course vhir-ucts-ueb - session 2 - rtqpcr

TECNOLOGÍAS DE ALTO RENDIMIENTO EN GENÓMICA

DIA 1. 5 de Octubre

Microarrays (Ricardo Gonzalo y Alex Sánchez) RTqPCR (Paqui Gallego y Alex Sánchez)

Programa del Seminario RTqPCR-2011

Definición de la técnica

Terminología asociada a qPCR

Diseñando un experimento de qPCR

Etapas en la realización de un experimento de qPCR

Evaluación de un ensayo de qPCR

Bibliografía muy recomendada

Definición de la Técnica

Termociclador

con sistema de detección

R Q

Sonda Agentes intercalantes

A G CNucleótidos

Taqpolimerasa

Tampón dereacción

Cebadores Ácido nucléico

PCR en tiempo real o qPCR o RT-qPCR

http://www.appliedbiosystems.com/support/apptech/#rt_pcr

UNG(opcional) ROX

TTU

ROX como referente pasivo

+ ROX - ROX

Δ R

n

Ciclos Ciclos

Desv St= ± 0.059

Desv St= ± 0.306

Fluoróforo referente pasivo más comúnmente utilizado para normalizar la fluorescencia específica en instrumentos de ABI y Stratagene.

ROX=6-carboxy-X-rhodamine

Programa del Seminario RTqPCR-2011

Definición de la técnica

Terminología asociada a qPCR

Diseñando un experimento de qPCR

Etapas en la realización de un experimento de qPCR

Evaluación de un ensayo de qPCR

Bibliografía muy recomendada

Escala semi-logarítmica

Cycle Number

Terminología asociada a qPCR

PlatóLineal

BaselineCt value= 15.5

ThresholdExpo

nenc

ial

Log

Fluo

resc

ence

Rn

RT-qPCR

Cualitativa y cuantitativa.

Elevado rango dinámico de detección Capaz de detectar cambios 2-fold. No requiere procesado post-PCR

PCR Convencional

Semi-cuantitativa:

Rango dinámico pequeño ›2 logs Baja Precisión; baja resolución y poco

Sensible. Manipulación post-PCR . Baja Resolución No-automatización Discriminación basada sólo en tamaño Los resultados no están expresados en

números. El BrET no es muy cuantitativo

RT-qPCR vs PCR Convencional

A tiempo real(fase exponencial)

Cuantificación Absoluta

Cuantificación Relativa

A tiempo final(fase plató)

Plus/MinusDiscriminación Alélica

Programa del Seminario RTqPCR-2011

Definición de la técnica

Terminología asociada a qPCR

Diseñando un experimento de qPCR

Etapas en la realización de un experimento de qPCR

Evaluación de un ensayo de qPCR

Bibliografía muy recomendada

Diseñando un experimento de qPCR

Aplicación

Método de Normalización

Química de detección: Sondas específicas marcadas con fluorocromos Agentes Intercalantes Fluorocromos unidos a primers

Reactivos: Core kit vs Master Mix dNTPs/dUTPs y UNG enzyme ROX como referente pasivo

Termociclador: Formato Número de canales de detección Software de análisis Duración del programa Precio y flexibilidad de la oferta

mRNAmiRNAncRNAsiRNAsaRNACNA

SNPCNVMutacionesAnálisis Metilación

Análisis en Células StemAnálisis en célula Única

MicoplasmaPatógenos en la comida

Aplicaciones RTqPCR

ProteínaTejido

Célula Eucariota

RNA

DNA

VirusBacteria

Target

5´oligo3´oligo

Validación Microarrays

Normalización respecto a la masa total de RNA exraído(chequeo calidad –RIN, moleculas/ng RNA)

Normalización respecto al volumen/masa de la muestra( moléculas/mg tejido; moléculas/ml sangre)

Normalización respecto al número de células( moléculas/célula)

Normalización respecto a un gen endógeno no regulable(GAPDH, tubulina, actina, albúmina, ciclofilina, micro-globulina, histonas, rRNA, ……)

Normalización respecto a más de un gen endógeno (›3) geNorm (Vandesompele et al. 2002. Genome Biology) BestKeeper (Pfaffl et. Al. 2004; Biotechnology Letters 2004) Normfinder Statistical modeling for selecting houskeeper genes (Szabo et al.2004, Genome Biology)

Estrategias de Normalización qPCR

BMC Bioinformatics 2009, 10:110Genes and Immunity (2005) 6, 279-284. Review

Placas-384

Plataforma de RTqPCR en la UCTS

Microfluidicas(Arrays de baja densidad)Placas-96

FAM, TAMRA, VIC, JOE, NED, SYBR, ROX

Formato 384-p: FAM, TAMRA, VIC, JOE, NED, SYBR, ROX, TET.Formato LDA: FAM, VIC, ROX.

7000 SDS 7900HT Fast SDS

Química

Softwares V1.2.3f2 con RQ studyPrimer Express 2.0

SDS 2.4.1RQ Manager 1.2

Tiras de 8 Tubos

LightCycler 480

White Plates-384

mode 9600 Emulation /Standard 9600 Emulation/StandardFast

Formato

Filtros/canales detección:500, 533, 568, 610, 640, 670 nm

Ref. Pasivo ROX ROX Ninguno

Fast

SW 1.5

9600 Emulation/Standard Fast

UNG:

Química: SYBRGreen SondasTaqMann SondasTaqMann

La UCTS dispone de los siguientes reactivos:

Mode:

Sí Sí

Programa del Seminario RTqPCR-2011

Definición de la técnica

Terminología asociada a qPCR

Diseñando un experimento de qPCR

Etapas en la realización de un experimento de qPCR

Evaluación de un ensayo de qPCR

Bibliografía muy recomendada

Etapas Implicadas en la Realización de un ensayo de qPCR

PreparaciónMuestra

Transcripción Reversa (RT)

PCR a tiempo Real (qPCR )

Extracción Ác. Nucléicos

RNA cDNA

Producto AmplificadoMuestra

DNA

Preparación Material de partida

PreparaciónMuestra

Extracción Ácidos Nucléicos

Transcripción Reversa (RT)

PCR a tiempo Real (qPCR )

Tipo de muestra Método Extracción

NATURE PROTOCOLS. Vol1, Num3, 2006

RNA cDNA

Producto AmplificadoMuestra

DNA

Preparación Material de partida

PreparaciónMuestra

Extracción Ácidos Nucléicos

Transcripción Reversa (RT)

PCR a tiempo Real (qPCR )

RNA total/mRNA/DNA Calidad & Cantidad Almacenamiento (-80ºC)

NATURE PROTOCOLS. Vol1, Num3, 2006

RNA cDNA

Producto AmplificadoMuestra

DNA

Pureza (ausencia de contaminación por DNA y Proteínas y ausencia de inhibidores)

Integridad Cantidad• Existen dif. métodos de cuantificación.• Generan difs. resultados.•Hay que cuantificar muestras comparables entre sí con el mismo método de cuantificación.

• ODA260/A280=1.8-2.0• OD A260/A230=2• SPUD assay (Nolan, 2006)

• rRNA ( 28S:18S=2:1)• Número RIN (› 5)• Ensayo 3´:5´(alrededor de 1 indica elevada integridad; ›5 degradado)

RNA Q &Q

Gel Desnt.Agarosa

Expert Rev. Mol. Diagn. 5, 493-498 (2005)

Evaluación del RNA

10.0 9.2 8.1 7.2 6.0 5.0 4.4 4.0

BUENO MALOPERFECTO

Molecular Aspects of Medicine 27 (2006) 126–139

2:1

Agilent Bioanalyzer

Reacción de Transcripción Reversa (RT)

One-Step vs Two Step CDNA Priming Pérfil Térmico Consideraciones Experimentales

PreparaciónMuestra

Extracción Ácidos Nucléicos

Transcripción Reversa (RT)

PCR a tiempo Real (qPCR )

RNA cDNAProducto AmplifcadoMuestra

NATURE PROTOCOLS. Vol1, Num3, 2006

One-Step RT-PCR Requiere una única mezcla de reacción ya que RT y PCR ocurren en el mismo tubo.

AmpErase UNG no se puede usar. Única enzima (ej. PolimerasaTth) RNA-y-DNA dependiente. Minimiza tiempo de preparación y el riesgo de contaminación. No es posible la optimización por separado de ambas reacciones. Requiere primer RT específico de secuencia. Menos sensible debido a la menor eficiencia de la actividad RT de la polimerasa. Acumulación de dímeros de primers.

Requiere dos mezclas de reacción (reacción RT y reacción PCR).

Más flexible (El cDNA se puede guardar y ser usado más tarde).

Permite la optimización por separado de ambas reacciones.

Permite el uso de primer RT específico de secuencia, random primers o oligo(dT).

Two-Step RT-PCR

One Step RT-PCR vs Two Step RT-PCR

RNA cDNA Producto Amplif.RT qPCR

RNA cDNART

cDNA Producto Amplif.qPCR

NATURE PROTOCOLS. Vol1, Num3, 2006

Transcripción Reversa: cDNA Priming

Consideraciones Experimentales de la RT

En general, usar el RNA total como molde para la RT.

Dado que la eficiencia de RT depende del gen diana y de la enzima de RT, es muy importante usar siempre el mismo enzima RT, los mismos primers para la síntesis de cDNA y las mismas condiciones experimentales si se quieren comparar resultados entre sí.

Hacer réplicas

Incluir siempre control no-RT

Añadir la misma cantidad de RNA total en cada reacción.

Siempre que sea posible, montar las reacciones de RT de todas las muestras al mismo tiempo para evitar la variación entre tandas.

Cuando se procesan múltiples muestras en diferentes tandas, incluir una muestra control positiva de referencia en todas las tandas.

NATURE PROTOCOLS. Vol1, Num3, 2006

qPCR

Elección en el software del ensayo a realizar Perfil Térmico Consideraciones Experimentales

PreparaciónMuestra

Extracción Ácidos Nucléicos

Transcripción Reversa (RT)

PCR a tiempo Real (qPCR )

RNA cDNAProducto AmplifcadoMuestra

NATURE PROTOCOLS. Vol1, Num3, 2006

Elección en el software del ensayo a realizar

7000 SDS de ABI 7900 SDS de ABI

Absolute Quantification (Standard Curve)

7000 SDS de ABI 7900 SDS de ABI

Con Curva Stándard

Standard Curve (AQ)

Elección en el software del ensayo a realizar

7000 SDS de ABI 7900 SDS de ABI

Relative Quantification (ddCt) Plate

ddCt

7000 SDS 7900 SDS∆∆Ct (RQ)

Relative Quantification (ddCt) Study

LightCycler 480 II

Perfil térmico que incluye paso de Activación UNG

Perfil térmico clásico qPCR

1.- Activación UNG2.- Activación Taq y desnaturalización UNG3.- Desnaturalización del dsDNA4.- Anillamiento y extensión primers

Consideraciones qPCR

Cuando se procesan múltiples muestras en diferentes placas, la inclusión de una muestra calibradora o curva estándar en cada placa es un control importante para medir la variabilidad inter-ensayo.

Duplicados técnicos son generalmente suficientes (Triplicados si Cts›35). Si las réplicas difieren ›0.5 Ct, las reacciones deberían repetirse. Son más importantes los duplicados biológicos.

Incluir Controles negativo (NTC) y positivos. Cargar el NTC en el pocillo que esté más distanciado de aquel que contenga mayor concentración de cDNA para evitar contaminación cruzada.

Preparar mezcla de reacción de pcr en laboratorio diferente de donde se manipule el cDNA.

Es siempre mejor no esperar demasiado en correr un run de qPCR después de la preparación de la placa. Si necesitas comparar dos placas idénticas con diferente ciclo de temperaturas, es mejor prepararlas al mismo tiempo, y guardar una de ellas a 4ºC protegido de la luz hasta 10 horas.

Especial atención en el sellado de la placa para evitar evaporaciones y evitar marcas y huellas en la parte superior del cobertor/tapa.

NATURE PROTOCOLS. Vol1, Num3, 2006Real-Time PCR Aplications Guide from Bio-Rad

Programa del Seminario RTqPCR-2011

Definición de la técnica

Terminología asociada a qPCR

Diseñando un experimento de qPCR

Etapas en la realización de un experimento de qPCR

Evaluación de un ensayo de qPCR

Bibliografía muy recomendada

PreparaciónMuestra

Transcripción Reversa (RT)

PCR a tiempo Real (qPCR )

Extracción Ác. Nucléicos

RNA cDNA

Producto Amplificado

Muestra

DNA

Análisis de datos

Calidad del Ensayo

Estadística

Métodos de Cuantificación

Etapas Implicadas en la Realización de un ensayo de qPCR

Calidad del Ensayo

Reproducibilidad (viene indicada por las réplicas)

Controles qPCR

NEGATIVOS NTC (Non Template Control) Detección de dímeros de primers y contaminación NAC (Non Amplif. Control) Detección de degradación de sondas No RT (No RT control) Detección de contaminación por DNA genómico

POSITIVOS Control Endógeno Testado de la calidad de los reactivos. Usado también para normalizar. Control Exógeno Testado de la calidad de los reactivos Spiking Control Detecta presencia de inhibidores

Curva de Disociación (SYBR Green)

Curva Estándar Linealidad de los datos Distancia entre las curvas de amplificación Eficiencia de amplificación

PendienteEficiencia

Amplificación

(E= 10-1/slope)

Convertir E enPorcentaje

%E= (E-1)100%-3,0 2,2 115

-3,1 2,1 110

-3,2 2,1 105

-3,3 2,0 101

-3,32 2,0 100

-3,4 2,0 97

-3,6 1,9 90

-3,7 1,9 86

-4 1,8 78

Curva Estándard:

Slope= -3.73

2n=Factor de dilución

FactorDilución

n=LG(Factor Dil.)/LG(2)

2 1,00

5 2,32

10 3,32

OK

R2 ›0.98 o r › 0.99

Calidad del Ensayo

Cuantificación Absoluta Cuantificación Relativa

Cantidad de ácido nucléico (número de copias, µg) por cantidad de muestra dada (por célula, por µg de RNA total)

Cantidad relativa de ácido nucléico de una muestra A respecto a una muestra B

Ejemplo: medida carga viral Ejemplo: Niveles de expresión génicaen Tumor vs Tejido normal.

104105 102103 10106

Ct

Log (Num de copias)

A.- Cuantificación Relativa con Curva Stándard:

Qty gen problemaQty gen EC

Muestra Problema =

Qty gen problemaQty gen EC

Calibradora =

B.- Método Pfaffl:

RQ = (Egen diana) dCT, gen diana (calibradora – muestra problema)

(Egen EC) dCT, gen EC (calibradora – muestra problema)

C.- Método (Livak) Doble Delta CT:dCT = CT(gen diana) – CT(gen EC)ddCT = dCT(muestra problema) – dCT (calibradora)

RQ= 2–ddCT

Métodos de Cuantificación

SlopeR2

ΔCt

= (C

t ge

n Ta

rget

– C

t ge

n En

dóge

no)

Log Diluciones

Y = 0.0471x + 3.0178R2 = 0.2315

Eficiencias del Gen Target vs Eficiencia gen EC

Routine lab method’s accuracy called into questionNATURE MEDICINE VOL 16,page 349 APRIL 2010Catherine Shaffer

1) Potential viral pathogenic mechanism for new variant inflammatory bowel diseaseV Uhlmann et al. Mol Pathol 2002;55:84–90

Estudio que causó una polémica en 1998 al sugerir un vínculo entre la vacuna triple vírica y el autismo.

RT-qPCR and molecular diagnostics: no evidence for measles virus in the GI tract of autistic children.S.A. Bustin. Eur Pharm Rev Dig 1 (2008) 11-16.

2) The mRNA of the Arabidopsis Gene FT Moves from Leaf to Shoot Apex and Induces flowering.Huang et al. Science 309 September 2005: 1694-1696“Breakthrough of the Year 2005”, the runners-up. Science 310:1880-1885

Retraction of Hung et al., Science 309 (5741) 1694-1696.H. Bohlenius et al. Sience 316 April 2007:367.

Ejemplos:

RTqPCR en tela de juicio

Diseño y Optimización de un experimento de RTqPCR

MIQE Guidelines

Programa del Seminario RTqPCR-2011

Definición de la técnica

Terminología asociada a qPCR

Diseñando un experimento de qPCR

Etapas en la realización de un experimento de qPCR

Evaluación de un ensayo de qPCR

Bibliografía muy recomendada

Direcciones de interés relacionadas con qPCR

http://qpcr.gene-quantification.info/

http://www.horizonpress.com/pcr/qPCR-machines.html

qPCR-Technical-Guide.pdf (Sigma Life Science)

http://www.eurogentec.com

http://www.dorak.info/genetics/glosrt.html

http://genex.gene-quantification.info/

Seminario RTqPCR18 de Octubre en VHIR

Prof. Michael KubistaEstá entre los pioneros que desarrollaron la RTqPCR

Gracias