biología molecular año 2019 elena g. orellano bioquímica
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Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
orellano@gmail.com ; eorellan@fbioyf.unr.edu.arConsulta: miércoles 16 hs
Biología Molecular Año 2019
Elena G. Orellano
Bioquímica
PRINCIPIOS Y EQUIPAMIENTO: etapas y ciclos dela PCR
SELECCIÓN DE CONDICIONES: componentes
DISEÑO DE CEBADORES
APLICACIONES Y TIPOS DE PCR: Nested PCR,Multiplex PCR, RT‐PCR, PCR en tiempo real o qRT‐PCR
Contenidos a desarrollar
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Clases de PCR
1)PCR I: bases PCR‐ 1 ejercicio colocar!!!
2) PCR II: reactivos, componentes‐ armar un protocolo de temperatura
3) PCR III: especiales
4) Clases de problemas grupales y en las comisiones
5) Laboratorios del tema PCR
6) Evaluación en el parcial
PCR• La reacción en cadena de la Polimerasa (PCR)
fue desarrollada por Kary B. Mullis.• Mullis diseñó la PCR en el año 1983, trabajando en Cetus, una de
las primeras compañías biotecnológicas, en California. Mullisestaba encargado de diseñar y sintetizar cadenas de DNA cortaspara otros científicos. Relata que él concibió la PCR mientrascruzaba la carretera de la costa del Pacífico una noche en sumoto. Pensaba en una nueva manera de analizar mutaciones en elDNA cuando se dió cuenta de que había inventado un métodopara amplificar cualquier región del DNA.
• Mullis recibió U$10,000 de prima de Cetus por su invención. En1992 Cetus, vendió la patente de la PCR y la Taq polimerasa aHoffmann‐La Roche por U$300 millones de dólares.
• Mullis fue galardonado con el premio Nobel de Química en 1993.
http://www.authorstream.com/Presentation/onuorpi‐1683121‐pcr‐revolutionized‐life‐scinces‐history/
3
¿Por qué reacción?
Una reacción consiste en la combinación de dos o más sustancias o componentes para dar
un nuevo compuesto
Reacción en cadena de la polimerasa
¿Por qué reacción en cadena?
Reacción en cadena porque da origen a moléculas‐sustancias que ocasionan
sucesivamente reacciones iguales a la primera.Sucesión de acontecimientos en la que cada uno
es provocado por el anterior.Cada ciclo de la PCR se repite n veces
Reacción en cadena de la polimerasa
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¿Por qué reacción en cadena de la polimerasa?
Las reacciones son catalizadas/dirigidas por la enzima DNA polimerasa
Reacción en cadena de la polimerasa
PCR: método selectivo, específico, sensible y
rápido
Constituye la técnica más importante para amplificar ácidos nucleicos in vitro.
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Ambas hebras del DNA de interés son replicadas exponencialmente mediante la síntesis enzimática
dirigida por una DNA polimerasa termoestable que es cebada por 2 oligonucleótidos (cebadores o primers) y por el agregado de los desoxirribonucleósidos trifosfato
(dNTPs sustratos de la enzima) en un medio buffer adecuado
Reacción en cadena de la polimerasa
Produce grandes cantidades de UN fragmento específico a partir de un molde de DNA complejo
regiones flanqueantes
regiones flanqueantes
Amplificación de la región de interés
fragmento de interés
fragmento de interés
fragmento amplificado
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Constituye la técnica más importante para amplificar ácidos nucleicos in vitro
Método para la amplificación exponencial de secuencias de DNA (ó RNA)
Revolucionó las técnicas de Biología Molecular
PCR: método selectivo, específico, sensible y rápido
Conceptos de la PCR
Sensibilidad: cantidad mínima de DNA necesaria para quese produzca la amplificación.
Especificidad: obtención de un solo producto amplificado.
Eficiencia o rendimiento: amplificación máxima que sepuede obtener con un número determinado de ciclos, serefiere a la cantidad de producto obtenido.
Fidelidad: errores que comete la DNA polimerasa durantela amplificación.
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Preparación de la mezcla de reacción
para la PCR
Reacción de la PCR en el Termociclador
Visualización de los resultados/fragmentos
Duración de una PCR: 2‐3hs
Pasos de la PCR
DNA polimerasa termoestable
DOS oligonucleótidos (cebadores o primers) simple hebra
Sustratos: dNTPs (desoxirribonucleósidos trifosfato)
Cofactor Mg2+
Buffer adecuado
Componentes de la reacción de PCR
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regiones flanqueantes
regiones flanqueantes
Amplificación de la región de interés
fragmento de interés
fragmento de interés
fragmento amplificado
5’3’
3’5’
Blanco
1. Desnaturalizar
2. Anillado primers
3. Extensión primers
Dos copiasdel target
1. Desnaturalizar
2. Anillado primers3. Extensión primers
4 copiasdel target
PCR Amplificación
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El ciclo de la PCR: 3 etapas
Desnaturalización Anillado Síntesis
minutos
• Temperatura de Desnaturalización
• Temperatura de Anillado‐ Hibridación
• Temperatura de Extensión‐ Síntesis
Tres temperaturas
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Los ciclos de la PCR
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Extensión:
72ºC 30 seg‐3 min
Desnaturalización:
92‐95ºC 30 seg‐1 min
Anillado o Hibridación:
40–65ºC 30 seg‐1 min
DNA molde o templado
Producto delimitado por los
cebadores
Productos largos de longitud variable
Supongamos que partimos de 1 copia de templado (en la práctica no es así!!)
En el 3er ciclo aparecen 2 moléculas de la longitud deseada
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n: número de ciclos X : número de copias del molde de DNA original
Considerando que la eficiencia de amplificación es igual a 1
Número total de productos: 2n. XNúmero de productos secundarios: 2.n. XNúmero de productos de longitud esperada: (2n – 2.n). X
EFICIENCIA DE LA PCR: determinada por la DNA polimerasa termoestable, inhibidores, etc.
A partir del ciclo 30 se alcanza la fase “plateau”
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Temperatura necesaria para separar las 2 hebras del DNA molde
•Depende del contenido GC (%)
•Longitud del fragmento a amplificar (DNA molde)
Usualmente 92‐95ºC, separa las 2 hebras del molde de DNA (porej. 45 segundos si G+C < 55%)
Etapa previa de desnaturalización
Etapa de Desnaturalización
Etapa de desnaturalización
Temperatura necesaria para separar las 2 hebras del DNA molde
Depende: contenido GC (%)
longitud del fragmento a amplificar (DNA molde)
Es importante tener en cuenta la vida media de la DNA polimerasa.
Por ejemplo la Taq polimerasa:
2 horas a 92°C
40 min. a 95°C
5 min. a 97,5°C
Usualmente 92‐95ºC, separa las 2 hebras del molde de DNA (45 segundossi G+C < 55%)
Etapa previa de desnaturalización (no la del ciclo de la PCR) si el DNAmolde es complejo: por ejemplo genómico. Sirve también para eliminarimpurezas (proteasas, cloroformo, etc.) de la preparación.
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Etapa de Anillado(annealing, hibridación o apareamiento)
al DNA Es la etapa de unión del cebador o primer al DNA molde desnaturalizado
Al bajar la T° los primers se anillan o hibridan al DNA molde
Esta etapa depende de la TEMPERATURA, del tiempo de anillado del primer, de la composición de bases del DNA molde,
de la longitud, de la concentración de los primers, etc.
Es la T° a la cual la mitad de los oligonucleótidos están anillados al DNA molde
Usualmente es de 45‐60ºC, permite a los primers o cebadoreshibridar al templado o molde, rastrea/barre el DNA molde paraencontrar su correcta secuencia blanco. Debe ser calculada odeterminada empíricamente para cada par de primers
Etapa de anillado (annealing o hibridación, apareamiento)
En esta etapa se produce la unión del cebador o primer al DNA simple hebra molde desnaturalizado, por lo tanto se baja la
temperatura para favorecer el anillado.
La temperatura de anillado debe ser unos grados menor (3 a 5°C) que la T de fusión o “melting” que es la T° en donde los oligos se disocian del templado (Tm= es la T° a la cual la mitad
de los oligonucleótidos están anillados al DNA molde)
Tm = 2 (A+T) + 4 (G+C)(para 20 a 30 nt)
Fórmula de Wallace
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Temp. annealing = 2 (A+T) + 4 (G+C) – 4(anillado ó Temperatura de apareamiento)
Ta: debe ser calculada o determinada empíricamente para cada par de primers y si no son iguales se usa la menor. En el equipo se puede
programar una sola temperatura de anillado por eso los primersdeben tener temperaturas similares.
Para oligont más largos:
Ecuación propuesta por Balton y McCarthy, modificada por Baldino(1989) que predice la Tm de oligont de 14-70 nt (en conc. de cationes 0,4 M o menos) (n= es el Nº de bases del oligo)
Tm ( en ºC)= 81,5 ºC + 16,6(log10[K+]) + 0,41(% [G+C]) – (675/n)
Tm = 2 (A+T) + 4 (G+C) (para 20 a 30 nt)
Fórmula de Wallace
Ta = 2 (A+T) + 4 (G+C) ‐ 4
Temperatura de melting
Temperatura de apareamiento
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Rango Standard: 45°C‐ 65°C, 30‐120 segundos.Durante el annealing, los primers son rápidamente hibridados.Diferencias en la Km presentada por diferentes DNA polimerasaspueden cambiar la hibridación efectiva del primer.
Tiempos de Anillado influyen también en la especificidad
Mejoras en la especificidad:
1. Incrementar la temperatura de anillado (incrementos de 2‐5°C son recomendados) puesto que reduce las posibilidadesde cebado‐priming no específico y por lo tanto de formaciónde productos no específicos.
2. Reducir los tiempos de anillado puesto que tiempos muylargos no mejoran normalmente la producción, pero puedenproducir un aumento en el apareamiento espurio y asímayores cantidades de productos no específicos de PCR.
Corresponde a la Temperatura de síntesis del DNA
Depende de la DNA polimerasa
Taq polimerasa es altamente procesiva: 35‐100 nt/s 2‐4 kb /min
Longitud del fragmento a amplificar: 1000‐2000 bp 1 minuto
Depende de la naturaleza del molde
Usualmente es de 72ºC, la DNA polimerasa se ancla en el complejo molde‐cebador (‐3´OH) y extiende a través de la región blanco
Etapa de Extensión o Polimerización
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Etapa de extensión‐ polimerización
La Temperatura de esta etapa es la óptima de la DNA polimerasa.
Taq. polimerasa: T° óptima 72°C (35‐100nt/seg: depende del buffer, pH, sales, etc.).
El tiempo depende de la longitud del fragmento a amplificar
400‐500 bp 30 segundos
1000‐2000 bp 1 minuto
Hasta 4 kb 1‐2 minuto
Depende de la Enzima DNA pol.
(Taq pol. es altamente procesiva: 2‐4 kb /min).
Si la concentración del molde es baja se pueden alargar los tiempos en los primeros ciclos.
PCR standard es ineficiente en la amplificación de fragmentos > 3 Kb.
Altas T° de annealing: alta discriminación contra primersincorrectamente hibridados y baja la adición de nucleótidos incorrectos
en el 3´
Altas T° de annealing: en los primeros ciclos aumentan la especificidad
Bajas T° de annealing: aumentan los productos inespecíficos
Tº demasiado alta = poco o nada de producto
Tº muy‐baja=anillado no específico = productos incorrectos
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Hot start: disminuye la inespecificidad causada por el anillado y la elongación a bajas T°: agregando a altas T° la enzima Taq polimerasa o por exclusión de 1 reactivo (dNTPs, primers, Mg2+ ) de la mezcla de reacción hasta que la reacción llega a la temperatura de desnaturalización del ciclo.
También puede ser con anti‐Taq: anticuerpo unido a la polimerasa que inhibe la actividad de la Taq polimerasa hasta la etapa de desnaturalización .
Touch down: utiliza T° variables en una sola reacción. Se requiere programar el termociclador.
Inicio a 15°C por sobre la Tm, luego bajar gradualmente (1° a 2° C por ciclo) hasta llegar a 4 °C por debajo de la Tm.
Método útil para evitar productos inespecíficos en la PCR, no deseados (para molde DNA genómico generalmente)
Se generan moldes específicos y luego se los copia a baja Tm.
Estrategias empleadas para una amplificación selectiva en los primeros ciclos y evitar el apareamiento inespecífico:
Elongación final‐última etapa de extensión:
Con ella se asegura que cualquier DNA de cadena simple restante sea totalmente polimerizado, para asegurar que los extremos sean
romos (doble hebra).Etapa única que se lleva a cabo a una temperatura de 70‐74 °C
durante 5‐15 minutos tras el último ciclo de PCR.
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Desnaturalización previa: (no la del ciclo de la PCR) si el DNA molde es complejo,por ejemplo DNA genómico. Sirve también para eliminar impurezas (proteasas,cloroformo, etc.) resultado de la preparación del DNA.
Extensión final: Elongación final‐última etapa de extensión: 7 minutos para asegurar que losextremos sean romos (doble hebra). Etapa única que se lleva a cabo a una temperatura de70‐74 °C durante 5‐15 minutos tras el último ciclo de PCR. Con ella se asegura que cualquierDNA de cadena simple restante sea totalmente ampliado.
Etapas fuera de los ciclos de la PCR
Ejemplo: Secuencia de DNA doble hebra que se desea amplificar o molde:
5´TTAACGGGGCCCTTTAGC.....450nt…TGTAAACCCGGGTTGAC3´3´AATTGCCCCGGGAAATCG....450nt…ACATTTGGGCCCAACTG 5´
(18nt) (17nt)
• Sólo se necesita conocer la secuencia de bases de la región que flanquea elsegmento, región particular que se desea amplificar
• El primer paso para la PCR es diseñar y sintetizar el par de "primers" que engeneral poseen cerca de 20 nucleótidos (14‐30) (Cebadores, oligonucleótidos)
• El primer directo o foward es exactamente igual a la secuencia izquierda de lahebra top y el primer reverso o reverse es complementario a la secuenciaderecha de la hebra top. Concentración: 0,1 ‐0,5 µM (1012 ‐ 1013 moléculas).
5’
3’
3’
3’ 5’
O. DirectoO. Reverso
5’
3’ 5’
20
5´TTAACGGGGCCCTTTAGC.....450nt…TGTAAACCCGGGTTACGTGAC 3´(18nt) 3´ACATTTGGGCCCAATGCACTG 5´
5´TTAACGGGGCCCTTTAGC 3´ (21nt)3´AATTGCCCCGGGAAATCG.....450nt…ACATTTGGGCCCAATGCACTG 5´
5´TTAACGGGGCCCTTTAGC.....450nt……..TGTAAACCCGGGTTGAC3´3´AATTGCCCCGGGAAATCG.....450nt……..ACATTTGGGCCCAACTG 5´
(18nt) (17nt)
5’
3’
3’
3’
O. DirectoO. Reverso
5’
3’
5’
5’
E: Fase temprana o de screening
M: Fase media o de amplificación exponencial
L: Fase tardía, efecto Plateau
Cinética de la reacción de PCR
Las tres fases de la PCR
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PCR: tres fases primariasFase screening (lag): es la selección del fragmento de DNA deseado en un molde complejo por la unión de cebadores específicos al templado
Síntesis por la DNA polimerasa:
5’ ‐T A C G T A C G T A C G A
3’ ‐A T G C A T G C A T G C T A T G C A C A C C G G 5’
3’
5’
3’
3’
5’5’
3’ 5’
Templado
o molde
Fase de amplificación (exponencial):el fragmento flanqueado por los primers seempieza a acumular en forma exponencialdurante ciclos en donde la temperatura sube ybaja permitiendo la síntesis de DNA (exceso molarde reactivos).
Fase tardía (meseta):efecto “plateau” (reasociación del productoporque se encuentra en alta concentracióncompitiendo por los sitios de hibridación de loscebadores, inactivación de compuestos,agotamiento de compuestos, etc.)
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Pérdida de eficiencia de PCR: Efecto Plateau
Factores que llevan a la pérdida de eficiencia de PCR
luego de varios ciclos:
Disminución de actividad de la DNA polimerasa.
Disminución de la disponibilidad de dNTPs y
cebadores. Disminución de la
disponibilidad de Mg2+, para el funcionamiento de la
enzima.
[DNA]
Nº de ciclo
Fase lag
Fase exponencial
Fase de meseta
El Efecto “Plateau”
Fase plateau, se alcanza al acumularse de 0,3 a 1 pmol del producto.Hebras del producto están en tal concentración que la hebrascomplementarias se anillan entre sí, removiendo muchos de los sitiosde fijación de los primers, restringiendo la síntesis. Se generanproductos espurios. La concentración del producto es mayor que la delprimer. Puede ocurrir por baja unión primer‐molde, inhibición porproducto, baja enzima o desnaturalización de la misma, bajo dNTPs,bajo primer, etc.
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Factores que pueden llevar al plateau:
• La disminución de sustratos, cebadores o dNTPs (degradación de losreactivos: enzima, etc.)
• La estabilidad de los reactivos‐ estabilidad de la enzima
• Inhibición por productos finales (formación de PPi)
• Competencia por reactivos, por productos no específicos o dímerosde los primers
• Re‐anillado del producto a altas concentraciones las cualesprevienen la extensión del proceso (10nM)
• Incompleta desnaturalización en concentraciones altas de producto
Número de Ciclos
• Número de ciclos:‐ algunos componentes se tornan limitantes después de 30 ciclos (si el númeroinicial = 105 moléculas de molde)‐ se necesitan >25 ciclos para amplificar un gen de copia única a partir de DNAgenómico de mamífero‐ pocos ciclos: bajan el rendimiento‐ muchos ciclos: aumentan la inespecificidad por eso incrementar el N° deciclos no incrementa la eficiencia. El efecto plateau beneficia lasamplificaciones inespecíficasDepende de la relaciónmolar primer/DNA moldeLimitado por el efecto plateauMayor a 40 ciclos: se aumenta la cantidad y complejidad de los productos no ‐
‐‐‐específicos
• Rango Standard : 25‐40 ciclos• Mejorar especificidad: Reducir el número de ciclos.• Mejorar eficiencia: Para amplificar fragmentos grandes (> 1 kb) incrementar la
duración de cada paso térmico.
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Método selectivo, sensible, específico, y rápido
Especificidad: se refiere a la obtención de un solo producto amplificado. Está determinada por los cebadores y la especificidad con la que se unen al DNA molde. De esta forma, si los cebadores tienen más de un sitio al que se pueden unir aparecerá más de un producto amplificado. Depende de
distintas variables pero la Temperatura es la más importante.
Sensibilidad: se refiere a la cantidad mínima de DNAnecesaria para que se produzca la amplificación. Se
relaciona con los falsos negativos, ya que puede ocurrir que una muestra sea positiva pero sea dada como negativa, porque no se ha amplificado por no tener
suficiente cantidad de DNA molde, de partida o sea del número de copias iniciales. Depende de cual es el material de partida para hacer la PCR . Por eso es
importante conocer el “período ventana” en el caso de las infecciones virales.
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Eficiencia o rendimientose refiere a la cantidad de producto obtenido
O sea la amplificación máxima que se puede obtener en un número determinado de ciclos,
Fidelidadse refiere a los errores que comete la DNA polimerasadurante la amplificación. Este concepto es de especial importancia en la secuenciación, pero en otros casos
no es tan importante. Asociado con la actividad3´‐ 5´ exonucleasa de la polimerasa.
Otros parámetros
Termocicladores
3 ‐ 5 min 94 ‐95ºC (DNA genómico)
30 ‐ 60 seg 94 ºC
30 – 60 seg T anillado
30 seg – 3 min 72 ºC
5 ‐ 10 min extensión final 72 ºC
25- 30 ciclos
Procedimientos pre ypost PCR:
‐se deben hacer en áreasseparadas del laboratorio.
‐Set de pipetas, tubos,guantes, etc.
‐la reacción se hace en muypequeño volumen en tubosde eppendorf (opcional:agregar 1 gota de aceitemineral)
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Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T (1989) In vitro Amplification of DNA bythe Polymerase Chain Reaction. In: Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T(Eds.) Molecular Cloning: a Laboratory Manual. New York: Cold SpringHarbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, USA, chapter 14.Sambrook J, Russell DW (2001) In vitro Amplification of DNA by thePolymerase Chain Reaction. In: Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T (Eds.)Molecular Cloning: a Laboratory Manual. New York: Cold Spring HarborLaboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, USA, Vol. 2, chapter 8.Sharrocks, A.D. (1994). The design of primers for PCR. In: Griffin, H.G. andGriffin, A.M (Eds.) PCR Technology: Current Innovations. London: CRCPress, pp. 5–11.Dale JW, von Schantz M, Plant N (2011) From Genes to Genomes:Concepts and Applications of DNA Technology, 3rd Ed., pp. 109‐130.Libre en internetMcPherson MJ, Møller SG (2006) PCR Second Edition, Taylor & FrancisGroup
Bibliografía
Biología Molecular e Ingeniería Genética‐Luque‐Cabrera y Herráez‐Sánchez
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5´TTAACGGGGCCCTTTAGC.....450nt…TGTAAACCCGGGTTACGTGAC 3´• (18nt) 3´ACATTTGGGCCCAATGCACTG 5´
5´TTAACGGGGCCCTTTAGC 3´ (21nt)3´AATTGCCCCGGGAAATCG.....450nt…ACATTTGGGCCCAATGCACTG 5´
Tamaño del producto final depende del: • Tamaño primer directo • Tamaño primer reverso• Zona a amplificar
Extremos 3´ de los oligos quedan enfrentados!!!!!!!!
5´‐
CGTGTATTACCATATAAAGAATCCCCAAACCTAAGGTTAACTAAGTGTGTATACTGTTCAGAAAGGAATAA
AATTCTTACTCTGATGGTTGGCCTCAAGCCTGTGTTGCTCCAGCACCCTCCTGCCTGACCATTCGGATTG
ACTCTTTCCTCCTAAATATGGCTGTAAGTTTATTCATTCATGAACCACTGCTCAGGAAGGTTCCATGAAAG
GGCAAAAAGTCAACTCTGACTGACCAGCTTGGTTCTATCCCATCCGGTAAAATGTAAAGATTAGGTAAA
ATTACTAACTTTGGGCAAATAATTTCCTCTCTTTGGAACCCTGGTTTTCTCATTTGGACAAGGGAAATTAC
TGTAATATTCACATTTCAAAATATTGGAGAATAATATAGTTAACAATTATAAAAACTGCTTTGTCAAGTATA
ATATGAGCAAGGTAACTGATTTTTTATTGATTACATTCTCTCATAGGTTCAGGTAACAATCTGTGAGTTTAT
TTACTTACACAAGCTGCTGACAAATGTTAATAAGAATCTGAGGCAAGGTTTTCTGTTAAACCTAAAAGAT
TGACAAATTTGAGTTGAGGGACAGTGTTTGCACCGCTTTTTTCCCCATTGTGACATCAAAGGAAAGATG
AAATTAACATTATGTCACATTATTGCGGCATAATTTTATGTTTGCTTTGCTCTTACAATGAAAAGCAGGAC
CTATGGAAATAAACAGATTTACTCCCTTTGTAACTTCAGTCAAGTTAATGAATCTCTTTATCAGTAAAATC
TGTGTTTTTAG 3´
744 nt sin los oligos
Oligo directo 22nt
Oligo reverso 22nt
Problema PCR modelo tipo 1
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Hoy, todo el proceso de la PCR está automatizadomediante un aparato llamado termociclador, quepermite calentar y enfriar los tubos de reacciónpara controlar la temperatura necesaria para cadaetapa de la reacción.
Muchos termocicladores modernos hacen uso delefecto Peltier, que permite tanto calentar comoenfriar los tubos simplemente invirtiendo lacorriente eléctrica. Los tubos usados para PCRtienen una pared muy fina, lo que favorece unabuena conductividad térmica, permitiendo que sealcance rápidamente el equilibrio térmico.
Casi todos los termocicladores tienen un sistemaque calienta la tapa de cierre con el fin de evitar lacondensación sobre los tubos de reacción.Los termocicladores más antiguos carecían de estesistema y solucionaban el problema de lacondensación con una capa de aceite en la partesuperior de la mezcla de reacción o con un poco decera dentro de los tubos.
TERMOCICLADORES
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