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Biofisicoquímica

Estudio de estructura nativa de proteínas

INSTITUTO DE CIENCIAS DE LA SALUDUNIVERSIDAD NACIONAL ARTURO JAURETCHE

Av. Lope de Vega 106, Florencio Varela – Buenos Aires – Argentina

Dr. Eduardo Prieto edprieto@quimica.unlp.edu.ar Dr. Ariel Alvarezaariel@iflysib.unlp.edu.ar

Estructura de proteínas

N Ia Ib In U

Agg

[Urea]

[Urea]

Cuerpos de inclusión (expresión in vivo en E. coli)

Ic

· El estado nativo es metaestable.· El estado conformacional predominante está en equilibrio

con los otros estados.

• Nativo (N)• Desplegado (U o D)• Parcialmente plegado (MG, I)

Degradación

¿Cuáles son las posibles conformaciones de una proteína?

La conformación nativa es la más estable

La proteína adquiere esta conformación como resultado de restricciones conformacionales impuestas por la cadena principal y por otras características físicas y químicas de los aminoácidos

Anfinsen desplegó a la RNasa bajo condiciones extremas y observó que la estructura de la enzima SE REPLIEGA ESPONTÁNEAMENTE en ausencia de otros factores biológicos externos.

N U

Hipótesis termodinámica del plegado proteico

En 1972 mientras recibe el Nobel

"The native conformation is determined by the totality of interatomic interactions and hence by the amino acid

sequence, in a given environment."

NC

N

C

MTEMKDDFAKLEEQFDAKLGIFALDTGTNRTVAYRPDERFAFASTIKALTVGVLLQQKSIEDLNQRITYTRDDLVNYNPITEKHVDTGMTLKELADASLRYSDNAAQNLILKQIGGPESLKKELRKIGDEVTNPERFEPELNEVNPGETQDTSTARALVTSLRAFALEDKLPSEKRELLIDWMKRNTTGDALIRAGVPDGWEVADKTGAASYGTRNDIAIIWPPKGDPVVLAVLSSRDKKDAKYDDKLIAEATKVVMKALNMNGDKLPSE

?

La secuencia de las proteínas o alguna propiedad relacionada con la secuencia determina la estructura 3D

La secuencia de las proteínas o alguna propiedad relacionada con la secuencia determina la estructura 3D

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-lactamasa

• Compactación óptima• Grupos polares en el exterior• Mínima superficie expuesta• Actividad biológica• Interacciones terciarias fijas• Resistente a la acción de proteasas

Caracteristicas del Estado nativo (N)

Ala237: posicionamiento de grupo carbonilo del anillo ‑lactámico.

Asn132, Arg244: interacción con sustrato.

Glu166: Activación de ser70 para ataque nucleofílico.

Ser70: ataque nuclofílico al grupo carbonilo del anillo ‑lactámico.

Lys73 y Ser130: participan en la formación del intermediario acil‑enzima.

Lys73

Arg244

Glu166

Ala273Ser70

Asn132

Ser130

4

3

loop

14

5

El sitio activo de la -lactamasa es una exquisita sonda conformacional, involucra residuos distantes en secuencia y que adquieren su ubicación espacial con el correcto plegado 3D.

Human Aldose reductase at 0.66 Å E. Howard

Interacciones del solvente con la estructura nativa

•Máxima expansión (aumenta el radio hidrodinámico promedio)

•Exposición al solvente máxima de las cadenas laterales. Máxima superficie expuesta

•En teoría infinitas conformaciones (random coil)

•Clusters apolares fluctuantes en teoría sin interacciones preferenciales

•Alta sensibilidad a proteasas

Características del Estado desplegado (U)

Expansión

•Grupo heterogéneo de conformaciones no nativas

•Estructura residual secundaria, nativa o no nativa

•Sin estructura terciaria rígida•Topología variable•Tendencia a la agregación•Sensibilidad a proteólisis

Características de los Estados parcialmente plegados (MG, I)

• La diferencia enorme entre el número de conformaciones permitidas a U y N

•El ordenamiento de las moléculas de agua sobre la superficie accesible

• La expulsión de moléculas de agua en el plegado

Las contribuciones entrópicas

• Las interacciones intramoleculares• Las interacciones con el solvente• Las interacciones entre moléculas del solvente.

Las contribuciones entalpicas

Entropía conformacional

Entropía del solvente

Entalpía de solvatación

Entalpía del solvente

N U

• La diferencia enorme entre el número de conformaciones permitidas a U y N• El ordenamiento de las moléculas de agua sobre la superficie accesible

• Interacciones de van der Waals• Puentes de hidrógeno• Puentes salinos

Cinética del plegado proteico

Escala de tiempoSide-chain rotations

Loop closure

Helix formation Folding of b--hairpins

Protein folding

Protein aggregation

demostró mediante algunos cálculos que si la búsqueda de la conformación plegada fuera al azar cada molécula debería atravesar por un número astronómico de conformaciones desde el estado desplegado.

La búsqueda le tomaría tanto tiempo a la cadena polipeptídica que haría del plegado un proceso muy poco probable

Cada aminoácido posee dos posibles conformaciones El polipéptido (100 residuos) entonces posee 2100 posibles conformaciones.· Damos 1 picosegundo para cada transición entre estados

conformacionales,

El tiempo requerido para el proceso de plegado sería de 1018 segundos o 1010 años.

Cyrus Levinthal (1968-69)

Sin embargo las proteínas en condiciones adecuadas se pliegan rápida, espontáneamente y en forma reversible.

Paradoja de Levinthal

N U

Anfinsen (experimentos con la ribonucleasa)

Depende solo de la estructura primaria de la proteína y de las interacciones con el solvente.

Ene

rgía

Coordenada de reacción

TS

UN

El plegado es un proceso espontáneo.

Osmolitos Caotropos

● Sulfato de sodio

● TMAO

● Urea

● Cloruro de guanidinio

● Tiocianato de guanidinio

¿Como se puede desplazar el equilibrio?

Ene

rgía Estado desplegado

Estado nativo

[D]

¿Como hacemos para determinar la cantidad de proteína nativa?

=[U] k u

[N] k f

= K NUG NU = - RTln K NU

[GdmHCl] (M)

[GdmHCl] (M)1 2 3 4 5 6

0UNΔG

0

Cm

m

m[D] ΔGΔG 0UNUN

]m[C ΔG m0

UN 0

][CmΔG m0

UN /

Desplegado en el equilibrio[G

dm

HC

l]

N Uk u

k f

N

UK UN ff 1

N

U

f

f

N

UK

[D] = CmUN ff 5.0

KRTG NU ln

U

NRTG NU ln

DmGG NUNUOHNU 2

KRT

G NU ln Ke RT

G NU

Ke RT

DmGNUOH

2

N Uk u

k f

K

KSSS UN

total

1

Ke RT

DmGNUOH

2

Estructura terciaria: CD en el UV cercano, fluorescencia, actividad enzimática

Estructura secundaria: CD en el UV lejano

Compactación: SEC-FPLC, DLS (RS)

¿Como nos damos cuenta de equilibrios intermedios?

Estados parcialmente plegados en equilibrio con la forma nativa

El plegado es un proceso espontáneo.

Modelos de plegado: Nucleación

Modelos de plegado: Difusión, colisión y coalescencia

Modelos de plegado: El modelo jerárquico

Modelos de plegado: El modelo del rompecabezas.

Modelos de plegado: El colapso hidrofóbico

Embudos conformacionales y paisajes energéticos.

Cinética de plegado

Ene

rgía

100.00

200.00

300.00

400.00

500.00

600.00

0 100 200 300 400 500 600

Flu

ore

scen

cia

(U.A

.)

Tiempo (S)

A

B

50.05 M GdmCl, 20 C

Actividad -lactamasa

t1/2(ES‑LC9) = 408 min

t1/2(ES‑L) = 1.2 min

SEC-FPLC

t1/2(ES‑LC9) = 398.5 min

Replegado 6 M GdmCl → 0.05 M GdmCl

Lisozima -lactalbumina

Dos proteínas con el mismo fold. Una dos estados y otra tres estados?