01 genética (1)
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GenticaIntroduccin
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EL NCLEO CELULAR
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El ncleo: centro de control de la clulaGeneralmente es el organelo ms conspicuo.
Consta de: La envoltura nuclear. La cromatina El nuclolo.
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Envoltura nuclear Es una membrana doble que rodea
al ncleo. La membrana nuclear tiene poros
por donde pasan algunas molculas desde el ncleo al citoplasma y viceversa.
Los poros nucleares son estructuras complejas que contienen por lo menos ocho subunidades proteicas con un canal pequeo en el centro.
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Permite el intercambio selectivo de materiales
El agua, los iones y las molculas pequeas como el ATP pueden pasar libremente por el canal central del poro, pero ste regula el paso de molculas mayores, en especial de protenas y de ARN.
Los poros ayudan a controlar el flujo de informacin de y desde el ADN.
Envoltura nuclear
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CromatinaAdems, est un material llamado cromatina, que est formada por ADN y proteinas histonas y no histonas.
En la divisin nuclear, la cromatina toma la forma de cromosoma.
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Cromatina
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En el interior del ncleo encontramos una estructura de forma irregular llamada nuclolo. Aqu se forma y se almacena el ARNr.
Nuclolo
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cidos nucleicos
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ADN
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El ADN de los cromosomas se compone de dos cadenas enrolladas una a la otra en una doble hlice.
Los azcares y fosfatos que unen un nucletido al siguiente forman el esqueleto en cada lado de la doble hlice.
En tanto que las bases de cada cadena se aparean en el centro de la hlice.
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Solo pares especficos de bases, llamados pares de bases complementarias, se pueden unir en la hlice mediante enlaces de hidrgeno: adenina con timina y guanina con citosina.
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COMPOSICIN DEL ADN
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Bases Nitrogenadas
Adenina Guanina Timina Citosina
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MOLCULA DE ADN
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REPLICACIN
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La divisin celular requiere de la duplicacin del material gentico
mitosis
mitosis
meiosis
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Mecanismo general
Cada hebra sirve como molde para replicar la complementaria
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AGCGATTAGGGGCGTAGATCGAATGAGTAGAT
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Propiedades
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Semiconservativa: cada nueva molcula esta formada por una hebra parental y una recin sintetizada
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Bidireccional: Se da hacia ambos lados del sitio de inicio denominado origen de replicacin
A cada lado de la burbuja de replicacin se forma una horquilla de replicacin
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Unisentido. Direccin de la sntesis: 5 3
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Semidiscontinua: Una de las hebras no puede ser sintetizada de continuo Consecuencia de la direccionalidad
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Replicacin en procariotas
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Mecanismo Inicio
Reconocimiento de orgenes de replicacin. Separacin de hebras. Posicionamiento de maquinaria enzimtica.
Elongacin
Crecimiento bidireccional de las horquillas de replicacin. semiconservativa, semidiscontinua, bidireccional, uni lectura .
Terminacin
Reconocimiento de seales de terminacin. Desensamble de replisomas.
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ADN polimerasas: Pol I Pol II Pol III (replicasa) Pol IV y V
Necesitan 3 OH libre
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Maquinaria enzimtica ADN polimerasas: Sntesis de ADN Primasas: Generacin 3OH libres Ligasas: Unin los fragmentos de Okazaki Helicasas: Separacin de hebras Topoisomerasas: Mantenimiento del grado
de superenrollamiento SSBs: Mantenimiento de simples hebras
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Inicio
Reconocimiento del origen y apertura de las hebras
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Elongacin
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Replisoma
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Terminacin
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Replicacin en eucariotas
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Los mecanismos son similares Ms de un origen de replicacin por cromosoma Es ms complejo
Proteins Functions
RPA PCNA RFC Pol /primase Pol / FENI DNA2 DNA ligase I Mcm2-7
Single-stranded DNA binding; stimulates DNA polymerases; facilitates helicase loading
Stimulates DNA polymerases and RFC ATPase DNA-dependent ATPase; primer-template DNA binding;
stimulates DNA polymerases; PCNA loading RNA-DNA primer synthesis DNA polymerase; 3'-5' exonuclease Nuclease for removal of DNA/RNA primers Nuclease for removal of DNA/RNA primers Ligation of DNA DNA helicase; primosome assembly, licensing factor
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ADN polimerasas
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Ocurre durante la fase S Una nica vez por ciclo celular
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Horquilla eucariota
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Telmeros
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Telomerasa
Enzima capaz de resolver el problema de acortamiento de los extremos
Ribonucleoprotena
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Mantenimiento de la informacin hereditaria
Errores durante la replicacin: Las ADN polimerasas no son 100% fieles Los errores son reparados en un alto porcentaje
de las veces Cuando los errores escapan los mecanismos de
reparacin ocurren cambios en la secuencia del ADN: Mutaciones
Las mutaciones tambin pueden ocurrir por fenmenos post replicacin (mutgenos fsicos, qumicos, etc.)
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Mecanismos de reparacin Las propias replicasas son capaces de
reparar sus errores durante la elongacin: actividad correctora de prueba (proofreading) Implica una actividad exonucleasa 3 5
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Mecanismos de reparacin
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Replicacin de ADN in-vitro: PCR Permite la amplificacin de un fragmento de ADN de inters Algunas aplicaciones:
Clonado acelular de molculas de ADN Deteccin de secuencias sin purificacin previa Anlisis de expresin gnica Secuenciacin de cidos nucleicos Amplificacin de ADN para su posterior clonacin celular Aplicaciones en medicina:
Diagnostico de enfermedades hereditarias/infecciosas Diagnstico parental (amniocentesis, vellosidades corinicas) Tipado de tejidos para transplantes Deteccin de clulas tumorales Estudios de asociacin genotipo-fenotipo
Tcnicas forenses: huellas genticas (Identificacin de polimorfismos) Identificacin individual Tests de paternidad
Filogenia Anlisis de gentica poblacional
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Reaccin de replicacin in-vitro: Molde ADN polimerasa: Taq polimerasa (termoestable) Cebadores:
3 OH libre Definen la regin a amplificar
dNTPs (A, C, G, T) Condiciones para el funcionamiento de la
enzima: Buffer Mg++ (cofactor de la enzima)
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Procedimiento Desnaturalizacin
del ADN (94C) Agregado e
hibridacin de los cebadores (50C-65C dependiendo de los cebadores)
Elongacin (72C) Repeticin de estas
etapas (25-35 ciclos)
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Luego de terminados los ciclos se obtienen millones de molculas de la regin blanco
La hace una tcnica extremadamente sensible Ventaja: se puede amplificar ADN partiendo de
muy poco material Desventaja: Contaminaciones
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Variantes del mtodo rt- PCR:
Se usa una transcriptasa reversa para pasar una muestra de ARN a ADN obteniendose ADN copia (ADNc)
Se realiza un PCR para amplificar el ADNc de inters
Estudios de expresin gnica Clonado de genes eucariotas (eliminacin de
intrones)
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PCR cuantitativo (real time PCR, qPCR): Se diferencia en que en cada ciclo de
amplificacin se cuantifica la cantidad de ADN obtenida
Permite inferir la cantidad de molculas de molde que exista originalmente en la muestra: Cuantificacin de la expresin gnica Cuantificacin de microorganismos
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Secuenciacin de ADN Mtodo de Sanger (nobel en 1980) Utiliza dideoxinucleotidos (ddNTPs) para
terminar una reaccin de sntesis de ADN in-vitro
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Realizando 4 reacciones independientes (una para cada base) se puede inferir la secuencia original
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Secuenciacin automtica Sigue el mismo principio A diferencia del mtodo anterior cada ddNTP se
marca con una molecula fluorescente diferente Esto permite realizar una unica reaccion en la
cual estan presentes los 4 ddNTPs marcados Los fragmentos obtenidos se separan por
electroforesis capilar La deteccin se realiza en un punto fijo al final de
la corrida
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Secuenciacin de genomas Cada reaccin de secuencia es capaz de
leer unas 500 pb Como se obtuvo la secuencia continua del
conjunto de los cromosomas humanos? Cada cromosoma tiene en promedio
150Mb (genoma completo 109)
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Construccin de biblioteca de ADN genmico fragmentado al azar
Lectura de secuencias individuales Las secuencias individuales son solapadas y
ensambladas (contigs) Para asegurarse de que todas las secuencias
estn representadas se leen unas 10 veces la cantidad de bases del genoma
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La velocidad de produccin de las secuencias ha ido en aumento.
Recientemente se dio un salto en este sentido con el desarrollo de los secuenciadores de prxima generacin
No usan terminacin de cadena
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Se coloca una base cada vez y se detecta cual fue incorporada a cada molcula que se esta secuenciando
Producen en una nica reaccin de secuencia mil lones de lecturas de fragmentos diferentes (paralelizacin)
108 1010 bases por corrida (menos de 1 da)
De esta forma se secuencio el genoma entero de Watson en menos de 1 mes a un bajo costo
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