico Gox - + 300 mV vs electrodo
intriacutenseco
Tabla 23 Continuacioacuten
Muestra
Rango dinaacutemico
Lineal (M) Sensibilidad
(mA M-1
cm-2
)
Liacutemite de
deteccioacuten (M) Estabilidad
Desde Hasta
1 Mosto de uva 2 10-6
10-3 - 5 10
-7 Hasta 1 mes
2 Jugo de uva 10-6
2 10-3
- 10-6 -
3 Vino 1 10-6
2 10-4
32 1 10-6
80 actividad inicial luego
de 20 horas
4 Vino - - - - actividad enzimaacutetica decae
rapidamente
5 Fermento
anaeroacutebico
1 10-5
1 10-5
10-3
1 10-3
a) 620
b) 142 -
sentildeal inicial luego de
uso continuo a) 60 a 90
hs b) 70 16 hs
6 Fermento de
jugo de uva 10
-51 10
-4 - 10
-6 -
7 - 10-5
1 10-3
- 10-6 -
8 Jarabe 997 10-7
10-4
162 cm2 43 10-7
80 actividad inicial luego
de 3 diacuteas
9 Vino 10-5
147 10-4
a) 101
b) 079
a) 4 10-6
b) 15 10-5
sentildeal inicial luego de
uso continuo a) 87 a 8
diacuteas b) 62 8 diacuteas
10 Vino 10
-6
4 10-7
2 10-5
1 10-5
a) 207
b) 250
a) 4 10-7
b) 31
sentildeal inicial luego de
uso continuo a) 87 a 51
diacuteas b) 46 8 diacuteas
11 Fermento - - - 11 10-6
-
12 Vino 10
-5
2 10-6
25 10-2
64 10-3
-
10-5
2 10-6 -
Objetivos
Objetivos
37
3 Objetivos
31 Objetivos generales
Desarrollar metodologiacuteas electroquiacutemicas que permitan identificar analitos de
intereacutes tanto para el diagnoacutestico cliacutenico como para la industria de combustibles
alternativos
32 Objetivos particulares
a) Obtener bioelectrodos que exhiban una corriente cataliacutetica diferencial al efectuar
inmunoensayos con muestras confirmadas positivas o negativas para infeccioacuten aguda
por T gondii
b) Desarrollar un meacutetodo electroquiacutemico que permita la cuantificacioacuten de glicerol
en medio acuoso para determinarlo por ejemplo luego de su extraccioacuten en
combustibles alternativos
c) Evidenciar electroquiacutemicamente la ocurrencia de lisis de M smegmatis por fagos
D29 indicadores de la presencia de micobacterias patoacutegenas emparentadas
provenientes de individuos padeciendo infeccioacuten tuberculosa
Materiales y Meacutetodos
Materiales y Meacutetodos
39
4 Materiales y meacutetodos
41 Reactivos y medios de cultivos
411 Reactivos
Todos los reactivos utilizados fueron de grado analiacutetico salvo que se indique lo
contrario Los aacutecidos aceacutetico sulfuacuterico niacutetrico clorhiacutedrico y percloacuterico las sales KCl
Na2HPO4 KH2PO4 NiSO4 CuSO45H2O y la sal disoacutedica del aacutecido etilen diamino tetra
aceacutetico (EDTA) dimetilsulfoacutexido (DMSO) imidazol tris base las enzimas peroxidasa
de raacutebano picante EC 11117 (tipo VI) (HRP) y glicerol deshidrogenasa de
cellulomonas EC 1116 (GlDH) acrilamida (adecuada para electroforesis) NNprime-(12-
dihidroxietilen) bisacrylamide (97) ditiotreitol (DTT) Coomasie blue G-250 alcohol
isopropiacutelico β-mercaptoetanol 33-diaminobenzidina tetrahidrocloruro (DAB)
nicotina adenina dinucleoacutetico (NAD) los desoxinucleoacutetidos trifosfato dATP dGTP
dCTP y dTTP reactivo de Folin-Ciocalteu glicina albuacutemina seacuterica bovina (ASB)
peptona de carne extracto de levadura fueron suministrados por Sigma-Aldrich El
polvo de carbono viacutetreo (esfeacuterico diaacutemetro de partiacutecula entre 2 y 12 microm pureza
9999+) fue suministrado por Aldrich El polvo de carbono grafito (pureza gt 99) fue
provisto por Fisher Scientific Dimetilformamida (DMF) 1 1rsquo-carbonil-diimidazol las
sales tartrato de sodio y potasio MgCl2 CaCl2 NaCl Na2CO3 NaHCO3 K2CO3
KHCO3 K3Fe(CN)6 K4Fe(CN)6 (NH4)2SO4 (NH4)2S2O8 (gt98) dodecil sulfato de
sodio (Farmacopea Unioacuten Europea) (SDS) NaOH KOH NNNprimeNprime-
tetrametiletilendiamino (Temed) azul de bromofenol (Farmacopea Unioacuten Europea)
xilencianol (para electroforesis) etanol absoluto fueron suministrados por Merck El
H2O2 y el glicerol fueron provistos por Cicareli El isopropil-β-D-1-
tiogalactopiranoacutesido (IPTG) fue suministrado por Promega La enzima ADN polimerasa
de Thermus aquaticus EC 2777 (polimerasa Taq) y los oligonucleoacutetidos fueron
suministrados por InvitrogenTM
Argentina La enzima peroxidasa de raacutebano picante
ligada a estreptavidina (HRP-EAV) fue provista por Abcam El ester biotin n-
hidroxisuccinimida fue provisto por Thermo Scientific La ampicilina (Farmacopea
Argentina) fue provista por laboratorios Klonal La aluacutemina para pulido (tamantildeo de
partiacutecula 03 microm) fue provista por Metrohm El anticuerpo de cabra anti IgG humana
ligado a HRP fue provisto por Zymed El Tween-20 fue provisto por Anhedra
No se detallan los reactivos contenidos en los equipos comerciales utilizados
disponibles en las paacuteginas web de los respectivos proveedores
Materiales y Meacutetodos
40
412 Medios de cultivos
Para el crecimiento de cepas de Escherichia coli (E coli) se utilizoacute el medio de
cultivo Luria-Bertani (LB) compuesto por 10 g L-1
peptona de carne 5 g L-1
extracto de
levadura y 10 g L-1
NaCl En los casos requeridos se suplementoacute este medio con el
antibioacutetico ampicilina (100 g mL-1
) Para la preparacioacuten de medios soacutelidos se agregoacute
agar en concentracioacuten final de 15 g L-1
Para el crecimiento de ceacutelulas de M smegmatis se utilizoacute el medio de cultivo
Middlebrook 7H9 provisto en forma anhidra por Difco y fue suplementado con NaCl
CaCl2 yo glicerol en concentraciones variables de acuerdo a los requerimientos del
ensayo analiacutetico ulterior la composicioacuten del medio provisto por Difco se detalla en la
siguiente tabla
Tabla 41 Caldo Middlebrook 7H9 (Difco) composicioacuten en g L-1
del medio liacutequido recieacuten preparado
(NH4)2SO4 050
Na2(HPO4) 250
K(H2PO4) 100
Citrato de sodio 010
MgSO4 005
CaCl2 0005
ZnSO4 0001
CuSO4 0001
Citrato feacuterrico amoacutenico 004
Aacutecido l-glutaacutemico 050
Piridoxina 0001
Biotina 00005
42 Cepas bacterianas
Las cepas bacterianas utilizadas y sus caracteriacutesticas relevantes se detallan en la
siguiente tabla
Materiales y Meacutetodos
41
Tabla 42 Cepas bacterianas utilizadas
Cepa Caracteriacutesticas
Escherichia
coli (E coli)
BL21 (DE3)
E F- ompT hsdS (rB-mB-) [lon] (DE3 immP21 int- lacI+
lacUV5lacZT7 ARN polimerasa) Contiene el gen de la T7
ARN polimerasa bajo el control del promotor lacUV5 El gen de
la ARN polimerasa estaacute integrado en el cromosoma bacteriano
desde (DE3) y su expresioacuten se induce por IPTG (Stratagene)
M smegmatis
mc2155
Mycobacterium smegmatis MC2155 es un organismo
aerobio quimioorganotrofo en forma de barra no moacutevil
patoacutegeno de humanos Esta bacteria fue inicialmente aislada de
esmegma humano Esta cepa es un mutante de M smegmatis Es
faacutecilmente transformable con vectores plasmiacutedicos usando
electroporacioacuten
43 Bacterioacutefagos
Se utilizoacute el bacterioacutefago D29 que infecta especiacuteficamente micobacterias Los
trabajos especiacuteficos de infeccioacuten de micobacterias fueron realizados en el Departamento
de Microbiologiacutea de la Facultad de Ciencias Meacutedicas (UNR) bajo la supervisioacuten del Dr
Ricardo Morbidoni
44 Plaacutesmidos
El plaacutesmido utilizado y sus caracteriacutesticas relevantes se detallan en la siguiente tabla
Tabla 43 Plaacutesmido utilizado
Plaacutesmido Caracteriacutesticas
pET32a
5900 pares de bases resistencia ampicilina promotor T7lac Produce
proteiacutenas fusionadas a 6 histidinas y a la proteiacutena tiorredoxina (TRX)
de 204 kDa lo que permite su purificacioacuten en columna de NTA-Ni2+
Este vector fue utilizado como sistema de expresioacuten en la cepa BL21
(DE3) de E coli
45 Reaccioacuten en cadena de la polimerasa
Las reacciones se llevaron a cabo en un volumen total de 25 μL conteniendo
solucioacuten de amplificacioacuten comercial suplementada con MgCl2 para alcanzar una
concentracioacuten final de MgCl2 25 mM y 02 mM de cada uno de los desoxinucleoacutetidos
trifosfato dATP dGTP dCTP y dTTP 20 pmoles de cebador directo y reverso y 1 UI
de polimerasa Taq Se empleoacute un termociclador BOECO (Germany) y se inicioacute la
reaccioacuten con un paso de desnaturalizacioacuten a 95 ordmC durante 5 min La amplificacioacuten de
los fragmentos se realizoacute en 30 ciclos de a) desnaturalizacioacuten 1 min a 95degC b)
Materiales y Meacutetodos
42
hibridizacioacuten 1 min a la temperatura oacuteptima para cada par de cebadores c) extensioacuten
72degC 15 min por cada Kpb amplificado finalmente se realizoacute un paso de extensioacuten
durante 10 min
Para la reaccioacuten de amplificacioacuten de la secuencia codificante de la proteiacutena se
disentildearon oligonucleoacutetidos cebadores especiacuteficos (ver maacutes adelante) En el disentildeo de los
mismos se introdujeron sitios de restriccioacuten apropiados para el posterior clonado del
fragmento en vectores de clonado o expresioacuten
Como molde se utilizoacute aproximadamente 003 g de ADN plasmiacutedico
Como cebadores se utilizaron los oligonucleoacutetidos (provistos por Invitrogen)
P22C directo 5- GGATCCACCACCGAGACGCCAGC -3
P22C reverso 5- GAATTCTTGCCCGTGAGAGACACAG -3
46 Electroforesis de ADN en geles de agarosa
Los fragmentos de ADN (ADN plasmiacutedico productos de PCR) fueron separados
mediante electroforesis en geles de agarosa de distinta concentracioacuten (08 a 2) seguacuten
el tamantildeo de los fragmentos a separar Se utilizoacute el sistema de tipo submarino La
solucioacuten reguladora tris-aceacutetico-EDTA (TAE) 05 X se utilizoacute como solucioacuten de
electroforesis y para la preparacioacuten de geles A estos uacuteltimos se les agregoacute el agente
intercalante bromuro de etidio en una concentracioacuten final de 03 g mL-1
antes de su
gelificacioacuten Previo a la siembra las muestras se mezclaron con solucioacuten de siembra
compuesta por 0025 (mv) azul de bromofenol 0025 (mv) xilencianol y 30
(vv) glicerol en una proporcioacuten 51 en volumen de muestra solucioacuten de siembra
Como marcadores de peso molecular se utilizaron Ladder 100 pb PB-L (Productos Bio-
Loacutegicos) La corrida electroforeacutetica se realizoacute a un potencial constante de 100 V con
una fuente BIO-RAD modelo 3000xi Luego de la electroforesis el ADN se visualizoacute
por fluorescencia en un transiluminador de luz ultravioleta Fotodyne y las imaacutegenes se
digitalizaron con una caacutemara FUJIFILM modelo FinePix A120
47 Minipreparacioacuten de ADN plasmiacutedico
El ADN plasmiacutedico se preparoacute a partir de cultivos celulares de E coli conteniendo
los plaacutesmidos de intereacutes seguacuten el meacutetodo de lisis alcalina o bien utilizando los equipos
comerciales ―WIZARDreg
PLUS SV Minipreps DNA purification system (Promega) El
resultado de la preparacioacuten se evaluoacute realizando una electroforesis en gel de agarosa de
una aliacutecuota de la misma
Materiales y Meacutetodos
43
48 Purificacioacuten del producto de amplificacioacuten
La purificacioacuten de aacutecidos nucleicos a partir de geles de agarosa se realizoacute utilizando
el equipo comercial ―GFXTM Gel Band Purification Kit (Amersham GE Healthcare)
seguacuten las especificaciones del fabricante El resultado de la purificacioacuten se evaluoacute
realizando una electroforesis en gel de agarosa de una aliacutecuota de la elusioacuten obtenida
49 Prueba de expresioacuten de proteiacutenas de fusioacuten a TRX y a ldquocolardquo de histidinas
Se cultivaron clones de las cepas de E coli BL21 (DE3) transformadas con el
vector pET32a (con el inserto correspondiente) haciendo distintas diluciones 175
1100 y 1200 de un cultivo saturado en 2 mL de LB fresco (suplementado con
ampicilina a 100 μg mL-1
) y cultivando a 37 ordmC con agitacioacuten vigorosa (180 rpm) hasta
una densidad oacuteptica a 630 nm (DO630nm) aproximada de 05 unidades Se indujo la
expresioacuten de la proteiacutena recombinante con IPTG (concentracioacuten final 1 o 01 mM)
durante 3 4 o 12 hs a 37 ordmC y con agitacioacuten vigorosa Posteriormente se cosecharon las
ceacutelulas centrifugando a 3000 rpm durante 10 min Finalmente se lisaron las ceacutelulas con
pulsos de ultrasonido utilizando un sonicador analoacutegico Sonifierreg S450A y se
separaron las fracciones soluble e insoluble del extracto por centrifugacioacuten a 18000 g
durante 20 min
410 Expresioacuten y purificacioacuten preparativas de antiacutegenos recombinantes
Se cultivoacute la cepa de E coli transformada con el vector pET32a con el inserto
correspondiente haciendo una dilucioacuten 1100 de un cultivo saturado en dos porciones
de 150 mL de LB suplementado con ampicilina (100 microg mL-1
) y cultivando a 37ordm C
hasta una DO630nm 05 Se agregoacute IPTG hasta concentracioacuten final oacuteptima 1 mM para
el Ang P35B o 01 mM para el Ang P22C y se indujo el tiempo oacuteptimo 4 h para el Ang
P35B o 12 h para el Ang P22C a 37ordm De esta manera se obtuvo la proteiacutena de fusioacuten
en forma soluble Se cosecharon las ceacutelulas por centrifugacioacuten y se lavaron con solucioacuten
tampoacuten fosfato (Na2HPO4 10 mM NaCl 05 M pH 8) Luego se las resuspendioacute en 20
mL de solucioacuten de lisis (Na2HPO4 50 mM NaCl 05 M pH 8) Las ceacutelulas se lisaron
por sonicado aplicando pulsos de 30 s de duracioacuten hasta clarificacioacuten del medio en
hielo Se separoacute la fraccioacuten soluble de la insoluble por centrifugacioacuten a 18000 g y 4 ordmC
La fraccioacuten soluble se congeloacute durante 24 h a -20 ordmC y se descongeloacute en hielo luego se
centrifugoacute nuevamente a 18000 g y 4 ordmC Este paso se repitioacute dos veces
Posteriormente se realizoacute una separacioacuten cromatograacutefica de afinidad con una columna
Materiales y Meacutetodos
44
de 5 mL empacada manualmente con resina Ni Sepharosetrade High Performance en
condiciones nativas elusioacuten con imidazol 250 mM seguacuten las especificaciones del
proveedor (GE Healthcare) En los sucesivos pasos se recogieron aliacutecuotas y se verificoacute
la purificacioacuten visualizando por electroforesis en gel desnaturalizante de poliacrilamida
(SDS-PAGE)
411 Separacioacuten de proteiacutenas mediante SDS-PAGE
Se utilizaron geles de 12 y de 15 de acrilamidabisacrilamida 291 Las
muestras se sembraron en geles desnaturalizantes mezclaacutendolas 21 con solucioacuten de
siembra 2 X compuesta por Tris-HCl pH 68 125 mM SDS 4 β-mercapto etanol 5
vv(alternativamente se usoacute DTT 200 mM) glicerol 20 y azul de bromofenol 02
Las corridas electroforeacuteticas se hicieron en solucioacuten Tris-glicina-SDS (Tris base 302
g L-1
glicina 144 g L-l SDS 1 g L
-1) Los geles fueron tentildeidos con azul brillante de
Coomasie G-250
412 Cuantificacioacuten de proteiacutenas
Se utilizoacute el meacutetodo propuesto por Lowry (Lowry y col1951) seguacuten el siguiente
protocolo un volumen de muestra cuya concentracioacuten de proteiacutena se desea determinar y
uno o dos testigos de albuacutemina (conteniendo tiacutepicamente de 5 a 25 microg de proteiacutenas
totales) se disolvieron en 040 mL de agua destilada y se mezclaron con 150 mL de
reactivo C preparado inmediatamente antes de usar El reactivo C se preparoacute mezclando
una parte de tartrato de sodio y potasio 2 mv una parte de CuSO4 1 mv y 100
partes de solucioacuten tampoacuten carbonato 2 mv e hidroacutexido de sodio 01 N Se dejoacute
reaccionar la mezcla durante 15 min a temperatura ambiente y luego se adicionoacute 0150
mL de reactivo de Folin-Ciocalteu diluido 13 con agua destilada inmediatamente antes
de usar Se dejoacute reposar durante 45 min y se leyoacute la absorbancia a 660 nm
413 Reaccioacuten de conjugacioacuten biotina-antiacutegeno
Previo a la reaccioacuten de conjugacioacuten el antiacutegeno P35B purificado se llevoacute a una
concentracioacuten final de 2 mg mL-1
(como miacutenimo) en solucioacuten tampoacuten carbonato de
sodio 01 M (pH 85) usando las membranas de poro controlado Amicon Ultra-4
(Millipore Co) seguacuten las instrucciones del proveedor Se disolvieron 20 mg del eacutester
biotinil-n-hidroxisuccinimida (BNHS) en 590 microL de DMSO e inmediatamente despueacutes
se mezclaron 80 microL de esta solucioacuten con 800 microL de solucioacuten de Ang
Materiales y Meacutetodos
45
Al antiacutegeno P22C purificado se lo llevoacute a una concentracioacuten final de 20 mg mL-1
(como miacutenimo) en solucioacuten tampoacuten carbonato de sodio 01 M (pH 85) usando las
membranas de poro controlado mencionadas Se disolvieron 25 mg BNHS en 590 microL
de DMSO e inmediatamente despueacutes se mezclaron 120 microL de esta solucioacuten con 100
mL de solucioacuten de Ang Se incuboacute 4 h a temperatura ambiente con agitacioacuten suave Se
eliminaron los restos de eacutester hidrolizado y se cambioacute la solucioacuten tampoacuten carbonato por
PBS 1 X pH 74 haciendo lavados reiterados y reteniendo el Ang en las membranas de
poro controlado
414 Revelado cromogeacutenico de la reaccioacuten de conjugacioacuten
El antiacutegeno marcado con biotina respectivo fue retenido en membrana de
nitrocelulosa sembrando 1 L del mismo sobre la membrana Se procedioacute a bloquear
los sitios activos de la membrana con leche descremada disuelta al 5 mv en PBS pH
74 durante 1 h Se realizaron 3 lavados con PBS pH 74 de 1 min cada uno Se incuboacute
la membrana con la enzima peroxidasa de raacutebano picante ligada a streptavidina (HRP-
EAV) disuelta en PBS pH 74-leche descremada al 1 mv Posteriormente se
realizaron 3 lavados con PBS pH 74 de 1 min cada uno Finalmente se reveloacute la
presencia de la enzima HRP con el reactivo de color recieacuten preparado seguacuten 5 mg de
33-diaminobenzidina tetrahidrocloruro (DAB) se disolvieron en 500 microL de DMSO y se
llevoacute a 100 mL de volumen final con PBS pH 74 A esta solucioacuten se le agregaron 100
microL de H2O2 10 voluacutemenes inmediatamente previo a su utilizacioacuten
415 Mediciones espectrofotomeacutetricas
Para las medidas de absorbancia (Abs) a longitudes de onda especiacuteficas o la
realizacioacuten de espectros de absorcioacuten ultravioleta-visible se utilizoacute el espectrofotoacutemetro
Beckman DU 640 Como celda se utilizoacute una cubeta de cuarzo de 1 cm de paso oacuteptico
416 Ensayos de inmunoabsorcioacuten ligados a enzima con deteccioacuten fotomeacutetrica
Como soporte soacutelido se utilizaron microplacas Microlon 600 high binding Greiner
Bio One provistas por GBO Argentina Para las lecturas de Abs se utilizoacute un lector de
microplacas PowerWave XS (BioTek) o alternativamente se utilizoacute el lector ELx808
Absorbance Microplate Reader (BioTek) Los ensayos preliminares se detallan en la
secioacuten 6 Experimentos Auxiliares
Materiales y Meacutetodos
46
4161 Esquema A
Sobre las microplacas de ELISA Microlon 600 high binding Greiner Bio One se
depositaron 100 microL de anticuerpo de captura (IgG de conejo anti IgM humana) provisto
por Dakko diluido 11000 en PBS pH 74 Se incubaron 48 h a 37 degC Luego se
realizaron 3 lavados con PBS Tween 20 al 005 (PBS-T) de 1 min cada uno Se
procedioacute al bloqueo de los sitios libres de la placa con 100 microL leche descremada
comercial (marca Milkaut) al 1 mv en PBS durante 30 min a 37 degC y se realizaron 3
lavados con PBS-T de 1 min cada uno Luego se incubaron con suero humano (muestra
incoacutegnita) 1100 en PBS con leche descremada al 1 mv durante 1 h a 37 degC y se
realizaron 3 lavados con PBS-T de 1 min cada uno Se realizaron distintas incubaciones
con los antiacutegenos P22C y P35B conjugados a biotina Luego de tres lavados con PBS-T
se incubaron con la enzima HRP-EAV en una dilucioacuten 12000 durante 1 h a 37degC
Posteriormente se realizaron 3 lavados con PBS-T para finalmente revelar utilizando
50 microL de solucioacuten comercial de 33prime55prime-tetrametilbenzidina (TMB) sustrato de la
enzima HRP que da coloracioacuten azul en el medio de reaccioacuten pasando a amarillo y
permaneciendo estable el color cuando se detiene la reaccioacuten acidificando el medio con
H2SO4 05 M
4162 Esquema B
Sobre las microplacas de ELISA comerciales se depositaron 500 ng de Ang P22C
disueltos en 100 L de solucioacuten carbonato pH 96 incubando 1 h a 37 degC Se realizaron
3 lavados con PBS Tween 20 al 005 (PBS-T) de 1 min cada uno Se bloquearon los
sitios libres de la placa con 100 microL leche descremada 1 mv en PBS durante 30 min a
37 degC Luego se realizaron 3 lavados con PBS-T de 1 min cada uno Se incubaron con
suero humano (muestra incoacutegnita) 1100 en PBS con leche descremada al 1 mv
durante 1 h a 37 degC Luego se realizaron 3 lavados con PBS-T de 1 min cada uno Se
realizoacute una incubacioacuten con el antiacutegeno P22C conjugado a biotina Luego de tres lavados
con PBS-T se incubaron con la enzima HRP-EAV en una dilucioacuten 12000 durante 1 h
a 37degC Posteriormente se realizaron 3 lavados con PBS-T Finalmente se reveloacute con
50 microL de solucioacuten comercial de TMB y se detuvo la reaccioacuten acidificando el medio con
50 microL H2SO4 05 M
Materiales y Meacutetodos
47
417 Reaccioacuten de color para determinacioacuten cuantitativa de glicerol por meacutetodo
espectrofotomeacutetrico
Se llevaron a cabo dos tipos de ensayos diferentes Por un lado se utilizoacute el meacutetodo
enzimaacutetico con un equipo comercial provisto por Wiener Lab TG GPO PAP AA (liacutenea
liacutequida) ensayando muestras de aliacutecuotas del medio Middlebrook 7H9 suplementadas
con glicerol en lugar de suero humano Por otro lado se realizaron reacciones de color
que se llevaron a cabo en un volumen final de 100 mL que resultoacute de la mezcla de 950
microL de reactivo A y 50 microL de muestra la cual consistioacute en medio de cultivo de
micobacterias Middlebrook 7H9 suplementado con distintas cantidades de glicerol En
los blancos de reaccioacuten se realizoacute un agregado de medio de cultivo Middlebrook 7H9
sin glicerol de igual volumen que en los otros dos casos para mantener las mismas
condiciones que en las otras reacciones
El reactivo A se preparoacute inmediatamente antes de ser usado mezclando los
reactivos necesarios seguacuten se indica en la siguiente tabla
Tabla 44 Mezcla de reactivos necesaria para preparar 950 microL de reactivo A (necesario para 1 reaccioacuten)
Los voluacutemenes necesarios para un nuacutemero n de reacciones se obtuvieron multiplicando por n
los voluacutemenes de esta tabla
Reactivo Volumen para una
reaccioacuten ( L)
Solucioacuten Tampoacuten carbonato
0125 M pH 105 815
K3Fe(NC)6 10-2
M 100
(NH4)2SO4 10 M 10
NAD+ 10
-2 M 25
Enzima GlDH 2 mg mL-1
1
Las reacciones se llevaron a cabo en tubos de Khan cerrados con parafilm para
evitar evaporacioacuten de liacutequido y en bantildeo termostatizado a 37 ordmC La lectura de
absorbancia se realizoacute cuando se cumplioacute una o dos h de iniciada la reaccioacuten seguacuten la
necesidad del ensayo Los experimentos se realizaron por triplicado
418 Determinacioacuten de glicerol remanente en cultivos de micobacterias
Procedimiento seguido a medios de cultivos Middlebrook 7H9 se los suplementoacute
con glicerol a concentracioacuten 0025 mv y se cultivaron cantidades iguales de ceacutelulas
de M smegmatis algunos medios se conservaron sin adicionar micobacterias en
Materiales y Meacutetodos
48
condiciones de esterilidad Se tomaron aliacutecuotas de estos cultivos a distintos tiempos Se
centrifugaron a 12500 rpm durante 5 min para separar las ceacutelulas del sobrenadante y a
estos uacuteltimos se los congeloacute a -20ordmC para su posterior anaacutelisis
Se realizaron determinaciones de glicerol con la teacutecnica fotomeacutetrica propuesta Se
realizaron reacciones de color por triplicado a las muestras e independientemente se
hizo un blanco de reaccioacuten y 2 testigos cuyas concentraciones fueron de 001 y 004
mv
4181 Determinacioacuten de glicerol remanente en cultivos de micobacterias con y sin
fago D29 y ensayos controles respectivos
Procedimiento seguido a medios de cultivos Middlebrook 7H9 se los suplementoacute
con glicerol a 0025 mv y se cultivaron cantidades iguales de a) ceacutelulas de M
smegmatis b) ceacutelulas de M smegmatis infectadas con fago D29 c) fagos D29 d)
algunos medios se conservaron sin adicionar micobacterias ni fagos en condiciones de
esterilidad Se tomaron aliacutecuotas de estos medios inmediatamente despueacutes de realizados
los inoacuteculos (tiempo 0) a las 2 h y a las 4 h de iniciados los cultivos Se centrifugaron a
12500 rpm durante 5 min para separar las ceacutelulas del sobrenadante y a estos uacuteltimos se
los congeloacute a -20 ordmC para su posterior anaacutelisis A estas muestras se les realizaron
determinaciones del glicerol remanente con la teacutecnica fotomeacutetrica propuesta Se
realizaron reacciones de color por triplicado a cada muestra utilizaacutendose como testigos
los medios en condiciones de esterilidad
419 Instrumental electroquiacutemico
Para los experimentos electroquiacutemicos se utilizoacute un analizador electroquiacutemico
Autolab (Eco Chemie) con amplificador electromeacutetrico diferencial PGSTAT 30 Se
utilizoacute una celda convencional de tres electrodos
4191 Electrodos de trabajo
41911 Bioelectrodo para evaluacioacuten de infeccioacuten toxoplaacutesmica
Se utilizaron electrodos macizos tipo ―banderita de oro de aproximadamente 1
cm2 de aacuterea geomeacutetrica El ensamblado se realizoacute de acuerdo al siguiente protocolo los
electrodos limpios se sumergieron durante 14 h en una solucioacuten de aacutecido 3 mercapto
propanosulfoacutenico preparada inmediatamente antes de usar disolviendo 22 mg en 12 mL
de H2SO4 0021 M (desoxigenenada con burbujeo de N2) en atmoacutesfera de N2 a
Materiales y Meacutetodos
49
temperatura ambiente (TA) Luego de enjuagar con agua destilada se sumergieron en
una solucioacuten de Ang recombinante P22C 02 mg mL-1
(PBS pH 74) durante 1 h a TA
Luego de un lavado con PBS se bloquearon los sitios libres no modificados con el Ang
sumergiendo los electrodos en solucioacuten de caseinato de sodio 01 mg mL-1
(preparada
inmediatamente antes de usar) 30 min a 37 degC Los electrodos se lavaron con PBS
Tween-20 05 mv y se sumergieron en una dilucioacuten 1200 de suero humano (muestra
incoacutegnita) en PBS durante 30 min a 37 degC Se lavaron con PBS Tween-20 05 y
finalmente se incubaron en una dilucioacuten 11500 de anticuerpos de conejo anti IgGh-
HRP Los biosensores asiacute ensamblados se guardaron en PBS pH 74 a 4degC hasta su
utilizacioacuten
41912 Electrodos para cuantificacioacuten de glicerol
Como electrodos de trabajo se utilizaron oro platino plata carbono viacutetreo pasta
de carbono (viacutetreo y grafito) y pastas de carbono modificadas
Los electrodos metaacutelicos y de carbono viacutetreo fueron provistos por Metrohm
(numero de cataacutelogo 612043XX) consistentes en barras del material de 3 mm de
diaacutemetro embutidas en un armazoacuten aislante
Las pastas de carbono utilizadas se enumeran a continuacioacuten indicando los
porcentajes en masa de cada componente respectivamente
a) Pasta A carbono viacutetreo aceite mineral (7030)
b) Pasta B carbono viacutetreo aceite mineral GLDH (68302)
c) Pasta C carbono viacutetreo aceite mineral GLDH MWCNT (5830210)
Las pastas se prepararon mezclando los componentes en mortero de aacutegata durante
15 a 20 min hasta obtener una mezcla homogeacutenea a la vista Cuando se utilizoacute enzima
GlDH se dispersoacute en aceite mineral primero y luego se mezcloacute con el polvo de carbono
viacutetreo Cuando se utilizaron NTC (MWCNT nanotubos de carbono de pared multiple)
se dispersoacute primero la enzima luego los NTC y finalmente el polvo de carbono viacutetreo
Asiacute preparadas se empaquetaron firmemente en un armazoacuten de tefloacuten (diaacutemetro 3 mm)
y se friccionoacute firmemente sobre un papel liso apoyado en un vidrio para eliminar el
exceso de pasta y pulir la superficie expuesta del electrodo
Cuando se utilizaron electrodos de pasta de carbono con las pastas B se realizoacute una
cubierta de poli-(o-fenilendiamino) que inmovilizara la enzima Una vez empaquetada
la pasta en el armazoacuten de Teflon se sumergioacute en una solucioacuten de o-fenilendiamino 5 x
10-4
M en solucioacuten tampoacuten carbonato 01 M (pH 10) Se burbujeoacute N2(g) para eliminar el
Materiales y Meacutetodos
50
O2(g) de la solucioacuten y dejar una atmoacutesfera libre de O2(g) Para electropolimerizar se
realizoacute un barrido de potencial ciacuteclico desde -051 V a + 069 V a 50 mV s-1
Finalmente se enjuagoacute con solucioacuten amortiguadora carbonato 01 M (pH 10)
4192 Limpieza de electrodos
Los electrodos de oro macizo policristalino tipo ―banderita se sumergieron en
solucioacuten ―pirantildea (H2SO4 concentrado peroacutexido de hidroacutegeno 30 en una relacioacuten 31)
durante 30 min a 80ordmC Luego se los enjuagoacute con abundante agua destilada En caso de
limpieza maacutes rigurosa previo al tratamiento con solucioacuten ―pirantildea se los colocoacute a la
llama directa hasta rojo vivo (Ribone y col 2006)
Los electrodos de oro policristalino macizo insertos en una barra de tefloacuten (Tips de
Au) se limpiaron siguiendo el siguiente protocolo desengrase frotaacutendolo sobre tela de
pulido humedecida con DMSO Lavado con abundante agua destilada Pulido con
suspensioacuten acuosa de aluacutemina (diaacutemetro promedio de partiacutecula 03 microm) sobre tela de
pulido Lavado con abundante agua destilada Sonicado durante 5 min en sonicador
Cole-Palmer 8890 Luego de un enjuague con abundante agua destilada se sumergieron
en HNO3 9 M durante 1 min a 60 ordmC Finalmente se lavaron con abundante agua
destilada
4193 Determinacioacuten del aacuterea real del electrodo
Para la determinacioacuten del aacuterea real de los electrodos metaacutelicos se utilizaron dos
metodologiacuteas in-situ
41931 Medicioacuten de la adsorcioacuten de oxiacutegeno
Se asume que el oxiacutegeno se quimioadsorbe en una capa monoatoacutemica antes de la
evolucioacuten de 02 con una correspondencia de uno-a-uno con los aacutetomos metaacutelicos de la
superficie El valor de la carga asociada a la reduccioacuten de la monocapa de oacutexido en
superficies de oro policristalino que se utilizoacute fue de 390plusmn10 microC cm-2
(Trasatti amp Petrii
1991)
Se realizaron VCs en H2SO4 a 50 mVs-1
y se midioacute la carga correspondiente al pico
de desorcioacuten de O2 sobre la superficie del electrodo y este valor se dividioacute por el valor
de referencia
Materiales y Meacutetodos
51
41932 Voltametriacutea ciacuteclica de ferricianuro de potasio
Registrando VCs a varias velocidades de barrido de potencial conociendo el
coeficiente de difusioacuten del ioacuten su concentracioacuten en la celda y midiendo la corriente de
pico a cada velocidad de barrido es posible determinar el aacuterea real del electrodo de
trabajo utilizando la ecuacioacuten de Randles Sevcik ec[216] (Belluzo y col 2008)
[216]
siendo la temperatura 25 degC y donde A estaacute en cm2 D en cm
2 s
-1 C en mol cm
-3 y
en V s-1
420 Medidas electroquiacutemicas
Todos los potenciales fueron medidos y referidos al electrodo de AgAgCl (KCl
300 M) que se utilizoacute como electrodo de referencia Como contraelectrodos se
utilizaron dos tipos uno de oro de superficie mayor a 5 veces la superficie del electrodo
de trabajo cuando se utilizaron electrodos metaacutelicos como electrodos de trabajo y una
barra de carbono viacutetreo cuando se utilizaron electrodos de pasta de C como electrodos
de trabajo En todos los casos las soluciones se burbujearon con N2 durante 1 min para
desplazar el O2 disuelto y se mantuvieron en atmoacutesfera de N2 durante las
determinaciones
Las voltametriacuteas ciacuteclicas se realizaron equilibrando el sistema al potencial de inicio
Para muestras conteniendo glicerol y utilizando electrodos de oro se realizaron
barridos desde -030 V hasta 060 V a distintas velocidades de barrido Cuando se
utilizaron electrodos de platino se realizaron barridos desde -080 V hasta 020 V a
distintas velocidades de barrido Cuando se utilizaron electrodos de pasta de carbono o
pasta de carbono modificada se realizaron barridos de potencial desde -040 V hasta
100 V Las corrientes que se informan son las intensidades de pico obtenidas trazando
una liacutenea de base recta desde los extremos del pico de corriente utilizando algoritmos
propios del programa General Purpose Electrochemical System (GPES)
4201 Mediciones amperomeacutetricas para evaluacioacuten de infeccioacuten toxoplaacutesmica
Las amperometriacuteas realizadas con el bioelectrodo para evaluacioacuten de infeccioacuten
toxoplaacutesmica se llevaron adelante en solucioacuten PBS (pH 74) FeMe 3 mM El potencial
de trabajo fue de 008V Se registroacute la corriente de base hasta que se estabilizoacute y una
Materiales y Meacutetodos
52
vez estable (usualmente a los 250 s) se adicionoacute el sustrato de la enzima (H2O2)
concentracioacuten en celda 18 mM y se registroacute la corriente final (500 s) La corriente
cataliacutetica se evaluoacute como la diferencia entre la corriente final y la de base
4202 Mediciones amperomeacutetricas para cuantificacioacuten de glicerol
42021 Amperometriacuteas con tip de oro
Las amperometriacuteas con tip de oro se realizaron en medio NaOH 01 M a potencial
constante (01 V) y a temperatura ambiente (20 a 25 ordmC) El sistema se preacondicionoacute
aplicando un potencial de 05 V se dejoacute equilibrar y se registroacute la corriente de base en
esas condiciones (generalmente a los 50 s) Luego se adicionoacute la muestra de forma de
lograr la concentracioacuten final de analito deseada La corriente fue registrada y se midioacute
una vez que se estabilizoacute (aproximadamente a los 400 s) La corriente cataliacutetica se
evaluoacute como la diferencia entre la corriente final y la de base
42022 Amperometriacuteas con electrodos de pasta de C
Las amperometriacuteas donde se utilizoacute la pasta de carbono B se realizaron en solucioacuten
tampoacuten carbonatobicarbonato de potasio 100 mM (NH4)2SO4 25 mM K3Fe(CN)6
1mM NAD+ 05 mM pH 105 Se trabajoacute a potencial constante 038 V y a temperatura
ambiente (25 ordmC) El sistema se preacondicionoacute aplicando el potencial de trabajo
correspondiente durante 50 s una vez iniciada la lectura de corriente se dejoacute equilibrar
y se registroacute la corriente de base en esas condiciones usualmente a los 300 s Luego se
adicionoacute la cantidad necesaria de muestra de forma de lograr la concentracioacuten final de
analito deseada La corriente fue registrada y se midioacute una vez que se estabilizoacute
(aproximadamente a los 500 s) La corriente cataliacutetica se evaluoacute como la diferencia
entre la corriente final y la de base
Las amperometriacuteas donde se utilizoacute la pasta de carbono C se realizaron en solucioacuten
tampoacuten carbonatobicarbonato de potasio 100 mM (NH4)2SO4 25 mM NAD+ 05 mM
pH 105 a potencial constante 051 V y a 25 ordmC El sistema se preacondicionoacute aplicando
el potencial de trabajo correspondiente durante 50 s una vez iniciada la lectura de
corriente se dejoacute equilibrar y se registroacute la corriente de base en esas condiciones
usualmente a los 300 s Luego se adicionoacute la cantidad necesaria de muestra de forma
de lograr la concentracioacuten final de analito deseada La corriente fue registrada y se
midioacute una vez que se estabilizoacute (aproximadamente a los 200 s del agregado) La
corriente cataliacutetica se evaluoacute como la diferencia entre la corriente final y la de base
Materiales y Meacutetodos
53
Cuando el tiempo de equilibrado no fue suficiente para que la corriente de base se
estabilizara se recurrioacute a realizar correcciones de liacutenea de base A tal fin se llevaron a
cero las corrientes de base aplicando los algoritmos que ofrece el programa GPES
versioacuten 49 provisto por Eco Chemie BV
4203 Voltamperometriacutea de onda cuadrada
Los experimentos de voltamperometriacutea de onda cuadrada se realizaron en solucioacuten
tampoacuten carbonatobicarbonato de potasio 100 mM (NH4)2SO4 25 mM NAD+ 05 mM
pH 105 y a 25 ordmC Los valores de escaloacuten de potencial utilizados fueron de 5 y 10 mV
Los valores de amplitud de pulso fueron de 25 y 50 mV Las frecuencias utilizadas
fueron de 8 10 20 30 40 60 y 70 Hz Especiacuteficamente se evitoacute utilizar 50 Hz
(frecuencia de la tensioacuten alterna de la liacutenea de alimentacioacuten) Los barridos de potencial
se realizaron desde -03 V hasta 10 V
Una vez registrado el blanco con medio Middlebrook 7H9 y se hicieron dos
agregados secuenciales de solucioacuten estaacutendar de glicerol 100 M obtenieacutendose una
concentracioacuten final de 25 y 50 mM respectivamente en la celda
421 Funcionalizacioacuten de nanotubos de carbono
Previo a la utilizacioacuten de los nanotubos de carbono se procedioacute a funcionalizarlos
realizando una carboxilacioacuten oxidativa Se siguioacute una comunicacioacuten personal del Dr
Joseacute Manuel Pingarroacuten del Departamento de Quiacutemica Analiacutetica Facultad de Ciencias
Quiacutemicas Universidad Complutense de Madrid A saber se pesaron aproximadamente
2 mg de MWCNT y se dispersaron en 2 mL en una mezcla de aacutecido sulfuacuterico aacutecido
niacutetrico 31 con agitacioacuten ultrasoacutenica durante 5 h Luego se diluyoacute la mezcla al 110
vertieacutendola suavemente en agua destilada enfriada en bantildeo de hielo para evitar
proyecciones Se eliminoacute el exceso de aacutecido centrifugando a 14000 rpm durante 30
min descartando el sobrenadante y dispersando el precipitado en agua destilada con
agitacioacuten ultrasoacutenica durante 30 min Esta operatoria se repitioacute 9 veces hasta que la
dispersioacuten de MWCNT en agua tuvo un pH cercano a la neutralidad (70 05) Los
MWCNT se secaron en desecador con sulfato de cobre anhidro y aplicando vaciacuteo al
sistema
Materiales y Meacutetodos
54
422 Programas de prediccioacuten de epiacutetopes lineales reconocidos por ceacutelulas B
4221 Base de datos de proteiacutenas
Se creo manualmente una base de datos para mejorar la exactitud de los resultados
Las proteiacutenas fueron seleccionadas de la base de datos de BciPep (Saha y col 2005)
HIV Molecular Immunology Database (disponible en httpwwwhivlanlgovcontent
immunologyindexhtml) o tomadas de la literatura VP1 (Wang y col 2011) proteiacutena
N (El-Manzalawy y col 2008) y Gliadina (Sweredoski amp Baldi 2009) El criterio de
seleccioacuten fue la confirmacioacuten experimental previa mediante ensayos de puntos de
inmunoadsorcioacuten ligado a enzima (ELIspot) o mediante el uso de paneles
multiespeciacuteficos de anticuerpos monoclonales que reconocen epiacutetopes lineales (Shin y
col 2005) Como resultado se seleccionaron 11 proteiacutenas de las que se obtuvieron un
total de 65 epiacutetopes lineales reconocidos por ceacutelulas linfociacuteticas tipo B
4222 Programas utilizados
Se utilizaron algunos programas para predecir los epiacutetopes lineales disponibles en
liacutenea gratuitamente Todos estos programas utilizan algoritmos matemaacuteticos con escalas
de propensioacuten yo datos experimentales de antigenicidad A menos que se indique lo
contrario cada programa se ejecutoacute utilizando los paraacutemetros por defecto Los
programas utilizados fueron AAPPred (Davydov amp Tonevitskii 2009) ABCpred
(Saha S amp Raghava 2006) BcePred (Saha y col 2005) BepiPred (Larsen y col
2006) y Antigenic (Kolaskar amp Tongaonkar 1990)
Los programas de prediccioacuten definen el grado de antigenicidad por medio de una
puntuacioacuten (score) en algunos casos para cada epiacutetope y en otros para cada residuo
amino aciacutedico En este uacuteltimo se puede definir una regioacuten antigeacutenica cuando varios
residuos con alta puntuacioacuten son adyacentes en la estructura primaria Por otra parte el
nuacutemero de epiacutetopes o regiones antigeacutenicas que los programas de prediccioacuten encuentran
depende de un umbral que es configurado por el usuario
423 Anaacutelisis de Datos
Los liacutemites de deteccioacuten (LD) y cuantificacioacuten (LC) se calcularon siguiendo las
sugerencias de Armbruster amp Pry (Armbruster amp Pry 2008) modificando la cantidad
de replicados utilizados para la obtencioacuten de los desviacuteos estaacutendar habieacutendose utilizado
10 reacuteplicas El caacutelculo del LD se realizoacute a partir del valor de corriente del blanco IB maacutes
Materiales y Meacutetodos
55
33 veces el valor del desviacuteo estaacutendar de la corriente leiacuteda (DSn1) de la muestra con
menor concentracioacuten de glicerol medida seguacuten
[41]
El valor del LC se calculoacute como
[42]
siendo m la pendiente de la curva de calibracioacuten
La capacidad de discriminacioacuten entre dos concentraciones diferentes de los
meacutetodos propuestos se evaluoacute como el error asociado a la estimacioacuten de la
concentracioacuten Ec calculada como
Nm
EE r
c
1
[43]
siendo Er el error relativo
424 Caacutelculos estadiacutesticos y disentildeo experimental
Para los caacutelculos estadiacutesticos se utilizaron los programas SigmaStat 32 (Sigma Plot
90 u 110) o Microcal Origin 80 en forma indistinta Para los caacutelculos de EJCR (regioacuten
eliacuteptica de confianza conjunta) se utilizoacute el programa Matlab con rutinas disentildeadas ―ad-
hoc
Resultados y Discusioacuten
Resultados y Discusioacuten
57
5 Resultados y discusioacuten
Para la obtencioacuten de antiacutegenos especiacuteficos de fase aguda de la toxoplasmosis se
comenzoacute seleccionando un conjunto de proteiacutenas denominadas P30 P22 y P35
mencionadas en la literatura como antiacutegenos de fase aguda (Harning y col 1996
Parmley y col 2000 Lu y col 2006) Sobre la base de estos estudios iniciales se
intentoacute identificar por medio de caacutelculos teoacutericos que regiones de estas proteiacutenas
conteniacutean mayor nuacutemero de epiacutetopes De este modo en la etapa siguiente se procurariacutea
expresarlos en forma soluble para su posterior utilizacioacuten en inmunoensayos Al
momento de seleccionar un programa de todos los disponibles ―on line verificamos
que eacutestos no informaban el valor predictivo positivo VPP Por ello se inicioacute un trabajo
de identificacioacuten del programa que predijera maacutes fidedignamente los epiacutetopes La
buacutesqueda se realizoacute comparando los resultados arrojados por 5 programas a los que se
solicitoacute prediccioacuten de epiacutetopes pertenecientes a 11 proteiacutenas cuyos epiacutetopes lineales
habiacutean sido perfectamente establecidos experimentalmente (Costa y col 2013) Se
analizoacute cuaacutel de ellos presentaba el mayor VPP (ver punto 61 seccioacuten Experimentos
Auxiliares) y para predecir epiacutetopes lineales se trabajoacute con este programa que resultoacute
ser AAPred
El anaacutelisis de los Ang seleccionados permitioacute identificar en P35 dos regiones que
concentraban los determinantes antigeacutenicos a las cuales se las denominoacute P35A y P35B
Los Ang P30 y P22 presentaban los determinantes antigeacutenicos distribuidos
homogeacuteneamente por lo tanto al momento de disentildear su clonado se tuvieron en cuenta
criterios que faciliten la expresioacuten y solubilidad mas allaacute de la antigenicidad
51 Evaluacioacuten de antiacutegenos recombinantes de T gondii
511 Antiacutegeno P30
El antiacutegeno de superficie 1 de T gondii SAG1 tambieacuten denominado proteiacutena P30
se ha identificado como antiacutegeno de fase aguda (Harning y col 1996) por lo cual se
procuroacute obtenerlo en forma soluble Sobre la base de ensayos previos realizados en el
LTI se continuoacute con la obtencioacuten y purificacioacuten de dos porciones del antiacutegeno P30
denominadas P30L y P30C (seccioacuten 410 Materiales y Meacutetodos) Luego de la cosecha
y lisis de las bacterias se separaron las fracciones soluble e insoluble del extracto se
tomaron aliacutecuotas de ambas y se analizaron por SDS-PAGE Los Angs buscados soacutelo se
Resultados y Discusioacuten
58
obtuvieron como proteiacutenas precipitadas en cuerpos de inclusioacuten en la fraccioacuten insoluble
Por ello se discontinuoacute el trabajo con las fracciones de P30
512 Antiacutegeno P22
El antiacutegeno de superficie 2 o antiacutegeno P22 de T gondii (Gen Bank ndeg M33572) ha
sido tambieacuten identificado como antiacutegeno de fase aguda (Parmley y col 1992 Lau amp
Fong 2006) En el presente trabajo se procuroacute amplificar la regioacuten del gen que
permitiese expresar la proteiacutena recombinante en forma soluble El producto de
amplificacioacuten se resolvioacute en un gel de agarosa tentildeido con bromuro de etidio como se
observa en la Fig 51
Figura 51 Gel de agarosa tentildeido con bromuro de etidio en transiluminador UV En PCR1 se observan los
productos de amplificacioacuten obtenidos utilizando cebadores especiacuteficos para la regioacuten P22C donde se
sentildeala el fragmento de tamantildeo esperado Control (-) muestra la misma mezcla de reaccioacuten pero sin ADN
molde MPM indica el marcador de peso molecular y el tamantildeo de los fragmentos se indica sobre la
derecha
Se aisloacute y purificoacute el fragmento de intereacutes utilizando un equipo comercial detallado
en el punto 48 seccioacuten Materiales y Meacutetodos En un paso posterior se ligoacute al vector
pET32a y con la construccioacuten resultante se transformaron ceacutelulas competentes de E
coli Las ceacutelulas transformadas se seleccionaron crecieacutendolas en medio LB con
ampicilina Se verificaron las condiciones para la expresioacuten en forma soluble (punto
410 seccioacuten Materiales y Meacutetodos) encontraacutendose que las condiciones oacuteptimas eran
01 mM IPTG y 12 h de incubacioacuten con agitacioacuten vigorosa
Para la induccioacuten preparativa se siguioacute el protocolo detallado en la seccioacuten 410 de
Materiales y Meacutetodos La Fig 52 muestra la fotografiacutea de un gel de poliacrilamida
luego de la tincioacuten donde se analizaron aliacutecuotas de todos los extractos obtenidos en los
distintos pasos separativos de la proteiacutena P22C
Resultados y Discusioacuten
59
Figura 52 Gel de poliacrilamida tentildeido con azul brillante de Coomassie En cada calle se sembraron 1
microL de muestra EC indica el extracto crudo P1 muestra la fraccioacuten insoluble del lisado celular P2 la
fraccioacuten insoluble luego del congelamiento-descongelamiento del extracto centrifugado FT muestra el
extracto que pasoacute por la columna Con L se indican las calles con las fracciones de lavados sucesivos con
tampoacuten imidazol 0 mM 20 mM 50 mM y 100 mM respectivamente E muestra las fracciones de
elucioacuten con solucioacuten imidazol 250 mM Las fracciones de elucioacuten recolectadas fueron de 15 mL cada
una
513 Antiacutegeno P35
El antiacutegeno de superficie P35 de T gondii (Gen Bank ndeg AF01275) se ha
identificado como antiacutegeno de fase aguda y distintas porciones del mismo presentan
diferentes desempentildeos en su uso diagnoacutestico (Lu y col 2006) Sobre la base de
ensayos previos realizados en el LTI se continuoacute con la obtencioacuten y purificacioacuten de las
dos porciones del antiacutegeno P35 denominadas P35A y P35B
Se ensayoacute la expresioacuten del antiacutegeno P35A (punto 49 seccioacuten Materiales y
meacutetodos) y soacutelo se obtuvo como cuerpos de inclusioacuten en la fraccioacuten insoluble Si bien
fue posible disolver las proteiacutenas recombinantes en urea 8 M al dializar volviacutean a
precipitar
El antiacutegeno P35B se pudo obtener en forma soluble y las condiciones oacuteptimas
encontradas para la induccioacuten del mismo fueron IPTG 1 mM y 4 h con agitacioacuten
vigorosa La Fig 53 muestra una imagen del gel de poliacrilamida luego de la corrida
electroforeacutetica y su tincioacuten Se observoacute que una banda de la fraccioacuten soluble estaba
sobreexpresada en los cultivos inducidos
Resultados y Discusioacuten
60
Figura 53 Gel de poliacrilamida al 12 en condiciones desnaturalizantes Se muestra lo obtenido para
aliacutecuotas de dos cultivos no inducidos 1 y 2 y dos inducidos 3 y 4 Con P se designan las fracciones
insolubles en la solucioacuten de lisis y con SN las fracciones solubles Las bandas que se observan del MPM
corresponden a fragmentos de 19445 KDa 28829 KDa 36545 KDa 49491 KDa 80664 KDa
103035 KDa Se indica la banda sobreexpresada de tamantildeo esperado
Para la induccioacuten preparativa del antiacutegeno P35B se siguioacute el protocolo descripto en
el punto 410 seccioacuten Materiales y Meacutetodos En la Fig 54 se muestra un gel de
poliacrilamida luego de la tincioacuten donde se analizaron aliacutecuotas de todos los extractos
obtenidos en los distintos pasos separativos
Figura 54 Gel de poliacrilamida tentildeido con azul brillante de Coomassie En cada calle se sembraron 7
microL de muestra P1 fraccioacuten insoluble del lisado celular P2 fraccioacuten insoluble luego del congelamiento-
descongelamiento del extracto centrifugado FT muestra el extracto que pasoacute por columna L calles con
las fracciones de lavados sucesivos con tampoacuten imidazol 20 mM 50 mM y 100 mM respectivamente E
fracciones de elucioacuten con solucioacuten imidazol 250 mM Las fracciones recolectadas fueron de 15 mL cada
una
En consecuencia se continuoacute el trabajo con P35B y se descartoacute transitoriamente la
utilizacioacuten del Ang P35A
52 Marcado de antiacutegenos recombinantes de T gondii
Para los ensayos tipo ELISA de captura especiacuteficos para IgM se propuso utilizar
como sistema revelador la enzima HRP-EAV que se une especiacuteficamente a biotina En
consecuencia se procedioacute a marcar los Ang solubles obtenidos con biotina
P35B
P1 P2 P3 P4 MPM
Inducido No Inducido
SN1
Inducido No Inducido
SN2 SN3 SN4
Resultados y Discusioacuten
61
La reaccioacuten de conjugacioacuten se realizoacute siguiendo el protocolo mencionado en el
punto 413 seccioacuten Materiales y Meacutetodos La conjugacioacuten se evidencioacute con la reaccioacuten
de color indicada en el inciso 413 En la Fig 55 se muestra la membrana de
nitrocelulosa sobre la que se fijaron las proteiacutenas P22 y P35B luego del revelado
cromogeacutenico con la enzima HRP conjugada a streptavidina Las reacciones de
conjugacioacuten se llevaron adelante por separado
Figura 55 Membranas de nitrocelulosa evidenciando las proteiacutenas P35B conjugada (izquierda) y P22C
conjugada (derecha)
53 Inmunoensayos
Estudios preliminares (ver punto 62 seccioacuten Experimentos Auxiliares) con los
antiacutegenos recombinantes obtenidos permitieron verificar por ELISA indirecto que sueros
confirmados positivos arrojaban resultados positivos mientras que los sueros negativos
daban el ensayo negativo Se procedioacute entonces a evaluar la capacidad de los antiacutegenos
obtenidos para discriminar sueros de pacientes con infeccioacuten aguda de sueros provenientes
de pacientes con infeccioacuten croacutenica
531 Inmunoensayos con deteccioacuten fotomeacutetrica
Como se anticipoacute en la introduccioacuten se realizaron ELISA siguiendo dos
alternativas de captura En la primera alternativa que denominamos A se procuroacute
capturar selectivamente la maacutexima cantidad de Ac del isotipo que se deseaba detectar
(IgMh) adsorbiendo sobre la placa un anticuerpo ―ad-hoc (Ac-a-IgMh) En la segunda
alternativa que denominamos B se buscoacute capturar con el Ang recombinante la maacutexima
cantidad de Ac especiacuteficos independientemente del isotipo que se tratara En el paso
siguiente del esquema B se tomoacute ventaja de la mayor valencia de las IgM respecto de
las IgG para el revelado
5311 Evaluacioacuten del esquema A
Sobre placas de ELISA se capturaron los Acs IgMh revelaacutendose la presencia de los
especiacuteficos con los antiacutegenos obtenidos marcados con biotina y uniendo a estos uacuteltimos la
enzima HRP-EAV En los ensayos preliminares (ver punto 622 seccioacuten Experimentos
Auxiliares) se identificoacute la cantidad de antiacutegeno marcado y las diluciones de HRP-EAV
oacuteptimas a utilizar para revelar la presencia de IgM especiacutefica capturada En la Tabla 51 se
Resultados y Discusioacuten
62
muestran los valores de absorbancia a 450 nm obtenidos para el panel de 9 sueros
ensayados Se utilizaron 5 g de P22C-biotina por pocillo y 100 L de HRP-EAV en
dilucioacuten 12000
Tabla 51 Absorbancias a 450 nm obtenidas en los ELISA siguiendo el esquema de captura A descrito
maacutes arriba
Placa 1 Placa 2
Agudos
0100 0158
0311 0273
0140 0165
Croacutenicos
0281 0322
0256 0278
0260 0226
Negativos
0217 0168
0235 0179
0409 0354
Sin suero
0135 0134
0143 0114
0126 0100
Sin suero
Sin
P22cBiotina
0071 0050
0070 0037
0047 0040
Los resultados obtenidos con ambos antiacutegenos fueron desalentadores (los resultados
obtenidos con P35B biotina no se informan) ya que no se hallaron diferencias
significativas entre los valores de absorbancia obtenidos con sueros de pacientes
agudos croacutenicos y negativos
5312 Esquema B
En base a los resultados obtenidos en la seccioacuten anterior se orientaron los ensayos
realizando los ELISA siguiendo un esquema no claacutesico al que denominamos B
Debido a la baja sensibilidad que presentaron los Angs conjugados a biotina para
detectar los Acs especiacuteficos pensamos en hacer una primera etapa de concentracioacuten de
los Acs especiacuteficos en la placa para luego revelar con el Ang conjugado a biotina Esto
se hizo adsorbiendo antiacutegeno recombinante sobre la superficie de la placa de
poliestireno enfrentaacutendola luego al suero a ensayar Asiacute se captura selectivamente las
inmunoglobulinas que reconocen al antiacutegeno ya sean IgM o IgG Luego se expone la
placa al mismo antiacutegeno recombinante pero ligado a biotina que se uniraacute a los
anticuerpos especiacuteficos para dicho Ang previamente capturados Finalmente se revela
Resultados y Discusioacuten
63
con HRP conjugada a streptavidina que forma un complejo estable con biotina De esta
forma se aumenta la cantidad de Ang marcado en mayor proporcioacuten para IgM que para
IgG dada la multivalencia de este isotipo de inmunoglobulina En la Fig 56 se
reproduce el esquema B que fue el que brindoacute los resultados maacutes promisorios
Antiacutegeno (Ang) Bloqueante Ang ligado a biotina Reactivo de color
IgM a-Ang IgG a-Ang streptavidina conjugada a HRP
Figura 56 Esquema de ensayo ELISA de captura tipo B El antiacutegeno expuesto en la placa captura la
porcioacuten de las IgM e IgG especiacuteficas presentes en el suero humano Haciendo uso de la polivalencia de
las IgM su presencia se revela con el antiacutegeno conjugado a biotina streptavidina ligada a HRP
adicionando el sustrato de la enzima y un cromoacutegeno actuando como cosustrato
Buscando diferenciar sueros de pacientes en fase de infeccioacuten aguda (agudos) de
sueros provenientes de pacientes sin infeccioacuten (negativos) En la Tabla 52 se muestran los
valores de absorbancia a 450 nm obtenidos
Tabla 52 Absorbancias a 450 nm obtenidas en los ELISA siguiendo el esquema de captura B
Ang
Sueros P35B 05ug P35B 001ug P22C 05ug P22C 001ug
Agudos 2131 1567 0335 0296
1849 1311 065 0413
Negativos 176 1350 0282 0327
1025 1676 0262 0325
Sin suero 1658 1658 0174 0149
1812 1504 0130 0144
Sin Ang
conjugado
0055 004 0041 0045
0057 0042 0039 004
Resultados y Discusioacuten
64
Este ensayo exploratorio demostroacute que los antiacutegenos P22C y P35B pueden ser usados
potencialmente en la deteccioacuten de toxoplasmosis aguda realizando inmunoensayos con el
esquema B propuesto en el presente trabajo Por ello siguiendo este esquema de trabajo se
exploraron cuales eran las condiciones oacuteptimas (ver punto 623 seccioacuten Experimentos
Auxiliares) Asiacute se establecioacute la dilucioacuten de la enzima HRP-EAV (12000) la cantidad de
P22C biotina (5 microg por pocillo) y se acotaron los valores de P22C adsorbidos inicialmente
en la placa entre 500 y 50 ng Finalmente se realizaron tres ensayos en paralelo donde se
evaluoacute la cantidad de antiacutegeno adsorbido inicialmente en la placa y se amplioacute el panel de
sueros Los resultados obtenidos se muestran en la Fig57
Figura 57 Absorbancias a 450 nm para los ELISA realizados con el esquema B (A) 50 ng de Ang P22C
(B) 200 ng de Ang P22C (C) 500 ng de Ang P22C Con se indican los sueros provenientes de
pacientes con infeccioacuten aguda (Agudos) con los provenientes de pacientes con infeccioacuten croacutenica
(Croacutenicos) y con los de pacientes sin infeccioacuten (Negativos) Con la liacutenea roja ( ) se indica el valor
de media menos tres desviacuteos estaacutendares de los agudos (AbsA ndash 3 DSA) y con la liacutenea verde ( ) el valor
de media maacutes tres desviacuteos estaacutendares de los croacutenicos (AbsC +3 DSC)
Resultados y Discusioacuten
65
En las tres condiciones evaluadas se obtiene una separacioacuten de las sentildeales obtenidas al
ensayar sueros provenientes de los pacientes con infeccioacuten aguda (Agudos) de los sueros
provenientes de pacientes con infeccioacuten croacutenica (Croacutenicos) y los pacientes sin infeccioacuten
(Negativos)
Los resultados obtenidos con P35B no resultaron alentadores debido al elevado ruido
de fondo (altos valores de absorbancia de los blancos) Por lo tanto los ensayos
electroquiacutemicos se iniciaron soacutelo con P22C
Mijak y colaboradores (Hiszczyntildeska-Sawicka y col 2005) sentildealan que ya se ha
demostrado la utilidad del Ang SAG2 para detectar IgG en el suero de pacientes con
toxoplasmosis aguda y croacutenica (Parmley y col 1992) destacando que en los resultados
presentados por ese mismo grupo en otra publicacioacuten (Li y col 2000a) soacutelo se examinaron
un reducido nuacutemero de sueros provenientes de pacientes con infeccioacuten aguda con
resultados tanto positivos como negativos Tambieacuten sentildeala que Maine y colaboradores
(Aubert y col 2000) no obtuvieron resultados satisfactorios con este antiacutegeno
recombinante realizando ELISA indirecto Los resultados obtenidos en este trabajo con
ELISA utilizando el esquema A han confirmado lo sentildealado por Mijak y col sobre el
desempentildeo de este Ang El anaacutelisis que estos autores hacen se orienta a que el uso de estos
antiacutegenos recombinantes debe contemplar necesariamente el uso combinado de otros Angs
Por otro lado en el presente trabajo se han presentado resultados que permitiriacutean
complementar esta visioacuten incorporando otro esquema para la deteccioacuten de sueros de
infectados agudos Si bien es necesario ampliar el nuacutemero de sueros para validar el ensayo
los resultados son promisorios Hemos propuesto que las diferencias obtenidas en los
ELISA de captura siguiendo el esquema B pueden deberse a dos mecanismos no
excluyentes entre si y que podriacutean estar actuando en conjunto Por un lado estaacute la
multivalencia que presentan las IgM respecto de las IgG que generariacutea una amplificacioacuten
selectiva de acuerdo al isotipo Por otro lado independientemente del isotipo capturado el
Ang de fase aguda brindariacutea la sensibilidad y especificidad necesaria al ensayo
identificando Acs de fase aguda Resta pues esclarecer si esto es asiacute fehacientemente o si
hay alguacuten otro mecanismo actuando concomitante que permita explicar las diferencias
observadas aquiacute entre sueros de fase aguda y de infectados croacutenicos
Resultados y Discusioacuten
66
532 Inmunoensayos con deteccioacuten amperomeacutetrica utilizando los antiacutegenos
recombinantes
Los bioelectrodos se ensamblaron como se describe en el inciso 41911 de
Materiales y Meacutetodos Al realizar los inmunoensayos con las diluciones pertinentes de
suero humano (muestra incoacutegnita) en caso de suero de paciente infectado (+) estaraacuten
presentes los anticuerpos IgG anti-P22 (analito de intereacutes) Cuando se sumergen en una
dilucioacuten de anticuerpos anti-IgG h conjugado con HRP (segundo anticuerpo marcado) eacuteste
quedaraacute retenido en el electrodo y frente al agregado del sustrato de la enzima (H2O2)
sobre PBS conteniendo el mediador FcMe se genera la especie que seraacute electro-reducida
sobre el electrodo al potencial de trabajo 008 V (vs AgAgCl ver inciso 420 2) A los
fines de claridad en la Fig 58 se reformula el esquema de funcionamiento del biosensor
previamente esquematizado (Fig 212) para el caso particular aquiacute detallado donde el
Ang es la proteiacutena P22C
Proteiacutena recombinante IgG a-IgGh conjugada a HRP
Bloqueante IgG humana ferrocenometanol
Figura 58 Sobre la superficie del electrodo se fija la proteiacutena P22C que capturaraacute los anticuerpos especiacuteficos
si estaacuten presentes en el suero El revelado se realiza con un segundo anticuerpo especiacutefico para IgG humana
marcado con HRP que en presencia de H2O2 oxida el mediador FcMe que se reduce sobre la superficie del
electrodo generando la sentildeal analiacutetica
En la Fig 59 se muestran tres amperogramas representativos obtenidos cuando se
ensayaron sueros confirmados (+) sueros confirmados (-) y blancos (sin suero alguno)
Los valores de corrientes se corrigieron por los valores de aacuterea reales determinados
mediante voltametriacutea ciacuteclica a distintas velocidades de soluciones de ioacuten ferricianuro
(punto 41932 seccioacuten Materiales y Meacutetodos)
Resultados y Discusioacuten
67
Figura 59 Amperometriacuteas comparativas con bioelectrodos ensamblados con la proteiacutena P22C
En la Tabla 54 se resumen los resultados de los ensayos sobre muestras confirmadas
positivas negativas y blanco
Tabla 54 Valores promedios de la corriente cataliacutetica diferencial obtenidas utilizando bioelectrodos
ensamblados con el antiacutegeno P22C
DS desviacioacuten estaacutendar
Las diferencias en las sentildeales registradas fueron estadiacutesticamente significativas
verificaacutendose la potencialidad del uso de esta metodologiacutea para discriminar entre sueros de
pacientes infectados con T gondii de sueros de pacientes no infectados Los ensayos
electroquiacutemicos preliminares informados permiten pensar en el desarrollo de un biosensor
amperomeacutetrico A futuro seriacutea deseable poder establecer un biosensor electroquiacutemico
basaacutendonos en el esquema B de los ELISA presentados en este trabajo de Tesis que
permita la discriminacioacuten entre sueros de pacientes cursando infeccioacuten aguda de sueros de
pacientes con infeccioacuten croacutenica
54 Determinacioacuten de la actividad electroquiacutemica del glicerol en medio acuoso
Si bien desde hace varios antildeos se ha estudiado la oxidacioacuten electrocataliacutetica de
polialcoholes auacuten no existe acuerdo acerca del procedimiento maacutes conveniente para su
cuantificacioacuten electroquiacutemica asiacute como tampoco ha sido posible identificar un uacutenico
mecanismo que deacute cuenta de los productos obtenidos luego de la reaccioacuten electroacutenica
(Kahyaoglu et al 1984 Kwon amp Koper 2010)
Muestra j = Icaacuterea
( A cm-2
)
DS
( A cm-2
)
Positivos -0455 0026
Negativos -0150 0021
Sin suero -0052 004
Resultados y Discusioacuten
68
Con el fin de encontrar el electrodo y las condiciones maacutes convenientes para
realizar la cuantificacioacuten del glicerol se realizaron ensayos exploratorios de
voltametriacuteas ciacuteclicas utilizando electrodos de carbono viacutetreo pasta de C (grafito y
viacutetreo) Au Pt y Ag Los medios ensayados fueron HClO4 01 M solucioacuten tampoacuten de
fosfato salino (PBS) pH 72 90 120 NaCl al 08 mv y NaOH 01 M El intervalo
de concentracioacuten de glicerol utilizado fue de 100 x 10-5
M hasta 01 M
En estos ensayos iniciales las maacuteximas sentildeales se obtuvieron con electrodos de Au
en medio alcalino (NaOH 01 M) coincidiendo con lo descripto por Lamy (Kahyaoglu
et al 1984) A modo ilustrativo en la Fig 510 se observan dos voltametriacuteas ciacuteclicas
para electrodos de oro y de platino en medio alcalino
Figura 510 Voltamperogramas tiacutepicos para soluciones de glicerol 10-2
M en soluciones de base fuerte
(NaOH 01M) utilizando electrodos de trabajo de Au (izquierda) y Pt (derecha)
En una etapa posterior se verificoacute que las sentildeales obtenidas Ip respondiacutean
proporcionalmente a la concentracioacuten de glicerol Se realizoacute una curva de calibracioacuten en
el intervalo de concentraciones de 50 x 10-4
a 10 x 10-2
M Todas las mediciones se
hicieron por triplicado La Tabla 55 muestra las medias de las corrientes de pico
obtenidas para cada concentracioacuten ensayada con su correspondiente desviacuteo estaacutendar La
corriente de pico se midioacute tomando una liacutenea de base recta a un valor de potencial de
010 V plusmn 005 V usando algoritmos propios del programa GPES 49
Tabla 55 Valores medios de corriente obtenidos por voltametriacutea ciacuteclica para la oxidacioacuten del
glicerol en medio alcalino (NaOH 01 M) sobre electrodos de oro
[Glicerol]
(mM)
Ip
(microA cm-2
)
DS Ip
(microA cm-2
)
050 18 032
100 28 038
200 74 041
500 17 035
750 262 055
100 347 053
-50E-05
00E+00
50E-05
10E-04
15E-04
20E-04
25E-04
-0400 -0200 0000 0200 0400 0600 0800
E(V)
i(A
)
-40E-06
00E+00
40E-06
80E-06
12E-05
16E-05
-1000 -0800 -0600 -0400 -0200 0000 0200 0400
E(V)
i(A
)
Resultados y Discusioacuten
69
En la Fig 511 se presenta la dependencia de la corriente de pico
voltamperomeacutetrica con la concentracioacuten de glicerol Las barras de error corresponden a
las desviaciones estaacutendar de cada medida realizada por triplicados independientes Se
ajustaron estos valores a una recta con el meacutetodo de los miacutenimos cuadrados y se obtuvo
la siguiente ecuacioacuten
[51]
donde IpA estaacute en microA cm-2
y [glicerol] en mM El valor de coeficiente de regresioacuten
(R2) obtenido fue de 09980
Figura 511 Dependencia de la corriente de pico voltamperomeacutetrica con la concentracioacuten de glicerol en
medio alcalino (NaOH 01 M) Se muestran los valores promedios de tres medidas independientes Las
barras de error se corresponden a los desviacuteos estaacutendares
En estas condiciones de trabajo el pico de corriente oxidativa tiene dependencia
lineal con la concentracioacuten de glicerol En funcioacuten de estos resultados se orientoacute la
buacutesqueda hacia una metodologiacutea que permitiese determinar al glicerol en
concentraciones de 10-5
M o menores Para esto iniciamos ensayos con teacutecnica
amperomeacutetrica
Se realizaron los ensayos amperomeacutetricos como se describe en el punto 4202 de la
seccioacuten Materiales y Meacutetodos La Fig 512 muestra el resultado de una amperometriacutea
tiacutepica para una solucioacuten de glicerol
Resultados y Discusioacuten
70
t s
0 50 100 150 200 250 300 350 400 450
I A
0
2
4
6
Figura 512 Amperometriacutea tiacutepica de una muestra con glicerol (concentracioacuten en celda 1 mM) Se dejoacute
estabilizar la corriente para una solucioacuten de NaOH 01 M y a los 50 segundos se realizoacute el agregado de la
muestra con glicerol y se midioacute la corriente hasta los 400 segundos
Se ensayaron soluciones de glicerol cuya concentracioacuten en la celda electroliacutetica
fueron desde 001 mM hasta 5 mM Como blanco se utilizoacute solucioacuten de NaOH 01 M
La corriente cataliacutetica se midioacute como la diferencia entre la corriente final y la inicial
(punto 4202 seccioacuten Materiales y Meacutetodos) A este valor de corriente se lo dividioacute
por el valor de aacuterea real del electrodo medida anteriormente esta densidad de corriente
(IcA) se tomoacute como la sentildeal analiacutetica En la Tabla 56 se muestran las medias de las
sentildeales obtenidas para cada concentracioacuten de glicerol ensayada con su correspondiente
desviacuteo estaacutendar
Tabla 56 Valores medios de densidades de corriente obtenidos por amperometriacutea para la oxidacioacuten de
glicerol en medio alcalino (NaOH 01 M)
[Glicerol]
(mM)
Ic A
( A cm-2
)
DS
( A cm-2
)
0000 0447 0029
0010 0763 0016
0025 1098 0068
0050 1510 0055
0100 285 049
0250 609 036
0500 1245 033
0750 1730 0097
100 2361 0099
150 3445 033
175 3997 020
200 4613 045
Resultados y Discusioacuten
71
En la Fig 513 se presenta la recta de regresioacuten lineal obtenida a partir de los
valores promedio de densidades de corriente para soluciones de glicerol en el intervalo
de concentraciones de 0025 mM y 2 mM Las barras de error corresponden a las
desviaciones estaacutendares de cada medida La ecuacioacuten de la recta obtenida por el meacutetodo
de miacutenimos cuadrados fue
[52]
Donde IcA estaacute en microA cm-2
y [Glicerol] en mM el valor del coeficiente de
regresioacuten (R2) obtenido fue de 09950
[Glicerol] mM
000 025 050 075 100 125 150 175 200
I cA
m
A c
m-2
0
10
20
30
40
50
Figura 513 Curva de calibracioacuten obtenida para glicerol en medio alcalino (NaOH 01 M) con la teacutecnica
amperomeacutetrica Se muestran los valores promedios de tres medidas independientes para cada solucioacuten
Las barras de error que se muestran corresponden al DS de cada punto
Las cifras de meacuterito para esta teacutecnica resultaron ser
Liacutemite de deteccioacuten 10 M
Liacutemite de cuantificacioacuten 24 M
Liacutemite de discriminacioacuten 10 M
Intervalo de linealidad 0024 mM ndash 200 mM
55 Cuantificacioacuten de glicerol en medios acuosos complejos
El glicerol es corrientemente utilizado como principal fuente de carbono en cultivos
bacterianos siendo degradado eficientemente por sistemas enzimaacuteticos que utilizan
mecanismos redox Por lo tanto se comenzoacute a estudiar la posible cuantificacioacuten
electroquiacutemica de este alcohol intentando detectar concentraciones del orden 10-5
M o
Resultados y Discusioacuten
72
menores para poder asiacute evidenciar su consumo en medios de cultivos bacterianos que
contienen glicerol como nutriente El meacutetodo amperomeacutetrico con electrodo de oro no
fue lo suficientemente selectivo para glicerol cuando este se encontraba en matrices
complejas (no se muestran los resultados) por lo tanto al momento de cuantificarlo en
medios de cultivos bacterianos tuvimos que optar por otra metodologiacutea
Sobre la base del trabajo de Tuntildeoacuten-Blanco y col (Aacutelvarez-Gonzaacutelez et al 2000)
se busco desarrollar un biosensor selectivo para este analito
Para verificar la funcionalidad del modelo propuesto se realizaron ensayos
espectrofotomeacutetricos La coenzima NAD(H) en su forma reducida (NADH) presenta un
maacuteximo de absorcioacuten a 340 nm ausente en la forma oxidada (NAD+) Puede apreciarse
en la Fig 514 que el mediador electroquiacutemico Fe(CN)63-
presenta un maacuteximo de
absorcioacuten a 420 nm ausente en la forma reducida Fe(CN)64-
En un primer ensayo se
verificoacute espectrofotomeacutetricamente que la longitud de onda escogida podiacutea utilizarse
para el seguimiento de la reaccioacuten En una serie de ensayos posteriores se monitoreoacute la
reaccioacuten enzimaacutetica en presencia y ausencia del mediador electroquiacutemico haciendo uso
de estas propiedades espectrales
Figura 514 Espectros de absorcioacuten UV-visible para las especies Fe(CN)33-
1 mM y Fe(CN)34-
1 mM
Ambas especies fueron disueltas en solucioacuten tampoacuten carbonato pH 105 Puede apreciarse claramente que
el maacuteximo de absorcioacuten a 420 nm presente en el Fe(CN)63-
se encuentra ausente en el Fe(CN)64-
La
velocidad de barrido fue 1200 nm min-1
551 Evaluacioacuten del modelo propuesto por medio de lecturas
espectrofotomeacutetricas
El primer ensayo para validar el modelo propuesto fue seleccionar la longitud de
onda oacuteptima para el seguimiento espectrofotomeacutetrico A tal fin se llevaron adelante dos
0
025
05
075
1
125
15
175
2
225
25
275
260 280 300 320 340 360 380 400 420 440 460 480 500
Longitud de onda (nm)
Ab
sorb
an
cia
Ferricianuro 1 mM
Ferrocianuro 1 mM
Resultados y Discusioacuten
73
reacciones a) glicerol disuelto en medio 7H9 coenzima Fe(CN)63-
y enzima GlDH y
b) glicerol disuelto en medio 7H9 coenzima Fe(CN)63-
pero sin la enzima GlDH En
ambos casos se realizoacute un barrido espectral de 320 a 480 nm registraacutendose la
absorbancia a una velocidad de barrido de 1200 nm min-1
cada 10 min Ambas
reacciones se llevaron a cabo en solucioacuten tampoacuten carbonato pH 105 En la Fig 515 se
muestran los barridos espectrales obtenidos para cada reaccioacuten y en ella puede
apreciarse que la mayor diferencia se presenta a la longitud de onda prevista (420 nm)
Figura 515 Espectros de absorcioacuten UV-visible para mezclas de reaccioacuten (A) En presencia de enzima
GlDH (B) Sin enzima GlDH Barrido espectral cada 10 min
Para elucidar si el consumo de Fe(CN)63-
observado se correspondiacutea
cuantitativamente con el NADH generado y en consecuencia con el glicerol
consumido se tuvieron en cuenta las siguientes reacciones
glicerol + Fe(CN)63-
DHA + Fe(CN)64-
(1)
glicerol + NAD+ NADH + DHA (2)
Se realizaron series de 3 reacciones en paralelo a saber a) blanco de reaccioacuten (BR)
con enzima GlDH NAD+ y Fe(CN)6
3- en ausencia de glicerol donde se siguioacute la
absorbancia a 420 nm b) reaccioacuten (1) con enzima GlDH NAD+ Fe(CN)6
3- y glicerol
donde se siguioacute la desaparicioacuten de Fe(CN)63-
a 420 nm c) reaccioacuten (2) con enzima
GlDH NAD+ y glicerol donde se siguioacute la aparicioacuten de NADH a 340 nm Debe tenerse
en cuenta por un lado que el NAD+ es reducido a NADH en la reaccioacuten (2) no se
regenera mientras que en la reaccioacuten (1) se regenera por la presencia del anioacuten
Fe(CN)63-
Esto implica que si bien ambas reacciones se lentifican con el paso del
tiempo a causa del consumo de glicerol (y acumulacioacuten de DHA) la reaccioacuten (2) se
lentifica maacutes que la (1) porque se consumen tanto el glicerol como el NAD+
y se
acumulan ambos productos de reaccioacuten (DHA y NADH) Los resultados pueden verse
en la Fig 516
A
0
015
03
045
06
075
09
105
12
135
15
320 340 360 380 400 420 440 460 480
Longitud de onda (nm)
Ab
sorb
an
cia
t = 0
t = 10 min
t = 20 min
t =30 min
t = 40 min
t = 50 min
t = 60 min
B
0
015
03
045
06
075
09
105
12
135
15
320 340 360 380 400 420 440 460 480
Longitud de onda (nm)
Ab
sorb
an
cia
t = 0 min
t = 10 min
t = 20 min
t = 30 min
t = 40 min
t = 50 min
t = 60 min
GlDHNAD+
GlDH
Resultados y Discusioacuten
74
Figura 516 Absorbancias registradas a 420 nm durante las reacciones descriptas en el texto A) Blanco
de reaccioacuten (BR) y reaccioacuten (1) B) Reaccioacuten (2) C) Segmento inicial de la curva representada en
B) a partir de la cual se calculoacute el valor liacutemite de la velocidad inicial de reaccioacuten Se muestra un
experimento representativo de un original y replicado
Se asumioacute que la reaccioacuten (1) transcurre a una velocidad constante en las
condiciones en que se llevoacute a cabo El anaacutelisis estadiacutestico demuestra que hay una ligera
tendencia a la no linealidad evidenciada por la distribucioacuten de los residuos No
obstante siendo las variancias iguales se consideroacute que no hay un alejamiento
significativo de la linealidad Por ello en los caacutelculos de variacioacuten de la concentracioacuten
de coenzima a lo largo del tiempo de reaccioacuten se tuvo en cuenta el cambio que se
produciriacutea si la velocidad de reaccioacuten se mantuviera constante e igual a la velocidad
inicial Para el caso del NAD+ consumido (o NADH generado) en la reaccioacuten (2)
tenemos
[53]
Asumiendo que en el intervalo de concentraciones de trabajo se cumple la ley de
Beer la ec [53] puede reescribirse como
[54]
Si la velocidad de la reaccioacuten enzimaacutetica se mantiene aproximadamente igual a la
velocidad inicial por la regeneracioacuten de la coenzima se puede admitir que la velocidad
A
05
056
062
068
074
08
086
092
098
104
11
0 600 1200 1800 2400 3000 3600
tiempo (s)
Ab
s 4
20
nm
B
0
004
008
012
016
02
024
028
032
036
04
044
048
0 600 1200 1800 2400 3000 3600tiempo (s)
Ab
s 3
40
nm
C
y = 00004405x
R2 = 09983921
0
0035
007
0105
014
0175
021
0 60 120 180 240 300 360 420 480
tiempo (s)
Ab
s 3
40
nm R
2 = 09984
Resultados y Discusioacuten
75
de reaccioacuten es constante (reaccioacuten de orden cero para los reactivos) pudieacutendose expresar
la ec [54] en la siguiente forma
b
k
tb
tk
tb
Abs
nmNADHnmNADHnmNADH
nm
340340340
340 [55]
donde k es la constante de velocidad para esa reaccioacuten en unidades de absorbancia por
unidad de tiempo (s-1
) y se obtiene como la pendiente del segmento lineal de la curva de
la Fig 516 B presentado en la Fig 516 C
La variacioacuten de concentracioacuten total de coenzima se obtiene multiplicando el valor
de velocidad por la variacioacuten de tiempo total
[56]
siendo los valores de los paraacutemetros y variables en cuestioacuten
εNADH 340nm = 6220 M-1
cm-1
Δt = 3600 s
b = 1 cm
k = 44 x 10-4
s-1
resultando
[57]
La variacioacuten de concentracioacuten del mediador seraacute
[58]
nmCNFe 420)( 36
= 1080 M-1
cm-1
ΔAbs420nm = 052
que reemplazando en la ec [58] arroja
M [59]
La variacioacuten de absorbancia observada en el blanco de reaccioacuten a lo largo de una
hora fue de 00046 unidades de absorbancia que representa menos del 1 de la
variacioacuten total observada en la reaccioacuten (1) Estos resultados permiten verificar que en
las condiciones de reaccioacuten el Fe(CN)63-
reducido a Fe(CN)64-
equivale
cuantitativamente al NADH generado en la reaccioacuten enzimaacutetica de acuerdo a la
siguiente estequiometriacutea
Resultados y Discusioacuten
76
2 Fe(CN)63-
+ NADH 2 Fe(CN)64-
+ NAD+ [510]
Lo mostrado corrobora la factibilidad del disentildeo de un biosensor de una sola
enzima con un mediador soluble econoacutemico
5511 Evaluacioacuten de la sentildeal con la concentracioacuten de glicerol
Para verificar si la sentildeal analiacutetica muestra dependencia con la concentracioacuten de
glicerol se realizaron 6 reacciones en paralelo registraacutendose la absorbancia a 420 nm
cada un minuto durante dos horas Se realizoacute un blanco de reaccioacuten sin glicerol y cinco
reacciones con concentraciones crecientes de glicerol Como muestras se utilizaron el
medio de cultivo de micobacterias Middlebrook 7H9 suplementado con glicerol a
distintas concentraciones En la Tabla 57 se presentan las concentraciones de glicerol
en las mezclas de reaccioacuten y en las muestras La Fig 517 muestra la absorbancia a 420
nm para las seis reacciones
Tabla 57 Concentraciones de glicerol en las mezclas de reaccioacuten
Reaccioacuten [glicerol] en mezcla
de reaccioacuten (mM) [glicerol] en muestra
(mM)
Blanco 0 0
Muestra 1 11 22
Muestra 2 082 16
Muestra 3 055 11
Muestra 4 027 55
Muestra 5 011 22
Resultados y Discusioacuten
77
Figura 517 Absorbancia a 420 nm de las mezclas de reaccioacuten descriptas en el texto ( ) 11 mM de
glicerol ( ) 082 mM de glicerol ( ) 055 mM de glicerol (o) 027 mM de glicerol (-) 011 mM de
ccedilglicerol ( ) blanco de reaccioacuten
Habiendo verificado la dependencia de la sentildeal analiacutetica con el analito de intereacutes se
procedioacute a determinar el intervalo dinaacutemico lineal Para ello se realizaron las reacciones
de color como se describe en el apartado 417 de la seccioacuten Materiales y meacutetodos Cada
reaccioacuten se hizo por triplicado En la Fig 518 se muestran resumidos los resultados
obtenidos
[Glicerol] mM
000 005 010 015 020 025 030 035 040
Ab
s 42
0 n
m
00
02
04
06
08
10
Figura 518 Curva de calibracioacuten para glicerol utilizando el meacutetodo colorimeacutetrico Se muestran los
valores promedios de tres medidas independientes Las barras de error corresponden a los desviacuteos
estaacutendares
La recta de regresioacuten que se obtuvo a partir de estos valores fue
Abs420nm = 0946 ndash 238 [glicerol] [511]
02
03
04
05
06
07
08
09
1
0 1200 2400 3600 4800 6000 7200
tiempo (s)
Ab
s 4
20
nm
Resultados y Discusioacuten
78
cuyo coeficiente de regresioacuten (R2) fue 09980 En el intervalo de concentraciones de
0025 a 027 mM la respuesta fue lineal
5512 Optimizacioacuten de condiciones para disminuir el costo operativo
Se verificoacute la posibilidad de cuantificar glicerol en medio Middlebrook 7H9
optimizando las concentraciones de reactivos y los tiempos de reaccioacuten para obtener la
maacutexima sentildeal con la mezcla maacutes econoacutemica posible Se ensayaron distintas
concentraciones de cofactor NAD+ a utilizar y 2 tiempos de reaccioacuten para una curva de
calibrado de 6 puntos consistente en un blanco y cinco estaacutendares de glicerol todos por
triplicado
Para verificar la factibilidad de disminuir la concentracioacuten de cofactor soluble sin
alterar significativamente la sensibilidad del meacutetodo se utilizoacute un disentildeo experimental
con un modelo de superficie de respuesta Como factores se tomaron la concentracioacuten
de cofactor y el tiempo de reaccioacuten Los niveles seleccionados en base a ensayos
previos fueron concentracioacuten de cofactor (NAD+) 01 mM 023 mM 037 mM y 05
mM tiempo 1 y 2 h Las respuestas que se evaluaron fueron la pendiente de una recta
de regresioacuten calculada a partir del meacutetodo de miacutenimos cuadrados y el coeficiente de
regresioacuten lineal correspondiente En la Tabla 58 se muestran los niveles parametrizados
y los valores de las respuestas obtenidas
Tabla 58 Disentildeo experimental factores parametrizados y respuestas obtenidas
Cada uno de los estaacutendares indicados en la Tabla 58 se correlaciona con una curva
de calibrado realizada En la Tabla 59 se informan los valores de concentracioacuten de
glicerol de las soluciones utilizadas para las reacciones de color y la concentracioacuten
correspondiente en la mezcla de reaccioacuten
Estaacutendar [NAD+] Tiempo Pendiente R2
4 1 -1 068 08790
7 03333 1 227 09962
8 1 1 184 09621
5 -1 1 159 09931
3 03333 -1 083 09590
2 -03333 -1 1 09850
6 -03333 1 244 09863
1 -1 -1 071 09914
Resultados y Discusioacuten
79
Tabla 59 Valores de concentracioacuten de los estaacutendares utilizados para los ensayos de optimizacioacuten
Reaccioacuten [glicerol] en mezcla
de reaccioacuten (mM) [glicerol] en muestra
(mM)
Blanco 0 0
Muestra 1 0010 02
Muestra 2 0025 05
Muestra 3 0050 10
Muestra 4 0075 15
Muestra 5 010 20
La ecuacioacuten de ajuste propuesta por el modelo de superficie de respuesta para la
pendiente fue
tBNADAm ][421 [512]
donde A y B son los coeficientes del modelo que se calculan a partir de la forma de la
superficie de respuesta e indican la dependencia de la pendiente (m) con la
concentracioacuten de cofactor ([NAD+]) y el tiempo de reaccioacuten (t) respectivamente El
anaacutelisis de los resultados indica que de los dos coeficientes solo B es significativo y su
valor es 062 mientras que A es un coeficiente no significativo Esto significa que la
pendiente de la recta de calibrado no muestra dependencia con la concentracioacuten de
cofactor NAD+ utilizado
Por otra parte el coeficiente de correlacioacuten no mostroacute dependencia con ninguno de
los factores elegidos Esto indica que el modelado de la funcioacuten deseabilidad global
queda reducido al de una sola respuesta la pendiente de la recta de calibrado y a un
uacutenico factor significativo que es el tiempo de reaccioacuten En base a estos resultados
pudimos establecer un uso miacutenimo de cofactor soluble
552 Determinacioacuten de glicerol remanente en cultivos de micobacterias
5521 Evaluacioacuten de glicerol remanente en cultivos axeacutenicos de M smegmatis
Primeramente se evaluoacute si podiacutea evidenciarse el consumo de glicerol por parte de
M smegmatis en un cultivo axeacutenico es decir conteniendo soacutelo este microorganismo
Para ello se realizaron cultivos de la micobacteria como se describe en el punto 418 de
la seccioacuten Materiales y Meacutetodos y se determinoacute el glicerol remanente haciendo uso del
meacutetodo fotomeacutetrico presentado previamente El anaacutelisis de la variancia de los valores de
absorbancia registrados y posteriormente se realizoacute un ensayo de comparaciones
muacuteltiples utilizando las pruebas de Tukey y de Bonferroni Se detectaron diferencias
estadiacutesticamente significativas en las absorbancias de las muestras del medio con M
Resultados y Discusioacuten
80
smegmatis a las 2 y 3 h de iniciados los cultivos respecto de aquellos medios
conservados en esterilidad
5522 Determinacioacuten de glicerol remanente en cultivos de micobacterias con y
sin fago D29 y ensayos controles respectivos
En una segunda serie de ensayos nos propusimos ver si habiacutea consumo diferencial
de glicerol entre cultivos de M smegmatis y cultivos de la micobacteria infectados con
el fago D29 siguiendo el protocolo descripto en el punto 4181 de la seccioacuten Materiales
y Meacutetodos En la Fig 519 se muestran los valores de absorbancia a 420 nm de las
muestras mencionadas Sobre este conjunto de datos nuevamente se realizoacute un anaacutelisis
de la variancia y ensayos de comparaciones muacuteltiples utilizando las pruebas de Tukey y
de Bonferroni
Los resultados obtenidos indican que todos los medios de cultivo a los cuales no se
le inoculoacute bacterias y aquellos medios donde se inoculoacute bacterias pero fueron
centrifugados inmediatamente despueacutes del inoacuteculo (muestras a t= 0) no mostraron
diferencias estadiacutesticamente significativas en los ensayos de comparaciones muacuteltiple
realizados Esto permite concluir que el agregado de fago y la incubacioacuten a 37 ordmC no
producen modificaciones significativas per se en las reacciones de color Por ello es
posible afirmar que en el futuro podraacuten simplificarse los controles a un uacutenico testigo
de concentracioacuten inicial conocida sin necesidad de tomar una muestra del cultivo
inmediatamente despueacutes del inoacuteculo o de la adicioacuten de fagos a los controles negativos
del ensayo
En este ensayo preliminar pudimos observar que las diferencias de absorbancia
resultaron estadiacutesticamente significativas entre los medios de cultivo donde crecieron
ceacutelulas de M smegmatis y los medios donde crecieron ceacutelulas de M smegmatis
infectadas con fago D29 tanto a las 2 como a las 4 h de iniciados los cultivos Este
resultado indicoacute que la hipoacutetesis de trabajo planteada era apropiada y en consecuencia
seriacutea factible desarrollar un meacutetodo para verificar la integridad de micobacterias en un
cultivo de las mismas
Resultados y Discusioacuten
81
Bla
nco
Med
io 0
025
00
25
+ F
ago t
= 0
00
25
C
eacutelula
s t
= 0
00
25
Ceacutel
ula
s +
Fag
o t
= 0
00
25
+ F
ago t
= 2
00
25
Ceacutel
ula
s t
= 2
00
25
Ceacutel
ula
s +
fag
o t
= 2
00
25
fa
go t
= 4
00
25
Ceacutel
ula
s t
= 4
00
25
Ceacutel
ula
s +
fag
o t
= 4
Abs
420 n
m
03
04
05
08
Figura 519 Absorbancias a 420 nm registradas para las muestras descritas Se indica concentracioacuten
inicial de glicerol en mv y tiempo de incubacioacuten a 37 ordmC El blanco corresponde al de la reaccioacuten de
color sin glicerol
553 Biosensor amperomeacutetrico a base de pasta de carbono viacutetreo modificada
En funcioacuten de los resultados previos se procedioacute al ensamblado de un biosensor
amperomeacutetrico siguiendo el esquema de reaccioacuten presentado previamente que se
reproduce en la figura 520
Figura 520 Esquema de reaccioacuten propuesto para biosensor amperomeacutetrico selectivo para glicerol La
coenzima reducida NADH se regenera a su forma oxidada NAD+ reaccionando con el Fe(CN)6
3- que se
reduce a Fe(CN)64-
Este uacuteltimo se reoxida electroquiacutemicamente sobre la superficie del electrodo
completando el ciclo cataliacutetico
Utilizando electrodos de pasta de carbono B (punto 41912 seccioacuten Materiales y
Meacutetodos) se realizaron amperometriacuteas siguiendo el protocolo descrito en el punto 4202
glicerol
DHA
GlDHox
GlDHred NAD+
NADH Mediador ox
Mediador red
e- Electrodo
Resultados y Discusioacuten
82
de la seccioacuten Materiales y Meacutetodos En la Fig 521 se muestra un amperograma tiacutepico
obtenido
Tiempo s
100 200 300 400 500
I
nA
0
20
40
60
80
100
Figura 521 A) Amperograma tiacutepico obtenido con un electrodo de trabajo de pasta de carbono B
trabajando a un potencial de 038 V Se agregaron 50 L de medio 7H9 suplementado con glicerol
usualmente a los 300 s de iniciada la lectura de corriente cuando eacutesta se estabilizoacute B) Agregados
sucesivos de 50 microL de medio 7H9 suplementado con glicerol 20 mM sobre 200 mL de la misma
solucioacuten
En la Fig 522 se presenta la recta de regresioacuten obtenida a partir de los valores
promedios de corrientes para soluciones de glicerol en el intervalo de concentraciones
de 0062 mM y 175 mM Las barras de error corresponden a las desviaciones estaacutendar
de cada medida La ecuacioacuten de la recta obtenida por el meacutetodo de miacutenimos cuadrados
fue
[513]
donde Ic estaacute en nA y [Glicerol] en mM el valor del coeficiente de regresioacuten (R2)
obtenido fue de 09982
Las cifras de meacuterito para esta teacutecnica resultaron ser
Liacutemite de deteccioacuten 20 M
Liacutemite de cuantificacioacuten 60 M
Liacutemite de discriminacioacuten 15 M
Intervalo de linealidad 0060 mM ndash 175 mM
Tiempo s
0 500 1000 1500 2000
I
nA
0
50
100
150
200
Resultados y Discusioacuten
83
[Glicerol] mM
000 025 050 075 100 125 150 175 200
Ic
nA
0
50
100
150
200
Figura 522 Recta de calibracioacuten para glicerol utilizando el meacutetodo amperomeacutetrico descrito en el texto
Se muestran los valores promedios de corrientes liacutemite corregidas y las desviaciones estaacutendares de 3
lecturas independientes
Una vez que se preparoacute la pasta de carbono viacutetreo modificada con la enzima esta
resultoacute estable durante 10 semanas sin peacuterdida de actividad enzimaacutetica siempre que se
mantuviese seca a 4 degC Una vez que se ensambloacute el biosensor con el poliacutemero
electrodepositado pudo utilizarse durante al menos 8 horas consecutivas con una
peacuterdida de sensibilidad insignificante En efecto los cambios observados en las sentildeales
registradas de forma consecutiva se encontraron dentro del error intriacutenseco del meacutetodo
propuesto La estabilidad de un mismo biosensor durante diacuteas sucesivos se evaluoacute
realizando medidas de la misma solucioacuten y evaluando la relacioacuten sentildealruido la cuaacutel
disminuyoacute un 15 del valor original al tercer diacutea y un 50 al quinto diacutea de uso
554 Desarrollo de un biosensor a base de pasta de carbono viacutetreo y
nanotubos de carbono
Para reducir los tiempos de anaacutelisis se procuroacute disminuir el periacuteodo de
estabilizacioacuten de la corriente modificando el esquema original propuesto para el sensor
Para esto se modificoacute la pasta de carbono con nanotubos de carbono de paredes
muacuteltiples (Rubianes amp Rivas 2003) Seguacuten trabajos previos esta estrategia permite
disminuir el sobrepotencial asociado a la electrooxidacioacuten de la coenzima NADH
evitaacutendose el uso de un mediador soluble (Musameh 2002) Previo a su utilizacioacuten los
NTC fueron funcionarizados por carboxilacioacuten oxidativa siguiendo el protocolo
especificado en el punto 421 de la seccioacuten Materiales y Meacutetodos
Resultados y Discusioacuten
84
En la Fig 523 (derecha) se muestran las voltametriacuteas que se obtuvieron utilizando
un electrodo de trabajo relleno con pasta B (pasta de carbono viacutetreo modificada con
enzima GlDH al 2 en masa)
Figura 523 Voltamperogramas ciacuteclicos utilizando bioelectrodos de pasa de carbono B con GlDH
(derecha) y pasta C con GlDH y MWCNT (izquierda) En liacutenea puntuada se muestran las voltametriacuteas de
la solucioacuten NAD+ 05 mM (NH4)2SO4 25mM K2CO3 KHCO3 01 M pH 105 (blanco) En liacutenea
continua las voltametriacuteas de las mismas soluciones con el agregado de glicerol en concentracioacuten final 25
mM La velocidad de barrido fue 50 mV s-1
Se marcan los picos de corriente observados y el potencial de
pico
El sobrepotencial asociado a la electroxidacioacuten de la coenzima NADH en el
electrodo de pasta de carbono B es 70 mV menor que el informado por Wang y col Ep
= 082V sobre electrodos de carbono viacutetreo (Musameh 2002) Esta diferencia podriacutea
deberse a los distintos pH de trabajo o bien a alguna diferencia en las cualidades de la
superficie del electrodo
En la Fig 523 (izquierda) se muestran los resultados obtenidos con los electrodos
de pasta C pasta de carbono modificada con GlDH al 2 y con MWCNT al 10 en
masa En este caso vemos que el sobrepotencial asociado a la electroxidacioacuten de NADH
es 0180 V menor Ep = 057 V que el observado para la pasta B Esta diferencia
podemos atribuirla a las cualidades diferentes de las superficies del electrodo debida a la
presencia de los MWCNT Es de destacar que Wang y col en la oxidacioacuten del NADH
sobre la superficie de carbono viacutetreo modificado con MWCNT observaron dos
procesos oxidativos uno principal con un Ep de 033 V y otro secundario con Ep de
057 V que aparece como hombro del primero (ver Fig 524 reproducida de Wang y
col)
Ep = 075 V
Resultados y Discusioacuten
85
Figura 524 Reproducido de Musameh y col 2002 Voltamperogramas correspondientes a una solucioacuten 5
mM de coenzima NADH en solucioacuten tampoacuten fosfato 005 M pH 74 utilizando electrodos de trabajo de
pasta de carbono viacutetreo sin modificar (A) y modificado con MWCNT (B) Velocidad de barrido 50 mV s-1
En el voltagrama B puede apreciarse el pico principal y el secundario que aparecen como hombro del
primero
En este trabajo soacutelo se pudo identificar un uacutenico proceso oxidativo a 057 V Si bien
auacuten estamos investigando posibles causas que hayan originado esta diferencia es de
esperar que el pH sea un factor determinante ya que la oxidacioacuten de NADH a NAD+
involucra la perdida de un H+ Por otra parte en los voltagramas realizados con pasta C
se registroacute un importante aumento de las corrientes capacitivas (18 μA) en relacioacuten a
las voltametriacuteas donde se utilizaron electrodos de pasta sin MWCNT Este mismo
efecto pero en menor magnitud (55 μA) tambieacuten fue registrado por Wang y
colaboradores al trabajar con electrodo de carbono viacutetreo modificado con MWCNT
(Musameh 2002) Los resultados obtenidos por Wang y colaboradores y los de este
trabajo de Tesis se muestran comparativamente en la Tabla 510
Tabla 510 Resultados obtenidos por Musameh y col 2002 y los correspondientes a este trabajo
Musameh y col
2002 Este trabajo
Electrodo de
trabajo Cv
C v +
MWCNT Pasta B Pasta C
V barrido 50 mV s-1 50 mV s
-1
pH 74 105
Ep (V) 082 033
057 075 057
Aumento de la
I cap (μA) - 55 - 18
Resultados y Discusioacuten
86
Con estos resultados preliminares comenzamos los ensayos amperomeacutetricos para
cuantificar el glicerol remanente en los medios de cultivos de micobacterias Se llevaron
adelante distintos ensayos y nuevamente el inconveniente principal al que nos
enfrentamos fue que la respuesta no era estable en el tiempo En la Fig 525 se muestra
un amperograma obtenido con un bioelectrodo de pasta C y realizando agregados
sucesivos de un estaacutendar de glicerol 20 mM disuelto en medio Middelbrook 7H9
Con este nuevo esquema de trabajo no se logroacute acortar los tiempos de estabilizacioacuten
de la corriente Los algoritmos de correccioacuten de corriente de base que estaacuten
incorporados al programa GPES tampoco permitieron solucionar este inconveniente
Por este motivo se optoacute por utilizar teacutecnicas voltameacutetricas de pulso que en principio
permitiriacutean evitar este inconveniente
Tiempo s
0 100 200 300 400 500 600 700 800 900
I A
0
1
2
3
4
Figura 525 Amperograma obtenido con un bioelectrodo de pasta de carbono C trabajando a 05 V vs
AgAgCl A t=200 s de iniciada la lectura se agregaron 50 L de medio 7H9 y posteriormente se
realizaron agregados sucesivos de 50 L de medio 7H9 suplementado con glicerol 20 mM
5541 Ensayos de cuantificacioacuten de glicerol con el bioelectrodo desarrollado
utilizando teacutecnicas de pulso
Las teacutecnicas voltameacutetricas de pulso presentan la ventaja de permitir trabajar durante
tiempos muy reducidos en la zona de potencial donde la especie electroactiva cambia
su estado de oxidacioacuten produciendo la sentildeal analiacutetica
Se optoacute por ensayar la voltametriacutea de onda cuadrada para los futuros ensayos de
cuantificacioacuten y los experimentos preliminares procuraron establecer los valores maacutes
convenientes de los paraacutemetros relevantes de la teacutecnica como la amplitud de pulso el
escaloacuten de potencial y la frecuencia (punto 633 seccioacuten Experimentos Auxiliares)
Resultados y Discusioacuten
87
En una segunda serie de ensayos se buscoacute observar la dependencia de la corriente
de pico con la concentracioacuten de glicerol Para esto se realizaron ensayos
independientes En este esquema de trabajo surgioacute un inconveniente respecto del criterio
de medida de la corriente de pico ya que en ensayos independientes no se pudo
establecer una liacutenea de base comuacuten a todos los voltamperogramas
Se ensayaron distintos criterios para determinar una liacutenea de base apropiada como
se detalla en el punto 6331 de la seccioacuten Experimentos Auxiliares y en la Fig 526 se
muestran los voltamperogramas corregidos siguiendo el criterio elegido
Figura 526 Voltamperogramas de onda cuadrada (corregidos) obtenidos utilizando electrodos de pasta
de carbono viacutetreo modificada con GlDH y MWCNT Se muestran los voltagramas de las soluciones
blanco (helliphelliphelliphellip
) glicerol 5 mM (mdash mdash) 125 mM (mdashmdash) 25 mM (diamsdiamsdiams) 36 mM (- - -) y 50 mM (mdash bull mdash)
En la Fig 527 se muestran la dependencia de la corriente de pico con la
concentracioacuten de glicerol obtenida a partir de experimentos exploratorios uacutenicos para
cada concentracioacuten Resta a futuro repetir los experimentos para establecer el error
asociado a la metodologiacutea el intervalo dinaacutemico lineal y el liacutemite de deteccioacuten
Resultados y Discusioacuten
88
Figura 527 Dependencia de la corriente de pico registrada en la VOC en funcioacuten de la concentracioacuten de
glicerol en la celda electroquiacutemica
56 Validacioacuten de meacutetodos
De los meacutetodos desarrollados se seleccionaron aquellos dos que dieron resultados
maacutes fiables meacutetodo amperomeacutetrico utilizando un electrodo de trabajo de oro y el
meacutetodo amperomeacutetrico utilizando el biosensor con GlDH con mediador soluble Se
realizaron ensayos en paralelo con un meacutetodo alternativo ampliamente utilizado en
particular se utilizoacute un equipo comercial que utiliza tres enzimas y deteccioacuten
espectrofotomeacutetrica (Wiener lab) La Fig 528 muestra la concentracioacuten nominal versus
concentracioacuten predicha obtenida por las tres metodologiacuteas ensayando diferentes
diluciones de muestra y graficaacutendose el valor medio de 3 medidas independientes
Nominal mM
00 02 04 06 08 10
Pre
dic
ho
mM
00
02
04
06
08
10
Equipo comercial
Tip Au
Biosensor
Recta identidad
Figura 528 Concentracioacuten nominal vs predicha para las dos metodologiacuteas propuestas en este trabajo de
tesis y un meacutetodo enzimaacutetico disponible comercialmente
0
05
1
15
2
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
[Glicerol] (mM)
Ip (
uA
)
Resultados y Discusioacuten
89
Es evidente que los meacutetodos propuestos se correlacionan adecuadamente con la
recta identidad En la Fig 529 se muestran las tres regiones eliacutepticas de confianza
conjuntas (EJCR) para la pendiente y ordenada al origen En este caso puede apreciarse
que las tres elipses contienen el punto (0 1) lo que indica una buena correlacioacuten entre
los meacutetodos propuestos en el presente trabajo y un meacutetodo disponible comercialmente
Pendiente
08 09 10 11 12
Ord
enad
a al
ori
gen
-06
-04
-02
00
02
04
06
Equipo comercial
Tip Au
Biosensor
Punto (1 0)
Figura 529 Regiones eliacutepticas de confianza conjuntas para dos metodologiacuteas presentadas en este trabajo
de Tesis y un meacutetodo enzimaacutetico disponible comercialmente
En la Tabla 511 se presentan distintas metodologiacuteas publicadas en la literatura
actual en las que se referencia la cuantificacioacuten de glicerol ya sean biosensores
electroquiacutemicos u otra metodologiacutea El anaacutelisis de la Tabla 511 permite ver que la
determinacioacuten de glicerol en medios alcalinos sin presencia de interferentes puede ser
llevada a delante con metodologiacuteas econoacutemicas Debe ser considerado que cuando se
realiza la determinacioacuten de glicerol en muestras de biodiesel dicha cuantificacioacuten
requiere extraer el analito de la matriz como puede verse en los meacutetodos maacutes
recientemente propuestos (Bondioli amp Bella 2005 Silva amp Rocha 2010 Lima y col
2012 Tehrani amp Ghani 2012 Maruta amp Paixao 2012 Lourenccedilo amp Stradiotto 2009
Stradiotto y col 2009) Ya sea que se utilice deteccioacuten espectroscoacutepica o
electroquiacutemica siempre se requiere la extraccioacuten previa a la determinacioacuten del analito
Incluso la propuesta de Fernaacutendez Band y col que es el uacutenico meacutetodo que hace una
diferencia notable al comparar las cifras de meacuterito (LD 04 microM tiempo de anaacutelisis 4
min) implica un pretratamiento de la muestra (Lima y col 2012)
Resultados y Discusioacuten
90
Tabla 511 Comparacioacuten de meacutetodos para cuantificar glicerol propuestos recientemente Adaptado de
Faccendini y col 2014
Meacutetodo (Tratamientos
previos) LD
(microM)
Rango de
linealidad
(M)
Muestra
ensayada
Tiempo de
anaacutelisis
(min)
Reactivos o
accesorios
onerosos Referencia
Espectrofotomeacutetrico
(Extraccioacuten del analito) 22
4 times 10-5
a
2 times10-4
Biodiesel 20 - Bondioli amp
Bella 2005 Espectrofotomeacutetrico
(Extraccioacuten del analito) 10
5 times 10minus5
a
5 times 10minus4
Biodiesel 20 a 30 - Silva amp Rocha
2010
Espectrofluoromeacutetrico
(Extraccioacuten del analito) 04
1 times 10minus6
a
5 times 10minus4
Biodiesel 4 - Lima y
col2012
Espectrofotomeacutetrico
multienzimaacutetico No
informa 2 times 10
minus2 a
1 times 10minus1
Jugo de cantildea 5 GK GPO
ATP Kronka y col
2001
Espectrofotomeacutetrico
multienzimaacutetico 8
8 times 10minus6
a
25 times 10minus4
Suero
Humano 10
GK PK
LDH ATP
NAD+
Li y col 2001
Electroquiacutemico VPD
(Extraccioacuten del analito) 33
5 times 10minus4
a
12 times 10minus2
Biodiesel 15 - Tehrani y
Ghani 2012 Electroquiacutemico VC
(Extraccioacuten del analito) 3
33 times 10minus5
a
17 times 10minus3
Biodiesel 30 FIA Maruta y
Paixao 2012
Electroquiacutemico VC
(Extraccioacuten del analito) 25
33 times 10minus5
a
17 times 10minus3
Biodiesel 20 Cartucho de
C18
Lourenccedilo amp
Stradiotto
2009 Electroquiacutemico
amperomeacutetrico
(Extraccioacuten del analito)
No
informa 16 times 10
minus4 a
16 times 10minus3
Biodiesel 60 - Stradiotto y
col 2009
Electroquiacutemico VL
VPD amperomeacutetrico
(Extraccioacuten del analito) 10
23 times 10minus5
a
23 times 10minus4
Solucioacuten
Acuosa
pH=13 5
MWCNT
funcionalizad
os con Ag
Pop y col 2011
Electroquiacutemico
amperomeacutetrico
(Extraccioacuten del analito) 10
25 times 10minus5
a
20 times 10minus3
Solucioacuten
Acuosa
pH=13 8 -
Este Trabajo
de Tesis
Electroquiacutemico
amperomeacutetrico
(Extraccioacuten del analito) 50
5 times 10minus5
a
23 times 10minus2
Solucioacuten
Tampoacuten
Fosfato
5
(estimados) GO
Goriushnika y
col 2010
Biosensor
amperomeacutetrico 04
10 times 10minus6
a
10 times 10minus4
Jarabe de
cantildea 15
(estimados) GlDH NAD+
Aacutelvarez-
Gonzalez y
col 2000
Biosensor
amperomeacutetrico 04
1 times 10minus6
a
2 times 10minus5
Vino 3 GlDH DP
NAD+ Gamella y
col 2008
Biosensor
amperomeacutetrico 03
1 times 10minus6
a
1 times 10minus5
Vino 3 GK GPO
HRP ATP Gamella y
col 2008 Biosensor
amperomeacutetrico 4
5 times 10minus6
a
1 times 10minus4
Vino 5 GK GPO
ATP Ghica amp Brett
2006
Biosensor
amperomeacutetrico 20
70 times 10minus5
a
18 times 10minus3
Caldo
Middlebrook 10
GlDHb
NAD+ Este Trabajo
de Tesis
Del mismo modo el enfoque de Tehrani y Ghani que utilizan un electrodo de grafito
modificado con nanopartiacuteculas de nickel trabajando a pH = 13 realizan una extraccioacuten
previa de glicerol a partir de muestras de biodiesel (Tehrani amp Ghani 2012) En este
Resultados y Discusioacuten
91
caso el LD fue de 33 microM mientras que en este trabajo de Tesis utilizando el mismo
medio hemos conseguido un LD de 10 microM empleando electrodos de oro policristalino
Maruta y Paixao han propuesto recientemente un meacutetodo amperomeacutetrico usando un
electrodo de cobre que trabaja a 065 V vs AgAgCl adaptado en un sistema de FIA
(Maruta amp Paixao 2012) mientras que Lourenccedilo y Stradiotto informaron sobre un
meacutetodo electroquiacutemico que requiere la extraccioacuten acuosa del glicerol a partir de la
muestra y la purificacioacuten adicional por elucioacuten a traveacutes de un cartucho de C18 seguida
de una concentracioacuten por evaporacioacuten y finalmente un anaacutelisis mediante VC (Lourenccedilo
amp Stradiotto 2009) Tambieacuten otras propuestas informan sobre la determinacioacuten de
glicerol por amperometriacutea haciendo uso de electrodos modificados tales como
electrodos de diamante dopados con boro y modificados con nanopartiacuteculas de niacutequel
(Stradiotto y col 2009) y electrodos compuestos de nanotubos de carbono de pared
muacuteltiple funcionalizados con plata (Pop y col 2011) Si bien ambos meacutetodos se
presentan como uacutetiles se requieren diferentes pasos operativos para eliminar posibles
interferencias tales como otros alcoholes que podriacutean ser oxidados a los potenciales de
trabajo 065 V o 130 V (vs AgAgCl) respectivamente En este sentido nuestros
resultados obtenidos por amperometriacutea usando electrodos de oro en medio alcalino
acuoso (pH = 13) estaacuten en el mismo orden que los obtenidos por Pop y colaboradores
utilizando LSV (Pop y col 2011) sobre electrodos compuestos de nanotubos de
carbono de pared muacuteltiple funcionalizados con plata Efectivamente este uacuteltimo y
nuestra metodologiacutea mostraron las mejores cifras de meacuterito entre los meacutetodos
electroquiacutemicos de bajo costo que no consumen enzimas
Los meacutetodos enzimaacuteticos espectrofotomeacutetricos aunque no son laboriosos presentan
la desventaja del consumo relativamente elevado de enzima cada muestra necesita la
adicioacuten del costoso reactivo bioloacutegico ya que no puede ser reutilizado Tambieacuten los LD
de los meacutetodos espectrofotomeacutetricos enzimaacuteticos informados son generalmente
superiores a los que presentan los biosensores Puede antildeadirse que estos uacuteltimos
presentan generalmente el intervalo dinaacutemico lineal maacutes amplio en comparacioacuten con
otros enfoques ya sean electroquiacutemicos o espectrofotomeacutetricos Soacutelo la metodologiacutea de
flujo discontinuo con deteccioacuten fluoromeacutetrica propuesta por Fernaacutendez Band y col
(Lima y col 2012) muestra una sensibilidad en el mismo orden que el maacutes bajo de los
biosensores
En el anaacutelisis de los biosensores que se muestran en la Tabla 511 hay que destacar
que el propuesto por Pingarroacuten y col (Gamella y col 2008) muestra el LD y tiempo de
Resultados y Discusioacuten
92
anaacutelisis total maacutes bajo Para evaluar costos operativos se presenta en la Tabla 512 un
resumen comparativo de la cantidad y concentracioacuten de los reactivos onerosos
consumidos por biosensor o por anaacutelisis entre la propuesta de Pingarroacuten y col y la del
biosensor aquiacute propuesto
Tabla 512 Comparacioacuten entre el meacutetodo enzimaacutetico que mejores cifras de meacuterito presenta y el propuesto
en el presente trabajo de Tesis Adaptado de Faccendini y col 2014
GlDH
bisosensor Diaforasa
biosensor tetratiofulvaleno
biosensor NAD
+ por
anaacutelisis
Gamella y
col 2008 75 U 162 U 15x10-6
M 5x10-3
M Este Trabajo
de Tesis 23 U - - 5x10-4
M
Podemos afirmar que nuestra propuesta es menos costosa hecho importante a ser
evaluado cuando se va a analizar un gran nuacutemero de muestras Mediante la reduccioacuten de
la cantidad de GlDH el LD se elevoacute desde 04 hasta 20 microM aunque es adecuado auacuten
para detectar cambios de concentracioacuten de glicerol en el orden de 15 microM Al mismo
tiempo evitando el uso de diaforasas el tiempo total de anaacutelisis se extendioacute de 3 a 10
min En conjunto los resultados presentados confirman que los cambios introducidos a
los biosensores informados previamente en la literatura tales como el uso de soacutelo una
enzima en baja proporcioacuten la sustitucioacuten del mediador redox por el ferricianuro soluble
y trabajar con el cofactor NAD+ soluble proporciona un sistema fiable de bajo costo
para cuantificar el glicerol
Experimentos Auxiliares
Experimentos Auxiliares
94
6 Experimentos Auxiliares
61 Comparacioacuten de programas de prediccioacuten de epiacutetopes lineales reconocidos
por ceacutelulas B
AAPPred BcePred ABCPred BepiPred y Antigenic se ejecutaron en liacutenea En la
Tabla 61 se muestran los VPP medios (ver definicioacuten en seccioacuten Materiales y Meacutetodos
pag 11) que se obtuvieron al predecir epiacutetopes lineales reconocidos por ceacutelulas B de
todas las proteiacutenas enumeradas en la Tabla 62
Los resultados obtenidos indican que BcePred es el uacutenico programa de los
evaluados que muestra un VPP inferior al obtenido con la prediccioacuten al azar Tambieacuten
se obtuvo que soacutelo dos de los programas estudiados AAPPred y ABCpred predijeron
epiacutetopes con un VPP significativamente mayor al valor de VPP de un procedimiento de
identificacioacuten aleatoria Estos dos programas produjeron predicciones con valores
maacuteximos de 862 y 786 de VPP respectivamente
Tabla 61 Valores predictivos positivos promedio que se obtuvieron con cada uno de los programas
predictores con los que se trabajoacute
Programa
VPP
promedio
AAPPred 691
ABCPred 628
BcePred 309
BepiPred 453
Antigenic 419
Aleatorio 382
En base a estos resultados se trabajoacute con el programa AAPPred y se identificaron
las regiones que concentraban el mayor nuacutemero de epiacutetopes reconocidos por ceacutelulas B
de las proteiacutenas P22 P30 y P35 con el fin de expresar estos Angs como proteiacutenas
recombinantes y utilizarlos en el desarrollo de meacutetodos de diagnoacutestico de la
toxoplasmosis aguda
Experimentos Auxiliares
95
Tabla 62 Base de datos experimental proteiacutenas seleccionadas para este estudio Se indican el nombre de
la proteiacutena el coacutedigo de acceso NCBI la longitud total (en residuos de amino aacutecidos) el
nuacutemero de epiacutetopes reales determinados experimentalmente y la localizacioacuten de los epiacutetopes o
regiones antigeacutenicas Proteiacutenas tomadas de base de datos (A) BciPep (B) VIH Inmunologiacutea
Molecular base de datos o tomado de la literatura (veacutease el nuacutemero de referencia 17 para VP1
16 para la proteiacutena N y 18 para gliadina)
Proteiacutena
Coacutedigo
NCBI
Nordm de
residuos
Cantidad de
epiacutetopes
Localizacioacuten de los epiacutetopes o regiones
antigeacutenicas
MPT70 (A) NP_217391 193 2 31-70 100-120
MSP-1 (A) BAF622801 1693 3 29-39 1594-1611 1644-1662
Exotoxina
A (A) NP_249839 638 8
297-313 324-333 354-387 412-421 510-522
528-539 557-593 596-638
GAG1 (A) P20873 504 10
11-25 113-122 142-156 176-214 216-268
280-308 312-321 330-367 406-416 428-448
Gp160 (A) NP_057856 856 13
30-141 161-191 211-231 252-281 294-344
346-413 424-511 525-558 561-615 639-701
724-747 761-778 822-855
Pr55 (B) NP_579876 132 2 11-38 51-78
Rev (B) NP_057854 116 4 5-15 32-51 70-91 96-116
VP1 (17) ABC87248 781 12
31-41 55-65 85-95 151-161 292-392 316-326
493-500 529-539 547-554 571-578 667-707
712-722
Gliadin
(18) A27319 296 3 31-72 165-176 237-264
Proteiacutena N
(16) AAP13445 422 6 1-6 45-61 153-192 211-223 225-235 354-412
Proteasa
(B) CAB66012 99 2 1-7 36-47
62 Puesta a punto de ensayos de inmunoabsorcioacuten ligados a enzima con
deteccioacuten fotomeacutetrica
Previo al inicio de los ELISA de captura iniciamos una serie de pruebas preliminares
con el propoacutesito de
a) Diferenciar sueros de pacientes infectados de sueros de individuos sin infeccioacuten De
este modo se pretende verificar la potencial utilidad en diagnoacutestico de los antiacutegenos
propuestos corroborando que los procesos quiacutemicos llevados a cabo como por ej la
conjugacioacuten no eliminaron epiacutetopes claves
Experimentos Auxiliares
96
b) Minimizar la sentildeal en los ensayos sin suero (blanco de reactivos) es decir
disminuir el ruido de fondo asociado a interacciones inespeciacuteficas
A tales fines se realizaron ELISA indirectos utilizando los antiacutegenos recombinantes
obtenidos (marcados y sin marcar) adsorbidos sobre la placa se utilizaron sueros
tipificados y se reveloacute la presencia de IgG humana revelando con anticuerpos de cabra anti
IgG humana Los resultados obtenidos se detallan en la siguiente tabla
Tabla 63 Valores de absorbancia a 450 nm obtenidos en ELISA indirectos con deteccioacuten de IgGh con
conjugado anti IgG humana-HRP
Sueros P22C P22C-
biotina P35B
P35B -
biotina
Positivos
2 gt3 26 1900
3 2900 2 gt3
gt3 gt3 26 gt3
Negativos
13 1000 11 0800
06 0500 09 0700
11 1600 1 1000
Si bien los valores de absorbancia leiacutedos en todos los pocillos resultaron elevados
los sueros confirmados positivos dieron los valores maacutes altos de absorbancia mientras
que los sueros negativos dieron los valores maacutes bajos Las diferencias observadas entre
sueros confirmados positivos y sueros confirmados negativos permitieron asumir que
los antiacutegenos obtenidos son de posible utilidad en diagnoacutestico Ademaacutes no se
detectaron diferencias significativas entre los valores de absorbancia obtenidos
utilizando antiacutegenos marcados de aquellos obtenidos con los no marcados
permitieacutendonos pensar que la conjugacioacuten llevada a cabo no eliminoacute epiacutetopes claves
Los elevados valores de absorbancia obtenidos en este ensayo junto a otros estudios
preliminares sugieren que existe una elevada adsorcioacuten inespeciacutefica
621 Bloqueante a utilizar
Se ensayaron diversos agentes bloqueantes para minimizar las interacciones
inespeciacuteficas encontradas durante los experimentos preliminares y asiacute evitar las altas
sentildeales obtenidas en los ensayos control realizados sin suero (blanco de reactivos) y con
sueros confirmados negativos (blancos de muestra) Sobre placas comerciales de
poliestireno se procedioacute al bloqueo total con el agente bloqueante a ensayar y
posteriormente se realizoacute una incubacioacuten con y sin antiacutegeno P22C por duplicado
Finalmente se reveloacute con la enzima HPR-EAV que se une especiacuteficamente a biotina En
la Tabla 64 se muestran los valores de absorbancia a 450 nm
Experimentos Auxiliares
97
Tabla 64 Valores promedio de absorbancia a 450 nm obtenidos en los ensayos de bloqueo
450 nm Sin P22cBiot Con P22cBiot
Sin Bloqueante ------- 1162
Leche 1 0066 01445
Caseinato 1 00725 02425
Gelatina 1 00725 03925
BSA 1 00625 0192
BSA 1 Tween 002 00615 01515
En base a estos resultados se continuoacute con el uso de leche descremada como agente
bloqueante
622 Esquema A
Cuando se realizaron ELISA siguiendo el esquema A se ensayaron dos diluciones
de la HRP-EAV 12000 y 15000 Por otro lado se ensayaron distintas masas de
antiacutegenos P22C y P35B conjugados a biotina con los que se intentoacute revelar presencia
de IgM especiacuteficas Especiacuteficamente se ensayaron 2 02 y 002 g por pocillo de P35B
biotina y 5 2 02 y 002 g por pocillo de P22C biotina Con esto se buscoacute encontrar
las cantidades oacuteptimas de reactivos para poder llevar adelante estos ensayos A modo
ilustrativo en la Tabla 65 se muestra un ensayo representativo siguiendo el esquema A
Se informan solamente los valores de absorbancia a 450 nm obtenidos para sueros
provenientes de pacientes con infeccioacuten croacutenica (croacutenicos) aguda (agudos) y de
pacientes sin infeccioacuten (negativos)
Tabla 65 Valores de absorbancia a 450 nm obtenidos en ELISA siguiendo el esquema A Se muestran 3
cantidades de antiacutegeno revelador utilizadas 2 02 y 002 microg En este ensayo la dilucioacuten de la
enzima HRP-EAV fue 15000 y se utilizaron 100 microL por pocillo
Antiacutegenos
Sueros
P22C biotina ( g) P35B biotina ( g)
2 02 002 2 02 002
Negativos 0576 0294 0155 1071 0681 0566
0543 0335 0176 1079 0769 023
Croacutenicos 0469 0246 0135 103 069 0299
0514 0215 0111 0914 0567 0196
Agudos 0331 0181 0109 081 0574 0168
0555 0254 0139 0789 0391 0169
Experimentos Auxiliares
98
623 Esquema B
Cuando se realizaron ELISAs siguiendo el esquema B se ensayaron distintas masas
de antiacutegeno P22C y P35B absorbidas sobre las microplacas comerciales a saber 500
200 50 10 o 5 ng (disueltos en 100 L de solucioacuten tampoacuten carbonato pH 96) En todos
los casos se incuboacute 1h a 37 degC
Para la incubacioacuten con la proteiacutena conjugada a biotina se ensayaron 2 y 5 ug por
pocillo En la Tabla 66 se resumen los resultados obtenidos
Tabla 66 Valores de absorbancia a 450 nm obtenidos en ELISA siguiendo el esquema B Se muestran
los resultados obtenidos para dos cantidades distintas de antiacutegeno de captura (P22C) 10 y 50
ng junto a 2 cantidades de antiacutegeno revelador (P22C-biotina) utilizadas 2 y 5 microg En este
ensayo la dilucioacuten de la enzima HRP-EAV fue 12000 y se utilizaron 100 microL por pocillo
2 microg P22C biotina 5 microg P22C biotina
Masa de P22C
(ng)
Muestras
50 10 50 10
Agudos 0393 0303 0553 0450
0273 0335 0793 0367
Croacutenicos 0230 0398 0316 0345
0284 0291 0444 0493
Negativos 0392 0210 0380 0380
0286 0292 0314 0350
Sin suero 0367 0468 0415 0411
0327 0358 0468 0536
Sin Prot conjugada a
biotina ni sueros
0102 0087 0128 0079
0131 0095 0116 0104
Los resultados obtenidos indicaron que para lograr una mejor discriminacioacuten de las
muestras es conveniente utilizar mayor cantidad de masa de antiacutegeno de captura (P22C)
depositada en el pocillo Por otro lado 5 microg de antiacutegeno revelador (P22C-biotina) por
pocillo contribuyoacute a aumentar la discriminacioacuten entre las muestras sin incrementar
significativamente el ruido de fondo
Experimentos Auxiliares
99
63 Ensayos electroquiacutemicos
631 Determinacioacuten del aacuterea real de un electrodo
6311 Meacutetodo de la adsorcioacuten de O2
Se realizaron barridos de potencial como se indica en el punto 41931 de la
seccioacuten Materiales y Meacutetodos La Fig 61 muestra un voltamperograma tiacutepico obtenido
Con el valor de la carga asociada a la desorcioacuten del oacutexido de oro pudo determinarse el
valor de aacuterea electroactiva del electrodo de trabajo utilizado como se indica en el punto
41931
E V
04 06 08 10 12 14 16
I
A
-15e-5
-10e-5
-50e-6
00
50e-6
Figura 61 Voltamperograma ciacuteclico tiacutepico obtenido con electrododos de oro en medio H2SO4 05 M
velocidad de barrido 50 mV s-1
Se indica en color turquesa el pico de desorcioacuten del oacutexido de oro la carga
(Q) obtenida del aacuterea encerrada en la curva se utilizoacute para determinar el aacuterea real de los electrodos de oro
previamente a los ensayos
6312 Voltametriacutea ciacuteclica a distintas velocidades
Se realizaron barridos de potencial a distintas velocidades como se indica en el
punto 41932 de la seccioacuten Materiales y Meacutetodos La Fig 62 muestra los voltagramas
tiacutepicos obtenidos en (A) y en (B) la dependencia de la corriente de pico Ip con la raiacutez
cuadrada de la velocidad de barrido Con el valor de la pendiente de la recta obtenida
por regresioacuten lineal pudo determinarse el valor de aacuterea electroactiva del electrodo de
trabajo utilizado como se indica en el punto 41932 habieacutendose utilizado un
coeficiente de difusioacuten del Fe(CN)63-
de 0762 cm2 s
-1 (Sawyer amp Roberts 1974)
Experimentos Auxiliares
100
E V
-02 -01 00 01 02 03 04 05 06
I
A
-20e-4
-10e-4
00
10e-4
20e-4
Figura 62 A) Voltametriacuteas ciacuteclicas de Fe(CN)63 1 mM en medio KCl 01 M a distintas velocidades de
barrido utilizando como electrodo de trabajo el biosensor amperomeacutetrico para evaluacioacuten de infeccioacuten
toxoplaacutesmica La flecha indica la direccioacuten de barrido B) Dependencia de Ip (en valores absolutos) con la
raiacutez de la velocidad de barrido el valor de pendiente de la recta de regresioacuten se utilizoacute para determinar el
aacuterea real del electrodo de trabajo
632 Cubierta del biosensor selectivo para glicerol y soluciones amortiguadoras
Se ensayaron distintos poliacutemeros para cubrir el biosensor de pasta de carbono B
utilizamos poliacutemeros de 4-vinilbenzilimine copolimerizados con cloruro de 4-
vinilbencil-trietilamonio y sulfonato de vinilfenilo (portadores de carga neta positiva y
negativa respectivamente) Si bien los poliacutemeros permitiacutean operar con complejos de
hierro utilizados como mediadores redox (Fe(CN)63-
y ferrocenometanol) no resultaron
uacutetiles en el ensamblado del biosensor por el elevado ruido de fondo que generaron
Se evaluaron distintas soluciones amortiguadoras de pH como fosfatos y
amoniacuteacoamonio Se optoacute por las soluciones de carbonato porque estas resultaron maacutes
sencillas de preparar y manipular que las amoniacales y presentaron mayor capacidad
reguladora en el pH oacuteptimo de la enzima GlDH que las de fosfato
633 Ensayos preliminares de voltametriacuteas de onda cuadrada
Los ensayos preliminares de voltametriacutea de onda cuadrada consistieron en
establecer los valores maacutes convenientes de la amplitud de pulso el escaloacuten de potencial
y la frecuencia para los futuros ensayos de cuantificacioacuten Se realizaron los voltagramas
en tres series de ensayos a seis valores de frecuencia 10 20 30 40 60 y 70 Hz
Los valores de salto de potencial ( ES) y amplitud de pulso ( E) utilizados en las
tres series de ensayos realizados se resumen en la siguiente tabla
(velocidad barrido)12 V12 s-12
006 008 010 012 014 016 018 020 022 024
Ip
A
40e-5
60e-5
80e-5
10e-4
12e-4
14e-4
16e-4
18e-4
20e-4
Experimentos Auxiliares
101
Tabla 67 Valores de salto de potencial y amplitud de onda cuadrada utilizados en los ensayos
voltameacutetricos
Serie 1 Serie 2 Serie 3
ES (mV) 5 5 10
E (mV) 25 50 50
En las 3 series de ensayos se observoacute que al aumentar la frecuencia la corriente de
pico no se incrementaba y el pico de corriente se deformaba aumentando
considerablemente el ruido Las mejores relaciones sentildealruido en las tres series de
ensayos se obtuvieron trabajando a 10 Hz Por su parte cuando se utilizoacute un escaloacuten de
potencial de 10 mV el pico de corriente se deformoacute levemente por lo que se optoacute por
trabajar con un ES = 5 mV Cuando la amplitud del pulso fue 50 mV se obtuvieron
mayores intensidades de corriente sin deformacioacuten de pico escogieacutendose en
consecuencia este valor En la Fig 63 se muestran los voltamperogramas obtenidos en
los ensayos de la serie 2 a una frecuencia de 10 Hz
Figura 63 Voltagramas de onda cuadrada obtenidos utilizando bioelectrodos de pasta de carbono viacutetreo
modificada con GlDH y MWCNT En liacutenea clara se muestra el voltagrama de la solucioacuten NAD+ 05 mM
(NH4)2SO4 25 mM K2CO3 KHCO3 100 mM pH 105 con medio Middelbrook 7H9 Superpuestos se
detallan los voltagramas de la misma solucioacuten luego del agregado de glicerol 100 M para llevar a
concentracioacuten final 25 mM (- - -) y 50 mM (____
)
6331 Seleccioacuten de un meacutetodo apropiado para establecer la liacutenea de base
Se buscoacute establecer una liacutenea de base para corregir los voltagramas obtenidos
utilizando algoritmos presentes en el programa GPES Se intentoacute con algoritmos de
correccioacuten que permiten establecer una liacutenea polinoacutemica ad-hoc para cada voltagrama
utilizando entre 2 y 5 puntos de la curva experimental Sin embargo las sentildeales
corregidas presentaban picos de corrientes con valores de ancho a la altura media Wfrac12
entre 0180 y 0220 V valores que resultan elevados comparados con 0123 Vn el valor
de referencia para este paraacutemetro en VOC donde n es el nuacutemero de electrones
Experimentos Auxiliares
102
intercambiados en la reaccioacuten Finalmente a cada VOC se les restoacute la VOC del blanco
buscaacutendose el pico de corriente con un algoritmo de buacutesqueda semiautomaacutetica del
programa GPES con una liacutenea de base recta y marcando manualmente el inicio y final
del pico establecieacutendose los mismos valores de potencial de inicio y finalizacioacuten del
pico de corriente en todos los voltamperogramas De este modo se obtuvieron picos
cuyos Wfrac12 eran proacuteximos al valor teoacutericamente predicho
Conclusiones
Conclusiones
104
7 Conclusiones
1- Se pudo encontrar cual de los programas de libre acceso para predecir epiacutetopes
lineales reconocidos por ceacutelulas B es el maacutes conveniente al momento de seleccionar
antiacutegenos con fines diagnoacutesticos
2- Se pudieron clonar expresar en forma soluble y marcar con biotina fragmentos
de antiacutegenos de toxoplasmosis de fase aguda que presentan alta concentracioacuten de
determinantes antigeacutenicos
3- Se verificoacute la utilidad de los antiacutegenos obtenidos para su posterior uso en el
ensamblado de bioelectrodos para diagnoacutestico de infeccioacuten aguda de toxoplasmosis
4- Se pudo cuantificar glicerol en muestras sencillas con un electrodo versaacutetil de
oro policristalino por medio de una metodologiacutea amperomeacutetrica a 01 V en medio
NaOH 01 M y con un tiempo de anaacutelisis de 8 min liacutemite de deteccioacuten 10 microM y un
intervalo de linealidad de 0024 a 200 mM
5- Se pudo cuantificar glicerol en medios de cultivo de micobacterias El meacutetodo
consiste en una amperometriacutea que emplea un bioelectrodo selectivo para glicerol
compuesto de pasta de C modificada con glicerol deshidrogenasa y lleva un tiempo de
anaacutelisis de 10 min liacutemite de deteccioacuten 20 microM y un rango de linealidad de 0060 a 175
mM Este meacutetodo podriacutea en un futuro ser uacutetil para identificar muestras de pacientes con
tuberculosis activa en un menor tiempo de anaacutelisis al actualmente empleado
6- Los meacutetodos para cuantificar glicerol aquiacute presentados fueron validados frente
a un equipo enzimaacutetico disponible comercialmente
Bibliografiacutea
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Iacutendice
v
553 Biosensor amperomeacutetrico a base de pasta de carbono viacutetreo
modificada 81
554 Desarrollo de un biosensor a base de pasta de carbono viacutetreo y
nanotubos de carbono 83
5541 Ensayos de cuantificacioacuten de glicerol con el bioelectrodo
desarrollado utilizando teacutecnicas de pulso 86
56 Validacioacuten de meacutetodos 88
6 Experimentos Auxiliares 94
61 Comparacioacuten de programas de prediccioacuten de epiacutetopes lineales reconocidos
por ceacutelulas B 94
62 Puesta a punto de ensayos de inmunoabsorcioacuten ligados a enzima con
deteccioacuten fotomeacutetrica 95
621 Bloqueante a utilizar 96
622 Esquema A 97
623 Esquema B 98
63 Ensayos electroquiacutemicos 99
631 Determinacioacuten del aacuterea real de un electrodo 99
6311 Meacutetodo de la adsorcioacuten de O2 99
6312 Voltametriacutea ciacuteclica a distintas velocidades 99
632 Cubierta del biosensor selectivo para glicerol y soluciones
amortiguadoras 100
633 Ensayos preliminares de voltametriacuteas de onda cuadrada 100
6331 Seleccioacuten de un meacutetodo apropiado para establecer la liacutenea
de base 101
7 Conclusiones 104
8 Bibliografiacutea 106
Resumen
vi
1 Resumen
Este trabajo de Tesis se orientoacute al desarrollo de meacutetodos analiacuteticos alternativos a los
hoy vigentes que faciliten la determinacioacuten de compuestos de intereacutes tanto para
diagnoacutestico cliacutenico como para la industria de combustibles alternativos Se realizaron
aportes para tres situaciones de relevancia diagnoacutestico de toxoplasmosis tuberculosis y
evaluacioacuten de calidad de biodiesel
La toxoplasmosis es una parasitosis causada por Toxoplasma gondii que afecta a
humanos sin generar complicaciones excepto cuando los infectados son
inmunodeprimidos o mujeres embarazadas que no cursaron previamente la enfermedad
En este caso el paraacutesito puede atravesar placenta generando infeccioacuten congeacutenita del
feto pudiendo producirle graves consecuencias que pueden llegar a la muerte Una de
las teacutecnicas de diagnoacutestico utiliza el ensayo de inmunoadsorcioacuten ligado a enzima
permitiendo la deteccioacuten de anticuerpos especiacuteficos contra el paraacutesito los cuales son
indicadores de existencia de infeccioacuten No obstante para detectar toxoplasmosis aguda
al diacutea de hoy se carece de una estandarizacioacuten confiable principalmente en la
preparacioacuten del antiacutegeno Por ello en este trabajo se procuroacute identificar regiones donde
se codificaraacuten algunos marcadores de fase aguda que concentraraacuten una alta proporcioacuten
de determinantes antigeacutenicos para luego clonarlas expresarlas como proteiacutenas
recombinantes marcarlas con biotina y asiacute utilizarlas como sistema de revelado de
anticuerpos especiacuteficos contra proteiacutenas de T gondii Los inmunoensayos aquiacute
presentados proponen una metodologiacutea que permitiraacute en un futuro distinguir sueros
provenientes de individuos con infeccioacuten aguda de aquellos con infeccioacuten croacutenica o no
infectados
La tuberculosis es una enfermedad infecto-contagiosa causada por la bacteria
Mycobacterium tuberculosis Su diagnoacutestico se basa en una serie de estudios que
finaliza con la identificacioacuten del agente etioloacutegico en cultivos obtenidos a partir de
esputo Esta identificacioacuten puede demorar aproximadamente dos meses debido al
prolongado tiempo de replicacioacuten de la micobacteria Esto conlleva la potencialidad de
contagio a individuos sanos y un compromiso importante de la salud del infectado
Uacuteltimamente se han desarrollado teacutecnicas indirectas de deteccioacuten de M tuberculosis
utilizando el bacterioacutefago D29 capaz de infectar especiacuteficamente micobacterias Es una
metodologiacutea donde se facilita la replicacioacuten del fago en la muestra proveniente del
paciente para luego evaluar el tiacutetulo de fagos liberados infectando un cultivo testigo de
Resumen
vii
Micobacterium smegmatis micobacteria de replicacioacuten raacutepida Siendo el glicerol fuente
de carbono en cultivos de micobacterias se planteoacute determinar su concentracioacuten
remanente como meacutetodo de evaluar integridad de M smegmatis establecieacutendose asiacute una
medida indirecta de la previa presencia de M tuberculosis en la muestra problema
Ademaacutes el glicerol es el principal subproducto en la elaboracioacuten del biodiesel y su
concentracioacuten es indicativa de la calidad del combustible transformaacutendose en analito
relevante para la industria de energiacuteas alternativas a la derivada del petroacuteleo
Se desarrollaron y validaron dos meacutetodos amperomeacutetricos de cuantificacioacuten de
glicerol a) Con electrodo de oro en NaOH 01 M aplicable a medios acuosos (LD 10
microM intervalo lineal 0024 a 200 mM) b) Con bioelectrodo de pasta de C modificada
con glicerol deshidrogenasa aplicable a medios complejos como cultivos bacterianos
(LD 20 M intervalo lineal 0060 a 175 mM)
Resumen
viii
1 Summary
This Thesis work was oriented to the development of analytical methods alternative
to those currently used to facilitate the identification of compounds of interest for both
clinical diagnosis and the alternative fuel industry Contributions of relevance to three
situations were performed Diagnosis of toxoplasmosis tuberculosis and the assessment
of biodiesel quality
Toxoplasmosis is a parasitic disease caused by Toxoplasma gondii which does not
bring complications in people except when the infected individual is an
immunocompromised patient or pregnant women who have not previously suffered
from the illness In this case the parasite can cross the placenta producing congenital
infection of the fetus and potentially causing serious consequences including death
One of the techniques used to its diagnosis is the enzyme-linked immunosorbent assay
allowing the detection of parasite-specific antibodies which are indicators of the
infection However this technique aimed to detect acute toxoplasmosis nowadays lacks
of reliable standardization particularly in the preparation of the antigen Therefore this
study focused on identifying regions encoding several markers of acute phase which
highly concentrated antigenic determinants to clone and express them as recombinant
proteins subsequently label them with biotin and thus use them as developing system of
specific antibodies against T gondii proteins The immunoassays presented here
propose a methodology which will allow in the future distinguishing sera from
individuals with acute infection of those with chronic infection or uninfected
Tuberculosis is an infectious and contagious disease caused by the bacterium
Mycobacterium tuberculosis Its diagnosis is based on a series of studies which
eventually identify the etiologic agent in cultures obtained from sputum This
identification can take about two months due to the extensive mycobacteria replication
time This leads to the potential contagion of healthy individuals and a major
commitment to the health of the infected patient Recently indirect M tuberculosis
detection techniques have been developed They use D29 bacteriophage which is able
to specifically infect mycobacteria The methodology allows phage replication in the
patientrsquos sample and then evaluates the number of released phages by infecting a
control culture of Mycobacterium smegmatis a short-term replicable mycobacteria As
glycerol is the carbon source commonly used in mycobacteria culture this work
proposes determining its residual concentration as a method of evaluating integrity of
Resumen
ix
M smegmatis thus establishing an indirect measurement of the previous presence of M
tuberculosis in the sample
Furthermore glycerol is the main by-product in biodiesel production and its
concentration is an indicator of the fuel quality becoming a relevant analyte to the
energy industry alternative to that derived of petroleum
Two amperometric methods for glycerol quantitation were developed and
validated a) Using a gold electrode in 01 M NaOH medium useful for simple aqueous
solutions (LD 10 microM linear range from 0024 to 200 mM) b) using a carbon paste
bioelectrode modified with glycerol dehydrogenase useful for complex media such as
bacterial cultures (LD 20 microM linear range 0060 to 175 mM)
Publicaciones
x
Publicaciones
Los resultados parciales del presente trabajo de Tesis han dado lugar a las
siguientes publicaciones
Trabajos en revistas internacionales
1- Costa J G Faccendini P L Sferco S J Lagier C M Marcipar I S
Evaluation and comparison of the ability of online available prediction programs to
predict true linear B-cell epitopes Protein amp Peptide Letters (2013) 20(6)724-30
2- Faccendini P L Ribone M E Lagier C M Selective application of two
rapid low-cost electrochemical methods to quantify glycerol according to the sample
nature Sensors and Actuators B (2014) 193 142ndash 148
Trabajos en congresos
1- Muntildeoz A Faccendini P L Ribone M E Lagier C M Oxidacioacuten
electroquiacutemica de polialcoholes sustrato de sistemas enzimaacuteticos bacterianos Estudio
de las condiciones para su cuantificacioacuten V Congreso Argentino de Quiacutemica Analiacutetica
Bahiacutea Blanca Noviembre de 2009
2- Costa J G Faccendini P L Carral L Kaufer F Lagier C M Marcipar I
S Evaluacioacuten de dos regiones de la Proteiacutena P35 de Toxoplasmama gondii para el
diagnostico de fase aguda de la toxoplasmosis Ascochinga Coacuterdoba Octubre de 2010
3- Costa J G Faccendini P L Lagier C M Marcipar I S Modelado y
prediccioacuten de los epiacutetopes del antigeno P22 de Toxoplasma gondii 2do Congreso de
Bioinformaacutetica y Biologiacutea Computacional Coacuterdoba Mayo de 2011
4- Faccendini P L Costa J G Ribone M E Marcipar I S Lagier C M
Ensamblado de un bioelectrodo econoacutemico para la deteccioacuten de glicerol en medios
altamente complejos 6deg Congreso Argentino de Quiacutemica Analiacutetica Santa Fe
Septiembre de 2011
5- Faccendini P L Costa J G Ribone M E Marcipar I S Lagier C M
Desarrollo y optimizacioacuten de un meacutetodo para la cuantificacioacuten de glicerol en matrices
complejas 6deg Congreso Argentino de Quiacutemica Analiacutetica Santa Fe Septiembre de 2011
Publicaciones
xi
6- Costa J G Perotti J Faccendini P L Lagier C M Mancipar I S
Optimization of the acute toxoplasmosis immunodiagnostic during the pregnancy
Workshop Fronteras en Biociencias Ministerio de Ciencia Tecnologiacutea e Innovacioacuten
Productiva Embajada Alemana Ciudad Autoacutenoma de Buenos Aires Abril de 2012
7- Costa J G Perotti J Faccendini P L Dure A Carral L Kaufer F Lagier
C M Mancipar I S Evaluacioacuten de diferentes regiones de las proteiacutenas p22 p30 y p35
para diagnoacutestico de la fase aguda de la toxoplasmosis XXV Reunioacuten Anual de la
Sociedad Argentina Protozoologiacutea 2012 Ciudad Autoacutenoma de Buenos Aires Agosto
de 2012
8- Costa J G Faccendini P L Sferco S J Lagier C M Mancipar I S
Comparison of the ability to predict true linear B-cell epitopes by on-line available
prediction programs 3er congreso de la sociedad argentina de bioinformaacutetica y biologiacutea
computacional Paranaacute Septiembre de 2012
9- Faccendini P L Costa J G Ribone M E Marcipar I S Lagier C M
Desarrollo de un sistema electroquiacutemico para evaluar infeccioacuten toxoplaacutesmica 7deg
Congreso Argentino de Quiacutemica Analiacutetica Mendoza Octubre de 2013
Abreviaturas y Siacutembolos
xii
Abreviaturas y Siacutembolos
AD Aglutinacioacuten Directa
ADN Aacutecido desoxiribonucleico
Ac(s) Anticuerpo(s)
Ang(s) Antiacutegeno(s)
D Coeficiente de difusioacuten
DHA 13 dihidroxiacetona
DMSO Dimetil sulfoacutexido
DO Densidad oacuteptica
DT Dye Test con azul de metileno (Reaccioacuten de Sabiacuten Feldman)
EDTA Aacutecido etilendiaminotetraaceacutetico
ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay (Ensayo de inmunoadsorcioacuten ligado
a enzima)
F Constante de Faraday
Frecuencia
GlDH Glicerol deshidrogenasa
HAI Hemoaglutinacioacuten indirecta
HEPES Aacutecido 4-(2-hydroxietil)-1-piperazina etano sulfoacutenico
HRP Horse radish peroxidase (Peroxidasa de raacutebano picante)
I Corriente eleacutectrica
IFI Inmunofluorescencia indirecta
IgA Inmunoglobulina A
IgG Inmunoglobulina G
IgE Inmunoglobulina E
IgM Inmunoglobulina M
IgM-IFI Inmunofluorescencia indirecta de IgM (Prueba de Remington)
IPTG Isopropil- -D-tiogalactopiranoacutesido
ISAGA Ensayo aglutinante de inmunoabsorcioacuten
LB Medio Luria-Bertani
LC Liacutemite de cuantificacioacuten
LD Liacutemite de deteccioacuten
MWCNT Multi-walled carboacuten nanotubes (Nanotubos de carbono de paredes
muacuteltiples)
Abreviaturas y Siacutembolos
xiii
N nuacutemero de moles de especie reducida u oxidada
OMS Organizacioacuten Mundial de la Salud
P35 Antiacutegeno de superficie de T gondii de 35 kDa de peso
PBS Phosphate buffer salin (Solucioacuten tampoacuten fosfato salino)
PCR Polimerasa chain reaction (Reaccioacuten en cadena de la polimerasa)
pET32a Vector plasmiacutedico
Q Carga eleacutectrica circulante
SAG1 Surface antigen 1 (Antiacutegeno de superficie 1 o antiacutegeno P30 de T gondii)
SAG2 Surface antigen 2 (Antiacutegeno de superficie 2 o antiacutegeno P22 de T gondii)
SDS Dodecil sulfato de sodio
TB Tuberculosis
TRX Tioredoxina
VBL Voltametriacutea de barrido lineal
VC Voltametriacutea ciacuteclica
VPD Voltametriacutea de pulso diferencial
Introduccioacuten
Introduccioacuten
1
2 Introduccioacuten
21 Toxoplasmosis
211 Generalidades
La toxoplasmosis es una enfermedad causada por el paraacutesito protozoario
Toxoplasma gondii que infecta animales herbiacutevoros carniacutevoros y omniacutevoros dentro de
los cuales se encuentra el hombre Estaacute ampliamente extendida por todo el mundo y su
incidencia y prevalencia variacutean mucho seguacuten las zonas geograacuteficas los haacutebitos
alimentarios el tipo de trabajo la higiene ambiental y la presencia o no de gatos
infectados (Atias 1998 Martiacuten-Hernaacutendez 2004) Es una zoonosis que afecta a los
humanos a traveacutes de formas infectivas producidas durante el ciclo bioloacutegico que se
desarrolla uacutenicamente en gatos y otros feacutelidos Dependiendo de la localizacioacuten
geograacutefica entre 15 y 85 de la poblacioacuten adulta mundial presenta infeccioacuten croacutenica
(Fuentes y col 2001)
Usualmente la principal viacutea de transmisioacuten de esta parasitosis es la oral por
ingestioacuten de carnes crudas o poco cocidas contaminadas con quistes o por la ingestioacuten
de ooquistes presentes en agua o alimentos contaminados con heces de gato Son menos
frecuentes las viacuteas de transmisioacuten parenteral respiratorias mucosal (conjuntival)
cutaacutenea y por transfusioacuten de sangre o trasplante de oacuterganos La transmisioacuten por viacutea
transplacentaria puede ocurrir cuando la embarazada padece la primoinfeccioacuten durante
el curso del embarazo aunque se han descripto casos raros de infeccioacuten congeacutenita por
toxoplasmosis materna anterior al embarazo (Martiacuten-Hernaacutendez 2004 Centers of
Diseases Control and Prevention (CDC) paacutegina web a)
Durante la infeccioacuten pueden distinguirse dos etapas A) Aguda Al breve tiempo de
ingerir ooquistes esporulados eacutestos se transforman en taquizoiacutetos ingresan a la ceacutelula
del hueacutesped y comienzan a dividirse en forma asexual hasta que la ceacutelula se lisa
liberando asiacute la progenie y ocasionando la parasitemia Posteriormente el taquizoiacuteto
evoluciona a bradizoiacuteto cuya multiplicacioacuten es lenta Se produce la invasioacuten de los
oacuterganos por viacutea linfaacutetica o hemaacutetica siendo los oacuterganos maacutes comprometidos los
muacutesculos esqueleacutetico y cardiacuteaco asiacute como cerebro y ojos B) Croacutenica En la medida que
evoluciona la defensa del hueacutesped desaparecen los paraacutesitos extracelulares limitaacutendose
la divisioacuten intracelular y quedando las formas resistentes principalmente en el sistema
nervioso central y muacutesculo esqueleacutetico Por lo general esta etapa es latente pero puede
Introduccioacuten
2
activarse por la ruptura de los quistes tisulares (Fuentes y col 2001 Trabattoni y col
2008)
212 Toxoplasma gondii
El Toxoplasma gondii es un paraacutesito intracelular obligado Su ubicacioacuten
taxonoacutemica se detalla en la Tabla 21
Tabla 21 Ubicacioacuten taxonoacutemica del T gondii
Reino Protista
Sub-reino Protozoa
Phylum Apicomplexa
Clase Sporozoea
Sub-clase Coccidea
Orden Eucoccidiia
Sub-orden Eimeriina
Familia Sarcocystidae
Sub-familia Toxoplasmatinae
Geacutenero Toxoplasma
Especie gondii
Durante el ciclo de vida del T gondii se distinguen tres formas a) los taquizoiacutetos
b) los bradizoiacutetos (o quistes tisulares) y c) los ooquistes Los taquizoiacutetos (o trofozoiacutetos)
son la forma proliferativa y de reproduccioacuten raacutepida dentro de la ceacutelula del hueacutesped
durante la fase aguda que posteriormente deviene en la formacioacuten de un pseudoquiste
Tiene forma de medialuna y mide de 4 a 7 μm de ancho Estaacute recubierto por un sistema
de membranas constituido por una membrana doble interna y una externa interrumpida
en dos puntos El taquizoiacuteto es afectado por anticuerpos (Acs) especiacuteficos y faacutermacos y
se destruye en condiciones ambientales adversas como congelamiento-
descongelamiento desecacioacuten y bajo pH (por ejemplo el de los jugos gaacutestricos) Los
quistes tisulares son redondeados de pared elaacutestica miden de 10 a 200 μm y pueden
contener hasta 3000 paraacutesitos denominados bradizoiacutetos Estas formas no son afectadas
por Acs ni faacutermacos pero pueden ser destruidos por calentamiento congelamiento-
descongelamiento y por desecacioacuten Cuando estos quistes son ingeridos los bradizoiacutetos
resistentes son liberados por la accioacuten gaacutestrica y pueden invadir la mucosa
gastrointestinal Los ooquistes son estructuras ovoides de 10 a 12 μm de diaacutemetro y son
eliminadas en la materia fecal del gato Recieacuten emitidos no son infectivos pero bajo
condiciones de temperatura humedad y presencia de oxiacutegeno esporulan tornaacutendose
Introduccioacuten
3
infectivos y resistentes por maacutes de un antildeo en el suelo y dos antildeos en el agua (Atias
1998 Perotti 2007)
La Fig 21 describe el ciclo de vida del paraacutesito Los uacutenicos hueacutespedes definitivos
conocidos de T gondii son miembros de la familia Felidae (por ejemplo gatos
domeacutesticos) Los ooquistes no esporulados son liberados en las heces del felino Los
ooquistes tardan entre 1 y 5 diacuteas en esporular en el ambiente y volverse infectivos Los
hueacutespedes intermediarios se infectan al ingerir tierra agua o plantas contaminadas con
los ooquistes Los ooquistes se transforman en taquizoiacutetos al breve tiempo de ser
ingeridos Estos taquizoiacutetos se localizan en los tejidos musculares y el sistema nervioso
y evolucionan a bradizoiacutetos formando los quistes tisulares (hiacutesticos) Los felinos se
infectan luego de ingerir la carne de hueacutespedes intermediarios que poseen quistes
tisulares o por ingestioacuten de los ooquistes esporulados Los animales de caza y los
criados para consumo humano tambieacuten pueden infectarse por ingestioacuten de ooquistes
esporulados En el hueacutesped humano los paraacutesitos forman quistes en los tejidos y suele
encontrarse generalmente en el muacutesculo esqueleacutetico el miocardio cerebro y ojos donde
pueden permanecer durante toda la vida del hueacutesped (Paacutegina web del CDC)
Figura 21 Ciclo de vida de T gondii El hueacutesped definitivo son miembros de la familia Felidae los
demaacutes hueacutespedes (incluido el hombre) se infectan accidentalmente y no son necesarios para completar el
ciclo de vida del paraacutesito Adaptado de httpwwwdpdcdcgovdpdxHTMLToxoplasmosishtm
Introduccioacuten
4
213 Diagnoacutestico
Puesto que las infecciones por T gondii en individuos inmunocompetentes son por
lo general asintomaacuteticas o presentan siacutentomas imperceptibles su diagnoacutestico se basa
principalmente en pruebas de laboratorio La toxoplasmosis no suele generar
complicaciones excepto en 2 situaciones cuando se infectan individuos
inmunodeprimidos y cuando se infectan por primera vez mujeres embarazadas En este
uacuteltimo caso el paraacutesito puede infectar al feto atravesando la placenta y generando la
infeccioacuten congeacutenita Las probabilidades de dantildear al feto o al nintildeo luego de nacer
dependeraacuten del trimestre en que suceda la infeccioacuten (Atias 1998 Martiacuten-Hernaacutendez
2005) Tanto en inmunocomprometidos como en el recieacuten nacido la infeccioacuten puede
producir graves consecuencias Es por ello que en estos casos asiacute como en la
embarazada el diagnoacutestico cobra particular relevancia (Remington y col 1995)
2131 Meacutetodos de diagnoacutestico
La infeccioacuten puede diagnosticarse por meacutetodos directos que consisten en la
identificacioacuten de las estructuras parasitarias (por un estudio histopatoloacutegico para lo cual
es necesario realizar biopsias puncioacuten de ganglios o cortes histoloacutegicos) o la
identificacioacuten de ADN del paraacutesito (a traveacutes de una reaccioacuten en cadena de la
polimerasa PCR) Tambieacuten se pueden realizar cultivos tisulares e inoculacioacuten al
peritoneo de ratoacuten pero este meacutetodo presenta la desventaja de involucrar el manejo de
paraacutesitos vivos y el uso de animales de laboratorio (Perotti 2007)
Los meacutetodos alternativos son las pruebas indirectas a saber
Intradermoreaccioacuten de Frenkel Evaluacutea la inmunidad celular Es una reaccioacuten
cualitativa tardiacutea y presenta resultado positivo a partir de la cuarta semana de infeccioacuten
aunque se han reportado casos de pacientes en los que llevoacute varios meses hasta dar
positiva Se utiliza con fines epidemioloacutegicos (Jirovec amp Jindrich 1961 Rodriacuteguez
Acar y col 2008)
Reaccioacuten de Sabiacuten Feldman o dye test con azul de metileno (DT) Es el meacutetodo
de referencia de la OMS Evaluacutea la inmunidad humoral y mide la cantidad total de Acs
que es capaz de destruir taquizoiacutetos viacutea activacioacuten del complemento Es un meacutetodo
cuantitativo y presenta valores positivos a partir de la primera o segunda semana de
infeccioacuten Tiene la desventaja de requerir taquizoiacutetos vivos y animales para su cultivo
por lo que soacutelo laboratorios de referencia llevan adelante este meacutetodo (Perotti 2007
Durlach y col 2008)
Introduccioacuten
5
Reaccioacuten de inmunofluorescencia indirecta (IFI) Evaluacutea la cantidad de Acs que
se unen a toxoplasmas inactivados La reaccioacuten se evidencia con Acs anti-IgG humana
marcados con isocianato de fluoresceiacutena y observando al microscopio de fluorescencia
Si bien no se trabaja con organismos vivos la necesidad de un microscopio de
fluorescencia y la subjetividad del operador limitan el uso de este meacutetodo Se han
informado resultados falso-positivos debidos a Acs anti-nucleares (Durlach y col
2008)
Aglutinacioacuten directa (AD) En este ensayo se produce una aglutinacioacuten visible con
toxoplasmas tratados con formol Se detecta fundamentalmente IgMs especiacuteficas
Hemoaglutinacioacuten indirecta (HAI) Se utilizan antiacutegenos (Angs) de T gondii con
los que se sensibiliza gloacutebulos rojos que en presencia de Acs especiacuteficos producen una
aglutinacioacuten visible como un botoacuten rojo En general es utilizado para determinar
incidencia o seroprevalencia en una regioacuten pero no se recomienda para la deteccioacuten de
la infeccioacuten aguda (Durlach y col 2008)
Fijacioacuten del complemento Se detectan Acs que activan el sistema del
complemento en presencia de Angs de T gondii La reaccioacuten se evidencia con el
sistema hemoliacutetico hemolisina-gloacutebulos rojos de carnero Resultados positivos aparecen
en forma maacutes tardiacutea que en el DT (Perotti 2007)
Western blot Se evaluacutea la presencia de Acs especiacuteficos a Angs que han sido
separados por electroforesis en un gel de poliacrilamida y transferidos a una membrana
Generalmente no es utilizada como teacutecnica de diagnoacutestico debido a su difiacutecil
estandarizacioacuten (Durlach y col 2008)
Prueba de Remington (IgM-IFI) Se sigue el mismo esquema que en IFI pero se
sustituyen el conjugado anti-IgG por uno anti-IgM lo que permite detectar infeccioacuten
aguda Acs anti-nucleares y el factor reumatoide pueden producir resultados falso-
positivos y los Acs tipo IgG pueden producir resultados falso-negativos (Perotti 2007)
Ensayo aglutinante de inmunoabsorcioacuten (ISAGA) Permite la deteccioacuten y dosaje
de Acs IgA IgE IgG e IgM especiacuteficos contra el paraacutesito Este meacutetodo posee mayor
sensibilidad en relacioacuten al IgM-IFI y al ensayo de inmunoadsorcioacuten ligado a enzima
(ELISA) de IgM para la deteccioacuten de infecciones congeacutenitas pero tiene la desventaja
que pueden detectarse IgM especiacuteficas luego de un antildeo de la primoinfeccioacuten Esto
dificulta la interpretacioacuten de un resultado positivo si se desea determinar la antiguumledad
de la infeccioacuten (Durlach y col 2008)
Introduccioacuten
6
Ensayo de inmunoadsorcioacuten ligado a enzima (ELISA) Permite la deteccioacuten de
Acs especiacuteficos contra el paraacutesito Se evidencia la reaccioacuten con una enzima ligada a Acs
o Angs (dependiendo del disentildeo del inmunoensayo ver maacutes adelante en punto 2134)
que transforma un reactivo auxiliar en un producto coloreado o fluorescente Es un
meacutetodo cuantitativo que utiliza un espectrofotoacutemetro o fluoroacutemetro lo que permite
hacer medidas maacutes objetivas y raacutepidas (Perotti 2007) Auacuten asiacute este meacutetodo aplicado a
la deteccioacuten de la toxoplasmosis de fase aguda carece de una estandarizacioacuten confiable
principalmente en la preparacioacuten del Ang
2132 Importancia del correcto diagnoacutestico en la embarazada
A pesar de toda la bateriacutea de ensayos arriba descritos disponibles para el
diagnoacutestico de la toxoplasmosis el de la infeccioacuten aguda en la mujer embarazada sigue
siendo problemaacutetico porque este diagnoacutestico se deduce a partir de los datos de las
concentraciones relativas de los distintos isotipos de las inmunoglobulinas especiacuteficas
En efecto la existencia y concentracioacuten de IgM IgA e IgG especiacuteficas contra T gondii
es muy dependiente de la respuesta inmune del individuo infectado Considerando que
el tratamiento para prevenir la transmisioacuten al feto consiste en administrar drogas
antiparasitarias que tienen efectos nocivos sobre el nonato auacuten en estos diacuteas se trabaja
en mejorar este diagnoacutestico ya que no se cuenta con un meacutetodo confiable como para
prevenir por un lado los dantildeos que suelen sufrir los recieacuten nacidos de madres con
primoinfeccioacuten no diagnosticada y por otra parte los efectos perjudiciales en los fetos
de las embarazadas incorrectamente diagnosticadas y medicadas Por ello es que en este
trabajo se intentoacute desarrollar nuevas metodologiacuteas de diagnoacutestico de la infeccioacuten
toxoplaacutesmica aguda utilizando teacutecnicas electroquiacutemicas
2133 Diagnoacutestico en la embarazada
El correcto diagnoacutestico de la infeccioacuten aguda en la embarazada incluye la
utilizacioacuten de teacutecnicas especiacuteficas y sensibles asiacute como tambieacuten la aplicacioacuten de un
esquema de seguimiento adecuado El diagnoacutestico generalmente es realizado por
serologiacutea Para determinar si la paciente cursa una infeccioacuten aguda se determinan los
tiacutetulos de los anticuerpos IgG IgA e IgM (Arcavi y col 1997) y se interpretan prima-
facie seguacuten
1 IgG IgA IgM negativas ausencia de infeccioacuten
2 IgG e IgA positivas IgM negativa infeccioacuten croacutenica
3 IgG IgA e IgM positivas posible infeccioacuten aguda
Introduccioacuten
7
2134 Ensayo de inmunoadsorcioacuten ligado a enzima
Los ensayos del tipo ELISA consisten en la deteccioacuten de un antiacutegeno o un
anticuerpo inmovilizado sobre un soporte soacutelido y mediante anticuerpos que directa o
indirectamente producen una reaccioacuten La prueba recurre al empleo de antiacutegenos o
anticuerpos conjugados a una enzima (marcados) que por reaccioacuten con su sustrato
producen una especie coloreada cuya concentracioacuten puede ser medida
fotomeacutetricamente Este ensayo tiene las ventajas de ser versaacutetil robusto simple en su
realizacioacuten y emplear reactivos relativamente econoacutemicos El uso de una fase soacutelida que
retiene el analito de intereacutes proporciona una elevada sensibilidad mientras que la
elevada especificidad del ensayo viene dada por la gran selectividad de los anticuerpos
por su antiacutegeno Las configuraciones maacutes sencillas para estos ensayos son el directo y el
indirecto ambas esquematizadas en la Fig 22
Antiacutegeno IgG conjugada a enzima
Bloqueante IgG humana Reactivo de color
Directo Indirecto
Figura 22 Esquemas que representan los ELISA directo (izquierda) e indirecto (derecha)
21341 Esquema de captura o tipo ldquoSandwichrdquo
Cuando los anticuerpos que desean detectarse son del isotipo IgM suele tenerse el
inconveniente que el isotipo IgG frecuentemente estaacute en mayor concentracioacuten que el
IgM y presenta una mayor afinidad por el antiacutegeno Por lo tanto las IgG suelen
dificultar la deteccioacuten de las IgM en suero cuando se sigue un esquema de ELISA
indirecto con anticuerpos anti-IgM humana (Ac-a-IgMh) marcados Es por esto que
suele optarse por un esquema de captura o tipo saacutendwich en el cual se aumenta la
sensibilidad del ensayo incorporando un eslaboacuten maacutes en el inmunocomplejo adsorbido
En este trabajo se ensayaron dos alternativas de captura o tipo saacutendwich En la
primera alternativa que sigue un esquema claacutesico (A) se adsorbieron los Ac-a-IgMh
Introduccioacuten
8
sobre la superficie de la placa de poliestireno Las placas asiacute sensibilizadas se
enfrentaron al suero a ensayar capturando selectivamente una porcioacuten de las IgM de la
muestra Luego se los enfrentoacute al antiacutegeno de intereacutes ligado a biotina que se une a las
IgMh especiacuteficas para dicho Ang previamente capturado Finalmente se buscoacute revelar
con enzima peroxidasa de raacutebano picante (HRP) conjugada a streptavidina esta uacuteltima
forma un complejo estable con biotina De esta forma se aumenta la cantidad de Ac que
se desean detectar adsorbido sobre la placa seleccionando el tipo de anticuerpo que se
adsorbe En la Fig 23 se muestra el esquema del ensayo tipo A
IgM Antiacutegeno ligado a biotina streptavidina conjugada a HRP
Bloqueante IgG anti-IgM Reactivo de color
Figura 23 Esquema de ensayo ELISA tipo captura claacutesico A Un anticuerpo anti IgMh captura una
porcioacuten de las IgM presentes en el suero humano una porcioacuten de estas IgM capturadas son especiacuteficas
para antiacutegeno de T gondii y se revela su presencia por medio del antiacutegeno recombinante ligado a biotina
streptavidina ligada a HRP adicionando el sustrato de la enzima y un cromoacutegeno actuando como
cosustrato
La segunda alternativa que denominamos tipo B sale del esquema tradicional de
los ELISA Se adsorbe el antiacutegeno recombinante sobre la superficie de la placa de
poliestireno enfrentaacutendola luego al suero a ensayar Asiacute se captura selectivamente las
inmunoglobulinas que reconocen al antiacutegeno Luego se expone la placa al mismo
antiacutegeno recombinante pero ligado a biotina que se uniraacute a los anticuerpos especiacuteficos
para dicho Ang previamente capturados Finalmente se revela con HRP conjugada a
streptavidina que forma un complejo estable con biotina De esta forma se aumenta la
cantidad de Ang marcado en mayor proporcioacuten para IgM que para IgG dada la
Introduccioacuten
9
multivalencia de este isotipo de inmunoglobulina En la Fig 24 se muestra el segundo
esquema que fue el que brindoacute los resultados maacutes promisorios
Antiacutegeno (Ang) Bloqueante Ang ligado a biotina Reactivo de color
IgM a-Ang IgG a-Ang streptavidina conjugada a HRP
Figura 24 Esquema de ensayo ELISA de captura tipo B El antiacutegeno expuesto en la placa captura la
porcioacuten de las IgM e IgG especiacuteficas presentes en el suero humano Haciendo uso de la polivalencia de
las IgM su presencia se revela con el antiacutegeno conjugado a biotina streptavidina ligada a HRP
adicionando el sustrato de la enzima y un cromoacutegeno actuando como cosustrato
2135 Obtencioacuten de antiacutegenos para diagnoacutestico
El diagnoacutestico de rutina de la toxoplasmosis se basa en la deteccioacuten seroloacutegica de
anticuerpos en el paciente Los antiacutegenos utilizados en estas pruebas seroloacutegicas son
generalmente proteiacutenas derivadas de ceacutelulas T gondii que se propagan en el ratoacuten o el
cultivo de ceacutelulas El cultivo y el mantenimiento de este paraacutesito es laborioso lento y
caro (Lau amp Fong 2006) El uso de antiacutegenos nativos de taquizoitos es difiacutecil de
estandarizar y con frecuencia produce reacciones positivas falsas (Hiszczyntildeska-Sawicka
y col 2005) Por lo tanto ha habido intentos de producir antiacutegenos a traveacutes de medios
maacutes seguros tales como tecnologiacutea de ADN recombinante La mayoriacutea de estos
esfuerzos se han centrado en los principales antiacutegenos de superficie del paraacutesito como el
antiacutegeno de superficie 1 (SAG1 del ingleacutes Surface antigen 1) y el antiacutegeno de superficie
2 (SAG2 del ingleacutes Surface antigen 2) (Lau amp Fong 2006) En estudios recientes se ha
estado evaluando que la presencia de IgM e IgG anti P35 seriacutea un mejor indicador de
infeccioacuten reciente que la evaluacioacuten de IgM utilizando taquizoitos enteros en ensayos
del tipo ELISA (Lu y col 2006) En efecto con la nueva tecnologiacutea de ADN
Introduccioacuten
10
recombinante es posible obtener cualquier proteiacutena contaacutendose ademaacutes con ventajas
como la posibilidad de seleccionar porciones especiacuteficas de un Ang para evitar
reacciones inespeciacuteficas ligar distintas porciones que naturalmente corresponden a otras
proteiacutenas para aumentar la sensibilidad del ensayo agregar secuencias aminoaciacutedicas
que faciliten la posterior purificacioacuten y estandarizacioacuten de la proteiacutena a utilizar
(Hiszczyntildeska-Sawicka y col 2005) A la postre todo el proceso resulta maacutes
econoacutemico seguro y confiable que la purificacioacuten de Angs a partir del microorganismo
nativo puesto que no requiere la manipulacioacuten de microorganismos patoacutegenos ya que
la expresioacuten de las proteiacutenas recombinantes se lleva adelante en microorganismos no
infectivos de raacutepido crecimiento (Babaie y col 2013)
Por lo arriba expresado debe seguirse un esquema para seleccionar cuales deben de
ser las proteiacutenas que conviene utilizar acorde al diagnoacutestico que se pretende abordar y
ello demanda un trabajo racional de seleccioacuten de antiacutegenos generalmente
inmunodominantes No obstante escoger tales proteiacutenas no es tarea sencilla por cuanto
la verificacioacuten del grado de bondad del Ang seleccionado exige una ardua tarea
experimental siendo conveniente acotar el nuacutemero de Angs alternativos a evaluar Un
modo de encarar esto es procurar predecir el grado de antigenicidad en base a la
secuencia aminoaciacutedica lo cual puede realizarse computacionalmente
214 Prediccioacuten de epiacutetopes reconocidos por ceacutelulas B
Los programas de prediccioacuten definen el grado de antigenicidad por medio de una
puntuacioacuten (score) en algunos casos para cada epiacutetope y en otros para cada residuo
amino aciacutedico En este uacuteltimo se puede definir una regioacuten antigeacutenica cuando varios
residuos con alta puntuacioacuten son adyacentes en la estructura primaria Por otra parte el
nuacutemero de epiacutetopes o regiones antigeacutenicas que los programas de prediccioacuten encuentran
depende de un umbral que es configurado por el usuario
En la actualidad los inmunoensayos para determinar anticuerpos son realizados
utilizando regiones antigeacutenicas definidas ya sea como moleacuteculas uacutenicas mezcla de
varios componentes o como antiacutegenos de fusioacuten multiepiacutetope (Camussone 2009) El
desarrollo de herramientas informaacuteticas para predecir de forma fiable la antigenicidad
de los epiacutetopes puede reducir el costoso y prolongado trabajo experimental requerido
para identificar las regiones de intereacutes (Namrata amp Rajat 2010) Al momento de
identificar estas regiones antigeacutenicas suele contarse soacutelo con la estructura primaria de
las proteiacutenas en estudio desconocieacutendose su estructura terciaria en la mayoriacutea de los
Introduccioacuten
11
casos De aquiacute que la prediccioacuten de epiacutetopes lineales es el meacutetodo maacutes utilizado para
seleccionar epiacutetopes putativos
Desde el informe inicial de Hopp y Woods en 1981 (Hopp amp Woods 1981) varios
procedimientos se han hecho populares para detectar epiacutetopes lineales reconocidos por
ceacutelulas B a partir de la estructura primaria de una proteiacutena El rendimiento de estos
programas auacuten no ha logrado una eficiencia oacuteptima seguacuten lo declarado por sus propios
autores (Kolaskar amp Tongaonkar 1990 Saha y col 2005 Saha amp Raghava 2006
Larsen y col 2006 Davydov amp Tonevitskii 2009)
La literatura sobre las aplicaciones de estos programas estaacute orientada
principalmente a identificar posibles vacunas (Namrata amp Rajat 2010) Por lo tanto la
sensibilidad (probabilidad de obtener un positivo entre los verdaderos positivos) y la
especificidad (probabilidad de obtener un negativo entre aquellos negativos verdaderos)
son los indicadores maacutes utilizados para evaluar la calidad de estos programas ya que un
uacutenico epiacutetope puede ser crucial para lograr una respuesta inmunoprotectora Al mismo
tiempo suele omitirse el valor predictivo positivo (VPP) que es la proporcioacuten de
muestras que dan positivo el ensayo siendo verdaderos positivos o sea es la capacidad
para encontrar los epiacutetopes reales de una proteiacutena (ver el recuadro 1) Sin embargo la
fiabilidad del epiacutetope predicho es maacutes importante que su sensibilidad para reducir el
nuacutemero de experimentos confirmatorios de su utilidad diagnoacutestica Es entonces
importante diferenciar ambos paraacutemetros ya que los programas de prediccioacuten pueden
realizar predicciones de baja sensibilidad pero al mismo tiempo si los epiacutetopes reales
fueron predichos la prediccioacuten presenta un alto VPP
Recuadro 1
Los casos posibles en un ensayo son
Verdaderos
positivos
Verdaderos
negativos
Ensayo
positivo A B
Ensayo
negativo C D
BA
A positivo predictivoValor
DB
D dadEspecifici
CA
A adSensibilid
Introduccioacuten
12
La falta de estudios comparativos entre los programas de prediccioacuten en la literatura
actual impide que los usuarios hagan la mejor eleccioacuten Por ello como trabajo inicial se
intentoacute evaluar los distintos programas disponibles en la red en cuanto a su capacidad
para predecir positivamente epiacutetopes
Introduccioacuten
13
22 Tuberculosis
221 Generalidades
La tuberculosis (TB) humana es una enfermedad infecto-contagiosa causada por la
bacteria Mycobacterium tuberculosis La infeccioacuten por M tuberculosis suele ser
asintomaacutetica en personas sanas dado que su sistema inmune es capaz de controlar la
bacteria No obstante en condiciones de desnutricioacuten o inmunocompromiso la
enfermedad suele ser grave La TB es una enfermedad vinculada a la pobreza que
puede afectar a adultos joacutevenes en edad productiva
La enfermedad se transmite por el aire de una persona a otra a traveacutes de gotiacuteculas
que portan bacterias Cuando una persona con infeccioacuten activa en pulmones o garganta
tose estornuda habla o canta las personas cercanas pueden respirar las bacterias
liberadas e infectarse
La enfermedad suele afectar los pulmones pero tambieacuten puede involucrar otros
oacuterganos como rintildeones columna vertebral y cerebro Los siacutentomas de la TB pulmonar
activa son tos a veces con esputo sanguinolento dolor toraacutecico debilidad peacuterdida de
peso fiebre y sudoracioacuten nocturna Si no se trata adecuadamente puede ser mortal La
mayoriacutea de las muertes por TB se producen en los paiacuteses en viacuteas de desarrollo (Paacutegina
web del CDC b)
La Organizacioacuten Mundial de la Salud (OMS) estima en 2000 millones a los
infectados por M tuberculosis que anualmente hay 9 millones de nuevos infectados y
que mueren casi 2 millones de personas al antildeo por causa de esta enfermedad (Paacutegina
web de la OMS)
222 Mycobacterium tuberculosis
Esta micobacteria tambieacuten conocida como Bacilo de Koch es una bacteria aacutecido-
alcohol resistente frecuentemente incolora y es aeroacutebica estricta Es muy resistente al
friacuteo la congelacioacuten y la desecacioacuten y por el contrario es muy sensible al calor la luz
solar y la luz ultravioleta Su replicacioacuten es muy lenta (una divisioacuten cada 16 a 20 horas)
y ante circunstancias adversas puede entrar en estado latente pudiendo retrasar su
multiplicacioacuten desde algunos diacuteas hasta varios antildeos El reservorio natural de M
tuberculosis es el hombre tanto el individuo infectado asintomaacutetico como el enfermo
con infeccioacuten activa Su clasificacioacuten taxonoacutemica se detalla en la Tabla 22
Introduccioacuten
14
Tabla 22 Ubicacioacuten taxonoacutemica de M tuberculosis
Reino Bacteria
Phylum Actinobacteria
Clase Actinobacteria
Sub-clase Actinobacteridae
Orden Actinomycetales
Sub-orden Corynebacterineae
Familia Mycobacteriaceae
Geacutenero Mycobacterium
Especie tuberculosis
223 Diagnoacutestico
El diagnoacutestico de la infeccioacuten tuberculosa se basa en una serie de estudios que se
inicia con placas radiograacuteficas pulmonares y la prueba de la tuberculina que pone de
manifiesto un estado de hipersensibilidad del hueacutesped frente a proteiacutenas de M
tuberculosis Esta sensibilidad se adquiere o bien por infeccioacuten con el bacilo o por
vacunacioacuten con cepas no infectivas (vacuna BCG) En una segunda etapa la infeccioacuten
activa es confirmada por identificacioacuten del agente etioloacutegico en cultivos obtenidos a
partir de la muestra bioloacutegica remitida al laboratorio Auacuten cuando la conjuncioacuten de los
meacutetodos de anaacutelisis vigentes permite un diagnoacutestico certero de la TB humana es
frecuente que se requiera de un prolongado tiempo de espera hasta la confirmacioacuten de la
infeccioacuten activa por cuanto ello depende del lento proceso de replicacioacuten del bacilo
Esto conlleva que exista potencialidad de contagio a individuos sanos y se comprometa
maacutes la salud del infectado
En los uacuteltimos antildeos se han desarrollado teacutecnicas de deteccioacuten de M tuberculosis
que involucran al bacterioacutefago D29 (en adelante fago) capaz de infectar
especiacuteficamente micobacterias (Park y col 2003 Mc Nerney y col 2004) Esta
metodologiacutea se basa en procesar la muestra del paciente sospechada de contener M
tuberculosis ponerla en contacto con el fago e incubarla para permitir su replicacioacuten
Finalmente se evaluacutea el tiacutetulo de los fagos liberados infectando un cultivo testigo de M
smegmatis (micobacterias de raacutepido crecimiento susceptibles al fago) y contando las
placas de lisis que se obtienen Esta novedosa metodologiacutea si bien indirecta y
preliminar permite reducir considerablemente los tiempos de diagnoacutestico puesto que se
trabaja con especies de crecimiento raacutepido Sin embargo al utilizar el conteo de placas
de lisis como eje central para el diagnoacutestico de infeccioacuten activa se recae en largos
Introduccioacuten
15
periacuteodos de incubaciones que podriacutean evitarse si se contase con otro meacutetodo de evaluar
la integridad celular de M smegmatis
Por lo arriba expuesto es que en este trabajo se intento desarrollar una nueva
metodologiacutea de verificacioacuten de lisis de micobacterias utilizando teacutecnicas
intriacutensecamente raacutepidas como son las electroquiacutemicas que en un futuro podriacutean
facilitar el diagnoacutestico de infeccioacuten tuberculosa
Introduccioacuten
16
23 Biodiesel
El grave impacto de la utilizacioacuten de combustibles derivados del petroacuteleo en el
medio ambiente la limitada disponibilidad de petroacuteleo crudo y sobre todo la
inestabilidad de los mercados del petroacuteleo han estimulado actualmente la propagacioacuten
de combustibles liacutequidos alternativos (Monteiro y col 2008) La organizacioacuten
American Society for Testing and Materials ASTM define biodiesel como una mezcla
de eacutesteres monoalquiacutelicos de aacutecidos grasos de cadena larga derivados de aceites
vegetales o grasas animales (American Society for Testing and Materials paacutegina web)
El biodiesel puro generalmente no se utiliza como combustible sino que suele
encontrase en mezcla con diesel de petroacuteleo El biodiesel es clasificado utilizando la
notacioacuten Bxx donde xx indica el porcentaje en volumen de contenido de biodiesel en el
liacutequido Asiacute B100 es biodiesel puro B50 contiene 50 en volumen de biodiesel B5
contiene 5 en volumen etc Las mezclas comerciales maacutes comunes son B2 B5 y B20
El biodiesel se obtiene a partir de la transesterificacioacuten de gliceroliacutepidos con
alcoholes de cadena corta como el etanol o el metanol siendo el glicerol el principal
subproducto en la elaboracioacuten de este combustible junto a productos menores como
mono y diacil gliceroles o aacutecidos grasos libres La masa de glicerol generada equivale
aproximadamente al 10 en peso del total del combustible producido siendo eacuteste uno
de los contaminantes frecuentes
231 Determinacioacuten de glicerol libre en biodiesel
La presencia de glicerol es indicativa de la calidad del biodiesel transformaacutendose
en un analito de intereacutes para la creciente industria de energiacuteas alternativas a la derivada
del refinamiento del petroacuteleo
Los meacutetodos quiacutemicos maacutes simples para cuantificar glicerol se basan en su
oxidacioacuten a formaldehiacutedo utilizando peryodato Luego el formaldehiacutedo formado se
determina cuantitativamente por diversos meacutetodos ya sea basados en reacciones
especiacuteficas evaluando los productos por diferentes metodologiacuteas o por titulacioacuten con
NaOH valorado (Lapenaite y col 2007)
La norma ASTM-D 6584 establece un meacutetodo basado en cromatografiacutea gaseosa
que permite la determinacioacuten en simultaacuteneo de glicerina libre y total (glicerol maacutes
mono di y trigliceacuteridos) No obstante este procedimiento no es aplicable a los eacutesteres
metiacutelicos de aceites vegetales obtenidos a partir de aceites laacuteuricos tales como aceite de
Introduccioacuten
17
coco o de palma quedando restringido el meacutetodo soacutelo para un grupo de biodiesels
particulares
En cuanto a los meacutetodos cromatograacuteficos tienen la desventaja de ser poco
amigables con el medio ambiente dado el profuso uso de solventes orgaacutenicos que son
potencialmente contaminantes a veces se tornan laboriosos y utilizan instrumental e
insumos caros
Considerando lo expresado arriba en este trabajo se ha planteado cuantificar
glicerol utilizando una metodologiacutea esencialmente econoacutemica simple y no
contaminante como lo son las teacutecnicas electroquiacutemicas convencionales
Introduccioacuten
18
24 Marco teoacuterico de las teacutecnicas electroquiacutemicas utilizadas
Los meacutetodos electroquiacutemicos de anaacutelisis estudian el analito de intereacutes mediante la
medicioacuten de los paraacutemetros fiacutesicos como potencial eleacutectrico yo corriente en una celda
electroquiacutemica El proceso fundamental en las teacutecnicas electroquiacutemicas es la
transferencia de electrones entre especies redox y la superficie del electrodo (Bard amp
Faulkner 2001) Este puede describirse con la siguiente reaccioacuten
O + ne- R [21]
Para reacciones reversibles y raacutepidas el potencial sigue la ley de Nernst
[22]
siendo y las actividades de las especies reducida y oxidada en la interfaz
electrodosolucioacuten respectivamente
La corriente que circula por la celda es la carga transportada por unidad de tiempo y
puede expresarse como
[23]
De acuerdo a las leyes de Faraday la carga circulante (Q) es proporcional a los
moles de especie reducida u oxidada (N) El factor de proporcionalidad es la carga del
electroacuten (n) por la constante de Faraday (F)
[24]
Combinando las Ecs 23 y 24 obtenemos
[25]
A medida que avanza la reaccioacuten se consume la especie electroactiva esto
produce un gradiente de concentracioacuten entre el seno de la solucioacuten y las inmediaciones
del electrodo donde la especie es electrotransformada y consecuentemente asociado se
Introduccioacuten
19
generaraacute un transporte de masa por difusioacuten Si el proceso estaacute bajo control difusional
la primera ley de Fick permite describir el flujo de partiacuteculas en funcioacuten de la posicioacuten
ec 26 y la segunda ley de Fick lo describe en funcioacuten de la variacioacuten de la
concentracioacuten de la especie electroactiva en funcioacuten del tiempo ec 27
[26]
[27]
donde D es el coeficiente de difusioacuten de la especie en estudio El gradiente de
concentracioacuten se generaraacute soacutelo para la especie electroactiva que se transforma en la
superficie del electrodo y su transporte de masa se verificaraacute en direccioacuten ndashx es decir
hacia el electrodo si se define x = 0 en la superficie Luego considerando la reaccioacuten de
reduccioacuten ec 21 el flujo J corresponderaacute al nuacutemero de partiacuteculas de O que cambian de
posicioacuten en direccioacuten -x con el tiempo por unidad de aacuterea y puede expresarse como
[28]
Combinando las ecs 26 27 y 28 obtenemos la expresioacuten combinada de las leyes
de Fick para una especie que estaacute reaccionando sobre un electrodo de aacuterea A
[29]
o directamente
[210]
Reemplazando en la ec 25 obtenemos una expresioacuten para la corriente (I) que
circula por la celda en la que se lleva a cabo la reaccioacuten ec 21 sobre un electrodo
uniformemente accesible de aacuterea A y cuando el transporte de masa es exclusivamente
controlado por difusioacuten
[211]
expresioacuten que indica que la corriente es directamente proporcional al gradiente de
concentracioacuten generado por efecto de la reaccioacuten electroacutedica
Introduccioacuten
20
Para un sistema en estado estacionario en el cual la velocidad de transformacioacuten de
la especie electroactiva es igual a la de transferencia de masa y suponiendo que la
reaccioacuten cumple las condiciones de rapidez y reversibilidad (Ec de Nernst) podemos
llegar a describir la relacioacuten entre la corriente circulante por la celda y el potencial al
cual se lleva adelante la reaccioacuten por
[212]
donde KR y KO son constantes que dependen del aacuterea del electrodo de trabajo y los
coeficientes de difusioacuten de las especies reducida y oxidada respectivamente e Il es la
corriente liacutemite
Se define como potencial de media onda al potencial al cual el valor de corriente es
la mitad del valor de corriente liacutemite y queda expresado por la siguiente ecuacioacuten
[213]
Tomando esta definicioacuten y operando en la ec 212 se arriba a la expresioacuten que
describe la corriente como funcioacuten del potencial de electrodo
ndash [214]
ecuacioacuten que corresponde a una funcioacuten sigmoidea por lo tanto al realizar un barrido
de potencial desde un potencial al cual no existe reaccioacuten electroacutedica hacia un potencial
al cual es posible reducir la especie electroactiva hasta alcanzar el estado estacionario la
corriente variaraacute con el potencial siguiendo la forma de una curva sigmoidea
Durante la ejecucioacuten del presente trabajo se utilizaron diversas teacutecnicas
voltamperomeacutetricas cronoamperometriacutea voltametriacutea de barrido lineal voltametriacutea
ciacuteclica y voltametriacutea de onda cuadrada Se pasa a comentar brevemente cada una de
ellas
241 Cronoampreometriacutea
En esta teacutecnica se estudia como variacutea la corriente que circula por la celda en
funcioacuten del tiempo transcurrido mientras el electrodo de trabajo es sometido a un
Introduccioacuten
21
determinado potencial Al aplicar un pulso de potencial se modifica el equilibrio de la
reaccioacuten redox ec 21 se pasa de un potencial inicial donde no ocurre reaccioacuten
electroacutedica a un potencial donde las especies pueden intercambiar electrones en la
interfaz electrodosolucioacuten favoreciendo la reaccioacuten en uno u otro sentido dependiendo
del potencial aplicado Esto da lugar a una corriente liacutemite difusional que variacutea en
funcioacuten del tiempo Para un electrodo uniformemente accesible esta corriente estaacute
descripta por la ec 211 Fijando las condiciones de contorno correspondientes al
experimento en cuestioacuten
t = 0 C0 = Cinfin (no hay reaccioacuten en el electrodo)
t ge0 lim C = Cinfin
t ge0 C0 = 0
donde C0 y Cinfin son las concentraciones de la especie electroactiva en la interfaz
electrodosolucioacuten y en el seno de la solucioacuten respectivamente Es posible entonces
resolver la ecuacioacuten diferencial de la segunda ley de Fick donde la solucioacuten viene dada
por la denominada ecuacioacuten de Cottrell
[215]
donde Id(t) es la corriente controlada por difusioacuten
En este trabajo se utilizoacute esta teacutecnica porque permite cuantificar glicerol utilizando
diferentes electrodos de trabajo seguacuten el medio especiacutefico donde se encuentre disuelto
242 Teacutecnicas voltameacutetricas
Todas las teacutecnicas voltameacutetricas tienen en comuacuten que el potencial eleacutectrico al que
se somete el electrodo de trabajo variacutea en funcioacuten del tiempo En todos los casos se
realiza un barrido lineal de potencial que va desde el potencial inicial (Ei) hasta un
potencial final (Ef) Este barrido se realiza a una velocidad constante que es el cociente
entre el salto (discreto) de potencial y el tiempo de duracioacuten de ese salto La forma en
que se realiza el barrido de potencial es lo que diferencia a una teacutecnica voltameacutetrica de
otra
Introduccioacuten
22
2421 Voltametriacutea de barrido lineal
En esta teacutecnica se realiza un barrido desde un potencial inicial (Ei) al cual no existe
proceso de transferencia de electrones en la interfaz electrodosolucioacuten y soacutelo podraacute
apreciarse corriente debida a procesos no faraacutedicos hasta un potencial final (Ef) En la
medida que el potencial aumenta alcanza un valor al cual ocurre la reaccioacuten electroacutedica
comenzando un flujo de carga debido a procesos faraacutedicos En la Fig 25 se muestra el
perfil del potencial en funcioacuten del tiempo utilizando el modo normal (en peldantildeos) para
el caso de los experimentos realizados con el instrumento utilizado en el presente
trabajo (Eco Chemie 2000)
Figura 25 Perfil de potencial en funcioacuten del tiempo Si bien el potencial es una variable continua un
potenciostato real solo puede establecer variaciones discretas de potencial de aquiacute que en lugar de
observar una ―rampa se observe una escalera
Para una reaccioacuten de reduccioacuten reversible ec 21 a medida que el potencial
aumenta se incrementaraacute la corriente siguiendo la forma de una sigmoidea (seguacuten la ec
21) Sin embargo cuando la velocidad de transporte de masa por difusioacuten de la especie
O sea menor que la velocidad de consumo por la reaccioacuten electroacutedica no seraacute posible
alcanzar el estado estacionario y la corriente llegaraacute a un maacuteximo Ip De aquiacute en maacutes la
corriente comenzaraacute a decaer con t12
tal como lo describe la ecuacioacuten de Cottrell ec
215 En la Fig 26 se muestra el perfil de corriente que se obtienen en experimentos
voltameacutetricos claacutesicos
t
Salto de potencial
Duracioacuten del salto
E
Introduccioacuten
23
Figura 26 Perfiles de corriente en funcioacuten del potencial para experimentos voltameacutetricos de barrido
lineal Liacutenea azul la velocidad de barrido es lo suficientemente baja establecieacutendose un estado
estacionario Liacuteneas verde negra y roja la velocidad de barrido es alta y se origina un pico de corriente
La corriente de pico crece proporcionalmente a la raiacutez cuadrada de la velocidad de barrido
El maacuteximo de corriente tambieacuten denominado corriente de pico se puede obtener a
partir de la ecuacioacuten de Randles-Sevcik (Bard amp Faulkner 2001)
[216]
siendo la temperatura 25 degC y donde A estaacute en cm2 D en cm
2 s
-1 C en mol cm
-3 y en
V s-1
2422 Voltametriacutea ciacuteclica
En esta teacutecnica se realiza un barrido desde un potencial inicial (Ei) a un primer
veacutertice de potencial (Ev1) y a partir de alliacute se invierte la direccioacuten de barrido hasta
llegar a un segundo veacutertice de potencial (Ev2) el cual puede coincidir con el Ei El perfil
de potencial en funcioacuten del tiempo que se obtiene utilizando el instrumento con el que
se trabajoacute y de acuerdo a lo indicado por el fabricante se esquematiza en la Fig 27
(izquierda) y el perfil de corriente en funcioacuten del potencial para una reaccioacuten reversible
se esquematiza en la Fig 27 (derecha)
Idif
IP
Introduccioacuten
24
Fig 27 Perfil de potencial en funcioacuten del tiempo (izquierda) Perfil de corriente en funcioacuten del
potencial para una reaccioacuten redox reversible (derecha)
En este trabajo se realizaron experimentos de voltametriacutea ciacuteclica para identificar la
presencia de mediadores redox que presentando reacciones electroacutedicas reversibles
permitieran la regeneracioacuten del cofactor de la enzima glicerol deshidrogenasa (GlDH)
Esta teacutecnica tambieacuten se utilizoacute para calcular las aacutereas de los electrodos de trabajo de
modo tal de normalizar la sentildeal obtenida con la superficie del electrodo utilizado
Ademaacutes se utilizoacute para cuantificar glicerol e identificar los potenciales de oxidacioacuten del
mismo
243 Teacutecnicas de pulso
Las teacutecnicas de pulso surgieron vinculadas a la polarografiacutea de corriente continua
la teacutecnica voltameacutetrica cuya particularidad es utilizar un electrodo de goteo de mercurio
Este grupo de teacutecnicas se ha ido diversificando a medida que se fueron haciendo maacutes
complejos tanto los esquemas de potenciales aplicados a los electrodos de trabajo
como las medidas de intensidades de corrientes (Bard amp Faulkner 2001)
2431 Voltamperometriacutea onda cuadrada VOC
Esta teacutecnica tiene varias ventajas entre las que se encuentran su excelente
sensibilidad (se han registrado liacutemites de deteccioacuten directa del orden de 10-8
M) la
eliminacioacuten de las corrientes de fondo y la rapidez con que se lleva a cabo el
experimento completo ya que se puede trabajar a velocidades de barrido de potencial
auacuten superiores a 1 V s-1
(Bard amp Faulkner 2001)
El perfil de potencial aplicado al electrodo de trabajo en funcioacuten del tiempo en la
VOC se presenta en la Fig 28 Consta de una onda cuadrada simeacutetrica con una
amplitud Ep superpuesta a una escalera de potencial con escalones o saltos de
potencial Es (Fig29) donde el pulso hacia adelante de la onda cuadrada coincide con
el escaloacuten de potencial de la escalera
E
I
Introduccioacuten
25
La utilizacioacuten de la teacutecnicas voltamperomeacutetricas de pulso presentan la ventaja de
permitir realizar un barrido de potencial donde la especie electroactiva se oxida
raacutepidamente produciendo una sentildeal analiacutetica No es necesario trabajar durante periacuteodos
prolongados de tiempo a los elevados potenciales donde se establece la corriente liacutemite
controlada por difusioacuten como lo requiere la teacutecnica amperomeacutetrica
Figura 28 Perfil de potencial aplicado al electrodo de trabajo en la VOC en funcioacuten del tiempo En
liacutenea cortada se indica cual es la escalera de potencial a la cual se le sobreimprime la onda cuadrada Se
indican resaltados ( ) los tiempos durante los que se realizan las lecturas de corriente En un ciclo se
realizan las lecturas de corrientes alta y baja Adaptado de Bard amp Faulkner 2001
Figura 29 a) Onda cuadrada simeacutetrica b) Perfil de potencial en funcioacuten del tiempo de una escalera
de potencial
a)
b)
E
E
E
t
Amplitud de la
onda cuadrada EP
Periacuteodo de la onda
Salto o escaloacuten
de potencial ES
Medida
alta
Medida
baja
t
Salto o escaloacuten
de potencial ES
t
Amplitud de la
onda cuadrada
EP
Periacuteodo de la onda
Introduccioacuten
26
El potensiostato registra la corriente durante la medida alta y la medida baja de un
ciclo La diferencia de estas corrientes es la corriente neta Ineta que se grafica en
funcioacuten del potencial de la escalera de potencial correspondiente a ese ciclo (liacutenea
cortada Fig 28) Para sistemas reversibles se obtiene una curva como se observa en la
Fig 210 donde se indican las corrientes de la medida alta de la medida baja y neta
que resulta en un pico de corriente La corriente de pico neta IP n observada en la VOC
es proporcional a la concentracioacuten de la especie electroactiva en el seno de la solucioacuten y
se centra alredewdor del potencial de la cupla redox
Figura 210 Voltamperograma de onda cuadrada tiacutepico para un sistema reversible la corriente neta
Ineta se obtiene por la diferencia entre la corriente registrada al finalizar el pulso I medida alta y la
corriente registrada previamente al nuevo pulso I medida baja
La frecuencia ( f ) de la onda cuadrada medida en Hz se define como
1f [217]
Siendo el periacuteodo de la onda cuadrada medido en segundos que a su vez es dos
veces el tiempo del pulso Pt por lo tanto tenemos que
P2
1
tf [218]
Luego
ft
2
1P [219]
Los valores de frecuencia pueden variar desde unos pocos Hz hasta varios miles
dependiendo de las condiciones particulares del caso La velocidad de barrido v queda
definida como el producto del salto de potencial ES por la frecuencia f
fSEv [220]
Introduccioacuten
27
Las velocidades de barrido en los experimentos de VOC se obtienen modificando la
frecuencia de la onda cuadrada ya que el salto de potencial suele ser un valor fijo
Se demostroacute que para cuplas redox controladas por difusioacuten los paraacutemetros de la
VOC maacutes adecuados son E = 50n mV y Es = 10n mV (Osteryoung y Osteryoung
1985)
Cuando se aplica un pulso de potencial en las cercaniacuteas del potencial de la cupla
redox las corrientes faradaicas aumentan significativamente conforme se oxida o se
reduce la especie electroactiva Estas corrientes decaen con el tiempo seguacuten la ecuacioacuten
de Cottrel ya expresada anteriormente como ec [215]
Si consideramos t como tP se observa que la disminucioacuten del tiempo del pulso
implica mayor corriente Luego a medida que se aumenta la frecuencia aumenta la
velocidad de barrido y disminuye el tiempo del pulso Para sistemas reversibles se
predice que la intensidad tiene una dependencia lineal con la raiacutez cuadrada de la
frecuencia (Osteryoung y Osteryoung 1985)
21 fBAnIp [221]
La eleccioacuten de la frecuencia adecuada es de suma importancia A frecuencias muy
altas aumentan significativamente las corrientes capacitivas perdiendose resolucioacuten lo
que impone un liacutemite al aumento de la frecuencia
25 Biosensores
En muchas determinaciones de analitos en muestras bioloacutegicas se necesitan pasos
previos a la evaluacioacuten propiamente dicha que permiten eliminar o enmascarar las
potenciales interferencias Sin embargo el pretratamiento de la muestra puede llevar a
una disminucioacuten de la concentracioacuten del analito ya sea por peacuterdidas en las etapas
consecutivas del anaacutelisis o por transformacioacuten del analito provocando errores por
defecto en la determinacioacuten (Lagier amp Verdini 2000) Cuando la evaluacioacuten de la
concentracioacuten del analito se utiliza con fines cliacutenicos tal resultado erroacuteneo puede
conducir a un diagnoacutestico incorrecto Es por ello que en la actualidad el desarrollo de
nuevas metodologiacuteas analiacuteticas tiende no soacutelo a acortar los tiempos de anaacutelisis
previnieacutendose asiacute las peacuterdidas por degradacioacuten del analito sino que ademaacutes procura
permitir la ejecucioacuten del anaacutelisis sin pasos separativos previos
En los uacuteltimos antildeos se ha avanzado en el desarrollo de biosensores ya que estos
dispositivos presentan ventajosas caracteriacutesticas que los convierten en herramientas
Introduccioacuten
28
prometedoras de anaacutelisis (Belluzo y col 2008) Los biosensores se pueden definir como
dispositivos analiacuteticos compuestos por dos componentes principales
1- Una superficie selectiva denominada bioreceptor o superficie bioreactiva (SBR)
generalmente de origen bioloacutegico o sinteacutetica biomimeacutetica la cual en contacto con la
muestra es capaz de interaccionar de manera especiacutefica con el analito (Vo-Dinh amp
Allain 2003) Este elemento es el que aporta la especificidad del dispositivo
2- Un transductor fiacutesico-quiacutemico encargado de producir una sentildeal que es funcioacuten
de la interaccioacuten entre el analito y la SBR (Vo-Dinh amp Allain 2003) Eacuteste es el
elemento que aporta la sensibilidad al dispositivo
Los biosensores pueden ser clasificados de acuerdo a la sentildeal fiacutesico-quiacutemica que
produce el transductor de acuerdo a
Sentildeal Biosensor
Cambio de temperatura Termomeacutetrico
Cambio en paraacutemetro eleacutectrico Electroquiacutemico
Cambio en propiedades de la luz Oacuteptico
Cambio de masa Piezoeleacutectrico Acuacutestico
(Adaptado de Vo-Dinh amp Allain 2003)
De los distintos tipos de biosensores los electroquiacutemicos han sido tradicionalmente
los maacutes desarrollados y usados debido a sus ventajas con respecto a otros biosensores
tales como la generacioacuten de una respuesta electroacutenica directa que permite una raacutepida
respuesta mayor simplicidad operativa versatilidad para la miniaturizacioacuten y bajo
costo Actualmente gracias al avance de la tecnologiacutea de los semiconductores y la
serigrafiacutea pueden ser producidos masivamente Dependiendo del paraacutemetro fiacutesico
medido por el detector los biosensores electroquiacutemicos pueden a su vez subdividirse en
conductimeacutetricos potenciomeacutetricos y amperomeacutetricos (Vo-Dinh amp Allain 2003)
251 Superficie de bioreconocimiento en biosensores
La SBR es un sistema bioloacutegico o biomimeacutetico que reacciona bioquiacutemica o
quiacutemicamente con el analito En la actualidad existe una gran diversidad de elementos
bioloacutegicos o derivados de ellos que son utilizados como SBR
Los mismos van desde moleacuteculas simples a sistemas complejos (Vo-Dinh amp Allain
2003) Asiacute la SBR puede contener antiacutegenos anticuerpos aacutecidos desoxiribonucleicos
(ADN) aacutecidos ribonueleicos (ARN) enzimas receptores de membrana tejidos
Introduccioacuten
29
microorganismos completos o compuestos sintetizados ―ad-hoc que emulan especies
bioloacutegicas como pueden ser estructuras biomimeacuteticas y poliacutemeros molecularmente
impresos (Vo-Dinh amp Allain 2003)
252 Biosensores amperomeacutetricos
De los biosensores electroquiacutemicos los amperomeacutetricos suelen presentar mayores
sensibilidades (Iost y col 2011)
En la Fig 211 se esquematiza un biosensor amperomeacutetrico El analito presente en
la muestra compleja reacciona selectivamente con la SBR lo que desencadena la sentildeal
analiacutetica en el transductor fiacutesico-quiacutemico
En este caso particular el transductor es un electrodo de trabajo que integra una
celda de tres electrodos El mismo estaacute sometido a un potencial eleacutectrico (con respecto a
un electrodo de referencia) y la sentildeal analiacutetica es la corriente eleacutectrica que circula por la
celda utilizando un contraelectrodo de gran aacuterea En estas condiciones la maacutexima
intensidad de corriente eleacutectrica que se observa estaacute limitada exclusivamente por la
reaccioacuten de oacutexido-reduccioacuten que ocurre en la superficie del electrodo de trabajo
Figura 211 El electrodo de trabajo es sometido a un potencial eleacutectrico en su superficie tiene lugar
la reaccioacuten de oacutexido-reduccioacuten Dicha reaccioacuten ocurre o no o bien transcurre a velocidades diferentes en
presencia o ausencia del analito de intereacutes
253 Biosensores de uso cliacutenico
En el caso de muestras para el diagnoacutestico cliacutenico de infecciones el analito a
determinar puede ser alguna de las moleacuteculas generadas por el individuo infectado
como respuesta a la presencia del agente infeccioso por ej los anticuerpos (Acs)
especiacuteficos o el agente infeccioso iacutentegro o partes del mismo En muchos casos la sola
presencia de Acs especiacuteficos es por siacute misma indicativa de infeccioacuten Hay casos en que
Introduccioacuten
30
la presencia de Acs no es per-seacute indicativa de infeccioacuten riesgosa Dos ejemplos de esta
situacioacuten son el de la toxoplasmosis y la tuberculosis
En el caso de la toxoplasmosis la deteccioacuten de Acs anti-T gondii es soacutelo de
trascendental importancia en embarazadas porque si la infeccioacuten ha sido adquirida
durante el embarazo el feto estaacute en riesgo de contagiarse y puede padecer lesiones
severas (Dunn y col 1999 Montoya amp Liesenfeld 2004) Por el contrario si se trata
de infeccioacuten croacutenica no es necesario exponer a la embarazada (y al feto) a medicacioacuten
innecesaria evitaacutendose con ello los riesgos que devienen del uso de los faacutermacos
especiacuteficos utilizados durante el tratamiento de la infeccioacuten (Freij amp Sever 1999)
Debido a la incertidumbre que acompantildea la deteccioacuten de los anticuerpos hasta hoy
utilizados con este fin se ha propuesto realizar pruebas utilizando antiacutegenos
recombinantes del paraacutesito Se ha evaluado el desempentildeo de antiacutegenos recombinantes
sintetizados por teacutecnicas de biologiacutea molecular en forma individual o mezclados para
evaluar la avidez de Acs IgG (Beghetto y col 2003) Se observoacute que utilizando el
fragmento del antiacutegeno MIC3 en este ensayo los iacutendices de avidez permitieron
determinar la antiguumledad de la infeccioacuten con mayor grado de certeza que empleando
homogenado total de paraacutesito resultando MIC3 un buen marcador para el diagnoacutestico
de infecciones agudas (Beghetto y col 2003) La proteiacutena recombinante P35 tambieacuten
fue propuesta como marcador seroloacutegico para diferenciar infeccioacuten aguda de croacutenica ya
que evidencioacute sensibilidades del 853 para sueros agudos y una especificidad del 98
respecto de sueros croacutenicos (Parmley y col 2000) No obstante y a pesar de haberse
descrito moleacuteculas para el diagnoacutestico de toxoplasmosis aguda no existe un acuerdo
sobre su efectividad por lo que se requiere de la evaluacioacuten de nuevos antiacutegenos para
este fin En general el uso de una sola moleacutecula recombinante no brinda suficiente
sensibilidad habieacutendose demostrado que el empleo de varios antiacutegenos recombinantes
la mejora (Pinon y col 2003) Se ha observado tambieacuten que una mezcla de moleacuteculas
no produce los mismos resultados que cuando se utilizan en forma separada (Silveira y
col 2001) Se ha postulado que esta diferencia se debe a las distintas caracteriacutesticas
fisicoquiacutemicas entre las moleacuteculas de una mezcla que impide la inmovilizacioacuten
homogeacutenea en las superficies de captura utilizadas en los inmunoensayos Por lo tanto
resulta muy factible que un ensayo que utilice una combinacioacuten o fusioacuten en una sola
moleacutecula de estos antiacutegenos recombinantes marcadores de infeccioacuten reciente pueda
mejorar el diagnoacutestico diferencial tal como ha sido demostrado para el diagnoacutestico de
otras infecciones (Camussone y col 2009)
Introduccioacuten
31
En el caso de la tuberculosis la mayoriacutea de los individuos de la poblacioacuten han
recibido la vacunacioacuten reglamentaria por inoculacioacuten de una cepa de micobacterias
inofensivas generando Acs anti-Mycobacterium tuberculosis (M tuberculosis) Por
ello estos Acs suelen estar presentes en casi toda la poblacioacuten De aquiacute que la deteccioacuten
de Acs anti-M tuberculosis no demuestra infeccioacuten activa de riesgo Por tal motivo el
indicador por excelencia de infeccioacuten activa es la evidenciacioacuten del patoacutegeno en la
muestra No obstante las muestras suelen poseer una extremadamente baja cantidad de
M tuberculosis lo que dificulta su deteccioacuten directa Por ello es preciso utilizar alguacuten
paso amplificador del analito a censar Dado el largo tiempo de replicacioacuten del
microorganismo los cultivos realizados para su replicacioacuten insumen periacuteodos
prolongados Siguiendo los trabajos de Park y col y McNerney y col (Park y col
2003 McNerney y col 2004) se formuloacute la siguiente hipoacutetesis de trabajo Sistemas
enzimaacuteticos presentes en M smegmatis permitiriacutean metabolizar sustratos electroactivos
a distintas velocidades de reaccioacuten dependiendo de la integridad del microorganismo
Siendo este el caso seriacutea posible distinguir entre cultivos de M smegmatis que han sido
lisados por el fago especiacutefico D29 de aquellos cultivos en que dichas micobacterias
estaacuten iacutentegras Si soacutelo existiera lisis cuando la muestra ensayada contiene organismos
filogeneacuteticamente emparentados como M tuberculosis que permitiesen la
amplificacioacuten selectiva del fago D29 previamente a la infeccioacuten del cultivo testigo de
M smegmatis la evaluacioacuten electroquiacutemica del sustrato metabolizable por el
microorganismo deberiacutea permitir evidenciar presencia o ausencia de M tuberculosis La
seleccioacuten del fago D29 se justifica porque es capaz de infectar micobacterias de
crecimiento raacutepido como M smegmatis y las de crecimiento lento como M tuberculosis
(Park y col 2003)
El glicerol es corrientemente utilizado como principal fuente de carbono en cultivos
de micobacterias siendo degradado eficientemente por sus sistemas enzimaacuteticos que
utilizan mecanismos redox En este trabajo nos hemos planteado detectar este
polialcohol como analito de intereacutes ya que su consumo estaraacute preferencialmente
vinculado a la presencia de micobacterias aptas para tal degradacioacuten Por este motivo
proponemos utilizar un bioelectrodo con una SBR que contenga una enzima cuyo
sustrato sea glicerol
Introduccioacuten
32
2531 Biosensores para evaluacioacuten de infeccioacuten toxoplaacutesmica
En el presente trabajo se propuso un biosensor para evaluacioacuten de infeccioacuten
toxoplaacutesmica utilizando un electrodo de oro policristalino macizo sobre el cual se
adsorbioacute un antiacutegeno recombinante y se siguioacute un esquema ELISA del tipo indirecto
con deteccioacuten de IgGh En la Fig 212 se muestra el esquema que se siguioacute para este
inmunoensayo
Proteiacutena recombinante IgG a-IgGh conjugada a HRP
Bloqueante IgG humana ferrocenometanol
Figura 212 Sobre la superficie del electrodo se fija la proteiacutena recombinante que capturaraacute los
anticuerpos especiacuteficos si estaacuten presentes en el suero El revelado se realiza con un segundo anticuerpo
especiacutefico para IgG humana marcado con HRP que en presencia de H2O2 oxida el mediador FcMe que
se reduce sobre la superficie del electrodo generando la sentildeal analiacutetica
254 Biosensores para cuantificacioacuten de glicerol
La determinacioacuten de glicerol ha ido ganando importancia en las uacuteltimas deacutecadas
debido al uso del mismo en varias industrias como la farmaceacuteutica automotriz
alimenticia y textil entre otros El compuesto es un producto importante de la
fermentacioacuten en la mayoriacutea de las bebidas alcohoacutelicas y su concentracioacuten es un
paraacutemetro uacutetil para el seguimiento del proceso fermentativo (Goriushkina y col 2010)
Tambieacuten es un componente no deseable del biodiesel y su concentracioacuten es un indicador
de la calidad del combustible (Monteiro y col 2008)
Se han desarrollado numerosas metodologiacuteas para llevar adelante la cuantificacioacuten
del glicerol que incluyen teacutecnicas espectrofotomeacutetricas yo espectrofluoromeacutetricas
(Bondioli amp Bella 2005 Silva amp Rocha 2010 Lima y col 2012) incluidos los basados
Introduccioacuten
33
en enzimas (Kronka y col 2001 Li y col 2001) los electroquiacutemicos (Tehrani amp
Ghani 2012 Gamella y col 2008 Wu amp Cheng 2005) y los cromatograacuteficos estos
uacuteltimos han sido oficialmente recomendado por la AOAC como los meacutetodos 96809
97210 (AOAC 2005) Sin embargo a pesar de que estos meacutetodos permiten determinar
con eficacia de glicerol en presencia de muchos compuestos que interfieren esta teacutecnica
se considera que es ecoloacutegicamente desfavorable debido a la utilizacioacuten de solventes
nocivos para el medio ambiente e intriacutensecamente onerosa debido a los altos costos de
los mismos (Gamella y col 2008)
Por un lado las propuestas espectrofotomeacutetricas que utilizan enzimas se basan en el
uso de sistemas o bien de una o varias enzimas relativamente caras que se eliminan
despueacutes de que se han utilizado en una uacutenica determinacioacuten En estos casos a menudo
son consumidos las enzimas yo cofactores caros como nicotinamida adenina
dinucleoacutetido (NAD+) o adenosina 5-trifosfato (ATP) a menudo son consumidos
(Kronka y col 2001 Li y col 2001 Wu amp Cheng 2005) Como un ejemplo la
propuesta de Li para determinar glicerol en matrices complejas se basa en el uso de tres
enzimas a saber glicerol quinasa (GK) piruvato quinasa (PK) y lactato
deshidrogenasa (LDH) ademaacutes de utilizar ATP y NAD+ (Li y col 2001) Este meacutetodo
produce buenos resultados en teacuterminos de sensibilidad y especificidad pero consume 1
U de GK 15 U de PK 22 U de LDH 2x10-6
moles de ATP y 33x10-7
moles de
NAD+ por determinacioacuten Por lo tanto el costo derivado por anaacutelisis es considerado
caro sobre todo cuando se debe analizar un elevado nuacutemero de muestras
Por otro lado se han propuesto herramientas versaacutetiles notables para cuantificar
glicerol como ser la basada en tecnologiacutea de biosensores en particular los basados en
meacutetodos amperomeacutetricos (Ghica amp Brett 2006 Gamella y col 2008) De hecho los
biosensores amperomeacutetricos proporcionan suficiente sensibilidad y selectividad para
permitir la determinacioacuten del analito junto con una velocidad apropiada para completar
el anaacutelisis En efecto los biosensores amperomeacutetricos que utilizan enzimas como
componente bioloacutegico para el reconocimiento dan lugar a una selectividad significativa
debido a su capacidad de reaccionar especiacuteficamente con su sustrato Este uacuteltimo es a
menudo el analito de intereacutes por lo que puede ser cuantificado de manera eficiente auacuten
ante la presencia de otros componentes similares estructuralmente que pueden hallarse
en la muestra (Belluzo y col 2008) Los dispositivos construidos con enzimas a
menudo pueden ser reutilizados y por lo tanto el costo por determinacioacuten puede ser
Introduccioacuten
34
reducido significativamente en comparacioacuten con los meacutetodos espectrofotomeacutetricos
mencionados anteriormente
Se han desarrollado varios biosensores utilizando enzimas que tienen como sustrato
al glicerol (Gamella y col 2008) En los disentildeos utilizados se utilizan diversas enzimas
que reaccionan especiacuteficamente con el glicerol en un primer paso y se censa un
producto de esta reaccioacuten En otros disentildeos se encuentran involucradas maacutes de una
enzima donde la segunda o tercer enzima utiliza como sustrato algunos de los
productos de la primera o segunda reaccioacuten y finalmente se censa un producto de la
uacuteltima reaccioacuten enzimaacutetica Algunos disentildeos que aparecieron en literatura al momento
de iniciar este trabajo de tesis fueron detallados por Pingarroacuten y colaboradores (Gamella
y col 2008) y se encuentran resumidos en la Tabla 23 al final de este capiacutetulo y se
corresponden a los esquemas evaluados al momento de iniciar este trabajo de tesis
Todos los disentildeos descriptos al momento presentan la desventaja de ser onerosos
tanto por el disentildeo en siacute como por el costo operativo devenido del consumo de elevadas
cantidades de reactivos caros
Sobre la base del modelo propuesto por Tuntildeoacuten-Blanco y colaboradores (Aacutelvarez-
Gonzaacutelez y col 2000) se comenzaron los ensayos para construir un bioelectrodo
selectivo para glicerol La propuesta contempla en primer lugar disminuir la cantidad
de enzima Glicerol deshidrogenasa En segundo lugar proponemos utilizar la coenzima
NAD(H) en forma soluble e introducir un mediador electroquiacutemico distinto al utilizado
previamente En el trabajo citado se generaba una cupla cataliacutetica por oxidacioacuten
electroacutedica del NAD+ presente en un electrodo de trabajo de pasta de C modificada En
nuestro caso el mediador soluble permite reoxidar la coenzima para cerrar el ciclo
cataliacutetico siguiendo el esquema de la Fig 213
Figura 213 Esquema de reacciones que ocurren en la celda DHA 13 dihidroxiacetona GlDH
gliceroldeshidrogenasa NAD(H) nicotinadenina dinucleoacutetido
glicerol
DHA
GlDHox
GlDHred NAD+
NADH Mediador ox
Mediador red
e- Electrodo
Introduccioacuten
35
Tabla 23 Biosensores selectivos para gicerol Las filas 1 a 10 son un extracto parcial del trabajo de
Gamella y col 2008 En las filas 11 y 12 se incluyen los disentildeos propuestos por Šefčovičovaacute y col
2008 y Goriushkina y col 2010
Electrodo Enzima Mediador Potencial
1 Pt GKGPOx - + 650 mV vs AgAgCl
2 Al GlDH Fe(CN)6 + 400mV vs ECS
3 Barras de grafito
espectroscoacutepico GlDH Complejo de Os + 200 mV vs AgAgCl
4 Serigraacutefico (SPE) pGlyDH N-(4-hidroxibenzilideno)-
4-ferrocenilanilina + 400 mV vs AgAgCl
5 Carboacuten Viacutetreo a) GlDHDP
b) GKGPOxHRP
a)Fe(CN)63-
b)Fe(CN)64-
a) + 350 mV vs AgAgCl
b) - 300 mV vs AgAgCl
6 SPE modificado con
ZrO2 y azul meldola GlDH Azul meldola + 100 mV vs AgAgCl
7 SPE modificado azul
de Prusia
GlDH Tt NADH
Ox Azul de Prusia - 50 mV vs AgAgCl
8 Pasta de carbono GlDH Producto de la electro-
oxidacioacuten del NAD+ + 150 mV vs AgAgCl
9 Flim de carbono a) GPOx
b)GKGPOx Poli (rojo neutro) - 350 mV vs ECS
10 Au a)GlDHDP
b) GKGPOxHRP Tetra thiafulvaleno
a) + 150 mV vs AgAgCl
b) 0 mV vs AgAgCl
11 Carboacuten Viacutetreo GlDHDP Fe(CN)63- + 350 mV vs AgAgCl
12 Platino serigraacutefico Gox - + 300 mV vs electrodo
intriacutenseco
Tabla 23 Continuacioacuten
Muestra
Rango dinaacutemico
Lineal (M) Sensibilidad
(mA M-1
cm-2
)
Liacutemite de
deteccioacuten (M) Estabilidad
Desde Hasta
1 Mosto de uva 2 10-6
10-3 - 5 10
-7 Hasta 1 mes
2 Jugo de uva 10-6
2 10-3
- 10-6 -
3 Vino 1 10-6
2 10-4
32 1 10-6
80 actividad inicial luego
de 20 horas
4 Vino - - - - actividad enzimaacutetica decae
rapidamente
5 Fermento
anaeroacutebico
1 10-5
1 10-5
10-3
1 10-3
a) 620
b) 142 -
sentildeal inicial luego de
uso continuo a) 60 a 90
hs b) 70 16 hs
6 Fermento de
jugo de uva 10
-51 10
-4 - 10
-6 -
7 - 10-5
1 10-3
- 10-6 -
8 Jarabe 997 10-7
10-4
162 cm2 43 10-7
80 actividad inicial luego
de 3 diacuteas
9 Vino 10-5
147 10-4
a) 101
b) 079
a) 4 10-6
b) 15 10-5
sentildeal inicial luego de
uso continuo a) 87 a 8
diacuteas b) 62 8 diacuteas
10 Vino 10
-6
4 10-7
2 10-5
1 10-5
a) 207
b) 250
a) 4 10-7
b) 31
sentildeal inicial luego de
uso continuo a) 87 a 51
diacuteas b) 46 8 diacuteas
11 Fermento - - - 11 10-6
-
12 Vino 10
-5
2 10-6
25 10-2
64 10-3
-
10-5
2 10-6 -
Objetivos
Objetivos
37
3 Objetivos
31 Objetivos generales
Desarrollar metodologiacuteas electroquiacutemicas que permitan identificar analitos de
intereacutes tanto para el diagnoacutestico cliacutenico como para la industria de combustibles
alternativos
32 Objetivos particulares
a) Obtener bioelectrodos que exhiban una corriente cataliacutetica diferencial al efectuar
inmunoensayos con muestras confirmadas positivas o negativas para infeccioacuten aguda
por T gondii
b) Desarrollar un meacutetodo electroquiacutemico que permita la cuantificacioacuten de glicerol
en medio acuoso para determinarlo por ejemplo luego de su extraccioacuten en
combustibles alternativos
c) Evidenciar electroquiacutemicamente la ocurrencia de lisis de M smegmatis por fagos
D29 indicadores de la presencia de micobacterias patoacutegenas emparentadas
provenientes de individuos padeciendo infeccioacuten tuberculosa
Materiales y Meacutetodos
Materiales y Meacutetodos
39
4 Materiales y meacutetodos
41 Reactivos y medios de cultivos
411 Reactivos
Todos los reactivos utilizados fueron de grado analiacutetico salvo que se indique lo
contrario Los aacutecidos aceacutetico sulfuacuterico niacutetrico clorhiacutedrico y percloacuterico las sales KCl
Na2HPO4 KH2PO4 NiSO4 CuSO45H2O y la sal disoacutedica del aacutecido etilen diamino tetra
aceacutetico (EDTA) dimetilsulfoacutexido (DMSO) imidazol tris base las enzimas peroxidasa
de raacutebano picante EC 11117 (tipo VI) (HRP) y glicerol deshidrogenasa de
cellulomonas EC 1116 (GlDH) acrilamida (adecuada para electroforesis) NNprime-(12-
dihidroxietilen) bisacrylamide (97) ditiotreitol (DTT) Coomasie blue G-250 alcohol
isopropiacutelico β-mercaptoetanol 33-diaminobenzidina tetrahidrocloruro (DAB)
nicotina adenina dinucleoacutetico (NAD) los desoxinucleoacutetidos trifosfato dATP dGTP
dCTP y dTTP reactivo de Folin-Ciocalteu glicina albuacutemina seacuterica bovina (ASB)
peptona de carne extracto de levadura fueron suministrados por Sigma-Aldrich El
polvo de carbono viacutetreo (esfeacuterico diaacutemetro de partiacutecula entre 2 y 12 microm pureza
9999+) fue suministrado por Aldrich El polvo de carbono grafito (pureza gt 99) fue
provisto por Fisher Scientific Dimetilformamida (DMF) 1 1rsquo-carbonil-diimidazol las
sales tartrato de sodio y potasio MgCl2 CaCl2 NaCl Na2CO3 NaHCO3 K2CO3
KHCO3 K3Fe(CN)6 K4Fe(CN)6 (NH4)2SO4 (NH4)2S2O8 (gt98) dodecil sulfato de
sodio (Farmacopea Unioacuten Europea) (SDS) NaOH KOH NNNprimeNprime-
tetrametiletilendiamino (Temed) azul de bromofenol (Farmacopea Unioacuten Europea)
xilencianol (para electroforesis) etanol absoluto fueron suministrados por Merck El
H2O2 y el glicerol fueron provistos por Cicareli El isopropil-β-D-1-
tiogalactopiranoacutesido (IPTG) fue suministrado por Promega La enzima ADN polimerasa
de Thermus aquaticus EC 2777 (polimerasa Taq) y los oligonucleoacutetidos fueron
suministrados por InvitrogenTM
Argentina La enzima peroxidasa de raacutebano picante
ligada a estreptavidina (HRP-EAV) fue provista por Abcam El ester biotin n-
hidroxisuccinimida fue provisto por Thermo Scientific La ampicilina (Farmacopea
Argentina) fue provista por laboratorios Klonal La aluacutemina para pulido (tamantildeo de
partiacutecula 03 microm) fue provista por Metrohm El anticuerpo de cabra anti IgG humana
ligado a HRP fue provisto por Zymed El Tween-20 fue provisto por Anhedra
No se detallan los reactivos contenidos en los equipos comerciales utilizados
disponibles en las paacuteginas web de los respectivos proveedores
Materiales y Meacutetodos
40
412 Medios de cultivos
Para el crecimiento de cepas de Escherichia coli (E coli) se utilizoacute el medio de
cultivo Luria-Bertani (LB) compuesto por 10 g L-1
peptona de carne 5 g L-1
extracto de
levadura y 10 g L-1
NaCl En los casos requeridos se suplementoacute este medio con el
antibioacutetico ampicilina (100 g mL-1
) Para la preparacioacuten de medios soacutelidos se agregoacute
agar en concentracioacuten final de 15 g L-1
Para el crecimiento de ceacutelulas de M smegmatis se utilizoacute el medio de cultivo
Middlebrook 7H9 provisto en forma anhidra por Difco y fue suplementado con NaCl
CaCl2 yo glicerol en concentraciones variables de acuerdo a los requerimientos del
ensayo analiacutetico ulterior la composicioacuten del medio provisto por Difco se detalla en la
siguiente tabla
Tabla 41 Caldo Middlebrook 7H9 (Difco) composicioacuten en g L-1
del medio liacutequido recieacuten preparado
(NH4)2SO4 050
Na2(HPO4) 250
K(H2PO4) 100
Citrato de sodio 010
MgSO4 005
CaCl2 0005
ZnSO4 0001
CuSO4 0001
Citrato feacuterrico amoacutenico 004
Aacutecido l-glutaacutemico 050
Piridoxina 0001
Biotina 00005
42 Cepas bacterianas
Las cepas bacterianas utilizadas y sus caracteriacutesticas relevantes se detallan en la
siguiente tabla
Materiales y Meacutetodos
41
Tabla 42 Cepas bacterianas utilizadas
Cepa Caracteriacutesticas
Escherichia
coli (E coli)
BL21 (DE3)
E F- ompT hsdS (rB-mB-) [lon] (DE3 immP21 int- lacI+
lacUV5lacZT7 ARN polimerasa) Contiene el gen de la T7
ARN polimerasa bajo el control del promotor lacUV5 El gen de
la ARN polimerasa estaacute integrado en el cromosoma bacteriano
desde (DE3) y su expresioacuten se induce por IPTG (Stratagene)
M smegmatis
mc2155
Mycobacterium smegmatis MC2155 es un organismo
aerobio quimioorganotrofo en forma de barra no moacutevil
patoacutegeno de humanos Esta bacteria fue inicialmente aislada de
esmegma humano Esta cepa es un mutante de M smegmatis Es
faacutecilmente transformable con vectores plasmiacutedicos usando
electroporacioacuten
43 Bacterioacutefagos
Se utilizoacute el bacterioacutefago D29 que infecta especiacuteficamente micobacterias Los
trabajos especiacuteficos de infeccioacuten de micobacterias fueron realizados en el Departamento
de Microbiologiacutea de la Facultad de Ciencias Meacutedicas (UNR) bajo la supervisioacuten del Dr
Ricardo Morbidoni
44 Plaacutesmidos
El plaacutesmido utilizado y sus caracteriacutesticas relevantes se detallan en la siguiente tabla
Tabla 43 Plaacutesmido utilizado
Plaacutesmido Caracteriacutesticas
pET32a
5900 pares de bases resistencia ampicilina promotor T7lac Produce
proteiacutenas fusionadas a 6 histidinas y a la proteiacutena tiorredoxina (TRX)
de 204 kDa lo que permite su purificacioacuten en columna de NTA-Ni2+
Este vector fue utilizado como sistema de expresioacuten en la cepa BL21
(DE3) de E coli
45 Reaccioacuten en cadena de la polimerasa
Las reacciones se llevaron a cabo en un volumen total de 25 μL conteniendo
solucioacuten de amplificacioacuten comercial suplementada con MgCl2 para alcanzar una
concentracioacuten final de MgCl2 25 mM y 02 mM de cada uno de los desoxinucleoacutetidos
trifosfato dATP dGTP dCTP y dTTP 20 pmoles de cebador directo y reverso y 1 UI
de polimerasa Taq Se empleoacute un termociclador BOECO (Germany) y se inicioacute la
reaccioacuten con un paso de desnaturalizacioacuten a 95 ordmC durante 5 min La amplificacioacuten de
los fragmentos se realizoacute en 30 ciclos de a) desnaturalizacioacuten 1 min a 95degC b)
Materiales y Meacutetodos
42
hibridizacioacuten 1 min a la temperatura oacuteptima para cada par de cebadores c) extensioacuten
72degC 15 min por cada Kpb amplificado finalmente se realizoacute un paso de extensioacuten
durante 10 min
Para la reaccioacuten de amplificacioacuten de la secuencia codificante de la proteiacutena se
disentildearon oligonucleoacutetidos cebadores especiacuteficos (ver maacutes adelante) En el disentildeo de los
mismos se introdujeron sitios de restriccioacuten apropiados para el posterior clonado del
fragmento en vectores de clonado o expresioacuten
Como molde se utilizoacute aproximadamente 003 g de ADN plasmiacutedico
Como cebadores se utilizaron los oligonucleoacutetidos (provistos por Invitrogen)
P22C directo 5- GGATCCACCACCGAGACGCCAGC -3
P22C reverso 5- GAATTCTTGCCCGTGAGAGACACAG -3
46 Electroforesis de ADN en geles de agarosa
Los fragmentos de ADN (ADN plasmiacutedico productos de PCR) fueron separados
mediante electroforesis en geles de agarosa de distinta concentracioacuten (08 a 2) seguacuten
el tamantildeo de los fragmentos a separar Se utilizoacute el sistema de tipo submarino La
solucioacuten reguladora tris-aceacutetico-EDTA (TAE) 05 X se utilizoacute como solucioacuten de
electroforesis y para la preparacioacuten de geles A estos uacuteltimos se les agregoacute el agente
intercalante bromuro de etidio en una concentracioacuten final de 03 g mL-1
antes de su
gelificacioacuten Previo a la siembra las muestras se mezclaron con solucioacuten de siembra
compuesta por 0025 (mv) azul de bromofenol 0025 (mv) xilencianol y 30
(vv) glicerol en una proporcioacuten 51 en volumen de muestra solucioacuten de siembra
Como marcadores de peso molecular se utilizaron Ladder 100 pb PB-L (Productos Bio-
Loacutegicos) La corrida electroforeacutetica se realizoacute a un potencial constante de 100 V con
una fuente BIO-RAD modelo 3000xi Luego de la electroforesis el ADN se visualizoacute
por fluorescencia en un transiluminador de luz ultravioleta Fotodyne y las imaacutegenes se
digitalizaron con una caacutemara FUJIFILM modelo FinePix A120
47 Minipreparacioacuten de ADN plasmiacutedico
El ADN plasmiacutedico se preparoacute a partir de cultivos celulares de E coli conteniendo
los plaacutesmidos de intereacutes seguacuten el meacutetodo de lisis alcalina o bien utilizando los equipos
comerciales ―WIZARDreg
PLUS SV Minipreps DNA purification system (Promega) El
resultado de la preparacioacuten se evaluoacute realizando una electroforesis en gel de agarosa de
una aliacutecuota de la misma
Materiales y Meacutetodos
43
48 Purificacioacuten del producto de amplificacioacuten
La purificacioacuten de aacutecidos nucleicos a partir de geles de agarosa se realizoacute utilizando
el equipo comercial ―GFXTM Gel Band Purification Kit (Amersham GE Healthcare)
seguacuten las especificaciones del fabricante El resultado de la purificacioacuten se evaluoacute
realizando una electroforesis en gel de agarosa de una aliacutecuota de la elusioacuten obtenida
49 Prueba de expresioacuten de proteiacutenas de fusioacuten a TRX y a ldquocolardquo de histidinas
Se cultivaron clones de las cepas de E coli BL21 (DE3) transformadas con el
vector pET32a (con el inserto correspondiente) haciendo distintas diluciones 175
1100 y 1200 de un cultivo saturado en 2 mL de LB fresco (suplementado con
ampicilina a 100 μg mL-1
) y cultivando a 37 ordmC con agitacioacuten vigorosa (180 rpm) hasta
una densidad oacuteptica a 630 nm (DO630nm) aproximada de 05 unidades Se indujo la
expresioacuten de la proteiacutena recombinante con IPTG (concentracioacuten final 1 o 01 mM)
durante 3 4 o 12 hs a 37 ordmC y con agitacioacuten vigorosa Posteriormente se cosecharon las
ceacutelulas centrifugando a 3000 rpm durante 10 min Finalmente se lisaron las ceacutelulas con
pulsos de ultrasonido utilizando un sonicador analoacutegico Sonifierreg S450A y se
separaron las fracciones soluble e insoluble del extracto por centrifugacioacuten a 18000 g
durante 20 min
410 Expresioacuten y purificacioacuten preparativas de antiacutegenos recombinantes
Se cultivoacute la cepa de E coli transformada con el vector pET32a con el inserto
correspondiente haciendo una dilucioacuten 1100 de un cultivo saturado en dos porciones
de 150 mL de LB suplementado con ampicilina (100 microg mL-1
) y cultivando a 37ordm C
hasta una DO630nm 05 Se agregoacute IPTG hasta concentracioacuten final oacuteptima 1 mM para
el Ang P35B o 01 mM para el Ang P22C y se indujo el tiempo oacuteptimo 4 h para el Ang
P35B o 12 h para el Ang P22C a 37ordm De esta manera se obtuvo la proteiacutena de fusioacuten
en forma soluble Se cosecharon las ceacutelulas por centrifugacioacuten y se lavaron con solucioacuten
tampoacuten fosfato (Na2HPO4 10 mM NaCl 05 M pH 8) Luego se las resuspendioacute en 20
mL de solucioacuten de lisis (Na2HPO4 50 mM NaCl 05 M pH 8) Las ceacutelulas se lisaron
por sonicado aplicando pulsos de 30 s de duracioacuten hasta clarificacioacuten del medio en
hielo Se separoacute la fraccioacuten soluble de la insoluble por centrifugacioacuten a 18000 g y 4 ordmC
La fraccioacuten soluble se congeloacute durante 24 h a -20 ordmC y se descongeloacute en hielo luego se
centrifugoacute nuevamente a 18000 g y 4 ordmC Este paso se repitioacute dos veces
Posteriormente se realizoacute una separacioacuten cromatograacutefica de afinidad con una columna
Materiales y Meacutetodos
44
de 5 mL empacada manualmente con resina Ni Sepharosetrade High Performance en
condiciones nativas elusioacuten con imidazol 250 mM seguacuten las especificaciones del
proveedor (GE Healthcare) En los sucesivos pasos se recogieron aliacutecuotas y se verificoacute
la purificacioacuten visualizando por electroforesis en gel desnaturalizante de poliacrilamida
(SDS-PAGE)
411 Separacioacuten de proteiacutenas mediante SDS-PAGE
Se utilizaron geles de 12 y de 15 de acrilamidabisacrilamida 291 Las
muestras se sembraron en geles desnaturalizantes mezclaacutendolas 21 con solucioacuten de
siembra 2 X compuesta por Tris-HCl pH 68 125 mM SDS 4 β-mercapto etanol 5
vv(alternativamente se usoacute DTT 200 mM) glicerol 20 y azul de bromofenol 02
Las corridas electroforeacuteticas se hicieron en solucioacuten Tris-glicina-SDS (Tris base 302
g L-1
glicina 144 g L-l SDS 1 g L
-1) Los geles fueron tentildeidos con azul brillante de
Coomasie G-250
412 Cuantificacioacuten de proteiacutenas
Se utilizoacute el meacutetodo propuesto por Lowry (Lowry y col1951) seguacuten el siguiente
protocolo un volumen de muestra cuya concentracioacuten de proteiacutena se desea determinar y
uno o dos testigos de albuacutemina (conteniendo tiacutepicamente de 5 a 25 microg de proteiacutenas
totales) se disolvieron en 040 mL de agua destilada y se mezclaron con 150 mL de
reactivo C preparado inmediatamente antes de usar El reactivo C se preparoacute mezclando
una parte de tartrato de sodio y potasio 2 mv una parte de CuSO4 1 mv y 100
partes de solucioacuten tampoacuten carbonato 2 mv e hidroacutexido de sodio 01 N Se dejoacute
reaccionar la mezcla durante 15 min a temperatura ambiente y luego se adicionoacute 0150
mL de reactivo de Folin-Ciocalteu diluido 13 con agua destilada inmediatamente antes
de usar Se dejoacute reposar durante 45 min y se leyoacute la absorbancia a 660 nm
413 Reaccioacuten de conjugacioacuten biotina-antiacutegeno
Previo a la reaccioacuten de conjugacioacuten el antiacutegeno P35B purificado se llevoacute a una
concentracioacuten final de 2 mg mL-1
(como miacutenimo) en solucioacuten tampoacuten carbonato de
sodio 01 M (pH 85) usando las membranas de poro controlado Amicon Ultra-4
(Millipore Co) seguacuten las instrucciones del proveedor Se disolvieron 20 mg del eacutester
biotinil-n-hidroxisuccinimida (BNHS) en 590 microL de DMSO e inmediatamente despueacutes
se mezclaron 80 microL de esta solucioacuten con 800 microL de solucioacuten de Ang
Materiales y Meacutetodos
45
Al antiacutegeno P22C purificado se lo llevoacute a una concentracioacuten final de 20 mg mL-1
(como miacutenimo) en solucioacuten tampoacuten carbonato de sodio 01 M (pH 85) usando las
membranas de poro controlado mencionadas Se disolvieron 25 mg BNHS en 590 microL
de DMSO e inmediatamente despueacutes se mezclaron 120 microL de esta solucioacuten con 100
mL de solucioacuten de Ang Se incuboacute 4 h a temperatura ambiente con agitacioacuten suave Se
eliminaron los restos de eacutester hidrolizado y se cambioacute la solucioacuten tampoacuten carbonato por
PBS 1 X pH 74 haciendo lavados reiterados y reteniendo el Ang en las membranas de
poro controlado
414 Revelado cromogeacutenico de la reaccioacuten de conjugacioacuten
El antiacutegeno marcado con biotina respectivo fue retenido en membrana de
nitrocelulosa sembrando 1 L del mismo sobre la membrana Se procedioacute a bloquear
los sitios activos de la membrana con leche descremada disuelta al 5 mv en PBS pH
74 durante 1 h Se realizaron 3 lavados con PBS pH 74 de 1 min cada uno Se incuboacute
la membrana con la enzima peroxidasa de raacutebano picante ligada a streptavidina (HRP-
EAV) disuelta en PBS pH 74-leche descremada al 1 mv Posteriormente se
realizaron 3 lavados con PBS pH 74 de 1 min cada uno Finalmente se reveloacute la
presencia de la enzima HRP con el reactivo de color recieacuten preparado seguacuten 5 mg de
33-diaminobenzidina tetrahidrocloruro (DAB) se disolvieron en 500 microL de DMSO y se
llevoacute a 100 mL de volumen final con PBS pH 74 A esta solucioacuten se le agregaron 100
microL de H2O2 10 voluacutemenes inmediatamente previo a su utilizacioacuten
415 Mediciones espectrofotomeacutetricas
Para las medidas de absorbancia (Abs) a longitudes de onda especiacuteficas o la
realizacioacuten de espectros de absorcioacuten ultravioleta-visible se utilizoacute el espectrofotoacutemetro
Beckman DU 640 Como celda se utilizoacute una cubeta de cuarzo de 1 cm de paso oacuteptico
416 Ensayos de inmunoabsorcioacuten ligados a enzima con deteccioacuten fotomeacutetrica
Como soporte soacutelido se utilizaron microplacas Microlon 600 high binding Greiner
Bio One provistas por GBO Argentina Para las lecturas de Abs se utilizoacute un lector de
microplacas PowerWave XS (BioTek) o alternativamente se utilizoacute el lector ELx808
Absorbance Microplate Reader (BioTek) Los ensayos preliminares se detallan en la
secioacuten 6 Experimentos Auxiliares
Materiales y Meacutetodos
46
4161 Esquema A
Sobre las microplacas de ELISA Microlon 600 high binding Greiner Bio One se
depositaron 100 microL de anticuerpo de captura (IgG de conejo anti IgM humana) provisto
por Dakko diluido 11000 en PBS pH 74 Se incubaron 48 h a 37 degC Luego se
realizaron 3 lavados con PBS Tween 20 al 005 (PBS-T) de 1 min cada uno Se
procedioacute al bloqueo de los sitios libres de la placa con 100 microL leche descremada
comercial (marca Milkaut) al 1 mv en PBS durante 30 min a 37 degC y se realizaron 3
lavados con PBS-T de 1 min cada uno Luego se incubaron con suero humano (muestra
incoacutegnita) 1100 en PBS con leche descremada al 1 mv durante 1 h a 37 degC y se
realizaron 3 lavados con PBS-T de 1 min cada uno Se realizaron distintas incubaciones
con los antiacutegenos P22C y P35B conjugados a biotina Luego de tres lavados con PBS-T
se incubaron con la enzima HRP-EAV en una dilucioacuten 12000 durante 1 h a 37degC
Posteriormente se realizaron 3 lavados con PBS-T para finalmente revelar utilizando
50 microL de solucioacuten comercial de 33prime55prime-tetrametilbenzidina (TMB) sustrato de la
enzima HRP que da coloracioacuten azul en el medio de reaccioacuten pasando a amarillo y
permaneciendo estable el color cuando se detiene la reaccioacuten acidificando el medio con
H2SO4 05 M
4162 Esquema B
Sobre las microplacas de ELISA comerciales se depositaron 500 ng de Ang P22C
disueltos en 100 L de solucioacuten carbonato pH 96 incubando 1 h a 37 degC Se realizaron
3 lavados con PBS Tween 20 al 005 (PBS-T) de 1 min cada uno Se bloquearon los
sitios libres de la placa con 100 microL leche descremada 1 mv en PBS durante 30 min a
37 degC Luego se realizaron 3 lavados con PBS-T de 1 min cada uno Se incubaron con
suero humano (muestra incoacutegnita) 1100 en PBS con leche descremada al 1 mv
durante 1 h a 37 degC Luego se realizaron 3 lavados con PBS-T de 1 min cada uno Se
realizoacute una incubacioacuten con el antiacutegeno P22C conjugado a biotina Luego de tres lavados
con PBS-T se incubaron con la enzima HRP-EAV en una dilucioacuten 12000 durante 1 h
a 37degC Posteriormente se realizaron 3 lavados con PBS-T Finalmente se reveloacute con
50 microL de solucioacuten comercial de TMB y se detuvo la reaccioacuten acidificando el medio con
50 microL H2SO4 05 M
Materiales y Meacutetodos
47
417 Reaccioacuten de color para determinacioacuten cuantitativa de glicerol por meacutetodo
espectrofotomeacutetrico
Se llevaron a cabo dos tipos de ensayos diferentes Por un lado se utilizoacute el meacutetodo
enzimaacutetico con un equipo comercial provisto por Wiener Lab TG GPO PAP AA (liacutenea
liacutequida) ensayando muestras de aliacutecuotas del medio Middlebrook 7H9 suplementadas
con glicerol en lugar de suero humano Por otro lado se realizaron reacciones de color
que se llevaron a cabo en un volumen final de 100 mL que resultoacute de la mezcla de 950
microL de reactivo A y 50 microL de muestra la cual consistioacute en medio de cultivo de
micobacterias Middlebrook 7H9 suplementado con distintas cantidades de glicerol En
los blancos de reaccioacuten se realizoacute un agregado de medio de cultivo Middlebrook 7H9
sin glicerol de igual volumen que en los otros dos casos para mantener las mismas
condiciones que en las otras reacciones
El reactivo A se preparoacute inmediatamente antes de ser usado mezclando los
reactivos necesarios seguacuten se indica en la siguiente tabla
Tabla 44 Mezcla de reactivos necesaria para preparar 950 microL de reactivo A (necesario para 1 reaccioacuten)
Los voluacutemenes necesarios para un nuacutemero n de reacciones se obtuvieron multiplicando por n
los voluacutemenes de esta tabla
Reactivo Volumen para una
reaccioacuten ( L)
Solucioacuten Tampoacuten carbonato
0125 M pH 105 815
K3Fe(NC)6 10-2
M 100
(NH4)2SO4 10 M 10
NAD+ 10
-2 M 25
Enzima GlDH 2 mg mL-1
1
Las reacciones se llevaron a cabo en tubos de Khan cerrados con parafilm para
evitar evaporacioacuten de liacutequido y en bantildeo termostatizado a 37 ordmC La lectura de
absorbancia se realizoacute cuando se cumplioacute una o dos h de iniciada la reaccioacuten seguacuten la
necesidad del ensayo Los experimentos se realizaron por triplicado
418 Determinacioacuten de glicerol remanente en cultivos de micobacterias
Procedimiento seguido a medios de cultivos Middlebrook 7H9 se los suplementoacute
con glicerol a concentracioacuten 0025 mv y se cultivaron cantidades iguales de ceacutelulas
de M smegmatis algunos medios se conservaron sin adicionar micobacterias en
Materiales y Meacutetodos
48
condiciones de esterilidad Se tomaron aliacutecuotas de estos cultivos a distintos tiempos Se
centrifugaron a 12500 rpm durante 5 min para separar las ceacutelulas del sobrenadante y a
estos uacuteltimos se los congeloacute a -20ordmC para su posterior anaacutelisis
Se realizaron determinaciones de glicerol con la teacutecnica fotomeacutetrica propuesta Se
realizaron reacciones de color por triplicado a las muestras e independientemente se
hizo un blanco de reaccioacuten y 2 testigos cuyas concentraciones fueron de 001 y 004
mv
4181 Determinacioacuten de glicerol remanente en cultivos de micobacterias con y sin
fago D29 y ensayos controles respectivos
Procedimiento seguido a medios de cultivos Middlebrook 7H9 se los suplementoacute
con glicerol a 0025 mv y se cultivaron cantidades iguales de a) ceacutelulas de M
smegmatis b) ceacutelulas de M smegmatis infectadas con fago D29 c) fagos D29 d)
algunos medios se conservaron sin adicionar micobacterias ni fagos en condiciones de
esterilidad Se tomaron aliacutecuotas de estos medios inmediatamente despueacutes de realizados
los inoacuteculos (tiempo 0) a las 2 h y a las 4 h de iniciados los cultivos Se centrifugaron a
12500 rpm durante 5 min para separar las ceacutelulas del sobrenadante y a estos uacuteltimos se
los congeloacute a -20 ordmC para su posterior anaacutelisis A estas muestras se les realizaron
determinaciones del glicerol remanente con la teacutecnica fotomeacutetrica propuesta Se
realizaron reacciones de color por triplicado a cada muestra utilizaacutendose como testigos
los medios en condiciones de esterilidad
419 Instrumental electroquiacutemico
Para los experimentos electroquiacutemicos se utilizoacute un analizador electroquiacutemico
Autolab (Eco Chemie) con amplificador electromeacutetrico diferencial PGSTAT 30 Se
utilizoacute una celda convencional de tres electrodos
4191 Electrodos de trabajo
41911 Bioelectrodo para evaluacioacuten de infeccioacuten toxoplaacutesmica
Se utilizaron electrodos macizos tipo ―banderita de oro de aproximadamente 1
cm2 de aacuterea geomeacutetrica El ensamblado se realizoacute de acuerdo al siguiente protocolo los
electrodos limpios se sumergieron durante 14 h en una solucioacuten de aacutecido 3 mercapto
propanosulfoacutenico preparada inmediatamente antes de usar disolviendo 22 mg en 12 mL
de H2SO4 0021 M (desoxigenenada con burbujeo de N2) en atmoacutesfera de N2 a
Materiales y Meacutetodos
49
temperatura ambiente (TA) Luego de enjuagar con agua destilada se sumergieron en
una solucioacuten de Ang recombinante P22C 02 mg mL-1
(PBS pH 74) durante 1 h a TA
Luego de un lavado con PBS se bloquearon los sitios libres no modificados con el Ang
sumergiendo los electrodos en solucioacuten de caseinato de sodio 01 mg mL-1
(preparada
inmediatamente antes de usar) 30 min a 37 degC Los electrodos se lavaron con PBS
Tween-20 05 mv y se sumergieron en una dilucioacuten 1200 de suero humano (muestra
incoacutegnita) en PBS durante 30 min a 37 degC Se lavaron con PBS Tween-20 05 y
finalmente se incubaron en una dilucioacuten 11500 de anticuerpos de conejo anti IgGh-
HRP Los biosensores asiacute ensamblados se guardaron en PBS pH 74 a 4degC hasta su
utilizacioacuten
41912 Electrodos para cuantificacioacuten de glicerol
Como electrodos de trabajo se utilizaron oro platino plata carbono viacutetreo pasta
de carbono (viacutetreo y grafito) y pastas de carbono modificadas
Los electrodos metaacutelicos y de carbono viacutetreo fueron provistos por Metrohm
(numero de cataacutelogo 612043XX) consistentes en barras del material de 3 mm de
diaacutemetro embutidas en un armazoacuten aislante
Las pastas de carbono utilizadas se enumeran a continuacioacuten indicando los
porcentajes en masa de cada componente respectivamente
a) Pasta A carbono viacutetreo aceite mineral (7030)
b) Pasta B carbono viacutetreo aceite mineral GLDH (68302)
c) Pasta C carbono viacutetreo aceite mineral GLDH MWCNT (5830210)
Las pastas se prepararon mezclando los componentes en mortero de aacutegata durante
15 a 20 min hasta obtener una mezcla homogeacutenea a la vista Cuando se utilizoacute enzima
GlDH se dispersoacute en aceite mineral primero y luego se mezcloacute con el polvo de carbono
viacutetreo Cuando se utilizaron NTC (MWCNT nanotubos de carbono de pared multiple)
se dispersoacute primero la enzima luego los NTC y finalmente el polvo de carbono viacutetreo
Asiacute preparadas se empaquetaron firmemente en un armazoacuten de tefloacuten (diaacutemetro 3 mm)
y se friccionoacute firmemente sobre un papel liso apoyado en un vidrio para eliminar el
exceso de pasta y pulir la superficie expuesta del electrodo
Cuando se utilizaron electrodos de pasta de carbono con las pastas B se realizoacute una
cubierta de poli-(o-fenilendiamino) que inmovilizara la enzima Una vez empaquetada
la pasta en el armazoacuten de Teflon se sumergioacute en una solucioacuten de o-fenilendiamino 5 x
10-4
M en solucioacuten tampoacuten carbonato 01 M (pH 10) Se burbujeoacute N2(g) para eliminar el
Materiales y Meacutetodos
50
O2(g) de la solucioacuten y dejar una atmoacutesfera libre de O2(g) Para electropolimerizar se
realizoacute un barrido de potencial ciacuteclico desde -051 V a + 069 V a 50 mV s-1
Finalmente se enjuagoacute con solucioacuten amortiguadora carbonato 01 M (pH 10)
4192 Limpieza de electrodos
Los electrodos de oro macizo policristalino tipo ―banderita se sumergieron en
solucioacuten ―pirantildea (H2SO4 concentrado peroacutexido de hidroacutegeno 30 en una relacioacuten 31)
durante 30 min a 80ordmC Luego se los enjuagoacute con abundante agua destilada En caso de
limpieza maacutes rigurosa previo al tratamiento con solucioacuten ―pirantildea se los colocoacute a la
llama directa hasta rojo vivo (Ribone y col 2006)
Los electrodos de oro policristalino macizo insertos en una barra de tefloacuten (Tips de
Au) se limpiaron siguiendo el siguiente protocolo desengrase frotaacutendolo sobre tela de
pulido humedecida con DMSO Lavado con abundante agua destilada Pulido con
suspensioacuten acuosa de aluacutemina (diaacutemetro promedio de partiacutecula 03 microm) sobre tela de
pulido Lavado con abundante agua destilada Sonicado durante 5 min en sonicador
Cole-Palmer 8890 Luego de un enjuague con abundante agua destilada se sumergieron
en HNO3 9 M durante 1 min a 60 ordmC Finalmente se lavaron con abundante agua
destilada
4193 Determinacioacuten del aacuterea real del electrodo
Para la determinacioacuten del aacuterea real de los electrodos metaacutelicos se utilizaron dos
metodologiacuteas in-situ
41931 Medicioacuten de la adsorcioacuten de oxiacutegeno
Se asume que el oxiacutegeno se quimioadsorbe en una capa monoatoacutemica antes de la
evolucioacuten de 02 con una correspondencia de uno-a-uno con los aacutetomos metaacutelicos de la
superficie El valor de la carga asociada a la reduccioacuten de la monocapa de oacutexido en
superficies de oro policristalino que se utilizoacute fue de 390plusmn10 microC cm-2
(Trasatti amp Petrii
1991)
Se realizaron VCs en H2SO4 a 50 mVs-1
y se midioacute la carga correspondiente al pico
de desorcioacuten de O2 sobre la superficie del electrodo y este valor se dividioacute por el valor
de referencia
Materiales y Meacutetodos
51
41932 Voltametriacutea ciacuteclica de ferricianuro de potasio
Registrando VCs a varias velocidades de barrido de potencial conociendo el
coeficiente de difusioacuten del ioacuten su concentracioacuten en la celda y midiendo la corriente de
pico a cada velocidad de barrido es posible determinar el aacuterea real del electrodo de
trabajo utilizando la ecuacioacuten de Randles Sevcik ec[216] (Belluzo y col 2008)
[216]
siendo la temperatura 25 degC y donde A estaacute en cm2 D en cm
2 s
-1 C en mol cm
-3 y
en V s-1
420 Medidas electroquiacutemicas
Todos los potenciales fueron medidos y referidos al electrodo de AgAgCl (KCl
300 M) que se utilizoacute como electrodo de referencia Como contraelectrodos se
utilizaron dos tipos uno de oro de superficie mayor a 5 veces la superficie del electrodo
de trabajo cuando se utilizaron electrodos metaacutelicos como electrodos de trabajo y una
barra de carbono viacutetreo cuando se utilizaron electrodos de pasta de C como electrodos
de trabajo En todos los casos las soluciones se burbujearon con N2 durante 1 min para
desplazar el O2 disuelto y se mantuvieron en atmoacutesfera de N2 durante las
determinaciones
Las voltametriacuteas ciacuteclicas se realizaron equilibrando el sistema al potencial de inicio
Para muestras conteniendo glicerol y utilizando electrodos de oro se realizaron
barridos desde -030 V hasta 060 V a distintas velocidades de barrido Cuando se
utilizaron electrodos de platino se realizaron barridos desde -080 V hasta 020 V a
distintas velocidades de barrido Cuando se utilizaron electrodos de pasta de carbono o
pasta de carbono modificada se realizaron barridos de potencial desde -040 V hasta
100 V Las corrientes que se informan son las intensidades de pico obtenidas trazando
una liacutenea de base recta desde los extremos del pico de corriente utilizando algoritmos
propios del programa General Purpose Electrochemical System (GPES)
4201 Mediciones amperomeacutetricas para evaluacioacuten de infeccioacuten toxoplaacutesmica
Las amperometriacuteas realizadas con el bioelectrodo para evaluacioacuten de infeccioacuten
toxoplaacutesmica se llevaron adelante en solucioacuten PBS (pH 74) FeMe 3 mM El potencial
de trabajo fue de 008V Se registroacute la corriente de base hasta que se estabilizoacute y una
Materiales y Meacutetodos
52
vez estable (usualmente a los 250 s) se adicionoacute el sustrato de la enzima (H2O2)
concentracioacuten en celda 18 mM y se registroacute la corriente final (500 s) La corriente
cataliacutetica se evaluoacute como la diferencia entre la corriente final y la de base
4202 Mediciones amperomeacutetricas para cuantificacioacuten de glicerol
42021 Amperometriacuteas con tip de oro
Las amperometriacuteas con tip de oro se realizaron en medio NaOH 01 M a potencial
constante (01 V) y a temperatura ambiente (20 a 25 ordmC) El sistema se preacondicionoacute
aplicando un potencial de 05 V se dejoacute equilibrar y se registroacute la corriente de base en
esas condiciones (generalmente a los 50 s) Luego se adicionoacute la muestra de forma de
lograr la concentracioacuten final de analito deseada La corriente fue registrada y se midioacute
una vez que se estabilizoacute (aproximadamente a los 400 s) La corriente cataliacutetica se
evaluoacute como la diferencia entre la corriente final y la de base
42022 Amperometriacuteas con electrodos de pasta de C
Las amperometriacuteas donde se utilizoacute la pasta de carbono B se realizaron en solucioacuten
tampoacuten carbonatobicarbonato de potasio 100 mM (NH4)2SO4 25 mM K3Fe(CN)6
1mM NAD+ 05 mM pH 105 Se trabajoacute a potencial constante 038 V y a temperatura
ambiente (25 ordmC) El sistema se preacondicionoacute aplicando el potencial de trabajo
correspondiente durante 50 s una vez iniciada la lectura de corriente se dejoacute equilibrar
y se registroacute la corriente de base en esas condiciones usualmente a los 300 s Luego se
adicionoacute la cantidad necesaria de muestra de forma de lograr la concentracioacuten final de
analito deseada La corriente fue registrada y se midioacute una vez que se estabilizoacute
(aproximadamente a los 500 s) La corriente cataliacutetica se evaluoacute como la diferencia
entre la corriente final y la de base
Las amperometriacuteas donde se utilizoacute la pasta de carbono C se realizaron en solucioacuten
tampoacuten carbonatobicarbonato de potasio 100 mM (NH4)2SO4 25 mM NAD+ 05 mM
pH 105 a potencial constante 051 V y a 25 ordmC El sistema se preacondicionoacute aplicando
el potencial de trabajo correspondiente durante 50 s una vez iniciada la lectura de
corriente se dejoacute equilibrar y se registroacute la corriente de base en esas condiciones
usualmente a los 300 s Luego se adicionoacute la cantidad necesaria de muestra de forma
de lograr la concentracioacuten final de analito deseada La corriente fue registrada y se
midioacute una vez que se estabilizoacute (aproximadamente a los 200 s del agregado) La
corriente cataliacutetica se evaluoacute como la diferencia entre la corriente final y la de base
Materiales y Meacutetodos
53
Cuando el tiempo de equilibrado no fue suficiente para que la corriente de base se
estabilizara se recurrioacute a realizar correcciones de liacutenea de base A tal fin se llevaron a
cero las corrientes de base aplicando los algoritmos que ofrece el programa GPES
versioacuten 49 provisto por Eco Chemie BV
4203 Voltamperometriacutea de onda cuadrada
Los experimentos de voltamperometriacutea de onda cuadrada se realizaron en solucioacuten
tampoacuten carbonatobicarbonato de potasio 100 mM (NH4)2SO4 25 mM NAD+ 05 mM
pH 105 y a 25 ordmC Los valores de escaloacuten de potencial utilizados fueron de 5 y 10 mV
Los valores de amplitud de pulso fueron de 25 y 50 mV Las frecuencias utilizadas
fueron de 8 10 20 30 40 60 y 70 Hz Especiacuteficamente se evitoacute utilizar 50 Hz
(frecuencia de la tensioacuten alterna de la liacutenea de alimentacioacuten) Los barridos de potencial
se realizaron desde -03 V hasta 10 V
Una vez registrado el blanco con medio Middlebrook 7H9 y se hicieron dos
agregados secuenciales de solucioacuten estaacutendar de glicerol 100 M obtenieacutendose una
concentracioacuten final de 25 y 50 mM respectivamente en la celda
421 Funcionalizacioacuten de nanotubos de carbono
Previo a la utilizacioacuten de los nanotubos de carbono se procedioacute a funcionalizarlos
realizando una carboxilacioacuten oxidativa Se siguioacute una comunicacioacuten personal del Dr
Joseacute Manuel Pingarroacuten del Departamento de Quiacutemica Analiacutetica Facultad de Ciencias
Quiacutemicas Universidad Complutense de Madrid A saber se pesaron aproximadamente
2 mg de MWCNT y se dispersaron en 2 mL en una mezcla de aacutecido sulfuacuterico aacutecido
niacutetrico 31 con agitacioacuten ultrasoacutenica durante 5 h Luego se diluyoacute la mezcla al 110
vertieacutendola suavemente en agua destilada enfriada en bantildeo de hielo para evitar
proyecciones Se eliminoacute el exceso de aacutecido centrifugando a 14000 rpm durante 30
min descartando el sobrenadante y dispersando el precipitado en agua destilada con
agitacioacuten ultrasoacutenica durante 30 min Esta operatoria se repitioacute 9 veces hasta que la
dispersioacuten de MWCNT en agua tuvo un pH cercano a la neutralidad (70 05) Los
MWCNT se secaron en desecador con sulfato de cobre anhidro y aplicando vaciacuteo al
sistema
Materiales y Meacutetodos
54
422 Programas de prediccioacuten de epiacutetopes lineales reconocidos por ceacutelulas B
4221 Base de datos de proteiacutenas
Se creo manualmente una base de datos para mejorar la exactitud de los resultados
Las proteiacutenas fueron seleccionadas de la base de datos de BciPep (Saha y col 2005)
HIV Molecular Immunology Database (disponible en httpwwwhivlanlgovcontent
immunologyindexhtml) o tomadas de la literatura VP1 (Wang y col 2011) proteiacutena
N (El-Manzalawy y col 2008) y Gliadina (Sweredoski amp Baldi 2009) El criterio de
seleccioacuten fue la confirmacioacuten experimental previa mediante ensayos de puntos de
inmunoadsorcioacuten ligado a enzima (ELIspot) o mediante el uso de paneles
multiespeciacuteficos de anticuerpos monoclonales que reconocen epiacutetopes lineales (Shin y
col 2005) Como resultado se seleccionaron 11 proteiacutenas de las que se obtuvieron un
total de 65 epiacutetopes lineales reconocidos por ceacutelulas linfociacuteticas tipo B
4222 Programas utilizados
Se utilizaron algunos programas para predecir los epiacutetopes lineales disponibles en
liacutenea gratuitamente Todos estos programas utilizan algoritmos matemaacuteticos con escalas
de propensioacuten yo datos experimentales de antigenicidad A menos que se indique lo
contrario cada programa se ejecutoacute utilizando los paraacutemetros por defecto Los
programas utilizados fueron AAPPred (Davydov amp Tonevitskii 2009) ABCpred
(Saha S amp Raghava 2006) BcePred (Saha y col 2005) BepiPred (Larsen y col
2006) y Antigenic (Kolaskar amp Tongaonkar 1990)
Los programas de prediccioacuten definen el grado de antigenicidad por medio de una
puntuacioacuten (score) en algunos casos para cada epiacutetope y en otros para cada residuo
amino aciacutedico En este uacuteltimo se puede definir una regioacuten antigeacutenica cuando varios
residuos con alta puntuacioacuten son adyacentes en la estructura primaria Por otra parte el
nuacutemero de epiacutetopes o regiones antigeacutenicas que los programas de prediccioacuten encuentran
depende de un umbral que es configurado por el usuario
423 Anaacutelisis de Datos
Los liacutemites de deteccioacuten (LD) y cuantificacioacuten (LC) se calcularon siguiendo las
sugerencias de Armbruster amp Pry (Armbruster amp Pry 2008) modificando la cantidad
de replicados utilizados para la obtencioacuten de los desviacuteos estaacutendar habieacutendose utilizado
10 reacuteplicas El caacutelculo del LD se realizoacute a partir del valor de corriente del blanco IB maacutes
Materiales y Meacutetodos
55
33 veces el valor del desviacuteo estaacutendar de la corriente leiacuteda (DSn1) de la muestra con
menor concentracioacuten de glicerol medida seguacuten
[41]
El valor del LC se calculoacute como
[42]
siendo m la pendiente de la curva de calibracioacuten
La capacidad de discriminacioacuten entre dos concentraciones diferentes de los
meacutetodos propuestos se evaluoacute como el error asociado a la estimacioacuten de la
concentracioacuten Ec calculada como
Nm
EE r
c
1
[43]
siendo Er el error relativo
424 Caacutelculos estadiacutesticos y disentildeo experimental
Para los caacutelculos estadiacutesticos se utilizaron los programas SigmaStat 32 (Sigma Plot
90 u 110) o Microcal Origin 80 en forma indistinta Para los caacutelculos de EJCR (regioacuten
eliacuteptica de confianza conjunta) se utilizoacute el programa Matlab con rutinas disentildeadas ―ad-
hoc
Resultados y Discusioacuten
Resultados y Discusioacuten
57
5 Resultados y discusioacuten
Para la obtencioacuten de antiacutegenos especiacuteficos de fase aguda de la toxoplasmosis se
comenzoacute seleccionando un conjunto de proteiacutenas denominadas P30 P22 y P35
mencionadas en la literatura como antiacutegenos de fase aguda (Harning y col 1996
Parmley y col 2000 Lu y col 2006) Sobre la base de estos estudios iniciales se
intentoacute identificar por medio de caacutelculos teoacutericos que regiones de estas proteiacutenas
conteniacutean mayor nuacutemero de epiacutetopes De este modo en la etapa siguiente se procurariacutea
expresarlos en forma soluble para su posterior utilizacioacuten en inmunoensayos Al
momento de seleccionar un programa de todos los disponibles ―on line verificamos
que eacutestos no informaban el valor predictivo positivo VPP Por ello se inicioacute un trabajo
de identificacioacuten del programa que predijera maacutes fidedignamente los epiacutetopes La
buacutesqueda se realizoacute comparando los resultados arrojados por 5 programas a los que se
solicitoacute prediccioacuten de epiacutetopes pertenecientes a 11 proteiacutenas cuyos epiacutetopes lineales
habiacutean sido perfectamente establecidos experimentalmente (Costa y col 2013) Se
analizoacute cuaacutel de ellos presentaba el mayor VPP (ver punto 61 seccioacuten Experimentos
Auxiliares) y para predecir epiacutetopes lineales se trabajoacute con este programa que resultoacute
ser AAPred
El anaacutelisis de los Ang seleccionados permitioacute identificar en P35 dos regiones que
concentraban los determinantes antigeacutenicos a las cuales se las denominoacute P35A y P35B
Los Ang P30 y P22 presentaban los determinantes antigeacutenicos distribuidos
homogeacuteneamente por lo tanto al momento de disentildear su clonado se tuvieron en cuenta
criterios que faciliten la expresioacuten y solubilidad mas allaacute de la antigenicidad
51 Evaluacioacuten de antiacutegenos recombinantes de T gondii
511 Antiacutegeno P30
El antiacutegeno de superficie 1 de T gondii SAG1 tambieacuten denominado proteiacutena P30
se ha identificado como antiacutegeno de fase aguda (Harning y col 1996) por lo cual se
procuroacute obtenerlo en forma soluble Sobre la base de ensayos previos realizados en el
LTI se continuoacute con la obtencioacuten y purificacioacuten de dos porciones del antiacutegeno P30
denominadas P30L y P30C (seccioacuten 410 Materiales y Meacutetodos) Luego de la cosecha
y lisis de las bacterias se separaron las fracciones soluble e insoluble del extracto se
tomaron aliacutecuotas de ambas y se analizaron por SDS-PAGE Los Angs buscados soacutelo se
Resultados y Discusioacuten
58
obtuvieron como proteiacutenas precipitadas en cuerpos de inclusioacuten en la fraccioacuten insoluble
Por ello se discontinuoacute el trabajo con las fracciones de P30
512 Antiacutegeno P22
El antiacutegeno de superficie 2 o antiacutegeno P22 de T gondii (Gen Bank ndeg M33572) ha
sido tambieacuten identificado como antiacutegeno de fase aguda (Parmley y col 1992 Lau amp
Fong 2006) En el presente trabajo se procuroacute amplificar la regioacuten del gen que
permitiese expresar la proteiacutena recombinante en forma soluble El producto de
amplificacioacuten se resolvioacute en un gel de agarosa tentildeido con bromuro de etidio como se
observa en la Fig 51
Figura 51 Gel de agarosa tentildeido con bromuro de etidio en transiluminador UV En PCR1 se observan los
productos de amplificacioacuten obtenidos utilizando cebadores especiacuteficos para la regioacuten P22C donde se
sentildeala el fragmento de tamantildeo esperado Control (-) muestra la misma mezcla de reaccioacuten pero sin ADN
molde MPM indica el marcador de peso molecular y el tamantildeo de los fragmentos se indica sobre la
derecha
Se aisloacute y purificoacute el fragmento de intereacutes utilizando un equipo comercial detallado
en el punto 48 seccioacuten Materiales y Meacutetodos En un paso posterior se ligoacute al vector
pET32a y con la construccioacuten resultante se transformaron ceacutelulas competentes de E
coli Las ceacutelulas transformadas se seleccionaron crecieacutendolas en medio LB con
ampicilina Se verificaron las condiciones para la expresioacuten en forma soluble (punto
410 seccioacuten Materiales y Meacutetodos) encontraacutendose que las condiciones oacuteptimas eran
01 mM IPTG y 12 h de incubacioacuten con agitacioacuten vigorosa
Para la induccioacuten preparativa se siguioacute el protocolo detallado en la seccioacuten 410 de
Materiales y Meacutetodos La Fig 52 muestra la fotografiacutea de un gel de poliacrilamida
luego de la tincioacuten donde se analizaron aliacutecuotas de todos los extractos obtenidos en los
distintos pasos separativos de la proteiacutena P22C
Resultados y Discusioacuten
59
Figura 52 Gel de poliacrilamida tentildeido con azul brillante de Coomassie En cada calle se sembraron 1
microL de muestra EC indica el extracto crudo P1 muestra la fraccioacuten insoluble del lisado celular P2 la
fraccioacuten insoluble luego del congelamiento-descongelamiento del extracto centrifugado FT muestra el
extracto que pasoacute por la columna Con L se indican las calles con las fracciones de lavados sucesivos con
tampoacuten imidazol 0 mM 20 mM 50 mM y 100 mM respectivamente E muestra las fracciones de
elucioacuten con solucioacuten imidazol 250 mM Las fracciones de elucioacuten recolectadas fueron de 15 mL cada
una
513 Antiacutegeno P35
El antiacutegeno de superficie P35 de T gondii (Gen Bank ndeg AF01275) se ha
identificado como antiacutegeno de fase aguda y distintas porciones del mismo presentan
diferentes desempentildeos en su uso diagnoacutestico (Lu y col 2006) Sobre la base de
ensayos previos realizados en el LTI se continuoacute con la obtencioacuten y purificacioacuten de las
dos porciones del antiacutegeno P35 denominadas P35A y P35B
Se ensayoacute la expresioacuten del antiacutegeno P35A (punto 49 seccioacuten Materiales y
meacutetodos) y soacutelo se obtuvo como cuerpos de inclusioacuten en la fraccioacuten insoluble Si bien
fue posible disolver las proteiacutenas recombinantes en urea 8 M al dializar volviacutean a
precipitar
El antiacutegeno P35B se pudo obtener en forma soluble y las condiciones oacuteptimas
encontradas para la induccioacuten del mismo fueron IPTG 1 mM y 4 h con agitacioacuten
vigorosa La Fig 53 muestra una imagen del gel de poliacrilamida luego de la corrida
electroforeacutetica y su tincioacuten Se observoacute que una banda de la fraccioacuten soluble estaba
sobreexpresada en los cultivos inducidos
Resultados y Discusioacuten
60
Figura 53 Gel de poliacrilamida al 12 en condiciones desnaturalizantes Se muestra lo obtenido para
aliacutecuotas de dos cultivos no inducidos 1 y 2 y dos inducidos 3 y 4 Con P se designan las fracciones
insolubles en la solucioacuten de lisis y con SN las fracciones solubles Las bandas que se observan del MPM
corresponden a fragmentos de 19445 KDa 28829 KDa 36545 KDa 49491 KDa 80664 KDa
103035 KDa Se indica la banda sobreexpresada de tamantildeo esperado
Para la induccioacuten preparativa del antiacutegeno P35B se siguioacute el protocolo descripto en
el punto 410 seccioacuten Materiales y Meacutetodos En la Fig 54 se muestra un gel de
poliacrilamida luego de la tincioacuten donde se analizaron aliacutecuotas de todos los extractos
obtenidos en los distintos pasos separativos
Figura 54 Gel de poliacrilamida tentildeido con azul brillante de Coomassie En cada calle se sembraron 7
microL de muestra P1 fraccioacuten insoluble del lisado celular P2 fraccioacuten insoluble luego del congelamiento-
descongelamiento del extracto centrifugado FT muestra el extracto que pasoacute por columna L calles con
las fracciones de lavados sucesivos con tampoacuten imidazol 20 mM 50 mM y 100 mM respectivamente E
fracciones de elucioacuten con solucioacuten imidazol 250 mM Las fracciones recolectadas fueron de 15 mL cada
una
En consecuencia se continuoacute el trabajo con P35B y se descartoacute transitoriamente la
utilizacioacuten del Ang P35A
52 Marcado de antiacutegenos recombinantes de T gondii
Para los ensayos tipo ELISA de captura especiacuteficos para IgM se propuso utilizar
como sistema revelador la enzima HRP-EAV que se une especiacuteficamente a biotina En
consecuencia se procedioacute a marcar los Ang solubles obtenidos con biotina
P35B
P1 P2 P3 P4 MPM
Inducido No Inducido
SN1
Inducido No Inducido
SN2 SN3 SN4
Resultados y Discusioacuten
61
La reaccioacuten de conjugacioacuten se realizoacute siguiendo el protocolo mencionado en el
punto 413 seccioacuten Materiales y Meacutetodos La conjugacioacuten se evidencioacute con la reaccioacuten
de color indicada en el inciso 413 En la Fig 55 se muestra la membrana de
nitrocelulosa sobre la que se fijaron las proteiacutenas P22 y P35B luego del revelado
cromogeacutenico con la enzima HRP conjugada a streptavidina Las reacciones de
conjugacioacuten se llevaron adelante por separado
Figura 55 Membranas de nitrocelulosa evidenciando las proteiacutenas P35B conjugada (izquierda) y P22C
conjugada (derecha)
53 Inmunoensayos
Estudios preliminares (ver punto 62 seccioacuten Experimentos Auxiliares) con los
antiacutegenos recombinantes obtenidos permitieron verificar por ELISA indirecto que sueros
confirmados positivos arrojaban resultados positivos mientras que los sueros negativos
daban el ensayo negativo Se procedioacute entonces a evaluar la capacidad de los antiacutegenos
obtenidos para discriminar sueros de pacientes con infeccioacuten aguda de sueros provenientes
de pacientes con infeccioacuten croacutenica
531 Inmunoensayos con deteccioacuten fotomeacutetrica
Como se anticipoacute en la introduccioacuten se realizaron ELISA siguiendo dos
alternativas de captura En la primera alternativa que denominamos A se procuroacute
capturar selectivamente la maacutexima cantidad de Ac del isotipo que se deseaba detectar
(IgMh) adsorbiendo sobre la placa un anticuerpo ―ad-hoc (Ac-a-IgMh) En la segunda
alternativa que denominamos B se buscoacute capturar con el Ang recombinante la maacutexima
cantidad de Ac especiacuteficos independientemente del isotipo que se tratara En el paso
siguiente del esquema B se tomoacute ventaja de la mayor valencia de las IgM respecto de
las IgG para el revelado
5311 Evaluacioacuten del esquema A
Sobre placas de ELISA se capturaron los Acs IgMh revelaacutendose la presencia de los
especiacuteficos con los antiacutegenos obtenidos marcados con biotina y uniendo a estos uacuteltimos la
enzima HRP-EAV En los ensayos preliminares (ver punto 622 seccioacuten Experimentos
Auxiliares) se identificoacute la cantidad de antiacutegeno marcado y las diluciones de HRP-EAV
oacuteptimas a utilizar para revelar la presencia de IgM especiacutefica capturada En la Tabla 51 se
Resultados y Discusioacuten
62
muestran los valores de absorbancia a 450 nm obtenidos para el panel de 9 sueros
ensayados Se utilizaron 5 g de P22C-biotina por pocillo y 100 L de HRP-EAV en
dilucioacuten 12000
Tabla 51 Absorbancias a 450 nm obtenidas en los ELISA siguiendo el esquema de captura A descrito
maacutes arriba
Placa 1 Placa 2
Agudos
0100 0158
0311 0273
0140 0165
Croacutenicos
0281 0322
0256 0278
0260 0226
Negativos
0217 0168
0235 0179
0409 0354
Sin suero
0135 0134
0143 0114
0126 0100
Sin suero
Sin
P22cBiotina
0071 0050
0070 0037
0047 0040
Los resultados obtenidos con ambos antiacutegenos fueron desalentadores (los resultados
obtenidos con P35B biotina no se informan) ya que no se hallaron diferencias
significativas entre los valores de absorbancia obtenidos con sueros de pacientes
agudos croacutenicos y negativos
5312 Esquema B
En base a los resultados obtenidos en la seccioacuten anterior se orientaron los ensayos
realizando los ELISA siguiendo un esquema no claacutesico al que denominamos B
Debido a la baja sensibilidad que presentaron los Angs conjugados a biotina para
detectar los Acs especiacuteficos pensamos en hacer una primera etapa de concentracioacuten de
los Acs especiacuteficos en la placa para luego revelar con el Ang conjugado a biotina Esto
se hizo adsorbiendo antiacutegeno recombinante sobre la superficie de la placa de
poliestireno enfrentaacutendola luego al suero a ensayar Asiacute se captura selectivamente las
inmunoglobulinas que reconocen al antiacutegeno ya sean IgM o IgG Luego se expone la
placa al mismo antiacutegeno recombinante pero ligado a biotina que se uniraacute a los
anticuerpos especiacuteficos para dicho Ang previamente capturados Finalmente se revela
Resultados y Discusioacuten
63
con HRP conjugada a streptavidina que forma un complejo estable con biotina De esta
forma se aumenta la cantidad de Ang marcado en mayor proporcioacuten para IgM que para
IgG dada la multivalencia de este isotipo de inmunoglobulina En la Fig 56 se
reproduce el esquema B que fue el que brindoacute los resultados maacutes promisorios
Antiacutegeno (Ang) Bloqueante Ang ligado a biotina Reactivo de color
IgM a-Ang IgG a-Ang streptavidina conjugada a HRP
Figura 56 Esquema de ensayo ELISA de captura tipo B El antiacutegeno expuesto en la placa captura la
porcioacuten de las IgM e IgG especiacuteficas presentes en el suero humano Haciendo uso de la polivalencia de
las IgM su presencia se revela con el antiacutegeno conjugado a biotina streptavidina ligada a HRP
adicionando el sustrato de la enzima y un cromoacutegeno actuando como cosustrato
Buscando diferenciar sueros de pacientes en fase de infeccioacuten aguda (agudos) de
sueros provenientes de pacientes sin infeccioacuten (negativos) En la Tabla 52 se muestran los
valores de absorbancia a 450 nm obtenidos
Tabla 52 Absorbancias a 450 nm obtenidas en los ELISA siguiendo el esquema de captura B
Ang
Sueros P35B 05ug P35B 001ug P22C 05ug P22C 001ug
Agudos 2131 1567 0335 0296
1849 1311 065 0413
Negativos 176 1350 0282 0327
1025 1676 0262 0325
Sin suero 1658 1658 0174 0149
1812 1504 0130 0144
Sin Ang
conjugado
0055 004 0041 0045
0057 0042 0039 004
Resultados y Discusioacuten
64
Este ensayo exploratorio demostroacute que los antiacutegenos P22C y P35B pueden ser usados
potencialmente en la deteccioacuten de toxoplasmosis aguda realizando inmunoensayos con el
esquema B propuesto en el presente trabajo Por ello siguiendo este esquema de trabajo se
exploraron cuales eran las condiciones oacuteptimas (ver punto 623 seccioacuten Experimentos
Auxiliares) Asiacute se establecioacute la dilucioacuten de la enzima HRP-EAV (12000) la cantidad de
P22C biotina (5 microg por pocillo) y se acotaron los valores de P22C adsorbidos inicialmente
en la placa entre 500 y 50 ng Finalmente se realizaron tres ensayos en paralelo donde se
evaluoacute la cantidad de antiacutegeno adsorbido inicialmente en la placa y se amplioacute el panel de
sueros Los resultados obtenidos se muestran en la Fig57
Figura 57 Absorbancias a 450 nm para los ELISA realizados con el esquema B (A) 50 ng de Ang P22C
(B) 200 ng de Ang P22C (C) 500 ng de Ang P22C Con se indican los sueros provenientes de
pacientes con infeccioacuten aguda (Agudos) con los provenientes de pacientes con infeccioacuten croacutenica
(Croacutenicos) y con los de pacientes sin infeccioacuten (Negativos) Con la liacutenea roja ( ) se indica el valor
de media menos tres desviacuteos estaacutendares de los agudos (AbsA ndash 3 DSA) y con la liacutenea verde ( ) el valor
de media maacutes tres desviacuteos estaacutendares de los croacutenicos (AbsC +3 DSC)
Resultados y Discusioacuten
65
En las tres condiciones evaluadas se obtiene una separacioacuten de las sentildeales obtenidas al
ensayar sueros provenientes de los pacientes con infeccioacuten aguda (Agudos) de los sueros
provenientes de pacientes con infeccioacuten croacutenica (Croacutenicos) y los pacientes sin infeccioacuten
(Negativos)
Los resultados obtenidos con P35B no resultaron alentadores debido al elevado ruido
de fondo (altos valores de absorbancia de los blancos) Por lo tanto los ensayos
electroquiacutemicos se iniciaron soacutelo con P22C
Mijak y colaboradores (Hiszczyntildeska-Sawicka y col 2005) sentildealan que ya se ha
demostrado la utilidad del Ang SAG2 para detectar IgG en el suero de pacientes con
toxoplasmosis aguda y croacutenica (Parmley y col 1992) destacando que en los resultados
presentados por ese mismo grupo en otra publicacioacuten (Li y col 2000a) soacutelo se examinaron
un reducido nuacutemero de sueros provenientes de pacientes con infeccioacuten aguda con
resultados tanto positivos como negativos Tambieacuten sentildeala que Maine y colaboradores
(Aubert y col 2000) no obtuvieron resultados satisfactorios con este antiacutegeno
recombinante realizando ELISA indirecto Los resultados obtenidos en este trabajo con
ELISA utilizando el esquema A han confirmado lo sentildealado por Mijak y col sobre el
desempentildeo de este Ang El anaacutelisis que estos autores hacen se orienta a que el uso de estos
antiacutegenos recombinantes debe contemplar necesariamente el uso combinado de otros Angs
Por otro lado en el presente trabajo se han presentado resultados que permitiriacutean
complementar esta visioacuten incorporando otro esquema para la deteccioacuten de sueros de
infectados agudos Si bien es necesario ampliar el nuacutemero de sueros para validar el ensayo
los resultados son promisorios Hemos propuesto que las diferencias obtenidas en los
ELISA de captura siguiendo el esquema B pueden deberse a dos mecanismos no
excluyentes entre si y que podriacutean estar actuando en conjunto Por un lado estaacute la
multivalencia que presentan las IgM respecto de las IgG que generariacutea una amplificacioacuten
selectiva de acuerdo al isotipo Por otro lado independientemente del isotipo capturado el
Ang de fase aguda brindariacutea la sensibilidad y especificidad necesaria al ensayo
identificando Acs de fase aguda Resta pues esclarecer si esto es asiacute fehacientemente o si
hay alguacuten otro mecanismo actuando concomitante que permita explicar las diferencias
observadas aquiacute entre sueros de fase aguda y de infectados croacutenicos
Resultados y Discusioacuten
66
532 Inmunoensayos con deteccioacuten amperomeacutetrica utilizando los antiacutegenos
recombinantes
Los bioelectrodos se ensamblaron como se describe en el inciso 41911 de
Materiales y Meacutetodos Al realizar los inmunoensayos con las diluciones pertinentes de
suero humano (muestra incoacutegnita) en caso de suero de paciente infectado (+) estaraacuten
presentes los anticuerpos IgG anti-P22 (analito de intereacutes) Cuando se sumergen en una
dilucioacuten de anticuerpos anti-IgG h conjugado con HRP (segundo anticuerpo marcado) eacuteste
quedaraacute retenido en el electrodo y frente al agregado del sustrato de la enzima (H2O2)
sobre PBS conteniendo el mediador FcMe se genera la especie que seraacute electro-reducida
sobre el electrodo al potencial de trabajo 008 V (vs AgAgCl ver inciso 420 2) A los
fines de claridad en la Fig 58 se reformula el esquema de funcionamiento del biosensor
previamente esquematizado (Fig 212) para el caso particular aquiacute detallado donde el
Ang es la proteiacutena P22C
Proteiacutena recombinante IgG a-IgGh conjugada a HRP
Bloqueante IgG humana ferrocenometanol
Figura 58 Sobre la superficie del electrodo se fija la proteiacutena P22C que capturaraacute los anticuerpos especiacuteficos
si estaacuten presentes en el suero El revelado se realiza con un segundo anticuerpo especiacutefico para IgG humana
marcado con HRP que en presencia de H2O2 oxida el mediador FcMe que se reduce sobre la superficie del
electrodo generando la sentildeal analiacutetica
En la Fig 59 se muestran tres amperogramas representativos obtenidos cuando se
ensayaron sueros confirmados (+) sueros confirmados (-) y blancos (sin suero alguno)
Los valores de corrientes se corrigieron por los valores de aacuterea reales determinados
mediante voltametriacutea ciacuteclica a distintas velocidades de soluciones de ioacuten ferricianuro
(punto 41932 seccioacuten Materiales y Meacutetodos)
Resultados y Discusioacuten
67
Figura 59 Amperometriacuteas comparativas con bioelectrodos ensamblados con la proteiacutena P22C
En la Tabla 54 se resumen los resultados de los ensayos sobre muestras confirmadas
positivas negativas y blanco
Tabla 54 Valores promedios de la corriente cataliacutetica diferencial obtenidas utilizando bioelectrodos
ensamblados con el antiacutegeno P22C
DS desviacioacuten estaacutendar
Las diferencias en las sentildeales registradas fueron estadiacutesticamente significativas
verificaacutendose la potencialidad del uso de esta metodologiacutea para discriminar entre sueros de
pacientes infectados con T gondii de sueros de pacientes no infectados Los ensayos
electroquiacutemicos preliminares informados permiten pensar en el desarrollo de un biosensor
amperomeacutetrico A futuro seriacutea deseable poder establecer un biosensor electroquiacutemico
basaacutendonos en el esquema B de los ELISA presentados en este trabajo de Tesis que
permita la discriminacioacuten entre sueros de pacientes cursando infeccioacuten aguda de sueros de
pacientes con infeccioacuten croacutenica
54 Determinacioacuten de la actividad electroquiacutemica del glicerol en medio acuoso
Si bien desde hace varios antildeos se ha estudiado la oxidacioacuten electrocataliacutetica de
polialcoholes auacuten no existe acuerdo acerca del procedimiento maacutes conveniente para su
cuantificacioacuten electroquiacutemica asiacute como tampoco ha sido posible identificar un uacutenico
mecanismo que deacute cuenta de los productos obtenidos luego de la reaccioacuten electroacutenica
(Kahyaoglu et al 1984 Kwon amp Koper 2010)
Muestra j = Icaacuterea
( A cm-2
)
DS
( A cm-2
)
Positivos -0455 0026
Negativos -0150 0021
Sin suero -0052 004
Resultados y Discusioacuten
68
Con el fin de encontrar el electrodo y las condiciones maacutes convenientes para
realizar la cuantificacioacuten del glicerol se realizaron ensayos exploratorios de
voltametriacuteas ciacuteclicas utilizando electrodos de carbono viacutetreo pasta de C (grafito y
viacutetreo) Au Pt y Ag Los medios ensayados fueron HClO4 01 M solucioacuten tampoacuten de
fosfato salino (PBS) pH 72 90 120 NaCl al 08 mv y NaOH 01 M El intervalo
de concentracioacuten de glicerol utilizado fue de 100 x 10-5
M hasta 01 M
En estos ensayos iniciales las maacuteximas sentildeales se obtuvieron con electrodos de Au
en medio alcalino (NaOH 01 M) coincidiendo con lo descripto por Lamy (Kahyaoglu
et al 1984) A modo ilustrativo en la Fig 510 se observan dos voltametriacuteas ciacuteclicas
para electrodos de oro y de platino en medio alcalino
Figura 510 Voltamperogramas tiacutepicos para soluciones de glicerol 10-2
M en soluciones de base fuerte
(NaOH 01M) utilizando electrodos de trabajo de Au (izquierda) y Pt (derecha)
En una etapa posterior se verificoacute que las sentildeales obtenidas Ip respondiacutean
proporcionalmente a la concentracioacuten de glicerol Se realizoacute una curva de calibracioacuten en
el intervalo de concentraciones de 50 x 10-4
a 10 x 10-2
M Todas las mediciones se
hicieron por triplicado La Tabla 55 muestra las medias de las corrientes de pico
obtenidas para cada concentracioacuten ensayada con su correspondiente desviacuteo estaacutendar La
corriente de pico se midioacute tomando una liacutenea de base recta a un valor de potencial de
010 V plusmn 005 V usando algoritmos propios del programa GPES 49
Tabla 55 Valores medios de corriente obtenidos por voltametriacutea ciacuteclica para la oxidacioacuten del
glicerol en medio alcalino (NaOH 01 M) sobre electrodos de oro
[Glicerol]
(mM)
Ip
(microA cm-2
)
DS Ip
(microA cm-2
)
050 18 032
100 28 038
200 74 041
500 17 035
750 262 055
100 347 053
-50E-05
00E+00
50E-05
10E-04
15E-04
20E-04
25E-04
-0400 -0200 0000 0200 0400 0600 0800
E(V)
i(A
)
-40E-06
00E+00
40E-06
80E-06
12E-05
16E-05
-1000 -0800 -0600 -0400 -0200 0000 0200 0400
E(V)
i(A
)
Resultados y Discusioacuten
69
En la Fig 511 se presenta la dependencia de la corriente de pico
voltamperomeacutetrica con la concentracioacuten de glicerol Las barras de error corresponden a
las desviaciones estaacutendar de cada medida realizada por triplicados independientes Se
ajustaron estos valores a una recta con el meacutetodo de los miacutenimos cuadrados y se obtuvo
la siguiente ecuacioacuten
[51]
donde IpA estaacute en microA cm-2
y [glicerol] en mM El valor de coeficiente de regresioacuten
(R2) obtenido fue de 09980
Figura 511 Dependencia de la corriente de pico voltamperomeacutetrica con la concentracioacuten de glicerol en
medio alcalino (NaOH 01 M) Se muestran los valores promedios de tres medidas independientes Las
barras de error se corresponden a los desviacuteos estaacutendares
En estas condiciones de trabajo el pico de corriente oxidativa tiene dependencia
lineal con la concentracioacuten de glicerol En funcioacuten de estos resultados se orientoacute la
buacutesqueda hacia una metodologiacutea que permitiese determinar al glicerol en
concentraciones de 10-5
M o menores Para esto iniciamos ensayos con teacutecnica
amperomeacutetrica
Se realizaron los ensayos amperomeacutetricos como se describe en el punto 4202 de la
seccioacuten Materiales y Meacutetodos La Fig 512 muestra el resultado de una amperometriacutea
tiacutepica para una solucioacuten de glicerol
Resultados y Discusioacuten
70
t s
0 50 100 150 200 250 300 350 400 450
I A
0
2
4
6
Figura 512 Amperometriacutea tiacutepica de una muestra con glicerol (concentracioacuten en celda 1 mM) Se dejoacute
estabilizar la corriente para una solucioacuten de NaOH 01 M y a los 50 segundos se realizoacute el agregado de la
muestra con glicerol y se midioacute la corriente hasta los 400 segundos
Se ensayaron soluciones de glicerol cuya concentracioacuten en la celda electroliacutetica
fueron desde 001 mM hasta 5 mM Como blanco se utilizoacute solucioacuten de NaOH 01 M
La corriente cataliacutetica se midioacute como la diferencia entre la corriente final y la inicial
(punto 4202 seccioacuten Materiales y Meacutetodos) A este valor de corriente se lo dividioacute
por el valor de aacuterea real del electrodo medida anteriormente esta densidad de corriente
(IcA) se tomoacute como la sentildeal analiacutetica En la Tabla 56 se muestran las medias de las
sentildeales obtenidas para cada concentracioacuten de glicerol ensayada con su correspondiente
desviacuteo estaacutendar
Tabla 56 Valores medios de densidades de corriente obtenidos por amperometriacutea para la oxidacioacuten de
glicerol en medio alcalino (NaOH 01 M)
[Glicerol]
(mM)
Ic A
( A cm-2
)
DS
( A cm-2
)
0000 0447 0029
0010 0763 0016
0025 1098 0068
0050 1510 0055
0100 285 049
0250 609 036
0500 1245 033
0750 1730 0097
100 2361 0099
150 3445 033
175 3997 020
200 4613 045
Resultados y Discusioacuten
71
En la Fig 513 se presenta la recta de regresioacuten lineal obtenida a partir de los
valores promedio de densidades de corriente para soluciones de glicerol en el intervalo
de concentraciones de 0025 mM y 2 mM Las barras de error corresponden a las
desviaciones estaacutendares de cada medida La ecuacioacuten de la recta obtenida por el meacutetodo
de miacutenimos cuadrados fue
[52]
Donde IcA estaacute en microA cm-2
y [Glicerol] en mM el valor del coeficiente de
regresioacuten (R2) obtenido fue de 09950
[Glicerol] mM
000 025 050 075 100 125 150 175 200
I cA
m
A c
m-2
0
10
20
30
40
50
Figura 513 Curva de calibracioacuten obtenida para glicerol en medio alcalino (NaOH 01 M) con la teacutecnica
amperomeacutetrica Se muestran los valores promedios de tres medidas independientes para cada solucioacuten
Las barras de error que se muestran corresponden al DS de cada punto
Las cifras de meacuterito para esta teacutecnica resultaron ser
Liacutemite de deteccioacuten 10 M
Liacutemite de cuantificacioacuten 24 M
Liacutemite de discriminacioacuten 10 M
Intervalo de linealidad 0024 mM ndash 200 mM
55 Cuantificacioacuten de glicerol en medios acuosos complejos
El glicerol es corrientemente utilizado como principal fuente de carbono en cultivos
bacterianos siendo degradado eficientemente por sistemas enzimaacuteticos que utilizan
mecanismos redox Por lo tanto se comenzoacute a estudiar la posible cuantificacioacuten
electroquiacutemica de este alcohol intentando detectar concentraciones del orden 10-5
M o
Resultados y Discusioacuten
72
menores para poder asiacute evidenciar su consumo en medios de cultivos bacterianos que
contienen glicerol como nutriente El meacutetodo amperomeacutetrico con electrodo de oro no
fue lo suficientemente selectivo para glicerol cuando este se encontraba en matrices
complejas (no se muestran los resultados) por lo tanto al momento de cuantificarlo en
medios de cultivos bacterianos tuvimos que optar por otra metodologiacutea
Sobre la base del trabajo de Tuntildeoacuten-Blanco y col (Aacutelvarez-Gonzaacutelez et al 2000)
se busco desarrollar un biosensor selectivo para este analito
Para verificar la funcionalidad del modelo propuesto se realizaron ensayos
espectrofotomeacutetricos La coenzima NAD(H) en su forma reducida (NADH) presenta un
maacuteximo de absorcioacuten a 340 nm ausente en la forma oxidada (NAD+) Puede apreciarse
en la Fig 514 que el mediador electroquiacutemico Fe(CN)63-
presenta un maacuteximo de
absorcioacuten a 420 nm ausente en la forma reducida Fe(CN)64-
En un primer ensayo se
verificoacute espectrofotomeacutetricamente que la longitud de onda escogida podiacutea utilizarse
para el seguimiento de la reaccioacuten En una serie de ensayos posteriores se monitoreoacute la
reaccioacuten enzimaacutetica en presencia y ausencia del mediador electroquiacutemico haciendo uso
de estas propiedades espectrales
Figura 514 Espectros de absorcioacuten UV-visible para las especies Fe(CN)33-
1 mM y Fe(CN)34-
1 mM
Ambas especies fueron disueltas en solucioacuten tampoacuten carbonato pH 105 Puede apreciarse claramente que
el maacuteximo de absorcioacuten a 420 nm presente en el Fe(CN)63-
se encuentra ausente en el Fe(CN)64-
La
velocidad de barrido fue 1200 nm min-1
551 Evaluacioacuten del modelo propuesto por medio de lecturas
espectrofotomeacutetricas
El primer ensayo para validar el modelo propuesto fue seleccionar la longitud de
onda oacuteptima para el seguimiento espectrofotomeacutetrico A tal fin se llevaron adelante dos
0
025
05
075
1
125
15
175
2
225
25
275
260 280 300 320 340 360 380 400 420 440 460 480 500
Longitud de onda (nm)
Ab
sorb
an
cia
Ferricianuro 1 mM
Ferrocianuro 1 mM
Resultados y Discusioacuten
73
reacciones a) glicerol disuelto en medio 7H9 coenzima Fe(CN)63-
y enzima GlDH y
b) glicerol disuelto en medio 7H9 coenzima Fe(CN)63-
pero sin la enzima GlDH En
ambos casos se realizoacute un barrido espectral de 320 a 480 nm registraacutendose la
absorbancia a una velocidad de barrido de 1200 nm min-1
cada 10 min Ambas
reacciones se llevaron a cabo en solucioacuten tampoacuten carbonato pH 105 En la Fig 515 se
muestran los barridos espectrales obtenidos para cada reaccioacuten y en ella puede
apreciarse que la mayor diferencia se presenta a la longitud de onda prevista (420 nm)
Figura 515 Espectros de absorcioacuten UV-visible para mezclas de reaccioacuten (A) En presencia de enzima
GlDH (B) Sin enzima GlDH Barrido espectral cada 10 min
Para elucidar si el consumo de Fe(CN)63-
observado se correspondiacutea
cuantitativamente con el NADH generado y en consecuencia con el glicerol
consumido se tuvieron en cuenta las siguientes reacciones
glicerol + Fe(CN)63-
DHA + Fe(CN)64-
(1)
glicerol + NAD+ NADH + DHA (2)
Se realizaron series de 3 reacciones en paralelo a saber a) blanco de reaccioacuten (BR)
con enzima GlDH NAD+ y Fe(CN)6
3- en ausencia de glicerol donde se siguioacute la
absorbancia a 420 nm b) reaccioacuten (1) con enzima GlDH NAD+ Fe(CN)6
3- y glicerol
donde se siguioacute la desaparicioacuten de Fe(CN)63-
a 420 nm c) reaccioacuten (2) con enzima
GlDH NAD+ y glicerol donde se siguioacute la aparicioacuten de NADH a 340 nm Debe tenerse
en cuenta por un lado que el NAD+ es reducido a NADH en la reaccioacuten (2) no se
regenera mientras que en la reaccioacuten (1) se regenera por la presencia del anioacuten
Fe(CN)63-
Esto implica que si bien ambas reacciones se lentifican con el paso del
tiempo a causa del consumo de glicerol (y acumulacioacuten de DHA) la reaccioacuten (2) se
lentifica maacutes que la (1) porque se consumen tanto el glicerol como el NAD+
y se
acumulan ambos productos de reaccioacuten (DHA y NADH) Los resultados pueden verse
en la Fig 516
A
0
015
03
045
06
075
09
105
12
135
15
320 340 360 380 400 420 440 460 480
Longitud de onda (nm)
Ab
sorb
an
cia
t = 0
t = 10 min
t = 20 min
t =30 min
t = 40 min
t = 50 min
t = 60 min
B
0
015
03
045
06
075
09
105
12
135
15
320 340 360 380 400 420 440 460 480
Longitud de onda (nm)
Ab
sorb
an
cia
t = 0 min
t = 10 min
t = 20 min
t = 30 min
t = 40 min
t = 50 min
t = 60 min
GlDHNAD+
GlDH
Resultados y Discusioacuten
74
Figura 516 Absorbancias registradas a 420 nm durante las reacciones descriptas en el texto A) Blanco
de reaccioacuten (BR) y reaccioacuten (1) B) Reaccioacuten (2) C) Segmento inicial de la curva representada en
B) a partir de la cual se calculoacute el valor liacutemite de la velocidad inicial de reaccioacuten Se muestra un
experimento representativo de un original y replicado
Se asumioacute que la reaccioacuten (1) transcurre a una velocidad constante en las
condiciones en que se llevoacute a cabo El anaacutelisis estadiacutestico demuestra que hay una ligera
tendencia a la no linealidad evidenciada por la distribucioacuten de los residuos No
obstante siendo las variancias iguales se consideroacute que no hay un alejamiento
significativo de la linealidad Por ello en los caacutelculos de variacioacuten de la concentracioacuten
de coenzima a lo largo del tiempo de reaccioacuten se tuvo en cuenta el cambio que se
produciriacutea si la velocidad de reaccioacuten se mantuviera constante e igual a la velocidad
inicial Para el caso del NAD+ consumido (o NADH generado) en la reaccioacuten (2)
tenemos
[53]
Asumiendo que en el intervalo de concentraciones de trabajo se cumple la ley de
Beer la ec [53] puede reescribirse como
[54]
Si la velocidad de la reaccioacuten enzimaacutetica se mantiene aproximadamente igual a la
velocidad inicial por la regeneracioacuten de la coenzima se puede admitir que la velocidad
A
05
056
062
068
074
08
086
092
098
104
11
0 600 1200 1800 2400 3000 3600
tiempo (s)
Ab
s 4
20
nm
B
0
004
008
012
016
02
024
028
032
036
04
044
048
0 600 1200 1800 2400 3000 3600tiempo (s)
Ab
s 3
40
nm
C
y = 00004405x
R2 = 09983921
0
0035
007
0105
014
0175
021
0 60 120 180 240 300 360 420 480
tiempo (s)
Ab
s 3
40
nm R
2 = 09984
Resultados y Discusioacuten
75
de reaccioacuten es constante (reaccioacuten de orden cero para los reactivos) pudieacutendose expresar
la ec [54] en la siguiente forma
b
k
tb
tk
tb
Abs
nmNADHnmNADHnmNADH
nm
340340340
340 [55]
donde k es la constante de velocidad para esa reaccioacuten en unidades de absorbancia por
unidad de tiempo (s-1
) y se obtiene como la pendiente del segmento lineal de la curva de
la Fig 516 B presentado en la Fig 516 C
La variacioacuten de concentracioacuten total de coenzima se obtiene multiplicando el valor
de velocidad por la variacioacuten de tiempo total
[56]
siendo los valores de los paraacutemetros y variables en cuestioacuten
εNADH 340nm = 6220 M-1
cm-1
Δt = 3600 s
b = 1 cm
k = 44 x 10-4
s-1
resultando
[57]
La variacioacuten de concentracioacuten del mediador seraacute
[58]
nmCNFe 420)( 36
= 1080 M-1
cm-1
ΔAbs420nm = 052
que reemplazando en la ec [58] arroja
M [59]
La variacioacuten de absorbancia observada en el blanco de reaccioacuten a lo largo de una
hora fue de 00046 unidades de absorbancia que representa menos del 1 de la
variacioacuten total observada en la reaccioacuten (1) Estos resultados permiten verificar que en
las condiciones de reaccioacuten el Fe(CN)63-
reducido a Fe(CN)64-
equivale
cuantitativamente al NADH generado en la reaccioacuten enzimaacutetica de acuerdo a la
siguiente estequiometriacutea
Resultados y Discusioacuten
76
2 Fe(CN)63-
+ NADH 2 Fe(CN)64-
+ NAD+ [510]
Lo mostrado corrobora la factibilidad del disentildeo de un biosensor de una sola
enzima con un mediador soluble econoacutemico
5511 Evaluacioacuten de la sentildeal con la concentracioacuten de glicerol
Para verificar si la sentildeal analiacutetica muestra dependencia con la concentracioacuten de
glicerol se realizaron 6 reacciones en paralelo registraacutendose la absorbancia a 420 nm
cada un minuto durante dos horas Se realizoacute un blanco de reaccioacuten sin glicerol y cinco
reacciones con concentraciones crecientes de glicerol Como muestras se utilizaron el
medio de cultivo de micobacterias Middlebrook 7H9 suplementado con glicerol a
distintas concentraciones En la Tabla 57 se presentan las concentraciones de glicerol
en las mezclas de reaccioacuten y en las muestras La Fig 517 muestra la absorbancia a 420
nm para las seis reacciones
Tabla 57 Concentraciones de glicerol en las mezclas de reaccioacuten
Reaccioacuten [glicerol] en mezcla
de reaccioacuten (mM) [glicerol] en muestra
(mM)
Blanco 0 0
Muestra 1 11 22
Muestra 2 082 16
Muestra 3 055 11
Muestra 4 027 55
Muestra 5 011 22
Resultados y Discusioacuten
77
Figura 517 Absorbancia a 420 nm de las mezclas de reaccioacuten descriptas en el texto ( ) 11 mM de
glicerol ( ) 082 mM de glicerol ( ) 055 mM de glicerol (o) 027 mM de glicerol (-) 011 mM de
ccedilglicerol ( ) blanco de reaccioacuten
Habiendo verificado la dependencia de la sentildeal analiacutetica con el analito de intereacutes se
procedioacute a determinar el intervalo dinaacutemico lineal Para ello se realizaron las reacciones
de color como se describe en el apartado 417 de la seccioacuten Materiales y meacutetodos Cada
reaccioacuten se hizo por triplicado En la Fig 518 se muestran resumidos los resultados
obtenidos
[Glicerol] mM
000 005 010 015 020 025 030 035 040
Ab
s 42
0 n
m
00
02
04
06
08
10
Figura 518 Curva de calibracioacuten para glicerol utilizando el meacutetodo colorimeacutetrico Se muestran los
valores promedios de tres medidas independientes Las barras de error corresponden a los desviacuteos
estaacutendares
La recta de regresioacuten que se obtuvo a partir de estos valores fue
Abs420nm = 0946 ndash 238 [glicerol] [511]
02
03
04
05
06
07
08
09
1
0 1200 2400 3600 4800 6000 7200
tiempo (s)
Ab
s 4
20
nm
Resultados y Discusioacuten
78
cuyo coeficiente de regresioacuten (R2) fue 09980 En el intervalo de concentraciones de
0025 a 027 mM la respuesta fue lineal
5512 Optimizacioacuten de condiciones para disminuir el costo operativo
Se verificoacute la posibilidad de cuantificar glicerol en medio Middlebrook 7H9
optimizando las concentraciones de reactivos y los tiempos de reaccioacuten para obtener la
maacutexima sentildeal con la mezcla maacutes econoacutemica posible Se ensayaron distintas
concentraciones de cofactor NAD+ a utilizar y 2 tiempos de reaccioacuten para una curva de
calibrado de 6 puntos consistente en un blanco y cinco estaacutendares de glicerol todos por
triplicado
Para verificar la factibilidad de disminuir la concentracioacuten de cofactor soluble sin
alterar significativamente la sensibilidad del meacutetodo se utilizoacute un disentildeo experimental
con un modelo de superficie de respuesta Como factores se tomaron la concentracioacuten
de cofactor y el tiempo de reaccioacuten Los niveles seleccionados en base a ensayos
previos fueron concentracioacuten de cofactor (NAD+) 01 mM 023 mM 037 mM y 05
mM tiempo 1 y 2 h Las respuestas que se evaluaron fueron la pendiente de una recta
de regresioacuten calculada a partir del meacutetodo de miacutenimos cuadrados y el coeficiente de
regresioacuten lineal correspondiente En la Tabla 58 se muestran los niveles parametrizados
y los valores de las respuestas obtenidas
Tabla 58 Disentildeo experimental factores parametrizados y respuestas obtenidas
Cada uno de los estaacutendares indicados en la Tabla 58 se correlaciona con una curva
de calibrado realizada En la Tabla 59 se informan los valores de concentracioacuten de
glicerol de las soluciones utilizadas para las reacciones de color y la concentracioacuten
correspondiente en la mezcla de reaccioacuten
Estaacutendar [NAD+] Tiempo Pendiente R2
4 1 -1 068 08790
7 03333 1 227 09962
8 1 1 184 09621
5 -1 1 159 09931
3 03333 -1 083 09590
2 -03333 -1 1 09850
6 -03333 1 244 09863
1 -1 -1 071 09914
Resultados y Discusioacuten
79
Tabla 59 Valores de concentracioacuten de los estaacutendares utilizados para los ensayos de optimizacioacuten
Reaccioacuten [glicerol] en mezcla
de reaccioacuten (mM) [glicerol] en muestra
(mM)
Blanco 0 0
Muestra 1 0010 02
Muestra 2 0025 05
Muestra 3 0050 10
Muestra 4 0075 15
Muestra 5 010 20
La ecuacioacuten de ajuste propuesta por el modelo de superficie de respuesta para la
pendiente fue
tBNADAm ][421 [512]
donde A y B son los coeficientes del modelo que se calculan a partir de la forma de la
superficie de respuesta e indican la dependencia de la pendiente (m) con la
concentracioacuten de cofactor ([NAD+]) y el tiempo de reaccioacuten (t) respectivamente El
anaacutelisis de los resultados indica que de los dos coeficientes solo B es significativo y su
valor es 062 mientras que A es un coeficiente no significativo Esto significa que la
pendiente de la recta de calibrado no muestra dependencia con la concentracioacuten de
cofactor NAD+ utilizado
Por otra parte el coeficiente de correlacioacuten no mostroacute dependencia con ninguno de
los factores elegidos Esto indica que el modelado de la funcioacuten deseabilidad global
queda reducido al de una sola respuesta la pendiente de la recta de calibrado y a un
uacutenico factor significativo que es el tiempo de reaccioacuten En base a estos resultados
pudimos establecer un uso miacutenimo de cofactor soluble
552 Determinacioacuten de glicerol remanente en cultivos de micobacterias
5521 Evaluacioacuten de glicerol remanente en cultivos axeacutenicos de M smegmatis
Primeramente se evaluoacute si podiacutea evidenciarse el consumo de glicerol por parte de
M smegmatis en un cultivo axeacutenico es decir conteniendo soacutelo este microorganismo
Para ello se realizaron cultivos de la micobacteria como se describe en el punto 418 de
la seccioacuten Materiales y Meacutetodos y se determinoacute el glicerol remanente haciendo uso del
meacutetodo fotomeacutetrico presentado previamente El anaacutelisis de la variancia de los valores de
absorbancia registrados y posteriormente se realizoacute un ensayo de comparaciones
muacuteltiples utilizando las pruebas de Tukey y de Bonferroni Se detectaron diferencias
estadiacutesticamente significativas en las absorbancias de las muestras del medio con M
Resultados y Discusioacuten
80
smegmatis a las 2 y 3 h de iniciados los cultivos respecto de aquellos medios
conservados en esterilidad
5522 Determinacioacuten de glicerol remanente en cultivos de micobacterias con y
sin fago D29 y ensayos controles respectivos
En una segunda serie de ensayos nos propusimos ver si habiacutea consumo diferencial
de glicerol entre cultivos de M smegmatis y cultivos de la micobacteria infectados con
el fago D29 siguiendo el protocolo descripto en el punto 4181 de la seccioacuten Materiales
y Meacutetodos En la Fig 519 se muestran los valores de absorbancia a 420 nm de las
muestras mencionadas Sobre este conjunto de datos nuevamente se realizoacute un anaacutelisis
de la variancia y ensayos de comparaciones muacuteltiples utilizando las pruebas de Tukey y
de Bonferroni
Los resultados obtenidos indican que todos los medios de cultivo a los cuales no se
le inoculoacute bacterias y aquellos medios donde se inoculoacute bacterias pero fueron
centrifugados inmediatamente despueacutes del inoacuteculo (muestras a t= 0) no mostraron
diferencias estadiacutesticamente significativas en los ensayos de comparaciones muacuteltiple
realizados Esto permite concluir que el agregado de fago y la incubacioacuten a 37 ordmC no
producen modificaciones significativas per se en las reacciones de color Por ello es
posible afirmar que en el futuro podraacuten simplificarse los controles a un uacutenico testigo
de concentracioacuten inicial conocida sin necesidad de tomar una muestra del cultivo
inmediatamente despueacutes del inoacuteculo o de la adicioacuten de fagos a los controles negativos
del ensayo
En este ensayo preliminar pudimos observar que las diferencias de absorbancia
resultaron estadiacutesticamente significativas entre los medios de cultivo donde crecieron
ceacutelulas de M smegmatis y los medios donde crecieron ceacutelulas de M smegmatis
infectadas con fago D29 tanto a las 2 como a las 4 h de iniciados los cultivos Este
resultado indicoacute que la hipoacutetesis de trabajo planteada era apropiada y en consecuencia
seriacutea factible desarrollar un meacutetodo para verificar la integridad de micobacterias en un
cultivo de las mismas
Resultados y Discusioacuten
81
Bla
nco
Med
io 0
025
00
25
+ F
ago t
= 0
00
25
C
eacutelula
s t
= 0
00
25
Ceacutel
ula
s +
Fag
o t
= 0
00
25
+ F
ago t
= 2
00
25
Ceacutel
ula
s t
= 2
00
25
Ceacutel
ula
s +
fag
o t
= 2
00
25
fa
go t
= 4
00
25
Ceacutel
ula
s t
= 4
00
25
Ceacutel
ula
s +
fag
o t
= 4
Abs
420 n
m
03
04
05
08
Figura 519 Absorbancias a 420 nm registradas para las muestras descritas Se indica concentracioacuten
inicial de glicerol en mv y tiempo de incubacioacuten a 37 ordmC El blanco corresponde al de la reaccioacuten de
color sin glicerol
553 Biosensor amperomeacutetrico a base de pasta de carbono viacutetreo modificada
En funcioacuten de los resultados previos se procedioacute al ensamblado de un biosensor
amperomeacutetrico siguiendo el esquema de reaccioacuten presentado previamente que se
reproduce en la figura 520
Figura 520 Esquema de reaccioacuten propuesto para biosensor amperomeacutetrico selectivo para glicerol La
coenzima reducida NADH se regenera a su forma oxidada NAD+ reaccionando con el Fe(CN)6
3- que se
reduce a Fe(CN)64-
Este uacuteltimo se reoxida electroquiacutemicamente sobre la superficie del electrodo
completando el ciclo cataliacutetico
Utilizando electrodos de pasta de carbono B (punto 41912 seccioacuten Materiales y
Meacutetodos) se realizaron amperometriacuteas siguiendo el protocolo descrito en el punto 4202
glicerol
DHA
GlDHox
GlDHred NAD+
NADH Mediador ox
Mediador red
e- Electrodo
Resultados y Discusioacuten
82
de la seccioacuten Materiales y Meacutetodos En la Fig 521 se muestra un amperograma tiacutepico
obtenido
Tiempo s
100 200 300 400 500
I
nA
0
20
40
60
80
100
Figura 521 A) Amperograma tiacutepico obtenido con un electrodo de trabajo de pasta de carbono B
trabajando a un potencial de 038 V Se agregaron 50 L de medio 7H9 suplementado con glicerol
usualmente a los 300 s de iniciada la lectura de corriente cuando eacutesta se estabilizoacute B) Agregados
sucesivos de 50 microL de medio 7H9 suplementado con glicerol 20 mM sobre 200 mL de la misma
solucioacuten
En la Fig 522 se presenta la recta de regresioacuten obtenida a partir de los valores
promedios de corrientes para soluciones de glicerol en el intervalo de concentraciones
de 0062 mM y 175 mM Las barras de error corresponden a las desviaciones estaacutendar
de cada medida La ecuacioacuten de la recta obtenida por el meacutetodo de miacutenimos cuadrados
fue
[513]
donde Ic estaacute en nA y [Glicerol] en mM el valor del coeficiente de regresioacuten (R2)
obtenido fue de 09982
Las cifras de meacuterito para esta teacutecnica resultaron ser
Liacutemite de deteccioacuten 20 M
Liacutemite de cuantificacioacuten 60 M
Liacutemite de discriminacioacuten 15 M
Intervalo de linealidad 0060 mM ndash 175 mM
Tiempo s
0 500 1000 1500 2000
I
nA
0
50
100
150
200
Resultados y Discusioacuten
83
[Glicerol] mM
000 025 050 075 100 125 150 175 200
Ic
nA
0
50
100
150
200
Figura 522 Recta de calibracioacuten para glicerol utilizando el meacutetodo amperomeacutetrico descrito en el texto
Se muestran los valores promedios de corrientes liacutemite corregidas y las desviaciones estaacutendares de 3
lecturas independientes
Una vez que se preparoacute la pasta de carbono viacutetreo modificada con la enzima esta
resultoacute estable durante 10 semanas sin peacuterdida de actividad enzimaacutetica siempre que se
mantuviese seca a 4 degC Una vez que se ensambloacute el biosensor con el poliacutemero
electrodepositado pudo utilizarse durante al menos 8 horas consecutivas con una
peacuterdida de sensibilidad insignificante En efecto los cambios observados en las sentildeales
registradas de forma consecutiva se encontraron dentro del error intriacutenseco del meacutetodo
propuesto La estabilidad de un mismo biosensor durante diacuteas sucesivos se evaluoacute
realizando medidas de la misma solucioacuten y evaluando la relacioacuten sentildealruido la cuaacutel
disminuyoacute un 15 del valor original al tercer diacutea y un 50 al quinto diacutea de uso
554 Desarrollo de un biosensor a base de pasta de carbono viacutetreo y
nanotubos de carbono
Para reducir los tiempos de anaacutelisis se procuroacute disminuir el periacuteodo de
estabilizacioacuten de la corriente modificando el esquema original propuesto para el sensor
Para esto se modificoacute la pasta de carbono con nanotubos de carbono de paredes
muacuteltiples (Rubianes amp Rivas 2003) Seguacuten trabajos previos esta estrategia permite
disminuir el sobrepotencial asociado a la electrooxidacioacuten de la coenzima NADH
evitaacutendose el uso de un mediador soluble (Musameh 2002) Previo a su utilizacioacuten los
NTC fueron funcionarizados por carboxilacioacuten oxidativa siguiendo el protocolo
especificado en el punto 421 de la seccioacuten Materiales y Meacutetodos
Resultados y Discusioacuten
84
En la Fig 523 (derecha) se muestran las voltametriacuteas que se obtuvieron utilizando
un electrodo de trabajo relleno con pasta B (pasta de carbono viacutetreo modificada con
enzima GlDH al 2 en masa)
Figura 523 Voltamperogramas ciacuteclicos utilizando bioelectrodos de pasa de carbono B con GlDH
(derecha) y pasta C con GlDH y MWCNT (izquierda) En liacutenea puntuada se muestran las voltametriacuteas de
la solucioacuten NAD+ 05 mM (NH4)2SO4 25mM K2CO3 KHCO3 01 M pH 105 (blanco) En liacutenea
continua las voltametriacuteas de las mismas soluciones con el agregado de glicerol en concentracioacuten final 25
mM La velocidad de barrido fue 50 mV s-1
Se marcan los picos de corriente observados y el potencial de
pico
El sobrepotencial asociado a la electroxidacioacuten de la coenzima NADH en el
electrodo de pasta de carbono B es 70 mV menor que el informado por Wang y col Ep
= 082V sobre electrodos de carbono viacutetreo (Musameh 2002) Esta diferencia podriacutea
deberse a los distintos pH de trabajo o bien a alguna diferencia en las cualidades de la
superficie del electrodo
En la Fig 523 (izquierda) se muestran los resultados obtenidos con los electrodos
de pasta C pasta de carbono modificada con GlDH al 2 y con MWCNT al 10 en
masa En este caso vemos que el sobrepotencial asociado a la electroxidacioacuten de NADH
es 0180 V menor Ep = 057 V que el observado para la pasta B Esta diferencia
podemos atribuirla a las cualidades diferentes de las superficies del electrodo debida a la
presencia de los MWCNT Es de destacar que Wang y col en la oxidacioacuten del NADH
sobre la superficie de carbono viacutetreo modificado con MWCNT observaron dos
procesos oxidativos uno principal con un Ep de 033 V y otro secundario con Ep de
057 V que aparece como hombro del primero (ver Fig 524 reproducida de Wang y
col)
Ep = 075 V
Resultados y Discusioacuten
85
Figura 524 Reproducido de Musameh y col 2002 Voltamperogramas correspondientes a una solucioacuten 5
mM de coenzima NADH en solucioacuten tampoacuten fosfato 005 M pH 74 utilizando electrodos de trabajo de
pasta de carbono viacutetreo sin modificar (A) y modificado con MWCNT (B) Velocidad de barrido 50 mV s-1
En el voltagrama B puede apreciarse el pico principal y el secundario que aparecen como hombro del
primero
En este trabajo soacutelo se pudo identificar un uacutenico proceso oxidativo a 057 V Si bien
auacuten estamos investigando posibles causas que hayan originado esta diferencia es de
esperar que el pH sea un factor determinante ya que la oxidacioacuten de NADH a NAD+
involucra la perdida de un H+ Por otra parte en los voltagramas realizados con pasta C
se registroacute un importante aumento de las corrientes capacitivas (18 μA) en relacioacuten a
las voltametriacuteas donde se utilizaron electrodos de pasta sin MWCNT Este mismo
efecto pero en menor magnitud (55 μA) tambieacuten fue registrado por Wang y
colaboradores al trabajar con electrodo de carbono viacutetreo modificado con MWCNT
(Musameh 2002) Los resultados obtenidos por Wang y colaboradores y los de este
trabajo de Tesis se muestran comparativamente en la Tabla 510
Tabla 510 Resultados obtenidos por Musameh y col 2002 y los correspondientes a este trabajo
Musameh y col
2002 Este trabajo
Electrodo de
trabajo Cv
C v +
MWCNT Pasta B Pasta C
V barrido 50 mV s-1 50 mV s
-1
pH 74 105
Ep (V) 082 033
057 075 057
Aumento de la
I cap (μA) - 55 - 18
Resultados y Discusioacuten
86
Con estos resultados preliminares comenzamos los ensayos amperomeacutetricos para
cuantificar el glicerol remanente en los medios de cultivos de micobacterias Se llevaron
adelante distintos ensayos y nuevamente el inconveniente principal al que nos
enfrentamos fue que la respuesta no era estable en el tiempo En la Fig 525 se muestra
un amperograma obtenido con un bioelectrodo de pasta C y realizando agregados
sucesivos de un estaacutendar de glicerol 20 mM disuelto en medio Middelbrook 7H9
Con este nuevo esquema de trabajo no se logroacute acortar los tiempos de estabilizacioacuten
de la corriente Los algoritmos de correccioacuten de corriente de base que estaacuten
incorporados al programa GPES tampoco permitieron solucionar este inconveniente
Por este motivo se optoacute por utilizar teacutecnicas voltameacutetricas de pulso que en principio
permitiriacutean evitar este inconveniente
Tiempo s
0 100 200 300 400 500 600 700 800 900
I A
0
1
2
3
4
Figura 525 Amperograma obtenido con un bioelectrodo de pasta de carbono C trabajando a 05 V vs
AgAgCl A t=200 s de iniciada la lectura se agregaron 50 L de medio 7H9 y posteriormente se
realizaron agregados sucesivos de 50 L de medio 7H9 suplementado con glicerol 20 mM
5541 Ensayos de cuantificacioacuten de glicerol con el bioelectrodo desarrollado
utilizando teacutecnicas de pulso
Las teacutecnicas voltameacutetricas de pulso presentan la ventaja de permitir trabajar durante
tiempos muy reducidos en la zona de potencial donde la especie electroactiva cambia
su estado de oxidacioacuten produciendo la sentildeal analiacutetica
Se optoacute por ensayar la voltametriacutea de onda cuadrada para los futuros ensayos de
cuantificacioacuten y los experimentos preliminares procuraron establecer los valores maacutes
convenientes de los paraacutemetros relevantes de la teacutecnica como la amplitud de pulso el
escaloacuten de potencial y la frecuencia (punto 633 seccioacuten Experimentos Auxiliares)
Resultados y Discusioacuten
87
En una segunda serie de ensayos se buscoacute observar la dependencia de la corriente
de pico con la concentracioacuten de glicerol Para esto se realizaron ensayos
independientes En este esquema de trabajo surgioacute un inconveniente respecto del criterio
de medida de la corriente de pico ya que en ensayos independientes no se pudo
establecer una liacutenea de base comuacuten a todos los voltamperogramas
Se ensayaron distintos criterios para determinar una liacutenea de base apropiada como
se detalla en el punto 6331 de la seccioacuten Experimentos Auxiliares y en la Fig 526 se
muestran los voltamperogramas corregidos siguiendo el criterio elegido
Figura 526 Voltamperogramas de onda cuadrada (corregidos) obtenidos utilizando electrodos de pasta
de carbono viacutetreo modificada con GlDH y MWCNT Se muestran los voltagramas de las soluciones
blanco (helliphelliphelliphellip
) glicerol 5 mM (mdash mdash) 125 mM (mdashmdash) 25 mM (diamsdiamsdiams) 36 mM (- - -) y 50 mM (mdash bull mdash)
En la Fig 527 se muestran la dependencia de la corriente de pico con la
concentracioacuten de glicerol obtenida a partir de experimentos exploratorios uacutenicos para
cada concentracioacuten Resta a futuro repetir los experimentos para establecer el error
asociado a la metodologiacutea el intervalo dinaacutemico lineal y el liacutemite de deteccioacuten
Resultados y Discusioacuten
88
Figura 527 Dependencia de la corriente de pico registrada en la VOC en funcioacuten de la concentracioacuten de
glicerol en la celda electroquiacutemica
56 Validacioacuten de meacutetodos
De los meacutetodos desarrollados se seleccionaron aquellos dos que dieron resultados
maacutes fiables meacutetodo amperomeacutetrico utilizando un electrodo de trabajo de oro y el
meacutetodo amperomeacutetrico utilizando el biosensor con GlDH con mediador soluble Se
realizaron ensayos en paralelo con un meacutetodo alternativo ampliamente utilizado en
particular se utilizoacute un equipo comercial que utiliza tres enzimas y deteccioacuten
espectrofotomeacutetrica (Wiener lab) La Fig 528 muestra la concentracioacuten nominal versus
concentracioacuten predicha obtenida por las tres metodologiacuteas ensayando diferentes
diluciones de muestra y graficaacutendose el valor medio de 3 medidas independientes
Nominal mM
00 02 04 06 08 10
Pre
dic
ho
mM
00
02
04
06
08
10
Equipo comercial
Tip Au
Biosensor
Recta identidad
Figura 528 Concentracioacuten nominal vs predicha para las dos metodologiacuteas propuestas en este trabajo de
tesis y un meacutetodo enzimaacutetico disponible comercialmente
0
05
1
15
2
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
[Glicerol] (mM)
Ip (
uA
)
Resultados y Discusioacuten
89
Es evidente que los meacutetodos propuestos se correlacionan adecuadamente con la
recta identidad En la Fig 529 se muestran las tres regiones eliacutepticas de confianza
conjuntas (EJCR) para la pendiente y ordenada al origen En este caso puede apreciarse
que las tres elipses contienen el punto (0 1) lo que indica una buena correlacioacuten entre
los meacutetodos propuestos en el presente trabajo y un meacutetodo disponible comercialmente
Pendiente
08 09 10 11 12
Ord
enad
a al
ori
gen
-06
-04
-02
00
02
04
06
Equipo comercial
Tip Au
Biosensor
Punto (1 0)
Figura 529 Regiones eliacutepticas de confianza conjuntas para dos metodologiacuteas presentadas en este trabajo
de Tesis y un meacutetodo enzimaacutetico disponible comercialmente
En la Tabla 511 se presentan distintas metodologiacuteas publicadas en la literatura
actual en las que se referencia la cuantificacioacuten de glicerol ya sean biosensores
electroquiacutemicos u otra metodologiacutea El anaacutelisis de la Tabla 511 permite ver que la
determinacioacuten de glicerol en medios alcalinos sin presencia de interferentes puede ser
llevada a delante con metodologiacuteas econoacutemicas Debe ser considerado que cuando se
realiza la determinacioacuten de glicerol en muestras de biodiesel dicha cuantificacioacuten
requiere extraer el analito de la matriz como puede verse en los meacutetodos maacutes
recientemente propuestos (Bondioli amp Bella 2005 Silva amp Rocha 2010 Lima y col
2012 Tehrani amp Ghani 2012 Maruta amp Paixao 2012 Lourenccedilo amp Stradiotto 2009
Stradiotto y col 2009) Ya sea que se utilice deteccioacuten espectroscoacutepica o
electroquiacutemica siempre se requiere la extraccioacuten previa a la determinacioacuten del analito
Incluso la propuesta de Fernaacutendez Band y col que es el uacutenico meacutetodo que hace una
diferencia notable al comparar las cifras de meacuterito (LD 04 microM tiempo de anaacutelisis 4
min) implica un pretratamiento de la muestra (Lima y col 2012)
Resultados y Discusioacuten
90
Tabla 511 Comparacioacuten de meacutetodos para cuantificar glicerol propuestos recientemente Adaptado de
Faccendini y col 2014
Meacutetodo (Tratamientos
previos) LD
(microM)
Rango de
linealidad
(M)
Muestra
ensayada
Tiempo de
anaacutelisis
(min)
Reactivos o
accesorios
onerosos Referencia
Espectrofotomeacutetrico
(Extraccioacuten del analito) 22
4 times 10-5
a
2 times10-4
Biodiesel 20 - Bondioli amp
Bella 2005 Espectrofotomeacutetrico
(Extraccioacuten del analito) 10
5 times 10minus5
a
5 times 10minus4
Biodiesel 20 a 30 - Silva amp Rocha
2010
Espectrofluoromeacutetrico
(Extraccioacuten del analito) 04
1 times 10minus6
a
5 times 10minus4
Biodiesel 4 - Lima y
col2012
Espectrofotomeacutetrico
multienzimaacutetico No
informa 2 times 10
minus2 a
1 times 10minus1
Jugo de cantildea 5 GK GPO
ATP Kronka y col
2001
Espectrofotomeacutetrico
multienzimaacutetico 8
8 times 10minus6
a
25 times 10minus4
Suero
Humano 10
GK PK
LDH ATP
NAD+
Li y col 2001
Electroquiacutemico VPD
(Extraccioacuten del analito) 33
5 times 10minus4
a
12 times 10minus2
Biodiesel 15 - Tehrani y
Ghani 2012 Electroquiacutemico VC
(Extraccioacuten del analito) 3
33 times 10minus5
a
17 times 10minus3
Biodiesel 30 FIA Maruta y
Paixao 2012
Electroquiacutemico VC
(Extraccioacuten del analito) 25
33 times 10minus5
a
17 times 10minus3
Biodiesel 20 Cartucho de
C18
Lourenccedilo amp
Stradiotto
2009 Electroquiacutemico
amperomeacutetrico
(Extraccioacuten del analito)
No
informa 16 times 10
minus4 a
16 times 10minus3
Biodiesel 60 - Stradiotto y
col 2009
Electroquiacutemico VL
VPD amperomeacutetrico
(Extraccioacuten del analito) 10
23 times 10minus5
a
23 times 10minus4
Solucioacuten
Acuosa
pH=13 5
MWCNT
funcionalizad
os con Ag
Pop y col 2011
Electroquiacutemico
amperomeacutetrico
(Extraccioacuten del analito) 10
25 times 10minus5
a
20 times 10minus3
Solucioacuten
Acuosa
pH=13 8 -
Este Trabajo
de Tesis
Electroquiacutemico
amperomeacutetrico
(Extraccioacuten del analito) 50
5 times 10minus5
a
23 times 10minus2
Solucioacuten
Tampoacuten
Fosfato
5
(estimados) GO
Goriushnika y
col 2010
Biosensor
amperomeacutetrico 04
10 times 10minus6
a
10 times 10minus4
Jarabe de
cantildea 15
(estimados) GlDH NAD+
Aacutelvarez-
Gonzalez y
col 2000
Biosensor
amperomeacutetrico 04
1 times 10minus6
a
2 times 10minus5
Vino 3 GlDH DP
NAD+ Gamella y
col 2008
Biosensor
amperomeacutetrico 03
1 times 10minus6
a
1 times 10minus5
Vino 3 GK GPO
HRP ATP Gamella y
col 2008 Biosensor
amperomeacutetrico 4
5 times 10minus6
a
1 times 10minus4
Vino 5 GK GPO
ATP Ghica amp Brett
2006
Biosensor
amperomeacutetrico 20
70 times 10minus5
a
18 times 10minus3
Caldo
Middlebrook 10
GlDHb
NAD+ Este Trabajo
de Tesis
Del mismo modo el enfoque de Tehrani y Ghani que utilizan un electrodo de grafito
modificado con nanopartiacuteculas de nickel trabajando a pH = 13 realizan una extraccioacuten
previa de glicerol a partir de muestras de biodiesel (Tehrani amp Ghani 2012) En este
Resultados y Discusioacuten
91
caso el LD fue de 33 microM mientras que en este trabajo de Tesis utilizando el mismo
medio hemos conseguido un LD de 10 microM empleando electrodos de oro policristalino
Maruta y Paixao han propuesto recientemente un meacutetodo amperomeacutetrico usando un
electrodo de cobre que trabaja a 065 V vs AgAgCl adaptado en un sistema de FIA
(Maruta amp Paixao 2012) mientras que Lourenccedilo y Stradiotto informaron sobre un
meacutetodo electroquiacutemico que requiere la extraccioacuten acuosa del glicerol a partir de la
muestra y la purificacioacuten adicional por elucioacuten a traveacutes de un cartucho de C18 seguida
de una concentracioacuten por evaporacioacuten y finalmente un anaacutelisis mediante VC (Lourenccedilo
amp Stradiotto 2009) Tambieacuten otras propuestas informan sobre la determinacioacuten de
glicerol por amperometriacutea haciendo uso de electrodos modificados tales como
electrodos de diamante dopados con boro y modificados con nanopartiacuteculas de niacutequel
(Stradiotto y col 2009) y electrodos compuestos de nanotubos de carbono de pared
muacuteltiple funcionalizados con plata (Pop y col 2011) Si bien ambos meacutetodos se
presentan como uacutetiles se requieren diferentes pasos operativos para eliminar posibles
interferencias tales como otros alcoholes que podriacutean ser oxidados a los potenciales de
trabajo 065 V o 130 V (vs AgAgCl) respectivamente En este sentido nuestros
resultados obtenidos por amperometriacutea usando electrodos de oro en medio alcalino
acuoso (pH = 13) estaacuten en el mismo orden que los obtenidos por Pop y colaboradores
utilizando LSV (Pop y col 2011) sobre electrodos compuestos de nanotubos de
carbono de pared muacuteltiple funcionalizados con plata Efectivamente este uacuteltimo y
nuestra metodologiacutea mostraron las mejores cifras de meacuterito entre los meacutetodos
electroquiacutemicos de bajo costo que no consumen enzimas
Los meacutetodos enzimaacuteticos espectrofotomeacutetricos aunque no son laboriosos presentan
la desventaja del consumo relativamente elevado de enzima cada muestra necesita la
adicioacuten del costoso reactivo bioloacutegico ya que no puede ser reutilizado Tambieacuten los LD
de los meacutetodos espectrofotomeacutetricos enzimaacuteticos informados son generalmente
superiores a los que presentan los biosensores Puede antildeadirse que estos uacuteltimos
presentan generalmente el intervalo dinaacutemico lineal maacutes amplio en comparacioacuten con
otros enfoques ya sean electroquiacutemicos o espectrofotomeacutetricos Soacutelo la metodologiacutea de
flujo discontinuo con deteccioacuten fluoromeacutetrica propuesta por Fernaacutendez Band y col
(Lima y col 2012) muestra una sensibilidad en el mismo orden que el maacutes bajo de los
biosensores
En el anaacutelisis de los biosensores que se muestran en la Tabla 511 hay que destacar
que el propuesto por Pingarroacuten y col (Gamella y col 2008) muestra el LD y tiempo de
Resultados y Discusioacuten
92
anaacutelisis total maacutes bajo Para evaluar costos operativos se presenta en la Tabla 512 un
resumen comparativo de la cantidad y concentracioacuten de los reactivos onerosos
consumidos por biosensor o por anaacutelisis entre la propuesta de Pingarroacuten y col y la del
biosensor aquiacute propuesto
Tabla 512 Comparacioacuten entre el meacutetodo enzimaacutetico que mejores cifras de meacuterito presenta y el propuesto
en el presente trabajo de Tesis Adaptado de Faccendini y col 2014
GlDH
bisosensor Diaforasa
biosensor tetratiofulvaleno
biosensor NAD
+ por
anaacutelisis
Gamella y
col 2008 75 U 162 U 15x10-6
M 5x10-3
M Este Trabajo
de Tesis 23 U - - 5x10-4
M
Podemos afirmar que nuestra propuesta es menos costosa hecho importante a ser
evaluado cuando se va a analizar un gran nuacutemero de muestras Mediante la reduccioacuten de
la cantidad de GlDH el LD se elevoacute desde 04 hasta 20 microM aunque es adecuado auacuten
para detectar cambios de concentracioacuten de glicerol en el orden de 15 microM Al mismo
tiempo evitando el uso de diaforasas el tiempo total de anaacutelisis se extendioacute de 3 a 10
min En conjunto los resultados presentados confirman que los cambios introducidos a
los biosensores informados previamente en la literatura tales como el uso de soacutelo una
enzima en baja proporcioacuten la sustitucioacuten del mediador redox por el ferricianuro soluble
y trabajar con el cofactor NAD+ soluble proporciona un sistema fiable de bajo costo
para cuantificar el glicerol
Experimentos Auxiliares
Experimentos Auxiliares
94
6 Experimentos Auxiliares
61 Comparacioacuten de programas de prediccioacuten de epiacutetopes lineales reconocidos
por ceacutelulas B
AAPPred BcePred ABCPred BepiPred y Antigenic se ejecutaron en liacutenea En la
Tabla 61 se muestran los VPP medios (ver definicioacuten en seccioacuten Materiales y Meacutetodos
pag 11) que se obtuvieron al predecir epiacutetopes lineales reconocidos por ceacutelulas B de
todas las proteiacutenas enumeradas en la Tabla 62
Los resultados obtenidos indican que BcePred es el uacutenico programa de los
evaluados que muestra un VPP inferior al obtenido con la prediccioacuten al azar Tambieacuten
se obtuvo que soacutelo dos de los programas estudiados AAPPred y ABCpred predijeron
epiacutetopes con un VPP significativamente mayor al valor de VPP de un procedimiento de
identificacioacuten aleatoria Estos dos programas produjeron predicciones con valores
maacuteximos de 862 y 786 de VPP respectivamente
Tabla 61 Valores predictivos positivos promedio que se obtuvieron con cada uno de los programas
predictores con los que se trabajoacute
Programa
VPP
promedio
AAPPred 691
ABCPred 628
BcePred 309
BepiPred 453
Antigenic 419
Aleatorio 382
En base a estos resultados se trabajoacute con el programa AAPPred y se identificaron
las regiones que concentraban el mayor nuacutemero de epiacutetopes reconocidos por ceacutelulas B
de las proteiacutenas P22 P30 y P35 con el fin de expresar estos Angs como proteiacutenas
recombinantes y utilizarlos en el desarrollo de meacutetodos de diagnoacutestico de la
toxoplasmosis aguda
Experimentos Auxiliares
95
Tabla 62 Base de datos experimental proteiacutenas seleccionadas para este estudio Se indican el nombre de
la proteiacutena el coacutedigo de acceso NCBI la longitud total (en residuos de amino aacutecidos) el
nuacutemero de epiacutetopes reales determinados experimentalmente y la localizacioacuten de los epiacutetopes o
regiones antigeacutenicas Proteiacutenas tomadas de base de datos (A) BciPep (B) VIH Inmunologiacutea
Molecular base de datos o tomado de la literatura (veacutease el nuacutemero de referencia 17 para VP1
16 para la proteiacutena N y 18 para gliadina)
Proteiacutena
Coacutedigo
NCBI
Nordm de
residuos
Cantidad de
epiacutetopes
Localizacioacuten de los epiacutetopes o regiones
antigeacutenicas
MPT70 (A) NP_217391 193 2 31-70 100-120
MSP-1 (A) BAF622801 1693 3 29-39 1594-1611 1644-1662
Exotoxina
A (A) NP_249839 638 8
297-313 324-333 354-387 412-421 510-522
528-539 557-593 596-638
GAG1 (A) P20873 504 10
11-25 113-122 142-156 176-214 216-268
280-308 312-321 330-367 406-416 428-448
Gp160 (A) NP_057856 856 13
30-141 161-191 211-231 252-281 294-344
346-413 424-511 525-558 561-615 639-701
724-747 761-778 822-855
Pr55 (B) NP_579876 132 2 11-38 51-78
Rev (B) NP_057854 116 4 5-15 32-51 70-91 96-116
VP1 (17) ABC87248 781 12
31-41 55-65 85-95 151-161 292-392 316-326
493-500 529-539 547-554 571-578 667-707
712-722
Gliadin
(18) A27319 296 3 31-72 165-176 237-264
Proteiacutena N
(16) AAP13445 422 6 1-6 45-61 153-192 211-223 225-235 354-412
Proteasa
(B) CAB66012 99 2 1-7 36-47
62 Puesta a punto de ensayos de inmunoabsorcioacuten ligados a enzima con
deteccioacuten fotomeacutetrica
Previo al inicio de los ELISA de captura iniciamos una serie de pruebas preliminares
con el propoacutesito de
a) Diferenciar sueros de pacientes infectados de sueros de individuos sin infeccioacuten De
este modo se pretende verificar la potencial utilidad en diagnoacutestico de los antiacutegenos
propuestos corroborando que los procesos quiacutemicos llevados a cabo como por ej la
conjugacioacuten no eliminaron epiacutetopes claves
Experimentos Auxiliares
96
b) Minimizar la sentildeal en los ensayos sin suero (blanco de reactivos) es decir
disminuir el ruido de fondo asociado a interacciones inespeciacuteficas
A tales fines se realizaron ELISA indirectos utilizando los antiacutegenos recombinantes
obtenidos (marcados y sin marcar) adsorbidos sobre la placa se utilizaron sueros
tipificados y se reveloacute la presencia de IgG humana revelando con anticuerpos de cabra anti
IgG humana Los resultados obtenidos se detallan en la siguiente tabla
Tabla 63 Valores de absorbancia a 450 nm obtenidos en ELISA indirectos con deteccioacuten de IgGh con
conjugado anti IgG humana-HRP
Sueros P22C P22C-
biotina P35B
P35B -
biotina
Positivos
2 gt3 26 1900
3 2900 2 gt3
gt3 gt3 26 gt3
Negativos
13 1000 11 0800
06 0500 09 0700
11 1600 1 1000
Si bien los valores de absorbancia leiacutedos en todos los pocillos resultaron elevados
los sueros confirmados positivos dieron los valores maacutes altos de absorbancia mientras
que los sueros negativos dieron los valores maacutes bajos Las diferencias observadas entre
sueros confirmados positivos y sueros confirmados negativos permitieron asumir que
los antiacutegenos obtenidos son de posible utilidad en diagnoacutestico Ademaacutes no se
detectaron diferencias significativas entre los valores de absorbancia obtenidos
utilizando antiacutegenos marcados de aquellos obtenidos con los no marcados
permitieacutendonos pensar que la conjugacioacuten llevada a cabo no eliminoacute epiacutetopes claves
Los elevados valores de absorbancia obtenidos en este ensayo junto a otros estudios
preliminares sugieren que existe una elevada adsorcioacuten inespeciacutefica
621 Bloqueante a utilizar
Se ensayaron diversos agentes bloqueantes para minimizar las interacciones
inespeciacuteficas encontradas durante los experimentos preliminares y asiacute evitar las altas
sentildeales obtenidas en los ensayos control realizados sin suero (blanco de reactivos) y con
sueros confirmados negativos (blancos de muestra) Sobre placas comerciales de
poliestireno se procedioacute al bloqueo total con el agente bloqueante a ensayar y
posteriormente se realizoacute una incubacioacuten con y sin antiacutegeno P22C por duplicado
Finalmente se reveloacute con la enzima HPR-EAV que se une especiacuteficamente a biotina En
la Tabla 64 se muestran los valores de absorbancia a 450 nm
Experimentos Auxiliares
97
Tabla 64 Valores promedio de absorbancia a 450 nm obtenidos en los ensayos de bloqueo
450 nm Sin P22cBiot Con P22cBiot
Sin Bloqueante ------- 1162
Leche 1 0066 01445
Caseinato 1 00725 02425
Gelatina 1 00725 03925
BSA 1 00625 0192
BSA 1 Tween 002 00615 01515
En base a estos resultados se continuoacute con el uso de leche descremada como agente
bloqueante
622 Esquema A
Cuando se realizaron ELISA siguiendo el esquema A se ensayaron dos diluciones
de la HRP-EAV 12000 y 15000 Por otro lado se ensayaron distintas masas de
antiacutegenos P22C y P35B conjugados a biotina con los que se intentoacute revelar presencia
de IgM especiacuteficas Especiacuteficamente se ensayaron 2 02 y 002 g por pocillo de P35B
biotina y 5 2 02 y 002 g por pocillo de P22C biotina Con esto se buscoacute encontrar
las cantidades oacuteptimas de reactivos para poder llevar adelante estos ensayos A modo
ilustrativo en la Tabla 65 se muestra un ensayo representativo siguiendo el esquema A
Se informan solamente los valores de absorbancia a 450 nm obtenidos para sueros
provenientes de pacientes con infeccioacuten croacutenica (croacutenicos) aguda (agudos) y de
pacientes sin infeccioacuten (negativos)
Tabla 65 Valores de absorbancia a 450 nm obtenidos en ELISA siguiendo el esquema A Se muestran 3
cantidades de antiacutegeno revelador utilizadas 2 02 y 002 microg En este ensayo la dilucioacuten de la
enzima HRP-EAV fue 15000 y se utilizaron 100 microL por pocillo
Antiacutegenos
Sueros
P22C biotina ( g) P35B biotina ( g)
2 02 002 2 02 002
Negativos 0576 0294 0155 1071 0681 0566
0543 0335 0176 1079 0769 023
Croacutenicos 0469 0246 0135 103 069 0299
0514 0215 0111 0914 0567 0196
Agudos 0331 0181 0109 081 0574 0168
0555 0254 0139 0789 0391 0169
Experimentos Auxiliares
98
623 Esquema B
Cuando se realizaron ELISAs siguiendo el esquema B se ensayaron distintas masas
de antiacutegeno P22C y P35B absorbidas sobre las microplacas comerciales a saber 500
200 50 10 o 5 ng (disueltos en 100 L de solucioacuten tampoacuten carbonato pH 96) En todos
los casos se incuboacute 1h a 37 degC
Para la incubacioacuten con la proteiacutena conjugada a biotina se ensayaron 2 y 5 ug por
pocillo En la Tabla 66 se resumen los resultados obtenidos
Tabla 66 Valores de absorbancia a 450 nm obtenidos en ELISA siguiendo el esquema B Se muestran
los resultados obtenidos para dos cantidades distintas de antiacutegeno de captura (P22C) 10 y 50
ng junto a 2 cantidades de antiacutegeno revelador (P22C-biotina) utilizadas 2 y 5 microg En este
ensayo la dilucioacuten de la enzima HRP-EAV fue 12000 y se utilizaron 100 microL por pocillo
2 microg P22C biotina 5 microg P22C biotina
Masa de P22C
(ng)
Muestras
50 10 50 10
Agudos 0393 0303 0553 0450
0273 0335 0793 0367
Croacutenicos 0230 0398 0316 0345
0284 0291 0444 0493
Negativos 0392 0210 0380 0380
0286 0292 0314 0350
Sin suero 0367 0468 0415 0411
0327 0358 0468 0536
Sin Prot conjugada a
biotina ni sueros
0102 0087 0128 0079
0131 0095 0116 0104
Los resultados obtenidos indicaron que para lograr una mejor discriminacioacuten de las
muestras es conveniente utilizar mayor cantidad de masa de antiacutegeno de captura (P22C)
depositada en el pocillo Por otro lado 5 microg de antiacutegeno revelador (P22C-biotina) por
pocillo contribuyoacute a aumentar la discriminacioacuten entre las muestras sin incrementar
significativamente el ruido de fondo
Experimentos Auxiliares
99
63 Ensayos electroquiacutemicos
631 Determinacioacuten del aacuterea real de un electrodo
6311 Meacutetodo de la adsorcioacuten de O2
Se realizaron barridos de potencial como se indica en el punto 41931 de la
seccioacuten Materiales y Meacutetodos La Fig 61 muestra un voltamperograma tiacutepico obtenido
Con el valor de la carga asociada a la desorcioacuten del oacutexido de oro pudo determinarse el
valor de aacuterea electroactiva del electrodo de trabajo utilizado como se indica en el punto
41931
E V
04 06 08 10 12 14 16
I
A
-15e-5
-10e-5
-50e-6
00
50e-6
Figura 61 Voltamperograma ciacuteclico tiacutepico obtenido con electrododos de oro en medio H2SO4 05 M
velocidad de barrido 50 mV s-1
Se indica en color turquesa el pico de desorcioacuten del oacutexido de oro la carga
(Q) obtenida del aacuterea encerrada en la curva se utilizoacute para determinar el aacuterea real de los electrodos de oro
previamente a los ensayos
6312 Voltametriacutea ciacuteclica a distintas velocidades
Se realizaron barridos de potencial a distintas velocidades como se indica en el
punto 41932 de la seccioacuten Materiales y Meacutetodos La Fig 62 muestra los voltagramas
tiacutepicos obtenidos en (A) y en (B) la dependencia de la corriente de pico Ip con la raiacutez
cuadrada de la velocidad de barrido Con el valor de la pendiente de la recta obtenida
por regresioacuten lineal pudo determinarse el valor de aacuterea electroactiva del electrodo de
trabajo utilizado como se indica en el punto 41932 habieacutendose utilizado un
coeficiente de difusioacuten del Fe(CN)63-
de 0762 cm2 s
-1 (Sawyer amp Roberts 1974)
Experimentos Auxiliares
100
E V
-02 -01 00 01 02 03 04 05 06
I
A
-20e-4
-10e-4
00
10e-4
20e-4
Figura 62 A) Voltametriacuteas ciacuteclicas de Fe(CN)63 1 mM en medio KCl 01 M a distintas velocidades de
barrido utilizando como electrodo de trabajo el biosensor amperomeacutetrico para evaluacioacuten de infeccioacuten
toxoplaacutesmica La flecha indica la direccioacuten de barrido B) Dependencia de Ip (en valores absolutos) con la
raiacutez de la velocidad de barrido el valor de pendiente de la recta de regresioacuten se utilizoacute para determinar el
aacuterea real del electrodo de trabajo
632 Cubierta del biosensor selectivo para glicerol y soluciones amortiguadoras
Se ensayaron distintos poliacutemeros para cubrir el biosensor de pasta de carbono B
utilizamos poliacutemeros de 4-vinilbenzilimine copolimerizados con cloruro de 4-
vinilbencil-trietilamonio y sulfonato de vinilfenilo (portadores de carga neta positiva y
negativa respectivamente) Si bien los poliacutemeros permitiacutean operar con complejos de
hierro utilizados como mediadores redox (Fe(CN)63-
y ferrocenometanol) no resultaron
uacutetiles en el ensamblado del biosensor por el elevado ruido de fondo que generaron
Se evaluaron distintas soluciones amortiguadoras de pH como fosfatos y
amoniacuteacoamonio Se optoacute por las soluciones de carbonato porque estas resultaron maacutes
sencillas de preparar y manipular que las amoniacales y presentaron mayor capacidad
reguladora en el pH oacuteptimo de la enzima GlDH que las de fosfato
633 Ensayos preliminares de voltametriacuteas de onda cuadrada
Los ensayos preliminares de voltametriacutea de onda cuadrada consistieron en
establecer los valores maacutes convenientes de la amplitud de pulso el escaloacuten de potencial
y la frecuencia para los futuros ensayos de cuantificacioacuten Se realizaron los voltagramas
en tres series de ensayos a seis valores de frecuencia 10 20 30 40 60 y 70 Hz
Los valores de salto de potencial ( ES) y amplitud de pulso ( E) utilizados en las
tres series de ensayos realizados se resumen en la siguiente tabla
(velocidad barrido)12 V12 s-12
006 008 010 012 014 016 018 020 022 024
Ip
A
40e-5
60e-5
80e-5
10e-4
12e-4
14e-4
16e-4
18e-4
20e-4
Experimentos Auxiliares
101
Tabla 67 Valores de salto de potencial y amplitud de onda cuadrada utilizados en los ensayos
voltameacutetricos
Serie 1 Serie 2 Serie 3
ES (mV) 5 5 10
E (mV) 25 50 50
En las 3 series de ensayos se observoacute que al aumentar la frecuencia la corriente de
pico no se incrementaba y el pico de corriente se deformaba aumentando
considerablemente el ruido Las mejores relaciones sentildealruido en las tres series de
ensayos se obtuvieron trabajando a 10 Hz Por su parte cuando se utilizoacute un escaloacuten de
potencial de 10 mV el pico de corriente se deformoacute levemente por lo que se optoacute por
trabajar con un ES = 5 mV Cuando la amplitud del pulso fue 50 mV se obtuvieron
mayores intensidades de corriente sin deformacioacuten de pico escogieacutendose en
consecuencia este valor En la Fig 63 se muestran los voltamperogramas obtenidos en
los ensayos de la serie 2 a una frecuencia de 10 Hz
Figura 63 Voltagramas de onda cuadrada obtenidos utilizando bioelectrodos de pasta de carbono viacutetreo
modificada con GlDH y MWCNT En liacutenea clara se muestra el voltagrama de la solucioacuten NAD+ 05 mM
(NH4)2SO4 25 mM K2CO3 KHCO3 100 mM pH 105 con medio Middelbrook 7H9 Superpuestos se
detallan los voltagramas de la misma solucioacuten luego del agregado de glicerol 100 M para llevar a
concentracioacuten final 25 mM (- - -) y 50 mM (____
)
6331 Seleccioacuten de un meacutetodo apropiado para establecer la liacutenea de base
Se buscoacute establecer una liacutenea de base para corregir los voltagramas obtenidos
utilizando algoritmos presentes en el programa GPES Se intentoacute con algoritmos de
correccioacuten que permiten establecer una liacutenea polinoacutemica ad-hoc para cada voltagrama
utilizando entre 2 y 5 puntos de la curva experimental Sin embargo las sentildeales
corregidas presentaban picos de corrientes con valores de ancho a la altura media Wfrac12
entre 0180 y 0220 V valores que resultan elevados comparados con 0123 Vn el valor
de referencia para este paraacutemetro en VOC donde n es el nuacutemero de electrones
Experimentos Auxiliares
102
intercambiados en la reaccioacuten Finalmente a cada VOC se les restoacute la VOC del blanco
buscaacutendose el pico de corriente con un algoritmo de buacutesqueda semiautomaacutetica del
programa GPES con una liacutenea de base recta y marcando manualmente el inicio y final
del pico establecieacutendose los mismos valores de potencial de inicio y finalizacioacuten del
pico de corriente en todos los voltamperogramas De este modo se obtuvieron picos
cuyos Wfrac12 eran proacuteximos al valor teoacutericamente predicho
Conclusiones
Conclusiones
104
7 Conclusiones
1- Se pudo encontrar cual de los programas de libre acceso para predecir epiacutetopes
lineales reconocidos por ceacutelulas B es el maacutes conveniente al momento de seleccionar
antiacutegenos con fines diagnoacutesticos
2- Se pudieron clonar expresar en forma soluble y marcar con biotina fragmentos
de antiacutegenos de toxoplasmosis de fase aguda que presentan alta concentracioacuten de
determinantes antigeacutenicos
3- Se verificoacute la utilidad de los antiacutegenos obtenidos para su posterior uso en el
ensamblado de bioelectrodos para diagnoacutestico de infeccioacuten aguda de toxoplasmosis
4- Se pudo cuantificar glicerol en muestras sencillas con un electrodo versaacutetil de
oro policristalino por medio de una metodologiacutea amperomeacutetrica a 01 V en medio
NaOH 01 M y con un tiempo de anaacutelisis de 8 min liacutemite de deteccioacuten 10 microM y un
intervalo de linealidad de 0024 a 200 mM
5- Se pudo cuantificar glicerol en medios de cultivo de micobacterias El meacutetodo
consiste en una amperometriacutea que emplea un bioelectrodo selectivo para glicerol
compuesto de pasta de C modificada con glicerol deshidrogenasa y lleva un tiempo de
anaacutelisis de 10 min liacutemite de deteccioacuten 20 microM y un rango de linealidad de 0060 a 175
mM Este meacutetodo podriacutea en un futuro ser uacutetil para identificar muestras de pacientes con
tuberculosis activa en un menor tiempo de anaacutelisis al actualmente empleado
6- Los meacutetodos para cuantificar glicerol aquiacute presentados fueron validados frente
a un equipo enzimaacutetico disponible comercialmente
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Resumen
vi
1 Resumen
Este trabajo de Tesis se orientoacute al desarrollo de meacutetodos analiacuteticos alternativos a los
hoy vigentes que faciliten la determinacioacuten de compuestos de intereacutes tanto para
diagnoacutestico cliacutenico como para la industria de combustibles alternativos Se realizaron
aportes para tres situaciones de relevancia diagnoacutestico de toxoplasmosis tuberculosis y
evaluacioacuten de calidad de biodiesel
La toxoplasmosis es una parasitosis causada por Toxoplasma gondii que afecta a
humanos sin generar complicaciones excepto cuando los infectados son
inmunodeprimidos o mujeres embarazadas que no cursaron previamente la enfermedad
En este caso el paraacutesito puede atravesar placenta generando infeccioacuten congeacutenita del
feto pudiendo producirle graves consecuencias que pueden llegar a la muerte Una de
las teacutecnicas de diagnoacutestico utiliza el ensayo de inmunoadsorcioacuten ligado a enzima
permitiendo la deteccioacuten de anticuerpos especiacuteficos contra el paraacutesito los cuales son
indicadores de existencia de infeccioacuten No obstante para detectar toxoplasmosis aguda
al diacutea de hoy se carece de una estandarizacioacuten confiable principalmente en la
preparacioacuten del antiacutegeno Por ello en este trabajo se procuroacute identificar regiones donde
se codificaraacuten algunos marcadores de fase aguda que concentraraacuten una alta proporcioacuten
de determinantes antigeacutenicos para luego clonarlas expresarlas como proteiacutenas
recombinantes marcarlas con biotina y asiacute utilizarlas como sistema de revelado de
anticuerpos especiacuteficos contra proteiacutenas de T gondii Los inmunoensayos aquiacute
presentados proponen una metodologiacutea que permitiraacute en un futuro distinguir sueros
provenientes de individuos con infeccioacuten aguda de aquellos con infeccioacuten croacutenica o no
infectados
La tuberculosis es una enfermedad infecto-contagiosa causada por la bacteria
Mycobacterium tuberculosis Su diagnoacutestico se basa en una serie de estudios que
finaliza con la identificacioacuten del agente etioloacutegico en cultivos obtenidos a partir de
esputo Esta identificacioacuten puede demorar aproximadamente dos meses debido al
prolongado tiempo de replicacioacuten de la micobacteria Esto conlleva la potencialidad de
contagio a individuos sanos y un compromiso importante de la salud del infectado
Uacuteltimamente se han desarrollado teacutecnicas indirectas de deteccioacuten de M tuberculosis
utilizando el bacterioacutefago D29 capaz de infectar especiacuteficamente micobacterias Es una
metodologiacutea donde se facilita la replicacioacuten del fago en la muestra proveniente del
paciente para luego evaluar el tiacutetulo de fagos liberados infectando un cultivo testigo de
Resumen
vii
Micobacterium smegmatis micobacteria de replicacioacuten raacutepida Siendo el glicerol fuente
de carbono en cultivos de micobacterias se planteoacute determinar su concentracioacuten
remanente como meacutetodo de evaluar integridad de M smegmatis establecieacutendose asiacute una
medida indirecta de la previa presencia de M tuberculosis en la muestra problema
Ademaacutes el glicerol es el principal subproducto en la elaboracioacuten del biodiesel y su
concentracioacuten es indicativa de la calidad del combustible transformaacutendose en analito
relevante para la industria de energiacuteas alternativas a la derivada del petroacuteleo
Se desarrollaron y validaron dos meacutetodos amperomeacutetricos de cuantificacioacuten de
glicerol a) Con electrodo de oro en NaOH 01 M aplicable a medios acuosos (LD 10
microM intervalo lineal 0024 a 200 mM) b) Con bioelectrodo de pasta de C modificada
con glicerol deshidrogenasa aplicable a medios complejos como cultivos bacterianos
(LD 20 M intervalo lineal 0060 a 175 mM)
Resumen
viii
1 Summary
This Thesis work was oriented to the development of analytical methods alternative
to those currently used to facilitate the identification of compounds of interest for both
clinical diagnosis and the alternative fuel industry Contributions of relevance to three
situations were performed Diagnosis of toxoplasmosis tuberculosis and the assessment
of biodiesel quality
Toxoplasmosis is a parasitic disease caused by Toxoplasma gondii which does not
bring complications in people except when the infected individual is an
immunocompromised patient or pregnant women who have not previously suffered
from the illness In this case the parasite can cross the placenta producing congenital
infection of the fetus and potentially causing serious consequences including death
One of the techniques used to its diagnosis is the enzyme-linked immunosorbent assay
allowing the detection of parasite-specific antibodies which are indicators of the
infection However this technique aimed to detect acute toxoplasmosis nowadays lacks
of reliable standardization particularly in the preparation of the antigen Therefore this
study focused on identifying regions encoding several markers of acute phase which
highly concentrated antigenic determinants to clone and express them as recombinant
proteins subsequently label them with biotin and thus use them as developing system of
specific antibodies against T gondii proteins The immunoassays presented here
propose a methodology which will allow in the future distinguishing sera from
individuals with acute infection of those with chronic infection or uninfected
Tuberculosis is an infectious and contagious disease caused by the bacterium
Mycobacterium tuberculosis Its diagnosis is based on a series of studies which
eventually identify the etiologic agent in cultures obtained from sputum This
identification can take about two months due to the extensive mycobacteria replication
time This leads to the potential contagion of healthy individuals and a major
commitment to the health of the infected patient Recently indirect M tuberculosis
detection techniques have been developed They use D29 bacteriophage which is able
to specifically infect mycobacteria The methodology allows phage replication in the
patientrsquos sample and then evaluates the number of released phages by infecting a
control culture of Mycobacterium smegmatis a short-term replicable mycobacteria As
glycerol is the carbon source commonly used in mycobacteria culture this work
proposes determining its residual concentration as a method of evaluating integrity of
Resumen
ix
M smegmatis thus establishing an indirect measurement of the previous presence of M
tuberculosis in the sample
Furthermore glycerol is the main by-product in biodiesel production and its
concentration is an indicator of the fuel quality becoming a relevant analyte to the
energy industry alternative to that derived of petroleum
Two amperometric methods for glycerol quantitation were developed and
validated a) Using a gold electrode in 01 M NaOH medium useful for simple aqueous
solutions (LD 10 microM linear range from 0024 to 200 mM) b) using a carbon paste
bioelectrode modified with glycerol dehydrogenase useful for complex media such as
bacterial cultures (LD 20 microM linear range 0060 to 175 mM)
Publicaciones
x
Publicaciones
Los resultados parciales del presente trabajo de Tesis han dado lugar a las
siguientes publicaciones
Trabajos en revistas internacionales
1- Costa J G Faccendini P L Sferco S J Lagier C M Marcipar I S
Evaluation and comparison of the ability of online available prediction programs to
predict true linear B-cell epitopes Protein amp Peptide Letters (2013) 20(6)724-30
2- Faccendini P L Ribone M E Lagier C M Selective application of two
rapid low-cost electrochemical methods to quantify glycerol according to the sample
nature Sensors and Actuators B (2014) 193 142ndash 148
Trabajos en congresos
1- Muntildeoz A Faccendini P L Ribone M E Lagier C M Oxidacioacuten
electroquiacutemica de polialcoholes sustrato de sistemas enzimaacuteticos bacterianos Estudio
de las condiciones para su cuantificacioacuten V Congreso Argentino de Quiacutemica Analiacutetica
Bahiacutea Blanca Noviembre de 2009
2- Costa J G Faccendini P L Carral L Kaufer F Lagier C M Marcipar I
S Evaluacioacuten de dos regiones de la Proteiacutena P35 de Toxoplasmama gondii para el
diagnostico de fase aguda de la toxoplasmosis Ascochinga Coacuterdoba Octubre de 2010
3- Costa J G Faccendini P L Lagier C M Marcipar I S Modelado y
prediccioacuten de los epiacutetopes del antigeno P22 de Toxoplasma gondii 2do Congreso de
Bioinformaacutetica y Biologiacutea Computacional Coacuterdoba Mayo de 2011
4- Faccendini P L Costa J G Ribone M E Marcipar I S Lagier C M
Ensamblado de un bioelectrodo econoacutemico para la deteccioacuten de glicerol en medios
altamente complejos 6deg Congreso Argentino de Quiacutemica Analiacutetica Santa Fe
Septiembre de 2011
5- Faccendini P L Costa J G Ribone M E Marcipar I S Lagier C M
Desarrollo y optimizacioacuten de un meacutetodo para la cuantificacioacuten de glicerol en matrices
complejas 6deg Congreso Argentino de Quiacutemica Analiacutetica Santa Fe Septiembre de 2011
Publicaciones
xi
6- Costa J G Perotti J Faccendini P L Lagier C M Mancipar I S
Optimization of the acute toxoplasmosis immunodiagnostic during the pregnancy
Workshop Fronteras en Biociencias Ministerio de Ciencia Tecnologiacutea e Innovacioacuten
Productiva Embajada Alemana Ciudad Autoacutenoma de Buenos Aires Abril de 2012
7- Costa J G Perotti J Faccendini P L Dure A Carral L Kaufer F Lagier
C M Mancipar I S Evaluacioacuten de diferentes regiones de las proteiacutenas p22 p30 y p35
para diagnoacutestico de la fase aguda de la toxoplasmosis XXV Reunioacuten Anual de la
Sociedad Argentina Protozoologiacutea 2012 Ciudad Autoacutenoma de Buenos Aires Agosto
de 2012
8- Costa J G Faccendini P L Sferco S J Lagier C M Mancipar I S
Comparison of the ability to predict true linear B-cell epitopes by on-line available
prediction programs 3er congreso de la sociedad argentina de bioinformaacutetica y biologiacutea
computacional Paranaacute Septiembre de 2012
9- Faccendini P L Costa J G Ribone M E Marcipar I S Lagier C M
Desarrollo de un sistema electroquiacutemico para evaluar infeccioacuten toxoplaacutesmica 7deg
Congreso Argentino de Quiacutemica Analiacutetica Mendoza Octubre de 2013
Abreviaturas y Siacutembolos
xii
Abreviaturas y Siacutembolos
AD Aglutinacioacuten Directa
ADN Aacutecido desoxiribonucleico
Ac(s) Anticuerpo(s)
Ang(s) Antiacutegeno(s)
D Coeficiente de difusioacuten
DHA 13 dihidroxiacetona
DMSO Dimetil sulfoacutexido
DO Densidad oacuteptica
DT Dye Test con azul de metileno (Reaccioacuten de Sabiacuten Feldman)
EDTA Aacutecido etilendiaminotetraaceacutetico
ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay (Ensayo de inmunoadsorcioacuten ligado
a enzima)
F Constante de Faraday
Frecuencia
GlDH Glicerol deshidrogenasa
HAI Hemoaglutinacioacuten indirecta
HEPES Aacutecido 4-(2-hydroxietil)-1-piperazina etano sulfoacutenico
HRP Horse radish peroxidase (Peroxidasa de raacutebano picante)
I Corriente eleacutectrica
IFI Inmunofluorescencia indirecta
IgA Inmunoglobulina A
IgG Inmunoglobulina G
IgE Inmunoglobulina E
IgM Inmunoglobulina M
IgM-IFI Inmunofluorescencia indirecta de IgM (Prueba de Remington)
IPTG Isopropil- -D-tiogalactopiranoacutesido
ISAGA Ensayo aglutinante de inmunoabsorcioacuten
LB Medio Luria-Bertani
LC Liacutemite de cuantificacioacuten
LD Liacutemite de deteccioacuten
MWCNT Multi-walled carboacuten nanotubes (Nanotubos de carbono de paredes
muacuteltiples)
Abreviaturas y Siacutembolos
xiii
N nuacutemero de moles de especie reducida u oxidada
OMS Organizacioacuten Mundial de la Salud
P35 Antiacutegeno de superficie de T gondii de 35 kDa de peso
PBS Phosphate buffer salin (Solucioacuten tampoacuten fosfato salino)
PCR Polimerasa chain reaction (Reaccioacuten en cadena de la polimerasa)
pET32a Vector plasmiacutedico
Q Carga eleacutectrica circulante
SAG1 Surface antigen 1 (Antiacutegeno de superficie 1 o antiacutegeno P30 de T gondii)
SAG2 Surface antigen 2 (Antiacutegeno de superficie 2 o antiacutegeno P22 de T gondii)
SDS Dodecil sulfato de sodio
TB Tuberculosis
TRX Tioredoxina
VBL Voltametriacutea de barrido lineal
VC Voltametriacutea ciacuteclica
VPD Voltametriacutea de pulso diferencial
Introduccioacuten
Introduccioacuten
1
2 Introduccioacuten
21 Toxoplasmosis
211 Generalidades
La toxoplasmosis es una enfermedad causada por el paraacutesito protozoario
Toxoplasma gondii que infecta animales herbiacutevoros carniacutevoros y omniacutevoros dentro de
los cuales se encuentra el hombre Estaacute ampliamente extendida por todo el mundo y su
incidencia y prevalencia variacutean mucho seguacuten las zonas geograacuteficas los haacutebitos
alimentarios el tipo de trabajo la higiene ambiental y la presencia o no de gatos
infectados (Atias 1998 Martiacuten-Hernaacutendez 2004) Es una zoonosis que afecta a los
humanos a traveacutes de formas infectivas producidas durante el ciclo bioloacutegico que se
desarrolla uacutenicamente en gatos y otros feacutelidos Dependiendo de la localizacioacuten
geograacutefica entre 15 y 85 de la poblacioacuten adulta mundial presenta infeccioacuten croacutenica
(Fuentes y col 2001)
Usualmente la principal viacutea de transmisioacuten de esta parasitosis es la oral por
ingestioacuten de carnes crudas o poco cocidas contaminadas con quistes o por la ingestioacuten
de ooquistes presentes en agua o alimentos contaminados con heces de gato Son menos
frecuentes las viacuteas de transmisioacuten parenteral respiratorias mucosal (conjuntival)
cutaacutenea y por transfusioacuten de sangre o trasplante de oacuterganos La transmisioacuten por viacutea
transplacentaria puede ocurrir cuando la embarazada padece la primoinfeccioacuten durante
el curso del embarazo aunque se han descripto casos raros de infeccioacuten congeacutenita por
toxoplasmosis materna anterior al embarazo (Martiacuten-Hernaacutendez 2004 Centers of
Diseases Control and Prevention (CDC) paacutegina web a)
Durante la infeccioacuten pueden distinguirse dos etapas A) Aguda Al breve tiempo de
ingerir ooquistes esporulados eacutestos se transforman en taquizoiacutetos ingresan a la ceacutelula
del hueacutesped y comienzan a dividirse en forma asexual hasta que la ceacutelula se lisa
liberando asiacute la progenie y ocasionando la parasitemia Posteriormente el taquizoiacuteto
evoluciona a bradizoiacuteto cuya multiplicacioacuten es lenta Se produce la invasioacuten de los
oacuterganos por viacutea linfaacutetica o hemaacutetica siendo los oacuterganos maacutes comprometidos los
muacutesculos esqueleacutetico y cardiacuteaco asiacute como cerebro y ojos B) Croacutenica En la medida que
evoluciona la defensa del hueacutesped desaparecen los paraacutesitos extracelulares limitaacutendose
la divisioacuten intracelular y quedando las formas resistentes principalmente en el sistema
nervioso central y muacutesculo esqueleacutetico Por lo general esta etapa es latente pero puede
Introduccioacuten
2
activarse por la ruptura de los quistes tisulares (Fuentes y col 2001 Trabattoni y col
2008)
212 Toxoplasma gondii
El Toxoplasma gondii es un paraacutesito intracelular obligado Su ubicacioacuten
taxonoacutemica se detalla en la Tabla 21
Tabla 21 Ubicacioacuten taxonoacutemica del T gondii
Reino Protista
Sub-reino Protozoa
Phylum Apicomplexa
Clase Sporozoea
Sub-clase Coccidea
Orden Eucoccidiia
Sub-orden Eimeriina
Familia Sarcocystidae
Sub-familia Toxoplasmatinae
Geacutenero Toxoplasma
Especie gondii
Durante el ciclo de vida del T gondii se distinguen tres formas a) los taquizoiacutetos
b) los bradizoiacutetos (o quistes tisulares) y c) los ooquistes Los taquizoiacutetos (o trofozoiacutetos)
son la forma proliferativa y de reproduccioacuten raacutepida dentro de la ceacutelula del hueacutesped
durante la fase aguda que posteriormente deviene en la formacioacuten de un pseudoquiste
Tiene forma de medialuna y mide de 4 a 7 μm de ancho Estaacute recubierto por un sistema
de membranas constituido por una membrana doble interna y una externa interrumpida
en dos puntos El taquizoiacuteto es afectado por anticuerpos (Acs) especiacuteficos y faacutermacos y
se destruye en condiciones ambientales adversas como congelamiento-
descongelamiento desecacioacuten y bajo pH (por ejemplo el de los jugos gaacutestricos) Los
quistes tisulares son redondeados de pared elaacutestica miden de 10 a 200 μm y pueden
contener hasta 3000 paraacutesitos denominados bradizoiacutetos Estas formas no son afectadas
por Acs ni faacutermacos pero pueden ser destruidos por calentamiento congelamiento-
descongelamiento y por desecacioacuten Cuando estos quistes son ingeridos los bradizoiacutetos
resistentes son liberados por la accioacuten gaacutestrica y pueden invadir la mucosa
gastrointestinal Los ooquistes son estructuras ovoides de 10 a 12 μm de diaacutemetro y son
eliminadas en la materia fecal del gato Recieacuten emitidos no son infectivos pero bajo
condiciones de temperatura humedad y presencia de oxiacutegeno esporulan tornaacutendose
Introduccioacuten
3
infectivos y resistentes por maacutes de un antildeo en el suelo y dos antildeos en el agua (Atias
1998 Perotti 2007)
La Fig 21 describe el ciclo de vida del paraacutesito Los uacutenicos hueacutespedes definitivos
conocidos de T gondii son miembros de la familia Felidae (por ejemplo gatos
domeacutesticos) Los ooquistes no esporulados son liberados en las heces del felino Los
ooquistes tardan entre 1 y 5 diacuteas en esporular en el ambiente y volverse infectivos Los
hueacutespedes intermediarios se infectan al ingerir tierra agua o plantas contaminadas con
los ooquistes Los ooquistes se transforman en taquizoiacutetos al breve tiempo de ser
ingeridos Estos taquizoiacutetos se localizan en los tejidos musculares y el sistema nervioso
y evolucionan a bradizoiacutetos formando los quistes tisulares (hiacutesticos) Los felinos se
infectan luego de ingerir la carne de hueacutespedes intermediarios que poseen quistes
tisulares o por ingestioacuten de los ooquistes esporulados Los animales de caza y los
criados para consumo humano tambieacuten pueden infectarse por ingestioacuten de ooquistes
esporulados En el hueacutesped humano los paraacutesitos forman quistes en los tejidos y suele
encontrarse generalmente en el muacutesculo esqueleacutetico el miocardio cerebro y ojos donde
pueden permanecer durante toda la vida del hueacutesped (Paacutegina web del CDC)
Figura 21 Ciclo de vida de T gondii El hueacutesped definitivo son miembros de la familia Felidae los
demaacutes hueacutespedes (incluido el hombre) se infectan accidentalmente y no son necesarios para completar el
ciclo de vida del paraacutesito Adaptado de httpwwwdpdcdcgovdpdxHTMLToxoplasmosishtm
Introduccioacuten
4
213 Diagnoacutestico
Puesto que las infecciones por T gondii en individuos inmunocompetentes son por
lo general asintomaacuteticas o presentan siacutentomas imperceptibles su diagnoacutestico se basa
principalmente en pruebas de laboratorio La toxoplasmosis no suele generar
complicaciones excepto en 2 situaciones cuando se infectan individuos
inmunodeprimidos y cuando se infectan por primera vez mujeres embarazadas En este
uacuteltimo caso el paraacutesito puede infectar al feto atravesando la placenta y generando la
infeccioacuten congeacutenita Las probabilidades de dantildear al feto o al nintildeo luego de nacer
dependeraacuten del trimestre en que suceda la infeccioacuten (Atias 1998 Martiacuten-Hernaacutendez
2005) Tanto en inmunocomprometidos como en el recieacuten nacido la infeccioacuten puede
producir graves consecuencias Es por ello que en estos casos asiacute como en la
embarazada el diagnoacutestico cobra particular relevancia (Remington y col 1995)
2131 Meacutetodos de diagnoacutestico
La infeccioacuten puede diagnosticarse por meacutetodos directos que consisten en la
identificacioacuten de las estructuras parasitarias (por un estudio histopatoloacutegico para lo cual
es necesario realizar biopsias puncioacuten de ganglios o cortes histoloacutegicos) o la
identificacioacuten de ADN del paraacutesito (a traveacutes de una reaccioacuten en cadena de la
polimerasa PCR) Tambieacuten se pueden realizar cultivos tisulares e inoculacioacuten al
peritoneo de ratoacuten pero este meacutetodo presenta la desventaja de involucrar el manejo de
paraacutesitos vivos y el uso de animales de laboratorio (Perotti 2007)
Los meacutetodos alternativos son las pruebas indirectas a saber
Intradermoreaccioacuten de Frenkel Evaluacutea la inmunidad celular Es una reaccioacuten
cualitativa tardiacutea y presenta resultado positivo a partir de la cuarta semana de infeccioacuten
aunque se han reportado casos de pacientes en los que llevoacute varios meses hasta dar
positiva Se utiliza con fines epidemioloacutegicos (Jirovec amp Jindrich 1961 Rodriacuteguez
Acar y col 2008)
Reaccioacuten de Sabiacuten Feldman o dye test con azul de metileno (DT) Es el meacutetodo
de referencia de la OMS Evaluacutea la inmunidad humoral y mide la cantidad total de Acs
que es capaz de destruir taquizoiacutetos viacutea activacioacuten del complemento Es un meacutetodo
cuantitativo y presenta valores positivos a partir de la primera o segunda semana de
infeccioacuten Tiene la desventaja de requerir taquizoiacutetos vivos y animales para su cultivo
por lo que soacutelo laboratorios de referencia llevan adelante este meacutetodo (Perotti 2007
Durlach y col 2008)
Introduccioacuten
5
Reaccioacuten de inmunofluorescencia indirecta (IFI) Evaluacutea la cantidad de Acs que
se unen a toxoplasmas inactivados La reaccioacuten se evidencia con Acs anti-IgG humana
marcados con isocianato de fluoresceiacutena y observando al microscopio de fluorescencia
Si bien no se trabaja con organismos vivos la necesidad de un microscopio de
fluorescencia y la subjetividad del operador limitan el uso de este meacutetodo Se han
informado resultados falso-positivos debidos a Acs anti-nucleares (Durlach y col
2008)
Aglutinacioacuten directa (AD) En este ensayo se produce una aglutinacioacuten visible con
toxoplasmas tratados con formol Se detecta fundamentalmente IgMs especiacuteficas
Hemoaglutinacioacuten indirecta (HAI) Se utilizan antiacutegenos (Angs) de T gondii con
los que se sensibiliza gloacutebulos rojos que en presencia de Acs especiacuteficos producen una
aglutinacioacuten visible como un botoacuten rojo En general es utilizado para determinar
incidencia o seroprevalencia en una regioacuten pero no se recomienda para la deteccioacuten de
la infeccioacuten aguda (Durlach y col 2008)
Fijacioacuten del complemento Se detectan Acs que activan el sistema del
complemento en presencia de Angs de T gondii La reaccioacuten se evidencia con el
sistema hemoliacutetico hemolisina-gloacutebulos rojos de carnero Resultados positivos aparecen
en forma maacutes tardiacutea que en el DT (Perotti 2007)
Western blot Se evaluacutea la presencia de Acs especiacuteficos a Angs que han sido
separados por electroforesis en un gel de poliacrilamida y transferidos a una membrana
Generalmente no es utilizada como teacutecnica de diagnoacutestico debido a su difiacutecil
estandarizacioacuten (Durlach y col 2008)
Prueba de Remington (IgM-IFI) Se sigue el mismo esquema que en IFI pero se
sustituyen el conjugado anti-IgG por uno anti-IgM lo que permite detectar infeccioacuten
aguda Acs anti-nucleares y el factor reumatoide pueden producir resultados falso-
positivos y los Acs tipo IgG pueden producir resultados falso-negativos (Perotti 2007)
Ensayo aglutinante de inmunoabsorcioacuten (ISAGA) Permite la deteccioacuten y dosaje
de Acs IgA IgE IgG e IgM especiacuteficos contra el paraacutesito Este meacutetodo posee mayor
sensibilidad en relacioacuten al IgM-IFI y al ensayo de inmunoadsorcioacuten ligado a enzima
(ELISA) de IgM para la deteccioacuten de infecciones congeacutenitas pero tiene la desventaja
que pueden detectarse IgM especiacuteficas luego de un antildeo de la primoinfeccioacuten Esto
dificulta la interpretacioacuten de un resultado positivo si se desea determinar la antiguumledad
de la infeccioacuten (Durlach y col 2008)
Introduccioacuten
6
Ensayo de inmunoadsorcioacuten ligado a enzima (ELISA) Permite la deteccioacuten de
Acs especiacuteficos contra el paraacutesito Se evidencia la reaccioacuten con una enzima ligada a Acs
o Angs (dependiendo del disentildeo del inmunoensayo ver maacutes adelante en punto 2134)
que transforma un reactivo auxiliar en un producto coloreado o fluorescente Es un
meacutetodo cuantitativo que utiliza un espectrofotoacutemetro o fluoroacutemetro lo que permite
hacer medidas maacutes objetivas y raacutepidas (Perotti 2007) Auacuten asiacute este meacutetodo aplicado a
la deteccioacuten de la toxoplasmosis de fase aguda carece de una estandarizacioacuten confiable
principalmente en la preparacioacuten del Ang
2132 Importancia del correcto diagnoacutestico en la embarazada
A pesar de toda la bateriacutea de ensayos arriba descritos disponibles para el
diagnoacutestico de la toxoplasmosis el de la infeccioacuten aguda en la mujer embarazada sigue
siendo problemaacutetico porque este diagnoacutestico se deduce a partir de los datos de las
concentraciones relativas de los distintos isotipos de las inmunoglobulinas especiacuteficas
En efecto la existencia y concentracioacuten de IgM IgA e IgG especiacuteficas contra T gondii
es muy dependiente de la respuesta inmune del individuo infectado Considerando que
el tratamiento para prevenir la transmisioacuten al feto consiste en administrar drogas
antiparasitarias que tienen efectos nocivos sobre el nonato auacuten en estos diacuteas se trabaja
en mejorar este diagnoacutestico ya que no se cuenta con un meacutetodo confiable como para
prevenir por un lado los dantildeos que suelen sufrir los recieacuten nacidos de madres con
primoinfeccioacuten no diagnosticada y por otra parte los efectos perjudiciales en los fetos
de las embarazadas incorrectamente diagnosticadas y medicadas Por ello es que en este
trabajo se intentoacute desarrollar nuevas metodologiacuteas de diagnoacutestico de la infeccioacuten
toxoplaacutesmica aguda utilizando teacutecnicas electroquiacutemicas
2133 Diagnoacutestico en la embarazada
El correcto diagnoacutestico de la infeccioacuten aguda en la embarazada incluye la
utilizacioacuten de teacutecnicas especiacuteficas y sensibles asiacute como tambieacuten la aplicacioacuten de un
esquema de seguimiento adecuado El diagnoacutestico generalmente es realizado por
serologiacutea Para determinar si la paciente cursa una infeccioacuten aguda se determinan los
tiacutetulos de los anticuerpos IgG IgA e IgM (Arcavi y col 1997) y se interpretan prima-
facie seguacuten
1 IgG IgA IgM negativas ausencia de infeccioacuten
2 IgG e IgA positivas IgM negativa infeccioacuten croacutenica
3 IgG IgA e IgM positivas posible infeccioacuten aguda
Introduccioacuten
7
2134 Ensayo de inmunoadsorcioacuten ligado a enzima
Los ensayos del tipo ELISA consisten en la deteccioacuten de un antiacutegeno o un
anticuerpo inmovilizado sobre un soporte soacutelido y mediante anticuerpos que directa o
indirectamente producen una reaccioacuten La prueba recurre al empleo de antiacutegenos o
anticuerpos conjugados a una enzima (marcados) que por reaccioacuten con su sustrato
producen una especie coloreada cuya concentracioacuten puede ser medida
fotomeacutetricamente Este ensayo tiene las ventajas de ser versaacutetil robusto simple en su
realizacioacuten y emplear reactivos relativamente econoacutemicos El uso de una fase soacutelida que
retiene el analito de intereacutes proporciona una elevada sensibilidad mientras que la
elevada especificidad del ensayo viene dada por la gran selectividad de los anticuerpos
por su antiacutegeno Las configuraciones maacutes sencillas para estos ensayos son el directo y el
indirecto ambas esquematizadas en la Fig 22
Antiacutegeno IgG conjugada a enzima
Bloqueante IgG humana Reactivo de color
Directo Indirecto
Figura 22 Esquemas que representan los ELISA directo (izquierda) e indirecto (derecha)
21341 Esquema de captura o tipo ldquoSandwichrdquo
Cuando los anticuerpos que desean detectarse son del isotipo IgM suele tenerse el
inconveniente que el isotipo IgG frecuentemente estaacute en mayor concentracioacuten que el
IgM y presenta una mayor afinidad por el antiacutegeno Por lo tanto las IgG suelen
dificultar la deteccioacuten de las IgM en suero cuando se sigue un esquema de ELISA
indirecto con anticuerpos anti-IgM humana (Ac-a-IgMh) marcados Es por esto que
suele optarse por un esquema de captura o tipo saacutendwich en el cual se aumenta la
sensibilidad del ensayo incorporando un eslaboacuten maacutes en el inmunocomplejo adsorbido
En este trabajo se ensayaron dos alternativas de captura o tipo saacutendwich En la
primera alternativa que sigue un esquema claacutesico (A) se adsorbieron los Ac-a-IgMh
Introduccioacuten
8
sobre la superficie de la placa de poliestireno Las placas asiacute sensibilizadas se
enfrentaron al suero a ensayar capturando selectivamente una porcioacuten de las IgM de la
muestra Luego se los enfrentoacute al antiacutegeno de intereacutes ligado a biotina que se une a las
IgMh especiacuteficas para dicho Ang previamente capturado Finalmente se buscoacute revelar
con enzima peroxidasa de raacutebano picante (HRP) conjugada a streptavidina esta uacuteltima
forma un complejo estable con biotina De esta forma se aumenta la cantidad de Ac que
se desean detectar adsorbido sobre la placa seleccionando el tipo de anticuerpo que se
adsorbe En la Fig 23 se muestra el esquema del ensayo tipo A
IgM Antiacutegeno ligado a biotina streptavidina conjugada a HRP
Bloqueante IgG anti-IgM Reactivo de color
Figura 23 Esquema de ensayo ELISA tipo captura claacutesico A Un anticuerpo anti IgMh captura una
porcioacuten de las IgM presentes en el suero humano una porcioacuten de estas IgM capturadas son especiacuteficas
para antiacutegeno de T gondii y se revela su presencia por medio del antiacutegeno recombinante ligado a biotina
streptavidina ligada a HRP adicionando el sustrato de la enzima y un cromoacutegeno actuando como
cosustrato
La segunda alternativa que denominamos tipo B sale del esquema tradicional de
los ELISA Se adsorbe el antiacutegeno recombinante sobre la superficie de la placa de
poliestireno enfrentaacutendola luego al suero a ensayar Asiacute se captura selectivamente las
inmunoglobulinas que reconocen al antiacutegeno Luego se expone la placa al mismo
antiacutegeno recombinante pero ligado a biotina que se uniraacute a los anticuerpos especiacuteficos
para dicho Ang previamente capturados Finalmente se revela con HRP conjugada a
streptavidina que forma un complejo estable con biotina De esta forma se aumenta la
cantidad de Ang marcado en mayor proporcioacuten para IgM que para IgG dada la
Introduccioacuten
9
multivalencia de este isotipo de inmunoglobulina En la Fig 24 se muestra el segundo
esquema que fue el que brindoacute los resultados maacutes promisorios
Antiacutegeno (Ang) Bloqueante Ang ligado a biotina Reactivo de color
IgM a-Ang IgG a-Ang streptavidina conjugada a HRP
Figura 24 Esquema de ensayo ELISA de captura tipo B El antiacutegeno expuesto en la placa captura la
porcioacuten de las IgM e IgG especiacuteficas presentes en el suero humano Haciendo uso de la polivalencia de
las IgM su presencia se revela con el antiacutegeno conjugado a biotina streptavidina ligada a HRP
adicionando el sustrato de la enzima y un cromoacutegeno actuando como cosustrato
2135 Obtencioacuten de antiacutegenos para diagnoacutestico
El diagnoacutestico de rutina de la toxoplasmosis se basa en la deteccioacuten seroloacutegica de
anticuerpos en el paciente Los antiacutegenos utilizados en estas pruebas seroloacutegicas son
generalmente proteiacutenas derivadas de ceacutelulas T gondii que se propagan en el ratoacuten o el
cultivo de ceacutelulas El cultivo y el mantenimiento de este paraacutesito es laborioso lento y
caro (Lau amp Fong 2006) El uso de antiacutegenos nativos de taquizoitos es difiacutecil de
estandarizar y con frecuencia produce reacciones positivas falsas (Hiszczyntildeska-Sawicka
y col 2005) Por lo tanto ha habido intentos de producir antiacutegenos a traveacutes de medios
maacutes seguros tales como tecnologiacutea de ADN recombinante La mayoriacutea de estos
esfuerzos se han centrado en los principales antiacutegenos de superficie del paraacutesito como el
antiacutegeno de superficie 1 (SAG1 del ingleacutes Surface antigen 1) y el antiacutegeno de superficie
2 (SAG2 del ingleacutes Surface antigen 2) (Lau amp Fong 2006) En estudios recientes se ha
estado evaluando que la presencia de IgM e IgG anti P35 seriacutea un mejor indicador de
infeccioacuten reciente que la evaluacioacuten de IgM utilizando taquizoitos enteros en ensayos
del tipo ELISA (Lu y col 2006) En efecto con la nueva tecnologiacutea de ADN
Introduccioacuten
10
recombinante es posible obtener cualquier proteiacutena contaacutendose ademaacutes con ventajas
como la posibilidad de seleccionar porciones especiacuteficas de un Ang para evitar
reacciones inespeciacuteficas ligar distintas porciones que naturalmente corresponden a otras
proteiacutenas para aumentar la sensibilidad del ensayo agregar secuencias aminoaciacutedicas
que faciliten la posterior purificacioacuten y estandarizacioacuten de la proteiacutena a utilizar
(Hiszczyntildeska-Sawicka y col 2005) A la postre todo el proceso resulta maacutes
econoacutemico seguro y confiable que la purificacioacuten de Angs a partir del microorganismo
nativo puesto que no requiere la manipulacioacuten de microorganismos patoacutegenos ya que
la expresioacuten de las proteiacutenas recombinantes se lleva adelante en microorganismos no
infectivos de raacutepido crecimiento (Babaie y col 2013)
Por lo arriba expresado debe seguirse un esquema para seleccionar cuales deben de
ser las proteiacutenas que conviene utilizar acorde al diagnoacutestico que se pretende abordar y
ello demanda un trabajo racional de seleccioacuten de antiacutegenos generalmente
inmunodominantes No obstante escoger tales proteiacutenas no es tarea sencilla por cuanto
la verificacioacuten del grado de bondad del Ang seleccionado exige una ardua tarea
experimental siendo conveniente acotar el nuacutemero de Angs alternativos a evaluar Un
modo de encarar esto es procurar predecir el grado de antigenicidad en base a la
secuencia aminoaciacutedica lo cual puede realizarse computacionalmente
214 Prediccioacuten de epiacutetopes reconocidos por ceacutelulas B
Los programas de prediccioacuten definen el grado de antigenicidad por medio de una
puntuacioacuten (score) en algunos casos para cada epiacutetope y en otros para cada residuo
amino aciacutedico En este uacuteltimo se puede definir una regioacuten antigeacutenica cuando varios
residuos con alta puntuacioacuten son adyacentes en la estructura primaria Por otra parte el
nuacutemero de epiacutetopes o regiones antigeacutenicas que los programas de prediccioacuten encuentran
depende de un umbral que es configurado por el usuario
En la actualidad los inmunoensayos para determinar anticuerpos son realizados
utilizando regiones antigeacutenicas definidas ya sea como moleacuteculas uacutenicas mezcla de
varios componentes o como antiacutegenos de fusioacuten multiepiacutetope (Camussone 2009) El
desarrollo de herramientas informaacuteticas para predecir de forma fiable la antigenicidad
de los epiacutetopes puede reducir el costoso y prolongado trabajo experimental requerido
para identificar las regiones de intereacutes (Namrata amp Rajat 2010) Al momento de
identificar estas regiones antigeacutenicas suele contarse soacutelo con la estructura primaria de
las proteiacutenas en estudio desconocieacutendose su estructura terciaria en la mayoriacutea de los
Introduccioacuten
11
casos De aquiacute que la prediccioacuten de epiacutetopes lineales es el meacutetodo maacutes utilizado para
seleccionar epiacutetopes putativos
Desde el informe inicial de Hopp y Woods en 1981 (Hopp amp Woods 1981) varios
procedimientos se han hecho populares para detectar epiacutetopes lineales reconocidos por
ceacutelulas B a partir de la estructura primaria de una proteiacutena El rendimiento de estos
programas auacuten no ha logrado una eficiencia oacuteptima seguacuten lo declarado por sus propios
autores (Kolaskar amp Tongaonkar 1990 Saha y col 2005 Saha amp Raghava 2006
Larsen y col 2006 Davydov amp Tonevitskii 2009)
La literatura sobre las aplicaciones de estos programas estaacute orientada
principalmente a identificar posibles vacunas (Namrata amp Rajat 2010) Por lo tanto la
sensibilidad (probabilidad de obtener un positivo entre los verdaderos positivos) y la
especificidad (probabilidad de obtener un negativo entre aquellos negativos verdaderos)
son los indicadores maacutes utilizados para evaluar la calidad de estos programas ya que un
uacutenico epiacutetope puede ser crucial para lograr una respuesta inmunoprotectora Al mismo
tiempo suele omitirse el valor predictivo positivo (VPP) que es la proporcioacuten de
muestras que dan positivo el ensayo siendo verdaderos positivos o sea es la capacidad
para encontrar los epiacutetopes reales de una proteiacutena (ver el recuadro 1) Sin embargo la
fiabilidad del epiacutetope predicho es maacutes importante que su sensibilidad para reducir el
nuacutemero de experimentos confirmatorios de su utilidad diagnoacutestica Es entonces
importante diferenciar ambos paraacutemetros ya que los programas de prediccioacuten pueden
realizar predicciones de baja sensibilidad pero al mismo tiempo si los epiacutetopes reales
fueron predichos la prediccioacuten presenta un alto VPP
Recuadro 1
Los casos posibles en un ensayo son
Verdaderos
positivos
Verdaderos
negativos
Ensayo
positivo A B
Ensayo
negativo C D
BA
A positivo predictivoValor
DB
D dadEspecifici
CA
A adSensibilid
Introduccioacuten
12
La falta de estudios comparativos entre los programas de prediccioacuten en la literatura
actual impide que los usuarios hagan la mejor eleccioacuten Por ello como trabajo inicial se
intentoacute evaluar los distintos programas disponibles en la red en cuanto a su capacidad
para predecir positivamente epiacutetopes
Introduccioacuten
13
22 Tuberculosis
221 Generalidades
La tuberculosis (TB) humana es una enfermedad infecto-contagiosa causada por la
bacteria Mycobacterium tuberculosis La infeccioacuten por M tuberculosis suele ser
asintomaacutetica en personas sanas dado que su sistema inmune es capaz de controlar la
bacteria No obstante en condiciones de desnutricioacuten o inmunocompromiso la
enfermedad suele ser grave La TB es una enfermedad vinculada a la pobreza que
puede afectar a adultos joacutevenes en edad productiva
La enfermedad se transmite por el aire de una persona a otra a traveacutes de gotiacuteculas
que portan bacterias Cuando una persona con infeccioacuten activa en pulmones o garganta
tose estornuda habla o canta las personas cercanas pueden respirar las bacterias
liberadas e infectarse
La enfermedad suele afectar los pulmones pero tambieacuten puede involucrar otros
oacuterganos como rintildeones columna vertebral y cerebro Los siacutentomas de la TB pulmonar
activa son tos a veces con esputo sanguinolento dolor toraacutecico debilidad peacuterdida de
peso fiebre y sudoracioacuten nocturna Si no se trata adecuadamente puede ser mortal La
mayoriacutea de las muertes por TB se producen en los paiacuteses en viacuteas de desarrollo (Paacutegina
web del CDC b)
La Organizacioacuten Mundial de la Salud (OMS) estima en 2000 millones a los
infectados por M tuberculosis que anualmente hay 9 millones de nuevos infectados y
que mueren casi 2 millones de personas al antildeo por causa de esta enfermedad (Paacutegina
web de la OMS)
222 Mycobacterium tuberculosis
Esta micobacteria tambieacuten conocida como Bacilo de Koch es una bacteria aacutecido-
alcohol resistente frecuentemente incolora y es aeroacutebica estricta Es muy resistente al
friacuteo la congelacioacuten y la desecacioacuten y por el contrario es muy sensible al calor la luz
solar y la luz ultravioleta Su replicacioacuten es muy lenta (una divisioacuten cada 16 a 20 horas)
y ante circunstancias adversas puede entrar en estado latente pudiendo retrasar su
multiplicacioacuten desde algunos diacuteas hasta varios antildeos El reservorio natural de M
tuberculosis es el hombre tanto el individuo infectado asintomaacutetico como el enfermo
con infeccioacuten activa Su clasificacioacuten taxonoacutemica se detalla en la Tabla 22
Introduccioacuten
14
Tabla 22 Ubicacioacuten taxonoacutemica de M tuberculosis
Reino Bacteria
Phylum Actinobacteria
Clase Actinobacteria
Sub-clase Actinobacteridae
Orden Actinomycetales
Sub-orden Corynebacterineae
Familia Mycobacteriaceae
Geacutenero Mycobacterium
Especie tuberculosis
223 Diagnoacutestico
El diagnoacutestico de la infeccioacuten tuberculosa se basa en una serie de estudios que se
inicia con placas radiograacuteficas pulmonares y la prueba de la tuberculina que pone de
manifiesto un estado de hipersensibilidad del hueacutesped frente a proteiacutenas de M
tuberculosis Esta sensibilidad se adquiere o bien por infeccioacuten con el bacilo o por
vacunacioacuten con cepas no infectivas (vacuna BCG) En una segunda etapa la infeccioacuten
activa es confirmada por identificacioacuten del agente etioloacutegico en cultivos obtenidos a
partir de la muestra bioloacutegica remitida al laboratorio Auacuten cuando la conjuncioacuten de los
meacutetodos de anaacutelisis vigentes permite un diagnoacutestico certero de la TB humana es
frecuente que se requiera de un prolongado tiempo de espera hasta la confirmacioacuten de la
infeccioacuten activa por cuanto ello depende del lento proceso de replicacioacuten del bacilo
Esto conlleva que exista potencialidad de contagio a individuos sanos y se comprometa
maacutes la salud del infectado
En los uacuteltimos antildeos se han desarrollado teacutecnicas de deteccioacuten de M tuberculosis
que involucran al bacterioacutefago D29 (en adelante fago) capaz de infectar
especiacuteficamente micobacterias (Park y col 2003 Mc Nerney y col 2004) Esta
metodologiacutea se basa en procesar la muestra del paciente sospechada de contener M
tuberculosis ponerla en contacto con el fago e incubarla para permitir su replicacioacuten
Finalmente se evaluacutea el tiacutetulo de los fagos liberados infectando un cultivo testigo de M
smegmatis (micobacterias de raacutepido crecimiento susceptibles al fago) y contando las
placas de lisis que se obtienen Esta novedosa metodologiacutea si bien indirecta y
preliminar permite reducir considerablemente los tiempos de diagnoacutestico puesto que se
trabaja con especies de crecimiento raacutepido Sin embargo al utilizar el conteo de placas
de lisis como eje central para el diagnoacutestico de infeccioacuten activa se recae en largos
Introduccioacuten
15
periacuteodos de incubaciones que podriacutean evitarse si se contase con otro meacutetodo de evaluar
la integridad celular de M smegmatis
Por lo arriba expuesto es que en este trabajo se intento desarrollar una nueva
metodologiacutea de verificacioacuten de lisis de micobacterias utilizando teacutecnicas
intriacutensecamente raacutepidas como son las electroquiacutemicas que en un futuro podriacutean
facilitar el diagnoacutestico de infeccioacuten tuberculosa
Introduccioacuten
16
23 Biodiesel
El grave impacto de la utilizacioacuten de combustibles derivados del petroacuteleo en el
medio ambiente la limitada disponibilidad de petroacuteleo crudo y sobre todo la
inestabilidad de los mercados del petroacuteleo han estimulado actualmente la propagacioacuten
de combustibles liacutequidos alternativos (Monteiro y col 2008) La organizacioacuten
American Society for Testing and Materials ASTM define biodiesel como una mezcla
de eacutesteres monoalquiacutelicos de aacutecidos grasos de cadena larga derivados de aceites
vegetales o grasas animales (American Society for Testing and Materials paacutegina web)
El biodiesel puro generalmente no se utiliza como combustible sino que suele
encontrase en mezcla con diesel de petroacuteleo El biodiesel es clasificado utilizando la
notacioacuten Bxx donde xx indica el porcentaje en volumen de contenido de biodiesel en el
liacutequido Asiacute B100 es biodiesel puro B50 contiene 50 en volumen de biodiesel B5
contiene 5 en volumen etc Las mezclas comerciales maacutes comunes son B2 B5 y B20
El biodiesel se obtiene a partir de la transesterificacioacuten de gliceroliacutepidos con
alcoholes de cadena corta como el etanol o el metanol siendo el glicerol el principal
subproducto en la elaboracioacuten de este combustible junto a productos menores como
mono y diacil gliceroles o aacutecidos grasos libres La masa de glicerol generada equivale
aproximadamente al 10 en peso del total del combustible producido siendo eacuteste uno
de los contaminantes frecuentes
231 Determinacioacuten de glicerol libre en biodiesel
La presencia de glicerol es indicativa de la calidad del biodiesel transformaacutendose
en un analito de intereacutes para la creciente industria de energiacuteas alternativas a la derivada
del refinamiento del petroacuteleo
Los meacutetodos quiacutemicos maacutes simples para cuantificar glicerol se basan en su
oxidacioacuten a formaldehiacutedo utilizando peryodato Luego el formaldehiacutedo formado se
determina cuantitativamente por diversos meacutetodos ya sea basados en reacciones
especiacuteficas evaluando los productos por diferentes metodologiacuteas o por titulacioacuten con
NaOH valorado (Lapenaite y col 2007)
La norma ASTM-D 6584 establece un meacutetodo basado en cromatografiacutea gaseosa
que permite la determinacioacuten en simultaacuteneo de glicerina libre y total (glicerol maacutes
mono di y trigliceacuteridos) No obstante este procedimiento no es aplicable a los eacutesteres
metiacutelicos de aceites vegetales obtenidos a partir de aceites laacuteuricos tales como aceite de
Introduccioacuten
17
coco o de palma quedando restringido el meacutetodo soacutelo para un grupo de biodiesels
particulares
En cuanto a los meacutetodos cromatograacuteficos tienen la desventaja de ser poco
amigables con el medio ambiente dado el profuso uso de solventes orgaacutenicos que son
potencialmente contaminantes a veces se tornan laboriosos y utilizan instrumental e
insumos caros
Considerando lo expresado arriba en este trabajo se ha planteado cuantificar
glicerol utilizando una metodologiacutea esencialmente econoacutemica simple y no
contaminante como lo son las teacutecnicas electroquiacutemicas convencionales
Introduccioacuten
18
24 Marco teoacuterico de las teacutecnicas electroquiacutemicas utilizadas
Los meacutetodos electroquiacutemicos de anaacutelisis estudian el analito de intereacutes mediante la
medicioacuten de los paraacutemetros fiacutesicos como potencial eleacutectrico yo corriente en una celda
electroquiacutemica El proceso fundamental en las teacutecnicas electroquiacutemicas es la
transferencia de electrones entre especies redox y la superficie del electrodo (Bard amp
Faulkner 2001) Este puede describirse con la siguiente reaccioacuten
O + ne- R [21]
Para reacciones reversibles y raacutepidas el potencial sigue la ley de Nernst
[22]
siendo y las actividades de las especies reducida y oxidada en la interfaz
electrodosolucioacuten respectivamente
La corriente que circula por la celda es la carga transportada por unidad de tiempo y
puede expresarse como
[23]
De acuerdo a las leyes de Faraday la carga circulante (Q) es proporcional a los
moles de especie reducida u oxidada (N) El factor de proporcionalidad es la carga del
electroacuten (n) por la constante de Faraday (F)
[24]
Combinando las Ecs 23 y 24 obtenemos
[25]
A medida que avanza la reaccioacuten se consume la especie electroactiva esto
produce un gradiente de concentracioacuten entre el seno de la solucioacuten y las inmediaciones
del electrodo donde la especie es electrotransformada y consecuentemente asociado se
Introduccioacuten
19
generaraacute un transporte de masa por difusioacuten Si el proceso estaacute bajo control difusional
la primera ley de Fick permite describir el flujo de partiacuteculas en funcioacuten de la posicioacuten
ec 26 y la segunda ley de Fick lo describe en funcioacuten de la variacioacuten de la
concentracioacuten de la especie electroactiva en funcioacuten del tiempo ec 27
[26]
[27]
donde D es el coeficiente de difusioacuten de la especie en estudio El gradiente de
concentracioacuten se generaraacute soacutelo para la especie electroactiva que se transforma en la
superficie del electrodo y su transporte de masa se verificaraacute en direccioacuten ndashx es decir
hacia el electrodo si se define x = 0 en la superficie Luego considerando la reaccioacuten de
reduccioacuten ec 21 el flujo J corresponderaacute al nuacutemero de partiacuteculas de O que cambian de
posicioacuten en direccioacuten -x con el tiempo por unidad de aacuterea y puede expresarse como
[28]
Combinando las ecs 26 27 y 28 obtenemos la expresioacuten combinada de las leyes
de Fick para una especie que estaacute reaccionando sobre un electrodo de aacuterea A
[29]
o directamente
[210]
Reemplazando en la ec 25 obtenemos una expresioacuten para la corriente (I) que
circula por la celda en la que se lleva a cabo la reaccioacuten ec 21 sobre un electrodo
uniformemente accesible de aacuterea A y cuando el transporte de masa es exclusivamente
controlado por difusioacuten
[211]
expresioacuten que indica que la corriente es directamente proporcional al gradiente de
concentracioacuten generado por efecto de la reaccioacuten electroacutedica
Introduccioacuten
20
Para un sistema en estado estacionario en el cual la velocidad de transformacioacuten de
la especie electroactiva es igual a la de transferencia de masa y suponiendo que la
reaccioacuten cumple las condiciones de rapidez y reversibilidad (Ec de Nernst) podemos
llegar a describir la relacioacuten entre la corriente circulante por la celda y el potencial al
cual se lleva adelante la reaccioacuten por
[212]
donde KR y KO son constantes que dependen del aacuterea del electrodo de trabajo y los
coeficientes de difusioacuten de las especies reducida y oxidada respectivamente e Il es la
corriente liacutemite
Se define como potencial de media onda al potencial al cual el valor de corriente es
la mitad del valor de corriente liacutemite y queda expresado por la siguiente ecuacioacuten
[213]
Tomando esta definicioacuten y operando en la ec 212 se arriba a la expresioacuten que
describe la corriente como funcioacuten del potencial de electrodo
ndash [214]
ecuacioacuten que corresponde a una funcioacuten sigmoidea por lo tanto al realizar un barrido
de potencial desde un potencial al cual no existe reaccioacuten electroacutedica hacia un potencial
al cual es posible reducir la especie electroactiva hasta alcanzar el estado estacionario la
corriente variaraacute con el potencial siguiendo la forma de una curva sigmoidea
Durante la ejecucioacuten del presente trabajo se utilizaron diversas teacutecnicas
voltamperomeacutetricas cronoamperometriacutea voltametriacutea de barrido lineal voltametriacutea
ciacuteclica y voltametriacutea de onda cuadrada Se pasa a comentar brevemente cada una de
ellas
241 Cronoampreometriacutea
En esta teacutecnica se estudia como variacutea la corriente que circula por la celda en
funcioacuten del tiempo transcurrido mientras el electrodo de trabajo es sometido a un
Introduccioacuten
21
determinado potencial Al aplicar un pulso de potencial se modifica el equilibrio de la
reaccioacuten redox ec 21 se pasa de un potencial inicial donde no ocurre reaccioacuten
electroacutedica a un potencial donde las especies pueden intercambiar electrones en la
interfaz electrodosolucioacuten favoreciendo la reaccioacuten en uno u otro sentido dependiendo
del potencial aplicado Esto da lugar a una corriente liacutemite difusional que variacutea en
funcioacuten del tiempo Para un electrodo uniformemente accesible esta corriente estaacute
descripta por la ec 211 Fijando las condiciones de contorno correspondientes al
experimento en cuestioacuten
t = 0 C0 = Cinfin (no hay reaccioacuten en el electrodo)
t ge0 lim C = Cinfin
t ge0 C0 = 0
donde C0 y Cinfin son las concentraciones de la especie electroactiva en la interfaz
electrodosolucioacuten y en el seno de la solucioacuten respectivamente Es posible entonces
resolver la ecuacioacuten diferencial de la segunda ley de Fick donde la solucioacuten viene dada
por la denominada ecuacioacuten de Cottrell
[215]
donde Id(t) es la corriente controlada por difusioacuten
En este trabajo se utilizoacute esta teacutecnica porque permite cuantificar glicerol utilizando
diferentes electrodos de trabajo seguacuten el medio especiacutefico donde se encuentre disuelto
242 Teacutecnicas voltameacutetricas
Todas las teacutecnicas voltameacutetricas tienen en comuacuten que el potencial eleacutectrico al que
se somete el electrodo de trabajo variacutea en funcioacuten del tiempo En todos los casos se
realiza un barrido lineal de potencial que va desde el potencial inicial (Ei) hasta un
potencial final (Ef) Este barrido se realiza a una velocidad constante que es el cociente
entre el salto (discreto) de potencial y el tiempo de duracioacuten de ese salto La forma en
que se realiza el barrido de potencial es lo que diferencia a una teacutecnica voltameacutetrica de
otra
Introduccioacuten
22
2421 Voltametriacutea de barrido lineal
En esta teacutecnica se realiza un barrido desde un potencial inicial (Ei) al cual no existe
proceso de transferencia de electrones en la interfaz electrodosolucioacuten y soacutelo podraacute
apreciarse corriente debida a procesos no faraacutedicos hasta un potencial final (Ef) En la
medida que el potencial aumenta alcanza un valor al cual ocurre la reaccioacuten electroacutedica
comenzando un flujo de carga debido a procesos faraacutedicos En la Fig 25 se muestra el
perfil del potencial en funcioacuten del tiempo utilizando el modo normal (en peldantildeos) para
el caso de los experimentos realizados con el instrumento utilizado en el presente
trabajo (Eco Chemie 2000)
Figura 25 Perfil de potencial en funcioacuten del tiempo Si bien el potencial es una variable continua un
potenciostato real solo puede establecer variaciones discretas de potencial de aquiacute que en lugar de
observar una ―rampa se observe una escalera
Para una reaccioacuten de reduccioacuten reversible ec 21 a medida que el potencial
aumenta se incrementaraacute la corriente siguiendo la forma de una sigmoidea (seguacuten la ec
21) Sin embargo cuando la velocidad de transporte de masa por difusioacuten de la especie
O sea menor que la velocidad de consumo por la reaccioacuten electroacutedica no seraacute posible
alcanzar el estado estacionario y la corriente llegaraacute a un maacuteximo Ip De aquiacute en maacutes la
corriente comenzaraacute a decaer con t12
tal como lo describe la ecuacioacuten de Cottrell ec
215 En la Fig 26 se muestra el perfil de corriente que se obtienen en experimentos
voltameacutetricos claacutesicos
t
Salto de potencial
Duracioacuten del salto
E
Introduccioacuten
23
Figura 26 Perfiles de corriente en funcioacuten del potencial para experimentos voltameacutetricos de barrido
lineal Liacutenea azul la velocidad de barrido es lo suficientemente baja establecieacutendose un estado
estacionario Liacuteneas verde negra y roja la velocidad de barrido es alta y se origina un pico de corriente
La corriente de pico crece proporcionalmente a la raiacutez cuadrada de la velocidad de barrido
El maacuteximo de corriente tambieacuten denominado corriente de pico se puede obtener a
partir de la ecuacioacuten de Randles-Sevcik (Bard amp Faulkner 2001)
[216]
siendo la temperatura 25 degC y donde A estaacute en cm2 D en cm
2 s
-1 C en mol cm
-3 y en
V s-1
2422 Voltametriacutea ciacuteclica
En esta teacutecnica se realiza un barrido desde un potencial inicial (Ei) a un primer
veacutertice de potencial (Ev1) y a partir de alliacute se invierte la direccioacuten de barrido hasta
llegar a un segundo veacutertice de potencial (Ev2) el cual puede coincidir con el Ei El perfil
de potencial en funcioacuten del tiempo que se obtiene utilizando el instrumento con el que
se trabajoacute y de acuerdo a lo indicado por el fabricante se esquematiza en la Fig 27
(izquierda) y el perfil de corriente en funcioacuten del potencial para una reaccioacuten reversible
se esquematiza en la Fig 27 (derecha)
Idif
IP
Introduccioacuten
24
Fig 27 Perfil de potencial en funcioacuten del tiempo (izquierda) Perfil de corriente en funcioacuten del
potencial para una reaccioacuten redox reversible (derecha)
En este trabajo se realizaron experimentos de voltametriacutea ciacuteclica para identificar la
presencia de mediadores redox que presentando reacciones electroacutedicas reversibles
permitieran la regeneracioacuten del cofactor de la enzima glicerol deshidrogenasa (GlDH)
Esta teacutecnica tambieacuten se utilizoacute para calcular las aacutereas de los electrodos de trabajo de
modo tal de normalizar la sentildeal obtenida con la superficie del electrodo utilizado
Ademaacutes se utilizoacute para cuantificar glicerol e identificar los potenciales de oxidacioacuten del
mismo
243 Teacutecnicas de pulso
Las teacutecnicas de pulso surgieron vinculadas a la polarografiacutea de corriente continua
la teacutecnica voltameacutetrica cuya particularidad es utilizar un electrodo de goteo de mercurio
Este grupo de teacutecnicas se ha ido diversificando a medida que se fueron haciendo maacutes
complejos tanto los esquemas de potenciales aplicados a los electrodos de trabajo
como las medidas de intensidades de corrientes (Bard amp Faulkner 2001)
2431 Voltamperometriacutea onda cuadrada VOC
Esta teacutecnica tiene varias ventajas entre las que se encuentran su excelente
sensibilidad (se han registrado liacutemites de deteccioacuten directa del orden de 10-8
M) la
eliminacioacuten de las corrientes de fondo y la rapidez con que se lleva a cabo el
experimento completo ya que se puede trabajar a velocidades de barrido de potencial
auacuten superiores a 1 V s-1
(Bard amp Faulkner 2001)
El perfil de potencial aplicado al electrodo de trabajo en funcioacuten del tiempo en la
VOC se presenta en la Fig 28 Consta de una onda cuadrada simeacutetrica con una
amplitud Ep superpuesta a una escalera de potencial con escalones o saltos de
potencial Es (Fig29) donde el pulso hacia adelante de la onda cuadrada coincide con
el escaloacuten de potencial de la escalera
E
I
Introduccioacuten
25
La utilizacioacuten de la teacutecnicas voltamperomeacutetricas de pulso presentan la ventaja de
permitir realizar un barrido de potencial donde la especie electroactiva se oxida
raacutepidamente produciendo una sentildeal analiacutetica No es necesario trabajar durante periacuteodos
prolongados de tiempo a los elevados potenciales donde se establece la corriente liacutemite
controlada por difusioacuten como lo requiere la teacutecnica amperomeacutetrica
Figura 28 Perfil de potencial aplicado al electrodo de trabajo en la VOC en funcioacuten del tiempo En
liacutenea cortada se indica cual es la escalera de potencial a la cual se le sobreimprime la onda cuadrada Se
indican resaltados ( ) los tiempos durante los que se realizan las lecturas de corriente En un ciclo se
realizan las lecturas de corrientes alta y baja Adaptado de Bard amp Faulkner 2001
Figura 29 a) Onda cuadrada simeacutetrica b) Perfil de potencial en funcioacuten del tiempo de una escalera
de potencial
a)
b)
E
E
E
t
Amplitud de la
onda cuadrada EP
Periacuteodo de la onda
Salto o escaloacuten
de potencial ES
Medida
alta
Medida
baja
t
Salto o escaloacuten
de potencial ES
t
Amplitud de la
onda cuadrada
EP
Periacuteodo de la onda
Introduccioacuten
26
El potensiostato registra la corriente durante la medida alta y la medida baja de un
ciclo La diferencia de estas corrientes es la corriente neta Ineta que se grafica en
funcioacuten del potencial de la escalera de potencial correspondiente a ese ciclo (liacutenea
cortada Fig 28) Para sistemas reversibles se obtiene una curva como se observa en la
Fig 210 donde se indican las corrientes de la medida alta de la medida baja y neta
que resulta en un pico de corriente La corriente de pico neta IP n observada en la VOC
es proporcional a la concentracioacuten de la especie electroactiva en el seno de la solucioacuten y
se centra alredewdor del potencial de la cupla redox
Figura 210 Voltamperograma de onda cuadrada tiacutepico para un sistema reversible la corriente neta
Ineta se obtiene por la diferencia entre la corriente registrada al finalizar el pulso I medida alta y la
corriente registrada previamente al nuevo pulso I medida baja
La frecuencia ( f ) de la onda cuadrada medida en Hz se define como
1f [217]
Siendo el periacuteodo de la onda cuadrada medido en segundos que a su vez es dos
veces el tiempo del pulso Pt por lo tanto tenemos que
P2
1
tf [218]
Luego
ft
2
1P [219]
Los valores de frecuencia pueden variar desde unos pocos Hz hasta varios miles
dependiendo de las condiciones particulares del caso La velocidad de barrido v queda
definida como el producto del salto de potencial ES por la frecuencia f
fSEv [220]
Introduccioacuten
27
Las velocidades de barrido en los experimentos de VOC se obtienen modificando la
frecuencia de la onda cuadrada ya que el salto de potencial suele ser un valor fijo
Se demostroacute que para cuplas redox controladas por difusioacuten los paraacutemetros de la
VOC maacutes adecuados son E = 50n mV y Es = 10n mV (Osteryoung y Osteryoung
1985)
Cuando se aplica un pulso de potencial en las cercaniacuteas del potencial de la cupla
redox las corrientes faradaicas aumentan significativamente conforme se oxida o se
reduce la especie electroactiva Estas corrientes decaen con el tiempo seguacuten la ecuacioacuten
de Cottrel ya expresada anteriormente como ec [215]
Si consideramos t como tP se observa que la disminucioacuten del tiempo del pulso
implica mayor corriente Luego a medida que se aumenta la frecuencia aumenta la
velocidad de barrido y disminuye el tiempo del pulso Para sistemas reversibles se
predice que la intensidad tiene una dependencia lineal con la raiacutez cuadrada de la
frecuencia (Osteryoung y Osteryoung 1985)
21 fBAnIp [221]
La eleccioacuten de la frecuencia adecuada es de suma importancia A frecuencias muy
altas aumentan significativamente las corrientes capacitivas perdiendose resolucioacuten lo
que impone un liacutemite al aumento de la frecuencia
25 Biosensores
En muchas determinaciones de analitos en muestras bioloacutegicas se necesitan pasos
previos a la evaluacioacuten propiamente dicha que permiten eliminar o enmascarar las
potenciales interferencias Sin embargo el pretratamiento de la muestra puede llevar a
una disminucioacuten de la concentracioacuten del analito ya sea por peacuterdidas en las etapas
consecutivas del anaacutelisis o por transformacioacuten del analito provocando errores por
defecto en la determinacioacuten (Lagier amp Verdini 2000) Cuando la evaluacioacuten de la
concentracioacuten del analito se utiliza con fines cliacutenicos tal resultado erroacuteneo puede
conducir a un diagnoacutestico incorrecto Es por ello que en la actualidad el desarrollo de
nuevas metodologiacuteas analiacuteticas tiende no soacutelo a acortar los tiempos de anaacutelisis
previnieacutendose asiacute las peacuterdidas por degradacioacuten del analito sino que ademaacutes procura
permitir la ejecucioacuten del anaacutelisis sin pasos separativos previos
En los uacuteltimos antildeos se ha avanzado en el desarrollo de biosensores ya que estos
dispositivos presentan ventajosas caracteriacutesticas que los convierten en herramientas
Introduccioacuten
28
prometedoras de anaacutelisis (Belluzo y col 2008) Los biosensores se pueden definir como
dispositivos analiacuteticos compuestos por dos componentes principales
1- Una superficie selectiva denominada bioreceptor o superficie bioreactiva (SBR)
generalmente de origen bioloacutegico o sinteacutetica biomimeacutetica la cual en contacto con la
muestra es capaz de interaccionar de manera especiacutefica con el analito (Vo-Dinh amp
Allain 2003) Este elemento es el que aporta la especificidad del dispositivo
2- Un transductor fiacutesico-quiacutemico encargado de producir una sentildeal que es funcioacuten
de la interaccioacuten entre el analito y la SBR (Vo-Dinh amp Allain 2003) Eacuteste es el
elemento que aporta la sensibilidad al dispositivo
Los biosensores pueden ser clasificados de acuerdo a la sentildeal fiacutesico-quiacutemica que
produce el transductor de acuerdo a
Sentildeal Biosensor
Cambio de temperatura Termomeacutetrico
Cambio en paraacutemetro eleacutectrico Electroquiacutemico
Cambio en propiedades de la luz Oacuteptico
Cambio de masa Piezoeleacutectrico Acuacutestico
(Adaptado de Vo-Dinh amp Allain 2003)
De los distintos tipos de biosensores los electroquiacutemicos han sido tradicionalmente
los maacutes desarrollados y usados debido a sus ventajas con respecto a otros biosensores
tales como la generacioacuten de una respuesta electroacutenica directa que permite una raacutepida
respuesta mayor simplicidad operativa versatilidad para la miniaturizacioacuten y bajo
costo Actualmente gracias al avance de la tecnologiacutea de los semiconductores y la
serigrafiacutea pueden ser producidos masivamente Dependiendo del paraacutemetro fiacutesico
medido por el detector los biosensores electroquiacutemicos pueden a su vez subdividirse en
conductimeacutetricos potenciomeacutetricos y amperomeacutetricos (Vo-Dinh amp Allain 2003)
251 Superficie de bioreconocimiento en biosensores
La SBR es un sistema bioloacutegico o biomimeacutetico que reacciona bioquiacutemica o
quiacutemicamente con el analito En la actualidad existe una gran diversidad de elementos
bioloacutegicos o derivados de ellos que son utilizados como SBR
Los mismos van desde moleacuteculas simples a sistemas complejos (Vo-Dinh amp Allain
2003) Asiacute la SBR puede contener antiacutegenos anticuerpos aacutecidos desoxiribonucleicos
(ADN) aacutecidos ribonueleicos (ARN) enzimas receptores de membrana tejidos
Introduccioacuten
29
microorganismos completos o compuestos sintetizados ―ad-hoc que emulan especies
bioloacutegicas como pueden ser estructuras biomimeacuteticas y poliacutemeros molecularmente
impresos (Vo-Dinh amp Allain 2003)
252 Biosensores amperomeacutetricos
De los biosensores electroquiacutemicos los amperomeacutetricos suelen presentar mayores
sensibilidades (Iost y col 2011)
En la Fig 211 se esquematiza un biosensor amperomeacutetrico El analito presente en
la muestra compleja reacciona selectivamente con la SBR lo que desencadena la sentildeal
analiacutetica en el transductor fiacutesico-quiacutemico
En este caso particular el transductor es un electrodo de trabajo que integra una
celda de tres electrodos El mismo estaacute sometido a un potencial eleacutectrico (con respecto a
un electrodo de referencia) y la sentildeal analiacutetica es la corriente eleacutectrica que circula por la
celda utilizando un contraelectrodo de gran aacuterea En estas condiciones la maacutexima
intensidad de corriente eleacutectrica que se observa estaacute limitada exclusivamente por la
reaccioacuten de oacutexido-reduccioacuten que ocurre en la superficie del electrodo de trabajo
Figura 211 El electrodo de trabajo es sometido a un potencial eleacutectrico en su superficie tiene lugar
la reaccioacuten de oacutexido-reduccioacuten Dicha reaccioacuten ocurre o no o bien transcurre a velocidades diferentes en
presencia o ausencia del analito de intereacutes
253 Biosensores de uso cliacutenico
En el caso de muestras para el diagnoacutestico cliacutenico de infecciones el analito a
determinar puede ser alguna de las moleacuteculas generadas por el individuo infectado
como respuesta a la presencia del agente infeccioso por ej los anticuerpos (Acs)
especiacuteficos o el agente infeccioso iacutentegro o partes del mismo En muchos casos la sola
presencia de Acs especiacuteficos es por siacute misma indicativa de infeccioacuten Hay casos en que
Introduccioacuten
30
la presencia de Acs no es per-seacute indicativa de infeccioacuten riesgosa Dos ejemplos de esta
situacioacuten son el de la toxoplasmosis y la tuberculosis
En el caso de la toxoplasmosis la deteccioacuten de Acs anti-T gondii es soacutelo de
trascendental importancia en embarazadas porque si la infeccioacuten ha sido adquirida
durante el embarazo el feto estaacute en riesgo de contagiarse y puede padecer lesiones
severas (Dunn y col 1999 Montoya amp Liesenfeld 2004) Por el contrario si se trata
de infeccioacuten croacutenica no es necesario exponer a la embarazada (y al feto) a medicacioacuten
innecesaria evitaacutendose con ello los riesgos que devienen del uso de los faacutermacos
especiacuteficos utilizados durante el tratamiento de la infeccioacuten (Freij amp Sever 1999)
Debido a la incertidumbre que acompantildea la deteccioacuten de los anticuerpos hasta hoy
utilizados con este fin se ha propuesto realizar pruebas utilizando antiacutegenos
recombinantes del paraacutesito Se ha evaluado el desempentildeo de antiacutegenos recombinantes
sintetizados por teacutecnicas de biologiacutea molecular en forma individual o mezclados para
evaluar la avidez de Acs IgG (Beghetto y col 2003) Se observoacute que utilizando el
fragmento del antiacutegeno MIC3 en este ensayo los iacutendices de avidez permitieron
determinar la antiguumledad de la infeccioacuten con mayor grado de certeza que empleando
homogenado total de paraacutesito resultando MIC3 un buen marcador para el diagnoacutestico
de infecciones agudas (Beghetto y col 2003) La proteiacutena recombinante P35 tambieacuten
fue propuesta como marcador seroloacutegico para diferenciar infeccioacuten aguda de croacutenica ya
que evidencioacute sensibilidades del 853 para sueros agudos y una especificidad del 98
respecto de sueros croacutenicos (Parmley y col 2000) No obstante y a pesar de haberse
descrito moleacuteculas para el diagnoacutestico de toxoplasmosis aguda no existe un acuerdo
sobre su efectividad por lo que se requiere de la evaluacioacuten de nuevos antiacutegenos para
este fin En general el uso de una sola moleacutecula recombinante no brinda suficiente
sensibilidad habieacutendose demostrado que el empleo de varios antiacutegenos recombinantes
la mejora (Pinon y col 2003) Se ha observado tambieacuten que una mezcla de moleacuteculas
no produce los mismos resultados que cuando se utilizan en forma separada (Silveira y
col 2001) Se ha postulado que esta diferencia se debe a las distintas caracteriacutesticas
fisicoquiacutemicas entre las moleacuteculas de una mezcla que impide la inmovilizacioacuten
homogeacutenea en las superficies de captura utilizadas en los inmunoensayos Por lo tanto
resulta muy factible que un ensayo que utilice una combinacioacuten o fusioacuten en una sola
moleacutecula de estos antiacutegenos recombinantes marcadores de infeccioacuten reciente pueda
mejorar el diagnoacutestico diferencial tal como ha sido demostrado para el diagnoacutestico de
otras infecciones (Camussone y col 2009)
Introduccioacuten
31
En el caso de la tuberculosis la mayoriacutea de los individuos de la poblacioacuten han
recibido la vacunacioacuten reglamentaria por inoculacioacuten de una cepa de micobacterias
inofensivas generando Acs anti-Mycobacterium tuberculosis (M tuberculosis) Por
ello estos Acs suelen estar presentes en casi toda la poblacioacuten De aquiacute que la deteccioacuten
de Acs anti-M tuberculosis no demuestra infeccioacuten activa de riesgo Por tal motivo el
indicador por excelencia de infeccioacuten activa es la evidenciacioacuten del patoacutegeno en la
muestra No obstante las muestras suelen poseer una extremadamente baja cantidad de
M tuberculosis lo que dificulta su deteccioacuten directa Por ello es preciso utilizar alguacuten
paso amplificador del analito a censar Dado el largo tiempo de replicacioacuten del
microorganismo los cultivos realizados para su replicacioacuten insumen periacuteodos
prolongados Siguiendo los trabajos de Park y col y McNerney y col (Park y col
2003 McNerney y col 2004) se formuloacute la siguiente hipoacutetesis de trabajo Sistemas
enzimaacuteticos presentes en M smegmatis permitiriacutean metabolizar sustratos electroactivos
a distintas velocidades de reaccioacuten dependiendo de la integridad del microorganismo
Siendo este el caso seriacutea posible distinguir entre cultivos de M smegmatis que han sido
lisados por el fago especiacutefico D29 de aquellos cultivos en que dichas micobacterias
estaacuten iacutentegras Si soacutelo existiera lisis cuando la muestra ensayada contiene organismos
filogeneacuteticamente emparentados como M tuberculosis que permitiesen la
amplificacioacuten selectiva del fago D29 previamente a la infeccioacuten del cultivo testigo de
M smegmatis la evaluacioacuten electroquiacutemica del sustrato metabolizable por el
microorganismo deberiacutea permitir evidenciar presencia o ausencia de M tuberculosis La
seleccioacuten del fago D29 se justifica porque es capaz de infectar micobacterias de
crecimiento raacutepido como M smegmatis y las de crecimiento lento como M tuberculosis
(Park y col 2003)
El glicerol es corrientemente utilizado como principal fuente de carbono en cultivos
de micobacterias siendo degradado eficientemente por sus sistemas enzimaacuteticos que
utilizan mecanismos redox En este trabajo nos hemos planteado detectar este
polialcohol como analito de intereacutes ya que su consumo estaraacute preferencialmente
vinculado a la presencia de micobacterias aptas para tal degradacioacuten Por este motivo
proponemos utilizar un bioelectrodo con una SBR que contenga una enzima cuyo
sustrato sea glicerol
Introduccioacuten
32
2531 Biosensores para evaluacioacuten de infeccioacuten toxoplaacutesmica
En el presente trabajo se propuso un biosensor para evaluacioacuten de infeccioacuten
toxoplaacutesmica utilizando un electrodo de oro policristalino macizo sobre el cual se
adsorbioacute un antiacutegeno recombinante y se siguioacute un esquema ELISA del tipo indirecto
con deteccioacuten de IgGh En la Fig 212 se muestra el esquema que se siguioacute para este
inmunoensayo
Proteiacutena recombinante IgG a-IgGh conjugada a HRP
Bloqueante IgG humana ferrocenometanol
Figura 212 Sobre la superficie del electrodo se fija la proteiacutena recombinante que capturaraacute los
anticuerpos especiacuteficos si estaacuten presentes en el suero El revelado se realiza con un segundo anticuerpo
especiacutefico para IgG humana marcado con HRP que en presencia de H2O2 oxida el mediador FcMe que
se reduce sobre la superficie del electrodo generando la sentildeal analiacutetica
254 Biosensores para cuantificacioacuten de glicerol
La determinacioacuten de glicerol ha ido ganando importancia en las uacuteltimas deacutecadas
debido al uso del mismo en varias industrias como la farmaceacuteutica automotriz
alimenticia y textil entre otros El compuesto es un producto importante de la
fermentacioacuten en la mayoriacutea de las bebidas alcohoacutelicas y su concentracioacuten es un
paraacutemetro uacutetil para el seguimiento del proceso fermentativo (Goriushkina y col 2010)
Tambieacuten es un componente no deseable del biodiesel y su concentracioacuten es un indicador
de la calidad del combustible (Monteiro y col 2008)
Se han desarrollado numerosas metodologiacuteas para llevar adelante la cuantificacioacuten
del glicerol que incluyen teacutecnicas espectrofotomeacutetricas yo espectrofluoromeacutetricas
(Bondioli amp Bella 2005 Silva amp Rocha 2010 Lima y col 2012) incluidos los basados
Introduccioacuten
33
en enzimas (Kronka y col 2001 Li y col 2001) los electroquiacutemicos (Tehrani amp
Ghani 2012 Gamella y col 2008 Wu amp Cheng 2005) y los cromatograacuteficos estos
uacuteltimos han sido oficialmente recomendado por la AOAC como los meacutetodos 96809
97210 (AOAC 2005) Sin embargo a pesar de que estos meacutetodos permiten determinar
con eficacia de glicerol en presencia de muchos compuestos que interfieren esta teacutecnica
se considera que es ecoloacutegicamente desfavorable debido a la utilizacioacuten de solventes
nocivos para el medio ambiente e intriacutensecamente onerosa debido a los altos costos de
los mismos (Gamella y col 2008)
Por un lado las propuestas espectrofotomeacutetricas que utilizan enzimas se basan en el
uso de sistemas o bien de una o varias enzimas relativamente caras que se eliminan
despueacutes de que se han utilizado en una uacutenica determinacioacuten En estos casos a menudo
son consumidos las enzimas yo cofactores caros como nicotinamida adenina
dinucleoacutetido (NAD+) o adenosina 5-trifosfato (ATP) a menudo son consumidos
(Kronka y col 2001 Li y col 2001 Wu amp Cheng 2005) Como un ejemplo la
propuesta de Li para determinar glicerol en matrices complejas se basa en el uso de tres
enzimas a saber glicerol quinasa (GK) piruvato quinasa (PK) y lactato
deshidrogenasa (LDH) ademaacutes de utilizar ATP y NAD+ (Li y col 2001) Este meacutetodo
produce buenos resultados en teacuterminos de sensibilidad y especificidad pero consume 1
U de GK 15 U de PK 22 U de LDH 2x10-6
moles de ATP y 33x10-7
moles de
NAD+ por determinacioacuten Por lo tanto el costo derivado por anaacutelisis es considerado
caro sobre todo cuando se debe analizar un elevado nuacutemero de muestras
Por otro lado se han propuesto herramientas versaacutetiles notables para cuantificar
glicerol como ser la basada en tecnologiacutea de biosensores en particular los basados en
meacutetodos amperomeacutetricos (Ghica amp Brett 2006 Gamella y col 2008) De hecho los
biosensores amperomeacutetricos proporcionan suficiente sensibilidad y selectividad para
permitir la determinacioacuten del analito junto con una velocidad apropiada para completar
el anaacutelisis En efecto los biosensores amperomeacutetricos que utilizan enzimas como
componente bioloacutegico para el reconocimiento dan lugar a una selectividad significativa
debido a su capacidad de reaccionar especiacuteficamente con su sustrato Este uacuteltimo es a
menudo el analito de intereacutes por lo que puede ser cuantificado de manera eficiente auacuten
ante la presencia de otros componentes similares estructuralmente que pueden hallarse
en la muestra (Belluzo y col 2008) Los dispositivos construidos con enzimas a
menudo pueden ser reutilizados y por lo tanto el costo por determinacioacuten puede ser
Introduccioacuten
34
reducido significativamente en comparacioacuten con los meacutetodos espectrofotomeacutetricos
mencionados anteriormente
Se han desarrollado varios biosensores utilizando enzimas que tienen como sustrato
al glicerol (Gamella y col 2008) En los disentildeos utilizados se utilizan diversas enzimas
que reaccionan especiacuteficamente con el glicerol en un primer paso y se censa un
producto de esta reaccioacuten En otros disentildeos se encuentran involucradas maacutes de una
enzima donde la segunda o tercer enzima utiliza como sustrato algunos de los
productos de la primera o segunda reaccioacuten y finalmente se censa un producto de la
uacuteltima reaccioacuten enzimaacutetica Algunos disentildeos que aparecieron en literatura al momento
de iniciar este trabajo de tesis fueron detallados por Pingarroacuten y colaboradores (Gamella
y col 2008) y se encuentran resumidos en la Tabla 23 al final de este capiacutetulo y se
corresponden a los esquemas evaluados al momento de iniciar este trabajo de tesis
Todos los disentildeos descriptos al momento presentan la desventaja de ser onerosos
tanto por el disentildeo en siacute como por el costo operativo devenido del consumo de elevadas
cantidades de reactivos caros
Sobre la base del modelo propuesto por Tuntildeoacuten-Blanco y colaboradores (Aacutelvarez-
Gonzaacutelez y col 2000) se comenzaron los ensayos para construir un bioelectrodo
selectivo para glicerol La propuesta contempla en primer lugar disminuir la cantidad
de enzima Glicerol deshidrogenasa En segundo lugar proponemos utilizar la coenzima
NAD(H) en forma soluble e introducir un mediador electroquiacutemico distinto al utilizado
previamente En el trabajo citado se generaba una cupla cataliacutetica por oxidacioacuten
electroacutedica del NAD+ presente en un electrodo de trabajo de pasta de C modificada En
nuestro caso el mediador soluble permite reoxidar la coenzima para cerrar el ciclo
cataliacutetico siguiendo el esquema de la Fig 213
Figura 213 Esquema de reacciones que ocurren en la celda DHA 13 dihidroxiacetona GlDH
gliceroldeshidrogenasa NAD(H) nicotinadenina dinucleoacutetido
glicerol
DHA
GlDHox
GlDHred NAD+
NADH Mediador ox
Mediador red
e- Electrodo
Introduccioacuten
35
Tabla 23 Biosensores selectivos para gicerol Las filas 1 a 10 son un extracto parcial del trabajo de
Gamella y col 2008 En las filas 11 y 12 se incluyen los disentildeos propuestos por Šefčovičovaacute y col
2008 y Goriushkina y col 2010
Electrodo Enzima Mediador Potencial
1 Pt GKGPOx - + 650 mV vs AgAgCl
2 Al GlDH Fe(CN)6 + 400mV vs ECS
3 Barras de grafito
espectroscoacutepico GlDH Complejo de Os + 200 mV vs AgAgCl
4 Serigraacutefico (SPE) pGlyDH N-(4-hidroxibenzilideno)-
4-ferrocenilanilina + 400 mV vs AgAgCl
5 Carboacuten Viacutetreo a) GlDHDP
b) GKGPOxHRP
a)Fe(CN)63-
b)Fe(CN)64-
a) + 350 mV vs AgAgCl
b) - 300 mV vs AgAgCl
6 SPE modificado con
ZrO2 y azul meldola GlDH Azul meldola + 100 mV vs AgAgCl
7 SPE modificado azul
de Prusia
GlDH Tt NADH
Ox Azul de Prusia - 50 mV vs AgAgCl
8 Pasta de carbono GlDH Producto de la electro-
oxidacioacuten del NAD+ + 150 mV vs AgAgCl
9 Flim de carbono a) GPOx
b)GKGPOx Poli (rojo neutro) - 350 mV vs ECS
10 Au a)GlDHDP
b) GKGPOxHRP Tetra thiafulvaleno
a) + 150 mV vs AgAgCl
b) 0 mV vs AgAgCl
11 Carboacuten Viacutetreo GlDHDP Fe(CN)63- + 350 mV vs AgAgCl
12 Platino serigraacutefico Gox - + 300 mV vs electrodo
intriacutenseco
Tabla 23 Continuacioacuten
Muestra
Rango dinaacutemico
Lineal (M) Sensibilidad
(mA M-1
cm-2
)
Liacutemite de
deteccioacuten (M) Estabilidad
Desde Hasta
1 Mosto de uva 2 10-6
10-3 - 5 10
-7 Hasta 1 mes
2 Jugo de uva 10-6
2 10-3
- 10-6 -
3 Vino 1 10-6
2 10-4
32 1 10-6
80 actividad inicial luego
de 20 horas
4 Vino - - - - actividad enzimaacutetica decae
rapidamente
5 Fermento
anaeroacutebico
1 10-5
1 10-5
10-3
1 10-3
a) 620
b) 142 -
sentildeal inicial luego de
uso continuo a) 60 a 90
hs b) 70 16 hs
6 Fermento de
jugo de uva 10
-51 10
-4 - 10
-6 -
7 - 10-5
1 10-3
- 10-6 -
8 Jarabe 997 10-7
10-4
162 cm2 43 10-7
80 actividad inicial luego
de 3 diacuteas
9 Vino 10-5
147 10-4
a) 101
b) 079
a) 4 10-6
b) 15 10-5
sentildeal inicial luego de
uso continuo a) 87 a 8
diacuteas b) 62 8 diacuteas
10 Vino 10
-6
4 10-7
2 10-5
1 10-5
a) 207
b) 250
a) 4 10-7
b) 31
sentildeal inicial luego de
uso continuo a) 87 a 51
diacuteas b) 46 8 diacuteas
11 Fermento - - - 11 10-6
-
12 Vino 10
-5
2 10-6
25 10-2
64 10-3
-
10-5
2 10-6 -
Objetivos
Objetivos
37
3 Objetivos
31 Objetivos generales
Desarrollar metodologiacuteas electroquiacutemicas que permitan identificar analitos de
intereacutes tanto para el diagnoacutestico cliacutenico como para la industria de combustibles
alternativos
32 Objetivos particulares
a) Obtener bioelectrodos que exhiban una corriente cataliacutetica diferencial al efectuar
inmunoensayos con muestras confirmadas positivas o negativas para infeccioacuten aguda
por T gondii
b) Desarrollar un meacutetodo electroquiacutemico que permita la cuantificacioacuten de glicerol
en medio acuoso para determinarlo por ejemplo luego de su extraccioacuten en
combustibles alternativos
c) Evidenciar electroquiacutemicamente la ocurrencia de lisis de M smegmatis por fagos
D29 indicadores de la presencia de micobacterias patoacutegenas emparentadas
provenientes de individuos padeciendo infeccioacuten tuberculosa
Materiales y Meacutetodos
Materiales y Meacutetodos
39
4 Materiales y meacutetodos
41 Reactivos y medios de cultivos
411 Reactivos
Todos los reactivos utilizados fueron de grado analiacutetico salvo que se indique lo
contrario Los aacutecidos aceacutetico sulfuacuterico niacutetrico clorhiacutedrico y percloacuterico las sales KCl
Na2HPO4 KH2PO4 NiSO4 CuSO45H2O y la sal disoacutedica del aacutecido etilen diamino tetra
aceacutetico (EDTA) dimetilsulfoacutexido (DMSO) imidazol tris base las enzimas peroxidasa
de raacutebano picante EC 11117 (tipo VI) (HRP) y glicerol deshidrogenasa de
cellulomonas EC 1116 (GlDH) acrilamida (adecuada para electroforesis) NNprime-(12-
dihidroxietilen) bisacrylamide (97) ditiotreitol (DTT) Coomasie blue G-250 alcohol
isopropiacutelico β-mercaptoetanol 33-diaminobenzidina tetrahidrocloruro (DAB)
nicotina adenina dinucleoacutetico (NAD) los desoxinucleoacutetidos trifosfato dATP dGTP
dCTP y dTTP reactivo de Folin-Ciocalteu glicina albuacutemina seacuterica bovina (ASB)
peptona de carne extracto de levadura fueron suministrados por Sigma-Aldrich El
polvo de carbono viacutetreo (esfeacuterico diaacutemetro de partiacutecula entre 2 y 12 microm pureza
9999+) fue suministrado por Aldrich El polvo de carbono grafito (pureza gt 99) fue
provisto por Fisher Scientific Dimetilformamida (DMF) 1 1rsquo-carbonil-diimidazol las
sales tartrato de sodio y potasio MgCl2 CaCl2 NaCl Na2CO3 NaHCO3 K2CO3
KHCO3 K3Fe(CN)6 K4Fe(CN)6 (NH4)2SO4 (NH4)2S2O8 (gt98) dodecil sulfato de
sodio (Farmacopea Unioacuten Europea) (SDS) NaOH KOH NNNprimeNprime-
tetrametiletilendiamino (Temed) azul de bromofenol (Farmacopea Unioacuten Europea)
xilencianol (para electroforesis) etanol absoluto fueron suministrados por Merck El
H2O2 y el glicerol fueron provistos por Cicareli El isopropil-β-D-1-
tiogalactopiranoacutesido (IPTG) fue suministrado por Promega La enzima ADN polimerasa
de Thermus aquaticus EC 2777 (polimerasa Taq) y los oligonucleoacutetidos fueron
suministrados por InvitrogenTM
Argentina La enzima peroxidasa de raacutebano picante
ligada a estreptavidina (HRP-EAV) fue provista por Abcam El ester biotin n-
hidroxisuccinimida fue provisto por Thermo Scientific La ampicilina (Farmacopea
Argentina) fue provista por laboratorios Klonal La aluacutemina para pulido (tamantildeo de
partiacutecula 03 microm) fue provista por Metrohm El anticuerpo de cabra anti IgG humana
ligado a HRP fue provisto por Zymed El Tween-20 fue provisto por Anhedra
No se detallan los reactivos contenidos en los equipos comerciales utilizados
disponibles en las paacuteginas web de los respectivos proveedores
Materiales y Meacutetodos
40
412 Medios de cultivos
Para el crecimiento de cepas de Escherichia coli (E coli) se utilizoacute el medio de
cultivo Luria-Bertani (LB) compuesto por 10 g L-1
peptona de carne 5 g L-1
extracto de
levadura y 10 g L-1
NaCl En los casos requeridos se suplementoacute este medio con el
antibioacutetico ampicilina (100 g mL-1
) Para la preparacioacuten de medios soacutelidos se agregoacute
agar en concentracioacuten final de 15 g L-1
Para el crecimiento de ceacutelulas de M smegmatis se utilizoacute el medio de cultivo
Middlebrook 7H9 provisto en forma anhidra por Difco y fue suplementado con NaCl
CaCl2 yo glicerol en concentraciones variables de acuerdo a los requerimientos del
ensayo analiacutetico ulterior la composicioacuten del medio provisto por Difco se detalla en la
siguiente tabla
Tabla 41 Caldo Middlebrook 7H9 (Difco) composicioacuten en g L-1
del medio liacutequido recieacuten preparado
(NH4)2SO4 050
Na2(HPO4) 250
K(H2PO4) 100
Citrato de sodio 010
MgSO4 005
CaCl2 0005
ZnSO4 0001
CuSO4 0001
Citrato feacuterrico amoacutenico 004
Aacutecido l-glutaacutemico 050
Piridoxina 0001
Biotina 00005
42 Cepas bacterianas
Las cepas bacterianas utilizadas y sus caracteriacutesticas relevantes se detallan en la
siguiente tabla
Materiales y Meacutetodos
41
Tabla 42 Cepas bacterianas utilizadas
Cepa Caracteriacutesticas
Escherichia
coli (E coli)
BL21 (DE3)
E F- ompT hsdS (rB-mB-) [lon] (DE3 immP21 int- lacI+
lacUV5lacZT7 ARN polimerasa) Contiene el gen de la T7
ARN polimerasa bajo el control del promotor lacUV5 El gen de
la ARN polimerasa estaacute integrado en el cromosoma bacteriano
desde (DE3) y su expresioacuten se induce por IPTG (Stratagene)
M smegmatis
mc2155
Mycobacterium smegmatis MC2155 es un organismo
aerobio quimioorganotrofo en forma de barra no moacutevil
patoacutegeno de humanos Esta bacteria fue inicialmente aislada de
esmegma humano Esta cepa es un mutante de M smegmatis Es
faacutecilmente transformable con vectores plasmiacutedicos usando
electroporacioacuten
43 Bacterioacutefagos
Se utilizoacute el bacterioacutefago D29 que infecta especiacuteficamente micobacterias Los
trabajos especiacuteficos de infeccioacuten de micobacterias fueron realizados en el Departamento
de Microbiologiacutea de la Facultad de Ciencias Meacutedicas (UNR) bajo la supervisioacuten del Dr
Ricardo Morbidoni
44 Plaacutesmidos
El plaacutesmido utilizado y sus caracteriacutesticas relevantes se detallan en la siguiente tabla
Tabla 43 Plaacutesmido utilizado
Plaacutesmido Caracteriacutesticas
pET32a
5900 pares de bases resistencia ampicilina promotor T7lac Produce
proteiacutenas fusionadas a 6 histidinas y a la proteiacutena tiorredoxina (TRX)
de 204 kDa lo que permite su purificacioacuten en columna de NTA-Ni2+
Este vector fue utilizado como sistema de expresioacuten en la cepa BL21
(DE3) de E coli
45 Reaccioacuten en cadena de la polimerasa
Las reacciones se llevaron a cabo en un volumen total de 25 μL conteniendo
solucioacuten de amplificacioacuten comercial suplementada con MgCl2 para alcanzar una
concentracioacuten final de MgCl2 25 mM y 02 mM de cada uno de los desoxinucleoacutetidos
trifosfato dATP dGTP dCTP y dTTP 20 pmoles de cebador directo y reverso y 1 UI
de polimerasa Taq Se empleoacute un termociclador BOECO (Germany) y se inicioacute la
reaccioacuten con un paso de desnaturalizacioacuten a 95 ordmC durante 5 min La amplificacioacuten de
los fragmentos se realizoacute en 30 ciclos de a) desnaturalizacioacuten 1 min a 95degC b)
Materiales y Meacutetodos
42
hibridizacioacuten 1 min a la temperatura oacuteptima para cada par de cebadores c) extensioacuten
72degC 15 min por cada Kpb amplificado finalmente se realizoacute un paso de extensioacuten
durante 10 min
Para la reaccioacuten de amplificacioacuten de la secuencia codificante de la proteiacutena se
disentildearon oligonucleoacutetidos cebadores especiacuteficos (ver maacutes adelante) En el disentildeo de los
mismos se introdujeron sitios de restriccioacuten apropiados para el posterior clonado del
fragmento en vectores de clonado o expresioacuten
Como molde se utilizoacute aproximadamente 003 g de ADN plasmiacutedico
Como cebadores se utilizaron los oligonucleoacutetidos (provistos por Invitrogen)
P22C directo 5- GGATCCACCACCGAGACGCCAGC -3
P22C reverso 5- GAATTCTTGCCCGTGAGAGACACAG -3
46 Electroforesis de ADN en geles de agarosa
Los fragmentos de ADN (ADN plasmiacutedico productos de PCR) fueron separados
mediante electroforesis en geles de agarosa de distinta concentracioacuten (08 a 2) seguacuten
el tamantildeo de los fragmentos a separar Se utilizoacute el sistema de tipo submarino La
solucioacuten reguladora tris-aceacutetico-EDTA (TAE) 05 X se utilizoacute como solucioacuten de
electroforesis y para la preparacioacuten de geles A estos uacuteltimos se les agregoacute el agente
intercalante bromuro de etidio en una concentracioacuten final de 03 g mL-1
antes de su
gelificacioacuten Previo a la siembra las muestras se mezclaron con solucioacuten de siembra
compuesta por 0025 (mv) azul de bromofenol 0025 (mv) xilencianol y 30
(vv) glicerol en una proporcioacuten 51 en volumen de muestra solucioacuten de siembra
Como marcadores de peso molecular se utilizaron Ladder 100 pb PB-L (Productos Bio-
Loacutegicos) La corrida electroforeacutetica se realizoacute a un potencial constante de 100 V con
una fuente BIO-RAD modelo 3000xi Luego de la electroforesis el ADN se visualizoacute
por fluorescencia en un transiluminador de luz ultravioleta Fotodyne y las imaacutegenes se
digitalizaron con una caacutemara FUJIFILM modelo FinePix A120
47 Minipreparacioacuten de ADN plasmiacutedico
El ADN plasmiacutedico se preparoacute a partir de cultivos celulares de E coli conteniendo
los plaacutesmidos de intereacutes seguacuten el meacutetodo de lisis alcalina o bien utilizando los equipos
comerciales ―WIZARDreg
PLUS SV Minipreps DNA purification system (Promega) El
resultado de la preparacioacuten se evaluoacute realizando una electroforesis en gel de agarosa de
una aliacutecuota de la misma
Materiales y Meacutetodos
43
48 Purificacioacuten del producto de amplificacioacuten
La purificacioacuten de aacutecidos nucleicos a partir de geles de agarosa se realizoacute utilizando
el equipo comercial ―GFXTM Gel Band Purification Kit (Amersham GE Healthcare)
seguacuten las especificaciones del fabricante El resultado de la purificacioacuten se evaluoacute
realizando una electroforesis en gel de agarosa de una aliacutecuota de la elusioacuten obtenida
49 Prueba de expresioacuten de proteiacutenas de fusioacuten a TRX y a ldquocolardquo de histidinas
Se cultivaron clones de las cepas de E coli BL21 (DE3) transformadas con el
vector pET32a (con el inserto correspondiente) haciendo distintas diluciones 175
1100 y 1200 de un cultivo saturado en 2 mL de LB fresco (suplementado con
ampicilina a 100 μg mL-1
) y cultivando a 37 ordmC con agitacioacuten vigorosa (180 rpm) hasta
una densidad oacuteptica a 630 nm (DO630nm) aproximada de 05 unidades Se indujo la
expresioacuten de la proteiacutena recombinante con IPTG (concentracioacuten final 1 o 01 mM)
durante 3 4 o 12 hs a 37 ordmC y con agitacioacuten vigorosa Posteriormente se cosecharon las
ceacutelulas centrifugando a 3000 rpm durante 10 min Finalmente se lisaron las ceacutelulas con
pulsos de ultrasonido utilizando un sonicador analoacutegico Sonifierreg S450A y se
separaron las fracciones soluble e insoluble del extracto por centrifugacioacuten a 18000 g
durante 20 min
410 Expresioacuten y purificacioacuten preparativas de antiacutegenos recombinantes
Se cultivoacute la cepa de E coli transformada con el vector pET32a con el inserto
correspondiente haciendo una dilucioacuten 1100 de un cultivo saturado en dos porciones
de 150 mL de LB suplementado con ampicilina (100 microg mL-1
) y cultivando a 37ordm C
hasta una DO630nm 05 Se agregoacute IPTG hasta concentracioacuten final oacuteptima 1 mM para
el Ang P35B o 01 mM para el Ang P22C y se indujo el tiempo oacuteptimo 4 h para el Ang
P35B o 12 h para el Ang P22C a 37ordm De esta manera se obtuvo la proteiacutena de fusioacuten
en forma soluble Se cosecharon las ceacutelulas por centrifugacioacuten y se lavaron con solucioacuten
tampoacuten fosfato (Na2HPO4 10 mM NaCl 05 M pH 8) Luego se las resuspendioacute en 20
mL de solucioacuten de lisis (Na2HPO4 50 mM NaCl 05 M pH 8) Las ceacutelulas se lisaron
por sonicado aplicando pulsos de 30 s de duracioacuten hasta clarificacioacuten del medio en
hielo Se separoacute la fraccioacuten soluble de la insoluble por centrifugacioacuten a 18000 g y 4 ordmC
La fraccioacuten soluble se congeloacute durante 24 h a -20 ordmC y se descongeloacute en hielo luego se
centrifugoacute nuevamente a 18000 g y 4 ordmC Este paso se repitioacute dos veces
Posteriormente se realizoacute una separacioacuten cromatograacutefica de afinidad con una columna
Materiales y Meacutetodos
44
de 5 mL empacada manualmente con resina Ni Sepharosetrade High Performance en
condiciones nativas elusioacuten con imidazol 250 mM seguacuten las especificaciones del
proveedor (GE Healthcare) En los sucesivos pasos se recogieron aliacutecuotas y se verificoacute
la purificacioacuten visualizando por electroforesis en gel desnaturalizante de poliacrilamida
(SDS-PAGE)
411 Separacioacuten de proteiacutenas mediante SDS-PAGE
Se utilizaron geles de 12 y de 15 de acrilamidabisacrilamida 291 Las
muestras se sembraron en geles desnaturalizantes mezclaacutendolas 21 con solucioacuten de
siembra 2 X compuesta por Tris-HCl pH 68 125 mM SDS 4 β-mercapto etanol 5
vv(alternativamente se usoacute DTT 200 mM) glicerol 20 y azul de bromofenol 02
Las corridas electroforeacuteticas se hicieron en solucioacuten Tris-glicina-SDS (Tris base 302
g L-1
glicina 144 g L-l SDS 1 g L
-1) Los geles fueron tentildeidos con azul brillante de
Coomasie G-250
412 Cuantificacioacuten de proteiacutenas
Se utilizoacute el meacutetodo propuesto por Lowry (Lowry y col1951) seguacuten el siguiente
protocolo un volumen de muestra cuya concentracioacuten de proteiacutena se desea determinar y
uno o dos testigos de albuacutemina (conteniendo tiacutepicamente de 5 a 25 microg de proteiacutenas
totales) se disolvieron en 040 mL de agua destilada y se mezclaron con 150 mL de
reactivo C preparado inmediatamente antes de usar El reactivo C se preparoacute mezclando
una parte de tartrato de sodio y potasio 2 mv una parte de CuSO4 1 mv y 100
partes de solucioacuten tampoacuten carbonato 2 mv e hidroacutexido de sodio 01 N Se dejoacute
reaccionar la mezcla durante 15 min a temperatura ambiente y luego se adicionoacute 0150
mL de reactivo de Folin-Ciocalteu diluido 13 con agua destilada inmediatamente antes
de usar Se dejoacute reposar durante 45 min y se leyoacute la absorbancia a 660 nm
413 Reaccioacuten de conjugacioacuten biotina-antiacutegeno
Previo a la reaccioacuten de conjugacioacuten el antiacutegeno P35B purificado se llevoacute a una
concentracioacuten final de 2 mg mL-1
(como miacutenimo) en solucioacuten tampoacuten carbonato de
sodio 01 M (pH 85) usando las membranas de poro controlado Amicon Ultra-4
(Millipore Co) seguacuten las instrucciones del proveedor Se disolvieron 20 mg del eacutester
biotinil-n-hidroxisuccinimida (BNHS) en 590 microL de DMSO e inmediatamente despueacutes
se mezclaron 80 microL de esta solucioacuten con 800 microL de solucioacuten de Ang
Materiales y Meacutetodos
45
Al antiacutegeno P22C purificado se lo llevoacute a una concentracioacuten final de 20 mg mL-1
(como miacutenimo) en solucioacuten tampoacuten carbonato de sodio 01 M (pH 85) usando las
membranas de poro controlado mencionadas Se disolvieron 25 mg BNHS en 590 microL
de DMSO e inmediatamente despueacutes se mezclaron 120 microL de esta solucioacuten con 100
mL de solucioacuten de Ang Se incuboacute 4 h a temperatura ambiente con agitacioacuten suave Se
eliminaron los restos de eacutester hidrolizado y se cambioacute la solucioacuten tampoacuten carbonato por
PBS 1 X pH 74 haciendo lavados reiterados y reteniendo el Ang en las membranas de
poro controlado
414 Revelado cromogeacutenico de la reaccioacuten de conjugacioacuten
El antiacutegeno marcado con biotina respectivo fue retenido en membrana de
nitrocelulosa sembrando 1 L del mismo sobre la membrana Se procedioacute a bloquear
los sitios activos de la membrana con leche descremada disuelta al 5 mv en PBS pH
74 durante 1 h Se realizaron 3 lavados con PBS pH 74 de 1 min cada uno Se incuboacute
la membrana con la enzima peroxidasa de raacutebano picante ligada a streptavidina (HRP-
EAV) disuelta en PBS pH 74-leche descremada al 1 mv Posteriormente se
realizaron 3 lavados con PBS pH 74 de 1 min cada uno Finalmente se reveloacute la
presencia de la enzima HRP con el reactivo de color recieacuten preparado seguacuten 5 mg de
33-diaminobenzidina tetrahidrocloruro (DAB) se disolvieron en 500 microL de DMSO y se
llevoacute a 100 mL de volumen final con PBS pH 74 A esta solucioacuten se le agregaron 100
microL de H2O2 10 voluacutemenes inmediatamente previo a su utilizacioacuten
415 Mediciones espectrofotomeacutetricas
Para las medidas de absorbancia (Abs) a longitudes de onda especiacuteficas o la
realizacioacuten de espectros de absorcioacuten ultravioleta-visible se utilizoacute el espectrofotoacutemetro
Beckman DU 640 Como celda se utilizoacute una cubeta de cuarzo de 1 cm de paso oacuteptico
416 Ensayos de inmunoabsorcioacuten ligados a enzima con deteccioacuten fotomeacutetrica
Como soporte soacutelido se utilizaron microplacas Microlon 600 high binding Greiner
Bio One provistas por GBO Argentina Para las lecturas de Abs se utilizoacute un lector de
microplacas PowerWave XS (BioTek) o alternativamente se utilizoacute el lector ELx808
Absorbance Microplate Reader (BioTek) Los ensayos preliminares se detallan en la
secioacuten 6 Experimentos Auxiliares
Materiales y Meacutetodos
46
4161 Esquema A
Sobre las microplacas de ELISA Microlon 600 high binding Greiner Bio One se
depositaron 100 microL de anticuerpo de captura (IgG de conejo anti IgM humana) provisto
por Dakko diluido 11000 en PBS pH 74 Se incubaron 48 h a 37 degC Luego se
realizaron 3 lavados con PBS Tween 20 al 005 (PBS-T) de 1 min cada uno Se
procedioacute al bloqueo de los sitios libres de la placa con 100 microL leche descremada
comercial (marca Milkaut) al 1 mv en PBS durante 30 min a 37 degC y se realizaron 3
lavados con PBS-T de 1 min cada uno Luego se incubaron con suero humano (muestra
incoacutegnita) 1100 en PBS con leche descremada al 1 mv durante 1 h a 37 degC y se
realizaron 3 lavados con PBS-T de 1 min cada uno Se realizaron distintas incubaciones
con los antiacutegenos P22C y P35B conjugados a biotina Luego de tres lavados con PBS-T
se incubaron con la enzima HRP-EAV en una dilucioacuten 12000 durante 1 h a 37degC
Posteriormente se realizaron 3 lavados con PBS-T para finalmente revelar utilizando
50 microL de solucioacuten comercial de 33prime55prime-tetrametilbenzidina (TMB) sustrato de la
enzima HRP que da coloracioacuten azul en el medio de reaccioacuten pasando a amarillo y
permaneciendo estable el color cuando se detiene la reaccioacuten acidificando el medio con
H2SO4 05 M
4162 Esquema B
Sobre las microplacas de ELISA comerciales se depositaron 500 ng de Ang P22C
disueltos en 100 L de solucioacuten carbonato pH 96 incubando 1 h a 37 degC Se realizaron
3 lavados con PBS Tween 20 al 005 (PBS-T) de 1 min cada uno Se bloquearon los
sitios libres de la placa con 100 microL leche descremada 1 mv en PBS durante 30 min a
37 degC Luego se realizaron 3 lavados con PBS-T de 1 min cada uno Se incubaron con
suero humano (muestra incoacutegnita) 1100 en PBS con leche descremada al 1 mv
durante 1 h a 37 degC Luego se realizaron 3 lavados con PBS-T de 1 min cada uno Se
realizoacute una incubacioacuten con el antiacutegeno P22C conjugado a biotina Luego de tres lavados
con PBS-T se incubaron con la enzima HRP-EAV en una dilucioacuten 12000 durante 1 h
a 37degC Posteriormente se realizaron 3 lavados con PBS-T Finalmente se reveloacute con
50 microL de solucioacuten comercial de TMB y se detuvo la reaccioacuten acidificando el medio con
50 microL H2SO4 05 M
Materiales y Meacutetodos
47
417 Reaccioacuten de color para determinacioacuten cuantitativa de glicerol por meacutetodo
espectrofotomeacutetrico
Se llevaron a cabo dos tipos de ensayos diferentes Por un lado se utilizoacute el meacutetodo
enzimaacutetico con un equipo comercial provisto por Wiener Lab TG GPO PAP AA (liacutenea
liacutequida) ensayando muestras de aliacutecuotas del medio Middlebrook 7H9 suplementadas
con glicerol en lugar de suero humano Por otro lado se realizaron reacciones de color
que se llevaron a cabo en un volumen final de 100 mL que resultoacute de la mezcla de 950
microL de reactivo A y 50 microL de muestra la cual consistioacute en medio de cultivo de
micobacterias Middlebrook 7H9 suplementado con distintas cantidades de glicerol En
los blancos de reaccioacuten se realizoacute un agregado de medio de cultivo Middlebrook 7H9
sin glicerol de igual volumen que en los otros dos casos para mantener las mismas
condiciones que en las otras reacciones
El reactivo A se preparoacute inmediatamente antes de ser usado mezclando los
reactivos necesarios seguacuten se indica en la siguiente tabla
Tabla 44 Mezcla de reactivos necesaria para preparar 950 microL de reactivo A (necesario para 1 reaccioacuten)
Los voluacutemenes necesarios para un nuacutemero n de reacciones se obtuvieron multiplicando por n
los voluacutemenes de esta tabla
Reactivo Volumen para una
reaccioacuten ( L)
Solucioacuten Tampoacuten carbonato
0125 M pH 105 815
K3Fe(NC)6 10-2
M 100
(NH4)2SO4 10 M 10
NAD+ 10
-2 M 25
Enzima GlDH 2 mg mL-1
1
Las reacciones se llevaron a cabo en tubos de Khan cerrados con parafilm para
evitar evaporacioacuten de liacutequido y en bantildeo termostatizado a 37 ordmC La lectura de
absorbancia se realizoacute cuando se cumplioacute una o dos h de iniciada la reaccioacuten seguacuten la
necesidad del ensayo Los experimentos se realizaron por triplicado
418 Determinacioacuten de glicerol remanente en cultivos de micobacterias
Procedimiento seguido a medios de cultivos Middlebrook 7H9 se los suplementoacute
con glicerol a concentracioacuten 0025 mv y se cultivaron cantidades iguales de ceacutelulas
de M smegmatis algunos medios se conservaron sin adicionar micobacterias en
Materiales y Meacutetodos
48
condiciones de esterilidad Se tomaron aliacutecuotas de estos cultivos a distintos tiempos Se
centrifugaron a 12500 rpm durante 5 min para separar las ceacutelulas del sobrenadante y a
estos uacuteltimos se los congeloacute a -20ordmC para su posterior anaacutelisis
Se realizaron determinaciones de glicerol con la teacutecnica fotomeacutetrica propuesta Se
realizaron reacciones de color por triplicado a las muestras e independientemente se
hizo un blanco de reaccioacuten y 2 testigos cuyas concentraciones fueron de 001 y 004
mv
4181 Determinacioacuten de glicerol remanente en cultivos de micobacterias con y sin
fago D29 y ensayos controles respectivos
Procedimiento seguido a medios de cultivos Middlebrook 7H9 se los suplementoacute
con glicerol a 0025 mv y se cultivaron cantidades iguales de a) ceacutelulas de M
smegmatis b) ceacutelulas de M smegmatis infectadas con fago D29 c) fagos D29 d)
algunos medios se conservaron sin adicionar micobacterias ni fagos en condiciones de
esterilidad Se tomaron aliacutecuotas de estos medios inmediatamente despueacutes de realizados
los inoacuteculos (tiempo 0) a las 2 h y a las 4 h de iniciados los cultivos Se centrifugaron a
12500 rpm durante 5 min para separar las ceacutelulas del sobrenadante y a estos uacuteltimos se
los congeloacute a -20 ordmC para su posterior anaacutelisis A estas muestras se les realizaron
determinaciones del glicerol remanente con la teacutecnica fotomeacutetrica propuesta Se
realizaron reacciones de color por triplicado a cada muestra utilizaacutendose como testigos
los medios en condiciones de esterilidad
419 Instrumental electroquiacutemico
Para los experimentos electroquiacutemicos se utilizoacute un analizador electroquiacutemico
Autolab (Eco Chemie) con amplificador electromeacutetrico diferencial PGSTAT 30 Se
utilizoacute una celda convencional de tres electrodos
4191 Electrodos de trabajo
41911 Bioelectrodo para evaluacioacuten de infeccioacuten toxoplaacutesmica
Se utilizaron electrodos macizos tipo ―banderita de oro de aproximadamente 1
cm2 de aacuterea geomeacutetrica El ensamblado se realizoacute de acuerdo al siguiente protocolo los
electrodos limpios se sumergieron durante 14 h en una solucioacuten de aacutecido 3 mercapto
propanosulfoacutenico preparada inmediatamente antes de usar disolviendo 22 mg en 12 mL
de H2SO4 0021 M (desoxigenenada con burbujeo de N2) en atmoacutesfera de N2 a
Materiales y Meacutetodos
49
temperatura ambiente (TA) Luego de enjuagar con agua destilada se sumergieron en
una solucioacuten de Ang recombinante P22C 02 mg mL-1
(PBS pH 74) durante 1 h a TA
Luego de un lavado con PBS se bloquearon los sitios libres no modificados con el Ang
sumergiendo los electrodos en solucioacuten de caseinato de sodio 01 mg mL-1
(preparada
inmediatamente antes de usar) 30 min a 37 degC Los electrodos se lavaron con PBS
Tween-20 05 mv y se sumergieron en una dilucioacuten 1200 de suero humano (muestra
incoacutegnita) en PBS durante 30 min a 37 degC Se lavaron con PBS Tween-20 05 y
finalmente se incubaron en una dilucioacuten 11500 de anticuerpos de conejo anti IgGh-
HRP Los biosensores asiacute ensamblados se guardaron en PBS pH 74 a 4degC hasta su
utilizacioacuten
41912 Electrodos para cuantificacioacuten de glicerol
Como electrodos de trabajo se utilizaron oro platino plata carbono viacutetreo pasta
de carbono (viacutetreo y grafito) y pastas de carbono modificadas
Los electrodos metaacutelicos y de carbono viacutetreo fueron provistos por Metrohm
(numero de cataacutelogo 612043XX) consistentes en barras del material de 3 mm de
diaacutemetro embutidas en un armazoacuten aislante
Las pastas de carbono utilizadas se enumeran a continuacioacuten indicando los
porcentajes en masa de cada componente respectivamente
a) Pasta A carbono viacutetreo aceite mineral (7030)
b) Pasta B carbono viacutetreo aceite mineral GLDH (68302)
c) Pasta C carbono viacutetreo aceite mineral GLDH MWCNT (5830210)
Las pastas se prepararon mezclando los componentes en mortero de aacutegata durante
15 a 20 min hasta obtener una mezcla homogeacutenea a la vista Cuando se utilizoacute enzima
GlDH se dispersoacute en aceite mineral primero y luego se mezcloacute con el polvo de carbono
viacutetreo Cuando se utilizaron NTC (MWCNT nanotubos de carbono de pared multiple)
se dispersoacute primero la enzima luego los NTC y finalmente el polvo de carbono viacutetreo
Asiacute preparadas se empaquetaron firmemente en un armazoacuten de tefloacuten (diaacutemetro 3 mm)
y se friccionoacute firmemente sobre un papel liso apoyado en un vidrio para eliminar el
exceso de pasta y pulir la superficie expuesta del electrodo
Cuando se utilizaron electrodos de pasta de carbono con las pastas B se realizoacute una
cubierta de poli-(o-fenilendiamino) que inmovilizara la enzima Una vez empaquetada
la pasta en el armazoacuten de Teflon se sumergioacute en una solucioacuten de o-fenilendiamino 5 x
10-4
M en solucioacuten tampoacuten carbonato 01 M (pH 10) Se burbujeoacute N2(g) para eliminar el
Materiales y Meacutetodos
50
O2(g) de la solucioacuten y dejar una atmoacutesfera libre de O2(g) Para electropolimerizar se
realizoacute un barrido de potencial ciacuteclico desde -051 V a + 069 V a 50 mV s-1
Finalmente se enjuagoacute con solucioacuten amortiguadora carbonato 01 M (pH 10)
4192 Limpieza de electrodos
Los electrodos de oro macizo policristalino tipo ―banderita se sumergieron en
solucioacuten ―pirantildea (H2SO4 concentrado peroacutexido de hidroacutegeno 30 en una relacioacuten 31)
durante 30 min a 80ordmC Luego se los enjuagoacute con abundante agua destilada En caso de
limpieza maacutes rigurosa previo al tratamiento con solucioacuten ―pirantildea se los colocoacute a la
llama directa hasta rojo vivo (Ribone y col 2006)
Los electrodos de oro policristalino macizo insertos en una barra de tefloacuten (Tips de
Au) se limpiaron siguiendo el siguiente protocolo desengrase frotaacutendolo sobre tela de
pulido humedecida con DMSO Lavado con abundante agua destilada Pulido con
suspensioacuten acuosa de aluacutemina (diaacutemetro promedio de partiacutecula 03 microm) sobre tela de
pulido Lavado con abundante agua destilada Sonicado durante 5 min en sonicador
Cole-Palmer 8890 Luego de un enjuague con abundante agua destilada se sumergieron
en HNO3 9 M durante 1 min a 60 ordmC Finalmente se lavaron con abundante agua
destilada
4193 Determinacioacuten del aacuterea real del electrodo
Para la determinacioacuten del aacuterea real de los electrodos metaacutelicos se utilizaron dos
metodologiacuteas in-situ
41931 Medicioacuten de la adsorcioacuten de oxiacutegeno
Se asume que el oxiacutegeno se quimioadsorbe en una capa monoatoacutemica antes de la
evolucioacuten de 02 con una correspondencia de uno-a-uno con los aacutetomos metaacutelicos de la
superficie El valor de la carga asociada a la reduccioacuten de la monocapa de oacutexido en
superficies de oro policristalino que se utilizoacute fue de 390plusmn10 microC cm-2
(Trasatti amp Petrii
1991)
Se realizaron VCs en H2SO4 a 50 mVs-1
y se midioacute la carga correspondiente al pico
de desorcioacuten de O2 sobre la superficie del electrodo y este valor se dividioacute por el valor
de referencia
Materiales y Meacutetodos
51
41932 Voltametriacutea ciacuteclica de ferricianuro de potasio
Registrando VCs a varias velocidades de barrido de potencial conociendo el
coeficiente de difusioacuten del ioacuten su concentracioacuten en la celda y midiendo la corriente de
pico a cada velocidad de barrido es posible determinar el aacuterea real del electrodo de
trabajo utilizando la ecuacioacuten de Randles Sevcik ec[216] (Belluzo y col 2008)
[216]
siendo la temperatura 25 degC y donde A estaacute en cm2 D en cm
2 s
-1 C en mol cm
-3 y
en V s-1
420 Medidas electroquiacutemicas
Todos los potenciales fueron medidos y referidos al electrodo de AgAgCl (KCl
300 M) que se utilizoacute como electrodo de referencia Como contraelectrodos se
utilizaron dos tipos uno de oro de superficie mayor a 5 veces la superficie del electrodo
de trabajo cuando se utilizaron electrodos metaacutelicos como electrodos de trabajo y una
barra de carbono viacutetreo cuando se utilizaron electrodos de pasta de C como electrodos
de trabajo En todos los casos las soluciones se burbujearon con N2 durante 1 min para
desplazar el O2 disuelto y se mantuvieron en atmoacutesfera de N2 durante las
determinaciones
Las voltametriacuteas ciacuteclicas se realizaron equilibrando el sistema al potencial de inicio
Para muestras conteniendo glicerol y utilizando electrodos de oro se realizaron
barridos desde -030 V hasta 060 V a distintas velocidades de barrido Cuando se
utilizaron electrodos de platino se realizaron barridos desde -080 V hasta 020 V a
distintas velocidades de barrido Cuando se utilizaron electrodos de pasta de carbono o
pasta de carbono modificada se realizaron barridos de potencial desde -040 V hasta
100 V Las corrientes que se informan son las intensidades de pico obtenidas trazando
una liacutenea de base recta desde los extremos del pico de corriente utilizando algoritmos
propios del programa General Purpose Electrochemical System (GPES)
4201 Mediciones amperomeacutetricas para evaluacioacuten de infeccioacuten toxoplaacutesmica
Las amperometriacuteas realizadas con el bioelectrodo para evaluacioacuten de infeccioacuten
toxoplaacutesmica se llevaron adelante en solucioacuten PBS (pH 74) FeMe 3 mM El potencial
de trabajo fue de 008V Se registroacute la corriente de base hasta que se estabilizoacute y una
Materiales y Meacutetodos
52
vez estable (usualmente a los 250 s) se adicionoacute el sustrato de la enzima (H2O2)
concentracioacuten en celda 18 mM y se registroacute la corriente final (500 s) La corriente
cataliacutetica se evaluoacute como la diferencia entre la corriente final y la de base
4202 Mediciones amperomeacutetricas para cuantificacioacuten de glicerol
42021 Amperometriacuteas con tip de oro
Las amperometriacuteas con tip de oro se realizaron en medio NaOH 01 M a potencial
constante (01 V) y a temperatura ambiente (20 a 25 ordmC) El sistema se preacondicionoacute
aplicando un potencial de 05 V se dejoacute equilibrar y se registroacute la corriente de base en
esas condiciones (generalmente a los 50 s) Luego se adicionoacute la muestra de forma de
lograr la concentracioacuten final de analito deseada La corriente fue registrada y se midioacute
una vez que se estabilizoacute (aproximadamente a los 400 s) La corriente cataliacutetica se
evaluoacute como la diferencia entre la corriente final y la de base
42022 Amperometriacuteas con electrodos de pasta de C
Las amperometriacuteas donde se utilizoacute la pasta de carbono B se realizaron en solucioacuten
tampoacuten carbonatobicarbonato de potasio 100 mM (NH4)2SO4 25 mM K3Fe(CN)6
1mM NAD+ 05 mM pH 105 Se trabajoacute a potencial constante 038 V y a temperatura
ambiente (25 ordmC) El sistema se preacondicionoacute aplicando el potencial de trabajo
correspondiente durante 50 s una vez iniciada la lectura de corriente se dejoacute equilibrar
y se registroacute la corriente de base en esas condiciones usualmente a los 300 s Luego se
adicionoacute la cantidad necesaria de muestra de forma de lograr la concentracioacuten final de
analito deseada La corriente fue registrada y se midioacute una vez que se estabilizoacute
(aproximadamente a los 500 s) La corriente cataliacutetica se evaluoacute como la diferencia
entre la corriente final y la de base
Las amperometriacuteas donde se utilizoacute la pasta de carbono C se realizaron en solucioacuten
tampoacuten carbonatobicarbonato de potasio 100 mM (NH4)2SO4 25 mM NAD+ 05 mM
pH 105 a potencial constante 051 V y a 25 ordmC El sistema se preacondicionoacute aplicando
el potencial de trabajo correspondiente durante 50 s una vez iniciada la lectura de
corriente se dejoacute equilibrar y se registroacute la corriente de base en esas condiciones
usualmente a los 300 s Luego se adicionoacute la cantidad necesaria de muestra de forma
de lograr la concentracioacuten final de analito deseada La corriente fue registrada y se
midioacute una vez que se estabilizoacute (aproximadamente a los 200 s del agregado) La
corriente cataliacutetica se evaluoacute como la diferencia entre la corriente final y la de base
Materiales y Meacutetodos
53
Cuando el tiempo de equilibrado no fue suficiente para que la corriente de base se
estabilizara se recurrioacute a realizar correcciones de liacutenea de base A tal fin se llevaron a
cero las corrientes de base aplicando los algoritmos que ofrece el programa GPES
versioacuten 49 provisto por Eco Chemie BV
4203 Voltamperometriacutea de onda cuadrada
Los experimentos de voltamperometriacutea de onda cuadrada se realizaron en solucioacuten
tampoacuten carbonatobicarbonato de potasio 100 mM (NH4)2SO4 25 mM NAD+ 05 mM
pH 105 y a 25 ordmC Los valores de escaloacuten de potencial utilizados fueron de 5 y 10 mV
Los valores de amplitud de pulso fueron de 25 y 50 mV Las frecuencias utilizadas
fueron de 8 10 20 30 40 60 y 70 Hz Especiacuteficamente se evitoacute utilizar 50 Hz
(frecuencia de la tensioacuten alterna de la liacutenea de alimentacioacuten) Los barridos de potencial
se realizaron desde -03 V hasta 10 V
Una vez registrado el blanco con medio Middlebrook 7H9 y se hicieron dos
agregados secuenciales de solucioacuten estaacutendar de glicerol 100 M obtenieacutendose una
concentracioacuten final de 25 y 50 mM respectivamente en la celda
421 Funcionalizacioacuten de nanotubos de carbono
Previo a la utilizacioacuten de los nanotubos de carbono se procedioacute a funcionalizarlos
realizando una carboxilacioacuten oxidativa Se siguioacute una comunicacioacuten personal del Dr
Joseacute Manuel Pingarroacuten del Departamento de Quiacutemica Analiacutetica Facultad de Ciencias
Quiacutemicas Universidad Complutense de Madrid A saber se pesaron aproximadamente
2 mg de MWCNT y se dispersaron en 2 mL en una mezcla de aacutecido sulfuacuterico aacutecido
niacutetrico 31 con agitacioacuten ultrasoacutenica durante 5 h Luego se diluyoacute la mezcla al 110
vertieacutendola suavemente en agua destilada enfriada en bantildeo de hielo para evitar
proyecciones Se eliminoacute el exceso de aacutecido centrifugando a 14000 rpm durante 30
min descartando el sobrenadante y dispersando el precipitado en agua destilada con
agitacioacuten ultrasoacutenica durante 30 min Esta operatoria se repitioacute 9 veces hasta que la
dispersioacuten de MWCNT en agua tuvo un pH cercano a la neutralidad (70 05) Los
MWCNT se secaron en desecador con sulfato de cobre anhidro y aplicando vaciacuteo al
sistema
Materiales y Meacutetodos
54
422 Programas de prediccioacuten de epiacutetopes lineales reconocidos por ceacutelulas B
4221 Base de datos de proteiacutenas
Se creo manualmente una base de datos para mejorar la exactitud de los resultados
Las proteiacutenas fueron seleccionadas de la base de datos de BciPep (Saha y col 2005)
HIV Molecular Immunology Database (disponible en httpwwwhivlanlgovcontent
immunologyindexhtml) o tomadas de la literatura VP1 (Wang y col 2011) proteiacutena
N (El-Manzalawy y col 2008) y Gliadina (Sweredoski amp Baldi 2009) El criterio de
seleccioacuten fue la confirmacioacuten experimental previa mediante ensayos de puntos de
inmunoadsorcioacuten ligado a enzima (ELIspot) o mediante el uso de paneles
multiespeciacuteficos de anticuerpos monoclonales que reconocen epiacutetopes lineales (Shin y
col 2005) Como resultado se seleccionaron 11 proteiacutenas de las que se obtuvieron un
total de 65 epiacutetopes lineales reconocidos por ceacutelulas linfociacuteticas tipo B
4222 Programas utilizados
Se utilizaron algunos programas para predecir los epiacutetopes lineales disponibles en
liacutenea gratuitamente Todos estos programas utilizan algoritmos matemaacuteticos con escalas
de propensioacuten yo datos experimentales de antigenicidad A menos que se indique lo
contrario cada programa se ejecutoacute utilizando los paraacutemetros por defecto Los
programas utilizados fueron AAPPred (Davydov amp Tonevitskii 2009) ABCpred
(Saha S amp Raghava 2006) BcePred (Saha y col 2005) BepiPred (Larsen y col
2006) y Antigenic (Kolaskar amp Tongaonkar 1990)
Los programas de prediccioacuten definen el grado de antigenicidad por medio de una
puntuacioacuten (score) en algunos casos para cada epiacutetope y en otros para cada residuo
amino aciacutedico En este uacuteltimo se puede definir una regioacuten antigeacutenica cuando varios
residuos con alta puntuacioacuten son adyacentes en la estructura primaria Por otra parte el
nuacutemero de epiacutetopes o regiones antigeacutenicas que los programas de prediccioacuten encuentran
depende de un umbral que es configurado por el usuario
423 Anaacutelisis de Datos
Los liacutemites de deteccioacuten (LD) y cuantificacioacuten (LC) se calcularon siguiendo las
sugerencias de Armbruster amp Pry (Armbruster amp Pry 2008) modificando la cantidad
de replicados utilizados para la obtencioacuten de los desviacuteos estaacutendar habieacutendose utilizado
10 reacuteplicas El caacutelculo del LD se realizoacute a partir del valor de corriente del blanco IB maacutes
Materiales y Meacutetodos
55
33 veces el valor del desviacuteo estaacutendar de la corriente leiacuteda (DSn1) de la muestra con
menor concentracioacuten de glicerol medida seguacuten
[41]
El valor del LC se calculoacute como
[42]
siendo m la pendiente de la curva de calibracioacuten
La capacidad de discriminacioacuten entre dos concentraciones diferentes de los
meacutetodos propuestos se evaluoacute como el error asociado a la estimacioacuten de la
concentracioacuten Ec calculada como
Nm
EE r
c
1
[43]
siendo Er el error relativo
424 Caacutelculos estadiacutesticos y disentildeo experimental
Para los caacutelculos estadiacutesticos se utilizaron los programas SigmaStat 32 (Sigma Plot
90 u 110) o Microcal Origin 80 en forma indistinta Para los caacutelculos de EJCR (regioacuten
eliacuteptica de confianza conjunta) se utilizoacute el programa Matlab con rutinas disentildeadas ―ad-
hoc
Resultados y Discusioacuten
Resultados y Discusioacuten
57
5 Resultados y discusioacuten
Para la obtencioacuten de antiacutegenos especiacuteficos de fase aguda de la toxoplasmosis se
comenzoacute seleccionando un conjunto de proteiacutenas denominadas P30 P22 y P35
mencionadas en la literatura como antiacutegenos de fase aguda (Harning y col 1996
Parmley y col 2000 Lu y col 2006) Sobre la base de estos estudios iniciales se
intentoacute identificar por medio de caacutelculos teoacutericos que regiones de estas proteiacutenas
conteniacutean mayor nuacutemero de epiacutetopes De este modo en la etapa siguiente se procurariacutea
expresarlos en forma soluble para su posterior utilizacioacuten en inmunoensayos Al
momento de seleccionar un programa de todos los disponibles ―on line verificamos
que eacutestos no informaban el valor predictivo positivo VPP Por ello se inicioacute un trabajo
de identificacioacuten del programa que predijera maacutes fidedignamente los epiacutetopes La
buacutesqueda se realizoacute comparando los resultados arrojados por 5 programas a los que se
solicitoacute prediccioacuten de epiacutetopes pertenecientes a 11 proteiacutenas cuyos epiacutetopes lineales
habiacutean sido perfectamente establecidos experimentalmente (Costa y col 2013) Se
analizoacute cuaacutel de ellos presentaba el mayor VPP (ver punto 61 seccioacuten Experimentos
Auxiliares) y para predecir epiacutetopes lineales se trabajoacute con este programa que resultoacute
ser AAPred
El anaacutelisis de los Ang seleccionados permitioacute identificar en P35 dos regiones que
concentraban los determinantes antigeacutenicos a las cuales se las denominoacute P35A y P35B
Los Ang P30 y P22 presentaban los determinantes antigeacutenicos distribuidos
homogeacuteneamente por lo tanto al momento de disentildear su clonado se tuvieron en cuenta
criterios que faciliten la expresioacuten y solubilidad mas allaacute de la antigenicidad
51 Evaluacioacuten de antiacutegenos recombinantes de T gondii
511 Antiacutegeno P30
El antiacutegeno de superficie 1 de T gondii SAG1 tambieacuten denominado proteiacutena P30
se ha identificado como antiacutegeno de fase aguda (Harning y col 1996) por lo cual se
procuroacute obtenerlo en forma soluble Sobre la base de ensayos previos realizados en el
LTI se continuoacute con la obtencioacuten y purificacioacuten de dos porciones del antiacutegeno P30
denominadas P30L y P30C (seccioacuten 410 Materiales y Meacutetodos) Luego de la cosecha
y lisis de las bacterias se separaron las fracciones soluble e insoluble del extracto se
tomaron aliacutecuotas de ambas y se analizaron por SDS-PAGE Los Angs buscados soacutelo se
Resultados y Discusioacuten
58
obtuvieron como proteiacutenas precipitadas en cuerpos de inclusioacuten en la fraccioacuten insoluble
Por ello se discontinuoacute el trabajo con las fracciones de P30
512 Antiacutegeno P22
El antiacutegeno de superficie 2 o antiacutegeno P22 de T gondii (Gen Bank ndeg M33572) ha
sido tambieacuten identificado como antiacutegeno de fase aguda (Parmley y col 1992 Lau amp
Fong 2006) En el presente trabajo se procuroacute amplificar la regioacuten del gen que
permitiese expresar la proteiacutena recombinante en forma soluble El producto de
amplificacioacuten se resolvioacute en un gel de agarosa tentildeido con bromuro de etidio como se
observa en la Fig 51
Figura 51 Gel de agarosa tentildeido con bromuro de etidio en transiluminador UV En PCR1 se observan los
productos de amplificacioacuten obtenidos utilizando cebadores especiacuteficos para la regioacuten P22C donde se
sentildeala el fragmento de tamantildeo esperado Control (-) muestra la misma mezcla de reaccioacuten pero sin ADN
molde MPM indica el marcador de peso molecular y el tamantildeo de los fragmentos se indica sobre la
derecha
Se aisloacute y purificoacute el fragmento de intereacutes utilizando un equipo comercial detallado
en el punto 48 seccioacuten Materiales y Meacutetodos En un paso posterior se ligoacute al vector
pET32a y con la construccioacuten resultante se transformaron ceacutelulas competentes de E
coli Las ceacutelulas transformadas se seleccionaron crecieacutendolas en medio LB con
ampicilina Se verificaron las condiciones para la expresioacuten en forma soluble (punto
410 seccioacuten Materiales y Meacutetodos) encontraacutendose que las condiciones oacuteptimas eran
01 mM IPTG y 12 h de incubacioacuten con agitacioacuten vigorosa
Para la induccioacuten preparativa se siguioacute el protocolo detallado en la seccioacuten 410 de
Materiales y Meacutetodos La Fig 52 muestra la fotografiacutea de un gel de poliacrilamida
luego de la tincioacuten donde se analizaron aliacutecuotas de todos los extractos obtenidos en los
distintos pasos separativos de la proteiacutena P22C
Resultados y Discusioacuten
59
Figura 52 Gel de poliacrilamida tentildeido con azul brillante de Coomassie En cada calle se sembraron 1
microL de muestra EC indica el extracto crudo P1 muestra la fraccioacuten insoluble del lisado celular P2 la
fraccioacuten insoluble luego del congelamiento-descongelamiento del extracto centrifugado FT muestra el
extracto que pasoacute por la columna Con L se indican las calles con las fracciones de lavados sucesivos con
tampoacuten imidazol 0 mM 20 mM 50 mM y 100 mM respectivamente E muestra las fracciones de
elucioacuten con solucioacuten imidazol 250 mM Las fracciones de elucioacuten recolectadas fueron de 15 mL cada
una
513 Antiacutegeno P35
El antiacutegeno de superficie P35 de T gondii (Gen Bank ndeg AF01275) se ha
identificado como antiacutegeno de fase aguda y distintas porciones del mismo presentan
diferentes desempentildeos en su uso diagnoacutestico (Lu y col 2006) Sobre la base de
ensayos previos realizados en el LTI se continuoacute con la obtencioacuten y purificacioacuten de las
dos porciones del antiacutegeno P35 denominadas P35A y P35B
Se ensayoacute la expresioacuten del antiacutegeno P35A (punto 49 seccioacuten Materiales y
meacutetodos) y soacutelo se obtuvo como cuerpos de inclusioacuten en la fraccioacuten insoluble Si bien
fue posible disolver las proteiacutenas recombinantes en urea 8 M al dializar volviacutean a
precipitar
El antiacutegeno P35B se pudo obtener en forma soluble y las condiciones oacuteptimas
encontradas para la induccioacuten del mismo fueron IPTG 1 mM y 4 h con agitacioacuten
vigorosa La Fig 53 muestra una imagen del gel de poliacrilamida luego de la corrida
electroforeacutetica y su tincioacuten Se observoacute que una banda de la fraccioacuten soluble estaba
sobreexpresada en los cultivos inducidos
Resultados y Discusioacuten
60
Figura 53 Gel de poliacrilamida al 12 en condiciones desnaturalizantes Se muestra lo obtenido para
aliacutecuotas de dos cultivos no inducidos 1 y 2 y dos inducidos 3 y 4 Con P se designan las fracciones
insolubles en la solucioacuten de lisis y con SN las fracciones solubles Las bandas que se observan del MPM
corresponden a fragmentos de 19445 KDa 28829 KDa 36545 KDa 49491 KDa 80664 KDa
103035 KDa Se indica la banda sobreexpresada de tamantildeo esperado
Para la induccioacuten preparativa del antiacutegeno P35B se siguioacute el protocolo descripto en
el punto 410 seccioacuten Materiales y Meacutetodos En la Fig 54 se muestra un gel de
poliacrilamida luego de la tincioacuten donde se analizaron aliacutecuotas de todos los extractos
obtenidos en los distintos pasos separativos
Figura 54 Gel de poliacrilamida tentildeido con azul brillante de Coomassie En cada calle se sembraron 7
microL de muestra P1 fraccioacuten insoluble del lisado celular P2 fraccioacuten insoluble luego del congelamiento-
descongelamiento del extracto centrifugado FT muestra el extracto que pasoacute por columna L calles con
las fracciones de lavados sucesivos con tampoacuten imidazol 20 mM 50 mM y 100 mM respectivamente E
fracciones de elucioacuten con solucioacuten imidazol 250 mM Las fracciones recolectadas fueron de 15 mL cada
una
En consecuencia se continuoacute el trabajo con P35B y se descartoacute transitoriamente la
utilizacioacuten del Ang P35A
52 Marcado de antiacutegenos recombinantes de T gondii
Para los ensayos tipo ELISA de captura especiacuteficos para IgM se propuso utilizar
como sistema revelador la enzima HRP-EAV que se une especiacuteficamente a biotina En
consecuencia se procedioacute a marcar los Ang solubles obtenidos con biotina
P35B
P1 P2 P3 P4 MPM
Inducido No Inducido
SN1
Inducido No Inducido
SN2 SN3 SN4
Resultados y Discusioacuten
61
La reaccioacuten de conjugacioacuten se realizoacute siguiendo el protocolo mencionado en el
punto 413 seccioacuten Materiales y Meacutetodos La conjugacioacuten se evidencioacute con la reaccioacuten
de color indicada en el inciso 413 En la Fig 55 se muestra la membrana de
nitrocelulosa sobre la que se fijaron las proteiacutenas P22 y P35B luego del revelado
cromogeacutenico con la enzima HRP conjugada a streptavidina Las reacciones de
conjugacioacuten se llevaron adelante por separado
Figura 55 Membranas de nitrocelulosa evidenciando las proteiacutenas P35B conjugada (izquierda) y P22C
conjugada (derecha)
53 Inmunoensayos
Estudios preliminares (ver punto 62 seccioacuten Experimentos Auxiliares) con los
antiacutegenos recombinantes obtenidos permitieron verificar por ELISA indirecto que sueros
confirmados positivos arrojaban resultados positivos mientras que los sueros negativos
daban el ensayo negativo Se procedioacute entonces a evaluar la capacidad de los antiacutegenos
obtenidos para discriminar sueros de pacientes con infeccioacuten aguda de sueros provenientes
de pacientes con infeccioacuten croacutenica
531 Inmunoensayos con deteccioacuten fotomeacutetrica
Como se anticipoacute en la introduccioacuten se realizaron ELISA siguiendo dos
alternativas de captura En la primera alternativa que denominamos A se procuroacute
capturar selectivamente la maacutexima cantidad de Ac del isotipo que se deseaba detectar
(IgMh) adsorbiendo sobre la placa un anticuerpo ―ad-hoc (Ac-a-IgMh) En la segunda
alternativa que denominamos B se buscoacute capturar con el Ang recombinante la maacutexima
cantidad de Ac especiacuteficos independientemente del isotipo que se tratara En el paso
siguiente del esquema B se tomoacute ventaja de la mayor valencia de las IgM respecto de
las IgG para el revelado
5311 Evaluacioacuten del esquema A
Sobre placas de ELISA se capturaron los Acs IgMh revelaacutendose la presencia de los
especiacuteficos con los antiacutegenos obtenidos marcados con biotina y uniendo a estos uacuteltimos la
enzima HRP-EAV En los ensayos preliminares (ver punto 622 seccioacuten Experimentos
Auxiliares) se identificoacute la cantidad de antiacutegeno marcado y las diluciones de HRP-EAV
oacuteptimas a utilizar para revelar la presencia de IgM especiacutefica capturada En la Tabla 51 se
Resultados y Discusioacuten
62
muestran los valores de absorbancia a 450 nm obtenidos para el panel de 9 sueros
ensayados Se utilizaron 5 g de P22C-biotina por pocillo y 100 L de HRP-EAV en
dilucioacuten 12000
Tabla 51 Absorbancias a 450 nm obtenidas en los ELISA siguiendo el esquema de captura A descrito
maacutes arriba
Placa 1 Placa 2
Agudos
0100 0158
0311 0273
0140 0165
Croacutenicos
0281 0322
0256 0278
0260 0226
Negativos
0217 0168
0235 0179
0409 0354
Sin suero
0135 0134
0143 0114
0126 0100
Sin suero
Sin
P22cBiotina
0071 0050
0070 0037
0047 0040
Los resultados obtenidos con ambos antiacutegenos fueron desalentadores (los resultados
obtenidos con P35B biotina no se informan) ya que no se hallaron diferencias
significativas entre los valores de absorbancia obtenidos con sueros de pacientes
agudos croacutenicos y negativos
5312 Esquema B
En base a los resultados obtenidos en la seccioacuten anterior se orientaron los ensayos
realizando los ELISA siguiendo un esquema no claacutesico al que denominamos B
Debido a la baja sensibilidad que presentaron los Angs conjugados a biotina para
detectar los Acs especiacuteficos pensamos en hacer una primera etapa de concentracioacuten de
los Acs especiacuteficos en la placa para luego revelar con el Ang conjugado a biotina Esto
se hizo adsorbiendo antiacutegeno recombinante sobre la superficie de la placa de
poliestireno enfrentaacutendola luego al suero a ensayar Asiacute se captura selectivamente las
inmunoglobulinas que reconocen al antiacutegeno ya sean IgM o IgG Luego se expone la
placa al mismo antiacutegeno recombinante pero ligado a biotina que se uniraacute a los
anticuerpos especiacuteficos para dicho Ang previamente capturados Finalmente se revela
Resultados y Discusioacuten
63
con HRP conjugada a streptavidina que forma un complejo estable con biotina De esta
forma se aumenta la cantidad de Ang marcado en mayor proporcioacuten para IgM que para
IgG dada la multivalencia de este isotipo de inmunoglobulina En la Fig 56 se
reproduce el esquema B que fue el que brindoacute los resultados maacutes promisorios
Antiacutegeno (Ang) Bloqueante Ang ligado a biotina Reactivo de color
IgM a-Ang IgG a-Ang streptavidina conjugada a HRP
Figura 56 Esquema de ensayo ELISA de captura tipo B El antiacutegeno expuesto en la placa captura la
porcioacuten de las IgM e IgG especiacuteficas presentes en el suero humano Haciendo uso de la polivalencia de
las IgM su presencia se revela con el antiacutegeno conjugado a biotina streptavidina ligada a HRP
adicionando el sustrato de la enzima y un cromoacutegeno actuando como cosustrato
Buscando diferenciar sueros de pacientes en fase de infeccioacuten aguda (agudos) de
sueros provenientes de pacientes sin infeccioacuten (negativos) En la Tabla 52 se muestran los
valores de absorbancia a 450 nm obtenidos
Tabla 52 Absorbancias a 450 nm obtenidas en los ELISA siguiendo el esquema de captura B
Ang
Sueros P35B 05ug P35B 001ug P22C 05ug P22C 001ug
Agudos 2131 1567 0335 0296
1849 1311 065 0413
Negativos 176 1350 0282 0327
1025 1676 0262 0325
Sin suero 1658 1658 0174 0149
1812 1504 0130 0144
Sin Ang
conjugado
0055 004 0041 0045
0057 0042 0039 004
Resultados y Discusioacuten
64
Este ensayo exploratorio demostroacute que los antiacutegenos P22C y P35B pueden ser usados
potencialmente en la deteccioacuten de toxoplasmosis aguda realizando inmunoensayos con el
esquema B propuesto en el presente trabajo Por ello siguiendo este esquema de trabajo se
exploraron cuales eran las condiciones oacuteptimas (ver punto 623 seccioacuten Experimentos
Auxiliares) Asiacute se establecioacute la dilucioacuten de la enzima HRP-EAV (12000) la cantidad de
P22C biotina (5 microg por pocillo) y se acotaron los valores de P22C adsorbidos inicialmente
en la placa entre 500 y 50 ng Finalmente se realizaron tres ensayos en paralelo donde se
evaluoacute la cantidad de antiacutegeno adsorbido inicialmente en la placa y se amplioacute el panel de
sueros Los resultados obtenidos se muestran en la Fig57
Figura 57 Absorbancias a 450 nm para los ELISA realizados con el esquema B (A) 50 ng de Ang P22C
(B) 200 ng de Ang P22C (C) 500 ng de Ang P22C Con se indican los sueros provenientes de
pacientes con infeccioacuten aguda (Agudos) con los provenientes de pacientes con infeccioacuten croacutenica
(Croacutenicos) y con los de pacientes sin infeccioacuten (Negativos) Con la liacutenea roja ( ) se indica el valor
de media menos tres desviacuteos estaacutendares de los agudos (AbsA ndash 3 DSA) y con la liacutenea verde ( ) el valor
de media maacutes tres desviacuteos estaacutendares de los croacutenicos (AbsC +3 DSC)
Resultados y Discusioacuten
65
En las tres condiciones evaluadas se obtiene una separacioacuten de las sentildeales obtenidas al
ensayar sueros provenientes de los pacientes con infeccioacuten aguda (Agudos) de los sueros
provenientes de pacientes con infeccioacuten croacutenica (Croacutenicos) y los pacientes sin infeccioacuten
(Negativos)
Los resultados obtenidos con P35B no resultaron alentadores debido al elevado ruido
de fondo (altos valores de absorbancia de los blancos) Por lo tanto los ensayos
electroquiacutemicos se iniciaron soacutelo con P22C
Mijak y colaboradores (Hiszczyntildeska-Sawicka y col 2005) sentildealan que ya se ha
demostrado la utilidad del Ang SAG2 para detectar IgG en el suero de pacientes con
toxoplasmosis aguda y croacutenica (Parmley y col 1992) destacando que en los resultados
presentados por ese mismo grupo en otra publicacioacuten (Li y col 2000a) soacutelo se examinaron
un reducido nuacutemero de sueros provenientes de pacientes con infeccioacuten aguda con
resultados tanto positivos como negativos Tambieacuten sentildeala que Maine y colaboradores
(Aubert y col 2000) no obtuvieron resultados satisfactorios con este antiacutegeno
recombinante realizando ELISA indirecto Los resultados obtenidos en este trabajo con
ELISA utilizando el esquema A han confirmado lo sentildealado por Mijak y col sobre el
desempentildeo de este Ang El anaacutelisis que estos autores hacen se orienta a que el uso de estos
antiacutegenos recombinantes debe contemplar necesariamente el uso combinado de otros Angs
Por otro lado en el presente trabajo se han presentado resultados que permitiriacutean
complementar esta visioacuten incorporando otro esquema para la deteccioacuten de sueros de
infectados agudos Si bien es necesario ampliar el nuacutemero de sueros para validar el ensayo
los resultados son promisorios Hemos propuesto que las diferencias obtenidas en los
ELISA de captura siguiendo el esquema B pueden deberse a dos mecanismos no
excluyentes entre si y que podriacutean estar actuando en conjunto Por un lado estaacute la
multivalencia que presentan las IgM respecto de las IgG que generariacutea una amplificacioacuten
selectiva de acuerdo al isotipo Por otro lado independientemente del isotipo capturado el
Ang de fase aguda brindariacutea la sensibilidad y especificidad necesaria al ensayo
identificando Acs de fase aguda Resta pues esclarecer si esto es asiacute fehacientemente o si
hay alguacuten otro mecanismo actuando concomitante que permita explicar las diferencias
observadas aquiacute entre sueros de fase aguda y de infectados croacutenicos
Resultados y Discusioacuten
66
532 Inmunoensayos con deteccioacuten amperomeacutetrica utilizando los antiacutegenos
recombinantes
Los bioelectrodos se ensamblaron como se describe en el inciso 41911 de
Materiales y Meacutetodos Al realizar los inmunoensayos con las diluciones pertinentes de
suero humano (muestra incoacutegnita) en caso de suero de paciente infectado (+) estaraacuten
presentes los anticuerpos IgG anti-P22 (analito de intereacutes) Cuando se sumergen en una
dilucioacuten de anticuerpos anti-IgG h conjugado con HRP (segundo anticuerpo marcado) eacuteste
quedaraacute retenido en el electrodo y frente al agregado del sustrato de la enzima (H2O2)
sobre PBS conteniendo el mediador FcMe se genera la especie que seraacute electro-reducida
sobre el electrodo al potencial de trabajo 008 V (vs AgAgCl ver inciso 420 2) A los
fines de claridad en la Fig 58 se reformula el esquema de funcionamiento del biosensor
previamente esquematizado (Fig 212) para el caso particular aquiacute detallado donde el
Ang es la proteiacutena P22C
Proteiacutena recombinante IgG a-IgGh conjugada a HRP
Bloqueante IgG humana ferrocenometanol
Figura 58 Sobre la superficie del electrodo se fija la proteiacutena P22C que capturaraacute los anticuerpos especiacuteficos
si estaacuten presentes en el suero El revelado se realiza con un segundo anticuerpo especiacutefico para IgG humana
marcado con HRP que en presencia de H2O2 oxida el mediador FcMe que se reduce sobre la superficie del
electrodo generando la sentildeal analiacutetica
En la Fig 59 se muestran tres amperogramas representativos obtenidos cuando se
ensayaron sueros confirmados (+) sueros confirmados (-) y blancos (sin suero alguno)
Los valores de corrientes se corrigieron por los valores de aacuterea reales determinados
mediante voltametriacutea ciacuteclica a distintas velocidades de soluciones de ioacuten ferricianuro
(punto 41932 seccioacuten Materiales y Meacutetodos)
Resultados y Discusioacuten
67
Figura 59 Amperometriacuteas comparativas con bioelectrodos ensamblados con la proteiacutena P22C
En la Tabla 54 se resumen los resultados de los ensayos sobre muestras confirmadas
positivas negativas y blanco
Tabla 54 Valores promedios de la corriente cataliacutetica diferencial obtenidas utilizando bioelectrodos
ensamblados con el antiacutegeno P22C
DS desviacioacuten estaacutendar
Las diferencias en las sentildeales registradas fueron estadiacutesticamente significativas
verificaacutendose la potencialidad del uso de esta metodologiacutea para discriminar entre sueros de
pacientes infectados con T gondii de sueros de pacientes no infectados Los ensayos
electroquiacutemicos preliminares informados permiten pensar en el desarrollo de un biosensor
amperomeacutetrico A futuro seriacutea deseable poder establecer un biosensor electroquiacutemico
basaacutendonos en el esquema B de los ELISA presentados en este trabajo de Tesis que
permita la discriminacioacuten entre sueros de pacientes cursando infeccioacuten aguda de sueros de
pacientes con infeccioacuten croacutenica
54 Determinacioacuten de la actividad electroquiacutemica del glicerol en medio acuoso
Si bien desde hace varios antildeos se ha estudiado la oxidacioacuten electrocataliacutetica de
polialcoholes auacuten no existe acuerdo acerca del procedimiento maacutes conveniente para su
cuantificacioacuten electroquiacutemica asiacute como tampoco ha sido posible identificar un uacutenico
mecanismo que deacute cuenta de los productos obtenidos luego de la reaccioacuten electroacutenica
(Kahyaoglu et al 1984 Kwon amp Koper 2010)
Muestra j = Icaacuterea
( A cm-2
)
DS
( A cm-2
)
Positivos -0455 0026
Negativos -0150 0021
Sin suero -0052 004
Resultados y Discusioacuten
68
Con el fin de encontrar el electrodo y las condiciones maacutes convenientes para
realizar la cuantificacioacuten del glicerol se realizaron ensayos exploratorios de
voltametriacuteas ciacuteclicas utilizando electrodos de carbono viacutetreo pasta de C (grafito y
viacutetreo) Au Pt y Ag Los medios ensayados fueron HClO4 01 M solucioacuten tampoacuten de
fosfato salino (PBS) pH 72 90 120 NaCl al 08 mv y NaOH 01 M El intervalo
de concentracioacuten de glicerol utilizado fue de 100 x 10-5
M hasta 01 M
En estos ensayos iniciales las maacuteximas sentildeales se obtuvieron con electrodos de Au
en medio alcalino (NaOH 01 M) coincidiendo con lo descripto por Lamy (Kahyaoglu
et al 1984) A modo ilustrativo en la Fig 510 se observan dos voltametriacuteas ciacuteclicas
para electrodos de oro y de platino en medio alcalino
Figura 510 Voltamperogramas tiacutepicos para soluciones de glicerol 10-2
M en soluciones de base fuerte
(NaOH 01M) utilizando electrodos de trabajo de Au (izquierda) y Pt (derecha)
En una etapa posterior se verificoacute que las sentildeales obtenidas Ip respondiacutean
proporcionalmente a la concentracioacuten de glicerol Se realizoacute una curva de calibracioacuten en
el intervalo de concentraciones de 50 x 10-4
a 10 x 10-2
M Todas las mediciones se
hicieron por triplicado La Tabla 55 muestra las medias de las corrientes de pico
obtenidas para cada concentracioacuten ensayada con su correspondiente desviacuteo estaacutendar La
corriente de pico se midioacute tomando una liacutenea de base recta a un valor de potencial de
010 V plusmn 005 V usando algoritmos propios del programa GPES 49
Tabla 55 Valores medios de corriente obtenidos por voltametriacutea ciacuteclica para la oxidacioacuten del
glicerol en medio alcalino (NaOH 01 M) sobre electrodos de oro
[Glicerol]
(mM)
Ip
(microA cm-2
)
DS Ip
(microA cm-2
)
050 18 032
100 28 038
200 74 041
500 17 035
750 262 055
100 347 053
-50E-05
00E+00
50E-05
10E-04
15E-04
20E-04
25E-04
-0400 -0200 0000 0200 0400 0600 0800
E(V)
i(A
)
-40E-06
00E+00
40E-06
80E-06
12E-05
16E-05
-1000 -0800 -0600 -0400 -0200 0000 0200 0400
E(V)
i(A
)
Resultados y Discusioacuten
69
En la Fig 511 se presenta la dependencia de la corriente de pico
voltamperomeacutetrica con la concentracioacuten de glicerol Las barras de error corresponden a
las desviaciones estaacutendar de cada medida realizada por triplicados independientes Se
ajustaron estos valores a una recta con el meacutetodo de los miacutenimos cuadrados y se obtuvo
la siguiente ecuacioacuten
[51]
donde IpA estaacute en microA cm-2
y [glicerol] en mM El valor de coeficiente de regresioacuten
(R2) obtenido fue de 09980
Figura 511 Dependencia de la corriente de pico voltamperomeacutetrica con la concentracioacuten de glicerol en
medio alcalino (NaOH 01 M) Se muestran los valores promedios de tres medidas independientes Las
barras de error se corresponden a los desviacuteos estaacutendares
En estas condiciones de trabajo el pico de corriente oxidativa tiene dependencia
lineal con la concentracioacuten de glicerol En funcioacuten de estos resultados se orientoacute la
buacutesqueda hacia una metodologiacutea que permitiese determinar al glicerol en
concentraciones de 10-5
M o menores Para esto iniciamos ensayos con teacutecnica
amperomeacutetrica
Se realizaron los ensayos amperomeacutetricos como se describe en el punto 4202 de la
seccioacuten Materiales y Meacutetodos La Fig 512 muestra el resultado de una amperometriacutea
tiacutepica para una solucioacuten de glicerol
Resultados y Discusioacuten
70
t s
0 50 100 150 200 250 300 350 400 450
I A
0
2
4
6
Figura 512 Amperometriacutea tiacutepica de una muestra con glicerol (concentracioacuten en celda 1 mM) Se dejoacute
estabilizar la corriente para una solucioacuten de NaOH 01 M y a los 50 segundos se realizoacute el agregado de la
muestra con glicerol y se midioacute la corriente hasta los 400 segundos
Se ensayaron soluciones de glicerol cuya concentracioacuten en la celda electroliacutetica
fueron desde 001 mM hasta 5 mM Como blanco se utilizoacute solucioacuten de NaOH 01 M
La corriente cataliacutetica se midioacute como la diferencia entre la corriente final y la inicial
(punto 4202 seccioacuten Materiales y Meacutetodos) A este valor de corriente se lo dividioacute
por el valor de aacuterea real del electrodo medida anteriormente esta densidad de corriente
(IcA) se tomoacute como la sentildeal analiacutetica En la Tabla 56 se muestran las medias de las
sentildeales obtenidas para cada concentracioacuten de glicerol ensayada con su correspondiente
desviacuteo estaacutendar
Tabla 56 Valores medios de densidades de corriente obtenidos por amperometriacutea para la oxidacioacuten de
glicerol en medio alcalino (NaOH 01 M)
[Glicerol]
(mM)
Ic A
( A cm-2
)
DS
( A cm-2
)
0000 0447 0029
0010 0763 0016
0025 1098 0068
0050 1510 0055
0100 285 049
0250 609 036
0500 1245 033
0750 1730 0097
100 2361 0099
150 3445 033
175 3997 020
200 4613 045
Resultados y Discusioacuten
71
En la Fig 513 se presenta la recta de regresioacuten lineal obtenida a partir de los
valores promedio de densidades de corriente para soluciones de glicerol en el intervalo
de concentraciones de 0025 mM y 2 mM Las barras de error corresponden a las
desviaciones estaacutendares de cada medida La ecuacioacuten de la recta obtenida por el meacutetodo
de miacutenimos cuadrados fue
[52]
Donde IcA estaacute en microA cm-2
y [Glicerol] en mM el valor del coeficiente de
regresioacuten (R2) obtenido fue de 09950
[Glicerol] mM
000 025 050 075 100 125 150 175 200
I cA
m
A c
m-2
0
10
20
30
40
50
Figura 513 Curva de calibracioacuten obtenida para glicerol en medio alcalino (NaOH 01 M) con la teacutecnica
amperomeacutetrica Se muestran los valores promedios de tres medidas independientes para cada solucioacuten
Las barras de error que se muestran corresponden al DS de cada punto
Las cifras de meacuterito para esta teacutecnica resultaron ser
Liacutemite de deteccioacuten 10 M
Liacutemite de cuantificacioacuten 24 M
Liacutemite de discriminacioacuten 10 M
Intervalo de linealidad 0024 mM ndash 200 mM
55 Cuantificacioacuten de glicerol en medios acuosos complejos
El glicerol es corrientemente utilizado como principal fuente de carbono en cultivos
bacterianos siendo degradado eficientemente por sistemas enzimaacuteticos que utilizan
mecanismos redox Por lo tanto se comenzoacute a estudiar la posible cuantificacioacuten
electroquiacutemica de este alcohol intentando detectar concentraciones del orden 10-5
M o
Resultados y Discusioacuten
72
menores para poder asiacute evidenciar su consumo en medios de cultivos bacterianos que
contienen glicerol como nutriente El meacutetodo amperomeacutetrico con electrodo de oro no
fue lo suficientemente selectivo para glicerol cuando este se encontraba en matrices
complejas (no se muestran los resultados) por lo tanto al momento de cuantificarlo en
medios de cultivos bacterianos tuvimos que optar por otra metodologiacutea
Sobre la base del trabajo de Tuntildeoacuten-Blanco y col (Aacutelvarez-Gonzaacutelez et al 2000)
se busco desarrollar un biosensor selectivo para este analito
Para verificar la funcionalidad del modelo propuesto se realizaron ensayos
espectrofotomeacutetricos La coenzima NAD(H) en su forma reducida (NADH) presenta un
maacuteximo de absorcioacuten a 340 nm ausente en la forma oxidada (NAD+) Puede apreciarse
en la Fig 514 que el mediador electroquiacutemico Fe(CN)63-
presenta un maacuteximo de
absorcioacuten a 420 nm ausente en la forma reducida Fe(CN)64-
En un primer ensayo se
verificoacute espectrofotomeacutetricamente que la longitud de onda escogida podiacutea utilizarse
para el seguimiento de la reaccioacuten En una serie de ensayos posteriores se monitoreoacute la
reaccioacuten enzimaacutetica en presencia y ausencia del mediador electroquiacutemico haciendo uso
de estas propiedades espectrales
Figura 514 Espectros de absorcioacuten UV-visible para las especies Fe(CN)33-
1 mM y Fe(CN)34-
1 mM
Ambas especies fueron disueltas en solucioacuten tampoacuten carbonato pH 105 Puede apreciarse claramente que
el maacuteximo de absorcioacuten a 420 nm presente en el Fe(CN)63-
se encuentra ausente en el Fe(CN)64-
La
velocidad de barrido fue 1200 nm min-1
551 Evaluacioacuten del modelo propuesto por medio de lecturas
espectrofotomeacutetricas
El primer ensayo para validar el modelo propuesto fue seleccionar la longitud de
onda oacuteptima para el seguimiento espectrofotomeacutetrico A tal fin se llevaron adelante dos
0
025
05
075
1
125
15
175
2
225
25
275
260 280 300 320 340 360 380 400 420 440 460 480 500
Longitud de onda (nm)
Ab
sorb
an
cia
Ferricianuro 1 mM
Ferrocianuro 1 mM
Resultados y Discusioacuten
73
reacciones a) glicerol disuelto en medio 7H9 coenzima Fe(CN)63-
y enzima GlDH y
b) glicerol disuelto en medio 7H9 coenzima Fe(CN)63-
pero sin la enzima GlDH En
ambos casos se realizoacute un barrido espectral de 320 a 480 nm registraacutendose la
absorbancia a una velocidad de barrido de 1200 nm min-1
cada 10 min Ambas
reacciones se llevaron a cabo en solucioacuten tampoacuten carbonato pH 105 En la Fig 515 se
muestran los barridos espectrales obtenidos para cada reaccioacuten y en ella puede
apreciarse que la mayor diferencia se presenta a la longitud de onda prevista (420 nm)
Figura 515 Espectros de absorcioacuten UV-visible para mezclas de reaccioacuten (A) En presencia de enzima
GlDH (B) Sin enzima GlDH Barrido espectral cada 10 min
Para elucidar si el consumo de Fe(CN)63-
observado se correspondiacutea
cuantitativamente con el NADH generado y en consecuencia con el glicerol
consumido se tuvieron en cuenta las siguientes reacciones
glicerol + Fe(CN)63-
DHA + Fe(CN)64-
(1)
glicerol + NAD+ NADH + DHA (2)
Se realizaron series de 3 reacciones en paralelo a saber a) blanco de reaccioacuten (BR)
con enzima GlDH NAD+ y Fe(CN)6
3- en ausencia de glicerol donde se siguioacute la
absorbancia a 420 nm b) reaccioacuten (1) con enzima GlDH NAD+ Fe(CN)6
3- y glicerol
donde se siguioacute la desaparicioacuten de Fe(CN)63-
a 420 nm c) reaccioacuten (2) con enzima
GlDH NAD+ y glicerol donde se siguioacute la aparicioacuten de NADH a 340 nm Debe tenerse
en cuenta por un lado que el NAD+ es reducido a NADH en la reaccioacuten (2) no se
regenera mientras que en la reaccioacuten (1) se regenera por la presencia del anioacuten
Fe(CN)63-
Esto implica que si bien ambas reacciones se lentifican con el paso del
tiempo a causa del consumo de glicerol (y acumulacioacuten de DHA) la reaccioacuten (2) se
lentifica maacutes que la (1) porque se consumen tanto el glicerol como el NAD+
y se
acumulan ambos productos de reaccioacuten (DHA y NADH) Los resultados pueden verse
en la Fig 516
A
0
015
03
045
06
075
09
105
12
135
15
320 340 360 380 400 420 440 460 480
Longitud de onda (nm)
Ab
sorb
an
cia
t = 0
t = 10 min
t = 20 min
t =30 min
t = 40 min
t = 50 min
t = 60 min
B
0
015
03
045
06
075
09
105
12
135
15
320 340 360 380 400 420 440 460 480
Longitud de onda (nm)
Ab
sorb
an
cia
t = 0 min
t = 10 min
t = 20 min
t = 30 min
t = 40 min
t = 50 min
t = 60 min
GlDHNAD+
GlDH
Resultados y Discusioacuten
74
Figura 516 Absorbancias registradas a 420 nm durante las reacciones descriptas en el texto A) Blanco
de reaccioacuten (BR) y reaccioacuten (1) B) Reaccioacuten (2) C) Segmento inicial de la curva representada en
B) a partir de la cual se calculoacute el valor liacutemite de la velocidad inicial de reaccioacuten Se muestra un
experimento representativo de un original y replicado
Se asumioacute que la reaccioacuten (1) transcurre a una velocidad constante en las
condiciones en que se llevoacute a cabo El anaacutelisis estadiacutestico demuestra que hay una ligera
tendencia a la no linealidad evidenciada por la distribucioacuten de los residuos No
obstante siendo las variancias iguales se consideroacute que no hay un alejamiento
significativo de la linealidad Por ello en los caacutelculos de variacioacuten de la concentracioacuten
de coenzima a lo largo del tiempo de reaccioacuten se tuvo en cuenta el cambio que se
produciriacutea si la velocidad de reaccioacuten se mantuviera constante e igual a la velocidad
inicial Para el caso del NAD+ consumido (o NADH generado) en la reaccioacuten (2)
tenemos
[53]
Asumiendo que en el intervalo de concentraciones de trabajo se cumple la ley de
Beer la ec [53] puede reescribirse como
[54]
Si la velocidad de la reaccioacuten enzimaacutetica se mantiene aproximadamente igual a la
velocidad inicial por la regeneracioacuten de la coenzima se puede admitir que la velocidad
A
05
056
062
068
074
08
086
092
098
104
11
0 600 1200 1800 2400 3000 3600
tiempo (s)
Ab
s 4
20
nm
B
0
004
008
012
016
02
024
028
032
036
04
044
048
0 600 1200 1800 2400 3000 3600tiempo (s)
Ab
s 3
40
nm
C
y = 00004405x
R2 = 09983921
0
0035
007
0105
014
0175
021
0 60 120 180 240 300 360 420 480
tiempo (s)
Ab
s 3
40
nm R
2 = 09984
Resultados y Discusioacuten
75
de reaccioacuten es constante (reaccioacuten de orden cero para los reactivos) pudieacutendose expresar
la ec [54] en la siguiente forma
b
k
tb
tk
tb
Abs
nmNADHnmNADHnmNADH
nm
340340340
340 [55]
donde k es la constante de velocidad para esa reaccioacuten en unidades de absorbancia por
unidad de tiempo (s-1
) y se obtiene como la pendiente del segmento lineal de la curva de
la Fig 516 B presentado en la Fig 516 C
La variacioacuten de concentracioacuten total de coenzima se obtiene multiplicando el valor
de velocidad por la variacioacuten de tiempo total
[56]
siendo los valores de los paraacutemetros y variables en cuestioacuten
εNADH 340nm = 6220 M-1
cm-1
Δt = 3600 s
b = 1 cm
k = 44 x 10-4
s-1
resultando
[57]
La variacioacuten de concentracioacuten del mediador seraacute
[58]
nmCNFe 420)( 36
= 1080 M-1
cm-1
ΔAbs420nm = 052
que reemplazando en la ec [58] arroja
M [59]
La variacioacuten de absorbancia observada en el blanco de reaccioacuten a lo largo de una
hora fue de 00046 unidades de absorbancia que representa menos del 1 de la
variacioacuten total observada en la reaccioacuten (1) Estos resultados permiten verificar que en
las condiciones de reaccioacuten el Fe(CN)63-
reducido a Fe(CN)64-
equivale
cuantitativamente al NADH generado en la reaccioacuten enzimaacutetica de acuerdo a la
siguiente estequiometriacutea
Resultados y Discusioacuten
76
2 Fe(CN)63-
+ NADH 2 Fe(CN)64-
+ NAD+ [510]
Lo mostrado corrobora la factibilidad del disentildeo de un biosensor de una sola
enzima con un mediador soluble econoacutemico
5511 Evaluacioacuten de la sentildeal con la concentracioacuten de glicerol
Para verificar si la sentildeal analiacutetica muestra dependencia con la concentracioacuten de
glicerol se realizaron 6 reacciones en paralelo registraacutendose la absorbancia a 420 nm
cada un minuto durante dos horas Se realizoacute un blanco de reaccioacuten sin glicerol y cinco
reacciones con concentraciones crecientes de glicerol Como muestras se utilizaron el
medio de cultivo de micobacterias Middlebrook 7H9 suplementado con glicerol a
distintas concentraciones En la Tabla 57 se presentan las concentraciones de glicerol
en las mezclas de reaccioacuten y en las muestras La Fig 517 muestra la absorbancia a 420
nm para las seis reacciones
Tabla 57 Concentraciones de glicerol en las mezclas de reaccioacuten
Reaccioacuten [glicerol] en mezcla
de reaccioacuten (mM) [glicerol] en muestra
(mM)
Blanco 0 0
Muestra 1 11 22
Muestra 2 082 16
Muestra 3 055 11
Muestra 4 027 55
Muestra 5 011 22
Resultados y Discusioacuten
77
Figura 517 Absorbancia a 420 nm de las mezclas de reaccioacuten descriptas en el texto ( ) 11 mM de
glicerol ( ) 082 mM de glicerol ( ) 055 mM de glicerol (o) 027 mM de glicerol (-) 011 mM de
ccedilglicerol ( ) blanco de reaccioacuten
Habiendo verificado la dependencia de la sentildeal analiacutetica con el analito de intereacutes se
procedioacute a determinar el intervalo dinaacutemico lineal Para ello se realizaron las reacciones
de color como se describe en el apartado 417 de la seccioacuten Materiales y meacutetodos Cada
reaccioacuten se hizo por triplicado En la Fig 518 se muestran resumidos los resultados
obtenidos
[Glicerol] mM
000 005 010 015 020 025 030 035 040
Ab
s 42
0 n
m
00
02
04
06
08
10
Figura 518 Curva de calibracioacuten para glicerol utilizando el meacutetodo colorimeacutetrico Se muestran los
valores promedios de tres medidas independientes Las barras de error corresponden a los desviacuteos
estaacutendares
La recta de regresioacuten que se obtuvo a partir de estos valores fue
Abs420nm = 0946 ndash 238 [glicerol] [511]
02
03
04
05
06
07
08
09
1
0 1200 2400 3600 4800 6000 7200
tiempo (s)
Ab
s 4
20
nm
Resultados y Discusioacuten
78
cuyo coeficiente de regresioacuten (R2) fue 09980 En el intervalo de concentraciones de
0025 a 027 mM la respuesta fue lineal
5512 Optimizacioacuten de condiciones para disminuir el costo operativo
Se verificoacute la posibilidad de cuantificar glicerol en medio Middlebrook 7H9
optimizando las concentraciones de reactivos y los tiempos de reaccioacuten para obtener la
maacutexima sentildeal con la mezcla maacutes econoacutemica posible Se ensayaron distintas
concentraciones de cofactor NAD+ a utilizar y 2 tiempos de reaccioacuten para una curva de
calibrado de 6 puntos consistente en un blanco y cinco estaacutendares de glicerol todos por
triplicado
Para verificar la factibilidad de disminuir la concentracioacuten de cofactor soluble sin
alterar significativamente la sensibilidad del meacutetodo se utilizoacute un disentildeo experimental
con un modelo de superficie de respuesta Como factores se tomaron la concentracioacuten
de cofactor y el tiempo de reaccioacuten Los niveles seleccionados en base a ensayos
previos fueron concentracioacuten de cofactor (NAD+) 01 mM 023 mM 037 mM y 05
mM tiempo 1 y 2 h Las respuestas que se evaluaron fueron la pendiente de una recta
de regresioacuten calculada a partir del meacutetodo de miacutenimos cuadrados y el coeficiente de
regresioacuten lineal correspondiente En la Tabla 58 se muestran los niveles parametrizados
y los valores de las respuestas obtenidas
Tabla 58 Disentildeo experimental factores parametrizados y respuestas obtenidas
Cada uno de los estaacutendares indicados en la Tabla 58 se correlaciona con una curva
de calibrado realizada En la Tabla 59 se informan los valores de concentracioacuten de
glicerol de las soluciones utilizadas para las reacciones de color y la concentracioacuten
correspondiente en la mezcla de reaccioacuten
Estaacutendar [NAD+] Tiempo Pendiente R2
4 1 -1 068 08790
7 03333 1 227 09962
8 1 1 184 09621
5 -1 1 159 09931
3 03333 -1 083 09590
2 -03333 -1 1 09850
6 -03333 1 244 09863
1 -1 -1 071 09914
Resultados y Discusioacuten
79
Tabla 59 Valores de concentracioacuten de los estaacutendares utilizados para los ensayos de optimizacioacuten
Reaccioacuten [glicerol] en mezcla
de reaccioacuten (mM) [glicerol] en muestra
(mM)
Blanco 0 0
Muestra 1 0010 02
Muestra 2 0025 05
Muestra 3 0050 10
Muestra 4 0075 15
Muestra 5 010 20
La ecuacioacuten de ajuste propuesta por el modelo de superficie de respuesta para la
pendiente fue
tBNADAm ][421 [512]
donde A y B son los coeficientes del modelo que se calculan a partir de la forma de la
superficie de respuesta e indican la dependencia de la pendiente (m) con la
concentracioacuten de cofactor ([NAD+]) y el tiempo de reaccioacuten (t) respectivamente El
anaacutelisis de los resultados indica que de los dos coeficientes solo B es significativo y su
valor es 062 mientras que A es un coeficiente no significativo Esto significa que la
pendiente de la recta de calibrado no muestra dependencia con la concentracioacuten de
cofactor NAD+ utilizado
Por otra parte el coeficiente de correlacioacuten no mostroacute dependencia con ninguno de
los factores elegidos Esto indica que el modelado de la funcioacuten deseabilidad global
queda reducido al de una sola respuesta la pendiente de la recta de calibrado y a un
uacutenico factor significativo que es el tiempo de reaccioacuten En base a estos resultados
pudimos establecer un uso miacutenimo de cofactor soluble
552 Determinacioacuten de glicerol remanente en cultivos de micobacterias
5521 Evaluacioacuten de glicerol remanente en cultivos axeacutenicos de M smegmatis
Primeramente se evaluoacute si podiacutea evidenciarse el consumo de glicerol por parte de
M smegmatis en un cultivo axeacutenico es decir conteniendo soacutelo este microorganismo
Para ello se realizaron cultivos de la micobacteria como se describe en el punto 418 de
la seccioacuten Materiales y Meacutetodos y se determinoacute el glicerol remanente haciendo uso del
meacutetodo fotomeacutetrico presentado previamente El anaacutelisis de la variancia de los valores de
absorbancia registrados y posteriormente se realizoacute un ensayo de comparaciones
muacuteltiples utilizando las pruebas de Tukey y de Bonferroni Se detectaron diferencias
estadiacutesticamente significativas en las absorbancias de las muestras del medio con M
Resultados y Discusioacuten
80
smegmatis a las 2 y 3 h de iniciados los cultivos respecto de aquellos medios
conservados en esterilidad
5522 Determinacioacuten de glicerol remanente en cultivos de micobacterias con y
sin fago D29 y ensayos controles respectivos
En una segunda serie de ensayos nos propusimos ver si habiacutea consumo diferencial
de glicerol entre cultivos de M smegmatis y cultivos de la micobacteria infectados con
el fago D29 siguiendo el protocolo descripto en el punto 4181 de la seccioacuten Materiales
y Meacutetodos En la Fig 519 se muestran los valores de absorbancia a 420 nm de las
muestras mencionadas Sobre este conjunto de datos nuevamente se realizoacute un anaacutelisis
de la variancia y ensayos de comparaciones muacuteltiples utilizando las pruebas de Tukey y
de Bonferroni
Los resultados obtenidos indican que todos los medios de cultivo a los cuales no se
le inoculoacute bacterias y aquellos medios donde se inoculoacute bacterias pero fueron
centrifugados inmediatamente despueacutes del inoacuteculo (muestras a t= 0) no mostraron
diferencias estadiacutesticamente significativas en los ensayos de comparaciones muacuteltiple
realizados Esto permite concluir que el agregado de fago y la incubacioacuten a 37 ordmC no
producen modificaciones significativas per se en las reacciones de color Por ello es
posible afirmar que en el futuro podraacuten simplificarse los controles a un uacutenico testigo
de concentracioacuten inicial conocida sin necesidad de tomar una muestra del cultivo
inmediatamente despueacutes del inoacuteculo o de la adicioacuten de fagos a los controles negativos
del ensayo
En este ensayo preliminar pudimos observar que las diferencias de absorbancia
resultaron estadiacutesticamente significativas entre los medios de cultivo donde crecieron
ceacutelulas de M smegmatis y los medios donde crecieron ceacutelulas de M smegmatis
infectadas con fago D29 tanto a las 2 como a las 4 h de iniciados los cultivos Este
resultado indicoacute que la hipoacutetesis de trabajo planteada era apropiada y en consecuencia
seriacutea factible desarrollar un meacutetodo para verificar la integridad de micobacterias en un
cultivo de las mismas
Resultados y Discusioacuten
81
Bla
nco
Med
io 0
025
00
25
+ F
ago t
= 0
00
25
C
eacutelula
s t
= 0
00
25
Ceacutel
ula
s +
Fag
o t
= 0
00
25
+ F
ago t
= 2
00
25
Ceacutel
ula
s t
= 2
00
25
Ceacutel
ula
s +
fag
o t
= 2
00
25
fa
go t
= 4
00
25
Ceacutel
ula
s t
= 4
00
25
Ceacutel
ula
s +
fag
o t
= 4
Abs
420 n
m
03
04
05
08
Figura 519 Absorbancias a 420 nm registradas para las muestras descritas Se indica concentracioacuten
inicial de glicerol en mv y tiempo de incubacioacuten a 37 ordmC El blanco corresponde al de la reaccioacuten de
color sin glicerol
553 Biosensor amperomeacutetrico a base de pasta de carbono viacutetreo modificada
En funcioacuten de los resultados previos se procedioacute al ensamblado de un biosensor
amperomeacutetrico siguiendo el esquema de reaccioacuten presentado previamente que se
reproduce en la figura 520
Figura 520 Esquema de reaccioacuten propuesto para biosensor amperomeacutetrico selectivo para glicerol La
coenzima reducida NADH se regenera a su forma oxidada NAD+ reaccionando con el Fe(CN)6
3- que se
reduce a Fe(CN)64-
Este uacuteltimo se reoxida electroquiacutemicamente sobre la superficie del electrodo
completando el ciclo cataliacutetico
Utilizando electrodos de pasta de carbono B (punto 41912 seccioacuten Materiales y
Meacutetodos) se realizaron amperometriacuteas siguiendo el protocolo descrito en el punto 4202
glicerol
DHA
GlDHox
GlDHred NAD+
NADH Mediador ox
Mediador red
e- Electrodo
Resultados y Discusioacuten
82
de la seccioacuten Materiales y Meacutetodos En la Fig 521 se muestra un amperograma tiacutepico
obtenido
Tiempo s
100 200 300 400 500
I
nA
0
20
40
60
80
100
Figura 521 A) Amperograma tiacutepico obtenido con un electrodo de trabajo de pasta de carbono B
trabajando a un potencial de 038 V Se agregaron 50 L de medio 7H9 suplementado con glicerol
usualmente a los 300 s de iniciada la lectura de corriente cuando eacutesta se estabilizoacute B) Agregados
sucesivos de 50 microL de medio 7H9 suplementado con glicerol 20 mM sobre 200 mL de la misma
solucioacuten
En la Fig 522 se presenta la recta de regresioacuten obtenida a partir de los valores
promedios de corrientes para soluciones de glicerol en el intervalo de concentraciones
de 0062 mM y 175 mM Las barras de error corresponden a las desviaciones estaacutendar
de cada medida La ecuacioacuten de la recta obtenida por el meacutetodo de miacutenimos cuadrados
fue
[513]
donde Ic estaacute en nA y [Glicerol] en mM el valor del coeficiente de regresioacuten (R2)
obtenido fue de 09982
Las cifras de meacuterito para esta teacutecnica resultaron ser
Liacutemite de deteccioacuten 20 M
Liacutemite de cuantificacioacuten 60 M
Liacutemite de discriminacioacuten 15 M
Intervalo de linealidad 0060 mM ndash 175 mM
Tiempo s
0 500 1000 1500 2000
I
nA
0
50
100
150
200
Resultados y Discusioacuten
83
[Glicerol] mM
000 025 050 075 100 125 150 175 200
Ic
nA
0
50
100
150
200
Figura 522 Recta de calibracioacuten para glicerol utilizando el meacutetodo amperomeacutetrico descrito en el texto
Se muestran los valores promedios de corrientes liacutemite corregidas y las desviaciones estaacutendares de 3
lecturas independientes
Una vez que se preparoacute la pasta de carbono viacutetreo modificada con la enzima esta
resultoacute estable durante 10 semanas sin peacuterdida de actividad enzimaacutetica siempre que se
mantuviese seca a 4 degC Una vez que se ensambloacute el biosensor con el poliacutemero
electrodepositado pudo utilizarse durante al menos 8 horas consecutivas con una
peacuterdida de sensibilidad insignificante En efecto los cambios observados en las sentildeales
registradas de forma consecutiva se encontraron dentro del error intriacutenseco del meacutetodo
propuesto La estabilidad de un mismo biosensor durante diacuteas sucesivos se evaluoacute
realizando medidas de la misma solucioacuten y evaluando la relacioacuten sentildealruido la cuaacutel
disminuyoacute un 15 del valor original al tercer diacutea y un 50 al quinto diacutea de uso
554 Desarrollo de un biosensor a base de pasta de carbono viacutetreo y
nanotubos de carbono
Para reducir los tiempos de anaacutelisis se procuroacute disminuir el periacuteodo de
estabilizacioacuten de la corriente modificando el esquema original propuesto para el sensor
Para esto se modificoacute la pasta de carbono con nanotubos de carbono de paredes
muacuteltiples (Rubianes amp Rivas 2003) Seguacuten trabajos previos esta estrategia permite
disminuir el sobrepotencial asociado a la electrooxidacioacuten de la coenzima NADH
evitaacutendose el uso de un mediador soluble (Musameh 2002) Previo a su utilizacioacuten los
NTC fueron funcionarizados por carboxilacioacuten oxidativa siguiendo el protocolo
especificado en el punto 421 de la seccioacuten Materiales y Meacutetodos
Resultados y Discusioacuten
84
En la Fig 523 (derecha) se muestran las voltametriacuteas que se obtuvieron utilizando
un electrodo de trabajo relleno con pasta B (pasta de carbono viacutetreo modificada con
enzima GlDH al 2 en masa)
Figura 523 Voltamperogramas ciacuteclicos utilizando bioelectrodos de pasa de carbono B con GlDH
(derecha) y pasta C con GlDH y MWCNT (izquierda) En liacutenea puntuada se muestran las voltametriacuteas de
la solucioacuten NAD+ 05 mM (NH4)2SO4 25mM K2CO3 KHCO3 01 M pH 105 (blanco) En liacutenea
continua las voltametriacuteas de las mismas soluciones con el agregado de glicerol en concentracioacuten final 25
mM La velocidad de barrido fue 50 mV s-1
Se marcan los picos de corriente observados y el potencial de
pico
El sobrepotencial asociado a la electroxidacioacuten de la coenzima NADH en el
electrodo de pasta de carbono B es 70 mV menor que el informado por Wang y col Ep
= 082V sobre electrodos de carbono viacutetreo (Musameh 2002) Esta diferencia podriacutea
deberse a los distintos pH de trabajo o bien a alguna diferencia en las cualidades de la
superficie del electrodo
En la Fig 523 (izquierda) se muestran los resultados obtenidos con los electrodos
de pasta C pasta de carbono modificada con GlDH al 2 y con MWCNT al 10 en
masa En este caso vemos que el sobrepotencial asociado a la electroxidacioacuten de NADH
es 0180 V menor Ep = 057 V que el observado para la pasta B Esta diferencia
podemos atribuirla a las cualidades diferentes de las superficies del electrodo debida a la
presencia de los MWCNT Es de destacar que Wang y col en la oxidacioacuten del NADH
sobre la superficie de carbono viacutetreo modificado con MWCNT observaron dos
procesos oxidativos uno principal con un Ep de 033 V y otro secundario con Ep de
057 V que aparece como hombro del primero (ver Fig 524 reproducida de Wang y
col)
Ep = 075 V
Resultados y Discusioacuten
85
Figura 524 Reproducido de Musameh y col 2002 Voltamperogramas correspondientes a una solucioacuten 5
mM de coenzima NADH en solucioacuten tampoacuten fosfato 005 M pH 74 utilizando electrodos de trabajo de
pasta de carbono viacutetreo sin modificar (A) y modificado con MWCNT (B) Velocidad de barrido 50 mV s-1
En el voltagrama B puede apreciarse el pico principal y el secundario que aparecen como hombro del
primero
En este trabajo soacutelo se pudo identificar un uacutenico proceso oxidativo a 057 V Si bien
auacuten estamos investigando posibles causas que hayan originado esta diferencia es de
esperar que el pH sea un factor determinante ya que la oxidacioacuten de NADH a NAD+
involucra la perdida de un H+ Por otra parte en los voltagramas realizados con pasta C
se registroacute un importante aumento de las corrientes capacitivas (18 μA) en relacioacuten a
las voltametriacuteas donde se utilizaron electrodos de pasta sin MWCNT Este mismo
efecto pero en menor magnitud (55 μA) tambieacuten fue registrado por Wang y
colaboradores al trabajar con electrodo de carbono viacutetreo modificado con MWCNT
(Musameh 2002) Los resultados obtenidos por Wang y colaboradores y los de este
trabajo de Tesis se muestran comparativamente en la Tabla 510
Tabla 510 Resultados obtenidos por Musameh y col 2002 y los correspondientes a este trabajo
Musameh y col
2002 Este trabajo
Electrodo de
trabajo Cv
C v +
MWCNT Pasta B Pasta C
V barrido 50 mV s-1 50 mV s
-1
pH 74 105
Ep (V) 082 033
057 075 057
Aumento de la
I cap (μA) - 55 - 18
Resultados y Discusioacuten
86
Con estos resultados preliminares comenzamos los ensayos amperomeacutetricos para
cuantificar el glicerol remanente en los medios de cultivos de micobacterias Se llevaron
adelante distintos ensayos y nuevamente el inconveniente principal al que nos
enfrentamos fue que la respuesta no era estable en el tiempo En la Fig 525 se muestra
un amperograma obtenido con un bioelectrodo de pasta C y realizando agregados
sucesivos de un estaacutendar de glicerol 20 mM disuelto en medio Middelbrook 7H9
Con este nuevo esquema de trabajo no se logroacute acortar los tiempos de estabilizacioacuten
de la corriente Los algoritmos de correccioacuten de corriente de base que estaacuten
incorporados al programa GPES tampoco permitieron solucionar este inconveniente
Por este motivo se optoacute por utilizar teacutecnicas voltameacutetricas de pulso que en principio
permitiriacutean evitar este inconveniente
Tiempo s
0 100 200 300 400 500 600 700 800 900
I A
0
1
2
3
4
Figura 525 Amperograma obtenido con un bioelectrodo de pasta de carbono C trabajando a 05 V vs
AgAgCl A t=200 s de iniciada la lectura se agregaron 50 L de medio 7H9 y posteriormente se
realizaron agregados sucesivos de 50 L de medio 7H9 suplementado con glicerol 20 mM
5541 Ensayos de cuantificacioacuten de glicerol con el bioelectrodo desarrollado
utilizando teacutecnicas de pulso
Las teacutecnicas voltameacutetricas de pulso presentan la ventaja de permitir trabajar durante
tiempos muy reducidos en la zona de potencial donde la especie electroactiva cambia
su estado de oxidacioacuten produciendo la sentildeal analiacutetica
Se optoacute por ensayar la voltametriacutea de onda cuadrada para los futuros ensayos de
cuantificacioacuten y los experimentos preliminares procuraron establecer los valores maacutes
convenientes de los paraacutemetros relevantes de la teacutecnica como la amplitud de pulso el
escaloacuten de potencial y la frecuencia (punto 633 seccioacuten Experimentos Auxiliares)
Resultados y Discusioacuten
87
En una segunda serie de ensayos se buscoacute observar la dependencia de la corriente
de pico con la concentracioacuten de glicerol Para esto se realizaron ensayos
independientes En este esquema de trabajo surgioacute un inconveniente respecto del criterio
de medida de la corriente de pico ya que en ensayos independientes no se pudo
establecer una liacutenea de base comuacuten a todos los voltamperogramas
Se ensayaron distintos criterios para determinar una liacutenea de base apropiada como
se detalla en el punto 6331 de la seccioacuten Experimentos Auxiliares y en la Fig 526 se
muestran los voltamperogramas corregidos siguiendo el criterio elegido
Figura 526 Voltamperogramas de onda cuadrada (corregidos) obtenidos utilizando electrodos de pasta
de carbono viacutetreo modificada con GlDH y MWCNT Se muestran los voltagramas de las soluciones
blanco (helliphelliphelliphellip
) glicerol 5 mM (mdash mdash) 125 mM (mdashmdash) 25 mM (diamsdiamsdiams) 36 mM (- - -) y 50 mM (mdash bull mdash)
En la Fig 527 se muestran la dependencia de la corriente de pico con la
concentracioacuten de glicerol obtenida a partir de experimentos exploratorios uacutenicos para
cada concentracioacuten Resta a futuro repetir los experimentos para establecer el error
asociado a la metodologiacutea el intervalo dinaacutemico lineal y el liacutemite de deteccioacuten
Resultados y Discusioacuten
88
Figura 527 Dependencia de la corriente de pico registrada en la VOC en funcioacuten de la concentracioacuten de
glicerol en la celda electroquiacutemica
56 Validacioacuten de meacutetodos
De los meacutetodos desarrollados se seleccionaron aquellos dos que dieron resultados
maacutes fiables meacutetodo amperomeacutetrico utilizando un electrodo de trabajo de oro y el
meacutetodo amperomeacutetrico utilizando el biosensor con GlDH con mediador soluble Se
realizaron ensayos en paralelo con un meacutetodo alternativo ampliamente utilizado en
particular se utilizoacute un equipo comercial que utiliza tres enzimas y deteccioacuten
espectrofotomeacutetrica (Wiener lab) La Fig 528 muestra la concentracioacuten nominal versus
concentracioacuten predicha obtenida por las tres metodologiacuteas ensayando diferentes
diluciones de muestra y graficaacutendose el valor medio de 3 medidas independientes
Nominal mM
00 02 04 06 08 10
Pre
dic
ho
mM
00
02
04
06
08
10
Equipo comercial
Tip Au
Biosensor
Recta identidad
Figura 528 Concentracioacuten nominal vs predicha para las dos metodologiacuteas propuestas en este trabajo de
tesis y un meacutetodo enzimaacutetico disponible comercialmente
0
05
1
15
2
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
[Glicerol] (mM)
Ip (
uA
)
Resultados y Discusioacuten
89
Es evidente que los meacutetodos propuestos se correlacionan adecuadamente con la
recta identidad En la Fig 529 se muestran las tres regiones eliacutepticas de confianza
conjuntas (EJCR) para la pendiente y ordenada al origen En este caso puede apreciarse
que las tres elipses contienen el punto (0 1) lo que indica una buena correlacioacuten entre
los meacutetodos propuestos en el presente trabajo y un meacutetodo disponible comercialmente
Pendiente
08 09 10 11 12
Ord
enad
a al
ori
gen
-06
-04
-02
00
02
04
06
Equipo comercial
Tip Au
Biosensor
Punto (1 0)
Figura 529 Regiones eliacutepticas de confianza conjuntas para dos metodologiacuteas presentadas en este trabajo
de Tesis y un meacutetodo enzimaacutetico disponible comercialmente
En la Tabla 511 se presentan distintas metodologiacuteas publicadas en la literatura
actual en las que se referencia la cuantificacioacuten de glicerol ya sean biosensores
electroquiacutemicos u otra metodologiacutea El anaacutelisis de la Tabla 511 permite ver que la
determinacioacuten de glicerol en medios alcalinos sin presencia de interferentes puede ser
llevada a delante con metodologiacuteas econoacutemicas Debe ser considerado que cuando se
realiza la determinacioacuten de glicerol en muestras de biodiesel dicha cuantificacioacuten
requiere extraer el analito de la matriz como puede verse en los meacutetodos maacutes
recientemente propuestos (Bondioli amp Bella 2005 Silva amp Rocha 2010 Lima y col
2012 Tehrani amp Ghani 2012 Maruta amp Paixao 2012 Lourenccedilo amp Stradiotto 2009
Stradiotto y col 2009) Ya sea que se utilice deteccioacuten espectroscoacutepica o
electroquiacutemica siempre se requiere la extraccioacuten previa a la determinacioacuten del analito
Incluso la propuesta de Fernaacutendez Band y col que es el uacutenico meacutetodo que hace una
diferencia notable al comparar las cifras de meacuterito (LD 04 microM tiempo de anaacutelisis 4
min) implica un pretratamiento de la muestra (Lima y col 2012)
Resultados y Discusioacuten
90
Tabla 511 Comparacioacuten de meacutetodos para cuantificar glicerol propuestos recientemente Adaptado de
Faccendini y col 2014
Meacutetodo (Tratamientos
previos) LD
(microM)
Rango de
linealidad
(M)
Muestra
ensayada
Tiempo de
anaacutelisis
(min)
Reactivos o
accesorios
onerosos Referencia
Espectrofotomeacutetrico
(Extraccioacuten del analito) 22
4 times 10-5
a
2 times10-4
Biodiesel 20 - Bondioli amp
Bella 2005 Espectrofotomeacutetrico
(Extraccioacuten del analito) 10
5 times 10minus5
a
5 times 10minus4
Biodiesel 20 a 30 - Silva amp Rocha
2010
Espectrofluoromeacutetrico
(Extraccioacuten del analito) 04
1 times 10minus6
a
5 times 10minus4
Biodiesel 4 - Lima y
col2012
Espectrofotomeacutetrico
multienzimaacutetico No
informa 2 times 10
minus2 a
1 times 10minus1
Jugo de cantildea 5 GK GPO
ATP Kronka y col
2001
Espectrofotomeacutetrico
multienzimaacutetico 8
8 times 10minus6
a
25 times 10minus4
Suero
Humano 10
GK PK
LDH ATP
NAD+
Li y col 2001
Electroquiacutemico VPD
(Extraccioacuten del analito) 33
5 times 10minus4
a
12 times 10minus2
Biodiesel 15 - Tehrani y
Ghani 2012 Electroquiacutemico VC
(Extraccioacuten del analito) 3
33 times 10minus5
a
17 times 10minus3
Biodiesel 30 FIA Maruta y
Paixao 2012
Electroquiacutemico VC
(Extraccioacuten del analito) 25
33 times 10minus5
a
17 times 10minus3
Biodiesel 20 Cartucho de
C18
Lourenccedilo amp
Stradiotto
2009 Electroquiacutemico
amperomeacutetrico
(Extraccioacuten del analito)
No
informa 16 times 10
minus4 a
16 times 10minus3
Biodiesel 60 - Stradiotto y
col 2009
Electroquiacutemico VL
VPD amperomeacutetrico
(Extraccioacuten del analito) 10
23 times 10minus5
a
23 times 10minus4
Solucioacuten
Acuosa
pH=13 5
MWCNT
funcionalizad
os con Ag
Pop y col 2011
Electroquiacutemico
amperomeacutetrico
(Extraccioacuten del analito) 10
25 times 10minus5
a
20 times 10minus3
Solucioacuten
Acuosa
pH=13 8 -
Este Trabajo
de Tesis
Electroquiacutemico
amperomeacutetrico
(Extraccioacuten del analito) 50
5 times 10minus5
a
23 times 10minus2
Solucioacuten
Tampoacuten
Fosfato
5
(estimados) GO
Goriushnika y
col 2010
Biosensor
amperomeacutetrico 04
10 times 10minus6
a
10 times 10minus4
Jarabe de
cantildea 15
(estimados) GlDH NAD+
Aacutelvarez-
Gonzalez y
col 2000
Biosensor
amperomeacutetrico 04
1 times 10minus6
a
2 times 10minus5
Vino 3 GlDH DP
NAD+ Gamella y
col 2008
Biosensor
amperomeacutetrico 03
1 times 10minus6
a
1 times 10minus5
Vino 3 GK GPO
HRP ATP Gamella y
col 2008 Biosensor
amperomeacutetrico 4
5 times 10minus6
a
1 times 10minus4
Vino 5 GK GPO
ATP Ghica amp Brett
2006
Biosensor
amperomeacutetrico 20
70 times 10minus5
a
18 times 10minus3
Caldo
Middlebrook 10
GlDHb
NAD+ Este Trabajo
de Tesis
Del mismo modo el enfoque de Tehrani y Ghani que utilizan un electrodo de grafito
modificado con nanopartiacuteculas de nickel trabajando a pH = 13 realizan una extraccioacuten
previa de glicerol a partir de muestras de biodiesel (Tehrani amp Ghani 2012) En este
Resultados y Discusioacuten
91
caso el LD fue de 33 microM mientras que en este trabajo de Tesis utilizando el mismo
medio hemos conseguido un LD de 10 microM empleando electrodos de oro policristalino
Maruta y Paixao han propuesto recientemente un meacutetodo amperomeacutetrico usando un
electrodo de cobre que trabaja a 065 V vs AgAgCl adaptado en un sistema de FIA
(Maruta amp Paixao 2012) mientras que Lourenccedilo y Stradiotto informaron sobre un
meacutetodo electroquiacutemico que requiere la extraccioacuten acuosa del glicerol a partir de la
muestra y la purificacioacuten adicional por elucioacuten a traveacutes de un cartucho de C18 seguida
de una concentracioacuten por evaporacioacuten y finalmente un anaacutelisis mediante VC (Lourenccedilo
amp Stradiotto 2009) Tambieacuten otras propuestas informan sobre la determinacioacuten de
glicerol por amperometriacutea haciendo uso de electrodos modificados tales como
electrodos de diamante dopados con boro y modificados con nanopartiacuteculas de niacutequel
(Stradiotto y col 2009) y electrodos compuestos de nanotubos de carbono de pared
muacuteltiple funcionalizados con plata (Pop y col 2011) Si bien ambos meacutetodos se
presentan como uacutetiles se requieren diferentes pasos operativos para eliminar posibles
interferencias tales como otros alcoholes que podriacutean ser oxidados a los potenciales de
trabajo 065 V o 130 V (vs AgAgCl) respectivamente En este sentido nuestros
resultados obtenidos por amperometriacutea usando electrodos de oro en medio alcalino
acuoso (pH = 13) estaacuten en el mismo orden que los obtenidos por Pop y colaboradores
utilizando LSV (Pop y col 2011) sobre electrodos compuestos de nanotubos de
carbono de pared muacuteltiple funcionalizados con plata Efectivamente este uacuteltimo y
nuestra metodologiacutea mostraron las mejores cifras de meacuterito entre los meacutetodos
electroquiacutemicos de bajo costo que no consumen enzimas
Los meacutetodos enzimaacuteticos espectrofotomeacutetricos aunque no son laboriosos presentan
la desventaja del consumo relativamente elevado de enzima cada muestra necesita la
adicioacuten del costoso reactivo bioloacutegico ya que no puede ser reutilizado Tambieacuten los LD
de los meacutetodos espectrofotomeacutetricos enzimaacuteticos informados son generalmente
superiores a los que presentan los biosensores Puede antildeadirse que estos uacuteltimos
presentan generalmente el intervalo dinaacutemico lineal maacutes amplio en comparacioacuten con
otros enfoques ya sean electroquiacutemicos o espectrofotomeacutetricos Soacutelo la metodologiacutea de
flujo discontinuo con deteccioacuten fluoromeacutetrica propuesta por Fernaacutendez Band y col
(Lima y col 2012) muestra una sensibilidad en el mismo orden que el maacutes bajo de los
biosensores
En el anaacutelisis de los biosensores que se muestran en la Tabla 511 hay que destacar
que el propuesto por Pingarroacuten y col (Gamella y col 2008) muestra el LD y tiempo de
Resultados y Discusioacuten
92
anaacutelisis total maacutes bajo Para evaluar costos operativos se presenta en la Tabla 512 un
resumen comparativo de la cantidad y concentracioacuten de los reactivos onerosos
consumidos por biosensor o por anaacutelisis entre la propuesta de Pingarroacuten y col y la del
biosensor aquiacute propuesto
Tabla 512 Comparacioacuten entre el meacutetodo enzimaacutetico que mejores cifras de meacuterito presenta y el propuesto
en el presente trabajo de Tesis Adaptado de Faccendini y col 2014
GlDH
bisosensor Diaforasa
biosensor tetratiofulvaleno
biosensor NAD
+ por
anaacutelisis
Gamella y
col 2008 75 U 162 U 15x10-6
M 5x10-3
M Este Trabajo
de Tesis 23 U - - 5x10-4
M
Podemos afirmar que nuestra propuesta es menos costosa hecho importante a ser
evaluado cuando se va a analizar un gran nuacutemero de muestras Mediante la reduccioacuten de
la cantidad de GlDH el LD se elevoacute desde 04 hasta 20 microM aunque es adecuado auacuten
para detectar cambios de concentracioacuten de glicerol en el orden de 15 microM Al mismo
tiempo evitando el uso de diaforasas el tiempo total de anaacutelisis se extendioacute de 3 a 10
min En conjunto los resultados presentados confirman que los cambios introducidos a
los biosensores informados previamente en la literatura tales como el uso de soacutelo una
enzima en baja proporcioacuten la sustitucioacuten del mediador redox por el ferricianuro soluble
y trabajar con el cofactor NAD+ soluble proporciona un sistema fiable de bajo costo
para cuantificar el glicerol
Experimentos Auxiliares
Experimentos Auxiliares
94
6 Experimentos Auxiliares
61 Comparacioacuten de programas de prediccioacuten de epiacutetopes lineales reconocidos
por ceacutelulas B
AAPPred BcePred ABCPred BepiPred y Antigenic se ejecutaron en liacutenea En la
Tabla 61 se muestran los VPP medios (ver definicioacuten en seccioacuten Materiales y Meacutetodos
pag 11) que se obtuvieron al predecir epiacutetopes lineales reconocidos por ceacutelulas B de
todas las proteiacutenas enumeradas en la Tabla 62
Los resultados obtenidos indican que BcePred es el uacutenico programa de los
evaluados que muestra un VPP inferior al obtenido con la prediccioacuten al azar Tambieacuten
se obtuvo que soacutelo dos de los programas estudiados AAPPred y ABCpred predijeron
epiacutetopes con un VPP significativamente mayor al valor de VPP de un procedimiento de
identificacioacuten aleatoria Estos dos programas produjeron predicciones con valores
maacuteximos de 862 y 786 de VPP respectivamente
Tabla 61 Valores predictivos positivos promedio que se obtuvieron con cada uno de los programas
predictores con los que se trabajoacute
Programa
VPP
promedio
AAPPred 691
ABCPred 628
BcePred 309
BepiPred 453
Antigenic 419
Aleatorio 382
En base a estos resultados se trabajoacute con el programa AAPPred y se identificaron
las regiones que concentraban el mayor nuacutemero de epiacutetopes reconocidos por ceacutelulas B
de las proteiacutenas P22 P30 y P35 con el fin de expresar estos Angs como proteiacutenas
recombinantes y utilizarlos en el desarrollo de meacutetodos de diagnoacutestico de la
toxoplasmosis aguda
Experimentos Auxiliares
95
Tabla 62 Base de datos experimental proteiacutenas seleccionadas para este estudio Se indican el nombre de
la proteiacutena el coacutedigo de acceso NCBI la longitud total (en residuos de amino aacutecidos) el
nuacutemero de epiacutetopes reales determinados experimentalmente y la localizacioacuten de los epiacutetopes o
regiones antigeacutenicas Proteiacutenas tomadas de base de datos (A) BciPep (B) VIH Inmunologiacutea
Molecular base de datos o tomado de la literatura (veacutease el nuacutemero de referencia 17 para VP1
16 para la proteiacutena N y 18 para gliadina)
Proteiacutena
Coacutedigo
NCBI
Nordm de
residuos
Cantidad de
epiacutetopes
Localizacioacuten de los epiacutetopes o regiones
antigeacutenicas
MPT70 (A) NP_217391 193 2 31-70 100-120
MSP-1 (A) BAF622801 1693 3 29-39 1594-1611 1644-1662
Exotoxina
A (A) NP_249839 638 8
297-313 324-333 354-387 412-421 510-522
528-539 557-593 596-638
GAG1 (A) P20873 504 10
11-25 113-122 142-156 176-214 216-268
280-308 312-321 330-367 406-416 428-448
Gp160 (A) NP_057856 856 13
30-141 161-191 211-231 252-281 294-344
346-413 424-511 525-558 561-615 639-701
724-747 761-778 822-855
Pr55 (B) NP_579876 132 2 11-38 51-78
Rev (B) NP_057854 116 4 5-15 32-51 70-91 96-116
VP1 (17) ABC87248 781 12
31-41 55-65 85-95 151-161 292-392 316-326
493-500 529-539 547-554 571-578 667-707
712-722
Gliadin
(18) A27319 296 3 31-72 165-176 237-264
Proteiacutena N
(16) AAP13445 422 6 1-6 45-61 153-192 211-223 225-235 354-412
Proteasa
(B) CAB66012 99 2 1-7 36-47
62 Puesta a punto de ensayos de inmunoabsorcioacuten ligados a enzima con
deteccioacuten fotomeacutetrica
Previo al inicio de los ELISA de captura iniciamos una serie de pruebas preliminares
con el propoacutesito de
a) Diferenciar sueros de pacientes infectados de sueros de individuos sin infeccioacuten De
este modo se pretende verificar la potencial utilidad en diagnoacutestico de los antiacutegenos
propuestos corroborando que los procesos quiacutemicos llevados a cabo como por ej la
conjugacioacuten no eliminaron epiacutetopes claves
Experimentos Auxiliares
96
b) Minimizar la sentildeal en los ensayos sin suero (blanco de reactivos) es decir
disminuir el ruido de fondo asociado a interacciones inespeciacuteficas
A tales fines se realizaron ELISA indirectos utilizando los antiacutegenos recombinantes
obtenidos (marcados y sin marcar) adsorbidos sobre la placa se utilizaron sueros
tipificados y se reveloacute la presencia de IgG humana revelando con anticuerpos de cabra anti
IgG humana Los resultados obtenidos se detallan en la siguiente tabla
Tabla 63 Valores de absorbancia a 450 nm obtenidos en ELISA indirectos con deteccioacuten de IgGh con
conjugado anti IgG humana-HRP
Sueros P22C P22C-
biotina P35B
P35B -
biotina
Positivos
2 gt3 26 1900
3 2900 2 gt3
gt3 gt3 26 gt3
Negativos
13 1000 11 0800
06 0500 09 0700
11 1600 1 1000
Si bien los valores de absorbancia leiacutedos en todos los pocillos resultaron elevados
los sueros confirmados positivos dieron los valores maacutes altos de absorbancia mientras
que los sueros negativos dieron los valores maacutes bajos Las diferencias observadas entre
sueros confirmados positivos y sueros confirmados negativos permitieron asumir que
los antiacutegenos obtenidos son de posible utilidad en diagnoacutestico Ademaacutes no se
detectaron diferencias significativas entre los valores de absorbancia obtenidos
utilizando antiacutegenos marcados de aquellos obtenidos con los no marcados
permitieacutendonos pensar que la conjugacioacuten llevada a cabo no eliminoacute epiacutetopes claves
Los elevados valores de absorbancia obtenidos en este ensayo junto a otros estudios
preliminares sugieren que existe una elevada adsorcioacuten inespeciacutefica
621 Bloqueante a utilizar
Se ensayaron diversos agentes bloqueantes para minimizar las interacciones
inespeciacuteficas encontradas durante los experimentos preliminares y asiacute evitar las altas
sentildeales obtenidas en los ensayos control realizados sin suero (blanco de reactivos) y con
sueros confirmados negativos (blancos de muestra) Sobre placas comerciales de
poliestireno se procedioacute al bloqueo total con el agente bloqueante a ensayar y
posteriormente se realizoacute una incubacioacuten con y sin antiacutegeno P22C por duplicado
Finalmente se reveloacute con la enzima HPR-EAV que se une especiacuteficamente a biotina En
la Tabla 64 se muestran los valores de absorbancia a 450 nm
Experimentos Auxiliares
97
Tabla 64 Valores promedio de absorbancia a 450 nm obtenidos en los ensayos de bloqueo
450 nm Sin P22cBiot Con P22cBiot
Sin Bloqueante ------- 1162
Leche 1 0066 01445
Caseinato 1 00725 02425
Gelatina 1 00725 03925
BSA 1 00625 0192
BSA 1 Tween 002 00615 01515
En base a estos resultados se continuoacute con el uso de leche descremada como agente
bloqueante
622 Esquema A
Cuando se realizaron ELISA siguiendo el esquema A se ensayaron dos diluciones
de la HRP-EAV 12000 y 15000 Por otro lado se ensayaron distintas masas de
antiacutegenos P22C y P35B conjugados a biotina con los que se intentoacute revelar presencia
de IgM especiacuteficas Especiacuteficamente se ensayaron 2 02 y 002 g por pocillo de P35B
biotina y 5 2 02 y 002 g por pocillo de P22C biotina Con esto se buscoacute encontrar
las cantidades oacuteptimas de reactivos para poder llevar adelante estos ensayos A modo
ilustrativo en la Tabla 65 se muestra un ensayo representativo siguiendo el esquema A
Se informan solamente los valores de absorbancia a 450 nm obtenidos para sueros
provenientes de pacientes con infeccioacuten croacutenica (croacutenicos) aguda (agudos) y de
pacientes sin infeccioacuten (negativos)
Tabla 65 Valores de absorbancia a 450 nm obtenidos en ELISA siguiendo el esquema A Se muestran 3
cantidades de antiacutegeno revelador utilizadas 2 02 y 002 microg En este ensayo la dilucioacuten de la
enzima HRP-EAV fue 15000 y se utilizaron 100 microL por pocillo
Antiacutegenos
Sueros
P22C biotina ( g) P35B biotina ( g)
2 02 002 2 02 002
Negativos 0576 0294 0155 1071 0681 0566
0543 0335 0176 1079 0769 023
Croacutenicos 0469 0246 0135 103 069 0299
0514 0215 0111 0914 0567 0196
Agudos 0331 0181 0109 081 0574 0168
0555 0254 0139 0789 0391 0169
Experimentos Auxiliares
98
623 Esquema B
Cuando se realizaron ELISAs siguiendo el esquema B se ensayaron distintas masas
de antiacutegeno P22C y P35B absorbidas sobre las microplacas comerciales a saber 500
200 50 10 o 5 ng (disueltos en 100 L de solucioacuten tampoacuten carbonato pH 96) En todos
los casos se incuboacute 1h a 37 degC
Para la incubacioacuten con la proteiacutena conjugada a biotina se ensayaron 2 y 5 ug por
pocillo En la Tabla 66 se resumen los resultados obtenidos
Tabla 66 Valores de absorbancia a 450 nm obtenidos en ELISA siguiendo el esquema B Se muestran
los resultados obtenidos para dos cantidades distintas de antiacutegeno de captura (P22C) 10 y 50
ng junto a 2 cantidades de antiacutegeno revelador (P22C-biotina) utilizadas 2 y 5 microg En este
ensayo la dilucioacuten de la enzima HRP-EAV fue 12000 y se utilizaron 100 microL por pocillo
2 microg P22C biotina 5 microg P22C biotina
Masa de P22C
(ng)
Muestras
50 10 50 10
Agudos 0393 0303 0553 0450
0273 0335 0793 0367
Croacutenicos 0230 0398 0316 0345
0284 0291 0444 0493
Negativos 0392 0210 0380 0380
0286 0292 0314 0350
Sin suero 0367 0468 0415 0411
0327 0358 0468 0536
Sin Prot conjugada a
biotina ni sueros
0102 0087 0128 0079
0131 0095 0116 0104
Los resultados obtenidos indicaron que para lograr una mejor discriminacioacuten de las
muestras es conveniente utilizar mayor cantidad de masa de antiacutegeno de captura (P22C)
depositada en el pocillo Por otro lado 5 microg de antiacutegeno revelador (P22C-biotina) por
pocillo contribuyoacute a aumentar la discriminacioacuten entre las muestras sin incrementar
significativamente el ruido de fondo
Experimentos Auxiliares
99
63 Ensayos electroquiacutemicos
631 Determinacioacuten del aacuterea real de un electrodo
6311 Meacutetodo de la adsorcioacuten de O2
Se realizaron barridos de potencial como se indica en el punto 41931 de la
seccioacuten Materiales y Meacutetodos La Fig 61 muestra un voltamperograma tiacutepico obtenido
Con el valor de la carga asociada a la desorcioacuten del oacutexido de oro pudo determinarse el
valor de aacuterea electroactiva del electrodo de trabajo utilizado como se indica en el punto
41931
E V
04 06 08 10 12 14 16
I
A
-15e-5
-10e-5
-50e-6
00
50e-6
Figura 61 Voltamperograma ciacuteclico tiacutepico obtenido con electrododos de oro en medio H2SO4 05 M
velocidad de barrido 50 mV s-1
Se indica en color turquesa el pico de desorcioacuten del oacutexido de oro la carga
(Q) obtenida del aacuterea encerrada en la curva se utilizoacute para determinar el aacuterea real de los electrodos de oro
previamente a los ensayos
6312 Voltametriacutea ciacuteclica a distintas velocidades
Se realizaron barridos de potencial a distintas velocidades como se indica en el
punto 41932 de la seccioacuten Materiales y Meacutetodos La Fig 62 muestra los voltagramas
tiacutepicos obtenidos en (A) y en (B) la dependencia de la corriente de pico Ip con la raiacutez
cuadrada de la velocidad de barrido Con el valor de la pendiente de la recta obtenida
por regresioacuten lineal pudo determinarse el valor de aacuterea electroactiva del electrodo de
trabajo utilizado como se indica en el punto 41932 habieacutendose utilizado un
coeficiente de difusioacuten del Fe(CN)63-
de 0762 cm2 s
-1 (Sawyer amp Roberts 1974)
Experimentos Auxiliares
100
E V
-02 -01 00 01 02 03 04 05 06
I
A
-20e-4
-10e-4
00
10e-4
20e-4
Figura 62 A) Voltametriacuteas ciacuteclicas de Fe(CN)63 1 mM en medio KCl 01 M a distintas velocidades de
barrido utilizando como electrodo de trabajo el biosensor amperomeacutetrico para evaluacioacuten de infeccioacuten
toxoplaacutesmica La flecha indica la direccioacuten de barrido B) Dependencia de Ip (en valores absolutos) con la
raiacutez de la velocidad de barrido el valor de pendiente de la recta de regresioacuten se utilizoacute para determinar el
aacuterea real del electrodo de trabajo
632 Cubierta del biosensor selectivo para glicerol y soluciones amortiguadoras
Se ensayaron distintos poliacutemeros para cubrir el biosensor de pasta de carbono B
utilizamos poliacutemeros de 4-vinilbenzilimine copolimerizados con cloruro de 4-
vinilbencil-trietilamonio y sulfonato de vinilfenilo (portadores de carga neta positiva y
negativa respectivamente) Si bien los poliacutemeros permitiacutean operar con complejos de
hierro utilizados como mediadores redox (Fe(CN)63-
y ferrocenometanol) no resultaron
uacutetiles en el ensamblado del biosensor por el elevado ruido de fondo que generaron
Se evaluaron distintas soluciones amortiguadoras de pH como fosfatos y
amoniacuteacoamonio Se optoacute por las soluciones de carbonato porque estas resultaron maacutes
sencillas de preparar y manipular que las amoniacales y presentaron mayor capacidad
reguladora en el pH oacuteptimo de la enzima GlDH que las de fosfato
633 Ensayos preliminares de voltametriacuteas de onda cuadrada
Los ensayos preliminares de voltametriacutea de onda cuadrada consistieron en
establecer los valores maacutes convenientes de la amplitud de pulso el escaloacuten de potencial
y la frecuencia para los futuros ensayos de cuantificacioacuten Se realizaron los voltagramas
en tres series de ensayos a seis valores de frecuencia 10 20 30 40 60 y 70 Hz
Los valores de salto de potencial ( ES) y amplitud de pulso ( E) utilizados en las
tres series de ensayos realizados se resumen en la siguiente tabla
(velocidad barrido)12 V12 s-12
006 008 010 012 014 016 018 020 022 024
Ip
A
40e-5
60e-5
80e-5
10e-4
12e-4
14e-4
16e-4
18e-4
20e-4
Experimentos Auxiliares
101
Tabla 67 Valores de salto de potencial y amplitud de onda cuadrada utilizados en los ensayos
voltameacutetricos
Serie 1 Serie 2 Serie 3
ES (mV) 5 5 10
E (mV) 25 50 50
En las 3 series de ensayos se observoacute que al aumentar la frecuencia la corriente de
pico no se incrementaba y el pico de corriente se deformaba aumentando
considerablemente el ruido Las mejores relaciones sentildealruido en las tres series de
ensayos se obtuvieron trabajando a 10 Hz Por su parte cuando se utilizoacute un escaloacuten de
potencial de 10 mV el pico de corriente se deformoacute levemente por lo que se optoacute por
trabajar con un ES = 5 mV Cuando la amplitud del pulso fue 50 mV se obtuvieron
mayores intensidades de corriente sin deformacioacuten de pico escogieacutendose en
consecuencia este valor En la Fig 63 se muestran los voltamperogramas obtenidos en
los ensayos de la serie 2 a una frecuencia de 10 Hz
Figura 63 Voltagramas de onda cuadrada obtenidos utilizando bioelectrodos de pasta de carbono viacutetreo
modificada con GlDH y MWCNT En liacutenea clara se muestra el voltagrama de la solucioacuten NAD+ 05 mM
(NH4)2SO4 25 mM K2CO3 KHCO3 100 mM pH 105 con medio Middelbrook 7H9 Superpuestos se
detallan los voltagramas de la misma solucioacuten luego del agregado de glicerol 100 M para llevar a
concentracioacuten final 25 mM (- - -) y 50 mM (____
)
6331 Seleccioacuten de un meacutetodo apropiado para establecer la liacutenea de base
Se buscoacute establecer una liacutenea de base para corregir los voltagramas obtenidos
utilizando algoritmos presentes en el programa GPES Se intentoacute con algoritmos de
correccioacuten que permiten establecer una liacutenea polinoacutemica ad-hoc para cada voltagrama
utilizando entre 2 y 5 puntos de la curva experimental Sin embargo las sentildeales
corregidas presentaban picos de corrientes con valores de ancho a la altura media Wfrac12
entre 0180 y 0220 V valores que resultan elevados comparados con 0123 Vn el valor
de referencia para este paraacutemetro en VOC donde n es el nuacutemero de electrones
Experimentos Auxiliares
102
intercambiados en la reaccioacuten Finalmente a cada VOC se les restoacute la VOC del blanco
buscaacutendose el pico de corriente con un algoritmo de buacutesqueda semiautomaacutetica del
programa GPES con una liacutenea de base recta y marcando manualmente el inicio y final
del pico establecieacutendose los mismos valores de potencial de inicio y finalizacioacuten del
pico de corriente en todos los voltamperogramas De este modo se obtuvieron picos
cuyos Wfrac12 eran proacuteximos al valor teoacutericamente predicho
Conclusiones
Conclusiones
104
7 Conclusiones
1- Se pudo encontrar cual de los programas de libre acceso para predecir epiacutetopes
lineales reconocidos por ceacutelulas B es el maacutes conveniente al momento de seleccionar
antiacutegenos con fines diagnoacutesticos
2- Se pudieron clonar expresar en forma soluble y marcar con biotina fragmentos
de antiacutegenos de toxoplasmosis de fase aguda que presentan alta concentracioacuten de
determinantes antigeacutenicos
3- Se verificoacute la utilidad de los antiacutegenos obtenidos para su posterior uso en el
ensamblado de bioelectrodos para diagnoacutestico de infeccioacuten aguda de toxoplasmosis
4- Se pudo cuantificar glicerol en muestras sencillas con un electrodo versaacutetil de
oro policristalino por medio de una metodologiacutea amperomeacutetrica a 01 V en medio
NaOH 01 M y con un tiempo de anaacutelisis de 8 min liacutemite de deteccioacuten 10 microM y un
intervalo de linealidad de 0024 a 200 mM
5- Se pudo cuantificar glicerol en medios de cultivo de micobacterias El meacutetodo
consiste en una amperometriacutea que emplea un bioelectrodo selectivo para glicerol
compuesto de pasta de C modificada con glicerol deshidrogenasa y lleva un tiempo de
anaacutelisis de 10 min liacutemite de deteccioacuten 20 microM y un rango de linealidad de 0060 a 175
mM Este meacutetodo podriacutea en un futuro ser uacutetil para identificar muestras de pacientes con
tuberculosis activa en un menor tiempo de anaacutelisis al actualmente empleado
6- Los meacutetodos para cuantificar glicerol aquiacute presentados fueron validados frente
a un equipo enzimaacutetico disponible comercialmente
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