aplicacion clinica de ls biologia molecular
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APLICACIÓN CLINICA DE LA
BIOLOGIA MOLECULAR
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Conceptos básicos
Objetivos del Módulo Al final de este módulo, los participantes estarán en capacidad de: Describir la estructura del material genético Entender el mecanismo de transmisión y las implicaciones fisiológicas Entender la replicación viral
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Conceptos básicos
DNA (Acido Deoxyribonucléico) – Provee información genética para la codificación de proteínas RNA (Ácido Ribonucléico) – Provee infromación para convertir la información genómica en proteínas. DNA y RNA Son polinucleótidos
Componentes de los Nucleótidos Deoxyribosa/Ribosa (5-carbon azucar) Base nitrogenada unida al azucar Grupo fosfato
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Conceptos básicos
Flujo de Información Genética
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Que son las Pruebas de Ácido nucleicos o Pruebas Moleculares?
Son pruebas del laboratorio para detectar, cuantificar o caracterizar un patógeno, utilizando su material genético (RNA o DNA)
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Conceptos básicos HIV
HIV es un virus miembro de la familia de los Retrovirus, su material genético está compuesto por RNA. El Grupo de mayor prevalencia es el M (Major) el cual se subdivide en al menos 11 subtipos.
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Conceptos básicos HIV
La infección por HIV causa SIDA
SIDA es el estado final de la infección por VIH
SIDA es una condición que gradualmente destruye el sistema inmune haciendo que el cuerpo se vuelva vulnerable a enfermedades por oportunistas.
El Virus se multiplica en las células blancas (CD4) encargadas de proteger el cuerpo de la enfermedad.
La transmisión del VIH se hace por sangre, semen, secreciones vaginales y otros fluidos biológicos de una persona infectada.
La transmisión se da por el uso de material corto punzante contaminado y existe la transmisión Madre-Hijo.
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Conceptos básicos HIV
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Modulo 1: Conceptos básicos Ciclo de Vida del HIV
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Ciclo de Vida del HIV
Unión e Ingreso a CD4: Los receptores del virus se unen a las células de inmunidad. Estos receptores están en la envoltura del virus Las Glicoproteínas gp120 y gp41 se unen a los receptores celulares de
los CD4. Después de la unión, el virión entra a la célula y el RNA viral es
liberado. Transcripción Reversa y Síntesis: El RNA viral es copiado por acción de la transcriptasa reversa en una
cadena doble de DNA
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Ciclo de Vida del HIV
Integración viral y Transcripción: La proteína viral integrasa, integra el DNA viral en el núcleo de la célula. El DNA viral puede ser trascrito en RNA por acción de la RNA
polimerasa de la célula huésped. Síntesis de Proteína virales: En el citoplasma de la célula huésped, los ribosomas transcriben el
RNA viral en proteínas Estas proteínas son transportadas a la membrana celular con le RNA
viral para el ensamble del nuevo material genético de las nuevas células.
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Ciclo de Vida del HIV
Ensamble del nuevo virus y liberación: Los nuevos componentes virales se reúnen en la
membrana celular Los nuevos núcleos que contienen RNA y proteínas son
ensamblados formando nuevas partículas virales llamadas viriones. El virión se vuelve activo cuando la enzima viral proteasa
rompe las proteínas en unidades activas volviendo el virión infeccioso. Las partículas virales son liberadas
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Ciclo de Vida del HIV
Replicación
La vida media de los CD4+ infectados es de 1,6 días
La vida media de los viriones es de 6 Horas.
El Virus se replica logarítmicamente (~10 billones/día)
SUPPLEMENTAL INFO FOR TRAINING PURPOSES ONLY Refer to Product Labeling for updated info.
Cómo afecta el HIV-1 / SIDA
clínicamente a los pacientes?
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Cómo afecta el HIV-1 / SIDA clínicamente a los pacientes?
Objetivos del módulo:
Al final de éste módulo los participantes deben estar en capacidad de:
Describir la importancia de la cuantificación de la carga viral
Describir la correlación entre carga viral y la progresión a SIDA.
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Cómo afecta el HIV-1 / SIDA clínicamente a los pacientes?
Los médicos emplean la carga viral junto con el cuadro clínico del paciente y otros marcadores de laboratorio como una ayuda en el manejo de individuos infectados con VIH.
NO es una prueba de diagnóstico.
La carga viral se emplea para determinar la progresión de la enfermedad a SIDA y para monitorear la eficacia de la terapia a con anti-retrovirales mediante la medición de cambios en los niveles de virus circulante durante el curso de la terapia.
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Cómo afecta el HIV-1 / SIDA clínicamente a los pacientes?
Infección por HIV Infección primaria/o Síndrome Agudo retroviral (ARS) Disminución de los CD4+ Altos niveles plasmáticos de HIV (Carga Viral (VL) Síntomas clínicos que se solucionan de 1 a 3 semanas y disminución de la carga viral. Latencia Clínica Alta replicación del virus Disminución de los CD4+ Promedio de duración de 10 años (Sin intervención terapéutica) SIDA El cuerpo se vuelve vulnerable a enfermedades por oportunistas Muy bajos recuentos de CD4+ Altos niveles de VL.
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Respuesta Virológica a la infección por VIH
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Tipos de Terapia
La terapia Anti-retroviral bloquea la replicación viral en las células: Inhibidores de la Transcriptasa Reversa (RTI), Enzima encargada de iniciar el ciclo reproductivo del virus, bloquendo la transcripción de RNA a DNA. Son de dos Clases: NNRTI: Análogos No-nucleosidos Analogues, se incorporan al DNA y detienen la replicación. NRTI: Análogos Nucleosidos, se unen directamente a la TR y previenen la conversión de RNA a DNA.
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Tipos de Terapia
Inhibidores de Proteasa (PI) Bloquean la proteasa enzima necesaria al final del ciclo reproductivo del HIV (Inhibe la maduración de proteína y el ensamble viral)
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Tipos de Terapia
Inhibidores de Fusión: Actúan sobre la glicoproteína gp41 del VIH-1
p41 es el nombre para designar la glicoproteína de membrana del virus VIH. Esta glicoproteína está presente en la infección de los linfocitos CD4 por el virus VIH.
La región genómica gp41 esta localizada en el gen de envoltura del VIH ( también llamado gene gp160).
Los inhibidores de fusión son una categoría de medicamentos diseñados para inhibir la infección del virus mediante su capacidad de bloquear la fusión del virus y las células CD4.
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TECNICAS MOLECULARES
PARA EL DIAGNOSTICO
DE ENFERMEDADES
INFECCIOSAS HIV, HCV Y
HBV
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Que ventajas hay en utilizar Tests de Biología Molecular ?
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Las pruebas de Biología Molecular utilizan el
material genético de células como blanco haciendo los ensayos mas sensibles y específicos.
En agentes infecciosos ayuda a:
•DIAGNOSTICAR •MONITOREAR •GUIAR EL TRATAMENTO.
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Tests de Biología Molecular
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Los ensayos moleculares detectan Ácidos Nucleicos DIRECTAMENTE en una muestra, diferente a los ensayos inmunodiagnósticos que detectan proteínas (Ag/Ac) específicas.
Rastrear el blanco no depende de la cantidad para su detección. Los ensayos de Biología Molecular hacen una “lectura” del material genético revelando información precisa y específica.
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Ensayos realizados en un Laboratorio de Biología Molecular
Examenes Cualitativos – TMA / PCR / PCR Tiempo
Real / “in house”
Examenes Cuantitativos – bDNA / PCR / NASBA /
PCR Tiempo Real / “in house”
Genotipaje – LiPA / Secuenciamiento / “in house”
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Pruebas Disponibles en el Mercado
b-DNA (Siemens): Amplificación de señal
PCR (Roche): Amplificación del Ácido Nucleico
NASBA (bioMérieux): Amplificación del Ácido
Nucleico
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Como funcionan estas pruebas ?
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Transcription mediated amplification (TMA)
La amplificación medida por transcripción, o TMA, se utiliza para
amplificar porciones de RNA y/o DNA.
La transcriptasa inversa crea una copia de DNA (cDNA) del ácido
nucleico seleccionado.
La polimerasa del RNA inicia la transcripción, sintetizando RNA. Algunos
de la amplificación del RNA sintetizados de nuevo, vuelven a entrar en
el ciclo de TMA sirviendo de molde para nuevos ciclos de
amplificación. Potencialmente se pueden sintetizar en una hora
billones de copias.
Las sondas marcadas con éster de acridinio (AE), hibridan
específicamente los productos de la amplificación. El proceso de
ensayo de protección de la hibridación (HPA) inactiva selectivamente
el marcado AE sobre las sondas no hibridadas para reducir al máximo
el ruido de fondo.
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TMA
La presentación en un solo tubo simplifica el análisis y minimiza la posibilidad de contaminación. » El proceso de captura selectiva no requiere preparación de la muestra, extracción o ultracentrifugación.
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ESQUEMA DE TRABAJO DE NASBA
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PCR
Esta técnica utiliza una enzima denominada ADN polimerasa
que copia cadenas de ADN en un proceso que simula la forma en la que el ADN se replica de modo natural en la célula.
Este proceso permite a los científicos obtener gran número
de copias a partir de un segmento determinado de ADN.
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FUNDAMENTO DE LA RT -PCR
1. Obtención de la muestra
2. Transcripción reversa del ARN ADNc
3. Amplificación del ADN (PCR)
4. Hibridación de amplicones con sondas específicas
5. Detección colorimetrica de productos amplificados
unidos a la sonda
Gen amplificado: Gen gag, 155 bp de largo
Primers SK 145 / SKCC1B
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CONVENTIONAL PCR 781P, 1137N PRIMERS
379 bp
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PCR en Tiempo Real
Es una PCR convencional en la que los termocicladores llevan incorporados un sistema de detección de fluorescencia, usando unas moléculas específicas denominadas fluoróforos y quenchers.
Monitorea en tiempo real, lo que esta ocurriendo dentro de
cada tubo en cada ciclo de amplificación y va a sustituir a los pasos de amplificación, electroforesis y análisis de imagen de una PCR tradicional.
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PCR en Tiempo Real
Los factores que afectan a la PCR cuantitativa son, entre otros:
optimización del protocolo de reacción para maximizar su eficiencia.
Una pequeña diferencia en la eficiencia de reacción por ciclo, tan solo
un 90% tan eficiente como otra, la relación de producto final entre
ambas reacciones después de 40 ciclos será alrededor de 65 a 1
evitar un número excesivo de ciclos de amplificación
adecuado procesamiento de las muestras que asegure la eliminación de
los inhibidores que pueden disminuir la eficiencia de amplificación.
Requiere 3 ambientes exclusivos para evitar contaminación.
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La fluorescencia aumenta con cada
enlace de DNA. Fluorescencia es
observada en tiempo real.
El colorante libre emite muy
poca fluorescencia
Detección de DNA con SYBR Green
Alinamiento de los primers
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Fundamento del Monitoreo de PCR con
el Sistema LightCycler
Comparación con termocicladores convencionales
Ventajas
CUANTIFICACION
MAS RAPIDO
MAS FACIL
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Sondas Taqman® Applied Biosystems
Usan la actividad 5’ exonucleasa de la Taq (Thermus aquaticus) polimerasa. Estas sondas tienen un marcador fluorescente en el extremo 5’ y una molécula que absorbe ("quencher") la fluorescencia emitida por el marcador en el otro extremo. La sonda hibrida con el fragmento específico (si está presente) y, a medida que se sintetiza la hebra complementaria, la sonda se va degradando por la acción exonucleasa, liberando el marcador emitiendo fluorescencia.
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Comparación de Pruebas de Carga Viral para HIV-1
178-5,000,000
50-1,000,000
No 0.2 mL
1 mL
RT-PCR Abbott HIV-1
50-100,000 No 500 l TMA Gen-Probe HIV-1
50-50,000 (ultra) 23,500g/1 h 500 l
400-750,000
(standard)
200 L RT-PCR Roche Amplicor
Monitor 1.0
50-500,000 23,500g/1 h 1 mL bDNA Siemens VERSANT
(bDNA)
40-10,000,000 No 50 l-2 mL NASBA Organon Teknika
NucliSens
Dynamic Range
(Copies/mL)
Ultracentrifugation
Required
Input Volume
Method
Test
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Características
Rango amplio
(50 – 500,000 copies/mL)
Sensibilidad
(50 copies/mL)
Plataforma automatizada:
Versant 440
Precisión y reproducibilidad
Detección de subtipo
Método de amplificación de señal
Beneficios
No necesita dilución de la muestra
Elimina costo de repetición
Permite el monitoreo de carga viral
De baja carga para determinar la respuesta de pacientes
a la terapia antiviral
hasta 168 muestras por corrida
Máxima eficiencia
Mínimo tiempo de manipulación
Provee resultados confiables
Cuantifica subtipos A–G
Asegura mayor confianza en los resultados
Reduce riesgo de contaminación
VERSANT HIV-1 RNA 3.0 Assay (bDNA)
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EXAMEN
CUANTITATIVO (CARGA
VIRAL)
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A cuantificación de la Carga Viral es considerada o marcador mas adecuado para o establecimiento del pronóstico (evaluación de la evolución de la infección) y monitoreo clínico.
La prueba de Carga Viral es uno de los métodos mas eficientes para definir el inicio del tratamiento, evaluación de la eficacia del tratamiento, alerta de surgimiento de oportunistas.
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MIDE LOS NÍVELES
PLASMÁTICOS DE ÁCIDO NUCLÉICO DEL AGENTE INFECCIOSO (HIV, HCV, HBV)
PUEDE SER DEFINIDA COMO:
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HIV - variación de 0,5 log
Resultado en copias/mL
HCV - variación de 2 log
1UI/mL = 5,2 copias/mL
HBV - variación de 1 Log
1UI/mL = 5,6 copias/mL
Respuesta al tratamiento:
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Tecnología de Amplificación de Señal emitido por molécula de DNA ramificado
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bDNA- branched DNA
Metodología que cuantifica o Ácido Nucleico viral con sondas específicamente diseñadas que se hibridizan directamente al blanco, tornando esta molécula detectable a través de una reacción de quimioluminiscencia.
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Hibridización: Una reacción donde se aparean las bases nitrogenadas complementarias (puentes de hidrogeno). Los Híbridos se pueden formar entre DNA-DNA, DNA-RNA o RNA-RNA. Forman entre una fila pequeña a una fila
grande donde exista una región para
complementar entre las dos. Una hibridización
imperfecta también puede ser formada y cuanto
mas imperfecto el pareamiento, menos estable
será la molécula.
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Que es una Sonda?
Sonda es un termino utilizado para denominar
un trecho de Ácido Nucleico, de secuencia
previamente conocida, diseñada para la
pesquisa del Ácido Nucleico en cuestión. En
este caso, la secuencia de la sonda es marcada
con una señal de fácil detección (radioactivo o
químico).
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HIV - Características Básicas del Ensayo: • Sensibilidad: 50 copias/mL • Linealidad: 500.000 copias/mL
• Especificidad: > 98,5 %
• Productividad: hasta 168 pruebas por ensayo
• No requiere extracción de RNA pero necesita formación de pellet (precipitación viral)
• Incubación overnight de 16 horas
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gag gene
pol gene
Tamaño de región utilizada para VERSANT HIV bDNA
> 80 sondas
~2700 pares de bases
Detección de Subtipos - HIV
Capacidad de detectar equivalentemente los
Subtipos de A – K (Grupo M)
2 filas negativas de RNA
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HCV - Características Básicas del Ensayo: • Sensibilidad: 3.200 copias/mL • Linealidad: 40.000.000 copias/mL
• Especificidad: > 95,0 %
• Productividad: hasta 168 pruebas por ensayo
• No requiere extracción de RNA ni formación de pellet
• Incubación overnight de 15 horas
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gag gene 5’UTR
Tamaño de la region utilizada en VERSANT HCV bDNA
6 sondas de captura
17 sondas blanco
Detección de Subtipos - HCV
Capacidad de detectar Genótipos HCV: 1a, 1b, 2a, 2b, 3a, 4a, 5a e 6a.
1 fila positiva de RNA
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HBV - Características Básicas do Ensayo:
• Sensibilidad: 2.000 copias/mL • Linealidad: 100.000.000 copias/mL
• Especificidad: > 95,0 %
• Productividad: hasta 168 pruebas por ensayo
• No requiere extracción do RNA ni formación de pellet
• Incubación de 1 hora + overnight de 15 horas
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gag gene Fila negativa
Tamaño de region utilizada en VERSANT HBV bDNA
Detección de Subtipos - HBV
Capacidad de detectar Genótipos HBV: A, B, C, D, E e F
Doble fila de DNA
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Características Básicas del Ensayo Ensayo overnight realizado en 3 etapas : 1. Preparación de pellet (HIV) y Lisis
2. Hibridización de las Sondas (blanco, captura,
pré-amplificación, amplificación y marcado)
3. Lectura en RLU (adición del substrato)
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System 340 (bDNA Analyzer) & Data Management Software
- Incubación / Agitación - Lavado - Lectura - RLUs (Reacción de quimioluminiscencia)
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Módulo de Fluídos, ensayo y computador integrados.
Módulo de fluídos
Versant 440 Molecular System
Módulo de procesamiento del ensayo
Teclado
Monitor LCD
DriveCD-RW
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Versant bDNA 340 System
96 Testes por kit: - 12 Testes : estándares y controles 6 estándares - A,B,C,D,E,F * (HIV / HBV) 3 controles: - Negativo - Positivo Bajo - Positivo Alto - 84 pacientes
* HCV: 4 estándares – A, B, C, D, E
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Microplacas de pruebas de bDNA
2 microplacas – 168 pacientes por rutina 84 pacientes/placa + 12 estándares y controles
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Reactivo de HIV RNA 3.0 bDNA
El Kit esta compuesto de 2 cajas de reactivos:
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Superfície do poço
Secuencia para fijar el vírus a
la placa
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Superfície de pozo
Ác. Nucléico Sonda Blanco
Sonda de Captura
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Superfície de pozo
Ác. Nucléico Sonda Blanco
Sonda de Captura
Sonda Pré-amplificadora
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Superfície de pozo
Sonda de Captura
Sondas Amplificadoras
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Sondas Blanco
Pre-amplificadoras
Micropozo
Blanco (vírus)
Sonda de
Captura
Micropozo con Sonda de Captura
Amplificadoras
hibridizadas con
Sondas
Marcadas
Con la adición del Substrato ocurre la reacción de quimioluminiscencia.
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Iso C & Iso G
• Bases Nitrogenadas no Naturales – Isómeros de Citosina y Guanina
• Reduce hibridizaciones no-específicas
• Aumento de Especificidad del Ensayo
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CURVA
DE
RESULTADOS
bDNA
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Pág 1 - Resultado
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Pág 1 - Gráfico da curva generada por los estandares
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Pág 2 y 3 – Resultados de las Muestras (cópias/ml)
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Pág 4, 5 e 6 – Event Log
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PRINCIPALES CARACTERÍSTICAS
Técnica simples, no necesita de extracción de RNA
Poco susceptible a contaminación
Necesita de apenas 01 sala
Reducción importante en relación al costo de insumos consumibles
Reducción de relación técnico / muestra / hora trabajada
hasta 168 pacientes por técnico/día
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Métodos de pruebas de Resistencia al HIV
Genotyping Sondas de hibridación, secuenciación DNA. Detecta mutaciones
genéticas especificas sobre el genoma viral que correlaciona con la resistencia viral a una droga particular.
Phenotyping Prueba de susceptibilidad a las drogas Determina a que drogas la muestra del paciente es susceptible o
resistente por exposición directo a la droga.
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Uso de Genotipificación para la prueba de Resistencia del HIV a las drogas
Detectar las variaciones en las secuencias génicas del virus que son capaces de
alterar la secuencia final o estructura de la enzima de la transcriptasa reversa (RT)
o enzima proteasa
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Trugene
Nuevo iMAC with OpenGene
Version 4.0
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El Genoma del HIV
9.8 kb
pol gag env
1.3 kb
Protease Reverse
Transcriptase
TRUGENE target regions:
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Flujo de trabajo
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DISTRIBUCIÓN AREAS DEL LABORATORIO PARA
EL PROCESAMIENTO DE TRUGENE HIV-1
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Procedimiento
Extracción y purificación de Ac.
Nucleico
Trascripción Reversa
Amplificación
CLIP secuenciación bi-direccional
separación por electroforesis
Análisis por GeneObjects
Reporte de Resistencia
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TRUGENE HIV-1 Report
(a través de GeneObjects 4.0)
Análisis por GeneObjects
Separacion de gel de electroforesis
(50 min/muestra)
Secuenciamento bidirecional – Reacion CLIP
(2hs)
Amplificacion (4hs)
Extraccion (1h)
Transcripcion Reversa
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Preparación del CLIP
A
C
G
T
A
C
G
T
Sample 1
Sample 2
Sample 3
Sample 4
Positive
Negative
RT Beginning
RT Beginning
RT Beginning
RT Beginning
RT Beginning
RT Beginning
P2
P2
P2
P2
P2
P2
Protease
Protease
Protease
Protease
Protease
Protease
RT-Middle
RT-Middle
RT-Middle
RT-Middle
RT-Middle
RT-Middle
Page 89
Page 90
MicroCel™ 500
HIV-1
PLACAS DE GEL DE POLIACRILAMIDA
Page 91
Page 92
1 2 3 4
Dire
ccio
n d
e m
igra
cio
n
A C G T
N
N
Migracion de los Fragmentos por Electroforesis
Page 93
Gel Electroforesis y Procesamiento
RT-Beginning
RT-Middle
Protease or P2
Page 94
Page 95
ANALIZANDO LA CORRIDA
Page 96
ANÁLISIS DE MUTACIONES
Page 97
ELABORACION DE REPORTE DE RESISTENCIA
Page 98
TRUGENE® HIV-1 Reporte Mutacion
Page 99
DROGAS ANTI-RETROVIRALES ANALISADAS
Inhibidor de RT Nucleosído y
Nucleotído
Zidovudina
Didanosina
Lamivudina/Entricitabina
Estavudina
Abacavir
Tenofovir
Inhibidor de RT no Nucleosído
Nevirapina
Efavirenz
Inhibidor de Protease
Saquinavir/Ritonavir
Indinavir
Nelfinavir
Amprenavir/Fosamprenavir
Lopinavir + Ritonavir
Atazanavir
Atazanavir + Ritonavir
Tipranavir + Ritonavir
Darunavir + Ritonavir
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MUCHAS GRACIAS
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Page 102
Esquema del Ensayo de bDNA HIV 3.0
MICROPLACA
Sondas de
Captura al
Microplaca
Sondas de
Captura
ARN del Virus de VIH-1
Sondas Diana
“target probe”
Sondas del Pre-amplificador
Sonda Marcadora
Substrato
Quimioluminescente
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