cromatografía en capa fina 1 23 y 25-02-09

CROMATOGRAFIA EN CAPA FINA

Análisis Instrumental II

MECANISMOS DE SEPARACIÓN

 Adsorción

 Reparto

  Intercambio iónico

BASES TEÓRICAS DE CCF  Principios de equilibrios de adsorción y partición:

OPERACIÓN DE CCF

 El adsorbente se mezcla con un aglutinante, a menudo yeso; esta mezcla se suspende en agua y se deposita sobre una placa de vidrio o sobre una superficie plana rígida, metálica o de un material plástico por medio de un dispositivo embadurnador apropiado. Al secarse, la suspensión queda adherida a la placa de vidrio, bien directamente o por efecto de un aglutinante, como una capa delgada y rugosa de adsorbente de un espesor de 0.1 a 2 mm. Esta capa puede utilizarse en cromatografía en forma similar a una hoja de papel. Pero, ahora la separación depende de las propiedades adsorbentes de la capa, tal como si el adsorbente estuviera rellenando una columna.

ADSORBENTES Y OTROS SEPARADORES CROMATOGRÁFICOS  Los mismos/similares a los usados en CC  < tamaño de partícula que en CC  Algunos adsorbentes tienen un indicador fluorescente

(Silicato Zn / 254 a 360 nm)  Adsorbente más utilizado en CCF, gel de sílice

ADSORBENTES Y OTROS SEPARADORES CROMATOGRÁFICOS  Óxido de Aluminio (Alúmina) Adsorbente alcalino, preparado también

como alúmina neutra y ácida. Utilidad: Separación de compuestos neutros

y alcalinos, hidrocarburos policíclicos, alcaloides, aminas, vitaminas liposolubles y algunas cetonas. La alúmina puede catalizar la descomposición de muchos compuestos organicos, en particular cetonas insaturadas

ADSORBENTES Y OTROS SEPARADORES CROMATOGRÁFICOS

 Gel de sílice: Para separar: aldehídos, cetonas, alcaloides,

azúcares, fenoles, esteroides, terpenoides, acidos grasos y aminoácidos.

Cuando la gel de sílice no se activa por calor, contiene agua suficiente para que las separaciones ocurran por un mecanismo de reparto.

ADSORBENTES Y OTROS SEPARADORES CROMATOGRÁFICOS  Celulosa y resinas cambiadoras de iones se

emplean en la cromatografía de capa delgada por intercambio iónico y las resinas se usan también para separación de compuestos orgánicos por mecanismo de reparto.

ADSORBENTES Y OTROS SEPARADORES CROMATOGRÁFICOS

 Polvo de poliamidas: Formación de enlaces de hidrógeno entre cadenas de polímero y solutos.

Preparadas a partir de nylon 66, nylon 11 y nylon 6 Tipos de compuestos separados: flavonoides,

fenoles, nitroanilinas, benzofenonas, derivados de aminoácidos, etc.

ADSORBENTES Y OTROS SEPARADORES CROMATOGRÁFICOS

 Aglutinantes: Su objeto es retener la capa del adsorbente sobre la placa; el más común es el yeso (sulfato de calcio monohidratado), que se añade a los adsorbentes en un 10 a 15%. Otro es el almidón que se añade en cantidades de 1 a 3%.

PREPARACIÓN DE PLACAS   Aplicador Kensaco Espesores múltiples y compuertas intercambiables: capas de 250,

275, 500, 1500 y 2000 µm de espesor. Compuerta para capas de espesores de 50 a 3000 µm en etapas de

50 µm. Valores de Rf constantes dentro de un intervalo de espesor

razonablemente amplio (10 a 20 µm) Compuertas con gradiente de espesor. Aplicadores con separadores de adsorbente, para dos a cinco

secciones paralelas de diferentes capas de adsorbentes sobre la misma placa.

  Aplicador Camag:   Estacionario, la placa se desplaza por debajo del aplicador. Se

producen placas de 300 a 500 µm de espesor y durante el secado se encoge la capa de 200 a 250 µm.

Preparación de portaobjetos por sumergimiento en suspensión de adsorbente.

OPERACIÓN DE CCF

PREPARACIÓN DE PLACAS

Secado: Gel de sílice o alúmina, secada durante 15 minutos manteniendo el soorte en posición vertical. Después se seca en posición vertical en un horno durante 1 a 2 h a 10-120°C. Actividad determinada efectuando la cromatografía de una mezcla patrón de colorantes (azobenceno, p-metoxiazobenceno, p-aminoazobenceno, sudán III y sudán IV) o mediante sustancias del tipo de las que se desean separar.

PREPARACIÓN Y APLICACIÓN DE MUESTRAS  Procedimientos similares a CP y CC. Aplicación de resinas intercambiadoras de iones en

punto de origen Muestras en disoluciones de 0.1 a 1% se aplican con

micropipetas o microjeringas de 10 a 100 µl de capacidad o con tubos capilares que terminen en un orificio de 0.5 a 0.1 mm de diámetro.

Manchas deben tener de 1 a 3 mm de diámetro y estar separadas por 1 a 2 cm (uso de plantillas es recomendable)

Separaciones analíticas: aplicaciones de 5 a 100 µg.

SELECCIÓN DE SISTEMAS DE DISOLVENTES  Tipos de disolventes utilizados en CCF

dependiendo del adsorbente, su actividad y los solutos:   Disolventes puros de las series elutrópicas   Mezclas de disolventes   Disolventes totalmente acuosos, totalmente

orgánicos, acuoso-orgánicos e iónicos.

Pequeñas variaciones en la composición de las mezclas de disolventes pueden variar Rf.

SELECCIÓN DE SISTEMAS DE DISOLVENTES  Mezclas equielutrópicas: Mezclas diversas de

disolventes que pueden originar iguales desplazamientos de una misma mancha.

 En el estudio de productos naturales o de productos farmacéuticos es conveniente correr cromatografías del material usando mezclas en diferente proporción de los mismos disolventes.

Sugerencias para el proceso de activación:

  El equilibrio de adsorción en la cromatoplaca depende de la presión, temperatura y humedad.

  El vapor del aliento puede disminuir localmente la actividad.

  En paises tropicales es indispensable activar las cromatoplacas para lograr reproducibilidad.

  El tiempo en que se alcanza el equilibrio (actividad cte.), depende del espesor de la capa y aumenta con éste.

  Algunos eluyentes pueden desproporcionar o condensar al estar en contacto con superficies activas (p.ej.: la acetona).

  Las sustancias patrón deben correrse sobre la misma placa que la muestra.

  Es preferible correr las placas en áreas climatizadas.

Sugerencias para el almacenamiento de cromatoplacas:

  Si se guardan en desecadores de vidrio, debe evitarse el uso de grasa en el cierre.

  No suele ser necesario almacenar sobre desecantes.

Preparación de las muestras:

  Si se efectúa un análisis de trazas o muestras de matrices complejas es necesaria una etapa previa de purificación y/o enriquecimiento (clean-up).

  El clean-up separa en la medida de lo posible separar las sustancias por grupos o tipos de sustancias antes de su separación definitiva por cromatografía.

  Dependiendo del tipo de matriz puede efectuarse extracción, destilación, sublimación o precipitación.

Sugerencias para efectuar un adecuado clean-up:

 Optimizar empíricamente el proceso.   Cualquier error cometido en la preparación se arrastra

hasta la evaluación final del cromatograma.   Utilizar cristalería absolutamente limpia y disolventes

adecuados para el tipo de análisis.

  Preparar suficiente extracto para efectuar medidas de control (duplicados, triplicados, blanco).

  Al trabajar con muestras lábiles, cromatografiar lo antes posible. Para almacenar una noche almacenar en refrigerador. Para almacenar más tiempo, utilizar un congelador.

Sugerencias para efectuar una adecuada dosificación en cromatoplaca:

  Aplicar en banda elimina sobrecargas que producen “colas”, se separan mejor y se evalúan con mayor exactitud, pero pueden aplicarse menos bandas por cromatoplaca.

Sugerencias para efectuar una adecuada dosificación en cromatoplaca:

  Evitar disoventes que eluyan en forma circular sobre el punto de partida.

  La muestra y el patrón deben ser solubles en el mismo disolvente.

  Evaporar uniformemente para evitar asimetrías de concentración debidas al ventilador.