aloe barbadensis
DESCRIPTION
EXTRACTO INYECTABLE DE ALOE BARBADENSIS ANTIVIRAL E INMUNOACTIVADOR. PROCEDIMIENTO DE OBTENCIONTRANSCRIPT
(19) REPUBLICA DE CUBA
Oficina Cubana de la Propiedad Industrial
(11) No de publicación:
CU 22397 A1
(21) No. de solicitud : 236/89
(51) Int. Cl: A61K 35/78
(12) Certificado de Autor de Invención
(22) Fecha de presentación: 1989.12.04
(30) Prioridad:
(45) Fecha de publicación: 1996.01.31
(71) Solicitantes: INSTITUTO SUPERIOR DEMEDICINA MILITAR ; (CU)
(72) Inventor/es: Villa Espinosa, Aleida (CU) ; AbelaCañizarez, Isabelina Ramona (CU) ; González-QuevedoRodríguez, Mario Oswaldo (CU) ; Larionova, María ; (SU)
(73) Titular: INSTITUTO SUPERIOR DE MEDICINAMILITAR ,domiciliado en Ave. Monumental y Carretera delAsilo, Hab. del Este, CH; (CU)
(74) Agente: González-Quevedo Rodríguez, MarioOswaldo; (CU)
(54) Título: EXTRACTO INYECTABLE DE ALOE BARBADENSIS ANTIVIRAL EINMUNOACTIVADOR.PROCEDIMIENTO DE OBTENCION
(57) Resumen: La presente invención está relacionada con la medicina. Se ha obtenido un extracto inyectable con propiedadesantivirales de amplio expectro: virucida, virustático inmunoactivador, contra virus DNA y RNA en concentraciones de 0,6-30mg/día a partir de hojas frescas y completas de plantas de zona tropical donde el suelo, la edad de la planta, época de recolecta ycaracterísticas de las hojas, han sido predeterminadas. Las hojas bioestimuladas son utilizadas en la obtención del extracto mediantetres reflujos acuosos y cloruro de sodio hasta obtener índices de oxidación de 1400-1800 mg 02/1 densidad óptica 0,09-0,3 4 pH 5-7,libre de lectinas y estéril, es estable más de 3 años protegido de la luz. Es inocuo para el organismo y contentivo de polisacáridosneutros totales manano mayoritario 0,05-0,15% aloe-emodina 0,1-0,5 mg% y aloina 0,6-1,6 mg %; ácido orgánico málicomayoritario 0,01-0,05 %. El tratamiento antiviral y para inmunoactivación con la formulación de la invención es sistémica, eficazpara la activación de macrófago y linfocitos T a partir de 7-14 días post inyección, así como un fuerte virucida y magníficovirustático contra hepatitis A, enfermedad de Aujesky Herpes mamilitis, renotraqueitis infecciosa bovina, encefalomiocarditis yotras en concentraciones de 0,6-30 mg/día.
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MEMORIA DESCRIPTIVA
EXTRACTO INYECTABLE DE Aloe barbadensis ANTIVIRAL EINMUNOACTIVADOR. PROCEDIMIENTO DE OBTENCION
La presente invención está relacionada con la medicina y específicamente dirigida a larealización sencilla de la terapia y/o profilaxis de afecciones virales que deterioran la saludhumana y animal. La terapéutica ha sido optimizada con un extracto inyectable no tóxicode amplio espectro de la planta medicinal Aloe barbadensis Miller.
Los métodos efectivos de tratamiento y prevención de infecciones virales son útiles y muyestimados, ya que los virus son causa frecuente de daños en la salud por períodosprolongados y aún dan en ocasiones al traste con la vida de personas y animales.
Los fármacos antivirales están clasificados en dos grandes grupos.
Grupo 1. Drogas o sustancias antivirales propiamente dichas.
Grupo 2. Drogas o sustancias inmunomoduladoras con acción antiviral.
Entre los primeros se destacan los siguientes:
Grupo 1.1 Sustancias virucidas: Actúan directamente sobre los viriones destruyéndolos,neutralizándolos, inactivándolos, etc., generalmente sobre viriones completos o el genomaviral, cuando estos se encuentran fuera de la célula del hospedero.
Grupo 1.2 Sustancias virustáticas: Actúan sobre algunas de las fases del proceso replicativoviral, disminuyendo la infección productiva y permitiendo el hospedero pasar por unaenfermedad específica con síntomas mínimos o leves.
Grupo 2. Este grupo de sustancias es utilizada para explotar fructíferamente los distintosmecanismos que se encuentran en la resistencia natural del hospedero hacia las infeccionesvirales y en la recuperación de ellas; es decir mejoran aquellos mecanismos inespecíficos oespecíficos que bajo circunstancias naturales producen al final la recuperación delhospedero después de una enfermedad más o menos grave o prolongada.
En la etapa actual, ni las vacunas, ni los compuestos antivirales presentan eficacia deamplio espectro: en el primer caso, deviene de los diversos y complejos mecanismos dereplicación viral y al hecho de no encontrarse inhibidores que puedan ser al mismo tiempo,sumamente activos sobre muchos procesos virales y no tóxicos para las células delhospedero, cuando se administran dosis antivirales efectivas. El Interferón es un ejemplode sustancia antiviral de amplio espectro, su origen es de células animales y su obtención yproducción es muy costosa.
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La presente propuesta de invención abarca todas las propiedades antivirales citadasanteriormente, sin embargo no existen medicamentos de origen vegetal en formulacióninyectable que logre contener las propiedades descritas.
Algunos principios activos de plantas de conocida actividad antiviral pero sin formulacionesson Phenge Heptatrine (PHT) y el L Tertienyl (LT) ambos de las hojas de la Bidens pilosa;el Thiophane A, Z-(4 Acetoxy-3-cloro-1 butyl 1), L-thiophene, ACBP thiophene de laTajetes patula.
En 1970 los hindúes Khurona y Bhargor reportaron (woo25 Naprarlert) J.Gen.Appl.Microbiol 16:225-230 el hallazgo de un efecto antiviral in vitro de las hojas secasde Aloe vera en solución alcohólica 95% sobre los virus Mild Mosaic, Distartion Rignspoty Ringspot de la Papaya.
Estos resultados difieren sustancialmente a los de la presente invención porque Khuroma yBhargor presentaron una formulación alcohólica con hojas secas de Aloe vera para eltratamiento de infecciones de virus vegetales.
El norteamericano Robert Sydinskis en 1987 registró patente 4,670-265 un método detratamiento para los herpes simples 1 y 2 de la piel con la aplicación tópica de extractos devarias plantas que contienen antraquinonas y Aloe emodina componentes que fueronextraídos con metanol, etanol, etilacetato, acetona o glicerina o utilizados en bruto (hojas,gel, savia de Aloe vera) en todas las porciones pudo demostrar el efecto virucida a estos dosvirus DNA in vitro con los procedimientos de unidades formadoras de placas virales yensayos clínicos en humanos enfermos de Herpes Labial recurrente, el autor demostró queel efecto virucida de ese principio activo es directamente proporcional al tiempo ytemperatura de incubación, así como concentración de la muestra. Pudo descubrir ademásque la ventaja principal con otras drogas antivirales tópicas es su no toxicidad en sus nivelesantivirales aunque no alcanzó conocer si el citado compuesto tiene efecto sobre el cicloreplicativo intracelular del herpes simple u otros virus por Ej.: los virus RNA, o si eraefectivo en aplicación sistemática o si activa el sistema inmune para la protección antiviral.
La formulación de la presente solicitud es para uso sistemático efectivo contra virus DNA yRNA por lo que es de amplio espectro.
Otro descubrimiento importante lo constituye el registrado por el norteamericano McAnalley Bill H en el tratado de cooperación de patentes PCT E.U. 86/01335, WO 87/00052él descubrió el Carrysin, polisacárido que confiere actividad biológica al gel de Aloe veray que purificó por ultrafiltración y caracterizó mediante el procedimiento de cromatografíalíquida de alta resolución, resonancia magnética entre otros. Este principio activo lo utilizóen ensayos clínicos con buenos resultados lo que le sugirió que la citada sustancia podíaestar involucrada entre los antivirales pero no lo comprobó científicamente, además de nohacer formulación y utilizar un principio activo solamente en el ensayo.
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El extracto inyectable de la presente invención le fue probada científicamente tras ensayosin vitro, in vivo y clínicos sus propiedades virucidas, virustáticas y de inmunoactivación, enla formulación se combina la acción de antraquinonas, polisacárido neutro tipo manano,aminoácidos, ácidos orgánicos y minerales, esta solicitud posibilita con su formulación lano utilización de la planta Aloe barbadensis en forma bruta basado en conocimientosempíricos tal como sucede en dolencias de hepatitis, viruela aviar, etc.
Muchas investigaciones se han realizado en el mundo sobre las propiedades beneficiosas oen combinaciones; el contenido en principio activo y procedimiento de obtención ypurificación, en este sentido cabe destacar las invenciones norteamericanas registradas enlas patentes de E.U. 3,360,510 (1967); 3,360,511 (1967); 3,360,951 (1968); 3,920,816(1975); 3,892,853 (1975); 4,708,873 (1985); 4,555,987 (1985); 4,725,578 (1985) y lasjaponeses 55,4086 (1980); 4,598,069 (1985); 625128 (1987); 625129 (1987), 6272624(1987). Ninguna de las patentes de métodos terapéuticos con Aloe citados están referidas ala actividad antiviral e inmunomoduladora, en algunos casos como las patentes 625128 y625129 japonesas el destino farmacéutico del producto obtenido es el resultado de la granactividad lectina del Aloe empleado, otras la utilizan como laxante por su contenido desavia amarilla y le preservan como en los registros de patentes 3,360,510; 3,360,511;3,360,951 o utilizan Aloes que tienen en la hoja componentes citotóxicos patentes3892,853. Además de todo esto existen estudios que indican que la savia de los Aloes estóxica para la piel humana. Juan E. Danhof et al (Estabilized Aloe vera: effect on humanskin cells. Drug and cosmetic end 52-54 p. 105-106, 1983).
Los contenidos de savia y lectinas del Aloe le confieren toxicidad y se encuentraníntimamente relacionados con su ambiente de cultivo, lugar de crecimiento, variedad, épocadel año; las bondades terapéuticas de esta planta son superiores en aquellos climas que leproporcionan una vida más fisiológica.
La variedad de Aloe utilizada en la formulación de esta invención crece en condicionesfisiológicas, en clima tropical, dicha formulación no contiene actividad lectinas por lo quese le ha eliminado la toxicidad y es permisivo de administración inyectable.
Muchos son los países que necesitan invernaderos para el cultivo de los Aloes, elrendimiento y la composición química varía con las condiciones climáticas por lo que aveces es poco económica su explotación. La especie aborescens importada de losinvernaderos de la URSS a Cuba no progresa en clima tropical. En la URSS elaboran elproducto "Extracto de Aloe", en Polonia la denominada Bioestimina, ambas a partir de laespecie arborescens para las especificaciones terapéuticas: cicatrización, anti-inflamatorios,enfermedades oftálmicas, úlceras del estómago, asma bronquial (Sidorenko, N. 1953 Aloeplanta medicinal URSS. Kiev. Aloe Extract. Datos clínicos (1951-1957) V.O.Sojuzchimexport, URSS, Moscú, Kibalchich, P. 1957. Aloe arborescens. MEDGIZ.Moscú. Stepanova O. 1977 Fisiologicheski activnie veshestva 3:290-301.
Las especies arborescens y barbadensis poseen diferencias cuantitativas y cualitativas en sucomposición química.
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El Aloe arborescens cultivado en invernaderos en la URSS posee aloina, ácido crisofánico,Aloe emodina aloinosidos A y B (Abdurjmanova, G, 1978 Farmatsia 2:40-42) pero no sereportan aloinosidos en el Aloe arborescens de Africa (Mc Carthy T.J. 1968. Planta Médica3:348-356).
En el extracto inyectable de Aloe barbadensis antiviral e inmunoactivador de la presenteinvención el contenido de antraquinonas libres (agliconas) se calcularon como Aloe emodinay los glicosidos antraquinonas como aloina. Para cuantificar las antraquinonas presentes enel extracto activo se utilizó el método colorimétrico de Auterhoff y Ball modificado.
La composición es cualitativa de este grupo de componentes químicos se realizó mediantecromatografía en capa fina de sílica gel 625 (cloroformo: metanol, agua (30:15:1), 5%KOM en metanol, UV 254 nm) utilizando como patrones de referencia aloina y Aloeemodina. El extracto activo se concentró previamente al vacío y el residuo disuelto enmetanol fue aplicado en la placa.
Entre los compuestos activos característicos para la especie del género Aloe se encuentranlos polisacáridos, inclusive hasta para la misma especie pueden presentarse variaciones endependencia de la época del año y las condiciones climáticas; así del Aloe vera de la zonasur de la India se aislaron cuatro gluco-mananos parcialmente acetilados con trazas de ácidogalacturónico, galactosa, xilosa, arabinosa (Govoda, D.C. 1979 Carbahydrate Research72:201-205).
La mezcla de polisacáridos a partir del Aloe barbadensis cultivado en Belgol del Este teníacomo principal componente el ácido péptico compuesto prácticamente por ácidogalacturónico y cantidades menores de galactano, arabinano y glucomanano (Mandal G,1980 Carbohydrate Research 86:247-257, 87:201-257). El Aloe barbadensis cultivado enTexas (valle del Río Grande) contiene polisacáridos tipo manano acetilado (Mc Analley1986 US Patent 86/01 335).
Entre los cultivos de Aloe arborescens se ha detectado también esta gran versatilidad.
Los polisacáridos del gel de Aloe arborescens cultivado en Georgia, URSS contienensustancias pécticas con 55% de ácido galacturónico y la presencia de glucosa galactosa,manosa, xilosa, arabinosa (Ovodova, R.C. 1975, Khimija Prirodnykh soedinerei 11:3-5).
De la misma especie cultivada en Japón fue aislado e identificado el polisacárido B-Dmanano parcialmente acetilado (Yugi A. 1977. Planta Med 31:17-20). A partir del crudode polisacáridos obtenidos de esta especie cultivada en Polonia en invernadero para laproducción de bioestimina, fueron determinadas galactosa, glucosa, arabinosa y manosa(Kodym, A 1979 Herba Polonica 3: 193-199).
El extracto inyectable de Aloe barbadensis antiviral e inmunoactivador de la presentesolicitud de invención está compuesto por los polisacáridos neutros manano mayoritario y
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galactosa, glucosa, rkamnosa y xilosa en cantidades menores. Los polisacáridos delextracto total de Aloe barbadensis contiene 43% de polisacáridos neutros y 1,6% depolisacáridos ácidos. Son estudios químicos de crudo de polisacáridos se realizaronutilizando las técnicas de fraccionamiento con Cetablon (Bromuro de cetil-trimetil amonio),hidrólisis ácida y respectivamente cromatografía de los monosacáridos en papel Wahtman#1 (N-butanol: piridina, agua (6:4:3), revelador ftalato de anilina.
Otro grupo de compuestos importantes presentes en el género Aloe son los ácidosorgánicos. Se destaca la función de los ácidos carboxílicos como estimulantes de losprocesos biológicos y la influencia positiva de los grupos carboxílicos (Stepanova, O. 1977.Fisiologecheski activnie veshestva 9:94-7). El contenido de ácidos orgánicos varía con laépoca del año y tiene fluctuación diurna según la especie y ambiente de cultivo. En lostejidos externos es aproximadamente 10 veces mayor a su contenido en el gel. Las hojas deAloe barbadensis están compuestas aproximadamente de 73% del gel y 27% de tejidosexternos, mientras que la de Aloe arborescens es de 48% y 52% respectivamente.
Los ácidos orgánicos detectados en las hojas de Aloe arborescens son ácidos succínico,cítrico, málico y trazas de ácido tartárico y los ácidos cinámicos y oxicinámico (en formade cumarinas). En el extracto inyectable de Aloe utilizado en el tratamiento antiviral y deinmunoactivación de la presente invención se detecta presencia de ácido málico comomayoritario, cítrico y tartárico. Para el estudio cromatográfico de los ácidos orgánicos seutilizaron las placas preelaboradas de celulosa Merek, fase móvil: Isobutanol - Acidofórmico 5 N (2:3) revelador solución de bromocresol y bromofenol, como patrones dereferencia se aplicaron ácido málico, cítrico, tartárico. Para estimar el contenido de losácidos totales libres utilizamos el método de Bennet-Claret (Mc Carthy, T.J. 1966. PlantaMedica 2:200-203).
Los minerales forman sales o complejos y se encuentran unidos a los compuestos orgánicosen las plantas de Aloes, la composición mineral dependen mucho del lugar donde crece laplanta, el suelo, el tiempo de recolección, las condiciones climáticas, por eso su contenidoen sales y la composición elemental de las hojas de Aloe y sus extractos difieren unos deotros (Kozak, C.A. 1977, Fisiologecheski-activnie Veshestva, 9:302-307). El Aloearborescens hojas secas poseen silicio 0,3%, magnesio 5%, calcio 5%, hierro 0,1%,manganeso 0,06%, fósforo 0,1%, cobre 0,0001%. Las hojas secas de Aloe barbadensishan encontrado 2,86% calcio, 1,21% magnesio, 1,56% potasio, 2,66% de cloro. (Joshi,A.J. 1978 Sakyu Kenkyu 24 (2) 49-54).
La composición mineral cuantitativa y cualitativa de micro y macro elementos del extractoinyectable de Aloe barbadensis empleado en el tratamiento antiviral y de inmunoactivaciónen esta invención presenta como elementos mayoritarios calcio y magnesio y el hierro,aluminio, manganeso y cobre en cantidades menores, para la determinación se empleó elmétodo semi-cuantitativo en absorción atómica.
La composición cuantitativa y cualitativa de aminoácidos también es variable, en el extractoinyectable de Aloe barbadensis de la presente invención están ausentes la tirosina y la
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ornitina, posee a diferencia con el extracto de arborescens de la URSS y la biostimina dePolonia; prolina y valina compartiendo similitud al ser contentivos de fenilafoserina, ácidoaspártico, todos detectados en analizador de aminoácidos LKB 1450 sistema litio.
Extracto inyectable de Aloe barbadensis con actividad antiviral e inmunoactivador las hojasfrescas y completas de la planta de zona tropical donde el suelo, edad de la planta, época derecolecta, características de las hojas han sido predeterminadas, se bioestimulansometiéndola a condiciones adversas durante 9-20 días de la elaboración del extracto en tresreflujos acuosos y salinos hasta obtener índice de oxidación de 1400-1800 mg O/l densidadóptica de 0,09-0,3 y pH 3-7, estable por más de 3 años protegido de la luz con notableeficiencia antiviral de amplio espectro contra virus DNA y RNA como virucida yvirustático y de inmunoactivación.
La invención será de más fácil comprensión al considerarse el siguiente ejemplo deejecución.
Por ejemplo:
Después de la recolecta, las hojas seleccionadas se lavan con agua y se transportan atemperatura de 4-10º C donde se mantienen durante 9-20 días, después de labioestimulación 200-500 g de las hojas son molidas y llevadas a 3 extracciones sucesivasrealizadas con 1,5:1:0,5 volúmenes respectivamente de agua destilada. La primeraextracción se realiza 4-10º C durante 0,5-2 horas luego el extracto se somete a ebullicióndurante 1-5 min. La segunda extracción se realiza a temperatura de ebullición de 1-5minutos y la tercera a temperatura ambiente durante 10-30 min.
Los tres extractos se unen y se mide el volumen total y se calcula el índice de oxidación(oxidometría:permanganatometría), adicionar entonces cloruro de sodio para unaconcentración de 0,5 M según volumen final.
El extracto se somete a ebullición durante 3-10 min se clarifica por filtración (membrana deacetato o nitrato de celulosa o asbesto 0,7 U) y ajustar el volumen con agua destilada segúnoxidación, ajustar pH 5-7 envasar en ámpulas por 1 ml esterilizar en autoclave 30 min 121ºC - 1 atms.
Los resultados de los estudios realizados fueron los siguientes:
Dosis máxima tolerada evaluada por el método de formación de colonias con células demieloma P3 X63 Ag8 en fase de crecimiento exponencial se cultivaron en una capa dealimentación de esplenocitos de ratón Balb/c. Se incluyeron concentraciones del extractoliofizado entre 300 pig a 30 mg sin encontrar el punto final por la no toxicidad.
Tres subcultivaciones seriadas sobre monocapas de fibroblasto de ratón con intervalos de 5días se realizaron con el extracto al 10% en el medio de cultivo completo sin que lasmismas mostraron daño citopáticos, vacualización, degeneración temprana,
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desprendimiento celular. El anclaje de las células, la velocidad de multiplicación y tiempode completamiento de las monocapas se vieron muy favorecidas. La morfología ymorbilidad de células cultivas in vitro a diferentes tiempos con varias concentraciones delextracto de forma repetida sin cambio del medio de cultivo y valoradas con los métodosMAY GRUNWALD Giensa, Van Giesson y técnicas de exclusión de tripan azul al 0,4%en NaCl, reveló que la morfología celular no sufre modificaciones, la viabilidad de lascélulas se incrementa con el número de repeticiones de la dosificación del extracto por día.
La dosis letal media (DL50 ratón) y la toxicidad subaguda se calcularon en ratones albinosde 25+ 2 g de peso. Los animales se sacrificaron a los 30 días y la mayoría de lasobservaciones histológicas en los cortes de órganos (cerebro, pulmón, hígado, bazo, riñón,corazón y médula ósea) estudiados fueron lesiones relacionadas con los cambios orgánicosque aparecen en la eutanasia. El extracto inyectable a Aloe barbadensis no produjo lesionesen los órganos vitales ni tampoco en médula ósea. La DL50 ratón es de 3,6 mg delextracto por gramo de peso.
La actividad lectina del extracto incluyó evaluaciones de la actividad blastogénica sobrelinfocitos humanos cultivados in vitro con PHA y extracto de Aloe barbadensis con métodoscualitativos de Giensa y cuantitativo con la adición de timidina tritiada de actividadespecífica 23 Ci/mM, el rango de concentraciones del extracto fue de 0,6 - 30 mg Ug/ml decultivo. Además incluyeron las pruebas de hemoglutinación con eritrocitos humanos endilución hasta 1:1024. Los linfocitos cultivados que recibieron extracto de Aloebarbadensis no manifestaron transformación blástica correspondiéndose con los controlescultivados sin nitrógeno. Todas las concentraciones de Extracto de Aloe barbadensis bajoprueba se mantuvieron con niveles de incorporación de 3H Timidina inferior a 2 veces loscpm de los controles con suero fetal bovino, lo que demostró la no inducción detransformación blastogénica.
La hemoglutinación fue negativa en todas las diluciones y ninguna dilución de sueroreaccionó positiva en la inmunodifusión con el extracto de Aloe barbadensis.
La actividad virucida del Extracto Aloe barbadensis in vitro se detectó con la prueba deunidades reductores de placas y virus neutralización entre las concentraciones variablesdesde 0,3-30 mg con 1000 DL50CT y 100 URP de las cepas modelos herpes bovino tipo 1y 2 y encefalomiocarditis viral (BHV-1), (BHV-2) (VEMC), empleando sistema de cultivocelulares sensibles a la replicación de estos virus. Las concentraciones, a partir de loscuales se observó una reducción del 50% o más del número de placas virales en relación alcontrol de virus replicados en células sin Aloe, fueron consideradas positivas de acciónantiviral. Las diluciones donde el efecto citopático viral (ecp) apareció en el 50% delsistema bajo prueba, fueron indicativos de actividad antiviral. Las mejores dosificacionesantivirales se definieron por aquellas concentraciones que redujeron las placas virales einhibieron el ECP viral en 50% o más.
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TABLA 1.- ACTIVIDAD VIRUCIDA DEL EXTRACTO INYECTABLE DE Aloebarbadensis FRENTE A 100 DI50 CT O 100 UFP DEL VEMC EN LA LINEACELULAR BB82.
Tiempos de incubación en min.
15 30 60Aloe
barbadensis(MG) VNT URP VNT URP VNT URP
0,3 0 NR 0 NR 0 NR"
0,6 50 25 25 39 25 30
1,2 25 58 25 67 50 60
2,4 100 90 100 95 100 90
4,8 100 89 100 91 100 91
6,0 100 93 100 95 100 100
% de protección% de reducción de placas viralesnº reducción del nº de placas
TABLA 2.- ACTIVIDAD VIRUCIDA DEL EXTRACTO ACUOSO INYECTABLE DELAloe barbadensis FRENTE A 100 DI50 CT O 100 UFP DEL BHV-2 EN CELULASCULTIVADAS in vitro.
Tiempos de incubación en min.
15 30 60Aloebarbadensis(MG) VNT URP VNT URP VNT URP
0,3 0 NR 0 NR 0 NR"
0,6 0 NR 25 30 25 30
1,2 50 53 50 53 75 79
2,4 25 58 75 77 75 83
4,8 100 91 100 91 100 95
6,0 100 95 100 92 100 95
% de protección
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% de reducción de placas viralesNº reducción del Nº de placas
TABLA 3.- ACTIVIDAD VIRUCIDA DEL EXTRACTO INYECTABLE DEL Aloe barbadensis FRENTE A 100 DI50 CT O 100 UFP DEL BHV-1 CELULASCULTIVABLES in vitro.
Tiempos de incubación en min.
15 30 60Aloebarbadensis(MG) VNT URP VNT URP VNT URP
0,3 0 NR 0 NR 0 NR"
0,6 50 63 50 72 75 93
1,2 100 95 100 100 100 100
2,4 50 91 75 97 50 91
4,8 25 46 50 52 50 83
6,0 25 36 50 56 50 87
% de protección % de reducción de placas viralesNº reducción del Nº de placas
La actividad virucida in vitro encontrada en el Extracto de Aloe barbadensis fuecomprobada in vitro con 100 y 1000 DL50 de la cepa VEMC en ratones albinos de 10 +2g de peso encontrándose la efectividad virucida a partir de la concentración 1,2 mg.
La determinación de la actividad virustática incluyó la infección viral en los sistemasbiológicos 1-3 horas antes del tratamiento con el Extracto de Aloe barbadensis enconcentraciones variables. La protección más efectiva frente a las cepas virales DNA yRNA incluidas en los ensayos in vitro se reveló a partir de 6 mg/ml en aplicación única alcultivo celular infectado. La validación de estos resultados en ensayos preclínicos enratones con 100 DI50 ton confirmó la dosificación de 6 mg/durante 3 días como mínimapara proteger a los ratones de la infección con el virus EMC quizás el más letal que afecta aesta especie
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TABLA 4.- VIRUSTATICA DEL EXTRACTO INYECTABLE DE Aloe barbadensisSOBRE DIFERENTES VIRUS DESPUES DE 1 HORA DE ABSORCION.
Virus de ensayo
BHV-1 BHV-2 EMCAloebarbadensis(mg) VNT URP VNT URP VNT URP
0,3 0 NR 0 NR 0 NR
0,6 0 NR 0 NR 0 NR
1,2 0 NR 0 NR 0 NR
2,4 0 NR 0 NR 0 NR
4,8 0 52 25 56 25 50
6,0 50 56 75 62 50 58
% de protección% de reducción de placas viralesNº reducción del Nº de placas
- Para verificar el estado de portador en los ratones que sobrevivieron al desafío viraldespués de 14 días de infección (Actividad virucida y virustática) se les hizo convivir conotros ratones susceptibles no infectados por más de 30 días. La sobrevivencia de losnuevos susceptibles fue de 100% (Virucida) y de 75% (Virustático), lo que indica unaeliminación mínima de virus, cuando se inyecta durante la infección.
- Para el efecto protector preventivo del Extracto inyectable de Aloe barbadensis ainfecciones por virus en sistemas de cultivos celulares en tratamientos con este a diferentesconcentraciones y diferentes intervalos de tiempo demostró que las células que recibentratamiento durante 96-120 h como mínimo antes de la infección viral en concentraciones apartir 4,8-6 mg pierden sensibilidad a la réplica viral.
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TABLA 5.- RESULTADOS DEL EFECTO DEL EXTRACTO ACUOSO DE Aloe barbadensis SOBRE UNA CEPA PATOGENA DEVEMC.
Tiempos de tratamientos previos (en horas)
1 6 12 24 48 96 120Aloebarbadensis(mg)
inh URP inh URP inh URP unh URP inh URP inh URP inh URP
0,3 0 NR 0 NR 0 NR 0 NR 0 NR 0 5 0 16
0,6 0 NR 0 NR 0 NR 0 NR 0 10 0 5 0 24
1,2 0 NR 0 NR 0 NR 0 NR 0 12 0 7 0 22
2,4 0 NR 0 NR 0 NR 0 NR 0 7 0 12 25 36
4,8 0 NR 0 NR 0 NR 0 2 0 15 25 23 50 58
6,0 0 NR 0 NR 0 NR 0 10 0 20 25 52 75 72
inh = Expresado como el % de inhibición del ecp viralURP = Expresado como el % de reducción de placas viralesNR = Nº Reducción de placas
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TABLA 6.- RESULTADOS DEL EFECTO DEL EXTRACTO ACUOSO DE Aloe barbadensis SOBRE UNA CEPA INDIGENA DE BHV-1.
Tiempos de tratamientos previos (en horas)
1 6 12 24 48 96 120Aloebarbadensis(mg) inh URP inh URP ihn URP inh URP inh URP inh URP inh URP
0,3 0 NR 0 NR 0 NR 0 NR 0 5 0 16 0 10
0,6 0 NR 0 NR 0 NR 0 NR 0 10 0 25 0 16
1,2 0 NR 0 NR 0 NR 0 NR 0 12 0 32 25 32
2,4 0 NR 0 NR 0 NR 0 NR 0 22 25 40 25 46
4,8 0 NR 0 NR 0 NR 0 NR 25 46 50 91 75 91
6,0 0 NR 0 NR 0 NR 0 NR 25 50 75 95 100 100
inh = Expresado como el % de inhibición del ecp viralURP = Expresado como el % de reducción de placas viralesNR = Nº Reducción de placas
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TABLA 7.- RESULTADOS DEL EFECTO DEL EXTRACTO ACUOSO DE Aloebarbadensis sobre la cepa MOTA/89 de BHV-2.
Tiempos de tratamientos previos (en horas)
1 6 12 24 48 96 120Aloebarbadensis(mg) inh URP inh URP inh URP inh URP inh URP inh URP inh URP
0,3 0 NR 0 NR 0 NR 0 NR 0 5 0 16 0 23
0,6 0 NR 0 NR 0 NR 0 NR 0 5 0 42 0 48
1,2 0 NR 0 NR 0 NR 0 NR 0 10 25 62 25 67
2,4 0 NR 0 NR 0 NR 0 NR 0 12 25 87 50 72
4,8 0 NR 0 NR 0 NR 0 NR 0 15 50 90 75 91
6,0 0 NR 0 NR 0 NR 0 NR 25 16 75 95 100 98
inh = Expresado como el % de inhibición del ecp viralURP = Expresado como el % de reducción de placas viralesNR = Nº de Reducción de placas
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La protección a la infección viral mediante la activación del sistema inmune seconoció con el desarrollo de los experimentos preclínicos en ratones, desafiando losmismos con 100 y 1000 DL50 ratón de cepa VEMC por vía oral e intraperitoneal.Estos ratones habían recibido concentraciones variables del Extracto inyectable deAloe barbadensis por vía intramuscular en intervalos de 7-15 días (cada experimento 1inyección única) previos a la infección viral. Como sustancias inmunoactivadoras conactividad antiviral conocida se incluyeron al adyuvante Completo de Freund ACF(Gartie y cols, 1968, Nature 216:1242-1244) por vía subcutánea 0,4 ml/ratón y elBacilo Carmette Guarine BCG (Floch, F., Werner, G.H., 1976. Ann.Inmunol.:127,173-186) por vía endovenosa 1 mg/ratón es decir alrededor de 10 bacilos vivos.
Durante los días 9 y 30 post infección los ratones desafiados sobrevivientes seinvestigaron mediante serología pareada por seroneutralización y el mismo día 30recibieron una reinfección con las mismas dosis virales del desafío y se evolucionaron15 días más. Después de 45 días de observación a los sobrevivientes se les realizóestudios de células peritoneales. Los exámenes incluyeron conteo global demacrófagos, viabilidad, rosetos EA (para receptores FC de Lgs), fagocitosis,migración e inhibición de la migración de macrófagos, linfoblastogénesis con PHA,PWM y LP5, rosetas activas y espontáneas.
Los ratones inyectados por lo menos 10 días antes con ACF, BCG o Aloe barbadensisa la provocación con 1000 DL50r por vía oral sobrevivieron, mientras que ningunosoportó la agresión intraperitoneal.
Frente a 100 DL50r, la sobrevivencia fue de 100% para la vía oral con los 3productos; 66% por vía intraperitoneal con la protección con Extracto inyectable deAloe barbadensis y ACF; la inyección de BCG no protegió a los ratones de la agresiónintraperitoneal con 100 DL50r de VEMC.
La serología pareada arrojó títulos de 1:4 + 1 log y la reinfección de estos animalesno produjo enfermedad clínica o muerte.
Las células del exudado peritoneal de los ratones sensibilizados con extracto inyectablede Aloe barbadensis y ACF mostraron una caída de 2-2,5 log en el título intracelulardel VEMC con relación a los macrófagos de los animales no tratados. El alcance dela réplica viral de la cepa VEMC en los macrófagos peritoneales de ratones infectadoscon BCG no se diferenció de la réplica de ese virus en las células de ratones testigos.
En la respuesta de activación celular del sistema inmuno se destaca el incremento de lapoblación de macrófagos y sus índices de fagocitosis; así como la población global delinfocitos T.
En una epidemia de Aujesky (Pseudorabia) en cerdos fue empleado el Extractoinyectable de Aloe barbadensis para el tratamiento antiviral no específico de losanimales clínicamente afectados y, para proteger a los recién nacidos de la infección
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viral, así como toda el área pericial N > 500. La epidemia fue detenida muyrápidamente.
En una epidemia la gastroenteritis viral en cerdos N > 500 con diagnóstico de Coronavirus se aplicó el Extracto inyectable de Aloe barbadensis a las categorías crías yprecebas disminuyéndose rápidamente la morbilidad y morbiletalidad.
Se llevaron a cabo ensayos clínicos en 60 pacientes con síntomas clínicos de HepatitisA que recibieron el tratamiento con Extracto inyectable de Aloe barbadensis (el 50%recibió tratamiento convencional de hepatitis); se pudo comprobar la prontanormalización de las transaminasas y el perfil hepático en general y por consiguienteuna mejoría clínica en un tiempo más corto que aquellos que recibieron el tratamientomédico convencional.
No realizaron ensayos clínicos en 30 pacientes inmunodeficientes multicausal(Politraumatizados, quemados, infecciones virales) con el Extracto inyectable de Aloebarbadensis, los mismos mostraron pronta mejoría clínica y en los estudio deinmunidad celular a ellos realizados antes y después del tratamiento se comprobó laactivación de macrófagos y linfocitos T.
Las ventajas técnico-económica de la presente invención son las siguientes:
1. Realización sencilla y económica.
2. Desde el punto de vista socio-económico también tienen gran repercusión tanto enmedicina humana como en medicina veterinaria; cualquier epidemia viral cuesta a unpaís millones de pesos, si se empleara una profilaxis o terapia antiviral proveniente deun recurso natural como el de la presente invención esos casos pudieran reducirsesobremanera.
REIVINDICACIONES
1.- Extracto inyectable de Aloe barbadensis antiviral e inmunoactivadorcaracterizado porque tiene propiedades como virucida, virustático e inmunoactivadorcontra virus DNA y RNA, es inócuo para el organismo y contiene como principiosactivos fundamentales polisacáridos totales entre 0,05 - 0,15%, antraquinonas libresentre 0,1-0,5 mg% aloina 0,6-1,6 mg% y ácidos orgánicos málico mayoritario entre0,01-0.05%.
2.- Procedimiento de obtención del extracto inyectable de Aloe barbadensiscaracterizado porque se parte de las hojas frescas y completas de plantas de zonatropical y el suelo,la edad de la planta, la época de recolecta y las características delas hojas predeterminadas, se bioestimulan las hojas durante 9-20 días a 4-10ºC, sereflujan tres veces en cloruro de sodio-agua destilada hasta estabilizar el índice deoxidación a 1400-1800 mg O2/l, densidad óptica 0,09-0,3, pH 5-7, libre de lectinas yestéril.