desarrollo de metodos por hplc
Post on 13-Apr-2018
217 Views
Preview:
TRANSCRIPT
-
7/27/2019 Desarrollo de Metodos Por HPLC
1/60
1
QUANTAR ; Laboratorio de Anlisis Qumico Especializado
-
7/27/2019 Desarrollo de Metodos Por HPLC
2/60
-
7/27/2019 Desarrollo de Metodos Por HPLC
3/60
3
QUANTAR ; Laboratorio de Anlisis Qumico Especializado
La cromatografa Lquida de Alta Eficiencia es la tcnicacon mayor mercado en el mundo instrumentalanaltico gracias a su versatilidad, excelente capacidadpara el anlisis de trazas, rapidez y adaptabilidad.
-
7/27/2019 Desarrollo de Metodos Por HPLC
4/60
4
QUANTAR ; Laboratorio de Anlisis Qumico Especializado
Limitaciones del HPLC : Falta de operadoresexperimentados.
Razones :
-Escaso entrenamiento en las universidades (costos deequipos y escasa experiencia de la mayora de losprofesores).
-Pocas personas interesadas en aprendercromatografa.
- Poca oportunidad practica de contacto con la tcnica.
-
7/27/2019 Desarrollo de Metodos Por HPLC
5/60
-
7/27/2019 Desarrollo de Metodos Por HPLC
6/60
6QUANTAR ; Laboratorio de Anlisis Qumico Especializado
-
7/27/2019 Desarrollo de Metodos Por HPLC
7/60
7
QUANTAR ; Laboratorio de Anlisis Qumico Especializado
Tiempo de retencin. Tiempo que
transcurre desde la inyeccin de lamuestra hasta que el soluto alcanza eldetector( tambin Ve, Te Tr)
Tiempo muerto. Tiempo necesariopara que una especie que no seretiene en la fase estacionariaalcance el detector (tambin Vm).
CROMATOGRAMA
Lnea base. Seal de la fase mvil
Ancho del pico en la base.
Medida del tiempo endonde se inicia la salida dela seal hasta dondetermina sta.
-
7/27/2019 Desarrollo de Metodos Por HPLC
8/60
8
QUANTAR ; Laboratorio de Anlisis Qumico Especializado
Longitudde la
columnaAltura equivalente del plato (HEPT) H = L
N
Es el sitio de interaccin donde se consigue un equilibrio transitorio deleluato entre la fase estacionaria y la fase mvil.
-
7/27/2019 Desarrollo de Metodos Por HPLC
9/60
9
QUANTAR ; Laboratorio de Anlisis Qumico Especializado
As10% =b/a
Ideal = 1Aceptable = 0.8 a 1.3
10% Altura
-
7/27/2019 Desarrollo de Metodos Por HPLC
10/60
10
QUANTAR ; Laboratorio de Anlisis Qumico Especializado
-
7/27/2019 Desarrollo de Metodos Por HPLC
11/60
11
QUANTAR ; Laboratorio de Anlisis Qumico Especializado
k = Nmero de moles de soluto en la fase estacionariaNmero de moles de soluto en la fase mvil
-
7/27/2019 Desarrollo de Metodos Por HPLC
12/60
12
QUANTAR ; Laboratorio de Anlisis Qumico Especializado
-
7/27/2019 Desarrollo de Metodos Por HPLC
13/60
13
QUANTAR ; Laboratorio de Anlisis Qumico Especializado
Procedimientos empricos = interminables ensayos de prueba y error.
Ejemplos de resultados :
- kmuy prximo a cero- Tailing > 2.0
- Cromatogramas con amplios sectores vacios separando bandasparcialmente solapadas.
- Ninguna documentacin de los ensayos realizados- etc
1. Intentar separacin por fase reversa regular2. Intentar por apareamiento inico3. Probar con diferentes columnas4. Modificar pH, temperatura, , etc.
-
7/27/2019 Desarrollo de Metodos Por HPLC
14/60
14
QUANTAR ; Laboratorio de Anlisis Qumico Especializado
Pico 1
Pico 2
Pico 3
Pico 4
20 min.5 min. 15 min.
-
7/27/2019 Desarrollo de Metodos Por HPLC
15/60
15
QUANTAR ; Laboratorio de Anlisis Qumico Especializado
Procedimientos sistemticos = Lgica y sentido comn (Bases tericas)
Reduccin de tiempos y costos !!
Pico 1
Pico 2
Pico 3
Pico 4
20 min.15 min.5 min.
Pico 1
Pico 2
Pico 3
Pico 4
20 min.5 min. 15 min.
-
7/27/2019 Desarrollo de Metodos Por HPLC
16/60
16
-
7/27/2019 Desarrollo de Metodos Por HPLC
17/60
17
QUANTAR ; Laboratorio de Anlisis Qumico Especializado
Objetivos :
- Screening, identificacin o cuantificacin ?
- Nivel de concentracin (macro o microcomponentes) ?
- Precisin requerida ?
- Ncomponentes a valorar ?
- Nmuestras a procesar ?
- Nivel de tecnologa disponible ?
- Operadores (habilidades, experiencia, capacitacin)
-
7/27/2019 Desarrollo de Metodos Por HPLC
18/60
18
QUANTAR ; Laboratorio de Anlisis Qumico Especializado
Informacin Sobre la Muestra :
- Identidad de componentes de inters
- Rango de pesos moleculares
- Estructura qumica, pKa, solubilidad, espectros UV
- Concentracin de los componentes de inters
- Naturaleza de la matriz ( producto natural, muestra biolgica, tabletas, etc.)
-
7/27/2019 Desarrollo de Metodos Por HPLC
19/60
19
QUANTAR ; Laboratorio de Anlisis Qumico Especializado
Definicin del Sistema Preliminar :
- Preparacin de la muestra :SolubilizacinExtraccin
PreconcentracinDerivatizacin
- Detector a utilizar :IRUV/VISConductividadElectroqumicoFluorescencia
- Peso molecular del analito (WM > 2000 Daltons WM < 2000 Daltons ?)
-
7/27/2019 Desarrollo de Metodos Por HPLC
20/60
20QUANTAR ; Laboratorio de Anlisis Qumico Especializado
Definicin del Sistema Preliminar :
- Mtodo cromatogrfico para molculas con WM > 2000 Daltons :Aplicacin en anlisis de Pptidos, Protenas, Polinucletidos, etc.
Primer alternativa :- Exclusin por tamao o SEC (GPC, GFC)
Otras alternativas :- C. Afinidad (anticuerpos, hormonas, etc. como fase estacionaria)- C. Intercambio Inico o IEC ( intercambiadores dbiles WAX y WCX o fuertes
SAX y SCX sobre base Slica o polimrica)- Interaccin hidrofbica, IEC, RP- Fase reversa (Partculas de 300 a 1000 )
-
7/27/2019 Desarrollo de Metodos Por HPLC
21/60
21
QUANTAR ; Laboratorio de Anlisis Qumico Especializado
Definicin del Sistema Preliminar :
-Mtodo o forma cromatogrfica para molculas con WM < 2000 Daltons :
a. Soluble en solventes orgnicos:- Slica gel no modificada- Fase normal (NP-BPC)- Fase reversa (RP-BPC)
b. Soluble en agua :- InicoIPC, IEC- No InicoNP, RP
-
7/27/2019 Desarrollo de Metodos Por HPLC
22/60
Compuestos Mtodo Columna Fase mvil y Aditivos
NeutrosNo inicos
RP C8 - C18Phe - CN
Aguamodificador(MeOH, AcN, THF)
Acidos dbiles RP Control de laIonizacion
C8 - C18Phe - CN
AguamodificadorAcido Fosfrico a pH 3.0 a 3.5
Bases dbiles RP C8 - C18Phe - CN
Aguamodificador30mM Trietilamina
Inicos e Ionizables RP de Apareamiento
ionico
Preferida C18
Alternativa C8 -CN
AguaMeOH
Alquilsulfonatos pH 3.5 (bases)Tetraalquilamonio pH 7.5 (cidos)
Lipoflicos insoluble en solventeshidroalcoholicos
NP CNNH2Silica
Solventes polares
Iones inorgnicos, Aminocidos, Pptidos,derivados de Acidos nucleicos
IEC SAXSCXBase silica opolimerica
AguamodificadorpH controlado
Fuerza inica controlada
Macromoleculas SEC
IEC
Base silica o
polimerica
Acuosos (GFC)
Orgnicos (GPC)
EstereoismerosIsmeros de posicin
NP Silica Solventes no polares
Enantimeros (Ismeros pticos) RPColumna Quiral
Quirales C18 AcuososCompuestos Quirales
Carbohidratos Columna Amino NH2 Agua - modificador
22
-
7/27/2019 Desarrollo de Metodos Por HPLC
23/60
23
-
7/27/2019 Desarrollo de Metodos Por HPLC
24/60
24
QUANTAR ; Laboratorio de Anlisis Qumico Especializado
A. Determinar longitud de onda de trabajo (Deteccin UV) :
- Mximo de absorcin-Normalmente 190 a 210 nm 254nm para muestras desconocidas.
B. Concentracin de muestra y volumen de inyeccin :
-Hasta 100 g en 20 l.
C. Control del flujo, presin y tiempo de corrida :
-
7/27/2019 Desarrollo de Metodos Por HPLC
25/60
25
QUANTAR ; Laboratorio de Anlisis Qumico Especializado
D. Determinar tipo y caractersticas de columna :
- Forma y dimetro de partcula
- Longitud de Columna
-
7/27/2019 Desarrollo de Metodos Por HPLC
26/60
26
QUANTAR ; Laboratorio de Anlisis Qumico Especializado
- Longitud y tipo de fase ligada C4, C8, C18, CN, Phe
Bondapak CN
Bondapak Phe
Bondapak C18
-
7/27/2019 Desarrollo de Metodos Por HPLC
27/60
27
QUANTAR ; Laboratorio de Anlisis Qumico Especializado
- Y la Marca (Fabricante ) ??
-
7/27/2019 Desarrollo de Metodos Por HPLC
28/60
28
QUANTAR ; Laboratorio de Anlisis Qumico Especializado
E. Establecer fase mvil de partida :
- Tipo de modificador orgnico (MeOH, ACN, THF)- Proporcin modificador : agua (%)
- pH y aditivos- Modo Isocrtico vs Gradiente
-
7/27/2019 Desarrollo de Metodos Por HPLC
29/60
29
QUANTAR ; Laboratorio de Anlisis Qumico Especializado
- Determinacin del tipo de modificador orgnico:
-
7/27/2019 Desarrollo de Metodos Por HPLC
30/60
30
QUANTAR ; Laboratorio de Anlisis Qumico Especializado
Propiedades de solventeshabituales de HPLC
-
7/27/2019 Desarrollo de Metodos Por HPLC
31/60
31
QUANTAR ; Laboratorio de Anlisis Qumico Especializado
- Determinacin de la proporcin agua - modificador orgnico:
1. Comenzar con concentracin media de modificador ?2. Comenzar con concentracin alta de modificador ?
3. Realizar gradiente (Lineal 0 100% de modificador) y calcular composicinpara corrida socrtica ?.
-
7/27/2019 Desarrollo de Metodos Por HPLC
32/60
32
QUANTAR ; Laboratorio de Anlisis Qumico Especializado
- Determinacin de la proporcin agua - modificador orgnico:
-
7/27/2019 Desarrollo de Metodos Por HPLC
33/60
QUANTAR ; Laboratorio de Anlisis Qumico Especializado
33
. Ejercicio!
-
7/27/2019 Desarrollo de Metodos Por HPLC
34/60
34
-
7/27/2019 Desarrollo de Metodos Por HPLC
35/60
35
QUANTAR ; Laboratorio de Anlisis Qumico Especializado
-Regulacin del pH de la fase mvil : Supresin Inica (Control de la Ionizacin)
a. Compuestos neutros (No ionizables)b. Compuestos cidos o bsicos (Control de la ionizacin)
AH A- + H+
B + H2O BH+ + OH-
pH = pKa + log Cs/ Ca
Cuidado con
la columna !!
-
7/27/2019 Desarrollo de Metodos Por HPLC
36/60
36QUANTAR ; Laboratorio de Anlisis Qumico Especializado
-
7/27/2019 Desarrollo de Metodos Por HPLC
37/60
37QUANTAR ; Laboratorio de Anlisis Qumico Especializado
- Mejorando el Tailing : (Columnas con base de Slica)
Muestra : Base NitrogenadaConc. : 0.05 y 5.0 mg/mlColumna : C18F.M. : Buffer MeOH (1:3)pH = 7.0Flujo : 1.0 ml/min.
Muestra : Base NitrogenadaConc. : 0.05 y 5.0 mg/mlColumna : C18F.M. : Buffer MeOH (2:3)con TEA 30mMpH = 3.0Flujo : 1.0 ml/min.
-
7/27/2019 Desarrollo de Metodos Por HPLC
38/60
38QUANTAR ; Laboratorio de Anlisis Qumico Especializado
F. Resultados no satisfactorios ? Cromatografa de apareamiento inico (IPC)
Limitaciones :
- Generalmente uso de columnas C18.- Principal modificador orgnico es MeOH. Solvente con mayor poder dedisolucin de sales.
- Los contraiones de apareamiento (alquilsulfonatos, tetraalquilamonio) sondifciles de remover. Modifican la selectividad de la columna.
-Las sales de tetraalquilamonio, complejan la silica gel aumentando susolubilidad especialmente a pH alcalino.
-
7/27/2019 Desarrollo de Metodos Por HPLC
39/60
39QUANTAR ; Laboratorio de Anlisis Qumico Especializado
- Condiciones en Cromatografa de apareamiento inico (IPC)
Para Bases :
Fase mvil : aguaMeOH (20:80) + Hexanosulfonato de sodio 5mM
pH : 3.0 - 4.0 con buffer 0.050.1M Fosfrico/Fosfato de amonioReducir proporcin de Metanol hasta conseguir separacin manteniendoconstantes el pH y la concentracin del contrain.
Para cidos :
Fase mvil : aguaMeOH (20:80) + Hidrxido de tetrabutil amonio 5mMpH : 7.07.5 con buffer de fosfatosReducir proporcin de Metanol hasta conseguir separacin manteniendoconstantes el pH y la concentracin del contrain.
-
7/27/2019 Desarrollo de Metodos Por HPLC
40/60
40QUANTAR ; Laboratorio de Anlisis Qumico Especializado
G. Realizar inyecciones de prueba :
1. Inyectar estndar de analito (puede ser materia prima)2. Inyectar cantidad suficiente para diferenciar de picos de posibles impurezas.3. Reducir cantidad inyectada hasta tener una respuesta menor a 0.5UA para asegurar
trabajar dentro del rango lineal del detector UV, aunque esto deber verificarsedurante la validacin.
+
Respuesta
Tiempo
-
7/27/2019 Desarrollo de Metodos Por HPLC
41/60
41
-
7/27/2019 Desarrollo de Metodos Por HPLC
42/60
42QUANTAR ; Laboratorio de Anlisis Qumico Especializado
Una vez establecido un sistema apropiado
(columna, solvente, parmetrosinstrumentales), se tiene un mtodopreliminar que deber optimizarse para
mejorar al mximo la separacincromatogrfica.
-
7/27/2019 Desarrollo de Metodos Por HPLC
43/60
43QUANTAR ; Laboratorio de Anlisis Qumico Especializado
-
7/27/2019 Desarrollo de Metodos Por HPLC
44/60
Ajuste de los parmetros cromatogrficos :
- Resolucin (R)- Capacidad (k)- Eficiencia (N)
- Selectividad ()
44
-
7/27/2019 Desarrollo de Metodos Por HPLC
45/60
45
QUANTAR ; Laboratorio de Anlisis Qumico Especializado
Formula de calculo basada enel grafico.
1. Resolucin :
R = (t2t1) .
(W2+ W1)
Formula dependiente de lostres factores :
- Capacidad (k)- Eficiencia (N)- Selectividad ()
R = (1).. N. k .
(1 + k)
-
7/27/2019 Desarrollo de Metodos Por HPLC
46/60
46
QUANTAR ; Laboratorio de Anlisis Qumico Especializado
tn , tiempo de retencin del pico de intersT0 , tiempo de volumen muerto
kvaria simplemente ajustando la fortaleza de la fase mvil
2. Regulacin de la capacidad (k):
k = (tnt0).
t0
Para fase reversa :
- A mayor proporcin de agua mayor k,o sea mayor retencin- A mayor proporcin de modificador menor k(MeOH, ACN, THF)
- Cambios de pH en la F.M. no modifican tr de compuestos neutros- Cambios de pH en la F.M. producen grandes cambios en el tr decompuestos disociables.- En IPC tr aumenta con la concentracin y longitud de la cadena alqulica
-
7/27/2019 Desarrollo de Metodos Por HPLC
47/60
47QUANTAR ; Laboratorio de Anlisis Qumico Especializado
La resolucin no varia linealmentecon k sino con k/(1 + k) de modo
que un aumento en la retencinproduce significativos cambios en laresolucin solo si k
-
7/27/2019 Desarrollo de Metodos Por HPLC
48/60
48
QUANTAR ; Laboratorio de Anlisis Qumico Especializado
Pico k
1 1.72 3.03 4.44 6.2
Pico k1 2.8
2 5.63 9.34 14.6
2. Regulacin de la capacidad (k): . Ejercicio !
-
7/27/2019 Desarrollo de Metodos Por HPLC
49/60
49
QUANTAR ; Laboratorio de Anlisis Qumico Especializado
N , platos tericos
tn, tiempo retencin del pico ensimo
wtan, ancho del pico tangencial
3. Regulacin de la eficiencia (N) :
N = 16(tn/ wtan).
N aumenta de varias formas :
- Disminuyendo el caudal- Utilizando columnas mas largas
- Columnas con partculas de menor dimetro- Acoplando columnas- Aumentando la temperatura- Columnas nuevas o regeneradas- Menor longitud de tuberas y menores volmenes muertos
-
7/27/2019 Desarrollo de Metodos Por HPLC
50/60
50
QUANTAR ; Laboratorio de Anlisis Qumico Especializado
La resolucin no varia linealmentecon la eficiencia (N) sino con su raz
cuadrada (N).
N N
10000 100.0
20000 141.440000 200.0
R = (1). . N. k . (1 + k)
3. Regulacin de la eficiencia (N) :
-
7/27/2019 Desarrollo de Metodos Por HPLC
51/60
51
QUANTAR ; Laboratorio de Anlisis Qumico Especializado
3. Regulacin de la eficiencia (N) :
Aumentar N :
-Disminuyendo el caudal-Utilizando columnas mas largas-Columnas con partculas de menor dimetro-Acoplando columnas-Aumentando la temperatura-Columnas nuevas o regeneradas-Menor longitud de tuberas y menores volmenes muertos
-
7/27/2019 Desarrollo de Metodos Por HPLC
52/60
52
QUANTAR ; Laboratorio de Anlisis Qumico Especializado
4. Regulacin de la selectividad () :
Coeficiente del factor de capacidad de un par de picos = k2/ k1.
Agotadas las variaciones de k y N, si la resolucin no es la adecuada seintenta un cambio de selectividad.
Implicaciones :
Modificaciones importantes en el sistema cromatogrfico con resultados quepueden ser imprevistos (mejores o peores).
1. Fase mvil2. Columna
-
7/27/2019 Desarrollo de Metodos Por HPLC
53/60
53
QUANTAR ; Laboratorio de Anlisis Qumico Especializado
4. Regulacin de la selectividad () : . Mejorando la fase mvil
Triangulo deselectividad desolventes propuestopor Snyder segn eltipo y magnitud deinteraccin
-
7/27/2019 Desarrollo de Metodos Por HPLC
54/60
54
QUANTAR ; Laboratorio de Anlisis Qumico Especializado
Fuerza de elucin de fase mvil:
Metanol
(Grupo II)Acetonitrilo
(Grupo VI)
Cambio de selectividad
F , Fuerza total de la fase mvilFi , Fuerza del solvente ii , Fraccin en volumen del solvente i
4. Regulacin de la selectividad () : . Mejorando la fase mvil
-
7/27/2019 Desarrollo de Metodos Por HPLC
55/60
55
QUANTAR ; Laboratorio de Anlisis Qumico Especializado
SolventeFuerza de
elucion
Agua 0.0
Metanol 2.6
Acetonitrilo 3.2
Tetrahidrofurano 4.5
4. Regulacin de la selectividad () : . Mejorando la fase mvil
-
7/27/2019 Desarrollo de Metodos Por HPLC
56/60
56
QUANTAR ; Laboratorio de Anlisis Qumico Especializado
FF.M.= FMeOHMeOH+ FH2OH2O
FMeOH.MeOH
ACN = F MeOHMeOHFACN
FACN.ACN=
ACN = 2.6 x 70
3.2
F.M.MeOH - H2O
(70:30)
F.M.
ACN - H2O
Cambio de selectividad
ACN = 56.88
4. Regulacin de la selectividad () : . Mejorando la fase mvil
(57:43)
-
7/27/2019 Desarrollo de Metodos Por HPLC
57/60
57
QUANTAR ; Laboratorio de Anlisis Qumico Especializado
Efecto delmodificador orgnicosobre la resolucin yseleccin de una fasemvil ternaria en
base a los resultados.
4. Regulacin de la selectividad () : . Mejorando la fase mvil
-
7/27/2019 Desarrollo de Metodos Por HPLC
58/60
-
7/27/2019 Desarrollo de Metodos Por HPLC
59/60
59
-
7/27/2019 Desarrollo de Metodos Por HPLC
60/60
60
GRACIAS POR TU ATENCION Y
EXCELENTE DISPOSICION !!
top related