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Las enzimas como herramientas

analíticasanalíticas

Dr. José Luis Cárdenas López

Las enzimas como herramientas analíticas

• Enzimas endógenas

• Enzimas exógenas• Enzimas exógenas

• Desarrollo de biosensores

Enzimas exógenas usadas para monitorear calidad de pescado

Enzima Medición Referencia

5’-Nucleotidasa, nucleosido

fosforliasa, xantina oxidasa

K-value (Lou, 1998)

Alcohol dehidrogenasa Etanol en pescado

enlatado

(Gill, 1990)

Diamina oxidasa, peroxidasa Histamina (Lopez-Sabater et al., 1993)

ELISA Identificación de

especies

(Carrera, 1996)

Glutamato dehidrogenasa Amoniaco (Huss, 1995) Glutamato dehidrogenasa Amoniaco (Huss, 1995)

Octopina dehidrogenasa, piruvato

oxidasa

Frescura de Scallops (Shin et al., 1998)

Purina nucleosido fosforilasa, xantina

oxidasa

ATPasa (Cheun et al., 1996)

Putrescina oxidasa Poliaminas (Chemnitius et al., 1992)

Trimetillamine dehidrogenasa Trimetilamina (Wong and Gill, 1987)

Ureasa Urea (Sheppard et al., 1996)

Xantina oxidasa Hipoxantina (Shen et al., 1996)

Análisis Principio Ventajas Desventajas Referencia

Hx · enzimas (xantina

oxidasa, XO)

inmovilizadas en una

· simple de usar tira de

ensayo

· rápido

· simple de usar fuera

del laboratorio

· semicuantitativo

· solamente puede

medir Hx (estados

finales del deterioro)

Jahns et al. (1976)

Hx, Ino · ensayo en tira, con

enzimas inmovilizadas

· rápido

· simple de usar fuera

del laboratorio

· semicuantitativo

· baja reproducibilidad

· limitado a Hx e Ino

(estados finales del

deterioro)

Ehira et al.(1986)

Relacionadas con degradación de nucleótidos

IMP, Ino, Hx · enzima cubierta con

electrodo de oxígeno

· rápido

· exacto

· más complicado y

consume más tiempo

que la tecnología de la

prueba mediante tira

Karube et al.(1984)

Indice-K · ensayo de enzima

acoplado "KV-101

Medidor de Frescura"

· rápido

· resultados

comparables a HPLC

· deben adquirirse

enzimas y reactivos

· ¿costo?

· disponible

comercialmente de

Orienta Electric, Niiza

Saitama 352, Japón

Indice-K · enzima cubierta con

electrodo de oxígeno

"Microfresh"

· rápido

· resultados

comparables a HPLC

· ¿costo? · disponible

comercialmente de

Pegasus Instruments,

Agincourt, ON, Canadá

• El etanol ha sido usado por muchos años como un indicador objetivo para la calidad de los productos pesqueros

• Puede ser obtenido a partir de carbohidratos por fermentación anaeróbica (glucólisis), y/o deaminación y decarboxilación de aminoácidos como la alanina, es un metabolito común a una gran variedad de bacterias

Etanol

• Ha sido usado para medir objetivamente la calidad de una variedad de pescados, incluyendo atún enlatado

• El medio más simple y confiable para medir etanol en el tejido de pescado es el uso del equipo para la prueba de enzima comercial, disponible de Boehringer Mannheim (Alemania) o de Diagnostic Chemicals (Charlottetown, P.E.I, Canadá)

• La ventaja de emplear etanol como indicador de deterioro es su estabilidad al calor (a pesar de ser volátil) y puede ser usado para evaluar la calidad de productos pesqueros enlatados

Las aminas biogénicas: histamina, putrescina y

cadaverina

H2N-(CH2)n-NH2

n=4: Putrescine; n=5: Cadaverina

u Formada por la biodegradación de los

aminoácidos ornitina y lisina por la

acción de bacterias de putrefacción

Sobresaturan las enzimas degradantes de

Histamina

u Formada por la decarboxilación de

histidina catalizada por las enzimas de

los microorganismos

N

NH

NH2

u Sobresaturan las enzimas degradantes de

la histamina, realzando el efecto tóxico

de la histamina

los microorganismos

u Estimula la contracción y relajación del

músculo liso

u Estimula neuronas sensoras y motoras

u Controla la secreción de ácidos

gástricos

amina oxidasa de cobre (AO)

u Fuentes biológicas : bacterias, hongos, plantas,

animales

u Funciones biológicas: involucradas enc crecimiento

celular, proliferación and diferenciación

u Cofactores:

Polímero Redox Activo(PVI13-dmeOs)

N

NN

N

a

b

O

NH

Reacción: R-CH2-NH2 + H2O + O2 → R-CHO + NH3 + H2O2

Topa quinona (TPQ) Cobre

Os

N

N N

NCl

2+/ 3+O

OH OCu(II)&

AOox

Eappl.= +200 mVvs. Ag/AgCl

Electrode

2e-

NH

NCH2

CH2

NH2NH3

Histamine

Mecanismo de trabajo para los electrodos

(monoenzimática)

AOred

NH

NCH2

CHO

OH2

Imidazoleacetaldehyde

Mecanismo de trabajo para los electrodos

(BIenzimática)

NH

NCH2

CH2

NH2

OH2

Histamine

AOox(TOPA -native)

H2O2

OH2

HRPred

HRPox

(Fe3+- native)

(Fe4+ = O, P+ inactive)

2e- Eappl.= -50 mVvs. Ag/AgCl

Electrode

2 Os2+

2 Os3+

2e-

NH

NCH2

OHC

NH3

Imidazoleacetaldehyde

AOred

(TOPA -inactive)O2

(Fe = O, P inactive)

Electrode type C

Electrode type DNo Os2+/3+

Muestras de pescado- (turbot)

15

20

25

30fish kept at -20°Cfish kept at 25°Cg h

ista

min

e/kg fish

0

5

10

0 2 4 6 8 10 12

•Contenido de histamina de pescado turbot en dos diferentes temperaturas (-20 y 25°C) analizado por el método de electródo bi-enzimático

g h

ista

min

e/kg fish

Days

AOox

AOred

ElectrodeH2O2

O2

NH

NCH2

CH2

NH2

NH

OH2

NH3

Histamine

+

+

Oxidación del producto de la rx de histamina

AOox

Eappl.= +200 mVvs. Ag/AgCl

Electrode

2e-

H2O2

NCH2

CHO

NH3

Imidazoleacetaldehyde

NH

NCH2

COOH

Imidazoleacetic acid

+

Putrescina y cadaverina forman compuestos cíclicos - ¡no se pueden oxidar más!

NH2

NH3

+

+ O2 + H2OAO

N

+ H2O2 + NH4+

Putrescine

1-Pyrroline

- H2O

NH2

O

NH3

+

NH2

+ O2 + H2OAO

N

+ H2O2 + NH4+

Cadaverine

1-Piperideine

- H2O

O

NH2

ELISA para

identificar

especies

Octopina deshidrogenasa para

medir frescura en escalopas

(NH2)2CO + H2O → CO2 + 2NH3

Ureasa

• Usada para medir amoníaco

• Amoníaco criterio de calidad microbiana • Amoníaco criterio de calidad microbiana

(tardía) de PM

• En A. clínicos la actividad de ureasa puede ser

indicadora de muchas condiciones patológicas

(piedras en vías urinarias, úlceras y males del

hígado)

Ureasa

• Hay muchos métodos para inmovilizar ureasa

y estimar la urea en muestras de pescado

• Paper usando conjugado de fulereno-ureasa

del 2013 en un electrodo potenciométricodel 2013 en un electrodo potenciométrico

– óptico[Kovacs, 2003], amperométric [Rajesh ,

2005; Tiwari, 2009;Kuralai 2006 ], térmico[Fulton,

1980; Xie, 1996] conductométrico[Castillo-Ortega,

2002], and potenciométrico [Ahuja, 2008, 2011;

Chen 2009]

Lo cotidiano

• Enzimas comerciales para medir algún

atributo

• Precio $$ y disponibilidad