bacterias acido lacticas y fermentacion … · eflujo de protones requiere atp ... fuerza protón...
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BACTERIAS ACIDO LACTICAS Y FERMENTACION
MALOLACTICA
Dra. Mariana CombinaLaboratorio de Microbiología Enológica
EEA Mendoza -INTA
Anaerobios aerotolerantes (citocromos, heminas)
Cocos o bacilosGram positivos
No Esporulados
Propiedades metabólicas y nutricionales comunes
Acido lácticoCatalasa negativa
Supeóxido dismutasa 2 O2 + 2 H+ O2 + H2O2
Catalasa 2 H2O2 2 H2O + O2
Peroxidasa C-org. + H2O2 C-O + H2O
Mn+2 2Mn+2 + 2 O2 2 MnO2
2 MnO2 MnO2- + O2 + Mn+2
RELACIONES CON EL OXIGENO
Compuestos tóxicos del oxígeno
Superóxido O2
peróxido de hidrógeno H2O2
Cocos o bacilosGram positivos
No Esporulados
Propiedades metabólicas y nutricionales comunes
Acido láctico
Anaerobios aerotolerantes (citocromos, heminas)
Poliauxótrofos
Catalasa negativa
POLIAUXOTROFOS
Mn+2Vitaminas de grupo B
aminoácidosbases púricas y pirimidínicas
Medios complejoscon peptona o Extracto de levadura
y azúcar fermentableAcido pantoténico (uva, tomate)
Cocos o bacilosGram positivos
No Esporulados
Propiedades metabólicas y nutricionales comunes
Acido láctico
Anaerobios aerotolerantes (citocromos, heminas)
Poliauxótrofos
Catalasa negativa
Metabolismo homo y heterofermentativo
Metabolismo
Azúcares: monosacáridos pentosas (arabinosa, xilosa, ribosa, ramnosa)hexosas (glucosa, fructosa)
disacáridos (sacarosa)
Ácidos orgánicos: cítrico, málico y tartáricoAlcoholes: glicerol
Pentosas se metabolizan por vía pentosa fosfato
1 pentosa 1 lactato + 1 acetato + 2 ATP
D-lactico/L-lactico
CLASIFICACION GENERAL
Pediococcus cocos 2 planos homoferment.
Lactococcus cocos 1 plano homoferment.(Streptococcus) (cadenas)
Leuconostoc cocos 1 plano heteroferment.(Oenococcus)
Lactobacillus bacilos homo L. maliL. casei (facultativo)
hetero L. plantarumL. hilgardiiL. fructivorans, otros
BAL están presentes en todas la etapas de la vinificación
Uva 103-104 ufc/mL Lb. plantarumLb. casei Lb. hilgardii
(madurez y sanidad uva) Lb. mesenteroides P. damnosus
Inicio de FOH 102-103 ufc/mL SO2
Final FOH mantiene bajo (fase latencia-variable)
Desarrollo hasta 106-108 ufc/mL Depende de distintos factores(pH, etanol, temperatura, SO2,interacción levadura, autolisis levadurasCO2)
Oenococcus oeni y algunos Pediococcus o Lactobacillus
Glucosa
Pentosa P
G3P
2 NADH
acetilP
etanol
Piruvatolactato
1 NADH
1 NAD
2 NAD
CO2
En condiciones limitantes de NAD ferm lácticano limitantes de NAD ferm. ácido mixta
Oenococcus oeni
ATP
1 ATP
acetato
ATP
FructosaF6P
1 NAD
2 ATP
Glucosa
ribulosa5P
G3P
2 NADH
acetilP
etanol
Piruvatolactato
Citrato
acetato
1 NADH
1 NAD
2 NAD
CO2
CO2
Presencia de otros aceptores externos modifica el metabolismo y estimula el crecimiento
1 NAD+
Oenococcus oeni
ATP
acetato
ATPmanitol
1 NAD
Fructosa
secuencial
Glucosa
ribulosa5P
G3P
2 NADH
acetilP
Piruvato
Citrato
CO2
diacetilo
Zaunmuller, 2006
Estimula el crecimiento bacteriano
pH elevado + acético - diacetilopH bajo - acético + diacetilo
Oenococcus oeni
Acetoina
Acido acético (0,1-0,2 g/L)
ATP
FML málico-cítrico secuencial??
Necesidad de control una vez finalizada la FML
Las bacterias permanecen largo tiempo en vino
Curvas de crecimiento (FML-espontánea)
3
4
5
6
7
8
9
4 11 21 29 38 46 53 60
Dias
log
UFC
/ml
log UfC/ml
2 per. media móvil (log
UfC/ml)
Final de degradación del ácido málico
Lavalle
1
2
3
4
5
6
7
8
9
9 19 23 27 32 39 43 63
Días
log
UF
C/m
l
log UFC/ml
2 per. media móvil (logUFC/ml)
Final de degradación del ácido málico
La Consulta
FML mecanismo adicional de energía (ATP)
Fuerza protón motriz+
Gradiente químico (pH)Potencial eléctrico (cargas + y -)
+
+++++
--
-
-
- -
H+
El mantenimiento de potencial requiere ATPasaEflujo de protones requiere ATPInflujo de protones genera ATP
H+
Membrana
FERMENTACION MALOLÁCTICA EN VINOS
FERMENTACION MALOLÁCTICA EN VINOS
Oenococcus oeni
Deben alcanzar106 cel/mL
Malato - - Malato - -
Lactato -
H+ (simporte)
ADP
ATP
H+H+
H+
lactato
CO2 alcaliniza y
aumenta gradiente de pH
interiorexterior
Fuerza protón motriz
Modificaciones en el vino- Positivas
Acidez Disminuye AT (pH aumenta 0,1-0,3 unidades)
SuavizaVolumen
Decrece astringenciaAumenta la condensación de taninosPolisacáridos
Aroma
Reducción de los herbáceosFrutales (¿?) damasco,ciruela
Madera, robleManteca y lácteos (diacetilo: 1-4 mg/L)β-glucosidasas en O.oeni
Estabilidad Consumo de azúcares-bacteriocinasFML espont.en botella
Modificaciones en el vino -negativas
Color
Puede disminuir hasta 30%:Modificación del pHAntocianasa (antocianos glucosilados)Consumo de acetaldehído
MantecaProducción de diacetilo (5-7 mg/L) (puede ser degradado por las levaduras)
Aroma Enmascara aromas varietales
Riesgo
Aromas fenolicos y piridinasAminas biógenasEtil-carbamatos
Acidez Elevar AV (0,2-0,3 g/L)
Fermentación maloláctica
Depende de factores:
azúcares-nitrógeno disponible
pH
Etanol
SO2
Temperatura
Azucares residuales (hexosas, pentosas, acidos orgánicos)
Fuentes de nitrógeno: autolisismantenimiento sobre borras
(absorción de compuestos tóxicos para BAL y generación de CO2)
Fermentación maloláctica
Depende de factores:
azúcares-nitrógeno disponible
pH
Etanol
SO2
Temperatura
pH <3,0 no BAL Oenocuccus más RpH crítico: 3,5 (otras BAL)
Importante: balance uso azucares y málico(óptimo enzima ML: 3,8 – 60% act: 3,0-3,2)Ensayo pH: 3,15 FML 165 días
3,8 FML 14 díasPH bajo: favorece FML y ingreso de málico
pH elevado: lenta entrada de málicofavorece el uso de azucares
aumento AV- picado
Fermentación maloláctica
Depende de factores:
azúcares-nitrógeno disponible
pH
Etanol
SO2
Temperatura
OH> 10% inhibe la mayoría de BAL
Importante: efecto inhibidor se potencia con pH – transporte malico
10% OH/pH 3,3: solo Oenococcus
12% OH/pH 3,2: selección de un m.o. nativo
Fermentación maloláctica
Depende de factores:
azúcares-nitrógeno disponible
pH
Etanol
SO2
Temperatura
Todas las formas de SO2 son activas (+ o -)Dependiente de pHDegrada acetaldehido libera SO2 ligado
10 mg/L libre sin problemaSO2
30 mg/L libre inhibe
Fermentación maloláctica
Depende de factores:
azúcares-nitrógeno disponible
pH
Etanol
SO2
Temperatura
Temperatura óptima creci: 28-30 ºC Temperatura óptima FML: 18-20 °C
Frío: 10-15ºC crecimiento insuficiente
106 cel/mL de mosto
Otros factores que afectan la FML
Taninos
Antocianos estimulan el crecimientoTaninos inhiben Solo luego de polimerización FMLExtracto de vino igual que testigo sin vino
Taninos de la piel estimulanTaninos de semilla inhiben (concentrac 10 veces sup.)Taninos de madera estimulan
Manoproteínas protegen a BAL de taninos
Evidencia en algunos tintos más FML que en otros
MERLOT Tendría fracciones tánicas que inhiben FML
Cabernet Sauvignon no dio igual – Tanah similar
Otros factores que afectan la FML
Carencias nutritivas
Exceso de oxígeno
Concentración inicial de acido málico
Mantenimiento sobre borrasExcesiva clarificaciónCompactación de borras – mover
En vinos difíciles (idem + polisacáridos y
celulosa para suspensión)
En agua de hidratación (levaduras inactivas,
aa, vitaminas, minerales)
Nutrición
Debe evitarse al final de la FA
Rango 0,8 a 4 g/L
Otros factores que afectan la FML
Cepa de levadura
Residuos de fungicidas
Adecuada elección de la cepa
BotriticidasSwitch (fluodioxinil+ciprodinil)
Competencia por sustratoSO2
EtanolAcidos grasos (C6-C12)Péptidos
5 4 3 2 1 0++ + + - - -- No information
QA23 DV10 EC1118 CEG M1 C1108
ICV D254 R2 PM SIMI White K1 C or R771B M2 ICV D21 2323 WAM FC9AMH W BDX 2226 Opale QD145W15 W27 BRL97 RHST T73
6U SLO T306 ALBCY3079 Cross evolution 2056 Syrah
W46 BGY RA17 M69RC212 CSM BM45 CGC62
ICV D80 VQ15 BM4x4 CKVN 228 BA11 GHM
VRB MCSICV GRE SVGICVD47
Rhone 4600CMCS2299NEMPMABC
CEG43
Yeast strains
Level of compatibility
Tabla de compatibilidad con la FML
Que hacer para si la FML no se produce
Re-inoculación
Eliminación de tóxicos
Test rápido para la FML
Paredes de levadurasBentonitaH2O2
Adecuada elección de la cepaNutriciónControl de temperaturaAdaptación de la cepa a las condiciones del vino
Fermentación maloláctica
Espontánea Inoculada
ImpredecibleLargos retrasos
Costo Riesgo alteración (Brett)
FML sp -Aminas biógenas
Disminución de la calidad sensorial
Medio poco favorable
Falta de adaptación
Bacterias no autóctonas
Implantación deficiente
Inadecuada activación
ProblemasUso de inóculos comerciales
Optimizar el tiempo de inoculación
Tiempo de inoculación
Inoculación temprana
Inoculación tardía
Simultáneamente con laslevaduras o
tempranamente en la FA
Después de completarsela FA
Co-inoculación – experimentación desde 2004
Impacto sobre:
• viabilidad de las levaduras y FA • viabilidad de las BAL y FML. • producción de acido acético• características físico-químicas y organolépticas de los vinos Malbec.
• Comparar los resultados obtenidos con co-inoculación con la práctica tradicional de inoculación secuencial (al final de la fermentación alcohólica) utilizando inóculos 1-Step y MBR.
Objetivo:
Evaluar la factibilidad de la co-inoculación en mostos tintos
Variables:
Distintas cepas de BAL MBR y en diferentes combinaciones con levaduras (paper)
Cepas MBR y pre-aclimatadas
Tiempo óptimo de inoculación temprana (24 hs y 48 hs)
Co-inoculación – ensayos 2007
- Malbec 1 = 3,6- Malbec 2 = 3,8
D254 + Alpha 1-Step
Inoculaciónsimultanea
Inoculaciónsecuencial
24 y 48hs Control MBR
Tiempo para alcanzar concentraciones de ácido málico menores a 0,1 g/L en los mostos Malbec 1 y 2
Final FA 13 días
Mosto
Tratamiento Tiempo de FML
desde inoculación (días)
Tiempo total de fermentación
(FA+FML)(días)
24 8 13 48 5 13 FA 1-Step 6 19
1
FA MBR 8 20
24
8
13
48 5 13 FA 1-Step 6 19
2
FA MBR 8 20
Levaduras y fermentación alcohólica
Malbec 1
0,98
1
1,02
1,04
1,06
1,08
1,1
1,12
0 2 4 6 8 10 12 14Tiempo (días)
De
nsid
ad
24-1 48-1FA 1-Step-1 FA MBR-1
Malbec 2
0,98
1
1,02
1,04
1,06
1,08
1,1
1,12
0 2 4 6 8 10 12 14Tiempo (días)
De
nsid
ad
24-2 48-2FA 1-Step-2 FA MBR-2
Seguimiento de la fermentación alcohólica realizada en los mostos 1 y 2 por la levadura ICV D254 y la bacteria Uvaferm Alpha 1-Step inoculada en distintos tiempos (24, 48 y FA 1-Step) y su control MBR inoculada al final de la FA (FA-MBR).
Malbec 1-24
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
0 2 4 6 8 10 12 14 16
Tiempo (días)
Lo
g U
FC
/mL
0
0,3
0,6
0,9
1,2
1,5
1,8
2,1
2,4
2,7
3
L-m
álico
(g/L
)
Malbec 1-48
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
0 2 4 6 8 10 12 14 16
Tiempo (días)
Lo
g U
FC
/mL
0
0,3
0,6
0,9
1,2
1,5
1,8
2,1
2,4
2,7
3
Ác
ido
L-m
álico
(g
-L)
Malbec1 -FA 1-Step
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
0 3 6 9 12 15 18 21 24
Tiempo (días)
Lo
g U
FC
/mL
0
0,3
0,6
0,9
1,2
1,5
1,8
2,1
2,4
2,7
3
Ác
ido
L-m
álico
(g/L
)
Final FA Inoculación BAL
Malbec 1 - FA MBR
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
0 3 6 9 12 15 18 21 24
Tiempo (días)L
og
UF
C/m
L
0
0,3
0,6
0,9
1,2
1,5
1,8
2,1
2,4
2,7
3
Ác
ido
L-m
álico
(g
-L)
ICV D254 1-Step Ácido L-málico
Degradación del ácido L-málico y viabilidad de Saccharomyces cerevisiae (ICV D254) y Oenococcus oeni(Uvaferm Alpha 1-Step y MBR) en el mosto 1 (pH 3,6) en distintos tiempos de inoculación. 24: 1-Step adicionada a las 24 horas, 48: 1-Step adicionada a las 48, FA 1-Step: 1-Step adicionada al final de la FA y FA MBR: cepa MBR adicionada al final de la FA. La línea de puntos indica la población de BAL nativas previas a la inoculación con la cepa comercial
Mosto Tratamiento Acido D-Láctico
(g/L)
24 0,134 48 0,170
FA 1-Step 0,138 1
FA MBR 0,141
24 0,064 48 0,080 FA 1-Step 0,070
2
FA MBR 0,083
Evaluación del consumo de azúcares
Malbec 1
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24Tiempo (días)
AV
(g
/L a
cé
tic
o)
24-1 48-1FA 1-Step-1 FA MBR-1
Malbec 2
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24Tiempo (días)
AV
(g
/L a
cé
tic
o)
24-2 48-2FA 1-Step-2 FA MBR-2
Producción de ácido acético en mostos 1 y 2 fermentados con la levadura ICV D254 inoculados con la bacteria láctica comercial Uvaferm Alpha 1-Step en distintos tiempos (24, 48 y FA 1-Step) y su control MBR inoculada al final de la FA (FA MBR).
Mosto
Tratamiento
Acidez
Volátil (g/L ac. acético)
Acidez total
(g/L ac. tartárico)
pH Etanol (% v/v)
Azúcares
reductores (g/L)
24 0,71 5,11 3,70 14,13 1,67 48 0,70 4,94 3,76 14,54 1,53 FA 1-Step 0,65 4,57 3,88 14,84 1,61
1
FA-MBR 0,68 4,72 3,85 14,87 1,95
24
0,80
5,08
3,83
14,26
1,69
48 0,60 4,51 3,95 14,72 1,83 FA 1-Step 0,70 4,62 3,93 14,97 2,03
2
FA-MBR 0,62 4,54 3,92 15,08 1,95
Valores físico-químicos finales de los vinos Malbec 1 y 2 fermentados con la levadura ICV D254 y labacteria Uvaferm Alpha 1-step inoculada en distintos tiempos (24, 48 y FA 1-Step) y su control MBRinoculada al final de la FA (FA MBR).
Fig. Nº1: Descriptores organolépticos de vinos Malbec pH 3,6. Medias correspondientes a 11 degustadores. INTA. 2007.
0,00
0,50
1,00
1,50
2,00
2,50
3,00
3,50
4,00
Intensidad de color
Matiz violeta
Intensidad aromática global
Frutal
Láctico
Reducido
Amargo
Astringencia
24 48 F1 FMBr
Parámetros como la viabilidad de las levaduras yperformance de la FA no fueron negativamente afectados.
En sólo un caso se observó un leve aumento en la acidez volátilfinal de los vinos comparado con los tratamientos control (dentro delos límites tolerados).
El análisis sensorial de los vinos mostró algunas diferenciassignificativas las cuales en general se presentaron a favor de lainoculación temprana con las cepas pre-aclimatadas
•Óptimo comportamiento para ser utilizados en inoculación temprana.• Buena adaptación tanto en mosto como en vino.• Rápida degradación del ácido málico.
Los inóculos de bacterias 1-Step previamente aclimatados presentan:
Conclusiones
Intentar que la FML finalice conjuntamente con la FA o días después
Evaluar el riesgo de las fermentaciones languidecientes
Mejor resistencia a los inhibidores (pesticidas)
Poco consumo de azucares (ácido D-láctico)
Cepas preaclimatadas mas rápidas que cepas de inoculacióndirecta
Importante la matriz y la elección de la cepa de levadura
Control de población nativa de BAL
Desarrollo exitoso de la FML
No afecta perfil sensorial o mejora preferencia consumidor
Consideraciones
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