bases microbiologicas de la terapÉutica y la resistencia antimicrobiana máster en investigación...
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BASES MICROBIOLOGICAS DE LA TERAPÉUTICA Y LA RESISTENCIA ANTIMICROBIANA
Máster en investigación médica, clínica y experimental
FARMACOLOGIA INTRACELULAR DE ANTIMICROBIANOSDra. Sofía Ballesta Mudarra
El objetivo del tratamiento antimicrobiano es concentrar en el lugar de la infección suficiente cantidad de antimicrobiano para inhibir o destruir al microorganismo
En este sentido los parámetros
PK/PD son predictivos del perfil
farmacocinético; son parámetros
que correlacionan la eficacia
frente a infecciones extracelulares
Para patógenos intracelulares, el lugar donde debe concentrarse el antimicrobiano es menos accesible.
Farmacología intracelular
Farmacología intracelular
Relaciones microorganismos y huésped
Intracelulares obligados. Adaptado a vivir exclusivamente en el interior de las células y necesitan estar en el interior de la célula para sobrevivir
Intracelulares facultativos pueden residir tanto dentro como fuera.
Intracelulares oportunistas
Farmacología intracelular
Farmacología intracelular
Intracellular drug concentrations (review)
Dollery, C.T.
Clinical Pharmacology and Therapeutics. 2013. Volumen 93, 263-266
Farmacología intracelular
Farmacología intracelular
Vida intracelular • Células fagocíticas • Células no fagocíticas (epiteliales)
La actividad intracelular va a depender de muchos factores, entre ellos
de donde se localice la bacteria y
de donde se acumule el antimicrobiano
La célula con antibiótico intracelular se convierte en un transportador fisiológico al lugar de la infección
Farmacología intracelular
Factores de los que depende la penetración de los ATB en la cell
Tipo de transporte que utilizan los ATB para entrar en la cell
Localización intracelular de los ATB en la célula
Elución del ATB desde el interior de la célula al medio extracelular
Actividad intracelular del ATB
Selección del ATB adecuado
DISEÑO de moléculas nuevas
Farmacología intracelular
Ci/Ce
Farmacología intracelular
Parámetros F-Q que rigen la penetración de ATB
LipofíliaP = coeficiente de reparto
Betelactámicos = hidrófilos
Quinolonas = moderadamente lipofílicas
Peso Molecular <700 Da
Capacidad de unión a proteinas
Naturaleza acido-base de la molécula
Ka; pKa
Farmacología intracelular
Parámetros F-Q que rigen la penetración de ATB
Naturaleza acido-base de la mólecula
Betalactámicos (acidos orgánicos)
Quinolonas (anfotéricas)Macrólidos (carácter básico)
Farmacología intracelular
Mecanismo de penetración de ATB en la célula
Moléculas
• Neutras• Lipófilas • <700 Da
- Betalactámicos- Quinolonas
Difusión pasiva
EndocitosisMoléculas• (No neutras)
Moléculas demasiados polares• (<<700 Da)
Moléculas demasiados voluminosas
- Aminoglicosidos y- Glicopéptidos
Farmacología intracelular
Mecanismo de penetración de ATB en la célula
Farmacología intracelular
Mecanismo de penetración de ATB en la célula
Canales transportadores
Activo pasivoMoléculas• Análogos de sustratos
endógenos transportables al interior de la célula
• Con o sin Energía
- Quinolonas y - Betalactámicos
Farmacología intracelular
Salida del ATB de la célula
Farmacología intracelular
Penetración intracelular de los ATB
antimicrobiano
célula eucariota
Aislamiento de células
(PMN, Macrófagos, células epiteliales…)
Incubación células + ATB
Medir la concentración del ATB intracelular
Farmacología intracelular
Penetración intracelular de los ATB
IncovenientesMide antimicrobiano asociado a la célula (fracción lipídica, proteica)
antibiótico intracelular ó unido a la superficie externa de la célula.
parte del antibiótico intracelular puede salir al exterior en el proceso
Farmacología intracelular
Penetración intracelular de los ATB
Técnica cromatográfica
V HPLC muy especifica
I Requiere grandes volúmenes de
células
I Altas concentraciones de ATC
Técnica radiométrica
V Muy sensible y reproducible
I ATB marcados radiactivamente
Técnica fluorométrica
V Muy sensible y reproducible
I ATB con fluorescencia
Farmacología intracelular
Caracterización de la penetración de ATB
Caracterizacion del paso por difusión pasiva
Viabilidad celular
Temperaturas
Saturación del proceso
Modificación del pH extracelular
Caracterizacion del transporte activo
Inhibidores metabólicos
Inhibidores de fuentes de energía ( NaCN, FNa, 2,4 dinitrofenol)
Desacoplantes de potencial de membrana (ouabaína o CCCP)
Ionóforos como el w-clorofenil hidrazona (CCP)
Análogos del transporte
Estimuladores celulares (PMA )
Caracterizacion del effluxInhibidores de bombasDistintos tiempos de incubación
Farmacología intracelular
Medida de la actividad intracelular
1. Medición de halos de inhibición del antibiótico del interior de las células
2. Medición de la reducción que se produce en la supervivencia intracelular de las bacterias
bacterias
antimicrobiano
célula eucariota
Diseño de nuevas moléculas.
Formulación de nuevos fármacos
Fluorquinolonas
Activos intracelularmente frente a patógenos intracelulares como Micobacteria, Legionella spp, Streptococcus pneumoniae y Sthapylococcus aureus.
Mecanismos de resistencia específicos asociados con mutaciones, principalmente en los genes gyr A y parC.
UB-8902 . Esta molécula se diseña con objeto de mejorar la actividad de ciprofloxacino y
norfloxacino frente a cepas resistentes.
X R1 R2 R3 R4 R5 R6
Ciprofloxacino NH C3H5 H H H H -
UB-8902 N C3H5 H H H H Met
Objetivo
• Evaluar la penetración de UB-8902 en leucocitos polimorfonucleares hunanos (PMNs)
• Estudiar la actividad intracelular de UB-8902 frente a S. aureus con resistecia asociada con mutaciones en los genes gyr A o parC
Strain
Mutations
gyrA Ser84 gyrA Glu88 grlA Ser805-61 wild-type wild-type wild-type
5-61 G8 wild-type wild-type mutant5-61 M14 wild-type mutant mutant
Cinética de penetración y eflujo de UB-8902
Tras 20 minutos de incubación con concentración extracelular de 2 mg/mL se alcanzan concentraciones intracelulares de 13,5 mg/mL (C/E=6.5).
Tras cinco minutos de incubación en medio libre de antimicrobiano se libera el 70% del mismo desde el interior de los PMN.
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
0 20 40 60 80 100 120
time (min)
Intr
acel
lula
r co
nce
ntr
atio
n (
µg/m
l)
PENETRACIÓN DE UB-8902 EN PMN
Fluorquinolonas
C/E
UB-8902 6.5
Norfloxacino 4.5
Lomefloxacino 6.9
Ofloxacino 6.6
Moxifloxacino 10
Trovafloxacino 10
0,0
10,0
20,0
30,0
40,0
50,0
60,0
70,0
80,0
90,0
100,0
2 5 10 25 50
Extracellular concentration (µg/ml)
Intr
acellu
lar
co
ncen
trati
on
(µg
/ml)
La cantidad de UB-8902 asociado a PMNS se saturó a concentraciones > 50 mg/ML
Influencia de los factores ambientales
Conditions C/E
Viable cells, 37ºC, pH 7’2 (control) 6.5 ± 0.8
Viable cells, 4ºC 6.3 ± 1.5
Dead cells, 37ºC 7.6 ± 1.3
pH 5 8.6 ± 1.0 a
pH 6 8.6 ± 1.6 a
pH 8 4.9 ± 1.1 a
a p <0.05 compared with the control.
Efecto de los estímulos de membrana
Conditions C/E
Control 6.5 ± 0.8
2,4-Dinitrophenol 0.1 mM 7.4 ± 1.1
Sodium cyanide 1.5 mM 3.3 ± 1.4 a
Sodium fluoride 1.5 mM 5.6 ± 1.8
m-Chlorophenylhydrazone 0.015 mM
6.0 ± 1.2
PMA 7.1 ± 0.8
S. aureus 5-61 7.1 ± 1.0
S. aureus 5-61 M14 6.9 ± 1.6
a p <0.05 compared with the control.
Conditions/ Value UB 8902 Moxifloxacino DX 619 TROVAFLOX OFXLVX
Viable cells, 37ºC, pH 7’2 (control) 6.5 ± 0.8 10 10 10 6.6 4.6
Viable cells, 4ºC = ↓* ↓* ↑* ↓* ↓*
Dead cells, 37ºC = = = = ↓* ↓*
Eflujo Rápido Rápido Rápido Rápido Rápido Rápido
Saturabilidad[0-40 mg/L]
No No No No No No
pH 6 ↑* = = ↑* ↑ ↑
pH 8 ↓* ↓* = = ↓* ↓*
2,4-Dinitrophenol 0.1 mM = = = = = =
Sodium fluoride 1.5 mM = ↓* = = = =
m-Chlorophenylhydrazone 0.015 mM
= ↓* ↓* = ↓* ↓*
Hidrofobicidad =Poco
hidrofóbica= Muy Hidrofóbica =
=
Pasivo Activo Activo/pasivo PasivoActivo/pasivo
Activo/pasivo
Actividad Intracelular de UB-8902
Cepa
Mutaciones CMI
gyrA Ser84
gyrA Glu88 grlA Ser80 UB 8902 Ciprofloxacino
5-61 wild-type wild-type wild-type 0,06 0,06
5-61 G8 wild-type wild-type mutant 0,5 8
5-61 M14 wild-type mutant mutant 4 64
La actividad de UB892 comparada con ciprofloxacino
se ve aumentada 16 veces
UB-8902
0,0
20,0
40,0
60,0
80,0
100,0
0,125 1 5
Extracellular concentration (mg/L)
Surv
ivin
g s
taphylo
cocci (
%)
S. aureus 5 61 CEPA 5 61 G8 CEPA 5 61 M14
En la cepa salvaje, UB 8902 provocó una reducción significativa de la supervivencia intracelular con las tres concentraciones extracelulares ensayadas.
En las cepas mutadas, solo produjo una reducción significativa de la supervivencia intracelular a con > 1 mg/mL, no apreciándose diferencias significativas entre ambos tipos de cepas
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