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Subtitulo de la presentación en una línea

Aplicación de metodologías tradicionales y alternativas en el diagnóstico oficial de E. coli

O157 H7 para procesos de exportación en Chile

IRMA ACEVEDO GONZÁLEZMÉDICO VETERINARIO

UNIDAD DE BACTERIOLOGÍA PECUARIADEPTO. LABORATORIOS LO AGUIRRE

S.A.G. - CHILE

Inocuidad en Chile

Agencia Chilena para la Calidad e Inocuidad Alimentaria

Entrenamiento Microbiológico FSIS/SAG en Técnicas    Diagnósticas para Salmonella y Escherichia coli Genérico

Victor CookTharon Hoephner

Santiago, 3 al 7 de Marzo 2003

Participan 20 profesionales de la red de laboratorios SAG y privados en vías de habilitarse.

Salmonella spp

Escherichia coli O157:H7

Escherichia coli O157:H7

Escherichia coli O157:H7

Instructivo Basado en U.S.D.A F.S.I.S. MLG 5.03

1. Etapa de detección

• Muestras de 25 g• Caldo E.C.Modificado con novobiocina.• Reveal® Neogen AOAC Official Method 2000.14

Procedimiento 20 horas.Sensibilidad 99.9 (FSIS ≥ 98%)Especificidad 99.4 (FSIS ≥ 90%)Promedio de falsos positivos ‹ 1% (FSIS≤ 2%)Promedio de falsos negativos ‹ 1% (FSIS≤ 10%)

Escherichia coli O157:H7

.2. Etapa de concentración para aislamiento.

• Perlas IMS Dynal® o ICE ®Biomerieux.• Medios altamente selectivos.

3. Etapa confirmación bioquímica y serológica.

• Sistemas de identificación API® 20E Biomerieux.• Aglutinación en latex E. coli RIM ® Remel.

4. Etapa Determinación presencia de Shigatoxinas.

• Premier EHEC Meridian Diagnostic.

Diferencias• Cepa Control :Cepa FSIS Fluorescente EC 465-97 vs

Cepa I.S.P.• Agar selectivo: Rainbow® Agar O157 vs Fluorocult®.

• Inclusión ICE® como alternativa a la Separación Inmunomagnética en columnas paramagnéticas.

Escherichia coli O157:H7Criterios de EquivalenciaCompliance guidelines for establishments on the

FSIS Microbiological testing program and other verification activities for Escherichia coli O157 H7. April ,2004

• Unidad analítica de al menos 325 g. analizadas como submuestras individuales de hasta 75 g.

• Sensibilidad igual o mayor al Método F.S.I.S.

a. Confirmación con metodos de cultivo que incluyen el uso de separación inmunomagnética o

b. Los resultados positivos obtenidos con métodos screening por AOAC Internacional u otra organización científica reconocida internacionalmente podría considerarse equivalente al método de FSIS .

• Método científicamente validado, aprobado o adoptado por una organización internacional.

• Solitud de equivalencia presentada en 2008 y aprobada en 2009.

Escherichia coli O157:H7

1. Etapa de detección.• Muestra de 325 g, 5 submuestras de 65g• Protocolos validados AFNOR (Nº 12/8-07/00) del

Instructivo VIDAS® E. coli O157 (VIDAS ECO).• CaldoTripticasa Soya modificado con novobiocina• 6 o 7h /41,5oC±1oC.• Caldo CT-MAC 18h±1h/35-37oC

2. Etapa de concentración para aislamiento.• VIDAS ICE ®Biomerieux.• Agar O157:H7 ID (BioMérieux ref. 42.605 y 42.630)

o un medio selectivo equivalente.

3. Etapa confirmación bioquímica y serológica.• Sistemas de identificación API 20E Biomerieux.• Aglutinación en latex E. coli RIM ® Remel.

4. Etapa Determinación presencia de Shigatoxinas/genes Shigatoxinas.

• PCR multiplex en Instituto de Salud Pública.

Escherichia coli O157 H7

Metodologías Incorporadas al Plan de Reducción de Patógenos

Metodologías Incorporadas al Plan de Reducción de PatógenosMétodo Screening Assurance GDS Salmonella

Validación AFNOR TRA 02/12-01/09

Ultimas Metodologías Aceptadas como Equivalentes

9 de Marzo 2011

VIDAS®UP E. coli Incluyendo H7 (VIDAS ECPT)Validación AFNOR Certificado BIO 12/25-05/09Acorde a Norma ISO 16.140:2003.Método de referencia EN 16654(2001):Horizontal method for the detection of Escherichia coli O157

VIDAS® Listeria monocytogenes Xpress( VIDAS LMX)Validación AFNOR Certificado BIO 12/27-02/10Acorde a Norma ISO 16.140:2003.Método de referencia EN 11290-1(1997) incluye Amendment A(2004):Horizontal method for the detection and enumeration of Listeria monocytogenes. Part 1 :Detection Method

El FSIS informa que se ha completado la revisión conducente a la equivalencia de los métodos screening mencionados, para ser utilizados en alimentos listos para el consumo enviados desde Chile.

Validación Interna e Implementación Método Screening VIDAS EASY SLM

• Protocolo de acuerdo a la Validación AFNOR BIO 12/16-09/05.• Metodología de referencia utilizada ISO 6579:2002• Matrices: Ingredientes de importación y alimentos completas para el

consumo animal.Harinas de viscerasHarinas de carne y hueso *Harinas de plumas y sangreAlimentos terminados para aves

• Se procesaron 317 muestras,261 muestras negativas y 56 muestras positivas a Salmonella spp.

• Para el análisis se consideraron 150 resultados,99 análisis negativos y 51 positivos dando cumplimiento a lo indicado en la Norma ISO 16140 para los cálculos de exactitud, sensibilidad y especificidad relativa, de contar con un total de resultados negativos que no supere el doble de los resultados positivos.

• La exactitud, sensibilidad y especificidad relativa obtenidas fue 100%.• Se adopta la nueva metodología a partir del 10 de Julio de 2011.*• Este estudio fue realizado por la Dra. Amelia Morales con la colaboración

de Nayaret Sepúlveda.

Shiga Toxin-Producing Escherichia coli in Certain Raw Beef Products (Federal Register)El Food Safety and Inspection Service (FSIS) del Departamento de Agricultura de los Estados Unidos (USDA) ha publicado en el Federal Register una determinación final con solicitud de comentarios referente a la adopción de nuevas medidas para combatir el E.Coli. En concreto, se considerarán como adulterantes a 6 serogrupos adicionales de E.Coli en carne bovina cruda. La agencia recibirá comentarios del público hasta el 21 de noviembre de 2011.

Próximos Desafíos

Otras serovariedades de Escherichia coli productoras de shigatoxinas

FSIS Guidance for evaluatingTest Kit Performance.

Gracias.Gracias.

irma.acevedo@sag.gob.cl