antioxidantes naturales aislamiento e identificaciÓn

ANTIOXIDANTES NATURALES

AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN

Carnosic acid

HOOC

CH3H3C

OH

HOCH3

CH3

CH

AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN

AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN

•Area Industrial 150.000 m2

•Facturación 10 M Eur•Empleados 60

•Dos Plantas de Fabricación•2000 Tm/Año M. Vegetal

•200 Tm de Extractos/Año

Planta de Extracción1999

Nueva Planta de Extracción2009

AreaAlmacenamiento

Disolventes

•4 Doctores•6 Licenciados/Ingenieros

•4 Diplomados

GC HPLC

AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN

•Acabado en Salas Blancas•8 Salas Clase D

•Garantía Sanitaria

• NUTRAFUR Extractos Botánicos

• NUTRAFUR Bioflavonoides y flavonoides puros

• NUTROX Antioxidantes para Alimentación

• NutraT Ingredientes Funcionales

Gama de Productos

AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN

AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN

1) Objetivo

2) Búsqueda Bibliográfica

3) Selección de las posibles fuentes vegetales

4) Métodos de extracción y purificación

5) Técnicas de identificación y cuantificación

AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN

AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN

1) Objetivo

Obtener una sustancia contenida en una matriz animal ovegetal manteniendo dicha sustancia inalterada

Emplearemos Procesos Físicos que no alteren la estructuramolecular de la sustancia.

Estos procesos estarán basados en dos propiedadesfundamentales: estabilidad y solubilidad de la sustancia endiferentes medios.

AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN

Agua Caliente Agua Fría

Procesos Físicos

Solubilidad

AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN

Estabilidad de la sustancia

• A la oxidación

- Ac. Carnósico a Carnosol. Inertización con N2

•A la temperatura

-Deshidratación o hidrólisis

-Cinarina a Ac. clorogénico

• Al pH (solo en medios que contengan agua)

-Oleuropeina a Hidroxitirosol

•A enzimas de la matriz (oxidasas, hidrolasas,etc)

-fenoles a quinonas

•Al disolvente

-Metilaciones, etilaciones o acilaciones

AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN

1) Objetivo

En algunos casos concretos podemos emplear ProcesosQuímicos, siempre que sean reversibles.

H+

OH-

AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN

H+

OH-

Flavanona Chalcona

AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN

• Máxima eficacia energética

• Vapor

• Electricidad

Mínimo Coste

• Máximo aprovechamiento

• Máxima pureza

1) Objetivo

AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN

2) Búsqueda Bibliográfica

Obtener la máxima información posible en relación a lossiguientes aspectos:

• Posibles fuentes de la sustancia : Plantas, origen, condiciones

• Contenidos: Partes de la planta, variedades

• Métodos de medición

• Estabilidad

• Actividad biológica

• Toxicidad

AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN

AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN

2) Búsqueda Bibliográfica

Fuentes bibliográficas:

•Libros y Monografías

•Farmacopeas

•Artículos científicos

•Internet

•Medline

•Scirus

•Ingenta Connect

AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN

En base a los siguientes criterios:

• Abundancia

• Accesibilidad

• Localización

• Estacionalidad

• Contenido en activos

• Gasto Disolvente

• Horas de trabajo

• Coste

• Facilidad de manejo

• Densidad aparente

• Humedad

• Estabilidad al almacenamiento

3) Selección de la fuente vegetal

AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN

UÑA DE GATO

Amazonía Peruana

ROMERO

Pradera Murciana

AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN

AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN

AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN

Preparación del material vegetal:

1) Extracción en fresco

• Cortado

• Inactivación de enzimas

2) Extracción en Seco

• Secado

• Molienda

4) Métodos de Extracción

AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN

Preparación del material vegetal:

1) Secado

• Natural

• Forzado

• Aire caliente

• Vacío

2) Tamaño de partícula

• Molienda

• Tamizado

4) Métodos de Extracción

AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN

AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN

Secado del Material Vegetal

Secado a sol Secado poraire

Secado a vacío

Largo tiempode secado

Corto tiempode secado

Corto tiempode secado

Bajatemperatura

Altatemperatura

Bajatemperatura

Bajo costeEnergético

Alto costeEnergético

Alto costeEnergético

AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN

Preparación del material vegetal:

1) Secado

• Natural

• Forzado

• Aire caliente

• Vacío

2) Tamaño de partícula

• Molienda

• M. Martillos

• M. Cuchillas

• Tamizado

4) Métodos de Extracción

AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN

Molino de Martillos

AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN

Molino de Cuchillas

1) Extracción con disolventes

1) Líquido-líquido

2) Sólido-líquido

3) En fase sólida

4) Extracción con fluidos

supercríticos

2) Métodos de Purificación

1) Precipitación y Filtración

2) Destilación

3) Columna de adsorción

4) Fermentación

Métodos de Extracción

Principales técnicas de separación

3) Cromatografía

En capa fina y en papel

En columna

Cromatografía de líquidos

Cromatografía de gases

Cromatografía con fluidos

supercríticos

Métodos de Extracción

Principales técnicas de separación y análisis

Fundamento: Diferencia de afinidad de una sustancia entre la muestra y el

disolvente extractante.

Objetivos:

1) Separación de una sustancia de la matriz

2) Separación de varias sustancias entre sí (empleando varios disolventes)

Mejor con cromatografía

3) Preconcentración (utilizando un pequeño volumen de disolvente afín a la

sustancia)

Extracción con disolventes

Definición: proceso por el cual se transfiere uno o más solutos de una fase a

otra, generalmente entre dos líquidos o entre un líquido y un sólido.

Elección del disolvente

Propiedades deseadas:

–No tóxico

–Bajo punto de ebullición (50-70 ºC)

–Miscible con agua (sol-liq) oinmiscible (liq-liq)

–Baja tendencia a formar emulsiones

Disolventes comunes:

–Agua

–Metanol CH3OH

–Etanol CH3CH2OH

–Isopropanol CH3CHOHCH3

–Acetona CH3COCH3

–Éter dietílico CH3CH2OCH2CH3

–Cloroformo CHCl3–Benceno C6H6

• Elección del disolvente

• Rendimiento

• Pureza

• Relación entre matriz y disolvente

• Vehiculación

• Relación solubilidad activo vs impurezas

• Coste (gasto en disol. vs aumento rend.)

• Tiempo

• Temperatura

• pH

• Numero de operaciones

Parámetros a optimizar

• Rendimiento. Cantidad de extracto obtenido

por cada 100 g de matriz.

• Pureza. Cantidad de principio(s) activo(s) por

cada 100g de extracto.

• Están relacionados entre sí y limitados por el

contenido en activos de la matriz original.

• Rendimientos por encima del contenido en

activos de la matriz reducen la pureza del

extracto.

Parámetros a optimizar

Rendimiento y Pureza

Elección del disolvente

Experiencia 1. Para la primera experiencia se fijaron las siguientescondiciones: relación sólido líquido 1/10, temperatura 50º C, tiempo deextracción 3 horas. La tabla 1 muestra la cantidad y pureza del extractoobtenido con los distintos disolventes estudiados:

Disolvente gr. de extracto % Pureza

Metanol 98% 15.3 79.6

Etanol 98% 14.2 79.9

Isopropanol 98% 17.5 61.2

Acetona 99% 6.7 58.6

Elección del disolvente

Experiencia 1. Para la primera experiencia se fijaron las siguientescondiciones: relación sólido líquido 1/10, temperatura 50º C, tiempo deextracción 3 horas. La tabla 1 muestra la cantidad y pureza del extractoobtenido con los distintos disolventes estudiados:

Disolvente gr. de extracto % Pureza

Metanol 98% 15.3 79.6

Etanol 98% 14.2 79.9

Isopropanol 98% 17.5 61.2

Acetona 99% 6.7 58.6

Isopropanol da mayor rendimiento pero con una pureza muy baja.10.71 gr de sustancia pura frente a 12.18 gr del metanol 98%.

Elección del disolvente

Experiencia 1. Para la primera experiencia se fijaron las siguientescondiciones: relación sólido líquido 1/10, temperatura 50º C, tiempo deextracción 3 horas. La tabla 1 muestra la cantidad y pureza del extractoobtenido con los distintos disolventes estudiados:

Disolvente gr. de extracto % Pureza

Metanol 98% 15.3 79.6

Etanol 98% 14.2 79.9

Isopropanol 98% 17.5 61.2

Acetona 99% 6.7 58.6

De los resultados anteriores se deduce que los alcoholes más polaresmetanol y etanol obtienen purezas suficientes con buenos rendimientos.

Elección del disolvente

Experiencia 2. Para la siguiente experiencia se mantuvieron lascondiciones y se utilizaron diferentes purezas de metanol y etanol.Los resultados se muestran en la tabla 2:

Disolvente gr. de extracto % Pureza

Metanol 98% 15.3 79.6

Metanol 95% 15.2 80.3

Metanol 90% 14.4 79.3

Etanol 98% 14.2 79.9

Etanol 96% 15.8 80.6

Etanol 90% 13.7 79.8

Elección del disolvente

Experiencia 2. Para la siguiente experiencia se mantuvieron lascondiciones y se utilizaron diferentes purezas de metanol y etanol.Los resultados se muestran en la tabla 2:

De estos resultados se deduce que el mejor solvente de extracción es el etanol96%, tanto por rendimiento como por la pureza del extracto obtenido. A partir deese momento todas las experiencias se realizaron con etanol 96%

Disolvente gr. de extracto % Pureza

Metanol 98% 15.3 79.6

Metanol 95% 15.2 80.3

Metanol 90% 14.4 79.3

Etanol 98% 14.2 79.9

Etanol 96% 15.8 80.6

Etanol 90% 13.7 79.8

• Relación entre matriz y disolvente

• Vehiculación

• Relación solubilidad activo vs impurezas

• Coste (gasto en disol. vs aumento rend.)

• Tiempo

• Temperatura

• pH

• Numero de operaciones

Parámetros a optimizar

AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN

AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN

Parámetros a optimizar

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0 2 4 6 8 10

Ratio disovente/matriz

Rendimiento

Pureza

Relación disolvente matriz

La pureza puede disminuir a partir de una relación determinada debidoa una mayor solubilidad relativa de alguna de las impurezas.

Experiencia 3. Para la optimización de la relación sólido/solvente serealizaron extracciones con etanol 96% y diferentes relacionessólido/líquido, manteniendo el resto de las condiciones como en laexperiencia 1, 3 hr y 50 ºC.

Hasta una relación sólido/líquido 1/4, el sólido no se puede vehicular con elagitador, por lo que ésta es la menor relación sólido/líquido a ensayar.

Relaciónsólido/solvente

gr. de extracto % Pureza

1:4 12.6 79.1

1:6 14.2 79.9

1:8 15.9 80.2

1:10 15.8 80.6

Experiencia 3. Para la optimización de la relación sólido/solvente serealizaron extracciones con etanol 96% y diferentes relacionessólido/líquido, manteniendo el resto de las condiciones como en laexperiencia 1. Hasta una relación sólido/líquido 1/4, el sólido no sepuede vehicular con el agitador, por lo que ésta es la menor relaciónsólido/líquido a ensayar.

De los resultados se observa que a partir de relaciones 1/8 los resultados sonidénticos. Esto se confirmó analizando el residuo vegetal y comprobando que noquedan prácticamente activos en él. Para las siguientes experiencias se usó larelación 1/8, en función del ahorro de disolvente.

Relaciónsólido/solvente

gr. de extracto % Pureza

1:4 12.6 79.1

1:6 14.2 79.9

1:8 15.9 80.2

1:10 15.8 80.6

• Relación entre matriz y disolvente

• Vehiculación

• Relación solubilidad activo vs impurezas

• Coste (gasto en disol. vs aumento rend.)

• Tiempo

• Temperatura

• pH

• Numero de operaciones

Parámetros a optimizar

Parámetros a optimizar

B

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0 2 4 6 8 10

Tiempo

Co

nc

en

tra

cio

n

B

El disolvente se satura de solutos. Incluso en ocasionespuede disminuir la concentración debido a degradacióndel activo. Influyen temperatura, pH y tamaño departícula.

Parámetros a optimizar

El disolvente se satura de solutos. Incluso en ocasionespuede disminuir la concentración debido a degradacióndel activo. Influyen temperatura, pH y tamaño departícula.

Tiempo de Extracción

Experiencia 4. En esta experiencia se estudió el tiempo mínimo deextracción necesario para obtener todos los activos presentes en lamateria prima. Las condiciones experimentales fueron: etanol 96%,relación sólido/líquido 1/8 y temperatura 50º C. Los resultados obtenidospara diversos tiempos de extracción se muestran en la tabla 4:

Los resultados obtenidos no presentan variaciones significativas con el tiempode extracción por lo que se utilizó en lo sucesivo tiempos de extracción de unahora.Mayor aprovechamiento de los equipos industriales.

Tiempo Extracción(hr)

gr. de extracto % Pureza

1 15.3 80.4

2 15.9 80.8

3 15.9 80.2

5 15.6 80.7

• Relación entre matriz y disolvente

• Vehiculación

• Relación solubilidad activo vs impurezas

• Coste (gasto en disol. vs aumento rend.)

• Tiempo

• Temperatura

• pH

• Numero de operaciones

Parámetros a optimizar

Extracción con disolventes

Tª 50 ºC

Tª 25 ºC

El calentamiento suele favorecer la extracción (sól/líq)

Experiencia 5. Por último se optimizó la temperatura de extracciónsobre las condiciones del experimento 4. Los resultados se muestran enla tabla 5:

Los resultados demuestran muy poca diferencia entre 50 y 70 ºC.

TemperaturaExtracción (ºC)

gr. de extracto % Pureza

20 11.9 81.1

30 14.1 80.8

40 15.1 80.2

50 15.3 80.4

60 15.6 80.6

70 15.5 80.2

Experiencia 5. Por último se optimizó la temperatura de extracciónsobre las condiciones del experimento 4. Los resultados se muestran enla tabla 5:

Se eligió 50º C, para minimizar las perdidas de disolvente por evaporación.Punto ebullición del disolvente en torno a 60 ºC..

TemperaturaExtracción (ºC)

gr. de extracto % Pureza

20 11.9 81.1

30 14.1 80.8

40 15.1 80.2

50 15.3 80.4

60 15.6 80.6

70 15.5 80.2

• Relación entre matriz y disolvente

• Vehiculación

• Relación solubilidad activo vs impurezas

• Coste (gasto en disol. vs aumento rend.)

• Tiempo

• Temperatura

• pH

• Numero de operaciones

Parámetros a optimizar

• Altera la ionización de grupos funcionales

tanto de los principios activos, como de las

impurezas, modificando sus propiedades de

solubilidad.

• Puede hidrolizar azucares y otros grupos

lábiles en la molécula del principio activo,

degradándolo. También pH altos pueden

favorecer la oxidación de grupos fenol.

Parámetros a optimizar

pH

AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN

H+

OH-

Flavanona Chalcona

• Relación entre matriz y disolvente

• Vehiculación

• Relación solubilidad activo vs impurezas

• Coste (gasto en disol. vs aumento rend.)

• Tiempo

• Temperatura

• pH

• Numero de operaciones

Parámetros a optimizar

Lo ideal es una sola operación. Esto es lo normal cuandose usa un tanque agitado. En sistemas de percolación serequiere un número mayor de operaciones para agotar lamatriz.

extracto = solvente + soluto

Residuo = Material vegetal“empobrecida” en soluto.

Centrífuga o Filtro

MaterialVegetal

Extractor

Disolvente

Solubilización de lasustancia en el

disolvente

Extracción convencional

AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN

Extractor y Centrífuga

DisolventeLimpio

extracto

Mat. Prima

Ext. 1 Ext. 2 Ext. 3

Extracción por percolación

extractoextracto

A Ext 1

A Ext 2

AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN

Percolación

• Material Vegetal estático

• Disolvente circula a través del material

vegetal

• Filtración en el mismo reactor

AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN

Percolación

• Material Vegetal estático

• Disolvente circula a través del material

vegetal

• Filtración en el mismo reactor

AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN

Percolación-Extracción de Café

Ventajas comparativas de la extracciónen tanque y por percolación

Menor Gasto disolventeMenor tiempo de procesoMas selectivoSin caminos

preferenciales

Menor coste de separaciónResiduo con menos

disolventes

Tanque Percolación

SC-CO2

(P, )

producto 1 producto 2 producto 3

extracto

Mat. prima P1, 1 P2, 2 P3, 3

fractionamiento

CO2 gas

Presión: P > P1 > P2 > P3

Densidad: > 1 > 2 > 3

Procesado de sólidos con fluidossupercríticos:percolación

AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN

Extractor Supercrítico en Altex

Granos de café tostados ysecados hasta el 30 – 50% dehumedad.

CO2 Supercrítico es generado atemperatura y presiónde 40 – 80 C y120 – 180 atm respectivamente.

CO2 Supercrítico pasa a través delos granos de café en contracorriente.

CO2 Supercrítico es capaz deextraer las pequeñas moleculas decafeína pero deja otras más grandesresponsabes del aroma y sabor decafé.

CO2 Supercritico como extractante

AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN

Extractor Supercrítico Descafeinado

Ventajas y desventajas de laextracción con SC-CO2

GRASEcológicoNo deja residuosNo es inflamableBarato

Poco util para grandes moleculasNecesidad de Co-solventesInstalación caraMayor gasto energético

Ventajas Desventajas

SECTORES SUSCEPTIBLE DE APLICACIÓN DE ESTA

TECNOLOGÍA:

Los resultados de la investigación tendrían aplicación industrial

en los siguientes sectores:

PRODUCTOS NATURALES:•Aceites esenciales y aromas.•Extracción de pigmentosnaturales.•Extracción de cafeína, nicotina,etc.

NUTRACEÚTICOS:• Extracción del licopeno.• Extracción debetacarotenos.• Extracción debioflavonoides.

FARMACEÚTICO:• Purificación de fármacos.• Separación de isómeros.• Microcristalización.• Presíntesis

ALIMENTACIÓN:• Extracción del lúpulo.• Extracción de colesterol.• Extracción de semillas.• Extracción de ácidosgrasos.

TEXTILES:• Extracción del lanolina.• Impregnación con SFC.• Acabado de fibras textiles.

OTROS:• Limpieza de productoselectrónicos.• Recuperación de Plastificadores.• Medio de reacción.• Nuevos materiales.

Cromatografía y extracción con fluidossupercríticos

Métodos de Purificación

1) Precipitación y Filtración

• pH

• Salting Out

2) Destilación

• Simple

• Fraccionada

3) Adsorción en columna

4) Fermentación

Separaciones por precipitación

R puede ser un ácido o una base (obtención hesperidina) obien una sal neutra soluble en el medio (obtenciónchalconas)

Separaciones por precipitación

R puede ser un ácido o una base (obtención hesperidina) obien una sal neutra soluble en el medio (obtenciónchalconas)

Separaciones por filtración

Medios filtrantes: tela, placa porosa o malla metálica

AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN

Separaciones por filtración

Separaciones por filtración

Filtro de placas

Filtros a Vacío

Filtro de Tambor

Filtros a Vacío

Filtro Nutcha

Separaciones por destilación

DESTILACION

SIMPLE

FRACCIONADA

ARRASTRE

UN COMPONENTEVOLATIL

2 COMPONENTESVOLATILES

LIQUIDOSNO VOLATILES

Separaciones por destilación

CONCENTRACIÓN Y PRECIPITACIÓN

Cromatografía en Capa Fina

Cromatografía en Capa Fina

fracción

Molec. NO INTERACCIÓN RÁPIDAS

* No se unen al ligando de la faseestacionaria.

Molec. INTERACCIÓN LENTAS

* Se unen al ligando de la f. estacionaria.Elución específica.

APLICACIÓNMUESTRA

LAVADO

ELUCIÓNESPECÍFICA

1 2 4 5 6 7 8 93

resp

uest

adeldete

cto

r

PERFIL DE ELUCIÓN

LAVADOELUCIÓN

ESPECÍFICA

molécula

CROMATOGRAFÍADE AFINIDADProducto A

Eluyente

Extracto

Eluyente

Cromatografía en Columna

Cromatografía en Columna

Eliminación Concentración

Cristalización

FiltraciónSecadoCondiciones:

1. Aireación continua

2. Control de pH y temperatura

3. Eliminación CO2 producido

4. Tiempo

Fermentación

Métodos de Purificación

Fermentación

Hesperetina +

Rhamnosa Glucosa

Hesperidina

Métodos de Purificación

Fermentación

Escalado 20 ml 2 lts 300 lts 3000 lts

30000 lts

Fermentación

Fermentación

• Para procesosindustriales, se usanfermentadores de hasta de400.000 litros decapacidad

• Los fermentadores sonconstruidos de aceroinoxidable y tienen unacamisa externa la cualpuede ser esterilizadainicialmente y enfriadadadurante la fermentación.

Fermentación

Métodos de medida

Espectrofotometría UV

• Método inespecífico basado en la medida de la

absorbancia de una solución de concentración

conocida del extracto a una longitud de onda

determinada.

• No es un método adecuado cuando la sustancia a

medir no es prácticamente pura. Ejemplo Extracto

de Cacao.

• Normalmente usa factores de corrección para el

cálculo de la pureza muy afectados por las

condiciones experimentales.

Métodos de medida

Espectrofotometría UV

Métodos de medida

Espectrofotometría UV

• Método inespecífico basado en la medida de la

absorbancia de una solución de concentración

conocida del extracto a una longitud de onda

determinada.

• No es un método adecuado cuando la sustancia a

medir no es prácticamente pura. Ejemplo Extracto

de Cacao.

• Normalmente usa factores de corrección para el

cálculo de la pureza muy afectados por las

condiciones experimentales.

Espectrofotometría UV

Teobromina

Procianidina

Métodos de medida

Espectrofotometría UV

• Método inespecífico basado en la medida de la

absorbancia de una solución de concentración

conocida del extracto a una longitud de onda

determinada.

• No es un método adecuado cuando la sustancia a

medir no es prácticamente pura. Ejemplo Extracto

de Cacao (incluir espectros).

• Normalmente usa factores de corrección para el

cálculo de la pureza muy afectados por las

condiciones experimentales.

Espectrofotometría UV

Técnicas de medición adecuadas:cromatografía HPLC y GC (HPLC-MS y GC-

MS)

Necesitan de:

• Standares adecuados

• Adecuados métodos depreparación de lasmuestras analíticas

• Buena elucidación

• Métodos Repetitivos

• Métodos ValidablesT i m e ( m i n )

0 1 0 2 0 3 0 4 0

0

1 0 0

2 0 0

3 0 0

Ab

sorb

an

ce28

0n

m

0

1 0 0

2 0 0

3 0 0

1

2

34

4

5

6

6

Análisis Cromatográfico

*La cromatografía, permite no sólo separar los componentesde una muestra, sinó tambien su identificación y cuantificación.

Análisis cualitativo

Esta basado en la medida de parámetros cromatográficos( tiempos y volúmenes de retención)

Análisis cuantitativo

Está basado en la medida de alturas u áreas de picoscromatográficos que se relacionan con la concentración.

La columna cromatográfica y la forma con la quese diseña, constituye el corazón de la separación.

El detector situado al final de la columna es elque garantiza la respuesta de los componentesque se separan ( los hay de muy diversos tipos)

Análisis cualitativo cromatográfico

Los parámetros cromatográficos que se utilizan en el análisiscualitativoson dos: tiempo de retención (tR) y volumen de retención (vR)

Procedimiento: ambos parámetros han de ser comparados con los de unasustancia patrón

Inconvenientes: No se tiene siempre certeza de que ambos parámetrossean reproducibles, ni aún manteniendo condiciones de trabajo constantes.Es preferible utilizar valores relativos, en vez de absolutos.

Bajo condiciones de flujode fase móvil Fc constante:

Tiempo de retención

tiempo de retención ajustado = t’r = tr - tm

retención relativa = = t’r2 / t’r1

HPLC

(Detector de índice de refracción)

Detección: Cuando la sustancia a medir no tiene un grupo

cromóforo hay que usar otro tipo de detector como son:

•Índice de refracción

•Electroquímico

•Fluorescencia

•MS

•ELSD

Detectores HPLC

Detección: Cuando la sustancia a medir tiene un grupo

cromóforo:

•Ultravioleta

•Array de Diodos (DAD)

•Fluorescencia

•MS

•ELSD

Detector Ultravioleta

Celda de flujo:0.5 cm de camino ópticoy 10 L de capacidad

Detector Ultravioleta

Es el detector más utilizado, porque muchos solutos absorbendicha radiación y es bastante sensible a ella.

El sistema más simple emplea la emisión a 254 nm de unalámpara de mercurio y detección a una sola longitud de onda.

También se utilizan una lámpara de deuterio y un monocromadorpara mediciones a longitud de onda variable.

El intervalo lineal comprende cinco órdenes de magnitud deconcentración de soluto (ejem 0.001 hasta 10).

Detectores HPLC

Detector Array de DiodosEn el detector de fotodiodostoda las longitudes de onda dela luz pasan a través de lacelda de muestra. Acontinuación cada longitud deonda particular incide en unsensor concreto. Sus ventajasson múltiples: velocidad,sensibilidad, medición enmúltiples longitudes de onda ala vez.

Su desventaja es que laresolución es 1 nm, vs 0.1 nmpara el UV normal.

Detectores HPLC

Detectores: Índice de refracción. Está basado en los cambios de

refracción que el soluto provoca en la fase móvil. Es casi universal,

responde a cualquier soluto.

La sensibilidad es unas mil veces menor que la de un

detector ultravioleta, y no es útil en gradiente.

Detectores HPLC

Detectores: Electroquímico. Está basado en la electrolisis de

los distintos solutos que se eluyen de la columna. El eluido

pasa por un una delgada célula donde hay un electrodo

mantenido a un potencial fijo. Si el potencial es mayor (más

positivo para oxidación, más negativo para reducción) que el

requerido para la electrolisis de la sustancia, una carga

medidle pasa del electrodo a la sustancia (o viceversa). La

corriente resultante es directamente proporcional a la

concentración del soluto que pasa a través de la ceda.

Es bastante selectivo, porque sólo ciertos analitos se oxidan ose reducen con facilidad.

Pueden detectarse por oxidación: fenoles, aminas aromáticas,

peróxidos y mercaptanos. Y por reducción: cetonas, aldehídos

y nitrilos.

Detectores HPLC

Detectores HPLC

Detector Electroquímico

Detectores: Fluorescencia. Este detector solamente puede

detectar compuestos que tengan fluorescencia nativa o

inducida por derivatización. Consiste en un haz de luz de

una determinada longitud de onda que al pasar a través de

la celda de muestra excita los grupos fluorescentes de la

molécula que a su vez emite luz de una longitud de onda

característica del compuesto. El detector debe estar

colocado perpendicular al haz de excitación.

Es muy sensible y se usa mucho en análisis farmacéutico,

análisis clínicos, productos naturales, etc.

Detectores HPLC

Detectores: Masas. El espectrómetro de masas usa la relación masa-

carga (m/z) de moléculas ionizadas. La fase móvil se introduce en una

cámara de vacío, donde se evapora el solvente y los solutos se ionizan

mediante un termo vaporizador-ionizador.

Es aplicable a compuestos termoestables y no volátiles. Se obtienen

espectros de impacto electrónico. Es una técnica muy poderosa que

permite cuantificar, identificar y da información acerca de la estructura

de compuestos desconocidos.

Detectores HPLC

HPLC-MS Schematic

LiquidChromatograph

IonizationSource

IonDetector

IonAccelerating

Region

A B C

A+ B + C +

A+

B+

C+

El detector registra todos los iones según su relaciónm/z (relación masa/carga) y los cuantifica según suabundancia relativa. (como generalmente se forman

iones con una sola carga m/z se trata simplemente de lamasa del Ion).

El ion molecular M+. generalmente no es el más abundante(porque se fragmenta) permite obtener el peso molecular de

la sustancia

Pico base: ion mas abundante del espectro(100 % abundancia relativa)

Los espectros de masa se registran como abundancia relativa vs.relación m/z

Espectro de masa del n-dodecano

Las moléculas se fragmentan por determinadoslugares→ los fragmentos permiten obtener información estructural de un compuesto.

Ejemplo:

Espectro de masa interpretado de 4-metil-3-penten-2-ona

Detectores: Detector de Luz dispersa evaporadora (ELSD). Es undetector universal porque su respuesta no depende de lascaracterísticas ópticas de a muestra. Así, cualquier compuesto novolátil, cromóforo o no cromóforo puede ser detectado. A respuesta estábasada en la masa y en la cantidad de luz dispersada, no habiendodiferencias entre la fase móvil y la muestra. Esto da una más precisamedida de la concentración de la muestra lo que hace que sea idealpara análisis de pureza. El detector ELSD da una línea de base establey es compatible con gradientes. Sin embargo posee algunaslimitaciones ya que la fase móvil debe ser volátil puesto que esta esevaporada. Si no lo es, el excesivo ruido de la línea de base dificulta lamedida. Esto limita el uso de modificadores no volátiles tales comotampones fosfato, ácido fosfórico y reactivos de par iónico.

Detectores HPLC

Otros detectores:

ultravioleta 0.1 - 1 siíndice de refracción 100 - 1000 noelectroquímico 0.01 - 1 nofluorescencia 0.001 - 0.01 siconductividad 0.5 - 1 noespectrofotometría de masa 0.1 - 1 siinfrarrojo de trasformada de Fourier 1000 si

Detector

Límite dedetección

¿Útil congradiente?

Procedimiento para análisis LC/UV/MSy LC/NMR

BombaHPLC

columna HPLC

INJECCION- Extracto- Fracción- Mezcla

LC/MSINTERFACE

Bomba

HPLC

Adición post-

columnade losaditivosLC/MS

Splitting dependientede la interfase LC/MSusada

desecho

ElectrodoLC

UV

MS

NMR

UV

desecho

MS

NMR

espectro

1

2Computercontrol of pump,UV and NMR forstop-flow experiments

Descripción del proceso industrial:

Cromatografía con fluidos supercríticos

Definición: Un cromatograma es el grupo de señales

obtenidas por un detector tras la separación cromatográfica

Características de los cromatogramas

Características de los cromatogramas

Efecto de la composición del disolvente en laResolución

Características de los cromatogramas

Posición del pico Información cualitativa

Área del pico Información cuantitativa

Forma del pico:

- Interesa alto (> sensibilidad) y estrecho (> selectividad)

- Depende de tres efectos:

a) Múltiples caminos: Diferencia de caminos seguidos por cada

molécula en la f.e.

b) Difusión en ambas fases

c) Transferencia de masa entre fase móvil y fase estacionaria.

Fig 5.4

Características de los cromatogramas

Efecto de los múltiples caminos

Eficacia de la separación cromatográfica

Ecuación de van Deemter: H=altura de plato

Múltiplescaminos

uCu

BAH

Difusión

Transferenciade masa

EficaciaH

Resolución de picoscromatográficos

Separaciónideal

Separación buena Separación deficiente