cap 14 ing. genetica
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Prof. Aida L. Méndez UPR-Aguadilla 1
Ingeniería Genética-I.G.
Microbiología General- Biol 3705
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Objetivos
Al terminar de discutir este capítulo, el estudiante estará capacitado para: Mencionar vocabulario de ingeniería
genética (biotecnología, clonación, otras) Denominar técnicas de ingeniería genética
como: endonucleasas de restricción, transcriptasa inversa, electroforesis, sondas de DNA, etc.
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Objetivos
Distinguirá las etapas de la recombinación del DNA, hacer una quimera
Explicará la técnica de reacción en cadena de polimerasa (PCR)
Mencionará algunos productos obtenidos a través de rDNA
Distinguirá metodología para realizar cultivos transgénicos, plantas y animales
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Introducción- I.G.
Ingeniería genética-manipulación y modificación genoma organismos
Biotecnología- desarrollo productos industriales usando organismos para nuestro beneficio Aplicacion tecnológica que usa sist. Biológicos,
para hacer o modificar productos o procesos para uso específico
DNA se aisla, maneja, y modifica Secuenciar DNA- orden de bases
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Introducción- I.G.
rDNA- DNA recombinado, insertar genes en célula, modificando genéticamente organismos
clonar- insertar y propagar DNA, requiere vectores especiales
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Steps in Cloning a Gene
Figure 14.1
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Herramientas y Téc. De I.G.
Características DNA Sube temp. de 90-95C se desnaturaliza, si
enfria temp. vuelven a unirse las bandas por enlaces de H
DNA se corta con endonucleasas de restricción
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Extraccion de DNA
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Extracción de DNA
Cultivo Sonido/bolitas vidrio Vortex + fenol +calor-
romper paredes y/o capsida; + detergente- remover membrana
Proteasas-precipitar proteínas + sales
Agitar mezcla con cloroformo y fenol- DNA en medio de 2 fases
DNA precipitarlo con etanol frío (insoluble en alcohol)
Pellet DNA lavarlo con alcohol frío
Secar y colocar en buffer
Confirmar presencia en electroforesis
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Endonucleasas de Restricción
Enzimas reconocen y cortan secciones palindrómicas (4-5-6-7 pares)
Se nombran por la 1a letra del género - bacteria aislada, 1as. 2 letras de la especie y núm. De endonucleasa EcoR1- G-A-A-T-T-C C-T-T-A-A-G usado para cortar DNA en pequeñas
porciones usado para remover e insertar en DNA
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Restriction Endonucleases and Their Recognition Sequences
Table 14.2
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Enzima de Restricción
Enzima de restricción Bam HI
Se obtiene de Bacillus amyloliquefaciens
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Endonucleasas de Restricción
No cortan DNA de donde provienen- está modificado por adición de grupos metilo (CH3 )
Cortan en “cohesive ends” o “sticky ends”- parean entre sí ej. DNA cortado con EcoR1 siempre
producirá los mismos “sticky ends” permite ‘sticky ends” se junten ( enlaces H)
al enfriar temp. no importa de donde provengan
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Endonucleasas Restricción
Hay cortes que no son “sticky ends”. Se llaman “blunt ends” y es menos eficiente Ej. C-C-C G-G-G Proceso de ligación es menos eficiente que
con “sticky ends”
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Eco R1
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Figure 14.3
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Enzima de Restricción
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Otras Enzimas- I.G.
Ligasas- sellan pedazos cortados previamente por endonucleasas, sellan genes en plásmido y cromosomas
Transcriptasa inversa- usada convertir RNA en DNA; copias hechas con esta enzima se denominan- cDNA (“complimentary”)- permite sintesís DNA de r,m,t RNA sin introns (eucariotas), descubierta en 1970
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Synthesis of cDNA
Figure 14.4
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Recombinant DNA molecules
Jackson, Symons, and Berg (1972) generated first recombinant DNA molecules
Cohen and Boyer (1973) produced first plasmid vector capable of
being replicated within a bacterial host vectors – carriers of foreign DNA
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Recombinant plasmid construction
Figure 14.5
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Análisis DNA- Electroforesis
Proceso verificación cortes DNA sean los correctos
Electroforesis-muestras cortadas colocarlas en gel (agarosa) y se expone a campo eléctrico DNA carga -, se moverá al área + partículas más peq. se moverán más rápido visualiza con bromuro de etidio y luz uv
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Electroforesis
Bandas se ven con bromuro de etidio y luz UV
Estándares permiten saber los cortes y tamaño de ellos
Permite decidir si 2 muestras son idénticas
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Gel Electrophoresis
used to separate molecules based on their charge and size
agarose or acrylamide gels can be used to separate DNA fragments
DNA is acidic; it migrates from the negative to the positive end of the gel each fragment’s migration rate is inversely
proportional to the log of its molecular weight
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Electroforesis
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Hibridización Acidos Nucleicos y Sondas (“Probes”)
Banda de DNA puede hibridizarse con otra- permite detectar secuencias específicas de nucleótidos de muestras desconocidas
Areas de hibridización se pueden visualizar por: Marcadores radiactivos Isótopos- emiten radiación
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Sondas de DNA
Sondas de DNA
DNA probe - a length of single-stranded DNA that matches part of the gene and is linked to a radioactive atom. The single-stranded probe seeks and binds to the gene. Radioactive signals from the probe are then made visible on x-ray film, showing where the probe and gene matched.
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Microscopy
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“Southern Blot”
Método donde se fragmenta DNA y separa por electroforesis, se desnaturaliza (1 hebra) e inmobiliza en un papel de filtro. Una sonda se incuba con la muestra y si halla áreas complementarias se hibridizará
Uso de sondas usadas diagnosticar infecciones e identificación de microorg. Hay kits comerciales para identificación de bacterias y virus
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Southern blotting technique
developed by Edwin M. Southern (1975)
used to detect specific DNA fragments often uses radioactive DNA
hybridization probes autoradiography
method for detecting radioactively labeled molecules
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Southern Blotting Technique
Figure 14.6
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Métodos de Recombinación DNA
rDNA- DNA recombinado, se conoce desde 1970
Se crean clones: Remover el gen seleccionado de X organismo
(donante), cortado con endonucleasas y aislado Propagación en un hospedero diferente Gen insertado a un vector (plásmido o virus) Insertar en hospedero de clonación (bacteria o
levadura)
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Características Vectores Clonación
Llevar DNA donado Aceptar hospedero de clonación Plásmidos excelentes , pequeños, fácil
de manejar- pueden transferirse por transformación
Bacteriófagos- buenos vectores, inyectan DNA a hospedro bacteriano por transducción
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Cloning Vectors and Creating Recombinant DNA
there are four types of cloning vectors plasmids (most commonly used) phages and viruses cosmids artificial chromosomes
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Cosmids
do not exist in nature these vectors have been constructed to
contain features from both phages and plasmids they have a selectable marker, multiple
cloning sites from plasmids and a cos site from λ phage
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Artificial Chromosomes
used when large fragments of DNA must be cloned
bacterial artificial chromosomes (BACs) played important role in the human
genome project
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Caract. Vectores Clonación
Vectores tienen información de resistencia a antibióticos (ampicilina, tetraciclina); lo que ayuda a usar medios selectivos y los clones recombinados sean evidentes
Hospedero de clonación deberá crecer rápido, usar medios de cultivo ordinarios, genoma conocido como E.coli , Saccharomyces , Bacillus subtilis
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Vector de Clonación - Plásmido
Vector de clonación pBR322 – plásmido
Contiene genes de resistencia a antibióticos : Ampicilina Tetraciclina
Tamaño DNA = menos de 5 kb (4,363 nucleótidos)
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Plasmido pBR322
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Bacteriofago Lambda
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Construction of a Recombinant Plasmid
Figure 14.13
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Reacción de Polimerasa en Cadena- PCR
Técnica bien sensitiva, puede detectar una sola célula cancerosa
Necesita materiales: “primers”- oligonucleótidos 15-30 bases DNA polimerasa- Taq polimeras (Thermus
aquaticus) Máquina realiza ciclos: desnaturaliza a 94C,
priming-enfriar de 50 (A=T), 65C (G=C)- 3 enlaces H, extensión- 72C
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The Polymerase Chain Reaction (PCR)
enables the rapid synthesis of many copies of a specific DNA fragment from a complex mixture of DNA and other cellular components
reaction mix contains primers target DNA thermostable DNA polymerase such as Taq polymerase each of the four deoxyribonucleotide triphosphates
thermocycler is the instrument used
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PCR
En 20 ciclos se producen 1 millón de copias, máquina puede hacer 20 ciclos en 2-3 horas desnaturalizar “priming” extensión
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Quimera
Quimera – inserción en hospedero de clonación y expresión genética
Ejemplo – Construcción Quimera 1. Se aisla gen interferón humano (500 pb y
codifica proteina de 166 amino ácidos). Se corta con endonucleasa Hind III
2. Se abre el plásmido (vector de clonación) con Hind III
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Quimera – cont.
3. Permite que lados “sticky ends” de (1) y de (2) se junten por complementaridad. Enzima ligasa sellará uniones = quimera
4. Quimera se introduce por transformación en hospedero de clonación E. coli
5. Cultivo de E. coli con quimera se coloca en medio de cultivo con ampicilina; solo crecerá E. coli que tenga el plásmido ( lleva gen de R-amp). Se seleccionan colonias de la placa petri.
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Quimera – cont.
6. Se cultivan colonias de E. coli transformadas
7. Se coloca (6) en medio de cultivo especial- condiciones óptimas que permita expresión del gen interferón humano por su transcripción y traducción; se sintetiza la proteina y la libera al medio de cultivo
8. Procesamiento final – purificación proteina y remoción del microorg.
9. Así se han sintetizado hormonas, enzimas, etc.
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Inserting Recombinant DNA into Host Cells
most common hosts E. coli - procaryotic host S.cerevisiae – eucaryotic host
hosts are engineered to lack restriction enzymes and recA
DNA introduction into microbes transformation electroporation
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Inserting Recombinant DNA into Eucaryotic Host Cells
electroporation microinjection gene gun Ti plasmid of Agrobacterium tumefaciens
(used to introduce foreign DNA into plant genomes)
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Expression of Foreign Genes in Host Cells
cloned genes, in the new host cell, are called heterologous genes ,and may not be expressed unless they are modified recombinant gene must have a promoter that host
RNA polymerase recognizes introduced eucaryotic genes must be modified to
have a procaryotic leader sequence and all introns must be removed
expression vectors are used to overcome problems with expression of recombinant genes in host cells
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Verificacion Cultivo Clonado
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Construction of Genomic Libraries
used when gene of interest is on a chromosome that has not been sequenced
the library is constructed by cleaving the genome and then cloning the fragments into vectors
the libraries are screened for the genes of interest in a variety of ways
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III. Productos Bioquímicos de Tecnología de DNA Recombinante
Tecnología DNA recombinante usada por compañias farmaceúticas – manufacturar medicinas contra: diabetis y enanismo Antes se usaba insulina porcina y bovina
para los diabéticos, aunque podia ocasionar reacciones alérgicas
Enanismo se trataba con hormona de crecimiento (HGH) extraída de cadáveres
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The Numerous Applications of Genetic Engineering
in medicine many useful proteins gene therapy
in agriculture use of genetic engineers allows for the
direct transfer of desirable traits to agriculturally important animals and plants
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Insulina rDNA
Insulina recombinada
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Productos de Tec. rDNA
Hoy se produce insulina y HGH por rDNA. También se elaboran vacunas.
Otros productos
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Organismos Genéticamente Modificados - GMO’s
Transfección – proceso de introducir genes extraños a un organismo
Transgénico – organismo modificado genéticamente (GMO’s) Pseudomonas fluorescens – se añadió 1
gen de Bacillus thuringiensis que codifica para la producción de un insecticida- proteina
Liberación de GMO’s regulado por EPA
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GMO’s
GMO’s pueden realizar bioremediación ( degradación de sustratos contaminantes como hidrocarburos, benceno, otros)
Plantas: Uso Agrobacterium tumefaciens – transfiere
fragmento de su DNA a planta y la recombina; tiene plásmido- usarlo como vector de clonación para alterar la planta
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Bioengineering of Plants
Figure 14.19
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GMO’s
Animales: Genes extraños se insertan al óvulo usando
alto voltaje o microinyección Se han logrado ratones transgénicos con
enfermedades de alzheimer, fibrosis cística, etc.
Usando animales transgénicos se ha logrado: sintetizar factores de coagulación de humanos; sustancia disuelve coágulos sanguíneos
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Terapia Genética
Sustituir genes defectuosos por genes funcionales usando vectores de clonación.
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Terapia Genetica
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Social Impact of Recombinant DNA technology
there is scientific and philosophical concern about the use of embryonic stem cells in gene therapy.
This is currently a major controversial issue in the U.S.
the production of genetically engineered food the possibility of the production of genetically
engineered organisms by bioterrorists and other issues
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Referencias
www.slic2.wsu.edu:82/.../pages/Chap10.html
Biotecnología en Bacterias
José MoreyMisraim Vélez
Producción de vacuna recombinante
Producción de vacuna recombinante
Producción de vacuna recombinante
Ventajas
Desarrollo de productos médicos Antibióticos Vacunas Hormonas Productos dificiles de
obtener, en grandes cantidades
Conclusión
Los microorganismos son máquinas flexibles y fascinantes capaces de producir un vasta variedad de compuestos útiles. Podemos esperar ver muy pronto la utilización de estos en la bioremediación y la producción de nuevos metabolitos, compuestos de bioconversiones y expresión de nuevas proteínas; Nos espera un futuro brillante en la biotecnología de microorganismos.
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