15. propiedades de las proteínas. titulación ácido-base de una proteína pi carga positiva neta...

15. Propiedades de las proteínas

Base añadida (uu.arbitrarias)

0 20 40 60 80 100

pH

0

2

4

6

8

10

12

14

Titulación ácido-base de una proteína

pI

Carga positiva neta

Carga negativa neta

Grupos disociables de una proteína

Ácidos(aniónicos, - )

Asp 3.86Cys 10.78Glu 4.25Tyr 10.07

Básicos(catiónicos, + )

Arg 12.48His 6.00Lys 10.53

Aniónicos: carga negativa neta por encima de su pKa

Catiónicos: carga positiva neta por debajo de su pKa

(Se indica el pKa de la cadena lateral en cada caso)

Proteínas ácidas: punto isoeléctrico (pI) inferior a 7Ricas en Asp y Glu; al pH celular presentancarga negativa neta.

Proteínas básicas: punto isoeléctrico (pI) superior a 7Ricas en Arg y Lys; al pH celular presentancarga positiva neta.

En el medio biológico, son, porlo general, más abundantes lasproteínas ácidas.

Electroforesis

1. Se realiza sobre un soportesólido o semisólido, para mini-mizar efectos de difusión

Muestra

+-2. Se somete el conjunto aun campo eléctrico constante, a un pH fijo; las proteínas migranconforme a su carga eléctrica

3. Terminada la carrera electro-forética, las proteínas se tiñencon un colorante adecuado(p.e., Azul de Coomassie)

Fundamento de la cromatografíaMuestra:

tres componentesmezclados

Fase móvil

Faseestacionaria

Se hace fluir una fasemóvil sobre la estacionaria

Dependiendo de la afinidadrelativa por ambas fases, loscomponentes de la mezcla

primitiva se separan

Se dispone una mezclasobre una fase estacionaria

1. Intercambio iónico- Separa según carga eléctrica- Fase estacionaria: grupos cargados unidos a un soporte insoluble- Fase móvil: gradiente de sal o de pH

2. Partición- Separa según solubilidad en solventes- Fase estacionaria: Un solvente sobre un soporte sólido- Fase móvil: El otro solvente fluyendo

Tipos de cromatografía

3. Afinidad- Separa según la afinidad de la proteína por un ligando inmovilizado- Fase estacionaria: ligando unido a soporte insoluble- Fase móvil: (1) solución sin ligando (2) solución con ligando libre

4. Hidrofóbica- Separa según hidrofobicidad- Fase estacionaria: grupos hidrofóbicos unidos a un soporte insoluble- Fase móvil: gradiente inverso de sal

5. Exclusión molecular- Separa según tamaño molecular- Fase estacionaria: dextrano o agarosa entrecruzados- Fase móvil: solución tamponada

+

+

+

+

++

+

+

+

---

-

----

--

-

+

+

+

+

++

+

+

+

-

--

-

---

---

- -- -

-

-

--

-

+

+

+

+

++

+

+

+

-

-

--

-

-

---

-

-

---

-

- -

--

-

Proteínas adsorbidasal intercambiador

iónico

A baja concentraciónde sal, se desprenden las proteínas menos

electronegativas

A mayor concentraciónde sal se desprenden

las proteínas máselectronegativas

Intercambio iónico

O

OH

HOCH2

OHH

H

HOO

O

OH

HOCH2

OH

O

H

H

H

H

nCelulosa

O

O

H

H

OH

CH2

O

H

O

O

OH

OH

HOCH2

H

O

H

H

n

AgarosaO

OH

CH2

OH

H

HOH

O

OH

OH

H

H

CH2

O

H

O

H

H

OH

H

O

n

Dextrano

Soportescromatográficos

CH2 CH2 NH+CH2

CH2 CH3

CH3

Dietilaminoetil (DEAE)

CH2 CH2 N+ CH2 CH3

CH2

CH3

CH2

CH3

Trietilaminoetil (TEAE)

CH2 CH2 N+ CH2

CH2

CH3

CH2

CH3

CHOH CH3

Dietil 2-hidroxipropil aminoetil (QAE)

CH2 COO-

Carboximetil (CM)

CH2 CH2 S

O

O

O-

Sulfoetil (SE)

CH2 CH2 CH2 S

O

O

O-

Sulfopropil (SP)

O P

O

O-

O-

Fosfo (P)

Bo m b a p e ristá ltic a

G e ne ra d o rd e g ra d ie nte

C o lum na

C o le c to r d efra c c io ne s

Re sina d einte rc a m b ioió nic o

Cromatografía deintercambio iónico

O

O HN NH

SO3-

N

N

N

NH

SO3-

O CH2

Cibacron Blue F3GA

Matriz de agarosa

Cromatografía de adsorción a colorantes

1 2 3

Cromatografía de afinidad

Solubilidad

pHpI

Punto isoeléctrico

Solubilidad

Fuerzaiónica, (M)

Salting in

Salting out

Solubilidad,g/L

Temperatura, ºC

00 100

100

Peso molecular de las proteínas

1. Métodos primitivos: presión osmótica, ultracentrifugación analítica, etc.

2. Cromatografía de exclusión molecular

3. Electroforesis SDS-PAGE

4. Cálculo directo a partir de estructura primaria

Cromatografía de exclusión molecular

Glucagon

Citocrom o c

Ribonucleasa

Seroalbúm ina

IgGTiroglobulina

Volumen

Peso molecular

280

240

200

160

120

80

40

103

104

105

106

BSDS

M ovilidad (cm)

Pesom olecular

Electroforesis en poliacrilamida-SDS (PAGE)

+

-

+

-

+

-

Método de Kjeldahl

Digestión ácida total de la proteína y conversión cuantitativa de nitrógeno

a NH3, que se valora por titulación.

Poco sensible. En desuso. Se sigue empleando para análisis

elemental (p.e., alimentos)

Proteína total= N x 100/16

Absorción a 280 nm

Se fundamenta en la absorción a 280 nm producidapor los aminoácidos aromáticos Phe, Tyr y Trp

- Sensible y fácil de practicar- Requiere soluciones puras de proteína; no es aplicable a mezclas- Distintas proteínas dan diferente grado de absorción, dependiendo de su contenido en aa. aromáticos

H2N C

O

NC

O

NH2

H O

C

NH

C

O

HN

HN

-O

C

HN

C-O

NH

NH

Cu++

OHH

OHH

BiuretComplejo cúprico coloreado

Reacción del biuret

Al tratar con Cu++ en medio alcalino, los compuestoscon grupos -CO-NH- dan una coloración violeta.Muy específica; relativamente poco sensible

Método de Lowry

Reacción en dos fases:

1. Reacción del biuret2. Tratamiento con reactivo de fenoles de Folin-Ciocalteu

- Muy sensible (muestras de 10 g) y sencillo- Resultados variables con distintas proteínas, pues depende del contenido en aminoácidos aromáticos

400 500 600

0.2

0.3

0.4

400 500 600

0.2

0.3

0.4

700

Colorante Colorante + proteína

Método de Bradford

La fijación de un colorante (Azul de Coomassie) a una proteínamodifica las características de absorción visible de aquél.

Sensible, fácil de practicar y resultados muy constantes