carro, ana clara czysezon, nicolás davies sala, carol martinez, jimena

Carro, Ana ClaraCzysezon, NicolásDavies Sala, Carol

Martinez, Jimena

Arreglos traslacionales y rotacionales de los nucleosomas con H2A.Z a lo largo

del genoma de Saccharomyces cerevisiae

Seminario VII Biología Molecular 2009

Nucleosoma: unidad básica de la cromatina

Core de dímeros de proteínas histonas alrededor del cual está enrollado el DNA 1.65 veces (-147pb)

Histonas: Canónicas: H2A, H2B, H3, H4, sintetizadas en fase S.

Variantes: H3.3, H2A.Z, sintetizadas en todo el ciclo celular, asociadas a regiones transcripcionalmente activas.

Fuera del core: H1 (linker)

La cola N-terminal emerge del core, a través del DNA.

Está sujeta a modificaciones (acetilación, metilación)

Introducción

Existen dos relaciones DNA- nucleosomaArreglo traslacional: define el midpoint del DNA relativo a un locusPuede estar posicionado dentro de un pequeño rango (Phased) o

con una distribución continua (Fuzzy)

Arreglo rotacional: define la orientación del DNA en la superficie de la histona

¿Cómo puede la cromatina interferir en la expresión génica?

1) Posicionamiento de nucleosomas (importancia en zonas promotoras).

2) Modificación post-traduccional de histonas (metilación, acetilación).

3) Cambio en la composición bioquímica de nucleosomas por reemplazo de histonas canónicas por histonas variantes (H2A.Z)

Preguntas

1. ¿Cuáles son las características del posicionamiento del DNA in vivo?

2. ¿Cuántos arreglos traslacionales y rotacionales ocupa el nucleosoma?

3. ¿Los elementos cromosomales poseen una arquitectura cromatínica específica?

4. ¿Cuál es la relación topológica entre la localización de los elementos promotores y los arreglos rotacionales y traslacionales de los nucleosomas?

Aislamiento y purificación del DNA nucleosomal.

Metodología

Selección del DNA

Distribución del DNA nucleosomal con H2A.Z

Resultados

→ Región arbitraria del genoma→Se observan regiones enriquecidas en nuclesomas con H2A.Z→Regiones con baja señal para H2A.Z, ¿Poseen función biológica?

↓Análisis regiones de rDNA → Determinan que no posee función biológica

Punto medio (MIDPOINT)

1 bp 147 bp

MIDPOINTMIDPOINT

00 +1+1 -1-1

Detalle de UN nucleosoma

→Distancia entre puntos medios da idea de la periodicidad traslacional

→Largo de la región total abarcada por los puntos medio da idea de la dispersiòn total del nucleosoma (fuzziness)

Eje X: posisción en el genoma del punto medio de este nucleosoma en cada individuo secuenciado.

Eje Y: cantidad de individuos que poseen el punto medio en esa posiciòn

Desvío standard en cadena Watson vs cadena Crick

Nucleosomas que poseen:

↑DS en cada cadena poseen mayor dispersión y por ende su ubicaciòn traslacional es màs difusa (fuzziness)

↓ DS en ambas cadenas, estàn localizados

Cada punto representa el DS del Midpoint de un nucleosoma (se calcula contemplando el punto medio obtenido para ese nucleosoma en cada uno de los genomas individuales secuenciado)

Examinaron más de 8000 nucleosomas bien posicionadosObservaron patrón de dinucleótidos AA/TT y GC

Enriquecimiento GC y deficiencia AT en 3-4 pb desde el borde del nucleosoma Donde emerge del DNA la cola H3

Deficiencia AT no es evidente hasta luego de 1pb del bordeLa especificidad de MNasa no depleta de AT los bordes

Periodicidad de 10 pb de los dinucleótidos

Esto restringe al DNA a un único arreglo rotacional que resulta en arreglos translacionales discretos en cuantos de 10 pb

Midieron distancia pico-pico entre los arreglos translacionales adyacentes

Genes con nucleosomas H2A.Z muy “fuzzy”

Contienen TATA, regulados positivamente por factores

remodeladores de la cromatina, negativamente por factores modificadores de histonas

Reposicionamiento de nucleosomas por reguladores de cromatina

tiene rol en la regulación de expresión génica

Mas experimentos…

Distribución de nucleosomas H2A.Z respecto de los elementos cromosómicos

Regiones teloméricas y centroméricas con nucleosomas H2A.Z en posiciones fijas

espaciadas a 200 pb.

Nucleosoma centromérico especializado sin H2A.Z H2A quizás?

Distribución de nucleosomas H2A.Z respecto de los elementos cromosómicos

Orígenes de replicación (ARSs) sin nucleosomas H2A.Z éstos

estaban flanqueándolos

Distribución de los nucleosomas H2A.Z respecto de los elementos cromosómicos

Promotores sin TATA: espaciamiento canónico de

nucleosomas (165 pb.)

Promotores con TATA: distribución no canónica

Y además…

Genes con distintos niveles de transcripción

Posicionamiento traslacional de nucleosomas siempre sobre el

ORF

Niveles de H2A.Z reducidos depleción de

nucleosomas

Distribución de los elementos regulatorios de la transcripción a lo largo de la superficie del nucleosoma.

a.- la región TATA está distribuida a lo largo del borde río abajo del primer nucleosoma río arriba.

b.- la región TSS está concentrada en el borde río arriba del nucleosoma +1, el cual tiende a ser menos “fuzzy” que otros nucleosomas.

Distribución de las regiones conservadas de unión a los factores de transcripción (TF).

c.-Los sitios de unión a TF están localizados cerca de los bordes de los nucleosomas y están concentrados a una distancia de 10 pb. entre ellos y concuerdan con la zona que se expone del nucleosoma (surco mayor del DNA) en el arreglo rotacional.

d.-Los sitios a los cuales se unen los TF están localizados cerca de los bordes de los nucleosomas, lo que sugeriría que una consecuencia de la unión de los TF provocaría un desplazamiento traslacional del nucleosoma.

Representación del arreglo rotacional de los sitios de unión a lo TF y TSSs sobre la superficie del nucleosoma.

Modelo propuesto

Conclusiones Se pudo establecer un mapa nucleosomal para H2A.Z a lo largo del genoma de S. cerevisiae

Se determinó una alta localización de H2A.Z en la región 5´de zonas trancripcionalmente activas. También está presente en otros elementos cromosomales como telómeros y centrómeros

Existe una periodicidad de dinucleótidos AA, TT, AT y TA en contrafase con dinucleotidos GG, CC, GC y CG, cada 10 bp. Esta periodicidad restringe al DNA a un único arreglo rotacional y limita a cuantos de 10 bp el arreglo traslacional

Los nucleosomas con H2A.Z pueden estar traslacionalmente posicionados o dispersos (fuzzy).

Los promotores con TATA box contienen los nucleosomas fuzzy mientras que aquellos sin TATA poseen los nucleosomas posicionados.

Los nucleosomas se ubican dispersos en el borde upstream de las cajas TATA, mientras que el nucleosoma del sitio de inicio de la transcripción (TSS) está posicionado.

Los sitios de unión para los factores de transcripción se ubican en los surcos mayores de la superficie externa del nucleosoma distal.

Gracias!