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Algoritmos iterativos de Algoritmos iterativos de tomografía tridimensional en tomografía tridimensional en
microscopía electrónicamicroscopía electrónica
Carlos Óscar Sánchez SorzanoCarlos Óscar Sánchez Sorzano
Unidad de BioComputaciónUnidad de BioComputación
Centro Nacional de Biotecnología (CSIC)Centro Nacional de Biotecnología (CSIC)
Directores: J.M.Carazo y Fco. Del Pozo
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ContenidoContenido• IntroducciónIntroducción
– Introducción al problema biológico– Introducción a la tomografía tridimensional
• Materiales y MétodosMateriales y Métodos– Optimización del proceso de reconstrucción– Corrección de la función de transferencia del
microscopio– Conocimiento a priori
• ResultadosResultados– Optimización de parámetros– Reconstrucción de partículas individuales
• ConclusionesConclusiones
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ContenidoContenido• IntroducciónIntroducción
– Introducción al problema biológico– Introducción a la tomografía tridimensional
• Materiales y MétodosMateriales y Métodos– Optimización del proceso de reconstrucción– Corrección de la función de transferencia del
microscopio– Conocimiento a priori
• ResultadosResultados– Optimización de parámetros – Reconstrucción de partículas individuales
• ConclusionesConclusiones
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Estudios estructurales
Estudios bioquímicos
Introducción al problema Introducción al problema biológicobiológico
ProteínasSustratos
MEFVALGGPDAGSPTPFPDEAGAFLGLGGGERTEAGGLLASYPSGRVS...
Propiedades:Solubilidad, peso, tamaño, temperatura de desnaturalización, ...
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Introducción al problema Introducción al problema biológicobiológico
Microscopio electrónicoMicroscopio electrónicofilamento
ánodo
columna lentecondensadora
lenteobjetivoportamuestras
lenteproyectadora
pantallafosforescente
placafotográfica
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Introducción al problema Introducción al problema biológicobiológico
Rango de estructuras estudiadas por Rango de estructuras estudiadas por microscopía electrónica de transmisiónmicroscopía electrónica de transmisión
10 nm. 1 m.100 nm.
proteína ribosoma vírus mitocondria
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Introducción al problema Introducción al problema biológicobiológico
Tinciónnegativa
Criomicroscopía
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ContenidoContenido• IntroducciónIntroducción
– Introducción al problema biológico– Introducción a la tomografía tridimensional
• Materiales y MétodosMateriales y Métodos– Optimización del proceso de reconstrucción– Corrección de la función de transferencia del
microscopio– Conocimiento a priori
• ResultadosResultados– Optimización de parámetros– Reconstrucción de partículas individuales
• ConclusionesConclusiones
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Introducción a la tomografía Introducción a la tomografía tridimensionaltridimensional
ConceptoConcepto
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Introducción a la tomografía Introducción a la tomografía tridimensionaltridimensional
• Las imágenes de Microscopía Electrónica son imágenes Las imágenes de Microscopía Electrónica son imágenes de proyección (Transformada de Rayos X) de la de proyección (Transformada de Rayos X) de la densidad electrónica del espécimen (densidad electrónica del espécimen (aproximadamenteaproximadamente) )
Suposición: Objeto de Fase Débil (Weak Phase Object)
(La dispersión (scattering) inelástico es tolerable frente al elástico y éste se considera un proceso lineal)
Transformada de rayos X
donde
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Introducción a la tomografía Introducción a la tomografía tridimensionaltridimensional
• Inversión de la Transformada de Rayos XInversión de la Transformada de Rayos X
Donde es la proyección de sobre Donde es la proyección de sobre
La distribución de densidad f(r) está determinada de forma única por el conjunto de todas sus integrales de línea . Además, las proyecciones recogidas no responden a las proyecciones exactas de f(r).
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Introducción a la tomografía Introducción a la tomografía tridimensionaltridimensional
Algoritmos de expansión en serieAlgoritmos de expansión en serie
bAx 10 Millones de ecuaciones
1 Millón de incógnitas
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Introducción a la tomografía Introducción a la tomografía tridimensionaltridimensional
Expansión en blobs sobre una rejilla centrada en el cuerpo (BCC)Expansión en blobs sobre una rejilla centrada en el cuerpo (BCC)
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Introducción a la tomografía Introducción a la tomografía tridimensionaltridimensional
-
Proyectar Retroproyectar
x
(k)
...
Iterar (n veces)
)(
,
1
2,
1
)1(,
)()1()(
kijiJ
i
Jk
iikk
jk
j ll
xlbxx
G.T. Herman. Academic Press 1980R.Marabini et al. Uñtramic. 72:53-65 1998
Técnica de reconstrucción algebraicaTécnica de reconstrucción algebraica
por bloques (ARTk)por bloques (ARTk)
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ContenidoContenido• IntroducciónIntroducción
– Introducción al problema biológico– Introducción a la tomografía tridimensional
• Materiales y MétodosMateriales y Métodos– Optimización del proceso de reconstrucción– Corrección de la función de transferencia del
microscopio– Conocimiento a priori
• ResultadosResultados– Optimización de parámetros– Reconstrucción de partículas individuales
• ConclusionesConclusiones
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Optimización del proceso de Optimización del proceso de reconstrucciónreconstrucción
• Reducción del espacio a reconstruirReducción del espacio a reconstruir
• Optimización del blob y rejilla de reconstrucciónOptimización del blob y rejilla de reconstrucción
• Optimización de parámetros libres mediante Optimización de parámetros libres mediante simulaciónsimulación
• Optimización del orden de las proyeccionesOptimización del orden de las proyecciones
• Estudio de normalizaciónEstudio de normalización
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Optimización del proceso de Optimización del proceso de reconstrucciónreconstrucción
Optimización del blob y rejilla de reconstrucciónOptimización del blob y rejilla de reconstrucción
E. Garduño et al. Electronic Notes in Theor. Comp. Sci. 46 2001S. Matej et al. IEEE Trans. Med. Im. 15: 68-78 1996
ErrorError alphaalpha
radioradio
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Optimización del proceso de Optimización del proceso de reconstrucciónreconstrucción
Optimización del blob y rejilla de reconstrucciónOptimización del blob y rejilla de reconstrucción
)0(
)(14,114,5.1),(
..
)2(),(
2minimizar
1
2
,
B
Ba
as
aaBCC
r
sT
a
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Optimización del proceso de Optimización del proceso de reconstrucciónreconstrucción
Optimización de parámetros libresOptimización de parámetros libres
• Simulación del proceso de reconstrucción Simulación del proceso de reconstrucción partiendo de volúmenes conocidospartiendo de volúmenes conocidos– Phantoms analíticos
– Especímenes de estructura atómica conocida
C.O.S. Sorzano et al. J. Struct. Biol. 133(2): 108-118 2001
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Optimización del proceso de Optimización del proceso de reconstrucciónreconstrucción
• Definición conceptual de (algunas) tareas y de sus Definición conceptual de (algunas) tareas y de sus Figuras de Mérito (FOM´s) asociadas:Figuras de Mérito (FOM´s) asociadas:
– Consistencia estructural:• FOM: Norma L2 y L1 del error
• FOM: Coincidencia de medias y varianzas
• FOM: Resolución, correlación, información mutua
• …
– Separabilidad estructural:• FOM: Solapamiento histogramas de fondo y señal
• FOM: Separabilidad estadística entre medias
• …
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Optimización del proceso de Optimización del proceso de reconstrucciónreconstrucción
FOMs: Fourier Shell Correlation (FSC)FOMs: Fourier Shell Correlation (FSC)
),(
2
),(
2
),(
*
)}({)}({
)}({)}({
))(,(
RRRR
RR
RrTFRpTF
RrTFRpTF
RrpFSC
thRwpFSCE
RrpFSCscinf
R
))(,(
))(,(max
thRrpFSCscinfR
))(,(max
M. Van Heel, Ultramicroscopy 21:95-100 1987
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Optimización del proceso de Optimización del proceso de reconstrucciónreconstrucción
• Análisis estadístico intra-experimento– Realizar una serie de reconstrucciones para j
– Evaluar cada reconstrucción obteniendo FOM i(j)– Eliminación de elementos no representativos, FOMs cuya media
no alcanza una precisión deseada a cada j, y FOMs no correlacionadas con
– Agrupación de FOMs por tendencias– Elección de un representante de clase– Combinación de los representantes de clase– Selección de la región óptima para este experimento
• Análisis estadístico inter-experimentoAnálisis estadístico inter-experimento– Identificación de variables relevantes– Determinación de un modelo para frente a dichas variables
Optimización de parámetros libresOptimización de parámetros libres
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ContenidoContenido• IntroducciónIntroducción
– Introducción al problema biológico– Introducción a la tomografía tridimensional
• Materiales y MétodosMateriales y Métodos– Optimización del proceso de reconstrucción– Corrección de la función de transferencia del
microscopio– Conocimiento a priori
• ResultadosResultados– Optimización de parámetros – Reconstrucción de partículas individuales
• ConclusionesConclusiones
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Corrección de la función de Corrección de la función de transferencia del microscopiotransferencia del microscopio
• Modelo teóricoModelo teórico
• Estimación del modelo teórico de cada Estimación del modelo teórico de cada micrografíamicrografía– Estimación espectral– Ajuste del modelo teórico a dicha estimación
• Corrección de la función de transferencia a Corrección de la función de transferencia a partir del modelo teórico encontradopartir del modelo teórico encontrado
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J. Frank CRC Press 1996
,...),,()( as CCffRCTF
Corrección de la función de Corrección de la función de transferencia del microscopiotransferencia del microscopio
)(ui
)(rim
)()()(22
RTFRCTFRTF iim
))(cos)()(sen()( 0 RQRRERCTF
Función de transferenciaFunción de transferencia
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Corrección de la función de Corrección de la función de transferencia del microscopiotransferencia del microscopio
Estimación espectralEstimación espectral
K
kk
yx
AVPERI I
NNKS
1
2)(
11)(ˆ RR
)(
)()(ˆ
R
RR
A
BS ARMA
I
Promediado de periodogramas
Modelado autoregresivo y
media móvil
(+) Menor varianza que promediado de periodogramas(+) Menor región de soporte
R. L. Kashyap IEEE Trans. Inf. Theory 30(5): 736-45 1984
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Corrección de la función de Corrección de la función de transferencia del microscopiotransferencia del microscopio
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)()(),(ˆmin)(2
,...,,,...,,
RRRR BgCTFSdCTF fCCARMAI
fCC asas
Corrección de la función de Corrección de la función de transferencia del microscopiotransferencia del microscopio
Ajuste de parámetrosAjuste de parámetros
)()(),()(corr)()()())(),(( RRRRRRRRRR
gWfWgfWgfdp
20
2)( gsS
R
gS
S eKeKbBg
RR
R
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Corrección de la función de Corrección de la función de transferencia del microscopiotransferencia del microscopio
Corrección de CTFCorrección de CTF
x(-1)
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Corrección de la función de Corrección de la función de transferencia del microscopiotransferencia del microscopio
Refinamiento Iterativo de DatosRefinamiento Iterativo de Datos
Start n=0
gn
ART
P C.P
-
+x
k
g
)1
01
)1 ).( kkk
k VPCPgg
G.T. Herman et al. Optical Eng. 29:513-23 1990
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ContenidoContenido• IntroducciónIntroducción
– Introducción al problema biológico– Introducción a la tomografía tridimensional
• Materiales y MétodosMateriales y Métodos– Optimización del proceso de reconstrucción– Corrección de la función de transferencia del
microscopio– Conocimiento a priori
• ResultadosResultados– Optimización de parámetros – Reconstrucción de partículas individuales
• ConclusionesConclusiones
![Page 32: Algoritmos iterativos de tomografía tridimensional en microscopía electrónica Carlos Óscar Sánchez Sorzano Unidad de BioComputación Centro Nacional de](https://reader035.vdocumento.com/reader035/viewer/2022062409/5665b4241a28abb57c8f794b/html5/thumbnails/32.jpg)
Conocimiento Conocimiento a prioria priori
• Simetría puntualSimetría puntual• Restricciones volumétricasRestricciones volumétricas
– Superficie– Volumen– Positividad– Solución inicial
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Conocimiento Conocimiento a prioria priori
SimetríaSimetría
Planos de simetría paraun eje rotacional de orden 6
La simetría supone el conocimiento de otras proyecciones
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Conocimiento Conocimiento a prioria priori
Restricciones volumétricasRestricciones volumétricas
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Restricciones a nivel volumétricoRestricciones a nivel volumétrico
• Solución inicialSolución inicial
• SuperficieSuperficie
• PositividadPositividad
• VolumenVolumen
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ContenidoContenido• IntroducciónIntroducción
– Introducción al problema biológico– Introducción a la tomografía tridimensional
• Materiales y MétodosMateriales y Métodos– Optimización del proceso de reconstrucción– Corrección de la función de transferencia del
microscopio– Conocimiento a priori
• ResultadosResultados– Optimización de parámetros – Reconstrucción de partículas individuales
• ConclusionesConclusiones
![Page 37: Algoritmos iterativos de tomografía tridimensional en microscopía electrónica Carlos Óscar Sánchez Sorzano Unidad de BioComputación Centro Nacional de](https://reader035.vdocumento.com/reader035/viewer/2022062409/5665b4241a28abb57c8f794b/html5/thumbnails/37.jpg)
Optimización de parámetrosOptimización de parámetros
Análisis intra-experimento
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OptimizaciónOptimización de parámetros de parámetros
00793.0max 7473.25224.2 N
0033.10095.0max 0001.00878.0 NS
74.02 R
82.02 R
Análisis inter-experimento
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Optimización de parámetrosOptimización de parámetros
N. Boisset et al., Ultramic. 74:201-7 1998ART, SIRT: Parámetro óptimo
SIRT: Parámetro no óptimo
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ContenidoContenido• IntroducciónIntroducción
– Introducción al problema biológico– Introducción a la tomografía tridimensional
• Materiales y MétodosMateriales y Métodos– Optimización del proceso de reconstrucción– Corrección de la función de transferencia del
microscopio– Conocimiento a priori
• ResultadosResultados– Optimización de parámetros– Reconstrucción de partículas individuales
• ConclusionesConclusiones
![Page 41: Algoritmos iterativos de tomografía tridimensional en microscopía electrónica Carlos Óscar Sánchez Sorzano Unidad de BioComputación Centro Nacional de](https://reader035.vdocumento.com/reader035/viewer/2022062409/5665b4241a28abb57c8f794b/html5/thumbnails/41.jpg)
Reconstrucción de partículas Reconstrucción de partículas individualesindividuales
Antígeno T de SV40
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Reconstrucción de partículas Reconstrucción de partículas individualesindividuales
Antígeno T de SV40
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Reconstrucción de partículas Reconstrucción de partículas individualesindividuales
Antígeno T de SV40
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Reconstrucción de partículas Reconstrucción de partículas individualesindividuales
Antígeno T de SV40
21Å
33Å
14Å
15Å
Frecuencia (1/Å)
FSC
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ContenidoContenido• IntroducciónIntroducción
– Introducción al problema biológico– Introducción a la tomografía tridimensional
• Materiales y MétodosMateriales y Métodos– Optimización del proceso de reconstrucción– Corrección de la función de transferencia del
microscopio– Conocimiento a priori– Reconstrucción de cristales
• ResultadosResultados– Optimización de parámetros – Reconstrucción de partículas individuales
• ConclusionesConclusiones
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ConclusionesConclusiones• Se ha puesto a punto un paquete de programas en el que
las ideas expuestas en la presente tesis están disponibles y ya han sido utilizadas en estudios concretos.
• Se ha desarrollado un método de estimación de la función de transfencia de contraste teórica (CTF).
• Se ha desarrollado un mecanismo de corrección de la función de transferencia de contraste, tanto en fase como en amplitud.
• Se ha desarrollado un método de optimización útil en entornos con una alta variabilidad, un amplio número de variables independientes y múltiples funciones objetivo a optimizar.
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ConclusionesConclusiones• Se han propuesto modelos para una gran variedad de Se han propuesto modelos para una gran variedad de
parámetros utilizados durante elparámetros utilizados durante el proceso de reconstrucciónproceso de reconstrucción..
• Se hanSe han incorporado mecanismos de introducción de incorporado mecanismos de introducción de información información aa prioripriori en el propio proceso de reconstrucción. en el propio proceso de reconstrucción.
• Se han extendido lSe han extendido los métodos iterativos de reconstrucción os métodos iterativos de reconstrucción tridimensionaltridimensional a estudios con cristales bidimensionales. a estudios con cristales bidimensionales.
• Todas estas aportaciones han contribuido a una mejora de la Todas estas aportaciones han contribuido a una mejora de la calidad decalidad de los volúmenes obtenidos materializada en una los volúmenes obtenidos materializada en una mejora apreciable de la resoluciónmejora apreciable de la resolución alcanzadaalcanzada en un valor en un valor entre 10entre 10ÅÅ y 15 y 15ÅÅ de resolución. de resolución.
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IntroducciónIntroducción
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DnaB: crio-microscopía
0
20
40
60
80
100
slice number
rota
tiona
l ene
rgy
(%)
harmonic 3
harmonic 61
6
11
16
21
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Complejo DnaB/DnaC
1 6
11 16
21 26
-40
-30
-20
-10
0
slice number
rota
tion
(deg
rees
)
0
25
50
75
100
slice number
rota
tiona
l ene
rgy
(%)
harmonic 3
harmonic 6
DnaC DnaB
91
Å
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Evolución del número de estructuras
depositadas en PDB
PDB Annual Report 2001http://www.rcsb.org/pdb/annual_report01.pdf
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objeto tridimensio
nal
proyecciones en
todas las direcciones posibles
algoritmos de reconstrucció
n
reconstrucción
tridimensional
Bases de la Microscopía Electrónica
Tridimensional
3. Es posible reconstruir la
estructura tridimensional de un objeto a partir
de sus proyecciones
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Material biológico:
• flexible• alto contenido en agua• sensible a radiación• genera poco contraste
Tinción negativa:
• deshidratación• ¿tinción parcial?• deformación / compresión• la imagen refleja la forma del “molde”
Criomicroscopía:
• entorno hidratado/fisiológico• menor riesgo de deformaciones• la imagen refleja la masa del especimen
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Partículas de baja simetría
Ribosoma (7.5/11.5 Å)
Matadeen et al. (1999) Structure 7, 1575-1583
Gabashvili et al. (2000) Cell 100, 537-549
U1 snRNP (10 Å)
Stark et al. (2001) Nature 409, 539-541
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Introducción a la tomografía Introducción a la tomografía tridimensionaltridimensional
Los ángulos de Euler son interpretables como un sistema de coordenadas solidario a la partícula
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Introducción a la tomografía Introducción a la tomografía tridimensionaltridimensional
•Reconstrucción del especimen medio (una sola imagen por especimen antes de su “destrucción”)
•Ruido traslacional, angular y en las imágenes (SNR<1)
•Especímenes son MUY sensibles a la radiación
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BlobsBlobs
In(x): Función de Bessel de primera especie modificadaJn(x): Función de Bessel de primera especie
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BlobsBlobs
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ARTART
SoluciónInicial
(1)(2)
(3)
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ARTART
(1)(2)
(3)
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Blobs y FOMsBlobs y FOMs
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Optimización del blob y la rejillaOptimización del blob y la rejilla
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FOMsFOMs
RN
i
iRiR
R
rp
NRscL
1
2
,,
2
11)(2
RN
i
iRiR
R
rp
NRscL
1
,,
2
11)(1
RrRpRsc ,,2
11)( RrRpRsc ,,1)(
RrRpRrRp mmMMRsc ,,,,2
11)(
BN
i
iRiR
iB
rp
dNBscbl
1
2
,,
2
111)(
BN
i
iRiRi
B
rpd
NBscap
1
2
,,
2
11)(
K
k
krTRkpTRK
Rscrt1
)(,)(,1
1)(
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FOMsFOMs
V
V
V
V
V
V
N
iVriVN
N
iVpiVN
N
iVriVVpiVN
rp
rpsc
1
2,,
1
1
2,,
1
1,,,,
1
)()(
))((
rH
rH
pH
pH
pH rH
rHpH
N
irrN
N
ippN
N
i
N
jprprNN
iHiHiHiH
jiHjiH
scinf
1
1
1
1
1 1
1
)(log)()(log)(
),(log),(
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FOMsFOMs
S
S
I
I
SI
NN
hsin22
S
S
O
O
SO
NN
hsbr22
![Page 67: Algoritmos iterativos de tomografía tridimensional en microscopía electrónica Carlos Óscar Sánchez Sorzano Unidad de BioComputación Centro Nacional de](https://reader035.vdocumento.com/reader035/viewer/2022062409/5665b4241a28abb57c8f794b/html5/thumbnails/67.jpg)
FOMsFOMs
dterr
dterrhsdt 1
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FOMsFOMs
222
321
321
421
2
hsvr
![Page 69: Algoritmos iterativos de tomografía tridimensional en microscopía electrónica Carlos Óscar Sánchez Sorzano Unidad de BioComputación Centro Nacional de](https://reader035.vdocumento.com/reader035/viewer/2022062409/5665b4241a28abb57c8f794b/html5/thumbnails/69.jpg)
Optimización del proceso de Optimización del proceso de reconstrucciónreconstrucción
Selección estadística de parámetrosSelección estadística de parámetros
FOM
max
maxEl máximo se encuentra en algún punto de este intervalo
ANOVA y regresión no lineal pueden ayudar a establecer modelos
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Combinación de FOMsCombinación de FOMs
T
ttt
T
tt FOMFOM
121
1
,...,
,..., 21 FOMFOM
Clasificación
Análisis de Componentes Principales (PCA)
,..., 2'
1'
tt FOMFOM
Representante de grupo
I
iiitt wFOMFOM
1
'
I
iit ww
1
T
ttt wFOMFOM
1
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Optimización del proceso de Optimización del proceso de reconstrucciónreconstrucción
Reducción del volumen reconstruidoReducción del volumen reconstruido
1. Implicaciones en velocidad2. Implicaciones en la
“determinación” del sistema
91.16
)2()2(
)2(
3
2
33
4
2
rrNrrN
Incog
Ecs
r
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Optimización del proceso de Optimización del proceso de reconstrucciónreconstrucción
Orden de las proyeccionesOrden de las proyecciones
-
Proyectar Retroproyectar
x
(k)
...
Iterar (n veces)
1
}0,max{
,minn
Lniji
jn
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Normalización de imágenesNormalización de imágenes
Gradiente localdentro de lamicrografía
Restar el planode fondo
Diferentes intensidades en las proyecciones Normalización
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Normalización y PositividadNormalización y Positividad
Datos originales
bnIaI id )(
n
nII
'
Resultado
(+) n es constante(+) Se elimina la dependencia con la transformación lineal(+) Se pueden aplicar restricciones de positividad al volumen(-) Puede depender de fuertes variaciones del desenfoque del microscopio
![Page 75: Algoritmos iterativos de tomografía tridimensional en microscopía electrónica Carlos Óscar Sánchez Sorzano Unidad de BioComputación Centro Nacional de](https://reader035.vdocumento.com/reader035/viewer/2022062409/5665b4241a28abb57c8f794b/html5/thumbnails/75.jpg)
NormalizaciónNormalización
![Page 76: Algoritmos iterativos de tomografía tridimensional en microscopía electrónica Carlos Óscar Sánchez Sorzano Unidad de BioComputación Centro Nacional de](https://reader035.vdocumento.com/reader035/viewer/2022062409/5665b4241a28abb57c8f794b/html5/thumbnails/76.jpg)
NormalizaciónNormalización
Microscopio
Transformaciónlineal
Digitalización
CorrecciónCTF
Normalización
Log
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NormalizaciónNormalización
•Microscopio: De densidad de potencial a negativo de películaVars: Dureza del haz, tiempo de exposición, desenfoque, calidad de la película
•Revelado: De negativo de película a densidades ópticasVars: concentración de los reveladores, tiempo de revelado
•Digitalización: De densidades ópticas a transmitanciaVars: no. of bits, global calibration, integration time
•Correcciones:•Logaritmo
Vars: no. de bits
•NormalizaciónVars: método
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NormalizaNormalizacióciónn
Los momentos de las proyecciones, salvo la media, de un objeto no tienen por qué coincidir
A
B
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NormalizaciónNormalización
Image mean Image variance
Background mean
Background variance
x x 2x 0 0
bnxay )( bxa )( 222nxa b 22
na
y
ymyy' 0 1
22nx
x
22
2
nx
n
n
y
m
myy' 0
2
2222
b
nxaa
3
2
b
bxa
b
xa
2
2
22
222222
2
22 )(
b
b
ba
anxana
b
xa
n
ymyy'
n
n
2
22
n
nx
0 1
ny
n
mm
myy' 1
2
22
n
nx
0
2
2
x
n
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CTFCTF
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Mejorando la resolución: la magia de los FEG
Cañón termoiónico de W Field Emission Gun
32 Å18 Å
![Page 82: Algoritmos iterativos de tomografía tridimensional en microscopía electrónica Carlos Óscar Sánchez Sorzano Unidad de BioComputación Centro Nacional de](https://reader035.vdocumento.com/reader035/viewer/2022062409/5665b4241a28abb57c8f794b/html5/thumbnails/82.jpg)
original FEG cañón termoiónico de W
Mejorando la resolución: efecto de la CTF
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J. Frank CRC Press 1996
,...),,()( fCCfRCTF as
Corrección de la función de Corrección de la función de transferencia del microscopiotransferencia del microscopio
)(ui
)(rim
)()()(22
RTFRCTFRTF iim
))(cos)()(sen()( 0 RQRRERCTF
Función de transferenciaFunción de transferencia
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CTFCTF
Vqvm ee 221
vm
h
e
)()( )( ueu iui
im 2
)( ufu
u
ruiiim eur )(2)()(
)()()( * rrrI imimim
)())(cos)((sen
)()0()()0(
)()())}(({)(
0
**
*
RIuQu
RR
RRRrITFRI
i
imimimim
imimim
Las ondas dispersadas llevan menor potencia que las no dispersadas
WPO
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CTFCTF
Aberración esférica: Variación de desenfoque en función de ladistancia al centro de la lente. Cs=1..5mm
2)(
432 RC
RfR s
Aberración cromática: Variación de la velocidad de los electronespor inestabilidad de la tensión de aceleración. Ca
Coherencia temporal: Dispersión energética de los electrones.U/U=2eV
2log
4241
)(RC U
Ua
eRE
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CTFCTF
Estabilidad de la lente: Variación de la corriente de la lente I/I<10ppm
2log
242
41
)(RC I
IUU
a
eRE
Apertura angular de la lente: variación del paralaje del hazde electrones. =1mrad
23222 )()( RfRCseRE
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CTFCTF
)()(2
0 RFJRE Desplazamiento mecánico transversal: en el plano focal por
fenómenos electrostáticos. R
)sinc()( RRRE
Desplazamiento mecánico longitudinal: perpendicular alplano focal. F
![Page 88: Algoritmos iterativos de tomografía tridimensional en microscopía electrónica Carlos Óscar Sánchez Sorzano Unidad de BioComputación Centro Nacional de](https://reader035.vdocumento.com/reader035/viewer/2022062409/5665b4241a28abb57c8f794b/html5/thumbnails/88.jpg)
CTFCTF
Astigmatismo: focalización asimétrica del haz. fm, fM y
22 )))sen(arg(()))cos(arg(()sgn()( RRR Mmm ffff
Diámetro angular: diafragma metálico de radio RA
A
A
RR
RRRE
0
1)(
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Modelado AR (Auto-Regresivo) y ARMA Modelado AR (Auto-Regresivo) y ARMA (Autoregresivo, Media Móvil)(Autoregresivo, Media Móvil)
ESTIMACIÓN ESPECTRALESTIMACIÓN ESPECTRAL : Se considera el ruido como un proceso aleatorio cuya : Se considera el ruido como un proceso aleatorio cuya potencia espectral hay que determinar.potencia espectral hay que determinar.
N
Np
M
Mq
yxqypxrqpayxr ),(),(),(),(
Modelo AR
),( )),(),((),(),(1),(
yxeqypxrqypxrqpayxrNqp
Modelo ARMA
AR) caso el (para
ARMA) caso el (para
),(
)M
Xq
M
Yi(p2
),(
)M
Xq
M
Yi(p2
ARMA) (filtro
1),(
),(1),(
),(1),(
),(),(
),(),(
2
XY
1
XY
YXB
eqpbYXB
eqpaYXA
YXEYXA
YXBYXR
Nqp
Nqp
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Determinación de los coeficientes ARMADeterminación de los coeficientes ARMA
Procedimiento propuesto por Kashyap (1984)
Selección de las regiones de soporte N1, N2, N3
N1
N2
N3=
Son las regiones cuya información se tendrá en cuenta para determinación del ARMA (deben ser simétricas)
023 NN
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Determinación de los coeficientes ARMADeterminación de los coeficientes ARMA
Solución de las Ecuaciones de Yule - Walker para determinar los coeficientes AR
3
),(
),(
)),(),((),(),(1
Nyx
qypxqypxqpayxNqp
Solución de la ecuación de autocorrelación en el pixel considerado para determinar la varianza del ruido
1),(
),(),(2)0,0(Nqp
yxqpa
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Determinación de los coeficientes ARMADeterminación de los coeficientes ARMA
Determinación de los coeficientes ARMA resolviendo las ecuaciones de Yule-Walker en la región de soporte N2
2
),(
),(
),()),(),((),(),(1
Nyx
yxbqypxqypxqpayxNqp
Realización del filtro ARMA sobre una imagen de ruido blanco de media 0 y varianza 1
),(),(
),(),( YXE
YXA
YXBYXR
FFT inversa
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¿Cuál de los modelos ARMA se ajusta más a ¿Cuál de los modelos ARMA se ajusta más a la CTF original ?la CTF original ?
MA
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ARMAARMA
Promediadoperiodogramas
ARMA
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Fases del ajusteFases del ajuste
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Fases del ajusteFases del ajuste
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Fases del ajusteFases del ajuste
![Page 98: Algoritmos iterativos de tomografía tridimensional en microscopía electrónica Carlos Óscar Sánchez Sorzano Unidad de BioComputación Centro Nacional de](https://reader035.vdocumento.com/reader035/viewer/2022062409/5665b4241a28abb57c8f794b/html5/thumbnails/98.jpg)
Fases del ajusteFases del ajuste
![Page 99: Algoritmos iterativos de tomografía tridimensional en microscopía electrónica Carlos Óscar Sánchez Sorzano Unidad de BioComputación Centro Nacional de](https://reader035.vdocumento.com/reader035/viewer/2022062409/5665b4241a28abb57c8f794b/html5/thumbnails/99.jpg)
Resultado del ajusteResultado del ajuste
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CTF de cada partículaCTF de cada partícula
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Experimento con IDRExperimento con IDR
Phantom
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Experimento con IDRExperimento con IDRReconstrucción sin corrección de CTF
![Page 103: Algoritmos iterativos de tomografía tridimensional en microscopía electrónica Carlos Óscar Sánchez Sorzano Unidad de BioComputación Centro Nacional de](https://reader035.vdocumento.com/reader035/viewer/2022062409/5665b4241a28abb57c8f794b/html5/thumbnails/103.jpg)
Experimento con IDRExperimento con IDR
Reconstrucción con corrección de fase
![Page 104: Algoritmos iterativos de tomografía tridimensional en microscopía electrónica Carlos Óscar Sánchez Sorzano Unidad de BioComputación Centro Nacional de](https://reader035.vdocumento.com/reader035/viewer/2022062409/5665b4241a28abb57c8f794b/html5/thumbnails/104.jpg)
Experimento con IDRExperimento con IDR
Reconstrucción con corrección de amplitud
![Page 105: Algoritmos iterativos de tomografía tridimensional en microscopía electrónica Carlos Óscar Sánchez Sorzano Unidad de BioComputación Centro Nacional de](https://reader035.vdocumento.com/reader035/viewer/2022062409/5665b4241a28abb57c8f794b/html5/thumbnails/105.jpg)
A prioriA priori
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SimetríaSimetría
M a tr iz d e s im e tr ía
A u to v a lo re s
R o ta c ió n r e s p e c to a l
e je Z
1,, jj ee
R e f le x ió n r e s p e c to a l p la n o X Y
1,1,1
R e f le x ió n r e s p e c to a l
e je Z
1,1,1
R e f le x ió n r e s p e c to a l
o r ig e n
1,1,1
100
0cossen
0sencos
100
010
001
100
010
001
100
010
001
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SimetríaSimetría
yxz
xzy
zyx
dttssEf
dttssSEf
dttssEfP
tyx
t
tyx
t
tyx
t
),,(
),,(
),,()(
','
,
,,
s
)()( rr Sff
tt SEE ,',' tSLEE ,','
![Page 108: Algoritmos iterativos de tomografía tridimensional en microscopía electrónica Carlos Óscar Sánchez Sorzano Unidad de BioComputación Centro Nacional de](https://reader035.vdocumento.com/reader035/viewer/2022062409/5665b4241a28abb57c8f794b/html5/thumbnails/108.jpg)
SimetríaSimetría
15 10 6
![Page 109: Algoritmos iterativos de tomografía tridimensional en microscopía electrónica Carlos Óscar Sánchez Sorzano Unidad de BioComputación Centro Nacional de](https://reader035.vdocumento.com/reader035/viewer/2022062409/5665b4241a28abb57c8f794b/html5/thumbnails/109.jpg)
Crio-ME:PRD1 en
diferentes estados
de ensamblaj
e
25 Å
14 Å
12 Å
![Page 110: Algoritmos iterativos de tomografía tridimensional en microscopía electrónica Carlos Óscar Sánchez Sorzano Unidad de BioComputación Centro Nacional de](https://reader035.vdocumento.com/reader035/viewer/2022062409/5665b4241a28abb57c8f794b/html5/thumbnails/110.jpg)
Adenovirus humano (wt)
![Page 111: Algoritmos iterativos de tomografía tridimensional en microscopía electrónica Carlos Óscar Sánchez Sorzano Unidad de BioComputación Centro Nacional de](https://reader035.vdocumento.com/reader035/viewer/2022062409/5665b4241a28abb57c8f794b/html5/thumbnails/111.jpg)
Adenovirus humano: polipéptido IX
Stewart, P. L., et al. 1993. EMBO J. 12:2589-99
Ad2: EMwt-Xray Ad5: EMwt-EMdl313
![Page 112: Algoritmos iterativos de tomografía tridimensional en microscopía electrónica Carlos Óscar Sánchez Sorzano Unidad de BioComputación Centro Nacional de](https://reader035.vdocumento.com/reader035/viewer/2022062409/5665b4241a28abb57c8f794b/html5/thumbnails/112.jpg)
Sombreado metálico(-) Altura desconocida
Restricciones volumétricasRestricciones volumétricas
![Page 113: Algoritmos iterativos de tomografía tridimensional en microscopía electrónica Carlos Óscar Sánchez Sorzano Unidad de BioComputación Centro Nacional de](https://reader035.vdocumento.com/reader035/viewer/2022062409/5665b4241a28abb57c8f794b/html5/thumbnails/113.jpg)
Restricciones volumétricasRestricciones volumétricas
Imagen tipo proporcionada por el microscopio de fuerzas atómicas
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Restricciones volumétricasRestricciones volumétricas
Corte a lo largo de Y
Datos reales: policabeza del bacteriófago T4
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Alineamiento de superficieAlineamiento de superficie
0.874 0.877 0.879 0.881 0.884 0.886 0.888 0.890 0.893 0.895
Inner surface, Original 2D correlations
ztop
zbo
tto
m
0.893392 0.892448 0.890992 0.888988 0.886435 0.883372 0.879875 0.876048
0.894509 0.893747 0.892463 0.890615 0.888196 0.885241 0.881825 0.87805
0.895524 0.894982 0.893916 0.892277 0.890051 0.887269 0.884001 0.88035
0.89634 0.896053 0.895249 0.893869 0.891892 0.889343 0.886288 0.882829
0.896868 0.896867 0.896365 0.895292 0.893618 0.89136 0.888578 0.885375
0.897039 0.897349 0.897184 0.896464 0.895145 0.893235 0.890785 0.887894
0.896793 0.897432 0.897635 0.897308 0.896395 0.894888 0.892825 0.890301
0.896054 0.897035 0.897633 0.897742 0.897286 0.896238 0.894622 0.892518
0.894852 0.896166 0.897161 0.897723 0.897756 0.897211 0.896086 0.894449
0.893171 0.894796 0.89618 0.897201 0.897744 0.897736 0.897148
0.89105 0.892945 0.894687 0.896149 0.8972 0.897744
0.888575 0.890683 0.89273 0.894588 0.896114
0.885875 0.888129 0.890413 0.892602
0.883099 0.885431 0.887874
0.880396 0.882743
0.877884-12
-8
-4
0
4
-12 -10 -8 -6 -4
3%
-0.036 -0.021 -0.006 0.009 0.025 0.040 0.055 0.070 0.086 0.101
Inner surface, 2D correlations
ztop
zbo
tto
m
-0.0186703
-0.0016104
0.0177465
0.0383556
0.0580639
0.0742878
0.0854067
0.0914891
0.0936882
0.0933613
0.0915979
0.0891555
0.0865295
0.0840303
0.0162883
0.0375149
0.0588474
0.077465
0.0909636
0.0987152
0.101716
0.101516
0.0994537
0.0964639
0.0931494
0.0898923
0.0869321
0.0592253
0.079686
0.0953585
0.104862
0.108844
0.108945
0.10673
0.103324
0.0994387
0.0955177
0.0918367
0.0885709
0.0983374
0.109473
0.114536
0.115106
0.112918
0.109269
0.104975
0.100541
0.0962715
0.0923641
0.0889449
0.118448
0.119641
0.117672
0.113971
0.10946
0.104693
0.0999994
0.0955919
0.0916153
0.0881678
0.120843
0.117297
0.11276
0.10784
0.102894
0.0981475
0.093751
0.0898173
0.0864273
0.114884
0.109986
0.10495
0.100014
0.095338
0.0910429
0.0872207
0.083944
0.106237
0.101249
0.0964224
0.0918827
0.0877347
0.0840649
0.0809348
0.0970794
0.0924075
0.0880358
0.0840586
0.0805577
0.077596
-12
-10
-8
-6
-4
-2
0
2
4
-12 -10 -8 -6 -4
3%
-0.015 -0.007 0.002 0.011 0.020 0.029 0.038 0.047 0.055 0.064
Inner surface, 3D correlations
ztop
zbo
tto
m
-0.0071804
0.0019605
0.0068172
0.012179
0.0229364
0.032937
0.0358189
0.040936
0.0450584
0.0453364
0.0461244
0.0477377
0.0484109
0.0486067
0.009881
0.0247057
0.0284893
0.0342802
0.0430266
0.0495163
0.0492914
0.0514212
0.0535882
0.0522333
0.0518381
0.0525441
0.052484
0.0312802
0.0510561
0.0505725
0.0533676
0.0576344
0.0601641
0.0574189
0.0573402
0.0583325
0.0560666
0.0549332
0.0550931
0.0532001
0.0734055
0.0657487
0.0641957
0.0646677
0.0647931
0.0607893
0.0594667
0.0599485
0.0573187
0.0557992
0.066776
0.0837563
0.0710968
0.0670459
0.0658277
0.0651271
0.0607609
0.0588737
0.0592388
0.0565738
0.0689066
0.0837519
0.0699129
0.0651409
0.0636031
0.0629012
0.0585879
0.056519
0.0569522
0.0646797
0.0790295
0.0658484
0.0610291
0.0597063
0.0592977
0.0551836
0.0531464
0.0585464
0.0729031
0.0607967
0.0560574
0.0550982
0.0550484
0.0511792
0.0523109
0.0666162
0.0555437
0.0509006
0.0503202
0.0506104
-12
-10
-8
-6
-4
-2
0
2
4
-12 -10 -8 -6 -4
3%
Determinación de la superficie con 2 o 4 Å
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Restricciones volumétricasRestricciones volumétricas
Bioquímicamente se conoce el peso de las estructurasbajo estudio.
Masa conocida
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Restricciones volumétricasRestricciones volumétricas
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CristalesCristales
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Reconstrucción de cristalesReconstrucción de cristales
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Reconstrucción de cristalesReconstrucción de cristales
![Page 121: Algoritmos iterativos de tomografía tridimensional en microscopía electrónica Carlos Óscar Sánchez Sorzano Unidad de BioComputación Centro Nacional de](https://reader035.vdocumento.com/reader035/viewer/2022062409/5665b4241a28abb57c8f794b/html5/thumbnails/121.jpg)
Reconstrucción de cristalesReconstrucción de cristales
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Reconstrucción de cristalesReconstrucción de cristales
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Reconstrucción de cristalesReconstrucción de cristales
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Reconstrucción de cristalesReconstrucción de cristales
G CDGkjiG kjiGCD ),,(, :),,( r
)(rb )()( rr DbbD
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Reconstrucción de cristalesReconstrucción de cristales
)()( 1,,, oo
o sApsp
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Teorema de la sección centralTeorema de la sección central
A) Objeto 3D
B) Proyección de A
C) Transformada de Fourier 2D de B
D) C es una sección de la transformada de Fourier 3D de A: Sección central.
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Transformada de Fourier 3D de un cristal Transformada de Fourier 3D de un cristal 2D2D
TF de una proyección de cristal 2D
La información estructural se organizaA lo largo de una línea en el espacio
Combinación de secciones centrales
Líneas de red a lo largo de Z*.
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Análisis de cristales 2DAnálisis de cristales 2D
ImagenOriginal
TransformadaDe Fourier
Extracción deComponentesDe Fourier
Síntesis
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Efecto del proceso de “Unbending”:Efecto del proceso de “Unbending”:Mapa de distorsiónMapa de distorsión
Antes de unbending Después de unbending
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Efecto del proceso de “unbending”Efecto del proceso de “unbending”
Antes de unbending Después de unbending
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Interpolación en la líneas de redInterpolación en la líneas de redPara aplicar la TF-1 3D las líneas deben estar muestreadasuniformemente
Conoperdido
Conoperdido
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Reconstrucción de cristalesReconstrucción de cristales
Sin ruido
MRC, 49 imgs
ART, 49 imgs
MRC, 97 imgs
ART, 97 imgs
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Reconstrucción de cristalesReconstrucción de cristales
Con ruido
MRC, 13 imgs
ART, 13 imgs
MRC, 49 imgs
ART, 49 imgs
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Reconstrucción de cristalesReconstrucción de cristales
![Page 135: Algoritmos iterativos de tomografía tridimensional en microscopía electrónica Carlos Óscar Sánchez Sorzano Unidad de BioComputación Centro Nacional de](https://reader035.vdocumento.com/reader035/viewer/2022062409/5665b4241a28abb57c8f794b/html5/thumbnails/135.jpg)
Reconstrucción de cristalesReconstrucción de cristales
![Page 136: Algoritmos iterativos de tomografía tridimensional en microscopía electrónica Carlos Óscar Sánchez Sorzano Unidad de BioComputación Centro Nacional de](https://reader035.vdocumento.com/reader035/viewer/2022062409/5665b4241a28abb57c8f794b/html5/thumbnails/136.jpg)
Reconstrucción de cristalesReconstrucción de cristales
Reconstrucción MRC Reconstrucción ART
Phi29
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Reconstrucción de cristalesReconstrucción de cristales
Reconstrucción MRC Reconstrucción ART
Policabeza del bacteriófago T4
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Reconstrucción de cristalesReconstrucción de cristales
Policabeza del bacteriófago T4ART
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Reconstrucción de cristalesReconstrucción de cristales
Policabeza del bacteriófago T4MRC
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Reconstrucción de cristalesReconstrucción de cristales
Policabeza del bacteriófago T4
![Page 141: Algoritmos iterativos de tomografía tridimensional en microscopía electrónica Carlos Óscar Sánchez Sorzano Unidad de BioComputación Centro Nacional de](https://reader035.vdocumento.com/reader035/viewer/2022062409/5665b4241a28abb57c8f794b/html5/thumbnails/141.jpg)
ResultadosResultados
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Optimización de parámetros ARTOptimización de parámetros ART
Frecuencia máxima del ruido: 0.2, 0.5Nº ecuaciones/incógnita: 50, 130, 210Blob: r=2, m=2, a=2, =10.4, g=sqrt(2)Nº iteraciones: 1Distribución angular: UniformePhantoms: Dobles cilindros aleatoriosSNR: <0.13
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Optimización ARMAOptimización ARMA
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Optimización IDROptimización IDR
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Optimización SuperficieOptimización Superficie
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Reconstrucción phantom simpleReconstrucción phantom simple
![Page 147: Algoritmos iterativos de tomografía tridimensional en microscopía electrónica Carlos Óscar Sánchez Sorzano Unidad de BioComputación Centro Nacional de](https://reader035.vdocumento.com/reader035/viewer/2022062409/5665b4241a28abb57c8f794b/html5/thumbnails/147.jpg)
Reconstrucción bacteriorodopsinaReconstrucción bacteriorodopsina
![Page 148: Algoritmos iterativos de tomografía tridimensional en microscopía electrónica Carlos Óscar Sánchez Sorzano Unidad de BioComputación Centro Nacional de](https://reader035.vdocumento.com/reader035/viewer/2022062409/5665b4241a28abb57c8f794b/html5/thumbnails/148.jpg)
Antígeno T SV40. 1400 imágenes WBP
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La misma reconstrucción aplicando ART y las ideas expuestas en esta tesis
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Reconstrucción de partículas Reconstrucción de partículas individualesindividuales
Antígeno T de SV40
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Algunos planosAlgunos planos
WBP
ART
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WBP
ART
Algunos planosAlgunos planos
![Page 153: Algoritmos iterativos de tomografía tridimensional en microscopía electrónica Carlos Óscar Sánchez Sorzano Unidad de BioComputación Centro Nacional de](https://reader035.vdocumento.com/reader035/viewer/2022062409/5665b4241a28abb57c8f794b/html5/thumbnails/153.jpg)
Dos planos de LATDos planos de LAT
![Page 154: Algoritmos iterativos de tomografía tridimensional en microscopía electrónica Carlos Óscar Sánchez Sorzano Unidad de BioComputación Centro Nacional de](https://reader035.vdocumento.com/reader035/viewer/2022062409/5665b4241a28abb57c8f794b/html5/thumbnails/154.jpg)
Dos planos del phantom de PDBDos planos del phantom de PDB
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Reconstrucción de virusReconstrucción de virus
Adenovirushumano
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Reconstrucción de virusReconstrucción de virus
Adenovirushumano