amaury cordero tapia, tesis de doctorado resumen ii

Amaury Cordero Tapia, Tesis de Doctorado Resumen

---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------EVALUACIÓN HISTOPATOLÓGICA DE LAS ETIOLOGÍAS COMUNES Y ASOCIADAS A FIBROPAPILOMA EN LA TORTUGA PRIETA (Chelonia mydas agassizii), DE BAHÍA MAGDALENA, BAJA CALIFORNIA SUR, MÉXICO

CIBNOR SC. La Paz Baja California Sur, México. Enero 2005

ii

RESUMEN

Se analizaron 53 individuos de tortuga prieta (Chelonia mydas agassizii) 44 en Bahía

Magdalena, Baja California Sur, México, capturadas por pesca incidental, estas fueron

muestreadas para estudios de histopatológia, bacteriología, inmunología, de presencia de

biotoxinas y nueve mantenidas en cautiverio en Bahía de los Ángeles, Baja California,

evaluadas serológica y bacteriológicamente. No se observó la manifestación neoplásica

cutánea característica de fibropapiloma (FP) en ningún espécimen. El estudio histológico

reveló dos neoplasias renales (fibromas), lesiones herpeticas en dermis (vacuolización

citoplasmática, cuerpos de inclusión intranucleares). Así mismo, se detectaron cambios

degenerativos asociados a parasitos adultos, huevos de Tremátodos: Spirorchidos

(prevalencia de 99.56%), infecciones bacterianas y deficiencia nutricional. La evaluación

serológica revelo la presencia de títulos en contra de los géneros virales Rabdovirus,

Herpesvirus, Ortomixovirus y a ocho serotipos de Leptospira interrogans. Se aislaron

géneros bacterianos Gram negativos, aeróbicos, potencialmente patógenos para organismos

acuáticos y terrestres incluyendo al ser humano (Escherichia coli, Salmonella sp,

Actinobacillus sp, Aeromona sp, Enterobacter sp, Kleibsiella sp, Moraxella sp,

Pseudomona sp, Shigella sp, Serratia sp y Yersinia sp). En corazón, se observo una

infección simple por huevos y estadios adultos de Learedius learedi (Trematodae:

Spirorchidae). En el estudio de la presencia de biotoxinas se encontraron resultados

positivos para toxinas del tipo paralíticas (PSP) y al tipo diarreicas (DSP).

Amaury Cordero Tapia, Tesis de Doctorado Resumen



iii

ABSTRACT

53 individuals of sea turtle (Chelonia mydas agassizii) 44 in Magdalena Bay analyzed

themselves, Baja California Sur, Mexico, captured by incidental fishing and nine

maintained in captivity in De Los Angeles Bay, Baja California, these were sampled for

studies of histopatológia, bacteriology, inmunology of presence biotoxinas, evaluated

serológica and bacteriologically. Characteristic tumour cutaneous manifestation of

fibropapiloma (FP) was not observed in any specimen. Histological study revealed in two

renal samples neoplastic changes (fibroma) and herpetic injuries in dermis (cytoplasmic

vacuolated, within nuclei inclusion bodies). Also, degenerative changes were detected

associate to adult parasites and eggs of Tremátodos: Spirorchidos (prevalence of 99,56%),

bacterial infections and nutritional deficiency. The serological evaluation reveal the

presence of titles against the virals sorts Rabdovirus, Herpesvirus, Ortomixovirus and to

eight serovars of Leptospira interrogans. Gram negative Bacterial sorts were isolated,

aerobics, potentially pathogenic for aquatic and terrestrial organisms including a the human

being (Escherichia coli, Salmonella sp, Actinobacillus sp, Aeromona sp, Enterobacter sp,

Kleibsiella sp, Moraxella sp, Pseudomona sp, Shigella sp, Serratia sp and Yersinia sp). In

heart, observed a simple infection by eggs and adult stages of Learedius learedi

(Trematodae: Spirorchidae). In the study of the presence of biotoxinas were positive results

for paralitic toxins of the type (PSP) and to the type dyarreic toxins (DSP).

Amaury Cordero Tapia, Tesis de Doctorado Dedicatoria iv

DEDICATORIA

A Alma D. Barajas Navarro, quien me ha dedicado su vida.

-EVALUACIÓN HISTOPATOLOGICA DE LAS ETIOLOGIAS COMUNES Y ASOCIADAS A FlBROPAPlLOMA EN LA TORTUGA PRIETA (Chelonia tnydas agassizit), DE BAHIA MAGDALENA, BAJA CALlFORNlA SUR, MEXICO


Amaury Cordero Tapia, Tesis de Doctorado Agradecimientos v

AGRADECIMIENTOS

A CONACYT por cuatro años y medio de beca y el apoyo para el proyecto al cual mi trabajo estuvo integrado.

A mi comité tutorial, Dra. Susan Gardner gracias por darme esta oportunidad. Dra. Tania Zenteno, le agradezco sus observaciones y comentarios, siempre acertados. Dra. Lía Méndez por su aporte a este trabajo. Dr. Álvaro Aguilar y Dr. Antonio Verdugo, por su apoyo, conocimiento y facilidades dadas en sus respectivos laboratorios para lograr esta tesis. Dr. Jorge Arellano, le agradezco su apoyo, ecuanimidad y paciencia. Me quedo con su ejemplo, actitud y con la enseñanza de que cada reunión es una nueva lección, que la objetividad es razón no pasión, que se puede ser científico sin dejar de ser humano, de disfrutar ayudando. Dr. un honor ser su alumno. Atodos por su paciencia y comprensión.

Al CIBNOR y todo el personal que se vio integrado en el desarrollo de esta investigación. Departamento de Posgrado, gracias Dra. Thelma. Laboratorio de Histología de CIBNOR en especial a Teresa Arteche, por su excelente trabajo en la elaboración de las laminillas indispensable para mi tesis. Norma Ochoa, Sofía Ramos y Roxana Inohuye (LIN, CIBNOR), por su ayuda en los aislamientos bacteriológicos y'descripción parasitológica de esta investigación y por la diversión de trabajar juntos. Edgar Yuen, Esther Ojeda, Antonio Díaz y Ana Maria Talamantes, (biblioteca CIBNOR) por la pronta ayuda en cualquier tipo de servicio solicitado y por darle a su trabajo el valor agregado de llevarlo a cabo con afecto y calidad. Manuel Melero, Horacio Sandoval, Adriana Landa y Gerardo Hernández, por sus asesorias y disposición, para el desarrollo de esta tesis y elaboración de los carteles para congresos y a quienes me demostraron que lo fácil se puede tornar imposible.

A MC. Rigoberto Hernández por tu asesoria en los aislamientos bacterianos, Biología molecular, Serologia, por dejarme ver que la FMVZ de la UNAM sigue siendo vanguardia. A todo el personal de la unidad de investigación inmunológica, del Hospital de Pediatría del Centro Medico Nacional siglo XXI del IMSS, donde se llevaron a cabo las pruebas inmunológicas. Estimada Dra. Arcelia Alvarado Islas, Investigadora del INIFAP, por el desarrollo de las pruebas de IBR y PI-3, así como por su tiempo y su sonrisa.

Al grupo tortuguero del CIBNOR; Sionnan L Fitzgerald (mi gabacha favorita) por tu transparencia. Paloma Valdivia por tu gran entusiasmo, tan grande que logras contagiarlo. Milagros López por tu camaradería. Itzel Sifuentes por tu empeño y dedicación ejemplo a seguir. Arturo Juárez por.. ....p or nada, ok por tu camaradería. Héctor Castelán por tu aporte al grupo. A todos por sus investigaciones y por desarrollar una red humana de conciencia. Por el apoyo a los Pilares en la investigación de las tortugas marinas: G. Balazs, J. Nichols, J. Seminoff, P. Dutton, A. Aguirre, T. Work.

A Guillermo Miranda y Martina de Isla Magdalena, personas básicas y fundamentales para la toma de muestras, desarrollo, logro de este trabajo y de todos los elaborados por este grupo, por brindarnos su casa, amistad y familia, mi sincero agradecimiento. Gracias a todos los pobladores de Puerto San Carlos en especial a Don Jesús (el zurdo), a los de Isla Magdalena y Puerto Alcatraz por su confianza y apoyo para la realización de este trabajo. Por confirmarme que lo grande de México esta en gente como ustedes.

TORTUGA PRIETA (Chelonia mydas agassizii], DE B A H ~ A MAGDALENA, BAJA CALIFORNIA SUR, MÉXICO CIBNOR SC. La Paz Baja California Sur, México. Enero 2005

Amaury Cordero Tapia, Tesis de Doctorado Agradecimientos vi

A el cBM Erick Núñez Vázquez por su tiempo y apoyo en la bibliografía, desarrollo e interpretación de la extracción de biotoxinas, y la comprensión de ese mundo y el de la ciencia.

Gracias "compa", mientras usted me viva no habrá carencia intelectual.

Al técnico Ariel Cruz Villacorta por su apoyo y asesoria en la separación y purificación de inmunoglobulinas. Así como, en la toma de imágenes en microscopia electrónica de barrido.

Gracias "compa", por tu amistad y por ir siempre antes que yo.

A el Dr. Dariel Tovar, MC Martín Ramírez, Dr. Eduardo Ruiz (pilori), Ariel y Erick por las confortables y siempre productivas reuniones y platicas académicas.

A Teresa Tapia Hernández, Manuel Cordero Soberanis y a sus hijos Darío Ademír, Noé, Jesús Antonio, Lisbeth y Ary. Alos primeros por darme la vida y a todos por consentir al Benjamín de la familia, hicieron bien, aun lo merece. Si se malcrio y sigue así es por las malas compañías, pero por eso no se preocupen ya no se regenerara. Pero debo mencionarles que aun así, sin embargo y por lo tanto, todavía la nostalgia del núcleo y la guarida familiar lo asalta.

A Don Javier Barajas y Doña Juana Navarro, por su apoyo incondicional, por estar siempre disponibles, por todo y cuanto falta y sobre todo por su hija.

A Nycte, Amaury y Edurne, por la tibieza de su amor en el abrazo, por la felicidad de su sonrisa, por compartirme y darme vida en sus besos.

A Alma Barajas Navarro, por amarme tanto, por 23 años compartidos, por estar aquí y por lo que disfrutaremos. Por ser aun sutil pasión que me estremece cuando el viento te trae a mi.

Finalmente a quien me regalo una sonrisa y su sinceridad, cuenta conmigo siempre.

EVALUACIÓN HISTOPATOLÓGICA DE LAS ETIOLOG~AS COMUNES Y ASOCIADAS A FIBROPAPILOMA EN LA TORTUGA PRIETA (Chelonia mydas agassizii), DE BAHÍA MAGDALENA, BAJA CALIFORNIA SUR, MÉXICO


Amaury Cordero Tapia, Tesis de Doctorado A manera de nota vii

Espinelas

Que como el perro que lame la mano de su señor,

el miedo ablande el rigor con el llanto que derrame; que la ignorancia reclame al cielo el bien que le falta.

Yo, con la frente muy alta, cual retando al rayo a herirme

soportaré sin rendirme la tempestad que me asalta.

No esperes en tu piedad que no inflexible se tuerza: yo seré esclavo por fuerza

pero no por voluntad.

Mi indomable vanidad no se aviene a ruin papel.

¿Humillarme? Ni ante aquel que enciende y apaga el día.

Si yo fuera ángel, sería el soberbio ángel Luzbel.

El hombre de corazón nunca cede a la malicia.

;No hay más Dios que la justicia ni más ley que la razón! ¿Sujetarme a la presión del levita o el escriba?

¿Doblegar la frente altiva ante torpes soberanos?

Yo no acepto a los tiranos ni aquí abajo ni allá arriba.

Salvador Díaz Mirón

-EVALUACIÓN HISTOPATOLÓGICA DE LAS ETIOLOGÍAS COMUNES Y ASOCIADAS A FIBROPAPILOMA EN LA TORTUGA PRIETA (Chelonia mydas agassizii), DE BAHIA MAGDALENA, BAJA CALIFORNIA SUR, MÉXICO


Amaury Cordero Tapia, Tesis de Doctorado Contenido



vii

CONTENIDO

CONFORMACIÓN DEL COMITÉ .......................................................................................i RESUMEN……………………...……………………... ............................................................ii ABSTRACT.................................................................................................................................iii DEDICATORIA..........................................................................................................................iv AGRADECIMIENTOS..............................................................................................................v CONTENIDO..............................................................................................................................vii LISTA DE PUBLICACIONES..................................................................................................viii ÍNDICE DE FIGURAS ..............................................................................................................ix ÍNDICE DE TABLAS ................................................................................................................x LISTA DE ABREVIATURAS ...................................................................................................xi 1.0 INTRODUCCIÓN ................................................................................................................ 1 1.1 Tortugas marinas ................................................................................ 1 1.2 Tortuga prieta ..................................................................................... 1 1.3 Situación de las tortugas marinas....................................................... 3 1.4 Situación de las tortugas marinas en México .................................... 4 1.5 Patología de la tortuga marina .......................................................... 5 1.6 Oncogénesis .......................................................................................... 5 1.7 Respuesta inmune ................................................................................ 8 1.8 Inmunopatología de los tumores .......................................................10 2.0 ANTECEDENTES................................................................................................................13 2.1 Fibropapilomatosis en tortugas marinas ...........................................13

2.2 Herpes virus de la tortuga verde (Green turtle Herpes Virus:GTHV) ............................................................................................. 16 2.3 Parasitos................................................................................................. 16 2.4 Bacterias ................................................................................................ 18 2.5 Transmisión ........................................................................................... 19 2.6 Biotoxinas .............................................................................................. 19 2.7 Contaminación ...................................................................................... 21 2.8 Tortugas en Baja California Sur ......................................................... 22

3.0 HIPÓTESIS ..........................................................................................................................23 4.0 OBJETIVOS..........................................................................................................................24 5.0 ÁREA DE ESTUDIO Y TOMA DE MUESTRAS ............................................................25 5.1 Área de estudio.....................................................................................25 5.1.1Alimentacion de la tortuga prieta en Bahía Magdalena ................25 5.2 Organismos...........................................................................................26 5.3 Toma de muestras ...............................................................................26 5.3.1 Muestras hemáticas ..........................................................................26 5.3.2 Muestras bacteriológicas ..................................................................26 5.3.3 Necropsia ..........................................................................................27 5.3.3.1. La inspección externa ...................................................................27

Amaury Cordero Tapia, Tesis de Doctorado Contenido



viii

5.3.3.2 Inspección interna .........................................................................27 6.0 METODOLOGÍA ..............................................................................................................31 6.1 Histopatología..............................................................................................31 6.2 Serología ......................................................................................................31 6.2.1 Técnica de reducción de focos fluorescentes .................................31 6.2.2 Prueba de la inhibición de la hemaglutinación .............................32 6.2.3 Prueba de seroneutralización vs Aujezky....................................... 33 6.2.4 Prueba de microaglutinación .......................................................... 34 6.3 Bacteriología................................................................................................ 34 6.3.1 Siembra agar bacteriológico ........................................................... 35 6.3.2 Tinción de Gram .............................................................................. 35 6.3.3 Bioquímicas ...................................................................................... 35 6.3.3.1 TSI (Triple azucar hierro) ............................................................35 6.3.3.2 SIM ................................................................................................. 36 6.3.3.3 Urea ................................................................................................ 36 6.3.3.4 Citrato ............................................................................................ 36 6.3.4 Oxidación de azucares ..................................................................... 37 6.4 Parasitología ...............................................................................................37 6.5 Biotoxinas .................................................................................................... 37 6.5.1 Extracción de biotoxinas hidrosolubles .......................................... 38 6.5.2 Extracción de bitoxinas liposolubles .............................................. 38 7.0 RESULTADOS .....................................................................................................................40 7.1 Histopatología..............................................................................................40 7.2 Bacteriología................................................................................................ 45 7.3 Serología ..................................................................................................... 49 7.4 Parasitología ............................................................................................... 49 7.5 Biotoxinas ................................................................................................... 51 7.5.1 Biotoxinas hidrosolubles .................................................................. 51 7.5.2 Biotoxinas liposolubles ..................................................................... 52 8.0 DISCUSIÓN ..........................................................................................................................53 9.0 CONCLUSIONES ................................................................................................................60 10.0 LITERATURA CITADA ...................................................................................................62 11.0 PRODUCCIÓN CIENTÍFICA ..........................................................................................80

Amaury Cordero Tapia, Tesis de Doctorado Publicaciones



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LISTA DE PUBLICACIONES

- A. Cordero-Tapia, S.C. Gardner, J. Arellano-Blanco, and R. B. Inohuye-Rivera. 2004.

Learedius learedi infection in black turtles (Chelonia mydas agassizii) Baja California Sur,

Mexico. Journal of Parasitology. 90(3): 645-647.

- Inohuye-Rivera, R., Cordero-Tapia, A., Arellano-Blanco, J. and Gardner-Susan C. 2004.

“Learedius learedi Price, 1934 (Trematoda: Spirorchidae) in Black turtle (Chelonia mydas

agassizii) hearts from Magdalena Bay, Baja California Sur, Mexico. Comparative

Parasitology. 71(1): 37-41.

Amaury Cordero Tapia, Tesis de Doctorado Índice figuras



ix

ix

INDICE DE FIGURAS Figura 1. Características fenotípicas de la tortuga prieta (Chelonia mydas agassizii)……..3 Figura 2. Fibropapiloma en tortugas marinas ……………………...…………………... ......15 Figura 3. Presencia de huevos de trematodos...........................................................................42 Figura 4 Huevo de trematodo, corte longitudinal....................................................................42 Figura 5 Huevo de trematodo ....................................................................................................42 Figura 6 Huevo de trematodo corte transversal ......................................................................42 Figura 7 Trematodo adulto en corazón ....................................................................................42 Figura 8 Trematodos adultos en peritoneo visceral ................................................................42 Figura 9 Eimeria sp en luz intestinal .........................................................................................43 Figura 10 Estructuras compatibles con Criptosporidium sp....................................................43 Figura 11 Melanosis hepática ....................................................................................................43 Figura 12 Hemosiderosis hepática.............................................................................................43 Figura 13 Esteatosis hepática.....................................................................................................43 Figura 14 Lesión herpetica.........................................................................................................43 Figura 15 Cuerpos de inclusión intranucleares, piel ...............................................................44 Figura 16 Degeneración muscular.............................................................................................44 Figura 17 Enteritis bacteriana...................................................................................................44 Figura 18 Enteritis parasitaria ..................................................................................................44 Figura 19 Hiperplasia de tejido linfoide ...................................................................................44 Figura 20 Hiperplasia de ductos biliares ..................................................................................44 Figura 21 Fibroma renal ............................................................................................................45 Figura 22 Estructura compatible con Chlamydia………………...……………………... .....45 Figura 23 Infiltrado no supurativoT .........................................................................................45 Figura 24 Escherichia coli ..........................................................................................................47 Figura 25 Salmonella sp..............................................................................................................47 Figura 26 Kleibsiella sp ...............................................................................................................47 Figura 27 Satelitismo bacteriano...............................................................................................47 Figura 28 Learedius learedi parásito adulto ............................................................................50 Figura 29 Migración de huevos de trematodo..........................................................................58 Figura 30 Estadios parasitarios en cámaras cardiacas ...........................................................59

Amaury Cordero Tapia, Tesis de Doctorado Índice tablas



x

ÍNDICE DE TABLAS

Tabla No. 1. Clave y datos de las tortugas prietas (Ch. mydas agassizii), pescadas incidentalmente en Bahía Magdalena ………………………………………………… 29 Tabla No.2. Hígados de tortugas marinas de Bahía Magdalena, B. C. S. empleados para la extracción de toxinas hidrosolubles y liposolubles……………………………………. 30 Tabla No 3. Numero de aislamientos bacterianos recuperados de la tortuga prieta (Ch. mydas agassizii), de Bahía Magdalena BCS, México………………………………….. 48 Tabla No. 4 Biotoxinas hidrosolubles en hígados de tortugas marinas de Bahía Magdalena, B. C. S., México………………………………………………………………………….51 Tabla No 5. Biotoxinas liposolubles en hígados de tortugas marinas de Bahía Magdalena, B. C. S., México………………………………………………………………………….52

Amaury Cordero Tapia, Tesis de Doctorado Lista de abreviaturas



xi

LISTA DE ABREVIATURAS

ADN Acido Desoxiribo Nucleico

AO Okadoic Acid

BC Baja California

BCS Baja California Sur

C. mydas Chelonia mydas

CITES Convention International Trade Endangered Species

Da Dalton

DSP Diarrhetic Shellfish poisoing

ej Ejemplo

ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay

Fig. Figura

FP Fibropapiloma

g Gramo

GPD Grey Match Disease

GTFP Green Turtle Fibro Papilloma

GTHP Green Turtle Herpes Virus

HP Herpes virus

IUCN Internacional Union for Conservation of Nature and Natural Resources

IL Interleucina

Kg Kilogramo

Amaury Cordero Tapia, Tesis de Doctorado Lista de abreviaturas



xii

Km Kilometro

LAK Linfocin Active Killer

LRC Largo Recto del Caparazón

LETD Lung eye trachea disease

µg Microgramo

µ Microlitro

MHC Major Histocompatibility Complex

N Norte

NK Natural Killer

oC Grados Celsius

OMS Organización Mundial de la Salud

PCB’S Poly Chloro Bifenil’s

PCR Polymerase Chain Reaction

PROFEPA Procuraduría Federal de Protección al Ambiente

PSP Paralitic Shellfish Poisoing

TNF Tumour Necrotic Factor

Amaury Cordero Tapia, Tesis de Doctorado Introducción

EVALUACIÓN HISTOPATOLÓGICA DE LAS ETIOLOGÍAS COMUNES Y ASOCIADAS A FIBROPAPILOMA EN LA TORTUGA PRIETA (Chelonia mydas agassizii), DE BAHÍA MAGDALENA, BAJA CALIFORNIA SUR, MÉXICO


1

1.0 INTRODUCCIÓN

1.1 Tortugas marinas

Las tortugas marinas se dividen en dos grandes familias: Cheloniidae y Dermochelyidae,

ambas provenientes de un ancestro común (Cryptodira) que data de hace 110 millones de

años. Actualmente se reconocen siete especies de tortugas marinas. El único representante

de la familia Dermochelyidae es la tortuga laúd (Dermochelys coriacea), las demás,

pertenecen a la familia Cheloniidae: tortuga caguama o amarilla (Caretta caretta), tortuga

carey (Eretmochelys imbricata), tortuga lora (Lepidochelys kempii), tortuga golfina

(Lepidochelys olivacea), tortuga plana (Natator depresus) y tortuga verde (Chelonia

mydas), con una variante que es la Chelonia mydas agassizii o tortuga prieta (Meylan y

Meylan, 2000), aunque algunos autores no la consideran diferente de la tortuga verde (Karl

y Bowen, 1999). Excepto por la tortuga lora y la tortuga plana, todas las tortugas marinas

son cosmopolitas; habitan las cuencas oceánicas, donde pueden encontrarse desde el Ártico

hasta Tasmania; presentan una fase pelágica en la cual se desconoce su actividad y

desarrollo fisiológico; mantienen un comportamiento migratorio a lo largo de su vida, con

el regreso periódico a las playas de anidación en la época reproductiva, denominado como

filopatria (Meylan y Meylan, 2000), y se reporta que alcanzan la madurez sexual, según la

especie y el hábitat entre los 15 y 50 años de edad (Balazs, 1982).

1.2 Tortuga prieta

La tortuga prieta (C. mydas agassizii) (Fig. 1), considerada por Pritchard y Mortimer

(2000) como una octava especie, difiere de la tortuga verde en varios aspectos: Talla de

acuerdo a la longitud recta del caparazón (LRC) de hasta 90 cm contra 120 cm en la tortuga

verde (C. mydas); peso promedio el cual en la tortuga negra adulta es de 70 Kg, con un

máximo de 120 contra un peso máximo de 180 kg en la tortuga verde; la coloración negra

en el dorso en las crías permanece hasta la etapa adulta, puede ser uniforme o presentar un

patrón moteado negro con un fondo grisáceo, en tanto que el color blanco en la región




2

ventral de las crías se transforma a gris a las pocas semanas de vida, por el contrario, las

tortugas verdes presentan diferentes niveles de pigmentación según la zona geográfica; el

caparazón de la tortuga negra es de forma oval, no aserrado, con una escotadura posterior

en los adultos, con forma en tienda de campaña, aplanado en el perfil anterior, con cuatro

pares de escudos costales, la tortuga verde a diferencia, presenta el caparazón

ocasionalmente festoneado, no presenta escotadura, la coloración negra en el dorso de las

crías se torna en una combinación de diferentes tonos de café en adultos, en un patrón de

vetas radiales, moteado o liso; la cabeza es redondeada en la porción anterior, con un ancho

de hasta 13 cm, presenta dos escamas prefrontales y cuatro postorbitales, mientras que en la

tortuga verde es corta y prominente en la zona cráneo frontal y su longitud es proporcional

(20%) a la longitud del caparazón; las extremidades son relativamente más largas en las

tortugas prietas (Pritchard y Mortimer, 2000). Debe anotarse que la tortuga verde tiene

diferencias en los intervalos de crecimiento por el área de alimentación (Bjorndal, 2000),

con un crecimiento corporal lento debido a un consumo proteico bajo en el hábitat natural

(Ross, 2000), su crecimiento reportado en Hawaii es de 1.7 a 2.0 cm anual, no se tienen

datos de la tortuga prieta. En fase adulta la tortuga prieta está presente todo el año en la

costas del noroeste de México (Península y Golfo de California), donde se alimentan de

pastos marinos (ej. Zostera, Thalasia) y algas (ej. Gelidium, Gracillaria) de aguas poco

profundas (Diez y Ottenwalder, 2000; López, 2000). La zona de desove mas grande de C.

mydas agassizii es Colola, en las costas de Michoacán, arriban entre agosto y septiembre

anualmente (Pritchard, 1997), el desplazamiento es a una velocidad entre 1.4 a 3.6 km/h y

nadan de 37.7 a 89.5 km/dia, (Wyneken, 1997). Sus huevos miden 4.5 cm y pesan 48 g en

promedio (Balazs et al., 1996).




3

Fig. 1 Características fenotípicas de la tortuga prieta (Chelonia mydas agassizii). Caparazón oval, aplanado en el perfil anterior, escotadura posterior, cuatro pares de escudos costales y cinco centrales; a, tortuga recién capturada; b, tortuga prieta con mas de 24 hrs fuera del agua; c. La cabeza es redondeada, presenta dos escamas prefrontales y cuatro postorbitales; d, e. La coloración negra puede ser uniforme o presentar un patrón moteado negro con un fondo grisáceo; b,c. Graficos a y d modificado de Pritchard y Mortimer (2000).

1.3 Situación de las tortugas marinas

Aunque en diferentes grados todas las especies de tortugas marinas están en las listas de

especies en peligro de extinción, de la Internacional Union for Conservation of Nature and

Natural Resources: IUCN y de la Convention International Trade Endangered Species:

CITES (US Fish and Wildlife Service, 1997). Lo anterior es fundamentalmente

consecuencia de la tradición y costumbre de consumir los huevos y tortugas en cualquier

etapa de desarrollo, de la pesca por medio de redes de arrastre las cuales no presentan

métodos para la liberación de las tortugas marinas y los asentamientos humanos




4

habitacionales o industriales en las regiones costeras, con un alto impacto en el hábitat y

con aporte de sustancias contaminantes (Lutcavage, 1997).

1.4 Situación de las tortugas marinas en México

En 1927 se inicia la protección de la tortuga marina en México con el artículo 5º del

reglamento de pesca, donde se declara la veda de la comercialización y destrucción de los

nidos de tortugas marinas. Confirmando lo anterior en 1929 se decreta la veda y se norman

las tallas mínimas de captura. En 1964 se establece el Programa Nacional de Tortugas

Marinas para la protección, conservación e investigación de las especies de tortugas

marinas que arriban al país. La veda total a la comercialización de los huevos de todas las

especies se decreta en 1966, creándose el Programa de Protección y Conservación de las

Principales Playas de Anidación en Tamaulipas, Michoacán y Colima. En 1967 se amplia

este programa a los estados de Oaxaca, Guerrero y Jalisco. De 1971 a 1972 se abre la

captura, aprovechamiento y comercialización de tres especies, sin embargo, la

sobreexplotación provoca la veda total, reservándose su explotación solo a las Sociedades

Cooperativas de Producción Pesquera. En 1973, se establece un régimen parcial de vedas

para todas las especies. Se decretan 16 zonas de reserva naturales en 1986. El ordenamiento

ecológico se establece en 1988. Es en el Diario Oficial de la Federación del 31 de mayo de

1990 donde se establece una veda total e indefinida de los productos o subproductos de

todas las especies de tortugas marinas, incluyendo capturar, molestar, perseguir o perjudicar

de cualquier forma. En 1991, con 30 campamentos en 13 estados de la Republica, se

ingresa a la convención internacional de especies amenazadas de fauna y flora silvestres

(CITES). En este mismo año, se establece una pena de seis meses a tres años de cárcel a

quien capture dañe o comercialice en cualquier forma a las tortugas marinas y mamíferos

marinos. En 1992, se crea el Centro Mexicano de la tortuga, en Mazunte Oaxaca, con fines

sociales, científicos y tecnológicos. Los excluidores de tortugas marinas en la redes de

pesca son obligatorias desde 1993. En mayo de 1994, El Diario Oficial publica y determina

las especies y subespecies de flora y fauna terrestres y acuáticas en peligro de extinción,

donde se incluye a las tortugas marinas. En 1996, se aumenta la pena de hasta seis años de




5

cárcel a quien trafique con productos o subproductos de cualquier especie de tortugas

marinas (SEMARNAP, 1999). En la actualidad, es un delito federal.

1.5 Patología de la tortuga marina

El estudio patológico sistemático de los animales marinos se inicia a partir de los años 70’ s

(Howard, 1983). Hoy en día, se reconoce un 66% de enfermedades infectocontagiosas

transmitidas del los animales al hombre y un 44% de etiologías transmitidas del humano a

los animales (Taylor, et al., 2001). Las enfermedades en las tortugas marinas no están del

todo descritas, centrándose la atención a las afecciones de mayor impacto visual como

lesiones o alteraciones físicas (neoplasias, traumas, infecciones ectópicas), siendo la

fibropapilomatosis o fibropapiloma (FP) la de mayor tasa de prevalencia e incidencia y por

ende la de mayor estudio (Balazs, 1991; Herbst, 1994; Herbst y Jacobson, 1995). La

literatura no reporta eventos importantes de mortalidad de tortugas marinas asociados a

procesos infecciosos agudos o subagudos. Los esfuerzos a nivel mundial de recuperación

de tortugas marinas enfermas o traumatizadas se encaminan tanto al control de la afección

como el aprendizaje de la clínica en estas especies (Walsh, 2000). En la zona de Baja

California, se tiene un reporte de varamiento de tortugas marinas por causas no

determinadas (PROFEPA, 1998).

Los contaminantes ambientales, pueden alterar fisiológicamente a los individuos afectados

y modificar la respuesta inmune (Aguirre et al, 1994a; Duffy, 1994; Lipscomb, 1993;

Pelletier, 1986). Las biotoxinas (ej. ácido okadáico, lingbiatoxina A) pueden actuar como

causales de intoxicaciones en el género humano, en diferentes grados (Cardellina et

al.,1979; Champetier et al, 1998; Silas y Fernando, 1984 ; Yasumoto, 1998), así como

inmunosupresores y agentes carcinógenicos (Landsberg, 1995; Noga, 1998; Turner, 1997).

1.6 Oncogénesis

Las teorías de la formación de las neoplasias (oncogénesis) son variadas: oncogénesis

somática (cambios tumorales incluidos en el proceso de envejecimiento del individuo,




6

células somáticas); oncogénesis física (ej. radiaciones ultravioleta, inducen la formación de

dímeros entre dos bases de timina vecinas, interfiriendo con la replicación de ADN celular);

oncogénesis química (sustancias químicas activas o transformadas metabolicamente,

afectan ADN); oncogénesis viral (virus ADN ; se captura el oncogen del genoma viral en el

ADN de la célula. Virus ARN, por medio de una trascripción en reversa, logran el efecto de

un virus ADN). Se han descrito diversos factores de riesgo: genéticos, infecciones

concomitantes y estrés, asociados a la oncogénesis (Butel, 2000; Owens; Prehn, 1997;

Yuspa, 2000).

El término tumor se define genéricamente como hinchazón o tumefacción. Las neoplasias,

incluyen a un grupo amplio de agentes etiológicos que provocan un crecimiento celular

benigno o maligno, no controlado de cualquier tipo de tejido y la diseminación de estas

células. A las neoplasias malignas, se les denomina cáncer en forma genérica y se utiliza al

igual que tumor para definir el aumento tisular. Para que la neoplasia se presente, el tejido

debe pasar por cambios celulares que van desde cambios normales como respuesta a una

agresión hasta la pérdida del control de crecimiento y detalle celular. El primer cambio es la

hipertrofia (aumento del tamaño celular), que se considera como un mecanismo de

compensación celular para reestablecer la actividad normal del órgano o tejido. La

hipertrofia puede ser adaptativa (hipertrofia cardíaca por endocarditis valvular) y hormonal

(fisiológica: glándula mamaria en lactancia; patológica: hipertrofia endometrial por

progesterona o PCB’s). El segundo cambio es la hiperplasia (aumento en el número de

células conservando su normalidad anatómica y funcional). La hiperplasia adaptativa

puede ser fisiológica (nefrectomía, el riñón restante compensa la falta) o patológica

(hiperplasia prostática por actividad sexual elevada). La hiperplasia hormonal puede ser

fisiológica (glándulas endometriales en gestación y pubertad) o patológica (hiperplasia

cortical suprarenal; síndrome de Cushing). La hipertrofia y la hiperplasia se presentan

generalmente simultáneas. El tercer cambio es la metaplasia, en donde se lleva a cabo la

sustitución de células maduras de una estirpe por células maduras de otra, se trata de una

sustitución no de una transformación, es un mecanismo de protección a una irritación

constante (ej. metaplasia escamosa del epitelio respiratorio en fumadores). Estos tres

primeros cambios pueden ser reversibles. El cuarto cambio es la displasia, de origen




7

congénito o adquirido, en donde se pierde el patrón, orientación y uniformidad celular, de

origen congénito o adquirido, se determina como proceso preneoplásico, puede ser

reversible si el origen es irritativo y éste se elimina. El último cambio se define como

anaplasia, es la alteración de las células que modifica su proceso de diferenciación y

provoca que adopten un aspecto primitivo e indiferenciado característico de las neoplasias

malignas, en donde el mayor grado de indiferenciación se asocia con mayor agresividad e

invasividad. La clasificación y nomenclatura de las neoplasias está dada por la estirpe

celular involucrada y el comportamiento celular de éstas (benigno, maligno, diferenciado,

funcional, etc), existen múltiples características de las neoplasias, pero se encuentran

definidas en su gran mayoría por agente etiológico, desarrollo y resolución (Stevens y

Lowe, 1995; García Conde-Bru, 1997).

La metástasis es la diseminación de las células neoplásicas a diferentes tejidos del lecho del

tumor primario, sea esto por vía linfática o sanguínea, la cual ocurre siguiendo un patrón

definido: proliferación progresiva (transformación celular continua) del tumor primario

presentada por aporte de nutrimentos; vascularizacion, producida por el factor tumoral de

angiogénesis sintetizado por las células neoplásicas; invasión y desprendimiento, logrado

por movimiento ameboideo de las células y la proliferación de vasos sanguíneos;

embolización, alrededor de 0.1% de las células malignas pasan a torrente sanguíneo;

implante, asociado con un efecto de tropismo de las células neoplásicas; extravasación,

donde las células malignas impactadas en lechos capilares atraviesan la pared e invaden el

tejido; evasión de las defensas y proliferación progresiva, las células evaden las defensas

corporales del individuo, instalándose y proliferando, llevando a cabo la metástasis

(Sschottenfeld and Fraumeni, 1996; Mundy, 2002).

En humanos y animales domésticos en se ha comprobado que el fibropapiloma es causado

por un Papilomavirus (Papovavirus), con más de 50 serotipos (Bosch et al., 1995; Nicholls

and Stanley, 2000).Provoca lesiones cutáneas, indoloras y en forma de coliflor, entre 2-10

mm, que pueden unirse (coaleser). Histopatológicamente se observa un estroma de tejido

conectivo y abundantes vasos de neoformación, ínterdigitaciones del estroma en el epitelio,

el cual se presenta normal y continuo, puede observarse la proliferación de la capas excepto




8

de la basal, se puede presentar hiperpigmentación, cuerpos de inclusión basofílicos

intranucleares, vacuolización citoplasmática en el estrato espinoso, núcleo pignótico y

queratinización variable (Sschottenfeld and Fraumeni, 1996; Taylor et al., 1999). Las

células con núcleos hipercromáticos rodeadas por un halo y con el citoplasma oscuro en la

periferia son llamados coilocitos. Las metástasis son hacia órganos con epitelio o mucosas

queratinizadas (sistema digestivo y genital), estas inician como lesiones lisas, tornándose

rugosas, pueden llegar a desarrollar el aspecto papilomatoso (Stevens, y Lowe, 1995;

Beveridge, y Sobin, 1974). En las tortugas marinas, la neoplasia conocida como

fibropapiloma, aunque muestra lesiones histopatológicas similares a las descritas

anteriormente, no se ha establecido con claridad el agente etiológico, algunos

investigadores han descrito la posible participación de parásitos, toxinas y diversos virus.

1. 7 Respuesta inmune

La respuesta inmune en animales superiores parece haber evolucionado de los mecanismos

de reconocimiento que permitieron a los organismos multicelulares primitivos distinguir

entre lo propio y lo no propio. Estos mecanismos de reconocimiento pueden identificarse

en especies marinas tales como estrellas de mar y corales donde parecen colaborar en el

mantenimiento de la individualidad biológica y la eliminación de agentes potencialmente

patogénicos. En los vertebrados, el reconocimiento de constituyentes no propios del

individuo o constituyentes propios modificados (antígenos endógenos o exógenos), se

efectúa tanto por mecanismos de defensa no específicos (inmunidad innata) como por

mecanismos específicos (inmunidad adaptativa). La respuesta inmune adaptativa a su vez

puede operar a través de mecanismos humorales (anticuerpos) como por células inmunes

(linfocitos T). Los agentes inductores de la respuesta inmune (antígenos) son presentados

por medio de moléculas del complejo principal de histocompatibilidad (major

histocompatibility complex: MHC). La intensidad de la respuesta inmune depende tanto de

las características del antígeno como extrañeza (en base a su estructura molecular), peso

molecular (mayor a 10000 Da), complejidad molecular y estabilidad estructural, como a

características genéticas del propio individuo. La primera exposición a una molécula

antigénica (respuesta primaria), la respuesta inmune humoral presenta una fase latente




9

(alrededor de una semana) en la que no se detectan anticuerpos específicos, demostrándose

una concentración máxima entre los 10 y 14 días posterior a la infección o inoculación. En

la respuesta inmune celular (ej. en los transplantes) se observa una situación similar en el

rechazo primario de injertos. La fase latente es utilizada por el individuo para captura y

procesamiento (presentación) del antígeno por medio de células fagocíticas (macrófagos,

células dendríticas y células B). Este procesamiento produce la formación de anticuerpos

específicos por células plasmáticas en contra del antígeno inductor y la generación de

células de memoria derivadas de linfocitos B encargadas de la respuesta inmune humoral, o

la producción de linfocitos T citotóxicos y células NK y linfocitos T de memoria,

encargados de la respuesta inmune celular. En la respuesta inmune secundaria estos

cambios provocan el acortamiento del periodo de latencia a no más de tres días y que la

concentración de anticuerpos sea más alta produciendo una inmunidad a largo plazo por

semanas, meses o años (William, 1999; Tizard, 1995).

Los vertebrados poseen una respuesta inmune con especificidad y memoria, capaz de actuar

en forma rápida y eficaz ante un estímulo antigénico (Abba, 1994). Los reptiles, aves y

anfibios, además de la producción de inmunoglobulina M (IgM), producen una

inmunoglobulina Y (IgY), homóloga de la inmunoglobulina G (IgG) de los mamíferos

(Origgi et al., 2001; Chiou, 2002). En la tortuga verde se ha observado una respuesta

inmune del tipo humoral y celular (Herbst y Klein, 1995; Work et al., 2000). La

incapacidad de responder adecuadamente a ciertos agentes infecciosos puede deberse tanto

a factores genéticos asociados a una mayor susceptibilidad así como a agentes ambientales

capaces de deprimir la respuesta inmune (Larski, 1998; Ross, 1996), con la consecuente

incapacidad para responder a factores externos e internos que generalmente no deberían

afectar al individuo (Guise, 1997; Repetto, 1996). Las tortugas marinas enfermas

disminuyen hasta 50% de sus actividades anatomofisiológicas (Brill et al., 1995), lo cual

pudiera facilitar su captura.




10

1. 8 Inmunopatología de los tumores

La respuesta inmune celular se considera responsable de la detección y eliminación de

patógenos intracelulares, inaccesibles a factores humorales, La autoinmunidad es una

manifestación de respuesta inmune exagerada contra antígenos propios, en tanto que el

rechazo de injertos es el resultado de una respuesta agresiva en contra de antígenos

extraños, en este mismo sentido una infección se hace crónica debido a una respuesta

inmune insuficiente o no efectiva y el desarrollo de cáncer se ha asociado a un sistema

inmune parcialmente afectado.

Individuos inmunosuprimidos por cualquier causa, incluyendo los transplantados,

desarrollan neoplasias. La respuesta inmune celular antitumoral está asociada a las células

asesinas naturales (Natural Killer; NK), linfocitos T citotóxicos y macrófagos activados.

Las NK no necesitan sensibilización previa, liberan factores citotóxicos (TNF-alfa) y una

perforina. La producción de interleucinas (IL-2, IL2R), aumentan su actividad citotóxica

(células asesinas activadas por linfocinas: LAK), previniendo su muerte (IL3) o

estimulando su función e intensificando su actividad (IL4). Los macrófagos activados por

interferón liberan factores antitumorales (arginasa, reactivan metabolitos de oxigeno),

pueden intensificar la producción de IL-1 o factor de necrosis tumoral (TNF) que estimulan

a las células T cooperadoras (CD4+), aunque, la forma de la eliminación de las células

tumorales in vivo aun no es clara.

La respuesta inmune antitumoral ha sido extensivamente investigada en individuos con

cáncer y en animales de experimentación. En general se considera que existen al menos tres

tipos de antígenos reconocidos por el huésped inmunocompetente: péptidos asociados al

tumor restringidos por moléculas MHC compartidos por tumores histológicamente distintos

y ausentes en tejido normal; antígenos específicos de diferenciación; antígenos únicos

generados por mutación de punto en genes que regulan funciones celulares clave.

Los antígenos asociados al tumor son reconocidos por las células inmunes del huésped,

como lo demuestra la respuesta mediada por anticuerpos y por células inmunes tanto en




11

humanos como en animales de experimentación. Una respuesta inmune celular efectiva

debiera atacar a las células tumorales y limitar su proliferación, posiblemente debido a un

sistema de vigilancia que detecta y elimina clonas de células neoplásicas de reciente

aparición. Sin embargo, la respuesta inmune generada en contra de estos antígenos parece

ser no efectiva en la eliminación del tumor, los antígenos carcinoma embrionario y la alfa

fetoproteina no son reconocidos por linfocitos CD4+ ni por células CD8+. Por ello, se

considera que los antígenos asociados al tumor son no inmunogénicos o débilmente

inmunogénicos.

Las causas por la cuales los tumores evitan esta “vigilancia inmunológica” son diversas.

Ciertos tumores malignos secretan el factor inhibidor de la activación de los macrófagos.

Neoplasias de tipo linfoide del tipo B, al parecer suprimen la formación de anticuerpos, en

tanto las de linfocitos T suprimen la respuesta inmune celular. Las tumoraciones

provocadas por sustancias químicas, pueden secretar factores inmunosupresores

(prostaglandinas). Los factores bloqueadores incluyen también anticuerpos antitumorales

que no fijan complemento, enmascarando los antígenos tumorales, evitando así la acción de

las células T citotóxicas (William, 1999; Tizard, 1995).

Algunas células pueden evadir la vigilancia a través de la modulación antigénica, en tal

forma que las células tumorales pierden antígenos (histocompatibilidad, grupos sanguíneos)

o ganan antígenos (antígeno carcinoma embrionario, alfa-fetoproteína). Los tumores

inducidos por oncovirus ganan antígenos característicos del virus inductor (leucemia viral

felina, Marek) principalmente. Las neoplasias inducidas por métodos químicos, llevan

antígenos de superficie distintivos de la neoplasia no de la sustancia. Aunque tumores

inducidos por una misma sustancia química pueden presentar en la misma masa tumoral

subpoblaciones antigénicamente diferentes (Tizard, 1995).

Las células tumorales parecen ser responsables de la inmunosupresión en pacientes con

cáncer. Existen varios reportes sobre la existencia de factores inmunosupresores producidos

por el tumor y no por el tejido normal en humanos, algunos de estos factores han sido

purificados parcialmente y han sido incluidos dentro de las citocinas, péptidos virales y




12

metabolitos normales sobre expresados. Esto parece ser cierto en el caso de los linfocitos

infiltrantes del tumor en humanos (TIL), células T CD3+, con proporciones variables de

células T citotóxicas CD8+ y células T cooperadoras CD4+. Estas son principalmente

células T de memoria CD45RO+, sin embargo las TIL son pobremente respondedoras

posiblemente por su interacción con factores tumorales inmunosupresores (Zbar etal.,

2002).

Amaury Cordero Tapia, Tesis de Doctorado Antecedentes



13

2.0 ANTECEDENTES

2.1 Fibropapilomatosis en tortugas marinas

El porcentaje de mortalidad por causas naturales: infecciosas y no infecciosas, no ha sido

documentado en las tortugas marinas (Ross, 2000; Lutcavage, 1997). Si bien, en éstas se

han aplicado diversos métodos diagnósticos de uso cotidiano para otras especies: análisis

hemáticos (Aguirre, 1998ª,b; Work y Balazs, 1999); parasitología, bacteriología (Herbst,

2000); prueba mediante la reacción en cadena de la polimerasa (Polymerase Chain

Reaction: PCR) (Aguirre, 1998; Lu et al., 2000; Castelán, 2004); inmunoensayos

enzimáticos (Enzyme Linked Immunosorbent Assay: ELISA) (Gracsyk et al.,1995); técnicas

inmunológicas específicas para la detección de agentes patógenos, dirigidas principalmente

a los asociados a FP (Herbst y Klein, 1995); cultivo celular de otras especies animales, así

como el desarrollo de líneas celulares de tortuga marina, específicamente de Ch. mydas

(Melody et al., 1997; Lu et al., 1999; Work et al., 2001); estudio del metabolismo oxidativo

(Valdivia, 2003) y de contaminantes ambientales (Gardner et al., 2003; Juárez, 2004), no se

han obtenido estadísticas confiables para poder entender con mayor claridad la interrelación

de esta patología con la estructura del ecosistema (Bjorndal, 2000). Aún en la zona de

mayor incidencia de FP en tortugas marinas, Bahía Kaneohe, Hawai (Balazs, 1991), el

reporte de Lu et al. (2000) indica la presencia del virus asociado al FP (Green Turtle Fibro

Papilloma: GTFP) en diversos órganos de peces arrecifales sin manifestación del FP los

individuos portadores del virus.

En la literatura internacional existen reportes a partir de 1938 sobre FP (Smith y Coates,

1938). Se ha estimado una prevalencia de entre el 1.4% hasta el 90% en diferentes zonas

geográficas. El tumor primario de FP es reportado en el tercer párpado, posteriormente se

disemina manteniendo un orden; zona periocular, cuello, hombros, boca, cloaca, caparazón

y apéndices externos. Tiene aspecto de coliflor, es de diferente forma y tamaño y muestra

un comportamiento metástasico de hasta el 30%, afectando hígado, riñón y bazo

principalmente (Aguirre et al., 1998; Herbst et al., 1994, 1999; Lu et al., 2000; Swimmer,

2000; Williams et al., 1994). La severidad de FP ha sido clasificada de forma relativa,




14

basándose en su tamaño y en la apreciación visual, determinándola el prosector (Work y

Balazs, 1999; Aguirre y Balazs, 2000). Esto sugiere la necesidad de hacer una reevaluación

histopatológica, para su estricta caracterización basándose en los cambios de sus

componentes celulares y anatomopatológicos involucrados de la neoplasia.

El FP se ha reportado en todas las zonas de anidación masiva, incluyendo México (Oaxaca)

en una tortuga L. olivacea (Quackenbush et al., 2001). Se ha considerado que las lesiones

neoplásicas en tortugas marinas representan una sola entidad patológica, sin embargo, el FP

se relacionado con afección por diversos agentes causales: Herpes virus, Retrovirus y

Papiloma virus (Herbst et al., 1995,1999; Casey et al., 1997; Yu, 2001), biotoxinas marinas

(Landsberg, 1996), metales pesados (Repetto, 1996), parásitos y cicatrización (Aguirre,

1998, Herbst, 1994). Los estudios histopatológicos de tumores en las tortugas marinas en

diferentes partes del mundo (Aguirre et al., 1999; Herbst, 1994), reportan cúmulos

uniformes de proliferación celular fusiforme (fibroblastoide) de origen mesenquimal,

acantosis, hiperplasia del estrato espinoso y basal (10-15 capas celulares), con presencia de

hiperqueratosis ortoqueratótica en forma papilar, núcleos con cuerpos de inclusión, células

fusiformes en forma linear paralelas a la dermis, vacuolización citoplasmática, cambios

reportados en papiloma y fibropapiloma en humanos y especies animales domesticas

(Beveridge y Sobin, 1974). De igual forma se reportan como cambios asociados a FP, la

necrosis central de la neoplasia, donde la infiltración linfoide en el estrato basal se asocia a

una dermatitis crónica y al fenómeno de regresión tumoral (Aguirre et al., 1994 a,b, 1999).

Diferencias en hemodinamia, hematocrito y niveles séricos de diversos componentes, la

hipoproteinemia, hipocalcemia, hipolipemia, leucopenia, linfopenia, eosinopenia,

heterofilia, neutrofilia, anemia y el incremento de glucocorticoides y lactato, se han

observado en los individuos afectados por la neoplasia, tanto en vida libre como

mantenidos en cautiverio (Work y Balazs, 1999; Aguirre et al., 1998; Aguirre y Balazs,

2000; Swimmer, 2000). Work et al. (2001) no encuentra diferencias significativa en el

estado inmunológico celular y humoral de las tortugas en presencia o ausencia de FP, por lo

que no considera un estado de inmunodepresión como prerrequisito para la presencia de

esta neoplasia. Sin embargo si se ha reportado una asociación positiva entre la presencia de

FP y el largo recto del caparazón (LRC) (Aguirre et al., 1998; Landsberg et al., 1999).




15

Fig. 2 Fibropapiloma en tortugas marinas. La neoplasia es de tamaño variable, se presenta en ojo, boca y

apéndices(a,b). Presencia de metástasis en riñón (c). Fotos modificadas de la página web del College of

Veterinary Medicine, Florida University: www.vetmed.ufl.edu/sacs/wildlife/photos/GTFibro.

a

b c




16

2.2 Herpes virus de la tortuga verde (Green Turtle Herpes Virus: GTHV)

El genero viral Herpes virus (HV) ha sido aislado hasta en un 95% de las tortugas marinas

de vida libre con FP y de forma experimental reprodujo la neoplasia (Herbst et al., 1994,

1999). El HV, perteneciente a la subfamilia alfa, también se ha asociado a enfermedades

tales como “enfermedad de pulmón-ojo-tráquea” (lung-eye-trachea; LETD) y “enfermedad

de la mancha gris” (grey patch disease; GPD) en tortugas marinas (Curry et al., 2000;

Lauckner, 1985), en “la enfermedad del tracto respiratorio superior” en tortugas terrestres y

ermitañas del mediterráneo (Orrigi et al., 2001; Lu et al., 2000). El ADN viral encontrado

solo en los tumores viscerales de tortugas marinas con FP externo e interno, tiene una

similitud del 53% con el HV de rinotraqueitis viral bovina (BHV-1) y de pseudorabia

(Aujezky), asi como un 59% de homología con el Herpes simple tipo 1 (HSV-1) y un 55%

con el virus de la enfermedad de Marek (Gallid-HV2), 48% con mononucleosis viral

(Epstein Barr) y 46% con el virus del sarcoma de Kaposi (KSHV) (Lackovich et al, 1999;

Quackenbush et al, 1998, 2001; Yu et al, 2001). En Ch. mydas agassizii sin FP cutáneo se

reporta un herpes virus con 75% de similitud con el herpes bovino 2 (HPV-2) (Castelán,

2004).

En Caretta caretta y Chelonia mydas con FP, se secuenció una región interior del gen

herpesviral, y difirieron en uno de 61 aminoácidos (Lackovich et al., 1998). Estas

etiologías mantienen antigenicidad cruzada, situación que complica el diagnóstico del HV

asociado a la fibropapilomatosis de la tortuga verde (GTFP), dado que los anticuerpos

contra éste, solo se han encontrado en la manifestación clínica de la neoplasia (Coberley et

al., 2001). El Herpes virus de la tortuga verde (GTHV) sobrevive en el agua marina 96

horas (Curry et al., 2000) y por inoculación provoca agregados en líneas celulares de

tortuga marina (Lu et al., 1999).

2.3 Parasitos

Las infecciones parasitarias mixtas y/o simples, por huevos y/o por formas adultas de

trematodos de la familia Spirorchiidae son comunes en los diferentes géneros de las




17

tortugas marinas y en diferentes zonas geográficas del mundo: Australia, Ch. mydas

(Cribb and Gordon, 1998), Puerto Rico, Ch. mydas, D. coriacea, E. imbricata (Dyer, 1991,

1995a, 1995b, 1995c; Rand y Wiles, 1985), incluyendo el suroeste, noroeste y noreste de

México (Caballero et al., 1950, 1962, Cordero et al., 2004, Inohuye et al., 2004; Pérez,

1996). La infección parasitaria llega a prevalecer hasta en un 95% de las tortugas

examinadas en eventos de varamientos y mortalidad (Dailey, et al., 1991, 1993; Gordon et

al., 1998; Sey, 1977).

Los huevos de este género miden entre 167 y 213µ y en general se encuentran dentro de los

vasos sanguíneos o pueden romper éstos con su consecuente salida al parénquima. El

estado adulto del parásito se recupera de las cámaras cardiacas (Glazebrook et al., 1981,

1990; Dyer et al., 1991; Rand y Wiles 1985; Caballero, 1955). La infestación por huevos y

tremátodos adultos provocan hemiplejia (Kinne, 1985), fluido mucoide en boca y naríz,

taquipnea, consolidación tisular, áreas de pigmentación, nódulos, trombosis, degeneración

de la grasa y del tejido subcutáneo, ascitis, degeneración muscular, edema subcutáneo y

pulmonar, hidropericardio, poliserositis miliar, aneurismas, endocarditis, trombosis

(Aguirre, 1998; Glazebrook,1989; Gordon, 1998; Dyer, 1991; Rand, 1985). Las lesiones

microscópicas más comunes son granulomas e infartos, edema perivascular, proliferación

papilar de la capa íntima en vasos, endocarditis necrótica, vacuolización e hinchazón de las

células endoteliales, hemosiderosis y gránulos de hemosiderina (citoplasma de hepatocitos,

epitelio alveolar y en las células de la pulpa roja). La hemosiderosis y los gránulos de

hemosiderina se han asociado a una infección crónica y a una anemia hemolítica

(Glazebrook, 1981, 1989; Gordon, 1998; Dyer, 1991; Raidal, 1998; Rand, 1985).

La respuesta inflamatoria en contra del parásito se caracteriza por la presencia de células

epitelioides, infiltrado linfocitario, tejido fibroso y células gigantes a cuerpo extraño.

Algunos autores asocian la severidad de ésta respuesta a la cantidad de huevos presentes en

la lesión, mayor a 50, respuesta granulomatosa severa; menor de 20 baja; de 2 a 3 junto al

vaso nula (Glazebrook, 1981, 1989; Rand,1985), por el contrario, Gordon et al. (1998)

encontró similar severidad en presencia de uno o hasta 200 huevos. En el 94% de las

tortugas marinas que manifiestan FP, se observan huevos de trematodos asociados




18

(Aguirre, 1998). Graczyk et al. (1995), mediante la técnica de ELISA desarrollada para la

detección de tremátodos Digenea: Spirorchidae (Learedius, Hapalotrema y Carettacola),

observó variación en los títulos de anticuerpos anti parásito según el origen geográfico, mas

aún, el 58% de las tortugas negativas a la prueba, presentaron FP. El ciclo biológico del

parásito es aún desconocido, la infección puede estar asociada al cambio de dieta en las

tortugas marinas de carnívora a herbívora entre los 30 a 40 cm de LRC, por la ingestión de

invertebrados (camarones, moluscos, briosoarios, pronocefálidos) que se encuentran en

huevos de peces o adheridos a la vegetación que ingieren las tortugas marinas, manteniendo

la cercaria latente o viva (Aguirre, 1998; Aznar, 1998; Cribb, 1998; Glazebrook, 1989;

Pérez, 1996; Raidal, 1998).

2.4 Bacterias

Los huevos de parásitos han sido asociados a transporte de bacterias: Salmonella sp,

Escherichia coli, Citrobacter sp, Moraxella sp (Raidal, 1998) y Pseudmona fluorescens

(Glazebrook, 1989). En la literatura internacional existen reportes de etiologías bacterianas

en tortugas marinas, en donde se han aislado por métodos convencionales diversos tipos de

bacilos y cocos, Gram positivos y Gram negativos. Los principales géneros bacterianos

reportados están clasificados como Gram negativas y dentro del grupo de las

enterobacterias. Estos han sido aislados de diferentes órganos de tortugas marinas

clínicamente sanas mantenidas en cautiverio, así como las que presentan lesiones o que

manifiestan enfermedad. Los géneros reportados son: Aeromona hydrofila, Arizona sp,

Edwardsiella sp, Escherichia coli, Citrobacter sp, Enterobacter sp, Mycobacterium sp,

Flavobacterium sp, Proteus sp, Pseudomonas fluorescens, P. putrefaciens, Salmonella sp,

Vibrio alginolyticus, V. damsela, V. fluvialis, Streptococcus no hemolítico. (Aguirre et al.,

1994 b; Glazebrook y Campbell, 1990; George, 1997; Wiles y Rand, 1987). Todos estos

géneros bacterianos son potencialmente patógenos para humanos y para especies animales

marinas ((Howard, 1983) y terrestres (Acha, 2001). Se ha reportado en sueros de tortugas

marinas (Ch. mydas) la presencia de anticuerpos en contra de Clamydia (Aguirre et al.,

1994 b).




19

2.5 Transmisión

En el caso de etiologías infecciosas, la transmisión en tortugas marinas puede asociarse al

contacto directo, como ocurre en los territorios de pastoreo, donde los machos utilizan

mordidas en cara, cuello, aletas y zona perianal, durante el apareo y como defensa contra

otros machos de la zona (Alvarado y Figueroa, 1990; Crowell, 1987). La manifestación

clínica de los agentes infecciosos, es facilitada por factores estresantes internos y externos;

factores fisiológicos (hormonal; apareamiento, migración) y ambientales (hábitat,

temperatura, alimentación, contaminación), que dependerán de la zona geográfica en donde

se encuentren las tortugas (Coberley, 2001). Los vectores participantes en la diseminación

de agentes infecciosos se encuentra en estudio, por ejemplo, peces en simbiosis con las

tortugas marinas que comen (limpian) los organismos adheridos a la superficie corporal de

éstas, muerden los tumores cutáneos cuando están presentes y continúan su proceso en los

diferentes individuos del grupo presente (Lu et al., 2000c) y de los cuales se ha aislado

GTHP (Lu et al., 2000).

La urbanización o modificación del medio ambiente (tierras para cultivo y explotaciones

animales para consumo humano), lleva a tener mayor contacto o interacción entre los

animales de vida libre y su microbiota (flora bacteriana, parasitaria, viral), con los animales

domésticos (de compañía o de producción) y con el ser humano, con la consecuente

transmisión y posible mutación de estos microorganismos en las transmisiones entre los

organismos de la misma o de diferente especie ( Taylor et al., 2001).

2.6 Biotoxinas marinas

Las biotoxinas marinas son producidas principalmente por microalgas (ej. dinoflagelados,

diatomeas y cianobacterias). Su transmisión esta dada por la redes tróficas, los principales

vectores son los organismos filtradores (moluscos bivalvos: almejas, ostras, etc), así como

peces, gasterópodos, crustáceos pueden actuar como transvectores. Se clasifican según la

sintomatología en el humano en cinco tipo de síndromes: Envenenamiento Paralizante por

Consumo de Mariscos (Paralytic Shellfish Poisoning: PSP); Envenenamiento Diarreico por




20

Consumo de Mariscos (Diarrhetic Shellfish Poisoning: DSP); Envenenamiento Amnésico

por Consumo de Mariscos (Amnesic Shellfish Poisoning: ASP); Envenenamiento

Neurotóxico por Consumo de Mariscos (Neurotoxic Shellfish Poisoning: NSP) y

Envenenamiento Ciguaterico por Consumo de Mariscos (Ciguatera Fish Poisoning: CFP)

(Yasumoto y Murata, 1993; Yasumoto, 2001).

Por otra parte, desde el siglo XVII se han registrado en diversos países del mundo casos

de envenenamiento debido al consumo de tortugas marinas; principalmente por las especies

Ch. mydas, E. imbricata y D. coriacea (Halstead, 1959, 1968; Hashimoto et al., 1967;

Hashimoto, 1979; Silas y Fernando, 1984; Ranaivoson et al., 1994). Los síntomas de la

intoxicación incluyen nausea, vómito, diarrea, dolor intenso de estómago, disnea,

taquicardia, dolor de cabeza, vértigo, fiebre, halitosis, adormecimiento de los labios, boca y

lengua, ulceración en la boca y lengua con fisuras y blanqueamiento, dificultad para

deglutir, en casos graves se presenta además hipersalivación, decaimiento, sueño y muerte.

Este cuadro clínico fue caracterizado y nombrado como el “síndrome del Chelonotoxismo”

por Halstead (1968). Recientemente Yasumoto, (1998) describió a la lingbiatoxina A, (una

toxina previamente descubierta en la cianobacteria Lyngbya majuscula por Cardellina et

al., 1979) como la causa de intoxicaciones por ingesta de tortugas marinas en Madagascar

(Champetier de Ribes et al., 1997) y que provoca la patología descrita (Ito et al., 2002). En

Hawai y Japón esta cianotoxina ha sido asociada como el agente causal de “la dermatitis

severa del bañista” (Mynderse et al., 1977; Cardellina et al., 1979; Hashimoto, 1979).

Otra toxina que recientemente detectada en hígado y riñón de tortugas marinas de Hawai

es el ácido okadáico (AO) es una toxina polieter, lipofílica, perteneciente al síndrome DSP

y producida por dinoflagelados de los géneros Prorocentrum y Dinophysis, la cual ha sido

asociada a FP en dichas tortugas (Landsberg et al., 1999). El AO en exposición crónica ha

sido descrito en ratones y ratas como promotor del desarrollo de carcinomas cutáneos y

papilomas, hiperplasia adenoide, y adenocarcinomas en la zona glandular gástrica (Fujiki et

al., 1985; Fujiki y Suganuma, 1993). También, la exposición crónica de lingbiatoxina A,

promueve la formación de tumores en ratones (Fujiki et al., 1981, 1984 a,b,).




21

La evaluación de Arthur et al. (2001; 2002) de L. majuscula en la dieta de la Ch. mydas (de

Hawai y Australia). Determinando que la cianobacteria es un componente variable de la

dieta de la tortuga verde, su consumo puede ser de hasta 41 µg de lingbiatoxina A y 125 µg

de debromoaplisitoxina por día, lo cual puede estar asociado a FP.

En México se desconoce la presencia de toxinas marinas, en tortugas marinas y su posible

relación con la FP. Así como, el impacto real en la salud pública, sin embargo se tienen

registros históricos de intoxicación por consumo de tortuga marina desde 1740 (Chevallier

y Dúchense [1851] citados por Strainchemps, 2000). En Bahía Magdalena, los pescadores

describen que el consumo de E. imbricata y en ocasiones el consumo de hígado de Ch.

mydas les ″cae pesado″, provocándoles dolor de estómago y diarrea por tres días.

2.7 Contaminación

Estudios de contaminación realizados en el Golfo de California, no revelan una distribución

uniforme ni una presencia constante o estable de sustancias contaminantes (PEMEX, 1991).

Algunas especies de bivalvos nativos han sido estudiadas como posibles bioindicadores de

contaminantes marinos, pero no se han obtenido datos que sustenten su confiabilidad

(Gutiérrez, 1999). Debe mencionarse así mismo, la posibilidad de encontrarse diferencia en

los resultados en estudios similares tales como lo observado por Gardner et al. (2003) que

encuentra en diferentes órganos de tortugas marinas, 17 congeneres de PCB’s, en tanto que

Juárez (2004), en un estudio paralelo en la misma zona no encuentra tales, pero si 10

compuestos organoclorados.

Fitzgerald (2004), encuentra la presencia y niveles elevados de metales pesados (Fe, Cd,

Ni, Cu, Zn, y Mn) en cuatro especies de tortugas marinas, incluyendo a la tortuga prieta, de

diferentes zonas de Baja California Sur. Una fuente importante de estos elementos son las

formaciones geológicas, como la de San Gregorio ubicada en La Paz, BCS, de donde se

extrae fosforita utilizada como fertilizante agrícola, la cual es también rica en elementos

como cadmio y arsénico. Méndez et al., (1998) reportan niveles de cadmio de hasta 32

ppm en sedimentos vecinos a esta zona. En la península de Baja California existen reportes




22

donde se mencionan niveles anómalos de cadmio en diferentes individuos de la cadena

trófica; en sedimentos (Méndez et al., 1998), mejillones (Villaescusa et al., 1991) plankton

(Martín y Broenkow, 1975) e insectos (Cheng et al., 1976). Con respecto a la

contaminación por plomo, se han reportado concentraciones que fluctúan entre 0.04 y 6.7

ugPb/g en peso seco de almeja Chione californiensis, (Pérez et al., 1993), siendo el límite

permisible establecido por la OMS de 1 ugPb/g para bivalvos. En Ballenas varadas en la

costa de Baja California Sur, no se han detectado altos niveles de metales (Méndez et al.,

2002), por lo que un factor importante debe ser la permanencia de los organismos en estas

costas.

2.8 Tortugas en Baja California Sur

La tortuga prieta (Ch. mydas agassizii) es un habitante común de las costas de BCS

(Pritchard, 1997; Pritchard y Mortimer, 2000). Bahía Magdalena, es conocida como una

zona importante para la alimentación de la tortuga prieta durante todo el año (López,

2002), calculándose para ésta una tasa mínima de mortalidad de 47 tortugas por mes (564

por año), sin evidenciarse las causas patológicas de las mismas (Gardner y Nichols, 2001).

En el estado de Baja California Sur (BCS) no existen estudios de la presencia de etiologías

infecciosas en tortugas marinas, tal como han sido descritas en otras entidades del país y a

nivel internacional (Quackenbush, 2001). El desconocimiento específico de los agentes

causales de enfermedades en las tortugas marinas puede deberse a una falla en el proceso

diagnóstico o a la falta de un esfuerzo constante para su identificación. Por tal motivo,

consideramos de interés conocer los agentes infecciosos o no infecciosos (Jacobson, 1996;

Lutcavage, 1990) específicos de la zona de Bahía Magdalena, potencialmente patógenos

para la tortuga negra y las posibles zoonosis que de ella puedan derivarse (Eckert, 2000;

Taylor et al., 2001).

Amaury Cordero Tapia, Tesis de Doctorado Hipótesis



23

3.0 HIPOTESIS

Si la tortuga marina Chelonia mydas agassizii de Bahía Magdalena es afectada por agentes

etiológicos, infecciosos y no infecciosos asociados a fibropapilomatosis, entonces la

evaluación histopatológia, serológica, bacteriológica, parasitológica y toxicológica de las

tortugas recuperadas muertas por pesca incidental revelara la presencia de

fibropapilomatosis a nivel clínico o subclínico.

Amaury Cordero Tapia, Tesis de Doctorado Objetivos



24

4.0 OBJETIVOS

4.1 OBJETIVO GENERAL

Determinar la presencia de agentes infecciosos y no infecciosos, relacionados o no al

fibropapiloma en la tortuga prieta (Chelonia mydas agassizii) de Bahía Magdalena, Baja

California Sur, México.

4.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

En cada uno de los tejidos recuperados de la tortuga prieta:

1.-Caracterizar y clasificar las lesiones histológicas encontradas.

2.-Determinar la microbiota aerobia de boca, ojo y cloaca.

3.-Determinar la presencia de etiologías virales.

4.- Determinar la presencia de ácido okadáico y lingbiatoxina A.

5.- Determinar la presencia de hemoparásitos Trematodos: Spirorchidos.

Amaury Cordero Tapia, Tesis de Doctorado Área de estudio y toma de muestras



25

5.0 ÁREA DE ESTUDIO Y TOMA DE MUESTRAS

5.1 ÁREA DE ESTUDIO

Se visitó mensualmente, de Marzo a Noviembre del 2001, el puerto pesquero Magdalena y

puerto Alcatraz en la Isla Margarita, ubicadas en el complejo lagunar de Bahía Magdalena

en BCS, al noroeste de México, 24º 15’N a 25º 20’N y 111º 30’ y 112º 15’ O (Gardner y

Nichols, 2001), con una temperatura promedio de 22.5 ºC con una máxima de 28 ºC y una

mínima de 19 ºC (López, 2002) y en una ocasión Bahía de los Ángeles, Baja California

(BC), 28º 58’N a 113º 33’ (Resendiz y Nichols, 2002). Puerto Magdalena, nuestra principal

área de estudio tiene una población constante de alrededor de 27 familias, todas ellas se

dedicadas a la pesca artesanal por medio de redes, trampas y buceo.

5.1.1 Alimentación de la tortuga prieta en Bahía Magdalena

La dieta de la tortuga marina en el complejo insular de Bahía Magdalena, es variada y

dependiente de la zona en donde pastorea. En el Pacifico (sustrato rocoso), predomina el

pasto marino Phyllospadix torreyi, y diversas algas que habitan sustratos duros y de alta

energía como Gelidium robustum (alga roja), Pterocladiella capillacea (alga roja) y

Codium simulans (alga verde). En Bahía Magdalena, por el contrario, hay una gran

variedad de algas de sustratos arenosos y también del pasto zostera marina que es el de

mayor abundancia. El consumo principal de las tortugas prietas es de algas rojas carnosas

como; Gracilariopsis lemaneiformis, Gracilaria Pacifica e Hypnea jhonstonii, y en menor

grado de Zostera y Codium amplivesiculatum (alga verde). En la zona de manglares,

predominan las algas de ambientes arenosos y epifitas que se unen a esponjas y conchas

presentes en el fondo, las principales especies que consume en invierno y primavera son

Codium amplivesiculatum y el alga roja Gracilaria textorii (López, 2002).




26

5.2 ORGANISMOS

Se muestro un total de 53 tortugas marinas Ch. mydas agassizii con un rango de largo recto

de caparazón de entre 40 y 60 cm. De estas, 44 murieron por pesca incidental en Bahía

Magdalena, BCS. Nueve tortugas mantenidas en cautiverio en el campamento tortuguero

“Archelon” en Bahía de los Ángeles, BC, fueron evaluadas exclusivamente en estudios

hematológicos y bacteriológicos.

5.3 TOMA DE MUESTRAS

5.3.1 Muestras hemáticas

La vena yugular externa, de 32 individuos muestreados, se localizó a ambos lados de la

línea media del cuello entre 1/3 y 1/2 de la distancia entre la zona occipital y el borde

anterior del caparazón, de 0.5 a 2 cm. de distancia a la línea media. Se introdujo la aguja en

un ángulo de 90º con respecto al cuello. Se emplearon por cada tortuga tres tubos

Vacutainer; uno sin anticoagulante (5ml) y dos tubos con anticoagulante, uno con heparina

de sodio (5 ml) y uno con heparina de litio (3 ml). (Owens, 2000; Wibbels, 2000; Dutton,

1996).

5.3.2 Muestras bacteriológicas

Con hisopos estériles humedecidos en solución salina estéril se muestreo boca (paladar,

nasofaringe y comisuras) y ojo (conjuntiva) esto con movimientos circulares y girando el

hisopos en la superficie, en la cloaca se introdujo lentamente el hisopo húmedo girándolo

en un sentido. En los órganos obtenidos de 24 especimenes, se esterilizó la superficie

colocando una espátula al rojo vivo, posteriormente se realizó un corte en cruz con tijeras

flameadas, en ese corte se introdujo en diferentes direcciones un hisopo estéril. Los hisopos

se almacenaron durante la estancia en la Isla (entre 3 a 7 días), cada uno dentro de una

bolsa de plástico y en hielo.




27

5.3.3 Necropsia

5.3.3.1 Inspección externa:

El cadáver se analizó cráneo-caudalmente y latero-lateral en la posición decúbito ventral y

decúbito dorsal, sucesivamente. Tomando como base las características físicas normales de

las tortugas marinas (Rainey, 1981; Wyneken, 2001; Work, 2000), se identificaron en el

cadáver los cambios externos, tales como: autólisis, estado nutricional, integridad corporal,

presencia de nodulaciones, parásitos, excoriaciones, lesiones infecciosas, traumas o marcas

de identificación. Las muestras hemáticas se tomaron directamente del corazón

5.3.3.2 Inspección interna:

La necropsia de 16 tortugas prietas en Bahía Magdalena, se efectuó siguiendo la

metodología de Rainey (1981) y Work (2000), llevando un orden sistemático y secuencial

para la inspección y toma de muestras de órganos y tejidos externos e internos. Se colocó a

la tortuga en posición decúbito dorsal. Se incidió con un cuchillo en la unión del plastrón

con el caparazón y se continuó el corte siguiendo el perímetro del plastrón, se disecaron los

ligamentos de las masas musculares pectorales y pélvicas unidas a éste para su total

separación. Se cortó la piel del cuello longitudinalmente en línea media ventral, para la

exposición de esófago y traquea. Los órganos internos se analizaron conforme su

presentación anatómica. Adicionalmente, se obtuvieron muestras de algunos tejidos

internos de 28 especimenes diferentes, los cuales fueron recuperados y facilitados por

pescadores de la isla.

Dependiendo de la conservación de los órganos (fijados o no en formalina al 10%), fueron

destinados para análisis histológico, bacteriología, parasitología, inmunología y pruebas

biológicas para la demostración de biotoxinas marinas. De Bahía Magdalena se recuperaron

de 44 especimenes 197 tejidos, 51 hisopos para bacteriología, 22 muestras sanguíneas. De

nueve tortugas mantenidas en cautiverio en el campo tortuguero ejidal Archelon (Bahía de




28

Los Ángeles), se obtuvieron nueve muestras hemáticas y 27 muestras para bacteriología

(hisopos oculares, orales y cloacales). El total del numero de muestras por tejido obtenidos

en este estudio es el siguiente: 22 de riñón, 30 de hígado, 19 de músculo esquelético, 19 de

pulmón, 18 de intestino, 15 de piel, 15 de corazón, 14 de bazo, 7 de estomago, 7 de traquea,

5 de páncreas, 5 de grandes vasos, 4 de esófago, 2 de vejiga, 2 de cerebro, 2 de timo, 2 de

tiroides, 2 de glándulas axilares y 31 sueros, Tabla # 1 y 2.

En el laboratorio se efectuó la siembra en agares bacteriológicos de las muestras de hisopos

y órganos internos. Los sueros obtenidos de las muestras hemáticas fueron alicuotados en

viales Eppendorf y mantenidas en congelación a -70º C hasta su uso.




29

Tabla No. 1. Clave y datos de las tortugas prietas (Ch. mydas agassizii), pescadas incidentalmente en Bahía Magdalena;

Isla Magdalena (I. Magd), Isla Margarita (I. Marg) y las mantenidas en cautiverio en Bahía de los Angeles (B. Ang.). Las

muestras fueron para histopatológia (H), Bacteriología (B) y Sueros para inmunología (S). En algunos casos, no se tiene

datos (S/D).

CLAVE FECHA LUGAR MEDIDAS CM.

TIPO MUESTRA

T1 ABRIL/2001 I. Magd 53.5/40.5 H, T2 ABRIL/2001 I. Magd 1.47/1.26 S,H,B T3 ABRIL/2001 I. Magd S/D H T4 ABRIL/2001 I. Magd 53/46 H T6 ABRIL/2001 I. Magd 56/42 H T7 ABRIL/2001 I. Magd 47/38.5 S T8 29/03/2001 I. Magd S/D S,H T9 15/03/2001 I. Magd S/D H

T10 18/03/2001 I. Magd S/D H T11 S/D I. Magd S/D H T12 S/D I. Magd S/D H T13 S/D I. Magd 47/35.5 H T14 S/D I. Magd 48.5/45/5 H T15 S/D I. Magd 53.5/43 H T18 27/06/2001 I. Marg 40/37 S,H, B T19 27/06/2001 I. Marg 67/56 S,B T20 07/06/2001 B. Ang 72/51 S,B T21 07/08/2001 B. Ang 70.8/58.7 S,B T23 07/11/2001 B. Ang S/D S,B T25 07/12/2001 B. Ang S/D S,B T26 07/12/2001 B. Ang S/D S,B T27 07/12/2001 B. Ang S/D S,B T28 07/12/2001 B. Ang S/D S,B T29 07/12/2001 B. Ang S/D S,B T30 08/12/2001 B. Ang S/D S,B T31 28/07/2001 I. Magd 48/39 S, H T32 29/07/2001 I. Magd 47/38 S, H, B T33 29/07/2001 I. Magd 56/43 S, H, B T34 29/07/2001 I. Magd 63/52 S, H, B T35 08/01/2001 I. Magd 46/35 B T37 08/04/2001 I. Marg 46/37 S, H, B T38 08/04/2001 I. Marg 49/38 S, H, B T39 08/04/2001 I. Marg 63/51 S, H, B T40 08/08/2001 I. Magd 46/41 S, H,B T41 01/09/2001 I. Magd S/D S, H,B T42 01-Sep I. Magd S/D S, H,B T43 01-Sep I. Marg S/D S, H,B T44 01-Sep I. Marg S/D S, H,B T46 01-Sep I. Magd S/D S, H,B




30

Tabla No.2 Hígados de tortugas marinas de Bahía Magdalena, B. C. S. empleados para la extracción de toxinas

hidrosolubles y liposolubles.

Especie Ejemplar Peso (g) Época de colecta

Ch. mydas agassizzi 1 56 invierno-primavera


Caretta caretta 3 24 invierno-primavera


Caretta caretta 5 11 invierno-primavera

Ch. mydas agassizzi 6 37 verano











Amaury Cordero Tapia, Tesis de Doctorado Metodología



31

6.0 METODOLOGÍA

6.1 Histopatología

Los órganos de las tortugas marinas (183 tejidos), fueron procesados por métodos

histológicos convencionales (Prophet, 1992), en el laboratorio de histología e histoquímica

del CIBNOR, SC. En detalle: los tejidos fueron colocados en cápsulas de plástico, con la

superficie a observar en contacto con ésta; se incluyeron en parafina y se cortaron a 4

micras en un micrótomo Leica RM2025; los cortes obtenidos se colocaron en baño de

flotación adicionado con gelatina tipo reactivo, se recuperaron por medio de porta objetos y

se fijaron por calor en una platina térmica; Los cortes fueron teñidos con Hematoxilina

Eosina y una vez teñidos se observaron en un microscopio óptico (Olimpus BX41). Las

imágenes de los cortes que presentaron cambios o alteraciones celulares relevantes se

digitalizaron y se analizaron en un analizador de imágenes (Image-Pro Plus versión 4.1 for

Windows).

6.2 Serología

Se obtuvieron 31 sueros a partir de las muestras sanguíneas sin anticoagulante (3 ml

promedio c/u), se separaron en alícuotas de 1 ml y se congelaron a -70º C. Estos sueros se

procesaron, por medio de diferentes técnicas diagnósticas de virología, en la Unidad de

Investigación Médica en Inmunología, Centro Medico Nacional Siglo XXI, del IMSS y

Departamento de Microbiología e Inmunología, de la Facultad de Medicina Veterinaria de

la UNAM para determinar el contacto con diferentes géneros de agentes infecciosos,

causantes de enfermedades en animales terrestres y acuáticos.

6.2.1 Técnica de reducción de focos fluorescentes

El diagnóstico de infección por Rabdovirus (Bourhy y Sureau, 1990), agente causal de

rabia en animales terrestres, ascitis primaveral en la carpa, septicemia hemorrágica viral en

salmónidos, necrosis hematopoyética infecciosa de los salmónidos y viremia ende los




32

cíclidos del río grande, se efectuó mediante reducción de focos fluorescentes. Para el

análisis se usó una línea celular de neuroblastoma murino, la cual fue mantenida en botellas

de cultivo en plástico de 25 cm3 conteniendo 10 ml de medio (BHK) suplementado con

10% de SFT hasta formar una monocapa confluente de alrededor de 6 millones de células.

La monocapa celular se lavó con 3 ml de PBS, pH 7.2 y se desprendió del fondo usando 2

ml de tripsina por botella durante 30 segundos. Las células desprendidas, se resuspendieron

en 15 ml de medio de cultivo, 100 µl de esta suspensión celular se cultivaron por 24 h en

placas de 96 pozos de fondo plano hasta formar una monocapa. Los sueros de las tortugas,

inactivados a 56º C durante 30 m fueron diluidos en forma seriada al triple (3, 9, 27, 81),

50 µl de la dilución respectiva se colocaron en los pozos de una placa de incubación,

excepto en los controles, junto con 50 µl de virus rábico ya estandarizado y se incubaron

durante 1 h en una atmósfera de CO2 al 5%. De la placa de células se retiró el medio de

cada pozo y se colocó la mezcla del virus y suero en los pozos de similar identificación (ej

A5:A5). La mezcla final (células de neuroblastoma, suero, virus) se incubó en una

atmósfera de CO2 al 5% durante 20 h a 37º C, posteriormente la placa se fijó con acetona al

80% por 30 m, se adicionó 30 µl de conjugado fluorescente antinucleocapside del virus de

la rabia en cada pozo y se incubo durante 30 minutos más a 37º C, evitando el contacto con

la luz. Finalmente, se colocó 150 µl de líquido de montaje a cada pozo y los resultados se

observaron al microscopio de inmunofluorescencia. La reducción de los focos fluorescentes

a nivel celular revela la presencia de anticuerpos específicos en contra del virus.

6.2.2 Prueba de la inhibición de la hemaglutinación

La prueba de inhibición de la hemaglutinación es utilizada para identificar la presencia

anticuerpos anti Mixovirus (Mahy, 1991; Purchase, 1989), agente causal de la influenza en

diversas especies animales; influenza porcina, influenza aviar, influenza humana, etc. Para

el ensayo se utilizaron eritrocitos humanos del tipo O Rh - al 1%. El virus estandarizado fue

proporcionado por la Productora Nacional de Biológicos Veterinarios (PRONABIVE). Para

titular su actividad hemaglutinante el virus se sometió a diluciones decuples (1:10) en

placas de 96 pozos y se incubo en una proporción 1:1 con glóbulos rojos. Una

hemoaglutinación del 50% de glóbulos rojos se tomó como una unidad hemoaglutinante




33

(UHA), el virus se uso a una concentración de 4 UHA. Los sueros de cada tortuga, fueron

inactivados a 56º C en baño Maria durante 30 m, y se hicieron diluciones logarítmicas base

2 hasta la dilución 1/256. De cada dilución 50 µl se incubaron con 50µl del virus a 4

UHA a temperatura ambiente durante 1 h, después de esto se aplicaron 50 µl de glóbulos

rojos al 1% y se incubaron por 1h más a temperatura ambiente. El titulo del suero

correspondio a la ultima dilución capaz de inhibir totalmente la hemoaglutinación

provocada por el virus.

6.2.3 Prueba de seroneutralización del virus de Aujezky (Mahy, 1991; Purchase,

1989).

El genero Herpes virus causa diferentes enfermedades: Aujezky afecta a mamíferos (suinos,

caninos, etc.). La laringotraqueitis afecta a las aves. En especies acuícolas provoca

enfermedades como la enfermedad viral del bagre, plaga del pez ángel y enfermedad de los

herpes virus de los salmónidos.

Se utilizaron células MDBK cultivadas en botellas de plastico hasta formar una monocapa

confluente de alrededor de 6 millones de células. Las células se resuspendieron en 15 ml de

medio de cultivo y de esta suspensión, se aplicaron 100 µl a cada pozo de una placa de 96

pozos de fondo plano y se incubaron durante 24 hrs. Los sueros de cada tortuga se

inactivaron a 56ºC durante 30 minutos. El virus proporcionado por PRONABIVE, se diluyó

en 1 a 30 (2.9ml de medio + 100µl de virus) en medio BHK sin suero. 50 µl de esta

dilución del virus se aplicaron a cada pozo, junto con 50µl de medio sin suero y 50µl de

suero de una tortuga diferente por cada línea de pozos. La mezcla se incubó en cámara

húmeda, a 37ºC con una atmósfera de CO2 al 5%, durante una hora. 50µl de la mezcla de

neutralización (Suero-virus) se añadió a la placa con células y se incubó nuevamente a 37ºC

con una atmósfera de CO2 al 5%, durante una hora. Se considera que los sueros con

anticuerpos específicos evitan el efecto citopático provocado por el virus. De tal manera

que en los pozos en donde puede apreciarse efecto citopático el suero es negativo.




34

6.2.4 Prueba de micro aglutinación (Myers, 1985).

Leptospira interrogans es un genero altamente infeccioso que afecta a diferentes especies

terrestres y marinas (Myers, 1983; Godinez, 1999). La prueba de microaglutinación

microscópica se aplicó a los sueros de las tortugas marinas para verificar la presencia de

anticuerpos en ellos. Esta prueba se realizó en el Departamento de Microbiología e

Inmunología de la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia de La Universidad

Nacional Autónoma de México (UNAM). Ciudad Universitaria, México, D F.

Los sueros se diluyeron a 1:25 con solución salina amortiguada de fosfatos (SAF). pH 7.2.

En cada pozo de una placa de fondo plano se colocaron 50 µl de suero diluido y 50 µl de

antígeno (cultivo liquido de cada serovar) para obtener una dilución 1:50, como prueba

tamiz. La placa con la muestras se incubo 2 h a temperatura ambiente y la lectura se realizó

en el microscopio de campo oscuro. Los sueros que reaccionaron con un 50% de

leptospiras aglutinadas en el campo visual se consideraron positivos. Los sueros positivos,

fueron diluidos mediante diluciones dobles seriadas hasta la dilución 1:3,200, poniéndose

en contacto con el serovar al cual fue positivo, tomando el tiempo de incubación que la

prueba tamiz, así como su interpretación.

6.3 Bacteriología

Los hisopos y órganos se sembraron en medios de cultivo bacteriológico en el laboratorio

de microbiología del CIBNOR. Todas las muestras se sembraron individualmente por estría

abierta y cruzada para obtener y purificar colonias bacterianas en cajas Petri de medios

bacteriológicos (agarosa sangre y agar Mac Conquey) en promedio 2 cajas por individuo,

su purificación fue en medios similares y su almacenamiento en medio de transporte Stuart.

Para determinar su morfología, se aplico la tinción de Gram. Su resiembra se realizo con

los mismos medios y métodos de purificación en el Departamento de Microbiología e

inmunología de la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia de la UNAM.




35

6.3.1 Siembra en agar bacteriológico

El hisopo se sembró tocando una parte que no excediera ½ cm en los medios

bacteriológicos, agarosa sangre y agar MacConkey. Se dispersaron con asa bacteriológica

por estría abierta y cruzada y se incubaron durante 24 h, se eligieron y sembraron colonias

en otras cajas con los mismos medios, para su purificación y se repitió la forma de siembra

y tiempo de incubación. Para la conservación se tomo una asada de colonias aisladas y se

inoculó por picadura en el medio de transporte Stuart.

6.3.2 Tinción de Gram

A las colonias bacterianas aisladas se les aplicó la tinción de Gram, para conocer su

morfología y su afinidad a la tinción. En un porta objetos se suspendió la colonia bacteriana

en una gota de agua destilada, para cada colonia bacteriana purificada y se fijó por medio

de calor. La colonia bacteriana se cubrió en secuencia con cristal violeta y bicarbonato de

sodio (1:1), durante 15 segundos, con Yodo durante 15 seg, con alcohol-acetona de 3 a 5

seg y con Fuscina básica 15 seg después de cada uno de los pasos se lavó con agua

destilada y al final con agua corriente. Todas las tinciones se observaron en microscopio

óptico a 100X, considerándose como Gram positivas a las bacterias que se tiñeron de color

azul y como Gram negativas a las que se tiñeron de color rojo. A las bacterias Gram

negativas (posibles enteró bacterias) se les realizaron estudios de caracterización por medio

de pruebas bioquímicas de TSI, SIM, urea y citrato.

6.3.3 Bioquímicas

Todas las técnicas realizaron de acuerdo a lo descrito por Staley (1989).

6.3.3.1 TSI (triple azúcar hierro), para diferenciar bacilos Gram negativos entéricos de

otros géneros bacterianos.

Las muestras se siembran por picadura y estría continua. Esta prueba se basa en la

capacidad de algunas bacterias de utilizar los azúcares. Los carbohidratos pueden ser

utilizados mediante la oxidación con la producción de ácido. Se usa el rojo fenol como

indicador que a pH alcalino se torna color amarillo y en pH ácido a rojo. La producción de




36

ácido sulfhídrico (H2S), algunas bacterias pueden reducir el tiosulfato de sodio a sulfuro de

hidrógeno, el cual reacciona con el sulfato ferroso del medio produciendo sulfuro de hierro:

un resultado positivo se considera cuando se forma un precipitado de color negro en el

medio. La producción de gas por fermentación de carbohidratos, sedetermina con la

producción de burbujas o el desplazamiento del medio. El resultado de estas tres reacciones,

tiene 6 diferentes posibilidades (Staley ,1989; Quinn et al., 1994).

6.3.3.2 SIM

Denominado SIM debido a las reacciones metabólicas que pueden presentar las bacterias

inoculadas; S, producción de ácido sulfhídrico (H2S). I, producción de indol. SIM sirve

para diferenciar E. coli de Enterobacter y Klebsiella, Proteus mirabilis de otros Proteus.

Determina la producción de triptofanasa y la oxidación del triptofano con producción de

indol. La realización de la prueba implica la aplicación de una gota del reactivo de Kovac’s

y se consideran positivos cuando se forma de inmediato un anillo de color rojo. En un

medio semisólido se inocula por picadura la colonia bacteriana y se observa la capacidad de

motilidad (M), que se manifiesta cuando el medio es turbio al centro y claro en la periferia.

6.3.3.3 Urea

Esta metodología se utiliza para diferenciar entre especies de enterobacterias Proteus spp,

Pasteurella spp, Corynebacterium spp y Brucella spp.. Determina la capacidad de las

bacterias de producir la enzima ureasa que desdobla la urea en amoniaco y se usa el rojo

fenol como indicador. Se tomaron como positivos los que presentaron una coloración roja

en el medio.

6.3.3.4 Citrato

Se utiliza para diferenciar Enterobacter y Klebsiella de E. coli. Se evalúa la capacidad de la

bacteria para utilizar el citrato de sodio como única fuente de carbono, con azul de

bromotimol como indicador. Se usa siembra por estría abierta y se reportan resultados

positivos cuando los medios que tornaron de verde a azul




37

6.3.4 Oxidación de azucares

La oxidación de azúcares: maltosa, rafinosa, salicin, xilosa, esculina, lactosa, sucrosa,

glucosa, VP30, ramnosa, arabinosa, trealosa se usa para determinar la especie de las

bacterias. Todas ellas en medio líquido, se inocularon con una asada de la colonia

bacteriana. Se tomo como positiva, cuando vira el color del medio.

6.4 Parasitología

Asociado a la evaluación de los cortes histológicos, se examinaron cuatro vísceras

cardiacas, esto en el laboratorio de Parasitologia del CIBNOR, S,C. La disección de las

mismas de efectuó siguiendo el sentido de la circulación sanguínea para verificar la

presencia de parásitos adultos de trematodos spirorchidos, bajo el microscopio

estereoscopico. Los parásitos recuperados se colocaron en alcohol 70% durante 48hrs. A

cada uno de los especimenes se les aplico la tinción de Tricromica de Gomori, modificada

de Sheehan y Hrapchak, 1973 para posteriormente clasificarse en base a sus características

morfológicas.

6.5 Biotoxinas

Se disecó el hígado de 16 tortugas marinas (14 de Ch. mydas agassizii y 2 de Caretta

caretta ) obtenidas en Bahía Magdalena, B. C. S., los cuales fueron transportados en hielo a

la Unidad de Patología Marina del CIBNOR para su procesamiento. Cinco de los hígados

fueron colectados en la época de invierno-primavera (febrero-abril del 2001 y 11 en verano

(julio-agosto del 2003). Una vez en el laboratorio los hígados fueron pesados y clasificados

para la extracción de toxinas hidrosolubles (empleando el método de PSP de la AOAC,

1995) y liposolubles (basado en el método de DSP descrito por Yasumoto et al., 1978 y

1984).




38

6.5.1. Extracción de Biotoxinas hidrosolubles (PSP: Paralytic Shellfish Poisoning,

AOAC, 1995).

El análisis de toxinas hidrosolubles se realizó con base en la metodología descrita para

toxinas paralíticas (saxitoxina –STX- y análogos) de la AOAC, 1995). Cabe señalar que

este bioensayo en ratón es el método internacional oficialmente utilizado y ha sido

adoptado por la Norma Oficial Mexicana (NOM) para la detección de este tipo de toxinas.

La extracción consistió en la homogeneización del tejido en HCl 0.1 N (en una relación 1:1

peso-volumen) llevando a ebullición durante 5 min, aforando el volumen perdido y

ajustando el pH a 4.0 con HCl o NaOH (según el caso); centrifugación a 1,100 g durante 10

minutos; recuperación y filtración del sobrenadante a través de membranas 0. 22 µ. Para el

bioensayo, se inyectó intraperitonialmente 1 ml de extracto a cada uno de 3 ratones albinos

cepa CD-1 de un peso entre 18-23 g; se observaron los signos clínicos por 24 hrs y se tomó

el tiempo de sobrevivencia. La concentración de STX en unidades ratón (UR), se definió

como la concentración de toxina capaz de matar a un ratón de peso entre 18-23 g en un

intervalo de 5-15 min y es equivalente a 0.2 µg de STX.

La concentración de toxina en la muestra se calculó mediante la siguiente ecuación:

µgVPM/100 g de tejido= media URC/ml x FC x FD x 200

Donde VPM es la cantidad de veneno paralizante en el hígado de la tortuga; URC son las

unidades de ratón corregidas (según tablas de Soomer en AOAC, 1995); FC y FD

representan los factores de conversión predeterminados, el primero de la toxina estándar y

el segundo del factor de dilución.

6.5.2. Extracción de Biotoxinas liposolubles (DSP: Diarrethic Shellfish Poisoning,

Yasumoto et al., 1978 y 1984).

El análisis de biotoxinas liposolubles se efectuó de acuerdo a la técnica descrita para la

valoración de toxinas diarreicas (ácido okadáico -AO- y dinofisitoxinas -DTXs-) por

Yasumoto et al., (1978 y 1984). En detalle, el tejido se homogeneizó en acetona fría en una

proporción 1:3 (tejido-solvente) y se dejó reposar en frío (7 °C) y al resguardo de la luz por

24 h. Posteriormente, cada extracto fue filtrado usando papel filtro Whatman No.1 y un

filtro Bushner. Los extractos acetónicos obtenidos fueron evaporados en un rotavapor a




39

50 °C (y los residuos resuspendidos en 25 ml de metanol al 80%) y se lavaron dos veces

con 25 ml de hexano mediante un embudo de separación. Cada extracto se diluyó a 50% de

metanol y se extrajo nuevamente con diclorometano volumen a volumen. Posteriormente,

las muestras fueron evaporadas a 35 °C para la eliminación del diclorometano y los

residuos fueron resuspendidos en una solución salina (0.15 M de NaCl) con 1% de Tween

60. Finalmente 0.5 ml de cada extracto se inyectó vía intraperitoneal, por triplicado en

ratones albinos CD-1 de 18-23 g de peso, se observaron los signos clínicos durante 48 h y

se registró el tiempo de sobrevivencia. El cálculo de la toxicidad para AO se realizó

mediante la fórmula: Log (UR)=2.6 log (1+T-1) , donde UR= Unidad ratón, 2.6 log fue

calculado para el estándar de AO y T= tiempo de muerte en horas.

Amaury Cordero Tapia, Tesis de Doctorado Resultados



40

7.0 RESULTADOS

7.1 HISTOPATOLOGIA

Se observaron cambios degenerativos asociados a la presencia de agentes infecciosos en el

100% de los especimenes analizados. La infección por parasitos de diferentes géneros y

especies, en diferentes estadios mostró una prevalencia del 99.56%. La presencia de

estructuras compatibles con huevos de trematodos spirorchidos se asoció en todos los tipos

de tejido analizado a la presencia de un exudado no supurativo, de ligero a moderado,

multifocal, con presencia de células gigantes y focos de necrosis, en algunas ocasiones sin

respuesta inflamatoria (Fig. 3). Estas estructuras se encontraban desplazando y lesionando

los tejidos. Un hallazgo común fue la presencia de células gigantes a cuerpo extraño.

La estructura de los huevos se caracterizó por presentar una cutícula queratinisada de color

verde. En cortes longitudinales el exterior se observo de forma ovoide con prolongaciones

polares filamentosas (1:1, filamento- cuerpo), estas se retraen por su línea media hacia el

cuerpo, una de las terminaciones tiene forma de ventosa, se aprecia una cavidad ovoide con

extremos romos, con un cúmulo celular que la ocupa total o parcialmente (Fig. 4, 5). En el

corte transversal, dependiendo del nivel del corte, se observa de forma circular con

extremos traslapados y un cúmulo celular al centro. Los cortes en los extremos se aprecian

como círculos de menor diámetro, con doble cutícula con o sin cúmulo celular (Fig.6).

La prevalencia y proporción de los huevos en los tejidos fue la siguiente: Intestino: 14 de

18 (0.77); Riñón: 7 de 22 (0.31); Pulmón: 8 de 19 (0.42); Músculo esquelético: 6 de 19

(0.31); Estomago: 3 de 7 (0.42); Corazón: 4 de 11 (0.33); Piel: 2 de 15; Hígado: 3 de 20;

Páncreas: 2 de 5; Bazo: 8 de 14; Cerebro 2 de 2.

La presencia de trematodos adultos (Fig. 7) se asocio con una similar respuesta inflamatoria

en 2 de 7 corazones (0.28); en 1 de 18 peritoneo visceral (0.05) (Fig.8). Adicionalmente,

en algunos tejidos fueron observadas estructuras parasitarias compatibles con Eimeria sp en

2 de 18 (0.11) (Fig. 9) y Criptosporidium sp en 3 de 18 (0.16) muestras de intestino

(Fig.10).




41

Los cambios degenerativos inflamatorios asociados a daños celulares por diferentes agentes

(virus, bacterias, hemoparasitos, intoxicaciones, etc) observados en los tejidos analizados

fueron; la hemosiderosis y melanosis (Fig.11, 12) en 8 de 20 (0.4) muestras de hígado; 2 de

14 (0.14) muestras de bazo; 1 de 18 (0.05) intestino; 1 de 22 (0.04) de tejido renal; 1 de 5

(0.20) muestras de Aorta; 1 de 15 (0.06) muestras de piel. Infiltración citoplasmática de

lípidos (esteatosis) de moderada a severa se observo en 11 de 20 (0.55) tejidos hepáticos

(Fig.13). Lesiones herpeticas con presencia de vacuolización citoplasmática de moderada a

severa en células basales y en estrato espinoso, así como núcleos con cromatina densa y

cuerpos de inclusión (Fig.14, 15) se observaron en 4 de 15 (0.26) tejidos epidérmicos.

Degeneración miofibrilar de ligero, moderada y severa se observo en dos de 19 (0.10),

muestras de músculo esquelético (Fig.16). Depleción linfoide moderada se observo en dos

muestras bazo de 14 (0.14). Atrofia del epitelio traqueal de moderado a severo en dos de

siete muestras (0.28), con presencia de colonias bacterianas. Atrofia de vellosidades de

moderada a severa se observo en dos de 18 (0.11) muestras de intestino también con

presencia de colonias bacterianas (Fig. 17), así como de huevos y de parasitos adultos

(Fig.18).

Los cambios hiperplásicos compensatorios, de reparación o de sustitución en los diferentes

tejidos, revelaron las siguientes prevalencias: hiperplasia mesangial moderada en tres de 22

riñones (0.13), hiperplasia del tejido linfoide y focos de fibrosis en uno de 18 (0.05) de

muestras de intestino (Fig. 19), hiperplasia del tejido linfoide en tejido pulmonar en 1 de 19

(0.52), hiperplasia de ductos biliares se observo en dos de 20 (0.1) muestras (Fig. 20) y

proliferación de células cúbicas a cilíndricas, discontinuas, con presencia de cilios en el

borde apical en peritoneo visceral en cinco de 18 (0.27) muestras.

Los cambios hiperplásicos neoplásicos (fibroma) se observaron en dos de 22 (0.9)

muestras renales, observándose focos de células fusiformes sin un arreglo definido, con

presencia de mitosis y con desplazamiento del parenquima (Fig. 21).

Se observaron estructura compatibles con Chlamydia sp en 1 de 19 (0.05) muestras

pulmonares (Fig. 22). En uno de 11 (0.09) tejidos cardiacos y en dos de 20 (0.1) tejidos

hepáticos se observo un infiltrado supurativo multifocal moderado. El infiltrado no

supurativo se observo en forma moderada en la mucosa y submucosa de tres muestras




42

intestinales de 18 (0.16), en 4 de 11 (0.36) tejidos cardiacos, sin asociación a una etiología

aparente (Fig. 23).

Fig. 3 Presencia de huevos de trematodos. Miositis parasitaria focal no supurativa ligera, necrosis focal, 20 x.

Fig.4 Huevo de trematodo. Corte longitudinal huevo de trematodo, cúmulo celular en la cavidad. Riñón 40x.

Fig.5 Huevo de trematodo (a) con prolongaciones filamentosas (b, c) una terminación en ventosa (b) y cúmulo celular en cavidad (d).

Fig. 6 Huevo de trematodo en corte transversal , extremos traslapados y el cúmulo celular en la cavidad, y extremos abiertos (a), Riñón 40x .

Fig. 7 Trematodo adulto en corazón, ligera respuesta inflamatoria 10x

Fig. 8 Trematodos adultos en peritoneo visceral, ligera respuesta inflamatoria, 4x.




43

Fig. 9 Eimeria sp en luz intestinal de tortuga, 100x.

Fig. 10 Estructuras compatibles con Criptosporidium sp en vellosidad intestinal, 100x.

Fig. 11 Melanosis hepática. Las células presentan reacción cromática, 100x.

Fig.12 Hemosiderosis hepática. Los macrófagos presentan hemosiderina fagocitada, 20x.

Fig.13 Esteatosis hepática. El citoplasma de los hepatocitos presentan vacuolas lipidicas, 40x.

Fig. 14 Lesión herpetica. Epidermis (e) con vacuolización celular (v) e infiltrado mononuclear en dermis (d), 10x.




44

Fig. 15 Cuerpos de inclusión intranucleares (flechas) en estrato basal de piel, reportado como FP 40x

Fig. 16 Degeneración muscular (miofibrilar). Perdida de las bandas o estrías musculares,40 X

Fig. 17 Enteritis bacteriana. Colonias bacterianas (flechas) presentes en el epitelio (e), infiltrado mononuclear (i), 10x.

Fig. 18 Enteritis parasitaria. Nemátodo en vellosidades (óvalos), 10x

Fig. 19 Hiperplasia de tejido linfoide. Foco de hiperplasia del tejido linfoide (tl), subepitelial (e) en intestino, 10x.

Fig.20 Hiperplasia de ductos biliares. Hiperplasia de células del ducto biliar ( flecha), 40x.




45

Fig.21 Fibroma renal. Las células fusiformes desplazan y sustituyen el tejido renal, 10x.

Fig. 22 Estructura compatible con Chlamydia sp. Estructura en tejido pulmonar,100x.

Fig.23 Infiltrado no supurativo. Infiltrado mononuclear

perivascular moderado focal, 20x.

7.2 Bacteriología

Se recuperaron 27 especies de 12 géneros de bacterianos gram negativos aeróbicos, en un

total de 58 aislamientos. Los sitios anatómicos de recuperación se describen en detalle en la

tabla. La bacteria con mayor aislamientos fue Escherichia coli (Fig. 24) con siete (12.06%),

siendo de estos 5 en boca, uno en cloaca y uno en bazo. Seguida de Salmonella spp




46

(Fig.25) con seis aislamientos (10.34%), tres de pulmón, dos de cloaca y uno de boca.

Shigella spp se aisló en cuatro ocasiones (6.89%). Serratia spp y Yersinia kinshasenii se

aislaron en tres ocasiones (5.17%). En nueve especies se obtuvieron dos aislamientos

(3.44%), Alcaligenes feacali, Aeromona hidrofila, Aeromona salmonicida , Enterobacter

spp, Moraxella spp, Serratia plymuthica, Yersinia sppia pestis, Yersinia Fredriksenni. En

11 especies se obtuvo un aislamiento (1.72%) de cada uno recupero Actinobacillus

salpingitidis, Aeromona spp, Enterobacter cloacae, Kleibsiella spp (Fig. 26), Kleibsiella

pneumonia, Pseudomona maltis, Pseudomona fluorescens, Serratia enterocolitica,

Yersinia enterocolitica, Yersinia kristensenii y Yersinia intermedia (Tabla No. 3). En dos

casos no se pudo establecer el genero, estas correspondieron a una bacteria de colonias

pequeñas, de forma circular de borde bien definido, color grisaceo, β hemolitica (4

aislamientos de boca) y a una bacteria de colonia mucoide, blanca, de bordes no definidos,

coalescente (1 aislamiento de boca). Esta ultima aparentemente con función de nodriza

(Fig.27).

La boca fue el órgano con mayor numero de especies aisladas (12 de los 25), de la cloaca se

recuperaron 10 especies, de riñón siete, de hígado cuatro, de pulmón tres y de bronquios y

grasa una.




47

Fig.24 Escherichia coli. Colonias de E. coli en agra sangre (izquierda) y agar Mac Conkey (derecha).

Fig.25 Salmonella sp. Colonia bacteriana de Salmonella sp en agar sangre.

Fig.26 Kleibsiella sp. Colonia bacteriana mucoide en agar Mac Conkey.

Fig. 27 Satelitismo bacteriano. Colonias nodrizas (grandes, mucoides) y colonias satélites (pequeñas, grisáceas).




48

Tabla No 3. Numero de aislamientos bacterianos recuperados de la tortuga prieta (Ch. mydas agassizii), de

Bahía Magdalena BCS, México.

ESPECIE BACTERIANA BOCA CLOACA OTROS ÓRGANOS TOTAL

Actinobacillus salpingitidis - 1 - 1

Alcaligenes feacalis 2 - - 2

Aeromona spp - - 1 riñón 1

Aeromona hidrofila - - 1 riñón, 1 hígado 2

Aeromona salmonicida - 1 1 hígado 2

Enterobacter spp - 1 1 riñón 2

Enterobacter cloacae - 1 - 1

Escherichia coli 5 1 1 bazo 7

Kleibsiella spp - - 1 riñón 1

Kleibsiella pneumoniae - - 1 riñón 1

Moraxella spp 1 - 1 pulmon 2

Pseudomona maltis 1 - - 1

Pseudomona fluorescens 1 - - 1

Salmonella spp 1 2 3 pulmón 6

Shigella spp 1 - 1 riñón, 2 pulmón 4

Serratia spp 2 1 3

Serratia plymuthica 2 2

Serratia enterocolitica 1 1

Yersinia spp 1 1 hígado 2

Yersinia kinshasenii 1 2 hígado 3

Yersinia pestis 1 1 pulmón 2

Yersinia enterocolitica 1 riñón 1

Yersinia Fredriksenni 2 2

Yersinia kristensenii 1 1

Yersinia intermedia 1 hígado 1

Sin clasificación 4 Hemolíticas, 1

Nodriza

Hemolíticas: 1 grasa. 6

TOTALES 25 11 22 58




49

7.3 SEROLOGÍA

Veinticinco de los sueros sometidos a las diferentes pruebas diagnosticas mostraron

anticuerpos contra ocho serotipos de Leptospira interrogans, tres mostraron anticuerpos

contra Rabia (Rabdovirus), dos contra Aujezky (Herpesvirus), y uno de estos contra

Influenza (Mixovirus). Todos los sueros fueron negativos a Rinits infecciosa bovina (IBR,

Herpes virus) y a Parainfluenza-3 (PI3, Paramixovirus).

7.4 PARASITOLOGÍA

El análisis histopatológico muestra estructuras compatibles con huevos de trematodos en

97.5% de los tejidos. Se obtuvieron hasta 75 ejemplares en un solo corazón, de trematodos

spirorchidos adultos (Caballero, 1955) pertenecientes a la especie Learedius learedi

(Inohuye et al., 2004). Las características anatómicas de la especie son pequeñas espinas en

toda la superficie corporal. La ventosa ventral se encuentra a la mitad del cuerpo es

pedunculada, circular con pequeñas espinas en la periferia. El cuerpo es elongado, plano, de

extremos redondeados, con una constricción en la zona de la ventosa ventral, ventosa

terminal en forma de copa. Ausencia de faringe y prefaringe, esófago largo ligeramente

sinuoso rodeado por células glandulares, bulbo esofágico presente en la unión del esófago y

ciegointestinal, el cual se bifurca anterior a la ventosa ventral, la curvatura del ciego

termina cercano al polo posterior. Presenta numerosos testículos de tamaño variable, de

bordes lisos, confluyendo o separados. La vesícula seminal externa es dilatada, localizada

del lado derecho entre los testículos y los ovarios. El cirrus esta bien desarrollado con una

pequeña vesícula seminal interna, y pars prostática y un largo ducto eyaculatorio. Poro

genital medial y ventral común entre el ovario y el reservorio vitelino. El ovario es grande y

con escasas lobulaciones, el oviducto emerge del lado derecho del ovario se une a la

apertura del receptáculo seminal ovoide dextrolateral del reservorio vitelino, se continua

posteriormente y crea el canal de Laurer con una papila en el poro dorsal. La glándula de

Mehlis se encuentra detrás del reservorio vitelino (Fig.28). El útero es pequeño y el huevo

fusiforme, con procesos polares (Fig 5).




50

Fig. 28 Learedius learedi. Parásito adulto obtenido de cámaras cardiacas de tortuga mariana (Ch. midas agassizii)




51

7.5 BIOTOXINAS

7.5.1 Biotoxinas hidrosolubles

En los ratones tratados con los extractos hidrosolubles de los hígados de los ejemplares

numero 5 (Caretta caretta) y 10, 12 y 15 (Ch. mydas agassizii). Se observaron signos

clínicos semejantes a los descritos para la presencia de toxinas tipo paralíticas. Sin

embargo, debido a que no ocurre la muerte de los ratones en los bioensayos, no pudo ser

cuantificado el nivel de toxinas (tabla No.3).

Tabla No. 4 Biotoxinas hidrosolubles en hígados de tortugas marinas de Bahía Magdalena, B. C. S., México

No. ratones Especie (ejemplar) Tratamiento Signos clínicos

3 Ch. mydas agassizzi (1) 1 ml (extracto) -----


3 Caretta caretta (3) 1 ml (extracto) -----


3 Caretta caretta (5) 1 ml (extracto) Temblor, disnea, saltos y diarrea





2 Ch. mydas agassizzi (10) 1 ml (extracto) Arqueamiento severo de la zona

lumbar, disnea, parálisis de los

cuartos traseros


2 Ch. mydas agassizzi (12) 1 ml (extracto) Disnea y paralisis cuartos

traseros



2 Ch. mydas agassizzi (15) 1 ml (extracto) Letargo y parálisis de los cuartos

traseros

2 Ch. mydas agassizzi (16) 1 ml (extracto) Letargo

4 Control 1 ml (0.1 N HCl) -----




52

7.5.2 Biotoxinas liposolubles.

En los ratones tratados con el extracto lipofilico del hígado del ejemplar No. 4 presentaron

signos clínicos semejantes a los descritos para DSP-toxinas, los extractos de los ejemplares

No. 7 y 11 causaron signos inespecificos de intoxicación. Los extractos en estudio tampoco

causaron la muerte de los ratones, por lo que no se pudo cuantificar la biotoxina (tabla 5).

Tabla No 5. Biotoxinas liposolubles en hígados de tortugas marinas de Bahía Magdalena, B. C. S., México

No. ratones Especie (ejemplar) Tratamiento Signos clínicos




3 Ch. mydas agassizzi (4) 1 ml (extracto) Decaimiento, diarrea y

parálisis de los cuartos

traseros.


2 Ch. mydas agassizzi (6) 0.5 ml (extracto) -----

2 Ch. mydas agassizzi (7) 0.5 ml (extracto) Temblor y saltos



2 Ch. mydas agassizzi (10) 0.5 ml (extracto)

2 Ch. mydas agassizzi (11) 0.5 ml (extracto) Temblor y saltos






4 Control 1 ml (Tween 60) -----

Amaury Cordero Tapia, Tesis de Doctorado Discusión



53

8.0 DISCUSIÓN

Este estudio describe por primera vez los cambios histológicos, parasitológicos e

inmunológicos en la tortuga prieta en BCS, México. No se tienen datos comparativos o de

referencia para este estudio. No existen reportes científicos previos ni de observación por

parte de los pescadores de Bahía Magdalena de neoplasias cutáneas o viscerales que

sugieran la presencia de FP en esta zona. El FP como se ha descrito ampliamente para la

tortuga verde, se caracteriza por iniciar en el tercer párpado, diseminándose a zona

periocular, cuello, hombros, boca, cloaca, caparazón y apéndices externos, con aspecto de

coliflor de diferente forma y tamaño, muestra un comportamiento metastásico de hasta el

30%, afectando hígado, riñón y bazo principalmente, estudios histopatológicos describen

cúmulos uniformes de proliferación celular fusiforme (fibroblastoide) de origen

mesenquimal, acantosis, hiperplasia del estrato espinoso y basal (10-15 capas celulares),

con presencia de hiperqueratosis ortoqueratótica en forma papilar, núcleos con cuerpos de

inclusión, células fusiformes en forma linear paralelas a la dermis y vacuolización

citoplasmática. En base a nuestros resultados, podemos demostrar la presencia de una o

varias de estas características en las tortugas prietas evaluadas tales como tumores

viscerales, lesiones megalocíticas, parasitosis, presencia de biotoxinas y presencia de

anticuerpos en contra de agentes virales asociados, no obstante nunca encontramos una

lesión patognomonica que pudiera confirmar la existencia de FP en la zona ni encontramos

mas de dos factores asociados a este juntos. Las lesiones neoplásicas epidérmicas

reportadas en la literatura como FP cutáneo, no se presentaron en los especimenes

muestreados. Nuestra observación de dos fibromas renales semejantes a lo reportado por L.

Herbst (1999) como lesiones metastásicas viscerales de FP, en nuestro estudio no tuvieron

relación con alguna lesión neoplásica en piel. Las lesiones histológicas observadas tales

como degeneración megalocítica, con vacuolización citoplasmática, con presencia de

cuerpos de inclusión, reportados como lesiones iniciales del FP. En ausencia de

presentación cutánea de FP, difícilmente podría confirmar la naturaleza metastásica de los

tumores observados.




54

De igual forma nuestra observación concuerda con lo estimado por Norton et al., (1990) y

Orós et al., (1998), con respecto a que todos tumores viscerales han sido identificados como

fibromas y/o mixofibromas. Sin embargo, en nuestro estudio los tumores viscerales no

tuvieron relación con las lesiones cutáneas de FP como lo reportan Herbst (1999) y

Aguirre, A. et al. (1998; 1999).

Los hallazgos histológicos en este trabajo de lesiones en piel de cloaca, evidencian la

presencia y daño de HV en las tortugas prietas de Bahía Magdalena BCS y confirman los

resultados serológicos de este mismo trabajo al demostrar la presencia de anticuerpos en

contra de un serotipo de HV que afecta a los cerdos. Lo anterior, se confirma con lo

reportado por Castelan (2004), quien replica material genómico de un serotipo de HV que

afecta a los bovinos, de muestras de tortugas prietas de la BCS. Esto es, el genero HV esta

presente en las tortugas prietas de la BCS, y se demuestra la presencia de serotipos que

mantienen una porcentaje alto de similitud mayor al 50% con el GTHP (Quackenbush et

al., 1998, 2001; Yu et al., 2001), reportado por diferentes autores (Aguirre et al., 1998;

Herbst et al., 1999; Landsberg et al., 1999; Work et al., 2001), como causal de GTFP.

Las lesiones megalociticas y la de cuerpos de inclusión observadas e el presente estudio son

asociadas en animales terrestres a una infección por HV, pero no a una presentación

neoplásica. En base a nuestros resultados consideramos que los tumores viscerales en las

tortugas marinas no son dependientes y/o provocados exclusivamente por tumores cutáneos

ni que estos tumores sean causados por una infección por HV. Las lesiones cutáneas

asociadas HV en diferentes especies marinas y terrestres, con presentacion de diferentes

cuadros clínicos (Blanchard et al., 2001; Brewer et al., 1996; Homer et al., 1998; Muro et

al., 1998; Pettan- Brewer, 1996; Richman et al., 2000), debe tomarse con precaución,

debido que es una entidad común en el medio terrestre y acuático, que mantiene un

potencial patogénico y virulento, pero es poco factible que un solo serotipo se manifieste en

un espécimen en diferentes rutas patofisiológicas (GPD, LETD, FP), aunque la posibilidad

se incrementa cuando se habla de diferentes individuos y poblaciones (Larski, 1988;

Purchase, 1989).

Otros hallazgos no reportados en la literatura de tortugas marinas y de interés en la salud de

las mismas son la hiperplasia de ductos biliares en hígado y del mesangio en riñón, lesiones




55

que se asocian a intoxicaciones subágudas o crónicas por diferentes compuestos químicos

(incluyendo los compuestos organoclorados). Las células peritoneales viscerales con borde

de cepillo, no son normales en este sito anatómico, aunque no presentaban cambios

asociados a malignidad se debe tomar como metaplasia, uno de los pasos para llegar a la

neoplasia (tumor).

Nuestro estudio revela la presencia de huevos de trematodos toda clase de tejido

muestreado con una prevalencia de 97.5% , cifra superior a lo reportado por Dailey et al.,

1993 (85%) y Aguirre et al.,1998 (94%), Sin embargo, sólo observamos una respuesta

inflamatoria severa en presencia de mas 200 de huevos por campo, en los otros tejidos la

respuesta fue ligera o nula independiente del numero de huevos, opuesto a lo mencionado

en diferentes estudios (Glazebrook et al., 1981, 1989; Gordon et al., 1998; Rand y Wiles,

1985). Lauckner (1985), describe que las infecciones en general son mixtas y que los

huevos migran por torrente sanguíneo, contrario a lo observado en nuestro trabajo en donde

se observo solo un género parasitario (Inohuye et al., 2004), si bien se encontraron huevos

dentro de los vasos sanguíneos, también observamos la migración a través del parénquima,

con movimiento independiente, punto que ayuda para el entendimiento del ciclo biológico

hasta ahora desconocido, confirmando la expulsión del huevo por medio de las heces como

se observa en la figura 29 (Cordero et al., 2004), no se encuentran pruebas para confirmar

como posible salida la orina (Smith, 1972; Dailey y Morris, 1995). En endocardio se

observaron parasitos adultos y un nódulo conteniendo un gran número de huevos,

demostrándose que no todos ellos son vertidos a torrente sanguíneo y que se mantiene una

migración tisular (Fig.30).En este trabajo se caracterizo el parásito adulto y los huevos de

este como Learedius learedi (Inohuye et al., 2004). Nuestro estudio, si bien revela una

extensa invasión a tejidos por huevos del parásito con la consecuente lesión tisular

(Cordero et al., 2004), los daños observados no se asocian a los descritos en el FP, por lo

que al igual que Aguirre et al (1998) no consideramos que la infección parasitaria sea un

agente causal de FP.

En este trabajo no se observo manifestación de FP. Sin embargo, dos de 20 sueros (10%)

presentaron anticuerpos contra un Herpes virus, genero asociado a FP (Aguirre y Spraker,

1996; Herbst et al., 1998.1999). El análisis, se llevo acabo con el serotipo de la enfermedad




56

de Aujezky como antígeno, el cual guarda una similitud con el GTHV de 53%

(Quackenbush et al., 1998, 2001; Yu et al., 2001). Este hallazgo, indica un contacto previo

con HV, debido a la reactividad cruzada entre diferentes serotipos de este genero

(Coberley, 2001; Castelan, 2004), indicando así la presencia de HV en tortugas marinas y

terrestres, con o sin manifestación neoplásica (Orrigi et al., 2001). Un suero con títulos a

HV también presento títulos en contra del virus de Influenza, genero causal de la gripe en

humanos y de graves enfermedades respiratorias en diferentes animales domésticos.

Un suero de los 20 (5%) fué positivo a Rabdovirus (Rabia), género que ha demostrado

efecto en las líneas celulares de tortugas marinas (Lu et al., 1999), en este trabajo el

serotipo de Rabdovirus usado fue el causal de rabia, amen de la antigenicidad cruzada por

el genero se debe tomar en cuenta la posibilidad de la transmisión o papel refractario de los

reptiles hacia la rabia. Estos resultados demuestran que las tortugas están expuestas y se

infectan con diferentes etiologías virales, que pueden ser patógenas o potencialmente

patógenas a ellas y a otras especies animales, actuando como vectores en sus viajes

migratorios.

Los resultados bacteriológicos de este trabajo son diferentes a los encontrados en las

tortugas marinas de Hawai por Aguirre et al., (1994b) y sólo concuerda con dos géneros

encontrados en tortugas en cautiverio con presencia de lesiones cutáneas en Australia y

Bermudas (Glazerbrook y Campbell, 1990; Wiles y Rand, 1987; Radial et al.,1998). La

diferencia encontrada en este trabajo, puede asociarse a la zona geográfica de los estudios.

Los géneros aislados pueden actuar como agentes oportunistas o como patógenos

primarios, tanto en especies animales marinas o terrestres, por contacto directo o indirecto.

En cualquier caso, los géneros bacterianos aislados pueden afectar a las tortugas marinas o

ser transmitidas tanto a especies marinas como terrestres, incluyendo al humano por medio

de ingesta de cualquier producto de la tortuga marina (carne, huevos). El género bacteriano

de Shigella sp, no se había reportado en tortugas marinas (Herbst y Jacobson, 1995). El

genero Moraxella sp, aislado en este trabajo, se reporta como productora de biotoxinas

PSP, cuando se ha aislado de organismos marinos (Kodama et al., 1990). Todas las

enterobacterias son potencialmente zoonóticas.




57

En el presente trabajo se observaron daños histológicos asociados a intoxicaciones, sin

embargo estos cambios no pueden definir el tipo de sustancia contaminante. Aguirre et al.

(1994), encuentran una correlación negativa entre la presencia de agentes contaminantes

(organoclorados, bifeniles policlorinados, organofosforados, carbamato) y la fase clínica de

FP cutáneo. En diferentes zonas costeras de la Península de Baja California, se reporta la

presencia de metales pesados (Shumilin et al., 2000; 2001; Méndez, 1998; Kot et al., 1999).

En este trabajo no se encuentran daños asociados a PCB’s, pero no puede asegurar su

ausencia o presencia de estos en las tortugas marinas. Sin embargo, Gardner et al. (2003)

reportan la presencia de PCB’s en tejidos de Ch. mydas agassizii, mientras Juárez (2004)

reporta la ausencia de estos en la misma especie y en la misma zona de muestreo este

estudio.

Nuestros resultados aportan la presencia de Biotoxinas en hígados de las tortugas marinas

muestreadas, factor reportado como inmunodepresor y carcinogénico. Así como, causal de

síndromes tóxicos de consideración en la salud publica no se tiene definido (Landsberg,

1995; Noga, 1998; Turner, 1997).

Se han encontrado en las tortugas prietas (Ch. mydas agassizii) de Bahía Magdalena BCS,

México, todos lo agentes reportados como posibles causas de la FP, inclusive lesiones

asociadas a esta, pero no se observo ninguna manifestación o lesión cutánea característica

de esta. Por lo tanto, consideramos que el FP es provocado por una gente especifico o la

coexistencia de varios factores predisponentes presentes en las zonas donde se manifiesta

clínicamente, así como factores genéticos asociados con la susceptibilidad y/o resistencia a

padecer FP que difieren en las diferente especies de tortugas marinas, entre ellas la Ch.

mydas mydas y Ch. mydas agassizii.




58

Fig.

29

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).




59

Fig. 30 Estadios parasitarios en cámaras cardiacas. Se aprecian parasitos adultos (flechas) y huevos en tejido miocardico (puntas de flecha).

Amaury Cordero Tapia, Tesis de Doctorado Conclusiones



60

9.0 CONCLUSIONES

Las tortugas marinas son vectores y portadoras de agentes etiológicos infecciosos y toxicos

que afectan a otras especies animales, tanto marinas como terrestres, incluyendo al humano.

En base a la población de tortuga prieta evaluada, podemos considerar que la fase clínica de

la FP cutánea, no esta presente en Bahía Magdalena, BCS, México. Sin embargo, el genero

Herpes virus y todos los factores no virales (bacterias, parásitos, contaminantes,

biotoxinas) reportados como posibles agentes causales de la FP están presentes.

La manifestación clínica de la FP, podría ser resultado de un complejo de factores

predisponentes genéticos y ambientales: especie, edad, sexo, estado nutricional, presencia

de agentes infecciosos y no infecciosos asociados con inmunosupresion, carcinogenesis y

desarrollo del FP. Alternativamente, y dado que el agente causal del FP no se ha

identificado plenamente, podríamos considerar que el verdadero agente de la

fibropapilomatosis no se encuentra presente en Bahía Magdalena, BCS, México.

Adicionalmente, podemos considerar que la definición de fibropapiloma en diferentes

publicaciones no concuerda con una sola entidad clínica. Así, los tumores viscerales

reportados en la literatura no son necesariamente metástasis de FP cutáneo y podrían tener

un origen distinto y ser provocados por diferentes etiologías; los huevos de trematodos

podrían no ser agente etiológico para FP, pero si una patología común de alta prevalencia e

incidencia en tortugas marinas, como lo demuestra la elevada prevalencia de infección por

trematodos (97.5%) y en particular de Learedius learedi (> 90%) en la tortuga marina Ch.

mydas agassizii de Bahía Magdalena, BCS, México, de la misma forma puede interpretarse

las biotoxinas, reportadas como carcinógenos, presentes en estas mismas en ausencia de FP

clínica.

Nuestros resultados demuestran daños reportados como FP dermica y metastasica, sin

observarse ninguna presentación clínica, por ello, concluimos que es una necesidad urgente

determinar la patología del FP. Esto es, identificar el verdadero agente causal y su vía de

Amaury Cordero Tapia, Tesis de Doctorado Conclusiones



61

infección, describir la patogenia para con ello conocer los factores extrínsecos e intrínsecos

asociados a esta y las características de cronicidad, severidad e intensidad de los cambios

anatomofisiologicos tanto celular como sistémico en el transcurso de la enfermedad, así

como su resolución. Solo de esta forma se evitara divagar entre las posibles etiologías, los

posibles daños macroscópicos y microscópicos, cambios clínicos y subclínicos. Con ello

elaborar un verdadero diagnostico de FP.

Amaury Cordero Tapia, Tesis de Doctorado Literatura citada

EVALUACIÓN HISTOPATOLÓGICA DE LAS ETIOLOGÍAS COMUNES Y ASOCIADAS A FIBROPAPILOMA EN LA TORTUGA PRIETA (Chelonia mydas agassizii), DE BAHÍA MAGDALENA, BAJA CALIFORNIA SUR, MÉXICO CIBNOR SC. La Paz Baja California Sur, México. Enero 2005

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