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AISLAMIENTO Of CEPAS NATIVAS DE PROBIOTICOS Y COMPARACION
DE LA VABILIDAD POR EFECTO DE ON PREBI6nco
BLANCA CECILIA SALAZAR ALZATS
middot AISLAMIENTO DE CEPAS NATIVAS DE PROBIOTICOS Y COMPARACI6N
DE LA VIABrLlDAD POR EFECTO DE UN PRfBrOT1CO
BLANCA CECILIA SALAZAR AlZATE
I I I
I t I
Trabajo dirigido de grado pre$entado
para optar al titulo de Magister
en BiotecnologiaI 1
I f Directora Qlga Ines Montoya Carnpulilno
Magister en Ciencias area de Microbiologfa
Asesor Jos6 Uriel Sepulveda V
UNIVERSIDAD NAC(ONAL DE COLOMBIA
~ ~~lXL1tD NACIONALJm COLaJl~ rmsUH
~middotmlTo DB DIDLIOTECAP i ii~~6 ~ll OOhmEr
FACULTAD DE CIENCJAS
Medellin 2003
UNAL-Medellfn IllliI1111 ~~III1I~~I~~II ~~ 1I1~~~ 11 l~11 6400000 18 O511)5_~~
AGRADECIMIENTOS
Quiaro agradecer a todas las personas que directa 0 indirectamente me
colaboraron
Agradezoo
A la doctora Olga Ines Montoya directora de trabajo de grado por su asesorfa y
apoyo incondicional
AI doctor Jose Uriel Sepulveda V POr su asesoria y spoyo
A las estudiantes de la practica en Bacterialogia del Instituto Universitario CoIegio
Mayor de Antioquia Angela Patricia Diaz Santos Carolina Calle Cardona y Dora
Areiza A
A las directivas del postgrado en Biotecnologfa muy especislmente aJ Doctor
Rafael Arango por su apoyo en momentos de dificultad econ6mica
A todo et personal del Laboratorio de Mlcrobialogia Universidad Nacional sade
Medellin
A todo el personal de la Planta de Leches de la Universidad Nacional sede
Medellin
RESUMEN
En este trabajo se aislaron cepas natives de Lactobacillus plantarum de muestras
yegetales fermentadas de pepino rapollo y repollitas de bruselas y Lactobacillus
brevis de leche ferm~ntada y mucosa humana resultando resistentes a pH=2 y
sales biliares 03 pv dos caracterfsticas importantes que deben cumplir los
microorganismos lIamados probioticos
utmzando a cepa nativa de Lactobacillus brevis aislada de leche fermentada se
elaboraron dos bebidas Iscteas fermentadas una sin ingrediente prebi6tico y otra
adicionada de avena 05 como ingredienta prsbiotico para comparer si habra
alguna incidencia de asta ingrediente en la viabilidad del probiotico
A ambas bebidas sa les hizo un seguimiento de pH y de acidez (expreSada
como acido lactico) durante los dias 27 14 Y21 Y 1a prueba de viabilidad en los
dias 7 14 Y21 despues de elaboradas cada una de las bebidas De estas bebidas
sehicieron 4 repeticiones
Sa obtuvo recuentos mayor-es de 106 UFCml de Lactobacillus brevis hasta el dia
21 encontrandose en aumento an los recuentos en a bebida con avena aunque
estadlsticamente no hubo diferencias significativas
TABLA OE CONTENIDO
lISTA DE TASLAS ------------~--~------------------------- ~
LISTA DE ANEXOSmiddot--------- ----------------------------------11
INTRODUCCON -----------------------------------------------------12
1 MARCO TEORICO Y ESTADO OEl AItTE---middot---middot-middot-- -------14
11 PROBIOTfCOS ------------- - middot------------------14 111 Historia------------------------- 14 1~ 12 Microorganismos probi6ticos---------------- 15 113 Caracteristicas fenotipicas de algunos microorganismos probi6ticos-----~------ ------- 16 114 Caracteristicas de los probi6ticos--- - ----17 115 Beneficio de los organismos probi6ticos---middot ----19 1151 Facilitar la digesti6n de la lactosa ------ 19 1152 Protegen contra enfermedades gastrointestinales - -19 1153 Protegen contra infecciones del tracto urogenital -------20 1154 Promueven la barrera de defensa endogena delintestino ---20 1155 Protegen contra cancer de colon- ---- ---~1 1156 Protegen contra infeGCiones respiratorias----------21 1~157 En at iratamiento y pre~enci6n deleczeroa-- - 22 1158 Previenen infeccion en heridas quirurgicas ---------23 12 PREBlOTICOS -- -----------------23
2 METODOLOGIA~~~~-~fO ~~~tfmiddot~I~~-____bullbull_--~---------middot26
21 lOCALIZACION~~======~-~--- ------26 22 METODOS------------------------------26 221 Aislamiento de cepas nativas -------_ 26 2211 De vegetales -- -- -26 2212 De Ja leche--------- -----------28 2213 De mucosa vaginal humana ----~---------------28 222 Almacenamiento de fas repas aisladas ----- --30 223 Pruebas para determinar el genera ---- 31 2231 Coloracion de Gram --------------------31 2232 Morfologra---~----------------- -- -31 2233 Prueba de esporulaci9n----------------~2
2234 Prueba de la catalasa--------------------~------ 32 224 Prueba para determinar la especie ----------~-------- 33
225 Pruebas para determinar microorganismos probi6ticos -----34 2251 Resistancia a pH=2 y sales biliares de concentracl6nO3piv --34 226 Conservacion ------------~-----------------35
227 Elaboraci6n de la bebida fermentada ---------35 2271 Pr~paraci6n de Ie muestra ---------------~----35 2272 Adici6n del Inocula ----~-------------------36 2273 Control de Ie fermentaci6n=~~~==~~-------------36
2274 Refrigeracion ------- ~-- ---- -------36 2275 Batido--~ ------------------------------------37 2276 Envasado y almacenamiento------------ 37 228 Determinacion del pH------- ---------- -----39 229 Determinacion de la acidez (Expresada como acido lactico) -39 middot2210 Prueba de viabiJidad ------~-------~----------39 2211 Am3lisis microbiol6gico de las bebidaslacteas(con ysinavena) -40 2212 Anslisis estadistico ~-~~-~---------=------------40
3 RESULTADOS Y DISCUSI6N-~------------------------------ --42
31 Coloraci6n de Gram y morioJpgfa --001-------- - -----42
32 Prueba de esporufacion y catafasa-----------------42 33 Prueba para determinars especie- -------- ---44 34 Pruebas para determiner microorganismos probi6ticos -----45 35 Seguimiento del pH en la bebida h3ctea con y sjn prebi6tico-----49 36 Seguimiento de la acidez expresada como de acidb lactico -----51 37 Prueba de viabiJidad-------- ----------54 38 Analisis microbiol6gicos de las babides lacteas con y sin avena --56
4
5
REFERENCIA~ BIBLIOGRAFICAS --~-------------middotmiddot---- ---------60
LISTA DE TABLAS
TABLA 1 ALGUNAS ESPECIES MICROBJANAS PROB16TICAS-------------~------middot15
TABLA 2 FueNTE De AISLAMIENTO DE CePAS NATJVAS --------------29
TABLA 3 RESULTADO DE PRUEBA DE ESPORULACI6N------------------43
TABLA 4 RESULTAOO PRUEBA DE LA CATAlASA ----------------------44
TABLA 5 ReSULTADO IOENTIFICACION CEPAS--------------------middot-----45
TABLA 6 ReSULTADOS APRUEBAS DE RESISTENOIA A pH=2 YSALES BILtARES 03 Pv
-----------~-- ----------~--46
TABLA 7 ReSUtTADO pH YOGUR SIN AVENA ----------------49
TABLA 8 ReSULTADO pH YOGUR CON AVENA ------------ --49
TABLA 9 COMPARACION DE MEDIAS PARA pH----------------------50
TABLA 10 ReSULTADO DE ACIDEZ (EXPRESADO COMO ACIDO LACTICO)-------51
YOGURT SIN AVENA ------------------------------51 TABLA 11 ResuLTAOo oJ ACIOEZ (EXPRESAOO COMO ACIDO ACTICo)----52
YOGURT CON AVENA--- ------------------- --- ----52 TABLA 12 COMPARACION DE MEDIAS PARA ACIOEZ----------------~~53
TABLA 13 RecuENTo DE LACTOBACILOS (UFCML) YOGHURT SIN AVENA--54
TABLA 14 RECUENTO DE LACTOBACILO$ (UFCML) YOGHURT CON AVENA ------54
tABLA is COMPARACl6N MEDIAS LOG LAcToBACltLUS-------------56
TABLA 16 RESULTADOS ANALiSIS MICROBIOL6GICO------------- --57
L1STA DE FJGURAS
FIGURA 1 CAMARA DE ANAEROBIOSIS----------middot------~----27
FIGUftA 2 CePAS EN TUBOS CON AGAR INCUNADO -----~--middot----------30
FIGURA 3 COLONrASAISLADAS EN AGAR MRS-------middot---------31
FIGURA 4 API CHL 50-PRUEBA sloaufMlcAS ------------- bull --33
FIGURA 5 DtAGRAMA DE FLUJO ------~---------- ----~-38
FIGURA 6 LACTOBACILLUS I3REVIS GRAM + AfSLAOA OE LECHE FERMENTADA------47
FIGURA 7 LACToBACILLUS BFEVS A1SLADA OS lECHS FERMENTADA DESPUES DE LA
PRUEBA DE RESfSTENCIA A pH=2 ----------------------~ - middot-48
fIGURA 8 LAcTOBAcILLUS BREVIS AISLADA DE LECHE FERMENTADA OESPUES DE LA
PRUEBA DE RESISTENCJA A SALES BILIARES 03 pN------------- ----48
FIGURA 9 COMPARACI6N DE MEDIAS PARA EL pH ---------- ---------50
FIGURA 10 COMPAAACI6N DE MEDIAS PARA LA AC1DEZ ----------------52
FIGURA 11 COMPARACI6N DE MEDIAS PARA LOG LAcTOBAcILLUS -------------55
LISTA DE ANEXOS
ANEXO A--- RESUl TADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AfSLADA DE
ANEXO B RESULTADO PRUEBAS BIOQUfMICAS DE CEPA AISLAOA DE
REPOLLO FERMENTADO --middot----------middot--------------------------68
ANEXO c RESULTADO PRUEBAS BIOQUIMICAS DE CEPA AISLADA DE
MUCOSA HUMANA ------------------------------------------ ------69
ANEXOD RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMCAS DE CEPA AISlADA DE
LECHE FERMENTADA---------------------------------------_-70
ANEXO E RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AtSLADA DE
REPOLLlTAS DE BRUSELAS tERMENTAOA ------------------------71
ANEXO F ANAUSIS DE REGRESION PARA pH EN BEBIDA SIN AVENA--- 72
ANEXO G- ANAUSIS DE REGRESION PARA pH EN BEBIDA CON AVENA --73
ANEXO H ANALISIS DE REGRESION PARA ACIDEZ EN BEBIDA SfN AVENA
ANEXO 1- ANALISIS DE REGRES[ON PARA ACIDEZ EN BEBIDA CON AVENA
ANEXO J- ANALISIS DE REGRESION PARA RECUENTO LACTOBACILOS
PARA 8EBItgtA SIN AVENA ~----------------------------------------wirEr
ANEXO K ANALlS1S DE REGRESION PARA RECUENTO LACTOBACILOS
PAFt BEBIDA CON AIlNA-------~-------~----------~------~---middot-----~-middot---irjr
INTRODUCCI6N
En los ultimos arios S9 ha comprobado los efedoS beneftcos que los
microorganismos probiotico$ ejercen sobre la salud humana a facilitar la digestion
de lactosa estimular 18 actividad inmungica modificar ef balance poblecional
tanto de la microbiola intestinal nativa can posibles sfeelos patogenos como de
las que causan toxiinfeCCiones alimentarias edemas se estan ensayando como
implante en heridas de piel para evttar contamlnacion can microorganismos
patogenos
Los microorganismos probi6ticos se emplean en fa elaboraci6n de productos
fermentados en especial los lacteos Estas industrias se han limitado a utilizar
cultivos iniciadores importados que rsquieren tiampo y culdados para su
manlpulacion y empleo En Colombia no se han realizado InY9s1igaciones que
involucren cepas nativas can activldad probiotica ni el afecto de ingredientes
prebi6tico$ sabre fa viabilidad de estos microorganismos tenienqo en cuenta que
al prebiotico es un ingrediente allmentario que estimula sefectivamente el
crecimiento y actividad de algunas especies de microorganismos probi6ticos
En esta investigacion se sislaron microorganismos probi6ticos a partir de
muestras de vegetales y lache crud a de vaca fermentadas naturafmente y de
mucosa humana utifizando medios de cultivo salactivos bajo condiciones
12
anaerobias Luego se procedio a verificar su rasistencia a los acidos gastricos y
sales biliares simulando asl las condiciones del tracto gastrointestinal de 10$
humanos Las capas que presentaron mejor comportamiento ante estas pruebas
sa caraeterizaron morfologles y bioquimicamente y sa seleccione una de eHas
para inocular en bebidas lacteas sin y can avena como ingrediente prebiotico y
verificar su viabilidad durante al almacenamiento
Los resultados de esta investigacion padren sar de gran irnportanoia para la
industria nacional de alimentos las univarsJdades con facultades relacionadas
can la salud y la alimentaci6n y para las entidades gubernamentales involucradas
en la alimentacion y nutricion de grupos de poblacion vulnerables tales como eJ
Instituto de Bienestar Familiar y Bienestar Social entre otros
13
middot~
1 MARCO TEORICO Y ESTADO DeL ARTE
11 P~OBI6TICOS
111 Historia
EI consumo de productos fermentados lecteos con microorganismos vivos
especialmente bacterias acido lacticas ha sido reportado a 10 largo de la historia
desde tiempos remotos se evidencia al conoeimiento de los beneficios que estes
proporcionaban perc real mente quian enfatiz6 en ellos fua 91 cienUfico ruso Elie
Metctinikcff que reaclon6 la ingesti6n de (eches fermentadas con la longevidad y
salud de las personas ( Pardio et al 1996)
En 1965 sa utilizo por primera vez et termino Probi6tico derivado dellatin pro
que significa a favor de y del gr9go bios que quiera decir vida tnieialmente esta
palabra defini6 a los microorganismos que promovian el erecimiento de otros
microorganismos Ivego se splico asta termino a extraetos de tajido que estimlilan
el crecimiento micrObianqEn la actuaidad sa han definldo como probiotieos los
cultivos (micas 0 mezclados de microorganismos vivos qua al ser ingeridos por
humanos Q animales majoran el balance poblacional de la microbiota intestinal
evitando la adherencia de patogenos (Schrezenmeir et albull2001) Sin embargo
estos microorganismos no nece_iamenta son habitantes propios del tracto
14
gastrointestinal (Holzapfel at a2001Gaitan at al 1998) p~r 10 tanto es
necesario consumir alimantos en los que se encuElntren estos mrcroorganismos
viables estos hacen parte de I~micfobiota de vegetales y leches interviniendo en
Ie fermentaci6n natural de estos~ntos
112 Microorganismos Probi6ticos
los microorganismos probi6ticos que tradicionatmente se han adicionado a la
tache para fermentarla y obtener yogurt y kumis a como suplementos pertenecen
a los generos Lactobacillus Enterococcus y Bifidobacterium (Ver tabla Nro 1) Sin
embargo se considera que solo algunas especies de los gelnsros Lactobacillus y
Bifidobacterium sobreviven en el tracto gastrointestinal En la tabla 1 58 muestran
algunas de estas especies
TABLA 1 Algunas especies microbianas probi6ticas
Lactobacillus Sifidobacferium Enterococcus
L acidophilus
L JohnsoN
L casei
L rhamnosus
Lgrasseri
L reuten
L plantarum
B bifidum
Blongum
B infantis
E fsecium
E faecalis
Fuente Gaitan et a 1998A
15
EI eonoeimiento a cerea de sus efeetos beneficos en el consumidor por su alta
viabilidad en el intestino como la producci6n de sustancias con aetividad
antieaneerigena el mejoramiento ltfel sistema inmunol6gico y el deSplazamiento
de la mierobiota pat6gena gastrointestinal en el consumidor ha estimulado una
mayor demanda de estos microorganismos como tambian de los productos que
los contienen (Heller 2001 Parada middot1998)
Existsn otros produetos fermentados de origen vegetal como et tampe col acida
y salsa de soya de los euales sa pueden aislar estos organismos probi6tieos
comp tambien de la mucosa intestinat humana y luego de suministrarlos a
ratones sa han comprobado sus caracteristicas beneficas (Molin 2001)
113 Caracteristicas fenotfpicas de algunos microorganismos
probi6ticos
las bacterias aeido lacticas de los generos Lactobacillus y Bifidobacterium son
consideradas probi6tieos y tradicionalmente se han clasificado con base en Sus
propiedades morfol6gicas crecimiento a diferentes temperaturas capacidad
fermentadora de glucosa y otros carbbhidratos y la configuraci6n del Bcido Jaetieo
producido (Holzapfel etal2001)
16
)lli~ h Dx nIILIOTECM
eJDe~~ l1ilmfJ tIDBnm
Los Lactobacillus son bacilas gram positiv~s no esparuladas aerotalerantes
acido - tolarantes estrictamente fermentadares formadores de Boido laclica como
producto principal catalasa negativo carentes de citocroma sin embargo se
presentan excepciones a esta descripcion parque afgunas especies pueden
formar catalasa 0 citacramo en medios que contienen hematina 0 compuestos
relacianados La produccion de catalasa no hema pseudocatalasa puede causar
tambien alguna confusion en fa identificacion de algunos Lactobacillus
las especies del genera Bifidobacterium san bacilos gram positivos no
esporulados generafmente anaerabios estricto$ aunque pueden creeer bajo
condiciones microaer6filas cuando estan ert presencia de C02 La mayorfa de sus
especies se pueden diferenciar par criterios biaquimicos simples como la
fermentacion de L arabinosa DmiddotxiJasa O-manosa O-manita y O sorbitat que
pueden servir coma caracterist1cas clave para su clasificacion (Holzapfel
etal2001 )
114 Caracteristicas de los probi6ticos
Las cepas de microorganismos prabi6ticos deben presenter y mantener unas
caracteristlcas que garanticen su crecimienta y supervivencia En el alimenta
como tambiEm durante su transito a traves del est6maga e intestino delgaQo
17
La primera CBtacterfstica es que sean viables esta viabifidad esla capacidad que
tienen los microorganismos probi6ticos de permanecer vivos tanto ~n el alimento
como en el Intestino del consumidor por un tiempo determinado En Colombia se
ha establecido que en bebidas fermentadas este tiempo debe ser minimo de 21
dras en el alimento (Minsalud 1986) Esta vjabilidad depende del metodo de
produccion y de la cepa utilizada (Tuomols at a 2001)
Luego de que se garantice que estos microorganismos eslan viVos en el alimento
ell os deben cumplir otro criterio importanle para ser considerados como
organismos probi6ticos y as tblerar las condiciones de acidez a un pH=2 y la
sccian de proteasas del est6mago ademas de sobrevivir y creeer en presencia de
acidos biliares (Tuomola et al 2001 Jacobsen at a 1999) para luego de
sobrevivir a estas condiciones adherirse a la mucosa intestinal y de esta manera
estimular al sistemainmunoJ6gico esta capacidad de adherirse a la mucosa es un
prerrequisito para la colonizacion del intestlno (Toumola etal2001 Alander et aI
1999)
Cuando los probioticos han pasado todas esta pruebas de supervivencia y luego
de impfantados en la mucosa producen acidos organicos peroxido de hidrogeno y
tambien bacteriocinas que actUan como inhibidore$ del crecimiento de
microorganismos patogenos u oportunistas (Tuomola at al 2001 Cintas et al
2000) complementando de asta manera su accion benefica sobre la mucosa
intestinal y en general sobre la saJud del huesped
18
116 Berieficios de los microorganismos probi6ticos
Los beneficios que se asocian a los microorganismos probioticos son muchos y
variados Entre ros comprobados mediante estudios se eneuentran
1151 Facilitar la digesti6n de la lactosa
los microorganismos probioticos cuando estan en el intestino liberan alii la
enzima pmiddotgalaotosidasa capaz de hidrolizar la lactosa haste glucosa y galactosa
evitando as que personas intolerantes a este carbohidrato presenten sfntomas
como flatulencia dolor abdominal y diarrea cuando consumen leche (be Vresse
et 81 2001)
1152 Protegen contra enfermedades gastrointesUnales
EI consumo de aJimentos con probioticos ha mostrado efeeto terapeutico frente a
los sintomas de diarrea asociada al surninistro de antibi6tico$ de amplio espectro
que destruye 0 disminuye la microbiota endogena esta imp ide la coJonizacion de
bacterias patogenas como Klebsiella oxytoca y Clostridium difficile que pueden
causer lesiones en el cn Los probi6ticos recuperan el balance de la microbiota
intestinal nativa y avitan Ie adhesion de algunos virus bacterias pat6genas a
parasitos que pueden ser agentes causales de gastroenteritis la diarrea del
19
J
viajero y 1(3 inflarnacion intestinal que en ultima instaneia oeasionan ef sfndrome
del colon irritable (Marteu et al 2001)
1153 Protegen contra infecciones del tracto urogenital
La vaginitis indueida por baeteriss yo por levaduras as una infecci6n
estrechamente relacionada con la exposici6n a antibi6ticos y espermicidas y
tambien depende del estado hormonal de la n1ujar Con al uso de mezcJas de
probi6ticos se han obtenido buenos resultados en la rastauraci6n de la rnicrobiota
natural urogenital benefica que desplaza a los eausantes de la inflamaci6n de Is
vagina y Ie uretra (Reid 2001 )
1154 Promueven la barrera de defensa end6gena del intestino
EI tracto gastrointestinal normal mente as una barrera natural contra anUgenos de
origen microbiano y alimentario Cuando los probi6ticos sa adhieren a Is mucosa
intestinal estimulan 0 potencian al sistema inmune favoreciendo la
inmunomodulaci6n que induce un aumentb de fa producci6n de inmunoglobulinas
activacion de las calulas mononueleares y de los linfocitos para proteger al
huesped de infeeciones (Isoulari et sl 2001)
20
1155 Protegen contra cancer de colon
EI cancer es el resultado de una serie de mutaciones somaticas que pueden
ocurrir durante al tiempo de vida del individuo y 10 padeca buena parte de la
poblacion mundial los probi6ticos en un sistema in vitro han demostrado un
efecto positivo en la prevenci6n de mutaciones aI desactivar carcin6genos
genotoxicos (Wolloswski et al J 2001)
1156 Protegen contra infecciones respiratorias
Sa ha demostrado que el conslJlno de probi6ticos disrninuye la incidencia de
infecqiones raspiretorias al aumentar la actividad fagocitica de maer6fagos
alveolares que aettian sobre microorganismos patogenos Se hizo un estudio en
571 ninos sanos con edades entre uno y seis anos divididos en dos grupos a uno
de ellos sa las incluy6 en su dieta leche suplementada can Lactobacillus GG y a
los otros ninos leche no suplementada AI final del estudio se observ6 una
disminucion del 19 en la incidencia de infeccionas respiratorias tratadas con
antibi6ticos tales como otitis media sinusitis bronquitis y neumonfas en el grupo
de los ninos que consumieron Lactobacillus GG (Hatakka et al 2001)
Alvarez et al (2001) encontraron que la administraci6n de yogurt con Lactobacillus
casei en ratones de tres arios de edad majora los espacios libres del puJrn6n de
la presencia de Pseudomona aeruginos8 induciendo un aumento
21
significativo en los niveles de gA a IgM datactadas en los lavados
broncoaJveolares y se observ~ un afecta dependiente de la dosis
1157 En el tratamientoy prevenci6n del eczema
Se ha encontrado que el consumo de probi6ticos mejora la inflamaci6n alergica 0
eczema at6pico en ninos alimentados con formula suplementada con probi6ticos
Encontraron una mejora significativa al suministrar Bifidobacteriummiddot actis y
Lactobacillus GG en 27 niiios con edad promedio de 46 meses Luego de aplicar
este tratamiento se sometieron a una prueha de SCORAD (mide fa extension y
gravedad del eczema) registrando una meJoria significatlva en las condiciones de
la pie concentraci6n de citoquinas cirClllantes an sueto y moleculas de adhesi6n
a las superficies de las celulas soJubles en suero (Isolari 2000)
Se realizaron otros estudios a 159 mujeres embarazadas con historia familiar de
eczema atopico de primer grado a las cuafes sa res 5uministro dosis diarias de
Lactobacillus GG durante 2 a 4 samanas previas al parto Oespues de ella fa
madres twiaron la opci6n de continuer tomando el ptobi6tico si amamantaban 0
bien darseio vIa oral La mayoria de las madras eJigieron dar las dosis at bebe
diariamente A los dos anos de vida se observ6 una disminuci6n del 50 en la
frecuencia del eczema at6pico en aquellos nHies que se les dio ef probi6tico
(Kalliomari etal 2001)
22
1158 Previenen infeccion en heridas quirurgicas
Los probi6ticos impiden la union de pat6genos a las superficies celulares en
heridas mediante la seCreci6n de proteinas Actuamente se encuentra en
estudio la aplicaci6n del Lactobacillus fermentum vivos sabre heridas en piel de
ratas y se ha encontrado una disminuci6n del 90 en la colonizaci6n par parte del
StaphylococcuS aureus uno de los patogenos mas temidos y de mayor lncidencia
en infecciones hospital arias mas aun se esta contempiando la posibilidad de
utilizar la protein a purificada an lugar de los mjcroorganismos para la protaccion
contra infecciones en heridas (Strauss 2000)
12 PREBIOTICOS
Son carbohidratos de cadena corta algunas veces reconocidQs como
oligosacaridos no digeribles par las enzimas del epitelio intestinal 0 de las
gliJnduJas anexas debido a su estructura quimica y de esta manera lIegan al
intestino grueso donde alcanzan a estar disponibles para la fermentaci6n por las
bacierias sacaroHticas que son especial mente laetobadlos y bifidobacterias
dando odgen a compuestos que ejercen efectos funcionales sobre la mucosa del
tubo digestivo (Brunser 2001)
Se consideran como tal algunos fructocligosacaridos isomaltooligosacariclos
oligomato palatinosa poHdextrosa pOJidextrrna raftilina y algunos oligosacaridos
23
)
de 1a soya y fa avena Estenmiddot presentes en alimentos como Ie cebolla ajo
banano puerros 1 derivados del trigo achicoria esparrago alcachofa (Cummings
etal 2001)
Algunos de estos prebi6ticos cuanda son incorporado$ a fa dieta en cantidades
dalerminadas alteran la microbiota intestinal disminuyendo los recuentos de
coliformes bacteroides y cocos y aumentando las bifidobacterias hasta en diez
veces ademas modifican la actividad metab6lica del coron logrando una
disminuci6n del pH y un incremento en el contenido fecal de acidos grasos de
cadena corta como at acatica propi6nico y butfrico El butirato aumen~ _I grosor
de la pared del coron e intestino delgado estimula eJ crecimiento de la mucosa del
colon y auManta su flujo sangufneo inhibe el crecimiento de tinsas tumorales
epiteliales de origen co16nico induce la diferenciaci6n de sus celulas y a
apoptosis entre otros(Brunsar 2001)
Eh estudios hechos en simuladores del intestino humano utilizando productos de
avena fermentados se encontro que estimularon al crecimiento tanto de
lactobacios como de bifidobacterias y en el caso de estas ultimas se incremento
la producci6n de los acidos acatico propionico y butfrico 10 que incide sobre la
implantacion de probi6tico$ e inhibe al crecimientos de otro tipo de
microorganismos (Alal1der eta1999 Kontula etal 1998 Jaskari etal 1998)
24
~ -1
(
AI comparar el comportamianto de las leches de diferente origen se ha
demostrado que Ie leche de vaca contiene caseinatos sustancias que forman
buffer ~n et intestino e inlpiden que los probi6ticos disminlJyen el pH del intestina
y de esta manera se impide al efecto deseado que es evitar fa proliferaci6n de
otros microorganismos entre los cuates pueden estar algunos patOganos En la
leche materna sa encuentran algunos carbohidratos como glucosa galactosa n
acetilglucosamina y algunos 0lig6meros de Ie fucosa en cOhoontracionesmiddot
importantes los cualeS favoreceh el crecimientc)middot de probi6ticos esto
complementado can 91 bajo contenido de protenas que se traduce en una
reducida capacidad buffer hacen de Ie lache materna IJn alimentd adecuado para
nllios en su etape de lactancia
Algunos prebi6ticos como 1a lactulosa yciertos compuestos que contiansn fructosa
no son digeridos en el intestino humano y pueden sar utilizados selectivamenta
par los probi6ticos 10 que hace que los probi6ticos en combinaci6n can prebi6ticos
pueden lIegar a ser un importante medio para prevenir algunas enfermedades del
tracto gastrointestinal (Bezkorovainy 2001)
25
2 METODOlOGfA
21 LOCALIZACION
EJ trabajo sa realizo en el laboratorio de Microbiologia y la planta da laches de Ja
Universidad Naclonal de Colombia- Secie Medellin
En al laboratorio se hiZQ al aislamiento a identificaci6n de fa capas y en fa Planta
sa eJaboro la leche fermentada con 1a cepa seleccionada y el prebi6trco
22 METODOS
221 Aisiamiento de cepas nativas
Las cepas nativas se sislaran de producto$ vegetales leches fermentadas y
mucosa vaginal humana
2211 De vegetales
Las muestras vegetales de repollo repollitas de brusefas y pepino se
seleccionaron porcionaron y mezclaron can cloruro de sadio al 10 pIp se
calacaron en un recipienta de vidrio balo anaerobiosis y sa dejarQn por 15 dias
26
luego S9 tomaron 3 ml de cada muestra y se jnocularon 9 ml de caldo MRS (Man
Rogosa and Sharpe) se incubaron a 37deg C durante cinco dias en camara de
anaerobiosis (Ver Figura 1) Oespues de este tiempo sa inocularon cajas de petri
con agar MRS con 1 ml del cultivo microbiano y se incubaron bajo las mismas
condiciones que eJ caldo Este procedirniento se realiz6 rapetidas veces hasta
seleccionar la cepa pura mediante observaci6n de caracteristicas morfologicas de
la cOlonia y a cada colonia se Ie practico la coloracion de gram con el fin de
observar las caracteristicas microscopicas de cada una e identificar las de mayor
similitud a los Lactobacilos y Bifidobacterias
Figura 1 Camara de anaerobiosis
27
2212 De la leche
Sa tomo 200 ml de teche cruda de la planta de leches y se colaca a fermentar
baja anaerobiosis durante 15 dras Luego sa procedia como en los vegetales
2213 De mucosa vaginal humana
Se tomo una muestra de frotis de mucosa vaginal humane can capito esteril sa
puso a ncubar en Caldo MRS y se procedi6 camo en 2211 y 2212 A cads
aislado sa Ie practico la coloracion de gram y sa seleccionaron aquellas que eran
bacilos gram positivos (Ver Tabla 2)
28
TABLA 2 Fuente de aislarniento de cepas nativas
CEPA FUENTE
1 Pepino fermentadQ
2 repollitas de bruselas fermentadas
3 Repolltgt fermentado
4 Repollo fermentado
5 Mucosa va~inal humana
6 Mucosa vaginal humana
7 repollitas de bruselas fermentadas
8 Repollo fermentado
9 repollitas de bruselas fermentadas
10 Mueo~a vaginal humana
11 Repollo fermentado
12 RepolJo fermentado
13 Leche fermentada
14 Mucosa vaginal humana
15 repollitas de bruselas fermentadas
16 Repollb fermentado
29
222 Almacenamiento de las cepas aisladas
Cuando las cepas crecieron en agar MRS homogEmeas en color morfologia
coloraci6n de Gram etc se pssaron a agar inclinado en tuba se cubrieron con
aceite mineral y se guardaran en refrigeraci6n a 4deg C para tomar de alii la cepa y
efectuarle las diferentes pruebas para confirmar el genera y determinar la especie
de cada una de eas (Ver Figura 2)
Figura 2 Cepas en tubos con agar inclinado
30
223 Pruebas para determinar et genero
2231 Coforaci6n de Gram
A cada cepa sospechosa de Lactobacilos se 1e hizo la coloraci6n de gram y se
seleccionaron las gram positivas
2232 Morfologfa
En agar MRS y despues de incubar en anaerobios~s crecian colonias grandes
cremosas de color beige con bordes homogeneos y c6ncavas(Ver Figura 3)
Figura 3 Colonias aisladas en agar MRS
31
2233 Prueba de esporulaci6n
A cada cepa aislada se Ie hizo esta prueba la cuel consistia en incubar en
aerobiosis durante ocho dias las cajas de agar MRS donde crecieron colonias de
Lactobacilo$ y luego se les (ealize) coloraci6n de espora Las capas que dieron
negativa a la prueba de espora se considararort sospechosas de sar Lactobacilos
y se continuo con la prueba de la catalasa (Ver Tabla 3)
2234 Prueba de la catalasa
los lactobacilos carecen de catalasa Eata prueba se hizo tomando una colonis
se deposito en vidrio de reloj y se Ie adicion6 dos gotas de peroxida de hidr6geno
(H202) la que no presentaba efervescencie eran cepe sospechosa de ser
Lactobacilo (Ver Tabla 4
Sa seleccionaron las capas euyo resultado fue aeorde con el genera Lactobacilfu$
y se continuo con la comirmaeion del genera y determinacion de la eSpecie
meqiante las pruebas bioqulmicas
32
224 Prueba para determlnar la especie
Para confirmar el genero y determinar la especie de las diferentes capas aisladas
se hizo una caracterizaci6n bioqufmica utilizando un kit de API 50 CHL Medium
Ref 50 410 que contiene una galed8 de medios que permite realizar el estudio
de fermentaci6n de los 49 azucares de 52 especies de Lactobacillus (Ver Figura 4
y tabla 5)
Figura 4 API CHL 50-Prueba bioquimica
33
225 Pruebas para determinar microorganismos probi6ticos
2251 Resistencia a pH=2 y sales biliares de concentraci6n O3pv
A las cepas idantificades como Lactobacillus brevis y Lactobacillus pantarum sa
las realiz6 Ie prueba dfl resistencia a pH=2 y sales biliares de concentraci6n 03
pv ( Jacobsen et al 1999) Una colonia de cada cepe aislada se inocul6 en 4 mt
de caldo MRS durante cinco dras bajo condiciones de anaerobiosis Oespues de
esta tiempo se dejaron pracipltar los microorganismos por sedimentaci6n se Ie
retire el sobrenadante y al precipitado se Ie adicion6 Sml de caldo MRS
previamente ajustado a pH=2 can seido clorhfdrico (HCI) dentro del mismo tuba de
ensayo G igual sa hizo can otro tubo previamente incubado pero a este se Ie
adiciono 5ml de caldo MRS con sales biliares a una concentra~i6n de 03 plv y
ambos se incuberon a 37deg C por 2 haras Sa midio 01 mi de cada uno de los
tubas al tiempo 0 y a las 2 horas y sa inoculeron en superficie en caJas de petri
con agar MRS S9 incubaron a 37deg C bajo anaerobiosis durante 48 horas Se
compararon visualrrente en cada caja de petri el crecimiento en superficie y las
que presentaron crecimiento en tos dos tiempos (0 y 2 horas) tanto en at media
acido como en sales I se consideraron resistentes a pH=2 y sales biliares (03
pv)
(Ver Tabla 6)
34
226 Conservacion
Todas fas capas que habian dado positiva Jas pruebas anteriores y que reaultaron
resistentes a pH=2 y sales biliares 03 pv y despues de identificadas en API 50
CHL sa repicaron en agar MRS en tuba inclinado y despues de Incubar a 37deg C
por 48 horas bajo anaerobiosis se Ctlbrie el biser completamente can aceite
mineral esteril y sa guardaron en refrigeraci6n
227 Elaboracj6n de fa bebida fermentada
2271 Preparaci6n de la mue$tra
Sa tome 1 mt de caldo MRS previamante inoculado e incubado que presentaba
una concentracion de Lactobacillus brevis de 27x108 Iml segun la escaJa de Mac
Farlan y sa adiciono a 9ml de leche pasteurizada en un tubo sa dej6 incubanda
en anaerobiosis por 48 hores Luego se pasaron estos 10 ml a un frasco qua
cont~nie 90 ml de leche pasterizada y se dej6 incubando par 48 haras en
anaerobiosis
35
2272 Adici6n del inOculo
A 900ml de leche pasteurizada se Ie adicion61os 100 ml de leche que habia sido
previamente ino(ulada dos veces con la cepa posteriormente se deja
fermantando la lache a temperatura de 37deg C
2273 Control de Ja fermentaci6n
Las muestras se hicieron por cuadruplicado y se les hizo un seguimiento de
aoidez hasta un valor entre 04 y 05 expresada como Bcido lactico esta
procedimiento corresponde a la babida fermentada sin prebi6tico La bebida ~on
prebi6tico tiene al mismo proeedirnianto pero adicionalmente se agrag6 avena a
una concentraci6n de 05 en el momento de la adici6n del in6e410 a los 900 ml
de leehe pasteurlzada y el procedimiento sigui6 igual al de la bebida sin prebi6tico
tambien se hizo por cuadruplicado
2274 Refrigeracl6n
Despues que las mezclas con y sin prebiotico alcanzaron el de acidez
requarido se IIeva ron a refrigeraci6n a una temperatura de 4deg C p~r 24 horas
para frenar proce~os metab6licos de los microorganisrtlos Despues de este
ti~mpo se procedi6 al batido
36
1 2275 Batido
Con un agitador se procedi6 a batir las bebidas para romper et coagulo formado
y de esta manera homogeneizar la mazela y obtener asf la bebida fermentada
2276 Envasado y almacenamiento
Ambas bebidas se envasaron en frascos vidrio para hacerles seguimiento de pH
acidez(expresado como acido tacticol y recuento de Lactobacillus breviSf los
dies 27 14 Y 21 despues de elaboradas las bebidas perfodo durante el cualta
muestra permanecfa afmacenada a temperatura de refrigeracion(Ver Figura 5
37
Fjgura 5 Diagrama de Flujo
PREPARACION DE LA MUESTRA
ADICION DEL INOCULO
~_____~_B~ATIDO~______~
INCUBACION 37deg C hasta acidez = 04-05 acido laotico
ENFRIAMIENTO
hasta 4 0 C ~------~ ~------~
ENVASADO Y ALMACENAMJENTO
dUrante 21 dfas a Temperatura 4 0 C
38
1
228 Determinaci6n del pH
Se determino por el metoda potenciometrico en un pH-metro manual durante los
dias 2) 7 14 Y 21 de las bebidas lacteas sin y con prebi6tica (Ver Tablas 7 y 8)
229 Oeterminaci6n de la acidez (Expresadfl como acido
lactica)
Se tomaron 9 mJ de las bebida~ sa Ie adicionaron 2 gotas de fanoftaleina como
indicador y sa titulo fa acidez con NaOH 01 N hasta la aparicion de un cotor rosado
debit EI volumen de NaOH utilizado se reporta como valor de de acidez
(VerTablas 10 y 11)
2210 Prueba de viabilidad
Qurante el perfoda de almacenamiento de la bebida lactea se procedi6 a hacer la
prueba de viabiHdad en los dias 7 14 Y 21 para determinar Si los lactobacilfus
permanecfan vivOs a una concentraci6n minima de 106 hasta el dia 21 como 10
establece eJ Articulo 10 de la Rasolucion 2310 del Ministerio de $alud de
Colombja
39
Para asta prueba se tamaron 10 rnl de muestra y se adicionaron a 90 ml de caldo
MRS ruego a partir de esta se hicieron diluciones de 10-2 hasta 10-11 de las
diluciones 109101deg 10-11 se inocul6 1 ml de cada uno en agar MRS siguiendo el
metodo de siembra en profundidad y por duplicado e incubando a 370 C x 5 dras
en anaerobiosis y luego se hicieron tos recuentos por duplicado para esi reportar
los recuentos promedio (Ver Tablas 13 y 14)
2211 AniUisls microbiol6glco de las bebidas Iicteas(con y sin
avena)
Con el fin de determinar las condiciones higienico-sanitarias del producto se
realizaron las pruebas microbiol6gicas de Recuento de mohos y fevadurasml en
agar OGY Recuento en superficia de Staphylococcus coagulasa positivoml en
agar Baird Parker Numero Mas Probable (NMP) de coUfor-mes totales y
Escherichia coliml en caldo Fluorocult y Presencia de Salmonela25ml con BHI
caldo tetrationato y agar Hecktoen (Montoya 1999)
(Var tabla 16)
2212 AnaUsis estadistico
A los datos obtenidos en la medici6n de pH acidez (expresada como Beido
laclico) en los dras 2714 Y 21 y el recuento de Lactobacillus en los dras 714 y21
40
realizados a los dos tratamlentos se tes aplic6 1a prueba t porque solo difieren
en la presencia 0 ausencia del prebi6tico para evaluar si habra diferencia
estadfsticamente significativa para los dos tratamientbs(Ver Tablas9 12 y 15)
41
3 RESULTADOS Y DISCUSION
31 Coloraci6n de Gram y morfologfa
Las cepas aisladas fesultaron Gram positivas (Ver Figura 6) colonias grandes
cremosas dE) color beige con bordes homogeneos y c6ncavos en su
morfologia (Ver Figura 3) resultando de acuerdo a 10 especificado en Stanley
1989 para Lactobacillus
32 Prueba de esporulaci6n y cataJasa
Los resultados de la pruebas de esporulaci6n y catalasa indicados en las
Tablas 3 y 4 respeclivamente dieron conforme a 10 especificado en Stanley
1989 para Lactobacillus
42
1
2 3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
TABLA 3 Resultado de prueba de esporuJaci6n
CEPA RESULfADO ESPORULACION
-- -------------
43
l i ~II bull ~ I I
TABLA 4 Resultado prueba de la catalasa
CEPA RESULTADO CATALASA
1 -2 -3 -4 -5 -6 -7 8 -9 -10 -11 12 -13 -14 -15 -16
3~3 Prueba para determinar la especie
Oespues de hacer las pruebas para seleccionar las cepas sospechosas de ser
Lactobacillus se realizo las pruebas bioquimicas fograndose identificar
Lactobacillus plantarum aislctdo de pepino repollo y repollitas de bruselas
44
fermentados y Lactobacillus brevis de mucosa vaginal y leche fermentada (Ver
Anexos del A al E y Tabla 5)
TABLA 5 Resultado identlficaci6n cepa~
CEPA NOMBRE
1 Lactobacillus planfarum
3 Lactobacillus plantarum
5 Lactobacillus brevis
13 Lactobacillus brevis
15 Lactobacillus plantarum
34 Pruebas para determinar microorganismos probi6ticos
las cepas de Lactobacillus brevis y Lactobacillus plantarum mostraron
rasistencia al medio acido de pH =2 Y sales biliares 03 pv resultado similar al
encontrado por Jacobsen et al 1999 para Lactobacillus plantarum (Ver tabla 6)
45
middot
~~~ttiI lltlmiddot~COX~dtJ ~xtc_~ 2 tr~ k-JlL~middot
-)~~TO DE lJIBUOTECUl rjRL]OTtCA twn GO1IU1
TABLA 6 Resultados a pruebas de resistencia a pH=2 y sales biliares 03 plv
CEPA RESISTENCIA pH=2 RESISTENCfA A SALES BIUARES ()3 pv
1 + +
2 + +
3 + +
4 + +
5 +
6 + +
7 + +
8 + +
9 + +
10 + +
11 + +
12 + +
13 + +
14 +1shy +M
15 + +
16 + +
+1 crecimiento debil
+ crecimiento abundante
46
Figura 6 Lactobacillus brevis Gram + aislado de leche fermentada
Ai observar en placa las celulas de lactobacilos despues de real1zar las pruebas
de resistenCia a la acidez y sales biliares se observo una tendencia a aglomerarse
posiblemente como un mecanismo de proteccion cOlitra estos medios que pueden
lIegar a ser adversos para elias (Ver figuras 7 y 8)
47
Figura 7 Lactobacillus brevis aislada de leche fermentada despu~s de la prueba de resistencia a pH=2
Figura 8 Lactobacillus brevis aislada de leche fermentada despues de la prueba de resistencie asales biUares 03 plv
fI
48
35 --Seguimiento del-pH-en-la-bebidaJacteacon y sin -prebi6tico
A continuacion se muestran las Tablas 7 y 8 donde sa registian los datos
recopilados de pHdurante 10$ dras Z 7 14 Y21 para las bebidas laaeas con ysin
prebi6tioo
TABLA 1 ResultadopH yogur sin avena
Dia Repetition 1 Repetici6n 2 Repeticion 3 Repetici6n 4
2 526 501 51 52
7 446 433 438 44
14 439 435 437 436
21 439 437 438 437
TABLA 8 -ResultadopHyogur con avena
Dia Repeticion 1 Repeticion2 Repeticion 3 - Repeticion 4
2 509 523 51 515
7 447 442 445 442
14 436 -438 439 437
21 432 433 435 434
Observando la Figura 9podamos ver que el pH en el -dfado$ para los dos
tratamientos as igual y empieza a descender rapidamente para estabilizarse a
partir del dra 7(Ver figura 9)
49
Figura 9 Comparacj6n de medias para -el pH
Comparaci6n de medias para pH
55 ~ 5 +----=gtIIIi-~i~~----=-r--it~ -- pH sin avena
a 45 1--~~~~=~~ 4 --- pH con
avena35 t-----r-- -------=------=--= ------- - ----
2 7 14 21
Dias
Aplicando la prueba t para comparar las medias de pH I S6 muestia una diferencia
altamants significativa en los dos tratamientos para el dia 21 (pltO05)
(Ver tabla 9)
TABLA 9 Compaiaci6n de medias para pH
DtAS SIN AVENA CON AVENA te p (VALOR)
2 514 514 0 10
7 439 444 -1 61 0159
14 437 I
438 -070 0510
21 438 433 528 00019 shy
- DiFERENCIA AlTAMENTE SIGNIFICATIVA
50
I
AI aplicar regrasi6n a los datos sa obtiene al modelo estimado
pHSinAyena =535606 - 01505650Ia +0005044340IaI2
La variabilidad en la respuesta de pH asta siendo explicada en un 8S7522 por
el modelo (Ver Anexo F)
EI tratamiento con avena mostro el siguiente modelo al analisis de ragresi6n
pHConAvena =534463 ~ 0140407Dia + 0004480980Ia2
La variabilidad an la respuesta de pH asta siendo explicada en un 903315 par
el nlodelo(Ver anexo G)
36 Seguimiento de la acidezmiddotmiddot expresada comomiddot de acido
lactico
A continuaci6n sa muestran las Tablas 10 y 11 donde sa registran los datos
tecopilados de acidezmiddotdurante los dias 27 14 Y 21 para las pebidas taetees con y
sin prebi6tico
TABLA 10 Resuttadode acidez (expresadocomo acido tactico) yogurt sin avena
CIA R~petici6n1 Repeticion2 Repetici6n 3 Repeticion 4
2 054 06 057 058
7 072 074 073 0]2
14 080 083 082 082
21 0]4 079 078 077
51
TABLA 11 Resultado de aCidez (expresado como acido Icktico) yogurt con avena
Dia Repetici6n 1 RepetiCi6n 2 Repetici6n 3 Repetici9n 4
2 059 055 058 057
7 071 073 072 072
14 089 087 088 086
21 092 091 090 091
Observando la Figura 10 se puede concluir que la acidez empieza a aumentar
hasta el dia 14 y luego trata de estabilizarse para los dos tratamientos
(Ver figura 10)
Figura 10 Comparaci6n de medias para la acidez
N G)
Comparacion de medias para acidez
1
2 0I 5 -+--=--------=-~~~= u
ltC
- Acidez sin avena
2 7 14
Dias
52
21
-it- Acidez con avena
Aplicando la prueba t para camparar las madias de acidez se muestra una
diferencia altarnante significativa en los dos tratamiantos para los dias 14 y 21
(pltO05)
(Var tabla 12)
TABLA 12Comparaci6n de medias para Acidez
DIASmiddot SIN AVENA CON AVENA te p(VALOR)
2 0572 0572 0 10
7 0727 0720 119 0278
14 0818 0875 -638 000070shy
21 077 091 -1212 i 0000019 shy
DIFERENCIA AL TAMENTE SlGNIFICATIVA
AI aplicar r~gresi6n a los datos se obtiene el modelo estimado
AcidezSlnAIena = 0491897 + O0436032Dia O00144613DfaA2
La variabilidad en la respuesta de acidez asta siendoexplicada en un 970978
por al modelo (Ver anexo H)
EI tratamiento con avena mostro elsiguiente modeloj a1 analisis de regresion
AcidezConAvena = 0491638 + 00406572Oia - OQOO982559OiaA2
La variabilidad enla respuesta acidez esta siendo explicadaen un 99212 por
el modelo (Ver anexo J)
53
I ~
37 Prueba de viabiJidad
A continuaci6n sa muestran las Tab~as 13 y 14 donde sa presentan los datos
recopilados del recuento de Lactobacilos durante los dias 7 14 Y 21 para las
bebidas lacteas con y sin prebi6tico
TABLA 13 Recuento de Lactobacilos (UFCml) yogurt sin avena
Dia Repetici6n 1 Repetici6n 2 Repeticion 3 Reptttici6n 4
7 1880X10l1 1454X1011 1642X1011 1780X10~
14 1560X10~ 646X1011J 1890X10l 140X10l1
21 1200x10lu 128Ox10u 1745x10J 1520x101V
TABLA 14 Recuento de Lactobacilos (UFCml) yogurt con avena
Dfa Repetieion 1 Repetici6n 2 Repeticion 3 Repeticf6n 4
7 1600X10lt 1240X10t 1640X10ll 1980X10t
14 540X1011 427X10n 546X10n 720X10ll
21 500x1011 492x1011 712)(1011 980x10~
AI analizar la Figura 11 sa puede observar un recuento mayor de Lactobacilos
en al tratamiento con avena resultado de acuerdo a 10 encontrado por Alander at
aI 1999 Kontula et aI 1998 y Jaskari et aI 1998
54
Figura 11 Comparaci6n de medias para Log Lactobacillus
Comparacion de medias para log Lactobacillus
~ 1350
-+- Sac Sin--() 13 co avenaIII
bull 125 -- Bac con 0)
0 12 avenaJ
115 7 14 21
Dias
Aplicando la prueba t para comparar las medias de recuento de Lactobacillus no
se encontr6 una diferenc1a estadfsUcamente significative entre los dos
tratamientos (Ver tabla 15)
Este aumento en al racuento influy6 en la disminuci6n del pH y en el aumento de
fa aeidez por la fermentacion que realizan los Lactobacillus sobre fa lactosa de la
lache y la avena adicionada como prebi6tico
55
1
TABLA 15 Comparaci6n medias lag Lactobacillus
DIAS SIN AVENA CON AVENA tc p(VALOR)
7 122257 122022 04846 06451
14 121065 132393 -19602 00977
21 129025 133087 -08236 04416
At aplicar regresion a los datos se obtiane al modelo astimado
LactobacillusSinAvena= 117347 + 004834640Ia
La variabilidad en la respuesta del recuento de LactobaCillus ssta siendo
explicada en un 260054 por el mod$loVar anexo J)
EI tratamiento con avena mostr6 al siguiente modalo al anal isis de regresion
Lactobacillu$ConAvena =118103 + 007903040Ias
La variabilidad en la respuesta de recuento esta siendo explicada en un 3068
por al modelo(Ver anexo K)~
38 Analisi$ microbiol6gicos de las bebidas lacteas con y sin
En la Tabla 16 estan recopilados los resultados microbiol6gieos obtenidos en ras
muestras con los dos tratamientos (con y sin avena)
I [
sa
TABLA 16 Resultados analisis microbiologico
Recuento de mohos y levaduras Iml lt10
Recuento de Staphylococcus coagulase positiva Iml lt100
NMP coliformes fotales y Escherichia coli Iml lt3
Presencia de Salmonella25ml Ausente
Los resultados de este analisis demuestran que las bebidas fermentadas con y
sin avena~ astan fibres de microorganismos patogenos
57
1
4 CONCLUSIONES
Se aislaron cepas nativas de Lactobacillus plantarum de las muestras vegetates
de repollo pepino repollitas de bruselas fermentadas y Lactobacillus brevis de
lache fermentada y mucosa vaginal humana Ambas cepas resistieran un pH=2 y
una concentraci6n de sales biliares det 03 ptv dos earacteristicas importantes
en los probi6ticos
Lamiddot cepa de Lactobacillus brevis aislada de lache Sa utiliz6 para elaborar una
bebida fermentada sin y con avana comoingrediente prebiotico obteniendose un
aJimento centon recuento del probi6tico viable durante 21 dras de seguimiento
ademas libre de microorganismos )at6gen05
No se encontr6 efecta significativo de la avena sobre Ie viabilidad del Lactobacillus
brevis aunque sa presento un aumento en 61 recuento de estos en la bebida con
avena
58
plusmn ~
5 RECOMENDACIONES
Ensayar la cepa de Lactobacillus plantartJm en productos carnicos madurados
como el salami
Ensayar la cepa de Lactobacillus l)revs en otros derivados lecteos como queso
quesito queso crema
Continuar con el estudio de estos microorganismos y caracterizarlos
molecularmente ademas de estudiar su capacidad de adherencja a fa mucosa
intestinal sobre algunes Hneas celulares como las CaCo~2
Estudiarel efedo de la avena sabre la viabiJidad del Lactobacillus breyis a una
concentraci6n mayor de 05
Realizer ensayos can las cepas de Lactobacillus brevis y Lactobrlcillus pJantarum
para elaborar masas acidas para panificacion reemplazando el Bromato de
Potasio aditivo prohibido desde marzo del 2003 en nuestro pais per 5U toxicidad
59
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65
ANEXOS
66
ANEXO A RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AlSLADA DE i
PEPINO it
Referencia Pepino 1 Fecha 06122002
IEXCELENTE IDENTIFICACION
Latto plantarum 1
Galeria API 50 CHL V50 Leida el 06122002
Perfil - -- - ++ - -- - ++++ - - -+- + - I I I I I I I I +t+ - +f- ~ - - + + ~ - - - +- + - shy
o - GLY - ERY DARA - LARA + RIB + DXYL - LXYL - ADO - MDX - GAL + GLU + FRU + MNE + SBE - RHA - DUL - INO bull MAN + SOR - MDM + MUG shyNAG + AMY + ARB + ESC + SAL + CEL + MAL + LAC + MEL + SAC + TRE + 1NU - MLZ + RAF + AMD - GLYG - XLT - GEN + TIJR + LYX - TAG - DFUC shyLFUC - DARL + LARL - aNT + 2KG - 5KG shy
--- Taxones significativos rd -----T -- Tests en contra
Lactoplantarum 1 999 092 1
Taxon siguiente Lactobrevis 1 OJ 044 3
i i
Lactoplantarum 1 1 test (5) en contra
D-SORBITOL (SOR) 78
Tax6n siguiente Lactobrevis 1 3 test (s) ert contra
METHYLD-MANNOSIDE (MOlM) 0 MELEZITOSE (MLZ) 14 D-TURANOSE (TUR) 14
67
ampb
ANEXO B RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AISLADA DE REPOLLO FERMENTADO
~
Referencia Repollo fermentado - 3 Fecha 03072003
EXCELENTE IDENTIFICACION
Lactoplantarum 1
Galena API 50 CRL V50 Leida el 03072003
Perfil - - ++ - - - - -H++ - - ~ + - + - I I 1 I I I I -H+ - ++ - - - + + - -- - - + - shy
o - GLY - ERY - DARA - LARA + RIB + DXYL - LXYL - ADO ~ MDX - GAL + GLU + FRU + MNE + SBE ~ RHA - DUL - INO - MAN + SOR - MDM + MDG shyNAG + AMY + ARR + ESC + SAT + CRL + MAL + LAC + MEL + SAC + TRE + lNU - MLZ + RAF + AMI) - GLYG - XLT - GEN + TOR + LYX - TAG - DFUC shyLFUC - DARL - LARL - GNT + 2KG - 5KG shy
------Taxones significativos _ _----- Id--- ---T---- Tests en contra
Lactoplantarum 1 999 095 1
Tax6n siguiente Lactobrevis 1 01 OA8 3
lJactoplantaru01 1 1 test (s) en contra
DSORBITOL (SOR) 78
Taxon siguiente Lactobrevis
METHYL-D-MANNOSIDE D-TURANOSE
1
(MOM) (TOR)
3 test (5) en contra
0 MELEZITOSE 14
(MLZ) 14
i
I
68
ANEXO C RESULTADO PRUEBAS BIOQUWICAS DE CEPA AISLADA DE MUCOSA HUMANA
Referenda Mucosa - 5 Fecha 27012003
BUENA IDENTlFICACION
Galeria API 50 CHL vso Leida el 270112003
Perfil - - - - +t--t - - - + - + - - - - - - - - -+- - - - - + - + - - - - - - - - - - - - - bull - - -+ - +
o - GLY ~ ERY - DARA bull LARA + RID + DXYL + LXYL - ADO bull MDX - GAL + OLU - FRU + MNE - SBE - IlliA - DUL - INa - MAN - SOR - MDM - MOO shyNAG + AMY - ARB - ESC ~ SAL bull CEL - MAL + lAC - MEL + SAC - TRE shyINU - MLZ - RAF - AMD - GLYG - XLT - GEN - 11JR - LYX - TAG - DFUC shyLFUC - DARL - IARL - ONT + 2KO - 5KG +
- - - - - - Taxones significativos - - - - - - - Id T -- Test en contra
Lactobrevis 3 963 088 1
Taxon siguiente Lactoco11inoides 36 075 2
Lactobrevis 3 1 test (s) en contra
GLUCOSE (GLU) 95
-~~~------------~---------------------------~--~-------~--~-----~----------~--------~------------~~--Taxon siguiente Lactocollinoides 2 test (s) en contra
GLUCOSE (GLU) 100 MELIBIOSE (MEL) 25
69
i r
ANEXO D RESULTADO PRUEBAS BIOQIJiMICAS DE CEPA AISLADA DE LECHE FERMENTADA
Referenda Leche fennentada ~ 13 Fecha 27012003
BUENA IDENTIFICACI6N
Galeria API 50 CHL V50 Leida el 270112003
Perfil - - - - -t-t+- - - - + - + - - - bull - - - - -+- - - - - + - + - - - - - - - - - - - - - - - - -+ - +
0 - GLY - ERY - DARA - LARA +Rll3 + DXYL + LXYL - ADO - MDX ~GAL + GLU - FRU + MNE SBE - RHA DUL bull INO MAN - SOR MDM bull MDG shy
~NAG + AMY - ARB - ESC - SAL - CEL - MAL + LAC - MEL + SAC - TRE I lNU - MLZ - RAF - AMD - GLYG - XLT - OEN - IUR LYX - TAG - DFUC bull i
LFUC - DARL - LARL -ONr + 2KG - SKO + 1
- -- - - Taxones significativos - - Id -- T --- Test en contra
Lacta brevis 3 963 088 1
Taxon siguiente Lactocollinoides 36 075 2
Lactobrevis 3 1 test (s) en contra
GLUCOSE (GLU) 95
-----------------------------------------------------------~------------------------------~-------------------Taxon siguiente Lactocollinoides 2 test (s) en contra
GLUCOSE (GLD) 100 MELffiIOSE (MEL) 25
70
II iJ1
I
I ANEXO E RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AISLADA DE REPOLLITAS DE BRUSELAS FERMENTADA
Referencia repollitas de bruselas 15 Fecha 03072003
EXCELENTE IDENTIFICACION
Lactoplantarum 1
Galeria API 50 CHL vsO Leida el 03072003
Perfil - - - - +t - - - - +H+ - +- - +t + - I I I I I I I f ++t - + - - - -+ + - - - -+ -+ - - I ij
o - GLY - ERY - DARA - LARA + RJB + DXYL - LXYL - ADO - MDX - GAL +
GLU + FRU + MNE + SBE RHA + DUL - INO - MAN + SOR + MDM + MOG shyNAG + AMY + ARB + ESC + SAL + eEL + MAL + LAC + MEl + SAC + TRE + i
I1NU - MLZ + RAF AMD GLYG - XLT - aEN + TUR + LYX - TAG - Druc LFUC - DARt + LARL - aNT + 2KG - 5KG shy n ----Taxones significativos ------ Id Tests en contra
Lactoplantarum 1 999 090 o
Taxon siguiente Lacto pentosus 01 012 7
Lactoplantarum 1 o test (s) en contra
Taxon siguiente Lacto pentosus 7 test (8) en contra
GLYCEROL (GLY) 75 D-XYLOSE (DXYL) 100 L-RHAMNOSE (RHA) 25 METHYL-D-MANNOSIDE (MOM) 1 MELEZITOSE (MLZ) 25 RAFFINOSE (RAF) 75 D-ARABITOL (DARL) 0
71
~
I i I
ANEXO F - ANALISIS DE REGRESION PARA pH EN BEBIDA SIN AVENA
Aruilisis de regresi6n polinomial
---~-~-------------------------------------------~-----------~~---------------------~--------------Variable dependiente pHSinAvena ---------------------------~-------------~--------------------~---------------------------------
Error T Parametro Estimado Estandar Estadistico P-Valor
CONSTANTE 535606 0094535 56657 00000 Dia -0150565 0020706 727154 00000 Dia2 000504434 0000871488 578819 00001
---~---------------------------------------------------------------------------------------------------
Anfllisis de Variama -------------------------------------------~-----------~-----------------------------~-~--- jSource Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor 11
------------------------~------------------------------------------------------------------------------~ Mod-elo 155772 2 0118861 4256 00000 Residual 0237877 13 00182983
Total (Corr) 11956 IS
R2 == 867522 percent
pHSinAvena == 535606 - 0150565Dia + 000504434Dia2
72
____
middot ANEXO G - ANALISIS DE REGRESION PARA pH EN BEBIDA CON AVENA
AmUisis de regresion polinomial _____~_____~__-_____~___4____________________bull____bull__________bull_____________~~----_------___________
Variable depcndiente pHConA vena ------------------------------------------------------------------------------------------~--------
Error T Parametro Estimado StAndar Estadfstico P-Valor
---------------------------------------------~-----------------------------------------------_---------CONSTANTE 534463 00801045 667208 00000 Dia -0140407 00175453 800253 00000 DiaA 2 000448098 0000738458 606803 00000
----------------------~---~-----------------------------~------------------------------~----AmUisis de Varianza
---~---------------------------------~---------------------~------------~-------------------~------Source Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio PValor --------------------------~-----------------------------------------------~------------~-----~~--~ ModeJo 159575 2 0797873 6073 00000 Residual 02170798 middot13 00131383 _______~_~ ~_~----------~------~--~-----~-M-----~-----____ _____________~-----------------------Total (COlT) 176654 15
R12 903315 percent
-----------~------------------------------------------------------------------------~-----------pHConAvena 534463 - 0140407Dia + 000448098DfaA 2
73
ANEXO H - ANALTSIS DE REGRESTON PARA ACIDEZ EN BEBJDA SIN AVENA
An8Jisis de Regtesi6fi P6lifJomial
Variable Depefidiefile~ AcidezSinAVenll _______________w_____~______~________________~-----------_________~_________________~~____~___~_____
Error T Pariirnetro Estimado Estandar Estadistico ---------------------------------------~--------------~-~-------~--------------------~------------CONSTANT 0491697 00123217 399051 00000 Dia 00436032 000269882 161564 00000 D1a2 -000144613 000011359 127312 00000 __w___~________________________~-_______-_____~----____________________________~__~---~_--__~___
AriiiJisis de varianza ~_~__~__________~_~____~________~___________- _________e_____________________________bull _____-________
Source Smn de cuadr Df Mean Square F-Ratio PmiddotValor_~~___________________________________bull ______~___________bull ____________bull ______~________w________________
Model 0135203 2 00676013 21747 00000 Residual 000404118 13 000031086
Total (Corr) 0139244 15
R2 970978 percent
AcidezSlnAvena 0491697 + O0436032Dia - 0OOl44613Dia2
74
I
ANEXO I ANALISIS DE REGRESION PARA ACIDEZ EN BEBIDA CON AVENA
1
Anwisis de tegtesi6fi polinomial
Variable dependiente Acidez Con Avena
Error T ParametTo Estimado Stlindar Estadfstico P-Valor ----------------~-------~---------------------~-----------------------------------------------------CONSTANT 0491639 000926607 530578 00000 Diamiddot 00406572 000202955 200326 00000 DfaA 2 0000982559 0000085421 -115025 00000
-------------~----------------------------~-------------------------~-----------------------------------
-------------~-----~~-----------------------------~---------------------------------------------_--Source Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio PValor
-~-------------~----------------------------------~------------------~~-------------------------- Modelo 0288008 2 0144004 81914 00000 Residual 000228539 13 0000175799
----------~~--------------~---------------------------------------------~---------------------------Total (Corr) 0290294 15
RA2 = 992127 percent
-------------------------~----~---~------------~---------------------------------~---------------~
AcidezConAvena == 049163amp + 00406572D1a - 0000982559DiaA2
75
I
(Ilmiddot il
ANEXO J- ANALISIS DE REGRESION PARA RECUENTO LACTOBACILOS PARA BEBIDA SIN AVENA
Amilisis de regresion - Modelo lineal Y = a + bX
------------------------~----------------------~-----------------------------~----------~-----------Variable Dcpendiente LactobacilJusSinAvena Variable independiente Dia
I--------~----------~-----------------------------------~-------~-~--~--------------------------~-Error T
Paramctro Estimado Standard Stadistico P-Valor
----~----~------------~-----~-----------------------~-------------~-----------------------------Intereepto 117347 0389973 300911 00000 Pendiente 00483464 00257889 18747 00903
Analisis de Varianza
---------~------------------~----------------~---------------------------------~---------~----------Source Sum decuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor
------------~---------------------~---------------------~--------------------------------~-----~----Modelo 0916252 1 244835 443 00616 Residual 260706 10 0260706
--~------------~---~------------------~~~-----~-------~---------~~-------------------------------------Total (Corr)352332 11
Coeficiente Correlaci6n = 0509955 R2 = 260054 percent
LactobacillusSinAvena= 117347 + 00483464Dfa
76
ANEXO K- ANALTSIS DE REGRESION PARA RECUENTO LACTOBACILOS PARA DEBIDA CON AVENA
Aruilisis de regresion - Modelo lineal Y = a + hX
Variable Dependiente LactobacillusConAvena Variable Independiente Dia ---~--------------------------------------------------------__-----------__--_--_-----------shy
Error T Paramctro Estimado Standard Estadistico P-Valor -~--------------------------------------------------------------------------------------------------
Irttercepto 118103 0567963 207942 00000 Pendiente 00790304 00375594 210414 00616
-----------------~----------------------------~----~-------~----~----------------------------
Analisis de Varianza
----------------~----------------~------------------~--------------------------~------~--------shySource Swn de cuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor
-----------------~--~--------------------------------------------------------------------------~---~ Mode10 244835 1 244835 443 00616 Residual 552997 10 0552997
Total (Corr)797832 11
Coeficiente Correlacion = 0553964 RI2 = 306875 percent
-----~--------------------------------------------------------~--------------------------------------
LactobacillusConAvena = 118103 + 00790304Dfas
77
middot AISLAMIENTO DE CEPAS NATIVAS DE PROBIOTICOS Y COMPARACI6N
DE LA VIABrLlDAD POR EFECTO DE UN PRfBrOT1CO
BLANCA CECILIA SALAZAR AlZATE
I I I
I t I
Trabajo dirigido de grado pre$entado
para optar al titulo de Magister
en BiotecnologiaI 1
I f Directora Qlga Ines Montoya Carnpulilno
Magister en Ciencias area de Microbiologfa
Asesor Jos6 Uriel Sepulveda V
UNIVERSIDAD NAC(ONAL DE COLOMBIA
~ ~~lXL1tD NACIONALJm COLaJl~ rmsUH
~middotmlTo DB DIDLIOTECAP i ii~~6 ~ll OOhmEr
FACULTAD DE CIENCJAS
Medellin 2003
UNAL-Medellfn IllliI1111 ~~III1I~~I~~II ~~ 1I1~~~ 11 l~11 6400000 18 O511)5_~~
AGRADECIMIENTOS
Quiaro agradecer a todas las personas que directa 0 indirectamente me
colaboraron
Agradezoo
A la doctora Olga Ines Montoya directora de trabajo de grado por su asesorfa y
apoyo incondicional
AI doctor Jose Uriel Sepulveda V POr su asesoria y spoyo
A las estudiantes de la practica en Bacterialogia del Instituto Universitario CoIegio
Mayor de Antioquia Angela Patricia Diaz Santos Carolina Calle Cardona y Dora
Areiza A
A las directivas del postgrado en Biotecnologfa muy especislmente aJ Doctor
Rafael Arango por su apoyo en momentos de dificultad econ6mica
A todo et personal del Laboratorio de Mlcrobialogia Universidad Nacional sade
Medellin
A todo el personal de la Planta de Leches de la Universidad Nacional sede
Medellin
RESUMEN
En este trabajo se aislaron cepas natives de Lactobacillus plantarum de muestras
yegetales fermentadas de pepino rapollo y repollitas de bruselas y Lactobacillus
brevis de leche ferm~ntada y mucosa humana resultando resistentes a pH=2 y
sales biliares 03 pv dos caracterfsticas importantes que deben cumplir los
microorganismos lIamados probioticos
utmzando a cepa nativa de Lactobacillus brevis aislada de leche fermentada se
elaboraron dos bebidas Iscteas fermentadas una sin ingrediente prebi6tico y otra
adicionada de avena 05 como ingredienta prsbiotico para comparer si habra
alguna incidencia de asta ingrediente en la viabilidad del probiotico
A ambas bebidas sa les hizo un seguimiento de pH y de acidez (expreSada
como acido lactico) durante los dias 27 14 Y21 Y 1a prueba de viabilidad en los
dias 7 14 Y21 despues de elaboradas cada una de las bebidas De estas bebidas
sehicieron 4 repeticiones
Sa obtuvo recuentos mayor-es de 106 UFCml de Lactobacillus brevis hasta el dia
21 encontrandose en aumento an los recuentos en a bebida con avena aunque
estadlsticamente no hubo diferencias significativas
TABLA OE CONTENIDO
lISTA DE TASLAS ------------~--~------------------------- ~
LISTA DE ANEXOSmiddot--------- ----------------------------------11
INTRODUCCON -----------------------------------------------------12
1 MARCO TEORICO Y ESTADO OEl AItTE---middot---middot-middot-- -------14
11 PROBIOTfCOS ------------- - middot------------------14 111 Historia------------------------- 14 1~ 12 Microorganismos probi6ticos---------------- 15 113 Caracteristicas fenotipicas de algunos microorganismos probi6ticos-----~------ ------- 16 114 Caracteristicas de los probi6ticos--- - ----17 115 Beneficio de los organismos probi6ticos---middot ----19 1151 Facilitar la digesti6n de la lactosa ------ 19 1152 Protegen contra enfermedades gastrointestinales - -19 1153 Protegen contra infecciones del tracto urogenital -------20 1154 Promueven la barrera de defensa endogena delintestino ---20 1155 Protegen contra cancer de colon- ---- ---~1 1156 Protegen contra infeGCiones respiratorias----------21 1~157 En at iratamiento y pre~enci6n deleczeroa-- - 22 1158 Previenen infeccion en heridas quirurgicas ---------23 12 PREBlOTICOS -- -----------------23
2 METODOLOGIA~~~~-~fO ~~~tfmiddot~I~~-____bullbull_--~---------middot26
21 lOCALIZACION~~======~-~--- ------26 22 METODOS------------------------------26 221 Aislamiento de cepas nativas -------_ 26 2211 De vegetales -- -- -26 2212 De Ja leche--------- -----------28 2213 De mucosa vaginal humana ----~---------------28 222 Almacenamiento de fas repas aisladas ----- --30 223 Pruebas para determinar el genera ---- 31 2231 Coloracion de Gram --------------------31 2232 Morfologra---~----------------- -- -31 2233 Prueba de esporulaci9n----------------~2
2234 Prueba de la catalasa--------------------~------ 32 224 Prueba para determinar la especie ----------~-------- 33
225 Pruebas para determinar microorganismos probi6ticos -----34 2251 Resistancia a pH=2 y sales biliares de concentracl6nO3piv --34 226 Conservacion ------------~-----------------35
227 Elaboraci6n de la bebida fermentada ---------35 2271 Pr~paraci6n de Ie muestra ---------------~----35 2272 Adici6n del Inocula ----~-------------------36 2273 Control de Ie fermentaci6n=~~~==~~-------------36
2274 Refrigeracion ------- ~-- ---- -------36 2275 Batido--~ ------------------------------------37 2276 Envasado y almacenamiento------------ 37 228 Determinacion del pH------- ---------- -----39 229 Determinacion de la acidez (Expresada como acido lactico) -39 middot2210 Prueba de viabiJidad ------~-------~----------39 2211 Am3lisis microbiol6gico de las bebidaslacteas(con ysinavena) -40 2212 Anslisis estadistico ~-~~-~---------=------------40
3 RESULTADOS Y DISCUSI6N-~------------------------------ --42
31 Coloraci6n de Gram y morioJpgfa --001-------- - -----42
32 Prueba de esporufacion y catafasa-----------------42 33 Prueba para determinars especie- -------- ---44 34 Pruebas para determiner microorganismos probi6ticos -----45 35 Seguimiento del pH en la bebida h3ctea con y sjn prebi6tico-----49 36 Seguimiento de la acidez expresada como de acidb lactico -----51 37 Prueba de viabiJidad-------- ----------54 38 Analisis microbiol6gicos de las babides lacteas con y sin avena --56
4
5
REFERENCIA~ BIBLIOGRAFICAS --~-------------middotmiddot---- ---------60
LISTA DE TABLAS
TABLA 1 ALGUNAS ESPECIES MICROBJANAS PROB16TICAS-------------~------middot15
TABLA 2 FueNTE De AISLAMIENTO DE CePAS NATJVAS --------------29
TABLA 3 RESULTADO DE PRUEBA DE ESPORULACI6N------------------43
TABLA 4 RESULTAOO PRUEBA DE LA CATAlASA ----------------------44
TABLA 5 ReSULTADO IOENTIFICACION CEPAS--------------------middot-----45
TABLA 6 ReSULTADOS APRUEBAS DE RESISTENOIA A pH=2 YSALES BILtARES 03 Pv
-----------~-- ----------~--46
TABLA 7 ReSUtTADO pH YOGUR SIN AVENA ----------------49
TABLA 8 ReSULTADO pH YOGUR CON AVENA ------------ --49
TABLA 9 COMPARACION DE MEDIAS PARA pH----------------------50
TABLA 10 ReSULTADO DE ACIDEZ (EXPRESADO COMO ACIDO LACTICO)-------51
YOGURT SIN AVENA ------------------------------51 TABLA 11 ResuLTAOo oJ ACIOEZ (EXPRESAOO COMO ACIDO ACTICo)----52
YOGURT CON AVENA--- ------------------- --- ----52 TABLA 12 COMPARACION DE MEDIAS PARA ACIOEZ----------------~~53
TABLA 13 RecuENTo DE LACTOBACILOS (UFCML) YOGHURT SIN AVENA--54
TABLA 14 RECUENTO DE LACTOBACILO$ (UFCML) YOGHURT CON AVENA ------54
tABLA is COMPARACl6N MEDIAS LOG LAcToBACltLUS-------------56
TABLA 16 RESULTADOS ANALiSIS MICROBIOL6GICO------------- --57
L1STA DE FJGURAS
FIGURA 1 CAMARA DE ANAEROBIOSIS----------middot------~----27
FIGUftA 2 CePAS EN TUBOS CON AGAR INCUNADO -----~--middot----------30
FIGURA 3 COLONrASAISLADAS EN AGAR MRS-------middot---------31
FIGURA 4 API CHL 50-PRUEBA sloaufMlcAS ------------- bull --33
FIGURA 5 DtAGRAMA DE FLUJO ------~---------- ----~-38
FIGURA 6 LACTOBACILLUS I3REVIS GRAM + AfSLAOA OE LECHE FERMENTADA------47
FIGURA 7 LACToBACILLUS BFEVS A1SLADA OS lECHS FERMENTADA DESPUES DE LA
PRUEBA DE RESfSTENCIA A pH=2 ----------------------~ - middot-48
fIGURA 8 LAcTOBAcILLUS BREVIS AISLADA DE LECHE FERMENTADA OESPUES DE LA
PRUEBA DE RESISTENCJA A SALES BILIARES 03 pN------------- ----48
FIGURA 9 COMPARACI6N DE MEDIAS PARA EL pH ---------- ---------50
FIGURA 10 COMPAAACI6N DE MEDIAS PARA LA AC1DEZ ----------------52
FIGURA 11 COMPARACI6N DE MEDIAS PARA LOG LAcTOBAcILLUS -------------55
LISTA DE ANEXOS
ANEXO A--- RESUl TADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AfSLADA DE
ANEXO B RESULTADO PRUEBAS BIOQUfMICAS DE CEPA AISLAOA DE
REPOLLO FERMENTADO --middot----------middot--------------------------68
ANEXO c RESULTADO PRUEBAS BIOQUIMICAS DE CEPA AISLADA DE
MUCOSA HUMANA ------------------------------------------ ------69
ANEXOD RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMCAS DE CEPA AISlADA DE
LECHE FERMENTADA---------------------------------------_-70
ANEXO E RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AtSLADA DE
REPOLLlTAS DE BRUSELAS tERMENTAOA ------------------------71
ANEXO F ANAUSIS DE REGRESION PARA pH EN BEBIDA SIN AVENA--- 72
ANEXO G- ANAUSIS DE REGRESION PARA pH EN BEBIDA CON AVENA --73
ANEXO H ANALISIS DE REGRESION PARA ACIDEZ EN BEBIDA SfN AVENA
ANEXO 1- ANALISIS DE REGRES[ON PARA ACIDEZ EN BEBIDA CON AVENA
ANEXO J- ANALISIS DE REGRESION PARA RECUENTO LACTOBACILOS
PARA 8EBItgtA SIN AVENA ~----------------------------------------wirEr
ANEXO K ANALlS1S DE REGRESION PARA RECUENTO LACTOBACILOS
PAFt BEBIDA CON AIlNA-------~-------~----------~------~---middot-----~-middot---irjr
INTRODUCCI6N
En los ultimos arios S9 ha comprobado los efedoS beneftcos que los
microorganismos probiotico$ ejercen sobre la salud humana a facilitar la digestion
de lactosa estimular 18 actividad inmungica modificar ef balance poblecional
tanto de la microbiola intestinal nativa can posibles sfeelos patogenos como de
las que causan toxiinfeCCiones alimentarias edemas se estan ensayando como
implante en heridas de piel para evttar contamlnacion can microorganismos
patogenos
Los microorganismos probi6ticos se emplean en fa elaboraci6n de productos
fermentados en especial los lacteos Estas industrias se han limitado a utilizar
cultivos iniciadores importados que rsquieren tiampo y culdados para su
manlpulacion y empleo En Colombia no se han realizado InY9s1igaciones que
involucren cepas nativas can activldad probiotica ni el afecto de ingredientes
prebi6tico$ sabre fa viabilidad de estos microorganismos tenienqo en cuenta que
al prebiotico es un ingrediente allmentario que estimula sefectivamente el
crecimiento y actividad de algunas especies de microorganismos probi6ticos
En esta investigacion se sislaron microorganismos probi6ticos a partir de
muestras de vegetales y lache crud a de vaca fermentadas naturafmente y de
mucosa humana utifizando medios de cultivo salactivos bajo condiciones
12
anaerobias Luego se procedio a verificar su rasistencia a los acidos gastricos y
sales biliares simulando asl las condiciones del tracto gastrointestinal de 10$
humanos Las capas que presentaron mejor comportamiento ante estas pruebas
sa caraeterizaron morfologles y bioquimicamente y sa seleccione una de eHas
para inocular en bebidas lacteas sin y can avena como ingrediente prebiotico y
verificar su viabilidad durante al almacenamiento
Los resultados de esta investigacion padren sar de gran irnportanoia para la
industria nacional de alimentos las univarsJdades con facultades relacionadas
can la salud y la alimentaci6n y para las entidades gubernamentales involucradas
en la alimentacion y nutricion de grupos de poblacion vulnerables tales como eJ
Instituto de Bienestar Familiar y Bienestar Social entre otros
13
middot~
1 MARCO TEORICO Y ESTADO DeL ARTE
11 P~OBI6TICOS
111 Historia
EI consumo de productos fermentados lecteos con microorganismos vivos
especialmente bacterias acido lacticas ha sido reportado a 10 largo de la historia
desde tiempos remotos se evidencia al conoeimiento de los beneficios que estes
proporcionaban perc real mente quian enfatiz6 en ellos fua 91 cienUfico ruso Elie
Metctinikcff que reaclon6 la ingesti6n de (eches fermentadas con la longevidad y
salud de las personas ( Pardio et al 1996)
En 1965 sa utilizo por primera vez et termino Probi6tico derivado dellatin pro
que significa a favor de y del gr9go bios que quiera decir vida tnieialmente esta
palabra defini6 a los microorganismos que promovian el erecimiento de otros
microorganismos Ivego se splico asta termino a extraetos de tajido que estimlilan
el crecimiento micrObianqEn la actuaidad sa han definldo como probiotieos los
cultivos (micas 0 mezclados de microorganismos vivos qua al ser ingeridos por
humanos Q animales majoran el balance poblacional de la microbiota intestinal
evitando la adherencia de patogenos (Schrezenmeir et albull2001) Sin embargo
estos microorganismos no nece_iamenta son habitantes propios del tracto
14
gastrointestinal (Holzapfel at a2001Gaitan at al 1998) p~r 10 tanto es
necesario consumir alimantos en los que se encuElntren estos mrcroorganismos
viables estos hacen parte de I~micfobiota de vegetales y leches interviniendo en
Ie fermentaci6n natural de estos~ntos
112 Microorganismos Probi6ticos
los microorganismos probi6ticos que tradicionatmente se han adicionado a la
tache para fermentarla y obtener yogurt y kumis a como suplementos pertenecen
a los generos Lactobacillus Enterococcus y Bifidobacterium (Ver tabla Nro 1) Sin
embargo se considera que solo algunas especies de los gelnsros Lactobacillus y
Bifidobacterium sobreviven en el tracto gastrointestinal En la tabla 1 58 muestran
algunas de estas especies
TABLA 1 Algunas especies microbianas probi6ticas
Lactobacillus Sifidobacferium Enterococcus
L acidophilus
L JohnsoN
L casei
L rhamnosus
Lgrasseri
L reuten
L plantarum
B bifidum
Blongum
B infantis
E fsecium
E faecalis
Fuente Gaitan et a 1998A
15
EI eonoeimiento a cerea de sus efeetos beneficos en el consumidor por su alta
viabilidad en el intestino como la producci6n de sustancias con aetividad
antieaneerigena el mejoramiento ltfel sistema inmunol6gico y el deSplazamiento
de la mierobiota pat6gena gastrointestinal en el consumidor ha estimulado una
mayor demanda de estos microorganismos como tambian de los productos que
los contienen (Heller 2001 Parada middot1998)
Existsn otros produetos fermentados de origen vegetal como et tampe col acida
y salsa de soya de los euales sa pueden aislar estos organismos probi6tieos
comp tambien de la mucosa intestinat humana y luego de suministrarlos a
ratones sa han comprobado sus caracteristicas beneficas (Molin 2001)
113 Caracteristicas fenotfpicas de algunos microorganismos
probi6ticos
las bacterias aeido lacticas de los generos Lactobacillus y Bifidobacterium son
consideradas probi6tieos y tradicionalmente se han clasificado con base en Sus
propiedades morfol6gicas crecimiento a diferentes temperaturas capacidad
fermentadora de glucosa y otros carbbhidratos y la configuraci6n del Bcido Jaetieo
producido (Holzapfel etal2001)
16
)lli~ h Dx nIILIOTECM
eJDe~~ l1ilmfJ tIDBnm
Los Lactobacillus son bacilas gram positiv~s no esparuladas aerotalerantes
acido - tolarantes estrictamente fermentadares formadores de Boido laclica como
producto principal catalasa negativo carentes de citocroma sin embargo se
presentan excepciones a esta descripcion parque afgunas especies pueden
formar catalasa 0 citacramo en medios que contienen hematina 0 compuestos
relacianados La produccion de catalasa no hema pseudocatalasa puede causar
tambien alguna confusion en fa identificacion de algunos Lactobacillus
las especies del genera Bifidobacterium san bacilos gram positivos no
esporulados generafmente anaerabios estricto$ aunque pueden creeer bajo
condiciones microaer6filas cuando estan ert presencia de C02 La mayorfa de sus
especies se pueden diferenciar par criterios biaquimicos simples como la
fermentacion de L arabinosa DmiddotxiJasa O-manosa O-manita y O sorbitat que
pueden servir coma caracterist1cas clave para su clasificacion (Holzapfel
etal2001 )
114 Caracteristicas de los probi6ticos
Las cepas de microorganismos prabi6ticos deben presenter y mantener unas
caracteristlcas que garanticen su crecimienta y supervivencia En el alimenta
como tambiEm durante su transito a traves del est6maga e intestino delgaQo
17
La primera CBtacterfstica es que sean viables esta viabifidad esla capacidad que
tienen los microorganismos probi6ticos de permanecer vivos tanto ~n el alimento
como en el Intestino del consumidor por un tiempo determinado En Colombia se
ha establecido que en bebidas fermentadas este tiempo debe ser minimo de 21
dras en el alimento (Minsalud 1986) Esta vjabilidad depende del metodo de
produccion y de la cepa utilizada (Tuomols at a 2001)
Luego de que se garantice que estos microorganismos eslan viVos en el alimento
ell os deben cumplir otro criterio importanle para ser considerados como
organismos probi6ticos y as tblerar las condiciones de acidez a un pH=2 y la
sccian de proteasas del est6mago ademas de sobrevivir y creeer en presencia de
acidos biliares (Tuomola et al 2001 Jacobsen at a 1999) para luego de
sobrevivir a estas condiciones adherirse a la mucosa intestinal y de esta manera
estimular al sistemainmunoJ6gico esta capacidad de adherirse a la mucosa es un
prerrequisito para la colonizacion del intestlno (Toumola etal2001 Alander et aI
1999)
Cuando los probioticos han pasado todas esta pruebas de supervivencia y luego
de impfantados en la mucosa producen acidos organicos peroxido de hidrogeno y
tambien bacteriocinas que actUan como inhibidore$ del crecimiento de
microorganismos patogenos u oportunistas (Tuomola at al 2001 Cintas et al
2000) complementando de asta manera su accion benefica sobre la mucosa
intestinal y en general sobre la saJud del huesped
18
116 Berieficios de los microorganismos probi6ticos
Los beneficios que se asocian a los microorganismos probioticos son muchos y
variados Entre ros comprobados mediante estudios se eneuentran
1151 Facilitar la digesti6n de la lactosa
los microorganismos probioticos cuando estan en el intestino liberan alii la
enzima pmiddotgalaotosidasa capaz de hidrolizar la lactosa haste glucosa y galactosa
evitando as que personas intolerantes a este carbohidrato presenten sfntomas
como flatulencia dolor abdominal y diarrea cuando consumen leche (be Vresse
et 81 2001)
1152 Protegen contra enfermedades gastrointesUnales
EI consumo de aJimentos con probioticos ha mostrado efeeto terapeutico frente a
los sintomas de diarrea asociada al surninistro de antibi6tico$ de amplio espectro
que destruye 0 disminuye la microbiota endogena esta imp ide la coJonizacion de
bacterias patogenas como Klebsiella oxytoca y Clostridium difficile que pueden
causer lesiones en el cn Los probi6ticos recuperan el balance de la microbiota
intestinal nativa y avitan Ie adhesion de algunos virus bacterias pat6genas a
parasitos que pueden ser agentes causales de gastroenteritis la diarrea del
19
J
viajero y 1(3 inflarnacion intestinal que en ultima instaneia oeasionan ef sfndrome
del colon irritable (Marteu et al 2001)
1153 Protegen contra infecciones del tracto urogenital
La vaginitis indueida por baeteriss yo por levaduras as una infecci6n
estrechamente relacionada con la exposici6n a antibi6ticos y espermicidas y
tambien depende del estado hormonal de la n1ujar Con al uso de mezcJas de
probi6ticos se han obtenido buenos resultados en la rastauraci6n de la rnicrobiota
natural urogenital benefica que desplaza a los eausantes de la inflamaci6n de Is
vagina y Ie uretra (Reid 2001 )
1154 Promueven la barrera de defensa end6gena del intestino
EI tracto gastrointestinal normal mente as una barrera natural contra anUgenos de
origen microbiano y alimentario Cuando los probi6ticos sa adhieren a Is mucosa
intestinal estimulan 0 potencian al sistema inmune favoreciendo la
inmunomodulaci6n que induce un aumentb de fa producci6n de inmunoglobulinas
activacion de las calulas mononueleares y de los linfocitos para proteger al
huesped de infeeciones (Isoulari et sl 2001)
20
1155 Protegen contra cancer de colon
EI cancer es el resultado de una serie de mutaciones somaticas que pueden
ocurrir durante al tiempo de vida del individuo y 10 padeca buena parte de la
poblacion mundial los probi6ticos en un sistema in vitro han demostrado un
efecto positivo en la prevenci6n de mutaciones aI desactivar carcin6genos
genotoxicos (Wolloswski et al J 2001)
1156 Protegen contra infecciones respiratorias
Sa ha demostrado que el conslJlno de probi6ticos disrninuye la incidencia de
infecqiones raspiretorias al aumentar la actividad fagocitica de maer6fagos
alveolares que aettian sobre microorganismos patogenos Se hizo un estudio en
571 ninos sanos con edades entre uno y seis anos divididos en dos grupos a uno
de ellos sa las incluy6 en su dieta leche suplementada can Lactobacillus GG y a
los otros ninos leche no suplementada AI final del estudio se observ6 una
disminucion del 19 en la incidencia de infeccionas respiratorias tratadas con
antibi6ticos tales como otitis media sinusitis bronquitis y neumonfas en el grupo
de los ninos que consumieron Lactobacillus GG (Hatakka et al 2001)
Alvarez et al (2001) encontraron que la administraci6n de yogurt con Lactobacillus
casei en ratones de tres arios de edad majora los espacios libres del puJrn6n de
la presencia de Pseudomona aeruginos8 induciendo un aumento
21
significativo en los niveles de gA a IgM datactadas en los lavados
broncoaJveolares y se observ~ un afecta dependiente de la dosis
1157 En el tratamientoy prevenci6n del eczema
Se ha encontrado que el consumo de probi6ticos mejora la inflamaci6n alergica 0
eczema at6pico en ninos alimentados con formula suplementada con probi6ticos
Encontraron una mejora significativa al suministrar Bifidobacteriummiddot actis y
Lactobacillus GG en 27 niiios con edad promedio de 46 meses Luego de aplicar
este tratamiento se sometieron a una prueha de SCORAD (mide fa extension y
gravedad del eczema) registrando una meJoria significatlva en las condiciones de
la pie concentraci6n de citoquinas cirClllantes an sueto y moleculas de adhesi6n
a las superficies de las celulas soJubles en suero (Isolari 2000)
Se realizaron otros estudios a 159 mujeres embarazadas con historia familiar de
eczema atopico de primer grado a las cuafes sa res 5uministro dosis diarias de
Lactobacillus GG durante 2 a 4 samanas previas al parto Oespues de ella fa
madres twiaron la opci6n de continuer tomando el ptobi6tico si amamantaban 0
bien darseio vIa oral La mayoria de las madras eJigieron dar las dosis at bebe
diariamente A los dos anos de vida se observ6 una disminuci6n del 50 en la
frecuencia del eczema at6pico en aquellos nHies que se les dio ef probi6tico
(Kalliomari etal 2001)
22
1158 Previenen infeccion en heridas quirurgicas
Los probi6ticos impiden la union de pat6genos a las superficies celulares en
heridas mediante la seCreci6n de proteinas Actuamente se encuentra en
estudio la aplicaci6n del Lactobacillus fermentum vivos sabre heridas en piel de
ratas y se ha encontrado una disminuci6n del 90 en la colonizaci6n par parte del
StaphylococcuS aureus uno de los patogenos mas temidos y de mayor lncidencia
en infecciones hospital arias mas aun se esta contempiando la posibilidad de
utilizar la protein a purificada an lugar de los mjcroorganismos para la protaccion
contra infecciones en heridas (Strauss 2000)
12 PREBIOTICOS
Son carbohidratos de cadena corta algunas veces reconocidQs como
oligosacaridos no digeribles par las enzimas del epitelio intestinal 0 de las
gliJnduJas anexas debido a su estructura quimica y de esta manera lIegan al
intestino grueso donde alcanzan a estar disponibles para la fermentaci6n por las
bacierias sacaroHticas que son especial mente laetobadlos y bifidobacterias
dando odgen a compuestos que ejercen efectos funcionales sobre la mucosa del
tubo digestivo (Brunser 2001)
Se consideran como tal algunos fructocligosacaridos isomaltooligosacariclos
oligomato palatinosa poHdextrosa pOJidextrrna raftilina y algunos oligosacaridos
23
)
de 1a soya y fa avena Estenmiddot presentes en alimentos como Ie cebolla ajo
banano puerros 1 derivados del trigo achicoria esparrago alcachofa (Cummings
etal 2001)
Algunos de estos prebi6ticos cuanda son incorporado$ a fa dieta en cantidades
dalerminadas alteran la microbiota intestinal disminuyendo los recuentos de
coliformes bacteroides y cocos y aumentando las bifidobacterias hasta en diez
veces ademas modifican la actividad metab6lica del coron logrando una
disminuci6n del pH y un incremento en el contenido fecal de acidos grasos de
cadena corta como at acatica propi6nico y butfrico El butirato aumen~ _I grosor
de la pared del coron e intestino delgado estimula eJ crecimiento de la mucosa del
colon y auManta su flujo sangufneo inhibe el crecimiento de tinsas tumorales
epiteliales de origen co16nico induce la diferenciaci6n de sus celulas y a
apoptosis entre otros(Brunsar 2001)
Eh estudios hechos en simuladores del intestino humano utilizando productos de
avena fermentados se encontro que estimularon al crecimiento tanto de
lactobacios como de bifidobacterias y en el caso de estas ultimas se incremento
la producci6n de los acidos acatico propionico y butfrico 10 que incide sobre la
implantacion de probi6tico$ e inhibe al crecimientos de otro tipo de
microorganismos (Alal1der eta1999 Kontula etal 1998 Jaskari etal 1998)
24
~ -1
(
AI comparar el comportamianto de las leches de diferente origen se ha
demostrado que Ie leche de vaca contiene caseinatos sustancias que forman
buffer ~n et intestino e inlpiden que los probi6ticos disminlJyen el pH del intestina
y de esta manera se impide al efecto deseado que es evitar fa proliferaci6n de
otros microorganismos entre los cuates pueden estar algunos patOganos En la
leche materna sa encuentran algunos carbohidratos como glucosa galactosa n
acetilglucosamina y algunos 0lig6meros de Ie fucosa en cOhoontracionesmiddot
importantes los cualeS favoreceh el crecimientc)middot de probi6ticos esto
complementado can 91 bajo contenido de protenas que se traduce en una
reducida capacidad buffer hacen de Ie lache materna IJn alimentd adecuado para
nllios en su etape de lactancia
Algunos prebi6ticos como 1a lactulosa yciertos compuestos que contiansn fructosa
no son digeridos en el intestino humano y pueden sar utilizados selectivamenta
par los probi6ticos 10 que hace que los probi6ticos en combinaci6n can prebi6ticos
pueden lIegar a ser un importante medio para prevenir algunas enfermedades del
tracto gastrointestinal (Bezkorovainy 2001)
25
2 METODOlOGfA
21 LOCALIZACION
EJ trabajo sa realizo en el laboratorio de Microbiologia y la planta da laches de Ja
Universidad Naclonal de Colombia- Secie Medellin
En al laboratorio se hiZQ al aislamiento a identificaci6n de fa capas y en fa Planta
sa eJaboro la leche fermentada con 1a cepa seleccionada y el prebi6trco
22 METODOS
221 Aisiamiento de cepas nativas
Las cepas nativas se sislaran de producto$ vegetales leches fermentadas y
mucosa vaginal humana
2211 De vegetales
Las muestras vegetales de repollo repollitas de brusefas y pepino se
seleccionaron porcionaron y mezclaron can cloruro de sadio al 10 pIp se
calacaron en un recipienta de vidrio balo anaerobiosis y sa dejarQn por 15 dias
26
luego S9 tomaron 3 ml de cada muestra y se jnocularon 9 ml de caldo MRS (Man
Rogosa and Sharpe) se incubaron a 37deg C durante cinco dias en camara de
anaerobiosis (Ver Figura 1) Oespues de este tiempo sa inocularon cajas de petri
con agar MRS con 1 ml del cultivo microbiano y se incubaron bajo las mismas
condiciones que eJ caldo Este procedirniento se realiz6 rapetidas veces hasta
seleccionar la cepa pura mediante observaci6n de caracteristicas morfologicas de
la cOlonia y a cada colonia se Ie practico la coloracion de gram con el fin de
observar las caracteristicas microscopicas de cada una e identificar las de mayor
similitud a los Lactobacilos y Bifidobacterias
Figura 1 Camara de anaerobiosis
27
2212 De la leche
Sa tomo 200 ml de teche cruda de la planta de leches y se colaca a fermentar
baja anaerobiosis durante 15 dras Luego sa procedia como en los vegetales
2213 De mucosa vaginal humana
Se tomo una muestra de frotis de mucosa vaginal humane can capito esteril sa
puso a ncubar en Caldo MRS y se procedi6 camo en 2211 y 2212 A cads
aislado sa Ie practico la coloracion de gram y sa seleccionaron aquellas que eran
bacilos gram positivos (Ver Tabla 2)
28
TABLA 2 Fuente de aislarniento de cepas nativas
CEPA FUENTE
1 Pepino fermentadQ
2 repollitas de bruselas fermentadas
3 Repolltgt fermentado
4 Repollo fermentado
5 Mucosa va~inal humana
6 Mucosa vaginal humana
7 repollitas de bruselas fermentadas
8 Repollo fermentado
9 repollitas de bruselas fermentadas
10 Mueo~a vaginal humana
11 Repollo fermentado
12 RepolJo fermentado
13 Leche fermentada
14 Mucosa vaginal humana
15 repollitas de bruselas fermentadas
16 Repollb fermentado
29
222 Almacenamiento de las cepas aisladas
Cuando las cepas crecieron en agar MRS homogEmeas en color morfologia
coloraci6n de Gram etc se pssaron a agar inclinado en tuba se cubrieron con
aceite mineral y se guardaran en refrigeraci6n a 4deg C para tomar de alii la cepa y
efectuarle las diferentes pruebas para confirmar el genera y determinar la especie
de cada una de eas (Ver Figura 2)
Figura 2 Cepas en tubos con agar inclinado
30
223 Pruebas para determinar et genero
2231 Coforaci6n de Gram
A cada cepa sospechosa de Lactobacilos se 1e hizo la coloraci6n de gram y se
seleccionaron las gram positivas
2232 Morfologfa
En agar MRS y despues de incubar en anaerobios~s crecian colonias grandes
cremosas de color beige con bordes homogeneos y c6ncavas(Ver Figura 3)
Figura 3 Colonias aisladas en agar MRS
31
2233 Prueba de esporulaci6n
A cada cepa aislada se Ie hizo esta prueba la cuel consistia en incubar en
aerobiosis durante ocho dias las cajas de agar MRS donde crecieron colonias de
Lactobacilo$ y luego se les (ealize) coloraci6n de espora Las capas que dieron
negativa a la prueba de espora se considararort sospechosas de sar Lactobacilos
y se continuo con la prueba de la catalasa (Ver Tabla 3)
2234 Prueba de la catalasa
los lactobacilos carecen de catalasa Eata prueba se hizo tomando una colonis
se deposito en vidrio de reloj y se Ie adicion6 dos gotas de peroxida de hidr6geno
(H202) la que no presentaba efervescencie eran cepe sospechosa de ser
Lactobacilo (Ver Tabla 4
Sa seleccionaron las capas euyo resultado fue aeorde con el genera Lactobacilfu$
y se continuo con la comirmaeion del genera y determinacion de la eSpecie
meqiante las pruebas bioqulmicas
32
224 Prueba para determlnar la especie
Para confirmar el genero y determinar la especie de las diferentes capas aisladas
se hizo una caracterizaci6n bioqufmica utilizando un kit de API 50 CHL Medium
Ref 50 410 que contiene una galed8 de medios que permite realizar el estudio
de fermentaci6n de los 49 azucares de 52 especies de Lactobacillus (Ver Figura 4
y tabla 5)
Figura 4 API CHL 50-Prueba bioquimica
33
225 Pruebas para determinar microorganismos probi6ticos
2251 Resistencia a pH=2 y sales biliares de concentraci6n O3pv
A las cepas idantificades como Lactobacillus brevis y Lactobacillus pantarum sa
las realiz6 Ie prueba dfl resistencia a pH=2 y sales biliares de concentraci6n 03
pv ( Jacobsen et al 1999) Una colonia de cada cepe aislada se inocul6 en 4 mt
de caldo MRS durante cinco dras bajo condiciones de anaerobiosis Oespues de
esta tiempo se dejaron pracipltar los microorganismos por sedimentaci6n se Ie
retire el sobrenadante y al precipitado se Ie adicion6 Sml de caldo MRS
previamente ajustado a pH=2 can seido clorhfdrico (HCI) dentro del mismo tuba de
ensayo G igual sa hizo can otro tubo previamente incubado pero a este se Ie
adiciono 5ml de caldo MRS con sales biliares a una concentra~i6n de 03 plv y
ambos se incuberon a 37deg C por 2 haras Sa midio 01 mi de cada uno de los
tubas al tiempo 0 y a las 2 horas y sa inoculeron en superficie en caJas de petri
con agar MRS S9 incubaron a 37deg C bajo anaerobiosis durante 48 horas Se
compararon visualrrente en cada caja de petri el crecimiento en superficie y las
que presentaron crecimiento en tos dos tiempos (0 y 2 horas) tanto en at media
acido como en sales I se consideraron resistentes a pH=2 y sales biliares (03
pv)
(Ver Tabla 6)
34
226 Conservacion
Todas fas capas que habian dado positiva Jas pruebas anteriores y que reaultaron
resistentes a pH=2 y sales biliares 03 pv y despues de identificadas en API 50
CHL sa repicaron en agar MRS en tuba inclinado y despues de Incubar a 37deg C
por 48 horas bajo anaerobiosis se Ctlbrie el biser completamente can aceite
mineral esteril y sa guardaron en refrigeraci6n
227 Elaboracj6n de fa bebida fermentada
2271 Preparaci6n de la mue$tra
Sa tome 1 mt de caldo MRS previamante inoculado e incubado que presentaba
una concentracion de Lactobacillus brevis de 27x108 Iml segun la escaJa de Mac
Farlan y sa adiciono a 9ml de leche pasteurizada en un tubo sa dej6 incubanda
en anaerobiosis por 48 hores Luego se pasaron estos 10 ml a un frasco qua
cont~nie 90 ml de leche pasterizada y se dej6 incubando par 48 haras en
anaerobiosis
35
2272 Adici6n del inOculo
A 900ml de leche pasteurizada se Ie adicion61os 100 ml de leche que habia sido
previamente ino(ulada dos veces con la cepa posteriormente se deja
fermantando la lache a temperatura de 37deg C
2273 Control de Ja fermentaci6n
Las muestras se hicieron por cuadruplicado y se les hizo un seguimiento de
aoidez hasta un valor entre 04 y 05 expresada como Bcido lactico esta
procedimiento corresponde a la babida fermentada sin prebi6tico La bebida ~on
prebi6tico tiene al mismo proeedirnianto pero adicionalmente se agrag6 avena a
una concentraci6n de 05 en el momento de la adici6n del in6e410 a los 900 ml
de leehe pasteurlzada y el procedimiento sigui6 igual al de la bebida sin prebi6tico
tambien se hizo por cuadruplicado
2274 Refrigeracl6n
Despues que las mezclas con y sin prebiotico alcanzaron el de acidez
requarido se IIeva ron a refrigeraci6n a una temperatura de 4deg C p~r 24 horas
para frenar proce~os metab6licos de los microorganisrtlos Despues de este
ti~mpo se procedi6 al batido
36
1 2275 Batido
Con un agitador se procedi6 a batir las bebidas para romper et coagulo formado
y de esta manera homogeneizar la mazela y obtener asf la bebida fermentada
2276 Envasado y almacenamiento
Ambas bebidas se envasaron en frascos vidrio para hacerles seguimiento de pH
acidez(expresado como acido tacticol y recuento de Lactobacillus breviSf los
dies 27 14 Y 21 despues de elaboradas las bebidas perfodo durante el cualta
muestra permanecfa afmacenada a temperatura de refrigeracion(Ver Figura 5
37
Fjgura 5 Diagrama de Flujo
PREPARACION DE LA MUESTRA
ADICION DEL INOCULO
~_____~_B~ATIDO~______~
INCUBACION 37deg C hasta acidez = 04-05 acido laotico
ENFRIAMIENTO
hasta 4 0 C ~------~ ~------~
ENVASADO Y ALMACENAMJENTO
dUrante 21 dfas a Temperatura 4 0 C
38
1
228 Determinaci6n del pH
Se determino por el metoda potenciometrico en un pH-metro manual durante los
dias 2) 7 14 Y 21 de las bebidas lacteas sin y con prebi6tica (Ver Tablas 7 y 8)
229 Oeterminaci6n de la acidez (Expresadfl como acido
lactica)
Se tomaron 9 mJ de las bebida~ sa Ie adicionaron 2 gotas de fanoftaleina como
indicador y sa titulo fa acidez con NaOH 01 N hasta la aparicion de un cotor rosado
debit EI volumen de NaOH utilizado se reporta como valor de de acidez
(VerTablas 10 y 11)
2210 Prueba de viabilidad
Qurante el perfoda de almacenamiento de la bebida lactea se procedi6 a hacer la
prueba de viabiHdad en los dias 7 14 Y 21 para determinar Si los lactobacilfus
permanecfan vivOs a una concentraci6n minima de 106 hasta el dia 21 como 10
establece eJ Articulo 10 de la Rasolucion 2310 del Ministerio de $alud de
Colombja
39
Para asta prueba se tamaron 10 rnl de muestra y se adicionaron a 90 ml de caldo
MRS ruego a partir de esta se hicieron diluciones de 10-2 hasta 10-11 de las
diluciones 109101deg 10-11 se inocul6 1 ml de cada uno en agar MRS siguiendo el
metodo de siembra en profundidad y por duplicado e incubando a 370 C x 5 dras
en anaerobiosis y luego se hicieron tos recuentos por duplicado para esi reportar
los recuentos promedio (Ver Tablas 13 y 14)
2211 AniUisls microbiol6glco de las bebidas Iicteas(con y sin
avena)
Con el fin de determinar las condiciones higienico-sanitarias del producto se
realizaron las pruebas microbiol6gicas de Recuento de mohos y fevadurasml en
agar OGY Recuento en superficia de Staphylococcus coagulasa positivoml en
agar Baird Parker Numero Mas Probable (NMP) de coUfor-mes totales y
Escherichia coliml en caldo Fluorocult y Presencia de Salmonela25ml con BHI
caldo tetrationato y agar Hecktoen (Montoya 1999)
(Var tabla 16)
2212 AnaUsis estadistico
A los datos obtenidos en la medici6n de pH acidez (expresada como Beido
laclico) en los dras 2714 Y 21 y el recuento de Lactobacillus en los dras 714 y21
40
realizados a los dos tratamlentos se tes aplic6 1a prueba t porque solo difieren
en la presencia 0 ausencia del prebi6tico para evaluar si habra diferencia
estadfsticamente significativa para los dos tratamientbs(Ver Tablas9 12 y 15)
41
3 RESULTADOS Y DISCUSION
31 Coloraci6n de Gram y morfologfa
Las cepas aisladas fesultaron Gram positivas (Ver Figura 6) colonias grandes
cremosas dE) color beige con bordes homogeneos y c6ncavos en su
morfologia (Ver Figura 3) resultando de acuerdo a 10 especificado en Stanley
1989 para Lactobacillus
32 Prueba de esporulaci6n y cataJasa
Los resultados de la pruebas de esporulaci6n y catalasa indicados en las
Tablas 3 y 4 respeclivamente dieron conforme a 10 especificado en Stanley
1989 para Lactobacillus
42
1
2 3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
TABLA 3 Resultado de prueba de esporuJaci6n
CEPA RESULfADO ESPORULACION
-- -------------
43
l i ~II bull ~ I I
TABLA 4 Resultado prueba de la catalasa
CEPA RESULTADO CATALASA
1 -2 -3 -4 -5 -6 -7 8 -9 -10 -11 12 -13 -14 -15 -16
3~3 Prueba para determinar la especie
Oespues de hacer las pruebas para seleccionar las cepas sospechosas de ser
Lactobacillus se realizo las pruebas bioquimicas fograndose identificar
Lactobacillus plantarum aislctdo de pepino repollo y repollitas de bruselas
44
fermentados y Lactobacillus brevis de mucosa vaginal y leche fermentada (Ver
Anexos del A al E y Tabla 5)
TABLA 5 Resultado identlficaci6n cepa~
CEPA NOMBRE
1 Lactobacillus planfarum
3 Lactobacillus plantarum
5 Lactobacillus brevis
13 Lactobacillus brevis
15 Lactobacillus plantarum
34 Pruebas para determinar microorganismos probi6ticos
las cepas de Lactobacillus brevis y Lactobacillus plantarum mostraron
rasistencia al medio acido de pH =2 Y sales biliares 03 pv resultado similar al
encontrado por Jacobsen et al 1999 para Lactobacillus plantarum (Ver tabla 6)
45
middot
~~~ttiI lltlmiddot~COX~dtJ ~xtc_~ 2 tr~ k-JlL~middot
-)~~TO DE lJIBUOTECUl rjRL]OTtCA twn GO1IU1
TABLA 6 Resultados a pruebas de resistencia a pH=2 y sales biliares 03 plv
CEPA RESISTENCIA pH=2 RESISTENCfA A SALES BIUARES ()3 pv
1 + +
2 + +
3 + +
4 + +
5 +
6 + +
7 + +
8 + +
9 + +
10 + +
11 + +
12 + +
13 + +
14 +1shy +M
15 + +
16 + +
+1 crecimiento debil
+ crecimiento abundante
46
Figura 6 Lactobacillus brevis Gram + aislado de leche fermentada
Ai observar en placa las celulas de lactobacilos despues de real1zar las pruebas
de resistenCia a la acidez y sales biliares se observo una tendencia a aglomerarse
posiblemente como un mecanismo de proteccion cOlitra estos medios que pueden
lIegar a ser adversos para elias (Ver figuras 7 y 8)
47
Figura 7 Lactobacillus brevis aislada de leche fermentada despu~s de la prueba de resistencia a pH=2
Figura 8 Lactobacillus brevis aislada de leche fermentada despues de la prueba de resistencie asales biUares 03 plv
fI
48
35 --Seguimiento del-pH-en-la-bebidaJacteacon y sin -prebi6tico
A continuacion se muestran las Tablas 7 y 8 donde sa registian los datos
recopilados de pHdurante 10$ dras Z 7 14 Y21 para las bebidas laaeas con ysin
prebi6tioo
TABLA 1 ResultadopH yogur sin avena
Dia Repetition 1 Repetici6n 2 Repeticion 3 Repetici6n 4
2 526 501 51 52
7 446 433 438 44
14 439 435 437 436
21 439 437 438 437
TABLA 8 -ResultadopHyogur con avena
Dia Repeticion 1 Repeticion2 Repeticion 3 - Repeticion 4
2 509 523 51 515
7 447 442 445 442
14 436 -438 439 437
21 432 433 435 434
Observando la Figura 9podamos ver que el pH en el -dfado$ para los dos
tratamientos as igual y empieza a descender rapidamente para estabilizarse a
partir del dra 7(Ver figura 9)
49
Figura 9 Comparacj6n de medias para -el pH
Comparaci6n de medias para pH
55 ~ 5 +----=gtIIIi-~i~~----=-r--it~ -- pH sin avena
a 45 1--~~~~=~~ 4 --- pH con
avena35 t-----r-- -------=------=--= ------- - ----
2 7 14 21
Dias
Aplicando la prueba t para comparar las medias de pH I S6 muestia una diferencia
altamants significativa en los dos tratamientos para el dia 21 (pltO05)
(Ver tabla 9)
TABLA 9 Compaiaci6n de medias para pH
DtAS SIN AVENA CON AVENA te p (VALOR)
2 514 514 0 10
7 439 444 -1 61 0159
14 437 I
438 -070 0510
21 438 433 528 00019 shy
- DiFERENCIA AlTAMENTE SIGNIFICATIVA
50
I
AI aplicar regrasi6n a los datos sa obtiene al modelo estimado
pHSinAyena =535606 - 01505650Ia +0005044340IaI2
La variabilidad en la respuesta de pH asta siendo explicada en un 8S7522 por
el modelo (Ver Anexo F)
EI tratamiento con avena mostro el siguiente modelo al analisis de ragresi6n
pHConAvena =534463 ~ 0140407Dia + 0004480980Ia2
La variabilidad an la respuesta de pH asta siendo explicada en un 903315 par
el nlodelo(Ver anexo G)
36 Seguimiento de la acidezmiddotmiddot expresada comomiddot de acido
lactico
A continuaci6n sa muestran las Tablas 10 y 11 donde sa registran los datos
tecopilados de acidezmiddotdurante los dias 27 14 Y 21 para las pebidas taetees con y
sin prebi6tico
TABLA 10 Resuttadode acidez (expresadocomo acido tactico) yogurt sin avena
CIA R~petici6n1 Repeticion2 Repetici6n 3 Repeticion 4
2 054 06 057 058
7 072 074 073 0]2
14 080 083 082 082
21 0]4 079 078 077
51
TABLA 11 Resultado de aCidez (expresado como acido Icktico) yogurt con avena
Dia Repetici6n 1 RepetiCi6n 2 Repetici6n 3 Repetici9n 4
2 059 055 058 057
7 071 073 072 072
14 089 087 088 086
21 092 091 090 091
Observando la Figura 10 se puede concluir que la acidez empieza a aumentar
hasta el dia 14 y luego trata de estabilizarse para los dos tratamientos
(Ver figura 10)
Figura 10 Comparaci6n de medias para la acidez
N G)
Comparacion de medias para acidez
1
2 0I 5 -+--=--------=-~~~= u
ltC
- Acidez sin avena
2 7 14
Dias
52
21
-it- Acidez con avena
Aplicando la prueba t para camparar las madias de acidez se muestra una
diferencia altarnante significativa en los dos tratamiantos para los dias 14 y 21
(pltO05)
(Var tabla 12)
TABLA 12Comparaci6n de medias para Acidez
DIASmiddot SIN AVENA CON AVENA te p(VALOR)
2 0572 0572 0 10
7 0727 0720 119 0278
14 0818 0875 -638 000070shy
21 077 091 -1212 i 0000019 shy
DIFERENCIA AL TAMENTE SlGNIFICATIVA
AI aplicar r~gresi6n a los datos se obtiene el modelo estimado
AcidezSlnAIena = 0491897 + O0436032Dia O00144613DfaA2
La variabilidad en la respuesta de acidez asta siendoexplicada en un 970978
por al modelo (Ver anexo H)
EI tratamiento con avena mostro elsiguiente modeloj a1 analisis de regresion
AcidezConAvena = 0491638 + 00406572Oia - OQOO982559OiaA2
La variabilidad enla respuesta acidez esta siendo explicadaen un 99212 por
el modelo (Ver anexo J)
53
I ~
37 Prueba de viabiJidad
A continuaci6n sa muestran las Tab~as 13 y 14 donde sa presentan los datos
recopilados del recuento de Lactobacilos durante los dias 7 14 Y 21 para las
bebidas lacteas con y sin prebi6tico
TABLA 13 Recuento de Lactobacilos (UFCml) yogurt sin avena
Dia Repetici6n 1 Repetici6n 2 Repeticion 3 Reptttici6n 4
7 1880X10l1 1454X1011 1642X1011 1780X10~
14 1560X10~ 646X1011J 1890X10l 140X10l1
21 1200x10lu 128Ox10u 1745x10J 1520x101V
TABLA 14 Recuento de Lactobacilos (UFCml) yogurt con avena
Dfa Repetieion 1 Repetici6n 2 Repeticion 3 Repeticf6n 4
7 1600X10lt 1240X10t 1640X10ll 1980X10t
14 540X1011 427X10n 546X10n 720X10ll
21 500x1011 492x1011 712)(1011 980x10~
AI analizar la Figura 11 sa puede observar un recuento mayor de Lactobacilos
en al tratamiento con avena resultado de acuerdo a 10 encontrado por Alander at
aI 1999 Kontula et aI 1998 y Jaskari et aI 1998
54
Figura 11 Comparaci6n de medias para Log Lactobacillus
Comparacion de medias para log Lactobacillus
~ 1350
-+- Sac Sin--() 13 co avenaIII
bull 125 -- Bac con 0)
0 12 avenaJ
115 7 14 21
Dias
Aplicando la prueba t para comparar las medias de recuento de Lactobacillus no
se encontr6 una diferenc1a estadfsUcamente significative entre los dos
tratamientos (Ver tabla 15)
Este aumento en al racuento influy6 en la disminuci6n del pH y en el aumento de
fa aeidez por la fermentacion que realizan los Lactobacillus sobre fa lactosa de la
lache y la avena adicionada como prebi6tico
55
1
TABLA 15 Comparaci6n medias lag Lactobacillus
DIAS SIN AVENA CON AVENA tc p(VALOR)
7 122257 122022 04846 06451
14 121065 132393 -19602 00977
21 129025 133087 -08236 04416
At aplicar regresion a los datos se obtiane al modelo astimado
LactobacillusSinAvena= 117347 + 004834640Ia
La variabilidad en la respuesta del recuento de LactobaCillus ssta siendo
explicada en un 260054 por el mod$loVar anexo J)
EI tratamiento con avena mostr6 al siguiente modalo al anal isis de regresion
Lactobacillu$ConAvena =118103 + 007903040Ias
La variabilidad en la respuesta de recuento esta siendo explicada en un 3068
por al modelo(Ver anexo K)~
38 Analisi$ microbiol6gicos de las bebidas lacteas con y sin
En la Tabla 16 estan recopilados los resultados microbiol6gieos obtenidos en ras
muestras con los dos tratamientos (con y sin avena)
I [
sa
TABLA 16 Resultados analisis microbiologico
Recuento de mohos y levaduras Iml lt10
Recuento de Staphylococcus coagulase positiva Iml lt100
NMP coliformes fotales y Escherichia coli Iml lt3
Presencia de Salmonella25ml Ausente
Los resultados de este analisis demuestran que las bebidas fermentadas con y
sin avena~ astan fibres de microorganismos patogenos
57
1
4 CONCLUSIONES
Se aislaron cepas nativas de Lactobacillus plantarum de las muestras vegetates
de repollo pepino repollitas de bruselas fermentadas y Lactobacillus brevis de
lache fermentada y mucosa vaginal humana Ambas cepas resistieran un pH=2 y
una concentraci6n de sales biliares det 03 ptv dos earacteristicas importantes
en los probi6ticos
Lamiddot cepa de Lactobacillus brevis aislada de lache Sa utiliz6 para elaborar una
bebida fermentada sin y con avana comoingrediente prebiotico obteniendose un
aJimento centon recuento del probi6tico viable durante 21 dras de seguimiento
ademas libre de microorganismos )at6gen05
No se encontr6 efecta significativo de la avena sobre Ie viabilidad del Lactobacillus
brevis aunque sa presento un aumento en 61 recuento de estos en la bebida con
avena
58
plusmn ~
5 RECOMENDACIONES
Ensayar la cepa de Lactobacillus plantartJm en productos carnicos madurados
como el salami
Ensayar la cepa de Lactobacillus l)revs en otros derivados lecteos como queso
quesito queso crema
Continuar con el estudio de estos microorganismos y caracterizarlos
molecularmente ademas de estudiar su capacidad de adherencja a fa mucosa
intestinal sobre algunes Hneas celulares como las CaCo~2
Estudiarel efedo de la avena sabre la viabiJidad del Lactobacillus breyis a una
concentraci6n mayor de 05
Realizer ensayos can las cepas de Lactobacillus brevis y Lactobrlcillus pJantarum
para elaborar masas acidas para panificacion reemplazando el Bromato de
Potasio aditivo prohibido desde marzo del 2003 en nuestro pais per 5U toxicidad
59
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65
ANEXOS
66
ANEXO A RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AlSLADA DE i
PEPINO it
Referencia Pepino 1 Fecha 06122002
IEXCELENTE IDENTIFICACION
Latto plantarum 1
Galeria API 50 CHL V50 Leida el 06122002
Perfil - -- - ++ - -- - ++++ - - -+- + - I I I I I I I I +t+ - +f- ~ - - + + ~ - - - +- + - shy
o - GLY - ERY DARA - LARA + RIB + DXYL - LXYL - ADO - MDX - GAL + GLU + FRU + MNE + SBE - RHA - DUL - INO bull MAN + SOR - MDM + MUG shyNAG + AMY + ARB + ESC + SAL + CEL + MAL + LAC + MEL + SAC + TRE + 1NU - MLZ + RAF + AMD - GLYG - XLT - GEN + TIJR + LYX - TAG - DFUC shyLFUC - DARL + LARL - aNT + 2KG - 5KG shy
--- Taxones significativos rd -----T -- Tests en contra
Lactoplantarum 1 999 092 1
Taxon siguiente Lactobrevis 1 OJ 044 3
i i
Lactoplantarum 1 1 test (5) en contra
D-SORBITOL (SOR) 78
Tax6n siguiente Lactobrevis 1 3 test (s) ert contra
METHYLD-MANNOSIDE (MOlM) 0 MELEZITOSE (MLZ) 14 D-TURANOSE (TUR) 14
67
ampb
ANEXO B RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AISLADA DE REPOLLO FERMENTADO
~
Referencia Repollo fermentado - 3 Fecha 03072003
EXCELENTE IDENTIFICACION
Lactoplantarum 1
Galena API 50 CRL V50 Leida el 03072003
Perfil - - ++ - - - - -H++ - - ~ + - + - I I 1 I I I I -H+ - ++ - - - + + - -- - - + - shy
o - GLY - ERY - DARA - LARA + RIB + DXYL - LXYL - ADO ~ MDX - GAL + GLU + FRU + MNE + SBE ~ RHA - DUL - INO - MAN + SOR - MDM + MDG shyNAG + AMY + ARR + ESC + SAT + CRL + MAL + LAC + MEL + SAC + TRE + lNU - MLZ + RAF + AMI) - GLYG - XLT - GEN + TOR + LYX - TAG - DFUC shyLFUC - DARL - LARL - GNT + 2KG - 5KG shy
------Taxones significativos _ _----- Id--- ---T---- Tests en contra
Lactoplantarum 1 999 095 1
Tax6n siguiente Lactobrevis 1 01 OA8 3
lJactoplantaru01 1 1 test (s) en contra
DSORBITOL (SOR) 78
Taxon siguiente Lactobrevis
METHYL-D-MANNOSIDE D-TURANOSE
1
(MOM) (TOR)
3 test (5) en contra
0 MELEZITOSE 14
(MLZ) 14
i
I
68
ANEXO C RESULTADO PRUEBAS BIOQUWICAS DE CEPA AISLADA DE MUCOSA HUMANA
Referenda Mucosa - 5 Fecha 27012003
BUENA IDENTlFICACION
Galeria API 50 CHL vso Leida el 270112003
Perfil - - - - +t--t - - - + - + - - - - - - - - -+- - - - - + - + - - - - - - - - - - - - - bull - - -+ - +
o - GLY ~ ERY - DARA bull LARA + RID + DXYL + LXYL - ADO bull MDX - GAL + OLU - FRU + MNE - SBE - IlliA - DUL - INa - MAN - SOR - MDM - MOO shyNAG + AMY - ARB - ESC ~ SAL bull CEL - MAL + lAC - MEL + SAC - TRE shyINU - MLZ - RAF - AMD - GLYG - XLT - GEN - 11JR - LYX - TAG - DFUC shyLFUC - DARL - IARL - ONT + 2KO - 5KG +
- - - - - - Taxones significativos - - - - - - - Id T -- Test en contra
Lactobrevis 3 963 088 1
Taxon siguiente Lactoco11inoides 36 075 2
Lactobrevis 3 1 test (s) en contra
GLUCOSE (GLU) 95
-~~~------------~---------------------------~--~-------~--~-----~----------~--------~------------~~--Taxon siguiente Lactocollinoides 2 test (s) en contra
GLUCOSE (GLU) 100 MELIBIOSE (MEL) 25
69
i r
ANEXO D RESULTADO PRUEBAS BIOQIJiMICAS DE CEPA AISLADA DE LECHE FERMENTADA
Referenda Leche fennentada ~ 13 Fecha 27012003
BUENA IDENTIFICACI6N
Galeria API 50 CHL V50 Leida el 270112003
Perfil - - - - -t-t+- - - - + - + - - - bull - - - - -+- - - - - + - + - - - - - - - - - - - - - - - - -+ - +
0 - GLY - ERY - DARA - LARA +Rll3 + DXYL + LXYL - ADO - MDX ~GAL + GLU - FRU + MNE SBE - RHA DUL bull INO MAN - SOR MDM bull MDG shy
~NAG + AMY - ARB - ESC - SAL - CEL - MAL + LAC - MEL + SAC - TRE I lNU - MLZ - RAF - AMD - GLYG - XLT - OEN - IUR LYX - TAG - DFUC bull i
LFUC - DARL - LARL -ONr + 2KG - SKO + 1
- -- - - Taxones significativos - - Id -- T --- Test en contra
Lacta brevis 3 963 088 1
Taxon siguiente Lactocollinoides 36 075 2
Lactobrevis 3 1 test (s) en contra
GLUCOSE (GLU) 95
-----------------------------------------------------------~------------------------------~-------------------Taxon siguiente Lactocollinoides 2 test (s) en contra
GLUCOSE (GLD) 100 MELffiIOSE (MEL) 25
70
II iJ1
I
I ANEXO E RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AISLADA DE REPOLLITAS DE BRUSELAS FERMENTADA
Referencia repollitas de bruselas 15 Fecha 03072003
EXCELENTE IDENTIFICACION
Lactoplantarum 1
Galeria API 50 CHL vsO Leida el 03072003
Perfil - - - - +t - - - - +H+ - +- - +t + - I I I I I I I f ++t - + - - - -+ + - - - -+ -+ - - I ij
o - GLY - ERY - DARA - LARA + RJB + DXYL - LXYL - ADO - MDX - GAL +
GLU + FRU + MNE + SBE RHA + DUL - INO - MAN + SOR + MDM + MOG shyNAG + AMY + ARB + ESC + SAL + eEL + MAL + LAC + MEl + SAC + TRE + i
I1NU - MLZ + RAF AMD GLYG - XLT - aEN + TUR + LYX - TAG - Druc LFUC - DARt + LARL - aNT + 2KG - 5KG shy n ----Taxones significativos ------ Id Tests en contra
Lactoplantarum 1 999 090 o
Taxon siguiente Lacto pentosus 01 012 7
Lactoplantarum 1 o test (s) en contra
Taxon siguiente Lacto pentosus 7 test (8) en contra
GLYCEROL (GLY) 75 D-XYLOSE (DXYL) 100 L-RHAMNOSE (RHA) 25 METHYL-D-MANNOSIDE (MOM) 1 MELEZITOSE (MLZ) 25 RAFFINOSE (RAF) 75 D-ARABITOL (DARL) 0
71
~
I i I
ANEXO F - ANALISIS DE REGRESION PARA pH EN BEBIDA SIN AVENA
Aruilisis de regresi6n polinomial
---~-~-------------------------------------------~-----------~~---------------------~--------------Variable dependiente pHSinAvena ---------------------------~-------------~--------------------~---------------------------------
Error T Parametro Estimado Estandar Estadistico P-Valor
CONSTANTE 535606 0094535 56657 00000 Dia -0150565 0020706 727154 00000 Dia2 000504434 0000871488 578819 00001
---~---------------------------------------------------------------------------------------------------
Anfllisis de Variama -------------------------------------------~-----------~-----------------------------~-~--- jSource Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor 11
------------------------~------------------------------------------------------------------------------~ Mod-elo 155772 2 0118861 4256 00000 Residual 0237877 13 00182983
Total (Corr) 11956 IS
R2 == 867522 percent
pHSinAvena == 535606 - 0150565Dia + 000504434Dia2
72
____
middot ANEXO G - ANALISIS DE REGRESION PARA pH EN BEBIDA CON AVENA
AmUisis de regresion polinomial _____~_____~__-_____~___4____________________bull____bull__________bull_____________~~----_------___________
Variable depcndiente pHConA vena ------------------------------------------------------------------------------------------~--------
Error T Parametro Estimado StAndar Estadfstico P-Valor
---------------------------------------------~-----------------------------------------------_---------CONSTANTE 534463 00801045 667208 00000 Dia -0140407 00175453 800253 00000 DiaA 2 000448098 0000738458 606803 00000
----------------------~---~-----------------------------~------------------------------~----AmUisis de Varianza
---~---------------------------------~---------------------~------------~-------------------~------Source Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio PValor --------------------------~-----------------------------------------------~------------~-----~~--~ ModeJo 159575 2 0797873 6073 00000 Residual 02170798 middot13 00131383 _______~_~ ~_~----------~------~--~-----~-M-----~-----____ _____________~-----------------------Total (COlT) 176654 15
R12 903315 percent
-----------~------------------------------------------------------------------------~-----------pHConAvena 534463 - 0140407Dia + 000448098DfaA 2
73
ANEXO H - ANALTSIS DE REGRESTON PARA ACIDEZ EN BEBJDA SIN AVENA
An8Jisis de Regtesi6fi P6lifJomial
Variable Depefidiefile~ AcidezSinAVenll _______________w_____~______~________________~-----------_________~_________________~~____~___~_____
Error T Pariirnetro Estimado Estandar Estadistico ---------------------------------------~--------------~-~-------~--------------------~------------CONSTANT 0491697 00123217 399051 00000 Dia 00436032 000269882 161564 00000 D1a2 -000144613 000011359 127312 00000 __w___~________________________~-_______-_____~----____________________________~__~---~_--__~___
AriiiJisis de varianza ~_~__~__________~_~____~________~___________- _________e_____________________________bull _____-________
Source Smn de cuadr Df Mean Square F-Ratio PmiddotValor_~~___________________________________bull ______~___________bull ____________bull ______~________w________________
Model 0135203 2 00676013 21747 00000 Residual 000404118 13 000031086
Total (Corr) 0139244 15
R2 970978 percent
AcidezSlnAvena 0491697 + O0436032Dia - 0OOl44613Dia2
74
I
ANEXO I ANALISIS DE REGRESION PARA ACIDEZ EN BEBIDA CON AVENA
1
Anwisis de tegtesi6fi polinomial
Variable dependiente Acidez Con Avena
Error T ParametTo Estimado Stlindar Estadfstico P-Valor ----------------~-------~---------------------~-----------------------------------------------------CONSTANT 0491639 000926607 530578 00000 Diamiddot 00406572 000202955 200326 00000 DfaA 2 0000982559 0000085421 -115025 00000
-------------~----------------------------~-------------------------~-----------------------------------
-------------~-----~~-----------------------------~---------------------------------------------_--Source Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio PValor
-~-------------~----------------------------------~------------------~~-------------------------- Modelo 0288008 2 0144004 81914 00000 Residual 000228539 13 0000175799
----------~~--------------~---------------------------------------------~---------------------------Total (Corr) 0290294 15
RA2 = 992127 percent
-------------------------~----~---~------------~---------------------------------~---------------~
AcidezConAvena == 049163amp + 00406572D1a - 0000982559DiaA2
75
I
(Ilmiddot il
ANEXO J- ANALISIS DE REGRESION PARA RECUENTO LACTOBACILOS PARA BEBIDA SIN AVENA
Amilisis de regresion - Modelo lineal Y = a + bX
------------------------~----------------------~-----------------------------~----------~-----------Variable Dcpendiente LactobacilJusSinAvena Variable independiente Dia
I--------~----------~-----------------------------------~-------~-~--~--------------------------~-Error T
Paramctro Estimado Standard Stadistico P-Valor
----~----~------------~-----~-----------------------~-------------~-----------------------------Intereepto 117347 0389973 300911 00000 Pendiente 00483464 00257889 18747 00903
Analisis de Varianza
---------~------------------~----------------~---------------------------------~---------~----------Source Sum decuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor
------------~---------------------~---------------------~--------------------------------~-----~----Modelo 0916252 1 244835 443 00616 Residual 260706 10 0260706
--~------------~---~------------------~~~-----~-------~---------~~-------------------------------------Total (Corr)352332 11
Coeficiente Correlaci6n = 0509955 R2 = 260054 percent
LactobacillusSinAvena= 117347 + 00483464Dfa
76
ANEXO K- ANALTSIS DE REGRESION PARA RECUENTO LACTOBACILOS PARA DEBIDA CON AVENA
Aruilisis de regresion - Modelo lineal Y = a + hX
Variable Dependiente LactobacillusConAvena Variable Independiente Dia ---~--------------------------------------------------------__-----------__--_--_-----------shy
Error T Paramctro Estimado Standard Estadistico P-Valor -~--------------------------------------------------------------------------------------------------
Irttercepto 118103 0567963 207942 00000 Pendiente 00790304 00375594 210414 00616
-----------------~----------------------------~----~-------~----~----------------------------
Analisis de Varianza
----------------~----------------~------------------~--------------------------~------~--------shySource Swn de cuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor
-----------------~--~--------------------------------------------------------------------------~---~ Mode10 244835 1 244835 443 00616 Residual 552997 10 0552997
Total (Corr)797832 11
Coeficiente Correlacion = 0553964 RI2 = 306875 percent
-----~--------------------------------------------------------~--------------------------------------
LactobacillusConAvena = 118103 + 00790304Dfas
77
AGRADECIMIENTOS
Quiaro agradecer a todas las personas que directa 0 indirectamente me
colaboraron
Agradezoo
A la doctora Olga Ines Montoya directora de trabajo de grado por su asesorfa y
apoyo incondicional
AI doctor Jose Uriel Sepulveda V POr su asesoria y spoyo
A las estudiantes de la practica en Bacterialogia del Instituto Universitario CoIegio
Mayor de Antioquia Angela Patricia Diaz Santos Carolina Calle Cardona y Dora
Areiza A
A las directivas del postgrado en Biotecnologfa muy especislmente aJ Doctor
Rafael Arango por su apoyo en momentos de dificultad econ6mica
A todo et personal del Laboratorio de Mlcrobialogia Universidad Nacional sade
Medellin
A todo el personal de la Planta de Leches de la Universidad Nacional sede
Medellin
RESUMEN
En este trabajo se aislaron cepas natives de Lactobacillus plantarum de muestras
yegetales fermentadas de pepino rapollo y repollitas de bruselas y Lactobacillus
brevis de leche ferm~ntada y mucosa humana resultando resistentes a pH=2 y
sales biliares 03 pv dos caracterfsticas importantes que deben cumplir los
microorganismos lIamados probioticos
utmzando a cepa nativa de Lactobacillus brevis aislada de leche fermentada se
elaboraron dos bebidas Iscteas fermentadas una sin ingrediente prebi6tico y otra
adicionada de avena 05 como ingredienta prsbiotico para comparer si habra
alguna incidencia de asta ingrediente en la viabilidad del probiotico
A ambas bebidas sa les hizo un seguimiento de pH y de acidez (expreSada
como acido lactico) durante los dias 27 14 Y21 Y 1a prueba de viabilidad en los
dias 7 14 Y21 despues de elaboradas cada una de las bebidas De estas bebidas
sehicieron 4 repeticiones
Sa obtuvo recuentos mayor-es de 106 UFCml de Lactobacillus brevis hasta el dia
21 encontrandose en aumento an los recuentos en a bebida con avena aunque
estadlsticamente no hubo diferencias significativas
TABLA OE CONTENIDO
lISTA DE TASLAS ------------~--~------------------------- ~
LISTA DE ANEXOSmiddot--------- ----------------------------------11
INTRODUCCON -----------------------------------------------------12
1 MARCO TEORICO Y ESTADO OEl AItTE---middot---middot-middot-- -------14
11 PROBIOTfCOS ------------- - middot------------------14 111 Historia------------------------- 14 1~ 12 Microorganismos probi6ticos---------------- 15 113 Caracteristicas fenotipicas de algunos microorganismos probi6ticos-----~------ ------- 16 114 Caracteristicas de los probi6ticos--- - ----17 115 Beneficio de los organismos probi6ticos---middot ----19 1151 Facilitar la digesti6n de la lactosa ------ 19 1152 Protegen contra enfermedades gastrointestinales - -19 1153 Protegen contra infecciones del tracto urogenital -------20 1154 Promueven la barrera de defensa endogena delintestino ---20 1155 Protegen contra cancer de colon- ---- ---~1 1156 Protegen contra infeGCiones respiratorias----------21 1~157 En at iratamiento y pre~enci6n deleczeroa-- - 22 1158 Previenen infeccion en heridas quirurgicas ---------23 12 PREBlOTICOS -- -----------------23
2 METODOLOGIA~~~~-~fO ~~~tfmiddot~I~~-____bullbull_--~---------middot26
21 lOCALIZACION~~======~-~--- ------26 22 METODOS------------------------------26 221 Aislamiento de cepas nativas -------_ 26 2211 De vegetales -- -- -26 2212 De Ja leche--------- -----------28 2213 De mucosa vaginal humana ----~---------------28 222 Almacenamiento de fas repas aisladas ----- --30 223 Pruebas para determinar el genera ---- 31 2231 Coloracion de Gram --------------------31 2232 Morfologra---~----------------- -- -31 2233 Prueba de esporulaci9n----------------~2
2234 Prueba de la catalasa--------------------~------ 32 224 Prueba para determinar la especie ----------~-------- 33
225 Pruebas para determinar microorganismos probi6ticos -----34 2251 Resistancia a pH=2 y sales biliares de concentracl6nO3piv --34 226 Conservacion ------------~-----------------35
227 Elaboraci6n de la bebida fermentada ---------35 2271 Pr~paraci6n de Ie muestra ---------------~----35 2272 Adici6n del Inocula ----~-------------------36 2273 Control de Ie fermentaci6n=~~~==~~-------------36
2274 Refrigeracion ------- ~-- ---- -------36 2275 Batido--~ ------------------------------------37 2276 Envasado y almacenamiento------------ 37 228 Determinacion del pH------- ---------- -----39 229 Determinacion de la acidez (Expresada como acido lactico) -39 middot2210 Prueba de viabiJidad ------~-------~----------39 2211 Am3lisis microbiol6gico de las bebidaslacteas(con ysinavena) -40 2212 Anslisis estadistico ~-~~-~---------=------------40
3 RESULTADOS Y DISCUSI6N-~------------------------------ --42
31 Coloraci6n de Gram y morioJpgfa --001-------- - -----42
32 Prueba de esporufacion y catafasa-----------------42 33 Prueba para determinars especie- -------- ---44 34 Pruebas para determiner microorganismos probi6ticos -----45 35 Seguimiento del pH en la bebida h3ctea con y sjn prebi6tico-----49 36 Seguimiento de la acidez expresada como de acidb lactico -----51 37 Prueba de viabiJidad-------- ----------54 38 Analisis microbiol6gicos de las babides lacteas con y sin avena --56
4
5
REFERENCIA~ BIBLIOGRAFICAS --~-------------middotmiddot---- ---------60
LISTA DE TABLAS
TABLA 1 ALGUNAS ESPECIES MICROBJANAS PROB16TICAS-------------~------middot15
TABLA 2 FueNTE De AISLAMIENTO DE CePAS NATJVAS --------------29
TABLA 3 RESULTADO DE PRUEBA DE ESPORULACI6N------------------43
TABLA 4 RESULTAOO PRUEBA DE LA CATAlASA ----------------------44
TABLA 5 ReSULTADO IOENTIFICACION CEPAS--------------------middot-----45
TABLA 6 ReSULTADOS APRUEBAS DE RESISTENOIA A pH=2 YSALES BILtARES 03 Pv
-----------~-- ----------~--46
TABLA 7 ReSUtTADO pH YOGUR SIN AVENA ----------------49
TABLA 8 ReSULTADO pH YOGUR CON AVENA ------------ --49
TABLA 9 COMPARACION DE MEDIAS PARA pH----------------------50
TABLA 10 ReSULTADO DE ACIDEZ (EXPRESADO COMO ACIDO LACTICO)-------51
YOGURT SIN AVENA ------------------------------51 TABLA 11 ResuLTAOo oJ ACIOEZ (EXPRESAOO COMO ACIDO ACTICo)----52
YOGURT CON AVENA--- ------------------- --- ----52 TABLA 12 COMPARACION DE MEDIAS PARA ACIOEZ----------------~~53
TABLA 13 RecuENTo DE LACTOBACILOS (UFCML) YOGHURT SIN AVENA--54
TABLA 14 RECUENTO DE LACTOBACILO$ (UFCML) YOGHURT CON AVENA ------54
tABLA is COMPARACl6N MEDIAS LOG LAcToBACltLUS-------------56
TABLA 16 RESULTADOS ANALiSIS MICROBIOL6GICO------------- --57
L1STA DE FJGURAS
FIGURA 1 CAMARA DE ANAEROBIOSIS----------middot------~----27
FIGUftA 2 CePAS EN TUBOS CON AGAR INCUNADO -----~--middot----------30
FIGURA 3 COLONrASAISLADAS EN AGAR MRS-------middot---------31
FIGURA 4 API CHL 50-PRUEBA sloaufMlcAS ------------- bull --33
FIGURA 5 DtAGRAMA DE FLUJO ------~---------- ----~-38
FIGURA 6 LACTOBACILLUS I3REVIS GRAM + AfSLAOA OE LECHE FERMENTADA------47
FIGURA 7 LACToBACILLUS BFEVS A1SLADA OS lECHS FERMENTADA DESPUES DE LA
PRUEBA DE RESfSTENCIA A pH=2 ----------------------~ - middot-48
fIGURA 8 LAcTOBAcILLUS BREVIS AISLADA DE LECHE FERMENTADA OESPUES DE LA
PRUEBA DE RESISTENCJA A SALES BILIARES 03 pN------------- ----48
FIGURA 9 COMPARACI6N DE MEDIAS PARA EL pH ---------- ---------50
FIGURA 10 COMPAAACI6N DE MEDIAS PARA LA AC1DEZ ----------------52
FIGURA 11 COMPARACI6N DE MEDIAS PARA LOG LAcTOBAcILLUS -------------55
LISTA DE ANEXOS
ANEXO A--- RESUl TADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AfSLADA DE
ANEXO B RESULTADO PRUEBAS BIOQUfMICAS DE CEPA AISLAOA DE
REPOLLO FERMENTADO --middot----------middot--------------------------68
ANEXO c RESULTADO PRUEBAS BIOQUIMICAS DE CEPA AISLADA DE
MUCOSA HUMANA ------------------------------------------ ------69
ANEXOD RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMCAS DE CEPA AISlADA DE
LECHE FERMENTADA---------------------------------------_-70
ANEXO E RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AtSLADA DE
REPOLLlTAS DE BRUSELAS tERMENTAOA ------------------------71
ANEXO F ANAUSIS DE REGRESION PARA pH EN BEBIDA SIN AVENA--- 72
ANEXO G- ANAUSIS DE REGRESION PARA pH EN BEBIDA CON AVENA --73
ANEXO H ANALISIS DE REGRESION PARA ACIDEZ EN BEBIDA SfN AVENA
ANEXO 1- ANALISIS DE REGRES[ON PARA ACIDEZ EN BEBIDA CON AVENA
ANEXO J- ANALISIS DE REGRESION PARA RECUENTO LACTOBACILOS
PARA 8EBItgtA SIN AVENA ~----------------------------------------wirEr
ANEXO K ANALlS1S DE REGRESION PARA RECUENTO LACTOBACILOS
PAFt BEBIDA CON AIlNA-------~-------~----------~------~---middot-----~-middot---irjr
INTRODUCCI6N
En los ultimos arios S9 ha comprobado los efedoS beneftcos que los
microorganismos probiotico$ ejercen sobre la salud humana a facilitar la digestion
de lactosa estimular 18 actividad inmungica modificar ef balance poblecional
tanto de la microbiola intestinal nativa can posibles sfeelos patogenos como de
las que causan toxiinfeCCiones alimentarias edemas se estan ensayando como
implante en heridas de piel para evttar contamlnacion can microorganismos
patogenos
Los microorganismos probi6ticos se emplean en fa elaboraci6n de productos
fermentados en especial los lacteos Estas industrias se han limitado a utilizar
cultivos iniciadores importados que rsquieren tiampo y culdados para su
manlpulacion y empleo En Colombia no se han realizado InY9s1igaciones que
involucren cepas nativas can activldad probiotica ni el afecto de ingredientes
prebi6tico$ sabre fa viabilidad de estos microorganismos tenienqo en cuenta que
al prebiotico es un ingrediente allmentario que estimula sefectivamente el
crecimiento y actividad de algunas especies de microorganismos probi6ticos
En esta investigacion se sislaron microorganismos probi6ticos a partir de
muestras de vegetales y lache crud a de vaca fermentadas naturafmente y de
mucosa humana utifizando medios de cultivo salactivos bajo condiciones
12
anaerobias Luego se procedio a verificar su rasistencia a los acidos gastricos y
sales biliares simulando asl las condiciones del tracto gastrointestinal de 10$
humanos Las capas que presentaron mejor comportamiento ante estas pruebas
sa caraeterizaron morfologles y bioquimicamente y sa seleccione una de eHas
para inocular en bebidas lacteas sin y can avena como ingrediente prebiotico y
verificar su viabilidad durante al almacenamiento
Los resultados de esta investigacion padren sar de gran irnportanoia para la
industria nacional de alimentos las univarsJdades con facultades relacionadas
can la salud y la alimentaci6n y para las entidades gubernamentales involucradas
en la alimentacion y nutricion de grupos de poblacion vulnerables tales como eJ
Instituto de Bienestar Familiar y Bienestar Social entre otros
13
middot~
1 MARCO TEORICO Y ESTADO DeL ARTE
11 P~OBI6TICOS
111 Historia
EI consumo de productos fermentados lecteos con microorganismos vivos
especialmente bacterias acido lacticas ha sido reportado a 10 largo de la historia
desde tiempos remotos se evidencia al conoeimiento de los beneficios que estes
proporcionaban perc real mente quian enfatiz6 en ellos fua 91 cienUfico ruso Elie
Metctinikcff que reaclon6 la ingesti6n de (eches fermentadas con la longevidad y
salud de las personas ( Pardio et al 1996)
En 1965 sa utilizo por primera vez et termino Probi6tico derivado dellatin pro
que significa a favor de y del gr9go bios que quiera decir vida tnieialmente esta
palabra defini6 a los microorganismos que promovian el erecimiento de otros
microorganismos Ivego se splico asta termino a extraetos de tajido que estimlilan
el crecimiento micrObianqEn la actuaidad sa han definldo como probiotieos los
cultivos (micas 0 mezclados de microorganismos vivos qua al ser ingeridos por
humanos Q animales majoran el balance poblacional de la microbiota intestinal
evitando la adherencia de patogenos (Schrezenmeir et albull2001) Sin embargo
estos microorganismos no nece_iamenta son habitantes propios del tracto
14
gastrointestinal (Holzapfel at a2001Gaitan at al 1998) p~r 10 tanto es
necesario consumir alimantos en los que se encuElntren estos mrcroorganismos
viables estos hacen parte de I~micfobiota de vegetales y leches interviniendo en
Ie fermentaci6n natural de estos~ntos
112 Microorganismos Probi6ticos
los microorganismos probi6ticos que tradicionatmente se han adicionado a la
tache para fermentarla y obtener yogurt y kumis a como suplementos pertenecen
a los generos Lactobacillus Enterococcus y Bifidobacterium (Ver tabla Nro 1) Sin
embargo se considera que solo algunas especies de los gelnsros Lactobacillus y
Bifidobacterium sobreviven en el tracto gastrointestinal En la tabla 1 58 muestran
algunas de estas especies
TABLA 1 Algunas especies microbianas probi6ticas
Lactobacillus Sifidobacferium Enterococcus
L acidophilus
L JohnsoN
L casei
L rhamnosus
Lgrasseri
L reuten
L plantarum
B bifidum
Blongum
B infantis
E fsecium
E faecalis
Fuente Gaitan et a 1998A
15
EI eonoeimiento a cerea de sus efeetos beneficos en el consumidor por su alta
viabilidad en el intestino como la producci6n de sustancias con aetividad
antieaneerigena el mejoramiento ltfel sistema inmunol6gico y el deSplazamiento
de la mierobiota pat6gena gastrointestinal en el consumidor ha estimulado una
mayor demanda de estos microorganismos como tambian de los productos que
los contienen (Heller 2001 Parada middot1998)
Existsn otros produetos fermentados de origen vegetal como et tampe col acida
y salsa de soya de los euales sa pueden aislar estos organismos probi6tieos
comp tambien de la mucosa intestinat humana y luego de suministrarlos a
ratones sa han comprobado sus caracteristicas beneficas (Molin 2001)
113 Caracteristicas fenotfpicas de algunos microorganismos
probi6ticos
las bacterias aeido lacticas de los generos Lactobacillus y Bifidobacterium son
consideradas probi6tieos y tradicionalmente se han clasificado con base en Sus
propiedades morfol6gicas crecimiento a diferentes temperaturas capacidad
fermentadora de glucosa y otros carbbhidratos y la configuraci6n del Bcido Jaetieo
producido (Holzapfel etal2001)
16
)lli~ h Dx nIILIOTECM
eJDe~~ l1ilmfJ tIDBnm
Los Lactobacillus son bacilas gram positiv~s no esparuladas aerotalerantes
acido - tolarantes estrictamente fermentadares formadores de Boido laclica como
producto principal catalasa negativo carentes de citocroma sin embargo se
presentan excepciones a esta descripcion parque afgunas especies pueden
formar catalasa 0 citacramo en medios que contienen hematina 0 compuestos
relacianados La produccion de catalasa no hema pseudocatalasa puede causar
tambien alguna confusion en fa identificacion de algunos Lactobacillus
las especies del genera Bifidobacterium san bacilos gram positivos no
esporulados generafmente anaerabios estricto$ aunque pueden creeer bajo
condiciones microaer6filas cuando estan ert presencia de C02 La mayorfa de sus
especies se pueden diferenciar par criterios biaquimicos simples como la
fermentacion de L arabinosa DmiddotxiJasa O-manosa O-manita y O sorbitat que
pueden servir coma caracterist1cas clave para su clasificacion (Holzapfel
etal2001 )
114 Caracteristicas de los probi6ticos
Las cepas de microorganismos prabi6ticos deben presenter y mantener unas
caracteristlcas que garanticen su crecimienta y supervivencia En el alimenta
como tambiEm durante su transito a traves del est6maga e intestino delgaQo
17
La primera CBtacterfstica es que sean viables esta viabifidad esla capacidad que
tienen los microorganismos probi6ticos de permanecer vivos tanto ~n el alimento
como en el Intestino del consumidor por un tiempo determinado En Colombia se
ha establecido que en bebidas fermentadas este tiempo debe ser minimo de 21
dras en el alimento (Minsalud 1986) Esta vjabilidad depende del metodo de
produccion y de la cepa utilizada (Tuomols at a 2001)
Luego de que se garantice que estos microorganismos eslan viVos en el alimento
ell os deben cumplir otro criterio importanle para ser considerados como
organismos probi6ticos y as tblerar las condiciones de acidez a un pH=2 y la
sccian de proteasas del est6mago ademas de sobrevivir y creeer en presencia de
acidos biliares (Tuomola et al 2001 Jacobsen at a 1999) para luego de
sobrevivir a estas condiciones adherirse a la mucosa intestinal y de esta manera
estimular al sistemainmunoJ6gico esta capacidad de adherirse a la mucosa es un
prerrequisito para la colonizacion del intestlno (Toumola etal2001 Alander et aI
1999)
Cuando los probioticos han pasado todas esta pruebas de supervivencia y luego
de impfantados en la mucosa producen acidos organicos peroxido de hidrogeno y
tambien bacteriocinas que actUan como inhibidore$ del crecimiento de
microorganismos patogenos u oportunistas (Tuomola at al 2001 Cintas et al
2000) complementando de asta manera su accion benefica sobre la mucosa
intestinal y en general sobre la saJud del huesped
18
116 Berieficios de los microorganismos probi6ticos
Los beneficios que se asocian a los microorganismos probioticos son muchos y
variados Entre ros comprobados mediante estudios se eneuentran
1151 Facilitar la digesti6n de la lactosa
los microorganismos probioticos cuando estan en el intestino liberan alii la
enzima pmiddotgalaotosidasa capaz de hidrolizar la lactosa haste glucosa y galactosa
evitando as que personas intolerantes a este carbohidrato presenten sfntomas
como flatulencia dolor abdominal y diarrea cuando consumen leche (be Vresse
et 81 2001)
1152 Protegen contra enfermedades gastrointesUnales
EI consumo de aJimentos con probioticos ha mostrado efeeto terapeutico frente a
los sintomas de diarrea asociada al surninistro de antibi6tico$ de amplio espectro
que destruye 0 disminuye la microbiota endogena esta imp ide la coJonizacion de
bacterias patogenas como Klebsiella oxytoca y Clostridium difficile que pueden
causer lesiones en el cn Los probi6ticos recuperan el balance de la microbiota
intestinal nativa y avitan Ie adhesion de algunos virus bacterias pat6genas a
parasitos que pueden ser agentes causales de gastroenteritis la diarrea del
19
J
viajero y 1(3 inflarnacion intestinal que en ultima instaneia oeasionan ef sfndrome
del colon irritable (Marteu et al 2001)
1153 Protegen contra infecciones del tracto urogenital
La vaginitis indueida por baeteriss yo por levaduras as una infecci6n
estrechamente relacionada con la exposici6n a antibi6ticos y espermicidas y
tambien depende del estado hormonal de la n1ujar Con al uso de mezcJas de
probi6ticos se han obtenido buenos resultados en la rastauraci6n de la rnicrobiota
natural urogenital benefica que desplaza a los eausantes de la inflamaci6n de Is
vagina y Ie uretra (Reid 2001 )
1154 Promueven la barrera de defensa end6gena del intestino
EI tracto gastrointestinal normal mente as una barrera natural contra anUgenos de
origen microbiano y alimentario Cuando los probi6ticos sa adhieren a Is mucosa
intestinal estimulan 0 potencian al sistema inmune favoreciendo la
inmunomodulaci6n que induce un aumentb de fa producci6n de inmunoglobulinas
activacion de las calulas mononueleares y de los linfocitos para proteger al
huesped de infeeciones (Isoulari et sl 2001)
20
1155 Protegen contra cancer de colon
EI cancer es el resultado de una serie de mutaciones somaticas que pueden
ocurrir durante al tiempo de vida del individuo y 10 padeca buena parte de la
poblacion mundial los probi6ticos en un sistema in vitro han demostrado un
efecto positivo en la prevenci6n de mutaciones aI desactivar carcin6genos
genotoxicos (Wolloswski et al J 2001)
1156 Protegen contra infecciones respiratorias
Sa ha demostrado que el conslJlno de probi6ticos disrninuye la incidencia de
infecqiones raspiretorias al aumentar la actividad fagocitica de maer6fagos
alveolares que aettian sobre microorganismos patogenos Se hizo un estudio en
571 ninos sanos con edades entre uno y seis anos divididos en dos grupos a uno
de ellos sa las incluy6 en su dieta leche suplementada can Lactobacillus GG y a
los otros ninos leche no suplementada AI final del estudio se observ6 una
disminucion del 19 en la incidencia de infeccionas respiratorias tratadas con
antibi6ticos tales como otitis media sinusitis bronquitis y neumonfas en el grupo
de los ninos que consumieron Lactobacillus GG (Hatakka et al 2001)
Alvarez et al (2001) encontraron que la administraci6n de yogurt con Lactobacillus
casei en ratones de tres arios de edad majora los espacios libres del puJrn6n de
la presencia de Pseudomona aeruginos8 induciendo un aumento
21
significativo en los niveles de gA a IgM datactadas en los lavados
broncoaJveolares y se observ~ un afecta dependiente de la dosis
1157 En el tratamientoy prevenci6n del eczema
Se ha encontrado que el consumo de probi6ticos mejora la inflamaci6n alergica 0
eczema at6pico en ninos alimentados con formula suplementada con probi6ticos
Encontraron una mejora significativa al suministrar Bifidobacteriummiddot actis y
Lactobacillus GG en 27 niiios con edad promedio de 46 meses Luego de aplicar
este tratamiento se sometieron a una prueha de SCORAD (mide fa extension y
gravedad del eczema) registrando una meJoria significatlva en las condiciones de
la pie concentraci6n de citoquinas cirClllantes an sueto y moleculas de adhesi6n
a las superficies de las celulas soJubles en suero (Isolari 2000)
Se realizaron otros estudios a 159 mujeres embarazadas con historia familiar de
eczema atopico de primer grado a las cuafes sa res 5uministro dosis diarias de
Lactobacillus GG durante 2 a 4 samanas previas al parto Oespues de ella fa
madres twiaron la opci6n de continuer tomando el ptobi6tico si amamantaban 0
bien darseio vIa oral La mayoria de las madras eJigieron dar las dosis at bebe
diariamente A los dos anos de vida se observ6 una disminuci6n del 50 en la
frecuencia del eczema at6pico en aquellos nHies que se les dio ef probi6tico
(Kalliomari etal 2001)
22
1158 Previenen infeccion en heridas quirurgicas
Los probi6ticos impiden la union de pat6genos a las superficies celulares en
heridas mediante la seCreci6n de proteinas Actuamente se encuentra en
estudio la aplicaci6n del Lactobacillus fermentum vivos sabre heridas en piel de
ratas y se ha encontrado una disminuci6n del 90 en la colonizaci6n par parte del
StaphylococcuS aureus uno de los patogenos mas temidos y de mayor lncidencia
en infecciones hospital arias mas aun se esta contempiando la posibilidad de
utilizar la protein a purificada an lugar de los mjcroorganismos para la protaccion
contra infecciones en heridas (Strauss 2000)
12 PREBIOTICOS
Son carbohidratos de cadena corta algunas veces reconocidQs como
oligosacaridos no digeribles par las enzimas del epitelio intestinal 0 de las
gliJnduJas anexas debido a su estructura quimica y de esta manera lIegan al
intestino grueso donde alcanzan a estar disponibles para la fermentaci6n por las
bacierias sacaroHticas que son especial mente laetobadlos y bifidobacterias
dando odgen a compuestos que ejercen efectos funcionales sobre la mucosa del
tubo digestivo (Brunser 2001)
Se consideran como tal algunos fructocligosacaridos isomaltooligosacariclos
oligomato palatinosa poHdextrosa pOJidextrrna raftilina y algunos oligosacaridos
23
)
de 1a soya y fa avena Estenmiddot presentes en alimentos como Ie cebolla ajo
banano puerros 1 derivados del trigo achicoria esparrago alcachofa (Cummings
etal 2001)
Algunos de estos prebi6ticos cuanda son incorporado$ a fa dieta en cantidades
dalerminadas alteran la microbiota intestinal disminuyendo los recuentos de
coliformes bacteroides y cocos y aumentando las bifidobacterias hasta en diez
veces ademas modifican la actividad metab6lica del coron logrando una
disminuci6n del pH y un incremento en el contenido fecal de acidos grasos de
cadena corta como at acatica propi6nico y butfrico El butirato aumen~ _I grosor
de la pared del coron e intestino delgado estimula eJ crecimiento de la mucosa del
colon y auManta su flujo sangufneo inhibe el crecimiento de tinsas tumorales
epiteliales de origen co16nico induce la diferenciaci6n de sus celulas y a
apoptosis entre otros(Brunsar 2001)
Eh estudios hechos en simuladores del intestino humano utilizando productos de
avena fermentados se encontro que estimularon al crecimiento tanto de
lactobacios como de bifidobacterias y en el caso de estas ultimas se incremento
la producci6n de los acidos acatico propionico y butfrico 10 que incide sobre la
implantacion de probi6tico$ e inhibe al crecimientos de otro tipo de
microorganismos (Alal1der eta1999 Kontula etal 1998 Jaskari etal 1998)
24
~ -1
(
AI comparar el comportamianto de las leches de diferente origen se ha
demostrado que Ie leche de vaca contiene caseinatos sustancias que forman
buffer ~n et intestino e inlpiden que los probi6ticos disminlJyen el pH del intestina
y de esta manera se impide al efecto deseado que es evitar fa proliferaci6n de
otros microorganismos entre los cuates pueden estar algunos patOganos En la
leche materna sa encuentran algunos carbohidratos como glucosa galactosa n
acetilglucosamina y algunos 0lig6meros de Ie fucosa en cOhoontracionesmiddot
importantes los cualeS favoreceh el crecimientc)middot de probi6ticos esto
complementado can 91 bajo contenido de protenas que se traduce en una
reducida capacidad buffer hacen de Ie lache materna IJn alimentd adecuado para
nllios en su etape de lactancia
Algunos prebi6ticos como 1a lactulosa yciertos compuestos que contiansn fructosa
no son digeridos en el intestino humano y pueden sar utilizados selectivamenta
par los probi6ticos 10 que hace que los probi6ticos en combinaci6n can prebi6ticos
pueden lIegar a ser un importante medio para prevenir algunas enfermedades del
tracto gastrointestinal (Bezkorovainy 2001)
25
2 METODOlOGfA
21 LOCALIZACION
EJ trabajo sa realizo en el laboratorio de Microbiologia y la planta da laches de Ja
Universidad Naclonal de Colombia- Secie Medellin
En al laboratorio se hiZQ al aislamiento a identificaci6n de fa capas y en fa Planta
sa eJaboro la leche fermentada con 1a cepa seleccionada y el prebi6trco
22 METODOS
221 Aisiamiento de cepas nativas
Las cepas nativas se sislaran de producto$ vegetales leches fermentadas y
mucosa vaginal humana
2211 De vegetales
Las muestras vegetales de repollo repollitas de brusefas y pepino se
seleccionaron porcionaron y mezclaron can cloruro de sadio al 10 pIp se
calacaron en un recipienta de vidrio balo anaerobiosis y sa dejarQn por 15 dias
26
luego S9 tomaron 3 ml de cada muestra y se jnocularon 9 ml de caldo MRS (Man
Rogosa and Sharpe) se incubaron a 37deg C durante cinco dias en camara de
anaerobiosis (Ver Figura 1) Oespues de este tiempo sa inocularon cajas de petri
con agar MRS con 1 ml del cultivo microbiano y se incubaron bajo las mismas
condiciones que eJ caldo Este procedirniento se realiz6 rapetidas veces hasta
seleccionar la cepa pura mediante observaci6n de caracteristicas morfologicas de
la cOlonia y a cada colonia se Ie practico la coloracion de gram con el fin de
observar las caracteristicas microscopicas de cada una e identificar las de mayor
similitud a los Lactobacilos y Bifidobacterias
Figura 1 Camara de anaerobiosis
27
2212 De la leche
Sa tomo 200 ml de teche cruda de la planta de leches y se colaca a fermentar
baja anaerobiosis durante 15 dras Luego sa procedia como en los vegetales
2213 De mucosa vaginal humana
Se tomo una muestra de frotis de mucosa vaginal humane can capito esteril sa
puso a ncubar en Caldo MRS y se procedi6 camo en 2211 y 2212 A cads
aislado sa Ie practico la coloracion de gram y sa seleccionaron aquellas que eran
bacilos gram positivos (Ver Tabla 2)
28
TABLA 2 Fuente de aislarniento de cepas nativas
CEPA FUENTE
1 Pepino fermentadQ
2 repollitas de bruselas fermentadas
3 Repolltgt fermentado
4 Repollo fermentado
5 Mucosa va~inal humana
6 Mucosa vaginal humana
7 repollitas de bruselas fermentadas
8 Repollo fermentado
9 repollitas de bruselas fermentadas
10 Mueo~a vaginal humana
11 Repollo fermentado
12 RepolJo fermentado
13 Leche fermentada
14 Mucosa vaginal humana
15 repollitas de bruselas fermentadas
16 Repollb fermentado
29
222 Almacenamiento de las cepas aisladas
Cuando las cepas crecieron en agar MRS homogEmeas en color morfologia
coloraci6n de Gram etc se pssaron a agar inclinado en tuba se cubrieron con
aceite mineral y se guardaran en refrigeraci6n a 4deg C para tomar de alii la cepa y
efectuarle las diferentes pruebas para confirmar el genera y determinar la especie
de cada una de eas (Ver Figura 2)
Figura 2 Cepas en tubos con agar inclinado
30
223 Pruebas para determinar et genero
2231 Coforaci6n de Gram
A cada cepa sospechosa de Lactobacilos se 1e hizo la coloraci6n de gram y se
seleccionaron las gram positivas
2232 Morfologfa
En agar MRS y despues de incubar en anaerobios~s crecian colonias grandes
cremosas de color beige con bordes homogeneos y c6ncavas(Ver Figura 3)
Figura 3 Colonias aisladas en agar MRS
31
2233 Prueba de esporulaci6n
A cada cepa aislada se Ie hizo esta prueba la cuel consistia en incubar en
aerobiosis durante ocho dias las cajas de agar MRS donde crecieron colonias de
Lactobacilo$ y luego se les (ealize) coloraci6n de espora Las capas que dieron
negativa a la prueba de espora se considararort sospechosas de sar Lactobacilos
y se continuo con la prueba de la catalasa (Ver Tabla 3)
2234 Prueba de la catalasa
los lactobacilos carecen de catalasa Eata prueba se hizo tomando una colonis
se deposito en vidrio de reloj y se Ie adicion6 dos gotas de peroxida de hidr6geno
(H202) la que no presentaba efervescencie eran cepe sospechosa de ser
Lactobacilo (Ver Tabla 4
Sa seleccionaron las capas euyo resultado fue aeorde con el genera Lactobacilfu$
y se continuo con la comirmaeion del genera y determinacion de la eSpecie
meqiante las pruebas bioqulmicas
32
224 Prueba para determlnar la especie
Para confirmar el genero y determinar la especie de las diferentes capas aisladas
se hizo una caracterizaci6n bioqufmica utilizando un kit de API 50 CHL Medium
Ref 50 410 que contiene una galed8 de medios que permite realizar el estudio
de fermentaci6n de los 49 azucares de 52 especies de Lactobacillus (Ver Figura 4
y tabla 5)
Figura 4 API CHL 50-Prueba bioquimica
33
225 Pruebas para determinar microorganismos probi6ticos
2251 Resistencia a pH=2 y sales biliares de concentraci6n O3pv
A las cepas idantificades como Lactobacillus brevis y Lactobacillus pantarum sa
las realiz6 Ie prueba dfl resistencia a pH=2 y sales biliares de concentraci6n 03
pv ( Jacobsen et al 1999) Una colonia de cada cepe aislada se inocul6 en 4 mt
de caldo MRS durante cinco dras bajo condiciones de anaerobiosis Oespues de
esta tiempo se dejaron pracipltar los microorganismos por sedimentaci6n se Ie
retire el sobrenadante y al precipitado se Ie adicion6 Sml de caldo MRS
previamente ajustado a pH=2 can seido clorhfdrico (HCI) dentro del mismo tuba de
ensayo G igual sa hizo can otro tubo previamente incubado pero a este se Ie
adiciono 5ml de caldo MRS con sales biliares a una concentra~i6n de 03 plv y
ambos se incuberon a 37deg C por 2 haras Sa midio 01 mi de cada uno de los
tubas al tiempo 0 y a las 2 horas y sa inoculeron en superficie en caJas de petri
con agar MRS S9 incubaron a 37deg C bajo anaerobiosis durante 48 horas Se
compararon visualrrente en cada caja de petri el crecimiento en superficie y las
que presentaron crecimiento en tos dos tiempos (0 y 2 horas) tanto en at media
acido como en sales I se consideraron resistentes a pH=2 y sales biliares (03
pv)
(Ver Tabla 6)
34
226 Conservacion
Todas fas capas que habian dado positiva Jas pruebas anteriores y que reaultaron
resistentes a pH=2 y sales biliares 03 pv y despues de identificadas en API 50
CHL sa repicaron en agar MRS en tuba inclinado y despues de Incubar a 37deg C
por 48 horas bajo anaerobiosis se Ctlbrie el biser completamente can aceite
mineral esteril y sa guardaron en refrigeraci6n
227 Elaboracj6n de fa bebida fermentada
2271 Preparaci6n de la mue$tra
Sa tome 1 mt de caldo MRS previamante inoculado e incubado que presentaba
una concentracion de Lactobacillus brevis de 27x108 Iml segun la escaJa de Mac
Farlan y sa adiciono a 9ml de leche pasteurizada en un tubo sa dej6 incubanda
en anaerobiosis por 48 hores Luego se pasaron estos 10 ml a un frasco qua
cont~nie 90 ml de leche pasterizada y se dej6 incubando par 48 haras en
anaerobiosis
35
2272 Adici6n del inOculo
A 900ml de leche pasteurizada se Ie adicion61os 100 ml de leche que habia sido
previamente ino(ulada dos veces con la cepa posteriormente se deja
fermantando la lache a temperatura de 37deg C
2273 Control de Ja fermentaci6n
Las muestras se hicieron por cuadruplicado y se les hizo un seguimiento de
aoidez hasta un valor entre 04 y 05 expresada como Bcido lactico esta
procedimiento corresponde a la babida fermentada sin prebi6tico La bebida ~on
prebi6tico tiene al mismo proeedirnianto pero adicionalmente se agrag6 avena a
una concentraci6n de 05 en el momento de la adici6n del in6e410 a los 900 ml
de leehe pasteurlzada y el procedimiento sigui6 igual al de la bebida sin prebi6tico
tambien se hizo por cuadruplicado
2274 Refrigeracl6n
Despues que las mezclas con y sin prebiotico alcanzaron el de acidez
requarido se IIeva ron a refrigeraci6n a una temperatura de 4deg C p~r 24 horas
para frenar proce~os metab6licos de los microorganisrtlos Despues de este
ti~mpo se procedi6 al batido
36
1 2275 Batido
Con un agitador se procedi6 a batir las bebidas para romper et coagulo formado
y de esta manera homogeneizar la mazela y obtener asf la bebida fermentada
2276 Envasado y almacenamiento
Ambas bebidas se envasaron en frascos vidrio para hacerles seguimiento de pH
acidez(expresado como acido tacticol y recuento de Lactobacillus breviSf los
dies 27 14 Y 21 despues de elaboradas las bebidas perfodo durante el cualta
muestra permanecfa afmacenada a temperatura de refrigeracion(Ver Figura 5
37
Fjgura 5 Diagrama de Flujo
PREPARACION DE LA MUESTRA
ADICION DEL INOCULO
~_____~_B~ATIDO~______~
INCUBACION 37deg C hasta acidez = 04-05 acido laotico
ENFRIAMIENTO
hasta 4 0 C ~------~ ~------~
ENVASADO Y ALMACENAMJENTO
dUrante 21 dfas a Temperatura 4 0 C
38
1
228 Determinaci6n del pH
Se determino por el metoda potenciometrico en un pH-metro manual durante los
dias 2) 7 14 Y 21 de las bebidas lacteas sin y con prebi6tica (Ver Tablas 7 y 8)
229 Oeterminaci6n de la acidez (Expresadfl como acido
lactica)
Se tomaron 9 mJ de las bebida~ sa Ie adicionaron 2 gotas de fanoftaleina como
indicador y sa titulo fa acidez con NaOH 01 N hasta la aparicion de un cotor rosado
debit EI volumen de NaOH utilizado se reporta como valor de de acidez
(VerTablas 10 y 11)
2210 Prueba de viabilidad
Qurante el perfoda de almacenamiento de la bebida lactea se procedi6 a hacer la
prueba de viabiHdad en los dias 7 14 Y 21 para determinar Si los lactobacilfus
permanecfan vivOs a una concentraci6n minima de 106 hasta el dia 21 como 10
establece eJ Articulo 10 de la Rasolucion 2310 del Ministerio de $alud de
Colombja
39
Para asta prueba se tamaron 10 rnl de muestra y se adicionaron a 90 ml de caldo
MRS ruego a partir de esta se hicieron diluciones de 10-2 hasta 10-11 de las
diluciones 109101deg 10-11 se inocul6 1 ml de cada uno en agar MRS siguiendo el
metodo de siembra en profundidad y por duplicado e incubando a 370 C x 5 dras
en anaerobiosis y luego se hicieron tos recuentos por duplicado para esi reportar
los recuentos promedio (Ver Tablas 13 y 14)
2211 AniUisls microbiol6glco de las bebidas Iicteas(con y sin
avena)
Con el fin de determinar las condiciones higienico-sanitarias del producto se
realizaron las pruebas microbiol6gicas de Recuento de mohos y fevadurasml en
agar OGY Recuento en superficia de Staphylococcus coagulasa positivoml en
agar Baird Parker Numero Mas Probable (NMP) de coUfor-mes totales y
Escherichia coliml en caldo Fluorocult y Presencia de Salmonela25ml con BHI
caldo tetrationato y agar Hecktoen (Montoya 1999)
(Var tabla 16)
2212 AnaUsis estadistico
A los datos obtenidos en la medici6n de pH acidez (expresada como Beido
laclico) en los dras 2714 Y 21 y el recuento de Lactobacillus en los dras 714 y21
40
realizados a los dos tratamlentos se tes aplic6 1a prueba t porque solo difieren
en la presencia 0 ausencia del prebi6tico para evaluar si habra diferencia
estadfsticamente significativa para los dos tratamientbs(Ver Tablas9 12 y 15)
41
3 RESULTADOS Y DISCUSION
31 Coloraci6n de Gram y morfologfa
Las cepas aisladas fesultaron Gram positivas (Ver Figura 6) colonias grandes
cremosas dE) color beige con bordes homogeneos y c6ncavos en su
morfologia (Ver Figura 3) resultando de acuerdo a 10 especificado en Stanley
1989 para Lactobacillus
32 Prueba de esporulaci6n y cataJasa
Los resultados de la pruebas de esporulaci6n y catalasa indicados en las
Tablas 3 y 4 respeclivamente dieron conforme a 10 especificado en Stanley
1989 para Lactobacillus
42
1
2 3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
TABLA 3 Resultado de prueba de esporuJaci6n
CEPA RESULfADO ESPORULACION
-- -------------
43
l i ~II bull ~ I I
TABLA 4 Resultado prueba de la catalasa
CEPA RESULTADO CATALASA
1 -2 -3 -4 -5 -6 -7 8 -9 -10 -11 12 -13 -14 -15 -16
3~3 Prueba para determinar la especie
Oespues de hacer las pruebas para seleccionar las cepas sospechosas de ser
Lactobacillus se realizo las pruebas bioquimicas fograndose identificar
Lactobacillus plantarum aislctdo de pepino repollo y repollitas de bruselas
44
fermentados y Lactobacillus brevis de mucosa vaginal y leche fermentada (Ver
Anexos del A al E y Tabla 5)
TABLA 5 Resultado identlficaci6n cepa~
CEPA NOMBRE
1 Lactobacillus planfarum
3 Lactobacillus plantarum
5 Lactobacillus brevis
13 Lactobacillus brevis
15 Lactobacillus plantarum
34 Pruebas para determinar microorganismos probi6ticos
las cepas de Lactobacillus brevis y Lactobacillus plantarum mostraron
rasistencia al medio acido de pH =2 Y sales biliares 03 pv resultado similar al
encontrado por Jacobsen et al 1999 para Lactobacillus plantarum (Ver tabla 6)
45
middot
~~~ttiI lltlmiddot~COX~dtJ ~xtc_~ 2 tr~ k-JlL~middot
-)~~TO DE lJIBUOTECUl rjRL]OTtCA twn GO1IU1
TABLA 6 Resultados a pruebas de resistencia a pH=2 y sales biliares 03 plv
CEPA RESISTENCIA pH=2 RESISTENCfA A SALES BIUARES ()3 pv
1 + +
2 + +
3 + +
4 + +
5 +
6 + +
7 + +
8 + +
9 + +
10 + +
11 + +
12 + +
13 + +
14 +1shy +M
15 + +
16 + +
+1 crecimiento debil
+ crecimiento abundante
46
Figura 6 Lactobacillus brevis Gram + aislado de leche fermentada
Ai observar en placa las celulas de lactobacilos despues de real1zar las pruebas
de resistenCia a la acidez y sales biliares se observo una tendencia a aglomerarse
posiblemente como un mecanismo de proteccion cOlitra estos medios que pueden
lIegar a ser adversos para elias (Ver figuras 7 y 8)
47
Figura 7 Lactobacillus brevis aislada de leche fermentada despu~s de la prueba de resistencia a pH=2
Figura 8 Lactobacillus brevis aislada de leche fermentada despues de la prueba de resistencie asales biUares 03 plv
fI
48
35 --Seguimiento del-pH-en-la-bebidaJacteacon y sin -prebi6tico
A continuacion se muestran las Tablas 7 y 8 donde sa registian los datos
recopilados de pHdurante 10$ dras Z 7 14 Y21 para las bebidas laaeas con ysin
prebi6tioo
TABLA 1 ResultadopH yogur sin avena
Dia Repetition 1 Repetici6n 2 Repeticion 3 Repetici6n 4
2 526 501 51 52
7 446 433 438 44
14 439 435 437 436
21 439 437 438 437
TABLA 8 -ResultadopHyogur con avena
Dia Repeticion 1 Repeticion2 Repeticion 3 - Repeticion 4
2 509 523 51 515
7 447 442 445 442
14 436 -438 439 437
21 432 433 435 434
Observando la Figura 9podamos ver que el pH en el -dfado$ para los dos
tratamientos as igual y empieza a descender rapidamente para estabilizarse a
partir del dra 7(Ver figura 9)
49
Figura 9 Comparacj6n de medias para -el pH
Comparaci6n de medias para pH
55 ~ 5 +----=gtIIIi-~i~~----=-r--it~ -- pH sin avena
a 45 1--~~~~=~~ 4 --- pH con
avena35 t-----r-- -------=------=--= ------- - ----
2 7 14 21
Dias
Aplicando la prueba t para comparar las medias de pH I S6 muestia una diferencia
altamants significativa en los dos tratamientos para el dia 21 (pltO05)
(Ver tabla 9)
TABLA 9 Compaiaci6n de medias para pH
DtAS SIN AVENA CON AVENA te p (VALOR)
2 514 514 0 10
7 439 444 -1 61 0159
14 437 I
438 -070 0510
21 438 433 528 00019 shy
- DiFERENCIA AlTAMENTE SIGNIFICATIVA
50
I
AI aplicar regrasi6n a los datos sa obtiene al modelo estimado
pHSinAyena =535606 - 01505650Ia +0005044340IaI2
La variabilidad en la respuesta de pH asta siendo explicada en un 8S7522 por
el modelo (Ver Anexo F)
EI tratamiento con avena mostro el siguiente modelo al analisis de ragresi6n
pHConAvena =534463 ~ 0140407Dia + 0004480980Ia2
La variabilidad an la respuesta de pH asta siendo explicada en un 903315 par
el nlodelo(Ver anexo G)
36 Seguimiento de la acidezmiddotmiddot expresada comomiddot de acido
lactico
A continuaci6n sa muestran las Tablas 10 y 11 donde sa registran los datos
tecopilados de acidezmiddotdurante los dias 27 14 Y 21 para las pebidas taetees con y
sin prebi6tico
TABLA 10 Resuttadode acidez (expresadocomo acido tactico) yogurt sin avena
CIA R~petici6n1 Repeticion2 Repetici6n 3 Repeticion 4
2 054 06 057 058
7 072 074 073 0]2
14 080 083 082 082
21 0]4 079 078 077
51
TABLA 11 Resultado de aCidez (expresado como acido Icktico) yogurt con avena
Dia Repetici6n 1 RepetiCi6n 2 Repetici6n 3 Repetici9n 4
2 059 055 058 057
7 071 073 072 072
14 089 087 088 086
21 092 091 090 091
Observando la Figura 10 se puede concluir que la acidez empieza a aumentar
hasta el dia 14 y luego trata de estabilizarse para los dos tratamientos
(Ver figura 10)
Figura 10 Comparaci6n de medias para la acidez
N G)
Comparacion de medias para acidez
1
2 0I 5 -+--=--------=-~~~= u
ltC
- Acidez sin avena
2 7 14
Dias
52
21
-it- Acidez con avena
Aplicando la prueba t para camparar las madias de acidez se muestra una
diferencia altarnante significativa en los dos tratamiantos para los dias 14 y 21
(pltO05)
(Var tabla 12)
TABLA 12Comparaci6n de medias para Acidez
DIASmiddot SIN AVENA CON AVENA te p(VALOR)
2 0572 0572 0 10
7 0727 0720 119 0278
14 0818 0875 -638 000070shy
21 077 091 -1212 i 0000019 shy
DIFERENCIA AL TAMENTE SlGNIFICATIVA
AI aplicar r~gresi6n a los datos se obtiene el modelo estimado
AcidezSlnAIena = 0491897 + O0436032Dia O00144613DfaA2
La variabilidad en la respuesta de acidez asta siendoexplicada en un 970978
por al modelo (Ver anexo H)
EI tratamiento con avena mostro elsiguiente modeloj a1 analisis de regresion
AcidezConAvena = 0491638 + 00406572Oia - OQOO982559OiaA2
La variabilidad enla respuesta acidez esta siendo explicadaen un 99212 por
el modelo (Ver anexo J)
53
I ~
37 Prueba de viabiJidad
A continuaci6n sa muestran las Tab~as 13 y 14 donde sa presentan los datos
recopilados del recuento de Lactobacilos durante los dias 7 14 Y 21 para las
bebidas lacteas con y sin prebi6tico
TABLA 13 Recuento de Lactobacilos (UFCml) yogurt sin avena
Dia Repetici6n 1 Repetici6n 2 Repeticion 3 Reptttici6n 4
7 1880X10l1 1454X1011 1642X1011 1780X10~
14 1560X10~ 646X1011J 1890X10l 140X10l1
21 1200x10lu 128Ox10u 1745x10J 1520x101V
TABLA 14 Recuento de Lactobacilos (UFCml) yogurt con avena
Dfa Repetieion 1 Repetici6n 2 Repeticion 3 Repeticf6n 4
7 1600X10lt 1240X10t 1640X10ll 1980X10t
14 540X1011 427X10n 546X10n 720X10ll
21 500x1011 492x1011 712)(1011 980x10~
AI analizar la Figura 11 sa puede observar un recuento mayor de Lactobacilos
en al tratamiento con avena resultado de acuerdo a 10 encontrado por Alander at
aI 1999 Kontula et aI 1998 y Jaskari et aI 1998
54
Figura 11 Comparaci6n de medias para Log Lactobacillus
Comparacion de medias para log Lactobacillus
~ 1350
-+- Sac Sin--() 13 co avenaIII
bull 125 -- Bac con 0)
0 12 avenaJ
115 7 14 21
Dias
Aplicando la prueba t para comparar las medias de recuento de Lactobacillus no
se encontr6 una diferenc1a estadfsUcamente significative entre los dos
tratamientos (Ver tabla 15)
Este aumento en al racuento influy6 en la disminuci6n del pH y en el aumento de
fa aeidez por la fermentacion que realizan los Lactobacillus sobre fa lactosa de la
lache y la avena adicionada como prebi6tico
55
1
TABLA 15 Comparaci6n medias lag Lactobacillus
DIAS SIN AVENA CON AVENA tc p(VALOR)
7 122257 122022 04846 06451
14 121065 132393 -19602 00977
21 129025 133087 -08236 04416
At aplicar regresion a los datos se obtiane al modelo astimado
LactobacillusSinAvena= 117347 + 004834640Ia
La variabilidad en la respuesta del recuento de LactobaCillus ssta siendo
explicada en un 260054 por el mod$loVar anexo J)
EI tratamiento con avena mostr6 al siguiente modalo al anal isis de regresion
Lactobacillu$ConAvena =118103 + 007903040Ias
La variabilidad en la respuesta de recuento esta siendo explicada en un 3068
por al modelo(Ver anexo K)~
38 Analisi$ microbiol6gicos de las bebidas lacteas con y sin
En la Tabla 16 estan recopilados los resultados microbiol6gieos obtenidos en ras
muestras con los dos tratamientos (con y sin avena)
I [
sa
TABLA 16 Resultados analisis microbiologico
Recuento de mohos y levaduras Iml lt10
Recuento de Staphylococcus coagulase positiva Iml lt100
NMP coliformes fotales y Escherichia coli Iml lt3
Presencia de Salmonella25ml Ausente
Los resultados de este analisis demuestran que las bebidas fermentadas con y
sin avena~ astan fibres de microorganismos patogenos
57
1
4 CONCLUSIONES
Se aislaron cepas nativas de Lactobacillus plantarum de las muestras vegetates
de repollo pepino repollitas de bruselas fermentadas y Lactobacillus brevis de
lache fermentada y mucosa vaginal humana Ambas cepas resistieran un pH=2 y
una concentraci6n de sales biliares det 03 ptv dos earacteristicas importantes
en los probi6ticos
Lamiddot cepa de Lactobacillus brevis aislada de lache Sa utiliz6 para elaborar una
bebida fermentada sin y con avana comoingrediente prebiotico obteniendose un
aJimento centon recuento del probi6tico viable durante 21 dras de seguimiento
ademas libre de microorganismos )at6gen05
No se encontr6 efecta significativo de la avena sobre Ie viabilidad del Lactobacillus
brevis aunque sa presento un aumento en 61 recuento de estos en la bebida con
avena
58
plusmn ~
5 RECOMENDACIONES
Ensayar la cepa de Lactobacillus plantartJm en productos carnicos madurados
como el salami
Ensayar la cepa de Lactobacillus l)revs en otros derivados lecteos como queso
quesito queso crema
Continuar con el estudio de estos microorganismos y caracterizarlos
molecularmente ademas de estudiar su capacidad de adherencja a fa mucosa
intestinal sobre algunes Hneas celulares como las CaCo~2
Estudiarel efedo de la avena sabre la viabiJidad del Lactobacillus breyis a una
concentraci6n mayor de 05
Realizer ensayos can las cepas de Lactobacillus brevis y Lactobrlcillus pJantarum
para elaborar masas acidas para panificacion reemplazando el Bromato de
Potasio aditivo prohibido desde marzo del 2003 en nuestro pais per 5U toxicidad
59
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65
ANEXOS
66
ANEXO A RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AlSLADA DE i
PEPINO it
Referencia Pepino 1 Fecha 06122002
IEXCELENTE IDENTIFICACION
Latto plantarum 1
Galeria API 50 CHL V50 Leida el 06122002
Perfil - -- - ++ - -- - ++++ - - -+- + - I I I I I I I I +t+ - +f- ~ - - + + ~ - - - +- + - shy
o - GLY - ERY DARA - LARA + RIB + DXYL - LXYL - ADO - MDX - GAL + GLU + FRU + MNE + SBE - RHA - DUL - INO bull MAN + SOR - MDM + MUG shyNAG + AMY + ARB + ESC + SAL + CEL + MAL + LAC + MEL + SAC + TRE + 1NU - MLZ + RAF + AMD - GLYG - XLT - GEN + TIJR + LYX - TAG - DFUC shyLFUC - DARL + LARL - aNT + 2KG - 5KG shy
--- Taxones significativos rd -----T -- Tests en contra
Lactoplantarum 1 999 092 1
Taxon siguiente Lactobrevis 1 OJ 044 3
i i
Lactoplantarum 1 1 test (5) en contra
D-SORBITOL (SOR) 78
Tax6n siguiente Lactobrevis 1 3 test (s) ert contra
METHYLD-MANNOSIDE (MOlM) 0 MELEZITOSE (MLZ) 14 D-TURANOSE (TUR) 14
67
ampb
ANEXO B RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AISLADA DE REPOLLO FERMENTADO
~
Referencia Repollo fermentado - 3 Fecha 03072003
EXCELENTE IDENTIFICACION
Lactoplantarum 1
Galena API 50 CRL V50 Leida el 03072003
Perfil - - ++ - - - - -H++ - - ~ + - + - I I 1 I I I I -H+ - ++ - - - + + - -- - - + - shy
o - GLY - ERY - DARA - LARA + RIB + DXYL - LXYL - ADO ~ MDX - GAL + GLU + FRU + MNE + SBE ~ RHA - DUL - INO - MAN + SOR - MDM + MDG shyNAG + AMY + ARR + ESC + SAT + CRL + MAL + LAC + MEL + SAC + TRE + lNU - MLZ + RAF + AMI) - GLYG - XLT - GEN + TOR + LYX - TAG - DFUC shyLFUC - DARL - LARL - GNT + 2KG - 5KG shy
------Taxones significativos _ _----- Id--- ---T---- Tests en contra
Lactoplantarum 1 999 095 1
Tax6n siguiente Lactobrevis 1 01 OA8 3
lJactoplantaru01 1 1 test (s) en contra
DSORBITOL (SOR) 78
Taxon siguiente Lactobrevis
METHYL-D-MANNOSIDE D-TURANOSE
1
(MOM) (TOR)
3 test (5) en contra
0 MELEZITOSE 14
(MLZ) 14
i
I
68
ANEXO C RESULTADO PRUEBAS BIOQUWICAS DE CEPA AISLADA DE MUCOSA HUMANA
Referenda Mucosa - 5 Fecha 27012003
BUENA IDENTlFICACION
Galeria API 50 CHL vso Leida el 270112003
Perfil - - - - +t--t - - - + - + - - - - - - - - -+- - - - - + - + - - - - - - - - - - - - - bull - - -+ - +
o - GLY ~ ERY - DARA bull LARA + RID + DXYL + LXYL - ADO bull MDX - GAL + OLU - FRU + MNE - SBE - IlliA - DUL - INa - MAN - SOR - MDM - MOO shyNAG + AMY - ARB - ESC ~ SAL bull CEL - MAL + lAC - MEL + SAC - TRE shyINU - MLZ - RAF - AMD - GLYG - XLT - GEN - 11JR - LYX - TAG - DFUC shyLFUC - DARL - IARL - ONT + 2KO - 5KG +
- - - - - - Taxones significativos - - - - - - - Id T -- Test en contra
Lactobrevis 3 963 088 1
Taxon siguiente Lactoco11inoides 36 075 2
Lactobrevis 3 1 test (s) en contra
GLUCOSE (GLU) 95
-~~~------------~---------------------------~--~-------~--~-----~----------~--------~------------~~--Taxon siguiente Lactocollinoides 2 test (s) en contra
GLUCOSE (GLU) 100 MELIBIOSE (MEL) 25
69
i r
ANEXO D RESULTADO PRUEBAS BIOQIJiMICAS DE CEPA AISLADA DE LECHE FERMENTADA
Referenda Leche fennentada ~ 13 Fecha 27012003
BUENA IDENTIFICACI6N
Galeria API 50 CHL V50 Leida el 270112003
Perfil - - - - -t-t+- - - - + - + - - - bull - - - - -+- - - - - + - + - - - - - - - - - - - - - - - - -+ - +
0 - GLY - ERY - DARA - LARA +Rll3 + DXYL + LXYL - ADO - MDX ~GAL + GLU - FRU + MNE SBE - RHA DUL bull INO MAN - SOR MDM bull MDG shy
~NAG + AMY - ARB - ESC - SAL - CEL - MAL + LAC - MEL + SAC - TRE I lNU - MLZ - RAF - AMD - GLYG - XLT - OEN - IUR LYX - TAG - DFUC bull i
LFUC - DARL - LARL -ONr + 2KG - SKO + 1
- -- - - Taxones significativos - - Id -- T --- Test en contra
Lacta brevis 3 963 088 1
Taxon siguiente Lactocollinoides 36 075 2
Lactobrevis 3 1 test (s) en contra
GLUCOSE (GLU) 95
-----------------------------------------------------------~------------------------------~-------------------Taxon siguiente Lactocollinoides 2 test (s) en contra
GLUCOSE (GLD) 100 MELffiIOSE (MEL) 25
70
II iJ1
I
I ANEXO E RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AISLADA DE REPOLLITAS DE BRUSELAS FERMENTADA
Referencia repollitas de bruselas 15 Fecha 03072003
EXCELENTE IDENTIFICACION
Lactoplantarum 1
Galeria API 50 CHL vsO Leida el 03072003
Perfil - - - - +t - - - - +H+ - +- - +t + - I I I I I I I f ++t - + - - - -+ + - - - -+ -+ - - I ij
o - GLY - ERY - DARA - LARA + RJB + DXYL - LXYL - ADO - MDX - GAL +
GLU + FRU + MNE + SBE RHA + DUL - INO - MAN + SOR + MDM + MOG shyNAG + AMY + ARB + ESC + SAL + eEL + MAL + LAC + MEl + SAC + TRE + i
I1NU - MLZ + RAF AMD GLYG - XLT - aEN + TUR + LYX - TAG - Druc LFUC - DARt + LARL - aNT + 2KG - 5KG shy n ----Taxones significativos ------ Id Tests en contra
Lactoplantarum 1 999 090 o
Taxon siguiente Lacto pentosus 01 012 7
Lactoplantarum 1 o test (s) en contra
Taxon siguiente Lacto pentosus 7 test (8) en contra
GLYCEROL (GLY) 75 D-XYLOSE (DXYL) 100 L-RHAMNOSE (RHA) 25 METHYL-D-MANNOSIDE (MOM) 1 MELEZITOSE (MLZ) 25 RAFFINOSE (RAF) 75 D-ARABITOL (DARL) 0
71
~
I i I
ANEXO F - ANALISIS DE REGRESION PARA pH EN BEBIDA SIN AVENA
Aruilisis de regresi6n polinomial
---~-~-------------------------------------------~-----------~~---------------------~--------------Variable dependiente pHSinAvena ---------------------------~-------------~--------------------~---------------------------------
Error T Parametro Estimado Estandar Estadistico P-Valor
CONSTANTE 535606 0094535 56657 00000 Dia -0150565 0020706 727154 00000 Dia2 000504434 0000871488 578819 00001
---~---------------------------------------------------------------------------------------------------
Anfllisis de Variama -------------------------------------------~-----------~-----------------------------~-~--- jSource Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor 11
------------------------~------------------------------------------------------------------------------~ Mod-elo 155772 2 0118861 4256 00000 Residual 0237877 13 00182983
Total (Corr) 11956 IS
R2 == 867522 percent
pHSinAvena == 535606 - 0150565Dia + 000504434Dia2
72
____
middot ANEXO G - ANALISIS DE REGRESION PARA pH EN BEBIDA CON AVENA
AmUisis de regresion polinomial _____~_____~__-_____~___4____________________bull____bull__________bull_____________~~----_------___________
Variable depcndiente pHConA vena ------------------------------------------------------------------------------------------~--------
Error T Parametro Estimado StAndar Estadfstico P-Valor
---------------------------------------------~-----------------------------------------------_---------CONSTANTE 534463 00801045 667208 00000 Dia -0140407 00175453 800253 00000 DiaA 2 000448098 0000738458 606803 00000
----------------------~---~-----------------------------~------------------------------~----AmUisis de Varianza
---~---------------------------------~---------------------~------------~-------------------~------Source Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio PValor --------------------------~-----------------------------------------------~------------~-----~~--~ ModeJo 159575 2 0797873 6073 00000 Residual 02170798 middot13 00131383 _______~_~ ~_~----------~------~--~-----~-M-----~-----____ _____________~-----------------------Total (COlT) 176654 15
R12 903315 percent
-----------~------------------------------------------------------------------------~-----------pHConAvena 534463 - 0140407Dia + 000448098DfaA 2
73
ANEXO H - ANALTSIS DE REGRESTON PARA ACIDEZ EN BEBJDA SIN AVENA
An8Jisis de Regtesi6fi P6lifJomial
Variable Depefidiefile~ AcidezSinAVenll _______________w_____~______~________________~-----------_________~_________________~~____~___~_____
Error T Pariirnetro Estimado Estandar Estadistico ---------------------------------------~--------------~-~-------~--------------------~------------CONSTANT 0491697 00123217 399051 00000 Dia 00436032 000269882 161564 00000 D1a2 -000144613 000011359 127312 00000 __w___~________________________~-_______-_____~----____________________________~__~---~_--__~___
AriiiJisis de varianza ~_~__~__________~_~____~________~___________- _________e_____________________________bull _____-________
Source Smn de cuadr Df Mean Square F-Ratio PmiddotValor_~~___________________________________bull ______~___________bull ____________bull ______~________w________________
Model 0135203 2 00676013 21747 00000 Residual 000404118 13 000031086
Total (Corr) 0139244 15
R2 970978 percent
AcidezSlnAvena 0491697 + O0436032Dia - 0OOl44613Dia2
74
I
ANEXO I ANALISIS DE REGRESION PARA ACIDEZ EN BEBIDA CON AVENA
1
Anwisis de tegtesi6fi polinomial
Variable dependiente Acidez Con Avena
Error T ParametTo Estimado Stlindar Estadfstico P-Valor ----------------~-------~---------------------~-----------------------------------------------------CONSTANT 0491639 000926607 530578 00000 Diamiddot 00406572 000202955 200326 00000 DfaA 2 0000982559 0000085421 -115025 00000
-------------~----------------------------~-------------------------~-----------------------------------
-------------~-----~~-----------------------------~---------------------------------------------_--Source Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio PValor
-~-------------~----------------------------------~------------------~~-------------------------- Modelo 0288008 2 0144004 81914 00000 Residual 000228539 13 0000175799
----------~~--------------~---------------------------------------------~---------------------------Total (Corr) 0290294 15
RA2 = 992127 percent
-------------------------~----~---~------------~---------------------------------~---------------~
AcidezConAvena == 049163amp + 00406572D1a - 0000982559DiaA2
75
I
(Ilmiddot il
ANEXO J- ANALISIS DE REGRESION PARA RECUENTO LACTOBACILOS PARA BEBIDA SIN AVENA
Amilisis de regresion - Modelo lineal Y = a + bX
------------------------~----------------------~-----------------------------~----------~-----------Variable Dcpendiente LactobacilJusSinAvena Variable independiente Dia
I--------~----------~-----------------------------------~-------~-~--~--------------------------~-Error T
Paramctro Estimado Standard Stadistico P-Valor
----~----~------------~-----~-----------------------~-------------~-----------------------------Intereepto 117347 0389973 300911 00000 Pendiente 00483464 00257889 18747 00903
Analisis de Varianza
---------~------------------~----------------~---------------------------------~---------~----------Source Sum decuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor
------------~---------------------~---------------------~--------------------------------~-----~----Modelo 0916252 1 244835 443 00616 Residual 260706 10 0260706
--~------------~---~------------------~~~-----~-------~---------~~-------------------------------------Total (Corr)352332 11
Coeficiente Correlaci6n = 0509955 R2 = 260054 percent
LactobacillusSinAvena= 117347 + 00483464Dfa
76
ANEXO K- ANALTSIS DE REGRESION PARA RECUENTO LACTOBACILOS PARA DEBIDA CON AVENA
Aruilisis de regresion - Modelo lineal Y = a + hX
Variable Dependiente LactobacillusConAvena Variable Independiente Dia ---~--------------------------------------------------------__-----------__--_--_-----------shy
Error T Paramctro Estimado Standard Estadistico P-Valor -~--------------------------------------------------------------------------------------------------
Irttercepto 118103 0567963 207942 00000 Pendiente 00790304 00375594 210414 00616
-----------------~----------------------------~----~-------~----~----------------------------
Analisis de Varianza
----------------~----------------~------------------~--------------------------~------~--------shySource Swn de cuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor
-----------------~--~--------------------------------------------------------------------------~---~ Mode10 244835 1 244835 443 00616 Residual 552997 10 0552997
Total (Corr)797832 11
Coeficiente Correlacion = 0553964 RI2 = 306875 percent
-----~--------------------------------------------------------~--------------------------------------
LactobacillusConAvena = 118103 + 00790304Dfas
77
A todo el personal de la Planta de Leches de la Universidad Nacional sede
Medellin
RESUMEN
En este trabajo se aislaron cepas natives de Lactobacillus plantarum de muestras
yegetales fermentadas de pepino rapollo y repollitas de bruselas y Lactobacillus
brevis de leche ferm~ntada y mucosa humana resultando resistentes a pH=2 y
sales biliares 03 pv dos caracterfsticas importantes que deben cumplir los
microorganismos lIamados probioticos
utmzando a cepa nativa de Lactobacillus brevis aislada de leche fermentada se
elaboraron dos bebidas Iscteas fermentadas una sin ingrediente prebi6tico y otra
adicionada de avena 05 como ingredienta prsbiotico para comparer si habra
alguna incidencia de asta ingrediente en la viabilidad del probiotico
A ambas bebidas sa les hizo un seguimiento de pH y de acidez (expreSada
como acido lactico) durante los dias 27 14 Y21 Y 1a prueba de viabilidad en los
dias 7 14 Y21 despues de elaboradas cada una de las bebidas De estas bebidas
sehicieron 4 repeticiones
Sa obtuvo recuentos mayor-es de 106 UFCml de Lactobacillus brevis hasta el dia
21 encontrandose en aumento an los recuentos en a bebida con avena aunque
estadlsticamente no hubo diferencias significativas
TABLA OE CONTENIDO
lISTA DE TASLAS ------------~--~------------------------- ~
LISTA DE ANEXOSmiddot--------- ----------------------------------11
INTRODUCCON -----------------------------------------------------12
1 MARCO TEORICO Y ESTADO OEl AItTE---middot---middot-middot-- -------14
11 PROBIOTfCOS ------------- - middot------------------14 111 Historia------------------------- 14 1~ 12 Microorganismos probi6ticos---------------- 15 113 Caracteristicas fenotipicas de algunos microorganismos probi6ticos-----~------ ------- 16 114 Caracteristicas de los probi6ticos--- - ----17 115 Beneficio de los organismos probi6ticos---middot ----19 1151 Facilitar la digesti6n de la lactosa ------ 19 1152 Protegen contra enfermedades gastrointestinales - -19 1153 Protegen contra infecciones del tracto urogenital -------20 1154 Promueven la barrera de defensa endogena delintestino ---20 1155 Protegen contra cancer de colon- ---- ---~1 1156 Protegen contra infeGCiones respiratorias----------21 1~157 En at iratamiento y pre~enci6n deleczeroa-- - 22 1158 Previenen infeccion en heridas quirurgicas ---------23 12 PREBlOTICOS -- -----------------23
2 METODOLOGIA~~~~-~fO ~~~tfmiddot~I~~-____bullbull_--~---------middot26
21 lOCALIZACION~~======~-~--- ------26 22 METODOS------------------------------26 221 Aislamiento de cepas nativas -------_ 26 2211 De vegetales -- -- -26 2212 De Ja leche--------- -----------28 2213 De mucosa vaginal humana ----~---------------28 222 Almacenamiento de fas repas aisladas ----- --30 223 Pruebas para determinar el genera ---- 31 2231 Coloracion de Gram --------------------31 2232 Morfologra---~----------------- -- -31 2233 Prueba de esporulaci9n----------------~2
2234 Prueba de la catalasa--------------------~------ 32 224 Prueba para determinar la especie ----------~-------- 33
225 Pruebas para determinar microorganismos probi6ticos -----34 2251 Resistancia a pH=2 y sales biliares de concentracl6nO3piv --34 226 Conservacion ------------~-----------------35
227 Elaboraci6n de la bebida fermentada ---------35 2271 Pr~paraci6n de Ie muestra ---------------~----35 2272 Adici6n del Inocula ----~-------------------36 2273 Control de Ie fermentaci6n=~~~==~~-------------36
2274 Refrigeracion ------- ~-- ---- -------36 2275 Batido--~ ------------------------------------37 2276 Envasado y almacenamiento------------ 37 228 Determinacion del pH------- ---------- -----39 229 Determinacion de la acidez (Expresada como acido lactico) -39 middot2210 Prueba de viabiJidad ------~-------~----------39 2211 Am3lisis microbiol6gico de las bebidaslacteas(con ysinavena) -40 2212 Anslisis estadistico ~-~~-~---------=------------40
3 RESULTADOS Y DISCUSI6N-~------------------------------ --42
31 Coloraci6n de Gram y morioJpgfa --001-------- - -----42
32 Prueba de esporufacion y catafasa-----------------42 33 Prueba para determinars especie- -------- ---44 34 Pruebas para determiner microorganismos probi6ticos -----45 35 Seguimiento del pH en la bebida h3ctea con y sjn prebi6tico-----49 36 Seguimiento de la acidez expresada como de acidb lactico -----51 37 Prueba de viabiJidad-------- ----------54 38 Analisis microbiol6gicos de las babides lacteas con y sin avena --56
4
5
REFERENCIA~ BIBLIOGRAFICAS --~-------------middotmiddot---- ---------60
LISTA DE TABLAS
TABLA 1 ALGUNAS ESPECIES MICROBJANAS PROB16TICAS-------------~------middot15
TABLA 2 FueNTE De AISLAMIENTO DE CePAS NATJVAS --------------29
TABLA 3 RESULTADO DE PRUEBA DE ESPORULACI6N------------------43
TABLA 4 RESULTAOO PRUEBA DE LA CATAlASA ----------------------44
TABLA 5 ReSULTADO IOENTIFICACION CEPAS--------------------middot-----45
TABLA 6 ReSULTADOS APRUEBAS DE RESISTENOIA A pH=2 YSALES BILtARES 03 Pv
-----------~-- ----------~--46
TABLA 7 ReSUtTADO pH YOGUR SIN AVENA ----------------49
TABLA 8 ReSULTADO pH YOGUR CON AVENA ------------ --49
TABLA 9 COMPARACION DE MEDIAS PARA pH----------------------50
TABLA 10 ReSULTADO DE ACIDEZ (EXPRESADO COMO ACIDO LACTICO)-------51
YOGURT SIN AVENA ------------------------------51 TABLA 11 ResuLTAOo oJ ACIOEZ (EXPRESAOO COMO ACIDO ACTICo)----52
YOGURT CON AVENA--- ------------------- --- ----52 TABLA 12 COMPARACION DE MEDIAS PARA ACIOEZ----------------~~53
TABLA 13 RecuENTo DE LACTOBACILOS (UFCML) YOGHURT SIN AVENA--54
TABLA 14 RECUENTO DE LACTOBACILO$ (UFCML) YOGHURT CON AVENA ------54
tABLA is COMPARACl6N MEDIAS LOG LAcToBACltLUS-------------56
TABLA 16 RESULTADOS ANALiSIS MICROBIOL6GICO------------- --57
L1STA DE FJGURAS
FIGURA 1 CAMARA DE ANAEROBIOSIS----------middot------~----27
FIGUftA 2 CePAS EN TUBOS CON AGAR INCUNADO -----~--middot----------30
FIGURA 3 COLONrASAISLADAS EN AGAR MRS-------middot---------31
FIGURA 4 API CHL 50-PRUEBA sloaufMlcAS ------------- bull --33
FIGURA 5 DtAGRAMA DE FLUJO ------~---------- ----~-38
FIGURA 6 LACTOBACILLUS I3REVIS GRAM + AfSLAOA OE LECHE FERMENTADA------47
FIGURA 7 LACToBACILLUS BFEVS A1SLADA OS lECHS FERMENTADA DESPUES DE LA
PRUEBA DE RESfSTENCIA A pH=2 ----------------------~ - middot-48
fIGURA 8 LAcTOBAcILLUS BREVIS AISLADA DE LECHE FERMENTADA OESPUES DE LA
PRUEBA DE RESISTENCJA A SALES BILIARES 03 pN------------- ----48
FIGURA 9 COMPARACI6N DE MEDIAS PARA EL pH ---------- ---------50
FIGURA 10 COMPAAACI6N DE MEDIAS PARA LA AC1DEZ ----------------52
FIGURA 11 COMPARACI6N DE MEDIAS PARA LOG LAcTOBAcILLUS -------------55
LISTA DE ANEXOS
ANEXO A--- RESUl TADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AfSLADA DE
ANEXO B RESULTADO PRUEBAS BIOQUfMICAS DE CEPA AISLAOA DE
REPOLLO FERMENTADO --middot----------middot--------------------------68
ANEXO c RESULTADO PRUEBAS BIOQUIMICAS DE CEPA AISLADA DE
MUCOSA HUMANA ------------------------------------------ ------69
ANEXOD RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMCAS DE CEPA AISlADA DE
LECHE FERMENTADA---------------------------------------_-70
ANEXO E RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AtSLADA DE
REPOLLlTAS DE BRUSELAS tERMENTAOA ------------------------71
ANEXO F ANAUSIS DE REGRESION PARA pH EN BEBIDA SIN AVENA--- 72
ANEXO G- ANAUSIS DE REGRESION PARA pH EN BEBIDA CON AVENA --73
ANEXO H ANALISIS DE REGRESION PARA ACIDEZ EN BEBIDA SfN AVENA
ANEXO 1- ANALISIS DE REGRES[ON PARA ACIDEZ EN BEBIDA CON AVENA
ANEXO J- ANALISIS DE REGRESION PARA RECUENTO LACTOBACILOS
PARA 8EBItgtA SIN AVENA ~----------------------------------------wirEr
ANEXO K ANALlS1S DE REGRESION PARA RECUENTO LACTOBACILOS
PAFt BEBIDA CON AIlNA-------~-------~----------~------~---middot-----~-middot---irjr
INTRODUCCI6N
En los ultimos arios S9 ha comprobado los efedoS beneftcos que los
microorganismos probiotico$ ejercen sobre la salud humana a facilitar la digestion
de lactosa estimular 18 actividad inmungica modificar ef balance poblecional
tanto de la microbiola intestinal nativa can posibles sfeelos patogenos como de
las que causan toxiinfeCCiones alimentarias edemas se estan ensayando como
implante en heridas de piel para evttar contamlnacion can microorganismos
patogenos
Los microorganismos probi6ticos se emplean en fa elaboraci6n de productos
fermentados en especial los lacteos Estas industrias se han limitado a utilizar
cultivos iniciadores importados que rsquieren tiampo y culdados para su
manlpulacion y empleo En Colombia no se han realizado InY9s1igaciones que
involucren cepas nativas can activldad probiotica ni el afecto de ingredientes
prebi6tico$ sabre fa viabilidad de estos microorganismos tenienqo en cuenta que
al prebiotico es un ingrediente allmentario que estimula sefectivamente el
crecimiento y actividad de algunas especies de microorganismos probi6ticos
En esta investigacion se sislaron microorganismos probi6ticos a partir de
muestras de vegetales y lache crud a de vaca fermentadas naturafmente y de
mucosa humana utifizando medios de cultivo salactivos bajo condiciones
12
anaerobias Luego se procedio a verificar su rasistencia a los acidos gastricos y
sales biliares simulando asl las condiciones del tracto gastrointestinal de 10$
humanos Las capas que presentaron mejor comportamiento ante estas pruebas
sa caraeterizaron morfologles y bioquimicamente y sa seleccione una de eHas
para inocular en bebidas lacteas sin y can avena como ingrediente prebiotico y
verificar su viabilidad durante al almacenamiento
Los resultados de esta investigacion padren sar de gran irnportanoia para la
industria nacional de alimentos las univarsJdades con facultades relacionadas
can la salud y la alimentaci6n y para las entidades gubernamentales involucradas
en la alimentacion y nutricion de grupos de poblacion vulnerables tales como eJ
Instituto de Bienestar Familiar y Bienestar Social entre otros
13
middot~
1 MARCO TEORICO Y ESTADO DeL ARTE
11 P~OBI6TICOS
111 Historia
EI consumo de productos fermentados lecteos con microorganismos vivos
especialmente bacterias acido lacticas ha sido reportado a 10 largo de la historia
desde tiempos remotos se evidencia al conoeimiento de los beneficios que estes
proporcionaban perc real mente quian enfatiz6 en ellos fua 91 cienUfico ruso Elie
Metctinikcff que reaclon6 la ingesti6n de (eches fermentadas con la longevidad y
salud de las personas ( Pardio et al 1996)
En 1965 sa utilizo por primera vez et termino Probi6tico derivado dellatin pro
que significa a favor de y del gr9go bios que quiera decir vida tnieialmente esta
palabra defini6 a los microorganismos que promovian el erecimiento de otros
microorganismos Ivego se splico asta termino a extraetos de tajido que estimlilan
el crecimiento micrObianqEn la actuaidad sa han definldo como probiotieos los
cultivos (micas 0 mezclados de microorganismos vivos qua al ser ingeridos por
humanos Q animales majoran el balance poblacional de la microbiota intestinal
evitando la adherencia de patogenos (Schrezenmeir et albull2001) Sin embargo
estos microorganismos no nece_iamenta son habitantes propios del tracto
14
gastrointestinal (Holzapfel at a2001Gaitan at al 1998) p~r 10 tanto es
necesario consumir alimantos en los que se encuElntren estos mrcroorganismos
viables estos hacen parte de I~micfobiota de vegetales y leches interviniendo en
Ie fermentaci6n natural de estos~ntos
112 Microorganismos Probi6ticos
los microorganismos probi6ticos que tradicionatmente se han adicionado a la
tache para fermentarla y obtener yogurt y kumis a como suplementos pertenecen
a los generos Lactobacillus Enterococcus y Bifidobacterium (Ver tabla Nro 1) Sin
embargo se considera que solo algunas especies de los gelnsros Lactobacillus y
Bifidobacterium sobreviven en el tracto gastrointestinal En la tabla 1 58 muestran
algunas de estas especies
TABLA 1 Algunas especies microbianas probi6ticas
Lactobacillus Sifidobacferium Enterococcus
L acidophilus
L JohnsoN
L casei
L rhamnosus
Lgrasseri
L reuten
L plantarum
B bifidum
Blongum
B infantis
E fsecium
E faecalis
Fuente Gaitan et a 1998A
15
EI eonoeimiento a cerea de sus efeetos beneficos en el consumidor por su alta
viabilidad en el intestino como la producci6n de sustancias con aetividad
antieaneerigena el mejoramiento ltfel sistema inmunol6gico y el deSplazamiento
de la mierobiota pat6gena gastrointestinal en el consumidor ha estimulado una
mayor demanda de estos microorganismos como tambian de los productos que
los contienen (Heller 2001 Parada middot1998)
Existsn otros produetos fermentados de origen vegetal como et tampe col acida
y salsa de soya de los euales sa pueden aislar estos organismos probi6tieos
comp tambien de la mucosa intestinat humana y luego de suministrarlos a
ratones sa han comprobado sus caracteristicas beneficas (Molin 2001)
113 Caracteristicas fenotfpicas de algunos microorganismos
probi6ticos
las bacterias aeido lacticas de los generos Lactobacillus y Bifidobacterium son
consideradas probi6tieos y tradicionalmente se han clasificado con base en Sus
propiedades morfol6gicas crecimiento a diferentes temperaturas capacidad
fermentadora de glucosa y otros carbbhidratos y la configuraci6n del Bcido Jaetieo
producido (Holzapfel etal2001)
16
)lli~ h Dx nIILIOTECM
eJDe~~ l1ilmfJ tIDBnm
Los Lactobacillus son bacilas gram positiv~s no esparuladas aerotalerantes
acido - tolarantes estrictamente fermentadares formadores de Boido laclica como
producto principal catalasa negativo carentes de citocroma sin embargo se
presentan excepciones a esta descripcion parque afgunas especies pueden
formar catalasa 0 citacramo en medios que contienen hematina 0 compuestos
relacianados La produccion de catalasa no hema pseudocatalasa puede causar
tambien alguna confusion en fa identificacion de algunos Lactobacillus
las especies del genera Bifidobacterium san bacilos gram positivos no
esporulados generafmente anaerabios estricto$ aunque pueden creeer bajo
condiciones microaer6filas cuando estan ert presencia de C02 La mayorfa de sus
especies se pueden diferenciar par criterios biaquimicos simples como la
fermentacion de L arabinosa DmiddotxiJasa O-manosa O-manita y O sorbitat que
pueden servir coma caracterist1cas clave para su clasificacion (Holzapfel
etal2001 )
114 Caracteristicas de los probi6ticos
Las cepas de microorganismos prabi6ticos deben presenter y mantener unas
caracteristlcas que garanticen su crecimienta y supervivencia En el alimenta
como tambiEm durante su transito a traves del est6maga e intestino delgaQo
17
La primera CBtacterfstica es que sean viables esta viabifidad esla capacidad que
tienen los microorganismos probi6ticos de permanecer vivos tanto ~n el alimento
como en el Intestino del consumidor por un tiempo determinado En Colombia se
ha establecido que en bebidas fermentadas este tiempo debe ser minimo de 21
dras en el alimento (Minsalud 1986) Esta vjabilidad depende del metodo de
produccion y de la cepa utilizada (Tuomols at a 2001)
Luego de que se garantice que estos microorganismos eslan viVos en el alimento
ell os deben cumplir otro criterio importanle para ser considerados como
organismos probi6ticos y as tblerar las condiciones de acidez a un pH=2 y la
sccian de proteasas del est6mago ademas de sobrevivir y creeer en presencia de
acidos biliares (Tuomola et al 2001 Jacobsen at a 1999) para luego de
sobrevivir a estas condiciones adherirse a la mucosa intestinal y de esta manera
estimular al sistemainmunoJ6gico esta capacidad de adherirse a la mucosa es un
prerrequisito para la colonizacion del intestlno (Toumola etal2001 Alander et aI
1999)
Cuando los probioticos han pasado todas esta pruebas de supervivencia y luego
de impfantados en la mucosa producen acidos organicos peroxido de hidrogeno y
tambien bacteriocinas que actUan como inhibidore$ del crecimiento de
microorganismos patogenos u oportunistas (Tuomola at al 2001 Cintas et al
2000) complementando de asta manera su accion benefica sobre la mucosa
intestinal y en general sobre la saJud del huesped
18
116 Berieficios de los microorganismos probi6ticos
Los beneficios que se asocian a los microorganismos probioticos son muchos y
variados Entre ros comprobados mediante estudios se eneuentran
1151 Facilitar la digesti6n de la lactosa
los microorganismos probioticos cuando estan en el intestino liberan alii la
enzima pmiddotgalaotosidasa capaz de hidrolizar la lactosa haste glucosa y galactosa
evitando as que personas intolerantes a este carbohidrato presenten sfntomas
como flatulencia dolor abdominal y diarrea cuando consumen leche (be Vresse
et 81 2001)
1152 Protegen contra enfermedades gastrointesUnales
EI consumo de aJimentos con probioticos ha mostrado efeeto terapeutico frente a
los sintomas de diarrea asociada al surninistro de antibi6tico$ de amplio espectro
que destruye 0 disminuye la microbiota endogena esta imp ide la coJonizacion de
bacterias patogenas como Klebsiella oxytoca y Clostridium difficile que pueden
causer lesiones en el cn Los probi6ticos recuperan el balance de la microbiota
intestinal nativa y avitan Ie adhesion de algunos virus bacterias pat6genas a
parasitos que pueden ser agentes causales de gastroenteritis la diarrea del
19
J
viajero y 1(3 inflarnacion intestinal que en ultima instaneia oeasionan ef sfndrome
del colon irritable (Marteu et al 2001)
1153 Protegen contra infecciones del tracto urogenital
La vaginitis indueida por baeteriss yo por levaduras as una infecci6n
estrechamente relacionada con la exposici6n a antibi6ticos y espermicidas y
tambien depende del estado hormonal de la n1ujar Con al uso de mezcJas de
probi6ticos se han obtenido buenos resultados en la rastauraci6n de la rnicrobiota
natural urogenital benefica que desplaza a los eausantes de la inflamaci6n de Is
vagina y Ie uretra (Reid 2001 )
1154 Promueven la barrera de defensa end6gena del intestino
EI tracto gastrointestinal normal mente as una barrera natural contra anUgenos de
origen microbiano y alimentario Cuando los probi6ticos sa adhieren a Is mucosa
intestinal estimulan 0 potencian al sistema inmune favoreciendo la
inmunomodulaci6n que induce un aumentb de fa producci6n de inmunoglobulinas
activacion de las calulas mononueleares y de los linfocitos para proteger al
huesped de infeeciones (Isoulari et sl 2001)
20
1155 Protegen contra cancer de colon
EI cancer es el resultado de una serie de mutaciones somaticas que pueden
ocurrir durante al tiempo de vida del individuo y 10 padeca buena parte de la
poblacion mundial los probi6ticos en un sistema in vitro han demostrado un
efecto positivo en la prevenci6n de mutaciones aI desactivar carcin6genos
genotoxicos (Wolloswski et al J 2001)
1156 Protegen contra infecciones respiratorias
Sa ha demostrado que el conslJlno de probi6ticos disrninuye la incidencia de
infecqiones raspiretorias al aumentar la actividad fagocitica de maer6fagos
alveolares que aettian sobre microorganismos patogenos Se hizo un estudio en
571 ninos sanos con edades entre uno y seis anos divididos en dos grupos a uno
de ellos sa las incluy6 en su dieta leche suplementada can Lactobacillus GG y a
los otros ninos leche no suplementada AI final del estudio se observ6 una
disminucion del 19 en la incidencia de infeccionas respiratorias tratadas con
antibi6ticos tales como otitis media sinusitis bronquitis y neumonfas en el grupo
de los ninos que consumieron Lactobacillus GG (Hatakka et al 2001)
Alvarez et al (2001) encontraron que la administraci6n de yogurt con Lactobacillus
casei en ratones de tres arios de edad majora los espacios libres del puJrn6n de
la presencia de Pseudomona aeruginos8 induciendo un aumento
21
significativo en los niveles de gA a IgM datactadas en los lavados
broncoaJveolares y se observ~ un afecta dependiente de la dosis
1157 En el tratamientoy prevenci6n del eczema
Se ha encontrado que el consumo de probi6ticos mejora la inflamaci6n alergica 0
eczema at6pico en ninos alimentados con formula suplementada con probi6ticos
Encontraron una mejora significativa al suministrar Bifidobacteriummiddot actis y
Lactobacillus GG en 27 niiios con edad promedio de 46 meses Luego de aplicar
este tratamiento se sometieron a una prueha de SCORAD (mide fa extension y
gravedad del eczema) registrando una meJoria significatlva en las condiciones de
la pie concentraci6n de citoquinas cirClllantes an sueto y moleculas de adhesi6n
a las superficies de las celulas soJubles en suero (Isolari 2000)
Se realizaron otros estudios a 159 mujeres embarazadas con historia familiar de
eczema atopico de primer grado a las cuafes sa res 5uministro dosis diarias de
Lactobacillus GG durante 2 a 4 samanas previas al parto Oespues de ella fa
madres twiaron la opci6n de continuer tomando el ptobi6tico si amamantaban 0
bien darseio vIa oral La mayoria de las madras eJigieron dar las dosis at bebe
diariamente A los dos anos de vida se observ6 una disminuci6n del 50 en la
frecuencia del eczema at6pico en aquellos nHies que se les dio ef probi6tico
(Kalliomari etal 2001)
22
1158 Previenen infeccion en heridas quirurgicas
Los probi6ticos impiden la union de pat6genos a las superficies celulares en
heridas mediante la seCreci6n de proteinas Actuamente se encuentra en
estudio la aplicaci6n del Lactobacillus fermentum vivos sabre heridas en piel de
ratas y se ha encontrado una disminuci6n del 90 en la colonizaci6n par parte del
StaphylococcuS aureus uno de los patogenos mas temidos y de mayor lncidencia
en infecciones hospital arias mas aun se esta contempiando la posibilidad de
utilizar la protein a purificada an lugar de los mjcroorganismos para la protaccion
contra infecciones en heridas (Strauss 2000)
12 PREBIOTICOS
Son carbohidratos de cadena corta algunas veces reconocidQs como
oligosacaridos no digeribles par las enzimas del epitelio intestinal 0 de las
gliJnduJas anexas debido a su estructura quimica y de esta manera lIegan al
intestino grueso donde alcanzan a estar disponibles para la fermentaci6n por las
bacierias sacaroHticas que son especial mente laetobadlos y bifidobacterias
dando odgen a compuestos que ejercen efectos funcionales sobre la mucosa del
tubo digestivo (Brunser 2001)
Se consideran como tal algunos fructocligosacaridos isomaltooligosacariclos
oligomato palatinosa poHdextrosa pOJidextrrna raftilina y algunos oligosacaridos
23
)
de 1a soya y fa avena Estenmiddot presentes en alimentos como Ie cebolla ajo
banano puerros 1 derivados del trigo achicoria esparrago alcachofa (Cummings
etal 2001)
Algunos de estos prebi6ticos cuanda son incorporado$ a fa dieta en cantidades
dalerminadas alteran la microbiota intestinal disminuyendo los recuentos de
coliformes bacteroides y cocos y aumentando las bifidobacterias hasta en diez
veces ademas modifican la actividad metab6lica del coron logrando una
disminuci6n del pH y un incremento en el contenido fecal de acidos grasos de
cadena corta como at acatica propi6nico y butfrico El butirato aumen~ _I grosor
de la pared del coron e intestino delgado estimula eJ crecimiento de la mucosa del
colon y auManta su flujo sangufneo inhibe el crecimiento de tinsas tumorales
epiteliales de origen co16nico induce la diferenciaci6n de sus celulas y a
apoptosis entre otros(Brunsar 2001)
Eh estudios hechos en simuladores del intestino humano utilizando productos de
avena fermentados se encontro que estimularon al crecimiento tanto de
lactobacios como de bifidobacterias y en el caso de estas ultimas se incremento
la producci6n de los acidos acatico propionico y butfrico 10 que incide sobre la
implantacion de probi6tico$ e inhibe al crecimientos de otro tipo de
microorganismos (Alal1der eta1999 Kontula etal 1998 Jaskari etal 1998)
24
~ -1
(
AI comparar el comportamianto de las leches de diferente origen se ha
demostrado que Ie leche de vaca contiene caseinatos sustancias que forman
buffer ~n et intestino e inlpiden que los probi6ticos disminlJyen el pH del intestina
y de esta manera se impide al efecto deseado que es evitar fa proliferaci6n de
otros microorganismos entre los cuates pueden estar algunos patOganos En la
leche materna sa encuentran algunos carbohidratos como glucosa galactosa n
acetilglucosamina y algunos 0lig6meros de Ie fucosa en cOhoontracionesmiddot
importantes los cualeS favoreceh el crecimientc)middot de probi6ticos esto
complementado can 91 bajo contenido de protenas que se traduce en una
reducida capacidad buffer hacen de Ie lache materna IJn alimentd adecuado para
nllios en su etape de lactancia
Algunos prebi6ticos como 1a lactulosa yciertos compuestos que contiansn fructosa
no son digeridos en el intestino humano y pueden sar utilizados selectivamenta
par los probi6ticos 10 que hace que los probi6ticos en combinaci6n can prebi6ticos
pueden lIegar a ser un importante medio para prevenir algunas enfermedades del
tracto gastrointestinal (Bezkorovainy 2001)
25
2 METODOlOGfA
21 LOCALIZACION
EJ trabajo sa realizo en el laboratorio de Microbiologia y la planta da laches de Ja
Universidad Naclonal de Colombia- Secie Medellin
En al laboratorio se hiZQ al aislamiento a identificaci6n de fa capas y en fa Planta
sa eJaboro la leche fermentada con 1a cepa seleccionada y el prebi6trco
22 METODOS
221 Aisiamiento de cepas nativas
Las cepas nativas se sislaran de producto$ vegetales leches fermentadas y
mucosa vaginal humana
2211 De vegetales
Las muestras vegetales de repollo repollitas de brusefas y pepino se
seleccionaron porcionaron y mezclaron can cloruro de sadio al 10 pIp se
calacaron en un recipienta de vidrio balo anaerobiosis y sa dejarQn por 15 dias
26
luego S9 tomaron 3 ml de cada muestra y se jnocularon 9 ml de caldo MRS (Man
Rogosa and Sharpe) se incubaron a 37deg C durante cinco dias en camara de
anaerobiosis (Ver Figura 1) Oespues de este tiempo sa inocularon cajas de petri
con agar MRS con 1 ml del cultivo microbiano y se incubaron bajo las mismas
condiciones que eJ caldo Este procedirniento se realiz6 rapetidas veces hasta
seleccionar la cepa pura mediante observaci6n de caracteristicas morfologicas de
la cOlonia y a cada colonia se Ie practico la coloracion de gram con el fin de
observar las caracteristicas microscopicas de cada una e identificar las de mayor
similitud a los Lactobacilos y Bifidobacterias
Figura 1 Camara de anaerobiosis
27
2212 De la leche
Sa tomo 200 ml de teche cruda de la planta de leches y se colaca a fermentar
baja anaerobiosis durante 15 dras Luego sa procedia como en los vegetales
2213 De mucosa vaginal humana
Se tomo una muestra de frotis de mucosa vaginal humane can capito esteril sa
puso a ncubar en Caldo MRS y se procedi6 camo en 2211 y 2212 A cads
aislado sa Ie practico la coloracion de gram y sa seleccionaron aquellas que eran
bacilos gram positivos (Ver Tabla 2)
28
TABLA 2 Fuente de aislarniento de cepas nativas
CEPA FUENTE
1 Pepino fermentadQ
2 repollitas de bruselas fermentadas
3 Repolltgt fermentado
4 Repollo fermentado
5 Mucosa va~inal humana
6 Mucosa vaginal humana
7 repollitas de bruselas fermentadas
8 Repollo fermentado
9 repollitas de bruselas fermentadas
10 Mueo~a vaginal humana
11 Repollo fermentado
12 RepolJo fermentado
13 Leche fermentada
14 Mucosa vaginal humana
15 repollitas de bruselas fermentadas
16 Repollb fermentado
29
222 Almacenamiento de las cepas aisladas
Cuando las cepas crecieron en agar MRS homogEmeas en color morfologia
coloraci6n de Gram etc se pssaron a agar inclinado en tuba se cubrieron con
aceite mineral y se guardaran en refrigeraci6n a 4deg C para tomar de alii la cepa y
efectuarle las diferentes pruebas para confirmar el genera y determinar la especie
de cada una de eas (Ver Figura 2)
Figura 2 Cepas en tubos con agar inclinado
30
223 Pruebas para determinar et genero
2231 Coforaci6n de Gram
A cada cepa sospechosa de Lactobacilos se 1e hizo la coloraci6n de gram y se
seleccionaron las gram positivas
2232 Morfologfa
En agar MRS y despues de incubar en anaerobios~s crecian colonias grandes
cremosas de color beige con bordes homogeneos y c6ncavas(Ver Figura 3)
Figura 3 Colonias aisladas en agar MRS
31
2233 Prueba de esporulaci6n
A cada cepa aislada se Ie hizo esta prueba la cuel consistia en incubar en
aerobiosis durante ocho dias las cajas de agar MRS donde crecieron colonias de
Lactobacilo$ y luego se les (ealize) coloraci6n de espora Las capas que dieron
negativa a la prueba de espora se considararort sospechosas de sar Lactobacilos
y se continuo con la prueba de la catalasa (Ver Tabla 3)
2234 Prueba de la catalasa
los lactobacilos carecen de catalasa Eata prueba se hizo tomando una colonis
se deposito en vidrio de reloj y se Ie adicion6 dos gotas de peroxida de hidr6geno
(H202) la que no presentaba efervescencie eran cepe sospechosa de ser
Lactobacilo (Ver Tabla 4
Sa seleccionaron las capas euyo resultado fue aeorde con el genera Lactobacilfu$
y se continuo con la comirmaeion del genera y determinacion de la eSpecie
meqiante las pruebas bioqulmicas
32
224 Prueba para determlnar la especie
Para confirmar el genero y determinar la especie de las diferentes capas aisladas
se hizo una caracterizaci6n bioqufmica utilizando un kit de API 50 CHL Medium
Ref 50 410 que contiene una galed8 de medios que permite realizar el estudio
de fermentaci6n de los 49 azucares de 52 especies de Lactobacillus (Ver Figura 4
y tabla 5)
Figura 4 API CHL 50-Prueba bioquimica
33
225 Pruebas para determinar microorganismos probi6ticos
2251 Resistencia a pH=2 y sales biliares de concentraci6n O3pv
A las cepas idantificades como Lactobacillus brevis y Lactobacillus pantarum sa
las realiz6 Ie prueba dfl resistencia a pH=2 y sales biliares de concentraci6n 03
pv ( Jacobsen et al 1999) Una colonia de cada cepe aislada se inocul6 en 4 mt
de caldo MRS durante cinco dras bajo condiciones de anaerobiosis Oespues de
esta tiempo se dejaron pracipltar los microorganismos por sedimentaci6n se Ie
retire el sobrenadante y al precipitado se Ie adicion6 Sml de caldo MRS
previamente ajustado a pH=2 can seido clorhfdrico (HCI) dentro del mismo tuba de
ensayo G igual sa hizo can otro tubo previamente incubado pero a este se Ie
adiciono 5ml de caldo MRS con sales biliares a una concentra~i6n de 03 plv y
ambos se incuberon a 37deg C por 2 haras Sa midio 01 mi de cada uno de los
tubas al tiempo 0 y a las 2 horas y sa inoculeron en superficie en caJas de petri
con agar MRS S9 incubaron a 37deg C bajo anaerobiosis durante 48 horas Se
compararon visualrrente en cada caja de petri el crecimiento en superficie y las
que presentaron crecimiento en tos dos tiempos (0 y 2 horas) tanto en at media
acido como en sales I se consideraron resistentes a pH=2 y sales biliares (03
pv)
(Ver Tabla 6)
34
226 Conservacion
Todas fas capas que habian dado positiva Jas pruebas anteriores y que reaultaron
resistentes a pH=2 y sales biliares 03 pv y despues de identificadas en API 50
CHL sa repicaron en agar MRS en tuba inclinado y despues de Incubar a 37deg C
por 48 horas bajo anaerobiosis se Ctlbrie el biser completamente can aceite
mineral esteril y sa guardaron en refrigeraci6n
227 Elaboracj6n de fa bebida fermentada
2271 Preparaci6n de la mue$tra
Sa tome 1 mt de caldo MRS previamante inoculado e incubado que presentaba
una concentracion de Lactobacillus brevis de 27x108 Iml segun la escaJa de Mac
Farlan y sa adiciono a 9ml de leche pasteurizada en un tubo sa dej6 incubanda
en anaerobiosis por 48 hores Luego se pasaron estos 10 ml a un frasco qua
cont~nie 90 ml de leche pasterizada y se dej6 incubando par 48 haras en
anaerobiosis
35
2272 Adici6n del inOculo
A 900ml de leche pasteurizada se Ie adicion61os 100 ml de leche que habia sido
previamente ino(ulada dos veces con la cepa posteriormente se deja
fermantando la lache a temperatura de 37deg C
2273 Control de Ja fermentaci6n
Las muestras se hicieron por cuadruplicado y se les hizo un seguimiento de
aoidez hasta un valor entre 04 y 05 expresada como Bcido lactico esta
procedimiento corresponde a la babida fermentada sin prebi6tico La bebida ~on
prebi6tico tiene al mismo proeedirnianto pero adicionalmente se agrag6 avena a
una concentraci6n de 05 en el momento de la adici6n del in6e410 a los 900 ml
de leehe pasteurlzada y el procedimiento sigui6 igual al de la bebida sin prebi6tico
tambien se hizo por cuadruplicado
2274 Refrigeracl6n
Despues que las mezclas con y sin prebiotico alcanzaron el de acidez
requarido se IIeva ron a refrigeraci6n a una temperatura de 4deg C p~r 24 horas
para frenar proce~os metab6licos de los microorganisrtlos Despues de este
ti~mpo se procedi6 al batido
36
1 2275 Batido
Con un agitador se procedi6 a batir las bebidas para romper et coagulo formado
y de esta manera homogeneizar la mazela y obtener asf la bebida fermentada
2276 Envasado y almacenamiento
Ambas bebidas se envasaron en frascos vidrio para hacerles seguimiento de pH
acidez(expresado como acido tacticol y recuento de Lactobacillus breviSf los
dies 27 14 Y 21 despues de elaboradas las bebidas perfodo durante el cualta
muestra permanecfa afmacenada a temperatura de refrigeracion(Ver Figura 5
37
Fjgura 5 Diagrama de Flujo
PREPARACION DE LA MUESTRA
ADICION DEL INOCULO
~_____~_B~ATIDO~______~
INCUBACION 37deg C hasta acidez = 04-05 acido laotico
ENFRIAMIENTO
hasta 4 0 C ~------~ ~------~
ENVASADO Y ALMACENAMJENTO
dUrante 21 dfas a Temperatura 4 0 C
38
1
228 Determinaci6n del pH
Se determino por el metoda potenciometrico en un pH-metro manual durante los
dias 2) 7 14 Y 21 de las bebidas lacteas sin y con prebi6tica (Ver Tablas 7 y 8)
229 Oeterminaci6n de la acidez (Expresadfl como acido
lactica)
Se tomaron 9 mJ de las bebida~ sa Ie adicionaron 2 gotas de fanoftaleina como
indicador y sa titulo fa acidez con NaOH 01 N hasta la aparicion de un cotor rosado
debit EI volumen de NaOH utilizado se reporta como valor de de acidez
(VerTablas 10 y 11)
2210 Prueba de viabilidad
Qurante el perfoda de almacenamiento de la bebida lactea se procedi6 a hacer la
prueba de viabiHdad en los dias 7 14 Y 21 para determinar Si los lactobacilfus
permanecfan vivOs a una concentraci6n minima de 106 hasta el dia 21 como 10
establece eJ Articulo 10 de la Rasolucion 2310 del Ministerio de $alud de
Colombja
39
Para asta prueba se tamaron 10 rnl de muestra y se adicionaron a 90 ml de caldo
MRS ruego a partir de esta se hicieron diluciones de 10-2 hasta 10-11 de las
diluciones 109101deg 10-11 se inocul6 1 ml de cada uno en agar MRS siguiendo el
metodo de siembra en profundidad y por duplicado e incubando a 370 C x 5 dras
en anaerobiosis y luego se hicieron tos recuentos por duplicado para esi reportar
los recuentos promedio (Ver Tablas 13 y 14)
2211 AniUisls microbiol6glco de las bebidas Iicteas(con y sin
avena)
Con el fin de determinar las condiciones higienico-sanitarias del producto se
realizaron las pruebas microbiol6gicas de Recuento de mohos y fevadurasml en
agar OGY Recuento en superficia de Staphylococcus coagulasa positivoml en
agar Baird Parker Numero Mas Probable (NMP) de coUfor-mes totales y
Escherichia coliml en caldo Fluorocult y Presencia de Salmonela25ml con BHI
caldo tetrationato y agar Hecktoen (Montoya 1999)
(Var tabla 16)
2212 AnaUsis estadistico
A los datos obtenidos en la medici6n de pH acidez (expresada como Beido
laclico) en los dras 2714 Y 21 y el recuento de Lactobacillus en los dras 714 y21
40
realizados a los dos tratamlentos se tes aplic6 1a prueba t porque solo difieren
en la presencia 0 ausencia del prebi6tico para evaluar si habra diferencia
estadfsticamente significativa para los dos tratamientbs(Ver Tablas9 12 y 15)
41
3 RESULTADOS Y DISCUSION
31 Coloraci6n de Gram y morfologfa
Las cepas aisladas fesultaron Gram positivas (Ver Figura 6) colonias grandes
cremosas dE) color beige con bordes homogeneos y c6ncavos en su
morfologia (Ver Figura 3) resultando de acuerdo a 10 especificado en Stanley
1989 para Lactobacillus
32 Prueba de esporulaci6n y cataJasa
Los resultados de la pruebas de esporulaci6n y catalasa indicados en las
Tablas 3 y 4 respeclivamente dieron conforme a 10 especificado en Stanley
1989 para Lactobacillus
42
1
2 3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
TABLA 3 Resultado de prueba de esporuJaci6n
CEPA RESULfADO ESPORULACION
-- -------------
43
l i ~II bull ~ I I
TABLA 4 Resultado prueba de la catalasa
CEPA RESULTADO CATALASA
1 -2 -3 -4 -5 -6 -7 8 -9 -10 -11 12 -13 -14 -15 -16
3~3 Prueba para determinar la especie
Oespues de hacer las pruebas para seleccionar las cepas sospechosas de ser
Lactobacillus se realizo las pruebas bioquimicas fograndose identificar
Lactobacillus plantarum aislctdo de pepino repollo y repollitas de bruselas
44
fermentados y Lactobacillus brevis de mucosa vaginal y leche fermentada (Ver
Anexos del A al E y Tabla 5)
TABLA 5 Resultado identlficaci6n cepa~
CEPA NOMBRE
1 Lactobacillus planfarum
3 Lactobacillus plantarum
5 Lactobacillus brevis
13 Lactobacillus brevis
15 Lactobacillus plantarum
34 Pruebas para determinar microorganismos probi6ticos
las cepas de Lactobacillus brevis y Lactobacillus plantarum mostraron
rasistencia al medio acido de pH =2 Y sales biliares 03 pv resultado similar al
encontrado por Jacobsen et al 1999 para Lactobacillus plantarum (Ver tabla 6)
45
middot
~~~ttiI lltlmiddot~COX~dtJ ~xtc_~ 2 tr~ k-JlL~middot
-)~~TO DE lJIBUOTECUl rjRL]OTtCA twn GO1IU1
TABLA 6 Resultados a pruebas de resistencia a pH=2 y sales biliares 03 plv
CEPA RESISTENCIA pH=2 RESISTENCfA A SALES BIUARES ()3 pv
1 + +
2 + +
3 + +
4 + +
5 +
6 + +
7 + +
8 + +
9 + +
10 + +
11 + +
12 + +
13 + +
14 +1shy +M
15 + +
16 + +
+1 crecimiento debil
+ crecimiento abundante
46
Figura 6 Lactobacillus brevis Gram + aislado de leche fermentada
Ai observar en placa las celulas de lactobacilos despues de real1zar las pruebas
de resistenCia a la acidez y sales biliares se observo una tendencia a aglomerarse
posiblemente como un mecanismo de proteccion cOlitra estos medios que pueden
lIegar a ser adversos para elias (Ver figuras 7 y 8)
47
Figura 7 Lactobacillus brevis aislada de leche fermentada despu~s de la prueba de resistencia a pH=2
Figura 8 Lactobacillus brevis aislada de leche fermentada despues de la prueba de resistencie asales biUares 03 plv
fI
48
35 --Seguimiento del-pH-en-la-bebidaJacteacon y sin -prebi6tico
A continuacion se muestran las Tablas 7 y 8 donde sa registian los datos
recopilados de pHdurante 10$ dras Z 7 14 Y21 para las bebidas laaeas con ysin
prebi6tioo
TABLA 1 ResultadopH yogur sin avena
Dia Repetition 1 Repetici6n 2 Repeticion 3 Repetici6n 4
2 526 501 51 52
7 446 433 438 44
14 439 435 437 436
21 439 437 438 437
TABLA 8 -ResultadopHyogur con avena
Dia Repeticion 1 Repeticion2 Repeticion 3 - Repeticion 4
2 509 523 51 515
7 447 442 445 442
14 436 -438 439 437
21 432 433 435 434
Observando la Figura 9podamos ver que el pH en el -dfado$ para los dos
tratamientos as igual y empieza a descender rapidamente para estabilizarse a
partir del dra 7(Ver figura 9)
49
Figura 9 Comparacj6n de medias para -el pH
Comparaci6n de medias para pH
55 ~ 5 +----=gtIIIi-~i~~----=-r--it~ -- pH sin avena
a 45 1--~~~~=~~ 4 --- pH con
avena35 t-----r-- -------=------=--= ------- - ----
2 7 14 21
Dias
Aplicando la prueba t para comparar las medias de pH I S6 muestia una diferencia
altamants significativa en los dos tratamientos para el dia 21 (pltO05)
(Ver tabla 9)
TABLA 9 Compaiaci6n de medias para pH
DtAS SIN AVENA CON AVENA te p (VALOR)
2 514 514 0 10
7 439 444 -1 61 0159
14 437 I
438 -070 0510
21 438 433 528 00019 shy
- DiFERENCIA AlTAMENTE SIGNIFICATIVA
50
I
AI aplicar regrasi6n a los datos sa obtiene al modelo estimado
pHSinAyena =535606 - 01505650Ia +0005044340IaI2
La variabilidad en la respuesta de pH asta siendo explicada en un 8S7522 por
el modelo (Ver Anexo F)
EI tratamiento con avena mostro el siguiente modelo al analisis de ragresi6n
pHConAvena =534463 ~ 0140407Dia + 0004480980Ia2
La variabilidad an la respuesta de pH asta siendo explicada en un 903315 par
el nlodelo(Ver anexo G)
36 Seguimiento de la acidezmiddotmiddot expresada comomiddot de acido
lactico
A continuaci6n sa muestran las Tablas 10 y 11 donde sa registran los datos
tecopilados de acidezmiddotdurante los dias 27 14 Y 21 para las pebidas taetees con y
sin prebi6tico
TABLA 10 Resuttadode acidez (expresadocomo acido tactico) yogurt sin avena
CIA R~petici6n1 Repeticion2 Repetici6n 3 Repeticion 4
2 054 06 057 058
7 072 074 073 0]2
14 080 083 082 082
21 0]4 079 078 077
51
TABLA 11 Resultado de aCidez (expresado como acido Icktico) yogurt con avena
Dia Repetici6n 1 RepetiCi6n 2 Repetici6n 3 Repetici9n 4
2 059 055 058 057
7 071 073 072 072
14 089 087 088 086
21 092 091 090 091
Observando la Figura 10 se puede concluir que la acidez empieza a aumentar
hasta el dia 14 y luego trata de estabilizarse para los dos tratamientos
(Ver figura 10)
Figura 10 Comparaci6n de medias para la acidez
N G)
Comparacion de medias para acidez
1
2 0I 5 -+--=--------=-~~~= u
ltC
- Acidez sin avena
2 7 14
Dias
52
21
-it- Acidez con avena
Aplicando la prueba t para camparar las madias de acidez se muestra una
diferencia altarnante significativa en los dos tratamiantos para los dias 14 y 21
(pltO05)
(Var tabla 12)
TABLA 12Comparaci6n de medias para Acidez
DIASmiddot SIN AVENA CON AVENA te p(VALOR)
2 0572 0572 0 10
7 0727 0720 119 0278
14 0818 0875 -638 000070shy
21 077 091 -1212 i 0000019 shy
DIFERENCIA AL TAMENTE SlGNIFICATIVA
AI aplicar r~gresi6n a los datos se obtiene el modelo estimado
AcidezSlnAIena = 0491897 + O0436032Dia O00144613DfaA2
La variabilidad en la respuesta de acidez asta siendoexplicada en un 970978
por al modelo (Ver anexo H)
EI tratamiento con avena mostro elsiguiente modeloj a1 analisis de regresion
AcidezConAvena = 0491638 + 00406572Oia - OQOO982559OiaA2
La variabilidad enla respuesta acidez esta siendo explicadaen un 99212 por
el modelo (Ver anexo J)
53
I ~
37 Prueba de viabiJidad
A continuaci6n sa muestran las Tab~as 13 y 14 donde sa presentan los datos
recopilados del recuento de Lactobacilos durante los dias 7 14 Y 21 para las
bebidas lacteas con y sin prebi6tico
TABLA 13 Recuento de Lactobacilos (UFCml) yogurt sin avena
Dia Repetici6n 1 Repetici6n 2 Repeticion 3 Reptttici6n 4
7 1880X10l1 1454X1011 1642X1011 1780X10~
14 1560X10~ 646X1011J 1890X10l 140X10l1
21 1200x10lu 128Ox10u 1745x10J 1520x101V
TABLA 14 Recuento de Lactobacilos (UFCml) yogurt con avena
Dfa Repetieion 1 Repetici6n 2 Repeticion 3 Repeticf6n 4
7 1600X10lt 1240X10t 1640X10ll 1980X10t
14 540X1011 427X10n 546X10n 720X10ll
21 500x1011 492x1011 712)(1011 980x10~
AI analizar la Figura 11 sa puede observar un recuento mayor de Lactobacilos
en al tratamiento con avena resultado de acuerdo a 10 encontrado por Alander at
aI 1999 Kontula et aI 1998 y Jaskari et aI 1998
54
Figura 11 Comparaci6n de medias para Log Lactobacillus
Comparacion de medias para log Lactobacillus
~ 1350
-+- Sac Sin--() 13 co avenaIII
bull 125 -- Bac con 0)
0 12 avenaJ
115 7 14 21
Dias
Aplicando la prueba t para comparar las medias de recuento de Lactobacillus no
se encontr6 una diferenc1a estadfsUcamente significative entre los dos
tratamientos (Ver tabla 15)
Este aumento en al racuento influy6 en la disminuci6n del pH y en el aumento de
fa aeidez por la fermentacion que realizan los Lactobacillus sobre fa lactosa de la
lache y la avena adicionada como prebi6tico
55
1
TABLA 15 Comparaci6n medias lag Lactobacillus
DIAS SIN AVENA CON AVENA tc p(VALOR)
7 122257 122022 04846 06451
14 121065 132393 -19602 00977
21 129025 133087 -08236 04416
At aplicar regresion a los datos se obtiane al modelo astimado
LactobacillusSinAvena= 117347 + 004834640Ia
La variabilidad en la respuesta del recuento de LactobaCillus ssta siendo
explicada en un 260054 por el mod$loVar anexo J)
EI tratamiento con avena mostr6 al siguiente modalo al anal isis de regresion
Lactobacillu$ConAvena =118103 + 007903040Ias
La variabilidad en la respuesta de recuento esta siendo explicada en un 3068
por al modelo(Ver anexo K)~
38 Analisi$ microbiol6gicos de las bebidas lacteas con y sin
En la Tabla 16 estan recopilados los resultados microbiol6gieos obtenidos en ras
muestras con los dos tratamientos (con y sin avena)
I [
sa
TABLA 16 Resultados analisis microbiologico
Recuento de mohos y levaduras Iml lt10
Recuento de Staphylococcus coagulase positiva Iml lt100
NMP coliformes fotales y Escherichia coli Iml lt3
Presencia de Salmonella25ml Ausente
Los resultados de este analisis demuestran que las bebidas fermentadas con y
sin avena~ astan fibres de microorganismos patogenos
57
1
4 CONCLUSIONES
Se aislaron cepas nativas de Lactobacillus plantarum de las muestras vegetates
de repollo pepino repollitas de bruselas fermentadas y Lactobacillus brevis de
lache fermentada y mucosa vaginal humana Ambas cepas resistieran un pH=2 y
una concentraci6n de sales biliares det 03 ptv dos earacteristicas importantes
en los probi6ticos
Lamiddot cepa de Lactobacillus brevis aislada de lache Sa utiliz6 para elaborar una
bebida fermentada sin y con avana comoingrediente prebiotico obteniendose un
aJimento centon recuento del probi6tico viable durante 21 dras de seguimiento
ademas libre de microorganismos )at6gen05
No se encontr6 efecta significativo de la avena sobre Ie viabilidad del Lactobacillus
brevis aunque sa presento un aumento en 61 recuento de estos en la bebida con
avena
58
plusmn ~
5 RECOMENDACIONES
Ensayar la cepa de Lactobacillus plantartJm en productos carnicos madurados
como el salami
Ensayar la cepa de Lactobacillus l)revs en otros derivados lecteos como queso
quesito queso crema
Continuar con el estudio de estos microorganismos y caracterizarlos
molecularmente ademas de estudiar su capacidad de adherencja a fa mucosa
intestinal sobre algunes Hneas celulares como las CaCo~2
Estudiarel efedo de la avena sabre la viabiJidad del Lactobacillus breyis a una
concentraci6n mayor de 05
Realizer ensayos can las cepas de Lactobacillus brevis y Lactobrlcillus pJantarum
para elaborar masas acidas para panificacion reemplazando el Bromato de
Potasio aditivo prohibido desde marzo del 2003 en nuestro pais per 5U toxicidad
59
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65
ANEXOS
66
ANEXO A RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AlSLADA DE i
PEPINO it
Referencia Pepino 1 Fecha 06122002
IEXCELENTE IDENTIFICACION
Latto plantarum 1
Galeria API 50 CHL V50 Leida el 06122002
Perfil - -- - ++ - -- - ++++ - - -+- + - I I I I I I I I +t+ - +f- ~ - - + + ~ - - - +- + - shy
o - GLY - ERY DARA - LARA + RIB + DXYL - LXYL - ADO - MDX - GAL + GLU + FRU + MNE + SBE - RHA - DUL - INO bull MAN + SOR - MDM + MUG shyNAG + AMY + ARB + ESC + SAL + CEL + MAL + LAC + MEL + SAC + TRE + 1NU - MLZ + RAF + AMD - GLYG - XLT - GEN + TIJR + LYX - TAG - DFUC shyLFUC - DARL + LARL - aNT + 2KG - 5KG shy
--- Taxones significativos rd -----T -- Tests en contra
Lactoplantarum 1 999 092 1
Taxon siguiente Lactobrevis 1 OJ 044 3
i i
Lactoplantarum 1 1 test (5) en contra
D-SORBITOL (SOR) 78
Tax6n siguiente Lactobrevis 1 3 test (s) ert contra
METHYLD-MANNOSIDE (MOlM) 0 MELEZITOSE (MLZ) 14 D-TURANOSE (TUR) 14
67
ampb
ANEXO B RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AISLADA DE REPOLLO FERMENTADO
~
Referencia Repollo fermentado - 3 Fecha 03072003
EXCELENTE IDENTIFICACION
Lactoplantarum 1
Galena API 50 CRL V50 Leida el 03072003
Perfil - - ++ - - - - -H++ - - ~ + - + - I I 1 I I I I -H+ - ++ - - - + + - -- - - + - shy
o - GLY - ERY - DARA - LARA + RIB + DXYL - LXYL - ADO ~ MDX - GAL + GLU + FRU + MNE + SBE ~ RHA - DUL - INO - MAN + SOR - MDM + MDG shyNAG + AMY + ARR + ESC + SAT + CRL + MAL + LAC + MEL + SAC + TRE + lNU - MLZ + RAF + AMI) - GLYG - XLT - GEN + TOR + LYX - TAG - DFUC shyLFUC - DARL - LARL - GNT + 2KG - 5KG shy
------Taxones significativos _ _----- Id--- ---T---- Tests en contra
Lactoplantarum 1 999 095 1
Tax6n siguiente Lactobrevis 1 01 OA8 3
lJactoplantaru01 1 1 test (s) en contra
DSORBITOL (SOR) 78
Taxon siguiente Lactobrevis
METHYL-D-MANNOSIDE D-TURANOSE
1
(MOM) (TOR)
3 test (5) en contra
0 MELEZITOSE 14
(MLZ) 14
i
I
68
ANEXO C RESULTADO PRUEBAS BIOQUWICAS DE CEPA AISLADA DE MUCOSA HUMANA
Referenda Mucosa - 5 Fecha 27012003
BUENA IDENTlFICACION
Galeria API 50 CHL vso Leida el 270112003
Perfil - - - - +t--t - - - + - + - - - - - - - - -+- - - - - + - + - - - - - - - - - - - - - bull - - -+ - +
o - GLY ~ ERY - DARA bull LARA + RID + DXYL + LXYL - ADO bull MDX - GAL + OLU - FRU + MNE - SBE - IlliA - DUL - INa - MAN - SOR - MDM - MOO shyNAG + AMY - ARB - ESC ~ SAL bull CEL - MAL + lAC - MEL + SAC - TRE shyINU - MLZ - RAF - AMD - GLYG - XLT - GEN - 11JR - LYX - TAG - DFUC shyLFUC - DARL - IARL - ONT + 2KO - 5KG +
- - - - - - Taxones significativos - - - - - - - Id T -- Test en contra
Lactobrevis 3 963 088 1
Taxon siguiente Lactoco11inoides 36 075 2
Lactobrevis 3 1 test (s) en contra
GLUCOSE (GLU) 95
-~~~------------~---------------------------~--~-------~--~-----~----------~--------~------------~~--Taxon siguiente Lactocollinoides 2 test (s) en contra
GLUCOSE (GLU) 100 MELIBIOSE (MEL) 25
69
i r
ANEXO D RESULTADO PRUEBAS BIOQIJiMICAS DE CEPA AISLADA DE LECHE FERMENTADA
Referenda Leche fennentada ~ 13 Fecha 27012003
BUENA IDENTIFICACI6N
Galeria API 50 CHL V50 Leida el 270112003
Perfil - - - - -t-t+- - - - + - + - - - bull - - - - -+- - - - - + - + - - - - - - - - - - - - - - - - -+ - +
0 - GLY - ERY - DARA - LARA +Rll3 + DXYL + LXYL - ADO - MDX ~GAL + GLU - FRU + MNE SBE - RHA DUL bull INO MAN - SOR MDM bull MDG shy
~NAG + AMY - ARB - ESC - SAL - CEL - MAL + LAC - MEL + SAC - TRE I lNU - MLZ - RAF - AMD - GLYG - XLT - OEN - IUR LYX - TAG - DFUC bull i
LFUC - DARL - LARL -ONr + 2KG - SKO + 1
- -- - - Taxones significativos - - Id -- T --- Test en contra
Lacta brevis 3 963 088 1
Taxon siguiente Lactocollinoides 36 075 2
Lactobrevis 3 1 test (s) en contra
GLUCOSE (GLU) 95
-----------------------------------------------------------~------------------------------~-------------------Taxon siguiente Lactocollinoides 2 test (s) en contra
GLUCOSE (GLD) 100 MELffiIOSE (MEL) 25
70
II iJ1
I
I ANEXO E RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AISLADA DE REPOLLITAS DE BRUSELAS FERMENTADA
Referencia repollitas de bruselas 15 Fecha 03072003
EXCELENTE IDENTIFICACION
Lactoplantarum 1
Galeria API 50 CHL vsO Leida el 03072003
Perfil - - - - +t - - - - +H+ - +- - +t + - I I I I I I I f ++t - + - - - -+ + - - - -+ -+ - - I ij
o - GLY - ERY - DARA - LARA + RJB + DXYL - LXYL - ADO - MDX - GAL +
GLU + FRU + MNE + SBE RHA + DUL - INO - MAN + SOR + MDM + MOG shyNAG + AMY + ARB + ESC + SAL + eEL + MAL + LAC + MEl + SAC + TRE + i
I1NU - MLZ + RAF AMD GLYG - XLT - aEN + TUR + LYX - TAG - Druc LFUC - DARt + LARL - aNT + 2KG - 5KG shy n ----Taxones significativos ------ Id Tests en contra
Lactoplantarum 1 999 090 o
Taxon siguiente Lacto pentosus 01 012 7
Lactoplantarum 1 o test (s) en contra
Taxon siguiente Lacto pentosus 7 test (8) en contra
GLYCEROL (GLY) 75 D-XYLOSE (DXYL) 100 L-RHAMNOSE (RHA) 25 METHYL-D-MANNOSIDE (MOM) 1 MELEZITOSE (MLZ) 25 RAFFINOSE (RAF) 75 D-ARABITOL (DARL) 0
71
~
I i I
ANEXO F - ANALISIS DE REGRESION PARA pH EN BEBIDA SIN AVENA
Aruilisis de regresi6n polinomial
---~-~-------------------------------------------~-----------~~---------------------~--------------Variable dependiente pHSinAvena ---------------------------~-------------~--------------------~---------------------------------
Error T Parametro Estimado Estandar Estadistico P-Valor
CONSTANTE 535606 0094535 56657 00000 Dia -0150565 0020706 727154 00000 Dia2 000504434 0000871488 578819 00001
---~---------------------------------------------------------------------------------------------------
Anfllisis de Variama -------------------------------------------~-----------~-----------------------------~-~--- jSource Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor 11
------------------------~------------------------------------------------------------------------------~ Mod-elo 155772 2 0118861 4256 00000 Residual 0237877 13 00182983
Total (Corr) 11956 IS
R2 == 867522 percent
pHSinAvena == 535606 - 0150565Dia + 000504434Dia2
72
____
middot ANEXO G - ANALISIS DE REGRESION PARA pH EN BEBIDA CON AVENA
AmUisis de regresion polinomial _____~_____~__-_____~___4____________________bull____bull__________bull_____________~~----_------___________
Variable depcndiente pHConA vena ------------------------------------------------------------------------------------------~--------
Error T Parametro Estimado StAndar Estadfstico P-Valor
---------------------------------------------~-----------------------------------------------_---------CONSTANTE 534463 00801045 667208 00000 Dia -0140407 00175453 800253 00000 DiaA 2 000448098 0000738458 606803 00000
----------------------~---~-----------------------------~------------------------------~----AmUisis de Varianza
---~---------------------------------~---------------------~------------~-------------------~------Source Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio PValor --------------------------~-----------------------------------------------~------------~-----~~--~ ModeJo 159575 2 0797873 6073 00000 Residual 02170798 middot13 00131383 _______~_~ ~_~----------~------~--~-----~-M-----~-----____ _____________~-----------------------Total (COlT) 176654 15
R12 903315 percent
-----------~------------------------------------------------------------------------~-----------pHConAvena 534463 - 0140407Dia + 000448098DfaA 2
73
ANEXO H - ANALTSIS DE REGRESTON PARA ACIDEZ EN BEBJDA SIN AVENA
An8Jisis de Regtesi6fi P6lifJomial
Variable Depefidiefile~ AcidezSinAVenll _______________w_____~______~________________~-----------_________~_________________~~____~___~_____
Error T Pariirnetro Estimado Estandar Estadistico ---------------------------------------~--------------~-~-------~--------------------~------------CONSTANT 0491697 00123217 399051 00000 Dia 00436032 000269882 161564 00000 D1a2 -000144613 000011359 127312 00000 __w___~________________________~-_______-_____~----____________________________~__~---~_--__~___
AriiiJisis de varianza ~_~__~__________~_~____~________~___________- _________e_____________________________bull _____-________
Source Smn de cuadr Df Mean Square F-Ratio PmiddotValor_~~___________________________________bull ______~___________bull ____________bull ______~________w________________
Model 0135203 2 00676013 21747 00000 Residual 000404118 13 000031086
Total (Corr) 0139244 15
R2 970978 percent
AcidezSlnAvena 0491697 + O0436032Dia - 0OOl44613Dia2
74
I
ANEXO I ANALISIS DE REGRESION PARA ACIDEZ EN BEBIDA CON AVENA
1
Anwisis de tegtesi6fi polinomial
Variable dependiente Acidez Con Avena
Error T ParametTo Estimado Stlindar Estadfstico P-Valor ----------------~-------~---------------------~-----------------------------------------------------CONSTANT 0491639 000926607 530578 00000 Diamiddot 00406572 000202955 200326 00000 DfaA 2 0000982559 0000085421 -115025 00000
-------------~----------------------------~-------------------------~-----------------------------------
-------------~-----~~-----------------------------~---------------------------------------------_--Source Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio PValor
-~-------------~----------------------------------~------------------~~-------------------------- Modelo 0288008 2 0144004 81914 00000 Residual 000228539 13 0000175799
----------~~--------------~---------------------------------------------~---------------------------Total (Corr) 0290294 15
RA2 = 992127 percent
-------------------------~----~---~------------~---------------------------------~---------------~
AcidezConAvena == 049163amp + 00406572D1a - 0000982559DiaA2
75
I
(Ilmiddot il
ANEXO J- ANALISIS DE REGRESION PARA RECUENTO LACTOBACILOS PARA BEBIDA SIN AVENA
Amilisis de regresion - Modelo lineal Y = a + bX
------------------------~----------------------~-----------------------------~----------~-----------Variable Dcpendiente LactobacilJusSinAvena Variable independiente Dia
I--------~----------~-----------------------------------~-------~-~--~--------------------------~-Error T
Paramctro Estimado Standard Stadistico P-Valor
----~----~------------~-----~-----------------------~-------------~-----------------------------Intereepto 117347 0389973 300911 00000 Pendiente 00483464 00257889 18747 00903
Analisis de Varianza
---------~------------------~----------------~---------------------------------~---------~----------Source Sum decuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor
------------~---------------------~---------------------~--------------------------------~-----~----Modelo 0916252 1 244835 443 00616 Residual 260706 10 0260706
--~------------~---~------------------~~~-----~-------~---------~~-------------------------------------Total (Corr)352332 11
Coeficiente Correlaci6n = 0509955 R2 = 260054 percent
LactobacillusSinAvena= 117347 + 00483464Dfa
76
ANEXO K- ANALTSIS DE REGRESION PARA RECUENTO LACTOBACILOS PARA DEBIDA CON AVENA
Aruilisis de regresion - Modelo lineal Y = a + hX
Variable Dependiente LactobacillusConAvena Variable Independiente Dia ---~--------------------------------------------------------__-----------__--_--_-----------shy
Error T Paramctro Estimado Standard Estadistico P-Valor -~--------------------------------------------------------------------------------------------------
Irttercepto 118103 0567963 207942 00000 Pendiente 00790304 00375594 210414 00616
-----------------~----------------------------~----~-------~----~----------------------------
Analisis de Varianza
----------------~----------------~------------------~--------------------------~------~--------shySource Swn de cuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor
-----------------~--~--------------------------------------------------------------------------~---~ Mode10 244835 1 244835 443 00616 Residual 552997 10 0552997
Total (Corr)797832 11
Coeficiente Correlacion = 0553964 RI2 = 306875 percent
-----~--------------------------------------------------------~--------------------------------------
LactobacillusConAvena = 118103 + 00790304Dfas
77
RESUMEN
En este trabajo se aislaron cepas natives de Lactobacillus plantarum de muestras
yegetales fermentadas de pepino rapollo y repollitas de bruselas y Lactobacillus
brevis de leche ferm~ntada y mucosa humana resultando resistentes a pH=2 y
sales biliares 03 pv dos caracterfsticas importantes que deben cumplir los
microorganismos lIamados probioticos
utmzando a cepa nativa de Lactobacillus brevis aislada de leche fermentada se
elaboraron dos bebidas Iscteas fermentadas una sin ingrediente prebi6tico y otra
adicionada de avena 05 como ingredienta prsbiotico para comparer si habra
alguna incidencia de asta ingrediente en la viabilidad del probiotico
A ambas bebidas sa les hizo un seguimiento de pH y de acidez (expreSada
como acido lactico) durante los dias 27 14 Y21 Y 1a prueba de viabilidad en los
dias 7 14 Y21 despues de elaboradas cada una de las bebidas De estas bebidas
sehicieron 4 repeticiones
Sa obtuvo recuentos mayor-es de 106 UFCml de Lactobacillus brevis hasta el dia
21 encontrandose en aumento an los recuentos en a bebida con avena aunque
estadlsticamente no hubo diferencias significativas
TABLA OE CONTENIDO
lISTA DE TASLAS ------------~--~------------------------- ~
LISTA DE ANEXOSmiddot--------- ----------------------------------11
INTRODUCCON -----------------------------------------------------12
1 MARCO TEORICO Y ESTADO OEl AItTE---middot---middot-middot-- -------14
11 PROBIOTfCOS ------------- - middot------------------14 111 Historia------------------------- 14 1~ 12 Microorganismos probi6ticos---------------- 15 113 Caracteristicas fenotipicas de algunos microorganismos probi6ticos-----~------ ------- 16 114 Caracteristicas de los probi6ticos--- - ----17 115 Beneficio de los organismos probi6ticos---middot ----19 1151 Facilitar la digesti6n de la lactosa ------ 19 1152 Protegen contra enfermedades gastrointestinales - -19 1153 Protegen contra infecciones del tracto urogenital -------20 1154 Promueven la barrera de defensa endogena delintestino ---20 1155 Protegen contra cancer de colon- ---- ---~1 1156 Protegen contra infeGCiones respiratorias----------21 1~157 En at iratamiento y pre~enci6n deleczeroa-- - 22 1158 Previenen infeccion en heridas quirurgicas ---------23 12 PREBlOTICOS -- -----------------23
2 METODOLOGIA~~~~-~fO ~~~tfmiddot~I~~-____bullbull_--~---------middot26
21 lOCALIZACION~~======~-~--- ------26 22 METODOS------------------------------26 221 Aislamiento de cepas nativas -------_ 26 2211 De vegetales -- -- -26 2212 De Ja leche--------- -----------28 2213 De mucosa vaginal humana ----~---------------28 222 Almacenamiento de fas repas aisladas ----- --30 223 Pruebas para determinar el genera ---- 31 2231 Coloracion de Gram --------------------31 2232 Morfologra---~----------------- -- -31 2233 Prueba de esporulaci9n----------------~2
2234 Prueba de la catalasa--------------------~------ 32 224 Prueba para determinar la especie ----------~-------- 33
225 Pruebas para determinar microorganismos probi6ticos -----34 2251 Resistancia a pH=2 y sales biliares de concentracl6nO3piv --34 226 Conservacion ------------~-----------------35
227 Elaboraci6n de la bebida fermentada ---------35 2271 Pr~paraci6n de Ie muestra ---------------~----35 2272 Adici6n del Inocula ----~-------------------36 2273 Control de Ie fermentaci6n=~~~==~~-------------36
2274 Refrigeracion ------- ~-- ---- -------36 2275 Batido--~ ------------------------------------37 2276 Envasado y almacenamiento------------ 37 228 Determinacion del pH------- ---------- -----39 229 Determinacion de la acidez (Expresada como acido lactico) -39 middot2210 Prueba de viabiJidad ------~-------~----------39 2211 Am3lisis microbiol6gico de las bebidaslacteas(con ysinavena) -40 2212 Anslisis estadistico ~-~~-~---------=------------40
3 RESULTADOS Y DISCUSI6N-~------------------------------ --42
31 Coloraci6n de Gram y morioJpgfa --001-------- - -----42
32 Prueba de esporufacion y catafasa-----------------42 33 Prueba para determinars especie- -------- ---44 34 Pruebas para determiner microorganismos probi6ticos -----45 35 Seguimiento del pH en la bebida h3ctea con y sjn prebi6tico-----49 36 Seguimiento de la acidez expresada como de acidb lactico -----51 37 Prueba de viabiJidad-------- ----------54 38 Analisis microbiol6gicos de las babides lacteas con y sin avena --56
4
5
REFERENCIA~ BIBLIOGRAFICAS --~-------------middotmiddot---- ---------60
LISTA DE TABLAS
TABLA 1 ALGUNAS ESPECIES MICROBJANAS PROB16TICAS-------------~------middot15
TABLA 2 FueNTE De AISLAMIENTO DE CePAS NATJVAS --------------29
TABLA 3 RESULTADO DE PRUEBA DE ESPORULACI6N------------------43
TABLA 4 RESULTAOO PRUEBA DE LA CATAlASA ----------------------44
TABLA 5 ReSULTADO IOENTIFICACION CEPAS--------------------middot-----45
TABLA 6 ReSULTADOS APRUEBAS DE RESISTENOIA A pH=2 YSALES BILtARES 03 Pv
-----------~-- ----------~--46
TABLA 7 ReSUtTADO pH YOGUR SIN AVENA ----------------49
TABLA 8 ReSULTADO pH YOGUR CON AVENA ------------ --49
TABLA 9 COMPARACION DE MEDIAS PARA pH----------------------50
TABLA 10 ReSULTADO DE ACIDEZ (EXPRESADO COMO ACIDO LACTICO)-------51
YOGURT SIN AVENA ------------------------------51 TABLA 11 ResuLTAOo oJ ACIOEZ (EXPRESAOO COMO ACIDO ACTICo)----52
YOGURT CON AVENA--- ------------------- --- ----52 TABLA 12 COMPARACION DE MEDIAS PARA ACIOEZ----------------~~53
TABLA 13 RecuENTo DE LACTOBACILOS (UFCML) YOGHURT SIN AVENA--54
TABLA 14 RECUENTO DE LACTOBACILO$ (UFCML) YOGHURT CON AVENA ------54
tABLA is COMPARACl6N MEDIAS LOG LAcToBACltLUS-------------56
TABLA 16 RESULTADOS ANALiSIS MICROBIOL6GICO------------- --57
L1STA DE FJGURAS
FIGURA 1 CAMARA DE ANAEROBIOSIS----------middot------~----27
FIGUftA 2 CePAS EN TUBOS CON AGAR INCUNADO -----~--middot----------30
FIGURA 3 COLONrASAISLADAS EN AGAR MRS-------middot---------31
FIGURA 4 API CHL 50-PRUEBA sloaufMlcAS ------------- bull --33
FIGURA 5 DtAGRAMA DE FLUJO ------~---------- ----~-38
FIGURA 6 LACTOBACILLUS I3REVIS GRAM + AfSLAOA OE LECHE FERMENTADA------47
FIGURA 7 LACToBACILLUS BFEVS A1SLADA OS lECHS FERMENTADA DESPUES DE LA
PRUEBA DE RESfSTENCIA A pH=2 ----------------------~ - middot-48
fIGURA 8 LAcTOBAcILLUS BREVIS AISLADA DE LECHE FERMENTADA OESPUES DE LA
PRUEBA DE RESISTENCJA A SALES BILIARES 03 pN------------- ----48
FIGURA 9 COMPARACI6N DE MEDIAS PARA EL pH ---------- ---------50
FIGURA 10 COMPAAACI6N DE MEDIAS PARA LA AC1DEZ ----------------52
FIGURA 11 COMPARACI6N DE MEDIAS PARA LOG LAcTOBAcILLUS -------------55
LISTA DE ANEXOS
ANEXO A--- RESUl TADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AfSLADA DE
ANEXO B RESULTADO PRUEBAS BIOQUfMICAS DE CEPA AISLAOA DE
REPOLLO FERMENTADO --middot----------middot--------------------------68
ANEXO c RESULTADO PRUEBAS BIOQUIMICAS DE CEPA AISLADA DE
MUCOSA HUMANA ------------------------------------------ ------69
ANEXOD RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMCAS DE CEPA AISlADA DE
LECHE FERMENTADA---------------------------------------_-70
ANEXO E RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AtSLADA DE
REPOLLlTAS DE BRUSELAS tERMENTAOA ------------------------71
ANEXO F ANAUSIS DE REGRESION PARA pH EN BEBIDA SIN AVENA--- 72
ANEXO G- ANAUSIS DE REGRESION PARA pH EN BEBIDA CON AVENA --73
ANEXO H ANALISIS DE REGRESION PARA ACIDEZ EN BEBIDA SfN AVENA
ANEXO 1- ANALISIS DE REGRES[ON PARA ACIDEZ EN BEBIDA CON AVENA
ANEXO J- ANALISIS DE REGRESION PARA RECUENTO LACTOBACILOS
PARA 8EBItgtA SIN AVENA ~----------------------------------------wirEr
ANEXO K ANALlS1S DE REGRESION PARA RECUENTO LACTOBACILOS
PAFt BEBIDA CON AIlNA-------~-------~----------~------~---middot-----~-middot---irjr
INTRODUCCI6N
En los ultimos arios S9 ha comprobado los efedoS beneftcos que los
microorganismos probiotico$ ejercen sobre la salud humana a facilitar la digestion
de lactosa estimular 18 actividad inmungica modificar ef balance poblecional
tanto de la microbiola intestinal nativa can posibles sfeelos patogenos como de
las que causan toxiinfeCCiones alimentarias edemas se estan ensayando como
implante en heridas de piel para evttar contamlnacion can microorganismos
patogenos
Los microorganismos probi6ticos se emplean en fa elaboraci6n de productos
fermentados en especial los lacteos Estas industrias se han limitado a utilizar
cultivos iniciadores importados que rsquieren tiampo y culdados para su
manlpulacion y empleo En Colombia no se han realizado InY9s1igaciones que
involucren cepas nativas can activldad probiotica ni el afecto de ingredientes
prebi6tico$ sabre fa viabilidad de estos microorganismos tenienqo en cuenta que
al prebiotico es un ingrediente allmentario que estimula sefectivamente el
crecimiento y actividad de algunas especies de microorganismos probi6ticos
En esta investigacion se sislaron microorganismos probi6ticos a partir de
muestras de vegetales y lache crud a de vaca fermentadas naturafmente y de
mucosa humana utifizando medios de cultivo salactivos bajo condiciones
12
anaerobias Luego se procedio a verificar su rasistencia a los acidos gastricos y
sales biliares simulando asl las condiciones del tracto gastrointestinal de 10$
humanos Las capas que presentaron mejor comportamiento ante estas pruebas
sa caraeterizaron morfologles y bioquimicamente y sa seleccione una de eHas
para inocular en bebidas lacteas sin y can avena como ingrediente prebiotico y
verificar su viabilidad durante al almacenamiento
Los resultados de esta investigacion padren sar de gran irnportanoia para la
industria nacional de alimentos las univarsJdades con facultades relacionadas
can la salud y la alimentaci6n y para las entidades gubernamentales involucradas
en la alimentacion y nutricion de grupos de poblacion vulnerables tales como eJ
Instituto de Bienestar Familiar y Bienestar Social entre otros
13
middot~
1 MARCO TEORICO Y ESTADO DeL ARTE
11 P~OBI6TICOS
111 Historia
EI consumo de productos fermentados lecteos con microorganismos vivos
especialmente bacterias acido lacticas ha sido reportado a 10 largo de la historia
desde tiempos remotos se evidencia al conoeimiento de los beneficios que estes
proporcionaban perc real mente quian enfatiz6 en ellos fua 91 cienUfico ruso Elie
Metctinikcff que reaclon6 la ingesti6n de (eches fermentadas con la longevidad y
salud de las personas ( Pardio et al 1996)
En 1965 sa utilizo por primera vez et termino Probi6tico derivado dellatin pro
que significa a favor de y del gr9go bios que quiera decir vida tnieialmente esta
palabra defini6 a los microorganismos que promovian el erecimiento de otros
microorganismos Ivego se splico asta termino a extraetos de tajido que estimlilan
el crecimiento micrObianqEn la actuaidad sa han definldo como probiotieos los
cultivos (micas 0 mezclados de microorganismos vivos qua al ser ingeridos por
humanos Q animales majoran el balance poblacional de la microbiota intestinal
evitando la adherencia de patogenos (Schrezenmeir et albull2001) Sin embargo
estos microorganismos no nece_iamenta son habitantes propios del tracto
14
gastrointestinal (Holzapfel at a2001Gaitan at al 1998) p~r 10 tanto es
necesario consumir alimantos en los que se encuElntren estos mrcroorganismos
viables estos hacen parte de I~micfobiota de vegetales y leches interviniendo en
Ie fermentaci6n natural de estos~ntos
112 Microorganismos Probi6ticos
los microorganismos probi6ticos que tradicionatmente se han adicionado a la
tache para fermentarla y obtener yogurt y kumis a como suplementos pertenecen
a los generos Lactobacillus Enterococcus y Bifidobacterium (Ver tabla Nro 1) Sin
embargo se considera que solo algunas especies de los gelnsros Lactobacillus y
Bifidobacterium sobreviven en el tracto gastrointestinal En la tabla 1 58 muestran
algunas de estas especies
TABLA 1 Algunas especies microbianas probi6ticas
Lactobacillus Sifidobacferium Enterococcus
L acidophilus
L JohnsoN
L casei
L rhamnosus
Lgrasseri
L reuten
L plantarum
B bifidum
Blongum
B infantis
E fsecium
E faecalis
Fuente Gaitan et a 1998A
15
EI eonoeimiento a cerea de sus efeetos beneficos en el consumidor por su alta
viabilidad en el intestino como la producci6n de sustancias con aetividad
antieaneerigena el mejoramiento ltfel sistema inmunol6gico y el deSplazamiento
de la mierobiota pat6gena gastrointestinal en el consumidor ha estimulado una
mayor demanda de estos microorganismos como tambian de los productos que
los contienen (Heller 2001 Parada middot1998)
Existsn otros produetos fermentados de origen vegetal como et tampe col acida
y salsa de soya de los euales sa pueden aislar estos organismos probi6tieos
comp tambien de la mucosa intestinat humana y luego de suministrarlos a
ratones sa han comprobado sus caracteristicas beneficas (Molin 2001)
113 Caracteristicas fenotfpicas de algunos microorganismos
probi6ticos
las bacterias aeido lacticas de los generos Lactobacillus y Bifidobacterium son
consideradas probi6tieos y tradicionalmente se han clasificado con base en Sus
propiedades morfol6gicas crecimiento a diferentes temperaturas capacidad
fermentadora de glucosa y otros carbbhidratos y la configuraci6n del Bcido Jaetieo
producido (Holzapfel etal2001)
16
)lli~ h Dx nIILIOTECM
eJDe~~ l1ilmfJ tIDBnm
Los Lactobacillus son bacilas gram positiv~s no esparuladas aerotalerantes
acido - tolarantes estrictamente fermentadares formadores de Boido laclica como
producto principal catalasa negativo carentes de citocroma sin embargo se
presentan excepciones a esta descripcion parque afgunas especies pueden
formar catalasa 0 citacramo en medios que contienen hematina 0 compuestos
relacianados La produccion de catalasa no hema pseudocatalasa puede causar
tambien alguna confusion en fa identificacion de algunos Lactobacillus
las especies del genera Bifidobacterium san bacilos gram positivos no
esporulados generafmente anaerabios estricto$ aunque pueden creeer bajo
condiciones microaer6filas cuando estan ert presencia de C02 La mayorfa de sus
especies se pueden diferenciar par criterios biaquimicos simples como la
fermentacion de L arabinosa DmiddotxiJasa O-manosa O-manita y O sorbitat que
pueden servir coma caracterist1cas clave para su clasificacion (Holzapfel
etal2001 )
114 Caracteristicas de los probi6ticos
Las cepas de microorganismos prabi6ticos deben presenter y mantener unas
caracteristlcas que garanticen su crecimienta y supervivencia En el alimenta
como tambiEm durante su transito a traves del est6maga e intestino delgaQo
17
La primera CBtacterfstica es que sean viables esta viabifidad esla capacidad que
tienen los microorganismos probi6ticos de permanecer vivos tanto ~n el alimento
como en el Intestino del consumidor por un tiempo determinado En Colombia se
ha establecido que en bebidas fermentadas este tiempo debe ser minimo de 21
dras en el alimento (Minsalud 1986) Esta vjabilidad depende del metodo de
produccion y de la cepa utilizada (Tuomols at a 2001)
Luego de que se garantice que estos microorganismos eslan viVos en el alimento
ell os deben cumplir otro criterio importanle para ser considerados como
organismos probi6ticos y as tblerar las condiciones de acidez a un pH=2 y la
sccian de proteasas del est6mago ademas de sobrevivir y creeer en presencia de
acidos biliares (Tuomola et al 2001 Jacobsen at a 1999) para luego de
sobrevivir a estas condiciones adherirse a la mucosa intestinal y de esta manera
estimular al sistemainmunoJ6gico esta capacidad de adherirse a la mucosa es un
prerrequisito para la colonizacion del intestlno (Toumola etal2001 Alander et aI
1999)
Cuando los probioticos han pasado todas esta pruebas de supervivencia y luego
de impfantados en la mucosa producen acidos organicos peroxido de hidrogeno y
tambien bacteriocinas que actUan como inhibidore$ del crecimiento de
microorganismos patogenos u oportunistas (Tuomola at al 2001 Cintas et al
2000) complementando de asta manera su accion benefica sobre la mucosa
intestinal y en general sobre la saJud del huesped
18
116 Berieficios de los microorganismos probi6ticos
Los beneficios que se asocian a los microorganismos probioticos son muchos y
variados Entre ros comprobados mediante estudios se eneuentran
1151 Facilitar la digesti6n de la lactosa
los microorganismos probioticos cuando estan en el intestino liberan alii la
enzima pmiddotgalaotosidasa capaz de hidrolizar la lactosa haste glucosa y galactosa
evitando as que personas intolerantes a este carbohidrato presenten sfntomas
como flatulencia dolor abdominal y diarrea cuando consumen leche (be Vresse
et 81 2001)
1152 Protegen contra enfermedades gastrointesUnales
EI consumo de aJimentos con probioticos ha mostrado efeeto terapeutico frente a
los sintomas de diarrea asociada al surninistro de antibi6tico$ de amplio espectro
que destruye 0 disminuye la microbiota endogena esta imp ide la coJonizacion de
bacterias patogenas como Klebsiella oxytoca y Clostridium difficile que pueden
causer lesiones en el cn Los probi6ticos recuperan el balance de la microbiota
intestinal nativa y avitan Ie adhesion de algunos virus bacterias pat6genas a
parasitos que pueden ser agentes causales de gastroenteritis la diarrea del
19
J
viajero y 1(3 inflarnacion intestinal que en ultima instaneia oeasionan ef sfndrome
del colon irritable (Marteu et al 2001)
1153 Protegen contra infecciones del tracto urogenital
La vaginitis indueida por baeteriss yo por levaduras as una infecci6n
estrechamente relacionada con la exposici6n a antibi6ticos y espermicidas y
tambien depende del estado hormonal de la n1ujar Con al uso de mezcJas de
probi6ticos se han obtenido buenos resultados en la rastauraci6n de la rnicrobiota
natural urogenital benefica que desplaza a los eausantes de la inflamaci6n de Is
vagina y Ie uretra (Reid 2001 )
1154 Promueven la barrera de defensa end6gena del intestino
EI tracto gastrointestinal normal mente as una barrera natural contra anUgenos de
origen microbiano y alimentario Cuando los probi6ticos sa adhieren a Is mucosa
intestinal estimulan 0 potencian al sistema inmune favoreciendo la
inmunomodulaci6n que induce un aumentb de fa producci6n de inmunoglobulinas
activacion de las calulas mononueleares y de los linfocitos para proteger al
huesped de infeeciones (Isoulari et sl 2001)
20
1155 Protegen contra cancer de colon
EI cancer es el resultado de una serie de mutaciones somaticas que pueden
ocurrir durante al tiempo de vida del individuo y 10 padeca buena parte de la
poblacion mundial los probi6ticos en un sistema in vitro han demostrado un
efecto positivo en la prevenci6n de mutaciones aI desactivar carcin6genos
genotoxicos (Wolloswski et al J 2001)
1156 Protegen contra infecciones respiratorias
Sa ha demostrado que el conslJlno de probi6ticos disrninuye la incidencia de
infecqiones raspiretorias al aumentar la actividad fagocitica de maer6fagos
alveolares que aettian sobre microorganismos patogenos Se hizo un estudio en
571 ninos sanos con edades entre uno y seis anos divididos en dos grupos a uno
de ellos sa las incluy6 en su dieta leche suplementada can Lactobacillus GG y a
los otros ninos leche no suplementada AI final del estudio se observ6 una
disminucion del 19 en la incidencia de infeccionas respiratorias tratadas con
antibi6ticos tales como otitis media sinusitis bronquitis y neumonfas en el grupo
de los ninos que consumieron Lactobacillus GG (Hatakka et al 2001)
Alvarez et al (2001) encontraron que la administraci6n de yogurt con Lactobacillus
casei en ratones de tres arios de edad majora los espacios libres del puJrn6n de
la presencia de Pseudomona aeruginos8 induciendo un aumento
21
significativo en los niveles de gA a IgM datactadas en los lavados
broncoaJveolares y se observ~ un afecta dependiente de la dosis
1157 En el tratamientoy prevenci6n del eczema
Se ha encontrado que el consumo de probi6ticos mejora la inflamaci6n alergica 0
eczema at6pico en ninos alimentados con formula suplementada con probi6ticos
Encontraron una mejora significativa al suministrar Bifidobacteriummiddot actis y
Lactobacillus GG en 27 niiios con edad promedio de 46 meses Luego de aplicar
este tratamiento se sometieron a una prueha de SCORAD (mide fa extension y
gravedad del eczema) registrando una meJoria significatlva en las condiciones de
la pie concentraci6n de citoquinas cirClllantes an sueto y moleculas de adhesi6n
a las superficies de las celulas soJubles en suero (Isolari 2000)
Se realizaron otros estudios a 159 mujeres embarazadas con historia familiar de
eczema atopico de primer grado a las cuafes sa res 5uministro dosis diarias de
Lactobacillus GG durante 2 a 4 samanas previas al parto Oespues de ella fa
madres twiaron la opci6n de continuer tomando el ptobi6tico si amamantaban 0
bien darseio vIa oral La mayoria de las madras eJigieron dar las dosis at bebe
diariamente A los dos anos de vida se observ6 una disminuci6n del 50 en la
frecuencia del eczema at6pico en aquellos nHies que se les dio ef probi6tico
(Kalliomari etal 2001)
22
1158 Previenen infeccion en heridas quirurgicas
Los probi6ticos impiden la union de pat6genos a las superficies celulares en
heridas mediante la seCreci6n de proteinas Actuamente se encuentra en
estudio la aplicaci6n del Lactobacillus fermentum vivos sabre heridas en piel de
ratas y se ha encontrado una disminuci6n del 90 en la colonizaci6n par parte del
StaphylococcuS aureus uno de los patogenos mas temidos y de mayor lncidencia
en infecciones hospital arias mas aun se esta contempiando la posibilidad de
utilizar la protein a purificada an lugar de los mjcroorganismos para la protaccion
contra infecciones en heridas (Strauss 2000)
12 PREBIOTICOS
Son carbohidratos de cadena corta algunas veces reconocidQs como
oligosacaridos no digeribles par las enzimas del epitelio intestinal 0 de las
gliJnduJas anexas debido a su estructura quimica y de esta manera lIegan al
intestino grueso donde alcanzan a estar disponibles para la fermentaci6n por las
bacierias sacaroHticas que son especial mente laetobadlos y bifidobacterias
dando odgen a compuestos que ejercen efectos funcionales sobre la mucosa del
tubo digestivo (Brunser 2001)
Se consideran como tal algunos fructocligosacaridos isomaltooligosacariclos
oligomato palatinosa poHdextrosa pOJidextrrna raftilina y algunos oligosacaridos
23
)
de 1a soya y fa avena Estenmiddot presentes en alimentos como Ie cebolla ajo
banano puerros 1 derivados del trigo achicoria esparrago alcachofa (Cummings
etal 2001)
Algunos de estos prebi6ticos cuanda son incorporado$ a fa dieta en cantidades
dalerminadas alteran la microbiota intestinal disminuyendo los recuentos de
coliformes bacteroides y cocos y aumentando las bifidobacterias hasta en diez
veces ademas modifican la actividad metab6lica del coron logrando una
disminuci6n del pH y un incremento en el contenido fecal de acidos grasos de
cadena corta como at acatica propi6nico y butfrico El butirato aumen~ _I grosor
de la pared del coron e intestino delgado estimula eJ crecimiento de la mucosa del
colon y auManta su flujo sangufneo inhibe el crecimiento de tinsas tumorales
epiteliales de origen co16nico induce la diferenciaci6n de sus celulas y a
apoptosis entre otros(Brunsar 2001)
Eh estudios hechos en simuladores del intestino humano utilizando productos de
avena fermentados se encontro que estimularon al crecimiento tanto de
lactobacios como de bifidobacterias y en el caso de estas ultimas se incremento
la producci6n de los acidos acatico propionico y butfrico 10 que incide sobre la
implantacion de probi6tico$ e inhibe al crecimientos de otro tipo de
microorganismos (Alal1der eta1999 Kontula etal 1998 Jaskari etal 1998)
24
~ -1
(
AI comparar el comportamianto de las leches de diferente origen se ha
demostrado que Ie leche de vaca contiene caseinatos sustancias que forman
buffer ~n et intestino e inlpiden que los probi6ticos disminlJyen el pH del intestina
y de esta manera se impide al efecto deseado que es evitar fa proliferaci6n de
otros microorganismos entre los cuates pueden estar algunos patOganos En la
leche materna sa encuentran algunos carbohidratos como glucosa galactosa n
acetilglucosamina y algunos 0lig6meros de Ie fucosa en cOhoontracionesmiddot
importantes los cualeS favoreceh el crecimientc)middot de probi6ticos esto
complementado can 91 bajo contenido de protenas que se traduce en una
reducida capacidad buffer hacen de Ie lache materna IJn alimentd adecuado para
nllios en su etape de lactancia
Algunos prebi6ticos como 1a lactulosa yciertos compuestos que contiansn fructosa
no son digeridos en el intestino humano y pueden sar utilizados selectivamenta
par los probi6ticos 10 que hace que los probi6ticos en combinaci6n can prebi6ticos
pueden lIegar a ser un importante medio para prevenir algunas enfermedades del
tracto gastrointestinal (Bezkorovainy 2001)
25
2 METODOlOGfA
21 LOCALIZACION
EJ trabajo sa realizo en el laboratorio de Microbiologia y la planta da laches de Ja
Universidad Naclonal de Colombia- Secie Medellin
En al laboratorio se hiZQ al aislamiento a identificaci6n de fa capas y en fa Planta
sa eJaboro la leche fermentada con 1a cepa seleccionada y el prebi6trco
22 METODOS
221 Aisiamiento de cepas nativas
Las cepas nativas se sislaran de producto$ vegetales leches fermentadas y
mucosa vaginal humana
2211 De vegetales
Las muestras vegetales de repollo repollitas de brusefas y pepino se
seleccionaron porcionaron y mezclaron can cloruro de sadio al 10 pIp se
calacaron en un recipienta de vidrio balo anaerobiosis y sa dejarQn por 15 dias
26
luego S9 tomaron 3 ml de cada muestra y se jnocularon 9 ml de caldo MRS (Man
Rogosa and Sharpe) se incubaron a 37deg C durante cinco dias en camara de
anaerobiosis (Ver Figura 1) Oespues de este tiempo sa inocularon cajas de petri
con agar MRS con 1 ml del cultivo microbiano y se incubaron bajo las mismas
condiciones que eJ caldo Este procedirniento se realiz6 rapetidas veces hasta
seleccionar la cepa pura mediante observaci6n de caracteristicas morfologicas de
la cOlonia y a cada colonia se Ie practico la coloracion de gram con el fin de
observar las caracteristicas microscopicas de cada una e identificar las de mayor
similitud a los Lactobacilos y Bifidobacterias
Figura 1 Camara de anaerobiosis
27
2212 De la leche
Sa tomo 200 ml de teche cruda de la planta de leches y se colaca a fermentar
baja anaerobiosis durante 15 dras Luego sa procedia como en los vegetales
2213 De mucosa vaginal humana
Se tomo una muestra de frotis de mucosa vaginal humane can capito esteril sa
puso a ncubar en Caldo MRS y se procedi6 camo en 2211 y 2212 A cads
aislado sa Ie practico la coloracion de gram y sa seleccionaron aquellas que eran
bacilos gram positivos (Ver Tabla 2)
28
TABLA 2 Fuente de aislarniento de cepas nativas
CEPA FUENTE
1 Pepino fermentadQ
2 repollitas de bruselas fermentadas
3 Repolltgt fermentado
4 Repollo fermentado
5 Mucosa va~inal humana
6 Mucosa vaginal humana
7 repollitas de bruselas fermentadas
8 Repollo fermentado
9 repollitas de bruselas fermentadas
10 Mueo~a vaginal humana
11 Repollo fermentado
12 RepolJo fermentado
13 Leche fermentada
14 Mucosa vaginal humana
15 repollitas de bruselas fermentadas
16 Repollb fermentado
29
222 Almacenamiento de las cepas aisladas
Cuando las cepas crecieron en agar MRS homogEmeas en color morfologia
coloraci6n de Gram etc se pssaron a agar inclinado en tuba se cubrieron con
aceite mineral y se guardaran en refrigeraci6n a 4deg C para tomar de alii la cepa y
efectuarle las diferentes pruebas para confirmar el genera y determinar la especie
de cada una de eas (Ver Figura 2)
Figura 2 Cepas en tubos con agar inclinado
30
223 Pruebas para determinar et genero
2231 Coforaci6n de Gram
A cada cepa sospechosa de Lactobacilos se 1e hizo la coloraci6n de gram y se
seleccionaron las gram positivas
2232 Morfologfa
En agar MRS y despues de incubar en anaerobios~s crecian colonias grandes
cremosas de color beige con bordes homogeneos y c6ncavas(Ver Figura 3)
Figura 3 Colonias aisladas en agar MRS
31
2233 Prueba de esporulaci6n
A cada cepa aislada se Ie hizo esta prueba la cuel consistia en incubar en
aerobiosis durante ocho dias las cajas de agar MRS donde crecieron colonias de
Lactobacilo$ y luego se les (ealize) coloraci6n de espora Las capas que dieron
negativa a la prueba de espora se considararort sospechosas de sar Lactobacilos
y se continuo con la prueba de la catalasa (Ver Tabla 3)
2234 Prueba de la catalasa
los lactobacilos carecen de catalasa Eata prueba se hizo tomando una colonis
se deposito en vidrio de reloj y se Ie adicion6 dos gotas de peroxida de hidr6geno
(H202) la que no presentaba efervescencie eran cepe sospechosa de ser
Lactobacilo (Ver Tabla 4
Sa seleccionaron las capas euyo resultado fue aeorde con el genera Lactobacilfu$
y se continuo con la comirmaeion del genera y determinacion de la eSpecie
meqiante las pruebas bioqulmicas
32
224 Prueba para determlnar la especie
Para confirmar el genero y determinar la especie de las diferentes capas aisladas
se hizo una caracterizaci6n bioqufmica utilizando un kit de API 50 CHL Medium
Ref 50 410 que contiene una galed8 de medios que permite realizar el estudio
de fermentaci6n de los 49 azucares de 52 especies de Lactobacillus (Ver Figura 4
y tabla 5)
Figura 4 API CHL 50-Prueba bioquimica
33
225 Pruebas para determinar microorganismos probi6ticos
2251 Resistencia a pH=2 y sales biliares de concentraci6n O3pv
A las cepas idantificades como Lactobacillus brevis y Lactobacillus pantarum sa
las realiz6 Ie prueba dfl resistencia a pH=2 y sales biliares de concentraci6n 03
pv ( Jacobsen et al 1999) Una colonia de cada cepe aislada se inocul6 en 4 mt
de caldo MRS durante cinco dras bajo condiciones de anaerobiosis Oespues de
esta tiempo se dejaron pracipltar los microorganismos por sedimentaci6n se Ie
retire el sobrenadante y al precipitado se Ie adicion6 Sml de caldo MRS
previamente ajustado a pH=2 can seido clorhfdrico (HCI) dentro del mismo tuba de
ensayo G igual sa hizo can otro tubo previamente incubado pero a este se Ie
adiciono 5ml de caldo MRS con sales biliares a una concentra~i6n de 03 plv y
ambos se incuberon a 37deg C por 2 haras Sa midio 01 mi de cada uno de los
tubas al tiempo 0 y a las 2 horas y sa inoculeron en superficie en caJas de petri
con agar MRS S9 incubaron a 37deg C bajo anaerobiosis durante 48 horas Se
compararon visualrrente en cada caja de petri el crecimiento en superficie y las
que presentaron crecimiento en tos dos tiempos (0 y 2 horas) tanto en at media
acido como en sales I se consideraron resistentes a pH=2 y sales biliares (03
pv)
(Ver Tabla 6)
34
226 Conservacion
Todas fas capas que habian dado positiva Jas pruebas anteriores y que reaultaron
resistentes a pH=2 y sales biliares 03 pv y despues de identificadas en API 50
CHL sa repicaron en agar MRS en tuba inclinado y despues de Incubar a 37deg C
por 48 horas bajo anaerobiosis se Ctlbrie el biser completamente can aceite
mineral esteril y sa guardaron en refrigeraci6n
227 Elaboracj6n de fa bebida fermentada
2271 Preparaci6n de la mue$tra
Sa tome 1 mt de caldo MRS previamante inoculado e incubado que presentaba
una concentracion de Lactobacillus brevis de 27x108 Iml segun la escaJa de Mac
Farlan y sa adiciono a 9ml de leche pasteurizada en un tubo sa dej6 incubanda
en anaerobiosis por 48 hores Luego se pasaron estos 10 ml a un frasco qua
cont~nie 90 ml de leche pasterizada y se dej6 incubando par 48 haras en
anaerobiosis
35
2272 Adici6n del inOculo
A 900ml de leche pasteurizada se Ie adicion61os 100 ml de leche que habia sido
previamente ino(ulada dos veces con la cepa posteriormente se deja
fermantando la lache a temperatura de 37deg C
2273 Control de Ja fermentaci6n
Las muestras se hicieron por cuadruplicado y se les hizo un seguimiento de
aoidez hasta un valor entre 04 y 05 expresada como Bcido lactico esta
procedimiento corresponde a la babida fermentada sin prebi6tico La bebida ~on
prebi6tico tiene al mismo proeedirnianto pero adicionalmente se agrag6 avena a
una concentraci6n de 05 en el momento de la adici6n del in6e410 a los 900 ml
de leehe pasteurlzada y el procedimiento sigui6 igual al de la bebida sin prebi6tico
tambien se hizo por cuadruplicado
2274 Refrigeracl6n
Despues que las mezclas con y sin prebiotico alcanzaron el de acidez
requarido se IIeva ron a refrigeraci6n a una temperatura de 4deg C p~r 24 horas
para frenar proce~os metab6licos de los microorganisrtlos Despues de este
ti~mpo se procedi6 al batido
36
1 2275 Batido
Con un agitador se procedi6 a batir las bebidas para romper et coagulo formado
y de esta manera homogeneizar la mazela y obtener asf la bebida fermentada
2276 Envasado y almacenamiento
Ambas bebidas se envasaron en frascos vidrio para hacerles seguimiento de pH
acidez(expresado como acido tacticol y recuento de Lactobacillus breviSf los
dies 27 14 Y 21 despues de elaboradas las bebidas perfodo durante el cualta
muestra permanecfa afmacenada a temperatura de refrigeracion(Ver Figura 5
37
Fjgura 5 Diagrama de Flujo
PREPARACION DE LA MUESTRA
ADICION DEL INOCULO
~_____~_B~ATIDO~______~
INCUBACION 37deg C hasta acidez = 04-05 acido laotico
ENFRIAMIENTO
hasta 4 0 C ~------~ ~------~
ENVASADO Y ALMACENAMJENTO
dUrante 21 dfas a Temperatura 4 0 C
38
1
228 Determinaci6n del pH
Se determino por el metoda potenciometrico en un pH-metro manual durante los
dias 2) 7 14 Y 21 de las bebidas lacteas sin y con prebi6tica (Ver Tablas 7 y 8)
229 Oeterminaci6n de la acidez (Expresadfl como acido
lactica)
Se tomaron 9 mJ de las bebida~ sa Ie adicionaron 2 gotas de fanoftaleina como
indicador y sa titulo fa acidez con NaOH 01 N hasta la aparicion de un cotor rosado
debit EI volumen de NaOH utilizado se reporta como valor de de acidez
(VerTablas 10 y 11)
2210 Prueba de viabilidad
Qurante el perfoda de almacenamiento de la bebida lactea se procedi6 a hacer la
prueba de viabiHdad en los dias 7 14 Y 21 para determinar Si los lactobacilfus
permanecfan vivOs a una concentraci6n minima de 106 hasta el dia 21 como 10
establece eJ Articulo 10 de la Rasolucion 2310 del Ministerio de $alud de
Colombja
39
Para asta prueba se tamaron 10 rnl de muestra y se adicionaron a 90 ml de caldo
MRS ruego a partir de esta se hicieron diluciones de 10-2 hasta 10-11 de las
diluciones 109101deg 10-11 se inocul6 1 ml de cada uno en agar MRS siguiendo el
metodo de siembra en profundidad y por duplicado e incubando a 370 C x 5 dras
en anaerobiosis y luego se hicieron tos recuentos por duplicado para esi reportar
los recuentos promedio (Ver Tablas 13 y 14)
2211 AniUisls microbiol6glco de las bebidas Iicteas(con y sin
avena)
Con el fin de determinar las condiciones higienico-sanitarias del producto se
realizaron las pruebas microbiol6gicas de Recuento de mohos y fevadurasml en
agar OGY Recuento en superficia de Staphylococcus coagulasa positivoml en
agar Baird Parker Numero Mas Probable (NMP) de coUfor-mes totales y
Escherichia coliml en caldo Fluorocult y Presencia de Salmonela25ml con BHI
caldo tetrationato y agar Hecktoen (Montoya 1999)
(Var tabla 16)
2212 AnaUsis estadistico
A los datos obtenidos en la medici6n de pH acidez (expresada como Beido
laclico) en los dras 2714 Y 21 y el recuento de Lactobacillus en los dras 714 y21
40
realizados a los dos tratamlentos se tes aplic6 1a prueba t porque solo difieren
en la presencia 0 ausencia del prebi6tico para evaluar si habra diferencia
estadfsticamente significativa para los dos tratamientbs(Ver Tablas9 12 y 15)
41
3 RESULTADOS Y DISCUSION
31 Coloraci6n de Gram y morfologfa
Las cepas aisladas fesultaron Gram positivas (Ver Figura 6) colonias grandes
cremosas dE) color beige con bordes homogeneos y c6ncavos en su
morfologia (Ver Figura 3) resultando de acuerdo a 10 especificado en Stanley
1989 para Lactobacillus
32 Prueba de esporulaci6n y cataJasa
Los resultados de la pruebas de esporulaci6n y catalasa indicados en las
Tablas 3 y 4 respeclivamente dieron conforme a 10 especificado en Stanley
1989 para Lactobacillus
42
1
2 3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
TABLA 3 Resultado de prueba de esporuJaci6n
CEPA RESULfADO ESPORULACION
-- -------------
43
l i ~II bull ~ I I
TABLA 4 Resultado prueba de la catalasa
CEPA RESULTADO CATALASA
1 -2 -3 -4 -5 -6 -7 8 -9 -10 -11 12 -13 -14 -15 -16
3~3 Prueba para determinar la especie
Oespues de hacer las pruebas para seleccionar las cepas sospechosas de ser
Lactobacillus se realizo las pruebas bioquimicas fograndose identificar
Lactobacillus plantarum aislctdo de pepino repollo y repollitas de bruselas
44
fermentados y Lactobacillus brevis de mucosa vaginal y leche fermentada (Ver
Anexos del A al E y Tabla 5)
TABLA 5 Resultado identlficaci6n cepa~
CEPA NOMBRE
1 Lactobacillus planfarum
3 Lactobacillus plantarum
5 Lactobacillus brevis
13 Lactobacillus brevis
15 Lactobacillus plantarum
34 Pruebas para determinar microorganismos probi6ticos
las cepas de Lactobacillus brevis y Lactobacillus plantarum mostraron
rasistencia al medio acido de pH =2 Y sales biliares 03 pv resultado similar al
encontrado por Jacobsen et al 1999 para Lactobacillus plantarum (Ver tabla 6)
45
middot
~~~ttiI lltlmiddot~COX~dtJ ~xtc_~ 2 tr~ k-JlL~middot
-)~~TO DE lJIBUOTECUl rjRL]OTtCA twn GO1IU1
TABLA 6 Resultados a pruebas de resistencia a pH=2 y sales biliares 03 plv
CEPA RESISTENCIA pH=2 RESISTENCfA A SALES BIUARES ()3 pv
1 + +
2 + +
3 + +
4 + +
5 +
6 + +
7 + +
8 + +
9 + +
10 + +
11 + +
12 + +
13 + +
14 +1shy +M
15 + +
16 + +
+1 crecimiento debil
+ crecimiento abundante
46
Figura 6 Lactobacillus brevis Gram + aislado de leche fermentada
Ai observar en placa las celulas de lactobacilos despues de real1zar las pruebas
de resistenCia a la acidez y sales biliares se observo una tendencia a aglomerarse
posiblemente como un mecanismo de proteccion cOlitra estos medios que pueden
lIegar a ser adversos para elias (Ver figuras 7 y 8)
47
Figura 7 Lactobacillus brevis aislada de leche fermentada despu~s de la prueba de resistencia a pH=2
Figura 8 Lactobacillus brevis aislada de leche fermentada despues de la prueba de resistencie asales biUares 03 plv
fI
48
35 --Seguimiento del-pH-en-la-bebidaJacteacon y sin -prebi6tico
A continuacion se muestran las Tablas 7 y 8 donde sa registian los datos
recopilados de pHdurante 10$ dras Z 7 14 Y21 para las bebidas laaeas con ysin
prebi6tioo
TABLA 1 ResultadopH yogur sin avena
Dia Repetition 1 Repetici6n 2 Repeticion 3 Repetici6n 4
2 526 501 51 52
7 446 433 438 44
14 439 435 437 436
21 439 437 438 437
TABLA 8 -ResultadopHyogur con avena
Dia Repeticion 1 Repeticion2 Repeticion 3 - Repeticion 4
2 509 523 51 515
7 447 442 445 442
14 436 -438 439 437
21 432 433 435 434
Observando la Figura 9podamos ver que el pH en el -dfado$ para los dos
tratamientos as igual y empieza a descender rapidamente para estabilizarse a
partir del dra 7(Ver figura 9)
49
Figura 9 Comparacj6n de medias para -el pH
Comparaci6n de medias para pH
55 ~ 5 +----=gtIIIi-~i~~----=-r--it~ -- pH sin avena
a 45 1--~~~~=~~ 4 --- pH con
avena35 t-----r-- -------=------=--= ------- - ----
2 7 14 21
Dias
Aplicando la prueba t para comparar las medias de pH I S6 muestia una diferencia
altamants significativa en los dos tratamientos para el dia 21 (pltO05)
(Ver tabla 9)
TABLA 9 Compaiaci6n de medias para pH
DtAS SIN AVENA CON AVENA te p (VALOR)
2 514 514 0 10
7 439 444 -1 61 0159
14 437 I
438 -070 0510
21 438 433 528 00019 shy
- DiFERENCIA AlTAMENTE SIGNIFICATIVA
50
I
AI aplicar regrasi6n a los datos sa obtiene al modelo estimado
pHSinAyena =535606 - 01505650Ia +0005044340IaI2
La variabilidad en la respuesta de pH asta siendo explicada en un 8S7522 por
el modelo (Ver Anexo F)
EI tratamiento con avena mostro el siguiente modelo al analisis de ragresi6n
pHConAvena =534463 ~ 0140407Dia + 0004480980Ia2
La variabilidad an la respuesta de pH asta siendo explicada en un 903315 par
el nlodelo(Ver anexo G)
36 Seguimiento de la acidezmiddotmiddot expresada comomiddot de acido
lactico
A continuaci6n sa muestran las Tablas 10 y 11 donde sa registran los datos
tecopilados de acidezmiddotdurante los dias 27 14 Y 21 para las pebidas taetees con y
sin prebi6tico
TABLA 10 Resuttadode acidez (expresadocomo acido tactico) yogurt sin avena
CIA R~petici6n1 Repeticion2 Repetici6n 3 Repeticion 4
2 054 06 057 058
7 072 074 073 0]2
14 080 083 082 082
21 0]4 079 078 077
51
TABLA 11 Resultado de aCidez (expresado como acido Icktico) yogurt con avena
Dia Repetici6n 1 RepetiCi6n 2 Repetici6n 3 Repetici9n 4
2 059 055 058 057
7 071 073 072 072
14 089 087 088 086
21 092 091 090 091
Observando la Figura 10 se puede concluir que la acidez empieza a aumentar
hasta el dia 14 y luego trata de estabilizarse para los dos tratamientos
(Ver figura 10)
Figura 10 Comparaci6n de medias para la acidez
N G)
Comparacion de medias para acidez
1
2 0I 5 -+--=--------=-~~~= u
ltC
- Acidez sin avena
2 7 14
Dias
52
21
-it- Acidez con avena
Aplicando la prueba t para camparar las madias de acidez se muestra una
diferencia altarnante significativa en los dos tratamiantos para los dias 14 y 21
(pltO05)
(Var tabla 12)
TABLA 12Comparaci6n de medias para Acidez
DIASmiddot SIN AVENA CON AVENA te p(VALOR)
2 0572 0572 0 10
7 0727 0720 119 0278
14 0818 0875 -638 000070shy
21 077 091 -1212 i 0000019 shy
DIFERENCIA AL TAMENTE SlGNIFICATIVA
AI aplicar r~gresi6n a los datos se obtiene el modelo estimado
AcidezSlnAIena = 0491897 + O0436032Dia O00144613DfaA2
La variabilidad en la respuesta de acidez asta siendoexplicada en un 970978
por al modelo (Ver anexo H)
EI tratamiento con avena mostro elsiguiente modeloj a1 analisis de regresion
AcidezConAvena = 0491638 + 00406572Oia - OQOO982559OiaA2
La variabilidad enla respuesta acidez esta siendo explicadaen un 99212 por
el modelo (Ver anexo J)
53
I ~
37 Prueba de viabiJidad
A continuaci6n sa muestran las Tab~as 13 y 14 donde sa presentan los datos
recopilados del recuento de Lactobacilos durante los dias 7 14 Y 21 para las
bebidas lacteas con y sin prebi6tico
TABLA 13 Recuento de Lactobacilos (UFCml) yogurt sin avena
Dia Repetici6n 1 Repetici6n 2 Repeticion 3 Reptttici6n 4
7 1880X10l1 1454X1011 1642X1011 1780X10~
14 1560X10~ 646X1011J 1890X10l 140X10l1
21 1200x10lu 128Ox10u 1745x10J 1520x101V
TABLA 14 Recuento de Lactobacilos (UFCml) yogurt con avena
Dfa Repetieion 1 Repetici6n 2 Repeticion 3 Repeticf6n 4
7 1600X10lt 1240X10t 1640X10ll 1980X10t
14 540X1011 427X10n 546X10n 720X10ll
21 500x1011 492x1011 712)(1011 980x10~
AI analizar la Figura 11 sa puede observar un recuento mayor de Lactobacilos
en al tratamiento con avena resultado de acuerdo a 10 encontrado por Alander at
aI 1999 Kontula et aI 1998 y Jaskari et aI 1998
54
Figura 11 Comparaci6n de medias para Log Lactobacillus
Comparacion de medias para log Lactobacillus
~ 1350
-+- Sac Sin--() 13 co avenaIII
bull 125 -- Bac con 0)
0 12 avenaJ
115 7 14 21
Dias
Aplicando la prueba t para comparar las medias de recuento de Lactobacillus no
se encontr6 una diferenc1a estadfsUcamente significative entre los dos
tratamientos (Ver tabla 15)
Este aumento en al racuento influy6 en la disminuci6n del pH y en el aumento de
fa aeidez por la fermentacion que realizan los Lactobacillus sobre fa lactosa de la
lache y la avena adicionada como prebi6tico
55
1
TABLA 15 Comparaci6n medias lag Lactobacillus
DIAS SIN AVENA CON AVENA tc p(VALOR)
7 122257 122022 04846 06451
14 121065 132393 -19602 00977
21 129025 133087 -08236 04416
At aplicar regresion a los datos se obtiane al modelo astimado
LactobacillusSinAvena= 117347 + 004834640Ia
La variabilidad en la respuesta del recuento de LactobaCillus ssta siendo
explicada en un 260054 por el mod$loVar anexo J)
EI tratamiento con avena mostr6 al siguiente modalo al anal isis de regresion
Lactobacillu$ConAvena =118103 + 007903040Ias
La variabilidad en la respuesta de recuento esta siendo explicada en un 3068
por al modelo(Ver anexo K)~
38 Analisi$ microbiol6gicos de las bebidas lacteas con y sin
En la Tabla 16 estan recopilados los resultados microbiol6gieos obtenidos en ras
muestras con los dos tratamientos (con y sin avena)
I [
sa
TABLA 16 Resultados analisis microbiologico
Recuento de mohos y levaduras Iml lt10
Recuento de Staphylococcus coagulase positiva Iml lt100
NMP coliformes fotales y Escherichia coli Iml lt3
Presencia de Salmonella25ml Ausente
Los resultados de este analisis demuestran que las bebidas fermentadas con y
sin avena~ astan fibres de microorganismos patogenos
57
1
4 CONCLUSIONES
Se aislaron cepas nativas de Lactobacillus plantarum de las muestras vegetates
de repollo pepino repollitas de bruselas fermentadas y Lactobacillus brevis de
lache fermentada y mucosa vaginal humana Ambas cepas resistieran un pH=2 y
una concentraci6n de sales biliares det 03 ptv dos earacteristicas importantes
en los probi6ticos
Lamiddot cepa de Lactobacillus brevis aislada de lache Sa utiliz6 para elaborar una
bebida fermentada sin y con avana comoingrediente prebiotico obteniendose un
aJimento centon recuento del probi6tico viable durante 21 dras de seguimiento
ademas libre de microorganismos )at6gen05
No se encontr6 efecta significativo de la avena sobre Ie viabilidad del Lactobacillus
brevis aunque sa presento un aumento en 61 recuento de estos en la bebida con
avena
58
plusmn ~
5 RECOMENDACIONES
Ensayar la cepa de Lactobacillus plantartJm en productos carnicos madurados
como el salami
Ensayar la cepa de Lactobacillus l)revs en otros derivados lecteos como queso
quesito queso crema
Continuar con el estudio de estos microorganismos y caracterizarlos
molecularmente ademas de estudiar su capacidad de adherencja a fa mucosa
intestinal sobre algunes Hneas celulares como las CaCo~2
Estudiarel efedo de la avena sabre la viabiJidad del Lactobacillus breyis a una
concentraci6n mayor de 05
Realizer ensayos can las cepas de Lactobacillus brevis y Lactobrlcillus pJantarum
para elaborar masas acidas para panificacion reemplazando el Bromato de
Potasio aditivo prohibido desde marzo del 2003 en nuestro pais per 5U toxicidad
59
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65
ANEXOS
66
ANEXO A RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AlSLADA DE i
PEPINO it
Referencia Pepino 1 Fecha 06122002
IEXCELENTE IDENTIFICACION
Latto plantarum 1
Galeria API 50 CHL V50 Leida el 06122002
Perfil - -- - ++ - -- - ++++ - - -+- + - I I I I I I I I +t+ - +f- ~ - - + + ~ - - - +- + - shy
o - GLY - ERY DARA - LARA + RIB + DXYL - LXYL - ADO - MDX - GAL + GLU + FRU + MNE + SBE - RHA - DUL - INO bull MAN + SOR - MDM + MUG shyNAG + AMY + ARB + ESC + SAL + CEL + MAL + LAC + MEL + SAC + TRE + 1NU - MLZ + RAF + AMD - GLYG - XLT - GEN + TIJR + LYX - TAG - DFUC shyLFUC - DARL + LARL - aNT + 2KG - 5KG shy
--- Taxones significativos rd -----T -- Tests en contra
Lactoplantarum 1 999 092 1
Taxon siguiente Lactobrevis 1 OJ 044 3
i i
Lactoplantarum 1 1 test (5) en contra
D-SORBITOL (SOR) 78
Tax6n siguiente Lactobrevis 1 3 test (s) ert contra
METHYLD-MANNOSIDE (MOlM) 0 MELEZITOSE (MLZ) 14 D-TURANOSE (TUR) 14
67
ampb
ANEXO B RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AISLADA DE REPOLLO FERMENTADO
~
Referencia Repollo fermentado - 3 Fecha 03072003
EXCELENTE IDENTIFICACION
Lactoplantarum 1
Galena API 50 CRL V50 Leida el 03072003
Perfil - - ++ - - - - -H++ - - ~ + - + - I I 1 I I I I -H+ - ++ - - - + + - -- - - + - shy
o - GLY - ERY - DARA - LARA + RIB + DXYL - LXYL - ADO ~ MDX - GAL + GLU + FRU + MNE + SBE ~ RHA - DUL - INO - MAN + SOR - MDM + MDG shyNAG + AMY + ARR + ESC + SAT + CRL + MAL + LAC + MEL + SAC + TRE + lNU - MLZ + RAF + AMI) - GLYG - XLT - GEN + TOR + LYX - TAG - DFUC shyLFUC - DARL - LARL - GNT + 2KG - 5KG shy
------Taxones significativos _ _----- Id--- ---T---- Tests en contra
Lactoplantarum 1 999 095 1
Tax6n siguiente Lactobrevis 1 01 OA8 3
lJactoplantaru01 1 1 test (s) en contra
DSORBITOL (SOR) 78
Taxon siguiente Lactobrevis
METHYL-D-MANNOSIDE D-TURANOSE
1
(MOM) (TOR)
3 test (5) en contra
0 MELEZITOSE 14
(MLZ) 14
i
I
68
ANEXO C RESULTADO PRUEBAS BIOQUWICAS DE CEPA AISLADA DE MUCOSA HUMANA
Referenda Mucosa - 5 Fecha 27012003
BUENA IDENTlFICACION
Galeria API 50 CHL vso Leida el 270112003
Perfil - - - - +t--t - - - + - + - - - - - - - - -+- - - - - + - + - - - - - - - - - - - - - bull - - -+ - +
o - GLY ~ ERY - DARA bull LARA + RID + DXYL + LXYL - ADO bull MDX - GAL + OLU - FRU + MNE - SBE - IlliA - DUL - INa - MAN - SOR - MDM - MOO shyNAG + AMY - ARB - ESC ~ SAL bull CEL - MAL + lAC - MEL + SAC - TRE shyINU - MLZ - RAF - AMD - GLYG - XLT - GEN - 11JR - LYX - TAG - DFUC shyLFUC - DARL - IARL - ONT + 2KO - 5KG +
- - - - - - Taxones significativos - - - - - - - Id T -- Test en contra
Lactobrevis 3 963 088 1
Taxon siguiente Lactoco11inoides 36 075 2
Lactobrevis 3 1 test (s) en contra
GLUCOSE (GLU) 95
-~~~------------~---------------------------~--~-------~--~-----~----------~--------~------------~~--Taxon siguiente Lactocollinoides 2 test (s) en contra
GLUCOSE (GLU) 100 MELIBIOSE (MEL) 25
69
i r
ANEXO D RESULTADO PRUEBAS BIOQIJiMICAS DE CEPA AISLADA DE LECHE FERMENTADA
Referenda Leche fennentada ~ 13 Fecha 27012003
BUENA IDENTIFICACI6N
Galeria API 50 CHL V50 Leida el 270112003
Perfil - - - - -t-t+- - - - + - + - - - bull - - - - -+- - - - - + - + - - - - - - - - - - - - - - - - -+ - +
0 - GLY - ERY - DARA - LARA +Rll3 + DXYL + LXYL - ADO - MDX ~GAL + GLU - FRU + MNE SBE - RHA DUL bull INO MAN - SOR MDM bull MDG shy
~NAG + AMY - ARB - ESC - SAL - CEL - MAL + LAC - MEL + SAC - TRE I lNU - MLZ - RAF - AMD - GLYG - XLT - OEN - IUR LYX - TAG - DFUC bull i
LFUC - DARL - LARL -ONr + 2KG - SKO + 1
- -- - - Taxones significativos - - Id -- T --- Test en contra
Lacta brevis 3 963 088 1
Taxon siguiente Lactocollinoides 36 075 2
Lactobrevis 3 1 test (s) en contra
GLUCOSE (GLU) 95
-----------------------------------------------------------~------------------------------~-------------------Taxon siguiente Lactocollinoides 2 test (s) en contra
GLUCOSE (GLD) 100 MELffiIOSE (MEL) 25
70
II iJ1
I
I ANEXO E RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AISLADA DE REPOLLITAS DE BRUSELAS FERMENTADA
Referencia repollitas de bruselas 15 Fecha 03072003
EXCELENTE IDENTIFICACION
Lactoplantarum 1
Galeria API 50 CHL vsO Leida el 03072003
Perfil - - - - +t - - - - +H+ - +- - +t + - I I I I I I I f ++t - + - - - -+ + - - - -+ -+ - - I ij
o - GLY - ERY - DARA - LARA + RJB + DXYL - LXYL - ADO - MDX - GAL +
GLU + FRU + MNE + SBE RHA + DUL - INO - MAN + SOR + MDM + MOG shyNAG + AMY + ARB + ESC + SAL + eEL + MAL + LAC + MEl + SAC + TRE + i
I1NU - MLZ + RAF AMD GLYG - XLT - aEN + TUR + LYX - TAG - Druc LFUC - DARt + LARL - aNT + 2KG - 5KG shy n ----Taxones significativos ------ Id Tests en contra
Lactoplantarum 1 999 090 o
Taxon siguiente Lacto pentosus 01 012 7
Lactoplantarum 1 o test (s) en contra
Taxon siguiente Lacto pentosus 7 test (8) en contra
GLYCEROL (GLY) 75 D-XYLOSE (DXYL) 100 L-RHAMNOSE (RHA) 25 METHYL-D-MANNOSIDE (MOM) 1 MELEZITOSE (MLZ) 25 RAFFINOSE (RAF) 75 D-ARABITOL (DARL) 0
71
~
I i I
ANEXO F - ANALISIS DE REGRESION PARA pH EN BEBIDA SIN AVENA
Aruilisis de regresi6n polinomial
---~-~-------------------------------------------~-----------~~---------------------~--------------Variable dependiente pHSinAvena ---------------------------~-------------~--------------------~---------------------------------
Error T Parametro Estimado Estandar Estadistico P-Valor
CONSTANTE 535606 0094535 56657 00000 Dia -0150565 0020706 727154 00000 Dia2 000504434 0000871488 578819 00001
---~---------------------------------------------------------------------------------------------------
Anfllisis de Variama -------------------------------------------~-----------~-----------------------------~-~--- jSource Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor 11
------------------------~------------------------------------------------------------------------------~ Mod-elo 155772 2 0118861 4256 00000 Residual 0237877 13 00182983
Total (Corr) 11956 IS
R2 == 867522 percent
pHSinAvena == 535606 - 0150565Dia + 000504434Dia2
72
____
middot ANEXO G - ANALISIS DE REGRESION PARA pH EN BEBIDA CON AVENA
AmUisis de regresion polinomial _____~_____~__-_____~___4____________________bull____bull__________bull_____________~~----_------___________
Variable depcndiente pHConA vena ------------------------------------------------------------------------------------------~--------
Error T Parametro Estimado StAndar Estadfstico P-Valor
---------------------------------------------~-----------------------------------------------_---------CONSTANTE 534463 00801045 667208 00000 Dia -0140407 00175453 800253 00000 DiaA 2 000448098 0000738458 606803 00000
----------------------~---~-----------------------------~------------------------------~----AmUisis de Varianza
---~---------------------------------~---------------------~------------~-------------------~------Source Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio PValor --------------------------~-----------------------------------------------~------------~-----~~--~ ModeJo 159575 2 0797873 6073 00000 Residual 02170798 middot13 00131383 _______~_~ ~_~----------~------~--~-----~-M-----~-----____ _____________~-----------------------Total (COlT) 176654 15
R12 903315 percent
-----------~------------------------------------------------------------------------~-----------pHConAvena 534463 - 0140407Dia + 000448098DfaA 2
73
ANEXO H - ANALTSIS DE REGRESTON PARA ACIDEZ EN BEBJDA SIN AVENA
An8Jisis de Regtesi6fi P6lifJomial
Variable Depefidiefile~ AcidezSinAVenll _______________w_____~______~________________~-----------_________~_________________~~____~___~_____
Error T Pariirnetro Estimado Estandar Estadistico ---------------------------------------~--------------~-~-------~--------------------~------------CONSTANT 0491697 00123217 399051 00000 Dia 00436032 000269882 161564 00000 D1a2 -000144613 000011359 127312 00000 __w___~________________________~-_______-_____~----____________________________~__~---~_--__~___
AriiiJisis de varianza ~_~__~__________~_~____~________~___________- _________e_____________________________bull _____-________
Source Smn de cuadr Df Mean Square F-Ratio PmiddotValor_~~___________________________________bull ______~___________bull ____________bull ______~________w________________
Model 0135203 2 00676013 21747 00000 Residual 000404118 13 000031086
Total (Corr) 0139244 15
R2 970978 percent
AcidezSlnAvena 0491697 + O0436032Dia - 0OOl44613Dia2
74
I
ANEXO I ANALISIS DE REGRESION PARA ACIDEZ EN BEBIDA CON AVENA
1
Anwisis de tegtesi6fi polinomial
Variable dependiente Acidez Con Avena
Error T ParametTo Estimado Stlindar Estadfstico P-Valor ----------------~-------~---------------------~-----------------------------------------------------CONSTANT 0491639 000926607 530578 00000 Diamiddot 00406572 000202955 200326 00000 DfaA 2 0000982559 0000085421 -115025 00000
-------------~----------------------------~-------------------------~-----------------------------------
-------------~-----~~-----------------------------~---------------------------------------------_--Source Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio PValor
-~-------------~----------------------------------~------------------~~-------------------------- Modelo 0288008 2 0144004 81914 00000 Residual 000228539 13 0000175799
----------~~--------------~---------------------------------------------~---------------------------Total (Corr) 0290294 15
RA2 = 992127 percent
-------------------------~----~---~------------~---------------------------------~---------------~
AcidezConAvena == 049163amp + 00406572D1a - 0000982559DiaA2
75
I
(Ilmiddot il
ANEXO J- ANALISIS DE REGRESION PARA RECUENTO LACTOBACILOS PARA BEBIDA SIN AVENA
Amilisis de regresion - Modelo lineal Y = a + bX
------------------------~----------------------~-----------------------------~----------~-----------Variable Dcpendiente LactobacilJusSinAvena Variable independiente Dia
I--------~----------~-----------------------------------~-------~-~--~--------------------------~-Error T
Paramctro Estimado Standard Stadistico P-Valor
----~----~------------~-----~-----------------------~-------------~-----------------------------Intereepto 117347 0389973 300911 00000 Pendiente 00483464 00257889 18747 00903
Analisis de Varianza
---------~------------------~----------------~---------------------------------~---------~----------Source Sum decuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor
------------~---------------------~---------------------~--------------------------------~-----~----Modelo 0916252 1 244835 443 00616 Residual 260706 10 0260706
--~------------~---~------------------~~~-----~-------~---------~~-------------------------------------Total (Corr)352332 11
Coeficiente Correlaci6n = 0509955 R2 = 260054 percent
LactobacillusSinAvena= 117347 + 00483464Dfa
76
ANEXO K- ANALTSIS DE REGRESION PARA RECUENTO LACTOBACILOS PARA DEBIDA CON AVENA
Aruilisis de regresion - Modelo lineal Y = a + hX
Variable Dependiente LactobacillusConAvena Variable Independiente Dia ---~--------------------------------------------------------__-----------__--_--_-----------shy
Error T Paramctro Estimado Standard Estadistico P-Valor -~--------------------------------------------------------------------------------------------------
Irttercepto 118103 0567963 207942 00000 Pendiente 00790304 00375594 210414 00616
-----------------~----------------------------~----~-------~----~----------------------------
Analisis de Varianza
----------------~----------------~------------------~--------------------------~------~--------shySource Swn de cuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor
-----------------~--~--------------------------------------------------------------------------~---~ Mode10 244835 1 244835 443 00616 Residual 552997 10 0552997
Total (Corr)797832 11
Coeficiente Correlacion = 0553964 RI2 = 306875 percent
-----~--------------------------------------------------------~--------------------------------------
LactobacillusConAvena = 118103 + 00790304Dfas
77
TABLA OE CONTENIDO
lISTA DE TASLAS ------------~--~------------------------- ~
LISTA DE ANEXOSmiddot--------- ----------------------------------11
INTRODUCCON -----------------------------------------------------12
1 MARCO TEORICO Y ESTADO OEl AItTE---middot---middot-middot-- -------14
11 PROBIOTfCOS ------------- - middot------------------14 111 Historia------------------------- 14 1~ 12 Microorganismos probi6ticos---------------- 15 113 Caracteristicas fenotipicas de algunos microorganismos probi6ticos-----~------ ------- 16 114 Caracteristicas de los probi6ticos--- - ----17 115 Beneficio de los organismos probi6ticos---middot ----19 1151 Facilitar la digesti6n de la lactosa ------ 19 1152 Protegen contra enfermedades gastrointestinales - -19 1153 Protegen contra infecciones del tracto urogenital -------20 1154 Promueven la barrera de defensa endogena delintestino ---20 1155 Protegen contra cancer de colon- ---- ---~1 1156 Protegen contra infeGCiones respiratorias----------21 1~157 En at iratamiento y pre~enci6n deleczeroa-- - 22 1158 Previenen infeccion en heridas quirurgicas ---------23 12 PREBlOTICOS -- -----------------23
2 METODOLOGIA~~~~-~fO ~~~tfmiddot~I~~-____bullbull_--~---------middot26
21 lOCALIZACION~~======~-~--- ------26 22 METODOS------------------------------26 221 Aislamiento de cepas nativas -------_ 26 2211 De vegetales -- -- -26 2212 De Ja leche--------- -----------28 2213 De mucosa vaginal humana ----~---------------28 222 Almacenamiento de fas repas aisladas ----- --30 223 Pruebas para determinar el genera ---- 31 2231 Coloracion de Gram --------------------31 2232 Morfologra---~----------------- -- -31 2233 Prueba de esporulaci9n----------------~2
2234 Prueba de la catalasa--------------------~------ 32 224 Prueba para determinar la especie ----------~-------- 33
225 Pruebas para determinar microorganismos probi6ticos -----34 2251 Resistancia a pH=2 y sales biliares de concentracl6nO3piv --34 226 Conservacion ------------~-----------------35
227 Elaboraci6n de la bebida fermentada ---------35 2271 Pr~paraci6n de Ie muestra ---------------~----35 2272 Adici6n del Inocula ----~-------------------36 2273 Control de Ie fermentaci6n=~~~==~~-------------36
2274 Refrigeracion ------- ~-- ---- -------36 2275 Batido--~ ------------------------------------37 2276 Envasado y almacenamiento------------ 37 228 Determinacion del pH------- ---------- -----39 229 Determinacion de la acidez (Expresada como acido lactico) -39 middot2210 Prueba de viabiJidad ------~-------~----------39 2211 Am3lisis microbiol6gico de las bebidaslacteas(con ysinavena) -40 2212 Anslisis estadistico ~-~~-~---------=------------40
3 RESULTADOS Y DISCUSI6N-~------------------------------ --42
31 Coloraci6n de Gram y morioJpgfa --001-------- - -----42
32 Prueba de esporufacion y catafasa-----------------42 33 Prueba para determinars especie- -------- ---44 34 Pruebas para determiner microorganismos probi6ticos -----45 35 Seguimiento del pH en la bebida h3ctea con y sjn prebi6tico-----49 36 Seguimiento de la acidez expresada como de acidb lactico -----51 37 Prueba de viabiJidad-------- ----------54 38 Analisis microbiol6gicos de las babides lacteas con y sin avena --56
4
5
REFERENCIA~ BIBLIOGRAFICAS --~-------------middotmiddot---- ---------60
LISTA DE TABLAS
TABLA 1 ALGUNAS ESPECIES MICROBJANAS PROB16TICAS-------------~------middot15
TABLA 2 FueNTE De AISLAMIENTO DE CePAS NATJVAS --------------29
TABLA 3 RESULTADO DE PRUEBA DE ESPORULACI6N------------------43
TABLA 4 RESULTAOO PRUEBA DE LA CATAlASA ----------------------44
TABLA 5 ReSULTADO IOENTIFICACION CEPAS--------------------middot-----45
TABLA 6 ReSULTADOS APRUEBAS DE RESISTENOIA A pH=2 YSALES BILtARES 03 Pv
-----------~-- ----------~--46
TABLA 7 ReSUtTADO pH YOGUR SIN AVENA ----------------49
TABLA 8 ReSULTADO pH YOGUR CON AVENA ------------ --49
TABLA 9 COMPARACION DE MEDIAS PARA pH----------------------50
TABLA 10 ReSULTADO DE ACIDEZ (EXPRESADO COMO ACIDO LACTICO)-------51
YOGURT SIN AVENA ------------------------------51 TABLA 11 ResuLTAOo oJ ACIOEZ (EXPRESAOO COMO ACIDO ACTICo)----52
YOGURT CON AVENA--- ------------------- --- ----52 TABLA 12 COMPARACION DE MEDIAS PARA ACIOEZ----------------~~53
TABLA 13 RecuENTo DE LACTOBACILOS (UFCML) YOGHURT SIN AVENA--54
TABLA 14 RECUENTO DE LACTOBACILO$ (UFCML) YOGHURT CON AVENA ------54
tABLA is COMPARACl6N MEDIAS LOG LAcToBACltLUS-------------56
TABLA 16 RESULTADOS ANALiSIS MICROBIOL6GICO------------- --57
L1STA DE FJGURAS
FIGURA 1 CAMARA DE ANAEROBIOSIS----------middot------~----27
FIGUftA 2 CePAS EN TUBOS CON AGAR INCUNADO -----~--middot----------30
FIGURA 3 COLONrASAISLADAS EN AGAR MRS-------middot---------31
FIGURA 4 API CHL 50-PRUEBA sloaufMlcAS ------------- bull --33
FIGURA 5 DtAGRAMA DE FLUJO ------~---------- ----~-38
FIGURA 6 LACTOBACILLUS I3REVIS GRAM + AfSLAOA OE LECHE FERMENTADA------47
FIGURA 7 LACToBACILLUS BFEVS A1SLADA OS lECHS FERMENTADA DESPUES DE LA
PRUEBA DE RESfSTENCIA A pH=2 ----------------------~ - middot-48
fIGURA 8 LAcTOBAcILLUS BREVIS AISLADA DE LECHE FERMENTADA OESPUES DE LA
PRUEBA DE RESISTENCJA A SALES BILIARES 03 pN------------- ----48
FIGURA 9 COMPARACI6N DE MEDIAS PARA EL pH ---------- ---------50
FIGURA 10 COMPAAACI6N DE MEDIAS PARA LA AC1DEZ ----------------52
FIGURA 11 COMPARACI6N DE MEDIAS PARA LOG LAcTOBAcILLUS -------------55
LISTA DE ANEXOS
ANEXO A--- RESUl TADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AfSLADA DE
ANEXO B RESULTADO PRUEBAS BIOQUfMICAS DE CEPA AISLAOA DE
REPOLLO FERMENTADO --middot----------middot--------------------------68
ANEXO c RESULTADO PRUEBAS BIOQUIMICAS DE CEPA AISLADA DE
MUCOSA HUMANA ------------------------------------------ ------69
ANEXOD RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMCAS DE CEPA AISlADA DE
LECHE FERMENTADA---------------------------------------_-70
ANEXO E RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AtSLADA DE
REPOLLlTAS DE BRUSELAS tERMENTAOA ------------------------71
ANEXO F ANAUSIS DE REGRESION PARA pH EN BEBIDA SIN AVENA--- 72
ANEXO G- ANAUSIS DE REGRESION PARA pH EN BEBIDA CON AVENA --73
ANEXO H ANALISIS DE REGRESION PARA ACIDEZ EN BEBIDA SfN AVENA
ANEXO 1- ANALISIS DE REGRES[ON PARA ACIDEZ EN BEBIDA CON AVENA
ANEXO J- ANALISIS DE REGRESION PARA RECUENTO LACTOBACILOS
PARA 8EBItgtA SIN AVENA ~----------------------------------------wirEr
ANEXO K ANALlS1S DE REGRESION PARA RECUENTO LACTOBACILOS
PAFt BEBIDA CON AIlNA-------~-------~----------~------~---middot-----~-middot---irjr
INTRODUCCI6N
En los ultimos arios S9 ha comprobado los efedoS beneftcos que los
microorganismos probiotico$ ejercen sobre la salud humana a facilitar la digestion
de lactosa estimular 18 actividad inmungica modificar ef balance poblecional
tanto de la microbiola intestinal nativa can posibles sfeelos patogenos como de
las que causan toxiinfeCCiones alimentarias edemas se estan ensayando como
implante en heridas de piel para evttar contamlnacion can microorganismos
patogenos
Los microorganismos probi6ticos se emplean en fa elaboraci6n de productos
fermentados en especial los lacteos Estas industrias se han limitado a utilizar
cultivos iniciadores importados que rsquieren tiampo y culdados para su
manlpulacion y empleo En Colombia no se han realizado InY9s1igaciones que
involucren cepas nativas can activldad probiotica ni el afecto de ingredientes
prebi6tico$ sabre fa viabilidad de estos microorganismos tenienqo en cuenta que
al prebiotico es un ingrediente allmentario que estimula sefectivamente el
crecimiento y actividad de algunas especies de microorganismos probi6ticos
En esta investigacion se sislaron microorganismos probi6ticos a partir de
muestras de vegetales y lache crud a de vaca fermentadas naturafmente y de
mucosa humana utifizando medios de cultivo salactivos bajo condiciones
12
anaerobias Luego se procedio a verificar su rasistencia a los acidos gastricos y
sales biliares simulando asl las condiciones del tracto gastrointestinal de 10$
humanos Las capas que presentaron mejor comportamiento ante estas pruebas
sa caraeterizaron morfologles y bioquimicamente y sa seleccione una de eHas
para inocular en bebidas lacteas sin y can avena como ingrediente prebiotico y
verificar su viabilidad durante al almacenamiento
Los resultados de esta investigacion padren sar de gran irnportanoia para la
industria nacional de alimentos las univarsJdades con facultades relacionadas
can la salud y la alimentaci6n y para las entidades gubernamentales involucradas
en la alimentacion y nutricion de grupos de poblacion vulnerables tales como eJ
Instituto de Bienestar Familiar y Bienestar Social entre otros
13
middot~
1 MARCO TEORICO Y ESTADO DeL ARTE
11 P~OBI6TICOS
111 Historia
EI consumo de productos fermentados lecteos con microorganismos vivos
especialmente bacterias acido lacticas ha sido reportado a 10 largo de la historia
desde tiempos remotos se evidencia al conoeimiento de los beneficios que estes
proporcionaban perc real mente quian enfatiz6 en ellos fua 91 cienUfico ruso Elie
Metctinikcff que reaclon6 la ingesti6n de (eches fermentadas con la longevidad y
salud de las personas ( Pardio et al 1996)
En 1965 sa utilizo por primera vez et termino Probi6tico derivado dellatin pro
que significa a favor de y del gr9go bios que quiera decir vida tnieialmente esta
palabra defini6 a los microorganismos que promovian el erecimiento de otros
microorganismos Ivego se splico asta termino a extraetos de tajido que estimlilan
el crecimiento micrObianqEn la actuaidad sa han definldo como probiotieos los
cultivos (micas 0 mezclados de microorganismos vivos qua al ser ingeridos por
humanos Q animales majoran el balance poblacional de la microbiota intestinal
evitando la adherencia de patogenos (Schrezenmeir et albull2001) Sin embargo
estos microorganismos no nece_iamenta son habitantes propios del tracto
14
gastrointestinal (Holzapfel at a2001Gaitan at al 1998) p~r 10 tanto es
necesario consumir alimantos en los que se encuElntren estos mrcroorganismos
viables estos hacen parte de I~micfobiota de vegetales y leches interviniendo en
Ie fermentaci6n natural de estos~ntos
112 Microorganismos Probi6ticos
los microorganismos probi6ticos que tradicionatmente se han adicionado a la
tache para fermentarla y obtener yogurt y kumis a como suplementos pertenecen
a los generos Lactobacillus Enterococcus y Bifidobacterium (Ver tabla Nro 1) Sin
embargo se considera que solo algunas especies de los gelnsros Lactobacillus y
Bifidobacterium sobreviven en el tracto gastrointestinal En la tabla 1 58 muestran
algunas de estas especies
TABLA 1 Algunas especies microbianas probi6ticas
Lactobacillus Sifidobacferium Enterococcus
L acidophilus
L JohnsoN
L casei
L rhamnosus
Lgrasseri
L reuten
L plantarum
B bifidum
Blongum
B infantis
E fsecium
E faecalis
Fuente Gaitan et a 1998A
15
EI eonoeimiento a cerea de sus efeetos beneficos en el consumidor por su alta
viabilidad en el intestino como la producci6n de sustancias con aetividad
antieaneerigena el mejoramiento ltfel sistema inmunol6gico y el deSplazamiento
de la mierobiota pat6gena gastrointestinal en el consumidor ha estimulado una
mayor demanda de estos microorganismos como tambian de los productos que
los contienen (Heller 2001 Parada middot1998)
Existsn otros produetos fermentados de origen vegetal como et tampe col acida
y salsa de soya de los euales sa pueden aislar estos organismos probi6tieos
comp tambien de la mucosa intestinat humana y luego de suministrarlos a
ratones sa han comprobado sus caracteristicas beneficas (Molin 2001)
113 Caracteristicas fenotfpicas de algunos microorganismos
probi6ticos
las bacterias aeido lacticas de los generos Lactobacillus y Bifidobacterium son
consideradas probi6tieos y tradicionalmente se han clasificado con base en Sus
propiedades morfol6gicas crecimiento a diferentes temperaturas capacidad
fermentadora de glucosa y otros carbbhidratos y la configuraci6n del Bcido Jaetieo
producido (Holzapfel etal2001)
16
)lli~ h Dx nIILIOTECM
eJDe~~ l1ilmfJ tIDBnm
Los Lactobacillus son bacilas gram positiv~s no esparuladas aerotalerantes
acido - tolarantes estrictamente fermentadares formadores de Boido laclica como
producto principal catalasa negativo carentes de citocroma sin embargo se
presentan excepciones a esta descripcion parque afgunas especies pueden
formar catalasa 0 citacramo en medios que contienen hematina 0 compuestos
relacianados La produccion de catalasa no hema pseudocatalasa puede causar
tambien alguna confusion en fa identificacion de algunos Lactobacillus
las especies del genera Bifidobacterium san bacilos gram positivos no
esporulados generafmente anaerabios estricto$ aunque pueden creeer bajo
condiciones microaer6filas cuando estan ert presencia de C02 La mayorfa de sus
especies se pueden diferenciar par criterios biaquimicos simples como la
fermentacion de L arabinosa DmiddotxiJasa O-manosa O-manita y O sorbitat que
pueden servir coma caracterist1cas clave para su clasificacion (Holzapfel
etal2001 )
114 Caracteristicas de los probi6ticos
Las cepas de microorganismos prabi6ticos deben presenter y mantener unas
caracteristlcas que garanticen su crecimienta y supervivencia En el alimenta
como tambiEm durante su transito a traves del est6maga e intestino delgaQo
17
La primera CBtacterfstica es que sean viables esta viabifidad esla capacidad que
tienen los microorganismos probi6ticos de permanecer vivos tanto ~n el alimento
como en el Intestino del consumidor por un tiempo determinado En Colombia se
ha establecido que en bebidas fermentadas este tiempo debe ser minimo de 21
dras en el alimento (Minsalud 1986) Esta vjabilidad depende del metodo de
produccion y de la cepa utilizada (Tuomols at a 2001)
Luego de que se garantice que estos microorganismos eslan viVos en el alimento
ell os deben cumplir otro criterio importanle para ser considerados como
organismos probi6ticos y as tblerar las condiciones de acidez a un pH=2 y la
sccian de proteasas del est6mago ademas de sobrevivir y creeer en presencia de
acidos biliares (Tuomola et al 2001 Jacobsen at a 1999) para luego de
sobrevivir a estas condiciones adherirse a la mucosa intestinal y de esta manera
estimular al sistemainmunoJ6gico esta capacidad de adherirse a la mucosa es un
prerrequisito para la colonizacion del intestlno (Toumola etal2001 Alander et aI
1999)
Cuando los probioticos han pasado todas esta pruebas de supervivencia y luego
de impfantados en la mucosa producen acidos organicos peroxido de hidrogeno y
tambien bacteriocinas que actUan como inhibidore$ del crecimiento de
microorganismos patogenos u oportunistas (Tuomola at al 2001 Cintas et al
2000) complementando de asta manera su accion benefica sobre la mucosa
intestinal y en general sobre la saJud del huesped
18
116 Berieficios de los microorganismos probi6ticos
Los beneficios que se asocian a los microorganismos probioticos son muchos y
variados Entre ros comprobados mediante estudios se eneuentran
1151 Facilitar la digesti6n de la lactosa
los microorganismos probioticos cuando estan en el intestino liberan alii la
enzima pmiddotgalaotosidasa capaz de hidrolizar la lactosa haste glucosa y galactosa
evitando as que personas intolerantes a este carbohidrato presenten sfntomas
como flatulencia dolor abdominal y diarrea cuando consumen leche (be Vresse
et 81 2001)
1152 Protegen contra enfermedades gastrointesUnales
EI consumo de aJimentos con probioticos ha mostrado efeeto terapeutico frente a
los sintomas de diarrea asociada al surninistro de antibi6tico$ de amplio espectro
que destruye 0 disminuye la microbiota endogena esta imp ide la coJonizacion de
bacterias patogenas como Klebsiella oxytoca y Clostridium difficile que pueden
causer lesiones en el cn Los probi6ticos recuperan el balance de la microbiota
intestinal nativa y avitan Ie adhesion de algunos virus bacterias pat6genas a
parasitos que pueden ser agentes causales de gastroenteritis la diarrea del
19
J
viajero y 1(3 inflarnacion intestinal que en ultima instaneia oeasionan ef sfndrome
del colon irritable (Marteu et al 2001)
1153 Protegen contra infecciones del tracto urogenital
La vaginitis indueida por baeteriss yo por levaduras as una infecci6n
estrechamente relacionada con la exposici6n a antibi6ticos y espermicidas y
tambien depende del estado hormonal de la n1ujar Con al uso de mezcJas de
probi6ticos se han obtenido buenos resultados en la rastauraci6n de la rnicrobiota
natural urogenital benefica que desplaza a los eausantes de la inflamaci6n de Is
vagina y Ie uretra (Reid 2001 )
1154 Promueven la barrera de defensa end6gena del intestino
EI tracto gastrointestinal normal mente as una barrera natural contra anUgenos de
origen microbiano y alimentario Cuando los probi6ticos sa adhieren a Is mucosa
intestinal estimulan 0 potencian al sistema inmune favoreciendo la
inmunomodulaci6n que induce un aumentb de fa producci6n de inmunoglobulinas
activacion de las calulas mononueleares y de los linfocitos para proteger al
huesped de infeeciones (Isoulari et sl 2001)
20
1155 Protegen contra cancer de colon
EI cancer es el resultado de una serie de mutaciones somaticas que pueden
ocurrir durante al tiempo de vida del individuo y 10 padeca buena parte de la
poblacion mundial los probi6ticos en un sistema in vitro han demostrado un
efecto positivo en la prevenci6n de mutaciones aI desactivar carcin6genos
genotoxicos (Wolloswski et al J 2001)
1156 Protegen contra infecciones respiratorias
Sa ha demostrado que el conslJlno de probi6ticos disrninuye la incidencia de
infecqiones raspiretorias al aumentar la actividad fagocitica de maer6fagos
alveolares que aettian sobre microorganismos patogenos Se hizo un estudio en
571 ninos sanos con edades entre uno y seis anos divididos en dos grupos a uno
de ellos sa las incluy6 en su dieta leche suplementada can Lactobacillus GG y a
los otros ninos leche no suplementada AI final del estudio se observ6 una
disminucion del 19 en la incidencia de infeccionas respiratorias tratadas con
antibi6ticos tales como otitis media sinusitis bronquitis y neumonfas en el grupo
de los ninos que consumieron Lactobacillus GG (Hatakka et al 2001)
Alvarez et al (2001) encontraron que la administraci6n de yogurt con Lactobacillus
casei en ratones de tres arios de edad majora los espacios libres del puJrn6n de
la presencia de Pseudomona aeruginos8 induciendo un aumento
21
significativo en los niveles de gA a IgM datactadas en los lavados
broncoaJveolares y se observ~ un afecta dependiente de la dosis
1157 En el tratamientoy prevenci6n del eczema
Se ha encontrado que el consumo de probi6ticos mejora la inflamaci6n alergica 0
eczema at6pico en ninos alimentados con formula suplementada con probi6ticos
Encontraron una mejora significativa al suministrar Bifidobacteriummiddot actis y
Lactobacillus GG en 27 niiios con edad promedio de 46 meses Luego de aplicar
este tratamiento se sometieron a una prueha de SCORAD (mide fa extension y
gravedad del eczema) registrando una meJoria significatlva en las condiciones de
la pie concentraci6n de citoquinas cirClllantes an sueto y moleculas de adhesi6n
a las superficies de las celulas soJubles en suero (Isolari 2000)
Se realizaron otros estudios a 159 mujeres embarazadas con historia familiar de
eczema atopico de primer grado a las cuafes sa res 5uministro dosis diarias de
Lactobacillus GG durante 2 a 4 samanas previas al parto Oespues de ella fa
madres twiaron la opci6n de continuer tomando el ptobi6tico si amamantaban 0
bien darseio vIa oral La mayoria de las madras eJigieron dar las dosis at bebe
diariamente A los dos anos de vida se observ6 una disminuci6n del 50 en la
frecuencia del eczema at6pico en aquellos nHies que se les dio ef probi6tico
(Kalliomari etal 2001)
22
1158 Previenen infeccion en heridas quirurgicas
Los probi6ticos impiden la union de pat6genos a las superficies celulares en
heridas mediante la seCreci6n de proteinas Actuamente se encuentra en
estudio la aplicaci6n del Lactobacillus fermentum vivos sabre heridas en piel de
ratas y se ha encontrado una disminuci6n del 90 en la colonizaci6n par parte del
StaphylococcuS aureus uno de los patogenos mas temidos y de mayor lncidencia
en infecciones hospital arias mas aun se esta contempiando la posibilidad de
utilizar la protein a purificada an lugar de los mjcroorganismos para la protaccion
contra infecciones en heridas (Strauss 2000)
12 PREBIOTICOS
Son carbohidratos de cadena corta algunas veces reconocidQs como
oligosacaridos no digeribles par las enzimas del epitelio intestinal 0 de las
gliJnduJas anexas debido a su estructura quimica y de esta manera lIegan al
intestino grueso donde alcanzan a estar disponibles para la fermentaci6n por las
bacierias sacaroHticas que son especial mente laetobadlos y bifidobacterias
dando odgen a compuestos que ejercen efectos funcionales sobre la mucosa del
tubo digestivo (Brunser 2001)
Se consideran como tal algunos fructocligosacaridos isomaltooligosacariclos
oligomato palatinosa poHdextrosa pOJidextrrna raftilina y algunos oligosacaridos
23
)
de 1a soya y fa avena Estenmiddot presentes en alimentos como Ie cebolla ajo
banano puerros 1 derivados del trigo achicoria esparrago alcachofa (Cummings
etal 2001)
Algunos de estos prebi6ticos cuanda son incorporado$ a fa dieta en cantidades
dalerminadas alteran la microbiota intestinal disminuyendo los recuentos de
coliformes bacteroides y cocos y aumentando las bifidobacterias hasta en diez
veces ademas modifican la actividad metab6lica del coron logrando una
disminuci6n del pH y un incremento en el contenido fecal de acidos grasos de
cadena corta como at acatica propi6nico y butfrico El butirato aumen~ _I grosor
de la pared del coron e intestino delgado estimula eJ crecimiento de la mucosa del
colon y auManta su flujo sangufneo inhibe el crecimiento de tinsas tumorales
epiteliales de origen co16nico induce la diferenciaci6n de sus celulas y a
apoptosis entre otros(Brunsar 2001)
Eh estudios hechos en simuladores del intestino humano utilizando productos de
avena fermentados se encontro que estimularon al crecimiento tanto de
lactobacios como de bifidobacterias y en el caso de estas ultimas se incremento
la producci6n de los acidos acatico propionico y butfrico 10 que incide sobre la
implantacion de probi6tico$ e inhibe al crecimientos de otro tipo de
microorganismos (Alal1der eta1999 Kontula etal 1998 Jaskari etal 1998)
24
~ -1
(
AI comparar el comportamianto de las leches de diferente origen se ha
demostrado que Ie leche de vaca contiene caseinatos sustancias que forman
buffer ~n et intestino e inlpiden que los probi6ticos disminlJyen el pH del intestina
y de esta manera se impide al efecto deseado que es evitar fa proliferaci6n de
otros microorganismos entre los cuates pueden estar algunos patOganos En la
leche materna sa encuentran algunos carbohidratos como glucosa galactosa n
acetilglucosamina y algunos 0lig6meros de Ie fucosa en cOhoontracionesmiddot
importantes los cualeS favoreceh el crecimientc)middot de probi6ticos esto
complementado can 91 bajo contenido de protenas que se traduce en una
reducida capacidad buffer hacen de Ie lache materna IJn alimentd adecuado para
nllios en su etape de lactancia
Algunos prebi6ticos como 1a lactulosa yciertos compuestos que contiansn fructosa
no son digeridos en el intestino humano y pueden sar utilizados selectivamenta
par los probi6ticos 10 que hace que los probi6ticos en combinaci6n can prebi6ticos
pueden lIegar a ser un importante medio para prevenir algunas enfermedades del
tracto gastrointestinal (Bezkorovainy 2001)
25
2 METODOlOGfA
21 LOCALIZACION
EJ trabajo sa realizo en el laboratorio de Microbiologia y la planta da laches de Ja
Universidad Naclonal de Colombia- Secie Medellin
En al laboratorio se hiZQ al aislamiento a identificaci6n de fa capas y en fa Planta
sa eJaboro la leche fermentada con 1a cepa seleccionada y el prebi6trco
22 METODOS
221 Aisiamiento de cepas nativas
Las cepas nativas se sislaran de producto$ vegetales leches fermentadas y
mucosa vaginal humana
2211 De vegetales
Las muestras vegetales de repollo repollitas de brusefas y pepino se
seleccionaron porcionaron y mezclaron can cloruro de sadio al 10 pIp se
calacaron en un recipienta de vidrio balo anaerobiosis y sa dejarQn por 15 dias
26
luego S9 tomaron 3 ml de cada muestra y se jnocularon 9 ml de caldo MRS (Man
Rogosa and Sharpe) se incubaron a 37deg C durante cinco dias en camara de
anaerobiosis (Ver Figura 1) Oespues de este tiempo sa inocularon cajas de petri
con agar MRS con 1 ml del cultivo microbiano y se incubaron bajo las mismas
condiciones que eJ caldo Este procedirniento se realiz6 rapetidas veces hasta
seleccionar la cepa pura mediante observaci6n de caracteristicas morfologicas de
la cOlonia y a cada colonia se Ie practico la coloracion de gram con el fin de
observar las caracteristicas microscopicas de cada una e identificar las de mayor
similitud a los Lactobacilos y Bifidobacterias
Figura 1 Camara de anaerobiosis
27
2212 De la leche
Sa tomo 200 ml de teche cruda de la planta de leches y se colaca a fermentar
baja anaerobiosis durante 15 dras Luego sa procedia como en los vegetales
2213 De mucosa vaginal humana
Se tomo una muestra de frotis de mucosa vaginal humane can capito esteril sa
puso a ncubar en Caldo MRS y se procedi6 camo en 2211 y 2212 A cads
aislado sa Ie practico la coloracion de gram y sa seleccionaron aquellas que eran
bacilos gram positivos (Ver Tabla 2)
28
TABLA 2 Fuente de aislarniento de cepas nativas
CEPA FUENTE
1 Pepino fermentadQ
2 repollitas de bruselas fermentadas
3 Repolltgt fermentado
4 Repollo fermentado
5 Mucosa va~inal humana
6 Mucosa vaginal humana
7 repollitas de bruselas fermentadas
8 Repollo fermentado
9 repollitas de bruselas fermentadas
10 Mueo~a vaginal humana
11 Repollo fermentado
12 RepolJo fermentado
13 Leche fermentada
14 Mucosa vaginal humana
15 repollitas de bruselas fermentadas
16 Repollb fermentado
29
222 Almacenamiento de las cepas aisladas
Cuando las cepas crecieron en agar MRS homogEmeas en color morfologia
coloraci6n de Gram etc se pssaron a agar inclinado en tuba se cubrieron con
aceite mineral y se guardaran en refrigeraci6n a 4deg C para tomar de alii la cepa y
efectuarle las diferentes pruebas para confirmar el genera y determinar la especie
de cada una de eas (Ver Figura 2)
Figura 2 Cepas en tubos con agar inclinado
30
223 Pruebas para determinar et genero
2231 Coforaci6n de Gram
A cada cepa sospechosa de Lactobacilos se 1e hizo la coloraci6n de gram y se
seleccionaron las gram positivas
2232 Morfologfa
En agar MRS y despues de incubar en anaerobios~s crecian colonias grandes
cremosas de color beige con bordes homogeneos y c6ncavas(Ver Figura 3)
Figura 3 Colonias aisladas en agar MRS
31
2233 Prueba de esporulaci6n
A cada cepa aislada se Ie hizo esta prueba la cuel consistia en incubar en
aerobiosis durante ocho dias las cajas de agar MRS donde crecieron colonias de
Lactobacilo$ y luego se les (ealize) coloraci6n de espora Las capas que dieron
negativa a la prueba de espora se considararort sospechosas de sar Lactobacilos
y se continuo con la prueba de la catalasa (Ver Tabla 3)
2234 Prueba de la catalasa
los lactobacilos carecen de catalasa Eata prueba se hizo tomando una colonis
se deposito en vidrio de reloj y se Ie adicion6 dos gotas de peroxida de hidr6geno
(H202) la que no presentaba efervescencie eran cepe sospechosa de ser
Lactobacilo (Ver Tabla 4
Sa seleccionaron las capas euyo resultado fue aeorde con el genera Lactobacilfu$
y se continuo con la comirmaeion del genera y determinacion de la eSpecie
meqiante las pruebas bioqulmicas
32
224 Prueba para determlnar la especie
Para confirmar el genero y determinar la especie de las diferentes capas aisladas
se hizo una caracterizaci6n bioqufmica utilizando un kit de API 50 CHL Medium
Ref 50 410 que contiene una galed8 de medios que permite realizar el estudio
de fermentaci6n de los 49 azucares de 52 especies de Lactobacillus (Ver Figura 4
y tabla 5)
Figura 4 API CHL 50-Prueba bioquimica
33
225 Pruebas para determinar microorganismos probi6ticos
2251 Resistencia a pH=2 y sales biliares de concentraci6n O3pv
A las cepas idantificades como Lactobacillus brevis y Lactobacillus pantarum sa
las realiz6 Ie prueba dfl resistencia a pH=2 y sales biliares de concentraci6n 03
pv ( Jacobsen et al 1999) Una colonia de cada cepe aislada se inocul6 en 4 mt
de caldo MRS durante cinco dras bajo condiciones de anaerobiosis Oespues de
esta tiempo se dejaron pracipltar los microorganismos por sedimentaci6n se Ie
retire el sobrenadante y al precipitado se Ie adicion6 Sml de caldo MRS
previamente ajustado a pH=2 can seido clorhfdrico (HCI) dentro del mismo tuba de
ensayo G igual sa hizo can otro tubo previamente incubado pero a este se Ie
adiciono 5ml de caldo MRS con sales biliares a una concentra~i6n de 03 plv y
ambos se incuberon a 37deg C por 2 haras Sa midio 01 mi de cada uno de los
tubas al tiempo 0 y a las 2 horas y sa inoculeron en superficie en caJas de petri
con agar MRS S9 incubaron a 37deg C bajo anaerobiosis durante 48 horas Se
compararon visualrrente en cada caja de petri el crecimiento en superficie y las
que presentaron crecimiento en tos dos tiempos (0 y 2 horas) tanto en at media
acido como en sales I se consideraron resistentes a pH=2 y sales biliares (03
pv)
(Ver Tabla 6)
34
226 Conservacion
Todas fas capas que habian dado positiva Jas pruebas anteriores y que reaultaron
resistentes a pH=2 y sales biliares 03 pv y despues de identificadas en API 50
CHL sa repicaron en agar MRS en tuba inclinado y despues de Incubar a 37deg C
por 48 horas bajo anaerobiosis se Ctlbrie el biser completamente can aceite
mineral esteril y sa guardaron en refrigeraci6n
227 Elaboracj6n de fa bebida fermentada
2271 Preparaci6n de la mue$tra
Sa tome 1 mt de caldo MRS previamante inoculado e incubado que presentaba
una concentracion de Lactobacillus brevis de 27x108 Iml segun la escaJa de Mac
Farlan y sa adiciono a 9ml de leche pasteurizada en un tubo sa dej6 incubanda
en anaerobiosis por 48 hores Luego se pasaron estos 10 ml a un frasco qua
cont~nie 90 ml de leche pasterizada y se dej6 incubando par 48 haras en
anaerobiosis
35
2272 Adici6n del inOculo
A 900ml de leche pasteurizada se Ie adicion61os 100 ml de leche que habia sido
previamente ino(ulada dos veces con la cepa posteriormente se deja
fermantando la lache a temperatura de 37deg C
2273 Control de Ja fermentaci6n
Las muestras se hicieron por cuadruplicado y se les hizo un seguimiento de
aoidez hasta un valor entre 04 y 05 expresada como Bcido lactico esta
procedimiento corresponde a la babida fermentada sin prebi6tico La bebida ~on
prebi6tico tiene al mismo proeedirnianto pero adicionalmente se agrag6 avena a
una concentraci6n de 05 en el momento de la adici6n del in6e410 a los 900 ml
de leehe pasteurlzada y el procedimiento sigui6 igual al de la bebida sin prebi6tico
tambien se hizo por cuadruplicado
2274 Refrigeracl6n
Despues que las mezclas con y sin prebiotico alcanzaron el de acidez
requarido se IIeva ron a refrigeraci6n a una temperatura de 4deg C p~r 24 horas
para frenar proce~os metab6licos de los microorganisrtlos Despues de este
ti~mpo se procedi6 al batido
36
1 2275 Batido
Con un agitador se procedi6 a batir las bebidas para romper et coagulo formado
y de esta manera homogeneizar la mazela y obtener asf la bebida fermentada
2276 Envasado y almacenamiento
Ambas bebidas se envasaron en frascos vidrio para hacerles seguimiento de pH
acidez(expresado como acido tacticol y recuento de Lactobacillus breviSf los
dies 27 14 Y 21 despues de elaboradas las bebidas perfodo durante el cualta
muestra permanecfa afmacenada a temperatura de refrigeracion(Ver Figura 5
37
Fjgura 5 Diagrama de Flujo
PREPARACION DE LA MUESTRA
ADICION DEL INOCULO
~_____~_B~ATIDO~______~
INCUBACION 37deg C hasta acidez = 04-05 acido laotico
ENFRIAMIENTO
hasta 4 0 C ~------~ ~------~
ENVASADO Y ALMACENAMJENTO
dUrante 21 dfas a Temperatura 4 0 C
38
1
228 Determinaci6n del pH
Se determino por el metoda potenciometrico en un pH-metro manual durante los
dias 2) 7 14 Y 21 de las bebidas lacteas sin y con prebi6tica (Ver Tablas 7 y 8)
229 Oeterminaci6n de la acidez (Expresadfl como acido
lactica)
Se tomaron 9 mJ de las bebida~ sa Ie adicionaron 2 gotas de fanoftaleina como
indicador y sa titulo fa acidez con NaOH 01 N hasta la aparicion de un cotor rosado
debit EI volumen de NaOH utilizado se reporta como valor de de acidez
(VerTablas 10 y 11)
2210 Prueba de viabilidad
Qurante el perfoda de almacenamiento de la bebida lactea se procedi6 a hacer la
prueba de viabiHdad en los dias 7 14 Y 21 para determinar Si los lactobacilfus
permanecfan vivOs a una concentraci6n minima de 106 hasta el dia 21 como 10
establece eJ Articulo 10 de la Rasolucion 2310 del Ministerio de $alud de
Colombja
39
Para asta prueba se tamaron 10 rnl de muestra y se adicionaron a 90 ml de caldo
MRS ruego a partir de esta se hicieron diluciones de 10-2 hasta 10-11 de las
diluciones 109101deg 10-11 se inocul6 1 ml de cada uno en agar MRS siguiendo el
metodo de siembra en profundidad y por duplicado e incubando a 370 C x 5 dras
en anaerobiosis y luego se hicieron tos recuentos por duplicado para esi reportar
los recuentos promedio (Ver Tablas 13 y 14)
2211 AniUisls microbiol6glco de las bebidas Iicteas(con y sin
avena)
Con el fin de determinar las condiciones higienico-sanitarias del producto se
realizaron las pruebas microbiol6gicas de Recuento de mohos y fevadurasml en
agar OGY Recuento en superficia de Staphylococcus coagulasa positivoml en
agar Baird Parker Numero Mas Probable (NMP) de coUfor-mes totales y
Escherichia coliml en caldo Fluorocult y Presencia de Salmonela25ml con BHI
caldo tetrationato y agar Hecktoen (Montoya 1999)
(Var tabla 16)
2212 AnaUsis estadistico
A los datos obtenidos en la medici6n de pH acidez (expresada como Beido
laclico) en los dras 2714 Y 21 y el recuento de Lactobacillus en los dras 714 y21
40
realizados a los dos tratamlentos se tes aplic6 1a prueba t porque solo difieren
en la presencia 0 ausencia del prebi6tico para evaluar si habra diferencia
estadfsticamente significativa para los dos tratamientbs(Ver Tablas9 12 y 15)
41
3 RESULTADOS Y DISCUSION
31 Coloraci6n de Gram y morfologfa
Las cepas aisladas fesultaron Gram positivas (Ver Figura 6) colonias grandes
cremosas dE) color beige con bordes homogeneos y c6ncavos en su
morfologia (Ver Figura 3) resultando de acuerdo a 10 especificado en Stanley
1989 para Lactobacillus
32 Prueba de esporulaci6n y cataJasa
Los resultados de la pruebas de esporulaci6n y catalasa indicados en las
Tablas 3 y 4 respeclivamente dieron conforme a 10 especificado en Stanley
1989 para Lactobacillus
42
1
2 3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
TABLA 3 Resultado de prueba de esporuJaci6n
CEPA RESULfADO ESPORULACION
-- -------------
43
l i ~II bull ~ I I
TABLA 4 Resultado prueba de la catalasa
CEPA RESULTADO CATALASA
1 -2 -3 -4 -5 -6 -7 8 -9 -10 -11 12 -13 -14 -15 -16
3~3 Prueba para determinar la especie
Oespues de hacer las pruebas para seleccionar las cepas sospechosas de ser
Lactobacillus se realizo las pruebas bioquimicas fograndose identificar
Lactobacillus plantarum aislctdo de pepino repollo y repollitas de bruselas
44
fermentados y Lactobacillus brevis de mucosa vaginal y leche fermentada (Ver
Anexos del A al E y Tabla 5)
TABLA 5 Resultado identlficaci6n cepa~
CEPA NOMBRE
1 Lactobacillus planfarum
3 Lactobacillus plantarum
5 Lactobacillus brevis
13 Lactobacillus brevis
15 Lactobacillus plantarum
34 Pruebas para determinar microorganismos probi6ticos
las cepas de Lactobacillus brevis y Lactobacillus plantarum mostraron
rasistencia al medio acido de pH =2 Y sales biliares 03 pv resultado similar al
encontrado por Jacobsen et al 1999 para Lactobacillus plantarum (Ver tabla 6)
45
middot
~~~ttiI lltlmiddot~COX~dtJ ~xtc_~ 2 tr~ k-JlL~middot
-)~~TO DE lJIBUOTECUl rjRL]OTtCA twn GO1IU1
TABLA 6 Resultados a pruebas de resistencia a pH=2 y sales biliares 03 plv
CEPA RESISTENCIA pH=2 RESISTENCfA A SALES BIUARES ()3 pv
1 + +
2 + +
3 + +
4 + +
5 +
6 + +
7 + +
8 + +
9 + +
10 + +
11 + +
12 + +
13 + +
14 +1shy +M
15 + +
16 + +
+1 crecimiento debil
+ crecimiento abundante
46
Figura 6 Lactobacillus brevis Gram + aislado de leche fermentada
Ai observar en placa las celulas de lactobacilos despues de real1zar las pruebas
de resistenCia a la acidez y sales biliares se observo una tendencia a aglomerarse
posiblemente como un mecanismo de proteccion cOlitra estos medios que pueden
lIegar a ser adversos para elias (Ver figuras 7 y 8)
47
Figura 7 Lactobacillus brevis aislada de leche fermentada despu~s de la prueba de resistencia a pH=2
Figura 8 Lactobacillus brevis aislada de leche fermentada despues de la prueba de resistencie asales biUares 03 plv
fI
48
35 --Seguimiento del-pH-en-la-bebidaJacteacon y sin -prebi6tico
A continuacion se muestran las Tablas 7 y 8 donde sa registian los datos
recopilados de pHdurante 10$ dras Z 7 14 Y21 para las bebidas laaeas con ysin
prebi6tioo
TABLA 1 ResultadopH yogur sin avena
Dia Repetition 1 Repetici6n 2 Repeticion 3 Repetici6n 4
2 526 501 51 52
7 446 433 438 44
14 439 435 437 436
21 439 437 438 437
TABLA 8 -ResultadopHyogur con avena
Dia Repeticion 1 Repeticion2 Repeticion 3 - Repeticion 4
2 509 523 51 515
7 447 442 445 442
14 436 -438 439 437
21 432 433 435 434
Observando la Figura 9podamos ver que el pH en el -dfado$ para los dos
tratamientos as igual y empieza a descender rapidamente para estabilizarse a
partir del dra 7(Ver figura 9)
49
Figura 9 Comparacj6n de medias para -el pH
Comparaci6n de medias para pH
55 ~ 5 +----=gtIIIi-~i~~----=-r--it~ -- pH sin avena
a 45 1--~~~~=~~ 4 --- pH con
avena35 t-----r-- -------=------=--= ------- - ----
2 7 14 21
Dias
Aplicando la prueba t para comparar las medias de pH I S6 muestia una diferencia
altamants significativa en los dos tratamientos para el dia 21 (pltO05)
(Ver tabla 9)
TABLA 9 Compaiaci6n de medias para pH
DtAS SIN AVENA CON AVENA te p (VALOR)
2 514 514 0 10
7 439 444 -1 61 0159
14 437 I
438 -070 0510
21 438 433 528 00019 shy
- DiFERENCIA AlTAMENTE SIGNIFICATIVA
50
I
AI aplicar regrasi6n a los datos sa obtiene al modelo estimado
pHSinAyena =535606 - 01505650Ia +0005044340IaI2
La variabilidad en la respuesta de pH asta siendo explicada en un 8S7522 por
el modelo (Ver Anexo F)
EI tratamiento con avena mostro el siguiente modelo al analisis de ragresi6n
pHConAvena =534463 ~ 0140407Dia + 0004480980Ia2
La variabilidad an la respuesta de pH asta siendo explicada en un 903315 par
el nlodelo(Ver anexo G)
36 Seguimiento de la acidezmiddotmiddot expresada comomiddot de acido
lactico
A continuaci6n sa muestran las Tablas 10 y 11 donde sa registran los datos
tecopilados de acidezmiddotdurante los dias 27 14 Y 21 para las pebidas taetees con y
sin prebi6tico
TABLA 10 Resuttadode acidez (expresadocomo acido tactico) yogurt sin avena
CIA R~petici6n1 Repeticion2 Repetici6n 3 Repeticion 4
2 054 06 057 058
7 072 074 073 0]2
14 080 083 082 082
21 0]4 079 078 077
51
TABLA 11 Resultado de aCidez (expresado como acido Icktico) yogurt con avena
Dia Repetici6n 1 RepetiCi6n 2 Repetici6n 3 Repetici9n 4
2 059 055 058 057
7 071 073 072 072
14 089 087 088 086
21 092 091 090 091
Observando la Figura 10 se puede concluir que la acidez empieza a aumentar
hasta el dia 14 y luego trata de estabilizarse para los dos tratamientos
(Ver figura 10)
Figura 10 Comparaci6n de medias para la acidez
N G)
Comparacion de medias para acidez
1
2 0I 5 -+--=--------=-~~~= u
ltC
- Acidez sin avena
2 7 14
Dias
52
21
-it- Acidez con avena
Aplicando la prueba t para camparar las madias de acidez se muestra una
diferencia altarnante significativa en los dos tratamiantos para los dias 14 y 21
(pltO05)
(Var tabla 12)
TABLA 12Comparaci6n de medias para Acidez
DIASmiddot SIN AVENA CON AVENA te p(VALOR)
2 0572 0572 0 10
7 0727 0720 119 0278
14 0818 0875 -638 000070shy
21 077 091 -1212 i 0000019 shy
DIFERENCIA AL TAMENTE SlGNIFICATIVA
AI aplicar r~gresi6n a los datos se obtiene el modelo estimado
AcidezSlnAIena = 0491897 + O0436032Dia O00144613DfaA2
La variabilidad en la respuesta de acidez asta siendoexplicada en un 970978
por al modelo (Ver anexo H)
EI tratamiento con avena mostro elsiguiente modeloj a1 analisis de regresion
AcidezConAvena = 0491638 + 00406572Oia - OQOO982559OiaA2
La variabilidad enla respuesta acidez esta siendo explicadaen un 99212 por
el modelo (Ver anexo J)
53
I ~
37 Prueba de viabiJidad
A continuaci6n sa muestran las Tab~as 13 y 14 donde sa presentan los datos
recopilados del recuento de Lactobacilos durante los dias 7 14 Y 21 para las
bebidas lacteas con y sin prebi6tico
TABLA 13 Recuento de Lactobacilos (UFCml) yogurt sin avena
Dia Repetici6n 1 Repetici6n 2 Repeticion 3 Reptttici6n 4
7 1880X10l1 1454X1011 1642X1011 1780X10~
14 1560X10~ 646X1011J 1890X10l 140X10l1
21 1200x10lu 128Ox10u 1745x10J 1520x101V
TABLA 14 Recuento de Lactobacilos (UFCml) yogurt con avena
Dfa Repetieion 1 Repetici6n 2 Repeticion 3 Repeticf6n 4
7 1600X10lt 1240X10t 1640X10ll 1980X10t
14 540X1011 427X10n 546X10n 720X10ll
21 500x1011 492x1011 712)(1011 980x10~
AI analizar la Figura 11 sa puede observar un recuento mayor de Lactobacilos
en al tratamiento con avena resultado de acuerdo a 10 encontrado por Alander at
aI 1999 Kontula et aI 1998 y Jaskari et aI 1998
54
Figura 11 Comparaci6n de medias para Log Lactobacillus
Comparacion de medias para log Lactobacillus
~ 1350
-+- Sac Sin--() 13 co avenaIII
bull 125 -- Bac con 0)
0 12 avenaJ
115 7 14 21
Dias
Aplicando la prueba t para comparar las medias de recuento de Lactobacillus no
se encontr6 una diferenc1a estadfsUcamente significative entre los dos
tratamientos (Ver tabla 15)
Este aumento en al racuento influy6 en la disminuci6n del pH y en el aumento de
fa aeidez por la fermentacion que realizan los Lactobacillus sobre fa lactosa de la
lache y la avena adicionada como prebi6tico
55
1
TABLA 15 Comparaci6n medias lag Lactobacillus
DIAS SIN AVENA CON AVENA tc p(VALOR)
7 122257 122022 04846 06451
14 121065 132393 -19602 00977
21 129025 133087 -08236 04416
At aplicar regresion a los datos se obtiane al modelo astimado
LactobacillusSinAvena= 117347 + 004834640Ia
La variabilidad en la respuesta del recuento de LactobaCillus ssta siendo
explicada en un 260054 por el mod$loVar anexo J)
EI tratamiento con avena mostr6 al siguiente modalo al anal isis de regresion
Lactobacillu$ConAvena =118103 + 007903040Ias
La variabilidad en la respuesta de recuento esta siendo explicada en un 3068
por al modelo(Ver anexo K)~
38 Analisi$ microbiol6gicos de las bebidas lacteas con y sin
En la Tabla 16 estan recopilados los resultados microbiol6gieos obtenidos en ras
muestras con los dos tratamientos (con y sin avena)
I [
sa
TABLA 16 Resultados analisis microbiologico
Recuento de mohos y levaduras Iml lt10
Recuento de Staphylococcus coagulase positiva Iml lt100
NMP coliformes fotales y Escherichia coli Iml lt3
Presencia de Salmonella25ml Ausente
Los resultados de este analisis demuestran que las bebidas fermentadas con y
sin avena~ astan fibres de microorganismos patogenos
57
1
4 CONCLUSIONES
Se aislaron cepas nativas de Lactobacillus plantarum de las muestras vegetates
de repollo pepino repollitas de bruselas fermentadas y Lactobacillus brevis de
lache fermentada y mucosa vaginal humana Ambas cepas resistieran un pH=2 y
una concentraci6n de sales biliares det 03 ptv dos earacteristicas importantes
en los probi6ticos
Lamiddot cepa de Lactobacillus brevis aislada de lache Sa utiliz6 para elaborar una
bebida fermentada sin y con avana comoingrediente prebiotico obteniendose un
aJimento centon recuento del probi6tico viable durante 21 dras de seguimiento
ademas libre de microorganismos )at6gen05
No se encontr6 efecta significativo de la avena sobre Ie viabilidad del Lactobacillus
brevis aunque sa presento un aumento en 61 recuento de estos en la bebida con
avena
58
plusmn ~
5 RECOMENDACIONES
Ensayar la cepa de Lactobacillus plantartJm en productos carnicos madurados
como el salami
Ensayar la cepa de Lactobacillus l)revs en otros derivados lecteos como queso
quesito queso crema
Continuar con el estudio de estos microorganismos y caracterizarlos
molecularmente ademas de estudiar su capacidad de adherencja a fa mucosa
intestinal sobre algunes Hneas celulares como las CaCo~2
Estudiarel efedo de la avena sabre la viabiJidad del Lactobacillus breyis a una
concentraci6n mayor de 05
Realizer ensayos can las cepas de Lactobacillus brevis y Lactobrlcillus pJantarum
para elaborar masas acidas para panificacion reemplazando el Bromato de
Potasio aditivo prohibido desde marzo del 2003 en nuestro pais per 5U toxicidad
59
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65
ANEXOS
66
ANEXO A RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AlSLADA DE i
PEPINO it
Referencia Pepino 1 Fecha 06122002
IEXCELENTE IDENTIFICACION
Latto plantarum 1
Galeria API 50 CHL V50 Leida el 06122002
Perfil - -- - ++ - -- - ++++ - - -+- + - I I I I I I I I +t+ - +f- ~ - - + + ~ - - - +- + - shy
o - GLY - ERY DARA - LARA + RIB + DXYL - LXYL - ADO - MDX - GAL + GLU + FRU + MNE + SBE - RHA - DUL - INO bull MAN + SOR - MDM + MUG shyNAG + AMY + ARB + ESC + SAL + CEL + MAL + LAC + MEL + SAC + TRE + 1NU - MLZ + RAF + AMD - GLYG - XLT - GEN + TIJR + LYX - TAG - DFUC shyLFUC - DARL + LARL - aNT + 2KG - 5KG shy
--- Taxones significativos rd -----T -- Tests en contra
Lactoplantarum 1 999 092 1
Taxon siguiente Lactobrevis 1 OJ 044 3
i i
Lactoplantarum 1 1 test (5) en contra
D-SORBITOL (SOR) 78
Tax6n siguiente Lactobrevis 1 3 test (s) ert contra
METHYLD-MANNOSIDE (MOlM) 0 MELEZITOSE (MLZ) 14 D-TURANOSE (TUR) 14
67
ampb
ANEXO B RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AISLADA DE REPOLLO FERMENTADO
~
Referencia Repollo fermentado - 3 Fecha 03072003
EXCELENTE IDENTIFICACION
Lactoplantarum 1
Galena API 50 CRL V50 Leida el 03072003
Perfil - - ++ - - - - -H++ - - ~ + - + - I I 1 I I I I -H+ - ++ - - - + + - -- - - + - shy
o - GLY - ERY - DARA - LARA + RIB + DXYL - LXYL - ADO ~ MDX - GAL + GLU + FRU + MNE + SBE ~ RHA - DUL - INO - MAN + SOR - MDM + MDG shyNAG + AMY + ARR + ESC + SAT + CRL + MAL + LAC + MEL + SAC + TRE + lNU - MLZ + RAF + AMI) - GLYG - XLT - GEN + TOR + LYX - TAG - DFUC shyLFUC - DARL - LARL - GNT + 2KG - 5KG shy
------Taxones significativos _ _----- Id--- ---T---- Tests en contra
Lactoplantarum 1 999 095 1
Tax6n siguiente Lactobrevis 1 01 OA8 3
lJactoplantaru01 1 1 test (s) en contra
DSORBITOL (SOR) 78
Taxon siguiente Lactobrevis
METHYL-D-MANNOSIDE D-TURANOSE
1
(MOM) (TOR)
3 test (5) en contra
0 MELEZITOSE 14
(MLZ) 14
i
I
68
ANEXO C RESULTADO PRUEBAS BIOQUWICAS DE CEPA AISLADA DE MUCOSA HUMANA
Referenda Mucosa - 5 Fecha 27012003
BUENA IDENTlFICACION
Galeria API 50 CHL vso Leida el 270112003
Perfil - - - - +t--t - - - + - + - - - - - - - - -+- - - - - + - + - - - - - - - - - - - - - bull - - -+ - +
o - GLY ~ ERY - DARA bull LARA + RID + DXYL + LXYL - ADO bull MDX - GAL + OLU - FRU + MNE - SBE - IlliA - DUL - INa - MAN - SOR - MDM - MOO shyNAG + AMY - ARB - ESC ~ SAL bull CEL - MAL + lAC - MEL + SAC - TRE shyINU - MLZ - RAF - AMD - GLYG - XLT - GEN - 11JR - LYX - TAG - DFUC shyLFUC - DARL - IARL - ONT + 2KO - 5KG +
- - - - - - Taxones significativos - - - - - - - Id T -- Test en contra
Lactobrevis 3 963 088 1
Taxon siguiente Lactoco11inoides 36 075 2
Lactobrevis 3 1 test (s) en contra
GLUCOSE (GLU) 95
-~~~------------~---------------------------~--~-------~--~-----~----------~--------~------------~~--Taxon siguiente Lactocollinoides 2 test (s) en contra
GLUCOSE (GLU) 100 MELIBIOSE (MEL) 25
69
i r
ANEXO D RESULTADO PRUEBAS BIOQIJiMICAS DE CEPA AISLADA DE LECHE FERMENTADA
Referenda Leche fennentada ~ 13 Fecha 27012003
BUENA IDENTIFICACI6N
Galeria API 50 CHL V50 Leida el 270112003
Perfil - - - - -t-t+- - - - + - + - - - bull - - - - -+- - - - - + - + - - - - - - - - - - - - - - - - -+ - +
0 - GLY - ERY - DARA - LARA +Rll3 + DXYL + LXYL - ADO - MDX ~GAL + GLU - FRU + MNE SBE - RHA DUL bull INO MAN - SOR MDM bull MDG shy
~NAG + AMY - ARB - ESC - SAL - CEL - MAL + LAC - MEL + SAC - TRE I lNU - MLZ - RAF - AMD - GLYG - XLT - OEN - IUR LYX - TAG - DFUC bull i
LFUC - DARL - LARL -ONr + 2KG - SKO + 1
- -- - - Taxones significativos - - Id -- T --- Test en contra
Lacta brevis 3 963 088 1
Taxon siguiente Lactocollinoides 36 075 2
Lactobrevis 3 1 test (s) en contra
GLUCOSE (GLU) 95
-----------------------------------------------------------~------------------------------~-------------------Taxon siguiente Lactocollinoides 2 test (s) en contra
GLUCOSE (GLD) 100 MELffiIOSE (MEL) 25
70
II iJ1
I
I ANEXO E RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AISLADA DE REPOLLITAS DE BRUSELAS FERMENTADA
Referencia repollitas de bruselas 15 Fecha 03072003
EXCELENTE IDENTIFICACION
Lactoplantarum 1
Galeria API 50 CHL vsO Leida el 03072003
Perfil - - - - +t - - - - +H+ - +- - +t + - I I I I I I I f ++t - + - - - -+ + - - - -+ -+ - - I ij
o - GLY - ERY - DARA - LARA + RJB + DXYL - LXYL - ADO - MDX - GAL +
GLU + FRU + MNE + SBE RHA + DUL - INO - MAN + SOR + MDM + MOG shyNAG + AMY + ARB + ESC + SAL + eEL + MAL + LAC + MEl + SAC + TRE + i
I1NU - MLZ + RAF AMD GLYG - XLT - aEN + TUR + LYX - TAG - Druc LFUC - DARt + LARL - aNT + 2KG - 5KG shy n ----Taxones significativos ------ Id Tests en contra
Lactoplantarum 1 999 090 o
Taxon siguiente Lacto pentosus 01 012 7
Lactoplantarum 1 o test (s) en contra
Taxon siguiente Lacto pentosus 7 test (8) en contra
GLYCEROL (GLY) 75 D-XYLOSE (DXYL) 100 L-RHAMNOSE (RHA) 25 METHYL-D-MANNOSIDE (MOM) 1 MELEZITOSE (MLZ) 25 RAFFINOSE (RAF) 75 D-ARABITOL (DARL) 0
71
~
I i I
ANEXO F - ANALISIS DE REGRESION PARA pH EN BEBIDA SIN AVENA
Aruilisis de regresi6n polinomial
---~-~-------------------------------------------~-----------~~---------------------~--------------Variable dependiente pHSinAvena ---------------------------~-------------~--------------------~---------------------------------
Error T Parametro Estimado Estandar Estadistico P-Valor
CONSTANTE 535606 0094535 56657 00000 Dia -0150565 0020706 727154 00000 Dia2 000504434 0000871488 578819 00001
---~---------------------------------------------------------------------------------------------------
Anfllisis de Variama -------------------------------------------~-----------~-----------------------------~-~--- jSource Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor 11
------------------------~------------------------------------------------------------------------------~ Mod-elo 155772 2 0118861 4256 00000 Residual 0237877 13 00182983
Total (Corr) 11956 IS
R2 == 867522 percent
pHSinAvena == 535606 - 0150565Dia + 000504434Dia2
72
____
middot ANEXO G - ANALISIS DE REGRESION PARA pH EN BEBIDA CON AVENA
AmUisis de regresion polinomial _____~_____~__-_____~___4____________________bull____bull__________bull_____________~~----_------___________
Variable depcndiente pHConA vena ------------------------------------------------------------------------------------------~--------
Error T Parametro Estimado StAndar Estadfstico P-Valor
---------------------------------------------~-----------------------------------------------_---------CONSTANTE 534463 00801045 667208 00000 Dia -0140407 00175453 800253 00000 DiaA 2 000448098 0000738458 606803 00000
----------------------~---~-----------------------------~------------------------------~----AmUisis de Varianza
---~---------------------------------~---------------------~------------~-------------------~------Source Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio PValor --------------------------~-----------------------------------------------~------------~-----~~--~ ModeJo 159575 2 0797873 6073 00000 Residual 02170798 middot13 00131383 _______~_~ ~_~----------~------~--~-----~-M-----~-----____ _____________~-----------------------Total (COlT) 176654 15
R12 903315 percent
-----------~------------------------------------------------------------------------~-----------pHConAvena 534463 - 0140407Dia + 000448098DfaA 2
73
ANEXO H - ANALTSIS DE REGRESTON PARA ACIDEZ EN BEBJDA SIN AVENA
An8Jisis de Regtesi6fi P6lifJomial
Variable Depefidiefile~ AcidezSinAVenll _______________w_____~______~________________~-----------_________~_________________~~____~___~_____
Error T Pariirnetro Estimado Estandar Estadistico ---------------------------------------~--------------~-~-------~--------------------~------------CONSTANT 0491697 00123217 399051 00000 Dia 00436032 000269882 161564 00000 D1a2 -000144613 000011359 127312 00000 __w___~________________________~-_______-_____~----____________________________~__~---~_--__~___
AriiiJisis de varianza ~_~__~__________~_~____~________~___________- _________e_____________________________bull _____-________
Source Smn de cuadr Df Mean Square F-Ratio PmiddotValor_~~___________________________________bull ______~___________bull ____________bull ______~________w________________
Model 0135203 2 00676013 21747 00000 Residual 000404118 13 000031086
Total (Corr) 0139244 15
R2 970978 percent
AcidezSlnAvena 0491697 + O0436032Dia - 0OOl44613Dia2
74
I
ANEXO I ANALISIS DE REGRESION PARA ACIDEZ EN BEBIDA CON AVENA
1
Anwisis de tegtesi6fi polinomial
Variable dependiente Acidez Con Avena
Error T ParametTo Estimado Stlindar Estadfstico P-Valor ----------------~-------~---------------------~-----------------------------------------------------CONSTANT 0491639 000926607 530578 00000 Diamiddot 00406572 000202955 200326 00000 DfaA 2 0000982559 0000085421 -115025 00000
-------------~----------------------------~-------------------------~-----------------------------------
-------------~-----~~-----------------------------~---------------------------------------------_--Source Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio PValor
-~-------------~----------------------------------~------------------~~-------------------------- Modelo 0288008 2 0144004 81914 00000 Residual 000228539 13 0000175799
----------~~--------------~---------------------------------------------~---------------------------Total (Corr) 0290294 15
RA2 = 992127 percent
-------------------------~----~---~------------~---------------------------------~---------------~
AcidezConAvena == 049163amp + 00406572D1a - 0000982559DiaA2
75
I
(Ilmiddot il
ANEXO J- ANALISIS DE REGRESION PARA RECUENTO LACTOBACILOS PARA BEBIDA SIN AVENA
Amilisis de regresion - Modelo lineal Y = a + bX
------------------------~----------------------~-----------------------------~----------~-----------Variable Dcpendiente LactobacilJusSinAvena Variable independiente Dia
I--------~----------~-----------------------------------~-------~-~--~--------------------------~-Error T
Paramctro Estimado Standard Stadistico P-Valor
----~----~------------~-----~-----------------------~-------------~-----------------------------Intereepto 117347 0389973 300911 00000 Pendiente 00483464 00257889 18747 00903
Analisis de Varianza
---------~------------------~----------------~---------------------------------~---------~----------Source Sum decuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor
------------~---------------------~---------------------~--------------------------------~-----~----Modelo 0916252 1 244835 443 00616 Residual 260706 10 0260706
--~------------~---~------------------~~~-----~-------~---------~~-------------------------------------Total (Corr)352332 11
Coeficiente Correlaci6n = 0509955 R2 = 260054 percent
LactobacillusSinAvena= 117347 + 00483464Dfa
76
ANEXO K- ANALTSIS DE REGRESION PARA RECUENTO LACTOBACILOS PARA DEBIDA CON AVENA
Aruilisis de regresion - Modelo lineal Y = a + hX
Variable Dependiente LactobacillusConAvena Variable Independiente Dia ---~--------------------------------------------------------__-----------__--_--_-----------shy
Error T Paramctro Estimado Standard Estadistico P-Valor -~--------------------------------------------------------------------------------------------------
Irttercepto 118103 0567963 207942 00000 Pendiente 00790304 00375594 210414 00616
-----------------~----------------------------~----~-------~----~----------------------------
Analisis de Varianza
----------------~----------------~------------------~--------------------------~------~--------shySource Swn de cuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor
-----------------~--~--------------------------------------------------------------------------~---~ Mode10 244835 1 244835 443 00616 Residual 552997 10 0552997
Total (Corr)797832 11
Coeficiente Correlacion = 0553964 RI2 = 306875 percent
-----~--------------------------------------------------------~--------------------------------------
LactobacillusConAvena = 118103 + 00790304Dfas
77
2234 Prueba de la catalasa--------------------~------ 32 224 Prueba para determinar la especie ----------~-------- 33
225 Pruebas para determinar microorganismos probi6ticos -----34 2251 Resistancia a pH=2 y sales biliares de concentracl6nO3piv --34 226 Conservacion ------------~-----------------35
227 Elaboraci6n de la bebida fermentada ---------35 2271 Pr~paraci6n de Ie muestra ---------------~----35 2272 Adici6n del Inocula ----~-------------------36 2273 Control de Ie fermentaci6n=~~~==~~-------------36
2274 Refrigeracion ------- ~-- ---- -------36 2275 Batido--~ ------------------------------------37 2276 Envasado y almacenamiento------------ 37 228 Determinacion del pH------- ---------- -----39 229 Determinacion de la acidez (Expresada como acido lactico) -39 middot2210 Prueba de viabiJidad ------~-------~----------39 2211 Am3lisis microbiol6gico de las bebidaslacteas(con ysinavena) -40 2212 Anslisis estadistico ~-~~-~---------=------------40
3 RESULTADOS Y DISCUSI6N-~------------------------------ --42
31 Coloraci6n de Gram y morioJpgfa --001-------- - -----42
32 Prueba de esporufacion y catafasa-----------------42 33 Prueba para determinars especie- -------- ---44 34 Pruebas para determiner microorganismos probi6ticos -----45 35 Seguimiento del pH en la bebida h3ctea con y sjn prebi6tico-----49 36 Seguimiento de la acidez expresada como de acidb lactico -----51 37 Prueba de viabiJidad-------- ----------54 38 Analisis microbiol6gicos de las babides lacteas con y sin avena --56
4
5
REFERENCIA~ BIBLIOGRAFICAS --~-------------middotmiddot---- ---------60
LISTA DE TABLAS
TABLA 1 ALGUNAS ESPECIES MICROBJANAS PROB16TICAS-------------~------middot15
TABLA 2 FueNTE De AISLAMIENTO DE CePAS NATJVAS --------------29
TABLA 3 RESULTADO DE PRUEBA DE ESPORULACI6N------------------43
TABLA 4 RESULTAOO PRUEBA DE LA CATAlASA ----------------------44
TABLA 5 ReSULTADO IOENTIFICACION CEPAS--------------------middot-----45
TABLA 6 ReSULTADOS APRUEBAS DE RESISTENOIA A pH=2 YSALES BILtARES 03 Pv
-----------~-- ----------~--46
TABLA 7 ReSUtTADO pH YOGUR SIN AVENA ----------------49
TABLA 8 ReSULTADO pH YOGUR CON AVENA ------------ --49
TABLA 9 COMPARACION DE MEDIAS PARA pH----------------------50
TABLA 10 ReSULTADO DE ACIDEZ (EXPRESADO COMO ACIDO LACTICO)-------51
YOGURT SIN AVENA ------------------------------51 TABLA 11 ResuLTAOo oJ ACIOEZ (EXPRESAOO COMO ACIDO ACTICo)----52
YOGURT CON AVENA--- ------------------- --- ----52 TABLA 12 COMPARACION DE MEDIAS PARA ACIOEZ----------------~~53
TABLA 13 RecuENTo DE LACTOBACILOS (UFCML) YOGHURT SIN AVENA--54
TABLA 14 RECUENTO DE LACTOBACILO$ (UFCML) YOGHURT CON AVENA ------54
tABLA is COMPARACl6N MEDIAS LOG LAcToBACltLUS-------------56
TABLA 16 RESULTADOS ANALiSIS MICROBIOL6GICO------------- --57
L1STA DE FJGURAS
FIGURA 1 CAMARA DE ANAEROBIOSIS----------middot------~----27
FIGUftA 2 CePAS EN TUBOS CON AGAR INCUNADO -----~--middot----------30
FIGURA 3 COLONrASAISLADAS EN AGAR MRS-------middot---------31
FIGURA 4 API CHL 50-PRUEBA sloaufMlcAS ------------- bull --33
FIGURA 5 DtAGRAMA DE FLUJO ------~---------- ----~-38
FIGURA 6 LACTOBACILLUS I3REVIS GRAM + AfSLAOA OE LECHE FERMENTADA------47
FIGURA 7 LACToBACILLUS BFEVS A1SLADA OS lECHS FERMENTADA DESPUES DE LA
PRUEBA DE RESfSTENCIA A pH=2 ----------------------~ - middot-48
fIGURA 8 LAcTOBAcILLUS BREVIS AISLADA DE LECHE FERMENTADA OESPUES DE LA
PRUEBA DE RESISTENCJA A SALES BILIARES 03 pN------------- ----48
FIGURA 9 COMPARACI6N DE MEDIAS PARA EL pH ---------- ---------50
FIGURA 10 COMPAAACI6N DE MEDIAS PARA LA AC1DEZ ----------------52
FIGURA 11 COMPARACI6N DE MEDIAS PARA LOG LAcTOBAcILLUS -------------55
LISTA DE ANEXOS
ANEXO A--- RESUl TADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AfSLADA DE
ANEXO B RESULTADO PRUEBAS BIOQUfMICAS DE CEPA AISLAOA DE
REPOLLO FERMENTADO --middot----------middot--------------------------68
ANEXO c RESULTADO PRUEBAS BIOQUIMICAS DE CEPA AISLADA DE
MUCOSA HUMANA ------------------------------------------ ------69
ANEXOD RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMCAS DE CEPA AISlADA DE
LECHE FERMENTADA---------------------------------------_-70
ANEXO E RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AtSLADA DE
REPOLLlTAS DE BRUSELAS tERMENTAOA ------------------------71
ANEXO F ANAUSIS DE REGRESION PARA pH EN BEBIDA SIN AVENA--- 72
ANEXO G- ANAUSIS DE REGRESION PARA pH EN BEBIDA CON AVENA --73
ANEXO H ANALISIS DE REGRESION PARA ACIDEZ EN BEBIDA SfN AVENA
ANEXO 1- ANALISIS DE REGRES[ON PARA ACIDEZ EN BEBIDA CON AVENA
ANEXO J- ANALISIS DE REGRESION PARA RECUENTO LACTOBACILOS
PARA 8EBItgtA SIN AVENA ~----------------------------------------wirEr
ANEXO K ANALlS1S DE REGRESION PARA RECUENTO LACTOBACILOS
PAFt BEBIDA CON AIlNA-------~-------~----------~------~---middot-----~-middot---irjr
INTRODUCCI6N
En los ultimos arios S9 ha comprobado los efedoS beneftcos que los
microorganismos probiotico$ ejercen sobre la salud humana a facilitar la digestion
de lactosa estimular 18 actividad inmungica modificar ef balance poblecional
tanto de la microbiola intestinal nativa can posibles sfeelos patogenos como de
las que causan toxiinfeCCiones alimentarias edemas se estan ensayando como
implante en heridas de piel para evttar contamlnacion can microorganismos
patogenos
Los microorganismos probi6ticos se emplean en fa elaboraci6n de productos
fermentados en especial los lacteos Estas industrias se han limitado a utilizar
cultivos iniciadores importados que rsquieren tiampo y culdados para su
manlpulacion y empleo En Colombia no se han realizado InY9s1igaciones que
involucren cepas nativas can activldad probiotica ni el afecto de ingredientes
prebi6tico$ sabre fa viabilidad de estos microorganismos tenienqo en cuenta que
al prebiotico es un ingrediente allmentario que estimula sefectivamente el
crecimiento y actividad de algunas especies de microorganismos probi6ticos
En esta investigacion se sislaron microorganismos probi6ticos a partir de
muestras de vegetales y lache crud a de vaca fermentadas naturafmente y de
mucosa humana utifizando medios de cultivo salactivos bajo condiciones
12
anaerobias Luego se procedio a verificar su rasistencia a los acidos gastricos y
sales biliares simulando asl las condiciones del tracto gastrointestinal de 10$
humanos Las capas que presentaron mejor comportamiento ante estas pruebas
sa caraeterizaron morfologles y bioquimicamente y sa seleccione una de eHas
para inocular en bebidas lacteas sin y can avena como ingrediente prebiotico y
verificar su viabilidad durante al almacenamiento
Los resultados de esta investigacion padren sar de gran irnportanoia para la
industria nacional de alimentos las univarsJdades con facultades relacionadas
can la salud y la alimentaci6n y para las entidades gubernamentales involucradas
en la alimentacion y nutricion de grupos de poblacion vulnerables tales como eJ
Instituto de Bienestar Familiar y Bienestar Social entre otros
13
middot~
1 MARCO TEORICO Y ESTADO DeL ARTE
11 P~OBI6TICOS
111 Historia
EI consumo de productos fermentados lecteos con microorganismos vivos
especialmente bacterias acido lacticas ha sido reportado a 10 largo de la historia
desde tiempos remotos se evidencia al conoeimiento de los beneficios que estes
proporcionaban perc real mente quian enfatiz6 en ellos fua 91 cienUfico ruso Elie
Metctinikcff que reaclon6 la ingesti6n de (eches fermentadas con la longevidad y
salud de las personas ( Pardio et al 1996)
En 1965 sa utilizo por primera vez et termino Probi6tico derivado dellatin pro
que significa a favor de y del gr9go bios que quiera decir vida tnieialmente esta
palabra defini6 a los microorganismos que promovian el erecimiento de otros
microorganismos Ivego se splico asta termino a extraetos de tajido que estimlilan
el crecimiento micrObianqEn la actuaidad sa han definldo como probiotieos los
cultivos (micas 0 mezclados de microorganismos vivos qua al ser ingeridos por
humanos Q animales majoran el balance poblacional de la microbiota intestinal
evitando la adherencia de patogenos (Schrezenmeir et albull2001) Sin embargo
estos microorganismos no nece_iamenta son habitantes propios del tracto
14
gastrointestinal (Holzapfel at a2001Gaitan at al 1998) p~r 10 tanto es
necesario consumir alimantos en los que se encuElntren estos mrcroorganismos
viables estos hacen parte de I~micfobiota de vegetales y leches interviniendo en
Ie fermentaci6n natural de estos~ntos
112 Microorganismos Probi6ticos
los microorganismos probi6ticos que tradicionatmente se han adicionado a la
tache para fermentarla y obtener yogurt y kumis a como suplementos pertenecen
a los generos Lactobacillus Enterococcus y Bifidobacterium (Ver tabla Nro 1) Sin
embargo se considera que solo algunas especies de los gelnsros Lactobacillus y
Bifidobacterium sobreviven en el tracto gastrointestinal En la tabla 1 58 muestran
algunas de estas especies
TABLA 1 Algunas especies microbianas probi6ticas
Lactobacillus Sifidobacferium Enterococcus
L acidophilus
L JohnsoN
L casei
L rhamnosus
Lgrasseri
L reuten
L plantarum
B bifidum
Blongum
B infantis
E fsecium
E faecalis
Fuente Gaitan et a 1998A
15
EI eonoeimiento a cerea de sus efeetos beneficos en el consumidor por su alta
viabilidad en el intestino como la producci6n de sustancias con aetividad
antieaneerigena el mejoramiento ltfel sistema inmunol6gico y el deSplazamiento
de la mierobiota pat6gena gastrointestinal en el consumidor ha estimulado una
mayor demanda de estos microorganismos como tambian de los productos que
los contienen (Heller 2001 Parada middot1998)
Existsn otros produetos fermentados de origen vegetal como et tampe col acida
y salsa de soya de los euales sa pueden aislar estos organismos probi6tieos
comp tambien de la mucosa intestinat humana y luego de suministrarlos a
ratones sa han comprobado sus caracteristicas beneficas (Molin 2001)
113 Caracteristicas fenotfpicas de algunos microorganismos
probi6ticos
las bacterias aeido lacticas de los generos Lactobacillus y Bifidobacterium son
consideradas probi6tieos y tradicionalmente se han clasificado con base en Sus
propiedades morfol6gicas crecimiento a diferentes temperaturas capacidad
fermentadora de glucosa y otros carbbhidratos y la configuraci6n del Bcido Jaetieo
producido (Holzapfel etal2001)
16
)lli~ h Dx nIILIOTECM
eJDe~~ l1ilmfJ tIDBnm
Los Lactobacillus son bacilas gram positiv~s no esparuladas aerotalerantes
acido - tolarantes estrictamente fermentadares formadores de Boido laclica como
producto principal catalasa negativo carentes de citocroma sin embargo se
presentan excepciones a esta descripcion parque afgunas especies pueden
formar catalasa 0 citacramo en medios que contienen hematina 0 compuestos
relacianados La produccion de catalasa no hema pseudocatalasa puede causar
tambien alguna confusion en fa identificacion de algunos Lactobacillus
las especies del genera Bifidobacterium san bacilos gram positivos no
esporulados generafmente anaerabios estricto$ aunque pueden creeer bajo
condiciones microaer6filas cuando estan ert presencia de C02 La mayorfa de sus
especies se pueden diferenciar par criterios biaquimicos simples como la
fermentacion de L arabinosa DmiddotxiJasa O-manosa O-manita y O sorbitat que
pueden servir coma caracterist1cas clave para su clasificacion (Holzapfel
etal2001 )
114 Caracteristicas de los probi6ticos
Las cepas de microorganismos prabi6ticos deben presenter y mantener unas
caracteristlcas que garanticen su crecimienta y supervivencia En el alimenta
como tambiEm durante su transito a traves del est6maga e intestino delgaQo
17
La primera CBtacterfstica es que sean viables esta viabifidad esla capacidad que
tienen los microorganismos probi6ticos de permanecer vivos tanto ~n el alimento
como en el Intestino del consumidor por un tiempo determinado En Colombia se
ha establecido que en bebidas fermentadas este tiempo debe ser minimo de 21
dras en el alimento (Minsalud 1986) Esta vjabilidad depende del metodo de
produccion y de la cepa utilizada (Tuomols at a 2001)
Luego de que se garantice que estos microorganismos eslan viVos en el alimento
ell os deben cumplir otro criterio importanle para ser considerados como
organismos probi6ticos y as tblerar las condiciones de acidez a un pH=2 y la
sccian de proteasas del est6mago ademas de sobrevivir y creeer en presencia de
acidos biliares (Tuomola et al 2001 Jacobsen at a 1999) para luego de
sobrevivir a estas condiciones adherirse a la mucosa intestinal y de esta manera
estimular al sistemainmunoJ6gico esta capacidad de adherirse a la mucosa es un
prerrequisito para la colonizacion del intestlno (Toumola etal2001 Alander et aI
1999)
Cuando los probioticos han pasado todas esta pruebas de supervivencia y luego
de impfantados en la mucosa producen acidos organicos peroxido de hidrogeno y
tambien bacteriocinas que actUan como inhibidore$ del crecimiento de
microorganismos patogenos u oportunistas (Tuomola at al 2001 Cintas et al
2000) complementando de asta manera su accion benefica sobre la mucosa
intestinal y en general sobre la saJud del huesped
18
116 Berieficios de los microorganismos probi6ticos
Los beneficios que se asocian a los microorganismos probioticos son muchos y
variados Entre ros comprobados mediante estudios se eneuentran
1151 Facilitar la digesti6n de la lactosa
los microorganismos probioticos cuando estan en el intestino liberan alii la
enzima pmiddotgalaotosidasa capaz de hidrolizar la lactosa haste glucosa y galactosa
evitando as que personas intolerantes a este carbohidrato presenten sfntomas
como flatulencia dolor abdominal y diarrea cuando consumen leche (be Vresse
et 81 2001)
1152 Protegen contra enfermedades gastrointesUnales
EI consumo de aJimentos con probioticos ha mostrado efeeto terapeutico frente a
los sintomas de diarrea asociada al surninistro de antibi6tico$ de amplio espectro
que destruye 0 disminuye la microbiota endogena esta imp ide la coJonizacion de
bacterias patogenas como Klebsiella oxytoca y Clostridium difficile que pueden
causer lesiones en el cn Los probi6ticos recuperan el balance de la microbiota
intestinal nativa y avitan Ie adhesion de algunos virus bacterias pat6genas a
parasitos que pueden ser agentes causales de gastroenteritis la diarrea del
19
J
viajero y 1(3 inflarnacion intestinal que en ultima instaneia oeasionan ef sfndrome
del colon irritable (Marteu et al 2001)
1153 Protegen contra infecciones del tracto urogenital
La vaginitis indueida por baeteriss yo por levaduras as una infecci6n
estrechamente relacionada con la exposici6n a antibi6ticos y espermicidas y
tambien depende del estado hormonal de la n1ujar Con al uso de mezcJas de
probi6ticos se han obtenido buenos resultados en la rastauraci6n de la rnicrobiota
natural urogenital benefica que desplaza a los eausantes de la inflamaci6n de Is
vagina y Ie uretra (Reid 2001 )
1154 Promueven la barrera de defensa end6gena del intestino
EI tracto gastrointestinal normal mente as una barrera natural contra anUgenos de
origen microbiano y alimentario Cuando los probi6ticos sa adhieren a Is mucosa
intestinal estimulan 0 potencian al sistema inmune favoreciendo la
inmunomodulaci6n que induce un aumentb de fa producci6n de inmunoglobulinas
activacion de las calulas mononueleares y de los linfocitos para proteger al
huesped de infeeciones (Isoulari et sl 2001)
20
1155 Protegen contra cancer de colon
EI cancer es el resultado de una serie de mutaciones somaticas que pueden
ocurrir durante al tiempo de vida del individuo y 10 padeca buena parte de la
poblacion mundial los probi6ticos en un sistema in vitro han demostrado un
efecto positivo en la prevenci6n de mutaciones aI desactivar carcin6genos
genotoxicos (Wolloswski et al J 2001)
1156 Protegen contra infecciones respiratorias
Sa ha demostrado que el conslJlno de probi6ticos disrninuye la incidencia de
infecqiones raspiretorias al aumentar la actividad fagocitica de maer6fagos
alveolares que aettian sobre microorganismos patogenos Se hizo un estudio en
571 ninos sanos con edades entre uno y seis anos divididos en dos grupos a uno
de ellos sa las incluy6 en su dieta leche suplementada can Lactobacillus GG y a
los otros ninos leche no suplementada AI final del estudio se observ6 una
disminucion del 19 en la incidencia de infeccionas respiratorias tratadas con
antibi6ticos tales como otitis media sinusitis bronquitis y neumonfas en el grupo
de los ninos que consumieron Lactobacillus GG (Hatakka et al 2001)
Alvarez et al (2001) encontraron que la administraci6n de yogurt con Lactobacillus
casei en ratones de tres arios de edad majora los espacios libres del puJrn6n de
la presencia de Pseudomona aeruginos8 induciendo un aumento
21
significativo en los niveles de gA a IgM datactadas en los lavados
broncoaJveolares y se observ~ un afecta dependiente de la dosis
1157 En el tratamientoy prevenci6n del eczema
Se ha encontrado que el consumo de probi6ticos mejora la inflamaci6n alergica 0
eczema at6pico en ninos alimentados con formula suplementada con probi6ticos
Encontraron una mejora significativa al suministrar Bifidobacteriummiddot actis y
Lactobacillus GG en 27 niiios con edad promedio de 46 meses Luego de aplicar
este tratamiento se sometieron a una prueha de SCORAD (mide fa extension y
gravedad del eczema) registrando una meJoria significatlva en las condiciones de
la pie concentraci6n de citoquinas cirClllantes an sueto y moleculas de adhesi6n
a las superficies de las celulas soJubles en suero (Isolari 2000)
Se realizaron otros estudios a 159 mujeres embarazadas con historia familiar de
eczema atopico de primer grado a las cuafes sa res 5uministro dosis diarias de
Lactobacillus GG durante 2 a 4 samanas previas al parto Oespues de ella fa
madres twiaron la opci6n de continuer tomando el ptobi6tico si amamantaban 0
bien darseio vIa oral La mayoria de las madras eJigieron dar las dosis at bebe
diariamente A los dos anos de vida se observ6 una disminuci6n del 50 en la
frecuencia del eczema at6pico en aquellos nHies que se les dio ef probi6tico
(Kalliomari etal 2001)
22
1158 Previenen infeccion en heridas quirurgicas
Los probi6ticos impiden la union de pat6genos a las superficies celulares en
heridas mediante la seCreci6n de proteinas Actuamente se encuentra en
estudio la aplicaci6n del Lactobacillus fermentum vivos sabre heridas en piel de
ratas y se ha encontrado una disminuci6n del 90 en la colonizaci6n par parte del
StaphylococcuS aureus uno de los patogenos mas temidos y de mayor lncidencia
en infecciones hospital arias mas aun se esta contempiando la posibilidad de
utilizar la protein a purificada an lugar de los mjcroorganismos para la protaccion
contra infecciones en heridas (Strauss 2000)
12 PREBIOTICOS
Son carbohidratos de cadena corta algunas veces reconocidQs como
oligosacaridos no digeribles par las enzimas del epitelio intestinal 0 de las
gliJnduJas anexas debido a su estructura quimica y de esta manera lIegan al
intestino grueso donde alcanzan a estar disponibles para la fermentaci6n por las
bacierias sacaroHticas que son especial mente laetobadlos y bifidobacterias
dando odgen a compuestos que ejercen efectos funcionales sobre la mucosa del
tubo digestivo (Brunser 2001)
Se consideran como tal algunos fructocligosacaridos isomaltooligosacariclos
oligomato palatinosa poHdextrosa pOJidextrrna raftilina y algunos oligosacaridos
23
)
de 1a soya y fa avena Estenmiddot presentes en alimentos como Ie cebolla ajo
banano puerros 1 derivados del trigo achicoria esparrago alcachofa (Cummings
etal 2001)
Algunos de estos prebi6ticos cuanda son incorporado$ a fa dieta en cantidades
dalerminadas alteran la microbiota intestinal disminuyendo los recuentos de
coliformes bacteroides y cocos y aumentando las bifidobacterias hasta en diez
veces ademas modifican la actividad metab6lica del coron logrando una
disminuci6n del pH y un incremento en el contenido fecal de acidos grasos de
cadena corta como at acatica propi6nico y butfrico El butirato aumen~ _I grosor
de la pared del coron e intestino delgado estimula eJ crecimiento de la mucosa del
colon y auManta su flujo sangufneo inhibe el crecimiento de tinsas tumorales
epiteliales de origen co16nico induce la diferenciaci6n de sus celulas y a
apoptosis entre otros(Brunsar 2001)
Eh estudios hechos en simuladores del intestino humano utilizando productos de
avena fermentados se encontro que estimularon al crecimiento tanto de
lactobacios como de bifidobacterias y en el caso de estas ultimas se incremento
la producci6n de los acidos acatico propionico y butfrico 10 que incide sobre la
implantacion de probi6tico$ e inhibe al crecimientos de otro tipo de
microorganismos (Alal1der eta1999 Kontula etal 1998 Jaskari etal 1998)
24
~ -1
(
AI comparar el comportamianto de las leches de diferente origen se ha
demostrado que Ie leche de vaca contiene caseinatos sustancias que forman
buffer ~n et intestino e inlpiden que los probi6ticos disminlJyen el pH del intestina
y de esta manera se impide al efecto deseado que es evitar fa proliferaci6n de
otros microorganismos entre los cuates pueden estar algunos patOganos En la
leche materna sa encuentran algunos carbohidratos como glucosa galactosa n
acetilglucosamina y algunos 0lig6meros de Ie fucosa en cOhoontracionesmiddot
importantes los cualeS favoreceh el crecimientc)middot de probi6ticos esto
complementado can 91 bajo contenido de protenas que se traduce en una
reducida capacidad buffer hacen de Ie lache materna IJn alimentd adecuado para
nllios en su etape de lactancia
Algunos prebi6ticos como 1a lactulosa yciertos compuestos que contiansn fructosa
no son digeridos en el intestino humano y pueden sar utilizados selectivamenta
par los probi6ticos 10 que hace que los probi6ticos en combinaci6n can prebi6ticos
pueden lIegar a ser un importante medio para prevenir algunas enfermedades del
tracto gastrointestinal (Bezkorovainy 2001)
25
2 METODOlOGfA
21 LOCALIZACION
EJ trabajo sa realizo en el laboratorio de Microbiologia y la planta da laches de Ja
Universidad Naclonal de Colombia- Secie Medellin
En al laboratorio se hiZQ al aislamiento a identificaci6n de fa capas y en fa Planta
sa eJaboro la leche fermentada con 1a cepa seleccionada y el prebi6trco
22 METODOS
221 Aisiamiento de cepas nativas
Las cepas nativas se sislaran de producto$ vegetales leches fermentadas y
mucosa vaginal humana
2211 De vegetales
Las muestras vegetales de repollo repollitas de brusefas y pepino se
seleccionaron porcionaron y mezclaron can cloruro de sadio al 10 pIp se
calacaron en un recipienta de vidrio balo anaerobiosis y sa dejarQn por 15 dias
26
luego S9 tomaron 3 ml de cada muestra y se jnocularon 9 ml de caldo MRS (Man
Rogosa and Sharpe) se incubaron a 37deg C durante cinco dias en camara de
anaerobiosis (Ver Figura 1) Oespues de este tiempo sa inocularon cajas de petri
con agar MRS con 1 ml del cultivo microbiano y se incubaron bajo las mismas
condiciones que eJ caldo Este procedirniento se realiz6 rapetidas veces hasta
seleccionar la cepa pura mediante observaci6n de caracteristicas morfologicas de
la cOlonia y a cada colonia se Ie practico la coloracion de gram con el fin de
observar las caracteristicas microscopicas de cada una e identificar las de mayor
similitud a los Lactobacilos y Bifidobacterias
Figura 1 Camara de anaerobiosis
27
2212 De la leche
Sa tomo 200 ml de teche cruda de la planta de leches y se colaca a fermentar
baja anaerobiosis durante 15 dras Luego sa procedia como en los vegetales
2213 De mucosa vaginal humana
Se tomo una muestra de frotis de mucosa vaginal humane can capito esteril sa
puso a ncubar en Caldo MRS y se procedi6 camo en 2211 y 2212 A cads
aislado sa Ie practico la coloracion de gram y sa seleccionaron aquellas que eran
bacilos gram positivos (Ver Tabla 2)
28
TABLA 2 Fuente de aislarniento de cepas nativas
CEPA FUENTE
1 Pepino fermentadQ
2 repollitas de bruselas fermentadas
3 Repolltgt fermentado
4 Repollo fermentado
5 Mucosa va~inal humana
6 Mucosa vaginal humana
7 repollitas de bruselas fermentadas
8 Repollo fermentado
9 repollitas de bruselas fermentadas
10 Mueo~a vaginal humana
11 Repollo fermentado
12 RepolJo fermentado
13 Leche fermentada
14 Mucosa vaginal humana
15 repollitas de bruselas fermentadas
16 Repollb fermentado
29
222 Almacenamiento de las cepas aisladas
Cuando las cepas crecieron en agar MRS homogEmeas en color morfologia
coloraci6n de Gram etc se pssaron a agar inclinado en tuba se cubrieron con
aceite mineral y se guardaran en refrigeraci6n a 4deg C para tomar de alii la cepa y
efectuarle las diferentes pruebas para confirmar el genera y determinar la especie
de cada una de eas (Ver Figura 2)
Figura 2 Cepas en tubos con agar inclinado
30
223 Pruebas para determinar et genero
2231 Coforaci6n de Gram
A cada cepa sospechosa de Lactobacilos se 1e hizo la coloraci6n de gram y se
seleccionaron las gram positivas
2232 Morfologfa
En agar MRS y despues de incubar en anaerobios~s crecian colonias grandes
cremosas de color beige con bordes homogeneos y c6ncavas(Ver Figura 3)
Figura 3 Colonias aisladas en agar MRS
31
2233 Prueba de esporulaci6n
A cada cepa aislada se Ie hizo esta prueba la cuel consistia en incubar en
aerobiosis durante ocho dias las cajas de agar MRS donde crecieron colonias de
Lactobacilo$ y luego se les (ealize) coloraci6n de espora Las capas que dieron
negativa a la prueba de espora se considararort sospechosas de sar Lactobacilos
y se continuo con la prueba de la catalasa (Ver Tabla 3)
2234 Prueba de la catalasa
los lactobacilos carecen de catalasa Eata prueba se hizo tomando una colonis
se deposito en vidrio de reloj y se Ie adicion6 dos gotas de peroxida de hidr6geno
(H202) la que no presentaba efervescencie eran cepe sospechosa de ser
Lactobacilo (Ver Tabla 4
Sa seleccionaron las capas euyo resultado fue aeorde con el genera Lactobacilfu$
y se continuo con la comirmaeion del genera y determinacion de la eSpecie
meqiante las pruebas bioqulmicas
32
224 Prueba para determlnar la especie
Para confirmar el genero y determinar la especie de las diferentes capas aisladas
se hizo una caracterizaci6n bioqufmica utilizando un kit de API 50 CHL Medium
Ref 50 410 que contiene una galed8 de medios que permite realizar el estudio
de fermentaci6n de los 49 azucares de 52 especies de Lactobacillus (Ver Figura 4
y tabla 5)
Figura 4 API CHL 50-Prueba bioquimica
33
225 Pruebas para determinar microorganismos probi6ticos
2251 Resistencia a pH=2 y sales biliares de concentraci6n O3pv
A las cepas idantificades como Lactobacillus brevis y Lactobacillus pantarum sa
las realiz6 Ie prueba dfl resistencia a pH=2 y sales biliares de concentraci6n 03
pv ( Jacobsen et al 1999) Una colonia de cada cepe aislada se inocul6 en 4 mt
de caldo MRS durante cinco dras bajo condiciones de anaerobiosis Oespues de
esta tiempo se dejaron pracipltar los microorganismos por sedimentaci6n se Ie
retire el sobrenadante y al precipitado se Ie adicion6 Sml de caldo MRS
previamente ajustado a pH=2 can seido clorhfdrico (HCI) dentro del mismo tuba de
ensayo G igual sa hizo can otro tubo previamente incubado pero a este se Ie
adiciono 5ml de caldo MRS con sales biliares a una concentra~i6n de 03 plv y
ambos se incuberon a 37deg C por 2 haras Sa midio 01 mi de cada uno de los
tubas al tiempo 0 y a las 2 horas y sa inoculeron en superficie en caJas de petri
con agar MRS S9 incubaron a 37deg C bajo anaerobiosis durante 48 horas Se
compararon visualrrente en cada caja de petri el crecimiento en superficie y las
que presentaron crecimiento en tos dos tiempos (0 y 2 horas) tanto en at media
acido como en sales I se consideraron resistentes a pH=2 y sales biliares (03
pv)
(Ver Tabla 6)
34
226 Conservacion
Todas fas capas que habian dado positiva Jas pruebas anteriores y que reaultaron
resistentes a pH=2 y sales biliares 03 pv y despues de identificadas en API 50
CHL sa repicaron en agar MRS en tuba inclinado y despues de Incubar a 37deg C
por 48 horas bajo anaerobiosis se Ctlbrie el biser completamente can aceite
mineral esteril y sa guardaron en refrigeraci6n
227 Elaboracj6n de fa bebida fermentada
2271 Preparaci6n de la mue$tra
Sa tome 1 mt de caldo MRS previamante inoculado e incubado que presentaba
una concentracion de Lactobacillus brevis de 27x108 Iml segun la escaJa de Mac
Farlan y sa adiciono a 9ml de leche pasteurizada en un tubo sa dej6 incubanda
en anaerobiosis por 48 hores Luego se pasaron estos 10 ml a un frasco qua
cont~nie 90 ml de leche pasterizada y se dej6 incubando par 48 haras en
anaerobiosis
35
2272 Adici6n del inOculo
A 900ml de leche pasteurizada se Ie adicion61os 100 ml de leche que habia sido
previamente ino(ulada dos veces con la cepa posteriormente se deja
fermantando la lache a temperatura de 37deg C
2273 Control de Ja fermentaci6n
Las muestras se hicieron por cuadruplicado y se les hizo un seguimiento de
aoidez hasta un valor entre 04 y 05 expresada como Bcido lactico esta
procedimiento corresponde a la babida fermentada sin prebi6tico La bebida ~on
prebi6tico tiene al mismo proeedirnianto pero adicionalmente se agrag6 avena a
una concentraci6n de 05 en el momento de la adici6n del in6e410 a los 900 ml
de leehe pasteurlzada y el procedimiento sigui6 igual al de la bebida sin prebi6tico
tambien se hizo por cuadruplicado
2274 Refrigeracl6n
Despues que las mezclas con y sin prebiotico alcanzaron el de acidez
requarido se IIeva ron a refrigeraci6n a una temperatura de 4deg C p~r 24 horas
para frenar proce~os metab6licos de los microorganisrtlos Despues de este
ti~mpo se procedi6 al batido
36
1 2275 Batido
Con un agitador se procedi6 a batir las bebidas para romper et coagulo formado
y de esta manera homogeneizar la mazela y obtener asf la bebida fermentada
2276 Envasado y almacenamiento
Ambas bebidas se envasaron en frascos vidrio para hacerles seguimiento de pH
acidez(expresado como acido tacticol y recuento de Lactobacillus breviSf los
dies 27 14 Y 21 despues de elaboradas las bebidas perfodo durante el cualta
muestra permanecfa afmacenada a temperatura de refrigeracion(Ver Figura 5
37
Fjgura 5 Diagrama de Flujo
PREPARACION DE LA MUESTRA
ADICION DEL INOCULO
~_____~_B~ATIDO~______~
INCUBACION 37deg C hasta acidez = 04-05 acido laotico
ENFRIAMIENTO
hasta 4 0 C ~------~ ~------~
ENVASADO Y ALMACENAMJENTO
dUrante 21 dfas a Temperatura 4 0 C
38
1
228 Determinaci6n del pH
Se determino por el metoda potenciometrico en un pH-metro manual durante los
dias 2) 7 14 Y 21 de las bebidas lacteas sin y con prebi6tica (Ver Tablas 7 y 8)
229 Oeterminaci6n de la acidez (Expresadfl como acido
lactica)
Se tomaron 9 mJ de las bebida~ sa Ie adicionaron 2 gotas de fanoftaleina como
indicador y sa titulo fa acidez con NaOH 01 N hasta la aparicion de un cotor rosado
debit EI volumen de NaOH utilizado se reporta como valor de de acidez
(VerTablas 10 y 11)
2210 Prueba de viabilidad
Qurante el perfoda de almacenamiento de la bebida lactea se procedi6 a hacer la
prueba de viabiHdad en los dias 7 14 Y 21 para determinar Si los lactobacilfus
permanecfan vivOs a una concentraci6n minima de 106 hasta el dia 21 como 10
establece eJ Articulo 10 de la Rasolucion 2310 del Ministerio de $alud de
Colombja
39
Para asta prueba se tamaron 10 rnl de muestra y se adicionaron a 90 ml de caldo
MRS ruego a partir de esta se hicieron diluciones de 10-2 hasta 10-11 de las
diluciones 109101deg 10-11 se inocul6 1 ml de cada uno en agar MRS siguiendo el
metodo de siembra en profundidad y por duplicado e incubando a 370 C x 5 dras
en anaerobiosis y luego se hicieron tos recuentos por duplicado para esi reportar
los recuentos promedio (Ver Tablas 13 y 14)
2211 AniUisls microbiol6glco de las bebidas Iicteas(con y sin
avena)
Con el fin de determinar las condiciones higienico-sanitarias del producto se
realizaron las pruebas microbiol6gicas de Recuento de mohos y fevadurasml en
agar OGY Recuento en superficia de Staphylococcus coagulasa positivoml en
agar Baird Parker Numero Mas Probable (NMP) de coUfor-mes totales y
Escherichia coliml en caldo Fluorocult y Presencia de Salmonela25ml con BHI
caldo tetrationato y agar Hecktoen (Montoya 1999)
(Var tabla 16)
2212 AnaUsis estadistico
A los datos obtenidos en la medici6n de pH acidez (expresada como Beido
laclico) en los dras 2714 Y 21 y el recuento de Lactobacillus en los dras 714 y21
40
realizados a los dos tratamlentos se tes aplic6 1a prueba t porque solo difieren
en la presencia 0 ausencia del prebi6tico para evaluar si habra diferencia
estadfsticamente significativa para los dos tratamientbs(Ver Tablas9 12 y 15)
41
3 RESULTADOS Y DISCUSION
31 Coloraci6n de Gram y morfologfa
Las cepas aisladas fesultaron Gram positivas (Ver Figura 6) colonias grandes
cremosas dE) color beige con bordes homogeneos y c6ncavos en su
morfologia (Ver Figura 3) resultando de acuerdo a 10 especificado en Stanley
1989 para Lactobacillus
32 Prueba de esporulaci6n y cataJasa
Los resultados de la pruebas de esporulaci6n y catalasa indicados en las
Tablas 3 y 4 respeclivamente dieron conforme a 10 especificado en Stanley
1989 para Lactobacillus
42
1
2 3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
TABLA 3 Resultado de prueba de esporuJaci6n
CEPA RESULfADO ESPORULACION
-- -------------
43
l i ~II bull ~ I I
TABLA 4 Resultado prueba de la catalasa
CEPA RESULTADO CATALASA
1 -2 -3 -4 -5 -6 -7 8 -9 -10 -11 12 -13 -14 -15 -16
3~3 Prueba para determinar la especie
Oespues de hacer las pruebas para seleccionar las cepas sospechosas de ser
Lactobacillus se realizo las pruebas bioquimicas fograndose identificar
Lactobacillus plantarum aislctdo de pepino repollo y repollitas de bruselas
44
fermentados y Lactobacillus brevis de mucosa vaginal y leche fermentada (Ver
Anexos del A al E y Tabla 5)
TABLA 5 Resultado identlficaci6n cepa~
CEPA NOMBRE
1 Lactobacillus planfarum
3 Lactobacillus plantarum
5 Lactobacillus brevis
13 Lactobacillus brevis
15 Lactobacillus plantarum
34 Pruebas para determinar microorganismos probi6ticos
las cepas de Lactobacillus brevis y Lactobacillus plantarum mostraron
rasistencia al medio acido de pH =2 Y sales biliares 03 pv resultado similar al
encontrado por Jacobsen et al 1999 para Lactobacillus plantarum (Ver tabla 6)
45
middot
~~~ttiI lltlmiddot~COX~dtJ ~xtc_~ 2 tr~ k-JlL~middot
-)~~TO DE lJIBUOTECUl rjRL]OTtCA twn GO1IU1
TABLA 6 Resultados a pruebas de resistencia a pH=2 y sales biliares 03 plv
CEPA RESISTENCIA pH=2 RESISTENCfA A SALES BIUARES ()3 pv
1 + +
2 + +
3 + +
4 + +
5 +
6 + +
7 + +
8 + +
9 + +
10 + +
11 + +
12 + +
13 + +
14 +1shy +M
15 + +
16 + +
+1 crecimiento debil
+ crecimiento abundante
46
Figura 6 Lactobacillus brevis Gram + aislado de leche fermentada
Ai observar en placa las celulas de lactobacilos despues de real1zar las pruebas
de resistenCia a la acidez y sales biliares se observo una tendencia a aglomerarse
posiblemente como un mecanismo de proteccion cOlitra estos medios que pueden
lIegar a ser adversos para elias (Ver figuras 7 y 8)
47
Figura 7 Lactobacillus brevis aislada de leche fermentada despu~s de la prueba de resistencia a pH=2
Figura 8 Lactobacillus brevis aislada de leche fermentada despues de la prueba de resistencie asales biUares 03 plv
fI
48
35 --Seguimiento del-pH-en-la-bebidaJacteacon y sin -prebi6tico
A continuacion se muestran las Tablas 7 y 8 donde sa registian los datos
recopilados de pHdurante 10$ dras Z 7 14 Y21 para las bebidas laaeas con ysin
prebi6tioo
TABLA 1 ResultadopH yogur sin avena
Dia Repetition 1 Repetici6n 2 Repeticion 3 Repetici6n 4
2 526 501 51 52
7 446 433 438 44
14 439 435 437 436
21 439 437 438 437
TABLA 8 -ResultadopHyogur con avena
Dia Repeticion 1 Repeticion2 Repeticion 3 - Repeticion 4
2 509 523 51 515
7 447 442 445 442
14 436 -438 439 437
21 432 433 435 434
Observando la Figura 9podamos ver que el pH en el -dfado$ para los dos
tratamientos as igual y empieza a descender rapidamente para estabilizarse a
partir del dra 7(Ver figura 9)
49
Figura 9 Comparacj6n de medias para -el pH
Comparaci6n de medias para pH
55 ~ 5 +----=gtIIIi-~i~~----=-r--it~ -- pH sin avena
a 45 1--~~~~=~~ 4 --- pH con
avena35 t-----r-- -------=------=--= ------- - ----
2 7 14 21
Dias
Aplicando la prueba t para comparar las medias de pH I S6 muestia una diferencia
altamants significativa en los dos tratamientos para el dia 21 (pltO05)
(Ver tabla 9)
TABLA 9 Compaiaci6n de medias para pH
DtAS SIN AVENA CON AVENA te p (VALOR)
2 514 514 0 10
7 439 444 -1 61 0159
14 437 I
438 -070 0510
21 438 433 528 00019 shy
- DiFERENCIA AlTAMENTE SIGNIFICATIVA
50
I
AI aplicar regrasi6n a los datos sa obtiene al modelo estimado
pHSinAyena =535606 - 01505650Ia +0005044340IaI2
La variabilidad en la respuesta de pH asta siendo explicada en un 8S7522 por
el modelo (Ver Anexo F)
EI tratamiento con avena mostro el siguiente modelo al analisis de ragresi6n
pHConAvena =534463 ~ 0140407Dia + 0004480980Ia2
La variabilidad an la respuesta de pH asta siendo explicada en un 903315 par
el nlodelo(Ver anexo G)
36 Seguimiento de la acidezmiddotmiddot expresada comomiddot de acido
lactico
A continuaci6n sa muestran las Tablas 10 y 11 donde sa registran los datos
tecopilados de acidezmiddotdurante los dias 27 14 Y 21 para las pebidas taetees con y
sin prebi6tico
TABLA 10 Resuttadode acidez (expresadocomo acido tactico) yogurt sin avena
CIA R~petici6n1 Repeticion2 Repetici6n 3 Repeticion 4
2 054 06 057 058
7 072 074 073 0]2
14 080 083 082 082
21 0]4 079 078 077
51
TABLA 11 Resultado de aCidez (expresado como acido Icktico) yogurt con avena
Dia Repetici6n 1 RepetiCi6n 2 Repetici6n 3 Repetici9n 4
2 059 055 058 057
7 071 073 072 072
14 089 087 088 086
21 092 091 090 091
Observando la Figura 10 se puede concluir que la acidez empieza a aumentar
hasta el dia 14 y luego trata de estabilizarse para los dos tratamientos
(Ver figura 10)
Figura 10 Comparaci6n de medias para la acidez
N G)
Comparacion de medias para acidez
1
2 0I 5 -+--=--------=-~~~= u
ltC
- Acidez sin avena
2 7 14
Dias
52
21
-it- Acidez con avena
Aplicando la prueba t para camparar las madias de acidez se muestra una
diferencia altarnante significativa en los dos tratamiantos para los dias 14 y 21
(pltO05)
(Var tabla 12)
TABLA 12Comparaci6n de medias para Acidez
DIASmiddot SIN AVENA CON AVENA te p(VALOR)
2 0572 0572 0 10
7 0727 0720 119 0278
14 0818 0875 -638 000070shy
21 077 091 -1212 i 0000019 shy
DIFERENCIA AL TAMENTE SlGNIFICATIVA
AI aplicar r~gresi6n a los datos se obtiene el modelo estimado
AcidezSlnAIena = 0491897 + O0436032Dia O00144613DfaA2
La variabilidad en la respuesta de acidez asta siendoexplicada en un 970978
por al modelo (Ver anexo H)
EI tratamiento con avena mostro elsiguiente modeloj a1 analisis de regresion
AcidezConAvena = 0491638 + 00406572Oia - OQOO982559OiaA2
La variabilidad enla respuesta acidez esta siendo explicadaen un 99212 por
el modelo (Ver anexo J)
53
I ~
37 Prueba de viabiJidad
A continuaci6n sa muestran las Tab~as 13 y 14 donde sa presentan los datos
recopilados del recuento de Lactobacilos durante los dias 7 14 Y 21 para las
bebidas lacteas con y sin prebi6tico
TABLA 13 Recuento de Lactobacilos (UFCml) yogurt sin avena
Dia Repetici6n 1 Repetici6n 2 Repeticion 3 Reptttici6n 4
7 1880X10l1 1454X1011 1642X1011 1780X10~
14 1560X10~ 646X1011J 1890X10l 140X10l1
21 1200x10lu 128Ox10u 1745x10J 1520x101V
TABLA 14 Recuento de Lactobacilos (UFCml) yogurt con avena
Dfa Repetieion 1 Repetici6n 2 Repeticion 3 Repeticf6n 4
7 1600X10lt 1240X10t 1640X10ll 1980X10t
14 540X1011 427X10n 546X10n 720X10ll
21 500x1011 492x1011 712)(1011 980x10~
AI analizar la Figura 11 sa puede observar un recuento mayor de Lactobacilos
en al tratamiento con avena resultado de acuerdo a 10 encontrado por Alander at
aI 1999 Kontula et aI 1998 y Jaskari et aI 1998
54
Figura 11 Comparaci6n de medias para Log Lactobacillus
Comparacion de medias para log Lactobacillus
~ 1350
-+- Sac Sin--() 13 co avenaIII
bull 125 -- Bac con 0)
0 12 avenaJ
115 7 14 21
Dias
Aplicando la prueba t para comparar las medias de recuento de Lactobacillus no
se encontr6 una diferenc1a estadfsUcamente significative entre los dos
tratamientos (Ver tabla 15)
Este aumento en al racuento influy6 en la disminuci6n del pH y en el aumento de
fa aeidez por la fermentacion que realizan los Lactobacillus sobre fa lactosa de la
lache y la avena adicionada como prebi6tico
55
1
TABLA 15 Comparaci6n medias lag Lactobacillus
DIAS SIN AVENA CON AVENA tc p(VALOR)
7 122257 122022 04846 06451
14 121065 132393 -19602 00977
21 129025 133087 -08236 04416
At aplicar regresion a los datos se obtiane al modelo astimado
LactobacillusSinAvena= 117347 + 004834640Ia
La variabilidad en la respuesta del recuento de LactobaCillus ssta siendo
explicada en un 260054 por el mod$loVar anexo J)
EI tratamiento con avena mostr6 al siguiente modalo al anal isis de regresion
Lactobacillu$ConAvena =118103 + 007903040Ias
La variabilidad en la respuesta de recuento esta siendo explicada en un 3068
por al modelo(Ver anexo K)~
38 Analisi$ microbiol6gicos de las bebidas lacteas con y sin
En la Tabla 16 estan recopilados los resultados microbiol6gieos obtenidos en ras
muestras con los dos tratamientos (con y sin avena)
I [
sa
TABLA 16 Resultados analisis microbiologico
Recuento de mohos y levaduras Iml lt10
Recuento de Staphylococcus coagulase positiva Iml lt100
NMP coliformes fotales y Escherichia coli Iml lt3
Presencia de Salmonella25ml Ausente
Los resultados de este analisis demuestran que las bebidas fermentadas con y
sin avena~ astan fibres de microorganismos patogenos
57
1
4 CONCLUSIONES
Se aislaron cepas nativas de Lactobacillus plantarum de las muestras vegetates
de repollo pepino repollitas de bruselas fermentadas y Lactobacillus brevis de
lache fermentada y mucosa vaginal humana Ambas cepas resistieran un pH=2 y
una concentraci6n de sales biliares det 03 ptv dos earacteristicas importantes
en los probi6ticos
Lamiddot cepa de Lactobacillus brevis aislada de lache Sa utiliz6 para elaborar una
bebida fermentada sin y con avana comoingrediente prebiotico obteniendose un
aJimento centon recuento del probi6tico viable durante 21 dras de seguimiento
ademas libre de microorganismos )at6gen05
No se encontr6 efecta significativo de la avena sobre Ie viabilidad del Lactobacillus
brevis aunque sa presento un aumento en 61 recuento de estos en la bebida con
avena
58
plusmn ~
5 RECOMENDACIONES
Ensayar la cepa de Lactobacillus plantartJm en productos carnicos madurados
como el salami
Ensayar la cepa de Lactobacillus l)revs en otros derivados lecteos como queso
quesito queso crema
Continuar con el estudio de estos microorganismos y caracterizarlos
molecularmente ademas de estudiar su capacidad de adherencja a fa mucosa
intestinal sobre algunes Hneas celulares como las CaCo~2
Estudiarel efedo de la avena sabre la viabiJidad del Lactobacillus breyis a una
concentraci6n mayor de 05
Realizer ensayos can las cepas de Lactobacillus brevis y Lactobrlcillus pJantarum
para elaborar masas acidas para panificacion reemplazando el Bromato de
Potasio aditivo prohibido desde marzo del 2003 en nuestro pais per 5U toxicidad
59
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ANEXOS
66
ANEXO A RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AlSLADA DE i
PEPINO it
Referencia Pepino 1 Fecha 06122002
IEXCELENTE IDENTIFICACION
Latto plantarum 1
Galeria API 50 CHL V50 Leida el 06122002
Perfil - -- - ++ - -- - ++++ - - -+- + - I I I I I I I I +t+ - +f- ~ - - + + ~ - - - +- + - shy
o - GLY - ERY DARA - LARA + RIB + DXYL - LXYL - ADO - MDX - GAL + GLU + FRU + MNE + SBE - RHA - DUL - INO bull MAN + SOR - MDM + MUG shyNAG + AMY + ARB + ESC + SAL + CEL + MAL + LAC + MEL + SAC + TRE + 1NU - MLZ + RAF + AMD - GLYG - XLT - GEN + TIJR + LYX - TAG - DFUC shyLFUC - DARL + LARL - aNT + 2KG - 5KG shy
--- Taxones significativos rd -----T -- Tests en contra
Lactoplantarum 1 999 092 1
Taxon siguiente Lactobrevis 1 OJ 044 3
i i
Lactoplantarum 1 1 test (5) en contra
D-SORBITOL (SOR) 78
Tax6n siguiente Lactobrevis 1 3 test (s) ert contra
METHYLD-MANNOSIDE (MOlM) 0 MELEZITOSE (MLZ) 14 D-TURANOSE (TUR) 14
67
ampb
ANEXO B RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AISLADA DE REPOLLO FERMENTADO
~
Referencia Repollo fermentado - 3 Fecha 03072003
EXCELENTE IDENTIFICACION
Lactoplantarum 1
Galena API 50 CRL V50 Leida el 03072003
Perfil - - ++ - - - - -H++ - - ~ + - + - I I 1 I I I I -H+ - ++ - - - + + - -- - - + - shy
o - GLY - ERY - DARA - LARA + RIB + DXYL - LXYL - ADO ~ MDX - GAL + GLU + FRU + MNE + SBE ~ RHA - DUL - INO - MAN + SOR - MDM + MDG shyNAG + AMY + ARR + ESC + SAT + CRL + MAL + LAC + MEL + SAC + TRE + lNU - MLZ + RAF + AMI) - GLYG - XLT - GEN + TOR + LYX - TAG - DFUC shyLFUC - DARL - LARL - GNT + 2KG - 5KG shy
------Taxones significativos _ _----- Id--- ---T---- Tests en contra
Lactoplantarum 1 999 095 1
Tax6n siguiente Lactobrevis 1 01 OA8 3
lJactoplantaru01 1 1 test (s) en contra
DSORBITOL (SOR) 78
Taxon siguiente Lactobrevis
METHYL-D-MANNOSIDE D-TURANOSE
1
(MOM) (TOR)
3 test (5) en contra
0 MELEZITOSE 14
(MLZ) 14
i
I
68
ANEXO C RESULTADO PRUEBAS BIOQUWICAS DE CEPA AISLADA DE MUCOSA HUMANA
Referenda Mucosa - 5 Fecha 27012003
BUENA IDENTlFICACION
Galeria API 50 CHL vso Leida el 270112003
Perfil - - - - +t--t - - - + - + - - - - - - - - -+- - - - - + - + - - - - - - - - - - - - - bull - - -+ - +
o - GLY ~ ERY - DARA bull LARA + RID + DXYL + LXYL - ADO bull MDX - GAL + OLU - FRU + MNE - SBE - IlliA - DUL - INa - MAN - SOR - MDM - MOO shyNAG + AMY - ARB - ESC ~ SAL bull CEL - MAL + lAC - MEL + SAC - TRE shyINU - MLZ - RAF - AMD - GLYG - XLT - GEN - 11JR - LYX - TAG - DFUC shyLFUC - DARL - IARL - ONT + 2KO - 5KG +
- - - - - - Taxones significativos - - - - - - - Id T -- Test en contra
Lactobrevis 3 963 088 1
Taxon siguiente Lactoco11inoides 36 075 2
Lactobrevis 3 1 test (s) en contra
GLUCOSE (GLU) 95
-~~~------------~---------------------------~--~-------~--~-----~----------~--------~------------~~--Taxon siguiente Lactocollinoides 2 test (s) en contra
GLUCOSE (GLU) 100 MELIBIOSE (MEL) 25
69
i r
ANEXO D RESULTADO PRUEBAS BIOQIJiMICAS DE CEPA AISLADA DE LECHE FERMENTADA
Referenda Leche fennentada ~ 13 Fecha 27012003
BUENA IDENTIFICACI6N
Galeria API 50 CHL V50 Leida el 270112003
Perfil - - - - -t-t+- - - - + - + - - - bull - - - - -+- - - - - + - + - - - - - - - - - - - - - - - - -+ - +
0 - GLY - ERY - DARA - LARA +Rll3 + DXYL + LXYL - ADO - MDX ~GAL + GLU - FRU + MNE SBE - RHA DUL bull INO MAN - SOR MDM bull MDG shy
~NAG + AMY - ARB - ESC - SAL - CEL - MAL + LAC - MEL + SAC - TRE I lNU - MLZ - RAF - AMD - GLYG - XLT - OEN - IUR LYX - TAG - DFUC bull i
LFUC - DARL - LARL -ONr + 2KG - SKO + 1
- -- - - Taxones significativos - - Id -- T --- Test en contra
Lacta brevis 3 963 088 1
Taxon siguiente Lactocollinoides 36 075 2
Lactobrevis 3 1 test (s) en contra
GLUCOSE (GLU) 95
-----------------------------------------------------------~------------------------------~-------------------Taxon siguiente Lactocollinoides 2 test (s) en contra
GLUCOSE (GLD) 100 MELffiIOSE (MEL) 25
70
II iJ1
I
I ANEXO E RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AISLADA DE REPOLLITAS DE BRUSELAS FERMENTADA
Referencia repollitas de bruselas 15 Fecha 03072003
EXCELENTE IDENTIFICACION
Lactoplantarum 1
Galeria API 50 CHL vsO Leida el 03072003
Perfil - - - - +t - - - - +H+ - +- - +t + - I I I I I I I f ++t - + - - - -+ + - - - -+ -+ - - I ij
o - GLY - ERY - DARA - LARA + RJB + DXYL - LXYL - ADO - MDX - GAL +
GLU + FRU + MNE + SBE RHA + DUL - INO - MAN + SOR + MDM + MOG shyNAG + AMY + ARB + ESC + SAL + eEL + MAL + LAC + MEl + SAC + TRE + i
I1NU - MLZ + RAF AMD GLYG - XLT - aEN + TUR + LYX - TAG - Druc LFUC - DARt + LARL - aNT + 2KG - 5KG shy n ----Taxones significativos ------ Id Tests en contra
Lactoplantarum 1 999 090 o
Taxon siguiente Lacto pentosus 01 012 7
Lactoplantarum 1 o test (s) en contra
Taxon siguiente Lacto pentosus 7 test (8) en contra
GLYCEROL (GLY) 75 D-XYLOSE (DXYL) 100 L-RHAMNOSE (RHA) 25 METHYL-D-MANNOSIDE (MOM) 1 MELEZITOSE (MLZ) 25 RAFFINOSE (RAF) 75 D-ARABITOL (DARL) 0
71
~
I i I
ANEXO F - ANALISIS DE REGRESION PARA pH EN BEBIDA SIN AVENA
Aruilisis de regresi6n polinomial
---~-~-------------------------------------------~-----------~~---------------------~--------------Variable dependiente pHSinAvena ---------------------------~-------------~--------------------~---------------------------------
Error T Parametro Estimado Estandar Estadistico P-Valor
CONSTANTE 535606 0094535 56657 00000 Dia -0150565 0020706 727154 00000 Dia2 000504434 0000871488 578819 00001
---~---------------------------------------------------------------------------------------------------
Anfllisis de Variama -------------------------------------------~-----------~-----------------------------~-~--- jSource Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor 11
------------------------~------------------------------------------------------------------------------~ Mod-elo 155772 2 0118861 4256 00000 Residual 0237877 13 00182983
Total (Corr) 11956 IS
R2 == 867522 percent
pHSinAvena == 535606 - 0150565Dia + 000504434Dia2
72
____
middot ANEXO G - ANALISIS DE REGRESION PARA pH EN BEBIDA CON AVENA
AmUisis de regresion polinomial _____~_____~__-_____~___4____________________bull____bull__________bull_____________~~----_------___________
Variable depcndiente pHConA vena ------------------------------------------------------------------------------------------~--------
Error T Parametro Estimado StAndar Estadfstico P-Valor
---------------------------------------------~-----------------------------------------------_---------CONSTANTE 534463 00801045 667208 00000 Dia -0140407 00175453 800253 00000 DiaA 2 000448098 0000738458 606803 00000
----------------------~---~-----------------------------~------------------------------~----AmUisis de Varianza
---~---------------------------------~---------------------~------------~-------------------~------Source Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio PValor --------------------------~-----------------------------------------------~------------~-----~~--~ ModeJo 159575 2 0797873 6073 00000 Residual 02170798 middot13 00131383 _______~_~ ~_~----------~------~--~-----~-M-----~-----____ _____________~-----------------------Total (COlT) 176654 15
R12 903315 percent
-----------~------------------------------------------------------------------------~-----------pHConAvena 534463 - 0140407Dia + 000448098DfaA 2
73
ANEXO H - ANALTSIS DE REGRESTON PARA ACIDEZ EN BEBJDA SIN AVENA
An8Jisis de Regtesi6fi P6lifJomial
Variable Depefidiefile~ AcidezSinAVenll _______________w_____~______~________________~-----------_________~_________________~~____~___~_____
Error T Pariirnetro Estimado Estandar Estadistico ---------------------------------------~--------------~-~-------~--------------------~------------CONSTANT 0491697 00123217 399051 00000 Dia 00436032 000269882 161564 00000 D1a2 -000144613 000011359 127312 00000 __w___~________________________~-_______-_____~----____________________________~__~---~_--__~___
AriiiJisis de varianza ~_~__~__________~_~____~________~___________- _________e_____________________________bull _____-________
Source Smn de cuadr Df Mean Square F-Ratio PmiddotValor_~~___________________________________bull ______~___________bull ____________bull ______~________w________________
Model 0135203 2 00676013 21747 00000 Residual 000404118 13 000031086
Total (Corr) 0139244 15
R2 970978 percent
AcidezSlnAvena 0491697 + O0436032Dia - 0OOl44613Dia2
74
I
ANEXO I ANALISIS DE REGRESION PARA ACIDEZ EN BEBIDA CON AVENA
1
Anwisis de tegtesi6fi polinomial
Variable dependiente Acidez Con Avena
Error T ParametTo Estimado Stlindar Estadfstico P-Valor ----------------~-------~---------------------~-----------------------------------------------------CONSTANT 0491639 000926607 530578 00000 Diamiddot 00406572 000202955 200326 00000 DfaA 2 0000982559 0000085421 -115025 00000
-------------~----------------------------~-------------------------~-----------------------------------
-------------~-----~~-----------------------------~---------------------------------------------_--Source Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio PValor
-~-------------~----------------------------------~------------------~~-------------------------- Modelo 0288008 2 0144004 81914 00000 Residual 000228539 13 0000175799
----------~~--------------~---------------------------------------------~---------------------------Total (Corr) 0290294 15
RA2 = 992127 percent
-------------------------~----~---~------------~---------------------------------~---------------~
AcidezConAvena == 049163amp + 00406572D1a - 0000982559DiaA2
75
I
(Ilmiddot il
ANEXO J- ANALISIS DE REGRESION PARA RECUENTO LACTOBACILOS PARA BEBIDA SIN AVENA
Amilisis de regresion - Modelo lineal Y = a + bX
------------------------~----------------------~-----------------------------~----------~-----------Variable Dcpendiente LactobacilJusSinAvena Variable independiente Dia
I--------~----------~-----------------------------------~-------~-~--~--------------------------~-Error T
Paramctro Estimado Standard Stadistico P-Valor
----~----~------------~-----~-----------------------~-------------~-----------------------------Intereepto 117347 0389973 300911 00000 Pendiente 00483464 00257889 18747 00903
Analisis de Varianza
---------~------------------~----------------~---------------------------------~---------~----------Source Sum decuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor
------------~---------------------~---------------------~--------------------------------~-----~----Modelo 0916252 1 244835 443 00616 Residual 260706 10 0260706
--~------------~---~------------------~~~-----~-------~---------~~-------------------------------------Total (Corr)352332 11
Coeficiente Correlaci6n = 0509955 R2 = 260054 percent
LactobacillusSinAvena= 117347 + 00483464Dfa
76
ANEXO K- ANALTSIS DE REGRESION PARA RECUENTO LACTOBACILOS PARA DEBIDA CON AVENA
Aruilisis de regresion - Modelo lineal Y = a + hX
Variable Dependiente LactobacillusConAvena Variable Independiente Dia ---~--------------------------------------------------------__-----------__--_--_-----------shy
Error T Paramctro Estimado Standard Estadistico P-Valor -~--------------------------------------------------------------------------------------------------
Irttercepto 118103 0567963 207942 00000 Pendiente 00790304 00375594 210414 00616
-----------------~----------------------------~----~-------~----~----------------------------
Analisis de Varianza
----------------~----------------~------------------~--------------------------~------~--------shySource Swn de cuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor
-----------------~--~--------------------------------------------------------------------------~---~ Mode10 244835 1 244835 443 00616 Residual 552997 10 0552997
Total (Corr)797832 11
Coeficiente Correlacion = 0553964 RI2 = 306875 percent
-----~--------------------------------------------------------~--------------------------------------
LactobacillusConAvena = 118103 + 00790304Dfas
77
LISTA DE TABLAS
TABLA 1 ALGUNAS ESPECIES MICROBJANAS PROB16TICAS-------------~------middot15
TABLA 2 FueNTE De AISLAMIENTO DE CePAS NATJVAS --------------29
TABLA 3 RESULTADO DE PRUEBA DE ESPORULACI6N------------------43
TABLA 4 RESULTAOO PRUEBA DE LA CATAlASA ----------------------44
TABLA 5 ReSULTADO IOENTIFICACION CEPAS--------------------middot-----45
TABLA 6 ReSULTADOS APRUEBAS DE RESISTENOIA A pH=2 YSALES BILtARES 03 Pv
-----------~-- ----------~--46
TABLA 7 ReSUtTADO pH YOGUR SIN AVENA ----------------49
TABLA 8 ReSULTADO pH YOGUR CON AVENA ------------ --49
TABLA 9 COMPARACION DE MEDIAS PARA pH----------------------50
TABLA 10 ReSULTADO DE ACIDEZ (EXPRESADO COMO ACIDO LACTICO)-------51
YOGURT SIN AVENA ------------------------------51 TABLA 11 ResuLTAOo oJ ACIOEZ (EXPRESAOO COMO ACIDO ACTICo)----52
YOGURT CON AVENA--- ------------------- --- ----52 TABLA 12 COMPARACION DE MEDIAS PARA ACIOEZ----------------~~53
TABLA 13 RecuENTo DE LACTOBACILOS (UFCML) YOGHURT SIN AVENA--54
TABLA 14 RECUENTO DE LACTOBACILO$ (UFCML) YOGHURT CON AVENA ------54
tABLA is COMPARACl6N MEDIAS LOG LAcToBACltLUS-------------56
TABLA 16 RESULTADOS ANALiSIS MICROBIOL6GICO------------- --57
L1STA DE FJGURAS
FIGURA 1 CAMARA DE ANAEROBIOSIS----------middot------~----27
FIGUftA 2 CePAS EN TUBOS CON AGAR INCUNADO -----~--middot----------30
FIGURA 3 COLONrASAISLADAS EN AGAR MRS-------middot---------31
FIGURA 4 API CHL 50-PRUEBA sloaufMlcAS ------------- bull --33
FIGURA 5 DtAGRAMA DE FLUJO ------~---------- ----~-38
FIGURA 6 LACTOBACILLUS I3REVIS GRAM + AfSLAOA OE LECHE FERMENTADA------47
FIGURA 7 LACToBACILLUS BFEVS A1SLADA OS lECHS FERMENTADA DESPUES DE LA
PRUEBA DE RESfSTENCIA A pH=2 ----------------------~ - middot-48
fIGURA 8 LAcTOBAcILLUS BREVIS AISLADA DE LECHE FERMENTADA OESPUES DE LA
PRUEBA DE RESISTENCJA A SALES BILIARES 03 pN------------- ----48
FIGURA 9 COMPARACI6N DE MEDIAS PARA EL pH ---------- ---------50
FIGURA 10 COMPAAACI6N DE MEDIAS PARA LA AC1DEZ ----------------52
FIGURA 11 COMPARACI6N DE MEDIAS PARA LOG LAcTOBAcILLUS -------------55
LISTA DE ANEXOS
ANEXO A--- RESUl TADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AfSLADA DE
ANEXO B RESULTADO PRUEBAS BIOQUfMICAS DE CEPA AISLAOA DE
REPOLLO FERMENTADO --middot----------middot--------------------------68
ANEXO c RESULTADO PRUEBAS BIOQUIMICAS DE CEPA AISLADA DE
MUCOSA HUMANA ------------------------------------------ ------69
ANEXOD RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMCAS DE CEPA AISlADA DE
LECHE FERMENTADA---------------------------------------_-70
ANEXO E RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AtSLADA DE
REPOLLlTAS DE BRUSELAS tERMENTAOA ------------------------71
ANEXO F ANAUSIS DE REGRESION PARA pH EN BEBIDA SIN AVENA--- 72
ANEXO G- ANAUSIS DE REGRESION PARA pH EN BEBIDA CON AVENA --73
ANEXO H ANALISIS DE REGRESION PARA ACIDEZ EN BEBIDA SfN AVENA
ANEXO 1- ANALISIS DE REGRES[ON PARA ACIDEZ EN BEBIDA CON AVENA
ANEXO J- ANALISIS DE REGRESION PARA RECUENTO LACTOBACILOS
PARA 8EBItgtA SIN AVENA ~----------------------------------------wirEr
ANEXO K ANALlS1S DE REGRESION PARA RECUENTO LACTOBACILOS
PAFt BEBIDA CON AIlNA-------~-------~----------~------~---middot-----~-middot---irjr
INTRODUCCI6N
En los ultimos arios S9 ha comprobado los efedoS beneftcos que los
microorganismos probiotico$ ejercen sobre la salud humana a facilitar la digestion
de lactosa estimular 18 actividad inmungica modificar ef balance poblecional
tanto de la microbiola intestinal nativa can posibles sfeelos patogenos como de
las que causan toxiinfeCCiones alimentarias edemas se estan ensayando como
implante en heridas de piel para evttar contamlnacion can microorganismos
patogenos
Los microorganismos probi6ticos se emplean en fa elaboraci6n de productos
fermentados en especial los lacteos Estas industrias se han limitado a utilizar
cultivos iniciadores importados que rsquieren tiampo y culdados para su
manlpulacion y empleo En Colombia no se han realizado InY9s1igaciones que
involucren cepas nativas can activldad probiotica ni el afecto de ingredientes
prebi6tico$ sabre fa viabilidad de estos microorganismos tenienqo en cuenta que
al prebiotico es un ingrediente allmentario que estimula sefectivamente el
crecimiento y actividad de algunas especies de microorganismos probi6ticos
En esta investigacion se sislaron microorganismos probi6ticos a partir de
muestras de vegetales y lache crud a de vaca fermentadas naturafmente y de
mucosa humana utifizando medios de cultivo salactivos bajo condiciones
12
anaerobias Luego se procedio a verificar su rasistencia a los acidos gastricos y
sales biliares simulando asl las condiciones del tracto gastrointestinal de 10$
humanos Las capas que presentaron mejor comportamiento ante estas pruebas
sa caraeterizaron morfologles y bioquimicamente y sa seleccione una de eHas
para inocular en bebidas lacteas sin y can avena como ingrediente prebiotico y
verificar su viabilidad durante al almacenamiento
Los resultados de esta investigacion padren sar de gran irnportanoia para la
industria nacional de alimentos las univarsJdades con facultades relacionadas
can la salud y la alimentaci6n y para las entidades gubernamentales involucradas
en la alimentacion y nutricion de grupos de poblacion vulnerables tales como eJ
Instituto de Bienestar Familiar y Bienestar Social entre otros
13
middot~
1 MARCO TEORICO Y ESTADO DeL ARTE
11 P~OBI6TICOS
111 Historia
EI consumo de productos fermentados lecteos con microorganismos vivos
especialmente bacterias acido lacticas ha sido reportado a 10 largo de la historia
desde tiempos remotos se evidencia al conoeimiento de los beneficios que estes
proporcionaban perc real mente quian enfatiz6 en ellos fua 91 cienUfico ruso Elie
Metctinikcff que reaclon6 la ingesti6n de (eches fermentadas con la longevidad y
salud de las personas ( Pardio et al 1996)
En 1965 sa utilizo por primera vez et termino Probi6tico derivado dellatin pro
que significa a favor de y del gr9go bios que quiera decir vida tnieialmente esta
palabra defini6 a los microorganismos que promovian el erecimiento de otros
microorganismos Ivego se splico asta termino a extraetos de tajido que estimlilan
el crecimiento micrObianqEn la actuaidad sa han definldo como probiotieos los
cultivos (micas 0 mezclados de microorganismos vivos qua al ser ingeridos por
humanos Q animales majoran el balance poblacional de la microbiota intestinal
evitando la adherencia de patogenos (Schrezenmeir et albull2001) Sin embargo
estos microorganismos no nece_iamenta son habitantes propios del tracto
14
gastrointestinal (Holzapfel at a2001Gaitan at al 1998) p~r 10 tanto es
necesario consumir alimantos en los que se encuElntren estos mrcroorganismos
viables estos hacen parte de I~micfobiota de vegetales y leches interviniendo en
Ie fermentaci6n natural de estos~ntos
112 Microorganismos Probi6ticos
los microorganismos probi6ticos que tradicionatmente se han adicionado a la
tache para fermentarla y obtener yogurt y kumis a como suplementos pertenecen
a los generos Lactobacillus Enterococcus y Bifidobacterium (Ver tabla Nro 1) Sin
embargo se considera que solo algunas especies de los gelnsros Lactobacillus y
Bifidobacterium sobreviven en el tracto gastrointestinal En la tabla 1 58 muestran
algunas de estas especies
TABLA 1 Algunas especies microbianas probi6ticas
Lactobacillus Sifidobacferium Enterococcus
L acidophilus
L JohnsoN
L casei
L rhamnosus
Lgrasseri
L reuten
L plantarum
B bifidum
Blongum
B infantis
E fsecium
E faecalis
Fuente Gaitan et a 1998A
15
EI eonoeimiento a cerea de sus efeetos beneficos en el consumidor por su alta
viabilidad en el intestino como la producci6n de sustancias con aetividad
antieaneerigena el mejoramiento ltfel sistema inmunol6gico y el deSplazamiento
de la mierobiota pat6gena gastrointestinal en el consumidor ha estimulado una
mayor demanda de estos microorganismos como tambian de los productos que
los contienen (Heller 2001 Parada middot1998)
Existsn otros produetos fermentados de origen vegetal como et tampe col acida
y salsa de soya de los euales sa pueden aislar estos organismos probi6tieos
comp tambien de la mucosa intestinat humana y luego de suministrarlos a
ratones sa han comprobado sus caracteristicas beneficas (Molin 2001)
113 Caracteristicas fenotfpicas de algunos microorganismos
probi6ticos
las bacterias aeido lacticas de los generos Lactobacillus y Bifidobacterium son
consideradas probi6tieos y tradicionalmente se han clasificado con base en Sus
propiedades morfol6gicas crecimiento a diferentes temperaturas capacidad
fermentadora de glucosa y otros carbbhidratos y la configuraci6n del Bcido Jaetieo
producido (Holzapfel etal2001)
16
)lli~ h Dx nIILIOTECM
eJDe~~ l1ilmfJ tIDBnm
Los Lactobacillus son bacilas gram positiv~s no esparuladas aerotalerantes
acido - tolarantes estrictamente fermentadares formadores de Boido laclica como
producto principal catalasa negativo carentes de citocroma sin embargo se
presentan excepciones a esta descripcion parque afgunas especies pueden
formar catalasa 0 citacramo en medios que contienen hematina 0 compuestos
relacianados La produccion de catalasa no hema pseudocatalasa puede causar
tambien alguna confusion en fa identificacion de algunos Lactobacillus
las especies del genera Bifidobacterium san bacilos gram positivos no
esporulados generafmente anaerabios estricto$ aunque pueden creeer bajo
condiciones microaer6filas cuando estan ert presencia de C02 La mayorfa de sus
especies se pueden diferenciar par criterios biaquimicos simples como la
fermentacion de L arabinosa DmiddotxiJasa O-manosa O-manita y O sorbitat que
pueden servir coma caracterist1cas clave para su clasificacion (Holzapfel
etal2001 )
114 Caracteristicas de los probi6ticos
Las cepas de microorganismos prabi6ticos deben presenter y mantener unas
caracteristlcas que garanticen su crecimienta y supervivencia En el alimenta
como tambiEm durante su transito a traves del est6maga e intestino delgaQo
17
La primera CBtacterfstica es que sean viables esta viabifidad esla capacidad que
tienen los microorganismos probi6ticos de permanecer vivos tanto ~n el alimento
como en el Intestino del consumidor por un tiempo determinado En Colombia se
ha establecido que en bebidas fermentadas este tiempo debe ser minimo de 21
dras en el alimento (Minsalud 1986) Esta vjabilidad depende del metodo de
produccion y de la cepa utilizada (Tuomols at a 2001)
Luego de que se garantice que estos microorganismos eslan viVos en el alimento
ell os deben cumplir otro criterio importanle para ser considerados como
organismos probi6ticos y as tblerar las condiciones de acidez a un pH=2 y la
sccian de proteasas del est6mago ademas de sobrevivir y creeer en presencia de
acidos biliares (Tuomola et al 2001 Jacobsen at a 1999) para luego de
sobrevivir a estas condiciones adherirse a la mucosa intestinal y de esta manera
estimular al sistemainmunoJ6gico esta capacidad de adherirse a la mucosa es un
prerrequisito para la colonizacion del intestlno (Toumola etal2001 Alander et aI
1999)
Cuando los probioticos han pasado todas esta pruebas de supervivencia y luego
de impfantados en la mucosa producen acidos organicos peroxido de hidrogeno y
tambien bacteriocinas que actUan como inhibidore$ del crecimiento de
microorganismos patogenos u oportunistas (Tuomola at al 2001 Cintas et al
2000) complementando de asta manera su accion benefica sobre la mucosa
intestinal y en general sobre la saJud del huesped
18
116 Berieficios de los microorganismos probi6ticos
Los beneficios que se asocian a los microorganismos probioticos son muchos y
variados Entre ros comprobados mediante estudios se eneuentran
1151 Facilitar la digesti6n de la lactosa
los microorganismos probioticos cuando estan en el intestino liberan alii la
enzima pmiddotgalaotosidasa capaz de hidrolizar la lactosa haste glucosa y galactosa
evitando as que personas intolerantes a este carbohidrato presenten sfntomas
como flatulencia dolor abdominal y diarrea cuando consumen leche (be Vresse
et 81 2001)
1152 Protegen contra enfermedades gastrointesUnales
EI consumo de aJimentos con probioticos ha mostrado efeeto terapeutico frente a
los sintomas de diarrea asociada al surninistro de antibi6tico$ de amplio espectro
que destruye 0 disminuye la microbiota endogena esta imp ide la coJonizacion de
bacterias patogenas como Klebsiella oxytoca y Clostridium difficile que pueden
causer lesiones en el cn Los probi6ticos recuperan el balance de la microbiota
intestinal nativa y avitan Ie adhesion de algunos virus bacterias pat6genas a
parasitos que pueden ser agentes causales de gastroenteritis la diarrea del
19
J
viajero y 1(3 inflarnacion intestinal que en ultima instaneia oeasionan ef sfndrome
del colon irritable (Marteu et al 2001)
1153 Protegen contra infecciones del tracto urogenital
La vaginitis indueida por baeteriss yo por levaduras as una infecci6n
estrechamente relacionada con la exposici6n a antibi6ticos y espermicidas y
tambien depende del estado hormonal de la n1ujar Con al uso de mezcJas de
probi6ticos se han obtenido buenos resultados en la rastauraci6n de la rnicrobiota
natural urogenital benefica que desplaza a los eausantes de la inflamaci6n de Is
vagina y Ie uretra (Reid 2001 )
1154 Promueven la barrera de defensa end6gena del intestino
EI tracto gastrointestinal normal mente as una barrera natural contra anUgenos de
origen microbiano y alimentario Cuando los probi6ticos sa adhieren a Is mucosa
intestinal estimulan 0 potencian al sistema inmune favoreciendo la
inmunomodulaci6n que induce un aumentb de fa producci6n de inmunoglobulinas
activacion de las calulas mononueleares y de los linfocitos para proteger al
huesped de infeeciones (Isoulari et sl 2001)
20
1155 Protegen contra cancer de colon
EI cancer es el resultado de una serie de mutaciones somaticas que pueden
ocurrir durante al tiempo de vida del individuo y 10 padeca buena parte de la
poblacion mundial los probi6ticos en un sistema in vitro han demostrado un
efecto positivo en la prevenci6n de mutaciones aI desactivar carcin6genos
genotoxicos (Wolloswski et al J 2001)
1156 Protegen contra infecciones respiratorias
Sa ha demostrado que el conslJlno de probi6ticos disrninuye la incidencia de
infecqiones raspiretorias al aumentar la actividad fagocitica de maer6fagos
alveolares que aettian sobre microorganismos patogenos Se hizo un estudio en
571 ninos sanos con edades entre uno y seis anos divididos en dos grupos a uno
de ellos sa las incluy6 en su dieta leche suplementada can Lactobacillus GG y a
los otros ninos leche no suplementada AI final del estudio se observ6 una
disminucion del 19 en la incidencia de infeccionas respiratorias tratadas con
antibi6ticos tales como otitis media sinusitis bronquitis y neumonfas en el grupo
de los ninos que consumieron Lactobacillus GG (Hatakka et al 2001)
Alvarez et al (2001) encontraron que la administraci6n de yogurt con Lactobacillus
casei en ratones de tres arios de edad majora los espacios libres del puJrn6n de
la presencia de Pseudomona aeruginos8 induciendo un aumento
21
significativo en los niveles de gA a IgM datactadas en los lavados
broncoaJveolares y se observ~ un afecta dependiente de la dosis
1157 En el tratamientoy prevenci6n del eczema
Se ha encontrado que el consumo de probi6ticos mejora la inflamaci6n alergica 0
eczema at6pico en ninos alimentados con formula suplementada con probi6ticos
Encontraron una mejora significativa al suministrar Bifidobacteriummiddot actis y
Lactobacillus GG en 27 niiios con edad promedio de 46 meses Luego de aplicar
este tratamiento se sometieron a una prueha de SCORAD (mide fa extension y
gravedad del eczema) registrando una meJoria significatlva en las condiciones de
la pie concentraci6n de citoquinas cirClllantes an sueto y moleculas de adhesi6n
a las superficies de las celulas soJubles en suero (Isolari 2000)
Se realizaron otros estudios a 159 mujeres embarazadas con historia familiar de
eczema atopico de primer grado a las cuafes sa res 5uministro dosis diarias de
Lactobacillus GG durante 2 a 4 samanas previas al parto Oespues de ella fa
madres twiaron la opci6n de continuer tomando el ptobi6tico si amamantaban 0
bien darseio vIa oral La mayoria de las madras eJigieron dar las dosis at bebe
diariamente A los dos anos de vida se observ6 una disminuci6n del 50 en la
frecuencia del eczema at6pico en aquellos nHies que se les dio ef probi6tico
(Kalliomari etal 2001)
22
1158 Previenen infeccion en heridas quirurgicas
Los probi6ticos impiden la union de pat6genos a las superficies celulares en
heridas mediante la seCreci6n de proteinas Actuamente se encuentra en
estudio la aplicaci6n del Lactobacillus fermentum vivos sabre heridas en piel de
ratas y se ha encontrado una disminuci6n del 90 en la colonizaci6n par parte del
StaphylococcuS aureus uno de los patogenos mas temidos y de mayor lncidencia
en infecciones hospital arias mas aun se esta contempiando la posibilidad de
utilizar la protein a purificada an lugar de los mjcroorganismos para la protaccion
contra infecciones en heridas (Strauss 2000)
12 PREBIOTICOS
Son carbohidratos de cadena corta algunas veces reconocidQs como
oligosacaridos no digeribles par las enzimas del epitelio intestinal 0 de las
gliJnduJas anexas debido a su estructura quimica y de esta manera lIegan al
intestino grueso donde alcanzan a estar disponibles para la fermentaci6n por las
bacierias sacaroHticas que son especial mente laetobadlos y bifidobacterias
dando odgen a compuestos que ejercen efectos funcionales sobre la mucosa del
tubo digestivo (Brunser 2001)
Se consideran como tal algunos fructocligosacaridos isomaltooligosacariclos
oligomato palatinosa poHdextrosa pOJidextrrna raftilina y algunos oligosacaridos
23
)
de 1a soya y fa avena Estenmiddot presentes en alimentos como Ie cebolla ajo
banano puerros 1 derivados del trigo achicoria esparrago alcachofa (Cummings
etal 2001)
Algunos de estos prebi6ticos cuanda son incorporado$ a fa dieta en cantidades
dalerminadas alteran la microbiota intestinal disminuyendo los recuentos de
coliformes bacteroides y cocos y aumentando las bifidobacterias hasta en diez
veces ademas modifican la actividad metab6lica del coron logrando una
disminuci6n del pH y un incremento en el contenido fecal de acidos grasos de
cadena corta como at acatica propi6nico y butfrico El butirato aumen~ _I grosor
de la pared del coron e intestino delgado estimula eJ crecimiento de la mucosa del
colon y auManta su flujo sangufneo inhibe el crecimiento de tinsas tumorales
epiteliales de origen co16nico induce la diferenciaci6n de sus celulas y a
apoptosis entre otros(Brunsar 2001)
Eh estudios hechos en simuladores del intestino humano utilizando productos de
avena fermentados se encontro que estimularon al crecimiento tanto de
lactobacios como de bifidobacterias y en el caso de estas ultimas se incremento
la producci6n de los acidos acatico propionico y butfrico 10 que incide sobre la
implantacion de probi6tico$ e inhibe al crecimientos de otro tipo de
microorganismos (Alal1der eta1999 Kontula etal 1998 Jaskari etal 1998)
24
~ -1
(
AI comparar el comportamianto de las leches de diferente origen se ha
demostrado que Ie leche de vaca contiene caseinatos sustancias que forman
buffer ~n et intestino e inlpiden que los probi6ticos disminlJyen el pH del intestina
y de esta manera se impide al efecto deseado que es evitar fa proliferaci6n de
otros microorganismos entre los cuates pueden estar algunos patOganos En la
leche materna sa encuentran algunos carbohidratos como glucosa galactosa n
acetilglucosamina y algunos 0lig6meros de Ie fucosa en cOhoontracionesmiddot
importantes los cualeS favoreceh el crecimientc)middot de probi6ticos esto
complementado can 91 bajo contenido de protenas que se traduce en una
reducida capacidad buffer hacen de Ie lache materna IJn alimentd adecuado para
nllios en su etape de lactancia
Algunos prebi6ticos como 1a lactulosa yciertos compuestos que contiansn fructosa
no son digeridos en el intestino humano y pueden sar utilizados selectivamenta
par los probi6ticos 10 que hace que los probi6ticos en combinaci6n can prebi6ticos
pueden lIegar a ser un importante medio para prevenir algunas enfermedades del
tracto gastrointestinal (Bezkorovainy 2001)
25
2 METODOlOGfA
21 LOCALIZACION
EJ trabajo sa realizo en el laboratorio de Microbiologia y la planta da laches de Ja
Universidad Naclonal de Colombia- Secie Medellin
En al laboratorio se hiZQ al aislamiento a identificaci6n de fa capas y en fa Planta
sa eJaboro la leche fermentada con 1a cepa seleccionada y el prebi6trco
22 METODOS
221 Aisiamiento de cepas nativas
Las cepas nativas se sislaran de producto$ vegetales leches fermentadas y
mucosa vaginal humana
2211 De vegetales
Las muestras vegetales de repollo repollitas de brusefas y pepino se
seleccionaron porcionaron y mezclaron can cloruro de sadio al 10 pIp se
calacaron en un recipienta de vidrio balo anaerobiosis y sa dejarQn por 15 dias
26
luego S9 tomaron 3 ml de cada muestra y se jnocularon 9 ml de caldo MRS (Man
Rogosa and Sharpe) se incubaron a 37deg C durante cinco dias en camara de
anaerobiosis (Ver Figura 1) Oespues de este tiempo sa inocularon cajas de petri
con agar MRS con 1 ml del cultivo microbiano y se incubaron bajo las mismas
condiciones que eJ caldo Este procedirniento se realiz6 rapetidas veces hasta
seleccionar la cepa pura mediante observaci6n de caracteristicas morfologicas de
la cOlonia y a cada colonia se Ie practico la coloracion de gram con el fin de
observar las caracteristicas microscopicas de cada una e identificar las de mayor
similitud a los Lactobacilos y Bifidobacterias
Figura 1 Camara de anaerobiosis
27
2212 De la leche
Sa tomo 200 ml de teche cruda de la planta de leches y se colaca a fermentar
baja anaerobiosis durante 15 dras Luego sa procedia como en los vegetales
2213 De mucosa vaginal humana
Se tomo una muestra de frotis de mucosa vaginal humane can capito esteril sa
puso a ncubar en Caldo MRS y se procedi6 camo en 2211 y 2212 A cads
aislado sa Ie practico la coloracion de gram y sa seleccionaron aquellas que eran
bacilos gram positivos (Ver Tabla 2)
28
TABLA 2 Fuente de aislarniento de cepas nativas
CEPA FUENTE
1 Pepino fermentadQ
2 repollitas de bruselas fermentadas
3 Repolltgt fermentado
4 Repollo fermentado
5 Mucosa va~inal humana
6 Mucosa vaginal humana
7 repollitas de bruselas fermentadas
8 Repollo fermentado
9 repollitas de bruselas fermentadas
10 Mueo~a vaginal humana
11 Repollo fermentado
12 RepolJo fermentado
13 Leche fermentada
14 Mucosa vaginal humana
15 repollitas de bruselas fermentadas
16 Repollb fermentado
29
222 Almacenamiento de las cepas aisladas
Cuando las cepas crecieron en agar MRS homogEmeas en color morfologia
coloraci6n de Gram etc se pssaron a agar inclinado en tuba se cubrieron con
aceite mineral y se guardaran en refrigeraci6n a 4deg C para tomar de alii la cepa y
efectuarle las diferentes pruebas para confirmar el genera y determinar la especie
de cada una de eas (Ver Figura 2)
Figura 2 Cepas en tubos con agar inclinado
30
223 Pruebas para determinar et genero
2231 Coforaci6n de Gram
A cada cepa sospechosa de Lactobacilos se 1e hizo la coloraci6n de gram y se
seleccionaron las gram positivas
2232 Morfologfa
En agar MRS y despues de incubar en anaerobios~s crecian colonias grandes
cremosas de color beige con bordes homogeneos y c6ncavas(Ver Figura 3)
Figura 3 Colonias aisladas en agar MRS
31
2233 Prueba de esporulaci6n
A cada cepa aislada se Ie hizo esta prueba la cuel consistia en incubar en
aerobiosis durante ocho dias las cajas de agar MRS donde crecieron colonias de
Lactobacilo$ y luego se les (ealize) coloraci6n de espora Las capas que dieron
negativa a la prueba de espora se considararort sospechosas de sar Lactobacilos
y se continuo con la prueba de la catalasa (Ver Tabla 3)
2234 Prueba de la catalasa
los lactobacilos carecen de catalasa Eata prueba se hizo tomando una colonis
se deposito en vidrio de reloj y se Ie adicion6 dos gotas de peroxida de hidr6geno
(H202) la que no presentaba efervescencie eran cepe sospechosa de ser
Lactobacilo (Ver Tabla 4
Sa seleccionaron las capas euyo resultado fue aeorde con el genera Lactobacilfu$
y se continuo con la comirmaeion del genera y determinacion de la eSpecie
meqiante las pruebas bioqulmicas
32
224 Prueba para determlnar la especie
Para confirmar el genero y determinar la especie de las diferentes capas aisladas
se hizo una caracterizaci6n bioqufmica utilizando un kit de API 50 CHL Medium
Ref 50 410 que contiene una galed8 de medios que permite realizar el estudio
de fermentaci6n de los 49 azucares de 52 especies de Lactobacillus (Ver Figura 4
y tabla 5)
Figura 4 API CHL 50-Prueba bioquimica
33
225 Pruebas para determinar microorganismos probi6ticos
2251 Resistencia a pH=2 y sales biliares de concentraci6n O3pv
A las cepas idantificades como Lactobacillus brevis y Lactobacillus pantarum sa
las realiz6 Ie prueba dfl resistencia a pH=2 y sales biliares de concentraci6n 03
pv ( Jacobsen et al 1999) Una colonia de cada cepe aislada se inocul6 en 4 mt
de caldo MRS durante cinco dras bajo condiciones de anaerobiosis Oespues de
esta tiempo se dejaron pracipltar los microorganismos por sedimentaci6n se Ie
retire el sobrenadante y al precipitado se Ie adicion6 Sml de caldo MRS
previamente ajustado a pH=2 can seido clorhfdrico (HCI) dentro del mismo tuba de
ensayo G igual sa hizo can otro tubo previamente incubado pero a este se Ie
adiciono 5ml de caldo MRS con sales biliares a una concentra~i6n de 03 plv y
ambos se incuberon a 37deg C por 2 haras Sa midio 01 mi de cada uno de los
tubas al tiempo 0 y a las 2 horas y sa inoculeron en superficie en caJas de petri
con agar MRS S9 incubaron a 37deg C bajo anaerobiosis durante 48 horas Se
compararon visualrrente en cada caja de petri el crecimiento en superficie y las
que presentaron crecimiento en tos dos tiempos (0 y 2 horas) tanto en at media
acido como en sales I se consideraron resistentes a pH=2 y sales biliares (03
pv)
(Ver Tabla 6)
34
226 Conservacion
Todas fas capas que habian dado positiva Jas pruebas anteriores y que reaultaron
resistentes a pH=2 y sales biliares 03 pv y despues de identificadas en API 50
CHL sa repicaron en agar MRS en tuba inclinado y despues de Incubar a 37deg C
por 48 horas bajo anaerobiosis se Ctlbrie el biser completamente can aceite
mineral esteril y sa guardaron en refrigeraci6n
227 Elaboracj6n de fa bebida fermentada
2271 Preparaci6n de la mue$tra
Sa tome 1 mt de caldo MRS previamante inoculado e incubado que presentaba
una concentracion de Lactobacillus brevis de 27x108 Iml segun la escaJa de Mac
Farlan y sa adiciono a 9ml de leche pasteurizada en un tubo sa dej6 incubanda
en anaerobiosis por 48 hores Luego se pasaron estos 10 ml a un frasco qua
cont~nie 90 ml de leche pasterizada y se dej6 incubando par 48 haras en
anaerobiosis
35
2272 Adici6n del inOculo
A 900ml de leche pasteurizada se Ie adicion61os 100 ml de leche que habia sido
previamente ino(ulada dos veces con la cepa posteriormente se deja
fermantando la lache a temperatura de 37deg C
2273 Control de Ja fermentaci6n
Las muestras se hicieron por cuadruplicado y se les hizo un seguimiento de
aoidez hasta un valor entre 04 y 05 expresada como Bcido lactico esta
procedimiento corresponde a la babida fermentada sin prebi6tico La bebida ~on
prebi6tico tiene al mismo proeedirnianto pero adicionalmente se agrag6 avena a
una concentraci6n de 05 en el momento de la adici6n del in6e410 a los 900 ml
de leehe pasteurlzada y el procedimiento sigui6 igual al de la bebida sin prebi6tico
tambien se hizo por cuadruplicado
2274 Refrigeracl6n
Despues que las mezclas con y sin prebiotico alcanzaron el de acidez
requarido se IIeva ron a refrigeraci6n a una temperatura de 4deg C p~r 24 horas
para frenar proce~os metab6licos de los microorganisrtlos Despues de este
ti~mpo se procedi6 al batido
36
1 2275 Batido
Con un agitador se procedi6 a batir las bebidas para romper et coagulo formado
y de esta manera homogeneizar la mazela y obtener asf la bebida fermentada
2276 Envasado y almacenamiento
Ambas bebidas se envasaron en frascos vidrio para hacerles seguimiento de pH
acidez(expresado como acido tacticol y recuento de Lactobacillus breviSf los
dies 27 14 Y 21 despues de elaboradas las bebidas perfodo durante el cualta
muestra permanecfa afmacenada a temperatura de refrigeracion(Ver Figura 5
37
Fjgura 5 Diagrama de Flujo
PREPARACION DE LA MUESTRA
ADICION DEL INOCULO
~_____~_B~ATIDO~______~
INCUBACION 37deg C hasta acidez = 04-05 acido laotico
ENFRIAMIENTO
hasta 4 0 C ~------~ ~------~
ENVASADO Y ALMACENAMJENTO
dUrante 21 dfas a Temperatura 4 0 C
38
1
228 Determinaci6n del pH
Se determino por el metoda potenciometrico en un pH-metro manual durante los
dias 2) 7 14 Y 21 de las bebidas lacteas sin y con prebi6tica (Ver Tablas 7 y 8)
229 Oeterminaci6n de la acidez (Expresadfl como acido
lactica)
Se tomaron 9 mJ de las bebida~ sa Ie adicionaron 2 gotas de fanoftaleina como
indicador y sa titulo fa acidez con NaOH 01 N hasta la aparicion de un cotor rosado
debit EI volumen de NaOH utilizado se reporta como valor de de acidez
(VerTablas 10 y 11)
2210 Prueba de viabilidad
Qurante el perfoda de almacenamiento de la bebida lactea se procedi6 a hacer la
prueba de viabiHdad en los dias 7 14 Y 21 para determinar Si los lactobacilfus
permanecfan vivOs a una concentraci6n minima de 106 hasta el dia 21 como 10
establece eJ Articulo 10 de la Rasolucion 2310 del Ministerio de $alud de
Colombja
39
Para asta prueba se tamaron 10 rnl de muestra y se adicionaron a 90 ml de caldo
MRS ruego a partir de esta se hicieron diluciones de 10-2 hasta 10-11 de las
diluciones 109101deg 10-11 se inocul6 1 ml de cada uno en agar MRS siguiendo el
metodo de siembra en profundidad y por duplicado e incubando a 370 C x 5 dras
en anaerobiosis y luego se hicieron tos recuentos por duplicado para esi reportar
los recuentos promedio (Ver Tablas 13 y 14)
2211 AniUisls microbiol6glco de las bebidas Iicteas(con y sin
avena)
Con el fin de determinar las condiciones higienico-sanitarias del producto se
realizaron las pruebas microbiol6gicas de Recuento de mohos y fevadurasml en
agar OGY Recuento en superficia de Staphylococcus coagulasa positivoml en
agar Baird Parker Numero Mas Probable (NMP) de coUfor-mes totales y
Escherichia coliml en caldo Fluorocult y Presencia de Salmonela25ml con BHI
caldo tetrationato y agar Hecktoen (Montoya 1999)
(Var tabla 16)
2212 AnaUsis estadistico
A los datos obtenidos en la medici6n de pH acidez (expresada como Beido
laclico) en los dras 2714 Y 21 y el recuento de Lactobacillus en los dras 714 y21
40
realizados a los dos tratamlentos se tes aplic6 1a prueba t porque solo difieren
en la presencia 0 ausencia del prebi6tico para evaluar si habra diferencia
estadfsticamente significativa para los dos tratamientbs(Ver Tablas9 12 y 15)
41
3 RESULTADOS Y DISCUSION
31 Coloraci6n de Gram y morfologfa
Las cepas aisladas fesultaron Gram positivas (Ver Figura 6) colonias grandes
cremosas dE) color beige con bordes homogeneos y c6ncavos en su
morfologia (Ver Figura 3) resultando de acuerdo a 10 especificado en Stanley
1989 para Lactobacillus
32 Prueba de esporulaci6n y cataJasa
Los resultados de la pruebas de esporulaci6n y catalasa indicados en las
Tablas 3 y 4 respeclivamente dieron conforme a 10 especificado en Stanley
1989 para Lactobacillus
42
1
2 3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
TABLA 3 Resultado de prueba de esporuJaci6n
CEPA RESULfADO ESPORULACION
-- -------------
43
l i ~II bull ~ I I
TABLA 4 Resultado prueba de la catalasa
CEPA RESULTADO CATALASA
1 -2 -3 -4 -5 -6 -7 8 -9 -10 -11 12 -13 -14 -15 -16
3~3 Prueba para determinar la especie
Oespues de hacer las pruebas para seleccionar las cepas sospechosas de ser
Lactobacillus se realizo las pruebas bioquimicas fograndose identificar
Lactobacillus plantarum aislctdo de pepino repollo y repollitas de bruselas
44
fermentados y Lactobacillus brevis de mucosa vaginal y leche fermentada (Ver
Anexos del A al E y Tabla 5)
TABLA 5 Resultado identlficaci6n cepa~
CEPA NOMBRE
1 Lactobacillus planfarum
3 Lactobacillus plantarum
5 Lactobacillus brevis
13 Lactobacillus brevis
15 Lactobacillus plantarum
34 Pruebas para determinar microorganismos probi6ticos
las cepas de Lactobacillus brevis y Lactobacillus plantarum mostraron
rasistencia al medio acido de pH =2 Y sales biliares 03 pv resultado similar al
encontrado por Jacobsen et al 1999 para Lactobacillus plantarum (Ver tabla 6)
45
middot
~~~ttiI lltlmiddot~COX~dtJ ~xtc_~ 2 tr~ k-JlL~middot
-)~~TO DE lJIBUOTECUl rjRL]OTtCA twn GO1IU1
TABLA 6 Resultados a pruebas de resistencia a pH=2 y sales biliares 03 plv
CEPA RESISTENCIA pH=2 RESISTENCfA A SALES BIUARES ()3 pv
1 + +
2 + +
3 + +
4 + +
5 +
6 + +
7 + +
8 + +
9 + +
10 + +
11 + +
12 + +
13 + +
14 +1shy +M
15 + +
16 + +
+1 crecimiento debil
+ crecimiento abundante
46
Figura 6 Lactobacillus brevis Gram + aislado de leche fermentada
Ai observar en placa las celulas de lactobacilos despues de real1zar las pruebas
de resistenCia a la acidez y sales biliares se observo una tendencia a aglomerarse
posiblemente como un mecanismo de proteccion cOlitra estos medios que pueden
lIegar a ser adversos para elias (Ver figuras 7 y 8)
47
Figura 7 Lactobacillus brevis aislada de leche fermentada despu~s de la prueba de resistencia a pH=2
Figura 8 Lactobacillus brevis aislada de leche fermentada despues de la prueba de resistencie asales biUares 03 plv
fI
48
35 --Seguimiento del-pH-en-la-bebidaJacteacon y sin -prebi6tico
A continuacion se muestran las Tablas 7 y 8 donde sa registian los datos
recopilados de pHdurante 10$ dras Z 7 14 Y21 para las bebidas laaeas con ysin
prebi6tioo
TABLA 1 ResultadopH yogur sin avena
Dia Repetition 1 Repetici6n 2 Repeticion 3 Repetici6n 4
2 526 501 51 52
7 446 433 438 44
14 439 435 437 436
21 439 437 438 437
TABLA 8 -ResultadopHyogur con avena
Dia Repeticion 1 Repeticion2 Repeticion 3 - Repeticion 4
2 509 523 51 515
7 447 442 445 442
14 436 -438 439 437
21 432 433 435 434
Observando la Figura 9podamos ver que el pH en el -dfado$ para los dos
tratamientos as igual y empieza a descender rapidamente para estabilizarse a
partir del dra 7(Ver figura 9)
49
Figura 9 Comparacj6n de medias para -el pH
Comparaci6n de medias para pH
55 ~ 5 +----=gtIIIi-~i~~----=-r--it~ -- pH sin avena
a 45 1--~~~~=~~ 4 --- pH con
avena35 t-----r-- -------=------=--= ------- - ----
2 7 14 21
Dias
Aplicando la prueba t para comparar las medias de pH I S6 muestia una diferencia
altamants significativa en los dos tratamientos para el dia 21 (pltO05)
(Ver tabla 9)
TABLA 9 Compaiaci6n de medias para pH
DtAS SIN AVENA CON AVENA te p (VALOR)
2 514 514 0 10
7 439 444 -1 61 0159
14 437 I
438 -070 0510
21 438 433 528 00019 shy
- DiFERENCIA AlTAMENTE SIGNIFICATIVA
50
I
AI aplicar regrasi6n a los datos sa obtiene al modelo estimado
pHSinAyena =535606 - 01505650Ia +0005044340IaI2
La variabilidad en la respuesta de pH asta siendo explicada en un 8S7522 por
el modelo (Ver Anexo F)
EI tratamiento con avena mostro el siguiente modelo al analisis de ragresi6n
pHConAvena =534463 ~ 0140407Dia + 0004480980Ia2
La variabilidad an la respuesta de pH asta siendo explicada en un 903315 par
el nlodelo(Ver anexo G)
36 Seguimiento de la acidezmiddotmiddot expresada comomiddot de acido
lactico
A continuaci6n sa muestran las Tablas 10 y 11 donde sa registran los datos
tecopilados de acidezmiddotdurante los dias 27 14 Y 21 para las pebidas taetees con y
sin prebi6tico
TABLA 10 Resuttadode acidez (expresadocomo acido tactico) yogurt sin avena
CIA R~petici6n1 Repeticion2 Repetici6n 3 Repeticion 4
2 054 06 057 058
7 072 074 073 0]2
14 080 083 082 082
21 0]4 079 078 077
51
TABLA 11 Resultado de aCidez (expresado como acido Icktico) yogurt con avena
Dia Repetici6n 1 RepetiCi6n 2 Repetici6n 3 Repetici9n 4
2 059 055 058 057
7 071 073 072 072
14 089 087 088 086
21 092 091 090 091
Observando la Figura 10 se puede concluir que la acidez empieza a aumentar
hasta el dia 14 y luego trata de estabilizarse para los dos tratamientos
(Ver figura 10)
Figura 10 Comparaci6n de medias para la acidez
N G)
Comparacion de medias para acidez
1
2 0I 5 -+--=--------=-~~~= u
ltC
- Acidez sin avena
2 7 14
Dias
52
21
-it- Acidez con avena
Aplicando la prueba t para camparar las madias de acidez se muestra una
diferencia altarnante significativa en los dos tratamiantos para los dias 14 y 21
(pltO05)
(Var tabla 12)
TABLA 12Comparaci6n de medias para Acidez
DIASmiddot SIN AVENA CON AVENA te p(VALOR)
2 0572 0572 0 10
7 0727 0720 119 0278
14 0818 0875 -638 000070shy
21 077 091 -1212 i 0000019 shy
DIFERENCIA AL TAMENTE SlGNIFICATIVA
AI aplicar r~gresi6n a los datos se obtiene el modelo estimado
AcidezSlnAIena = 0491897 + O0436032Dia O00144613DfaA2
La variabilidad en la respuesta de acidez asta siendoexplicada en un 970978
por al modelo (Ver anexo H)
EI tratamiento con avena mostro elsiguiente modeloj a1 analisis de regresion
AcidezConAvena = 0491638 + 00406572Oia - OQOO982559OiaA2
La variabilidad enla respuesta acidez esta siendo explicadaen un 99212 por
el modelo (Ver anexo J)
53
I ~
37 Prueba de viabiJidad
A continuaci6n sa muestran las Tab~as 13 y 14 donde sa presentan los datos
recopilados del recuento de Lactobacilos durante los dias 7 14 Y 21 para las
bebidas lacteas con y sin prebi6tico
TABLA 13 Recuento de Lactobacilos (UFCml) yogurt sin avena
Dia Repetici6n 1 Repetici6n 2 Repeticion 3 Reptttici6n 4
7 1880X10l1 1454X1011 1642X1011 1780X10~
14 1560X10~ 646X1011J 1890X10l 140X10l1
21 1200x10lu 128Ox10u 1745x10J 1520x101V
TABLA 14 Recuento de Lactobacilos (UFCml) yogurt con avena
Dfa Repetieion 1 Repetici6n 2 Repeticion 3 Repeticf6n 4
7 1600X10lt 1240X10t 1640X10ll 1980X10t
14 540X1011 427X10n 546X10n 720X10ll
21 500x1011 492x1011 712)(1011 980x10~
AI analizar la Figura 11 sa puede observar un recuento mayor de Lactobacilos
en al tratamiento con avena resultado de acuerdo a 10 encontrado por Alander at
aI 1999 Kontula et aI 1998 y Jaskari et aI 1998
54
Figura 11 Comparaci6n de medias para Log Lactobacillus
Comparacion de medias para log Lactobacillus
~ 1350
-+- Sac Sin--() 13 co avenaIII
bull 125 -- Bac con 0)
0 12 avenaJ
115 7 14 21
Dias
Aplicando la prueba t para comparar las medias de recuento de Lactobacillus no
se encontr6 una diferenc1a estadfsUcamente significative entre los dos
tratamientos (Ver tabla 15)
Este aumento en al racuento influy6 en la disminuci6n del pH y en el aumento de
fa aeidez por la fermentacion que realizan los Lactobacillus sobre fa lactosa de la
lache y la avena adicionada como prebi6tico
55
1
TABLA 15 Comparaci6n medias lag Lactobacillus
DIAS SIN AVENA CON AVENA tc p(VALOR)
7 122257 122022 04846 06451
14 121065 132393 -19602 00977
21 129025 133087 -08236 04416
At aplicar regresion a los datos se obtiane al modelo astimado
LactobacillusSinAvena= 117347 + 004834640Ia
La variabilidad en la respuesta del recuento de LactobaCillus ssta siendo
explicada en un 260054 por el mod$loVar anexo J)
EI tratamiento con avena mostr6 al siguiente modalo al anal isis de regresion
Lactobacillu$ConAvena =118103 + 007903040Ias
La variabilidad en la respuesta de recuento esta siendo explicada en un 3068
por al modelo(Ver anexo K)~
38 Analisi$ microbiol6gicos de las bebidas lacteas con y sin
En la Tabla 16 estan recopilados los resultados microbiol6gieos obtenidos en ras
muestras con los dos tratamientos (con y sin avena)
I [
sa
TABLA 16 Resultados analisis microbiologico
Recuento de mohos y levaduras Iml lt10
Recuento de Staphylococcus coagulase positiva Iml lt100
NMP coliformes fotales y Escherichia coli Iml lt3
Presencia de Salmonella25ml Ausente
Los resultados de este analisis demuestran que las bebidas fermentadas con y
sin avena~ astan fibres de microorganismos patogenos
57
1
4 CONCLUSIONES
Se aislaron cepas nativas de Lactobacillus plantarum de las muestras vegetates
de repollo pepino repollitas de bruselas fermentadas y Lactobacillus brevis de
lache fermentada y mucosa vaginal humana Ambas cepas resistieran un pH=2 y
una concentraci6n de sales biliares det 03 ptv dos earacteristicas importantes
en los probi6ticos
Lamiddot cepa de Lactobacillus brevis aislada de lache Sa utiliz6 para elaborar una
bebida fermentada sin y con avana comoingrediente prebiotico obteniendose un
aJimento centon recuento del probi6tico viable durante 21 dras de seguimiento
ademas libre de microorganismos )at6gen05
No se encontr6 efecta significativo de la avena sobre Ie viabilidad del Lactobacillus
brevis aunque sa presento un aumento en 61 recuento de estos en la bebida con
avena
58
plusmn ~
5 RECOMENDACIONES
Ensayar la cepa de Lactobacillus plantartJm en productos carnicos madurados
como el salami
Ensayar la cepa de Lactobacillus l)revs en otros derivados lecteos como queso
quesito queso crema
Continuar con el estudio de estos microorganismos y caracterizarlos
molecularmente ademas de estudiar su capacidad de adherencja a fa mucosa
intestinal sobre algunes Hneas celulares como las CaCo~2
Estudiarel efedo de la avena sabre la viabiJidad del Lactobacillus breyis a una
concentraci6n mayor de 05
Realizer ensayos can las cepas de Lactobacillus brevis y Lactobrlcillus pJantarum
para elaborar masas acidas para panificacion reemplazando el Bromato de
Potasio aditivo prohibido desde marzo del 2003 en nuestro pais per 5U toxicidad
59
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65
ANEXOS
66
ANEXO A RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AlSLADA DE i
PEPINO it
Referencia Pepino 1 Fecha 06122002
IEXCELENTE IDENTIFICACION
Latto plantarum 1
Galeria API 50 CHL V50 Leida el 06122002
Perfil - -- - ++ - -- - ++++ - - -+- + - I I I I I I I I +t+ - +f- ~ - - + + ~ - - - +- + - shy
o - GLY - ERY DARA - LARA + RIB + DXYL - LXYL - ADO - MDX - GAL + GLU + FRU + MNE + SBE - RHA - DUL - INO bull MAN + SOR - MDM + MUG shyNAG + AMY + ARB + ESC + SAL + CEL + MAL + LAC + MEL + SAC + TRE + 1NU - MLZ + RAF + AMD - GLYG - XLT - GEN + TIJR + LYX - TAG - DFUC shyLFUC - DARL + LARL - aNT + 2KG - 5KG shy
--- Taxones significativos rd -----T -- Tests en contra
Lactoplantarum 1 999 092 1
Taxon siguiente Lactobrevis 1 OJ 044 3
i i
Lactoplantarum 1 1 test (5) en contra
D-SORBITOL (SOR) 78
Tax6n siguiente Lactobrevis 1 3 test (s) ert contra
METHYLD-MANNOSIDE (MOlM) 0 MELEZITOSE (MLZ) 14 D-TURANOSE (TUR) 14
67
ampb
ANEXO B RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AISLADA DE REPOLLO FERMENTADO
~
Referencia Repollo fermentado - 3 Fecha 03072003
EXCELENTE IDENTIFICACION
Lactoplantarum 1
Galena API 50 CRL V50 Leida el 03072003
Perfil - - ++ - - - - -H++ - - ~ + - + - I I 1 I I I I -H+ - ++ - - - + + - -- - - + - shy
o - GLY - ERY - DARA - LARA + RIB + DXYL - LXYL - ADO ~ MDX - GAL + GLU + FRU + MNE + SBE ~ RHA - DUL - INO - MAN + SOR - MDM + MDG shyNAG + AMY + ARR + ESC + SAT + CRL + MAL + LAC + MEL + SAC + TRE + lNU - MLZ + RAF + AMI) - GLYG - XLT - GEN + TOR + LYX - TAG - DFUC shyLFUC - DARL - LARL - GNT + 2KG - 5KG shy
------Taxones significativos _ _----- Id--- ---T---- Tests en contra
Lactoplantarum 1 999 095 1
Tax6n siguiente Lactobrevis 1 01 OA8 3
lJactoplantaru01 1 1 test (s) en contra
DSORBITOL (SOR) 78
Taxon siguiente Lactobrevis
METHYL-D-MANNOSIDE D-TURANOSE
1
(MOM) (TOR)
3 test (5) en contra
0 MELEZITOSE 14
(MLZ) 14
i
I
68
ANEXO C RESULTADO PRUEBAS BIOQUWICAS DE CEPA AISLADA DE MUCOSA HUMANA
Referenda Mucosa - 5 Fecha 27012003
BUENA IDENTlFICACION
Galeria API 50 CHL vso Leida el 270112003
Perfil - - - - +t--t - - - + - + - - - - - - - - -+- - - - - + - + - - - - - - - - - - - - - bull - - -+ - +
o - GLY ~ ERY - DARA bull LARA + RID + DXYL + LXYL - ADO bull MDX - GAL + OLU - FRU + MNE - SBE - IlliA - DUL - INa - MAN - SOR - MDM - MOO shyNAG + AMY - ARB - ESC ~ SAL bull CEL - MAL + lAC - MEL + SAC - TRE shyINU - MLZ - RAF - AMD - GLYG - XLT - GEN - 11JR - LYX - TAG - DFUC shyLFUC - DARL - IARL - ONT + 2KO - 5KG +
- - - - - - Taxones significativos - - - - - - - Id T -- Test en contra
Lactobrevis 3 963 088 1
Taxon siguiente Lactoco11inoides 36 075 2
Lactobrevis 3 1 test (s) en contra
GLUCOSE (GLU) 95
-~~~------------~---------------------------~--~-------~--~-----~----------~--------~------------~~--Taxon siguiente Lactocollinoides 2 test (s) en contra
GLUCOSE (GLU) 100 MELIBIOSE (MEL) 25
69
i r
ANEXO D RESULTADO PRUEBAS BIOQIJiMICAS DE CEPA AISLADA DE LECHE FERMENTADA
Referenda Leche fennentada ~ 13 Fecha 27012003
BUENA IDENTIFICACI6N
Galeria API 50 CHL V50 Leida el 270112003
Perfil - - - - -t-t+- - - - + - + - - - bull - - - - -+- - - - - + - + - - - - - - - - - - - - - - - - -+ - +
0 - GLY - ERY - DARA - LARA +Rll3 + DXYL + LXYL - ADO - MDX ~GAL + GLU - FRU + MNE SBE - RHA DUL bull INO MAN - SOR MDM bull MDG shy
~NAG + AMY - ARB - ESC - SAL - CEL - MAL + LAC - MEL + SAC - TRE I lNU - MLZ - RAF - AMD - GLYG - XLT - OEN - IUR LYX - TAG - DFUC bull i
LFUC - DARL - LARL -ONr + 2KG - SKO + 1
- -- - - Taxones significativos - - Id -- T --- Test en contra
Lacta brevis 3 963 088 1
Taxon siguiente Lactocollinoides 36 075 2
Lactobrevis 3 1 test (s) en contra
GLUCOSE (GLU) 95
-----------------------------------------------------------~------------------------------~-------------------Taxon siguiente Lactocollinoides 2 test (s) en contra
GLUCOSE (GLD) 100 MELffiIOSE (MEL) 25
70
II iJ1
I
I ANEXO E RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AISLADA DE REPOLLITAS DE BRUSELAS FERMENTADA
Referencia repollitas de bruselas 15 Fecha 03072003
EXCELENTE IDENTIFICACION
Lactoplantarum 1
Galeria API 50 CHL vsO Leida el 03072003
Perfil - - - - +t - - - - +H+ - +- - +t + - I I I I I I I f ++t - + - - - -+ + - - - -+ -+ - - I ij
o - GLY - ERY - DARA - LARA + RJB + DXYL - LXYL - ADO - MDX - GAL +
GLU + FRU + MNE + SBE RHA + DUL - INO - MAN + SOR + MDM + MOG shyNAG + AMY + ARB + ESC + SAL + eEL + MAL + LAC + MEl + SAC + TRE + i
I1NU - MLZ + RAF AMD GLYG - XLT - aEN + TUR + LYX - TAG - Druc LFUC - DARt + LARL - aNT + 2KG - 5KG shy n ----Taxones significativos ------ Id Tests en contra
Lactoplantarum 1 999 090 o
Taxon siguiente Lacto pentosus 01 012 7
Lactoplantarum 1 o test (s) en contra
Taxon siguiente Lacto pentosus 7 test (8) en contra
GLYCEROL (GLY) 75 D-XYLOSE (DXYL) 100 L-RHAMNOSE (RHA) 25 METHYL-D-MANNOSIDE (MOM) 1 MELEZITOSE (MLZ) 25 RAFFINOSE (RAF) 75 D-ARABITOL (DARL) 0
71
~
I i I
ANEXO F - ANALISIS DE REGRESION PARA pH EN BEBIDA SIN AVENA
Aruilisis de regresi6n polinomial
---~-~-------------------------------------------~-----------~~---------------------~--------------Variable dependiente pHSinAvena ---------------------------~-------------~--------------------~---------------------------------
Error T Parametro Estimado Estandar Estadistico P-Valor
CONSTANTE 535606 0094535 56657 00000 Dia -0150565 0020706 727154 00000 Dia2 000504434 0000871488 578819 00001
---~---------------------------------------------------------------------------------------------------
Anfllisis de Variama -------------------------------------------~-----------~-----------------------------~-~--- jSource Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor 11
------------------------~------------------------------------------------------------------------------~ Mod-elo 155772 2 0118861 4256 00000 Residual 0237877 13 00182983
Total (Corr) 11956 IS
R2 == 867522 percent
pHSinAvena == 535606 - 0150565Dia + 000504434Dia2
72
____
middot ANEXO G - ANALISIS DE REGRESION PARA pH EN BEBIDA CON AVENA
AmUisis de regresion polinomial _____~_____~__-_____~___4____________________bull____bull__________bull_____________~~----_------___________
Variable depcndiente pHConA vena ------------------------------------------------------------------------------------------~--------
Error T Parametro Estimado StAndar Estadfstico P-Valor
---------------------------------------------~-----------------------------------------------_---------CONSTANTE 534463 00801045 667208 00000 Dia -0140407 00175453 800253 00000 DiaA 2 000448098 0000738458 606803 00000
----------------------~---~-----------------------------~------------------------------~----AmUisis de Varianza
---~---------------------------------~---------------------~------------~-------------------~------Source Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio PValor --------------------------~-----------------------------------------------~------------~-----~~--~ ModeJo 159575 2 0797873 6073 00000 Residual 02170798 middot13 00131383 _______~_~ ~_~----------~------~--~-----~-M-----~-----____ _____________~-----------------------Total (COlT) 176654 15
R12 903315 percent
-----------~------------------------------------------------------------------------~-----------pHConAvena 534463 - 0140407Dia + 000448098DfaA 2
73
ANEXO H - ANALTSIS DE REGRESTON PARA ACIDEZ EN BEBJDA SIN AVENA
An8Jisis de Regtesi6fi P6lifJomial
Variable Depefidiefile~ AcidezSinAVenll _______________w_____~______~________________~-----------_________~_________________~~____~___~_____
Error T Pariirnetro Estimado Estandar Estadistico ---------------------------------------~--------------~-~-------~--------------------~------------CONSTANT 0491697 00123217 399051 00000 Dia 00436032 000269882 161564 00000 D1a2 -000144613 000011359 127312 00000 __w___~________________________~-_______-_____~----____________________________~__~---~_--__~___
AriiiJisis de varianza ~_~__~__________~_~____~________~___________- _________e_____________________________bull _____-________
Source Smn de cuadr Df Mean Square F-Ratio PmiddotValor_~~___________________________________bull ______~___________bull ____________bull ______~________w________________
Model 0135203 2 00676013 21747 00000 Residual 000404118 13 000031086
Total (Corr) 0139244 15
R2 970978 percent
AcidezSlnAvena 0491697 + O0436032Dia - 0OOl44613Dia2
74
I
ANEXO I ANALISIS DE REGRESION PARA ACIDEZ EN BEBIDA CON AVENA
1
Anwisis de tegtesi6fi polinomial
Variable dependiente Acidez Con Avena
Error T ParametTo Estimado Stlindar Estadfstico P-Valor ----------------~-------~---------------------~-----------------------------------------------------CONSTANT 0491639 000926607 530578 00000 Diamiddot 00406572 000202955 200326 00000 DfaA 2 0000982559 0000085421 -115025 00000
-------------~----------------------------~-------------------------~-----------------------------------
-------------~-----~~-----------------------------~---------------------------------------------_--Source Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio PValor
-~-------------~----------------------------------~------------------~~-------------------------- Modelo 0288008 2 0144004 81914 00000 Residual 000228539 13 0000175799
----------~~--------------~---------------------------------------------~---------------------------Total (Corr) 0290294 15
RA2 = 992127 percent
-------------------------~----~---~------------~---------------------------------~---------------~
AcidezConAvena == 049163amp + 00406572D1a - 0000982559DiaA2
75
I
(Ilmiddot il
ANEXO J- ANALISIS DE REGRESION PARA RECUENTO LACTOBACILOS PARA BEBIDA SIN AVENA
Amilisis de regresion - Modelo lineal Y = a + bX
------------------------~----------------------~-----------------------------~----------~-----------Variable Dcpendiente LactobacilJusSinAvena Variable independiente Dia
I--------~----------~-----------------------------------~-------~-~--~--------------------------~-Error T
Paramctro Estimado Standard Stadistico P-Valor
----~----~------------~-----~-----------------------~-------------~-----------------------------Intereepto 117347 0389973 300911 00000 Pendiente 00483464 00257889 18747 00903
Analisis de Varianza
---------~------------------~----------------~---------------------------------~---------~----------Source Sum decuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor
------------~---------------------~---------------------~--------------------------------~-----~----Modelo 0916252 1 244835 443 00616 Residual 260706 10 0260706
--~------------~---~------------------~~~-----~-------~---------~~-------------------------------------Total (Corr)352332 11
Coeficiente Correlaci6n = 0509955 R2 = 260054 percent
LactobacillusSinAvena= 117347 + 00483464Dfa
76
ANEXO K- ANALTSIS DE REGRESION PARA RECUENTO LACTOBACILOS PARA DEBIDA CON AVENA
Aruilisis de regresion - Modelo lineal Y = a + hX
Variable Dependiente LactobacillusConAvena Variable Independiente Dia ---~--------------------------------------------------------__-----------__--_--_-----------shy
Error T Paramctro Estimado Standard Estadistico P-Valor -~--------------------------------------------------------------------------------------------------
Irttercepto 118103 0567963 207942 00000 Pendiente 00790304 00375594 210414 00616
-----------------~----------------------------~----~-------~----~----------------------------
Analisis de Varianza
----------------~----------------~------------------~--------------------------~------~--------shySource Swn de cuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor
-----------------~--~--------------------------------------------------------------------------~---~ Mode10 244835 1 244835 443 00616 Residual 552997 10 0552997
Total (Corr)797832 11
Coeficiente Correlacion = 0553964 RI2 = 306875 percent
-----~--------------------------------------------------------~--------------------------------------
LactobacillusConAvena = 118103 + 00790304Dfas
77
L1STA DE FJGURAS
FIGURA 1 CAMARA DE ANAEROBIOSIS----------middot------~----27
FIGUftA 2 CePAS EN TUBOS CON AGAR INCUNADO -----~--middot----------30
FIGURA 3 COLONrASAISLADAS EN AGAR MRS-------middot---------31
FIGURA 4 API CHL 50-PRUEBA sloaufMlcAS ------------- bull --33
FIGURA 5 DtAGRAMA DE FLUJO ------~---------- ----~-38
FIGURA 6 LACTOBACILLUS I3REVIS GRAM + AfSLAOA OE LECHE FERMENTADA------47
FIGURA 7 LACToBACILLUS BFEVS A1SLADA OS lECHS FERMENTADA DESPUES DE LA
PRUEBA DE RESfSTENCIA A pH=2 ----------------------~ - middot-48
fIGURA 8 LAcTOBAcILLUS BREVIS AISLADA DE LECHE FERMENTADA OESPUES DE LA
PRUEBA DE RESISTENCJA A SALES BILIARES 03 pN------------- ----48
FIGURA 9 COMPARACI6N DE MEDIAS PARA EL pH ---------- ---------50
FIGURA 10 COMPAAACI6N DE MEDIAS PARA LA AC1DEZ ----------------52
FIGURA 11 COMPARACI6N DE MEDIAS PARA LOG LAcTOBAcILLUS -------------55
LISTA DE ANEXOS
ANEXO A--- RESUl TADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AfSLADA DE
ANEXO B RESULTADO PRUEBAS BIOQUfMICAS DE CEPA AISLAOA DE
REPOLLO FERMENTADO --middot----------middot--------------------------68
ANEXO c RESULTADO PRUEBAS BIOQUIMICAS DE CEPA AISLADA DE
MUCOSA HUMANA ------------------------------------------ ------69
ANEXOD RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMCAS DE CEPA AISlADA DE
LECHE FERMENTADA---------------------------------------_-70
ANEXO E RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AtSLADA DE
REPOLLlTAS DE BRUSELAS tERMENTAOA ------------------------71
ANEXO F ANAUSIS DE REGRESION PARA pH EN BEBIDA SIN AVENA--- 72
ANEXO G- ANAUSIS DE REGRESION PARA pH EN BEBIDA CON AVENA --73
ANEXO H ANALISIS DE REGRESION PARA ACIDEZ EN BEBIDA SfN AVENA
ANEXO 1- ANALISIS DE REGRES[ON PARA ACIDEZ EN BEBIDA CON AVENA
ANEXO J- ANALISIS DE REGRESION PARA RECUENTO LACTOBACILOS
PARA 8EBItgtA SIN AVENA ~----------------------------------------wirEr
ANEXO K ANALlS1S DE REGRESION PARA RECUENTO LACTOBACILOS
PAFt BEBIDA CON AIlNA-------~-------~----------~------~---middot-----~-middot---irjr
INTRODUCCI6N
En los ultimos arios S9 ha comprobado los efedoS beneftcos que los
microorganismos probiotico$ ejercen sobre la salud humana a facilitar la digestion
de lactosa estimular 18 actividad inmungica modificar ef balance poblecional
tanto de la microbiola intestinal nativa can posibles sfeelos patogenos como de
las que causan toxiinfeCCiones alimentarias edemas se estan ensayando como
implante en heridas de piel para evttar contamlnacion can microorganismos
patogenos
Los microorganismos probi6ticos se emplean en fa elaboraci6n de productos
fermentados en especial los lacteos Estas industrias se han limitado a utilizar
cultivos iniciadores importados que rsquieren tiampo y culdados para su
manlpulacion y empleo En Colombia no se han realizado InY9s1igaciones que
involucren cepas nativas can activldad probiotica ni el afecto de ingredientes
prebi6tico$ sabre fa viabilidad de estos microorganismos tenienqo en cuenta que
al prebiotico es un ingrediente allmentario que estimula sefectivamente el
crecimiento y actividad de algunas especies de microorganismos probi6ticos
En esta investigacion se sislaron microorganismos probi6ticos a partir de
muestras de vegetales y lache crud a de vaca fermentadas naturafmente y de
mucosa humana utifizando medios de cultivo salactivos bajo condiciones
12
anaerobias Luego se procedio a verificar su rasistencia a los acidos gastricos y
sales biliares simulando asl las condiciones del tracto gastrointestinal de 10$
humanos Las capas que presentaron mejor comportamiento ante estas pruebas
sa caraeterizaron morfologles y bioquimicamente y sa seleccione una de eHas
para inocular en bebidas lacteas sin y can avena como ingrediente prebiotico y
verificar su viabilidad durante al almacenamiento
Los resultados de esta investigacion padren sar de gran irnportanoia para la
industria nacional de alimentos las univarsJdades con facultades relacionadas
can la salud y la alimentaci6n y para las entidades gubernamentales involucradas
en la alimentacion y nutricion de grupos de poblacion vulnerables tales como eJ
Instituto de Bienestar Familiar y Bienestar Social entre otros
13
middot~
1 MARCO TEORICO Y ESTADO DeL ARTE
11 P~OBI6TICOS
111 Historia
EI consumo de productos fermentados lecteos con microorganismos vivos
especialmente bacterias acido lacticas ha sido reportado a 10 largo de la historia
desde tiempos remotos se evidencia al conoeimiento de los beneficios que estes
proporcionaban perc real mente quian enfatiz6 en ellos fua 91 cienUfico ruso Elie
Metctinikcff que reaclon6 la ingesti6n de (eches fermentadas con la longevidad y
salud de las personas ( Pardio et al 1996)
En 1965 sa utilizo por primera vez et termino Probi6tico derivado dellatin pro
que significa a favor de y del gr9go bios que quiera decir vida tnieialmente esta
palabra defini6 a los microorganismos que promovian el erecimiento de otros
microorganismos Ivego se splico asta termino a extraetos de tajido que estimlilan
el crecimiento micrObianqEn la actuaidad sa han definldo como probiotieos los
cultivos (micas 0 mezclados de microorganismos vivos qua al ser ingeridos por
humanos Q animales majoran el balance poblacional de la microbiota intestinal
evitando la adherencia de patogenos (Schrezenmeir et albull2001) Sin embargo
estos microorganismos no nece_iamenta son habitantes propios del tracto
14
gastrointestinal (Holzapfel at a2001Gaitan at al 1998) p~r 10 tanto es
necesario consumir alimantos en los que se encuElntren estos mrcroorganismos
viables estos hacen parte de I~micfobiota de vegetales y leches interviniendo en
Ie fermentaci6n natural de estos~ntos
112 Microorganismos Probi6ticos
los microorganismos probi6ticos que tradicionatmente se han adicionado a la
tache para fermentarla y obtener yogurt y kumis a como suplementos pertenecen
a los generos Lactobacillus Enterococcus y Bifidobacterium (Ver tabla Nro 1) Sin
embargo se considera que solo algunas especies de los gelnsros Lactobacillus y
Bifidobacterium sobreviven en el tracto gastrointestinal En la tabla 1 58 muestran
algunas de estas especies
TABLA 1 Algunas especies microbianas probi6ticas
Lactobacillus Sifidobacferium Enterococcus
L acidophilus
L JohnsoN
L casei
L rhamnosus
Lgrasseri
L reuten
L plantarum
B bifidum
Blongum
B infantis
E fsecium
E faecalis
Fuente Gaitan et a 1998A
15
EI eonoeimiento a cerea de sus efeetos beneficos en el consumidor por su alta
viabilidad en el intestino como la producci6n de sustancias con aetividad
antieaneerigena el mejoramiento ltfel sistema inmunol6gico y el deSplazamiento
de la mierobiota pat6gena gastrointestinal en el consumidor ha estimulado una
mayor demanda de estos microorganismos como tambian de los productos que
los contienen (Heller 2001 Parada middot1998)
Existsn otros produetos fermentados de origen vegetal como et tampe col acida
y salsa de soya de los euales sa pueden aislar estos organismos probi6tieos
comp tambien de la mucosa intestinat humana y luego de suministrarlos a
ratones sa han comprobado sus caracteristicas beneficas (Molin 2001)
113 Caracteristicas fenotfpicas de algunos microorganismos
probi6ticos
las bacterias aeido lacticas de los generos Lactobacillus y Bifidobacterium son
consideradas probi6tieos y tradicionalmente se han clasificado con base en Sus
propiedades morfol6gicas crecimiento a diferentes temperaturas capacidad
fermentadora de glucosa y otros carbbhidratos y la configuraci6n del Bcido Jaetieo
producido (Holzapfel etal2001)
16
)lli~ h Dx nIILIOTECM
eJDe~~ l1ilmfJ tIDBnm
Los Lactobacillus son bacilas gram positiv~s no esparuladas aerotalerantes
acido - tolarantes estrictamente fermentadares formadores de Boido laclica como
producto principal catalasa negativo carentes de citocroma sin embargo se
presentan excepciones a esta descripcion parque afgunas especies pueden
formar catalasa 0 citacramo en medios que contienen hematina 0 compuestos
relacianados La produccion de catalasa no hema pseudocatalasa puede causar
tambien alguna confusion en fa identificacion de algunos Lactobacillus
las especies del genera Bifidobacterium san bacilos gram positivos no
esporulados generafmente anaerabios estricto$ aunque pueden creeer bajo
condiciones microaer6filas cuando estan ert presencia de C02 La mayorfa de sus
especies se pueden diferenciar par criterios biaquimicos simples como la
fermentacion de L arabinosa DmiddotxiJasa O-manosa O-manita y O sorbitat que
pueden servir coma caracterist1cas clave para su clasificacion (Holzapfel
etal2001 )
114 Caracteristicas de los probi6ticos
Las cepas de microorganismos prabi6ticos deben presenter y mantener unas
caracteristlcas que garanticen su crecimienta y supervivencia En el alimenta
como tambiEm durante su transito a traves del est6maga e intestino delgaQo
17
La primera CBtacterfstica es que sean viables esta viabifidad esla capacidad que
tienen los microorganismos probi6ticos de permanecer vivos tanto ~n el alimento
como en el Intestino del consumidor por un tiempo determinado En Colombia se
ha establecido que en bebidas fermentadas este tiempo debe ser minimo de 21
dras en el alimento (Minsalud 1986) Esta vjabilidad depende del metodo de
produccion y de la cepa utilizada (Tuomols at a 2001)
Luego de que se garantice que estos microorganismos eslan viVos en el alimento
ell os deben cumplir otro criterio importanle para ser considerados como
organismos probi6ticos y as tblerar las condiciones de acidez a un pH=2 y la
sccian de proteasas del est6mago ademas de sobrevivir y creeer en presencia de
acidos biliares (Tuomola et al 2001 Jacobsen at a 1999) para luego de
sobrevivir a estas condiciones adherirse a la mucosa intestinal y de esta manera
estimular al sistemainmunoJ6gico esta capacidad de adherirse a la mucosa es un
prerrequisito para la colonizacion del intestlno (Toumola etal2001 Alander et aI
1999)
Cuando los probioticos han pasado todas esta pruebas de supervivencia y luego
de impfantados en la mucosa producen acidos organicos peroxido de hidrogeno y
tambien bacteriocinas que actUan como inhibidore$ del crecimiento de
microorganismos patogenos u oportunistas (Tuomola at al 2001 Cintas et al
2000) complementando de asta manera su accion benefica sobre la mucosa
intestinal y en general sobre la saJud del huesped
18
116 Berieficios de los microorganismos probi6ticos
Los beneficios que se asocian a los microorganismos probioticos son muchos y
variados Entre ros comprobados mediante estudios se eneuentran
1151 Facilitar la digesti6n de la lactosa
los microorganismos probioticos cuando estan en el intestino liberan alii la
enzima pmiddotgalaotosidasa capaz de hidrolizar la lactosa haste glucosa y galactosa
evitando as que personas intolerantes a este carbohidrato presenten sfntomas
como flatulencia dolor abdominal y diarrea cuando consumen leche (be Vresse
et 81 2001)
1152 Protegen contra enfermedades gastrointesUnales
EI consumo de aJimentos con probioticos ha mostrado efeeto terapeutico frente a
los sintomas de diarrea asociada al surninistro de antibi6tico$ de amplio espectro
que destruye 0 disminuye la microbiota endogena esta imp ide la coJonizacion de
bacterias patogenas como Klebsiella oxytoca y Clostridium difficile que pueden
causer lesiones en el cn Los probi6ticos recuperan el balance de la microbiota
intestinal nativa y avitan Ie adhesion de algunos virus bacterias pat6genas a
parasitos que pueden ser agentes causales de gastroenteritis la diarrea del
19
J
viajero y 1(3 inflarnacion intestinal que en ultima instaneia oeasionan ef sfndrome
del colon irritable (Marteu et al 2001)
1153 Protegen contra infecciones del tracto urogenital
La vaginitis indueida por baeteriss yo por levaduras as una infecci6n
estrechamente relacionada con la exposici6n a antibi6ticos y espermicidas y
tambien depende del estado hormonal de la n1ujar Con al uso de mezcJas de
probi6ticos se han obtenido buenos resultados en la rastauraci6n de la rnicrobiota
natural urogenital benefica que desplaza a los eausantes de la inflamaci6n de Is
vagina y Ie uretra (Reid 2001 )
1154 Promueven la barrera de defensa end6gena del intestino
EI tracto gastrointestinal normal mente as una barrera natural contra anUgenos de
origen microbiano y alimentario Cuando los probi6ticos sa adhieren a Is mucosa
intestinal estimulan 0 potencian al sistema inmune favoreciendo la
inmunomodulaci6n que induce un aumentb de fa producci6n de inmunoglobulinas
activacion de las calulas mononueleares y de los linfocitos para proteger al
huesped de infeeciones (Isoulari et sl 2001)
20
1155 Protegen contra cancer de colon
EI cancer es el resultado de una serie de mutaciones somaticas que pueden
ocurrir durante al tiempo de vida del individuo y 10 padeca buena parte de la
poblacion mundial los probi6ticos en un sistema in vitro han demostrado un
efecto positivo en la prevenci6n de mutaciones aI desactivar carcin6genos
genotoxicos (Wolloswski et al J 2001)
1156 Protegen contra infecciones respiratorias
Sa ha demostrado que el conslJlno de probi6ticos disrninuye la incidencia de
infecqiones raspiretorias al aumentar la actividad fagocitica de maer6fagos
alveolares que aettian sobre microorganismos patogenos Se hizo un estudio en
571 ninos sanos con edades entre uno y seis anos divididos en dos grupos a uno
de ellos sa las incluy6 en su dieta leche suplementada can Lactobacillus GG y a
los otros ninos leche no suplementada AI final del estudio se observ6 una
disminucion del 19 en la incidencia de infeccionas respiratorias tratadas con
antibi6ticos tales como otitis media sinusitis bronquitis y neumonfas en el grupo
de los ninos que consumieron Lactobacillus GG (Hatakka et al 2001)
Alvarez et al (2001) encontraron que la administraci6n de yogurt con Lactobacillus
casei en ratones de tres arios de edad majora los espacios libres del puJrn6n de
la presencia de Pseudomona aeruginos8 induciendo un aumento
21
significativo en los niveles de gA a IgM datactadas en los lavados
broncoaJveolares y se observ~ un afecta dependiente de la dosis
1157 En el tratamientoy prevenci6n del eczema
Se ha encontrado que el consumo de probi6ticos mejora la inflamaci6n alergica 0
eczema at6pico en ninos alimentados con formula suplementada con probi6ticos
Encontraron una mejora significativa al suministrar Bifidobacteriummiddot actis y
Lactobacillus GG en 27 niiios con edad promedio de 46 meses Luego de aplicar
este tratamiento se sometieron a una prueha de SCORAD (mide fa extension y
gravedad del eczema) registrando una meJoria significatlva en las condiciones de
la pie concentraci6n de citoquinas cirClllantes an sueto y moleculas de adhesi6n
a las superficies de las celulas soJubles en suero (Isolari 2000)
Se realizaron otros estudios a 159 mujeres embarazadas con historia familiar de
eczema atopico de primer grado a las cuafes sa res 5uministro dosis diarias de
Lactobacillus GG durante 2 a 4 samanas previas al parto Oespues de ella fa
madres twiaron la opci6n de continuer tomando el ptobi6tico si amamantaban 0
bien darseio vIa oral La mayoria de las madras eJigieron dar las dosis at bebe
diariamente A los dos anos de vida se observ6 una disminuci6n del 50 en la
frecuencia del eczema at6pico en aquellos nHies que se les dio ef probi6tico
(Kalliomari etal 2001)
22
1158 Previenen infeccion en heridas quirurgicas
Los probi6ticos impiden la union de pat6genos a las superficies celulares en
heridas mediante la seCreci6n de proteinas Actuamente se encuentra en
estudio la aplicaci6n del Lactobacillus fermentum vivos sabre heridas en piel de
ratas y se ha encontrado una disminuci6n del 90 en la colonizaci6n par parte del
StaphylococcuS aureus uno de los patogenos mas temidos y de mayor lncidencia
en infecciones hospital arias mas aun se esta contempiando la posibilidad de
utilizar la protein a purificada an lugar de los mjcroorganismos para la protaccion
contra infecciones en heridas (Strauss 2000)
12 PREBIOTICOS
Son carbohidratos de cadena corta algunas veces reconocidQs como
oligosacaridos no digeribles par las enzimas del epitelio intestinal 0 de las
gliJnduJas anexas debido a su estructura quimica y de esta manera lIegan al
intestino grueso donde alcanzan a estar disponibles para la fermentaci6n por las
bacierias sacaroHticas que son especial mente laetobadlos y bifidobacterias
dando odgen a compuestos que ejercen efectos funcionales sobre la mucosa del
tubo digestivo (Brunser 2001)
Se consideran como tal algunos fructocligosacaridos isomaltooligosacariclos
oligomato palatinosa poHdextrosa pOJidextrrna raftilina y algunos oligosacaridos
23
)
de 1a soya y fa avena Estenmiddot presentes en alimentos como Ie cebolla ajo
banano puerros 1 derivados del trigo achicoria esparrago alcachofa (Cummings
etal 2001)
Algunos de estos prebi6ticos cuanda son incorporado$ a fa dieta en cantidades
dalerminadas alteran la microbiota intestinal disminuyendo los recuentos de
coliformes bacteroides y cocos y aumentando las bifidobacterias hasta en diez
veces ademas modifican la actividad metab6lica del coron logrando una
disminuci6n del pH y un incremento en el contenido fecal de acidos grasos de
cadena corta como at acatica propi6nico y butfrico El butirato aumen~ _I grosor
de la pared del coron e intestino delgado estimula eJ crecimiento de la mucosa del
colon y auManta su flujo sangufneo inhibe el crecimiento de tinsas tumorales
epiteliales de origen co16nico induce la diferenciaci6n de sus celulas y a
apoptosis entre otros(Brunsar 2001)
Eh estudios hechos en simuladores del intestino humano utilizando productos de
avena fermentados se encontro que estimularon al crecimiento tanto de
lactobacios como de bifidobacterias y en el caso de estas ultimas se incremento
la producci6n de los acidos acatico propionico y butfrico 10 que incide sobre la
implantacion de probi6tico$ e inhibe al crecimientos de otro tipo de
microorganismos (Alal1der eta1999 Kontula etal 1998 Jaskari etal 1998)
24
~ -1
(
AI comparar el comportamianto de las leches de diferente origen se ha
demostrado que Ie leche de vaca contiene caseinatos sustancias que forman
buffer ~n et intestino e inlpiden que los probi6ticos disminlJyen el pH del intestina
y de esta manera se impide al efecto deseado que es evitar fa proliferaci6n de
otros microorganismos entre los cuates pueden estar algunos patOganos En la
leche materna sa encuentran algunos carbohidratos como glucosa galactosa n
acetilglucosamina y algunos 0lig6meros de Ie fucosa en cOhoontracionesmiddot
importantes los cualeS favoreceh el crecimientc)middot de probi6ticos esto
complementado can 91 bajo contenido de protenas que se traduce en una
reducida capacidad buffer hacen de Ie lache materna IJn alimentd adecuado para
nllios en su etape de lactancia
Algunos prebi6ticos como 1a lactulosa yciertos compuestos que contiansn fructosa
no son digeridos en el intestino humano y pueden sar utilizados selectivamenta
par los probi6ticos 10 que hace que los probi6ticos en combinaci6n can prebi6ticos
pueden lIegar a ser un importante medio para prevenir algunas enfermedades del
tracto gastrointestinal (Bezkorovainy 2001)
25
2 METODOlOGfA
21 LOCALIZACION
EJ trabajo sa realizo en el laboratorio de Microbiologia y la planta da laches de Ja
Universidad Naclonal de Colombia- Secie Medellin
En al laboratorio se hiZQ al aislamiento a identificaci6n de fa capas y en fa Planta
sa eJaboro la leche fermentada con 1a cepa seleccionada y el prebi6trco
22 METODOS
221 Aisiamiento de cepas nativas
Las cepas nativas se sislaran de producto$ vegetales leches fermentadas y
mucosa vaginal humana
2211 De vegetales
Las muestras vegetales de repollo repollitas de brusefas y pepino se
seleccionaron porcionaron y mezclaron can cloruro de sadio al 10 pIp se
calacaron en un recipienta de vidrio balo anaerobiosis y sa dejarQn por 15 dias
26
luego S9 tomaron 3 ml de cada muestra y se jnocularon 9 ml de caldo MRS (Man
Rogosa and Sharpe) se incubaron a 37deg C durante cinco dias en camara de
anaerobiosis (Ver Figura 1) Oespues de este tiempo sa inocularon cajas de petri
con agar MRS con 1 ml del cultivo microbiano y se incubaron bajo las mismas
condiciones que eJ caldo Este procedirniento se realiz6 rapetidas veces hasta
seleccionar la cepa pura mediante observaci6n de caracteristicas morfologicas de
la cOlonia y a cada colonia se Ie practico la coloracion de gram con el fin de
observar las caracteristicas microscopicas de cada una e identificar las de mayor
similitud a los Lactobacilos y Bifidobacterias
Figura 1 Camara de anaerobiosis
27
2212 De la leche
Sa tomo 200 ml de teche cruda de la planta de leches y se colaca a fermentar
baja anaerobiosis durante 15 dras Luego sa procedia como en los vegetales
2213 De mucosa vaginal humana
Se tomo una muestra de frotis de mucosa vaginal humane can capito esteril sa
puso a ncubar en Caldo MRS y se procedi6 camo en 2211 y 2212 A cads
aislado sa Ie practico la coloracion de gram y sa seleccionaron aquellas que eran
bacilos gram positivos (Ver Tabla 2)
28
TABLA 2 Fuente de aislarniento de cepas nativas
CEPA FUENTE
1 Pepino fermentadQ
2 repollitas de bruselas fermentadas
3 Repolltgt fermentado
4 Repollo fermentado
5 Mucosa va~inal humana
6 Mucosa vaginal humana
7 repollitas de bruselas fermentadas
8 Repollo fermentado
9 repollitas de bruselas fermentadas
10 Mueo~a vaginal humana
11 Repollo fermentado
12 RepolJo fermentado
13 Leche fermentada
14 Mucosa vaginal humana
15 repollitas de bruselas fermentadas
16 Repollb fermentado
29
222 Almacenamiento de las cepas aisladas
Cuando las cepas crecieron en agar MRS homogEmeas en color morfologia
coloraci6n de Gram etc se pssaron a agar inclinado en tuba se cubrieron con
aceite mineral y se guardaran en refrigeraci6n a 4deg C para tomar de alii la cepa y
efectuarle las diferentes pruebas para confirmar el genera y determinar la especie
de cada una de eas (Ver Figura 2)
Figura 2 Cepas en tubos con agar inclinado
30
223 Pruebas para determinar et genero
2231 Coforaci6n de Gram
A cada cepa sospechosa de Lactobacilos se 1e hizo la coloraci6n de gram y se
seleccionaron las gram positivas
2232 Morfologfa
En agar MRS y despues de incubar en anaerobios~s crecian colonias grandes
cremosas de color beige con bordes homogeneos y c6ncavas(Ver Figura 3)
Figura 3 Colonias aisladas en agar MRS
31
2233 Prueba de esporulaci6n
A cada cepa aislada se Ie hizo esta prueba la cuel consistia en incubar en
aerobiosis durante ocho dias las cajas de agar MRS donde crecieron colonias de
Lactobacilo$ y luego se les (ealize) coloraci6n de espora Las capas que dieron
negativa a la prueba de espora se considararort sospechosas de sar Lactobacilos
y se continuo con la prueba de la catalasa (Ver Tabla 3)
2234 Prueba de la catalasa
los lactobacilos carecen de catalasa Eata prueba se hizo tomando una colonis
se deposito en vidrio de reloj y se Ie adicion6 dos gotas de peroxida de hidr6geno
(H202) la que no presentaba efervescencie eran cepe sospechosa de ser
Lactobacilo (Ver Tabla 4
Sa seleccionaron las capas euyo resultado fue aeorde con el genera Lactobacilfu$
y se continuo con la comirmaeion del genera y determinacion de la eSpecie
meqiante las pruebas bioqulmicas
32
224 Prueba para determlnar la especie
Para confirmar el genero y determinar la especie de las diferentes capas aisladas
se hizo una caracterizaci6n bioqufmica utilizando un kit de API 50 CHL Medium
Ref 50 410 que contiene una galed8 de medios que permite realizar el estudio
de fermentaci6n de los 49 azucares de 52 especies de Lactobacillus (Ver Figura 4
y tabla 5)
Figura 4 API CHL 50-Prueba bioquimica
33
225 Pruebas para determinar microorganismos probi6ticos
2251 Resistencia a pH=2 y sales biliares de concentraci6n O3pv
A las cepas idantificades como Lactobacillus brevis y Lactobacillus pantarum sa
las realiz6 Ie prueba dfl resistencia a pH=2 y sales biliares de concentraci6n 03
pv ( Jacobsen et al 1999) Una colonia de cada cepe aislada se inocul6 en 4 mt
de caldo MRS durante cinco dras bajo condiciones de anaerobiosis Oespues de
esta tiempo se dejaron pracipltar los microorganismos por sedimentaci6n se Ie
retire el sobrenadante y al precipitado se Ie adicion6 Sml de caldo MRS
previamente ajustado a pH=2 can seido clorhfdrico (HCI) dentro del mismo tuba de
ensayo G igual sa hizo can otro tubo previamente incubado pero a este se Ie
adiciono 5ml de caldo MRS con sales biliares a una concentra~i6n de 03 plv y
ambos se incuberon a 37deg C por 2 haras Sa midio 01 mi de cada uno de los
tubas al tiempo 0 y a las 2 horas y sa inoculeron en superficie en caJas de petri
con agar MRS S9 incubaron a 37deg C bajo anaerobiosis durante 48 horas Se
compararon visualrrente en cada caja de petri el crecimiento en superficie y las
que presentaron crecimiento en tos dos tiempos (0 y 2 horas) tanto en at media
acido como en sales I se consideraron resistentes a pH=2 y sales biliares (03
pv)
(Ver Tabla 6)
34
226 Conservacion
Todas fas capas que habian dado positiva Jas pruebas anteriores y que reaultaron
resistentes a pH=2 y sales biliares 03 pv y despues de identificadas en API 50
CHL sa repicaron en agar MRS en tuba inclinado y despues de Incubar a 37deg C
por 48 horas bajo anaerobiosis se Ctlbrie el biser completamente can aceite
mineral esteril y sa guardaron en refrigeraci6n
227 Elaboracj6n de fa bebida fermentada
2271 Preparaci6n de la mue$tra
Sa tome 1 mt de caldo MRS previamante inoculado e incubado que presentaba
una concentracion de Lactobacillus brevis de 27x108 Iml segun la escaJa de Mac
Farlan y sa adiciono a 9ml de leche pasteurizada en un tubo sa dej6 incubanda
en anaerobiosis por 48 hores Luego se pasaron estos 10 ml a un frasco qua
cont~nie 90 ml de leche pasterizada y se dej6 incubando par 48 haras en
anaerobiosis
35
2272 Adici6n del inOculo
A 900ml de leche pasteurizada se Ie adicion61os 100 ml de leche que habia sido
previamente ino(ulada dos veces con la cepa posteriormente se deja
fermantando la lache a temperatura de 37deg C
2273 Control de Ja fermentaci6n
Las muestras se hicieron por cuadruplicado y se les hizo un seguimiento de
aoidez hasta un valor entre 04 y 05 expresada como Bcido lactico esta
procedimiento corresponde a la babida fermentada sin prebi6tico La bebida ~on
prebi6tico tiene al mismo proeedirnianto pero adicionalmente se agrag6 avena a
una concentraci6n de 05 en el momento de la adici6n del in6e410 a los 900 ml
de leehe pasteurlzada y el procedimiento sigui6 igual al de la bebida sin prebi6tico
tambien se hizo por cuadruplicado
2274 Refrigeracl6n
Despues que las mezclas con y sin prebiotico alcanzaron el de acidez
requarido se IIeva ron a refrigeraci6n a una temperatura de 4deg C p~r 24 horas
para frenar proce~os metab6licos de los microorganisrtlos Despues de este
ti~mpo se procedi6 al batido
36
1 2275 Batido
Con un agitador se procedi6 a batir las bebidas para romper et coagulo formado
y de esta manera homogeneizar la mazela y obtener asf la bebida fermentada
2276 Envasado y almacenamiento
Ambas bebidas se envasaron en frascos vidrio para hacerles seguimiento de pH
acidez(expresado como acido tacticol y recuento de Lactobacillus breviSf los
dies 27 14 Y 21 despues de elaboradas las bebidas perfodo durante el cualta
muestra permanecfa afmacenada a temperatura de refrigeracion(Ver Figura 5
37
Fjgura 5 Diagrama de Flujo
PREPARACION DE LA MUESTRA
ADICION DEL INOCULO
~_____~_B~ATIDO~______~
INCUBACION 37deg C hasta acidez = 04-05 acido laotico
ENFRIAMIENTO
hasta 4 0 C ~------~ ~------~
ENVASADO Y ALMACENAMJENTO
dUrante 21 dfas a Temperatura 4 0 C
38
1
228 Determinaci6n del pH
Se determino por el metoda potenciometrico en un pH-metro manual durante los
dias 2) 7 14 Y 21 de las bebidas lacteas sin y con prebi6tica (Ver Tablas 7 y 8)
229 Oeterminaci6n de la acidez (Expresadfl como acido
lactica)
Se tomaron 9 mJ de las bebida~ sa Ie adicionaron 2 gotas de fanoftaleina como
indicador y sa titulo fa acidez con NaOH 01 N hasta la aparicion de un cotor rosado
debit EI volumen de NaOH utilizado se reporta como valor de de acidez
(VerTablas 10 y 11)
2210 Prueba de viabilidad
Qurante el perfoda de almacenamiento de la bebida lactea se procedi6 a hacer la
prueba de viabiHdad en los dias 7 14 Y 21 para determinar Si los lactobacilfus
permanecfan vivOs a una concentraci6n minima de 106 hasta el dia 21 como 10
establece eJ Articulo 10 de la Rasolucion 2310 del Ministerio de $alud de
Colombja
39
Para asta prueba se tamaron 10 rnl de muestra y se adicionaron a 90 ml de caldo
MRS ruego a partir de esta se hicieron diluciones de 10-2 hasta 10-11 de las
diluciones 109101deg 10-11 se inocul6 1 ml de cada uno en agar MRS siguiendo el
metodo de siembra en profundidad y por duplicado e incubando a 370 C x 5 dras
en anaerobiosis y luego se hicieron tos recuentos por duplicado para esi reportar
los recuentos promedio (Ver Tablas 13 y 14)
2211 AniUisls microbiol6glco de las bebidas Iicteas(con y sin
avena)
Con el fin de determinar las condiciones higienico-sanitarias del producto se
realizaron las pruebas microbiol6gicas de Recuento de mohos y fevadurasml en
agar OGY Recuento en superficia de Staphylococcus coagulasa positivoml en
agar Baird Parker Numero Mas Probable (NMP) de coUfor-mes totales y
Escherichia coliml en caldo Fluorocult y Presencia de Salmonela25ml con BHI
caldo tetrationato y agar Hecktoen (Montoya 1999)
(Var tabla 16)
2212 AnaUsis estadistico
A los datos obtenidos en la medici6n de pH acidez (expresada como Beido
laclico) en los dras 2714 Y 21 y el recuento de Lactobacillus en los dras 714 y21
40
realizados a los dos tratamlentos se tes aplic6 1a prueba t porque solo difieren
en la presencia 0 ausencia del prebi6tico para evaluar si habra diferencia
estadfsticamente significativa para los dos tratamientbs(Ver Tablas9 12 y 15)
41
3 RESULTADOS Y DISCUSION
31 Coloraci6n de Gram y morfologfa
Las cepas aisladas fesultaron Gram positivas (Ver Figura 6) colonias grandes
cremosas dE) color beige con bordes homogeneos y c6ncavos en su
morfologia (Ver Figura 3) resultando de acuerdo a 10 especificado en Stanley
1989 para Lactobacillus
32 Prueba de esporulaci6n y cataJasa
Los resultados de la pruebas de esporulaci6n y catalasa indicados en las
Tablas 3 y 4 respeclivamente dieron conforme a 10 especificado en Stanley
1989 para Lactobacillus
42
1
2 3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
TABLA 3 Resultado de prueba de esporuJaci6n
CEPA RESULfADO ESPORULACION
-- -------------
43
l i ~II bull ~ I I
TABLA 4 Resultado prueba de la catalasa
CEPA RESULTADO CATALASA
1 -2 -3 -4 -5 -6 -7 8 -9 -10 -11 12 -13 -14 -15 -16
3~3 Prueba para determinar la especie
Oespues de hacer las pruebas para seleccionar las cepas sospechosas de ser
Lactobacillus se realizo las pruebas bioquimicas fograndose identificar
Lactobacillus plantarum aislctdo de pepino repollo y repollitas de bruselas
44
fermentados y Lactobacillus brevis de mucosa vaginal y leche fermentada (Ver
Anexos del A al E y Tabla 5)
TABLA 5 Resultado identlficaci6n cepa~
CEPA NOMBRE
1 Lactobacillus planfarum
3 Lactobacillus plantarum
5 Lactobacillus brevis
13 Lactobacillus brevis
15 Lactobacillus plantarum
34 Pruebas para determinar microorganismos probi6ticos
las cepas de Lactobacillus brevis y Lactobacillus plantarum mostraron
rasistencia al medio acido de pH =2 Y sales biliares 03 pv resultado similar al
encontrado por Jacobsen et al 1999 para Lactobacillus plantarum (Ver tabla 6)
45
middot
~~~ttiI lltlmiddot~COX~dtJ ~xtc_~ 2 tr~ k-JlL~middot
-)~~TO DE lJIBUOTECUl rjRL]OTtCA twn GO1IU1
TABLA 6 Resultados a pruebas de resistencia a pH=2 y sales biliares 03 plv
CEPA RESISTENCIA pH=2 RESISTENCfA A SALES BIUARES ()3 pv
1 + +
2 + +
3 + +
4 + +
5 +
6 + +
7 + +
8 + +
9 + +
10 + +
11 + +
12 + +
13 + +
14 +1shy +M
15 + +
16 + +
+1 crecimiento debil
+ crecimiento abundante
46
Figura 6 Lactobacillus brevis Gram + aislado de leche fermentada
Ai observar en placa las celulas de lactobacilos despues de real1zar las pruebas
de resistenCia a la acidez y sales biliares se observo una tendencia a aglomerarse
posiblemente como un mecanismo de proteccion cOlitra estos medios que pueden
lIegar a ser adversos para elias (Ver figuras 7 y 8)
47
Figura 7 Lactobacillus brevis aislada de leche fermentada despu~s de la prueba de resistencia a pH=2
Figura 8 Lactobacillus brevis aislada de leche fermentada despues de la prueba de resistencie asales biUares 03 plv
fI
48
35 --Seguimiento del-pH-en-la-bebidaJacteacon y sin -prebi6tico
A continuacion se muestran las Tablas 7 y 8 donde sa registian los datos
recopilados de pHdurante 10$ dras Z 7 14 Y21 para las bebidas laaeas con ysin
prebi6tioo
TABLA 1 ResultadopH yogur sin avena
Dia Repetition 1 Repetici6n 2 Repeticion 3 Repetici6n 4
2 526 501 51 52
7 446 433 438 44
14 439 435 437 436
21 439 437 438 437
TABLA 8 -ResultadopHyogur con avena
Dia Repeticion 1 Repeticion2 Repeticion 3 - Repeticion 4
2 509 523 51 515
7 447 442 445 442
14 436 -438 439 437
21 432 433 435 434
Observando la Figura 9podamos ver que el pH en el -dfado$ para los dos
tratamientos as igual y empieza a descender rapidamente para estabilizarse a
partir del dra 7(Ver figura 9)
49
Figura 9 Comparacj6n de medias para -el pH
Comparaci6n de medias para pH
55 ~ 5 +----=gtIIIi-~i~~----=-r--it~ -- pH sin avena
a 45 1--~~~~=~~ 4 --- pH con
avena35 t-----r-- -------=------=--= ------- - ----
2 7 14 21
Dias
Aplicando la prueba t para comparar las medias de pH I S6 muestia una diferencia
altamants significativa en los dos tratamientos para el dia 21 (pltO05)
(Ver tabla 9)
TABLA 9 Compaiaci6n de medias para pH
DtAS SIN AVENA CON AVENA te p (VALOR)
2 514 514 0 10
7 439 444 -1 61 0159
14 437 I
438 -070 0510
21 438 433 528 00019 shy
- DiFERENCIA AlTAMENTE SIGNIFICATIVA
50
I
AI aplicar regrasi6n a los datos sa obtiene al modelo estimado
pHSinAyena =535606 - 01505650Ia +0005044340IaI2
La variabilidad en la respuesta de pH asta siendo explicada en un 8S7522 por
el modelo (Ver Anexo F)
EI tratamiento con avena mostro el siguiente modelo al analisis de ragresi6n
pHConAvena =534463 ~ 0140407Dia + 0004480980Ia2
La variabilidad an la respuesta de pH asta siendo explicada en un 903315 par
el nlodelo(Ver anexo G)
36 Seguimiento de la acidezmiddotmiddot expresada comomiddot de acido
lactico
A continuaci6n sa muestran las Tablas 10 y 11 donde sa registran los datos
tecopilados de acidezmiddotdurante los dias 27 14 Y 21 para las pebidas taetees con y
sin prebi6tico
TABLA 10 Resuttadode acidez (expresadocomo acido tactico) yogurt sin avena
CIA R~petici6n1 Repeticion2 Repetici6n 3 Repeticion 4
2 054 06 057 058
7 072 074 073 0]2
14 080 083 082 082
21 0]4 079 078 077
51
TABLA 11 Resultado de aCidez (expresado como acido Icktico) yogurt con avena
Dia Repetici6n 1 RepetiCi6n 2 Repetici6n 3 Repetici9n 4
2 059 055 058 057
7 071 073 072 072
14 089 087 088 086
21 092 091 090 091
Observando la Figura 10 se puede concluir que la acidez empieza a aumentar
hasta el dia 14 y luego trata de estabilizarse para los dos tratamientos
(Ver figura 10)
Figura 10 Comparaci6n de medias para la acidez
N G)
Comparacion de medias para acidez
1
2 0I 5 -+--=--------=-~~~= u
ltC
- Acidez sin avena
2 7 14
Dias
52
21
-it- Acidez con avena
Aplicando la prueba t para camparar las madias de acidez se muestra una
diferencia altarnante significativa en los dos tratamiantos para los dias 14 y 21
(pltO05)
(Var tabla 12)
TABLA 12Comparaci6n de medias para Acidez
DIASmiddot SIN AVENA CON AVENA te p(VALOR)
2 0572 0572 0 10
7 0727 0720 119 0278
14 0818 0875 -638 000070shy
21 077 091 -1212 i 0000019 shy
DIFERENCIA AL TAMENTE SlGNIFICATIVA
AI aplicar r~gresi6n a los datos se obtiene el modelo estimado
AcidezSlnAIena = 0491897 + O0436032Dia O00144613DfaA2
La variabilidad en la respuesta de acidez asta siendoexplicada en un 970978
por al modelo (Ver anexo H)
EI tratamiento con avena mostro elsiguiente modeloj a1 analisis de regresion
AcidezConAvena = 0491638 + 00406572Oia - OQOO982559OiaA2
La variabilidad enla respuesta acidez esta siendo explicadaen un 99212 por
el modelo (Ver anexo J)
53
I ~
37 Prueba de viabiJidad
A continuaci6n sa muestran las Tab~as 13 y 14 donde sa presentan los datos
recopilados del recuento de Lactobacilos durante los dias 7 14 Y 21 para las
bebidas lacteas con y sin prebi6tico
TABLA 13 Recuento de Lactobacilos (UFCml) yogurt sin avena
Dia Repetici6n 1 Repetici6n 2 Repeticion 3 Reptttici6n 4
7 1880X10l1 1454X1011 1642X1011 1780X10~
14 1560X10~ 646X1011J 1890X10l 140X10l1
21 1200x10lu 128Ox10u 1745x10J 1520x101V
TABLA 14 Recuento de Lactobacilos (UFCml) yogurt con avena
Dfa Repetieion 1 Repetici6n 2 Repeticion 3 Repeticf6n 4
7 1600X10lt 1240X10t 1640X10ll 1980X10t
14 540X1011 427X10n 546X10n 720X10ll
21 500x1011 492x1011 712)(1011 980x10~
AI analizar la Figura 11 sa puede observar un recuento mayor de Lactobacilos
en al tratamiento con avena resultado de acuerdo a 10 encontrado por Alander at
aI 1999 Kontula et aI 1998 y Jaskari et aI 1998
54
Figura 11 Comparaci6n de medias para Log Lactobacillus
Comparacion de medias para log Lactobacillus
~ 1350
-+- Sac Sin--() 13 co avenaIII
bull 125 -- Bac con 0)
0 12 avenaJ
115 7 14 21
Dias
Aplicando la prueba t para comparar las medias de recuento de Lactobacillus no
se encontr6 una diferenc1a estadfsUcamente significative entre los dos
tratamientos (Ver tabla 15)
Este aumento en al racuento influy6 en la disminuci6n del pH y en el aumento de
fa aeidez por la fermentacion que realizan los Lactobacillus sobre fa lactosa de la
lache y la avena adicionada como prebi6tico
55
1
TABLA 15 Comparaci6n medias lag Lactobacillus
DIAS SIN AVENA CON AVENA tc p(VALOR)
7 122257 122022 04846 06451
14 121065 132393 -19602 00977
21 129025 133087 -08236 04416
At aplicar regresion a los datos se obtiane al modelo astimado
LactobacillusSinAvena= 117347 + 004834640Ia
La variabilidad en la respuesta del recuento de LactobaCillus ssta siendo
explicada en un 260054 por el mod$loVar anexo J)
EI tratamiento con avena mostr6 al siguiente modalo al anal isis de regresion
Lactobacillu$ConAvena =118103 + 007903040Ias
La variabilidad en la respuesta de recuento esta siendo explicada en un 3068
por al modelo(Ver anexo K)~
38 Analisi$ microbiol6gicos de las bebidas lacteas con y sin
En la Tabla 16 estan recopilados los resultados microbiol6gieos obtenidos en ras
muestras con los dos tratamientos (con y sin avena)
I [
sa
TABLA 16 Resultados analisis microbiologico
Recuento de mohos y levaduras Iml lt10
Recuento de Staphylococcus coagulase positiva Iml lt100
NMP coliformes fotales y Escherichia coli Iml lt3
Presencia de Salmonella25ml Ausente
Los resultados de este analisis demuestran que las bebidas fermentadas con y
sin avena~ astan fibres de microorganismos patogenos
57
1
4 CONCLUSIONES
Se aislaron cepas nativas de Lactobacillus plantarum de las muestras vegetates
de repollo pepino repollitas de bruselas fermentadas y Lactobacillus brevis de
lache fermentada y mucosa vaginal humana Ambas cepas resistieran un pH=2 y
una concentraci6n de sales biliares det 03 ptv dos earacteristicas importantes
en los probi6ticos
Lamiddot cepa de Lactobacillus brevis aislada de lache Sa utiliz6 para elaborar una
bebida fermentada sin y con avana comoingrediente prebiotico obteniendose un
aJimento centon recuento del probi6tico viable durante 21 dras de seguimiento
ademas libre de microorganismos )at6gen05
No se encontr6 efecta significativo de la avena sobre Ie viabilidad del Lactobacillus
brevis aunque sa presento un aumento en 61 recuento de estos en la bebida con
avena
58
plusmn ~
5 RECOMENDACIONES
Ensayar la cepa de Lactobacillus plantartJm en productos carnicos madurados
como el salami
Ensayar la cepa de Lactobacillus l)revs en otros derivados lecteos como queso
quesito queso crema
Continuar con el estudio de estos microorganismos y caracterizarlos
molecularmente ademas de estudiar su capacidad de adherencja a fa mucosa
intestinal sobre algunes Hneas celulares como las CaCo~2
Estudiarel efedo de la avena sabre la viabiJidad del Lactobacillus breyis a una
concentraci6n mayor de 05
Realizer ensayos can las cepas de Lactobacillus brevis y Lactobrlcillus pJantarum
para elaborar masas acidas para panificacion reemplazando el Bromato de
Potasio aditivo prohibido desde marzo del 2003 en nuestro pais per 5U toxicidad
59
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65
ANEXOS
66
ANEXO A RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AlSLADA DE i
PEPINO it
Referencia Pepino 1 Fecha 06122002
IEXCELENTE IDENTIFICACION
Latto plantarum 1
Galeria API 50 CHL V50 Leida el 06122002
Perfil - -- - ++ - -- - ++++ - - -+- + - I I I I I I I I +t+ - +f- ~ - - + + ~ - - - +- + - shy
o - GLY - ERY DARA - LARA + RIB + DXYL - LXYL - ADO - MDX - GAL + GLU + FRU + MNE + SBE - RHA - DUL - INO bull MAN + SOR - MDM + MUG shyNAG + AMY + ARB + ESC + SAL + CEL + MAL + LAC + MEL + SAC + TRE + 1NU - MLZ + RAF + AMD - GLYG - XLT - GEN + TIJR + LYX - TAG - DFUC shyLFUC - DARL + LARL - aNT + 2KG - 5KG shy
--- Taxones significativos rd -----T -- Tests en contra
Lactoplantarum 1 999 092 1
Taxon siguiente Lactobrevis 1 OJ 044 3
i i
Lactoplantarum 1 1 test (5) en contra
D-SORBITOL (SOR) 78
Tax6n siguiente Lactobrevis 1 3 test (s) ert contra
METHYLD-MANNOSIDE (MOlM) 0 MELEZITOSE (MLZ) 14 D-TURANOSE (TUR) 14
67
ampb
ANEXO B RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AISLADA DE REPOLLO FERMENTADO
~
Referencia Repollo fermentado - 3 Fecha 03072003
EXCELENTE IDENTIFICACION
Lactoplantarum 1
Galena API 50 CRL V50 Leida el 03072003
Perfil - - ++ - - - - -H++ - - ~ + - + - I I 1 I I I I -H+ - ++ - - - + + - -- - - + - shy
o - GLY - ERY - DARA - LARA + RIB + DXYL - LXYL - ADO ~ MDX - GAL + GLU + FRU + MNE + SBE ~ RHA - DUL - INO - MAN + SOR - MDM + MDG shyNAG + AMY + ARR + ESC + SAT + CRL + MAL + LAC + MEL + SAC + TRE + lNU - MLZ + RAF + AMI) - GLYG - XLT - GEN + TOR + LYX - TAG - DFUC shyLFUC - DARL - LARL - GNT + 2KG - 5KG shy
------Taxones significativos _ _----- Id--- ---T---- Tests en contra
Lactoplantarum 1 999 095 1
Tax6n siguiente Lactobrevis 1 01 OA8 3
lJactoplantaru01 1 1 test (s) en contra
DSORBITOL (SOR) 78
Taxon siguiente Lactobrevis
METHYL-D-MANNOSIDE D-TURANOSE
1
(MOM) (TOR)
3 test (5) en contra
0 MELEZITOSE 14
(MLZ) 14
i
I
68
ANEXO C RESULTADO PRUEBAS BIOQUWICAS DE CEPA AISLADA DE MUCOSA HUMANA
Referenda Mucosa - 5 Fecha 27012003
BUENA IDENTlFICACION
Galeria API 50 CHL vso Leida el 270112003
Perfil - - - - +t--t - - - + - + - - - - - - - - -+- - - - - + - + - - - - - - - - - - - - - bull - - -+ - +
o - GLY ~ ERY - DARA bull LARA + RID + DXYL + LXYL - ADO bull MDX - GAL + OLU - FRU + MNE - SBE - IlliA - DUL - INa - MAN - SOR - MDM - MOO shyNAG + AMY - ARB - ESC ~ SAL bull CEL - MAL + lAC - MEL + SAC - TRE shyINU - MLZ - RAF - AMD - GLYG - XLT - GEN - 11JR - LYX - TAG - DFUC shyLFUC - DARL - IARL - ONT + 2KO - 5KG +
- - - - - - Taxones significativos - - - - - - - Id T -- Test en contra
Lactobrevis 3 963 088 1
Taxon siguiente Lactoco11inoides 36 075 2
Lactobrevis 3 1 test (s) en contra
GLUCOSE (GLU) 95
-~~~------------~---------------------------~--~-------~--~-----~----------~--------~------------~~--Taxon siguiente Lactocollinoides 2 test (s) en contra
GLUCOSE (GLU) 100 MELIBIOSE (MEL) 25
69
i r
ANEXO D RESULTADO PRUEBAS BIOQIJiMICAS DE CEPA AISLADA DE LECHE FERMENTADA
Referenda Leche fennentada ~ 13 Fecha 27012003
BUENA IDENTIFICACI6N
Galeria API 50 CHL V50 Leida el 270112003
Perfil - - - - -t-t+- - - - + - + - - - bull - - - - -+- - - - - + - + - - - - - - - - - - - - - - - - -+ - +
0 - GLY - ERY - DARA - LARA +Rll3 + DXYL + LXYL - ADO - MDX ~GAL + GLU - FRU + MNE SBE - RHA DUL bull INO MAN - SOR MDM bull MDG shy
~NAG + AMY - ARB - ESC - SAL - CEL - MAL + LAC - MEL + SAC - TRE I lNU - MLZ - RAF - AMD - GLYG - XLT - OEN - IUR LYX - TAG - DFUC bull i
LFUC - DARL - LARL -ONr + 2KG - SKO + 1
- -- - - Taxones significativos - - Id -- T --- Test en contra
Lacta brevis 3 963 088 1
Taxon siguiente Lactocollinoides 36 075 2
Lactobrevis 3 1 test (s) en contra
GLUCOSE (GLU) 95
-----------------------------------------------------------~------------------------------~-------------------Taxon siguiente Lactocollinoides 2 test (s) en contra
GLUCOSE (GLD) 100 MELffiIOSE (MEL) 25
70
II iJ1
I
I ANEXO E RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AISLADA DE REPOLLITAS DE BRUSELAS FERMENTADA
Referencia repollitas de bruselas 15 Fecha 03072003
EXCELENTE IDENTIFICACION
Lactoplantarum 1
Galeria API 50 CHL vsO Leida el 03072003
Perfil - - - - +t - - - - +H+ - +- - +t + - I I I I I I I f ++t - + - - - -+ + - - - -+ -+ - - I ij
o - GLY - ERY - DARA - LARA + RJB + DXYL - LXYL - ADO - MDX - GAL +
GLU + FRU + MNE + SBE RHA + DUL - INO - MAN + SOR + MDM + MOG shyNAG + AMY + ARB + ESC + SAL + eEL + MAL + LAC + MEl + SAC + TRE + i
I1NU - MLZ + RAF AMD GLYG - XLT - aEN + TUR + LYX - TAG - Druc LFUC - DARt + LARL - aNT + 2KG - 5KG shy n ----Taxones significativos ------ Id Tests en contra
Lactoplantarum 1 999 090 o
Taxon siguiente Lacto pentosus 01 012 7
Lactoplantarum 1 o test (s) en contra
Taxon siguiente Lacto pentosus 7 test (8) en contra
GLYCEROL (GLY) 75 D-XYLOSE (DXYL) 100 L-RHAMNOSE (RHA) 25 METHYL-D-MANNOSIDE (MOM) 1 MELEZITOSE (MLZ) 25 RAFFINOSE (RAF) 75 D-ARABITOL (DARL) 0
71
~
I i I
ANEXO F - ANALISIS DE REGRESION PARA pH EN BEBIDA SIN AVENA
Aruilisis de regresi6n polinomial
---~-~-------------------------------------------~-----------~~---------------------~--------------Variable dependiente pHSinAvena ---------------------------~-------------~--------------------~---------------------------------
Error T Parametro Estimado Estandar Estadistico P-Valor
CONSTANTE 535606 0094535 56657 00000 Dia -0150565 0020706 727154 00000 Dia2 000504434 0000871488 578819 00001
---~---------------------------------------------------------------------------------------------------
Anfllisis de Variama -------------------------------------------~-----------~-----------------------------~-~--- jSource Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor 11
------------------------~------------------------------------------------------------------------------~ Mod-elo 155772 2 0118861 4256 00000 Residual 0237877 13 00182983
Total (Corr) 11956 IS
R2 == 867522 percent
pHSinAvena == 535606 - 0150565Dia + 000504434Dia2
72
____
middot ANEXO G - ANALISIS DE REGRESION PARA pH EN BEBIDA CON AVENA
AmUisis de regresion polinomial _____~_____~__-_____~___4____________________bull____bull__________bull_____________~~----_------___________
Variable depcndiente pHConA vena ------------------------------------------------------------------------------------------~--------
Error T Parametro Estimado StAndar Estadfstico P-Valor
---------------------------------------------~-----------------------------------------------_---------CONSTANTE 534463 00801045 667208 00000 Dia -0140407 00175453 800253 00000 DiaA 2 000448098 0000738458 606803 00000
----------------------~---~-----------------------------~------------------------------~----AmUisis de Varianza
---~---------------------------------~---------------------~------------~-------------------~------Source Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio PValor --------------------------~-----------------------------------------------~------------~-----~~--~ ModeJo 159575 2 0797873 6073 00000 Residual 02170798 middot13 00131383 _______~_~ ~_~----------~------~--~-----~-M-----~-----____ _____________~-----------------------Total (COlT) 176654 15
R12 903315 percent
-----------~------------------------------------------------------------------------~-----------pHConAvena 534463 - 0140407Dia + 000448098DfaA 2
73
ANEXO H - ANALTSIS DE REGRESTON PARA ACIDEZ EN BEBJDA SIN AVENA
An8Jisis de Regtesi6fi P6lifJomial
Variable Depefidiefile~ AcidezSinAVenll _______________w_____~______~________________~-----------_________~_________________~~____~___~_____
Error T Pariirnetro Estimado Estandar Estadistico ---------------------------------------~--------------~-~-------~--------------------~------------CONSTANT 0491697 00123217 399051 00000 Dia 00436032 000269882 161564 00000 D1a2 -000144613 000011359 127312 00000 __w___~________________________~-_______-_____~----____________________________~__~---~_--__~___
AriiiJisis de varianza ~_~__~__________~_~____~________~___________- _________e_____________________________bull _____-________
Source Smn de cuadr Df Mean Square F-Ratio PmiddotValor_~~___________________________________bull ______~___________bull ____________bull ______~________w________________
Model 0135203 2 00676013 21747 00000 Residual 000404118 13 000031086
Total (Corr) 0139244 15
R2 970978 percent
AcidezSlnAvena 0491697 + O0436032Dia - 0OOl44613Dia2
74
I
ANEXO I ANALISIS DE REGRESION PARA ACIDEZ EN BEBIDA CON AVENA
1
Anwisis de tegtesi6fi polinomial
Variable dependiente Acidez Con Avena
Error T ParametTo Estimado Stlindar Estadfstico P-Valor ----------------~-------~---------------------~-----------------------------------------------------CONSTANT 0491639 000926607 530578 00000 Diamiddot 00406572 000202955 200326 00000 DfaA 2 0000982559 0000085421 -115025 00000
-------------~----------------------------~-------------------------~-----------------------------------
-------------~-----~~-----------------------------~---------------------------------------------_--Source Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio PValor
-~-------------~----------------------------------~------------------~~-------------------------- Modelo 0288008 2 0144004 81914 00000 Residual 000228539 13 0000175799
----------~~--------------~---------------------------------------------~---------------------------Total (Corr) 0290294 15
RA2 = 992127 percent
-------------------------~----~---~------------~---------------------------------~---------------~
AcidezConAvena == 049163amp + 00406572D1a - 0000982559DiaA2
75
I
(Ilmiddot il
ANEXO J- ANALISIS DE REGRESION PARA RECUENTO LACTOBACILOS PARA BEBIDA SIN AVENA
Amilisis de regresion - Modelo lineal Y = a + bX
------------------------~----------------------~-----------------------------~----------~-----------Variable Dcpendiente LactobacilJusSinAvena Variable independiente Dia
I--------~----------~-----------------------------------~-------~-~--~--------------------------~-Error T
Paramctro Estimado Standard Stadistico P-Valor
----~----~------------~-----~-----------------------~-------------~-----------------------------Intereepto 117347 0389973 300911 00000 Pendiente 00483464 00257889 18747 00903
Analisis de Varianza
---------~------------------~----------------~---------------------------------~---------~----------Source Sum decuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor
------------~---------------------~---------------------~--------------------------------~-----~----Modelo 0916252 1 244835 443 00616 Residual 260706 10 0260706
--~------------~---~------------------~~~-----~-------~---------~~-------------------------------------Total (Corr)352332 11
Coeficiente Correlaci6n = 0509955 R2 = 260054 percent
LactobacillusSinAvena= 117347 + 00483464Dfa
76
ANEXO K- ANALTSIS DE REGRESION PARA RECUENTO LACTOBACILOS PARA DEBIDA CON AVENA
Aruilisis de regresion - Modelo lineal Y = a + hX
Variable Dependiente LactobacillusConAvena Variable Independiente Dia ---~--------------------------------------------------------__-----------__--_--_-----------shy
Error T Paramctro Estimado Standard Estadistico P-Valor -~--------------------------------------------------------------------------------------------------
Irttercepto 118103 0567963 207942 00000 Pendiente 00790304 00375594 210414 00616
-----------------~----------------------------~----~-------~----~----------------------------
Analisis de Varianza
----------------~----------------~------------------~--------------------------~------~--------shySource Swn de cuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor
-----------------~--~--------------------------------------------------------------------------~---~ Mode10 244835 1 244835 443 00616 Residual 552997 10 0552997
Total (Corr)797832 11
Coeficiente Correlacion = 0553964 RI2 = 306875 percent
-----~--------------------------------------------------------~--------------------------------------
LactobacillusConAvena = 118103 + 00790304Dfas
77
LISTA DE ANEXOS
ANEXO A--- RESUl TADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AfSLADA DE
ANEXO B RESULTADO PRUEBAS BIOQUfMICAS DE CEPA AISLAOA DE
REPOLLO FERMENTADO --middot----------middot--------------------------68
ANEXO c RESULTADO PRUEBAS BIOQUIMICAS DE CEPA AISLADA DE
MUCOSA HUMANA ------------------------------------------ ------69
ANEXOD RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMCAS DE CEPA AISlADA DE
LECHE FERMENTADA---------------------------------------_-70
ANEXO E RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AtSLADA DE
REPOLLlTAS DE BRUSELAS tERMENTAOA ------------------------71
ANEXO F ANAUSIS DE REGRESION PARA pH EN BEBIDA SIN AVENA--- 72
ANEXO G- ANAUSIS DE REGRESION PARA pH EN BEBIDA CON AVENA --73
ANEXO H ANALISIS DE REGRESION PARA ACIDEZ EN BEBIDA SfN AVENA
ANEXO 1- ANALISIS DE REGRES[ON PARA ACIDEZ EN BEBIDA CON AVENA
ANEXO J- ANALISIS DE REGRESION PARA RECUENTO LACTOBACILOS
PARA 8EBItgtA SIN AVENA ~----------------------------------------wirEr
ANEXO K ANALlS1S DE REGRESION PARA RECUENTO LACTOBACILOS
PAFt BEBIDA CON AIlNA-------~-------~----------~------~---middot-----~-middot---irjr
INTRODUCCI6N
En los ultimos arios S9 ha comprobado los efedoS beneftcos que los
microorganismos probiotico$ ejercen sobre la salud humana a facilitar la digestion
de lactosa estimular 18 actividad inmungica modificar ef balance poblecional
tanto de la microbiola intestinal nativa can posibles sfeelos patogenos como de
las que causan toxiinfeCCiones alimentarias edemas se estan ensayando como
implante en heridas de piel para evttar contamlnacion can microorganismos
patogenos
Los microorganismos probi6ticos se emplean en fa elaboraci6n de productos
fermentados en especial los lacteos Estas industrias se han limitado a utilizar
cultivos iniciadores importados que rsquieren tiampo y culdados para su
manlpulacion y empleo En Colombia no se han realizado InY9s1igaciones que
involucren cepas nativas can activldad probiotica ni el afecto de ingredientes
prebi6tico$ sabre fa viabilidad de estos microorganismos tenienqo en cuenta que
al prebiotico es un ingrediente allmentario que estimula sefectivamente el
crecimiento y actividad de algunas especies de microorganismos probi6ticos
En esta investigacion se sislaron microorganismos probi6ticos a partir de
muestras de vegetales y lache crud a de vaca fermentadas naturafmente y de
mucosa humana utifizando medios de cultivo salactivos bajo condiciones
12
anaerobias Luego se procedio a verificar su rasistencia a los acidos gastricos y
sales biliares simulando asl las condiciones del tracto gastrointestinal de 10$
humanos Las capas que presentaron mejor comportamiento ante estas pruebas
sa caraeterizaron morfologles y bioquimicamente y sa seleccione una de eHas
para inocular en bebidas lacteas sin y can avena como ingrediente prebiotico y
verificar su viabilidad durante al almacenamiento
Los resultados de esta investigacion padren sar de gran irnportanoia para la
industria nacional de alimentos las univarsJdades con facultades relacionadas
can la salud y la alimentaci6n y para las entidades gubernamentales involucradas
en la alimentacion y nutricion de grupos de poblacion vulnerables tales como eJ
Instituto de Bienestar Familiar y Bienestar Social entre otros
13
middot~
1 MARCO TEORICO Y ESTADO DeL ARTE
11 P~OBI6TICOS
111 Historia
EI consumo de productos fermentados lecteos con microorganismos vivos
especialmente bacterias acido lacticas ha sido reportado a 10 largo de la historia
desde tiempos remotos se evidencia al conoeimiento de los beneficios que estes
proporcionaban perc real mente quian enfatiz6 en ellos fua 91 cienUfico ruso Elie
Metctinikcff que reaclon6 la ingesti6n de (eches fermentadas con la longevidad y
salud de las personas ( Pardio et al 1996)
En 1965 sa utilizo por primera vez et termino Probi6tico derivado dellatin pro
que significa a favor de y del gr9go bios que quiera decir vida tnieialmente esta
palabra defini6 a los microorganismos que promovian el erecimiento de otros
microorganismos Ivego se splico asta termino a extraetos de tajido que estimlilan
el crecimiento micrObianqEn la actuaidad sa han definldo como probiotieos los
cultivos (micas 0 mezclados de microorganismos vivos qua al ser ingeridos por
humanos Q animales majoran el balance poblacional de la microbiota intestinal
evitando la adherencia de patogenos (Schrezenmeir et albull2001) Sin embargo
estos microorganismos no nece_iamenta son habitantes propios del tracto
14
gastrointestinal (Holzapfel at a2001Gaitan at al 1998) p~r 10 tanto es
necesario consumir alimantos en los que se encuElntren estos mrcroorganismos
viables estos hacen parte de I~micfobiota de vegetales y leches interviniendo en
Ie fermentaci6n natural de estos~ntos
112 Microorganismos Probi6ticos
los microorganismos probi6ticos que tradicionatmente se han adicionado a la
tache para fermentarla y obtener yogurt y kumis a como suplementos pertenecen
a los generos Lactobacillus Enterococcus y Bifidobacterium (Ver tabla Nro 1) Sin
embargo se considera que solo algunas especies de los gelnsros Lactobacillus y
Bifidobacterium sobreviven en el tracto gastrointestinal En la tabla 1 58 muestran
algunas de estas especies
TABLA 1 Algunas especies microbianas probi6ticas
Lactobacillus Sifidobacferium Enterococcus
L acidophilus
L JohnsoN
L casei
L rhamnosus
Lgrasseri
L reuten
L plantarum
B bifidum
Blongum
B infantis
E fsecium
E faecalis
Fuente Gaitan et a 1998A
15
EI eonoeimiento a cerea de sus efeetos beneficos en el consumidor por su alta
viabilidad en el intestino como la producci6n de sustancias con aetividad
antieaneerigena el mejoramiento ltfel sistema inmunol6gico y el deSplazamiento
de la mierobiota pat6gena gastrointestinal en el consumidor ha estimulado una
mayor demanda de estos microorganismos como tambian de los productos que
los contienen (Heller 2001 Parada middot1998)
Existsn otros produetos fermentados de origen vegetal como et tampe col acida
y salsa de soya de los euales sa pueden aislar estos organismos probi6tieos
comp tambien de la mucosa intestinat humana y luego de suministrarlos a
ratones sa han comprobado sus caracteristicas beneficas (Molin 2001)
113 Caracteristicas fenotfpicas de algunos microorganismos
probi6ticos
las bacterias aeido lacticas de los generos Lactobacillus y Bifidobacterium son
consideradas probi6tieos y tradicionalmente se han clasificado con base en Sus
propiedades morfol6gicas crecimiento a diferentes temperaturas capacidad
fermentadora de glucosa y otros carbbhidratos y la configuraci6n del Bcido Jaetieo
producido (Holzapfel etal2001)
16
)lli~ h Dx nIILIOTECM
eJDe~~ l1ilmfJ tIDBnm
Los Lactobacillus son bacilas gram positiv~s no esparuladas aerotalerantes
acido - tolarantes estrictamente fermentadares formadores de Boido laclica como
producto principal catalasa negativo carentes de citocroma sin embargo se
presentan excepciones a esta descripcion parque afgunas especies pueden
formar catalasa 0 citacramo en medios que contienen hematina 0 compuestos
relacianados La produccion de catalasa no hema pseudocatalasa puede causar
tambien alguna confusion en fa identificacion de algunos Lactobacillus
las especies del genera Bifidobacterium san bacilos gram positivos no
esporulados generafmente anaerabios estricto$ aunque pueden creeer bajo
condiciones microaer6filas cuando estan ert presencia de C02 La mayorfa de sus
especies se pueden diferenciar par criterios biaquimicos simples como la
fermentacion de L arabinosa DmiddotxiJasa O-manosa O-manita y O sorbitat que
pueden servir coma caracterist1cas clave para su clasificacion (Holzapfel
etal2001 )
114 Caracteristicas de los probi6ticos
Las cepas de microorganismos prabi6ticos deben presenter y mantener unas
caracteristlcas que garanticen su crecimienta y supervivencia En el alimenta
como tambiEm durante su transito a traves del est6maga e intestino delgaQo
17
La primera CBtacterfstica es que sean viables esta viabifidad esla capacidad que
tienen los microorganismos probi6ticos de permanecer vivos tanto ~n el alimento
como en el Intestino del consumidor por un tiempo determinado En Colombia se
ha establecido que en bebidas fermentadas este tiempo debe ser minimo de 21
dras en el alimento (Minsalud 1986) Esta vjabilidad depende del metodo de
produccion y de la cepa utilizada (Tuomols at a 2001)
Luego de que se garantice que estos microorganismos eslan viVos en el alimento
ell os deben cumplir otro criterio importanle para ser considerados como
organismos probi6ticos y as tblerar las condiciones de acidez a un pH=2 y la
sccian de proteasas del est6mago ademas de sobrevivir y creeer en presencia de
acidos biliares (Tuomola et al 2001 Jacobsen at a 1999) para luego de
sobrevivir a estas condiciones adherirse a la mucosa intestinal y de esta manera
estimular al sistemainmunoJ6gico esta capacidad de adherirse a la mucosa es un
prerrequisito para la colonizacion del intestlno (Toumola etal2001 Alander et aI
1999)
Cuando los probioticos han pasado todas esta pruebas de supervivencia y luego
de impfantados en la mucosa producen acidos organicos peroxido de hidrogeno y
tambien bacteriocinas que actUan como inhibidore$ del crecimiento de
microorganismos patogenos u oportunistas (Tuomola at al 2001 Cintas et al
2000) complementando de asta manera su accion benefica sobre la mucosa
intestinal y en general sobre la saJud del huesped
18
116 Berieficios de los microorganismos probi6ticos
Los beneficios que se asocian a los microorganismos probioticos son muchos y
variados Entre ros comprobados mediante estudios se eneuentran
1151 Facilitar la digesti6n de la lactosa
los microorganismos probioticos cuando estan en el intestino liberan alii la
enzima pmiddotgalaotosidasa capaz de hidrolizar la lactosa haste glucosa y galactosa
evitando as que personas intolerantes a este carbohidrato presenten sfntomas
como flatulencia dolor abdominal y diarrea cuando consumen leche (be Vresse
et 81 2001)
1152 Protegen contra enfermedades gastrointesUnales
EI consumo de aJimentos con probioticos ha mostrado efeeto terapeutico frente a
los sintomas de diarrea asociada al surninistro de antibi6tico$ de amplio espectro
que destruye 0 disminuye la microbiota endogena esta imp ide la coJonizacion de
bacterias patogenas como Klebsiella oxytoca y Clostridium difficile que pueden
causer lesiones en el cn Los probi6ticos recuperan el balance de la microbiota
intestinal nativa y avitan Ie adhesion de algunos virus bacterias pat6genas a
parasitos que pueden ser agentes causales de gastroenteritis la diarrea del
19
J
viajero y 1(3 inflarnacion intestinal que en ultima instaneia oeasionan ef sfndrome
del colon irritable (Marteu et al 2001)
1153 Protegen contra infecciones del tracto urogenital
La vaginitis indueida por baeteriss yo por levaduras as una infecci6n
estrechamente relacionada con la exposici6n a antibi6ticos y espermicidas y
tambien depende del estado hormonal de la n1ujar Con al uso de mezcJas de
probi6ticos se han obtenido buenos resultados en la rastauraci6n de la rnicrobiota
natural urogenital benefica que desplaza a los eausantes de la inflamaci6n de Is
vagina y Ie uretra (Reid 2001 )
1154 Promueven la barrera de defensa end6gena del intestino
EI tracto gastrointestinal normal mente as una barrera natural contra anUgenos de
origen microbiano y alimentario Cuando los probi6ticos sa adhieren a Is mucosa
intestinal estimulan 0 potencian al sistema inmune favoreciendo la
inmunomodulaci6n que induce un aumentb de fa producci6n de inmunoglobulinas
activacion de las calulas mononueleares y de los linfocitos para proteger al
huesped de infeeciones (Isoulari et sl 2001)
20
1155 Protegen contra cancer de colon
EI cancer es el resultado de una serie de mutaciones somaticas que pueden
ocurrir durante al tiempo de vida del individuo y 10 padeca buena parte de la
poblacion mundial los probi6ticos en un sistema in vitro han demostrado un
efecto positivo en la prevenci6n de mutaciones aI desactivar carcin6genos
genotoxicos (Wolloswski et al J 2001)
1156 Protegen contra infecciones respiratorias
Sa ha demostrado que el conslJlno de probi6ticos disrninuye la incidencia de
infecqiones raspiretorias al aumentar la actividad fagocitica de maer6fagos
alveolares que aettian sobre microorganismos patogenos Se hizo un estudio en
571 ninos sanos con edades entre uno y seis anos divididos en dos grupos a uno
de ellos sa las incluy6 en su dieta leche suplementada can Lactobacillus GG y a
los otros ninos leche no suplementada AI final del estudio se observ6 una
disminucion del 19 en la incidencia de infeccionas respiratorias tratadas con
antibi6ticos tales como otitis media sinusitis bronquitis y neumonfas en el grupo
de los ninos que consumieron Lactobacillus GG (Hatakka et al 2001)
Alvarez et al (2001) encontraron que la administraci6n de yogurt con Lactobacillus
casei en ratones de tres arios de edad majora los espacios libres del puJrn6n de
la presencia de Pseudomona aeruginos8 induciendo un aumento
21
significativo en los niveles de gA a IgM datactadas en los lavados
broncoaJveolares y se observ~ un afecta dependiente de la dosis
1157 En el tratamientoy prevenci6n del eczema
Se ha encontrado que el consumo de probi6ticos mejora la inflamaci6n alergica 0
eczema at6pico en ninos alimentados con formula suplementada con probi6ticos
Encontraron una mejora significativa al suministrar Bifidobacteriummiddot actis y
Lactobacillus GG en 27 niiios con edad promedio de 46 meses Luego de aplicar
este tratamiento se sometieron a una prueha de SCORAD (mide fa extension y
gravedad del eczema) registrando una meJoria significatlva en las condiciones de
la pie concentraci6n de citoquinas cirClllantes an sueto y moleculas de adhesi6n
a las superficies de las celulas soJubles en suero (Isolari 2000)
Se realizaron otros estudios a 159 mujeres embarazadas con historia familiar de
eczema atopico de primer grado a las cuafes sa res 5uministro dosis diarias de
Lactobacillus GG durante 2 a 4 samanas previas al parto Oespues de ella fa
madres twiaron la opci6n de continuer tomando el ptobi6tico si amamantaban 0
bien darseio vIa oral La mayoria de las madras eJigieron dar las dosis at bebe
diariamente A los dos anos de vida se observ6 una disminuci6n del 50 en la
frecuencia del eczema at6pico en aquellos nHies que se les dio ef probi6tico
(Kalliomari etal 2001)
22
1158 Previenen infeccion en heridas quirurgicas
Los probi6ticos impiden la union de pat6genos a las superficies celulares en
heridas mediante la seCreci6n de proteinas Actuamente se encuentra en
estudio la aplicaci6n del Lactobacillus fermentum vivos sabre heridas en piel de
ratas y se ha encontrado una disminuci6n del 90 en la colonizaci6n par parte del
StaphylococcuS aureus uno de los patogenos mas temidos y de mayor lncidencia
en infecciones hospital arias mas aun se esta contempiando la posibilidad de
utilizar la protein a purificada an lugar de los mjcroorganismos para la protaccion
contra infecciones en heridas (Strauss 2000)
12 PREBIOTICOS
Son carbohidratos de cadena corta algunas veces reconocidQs como
oligosacaridos no digeribles par las enzimas del epitelio intestinal 0 de las
gliJnduJas anexas debido a su estructura quimica y de esta manera lIegan al
intestino grueso donde alcanzan a estar disponibles para la fermentaci6n por las
bacierias sacaroHticas que son especial mente laetobadlos y bifidobacterias
dando odgen a compuestos que ejercen efectos funcionales sobre la mucosa del
tubo digestivo (Brunser 2001)
Se consideran como tal algunos fructocligosacaridos isomaltooligosacariclos
oligomato palatinosa poHdextrosa pOJidextrrna raftilina y algunos oligosacaridos
23
)
de 1a soya y fa avena Estenmiddot presentes en alimentos como Ie cebolla ajo
banano puerros 1 derivados del trigo achicoria esparrago alcachofa (Cummings
etal 2001)
Algunos de estos prebi6ticos cuanda son incorporado$ a fa dieta en cantidades
dalerminadas alteran la microbiota intestinal disminuyendo los recuentos de
coliformes bacteroides y cocos y aumentando las bifidobacterias hasta en diez
veces ademas modifican la actividad metab6lica del coron logrando una
disminuci6n del pH y un incremento en el contenido fecal de acidos grasos de
cadena corta como at acatica propi6nico y butfrico El butirato aumen~ _I grosor
de la pared del coron e intestino delgado estimula eJ crecimiento de la mucosa del
colon y auManta su flujo sangufneo inhibe el crecimiento de tinsas tumorales
epiteliales de origen co16nico induce la diferenciaci6n de sus celulas y a
apoptosis entre otros(Brunsar 2001)
Eh estudios hechos en simuladores del intestino humano utilizando productos de
avena fermentados se encontro que estimularon al crecimiento tanto de
lactobacios como de bifidobacterias y en el caso de estas ultimas se incremento
la producci6n de los acidos acatico propionico y butfrico 10 que incide sobre la
implantacion de probi6tico$ e inhibe al crecimientos de otro tipo de
microorganismos (Alal1der eta1999 Kontula etal 1998 Jaskari etal 1998)
24
~ -1
(
AI comparar el comportamianto de las leches de diferente origen se ha
demostrado que Ie leche de vaca contiene caseinatos sustancias que forman
buffer ~n et intestino e inlpiden que los probi6ticos disminlJyen el pH del intestina
y de esta manera se impide al efecto deseado que es evitar fa proliferaci6n de
otros microorganismos entre los cuates pueden estar algunos patOganos En la
leche materna sa encuentran algunos carbohidratos como glucosa galactosa n
acetilglucosamina y algunos 0lig6meros de Ie fucosa en cOhoontracionesmiddot
importantes los cualeS favoreceh el crecimientc)middot de probi6ticos esto
complementado can 91 bajo contenido de protenas que se traduce en una
reducida capacidad buffer hacen de Ie lache materna IJn alimentd adecuado para
nllios en su etape de lactancia
Algunos prebi6ticos como 1a lactulosa yciertos compuestos que contiansn fructosa
no son digeridos en el intestino humano y pueden sar utilizados selectivamenta
par los probi6ticos 10 que hace que los probi6ticos en combinaci6n can prebi6ticos
pueden lIegar a ser un importante medio para prevenir algunas enfermedades del
tracto gastrointestinal (Bezkorovainy 2001)
25
2 METODOlOGfA
21 LOCALIZACION
EJ trabajo sa realizo en el laboratorio de Microbiologia y la planta da laches de Ja
Universidad Naclonal de Colombia- Secie Medellin
En al laboratorio se hiZQ al aislamiento a identificaci6n de fa capas y en fa Planta
sa eJaboro la leche fermentada con 1a cepa seleccionada y el prebi6trco
22 METODOS
221 Aisiamiento de cepas nativas
Las cepas nativas se sislaran de producto$ vegetales leches fermentadas y
mucosa vaginal humana
2211 De vegetales
Las muestras vegetales de repollo repollitas de brusefas y pepino se
seleccionaron porcionaron y mezclaron can cloruro de sadio al 10 pIp se
calacaron en un recipienta de vidrio balo anaerobiosis y sa dejarQn por 15 dias
26
luego S9 tomaron 3 ml de cada muestra y se jnocularon 9 ml de caldo MRS (Man
Rogosa and Sharpe) se incubaron a 37deg C durante cinco dias en camara de
anaerobiosis (Ver Figura 1) Oespues de este tiempo sa inocularon cajas de petri
con agar MRS con 1 ml del cultivo microbiano y se incubaron bajo las mismas
condiciones que eJ caldo Este procedirniento se realiz6 rapetidas veces hasta
seleccionar la cepa pura mediante observaci6n de caracteristicas morfologicas de
la cOlonia y a cada colonia se Ie practico la coloracion de gram con el fin de
observar las caracteristicas microscopicas de cada una e identificar las de mayor
similitud a los Lactobacilos y Bifidobacterias
Figura 1 Camara de anaerobiosis
27
2212 De la leche
Sa tomo 200 ml de teche cruda de la planta de leches y se colaca a fermentar
baja anaerobiosis durante 15 dras Luego sa procedia como en los vegetales
2213 De mucosa vaginal humana
Se tomo una muestra de frotis de mucosa vaginal humane can capito esteril sa
puso a ncubar en Caldo MRS y se procedi6 camo en 2211 y 2212 A cads
aislado sa Ie practico la coloracion de gram y sa seleccionaron aquellas que eran
bacilos gram positivos (Ver Tabla 2)
28
TABLA 2 Fuente de aislarniento de cepas nativas
CEPA FUENTE
1 Pepino fermentadQ
2 repollitas de bruselas fermentadas
3 Repolltgt fermentado
4 Repollo fermentado
5 Mucosa va~inal humana
6 Mucosa vaginal humana
7 repollitas de bruselas fermentadas
8 Repollo fermentado
9 repollitas de bruselas fermentadas
10 Mueo~a vaginal humana
11 Repollo fermentado
12 RepolJo fermentado
13 Leche fermentada
14 Mucosa vaginal humana
15 repollitas de bruselas fermentadas
16 Repollb fermentado
29
222 Almacenamiento de las cepas aisladas
Cuando las cepas crecieron en agar MRS homogEmeas en color morfologia
coloraci6n de Gram etc se pssaron a agar inclinado en tuba se cubrieron con
aceite mineral y se guardaran en refrigeraci6n a 4deg C para tomar de alii la cepa y
efectuarle las diferentes pruebas para confirmar el genera y determinar la especie
de cada una de eas (Ver Figura 2)
Figura 2 Cepas en tubos con agar inclinado
30
223 Pruebas para determinar et genero
2231 Coforaci6n de Gram
A cada cepa sospechosa de Lactobacilos se 1e hizo la coloraci6n de gram y se
seleccionaron las gram positivas
2232 Morfologfa
En agar MRS y despues de incubar en anaerobios~s crecian colonias grandes
cremosas de color beige con bordes homogeneos y c6ncavas(Ver Figura 3)
Figura 3 Colonias aisladas en agar MRS
31
2233 Prueba de esporulaci6n
A cada cepa aislada se Ie hizo esta prueba la cuel consistia en incubar en
aerobiosis durante ocho dias las cajas de agar MRS donde crecieron colonias de
Lactobacilo$ y luego se les (ealize) coloraci6n de espora Las capas que dieron
negativa a la prueba de espora se considararort sospechosas de sar Lactobacilos
y se continuo con la prueba de la catalasa (Ver Tabla 3)
2234 Prueba de la catalasa
los lactobacilos carecen de catalasa Eata prueba se hizo tomando una colonis
se deposito en vidrio de reloj y se Ie adicion6 dos gotas de peroxida de hidr6geno
(H202) la que no presentaba efervescencie eran cepe sospechosa de ser
Lactobacilo (Ver Tabla 4
Sa seleccionaron las capas euyo resultado fue aeorde con el genera Lactobacilfu$
y se continuo con la comirmaeion del genera y determinacion de la eSpecie
meqiante las pruebas bioqulmicas
32
224 Prueba para determlnar la especie
Para confirmar el genero y determinar la especie de las diferentes capas aisladas
se hizo una caracterizaci6n bioqufmica utilizando un kit de API 50 CHL Medium
Ref 50 410 que contiene una galed8 de medios que permite realizar el estudio
de fermentaci6n de los 49 azucares de 52 especies de Lactobacillus (Ver Figura 4
y tabla 5)
Figura 4 API CHL 50-Prueba bioquimica
33
225 Pruebas para determinar microorganismos probi6ticos
2251 Resistencia a pH=2 y sales biliares de concentraci6n O3pv
A las cepas idantificades como Lactobacillus brevis y Lactobacillus pantarum sa
las realiz6 Ie prueba dfl resistencia a pH=2 y sales biliares de concentraci6n 03
pv ( Jacobsen et al 1999) Una colonia de cada cepe aislada se inocul6 en 4 mt
de caldo MRS durante cinco dras bajo condiciones de anaerobiosis Oespues de
esta tiempo se dejaron pracipltar los microorganismos por sedimentaci6n se Ie
retire el sobrenadante y al precipitado se Ie adicion6 Sml de caldo MRS
previamente ajustado a pH=2 can seido clorhfdrico (HCI) dentro del mismo tuba de
ensayo G igual sa hizo can otro tubo previamente incubado pero a este se Ie
adiciono 5ml de caldo MRS con sales biliares a una concentra~i6n de 03 plv y
ambos se incuberon a 37deg C por 2 haras Sa midio 01 mi de cada uno de los
tubas al tiempo 0 y a las 2 horas y sa inoculeron en superficie en caJas de petri
con agar MRS S9 incubaron a 37deg C bajo anaerobiosis durante 48 horas Se
compararon visualrrente en cada caja de petri el crecimiento en superficie y las
que presentaron crecimiento en tos dos tiempos (0 y 2 horas) tanto en at media
acido como en sales I se consideraron resistentes a pH=2 y sales biliares (03
pv)
(Ver Tabla 6)
34
226 Conservacion
Todas fas capas que habian dado positiva Jas pruebas anteriores y que reaultaron
resistentes a pH=2 y sales biliares 03 pv y despues de identificadas en API 50
CHL sa repicaron en agar MRS en tuba inclinado y despues de Incubar a 37deg C
por 48 horas bajo anaerobiosis se Ctlbrie el biser completamente can aceite
mineral esteril y sa guardaron en refrigeraci6n
227 Elaboracj6n de fa bebida fermentada
2271 Preparaci6n de la mue$tra
Sa tome 1 mt de caldo MRS previamante inoculado e incubado que presentaba
una concentracion de Lactobacillus brevis de 27x108 Iml segun la escaJa de Mac
Farlan y sa adiciono a 9ml de leche pasteurizada en un tubo sa dej6 incubanda
en anaerobiosis por 48 hores Luego se pasaron estos 10 ml a un frasco qua
cont~nie 90 ml de leche pasterizada y se dej6 incubando par 48 haras en
anaerobiosis
35
2272 Adici6n del inOculo
A 900ml de leche pasteurizada se Ie adicion61os 100 ml de leche que habia sido
previamente ino(ulada dos veces con la cepa posteriormente se deja
fermantando la lache a temperatura de 37deg C
2273 Control de Ja fermentaci6n
Las muestras se hicieron por cuadruplicado y se les hizo un seguimiento de
aoidez hasta un valor entre 04 y 05 expresada como Bcido lactico esta
procedimiento corresponde a la babida fermentada sin prebi6tico La bebida ~on
prebi6tico tiene al mismo proeedirnianto pero adicionalmente se agrag6 avena a
una concentraci6n de 05 en el momento de la adici6n del in6e410 a los 900 ml
de leehe pasteurlzada y el procedimiento sigui6 igual al de la bebida sin prebi6tico
tambien se hizo por cuadruplicado
2274 Refrigeracl6n
Despues que las mezclas con y sin prebiotico alcanzaron el de acidez
requarido se IIeva ron a refrigeraci6n a una temperatura de 4deg C p~r 24 horas
para frenar proce~os metab6licos de los microorganisrtlos Despues de este
ti~mpo se procedi6 al batido
36
1 2275 Batido
Con un agitador se procedi6 a batir las bebidas para romper et coagulo formado
y de esta manera homogeneizar la mazela y obtener asf la bebida fermentada
2276 Envasado y almacenamiento
Ambas bebidas se envasaron en frascos vidrio para hacerles seguimiento de pH
acidez(expresado como acido tacticol y recuento de Lactobacillus breviSf los
dies 27 14 Y 21 despues de elaboradas las bebidas perfodo durante el cualta
muestra permanecfa afmacenada a temperatura de refrigeracion(Ver Figura 5
37
Fjgura 5 Diagrama de Flujo
PREPARACION DE LA MUESTRA
ADICION DEL INOCULO
~_____~_B~ATIDO~______~
INCUBACION 37deg C hasta acidez = 04-05 acido laotico
ENFRIAMIENTO
hasta 4 0 C ~------~ ~------~
ENVASADO Y ALMACENAMJENTO
dUrante 21 dfas a Temperatura 4 0 C
38
1
228 Determinaci6n del pH
Se determino por el metoda potenciometrico en un pH-metro manual durante los
dias 2) 7 14 Y 21 de las bebidas lacteas sin y con prebi6tica (Ver Tablas 7 y 8)
229 Oeterminaci6n de la acidez (Expresadfl como acido
lactica)
Se tomaron 9 mJ de las bebida~ sa Ie adicionaron 2 gotas de fanoftaleina como
indicador y sa titulo fa acidez con NaOH 01 N hasta la aparicion de un cotor rosado
debit EI volumen de NaOH utilizado se reporta como valor de de acidez
(VerTablas 10 y 11)
2210 Prueba de viabilidad
Qurante el perfoda de almacenamiento de la bebida lactea se procedi6 a hacer la
prueba de viabiHdad en los dias 7 14 Y 21 para determinar Si los lactobacilfus
permanecfan vivOs a una concentraci6n minima de 106 hasta el dia 21 como 10
establece eJ Articulo 10 de la Rasolucion 2310 del Ministerio de $alud de
Colombja
39
Para asta prueba se tamaron 10 rnl de muestra y se adicionaron a 90 ml de caldo
MRS ruego a partir de esta se hicieron diluciones de 10-2 hasta 10-11 de las
diluciones 109101deg 10-11 se inocul6 1 ml de cada uno en agar MRS siguiendo el
metodo de siembra en profundidad y por duplicado e incubando a 370 C x 5 dras
en anaerobiosis y luego se hicieron tos recuentos por duplicado para esi reportar
los recuentos promedio (Ver Tablas 13 y 14)
2211 AniUisls microbiol6glco de las bebidas Iicteas(con y sin
avena)
Con el fin de determinar las condiciones higienico-sanitarias del producto se
realizaron las pruebas microbiol6gicas de Recuento de mohos y fevadurasml en
agar OGY Recuento en superficia de Staphylococcus coagulasa positivoml en
agar Baird Parker Numero Mas Probable (NMP) de coUfor-mes totales y
Escherichia coliml en caldo Fluorocult y Presencia de Salmonela25ml con BHI
caldo tetrationato y agar Hecktoen (Montoya 1999)
(Var tabla 16)
2212 AnaUsis estadistico
A los datos obtenidos en la medici6n de pH acidez (expresada como Beido
laclico) en los dras 2714 Y 21 y el recuento de Lactobacillus en los dras 714 y21
40
realizados a los dos tratamlentos se tes aplic6 1a prueba t porque solo difieren
en la presencia 0 ausencia del prebi6tico para evaluar si habra diferencia
estadfsticamente significativa para los dos tratamientbs(Ver Tablas9 12 y 15)
41
3 RESULTADOS Y DISCUSION
31 Coloraci6n de Gram y morfologfa
Las cepas aisladas fesultaron Gram positivas (Ver Figura 6) colonias grandes
cremosas dE) color beige con bordes homogeneos y c6ncavos en su
morfologia (Ver Figura 3) resultando de acuerdo a 10 especificado en Stanley
1989 para Lactobacillus
32 Prueba de esporulaci6n y cataJasa
Los resultados de la pruebas de esporulaci6n y catalasa indicados en las
Tablas 3 y 4 respeclivamente dieron conforme a 10 especificado en Stanley
1989 para Lactobacillus
42
1
2 3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
TABLA 3 Resultado de prueba de esporuJaci6n
CEPA RESULfADO ESPORULACION
-- -------------
43
l i ~II bull ~ I I
TABLA 4 Resultado prueba de la catalasa
CEPA RESULTADO CATALASA
1 -2 -3 -4 -5 -6 -7 8 -9 -10 -11 12 -13 -14 -15 -16
3~3 Prueba para determinar la especie
Oespues de hacer las pruebas para seleccionar las cepas sospechosas de ser
Lactobacillus se realizo las pruebas bioquimicas fograndose identificar
Lactobacillus plantarum aislctdo de pepino repollo y repollitas de bruselas
44
fermentados y Lactobacillus brevis de mucosa vaginal y leche fermentada (Ver
Anexos del A al E y Tabla 5)
TABLA 5 Resultado identlficaci6n cepa~
CEPA NOMBRE
1 Lactobacillus planfarum
3 Lactobacillus plantarum
5 Lactobacillus brevis
13 Lactobacillus brevis
15 Lactobacillus plantarum
34 Pruebas para determinar microorganismos probi6ticos
las cepas de Lactobacillus brevis y Lactobacillus plantarum mostraron
rasistencia al medio acido de pH =2 Y sales biliares 03 pv resultado similar al
encontrado por Jacobsen et al 1999 para Lactobacillus plantarum (Ver tabla 6)
45
middot
~~~ttiI lltlmiddot~COX~dtJ ~xtc_~ 2 tr~ k-JlL~middot
-)~~TO DE lJIBUOTECUl rjRL]OTtCA twn GO1IU1
TABLA 6 Resultados a pruebas de resistencia a pH=2 y sales biliares 03 plv
CEPA RESISTENCIA pH=2 RESISTENCfA A SALES BIUARES ()3 pv
1 + +
2 + +
3 + +
4 + +
5 +
6 + +
7 + +
8 + +
9 + +
10 + +
11 + +
12 + +
13 + +
14 +1shy +M
15 + +
16 + +
+1 crecimiento debil
+ crecimiento abundante
46
Figura 6 Lactobacillus brevis Gram + aislado de leche fermentada
Ai observar en placa las celulas de lactobacilos despues de real1zar las pruebas
de resistenCia a la acidez y sales biliares se observo una tendencia a aglomerarse
posiblemente como un mecanismo de proteccion cOlitra estos medios que pueden
lIegar a ser adversos para elias (Ver figuras 7 y 8)
47
Figura 7 Lactobacillus brevis aislada de leche fermentada despu~s de la prueba de resistencia a pH=2
Figura 8 Lactobacillus brevis aislada de leche fermentada despues de la prueba de resistencie asales biUares 03 plv
fI
48
35 --Seguimiento del-pH-en-la-bebidaJacteacon y sin -prebi6tico
A continuacion se muestran las Tablas 7 y 8 donde sa registian los datos
recopilados de pHdurante 10$ dras Z 7 14 Y21 para las bebidas laaeas con ysin
prebi6tioo
TABLA 1 ResultadopH yogur sin avena
Dia Repetition 1 Repetici6n 2 Repeticion 3 Repetici6n 4
2 526 501 51 52
7 446 433 438 44
14 439 435 437 436
21 439 437 438 437
TABLA 8 -ResultadopHyogur con avena
Dia Repeticion 1 Repeticion2 Repeticion 3 - Repeticion 4
2 509 523 51 515
7 447 442 445 442
14 436 -438 439 437
21 432 433 435 434
Observando la Figura 9podamos ver que el pH en el -dfado$ para los dos
tratamientos as igual y empieza a descender rapidamente para estabilizarse a
partir del dra 7(Ver figura 9)
49
Figura 9 Comparacj6n de medias para -el pH
Comparaci6n de medias para pH
55 ~ 5 +----=gtIIIi-~i~~----=-r--it~ -- pH sin avena
a 45 1--~~~~=~~ 4 --- pH con
avena35 t-----r-- -------=------=--= ------- - ----
2 7 14 21
Dias
Aplicando la prueba t para comparar las medias de pH I S6 muestia una diferencia
altamants significativa en los dos tratamientos para el dia 21 (pltO05)
(Ver tabla 9)
TABLA 9 Compaiaci6n de medias para pH
DtAS SIN AVENA CON AVENA te p (VALOR)
2 514 514 0 10
7 439 444 -1 61 0159
14 437 I
438 -070 0510
21 438 433 528 00019 shy
- DiFERENCIA AlTAMENTE SIGNIFICATIVA
50
I
AI aplicar regrasi6n a los datos sa obtiene al modelo estimado
pHSinAyena =535606 - 01505650Ia +0005044340IaI2
La variabilidad en la respuesta de pH asta siendo explicada en un 8S7522 por
el modelo (Ver Anexo F)
EI tratamiento con avena mostro el siguiente modelo al analisis de ragresi6n
pHConAvena =534463 ~ 0140407Dia + 0004480980Ia2
La variabilidad an la respuesta de pH asta siendo explicada en un 903315 par
el nlodelo(Ver anexo G)
36 Seguimiento de la acidezmiddotmiddot expresada comomiddot de acido
lactico
A continuaci6n sa muestran las Tablas 10 y 11 donde sa registran los datos
tecopilados de acidezmiddotdurante los dias 27 14 Y 21 para las pebidas taetees con y
sin prebi6tico
TABLA 10 Resuttadode acidez (expresadocomo acido tactico) yogurt sin avena
CIA R~petici6n1 Repeticion2 Repetici6n 3 Repeticion 4
2 054 06 057 058
7 072 074 073 0]2
14 080 083 082 082
21 0]4 079 078 077
51
TABLA 11 Resultado de aCidez (expresado como acido Icktico) yogurt con avena
Dia Repetici6n 1 RepetiCi6n 2 Repetici6n 3 Repetici9n 4
2 059 055 058 057
7 071 073 072 072
14 089 087 088 086
21 092 091 090 091
Observando la Figura 10 se puede concluir que la acidez empieza a aumentar
hasta el dia 14 y luego trata de estabilizarse para los dos tratamientos
(Ver figura 10)
Figura 10 Comparaci6n de medias para la acidez
N G)
Comparacion de medias para acidez
1
2 0I 5 -+--=--------=-~~~= u
ltC
- Acidez sin avena
2 7 14
Dias
52
21
-it- Acidez con avena
Aplicando la prueba t para camparar las madias de acidez se muestra una
diferencia altarnante significativa en los dos tratamiantos para los dias 14 y 21
(pltO05)
(Var tabla 12)
TABLA 12Comparaci6n de medias para Acidez
DIASmiddot SIN AVENA CON AVENA te p(VALOR)
2 0572 0572 0 10
7 0727 0720 119 0278
14 0818 0875 -638 000070shy
21 077 091 -1212 i 0000019 shy
DIFERENCIA AL TAMENTE SlGNIFICATIVA
AI aplicar r~gresi6n a los datos se obtiene el modelo estimado
AcidezSlnAIena = 0491897 + O0436032Dia O00144613DfaA2
La variabilidad en la respuesta de acidez asta siendoexplicada en un 970978
por al modelo (Ver anexo H)
EI tratamiento con avena mostro elsiguiente modeloj a1 analisis de regresion
AcidezConAvena = 0491638 + 00406572Oia - OQOO982559OiaA2
La variabilidad enla respuesta acidez esta siendo explicadaen un 99212 por
el modelo (Ver anexo J)
53
I ~
37 Prueba de viabiJidad
A continuaci6n sa muestran las Tab~as 13 y 14 donde sa presentan los datos
recopilados del recuento de Lactobacilos durante los dias 7 14 Y 21 para las
bebidas lacteas con y sin prebi6tico
TABLA 13 Recuento de Lactobacilos (UFCml) yogurt sin avena
Dia Repetici6n 1 Repetici6n 2 Repeticion 3 Reptttici6n 4
7 1880X10l1 1454X1011 1642X1011 1780X10~
14 1560X10~ 646X1011J 1890X10l 140X10l1
21 1200x10lu 128Ox10u 1745x10J 1520x101V
TABLA 14 Recuento de Lactobacilos (UFCml) yogurt con avena
Dfa Repetieion 1 Repetici6n 2 Repeticion 3 Repeticf6n 4
7 1600X10lt 1240X10t 1640X10ll 1980X10t
14 540X1011 427X10n 546X10n 720X10ll
21 500x1011 492x1011 712)(1011 980x10~
AI analizar la Figura 11 sa puede observar un recuento mayor de Lactobacilos
en al tratamiento con avena resultado de acuerdo a 10 encontrado por Alander at
aI 1999 Kontula et aI 1998 y Jaskari et aI 1998
54
Figura 11 Comparaci6n de medias para Log Lactobacillus
Comparacion de medias para log Lactobacillus
~ 1350
-+- Sac Sin--() 13 co avenaIII
bull 125 -- Bac con 0)
0 12 avenaJ
115 7 14 21
Dias
Aplicando la prueba t para comparar las medias de recuento de Lactobacillus no
se encontr6 una diferenc1a estadfsUcamente significative entre los dos
tratamientos (Ver tabla 15)
Este aumento en al racuento influy6 en la disminuci6n del pH y en el aumento de
fa aeidez por la fermentacion que realizan los Lactobacillus sobre fa lactosa de la
lache y la avena adicionada como prebi6tico
55
1
TABLA 15 Comparaci6n medias lag Lactobacillus
DIAS SIN AVENA CON AVENA tc p(VALOR)
7 122257 122022 04846 06451
14 121065 132393 -19602 00977
21 129025 133087 -08236 04416
At aplicar regresion a los datos se obtiane al modelo astimado
LactobacillusSinAvena= 117347 + 004834640Ia
La variabilidad en la respuesta del recuento de LactobaCillus ssta siendo
explicada en un 260054 por el mod$loVar anexo J)
EI tratamiento con avena mostr6 al siguiente modalo al anal isis de regresion
Lactobacillu$ConAvena =118103 + 007903040Ias
La variabilidad en la respuesta de recuento esta siendo explicada en un 3068
por al modelo(Ver anexo K)~
38 Analisi$ microbiol6gicos de las bebidas lacteas con y sin
En la Tabla 16 estan recopilados los resultados microbiol6gieos obtenidos en ras
muestras con los dos tratamientos (con y sin avena)
I [
sa
TABLA 16 Resultados analisis microbiologico
Recuento de mohos y levaduras Iml lt10
Recuento de Staphylococcus coagulase positiva Iml lt100
NMP coliformes fotales y Escherichia coli Iml lt3
Presencia de Salmonella25ml Ausente
Los resultados de este analisis demuestran que las bebidas fermentadas con y
sin avena~ astan fibres de microorganismos patogenos
57
1
4 CONCLUSIONES
Se aislaron cepas nativas de Lactobacillus plantarum de las muestras vegetates
de repollo pepino repollitas de bruselas fermentadas y Lactobacillus brevis de
lache fermentada y mucosa vaginal humana Ambas cepas resistieran un pH=2 y
una concentraci6n de sales biliares det 03 ptv dos earacteristicas importantes
en los probi6ticos
Lamiddot cepa de Lactobacillus brevis aislada de lache Sa utiliz6 para elaborar una
bebida fermentada sin y con avana comoingrediente prebiotico obteniendose un
aJimento centon recuento del probi6tico viable durante 21 dras de seguimiento
ademas libre de microorganismos )at6gen05
No se encontr6 efecta significativo de la avena sobre Ie viabilidad del Lactobacillus
brevis aunque sa presento un aumento en 61 recuento de estos en la bebida con
avena
58
plusmn ~
5 RECOMENDACIONES
Ensayar la cepa de Lactobacillus plantartJm en productos carnicos madurados
como el salami
Ensayar la cepa de Lactobacillus l)revs en otros derivados lecteos como queso
quesito queso crema
Continuar con el estudio de estos microorganismos y caracterizarlos
molecularmente ademas de estudiar su capacidad de adherencja a fa mucosa
intestinal sobre algunes Hneas celulares como las CaCo~2
Estudiarel efedo de la avena sabre la viabiJidad del Lactobacillus breyis a una
concentraci6n mayor de 05
Realizer ensayos can las cepas de Lactobacillus brevis y Lactobrlcillus pJantarum
para elaborar masas acidas para panificacion reemplazando el Bromato de
Potasio aditivo prohibido desde marzo del 2003 en nuestro pais per 5U toxicidad
59
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65
ANEXOS
66
ANEXO A RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AlSLADA DE i
PEPINO it
Referencia Pepino 1 Fecha 06122002
IEXCELENTE IDENTIFICACION
Latto plantarum 1
Galeria API 50 CHL V50 Leida el 06122002
Perfil - -- - ++ - -- - ++++ - - -+- + - I I I I I I I I +t+ - +f- ~ - - + + ~ - - - +- + - shy
o - GLY - ERY DARA - LARA + RIB + DXYL - LXYL - ADO - MDX - GAL + GLU + FRU + MNE + SBE - RHA - DUL - INO bull MAN + SOR - MDM + MUG shyNAG + AMY + ARB + ESC + SAL + CEL + MAL + LAC + MEL + SAC + TRE + 1NU - MLZ + RAF + AMD - GLYG - XLT - GEN + TIJR + LYX - TAG - DFUC shyLFUC - DARL + LARL - aNT + 2KG - 5KG shy
--- Taxones significativos rd -----T -- Tests en contra
Lactoplantarum 1 999 092 1
Taxon siguiente Lactobrevis 1 OJ 044 3
i i
Lactoplantarum 1 1 test (5) en contra
D-SORBITOL (SOR) 78
Tax6n siguiente Lactobrevis 1 3 test (s) ert contra
METHYLD-MANNOSIDE (MOlM) 0 MELEZITOSE (MLZ) 14 D-TURANOSE (TUR) 14
67
ampb
ANEXO B RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AISLADA DE REPOLLO FERMENTADO
~
Referencia Repollo fermentado - 3 Fecha 03072003
EXCELENTE IDENTIFICACION
Lactoplantarum 1
Galena API 50 CRL V50 Leida el 03072003
Perfil - - ++ - - - - -H++ - - ~ + - + - I I 1 I I I I -H+ - ++ - - - + + - -- - - + - shy
o - GLY - ERY - DARA - LARA + RIB + DXYL - LXYL - ADO ~ MDX - GAL + GLU + FRU + MNE + SBE ~ RHA - DUL - INO - MAN + SOR - MDM + MDG shyNAG + AMY + ARR + ESC + SAT + CRL + MAL + LAC + MEL + SAC + TRE + lNU - MLZ + RAF + AMI) - GLYG - XLT - GEN + TOR + LYX - TAG - DFUC shyLFUC - DARL - LARL - GNT + 2KG - 5KG shy
------Taxones significativos _ _----- Id--- ---T---- Tests en contra
Lactoplantarum 1 999 095 1
Tax6n siguiente Lactobrevis 1 01 OA8 3
lJactoplantaru01 1 1 test (s) en contra
DSORBITOL (SOR) 78
Taxon siguiente Lactobrevis
METHYL-D-MANNOSIDE D-TURANOSE
1
(MOM) (TOR)
3 test (5) en contra
0 MELEZITOSE 14
(MLZ) 14
i
I
68
ANEXO C RESULTADO PRUEBAS BIOQUWICAS DE CEPA AISLADA DE MUCOSA HUMANA
Referenda Mucosa - 5 Fecha 27012003
BUENA IDENTlFICACION
Galeria API 50 CHL vso Leida el 270112003
Perfil - - - - +t--t - - - + - + - - - - - - - - -+- - - - - + - + - - - - - - - - - - - - - bull - - -+ - +
o - GLY ~ ERY - DARA bull LARA + RID + DXYL + LXYL - ADO bull MDX - GAL + OLU - FRU + MNE - SBE - IlliA - DUL - INa - MAN - SOR - MDM - MOO shyNAG + AMY - ARB - ESC ~ SAL bull CEL - MAL + lAC - MEL + SAC - TRE shyINU - MLZ - RAF - AMD - GLYG - XLT - GEN - 11JR - LYX - TAG - DFUC shyLFUC - DARL - IARL - ONT + 2KO - 5KG +
- - - - - - Taxones significativos - - - - - - - Id T -- Test en contra
Lactobrevis 3 963 088 1
Taxon siguiente Lactoco11inoides 36 075 2
Lactobrevis 3 1 test (s) en contra
GLUCOSE (GLU) 95
-~~~------------~---------------------------~--~-------~--~-----~----------~--------~------------~~--Taxon siguiente Lactocollinoides 2 test (s) en contra
GLUCOSE (GLU) 100 MELIBIOSE (MEL) 25
69
i r
ANEXO D RESULTADO PRUEBAS BIOQIJiMICAS DE CEPA AISLADA DE LECHE FERMENTADA
Referenda Leche fennentada ~ 13 Fecha 27012003
BUENA IDENTIFICACI6N
Galeria API 50 CHL V50 Leida el 270112003
Perfil - - - - -t-t+- - - - + - + - - - bull - - - - -+- - - - - + - + - - - - - - - - - - - - - - - - -+ - +
0 - GLY - ERY - DARA - LARA +Rll3 + DXYL + LXYL - ADO - MDX ~GAL + GLU - FRU + MNE SBE - RHA DUL bull INO MAN - SOR MDM bull MDG shy
~NAG + AMY - ARB - ESC - SAL - CEL - MAL + LAC - MEL + SAC - TRE I lNU - MLZ - RAF - AMD - GLYG - XLT - OEN - IUR LYX - TAG - DFUC bull i
LFUC - DARL - LARL -ONr + 2KG - SKO + 1
- -- - - Taxones significativos - - Id -- T --- Test en contra
Lacta brevis 3 963 088 1
Taxon siguiente Lactocollinoides 36 075 2
Lactobrevis 3 1 test (s) en contra
GLUCOSE (GLU) 95
-----------------------------------------------------------~------------------------------~-------------------Taxon siguiente Lactocollinoides 2 test (s) en contra
GLUCOSE (GLD) 100 MELffiIOSE (MEL) 25
70
II iJ1
I
I ANEXO E RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AISLADA DE REPOLLITAS DE BRUSELAS FERMENTADA
Referencia repollitas de bruselas 15 Fecha 03072003
EXCELENTE IDENTIFICACION
Lactoplantarum 1
Galeria API 50 CHL vsO Leida el 03072003
Perfil - - - - +t - - - - +H+ - +- - +t + - I I I I I I I f ++t - + - - - -+ + - - - -+ -+ - - I ij
o - GLY - ERY - DARA - LARA + RJB + DXYL - LXYL - ADO - MDX - GAL +
GLU + FRU + MNE + SBE RHA + DUL - INO - MAN + SOR + MDM + MOG shyNAG + AMY + ARB + ESC + SAL + eEL + MAL + LAC + MEl + SAC + TRE + i
I1NU - MLZ + RAF AMD GLYG - XLT - aEN + TUR + LYX - TAG - Druc LFUC - DARt + LARL - aNT + 2KG - 5KG shy n ----Taxones significativos ------ Id Tests en contra
Lactoplantarum 1 999 090 o
Taxon siguiente Lacto pentosus 01 012 7
Lactoplantarum 1 o test (s) en contra
Taxon siguiente Lacto pentosus 7 test (8) en contra
GLYCEROL (GLY) 75 D-XYLOSE (DXYL) 100 L-RHAMNOSE (RHA) 25 METHYL-D-MANNOSIDE (MOM) 1 MELEZITOSE (MLZ) 25 RAFFINOSE (RAF) 75 D-ARABITOL (DARL) 0
71
~
I i I
ANEXO F - ANALISIS DE REGRESION PARA pH EN BEBIDA SIN AVENA
Aruilisis de regresi6n polinomial
---~-~-------------------------------------------~-----------~~---------------------~--------------Variable dependiente pHSinAvena ---------------------------~-------------~--------------------~---------------------------------
Error T Parametro Estimado Estandar Estadistico P-Valor
CONSTANTE 535606 0094535 56657 00000 Dia -0150565 0020706 727154 00000 Dia2 000504434 0000871488 578819 00001
---~---------------------------------------------------------------------------------------------------
Anfllisis de Variama -------------------------------------------~-----------~-----------------------------~-~--- jSource Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor 11
------------------------~------------------------------------------------------------------------------~ Mod-elo 155772 2 0118861 4256 00000 Residual 0237877 13 00182983
Total (Corr) 11956 IS
R2 == 867522 percent
pHSinAvena == 535606 - 0150565Dia + 000504434Dia2
72
____
middot ANEXO G - ANALISIS DE REGRESION PARA pH EN BEBIDA CON AVENA
AmUisis de regresion polinomial _____~_____~__-_____~___4____________________bull____bull__________bull_____________~~----_------___________
Variable depcndiente pHConA vena ------------------------------------------------------------------------------------------~--------
Error T Parametro Estimado StAndar Estadfstico P-Valor
---------------------------------------------~-----------------------------------------------_---------CONSTANTE 534463 00801045 667208 00000 Dia -0140407 00175453 800253 00000 DiaA 2 000448098 0000738458 606803 00000
----------------------~---~-----------------------------~------------------------------~----AmUisis de Varianza
---~---------------------------------~---------------------~------------~-------------------~------Source Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio PValor --------------------------~-----------------------------------------------~------------~-----~~--~ ModeJo 159575 2 0797873 6073 00000 Residual 02170798 middot13 00131383 _______~_~ ~_~----------~------~--~-----~-M-----~-----____ _____________~-----------------------Total (COlT) 176654 15
R12 903315 percent
-----------~------------------------------------------------------------------------~-----------pHConAvena 534463 - 0140407Dia + 000448098DfaA 2
73
ANEXO H - ANALTSIS DE REGRESTON PARA ACIDEZ EN BEBJDA SIN AVENA
An8Jisis de Regtesi6fi P6lifJomial
Variable Depefidiefile~ AcidezSinAVenll _______________w_____~______~________________~-----------_________~_________________~~____~___~_____
Error T Pariirnetro Estimado Estandar Estadistico ---------------------------------------~--------------~-~-------~--------------------~------------CONSTANT 0491697 00123217 399051 00000 Dia 00436032 000269882 161564 00000 D1a2 -000144613 000011359 127312 00000 __w___~________________________~-_______-_____~----____________________________~__~---~_--__~___
AriiiJisis de varianza ~_~__~__________~_~____~________~___________- _________e_____________________________bull _____-________
Source Smn de cuadr Df Mean Square F-Ratio PmiddotValor_~~___________________________________bull ______~___________bull ____________bull ______~________w________________
Model 0135203 2 00676013 21747 00000 Residual 000404118 13 000031086
Total (Corr) 0139244 15
R2 970978 percent
AcidezSlnAvena 0491697 + O0436032Dia - 0OOl44613Dia2
74
I
ANEXO I ANALISIS DE REGRESION PARA ACIDEZ EN BEBIDA CON AVENA
1
Anwisis de tegtesi6fi polinomial
Variable dependiente Acidez Con Avena
Error T ParametTo Estimado Stlindar Estadfstico P-Valor ----------------~-------~---------------------~-----------------------------------------------------CONSTANT 0491639 000926607 530578 00000 Diamiddot 00406572 000202955 200326 00000 DfaA 2 0000982559 0000085421 -115025 00000
-------------~----------------------------~-------------------------~-----------------------------------
-------------~-----~~-----------------------------~---------------------------------------------_--Source Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio PValor
-~-------------~----------------------------------~------------------~~-------------------------- Modelo 0288008 2 0144004 81914 00000 Residual 000228539 13 0000175799
----------~~--------------~---------------------------------------------~---------------------------Total (Corr) 0290294 15
RA2 = 992127 percent
-------------------------~----~---~------------~---------------------------------~---------------~
AcidezConAvena == 049163amp + 00406572D1a - 0000982559DiaA2
75
I
(Ilmiddot il
ANEXO J- ANALISIS DE REGRESION PARA RECUENTO LACTOBACILOS PARA BEBIDA SIN AVENA
Amilisis de regresion - Modelo lineal Y = a + bX
------------------------~----------------------~-----------------------------~----------~-----------Variable Dcpendiente LactobacilJusSinAvena Variable independiente Dia
I--------~----------~-----------------------------------~-------~-~--~--------------------------~-Error T
Paramctro Estimado Standard Stadistico P-Valor
----~----~------------~-----~-----------------------~-------------~-----------------------------Intereepto 117347 0389973 300911 00000 Pendiente 00483464 00257889 18747 00903
Analisis de Varianza
---------~------------------~----------------~---------------------------------~---------~----------Source Sum decuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor
------------~---------------------~---------------------~--------------------------------~-----~----Modelo 0916252 1 244835 443 00616 Residual 260706 10 0260706
--~------------~---~------------------~~~-----~-------~---------~~-------------------------------------Total (Corr)352332 11
Coeficiente Correlaci6n = 0509955 R2 = 260054 percent
LactobacillusSinAvena= 117347 + 00483464Dfa
76
ANEXO K- ANALTSIS DE REGRESION PARA RECUENTO LACTOBACILOS PARA DEBIDA CON AVENA
Aruilisis de regresion - Modelo lineal Y = a + hX
Variable Dependiente LactobacillusConAvena Variable Independiente Dia ---~--------------------------------------------------------__-----------__--_--_-----------shy
Error T Paramctro Estimado Standard Estadistico P-Valor -~--------------------------------------------------------------------------------------------------
Irttercepto 118103 0567963 207942 00000 Pendiente 00790304 00375594 210414 00616
-----------------~----------------------------~----~-------~----~----------------------------
Analisis de Varianza
----------------~----------------~------------------~--------------------------~------~--------shySource Swn de cuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor
-----------------~--~--------------------------------------------------------------------------~---~ Mode10 244835 1 244835 443 00616 Residual 552997 10 0552997
Total (Corr)797832 11
Coeficiente Correlacion = 0553964 RI2 = 306875 percent
-----~--------------------------------------------------------~--------------------------------------
LactobacillusConAvena = 118103 + 00790304Dfas
77
INTRODUCCI6N
En los ultimos arios S9 ha comprobado los efedoS beneftcos que los
microorganismos probiotico$ ejercen sobre la salud humana a facilitar la digestion
de lactosa estimular 18 actividad inmungica modificar ef balance poblecional
tanto de la microbiola intestinal nativa can posibles sfeelos patogenos como de
las que causan toxiinfeCCiones alimentarias edemas se estan ensayando como
implante en heridas de piel para evttar contamlnacion can microorganismos
patogenos
Los microorganismos probi6ticos se emplean en fa elaboraci6n de productos
fermentados en especial los lacteos Estas industrias se han limitado a utilizar
cultivos iniciadores importados que rsquieren tiampo y culdados para su
manlpulacion y empleo En Colombia no se han realizado InY9s1igaciones que
involucren cepas nativas can activldad probiotica ni el afecto de ingredientes
prebi6tico$ sabre fa viabilidad de estos microorganismos tenienqo en cuenta que
al prebiotico es un ingrediente allmentario que estimula sefectivamente el
crecimiento y actividad de algunas especies de microorganismos probi6ticos
En esta investigacion se sislaron microorganismos probi6ticos a partir de
muestras de vegetales y lache crud a de vaca fermentadas naturafmente y de
mucosa humana utifizando medios de cultivo salactivos bajo condiciones
12
anaerobias Luego se procedio a verificar su rasistencia a los acidos gastricos y
sales biliares simulando asl las condiciones del tracto gastrointestinal de 10$
humanos Las capas que presentaron mejor comportamiento ante estas pruebas
sa caraeterizaron morfologles y bioquimicamente y sa seleccione una de eHas
para inocular en bebidas lacteas sin y can avena como ingrediente prebiotico y
verificar su viabilidad durante al almacenamiento
Los resultados de esta investigacion padren sar de gran irnportanoia para la
industria nacional de alimentos las univarsJdades con facultades relacionadas
can la salud y la alimentaci6n y para las entidades gubernamentales involucradas
en la alimentacion y nutricion de grupos de poblacion vulnerables tales como eJ
Instituto de Bienestar Familiar y Bienestar Social entre otros
13
middot~
1 MARCO TEORICO Y ESTADO DeL ARTE
11 P~OBI6TICOS
111 Historia
EI consumo de productos fermentados lecteos con microorganismos vivos
especialmente bacterias acido lacticas ha sido reportado a 10 largo de la historia
desde tiempos remotos se evidencia al conoeimiento de los beneficios que estes
proporcionaban perc real mente quian enfatiz6 en ellos fua 91 cienUfico ruso Elie
Metctinikcff que reaclon6 la ingesti6n de (eches fermentadas con la longevidad y
salud de las personas ( Pardio et al 1996)
En 1965 sa utilizo por primera vez et termino Probi6tico derivado dellatin pro
que significa a favor de y del gr9go bios que quiera decir vida tnieialmente esta
palabra defini6 a los microorganismos que promovian el erecimiento de otros
microorganismos Ivego se splico asta termino a extraetos de tajido que estimlilan
el crecimiento micrObianqEn la actuaidad sa han definldo como probiotieos los
cultivos (micas 0 mezclados de microorganismos vivos qua al ser ingeridos por
humanos Q animales majoran el balance poblacional de la microbiota intestinal
evitando la adherencia de patogenos (Schrezenmeir et albull2001) Sin embargo
estos microorganismos no nece_iamenta son habitantes propios del tracto
14
gastrointestinal (Holzapfel at a2001Gaitan at al 1998) p~r 10 tanto es
necesario consumir alimantos en los que se encuElntren estos mrcroorganismos
viables estos hacen parte de I~micfobiota de vegetales y leches interviniendo en
Ie fermentaci6n natural de estos~ntos
112 Microorganismos Probi6ticos
los microorganismos probi6ticos que tradicionatmente se han adicionado a la
tache para fermentarla y obtener yogurt y kumis a como suplementos pertenecen
a los generos Lactobacillus Enterococcus y Bifidobacterium (Ver tabla Nro 1) Sin
embargo se considera que solo algunas especies de los gelnsros Lactobacillus y
Bifidobacterium sobreviven en el tracto gastrointestinal En la tabla 1 58 muestran
algunas de estas especies
TABLA 1 Algunas especies microbianas probi6ticas
Lactobacillus Sifidobacferium Enterococcus
L acidophilus
L JohnsoN
L casei
L rhamnosus
Lgrasseri
L reuten
L plantarum
B bifidum
Blongum
B infantis
E fsecium
E faecalis
Fuente Gaitan et a 1998A
15
EI eonoeimiento a cerea de sus efeetos beneficos en el consumidor por su alta
viabilidad en el intestino como la producci6n de sustancias con aetividad
antieaneerigena el mejoramiento ltfel sistema inmunol6gico y el deSplazamiento
de la mierobiota pat6gena gastrointestinal en el consumidor ha estimulado una
mayor demanda de estos microorganismos como tambian de los productos que
los contienen (Heller 2001 Parada middot1998)
Existsn otros produetos fermentados de origen vegetal como et tampe col acida
y salsa de soya de los euales sa pueden aislar estos organismos probi6tieos
comp tambien de la mucosa intestinat humana y luego de suministrarlos a
ratones sa han comprobado sus caracteristicas beneficas (Molin 2001)
113 Caracteristicas fenotfpicas de algunos microorganismos
probi6ticos
las bacterias aeido lacticas de los generos Lactobacillus y Bifidobacterium son
consideradas probi6tieos y tradicionalmente se han clasificado con base en Sus
propiedades morfol6gicas crecimiento a diferentes temperaturas capacidad
fermentadora de glucosa y otros carbbhidratos y la configuraci6n del Bcido Jaetieo
producido (Holzapfel etal2001)
16
)lli~ h Dx nIILIOTECM
eJDe~~ l1ilmfJ tIDBnm
Los Lactobacillus son bacilas gram positiv~s no esparuladas aerotalerantes
acido - tolarantes estrictamente fermentadares formadores de Boido laclica como
producto principal catalasa negativo carentes de citocroma sin embargo se
presentan excepciones a esta descripcion parque afgunas especies pueden
formar catalasa 0 citacramo en medios que contienen hematina 0 compuestos
relacianados La produccion de catalasa no hema pseudocatalasa puede causar
tambien alguna confusion en fa identificacion de algunos Lactobacillus
las especies del genera Bifidobacterium san bacilos gram positivos no
esporulados generafmente anaerabios estricto$ aunque pueden creeer bajo
condiciones microaer6filas cuando estan ert presencia de C02 La mayorfa de sus
especies se pueden diferenciar par criterios biaquimicos simples como la
fermentacion de L arabinosa DmiddotxiJasa O-manosa O-manita y O sorbitat que
pueden servir coma caracterist1cas clave para su clasificacion (Holzapfel
etal2001 )
114 Caracteristicas de los probi6ticos
Las cepas de microorganismos prabi6ticos deben presenter y mantener unas
caracteristlcas que garanticen su crecimienta y supervivencia En el alimenta
como tambiEm durante su transito a traves del est6maga e intestino delgaQo
17
La primera CBtacterfstica es que sean viables esta viabifidad esla capacidad que
tienen los microorganismos probi6ticos de permanecer vivos tanto ~n el alimento
como en el Intestino del consumidor por un tiempo determinado En Colombia se
ha establecido que en bebidas fermentadas este tiempo debe ser minimo de 21
dras en el alimento (Minsalud 1986) Esta vjabilidad depende del metodo de
produccion y de la cepa utilizada (Tuomols at a 2001)
Luego de que se garantice que estos microorganismos eslan viVos en el alimento
ell os deben cumplir otro criterio importanle para ser considerados como
organismos probi6ticos y as tblerar las condiciones de acidez a un pH=2 y la
sccian de proteasas del est6mago ademas de sobrevivir y creeer en presencia de
acidos biliares (Tuomola et al 2001 Jacobsen at a 1999) para luego de
sobrevivir a estas condiciones adherirse a la mucosa intestinal y de esta manera
estimular al sistemainmunoJ6gico esta capacidad de adherirse a la mucosa es un
prerrequisito para la colonizacion del intestlno (Toumola etal2001 Alander et aI
1999)
Cuando los probioticos han pasado todas esta pruebas de supervivencia y luego
de impfantados en la mucosa producen acidos organicos peroxido de hidrogeno y
tambien bacteriocinas que actUan como inhibidore$ del crecimiento de
microorganismos patogenos u oportunistas (Tuomola at al 2001 Cintas et al
2000) complementando de asta manera su accion benefica sobre la mucosa
intestinal y en general sobre la saJud del huesped
18
116 Berieficios de los microorganismos probi6ticos
Los beneficios que se asocian a los microorganismos probioticos son muchos y
variados Entre ros comprobados mediante estudios se eneuentran
1151 Facilitar la digesti6n de la lactosa
los microorganismos probioticos cuando estan en el intestino liberan alii la
enzima pmiddotgalaotosidasa capaz de hidrolizar la lactosa haste glucosa y galactosa
evitando as que personas intolerantes a este carbohidrato presenten sfntomas
como flatulencia dolor abdominal y diarrea cuando consumen leche (be Vresse
et 81 2001)
1152 Protegen contra enfermedades gastrointesUnales
EI consumo de aJimentos con probioticos ha mostrado efeeto terapeutico frente a
los sintomas de diarrea asociada al surninistro de antibi6tico$ de amplio espectro
que destruye 0 disminuye la microbiota endogena esta imp ide la coJonizacion de
bacterias patogenas como Klebsiella oxytoca y Clostridium difficile que pueden
causer lesiones en el cn Los probi6ticos recuperan el balance de la microbiota
intestinal nativa y avitan Ie adhesion de algunos virus bacterias pat6genas a
parasitos que pueden ser agentes causales de gastroenteritis la diarrea del
19
J
viajero y 1(3 inflarnacion intestinal que en ultima instaneia oeasionan ef sfndrome
del colon irritable (Marteu et al 2001)
1153 Protegen contra infecciones del tracto urogenital
La vaginitis indueida por baeteriss yo por levaduras as una infecci6n
estrechamente relacionada con la exposici6n a antibi6ticos y espermicidas y
tambien depende del estado hormonal de la n1ujar Con al uso de mezcJas de
probi6ticos se han obtenido buenos resultados en la rastauraci6n de la rnicrobiota
natural urogenital benefica que desplaza a los eausantes de la inflamaci6n de Is
vagina y Ie uretra (Reid 2001 )
1154 Promueven la barrera de defensa end6gena del intestino
EI tracto gastrointestinal normal mente as una barrera natural contra anUgenos de
origen microbiano y alimentario Cuando los probi6ticos sa adhieren a Is mucosa
intestinal estimulan 0 potencian al sistema inmune favoreciendo la
inmunomodulaci6n que induce un aumentb de fa producci6n de inmunoglobulinas
activacion de las calulas mononueleares y de los linfocitos para proteger al
huesped de infeeciones (Isoulari et sl 2001)
20
1155 Protegen contra cancer de colon
EI cancer es el resultado de una serie de mutaciones somaticas que pueden
ocurrir durante al tiempo de vida del individuo y 10 padeca buena parte de la
poblacion mundial los probi6ticos en un sistema in vitro han demostrado un
efecto positivo en la prevenci6n de mutaciones aI desactivar carcin6genos
genotoxicos (Wolloswski et al J 2001)
1156 Protegen contra infecciones respiratorias
Sa ha demostrado que el conslJlno de probi6ticos disrninuye la incidencia de
infecqiones raspiretorias al aumentar la actividad fagocitica de maer6fagos
alveolares que aettian sobre microorganismos patogenos Se hizo un estudio en
571 ninos sanos con edades entre uno y seis anos divididos en dos grupos a uno
de ellos sa las incluy6 en su dieta leche suplementada can Lactobacillus GG y a
los otros ninos leche no suplementada AI final del estudio se observ6 una
disminucion del 19 en la incidencia de infeccionas respiratorias tratadas con
antibi6ticos tales como otitis media sinusitis bronquitis y neumonfas en el grupo
de los ninos que consumieron Lactobacillus GG (Hatakka et al 2001)
Alvarez et al (2001) encontraron que la administraci6n de yogurt con Lactobacillus
casei en ratones de tres arios de edad majora los espacios libres del puJrn6n de
la presencia de Pseudomona aeruginos8 induciendo un aumento
21
significativo en los niveles de gA a IgM datactadas en los lavados
broncoaJveolares y se observ~ un afecta dependiente de la dosis
1157 En el tratamientoy prevenci6n del eczema
Se ha encontrado que el consumo de probi6ticos mejora la inflamaci6n alergica 0
eczema at6pico en ninos alimentados con formula suplementada con probi6ticos
Encontraron una mejora significativa al suministrar Bifidobacteriummiddot actis y
Lactobacillus GG en 27 niiios con edad promedio de 46 meses Luego de aplicar
este tratamiento se sometieron a una prueha de SCORAD (mide fa extension y
gravedad del eczema) registrando una meJoria significatlva en las condiciones de
la pie concentraci6n de citoquinas cirClllantes an sueto y moleculas de adhesi6n
a las superficies de las celulas soJubles en suero (Isolari 2000)
Se realizaron otros estudios a 159 mujeres embarazadas con historia familiar de
eczema atopico de primer grado a las cuafes sa res 5uministro dosis diarias de
Lactobacillus GG durante 2 a 4 samanas previas al parto Oespues de ella fa
madres twiaron la opci6n de continuer tomando el ptobi6tico si amamantaban 0
bien darseio vIa oral La mayoria de las madras eJigieron dar las dosis at bebe
diariamente A los dos anos de vida se observ6 una disminuci6n del 50 en la
frecuencia del eczema at6pico en aquellos nHies que se les dio ef probi6tico
(Kalliomari etal 2001)
22
1158 Previenen infeccion en heridas quirurgicas
Los probi6ticos impiden la union de pat6genos a las superficies celulares en
heridas mediante la seCreci6n de proteinas Actuamente se encuentra en
estudio la aplicaci6n del Lactobacillus fermentum vivos sabre heridas en piel de
ratas y se ha encontrado una disminuci6n del 90 en la colonizaci6n par parte del
StaphylococcuS aureus uno de los patogenos mas temidos y de mayor lncidencia
en infecciones hospital arias mas aun se esta contempiando la posibilidad de
utilizar la protein a purificada an lugar de los mjcroorganismos para la protaccion
contra infecciones en heridas (Strauss 2000)
12 PREBIOTICOS
Son carbohidratos de cadena corta algunas veces reconocidQs como
oligosacaridos no digeribles par las enzimas del epitelio intestinal 0 de las
gliJnduJas anexas debido a su estructura quimica y de esta manera lIegan al
intestino grueso donde alcanzan a estar disponibles para la fermentaci6n por las
bacierias sacaroHticas que son especial mente laetobadlos y bifidobacterias
dando odgen a compuestos que ejercen efectos funcionales sobre la mucosa del
tubo digestivo (Brunser 2001)
Se consideran como tal algunos fructocligosacaridos isomaltooligosacariclos
oligomato palatinosa poHdextrosa pOJidextrrna raftilina y algunos oligosacaridos
23
)
de 1a soya y fa avena Estenmiddot presentes en alimentos como Ie cebolla ajo
banano puerros 1 derivados del trigo achicoria esparrago alcachofa (Cummings
etal 2001)
Algunos de estos prebi6ticos cuanda son incorporado$ a fa dieta en cantidades
dalerminadas alteran la microbiota intestinal disminuyendo los recuentos de
coliformes bacteroides y cocos y aumentando las bifidobacterias hasta en diez
veces ademas modifican la actividad metab6lica del coron logrando una
disminuci6n del pH y un incremento en el contenido fecal de acidos grasos de
cadena corta como at acatica propi6nico y butfrico El butirato aumen~ _I grosor
de la pared del coron e intestino delgado estimula eJ crecimiento de la mucosa del
colon y auManta su flujo sangufneo inhibe el crecimiento de tinsas tumorales
epiteliales de origen co16nico induce la diferenciaci6n de sus celulas y a
apoptosis entre otros(Brunsar 2001)
Eh estudios hechos en simuladores del intestino humano utilizando productos de
avena fermentados se encontro que estimularon al crecimiento tanto de
lactobacios como de bifidobacterias y en el caso de estas ultimas se incremento
la producci6n de los acidos acatico propionico y butfrico 10 que incide sobre la
implantacion de probi6tico$ e inhibe al crecimientos de otro tipo de
microorganismos (Alal1der eta1999 Kontula etal 1998 Jaskari etal 1998)
24
~ -1
(
AI comparar el comportamianto de las leches de diferente origen se ha
demostrado que Ie leche de vaca contiene caseinatos sustancias que forman
buffer ~n et intestino e inlpiden que los probi6ticos disminlJyen el pH del intestina
y de esta manera se impide al efecto deseado que es evitar fa proliferaci6n de
otros microorganismos entre los cuates pueden estar algunos patOganos En la
leche materna sa encuentran algunos carbohidratos como glucosa galactosa n
acetilglucosamina y algunos 0lig6meros de Ie fucosa en cOhoontracionesmiddot
importantes los cualeS favoreceh el crecimientc)middot de probi6ticos esto
complementado can 91 bajo contenido de protenas que se traduce en una
reducida capacidad buffer hacen de Ie lache materna IJn alimentd adecuado para
nllios en su etape de lactancia
Algunos prebi6ticos como 1a lactulosa yciertos compuestos que contiansn fructosa
no son digeridos en el intestino humano y pueden sar utilizados selectivamenta
par los probi6ticos 10 que hace que los probi6ticos en combinaci6n can prebi6ticos
pueden lIegar a ser un importante medio para prevenir algunas enfermedades del
tracto gastrointestinal (Bezkorovainy 2001)
25
2 METODOlOGfA
21 LOCALIZACION
EJ trabajo sa realizo en el laboratorio de Microbiologia y la planta da laches de Ja
Universidad Naclonal de Colombia- Secie Medellin
En al laboratorio se hiZQ al aislamiento a identificaci6n de fa capas y en fa Planta
sa eJaboro la leche fermentada con 1a cepa seleccionada y el prebi6trco
22 METODOS
221 Aisiamiento de cepas nativas
Las cepas nativas se sislaran de producto$ vegetales leches fermentadas y
mucosa vaginal humana
2211 De vegetales
Las muestras vegetales de repollo repollitas de brusefas y pepino se
seleccionaron porcionaron y mezclaron can cloruro de sadio al 10 pIp se
calacaron en un recipienta de vidrio balo anaerobiosis y sa dejarQn por 15 dias
26
luego S9 tomaron 3 ml de cada muestra y se jnocularon 9 ml de caldo MRS (Man
Rogosa and Sharpe) se incubaron a 37deg C durante cinco dias en camara de
anaerobiosis (Ver Figura 1) Oespues de este tiempo sa inocularon cajas de petri
con agar MRS con 1 ml del cultivo microbiano y se incubaron bajo las mismas
condiciones que eJ caldo Este procedirniento se realiz6 rapetidas veces hasta
seleccionar la cepa pura mediante observaci6n de caracteristicas morfologicas de
la cOlonia y a cada colonia se Ie practico la coloracion de gram con el fin de
observar las caracteristicas microscopicas de cada una e identificar las de mayor
similitud a los Lactobacilos y Bifidobacterias
Figura 1 Camara de anaerobiosis
27
2212 De la leche
Sa tomo 200 ml de teche cruda de la planta de leches y se colaca a fermentar
baja anaerobiosis durante 15 dras Luego sa procedia como en los vegetales
2213 De mucosa vaginal humana
Se tomo una muestra de frotis de mucosa vaginal humane can capito esteril sa
puso a ncubar en Caldo MRS y se procedi6 camo en 2211 y 2212 A cads
aislado sa Ie practico la coloracion de gram y sa seleccionaron aquellas que eran
bacilos gram positivos (Ver Tabla 2)
28
TABLA 2 Fuente de aislarniento de cepas nativas
CEPA FUENTE
1 Pepino fermentadQ
2 repollitas de bruselas fermentadas
3 Repolltgt fermentado
4 Repollo fermentado
5 Mucosa va~inal humana
6 Mucosa vaginal humana
7 repollitas de bruselas fermentadas
8 Repollo fermentado
9 repollitas de bruselas fermentadas
10 Mueo~a vaginal humana
11 Repollo fermentado
12 RepolJo fermentado
13 Leche fermentada
14 Mucosa vaginal humana
15 repollitas de bruselas fermentadas
16 Repollb fermentado
29
222 Almacenamiento de las cepas aisladas
Cuando las cepas crecieron en agar MRS homogEmeas en color morfologia
coloraci6n de Gram etc se pssaron a agar inclinado en tuba se cubrieron con
aceite mineral y se guardaran en refrigeraci6n a 4deg C para tomar de alii la cepa y
efectuarle las diferentes pruebas para confirmar el genera y determinar la especie
de cada una de eas (Ver Figura 2)
Figura 2 Cepas en tubos con agar inclinado
30
223 Pruebas para determinar et genero
2231 Coforaci6n de Gram
A cada cepa sospechosa de Lactobacilos se 1e hizo la coloraci6n de gram y se
seleccionaron las gram positivas
2232 Morfologfa
En agar MRS y despues de incubar en anaerobios~s crecian colonias grandes
cremosas de color beige con bordes homogeneos y c6ncavas(Ver Figura 3)
Figura 3 Colonias aisladas en agar MRS
31
2233 Prueba de esporulaci6n
A cada cepa aislada se Ie hizo esta prueba la cuel consistia en incubar en
aerobiosis durante ocho dias las cajas de agar MRS donde crecieron colonias de
Lactobacilo$ y luego se les (ealize) coloraci6n de espora Las capas que dieron
negativa a la prueba de espora se considararort sospechosas de sar Lactobacilos
y se continuo con la prueba de la catalasa (Ver Tabla 3)
2234 Prueba de la catalasa
los lactobacilos carecen de catalasa Eata prueba se hizo tomando una colonis
se deposito en vidrio de reloj y se Ie adicion6 dos gotas de peroxida de hidr6geno
(H202) la que no presentaba efervescencie eran cepe sospechosa de ser
Lactobacilo (Ver Tabla 4
Sa seleccionaron las capas euyo resultado fue aeorde con el genera Lactobacilfu$
y se continuo con la comirmaeion del genera y determinacion de la eSpecie
meqiante las pruebas bioqulmicas
32
224 Prueba para determlnar la especie
Para confirmar el genero y determinar la especie de las diferentes capas aisladas
se hizo una caracterizaci6n bioqufmica utilizando un kit de API 50 CHL Medium
Ref 50 410 que contiene una galed8 de medios que permite realizar el estudio
de fermentaci6n de los 49 azucares de 52 especies de Lactobacillus (Ver Figura 4
y tabla 5)
Figura 4 API CHL 50-Prueba bioquimica
33
225 Pruebas para determinar microorganismos probi6ticos
2251 Resistencia a pH=2 y sales biliares de concentraci6n O3pv
A las cepas idantificades como Lactobacillus brevis y Lactobacillus pantarum sa
las realiz6 Ie prueba dfl resistencia a pH=2 y sales biliares de concentraci6n 03
pv ( Jacobsen et al 1999) Una colonia de cada cepe aislada se inocul6 en 4 mt
de caldo MRS durante cinco dras bajo condiciones de anaerobiosis Oespues de
esta tiempo se dejaron pracipltar los microorganismos por sedimentaci6n se Ie
retire el sobrenadante y al precipitado se Ie adicion6 Sml de caldo MRS
previamente ajustado a pH=2 can seido clorhfdrico (HCI) dentro del mismo tuba de
ensayo G igual sa hizo can otro tubo previamente incubado pero a este se Ie
adiciono 5ml de caldo MRS con sales biliares a una concentra~i6n de 03 plv y
ambos se incuberon a 37deg C por 2 haras Sa midio 01 mi de cada uno de los
tubas al tiempo 0 y a las 2 horas y sa inoculeron en superficie en caJas de petri
con agar MRS S9 incubaron a 37deg C bajo anaerobiosis durante 48 horas Se
compararon visualrrente en cada caja de petri el crecimiento en superficie y las
que presentaron crecimiento en tos dos tiempos (0 y 2 horas) tanto en at media
acido como en sales I se consideraron resistentes a pH=2 y sales biliares (03
pv)
(Ver Tabla 6)
34
226 Conservacion
Todas fas capas que habian dado positiva Jas pruebas anteriores y que reaultaron
resistentes a pH=2 y sales biliares 03 pv y despues de identificadas en API 50
CHL sa repicaron en agar MRS en tuba inclinado y despues de Incubar a 37deg C
por 48 horas bajo anaerobiosis se Ctlbrie el biser completamente can aceite
mineral esteril y sa guardaron en refrigeraci6n
227 Elaboracj6n de fa bebida fermentada
2271 Preparaci6n de la mue$tra
Sa tome 1 mt de caldo MRS previamante inoculado e incubado que presentaba
una concentracion de Lactobacillus brevis de 27x108 Iml segun la escaJa de Mac
Farlan y sa adiciono a 9ml de leche pasteurizada en un tubo sa dej6 incubanda
en anaerobiosis por 48 hores Luego se pasaron estos 10 ml a un frasco qua
cont~nie 90 ml de leche pasterizada y se dej6 incubando par 48 haras en
anaerobiosis
35
2272 Adici6n del inOculo
A 900ml de leche pasteurizada se Ie adicion61os 100 ml de leche que habia sido
previamente ino(ulada dos veces con la cepa posteriormente se deja
fermantando la lache a temperatura de 37deg C
2273 Control de Ja fermentaci6n
Las muestras se hicieron por cuadruplicado y se les hizo un seguimiento de
aoidez hasta un valor entre 04 y 05 expresada como Bcido lactico esta
procedimiento corresponde a la babida fermentada sin prebi6tico La bebida ~on
prebi6tico tiene al mismo proeedirnianto pero adicionalmente se agrag6 avena a
una concentraci6n de 05 en el momento de la adici6n del in6e410 a los 900 ml
de leehe pasteurlzada y el procedimiento sigui6 igual al de la bebida sin prebi6tico
tambien se hizo por cuadruplicado
2274 Refrigeracl6n
Despues que las mezclas con y sin prebiotico alcanzaron el de acidez
requarido se IIeva ron a refrigeraci6n a una temperatura de 4deg C p~r 24 horas
para frenar proce~os metab6licos de los microorganisrtlos Despues de este
ti~mpo se procedi6 al batido
36
1 2275 Batido
Con un agitador se procedi6 a batir las bebidas para romper et coagulo formado
y de esta manera homogeneizar la mazela y obtener asf la bebida fermentada
2276 Envasado y almacenamiento
Ambas bebidas se envasaron en frascos vidrio para hacerles seguimiento de pH
acidez(expresado como acido tacticol y recuento de Lactobacillus breviSf los
dies 27 14 Y 21 despues de elaboradas las bebidas perfodo durante el cualta
muestra permanecfa afmacenada a temperatura de refrigeracion(Ver Figura 5
37
Fjgura 5 Diagrama de Flujo
PREPARACION DE LA MUESTRA
ADICION DEL INOCULO
~_____~_B~ATIDO~______~
INCUBACION 37deg C hasta acidez = 04-05 acido laotico
ENFRIAMIENTO
hasta 4 0 C ~------~ ~------~
ENVASADO Y ALMACENAMJENTO
dUrante 21 dfas a Temperatura 4 0 C
38
1
228 Determinaci6n del pH
Se determino por el metoda potenciometrico en un pH-metro manual durante los
dias 2) 7 14 Y 21 de las bebidas lacteas sin y con prebi6tica (Ver Tablas 7 y 8)
229 Oeterminaci6n de la acidez (Expresadfl como acido
lactica)
Se tomaron 9 mJ de las bebida~ sa Ie adicionaron 2 gotas de fanoftaleina como
indicador y sa titulo fa acidez con NaOH 01 N hasta la aparicion de un cotor rosado
debit EI volumen de NaOH utilizado se reporta como valor de de acidez
(VerTablas 10 y 11)
2210 Prueba de viabilidad
Qurante el perfoda de almacenamiento de la bebida lactea se procedi6 a hacer la
prueba de viabiHdad en los dias 7 14 Y 21 para determinar Si los lactobacilfus
permanecfan vivOs a una concentraci6n minima de 106 hasta el dia 21 como 10
establece eJ Articulo 10 de la Rasolucion 2310 del Ministerio de $alud de
Colombja
39
Para asta prueba se tamaron 10 rnl de muestra y se adicionaron a 90 ml de caldo
MRS ruego a partir de esta se hicieron diluciones de 10-2 hasta 10-11 de las
diluciones 109101deg 10-11 se inocul6 1 ml de cada uno en agar MRS siguiendo el
metodo de siembra en profundidad y por duplicado e incubando a 370 C x 5 dras
en anaerobiosis y luego se hicieron tos recuentos por duplicado para esi reportar
los recuentos promedio (Ver Tablas 13 y 14)
2211 AniUisls microbiol6glco de las bebidas Iicteas(con y sin
avena)
Con el fin de determinar las condiciones higienico-sanitarias del producto se
realizaron las pruebas microbiol6gicas de Recuento de mohos y fevadurasml en
agar OGY Recuento en superficia de Staphylococcus coagulasa positivoml en
agar Baird Parker Numero Mas Probable (NMP) de coUfor-mes totales y
Escherichia coliml en caldo Fluorocult y Presencia de Salmonela25ml con BHI
caldo tetrationato y agar Hecktoen (Montoya 1999)
(Var tabla 16)
2212 AnaUsis estadistico
A los datos obtenidos en la medici6n de pH acidez (expresada como Beido
laclico) en los dras 2714 Y 21 y el recuento de Lactobacillus en los dras 714 y21
40
realizados a los dos tratamlentos se tes aplic6 1a prueba t porque solo difieren
en la presencia 0 ausencia del prebi6tico para evaluar si habra diferencia
estadfsticamente significativa para los dos tratamientbs(Ver Tablas9 12 y 15)
41
3 RESULTADOS Y DISCUSION
31 Coloraci6n de Gram y morfologfa
Las cepas aisladas fesultaron Gram positivas (Ver Figura 6) colonias grandes
cremosas dE) color beige con bordes homogeneos y c6ncavos en su
morfologia (Ver Figura 3) resultando de acuerdo a 10 especificado en Stanley
1989 para Lactobacillus
32 Prueba de esporulaci6n y cataJasa
Los resultados de la pruebas de esporulaci6n y catalasa indicados en las
Tablas 3 y 4 respeclivamente dieron conforme a 10 especificado en Stanley
1989 para Lactobacillus
42
1
2 3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
TABLA 3 Resultado de prueba de esporuJaci6n
CEPA RESULfADO ESPORULACION
-- -------------
43
l i ~II bull ~ I I
TABLA 4 Resultado prueba de la catalasa
CEPA RESULTADO CATALASA
1 -2 -3 -4 -5 -6 -7 8 -9 -10 -11 12 -13 -14 -15 -16
3~3 Prueba para determinar la especie
Oespues de hacer las pruebas para seleccionar las cepas sospechosas de ser
Lactobacillus se realizo las pruebas bioquimicas fograndose identificar
Lactobacillus plantarum aislctdo de pepino repollo y repollitas de bruselas
44
fermentados y Lactobacillus brevis de mucosa vaginal y leche fermentada (Ver
Anexos del A al E y Tabla 5)
TABLA 5 Resultado identlficaci6n cepa~
CEPA NOMBRE
1 Lactobacillus planfarum
3 Lactobacillus plantarum
5 Lactobacillus brevis
13 Lactobacillus brevis
15 Lactobacillus plantarum
34 Pruebas para determinar microorganismos probi6ticos
las cepas de Lactobacillus brevis y Lactobacillus plantarum mostraron
rasistencia al medio acido de pH =2 Y sales biliares 03 pv resultado similar al
encontrado por Jacobsen et al 1999 para Lactobacillus plantarum (Ver tabla 6)
45
middot
~~~ttiI lltlmiddot~COX~dtJ ~xtc_~ 2 tr~ k-JlL~middot
-)~~TO DE lJIBUOTECUl rjRL]OTtCA twn GO1IU1
TABLA 6 Resultados a pruebas de resistencia a pH=2 y sales biliares 03 plv
CEPA RESISTENCIA pH=2 RESISTENCfA A SALES BIUARES ()3 pv
1 + +
2 + +
3 + +
4 + +
5 +
6 + +
7 + +
8 + +
9 + +
10 + +
11 + +
12 + +
13 + +
14 +1shy +M
15 + +
16 + +
+1 crecimiento debil
+ crecimiento abundante
46
Figura 6 Lactobacillus brevis Gram + aislado de leche fermentada
Ai observar en placa las celulas de lactobacilos despues de real1zar las pruebas
de resistenCia a la acidez y sales biliares se observo una tendencia a aglomerarse
posiblemente como un mecanismo de proteccion cOlitra estos medios que pueden
lIegar a ser adversos para elias (Ver figuras 7 y 8)
47
Figura 7 Lactobacillus brevis aislada de leche fermentada despu~s de la prueba de resistencia a pH=2
Figura 8 Lactobacillus brevis aislada de leche fermentada despues de la prueba de resistencie asales biUares 03 plv
fI
48
35 --Seguimiento del-pH-en-la-bebidaJacteacon y sin -prebi6tico
A continuacion se muestran las Tablas 7 y 8 donde sa registian los datos
recopilados de pHdurante 10$ dras Z 7 14 Y21 para las bebidas laaeas con ysin
prebi6tioo
TABLA 1 ResultadopH yogur sin avena
Dia Repetition 1 Repetici6n 2 Repeticion 3 Repetici6n 4
2 526 501 51 52
7 446 433 438 44
14 439 435 437 436
21 439 437 438 437
TABLA 8 -ResultadopHyogur con avena
Dia Repeticion 1 Repeticion2 Repeticion 3 - Repeticion 4
2 509 523 51 515
7 447 442 445 442
14 436 -438 439 437
21 432 433 435 434
Observando la Figura 9podamos ver que el pH en el -dfado$ para los dos
tratamientos as igual y empieza a descender rapidamente para estabilizarse a
partir del dra 7(Ver figura 9)
49
Figura 9 Comparacj6n de medias para -el pH
Comparaci6n de medias para pH
55 ~ 5 +----=gtIIIi-~i~~----=-r--it~ -- pH sin avena
a 45 1--~~~~=~~ 4 --- pH con
avena35 t-----r-- -------=------=--= ------- - ----
2 7 14 21
Dias
Aplicando la prueba t para comparar las medias de pH I S6 muestia una diferencia
altamants significativa en los dos tratamientos para el dia 21 (pltO05)
(Ver tabla 9)
TABLA 9 Compaiaci6n de medias para pH
DtAS SIN AVENA CON AVENA te p (VALOR)
2 514 514 0 10
7 439 444 -1 61 0159
14 437 I
438 -070 0510
21 438 433 528 00019 shy
- DiFERENCIA AlTAMENTE SIGNIFICATIVA
50
I
AI aplicar regrasi6n a los datos sa obtiene al modelo estimado
pHSinAyena =535606 - 01505650Ia +0005044340IaI2
La variabilidad en la respuesta de pH asta siendo explicada en un 8S7522 por
el modelo (Ver Anexo F)
EI tratamiento con avena mostro el siguiente modelo al analisis de ragresi6n
pHConAvena =534463 ~ 0140407Dia + 0004480980Ia2
La variabilidad an la respuesta de pH asta siendo explicada en un 903315 par
el nlodelo(Ver anexo G)
36 Seguimiento de la acidezmiddotmiddot expresada comomiddot de acido
lactico
A continuaci6n sa muestran las Tablas 10 y 11 donde sa registran los datos
tecopilados de acidezmiddotdurante los dias 27 14 Y 21 para las pebidas taetees con y
sin prebi6tico
TABLA 10 Resuttadode acidez (expresadocomo acido tactico) yogurt sin avena
CIA R~petici6n1 Repeticion2 Repetici6n 3 Repeticion 4
2 054 06 057 058
7 072 074 073 0]2
14 080 083 082 082
21 0]4 079 078 077
51
TABLA 11 Resultado de aCidez (expresado como acido Icktico) yogurt con avena
Dia Repetici6n 1 RepetiCi6n 2 Repetici6n 3 Repetici9n 4
2 059 055 058 057
7 071 073 072 072
14 089 087 088 086
21 092 091 090 091
Observando la Figura 10 se puede concluir que la acidez empieza a aumentar
hasta el dia 14 y luego trata de estabilizarse para los dos tratamientos
(Ver figura 10)
Figura 10 Comparaci6n de medias para la acidez
N G)
Comparacion de medias para acidez
1
2 0I 5 -+--=--------=-~~~= u
ltC
- Acidez sin avena
2 7 14
Dias
52
21
-it- Acidez con avena
Aplicando la prueba t para camparar las madias de acidez se muestra una
diferencia altarnante significativa en los dos tratamiantos para los dias 14 y 21
(pltO05)
(Var tabla 12)
TABLA 12Comparaci6n de medias para Acidez
DIASmiddot SIN AVENA CON AVENA te p(VALOR)
2 0572 0572 0 10
7 0727 0720 119 0278
14 0818 0875 -638 000070shy
21 077 091 -1212 i 0000019 shy
DIFERENCIA AL TAMENTE SlGNIFICATIVA
AI aplicar r~gresi6n a los datos se obtiene el modelo estimado
AcidezSlnAIena = 0491897 + O0436032Dia O00144613DfaA2
La variabilidad en la respuesta de acidez asta siendoexplicada en un 970978
por al modelo (Ver anexo H)
EI tratamiento con avena mostro elsiguiente modeloj a1 analisis de regresion
AcidezConAvena = 0491638 + 00406572Oia - OQOO982559OiaA2
La variabilidad enla respuesta acidez esta siendo explicadaen un 99212 por
el modelo (Ver anexo J)
53
I ~
37 Prueba de viabiJidad
A continuaci6n sa muestran las Tab~as 13 y 14 donde sa presentan los datos
recopilados del recuento de Lactobacilos durante los dias 7 14 Y 21 para las
bebidas lacteas con y sin prebi6tico
TABLA 13 Recuento de Lactobacilos (UFCml) yogurt sin avena
Dia Repetici6n 1 Repetici6n 2 Repeticion 3 Reptttici6n 4
7 1880X10l1 1454X1011 1642X1011 1780X10~
14 1560X10~ 646X1011J 1890X10l 140X10l1
21 1200x10lu 128Ox10u 1745x10J 1520x101V
TABLA 14 Recuento de Lactobacilos (UFCml) yogurt con avena
Dfa Repetieion 1 Repetici6n 2 Repeticion 3 Repeticf6n 4
7 1600X10lt 1240X10t 1640X10ll 1980X10t
14 540X1011 427X10n 546X10n 720X10ll
21 500x1011 492x1011 712)(1011 980x10~
AI analizar la Figura 11 sa puede observar un recuento mayor de Lactobacilos
en al tratamiento con avena resultado de acuerdo a 10 encontrado por Alander at
aI 1999 Kontula et aI 1998 y Jaskari et aI 1998
54
Figura 11 Comparaci6n de medias para Log Lactobacillus
Comparacion de medias para log Lactobacillus
~ 1350
-+- Sac Sin--() 13 co avenaIII
bull 125 -- Bac con 0)
0 12 avenaJ
115 7 14 21
Dias
Aplicando la prueba t para comparar las medias de recuento de Lactobacillus no
se encontr6 una diferenc1a estadfsUcamente significative entre los dos
tratamientos (Ver tabla 15)
Este aumento en al racuento influy6 en la disminuci6n del pH y en el aumento de
fa aeidez por la fermentacion que realizan los Lactobacillus sobre fa lactosa de la
lache y la avena adicionada como prebi6tico
55
1
TABLA 15 Comparaci6n medias lag Lactobacillus
DIAS SIN AVENA CON AVENA tc p(VALOR)
7 122257 122022 04846 06451
14 121065 132393 -19602 00977
21 129025 133087 -08236 04416
At aplicar regresion a los datos se obtiane al modelo astimado
LactobacillusSinAvena= 117347 + 004834640Ia
La variabilidad en la respuesta del recuento de LactobaCillus ssta siendo
explicada en un 260054 por el mod$loVar anexo J)
EI tratamiento con avena mostr6 al siguiente modalo al anal isis de regresion
Lactobacillu$ConAvena =118103 + 007903040Ias
La variabilidad en la respuesta de recuento esta siendo explicada en un 3068
por al modelo(Ver anexo K)~
38 Analisi$ microbiol6gicos de las bebidas lacteas con y sin
En la Tabla 16 estan recopilados los resultados microbiol6gieos obtenidos en ras
muestras con los dos tratamientos (con y sin avena)
I [
sa
TABLA 16 Resultados analisis microbiologico
Recuento de mohos y levaduras Iml lt10
Recuento de Staphylococcus coagulase positiva Iml lt100
NMP coliformes fotales y Escherichia coli Iml lt3
Presencia de Salmonella25ml Ausente
Los resultados de este analisis demuestran que las bebidas fermentadas con y
sin avena~ astan fibres de microorganismos patogenos
57
1
4 CONCLUSIONES
Se aislaron cepas nativas de Lactobacillus plantarum de las muestras vegetates
de repollo pepino repollitas de bruselas fermentadas y Lactobacillus brevis de
lache fermentada y mucosa vaginal humana Ambas cepas resistieran un pH=2 y
una concentraci6n de sales biliares det 03 ptv dos earacteristicas importantes
en los probi6ticos
Lamiddot cepa de Lactobacillus brevis aislada de lache Sa utiliz6 para elaborar una
bebida fermentada sin y con avana comoingrediente prebiotico obteniendose un
aJimento centon recuento del probi6tico viable durante 21 dras de seguimiento
ademas libre de microorganismos )at6gen05
No se encontr6 efecta significativo de la avena sobre Ie viabilidad del Lactobacillus
brevis aunque sa presento un aumento en 61 recuento de estos en la bebida con
avena
58
plusmn ~
5 RECOMENDACIONES
Ensayar la cepa de Lactobacillus plantartJm en productos carnicos madurados
como el salami
Ensayar la cepa de Lactobacillus l)revs en otros derivados lecteos como queso
quesito queso crema
Continuar con el estudio de estos microorganismos y caracterizarlos
molecularmente ademas de estudiar su capacidad de adherencja a fa mucosa
intestinal sobre algunes Hneas celulares como las CaCo~2
Estudiarel efedo de la avena sabre la viabiJidad del Lactobacillus breyis a una
concentraci6n mayor de 05
Realizer ensayos can las cepas de Lactobacillus brevis y Lactobrlcillus pJantarum
para elaborar masas acidas para panificacion reemplazando el Bromato de
Potasio aditivo prohibido desde marzo del 2003 en nuestro pais per 5U toxicidad
59
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65
ANEXOS
66
ANEXO A RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AlSLADA DE i
PEPINO it
Referencia Pepino 1 Fecha 06122002
IEXCELENTE IDENTIFICACION
Latto plantarum 1
Galeria API 50 CHL V50 Leida el 06122002
Perfil - -- - ++ - -- - ++++ - - -+- + - I I I I I I I I +t+ - +f- ~ - - + + ~ - - - +- + - shy
o - GLY - ERY DARA - LARA + RIB + DXYL - LXYL - ADO - MDX - GAL + GLU + FRU + MNE + SBE - RHA - DUL - INO bull MAN + SOR - MDM + MUG shyNAG + AMY + ARB + ESC + SAL + CEL + MAL + LAC + MEL + SAC + TRE + 1NU - MLZ + RAF + AMD - GLYG - XLT - GEN + TIJR + LYX - TAG - DFUC shyLFUC - DARL + LARL - aNT + 2KG - 5KG shy
--- Taxones significativos rd -----T -- Tests en contra
Lactoplantarum 1 999 092 1
Taxon siguiente Lactobrevis 1 OJ 044 3
i i
Lactoplantarum 1 1 test (5) en contra
D-SORBITOL (SOR) 78
Tax6n siguiente Lactobrevis 1 3 test (s) ert contra
METHYLD-MANNOSIDE (MOlM) 0 MELEZITOSE (MLZ) 14 D-TURANOSE (TUR) 14
67
ampb
ANEXO B RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AISLADA DE REPOLLO FERMENTADO
~
Referencia Repollo fermentado - 3 Fecha 03072003
EXCELENTE IDENTIFICACION
Lactoplantarum 1
Galena API 50 CRL V50 Leida el 03072003
Perfil - - ++ - - - - -H++ - - ~ + - + - I I 1 I I I I -H+ - ++ - - - + + - -- - - + - shy
o - GLY - ERY - DARA - LARA + RIB + DXYL - LXYL - ADO ~ MDX - GAL + GLU + FRU + MNE + SBE ~ RHA - DUL - INO - MAN + SOR - MDM + MDG shyNAG + AMY + ARR + ESC + SAT + CRL + MAL + LAC + MEL + SAC + TRE + lNU - MLZ + RAF + AMI) - GLYG - XLT - GEN + TOR + LYX - TAG - DFUC shyLFUC - DARL - LARL - GNT + 2KG - 5KG shy
------Taxones significativos _ _----- Id--- ---T---- Tests en contra
Lactoplantarum 1 999 095 1
Tax6n siguiente Lactobrevis 1 01 OA8 3
lJactoplantaru01 1 1 test (s) en contra
DSORBITOL (SOR) 78
Taxon siguiente Lactobrevis
METHYL-D-MANNOSIDE D-TURANOSE
1
(MOM) (TOR)
3 test (5) en contra
0 MELEZITOSE 14
(MLZ) 14
i
I
68
ANEXO C RESULTADO PRUEBAS BIOQUWICAS DE CEPA AISLADA DE MUCOSA HUMANA
Referenda Mucosa - 5 Fecha 27012003
BUENA IDENTlFICACION
Galeria API 50 CHL vso Leida el 270112003
Perfil - - - - +t--t - - - + - + - - - - - - - - -+- - - - - + - + - - - - - - - - - - - - - bull - - -+ - +
o - GLY ~ ERY - DARA bull LARA + RID + DXYL + LXYL - ADO bull MDX - GAL + OLU - FRU + MNE - SBE - IlliA - DUL - INa - MAN - SOR - MDM - MOO shyNAG + AMY - ARB - ESC ~ SAL bull CEL - MAL + lAC - MEL + SAC - TRE shyINU - MLZ - RAF - AMD - GLYG - XLT - GEN - 11JR - LYX - TAG - DFUC shyLFUC - DARL - IARL - ONT + 2KO - 5KG +
- - - - - - Taxones significativos - - - - - - - Id T -- Test en contra
Lactobrevis 3 963 088 1
Taxon siguiente Lactoco11inoides 36 075 2
Lactobrevis 3 1 test (s) en contra
GLUCOSE (GLU) 95
-~~~------------~---------------------------~--~-------~--~-----~----------~--------~------------~~--Taxon siguiente Lactocollinoides 2 test (s) en contra
GLUCOSE (GLU) 100 MELIBIOSE (MEL) 25
69
i r
ANEXO D RESULTADO PRUEBAS BIOQIJiMICAS DE CEPA AISLADA DE LECHE FERMENTADA
Referenda Leche fennentada ~ 13 Fecha 27012003
BUENA IDENTIFICACI6N
Galeria API 50 CHL V50 Leida el 270112003
Perfil - - - - -t-t+- - - - + - + - - - bull - - - - -+- - - - - + - + - - - - - - - - - - - - - - - - -+ - +
0 - GLY - ERY - DARA - LARA +Rll3 + DXYL + LXYL - ADO - MDX ~GAL + GLU - FRU + MNE SBE - RHA DUL bull INO MAN - SOR MDM bull MDG shy
~NAG + AMY - ARB - ESC - SAL - CEL - MAL + LAC - MEL + SAC - TRE I lNU - MLZ - RAF - AMD - GLYG - XLT - OEN - IUR LYX - TAG - DFUC bull i
LFUC - DARL - LARL -ONr + 2KG - SKO + 1
- -- - - Taxones significativos - - Id -- T --- Test en contra
Lacta brevis 3 963 088 1
Taxon siguiente Lactocollinoides 36 075 2
Lactobrevis 3 1 test (s) en contra
GLUCOSE (GLU) 95
-----------------------------------------------------------~------------------------------~-------------------Taxon siguiente Lactocollinoides 2 test (s) en contra
GLUCOSE (GLD) 100 MELffiIOSE (MEL) 25
70
II iJ1
I
I ANEXO E RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AISLADA DE REPOLLITAS DE BRUSELAS FERMENTADA
Referencia repollitas de bruselas 15 Fecha 03072003
EXCELENTE IDENTIFICACION
Lactoplantarum 1
Galeria API 50 CHL vsO Leida el 03072003
Perfil - - - - +t - - - - +H+ - +- - +t + - I I I I I I I f ++t - + - - - -+ + - - - -+ -+ - - I ij
o - GLY - ERY - DARA - LARA + RJB + DXYL - LXYL - ADO - MDX - GAL +
GLU + FRU + MNE + SBE RHA + DUL - INO - MAN + SOR + MDM + MOG shyNAG + AMY + ARB + ESC + SAL + eEL + MAL + LAC + MEl + SAC + TRE + i
I1NU - MLZ + RAF AMD GLYG - XLT - aEN + TUR + LYX - TAG - Druc LFUC - DARt + LARL - aNT + 2KG - 5KG shy n ----Taxones significativos ------ Id Tests en contra
Lactoplantarum 1 999 090 o
Taxon siguiente Lacto pentosus 01 012 7
Lactoplantarum 1 o test (s) en contra
Taxon siguiente Lacto pentosus 7 test (8) en contra
GLYCEROL (GLY) 75 D-XYLOSE (DXYL) 100 L-RHAMNOSE (RHA) 25 METHYL-D-MANNOSIDE (MOM) 1 MELEZITOSE (MLZ) 25 RAFFINOSE (RAF) 75 D-ARABITOL (DARL) 0
71
~
I i I
ANEXO F - ANALISIS DE REGRESION PARA pH EN BEBIDA SIN AVENA
Aruilisis de regresi6n polinomial
---~-~-------------------------------------------~-----------~~---------------------~--------------Variable dependiente pHSinAvena ---------------------------~-------------~--------------------~---------------------------------
Error T Parametro Estimado Estandar Estadistico P-Valor
CONSTANTE 535606 0094535 56657 00000 Dia -0150565 0020706 727154 00000 Dia2 000504434 0000871488 578819 00001
---~---------------------------------------------------------------------------------------------------
Anfllisis de Variama -------------------------------------------~-----------~-----------------------------~-~--- jSource Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor 11
------------------------~------------------------------------------------------------------------------~ Mod-elo 155772 2 0118861 4256 00000 Residual 0237877 13 00182983
Total (Corr) 11956 IS
R2 == 867522 percent
pHSinAvena == 535606 - 0150565Dia + 000504434Dia2
72
____
middot ANEXO G - ANALISIS DE REGRESION PARA pH EN BEBIDA CON AVENA
AmUisis de regresion polinomial _____~_____~__-_____~___4____________________bull____bull__________bull_____________~~----_------___________
Variable depcndiente pHConA vena ------------------------------------------------------------------------------------------~--------
Error T Parametro Estimado StAndar Estadfstico P-Valor
---------------------------------------------~-----------------------------------------------_---------CONSTANTE 534463 00801045 667208 00000 Dia -0140407 00175453 800253 00000 DiaA 2 000448098 0000738458 606803 00000
----------------------~---~-----------------------------~------------------------------~----AmUisis de Varianza
---~---------------------------------~---------------------~------------~-------------------~------Source Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio PValor --------------------------~-----------------------------------------------~------------~-----~~--~ ModeJo 159575 2 0797873 6073 00000 Residual 02170798 middot13 00131383 _______~_~ ~_~----------~------~--~-----~-M-----~-----____ _____________~-----------------------Total (COlT) 176654 15
R12 903315 percent
-----------~------------------------------------------------------------------------~-----------pHConAvena 534463 - 0140407Dia + 000448098DfaA 2
73
ANEXO H - ANALTSIS DE REGRESTON PARA ACIDEZ EN BEBJDA SIN AVENA
An8Jisis de Regtesi6fi P6lifJomial
Variable Depefidiefile~ AcidezSinAVenll _______________w_____~______~________________~-----------_________~_________________~~____~___~_____
Error T Pariirnetro Estimado Estandar Estadistico ---------------------------------------~--------------~-~-------~--------------------~------------CONSTANT 0491697 00123217 399051 00000 Dia 00436032 000269882 161564 00000 D1a2 -000144613 000011359 127312 00000 __w___~________________________~-_______-_____~----____________________________~__~---~_--__~___
AriiiJisis de varianza ~_~__~__________~_~____~________~___________- _________e_____________________________bull _____-________
Source Smn de cuadr Df Mean Square F-Ratio PmiddotValor_~~___________________________________bull ______~___________bull ____________bull ______~________w________________
Model 0135203 2 00676013 21747 00000 Residual 000404118 13 000031086
Total (Corr) 0139244 15
R2 970978 percent
AcidezSlnAvena 0491697 + O0436032Dia - 0OOl44613Dia2
74
I
ANEXO I ANALISIS DE REGRESION PARA ACIDEZ EN BEBIDA CON AVENA
1
Anwisis de tegtesi6fi polinomial
Variable dependiente Acidez Con Avena
Error T ParametTo Estimado Stlindar Estadfstico P-Valor ----------------~-------~---------------------~-----------------------------------------------------CONSTANT 0491639 000926607 530578 00000 Diamiddot 00406572 000202955 200326 00000 DfaA 2 0000982559 0000085421 -115025 00000
-------------~----------------------------~-------------------------~-----------------------------------
-------------~-----~~-----------------------------~---------------------------------------------_--Source Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio PValor
-~-------------~----------------------------------~------------------~~-------------------------- Modelo 0288008 2 0144004 81914 00000 Residual 000228539 13 0000175799
----------~~--------------~---------------------------------------------~---------------------------Total (Corr) 0290294 15
RA2 = 992127 percent
-------------------------~----~---~------------~---------------------------------~---------------~
AcidezConAvena == 049163amp + 00406572D1a - 0000982559DiaA2
75
I
(Ilmiddot il
ANEXO J- ANALISIS DE REGRESION PARA RECUENTO LACTOBACILOS PARA BEBIDA SIN AVENA
Amilisis de regresion - Modelo lineal Y = a + bX
------------------------~----------------------~-----------------------------~----------~-----------Variable Dcpendiente LactobacilJusSinAvena Variable independiente Dia
I--------~----------~-----------------------------------~-------~-~--~--------------------------~-Error T
Paramctro Estimado Standard Stadistico P-Valor
----~----~------------~-----~-----------------------~-------------~-----------------------------Intereepto 117347 0389973 300911 00000 Pendiente 00483464 00257889 18747 00903
Analisis de Varianza
---------~------------------~----------------~---------------------------------~---------~----------Source Sum decuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor
------------~---------------------~---------------------~--------------------------------~-----~----Modelo 0916252 1 244835 443 00616 Residual 260706 10 0260706
--~------------~---~------------------~~~-----~-------~---------~~-------------------------------------Total (Corr)352332 11
Coeficiente Correlaci6n = 0509955 R2 = 260054 percent
LactobacillusSinAvena= 117347 + 00483464Dfa
76
ANEXO K- ANALTSIS DE REGRESION PARA RECUENTO LACTOBACILOS PARA DEBIDA CON AVENA
Aruilisis de regresion - Modelo lineal Y = a + hX
Variable Dependiente LactobacillusConAvena Variable Independiente Dia ---~--------------------------------------------------------__-----------__--_--_-----------shy
Error T Paramctro Estimado Standard Estadistico P-Valor -~--------------------------------------------------------------------------------------------------
Irttercepto 118103 0567963 207942 00000 Pendiente 00790304 00375594 210414 00616
-----------------~----------------------------~----~-------~----~----------------------------
Analisis de Varianza
----------------~----------------~------------------~--------------------------~------~--------shySource Swn de cuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor
-----------------~--~--------------------------------------------------------------------------~---~ Mode10 244835 1 244835 443 00616 Residual 552997 10 0552997
Total (Corr)797832 11
Coeficiente Correlacion = 0553964 RI2 = 306875 percent
-----~--------------------------------------------------------~--------------------------------------
LactobacillusConAvena = 118103 + 00790304Dfas
77
anaerobias Luego se procedio a verificar su rasistencia a los acidos gastricos y
sales biliares simulando asl las condiciones del tracto gastrointestinal de 10$
humanos Las capas que presentaron mejor comportamiento ante estas pruebas
sa caraeterizaron morfologles y bioquimicamente y sa seleccione una de eHas
para inocular en bebidas lacteas sin y can avena como ingrediente prebiotico y
verificar su viabilidad durante al almacenamiento
Los resultados de esta investigacion padren sar de gran irnportanoia para la
industria nacional de alimentos las univarsJdades con facultades relacionadas
can la salud y la alimentaci6n y para las entidades gubernamentales involucradas
en la alimentacion y nutricion de grupos de poblacion vulnerables tales como eJ
Instituto de Bienestar Familiar y Bienestar Social entre otros
13
middot~
1 MARCO TEORICO Y ESTADO DeL ARTE
11 P~OBI6TICOS
111 Historia
EI consumo de productos fermentados lecteos con microorganismos vivos
especialmente bacterias acido lacticas ha sido reportado a 10 largo de la historia
desde tiempos remotos se evidencia al conoeimiento de los beneficios que estes
proporcionaban perc real mente quian enfatiz6 en ellos fua 91 cienUfico ruso Elie
Metctinikcff que reaclon6 la ingesti6n de (eches fermentadas con la longevidad y
salud de las personas ( Pardio et al 1996)
En 1965 sa utilizo por primera vez et termino Probi6tico derivado dellatin pro
que significa a favor de y del gr9go bios que quiera decir vida tnieialmente esta
palabra defini6 a los microorganismos que promovian el erecimiento de otros
microorganismos Ivego se splico asta termino a extraetos de tajido que estimlilan
el crecimiento micrObianqEn la actuaidad sa han definldo como probiotieos los
cultivos (micas 0 mezclados de microorganismos vivos qua al ser ingeridos por
humanos Q animales majoran el balance poblacional de la microbiota intestinal
evitando la adherencia de patogenos (Schrezenmeir et albull2001) Sin embargo
estos microorganismos no nece_iamenta son habitantes propios del tracto
14
gastrointestinal (Holzapfel at a2001Gaitan at al 1998) p~r 10 tanto es
necesario consumir alimantos en los que se encuElntren estos mrcroorganismos
viables estos hacen parte de I~micfobiota de vegetales y leches interviniendo en
Ie fermentaci6n natural de estos~ntos
112 Microorganismos Probi6ticos
los microorganismos probi6ticos que tradicionatmente se han adicionado a la
tache para fermentarla y obtener yogurt y kumis a como suplementos pertenecen
a los generos Lactobacillus Enterococcus y Bifidobacterium (Ver tabla Nro 1) Sin
embargo se considera que solo algunas especies de los gelnsros Lactobacillus y
Bifidobacterium sobreviven en el tracto gastrointestinal En la tabla 1 58 muestran
algunas de estas especies
TABLA 1 Algunas especies microbianas probi6ticas
Lactobacillus Sifidobacferium Enterococcus
L acidophilus
L JohnsoN
L casei
L rhamnosus
Lgrasseri
L reuten
L plantarum
B bifidum
Blongum
B infantis
E fsecium
E faecalis
Fuente Gaitan et a 1998A
15
EI eonoeimiento a cerea de sus efeetos beneficos en el consumidor por su alta
viabilidad en el intestino como la producci6n de sustancias con aetividad
antieaneerigena el mejoramiento ltfel sistema inmunol6gico y el deSplazamiento
de la mierobiota pat6gena gastrointestinal en el consumidor ha estimulado una
mayor demanda de estos microorganismos como tambian de los productos que
los contienen (Heller 2001 Parada middot1998)
Existsn otros produetos fermentados de origen vegetal como et tampe col acida
y salsa de soya de los euales sa pueden aislar estos organismos probi6tieos
comp tambien de la mucosa intestinat humana y luego de suministrarlos a
ratones sa han comprobado sus caracteristicas beneficas (Molin 2001)
113 Caracteristicas fenotfpicas de algunos microorganismos
probi6ticos
las bacterias aeido lacticas de los generos Lactobacillus y Bifidobacterium son
consideradas probi6tieos y tradicionalmente se han clasificado con base en Sus
propiedades morfol6gicas crecimiento a diferentes temperaturas capacidad
fermentadora de glucosa y otros carbbhidratos y la configuraci6n del Bcido Jaetieo
producido (Holzapfel etal2001)
16
)lli~ h Dx nIILIOTECM
eJDe~~ l1ilmfJ tIDBnm
Los Lactobacillus son bacilas gram positiv~s no esparuladas aerotalerantes
acido - tolarantes estrictamente fermentadares formadores de Boido laclica como
producto principal catalasa negativo carentes de citocroma sin embargo se
presentan excepciones a esta descripcion parque afgunas especies pueden
formar catalasa 0 citacramo en medios que contienen hematina 0 compuestos
relacianados La produccion de catalasa no hema pseudocatalasa puede causar
tambien alguna confusion en fa identificacion de algunos Lactobacillus
las especies del genera Bifidobacterium san bacilos gram positivos no
esporulados generafmente anaerabios estricto$ aunque pueden creeer bajo
condiciones microaer6filas cuando estan ert presencia de C02 La mayorfa de sus
especies se pueden diferenciar par criterios biaquimicos simples como la
fermentacion de L arabinosa DmiddotxiJasa O-manosa O-manita y O sorbitat que
pueden servir coma caracterist1cas clave para su clasificacion (Holzapfel
etal2001 )
114 Caracteristicas de los probi6ticos
Las cepas de microorganismos prabi6ticos deben presenter y mantener unas
caracteristlcas que garanticen su crecimienta y supervivencia En el alimenta
como tambiEm durante su transito a traves del est6maga e intestino delgaQo
17
La primera CBtacterfstica es que sean viables esta viabifidad esla capacidad que
tienen los microorganismos probi6ticos de permanecer vivos tanto ~n el alimento
como en el Intestino del consumidor por un tiempo determinado En Colombia se
ha establecido que en bebidas fermentadas este tiempo debe ser minimo de 21
dras en el alimento (Minsalud 1986) Esta vjabilidad depende del metodo de
produccion y de la cepa utilizada (Tuomols at a 2001)
Luego de que se garantice que estos microorganismos eslan viVos en el alimento
ell os deben cumplir otro criterio importanle para ser considerados como
organismos probi6ticos y as tblerar las condiciones de acidez a un pH=2 y la
sccian de proteasas del est6mago ademas de sobrevivir y creeer en presencia de
acidos biliares (Tuomola et al 2001 Jacobsen at a 1999) para luego de
sobrevivir a estas condiciones adherirse a la mucosa intestinal y de esta manera
estimular al sistemainmunoJ6gico esta capacidad de adherirse a la mucosa es un
prerrequisito para la colonizacion del intestlno (Toumola etal2001 Alander et aI
1999)
Cuando los probioticos han pasado todas esta pruebas de supervivencia y luego
de impfantados en la mucosa producen acidos organicos peroxido de hidrogeno y
tambien bacteriocinas que actUan como inhibidore$ del crecimiento de
microorganismos patogenos u oportunistas (Tuomola at al 2001 Cintas et al
2000) complementando de asta manera su accion benefica sobre la mucosa
intestinal y en general sobre la saJud del huesped
18
116 Berieficios de los microorganismos probi6ticos
Los beneficios que se asocian a los microorganismos probioticos son muchos y
variados Entre ros comprobados mediante estudios se eneuentran
1151 Facilitar la digesti6n de la lactosa
los microorganismos probioticos cuando estan en el intestino liberan alii la
enzima pmiddotgalaotosidasa capaz de hidrolizar la lactosa haste glucosa y galactosa
evitando as que personas intolerantes a este carbohidrato presenten sfntomas
como flatulencia dolor abdominal y diarrea cuando consumen leche (be Vresse
et 81 2001)
1152 Protegen contra enfermedades gastrointesUnales
EI consumo de aJimentos con probioticos ha mostrado efeeto terapeutico frente a
los sintomas de diarrea asociada al surninistro de antibi6tico$ de amplio espectro
que destruye 0 disminuye la microbiota endogena esta imp ide la coJonizacion de
bacterias patogenas como Klebsiella oxytoca y Clostridium difficile que pueden
causer lesiones en el cn Los probi6ticos recuperan el balance de la microbiota
intestinal nativa y avitan Ie adhesion de algunos virus bacterias pat6genas a
parasitos que pueden ser agentes causales de gastroenteritis la diarrea del
19
J
viajero y 1(3 inflarnacion intestinal que en ultima instaneia oeasionan ef sfndrome
del colon irritable (Marteu et al 2001)
1153 Protegen contra infecciones del tracto urogenital
La vaginitis indueida por baeteriss yo por levaduras as una infecci6n
estrechamente relacionada con la exposici6n a antibi6ticos y espermicidas y
tambien depende del estado hormonal de la n1ujar Con al uso de mezcJas de
probi6ticos se han obtenido buenos resultados en la rastauraci6n de la rnicrobiota
natural urogenital benefica que desplaza a los eausantes de la inflamaci6n de Is
vagina y Ie uretra (Reid 2001 )
1154 Promueven la barrera de defensa end6gena del intestino
EI tracto gastrointestinal normal mente as una barrera natural contra anUgenos de
origen microbiano y alimentario Cuando los probi6ticos sa adhieren a Is mucosa
intestinal estimulan 0 potencian al sistema inmune favoreciendo la
inmunomodulaci6n que induce un aumentb de fa producci6n de inmunoglobulinas
activacion de las calulas mononueleares y de los linfocitos para proteger al
huesped de infeeciones (Isoulari et sl 2001)
20
1155 Protegen contra cancer de colon
EI cancer es el resultado de una serie de mutaciones somaticas que pueden
ocurrir durante al tiempo de vida del individuo y 10 padeca buena parte de la
poblacion mundial los probi6ticos en un sistema in vitro han demostrado un
efecto positivo en la prevenci6n de mutaciones aI desactivar carcin6genos
genotoxicos (Wolloswski et al J 2001)
1156 Protegen contra infecciones respiratorias
Sa ha demostrado que el conslJlno de probi6ticos disrninuye la incidencia de
infecqiones raspiretorias al aumentar la actividad fagocitica de maer6fagos
alveolares que aettian sobre microorganismos patogenos Se hizo un estudio en
571 ninos sanos con edades entre uno y seis anos divididos en dos grupos a uno
de ellos sa las incluy6 en su dieta leche suplementada can Lactobacillus GG y a
los otros ninos leche no suplementada AI final del estudio se observ6 una
disminucion del 19 en la incidencia de infeccionas respiratorias tratadas con
antibi6ticos tales como otitis media sinusitis bronquitis y neumonfas en el grupo
de los ninos que consumieron Lactobacillus GG (Hatakka et al 2001)
Alvarez et al (2001) encontraron que la administraci6n de yogurt con Lactobacillus
casei en ratones de tres arios de edad majora los espacios libres del puJrn6n de
la presencia de Pseudomona aeruginos8 induciendo un aumento
21
significativo en los niveles de gA a IgM datactadas en los lavados
broncoaJveolares y se observ~ un afecta dependiente de la dosis
1157 En el tratamientoy prevenci6n del eczema
Se ha encontrado que el consumo de probi6ticos mejora la inflamaci6n alergica 0
eczema at6pico en ninos alimentados con formula suplementada con probi6ticos
Encontraron una mejora significativa al suministrar Bifidobacteriummiddot actis y
Lactobacillus GG en 27 niiios con edad promedio de 46 meses Luego de aplicar
este tratamiento se sometieron a una prueha de SCORAD (mide fa extension y
gravedad del eczema) registrando una meJoria significatlva en las condiciones de
la pie concentraci6n de citoquinas cirClllantes an sueto y moleculas de adhesi6n
a las superficies de las celulas soJubles en suero (Isolari 2000)
Se realizaron otros estudios a 159 mujeres embarazadas con historia familiar de
eczema atopico de primer grado a las cuafes sa res 5uministro dosis diarias de
Lactobacillus GG durante 2 a 4 samanas previas al parto Oespues de ella fa
madres twiaron la opci6n de continuer tomando el ptobi6tico si amamantaban 0
bien darseio vIa oral La mayoria de las madras eJigieron dar las dosis at bebe
diariamente A los dos anos de vida se observ6 una disminuci6n del 50 en la
frecuencia del eczema at6pico en aquellos nHies que se les dio ef probi6tico
(Kalliomari etal 2001)
22
1158 Previenen infeccion en heridas quirurgicas
Los probi6ticos impiden la union de pat6genos a las superficies celulares en
heridas mediante la seCreci6n de proteinas Actuamente se encuentra en
estudio la aplicaci6n del Lactobacillus fermentum vivos sabre heridas en piel de
ratas y se ha encontrado una disminuci6n del 90 en la colonizaci6n par parte del
StaphylococcuS aureus uno de los patogenos mas temidos y de mayor lncidencia
en infecciones hospital arias mas aun se esta contempiando la posibilidad de
utilizar la protein a purificada an lugar de los mjcroorganismos para la protaccion
contra infecciones en heridas (Strauss 2000)
12 PREBIOTICOS
Son carbohidratos de cadena corta algunas veces reconocidQs como
oligosacaridos no digeribles par las enzimas del epitelio intestinal 0 de las
gliJnduJas anexas debido a su estructura quimica y de esta manera lIegan al
intestino grueso donde alcanzan a estar disponibles para la fermentaci6n por las
bacierias sacaroHticas que son especial mente laetobadlos y bifidobacterias
dando odgen a compuestos que ejercen efectos funcionales sobre la mucosa del
tubo digestivo (Brunser 2001)
Se consideran como tal algunos fructocligosacaridos isomaltooligosacariclos
oligomato palatinosa poHdextrosa pOJidextrrna raftilina y algunos oligosacaridos
23
)
de 1a soya y fa avena Estenmiddot presentes en alimentos como Ie cebolla ajo
banano puerros 1 derivados del trigo achicoria esparrago alcachofa (Cummings
etal 2001)
Algunos de estos prebi6ticos cuanda son incorporado$ a fa dieta en cantidades
dalerminadas alteran la microbiota intestinal disminuyendo los recuentos de
coliformes bacteroides y cocos y aumentando las bifidobacterias hasta en diez
veces ademas modifican la actividad metab6lica del coron logrando una
disminuci6n del pH y un incremento en el contenido fecal de acidos grasos de
cadena corta como at acatica propi6nico y butfrico El butirato aumen~ _I grosor
de la pared del coron e intestino delgado estimula eJ crecimiento de la mucosa del
colon y auManta su flujo sangufneo inhibe el crecimiento de tinsas tumorales
epiteliales de origen co16nico induce la diferenciaci6n de sus celulas y a
apoptosis entre otros(Brunsar 2001)
Eh estudios hechos en simuladores del intestino humano utilizando productos de
avena fermentados se encontro que estimularon al crecimiento tanto de
lactobacios como de bifidobacterias y en el caso de estas ultimas se incremento
la producci6n de los acidos acatico propionico y butfrico 10 que incide sobre la
implantacion de probi6tico$ e inhibe al crecimientos de otro tipo de
microorganismos (Alal1der eta1999 Kontula etal 1998 Jaskari etal 1998)
24
~ -1
(
AI comparar el comportamianto de las leches de diferente origen se ha
demostrado que Ie leche de vaca contiene caseinatos sustancias que forman
buffer ~n et intestino e inlpiden que los probi6ticos disminlJyen el pH del intestina
y de esta manera se impide al efecto deseado que es evitar fa proliferaci6n de
otros microorganismos entre los cuates pueden estar algunos patOganos En la
leche materna sa encuentran algunos carbohidratos como glucosa galactosa n
acetilglucosamina y algunos 0lig6meros de Ie fucosa en cOhoontracionesmiddot
importantes los cualeS favoreceh el crecimientc)middot de probi6ticos esto
complementado can 91 bajo contenido de protenas que se traduce en una
reducida capacidad buffer hacen de Ie lache materna IJn alimentd adecuado para
nllios en su etape de lactancia
Algunos prebi6ticos como 1a lactulosa yciertos compuestos que contiansn fructosa
no son digeridos en el intestino humano y pueden sar utilizados selectivamenta
par los probi6ticos 10 que hace que los probi6ticos en combinaci6n can prebi6ticos
pueden lIegar a ser un importante medio para prevenir algunas enfermedades del
tracto gastrointestinal (Bezkorovainy 2001)
25
2 METODOlOGfA
21 LOCALIZACION
EJ trabajo sa realizo en el laboratorio de Microbiologia y la planta da laches de Ja
Universidad Naclonal de Colombia- Secie Medellin
En al laboratorio se hiZQ al aislamiento a identificaci6n de fa capas y en fa Planta
sa eJaboro la leche fermentada con 1a cepa seleccionada y el prebi6trco
22 METODOS
221 Aisiamiento de cepas nativas
Las cepas nativas se sislaran de producto$ vegetales leches fermentadas y
mucosa vaginal humana
2211 De vegetales
Las muestras vegetales de repollo repollitas de brusefas y pepino se
seleccionaron porcionaron y mezclaron can cloruro de sadio al 10 pIp se
calacaron en un recipienta de vidrio balo anaerobiosis y sa dejarQn por 15 dias
26
luego S9 tomaron 3 ml de cada muestra y se jnocularon 9 ml de caldo MRS (Man
Rogosa and Sharpe) se incubaron a 37deg C durante cinco dias en camara de
anaerobiosis (Ver Figura 1) Oespues de este tiempo sa inocularon cajas de petri
con agar MRS con 1 ml del cultivo microbiano y se incubaron bajo las mismas
condiciones que eJ caldo Este procedirniento se realiz6 rapetidas veces hasta
seleccionar la cepa pura mediante observaci6n de caracteristicas morfologicas de
la cOlonia y a cada colonia se Ie practico la coloracion de gram con el fin de
observar las caracteristicas microscopicas de cada una e identificar las de mayor
similitud a los Lactobacilos y Bifidobacterias
Figura 1 Camara de anaerobiosis
27
2212 De la leche
Sa tomo 200 ml de teche cruda de la planta de leches y se colaca a fermentar
baja anaerobiosis durante 15 dras Luego sa procedia como en los vegetales
2213 De mucosa vaginal humana
Se tomo una muestra de frotis de mucosa vaginal humane can capito esteril sa
puso a ncubar en Caldo MRS y se procedi6 camo en 2211 y 2212 A cads
aislado sa Ie practico la coloracion de gram y sa seleccionaron aquellas que eran
bacilos gram positivos (Ver Tabla 2)
28
TABLA 2 Fuente de aislarniento de cepas nativas
CEPA FUENTE
1 Pepino fermentadQ
2 repollitas de bruselas fermentadas
3 Repolltgt fermentado
4 Repollo fermentado
5 Mucosa va~inal humana
6 Mucosa vaginal humana
7 repollitas de bruselas fermentadas
8 Repollo fermentado
9 repollitas de bruselas fermentadas
10 Mueo~a vaginal humana
11 Repollo fermentado
12 RepolJo fermentado
13 Leche fermentada
14 Mucosa vaginal humana
15 repollitas de bruselas fermentadas
16 Repollb fermentado
29
222 Almacenamiento de las cepas aisladas
Cuando las cepas crecieron en agar MRS homogEmeas en color morfologia
coloraci6n de Gram etc se pssaron a agar inclinado en tuba se cubrieron con
aceite mineral y se guardaran en refrigeraci6n a 4deg C para tomar de alii la cepa y
efectuarle las diferentes pruebas para confirmar el genera y determinar la especie
de cada una de eas (Ver Figura 2)
Figura 2 Cepas en tubos con agar inclinado
30
223 Pruebas para determinar et genero
2231 Coforaci6n de Gram
A cada cepa sospechosa de Lactobacilos se 1e hizo la coloraci6n de gram y se
seleccionaron las gram positivas
2232 Morfologfa
En agar MRS y despues de incubar en anaerobios~s crecian colonias grandes
cremosas de color beige con bordes homogeneos y c6ncavas(Ver Figura 3)
Figura 3 Colonias aisladas en agar MRS
31
2233 Prueba de esporulaci6n
A cada cepa aislada se Ie hizo esta prueba la cuel consistia en incubar en
aerobiosis durante ocho dias las cajas de agar MRS donde crecieron colonias de
Lactobacilo$ y luego se les (ealize) coloraci6n de espora Las capas que dieron
negativa a la prueba de espora se considararort sospechosas de sar Lactobacilos
y se continuo con la prueba de la catalasa (Ver Tabla 3)
2234 Prueba de la catalasa
los lactobacilos carecen de catalasa Eata prueba se hizo tomando una colonis
se deposito en vidrio de reloj y se Ie adicion6 dos gotas de peroxida de hidr6geno
(H202) la que no presentaba efervescencie eran cepe sospechosa de ser
Lactobacilo (Ver Tabla 4
Sa seleccionaron las capas euyo resultado fue aeorde con el genera Lactobacilfu$
y se continuo con la comirmaeion del genera y determinacion de la eSpecie
meqiante las pruebas bioqulmicas
32
224 Prueba para determlnar la especie
Para confirmar el genero y determinar la especie de las diferentes capas aisladas
se hizo una caracterizaci6n bioqufmica utilizando un kit de API 50 CHL Medium
Ref 50 410 que contiene una galed8 de medios que permite realizar el estudio
de fermentaci6n de los 49 azucares de 52 especies de Lactobacillus (Ver Figura 4
y tabla 5)
Figura 4 API CHL 50-Prueba bioquimica
33
225 Pruebas para determinar microorganismos probi6ticos
2251 Resistencia a pH=2 y sales biliares de concentraci6n O3pv
A las cepas idantificades como Lactobacillus brevis y Lactobacillus pantarum sa
las realiz6 Ie prueba dfl resistencia a pH=2 y sales biliares de concentraci6n 03
pv ( Jacobsen et al 1999) Una colonia de cada cepe aislada se inocul6 en 4 mt
de caldo MRS durante cinco dras bajo condiciones de anaerobiosis Oespues de
esta tiempo se dejaron pracipltar los microorganismos por sedimentaci6n se Ie
retire el sobrenadante y al precipitado se Ie adicion6 Sml de caldo MRS
previamente ajustado a pH=2 can seido clorhfdrico (HCI) dentro del mismo tuba de
ensayo G igual sa hizo can otro tubo previamente incubado pero a este se Ie
adiciono 5ml de caldo MRS con sales biliares a una concentra~i6n de 03 plv y
ambos se incuberon a 37deg C por 2 haras Sa midio 01 mi de cada uno de los
tubas al tiempo 0 y a las 2 horas y sa inoculeron en superficie en caJas de petri
con agar MRS S9 incubaron a 37deg C bajo anaerobiosis durante 48 horas Se
compararon visualrrente en cada caja de petri el crecimiento en superficie y las
que presentaron crecimiento en tos dos tiempos (0 y 2 horas) tanto en at media
acido como en sales I se consideraron resistentes a pH=2 y sales biliares (03
pv)
(Ver Tabla 6)
34
226 Conservacion
Todas fas capas que habian dado positiva Jas pruebas anteriores y que reaultaron
resistentes a pH=2 y sales biliares 03 pv y despues de identificadas en API 50
CHL sa repicaron en agar MRS en tuba inclinado y despues de Incubar a 37deg C
por 48 horas bajo anaerobiosis se Ctlbrie el biser completamente can aceite
mineral esteril y sa guardaron en refrigeraci6n
227 Elaboracj6n de fa bebida fermentada
2271 Preparaci6n de la mue$tra
Sa tome 1 mt de caldo MRS previamante inoculado e incubado que presentaba
una concentracion de Lactobacillus brevis de 27x108 Iml segun la escaJa de Mac
Farlan y sa adiciono a 9ml de leche pasteurizada en un tubo sa dej6 incubanda
en anaerobiosis por 48 hores Luego se pasaron estos 10 ml a un frasco qua
cont~nie 90 ml de leche pasterizada y se dej6 incubando par 48 haras en
anaerobiosis
35
2272 Adici6n del inOculo
A 900ml de leche pasteurizada se Ie adicion61os 100 ml de leche que habia sido
previamente ino(ulada dos veces con la cepa posteriormente se deja
fermantando la lache a temperatura de 37deg C
2273 Control de Ja fermentaci6n
Las muestras se hicieron por cuadruplicado y se les hizo un seguimiento de
aoidez hasta un valor entre 04 y 05 expresada como Bcido lactico esta
procedimiento corresponde a la babida fermentada sin prebi6tico La bebida ~on
prebi6tico tiene al mismo proeedirnianto pero adicionalmente se agrag6 avena a
una concentraci6n de 05 en el momento de la adici6n del in6e410 a los 900 ml
de leehe pasteurlzada y el procedimiento sigui6 igual al de la bebida sin prebi6tico
tambien se hizo por cuadruplicado
2274 Refrigeracl6n
Despues que las mezclas con y sin prebiotico alcanzaron el de acidez
requarido se IIeva ron a refrigeraci6n a una temperatura de 4deg C p~r 24 horas
para frenar proce~os metab6licos de los microorganisrtlos Despues de este
ti~mpo se procedi6 al batido
36
1 2275 Batido
Con un agitador se procedi6 a batir las bebidas para romper et coagulo formado
y de esta manera homogeneizar la mazela y obtener asf la bebida fermentada
2276 Envasado y almacenamiento
Ambas bebidas se envasaron en frascos vidrio para hacerles seguimiento de pH
acidez(expresado como acido tacticol y recuento de Lactobacillus breviSf los
dies 27 14 Y 21 despues de elaboradas las bebidas perfodo durante el cualta
muestra permanecfa afmacenada a temperatura de refrigeracion(Ver Figura 5
37
Fjgura 5 Diagrama de Flujo
PREPARACION DE LA MUESTRA
ADICION DEL INOCULO
~_____~_B~ATIDO~______~
INCUBACION 37deg C hasta acidez = 04-05 acido laotico
ENFRIAMIENTO
hasta 4 0 C ~------~ ~------~
ENVASADO Y ALMACENAMJENTO
dUrante 21 dfas a Temperatura 4 0 C
38
1
228 Determinaci6n del pH
Se determino por el metoda potenciometrico en un pH-metro manual durante los
dias 2) 7 14 Y 21 de las bebidas lacteas sin y con prebi6tica (Ver Tablas 7 y 8)
229 Oeterminaci6n de la acidez (Expresadfl como acido
lactica)
Se tomaron 9 mJ de las bebida~ sa Ie adicionaron 2 gotas de fanoftaleina como
indicador y sa titulo fa acidez con NaOH 01 N hasta la aparicion de un cotor rosado
debit EI volumen de NaOH utilizado se reporta como valor de de acidez
(VerTablas 10 y 11)
2210 Prueba de viabilidad
Qurante el perfoda de almacenamiento de la bebida lactea se procedi6 a hacer la
prueba de viabiHdad en los dias 7 14 Y 21 para determinar Si los lactobacilfus
permanecfan vivOs a una concentraci6n minima de 106 hasta el dia 21 como 10
establece eJ Articulo 10 de la Rasolucion 2310 del Ministerio de $alud de
Colombja
39
Para asta prueba se tamaron 10 rnl de muestra y se adicionaron a 90 ml de caldo
MRS ruego a partir de esta se hicieron diluciones de 10-2 hasta 10-11 de las
diluciones 109101deg 10-11 se inocul6 1 ml de cada uno en agar MRS siguiendo el
metodo de siembra en profundidad y por duplicado e incubando a 370 C x 5 dras
en anaerobiosis y luego se hicieron tos recuentos por duplicado para esi reportar
los recuentos promedio (Ver Tablas 13 y 14)
2211 AniUisls microbiol6glco de las bebidas Iicteas(con y sin
avena)
Con el fin de determinar las condiciones higienico-sanitarias del producto se
realizaron las pruebas microbiol6gicas de Recuento de mohos y fevadurasml en
agar OGY Recuento en superficia de Staphylococcus coagulasa positivoml en
agar Baird Parker Numero Mas Probable (NMP) de coUfor-mes totales y
Escherichia coliml en caldo Fluorocult y Presencia de Salmonela25ml con BHI
caldo tetrationato y agar Hecktoen (Montoya 1999)
(Var tabla 16)
2212 AnaUsis estadistico
A los datos obtenidos en la medici6n de pH acidez (expresada como Beido
laclico) en los dras 2714 Y 21 y el recuento de Lactobacillus en los dras 714 y21
40
realizados a los dos tratamlentos se tes aplic6 1a prueba t porque solo difieren
en la presencia 0 ausencia del prebi6tico para evaluar si habra diferencia
estadfsticamente significativa para los dos tratamientbs(Ver Tablas9 12 y 15)
41
3 RESULTADOS Y DISCUSION
31 Coloraci6n de Gram y morfologfa
Las cepas aisladas fesultaron Gram positivas (Ver Figura 6) colonias grandes
cremosas dE) color beige con bordes homogeneos y c6ncavos en su
morfologia (Ver Figura 3) resultando de acuerdo a 10 especificado en Stanley
1989 para Lactobacillus
32 Prueba de esporulaci6n y cataJasa
Los resultados de la pruebas de esporulaci6n y catalasa indicados en las
Tablas 3 y 4 respeclivamente dieron conforme a 10 especificado en Stanley
1989 para Lactobacillus
42
1
2 3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
TABLA 3 Resultado de prueba de esporuJaci6n
CEPA RESULfADO ESPORULACION
-- -------------
43
l i ~II bull ~ I I
TABLA 4 Resultado prueba de la catalasa
CEPA RESULTADO CATALASA
1 -2 -3 -4 -5 -6 -7 8 -9 -10 -11 12 -13 -14 -15 -16
3~3 Prueba para determinar la especie
Oespues de hacer las pruebas para seleccionar las cepas sospechosas de ser
Lactobacillus se realizo las pruebas bioquimicas fograndose identificar
Lactobacillus plantarum aislctdo de pepino repollo y repollitas de bruselas
44
fermentados y Lactobacillus brevis de mucosa vaginal y leche fermentada (Ver
Anexos del A al E y Tabla 5)
TABLA 5 Resultado identlficaci6n cepa~
CEPA NOMBRE
1 Lactobacillus planfarum
3 Lactobacillus plantarum
5 Lactobacillus brevis
13 Lactobacillus brevis
15 Lactobacillus plantarum
34 Pruebas para determinar microorganismos probi6ticos
las cepas de Lactobacillus brevis y Lactobacillus plantarum mostraron
rasistencia al medio acido de pH =2 Y sales biliares 03 pv resultado similar al
encontrado por Jacobsen et al 1999 para Lactobacillus plantarum (Ver tabla 6)
45
middot
~~~ttiI lltlmiddot~COX~dtJ ~xtc_~ 2 tr~ k-JlL~middot
-)~~TO DE lJIBUOTECUl rjRL]OTtCA twn GO1IU1
TABLA 6 Resultados a pruebas de resistencia a pH=2 y sales biliares 03 plv
CEPA RESISTENCIA pH=2 RESISTENCfA A SALES BIUARES ()3 pv
1 + +
2 + +
3 + +
4 + +
5 +
6 + +
7 + +
8 + +
9 + +
10 + +
11 + +
12 + +
13 + +
14 +1shy +M
15 + +
16 + +
+1 crecimiento debil
+ crecimiento abundante
46
Figura 6 Lactobacillus brevis Gram + aislado de leche fermentada
Ai observar en placa las celulas de lactobacilos despues de real1zar las pruebas
de resistenCia a la acidez y sales biliares se observo una tendencia a aglomerarse
posiblemente como un mecanismo de proteccion cOlitra estos medios que pueden
lIegar a ser adversos para elias (Ver figuras 7 y 8)
47
Figura 7 Lactobacillus brevis aislada de leche fermentada despu~s de la prueba de resistencia a pH=2
Figura 8 Lactobacillus brevis aislada de leche fermentada despues de la prueba de resistencie asales biUares 03 plv
fI
48
35 --Seguimiento del-pH-en-la-bebidaJacteacon y sin -prebi6tico
A continuacion se muestran las Tablas 7 y 8 donde sa registian los datos
recopilados de pHdurante 10$ dras Z 7 14 Y21 para las bebidas laaeas con ysin
prebi6tioo
TABLA 1 ResultadopH yogur sin avena
Dia Repetition 1 Repetici6n 2 Repeticion 3 Repetici6n 4
2 526 501 51 52
7 446 433 438 44
14 439 435 437 436
21 439 437 438 437
TABLA 8 -ResultadopHyogur con avena
Dia Repeticion 1 Repeticion2 Repeticion 3 - Repeticion 4
2 509 523 51 515
7 447 442 445 442
14 436 -438 439 437
21 432 433 435 434
Observando la Figura 9podamos ver que el pH en el -dfado$ para los dos
tratamientos as igual y empieza a descender rapidamente para estabilizarse a
partir del dra 7(Ver figura 9)
49
Figura 9 Comparacj6n de medias para -el pH
Comparaci6n de medias para pH
55 ~ 5 +----=gtIIIi-~i~~----=-r--it~ -- pH sin avena
a 45 1--~~~~=~~ 4 --- pH con
avena35 t-----r-- -------=------=--= ------- - ----
2 7 14 21
Dias
Aplicando la prueba t para comparar las medias de pH I S6 muestia una diferencia
altamants significativa en los dos tratamientos para el dia 21 (pltO05)
(Ver tabla 9)
TABLA 9 Compaiaci6n de medias para pH
DtAS SIN AVENA CON AVENA te p (VALOR)
2 514 514 0 10
7 439 444 -1 61 0159
14 437 I
438 -070 0510
21 438 433 528 00019 shy
- DiFERENCIA AlTAMENTE SIGNIFICATIVA
50
I
AI aplicar regrasi6n a los datos sa obtiene al modelo estimado
pHSinAyena =535606 - 01505650Ia +0005044340IaI2
La variabilidad en la respuesta de pH asta siendo explicada en un 8S7522 por
el modelo (Ver Anexo F)
EI tratamiento con avena mostro el siguiente modelo al analisis de ragresi6n
pHConAvena =534463 ~ 0140407Dia + 0004480980Ia2
La variabilidad an la respuesta de pH asta siendo explicada en un 903315 par
el nlodelo(Ver anexo G)
36 Seguimiento de la acidezmiddotmiddot expresada comomiddot de acido
lactico
A continuaci6n sa muestran las Tablas 10 y 11 donde sa registran los datos
tecopilados de acidezmiddotdurante los dias 27 14 Y 21 para las pebidas taetees con y
sin prebi6tico
TABLA 10 Resuttadode acidez (expresadocomo acido tactico) yogurt sin avena
CIA R~petici6n1 Repeticion2 Repetici6n 3 Repeticion 4
2 054 06 057 058
7 072 074 073 0]2
14 080 083 082 082
21 0]4 079 078 077
51
TABLA 11 Resultado de aCidez (expresado como acido Icktico) yogurt con avena
Dia Repetici6n 1 RepetiCi6n 2 Repetici6n 3 Repetici9n 4
2 059 055 058 057
7 071 073 072 072
14 089 087 088 086
21 092 091 090 091
Observando la Figura 10 se puede concluir que la acidez empieza a aumentar
hasta el dia 14 y luego trata de estabilizarse para los dos tratamientos
(Ver figura 10)
Figura 10 Comparaci6n de medias para la acidez
N G)
Comparacion de medias para acidez
1
2 0I 5 -+--=--------=-~~~= u
ltC
- Acidez sin avena
2 7 14
Dias
52
21
-it- Acidez con avena
Aplicando la prueba t para camparar las madias de acidez se muestra una
diferencia altarnante significativa en los dos tratamiantos para los dias 14 y 21
(pltO05)
(Var tabla 12)
TABLA 12Comparaci6n de medias para Acidez
DIASmiddot SIN AVENA CON AVENA te p(VALOR)
2 0572 0572 0 10
7 0727 0720 119 0278
14 0818 0875 -638 000070shy
21 077 091 -1212 i 0000019 shy
DIFERENCIA AL TAMENTE SlGNIFICATIVA
AI aplicar r~gresi6n a los datos se obtiene el modelo estimado
AcidezSlnAIena = 0491897 + O0436032Dia O00144613DfaA2
La variabilidad en la respuesta de acidez asta siendoexplicada en un 970978
por al modelo (Ver anexo H)
EI tratamiento con avena mostro elsiguiente modeloj a1 analisis de regresion
AcidezConAvena = 0491638 + 00406572Oia - OQOO982559OiaA2
La variabilidad enla respuesta acidez esta siendo explicadaen un 99212 por
el modelo (Ver anexo J)
53
I ~
37 Prueba de viabiJidad
A continuaci6n sa muestran las Tab~as 13 y 14 donde sa presentan los datos
recopilados del recuento de Lactobacilos durante los dias 7 14 Y 21 para las
bebidas lacteas con y sin prebi6tico
TABLA 13 Recuento de Lactobacilos (UFCml) yogurt sin avena
Dia Repetici6n 1 Repetici6n 2 Repeticion 3 Reptttici6n 4
7 1880X10l1 1454X1011 1642X1011 1780X10~
14 1560X10~ 646X1011J 1890X10l 140X10l1
21 1200x10lu 128Ox10u 1745x10J 1520x101V
TABLA 14 Recuento de Lactobacilos (UFCml) yogurt con avena
Dfa Repetieion 1 Repetici6n 2 Repeticion 3 Repeticf6n 4
7 1600X10lt 1240X10t 1640X10ll 1980X10t
14 540X1011 427X10n 546X10n 720X10ll
21 500x1011 492x1011 712)(1011 980x10~
AI analizar la Figura 11 sa puede observar un recuento mayor de Lactobacilos
en al tratamiento con avena resultado de acuerdo a 10 encontrado por Alander at
aI 1999 Kontula et aI 1998 y Jaskari et aI 1998
54
Figura 11 Comparaci6n de medias para Log Lactobacillus
Comparacion de medias para log Lactobacillus
~ 1350
-+- Sac Sin--() 13 co avenaIII
bull 125 -- Bac con 0)
0 12 avenaJ
115 7 14 21
Dias
Aplicando la prueba t para comparar las medias de recuento de Lactobacillus no
se encontr6 una diferenc1a estadfsUcamente significative entre los dos
tratamientos (Ver tabla 15)
Este aumento en al racuento influy6 en la disminuci6n del pH y en el aumento de
fa aeidez por la fermentacion que realizan los Lactobacillus sobre fa lactosa de la
lache y la avena adicionada como prebi6tico
55
1
TABLA 15 Comparaci6n medias lag Lactobacillus
DIAS SIN AVENA CON AVENA tc p(VALOR)
7 122257 122022 04846 06451
14 121065 132393 -19602 00977
21 129025 133087 -08236 04416
At aplicar regresion a los datos se obtiane al modelo astimado
LactobacillusSinAvena= 117347 + 004834640Ia
La variabilidad en la respuesta del recuento de LactobaCillus ssta siendo
explicada en un 260054 por el mod$loVar anexo J)
EI tratamiento con avena mostr6 al siguiente modalo al anal isis de regresion
Lactobacillu$ConAvena =118103 + 007903040Ias
La variabilidad en la respuesta de recuento esta siendo explicada en un 3068
por al modelo(Ver anexo K)~
38 Analisi$ microbiol6gicos de las bebidas lacteas con y sin
En la Tabla 16 estan recopilados los resultados microbiol6gieos obtenidos en ras
muestras con los dos tratamientos (con y sin avena)
I [
sa
TABLA 16 Resultados analisis microbiologico
Recuento de mohos y levaduras Iml lt10
Recuento de Staphylococcus coagulase positiva Iml lt100
NMP coliformes fotales y Escherichia coli Iml lt3
Presencia de Salmonella25ml Ausente
Los resultados de este analisis demuestran que las bebidas fermentadas con y
sin avena~ astan fibres de microorganismos patogenos
57
1
4 CONCLUSIONES
Se aislaron cepas nativas de Lactobacillus plantarum de las muestras vegetates
de repollo pepino repollitas de bruselas fermentadas y Lactobacillus brevis de
lache fermentada y mucosa vaginal humana Ambas cepas resistieran un pH=2 y
una concentraci6n de sales biliares det 03 ptv dos earacteristicas importantes
en los probi6ticos
Lamiddot cepa de Lactobacillus brevis aislada de lache Sa utiliz6 para elaborar una
bebida fermentada sin y con avana comoingrediente prebiotico obteniendose un
aJimento centon recuento del probi6tico viable durante 21 dras de seguimiento
ademas libre de microorganismos )at6gen05
No se encontr6 efecta significativo de la avena sobre Ie viabilidad del Lactobacillus
brevis aunque sa presento un aumento en 61 recuento de estos en la bebida con
avena
58
plusmn ~
5 RECOMENDACIONES
Ensayar la cepa de Lactobacillus plantartJm en productos carnicos madurados
como el salami
Ensayar la cepa de Lactobacillus l)revs en otros derivados lecteos como queso
quesito queso crema
Continuar con el estudio de estos microorganismos y caracterizarlos
molecularmente ademas de estudiar su capacidad de adherencja a fa mucosa
intestinal sobre algunes Hneas celulares como las CaCo~2
Estudiarel efedo de la avena sabre la viabiJidad del Lactobacillus breyis a una
concentraci6n mayor de 05
Realizer ensayos can las cepas de Lactobacillus brevis y Lactobrlcillus pJantarum
para elaborar masas acidas para panificacion reemplazando el Bromato de
Potasio aditivo prohibido desde marzo del 2003 en nuestro pais per 5U toxicidad
59
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65
ANEXOS
66
ANEXO A RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AlSLADA DE i
PEPINO it
Referencia Pepino 1 Fecha 06122002
IEXCELENTE IDENTIFICACION
Latto plantarum 1
Galeria API 50 CHL V50 Leida el 06122002
Perfil - -- - ++ - -- - ++++ - - -+- + - I I I I I I I I +t+ - +f- ~ - - + + ~ - - - +- + - shy
o - GLY - ERY DARA - LARA + RIB + DXYL - LXYL - ADO - MDX - GAL + GLU + FRU + MNE + SBE - RHA - DUL - INO bull MAN + SOR - MDM + MUG shyNAG + AMY + ARB + ESC + SAL + CEL + MAL + LAC + MEL + SAC + TRE + 1NU - MLZ + RAF + AMD - GLYG - XLT - GEN + TIJR + LYX - TAG - DFUC shyLFUC - DARL + LARL - aNT + 2KG - 5KG shy
--- Taxones significativos rd -----T -- Tests en contra
Lactoplantarum 1 999 092 1
Taxon siguiente Lactobrevis 1 OJ 044 3
i i
Lactoplantarum 1 1 test (5) en contra
D-SORBITOL (SOR) 78
Tax6n siguiente Lactobrevis 1 3 test (s) ert contra
METHYLD-MANNOSIDE (MOlM) 0 MELEZITOSE (MLZ) 14 D-TURANOSE (TUR) 14
67
ampb
ANEXO B RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AISLADA DE REPOLLO FERMENTADO
~
Referencia Repollo fermentado - 3 Fecha 03072003
EXCELENTE IDENTIFICACION
Lactoplantarum 1
Galena API 50 CRL V50 Leida el 03072003
Perfil - - ++ - - - - -H++ - - ~ + - + - I I 1 I I I I -H+ - ++ - - - + + - -- - - + - shy
o - GLY - ERY - DARA - LARA + RIB + DXYL - LXYL - ADO ~ MDX - GAL + GLU + FRU + MNE + SBE ~ RHA - DUL - INO - MAN + SOR - MDM + MDG shyNAG + AMY + ARR + ESC + SAT + CRL + MAL + LAC + MEL + SAC + TRE + lNU - MLZ + RAF + AMI) - GLYG - XLT - GEN + TOR + LYX - TAG - DFUC shyLFUC - DARL - LARL - GNT + 2KG - 5KG shy
------Taxones significativos _ _----- Id--- ---T---- Tests en contra
Lactoplantarum 1 999 095 1
Tax6n siguiente Lactobrevis 1 01 OA8 3
lJactoplantaru01 1 1 test (s) en contra
DSORBITOL (SOR) 78
Taxon siguiente Lactobrevis
METHYL-D-MANNOSIDE D-TURANOSE
1
(MOM) (TOR)
3 test (5) en contra
0 MELEZITOSE 14
(MLZ) 14
i
I
68
ANEXO C RESULTADO PRUEBAS BIOQUWICAS DE CEPA AISLADA DE MUCOSA HUMANA
Referenda Mucosa - 5 Fecha 27012003
BUENA IDENTlFICACION
Galeria API 50 CHL vso Leida el 270112003
Perfil - - - - +t--t - - - + - + - - - - - - - - -+- - - - - + - + - - - - - - - - - - - - - bull - - -+ - +
o - GLY ~ ERY - DARA bull LARA + RID + DXYL + LXYL - ADO bull MDX - GAL + OLU - FRU + MNE - SBE - IlliA - DUL - INa - MAN - SOR - MDM - MOO shyNAG + AMY - ARB - ESC ~ SAL bull CEL - MAL + lAC - MEL + SAC - TRE shyINU - MLZ - RAF - AMD - GLYG - XLT - GEN - 11JR - LYX - TAG - DFUC shyLFUC - DARL - IARL - ONT + 2KO - 5KG +
- - - - - - Taxones significativos - - - - - - - Id T -- Test en contra
Lactobrevis 3 963 088 1
Taxon siguiente Lactoco11inoides 36 075 2
Lactobrevis 3 1 test (s) en contra
GLUCOSE (GLU) 95
-~~~------------~---------------------------~--~-------~--~-----~----------~--------~------------~~--Taxon siguiente Lactocollinoides 2 test (s) en contra
GLUCOSE (GLU) 100 MELIBIOSE (MEL) 25
69
i r
ANEXO D RESULTADO PRUEBAS BIOQIJiMICAS DE CEPA AISLADA DE LECHE FERMENTADA
Referenda Leche fennentada ~ 13 Fecha 27012003
BUENA IDENTIFICACI6N
Galeria API 50 CHL V50 Leida el 270112003
Perfil - - - - -t-t+- - - - + - + - - - bull - - - - -+- - - - - + - + - - - - - - - - - - - - - - - - -+ - +
0 - GLY - ERY - DARA - LARA +Rll3 + DXYL + LXYL - ADO - MDX ~GAL + GLU - FRU + MNE SBE - RHA DUL bull INO MAN - SOR MDM bull MDG shy
~NAG + AMY - ARB - ESC - SAL - CEL - MAL + LAC - MEL + SAC - TRE I lNU - MLZ - RAF - AMD - GLYG - XLT - OEN - IUR LYX - TAG - DFUC bull i
LFUC - DARL - LARL -ONr + 2KG - SKO + 1
- -- - - Taxones significativos - - Id -- T --- Test en contra
Lacta brevis 3 963 088 1
Taxon siguiente Lactocollinoides 36 075 2
Lactobrevis 3 1 test (s) en contra
GLUCOSE (GLU) 95
-----------------------------------------------------------~------------------------------~-------------------Taxon siguiente Lactocollinoides 2 test (s) en contra
GLUCOSE (GLD) 100 MELffiIOSE (MEL) 25
70
II iJ1
I
I ANEXO E RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AISLADA DE REPOLLITAS DE BRUSELAS FERMENTADA
Referencia repollitas de bruselas 15 Fecha 03072003
EXCELENTE IDENTIFICACION
Lactoplantarum 1
Galeria API 50 CHL vsO Leida el 03072003
Perfil - - - - +t - - - - +H+ - +- - +t + - I I I I I I I f ++t - + - - - -+ + - - - -+ -+ - - I ij
o - GLY - ERY - DARA - LARA + RJB + DXYL - LXYL - ADO - MDX - GAL +
GLU + FRU + MNE + SBE RHA + DUL - INO - MAN + SOR + MDM + MOG shyNAG + AMY + ARB + ESC + SAL + eEL + MAL + LAC + MEl + SAC + TRE + i
I1NU - MLZ + RAF AMD GLYG - XLT - aEN + TUR + LYX - TAG - Druc LFUC - DARt + LARL - aNT + 2KG - 5KG shy n ----Taxones significativos ------ Id Tests en contra
Lactoplantarum 1 999 090 o
Taxon siguiente Lacto pentosus 01 012 7
Lactoplantarum 1 o test (s) en contra
Taxon siguiente Lacto pentosus 7 test (8) en contra
GLYCEROL (GLY) 75 D-XYLOSE (DXYL) 100 L-RHAMNOSE (RHA) 25 METHYL-D-MANNOSIDE (MOM) 1 MELEZITOSE (MLZ) 25 RAFFINOSE (RAF) 75 D-ARABITOL (DARL) 0
71
~
I i I
ANEXO F - ANALISIS DE REGRESION PARA pH EN BEBIDA SIN AVENA
Aruilisis de regresi6n polinomial
---~-~-------------------------------------------~-----------~~---------------------~--------------Variable dependiente pHSinAvena ---------------------------~-------------~--------------------~---------------------------------
Error T Parametro Estimado Estandar Estadistico P-Valor
CONSTANTE 535606 0094535 56657 00000 Dia -0150565 0020706 727154 00000 Dia2 000504434 0000871488 578819 00001
---~---------------------------------------------------------------------------------------------------
Anfllisis de Variama -------------------------------------------~-----------~-----------------------------~-~--- jSource Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor 11
------------------------~------------------------------------------------------------------------------~ Mod-elo 155772 2 0118861 4256 00000 Residual 0237877 13 00182983
Total (Corr) 11956 IS
R2 == 867522 percent
pHSinAvena == 535606 - 0150565Dia + 000504434Dia2
72
____
middot ANEXO G - ANALISIS DE REGRESION PARA pH EN BEBIDA CON AVENA
AmUisis de regresion polinomial _____~_____~__-_____~___4____________________bull____bull__________bull_____________~~----_------___________
Variable depcndiente pHConA vena ------------------------------------------------------------------------------------------~--------
Error T Parametro Estimado StAndar Estadfstico P-Valor
---------------------------------------------~-----------------------------------------------_---------CONSTANTE 534463 00801045 667208 00000 Dia -0140407 00175453 800253 00000 DiaA 2 000448098 0000738458 606803 00000
----------------------~---~-----------------------------~------------------------------~----AmUisis de Varianza
---~---------------------------------~---------------------~------------~-------------------~------Source Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio PValor --------------------------~-----------------------------------------------~------------~-----~~--~ ModeJo 159575 2 0797873 6073 00000 Residual 02170798 middot13 00131383 _______~_~ ~_~----------~------~--~-----~-M-----~-----____ _____________~-----------------------Total (COlT) 176654 15
R12 903315 percent
-----------~------------------------------------------------------------------------~-----------pHConAvena 534463 - 0140407Dia + 000448098DfaA 2
73
ANEXO H - ANALTSIS DE REGRESTON PARA ACIDEZ EN BEBJDA SIN AVENA
An8Jisis de Regtesi6fi P6lifJomial
Variable Depefidiefile~ AcidezSinAVenll _______________w_____~______~________________~-----------_________~_________________~~____~___~_____
Error T Pariirnetro Estimado Estandar Estadistico ---------------------------------------~--------------~-~-------~--------------------~------------CONSTANT 0491697 00123217 399051 00000 Dia 00436032 000269882 161564 00000 D1a2 -000144613 000011359 127312 00000 __w___~________________________~-_______-_____~----____________________________~__~---~_--__~___
AriiiJisis de varianza ~_~__~__________~_~____~________~___________- _________e_____________________________bull _____-________
Source Smn de cuadr Df Mean Square F-Ratio PmiddotValor_~~___________________________________bull ______~___________bull ____________bull ______~________w________________
Model 0135203 2 00676013 21747 00000 Residual 000404118 13 000031086
Total (Corr) 0139244 15
R2 970978 percent
AcidezSlnAvena 0491697 + O0436032Dia - 0OOl44613Dia2
74
I
ANEXO I ANALISIS DE REGRESION PARA ACIDEZ EN BEBIDA CON AVENA
1
Anwisis de tegtesi6fi polinomial
Variable dependiente Acidez Con Avena
Error T ParametTo Estimado Stlindar Estadfstico P-Valor ----------------~-------~---------------------~-----------------------------------------------------CONSTANT 0491639 000926607 530578 00000 Diamiddot 00406572 000202955 200326 00000 DfaA 2 0000982559 0000085421 -115025 00000
-------------~----------------------------~-------------------------~-----------------------------------
-------------~-----~~-----------------------------~---------------------------------------------_--Source Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio PValor
-~-------------~----------------------------------~------------------~~-------------------------- Modelo 0288008 2 0144004 81914 00000 Residual 000228539 13 0000175799
----------~~--------------~---------------------------------------------~---------------------------Total (Corr) 0290294 15
RA2 = 992127 percent
-------------------------~----~---~------------~---------------------------------~---------------~
AcidezConAvena == 049163amp + 00406572D1a - 0000982559DiaA2
75
I
(Ilmiddot il
ANEXO J- ANALISIS DE REGRESION PARA RECUENTO LACTOBACILOS PARA BEBIDA SIN AVENA
Amilisis de regresion - Modelo lineal Y = a + bX
------------------------~----------------------~-----------------------------~----------~-----------Variable Dcpendiente LactobacilJusSinAvena Variable independiente Dia
I--------~----------~-----------------------------------~-------~-~--~--------------------------~-Error T
Paramctro Estimado Standard Stadistico P-Valor
----~----~------------~-----~-----------------------~-------------~-----------------------------Intereepto 117347 0389973 300911 00000 Pendiente 00483464 00257889 18747 00903
Analisis de Varianza
---------~------------------~----------------~---------------------------------~---------~----------Source Sum decuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor
------------~---------------------~---------------------~--------------------------------~-----~----Modelo 0916252 1 244835 443 00616 Residual 260706 10 0260706
--~------------~---~------------------~~~-----~-------~---------~~-------------------------------------Total (Corr)352332 11
Coeficiente Correlaci6n = 0509955 R2 = 260054 percent
LactobacillusSinAvena= 117347 + 00483464Dfa
76
ANEXO K- ANALTSIS DE REGRESION PARA RECUENTO LACTOBACILOS PARA DEBIDA CON AVENA
Aruilisis de regresion - Modelo lineal Y = a + hX
Variable Dependiente LactobacillusConAvena Variable Independiente Dia ---~--------------------------------------------------------__-----------__--_--_-----------shy
Error T Paramctro Estimado Standard Estadistico P-Valor -~--------------------------------------------------------------------------------------------------
Irttercepto 118103 0567963 207942 00000 Pendiente 00790304 00375594 210414 00616
-----------------~----------------------------~----~-------~----~----------------------------
Analisis de Varianza
----------------~----------------~------------------~--------------------------~------~--------shySource Swn de cuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor
-----------------~--~--------------------------------------------------------------------------~---~ Mode10 244835 1 244835 443 00616 Residual 552997 10 0552997
Total (Corr)797832 11
Coeficiente Correlacion = 0553964 RI2 = 306875 percent
-----~--------------------------------------------------------~--------------------------------------
LactobacillusConAvena = 118103 + 00790304Dfas
77
middot~
1 MARCO TEORICO Y ESTADO DeL ARTE
11 P~OBI6TICOS
111 Historia
EI consumo de productos fermentados lecteos con microorganismos vivos
especialmente bacterias acido lacticas ha sido reportado a 10 largo de la historia
desde tiempos remotos se evidencia al conoeimiento de los beneficios que estes
proporcionaban perc real mente quian enfatiz6 en ellos fua 91 cienUfico ruso Elie
Metctinikcff que reaclon6 la ingesti6n de (eches fermentadas con la longevidad y
salud de las personas ( Pardio et al 1996)
En 1965 sa utilizo por primera vez et termino Probi6tico derivado dellatin pro
que significa a favor de y del gr9go bios que quiera decir vida tnieialmente esta
palabra defini6 a los microorganismos que promovian el erecimiento de otros
microorganismos Ivego se splico asta termino a extraetos de tajido que estimlilan
el crecimiento micrObianqEn la actuaidad sa han definldo como probiotieos los
cultivos (micas 0 mezclados de microorganismos vivos qua al ser ingeridos por
humanos Q animales majoran el balance poblacional de la microbiota intestinal
evitando la adherencia de patogenos (Schrezenmeir et albull2001) Sin embargo
estos microorganismos no nece_iamenta son habitantes propios del tracto
14
gastrointestinal (Holzapfel at a2001Gaitan at al 1998) p~r 10 tanto es
necesario consumir alimantos en los que se encuElntren estos mrcroorganismos
viables estos hacen parte de I~micfobiota de vegetales y leches interviniendo en
Ie fermentaci6n natural de estos~ntos
112 Microorganismos Probi6ticos
los microorganismos probi6ticos que tradicionatmente se han adicionado a la
tache para fermentarla y obtener yogurt y kumis a como suplementos pertenecen
a los generos Lactobacillus Enterococcus y Bifidobacterium (Ver tabla Nro 1) Sin
embargo se considera que solo algunas especies de los gelnsros Lactobacillus y
Bifidobacterium sobreviven en el tracto gastrointestinal En la tabla 1 58 muestran
algunas de estas especies
TABLA 1 Algunas especies microbianas probi6ticas
Lactobacillus Sifidobacferium Enterococcus
L acidophilus
L JohnsoN
L casei
L rhamnosus
Lgrasseri
L reuten
L plantarum
B bifidum
Blongum
B infantis
E fsecium
E faecalis
Fuente Gaitan et a 1998A
15
EI eonoeimiento a cerea de sus efeetos beneficos en el consumidor por su alta
viabilidad en el intestino como la producci6n de sustancias con aetividad
antieaneerigena el mejoramiento ltfel sistema inmunol6gico y el deSplazamiento
de la mierobiota pat6gena gastrointestinal en el consumidor ha estimulado una
mayor demanda de estos microorganismos como tambian de los productos que
los contienen (Heller 2001 Parada middot1998)
Existsn otros produetos fermentados de origen vegetal como et tampe col acida
y salsa de soya de los euales sa pueden aislar estos organismos probi6tieos
comp tambien de la mucosa intestinat humana y luego de suministrarlos a
ratones sa han comprobado sus caracteristicas beneficas (Molin 2001)
113 Caracteristicas fenotfpicas de algunos microorganismos
probi6ticos
las bacterias aeido lacticas de los generos Lactobacillus y Bifidobacterium son
consideradas probi6tieos y tradicionalmente se han clasificado con base en Sus
propiedades morfol6gicas crecimiento a diferentes temperaturas capacidad
fermentadora de glucosa y otros carbbhidratos y la configuraci6n del Bcido Jaetieo
producido (Holzapfel etal2001)
16
)lli~ h Dx nIILIOTECM
eJDe~~ l1ilmfJ tIDBnm
Los Lactobacillus son bacilas gram positiv~s no esparuladas aerotalerantes
acido - tolarantes estrictamente fermentadares formadores de Boido laclica como
producto principal catalasa negativo carentes de citocroma sin embargo se
presentan excepciones a esta descripcion parque afgunas especies pueden
formar catalasa 0 citacramo en medios que contienen hematina 0 compuestos
relacianados La produccion de catalasa no hema pseudocatalasa puede causar
tambien alguna confusion en fa identificacion de algunos Lactobacillus
las especies del genera Bifidobacterium san bacilos gram positivos no
esporulados generafmente anaerabios estricto$ aunque pueden creeer bajo
condiciones microaer6filas cuando estan ert presencia de C02 La mayorfa de sus
especies se pueden diferenciar par criterios biaquimicos simples como la
fermentacion de L arabinosa DmiddotxiJasa O-manosa O-manita y O sorbitat que
pueden servir coma caracterist1cas clave para su clasificacion (Holzapfel
etal2001 )
114 Caracteristicas de los probi6ticos
Las cepas de microorganismos prabi6ticos deben presenter y mantener unas
caracteristlcas que garanticen su crecimienta y supervivencia En el alimenta
como tambiEm durante su transito a traves del est6maga e intestino delgaQo
17
La primera CBtacterfstica es que sean viables esta viabifidad esla capacidad que
tienen los microorganismos probi6ticos de permanecer vivos tanto ~n el alimento
como en el Intestino del consumidor por un tiempo determinado En Colombia se
ha establecido que en bebidas fermentadas este tiempo debe ser minimo de 21
dras en el alimento (Minsalud 1986) Esta vjabilidad depende del metodo de
produccion y de la cepa utilizada (Tuomols at a 2001)
Luego de que se garantice que estos microorganismos eslan viVos en el alimento
ell os deben cumplir otro criterio importanle para ser considerados como
organismos probi6ticos y as tblerar las condiciones de acidez a un pH=2 y la
sccian de proteasas del est6mago ademas de sobrevivir y creeer en presencia de
acidos biliares (Tuomola et al 2001 Jacobsen at a 1999) para luego de
sobrevivir a estas condiciones adherirse a la mucosa intestinal y de esta manera
estimular al sistemainmunoJ6gico esta capacidad de adherirse a la mucosa es un
prerrequisito para la colonizacion del intestlno (Toumola etal2001 Alander et aI
1999)
Cuando los probioticos han pasado todas esta pruebas de supervivencia y luego
de impfantados en la mucosa producen acidos organicos peroxido de hidrogeno y
tambien bacteriocinas que actUan como inhibidore$ del crecimiento de
microorganismos patogenos u oportunistas (Tuomola at al 2001 Cintas et al
2000) complementando de asta manera su accion benefica sobre la mucosa
intestinal y en general sobre la saJud del huesped
18
116 Berieficios de los microorganismos probi6ticos
Los beneficios que se asocian a los microorganismos probioticos son muchos y
variados Entre ros comprobados mediante estudios se eneuentran
1151 Facilitar la digesti6n de la lactosa
los microorganismos probioticos cuando estan en el intestino liberan alii la
enzima pmiddotgalaotosidasa capaz de hidrolizar la lactosa haste glucosa y galactosa
evitando as que personas intolerantes a este carbohidrato presenten sfntomas
como flatulencia dolor abdominal y diarrea cuando consumen leche (be Vresse
et 81 2001)
1152 Protegen contra enfermedades gastrointesUnales
EI consumo de aJimentos con probioticos ha mostrado efeeto terapeutico frente a
los sintomas de diarrea asociada al surninistro de antibi6tico$ de amplio espectro
que destruye 0 disminuye la microbiota endogena esta imp ide la coJonizacion de
bacterias patogenas como Klebsiella oxytoca y Clostridium difficile que pueden
causer lesiones en el cn Los probi6ticos recuperan el balance de la microbiota
intestinal nativa y avitan Ie adhesion de algunos virus bacterias pat6genas a
parasitos que pueden ser agentes causales de gastroenteritis la diarrea del
19
J
viajero y 1(3 inflarnacion intestinal que en ultima instaneia oeasionan ef sfndrome
del colon irritable (Marteu et al 2001)
1153 Protegen contra infecciones del tracto urogenital
La vaginitis indueida por baeteriss yo por levaduras as una infecci6n
estrechamente relacionada con la exposici6n a antibi6ticos y espermicidas y
tambien depende del estado hormonal de la n1ujar Con al uso de mezcJas de
probi6ticos se han obtenido buenos resultados en la rastauraci6n de la rnicrobiota
natural urogenital benefica que desplaza a los eausantes de la inflamaci6n de Is
vagina y Ie uretra (Reid 2001 )
1154 Promueven la barrera de defensa end6gena del intestino
EI tracto gastrointestinal normal mente as una barrera natural contra anUgenos de
origen microbiano y alimentario Cuando los probi6ticos sa adhieren a Is mucosa
intestinal estimulan 0 potencian al sistema inmune favoreciendo la
inmunomodulaci6n que induce un aumentb de fa producci6n de inmunoglobulinas
activacion de las calulas mononueleares y de los linfocitos para proteger al
huesped de infeeciones (Isoulari et sl 2001)
20
1155 Protegen contra cancer de colon
EI cancer es el resultado de una serie de mutaciones somaticas que pueden
ocurrir durante al tiempo de vida del individuo y 10 padeca buena parte de la
poblacion mundial los probi6ticos en un sistema in vitro han demostrado un
efecto positivo en la prevenci6n de mutaciones aI desactivar carcin6genos
genotoxicos (Wolloswski et al J 2001)
1156 Protegen contra infecciones respiratorias
Sa ha demostrado que el conslJlno de probi6ticos disrninuye la incidencia de
infecqiones raspiretorias al aumentar la actividad fagocitica de maer6fagos
alveolares que aettian sobre microorganismos patogenos Se hizo un estudio en
571 ninos sanos con edades entre uno y seis anos divididos en dos grupos a uno
de ellos sa las incluy6 en su dieta leche suplementada can Lactobacillus GG y a
los otros ninos leche no suplementada AI final del estudio se observ6 una
disminucion del 19 en la incidencia de infeccionas respiratorias tratadas con
antibi6ticos tales como otitis media sinusitis bronquitis y neumonfas en el grupo
de los ninos que consumieron Lactobacillus GG (Hatakka et al 2001)
Alvarez et al (2001) encontraron que la administraci6n de yogurt con Lactobacillus
casei en ratones de tres arios de edad majora los espacios libres del puJrn6n de
la presencia de Pseudomona aeruginos8 induciendo un aumento
21
significativo en los niveles de gA a IgM datactadas en los lavados
broncoaJveolares y se observ~ un afecta dependiente de la dosis
1157 En el tratamientoy prevenci6n del eczema
Se ha encontrado que el consumo de probi6ticos mejora la inflamaci6n alergica 0
eczema at6pico en ninos alimentados con formula suplementada con probi6ticos
Encontraron una mejora significativa al suministrar Bifidobacteriummiddot actis y
Lactobacillus GG en 27 niiios con edad promedio de 46 meses Luego de aplicar
este tratamiento se sometieron a una prueha de SCORAD (mide fa extension y
gravedad del eczema) registrando una meJoria significatlva en las condiciones de
la pie concentraci6n de citoquinas cirClllantes an sueto y moleculas de adhesi6n
a las superficies de las celulas soJubles en suero (Isolari 2000)
Se realizaron otros estudios a 159 mujeres embarazadas con historia familiar de
eczema atopico de primer grado a las cuafes sa res 5uministro dosis diarias de
Lactobacillus GG durante 2 a 4 samanas previas al parto Oespues de ella fa
madres twiaron la opci6n de continuer tomando el ptobi6tico si amamantaban 0
bien darseio vIa oral La mayoria de las madras eJigieron dar las dosis at bebe
diariamente A los dos anos de vida se observ6 una disminuci6n del 50 en la
frecuencia del eczema at6pico en aquellos nHies que se les dio ef probi6tico
(Kalliomari etal 2001)
22
1158 Previenen infeccion en heridas quirurgicas
Los probi6ticos impiden la union de pat6genos a las superficies celulares en
heridas mediante la seCreci6n de proteinas Actuamente se encuentra en
estudio la aplicaci6n del Lactobacillus fermentum vivos sabre heridas en piel de
ratas y se ha encontrado una disminuci6n del 90 en la colonizaci6n par parte del
StaphylococcuS aureus uno de los patogenos mas temidos y de mayor lncidencia
en infecciones hospital arias mas aun se esta contempiando la posibilidad de
utilizar la protein a purificada an lugar de los mjcroorganismos para la protaccion
contra infecciones en heridas (Strauss 2000)
12 PREBIOTICOS
Son carbohidratos de cadena corta algunas veces reconocidQs como
oligosacaridos no digeribles par las enzimas del epitelio intestinal 0 de las
gliJnduJas anexas debido a su estructura quimica y de esta manera lIegan al
intestino grueso donde alcanzan a estar disponibles para la fermentaci6n por las
bacierias sacaroHticas que son especial mente laetobadlos y bifidobacterias
dando odgen a compuestos que ejercen efectos funcionales sobre la mucosa del
tubo digestivo (Brunser 2001)
Se consideran como tal algunos fructocligosacaridos isomaltooligosacariclos
oligomato palatinosa poHdextrosa pOJidextrrna raftilina y algunos oligosacaridos
23
)
de 1a soya y fa avena Estenmiddot presentes en alimentos como Ie cebolla ajo
banano puerros 1 derivados del trigo achicoria esparrago alcachofa (Cummings
etal 2001)
Algunos de estos prebi6ticos cuanda son incorporado$ a fa dieta en cantidades
dalerminadas alteran la microbiota intestinal disminuyendo los recuentos de
coliformes bacteroides y cocos y aumentando las bifidobacterias hasta en diez
veces ademas modifican la actividad metab6lica del coron logrando una
disminuci6n del pH y un incremento en el contenido fecal de acidos grasos de
cadena corta como at acatica propi6nico y butfrico El butirato aumen~ _I grosor
de la pared del coron e intestino delgado estimula eJ crecimiento de la mucosa del
colon y auManta su flujo sangufneo inhibe el crecimiento de tinsas tumorales
epiteliales de origen co16nico induce la diferenciaci6n de sus celulas y a
apoptosis entre otros(Brunsar 2001)
Eh estudios hechos en simuladores del intestino humano utilizando productos de
avena fermentados se encontro que estimularon al crecimiento tanto de
lactobacios como de bifidobacterias y en el caso de estas ultimas se incremento
la producci6n de los acidos acatico propionico y butfrico 10 que incide sobre la
implantacion de probi6tico$ e inhibe al crecimientos de otro tipo de
microorganismos (Alal1der eta1999 Kontula etal 1998 Jaskari etal 1998)
24
~ -1
(
AI comparar el comportamianto de las leches de diferente origen se ha
demostrado que Ie leche de vaca contiene caseinatos sustancias que forman
buffer ~n et intestino e inlpiden que los probi6ticos disminlJyen el pH del intestina
y de esta manera se impide al efecto deseado que es evitar fa proliferaci6n de
otros microorganismos entre los cuates pueden estar algunos patOganos En la
leche materna sa encuentran algunos carbohidratos como glucosa galactosa n
acetilglucosamina y algunos 0lig6meros de Ie fucosa en cOhoontracionesmiddot
importantes los cualeS favoreceh el crecimientc)middot de probi6ticos esto
complementado can 91 bajo contenido de protenas que se traduce en una
reducida capacidad buffer hacen de Ie lache materna IJn alimentd adecuado para
nllios en su etape de lactancia
Algunos prebi6ticos como 1a lactulosa yciertos compuestos que contiansn fructosa
no son digeridos en el intestino humano y pueden sar utilizados selectivamenta
par los probi6ticos 10 que hace que los probi6ticos en combinaci6n can prebi6ticos
pueden lIegar a ser un importante medio para prevenir algunas enfermedades del
tracto gastrointestinal (Bezkorovainy 2001)
25
2 METODOlOGfA
21 LOCALIZACION
EJ trabajo sa realizo en el laboratorio de Microbiologia y la planta da laches de Ja
Universidad Naclonal de Colombia- Secie Medellin
En al laboratorio se hiZQ al aislamiento a identificaci6n de fa capas y en fa Planta
sa eJaboro la leche fermentada con 1a cepa seleccionada y el prebi6trco
22 METODOS
221 Aisiamiento de cepas nativas
Las cepas nativas se sislaran de producto$ vegetales leches fermentadas y
mucosa vaginal humana
2211 De vegetales
Las muestras vegetales de repollo repollitas de brusefas y pepino se
seleccionaron porcionaron y mezclaron can cloruro de sadio al 10 pIp se
calacaron en un recipienta de vidrio balo anaerobiosis y sa dejarQn por 15 dias
26
luego S9 tomaron 3 ml de cada muestra y se jnocularon 9 ml de caldo MRS (Man
Rogosa and Sharpe) se incubaron a 37deg C durante cinco dias en camara de
anaerobiosis (Ver Figura 1) Oespues de este tiempo sa inocularon cajas de petri
con agar MRS con 1 ml del cultivo microbiano y se incubaron bajo las mismas
condiciones que eJ caldo Este procedirniento se realiz6 rapetidas veces hasta
seleccionar la cepa pura mediante observaci6n de caracteristicas morfologicas de
la cOlonia y a cada colonia se Ie practico la coloracion de gram con el fin de
observar las caracteristicas microscopicas de cada una e identificar las de mayor
similitud a los Lactobacilos y Bifidobacterias
Figura 1 Camara de anaerobiosis
27
2212 De la leche
Sa tomo 200 ml de teche cruda de la planta de leches y se colaca a fermentar
baja anaerobiosis durante 15 dras Luego sa procedia como en los vegetales
2213 De mucosa vaginal humana
Se tomo una muestra de frotis de mucosa vaginal humane can capito esteril sa
puso a ncubar en Caldo MRS y se procedi6 camo en 2211 y 2212 A cads
aislado sa Ie practico la coloracion de gram y sa seleccionaron aquellas que eran
bacilos gram positivos (Ver Tabla 2)
28
TABLA 2 Fuente de aislarniento de cepas nativas
CEPA FUENTE
1 Pepino fermentadQ
2 repollitas de bruselas fermentadas
3 Repolltgt fermentado
4 Repollo fermentado
5 Mucosa va~inal humana
6 Mucosa vaginal humana
7 repollitas de bruselas fermentadas
8 Repollo fermentado
9 repollitas de bruselas fermentadas
10 Mueo~a vaginal humana
11 Repollo fermentado
12 RepolJo fermentado
13 Leche fermentada
14 Mucosa vaginal humana
15 repollitas de bruselas fermentadas
16 Repollb fermentado
29
222 Almacenamiento de las cepas aisladas
Cuando las cepas crecieron en agar MRS homogEmeas en color morfologia
coloraci6n de Gram etc se pssaron a agar inclinado en tuba se cubrieron con
aceite mineral y se guardaran en refrigeraci6n a 4deg C para tomar de alii la cepa y
efectuarle las diferentes pruebas para confirmar el genera y determinar la especie
de cada una de eas (Ver Figura 2)
Figura 2 Cepas en tubos con agar inclinado
30
223 Pruebas para determinar et genero
2231 Coforaci6n de Gram
A cada cepa sospechosa de Lactobacilos se 1e hizo la coloraci6n de gram y se
seleccionaron las gram positivas
2232 Morfologfa
En agar MRS y despues de incubar en anaerobios~s crecian colonias grandes
cremosas de color beige con bordes homogeneos y c6ncavas(Ver Figura 3)
Figura 3 Colonias aisladas en agar MRS
31
2233 Prueba de esporulaci6n
A cada cepa aislada se Ie hizo esta prueba la cuel consistia en incubar en
aerobiosis durante ocho dias las cajas de agar MRS donde crecieron colonias de
Lactobacilo$ y luego se les (ealize) coloraci6n de espora Las capas que dieron
negativa a la prueba de espora se considararort sospechosas de sar Lactobacilos
y se continuo con la prueba de la catalasa (Ver Tabla 3)
2234 Prueba de la catalasa
los lactobacilos carecen de catalasa Eata prueba se hizo tomando una colonis
se deposito en vidrio de reloj y se Ie adicion6 dos gotas de peroxida de hidr6geno
(H202) la que no presentaba efervescencie eran cepe sospechosa de ser
Lactobacilo (Ver Tabla 4
Sa seleccionaron las capas euyo resultado fue aeorde con el genera Lactobacilfu$
y se continuo con la comirmaeion del genera y determinacion de la eSpecie
meqiante las pruebas bioqulmicas
32
224 Prueba para determlnar la especie
Para confirmar el genero y determinar la especie de las diferentes capas aisladas
se hizo una caracterizaci6n bioqufmica utilizando un kit de API 50 CHL Medium
Ref 50 410 que contiene una galed8 de medios que permite realizar el estudio
de fermentaci6n de los 49 azucares de 52 especies de Lactobacillus (Ver Figura 4
y tabla 5)
Figura 4 API CHL 50-Prueba bioquimica
33
225 Pruebas para determinar microorganismos probi6ticos
2251 Resistencia a pH=2 y sales biliares de concentraci6n O3pv
A las cepas idantificades como Lactobacillus brevis y Lactobacillus pantarum sa
las realiz6 Ie prueba dfl resistencia a pH=2 y sales biliares de concentraci6n 03
pv ( Jacobsen et al 1999) Una colonia de cada cepe aislada se inocul6 en 4 mt
de caldo MRS durante cinco dras bajo condiciones de anaerobiosis Oespues de
esta tiempo se dejaron pracipltar los microorganismos por sedimentaci6n se Ie
retire el sobrenadante y al precipitado se Ie adicion6 Sml de caldo MRS
previamente ajustado a pH=2 can seido clorhfdrico (HCI) dentro del mismo tuba de
ensayo G igual sa hizo can otro tubo previamente incubado pero a este se Ie
adiciono 5ml de caldo MRS con sales biliares a una concentra~i6n de 03 plv y
ambos se incuberon a 37deg C por 2 haras Sa midio 01 mi de cada uno de los
tubas al tiempo 0 y a las 2 horas y sa inoculeron en superficie en caJas de petri
con agar MRS S9 incubaron a 37deg C bajo anaerobiosis durante 48 horas Se
compararon visualrrente en cada caja de petri el crecimiento en superficie y las
que presentaron crecimiento en tos dos tiempos (0 y 2 horas) tanto en at media
acido como en sales I se consideraron resistentes a pH=2 y sales biliares (03
pv)
(Ver Tabla 6)
34
226 Conservacion
Todas fas capas que habian dado positiva Jas pruebas anteriores y que reaultaron
resistentes a pH=2 y sales biliares 03 pv y despues de identificadas en API 50
CHL sa repicaron en agar MRS en tuba inclinado y despues de Incubar a 37deg C
por 48 horas bajo anaerobiosis se Ctlbrie el biser completamente can aceite
mineral esteril y sa guardaron en refrigeraci6n
227 Elaboracj6n de fa bebida fermentada
2271 Preparaci6n de la mue$tra
Sa tome 1 mt de caldo MRS previamante inoculado e incubado que presentaba
una concentracion de Lactobacillus brevis de 27x108 Iml segun la escaJa de Mac
Farlan y sa adiciono a 9ml de leche pasteurizada en un tubo sa dej6 incubanda
en anaerobiosis por 48 hores Luego se pasaron estos 10 ml a un frasco qua
cont~nie 90 ml de leche pasterizada y se dej6 incubando par 48 haras en
anaerobiosis
35
2272 Adici6n del inOculo
A 900ml de leche pasteurizada se Ie adicion61os 100 ml de leche que habia sido
previamente ino(ulada dos veces con la cepa posteriormente se deja
fermantando la lache a temperatura de 37deg C
2273 Control de Ja fermentaci6n
Las muestras se hicieron por cuadruplicado y se les hizo un seguimiento de
aoidez hasta un valor entre 04 y 05 expresada como Bcido lactico esta
procedimiento corresponde a la babida fermentada sin prebi6tico La bebida ~on
prebi6tico tiene al mismo proeedirnianto pero adicionalmente se agrag6 avena a
una concentraci6n de 05 en el momento de la adici6n del in6e410 a los 900 ml
de leehe pasteurlzada y el procedimiento sigui6 igual al de la bebida sin prebi6tico
tambien se hizo por cuadruplicado
2274 Refrigeracl6n
Despues que las mezclas con y sin prebiotico alcanzaron el de acidez
requarido se IIeva ron a refrigeraci6n a una temperatura de 4deg C p~r 24 horas
para frenar proce~os metab6licos de los microorganisrtlos Despues de este
ti~mpo se procedi6 al batido
36
1 2275 Batido
Con un agitador se procedi6 a batir las bebidas para romper et coagulo formado
y de esta manera homogeneizar la mazela y obtener asf la bebida fermentada
2276 Envasado y almacenamiento
Ambas bebidas se envasaron en frascos vidrio para hacerles seguimiento de pH
acidez(expresado como acido tacticol y recuento de Lactobacillus breviSf los
dies 27 14 Y 21 despues de elaboradas las bebidas perfodo durante el cualta
muestra permanecfa afmacenada a temperatura de refrigeracion(Ver Figura 5
37
Fjgura 5 Diagrama de Flujo
PREPARACION DE LA MUESTRA
ADICION DEL INOCULO
~_____~_B~ATIDO~______~
INCUBACION 37deg C hasta acidez = 04-05 acido laotico
ENFRIAMIENTO
hasta 4 0 C ~------~ ~------~
ENVASADO Y ALMACENAMJENTO
dUrante 21 dfas a Temperatura 4 0 C
38
1
228 Determinaci6n del pH
Se determino por el metoda potenciometrico en un pH-metro manual durante los
dias 2) 7 14 Y 21 de las bebidas lacteas sin y con prebi6tica (Ver Tablas 7 y 8)
229 Oeterminaci6n de la acidez (Expresadfl como acido
lactica)
Se tomaron 9 mJ de las bebida~ sa Ie adicionaron 2 gotas de fanoftaleina como
indicador y sa titulo fa acidez con NaOH 01 N hasta la aparicion de un cotor rosado
debit EI volumen de NaOH utilizado se reporta como valor de de acidez
(VerTablas 10 y 11)
2210 Prueba de viabilidad
Qurante el perfoda de almacenamiento de la bebida lactea se procedi6 a hacer la
prueba de viabiHdad en los dias 7 14 Y 21 para determinar Si los lactobacilfus
permanecfan vivOs a una concentraci6n minima de 106 hasta el dia 21 como 10
establece eJ Articulo 10 de la Rasolucion 2310 del Ministerio de $alud de
Colombja
39
Para asta prueba se tamaron 10 rnl de muestra y se adicionaron a 90 ml de caldo
MRS ruego a partir de esta se hicieron diluciones de 10-2 hasta 10-11 de las
diluciones 109101deg 10-11 se inocul6 1 ml de cada uno en agar MRS siguiendo el
metodo de siembra en profundidad y por duplicado e incubando a 370 C x 5 dras
en anaerobiosis y luego se hicieron tos recuentos por duplicado para esi reportar
los recuentos promedio (Ver Tablas 13 y 14)
2211 AniUisls microbiol6glco de las bebidas Iicteas(con y sin
avena)
Con el fin de determinar las condiciones higienico-sanitarias del producto se
realizaron las pruebas microbiol6gicas de Recuento de mohos y fevadurasml en
agar OGY Recuento en superficia de Staphylococcus coagulasa positivoml en
agar Baird Parker Numero Mas Probable (NMP) de coUfor-mes totales y
Escherichia coliml en caldo Fluorocult y Presencia de Salmonela25ml con BHI
caldo tetrationato y agar Hecktoen (Montoya 1999)
(Var tabla 16)
2212 AnaUsis estadistico
A los datos obtenidos en la medici6n de pH acidez (expresada como Beido
laclico) en los dras 2714 Y 21 y el recuento de Lactobacillus en los dras 714 y21
40
realizados a los dos tratamlentos se tes aplic6 1a prueba t porque solo difieren
en la presencia 0 ausencia del prebi6tico para evaluar si habra diferencia
estadfsticamente significativa para los dos tratamientbs(Ver Tablas9 12 y 15)
41
3 RESULTADOS Y DISCUSION
31 Coloraci6n de Gram y morfologfa
Las cepas aisladas fesultaron Gram positivas (Ver Figura 6) colonias grandes
cremosas dE) color beige con bordes homogeneos y c6ncavos en su
morfologia (Ver Figura 3) resultando de acuerdo a 10 especificado en Stanley
1989 para Lactobacillus
32 Prueba de esporulaci6n y cataJasa
Los resultados de la pruebas de esporulaci6n y catalasa indicados en las
Tablas 3 y 4 respeclivamente dieron conforme a 10 especificado en Stanley
1989 para Lactobacillus
42
1
2 3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
TABLA 3 Resultado de prueba de esporuJaci6n
CEPA RESULfADO ESPORULACION
-- -------------
43
l i ~II bull ~ I I
TABLA 4 Resultado prueba de la catalasa
CEPA RESULTADO CATALASA
1 -2 -3 -4 -5 -6 -7 8 -9 -10 -11 12 -13 -14 -15 -16
3~3 Prueba para determinar la especie
Oespues de hacer las pruebas para seleccionar las cepas sospechosas de ser
Lactobacillus se realizo las pruebas bioquimicas fograndose identificar
Lactobacillus plantarum aislctdo de pepino repollo y repollitas de bruselas
44
fermentados y Lactobacillus brevis de mucosa vaginal y leche fermentada (Ver
Anexos del A al E y Tabla 5)
TABLA 5 Resultado identlficaci6n cepa~
CEPA NOMBRE
1 Lactobacillus planfarum
3 Lactobacillus plantarum
5 Lactobacillus brevis
13 Lactobacillus brevis
15 Lactobacillus plantarum
34 Pruebas para determinar microorganismos probi6ticos
las cepas de Lactobacillus brevis y Lactobacillus plantarum mostraron
rasistencia al medio acido de pH =2 Y sales biliares 03 pv resultado similar al
encontrado por Jacobsen et al 1999 para Lactobacillus plantarum (Ver tabla 6)
45
middot
~~~ttiI lltlmiddot~COX~dtJ ~xtc_~ 2 tr~ k-JlL~middot
-)~~TO DE lJIBUOTECUl rjRL]OTtCA twn GO1IU1
TABLA 6 Resultados a pruebas de resistencia a pH=2 y sales biliares 03 plv
CEPA RESISTENCIA pH=2 RESISTENCfA A SALES BIUARES ()3 pv
1 + +
2 + +
3 + +
4 + +
5 +
6 + +
7 + +
8 + +
9 + +
10 + +
11 + +
12 + +
13 + +
14 +1shy +M
15 + +
16 + +
+1 crecimiento debil
+ crecimiento abundante
46
Figura 6 Lactobacillus brevis Gram + aislado de leche fermentada
Ai observar en placa las celulas de lactobacilos despues de real1zar las pruebas
de resistenCia a la acidez y sales biliares se observo una tendencia a aglomerarse
posiblemente como un mecanismo de proteccion cOlitra estos medios que pueden
lIegar a ser adversos para elias (Ver figuras 7 y 8)
47
Figura 7 Lactobacillus brevis aislada de leche fermentada despu~s de la prueba de resistencia a pH=2
Figura 8 Lactobacillus brevis aislada de leche fermentada despues de la prueba de resistencie asales biUares 03 plv
fI
48
35 --Seguimiento del-pH-en-la-bebidaJacteacon y sin -prebi6tico
A continuacion se muestran las Tablas 7 y 8 donde sa registian los datos
recopilados de pHdurante 10$ dras Z 7 14 Y21 para las bebidas laaeas con ysin
prebi6tioo
TABLA 1 ResultadopH yogur sin avena
Dia Repetition 1 Repetici6n 2 Repeticion 3 Repetici6n 4
2 526 501 51 52
7 446 433 438 44
14 439 435 437 436
21 439 437 438 437
TABLA 8 -ResultadopHyogur con avena
Dia Repeticion 1 Repeticion2 Repeticion 3 - Repeticion 4
2 509 523 51 515
7 447 442 445 442
14 436 -438 439 437
21 432 433 435 434
Observando la Figura 9podamos ver que el pH en el -dfado$ para los dos
tratamientos as igual y empieza a descender rapidamente para estabilizarse a
partir del dra 7(Ver figura 9)
49
Figura 9 Comparacj6n de medias para -el pH
Comparaci6n de medias para pH
55 ~ 5 +----=gtIIIi-~i~~----=-r--it~ -- pH sin avena
a 45 1--~~~~=~~ 4 --- pH con
avena35 t-----r-- -------=------=--= ------- - ----
2 7 14 21
Dias
Aplicando la prueba t para comparar las medias de pH I S6 muestia una diferencia
altamants significativa en los dos tratamientos para el dia 21 (pltO05)
(Ver tabla 9)
TABLA 9 Compaiaci6n de medias para pH
DtAS SIN AVENA CON AVENA te p (VALOR)
2 514 514 0 10
7 439 444 -1 61 0159
14 437 I
438 -070 0510
21 438 433 528 00019 shy
- DiFERENCIA AlTAMENTE SIGNIFICATIVA
50
I
AI aplicar regrasi6n a los datos sa obtiene al modelo estimado
pHSinAyena =535606 - 01505650Ia +0005044340IaI2
La variabilidad en la respuesta de pH asta siendo explicada en un 8S7522 por
el modelo (Ver Anexo F)
EI tratamiento con avena mostro el siguiente modelo al analisis de ragresi6n
pHConAvena =534463 ~ 0140407Dia + 0004480980Ia2
La variabilidad an la respuesta de pH asta siendo explicada en un 903315 par
el nlodelo(Ver anexo G)
36 Seguimiento de la acidezmiddotmiddot expresada comomiddot de acido
lactico
A continuaci6n sa muestran las Tablas 10 y 11 donde sa registran los datos
tecopilados de acidezmiddotdurante los dias 27 14 Y 21 para las pebidas taetees con y
sin prebi6tico
TABLA 10 Resuttadode acidez (expresadocomo acido tactico) yogurt sin avena
CIA R~petici6n1 Repeticion2 Repetici6n 3 Repeticion 4
2 054 06 057 058
7 072 074 073 0]2
14 080 083 082 082
21 0]4 079 078 077
51
TABLA 11 Resultado de aCidez (expresado como acido Icktico) yogurt con avena
Dia Repetici6n 1 RepetiCi6n 2 Repetici6n 3 Repetici9n 4
2 059 055 058 057
7 071 073 072 072
14 089 087 088 086
21 092 091 090 091
Observando la Figura 10 se puede concluir que la acidez empieza a aumentar
hasta el dia 14 y luego trata de estabilizarse para los dos tratamientos
(Ver figura 10)
Figura 10 Comparaci6n de medias para la acidez
N G)
Comparacion de medias para acidez
1
2 0I 5 -+--=--------=-~~~= u
ltC
- Acidez sin avena
2 7 14
Dias
52
21
-it- Acidez con avena
Aplicando la prueba t para camparar las madias de acidez se muestra una
diferencia altarnante significativa en los dos tratamiantos para los dias 14 y 21
(pltO05)
(Var tabla 12)
TABLA 12Comparaci6n de medias para Acidez
DIASmiddot SIN AVENA CON AVENA te p(VALOR)
2 0572 0572 0 10
7 0727 0720 119 0278
14 0818 0875 -638 000070shy
21 077 091 -1212 i 0000019 shy
DIFERENCIA AL TAMENTE SlGNIFICATIVA
AI aplicar r~gresi6n a los datos se obtiene el modelo estimado
AcidezSlnAIena = 0491897 + O0436032Dia O00144613DfaA2
La variabilidad en la respuesta de acidez asta siendoexplicada en un 970978
por al modelo (Ver anexo H)
EI tratamiento con avena mostro elsiguiente modeloj a1 analisis de regresion
AcidezConAvena = 0491638 + 00406572Oia - OQOO982559OiaA2
La variabilidad enla respuesta acidez esta siendo explicadaen un 99212 por
el modelo (Ver anexo J)
53
I ~
37 Prueba de viabiJidad
A continuaci6n sa muestran las Tab~as 13 y 14 donde sa presentan los datos
recopilados del recuento de Lactobacilos durante los dias 7 14 Y 21 para las
bebidas lacteas con y sin prebi6tico
TABLA 13 Recuento de Lactobacilos (UFCml) yogurt sin avena
Dia Repetici6n 1 Repetici6n 2 Repeticion 3 Reptttici6n 4
7 1880X10l1 1454X1011 1642X1011 1780X10~
14 1560X10~ 646X1011J 1890X10l 140X10l1
21 1200x10lu 128Ox10u 1745x10J 1520x101V
TABLA 14 Recuento de Lactobacilos (UFCml) yogurt con avena
Dfa Repetieion 1 Repetici6n 2 Repeticion 3 Repeticf6n 4
7 1600X10lt 1240X10t 1640X10ll 1980X10t
14 540X1011 427X10n 546X10n 720X10ll
21 500x1011 492x1011 712)(1011 980x10~
AI analizar la Figura 11 sa puede observar un recuento mayor de Lactobacilos
en al tratamiento con avena resultado de acuerdo a 10 encontrado por Alander at
aI 1999 Kontula et aI 1998 y Jaskari et aI 1998
54
Figura 11 Comparaci6n de medias para Log Lactobacillus
Comparacion de medias para log Lactobacillus
~ 1350
-+- Sac Sin--() 13 co avenaIII
bull 125 -- Bac con 0)
0 12 avenaJ
115 7 14 21
Dias
Aplicando la prueba t para comparar las medias de recuento de Lactobacillus no
se encontr6 una diferenc1a estadfsUcamente significative entre los dos
tratamientos (Ver tabla 15)
Este aumento en al racuento influy6 en la disminuci6n del pH y en el aumento de
fa aeidez por la fermentacion que realizan los Lactobacillus sobre fa lactosa de la
lache y la avena adicionada como prebi6tico
55
1
TABLA 15 Comparaci6n medias lag Lactobacillus
DIAS SIN AVENA CON AVENA tc p(VALOR)
7 122257 122022 04846 06451
14 121065 132393 -19602 00977
21 129025 133087 -08236 04416
At aplicar regresion a los datos se obtiane al modelo astimado
LactobacillusSinAvena= 117347 + 004834640Ia
La variabilidad en la respuesta del recuento de LactobaCillus ssta siendo
explicada en un 260054 por el mod$loVar anexo J)
EI tratamiento con avena mostr6 al siguiente modalo al anal isis de regresion
Lactobacillu$ConAvena =118103 + 007903040Ias
La variabilidad en la respuesta de recuento esta siendo explicada en un 3068
por al modelo(Ver anexo K)~
38 Analisi$ microbiol6gicos de las bebidas lacteas con y sin
En la Tabla 16 estan recopilados los resultados microbiol6gieos obtenidos en ras
muestras con los dos tratamientos (con y sin avena)
I [
sa
TABLA 16 Resultados analisis microbiologico
Recuento de mohos y levaduras Iml lt10
Recuento de Staphylococcus coagulase positiva Iml lt100
NMP coliformes fotales y Escherichia coli Iml lt3
Presencia de Salmonella25ml Ausente
Los resultados de este analisis demuestran que las bebidas fermentadas con y
sin avena~ astan fibres de microorganismos patogenos
57
1
4 CONCLUSIONES
Se aislaron cepas nativas de Lactobacillus plantarum de las muestras vegetates
de repollo pepino repollitas de bruselas fermentadas y Lactobacillus brevis de
lache fermentada y mucosa vaginal humana Ambas cepas resistieran un pH=2 y
una concentraci6n de sales biliares det 03 ptv dos earacteristicas importantes
en los probi6ticos
Lamiddot cepa de Lactobacillus brevis aislada de lache Sa utiliz6 para elaborar una
bebida fermentada sin y con avana comoingrediente prebiotico obteniendose un
aJimento centon recuento del probi6tico viable durante 21 dras de seguimiento
ademas libre de microorganismos )at6gen05
No se encontr6 efecta significativo de la avena sobre Ie viabilidad del Lactobacillus
brevis aunque sa presento un aumento en 61 recuento de estos en la bebida con
avena
58
plusmn ~
5 RECOMENDACIONES
Ensayar la cepa de Lactobacillus plantartJm en productos carnicos madurados
como el salami
Ensayar la cepa de Lactobacillus l)revs en otros derivados lecteos como queso
quesito queso crema
Continuar con el estudio de estos microorganismos y caracterizarlos
molecularmente ademas de estudiar su capacidad de adherencja a fa mucosa
intestinal sobre algunes Hneas celulares como las CaCo~2
Estudiarel efedo de la avena sabre la viabiJidad del Lactobacillus breyis a una
concentraci6n mayor de 05
Realizer ensayos can las cepas de Lactobacillus brevis y Lactobrlcillus pJantarum
para elaborar masas acidas para panificacion reemplazando el Bromato de
Potasio aditivo prohibido desde marzo del 2003 en nuestro pais per 5U toxicidad
59
REFERENCfAS BIBUOGRAFICAS
ALANDER M SATORAKI R KORPELA R (1999) Persistence of colonization
of human colonic mucosa by a probiotic strain Lactobacillus rhamnosus GG En
Applied and Environmental Microbiology Vol 65 pp 351-4
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ANEXOS
66
ANEXO A RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AlSLADA DE i
PEPINO it
Referencia Pepino 1 Fecha 06122002
IEXCELENTE IDENTIFICACION
Latto plantarum 1
Galeria API 50 CHL V50 Leida el 06122002
Perfil - -- - ++ - -- - ++++ - - -+- + - I I I I I I I I +t+ - +f- ~ - - + + ~ - - - +- + - shy
o - GLY - ERY DARA - LARA + RIB + DXYL - LXYL - ADO - MDX - GAL + GLU + FRU + MNE + SBE - RHA - DUL - INO bull MAN + SOR - MDM + MUG shyNAG + AMY + ARB + ESC + SAL + CEL + MAL + LAC + MEL + SAC + TRE + 1NU - MLZ + RAF + AMD - GLYG - XLT - GEN + TIJR + LYX - TAG - DFUC shyLFUC - DARL + LARL - aNT + 2KG - 5KG shy
--- Taxones significativos rd -----T -- Tests en contra
Lactoplantarum 1 999 092 1
Taxon siguiente Lactobrevis 1 OJ 044 3
i i
Lactoplantarum 1 1 test (5) en contra
D-SORBITOL (SOR) 78
Tax6n siguiente Lactobrevis 1 3 test (s) ert contra
METHYLD-MANNOSIDE (MOlM) 0 MELEZITOSE (MLZ) 14 D-TURANOSE (TUR) 14
67
ampb
ANEXO B RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AISLADA DE REPOLLO FERMENTADO
~
Referencia Repollo fermentado - 3 Fecha 03072003
EXCELENTE IDENTIFICACION
Lactoplantarum 1
Galena API 50 CRL V50 Leida el 03072003
Perfil - - ++ - - - - -H++ - - ~ + - + - I I 1 I I I I -H+ - ++ - - - + + - -- - - + - shy
o - GLY - ERY - DARA - LARA + RIB + DXYL - LXYL - ADO ~ MDX - GAL + GLU + FRU + MNE + SBE ~ RHA - DUL - INO - MAN + SOR - MDM + MDG shyNAG + AMY + ARR + ESC + SAT + CRL + MAL + LAC + MEL + SAC + TRE + lNU - MLZ + RAF + AMI) - GLYG - XLT - GEN + TOR + LYX - TAG - DFUC shyLFUC - DARL - LARL - GNT + 2KG - 5KG shy
------Taxones significativos _ _----- Id--- ---T---- Tests en contra
Lactoplantarum 1 999 095 1
Tax6n siguiente Lactobrevis 1 01 OA8 3
lJactoplantaru01 1 1 test (s) en contra
DSORBITOL (SOR) 78
Taxon siguiente Lactobrevis
METHYL-D-MANNOSIDE D-TURANOSE
1
(MOM) (TOR)
3 test (5) en contra
0 MELEZITOSE 14
(MLZ) 14
i
I
68
ANEXO C RESULTADO PRUEBAS BIOQUWICAS DE CEPA AISLADA DE MUCOSA HUMANA
Referenda Mucosa - 5 Fecha 27012003
BUENA IDENTlFICACION
Galeria API 50 CHL vso Leida el 270112003
Perfil - - - - +t--t - - - + - + - - - - - - - - -+- - - - - + - + - - - - - - - - - - - - - bull - - -+ - +
o - GLY ~ ERY - DARA bull LARA + RID + DXYL + LXYL - ADO bull MDX - GAL + OLU - FRU + MNE - SBE - IlliA - DUL - INa - MAN - SOR - MDM - MOO shyNAG + AMY - ARB - ESC ~ SAL bull CEL - MAL + lAC - MEL + SAC - TRE shyINU - MLZ - RAF - AMD - GLYG - XLT - GEN - 11JR - LYX - TAG - DFUC shyLFUC - DARL - IARL - ONT + 2KO - 5KG +
- - - - - - Taxones significativos - - - - - - - Id T -- Test en contra
Lactobrevis 3 963 088 1
Taxon siguiente Lactoco11inoides 36 075 2
Lactobrevis 3 1 test (s) en contra
GLUCOSE (GLU) 95
-~~~------------~---------------------------~--~-------~--~-----~----------~--------~------------~~--Taxon siguiente Lactocollinoides 2 test (s) en contra
GLUCOSE (GLU) 100 MELIBIOSE (MEL) 25
69
i r
ANEXO D RESULTADO PRUEBAS BIOQIJiMICAS DE CEPA AISLADA DE LECHE FERMENTADA
Referenda Leche fennentada ~ 13 Fecha 27012003
BUENA IDENTIFICACI6N
Galeria API 50 CHL V50 Leida el 270112003
Perfil - - - - -t-t+- - - - + - + - - - bull - - - - -+- - - - - + - + - - - - - - - - - - - - - - - - -+ - +
0 - GLY - ERY - DARA - LARA +Rll3 + DXYL + LXYL - ADO - MDX ~GAL + GLU - FRU + MNE SBE - RHA DUL bull INO MAN - SOR MDM bull MDG shy
~NAG + AMY - ARB - ESC - SAL - CEL - MAL + LAC - MEL + SAC - TRE I lNU - MLZ - RAF - AMD - GLYG - XLT - OEN - IUR LYX - TAG - DFUC bull i
LFUC - DARL - LARL -ONr + 2KG - SKO + 1
- -- - - Taxones significativos - - Id -- T --- Test en contra
Lacta brevis 3 963 088 1
Taxon siguiente Lactocollinoides 36 075 2
Lactobrevis 3 1 test (s) en contra
GLUCOSE (GLU) 95
-----------------------------------------------------------~------------------------------~-------------------Taxon siguiente Lactocollinoides 2 test (s) en contra
GLUCOSE (GLD) 100 MELffiIOSE (MEL) 25
70
II iJ1
I
I ANEXO E RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AISLADA DE REPOLLITAS DE BRUSELAS FERMENTADA
Referencia repollitas de bruselas 15 Fecha 03072003
EXCELENTE IDENTIFICACION
Lactoplantarum 1
Galeria API 50 CHL vsO Leida el 03072003
Perfil - - - - +t - - - - +H+ - +- - +t + - I I I I I I I f ++t - + - - - -+ + - - - -+ -+ - - I ij
o - GLY - ERY - DARA - LARA + RJB + DXYL - LXYL - ADO - MDX - GAL +
GLU + FRU + MNE + SBE RHA + DUL - INO - MAN + SOR + MDM + MOG shyNAG + AMY + ARB + ESC + SAL + eEL + MAL + LAC + MEl + SAC + TRE + i
I1NU - MLZ + RAF AMD GLYG - XLT - aEN + TUR + LYX - TAG - Druc LFUC - DARt + LARL - aNT + 2KG - 5KG shy n ----Taxones significativos ------ Id Tests en contra
Lactoplantarum 1 999 090 o
Taxon siguiente Lacto pentosus 01 012 7
Lactoplantarum 1 o test (s) en contra
Taxon siguiente Lacto pentosus 7 test (8) en contra
GLYCEROL (GLY) 75 D-XYLOSE (DXYL) 100 L-RHAMNOSE (RHA) 25 METHYL-D-MANNOSIDE (MOM) 1 MELEZITOSE (MLZ) 25 RAFFINOSE (RAF) 75 D-ARABITOL (DARL) 0
71
~
I i I
ANEXO F - ANALISIS DE REGRESION PARA pH EN BEBIDA SIN AVENA
Aruilisis de regresi6n polinomial
---~-~-------------------------------------------~-----------~~---------------------~--------------Variable dependiente pHSinAvena ---------------------------~-------------~--------------------~---------------------------------
Error T Parametro Estimado Estandar Estadistico P-Valor
CONSTANTE 535606 0094535 56657 00000 Dia -0150565 0020706 727154 00000 Dia2 000504434 0000871488 578819 00001
---~---------------------------------------------------------------------------------------------------
Anfllisis de Variama -------------------------------------------~-----------~-----------------------------~-~--- jSource Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor 11
------------------------~------------------------------------------------------------------------------~ Mod-elo 155772 2 0118861 4256 00000 Residual 0237877 13 00182983
Total (Corr) 11956 IS
R2 == 867522 percent
pHSinAvena == 535606 - 0150565Dia + 000504434Dia2
72
____
middot ANEXO G - ANALISIS DE REGRESION PARA pH EN BEBIDA CON AVENA
AmUisis de regresion polinomial _____~_____~__-_____~___4____________________bull____bull__________bull_____________~~----_------___________
Variable depcndiente pHConA vena ------------------------------------------------------------------------------------------~--------
Error T Parametro Estimado StAndar Estadfstico P-Valor
---------------------------------------------~-----------------------------------------------_---------CONSTANTE 534463 00801045 667208 00000 Dia -0140407 00175453 800253 00000 DiaA 2 000448098 0000738458 606803 00000
----------------------~---~-----------------------------~------------------------------~----AmUisis de Varianza
---~---------------------------------~---------------------~------------~-------------------~------Source Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio PValor --------------------------~-----------------------------------------------~------------~-----~~--~ ModeJo 159575 2 0797873 6073 00000 Residual 02170798 middot13 00131383 _______~_~ ~_~----------~------~--~-----~-M-----~-----____ _____________~-----------------------Total (COlT) 176654 15
R12 903315 percent
-----------~------------------------------------------------------------------------~-----------pHConAvena 534463 - 0140407Dia + 000448098DfaA 2
73
ANEXO H - ANALTSIS DE REGRESTON PARA ACIDEZ EN BEBJDA SIN AVENA
An8Jisis de Regtesi6fi P6lifJomial
Variable Depefidiefile~ AcidezSinAVenll _______________w_____~______~________________~-----------_________~_________________~~____~___~_____
Error T Pariirnetro Estimado Estandar Estadistico ---------------------------------------~--------------~-~-------~--------------------~------------CONSTANT 0491697 00123217 399051 00000 Dia 00436032 000269882 161564 00000 D1a2 -000144613 000011359 127312 00000 __w___~________________________~-_______-_____~----____________________________~__~---~_--__~___
AriiiJisis de varianza ~_~__~__________~_~____~________~___________- _________e_____________________________bull _____-________
Source Smn de cuadr Df Mean Square F-Ratio PmiddotValor_~~___________________________________bull ______~___________bull ____________bull ______~________w________________
Model 0135203 2 00676013 21747 00000 Residual 000404118 13 000031086
Total (Corr) 0139244 15
R2 970978 percent
AcidezSlnAvena 0491697 + O0436032Dia - 0OOl44613Dia2
74
I
ANEXO I ANALISIS DE REGRESION PARA ACIDEZ EN BEBIDA CON AVENA
1
Anwisis de tegtesi6fi polinomial
Variable dependiente Acidez Con Avena
Error T ParametTo Estimado Stlindar Estadfstico P-Valor ----------------~-------~---------------------~-----------------------------------------------------CONSTANT 0491639 000926607 530578 00000 Diamiddot 00406572 000202955 200326 00000 DfaA 2 0000982559 0000085421 -115025 00000
-------------~----------------------------~-------------------------~-----------------------------------
-------------~-----~~-----------------------------~---------------------------------------------_--Source Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio PValor
-~-------------~----------------------------------~------------------~~-------------------------- Modelo 0288008 2 0144004 81914 00000 Residual 000228539 13 0000175799
----------~~--------------~---------------------------------------------~---------------------------Total (Corr) 0290294 15
RA2 = 992127 percent
-------------------------~----~---~------------~---------------------------------~---------------~
AcidezConAvena == 049163amp + 00406572D1a - 0000982559DiaA2
75
I
(Ilmiddot il
ANEXO J- ANALISIS DE REGRESION PARA RECUENTO LACTOBACILOS PARA BEBIDA SIN AVENA
Amilisis de regresion - Modelo lineal Y = a + bX
------------------------~----------------------~-----------------------------~----------~-----------Variable Dcpendiente LactobacilJusSinAvena Variable independiente Dia
I--------~----------~-----------------------------------~-------~-~--~--------------------------~-Error T
Paramctro Estimado Standard Stadistico P-Valor
----~----~------------~-----~-----------------------~-------------~-----------------------------Intereepto 117347 0389973 300911 00000 Pendiente 00483464 00257889 18747 00903
Analisis de Varianza
---------~------------------~----------------~---------------------------------~---------~----------Source Sum decuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor
------------~---------------------~---------------------~--------------------------------~-----~----Modelo 0916252 1 244835 443 00616 Residual 260706 10 0260706
--~------------~---~------------------~~~-----~-------~---------~~-------------------------------------Total (Corr)352332 11
Coeficiente Correlaci6n = 0509955 R2 = 260054 percent
LactobacillusSinAvena= 117347 + 00483464Dfa
76
ANEXO K- ANALTSIS DE REGRESION PARA RECUENTO LACTOBACILOS PARA DEBIDA CON AVENA
Aruilisis de regresion - Modelo lineal Y = a + hX
Variable Dependiente LactobacillusConAvena Variable Independiente Dia ---~--------------------------------------------------------__-----------__--_--_-----------shy
Error T Paramctro Estimado Standard Estadistico P-Valor -~--------------------------------------------------------------------------------------------------
Irttercepto 118103 0567963 207942 00000 Pendiente 00790304 00375594 210414 00616
-----------------~----------------------------~----~-------~----~----------------------------
Analisis de Varianza
----------------~----------------~------------------~--------------------------~------~--------shySource Swn de cuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor
-----------------~--~--------------------------------------------------------------------------~---~ Mode10 244835 1 244835 443 00616 Residual 552997 10 0552997
Total (Corr)797832 11
Coeficiente Correlacion = 0553964 RI2 = 306875 percent
-----~--------------------------------------------------------~--------------------------------------
LactobacillusConAvena = 118103 + 00790304Dfas
77
gastrointestinal (Holzapfel at a2001Gaitan at al 1998) p~r 10 tanto es
necesario consumir alimantos en los que se encuElntren estos mrcroorganismos
viables estos hacen parte de I~micfobiota de vegetales y leches interviniendo en
Ie fermentaci6n natural de estos~ntos
112 Microorganismos Probi6ticos
los microorganismos probi6ticos que tradicionatmente se han adicionado a la
tache para fermentarla y obtener yogurt y kumis a como suplementos pertenecen
a los generos Lactobacillus Enterococcus y Bifidobacterium (Ver tabla Nro 1) Sin
embargo se considera que solo algunas especies de los gelnsros Lactobacillus y
Bifidobacterium sobreviven en el tracto gastrointestinal En la tabla 1 58 muestran
algunas de estas especies
TABLA 1 Algunas especies microbianas probi6ticas
Lactobacillus Sifidobacferium Enterococcus
L acidophilus
L JohnsoN
L casei
L rhamnosus
Lgrasseri
L reuten
L plantarum
B bifidum
Blongum
B infantis
E fsecium
E faecalis
Fuente Gaitan et a 1998A
15
EI eonoeimiento a cerea de sus efeetos beneficos en el consumidor por su alta
viabilidad en el intestino como la producci6n de sustancias con aetividad
antieaneerigena el mejoramiento ltfel sistema inmunol6gico y el deSplazamiento
de la mierobiota pat6gena gastrointestinal en el consumidor ha estimulado una
mayor demanda de estos microorganismos como tambian de los productos que
los contienen (Heller 2001 Parada middot1998)
Existsn otros produetos fermentados de origen vegetal como et tampe col acida
y salsa de soya de los euales sa pueden aislar estos organismos probi6tieos
comp tambien de la mucosa intestinat humana y luego de suministrarlos a
ratones sa han comprobado sus caracteristicas beneficas (Molin 2001)
113 Caracteristicas fenotfpicas de algunos microorganismos
probi6ticos
las bacterias aeido lacticas de los generos Lactobacillus y Bifidobacterium son
consideradas probi6tieos y tradicionalmente se han clasificado con base en Sus
propiedades morfol6gicas crecimiento a diferentes temperaturas capacidad
fermentadora de glucosa y otros carbbhidratos y la configuraci6n del Bcido Jaetieo
producido (Holzapfel etal2001)
16
)lli~ h Dx nIILIOTECM
eJDe~~ l1ilmfJ tIDBnm
Los Lactobacillus son bacilas gram positiv~s no esparuladas aerotalerantes
acido - tolarantes estrictamente fermentadares formadores de Boido laclica como
producto principal catalasa negativo carentes de citocroma sin embargo se
presentan excepciones a esta descripcion parque afgunas especies pueden
formar catalasa 0 citacramo en medios que contienen hematina 0 compuestos
relacianados La produccion de catalasa no hema pseudocatalasa puede causar
tambien alguna confusion en fa identificacion de algunos Lactobacillus
las especies del genera Bifidobacterium san bacilos gram positivos no
esporulados generafmente anaerabios estricto$ aunque pueden creeer bajo
condiciones microaer6filas cuando estan ert presencia de C02 La mayorfa de sus
especies se pueden diferenciar par criterios biaquimicos simples como la
fermentacion de L arabinosa DmiddotxiJasa O-manosa O-manita y O sorbitat que
pueden servir coma caracterist1cas clave para su clasificacion (Holzapfel
etal2001 )
114 Caracteristicas de los probi6ticos
Las cepas de microorganismos prabi6ticos deben presenter y mantener unas
caracteristlcas que garanticen su crecimienta y supervivencia En el alimenta
como tambiEm durante su transito a traves del est6maga e intestino delgaQo
17
La primera CBtacterfstica es que sean viables esta viabifidad esla capacidad que
tienen los microorganismos probi6ticos de permanecer vivos tanto ~n el alimento
como en el Intestino del consumidor por un tiempo determinado En Colombia se
ha establecido que en bebidas fermentadas este tiempo debe ser minimo de 21
dras en el alimento (Minsalud 1986) Esta vjabilidad depende del metodo de
produccion y de la cepa utilizada (Tuomols at a 2001)
Luego de que se garantice que estos microorganismos eslan viVos en el alimento
ell os deben cumplir otro criterio importanle para ser considerados como
organismos probi6ticos y as tblerar las condiciones de acidez a un pH=2 y la
sccian de proteasas del est6mago ademas de sobrevivir y creeer en presencia de
acidos biliares (Tuomola et al 2001 Jacobsen at a 1999) para luego de
sobrevivir a estas condiciones adherirse a la mucosa intestinal y de esta manera
estimular al sistemainmunoJ6gico esta capacidad de adherirse a la mucosa es un
prerrequisito para la colonizacion del intestlno (Toumola etal2001 Alander et aI
1999)
Cuando los probioticos han pasado todas esta pruebas de supervivencia y luego
de impfantados en la mucosa producen acidos organicos peroxido de hidrogeno y
tambien bacteriocinas que actUan como inhibidore$ del crecimiento de
microorganismos patogenos u oportunistas (Tuomola at al 2001 Cintas et al
2000) complementando de asta manera su accion benefica sobre la mucosa
intestinal y en general sobre la saJud del huesped
18
116 Berieficios de los microorganismos probi6ticos
Los beneficios que se asocian a los microorganismos probioticos son muchos y
variados Entre ros comprobados mediante estudios se eneuentran
1151 Facilitar la digesti6n de la lactosa
los microorganismos probioticos cuando estan en el intestino liberan alii la
enzima pmiddotgalaotosidasa capaz de hidrolizar la lactosa haste glucosa y galactosa
evitando as que personas intolerantes a este carbohidrato presenten sfntomas
como flatulencia dolor abdominal y diarrea cuando consumen leche (be Vresse
et 81 2001)
1152 Protegen contra enfermedades gastrointesUnales
EI consumo de aJimentos con probioticos ha mostrado efeeto terapeutico frente a
los sintomas de diarrea asociada al surninistro de antibi6tico$ de amplio espectro
que destruye 0 disminuye la microbiota endogena esta imp ide la coJonizacion de
bacterias patogenas como Klebsiella oxytoca y Clostridium difficile que pueden
causer lesiones en el cn Los probi6ticos recuperan el balance de la microbiota
intestinal nativa y avitan Ie adhesion de algunos virus bacterias pat6genas a
parasitos que pueden ser agentes causales de gastroenteritis la diarrea del
19
J
viajero y 1(3 inflarnacion intestinal que en ultima instaneia oeasionan ef sfndrome
del colon irritable (Marteu et al 2001)
1153 Protegen contra infecciones del tracto urogenital
La vaginitis indueida por baeteriss yo por levaduras as una infecci6n
estrechamente relacionada con la exposici6n a antibi6ticos y espermicidas y
tambien depende del estado hormonal de la n1ujar Con al uso de mezcJas de
probi6ticos se han obtenido buenos resultados en la rastauraci6n de la rnicrobiota
natural urogenital benefica que desplaza a los eausantes de la inflamaci6n de Is
vagina y Ie uretra (Reid 2001 )
1154 Promueven la barrera de defensa end6gena del intestino
EI tracto gastrointestinal normal mente as una barrera natural contra anUgenos de
origen microbiano y alimentario Cuando los probi6ticos sa adhieren a Is mucosa
intestinal estimulan 0 potencian al sistema inmune favoreciendo la
inmunomodulaci6n que induce un aumentb de fa producci6n de inmunoglobulinas
activacion de las calulas mononueleares y de los linfocitos para proteger al
huesped de infeeciones (Isoulari et sl 2001)
20
1155 Protegen contra cancer de colon
EI cancer es el resultado de una serie de mutaciones somaticas que pueden
ocurrir durante al tiempo de vida del individuo y 10 padeca buena parte de la
poblacion mundial los probi6ticos en un sistema in vitro han demostrado un
efecto positivo en la prevenci6n de mutaciones aI desactivar carcin6genos
genotoxicos (Wolloswski et al J 2001)
1156 Protegen contra infecciones respiratorias
Sa ha demostrado que el conslJlno de probi6ticos disrninuye la incidencia de
infecqiones raspiretorias al aumentar la actividad fagocitica de maer6fagos
alveolares que aettian sobre microorganismos patogenos Se hizo un estudio en
571 ninos sanos con edades entre uno y seis anos divididos en dos grupos a uno
de ellos sa las incluy6 en su dieta leche suplementada can Lactobacillus GG y a
los otros ninos leche no suplementada AI final del estudio se observ6 una
disminucion del 19 en la incidencia de infeccionas respiratorias tratadas con
antibi6ticos tales como otitis media sinusitis bronquitis y neumonfas en el grupo
de los ninos que consumieron Lactobacillus GG (Hatakka et al 2001)
Alvarez et al (2001) encontraron que la administraci6n de yogurt con Lactobacillus
casei en ratones de tres arios de edad majora los espacios libres del puJrn6n de
la presencia de Pseudomona aeruginos8 induciendo un aumento
21
significativo en los niveles de gA a IgM datactadas en los lavados
broncoaJveolares y se observ~ un afecta dependiente de la dosis
1157 En el tratamientoy prevenci6n del eczema
Se ha encontrado que el consumo de probi6ticos mejora la inflamaci6n alergica 0
eczema at6pico en ninos alimentados con formula suplementada con probi6ticos
Encontraron una mejora significativa al suministrar Bifidobacteriummiddot actis y
Lactobacillus GG en 27 niiios con edad promedio de 46 meses Luego de aplicar
este tratamiento se sometieron a una prueha de SCORAD (mide fa extension y
gravedad del eczema) registrando una meJoria significatlva en las condiciones de
la pie concentraci6n de citoquinas cirClllantes an sueto y moleculas de adhesi6n
a las superficies de las celulas soJubles en suero (Isolari 2000)
Se realizaron otros estudios a 159 mujeres embarazadas con historia familiar de
eczema atopico de primer grado a las cuafes sa res 5uministro dosis diarias de
Lactobacillus GG durante 2 a 4 samanas previas al parto Oespues de ella fa
madres twiaron la opci6n de continuer tomando el ptobi6tico si amamantaban 0
bien darseio vIa oral La mayoria de las madras eJigieron dar las dosis at bebe
diariamente A los dos anos de vida se observ6 una disminuci6n del 50 en la
frecuencia del eczema at6pico en aquellos nHies que se les dio ef probi6tico
(Kalliomari etal 2001)
22
1158 Previenen infeccion en heridas quirurgicas
Los probi6ticos impiden la union de pat6genos a las superficies celulares en
heridas mediante la seCreci6n de proteinas Actuamente se encuentra en
estudio la aplicaci6n del Lactobacillus fermentum vivos sabre heridas en piel de
ratas y se ha encontrado una disminuci6n del 90 en la colonizaci6n par parte del
StaphylococcuS aureus uno de los patogenos mas temidos y de mayor lncidencia
en infecciones hospital arias mas aun se esta contempiando la posibilidad de
utilizar la protein a purificada an lugar de los mjcroorganismos para la protaccion
contra infecciones en heridas (Strauss 2000)
12 PREBIOTICOS
Son carbohidratos de cadena corta algunas veces reconocidQs como
oligosacaridos no digeribles par las enzimas del epitelio intestinal 0 de las
gliJnduJas anexas debido a su estructura quimica y de esta manera lIegan al
intestino grueso donde alcanzan a estar disponibles para la fermentaci6n por las
bacierias sacaroHticas que son especial mente laetobadlos y bifidobacterias
dando odgen a compuestos que ejercen efectos funcionales sobre la mucosa del
tubo digestivo (Brunser 2001)
Se consideran como tal algunos fructocligosacaridos isomaltooligosacariclos
oligomato palatinosa poHdextrosa pOJidextrrna raftilina y algunos oligosacaridos
23
)
de 1a soya y fa avena Estenmiddot presentes en alimentos como Ie cebolla ajo
banano puerros 1 derivados del trigo achicoria esparrago alcachofa (Cummings
etal 2001)
Algunos de estos prebi6ticos cuanda son incorporado$ a fa dieta en cantidades
dalerminadas alteran la microbiota intestinal disminuyendo los recuentos de
coliformes bacteroides y cocos y aumentando las bifidobacterias hasta en diez
veces ademas modifican la actividad metab6lica del coron logrando una
disminuci6n del pH y un incremento en el contenido fecal de acidos grasos de
cadena corta como at acatica propi6nico y butfrico El butirato aumen~ _I grosor
de la pared del coron e intestino delgado estimula eJ crecimiento de la mucosa del
colon y auManta su flujo sangufneo inhibe el crecimiento de tinsas tumorales
epiteliales de origen co16nico induce la diferenciaci6n de sus celulas y a
apoptosis entre otros(Brunsar 2001)
Eh estudios hechos en simuladores del intestino humano utilizando productos de
avena fermentados se encontro que estimularon al crecimiento tanto de
lactobacios como de bifidobacterias y en el caso de estas ultimas se incremento
la producci6n de los acidos acatico propionico y butfrico 10 que incide sobre la
implantacion de probi6tico$ e inhibe al crecimientos de otro tipo de
microorganismos (Alal1der eta1999 Kontula etal 1998 Jaskari etal 1998)
24
~ -1
(
AI comparar el comportamianto de las leches de diferente origen se ha
demostrado que Ie leche de vaca contiene caseinatos sustancias que forman
buffer ~n et intestino e inlpiden que los probi6ticos disminlJyen el pH del intestina
y de esta manera se impide al efecto deseado que es evitar fa proliferaci6n de
otros microorganismos entre los cuates pueden estar algunos patOganos En la
leche materna sa encuentran algunos carbohidratos como glucosa galactosa n
acetilglucosamina y algunos 0lig6meros de Ie fucosa en cOhoontracionesmiddot
importantes los cualeS favoreceh el crecimientc)middot de probi6ticos esto
complementado can 91 bajo contenido de protenas que se traduce en una
reducida capacidad buffer hacen de Ie lache materna IJn alimentd adecuado para
nllios en su etape de lactancia
Algunos prebi6ticos como 1a lactulosa yciertos compuestos que contiansn fructosa
no son digeridos en el intestino humano y pueden sar utilizados selectivamenta
par los probi6ticos 10 que hace que los probi6ticos en combinaci6n can prebi6ticos
pueden lIegar a ser un importante medio para prevenir algunas enfermedades del
tracto gastrointestinal (Bezkorovainy 2001)
25
2 METODOlOGfA
21 LOCALIZACION
EJ trabajo sa realizo en el laboratorio de Microbiologia y la planta da laches de Ja
Universidad Naclonal de Colombia- Secie Medellin
En al laboratorio se hiZQ al aislamiento a identificaci6n de fa capas y en fa Planta
sa eJaboro la leche fermentada con 1a cepa seleccionada y el prebi6trco
22 METODOS
221 Aisiamiento de cepas nativas
Las cepas nativas se sislaran de producto$ vegetales leches fermentadas y
mucosa vaginal humana
2211 De vegetales
Las muestras vegetales de repollo repollitas de brusefas y pepino se
seleccionaron porcionaron y mezclaron can cloruro de sadio al 10 pIp se
calacaron en un recipienta de vidrio balo anaerobiosis y sa dejarQn por 15 dias
26
luego S9 tomaron 3 ml de cada muestra y se jnocularon 9 ml de caldo MRS (Man
Rogosa and Sharpe) se incubaron a 37deg C durante cinco dias en camara de
anaerobiosis (Ver Figura 1) Oespues de este tiempo sa inocularon cajas de petri
con agar MRS con 1 ml del cultivo microbiano y se incubaron bajo las mismas
condiciones que eJ caldo Este procedirniento se realiz6 rapetidas veces hasta
seleccionar la cepa pura mediante observaci6n de caracteristicas morfologicas de
la cOlonia y a cada colonia se Ie practico la coloracion de gram con el fin de
observar las caracteristicas microscopicas de cada una e identificar las de mayor
similitud a los Lactobacilos y Bifidobacterias
Figura 1 Camara de anaerobiosis
27
2212 De la leche
Sa tomo 200 ml de teche cruda de la planta de leches y se colaca a fermentar
baja anaerobiosis durante 15 dras Luego sa procedia como en los vegetales
2213 De mucosa vaginal humana
Se tomo una muestra de frotis de mucosa vaginal humane can capito esteril sa
puso a ncubar en Caldo MRS y se procedi6 camo en 2211 y 2212 A cads
aislado sa Ie practico la coloracion de gram y sa seleccionaron aquellas que eran
bacilos gram positivos (Ver Tabla 2)
28
TABLA 2 Fuente de aislarniento de cepas nativas
CEPA FUENTE
1 Pepino fermentadQ
2 repollitas de bruselas fermentadas
3 Repolltgt fermentado
4 Repollo fermentado
5 Mucosa va~inal humana
6 Mucosa vaginal humana
7 repollitas de bruselas fermentadas
8 Repollo fermentado
9 repollitas de bruselas fermentadas
10 Mueo~a vaginal humana
11 Repollo fermentado
12 RepolJo fermentado
13 Leche fermentada
14 Mucosa vaginal humana
15 repollitas de bruselas fermentadas
16 Repollb fermentado
29
222 Almacenamiento de las cepas aisladas
Cuando las cepas crecieron en agar MRS homogEmeas en color morfologia
coloraci6n de Gram etc se pssaron a agar inclinado en tuba se cubrieron con
aceite mineral y se guardaran en refrigeraci6n a 4deg C para tomar de alii la cepa y
efectuarle las diferentes pruebas para confirmar el genera y determinar la especie
de cada una de eas (Ver Figura 2)
Figura 2 Cepas en tubos con agar inclinado
30
223 Pruebas para determinar et genero
2231 Coforaci6n de Gram
A cada cepa sospechosa de Lactobacilos se 1e hizo la coloraci6n de gram y se
seleccionaron las gram positivas
2232 Morfologfa
En agar MRS y despues de incubar en anaerobios~s crecian colonias grandes
cremosas de color beige con bordes homogeneos y c6ncavas(Ver Figura 3)
Figura 3 Colonias aisladas en agar MRS
31
2233 Prueba de esporulaci6n
A cada cepa aislada se Ie hizo esta prueba la cuel consistia en incubar en
aerobiosis durante ocho dias las cajas de agar MRS donde crecieron colonias de
Lactobacilo$ y luego se les (ealize) coloraci6n de espora Las capas que dieron
negativa a la prueba de espora se considararort sospechosas de sar Lactobacilos
y se continuo con la prueba de la catalasa (Ver Tabla 3)
2234 Prueba de la catalasa
los lactobacilos carecen de catalasa Eata prueba se hizo tomando una colonis
se deposito en vidrio de reloj y se Ie adicion6 dos gotas de peroxida de hidr6geno
(H202) la que no presentaba efervescencie eran cepe sospechosa de ser
Lactobacilo (Ver Tabla 4
Sa seleccionaron las capas euyo resultado fue aeorde con el genera Lactobacilfu$
y se continuo con la comirmaeion del genera y determinacion de la eSpecie
meqiante las pruebas bioqulmicas
32
224 Prueba para determlnar la especie
Para confirmar el genero y determinar la especie de las diferentes capas aisladas
se hizo una caracterizaci6n bioqufmica utilizando un kit de API 50 CHL Medium
Ref 50 410 que contiene una galed8 de medios que permite realizar el estudio
de fermentaci6n de los 49 azucares de 52 especies de Lactobacillus (Ver Figura 4
y tabla 5)
Figura 4 API CHL 50-Prueba bioquimica
33
225 Pruebas para determinar microorganismos probi6ticos
2251 Resistencia a pH=2 y sales biliares de concentraci6n O3pv
A las cepas idantificades como Lactobacillus brevis y Lactobacillus pantarum sa
las realiz6 Ie prueba dfl resistencia a pH=2 y sales biliares de concentraci6n 03
pv ( Jacobsen et al 1999) Una colonia de cada cepe aislada se inocul6 en 4 mt
de caldo MRS durante cinco dras bajo condiciones de anaerobiosis Oespues de
esta tiempo se dejaron pracipltar los microorganismos por sedimentaci6n se Ie
retire el sobrenadante y al precipitado se Ie adicion6 Sml de caldo MRS
previamente ajustado a pH=2 can seido clorhfdrico (HCI) dentro del mismo tuba de
ensayo G igual sa hizo can otro tubo previamente incubado pero a este se Ie
adiciono 5ml de caldo MRS con sales biliares a una concentra~i6n de 03 plv y
ambos se incuberon a 37deg C por 2 haras Sa midio 01 mi de cada uno de los
tubas al tiempo 0 y a las 2 horas y sa inoculeron en superficie en caJas de petri
con agar MRS S9 incubaron a 37deg C bajo anaerobiosis durante 48 horas Se
compararon visualrrente en cada caja de petri el crecimiento en superficie y las
que presentaron crecimiento en tos dos tiempos (0 y 2 horas) tanto en at media
acido como en sales I se consideraron resistentes a pH=2 y sales biliares (03
pv)
(Ver Tabla 6)
34
226 Conservacion
Todas fas capas que habian dado positiva Jas pruebas anteriores y que reaultaron
resistentes a pH=2 y sales biliares 03 pv y despues de identificadas en API 50
CHL sa repicaron en agar MRS en tuba inclinado y despues de Incubar a 37deg C
por 48 horas bajo anaerobiosis se Ctlbrie el biser completamente can aceite
mineral esteril y sa guardaron en refrigeraci6n
227 Elaboracj6n de fa bebida fermentada
2271 Preparaci6n de la mue$tra
Sa tome 1 mt de caldo MRS previamante inoculado e incubado que presentaba
una concentracion de Lactobacillus brevis de 27x108 Iml segun la escaJa de Mac
Farlan y sa adiciono a 9ml de leche pasteurizada en un tubo sa dej6 incubanda
en anaerobiosis por 48 hores Luego se pasaron estos 10 ml a un frasco qua
cont~nie 90 ml de leche pasterizada y se dej6 incubando par 48 haras en
anaerobiosis
35
2272 Adici6n del inOculo
A 900ml de leche pasteurizada se Ie adicion61os 100 ml de leche que habia sido
previamente ino(ulada dos veces con la cepa posteriormente se deja
fermantando la lache a temperatura de 37deg C
2273 Control de Ja fermentaci6n
Las muestras se hicieron por cuadruplicado y se les hizo un seguimiento de
aoidez hasta un valor entre 04 y 05 expresada como Bcido lactico esta
procedimiento corresponde a la babida fermentada sin prebi6tico La bebida ~on
prebi6tico tiene al mismo proeedirnianto pero adicionalmente se agrag6 avena a
una concentraci6n de 05 en el momento de la adici6n del in6e410 a los 900 ml
de leehe pasteurlzada y el procedimiento sigui6 igual al de la bebida sin prebi6tico
tambien se hizo por cuadruplicado
2274 Refrigeracl6n
Despues que las mezclas con y sin prebiotico alcanzaron el de acidez
requarido se IIeva ron a refrigeraci6n a una temperatura de 4deg C p~r 24 horas
para frenar proce~os metab6licos de los microorganisrtlos Despues de este
ti~mpo se procedi6 al batido
36
1 2275 Batido
Con un agitador se procedi6 a batir las bebidas para romper et coagulo formado
y de esta manera homogeneizar la mazela y obtener asf la bebida fermentada
2276 Envasado y almacenamiento
Ambas bebidas se envasaron en frascos vidrio para hacerles seguimiento de pH
acidez(expresado como acido tacticol y recuento de Lactobacillus breviSf los
dies 27 14 Y 21 despues de elaboradas las bebidas perfodo durante el cualta
muestra permanecfa afmacenada a temperatura de refrigeracion(Ver Figura 5
37
Fjgura 5 Diagrama de Flujo
PREPARACION DE LA MUESTRA
ADICION DEL INOCULO
~_____~_B~ATIDO~______~
INCUBACION 37deg C hasta acidez = 04-05 acido laotico
ENFRIAMIENTO
hasta 4 0 C ~------~ ~------~
ENVASADO Y ALMACENAMJENTO
dUrante 21 dfas a Temperatura 4 0 C
38
1
228 Determinaci6n del pH
Se determino por el metoda potenciometrico en un pH-metro manual durante los
dias 2) 7 14 Y 21 de las bebidas lacteas sin y con prebi6tica (Ver Tablas 7 y 8)
229 Oeterminaci6n de la acidez (Expresadfl como acido
lactica)
Se tomaron 9 mJ de las bebida~ sa Ie adicionaron 2 gotas de fanoftaleina como
indicador y sa titulo fa acidez con NaOH 01 N hasta la aparicion de un cotor rosado
debit EI volumen de NaOH utilizado se reporta como valor de de acidez
(VerTablas 10 y 11)
2210 Prueba de viabilidad
Qurante el perfoda de almacenamiento de la bebida lactea se procedi6 a hacer la
prueba de viabiHdad en los dias 7 14 Y 21 para determinar Si los lactobacilfus
permanecfan vivOs a una concentraci6n minima de 106 hasta el dia 21 como 10
establece eJ Articulo 10 de la Rasolucion 2310 del Ministerio de $alud de
Colombja
39
Para asta prueba se tamaron 10 rnl de muestra y se adicionaron a 90 ml de caldo
MRS ruego a partir de esta se hicieron diluciones de 10-2 hasta 10-11 de las
diluciones 109101deg 10-11 se inocul6 1 ml de cada uno en agar MRS siguiendo el
metodo de siembra en profundidad y por duplicado e incubando a 370 C x 5 dras
en anaerobiosis y luego se hicieron tos recuentos por duplicado para esi reportar
los recuentos promedio (Ver Tablas 13 y 14)
2211 AniUisls microbiol6glco de las bebidas Iicteas(con y sin
avena)
Con el fin de determinar las condiciones higienico-sanitarias del producto se
realizaron las pruebas microbiol6gicas de Recuento de mohos y fevadurasml en
agar OGY Recuento en superficia de Staphylococcus coagulasa positivoml en
agar Baird Parker Numero Mas Probable (NMP) de coUfor-mes totales y
Escherichia coliml en caldo Fluorocult y Presencia de Salmonela25ml con BHI
caldo tetrationato y agar Hecktoen (Montoya 1999)
(Var tabla 16)
2212 AnaUsis estadistico
A los datos obtenidos en la medici6n de pH acidez (expresada como Beido
laclico) en los dras 2714 Y 21 y el recuento de Lactobacillus en los dras 714 y21
40
realizados a los dos tratamlentos se tes aplic6 1a prueba t porque solo difieren
en la presencia 0 ausencia del prebi6tico para evaluar si habra diferencia
estadfsticamente significativa para los dos tratamientbs(Ver Tablas9 12 y 15)
41
3 RESULTADOS Y DISCUSION
31 Coloraci6n de Gram y morfologfa
Las cepas aisladas fesultaron Gram positivas (Ver Figura 6) colonias grandes
cremosas dE) color beige con bordes homogeneos y c6ncavos en su
morfologia (Ver Figura 3) resultando de acuerdo a 10 especificado en Stanley
1989 para Lactobacillus
32 Prueba de esporulaci6n y cataJasa
Los resultados de la pruebas de esporulaci6n y catalasa indicados en las
Tablas 3 y 4 respeclivamente dieron conforme a 10 especificado en Stanley
1989 para Lactobacillus
42
1
2 3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
TABLA 3 Resultado de prueba de esporuJaci6n
CEPA RESULfADO ESPORULACION
-- -------------
43
l i ~II bull ~ I I
TABLA 4 Resultado prueba de la catalasa
CEPA RESULTADO CATALASA
1 -2 -3 -4 -5 -6 -7 8 -9 -10 -11 12 -13 -14 -15 -16
3~3 Prueba para determinar la especie
Oespues de hacer las pruebas para seleccionar las cepas sospechosas de ser
Lactobacillus se realizo las pruebas bioquimicas fograndose identificar
Lactobacillus plantarum aislctdo de pepino repollo y repollitas de bruselas
44
fermentados y Lactobacillus brevis de mucosa vaginal y leche fermentada (Ver
Anexos del A al E y Tabla 5)
TABLA 5 Resultado identlficaci6n cepa~
CEPA NOMBRE
1 Lactobacillus planfarum
3 Lactobacillus plantarum
5 Lactobacillus brevis
13 Lactobacillus brevis
15 Lactobacillus plantarum
34 Pruebas para determinar microorganismos probi6ticos
las cepas de Lactobacillus brevis y Lactobacillus plantarum mostraron
rasistencia al medio acido de pH =2 Y sales biliares 03 pv resultado similar al
encontrado por Jacobsen et al 1999 para Lactobacillus plantarum (Ver tabla 6)
45
middot
~~~ttiI lltlmiddot~COX~dtJ ~xtc_~ 2 tr~ k-JlL~middot
-)~~TO DE lJIBUOTECUl rjRL]OTtCA twn GO1IU1
TABLA 6 Resultados a pruebas de resistencia a pH=2 y sales biliares 03 plv
CEPA RESISTENCIA pH=2 RESISTENCfA A SALES BIUARES ()3 pv
1 + +
2 + +
3 + +
4 + +
5 +
6 + +
7 + +
8 + +
9 + +
10 + +
11 + +
12 + +
13 + +
14 +1shy +M
15 + +
16 + +
+1 crecimiento debil
+ crecimiento abundante
46
Figura 6 Lactobacillus brevis Gram + aislado de leche fermentada
Ai observar en placa las celulas de lactobacilos despues de real1zar las pruebas
de resistenCia a la acidez y sales biliares se observo una tendencia a aglomerarse
posiblemente como un mecanismo de proteccion cOlitra estos medios que pueden
lIegar a ser adversos para elias (Ver figuras 7 y 8)
47
Figura 7 Lactobacillus brevis aislada de leche fermentada despu~s de la prueba de resistencia a pH=2
Figura 8 Lactobacillus brevis aislada de leche fermentada despues de la prueba de resistencie asales biUares 03 plv
fI
48
35 --Seguimiento del-pH-en-la-bebidaJacteacon y sin -prebi6tico
A continuacion se muestran las Tablas 7 y 8 donde sa registian los datos
recopilados de pHdurante 10$ dras Z 7 14 Y21 para las bebidas laaeas con ysin
prebi6tioo
TABLA 1 ResultadopH yogur sin avena
Dia Repetition 1 Repetici6n 2 Repeticion 3 Repetici6n 4
2 526 501 51 52
7 446 433 438 44
14 439 435 437 436
21 439 437 438 437
TABLA 8 -ResultadopHyogur con avena
Dia Repeticion 1 Repeticion2 Repeticion 3 - Repeticion 4
2 509 523 51 515
7 447 442 445 442
14 436 -438 439 437
21 432 433 435 434
Observando la Figura 9podamos ver que el pH en el -dfado$ para los dos
tratamientos as igual y empieza a descender rapidamente para estabilizarse a
partir del dra 7(Ver figura 9)
49
Figura 9 Comparacj6n de medias para -el pH
Comparaci6n de medias para pH
55 ~ 5 +----=gtIIIi-~i~~----=-r--it~ -- pH sin avena
a 45 1--~~~~=~~ 4 --- pH con
avena35 t-----r-- -------=------=--= ------- - ----
2 7 14 21
Dias
Aplicando la prueba t para comparar las medias de pH I S6 muestia una diferencia
altamants significativa en los dos tratamientos para el dia 21 (pltO05)
(Ver tabla 9)
TABLA 9 Compaiaci6n de medias para pH
DtAS SIN AVENA CON AVENA te p (VALOR)
2 514 514 0 10
7 439 444 -1 61 0159
14 437 I
438 -070 0510
21 438 433 528 00019 shy
- DiFERENCIA AlTAMENTE SIGNIFICATIVA
50
I
AI aplicar regrasi6n a los datos sa obtiene al modelo estimado
pHSinAyena =535606 - 01505650Ia +0005044340IaI2
La variabilidad en la respuesta de pH asta siendo explicada en un 8S7522 por
el modelo (Ver Anexo F)
EI tratamiento con avena mostro el siguiente modelo al analisis de ragresi6n
pHConAvena =534463 ~ 0140407Dia + 0004480980Ia2
La variabilidad an la respuesta de pH asta siendo explicada en un 903315 par
el nlodelo(Ver anexo G)
36 Seguimiento de la acidezmiddotmiddot expresada comomiddot de acido
lactico
A continuaci6n sa muestran las Tablas 10 y 11 donde sa registran los datos
tecopilados de acidezmiddotdurante los dias 27 14 Y 21 para las pebidas taetees con y
sin prebi6tico
TABLA 10 Resuttadode acidez (expresadocomo acido tactico) yogurt sin avena
CIA R~petici6n1 Repeticion2 Repetici6n 3 Repeticion 4
2 054 06 057 058
7 072 074 073 0]2
14 080 083 082 082
21 0]4 079 078 077
51
TABLA 11 Resultado de aCidez (expresado como acido Icktico) yogurt con avena
Dia Repetici6n 1 RepetiCi6n 2 Repetici6n 3 Repetici9n 4
2 059 055 058 057
7 071 073 072 072
14 089 087 088 086
21 092 091 090 091
Observando la Figura 10 se puede concluir que la acidez empieza a aumentar
hasta el dia 14 y luego trata de estabilizarse para los dos tratamientos
(Ver figura 10)
Figura 10 Comparaci6n de medias para la acidez
N G)
Comparacion de medias para acidez
1
2 0I 5 -+--=--------=-~~~= u
ltC
- Acidez sin avena
2 7 14
Dias
52
21
-it- Acidez con avena
Aplicando la prueba t para camparar las madias de acidez se muestra una
diferencia altarnante significativa en los dos tratamiantos para los dias 14 y 21
(pltO05)
(Var tabla 12)
TABLA 12Comparaci6n de medias para Acidez
DIASmiddot SIN AVENA CON AVENA te p(VALOR)
2 0572 0572 0 10
7 0727 0720 119 0278
14 0818 0875 -638 000070shy
21 077 091 -1212 i 0000019 shy
DIFERENCIA AL TAMENTE SlGNIFICATIVA
AI aplicar r~gresi6n a los datos se obtiene el modelo estimado
AcidezSlnAIena = 0491897 + O0436032Dia O00144613DfaA2
La variabilidad en la respuesta de acidez asta siendoexplicada en un 970978
por al modelo (Ver anexo H)
EI tratamiento con avena mostro elsiguiente modeloj a1 analisis de regresion
AcidezConAvena = 0491638 + 00406572Oia - OQOO982559OiaA2
La variabilidad enla respuesta acidez esta siendo explicadaen un 99212 por
el modelo (Ver anexo J)
53
I ~
37 Prueba de viabiJidad
A continuaci6n sa muestran las Tab~as 13 y 14 donde sa presentan los datos
recopilados del recuento de Lactobacilos durante los dias 7 14 Y 21 para las
bebidas lacteas con y sin prebi6tico
TABLA 13 Recuento de Lactobacilos (UFCml) yogurt sin avena
Dia Repetici6n 1 Repetici6n 2 Repeticion 3 Reptttici6n 4
7 1880X10l1 1454X1011 1642X1011 1780X10~
14 1560X10~ 646X1011J 1890X10l 140X10l1
21 1200x10lu 128Ox10u 1745x10J 1520x101V
TABLA 14 Recuento de Lactobacilos (UFCml) yogurt con avena
Dfa Repetieion 1 Repetici6n 2 Repeticion 3 Repeticf6n 4
7 1600X10lt 1240X10t 1640X10ll 1980X10t
14 540X1011 427X10n 546X10n 720X10ll
21 500x1011 492x1011 712)(1011 980x10~
AI analizar la Figura 11 sa puede observar un recuento mayor de Lactobacilos
en al tratamiento con avena resultado de acuerdo a 10 encontrado por Alander at
aI 1999 Kontula et aI 1998 y Jaskari et aI 1998
54
Figura 11 Comparaci6n de medias para Log Lactobacillus
Comparacion de medias para log Lactobacillus
~ 1350
-+- Sac Sin--() 13 co avenaIII
bull 125 -- Bac con 0)
0 12 avenaJ
115 7 14 21
Dias
Aplicando la prueba t para comparar las medias de recuento de Lactobacillus no
se encontr6 una diferenc1a estadfsUcamente significative entre los dos
tratamientos (Ver tabla 15)
Este aumento en al racuento influy6 en la disminuci6n del pH y en el aumento de
fa aeidez por la fermentacion que realizan los Lactobacillus sobre fa lactosa de la
lache y la avena adicionada como prebi6tico
55
1
TABLA 15 Comparaci6n medias lag Lactobacillus
DIAS SIN AVENA CON AVENA tc p(VALOR)
7 122257 122022 04846 06451
14 121065 132393 -19602 00977
21 129025 133087 -08236 04416
At aplicar regresion a los datos se obtiane al modelo astimado
LactobacillusSinAvena= 117347 + 004834640Ia
La variabilidad en la respuesta del recuento de LactobaCillus ssta siendo
explicada en un 260054 por el mod$loVar anexo J)
EI tratamiento con avena mostr6 al siguiente modalo al anal isis de regresion
Lactobacillu$ConAvena =118103 + 007903040Ias
La variabilidad en la respuesta de recuento esta siendo explicada en un 3068
por al modelo(Ver anexo K)~
38 Analisi$ microbiol6gicos de las bebidas lacteas con y sin
En la Tabla 16 estan recopilados los resultados microbiol6gieos obtenidos en ras
muestras con los dos tratamientos (con y sin avena)
I [
sa
TABLA 16 Resultados analisis microbiologico
Recuento de mohos y levaduras Iml lt10
Recuento de Staphylococcus coagulase positiva Iml lt100
NMP coliformes fotales y Escherichia coli Iml lt3
Presencia de Salmonella25ml Ausente
Los resultados de este analisis demuestran que las bebidas fermentadas con y
sin avena~ astan fibres de microorganismos patogenos
57
1
4 CONCLUSIONES
Se aislaron cepas nativas de Lactobacillus plantarum de las muestras vegetates
de repollo pepino repollitas de bruselas fermentadas y Lactobacillus brevis de
lache fermentada y mucosa vaginal humana Ambas cepas resistieran un pH=2 y
una concentraci6n de sales biliares det 03 ptv dos earacteristicas importantes
en los probi6ticos
Lamiddot cepa de Lactobacillus brevis aislada de lache Sa utiliz6 para elaborar una
bebida fermentada sin y con avana comoingrediente prebiotico obteniendose un
aJimento centon recuento del probi6tico viable durante 21 dras de seguimiento
ademas libre de microorganismos )at6gen05
No se encontr6 efecta significativo de la avena sobre Ie viabilidad del Lactobacillus
brevis aunque sa presento un aumento en 61 recuento de estos en la bebida con
avena
58
plusmn ~
5 RECOMENDACIONES
Ensayar la cepa de Lactobacillus plantartJm en productos carnicos madurados
como el salami
Ensayar la cepa de Lactobacillus l)revs en otros derivados lecteos como queso
quesito queso crema
Continuar con el estudio de estos microorganismos y caracterizarlos
molecularmente ademas de estudiar su capacidad de adherencja a fa mucosa
intestinal sobre algunes Hneas celulares como las CaCo~2
Estudiarel efedo de la avena sabre la viabiJidad del Lactobacillus breyis a una
concentraci6n mayor de 05
Realizer ensayos can las cepas de Lactobacillus brevis y Lactobrlcillus pJantarum
para elaborar masas acidas para panificacion reemplazando el Bromato de
Potasio aditivo prohibido desde marzo del 2003 en nuestro pais per 5U toxicidad
59
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65
ANEXOS
66
ANEXO A RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AlSLADA DE i
PEPINO it
Referencia Pepino 1 Fecha 06122002
IEXCELENTE IDENTIFICACION
Latto plantarum 1
Galeria API 50 CHL V50 Leida el 06122002
Perfil - -- - ++ - -- - ++++ - - -+- + - I I I I I I I I +t+ - +f- ~ - - + + ~ - - - +- + - shy
o - GLY - ERY DARA - LARA + RIB + DXYL - LXYL - ADO - MDX - GAL + GLU + FRU + MNE + SBE - RHA - DUL - INO bull MAN + SOR - MDM + MUG shyNAG + AMY + ARB + ESC + SAL + CEL + MAL + LAC + MEL + SAC + TRE + 1NU - MLZ + RAF + AMD - GLYG - XLT - GEN + TIJR + LYX - TAG - DFUC shyLFUC - DARL + LARL - aNT + 2KG - 5KG shy
--- Taxones significativos rd -----T -- Tests en contra
Lactoplantarum 1 999 092 1
Taxon siguiente Lactobrevis 1 OJ 044 3
i i
Lactoplantarum 1 1 test (5) en contra
D-SORBITOL (SOR) 78
Tax6n siguiente Lactobrevis 1 3 test (s) ert contra
METHYLD-MANNOSIDE (MOlM) 0 MELEZITOSE (MLZ) 14 D-TURANOSE (TUR) 14
67
ampb
ANEXO B RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AISLADA DE REPOLLO FERMENTADO
~
Referencia Repollo fermentado - 3 Fecha 03072003
EXCELENTE IDENTIFICACION
Lactoplantarum 1
Galena API 50 CRL V50 Leida el 03072003
Perfil - - ++ - - - - -H++ - - ~ + - + - I I 1 I I I I -H+ - ++ - - - + + - -- - - + - shy
o - GLY - ERY - DARA - LARA + RIB + DXYL - LXYL - ADO ~ MDX - GAL + GLU + FRU + MNE + SBE ~ RHA - DUL - INO - MAN + SOR - MDM + MDG shyNAG + AMY + ARR + ESC + SAT + CRL + MAL + LAC + MEL + SAC + TRE + lNU - MLZ + RAF + AMI) - GLYG - XLT - GEN + TOR + LYX - TAG - DFUC shyLFUC - DARL - LARL - GNT + 2KG - 5KG shy
------Taxones significativos _ _----- Id--- ---T---- Tests en contra
Lactoplantarum 1 999 095 1
Tax6n siguiente Lactobrevis 1 01 OA8 3
lJactoplantaru01 1 1 test (s) en contra
DSORBITOL (SOR) 78
Taxon siguiente Lactobrevis
METHYL-D-MANNOSIDE D-TURANOSE
1
(MOM) (TOR)
3 test (5) en contra
0 MELEZITOSE 14
(MLZ) 14
i
I
68
ANEXO C RESULTADO PRUEBAS BIOQUWICAS DE CEPA AISLADA DE MUCOSA HUMANA
Referenda Mucosa - 5 Fecha 27012003
BUENA IDENTlFICACION
Galeria API 50 CHL vso Leida el 270112003
Perfil - - - - +t--t - - - + - + - - - - - - - - -+- - - - - + - + - - - - - - - - - - - - - bull - - -+ - +
o - GLY ~ ERY - DARA bull LARA + RID + DXYL + LXYL - ADO bull MDX - GAL + OLU - FRU + MNE - SBE - IlliA - DUL - INa - MAN - SOR - MDM - MOO shyNAG + AMY - ARB - ESC ~ SAL bull CEL - MAL + lAC - MEL + SAC - TRE shyINU - MLZ - RAF - AMD - GLYG - XLT - GEN - 11JR - LYX - TAG - DFUC shyLFUC - DARL - IARL - ONT + 2KO - 5KG +
- - - - - - Taxones significativos - - - - - - - Id T -- Test en contra
Lactobrevis 3 963 088 1
Taxon siguiente Lactoco11inoides 36 075 2
Lactobrevis 3 1 test (s) en contra
GLUCOSE (GLU) 95
-~~~------------~---------------------------~--~-------~--~-----~----------~--------~------------~~--Taxon siguiente Lactocollinoides 2 test (s) en contra
GLUCOSE (GLU) 100 MELIBIOSE (MEL) 25
69
i r
ANEXO D RESULTADO PRUEBAS BIOQIJiMICAS DE CEPA AISLADA DE LECHE FERMENTADA
Referenda Leche fennentada ~ 13 Fecha 27012003
BUENA IDENTIFICACI6N
Galeria API 50 CHL V50 Leida el 270112003
Perfil - - - - -t-t+- - - - + - + - - - bull - - - - -+- - - - - + - + - - - - - - - - - - - - - - - - -+ - +
0 - GLY - ERY - DARA - LARA +Rll3 + DXYL + LXYL - ADO - MDX ~GAL + GLU - FRU + MNE SBE - RHA DUL bull INO MAN - SOR MDM bull MDG shy
~NAG + AMY - ARB - ESC - SAL - CEL - MAL + LAC - MEL + SAC - TRE I lNU - MLZ - RAF - AMD - GLYG - XLT - OEN - IUR LYX - TAG - DFUC bull i
LFUC - DARL - LARL -ONr + 2KG - SKO + 1
- -- - - Taxones significativos - - Id -- T --- Test en contra
Lacta brevis 3 963 088 1
Taxon siguiente Lactocollinoides 36 075 2
Lactobrevis 3 1 test (s) en contra
GLUCOSE (GLU) 95
-----------------------------------------------------------~------------------------------~-------------------Taxon siguiente Lactocollinoides 2 test (s) en contra
GLUCOSE (GLD) 100 MELffiIOSE (MEL) 25
70
II iJ1
I
I ANEXO E RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AISLADA DE REPOLLITAS DE BRUSELAS FERMENTADA
Referencia repollitas de bruselas 15 Fecha 03072003
EXCELENTE IDENTIFICACION
Lactoplantarum 1
Galeria API 50 CHL vsO Leida el 03072003
Perfil - - - - +t - - - - +H+ - +- - +t + - I I I I I I I f ++t - + - - - -+ + - - - -+ -+ - - I ij
o - GLY - ERY - DARA - LARA + RJB + DXYL - LXYL - ADO - MDX - GAL +
GLU + FRU + MNE + SBE RHA + DUL - INO - MAN + SOR + MDM + MOG shyNAG + AMY + ARB + ESC + SAL + eEL + MAL + LAC + MEl + SAC + TRE + i
I1NU - MLZ + RAF AMD GLYG - XLT - aEN + TUR + LYX - TAG - Druc LFUC - DARt + LARL - aNT + 2KG - 5KG shy n ----Taxones significativos ------ Id Tests en contra
Lactoplantarum 1 999 090 o
Taxon siguiente Lacto pentosus 01 012 7
Lactoplantarum 1 o test (s) en contra
Taxon siguiente Lacto pentosus 7 test (8) en contra
GLYCEROL (GLY) 75 D-XYLOSE (DXYL) 100 L-RHAMNOSE (RHA) 25 METHYL-D-MANNOSIDE (MOM) 1 MELEZITOSE (MLZ) 25 RAFFINOSE (RAF) 75 D-ARABITOL (DARL) 0
71
~
I i I
ANEXO F - ANALISIS DE REGRESION PARA pH EN BEBIDA SIN AVENA
Aruilisis de regresi6n polinomial
---~-~-------------------------------------------~-----------~~---------------------~--------------Variable dependiente pHSinAvena ---------------------------~-------------~--------------------~---------------------------------
Error T Parametro Estimado Estandar Estadistico P-Valor
CONSTANTE 535606 0094535 56657 00000 Dia -0150565 0020706 727154 00000 Dia2 000504434 0000871488 578819 00001
---~---------------------------------------------------------------------------------------------------
Anfllisis de Variama -------------------------------------------~-----------~-----------------------------~-~--- jSource Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor 11
------------------------~------------------------------------------------------------------------------~ Mod-elo 155772 2 0118861 4256 00000 Residual 0237877 13 00182983
Total (Corr) 11956 IS
R2 == 867522 percent
pHSinAvena == 535606 - 0150565Dia + 000504434Dia2
72
____
middot ANEXO G - ANALISIS DE REGRESION PARA pH EN BEBIDA CON AVENA
AmUisis de regresion polinomial _____~_____~__-_____~___4____________________bull____bull__________bull_____________~~----_------___________
Variable depcndiente pHConA vena ------------------------------------------------------------------------------------------~--------
Error T Parametro Estimado StAndar Estadfstico P-Valor
---------------------------------------------~-----------------------------------------------_---------CONSTANTE 534463 00801045 667208 00000 Dia -0140407 00175453 800253 00000 DiaA 2 000448098 0000738458 606803 00000
----------------------~---~-----------------------------~------------------------------~----AmUisis de Varianza
---~---------------------------------~---------------------~------------~-------------------~------Source Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio PValor --------------------------~-----------------------------------------------~------------~-----~~--~ ModeJo 159575 2 0797873 6073 00000 Residual 02170798 middot13 00131383 _______~_~ ~_~----------~------~--~-----~-M-----~-----____ _____________~-----------------------Total (COlT) 176654 15
R12 903315 percent
-----------~------------------------------------------------------------------------~-----------pHConAvena 534463 - 0140407Dia + 000448098DfaA 2
73
ANEXO H - ANALTSIS DE REGRESTON PARA ACIDEZ EN BEBJDA SIN AVENA
An8Jisis de Regtesi6fi P6lifJomial
Variable Depefidiefile~ AcidezSinAVenll _______________w_____~______~________________~-----------_________~_________________~~____~___~_____
Error T Pariirnetro Estimado Estandar Estadistico ---------------------------------------~--------------~-~-------~--------------------~------------CONSTANT 0491697 00123217 399051 00000 Dia 00436032 000269882 161564 00000 D1a2 -000144613 000011359 127312 00000 __w___~________________________~-_______-_____~----____________________________~__~---~_--__~___
AriiiJisis de varianza ~_~__~__________~_~____~________~___________- _________e_____________________________bull _____-________
Source Smn de cuadr Df Mean Square F-Ratio PmiddotValor_~~___________________________________bull ______~___________bull ____________bull ______~________w________________
Model 0135203 2 00676013 21747 00000 Residual 000404118 13 000031086
Total (Corr) 0139244 15
R2 970978 percent
AcidezSlnAvena 0491697 + O0436032Dia - 0OOl44613Dia2
74
I
ANEXO I ANALISIS DE REGRESION PARA ACIDEZ EN BEBIDA CON AVENA
1
Anwisis de tegtesi6fi polinomial
Variable dependiente Acidez Con Avena
Error T ParametTo Estimado Stlindar Estadfstico P-Valor ----------------~-------~---------------------~-----------------------------------------------------CONSTANT 0491639 000926607 530578 00000 Diamiddot 00406572 000202955 200326 00000 DfaA 2 0000982559 0000085421 -115025 00000
-------------~----------------------------~-------------------------~-----------------------------------
-------------~-----~~-----------------------------~---------------------------------------------_--Source Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio PValor
-~-------------~----------------------------------~------------------~~-------------------------- Modelo 0288008 2 0144004 81914 00000 Residual 000228539 13 0000175799
----------~~--------------~---------------------------------------------~---------------------------Total (Corr) 0290294 15
RA2 = 992127 percent
-------------------------~----~---~------------~---------------------------------~---------------~
AcidezConAvena == 049163amp + 00406572D1a - 0000982559DiaA2
75
I
(Ilmiddot il
ANEXO J- ANALISIS DE REGRESION PARA RECUENTO LACTOBACILOS PARA BEBIDA SIN AVENA
Amilisis de regresion - Modelo lineal Y = a + bX
------------------------~----------------------~-----------------------------~----------~-----------Variable Dcpendiente LactobacilJusSinAvena Variable independiente Dia
I--------~----------~-----------------------------------~-------~-~--~--------------------------~-Error T
Paramctro Estimado Standard Stadistico P-Valor
----~----~------------~-----~-----------------------~-------------~-----------------------------Intereepto 117347 0389973 300911 00000 Pendiente 00483464 00257889 18747 00903
Analisis de Varianza
---------~------------------~----------------~---------------------------------~---------~----------Source Sum decuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor
------------~---------------------~---------------------~--------------------------------~-----~----Modelo 0916252 1 244835 443 00616 Residual 260706 10 0260706
--~------------~---~------------------~~~-----~-------~---------~~-------------------------------------Total (Corr)352332 11
Coeficiente Correlaci6n = 0509955 R2 = 260054 percent
LactobacillusSinAvena= 117347 + 00483464Dfa
76
ANEXO K- ANALTSIS DE REGRESION PARA RECUENTO LACTOBACILOS PARA DEBIDA CON AVENA
Aruilisis de regresion - Modelo lineal Y = a + hX
Variable Dependiente LactobacillusConAvena Variable Independiente Dia ---~--------------------------------------------------------__-----------__--_--_-----------shy
Error T Paramctro Estimado Standard Estadistico P-Valor -~--------------------------------------------------------------------------------------------------
Irttercepto 118103 0567963 207942 00000 Pendiente 00790304 00375594 210414 00616
-----------------~----------------------------~----~-------~----~----------------------------
Analisis de Varianza
----------------~----------------~------------------~--------------------------~------~--------shySource Swn de cuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor
-----------------~--~--------------------------------------------------------------------------~---~ Mode10 244835 1 244835 443 00616 Residual 552997 10 0552997
Total (Corr)797832 11
Coeficiente Correlacion = 0553964 RI2 = 306875 percent
-----~--------------------------------------------------------~--------------------------------------
LactobacillusConAvena = 118103 + 00790304Dfas
77
EI eonoeimiento a cerea de sus efeetos beneficos en el consumidor por su alta
viabilidad en el intestino como la producci6n de sustancias con aetividad
antieaneerigena el mejoramiento ltfel sistema inmunol6gico y el deSplazamiento
de la mierobiota pat6gena gastrointestinal en el consumidor ha estimulado una
mayor demanda de estos microorganismos como tambian de los productos que
los contienen (Heller 2001 Parada middot1998)
Existsn otros produetos fermentados de origen vegetal como et tampe col acida
y salsa de soya de los euales sa pueden aislar estos organismos probi6tieos
comp tambien de la mucosa intestinat humana y luego de suministrarlos a
ratones sa han comprobado sus caracteristicas beneficas (Molin 2001)
113 Caracteristicas fenotfpicas de algunos microorganismos
probi6ticos
las bacterias aeido lacticas de los generos Lactobacillus y Bifidobacterium son
consideradas probi6tieos y tradicionalmente se han clasificado con base en Sus
propiedades morfol6gicas crecimiento a diferentes temperaturas capacidad
fermentadora de glucosa y otros carbbhidratos y la configuraci6n del Bcido Jaetieo
producido (Holzapfel etal2001)
16
)lli~ h Dx nIILIOTECM
eJDe~~ l1ilmfJ tIDBnm
Los Lactobacillus son bacilas gram positiv~s no esparuladas aerotalerantes
acido - tolarantes estrictamente fermentadares formadores de Boido laclica como
producto principal catalasa negativo carentes de citocroma sin embargo se
presentan excepciones a esta descripcion parque afgunas especies pueden
formar catalasa 0 citacramo en medios que contienen hematina 0 compuestos
relacianados La produccion de catalasa no hema pseudocatalasa puede causar
tambien alguna confusion en fa identificacion de algunos Lactobacillus
las especies del genera Bifidobacterium san bacilos gram positivos no
esporulados generafmente anaerabios estricto$ aunque pueden creeer bajo
condiciones microaer6filas cuando estan ert presencia de C02 La mayorfa de sus
especies se pueden diferenciar par criterios biaquimicos simples como la
fermentacion de L arabinosa DmiddotxiJasa O-manosa O-manita y O sorbitat que
pueden servir coma caracterist1cas clave para su clasificacion (Holzapfel
etal2001 )
114 Caracteristicas de los probi6ticos
Las cepas de microorganismos prabi6ticos deben presenter y mantener unas
caracteristlcas que garanticen su crecimienta y supervivencia En el alimenta
como tambiEm durante su transito a traves del est6maga e intestino delgaQo
17
La primera CBtacterfstica es que sean viables esta viabifidad esla capacidad que
tienen los microorganismos probi6ticos de permanecer vivos tanto ~n el alimento
como en el Intestino del consumidor por un tiempo determinado En Colombia se
ha establecido que en bebidas fermentadas este tiempo debe ser minimo de 21
dras en el alimento (Minsalud 1986) Esta vjabilidad depende del metodo de
produccion y de la cepa utilizada (Tuomols at a 2001)
Luego de que se garantice que estos microorganismos eslan viVos en el alimento
ell os deben cumplir otro criterio importanle para ser considerados como
organismos probi6ticos y as tblerar las condiciones de acidez a un pH=2 y la
sccian de proteasas del est6mago ademas de sobrevivir y creeer en presencia de
acidos biliares (Tuomola et al 2001 Jacobsen at a 1999) para luego de
sobrevivir a estas condiciones adherirse a la mucosa intestinal y de esta manera
estimular al sistemainmunoJ6gico esta capacidad de adherirse a la mucosa es un
prerrequisito para la colonizacion del intestlno (Toumola etal2001 Alander et aI
1999)
Cuando los probioticos han pasado todas esta pruebas de supervivencia y luego
de impfantados en la mucosa producen acidos organicos peroxido de hidrogeno y
tambien bacteriocinas que actUan como inhibidore$ del crecimiento de
microorganismos patogenos u oportunistas (Tuomola at al 2001 Cintas et al
2000) complementando de asta manera su accion benefica sobre la mucosa
intestinal y en general sobre la saJud del huesped
18
116 Berieficios de los microorganismos probi6ticos
Los beneficios que se asocian a los microorganismos probioticos son muchos y
variados Entre ros comprobados mediante estudios se eneuentran
1151 Facilitar la digesti6n de la lactosa
los microorganismos probioticos cuando estan en el intestino liberan alii la
enzima pmiddotgalaotosidasa capaz de hidrolizar la lactosa haste glucosa y galactosa
evitando as que personas intolerantes a este carbohidrato presenten sfntomas
como flatulencia dolor abdominal y diarrea cuando consumen leche (be Vresse
et 81 2001)
1152 Protegen contra enfermedades gastrointesUnales
EI consumo de aJimentos con probioticos ha mostrado efeeto terapeutico frente a
los sintomas de diarrea asociada al surninistro de antibi6tico$ de amplio espectro
que destruye 0 disminuye la microbiota endogena esta imp ide la coJonizacion de
bacterias patogenas como Klebsiella oxytoca y Clostridium difficile que pueden
causer lesiones en el cn Los probi6ticos recuperan el balance de la microbiota
intestinal nativa y avitan Ie adhesion de algunos virus bacterias pat6genas a
parasitos que pueden ser agentes causales de gastroenteritis la diarrea del
19
J
viajero y 1(3 inflarnacion intestinal que en ultima instaneia oeasionan ef sfndrome
del colon irritable (Marteu et al 2001)
1153 Protegen contra infecciones del tracto urogenital
La vaginitis indueida por baeteriss yo por levaduras as una infecci6n
estrechamente relacionada con la exposici6n a antibi6ticos y espermicidas y
tambien depende del estado hormonal de la n1ujar Con al uso de mezcJas de
probi6ticos se han obtenido buenos resultados en la rastauraci6n de la rnicrobiota
natural urogenital benefica que desplaza a los eausantes de la inflamaci6n de Is
vagina y Ie uretra (Reid 2001 )
1154 Promueven la barrera de defensa end6gena del intestino
EI tracto gastrointestinal normal mente as una barrera natural contra anUgenos de
origen microbiano y alimentario Cuando los probi6ticos sa adhieren a Is mucosa
intestinal estimulan 0 potencian al sistema inmune favoreciendo la
inmunomodulaci6n que induce un aumentb de fa producci6n de inmunoglobulinas
activacion de las calulas mononueleares y de los linfocitos para proteger al
huesped de infeeciones (Isoulari et sl 2001)
20
1155 Protegen contra cancer de colon
EI cancer es el resultado de una serie de mutaciones somaticas que pueden
ocurrir durante al tiempo de vida del individuo y 10 padeca buena parte de la
poblacion mundial los probi6ticos en un sistema in vitro han demostrado un
efecto positivo en la prevenci6n de mutaciones aI desactivar carcin6genos
genotoxicos (Wolloswski et al J 2001)
1156 Protegen contra infecciones respiratorias
Sa ha demostrado que el conslJlno de probi6ticos disrninuye la incidencia de
infecqiones raspiretorias al aumentar la actividad fagocitica de maer6fagos
alveolares que aettian sobre microorganismos patogenos Se hizo un estudio en
571 ninos sanos con edades entre uno y seis anos divididos en dos grupos a uno
de ellos sa las incluy6 en su dieta leche suplementada can Lactobacillus GG y a
los otros ninos leche no suplementada AI final del estudio se observ6 una
disminucion del 19 en la incidencia de infeccionas respiratorias tratadas con
antibi6ticos tales como otitis media sinusitis bronquitis y neumonfas en el grupo
de los ninos que consumieron Lactobacillus GG (Hatakka et al 2001)
Alvarez et al (2001) encontraron que la administraci6n de yogurt con Lactobacillus
casei en ratones de tres arios de edad majora los espacios libres del puJrn6n de
la presencia de Pseudomona aeruginos8 induciendo un aumento
21
significativo en los niveles de gA a IgM datactadas en los lavados
broncoaJveolares y se observ~ un afecta dependiente de la dosis
1157 En el tratamientoy prevenci6n del eczema
Se ha encontrado que el consumo de probi6ticos mejora la inflamaci6n alergica 0
eczema at6pico en ninos alimentados con formula suplementada con probi6ticos
Encontraron una mejora significativa al suministrar Bifidobacteriummiddot actis y
Lactobacillus GG en 27 niiios con edad promedio de 46 meses Luego de aplicar
este tratamiento se sometieron a una prueha de SCORAD (mide fa extension y
gravedad del eczema) registrando una meJoria significatlva en las condiciones de
la pie concentraci6n de citoquinas cirClllantes an sueto y moleculas de adhesi6n
a las superficies de las celulas soJubles en suero (Isolari 2000)
Se realizaron otros estudios a 159 mujeres embarazadas con historia familiar de
eczema atopico de primer grado a las cuafes sa res 5uministro dosis diarias de
Lactobacillus GG durante 2 a 4 samanas previas al parto Oespues de ella fa
madres twiaron la opci6n de continuer tomando el ptobi6tico si amamantaban 0
bien darseio vIa oral La mayoria de las madras eJigieron dar las dosis at bebe
diariamente A los dos anos de vida se observ6 una disminuci6n del 50 en la
frecuencia del eczema at6pico en aquellos nHies que se les dio ef probi6tico
(Kalliomari etal 2001)
22
1158 Previenen infeccion en heridas quirurgicas
Los probi6ticos impiden la union de pat6genos a las superficies celulares en
heridas mediante la seCreci6n de proteinas Actuamente se encuentra en
estudio la aplicaci6n del Lactobacillus fermentum vivos sabre heridas en piel de
ratas y se ha encontrado una disminuci6n del 90 en la colonizaci6n par parte del
StaphylococcuS aureus uno de los patogenos mas temidos y de mayor lncidencia
en infecciones hospital arias mas aun se esta contempiando la posibilidad de
utilizar la protein a purificada an lugar de los mjcroorganismos para la protaccion
contra infecciones en heridas (Strauss 2000)
12 PREBIOTICOS
Son carbohidratos de cadena corta algunas veces reconocidQs como
oligosacaridos no digeribles par las enzimas del epitelio intestinal 0 de las
gliJnduJas anexas debido a su estructura quimica y de esta manera lIegan al
intestino grueso donde alcanzan a estar disponibles para la fermentaci6n por las
bacierias sacaroHticas que son especial mente laetobadlos y bifidobacterias
dando odgen a compuestos que ejercen efectos funcionales sobre la mucosa del
tubo digestivo (Brunser 2001)
Se consideran como tal algunos fructocligosacaridos isomaltooligosacariclos
oligomato palatinosa poHdextrosa pOJidextrrna raftilina y algunos oligosacaridos
23
)
de 1a soya y fa avena Estenmiddot presentes en alimentos como Ie cebolla ajo
banano puerros 1 derivados del trigo achicoria esparrago alcachofa (Cummings
etal 2001)
Algunos de estos prebi6ticos cuanda son incorporado$ a fa dieta en cantidades
dalerminadas alteran la microbiota intestinal disminuyendo los recuentos de
coliformes bacteroides y cocos y aumentando las bifidobacterias hasta en diez
veces ademas modifican la actividad metab6lica del coron logrando una
disminuci6n del pH y un incremento en el contenido fecal de acidos grasos de
cadena corta como at acatica propi6nico y butfrico El butirato aumen~ _I grosor
de la pared del coron e intestino delgado estimula eJ crecimiento de la mucosa del
colon y auManta su flujo sangufneo inhibe el crecimiento de tinsas tumorales
epiteliales de origen co16nico induce la diferenciaci6n de sus celulas y a
apoptosis entre otros(Brunsar 2001)
Eh estudios hechos en simuladores del intestino humano utilizando productos de
avena fermentados se encontro que estimularon al crecimiento tanto de
lactobacios como de bifidobacterias y en el caso de estas ultimas se incremento
la producci6n de los acidos acatico propionico y butfrico 10 que incide sobre la
implantacion de probi6tico$ e inhibe al crecimientos de otro tipo de
microorganismos (Alal1der eta1999 Kontula etal 1998 Jaskari etal 1998)
24
~ -1
(
AI comparar el comportamianto de las leches de diferente origen se ha
demostrado que Ie leche de vaca contiene caseinatos sustancias que forman
buffer ~n et intestino e inlpiden que los probi6ticos disminlJyen el pH del intestina
y de esta manera se impide al efecto deseado que es evitar fa proliferaci6n de
otros microorganismos entre los cuates pueden estar algunos patOganos En la
leche materna sa encuentran algunos carbohidratos como glucosa galactosa n
acetilglucosamina y algunos 0lig6meros de Ie fucosa en cOhoontracionesmiddot
importantes los cualeS favoreceh el crecimientc)middot de probi6ticos esto
complementado can 91 bajo contenido de protenas que se traduce en una
reducida capacidad buffer hacen de Ie lache materna IJn alimentd adecuado para
nllios en su etape de lactancia
Algunos prebi6ticos como 1a lactulosa yciertos compuestos que contiansn fructosa
no son digeridos en el intestino humano y pueden sar utilizados selectivamenta
par los probi6ticos 10 que hace que los probi6ticos en combinaci6n can prebi6ticos
pueden lIegar a ser un importante medio para prevenir algunas enfermedades del
tracto gastrointestinal (Bezkorovainy 2001)
25
2 METODOlOGfA
21 LOCALIZACION
EJ trabajo sa realizo en el laboratorio de Microbiologia y la planta da laches de Ja
Universidad Naclonal de Colombia- Secie Medellin
En al laboratorio se hiZQ al aislamiento a identificaci6n de fa capas y en fa Planta
sa eJaboro la leche fermentada con 1a cepa seleccionada y el prebi6trco
22 METODOS
221 Aisiamiento de cepas nativas
Las cepas nativas se sislaran de producto$ vegetales leches fermentadas y
mucosa vaginal humana
2211 De vegetales
Las muestras vegetales de repollo repollitas de brusefas y pepino se
seleccionaron porcionaron y mezclaron can cloruro de sadio al 10 pIp se
calacaron en un recipienta de vidrio balo anaerobiosis y sa dejarQn por 15 dias
26
luego S9 tomaron 3 ml de cada muestra y se jnocularon 9 ml de caldo MRS (Man
Rogosa and Sharpe) se incubaron a 37deg C durante cinco dias en camara de
anaerobiosis (Ver Figura 1) Oespues de este tiempo sa inocularon cajas de petri
con agar MRS con 1 ml del cultivo microbiano y se incubaron bajo las mismas
condiciones que eJ caldo Este procedirniento se realiz6 rapetidas veces hasta
seleccionar la cepa pura mediante observaci6n de caracteristicas morfologicas de
la cOlonia y a cada colonia se Ie practico la coloracion de gram con el fin de
observar las caracteristicas microscopicas de cada una e identificar las de mayor
similitud a los Lactobacilos y Bifidobacterias
Figura 1 Camara de anaerobiosis
27
2212 De la leche
Sa tomo 200 ml de teche cruda de la planta de leches y se colaca a fermentar
baja anaerobiosis durante 15 dras Luego sa procedia como en los vegetales
2213 De mucosa vaginal humana
Se tomo una muestra de frotis de mucosa vaginal humane can capito esteril sa
puso a ncubar en Caldo MRS y se procedi6 camo en 2211 y 2212 A cads
aislado sa Ie practico la coloracion de gram y sa seleccionaron aquellas que eran
bacilos gram positivos (Ver Tabla 2)
28
TABLA 2 Fuente de aislarniento de cepas nativas
CEPA FUENTE
1 Pepino fermentadQ
2 repollitas de bruselas fermentadas
3 Repolltgt fermentado
4 Repollo fermentado
5 Mucosa va~inal humana
6 Mucosa vaginal humana
7 repollitas de bruselas fermentadas
8 Repollo fermentado
9 repollitas de bruselas fermentadas
10 Mueo~a vaginal humana
11 Repollo fermentado
12 RepolJo fermentado
13 Leche fermentada
14 Mucosa vaginal humana
15 repollitas de bruselas fermentadas
16 Repollb fermentado
29
222 Almacenamiento de las cepas aisladas
Cuando las cepas crecieron en agar MRS homogEmeas en color morfologia
coloraci6n de Gram etc se pssaron a agar inclinado en tuba se cubrieron con
aceite mineral y se guardaran en refrigeraci6n a 4deg C para tomar de alii la cepa y
efectuarle las diferentes pruebas para confirmar el genera y determinar la especie
de cada una de eas (Ver Figura 2)
Figura 2 Cepas en tubos con agar inclinado
30
223 Pruebas para determinar et genero
2231 Coforaci6n de Gram
A cada cepa sospechosa de Lactobacilos se 1e hizo la coloraci6n de gram y se
seleccionaron las gram positivas
2232 Morfologfa
En agar MRS y despues de incubar en anaerobios~s crecian colonias grandes
cremosas de color beige con bordes homogeneos y c6ncavas(Ver Figura 3)
Figura 3 Colonias aisladas en agar MRS
31
2233 Prueba de esporulaci6n
A cada cepa aislada se Ie hizo esta prueba la cuel consistia en incubar en
aerobiosis durante ocho dias las cajas de agar MRS donde crecieron colonias de
Lactobacilo$ y luego se les (ealize) coloraci6n de espora Las capas que dieron
negativa a la prueba de espora se considararort sospechosas de sar Lactobacilos
y se continuo con la prueba de la catalasa (Ver Tabla 3)
2234 Prueba de la catalasa
los lactobacilos carecen de catalasa Eata prueba se hizo tomando una colonis
se deposito en vidrio de reloj y se Ie adicion6 dos gotas de peroxida de hidr6geno
(H202) la que no presentaba efervescencie eran cepe sospechosa de ser
Lactobacilo (Ver Tabla 4
Sa seleccionaron las capas euyo resultado fue aeorde con el genera Lactobacilfu$
y se continuo con la comirmaeion del genera y determinacion de la eSpecie
meqiante las pruebas bioqulmicas
32
224 Prueba para determlnar la especie
Para confirmar el genero y determinar la especie de las diferentes capas aisladas
se hizo una caracterizaci6n bioqufmica utilizando un kit de API 50 CHL Medium
Ref 50 410 que contiene una galed8 de medios que permite realizar el estudio
de fermentaci6n de los 49 azucares de 52 especies de Lactobacillus (Ver Figura 4
y tabla 5)
Figura 4 API CHL 50-Prueba bioquimica
33
225 Pruebas para determinar microorganismos probi6ticos
2251 Resistencia a pH=2 y sales biliares de concentraci6n O3pv
A las cepas idantificades como Lactobacillus brevis y Lactobacillus pantarum sa
las realiz6 Ie prueba dfl resistencia a pH=2 y sales biliares de concentraci6n 03
pv ( Jacobsen et al 1999) Una colonia de cada cepe aislada se inocul6 en 4 mt
de caldo MRS durante cinco dras bajo condiciones de anaerobiosis Oespues de
esta tiempo se dejaron pracipltar los microorganismos por sedimentaci6n se Ie
retire el sobrenadante y al precipitado se Ie adicion6 Sml de caldo MRS
previamente ajustado a pH=2 can seido clorhfdrico (HCI) dentro del mismo tuba de
ensayo G igual sa hizo can otro tubo previamente incubado pero a este se Ie
adiciono 5ml de caldo MRS con sales biliares a una concentra~i6n de 03 plv y
ambos se incuberon a 37deg C por 2 haras Sa midio 01 mi de cada uno de los
tubas al tiempo 0 y a las 2 horas y sa inoculeron en superficie en caJas de petri
con agar MRS S9 incubaron a 37deg C bajo anaerobiosis durante 48 horas Se
compararon visualrrente en cada caja de petri el crecimiento en superficie y las
que presentaron crecimiento en tos dos tiempos (0 y 2 horas) tanto en at media
acido como en sales I se consideraron resistentes a pH=2 y sales biliares (03
pv)
(Ver Tabla 6)
34
226 Conservacion
Todas fas capas que habian dado positiva Jas pruebas anteriores y que reaultaron
resistentes a pH=2 y sales biliares 03 pv y despues de identificadas en API 50
CHL sa repicaron en agar MRS en tuba inclinado y despues de Incubar a 37deg C
por 48 horas bajo anaerobiosis se Ctlbrie el biser completamente can aceite
mineral esteril y sa guardaron en refrigeraci6n
227 Elaboracj6n de fa bebida fermentada
2271 Preparaci6n de la mue$tra
Sa tome 1 mt de caldo MRS previamante inoculado e incubado que presentaba
una concentracion de Lactobacillus brevis de 27x108 Iml segun la escaJa de Mac
Farlan y sa adiciono a 9ml de leche pasteurizada en un tubo sa dej6 incubanda
en anaerobiosis por 48 hores Luego se pasaron estos 10 ml a un frasco qua
cont~nie 90 ml de leche pasterizada y se dej6 incubando par 48 haras en
anaerobiosis
35
2272 Adici6n del inOculo
A 900ml de leche pasteurizada se Ie adicion61os 100 ml de leche que habia sido
previamente ino(ulada dos veces con la cepa posteriormente se deja
fermantando la lache a temperatura de 37deg C
2273 Control de Ja fermentaci6n
Las muestras se hicieron por cuadruplicado y se les hizo un seguimiento de
aoidez hasta un valor entre 04 y 05 expresada como Bcido lactico esta
procedimiento corresponde a la babida fermentada sin prebi6tico La bebida ~on
prebi6tico tiene al mismo proeedirnianto pero adicionalmente se agrag6 avena a
una concentraci6n de 05 en el momento de la adici6n del in6e410 a los 900 ml
de leehe pasteurlzada y el procedimiento sigui6 igual al de la bebida sin prebi6tico
tambien se hizo por cuadruplicado
2274 Refrigeracl6n
Despues que las mezclas con y sin prebiotico alcanzaron el de acidez
requarido se IIeva ron a refrigeraci6n a una temperatura de 4deg C p~r 24 horas
para frenar proce~os metab6licos de los microorganisrtlos Despues de este
ti~mpo se procedi6 al batido
36
1 2275 Batido
Con un agitador se procedi6 a batir las bebidas para romper et coagulo formado
y de esta manera homogeneizar la mazela y obtener asf la bebida fermentada
2276 Envasado y almacenamiento
Ambas bebidas se envasaron en frascos vidrio para hacerles seguimiento de pH
acidez(expresado como acido tacticol y recuento de Lactobacillus breviSf los
dies 27 14 Y 21 despues de elaboradas las bebidas perfodo durante el cualta
muestra permanecfa afmacenada a temperatura de refrigeracion(Ver Figura 5
37
Fjgura 5 Diagrama de Flujo
PREPARACION DE LA MUESTRA
ADICION DEL INOCULO
~_____~_B~ATIDO~______~
INCUBACION 37deg C hasta acidez = 04-05 acido laotico
ENFRIAMIENTO
hasta 4 0 C ~------~ ~------~
ENVASADO Y ALMACENAMJENTO
dUrante 21 dfas a Temperatura 4 0 C
38
1
228 Determinaci6n del pH
Se determino por el metoda potenciometrico en un pH-metro manual durante los
dias 2) 7 14 Y 21 de las bebidas lacteas sin y con prebi6tica (Ver Tablas 7 y 8)
229 Oeterminaci6n de la acidez (Expresadfl como acido
lactica)
Se tomaron 9 mJ de las bebida~ sa Ie adicionaron 2 gotas de fanoftaleina como
indicador y sa titulo fa acidez con NaOH 01 N hasta la aparicion de un cotor rosado
debit EI volumen de NaOH utilizado se reporta como valor de de acidez
(VerTablas 10 y 11)
2210 Prueba de viabilidad
Qurante el perfoda de almacenamiento de la bebida lactea se procedi6 a hacer la
prueba de viabiHdad en los dias 7 14 Y 21 para determinar Si los lactobacilfus
permanecfan vivOs a una concentraci6n minima de 106 hasta el dia 21 como 10
establece eJ Articulo 10 de la Rasolucion 2310 del Ministerio de $alud de
Colombja
39
Para asta prueba se tamaron 10 rnl de muestra y se adicionaron a 90 ml de caldo
MRS ruego a partir de esta se hicieron diluciones de 10-2 hasta 10-11 de las
diluciones 109101deg 10-11 se inocul6 1 ml de cada uno en agar MRS siguiendo el
metodo de siembra en profundidad y por duplicado e incubando a 370 C x 5 dras
en anaerobiosis y luego se hicieron tos recuentos por duplicado para esi reportar
los recuentos promedio (Ver Tablas 13 y 14)
2211 AniUisls microbiol6glco de las bebidas Iicteas(con y sin
avena)
Con el fin de determinar las condiciones higienico-sanitarias del producto se
realizaron las pruebas microbiol6gicas de Recuento de mohos y fevadurasml en
agar OGY Recuento en superficia de Staphylococcus coagulasa positivoml en
agar Baird Parker Numero Mas Probable (NMP) de coUfor-mes totales y
Escherichia coliml en caldo Fluorocult y Presencia de Salmonela25ml con BHI
caldo tetrationato y agar Hecktoen (Montoya 1999)
(Var tabla 16)
2212 AnaUsis estadistico
A los datos obtenidos en la medici6n de pH acidez (expresada como Beido
laclico) en los dras 2714 Y 21 y el recuento de Lactobacillus en los dras 714 y21
40
realizados a los dos tratamlentos se tes aplic6 1a prueba t porque solo difieren
en la presencia 0 ausencia del prebi6tico para evaluar si habra diferencia
estadfsticamente significativa para los dos tratamientbs(Ver Tablas9 12 y 15)
41
3 RESULTADOS Y DISCUSION
31 Coloraci6n de Gram y morfologfa
Las cepas aisladas fesultaron Gram positivas (Ver Figura 6) colonias grandes
cremosas dE) color beige con bordes homogeneos y c6ncavos en su
morfologia (Ver Figura 3) resultando de acuerdo a 10 especificado en Stanley
1989 para Lactobacillus
32 Prueba de esporulaci6n y cataJasa
Los resultados de la pruebas de esporulaci6n y catalasa indicados en las
Tablas 3 y 4 respeclivamente dieron conforme a 10 especificado en Stanley
1989 para Lactobacillus
42
1
2 3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
TABLA 3 Resultado de prueba de esporuJaci6n
CEPA RESULfADO ESPORULACION
-- -------------
43
l i ~II bull ~ I I
TABLA 4 Resultado prueba de la catalasa
CEPA RESULTADO CATALASA
1 -2 -3 -4 -5 -6 -7 8 -9 -10 -11 12 -13 -14 -15 -16
3~3 Prueba para determinar la especie
Oespues de hacer las pruebas para seleccionar las cepas sospechosas de ser
Lactobacillus se realizo las pruebas bioquimicas fograndose identificar
Lactobacillus plantarum aislctdo de pepino repollo y repollitas de bruselas
44
fermentados y Lactobacillus brevis de mucosa vaginal y leche fermentada (Ver
Anexos del A al E y Tabla 5)
TABLA 5 Resultado identlficaci6n cepa~
CEPA NOMBRE
1 Lactobacillus planfarum
3 Lactobacillus plantarum
5 Lactobacillus brevis
13 Lactobacillus brevis
15 Lactobacillus plantarum
34 Pruebas para determinar microorganismos probi6ticos
las cepas de Lactobacillus brevis y Lactobacillus plantarum mostraron
rasistencia al medio acido de pH =2 Y sales biliares 03 pv resultado similar al
encontrado por Jacobsen et al 1999 para Lactobacillus plantarum (Ver tabla 6)
45
middot
~~~ttiI lltlmiddot~COX~dtJ ~xtc_~ 2 tr~ k-JlL~middot
-)~~TO DE lJIBUOTECUl rjRL]OTtCA twn GO1IU1
TABLA 6 Resultados a pruebas de resistencia a pH=2 y sales biliares 03 plv
CEPA RESISTENCIA pH=2 RESISTENCfA A SALES BIUARES ()3 pv
1 + +
2 + +
3 + +
4 + +
5 +
6 + +
7 + +
8 + +
9 + +
10 + +
11 + +
12 + +
13 + +
14 +1shy +M
15 + +
16 + +
+1 crecimiento debil
+ crecimiento abundante
46
Figura 6 Lactobacillus brevis Gram + aislado de leche fermentada
Ai observar en placa las celulas de lactobacilos despues de real1zar las pruebas
de resistenCia a la acidez y sales biliares se observo una tendencia a aglomerarse
posiblemente como un mecanismo de proteccion cOlitra estos medios que pueden
lIegar a ser adversos para elias (Ver figuras 7 y 8)
47
Figura 7 Lactobacillus brevis aislada de leche fermentada despu~s de la prueba de resistencia a pH=2
Figura 8 Lactobacillus brevis aislada de leche fermentada despues de la prueba de resistencie asales biUares 03 plv
fI
48
35 --Seguimiento del-pH-en-la-bebidaJacteacon y sin -prebi6tico
A continuacion se muestran las Tablas 7 y 8 donde sa registian los datos
recopilados de pHdurante 10$ dras Z 7 14 Y21 para las bebidas laaeas con ysin
prebi6tioo
TABLA 1 ResultadopH yogur sin avena
Dia Repetition 1 Repetici6n 2 Repeticion 3 Repetici6n 4
2 526 501 51 52
7 446 433 438 44
14 439 435 437 436
21 439 437 438 437
TABLA 8 -ResultadopHyogur con avena
Dia Repeticion 1 Repeticion2 Repeticion 3 - Repeticion 4
2 509 523 51 515
7 447 442 445 442
14 436 -438 439 437
21 432 433 435 434
Observando la Figura 9podamos ver que el pH en el -dfado$ para los dos
tratamientos as igual y empieza a descender rapidamente para estabilizarse a
partir del dra 7(Ver figura 9)
49
Figura 9 Comparacj6n de medias para -el pH
Comparaci6n de medias para pH
55 ~ 5 +----=gtIIIi-~i~~----=-r--it~ -- pH sin avena
a 45 1--~~~~=~~ 4 --- pH con
avena35 t-----r-- -------=------=--= ------- - ----
2 7 14 21
Dias
Aplicando la prueba t para comparar las medias de pH I S6 muestia una diferencia
altamants significativa en los dos tratamientos para el dia 21 (pltO05)
(Ver tabla 9)
TABLA 9 Compaiaci6n de medias para pH
DtAS SIN AVENA CON AVENA te p (VALOR)
2 514 514 0 10
7 439 444 -1 61 0159
14 437 I
438 -070 0510
21 438 433 528 00019 shy
- DiFERENCIA AlTAMENTE SIGNIFICATIVA
50
I
AI aplicar regrasi6n a los datos sa obtiene al modelo estimado
pHSinAyena =535606 - 01505650Ia +0005044340IaI2
La variabilidad en la respuesta de pH asta siendo explicada en un 8S7522 por
el modelo (Ver Anexo F)
EI tratamiento con avena mostro el siguiente modelo al analisis de ragresi6n
pHConAvena =534463 ~ 0140407Dia + 0004480980Ia2
La variabilidad an la respuesta de pH asta siendo explicada en un 903315 par
el nlodelo(Ver anexo G)
36 Seguimiento de la acidezmiddotmiddot expresada comomiddot de acido
lactico
A continuaci6n sa muestran las Tablas 10 y 11 donde sa registran los datos
tecopilados de acidezmiddotdurante los dias 27 14 Y 21 para las pebidas taetees con y
sin prebi6tico
TABLA 10 Resuttadode acidez (expresadocomo acido tactico) yogurt sin avena
CIA R~petici6n1 Repeticion2 Repetici6n 3 Repeticion 4
2 054 06 057 058
7 072 074 073 0]2
14 080 083 082 082
21 0]4 079 078 077
51
TABLA 11 Resultado de aCidez (expresado como acido Icktico) yogurt con avena
Dia Repetici6n 1 RepetiCi6n 2 Repetici6n 3 Repetici9n 4
2 059 055 058 057
7 071 073 072 072
14 089 087 088 086
21 092 091 090 091
Observando la Figura 10 se puede concluir que la acidez empieza a aumentar
hasta el dia 14 y luego trata de estabilizarse para los dos tratamientos
(Ver figura 10)
Figura 10 Comparaci6n de medias para la acidez
N G)
Comparacion de medias para acidez
1
2 0I 5 -+--=--------=-~~~= u
ltC
- Acidez sin avena
2 7 14
Dias
52
21
-it- Acidez con avena
Aplicando la prueba t para camparar las madias de acidez se muestra una
diferencia altarnante significativa en los dos tratamiantos para los dias 14 y 21
(pltO05)
(Var tabla 12)
TABLA 12Comparaci6n de medias para Acidez
DIASmiddot SIN AVENA CON AVENA te p(VALOR)
2 0572 0572 0 10
7 0727 0720 119 0278
14 0818 0875 -638 000070shy
21 077 091 -1212 i 0000019 shy
DIFERENCIA AL TAMENTE SlGNIFICATIVA
AI aplicar r~gresi6n a los datos se obtiene el modelo estimado
AcidezSlnAIena = 0491897 + O0436032Dia O00144613DfaA2
La variabilidad en la respuesta de acidez asta siendoexplicada en un 970978
por al modelo (Ver anexo H)
EI tratamiento con avena mostro elsiguiente modeloj a1 analisis de regresion
AcidezConAvena = 0491638 + 00406572Oia - OQOO982559OiaA2
La variabilidad enla respuesta acidez esta siendo explicadaen un 99212 por
el modelo (Ver anexo J)
53
I ~
37 Prueba de viabiJidad
A continuaci6n sa muestran las Tab~as 13 y 14 donde sa presentan los datos
recopilados del recuento de Lactobacilos durante los dias 7 14 Y 21 para las
bebidas lacteas con y sin prebi6tico
TABLA 13 Recuento de Lactobacilos (UFCml) yogurt sin avena
Dia Repetici6n 1 Repetici6n 2 Repeticion 3 Reptttici6n 4
7 1880X10l1 1454X1011 1642X1011 1780X10~
14 1560X10~ 646X1011J 1890X10l 140X10l1
21 1200x10lu 128Ox10u 1745x10J 1520x101V
TABLA 14 Recuento de Lactobacilos (UFCml) yogurt con avena
Dfa Repetieion 1 Repetici6n 2 Repeticion 3 Repeticf6n 4
7 1600X10lt 1240X10t 1640X10ll 1980X10t
14 540X1011 427X10n 546X10n 720X10ll
21 500x1011 492x1011 712)(1011 980x10~
AI analizar la Figura 11 sa puede observar un recuento mayor de Lactobacilos
en al tratamiento con avena resultado de acuerdo a 10 encontrado por Alander at
aI 1999 Kontula et aI 1998 y Jaskari et aI 1998
54
Figura 11 Comparaci6n de medias para Log Lactobacillus
Comparacion de medias para log Lactobacillus
~ 1350
-+- Sac Sin--() 13 co avenaIII
bull 125 -- Bac con 0)
0 12 avenaJ
115 7 14 21
Dias
Aplicando la prueba t para comparar las medias de recuento de Lactobacillus no
se encontr6 una diferenc1a estadfsUcamente significative entre los dos
tratamientos (Ver tabla 15)
Este aumento en al racuento influy6 en la disminuci6n del pH y en el aumento de
fa aeidez por la fermentacion que realizan los Lactobacillus sobre fa lactosa de la
lache y la avena adicionada como prebi6tico
55
1
TABLA 15 Comparaci6n medias lag Lactobacillus
DIAS SIN AVENA CON AVENA tc p(VALOR)
7 122257 122022 04846 06451
14 121065 132393 -19602 00977
21 129025 133087 -08236 04416
At aplicar regresion a los datos se obtiane al modelo astimado
LactobacillusSinAvena= 117347 + 004834640Ia
La variabilidad en la respuesta del recuento de LactobaCillus ssta siendo
explicada en un 260054 por el mod$loVar anexo J)
EI tratamiento con avena mostr6 al siguiente modalo al anal isis de regresion
Lactobacillu$ConAvena =118103 + 007903040Ias
La variabilidad en la respuesta de recuento esta siendo explicada en un 3068
por al modelo(Ver anexo K)~
38 Analisi$ microbiol6gicos de las bebidas lacteas con y sin
En la Tabla 16 estan recopilados los resultados microbiol6gieos obtenidos en ras
muestras con los dos tratamientos (con y sin avena)
I [
sa
TABLA 16 Resultados analisis microbiologico
Recuento de mohos y levaduras Iml lt10
Recuento de Staphylococcus coagulase positiva Iml lt100
NMP coliformes fotales y Escherichia coli Iml lt3
Presencia de Salmonella25ml Ausente
Los resultados de este analisis demuestran que las bebidas fermentadas con y
sin avena~ astan fibres de microorganismos patogenos
57
1
4 CONCLUSIONES
Se aislaron cepas nativas de Lactobacillus plantarum de las muestras vegetates
de repollo pepino repollitas de bruselas fermentadas y Lactobacillus brevis de
lache fermentada y mucosa vaginal humana Ambas cepas resistieran un pH=2 y
una concentraci6n de sales biliares det 03 ptv dos earacteristicas importantes
en los probi6ticos
Lamiddot cepa de Lactobacillus brevis aislada de lache Sa utiliz6 para elaborar una
bebida fermentada sin y con avana comoingrediente prebiotico obteniendose un
aJimento centon recuento del probi6tico viable durante 21 dras de seguimiento
ademas libre de microorganismos )at6gen05
No se encontr6 efecta significativo de la avena sobre Ie viabilidad del Lactobacillus
brevis aunque sa presento un aumento en 61 recuento de estos en la bebida con
avena
58
plusmn ~
5 RECOMENDACIONES
Ensayar la cepa de Lactobacillus plantartJm en productos carnicos madurados
como el salami
Ensayar la cepa de Lactobacillus l)revs en otros derivados lecteos como queso
quesito queso crema
Continuar con el estudio de estos microorganismos y caracterizarlos
molecularmente ademas de estudiar su capacidad de adherencja a fa mucosa
intestinal sobre algunes Hneas celulares como las CaCo~2
Estudiarel efedo de la avena sabre la viabiJidad del Lactobacillus breyis a una
concentraci6n mayor de 05
Realizer ensayos can las cepas de Lactobacillus brevis y Lactobrlcillus pJantarum
para elaborar masas acidas para panificacion reemplazando el Bromato de
Potasio aditivo prohibido desde marzo del 2003 en nuestro pais per 5U toxicidad
59
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65
ANEXOS
66
ANEXO A RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AlSLADA DE i
PEPINO it
Referencia Pepino 1 Fecha 06122002
IEXCELENTE IDENTIFICACION
Latto plantarum 1
Galeria API 50 CHL V50 Leida el 06122002
Perfil - -- - ++ - -- - ++++ - - -+- + - I I I I I I I I +t+ - +f- ~ - - + + ~ - - - +- + - shy
o - GLY - ERY DARA - LARA + RIB + DXYL - LXYL - ADO - MDX - GAL + GLU + FRU + MNE + SBE - RHA - DUL - INO bull MAN + SOR - MDM + MUG shyNAG + AMY + ARB + ESC + SAL + CEL + MAL + LAC + MEL + SAC + TRE + 1NU - MLZ + RAF + AMD - GLYG - XLT - GEN + TIJR + LYX - TAG - DFUC shyLFUC - DARL + LARL - aNT + 2KG - 5KG shy
--- Taxones significativos rd -----T -- Tests en contra
Lactoplantarum 1 999 092 1
Taxon siguiente Lactobrevis 1 OJ 044 3
i i
Lactoplantarum 1 1 test (5) en contra
D-SORBITOL (SOR) 78
Tax6n siguiente Lactobrevis 1 3 test (s) ert contra
METHYLD-MANNOSIDE (MOlM) 0 MELEZITOSE (MLZ) 14 D-TURANOSE (TUR) 14
67
ampb
ANEXO B RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AISLADA DE REPOLLO FERMENTADO
~
Referencia Repollo fermentado - 3 Fecha 03072003
EXCELENTE IDENTIFICACION
Lactoplantarum 1
Galena API 50 CRL V50 Leida el 03072003
Perfil - - ++ - - - - -H++ - - ~ + - + - I I 1 I I I I -H+ - ++ - - - + + - -- - - + - shy
o - GLY - ERY - DARA - LARA + RIB + DXYL - LXYL - ADO ~ MDX - GAL + GLU + FRU + MNE + SBE ~ RHA - DUL - INO - MAN + SOR - MDM + MDG shyNAG + AMY + ARR + ESC + SAT + CRL + MAL + LAC + MEL + SAC + TRE + lNU - MLZ + RAF + AMI) - GLYG - XLT - GEN + TOR + LYX - TAG - DFUC shyLFUC - DARL - LARL - GNT + 2KG - 5KG shy
------Taxones significativos _ _----- Id--- ---T---- Tests en contra
Lactoplantarum 1 999 095 1
Tax6n siguiente Lactobrevis 1 01 OA8 3
lJactoplantaru01 1 1 test (s) en contra
DSORBITOL (SOR) 78
Taxon siguiente Lactobrevis
METHYL-D-MANNOSIDE D-TURANOSE
1
(MOM) (TOR)
3 test (5) en contra
0 MELEZITOSE 14
(MLZ) 14
i
I
68
ANEXO C RESULTADO PRUEBAS BIOQUWICAS DE CEPA AISLADA DE MUCOSA HUMANA
Referenda Mucosa - 5 Fecha 27012003
BUENA IDENTlFICACION
Galeria API 50 CHL vso Leida el 270112003
Perfil - - - - +t--t - - - + - + - - - - - - - - -+- - - - - + - + - - - - - - - - - - - - - bull - - -+ - +
o - GLY ~ ERY - DARA bull LARA + RID + DXYL + LXYL - ADO bull MDX - GAL + OLU - FRU + MNE - SBE - IlliA - DUL - INa - MAN - SOR - MDM - MOO shyNAG + AMY - ARB - ESC ~ SAL bull CEL - MAL + lAC - MEL + SAC - TRE shyINU - MLZ - RAF - AMD - GLYG - XLT - GEN - 11JR - LYX - TAG - DFUC shyLFUC - DARL - IARL - ONT + 2KO - 5KG +
- - - - - - Taxones significativos - - - - - - - Id T -- Test en contra
Lactobrevis 3 963 088 1
Taxon siguiente Lactoco11inoides 36 075 2
Lactobrevis 3 1 test (s) en contra
GLUCOSE (GLU) 95
-~~~------------~---------------------------~--~-------~--~-----~----------~--------~------------~~--Taxon siguiente Lactocollinoides 2 test (s) en contra
GLUCOSE (GLU) 100 MELIBIOSE (MEL) 25
69
i r
ANEXO D RESULTADO PRUEBAS BIOQIJiMICAS DE CEPA AISLADA DE LECHE FERMENTADA
Referenda Leche fennentada ~ 13 Fecha 27012003
BUENA IDENTIFICACI6N
Galeria API 50 CHL V50 Leida el 270112003
Perfil - - - - -t-t+- - - - + - + - - - bull - - - - -+- - - - - + - + - - - - - - - - - - - - - - - - -+ - +
0 - GLY - ERY - DARA - LARA +Rll3 + DXYL + LXYL - ADO - MDX ~GAL + GLU - FRU + MNE SBE - RHA DUL bull INO MAN - SOR MDM bull MDG shy
~NAG + AMY - ARB - ESC - SAL - CEL - MAL + LAC - MEL + SAC - TRE I lNU - MLZ - RAF - AMD - GLYG - XLT - OEN - IUR LYX - TAG - DFUC bull i
LFUC - DARL - LARL -ONr + 2KG - SKO + 1
- -- - - Taxones significativos - - Id -- T --- Test en contra
Lacta brevis 3 963 088 1
Taxon siguiente Lactocollinoides 36 075 2
Lactobrevis 3 1 test (s) en contra
GLUCOSE (GLU) 95
-----------------------------------------------------------~------------------------------~-------------------Taxon siguiente Lactocollinoides 2 test (s) en contra
GLUCOSE (GLD) 100 MELffiIOSE (MEL) 25
70
II iJ1
I
I ANEXO E RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AISLADA DE REPOLLITAS DE BRUSELAS FERMENTADA
Referencia repollitas de bruselas 15 Fecha 03072003
EXCELENTE IDENTIFICACION
Lactoplantarum 1
Galeria API 50 CHL vsO Leida el 03072003
Perfil - - - - +t - - - - +H+ - +- - +t + - I I I I I I I f ++t - + - - - -+ + - - - -+ -+ - - I ij
o - GLY - ERY - DARA - LARA + RJB + DXYL - LXYL - ADO - MDX - GAL +
GLU + FRU + MNE + SBE RHA + DUL - INO - MAN + SOR + MDM + MOG shyNAG + AMY + ARB + ESC + SAL + eEL + MAL + LAC + MEl + SAC + TRE + i
I1NU - MLZ + RAF AMD GLYG - XLT - aEN + TUR + LYX - TAG - Druc LFUC - DARt + LARL - aNT + 2KG - 5KG shy n ----Taxones significativos ------ Id Tests en contra
Lactoplantarum 1 999 090 o
Taxon siguiente Lacto pentosus 01 012 7
Lactoplantarum 1 o test (s) en contra
Taxon siguiente Lacto pentosus 7 test (8) en contra
GLYCEROL (GLY) 75 D-XYLOSE (DXYL) 100 L-RHAMNOSE (RHA) 25 METHYL-D-MANNOSIDE (MOM) 1 MELEZITOSE (MLZ) 25 RAFFINOSE (RAF) 75 D-ARABITOL (DARL) 0
71
~
I i I
ANEXO F - ANALISIS DE REGRESION PARA pH EN BEBIDA SIN AVENA
Aruilisis de regresi6n polinomial
---~-~-------------------------------------------~-----------~~---------------------~--------------Variable dependiente pHSinAvena ---------------------------~-------------~--------------------~---------------------------------
Error T Parametro Estimado Estandar Estadistico P-Valor
CONSTANTE 535606 0094535 56657 00000 Dia -0150565 0020706 727154 00000 Dia2 000504434 0000871488 578819 00001
---~---------------------------------------------------------------------------------------------------
Anfllisis de Variama -------------------------------------------~-----------~-----------------------------~-~--- jSource Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor 11
------------------------~------------------------------------------------------------------------------~ Mod-elo 155772 2 0118861 4256 00000 Residual 0237877 13 00182983
Total (Corr) 11956 IS
R2 == 867522 percent
pHSinAvena == 535606 - 0150565Dia + 000504434Dia2
72
____
middot ANEXO G - ANALISIS DE REGRESION PARA pH EN BEBIDA CON AVENA
AmUisis de regresion polinomial _____~_____~__-_____~___4____________________bull____bull__________bull_____________~~----_------___________
Variable depcndiente pHConA vena ------------------------------------------------------------------------------------------~--------
Error T Parametro Estimado StAndar Estadfstico P-Valor
---------------------------------------------~-----------------------------------------------_---------CONSTANTE 534463 00801045 667208 00000 Dia -0140407 00175453 800253 00000 DiaA 2 000448098 0000738458 606803 00000
----------------------~---~-----------------------------~------------------------------~----AmUisis de Varianza
---~---------------------------------~---------------------~------------~-------------------~------Source Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio PValor --------------------------~-----------------------------------------------~------------~-----~~--~ ModeJo 159575 2 0797873 6073 00000 Residual 02170798 middot13 00131383 _______~_~ ~_~----------~------~--~-----~-M-----~-----____ _____________~-----------------------Total (COlT) 176654 15
R12 903315 percent
-----------~------------------------------------------------------------------------~-----------pHConAvena 534463 - 0140407Dia + 000448098DfaA 2
73
ANEXO H - ANALTSIS DE REGRESTON PARA ACIDEZ EN BEBJDA SIN AVENA
An8Jisis de Regtesi6fi P6lifJomial
Variable Depefidiefile~ AcidezSinAVenll _______________w_____~______~________________~-----------_________~_________________~~____~___~_____
Error T Pariirnetro Estimado Estandar Estadistico ---------------------------------------~--------------~-~-------~--------------------~------------CONSTANT 0491697 00123217 399051 00000 Dia 00436032 000269882 161564 00000 D1a2 -000144613 000011359 127312 00000 __w___~________________________~-_______-_____~----____________________________~__~---~_--__~___
AriiiJisis de varianza ~_~__~__________~_~____~________~___________- _________e_____________________________bull _____-________
Source Smn de cuadr Df Mean Square F-Ratio PmiddotValor_~~___________________________________bull ______~___________bull ____________bull ______~________w________________
Model 0135203 2 00676013 21747 00000 Residual 000404118 13 000031086
Total (Corr) 0139244 15
R2 970978 percent
AcidezSlnAvena 0491697 + O0436032Dia - 0OOl44613Dia2
74
I
ANEXO I ANALISIS DE REGRESION PARA ACIDEZ EN BEBIDA CON AVENA
1
Anwisis de tegtesi6fi polinomial
Variable dependiente Acidez Con Avena
Error T ParametTo Estimado Stlindar Estadfstico P-Valor ----------------~-------~---------------------~-----------------------------------------------------CONSTANT 0491639 000926607 530578 00000 Diamiddot 00406572 000202955 200326 00000 DfaA 2 0000982559 0000085421 -115025 00000
-------------~----------------------------~-------------------------~-----------------------------------
-------------~-----~~-----------------------------~---------------------------------------------_--Source Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio PValor
-~-------------~----------------------------------~------------------~~-------------------------- Modelo 0288008 2 0144004 81914 00000 Residual 000228539 13 0000175799
----------~~--------------~---------------------------------------------~---------------------------Total (Corr) 0290294 15
RA2 = 992127 percent
-------------------------~----~---~------------~---------------------------------~---------------~
AcidezConAvena == 049163amp + 00406572D1a - 0000982559DiaA2
75
I
(Ilmiddot il
ANEXO J- ANALISIS DE REGRESION PARA RECUENTO LACTOBACILOS PARA BEBIDA SIN AVENA
Amilisis de regresion - Modelo lineal Y = a + bX
------------------------~----------------------~-----------------------------~----------~-----------Variable Dcpendiente LactobacilJusSinAvena Variable independiente Dia
I--------~----------~-----------------------------------~-------~-~--~--------------------------~-Error T
Paramctro Estimado Standard Stadistico P-Valor
----~----~------------~-----~-----------------------~-------------~-----------------------------Intereepto 117347 0389973 300911 00000 Pendiente 00483464 00257889 18747 00903
Analisis de Varianza
---------~------------------~----------------~---------------------------------~---------~----------Source Sum decuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor
------------~---------------------~---------------------~--------------------------------~-----~----Modelo 0916252 1 244835 443 00616 Residual 260706 10 0260706
--~------------~---~------------------~~~-----~-------~---------~~-------------------------------------Total (Corr)352332 11
Coeficiente Correlaci6n = 0509955 R2 = 260054 percent
LactobacillusSinAvena= 117347 + 00483464Dfa
76
ANEXO K- ANALTSIS DE REGRESION PARA RECUENTO LACTOBACILOS PARA DEBIDA CON AVENA
Aruilisis de regresion - Modelo lineal Y = a + hX
Variable Dependiente LactobacillusConAvena Variable Independiente Dia ---~--------------------------------------------------------__-----------__--_--_-----------shy
Error T Paramctro Estimado Standard Estadistico P-Valor -~--------------------------------------------------------------------------------------------------
Irttercepto 118103 0567963 207942 00000 Pendiente 00790304 00375594 210414 00616
-----------------~----------------------------~----~-------~----~----------------------------
Analisis de Varianza
----------------~----------------~------------------~--------------------------~------~--------shySource Swn de cuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor
-----------------~--~--------------------------------------------------------------------------~---~ Mode10 244835 1 244835 443 00616 Residual 552997 10 0552997
Total (Corr)797832 11
Coeficiente Correlacion = 0553964 RI2 = 306875 percent
-----~--------------------------------------------------------~--------------------------------------
LactobacillusConAvena = 118103 + 00790304Dfas
77
)lli~ h Dx nIILIOTECM
eJDe~~ l1ilmfJ tIDBnm
Los Lactobacillus son bacilas gram positiv~s no esparuladas aerotalerantes
acido - tolarantes estrictamente fermentadares formadores de Boido laclica como
producto principal catalasa negativo carentes de citocroma sin embargo se
presentan excepciones a esta descripcion parque afgunas especies pueden
formar catalasa 0 citacramo en medios que contienen hematina 0 compuestos
relacianados La produccion de catalasa no hema pseudocatalasa puede causar
tambien alguna confusion en fa identificacion de algunos Lactobacillus
las especies del genera Bifidobacterium san bacilos gram positivos no
esporulados generafmente anaerabios estricto$ aunque pueden creeer bajo
condiciones microaer6filas cuando estan ert presencia de C02 La mayorfa de sus
especies se pueden diferenciar par criterios biaquimicos simples como la
fermentacion de L arabinosa DmiddotxiJasa O-manosa O-manita y O sorbitat que
pueden servir coma caracterist1cas clave para su clasificacion (Holzapfel
etal2001 )
114 Caracteristicas de los probi6ticos
Las cepas de microorganismos prabi6ticos deben presenter y mantener unas
caracteristlcas que garanticen su crecimienta y supervivencia En el alimenta
como tambiEm durante su transito a traves del est6maga e intestino delgaQo
17
La primera CBtacterfstica es que sean viables esta viabifidad esla capacidad que
tienen los microorganismos probi6ticos de permanecer vivos tanto ~n el alimento
como en el Intestino del consumidor por un tiempo determinado En Colombia se
ha establecido que en bebidas fermentadas este tiempo debe ser minimo de 21
dras en el alimento (Minsalud 1986) Esta vjabilidad depende del metodo de
produccion y de la cepa utilizada (Tuomols at a 2001)
Luego de que se garantice que estos microorganismos eslan viVos en el alimento
ell os deben cumplir otro criterio importanle para ser considerados como
organismos probi6ticos y as tblerar las condiciones de acidez a un pH=2 y la
sccian de proteasas del est6mago ademas de sobrevivir y creeer en presencia de
acidos biliares (Tuomola et al 2001 Jacobsen at a 1999) para luego de
sobrevivir a estas condiciones adherirse a la mucosa intestinal y de esta manera
estimular al sistemainmunoJ6gico esta capacidad de adherirse a la mucosa es un
prerrequisito para la colonizacion del intestlno (Toumola etal2001 Alander et aI
1999)
Cuando los probioticos han pasado todas esta pruebas de supervivencia y luego
de impfantados en la mucosa producen acidos organicos peroxido de hidrogeno y
tambien bacteriocinas que actUan como inhibidore$ del crecimiento de
microorganismos patogenos u oportunistas (Tuomola at al 2001 Cintas et al
2000) complementando de asta manera su accion benefica sobre la mucosa
intestinal y en general sobre la saJud del huesped
18
116 Berieficios de los microorganismos probi6ticos
Los beneficios que se asocian a los microorganismos probioticos son muchos y
variados Entre ros comprobados mediante estudios se eneuentran
1151 Facilitar la digesti6n de la lactosa
los microorganismos probioticos cuando estan en el intestino liberan alii la
enzima pmiddotgalaotosidasa capaz de hidrolizar la lactosa haste glucosa y galactosa
evitando as que personas intolerantes a este carbohidrato presenten sfntomas
como flatulencia dolor abdominal y diarrea cuando consumen leche (be Vresse
et 81 2001)
1152 Protegen contra enfermedades gastrointesUnales
EI consumo de aJimentos con probioticos ha mostrado efeeto terapeutico frente a
los sintomas de diarrea asociada al surninistro de antibi6tico$ de amplio espectro
que destruye 0 disminuye la microbiota endogena esta imp ide la coJonizacion de
bacterias patogenas como Klebsiella oxytoca y Clostridium difficile que pueden
causer lesiones en el cn Los probi6ticos recuperan el balance de la microbiota
intestinal nativa y avitan Ie adhesion de algunos virus bacterias pat6genas a
parasitos que pueden ser agentes causales de gastroenteritis la diarrea del
19
J
viajero y 1(3 inflarnacion intestinal que en ultima instaneia oeasionan ef sfndrome
del colon irritable (Marteu et al 2001)
1153 Protegen contra infecciones del tracto urogenital
La vaginitis indueida por baeteriss yo por levaduras as una infecci6n
estrechamente relacionada con la exposici6n a antibi6ticos y espermicidas y
tambien depende del estado hormonal de la n1ujar Con al uso de mezcJas de
probi6ticos se han obtenido buenos resultados en la rastauraci6n de la rnicrobiota
natural urogenital benefica que desplaza a los eausantes de la inflamaci6n de Is
vagina y Ie uretra (Reid 2001 )
1154 Promueven la barrera de defensa end6gena del intestino
EI tracto gastrointestinal normal mente as una barrera natural contra anUgenos de
origen microbiano y alimentario Cuando los probi6ticos sa adhieren a Is mucosa
intestinal estimulan 0 potencian al sistema inmune favoreciendo la
inmunomodulaci6n que induce un aumentb de fa producci6n de inmunoglobulinas
activacion de las calulas mononueleares y de los linfocitos para proteger al
huesped de infeeciones (Isoulari et sl 2001)
20
1155 Protegen contra cancer de colon
EI cancer es el resultado de una serie de mutaciones somaticas que pueden
ocurrir durante al tiempo de vida del individuo y 10 padeca buena parte de la
poblacion mundial los probi6ticos en un sistema in vitro han demostrado un
efecto positivo en la prevenci6n de mutaciones aI desactivar carcin6genos
genotoxicos (Wolloswski et al J 2001)
1156 Protegen contra infecciones respiratorias
Sa ha demostrado que el conslJlno de probi6ticos disrninuye la incidencia de
infecqiones raspiretorias al aumentar la actividad fagocitica de maer6fagos
alveolares que aettian sobre microorganismos patogenos Se hizo un estudio en
571 ninos sanos con edades entre uno y seis anos divididos en dos grupos a uno
de ellos sa las incluy6 en su dieta leche suplementada can Lactobacillus GG y a
los otros ninos leche no suplementada AI final del estudio se observ6 una
disminucion del 19 en la incidencia de infeccionas respiratorias tratadas con
antibi6ticos tales como otitis media sinusitis bronquitis y neumonfas en el grupo
de los ninos que consumieron Lactobacillus GG (Hatakka et al 2001)
Alvarez et al (2001) encontraron que la administraci6n de yogurt con Lactobacillus
casei en ratones de tres arios de edad majora los espacios libres del puJrn6n de
la presencia de Pseudomona aeruginos8 induciendo un aumento
21
significativo en los niveles de gA a IgM datactadas en los lavados
broncoaJveolares y se observ~ un afecta dependiente de la dosis
1157 En el tratamientoy prevenci6n del eczema
Se ha encontrado que el consumo de probi6ticos mejora la inflamaci6n alergica 0
eczema at6pico en ninos alimentados con formula suplementada con probi6ticos
Encontraron una mejora significativa al suministrar Bifidobacteriummiddot actis y
Lactobacillus GG en 27 niiios con edad promedio de 46 meses Luego de aplicar
este tratamiento se sometieron a una prueha de SCORAD (mide fa extension y
gravedad del eczema) registrando una meJoria significatlva en las condiciones de
la pie concentraci6n de citoquinas cirClllantes an sueto y moleculas de adhesi6n
a las superficies de las celulas soJubles en suero (Isolari 2000)
Se realizaron otros estudios a 159 mujeres embarazadas con historia familiar de
eczema atopico de primer grado a las cuafes sa res 5uministro dosis diarias de
Lactobacillus GG durante 2 a 4 samanas previas al parto Oespues de ella fa
madres twiaron la opci6n de continuer tomando el ptobi6tico si amamantaban 0
bien darseio vIa oral La mayoria de las madras eJigieron dar las dosis at bebe
diariamente A los dos anos de vida se observ6 una disminuci6n del 50 en la
frecuencia del eczema at6pico en aquellos nHies que se les dio ef probi6tico
(Kalliomari etal 2001)
22
1158 Previenen infeccion en heridas quirurgicas
Los probi6ticos impiden la union de pat6genos a las superficies celulares en
heridas mediante la seCreci6n de proteinas Actuamente se encuentra en
estudio la aplicaci6n del Lactobacillus fermentum vivos sabre heridas en piel de
ratas y se ha encontrado una disminuci6n del 90 en la colonizaci6n par parte del
StaphylococcuS aureus uno de los patogenos mas temidos y de mayor lncidencia
en infecciones hospital arias mas aun se esta contempiando la posibilidad de
utilizar la protein a purificada an lugar de los mjcroorganismos para la protaccion
contra infecciones en heridas (Strauss 2000)
12 PREBIOTICOS
Son carbohidratos de cadena corta algunas veces reconocidQs como
oligosacaridos no digeribles par las enzimas del epitelio intestinal 0 de las
gliJnduJas anexas debido a su estructura quimica y de esta manera lIegan al
intestino grueso donde alcanzan a estar disponibles para la fermentaci6n por las
bacierias sacaroHticas que son especial mente laetobadlos y bifidobacterias
dando odgen a compuestos que ejercen efectos funcionales sobre la mucosa del
tubo digestivo (Brunser 2001)
Se consideran como tal algunos fructocligosacaridos isomaltooligosacariclos
oligomato palatinosa poHdextrosa pOJidextrrna raftilina y algunos oligosacaridos
23
)
de 1a soya y fa avena Estenmiddot presentes en alimentos como Ie cebolla ajo
banano puerros 1 derivados del trigo achicoria esparrago alcachofa (Cummings
etal 2001)
Algunos de estos prebi6ticos cuanda son incorporado$ a fa dieta en cantidades
dalerminadas alteran la microbiota intestinal disminuyendo los recuentos de
coliformes bacteroides y cocos y aumentando las bifidobacterias hasta en diez
veces ademas modifican la actividad metab6lica del coron logrando una
disminuci6n del pH y un incremento en el contenido fecal de acidos grasos de
cadena corta como at acatica propi6nico y butfrico El butirato aumen~ _I grosor
de la pared del coron e intestino delgado estimula eJ crecimiento de la mucosa del
colon y auManta su flujo sangufneo inhibe el crecimiento de tinsas tumorales
epiteliales de origen co16nico induce la diferenciaci6n de sus celulas y a
apoptosis entre otros(Brunsar 2001)
Eh estudios hechos en simuladores del intestino humano utilizando productos de
avena fermentados se encontro que estimularon al crecimiento tanto de
lactobacios como de bifidobacterias y en el caso de estas ultimas se incremento
la producci6n de los acidos acatico propionico y butfrico 10 que incide sobre la
implantacion de probi6tico$ e inhibe al crecimientos de otro tipo de
microorganismos (Alal1der eta1999 Kontula etal 1998 Jaskari etal 1998)
24
~ -1
(
AI comparar el comportamianto de las leches de diferente origen se ha
demostrado que Ie leche de vaca contiene caseinatos sustancias que forman
buffer ~n et intestino e inlpiden que los probi6ticos disminlJyen el pH del intestina
y de esta manera se impide al efecto deseado que es evitar fa proliferaci6n de
otros microorganismos entre los cuates pueden estar algunos patOganos En la
leche materna sa encuentran algunos carbohidratos como glucosa galactosa n
acetilglucosamina y algunos 0lig6meros de Ie fucosa en cOhoontracionesmiddot
importantes los cualeS favoreceh el crecimientc)middot de probi6ticos esto
complementado can 91 bajo contenido de protenas que se traduce en una
reducida capacidad buffer hacen de Ie lache materna IJn alimentd adecuado para
nllios en su etape de lactancia
Algunos prebi6ticos como 1a lactulosa yciertos compuestos que contiansn fructosa
no son digeridos en el intestino humano y pueden sar utilizados selectivamenta
par los probi6ticos 10 que hace que los probi6ticos en combinaci6n can prebi6ticos
pueden lIegar a ser un importante medio para prevenir algunas enfermedades del
tracto gastrointestinal (Bezkorovainy 2001)
25
2 METODOlOGfA
21 LOCALIZACION
EJ trabajo sa realizo en el laboratorio de Microbiologia y la planta da laches de Ja
Universidad Naclonal de Colombia- Secie Medellin
En al laboratorio se hiZQ al aislamiento a identificaci6n de fa capas y en fa Planta
sa eJaboro la leche fermentada con 1a cepa seleccionada y el prebi6trco
22 METODOS
221 Aisiamiento de cepas nativas
Las cepas nativas se sislaran de producto$ vegetales leches fermentadas y
mucosa vaginal humana
2211 De vegetales
Las muestras vegetales de repollo repollitas de brusefas y pepino se
seleccionaron porcionaron y mezclaron can cloruro de sadio al 10 pIp se
calacaron en un recipienta de vidrio balo anaerobiosis y sa dejarQn por 15 dias
26
luego S9 tomaron 3 ml de cada muestra y se jnocularon 9 ml de caldo MRS (Man
Rogosa and Sharpe) se incubaron a 37deg C durante cinco dias en camara de
anaerobiosis (Ver Figura 1) Oespues de este tiempo sa inocularon cajas de petri
con agar MRS con 1 ml del cultivo microbiano y se incubaron bajo las mismas
condiciones que eJ caldo Este procedirniento se realiz6 rapetidas veces hasta
seleccionar la cepa pura mediante observaci6n de caracteristicas morfologicas de
la cOlonia y a cada colonia se Ie practico la coloracion de gram con el fin de
observar las caracteristicas microscopicas de cada una e identificar las de mayor
similitud a los Lactobacilos y Bifidobacterias
Figura 1 Camara de anaerobiosis
27
2212 De la leche
Sa tomo 200 ml de teche cruda de la planta de leches y se colaca a fermentar
baja anaerobiosis durante 15 dras Luego sa procedia como en los vegetales
2213 De mucosa vaginal humana
Se tomo una muestra de frotis de mucosa vaginal humane can capito esteril sa
puso a ncubar en Caldo MRS y se procedi6 camo en 2211 y 2212 A cads
aislado sa Ie practico la coloracion de gram y sa seleccionaron aquellas que eran
bacilos gram positivos (Ver Tabla 2)
28
TABLA 2 Fuente de aislarniento de cepas nativas
CEPA FUENTE
1 Pepino fermentadQ
2 repollitas de bruselas fermentadas
3 Repolltgt fermentado
4 Repollo fermentado
5 Mucosa va~inal humana
6 Mucosa vaginal humana
7 repollitas de bruselas fermentadas
8 Repollo fermentado
9 repollitas de bruselas fermentadas
10 Mueo~a vaginal humana
11 Repollo fermentado
12 RepolJo fermentado
13 Leche fermentada
14 Mucosa vaginal humana
15 repollitas de bruselas fermentadas
16 Repollb fermentado
29
222 Almacenamiento de las cepas aisladas
Cuando las cepas crecieron en agar MRS homogEmeas en color morfologia
coloraci6n de Gram etc se pssaron a agar inclinado en tuba se cubrieron con
aceite mineral y se guardaran en refrigeraci6n a 4deg C para tomar de alii la cepa y
efectuarle las diferentes pruebas para confirmar el genera y determinar la especie
de cada una de eas (Ver Figura 2)
Figura 2 Cepas en tubos con agar inclinado
30
223 Pruebas para determinar et genero
2231 Coforaci6n de Gram
A cada cepa sospechosa de Lactobacilos se 1e hizo la coloraci6n de gram y se
seleccionaron las gram positivas
2232 Morfologfa
En agar MRS y despues de incubar en anaerobios~s crecian colonias grandes
cremosas de color beige con bordes homogeneos y c6ncavas(Ver Figura 3)
Figura 3 Colonias aisladas en agar MRS
31
2233 Prueba de esporulaci6n
A cada cepa aislada se Ie hizo esta prueba la cuel consistia en incubar en
aerobiosis durante ocho dias las cajas de agar MRS donde crecieron colonias de
Lactobacilo$ y luego se les (ealize) coloraci6n de espora Las capas que dieron
negativa a la prueba de espora se considararort sospechosas de sar Lactobacilos
y se continuo con la prueba de la catalasa (Ver Tabla 3)
2234 Prueba de la catalasa
los lactobacilos carecen de catalasa Eata prueba se hizo tomando una colonis
se deposito en vidrio de reloj y se Ie adicion6 dos gotas de peroxida de hidr6geno
(H202) la que no presentaba efervescencie eran cepe sospechosa de ser
Lactobacilo (Ver Tabla 4
Sa seleccionaron las capas euyo resultado fue aeorde con el genera Lactobacilfu$
y se continuo con la comirmaeion del genera y determinacion de la eSpecie
meqiante las pruebas bioqulmicas
32
224 Prueba para determlnar la especie
Para confirmar el genero y determinar la especie de las diferentes capas aisladas
se hizo una caracterizaci6n bioqufmica utilizando un kit de API 50 CHL Medium
Ref 50 410 que contiene una galed8 de medios que permite realizar el estudio
de fermentaci6n de los 49 azucares de 52 especies de Lactobacillus (Ver Figura 4
y tabla 5)
Figura 4 API CHL 50-Prueba bioquimica
33
225 Pruebas para determinar microorganismos probi6ticos
2251 Resistencia a pH=2 y sales biliares de concentraci6n O3pv
A las cepas idantificades como Lactobacillus brevis y Lactobacillus pantarum sa
las realiz6 Ie prueba dfl resistencia a pH=2 y sales biliares de concentraci6n 03
pv ( Jacobsen et al 1999) Una colonia de cada cepe aislada se inocul6 en 4 mt
de caldo MRS durante cinco dras bajo condiciones de anaerobiosis Oespues de
esta tiempo se dejaron pracipltar los microorganismos por sedimentaci6n se Ie
retire el sobrenadante y al precipitado se Ie adicion6 Sml de caldo MRS
previamente ajustado a pH=2 can seido clorhfdrico (HCI) dentro del mismo tuba de
ensayo G igual sa hizo can otro tubo previamente incubado pero a este se Ie
adiciono 5ml de caldo MRS con sales biliares a una concentra~i6n de 03 plv y
ambos se incuberon a 37deg C por 2 haras Sa midio 01 mi de cada uno de los
tubas al tiempo 0 y a las 2 horas y sa inoculeron en superficie en caJas de petri
con agar MRS S9 incubaron a 37deg C bajo anaerobiosis durante 48 horas Se
compararon visualrrente en cada caja de petri el crecimiento en superficie y las
que presentaron crecimiento en tos dos tiempos (0 y 2 horas) tanto en at media
acido como en sales I se consideraron resistentes a pH=2 y sales biliares (03
pv)
(Ver Tabla 6)
34
226 Conservacion
Todas fas capas que habian dado positiva Jas pruebas anteriores y que reaultaron
resistentes a pH=2 y sales biliares 03 pv y despues de identificadas en API 50
CHL sa repicaron en agar MRS en tuba inclinado y despues de Incubar a 37deg C
por 48 horas bajo anaerobiosis se Ctlbrie el biser completamente can aceite
mineral esteril y sa guardaron en refrigeraci6n
227 Elaboracj6n de fa bebida fermentada
2271 Preparaci6n de la mue$tra
Sa tome 1 mt de caldo MRS previamante inoculado e incubado que presentaba
una concentracion de Lactobacillus brevis de 27x108 Iml segun la escaJa de Mac
Farlan y sa adiciono a 9ml de leche pasteurizada en un tubo sa dej6 incubanda
en anaerobiosis por 48 hores Luego se pasaron estos 10 ml a un frasco qua
cont~nie 90 ml de leche pasterizada y se dej6 incubando par 48 haras en
anaerobiosis
35
2272 Adici6n del inOculo
A 900ml de leche pasteurizada se Ie adicion61os 100 ml de leche que habia sido
previamente ino(ulada dos veces con la cepa posteriormente se deja
fermantando la lache a temperatura de 37deg C
2273 Control de Ja fermentaci6n
Las muestras se hicieron por cuadruplicado y se les hizo un seguimiento de
aoidez hasta un valor entre 04 y 05 expresada como Bcido lactico esta
procedimiento corresponde a la babida fermentada sin prebi6tico La bebida ~on
prebi6tico tiene al mismo proeedirnianto pero adicionalmente se agrag6 avena a
una concentraci6n de 05 en el momento de la adici6n del in6e410 a los 900 ml
de leehe pasteurlzada y el procedimiento sigui6 igual al de la bebida sin prebi6tico
tambien se hizo por cuadruplicado
2274 Refrigeracl6n
Despues que las mezclas con y sin prebiotico alcanzaron el de acidez
requarido se IIeva ron a refrigeraci6n a una temperatura de 4deg C p~r 24 horas
para frenar proce~os metab6licos de los microorganisrtlos Despues de este
ti~mpo se procedi6 al batido
36
1 2275 Batido
Con un agitador se procedi6 a batir las bebidas para romper et coagulo formado
y de esta manera homogeneizar la mazela y obtener asf la bebida fermentada
2276 Envasado y almacenamiento
Ambas bebidas se envasaron en frascos vidrio para hacerles seguimiento de pH
acidez(expresado como acido tacticol y recuento de Lactobacillus breviSf los
dies 27 14 Y 21 despues de elaboradas las bebidas perfodo durante el cualta
muestra permanecfa afmacenada a temperatura de refrigeracion(Ver Figura 5
37
Fjgura 5 Diagrama de Flujo
PREPARACION DE LA MUESTRA
ADICION DEL INOCULO
~_____~_B~ATIDO~______~
INCUBACION 37deg C hasta acidez = 04-05 acido laotico
ENFRIAMIENTO
hasta 4 0 C ~------~ ~------~
ENVASADO Y ALMACENAMJENTO
dUrante 21 dfas a Temperatura 4 0 C
38
1
228 Determinaci6n del pH
Se determino por el metoda potenciometrico en un pH-metro manual durante los
dias 2) 7 14 Y 21 de las bebidas lacteas sin y con prebi6tica (Ver Tablas 7 y 8)
229 Oeterminaci6n de la acidez (Expresadfl como acido
lactica)
Se tomaron 9 mJ de las bebida~ sa Ie adicionaron 2 gotas de fanoftaleina como
indicador y sa titulo fa acidez con NaOH 01 N hasta la aparicion de un cotor rosado
debit EI volumen de NaOH utilizado se reporta como valor de de acidez
(VerTablas 10 y 11)
2210 Prueba de viabilidad
Qurante el perfoda de almacenamiento de la bebida lactea se procedi6 a hacer la
prueba de viabiHdad en los dias 7 14 Y 21 para determinar Si los lactobacilfus
permanecfan vivOs a una concentraci6n minima de 106 hasta el dia 21 como 10
establece eJ Articulo 10 de la Rasolucion 2310 del Ministerio de $alud de
Colombja
39
Para asta prueba se tamaron 10 rnl de muestra y se adicionaron a 90 ml de caldo
MRS ruego a partir de esta se hicieron diluciones de 10-2 hasta 10-11 de las
diluciones 109101deg 10-11 se inocul6 1 ml de cada uno en agar MRS siguiendo el
metodo de siembra en profundidad y por duplicado e incubando a 370 C x 5 dras
en anaerobiosis y luego se hicieron tos recuentos por duplicado para esi reportar
los recuentos promedio (Ver Tablas 13 y 14)
2211 AniUisls microbiol6glco de las bebidas Iicteas(con y sin
avena)
Con el fin de determinar las condiciones higienico-sanitarias del producto se
realizaron las pruebas microbiol6gicas de Recuento de mohos y fevadurasml en
agar OGY Recuento en superficia de Staphylococcus coagulasa positivoml en
agar Baird Parker Numero Mas Probable (NMP) de coUfor-mes totales y
Escherichia coliml en caldo Fluorocult y Presencia de Salmonela25ml con BHI
caldo tetrationato y agar Hecktoen (Montoya 1999)
(Var tabla 16)
2212 AnaUsis estadistico
A los datos obtenidos en la medici6n de pH acidez (expresada como Beido
laclico) en los dras 2714 Y 21 y el recuento de Lactobacillus en los dras 714 y21
40
realizados a los dos tratamlentos se tes aplic6 1a prueba t porque solo difieren
en la presencia 0 ausencia del prebi6tico para evaluar si habra diferencia
estadfsticamente significativa para los dos tratamientbs(Ver Tablas9 12 y 15)
41
3 RESULTADOS Y DISCUSION
31 Coloraci6n de Gram y morfologfa
Las cepas aisladas fesultaron Gram positivas (Ver Figura 6) colonias grandes
cremosas dE) color beige con bordes homogeneos y c6ncavos en su
morfologia (Ver Figura 3) resultando de acuerdo a 10 especificado en Stanley
1989 para Lactobacillus
32 Prueba de esporulaci6n y cataJasa
Los resultados de la pruebas de esporulaci6n y catalasa indicados en las
Tablas 3 y 4 respeclivamente dieron conforme a 10 especificado en Stanley
1989 para Lactobacillus
42
1
2 3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
TABLA 3 Resultado de prueba de esporuJaci6n
CEPA RESULfADO ESPORULACION
-- -------------
43
l i ~II bull ~ I I
TABLA 4 Resultado prueba de la catalasa
CEPA RESULTADO CATALASA
1 -2 -3 -4 -5 -6 -7 8 -9 -10 -11 12 -13 -14 -15 -16
3~3 Prueba para determinar la especie
Oespues de hacer las pruebas para seleccionar las cepas sospechosas de ser
Lactobacillus se realizo las pruebas bioquimicas fograndose identificar
Lactobacillus plantarum aislctdo de pepino repollo y repollitas de bruselas
44
fermentados y Lactobacillus brevis de mucosa vaginal y leche fermentada (Ver
Anexos del A al E y Tabla 5)
TABLA 5 Resultado identlficaci6n cepa~
CEPA NOMBRE
1 Lactobacillus planfarum
3 Lactobacillus plantarum
5 Lactobacillus brevis
13 Lactobacillus brevis
15 Lactobacillus plantarum
34 Pruebas para determinar microorganismos probi6ticos
las cepas de Lactobacillus brevis y Lactobacillus plantarum mostraron
rasistencia al medio acido de pH =2 Y sales biliares 03 pv resultado similar al
encontrado por Jacobsen et al 1999 para Lactobacillus plantarum (Ver tabla 6)
45
middot
~~~ttiI lltlmiddot~COX~dtJ ~xtc_~ 2 tr~ k-JlL~middot
-)~~TO DE lJIBUOTECUl rjRL]OTtCA twn GO1IU1
TABLA 6 Resultados a pruebas de resistencia a pH=2 y sales biliares 03 plv
CEPA RESISTENCIA pH=2 RESISTENCfA A SALES BIUARES ()3 pv
1 + +
2 + +
3 + +
4 + +
5 +
6 + +
7 + +
8 + +
9 + +
10 + +
11 + +
12 + +
13 + +
14 +1shy +M
15 + +
16 + +
+1 crecimiento debil
+ crecimiento abundante
46
Figura 6 Lactobacillus brevis Gram + aislado de leche fermentada
Ai observar en placa las celulas de lactobacilos despues de real1zar las pruebas
de resistenCia a la acidez y sales biliares se observo una tendencia a aglomerarse
posiblemente como un mecanismo de proteccion cOlitra estos medios que pueden
lIegar a ser adversos para elias (Ver figuras 7 y 8)
47
Figura 7 Lactobacillus brevis aislada de leche fermentada despu~s de la prueba de resistencia a pH=2
Figura 8 Lactobacillus brevis aislada de leche fermentada despues de la prueba de resistencie asales biUares 03 plv
fI
48
35 --Seguimiento del-pH-en-la-bebidaJacteacon y sin -prebi6tico
A continuacion se muestran las Tablas 7 y 8 donde sa registian los datos
recopilados de pHdurante 10$ dras Z 7 14 Y21 para las bebidas laaeas con ysin
prebi6tioo
TABLA 1 ResultadopH yogur sin avena
Dia Repetition 1 Repetici6n 2 Repeticion 3 Repetici6n 4
2 526 501 51 52
7 446 433 438 44
14 439 435 437 436
21 439 437 438 437
TABLA 8 -ResultadopHyogur con avena
Dia Repeticion 1 Repeticion2 Repeticion 3 - Repeticion 4
2 509 523 51 515
7 447 442 445 442
14 436 -438 439 437
21 432 433 435 434
Observando la Figura 9podamos ver que el pH en el -dfado$ para los dos
tratamientos as igual y empieza a descender rapidamente para estabilizarse a
partir del dra 7(Ver figura 9)
49
Figura 9 Comparacj6n de medias para -el pH
Comparaci6n de medias para pH
55 ~ 5 +----=gtIIIi-~i~~----=-r--it~ -- pH sin avena
a 45 1--~~~~=~~ 4 --- pH con
avena35 t-----r-- -------=------=--= ------- - ----
2 7 14 21
Dias
Aplicando la prueba t para comparar las medias de pH I S6 muestia una diferencia
altamants significativa en los dos tratamientos para el dia 21 (pltO05)
(Ver tabla 9)
TABLA 9 Compaiaci6n de medias para pH
DtAS SIN AVENA CON AVENA te p (VALOR)
2 514 514 0 10
7 439 444 -1 61 0159
14 437 I
438 -070 0510
21 438 433 528 00019 shy
- DiFERENCIA AlTAMENTE SIGNIFICATIVA
50
I
AI aplicar regrasi6n a los datos sa obtiene al modelo estimado
pHSinAyena =535606 - 01505650Ia +0005044340IaI2
La variabilidad en la respuesta de pH asta siendo explicada en un 8S7522 por
el modelo (Ver Anexo F)
EI tratamiento con avena mostro el siguiente modelo al analisis de ragresi6n
pHConAvena =534463 ~ 0140407Dia + 0004480980Ia2
La variabilidad an la respuesta de pH asta siendo explicada en un 903315 par
el nlodelo(Ver anexo G)
36 Seguimiento de la acidezmiddotmiddot expresada comomiddot de acido
lactico
A continuaci6n sa muestran las Tablas 10 y 11 donde sa registran los datos
tecopilados de acidezmiddotdurante los dias 27 14 Y 21 para las pebidas taetees con y
sin prebi6tico
TABLA 10 Resuttadode acidez (expresadocomo acido tactico) yogurt sin avena
CIA R~petici6n1 Repeticion2 Repetici6n 3 Repeticion 4
2 054 06 057 058
7 072 074 073 0]2
14 080 083 082 082
21 0]4 079 078 077
51
TABLA 11 Resultado de aCidez (expresado como acido Icktico) yogurt con avena
Dia Repetici6n 1 RepetiCi6n 2 Repetici6n 3 Repetici9n 4
2 059 055 058 057
7 071 073 072 072
14 089 087 088 086
21 092 091 090 091
Observando la Figura 10 se puede concluir que la acidez empieza a aumentar
hasta el dia 14 y luego trata de estabilizarse para los dos tratamientos
(Ver figura 10)
Figura 10 Comparaci6n de medias para la acidez
N G)
Comparacion de medias para acidez
1
2 0I 5 -+--=--------=-~~~= u
ltC
- Acidez sin avena
2 7 14
Dias
52
21
-it- Acidez con avena
Aplicando la prueba t para camparar las madias de acidez se muestra una
diferencia altarnante significativa en los dos tratamiantos para los dias 14 y 21
(pltO05)
(Var tabla 12)
TABLA 12Comparaci6n de medias para Acidez
DIASmiddot SIN AVENA CON AVENA te p(VALOR)
2 0572 0572 0 10
7 0727 0720 119 0278
14 0818 0875 -638 000070shy
21 077 091 -1212 i 0000019 shy
DIFERENCIA AL TAMENTE SlGNIFICATIVA
AI aplicar r~gresi6n a los datos se obtiene el modelo estimado
AcidezSlnAIena = 0491897 + O0436032Dia O00144613DfaA2
La variabilidad en la respuesta de acidez asta siendoexplicada en un 970978
por al modelo (Ver anexo H)
EI tratamiento con avena mostro elsiguiente modeloj a1 analisis de regresion
AcidezConAvena = 0491638 + 00406572Oia - OQOO982559OiaA2
La variabilidad enla respuesta acidez esta siendo explicadaen un 99212 por
el modelo (Ver anexo J)
53
I ~
37 Prueba de viabiJidad
A continuaci6n sa muestran las Tab~as 13 y 14 donde sa presentan los datos
recopilados del recuento de Lactobacilos durante los dias 7 14 Y 21 para las
bebidas lacteas con y sin prebi6tico
TABLA 13 Recuento de Lactobacilos (UFCml) yogurt sin avena
Dia Repetici6n 1 Repetici6n 2 Repeticion 3 Reptttici6n 4
7 1880X10l1 1454X1011 1642X1011 1780X10~
14 1560X10~ 646X1011J 1890X10l 140X10l1
21 1200x10lu 128Ox10u 1745x10J 1520x101V
TABLA 14 Recuento de Lactobacilos (UFCml) yogurt con avena
Dfa Repetieion 1 Repetici6n 2 Repeticion 3 Repeticf6n 4
7 1600X10lt 1240X10t 1640X10ll 1980X10t
14 540X1011 427X10n 546X10n 720X10ll
21 500x1011 492x1011 712)(1011 980x10~
AI analizar la Figura 11 sa puede observar un recuento mayor de Lactobacilos
en al tratamiento con avena resultado de acuerdo a 10 encontrado por Alander at
aI 1999 Kontula et aI 1998 y Jaskari et aI 1998
54
Figura 11 Comparaci6n de medias para Log Lactobacillus
Comparacion de medias para log Lactobacillus
~ 1350
-+- Sac Sin--() 13 co avenaIII
bull 125 -- Bac con 0)
0 12 avenaJ
115 7 14 21
Dias
Aplicando la prueba t para comparar las medias de recuento de Lactobacillus no
se encontr6 una diferenc1a estadfsUcamente significative entre los dos
tratamientos (Ver tabla 15)
Este aumento en al racuento influy6 en la disminuci6n del pH y en el aumento de
fa aeidez por la fermentacion que realizan los Lactobacillus sobre fa lactosa de la
lache y la avena adicionada como prebi6tico
55
1
TABLA 15 Comparaci6n medias lag Lactobacillus
DIAS SIN AVENA CON AVENA tc p(VALOR)
7 122257 122022 04846 06451
14 121065 132393 -19602 00977
21 129025 133087 -08236 04416
At aplicar regresion a los datos se obtiane al modelo astimado
LactobacillusSinAvena= 117347 + 004834640Ia
La variabilidad en la respuesta del recuento de LactobaCillus ssta siendo
explicada en un 260054 por el mod$loVar anexo J)
EI tratamiento con avena mostr6 al siguiente modalo al anal isis de regresion
Lactobacillu$ConAvena =118103 + 007903040Ias
La variabilidad en la respuesta de recuento esta siendo explicada en un 3068
por al modelo(Ver anexo K)~
38 Analisi$ microbiol6gicos de las bebidas lacteas con y sin
En la Tabla 16 estan recopilados los resultados microbiol6gieos obtenidos en ras
muestras con los dos tratamientos (con y sin avena)
I [
sa
TABLA 16 Resultados analisis microbiologico
Recuento de mohos y levaduras Iml lt10
Recuento de Staphylococcus coagulase positiva Iml lt100
NMP coliformes fotales y Escherichia coli Iml lt3
Presencia de Salmonella25ml Ausente
Los resultados de este analisis demuestran que las bebidas fermentadas con y
sin avena~ astan fibres de microorganismos patogenos
57
1
4 CONCLUSIONES
Se aislaron cepas nativas de Lactobacillus plantarum de las muestras vegetates
de repollo pepino repollitas de bruselas fermentadas y Lactobacillus brevis de
lache fermentada y mucosa vaginal humana Ambas cepas resistieran un pH=2 y
una concentraci6n de sales biliares det 03 ptv dos earacteristicas importantes
en los probi6ticos
Lamiddot cepa de Lactobacillus brevis aislada de lache Sa utiliz6 para elaborar una
bebida fermentada sin y con avana comoingrediente prebiotico obteniendose un
aJimento centon recuento del probi6tico viable durante 21 dras de seguimiento
ademas libre de microorganismos )at6gen05
No se encontr6 efecta significativo de la avena sobre Ie viabilidad del Lactobacillus
brevis aunque sa presento un aumento en 61 recuento de estos en la bebida con
avena
58
plusmn ~
5 RECOMENDACIONES
Ensayar la cepa de Lactobacillus plantartJm en productos carnicos madurados
como el salami
Ensayar la cepa de Lactobacillus l)revs en otros derivados lecteos como queso
quesito queso crema
Continuar con el estudio de estos microorganismos y caracterizarlos
molecularmente ademas de estudiar su capacidad de adherencja a fa mucosa
intestinal sobre algunes Hneas celulares como las CaCo~2
Estudiarel efedo de la avena sabre la viabiJidad del Lactobacillus breyis a una
concentraci6n mayor de 05
Realizer ensayos can las cepas de Lactobacillus brevis y Lactobrlcillus pJantarum
para elaborar masas acidas para panificacion reemplazando el Bromato de
Potasio aditivo prohibido desde marzo del 2003 en nuestro pais per 5U toxicidad
59
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65
ANEXOS
66
ANEXO A RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AlSLADA DE i
PEPINO it
Referencia Pepino 1 Fecha 06122002
IEXCELENTE IDENTIFICACION
Latto plantarum 1
Galeria API 50 CHL V50 Leida el 06122002
Perfil - -- - ++ - -- - ++++ - - -+- + - I I I I I I I I +t+ - +f- ~ - - + + ~ - - - +- + - shy
o - GLY - ERY DARA - LARA + RIB + DXYL - LXYL - ADO - MDX - GAL + GLU + FRU + MNE + SBE - RHA - DUL - INO bull MAN + SOR - MDM + MUG shyNAG + AMY + ARB + ESC + SAL + CEL + MAL + LAC + MEL + SAC + TRE + 1NU - MLZ + RAF + AMD - GLYG - XLT - GEN + TIJR + LYX - TAG - DFUC shyLFUC - DARL + LARL - aNT + 2KG - 5KG shy
--- Taxones significativos rd -----T -- Tests en contra
Lactoplantarum 1 999 092 1
Taxon siguiente Lactobrevis 1 OJ 044 3
i i
Lactoplantarum 1 1 test (5) en contra
D-SORBITOL (SOR) 78
Tax6n siguiente Lactobrevis 1 3 test (s) ert contra
METHYLD-MANNOSIDE (MOlM) 0 MELEZITOSE (MLZ) 14 D-TURANOSE (TUR) 14
67
ampb
ANEXO B RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AISLADA DE REPOLLO FERMENTADO
~
Referencia Repollo fermentado - 3 Fecha 03072003
EXCELENTE IDENTIFICACION
Lactoplantarum 1
Galena API 50 CRL V50 Leida el 03072003
Perfil - - ++ - - - - -H++ - - ~ + - + - I I 1 I I I I -H+ - ++ - - - + + - -- - - + - shy
o - GLY - ERY - DARA - LARA + RIB + DXYL - LXYL - ADO ~ MDX - GAL + GLU + FRU + MNE + SBE ~ RHA - DUL - INO - MAN + SOR - MDM + MDG shyNAG + AMY + ARR + ESC + SAT + CRL + MAL + LAC + MEL + SAC + TRE + lNU - MLZ + RAF + AMI) - GLYG - XLT - GEN + TOR + LYX - TAG - DFUC shyLFUC - DARL - LARL - GNT + 2KG - 5KG shy
------Taxones significativos _ _----- Id--- ---T---- Tests en contra
Lactoplantarum 1 999 095 1
Tax6n siguiente Lactobrevis 1 01 OA8 3
lJactoplantaru01 1 1 test (s) en contra
DSORBITOL (SOR) 78
Taxon siguiente Lactobrevis
METHYL-D-MANNOSIDE D-TURANOSE
1
(MOM) (TOR)
3 test (5) en contra
0 MELEZITOSE 14
(MLZ) 14
i
I
68
ANEXO C RESULTADO PRUEBAS BIOQUWICAS DE CEPA AISLADA DE MUCOSA HUMANA
Referenda Mucosa - 5 Fecha 27012003
BUENA IDENTlFICACION
Galeria API 50 CHL vso Leida el 270112003
Perfil - - - - +t--t - - - + - + - - - - - - - - -+- - - - - + - + - - - - - - - - - - - - - bull - - -+ - +
o - GLY ~ ERY - DARA bull LARA + RID + DXYL + LXYL - ADO bull MDX - GAL + OLU - FRU + MNE - SBE - IlliA - DUL - INa - MAN - SOR - MDM - MOO shyNAG + AMY - ARB - ESC ~ SAL bull CEL - MAL + lAC - MEL + SAC - TRE shyINU - MLZ - RAF - AMD - GLYG - XLT - GEN - 11JR - LYX - TAG - DFUC shyLFUC - DARL - IARL - ONT + 2KO - 5KG +
- - - - - - Taxones significativos - - - - - - - Id T -- Test en contra
Lactobrevis 3 963 088 1
Taxon siguiente Lactoco11inoides 36 075 2
Lactobrevis 3 1 test (s) en contra
GLUCOSE (GLU) 95
-~~~------------~---------------------------~--~-------~--~-----~----------~--------~------------~~--Taxon siguiente Lactocollinoides 2 test (s) en contra
GLUCOSE (GLU) 100 MELIBIOSE (MEL) 25
69
i r
ANEXO D RESULTADO PRUEBAS BIOQIJiMICAS DE CEPA AISLADA DE LECHE FERMENTADA
Referenda Leche fennentada ~ 13 Fecha 27012003
BUENA IDENTIFICACI6N
Galeria API 50 CHL V50 Leida el 270112003
Perfil - - - - -t-t+- - - - + - + - - - bull - - - - -+- - - - - + - + - - - - - - - - - - - - - - - - -+ - +
0 - GLY - ERY - DARA - LARA +Rll3 + DXYL + LXYL - ADO - MDX ~GAL + GLU - FRU + MNE SBE - RHA DUL bull INO MAN - SOR MDM bull MDG shy
~NAG + AMY - ARB - ESC - SAL - CEL - MAL + LAC - MEL + SAC - TRE I lNU - MLZ - RAF - AMD - GLYG - XLT - OEN - IUR LYX - TAG - DFUC bull i
LFUC - DARL - LARL -ONr + 2KG - SKO + 1
- -- - - Taxones significativos - - Id -- T --- Test en contra
Lacta brevis 3 963 088 1
Taxon siguiente Lactocollinoides 36 075 2
Lactobrevis 3 1 test (s) en contra
GLUCOSE (GLU) 95
-----------------------------------------------------------~------------------------------~-------------------Taxon siguiente Lactocollinoides 2 test (s) en contra
GLUCOSE (GLD) 100 MELffiIOSE (MEL) 25
70
II iJ1
I
I ANEXO E RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AISLADA DE REPOLLITAS DE BRUSELAS FERMENTADA
Referencia repollitas de bruselas 15 Fecha 03072003
EXCELENTE IDENTIFICACION
Lactoplantarum 1
Galeria API 50 CHL vsO Leida el 03072003
Perfil - - - - +t - - - - +H+ - +- - +t + - I I I I I I I f ++t - + - - - -+ + - - - -+ -+ - - I ij
o - GLY - ERY - DARA - LARA + RJB + DXYL - LXYL - ADO - MDX - GAL +
GLU + FRU + MNE + SBE RHA + DUL - INO - MAN + SOR + MDM + MOG shyNAG + AMY + ARB + ESC + SAL + eEL + MAL + LAC + MEl + SAC + TRE + i
I1NU - MLZ + RAF AMD GLYG - XLT - aEN + TUR + LYX - TAG - Druc LFUC - DARt + LARL - aNT + 2KG - 5KG shy n ----Taxones significativos ------ Id Tests en contra
Lactoplantarum 1 999 090 o
Taxon siguiente Lacto pentosus 01 012 7
Lactoplantarum 1 o test (s) en contra
Taxon siguiente Lacto pentosus 7 test (8) en contra
GLYCEROL (GLY) 75 D-XYLOSE (DXYL) 100 L-RHAMNOSE (RHA) 25 METHYL-D-MANNOSIDE (MOM) 1 MELEZITOSE (MLZ) 25 RAFFINOSE (RAF) 75 D-ARABITOL (DARL) 0
71
~
I i I
ANEXO F - ANALISIS DE REGRESION PARA pH EN BEBIDA SIN AVENA
Aruilisis de regresi6n polinomial
---~-~-------------------------------------------~-----------~~---------------------~--------------Variable dependiente pHSinAvena ---------------------------~-------------~--------------------~---------------------------------
Error T Parametro Estimado Estandar Estadistico P-Valor
CONSTANTE 535606 0094535 56657 00000 Dia -0150565 0020706 727154 00000 Dia2 000504434 0000871488 578819 00001
---~---------------------------------------------------------------------------------------------------
Anfllisis de Variama -------------------------------------------~-----------~-----------------------------~-~--- jSource Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor 11
------------------------~------------------------------------------------------------------------------~ Mod-elo 155772 2 0118861 4256 00000 Residual 0237877 13 00182983
Total (Corr) 11956 IS
R2 == 867522 percent
pHSinAvena == 535606 - 0150565Dia + 000504434Dia2
72
____
middot ANEXO G - ANALISIS DE REGRESION PARA pH EN BEBIDA CON AVENA
AmUisis de regresion polinomial _____~_____~__-_____~___4____________________bull____bull__________bull_____________~~----_------___________
Variable depcndiente pHConA vena ------------------------------------------------------------------------------------------~--------
Error T Parametro Estimado StAndar Estadfstico P-Valor
---------------------------------------------~-----------------------------------------------_---------CONSTANTE 534463 00801045 667208 00000 Dia -0140407 00175453 800253 00000 DiaA 2 000448098 0000738458 606803 00000
----------------------~---~-----------------------------~------------------------------~----AmUisis de Varianza
---~---------------------------------~---------------------~------------~-------------------~------Source Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio PValor --------------------------~-----------------------------------------------~------------~-----~~--~ ModeJo 159575 2 0797873 6073 00000 Residual 02170798 middot13 00131383 _______~_~ ~_~----------~------~--~-----~-M-----~-----____ _____________~-----------------------Total (COlT) 176654 15
R12 903315 percent
-----------~------------------------------------------------------------------------~-----------pHConAvena 534463 - 0140407Dia + 000448098DfaA 2
73
ANEXO H - ANALTSIS DE REGRESTON PARA ACIDEZ EN BEBJDA SIN AVENA
An8Jisis de Regtesi6fi P6lifJomial
Variable Depefidiefile~ AcidezSinAVenll _______________w_____~______~________________~-----------_________~_________________~~____~___~_____
Error T Pariirnetro Estimado Estandar Estadistico ---------------------------------------~--------------~-~-------~--------------------~------------CONSTANT 0491697 00123217 399051 00000 Dia 00436032 000269882 161564 00000 D1a2 -000144613 000011359 127312 00000 __w___~________________________~-_______-_____~----____________________________~__~---~_--__~___
AriiiJisis de varianza ~_~__~__________~_~____~________~___________- _________e_____________________________bull _____-________
Source Smn de cuadr Df Mean Square F-Ratio PmiddotValor_~~___________________________________bull ______~___________bull ____________bull ______~________w________________
Model 0135203 2 00676013 21747 00000 Residual 000404118 13 000031086
Total (Corr) 0139244 15
R2 970978 percent
AcidezSlnAvena 0491697 + O0436032Dia - 0OOl44613Dia2
74
I
ANEXO I ANALISIS DE REGRESION PARA ACIDEZ EN BEBIDA CON AVENA
1
Anwisis de tegtesi6fi polinomial
Variable dependiente Acidez Con Avena
Error T ParametTo Estimado Stlindar Estadfstico P-Valor ----------------~-------~---------------------~-----------------------------------------------------CONSTANT 0491639 000926607 530578 00000 Diamiddot 00406572 000202955 200326 00000 DfaA 2 0000982559 0000085421 -115025 00000
-------------~----------------------------~-------------------------~-----------------------------------
-------------~-----~~-----------------------------~---------------------------------------------_--Source Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio PValor
-~-------------~----------------------------------~------------------~~-------------------------- Modelo 0288008 2 0144004 81914 00000 Residual 000228539 13 0000175799
----------~~--------------~---------------------------------------------~---------------------------Total (Corr) 0290294 15
RA2 = 992127 percent
-------------------------~----~---~------------~---------------------------------~---------------~
AcidezConAvena == 049163amp + 00406572D1a - 0000982559DiaA2
75
I
(Ilmiddot il
ANEXO J- ANALISIS DE REGRESION PARA RECUENTO LACTOBACILOS PARA BEBIDA SIN AVENA
Amilisis de regresion - Modelo lineal Y = a + bX
------------------------~----------------------~-----------------------------~----------~-----------Variable Dcpendiente LactobacilJusSinAvena Variable independiente Dia
I--------~----------~-----------------------------------~-------~-~--~--------------------------~-Error T
Paramctro Estimado Standard Stadistico P-Valor
----~----~------------~-----~-----------------------~-------------~-----------------------------Intereepto 117347 0389973 300911 00000 Pendiente 00483464 00257889 18747 00903
Analisis de Varianza
---------~------------------~----------------~---------------------------------~---------~----------Source Sum decuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor
------------~---------------------~---------------------~--------------------------------~-----~----Modelo 0916252 1 244835 443 00616 Residual 260706 10 0260706
--~------------~---~------------------~~~-----~-------~---------~~-------------------------------------Total (Corr)352332 11
Coeficiente Correlaci6n = 0509955 R2 = 260054 percent
LactobacillusSinAvena= 117347 + 00483464Dfa
76
ANEXO K- ANALTSIS DE REGRESION PARA RECUENTO LACTOBACILOS PARA DEBIDA CON AVENA
Aruilisis de regresion - Modelo lineal Y = a + hX
Variable Dependiente LactobacillusConAvena Variable Independiente Dia ---~--------------------------------------------------------__-----------__--_--_-----------shy
Error T Paramctro Estimado Standard Estadistico P-Valor -~--------------------------------------------------------------------------------------------------
Irttercepto 118103 0567963 207942 00000 Pendiente 00790304 00375594 210414 00616
-----------------~----------------------------~----~-------~----~----------------------------
Analisis de Varianza
----------------~----------------~------------------~--------------------------~------~--------shySource Swn de cuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor
-----------------~--~--------------------------------------------------------------------------~---~ Mode10 244835 1 244835 443 00616 Residual 552997 10 0552997
Total (Corr)797832 11
Coeficiente Correlacion = 0553964 RI2 = 306875 percent
-----~--------------------------------------------------------~--------------------------------------
LactobacillusConAvena = 118103 + 00790304Dfas
77
La primera CBtacterfstica es que sean viables esta viabifidad esla capacidad que
tienen los microorganismos probi6ticos de permanecer vivos tanto ~n el alimento
como en el Intestino del consumidor por un tiempo determinado En Colombia se
ha establecido que en bebidas fermentadas este tiempo debe ser minimo de 21
dras en el alimento (Minsalud 1986) Esta vjabilidad depende del metodo de
produccion y de la cepa utilizada (Tuomols at a 2001)
Luego de que se garantice que estos microorganismos eslan viVos en el alimento
ell os deben cumplir otro criterio importanle para ser considerados como
organismos probi6ticos y as tblerar las condiciones de acidez a un pH=2 y la
sccian de proteasas del est6mago ademas de sobrevivir y creeer en presencia de
acidos biliares (Tuomola et al 2001 Jacobsen at a 1999) para luego de
sobrevivir a estas condiciones adherirse a la mucosa intestinal y de esta manera
estimular al sistemainmunoJ6gico esta capacidad de adherirse a la mucosa es un
prerrequisito para la colonizacion del intestlno (Toumola etal2001 Alander et aI
1999)
Cuando los probioticos han pasado todas esta pruebas de supervivencia y luego
de impfantados en la mucosa producen acidos organicos peroxido de hidrogeno y
tambien bacteriocinas que actUan como inhibidore$ del crecimiento de
microorganismos patogenos u oportunistas (Tuomola at al 2001 Cintas et al
2000) complementando de asta manera su accion benefica sobre la mucosa
intestinal y en general sobre la saJud del huesped
18
116 Berieficios de los microorganismos probi6ticos
Los beneficios que se asocian a los microorganismos probioticos son muchos y
variados Entre ros comprobados mediante estudios se eneuentran
1151 Facilitar la digesti6n de la lactosa
los microorganismos probioticos cuando estan en el intestino liberan alii la
enzima pmiddotgalaotosidasa capaz de hidrolizar la lactosa haste glucosa y galactosa
evitando as que personas intolerantes a este carbohidrato presenten sfntomas
como flatulencia dolor abdominal y diarrea cuando consumen leche (be Vresse
et 81 2001)
1152 Protegen contra enfermedades gastrointesUnales
EI consumo de aJimentos con probioticos ha mostrado efeeto terapeutico frente a
los sintomas de diarrea asociada al surninistro de antibi6tico$ de amplio espectro
que destruye 0 disminuye la microbiota endogena esta imp ide la coJonizacion de
bacterias patogenas como Klebsiella oxytoca y Clostridium difficile que pueden
causer lesiones en el cn Los probi6ticos recuperan el balance de la microbiota
intestinal nativa y avitan Ie adhesion de algunos virus bacterias pat6genas a
parasitos que pueden ser agentes causales de gastroenteritis la diarrea del
19
J
viajero y 1(3 inflarnacion intestinal que en ultima instaneia oeasionan ef sfndrome
del colon irritable (Marteu et al 2001)
1153 Protegen contra infecciones del tracto urogenital
La vaginitis indueida por baeteriss yo por levaduras as una infecci6n
estrechamente relacionada con la exposici6n a antibi6ticos y espermicidas y
tambien depende del estado hormonal de la n1ujar Con al uso de mezcJas de
probi6ticos se han obtenido buenos resultados en la rastauraci6n de la rnicrobiota
natural urogenital benefica que desplaza a los eausantes de la inflamaci6n de Is
vagina y Ie uretra (Reid 2001 )
1154 Promueven la barrera de defensa end6gena del intestino
EI tracto gastrointestinal normal mente as una barrera natural contra anUgenos de
origen microbiano y alimentario Cuando los probi6ticos sa adhieren a Is mucosa
intestinal estimulan 0 potencian al sistema inmune favoreciendo la
inmunomodulaci6n que induce un aumentb de fa producci6n de inmunoglobulinas
activacion de las calulas mononueleares y de los linfocitos para proteger al
huesped de infeeciones (Isoulari et sl 2001)
20
1155 Protegen contra cancer de colon
EI cancer es el resultado de una serie de mutaciones somaticas que pueden
ocurrir durante al tiempo de vida del individuo y 10 padeca buena parte de la
poblacion mundial los probi6ticos en un sistema in vitro han demostrado un
efecto positivo en la prevenci6n de mutaciones aI desactivar carcin6genos
genotoxicos (Wolloswski et al J 2001)
1156 Protegen contra infecciones respiratorias
Sa ha demostrado que el conslJlno de probi6ticos disrninuye la incidencia de
infecqiones raspiretorias al aumentar la actividad fagocitica de maer6fagos
alveolares que aettian sobre microorganismos patogenos Se hizo un estudio en
571 ninos sanos con edades entre uno y seis anos divididos en dos grupos a uno
de ellos sa las incluy6 en su dieta leche suplementada can Lactobacillus GG y a
los otros ninos leche no suplementada AI final del estudio se observ6 una
disminucion del 19 en la incidencia de infeccionas respiratorias tratadas con
antibi6ticos tales como otitis media sinusitis bronquitis y neumonfas en el grupo
de los ninos que consumieron Lactobacillus GG (Hatakka et al 2001)
Alvarez et al (2001) encontraron que la administraci6n de yogurt con Lactobacillus
casei en ratones de tres arios de edad majora los espacios libres del puJrn6n de
la presencia de Pseudomona aeruginos8 induciendo un aumento
21
significativo en los niveles de gA a IgM datactadas en los lavados
broncoaJveolares y se observ~ un afecta dependiente de la dosis
1157 En el tratamientoy prevenci6n del eczema
Se ha encontrado que el consumo de probi6ticos mejora la inflamaci6n alergica 0
eczema at6pico en ninos alimentados con formula suplementada con probi6ticos
Encontraron una mejora significativa al suministrar Bifidobacteriummiddot actis y
Lactobacillus GG en 27 niiios con edad promedio de 46 meses Luego de aplicar
este tratamiento se sometieron a una prueha de SCORAD (mide fa extension y
gravedad del eczema) registrando una meJoria significatlva en las condiciones de
la pie concentraci6n de citoquinas cirClllantes an sueto y moleculas de adhesi6n
a las superficies de las celulas soJubles en suero (Isolari 2000)
Se realizaron otros estudios a 159 mujeres embarazadas con historia familiar de
eczema atopico de primer grado a las cuafes sa res 5uministro dosis diarias de
Lactobacillus GG durante 2 a 4 samanas previas al parto Oespues de ella fa
madres twiaron la opci6n de continuer tomando el ptobi6tico si amamantaban 0
bien darseio vIa oral La mayoria de las madras eJigieron dar las dosis at bebe
diariamente A los dos anos de vida se observ6 una disminuci6n del 50 en la
frecuencia del eczema at6pico en aquellos nHies que se les dio ef probi6tico
(Kalliomari etal 2001)
22
1158 Previenen infeccion en heridas quirurgicas
Los probi6ticos impiden la union de pat6genos a las superficies celulares en
heridas mediante la seCreci6n de proteinas Actuamente se encuentra en
estudio la aplicaci6n del Lactobacillus fermentum vivos sabre heridas en piel de
ratas y se ha encontrado una disminuci6n del 90 en la colonizaci6n par parte del
StaphylococcuS aureus uno de los patogenos mas temidos y de mayor lncidencia
en infecciones hospital arias mas aun se esta contempiando la posibilidad de
utilizar la protein a purificada an lugar de los mjcroorganismos para la protaccion
contra infecciones en heridas (Strauss 2000)
12 PREBIOTICOS
Son carbohidratos de cadena corta algunas veces reconocidQs como
oligosacaridos no digeribles par las enzimas del epitelio intestinal 0 de las
gliJnduJas anexas debido a su estructura quimica y de esta manera lIegan al
intestino grueso donde alcanzan a estar disponibles para la fermentaci6n por las
bacierias sacaroHticas que son especial mente laetobadlos y bifidobacterias
dando odgen a compuestos que ejercen efectos funcionales sobre la mucosa del
tubo digestivo (Brunser 2001)
Se consideran como tal algunos fructocligosacaridos isomaltooligosacariclos
oligomato palatinosa poHdextrosa pOJidextrrna raftilina y algunos oligosacaridos
23
)
de 1a soya y fa avena Estenmiddot presentes en alimentos como Ie cebolla ajo
banano puerros 1 derivados del trigo achicoria esparrago alcachofa (Cummings
etal 2001)
Algunos de estos prebi6ticos cuanda son incorporado$ a fa dieta en cantidades
dalerminadas alteran la microbiota intestinal disminuyendo los recuentos de
coliformes bacteroides y cocos y aumentando las bifidobacterias hasta en diez
veces ademas modifican la actividad metab6lica del coron logrando una
disminuci6n del pH y un incremento en el contenido fecal de acidos grasos de
cadena corta como at acatica propi6nico y butfrico El butirato aumen~ _I grosor
de la pared del coron e intestino delgado estimula eJ crecimiento de la mucosa del
colon y auManta su flujo sangufneo inhibe el crecimiento de tinsas tumorales
epiteliales de origen co16nico induce la diferenciaci6n de sus celulas y a
apoptosis entre otros(Brunsar 2001)
Eh estudios hechos en simuladores del intestino humano utilizando productos de
avena fermentados se encontro que estimularon al crecimiento tanto de
lactobacios como de bifidobacterias y en el caso de estas ultimas se incremento
la producci6n de los acidos acatico propionico y butfrico 10 que incide sobre la
implantacion de probi6tico$ e inhibe al crecimientos de otro tipo de
microorganismos (Alal1der eta1999 Kontula etal 1998 Jaskari etal 1998)
24
~ -1
(
AI comparar el comportamianto de las leches de diferente origen se ha
demostrado que Ie leche de vaca contiene caseinatos sustancias que forman
buffer ~n et intestino e inlpiden que los probi6ticos disminlJyen el pH del intestina
y de esta manera se impide al efecto deseado que es evitar fa proliferaci6n de
otros microorganismos entre los cuates pueden estar algunos patOganos En la
leche materna sa encuentran algunos carbohidratos como glucosa galactosa n
acetilglucosamina y algunos 0lig6meros de Ie fucosa en cOhoontracionesmiddot
importantes los cualeS favoreceh el crecimientc)middot de probi6ticos esto
complementado can 91 bajo contenido de protenas que se traduce en una
reducida capacidad buffer hacen de Ie lache materna IJn alimentd adecuado para
nllios en su etape de lactancia
Algunos prebi6ticos como 1a lactulosa yciertos compuestos que contiansn fructosa
no son digeridos en el intestino humano y pueden sar utilizados selectivamenta
par los probi6ticos 10 que hace que los probi6ticos en combinaci6n can prebi6ticos
pueden lIegar a ser un importante medio para prevenir algunas enfermedades del
tracto gastrointestinal (Bezkorovainy 2001)
25
2 METODOlOGfA
21 LOCALIZACION
EJ trabajo sa realizo en el laboratorio de Microbiologia y la planta da laches de Ja
Universidad Naclonal de Colombia- Secie Medellin
En al laboratorio se hiZQ al aislamiento a identificaci6n de fa capas y en fa Planta
sa eJaboro la leche fermentada con 1a cepa seleccionada y el prebi6trco
22 METODOS
221 Aisiamiento de cepas nativas
Las cepas nativas se sislaran de producto$ vegetales leches fermentadas y
mucosa vaginal humana
2211 De vegetales
Las muestras vegetales de repollo repollitas de brusefas y pepino se
seleccionaron porcionaron y mezclaron can cloruro de sadio al 10 pIp se
calacaron en un recipienta de vidrio balo anaerobiosis y sa dejarQn por 15 dias
26
luego S9 tomaron 3 ml de cada muestra y se jnocularon 9 ml de caldo MRS (Man
Rogosa and Sharpe) se incubaron a 37deg C durante cinco dias en camara de
anaerobiosis (Ver Figura 1) Oespues de este tiempo sa inocularon cajas de petri
con agar MRS con 1 ml del cultivo microbiano y se incubaron bajo las mismas
condiciones que eJ caldo Este procedirniento se realiz6 rapetidas veces hasta
seleccionar la cepa pura mediante observaci6n de caracteristicas morfologicas de
la cOlonia y a cada colonia se Ie practico la coloracion de gram con el fin de
observar las caracteristicas microscopicas de cada una e identificar las de mayor
similitud a los Lactobacilos y Bifidobacterias
Figura 1 Camara de anaerobiosis
27
2212 De la leche
Sa tomo 200 ml de teche cruda de la planta de leches y se colaca a fermentar
baja anaerobiosis durante 15 dras Luego sa procedia como en los vegetales
2213 De mucosa vaginal humana
Se tomo una muestra de frotis de mucosa vaginal humane can capito esteril sa
puso a ncubar en Caldo MRS y se procedi6 camo en 2211 y 2212 A cads
aislado sa Ie practico la coloracion de gram y sa seleccionaron aquellas que eran
bacilos gram positivos (Ver Tabla 2)
28
TABLA 2 Fuente de aislarniento de cepas nativas
CEPA FUENTE
1 Pepino fermentadQ
2 repollitas de bruselas fermentadas
3 Repolltgt fermentado
4 Repollo fermentado
5 Mucosa va~inal humana
6 Mucosa vaginal humana
7 repollitas de bruselas fermentadas
8 Repollo fermentado
9 repollitas de bruselas fermentadas
10 Mueo~a vaginal humana
11 Repollo fermentado
12 RepolJo fermentado
13 Leche fermentada
14 Mucosa vaginal humana
15 repollitas de bruselas fermentadas
16 Repollb fermentado
29
222 Almacenamiento de las cepas aisladas
Cuando las cepas crecieron en agar MRS homogEmeas en color morfologia
coloraci6n de Gram etc se pssaron a agar inclinado en tuba se cubrieron con
aceite mineral y se guardaran en refrigeraci6n a 4deg C para tomar de alii la cepa y
efectuarle las diferentes pruebas para confirmar el genera y determinar la especie
de cada una de eas (Ver Figura 2)
Figura 2 Cepas en tubos con agar inclinado
30
223 Pruebas para determinar et genero
2231 Coforaci6n de Gram
A cada cepa sospechosa de Lactobacilos se 1e hizo la coloraci6n de gram y se
seleccionaron las gram positivas
2232 Morfologfa
En agar MRS y despues de incubar en anaerobios~s crecian colonias grandes
cremosas de color beige con bordes homogeneos y c6ncavas(Ver Figura 3)
Figura 3 Colonias aisladas en agar MRS
31
2233 Prueba de esporulaci6n
A cada cepa aislada se Ie hizo esta prueba la cuel consistia en incubar en
aerobiosis durante ocho dias las cajas de agar MRS donde crecieron colonias de
Lactobacilo$ y luego se les (ealize) coloraci6n de espora Las capas que dieron
negativa a la prueba de espora se considararort sospechosas de sar Lactobacilos
y se continuo con la prueba de la catalasa (Ver Tabla 3)
2234 Prueba de la catalasa
los lactobacilos carecen de catalasa Eata prueba se hizo tomando una colonis
se deposito en vidrio de reloj y se Ie adicion6 dos gotas de peroxida de hidr6geno
(H202) la que no presentaba efervescencie eran cepe sospechosa de ser
Lactobacilo (Ver Tabla 4
Sa seleccionaron las capas euyo resultado fue aeorde con el genera Lactobacilfu$
y se continuo con la comirmaeion del genera y determinacion de la eSpecie
meqiante las pruebas bioqulmicas
32
224 Prueba para determlnar la especie
Para confirmar el genero y determinar la especie de las diferentes capas aisladas
se hizo una caracterizaci6n bioqufmica utilizando un kit de API 50 CHL Medium
Ref 50 410 que contiene una galed8 de medios que permite realizar el estudio
de fermentaci6n de los 49 azucares de 52 especies de Lactobacillus (Ver Figura 4
y tabla 5)
Figura 4 API CHL 50-Prueba bioquimica
33
225 Pruebas para determinar microorganismos probi6ticos
2251 Resistencia a pH=2 y sales biliares de concentraci6n O3pv
A las cepas idantificades como Lactobacillus brevis y Lactobacillus pantarum sa
las realiz6 Ie prueba dfl resistencia a pH=2 y sales biliares de concentraci6n 03
pv ( Jacobsen et al 1999) Una colonia de cada cepe aislada se inocul6 en 4 mt
de caldo MRS durante cinco dras bajo condiciones de anaerobiosis Oespues de
esta tiempo se dejaron pracipltar los microorganismos por sedimentaci6n se Ie
retire el sobrenadante y al precipitado se Ie adicion6 Sml de caldo MRS
previamente ajustado a pH=2 can seido clorhfdrico (HCI) dentro del mismo tuba de
ensayo G igual sa hizo can otro tubo previamente incubado pero a este se Ie
adiciono 5ml de caldo MRS con sales biliares a una concentra~i6n de 03 plv y
ambos se incuberon a 37deg C por 2 haras Sa midio 01 mi de cada uno de los
tubas al tiempo 0 y a las 2 horas y sa inoculeron en superficie en caJas de petri
con agar MRS S9 incubaron a 37deg C bajo anaerobiosis durante 48 horas Se
compararon visualrrente en cada caja de petri el crecimiento en superficie y las
que presentaron crecimiento en tos dos tiempos (0 y 2 horas) tanto en at media
acido como en sales I se consideraron resistentes a pH=2 y sales biliares (03
pv)
(Ver Tabla 6)
34
226 Conservacion
Todas fas capas que habian dado positiva Jas pruebas anteriores y que reaultaron
resistentes a pH=2 y sales biliares 03 pv y despues de identificadas en API 50
CHL sa repicaron en agar MRS en tuba inclinado y despues de Incubar a 37deg C
por 48 horas bajo anaerobiosis se Ctlbrie el biser completamente can aceite
mineral esteril y sa guardaron en refrigeraci6n
227 Elaboracj6n de fa bebida fermentada
2271 Preparaci6n de la mue$tra
Sa tome 1 mt de caldo MRS previamante inoculado e incubado que presentaba
una concentracion de Lactobacillus brevis de 27x108 Iml segun la escaJa de Mac
Farlan y sa adiciono a 9ml de leche pasteurizada en un tubo sa dej6 incubanda
en anaerobiosis por 48 hores Luego se pasaron estos 10 ml a un frasco qua
cont~nie 90 ml de leche pasterizada y se dej6 incubando par 48 haras en
anaerobiosis
35
2272 Adici6n del inOculo
A 900ml de leche pasteurizada se Ie adicion61os 100 ml de leche que habia sido
previamente ino(ulada dos veces con la cepa posteriormente se deja
fermantando la lache a temperatura de 37deg C
2273 Control de Ja fermentaci6n
Las muestras se hicieron por cuadruplicado y se les hizo un seguimiento de
aoidez hasta un valor entre 04 y 05 expresada como Bcido lactico esta
procedimiento corresponde a la babida fermentada sin prebi6tico La bebida ~on
prebi6tico tiene al mismo proeedirnianto pero adicionalmente se agrag6 avena a
una concentraci6n de 05 en el momento de la adici6n del in6e410 a los 900 ml
de leehe pasteurlzada y el procedimiento sigui6 igual al de la bebida sin prebi6tico
tambien se hizo por cuadruplicado
2274 Refrigeracl6n
Despues que las mezclas con y sin prebiotico alcanzaron el de acidez
requarido se IIeva ron a refrigeraci6n a una temperatura de 4deg C p~r 24 horas
para frenar proce~os metab6licos de los microorganisrtlos Despues de este
ti~mpo se procedi6 al batido
36
1 2275 Batido
Con un agitador se procedi6 a batir las bebidas para romper et coagulo formado
y de esta manera homogeneizar la mazela y obtener asf la bebida fermentada
2276 Envasado y almacenamiento
Ambas bebidas se envasaron en frascos vidrio para hacerles seguimiento de pH
acidez(expresado como acido tacticol y recuento de Lactobacillus breviSf los
dies 27 14 Y 21 despues de elaboradas las bebidas perfodo durante el cualta
muestra permanecfa afmacenada a temperatura de refrigeracion(Ver Figura 5
37
Fjgura 5 Diagrama de Flujo
PREPARACION DE LA MUESTRA
ADICION DEL INOCULO
~_____~_B~ATIDO~______~
INCUBACION 37deg C hasta acidez = 04-05 acido laotico
ENFRIAMIENTO
hasta 4 0 C ~------~ ~------~
ENVASADO Y ALMACENAMJENTO
dUrante 21 dfas a Temperatura 4 0 C
38
1
228 Determinaci6n del pH
Se determino por el metoda potenciometrico en un pH-metro manual durante los
dias 2) 7 14 Y 21 de las bebidas lacteas sin y con prebi6tica (Ver Tablas 7 y 8)
229 Oeterminaci6n de la acidez (Expresadfl como acido
lactica)
Se tomaron 9 mJ de las bebida~ sa Ie adicionaron 2 gotas de fanoftaleina como
indicador y sa titulo fa acidez con NaOH 01 N hasta la aparicion de un cotor rosado
debit EI volumen de NaOH utilizado se reporta como valor de de acidez
(VerTablas 10 y 11)
2210 Prueba de viabilidad
Qurante el perfoda de almacenamiento de la bebida lactea se procedi6 a hacer la
prueba de viabiHdad en los dias 7 14 Y 21 para determinar Si los lactobacilfus
permanecfan vivOs a una concentraci6n minima de 106 hasta el dia 21 como 10
establece eJ Articulo 10 de la Rasolucion 2310 del Ministerio de $alud de
Colombja
39
Para asta prueba se tamaron 10 rnl de muestra y se adicionaron a 90 ml de caldo
MRS ruego a partir de esta se hicieron diluciones de 10-2 hasta 10-11 de las
diluciones 109101deg 10-11 se inocul6 1 ml de cada uno en agar MRS siguiendo el
metodo de siembra en profundidad y por duplicado e incubando a 370 C x 5 dras
en anaerobiosis y luego se hicieron tos recuentos por duplicado para esi reportar
los recuentos promedio (Ver Tablas 13 y 14)
2211 AniUisls microbiol6glco de las bebidas Iicteas(con y sin
avena)
Con el fin de determinar las condiciones higienico-sanitarias del producto se
realizaron las pruebas microbiol6gicas de Recuento de mohos y fevadurasml en
agar OGY Recuento en superficia de Staphylococcus coagulasa positivoml en
agar Baird Parker Numero Mas Probable (NMP) de coUfor-mes totales y
Escherichia coliml en caldo Fluorocult y Presencia de Salmonela25ml con BHI
caldo tetrationato y agar Hecktoen (Montoya 1999)
(Var tabla 16)
2212 AnaUsis estadistico
A los datos obtenidos en la medici6n de pH acidez (expresada como Beido
laclico) en los dras 2714 Y 21 y el recuento de Lactobacillus en los dras 714 y21
40
realizados a los dos tratamlentos se tes aplic6 1a prueba t porque solo difieren
en la presencia 0 ausencia del prebi6tico para evaluar si habra diferencia
estadfsticamente significativa para los dos tratamientbs(Ver Tablas9 12 y 15)
41
3 RESULTADOS Y DISCUSION
31 Coloraci6n de Gram y morfologfa
Las cepas aisladas fesultaron Gram positivas (Ver Figura 6) colonias grandes
cremosas dE) color beige con bordes homogeneos y c6ncavos en su
morfologia (Ver Figura 3) resultando de acuerdo a 10 especificado en Stanley
1989 para Lactobacillus
32 Prueba de esporulaci6n y cataJasa
Los resultados de la pruebas de esporulaci6n y catalasa indicados en las
Tablas 3 y 4 respeclivamente dieron conforme a 10 especificado en Stanley
1989 para Lactobacillus
42
1
2 3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
TABLA 3 Resultado de prueba de esporuJaci6n
CEPA RESULfADO ESPORULACION
-- -------------
43
l i ~II bull ~ I I
TABLA 4 Resultado prueba de la catalasa
CEPA RESULTADO CATALASA
1 -2 -3 -4 -5 -6 -7 8 -9 -10 -11 12 -13 -14 -15 -16
3~3 Prueba para determinar la especie
Oespues de hacer las pruebas para seleccionar las cepas sospechosas de ser
Lactobacillus se realizo las pruebas bioquimicas fograndose identificar
Lactobacillus plantarum aislctdo de pepino repollo y repollitas de bruselas
44
fermentados y Lactobacillus brevis de mucosa vaginal y leche fermentada (Ver
Anexos del A al E y Tabla 5)
TABLA 5 Resultado identlficaci6n cepa~
CEPA NOMBRE
1 Lactobacillus planfarum
3 Lactobacillus plantarum
5 Lactobacillus brevis
13 Lactobacillus brevis
15 Lactobacillus plantarum
34 Pruebas para determinar microorganismos probi6ticos
las cepas de Lactobacillus brevis y Lactobacillus plantarum mostraron
rasistencia al medio acido de pH =2 Y sales biliares 03 pv resultado similar al
encontrado por Jacobsen et al 1999 para Lactobacillus plantarum (Ver tabla 6)
45
middot
~~~ttiI lltlmiddot~COX~dtJ ~xtc_~ 2 tr~ k-JlL~middot
-)~~TO DE lJIBUOTECUl rjRL]OTtCA twn GO1IU1
TABLA 6 Resultados a pruebas de resistencia a pH=2 y sales biliares 03 plv
CEPA RESISTENCIA pH=2 RESISTENCfA A SALES BIUARES ()3 pv
1 + +
2 + +
3 + +
4 + +
5 +
6 + +
7 + +
8 + +
9 + +
10 + +
11 + +
12 + +
13 + +
14 +1shy +M
15 + +
16 + +
+1 crecimiento debil
+ crecimiento abundante
46
Figura 6 Lactobacillus brevis Gram + aislado de leche fermentada
Ai observar en placa las celulas de lactobacilos despues de real1zar las pruebas
de resistenCia a la acidez y sales biliares se observo una tendencia a aglomerarse
posiblemente como un mecanismo de proteccion cOlitra estos medios que pueden
lIegar a ser adversos para elias (Ver figuras 7 y 8)
47
Figura 7 Lactobacillus brevis aislada de leche fermentada despu~s de la prueba de resistencia a pH=2
Figura 8 Lactobacillus brevis aislada de leche fermentada despues de la prueba de resistencie asales biUares 03 plv
fI
48
35 --Seguimiento del-pH-en-la-bebidaJacteacon y sin -prebi6tico
A continuacion se muestran las Tablas 7 y 8 donde sa registian los datos
recopilados de pHdurante 10$ dras Z 7 14 Y21 para las bebidas laaeas con ysin
prebi6tioo
TABLA 1 ResultadopH yogur sin avena
Dia Repetition 1 Repetici6n 2 Repeticion 3 Repetici6n 4
2 526 501 51 52
7 446 433 438 44
14 439 435 437 436
21 439 437 438 437
TABLA 8 -ResultadopHyogur con avena
Dia Repeticion 1 Repeticion2 Repeticion 3 - Repeticion 4
2 509 523 51 515
7 447 442 445 442
14 436 -438 439 437
21 432 433 435 434
Observando la Figura 9podamos ver que el pH en el -dfado$ para los dos
tratamientos as igual y empieza a descender rapidamente para estabilizarse a
partir del dra 7(Ver figura 9)
49
Figura 9 Comparacj6n de medias para -el pH
Comparaci6n de medias para pH
55 ~ 5 +----=gtIIIi-~i~~----=-r--it~ -- pH sin avena
a 45 1--~~~~=~~ 4 --- pH con
avena35 t-----r-- -------=------=--= ------- - ----
2 7 14 21
Dias
Aplicando la prueba t para comparar las medias de pH I S6 muestia una diferencia
altamants significativa en los dos tratamientos para el dia 21 (pltO05)
(Ver tabla 9)
TABLA 9 Compaiaci6n de medias para pH
DtAS SIN AVENA CON AVENA te p (VALOR)
2 514 514 0 10
7 439 444 -1 61 0159
14 437 I
438 -070 0510
21 438 433 528 00019 shy
- DiFERENCIA AlTAMENTE SIGNIFICATIVA
50
I
AI aplicar regrasi6n a los datos sa obtiene al modelo estimado
pHSinAyena =535606 - 01505650Ia +0005044340IaI2
La variabilidad en la respuesta de pH asta siendo explicada en un 8S7522 por
el modelo (Ver Anexo F)
EI tratamiento con avena mostro el siguiente modelo al analisis de ragresi6n
pHConAvena =534463 ~ 0140407Dia + 0004480980Ia2
La variabilidad an la respuesta de pH asta siendo explicada en un 903315 par
el nlodelo(Ver anexo G)
36 Seguimiento de la acidezmiddotmiddot expresada comomiddot de acido
lactico
A continuaci6n sa muestran las Tablas 10 y 11 donde sa registran los datos
tecopilados de acidezmiddotdurante los dias 27 14 Y 21 para las pebidas taetees con y
sin prebi6tico
TABLA 10 Resuttadode acidez (expresadocomo acido tactico) yogurt sin avena
CIA R~petici6n1 Repeticion2 Repetici6n 3 Repeticion 4
2 054 06 057 058
7 072 074 073 0]2
14 080 083 082 082
21 0]4 079 078 077
51
TABLA 11 Resultado de aCidez (expresado como acido Icktico) yogurt con avena
Dia Repetici6n 1 RepetiCi6n 2 Repetici6n 3 Repetici9n 4
2 059 055 058 057
7 071 073 072 072
14 089 087 088 086
21 092 091 090 091
Observando la Figura 10 se puede concluir que la acidez empieza a aumentar
hasta el dia 14 y luego trata de estabilizarse para los dos tratamientos
(Ver figura 10)
Figura 10 Comparaci6n de medias para la acidez
N G)
Comparacion de medias para acidez
1
2 0I 5 -+--=--------=-~~~= u
ltC
- Acidez sin avena
2 7 14
Dias
52
21
-it- Acidez con avena
Aplicando la prueba t para camparar las madias de acidez se muestra una
diferencia altarnante significativa en los dos tratamiantos para los dias 14 y 21
(pltO05)
(Var tabla 12)
TABLA 12Comparaci6n de medias para Acidez
DIASmiddot SIN AVENA CON AVENA te p(VALOR)
2 0572 0572 0 10
7 0727 0720 119 0278
14 0818 0875 -638 000070shy
21 077 091 -1212 i 0000019 shy
DIFERENCIA AL TAMENTE SlGNIFICATIVA
AI aplicar r~gresi6n a los datos se obtiene el modelo estimado
AcidezSlnAIena = 0491897 + O0436032Dia O00144613DfaA2
La variabilidad en la respuesta de acidez asta siendoexplicada en un 970978
por al modelo (Ver anexo H)
EI tratamiento con avena mostro elsiguiente modeloj a1 analisis de regresion
AcidezConAvena = 0491638 + 00406572Oia - OQOO982559OiaA2
La variabilidad enla respuesta acidez esta siendo explicadaen un 99212 por
el modelo (Ver anexo J)
53
I ~
37 Prueba de viabiJidad
A continuaci6n sa muestran las Tab~as 13 y 14 donde sa presentan los datos
recopilados del recuento de Lactobacilos durante los dias 7 14 Y 21 para las
bebidas lacteas con y sin prebi6tico
TABLA 13 Recuento de Lactobacilos (UFCml) yogurt sin avena
Dia Repetici6n 1 Repetici6n 2 Repeticion 3 Reptttici6n 4
7 1880X10l1 1454X1011 1642X1011 1780X10~
14 1560X10~ 646X1011J 1890X10l 140X10l1
21 1200x10lu 128Ox10u 1745x10J 1520x101V
TABLA 14 Recuento de Lactobacilos (UFCml) yogurt con avena
Dfa Repetieion 1 Repetici6n 2 Repeticion 3 Repeticf6n 4
7 1600X10lt 1240X10t 1640X10ll 1980X10t
14 540X1011 427X10n 546X10n 720X10ll
21 500x1011 492x1011 712)(1011 980x10~
AI analizar la Figura 11 sa puede observar un recuento mayor de Lactobacilos
en al tratamiento con avena resultado de acuerdo a 10 encontrado por Alander at
aI 1999 Kontula et aI 1998 y Jaskari et aI 1998
54
Figura 11 Comparaci6n de medias para Log Lactobacillus
Comparacion de medias para log Lactobacillus
~ 1350
-+- Sac Sin--() 13 co avenaIII
bull 125 -- Bac con 0)
0 12 avenaJ
115 7 14 21
Dias
Aplicando la prueba t para comparar las medias de recuento de Lactobacillus no
se encontr6 una diferenc1a estadfsUcamente significative entre los dos
tratamientos (Ver tabla 15)
Este aumento en al racuento influy6 en la disminuci6n del pH y en el aumento de
fa aeidez por la fermentacion que realizan los Lactobacillus sobre fa lactosa de la
lache y la avena adicionada como prebi6tico
55
1
TABLA 15 Comparaci6n medias lag Lactobacillus
DIAS SIN AVENA CON AVENA tc p(VALOR)
7 122257 122022 04846 06451
14 121065 132393 -19602 00977
21 129025 133087 -08236 04416
At aplicar regresion a los datos se obtiane al modelo astimado
LactobacillusSinAvena= 117347 + 004834640Ia
La variabilidad en la respuesta del recuento de LactobaCillus ssta siendo
explicada en un 260054 por el mod$loVar anexo J)
EI tratamiento con avena mostr6 al siguiente modalo al anal isis de regresion
Lactobacillu$ConAvena =118103 + 007903040Ias
La variabilidad en la respuesta de recuento esta siendo explicada en un 3068
por al modelo(Ver anexo K)~
38 Analisi$ microbiol6gicos de las bebidas lacteas con y sin
En la Tabla 16 estan recopilados los resultados microbiol6gieos obtenidos en ras
muestras con los dos tratamientos (con y sin avena)
I [
sa
TABLA 16 Resultados analisis microbiologico
Recuento de mohos y levaduras Iml lt10
Recuento de Staphylococcus coagulase positiva Iml lt100
NMP coliformes fotales y Escherichia coli Iml lt3
Presencia de Salmonella25ml Ausente
Los resultados de este analisis demuestran que las bebidas fermentadas con y
sin avena~ astan fibres de microorganismos patogenos
57
1
4 CONCLUSIONES
Se aislaron cepas nativas de Lactobacillus plantarum de las muestras vegetates
de repollo pepino repollitas de bruselas fermentadas y Lactobacillus brevis de
lache fermentada y mucosa vaginal humana Ambas cepas resistieran un pH=2 y
una concentraci6n de sales biliares det 03 ptv dos earacteristicas importantes
en los probi6ticos
Lamiddot cepa de Lactobacillus brevis aislada de lache Sa utiliz6 para elaborar una
bebida fermentada sin y con avana comoingrediente prebiotico obteniendose un
aJimento centon recuento del probi6tico viable durante 21 dras de seguimiento
ademas libre de microorganismos )at6gen05
No se encontr6 efecta significativo de la avena sobre Ie viabilidad del Lactobacillus
brevis aunque sa presento un aumento en 61 recuento de estos en la bebida con
avena
58
plusmn ~
5 RECOMENDACIONES
Ensayar la cepa de Lactobacillus plantartJm en productos carnicos madurados
como el salami
Ensayar la cepa de Lactobacillus l)revs en otros derivados lecteos como queso
quesito queso crema
Continuar con el estudio de estos microorganismos y caracterizarlos
molecularmente ademas de estudiar su capacidad de adherencja a fa mucosa
intestinal sobre algunes Hneas celulares como las CaCo~2
Estudiarel efedo de la avena sabre la viabiJidad del Lactobacillus breyis a una
concentraci6n mayor de 05
Realizer ensayos can las cepas de Lactobacillus brevis y Lactobrlcillus pJantarum
para elaborar masas acidas para panificacion reemplazando el Bromato de
Potasio aditivo prohibido desde marzo del 2003 en nuestro pais per 5U toxicidad
59
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65
ANEXOS
66
ANEXO A RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AlSLADA DE i
PEPINO it
Referencia Pepino 1 Fecha 06122002
IEXCELENTE IDENTIFICACION
Latto plantarum 1
Galeria API 50 CHL V50 Leida el 06122002
Perfil - -- - ++ - -- - ++++ - - -+- + - I I I I I I I I +t+ - +f- ~ - - + + ~ - - - +- + - shy
o - GLY - ERY DARA - LARA + RIB + DXYL - LXYL - ADO - MDX - GAL + GLU + FRU + MNE + SBE - RHA - DUL - INO bull MAN + SOR - MDM + MUG shyNAG + AMY + ARB + ESC + SAL + CEL + MAL + LAC + MEL + SAC + TRE + 1NU - MLZ + RAF + AMD - GLYG - XLT - GEN + TIJR + LYX - TAG - DFUC shyLFUC - DARL + LARL - aNT + 2KG - 5KG shy
--- Taxones significativos rd -----T -- Tests en contra
Lactoplantarum 1 999 092 1
Taxon siguiente Lactobrevis 1 OJ 044 3
i i
Lactoplantarum 1 1 test (5) en contra
D-SORBITOL (SOR) 78
Tax6n siguiente Lactobrevis 1 3 test (s) ert contra
METHYLD-MANNOSIDE (MOlM) 0 MELEZITOSE (MLZ) 14 D-TURANOSE (TUR) 14
67
ampb
ANEXO B RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AISLADA DE REPOLLO FERMENTADO
~
Referencia Repollo fermentado - 3 Fecha 03072003
EXCELENTE IDENTIFICACION
Lactoplantarum 1
Galena API 50 CRL V50 Leida el 03072003
Perfil - - ++ - - - - -H++ - - ~ + - + - I I 1 I I I I -H+ - ++ - - - + + - -- - - + - shy
o - GLY - ERY - DARA - LARA + RIB + DXYL - LXYL - ADO ~ MDX - GAL + GLU + FRU + MNE + SBE ~ RHA - DUL - INO - MAN + SOR - MDM + MDG shyNAG + AMY + ARR + ESC + SAT + CRL + MAL + LAC + MEL + SAC + TRE + lNU - MLZ + RAF + AMI) - GLYG - XLT - GEN + TOR + LYX - TAG - DFUC shyLFUC - DARL - LARL - GNT + 2KG - 5KG shy
------Taxones significativos _ _----- Id--- ---T---- Tests en contra
Lactoplantarum 1 999 095 1
Tax6n siguiente Lactobrevis 1 01 OA8 3
lJactoplantaru01 1 1 test (s) en contra
DSORBITOL (SOR) 78
Taxon siguiente Lactobrevis
METHYL-D-MANNOSIDE D-TURANOSE
1
(MOM) (TOR)
3 test (5) en contra
0 MELEZITOSE 14
(MLZ) 14
i
I
68
ANEXO C RESULTADO PRUEBAS BIOQUWICAS DE CEPA AISLADA DE MUCOSA HUMANA
Referenda Mucosa - 5 Fecha 27012003
BUENA IDENTlFICACION
Galeria API 50 CHL vso Leida el 270112003
Perfil - - - - +t--t - - - + - + - - - - - - - - -+- - - - - + - + - - - - - - - - - - - - - bull - - -+ - +
o - GLY ~ ERY - DARA bull LARA + RID + DXYL + LXYL - ADO bull MDX - GAL + OLU - FRU + MNE - SBE - IlliA - DUL - INa - MAN - SOR - MDM - MOO shyNAG + AMY - ARB - ESC ~ SAL bull CEL - MAL + lAC - MEL + SAC - TRE shyINU - MLZ - RAF - AMD - GLYG - XLT - GEN - 11JR - LYX - TAG - DFUC shyLFUC - DARL - IARL - ONT + 2KO - 5KG +
- - - - - - Taxones significativos - - - - - - - Id T -- Test en contra
Lactobrevis 3 963 088 1
Taxon siguiente Lactoco11inoides 36 075 2
Lactobrevis 3 1 test (s) en contra
GLUCOSE (GLU) 95
-~~~------------~---------------------------~--~-------~--~-----~----------~--------~------------~~--Taxon siguiente Lactocollinoides 2 test (s) en contra
GLUCOSE (GLU) 100 MELIBIOSE (MEL) 25
69
i r
ANEXO D RESULTADO PRUEBAS BIOQIJiMICAS DE CEPA AISLADA DE LECHE FERMENTADA
Referenda Leche fennentada ~ 13 Fecha 27012003
BUENA IDENTIFICACI6N
Galeria API 50 CHL V50 Leida el 270112003
Perfil - - - - -t-t+- - - - + - + - - - bull - - - - -+- - - - - + - + - - - - - - - - - - - - - - - - -+ - +
0 - GLY - ERY - DARA - LARA +Rll3 + DXYL + LXYL - ADO - MDX ~GAL + GLU - FRU + MNE SBE - RHA DUL bull INO MAN - SOR MDM bull MDG shy
~NAG + AMY - ARB - ESC - SAL - CEL - MAL + LAC - MEL + SAC - TRE I lNU - MLZ - RAF - AMD - GLYG - XLT - OEN - IUR LYX - TAG - DFUC bull i
LFUC - DARL - LARL -ONr + 2KG - SKO + 1
- -- - - Taxones significativos - - Id -- T --- Test en contra
Lacta brevis 3 963 088 1
Taxon siguiente Lactocollinoides 36 075 2
Lactobrevis 3 1 test (s) en contra
GLUCOSE (GLU) 95
-----------------------------------------------------------~------------------------------~-------------------Taxon siguiente Lactocollinoides 2 test (s) en contra
GLUCOSE (GLD) 100 MELffiIOSE (MEL) 25
70
II iJ1
I
I ANEXO E RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AISLADA DE REPOLLITAS DE BRUSELAS FERMENTADA
Referencia repollitas de bruselas 15 Fecha 03072003
EXCELENTE IDENTIFICACION
Lactoplantarum 1
Galeria API 50 CHL vsO Leida el 03072003
Perfil - - - - +t - - - - +H+ - +- - +t + - I I I I I I I f ++t - + - - - -+ + - - - -+ -+ - - I ij
o - GLY - ERY - DARA - LARA + RJB + DXYL - LXYL - ADO - MDX - GAL +
GLU + FRU + MNE + SBE RHA + DUL - INO - MAN + SOR + MDM + MOG shyNAG + AMY + ARB + ESC + SAL + eEL + MAL + LAC + MEl + SAC + TRE + i
I1NU - MLZ + RAF AMD GLYG - XLT - aEN + TUR + LYX - TAG - Druc LFUC - DARt + LARL - aNT + 2KG - 5KG shy n ----Taxones significativos ------ Id Tests en contra
Lactoplantarum 1 999 090 o
Taxon siguiente Lacto pentosus 01 012 7
Lactoplantarum 1 o test (s) en contra
Taxon siguiente Lacto pentosus 7 test (8) en contra
GLYCEROL (GLY) 75 D-XYLOSE (DXYL) 100 L-RHAMNOSE (RHA) 25 METHYL-D-MANNOSIDE (MOM) 1 MELEZITOSE (MLZ) 25 RAFFINOSE (RAF) 75 D-ARABITOL (DARL) 0
71
~
I i I
ANEXO F - ANALISIS DE REGRESION PARA pH EN BEBIDA SIN AVENA
Aruilisis de regresi6n polinomial
---~-~-------------------------------------------~-----------~~---------------------~--------------Variable dependiente pHSinAvena ---------------------------~-------------~--------------------~---------------------------------
Error T Parametro Estimado Estandar Estadistico P-Valor
CONSTANTE 535606 0094535 56657 00000 Dia -0150565 0020706 727154 00000 Dia2 000504434 0000871488 578819 00001
---~---------------------------------------------------------------------------------------------------
Anfllisis de Variama -------------------------------------------~-----------~-----------------------------~-~--- jSource Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor 11
------------------------~------------------------------------------------------------------------------~ Mod-elo 155772 2 0118861 4256 00000 Residual 0237877 13 00182983
Total (Corr) 11956 IS
R2 == 867522 percent
pHSinAvena == 535606 - 0150565Dia + 000504434Dia2
72
____
middot ANEXO G - ANALISIS DE REGRESION PARA pH EN BEBIDA CON AVENA
AmUisis de regresion polinomial _____~_____~__-_____~___4____________________bull____bull__________bull_____________~~----_------___________
Variable depcndiente pHConA vena ------------------------------------------------------------------------------------------~--------
Error T Parametro Estimado StAndar Estadfstico P-Valor
---------------------------------------------~-----------------------------------------------_---------CONSTANTE 534463 00801045 667208 00000 Dia -0140407 00175453 800253 00000 DiaA 2 000448098 0000738458 606803 00000
----------------------~---~-----------------------------~------------------------------~----AmUisis de Varianza
---~---------------------------------~---------------------~------------~-------------------~------Source Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio PValor --------------------------~-----------------------------------------------~------------~-----~~--~ ModeJo 159575 2 0797873 6073 00000 Residual 02170798 middot13 00131383 _______~_~ ~_~----------~------~--~-----~-M-----~-----____ _____________~-----------------------Total (COlT) 176654 15
R12 903315 percent
-----------~------------------------------------------------------------------------~-----------pHConAvena 534463 - 0140407Dia + 000448098DfaA 2
73
ANEXO H - ANALTSIS DE REGRESTON PARA ACIDEZ EN BEBJDA SIN AVENA
An8Jisis de Regtesi6fi P6lifJomial
Variable Depefidiefile~ AcidezSinAVenll _______________w_____~______~________________~-----------_________~_________________~~____~___~_____
Error T Pariirnetro Estimado Estandar Estadistico ---------------------------------------~--------------~-~-------~--------------------~------------CONSTANT 0491697 00123217 399051 00000 Dia 00436032 000269882 161564 00000 D1a2 -000144613 000011359 127312 00000 __w___~________________________~-_______-_____~----____________________________~__~---~_--__~___
AriiiJisis de varianza ~_~__~__________~_~____~________~___________- _________e_____________________________bull _____-________
Source Smn de cuadr Df Mean Square F-Ratio PmiddotValor_~~___________________________________bull ______~___________bull ____________bull ______~________w________________
Model 0135203 2 00676013 21747 00000 Residual 000404118 13 000031086
Total (Corr) 0139244 15
R2 970978 percent
AcidezSlnAvena 0491697 + O0436032Dia - 0OOl44613Dia2
74
I
ANEXO I ANALISIS DE REGRESION PARA ACIDEZ EN BEBIDA CON AVENA
1
Anwisis de tegtesi6fi polinomial
Variable dependiente Acidez Con Avena
Error T ParametTo Estimado Stlindar Estadfstico P-Valor ----------------~-------~---------------------~-----------------------------------------------------CONSTANT 0491639 000926607 530578 00000 Diamiddot 00406572 000202955 200326 00000 DfaA 2 0000982559 0000085421 -115025 00000
-------------~----------------------------~-------------------------~-----------------------------------
-------------~-----~~-----------------------------~---------------------------------------------_--Source Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio PValor
-~-------------~----------------------------------~------------------~~-------------------------- Modelo 0288008 2 0144004 81914 00000 Residual 000228539 13 0000175799
----------~~--------------~---------------------------------------------~---------------------------Total (Corr) 0290294 15
RA2 = 992127 percent
-------------------------~----~---~------------~---------------------------------~---------------~
AcidezConAvena == 049163amp + 00406572D1a - 0000982559DiaA2
75
I
(Ilmiddot il
ANEXO J- ANALISIS DE REGRESION PARA RECUENTO LACTOBACILOS PARA BEBIDA SIN AVENA
Amilisis de regresion - Modelo lineal Y = a + bX
------------------------~----------------------~-----------------------------~----------~-----------Variable Dcpendiente LactobacilJusSinAvena Variable independiente Dia
I--------~----------~-----------------------------------~-------~-~--~--------------------------~-Error T
Paramctro Estimado Standard Stadistico P-Valor
----~----~------------~-----~-----------------------~-------------~-----------------------------Intereepto 117347 0389973 300911 00000 Pendiente 00483464 00257889 18747 00903
Analisis de Varianza
---------~------------------~----------------~---------------------------------~---------~----------Source Sum decuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor
------------~---------------------~---------------------~--------------------------------~-----~----Modelo 0916252 1 244835 443 00616 Residual 260706 10 0260706
--~------------~---~------------------~~~-----~-------~---------~~-------------------------------------Total (Corr)352332 11
Coeficiente Correlaci6n = 0509955 R2 = 260054 percent
LactobacillusSinAvena= 117347 + 00483464Dfa
76
ANEXO K- ANALTSIS DE REGRESION PARA RECUENTO LACTOBACILOS PARA DEBIDA CON AVENA
Aruilisis de regresion - Modelo lineal Y = a + hX
Variable Dependiente LactobacillusConAvena Variable Independiente Dia ---~--------------------------------------------------------__-----------__--_--_-----------shy
Error T Paramctro Estimado Standard Estadistico P-Valor -~--------------------------------------------------------------------------------------------------
Irttercepto 118103 0567963 207942 00000 Pendiente 00790304 00375594 210414 00616
-----------------~----------------------------~----~-------~----~----------------------------
Analisis de Varianza
----------------~----------------~------------------~--------------------------~------~--------shySource Swn de cuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor
-----------------~--~--------------------------------------------------------------------------~---~ Mode10 244835 1 244835 443 00616 Residual 552997 10 0552997
Total (Corr)797832 11
Coeficiente Correlacion = 0553964 RI2 = 306875 percent
-----~--------------------------------------------------------~--------------------------------------
LactobacillusConAvena = 118103 + 00790304Dfas
77
116 Berieficios de los microorganismos probi6ticos
Los beneficios que se asocian a los microorganismos probioticos son muchos y
variados Entre ros comprobados mediante estudios se eneuentran
1151 Facilitar la digesti6n de la lactosa
los microorganismos probioticos cuando estan en el intestino liberan alii la
enzima pmiddotgalaotosidasa capaz de hidrolizar la lactosa haste glucosa y galactosa
evitando as que personas intolerantes a este carbohidrato presenten sfntomas
como flatulencia dolor abdominal y diarrea cuando consumen leche (be Vresse
et 81 2001)
1152 Protegen contra enfermedades gastrointesUnales
EI consumo de aJimentos con probioticos ha mostrado efeeto terapeutico frente a
los sintomas de diarrea asociada al surninistro de antibi6tico$ de amplio espectro
que destruye 0 disminuye la microbiota endogena esta imp ide la coJonizacion de
bacterias patogenas como Klebsiella oxytoca y Clostridium difficile que pueden
causer lesiones en el cn Los probi6ticos recuperan el balance de la microbiota
intestinal nativa y avitan Ie adhesion de algunos virus bacterias pat6genas a
parasitos que pueden ser agentes causales de gastroenteritis la diarrea del
19
J
viajero y 1(3 inflarnacion intestinal que en ultima instaneia oeasionan ef sfndrome
del colon irritable (Marteu et al 2001)
1153 Protegen contra infecciones del tracto urogenital
La vaginitis indueida por baeteriss yo por levaduras as una infecci6n
estrechamente relacionada con la exposici6n a antibi6ticos y espermicidas y
tambien depende del estado hormonal de la n1ujar Con al uso de mezcJas de
probi6ticos se han obtenido buenos resultados en la rastauraci6n de la rnicrobiota
natural urogenital benefica que desplaza a los eausantes de la inflamaci6n de Is
vagina y Ie uretra (Reid 2001 )
1154 Promueven la barrera de defensa end6gena del intestino
EI tracto gastrointestinal normal mente as una barrera natural contra anUgenos de
origen microbiano y alimentario Cuando los probi6ticos sa adhieren a Is mucosa
intestinal estimulan 0 potencian al sistema inmune favoreciendo la
inmunomodulaci6n que induce un aumentb de fa producci6n de inmunoglobulinas
activacion de las calulas mononueleares y de los linfocitos para proteger al
huesped de infeeciones (Isoulari et sl 2001)
20
1155 Protegen contra cancer de colon
EI cancer es el resultado de una serie de mutaciones somaticas que pueden
ocurrir durante al tiempo de vida del individuo y 10 padeca buena parte de la
poblacion mundial los probi6ticos en un sistema in vitro han demostrado un
efecto positivo en la prevenci6n de mutaciones aI desactivar carcin6genos
genotoxicos (Wolloswski et al J 2001)
1156 Protegen contra infecciones respiratorias
Sa ha demostrado que el conslJlno de probi6ticos disrninuye la incidencia de
infecqiones raspiretorias al aumentar la actividad fagocitica de maer6fagos
alveolares que aettian sobre microorganismos patogenos Se hizo un estudio en
571 ninos sanos con edades entre uno y seis anos divididos en dos grupos a uno
de ellos sa las incluy6 en su dieta leche suplementada can Lactobacillus GG y a
los otros ninos leche no suplementada AI final del estudio se observ6 una
disminucion del 19 en la incidencia de infeccionas respiratorias tratadas con
antibi6ticos tales como otitis media sinusitis bronquitis y neumonfas en el grupo
de los ninos que consumieron Lactobacillus GG (Hatakka et al 2001)
Alvarez et al (2001) encontraron que la administraci6n de yogurt con Lactobacillus
casei en ratones de tres arios de edad majora los espacios libres del puJrn6n de
la presencia de Pseudomona aeruginos8 induciendo un aumento
21
significativo en los niveles de gA a IgM datactadas en los lavados
broncoaJveolares y se observ~ un afecta dependiente de la dosis
1157 En el tratamientoy prevenci6n del eczema
Se ha encontrado que el consumo de probi6ticos mejora la inflamaci6n alergica 0
eczema at6pico en ninos alimentados con formula suplementada con probi6ticos
Encontraron una mejora significativa al suministrar Bifidobacteriummiddot actis y
Lactobacillus GG en 27 niiios con edad promedio de 46 meses Luego de aplicar
este tratamiento se sometieron a una prueha de SCORAD (mide fa extension y
gravedad del eczema) registrando una meJoria significatlva en las condiciones de
la pie concentraci6n de citoquinas cirClllantes an sueto y moleculas de adhesi6n
a las superficies de las celulas soJubles en suero (Isolari 2000)
Se realizaron otros estudios a 159 mujeres embarazadas con historia familiar de
eczema atopico de primer grado a las cuafes sa res 5uministro dosis diarias de
Lactobacillus GG durante 2 a 4 samanas previas al parto Oespues de ella fa
madres twiaron la opci6n de continuer tomando el ptobi6tico si amamantaban 0
bien darseio vIa oral La mayoria de las madras eJigieron dar las dosis at bebe
diariamente A los dos anos de vida se observ6 una disminuci6n del 50 en la
frecuencia del eczema at6pico en aquellos nHies que se les dio ef probi6tico
(Kalliomari etal 2001)
22
1158 Previenen infeccion en heridas quirurgicas
Los probi6ticos impiden la union de pat6genos a las superficies celulares en
heridas mediante la seCreci6n de proteinas Actuamente se encuentra en
estudio la aplicaci6n del Lactobacillus fermentum vivos sabre heridas en piel de
ratas y se ha encontrado una disminuci6n del 90 en la colonizaci6n par parte del
StaphylococcuS aureus uno de los patogenos mas temidos y de mayor lncidencia
en infecciones hospital arias mas aun se esta contempiando la posibilidad de
utilizar la protein a purificada an lugar de los mjcroorganismos para la protaccion
contra infecciones en heridas (Strauss 2000)
12 PREBIOTICOS
Son carbohidratos de cadena corta algunas veces reconocidQs como
oligosacaridos no digeribles par las enzimas del epitelio intestinal 0 de las
gliJnduJas anexas debido a su estructura quimica y de esta manera lIegan al
intestino grueso donde alcanzan a estar disponibles para la fermentaci6n por las
bacierias sacaroHticas que son especial mente laetobadlos y bifidobacterias
dando odgen a compuestos que ejercen efectos funcionales sobre la mucosa del
tubo digestivo (Brunser 2001)
Se consideran como tal algunos fructocligosacaridos isomaltooligosacariclos
oligomato palatinosa poHdextrosa pOJidextrrna raftilina y algunos oligosacaridos
23
)
de 1a soya y fa avena Estenmiddot presentes en alimentos como Ie cebolla ajo
banano puerros 1 derivados del trigo achicoria esparrago alcachofa (Cummings
etal 2001)
Algunos de estos prebi6ticos cuanda son incorporado$ a fa dieta en cantidades
dalerminadas alteran la microbiota intestinal disminuyendo los recuentos de
coliformes bacteroides y cocos y aumentando las bifidobacterias hasta en diez
veces ademas modifican la actividad metab6lica del coron logrando una
disminuci6n del pH y un incremento en el contenido fecal de acidos grasos de
cadena corta como at acatica propi6nico y butfrico El butirato aumen~ _I grosor
de la pared del coron e intestino delgado estimula eJ crecimiento de la mucosa del
colon y auManta su flujo sangufneo inhibe el crecimiento de tinsas tumorales
epiteliales de origen co16nico induce la diferenciaci6n de sus celulas y a
apoptosis entre otros(Brunsar 2001)
Eh estudios hechos en simuladores del intestino humano utilizando productos de
avena fermentados se encontro que estimularon al crecimiento tanto de
lactobacios como de bifidobacterias y en el caso de estas ultimas se incremento
la producci6n de los acidos acatico propionico y butfrico 10 que incide sobre la
implantacion de probi6tico$ e inhibe al crecimientos de otro tipo de
microorganismos (Alal1der eta1999 Kontula etal 1998 Jaskari etal 1998)
24
~ -1
(
AI comparar el comportamianto de las leches de diferente origen se ha
demostrado que Ie leche de vaca contiene caseinatos sustancias que forman
buffer ~n et intestino e inlpiden que los probi6ticos disminlJyen el pH del intestina
y de esta manera se impide al efecto deseado que es evitar fa proliferaci6n de
otros microorganismos entre los cuates pueden estar algunos patOganos En la
leche materna sa encuentran algunos carbohidratos como glucosa galactosa n
acetilglucosamina y algunos 0lig6meros de Ie fucosa en cOhoontracionesmiddot
importantes los cualeS favoreceh el crecimientc)middot de probi6ticos esto
complementado can 91 bajo contenido de protenas que se traduce en una
reducida capacidad buffer hacen de Ie lache materna IJn alimentd adecuado para
nllios en su etape de lactancia
Algunos prebi6ticos como 1a lactulosa yciertos compuestos que contiansn fructosa
no son digeridos en el intestino humano y pueden sar utilizados selectivamenta
par los probi6ticos 10 que hace que los probi6ticos en combinaci6n can prebi6ticos
pueden lIegar a ser un importante medio para prevenir algunas enfermedades del
tracto gastrointestinal (Bezkorovainy 2001)
25
2 METODOlOGfA
21 LOCALIZACION
EJ trabajo sa realizo en el laboratorio de Microbiologia y la planta da laches de Ja
Universidad Naclonal de Colombia- Secie Medellin
En al laboratorio se hiZQ al aislamiento a identificaci6n de fa capas y en fa Planta
sa eJaboro la leche fermentada con 1a cepa seleccionada y el prebi6trco
22 METODOS
221 Aisiamiento de cepas nativas
Las cepas nativas se sislaran de producto$ vegetales leches fermentadas y
mucosa vaginal humana
2211 De vegetales
Las muestras vegetales de repollo repollitas de brusefas y pepino se
seleccionaron porcionaron y mezclaron can cloruro de sadio al 10 pIp se
calacaron en un recipienta de vidrio balo anaerobiosis y sa dejarQn por 15 dias
26
luego S9 tomaron 3 ml de cada muestra y se jnocularon 9 ml de caldo MRS (Man
Rogosa and Sharpe) se incubaron a 37deg C durante cinco dias en camara de
anaerobiosis (Ver Figura 1) Oespues de este tiempo sa inocularon cajas de petri
con agar MRS con 1 ml del cultivo microbiano y se incubaron bajo las mismas
condiciones que eJ caldo Este procedirniento se realiz6 rapetidas veces hasta
seleccionar la cepa pura mediante observaci6n de caracteristicas morfologicas de
la cOlonia y a cada colonia se Ie practico la coloracion de gram con el fin de
observar las caracteristicas microscopicas de cada una e identificar las de mayor
similitud a los Lactobacilos y Bifidobacterias
Figura 1 Camara de anaerobiosis
27
2212 De la leche
Sa tomo 200 ml de teche cruda de la planta de leches y se colaca a fermentar
baja anaerobiosis durante 15 dras Luego sa procedia como en los vegetales
2213 De mucosa vaginal humana
Se tomo una muestra de frotis de mucosa vaginal humane can capito esteril sa
puso a ncubar en Caldo MRS y se procedi6 camo en 2211 y 2212 A cads
aislado sa Ie practico la coloracion de gram y sa seleccionaron aquellas que eran
bacilos gram positivos (Ver Tabla 2)
28
TABLA 2 Fuente de aislarniento de cepas nativas
CEPA FUENTE
1 Pepino fermentadQ
2 repollitas de bruselas fermentadas
3 Repolltgt fermentado
4 Repollo fermentado
5 Mucosa va~inal humana
6 Mucosa vaginal humana
7 repollitas de bruselas fermentadas
8 Repollo fermentado
9 repollitas de bruselas fermentadas
10 Mueo~a vaginal humana
11 Repollo fermentado
12 RepolJo fermentado
13 Leche fermentada
14 Mucosa vaginal humana
15 repollitas de bruselas fermentadas
16 Repollb fermentado
29
222 Almacenamiento de las cepas aisladas
Cuando las cepas crecieron en agar MRS homogEmeas en color morfologia
coloraci6n de Gram etc se pssaron a agar inclinado en tuba se cubrieron con
aceite mineral y se guardaran en refrigeraci6n a 4deg C para tomar de alii la cepa y
efectuarle las diferentes pruebas para confirmar el genera y determinar la especie
de cada una de eas (Ver Figura 2)
Figura 2 Cepas en tubos con agar inclinado
30
223 Pruebas para determinar et genero
2231 Coforaci6n de Gram
A cada cepa sospechosa de Lactobacilos se 1e hizo la coloraci6n de gram y se
seleccionaron las gram positivas
2232 Morfologfa
En agar MRS y despues de incubar en anaerobios~s crecian colonias grandes
cremosas de color beige con bordes homogeneos y c6ncavas(Ver Figura 3)
Figura 3 Colonias aisladas en agar MRS
31
2233 Prueba de esporulaci6n
A cada cepa aislada se Ie hizo esta prueba la cuel consistia en incubar en
aerobiosis durante ocho dias las cajas de agar MRS donde crecieron colonias de
Lactobacilo$ y luego se les (ealize) coloraci6n de espora Las capas que dieron
negativa a la prueba de espora se considararort sospechosas de sar Lactobacilos
y se continuo con la prueba de la catalasa (Ver Tabla 3)
2234 Prueba de la catalasa
los lactobacilos carecen de catalasa Eata prueba se hizo tomando una colonis
se deposito en vidrio de reloj y se Ie adicion6 dos gotas de peroxida de hidr6geno
(H202) la que no presentaba efervescencie eran cepe sospechosa de ser
Lactobacilo (Ver Tabla 4
Sa seleccionaron las capas euyo resultado fue aeorde con el genera Lactobacilfu$
y se continuo con la comirmaeion del genera y determinacion de la eSpecie
meqiante las pruebas bioqulmicas
32
224 Prueba para determlnar la especie
Para confirmar el genero y determinar la especie de las diferentes capas aisladas
se hizo una caracterizaci6n bioqufmica utilizando un kit de API 50 CHL Medium
Ref 50 410 que contiene una galed8 de medios que permite realizar el estudio
de fermentaci6n de los 49 azucares de 52 especies de Lactobacillus (Ver Figura 4
y tabla 5)
Figura 4 API CHL 50-Prueba bioquimica
33
225 Pruebas para determinar microorganismos probi6ticos
2251 Resistencia a pH=2 y sales biliares de concentraci6n O3pv
A las cepas idantificades como Lactobacillus brevis y Lactobacillus pantarum sa
las realiz6 Ie prueba dfl resistencia a pH=2 y sales biliares de concentraci6n 03
pv ( Jacobsen et al 1999) Una colonia de cada cepe aislada se inocul6 en 4 mt
de caldo MRS durante cinco dras bajo condiciones de anaerobiosis Oespues de
esta tiempo se dejaron pracipltar los microorganismos por sedimentaci6n se Ie
retire el sobrenadante y al precipitado se Ie adicion6 Sml de caldo MRS
previamente ajustado a pH=2 can seido clorhfdrico (HCI) dentro del mismo tuba de
ensayo G igual sa hizo can otro tubo previamente incubado pero a este se Ie
adiciono 5ml de caldo MRS con sales biliares a una concentra~i6n de 03 plv y
ambos se incuberon a 37deg C por 2 haras Sa midio 01 mi de cada uno de los
tubas al tiempo 0 y a las 2 horas y sa inoculeron en superficie en caJas de petri
con agar MRS S9 incubaron a 37deg C bajo anaerobiosis durante 48 horas Se
compararon visualrrente en cada caja de petri el crecimiento en superficie y las
que presentaron crecimiento en tos dos tiempos (0 y 2 horas) tanto en at media
acido como en sales I se consideraron resistentes a pH=2 y sales biliares (03
pv)
(Ver Tabla 6)
34
226 Conservacion
Todas fas capas que habian dado positiva Jas pruebas anteriores y que reaultaron
resistentes a pH=2 y sales biliares 03 pv y despues de identificadas en API 50
CHL sa repicaron en agar MRS en tuba inclinado y despues de Incubar a 37deg C
por 48 horas bajo anaerobiosis se Ctlbrie el biser completamente can aceite
mineral esteril y sa guardaron en refrigeraci6n
227 Elaboracj6n de fa bebida fermentada
2271 Preparaci6n de la mue$tra
Sa tome 1 mt de caldo MRS previamante inoculado e incubado que presentaba
una concentracion de Lactobacillus brevis de 27x108 Iml segun la escaJa de Mac
Farlan y sa adiciono a 9ml de leche pasteurizada en un tubo sa dej6 incubanda
en anaerobiosis por 48 hores Luego se pasaron estos 10 ml a un frasco qua
cont~nie 90 ml de leche pasterizada y se dej6 incubando par 48 haras en
anaerobiosis
35
2272 Adici6n del inOculo
A 900ml de leche pasteurizada se Ie adicion61os 100 ml de leche que habia sido
previamente ino(ulada dos veces con la cepa posteriormente se deja
fermantando la lache a temperatura de 37deg C
2273 Control de Ja fermentaci6n
Las muestras se hicieron por cuadruplicado y se les hizo un seguimiento de
aoidez hasta un valor entre 04 y 05 expresada como Bcido lactico esta
procedimiento corresponde a la babida fermentada sin prebi6tico La bebida ~on
prebi6tico tiene al mismo proeedirnianto pero adicionalmente se agrag6 avena a
una concentraci6n de 05 en el momento de la adici6n del in6e410 a los 900 ml
de leehe pasteurlzada y el procedimiento sigui6 igual al de la bebida sin prebi6tico
tambien se hizo por cuadruplicado
2274 Refrigeracl6n
Despues que las mezclas con y sin prebiotico alcanzaron el de acidez
requarido se IIeva ron a refrigeraci6n a una temperatura de 4deg C p~r 24 horas
para frenar proce~os metab6licos de los microorganisrtlos Despues de este
ti~mpo se procedi6 al batido
36
1 2275 Batido
Con un agitador se procedi6 a batir las bebidas para romper et coagulo formado
y de esta manera homogeneizar la mazela y obtener asf la bebida fermentada
2276 Envasado y almacenamiento
Ambas bebidas se envasaron en frascos vidrio para hacerles seguimiento de pH
acidez(expresado como acido tacticol y recuento de Lactobacillus breviSf los
dies 27 14 Y 21 despues de elaboradas las bebidas perfodo durante el cualta
muestra permanecfa afmacenada a temperatura de refrigeracion(Ver Figura 5
37
Fjgura 5 Diagrama de Flujo
PREPARACION DE LA MUESTRA
ADICION DEL INOCULO
~_____~_B~ATIDO~______~
INCUBACION 37deg C hasta acidez = 04-05 acido laotico
ENFRIAMIENTO
hasta 4 0 C ~------~ ~------~
ENVASADO Y ALMACENAMJENTO
dUrante 21 dfas a Temperatura 4 0 C
38
1
228 Determinaci6n del pH
Se determino por el metoda potenciometrico en un pH-metro manual durante los
dias 2) 7 14 Y 21 de las bebidas lacteas sin y con prebi6tica (Ver Tablas 7 y 8)
229 Oeterminaci6n de la acidez (Expresadfl como acido
lactica)
Se tomaron 9 mJ de las bebida~ sa Ie adicionaron 2 gotas de fanoftaleina como
indicador y sa titulo fa acidez con NaOH 01 N hasta la aparicion de un cotor rosado
debit EI volumen de NaOH utilizado se reporta como valor de de acidez
(VerTablas 10 y 11)
2210 Prueba de viabilidad
Qurante el perfoda de almacenamiento de la bebida lactea se procedi6 a hacer la
prueba de viabiHdad en los dias 7 14 Y 21 para determinar Si los lactobacilfus
permanecfan vivOs a una concentraci6n minima de 106 hasta el dia 21 como 10
establece eJ Articulo 10 de la Rasolucion 2310 del Ministerio de $alud de
Colombja
39
Para asta prueba se tamaron 10 rnl de muestra y se adicionaron a 90 ml de caldo
MRS ruego a partir de esta se hicieron diluciones de 10-2 hasta 10-11 de las
diluciones 109101deg 10-11 se inocul6 1 ml de cada uno en agar MRS siguiendo el
metodo de siembra en profundidad y por duplicado e incubando a 370 C x 5 dras
en anaerobiosis y luego se hicieron tos recuentos por duplicado para esi reportar
los recuentos promedio (Ver Tablas 13 y 14)
2211 AniUisls microbiol6glco de las bebidas Iicteas(con y sin
avena)
Con el fin de determinar las condiciones higienico-sanitarias del producto se
realizaron las pruebas microbiol6gicas de Recuento de mohos y fevadurasml en
agar OGY Recuento en superficia de Staphylococcus coagulasa positivoml en
agar Baird Parker Numero Mas Probable (NMP) de coUfor-mes totales y
Escherichia coliml en caldo Fluorocult y Presencia de Salmonela25ml con BHI
caldo tetrationato y agar Hecktoen (Montoya 1999)
(Var tabla 16)
2212 AnaUsis estadistico
A los datos obtenidos en la medici6n de pH acidez (expresada como Beido
laclico) en los dras 2714 Y 21 y el recuento de Lactobacillus en los dras 714 y21
40
realizados a los dos tratamlentos se tes aplic6 1a prueba t porque solo difieren
en la presencia 0 ausencia del prebi6tico para evaluar si habra diferencia
estadfsticamente significativa para los dos tratamientbs(Ver Tablas9 12 y 15)
41
3 RESULTADOS Y DISCUSION
31 Coloraci6n de Gram y morfologfa
Las cepas aisladas fesultaron Gram positivas (Ver Figura 6) colonias grandes
cremosas dE) color beige con bordes homogeneos y c6ncavos en su
morfologia (Ver Figura 3) resultando de acuerdo a 10 especificado en Stanley
1989 para Lactobacillus
32 Prueba de esporulaci6n y cataJasa
Los resultados de la pruebas de esporulaci6n y catalasa indicados en las
Tablas 3 y 4 respeclivamente dieron conforme a 10 especificado en Stanley
1989 para Lactobacillus
42
1
2 3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
TABLA 3 Resultado de prueba de esporuJaci6n
CEPA RESULfADO ESPORULACION
-- -------------
43
l i ~II bull ~ I I
TABLA 4 Resultado prueba de la catalasa
CEPA RESULTADO CATALASA
1 -2 -3 -4 -5 -6 -7 8 -9 -10 -11 12 -13 -14 -15 -16
3~3 Prueba para determinar la especie
Oespues de hacer las pruebas para seleccionar las cepas sospechosas de ser
Lactobacillus se realizo las pruebas bioquimicas fograndose identificar
Lactobacillus plantarum aislctdo de pepino repollo y repollitas de bruselas
44
fermentados y Lactobacillus brevis de mucosa vaginal y leche fermentada (Ver
Anexos del A al E y Tabla 5)
TABLA 5 Resultado identlficaci6n cepa~
CEPA NOMBRE
1 Lactobacillus planfarum
3 Lactobacillus plantarum
5 Lactobacillus brevis
13 Lactobacillus brevis
15 Lactobacillus plantarum
34 Pruebas para determinar microorganismos probi6ticos
las cepas de Lactobacillus brevis y Lactobacillus plantarum mostraron
rasistencia al medio acido de pH =2 Y sales biliares 03 pv resultado similar al
encontrado por Jacobsen et al 1999 para Lactobacillus plantarum (Ver tabla 6)
45
middot
~~~ttiI lltlmiddot~COX~dtJ ~xtc_~ 2 tr~ k-JlL~middot
-)~~TO DE lJIBUOTECUl rjRL]OTtCA twn GO1IU1
TABLA 6 Resultados a pruebas de resistencia a pH=2 y sales biliares 03 plv
CEPA RESISTENCIA pH=2 RESISTENCfA A SALES BIUARES ()3 pv
1 + +
2 + +
3 + +
4 + +
5 +
6 + +
7 + +
8 + +
9 + +
10 + +
11 + +
12 + +
13 + +
14 +1shy +M
15 + +
16 + +
+1 crecimiento debil
+ crecimiento abundante
46
Figura 6 Lactobacillus brevis Gram + aislado de leche fermentada
Ai observar en placa las celulas de lactobacilos despues de real1zar las pruebas
de resistenCia a la acidez y sales biliares se observo una tendencia a aglomerarse
posiblemente como un mecanismo de proteccion cOlitra estos medios que pueden
lIegar a ser adversos para elias (Ver figuras 7 y 8)
47
Figura 7 Lactobacillus brevis aislada de leche fermentada despu~s de la prueba de resistencia a pH=2
Figura 8 Lactobacillus brevis aislada de leche fermentada despues de la prueba de resistencie asales biUares 03 plv
fI
48
35 --Seguimiento del-pH-en-la-bebidaJacteacon y sin -prebi6tico
A continuacion se muestran las Tablas 7 y 8 donde sa registian los datos
recopilados de pHdurante 10$ dras Z 7 14 Y21 para las bebidas laaeas con ysin
prebi6tioo
TABLA 1 ResultadopH yogur sin avena
Dia Repetition 1 Repetici6n 2 Repeticion 3 Repetici6n 4
2 526 501 51 52
7 446 433 438 44
14 439 435 437 436
21 439 437 438 437
TABLA 8 -ResultadopHyogur con avena
Dia Repeticion 1 Repeticion2 Repeticion 3 - Repeticion 4
2 509 523 51 515
7 447 442 445 442
14 436 -438 439 437
21 432 433 435 434
Observando la Figura 9podamos ver que el pH en el -dfado$ para los dos
tratamientos as igual y empieza a descender rapidamente para estabilizarse a
partir del dra 7(Ver figura 9)
49
Figura 9 Comparacj6n de medias para -el pH
Comparaci6n de medias para pH
55 ~ 5 +----=gtIIIi-~i~~----=-r--it~ -- pH sin avena
a 45 1--~~~~=~~ 4 --- pH con
avena35 t-----r-- -------=------=--= ------- - ----
2 7 14 21
Dias
Aplicando la prueba t para comparar las medias de pH I S6 muestia una diferencia
altamants significativa en los dos tratamientos para el dia 21 (pltO05)
(Ver tabla 9)
TABLA 9 Compaiaci6n de medias para pH
DtAS SIN AVENA CON AVENA te p (VALOR)
2 514 514 0 10
7 439 444 -1 61 0159
14 437 I
438 -070 0510
21 438 433 528 00019 shy
- DiFERENCIA AlTAMENTE SIGNIFICATIVA
50
I
AI aplicar regrasi6n a los datos sa obtiene al modelo estimado
pHSinAyena =535606 - 01505650Ia +0005044340IaI2
La variabilidad en la respuesta de pH asta siendo explicada en un 8S7522 por
el modelo (Ver Anexo F)
EI tratamiento con avena mostro el siguiente modelo al analisis de ragresi6n
pHConAvena =534463 ~ 0140407Dia + 0004480980Ia2
La variabilidad an la respuesta de pH asta siendo explicada en un 903315 par
el nlodelo(Ver anexo G)
36 Seguimiento de la acidezmiddotmiddot expresada comomiddot de acido
lactico
A continuaci6n sa muestran las Tablas 10 y 11 donde sa registran los datos
tecopilados de acidezmiddotdurante los dias 27 14 Y 21 para las pebidas taetees con y
sin prebi6tico
TABLA 10 Resuttadode acidez (expresadocomo acido tactico) yogurt sin avena
CIA R~petici6n1 Repeticion2 Repetici6n 3 Repeticion 4
2 054 06 057 058
7 072 074 073 0]2
14 080 083 082 082
21 0]4 079 078 077
51
TABLA 11 Resultado de aCidez (expresado como acido Icktico) yogurt con avena
Dia Repetici6n 1 RepetiCi6n 2 Repetici6n 3 Repetici9n 4
2 059 055 058 057
7 071 073 072 072
14 089 087 088 086
21 092 091 090 091
Observando la Figura 10 se puede concluir que la acidez empieza a aumentar
hasta el dia 14 y luego trata de estabilizarse para los dos tratamientos
(Ver figura 10)
Figura 10 Comparaci6n de medias para la acidez
N G)
Comparacion de medias para acidez
1
2 0I 5 -+--=--------=-~~~= u
ltC
- Acidez sin avena
2 7 14
Dias
52
21
-it- Acidez con avena
Aplicando la prueba t para camparar las madias de acidez se muestra una
diferencia altarnante significativa en los dos tratamiantos para los dias 14 y 21
(pltO05)
(Var tabla 12)
TABLA 12Comparaci6n de medias para Acidez
DIASmiddot SIN AVENA CON AVENA te p(VALOR)
2 0572 0572 0 10
7 0727 0720 119 0278
14 0818 0875 -638 000070shy
21 077 091 -1212 i 0000019 shy
DIFERENCIA AL TAMENTE SlGNIFICATIVA
AI aplicar r~gresi6n a los datos se obtiene el modelo estimado
AcidezSlnAIena = 0491897 + O0436032Dia O00144613DfaA2
La variabilidad en la respuesta de acidez asta siendoexplicada en un 970978
por al modelo (Ver anexo H)
EI tratamiento con avena mostro elsiguiente modeloj a1 analisis de regresion
AcidezConAvena = 0491638 + 00406572Oia - OQOO982559OiaA2
La variabilidad enla respuesta acidez esta siendo explicadaen un 99212 por
el modelo (Ver anexo J)
53
I ~
37 Prueba de viabiJidad
A continuaci6n sa muestran las Tab~as 13 y 14 donde sa presentan los datos
recopilados del recuento de Lactobacilos durante los dias 7 14 Y 21 para las
bebidas lacteas con y sin prebi6tico
TABLA 13 Recuento de Lactobacilos (UFCml) yogurt sin avena
Dia Repetici6n 1 Repetici6n 2 Repeticion 3 Reptttici6n 4
7 1880X10l1 1454X1011 1642X1011 1780X10~
14 1560X10~ 646X1011J 1890X10l 140X10l1
21 1200x10lu 128Ox10u 1745x10J 1520x101V
TABLA 14 Recuento de Lactobacilos (UFCml) yogurt con avena
Dfa Repetieion 1 Repetici6n 2 Repeticion 3 Repeticf6n 4
7 1600X10lt 1240X10t 1640X10ll 1980X10t
14 540X1011 427X10n 546X10n 720X10ll
21 500x1011 492x1011 712)(1011 980x10~
AI analizar la Figura 11 sa puede observar un recuento mayor de Lactobacilos
en al tratamiento con avena resultado de acuerdo a 10 encontrado por Alander at
aI 1999 Kontula et aI 1998 y Jaskari et aI 1998
54
Figura 11 Comparaci6n de medias para Log Lactobacillus
Comparacion de medias para log Lactobacillus
~ 1350
-+- Sac Sin--() 13 co avenaIII
bull 125 -- Bac con 0)
0 12 avenaJ
115 7 14 21
Dias
Aplicando la prueba t para comparar las medias de recuento de Lactobacillus no
se encontr6 una diferenc1a estadfsUcamente significative entre los dos
tratamientos (Ver tabla 15)
Este aumento en al racuento influy6 en la disminuci6n del pH y en el aumento de
fa aeidez por la fermentacion que realizan los Lactobacillus sobre fa lactosa de la
lache y la avena adicionada como prebi6tico
55
1
TABLA 15 Comparaci6n medias lag Lactobacillus
DIAS SIN AVENA CON AVENA tc p(VALOR)
7 122257 122022 04846 06451
14 121065 132393 -19602 00977
21 129025 133087 -08236 04416
At aplicar regresion a los datos se obtiane al modelo astimado
LactobacillusSinAvena= 117347 + 004834640Ia
La variabilidad en la respuesta del recuento de LactobaCillus ssta siendo
explicada en un 260054 por el mod$loVar anexo J)
EI tratamiento con avena mostr6 al siguiente modalo al anal isis de regresion
Lactobacillu$ConAvena =118103 + 007903040Ias
La variabilidad en la respuesta de recuento esta siendo explicada en un 3068
por al modelo(Ver anexo K)~
38 Analisi$ microbiol6gicos de las bebidas lacteas con y sin
En la Tabla 16 estan recopilados los resultados microbiol6gieos obtenidos en ras
muestras con los dos tratamientos (con y sin avena)
I [
sa
TABLA 16 Resultados analisis microbiologico
Recuento de mohos y levaduras Iml lt10
Recuento de Staphylococcus coagulase positiva Iml lt100
NMP coliformes fotales y Escherichia coli Iml lt3
Presencia de Salmonella25ml Ausente
Los resultados de este analisis demuestran que las bebidas fermentadas con y
sin avena~ astan fibres de microorganismos patogenos
57
1
4 CONCLUSIONES
Se aislaron cepas nativas de Lactobacillus plantarum de las muestras vegetates
de repollo pepino repollitas de bruselas fermentadas y Lactobacillus brevis de
lache fermentada y mucosa vaginal humana Ambas cepas resistieran un pH=2 y
una concentraci6n de sales biliares det 03 ptv dos earacteristicas importantes
en los probi6ticos
Lamiddot cepa de Lactobacillus brevis aislada de lache Sa utiliz6 para elaborar una
bebida fermentada sin y con avana comoingrediente prebiotico obteniendose un
aJimento centon recuento del probi6tico viable durante 21 dras de seguimiento
ademas libre de microorganismos )at6gen05
No se encontr6 efecta significativo de la avena sobre Ie viabilidad del Lactobacillus
brevis aunque sa presento un aumento en 61 recuento de estos en la bebida con
avena
58
plusmn ~
5 RECOMENDACIONES
Ensayar la cepa de Lactobacillus plantartJm en productos carnicos madurados
como el salami
Ensayar la cepa de Lactobacillus l)revs en otros derivados lecteos como queso
quesito queso crema
Continuar con el estudio de estos microorganismos y caracterizarlos
molecularmente ademas de estudiar su capacidad de adherencja a fa mucosa
intestinal sobre algunes Hneas celulares como las CaCo~2
Estudiarel efedo de la avena sabre la viabiJidad del Lactobacillus breyis a una
concentraci6n mayor de 05
Realizer ensayos can las cepas de Lactobacillus brevis y Lactobrlcillus pJantarum
para elaborar masas acidas para panificacion reemplazando el Bromato de
Potasio aditivo prohibido desde marzo del 2003 en nuestro pais per 5U toxicidad
59
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65
ANEXOS
66
ANEXO A RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AlSLADA DE i
PEPINO it
Referencia Pepino 1 Fecha 06122002
IEXCELENTE IDENTIFICACION
Latto plantarum 1
Galeria API 50 CHL V50 Leida el 06122002
Perfil - -- - ++ - -- - ++++ - - -+- + - I I I I I I I I +t+ - +f- ~ - - + + ~ - - - +- + - shy
o - GLY - ERY DARA - LARA + RIB + DXYL - LXYL - ADO - MDX - GAL + GLU + FRU + MNE + SBE - RHA - DUL - INO bull MAN + SOR - MDM + MUG shyNAG + AMY + ARB + ESC + SAL + CEL + MAL + LAC + MEL + SAC + TRE + 1NU - MLZ + RAF + AMD - GLYG - XLT - GEN + TIJR + LYX - TAG - DFUC shyLFUC - DARL + LARL - aNT + 2KG - 5KG shy
--- Taxones significativos rd -----T -- Tests en contra
Lactoplantarum 1 999 092 1
Taxon siguiente Lactobrevis 1 OJ 044 3
i i
Lactoplantarum 1 1 test (5) en contra
D-SORBITOL (SOR) 78
Tax6n siguiente Lactobrevis 1 3 test (s) ert contra
METHYLD-MANNOSIDE (MOlM) 0 MELEZITOSE (MLZ) 14 D-TURANOSE (TUR) 14
67
ampb
ANEXO B RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AISLADA DE REPOLLO FERMENTADO
~
Referencia Repollo fermentado - 3 Fecha 03072003
EXCELENTE IDENTIFICACION
Lactoplantarum 1
Galena API 50 CRL V50 Leida el 03072003
Perfil - - ++ - - - - -H++ - - ~ + - + - I I 1 I I I I -H+ - ++ - - - + + - -- - - + - shy
o - GLY - ERY - DARA - LARA + RIB + DXYL - LXYL - ADO ~ MDX - GAL + GLU + FRU + MNE + SBE ~ RHA - DUL - INO - MAN + SOR - MDM + MDG shyNAG + AMY + ARR + ESC + SAT + CRL + MAL + LAC + MEL + SAC + TRE + lNU - MLZ + RAF + AMI) - GLYG - XLT - GEN + TOR + LYX - TAG - DFUC shyLFUC - DARL - LARL - GNT + 2KG - 5KG shy
------Taxones significativos _ _----- Id--- ---T---- Tests en contra
Lactoplantarum 1 999 095 1
Tax6n siguiente Lactobrevis 1 01 OA8 3
lJactoplantaru01 1 1 test (s) en contra
DSORBITOL (SOR) 78
Taxon siguiente Lactobrevis
METHYL-D-MANNOSIDE D-TURANOSE
1
(MOM) (TOR)
3 test (5) en contra
0 MELEZITOSE 14
(MLZ) 14
i
I
68
ANEXO C RESULTADO PRUEBAS BIOQUWICAS DE CEPA AISLADA DE MUCOSA HUMANA
Referenda Mucosa - 5 Fecha 27012003
BUENA IDENTlFICACION
Galeria API 50 CHL vso Leida el 270112003
Perfil - - - - +t--t - - - + - + - - - - - - - - -+- - - - - + - + - - - - - - - - - - - - - bull - - -+ - +
o - GLY ~ ERY - DARA bull LARA + RID + DXYL + LXYL - ADO bull MDX - GAL + OLU - FRU + MNE - SBE - IlliA - DUL - INa - MAN - SOR - MDM - MOO shyNAG + AMY - ARB - ESC ~ SAL bull CEL - MAL + lAC - MEL + SAC - TRE shyINU - MLZ - RAF - AMD - GLYG - XLT - GEN - 11JR - LYX - TAG - DFUC shyLFUC - DARL - IARL - ONT + 2KO - 5KG +
- - - - - - Taxones significativos - - - - - - - Id T -- Test en contra
Lactobrevis 3 963 088 1
Taxon siguiente Lactoco11inoides 36 075 2
Lactobrevis 3 1 test (s) en contra
GLUCOSE (GLU) 95
-~~~------------~---------------------------~--~-------~--~-----~----------~--------~------------~~--Taxon siguiente Lactocollinoides 2 test (s) en contra
GLUCOSE (GLU) 100 MELIBIOSE (MEL) 25
69
i r
ANEXO D RESULTADO PRUEBAS BIOQIJiMICAS DE CEPA AISLADA DE LECHE FERMENTADA
Referenda Leche fennentada ~ 13 Fecha 27012003
BUENA IDENTIFICACI6N
Galeria API 50 CHL V50 Leida el 270112003
Perfil - - - - -t-t+- - - - + - + - - - bull - - - - -+- - - - - + - + - - - - - - - - - - - - - - - - -+ - +
0 - GLY - ERY - DARA - LARA +Rll3 + DXYL + LXYL - ADO - MDX ~GAL + GLU - FRU + MNE SBE - RHA DUL bull INO MAN - SOR MDM bull MDG shy
~NAG + AMY - ARB - ESC - SAL - CEL - MAL + LAC - MEL + SAC - TRE I lNU - MLZ - RAF - AMD - GLYG - XLT - OEN - IUR LYX - TAG - DFUC bull i
LFUC - DARL - LARL -ONr + 2KG - SKO + 1
- -- - - Taxones significativos - - Id -- T --- Test en contra
Lacta brevis 3 963 088 1
Taxon siguiente Lactocollinoides 36 075 2
Lactobrevis 3 1 test (s) en contra
GLUCOSE (GLU) 95
-----------------------------------------------------------~------------------------------~-------------------Taxon siguiente Lactocollinoides 2 test (s) en contra
GLUCOSE (GLD) 100 MELffiIOSE (MEL) 25
70
II iJ1
I
I ANEXO E RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AISLADA DE REPOLLITAS DE BRUSELAS FERMENTADA
Referencia repollitas de bruselas 15 Fecha 03072003
EXCELENTE IDENTIFICACION
Lactoplantarum 1
Galeria API 50 CHL vsO Leida el 03072003
Perfil - - - - +t - - - - +H+ - +- - +t + - I I I I I I I f ++t - + - - - -+ + - - - -+ -+ - - I ij
o - GLY - ERY - DARA - LARA + RJB + DXYL - LXYL - ADO - MDX - GAL +
GLU + FRU + MNE + SBE RHA + DUL - INO - MAN + SOR + MDM + MOG shyNAG + AMY + ARB + ESC + SAL + eEL + MAL + LAC + MEl + SAC + TRE + i
I1NU - MLZ + RAF AMD GLYG - XLT - aEN + TUR + LYX - TAG - Druc LFUC - DARt + LARL - aNT + 2KG - 5KG shy n ----Taxones significativos ------ Id Tests en contra
Lactoplantarum 1 999 090 o
Taxon siguiente Lacto pentosus 01 012 7
Lactoplantarum 1 o test (s) en contra
Taxon siguiente Lacto pentosus 7 test (8) en contra
GLYCEROL (GLY) 75 D-XYLOSE (DXYL) 100 L-RHAMNOSE (RHA) 25 METHYL-D-MANNOSIDE (MOM) 1 MELEZITOSE (MLZ) 25 RAFFINOSE (RAF) 75 D-ARABITOL (DARL) 0
71
~
I i I
ANEXO F - ANALISIS DE REGRESION PARA pH EN BEBIDA SIN AVENA
Aruilisis de regresi6n polinomial
---~-~-------------------------------------------~-----------~~---------------------~--------------Variable dependiente pHSinAvena ---------------------------~-------------~--------------------~---------------------------------
Error T Parametro Estimado Estandar Estadistico P-Valor
CONSTANTE 535606 0094535 56657 00000 Dia -0150565 0020706 727154 00000 Dia2 000504434 0000871488 578819 00001
---~---------------------------------------------------------------------------------------------------
Anfllisis de Variama -------------------------------------------~-----------~-----------------------------~-~--- jSource Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor 11
------------------------~------------------------------------------------------------------------------~ Mod-elo 155772 2 0118861 4256 00000 Residual 0237877 13 00182983
Total (Corr) 11956 IS
R2 == 867522 percent
pHSinAvena == 535606 - 0150565Dia + 000504434Dia2
72
____
middot ANEXO G - ANALISIS DE REGRESION PARA pH EN BEBIDA CON AVENA
AmUisis de regresion polinomial _____~_____~__-_____~___4____________________bull____bull__________bull_____________~~----_------___________
Variable depcndiente pHConA vena ------------------------------------------------------------------------------------------~--------
Error T Parametro Estimado StAndar Estadfstico P-Valor
---------------------------------------------~-----------------------------------------------_---------CONSTANTE 534463 00801045 667208 00000 Dia -0140407 00175453 800253 00000 DiaA 2 000448098 0000738458 606803 00000
----------------------~---~-----------------------------~------------------------------~----AmUisis de Varianza
---~---------------------------------~---------------------~------------~-------------------~------Source Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio PValor --------------------------~-----------------------------------------------~------------~-----~~--~ ModeJo 159575 2 0797873 6073 00000 Residual 02170798 middot13 00131383 _______~_~ ~_~----------~------~--~-----~-M-----~-----____ _____________~-----------------------Total (COlT) 176654 15
R12 903315 percent
-----------~------------------------------------------------------------------------~-----------pHConAvena 534463 - 0140407Dia + 000448098DfaA 2
73
ANEXO H - ANALTSIS DE REGRESTON PARA ACIDEZ EN BEBJDA SIN AVENA
An8Jisis de Regtesi6fi P6lifJomial
Variable Depefidiefile~ AcidezSinAVenll _______________w_____~______~________________~-----------_________~_________________~~____~___~_____
Error T Pariirnetro Estimado Estandar Estadistico ---------------------------------------~--------------~-~-------~--------------------~------------CONSTANT 0491697 00123217 399051 00000 Dia 00436032 000269882 161564 00000 D1a2 -000144613 000011359 127312 00000 __w___~________________________~-_______-_____~----____________________________~__~---~_--__~___
AriiiJisis de varianza ~_~__~__________~_~____~________~___________- _________e_____________________________bull _____-________
Source Smn de cuadr Df Mean Square F-Ratio PmiddotValor_~~___________________________________bull ______~___________bull ____________bull ______~________w________________
Model 0135203 2 00676013 21747 00000 Residual 000404118 13 000031086
Total (Corr) 0139244 15
R2 970978 percent
AcidezSlnAvena 0491697 + O0436032Dia - 0OOl44613Dia2
74
I
ANEXO I ANALISIS DE REGRESION PARA ACIDEZ EN BEBIDA CON AVENA
1
Anwisis de tegtesi6fi polinomial
Variable dependiente Acidez Con Avena
Error T ParametTo Estimado Stlindar Estadfstico P-Valor ----------------~-------~---------------------~-----------------------------------------------------CONSTANT 0491639 000926607 530578 00000 Diamiddot 00406572 000202955 200326 00000 DfaA 2 0000982559 0000085421 -115025 00000
-------------~----------------------------~-------------------------~-----------------------------------
-------------~-----~~-----------------------------~---------------------------------------------_--Source Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio PValor
-~-------------~----------------------------------~------------------~~-------------------------- Modelo 0288008 2 0144004 81914 00000 Residual 000228539 13 0000175799
----------~~--------------~---------------------------------------------~---------------------------Total (Corr) 0290294 15
RA2 = 992127 percent
-------------------------~----~---~------------~---------------------------------~---------------~
AcidezConAvena == 049163amp + 00406572D1a - 0000982559DiaA2
75
I
(Ilmiddot il
ANEXO J- ANALISIS DE REGRESION PARA RECUENTO LACTOBACILOS PARA BEBIDA SIN AVENA
Amilisis de regresion - Modelo lineal Y = a + bX
------------------------~----------------------~-----------------------------~----------~-----------Variable Dcpendiente LactobacilJusSinAvena Variable independiente Dia
I--------~----------~-----------------------------------~-------~-~--~--------------------------~-Error T
Paramctro Estimado Standard Stadistico P-Valor
----~----~------------~-----~-----------------------~-------------~-----------------------------Intereepto 117347 0389973 300911 00000 Pendiente 00483464 00257889 18747 00903
Analisis de Varianza
---------~------------------~----------------~---------------------------------~---------~----------Source Sum decuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor
------------~---------------------~---------------------~--------------------------------~-----~----Modelo 0916252 1 244835 443 00616 Residual 260706 10 0260706
--~------------~---~------------------~~~-----~-------~---------~~-------------------------------------Total (Corr)352332 11
Coeficiente Correlaci6n = 0509955 R2 = 260054 percent
LactobacillusSinAvena= 117347 + 00483464Dfa
76
ANEXO K- ANALTSIS DE REGRESION PARA RECUENTO LACTOBACILOS PARA DEBIDA CON AVENA
Aruilisis de regresion - Modelo lineal Y = a + hX
Variable Dependiente LactobacillusConAvena Variable Independiente Dia ---~--------------------------------------------------------__-----------__--_--_-----------shy
Error T Paramctro Estimado Standard Estadistico P-Valor -~--------------------------------------------------------------------------------------------------
Irttercepto 118103 0567963 207942 00000 Pendiente 00790304 00375594 210414 00616
-----------------~----------------------------~----~-------~----~----------------------------
Analisis de Varianza
----------------~----------------~------------------~--------------------------~------~--------shySource Swn de cuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor
-----------------~--~--------------------------------------------------------------------------~---~ Mode10 244835 1 244835 443 00616 Residual 552997 10 0552997
Total (Corr)797832 11
Coeficiente Correlacion = 0553964 RI2 = 306875 percent
-----~--------------------------------------------------------~--------------------------------------
LactobacillusConAvena = 118103 + 00790304Dfas
77
J
viajero y 1(3 inflarnacion intestinal que en ultima instaneia oeasionan ef sfndrome
del colon irritable (Marteu et al 2001)
1153 Protegen contra infecciones del tracto urogenital
La vaginitis indueida por baeteriss yo por levaduras as una infecci6n
estrechamente relacionada con la exposici6n a antibi6ticos y espermicidas y
tambien depende del estado hormonal de la n1ujar Con al uso de mezcJas de
probi6ticos se han obtenido buenos resultados en la rastauraci6n de la rnicrobiota
natural urogenital benefica que desplaza a los eausantes de la inflamaci6n de Is
vagina y Ie uretra (Reid 2001 )
1154 Promueven la barrera de defensa end6gena del intestino
EI tracto gastrointestinal normal mente as una barrera natural contra anUgenos de
origen microbiano y alimentario Cuando los probi6ticos sa adhieren a Is mucosa
intestinal estimulan 0 potencian al sistema inmune favoreciendo la
inmunomodulaci6n que induce un aumentb de fa producci6n de inmunoglobulinas
activacion de las calulas mononueleares y de los linfocitos para proteger al
huesped de infeeciones (Isoulari et sl 2001)
20
1155 Protegen contra cancer de colon
EI cancer es el resultado de una serie de mutaciones somaticas que pueden
ocurrir durante al tiempo de vida del individuo y 10 padeca buena parte de la
poblacion mundial los probi6ticos en un sistema in vitro han demostrado un
efecto positivo en la prevenci6n de mutaciones aI desactivar carcin6genos
genotoxicos (Wolloswski et al J 2001)
1156 Protegen contra infecciones respiratorias
Sa ha demostrado que el conslJlno de probi6ticos disrninuye la incidencia de
infecqiones raspiretorias al aumentar la actividad fagocitica de maer6fagos
alveolares que aettian sobre microorganismos patogenos Se hizo un estudio en
571 ninos sanos con edades entre uno y seis anos divididos en dos grupos a uno
de ellos sa las incluy6 en su dieta leche suplementada can Lactobacillus GG y a
los otros ninos leche no suplementada AI final del estudio se observ6 una
disminucion del 19 en la incidencia de infeccionas respiratorias tratadas con
antibi6ticos tales como otitis media sinusitis bronquitis y neumonfas en el grupo
de los ninos que consumieron Lactobacillus GG (Hatakka et al 2001)
Alvarez et al (2001) encontraron que la administraci6n de yogurt con Lactobacillus
casei en ratones de tres arios de edad majora los espacios libres del puJrn6n de
la presencia de Pseudomona aeruginos8 induciendo un aumento
21
significativo en los niveles de gA a IgM datactadas en los lavados
broncoaJveolares y se observ~ un afecta dependiente de la dosis
1157 En el tratamientoy prevenci6n del eczema
Se ha encontrado que el consumo de probi6ticos mejora la inflamaci6n alergica 0
eczema at6pico en ninos alimentados con formula suplementada con probi6ticos
Encontraron una mejora significativa al suministrar Bifidobacteriummiddot actis y
Lactobacillus GG en 27 niiios con edad promedio de 46 meses Luego de aplicar
este tratamiento se sometieron a una prueha de SCORAD (mide fa extension y
gravedad del eczema) registrando una meJoria significatlva en las condiciones de
la pie concentraci6n de citoquinas cirClllantes an sueto y moleculas de adhesi6n
a las superficies de las celulas soJubles en suero (Isolari 2000)
Se realizaron otros estudios a 159 mujeres embarazadas con historia familiar de
eczema atopico de primer grado a las cuafes sa res 5uministro dosis diarias de
Lactobacillus GG durante 2 a 4 samanas previas al parto Oespues de ella fa
madres twiaron la opci6n de continuer tomando el ptobi6tico si amamantaban 0
bien darseio vIa oral La mayoria de las madras eJigieron dar las dosis at bebe
diariamente A los dos anos de vida se observ6 una disminuci6n del 50 en la
frecuencia del eczema at6pico en aquellos nHies que se les dio ef probi6tico
(Kalliomari etal 2001)
22
1158 Previenen infeccion en heridas quirurgicas
Los probi6ticos impiden la union de pat6genos a las superficies celulares en
heridas mediante la seCreci6n de proteinas Actuamente se encuentra en
estudio la aplicaci6n del Lactobacillus fermentum vivos sabre heridas en piel de
ratas y se ha encontrado una disminuci6n del 90 en la colonizaci6n par parte del
StaphylococcuS aureus uno de los patogenos mas temidos y de mayor lncidencia
en infecciones hospital arias mas aun se esta contempiando la posibilidad de
utilizar la protein a purificada an lugar de los mjcroorganismos para la protaccion
contra infecciones en heridas (Strauss 2000)
12 PREBIOTICOS
Son carbohidratos de cadena corta algunas veces reconocidQs como
oligosacaridos no digeribles par las enzimas del epitelio intestinal 0 de las
gliJnduJas anexas debido a su estructura quimica y de esta manera lIegan al
intestino grueso donde alcanzan a estar disponibles para la fermentaci6n por las
bacierias sacaroHticas que son especial mente laetobadlos y bifidobacterias
dando odgen a compuestos que ejercen efectos funcionales sobre la mucosa del
tubo digestivo (Brunser 2001)
Se consideran como tal algunos fructocligosacaridos isomaltooligosacariclos
oligomato palatinosa poHdextrosa pOJidextrrna raftilina y algunos oligosacaridos
23
)
de 1a soya y fa avena Estenmiddot presentes en alimentos como Ie cebolla ajo
banano puerros 1 derivados del trigo achicoria esparrago alcachofa (Cummings
etal 2001)
Algunos de estos prebi6ticos cuanda son incorporado$ a fa dieta en cantidades
dalerminadas alteran la microbiota intestinal disminuyendo los recuentos de
coliformes bacteroides y cocos y aumentando las bifidobacterias hasta en diez
veces ademas modifican la actividad metab6lica del coron logrando una
disminuci6n del pH y un incremento en el contenido fecal de acidos grasos de
cadena corta como at acatica propi6nico y butfrico El butirato aumen~ _I grosor
de la pared del coron e intestino delgado estimula eJ crecimiento de la mucosa del
colon y auManta su flujo sangufneo inhibe el crecimiento de tinsas tumorales
epiteliales de origen co16nico induce la diferenciaci6n de sus celulas y a
apoptosis entre otros(Brunsar 2001)
Eh estudios hechos en simuladores del intestino humano utilizando productos de
avena fermentados se encontro que estimularon al crecimiento tanto de
lactobacios como de bifidobacterias y en el caso de estas ultimas se incremento
la producci6n de los acidos acatico propionico y butfrico 10 que incide sobre la
implantacion de probi6tico$ e inhibe al crecimientos de otro tipo de
microorganismos (Alal1der eta1999 Kontula etal 1998 Jaskari etal 1998)
24
~ -1
(
AI comparar el comportamianto de las leches de diferente origen se ha
demostrado que Ie leche de vaca contiene caseinatos sustancias que forman
buffer ~n et intestino e inlpiden que los probi6ticos disminlJyen el pH del intestina
y de esta manera se impide al efecto deseado que es evitar fa proliferaci6n de
otros microorganismos entre los cuates pueden estar algunos patOganos En la
leche materna sa encuentran algunos carbohidratos como glucosa galactosa n
acetilglucosamina y algunos 0lig6meros de Ie fucosa en cOhoontracionesmiddot
importantes los cualeS favoreceh el crecimientc)middot de probi6ticos esto
complementado can 91 bajo contenido de protenas que se traduce en una
reducida capacidad buffer hacen de Ie lache materna IJn alimentd adecuado para
nllios en su etape de lactancia
Algunos prebi6ticos como 1a lactulosa yciertos compuestos que contiansn fructosa
no son digeridos en el intestino humano y pueden sar utilizados selectivamenta
par los probi6ticos 10 que hace que los probi6ticos en combinaci6n can prebi6ticos
pueden lIegar a ser un importante medio para prevenir algunas enfermedades del
tracto gastrointestinal (Bezkorovainy 2001)
25
2 METODOlOGfA
21 LOCALIZACION
EJ trabajo sa realizo en el laboratorio de Microbiologia y la planta da laches de Ja
Universidad Naclonal de Colombia- Secie Medellin
En al laboratorio se hiZQ al aislamiento a identificaci6n de fa capas y en fa Planta
sa eJaboro la leche fermentada con 1a cepa seleccionada y el prebi6trco
22 METODOS
221 Aisiamiento de cepas nativas
Las cepas nativas se sislaran de producto$ vegetales leches fermentadas y
mucosa vaginal humana
2211 De vegetales
Las muestras vegetales de repollo repollitas de brusefas y pepino se
seleccionaron porcionaron y mezclaron can cloruro de sadio al 10 pIp se
calacaron en un recipienta de vidrio balo anaerobiosis y sa dejarQn por 15 dias
26
luego S9 tomaron 3 ml de cada muestra y se jnocularon 9 ml de caldo MRS (Man
Rogosa and Sharpe) se incubaron a 37deg C durante cinco dias en camara de
anaerobiosis (Ver Figura 1) Oespues de este tiempo sa inocularon cajas de petri
con agar MRS con 1 ml del cultivo microbiano y se incubaron bajo las mismas
condiciones que eJ caldo Este procedirniento se realiz6 rapetidas veces hasta
seleccionar la cepa pura mediante observaci6n de caracteristicas morfologicas de
la cOlonia y a cada colonia se Ie practico la coloracion de gram con el fin de
observar las caracteristicas microscopicas de cada una e identificar las de mayor
similitud a los Lactobacilos y Bifidobacterias
Figura 1 Camara de anaerobiosis
27
2212 De la leche
Sa tomo 200 ml de teche cruda de la planta de leches y se colaca a fermentar
baja anaerobiosis durante 15 dras Luego sa procedia como en los vegetales
2213 De mucosa vaginal humana
Se tomo una muestra de frotis de mucosa vaginal humane can capito esteril sa
puso a ncubar en Caldo MRS y se procedi6 camo en 2211 y 2212 A cads
aislado sa Ie practico la coloracion de gram y sa seleccionaron aquellas que eran
bacilos gram positivos (Ver Tabla 2)
28
TABLA 2 Fuente de aislarniento de cepas nativas
CEPA FUENTE
1 Pepino fermentadQ
2 repollitas de bruselas fermentadas
3 Repolltgt fermentado
4 Repollo fermentado
5 Mucosa va~inal humana
6 Mucosa vaginal humana
7 repollitas de bruselas fermentadas
8 Repollo fermentado
9 repollitas de bruselas fermentadas
10 Mueo~a vaginal humana
11 Repollo fermentado
12 RepolJo fermentado
13 Leche fermentada
14 Mucosa vaginal humana
15 repollitas de bruselas fermentadas
16 Repollb fermentado
29
222 Almacenamiento de las cepas aisladas
Cuando las cepas crecieron en agar MRS homogEmeas en color morfologia
coloraci6n de Gram etc se pssaron a agar inclinado en tuba se cubrieron con
aceite mineral y se guardaran en refrigeraci6n a 4deg C para tomar de alii la cepa y
efectuarle las diferentes pruebas para confirmar el genera y determinar la especie
de cada una de eas (Ver Figura 2)
Figura 2 Cepas en tubos con agar inclinado
30
223 Pruebas para determinar et genero
2231 Coforaci6n de Gram
A cada cepa sospechosa de Lactobacilos se 1e hizo la coloraci6n de gram y se
seleccionaron las gram positivas
2232 Morfologfa
En agar MRS y despues de incubar en anaerobios~s crecian colonias grandes
cremosas de color beige con bordes homogeneos y c6ncavas(Ver Figura 3)
Figura 3 Colonias aisladas en agar MRS
31
2233 Prueba de esporulaci6n
A cada cepa aislada se Ie hizo esta prueba la cuel consistia en incubar en
aerobiosis durante ocho dias las cajas de agar MRS donde crecieron colonias de
Lactobacilo$ y luego se les (ealize) coloraci6n de espora Las capas que dieron
negativa a la prueba de espora se considararort sospechosas de sar Lactobacilos
y se continuo con la prueba de la catalasa (Ver Tabla 3)
2234 Prueba de la catalasa
los lactobacilos carecen de catalasa Eata prueba se hizo tomando una colonis
se deposito en vidrio de reloj y se Ie adicion6 dos gotas de peroxida de hidr6geno
(H202) la que no presentaba efervescencie eran cepe sospechosa de ser
Lactobacilo (Ver Tabla 4
Sa seleccionaron las capas euyo resultado fue aeorde con el genera Lactobacilfu$
y se continuo con la comirmaeion del genera y determinacion de la eSpecie
meqiante las pruebas bioqulmicas
32
224 Prueba para determlnar la especie
Para confirmar el genero y determinar la especie de las diferentes capas aisladas
se hizo una caracterizaci6n bioqufmica utilizando un kit de API 50 CHL Medium
Ref 50 410 que contiene una galed8 de medios que permite realizar el estudio
de fermentaci6n de los 49 azucares de 52 especies de Lactobacillus (Ver Figura 4
y tabla 5)
Figura 4 API CHL 50-Prueba bioquimica
33
225 Pruebas para determinar microorganismos probi6ticos
2251 Resistencia a pH=2 y sales biliares de concentraci6n O3pv
A las cepas idantificades como Lactobacillus brevis y Lactobacillus pantarum sa
las realiz6 Ie prueba dfl resistencia a pH=2 y sales biliares de concentraci6n 03
pv ( Jacobsen et al 1999) Una colonia de cada cepe aislada se inocul6 en 4 mt
de caldo MRS durante cinco dras bajo condiciones de anaerobiosis Oespues de
esta tiempo se dejaron pracipltar los microorganismos por sedimentaci6n se Ie
retire el sobrenadante y al precipitado se Ie adicion6 Sml de caldo MRS
previamente ajustado a pH=2 can seido clorhfdrico (HCI) dentro del mismo tuba de
ensayo G igual sa hizo can otro tubo previamente incubado pero a este se Ie
adiciono 5ml de caldo MRS con sales biliares a una concentra~i6n de 03 plv y
ambos se incuberon a 37deg C por 2 haras Sa midio 01 mi de cada uno de los
tubas al tiempo 0 y a las 2 horas y sa inoculeron en superficie en caJas de petri
con agar MRS S9 incubaron a 37deg C bajo anaerobiosis durante 48 horas Se
compararon visualrrente en cada caja de petri el crecimiento en superficie y las
que presentaron crecimiento en tos dos tiempos (0 y 2 horas) tanto en at media
acido como en sales I se consideraron resistentes a pH=2 y sales biliares (03
pv)
(Ver Tabla 6)
34
226 Conservacion
Todas fas capas que habian dado positiva Jas pruebas anteriores y que reaultaron
resistentes a pH=2 y sales biliares 03 pv y despues de identificadas en API 50
CHL sa repicaron en agar MRS en tuba inclinado y despues de Incubar a 37deg C
por 48 horas bajo anaerobiosis se Ctlbrie el biser completamente can aceite
mineral esteril y sa guardaron en refrigeraci6n
227 Elaboracj6n de fa bebida fermentada
2271 Preparaci6n de la mue$tra
Sa tome 1 mt de caldo MRS previamante inoculado e incubado que presentaba
una concentracion de Lactobacillus brevis de 27x108 Iml segun la escaJa de Mac
Farlan y sa adiciono a 9ml de leche pasteurizada en un tubo sa dej6 incubanda
en anaerobiosis por 48 hores Luego se pasaron estos 10 ml a un frasco qua
cont~nie 90 ml de leche pasterizada y se dej6 incubando par 48 haras en
anaerobiosis
35
2272 Adici6n del inOculo
A 900ml de leche pasteurizada se Ie adicion61os 100 ml de leche que habia sido
previamente ino(ulada dos veces con la cepa posteriormente se deja
fermantando la lache a temperatura de 37deg C
2273 Control de Ja fermentaci6n
Las muestras se hicieron por cuadruplicado y se les hizo un seguimiento de
aoidez hasta un valor entre 04 y 05 expresada como Bcido lactico esta
procedimiento corresponde a la babida fermentada sin prebi6tico La bebida ~on
prebi6tico tiene al mismo proeedirnianto pero adicionalmente se agrag6 avena a
una concentraci6n de 05 en el momento de la adici6n del in6e410 a los 900 ml
de leehe pasteurlzada y el procedimiento sigui6 igual al de la bebida sin prebi6tico
tambien se hizo por cuadruplicado
2274 Refrigeracl6n
Despues que las mezclas con y sin prebiotico alcanzaron el de acidez
requarido se IIeva ron a refrigeraci6n a una temperatura de 4deg C p~r 24 horas
para frenar proce~os metab6licos de los microorganisrtlos Despues de este
ti~mpo se procedi6 al batido
36
1 2275 Batido
Con un agitador se procedi6 a batir las bebidas para romper et coagulo formado
y de esta manera homogeneizar la mazela y obtener asf la bebida fermentada
2276 Envasado y almacenamiento
Ambas bebidas se envasaron en frascos vidrio para hacerles seguimiento de pH
acidez(expresado como acido tacticol y recuento de Lactobacillus breviSf los
dies 27 14 Y 21 despues de elaboradas las bebidas perfodo durante el cualta
muestra permanecfa afmacenada a temperatura de refrigeracion(Ver Figura 5
37
Fjgura 5 Diagrama de Flujo
PREPARACION DE LA MUESTRA
ADICION DEL INOCULO
~_____~_B~ATIDO~______~
INCUBACION 37deg C hasta acidez = 04-05 acido laotico
ENFRIAMIENTO
hasta 4 0 C ~------~ ~------~
ENVASADO Y ALMACENAMJENTO
dUrante 21 dfas a Temperatura 4 0 C
38
1
228 Determinaci6n del pH
Se determino por el metoda potenciometrico en un pH-metro manual durante los
dias 2) 7 14 Y 21 de las bebidas lacteas sin y con prebi6tica (Ver Tablas 7 y 8)
229 Oeterminaci6n de la acidez (Expresadfl como acido
lactica)
Se tomaron 9 mJ de las bebida~ sa Ie adicionaron 2 gotas de fanoftaleina como
indicador y sa titulo fa acidez con NaOH 01 N hasta la aparicion de un cotor rosado
debit EI volumen de NaOH utilizado se reporta como valor de de acidez
(VerTablas 10 y 11)
2210 Prueba de viabilidad
Qurante el perfoda de almacenamiento de la bebida lactea se procedi6 a hacer la
prueba de viabiHdad en los dias 7 14 Y 21 para determinar Si los lactobacilfus
permanecfan vivOs a una concentraci6n minima de 106 hasta el dia 21 como 10
establece eJ Articulo 10 de la Rasolucion 2310 del Ministerio de $alud de
Colombja
39
Para asta prueba se tamaron 10 rnl de muestra y se adicionaron a 90 ml de caldo
MRS ruego a partir de esta se hicieron diluciones de 10-2 hasta 10-11 de las
diluciones 109101deg 10-11 se inocul6 1 ml de cada uno en agar MRS siguiendo el
metodo de siembra en profundidad y por duplicado e incubando a 370 C x 5 dras
en anaerobiosis y luego se hicieron tos recuentos por duplicado para esi reportar
los recuentos promedio (Ver Tablas 13 y 14)
2211 AniUisls microbiol6glco de las bebidas Iicteas(con y sin
avena)
Con el fin de determinar las condiciones higienico-sanitarias del producto se
realizaron las pruebas microbiol6gicas de Recuento de mohos y fevadurasml en
agar OGY Recuento en superficia de Staphylococcus coagulasa positivoml en
agar Baird Parker Numero Mas Probable (NMP) de coUfor-mes totales y
Escherichia coliml en caldo Fluorocult y Presencia de Salmonela25ml con BHI
caldo tetrationato y agar Hecktoen (Montoya 1999)
(Var tabla 16)
2212 AnaUsis estadistico
A los datos obtenidos en la medici6n de pH acidez (expresada como Beido
laclico) en los dras 2714 Y 21 y el recuento de Lactobacillus en los dras 714 y21
40
realizados a los dos tratamlentos se tes aplic6 1a prueba t porque solo difieren
en la presencia 0 ausencia del prebi6tico para evaluar si habra diferencia
estadfsticamente significativa para los dos tratamientbs(Ver Tablas9 12 y 15)
41
3 RESULTADOS Y DISCUSION
31 Coloraci6n de Gram y morfologfa
Las cepas aisladas fesultaron Gram positivas (Ver Figura 6) colonias grandes
cremosas dE) color beige con bordes homogeneos y c6ncavos en su
morfologia (Ver Figura 3) resultando de acuerdo a 10 especificado en Stanley
1989 para Lactobacillus
32 Prueba de esporulaci6n y cataJasa
Los resultados de la pruebas de esporulaci6n y catalasa indicados en las
Tablas 3 y 4 respeclivamente dieron conforme a 10 especificado en Stanley
1989 para Lactobacillus
42
1
2 3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
TABLA 3 Resultado de prueba de esporuJaci6n
CEPA RESULfADO ESPORULACION
-- -------------
43
l i ~II bull ~ I I
TABLA 4 Resultado prueba de la catalasa
CEPA RESULTADO CATALASA
1 -2 -3 -4 -5 -6 -7 8 -9 -10 -11 12 -13 -14 -15 -16
3~3 Prueba para determinar la especie
Oespues de hacer las pruebas para seleccionar las cepas sospechosas de ser
Lactobacillus se realizo las pruebas bioquimicas fograndose identificar
Lactobacillus plantarum aislctdo de pepino repollo y repollitas de bruselas
44
fermentados y Lactobacillus brevis de mucosa vaginal y leche fermentada (Ver
Anexos del A al E y Tabla 5)
TABLA 5 Resultado identlficaci6n cepa~
CEPA NOMBRE
1 Lactobacillus planfarum
3 Lactobacillus plantarum
5 Lactobacillus brevis
13 Lactobacillus brevis
15 Lactobacillus plantarum
34 Pruebas para determinar microorganismos probi6ticos
las cepas de Lactobacillus brevis y Lactobacillus plantarum mostraron
rasistencia al medio acido de pH =2 Y sales biliares 03 pv resultado similar al
encontrado por Jacobsen et al 1999 para Lactobacillus plantarum (Ver tabla 6)
45
middot
~~~ttiI lltlmiddot~COX~dtJ ~xtc_~ 2 tr~ k-JlL~middot
-)~~TO DE lJIBUOTECUl rjRL]OTtCA twn GO1IU1
TABLA 6 Resultados a pruebas de resistencia a pH=2 y sales biliares 03 plv
CEPA RESISTENCIA pH=2 RESISTENCfA A SALES BIUARES ()3 pv
1 + +
2 + +
3 + +
4 + +
5 +
6 + +
7 + +
8 + +
9 + +
10 + +
11 + +
12 + +
13 + +
14 +1shy +M
15 + +
16 + +
+1 crecimiento debil
+ crecimiento abundante
46
Figura 6 Lactobacillus brevis Gram + aislado de leche fermentada
Ai observar en placa las celulas de lactobacilos despues de real1zar las pruebas
de resistenCia a la acidez y sales biliares se observo una tendencia a aglomerarse
posiblemente como un mecanismo de proteccion cOlitra estos medios que pueden
lIegar a ser adversos para elias (Ver figuras 7 y 8)
47
Figura 7 Lactobacillus brevis aislada de leche fermentada despu~s de la prueba de resistencia a pH=2
Figura 8 Lactobacillus brevis aislada de leche fermentada despues de la prueba de resistencie asales biUares 03 plv
fI
48
35 --Seguimiento del-pH-en-la-bebidaJacteacon y sin -prebi6tico
A continuacion se muestran las Tablas 7 y 8 donde sa registian los datos
recopilados de pHdurante 10$ dras Z 7 14 Y21 para las bebidas laaeas con ysin
prebi6tioo
TABLA 1 ResultadopH yogur sin avena
Dia Repetition 1 Repetici6n 2 Repeticion 3 Repetici6n 4
2 526 501 51 52
7 446 433 438 44
14 439 435 437 436
21 439 437 438 437
TABLA 8 -ResultadopHyogur con avena
Dia Repeticion 1 Repeticion2 Repeticion 3 - Repeticion 4
2 509 523 51 515
7 447 442 445 442
14 436 -438 439 437
21 432 433 435 434
Observando la Figura 9podamos ver que el pH en el -dfado$ para los dos
tratamientos as igual y empieza a descender rapidamente para estabilizarse a
partir del dra 7(Ver figura 9)
49
Figura 9 Comparacj6n de medias para -el pH
Comparaci6n de medias para pH
55 ~ 5 +----=gtIIIi-~i~~----=-r--it~ -- pH sin avena
a 45 1--~~~~=~~ 4 --- pH con
avena35 t-----r-- -------=------=--= ------- - ----
2 7 14 21
Dias
Aplicando la prueba t para comparar las medias de pH I S6 muestia una diferencia
altamants significativa en los dos tratamientos para el dia 21 (pltO05)
(Ver tabla 9)
TABLA 9 Compaiaci6n de medias para pH
DtAS SIN AVENA CON AVENA te p (VALOR)
2 514 514 0 10
7 439 444 -1 61 0159
14 437 I
438 -070 0510
21 438 433 528 00019 shy
- DiFERENCIA AlTAMENTE SIGNIFICATIVA
50
I
AI aplicar regrasi6n a los datos sa obtiene al modelo estimado
pHSinAyena =535606 - 01505650Ia +0005044340IaI2
La variabilidad en la respuesta de pH asta siendo explicada en un 8S7522 por
el modelo (Ver Anexo F)
EI tratamiento con avena mostro el siguiente modelo al analisis de ragresi6n
pHConAvena =534463 ~ 0140407Dia + 0004480980Ia2
La variabilidad an la respuesta de pH asta siendo explicada en un 903315 par
el nlodelo(Ver anexo G)
36 Seguimiento de la acidezmiddotmiddot expresada comomiddot de acido
lactico
A continuaci6n sa muestran las Tablas 10 y 11 donde sa registran los datos
tecopilados de acidezmiddotdurante los dias 27 14 Y 21 para las pebidas taetees con y
sin prebi6tico
TABLA 10 Resuttadode acidez (expresadocomo acido tactico) yogurt sin avena
CIA R~petici6n1 Repeticion2 Repetici6n 3 Repeticion 4
2 054 06 057 058
7 072 074 073 0]2
14 080 083 082 082
21 0]4 079 078 077
51
TABLA 11 Resultado de aCidez (expresado como acido Icktico) yogurt con avena
Dia Repetici6n 1 RepetiCi6n 2 Repetici6n 3 Repetici9n 4
2 059 055 058 057
7 071 073 072 072
14 089 087 088 086
21 092 091 090 091
Observando la Figura 10 se puede concluir que la acidez empieza a aumentar
hasta el dia 14 y luego trata de estabilizarse para los dos tratamientos
(Ver figura 10)
Figura 10 Comparaci6n de medias para la acidez
N G)
Comparacion de medias para acidez
1
2 0I 5 -+--=--------=-~~~= u
ltC
- Acidez sin avena
2 7 14
Dias
52
21
-it- Acidez con avena
Aplicando la prueba t para camparar las madias de acidez se muestra una
diferencia altarnante significativa en los dos tratamiantos para los dias 14 y 21
(pltO05)
(Var tabla 12)
TABLA 12Comparaci6n de medias para Acidez
DIASmiddot SIN AVENA CON AVENA te p(VALOR)
2 0572 0572 0 10
7 0727 0720 119 0278
14 0818 0875 -638 000070shy
21 077 091 -1212 i 0000019 shy
DIFERENCIA AL TAMENTE SlGNIFICATIVA
AI aplicar r~gresi6n a los datos se obtiene el modelo estimado
AcidezSlnAIena = 0491897 + O0436032Dia O00144613DfaA2
La variabilidad en la respuesta de acidez asta siendoexplicada en un 970978
por al modelo (Ver anexo H)
EI tratamiento con avena mostro elsiguiente modeloj a1 analisis de regresion
AcidezConAvena = 0491638 + 00406572Oia - OQOO982559OiaA2
La variabilidad enla respuesta acidez esta siendo explicadaen un 99212 por
el modelo (Ver anexo J)
53
I ~
37 Prueba de viabiJidad
A continuaci6n sa muestran las Tab~as 13 y 14 donde sa presentan los datos
recopilados del recuento de Lactobacilos durante los dias 7 14 Y 21 para las
bebidas lacteas con y sin prebi6tico
TABLA 13 Recuento de Lactobacilos (UFCml) yogurt sin avena
Dia Repetici6n 1 Repetici6n 2 Repeticion 3 Reptttici6n 4
7 1880X10l1 1454X1011 1642X1011 1780X10~
14 1560X10~ 646X1011J 1890X10l 140X10l1
21 1200x10lu 128Ox10u 1745x10J 1520x101V
TABLA 14 Recuento de Lactobacilos (UFCml) yogurt con avena
Dfa Repetieion 1 Repetici6n 2 Repeticion 3 Repeticf6n 4
7 1600X10lt 1240X10t 1640X10ll 1980X10t
14 540X1011 427X10n 546X10n 720X10ll
21 500x1011 492x1011 712)(1011 980x10~
AI analizar la Figura 11 sa puede observar un recuento mayor de Lactobacilos
en al tratamiento con avena resultado de acuerdo a 10 encontrado por Alander at
aI 1999 Kontula et aI 1998 y Jaskari et aI 1998
54
Figura 11 Comparaci6n de medias para Log Lactobacillus
Comparacion de medias para log Lactobacillus
~ 1350
-+- Sac Sin--() 13 co avenaIII
bull 125 -- Bac con 0)
0 12 avenaJ
115 7 14 21
Dias
Aplicando la prueba t para comparar las medias de recuento de Lactobacillus no
se encontr6 una diferenc1a estadfsUcamente significative entre los dos
tratamientos (Ver tabla 15)
Este aumento en al racuento influy6 en la disminuci6n del pH y en el aumento de
fa aeidez por la fermentacion que realizan los Lactobacillus sobre fa lactosa de la
lache y la avena adicionada como prebi6tico
55
1
TABLA 15 Comparaci6n medias lag Lactobacillus
DIAS SIN AVENA CON AVENA tc p(VALOR)
7 122257 122022 04846 06451
14 121065 132393 -19602 00977
21 129025 133087 -08236 04416
At aplicar regresion a los datos se obtiane al modelo astimado
LactobacillusSinAvena= 117347 + 004834640Ia
La variabilidad en la respuesta del recuento de LactobaCillus ssta siendo
explicada en un 260054 por el mod$loVar anexo J)
EI tratamiento con avena mostr6 al siguiente modalo al anal isis de regresion
Lactobacillu$ConAvena =118103 + 007903040Ias
La variabilidad en la respuesta de recuento esta siendo explicada en un 3068
por al modelo(Ver anexo K)~
38 Analisi$ microbiol6gicos de las bebidas lacteas con y sin
En la Tabla 16 estan recopilados los resultados microbiol6gieos obtenidos en ras
muestras con los dos tratamientos (con y sin avena)
I [
sa
TABLA 16 Resultados analisis microbiologico
Recuento de mohos y levaduras Iml lt10
Recuento de Staphylococcus coagulase positiva Iml lt100
NMP coliformes fotales y Escherichia coli Iml lt3
Presencia de Salmonella25ml Ausente
Los resultados de este analisis demuestran que las bebidas fermentadas con y
sin avena~ astan fibres de microorganismos patogenos
57
1
4 CONCLUSIONES
Se aislaron cepas nativas de Lactobacillus plantarum de las muestras vegetates
de repollo pepino repollitas de bruselas fermentadas y Lactobacillus brevis de
lache fermentada y mucosa vaginal humana Ambas cepas resistieran un pH=2 y
una concentraci6n de sales biliares det 03 ptv dos earacteristicas importantes
en los probi6ticos
Lamiddot cepa de Lactobacillus brevis aislada de lache Sa utiliz6 para elaborar una
bebida fermentada sin y con avana comoingrediente prebiotico obteniendose un
aJimento centon recuento del probi6tico viable durante 21 dras de seguimiento
ademas libre de microorganismos )at6gen05
No se encontr6 efecta significativo de la avena sobre Ie viabilidad del Lactobacillus
brevis aunque sa presento un aumento en 61 recuento de estos en la bebida con
avena
58
plusmn ~
5 RECOMENDACIONES
Ensayar la cepa de Lactobacillus plantartJm en productos carnicos madurados
como el salami
Ensayar la cepa de Lactobacillus l)revs en otros derivados lecteos como queso
quesito queso crema
Continuar con el estudio de estos microorganismos y caracterizarlos
molecularmente ademas de estudiar su capacidad de adherencja a fa mucosa
intestinal sobre algunes Hneas celulares como las CaCo~2
Estudiarel efedo de la avena sabre la viabiJidad del Lactobacillus breyis a una
concentraci6n mayor de 05
Realizer ensayos can las cepas de Lactobacillus brevis y Lactobrlcillus pJantarum
para elaborar masas acidas para panificacion reemplazando el Bromato de
Potasio aditivo prohibido desde marzo del 2003 en nuestro pais per 5U toxicidad
59
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65
ANEXOS
66
ANEXO A RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AlSLADA DE i
PEPINO it
Referencia Pepino 1 Fecha 06122002
IEXCELENTE IDENTIFICACION
Latto plantarum 1
Galeria API 50 CHL V50 Leida el 06122002
Perfil - -- - ++ - -- - ++++ - - -+- + - I I I I I I I I +t+ - +f- ~ - - + + ~ - - - +- + - shy
o - GLY - ERY DARA - LARA + RIB + DXYL - LXYL - ADO - MDX - GAL + GLU + FRU + MNE + SBE - RHA - DUL - INO bull MAN + SOR - MDM + MUG shyNAG + AMY + ARB + ESC + SAL + CEL + MAL + LAC + MEL + SAC + TRE + 1NU - MLZ + RAF + AMD - GLYG - XLT - GEN + TIJR + LYX - TAG - DFUC shyLFUC - DARL + LARL - aNT + 2KG - 5KG shy
--- Taxones significativos rd -----T -- Tests en contra
Lactoplantarum 1 999 092 1
Taxon siguiente Lactobrevis 1 OJ 044 3
i i
Lactoplantarum 1 1 test (5) en contra
D-SORBITOL (SOR) 78
Tax6n siguiente Lactobrevis 1 3 test (s) ert contra
METHYLD-MANNOSIDE (MOlM) 0 MELEZITOSE (MLZ) 14 D-TURANOSE (TUR) 14
67
ampb
ANEXO B RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AISLADA DE REPOLLO FERMENTADO
~
Referencia Repollo fermentado - 3 Fecha 03072003
EXCELENTE IDENTIFICACION
Lactoplantarum 1
Galena API 50 CRL V50 Leida el 03072003
Perfil - - ++ - - - - -H++ - - ~ + - + - I I 1 I I I I -H+ - ++ - - - + + - -- - - + - shy
o - GLY - ERY - DARA - LARA + RIB + DXYL - LXYL - ADO ~ MDX - GAL + GLU + FRU + MNE + SBE ~ RHA - DUL - INO - MAN + SOR - MDM + MDG shyNAG + AMY + ARR + ESC + SAT + CRL + MAL + LAC + MEL + SAC + TRE + lNU - MLZ + RAF + AMI) - GLYG - XLT - GEN + TOR + LYX - TAG - DFUC shyLFUC - DARL - LARL - GNT + 2KG - 5KG shy
------Taxones significativos _ _----- Id--- ---T---- Tests en contra
Lactoplantarum 1 999 095 1
Tax6n siguiente Lactobrevis 1 01 OA8 3
lJactoplantaru01 1 1 test (s) en contra
DSORBITOL (SOR) 78
Taxon siguiente Lactobrevis
METHYL-D-MANNOSIDE D-TURANOSE
1
(MOM) (TOR)
3 test (5) en contra
0 MELEZITOSE 14
(MLZ) 14
i
I
68
ANEXO C RESULTADO PRUEBAS BIOQUWICAS DE CEPA AISLADA DE MUCOSA HUMANA
Referenda Mucosa - 5 Fecha 27012003
BUENA IDENTlFICACION
Galeria API 50 CHL vso Leida el 270112003
Perfil - - - - +t--t - - - + - + - - - - - - - - -+- - - - - + - + - - - - - - - - - - - - - bull - - -+ - +
o - GLY ~ ERY - DARA bull LARA + RID + DXYL + LXYL - ADO bull MDX - GAL + OLU - FRU + MNE - SBE - IlliA - DUL - INa - MAN - SOR - MDM - MOO shyNAG + AMY - ARB - ESC ~ SAL bull CEL - MAL + lAC - MEL + SAC - TRE shyINU - MLZ - RAF - AMD - GLYG - XLT - GEN - 11JR - LYX - TAG - DFUC shyLFUC - DARL - IARL - ONT + 2KO - 5KG +
- - - - - - Taxones significativos - - - - - - - Id T -- Test en contra
Lactobrevis 3 963 088 1
Taxon siguiente Lactoco11inoides 36 075 2
Lactobrevis 3 1 test (s) en contra
GLUCOSE (GLU) 95
-~~~------------~---------------------------~--~-------~--~-----~----------~--------~------------~~--Taxon siguiente Lactocollinoides 2 test (s) en contra
GLUCOSE (GLU) 100 MELIBIOSE (MEL) 25
69
i r
ANEXO D RESULTADO PRUEBAS BIOQIJiMICAS DE CEPA AISLADA DE LECHE FERMENTADA
Referenda Leche fennentada ~ 13 Fecha 27012003
BUENA IDENTIFICACI6N
Galeria API 50 CHL V50 Leida el 270112003
Perfil - - - - -t-t+- - - - + - + - - - bull - - - - -+- - - - - + - + - - - - - - - - - - - - - - - - -+ - +
0 - GLY - ERY - DARA - LARA +Rll3 + DXYL + LXYL - ADO - MDX ~GAL + GLU - FRU + MNE SBE - RHA DUL bull INO MAN - SOR MDM bull MDG shy
~NAG + AMY - ARB - ESC - SAL - CEL - MAL + LAC - MEL + SAC - TRE I lNU - MLZ - RAF - AMD - GLYG - XLT - OEN - IUR LYX - TAG - DFUC bull i
LFUC - DARL - LARL -ONr + 2KG - SKO + 1
- -- - - Taxones significativos - - Id -- T --- Test en contra
Lacta brevis 3 963 088 1
Taxon siguiente Lactocollinoides 36 075 2
Lactobrevis 3 1 test (s) en contra
GLUCOSE (GLU) 95
-----------------------------------------------------------~------------------------------~-------------------Taxon siguiente Lactocollinoides 2 test (s) en contra
GLUCOSE (GLD) 100 MELffiIOSE (MEL) 25
70
II iJ1
I
I ANEXO E RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AISLADA DE REPOLLITAS DE BRUSELAS FERMENTADA
Referencia repollitas de bruselas 15 Fecha 03072003
EXCELENTE IDENTIFICACION
Lactoplantarum 1
Galeria API 50 CHL vsO Leida el 03072003
Perfil - - - - +t - - - - +H+ - +- - +t + - I I I I I I I f ++t - + - - - -+ + - - - -+ -+ - - I ij
o - GLY - ERY - DARA - LARA + RJB + DXYL - LXYL - ADO - MDX - GAL +
GLU + FRU + MNE + SBE RHA + DUL - INO - MAN + SOR + MDM + MOG shyNAG + AMY + ARB + ESC + SAL + eEL + MAL + LAC + MEl + SAC + TRE + i
I1NU - MLZ + RAF AMD GLYG - XLT - aEN + TUR + LYX - TAG - Druc LFUC - DARt + LARL - aNT + 2KG - 5KG shy n ----Taxones significativos ------ Id Tests en contra
Lactoplantarum 1 999 090 o
Taxon siguiente Lacto pentosus 01 012 7
Lactoplantarum 1 o test (s) en contra
Taxon siguiente Lacto pentosus 7 test (8) en contra
GLYCEROL (GLY) 75 D-XYLOSE (DXYL) 100 L-RHAMNOSE (RHA) 25 METHYL-D-MANNOSIDE (MOM) 1 MELEZITOSE (MLZ) 25 RAFFINOSE (RAF) 75 D-ARABITOL (DARL) 0
71
~
I i I
ANEXO F - ANALISIS DE REGRESION PARA pH EN BEBIDA SIN AVENA
Aruilisis de regresi6n polinomial
---~-~-------------------------------------------~-----------~~---------------------~--------------Variable dependiente pHSinAvena ---------------------------~-------------~--------------------~---------------------------------
Error T Parametro Estimado Estandar Estadistico P-Valor
CONSTANTE 535606 0094535 56657 00000 Dia -0150565 0020706 727154 00000 Dia2 000504434 0000871488 578819 00001
---~---------------------------------------------------------------------------------------------------
Anfllisis de Variama -------------------------------------------~-----------~-----------------------------~-~--- jSource Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor 11
------------------------~------------------------------------------------------------------------------~ Mod-elo 155772 2 0118861 4256 00000 Residual 0237877 13 00182983
Total (Corr) 11956 IS
R2 == 867522 percent
pHSinAvena == 535606 - 0150565Dia + 000504434Dia2
72
____
middot ANEXO G - ANALISIS DE REGRESION PARA pH EN BEBIDA CON AVENA
AmUisis de regresion polinomial _____~_____~__-_____~___4____________________bull____bull__________bull_____________~~----_------___________
Variable depcndiente pHConA vena ------------------------------------------------------------------------------------------~--------
Error T Parametro Estimado StAndar Estadfstico P-Valor
---------------------------------------------~-----------------------------------------------_---------CONSTANTE 534463 00801045 667208 00000 Dia -0140407 00175453 800253 00000 DiaA 2 000448098 0000738458 606803 00000
----------------------~---~-----------------------------~------------------------------~----AmUisis de Varianza
---~---------------------------------~---------------------~------------~-------------------~------Source Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio PValor --------------------------~-----------------------------------------------~------------~-----~~--~ ModeJo 159575 2 0797873 6073 00000 Residual 02170798 middot13 00131383 _______~_~ ~_~----------~------~--~-----~-M-----~-----____ _____________~-----------------------Total (COlT) 176654 15
R12 903315 percent
-----------~------------------------------------------------------------------------~-----------pHConAvena 534463 - 0140407Dia + 000448098DfaA 2
73
ANEXO H - ANALTSIS DE REGRESTON PARA ACIDEZ EN BEBJDA SIN AVENA
An8Jisis de Regtesi6fi P6lifJomial
Variable Depefidiefile~ AcidezSinAVenll _______________w_____~______~________________~-----------_________~_________________~~____~___~_____
Error T Pariirnetro Estimado Estandar Estadistico ---------------------------------------~--------------~-~-------~--------------------~------------CONSTANT 0491697 00123217 399051 00000 Dia 00436032 000269882 161564 00000 D1a2 -000144613 000011359 127312 00000 __w___~________________________~-_______-_____~----____________________________~__~---~_--__~___
AriiiJisis de varianza ~_~__~__________~_~____~________~___________- _________e_____________________________bull _____-________
Source Smn de cuadr Df Mean Square F-Ratio PmiddotValor_~~___________________________________bull ______~___________bull ____________bull ______~________w________________
Model 0135203 2 00676013 21747 00000 Residual 000404118 13 000031086
Total (Corr) 0139244 15
R2 970978 percent
AcidezSlnAvena 0491697 + O0436032Dia - 0OOl44613Dia2
74
I
ANEXO I ANALISIS DE REGRESION PARA ACIDEZ EN BEBIDA CON AVENA
1
Anwisis de tegtesi6fi polinomial
Variable dependiente Acidez Con Avena
Error T ParametTo Estimado Stlindar Estadfstico P-Valor ----------------~-------~---------------------~-----------------------------------------------------CONSTANT 0491639 000926607 530578 00000 Diamiddot 00406572 000202955 200326 00000 DfaA 2 0000982559 0000085421 -115025 00000
-------------~----------------------------~-------------------------~-----------------------------------
-------------~-----~~-----------------------------~---------------------------------------------_--Source Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio PValor
-~-------------~----------------------------------~------------------~~-------------------------- Modelo 0288008 2 0144004 81914 00000 Residual 000228539 13 0000175799
----------~~--------------~---------------------------------------------~---------------------------Total (Corr) 0290294 15
RA2 = 992127 percent
-------------------------~----~---~------------~---------------------------------~---------------~
AcidezConAvena == 049163amp + 00406572D1a - 0000982559DiaA2
75
I
(Ilmiddot il
ANEXO J- ANALISIS DE REGRESION PARA RECUENTO LACTOBACILOS PARA BEBIDA SIN AVENA
Amilisis de regresion - Modelo lineal Y = a + bX
------------------------~----------------------~-----------------------------~----------~-----------Variable Dcpendiente LactobacilJusSinAvena Variable independiente Dia
I--------~----------~-----------------------------------~-------~-~--~--------------------------~-Error T
Paramctro Estimado Standard Stadistico P-Valor
----~----~------------~-----~-----------------------~-------------~-----------------------------Intereepto 117347 0389973 300911 00000 Pendiente 00483464 00257889 18747 00903
Analisis de Varianza
---------~------------------~----------------~---------------------------------~---------~----------Source Sum decuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor
------------~---------------------~---------------------~--------------------------------~-----~----Modelo 0916252 1 244835 443 00616 Residual 260706 10 0260706
--~------------~---~------------------~~~-----~-------~---------~~-------------------------------------Total (Corr)352332 11
Coeficiente Correlaci6n = 0509955 R2 = 260054 percent
LactobacillusSinAvena= 117347 + 00483464Dfa
76
ANEXO K- ANALTSIS DE REGRESION PARA RECUENTO LACTOBACILOS PARA DEBIDA CON AVENA
Aruilisis de regresion - Modelo lineal Y = a + hX
Variable Dependiente LactobacillusConAvena Variable Independiente Dia ---~--------------------------------------------------------__-----------__--_--_-----------shy
Error T Paramctro Estimado Standard Estadistico P-Valor -~--------------------------------------------------------------------------------------------------
Irttercepto 118103 0567963 207942 00000 Pendiente 00790304 00375594 210414 00616
-----------------~----------------------------~----~-------~----~----------------------------
Analisis de Varianza
----------------~----------------~------------------~--------------------------~------~--------shySource Swn de cuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor
-----------------~--~--------------------------------------------------------------------------~---~ Mode10 244835 1 244835 443 00616 Residual 552997 10 0552997
Total (Corr)797832 11
Coeficiente Correlacion = 0553964 RI2 = 306875 percent
-----~--------------------------------------------------------~--------------------------------------
LactobacillusConAvena = 118103 + 00790304Dfas
77
1155 Protegen contra cancer de colon
EI cancer es el resultado de una serie de mutaciones somaticas que pueden
ocurrir durante al tiempo de vida del individuo y 10 padeca buena parte de la
poblacion mundial los probi6ticos en un sistema in vitro han demostrado un
efecto positivo en la prevenci6n de mutaciones aI desactivar carcin6genos
genotoxicos (Wolloswski et al J 2001)
1156 Protegen contra infecciones respiratorias
Sa ha demostrado que el conslJlno de probi6ticos disrninuye la incidencia de
infecqiones raspiretorias al aumentar la actividad fagocitica de maer6fagos
alveolares que aettian sobre microorganismos patogenos Se hizo un estudio en
571 ninos sanos con edades entre uno y seis anos divididos en dos grupos a uno
de ellos sa las incluy6 en su dieta leche suplementada can Lactobacillus GG y a
los otros ninos leche no suplementada AI final del estudio se observ6 una
disminucion del 19 en la incidencia de infeccionas respiratorias tratadas con
antibi6ticos tales como otitis media sinusitis bronquitis y neumonfas en el grupo
de los ninos que consumieron Lactobacillus GG (Hatakka et al 2001)
Alvarez et al (2001) encontraron que la administraci6n de yogurt con Lactobacillus
casei en ratones de tres arios de edad majora los espacios libres del puJrn6n de
la presencia de Pseudomona aeruginos8 induciendo un aumento
21
significativo en los niveles de gA a IgM datactadas en los lavados
broncoaJveolares y se observ~ un afecta dependiente de la dosis
1157 En el tratamientoy prevenci6n del eczema
Se ha encontrado que el consumo de probi6ticos mejora la inflamaci6n alergica 0
eczema at6pico en ninos alimentados con formula suplementada con probi6ticos
Encontraron una mejora significativa al suministrar Bifidobacteriummiddot actis y
Lactobacillus GG en 27 niiios con edad promedio de 46 meses Luego de aplicar
este tratamiento se sometieron a una prueha de SCORAD (mide fa extension y
gravedad del eczema) registrando una meJoria significatlva en las condiciones de
la pie concentraci6n de citoquinas cirClllantes an sueto y moleculas de adhesi6n
a las superficies de las celulas soJubles en suero (Isolari 2000)
Se realizaron otros estudios a 159 mujeres embarazadas con historia familiar de
eczema atopico de primer grado a las cuafes sa res 5uministro dosis diarias de
Lactobacillus GG durante 2 a 4 samanas previas al parto Oespues de ella fa
madres twiaron la opci6n de continuer tomando el ptobi6tico si amamantaban 0
bien darseio vIa oral La mayoria de las madras eJigieron dar las dosis at bebe
diariamente A los dos anos de vida se observ6 una disminuci6n del 50 en la
frecuencia del eczema at6pico en aquellos nHies que se les dio ef probi6tico
(Kalliomari etal 2001)
22
1158 Previenen infeccion en heridas quirurgicas
Los probi6ticos impiden la union de pat6genos a las superficies celulares en
heridas mediante la seCreci6n de proteinas Actuamente se encuentra en
estudio la aplicaci6n del Lactobacillus fermentum vivos sabre heridas en piel de
ratas y se ha encontrado una disminuci6n del 90 en la colonizaci6n par parte del
StaphylococcuS aureus uno de los patogenos mas temidos y de mayor lncidencia
en infecciones hospital arias mas aun se esta contempiando la posibilidad de
utilizar la protein a purificada an lugar de los mjcroorganismos para la protaccion
contra infecciones en heridas (Strauss 2000)
12 PREBIOTICOS
Son carbohidratos de cadena corta algunas veces reconocidQs como
oligosacaridos no digeribles par las enzimas del epitelio intestinal 0 de las
gliJnduJas anexas debido a su estructura quimica y de esta manera lIegan al
intestino grueso donde alcanzan a estar disponibles para la fermentaci6n por las
bacierias sacaroHticas que son especial mente laetobadlos y bifidobacterias
dando odgen a compuestos que ejercen efectos funcionales sobre la mucosa del
tubo digestivo (Brunser 2001)
Se consideran como tal algunos fructocligosacaridos isomaltooligosacariclos
oligomato palatinosa poHdextrosa pOJidextrrna raftilina y algunos oligosacaridos
23
)
de 1a soya y fa avena Estenmiddot presentes en alimentos como Ie cebolla ajo
banano puerros 1 derivados del trigo achicoria esparrago alcachofa (Cummings
etal 2001)
Algunos de estos prebi6ticos cuanda son incorporado$ a fa dieta en cantidades
dalerminadas alteran la microbiota intestinal disminuyendo los recuentos de
coliformes bacteroides y cocos y aumentando las bifidobacterias hasta en diez
veces ademas modifican la actividad metab6lica del coron logrando una
disminuci6n del pH y un incremento en el contenido fecal de acidos grasos de
cadena corta como at acatica propi6nico y butfrico El butirato aumen~ _I grosor
de la pared del coron e intestino delgado estimula eJ crecimiento de la mucosa del
colon y auManta su flujo sangufneo inhibe el crecimiento de tinsas tumorales
epiteliales de origen co16nico induce la diferenciaci6n de sus celulas y a
apoptosis entre otros(Brunsar 2001)
Eh estudios hechos en simuladores del intestino humano utilizando productos de
avena fermentados se encontro que estimularon al crecimiento tanto de
lactobacios como de bifidobacterias y en el caso de estas ultimas se incremento
la producci6n de los acidos acatico propionico y butfrico 10 que incide sobre la
implantacion de probi6tico$ e inhibe al crecimientos de otro tipo de
microorganismos (Alal1der eta1999 Kontula etal 1998 Jaskari etal 1998)
24
~ -1
(
AI comparar el comportamianto de las leches de diferente origen se ha
demostrado que Ie leche de vaca contiene caseinatos sustancias que forman
buffer ~n et intestino e inlpiden que los probi6ticos disminlJyen el pH del intestina
y de esta manera se impide al efecto deseado que es evitar fa proliferaci6n de
otros microorganismos entre los cuates pueden estar algunos patOganos En la
leche materna sa encuentran algunos carbohidratos como glucosa galactosa n
acetilglucosamina y algunos 0lig6meros de Ie fucosa en cOhoontracionesmiddot
importantes los cualeS favoreceh el crecimientc)middot de probi6ticos esto
complementado can 91 bajo contenido de protenas que se traduce en una
reducida capacidad buffer hacen de Ie lache materna IJn alimentd adecuado para
nllios en su etape de lactancia
Algunos prebi6ticos como 1a lactulosa yciertos compuestos que contiansn fructosa
no son digeridos en el intestino humano y pueden sar utilizados selectivamenta
par los probi6ticos 10 que hace que los probi6ticos en combinaci6n can prebi6ticos
pueden lIegar a ser un importante medio para prevenir algunas enfermedades del
tracto gastrointestinal (Bezkorovainy 2001)
25
2 METODOlOGfA
21 LOCALIZACION
EJ trabajo sa realizo en el laboratorio de Microbiologia y la planta da laches de Ja
Universidad Naclonal de Colombia- Secie Medellin
En al laboratorio se hiZQ al aislamiento a identificaci6n de fa capas y en fa Planta
sa eJaboro la leche fermentada con 1a cepa seleccionada y el prebi6trco
22 METODOS
221 Aisiamiento de cepas nativas
Las cepas nativas se sislaran de producto$ vegetales leches fermentadas y
mucosa vaginal humana
2211 De vegetales
Las muestras vegetales de repollo repollitas de brusefas y pepino se
seleccionaron porcionaron y mezclaron can cloruro de sadio al 10 pIp se
calacaron en un recipienta de vidrio balo anaerobiosis y sa dejarQn por 15 dias
26
luego S9 tomaron 3 ml de cada muestra y se jnocularon 9 ml de caldo MRS (Man
Rogosa and Sharpe) se incubaron a 37deg C durante cinco dias en camara de
anaerobiosis (Ver Figura 1) Oespues de este tiempo sa inocularon cajas de petri
con agar MRS con 1 ml del cultivo microbiano y se incubaron bajo las mismas
condiciones que eJ caldo Este procedirniento se realiz6 rapetidas veces hasta
seleccionar la cepa pura mediante observaci6n de caracteristicas morfologicas de
la cOlonia y a cada colonia se Ie practico la coloracion de gram con el fin de
observar las caracteristicas microscopicas de cada una e identificar las de mayor
similitud a los Lactobacilos y Bifidobacterias
Figura 1 Camara de anaerobiosis
27
2212 De la leche
Sa tomo 200 ml de teche cruda de la planta de leches y se colaca a fermentar
baja anaerobiosis durante 15 dras Luego sa procedia como en los vegetales
2213 De mucosa vaginal humana
Se tomo una muestra de frotis de mucosa vaginal humane can capito esteril sa
puso a ncubar en Caldo MRS y se procedi6 camo en 2211 y 2212 A cads
aislado sa Ie practico la coloracion de gram y sa seleccionaron aquellas que eran
bacilos gram positivos (Ver Tabla 2)
28
TABLA 2 Fuente de aislarniento de cepas nativas
CEPA FUENTE
1 Pepino fermentadQ
2 repollitas de bruselas fermentadas
3 Repolltgt fermentado
4 Repollo fermentado
5 Mucosa va~inal humana
6 Mucosa vaginal humana
7 repollitas de bruselas fermentadas
8 Repollo fermentado
9 repollitas de bruselas fermentadas
10 Mueo~a vaginal humana
11 Repollo fermentado
12 RepolJo fermentado
13 Leche fermentada
14 Mucosa vaginal humana
15 repollitas de bruselas fermentadas
16 Repollb fermentado
29
222 Almacenamiento de las cepas aisladas
Cuando las cepas crecieron en agar MRS homogEmeas en color morfologia
coloraci6n de Gram etc se pssaron a agar inclinado en tuba se cubrieron con
aceite mineral y se guardaran en refrigeraci6n a 4deg C para tomar de alii la cepa y
efectuarle las diferentes pruebas para confirmar el genera y determinar la especie
de cada una de eas (Ver Figura 2)
Figura 2 Cepas en tubos con agar inclinado
30
223 Pruebas para determinar et genero
2231 Coforaci6n de Gram
A cada cepa sospechosa de Lactobacilos se 1e hizo la coloraci6n de gram y se
seleccionaron las gram positivas
2232 Morfologfa
En agar MRS y despues de incubar en anaerobios~s crecian colonias grandes
cremosas de color beige con bordes homogeneos y c6ncavas(Ver Figura 3)
Figura 3 Colonias aisladas en agar MRS
31
2233 Prueba de esporulaci6n
A cada cepa aislada se Ie hizo esta prueba la cuel consistia en incubar en
aerobiosis durante ocho dias las cajas de agar MRS donde crecieron colonias de
Lactobacilo$ y luego se les (ealize) coloraci6n de espora Las capas que dieron
negativa a la prueba de espora se considararort sospechosas de sar Lactobacilos
y se continuo con la prueba de la catalasa (Ver Tabla 3)
2234 Prueba de la catalasa
los lactobacilos carecen de catalasa Eata prueba se hizo tomando una colonis
se deposito en vidrio de reloj y se Ie adicion6 dos gotas de peroxida de hidr6geno
(H202) la que no presentaba efervescencie eran cepe sospechosa de ser
Lactobacilo (Ver Tabla 4
Sa seleccionaron las capas euyo resultado fue aeorde con el genera Lactobacilfu$
y se continuo con la comirmaeion del genera y determinacion de la eSpecie
meqiante las pruebas bioqulmicas
32
224 Prueba para determlnar la especie
Para confirmar el genero y determinar la especie de las diferentes capas aisladas
se hizo una caracterizaci6n bioqufmica utilizando un kit de API 50 CHL Medium
Ref 50 410 que contiene una galed8 de medios que permite realizar el estudio
de fermentaci6n de los 49 azucares de 52 especies de Lactobacillus (Ver Figura 4
y tabla 5)
Figura 4 API CHL 50-Prueba bioquimica
33
225 Pruebas para determinar microorganismos probi6ticos
2251 Resistencia a pH=2 y sales biliares de concentraci6n O3pv
A las cepas idantificades como Lactobacillus brevis y Lactobacillus pantarum sa
las realiz6 Ie prueba dfl resistencia a pH=2 y sales biliares de concentraci6n 03
pv ( Jacobsen et al 1999) Una colonia de cada cepe aislada se inocul6 en 4 mt
de caldo MRS durante cinco dras bajo condiciones de anaerobiosis Oespues de
esta tiempo se dejaron pracipltar los microorganismos por sedimentaci6n se Ie
retire el sobrenadante y al precipitado se Ie adicion6 Sml de caldo MRS
previamente ajustado a pH=2 can seido clorhfdrico (HCI) dentro del mismo tuba de
ensayo G igual sa hizo can otro tubo previamente incubado pero a este se Ie
adiciono 5ml de caldo MRS con sales biliares a una concentra~i6n de 03 plv y
ambos se incuberon a 37deg C por 2 haras Sa midio 01 mi de cada uno de los
tubas al tiempo 0 y a las 2 horas y sa inoculeron en superficie en caJas de petri
con agar MRS S9 incubaron a 37deg C bajo anaerobiosis durante 48 horas Se
compararon visualrrente en cada caja de petri el crecimiento en superficie y las
que presentaron crecimiento en tos dos tiempos (0 y 2 horas) tanto en at media
acido como en sales I se consideraron resistentes a pH=2 y sales biliares (03
pv)
(Ver Tabla 6)
34
226 Conservacion
Todas fas capas que habian dado positiva Jas pruebas anteriores y que reaultaron
resistentes a pH=2 y sales biliares 03 pv y despues de identificadas en API 50
CHL sa repicaron en agar MRS en tuba inclinado y despues de Incubar a 37deg C
por 48 horas bajo anaerobiosis se Ctlbrie el biser completamente can aceite
mineral esteril y sa guardaron en refrigeraci6n
227 Elaboracj6n de fa bebida fermentada
2271 Preparaci6n de la mue$tra
Sa tome 1 mt de caldo MRS previamante inoculado e incubado que presentaba
una concentracion de Lactobacillus brevis de 27x108 Iml segun la escaJa de Mac
Farlan y sa adiciono a 9ml de leche pasteurizada en un tubo sa dej6 incubanda
en anaerobiosis por 48 hores Luego se pasaron estos 10 ml a un frasco qua
cont~nie 90 ml de leche pasterizada y se dej6 incubando par 48 haras en
anaerobiosis
35
2272 Adici6n del inOculo
A 900ml de leche pasteurizada se Ie adicion61os 100 ml de leche que habia sido
previamente ino(ulada dos veces con la cepa posteriormente se deja
fermantando la lache a temperatura de 37deg C
2273 Control de Ja fermentaci6n
Las muestras se hicieron por cuadruplicado y se les hizo un seguimiento de
aoidez hasta un valor entre 04 y 05 expresada como Bcido lactico esta
procedimiento corresponde a la babida fermentada sin prebi6tico La bebida ~on
prebi6tico tiene al mismo proeedirnianto pero adicionalmente se agrag6 avena a
una concentraci6n de 05 en el momento de la adici6n del in6e410 a los 900 ml
de leehe pasteurlzada y el procedimiento sigui6 igual al de la bebida sin prebi6tico
tambien se hizo por cuadruplicado
2274 Refrigeracl6n
Despues que las mezclas con y sin prebiotico alcanzaron el de acidez
requarido se IIeva ron a refrigeraci6n a una temperatura de 4deg C p~r 24 horas
para frenar proce~os metab6licos de los microorganisrtlos Despues de este
ti~mpo se procedi6 al batido
36
1 2275 Batido
Con un agitador se procedi6 a batir las bebidas para romper et coagulo formado
y de esta manera homogeneizar la mazela y obtener asf la bebida fermentada
2276 Envasado y almacenamiento
Ambas bebidas se envasaron en frascos vidrio para hacerles seguimiento de pH
acidez(expresado como acido tacticol y recuento de Lactobacillus breviSf los
dies 27 14 Y 21 despues de elaboradas las bebidas perfodo durante el cualta
muestra permanecfa afmacenada a temperatura de refrigeracion(Ver Figura 5
37
Fjgura 5 Diagrama de Flujo
PREPARACION DE LA MUESTRA
ADICION DEL INOCULO
~_____~_B~ATIDO~______~
INCUBACION 37deg C hasta acidez = 04-05 acido laotico
ENFRIAMIENTO
hasta 4 0 C ~------~ ~------~
ENVASADO Y ALMACENAMJENTO
dUrante 21 dfas a Temperatura 4 0 C
38
1
228 Determinaci6n del pH
Se determino por el metoda potenciometrico en un pH-metro manual durante los
dias 2) 7 14 Y 21 de las bebidas lacteas sin y con prebi6tica (Ver Tablas 7 y 8)
229 Oeterminaci6n de la acidez (Expresadfl como acido
lactica)
Se tomaron 9 mJ de las bebida~ sa Ie adicionaron 2 gotas de fanoftaleina como
indicador y sa titulo fa acidez con NaOH 01 N hasta la aparicion de un cotor rosado
debit EI volumen de NaOH utilizado se reporta como valor de de acidez
(VerTablas 10 y 11)
2210 Prueba de viabilidad
Qurante el perfoda de almacenamiento de la bebida lactea se procedi6 a hacer la
prueba de viabiHdad en los dias 7 14 Y 21 para determinar Si los lactobacilfus
permanecfan vivOs a una concentraci6n minima de 106 hasta el dia 21 como 10
establece eJ Articulo 10 de la Rasolucion 2310 del Ministerio de $alud de
Colombja
39
Para asta prueba se tamaron 10 rnl de muestra y se adicionaron a 90 ml de caldo
MRS ruego a partir de esta se hicieron diluciones de 10-2 hasta 10-11 de las
diluciones 109101deg 10-11 se inocul6 1 ml de cada uno en agar MRS siguiendo el
metodo de siembra en profundidad y por duplicado e incubando a 370 C x 5 dras
en anaerobiosis y luego se hicieron tos recuentos por duplicado para esi reportar
los recuentos promedio (Ver Tablas 13 y 14)
2211 AniUisls microbiol6glco de las bebidas Iicteas(con y sin
avena)
Con el fin de determinar las condiciones higienico-sanitarias del producto se
realizaron las pruebas microbiol6gicas de Recuento de mohos y fevadurasml en
agar OGY Recuento en superficia de Staphylococcus coagulasa positivoml en
agar Baird Parker Numero Mas Probable (NMP) de coUfor-mes totales y
Escherichia coliml en caldo Fluorocult y Presencia de Salmonela25ml con BHI
caldo tetrationato y agar Hecktoen (Montoya 1999)
(Var tabla 16)
2212 AnaUsis estadistico
A los datos obtenidos en la medici6n de pH acidez (expresada como Beido
laclico) en los dras 2714 Y 21 y el recuento de Lactobacillus en los dras 714 y21
40
realizados a los dos tratamlentos se tes aplic6 1a prueba t porque solo difieren
en la presencia 0 ausencia del prebi6tico para evaluar si habra diferencia
estadfsticamente significativa para los dos tratamientbs(Ver Tablas9 12 y 15)
41
3 RESULTADOS Y DISCUSION
31 Coloraci6n de Gram y morfologfa
Las cepas aisladas fesultaron Gram positivas (Ver Figura 6) colonias grandes
cremosas dE) color beige con bordes homogeneos y c6ncavos en su
morfologia (Ver Figura 3) resultando de acuerdo a 10 especificado en Stanley
1989 para Lactobacillus
32 Prueba de esporulaci6n y cataJasa
Los resultados de la pruebas de esporulaci6n y catalasa indicados en las
Tablas 3 y 4 respeclivamente dieron conforme a 10 especificado en Stanley
1989 para Lactobacillus
42
1
2 3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
TABLA 3 Resultado de prueba de esporuJaci6n
CEPA RESULfADO ESPORULACION
-- -------------
43
l i ~II bull ~ I I
TABLA 4 Resultado prueba de la catalasa
CEPA RESULTADO CATALASA
1 -2 -3 -4 -5 -6 -7 8 -9 -10 -11 12 -13 -14 -15 -16
3~3 Prueba para determinar la especie
Oespues de hacer las pruebas para seleccionar las cepas sospechosas de ser
Lactobacillus se realizo las pruebas bioquimicas fograndose identificar
Lactobacillus plantarum aislctdo de pepino repollo y repollitas de bruselas
44
fermentados y Lactobacillus brevis de mucosa vaginal y leche fermentada (Ver
Anexos del A al E y Tabla 5)
TABLA 5 Resultado identlficaci6n cepa~
CEPA NOMBRE
1 Lactobacillus planfarum
3 Lactobacillus plantarum
5 Lactobacillus brevis
13 Lactobacillus brevis
15 Lactobacillus plantarum
34 Pruebas para determinar microorganismos probi6ticos
las cepas de Lactobacillus brevis y Lactobacillus plantarum mostraron
rasistencia al medio acido de pH =2 Y sales biliares 03 pv resultado similar al
encontrado por Jacobsen et al 1999 para Lactobacillus plantarum (Ver tabla 6)
45
middot
~~~ttiI lltlmiddot~COX~dtJ ~xtc_~ 2 tr~ k-JlL~middot
-)~~TO DE lJIBUOTECUl rjRL]OTtCA twn GO1IU1
TABLA 6 Resultados a pruebas de resistencia a pH=2 y sales biliares 03 plv
CEPA RESISTENCIA pH=2 RESISTENCfA A SALES BIUARES ()3 pv
1 + +
2 + +
3 + +
4 + +
5 +
6 + +
7 + +
8 + +
9 + +
10 + +
11 + +
12 + +
13 + +
14 +1shy +M
15 + +
16 + +
+1 crecimiento debil
+ crecimiento abundante
46
Figura 6 Lactobacillus brevis Gram + aislado de leche fermentada
Ai observar en placa las celulas de lactobacilos despues de real1zar las pruebas
de resistenCia a la acidez y sales biliares se observo una tendencia a aglomerarse
posiblemente como un mecanismo de proteccion cOlitra estos medios que pueden
lIegar a ser adversos para elias (Ver figuras 7 y 8)
47
Figura 7 Lactobacillus brevis aislada de leche fermentada despu~s de la prueba de resistencia a pH=2
Figura 8 Lactobacillus brevis aislada de leche fermentada despues de la prueba de resistencie asales biUares 03 plv
fI
48
35 --Seguimiento del-pH-en-la-bebidaJacteacon y sin -prebi6tico
A continuacion se muestran las Tablas 7 y 8 donde sa registian los datos
recopilados de pHdurante 10$ dras Z 7 14 Y21 para las bebidas laaeas con ysin
prebi6tioo
TABLA 1 ResultadopH yogur sin avena
Dia Repetition 1 Repetici6n 2 Repeticion 3 Repetici6n 4
2 526 501 51 52
7 446 433 438 44
14 439 435 437 436
21 439 437 438 437
TABLA 8 -ResultadopHyogur con avena
Dia Repeticion 1 Repeticion2 Repeticion 3 - Repeticion 4
2 509 523 51 515
7 447 442 445 442
14 436 -438 439 437
21 432 433 435 434
Observando la Figura 9podamos ver que el pH en el -dfado$ para los dos
tratamientos as igual y empieza a descender rapidamente para estabilizarse a
partir del dra 7(Ver figura 9)
49
Figura 9 Comparacj6n de medias para -el pH
Comparaci6n de medias para pH
55 ~ 5 +----=gtIIIi-~i~~----=-r--it~ -- pH sin avena
a 45 1--~~~~=~~ 4 --- pH con
avena35 t-----r-- -------=------=--= ------- - ----
2 7 14 21
Dias
Aplicando la prueba t para comparar las medias de pH I S6 muestia una diferencia
altamants significativa en los dos tratamientos para el dia 21 (pltO05)
(Ver tabla 9)
TABLA 9 Compaiaci6n de medias para pH
DtAS SIN AVENA CON AVENA te p (VALOR)
2 514 514 0 10
7 439 444 -1 61 0159
14 437 I
438 -070 0510
21 438 433 528 00019 shy
- DiFERENCIA AlTAMENTE SIGNIFICATIVA
50
I
AI aplicar regrasi6n a los datos sa obtiene al modelo estimado
pHSinAyena =535606 - 01505650Ia +0005044340IaI2
La variabilidad en la respuesta de pH asta siendo explicada en un 8S7522 por
el modelo (Ver Anexo F)
EI tratamiento con avena mostro el siguiente modelo al analisis de ragresi6n
pHConAvena =534463 ~ 0140407Dia + 0004480980Ia2
La variabilidad an la respuesta de pH asta siendo explicada en un 903315 par
el nlodelo(Ver anexo G)
36 Seguimiento de la acidezmiddotmiddot expresada comomiddot de acido
lactico
A continuaci6n sa muestran las Tablas 10 y 11 donde sa registran los datos
tecopilados de acidezmiddotdurante los dias 27 14 Y 21 para las pebidas taetees con y
sin prebi6tico
TABLA 10 Resuttadode acidez (expresadocomo acido tactico) yogurt sin avena
CIA R~petici6n1 Repeticion2 Repetici6n 3 Repeticion 4
2 054 06 057 058
7 072 074 073 0]2
14 080 083 082 082
21 0]4 079 078 077
51
TABLA 11 Resultado de aCidez (expresado como acido Icktico) yogurt con avena
Dia Repetici6n 1 RepetiCi6n 2 Repetici6n 3 Repetici9n 4
2 059 055 058 057
7 071 073 072 072
14 089 087 088 086
21 092 091 090 091
Observando la Figura 10 se puede concluir que la acidez empieza a aumentar
hasta el dia 14 y luego trata de estabilizarse para los dos tratamientos
(Ver figura 10)
Figura 10 Comparaci6n de medias para la acidez
N G)
Comparacion de medias para acidez
1
2 0I 5 -+--=--------=-~~~= u
ltC
- Acidez sin avena
2 7 14
Dias
52
21
-it- Acidez con avena
Aplicando la prueba t para camparar las madias de acidez se muestra una
diferencia altarnante significativa en los dos tratamiantos para los dias 14 y 21
(pltO05)
(Var tabla 12)
TABLA 12Comparaci6n de medias para Acidez
DIASmiddot SIN AVENA CON AVENA te p(VALOR)
2 0572 0572 0 10
7 0727 0720 119 0278
14 0818 0875 -638 000070shy
21 077 091 -1212 i 0000019 shy
DIFERENCIA AL TAMENTE SlGNIFICATIVA
AI aplicar r~gresi6n a los datos se obtiene el modelo estimado
AcidezSlnAIena = 0491897 + O0436032Dia O00144613DfaA2
La variabilidad en la respuesta de acidez asta siendoexplicada en un 970978
por al modelo (Ver anexo H)
EI tratamiento con avena mostro elsiguiente modeloj a1 analisis de regresion
AcidezConAvena = 0491638 + 00406572Oia - OQOO982559OiaA2
La variabilidad enla respuesta acidez esta siendo explicadaen un 99212 por
el modelo (Ver anexo J)
53
I ~
37 Prueba de viabiJidad
A continuaci6n sa muestran las Tab~as 13 y 14 donde sa presentan los datos
recopilados del recuento de Lactobacilos durante los dias 7 14 Y 21 para las
bebidas lacteas con y sin prebi6tico
TABLA 13 Recuento de Lactobacilos (UFCml) yogurt sin avena
Dia Repetici6n 1 Repetici6n 2 Repeticion 3 Reptttici6n 4
7 1880X10l1 1454X1011 1642X1011 1780X10~
14 1560X10~ 646X1011J 1890X10l 140X10l1
21 1200x10lu 128Ox10u 1745x10J 1520x101V
TABLA 14 Recuento de Lactobacilos (UFCml) yogurt con avena
Dfa Repetieion 1 Repetici6n 2 Repeticion 3 Repeticf6n 4
7 1600X10lt 1240X10t 1640X10ll 1980X10t
14 540X1011 427X10n 546X10n 720X10ll
21 500x1011 492x1011 712)(1011 980x10~
AI analizar la Figura 11 sa puede observar un recuento mayor de Lactobacilos
en al tratamiento con avena resultado de acuerdo a 10 encontrado por Alander at
aI 1999 Kontula et aI 1998 y Jaskari et aI 1998
54
Figura 11 Comparaci6n de medias para Log Lactobacillus
Comparacion de medias para log Lactobacillus
~ 1350
-+- Sac Sin--() 13 co avenaIII
bull 125 -- Bac con 0)
0 12 avenaJ
115 7 14 21
Dias
Aplicando la prueba t para comparar las medias de recuento de Lactobacillus no
se encontr6 una diferenc1a estadfsUcamente significative entre los dos
tratamientos (Ver tabla 15)
Este aumento en al racuento influy6 en la disminuci6n del pH y en el aumento de
fa aeidez por la fermentacion que realizan los Lactobacillus sobre fa lactosa de la
lache y la avena adicionada como prebi6tico
55
1
TABLA 15 Comparaci6n medias lag Lactobacillus
DIAS SIN AVENA CON AVENA tc p(VALOR)
7 122257 122022 04846 06451
14 121065 132393 -19602 00977
21 129025 133087 -08236 04416
At aplicar regresion a los datos se obtiane al modelo astimado
LactobacillusSinAvena= 117347 + 004834640Ia
La variabilidad en la respuesta del recuento de LactobaCillus ssta siendo
explicada en un 260054 por el mod$loVar anexo J)
EI tratamiento con avena mostr6 al siguiente modalo al anal isis de regresion
Lactobacillu$ConAvena =118103 + 007903040Ias
La variabilidad en la respuesta de recuento esta siendo explicada en un 3068
por al modelo(Ver anexo K)~
38 Analisi$ microbiol6gicos de las bebidas lacteas con y sin
En la Tabla 16 estan recopilados los resultados microbiol6gieos obtenidos en ras
muestras con los dos tratamientos (con y sin avena)
I [
sa
TABLA 16 Resultados analisis microbiologico
Recuento de mohos y levaduras Iml lt10
Recuento de Staphylococcus coagulase positiva Iml lt100
NMP coliformes fotales y Escherichia coli Iml lt3
Presencia de Salmonella25ml Ausente
Los resultados de este analisis demuestran que las bebidas fermentadas con y
sin avena~ astan fibres de microorganismos patogenos
57
1
4 CONCLUSIONES
Se aislaron cepas nativas de Lactobacillus plantarum de las muestras vegetates
de repollo pepino repollitas de bruselas fermentadas y Lactobacillus brevis de
lache fermentada y mucosa vaginal humana Ambas cepas resistieran un pH=2 y
una concentraci6n de sales biliares det 03 ptv dos earacteristicas importantes
en los probi6ticos
Lamiddot cepa de Lactobacillus brevis aislada de lache Sa utiliz6 para elaborar una
bebida fermentada sin y con avana comoingrediente prebiotico obteniendose un
aJimento centon recuento del probi6tico viable durante 21 dras de seguimiento
ademas libre de microorganismos )at6gen05
No se encontr6 efecta significativo de la avena sobre Ie viabilidad del Lactobacillus
brevis aunque sa presento un aumento en 61 recuento de estos en la bebida con
avena
58
plusmn ~
5 RECOMENDACIONES
Ensayar la cepa de Lactobacillus plantartJm en productos carnicos madurados
como el salami
Ensayar la cepa de Lactobacillus l)revs en otros derivados lecteos como queso
quesito queso crema
Continuar con el estudio de estos microorganismos y caracterizarlos
molecularmente ademas de estudiar su capacidad de adherencja a fa mucosa
intestinal sobre algunes Hneas celulares como las CaCo~2
Estudiarel efedo de la avena sabre la viabiJidad del Lactobacillus breyis a una
concentraci6n mayor de 05
Realizer ensayos can las cepas de Lactobacillus brevis y Lactobrlcillus pJantarum
para elaborar masas acidas para panificacion reemplazando el Bromato de
Potasio aditivo prohibido desde marzo del 2003 en nuestro pais per 5U toxicidad
59
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65
ANEXOS
66
ANEXO A RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AlSLADA DE i
PEPINO it
Referencia Pepino 1 Fecha 06122002
IEXCELENTE IDENTIFICACION
Latto plantarum 1
Galeria API 50 CHL V50 Leida el 06122002
Perfil - -- - ++ - -- - ++++ - - -+- + - I I I I I I I I +t+ - +f- ~ - - + + ~ - - - +- + - shy
o - GLY - ERY DARA - LARA + RIB + DXYL - LXYL - ADO - MDX - GAL + GLU + FRU + MNE + SBE - RHA - DUL - INO bull MAN + SOR - MDM + MUG shyNAG + AMY + ARB + ESC + SAL + CEL + MAL + LAC + MEL + SAC + TRE + 1NU - MLZ + RAF + AMD - GLYG - XLT - GEN + TIJR + LYX - TAG - DFUC shyLFUC - DARL + LARL - aNT + 2KG - 5KG shy
--- Taxones significativos rd -----T -- Tests en contra
Lactoplantarum 1 999 092 1
Taxon siguiente Lactobrevis 1 OJ 044 3
i i
Lactoplantarum 1 1 test (5) en contra
D-SORBITOL (SOR) 78
Tax6n siguiente Lactobrevis 1 3 test (s) ert contra
METHYLD-MANNOSIDE (MOlM) 0 MELEZITOSE (MLZ) 14 D-TURANOSE (TUR) 14
67
ampb
ANEXO B RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AISLADA DE REPOLLO FERMENTADO
~
Referencia Repollo fermentado - 3 Fecha 03072003
EXCELENTE IDENTIFICACION
Lactoplantarum 1
Galena API 50 CRL V50 Leida el 03072003
Perfil - - ++ - - - - -H++ - - ~ + - + - I I 1 I I I I -H+ - ++ - - - + + - -- - - + - shy
o - GLY - ERY - DARA - LARA + RIB + DXYL - LXYL - ADO ~ MDX - GAL + GLU + FRU + MNE + SBE ~ RHA - DUL - INO - MAN + SOR - MDM + MDG shyNAG + AMY + ARR + ESC + SAT + CRL + MAL + LAC + MEL + SAC + TRE + lNU - MLZ + RAF + AMI) - GLYG - XLT - GEN + TOR + LYX - TAG - DFUC shyLFUC - DARL - LARL - GNT + 2KG - 5KG shy
------Taxones significativos _ _----- Id--- ---T---- Tests en contra
Lactoplantarum 1 999 095 1
Tax6n siguiente Lactobrevis 1 01 OA8 3
lJactoplantaru01 1 1 test (s) en contra
DSORBITOL (SOR) 78
Taxon siguiente Lactobrevis
METHYL-D-MANNOSIDE D-TURANOSE
1
(MOM) (TOR)
3 test (5) en contra
0 MELEZITOSE 14
(MLZ) 14
i
I
68
ANEXO C RESULTADO PRUEBAS BIOQUWICAS DE CEPA AISLADA DE MUCOSA HUMANA
Referenda Mucosa - 5 Fecha 27012003
BUENA IDENTlFICACION
Galeria API 50 CHL vso Leida el 270112003
Perfil - - - - +t--t - - - + - + - - - - - - - - -+- - - - - + - + - - - - - - - - - - - - - bull - - -+ - +
o - GLY ~ ERY - DARA bull LARA + RID + DXYL + LXYL - ADO bull MDX - GAL + OLU - FRU + MNE - SBE - IlliA - DUL - INa - MAN - SOR - MDM - MOO shyNAG + AMY - ARB - ESC ~ SAL bull CEL - MAL + lAC - MEL + SAC - TRE shyINU - MLZ - RAF - AMD - GLYG - XLT - GEN - 11JR - LYX - TAG - DFUC shyLFUC - DARL - IARL - ONT + 2KO - 5KG +
- - - - - - Taxones significativos - - - - - - - Id T -- Test en contra
Lactobrevis 3 963 088 1
Taxon siguiente Lactoco11inoides 36 075 2
Lactobrevis 3 1 test (s) en contra
GLUCOSE (GLU) 95
-~~~------------~---------------------------~--~-------~--~-----~----------~--------~------------~~--Taxon siguiente Lactocollinoides 2 test (s) en contra
GLUCOSE (GLU) 100 MELIBIOSE (MEL) 25
69
i r
ANEXO D RESULTADO PRUEBAS BIOQIJiMICAS DE CEPA AISLADA DE LECHE FERMENTADA
Referenda Leche fennentada ~ 13 Fecha 27012003
BUENA IDENTIFICACI6N
Galeria API 50 CHL V50 Leida el 270112003
Perfil - - - - -t-t+- - - - + - + - - - bull - - - - -+- - - - - + - + - - - - - - - - - - - - - - - - -+ - +
0 - GLY - ERY - DARA - LARA +Rll3 + DXYL + LXYL - ADO - MDX ~GAL + GLU - FRU + MNE SBE - RHA DUL bull INO MAN - SOR MDM bull MDG shy
~NAG + AMY - ARB - ESC - SAL - CEL - MAL + LAC - MEL + SAC - TRE I lNU - MLZ - RAF - AMD - GLYG - XLT - OEN - IUR LYX - TAG - DFUC bull i
LFUC - DARL - LARL -ONr + 2KG - SKO + 1
- -- - - Taxones significativos - - Id -- T --- Test en contra
Lacta brevis 3 963 088 1
Taxon siguiente Lactocollinoides 36 075 2
Lactobrevis 3 1 test (s) en contra
GLUCOSE (GLU) 95
-----------------------------------------------------------~------------------------------~-------------------Taxon siguiente Lactocollinoides 2 test (s) en contra
GLUCOSE (GLD) 100 MELffiIOSE (MEL) 25
70
II iJ1
I
I ANEXO E RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AISLADA DE REPOLLITAS DE BRUSELAS FERMENTADA
Referencia repollitas de bruselas 15 Fecha 03072003
EXCELENTE IDENTIFICACION
Lactoplantarum 1
Galeria API 50 CHL vsO Leida el 03072003
Perfil - - - - +t - - - - +H+ - +- - +t + - I I I I I I I f ++t - + - - - -+ + - - - -+ -+ - - I ij
o - GLY - ERY - DARA - LARA + RJB + DXYL - LXYL - ADO - MDX - GAL +
GLU + FRU + MNE + SBE RHA + DUL - INO - MAN + SOR + MDM + MOG shyNAG + AMY + ARB + ESC + SAL + eEL + MAL + LAC + MEl + SAC + TRE + i
I1NU - MLZ + RAF AMD GLYG - XLT - aEN + TUR + LYX - TAG - Druc LFUC - DARt + LARL - aNT + 2KG - 5KG shy n ----Taxones significativos ------ Id Tests en contra
Lactoplantarum 1 999 090 o
Taxon siguiente Lacto pentosus 01 012 7
Lactoplantarum 1 o test (s) en contra
Taxon siguiente Lacto pentosus 7 test (8) en contra
GLYCEROL (GLY) 75 D-XYLOSE (DXYL) 100 L-RHAMNOSE (RHA) 25 METHYL-D-MANNOSIDE (MOM) 1 MELEZITOSE (MLZ) 25 RAFFINOSE (RAF) 75 D-ARABITOL (DARL) 0
71
~
I i I
ANEXO F - ANALISIS DE REGRESION PARA pH EN BEBIDA SIN AVENA
Aruilisis de regresi6n polinomial
---~-~-------------------------------------------~-----------~~---------------------~--------------Variable dependiente pHSinAvena ---------------------------~-------------~--------------------~---------------------------------
Error T Parametro Estimado Estandar Estadistico P-Valor
CONSTANTE 535606 0094535 56657 00000 Dia -0150565 0020706 727154 00000 Dia2 000504434 0000871488 578819 00001
---~---------------------------------------------------------------------------------------------------
Anfllisis de Variama -------------------------------------------~-----------~-----------------------------~-~--- jSource Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor 11
------------------------~------------------------------------------------------------------------------~ Mod-elo 155772 2 0118861 4256 00000 Residual 0237877 13 00182983
Total (Corr) 11956 IS
R2 == 867522 percent
pHSinAvena == 535606 - 0150565Dia + 000504434Dia2
72
____
middot ANEXO G - ANALISIS DE REGRESION PARA pH EN BEBIDA CON AVENA
AmUisis de regresion polinomial _____~_____~__-_____~___4____________________bull____bull__________bull_____________~~----_------___________
Variable depcndiente pHConA vena ------------------------------------------------------------------------------------------~--------
Error T Parametro Estimado StAndar Estadfstico P-Valor
---------------------------------------------~-----------------------------------------------_---------CONSTANTE 534463 00801045 667208 00000 Dia -0140407 00175453 800253 00000 DiaA 2 000448098 0000738458 606803 00000
----------------------~---~-----------------------------~------------------------------~----AmUisis de Varianza
---~---------------------------------~---------------------~------------~-------------------~------Source Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio PValor --------------------------~-----------------------------------------------~------------~-----~~--~ ModeJo 159575 2 0797873 6073 00000 Residual 02170798 middot13 00131383 _______~_~ ~_~----------~------~--~-----~-M-----~-----____ _____________~-----------------------Total (COlT) 176654 15
R12 903315 percent
-----------~------------------------------------------------------------------------~-----------pHConAvena 534463 - 0140407Dia + 000448098DfaA 2
73
ANEXO H - ANALTSIS DE REGRESTON PARA ACIDEZ EN BEBJDA SIN AVENA
An8Jisis de Regtesi6fi P6lifJomial
Variable Depefidiefile~ AcidezSinAVenll _______________w_____~______~________________~-----------_________~_________________~~____~___~_____
Error T Pariirnetro Estimado Estandar Estadistico ---------------------------------------~--------------~-~-------~--------------------~------------CONSTANT 0491697 00123217 399051 00000 Dia 00436032 000269882 161564 00000 D1a2 -000144613 000011359 127312 00000 __w___~________________________~-_______-_____~----____________________________~__~---~_--__~___
AriiiJisis de varianza ~_~__~__________~_~____~________~___________- _________e_____________________________bull _____-________
Source Smn de cuadr Df Mean Square F-Ratio PmiddotValor_~~___________________________________bull ______~___________bull ____________bull ______~________w________________
Model 0135203 2 00676013 21747 00000 Residual 000404118 13 000031086
Total (Corr) 0139244 15
R2 970978 percent
AcidezSlnAvena 0491697 + O0436032Dia - 0OOl44613Dia2
74
I
ANEXO I ANALISIS DE REGRESION PARA ACIDEZ EN BEBIDA CON AVENA
1
Anwisis de tegtesi6fi polinomial
Variable dependiente Acidez Con Avena
Error T ParametTo Estimado Stlindar Estadfstico P-Valor ----------------~-------~---------------------~-----------------------------------------------------CONSTANT 0491639 000926607 530578 00000 Diamiddot 00406572 000202955 200326 00000 DfaA 2 0000982559 0000085421 -115025 00000
-------------~----------------------------~-------------------------~-----------------------------------
-------------~-----~~-----------------------------~---------------------------------------------_--Source Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio PValor
-~-------------~----------------------------------~------------------~~-------------------------- Modelo 0288008 2 0144004 81914 00000 Residual 000228539 13 0000175799
----------~~--------------~---------------------------------------------~---------------------------Total (Corr) 0290294 15
RA2 = 992127 percent
-------------------------~----~---~------------~---------------------------------~---------------~
AcidezConAvena == 049163amp + 00406572D1a - 0000982559DiaA2
75
I
(Ilmiddot il
ANEXO J- ANALISIS DE REGRESION PARA RECUENTO LACTOBACILOS PARA BEBIDA SIN AVENA
Amilisis de regresion - Modelo lineal Y = a + bX
------------------------~----------------------~-----------------------------~----------~-----------Variable Dcpendiente LactobacilJusSinAvena Variable independiente Dia
I--------~----------~-----------------------------------~-------~-~--~--------------------------~-Error T
Paramctro Estimado Standard Stadistico P-Valor
----~----~------------~-----~-----------------------~-------------~-----------------------------Intereepto 117347 0389973 300911 00000 Pendiente 00483464 00257889 18747 00903
Analisis de Varianza
---------~------------------~----------------~---------------------------------~---------~----------Source Sum decuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor
------------~---------------------~---------------------~--------------------------------~-----~----Modelo 0916252 1 244835 443 00616 Residual 260706 10 0260706
--~------------~---~------------------~~~-----~-------~---------~~-------------------------------------Total (Corr)352332 11
Coeficiente Correlaci6n = 0509955 R2 = 260054 percent
LactobacillusSinAvena= 117347 + 00483464Dfa
76
ANEXO K- ANALTSIS DE REGRESION PARA RECUENTO LACTOBACILOS PARA DEBIDA CON AVENA
Aruilisis de regresion - Modelo lineal Y = a + hX
Variable Dependiente LactobacillusConAvena Variable Independiente Dia ---~--------------------------------------------------------__-----------__--_--_-----------shy
Error T Paramctro Estimado Standard Estadistico P-Valor -~--------------------------------------------------------------------------------------------------
Irttercepto 118103 0567963 207942 00000 Pendiente 00790304 00375594 210414 00616
-----------------~----------------------------~----~-------~----~----------------------------
Analisis de Varianza
----------------~----------------~------------------~--------------------------~------~--------shySource Swn de cuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor
-----------------~--~--------------------------------------------------------------------------~---~ Mode10 244835 1 244835 443 00616 Residual 552997 10 0552997
Total (Corr)797832 11
Coeficiente Correlacion = 0553964 RI2 = 306875 percent
-----~--------------------------------------------------------~--------------------------------------
LactobacillusConAvena = 118103 + 00790304Dfas
77
significativo en los niveles de gA a IgM datactadas en los lavados
broncoaJveolares y se observ~ un afecta dependiente de la dosis
1157 En el tratamientoy prevenci6n del eczema
Se ha encontrado que el consumo de probi6ticos mejora la inflamaci6n alergica 0
eczema at6pico en ninos alimentados con formula suplementada con probi6ticos
Encontraron una mejora significativa al suministrar Bifidobacteriummiddot actis y
Lactobacillus GG en 27 niiios con edad promedio de 46 meses Luego de aplicar
este tratamiento se sometieron a una prueha de SCORAD (mide fa extension y
gravedad del eczema) registrando una meJoria significatlva en las condiciones de
la pie concentraci6n de citoquinas cirClllantes an sueto y moleculas de adhesi6n
a las superficies de las celulas soJubles en suero (Isolari 2000)
Se realizaron otros estudios a 159 mujeres embarazadas con historia familiar de
eczema atopico de primer grado a las cuafes sa res 5uministro dosis diarias de
Lactobacillus GG durante 2 a 4 samanas previas al parto Oespues de ella fa
madres twiaron la opci6n de continuer tomando el ptobi6tico si amamantaban 0
bien darseio vIa oral La mayoria de las madras eJigieron dar las dosis at bebe
diariamente A los dos anos de vida se observ6 una disminuci6n del 50 en la
frecuencia del eczema at6pico en aquellos nHies que se les dio ef probi6tico
(Kalliomari etal 2001)
22
1158 Previenen infeccion en heridas quirurgicas
Los probi6ticos impiden la union de pat6genos a las superficies celulares en
heridas mediante la seCreci6n de proteinas Actuamente se encuentra en
estudio la aplicaci6n del Lactobacillus fermentum vivos sabre heridas en piel de
ratas y se ha encontrado una disminuci6n del 90 en la colonizaci6n par parte del
StaphylococcuS aureus uno de los patogenos mas temidos y de mayor lncidencia
en infecciones hospital arias mas aun se esta contempiando la posibilidad de
utilizar la protein a purificada an lugar de los mjcroorganismos para la protaccion
contra infecciones en heridas (Strauss 2000)
12 PREBIOTICOS
Son carbohidratos de cadena corta algunas veces reconocidQs como
oligosacaridos no digeribles par las enzimas del epitelio intestinal 0 de las
gliJnduJas anexas debido a su estructura quimica y de esta manera lIegan al
intestino grueso donde alcanzan a estar disponibles para la fermentaci6n por las
bacierias sacaroHticas que son especial mente laetobadlos y bifidobacterias
dando odgen a compuestos que ejercen efectos funcionales sobre la mucosa del
tubo digestivo (Brunser 2001)
Se consideran como tal algunos fructocligosacaridos isomaltooligosacariclos
oligomato palatinosa poHdextrosa pOJidextrrna raftilina y algunos oligosacaridos
23
)
de 1a soya y fa avena Estenmiddot presentes en alimentos como Ie cebolla ajo
banano puerros 1 derivados del trigo achicoria esparrago alcachofa (Cummings
etal 2001)
Algunos de estos prebi6ticos cuanda son incorporado$ a fa dieta en cantidades
dalerminadas alteran la microbiota intestinal disminuyendo los recuentos de
coliformes bacteroides y cocos y aumentando las bifidobacterias hasta en diez
veces ademas modifican la actividad metab6lica del coron logrando una
disminuci6n del pH y un incremento en el contenido fecal de acidos grasos de
cadena corta como at acatica propi6nico y butfrico El butirato aumen~ _I grosor
de la pared del coron e intestino delgado estimula eJ crecimiento de la mucosa del
colon y auManta su flujo sangufneo inhibe el crecimiento de tinsas tumorales
epiteliales de origen co16nico induce la diferenciaci6n de sus celulas y a
apoptosis entre otros(Brunsar 2001)
Eh estudios hechos en simuladores del intestino humano utilizando productos de
avena fermentados se encontro que estimularon al crecimiento tanto de
lactobacios como de bifidobacterias y en el caso de estas ultimas se incremento
la producci6n de los acidos acatico propionico y butfrico 10 que incide sobre la
implantacion de probi6tico$ e inhibe al crecimientos de otro tipo de
microorganismos (Alal1der eta1999 Kontula etal 1998 Jaskari etal 1998)
24
~ -1
(
AI comparar el comportamianto de las leches de diferente origen se ha
demostrado que Ie leche de vaca contiene caseinatos sustancias que forman
buffer ~n et intestino e inlpiden que los probi6ticos disminlJyen el pH del intestina
y de esta manera se impide al efecto deseado que es evitar fa proliferaci6n de
otros microorganismos entre los cuates pueden estar algunos patOganos En la
leche materna sa encuentran algunos carbohidratos como glucosa galactosa n
acetilglucosamina y algunos 0lig6meros de Ie fucosa en cOhoontracionesmiddot
importantes los cualeS favoreceh el crecimientc)middot de probi6ticos esto
complementado can 91 bajo contenido de protenas que se traduce en una
reducida capacidad buffer hacen de Ie lache materna IJn alimentd adecuado para
nllios en su etape de lactancia
Algunos prebi6ticos como 1a lactulosa yciertos compuestos que contiansn fructosa
no son digeridos en el intestino humano y pueden sar utilizados selectivamenta
par los probi6ticos 10 que hace que los probi6ticos en combinaci6n can prebi6ticos
pueden lIegar a ser un importante medio para prevenir algunas enfermedades del
tracto gastrointestinal (Bezkorovainy 2001)
25
2 METODOlOGfA
21 LOCALIZACION
EJ trabajo sa realizo en el laboratorio de Microbiologia y la planta da laches de Ja
Universidad Naclonal de Colombia- Secie Medellin
En al laboratorio se hiZQ al aislamiento a identificaci6n de fa capas y en fa Planta
sa eJaboro la leche fermentada con 1a cepa seleccionada y el prebi6trco
22 METODOS
221 Aisiamiento de cepas nativas
Las cepas nativas se sislaran de producto$ vegetales leches fermentadas y
mucosa vaginal humana
2211 De vegetales
Las muestras vegetales de repollo repollitas de brusefas y pepino se
seleccionaron porcionaron y mezclaron can cloruro de sadio al 10 pIp se
calacaron en un recipienta de vidrio balo anaerobiosis y sa dejarQn por 15 dias
26
luego S9 tomaron 3 ml de cada muestra y se jnocularon 9 ml de caldo MRS (Man
Rogosa and Sharpe) se incubaron a 37deg C durante cinco dias en camara de
anaerobiosis (Ver Figura 1) Oespues de este tiempo sa inocularon cajas de petri
con agar MRS con 1 ml del cultivo microbiano y se incubaron bajo las mismas
condiciones que eJ caldo Este procedirniento se realiz6 rapetidas veces hasta
seleccionar la cepa pura mediante observaci6n de caracteristicas morfologicas de
la cOlonia y a cada colonia se Ie practico la coloracion de gram con el fin de
observar las caracteristicas microscopicas de cada una e identificar las de mayor
similitud a los Lactobacilos y Bifidobacterias
Figura 1 Camara de anaerobiosis
27
2212 De la leche
Sa tomo 200 ml de teche cruda de la planta de leches y se colaca a fermentar
baja anaerobiosis durante 15 dras Luego sa procedia como en los vegetales
2213 De mucosa vaginal humana
Se tomo una muestra de frotis de mucosa vaginal humane can capito esteril sa
puso a ncubar en Caldo MRS y se procedi6 camo en 2211 y 2212 A cads
aislado sa Ie practico la coloracion de gram y sa seleccionaron aquellas que eran
bacilos gram positivos (Ver Tabla 2)
28
TABLA 2 Fuente de aislarniento de cepas nativas
CEPA FUENTE
1 Pepino fermentadQ
2 repollitas de bruselas fermentadas
3 Repolltgt fermentado
4 Repollo fermentado
5 Mucosa va~inal humana
6 Mucosa vaginal humana
7 repollitas de bruselas fermentadas
8 Repollo fermentado
9 repollitas de bruselas fermentadas
10 Mueo~a vaginal humana
11 Repollo fermentado
12 RepolJo fermentado
13 Leche fermentada
14 Mucosa vaginal humana
15 repollitas de bruselas fermentadas
16 Repollb fermentado
29
222 Almacenamiento de las cepas aisladas
Cuando las cepas crecieron en agar MRS homogEmeas en color morfologia
coloraci6n de Gram etc se pssaron a agar inclinado en tuba se cubrieron con
aceite mineral y se guardaran en refrigeraci6n a 4deg C para tomar de alii la cepa y
efectuarle las diferentes pruebas para confirmar el genera y determinar la especie
de cada una de eas (Ver Figura 2)
Figura 2 Cepas en tubos con agar inclinado
30
223 Pruebas para determinar et genero
2231 Coforaci6n de Gram
A cada cepa sospechosa de Lactobacilos se 1e hizo la coloraci6n de gram y se
seleccionaron las gram positivas
2232 Morfologfa
En agar MRS y despues de incubar en anaerobios~s crecian colonias grandes
cremosas de color beige con bordes homogeneos y c6ncavas(Ver Figura 3)
Figura 3 Colonias aisladas en agar MRS
31
2233 Prueba de esporulaci6n
A cada cepa aislada se Ie hizo esta prueba la cuel consistia en incubar en
aerobiosis durante ocho dias las cajas de agar MRS donde crecieron colonias de
Lactobacilo$ y luego se les (ealize) coloraci6n de espora Las capas que dieron
negativa a la prueba de espora se considararort sospechosas de sar Lactobacilos
y se continuo con la prueba de la catalasa (Ver Tabla 3)
2234 Prueba de la catalasa
los lactobacilos carecen de catalasa Eata prueba se hizo tomando una colonis
se deposito en vidrio de reloj y se Ie adicion6 dos gotas de peroxida de hidr6geno
(H202) la que no presentaba efervescencie eran cepe sospechosa de ser
Lactobacilo (Ver Tabla 4
Sa seleccionaron las capas euyo resultado fue aeorde con el genera Lactobacilfu$
y se continuo con la comirmaeion del genera y determinacion de la eSpecie
meqiante las pruebas bioqulmicas
32
224 Prueba para determlnar la especie
Para confirmar el genero y determinar la especie de las diferentes capas aisladas
se hizo una caracterizaci6n bioqufmica utilizando un kit de API 50 CHL Medium
Ref 50 410 que contiene una galed8 de medios que permite realizar el estudio
de fermentaci6n de los 49 azucares de 52 especies de Lactobacillus (Ver Figura 4
y tabla 5)
Figura 4 API CHL 50-Prueba bioquimica
33
225 Pruebas para determinar microorganismos probi6ticos
2251 Resistencia a pH=2 y sales biliares de concentraci6n O3pv
A las cepas idantificades como Lactobacillus brevis y Lactobacillus pantarum sa
las realiz6 Ie prueba dfl resistencia a pH=2 y sales biliares de concentraci6n 03
pv ( Jacobsen et al 1999) Una colonia de cada cepe aislada se inocul6 en 4 mt
de caldo MRS durante cinco dras bajo condiciones de anaerobiosis Oespues de
esta tiempo se dejaron pracipltar los microorganismos por sedimentaci6n se Ie
retire el sobrenadante y al precipitado se Ie adicion6 Sml de caldo MRS
previamente ajustado a pH=2 can seido clorhfdrico (HCI) dentro del mismo tuba de
ensayo G igual sa hizo can otro tubo previamente incubado pero a este se Ie
adiciono 5ml de caldo MRS con sales biliares a una concentra~i6n de 03 plv y
ambos se incuberon a 37deg C por 2 haras Sa midio 01 mi de cada uno de los
tubas al tiempo 0 y a las 2 horas y sa inoculeron en superficie en caJas de petri
con agar MRS S9 incubaron a 37deg C bajo anaerobiosis durante 48 horas Se
compararon visualrrente en cada caja de petri el crecimiento en superficie y las
que presentaron crecimiento en tos dos tiempos (0 y 2 horas) tanto en at media
acido como en sales I se consideraron resistentes a pH=2 y sales biliares (03
pv)
(Ver Tabla 6)
34
226 Conservacion
Todas fas capas que habian dado positiva Jas pruebas anteriores y que reaultaron
resistentes a pH=2 y sales biliares 03 pv y despues de identificadas en API 50
CHL sa repicaron en agar MRS en tuba inclinado y despues de Incubar a 37deg C
por 48 horas bajo anaerobiosis se Ctlbrie el biser completamente can aceite
mineral esteril y sa guardaron en refrigeraci6n
227 Elaboracj6n de fa bebida fermentada
2271 Preparaci6n de la mue$tra
Sa tome 1 mt de caldo MRS previamante inoculado e incubado que presentaba
una concentracion de Lactobacillus brevis de 27x108 Iml segun la escaJa de Mac
Farlan y sa adiciono a 9ml de leche pasteurizada en un tubo sa dej6 incubanda
en anaerobiosis por 48 hores Luego se pasaron estos 10 ml a un frasco qua
cont~nie 90 ml de leche pasterizada y se dej6 incubando par 48 haras en
anaerobiosis
35
2272 Adici6n del inOculo
A 900ml de leche pasteurizada se Ie adicion61os 100 ml de leche que habia sido
previamente ino(ulada dos veces con la cepa posteriormente se deja
fermantando la lache a temperatura de 37deg C
2273 Control de Ja fermentaci6n
Las muestras se hicieron por cuadruplicado y se les hizo un seguimiento de
aoidez hasta un valor entre 04 y 05 expresada como Bcido lactico esta
procedimiento corresponde a la babida fermentada sin prebi6tico La bebida ~on
prebi6tico tiene al mismo proeedirnianto pero adicionalmente se agrag6 avena a
una concentraci6n de 05 en el momento de la adici6n del in6e410 a los 900 ml
de leehe pasteurlzada y el procedimiento sigui6 igual al de la bebida sin prebi6tico
tambien se hizo por cuadruplicado
2274 Refrigeracl6n
Despues que las mezclas con y sin prebiotico alcanzaron el de acidez
requarido se IIeva ron a refrigeraci6n a una temperatura de 4deg C p~r 24 horas
para frenar proce~os metab6licos de los microorganisrtlos Despues de este
ti~mpo se procedi6 al batido
36
1 2275 Batido
Con un agitador se procedi6 a batir las bebidas para romper et coagulo formado
y de esta manera homogeneizar la mazela y obtener asf la bebida fermentada
2276 Envasado y almacenamiento
Ambas bebidas se envasaron en frascos vidrio para hacerles seguimiento de pH
acidez(expresado como acido tacticol y recuento de Lactobacillus breviSf los
dies 27 14 Y 21 despues de elaboradas las bebidas perfodo durante el cualta
muestra permanecfa afmacenada a temperatura de refrigeracion(Ver Figura 5
37
Fjgura 5 Diagrama de Flujo
PREPARACION DE LA MUESTRA
ADICION DEL INOCULO
~_____~_B~ATIDO~______~
INCUBACION 37deg C hasta acidez = 04-05 acido laotico
ENFRIAMIENTO
hasta 4 0 C ~------~ ~------~
ENVASADO Y ALMACENAMJENTO
dUrante 21 dfas a Temperatura 4 0 C
38
1
228 Determinaci6n del pH
Se determino por el metoda potenciometrico en un pH-metro manual durante los
dias 2) 7 14 Y 21 de las bebidas lacteas sin y con prebi6tica (Ver Tablas 7 y 8)
229 Oeterminaci6n de la acidez (Expresadfl como acido
lactica)
Se tomaron 9 mJ de las bebida~ sa Ie adicionaron 2 gotas de fanoftaleina como
indicador y sa titulo fa acidez con NaOH 01 N hasta la aparicion de un cotor rosado
debit EI volumen de NaOH utilizado se reporta como valor de de acidez
(VerTablas 10 y 11)
2210 Prueba de viabilidad
Qurante el perfoda de almacenamiento de la bebida lactea se procedi6 a hacer la
prueba de viabiHdad en los dias 7 14 Y 21 para determinar Si los lactobacilfus
permanecfan vivOs a una concentraci6n minima de 106 hasta el dia 21 como 10
establece eJ Articulo 10 de la Rasolucion 2310 del Ministerio de $alud de
Colombja
39
Para asta prueba se tamaron 10 rnl de muestra y se adicionaron a 90 ml de caldo
MRS ruego a partir de esta se hicieron diluciones de 10-2 hasta 10-11 de las
diluciones 109101deg 10-11 se inocul6 1 ml de cada uno en agar MRS siguiendo el
metodo de siembra en profundidad y por duplicado e incubando a 370 C x 5 dras
en anaerobiosis y luego se hicieron tos recuentos por duplicado para esi reportar
los recuentos promedio (Ver Tablas 13 y 14)
2211 AniUisls microbiol6glco de las bebidas Iicteas(con y sin
avena)
Con el fin de determinar las condiciones higienico-sanitarias del producto se
realizaron las pruebas microbiol6gicas de Recuento de mohos y fevadurasml en
agar OGY Recuento en superficia de Staphylococcus coagulasa positivoml en
agar Baird Parker Numero Mas Probable (NMP) de coUfor-mes totales y
Escherichia coliml en caldo Fluorocult y Presencia de Salmonela25ml con BHI
caldo tetrationato y agar Hecktoen (Montoya 1999)
(Var tabla 16)
2212 AnaUsis estadistico
A los datos obtenidos en la medici6n de pH acidez (expresada como Beido
laclico) en los dras 2714 Y 21 y el recuento de Lactobacillus en los dras 714 y21
40
realizados a los dos tratamlentos se tes aplic6 1a prueba t porque solo difieren
en la presencia 0 ausencia del prebi6tico para evaluar si habra diferencia
estadfsticamente significativa para los dos tratamientbs(Ver Tablas9 12 y 15)
41
3 RESULTADOS Y DISCUSION
31 Coloraci6n de Gram y morfologfa
Las cepas aisladas fesultaron Gram positivas (Ver Figura 6) colonias grandes
cremosas dE) color beige con bordes homogeneos y c6ncavos en su
morfologia (Ver Figura 3) resultando de acuerdo a 10 especificado en Stanley
1989 para Lactobacillus
32 Prueba de esporulaci6n y cataJasa
Los resultados de la pruebas de esporulaci6n y catalasa indicados en las
Tablas 3 y 4 respeclivamente dieron conforme a 10 especificado en Stanley
1989 para Lactobacillus
42
1
2 3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
TABLA 3 Resultado de prueba de esporuJaci6n
CEPA RESULfADO ESPORULACION
-- -------------
43
l i ~II bull ~ I I
TABLA 4 Resultado prueba de la catalasa
CEPA RESULTADO CATALASA
1 -2 -3 -4 -5 -6 -7 8 -9 -10 -11 12 -13 -14 -15 -16
3~3 Prueba para determinar la especie
Oespues de hacer las pruebas para seleccionar las cepas sospechosas de ser
Lactobacillus se realizo las pruebas bioquimicas fograndose identificar
Lactobacillus plantarum aislctdo de pepino repollo y repollitas de bruselas
44
fermentados y Lactobacillus brevis de mucosa vaginal y leche fermentada (Ver
Anexos del A al E y Tabla 5)
TABLA 5 Resultado identlficaci6n cepa~
CEPA NOMBRE
1 Lactobacillus planfarum
3 Lactobacillus plantarum
5 Lactobacillus brevis
13 Lactobacillus brevis
15 Lactobacillus plantarum
34 Pruebas para determinar microorganismos probi6ticos
las cepas de Lactobacillus brevis y Lactobacillus plantarum mostraron
rasistencia al medio acido de pH =2 Y sales biliares 03 pv resultado similar al
encontrado por Jacobsen et al 1999 para Lactobacillus plantarum (Ver tabla 6)
45
middot
~~~ttiI lltlmiddot~COX~dtJ ~xtc_~ 2 tr~ k-JlL~middot
-)~~TO DE lJIBUOTECUl rjRL]OTtCA twn GO1IU1
TABLA 6 Resultados a pruebas de resistencia a pH=2 y sales biliares 03 plv
CEPA RESISTENCIA pH=2 RESISTENCfA A SALES BIUARES ()3 pv
1 + +
2 + +
3 + +
4 + +
5 +
6 + +
7 + +
8 + +
9 + +
10 + +
11 + +
12 + +
13 + +
14 +1shy +M
15 + +
16 + +
+1 crecimiento debil
+ crecimiento abundante
46
Figura 6 Lactobacillus brevis Gram + aislado de leche fermentada
Ai observar en placa las celulas de lactobacilos despues de real1zar las pruebas
de resistenCia a la acidez y sales biliares se observo una tendencia a aglomerarse
posiblemente como un mecanismo de proteccion cOlitra estos medios que pueden
lIegar a ser adversos para elias (Ver figuras 7 y 8)
47
Figura 7 Lactobacillus brevis aislada de leche fermentada despu~s de la prueba de resistencia a pH=2
Figura 8 Lactobacillus brevis aislada de leche fermentada despues de la prueba de resistencie asales biUares 03 plv
fI
48
35 --Seguimiento del-pH-en-la-bebidaJacteacon y sin -prebi6tico
A continuacion se muestran las Tablas 7 y 8 donde sa registian los datos
recopilados de pHdurante 10$ dras Z 7 14 Y21 para las bebidas laaeas con ysin
prebi6tioo
TABLA 1 ResultadopH yogur sin avena
Dia Repetition 1 Repetici6n 2 Repeticion 3 Repetici6n 4
2 526 501 51 52
7 446 433 438 44
14 439 435 437 436
21 439 437 438 437
TABLA 8 -ResultadopHyogur con avena
Dia Repeticion 1 Repeticion2 Repeticion 3 - Repeticion 4
2 509 523 51 515
7 447 442 445 442
14 436 -438 439 437
21 432 433 435 434
Observando la Figura 9podamos ver que el pH en el -dfado$ para los dos
tratamientos as igual y empieza a descender rapidamente para estabilizarse a
partir del dra 7(Ver figura 9)
49
Figura 9 Comparacj6n de medias para -el pH
Comparaci6n de medias para pH
55 ~ 5 +----=gtIIIi-~i~~----=-r--it~ -- pH sin avena
a 45 1--~~~~=~~ 4 --- pH con
avena35 t-----r-- -------=------=--= ------- - ----
2 7 14 21
Dias
Aplicando la prueba t para comparar las medias de pH I S6 muestia una diferencia
altamants significativa en los dos tratamientos para el dia 21 (pltO05)
(Ver tabla 9)
TABLA 9 Compaiaci6n de medias para pH
DtAS SIN AVENA CON AVENA te p (VALOR)
2 514 514 0 10
7 439 444 -1 61 0159
14 437 I
438 -070 0510
21 438 433 528 00019 shy
- DiFERENCIA AlTAMENTE SIGNIFICATIVA
50
I
AI aplicar regrasi6n a los datos sa obtiene al modelo estimado
pHSinAyena =535606 - 01505650Ia +0005044340IaI2
La variabilidad en la respuesta de pH asta siendo explicada en un 8S7522 por
el modelo (Ver Anexo F)
EI tratamiento con avena mostro el siguiente modelo al analisis de ragresi6n
pHConAvena =534463 ~ 0140407Dia + 0004480980Ia2
La variabilidad an la respuesta de pH asta siendo explicada en un 903315 par
el nlodelo(Ver anexo G)
36 Seguimiento de la acidezmiddotmiddot expresada comomiddot de acido
lactico
A continuaci6n sa muestran las Tablas 10 y 11 donde sa registran los datos
tecopilados de acidezmiddotdurante los dias 27 14 Y 21 para las pebidas taetees con y
sin prebi6tico
TABLA 10 Resuttadode acidez (expresadocomo acido tactico) yogurt sin avena
CIA R~petici6n1 Repeticion2 Repetici6n 3 Repeticion 4
2 054 06 057 058
7 072 074 073 0]2
14 080 083 082 082
21 0]4 079 078 077
51
TABLA 11 Resultado de aCidez (expresado como acido Icktico) yogurt con avena
Dia Repetici6n 1 RepetiCi6n 2 Repetici6n 3 Repetici9n 4
2 059 055 058 057
7 071 073 072 072
14 089 087 088 086
21 092 091 090 091
Observando la Figura 10 se puede concluir que la acidez empieza a aumentar
hasta el dia 14 y luego trata de estabilizarse para los dos tratamientos
(Ver figura 10)
Figura 10 Comparaci6n de medias para la acidez
N G)
Comparacion de medias para acidez
1
2 0I 5 -+--=--------=-~~~= u
ltC
- Acidez sin avena
2 7 14
Dias
52
21
-it- Acidez con avena
Aplicando la prueba t para camparar las madias de acidez se muestra una
diferencia altarnante significativa en los dos tratamiantos para los dias 14 y 21
(pltO05)
(Var tabla 12)
TABLA 12Comparaci6n de medias para Acidez
DIASmiddot SIN AVENA CON AVENA te p(VALOR)
2 0572 0572 0 10
7 0727 0720 119 0278
14 0818 0875 -638 000070shy
21 077 091 -1212 i 0000019 shy
DIFERENCIA AL TAMENTE SlGNIFICATIVA
AI aplicar r~gresi6n a los datos se obtiene el modelo estimado
AcidezSlnAIena = 0491897 + O0436032Dia O00144613DfaA2
La variabilidad en la respuesta de acidez asta siendoexplicada en un 970978
por al modelo (Ver anexo H)
EI tratamiento con avena mostro elsiguiente modeloj a1 analisis de regresion
AcidezConAvena = 0491638 + 00406572Oia - OQOO982559OiaA2
La variabilidad enla respuesta acidez esta siendo explicadaen un 99212 por
el modelo (Ver anexo J)
53
I ~
37 Prueba de viabiJidad
A continuaci6n sa muestran las Tab~as 13 y 14 donde sa presentan los datos
recopilados del recuento de Lactobacilos durante los dias 7 14 Y 21 para las
bebidas lacteas con y sin prebi6tico
TABLA 13 Recuento de Lactobacilos (UFCml) yogurt sin avena
Dia Repetici6n 1 Repetici6n 2 Repeticion 3 Reptttici6n 4
7 1880X10l1 1454X1011 1642X1011 1780X10~
14 1560X10~ 646X1011J 1890X10l 140X10l1
21 1200x10lu 128Ox10u 1745x10J 1520x101V
TABLA 14 Recuento de Lactobacilos (UFCml) yogurt con avena
Dfa Repetieion 1 Repetici6n 2 Repeticion 3 Repeticf6n 4
7 1600X10lt 1240X10t 1640X10ll 1980X10t
14 540X1011 427X10n 546X10n 720X10ll
21 500x1011 492x1011 712)(1011 980x10~
AI analizar la Figura 11 sa puede observar un recuento mayor de Lactobacilos
en al tratamiento con avena resultado de acuerdo a 10 encontrado por Alander at
aI 1999 Kontula et aI 1998 y Jaskari et aI 1998
54
Figura 11 Comparaci6n de medias para Log Lactobacillus
Comparacion de medias para log Lactobacillus
~ 1350
-+- Sac Sin--() 13 co avenaIII
bull 125 -- Bac con 0)
0 12 avenaJ
115 7 14 21
Dias
Aplicando la prueba t para comparar las medias de recuento de Lactobacillus no
se encontr6 una diferenc1a estadfsUcamente significative entre los dos
tratamientos (Ver tabla 15)
Este aumento en al racuento influy6 en la disminuci6n del pH y en el aumento de
fa aeidez por la fermentacion que realizan los Lactobacillus sobre fa lactosa de la
lache y la avena adicionada como prebi6tico
55
1
TABLA 15 Comparaci6n medias lag Lactobacillus
DIAS SIN AVENA CON AVENA tc p(VALOR)
7 122257 122022 04846 06451
14 121065 132393 -19602 00977
21 129025 133087 -08236 04416
At aplicar regresion a los datos se obtiane al modelo astimado
LactobacillusSinAvena= 117347 + 004834640Ia
La variabilidad en la respuesta del recuento de LactobaCillus ssta siendo
explicada en un 260054 por el mod$loVar anexo J)
EI tratamiento con avena mostr6 al siguiente modalo al anal isis de regresion
Lactobacillu$ConAvena =118103 + 007903040Ias
La variabilidad en la respuesta de recuento esta siendo explicada en un 3068
por al modelo(Ver anexo K)~
38 Analisi$ microbiol6gicos de las bebidas lacteas con y sin
En la Tabla 16 estan recopilados los resultados microbiol6gieos obtenidos en ras
muestras con los dos tratamientos (con y sin avena)
I [
sa
TABLA 16 Resultados analisis microbiologico
Recuento de mohos y levaduras Iml lt10
Recuento de Staphylococcus coagulase positiva Iml lt100
NMP coliformes fotales y Escherichia coli Iml lt3
Presencia de Salmonella25ml Ausente
Los resultados de este analisis demuestran que las bebidas fermentadas con y
sin avena~ astan fibres de microorganismos patogenos
57
1
4 CONCLUSIONES
Se aislaron cepas nativas de Lactobacillus plantarum de las muestras vegetates
de repollo pepino repollitas de bruselas fermentadas y Lactobacillus brevis de
lache fermentada y mucosa vaginal humana Ambas cepas resistieran un pH=2 y
una concentraci6n de sales biliares det 03 ptv dos earacteristicas importantes
en los probi6ticos
Lamiddot cepa de Lactobacillus brevis aislada de lache Sa utiliz6 para elaborar una
bebida fermentada sin y con avana comoingrediente prebiotico obteniendose un
aJimento centon recuento del probi6tico viable durante 21 dras de seguimiento
ademas libre de microorganismos )at6gen05
No se encontr6 efecta significativo de la avena sobre Ie viabilidad del Lactobacillus
brevis aunque sa presento un aumento en 61 recuento de estos en la bebida con
avena
58
plusmn ~
5 RECOMENDACIONES
Ensayar la cepa de Lactobacillus plantartJm en productos carnicos madurados
como el salami
Ensayar la cepa de Lactobacillus l)revs en otros derivados lecteos como queso
quesito queso crema
Continuar con el estudio de estos microorganismos y caracterizarlos
molecularmente ademas de estudiar su capacidad de adherencja a fa mucosa
intestinal sobre algunes Hneas celulares como las CaCo~2
Estudiarel efedo de la avena sabre la viabiJidad del Lactobacillus breyis a una
concentraci6n mayor de 05
Realizer ensayos can las cepas de Lactobacillus brevis y Lactobrlcillus pJantarum
para elaborar masas acidas para panificacion reemplazando el Bromato de
Potasio aditivo prohibido desde marzo del 2003 en nuestro pais per 5U toxicidad
59
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65
ANEXOS
66
ANEXO A RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AlSLADA DE i
PEPINO it
Referencia Pepino 1 Fecha 06122002
IEXCELENTE IDENTIFICACION
Latto plantarum 1
Galeria API 50 CHL V50 Leida el 06122002
Perfil - -- - ++ - -- - ++++ - - -+- + - I I I I I I I I +t+ - +f- ~ - - + + ~ - - - +- + - shy
o - GLY - ERY DARA - LARA + RIB + DXYL - LXYL - ADO - MDX - GAL + GLU + FRU + MNE + SBE - RHA - DUL - INO bull MAN + SOR - MDM + MUG shyNAG + AMY + ARB + ESC + SAL + CEL + MAL + LAC + MEL + SAC + TRE + 1NU - MLZ + RAF + AMD - GLYG - XLT - GEN + TIJR + LYX - TAG - DFUC shyLFUC - DARL + LARL - aNT + 2KG - 5KG shy
--- Taxones significativos rd -----T -- Tests en contra
Lactoplantarum 1 999 092 1
Taxon siguiente Lactobrevis 1 OJ 044 3
i i
Lactoplantarum 1 1 test (5) en contra
D-SORBITOL (SOR) 78
Tax6n siguiente Lactobrevis 1 3 test (s) ert contra
METHYLD-MANNOSIDE (MOlM) 0 MELEZITOSE (MLZ) 14 D-TURANOSE (TUR) 14
67
ampb
ANEXO B RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AISLADA DE REPOLLO FERMENTADO
~
Referencia Repollo fermentado - 3 Fecha 03072003
EXCELENTE IDENTIFICACION
Lactoplantarum 1
Galena API 50 CRL V50 Leida el 03072003
Perfil - - ++ - - - - -H++ - - ~ + - + - I I 1 I I I I -H+ - ++ - - - + + - -- - - + - shy
o - GLY - ERY - DARA - LARA + RIB + DXYL - LXYL - ADO ~ MDX - GAL + GLU + FRU + MNE + SBE ~ RHA - DUL - INO - MAN + SOR - MDM + MDG shyNAG + AMY + ARR + ESC + SAT + CRL + MAL + LAC + MEL + SAC + TRE + lNU - MLZ + RAF + AMI) - GLYG - XLT - GEN + TOR + LYX - TAG - DFUC shyLFUC - DARL - LARL - GNT + 2KG - 5KG shy
------Taxones significativos _ _----- Id--- ---T---- Tests en contra
Lactoplantarum 1 999 095 1
Tax6n siguiente Lactobrevis 1 01 OA8 3
lJactoplantaru01 1 1 test (s) en contra
DSORBITOL (SOR) 78
Taxon siguiente Lactobrevis
METHYL-D-MANNOSIDE D-TURANOSE
1
(MOM) (TOR)
3 test (5) en contra
0 MELEZITOSE 14
(MLZ) 14
i
I
68
ANEXO C RESULTADO PRUEBAS BIOQUWICAS DE CEPA AISLADA DE MUCOSA HUMANA
Referenda Mucosa - 5 Fecha 27012003
BUENA IDENTlFICACION
Galeria API 50 CHL vso Leida el 270112003
Perfil - - - - +t--t - - - + - + - - - - - - - - -+- - - - - + - + - - - - - - - - - - - - - bull - - -+ - +
o - GLY ~ ERY - DARA bull LARA + RID + DXYL + LXYL - ADO bull MDX - GAL + OLU - FRU + MNE - SBE - IlliA - DUL - INa - MAN - SOR - MDM - MOO shyNAG + AMY - ARB - ESC ~ SAL bull CEL - MAL + lAC - MEL + SAC - TRE shyINU - MLZ - RAF - AMD - GLYG - XLT - GEN - 11JR - LYX - TAG - DFUC shyLFUC - DARL - IARL - ONT + 2KO - 5KG +
- - - - - - Taxones significativos - - - - - - - Id T -- Test en contra
Lactobrevis 3 963 088 1
Taxon siguiente Lactoco11inoides 36 075 2
Lactobrevis 3 1 test (s) en contra
GLUCOSE (GLU) 95
-~~~------------~---------------------------~--~-------~--~-----~----------~--------~------------~~--Taxon siguiente Lactocollinoides 2 test (s) en contra
GLUCOSE (GLU) 100 MELIBIOSE (MEL) 25
69
i r
ANEXO D RESULTADO PRUEBAS BIOQIJiMICAS DE CEPA AISLADA DE LECHE FERMENTADA
Referenda Leche fennentada ~ 13 Fecha 27012003
BUENA IDENTIFICACI6N
Galeria API 50 CHL V50 Leida el 270112003
Perfil - - - - -t-t+- - - - + - + - - - bull - - - - -+- - - - - + - + - - - - - - - - - - - - - - - - -+ - +
0 - GLY - ERY - DARA - LARA +Rll3 + DXYL + LXYL - ADO - MDX ~GAL + GLU - FRU + MNE SBE - RHA DUL bull INO MAN - SOR MDM bull MDG shy
~NAG + AMY - ARB - ESC - SAL - CEL - MAL + LAC - MEL + SAC - TRE I lNU - MLZ - RAF - AMD - GLYG - XLT - OEN - IUR LYX - TAG - DFUC bull i
LFUC - DARL - LARL -ONr + 2KG - SKO + 1
- -- - - Taxones significativos - - Id -- T --- Test en contra
Lacta brevis 3 963 088 1
Taxon siguiente Lactocollinoides 36 075 2
Lactobrevis 3 1 test (s) en contra
GLUCOSE (GLU) 95
-----------------------------------------------------------~------------------------------~-------------------Taxon siguiente Lactocollinoides 2 test (s) en contra
GLUCOSE (GLD) 100 MELffiIOSE (MEL) 25
70
II iJ1
I
I ANEXO E RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AISLADA DE REPOLLITAS DE BRUSELAS FERMENTADA
Referencia repollitas de bruselas 15 Fecha 03072003
EXCELENTE IDENTIFICACION
Lactoplantarum 1
Galeria API 50 CHL vsO Leida el 03072003
Perfil - - - - +t - - - - +H+ - +- - +t + - I I I I I I I f ++t - + - - - -+ + - - - -+ -+ - - I ij
o - GLY - ERY - DARA - LARA + RJB + DXYL - LXYL - ADO - MDX - GAL +
GLU + FRU + MNE + SBE RHA + DUL - INO - MAN + SOR + MDM + MOG shyNAG + AMY + ARB + ESC + SAL + eEL + MAL + LAC + MEl + SAC + TRE + i
I1NU - MLZ + RAF AMD GLYG - XLT - aEN + TUR + LYX - TAG - Druc LFUC - DARt + LARL - aNT + 2KG - 5KG shy n ----Taxones significativos ------ Id Tests en contra
Lactoplantarum 1 999 090 o
Taxon siguiente Lacto pentosus 01 012 7
Lactoplantarum 1 o test (s) en contra
Taxon siguiente Lacto pentosus 7 test (8) en contra
GLYCEROL (GLY) 75 D-XYLOSE (DXYL) 100 L-RHAMNOSE (RHA) 25 METHYL-D-MANNOSIDE (MOM) 1 MELEZITOSE (MLZ) 25 RAFFINOSE (RAF) 75 D-ARABITOL (DARL) 0
71
~
I i I
ANEXO F - ANALISIS DE REGRESION PARA pH EN BEBIDA SIN AVENA
Aruilisis de regresi6n polinomial
---~-~-------------------------------------------~-----------~~---------------------~--------------Variable dependiente pHSinAvena ---------------------------~-------------~--------------------~---------------------------------
Error T Parametro Estimado Estandar Estadistico P-Valor
CONSTANTE 535606 0094535 56657 00000 Dia -0150565 0020706 727154 00000 Dia2 000504434 0000871488 578819 00001
---~---------------------------------------------------------------------------------------------------
Anfllisis de Variama -------------------------------------------~-----------~-----------------------------~-~--- jSource Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor 11
------------------------~------------------------------------------------------------------------------~ Mod-elo 155772 2 0118861 4256 00000 Residual 0237877 13 00182983
Total (Corr) 11956 IS
R2 == 867522 percent
pHSinAvena == 535606 - 0150565Dia + 000504434Dia2
72
____
middot ANEXO G - ANALISIS DE REGRESION PARA pH EN BEBIDA CON AVENA
AmUisis de regresion polinomial _____~_____~__-_____~___4____________________bull____bull__________bull_____________~~----_------___________
Variable depcndiente pHConA vena ------------------------------------------------------------------------------------------~--------
Error T Parametro Estimado StAndar Estadfstico P-Valor
---------------------------------------------~-----------------------------------------------_---------CONSTANTE 534463 00801045 667208 00000 Dia -0140407 00175453 800253 00000 DiaA 2 000448098 0000738458 606803 00000
----------------------~---~-----------------------------~------------------------------~----AmUisis de Varianza
---~---------------------------------~---------------------~------------~-------------------~------Source Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio PValor --------------------------~-----------------------------------------------~------------~-----~~--~ ModeJo 159575 2 0797873 6073 00000 Residual 02170798 middot13 00131383 _______~_~ ~_~----------~------~--~-----~-M-----~-----____ _____________~-----------------------Total (COlT) 176654 15
R12 903315 percent
-----------~------------------------------------------------------------------------~-----------pHConAvena 534463 - 0140407Dia + 000448098DfaA 2
73
ANEXO H - ANALTSIS DE REGRESTON PARA ACIDEZ EN BEBJDA SIN AVENA
An8Jisis de Regtesi6fi P6lifJomial
Variable Depefidiefile~ AcidezSinAVenll _______________w_____~______~________________~-----------_________~_________________~~____~___~_____
Error T Pariirnetro Estimado Estandar Estadistico ---------------------------------------~--------------~-~-------~--------------------~------------CONSTANT 0491697 00123217 399051 00000 Dia 00436032 000269882 161564 00000 D1a2 -000144613 000011359 127312 00000 __w___~________________________~-_______-_____~----____________________________~__~---~_--__~___
AriiiJisis de varianza ~_~__~__________~_~____~________~___________- _________e_____________________________bull _____-________
Source Smn de cuadr Df Mean Square F-Ratio PmiddotValor_~~___________________________________bull ______~___________bull ____________bull ______~________w________________
Model 0135203 2 00676013 21747 00000 Residual 000404118 13 000031086
Total (Corr) 0139244 15
R2 970978 percent
AcidezSlnAvena 0491697 + O0436032Dia - 0OOl44613Dia2
74
I
ANEXO I ANALISIS DE REGRESION PARA ACIDEZ EN BEBIDA CON AVENA
1
Anwisis de tegtesi6fi polinomial
Variable dependiente Acidez Con Avena
Error T ParametTo Estimado Stlindar Estadfstico P-Valor ----------------~-------~---------------------~-----------------------------------------------------CONSTANT 0491639 000926607 530578 00000 Diamiddot 00406572 000202955 200326 00000 DfaA 2 0000982559 0000085421 -115025 00000
-------------~----------------------------~-------------------------~-----------------------------------
-------------~-----~~-----------------------------~---------------------------------------------_--Source Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio PValor
-~-------------~----------------------------------~------------------~~-------------------------- Modelo 0288008 2 0144004 81914 00000 Residual 000228539 13 0000175799
----------~~--------------~---------------------------------------------~---------------------------Total (Corr) 0290294 15
RA2 = 992127 percent
-------------------------~----~---~------------~---------------------------------~---------------~
AcidezConAvena == 049163amp + 00406572D1a - 0000982559DiaA2
75
I
(Ilmiddot il
ANEXO J- ANALISIS DE REGRESION PARA RECUENTO LACTOBACILOS PARA BEBIDA SIN AVENA
Amilisis de regresion - Modelo lineal Y = a + bX
------------------------~----------------------~-----------------------------~----------~-----------Variable Dcpendiente LactobacilJusSinAvena Variable independiente Dia
I--------~----------~-----------------------------------~-------~-~--~--------------------------~-Error T
Paramctro Estimado Standard Stadistico P-Valor
----~----~------------~-----~-----------------------~-------------~-----------------------------Intereepto 117347 0389973 300911 00000 Pendiente 00483464 00257889 18747 00903
Analisis de Varianza
---------~------------------~----------------~---------------------------------~---------~----------Source Sum decuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor
------------~---------------------~---------------------~--------------------------------~-----~----Modelo 0916252 1 244835 443 00616 Residual 260706 10 0260706
--~------------~---~------------------~~~-----~-------~---------~~-------------------------------------Total (Corr)352332 11
Coeficiente Correlaci6n = 0509955 R2 = 260054 percent
LactobacillusSinAvena= 117347 + 00483464Dfa
76
ANEXO K- ANALTSIS DE REGRESION PARA RECUENTO LACTOBACILOS PARA DEBIDA CON AVENA
Aruilisis de regresion - Modelo lineal Y = a + hX
Variable Dependiente LactobacillusConAvena Variable Independiente Dia ---~--------------------------------------------------------__-----------__--_--_-----------shy
Error T Paramctro Estimado Standard Estadistico P-Valor -~--------------------------------------------------------------------------------------------------
Irttercepto 118103 0567963 207942 00000 Pendiente 00790304 00375594 210414 00616
-----------------~----------------------------~----~-------~----~----------------------------
Analisis de Varianza
----------------~----------------~------------------~--------------------------~------~--------shySource Swn de cuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor
-----------------~--~--------------------------------------------------------------------------~---~ Mode10 244835 1 244835 443 00616 Residual 552997 10 0552997
Total (Corr)797832 11
Coeficiente Correlacion = 0553964 RI2 = 306875 percent
-----~--------------------------------------------------------~--------------------------------------
LactobacillusConAvena = 118103 + 00790304Dfas
77
1158 Previenen infeccion en heridas quirurgicas
Los probi6ticos impiden la union de pat6genos a las superficies celulares en
heridas mediante la seCreci6n de proteinas Actuamente se encuentra en
estudio la aplicaci6n del Lactobacillus fermentum vivos sabre heridas en piel de
ratas y se ha encontrado una disminuci6n del 90 en la colonizaci6n par parte del
StaphylococcuS aureus uno de los patogenos mas temidos y de mayor lncidencia
en infecciones hospital arias mas aun se esta contempiando la posibilidad de
utilizar la protein a purificada an lugar de los mjcroorganismos para la protaccion
contra infecciones en heridas (Strauss 2000)
12 PREBIOTICOS
Son carbohidratos de cadena corta algunas veces reconocidQs como
oligosacaridos no digeribles par las enzimas del epitelio intestinal 0 de las
gliJnduJas anexas debido a su estructura quimica y de esta manera lIegan al
intestino grueso donde alcanzan a estar disponibles para la fermentaci6n por las
bacierias sacaroHticas que son especial mente laetobadlos y bifidobacterias
dando odgen a compuestos que ejercen efectos funcionales sobre la mucosa del
tubo digestivo (Brunser 2001)
Se consideran como tal algunos fructocligosacaridos isomaltooligosacariclos
oligomato palatinosa poHdextrosa pOJidextrrna raftilina y algunos oligosacaridos
23
)
de 1a soya y fa avena Estenmiddot presentes en alimentos como Ie cebolla ajo
banano puerros 1 derivados del trigo achicoria esparrago alcachofa (Cummings
etal 2001)
Algunos de estos prebi6ticos cuanda son incorporado$ a fa dieta en cantidades
dalerminadas alteran la microbiota intestinal disminuyendo los recuentos de
coliformes bacteroides y cocos y aumentando las bifidobacterias hasta en diez
veces ademas modifican la actividad metab6lica del coron logrando una
disminuci6n del pH y un incremento en el contenido fecal de acidos grasos de
cadena corta como at acatica propi6nico y butfrico El butirato aumen~ _I grosor
de la pared del coron e intestino delgado estimula eJ crecimiento de la mucosa del
colon y auManta su flujo sangufneo inhibe el crecimiento de tinsas tumorales
epiteliales de origen co16nico induce la diferenciaci6n de sus celulas y a
apoptosis entre otros(Brunsar 2001)
Eh estudios hechos en simuladores del intestino humano utilizando productos de
avena fermentados se encontro que estimularon al crecimiento tanto de
lactobacios como de bifidobacterias y en el caso de estas ultimas se incremento
la producci6n de los acidos acatico propionico y butfrico 10 que incide sobre la
implantacion de probi6tico$ e inhibe al crecimientos de otro tipo de
microorganismos (Alal1der eta1999 Kontula etal 1998 Jaskari etal 1998)
24
~ -1
(
AI comparar el comportamianto de las leches de diferente origen se ha
demostrado que Ie leche de vaca contiene caseinatos sustancias que forman
buffer ~n et intestino e inlpiden que los probi6ticos disminlJyen el pH del intestina
y de esta manera se impide al efecto deseado que es evitar fa proliferaci6n de
otros microorganismos entre los cuates pueden estar algunos patOganos En la
leche materna sa encuentran algunos carbohidratos como glucosa galactosa n
acetilglucosamina y algunos 0lig6meros de Ie fucosa en cOhoontracionesmiddot
importantes los cualeS favoreceh el crecimientc)middot de probi6ticos esto
complementado can 91 bajo contenido de protenas que se traduce en una
reducida capacidad buffer hacen de Ie lache materna IJn alimentd adecuado para
nllios en su etape de lactancia
Algunos prebi6ticos como 1a lactulosa yciertos compuestos que contiansn fructosa
no son digeridos en el intestino humano y pueden sar utilizados selectivamenta
par los probi6ticos 10 que hace que los probi6ticos en combinaci6n can prebi6ticos
pueden lIegar a ser un importante medio para prevenir algunas enfermedades del
tracto gastrointestinal (Bezkorovainy 2001)
25
2 METODOlOGfA
21 LOCALIZACION
EJ trabajo sa realizo en el laboratorio de Microbiologia y la planta da laches de Ja
Universidad Naclonal de Colombia- Secie Medellin
En al laboratorio se hiZQ al aislamiento a identificaci6n de fa capas y en fa Planta
sa eJaboro la leche fermentada con 1a cepa seleccionada y el prebi6trco
22 METODOS
221 Aisiamiento de cepas nativas
Las cepas nativas se sislaran de producto$ vegetales leches fermentadas y
mucosa vaginal humana
2211 De vegetales
Las muestras vegetales de repollo repollitas de brusefas y pepino se
seleccionaron porcionaron y mezclaron can cloruro de sadio al 10 pIp se
calacaron en un recipienta de vidrio balo anaerobiosis y sa dejarQn por 15 dias
26
luego S9 tomaron 3 ml de cada muestra y se jnocularon 9 ml de caldo MRS (Man
Rogosa and Sharpe) se incubaron a 37deg C durante cinco dias en camara de
anaerobiosis (Ver Figura 1) Oespues de este tiempo sa inocularon cajas de petri
con agar MRS con 1 ml del cultivo microbiano y se incubaron bajo las mismas
condiciones que eJ caldo Este procedirniento se realiz6 rapetidas veces hasta
seleccionar la cepa pura mediante observaci6n de caracteristicas morfologicas de
la cOlonia y a cada colonia se Ie practico la coloracion de gram con el fin de
observar las caracteristicas microscopicas de cada una e identificar las de mayor
similitud a los Lactobacilos y Bifidobacterias
Figura 1 Camara de anaerobiosis
27
2212 De la leche
Sa tomo 200 ml de teche cruda de la planta de leches y se colaca a fermentar
baja anaerobiosis durante 15 dras Luego sa procedia como en los vegetales
2213 De mucosa vaginal humana
Se tomo una muestra de frotis de mucosa vaginal humane can capito esteril sa
puso a ncubar en Caldo MRS y se procedi6 camo en 2211 y 2212 A cads
aislado sa Ie practico la coloracion de gram y sa seleccionaron aquellas que eran
bacilos gram positivos (Ver Tabla 2)
28
TABLA 2 Fuente de aislarniento de cepas nativas
CEPA FUENTE
1 Pepino fermentadQ
2 repollitas de bruselas fermentadas
3 Repolltgt fermentado
4 Repollo fermentado
5 Mucosa va~inal humana
6 Mucosa vaginal humana
7 repollitas de bruselas fermentadas
8 Repollo fermentado
9 repollitas de bruselas fermentadas
10 Mueo~a vaginal humana
11 Repollo fermentado
12 RepolJo fermentado
13 Leche fermentada
14 Mucosa vaginal humana
15 repollitas de bruselas fermentadas
16 Repollb fermentado
29
222 Almacenamiento de las cepas aisladas
Cuando las cepas crecieron en agar MRS homogEmeas en color morfologia
coloraci6n de Gram etc se pssaron a agar inclinado en tuba se cubrieron con
aceite mineral y se guardaran en refrigeraci6n a 4deg C para tomar de alii la cepa y
efectuarle las diferentes pruebas para confirmar el genera y determinar la especie
de cada una de eas (Ver Figura 2)
Figura 2 Cepas en tubos con agar inclinado
30
223 Pruebas para determinar et genero
2231 Coforaci6n de Gram
A cada cepa sospechosa de Lactobacilos se 1e hizo la coloraci6n de gram y se
seleccionaron las gram positivas
2232 Morfologfa
En agar MRS y despues de incubar en anaerobios~s crecian colonias grandes
cremosas de color beige con bordes homogeneos y c6ncavas(Ver Figura 3)
Figura 3 Colonias aisladas en agar MRS
31
2233 Prueba de esporulaci6n
A cada cepa aislada se Ie hizo esta prueba la cuel consistia en incubar en
aerobiosis durante ocho dias las cajas de agar MRS donde crecieron colonias de
Lactobacilo$ y luego se les (ealize) coloraci6n de espora Las capas que dieron
negativa a la prueba de espora se considararort sospechosas de sar Lactobacilos
y se continuo con la prueba de la catalasa (Ver Tabla 3)
2234 Prueba de la catalasa
los lactobacilos carecen de catalasa Eata prueba se hizo tomando una colonis
se deposito en vidrio de reloj y se Ie adicion6 dos gotas de peroxida de hidr6geno
(H202) la que no presentaba efervescencie eran cepe sospechosa de ser
Lactobacilo (Ver Tabla 4
Sa seleccionaron las capas euyo resultado fue aeorde con el genera Lactobacilfu$
y se continuo con la comirmaeion del genera y determinacion de la eSpecie
meqiante las pruebas bioqulmicas
32
224 Prueba para determlnar la especie
Para confirmar el genero y determinar la especie de las diferentes capas aisladas
se hizo una caracterizaci6n bioqufmica utilizando un kit de API 50 CHL Medium
Ref 50 410 que contiene una galed8 de medios que permite realizar el estudio
de fermentaci6n de los 49 azucares de 52 especies de Lactobacillus (Ver Figura 4
y tabla 5)
Figura 4 API CHL 50-Prueba bioquimica
33
225 Pruebas para determinar microorganismos probi6ticos
2251 Resistencia a pH=2 y sales biliares de concentraci6n O3pv
A las cepas idantificades como Lactobacillus brevis y Lactobacillus pantarum sa
las realiz6 Ie prueba dfl resistencia a pH=2 y sales biliares de concentraci6n 03
pv ( Jacobsen et al 1999) Una colonia de cada cepe aislada se inocul6 en 4 mt
de caldo MRS durante cinco dras bajo condiciones de anaerobiosis Oespues de
esta tiempo se dejaron pracipltar los microorganismos por sedimentaci6n se Ie
retire el sobrenadante y al precipitado se Ie adicion6 Sml de caldo MRS
previamente ajustado a pH=2 can seido clorhfdrico (HCI) dentro del mismo tuba de
ensayo G igual sa hizo can otro tubo previamente incubado pero a este se Ie
adiciono 5ml de caldo MRS con sales biliares a una concentra~i6n de 03 plv y
ambos se incuberon a 37deg C por 2 haras Sa midio 01 mi de cada uno de los
tubas al tiempo 0 y a las 2 horas y sa inoculeron en superficie en caJas de petri
con agar MRS S9 incubaron a 37deg C bajo anaerobiosis durante 48 horas Se
compararon visualrrente en cada caja de petri el crecimiento en superficie y las
que presentaron crecimiento en tos dos tiempos (0 y 2 horas) tanto en at media
acido como en sales I se consideraron resistentes a pH=2 y sales biliares (03
pv)
(Ver Tabla 6)
34
226 Conservacion
Todas fas capas que habian dado positiva Jas pruebas anteriores y que reaultaron
resistentes a pH=2 y sales biliares 03 pv y despues de identificadas en API 50
CHL sa repicaron en agar MRS en tuba inclinado y despues de Incubar a 37deg C
por 48 horas bajo anaerobiosis se Ctlbrie el biser completamente can aceite
mineral esteril y sa guardaron en refrigeraci6n
227 Elaboracj6n de fa bebida fermentada
2271 Preparaci6n de la mue$tra
Sa tome 1 mt de caldo MRS previamante inoculado e incubado que presentaba
una concentracion de Lactobacillus brevis de 27x108 Iml segun la escaJa de Mac
Farlan y sa adiciono a 9ml de leche pasteurizada en un tubo sa dej6 incubanda
en anaerobiosis por 48 hores Luego se pasaron estos 10 ml a un frasco qua
cont~nie 90 ml de leche pasterizada y se dej6 incubando par 48 haras en
anaerobiosis
35
2272 Adici6n del inOculo
A 900ml de leche pasteurizada se Ie adicion61os 100 ml de leche que habia sido
previamente ino(ulada dos veces con la cepa posteriormente se deja
fermantando la lache a temperatura de 37deg C
2273 Control de Ja fermentaci6n
Las muestras se hicieron por cuadruplicado y se les hizo un seguimiento de
aoidez hasta un valor entre 04 y 05 expresada como Bcido lactico esta
procedimiento corresponde a la babida fermentada sin prebi6tico La bebida ~on
prebi6tico tiene al mismo proeedirnianto pero adicionalmente se agrag6 avena a
una concentraci6n de 05 en el momento de la adici6n del in6e410 a los 900 ml
de leehe pasteurlzada y el procedimiento sigui6 igual al de la bebida sin prebi6tico
tambien se hizo por cuadruplicado
2274 Refrigeracl6n
Despues que las mezclas con y sin prebiotico alcanzaron el de acidez
requarido se IIeva ron a refrigeraci6n a una temperatura de 4deg C p~r 24 horas
para frenar proce~os metab6licos de los microorganisrtlos Despues de este
ti~mpo se procedi6 al batido
36
1 2275 Batido
Con un agitador se procedi6 a batir las bebidas para romper et coagulo formado
y de esta manera homogeneizar la mazela y obtener asf la bebida fermentada
2276 Envasado y almacenamiento
Ambas bebidas se envasaron en frascos vidrio para hacerles seguimiento de pH
acidez(expresado como acido tacticol y recuento de Lactobacillus breviSf los
dies 27 14 Y 21 despues de elaboradas las bebidas perfodo durante el cualta
muestra permanecfa afmacenada a temperatura de refrigeracion(Ver Figura 5
37
Fjgura 5 Diagrama de Flujo
PREPARACION DE LA MUESTRA
ADICION DEL INOCULO
~_____~_B~ATIDO~______~
INCUBACION 37deg C hasta acidez = 04-05 acido laotico
ENFRIAMIENTO
hasta 4 0 C ~------~ ~------~
ENVASADO Y ALMACENAMJENTO
dUrante 21 dfas a Temperatura 4 0 C
38
1
228 Determinaci6n del pH
Se determino por el metoda potenciometrico en un pH-metro manual durante los
dias 2) 7 14 Y 21 de las bebidas lacteas sin y con prebi6tica (Ver Tablas 7 y 8)
229 Oeterminaci6n de la acidez (Expresadfl como acido
lactica)
Se tomaron 9 mJ de las bebida~ sa Ie adicionaron 2 gotas de fanoftaleina como
indicador y sa titulo fa acidez con NaOH 01 N hasta la aparicion de un cotor rosado
debit EI volumen de NaOH utilizado se reporta como valor de de acidez
(VerTablas 10 y 11)
2210 Prueba de viabilidad
Qurante el perfoda de almacenamiento de la bebida lactea se procedi6 a hacer la
prueba de viabiHdad en los dias 7 14 Y 21 para determinar Si los lactobacilfus
permanecfan vivOs a una concentraci6n minima de 106 hasta el dia 21 como 10
establece eJ Articulo 10 de la Rasolucion 2310 del Ministerio de $alud de
Colombja
39
Para asta prueba se tamaron 10 rnl de muestra y se adicionaron a 90 ml de caldo
MRS ruego a partir de esta se hicieron diluciones de 10-2 hasta 10-11 de las
diluciones 109101deg 10-11 se inocul6 1 ml de cada uno en agar MRS siguiendo el
metodo de siembra en profundidad y por duplicado e incubando a 370 C x 5 dras
en anaerobiosis y luego se hicieron tos recuentos por duplicado para esi reportar
los recuentos promedio (Ver Tablas 13 y 14)
2211 AniUisls microbiol6glco de las bebidas Iicteas(con y sin
avena)
Con el fin de determinar las condiciones higienico-sanitarias del producto se
realizaron las pruebas microbiol6gicas de Recuento de mohos y fevadurasml en
agar OGY Recuento en superficia de Staphylococcus coagulasa positivoml en
agar Baird Parker Numero Mas Probable (NMP) de coUfor-mes totales y
Escherichia coliml en caldo Fluorocult y Presencia de Salmonela25ml con BHI
caldo tetrationato y agar Hecktoen (Montoya 1999)
(Var tabla 16)
2212 AnaUsis estadistico
A los datos obtenidos en la medici6n de pH acidez (expresada como Beido
laclico) en los dras 2714 Y 21 y el recuento de Lactobacillus en los dras 714 y21
40
realizados a los dos tratamlentos se tes aplic6 1a prueba t porque solo difieren
en la presencia 0 ausencia del prebi6tico para evaluar si habra diferencia
estadfsticamente significativa para los dos tratamientbs(Ver Tablas9 12 y 15)
41
3 RESULTADOS Y DISCUSION
31 Coloraci6n de Gram y morfologfa
Las cepas aisladas fesultaron Gram positivas (Ver Figura 6) colonias grandes
cremosas dE) color beige con bordes homogeneos y c6ncavos en su
morfologia (Ver Figura 3) resultando de acuerdo a 10 especificado en Stanley
1989 para Lactobacillus
32 Prueba de esporulaci6n y cataJasa
Los resultados de la pruebas de esporulaci6n y catalasa indicados en las
Tablas 3 y 4 respeclivamente dieron conforme a 10 especificado en Stanley
1989 para Lactobacillus
42
1
2 3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
TABLA 3 Resultado de prueba de esporuJaci6n
CEPA RESULfADO ESPORULACION
-- -------------
43
l i ~II bull ~ I I
TABLA 4 Resultado prueba de la catalasa
CEPA RESULTADO CATALASA
1 -2 -3 -4 -5 -6 -7 8 -9 -10 -11 12 -13 -14 -15 -16
3~3 Prueba para determinar la especie
Oespues de hacer las pruebas para seleccionar las cepas sospechosas de ser
Lactobacillus se realizo las pruebas bioquimicas fograndose identificar
Lactobacillus plantarum aislctdo de pepino repollo y repollitas de bruselas
44
fermentados y Lactobacillus brevis de mucosa vaginal y leche fermentada (Ver
Anexos del A al E y Tabla 5)
TABLA 5 Resultado identlficaci6n cepa~
CEPA NOMBRE
1 Lactobacillus planfarum
3 Lactobacillus plantarum
5 Lactobacillus brevis
13 Lactobacillus brevis
15 Lactobacillus plantarum
34 Pruebas para determinar microorganismos probi6ticos
las cepas de Lactobacillus brevis y Lactobacillus plantarum mostraron
rasistencia al medio acido de pH =2 Y sales biliares 03 pv resultado similar al
encontrado por Jacobsen et al 1999 para Lactobacillus plantarum (Ver tabla 6)
45
middot
~~~ttiI lltlmiddot~COX~dtJ ~xtc_~ 2 tr~ k-JlL~middot
-)~~TO DE lJIBUOTECUl rjRL]OTtCA twn GO1IU1
TABLA 6 Resultados a pruebas de resistencia a pH=2 y sales biliares 03 plv
CEPA RESISTENCIA pH=2 RESISTENCfA A SALES BIUARES ()3 pv
1 + +
2 + +
3 + +
4 + +
5 +
6 + +
7 + +
8 + +
9 + +
10 + +
11 + +
12 + +
13 + +
14 +1shy +M
15 + +
16 + +
+1 crecimiento debil
+ crecimiento abundante
46
Figura 6 Lactobacillus brevis Gram + aislado de leche fermentada
Ai observar en placa las celulas de lactobacilos despues de real1zar las pruebas
de resistenCia a la acidez y sales biliares se observo una tendencia a aglomerarse
posiblemente como un mecanismo de proteccion cOlitra estos medios que pueden
lIegar a ser adversos para elias (Ver figuras 7 y 8)
47
Figura 7 Lactobacillus brevis aislada de leche fermentada despu~s de la prueba de resistencia a pH=2
Figura 8 Lactobacillus brevis aislada de leche fermentada despues de la prueba de resistencie asales biUares 03 plv
fI
48
35 --Seguimiento del-pH-en-la-bebidaJacteacon y sin -prebi6tico
A continuacion se muestran las Tablas 7 y 8 donde sa registian los datos
recopilados de pHdurante 10$ dras Z 7 14 Y21 para las bebidas laaeas con ysin
prebi6tioo
TABLA 1 ResultadopH yogur sin avena
Dia Repetition 1 Repetici6n 2 Repeticion 3 Repetici6n 4
2 526 501 51 52
7 446 433 438 44
14 439 435 437 436
21 439 437 438 437
TABLA 8 -ResultadopHyogur con avena
Dia Repeticion 1 Repeticion2 Repeticion 3 - Repeticion 4
2 509 523 51 515
7 447 442 445 442
14 436 -438 439 437
21 432 433 435 434
Observando la Figura 9podamos ver que el pH en el -dfado$ para los dos
tratamientos as igual y empieza a descender rapidamente para estabilizarse a
partir del dra 7(Ver figura 9)
49
Figura 9 Comparacj6n de medias para -el pH
Comparaci6n de medias para pH
55 ~ 5 +----=gtIIIi-~i~~----=-r--it~ -- pH sin avena
a 45 1--~~~~=~~ 4 --- pH con
avena35 t-----r-- -------=------=--= ------- - ----
2 7 14 21
Dias
Aplicando la prueba t para comparar las medias de pH I S6 muestia una diferencia
altamants significativa en los dos tratamientos para el dia 21 (pltO05)
(Ver tabla 9)
TABLA 9 Compaiaci6n de medias para pH
DtAS SIN AVENA CON AVENA te p (VALOR)
2 514 514 0 10
7 439 444 -1 61 0159
14 437 I
438 -070 0510
21 438 433 528 00019 shy
- DiFERENCIA AlTAMENTE SIGNIFICATIVA
50
I
AI aplicar regrasi6n a los datos sa obtiene al modelo estimado
pHSinAyena =535606 - 01505650Ia +0005044340IaI2
La variabilidad en la respuesta de pH asta siendo explicada en un 8S7522 por
el modelo (Ver Anexo F)
EI tratamiento con avena mostro el siguiente modelo al analisis de ragresi6n
pHConAvena =534463 ~ 0140407Dia + 0004480980Ia2
La variabilidad an la respuesta de pH asta siendo explicada en un 903315 par
el nlodelo(Ver anexo G)
36 Seguimiento de la acidezmiddotmiddot expresada comomiddot de acido
lactico
A continuaci6n sa muestran las Tablas 10 y 11 donde sa registran los datos
tecopilados de acidezmiddotdurante los dias 27 14 Y 21 para las pebidas taetees con y
sin prebi6tico
TABLA 10 Resuttadode acidez (expresadocomo acido tactico) yogurt sin avena
CIA R~petici6n1 Repeticion2 Repetici6n 3 Repeticion 4
2 054 06 057 058
7 072 074 073 0]2
14 080 083 082 082
21 0]4 079 078 077
51
TABLA 11 Resultado de aCidez (expresado como acido Icktico) yogurt con avena
Dia Repetici6n 1 RepetiCi6n 2 Repetici6n 3 Repetici9n 4
2 059 055 058 057
7 071 073 072 072
14 089 087 088 086
21 092 091 090 091
Observando la Figura 10 se puede concluir que la acidez empieza a aumentar
hasta el dia 14 y luego trata de estabilizarse para los dos tratamientos
(Ver figura 10)
Figura 10 Comparaci6n de medias para la acidez
N G)
Comparacion de medias para acidez
1
2 0I 5 -+--=--------=-~~~= u
ltC
- Acidez sin avena
2 7 14
Dias
52
21
-it- Acidez con avena
Aplicando la prueba t para camparar las madias de acidez se muestra una
diferencia altarnante significativa en los dos tratamiantos para los dias 14 y 21
(pltO05)
(Var tabla 12)
TABLA 12Comparaci6n de medias para Acidez
DIASmiddot SIN AVENA CON AVENA te p(VALOR)
2 0572 0572 0 10
7 0727 0720 119 0278
14 0818 0875 -638 000070shy
21 077 091 -1212 i 0000019 shy
DIFERENCIA AL TAMENTE SlGNIFICATIVA
AI aplicar r~gresi6n a los datos se obtiene el modelo estimado
AcidezSlnAIena = 0491897 + O0436032Dia O00144613DfaA2
La variabilidad en la respuesta de acidez asta siendoexplicada en un 970978
por al modelo (Ver anexo H)
EI tratamiento con avena mostro elsiguiente modeloj a1 analisis de regresion
AcidezConAvena = 0491638 + 00406572Oia - OQOO982559OiaA2
La variabilidad enla respuesta acidez esta siendo explicadaen un 99212 por
el modelo (Ver anexo J)
53
I ~
37 Prueba de viabiJidad
A continuaci6n sa muestran las Tab~as 13 y 14 donde sa presentan los datos
recopilados del recuento de Lactobacilos durante los dias 7 14 Y 21 para las
bebidas lacteas con y sin prebi6tico
TABLA 13 Recuento de Lactobacilos (UFCml) yogurt sin avena
Dia Repetici6n 1 Repetici6n 2 Repeticion 3 Reptttici6n 4
7 1880X10l1 1454X1011 1642X1011 1780X10~
14 1560X10~ 646X1011J 1890X10l 140X10l1
21 1200x10lu 128Ox10u 1745x10J 1520x101V
TABLA 14 Recuento de Lactobacilos (UFCml) yogurt con avena
Dfa Repetieion 1 Repetici6n 2 Repeticion 3 Repeticf6n 4
7 1600X10lt 1240X10t 1640X10ll 1980X10t
14 540X1011 427X10n 546X10n 720X10ll
21 500x1011 492x1011 712)(1011 980x10~
AI analizar la Figura 11 sa puede observar un recuento mayor de Lactobacilos
en al tratamiento con avena resultado de acuerdo a 10 encontrado por Alander at
aI 1999 Kontula et aI 1998 y Jaskari et aI 1998
54
Figura 11 Comparaci6n de medias para Log Lactobacillus
Comparacion de medias para log Lactobacillus
~ 1350
-+- Sac Sin--() 13 co avenaIII
bull 125 -- Bac con 0)
0 12 avenaJ
115 7 14 21
Dias
Aplicando la prueba t para comparar las medias de recuento de Lactobacillus no
se encontr6 una diferenc1a estadfsUcamente significative entre los dos
tratamientos (Ver tabla 15)
Este aumento en al racuento influy6 en la disminuci6n del pH y en el aumento de
fa aeidez por la fermentacion que realizan los Lactobacillus sobre fa lactosa de la
lache y la avena adicionada como prebi6tico
55
1
TABLA 15 Comparaci6n medias lag Lactobacillus
DIAS SIN AVENA CON AVENA tc p(VALOR)
7 122257 122022 04846 06451
14 121065 132393 -19602 00977
21 129025 133087 -08236 04416
At aplicar regresion a los datos se obtiane al modelo astimado
LactobacillusSinAvena= 117347 + 004834640Ia
La variabilidad en la respuesta del recuento de LactobaCillus ssta siendo
explicada en un 260054 por el mod$loVar anexo J)
EI tratamiento con avena mostr6 al siguiente modalo al anal isis de regresion
Lactobacillu$ConAvena =118103 + 007903040Ias
La variabilidad en la respuesta de recuento esta siendo explicada en un 3068
por al modelo(Ver anexo K)~
38 Analisi$ microbiol6gicos de las bebidas lacteas con y sin
En la Tabla 16 estan recopilados los resultados microbiol6gieos obtenidos en ras
muestras con los dos tratamientos (con y sin avena)
I [
sa
TABLA 16 Resultados analisis microbiologico
Recuento de mohos y levaduras Iml lt10
Recuento de Staphylococcus coagulase positiva Iml lt100
NMP coliformes fotales y Escherichia coli Iml lt3
Presencia de Salmonella25ml Ausente
Los resultados de este analisis demuestran que las bebidas fermentadas con y
sin avena~ astan fibres de microorganismos patogenos
57
1
4 CONCLUSIONES
Se aislaron cepas nativas de Lactobacillus plantarum de las muestras vegetates
de repollo pepino repollitas de bruselas fermentadas y Lactobacillus brevis de
lache fermentada y mucosa vaginal humana Ambas cepas resistieran un pH=2 y
una concentraci6n de sales biliares det 03 ptv dos earacteristicas importantes
en los probi6ticos
Lamiddot cepa de Lactobacillus brevis aislada de lache Sa utiliz6 para elaborar una
bebida fermentada sin y con avana comoingrediente prebiotico obteniendose un
aJimento centon recuento del probi6tico viable durante 21 dras de seguimiento
ademas libre de microorganismos )at6gen05
No se encontr6 efecta significativo de la avena sobre Ie viabilidad del Lactobacillus
brevis aunque sa presento un aumento en 61 recuento de estos en la bebida con
avena
58
plusmn ~
5 RECOMENDACIONES
Ensayar la cepa de Lactobacillus plantartJm en productos carnicos madurados
como el salami
Ensayar la cepa de Lactobacillus l)revs en otros derivados lecteos como queso
quesito queso crema
Continuar con el estudio de estos microorganismos y caracterizarlos
molecularmente ademas de estudiar su capacidad de adherencja a fa mucosa
intestinal sobre algunes Hneas celulares como las CaCo~2
Estudiarel efedo de la avena sabre la viabiJidad del Lactobacillus breyis a una
concentraci6n mayor de 05
Realizer ensayos can las cepas de Lactobacillus brevis y Lactobrlcillus pJantarum
para elaborar masas acidas para panificacion reemplazando el Bromato de
Potasio aditivo prohibido desde marzo del 2003 en nuestro pais per 5U toxicidad
59
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65
ANEXOS
66
ANEXO A RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AlSLADA DE i
PEPINO it
Referencia Pepino 1 Fecha 06122002
IEXCELENTE IDENTIFICACION
Latto plantarum 1
Galeria API 50 CHL V50 Leida el 06122002
Perfil - -- - ++ - -- - ++++ - - -+- + - I I I I I I I I +t+ - +f- ~ - - + + ~ - - - +- + - shy
o - GLY - ERY DARA - LARA + RIB + DXYL - LXYL - ADO - MDX - GAL + GLU + FRU + MNE + SBE - RHA - DUL - INO bull MAN + SOR - MDM + MUG shyNAG + AMY + ARB + ESC + SAL + CEL + MAL + LAC + MEL + SAC + TRE + 1NU - MLZ + RAF + AMD - GLYG - XLT - GEN + TIJR + LYX - TAG - DFUC shyLFUC - DARL + LARL - aNT + 2KG - 5KG shy
--- Taxones significativos rd -----T -- Tests en contra
Lactoplantarum 1 999 092 1
Taxon siguiente Lactobrevis 1 OJ 044 3
i i
Lactoplantarum 1 1 test (5) en contra
D-SORBITOL (SOR) 78
Tax6n siguiente Lactobrevis 1 3 test (s) ert contra
METHYLD-MANNOSIDE (MOlM) 0 MELEZITOSE (MLZ) 14 D-TURANOSE (TUR) 14
67
ampb
ANEXO B RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AISLADA DE REPOLLO FERMENTADO
~
Referencia Repollo fermentado - 3 Fecha 03072003
EXCELENTE IDENTIFICACION
Lactoplantarum 1
Galena API 50 CRL V50 Leida el 03072003
Perfil - - ++ - - - - -H++ - - ~ + - + - I I 1 I I I I -H+ - ++ - - - + + - -- - - + - shy
o - GLY - ERY - DARA - LARA + RIB + DXYL - LXYL - ADO ~ MDX - GAL + GLU + FRU + MNE + SBE ~ RHA - DUL - INO - MAN + SOR - MDM + MDG shyNAG + AMY + ARR + ESC + SAT + CRL + MAL + LAC + MEL + SAC + TRE + lNU - MLZ + RAF + AMI) - GLYG - XLT - GEN + TOR + LYX - TAG - DFUC shyLFUC - DARL - LARL - GNT + 2KG - 5KG shy
------Taxones significativos _ _----- Id--- ---T---- Tests en contra
Lactoplantarum 1 999 095 1
Tax6n siguiente Lactobrevis 1 01 OA8 3
lJactoplantaru01 1 1 test (s) en contra
DSORBITOL (SOR) 78
Taxon siguiente Lactobrevis
METHYL-D-MANNOSIDE D-TURANOSE
1
(MOM) (TOR)
3 test (5) en contra
0 MELEZITOSE 14
(MLZ) 14
i
I
68
ANEXO C RESULTADO PRUEBAS BIOQUWICAS DE CEPA AISLADA DE MUCOSA HUMANA
Referenda Mucosa - 5 Fecha 27012003
BUENA IDENTlFICACION
Galeria API 50 CHL vso Leida el 270112003
Perfil - - - - +t--t - - - + - + - - - - - - - - -+- - - - - + - + - - - - - - - - - - - - - bull - - -+ - +
o - GLY ~ ERY - DARA bull LARA + RID + DXYL + LXYL - ADO bull MDX - GAL + OLU - FRU + MNE - SBE - IlliA - DUL - INa - MAN - SOR - MDM - MOO shyNAG + AMY - ARB - ESC ~ SAL bull CEL - MAL + lAC - MEL + SAC - TRE shyINU - MLZ - RAF - AMD - GLYG - XLT - GEN - 11JR - LYX - TAG - DFUC shyLFUC - DARL - IARL - ONT + 2KO - 5KG +
- - - - - - Taxones significativos - - - - - - - Id T -- Test en contra
Lactobrevis 3 963 088 1
Taxon siguiente Lactoco11inoides 36 075 2
Lactobrevis 3 1 test (s) en contra
GLUCOSE (GLU) 95
-~~~------------~---------------------------~--~-------~--~-----~----------~--------~------------~~--Taxon siguiente Lactocollinoides 2 test (s) en contra
GLUCOSE (GLU) 100 MELIBIOSE (MEL) 25
69
i r
ANEXO D RESULTADO PRUEBAS BIOQIJiMICAS DE CEPA AISLADA DE LECHE FERMENTADA
Referenda Leche fennentada ~ 13 Fecha 27012003
BUENA IDENTIFICACI6N
Galeria API 50 CHL V50 Leida el 270112003
Perfil - - - - -t-t+- - - - + - + - - - bull - - - - -+- - - - - + - + - - - - - - - - - - - - - - - - -+ - +
0 - GLY - ERY - DARA - LARA +Rll3 + DXYL + LXYL - ADO - MDX ~GAL + GLU - FRU + MNE SBE - RHA DUL bull INO MAN - SOR MDM bull MDG shy
~NAG + AMY - ARB - ESC - SAL - CEL - MAL + LAC - MEL + SAC - TRE I lNU - MLZ - RAF - AMD - GLYG - XLT - OEN - IUR LYX - TAG - DFUC bull i
LFUC - DARL - LARL -ONr + 2KG - SKO + 1
- -- - - Taxones significativos - - Id -- T --- Test en contra
Lacta brevis 3 963 088 1
Taxon siguiente Lactocollinoides 36 075 2
Lactobrevis 3 1 test (s) en contra
GLUCOSE (GLU) 95
-----------------------------------------------------------~------------------------------~-------------------Taxon siguiente Lactocollinoides 2 test (s) en contra
GLUCOSE (GLD) 100 MELffiIOSE (MEL) 25
70
II iJ1
I
I ANEXO E RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AISLADA DE REPOLLITAS DE BRUSELAS FERMENTADA
Referencia repollitas de bruselas 15 Fecha 03072003
EXCELENTE IDENTIFICACION
Lactoplantarum 1
Galeria API 50 CHL vsO Leida el 03072003
Perfil - - - - +t - - - - +H+ - +- - +t + - I I I I I I I f ++t - + - - - -+ + - - - -+ -+ - - I ij
o - GLY - ERY - DARA - LARA + RJB + DXYL - LXYL - ADO - MDX - GAL +
GLU + FRU + MNE + SBE RHA + DUL - INO - MAN + SOR + MDM + MOG shyNAG + AMY + ARB + ESC + SAL + eEL + MAL + LAC + MEl + SAC + TRE + i
I1NU - MLZ + RAF AMD GLYG - XLT - aEN + TUR + LYX - TAG - Druc LFUC - DARt + LARL - aNT + 2KG - 5KG shy n ----Taxones significativos ------ Id Tests en contra
Lactoplantarum 1 999 090 o
Taxon siguiente Lacto pentosus 01 012 7
Lactoplantarum 1 o test (s) en contra
Taxon siguiente Lacto pentosus 7 test (8) en contra
GLYCEROL (GLY) 75 D-XYLOSE (DXYL) 100 L-RHAMNOSE (RHA) 25 METHYL-D-MANNOSIDE (MOM) 1 MELEZITOSE (MLZ) 25 RAFFINOSE (RAF) 75 D-ARABITOL (DARL) 0
71
~
I i I
ANEXO F - ANALISIS DE REGRESION PARA pH EN BEBIDA SIN AVENA
Aruilisis de regresi6n polinomial
---~-~-------------------------------------------~-----------~~---------------------~--------------Variable dependiente pHSinAvena ---------------------------~-------------~--------------------~---------------------------------
Error T Parametro Estimado Estandar Estadistico P-Valor
CONSTANTE 535606 0094535 56657 00000 Dia -0150565 0020706 727154 00000 Dia2 000504434 0000871488 578819 00001
---~---------------------------------------------------------------------------------------------------
Anfllisis de Variama -------------------------------------------~-----------~-----------------------------~-~--- jSource Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor 11
------------------------~------------------------------------------------------------------------------~ Mod-elo 155772 2 0118861 4256 00000 Residual 0237877 13 00182983
Total (Corr) 11956 IS
R2 == 867522 percent
pHSinAvena == 535606 - 0150565Dia + 000504434Dia2
72
____
middot ANEXO G - ANALISIS DE REGRESION PARA pH EN BEBIDA CON AVENA
AmUisis de regresion polinomial _____~_____~__-_____~___4____________________bull____bull__________bull_____________~~----_------___________
Variable depcndiente pHConA vena ------------------------------------------------------------------------------------------~--------
Error T Parametro Estimado StAndar Estadfstico P-Valor
---------------------------------------------~-----------------------------------------------_---------CONSTANTE 534463 00801045 667208 00000 Dia -0140407 00175453 800253 00000 DiaA 2 000448098 0000738458 606803 00000
----------------------~---~-----------------------------~------------------------------~----AmUisis de Varianza
---~---------------------------------~---------------------~------------~-------------------~------Source Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio PValor --------------------------~-----------------------------------------------~------------~-----~~--~ ModeJo 159575 2 0797873 6073 00000 Residual 02170798 middot13 00131383 _______~_~ ~_~----------~------~--~-----~-M-----~-----____ _____________~-----------------------Total (COlT) 176654 15
R12 903315 percent
-----------~------------------------------------------------------------------------~-----------pHConAvena 534463 - 0140407Dia + 000448098DfaA 2
73
ANEXO H - ANALTSIS DE REGRESTON PARA ACIDEZ EN BEBJDA SIN AVENA
An8Jisis de Regtesi6fi P6lifJomial
Variable Depefidiefile~ AcidezSinAVenll _______________w_____~______~________________~-----------_________~_________________~~____~___~_____
Error T Pariirnetro Estimado Estandar Estadistico ---------------------------------------~--------------~-~-------~--------------------~------------CONSTANT 0491697 00123217 399051 00000 Dia 00436032 000269882 161564 00000 D1a2 -000144613 000011359 127312 00000 __w___~________________________~-_______-_____~----____________________________~__~---~_--__~___
AriiiJisis de varianza ~_~__~__________~_~____~________~___________- _________e_____________________________bull _____-________
Source Smn de cuadr Df Mean Square F-Ratio PmiddotValor_~~___________________________________bull ______~___________bull ____________bull ______~________w________________
Model 0135203 2 00676013 21747 00000 Residual 000404118 13 000031086
Total (Corr) 0139244 15
R2 970978 percent
AcidezSlnAvena 0491697 + O0436032Dia - 0OOl44613Dia2
74
I
ANEXO I ANALISIS DE REGRESION PARA ACIDEZ EN BEBIDA CON AVENA
1
Anwisis de tegtesi6fi polinomial
Variable dependiente Acidez Con Avena
Error T ParametTo Estimado Stlindar Estadfstico P-Valor ----------------~-------~---------------------~-----------------------------------------------------CONSTANT 0491639 000926607 530578 00000 Diamiddot 00406572 000202955 200326 00000 DfaA 2 0000982559 0000085421 -115025 00000
-------------~----------------------------~-------------------------~-----------------------------------
-------------~-----~~-----------------------------~---------------------------------------------_--Source Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio PValor
-~-------------~----------------------------------~------------------~~-------------------------- Modelo 0288008 2 0144004 81914 00000 Residual 000228539 13 0000175799
----------~~--------------~---------------------------------------------~---------------------------Total (Corr) 0290294 15
RA2 = 992127 percent
-------------------------~----~---~------------~---------------------------------~---------------~
AcidezConAvena == 049163amp + 00406572D1a - 0000982559DiaA2
75
I
(Ilmiddot il
ANEXO J- ANALISIS DE REGRESION PARA RECUENTO LACTOBACILOS PARA BEBIDA SIN AVENA
Amilisis de regresion - Modelo lineal Y = a + bX
------------------------~----------------------~-----------------------------~----------~-----------Variable Dcpendiente LactobacilJusSinAvena Variable independiente Dia
I--------~----------~-----------------------------------~-------~-~--~--------------------------~-Error T
Paramctro Estimado Standard Stadistico P-Valor
----~----~------------~-----~-----------------------~-------------~-----------------------------Intereepto 117347 0389973 300911 00000 Pendiente 00483464 00257889 18747 00903
Analisis de Varianza
---------~------------------~----------------~---------------------------------~---------~----------Source Sum decuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor
------------~---------------------~---------------------~--------------------------------~-----~----Modelo 0916252 1 244835 443 00616 Residual 260706 10 0260706
--~------------~---~------------------~~~-----~-------~---------~~-------------------------------------Total (Corr)352332 11
Coeficiente Correlaci6n = 0509955 R2 = 260054 percent
LactobacillusSinAvena= 117347 + 00483464Dfa
76
ANEXO K- ANALTSIS DE REGRESION PARA RECUENTO LACTOBACILOS PARA DEBIDA CON AVENA
Aruilisis de regresion - Modelo lineal Y = a + hX
Variable Dependiente LactobacillusConAvena Variable Independiente Dia ---~--------------------------------------------------------__-----------__--_--_-----------shy
Error T Paramctro Estimado Standard Estadistico P-Valor -~--------------------------------------------------------------------------------------------------
Irttercepto 118103 0567963 207942 00000 Pendiente 00790304 00375594 210414 00616
-----------------~----------------------------~----~-------~----~----------------------------
Analisis de Varianza
----------------~----------------~------------------~--------------------------~------~--------shySource Swn de cuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor
-----------------~--~--------------------------------------------------------------------------~---~ Mode10 244835 1 244835 443 00616 Residual 552997 10 0552997
Total (Corr)797832 11
Coeficiente Correlacion = 0553964 RI2 = 306875 percent
-----~--------------------------------------------------------~--------------------------------------
LactobacillusConAvena = 118103 + 00790304Dfas
77
)
de 1a soya y fa avena Estenmiddot presentes en alimentos como Ie cebolla ajo
banano puerros 1 derivados del trigo achicoria esparrago alcachofa (Cummings
etal 2001)
Algunos de estos prebi6ticos cuanda son incorporado$ a fa dieta en cantidades
dalerminadas alteran la microbiota intestinal disminuyendo los recuentos de
coliformes bacteroides y cocos y aumentando las bifidobacterias hasta en diez
veces ademas modifican la actividad metab6lica del coron logrando una
disminuci6n del pH y un incremento en el contenido fecal de acidos grasos de
cadena corta como at acatica propi6nico y butfrico El butirato aumen~ _I grosor
de la pared del coron e intestino delgado estimula eJ crecimiento de la mucosa del
colon y auManta su flujo sangufneo inhibe el crecimiento de tinsas tumorales
epiteliales de origen co16nico induce la diferenciaci6n de sus celulas y a
apoptosis entre otros(Brunsar 2001)
Eh estudios hechos en simuladores del intestino humano utilizando productos de
avena fermentados se encontro que estimularon al crecimiento tanto de
lactobacios como de bifidobacterias y en el caso de estas ultimas se incremento
la producci6n de los acidos acatico propionico y butfrico 10 que incide sobre la
implantacion de probi6tico$ e inhibe al crecimientos de otro tipo de
microorganismos (Alal1der eta1999 Kontula etal 1998 Jaskari etal 1998)
24
~ -1
(
AI comparar el comportamianto de las leches de diferente origen se ha
demostrado que Ie leche de vaca contiene caseinatos sustancias que forman
buffer ~n et intestino e inlpiden que los probi6ticos disminlJyen el pH del intestina
y de esta manera se impide al efecto deseado que es evitar fa proliferaci6n de
otros microorganismos entre los cuates pueden estar algunos patOganos En la
leche materna sa encuentran algunos carbohidratos como glucosa galactosa n
acetilglucosamina y algunos 0lig6meros de Ie fucosa en cOhoontracionesmiddot
importantes los cualeS favoreceh el crecimientc)middot de probi6ticos esto
complementado can 91 bajo contenido de protenas que se traduce en una
reducida capacidad buffer hacen de Ie lache materna IJn alimentd adecuado para
nllios en su etape de lactancia
Algunos prebi6ticos como 1a lactulosa yciertos compuestos que contiansn fructosa
no son digeridos en el intestino humano y pueden sar utilizados selectivamenta
par los probi6ticos 10 que hace que los probi6ticos en combinaci6n can prebi6ticos
pueden lIegar a ser un importante medio para prevenir algunas enfermedades del
tracto gastrointestinal (Bezkorovainy 2001)
25
2 METODOlOGfA
21 LOCALIZACION
EJ trabajo sa realizo en el laboratorio de Microbiologia y la planta da laches de Ja
Universidad Naclonal de Colombia- Secie Medellin
En al laboratorio se hiZQ al aislamiento a identificaci6n de fa capas y en fa Planta
sa eJaboro la leche fermentada con 1a cepa seleccionada y el prebi6trco
22 METODOS
221 Aisiamiento de cepas nativas
Las cepas nativas se sislaran de producto$ vegetales leches fermentadas y
mucosa vaginal humana
2211 De vegetales
Las muestras vegetales de repollo repollitas de brusefas y pepino se
seleccionaron porcionaron y mezclaron can cloruro de sadio al 10 pIp se
calacaron en un recipienta de vidrio balo anaerobiosis y sa dejarQn por 15 dias
26
luego S9 tomaron 3 ml de cada muestra y se jnocularon 9 ml de caldo MRS (Man
Rogosa and Sharpe) se incubaron a 37deg C durante cinco dias en camara de
anaerobiosis (Ver Figura 1) Oespues de este tiempo sa inocularon cajas de petri
con agar MRS con 1 ml del cultivo microbiano y se incubaron bajo las mismas
condiciones que eJ caldo Este procedirniento se realiz6 rapetidas veces hasta
seleccionar la cepa pura mediante observaci6n de caracteristicas morfologicas de
la cOlonia y a cada colonia se Ie practico la coloracion de gram con el fin de
observar las caracteristicas microscopicas de cada una e identificar las de mayor
similitud a los Lactobacilos y Bifidobacterias
Figura 1 Camara de anaerobiosis
27
2212 De la leche
Sa tomo 200 ml de teche cruda de la planta de leches y se colaca a fermentar
baja anaerobiosis durante 15 dras Luego sa procedia como en los vegetales
2213 De mucosa vaginal humana
Se tomo una muestra de frotis de mucosa vaginal humane can capito esteril sa
puso a ncubar en Caldo MRS y se procedi6 camo en 2211 y 2212 A cads
aislado sa Ie practico la coloracion de gram y sa seleccionaron aquellas que eran
bacilos gram positivos (Ver Tabla 2)
28
TABLA 2 Fuente de aislarniento de cepas nativas
CEPA FUENTE
1 Pepino fermentadQ
2 repollitas de bruselas fermentadas
3 Repolltgt fermentado
4 Repollo fermentado
5 Mucosa va~inal humana
6 Mucosa vaginal humana
7 repollitas de bruselas fermentadas
8 Repollo fermentado
9 repollitas de bruselas fermentadas
10 Mueo~a vaginal humana
11 Repollo fermentado
12 RepolJo fermentado
13 Leche fermentada
14 Mucosa vaginal humana
15 repollitas de bruselas fermentadas
16 Repollb fermentado
29
222 Almacenamiento de las cepas aisladas
Cuando las cepas crecieron en agar MRS homogEmeas en color morfologia
coloraci6n de Gram etc se pssaron a agar inclinado en tuba se cubrieron con
aceite mineral y se guardaran en refrigeraci6n a 4deg C para tomar de alii la cepa y
efectuarle las diferentes pruebas para confirmar el genera y determinar la especie
de cada una de eas (Ver Figura 2)
Figura 2 Cepas en tubos con agar inclinado
30
223 Pruebas para determinar et genero
2231 Coforaci6n de Gram
A cada cepa sospechosa de Lactobacilos se 1e hizo la coloraci6n de gram y se
seleccionaron las gram positivas
2232 Morfologfa
En agar MRS y despues de incubar en anaerobios~s crecian colonias grandes
cremosas de color beige con bordes homogeneos y c6ncavas(Ver Figura 3)
Figura 3 Colonias aisladas en agar MRS
31
2233 Prueba de esporulaci6n
A cada cepa aislada se Ie hizo esta prueba la cuel consistia en incubar en
aerobiosis durante ocho dias las cajas de agar MRS donde crecieron colonias de
Lactobacilo$ y luego se les (ealize) coloraci6n de espora Las capas que dieron
negativa a la prueba de espora se considararort sospechosas de sar Lactobacilos
y se continuo con la prueba de la catalasa (Ver Tabla 3)
2234 Prueba de la catalasa
los lactobacilos carecen de catalasa Eata prueba se hizo tomando una colonis
se deposito en vidrio de reloj y se Ie adicion6 dos gotas de peroxida de hidr6geno
(H202) la que no presentaba efervescencie eran cepe sospechosa de ser
Lactobacilo (Ver Tabla 4
Sa seleccionaron las capas euyo resultado fue aeorde con el genera Lactobacilfu$
y se continuo con la comirmaeion del genera y determinacion de la eSpecie
meqiante las pruebas bioqulmicas
32
224 Prueba para determlnar la especie
Para confirmar el genero y determinar la especie de las diferentes capas aisladas
se hizo una caracterizaci6n bioqufmica utilizando un kit de API 50 CHL Medium
Ref 50 410 que contiene una galed8 de medios que permite realizar el estudio
de fermentaci6n de los 49 azucares de 52 especies de Lactobacillus (Ver Figura 4
y tabla 5)
Figura 4 API CHL 50-Prueba bioquimica
33
225 Pruebas para determinar microorganismos probi6ticos
2251 Resistencia a pH=2 y sales biliares de concentraci6n O3pv
A las cepas idantificades como Lactobacillus brevis y Lactobacillus pantarum sa
las realiz6 Ie prueba dfl resistencia a pH=2 y sales biliares de concentraci6n 03
pv ( Jacobsen et al 1999) Una colonia de cada cepe aislada se inocul6 en 4 mt
de caldo MRS durante cinco dras bajo condiciones de anaerobiosis Oespues de
esta tiempo se dejaron pracipltar los microorganismos por sedimentaci6n se Ie
retire el sobrenadante y al precipitado se Ie adicion6 Sml de caldo MRS
previamente ajustado a pH=2 can seido clorhfdrico (HCI) dentro del mismo tuba de
ensayo G igual sa hizo can otro tubo previamente incubado pero a este se Ie
adiciono 5ml de caldo MRS con sales biliares a una concentra~i6n de 03 plv y
ambos se incuberon a 37deg C por 2 haras Sa midio 01 mi de cada uno de los
tubas al tiempo 0 y a las 2 horas y sa inoculeron en superficie en caJas de petri
con agar MRS S9 incubaron a 37deg C bajo anaerobiosis durante 48 horas Se
compararon visualrrente en cada caja de petri el crecimiento en superficie y las
que presentaron crecimiento en tos dos tiempos (0 y 2 horas) tanto en at media
acido como en sales I se consideraron resistentes a pH=2 y sales biliares (03
pv)
(Ver Tabla 6)
34
226 Conservacion
Todas fas capas que habian dado positiva Jas pruebas anteriores y que reaultaron
resistentes a pH=2 y sales biliares 03 pv y despues de identificadas en API 50
CHL sa repicaron en agar MRS en tuba inclinado y despues de Incubar a 37deg C
por 48 horas bajo anaerobiosis se Ctlbrie el biser completamente can aceite
mineral esteril y sa guardaron en refrigeraci6n
227 Elaboracj6n de fa bebida fermentada
2271 Preparaci6n de la mue$tra
Sa tome 1 mt de caldo MRS previamante inoculado e incubado que presentaba
una concentracion de Lactobacillus brevis de 27x108 Iml segun la escaJa de Mac
Farlan y sa adiciono a 9ml de leche pasteurizada en un tubo sa dej6 incubanda
en anaerobiosis por 48 hores Luego se pasaron estos 10 ml a un frasco qua
cont~nie 90 ml de leche pasterizada y se dej6 incubando par 48 haras en
anaerobiosis
35
2272 Adici6n del inOculo
A 900ml de leche pasteurizada se Ie adicion61os 100 ml de leche que habia sido
previamente ino(ulada dos veces con la cepa posteriormente se deja
fermantando la lache a temperatura de 37deg C
2273 Control de Ja fermentaci6n
Las muestras se hicieron por cuadruplicado y se les hizo un seguimiento de
aoidez hasta un valor entre 04 y 05 expresada como Bcido lactico esta
procedimiento corresponde a la babida fermentada sin prebi6tico La bebida ~on
prebi6tico tiene al mismo proeedirnianto pero adicionalmente se agrag6 avena a
una concentraci6n de 05 en el momento de la adici6n del in6e410 a los 900 ml
de leehe pasteurlzada y el procedimiento sigui6 igual al de la bebida sin prebi6tico
tambien se hizo por cuadruplicado
2274 Refrigeracl6n
Despues que las mezclas con y sin prebiotico alcanzaron el de acidez
requarido se IIeva ron a refrigeraci6n a una temperatura de 4deg C p~r 24 horas
para frenar proce~os metab6licos de los microorganisrtlos Despues de este
ti~mpo se procedi6 al batido
36
1 2275 Batido
Con un agitador se procedi6 a batir las bebidas para romper et coagulo formado
y de esta manera homogeneizar la mazela y obtener asf la bebida fermentada
2276 Envasado y almacenamiento
Ambas bebidas se envasaron en frascos vidrio para hacerles seguimiento de pH
acidez(expresado como acido tacticol y recuento de Lactobacillus breviSf los
dies 27 14 Y 21 despues de elaboradas las bebidas perfodo durante el cualta
muestra permanecfa afmacenada a temperatura de refrigeracion(Ver Figura 5
37
Fjgura 5 Diagrama de Flujo
PREPARACION DE LA MUESTRA
ADICION DEL INOCULO
~_____~_B~ATIDO~______~
INCUBACION 37deg C hasta acidez = 04-05 acido laotico
ENFRIAMIENTO
hasta 4 0 C ~------~ ~------~
ENVASADO Y ALMACENAMJENTO
dUrante 21 dfas a Temperatura 4 0 C
38
1
228 Determinaci6n del pH
Se determino por el metoda potenciometrico en un pH-metro manual durante los
dias 2) 7 14 Y 21 de las bebidas lacteas sin y con prebi6tica (Ver Tablas 7 y 8)
229 Oeterminaci6n de la acidez (Expresadfl como acido
lactica)
Se tomaron 9 mJ de las bebida~ sa Ie adicionaron 2 gotas de fanoftaleina como
indicador y sa titulo fa acidez con NaOH 01 N hasta la aparicion de un cotor rosado
debit EI volumen de NaOH utilizado se reporta como valor de de acidez
(VerTablas 10 y 11)
2210 Prueba de viabilidad
Qurante el perfoda de almacenamiento de la bebida lactea se procedi6 a hacer la
prueba de viabiHdad en los dias 7 14 Y 21 para determinar Si los lactobacilfus
permanecfan vivOs a una concentraci6n minima de 106 hasta el dia 21 como 10
establece eJ Articulo 10 de la Rasolucion 2310 del Ministerio de $alud de
Colombja
39
Para asta prueba se tamaron 10 rnl de muestra y se adicionaron a 90 ml de caldo
MRS ruego a partir de esta se hicieron diluciones de 10-2 hasta 10-11 de las
diluciones 109101deg 10-11 se inocul6 1 ml de cada uno en agar MRS siguiendo el
metodo de siembra en profundidad y por duplicado e incubando a 370 C x 5 dras
en anaerobiosis y luego se hicieron tos recuentos por duplicado para esi reportar
los recuentos promedio (Ver Tablas 13 y 14)
2211 AniUisls microbiol6glco de las bebidas Iicteas(con y sin
avena)
Con el fin de determinar las condiciones higienico-sanitarias del producto se
realizaron las pruebas microbiol6gicas de Recuento de mohos y fevadurasml en
agar OGY Recuento en superficia de Staphylococcus coagulasa positivoml en
agar Baird Parker Numero Mas Probable (NMP) de coUfor-mes totales y
Escherichia coliml en caldo Fluorocult y Presencia de Salmonela25ml con BHI
caldo tetrationato y agar Hecktoen (Montoya 1999)
(Var tabla 16)
2212 AnaUsis estadistico
A los datos obtenidos en la medici6n de pH acidez (expresada como Beido
laclico) en los dras 2714 Y 21 y el recuento de Lactobacillus en los dras 714 y21
40
realizados a los dos tratamlentos se tes aplic6 1a prueba t porque solo difieren
en la presencia 0 ausencia del prebi6tico para evaluar si habra diferencia
estadfsticamente significativa para los dos tratamientbs(Ver Tablas9 12 y 15)
41
3 RESULTADOS Y DISCUSION
31 Coloraci6n de Gram y morfologfa
Las cepas aisladas fesultaron Gram positivas (Ver Figura 6) colonias grandes
cremosas dE) color beige con bordes homogeneos y c6ncavos en su
morfologia (Ver Figura 3) resultando de acuerdo a 10 especificado en Stanley
1989 para Lactobacillus
32 Prueba de esporulaci6n y cataJasa
Los resultados de la pruebas de esporulaci6n y catalasa indicados en las
Tablas 3 y 4 respeclivamente dieron conforme a 10 especificado en Stanley
1989 para Lactobacillus
42
1
2 3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
TABLA 3 Resultado de prueba de esporuJaci6n
CEPA RESULfADO ESPORULACION
-- -------------
43
l i ~II bull ~ I I
TABLA 4 Resultado prueba de la catalasa
CEPA RESULTADO CATALASA
1 -2 -3 -4 -5 -6 -7 8 -9 -10 -11 12 -13 -14 -15 -16
3~3 Prueba para determinar la especie
Oespues de hacer las pruebas para seleccionar las cepas sospechosas de ser
Lactobacillus se realizo las pruebas bioquimicas fograndose identificar
Lactobacillus plantarum aislctdo de pepino repollo y repollitas de bruselas
44
fermentados y Lactobacillus brevis de mucosa vaginal y leche fermentada (Ver
Anexos del A al E y Tabla 5)
TABLA 5 Resultado identlficaci6n cepa~
CEPA NOMBRE
1 Lactobacillus planfarum
3 Lactobacillus plantarum
5 Lactobacillus brevis
13 Lactobacillus brevis
15 Lactobacillus plantarum
34 Pruebas para determinar microorganismos probi6ticos
las cepas de Lactobacillus brevis y Lactobacillus plantarum mostraron
rasistencia al medio acido de pH =2 Y sales biliares 03 pv resultado similar al
encontrado por Jacobsen et al 1999 para Lactobacillus plantarum (Ver tabla 6)
45
middot
~~~ttiI lltlmiddot~COX~dtJ ~xtc_~ 2 tr~ k-JlL~middot
-)~~TO DE lJIBUOTECUl rjRL]OTtCA twn GO1IU1
TABLA 6 Resultados a pruebas de resistencia a pH=2 y sales biliares 03 plv
CEPA RESISTENCIA pH=2 RESISTENCfA A SALES BIUARES ()3 pv
1 + +
2 + +
3 + +
4 + +
5 +
6 + +
7 + +
8 + +
9 + +
10 + +
11 + +
12 + +
13 + +
14 +1shy +M
15 + +
16 + +
+1 crecimiento debil
+ crecimiento abundante
46
Figura 6 Lactobacillus brevis Gram + aislado de leche fermentada
Ai observar en placa las celulas de lactobacilos despues de real1zar las pruebas
de resistenCia a la acidez y sales biliares se observo una tendencia a aglomerarse
posiblemente como un mecanismo de proteccion cOlitra estos medios que pueden
lIegar a ser adversos para elias (Ver figuras 7 y 8)
47
Figura 7 Lactobacillus brevis aislada de leche fermentada despu~s de la prueba de resistencia a pH=2
Figura 8 Lactobacillus brevis aislada de leche fermentada despues de la prueba de resistencie asales biUares 03 plv
fI
48
35 --Seguimiento del-pH-en-la-bebidaJacteacon y sin -prebi6tico
A continuacion se muestran las Tablas 7 y 8 donde sa registian los datos
recopilados de pHdurante 10$ dras Z 7 14 Y21 para las bebidas laaeas con ysin
prebi6tioo
TABLA 1 ResultadopH yogur sin avena
Dia Repetition 1 Repetici6n 2 Repeticion 3 Repetici6n 4
2 526 501 51 52
7 446 433 438 44
14 439 435 437 436
21 439 437 438 437
TABLA 8 -ResultadopHyogur con avena
Dia Repeticion 1 Repeticion2 Repeticion 3 - Repeticion 4
2 509 523 51 515
7 447 442 445 442
14 436 -438 439 437
21 432 433 435 434
Observando la Figura 9podamos ver que el pH en el -dfado$ para los dos
tratamientos as igual y empieza a descender rapidamente para estabilizarse a
partir del dra 7(Ver figura 9)
49
Figura 9 Comparacj6n de medias para -el pH
Comparaci6n de medias para pH
55 ~ 5 +----=gtIIIi-~i~~----=-r--it~ -- pH sin avena
a 45 1--~~~~=~~ 4 --- pH con
avena35 t-----r-- -------=------=--= ------- - ----
2 7 14 21
Dias
Aplicando la prueba t para comparar las medias de pH I S6 muestia una diferencia
altamants significativa en los dos tratamientos para el dia 21 (pltO05)
(Ver tabla 9)
TABLA 9 Compaiaci6n de medias para pH
DtAS SIN AVENA CON AVENA te p (VALOR)
2 514 514 0 10
7 439 444 -1 61 0159
14 437 I
438 -070 0510
21 438 433 528 00019 shy
- DiFERENCIA AlTAMENTE SIGNIFICATIVA
50
I
AI aplicar regrasi6n a los datos sa obtiene al modelo estimado
pHSinAyena =535606 - 01505650Ia +0005044340IaI2
La variabilidad en la respuesta de pH asta siendo explicada en un 8S7522 por
el modelo (Ver Anexo F)
EI tratamiento con avena mostro el siguiente modelo al analisis de ragresi6n
pHConAvena =534463 ~ 0140407Dia + 0004480980Ia2
La variabilidad an la respuesta de pH asta siendo explicada en un 903315 par
el nlodelo(Ver anexo G)
36 Seguimiento de la acidezmiddotmiddot expresada comomiddot de acido
lactico
A continuaci6n sa muestran las Tablas 10 y 11 donde sa registran los datos
tecopilados de acidezmiddotdurante los dias 27 14 Y 21 para las pebidas taetees con y
sin prebi6tico
TABLA 10 Resuttadode acidez (expresadocomo acido tactico) yogurt sin avena
CIA R~petici6n1 Repeticion2 Repetici6n 3 Repeticion 4
2 054 06 057 058
7 072 074 073 0]2
14 080 083 082 082
21 0]4 079 078 077
51
TABLA 11 Resultado de aCidez (expresado como acido Icktico) yogurt con avena
Dia Repetici6n 1 RepetiCi6n 2 Repetici6n 3 Repetici9n 4
2 059 055 058 057
7 071 073 072 072
14 089 087 088 086
21 092 091 090 091
Observando la Figura 10 se puede concluir que la acidez empieza a aumentar
hasta el dia 14 y luego trata de estabilizarse para los dos tratamientos
(Ver figura 10)
Figura 10 Comparaci6n de medias para la acidez
N G)
Comparacion de medias para acidez
1
2 0I 5 -+--=--------=-~~~= u
ltC
- Acidez sin avena
2 7 14
Dias
52
21
-it- Acidez con avena
Aplicando la prueba t para camparar las madias de acidez se muestra una
diferencia altarnante significativa en los dos tratamiantos para los dias 14 y 21
(pltO05)
(Var tabla 12)
TABLA 12Comparaci6n de medias para Acidez
DIASmiddot SIN AVENA CON AVENA te p(VALOR)
2 0572 0572 0 10
7 0727 0720 119 0278
14 0818 0875 -638 000070shy
21 077 091 -1212 i 0000019 shy
DIFERENCIA AL TAMENTE SlGNIFICATIVA
AI aplicar r~gresi6n a los datos se obtiene el modelo estimado
AcidezSlnAIena = 0491897 + O0436032Dia O00144613DfaA2
La variabilidad en la respuesta de acidez asta siendoexplicada en un 970978
por al modelo (Ver anexo H)
EI tratamiento con avena mostro elsiguiente modeloj a1 analisis de regresion
AcidezConAvena = 0491638 + 00406572Oia - OQOO982559OiaA2
La variabilidad enla respuesta acidez esta siendo explicadaen un 99212 por
el modelo (Ver anexo J)
53
I ~
37 Prueba de viabiJidad
A continuaci6n sa muestran las Tab~as 13 y 14 donde sa presentan los datos
recopilados del recuento de Lactobacilos durante los dias 7 14 Y 21 para las
bebidas lacteas con y sin prebi6tico
TABLA 13 Recuento de Lactobacilos (UFCml) yogurt sin avena
Dia Repetici6n 1 Repetici6n 2 Repeticion 3 Reptttici6n 4
7 1880X10l1 1454X1011 1642X1011 1780X10~
14 1560X10~ 646X1011J 1890X10l 140X10l1
21 1200x10lu 128Ox10u 1745x10J 1520x101V
TABLA 14 Recuento de Lactobacilos (UFCml) yogurt con avena
Dfa Repetieion 1 Repetici6n 2 Repeticion 3 Repeticf6n 4
7 1600X10lt 1240X10t 1640X10ll 1980X10t
14 540X1011 427X10n 546X10n 720X10ll
21 500x1011 492x1011 712)(1011 980x10~
AI analizar la Figura 11 sa puede observar un recuento mayor de Lactobacilos
en al tratamiento con avena resultado de acuerdo a 10 encontrado por Alander at
aI 1999 Kontula et aI 1998 y Jaskari et aI 1998
54
Figura 11 Comparaci6n de medias para Log Lactobacillus
Comparacion de medias para log Lactobacillus
~ 1350
-+- Sac Sin--() 13 co avenaIII
bull 125 -- Bac con 0)
0 12 avenaJ
115 7 14 21
Dias
Aplicando la prueba t para comparar las medias de recuento de Lactobacillus no
se encontr6 una diferenc1a estadfsUcamente significative entre los dos
tratamientos (Ver tabla 15)
Este aumento en al racuento influy6 en la disminuci6n del pH y en el aumento de
fa aeidez por la fermentacion que realizan los Lactobacillus sobre fa lactosa de la
lache y la avena adicionada como prebi6tico
55
1
TABLA 15 Comparaci6n medias lag Lactobacillus
DIAS SIN AVENA CON AVENA tc p(VALOR)
7 122257 122022 04846 06451
14 121065 132393 -19602 00977
21 129025 133087 -08236 04416
At aplicar regresion a los datos se obtiane al modelo astimado
LactobacillusSinAvena= 117347 + 004834640Ia
La variabilidad en la respuesta del recuento de LactobaCillus ssta siendo
explicada en un 260054 por el mod$loVar anexo J)
EI tratamiento con avena mostr6 al siguiente modalo al anal isis de regresion
Lactobacillu$ConAvena =118103 + 007903040Ias
La variabilidad en la respuesta de recuento esta siendo explicada en un 3068
por al modelo(Ver anexo K)~
38 Analisi$ microbiol6gicos de las bebidas lacteas con y sin
En la Tabla 16 estan recopilados los resultados microbiol6gieos obtenidos en ras
muestras con los dos tratamientos (con y sin avena)
I [
sa
TABLA 16 Resultados analisis microbiologico
Recuento de mohos y levaduras Iml lt10
Recuento de Staphylococcus coagulase positiva Iml lt100
NMP coliformes fotales y Escherichia coli Iml lt3
Presencia de Salmonella25ml Ausente
Los resultados de este analisis demuestran que las bebidas fermentadas con y
sin avena~ astan fibres de microorganismos patogenos
57
1
4 CONCLUSIONES
Se aislaron cepas nativas de Lactobacillus plantarum de las muestras vegetates
de repollo pepino repollitas de bruselas fermentadas y Lactobacillus brevis de
lache fermentada y mucosa vaginal humana Ambas cepas resistieran un pH=2 y
una concentraci6n de sales biliares det 03 ptv dos earacteristicas importantes
en los probi6ticos
Lamiddot cepa de Lactobacillus brevis aislada de lache Sa utiliz6 para elaborar una
bebida fermentada sin y con avana comoingrediente prebiotico obteniendose un
aJimento centon recuento del probi6tico viable durante 21 dras de seguimiento
ademas libre de microorganismos )at6gen05
No se encontr6 efecta significativo de la avena sobre Ie viabilidad del Lactobacillus
brevis aunque sa presento un aumento en 61 recuento de estos en la bebida con
avena
58
plusmn ~
5 RECOMENDACIONES
Ensayar la cepa de Lactobacillus plantartJm en productos carnicos madurados
como el salami
Ensayar la cepa de Lactobacillus l)revs en otros derivados lecteos como queso
quesito queso crema
Continuar con el estudio de estos microorganismos y caracterizarlos
molecularmente ademas de estudiar su capacidad de adherencja a fa mucosa
intestinal sobre algunes Hneas celulares como las CaCo~2
Estudiarel efedo de la avena sabre la viabiJidad del Lactobacillus breyis a una
concentraci6n mayor de 05
Realizer ensayos can las cepas de Lactobacillus brevis y Lactobrlcillus pJantarum
para elaborar masas acidas para panificacion reemplazando el Bromato de
Potasio aditivo prohibido desde marzo del 2003 en nuestro pais per 5U toxicidad
59
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65
ANEXOS
66
ANEXO A RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AlSLADA DE i
PEPINO it
Referencia Pepino 1 Fecha 06122002
IEXCELENTE IDENTIFICACION
Latto plantarum 1
Galeria API 50 CHL V50 Leida el 06122002
Perfil - -- - ++ - -- - ++++ - - -+- + - I I I I I I I I +t+ - +f- ~ - - + + ~ - - - +- + - shy
o - GLY - ERY DARA - LARA + RIB + DXYL - LXYL - ADO - MDX - GAL + GLU + FRU + MNE + SBE - RHA - DUL - INO bull MAN + SOR - MDM + MUG shyNAG + AMY + ARB + ESC + SAL + CEL + MAL + LAC + MEL + SAC + TRE + 1NU - MLZ + RAF + AMD - GLYG - XLT - GEN + TIJR + LYX - TAG - DFUC shyLFUC - DARL + LARL - aNT + 2KG - 5KG shy
--- Taxones significativos rd -----T -- Tests en contra
Lactoplantarum 1 999 092 1
Taxon siguiente Lactobrevis 1 OJ 044 3
i i
Lactoplantarum 1 1 test (5) en contra
D-SORBITOL (SOR) 78
Tax6n siguiente Lactobrevis 1 3 test (s) ert contra
METHYLD-MANNOSIDE (MOlM) 0 MELEZITOSE (MLZ) 14 D-TURANOSE (TUR) 14
67
ampb
ANEXO B RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AISLADA DE REPOLLO FERMENTADO
~
Referencia Repollo fermentado - 3 Fecha 03072003
EXCELENTE IDENTIFICACION
Lactoplantarum 1
Galena API 50 CRL V50 Leida el 03072003
Perfil - - ++ - - - - -H++ - - ~ + - + - I I 1 I I I I -H+ - ++ - - - + + - -- - - + - shy
o - GLY - ERY - DARA - LARA + RIB + DXYL - LXYL - ADO ~ MDX - GAL + GLU + FRU + MNE + SBE ~ RHA - DUL - INO - MAN + SOR - MDM + MDG shyNAG + AMY + ARR + ESC + SAT + CRL + MAL + LAC + MEL + SAC + TRE + lNU - MLZ + RAF + AMI) - GLYG - XLT - GEN + TOR + LYX - TAG - DFUC shyLFUC - DARL - LARL - GNT + 2KG - 5KG shy
------Taxones significativos _ _----- Id--- ---T---- Tests en contra
Lactoplantarum 1 999 095 1
Tax6n siguiente Lactobrevis 1 01 OA8 3
lJactoplantaru01 1 1 test (s) en contra
DSORBITOL (SOR) 78
Taxon siguiente Lactobrevis
METHYL-D-MANNOSIDE D-TURANOSE
1
(MOM) (TOR)
3 test (5) en contra
0 MELEZITOSE 14
(MLZ) 14
i
I
68
ANEXO C RESULTADO PRUEBAS BIOQUWICAS DE CEPA AISLADA DE MUCOSA HUMANA
Referenda Mucosa - 5 Fecha 27012003
BUENA IDENTlFICACION
Galeria API 50 CHL vso Leida el 270112003
Perfil - - - - +t--t - - - + - + - - - - - - - - -+- - - - - + - + - - - - - - - - - - - - - bull - - -+ - +
o - GLY ~ ERY - DARA bull LARA + RID + DXYL + LXYL - ADO bull MDX - GAL + OLU - FRU + MNE - SBE - IlliA - DUL - INa - MAN - SOR - MDM - MOO shyNAG + AMY - ARB - ESC ~ SAL bull CEL - MAL + lAC - MEL + SAC - TRE shyINU - MLZ - RAF - AMD - GLYG - XLT - GEN - 11JR - LYX - TAG - DFUC shyLFUC - DARL - IARL - ONT + 2KO - 5KG +
- - - - - - Taxones significativos - - - - - - - Id T -- Test en contra
Lactobrevis 3 963 088 1
Taxon siguiente Lactoco11inoides 36 075 2
Lactobrevis 3 1 test (s) en contra
GLUCOSE (GLU) 95
-~~~------------~---------------------------~--~-------~--~-----~----------~--------~------------~~--Taxon siguiente Lactocollinoides 2 test (s) en contra
GLUCOSE (GLU) 100 MELIBIOSE (MEL) 25
69
i r
ANEXO D RESULTADO PRUEBAS BIOQIJiMICAS DE CEPA AISLADA DE LECHE FERMENTADA
Referenda Leche fennentada ~ 13 Fecha 27012003
BUENA IDENTIFICACI6N
Galeria API 50 CHL V50 Leida el 270112003
Perfil - - - - -t-t+- - - - + - + - - - bull - - - - -+- - - - - + - + - - - - - - - - - - - - - - - - -+ - +
0 - GLY - ERY - DARA - LARA +Rll3 + DXYL + LXYL - ADO - MDX ~GAL + GLU - FRU + MNE SBE - RHA DUL bull INO MAN - SOR MDM bull MDG shy
~NAG + AMY - ARB - ESC - SAL - CEL - MAL + LAC - MEL + SAC - TRE I lNU - MLZ - RAF - AMD - GLYG - XLT - OEN - IUR LYX - TAG - DFUC bull i
LFUC - DARL - LARL -ONr + 2KG - SKO + 1
- -- - - Taxones significativos - - Id -- T --- Test en contra
Lacta brevis 3 963 088 1
Taxon siguiente Lactocollinoides 36 075 2
Lactobrevis 3 1 test (s) en contra
GLUCOSE (GLU) 95
-----------------------------------------------------------~------------------------------~-------------------Taxon siguiente Lactocollinoides 2 test (s) en contra
GLUCOSE (GLD) 100 MELffiIOSE (MEL) 25
70
II iJ1
I
I ANEXO E RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AISLADA DE REPOLLITAS DE BRUSELAS FERMENTADA
Referencia repollitas de bruselas 15 Fecha 03072003
EXCELENTE IDENTIFICACION
Lactoplantarum 1
Galeria API 50 CHL vsO Leida el 03072003
Perfil - - - - +t - - - - +H+ - +- - +t + - I I I I I I I f ++t - + - - - -+ + - - - -+ -+ - - I ij
o - GLY - ERY - DARA - LARA + RJB + DXYL - LXYL - ADO - MDX - GAL +
GLU + FRU + MNE + SBE RHA + DUL - INO - MAN + SOR + MDM + MOG shyNAG + AMY + ARB + ESC + SAL + eEL + MAL + LAC + MEl + SAC + TRE + i
I1NU - MLZ + RAF AMD GLYG - XLT - aEN + TUR + LYX - TAG - Druc LFUC - DARt + LARL - aNT + 2KG - 5KG shy n ----Taxones significativos ------ Id Tests en contra
Lactoplantarum 1 999 090 o
Taxon siguiente Lacto pentosus 01 012 7
Lactoplantarum 1 o test (s) en contra
Taxon siguiente Lacto pentosus 7 test (8) en contra
GLYCEROL (GLY) 75 D-XYLOSE (DXYL) 100 L-RHAMNOSE (RHA) 25 METHYL-D-MANNOSIDE (MOM) 1 MELEZITOSE (MLZ) 25 RAFFINOSE (RAF) 75 D-ARABITOL (DARL) 0
71
~
I i I
ANEXO F - ANALISIS DE REGRESION PARA pH EN BEBIDA SIN AVENA
Aruilisis de regresi6n polinomial
---~-~-------------------------------------------~-----------~~---------------------~--------------Variable dependiente pHSinAvena ---------------------------~-------------~--------------------~---------------------------------
Error T Parametro Estimado Estandar Estadistico P-Valor
CONSTANTE 535606 0094535 56657 00000 Dia -0150565 0020706 727154 00000 Dia2 000504434 0000871488 578819 00001
---~---------------------------------------------------------------------------------------------------
Anfllisis de Variama -------------------------------------------~-----------~-----------------------------~-~--- jSource Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor 11
------------------------~------------------------------------------------------------------------------~ Mod-elo 155772 2 0118861 4256 00000 Residual 0237877 13 00182983
Total (Corr) 11956 IS
R2 == 867522 percent
pHSinAvena == 535606 - 0150565Dia + 000504434Dia2
72
____
middot ANEXO G - ANALISIS DE REGRESION PARA pH EN BEBIDA CON AVENA
AmUisis de regresion polinomial _____~_____~__-_____~___4____________________bull____bull__________bull_____________~~----_------___________
Variable depcndiente pHConA vena ------------------------------------------------------------------------------------------~--------
Error T Parametro Estimado StAndar Estadfstico P-Valor
---------------------------------------------~-----------------------------------------------_---------CONSTANTE 534463 00801045 667208 00000 Dia -0140407 00175453 800253 00000 DiaA 2 000448098 0000738458 606803 00000
----------------------~---~-----------------------------~------------------------------~----AmUisis de Varianza
---~---------------------------------~---------------------~------------~-------------------~------Source Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio PValor --------------------------~-----------------------------------------------~------------~-----~~--~ ModeJo 159575 2 0797873 6073 00000 Residual 02170798 middot13 00131383 _______~_~ ~_~----------~------~--~-----~-M-----~-----____ _____________~-----------------------Total (COlT) 176654 15
R12 903315 percent
-----------~------------------------------------------------------------------------~-----------pHConAvena 534463 - 0140407Dia + 000448098DfaA 2
73
ANEXO H - ANALTSIS DE REGRESTON PARA ACIDEZ EN BEBJDA SIN AVENA
An8Jisis de Regtesi6fi P6lifJomial
Variable Depefidiefile~ AcidezSinAVenll _______________w_____~______~________________~-----------_________~_________________~~____~___~_____
Error T Pariirnetro Estimado Estandar Estadistico ---------------------------------------~--------------~-~-------~--------------------~------------CONSTANT 0491697 00123217 399051 00000 Dia 00436032 000269882 161564 00000 D1a2 -000144613 000011359 127312 00000 __w___~________________________~-_______-_____~----____________________________~__~---~_--__~___
AriiiJisis de varianza ~_~__~__________~_~____~________~___________- _________e_____________________________bull _____-________
Source Smn de cuadr Df Mean Square F-Ratio PmiddotValor_~~___________________________________bull ______~___________bull ____________bull ______~________w________________
Model 0135203 2 00676013 21747 00000 Residual 000404118 13 000031086
Total (Corr) 0139244 15
R2 970978 percent
AcidezSlnAvena 0491697 + O0436032Dia - 0OOl44613Dia2
74
I
ANEXO I ANALISIS DE REGRESION PARA ACIDEZ EN BEBIDA CON AVENA
1
Anwisis de tegtesi6fi polinomial
Variable dependiente Acidez Con Avena
Error T ParametTo Estimado Stlindar Estadfstico P-Valor ----------------~-------~---------------------~-----------------------------------------------------CONSTANT 0491639 000926607 530578 00000 Diamiddot 00406572 000202955 200326 00000 DfaA 2 0000982559 0000085421 -115025 00000
-------------~----------------------------~-------------------------~-----------------------------------
-------------~-----~~-----------------------------~---------------------------------------------_--Source Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio PValor
-~-------------~----------------------------------~------------------~~-------------------------- Modelo 0288008 2 0144004 81914 00000 Residual 000228539 13 0000175799
----------~~--------------~---------------------------------------------~---------------------------Total (Corr) 0290294 15
RA2 = 992127 percent
-------------------------~----~---~------------~---------------------------------~---------------~
AcidezConAvena == 049163amp + 00406572D1a - 0000982559DiaA2
75
I
(Ilmiddot il
ANEXO J- ANALISIS DE REGRESION PARA RECUENTO LACTOBACILOS PARA BEBIDA SIN AVENA
Amilisis de regresion - Modelo lineal Y = a + bX
------------------------~----------------------~-----------------------------~----------~-----------Variable Dcpendiente LactobacilJusSinAvena Variable independiente Dia
I--------~----------~-----------------------------------~-------~-~--~--------------------------~-Error T
Paramctro Estimado Standard Stadistico P-Valor
----~----~------------~-----~-----------------------~-------------~-----------------------------Intereepto 117347 0389973 300911 00000 Pendiente 00483464 00257889 18747 00903
Analisis de Varianza
---------~------------------~----------------~---------------------------------~---------~----------Source Sum decuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor
------------~---------------------~---------------------~--------------------------------~-----~----Modelo 0916252 1 244835 443 00616 Residual 260706 10 0260706
--~------------~---~------------------~~~-----~-------~---------~~-------------------------------------Total (Corr)352332 11
Coeficiente Correlaci6n = 0509955 R2 = 260054 percent
LactobacillusSinAvena= 117347 + 00483464Dfa
76
ANEXO K- ANALTSIS DE REGRESION PARA RECUENTO LACTOBACILOS PARA DEBIDA CON AVENA
Aruilisis de regresion - Modelo lineal Y = a + hX
Variable Dependiente LactobacillusConAvena Variable Independiente Dia ---~--------------------------------------------------------__-----------__--_--_-----------shy
Error T Paramctro Estimado Standard Estadistico P-Valor -~--------------------------------------------------------------------------------------------------
Irttercepto 118103 0567963 207942 00000 Pendiente 00790304 00375594 210414 00616
-----------------~----------------------------~----~-------~----~----------------------------
Analisis de Varianza
----------------~----------------~------------------~--------------------------~------~--------shySource Swn de cuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor
-----------------~--~--------------------------------------------------------------------------~---~ Mode10 244835 1 244835 443 00616 Residual 552997 10 0552997
Total (Corr)797832 11
Coeficiente Correlacion = 0553964 RI2 = 306875 percent
-----~--------------------------------------------------------~--------------------------------------
LactobacillusConAvena = 118103 + 00790304Dfas
77
~ -1
(
AI comparar el comportamianto de las leches de diferente origen se ha
demostrado que Ie leche de vaca contiene caseinatos sustancias que forman
buffer ~n et intestino e inlpiden que los probi6ticos disminlJyen el pH del intestina
y de esta manera se impide al efecto deseado que es evitar fa proliferaci6n de
otros microorganismos entre los cuates pueden estar algunos patOganos En la
leche materna sa encuentran algunos carbohidratos como glucosa galactosa n
acetilglucosamina y algunos 0lig6meros de Ie fucosa en cOhoontracionesmiddot
importantes los cualeS favoreceh el crecimientc)middot de probi6ticos esto
complementado can 91 bajo contenido de protenas que se traduce en una
reducida capacidad buffer hacen de Ie lache materna IJn alimentd adecuado para
nllios en su etape de lactancia
Algunos prebi6ticos como 1a lactulosa yciertos compuestos que contiansn fructosa
no son digeridos en el intestino humano y pueden sar utilizados selectivamenta
par los probi6ticos 10 que hace que los probi6ticos en combinaci6n can prebi6ticos
pueden lIegar a ser un importante medio para prevenir algunas enfermedades del
tracto gastrointestinal (Bezkorovainy 2001)
25
2 METODOlOGfA
21 LOCALIZACION
EJ trabajo sa realizo en el laboratorio de Microbiologia y la planta da laches de Ja
Universidad Naclonal de Colombia- Secie Medellin
En al laboratorio se hiZQ al aislamiento a identificaci6n de fa capas y en fa Planta
sa eJaboro la leche fermentada con 1a cepa seleccionada y el prebi6trco
22 METODOS
221 Aisiamiento de cepas nativas
Las cepas nativas se sislaran de producto$ vegetales leches fermentadas y
mucosa vaginal humana
2211 De vegetales
Las muestras vegetales de repollo repollitas de brusefas y pepino se
seleccionaron porcionaron y mezclaron can cloruro de sadio al 10 pIp se
calacaron en un recipienta de vidrio balo anaerobiosis y sa dejarQn por 15 dias
26
luego S9 tomaron 3 ml de cada muestra y se jnocularon 9 ml de caldo MRS (Man
Rogosa and Sharpe) se incubaron a 37deg C durante cinco dias en camara de
anaerobiosis (Ver Figura 1) Oespues de este tiempo sa inocularon cajas de petri
con agar MRS con 1 ml del cultivo microbiano y se incubaron bajo las mismas
condiciones que eJ caldo Este procedirniento se realiz6 rapetidas veces hasta
seleccionar la cepa pura mediante observaci6n de caracteristicas morfologicas de
la cOlonia y a cada colonia se Ie practico la coloracion de gram con el fin de
observar las caracteristicas microscopicas de cada una e identificar las de mayor
similitud a los Lactobacilos y Bifidobacterias
Figura 1 Camara de anaerobiosis
27
2212 De la leche
Sa tomo 200 ml de teche cruda de la planta de leches y se colaca a fermentar
baja anaerobiosis durante 15 dras Luego sa procedia como en los vegetales
2213 De mucosa vaginal humana
Se tomo una muestra de frotis de mucosa vaginal humane can capito esteril sa
puso a ncubar en Caldo MRS y se procedi6 camo en 2211 y 2212 A cads
aislado sa Ie practico la coloracion de gram y sa seleccionaron aquellas que eran
bacilos gram positivos (Ver Tabla 2)
28
TABLA 2 Fuente de aislarniento de cepas nativas
CEPA FUENTE
1 Pepino fermentadQ
2 repollitas de bruselas fermentadas
3 Repolltgt fermentado
4 Repollo fermentado
5 Mucosa va~inal humana
6 Mucosa vaginal humana
7 repollitas de bruselas fermentadas
8 Repollo fermentado
9 repollitas de bruselas fermentadas
10 Mueo~a vaginal humana
11 Repollo fermentado
12 RepolJo fermentado
13 Leche fermentada
14 Mucosa vaginal humana
15 repollitas de bruselas fermentadas
16 Repollb fermentado
29
222 Almacenamiento de las cepas aisladas
Cuando las cepas crecieron en agar MRS homogEmeas en color morfologia
coloraci6n de Gram etc se pssaron a agar inclinado en tuba se cubrieron con
aceite mineral y se guardaran en refrigeraci6n a 4deg C para tomar de alii la cepa y
efectuarle las diferentes pruebas para confirmar el genera y determinar la especie
de cada una de eas (Ver Figura 2)
Figura 2 Cepas en tubos con agar inclinado
30
223 Pruebas para determinar et genero
2231 Coforaci6n de Gram
A cada cepa sospechosa de Lactobacilos se 1e hizo la coloraci6n de gram y se
seleccionaron las gram positivas
2232 Morfologfa
En agar MRS y despues de incubar en anaerobios~s crecian colonias grandes
cremosas de color beige con bordes homogeneos y c6ncavas(Ver Figura 3)
Figura 3 Colonias aisladas en agar MRS
31
2233 Prueba de esporulaci6n
A cada cepa aislada se Ie hizo esta prueba la cuel consistia en incubar en
aerobiosis durante ocho dias las cajas de agar MRS donde crecieron colonias de
Lactobacilo$ y luego se les (ealize) coloraci6n de espora Las capas que dieron
negativa a la prueba de espora se considararort sospechosas de sar Lactobacilos
y se continuo con la prueba de la catalasa (Ver Tabla 3)
2234 Prueba de la catalasa
los lactobacilos carecen de catalasa Eata prueba se hizo tomando una colonis
se deposito en vidrio de reloj y se Ie adicion6 dos gotas de peroxida de hidr6geno
(H202) la que no presentaba efervescencie eran cepe sospechosa de ser
Lactobacilo (Ver Tabla 4
Sa seleccionaron las capas euyo resultado fue aeorde con el genera Lactobacilfu$
y se continuo con la comirmaeion del genera y determinacion de la eSpecie
meqiante las pruebas bioqulmicas
32
224 Prueba para determlnar la especie
Para confirmar el genero y determinar la especie de las diferentes capas aisladas
se hizo una caracterizaci6n bioqufmica utilizando un kit de API 50 CHL Medium
Ref 50 410 que contiene una galed8 de medios que permite realizar el estudio
de fermentaci6n de los 49 azucares de 52 especies de Lactobacillus (Ver Figura 4
y tabla 5)
Figura 4 API CHL 50-Prueba bioquimica
33
225 Pruebas para determinar microorganismos probi6ticos
2251 Resistencia a pH=2 y sales biliares de concentraci6n O3pv
A las cepas idantificades como Lactobacillus brevis y Lactobacillus pantarum sa
las realiz6 Ie prueba dfl resistencia a pH=2 y sales biliares de concentraci6n 03
pv ( Jacobsen et al 1999) Una colonia de cada cepe aislada se inocul6 en 4 mt
de caldo MRS durante cinco dras bajo condiciones de anaerobiosis Oespues de
esta tiempo se dejaron pracipltar los microorganismos por sedimentaci6n se Ie
retire el sobrenadante y al precipitado se Ie adicion6 Sml de caldo MRS
previamente ajustado a pH=2 can seido clorhfdrico (HCI) dentro del mismo tuba de
ensayo G igual sa hizo can otro tubo previamente incubado pero a este se Ie
adiciono 5ml de caldo MRS con sales biliares a una concentra~i6n de 03 plv y
ambos se incuberon a 37deg C por 2 haras Sa midio 01 mi de cada uno de los
tubas al tiempo 0 y a las 2 horas y sa inoculeron en superficie en caJas de petri
con agar MRS S9 incubaron a 37deg C bajo anaerobiosis durante 48 horas Se
compararon visualrrente en cada caja de petri el crecimiento en superficie y las
que presentaron crecimiento en tos dos tiempos (0 y 2 horas) tanto en at media
acido como en sales I se consideraron resistentes a pH=2 y sales biliares (03
pv)
(Ver Tabla 6)
34
226 Conservacion
Todas fas capas que habian dado positiva Jas pruebas anteriores y que reaultaron
resistentes a pH=2 y sales biliares 03 pv y despues de identificadas en API 50
CHL sa repicaron en agar MRS en tuba inclinado y despues de Incubar a 37deg C
por 48 horas bajo anaerobiosis se Ctlbrie el biser completamente can aceite
mineral esteril y sa guardaron en refrigeraci6n
227 Elaboracj6n de fa bebida fermentada
2271 Preparaci6n de la mue$tra
Sa tome 1 mt de caldo MRS previamante inoculado e incubado que presentaba
una concentracion de Lactobacillus brevis de 27x108 Iml segun la escaJa de Mac
Farlan y sa adiciono a 9ml de leche pasteurizada en un tubo sa dej6 incubanda
en anaerobiosis por 48 hores Luego se pasaron estos 10 ml a un frasco qua
cont~nie 90 ml de leche pasterizada y se dej6 incubando par 48 haras en
anaerobiosis
35
2272 Adici6n del inOculo
A 900ml de leche pasteurizada se Ie adicion61os 100 ml de leche que habia sido
previamente ino(ulada dos veces con la cepa posteriormente se deja
fermantando la lache a temperatura de 37deg C
2273 Control de Ja fermentaci6n
Las muestras se hicieron por cuadruplicado y se les hizo un seguimiento de
aoidez hasta un valor entre 04 y 05 expresada como Bcido lactico esta
procedimiento corresponde a la babida fermentada sin prebi6tico La bebida ~on
prebi6tico tiene al mismo proeedirnianto pero adicionalmente se agrag6 avena a
una concentraci6n de 05 en el momento de la adici6n del in6e410 a los 900 ml
de leehe pasteurlzada y el procedimiento sigui6 igual al de la bebida sin prebi6tico
tambien se hizo por cuadruplicado
2274 Refrigeracl6n
Despues que las mezclas con y sin prebiotico alcanzaron el de acidez
requarido se IIeva ron a refrigeraci6n a una temperatura de 4deg C p~r 24 horas
para frenar proce~os metab6licos de los microorganisrtlos Despues de este
ti~mpo se procedi6 al batido
36
1 2275 Batido
Con un agitador se procedi6 a batir las bebidas para romper et coagulo formado
y de esta manera homogeneizar la mazela y obtener asf la bebida fermentada
2276 Envasado y almacenamiento
Ambas bebidas se envasaron en frascos vidrio para hacerles seguimiento de pH
acidez(expresado como acido tacticol y recuento de Lactobacillus breviSf los
dies 27 14 Y 21 despues de elaboradas las bebidas perfodo durante el cualta
muestra permanecfa afmacenada a temperatura de refrigeracion(Ver Figura 5
37
Fjgura 5 Diagrama de Flujo
PREPARACION DE LA MUESTRA
ADICION DEL INOCULO
~_____~_B~ATIDO~______~
INCUBACION 37deg C hasta acidez = 04-05 acido laotico
ENFRIAMIENTO
hasta 4 0 C ~------~ ~------~
ENVASADO Y ALMACENAMJENTO
dUrante 21 dfas a Temperatura 4 0 C
38
1
228 Determinaci6n del pH
Se determino por el metoda potenciometrico en un pH-metro manual durante los
dias 2) 7 14 Y 21 de las bebidas lacteas sin y con prebi6tica (Ver Tablas 7 y 8)
229 Oeterminaci6n de la acidez (Expresadfl como acido
lactica)
Se tomaron 9 mJ de las bebida~ sa Ie adicionaron 2 gotas de fanoftaleina como
indicador y sa titulo fa acidez con NaOH 01 N hasta la aparicion de un cotor rosado
debit EI volumen de NaOH utilizado se reporta como valor de de acidez
(VerTablas 10 y 11)
2210 Prueba de viabilidad
Qurante el perfoda de almacenamiento de la bebida lactea se procedi6 a hacer la
prueba de viabiHdad en los dias 7 14 Y 21 para determinar Si los lactobacilfus
permanecfan vivOs a una concentraci6n minima de 106 hasta el dia 21 como 10
establece eJ Articulo 10 de la Rasolucion 2310 del Ministerio de $alud de
Colombja
39
Para asta prueba se tamaron 10 rnl de muestra y se adicionaron a 90 ml de caldo
MRS ruego a partir de esta se hicieron diluciones de 10-2 hasta 10-11 de las
diluciones 109101deg 10-11 se inocul6 1 ml de cada uno en agar MRS siguiendo el
metodo de siembra en profundidad y por duplicado e incubando a 370 C x 5 dras
en anaerobiosis y luego se hicieron tos recuentos por duplicado para esi reportar
los recuentos promedio (Ver Tablas 13 y 14)
2211 AniUisls microbiol6glco de las bebidas Iicteas(con y sin
avena)
Con el fin de determinar las condiciones higienico-sanitarias del producto se
realizaron las pruebas microbiol6gicas de Recuento de mohos y fevadurasml en
agar OGY Recuento en superficia de Staphylococcus coagulasa positivoml en
agar Baird Parker Numero Mas Probable (NMP) de coUfor-mes totales y
Escherichia coliml en caldo Fluorocult y Presencia de Salmonela25ml con BHI
caldo tetrationato y agar Hecktoen (Montoya 1999)
(Var tabla 16)
2212 AnaUsis estadistico
A los datos obtenidos en la medici6n de pH acidez (expresada como Beido
laclico) en los dras 2714 Y 21 y el recuento de Lactobacillus en los dras 714 y21
40
realizados a los dos tratamlentos se tes aplic6 1a prueba t porque solo difieren
en la presencia 0 ausencia del prebi6tico para evaluar si habra diferencia
estadfsticamente significativa para los dos tratamientbs(Ver Tablas9 12 y 15)
41
3 RESULTADOS Y DISCUSION
31 Coloraci6n de Gram y morfologfa
Las cepas aisladas fesultaron Gram positivas (Ver Figura 6) colonias grandes
cremosas dE) color beige con bordes homogeneos y c6ncavos en su
morfologia (Ver Figura 3) resultando de acuerdo a 10 especificado en Stanley
1989 para Lactobacillus
32 Prueba de esporulaci6n y cataJasa
Los resultados de la pruebas de esporulaci6n y catalasa indicados en las
Tablas 3 y 4 respeclivamente dieron conforme a 10 especificado en Stanley
1989 para Lactobacillus
42
1
2 3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
TABLA 3 Resultado de prueba de esporuJaci6n
CEPA RESULfADO ESPORULACION
-- -------------
43
l i ~II bull ~ I I
TABLA 4 Resultado prueba de la catalasa
CEPA RESULTADO CATALASA
1 -2 -3 -4 -5 -6 -7 8 -9 -10 -11 12 -13 -14 -15 -16
3~3 Prueba para determinar la especie
Oespues de hacer las pruebas para seleccionar las cepas sospechosas de ser
Lactobacillus se realizo las pruebas bioquimicas fograndose identificar
Lactobacillus plantarum aislctdo de pepino repollo y repollitas de bruselas
44
fermentados y Lactobacillus brevis de mucosa vaginal y leche fermentada (Ver
Anexos del A al E y Tabla 5)
TABLA 5 Resultado identlficaci6n cepa~
CEPA NOMBRE
1 Lactobacillus planfarum
3 Lactobacillus plantarum
5 Lactobacillus brevis
13 Lactobacillus brevis
15 Lactobacillus plantarum
34 Pruebas para determinar microorganismos probi6ticos
las cepas de Lactobacillus brevis y Lactobacillus plantarum mostraron
rasistencia al medio acido de pH =2 Y sales biliares 03 pv resultado similar al
encontrado por Jacobsen et al 1999 para Lactobacillus plantarum (Ver tabla 6)
45
middot
~~~ttiI lltlmiddot~COX~dtJ ~xtc_~ 2 tr~ k-JlL~middot
-)~~TO DE lJIBUOTECUl rjRL]OTtCA twn GO1IU1
TABLA 6 Resultados a pruebas de resistencia a pH=2 y sales biliares 03 plv
CEPA RESISTENCIA pH=2 RESISTENCfA A SALES BIUARES ()3 pv
1 + +
2 + +
3 + +
4 + +
5 +
6 + +
7 + +
8 + +
9 + +
10 + +
11 + +
12 + +
13 + +
14 +1shy +M
15 + +
16 + +
+1 crecimiento debil
+ crecimiento abundante
46
Figura 6 Lactobacillus brevis Gram + aislado de leche fermentada
Ai observar en placa las celulas de lactobacilos despues de real1zar las pruebas
de resistenCia a la acidez y sales biliares se observo una tendencia a aglomerarse
posiblemente como un mecanismo de proteccion cOlitra estos medios que pueden
lIegar a ser adversos para elias (Ver figuras 7 y 8)
47
Figura 7 Lactobacillus brevis aislada de leche fermentada despu~s de la prueba de resistencia a pH=2
Figura 8 Lactobacillus brevis aislada de leche fermentada despues de la prueba de resistencie asales biUares 03 plv
fI
48
35 --Seguimiento del-pH-en-la-bebidaJacteacon y sin -prebi6tico
A continuacion se muestran las Tablas 7 y 8 donde sa registian los datos
recopilados de pHdurante 10$ dras Z 7 14 Y21 para las bebidas laaeas con ysin
prebi6tioo
TABLA 1 ResultadopH yogur sin avena
Dia Repetition 1 Repetici6n 2 Repeticion 3 Repetici6n 4
2 526 501 51 52
7 446 433 438 44
14 439 435 437 436
21 439 437 438 437
TABLA 8 -ResultadopHyogur con avena
Dia Repeticion 1 Repeticion2 Repeticion 3 - Repeticion 4
2 509 523 51 515
7 447 442 445 442
14 436 -438 439 437
21 432 433 435 434
Observando la Figura 9podamos ver que el pH en el -dfado$ para los dos
tratamientos as igual y empieza a descender rapidamente para estabilizarse a
partir del dra 7(Ver figura 9)
49
Figura 9 Comparacj6n de medias para -el pH
Comparaci6n de medias para pH
55 ~ 5 +----=gtIIIi-~i~~----=-r--it~ -- pH sin avena
a 45 1--~~~~=~~ 4 --- pH con
avena35 t-----r-- -------=------=--= ------- - ----
2 7 14 21
Dias
Aplicando la prueba t para comparar las medias de pH I S6 muestia una diferencia
altamants significativa en los dos tratamientos para el dia 21 (pltO05)
(Ver tabla 9)
TABLA 9 Compaiaci6n de medias para pH
DtAS SIN AVENA CON AVENA te p (VALOR)
2 514 514 0 10
7 439 444 -1 61 0159
14 437 I
438 -070 0510
21 438 433 528 00019 shy
- DiFERENCIA AlTAMENTE SIGNIFICATIVA
50
I
AI aplicar regrasi6n a los datos sa obtiene al modelo estimado
pHSinAyena =535606 - 01505650Ia +0005044340IaI2
La variabilidad en la respuesta de pH asta siendo explicada en un 8S7522 por
el modelo (Ver Anexo F)
EI tratamiento con avena mostro el siguiente modelo al analisis de ragresi6n
pHConAvena =534463 ~ 0140407Dia + 0004480980Ia2
La variabilidad an la respuesta de pH asta siendo explicada en un 903315 par
el nlodelo(Ver anexo G)
36 Seguimiento de la acidezmiddotmiddot expresada comomiddot de acido
lactico
A continuaci6n sa muestran las Tablas 10 y 11 donde sa registran los datos
tecopilados de acidezmiddotdurante los dias 27 14 Y 21 para las pebidas taetees con y
sin prebi6tico
TABLA 10 Resuttadode acidez (expresadocomo acido tactico) yogurt sin avena
CIA R~petici6n1 Repeticion2 Repetici6n 3 Repeticion 4
2 054 06 057 058
7 072 074 073 0]2
14 080 083 082 082
21 0]4 079 078 077
51
TABLA 11 Resultado de aCidez (expresado como acido Icktico) yogurt con avena
Dia Repetici6n 1 RepetiCi6n 2 Repetici6n 3 Repetici9n 4
2 059 055 058 057
7 071 073 072 072
14 089 087 088 086
21 092 091 090 091
Observando la Figura 10 se puede concluir que la acidez empieza a aumentar
hasta el dia 14 y luego trata de estabilizarse para los dos tratamientos
(Ver figura 10)
Figura 10 Comparaci6n de medias para la acidez
N G)
Comparacion de medias para acidez
1
2 0I 5 -+--=--------=-~~~= u
ltC
- Acidez sin avena
2 7 14
Dias
52
21
-it- Acidez con avena
Aplicando la prueba t para camparar las madias de acidez se muestra una
diferencia altarnante significativa en los dos tratamiantos para los dias 14 y 21
(pltO05)
(Var tabla 12)
TABLA 12Comparaci6n de medias para Acidez
DIASmiddot SIN AVENA CON AVENA te p(VALOR)
2 0572 0572 0 10
7 0727 0720 119 0278
14 0818 0875 -638 000070shy
21 077 091 -1212 i 0000019 shy
DIFERENCIA AL TAMENTE SlGNIFICATIVA
AI aplicar r~gresi6n a los datos se obtiene el modelo estimado
AcidezSlnAIena = 0491897 + O0436032Dia O00144613DfaA2
La variabilidad en la respuesta de acidez asta siendoexplicada en un 970978
por al modelo (Ver anexo H)
EI tratamiento con avena mostro elsiguiente modeloj a1 analisis de regresion
AcidezConAvena = 0491638 + 00406572Oia - OQOO982559OiaA2
La variabilidad enla respuesta acidez esta siendo explicadaen un 99212 por
el modelo (Ver anexo J)
53
I ~
37 Prueba de viabiJidad
A continuaci6n sa muestran las Tab~as 13 y 14 donde sa presentan los datos
recopilados del recuento de Lactobacilos durante los dias 7 14 Y 21 para las
bebidas lacteas con y sin prebi6tico
TABLA 13 Recuento de Lactobacilos (UFCml) yogurt sin avena
Dia Repetici6n 1 Repetici6n 2 Repeticion 3 Reptttici6n 4
7 1880X10l1 1454X1011 1642X1011 1780X10~
14 1560X10~ 646X1011J 1890X10l 140X10l1
21 1200x10lu 128Ox10u 1745x10J 1520x101V
TABLA 14 Recuento de Lactobacilos (UFCml) yogurt con avena
Dfa Repetieion 1 Repetici6n 2 Repeticion 3 Repeticf6n 4
7 1600X10lt 1240X10t 1640X10ll 1980X10t
14 540X1011 427X10n 546X10n 720X10ll
21 500x1011 492x1011 712)(1011 980x10~
AI analizar la Figura 11 sa puede observar un recuento mayor de Lactobacilos
en al tratamiento con avena resultado de acuerdo a 10 encontrado por Alander at
aI 1999 Kontula et aI 1998 y Jaskari et aI 1998
54
Figura 11 Comparaci6n de medias para Log Lactobacillus
Comparacion de medias para log Lactobacillus
~ 1350
-+- Sac Sin--() 13 co avenaIII
bull 125 -- Bac con 0)
0 12 avenaJ
115 7 14 21
Dias
Aplicando la prueba t para comparar las medias de recuento de Lactobacillus no
se encontr6 una diferenc1a estadfsUcamente significative entre los dos
tratamientos (Ver tabla 15)
Este aumento en al racuento influy6 en la disminuci6n del pH y en el aumento de
fa aeidez por la fermentacion que realizan los Lactobacillus sobre fa lactosa de la
lache y la avena adicionada como prebi6tico
55
1
TABLA 15 Comparaci6n medias lag Lactobacillus
DIAS SIN AVENA CON AVENA tc p(VALOR)
7 122257 122022 04846 06451
14 121065 132393 -19602 00977
21 129025 133087 -08236 04416
At aplicar regresion a los datos se obtiane al modelo astimado
LactobacillusSinAvena= 117347 + 004834640Ia
La variabilidad en la respuesta del recuento de LactobaCillus ssta siendo
explicada en un 260054 por el mod$loVar anexo J)
EI tratamiento con avena mostr6 al siguiente modalo al anal isis de regresion
Lactobacillu$ConAvena =118103 + 007903040Ias
La variabilidad en la respuesta de recuento esta siendo explicada en un 3068
por al modelo(Ver anexo K)~
38 Analisi$ microbiol6gicos de las bebidas lacteas con y sin
En la Tabla 16 estan recopilados los resultados microbiol6gieos obtenidos en ras
muestras con los dos tratamientos (con y sin avena)
I [
sa
TABLA 16 Resultados analisis microbiologico
Recuento de mohos y levaduras Iml lt10
Recuento de Staphylococcus coagulase positiva Iml lt100
NMP coliformes fotales y Escherichia coli Iml lt3
Presencia de Salmonella25ml Ausente
Los resultados de este analisis demuestran que las bebidas fermentadas con y
sin avena~ astan fibres de microorganismos patogenos
57
1
4 CONCLUSIONES
Se aislaron cepas nativas de Lactobacillus plantarum de las muestras vegetates
de repollo pepino repollitas de bruselas fermentadas y Lactobacillus brevis de
lache fermentada y mucosa vaginal humana Ambas cepas resistieran un pH=2 y
una concentraci6n de sales biliares det 03 ptv dos earacteristicas importantes
en los probi6ticos
Lamiddot cepa de Lactobacillus brevis aislada de lache Sa utiliz6 para elaborar una
bebida fermentada sin y con avana comoingrediente prebiotico obteniendose un
aJimento centon recuento del probi6tico viable durante 21 dras de seguimiento
ademas libre de microorganismos )at6gen05
No se encontr6 efecta significativo de la avena sobre Ie viabilidad del Lactobacillus
brevis aunque sa presento un aumento en 61 recuento de estos en la bebida con
avena
58
plusmn ~
5 RECOMENDACIONES
Ensayar la cepa de Lactobacillus plantartJm en productos carnicos madurados
como el salami
Ensayar la cepa de Lactobacillus l)revs en otros derivados lecteos como queso
quesito queso crema
Continuar con el estudio de estos microorganismos y caracterizarlos
molecularmente ademas de estudiar su capacidad de adherencja a fa mucosa
intestinal sobre algunes Hneas celulares como las CaCo~2
Estudiarel efedo de la avena sabre la viabiJidad del Lactobacillus breyis a una
concentraci6n mayor de 05
Realizer ensayos can las cepas de Lactobacillus brevis y Lactobrlcillus pJantarum
para elaborar masas acidas para panificacion reemplazando el Bromato de
Potasio aditivo prohibido desde marzo del 2003 en nuestro pais per 5U toxicidad
59
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65
ANEXOS
66
ANEXO A RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AlSLADA DE i
PEPINO it
Referencia Pepino 1 Fecha 06122002
IEXCELENTE IDENTIFICACION
Latto plantarum 1
Galeria API 50 CHL V50 Leida el 06122002
Perfil - -- - ++ - -- - ++++ - - -+- + - I I I I I I I I +t+ - +f- ~ - - + + ~ - - - +- + - shy
o - GLY - ERY DARA - LARA + RIB + DXYL - LXYL - ADO - MDX - GAL + GLU + FRU + MNE + SBE - RHA - DUL - INO bull MAN + SOR - MDM + MUG shyNAG + AMY + ARB + ESC + SAL + CEL + MAL + LAC + MEL + SAC + TRE + 1NU - MLZ + RAF + AMD - GLYG - XLT - GEN + TIJR + LYX - TAG - DFUC shyLFUC - DARL + LARL - aNT + 2KG - 5KG shy
--- Taxones significativos rd -----T -- Tests en contra
Lactoplantarum 1 999 092 1
Taxon siguiente Lactobrevis 1 OJ 044 3
i i
Lactoplantarum 1 1 test (5) en contra
D-SORBITOL (SOR) 78
Tax6n siguiente Lactobrevis 1 3 test (s) ert contra
METHYLD-MANNOSIDE (MOlM) 0 MELEZITOSE (MLZ) 14 D-TURANOSE (TUR) 14
67
ampb
ANEXO B RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AISLADA DE REPOLLO FERMENTADO
~
Referencia Repollo fermentado - 3 Fecha 03072003
EXCELENTE IDENTIFICACION
Lactoplantarum 1
Galena API 50 CRL V50 Leida el 03072003
Perfil - - ++ - - - - -H++ - - ~ + - + - I I 1 I I I I -H+ - ++ - - - + + - -- - - + - shy
o - GLY - ERY - DARA - LARA + RIB + DXYL - LXYL - ADO ~ MDX - GAL + GLU + FRU + MNE + SBE ~ RHA - DUL - INO - MAN + SOR - MDM + MDG shyNAG + AMY + ARR + ESC + SAT + CRL + MAL + LAC + MEL + SAC + TRE + lNU - MLZ + RAF + AMI) - GLYG - XLT - GEN + TOR + LYX - TAG - DFUC shyLFUC - DARL - LARL - GNT + 2KG - 5KG shy
------Taxones significativos _ _----- Id--- ---T---- Tests en contra
Lactoplantarum 1 999 095 1
Tax6n siguiente Lactobrevis 1 01 OA8 3
lJactoplantaru01 1 1 test (s) en contra
DSORBITOL (SOR) 78
Taxon siguiente Lactobrevis
METHYL-D-MANNOSIDE D-TURANOSE
1
(MOM) (TOR)
3 test (5) en contra
0 MELEZITOSE 14
(MLZ) 14
i
I
68
ANEXO C RESULTADO PRUEBAS BIOQUWICAS DE CEPA AISLADA DE MUCOSA HUMANA
Referenda Mucosa - 5 Fecha 27012003
BUENA IDENTlFICACION
Galeria API 50 CHL vso Leida el 270112003
Perfil - - - - +t--t - - - + - + - - - - - - - - -+- - - - - + - + - - - - - - - - - - - - - bull - - -+ - +
o - GLY ~ ERY - DARA bull LARA + RID + DXYL + LXYL - ADO bull MDX - GAL + OLU - FRU + MNE - SBE - IlliA - DUL - INa - MAN - SOR - MDM - MOO shyNAG + AMY - ARB - ESC ~ SAL bull CEL - MAL + lAC - MEL + SAC - TRE shyINU - MLZ - RAF - AMD - GLYG - XLT - GEN - 11JR - LYX - TAG - DFUC shyLFUC - DARL - IARL - ONT + 2KO - 5KG +
- - - - - - Taxones significativos - - - - - - - Id T -- Test en contra
Lactobrevis 3 963 088 1
Taxon siguiente Lactoco11inoides 36 075 2
Lactobrevis 3 1 test (s) en contra
GLUCOSE (GLU) 95
-~~~------------~---------------------------~--~-------~--~-----~----------~--------~------------~~--Taxon siguiente Lactocollinoides 2 test (s) en contra
GLUCOSE (GLU) 100 MELIBIOSE (MEL) 25
69
i r
ANEXO D RESULTADO PRUEBAS BIOQIJiMICAS DE CEPA AISLADA DE LECHE FERMENTADA
Referenda Leche fennentada ~ 13 Fecha 27012003
BUENA IDENTIFICACI6N
Galeria API 50 CHL V50 Leida el 270112003
Perfil - - - - -t-t+- - - - + - + - - - bull - - - - -+- - - - - + - + - - - - - - - - - - - - - - - - -+ - +
0 - GLY - ERY - DARA - LARA +Rll3 + DXYL + LXYL - ADO - MDX ~GAL + GLU - FRU + MNE SBE - RHA DUL bull INO MAN - SOR MDM bull MDG shy
~NAG + AMY - ARB - ESC - SAL - CEL - MAL + LAC - MEL + SAC - TRE I lNU - MLZ - RAF - AMD - GLYG - XLT - OEN - IUR LYX - TAG - DFUC bull i
LFUC - DARL - LARL -ONr + 2KG - SKO + 1
- -- - - Taxones significativos - - Id -- T --- Test en contra
Lacta brevis 3 963 088 1
Taxon siguiente Lactocollinoides 36 075 2
Lactobrevis 3 1 test (s) en contra
GLUCOSE (GLU) 95
-----------------------------------------------------------~------------------------------~-------------------Taxon siguiente Lactocollinoides 2 test (s) en contra
GLUCOSE (GLD) 100 MELffiIOSE (MEL) 25
70
II iJ1
I
I ANEXO E RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AISLADA DE REPOLLITAS DE BRUSELAS FERMENTADA
Referencia repollitas de bruselas 15 Fecha 03072003
EXCELENTE IDENTIFICACION
Lactoplantarum 1
Galeria API 50 CHL vsO Leida el 03072003
Perfil - - - - +t - - - - +H+ - +- - +t + - I I I I I I I f ++t - + - - - -+ + - - - -+ -+ - - I ij
o - GLY - ERY - DARA - LARA + RJB + DXYL - LXYL - ADO - MDX - GAL +
GLU + FRU + MNE + SBE RHA + DUL - INO - MAN + SOR + MDM + MOG shyNAG + AMY + ARB + ESC + SAL + eEL + MAL + LAC + MEl + SAC + TRE + i
I1NU - MLZ + RAF AMD GLYG - XLT - aEN + TUR + LYX - TAG - Druc LFUC - DARt + LARL - aNT + 2KG - 5KG shy n ----Taxones significativos ------ Id Tests en contra
Lactoplantarum 1 999 090 o
Taxon siguiente Lacto pentosus 01 012 7
Lactoplantarum 1 o test (s) en contra
Taxon siguiente Lacto pentosus 7 test (8) en contra
GLYCEROL (GLY) 75 D-XYLOSE (DXYL) 100 L-RHAMNOSE (RHA) 25 METHYL-D-MANNOSIDE (MOM) 1 MELEZITOSE (MLZ) 25 RAFFINOSE (RAF) 75 D-ARABITOL (DARL) 0
71
~
I i I
ANEXO F - ANALISIS DE REGRESION PARA pH EN BEBIDA SIN AVENA
Aruilisis de regresi6n polinomial
---~-~-------------------------------------------~-----------~~---------------------~--------------Variable dependiente pHSinAvena ---------------------------~-------------~--------------------~---------------------------------
Error T Parametro Estimado Estandar Estadistico P-Valor
CONSTANTE 535606 0094535 56657 00000 Dia -0150565 0020706 727154 00000 Dia2 000504434 0000871488 578819 00001
---~---------------------------------------------------------------------------------------------------
Anfllisis de Variama -------------------------------------------~-----------~-----------------------------~-~--- jSource Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor 11
------------------------~------------------------------------------------------------------------------~ Mod-elo 155772 2 0118861 4256 00000 Residual 0237877 13 00182983
Total (Corr) 11956 IS
R2 == 867522 percent
pHSinAvena == 535606 - 0150565Dia + 000504434Dia2
72
____
middot ANEXO G - ANALISIS DE REGRESION PARA pH EN BEBIDA CON AVENA
AmUisis de regresion polinomial _____~_____~__-_____~___4____________________bull____bull__________bull_____________~~----_------___________
Variable depcndiente pHConA vena ------------------------------------------------------------------------------------------~--------
Error T Parametro Estimado StAndar Estadfstico P-Valor
---------------------------------------------~-----------------------------------------------_---------CONSTANTE 534463 00801045 667208 00000 Dia -0140407 00175453 800253 00000 DiaA 2 000448098 0000738458 606803 00000
----------------------~---~-----------------------------~------------------------------~----AmUisis de Varianza
---~---------------------------------~---------------------~------------~-------------------~------Source Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio PValor --------------------------~-----------------------------------------------~------------~-----~~--~ ModeJo 159575 2 0797873 6073 00000 Residual 02170798 middot13 00131383 _______~_~ ~_~----------~------~--~-----~-M-----~-----____ _____________~-----------------------Total (COlT) 176654 15
R12 903315 percent
-----------~------------------------------------------------------------------------~-----------pHConAvena 534463 - 0140407Dia + 000448098DfaA 2
73
ANEXO H - ANALTSIS DE REGRESTON PARA ACIDEZ EN BEBJDA SIN AVENA
An8Jisis de Regtesi6fi P6lifJomial
Variable Depefidiefile~ AcidezSinAVenll _______________w_____~______~________________~-----------_________~_________________~~____~___~_____
Error T Pariirnetro Estimado Estandar Estadistico ---------------------------------------~--------------~-~-------~--------------------~------------CONSTANT 0491697 00123217 399051 00000 Dia 00436032 000269882 161564 00000 D1a2 -000144613 000011359 127312 00000 __w___~________________________~-_______-_____~----____________________________~__~---~_--__~___
AriiiJisis de varianza ~_~__~__________~_~____~________~___________- _________e_____________________________bull _____-________
Source Smn de cuadr Df Mean Square F-Ratio PmiddotValor_~~___________________________________bull ______~___________bull ____________bull ______~________w________________
Model 0135203 2 00676013 21747 00000 Residual 000404118 13 000031086
Total (Corr) 0139244 15
R2 970978 percent
AcidezSlnAvena 0491697 + O0436032Dia - 0OOl44613Dia2
74
I
ANEXO I ANALISIS DE REGRESION PARA ACIDEZ EN BEBIDA CON AVENA
1
Anwisis de tegtesi6fi polinomial
Variable dependiente Acidez Con Avena
Error T ParametTo Estimado Stlindar Estadfstico P-Valor ----------------~-------~---------------------~-----------------------------------------------------CONSTANT 0491639 000926607 530578 00000 Diamiddot 00406572 000202955 200326 00000 DfaA 2 0000982559 0000085421 -115025 00000
-------------~----------------------------~-------------------------~-----------------------------------
-------------~-----~~-----------------------------~---------------------------------------------_--Source Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio PValor
-~-------------~----------------------------------~------------------~~-------------------------- Modelo 0288008 2 0144004 81914 00000 Residual 000228539 13 0000175799
----------~~--------------~---------------------------------------------~---------------------------Total (Corr) 0290294 15
RA2 = 992127 percent
-------------------------~----~---~------------~---------------------------------~---------------~
AcidezConAvena == 049163amp + 00406572D1a - 0000982559DiaA2
75
I
(Ilmiddot il
ANEXO J- ANALISIS DE REGRESION PARA RECUENTO LACTOBACILOS PARA BEBIDA SIN AVENA
Amilisis de regresion - Modelo lineal Y = a + bX
------------------------~----------------------~-----------------------------~----------~-----------Variable Dcpendiente LactobacilJusSinAvena Variable independiente Dia
I--------~----------~-----------------------------------~-------~-~--~--------------------------~-Error T
Paramctro Estimado Standard Stadistico P-Valor
----~----~------------~-----~-----------------------~-------------~-----------------------------Intereepto 117347 0389973 300911 00000 Pendiente 00483464 00257889 18747 00903
Analisis de Varianza
---------~------------------~----------------~---------------------------------~---------~----------Source Sum decuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor
------------~---------------------~---------------------~--------------------------------~-----~----Modelo 0916252 1 244835 443 00616 Residual 260706 10 0260706
--~------------~---~------------------~~~-----~-------~---------~~-------------------------------------Total (Corr)352332 11
Coeficiente Correlaci6n = 0509955 R2 = 260054 percent
LactobacillusSinAvena= 117347 + 00483464Dfa
76
ANEXO K- ANALTSIS DE REGRESION PARA RECUENTO LACTOBACILOS PARA DEBIDA CON AVENA
Aruilisis de regresion - Modelo lineal Y = a + hX
Variable Dependiente LactobacillusConAvena Variable Independiente Dia ---~--------------------------------------------------------__-----------__--_--_-----------shy
Error T Paramctro Estimado Standard Estadistico P-Valor -~--------------------------------------------------------------------------------------------------
Irttercepto 118103 0567963 207942 00000 Pendiente 00790304 00375594 210414 00616
-----------------~----------------------------~----~-------~----~----------------------------
Analisis de Varianza
----------------~----------------~------------------~--------------------------~------~--------shySource Swn de cuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor
-----------------~--~--------------------------------------------------------------------------~---~ Mode10 244835 1 244835 443 00616 Residual 552997 10 0552997
Total (Corr)797832 11
Coeficiente Correlacion = 0553964 RI2 = 306875 percent
-----~--------------------------------------------------------~--------------------------------------
LactobacillusConAvena = 118103 + 00790304Dfas
77
2 METODOlOGfA
21 LOCALIZACION
EJ trabajo sa realizo en el laboratorio de Microbiologia y la planta da laches de Ja
Universidad Naclonal de Colombia- Secie Medellin
En al laboratorio se hiZQ al aislamiento a identificaci6n de fa capas y en fa Planta
sa eJaboro la leche fermentada con 1a cepa seleccionada y el prebi6trco
22 METODOS
221 Aisiamiento de cepas nativas
Las cepas nativas se sislaran de producto$ vegetales leches fermentadas y
mucosa vaginal humana
2211 De vegetales
Las muestras vegetales de repollo repollitas de brusefas y pepino se
seleccionaron porcionaron y mezclaron can cloruro de sadio al 10 pIp se
calacaron en un recipienta de vidrio balo anaerobiosis y sa dejarQn por 15 dias
26
luego S9 tomaron 3 ml de cada muestra y se jnocularon 9 ml de caldo MRS (Man
Rogosa and Sharpe) se incubaron a 37deg C durante cinco dias en camara de
anaerobiosis (Ver Figura 1) Oespues de este tiempo sa inocularon cajas de petri
con agar MRS con 1 ml del cultivo microbiano y se incubaron bajo las mismas
condiciones que eJ caldo Este procedirniento se realiz6 rapetidas veces hasta
seleccionar la cepa pura mediante observaci6n de caracteristicas morfologicas de
la cOlonia y a cada colonia se Ie practico la coloracion de gram con el fin de
observar las caracteristicas microscopicas de cada una e identificar las de mayor
similitud a los Lactobacilos y Bifidobacterias
Figura 1 Camara de anaerobiosis
27
2212 De la leche
Sa tomo 200 ml de teche cruda de la planta de leches y se colaca a fermentar
baja anaerobiosis durante 15 dras Luego sa procedia como en los vegetales
2213 De mucosa vaginal humana
Se tomo una muestra de frotis de mucosa vaginal humane can capito esteril sa
puso a ncubar en Caldo MRS y se procedi6 camo en 2211 y 2212 A cads
aislado sa Ie practico la coloracion de gram y sa seleccionaron aquellas que eran
bacilos gram positivos (Ver Tabla 2)
28
TABLA 2 Fuente de aislarniento de cepas nativas
CEPA FUENTE
1 Pepino fermentadQ
2 repollitas de bruselas fermentadas
3 Repolltgt fermentado
4 Repollo fermentado
5 Mucosa va~inal humana
6 Mucosa vaginal humana
7 repollitas de bruselas fermentadas
8 Repollo fermentado
9 repollitas de bruselas fermentadas
10 Mueo~a vaginal humana
11 Repollo fermentado
12 RepolJo fermentado
13 Leche fermentada
14 Mucosa vaginal humana
15 repollitas de bruselas fermentadas
16 Repollb fermentado
29
222 Almacenamiento de las cepas aisladas
Cuando las cepas crecieron en agar MRS homogEmeas en color morfologia
coloraci6n de Gram etc se pssaron a agar inclinado en tuba se cubrieron con
aceite mineral y se guardaran en refrigeraci6n a 4deg C para tomar de alii la cepa y
efectuarle las diferentes pruebas para confirmar el genera y determinar la especie
de cada una de eas (Ver Figura 2)
Figura 2 Cepas en tubos con agar inclinado
30
223 Pruebas para determinar et genero
2231 Coforaci6n de Gram
A cada cepa sospechosa de Lactobacilos se 1e hizo la coloraci6n de gram y se
seleccionaron las gram positivas
2232 Morfologfa
En agar MRS y despues de incubar en anaerobios~s crecian colonias grandes
cremosas de color beige con bordes homogeneos y c6ncavas(Ver Figura 3)
Figura 3 Colonias aisladas en agar MRS
31
2233 Prueba de esporulaci6n
A cada cepa aislada se Ie hizo esta prueba la cuel consistia en incubar en
aerobiosis durante ocho dias las cajas de agar MRS donde crecieron colonias de
Lactobacilo$ y luego se les (ealize) coloraci6n de espora Las capas que dieron
negativa a la prueba de espora se considararort sospechosas de sar Lactobacilos
y se continuo con la prueba de la catalasa (Ver Tabla 3)
2234 Prueba de la catalasa
los lactobacilos carecen de catalasa Eata prueba se hizo tomando una colonis
se deposito en vidrio de reloj y se Ie adicion6 dos gotas de peroxida de hidr6geno
(H202) la que no presentaba efervescencie eran cepe sospechosa de ser
Lactobacilo (Ver Tabla 4
Sa seleccionaron las capas euyo resultado fue aeorde con el genera Lactobacilfu$
y se continuo con la comirmaeion del genera y determinacion de la eSpecie
meqiante las pruebas bioqulmicas
32
224 Prueba para determlnar la especie
Para confirmar el genero y determinar la especie de las diferentes capas aisladas
se hizo una caracterizaci6n bioqufmica utilizando un kit de API 50 CHL Medium
Ref 50 410 que contiene una galed8 de medios que permite realizar el estudio
de fermentaci6n de los 49 azucares de 52 especies de Lactobacillus (Ver Figura 4
y tabla 5)
Figura 4 API CHL 50-Prueba bioquimica
33
225 Pruebas para determinar microorganismos probi6ticos
2251 Resistencia a pH=2 y sales biliares de concentraci6n O3pv
A las cepas idantificades como Lactobacillus brevis y Lactobacillus pantarum sa
las realiz6 Ie prueba dfl resistencia a pH=2 y sales biliares de concentraci6n 03
pv ( Jacobsen et al 1999) Una colonia de cada cepe aislada se inocul6 en 4 mt
de caldo MRS durante cinco dras bajo condiciones de anaerobiosis Oespues de
esta tiempo se dejaron pracipltar los microorganismos por sedimentaci6n se Ie
retire el sobrenadante y al precipitado se Ie adicion6 Sml de caldo MRS
previamente ajustado a pH=2 can seido clorhfdrico (HCI) dentro del mismo tuba de
ensayo G igual sa hizo can otro tubo previamente incubado pero a este se Ie
adiciono 5ml de caldo MRS con sales biliares a una concentra~i6n de 03 plv y
ambos se incuberon a 37deg C por 2 haras Sa midio 01 mi de cada uno de los
tubas al tiempo 0 y a las 2 horas y sa inoculeron en superficie en caJas de petri
con agar MRS S9 incubaron a 37deg C bajo anaerobiosis durante 48 horas Se
compararon visualrrente en cada caja de petri el crecimiento en superficie y las
que presentaron crecimiento en tos dos tiempos (0 y 2 horas) tanto en at media
acido como en sales I se consideraron resistentes a pH=2 y sales biliares (03
pv)
(Ver Tabla 6)
34
226 Conservacion
Todas fas capas que habian dado positiva Jas pruebas anteriores y que reaultaron
resistentes a pH=2 y sales biliares 03 pv y despues de identificadas en API 50
CHL sa repicaron en agar MRS en tuba inclinado y despues de Incubar a 37deg C
por 48 horas bajo anaerobiosis se Ctlbrie el biser completamente can aceite
mineral esteril y sa guardaron en refrigeraci6n
227 Elaboracj6n de fa bebida fermentada
2271 Preparaci6n de la mue$tra
Sa tome 1 mt de caldo MRS previamante inoculado e incubado que presentaba
una concentracion de Lactobacillus brevis de 27x108 Iml segun la escaJa de Mac
Farlan y sa adiciono a 9ml de leche pasteurizada en un tubo sa dej6 incubanda
en anaerobiosis por 48 hores Luego se pasaron estos 10 ml a un frasco qua
cont~nie 90 ml de leche pasterizada y se dej6 incubando par 48 haras en
anaerobiosis
35
2272 Adici6n del inOculo
A 900ml de leche pasteurizada se Ie adicion61os 100 ml de leche que habia sido
previamente ino(ulada dos veces con la cepa posteriormente se deja
fermantando la lache a temperatura de 37deg C
2273 Control de Ja fermentaci6n
Las muestras se hicieron por cuadruplicado y se les hizo un seguimiento de
aoidez hasta un valor entre 04 y 05 expresada como Bcido lactico esta
procedimiento corresponde a la babida fermentada sin prebi6tico La bebida ~on
prebi6tico tiene al mismo proeedirnianto pero adicionalmente se agrag6 avena a
una concentraci6n de 05 en el momento de la adici6n del in6e410 a los 900 ml
de leehe pasteurlzada y el procedimiento sigui6 igual al de la bebida sin prebi6tico
tambien se hizo por cuadruplicado
2274 Refrigeracl6n
Despues que las mezclas con y sin prebiotico alcanzaron el de acidez
requarido se IIeva ron a refrigeraci6n a una temperatura de 4deg C p~r 24 horas
para frenar proce~os metab6licos de los microorganisrtlos Despues de este
ti~mpo se procedi6 al batido
36
1 2275 Batido
Con un agitador se procedi6 a batir las bebidas para romper et coagulo formado
y de esta manera homogeneizar la mazela y obtener asf la bebida fermentada
2276 Envasado y almacenamiento
Ambas bebidas se envasaron en frascos vidrio para hacerles seguimiento de pH
acidez(expresado como acido tacticol y recuento de Lactobacillus breviSf los
dies 27 14 Y 21 despues de elaboradas las bebidas perfodo durante el cualta
muestra permanecfa afmacenada a temperatura de refrigeracion(Ver Figura 5
37
Fjgura 5 Diagrama de Flujo
PREPARACION DE LA MUESTRA
ADICION DEL INOCULO
~_____~_B~ATIDO~______~
INCUBACION 37deg C hasta acidez = 04-05 acido laotico
ENFRIAMIENTO
hasta 4 0 C ~------~ ~------~
ENVASADO Y ALMACENAMJENTO
dUrante 21 dfas a Temperatura 4 0 C
38
1
228 Determinaci6n del pH
Se determino por el metoda potenciometrico en un pH-metro manual durante los
dias 2) 7 14 Y 21 de las bebidas lacteas sin y con prebi6tica (Ver Tablas 7 y 8)
229 Oeterminaci6n de la acidez (Expresadfl como acido
lactica)
Se tomaron 9 mJ de las bebida~ sa Ie adicionaron 2 gotas de fanoftaleina como
indicador y sa titulo fa acidez con NaOH 01 N hasta la aparicion de un cotor rosado
debit EI volumen de NaOH utilizado se reporta como valor de de acidez
(VerTablas 10 y 11)
2210 Prueba de viabilidad
Qurante el perfoda de almacenamiento de la bebida lactea se procedi6 a hacer la
prueba de viabiHdad en los dias 7 14 Y 21 para determinar Si los lactobacilfus
permanecfan vivOs a una concentraci6n minima de 106 hasta el dia 21 como 10
establece eJ Articulo 10 de la Rasolucion 2310 del Ministerio de $alud de
Colombja
39
Para asta prueba se tamaron 10 rnl de muestra y se adicionaron a 90 ml de caldo
MRS ruego a partir de esta se hicieron diluciones de 10-2 hasta 10-11 de las
diluciones 109101deg 10-11 se inocul6 1 ml de cada uno en agar MRS siguiendo el
metodo de siembra en profundidad y por duplicado e incubando a 370 C x 5 dras
en anaerobiosis y luego se hicieron tos recuentos por duplicado para esi reportar
los recuentos promedio (Ver Tablas 13 y 14)
2211 AniUisls microbiol6glco de las bebidas Iicteas(con y sin
avena)
Con el fin de determinar las condiciones higienico-sanitarias del producto se
realizaron las pruebas microbiol6gicas de Recuento de mohos y fevadurasml en
agar OGY Recuento en superficia de Staphylococcus coagulasa positivoml en
agar Baird Parker Numero Mas Probable (NMP) de coUfor-mes totales y
Escherichia coliml en caldo Fluorocult y Presencia de Salmonela25ml con BHI
caldo tetrationato y agar Hecktoen (Montoya 1999)
(Var tabla 16)
2212 AnaUsis estadistico
A los datos obtenidos en la medici6n de pH acidez (expresada como Beido
laclico) en los dras 2714 Y 21 y el recuento de Lactobacillus en los dras 714 y21
40
realizados a los dos tratamlentos se tes aplic6 1a prueba t porque solo difieren
en la presencia 0 ausencia del prebi6tico para evaluar si habra diferencia
estadfsticamente significativa para los dos tratamientbs(Ver Tablas9 12 y 15)
41
3 RESULTADOS Y DISCUSION
31 Coloraci6n de Gram y morfologfa
Las cepas aisladas fesultaron Gram positivas (Ver Figura 6) colonias grandes
cremosas dE) color beige con bordes homogeneos y c6ncavos en su
morfologia (Ver Figura 3) resultando de acuerdo a 10 especificado en Stanley
1989 para Lactobacillus
32 Prueba de esporulaci6n y cataJasa
Los resultados de la pruebas de esporulaci6n y catalasa indicados en las
Tablas 3 y 4 respeclivamente dieron conforme a 10 especificado en Stanley
1989 para Lactobacillus
42
1
2 3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
TABLA 3 Resultado de prueba de esporuJaci6n
CEPA RESULfADO ESPORULACION
-- -------------
43
l i ~II bull ~ I I
TABLA 4 Resultado prueba de la catalasa
CEPA RESULTADO CATALASA
1 -2 -3 -4 -5 -6 -7 8 -9 -10 -11 12 -13 -14 -15 -16
3~3 Prueba para determinar la especie
Oespues de hacer las pruebas para seleccionar las cepas sospechosas de ser
Lactobacillus se realizo las pruebas bioquimicas fograndose identificar
Lactobacillus plantarum aislctdo de pepino repollo y repollitas de bruselas
44
fermentados y Lactobacillus brevis de mucosa vaginal y leche fermentada (Ver
Anexos del A al E y Tabla 5)
TABLA 5 Resultado identlficaci6n cepa~
CEPA NOMBRE
1 Lactobacillus planfarum
3 Lactobacillus plantarum
5 Lactobacillus brevis
13 Lactobacillus brevis
15 Lactobacillus plantarum
34 Pruebas para determinar microorganismos probi6ticos
las cepas de Lactobacillus brevis y Lactobacillus plantarum mostraron
rasistencia al medio acido de pH =2 Y sales biliares 03 pv resultado similar al
encontrado por Jacobsen et al 1999 para Lactobacillus plantarum (Ver tabla 6)
45
middot
~~~ttiI lltlmiddot~COX~dtJ ~xtc_~ 2 tr~ k-JlL~middot
-)~~TO DE lJIBUOTECUl rjRL]OTtCA twn GO1IU1
TABLA 6 Resultados a pruebas de resistencia a pH=2 y sales biliares 03 plv
CEPA RESISTENCIA pH=2 RESISTENCfA A SALES BIUARES ()3 pv
1 + +
2 + +
3 + +
4 + +
5 +
6 + +
7 + +
8 + +
9 + +
10 + +
11 + +
12 + +
13 + +
14 +1shy +M
15 + +
16 + +
+1 crecimiento debil
+ crecimiento abundante
46
Figura 6 Lactobacillus brevis Gram + aislado de leche fermentada
Ai observar en placa las celulas de lactobacilos despues de real1zar las pruebas
de resistenCia a la acidez y sales biliares se observo una tendencia a aglomerarse
posiblemente como un mecanismo de proteccion cOlitra estos medios que pueden
lIegar a ser adversos para elias (Ver figuras 7 y 8)
47
Figura 7 Lactobacillus brevis aislada de leche fermentada despu~s de la prueba de resistencia a pH=2
Figura 8 Lactobacillus brevis aislada de leche fermentada despues de la prueba de resistencie asales biUares 03 plv
fI
48
35 --Seguimiento del-pH-en-la-bebidaJacteacon y sin -prebi6tico
A continuacion se muestran las Tablas 7 y 8 donde sa registian los datos
recopilados de pHdurante 10$ dras Z 7 14 Y21 para las bebidas laaeas con ysin
prebi6tioo
TABLA 1 ResultadopH yogur sin avena
Dia Repetition 1 Repetici6n 2 Repeticion 3 Repetici6n 4
2 526 501 51 52
7 446 433 438 44
14 439 435 437 436
21 439 437 438 437
TABLA 8 -ResultadopHyogur con avena
Dia Repeticion 1 Repeticion2 Repeticion 3 - Repeticion 4
2 509 523 51 515
7 447 442 445 442
14 436 -438 439 437
21 432 433 435 434
Observando la Figura 9podamos ver que el pH en el -dfado$ para los dos
tratamientos as igual y empieza a descender rapidamente para estabilizarse a
partir del dra 7(Ver figura 9)
49
Figura 9 Comparacj6n de medias para -el pH
Comparaci6n de medias para pH
55 ~ 5 +----=gtIIIi-~i~~----=-r--it~ -- pH sin avena
a 45 1--~~~~=~~ 4 --- pH con
avena35 t-----r-- -------=------=--= ------- - ----
2 7 14 21
Dias
Aplicando la prueba t para comparar las medias de pH I S6 muestia una diferencia
altamants significativa en los dos tratamientos para el dia 21 (pltO05)
(Ver tabla 9)
TABLA 9 Compaiaci6n de medias para pH
DtAS SIN AVENA CON AVENA te p (VALOR)
2 514 514 0 10
7 439 444 -1 61 0159
14 437 I
438 -070 0510
21 438 433 528 00019 shy
- DiFERENCIA AlTAMENTE SIGNIFICATIVA
50
I
AI aplicar regrasi6n a los datos sa obtiene al modelo estimado
pHSinAyena =535606 - 01505650Ia +0005044340IaI2
La variabilidad en la respuesta de pH asta siendo explicada en un 8S7522 por
el modelo (Ver Anexo F)
EI tratamiento con avena mostro el siguiente modelo al analisis de ragresi6n
pHConAvena =534463 ~ 0140407Dia + 0004480980Ia2
La variabilidad an la respuesta de pH asta siendo explicada en un 903315 par
el nlodelo(Ver anexo G)
36 Seguimiento de la acidezmiddotmiddot expresada comomiddot de acido
lactico
A continuaci6n sa muestran las Tablas 10 y 11 donde sa registran los datos
tecopilados de acidezmiddotdurante los dias 27 14 Y 21 para las pebidas taetees con y
sin prebi6tico
TABLA 10 Resuttadode acidez (expresadocomo acido tactico) yogurt sin avena
CIA R~petici6n1 Repeticion2 Repetici6n 3 Repeticion 4
2 054 06 057 058
7 072 074 073 0]2
14 080 083 082 082
21 0]4 079 078 077
51
TABLA 11 Resultado de aCidez (expresado como acido Icktico) yogurt con avena
Dia Repetici6n 1 RepetiCi6n 2 Repetici6n 3 Repetici9n 4
2 059 055 058 057
7 071 073 072 072
14 089 087 088 086
21 092 091 090 091
Observando la Figura 10 se puede concluir que la acidez empieza a aumentar
hasta el dia 14 y luego trata de estabilizarse para los dos tratamientos
(Ver figura 10)
Figura 10 Comparaci6n de medias para la acidez
N G)
Comparacion de medias para acidez
1
2 0I 5 -+--=--------=-~~~= u
ltC
- Acidez sin avena
2 7 14
Dias
52
21
-it- Acidez con avena
Aplicando la prueba t para camparar las madias de acidez se muestra una
diferencia altarnante significativa en los dos tratamiantos para los dias 14 y 21
(pltO05)
(Var tabla 12)
TABLA 12Comparaci6n de medias para Acidez
DIASmiddot SIN AVENA CON AVENA te p(VALOR)
2 0572 0572 0 10
7 0727 0720 119 0278
14 0818 0875 -638 000070shy
21 077 091 -1212 i 0000019 shy
DIFERENCIA AL TAMENTE SlGNIFICATIVA
AI aplicar r~gresi6n a los datos se obtiene el modelo estimado
AcidezSlnAIena = 0491897 + O0436032Dia O00144613DfaA2
La variabilidad en la respuesta de acidez asta siendoexplicada en un 970978
por al modelo (Ver anexo H)
EI tratamiento con avena mostro elsiguiente modeloj a1 analisis de regresion
AcidezConAvena = 0491638 + 00406572Oia - OQOO982559OiaA2
La variabilidad enla respuesta acidez esta siendo explicadaen un 99212 por
el modelo (Ver anexo J)
53
I ~
37 Prueba de viabiJidad
A continuaci6n sa muestran las Tab~as 13 y 14 donde sa presentan los datos
recopilados del recuento de Lactobacilos durante los dias 7 14 Y 21 para las
bebidas lacteas con y sin prebi6tico
TABLA 13 Recuento de Lactobacilos (UFCml) yogurt sin avena
Dia Repetici6n 1 Repetici6n 2 Repeticion 3 Reptttici6n 4
7 1880X10l1 1454X1011 1642X1011 1780X10~
14 1560X10~ 646X1011J 1890X10l 140X10l1
21 1200x10lu 128Ox10u 1745x10J 1520x101V
TABLA 14 Recuento de Lactobacilos (UFCml) yogurt con avena
Dfa Repetieion 1 Repetici6n 2 Repeticion 3 Repeticf6n 4
7 1600X10lt 1240X10t 1640X10ll 1980X10t
14 540X1011 427X10n 546X10n 720X10ll
21 500x1011 492x1011 712)(1011 980x10~
AI analizar la Figura 11 sa puede observar un recuento mayor de Lactobacilos
en al tratamiento con avena resultado de acuerdo a 10 encontrado por Alander at
aI 1999 Kontula et aI 1998 y Jaskari et aI 1998
54
Figura 11 Comparaci6n de medias para Log Lactobacillus
Comparacion de medias para log Lactobacillus
~ 1350
-+- Sac Sin--() 13 co avenaIII
bull 125 -- Bac con 0)
0 12 avenaJ
115 7 14 21
Dias
Aplicando la prueba t para comparar las medias de recuento de Lactobacillus no
se encontr6 una diferenc1a estadfsUcamente significative entre los dos
tratamientos (Ver tabla 15)
Este aumento en al racuento influy6 en la disminuci6n del pH y en el aumento de
fa aeidez por la fermentacion que realizan los Lactobacillus sobre fa lactosa de la
lache y la avena adicionada como prebi6tico
55
1
TABLA 15 Comparaci6n medias lag Lactobacillus
DIAS SIN AVENA CON AVENA tc p(VALOR)
7 122257 122022 04846 06451
14 121065 132393 -19602 00977
21 129025 133087 -08236 04416
At aplicar regresion a los datos se obtiane al modelo astimado
LactobacillusSinAvena= 117347 + 004834640Ia
La variabilidad en la respuesta del recuento de LactobaCillus ssta siendo
explicada en un 260054 por el mod$loVar anexo J)
EI tratamiento con avena mostr6 al siguiente modalo al anal isis de regresion
Lactobacillu$ConAvena =118103 + 007903040Ias
La variabilidad en la respuesta de recuento esta siendo explicada en un 3068
por al modelo(Ver anexo K)~
38 Analisi$ microbiol6gicos de las bebidas lacteas con y sin
En la Tabla 16 estan recopilados los resultados microbiol6gieos obtenidos en ras
muestras con los dos tratamientos (con y sin avena)
I [
sa
TABLA 16 Resultados analisis microbiologico
Recuento de mohos y levaduras Iml lt10
Recuento de Staphylococcus coagulase positiva Iml lt100
NMP coliformes fotales y Escherichia coli Iml lt3
Presencia de Salmonella25ml Ausente
Los resultados de este analisis demuestran que las bebidas fermentadas con y
sin avena~ astan fibres de microorganismos patogenos
57
1
4 CONCLUSIONES
Se aislaron cepas nativas de Lactobacillus plantarum de las muestras vegetates
de repollo pepino repollitas de bruselas fermentadas y Lactobacillus brevis de
lache fermentada y mucosa vaginal humana Ambas cepas resistieran un pH=2 y
una concentraci6n de sales biliares det 03 ptv dos earacteristicas importantes
en los probi6ticos
Lamiddot cepa de Lactobacillus brevis aislada de lache Sa utiliz6 para elaborar una
bebida fermentada sin y con avana comoingrediente prebiotico obteniendose un
aJimento centon recuento del probi6tico viable durante 21 dras de seguimiento
ademas libre de microorganismos )at6gen05
No se encontr6 efecta significativo de la avena sobre Ie viabilidad del Lactobacillus
brevis aunque sa presento un aumento en 61 recuento de estos en la bebida con
avena
58
plusmn ~
5 RECOMENDACIONES
Ensayar la cepa de Lactobacillus plantartJm en productos carnicos madurados
como el salami
Ensayar la cepa de Lactobacillus l)revs en otros derivados lecteos como queso
quesito queso crema
Continuar con el estudio de estos microorganismos y caracterizarlos
molecularmente ademas de estudiar su capacidad de adherencja a fa mucosa
intestinal sobre algunes Hneas celulares como las CaCo~2
Estudiarel efedo de la avena sabre la viabiJidad del Lactobacillus breyis a una
concentraci6n mayor de 05
Realizer ensayos can las cepas de Lactobacillus brevis y Lactobrlcillus pJantarum
para elaborar masas acidas para panificacion reemplazando el Bromato de
Potasio aditivo prohibido desde marzo del 2003 en nuestro pais per 5U toxicidad
59
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65
ANEXOS
66
ANEXO A RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AlSLADA DE i
PEPINO it
Referencia Pepino 1 Fecha 06122002
IEXCELENTE IDENTIFICACION
Latto plantarum 1
Galeria API 50 CHL V50 Leida el 06122002
Perfil - -- - ++ - -- - ++++ - - -+- + - I I I I I I I I +t+ - +f- ~ - - + + ~ - - - +- + - shy
o - GLY - ERY DARA - LARA + RIB + DXYL - LXYL - ADO - MDX - GAL + GLU + FRU + MNE + SBE - RHA - DUL - INO bull MAN + SOR - MDM + MUG shyNAG + AMY + ARB + ESC + SAL + CEL + MAL + LAC + MEL + SAC + TRE + 1NU - MLZ + RAF + AMD - GLYG - XLT - GEN + TIJR + LYX - TAG - DFUC shyLFUC - DARL + LARL - aNT + 2KG - 5KG shy
--- Taxones significativos rd -----T -- Tests en contra
Lactoplantarum 1 999 092 1
Taxon siguiente Lactobrevis 1 OJ 044 3
i i
Lactoplantarum 1 1 test (5) en contra
D-SORBITOL (SOR) 78
Tax6n siguiente Lactobrevis 1 3 test (s) ert contra
METHYLD-MANNOSIDE (MOlM) 0 MELEZITOSE (MLZ) 14 D-TURANOSE (TUR) 14
67
ampb
ANEXO B RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AISLADA DE REPOLLO FERMENTADO
~
Referencia Repollo fermentado - 3 Fecha 03072003
EXCELENTE IDENTIFICACION
Lactoplantarum 1
Galena API 50 CRL V50 Leida el 03072003
Perfil - - ++ - - - - -H++ - - ~ + - + - I I 1 I I I I -H+ - ++ - - - + + - -- - - + - shy
o - GLY - ERY - DARA - LARA + RIB + DXYL - LXYL - ADO ~ MDX - GAL + GLU + FRU + MNE + SBE ~ RHA - DUL - INO - MAN + SOR - MDM + MDG shyNAG + AMY + ARR + ESC + SAT + CRL + MAL + LAC + MEL + SAC + TRE + lNU - MLZ + RAF + AMI) - GLYG - XLT - GEN + TOR + LYX - TAG - DFUC shyLFUC - DARL - LARL - GNT + 2KG - 5KG shy
------Taxones significativos _ _----- Id--- ---T---- Tests en contra
Lactoplantarum 1 999 095 1
Tax6n siguiente Lactobrevis 1 01 OA8 3
lJactoplantaru01 1 1 test (s) en contra
DSORBITOL (SOR) 78
Taxon siguiente Lactobrevis
METHYL-D-MANNOSIDE D-TURANOSE
1
(MOM) (TOR)
3 test (5) en contra
0 MELEZITOSE 14
(MLZ) 14
i
I
68
ANEXO C RESULTADO PRUEBAS BIOQUWICAS DE CEPA AISLADA DE MUCOSA HUMANA
Referenda Mucosa - 5 Fecha 27012003
BUENA IDENTlFICACION
Galeria API 50 CHL vso Leida el 270112003
Perfil - - - - +t--t - - - + - + - - - - - - - - -+- - - - - + - + - - - - - - - - - - - - - bull - - -+ - +
o - GLY ~ ERY - DARA bull LARA + RID + DXYL + LXYL - ADO bull MDX - GAL + OLU - FRU + MNE - SBE - IlliA - DUL - INa - MAN - SOR - MDM - MOO shyNAG + AMY - ARB - ESC ~ SAL bull CEL - MAL + lAC - MEL + SAC - TRE shyINU - MLZ - RAF - AMD - GLYG - XLT - GEN - 11JR - LYX - TAG - DFUC shyLFUC - DARL - IARL - ONT + 2KO - 5KG +
- - - - - - Taxones significativos - - - - - - - Id T -- Test en contra
Lactobrevis 3 963 088 1
Taxon siguiente Lactoco11inoides 36 075 2
Lactobrevis 3 1 test (s) en contra
GLUCOSE (GLU) 95
-~~~------------~---------------------------~--~-------~--~-----~----------~--------~------------~~--Taxon siguiente Lactocollinoides 2 test (s) en contra
GLUCOSE (GLU) 100 MELIBIOSE (MEL) 25
69
i r
ANEXO D RESULTADO PRUEBAS BIOQIJiMICAS DE CEPA AISLADA DE LECHE FERMENTADA
Referenda Leche fennentada ~ 13 Fecha 27012003
BUENA IDENTIFICACI6N
Galeria API 50 CHL V50 Leida el 270112003
Perfil - - - - -t-t+- - - - + - + - - - bull - - - - -+- - - - - + - + - - - - - - - - - - - - - - - - -+ - +
0 - GLY - ERY - DARA - LARA +Rll3 + DXYL + LXYL - ADO - MDX ~GAL + GLU - FRU + MNE SBE - RHA DUL bull INO MAN - SOR MDM bull MDG shy
~NAG + AMY - ARB - ESC - SAL - CEL - MAL + LAC - MEL + SAC - TRE I lNU - MLZ - RAF - AMD - GLYG - XLT - OEN - IUR LYX - TAG - DFUC bull i
LFUC - DARL - LARL -ONr + 2KG - SKO + 1
- -- - - Taxones significativos - - Id -- T --- Test en contra
Lacta brevis 3 963 088 1
Taxon siguiente Lactocollinoides 36 075 2
Lactobrevis 3 1 test (s) en contra
GLUCOSE (GLU) 95
-----------------------------------------------------------~------------------------------~-------------------Taxon siguiente Lactocollinoides 2 test (s) en contra
GLUCOSE (GLD) 100 MELffiIOSE (MEL) 25
70
II iJ1
I
I ANEXO E RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AISLADA DE REPOLLITAS DE BRUSELAS FERMENTADA
Referencia repollitas de bruselas 15 Fecha 03072003
EXCELENTE IDENTIFICACION
Lactoplantarum 1
Galeria API 50 CHL vsO Leida el 03072003
Perfil - - - - +t - - - - +H+ - +- - +t + - I I I I I I I f ++t - + - - - -+ + - - - -+ -+ - - I ij
o - GLY - ERY - DARA - LARA + RJB + DXYL - LXYL - ADO - MDX - GAL +
GLU + FRU + MNE + SBE RHA + DUL - INO - MAN + SOR + MDM + MOG shyNAG + AMY + ARB + ESC + SAL + eEL + MAL + LAC + MEl + SAC + TRE + i
I1NU - MLZ + RAF AMD GLYG - XLT - aEN + TUR + LYX - TAG - Druc LFUC - DARt + LARL - aNT + 2KG - 5KG shy n ----Taxones significativos ------ Id Tests en contra
Lactoplantarum 1 999 090 o
Taxon siguiente Lacto pentosus 01 012 7
Lactoplantarum 1 o test (s) en contra
Taxon siguiente Lacto pentosus 7 test (8) en contra
GLYCEROL (GLY) 75 D-XYLOSE (DXYL) 100 L-RHAMNOSE (RHA) 25 METHYL-D-MANNOSIDE (MOM) 1 MELEZITOSE (MLZ) 25 RAFFINOSE (RAF) 75 D-ARABITOL (DARL) 0
71
~
I i I
ANEXO F - ANALISIS DE REGRESION PARA pH EN BEBIDA SIN AVENA
Aruilisis de regresi6n polinomial
---~-~-------------------------------------------~-----------~~---------------------~--------------Variable dependiente pHSinAvena ---------------------------~-------------~--------------------~---------------------------------
Error T Parametro Estimado Estandar Estadistico P-Valor
CONSTANTE 535606 0094535 56657 00000 Dia -0150565 0020706 727154 00000 Dia2 000504434 0000871488 578819 00001
---~---------------------------------------------------------------------------------------------------
Anfllisis de Variama -------------------------------------------~-----------~-----------------------------~-~--- jSource Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor 11
------------------------~------------------------------------------------------------------------------~ Mod-elo 155772 2 0118861 4256 00000 Residual 0237877 13 00182983
Total (Corr) 11956 IS
R2 == 867522 percent
pHSinAvena == 535606 - 0150565Dia + 000504434Dia2
72
____
middot ANEXO G - ANALISIS DE REGRESION PARA pH EN BEBIDA CON AVENA
AmUisis de regresion polinomial _____~_____~__-_____~___4____________________bull____bull__________bull_____________~~----_------___________
Variable depcndiente pHConA vena ------------------------------------------------------------------------------------------~--------
Error T Parametro Estimado StAndar Estadfstico P-Valor
---------------------------------------------~-----------------------------------------------_---------CONSTANTE 534463 00801045 667208 00000 Dia -0140407 00175453 800253 00000 DiaA 2 000448098 0000738458 606803 00000
----------------------~---~-----------------------------~------------------------------~----AmUisis de Varianza
---~---------------------------------~---------------------~------------~-------------------~------Source Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio PValor --------------------------~-----------------------------------------------~------------~-----~~--~ ModeJo 159575 2 0797873 6073 00000 Residual 02170798 middot13 00131383 _______~_~ ~_~----------~------~--~-----~-M-----~-----____ _____________~-----------------------Total (COlT) 176654 15
R12 903315 percent
-----------~------------------------------------------------------------------------~-----------pHConAvena 534463 - 0140407Dia + 000448098DfaA 2
73
ANEXO H - ANALTSIS DE REGRESTON PARA ACIDEZ EN BEBJDA SIN AVENA
An8Jisis de Regtesi6fi P6lifJomial
Variable Depefidiefile~ AcidezSinAVenll _______________w_____~______~________________~-----------_________~_________________~~____~___~_____
Error T Pariirnetro Estimado Estandar Estadistico ---------------------------------------~--------------~-~-------~--------------------~------------CONSTANT 0491697 00123217 399051 00000 Dia 00436032 000269882 161564 00000 D1a2 -000144613 000011359 127312 00000 __w___~________________________~-_______-_____~----____________________________~__~---~_--__~___
AriiiJisis de varianza ~_~__~__________~_~____~________~___________- _________e_____________________________bull _____-________
Source Smn de cuadr Df Mean Square F-Ratio PmiddotValor_~~___________________________________bull ______~___________bull ____________bull ______~________w________________
Model 0135203 2 00676013 21747 00000 Residual 000404118 13 000031086
Total (Corr) 0139244 15
R2 970978 percent
AcidezSlnAvena 0491697 + O0436032Dia - 0OOl44613Dia2
74
I
ANEXO I ANALISIS DE REGRESION PARA ACIDEZ EN BEBIDA CON AVENA
1
Anwisis de tegtesi6fi polinomial
Variable dependiente Acidez Con Avena
Error T ParametTo Estimado Stlindar Estadfstico P-Valor ----------------~-------~---------------------~-----------------------------------------------------CONSTANT 0491639 000926607 530578 00000 Diamiddot 00406572 000202955 200326 00000 DfaA 2 0000982559 0000085421 -115025 00000
-------------~----------------------------~-------------------------~-----------------------------------
-------------~-----~~-----------------------------~---------------------------------------------_--Source Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio PValor
-~-------------~----------------------------------~------------------~~-------------------------- Modelo 0288008 2 0144004 81914 00000 Residual 000228539 13 0000175799
----------~~--------------~---------------------------------------------~---------------------------Total (Corr) 0290294 15
RA2 = 992127 percent
-------------------------~----~---~------------~---------------------------------~---------------~
AcidezConAvena == 049163amp + 00406572D1a - 0000982559DiaA2
75
I
(Ilmiddot il
ANEXO J- ANALISIS DE REGRESION PARA RECUENTO LACTOBACILOS PARA BEBIDA SIN AVENA
Amilisis de regresion - Modelo lineal Y = a + bX
------------------------~----------------------~-----------------------------~----------~-----------Variable Dcpendiente LactobacilJusSinAvena Variable independiente Dia
I--------~----------~-----------------------------------~-------~-~--~--------------------------~-Error T
Paramctro Estimado Standard Stadistico P-Valor
----~----~------------~-----~-----------------------~-------------~-----------------------------Intereepto 117347 0389973 300911 00000 Pendiente 00483464 00257889 18747 00903
Analisis de Varianza
---------~------------------~----------------~---------------------------------~---------~----------Source Sum decuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor
------------~---------------------~---------------------~--------------------------------~-----~----Modelo 0916252 1 244835 443 00616 Residual 260706 10 0260706
--~------------~---~------------------~~~-----~-------~---------~~-------------------------------------Total (Corr)352332 11
Coeficiente Correlaci6n = 0509955 R2 = 260054 percent
LactobacillusSinAvena= 117347 + 00483464Dfa
76
ANEXO K- ANALTSIS DE REGRESION PARA RECUENTO LACTOBACILOS PARA DEBIDA CON AVENA
Aruilisis de regresion - Modelo lineal Y = a + hX
Variable Dependiente LactobacillusConAvena Variable Independiente Dia ---~--------------------------------------------------------__-----------__--_--_-----------shy
Error T Paramctro Estimado Standard Estadistico P-Valor -~--------------------------------------------------------------------------------------------------
Irttercepto 118103 0567963 207942 00000 Pendiente 00790304 00375594 210414 00616
-----------------~----------------------------~----~-------~----~----------------------------
Analisis de Varianza
----------------~----------------~------------------~--------------------------~------~--------shySource Swn de cuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor
-----------------~--~--------------------------------------------------------------------------~---~ Mode10 244835 1 244835 443 00616 Residual 552997 10 0552997
Total (Corr)797832 11
Coeficiente Correlacion = 0553964 RI2 = 306875 percent
-----~--------------------------------------------------------~--------------------------------------
LactobacillusConAvena = 118103 + 00790304Dfas
77
luego S9 tomaron 3 ml de cada muestra y se jnocularon 9 ml de caldo MRS (Man
Rogosa and Sharpe) se incubaron a 37deg C durante cinco dias en camara de
anaerobiosis (Ver Figura 1) Oespues de este tiempo sa inocularon cajas de petri
con agar MRS con 1 ml del cultivo microbiano y se incubaron bajo las mismas
condiciones que eJ caldo Este procedirniento se realiz6 rapetidas veces hasta
seleccionar la cepa pura mediante observaci6n de caracteristicas morfologicas de
la cOlonia y a cada colonia se Ie practico la coloracion de gram con el fin de
observar las caracteristicas microscopicas de cada una e identificar las de mayor
similitud a los Lactobacilos y Bifidobacterias
Figura 1 Camara de anaerobiosis
27
2212 De la leche
Sa tomo 200 ml de teche cruda de la planta de leches y se colaca a fermentar
baja anaerobiosis durante 15 dras Luego sa procedia como en los vegetales
2213 De mucosa vaginal humana
Se tomo una muestra de frotis de mucosa vaginal humane can capito esteril sa
puso a ncubar en Caldo MRS y se procedi6 camo en 2211 y 2212 A cads
aislado sa Ie practico la coloracion de gram y sa seleccionaron aquellas que eran
bacilos gram positivos (Ver Tabla 2)
28
TABLA 2 Fuente de aislarniento de cepas nativas
CEPA FUENTE
1 Pepino fermentadQ
2 repollitas de bruselas fermentadas
3 Repolltgt fermentado
4 Repollo fermentado
5 Mucosa va~inal humana
6 Mucosa vaginal humana
7 repollitas de bruselas fermentadas
8 Repollo fermentado
9 repollitas de bruselas fermentadas
10 Mueo~a vaginal humana
11 Repollo fermentado
12 RepolJo fermentado
13 Leche fermentada
14 Mucosa vaginal humana
15 repollitas de bruselas fermentadas
16 Repollb fermentado
29
222 Almacenamiento de las cepas aisladas
Cuando las cepas crecieron en agar MRS homogEmeas en color morfologia
coloraci6n de Gram etc se pssaron a agar inclinado en tuba se cubrieron con
aceite mineral y se guardaran en refrigeraci6n a 4deg C para tomar de alii la cepa y
efectuarle las diferentes pruebas para confirmar el genera y determinar la especie
de cada una de eas (Ver Figura 2)
Figura 2 Cepas en tubos con agar inclinado
30
223 Pruebas para determinar et genero
2231 Coforaci6n de Gram
A cada cepa sospechosa de Lactobacilos se 1e hizo la coloraci6n de gram y se
seleccionaron las gram positivas
2232 Morfologfa
En agar MRS y despues de incubar en anaerobios~s crecian colonias grandes
cremosas de color beige con bordes homogeneos y c6ncavas(Ver Figura 3)
Figura 3 Colonias aisladas en agar MRS
31
2233 Prueba de esporulaci6n
A cada cepa aislada se Ie hizo esta prueba la cuel consistia en incubar en
aerobiosis durante ocho dias las cajas de agar MRS donde crecieron colonias de
Lactobacilo$ y luego se les (ealize) coloraci6n de espora Las capas que dieron
negativa a la prueba de espora se considararort sospechosas de sar Lactobacilos
y se continuo con la prueba de la catalasa (Ver Tabla 3)
2234 Prueba de la catalasa
los lactobacilos carecen de catalasa Eata prueba se hizo tomando una colonis
se deposito en vidrio de reloj y se Ie adicion6 dos gotas de peroxida de hidr6geno
(H202) la que no presentaba efervescencie eran cepe sospechosa de ser
Lactobacilo (Ver Tabla 4
Sa seleccionaron las capas euyo resultado fue aeorde con el genera Lactobacilfu$
y se continuo con la comirmaeion del genera y determinacion de la eSpecie
meqiante las pruebas bioqulmicas
32
224 Prueba para determlnar la especie
Para confirmar el genero y determinar la especie de las diferentes capas aisladas
se hizo una caracterizaci6n bioqufmica utilizando un kit de API 50 CHL Medium
Ref 50 410 que contiene una galed8 de medios que permite realizar el estudio
de fermentaci6n de los 49 azucares de 52 especies de Lactobacillus (Ver Figura 4
y tabla 5)
Figura 4 API CHL 50-Prueba bioquimica
33
225 Pruebas para determinar microorganismos probi6ticos
2251 Resistencia a pH=2 y sales biliares de concentraci6n O3pv
A las cepas idantificades como Lactobacillus brevis y Lactobacillus pantarum sa
las realiz6 Ie prueba dfl resistencia a pH=2 y sales biliares de concentraci6n 03
pv ( Jacobsen et al 1999) Una colonia de cada cepe aislada se inocul6 en 4 mt
de caldo MRS durante cinco dras bajo condiciones de anaerobiosis Oespues de
esta tiempo se dejaron pracipltar los microorganismos por sedimentaci6n se Ie
retire el sobrenadante y al precipitado se Ie adicion6 Sml de caldo MRS
previamente ajustado a pH=2 can seido clorhfdrico (HCI) dentro del mismo tuba de
ensayo G igual sa hizo can otro tubo previamente incubado pero a este se Ie
adiciono 5ml de caldo MRS con sales biliares a una concentra~i6n de 03 plv y
ambos se incuberon a 37deg C por 2 haras Sa midio 01 mi de cada uno de los
tubas al tiempo 0 y a las 2 horas y sa inoculeron en superficie en caJas de petri
con agar MRS S9 incubaron a 37deg C bajo anaerobiosis durante 48 horas Se
compararon visualrrente en cada caja de petri el crecimiento en superficie y las
que presentaron crecimiento en tos dos tiempos (0 y 2 horas) tanto en at media
acido como en sales I se consideraron resistentes a pH=2 y sales biliares (03
pv)
(Ver Tabla 6)
34
226 Conservacion
Todas fas capas que habian dado positiva Jas pruebas anteriores y que reaultaron
resistentes a pH=2 y sales biliares 03 pv y despues de identificadas en API 50
CHL sa repicaron en agar MRS en tuba inclinado y despues de Incubar a 37deg C
por 48 horas bajo anaerobiosis se Ctlbrie el biser completamente can aceite
mineral esteril y sa guardaron en refrigeraci6n
227 Elaboracj6n de fa bebida fermentada
2271 Preparaci6n de la mue$tra
Sa tome 1 mt de caldo MRS previamante inoculado e incubado que presentaba
una concentracion de Lactobacillus brevis de 27x108 Iml segun la escaJa de Mac
Farlan y sa adiciono a 9ml de leche pasteurizada en un tubo sa dej6 incubanda
en anaerobiosis por 48 hores Luego se pasaron estos 10 ml a un frasco qua
cont~nie 90 ml de leche pasterizada y se dej6 incubando par 48 haras en
anaerobiosis
35
2272 Adici6n del inOculo
A 900ml de leche pasteurizada se Ie adicion61os 100 ml de leche que habia sido
previamente ino(ulada dos veces con la cepa posteriormente se deja
fermantando la lache a temperatura de 37deg C
2273 Control de Ja fermentaci6n
Las muestras se hicieron por cuadruplicado y se les hizo un seguimiento de
aoidez hasta un valor entre 04 y 05 expresada como Bcido lactico esta
procedimiento corresponde a la babida fermentada sin prebi6tico La bebida ~on
prebi6tico tiene al mismo proeedirnianto pero adicionalmente se agrag6 avena a
una concentraci6n de 05 en el momento de la adici6n del in6e410 a los 900 ml
de leehe pasteurlzada y el procedimiento sigui6 igual al de la bebida sin prebi6tico
tambien se hizo por cuadruplicado
2274 Refrigeracl6n
Despues que las mezclas con y sin prebiotico alcanzaron el de acidez
requarido se IIeva ron a refrigeraci6n a una temperatura de 4deg C p~r 24 horas
para frenar proce~os metab6licos de los microorganisrtlos Despues de este
ti~mpo se procedi6 al batido
36
1 2275 Batido
Con un agitador se procedi6 a batir las bebidas para romper et coagulo formado
y de esta manera homogeneizar la mazela y obtener asf la bebida fermentada
2276 Envasado y almacenamiento
Ambas bebidas se envasaron en frascos vidrio para hacerles seguimiento de pH
acidez(expresado como acido tacticol y recuento de Lactobacillus breviSf los
dies 27 14 Y 21 despues de elaboradas las bebidas perfodo durante el cualta
muestra permanecfa afmacenada a temperatura de refrigeracion(Ver Figura 5
37
Fjgura 5 Diagrama de Flujo
PREPARACION DE LA MUESTRA
ADICION DEL INOCULO
~_____~_B~ATIDO~______~
INCUBACION 37deg C hasta acidez = 04-05 acido laotico
ENFRIAMIENTO
hasta 4 0 C ~------~ ~------~
ENVASADO Y ALMACENAMJENTO
dUrante 21 dfas a Temperatura 4 0 C
38
1
228 Determinaci6n del pH
Se determino por el metoda potenciometrico en un pH-metro manual durante los
dias 2) 7 14 Y 21 de las bebidas lacteas sin y con prebi6tica (Ver Tablas 7 y 8)
229 Oeterminaci6n de la acidez (Expresadfl como acido
lactica)
Se tomaron 9 mJ de las bebida~ sa Ie adicionaron 2 gotas de fanoftaleina como
indicador y sa titulo fa acidez con NaOH 01 N hasta la aparicion de un cotor rosado
debit EI volumen de NaOH utilizado se reporta como valor de de acidez
(VerTablas 10 y 11)
2210 Prueba de viabilidad
Qurante el perfoda de almacenamiento de la bebida lactea se procedi6 a hacer la
prueba de viabiHdad en los dias 7 14 Y 21 para determinar Si los lactobacilfus
permanecfan vivOs a una concentraci6n minima de 106 hasta el dia 21 como 10
establece eJ Articulo 10 de la Rasolucion 2310 del Ministerio de $alud de
Colombja
39
Para asta prueba se tamaron 10 rnl de muestra y se adicionaron a 90 ml de caldo
MRS ruego a partir de esta se hicieron diluciones de 10-2 hasta 10-11 de las
diluciones 109101deg 10-11 se inocul6 1 ml de cada uno en agar MRS siguiendo el
metodo de siembra en profundidad y por duplicado e incubando a 370 C x 5 dras
en anaerobiosis y luego se hicieron tos recuentos por duplicado para esi reportar
los recuentos promedio (Ver Tablas 13 y 14)
2211 AniUisls microbiol6glco de las bebidas Iicteas(con y sin
avena)
Con el fin de determinar las condiciones higienico-sanitarias del producto se
realizaron las pruebas microbiol6gicas de Recuento de mohos y fevadurasml en
agar OGY Recuento en superficia de Staphylococcus coagulasa positivoml en
agar Baird Parker Numero Mas Probable (NMP) de coUfor-mes totales y
Escherichia coliml en caldo Fluorocult y Presencia de Salmonela25ml con BHI
caldo tetrationato y agar Hecktoen (Montoya 1999)
(Var tabla 16)
2212 AnaUsis estadistico
A los datos obtenidos en la medici6n de pH acidez (expresada como Beido
laclico) en los dras 2714 Y 21 y el recuento de Lactobacillus en los dras 714 y21
40
realizados a los dos tratamlentos se tes aplic6 1a prueba t porque solo difieren
en la presencia 0 ausencia del prebi6tico para evaluar si habra diferencia
estadfsticamente significativa para los dos tratamientbs(Ver Tablas9 12 y 15)
41
3 RESULTADOS Y DISCUSION
31 Coloraci6n de Gram y morfologfa
Las cepas aisladas fesultaron Gram positivas (Ver Figura 6) colonias grandes
cremosas dE) color beige con bordes homogeneos y c6ncavos en su
morfologia (Ver Figura 3) resultando de acuerdo a 10 especificado en Stanley
1989 para Lactobacillus
32 Prueba de esporulaci6n y cataJasa
Los resultados de la pruebas de esporulaci6n y catalasa indicados en las
Tablas 3 y 4 respeclivamente dieron conforme a 10 especificado en Stanley
1989 para Lactobacillus
42
1
2 3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
TABLA 3 Resultado de prueba de esporuJaci6n
CEPA RESULfADO ESPORULACION
-- -------------
43
l i ~II bull ~ I I
TABLA 4 Resultado prueba de la catalasa
CEPA RESULTADO CATALASA
1 -2 -3 -4 -5 -6 -7 8 -9 -10 -11 12 -13 -14 -15 -16
3~3 Prueba para determinar la especie
Oespues de hacer las pruebas para seleccionar las cepas sospechosas de ser
Lactobacillus se realizo las pruebas bioquimicas fograndose identificar
Lactobacillus plantarum aislctdo de pepino repollo y repollitas de bruselas
44
fermentados y Lactobacillus brevis de mucosa vaginal y leche fermentada (Ver
Anexos del A al E y Tabla 5)
TABLA 5 Resultado identlficaci6n cepa~
CEPA NOMBRE
1 Lactobacillus planfarum
3 Lactobacillus plantarum
5 Lactobacillus brevis
13 Lactobacillus brevis
15 Lactobacillus plantarum
34 Pruebas para determinar microorganismos probi6ticos
las cepas de Lactobacillus brevis y Lactobacillus plantarum mostraron
rasistencia al medio acido de pH =2 Y sales biliares 03 pv resultado similar al
encontrado por Jacobsen et al 1999 para Lactobacillus plantarum (Ver tabla 6)
45
middot
~~~ttiI lltlmiddot~COX~dtJ ~xtc_~ 2 tr~ k-JlL~middot
-)~~TO DE lJIBUOTECUl rjRL]OTtCA twn GO1IU1
TABLA 6 Resultados a pruebas de resistencia a pH=2 y sales biliares 03 plv
CEPA RESISTENCIA pH=2 RESISTENCfA A SALES BIUARES ()3 pv
1 + +
2 + +
3 + +
4 + +
5 +
6 + +
7 + +
8 + +
9 + +
10 + +
11 + +
12 + +
13 + +
14 +1shy +M
15 + +
16 + +
+1 crecimiento debil
+ crecimiento abundante
46
Figura 6 Lactobacillus brevis Gram + aislado de leche fermentada
Ai observar en placa las celulas de lactobacilos despues de real1zar las pruebas
de resistenCia a la acidez y sales biliares se observo una tendencia a aglomerarse
posiblemente como un mecanismo de proteccion cOlitra estos medios que pueden
lIegar a ser adversos para elias (Ver figuras 7 y 8)
47
Figura 7 Lactobacillus brevis aislada de leche fermentada despu~s de la prueba de resistencia a pH=2
Figura 8 Lactobacillus brevis aislada de leche fermentada despues de la prueba de resistencie asales biUares 03 plv
fI
48
35 --Seguimiento del-pH-en-la-bebidaJacteacon y sin -prebi6tico
A continuacion se muestran las Tablas 7 y 8 donde sa registian los datos
recopilados de pHdurante 10$ dras Z 7 14 Y21 para las bebidas laaeas con ysin
prebi6tioo
TABLA 1 ResultadopH yogur sin avena
Dia Repetition 1 Repetici6n 2 Repeticion 3 Repetici6n 4
2 526 501 51 52
7 446 433 438 44
14 439 435 437 436
21 439 437 438 437
TABLA 8 -ResultadopHyogur con avena
Dia Repeticion 1 Repeticion2 Repeticion 3 - Repeticion 4
2 509 523 51 515
7 447 442 445 442
14 436 -438 439 437
21 432 433 435 434
Observando la Figura 9podamos ver que el pH en el -dfado$ para los dos
tratamientos as igual y empieza a descender rapidamente para estabilizarse a
partir del dra 7(Ver figura 9)
49
Figura 9 Comparacj6n de medias para -el pH
Comparaci6n de medias para pH
55 ~ 5 +----=gtIIIi-~i~~----=-r--it~ -- pH sin avena
a 45 1--~~~~=~~ 4 --- pH con
avena35 t-----r-- -------=------=--= ------- - ----
2 7 14 21
Dias
Aplicando la prueba t para comparar las medias de pH I S6 muestia una diferencia
altamants significativa en los dos tratamientos para el dia 21 (pltO05)
(Ver tabla 9)
TABLA 9 Compaiaci6n de medias para pH
DtAS SIN AVENA CON AVENA te p (VALOR)
2 514 514 0 10
7 439 444 -1 61 0159
14 437 I
438 -070 0510
21 438 433 528 00019 shy
- DiFERENCIA AlTAMENTE SIGNIFICATIVA
50
I
AI aplicar regrasi6n a los datos sa obtiene al modelo estimado
pHSinAyena =535606 - 01505650Ia +0005044340IaI2
La variabilidad en la respuesta de pH asta siendo explicada en un 8S7522 por
el modelo (Ver Anexo F)
EI tratamiento con avena mostro el siguiente modelo al analisis de ragresi6n
pHConAvena =534463 ~ 0140407Dia + 0004480980Ia2
La variabilidad an la respuesta de pH asta siendo explicada en un 903315 par
el nlodelo(Ver anexo G)
36 Seguimiento de la acidezmiddotmiddot expresada comomiddot de acido
lactico
A continuaci6n sa muestran las Tablas 10 y 11 donde sa registran los datos
tecopilados de acidezmiddotdurante los dias 27 14 Y 21 para las pebidas taetees con y
sin prebi6tico
TABLA 10 Resuttadode acidez (expresadocomo acido tactico) yogurt sin avena
CIA R~petici6n1 Repeticion2 Repetici6n 3 Repeticion 4
2 054 06 057 058
7 072 074 073 0]2
14 080 083 082 082
21 0]4 079 078 077
51
TABLA 11 Resultado de aCidez (expresado como acido Icktico) yogurt con avena
Dia Repetici6n 1 RepetiCi6n 2 Repetici6n 3 Repetici9n 4
2 059 055 058 057
7 071 073 072 072
14 089 087 088 086
21 092 091 090 091
Observando la Figura 10 se puede concluir que la acidez empieza a aumentar
hasta el dia 14 y luego trata de estabilizarse para los dos tratamientos
(Ver figura 10)
Figura 10 Comparaci6n de medias para la acidez
N G)
Comparacion de medias para acidez
1
2 0I 5 -+--=--------=-~~~= u
ltC
- Acidez sin avena
2 7 14
Dias
52
21
-it- Acidez con avena
Aplicando la prueba t para camparar las madias de acidez se muestra una
diferencia altarnante significativa en los dos tratamiantos para los dias 14 y 21
(pltO05)
(Var tabla 12)
TABLA 12Comparaci6n de medias para Acidez
DIASmiddot SIN AVENA CON AVENA te p(VALOR)
2 0572 0572 0 10
7 0727 0720 119 0278
14 0818 0875 -638 000070shy
21 077 091 -1212 i 0000019 shy
DIFERENCIA AL TAMENTE SlGNIFICATIVA
AI aplicar r~gresi6n a los datos se obtiene el modelo estimado
AcidezSlnAIena = 0491897 + O0436032Dia O00144613DfaA2
La variabilidad en la respuesta de acidez asta siendoexplicada en un 970978
por al modelo (Ver anexo H)
EI tratamiento con avena mostro elsiguiente modeloj a1 analisis de regresion
AcidezConAvena = 0491638 + 00406572Oia - OQOO982559OiaA2
La variabilidad enla respuesta acidez esta siendo explicadaen un 99212 por
el modelo (Ver anexo J)
53
I ~
37 Prueba de viabiJidad
A continuaci6n sa muestran las Tab~as 13 y 14 donde sa presentan los datos
recopilados del recuento de Lactobacilos durante los dias 7 14 Y 21 para las
bebidas lacteas con y sin prebi6tico
TABLA 13 Recuento de Lactobacilos (UFCml) yogurt sin avena
Dia Repetici6n 1 Repetici6n 2 Repeticion 3 Reptttici6n 4
7 1880X10l1 1454X1011 1642X1011 1780X10~
14 1560X10~ 646X1011J 1890X10l 140X10l1
21 1200x10lu 128Ox10u 1745x10J 1520x101V
TABLA 14 Recuento de Lactobacilos (UFCml) yogurt con avena
Dfa Repetieion 1 Repetici6n 2 Repeticion 3 Repeticf6n 4
7 1600X10lt 1240X10t 1640X10ll 1980X10t
14 540X1011 427X10n 546X10n 720X10ll
21 500x1011 492x1011 712)(1011 980x10~
AI analizar la Figura 11 sa puede observar un recuento mayor de Lactobacilos
en al tratamiento con avena resultado de acuerdo a 10 encontrado por Alander at
aI 1999 Kontula et aI 1998 y Jaskari et aI 1998
54
Figura 11 Comparaci6n de medias para Log Lactobacillus
Comparacion de medias para log Lactobacillus
~ 1350
-+- Sac Sin--() 13 co avenaIII
bull 125 -- Bac con 0)
0 12 avenaJ
115 7 14 21
Dias
Aplicando la prueba t para comparar las medias de recuento de Lactobacillus no
se encontr6 una diferenc1a estadfsUcamente significative entre los dos
tratamientos (Ver tabla 15)
Este aumento en al racuento influy6 en la disminuci6n del pH y en el aumento de
fa aeidez por la fermentacion que realizan los Lactobacillus sobre fa lactosa de la
lache y la avena adicionada como prebi6tico
55
1
TABLA 15 Comparaci6n medias lag Lactobacillus
DIAS SIN AVENA CON AVENA tc p(VALOR)
7 122257 122022 04846 06451
14 121065 132393 -19602 00977
21 129025 133087 -08236 04416
At aplicar regresion a los datos se obtiane al modelo astimado
LactobacillusSinAvena= 117347 + 004834640Ia
La variabilidad en la respuesta del recuento de LactobaCillus ssta siendo
explicada en un 260054 por el mod$loVar anexo J)
EI tratamiento con avena mostr6 al siguiente modalo al anal isis de regresion
Lactobacillu$ConAvena =118103 + 007903040Ias
La variabilidad en la respuesta de recuento esta siendo explicada en un 3068
por al modelo(Ver anexo K)~
38 Analisi$ microbiol6gicos de las bebidas lacteas con y sin
En la Tabla 16 estan recopilados los resultados microbiol6gieos obtenidos en ras
muestras con los dos tratamientos (con y sin avena)
I [
sa
TABLA 16 Resultados analisis microbiologico
Recuento de mohos y levaduras Iml lt10
Recuento de Staphylococcus coagulase positiva Iml lt100
NMP coliformes fotales y Escherichia coli Iml lt3
Presencia de Salmonella25ml Ausente
Los resultados de este analisis demuestran que las bebidas fermentadas con y
sin avena~ astan fibres de microorganismos patogenos
57
1
4 CONCLUSIONES
Se aislaron cepas nativas de Lactobacillus plantarum de las muestras vegetates
de repollo pepino repollitas de bruselas fermentadas y Lactobacillus brevis de
lache fermentada y mucosa vaginal humana Ambas cepas resistieran un pH=2 y
una concentraci6n de sales biliares det 03 ptv dos earacteristicas importantes
en los probi6ticos
Lamiddot cepa de Lactobacillus brevis aislada de lache Sa utiliz6 para elaborar una
bebida fermentada sin y con avana comoingrediente prebiotico obteniendose un
aJimento centon recuento del probi6tico viable durante 21 dras de seguimiento
ademas libre de microorganismos )at6gen05
No se encontr6 efecta significativo de la avena sobre Ie viabilidad del Lactobacillus
brevis aunque sa presento un aumento en 61 recuento de estos en la bebida con
avena
58
plusmn ~
5 RECOMENDACIONES
Ensayar la cepa de Lactobacillus plantartJm en productos carnicos madurados
como el salami
Ensayar la cepa de Lactobacillus l)revs en otros derivados lecteos como queso
quesito queso crema
Continuar con el estudio de estos microorganismos y caracterizarlos
molecularmente ademas de estudiar su capacidad de adherencja a fa mucosa
intestinal sobre algunes Hneas celulares como las CaCo~2
Estudiarel efedo de la avena sabre la viabiJidad del Lactobacillus breyis a una
concentraci6n mayor de 05
Realizer ensayos can las cepas de Lactobacillus brevis y Lactobrlcillus pJantarum
para elaborar masas acidas para panificacion reemplazando el Bromato de
Potasio aditivo prohibido desde marzo del 2003 en nuestro pais per 5U toxicidad
59
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65
ANEXOS
66
ANEXO A RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AlSLADA DE i
PEPINO it
Referencia Pepino 1 Fecha 06122002
IEXCELENTE IDENTIFICACION
Latto plantarum 1
Galeria API 50 CHL V50 Leida el 06122002
Perfil - -- - ++ - -- - ++++ - - -+- + - I I I I I I I I +t+ - +f- ~ - - + + ~ - - - +- + - shy
o - GLY - ERY DARA - LARA + RIB + DXYL - LXYL - ADO - MDX - GAL + GLU + FRU + MNE + SBE - RHA - DUL - INO bull MAN + SOR - MDM + MUG shyNAG + AMY + ARB + ESC + SAL + CEL + MAL + LAC + MEL + SAC + TRE + 1NU - MLZ + RAF + AMD - GLYG - XLT - GEN + TIJR + LYX - TAG - DFUC shyLFUC - DARL + LARL - aNT + 2KG - 5KG shy
--- Taxones significativos rd -----T -- Tests en contra
Lactoplantarum 1 999 092 1
Taxon siguiente Lactobrevis 1 OJ 044 3
i i
Lactoplantarum 1 1 test (5) en contra
D-SORBITOL (SOR) 78
Tax6n siguiente Lactobrevis 1 3 test (s) ert contra
METHYLD-MANNOSIDE (MOlM) 0 MELEZITOSE (MLZ) 14 D-TURANOSE (TUR) 14
67
ampb
ANEXO B RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AISLADA DE REPOLLO FERMENTADO
~
Referencia Repollo fermentado - 3 Fecha 03072003
EXCELENTE IDENTIFICACION
Lactoplantarum 1
Galena API 50 CRL V50 Leida el 03072003
Perfil - - ++ - - - - -H++ - - ~ + - + - I I 1 I I I I -H+ - ++ - - - + + - -- - - + - shy
o - GLY - ERY - DARA - LARA + RIB + DXYL - LXYL - ADO ~ MDX - GAL + GLU + FRU + MNE + SBE ~ RHA - DUL - INO - MAN + SOR - MDM + MDG shyNAG + AMY + ARR + ESC + SAT + CRL + MAL + LAC + MEL + SAC + TRE + lNU - MLZ + RAF + AMI) - GLYG - XLT - GEN + TOR + LYX - TAG - DFUC shyLFUC - DARL - LARL - GNT + 2KG - 5KG shy
------Taxones significativos _ _----- Id--- ---T---- Tests en contra
Lactoplantarum 1 999 095 1
Tax6n siguiente Lactobrevis 1 01 OA8 3
lJactoplantaru01 1 1 test (s) en contra
DSORBITOL (SOR) 78
Taxon siguiente Lactobrevis
METHYL-D-MANNOSIDE D-TURANOSE
1
(MOM) (TOR)
3 test (5) en contra
0 MELEZITOSE 14
(MLZ) 14
i
I
68
ANEXO C RESULTADO PRUEBAS BIOQUWICAS DE CEPA AISLADA DE MUCOSA HUMANA
Referenda Mucosa - 5 Fecha 27012003
BUENA IDENTlFICACION
Galeria API 50 CHL vso Leida el 270112003
Perfil - - - - +t--t - - - + - + - - - - - - - - -+- - - - - + - + - - - - - - - - - - - - - bull - - -+ - +
o - GLY ~ ERY - DARA bull LARA + RID + DXYL + LXYL - ADO bull MDX - GAL + OLU - FRU + MNE - SBE - IlliA - DUL - INa - MAN - SOR - MDM - MOO shyNAG + AMY - ARB - ESC ~ SAL bull CEL - MAL + lAC - MEL + SAC - TRE shyINU - MLZ - RAF - AMD - GLYG - XLT - GEN - 11JR - LYX - TAG - DFUC shyLFUC - DARL - IARL - ONT + 2KO - 5KG +
- - - - - - Taxones significativos - - - - - - - Id T -- Test en contra
Lactobrevis 3 963 088 1
Taxon siguiente Lactoco11inoides 36 075 2
Lactobrevis 3 1 test (s) en contra
GLUCOSE (GLU) 95
-~~~------------~---------------------------~--~-------~--~-----~----------~--------~------------~~--Taxon siguiente Lactocollinoides 2 test (s) en contra
GLUCOSE (GLU) 100 MELIBIOSE (MEL) 25
69
i r
ANEXO D RESULTADO PRUEBAS BIOQIJiMICAS DE CEPA AISLADA DE LECHE FERMENTADA
Referenda Leche fennentada ~ 13 Fecha 27012003
BUENA IDENTIFICACI6N
Galeria API 50 CHL V50 Leida el 270112003
Perfil - - - - -t-t+- - - - + - + - - - bull - - - - -+- - - - - + - + - - - - - - - - - - - - - - - - -+ - +
0 - GLY - ERY - DARA - LARA +Rll3 + DXYL + LXYL - ADO - MDX ~GAL + GLU - FRU + MNE SBE - RHA DUL bull INO MAN - SOR MDM bull MDG shy
~NAG + AMY - ARB - ESC - SAL - CEL - MAL + LAC - MEL + SAC - TRE I lNU - MLZ - RAF - AMD - GLYG - XLT - OEN - IUR LYX - TAG - DFUC bull i
LFUC - DARL - LARL -ONr + 2KG - SKO + 1
- -- - - Taxones significativos - - Id -- T --- Test en contra
Lacta brevis 3 963 088 1
Taxon siguiente Lactocollinoides 36 075 2
Lactobrevis 3 1 test (s) en contra
GLUCOSE (GLU) 95
-----------------------------------------------------------~------------------------------~-------------------Taxon siguiente Lactocollinoides 2 test (s) en contra
GLUCOSE (GLD) 100 MELffiIOSE (MEL) 25
70
II iJ1
I
I ANEXO E RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AISLADA DE REPOLLITAS DE BRUSELAS FERMENTADA
Referencia repollitas de bruselas 15 Fecha 03072003
EXCELENTE IDENTIFICACION
Lactoplantarum 1
Galeria API 50 CHL vsO Leida el 03072003
Perfil - - - - +t - - - - +H+ - +- - +t + - I I I I I I I f ++t - + - - - -+ + - - - -+ -+ - - I ij
o - GLY - ERY - DARA - LARA + RJB + DXYL - LXYL - ADO - MDX - GAL +
GLU + FRU + MNE + SBE RHA + DUL - INO - MAN + SOR + MDM + MOG shyNAG + AMY + ARB + ESC + SAL + eEL + MAL + LAC + MEl + SAC + TRE + i
I1NU - MLZ + RAF AMD GLYG - XLT - aEN + TUR + LYX - TAG - Druc LFUC - DARt + LARL - aNT + 2KG - 5KG shy n ----Taxones significativos ------ Id Tests en contra
Lactoplantarum 1 999 090 o
Taxon siguiente Lacto pentosus 01 012 7
Lactoplantarum 1 o test (s) en contra
Taxon siguiente Lacto pentosus 7 test (8) en contra
GLYCEROL (GLY) 75 D-XYLOSE (DXYL) 100 L-RHAMNOSE (RHA) 25 METHYL-D-MANNOSIDE (MOM) 1 MELEZITOSE (MLZ) 25 RAFFINOSE (RAF) 75 D-ARABITOL (DARL) 0
71
~
I i I
ANEXO F - ANALISIS DE REGRESION PARA pH EN BEBIDA SIN AVENA
Aruilisis de regresi6n polinomial
---~-~-------------------------------------------~-----------~~---------------------~--------------Variable dependiente pHSinAvena ---------------------------~-------------~--------------------~---------------------------------
Error T Parametro Estimado Estandar Estadistico P-Valor
CONSTANTE 535606 0094535 56657 00000 Dia -0150565 0020706 727154 00000 Dia2 000504434 0000871488 578819 00001
---~---------------------------------------------------------------------------------------------------
Anfllisis de Variama -------------------------------------------~-----------~-----------------------------~-~--- jSource Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor 11
------------------------~------------------------------------------------------------------------------~ Mod-elo 155772 2 0118861 4256 00000 Residual 0237877 13 00182983
Total (Corr) 11956 IS
R2 == 867522 percent
pHSinAvena == 535606 - 0150565Dia + 000504434Dia2
72
____
middot ANEXO G - ANALISIS DE REGRESION PARA pH EN BEBIDA CON AVENA
AmUisis de regresion polinomial _____~_____~__-_____~___4____________________bull____bull__________bull_____________~~----_------___________
Variable depcndiente pHConA vena ------------------------------------------------------------------------------------------~--------
Error T Parametro Estimado StAndar Estadfstico P-Valor
---------------------------------------------~-----------------------------------------------_---------CONSTANTE 534463 00801045 667208 00000 Dia -0140407 00175453 800253 00000 DiaA 2 000448098 0000738458 606803 00000
----------------------~---~-----------------------------~------------------------------~----AmUisis de Varianza
---~---------------------------------~---------------------~------------~-------------------~------Source Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio PValor --------------------------~-----------------------------------------------~------------~-----~~--~ ModeJo 159575 2 0797873 6073 00000 Residual 02170798 middot13 00131383 _______~_~ ~_~----------~------~--~-----~-M-----~-----____ _____________~-----------------------Total (COlT) 176654 15
R12 903315 percent
-----------~------------------------------------------------------------------------~-----------pHConAvena 534463 - 0140407Dia + 000448098DfaA 2
73
ANEXO H - ANALTSIS DE REGRESTON PARA ACIDEZ EN BEBJDA SIN AVENA
An8Jisis de Regtesi6fi P6lifJomial
Variable Depefidiefile~ AcidezSinAVenll _______________w_____~______~________________~-----------_________~_________________~~____~___~_____
Error T Pariirnetro Estimado Estandar Estadistico ---------------------------------------~--------------~-~-------~--------------------~------------CONSTANT 0491697 00123217 399051 00000 Dia 00436032 000269882 161564 00000 D1a2 -000144613 000011359 127312 00000 __w___~________________________~-_______-_____~----____________________________~__~---~_--__~___
AriiiJisis de varianza ~_~__~__________~_~____~________~___________- _________e_____________________________bull _____-________
Source Smn de cuadr Df Mean Square F-Ratio PmiddotValor_~~___________________________________bull ______~___________bull ____________bull ______~________w________________
Model 0135203 2 00676013 21747 00000 Residual 000404118 13 000031086
Total (Corr) 0139244 15
R2 970978 percent
AcidezSlnAvena 0491697 + O0436032Dia - 0OOl44613Dia2
74
I
ANEXO I ANALISIS DE REGRESION PARA ACIDEZ EN BEBIDA CON AVENA
1
Anwisis de tegtesi6fi polinomial
Variable dependiente Acidez Con Avena
Error T ParametTo Estimado Stlindar Estadfstico P-Valor ----------------~-------~---------------------~-----------------------------------------------------CONSTANT 0491639 000926607 530578 00000 Diamiddot 00406572 000202955 200326 00000 DfaA 2 0000982559 0000085421 -115025 00000
-------------~----------------------------~-------------------------~-----------------------------------
-------------~-----~~-----------------------------~---------------------------------------------_--Source Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio PValor
-~-------------~----------------------------------~------------------~~-------------------------- Modelo 0288008 2 0144004 81914 00000 Residual 000228539 13 0000175799
----------~~--------------~---------------------------------------------~---------------------------Total (Corr) 0290294 15
RA2 = 992127 percent
-------------------------~----~---~------------~---------------------------------~---------------~
AcidezConAvena == 049163amp + 00406572D1a - 0000982559DiaA2
75
I
(Ilmiddot il
ANEXO J- ANALISIS DE REGRESION PARA RECUENTO LACTOBACILOS PARA BEBIDA SIN AVENA
Amilisis de regresion - Modelo lineal Y = a + bX
------------------------~----------------------~-----------------------------~----------~-----------Variable Dcpendiente LactobacilJusSinAvena Variable independiente Dia
I--------~----------~-----------------------------------~-------~-~--~--------------------------~-Error T
Paramctro Estimado Standard Stadistico P-Valor
----~----~------------~-----~-----------------------~-------------~-----------------------------Intereepto 117347 0389973 300911 00000 Pendiente 00483464 00257889 18747 00903
Analisis de Varianza
---------~------------------~----------------~---------------------------------~---------~----------Source Sum decuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor
------------~---------------------~---------------------~--------------------------------~-----~----Modelo 0916252 1 244835 443 00616 Residual 260706 10 0260706
--~------------~---~------------------~~~-----~-------~---------~~-------------------------------------Total (Corr)352332 11
Coeficiente Correlaci6n = 0509955 R2 = 260054 percent
LactobacillusSinAvena= 117347 + 00483464Dfa
76
ANEXO K- ANALTSIS DE REGRESION PARA RECUENTO LACTOBACILOS PARA DEBIDA CON AVENA
Aruilisis de regresion - Modelo lineal Y = a + hX
Variable Dependiente LactobacillusConAvena Variable Independiente Dia ---~--------------------------------------------------------__-----------__--_--_-----------shy
Error T Paramctro Estimado Standard Estadistico P-Valor -~--------------------------------------------------------------------------------------------------
Irttercepto 118103 0567963 207942 00000 Pendiente 00790304 00375594 210414 00616
-----------------~----------------------------~----~-------~----~----------------------------
Analisis de Varianza
----------------~----------------~------------------~--------------------------~------~--------shySource Swn de cuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor
-----------------~--~--------------------------------------------------------------------------~---~ Mode10 244835 1 244835 443 00616 Residual 552997 10 0552997
Total (Corr)797832 11
Coeficiente Correlacion = 0553964 RI2 = 306875 percent
-----~--------------------------------------------------------~--------------------------------------
LactobacillusConAvena = 118103 + 00790304Dfas
77
2212 De la leche
Sa tomo 200 ml de teche cruda de la planta de leches y se colaca a fermentar
baja anaerobiosis durante 15 dras Luego sa procedia como en los vegetales
2213 De mucosa vaginal humana
Se tomo una muestra de frotis de mucosa vaginal humane can capito esteril sa
puso a ncubar en Caldo MRS y se procedi6 camo en 2211 y 2212 A cads
aislado sa Ie practico la coloracion de gram y sa seleccionaron aquellas que eran
bacilos gram positivos (Ver Tabla 2)
28
TABLA 2 Fuente de aislarniento de cepas nativas
CEPA FUENTE
1 Pepino fermentadQ
2 repollitas de bruselas fermentadas
3 Repolltgt fermentado
4 Repollo fermentado
5 Mucosa va~inal humana
6 Mucosa vaginal humana
7 repollitas de bruselas fermentadas
8 Repollo fermentado
9 repollitas de bruselas fermentadas
10 Mueo~a vaginal humana
11 Repollo fermentado
12 RepolJo fermentado
13 Leche fermentada
14 Mucosa vaginal humana
15 repollitas de bruselas fermentadas
16 Repollb fermentado
29
222 Almacenamiento de las cepas aisladas
Cuando las cepas crecieron en agar MRS homogEmeas en color morfologia
coloraci6n de Gram etc se pssaron a agar inclinado en tuba se cubrieron con
aceite mineral y se guardaran en refrigeraci6n a 4deg C para tomar de alii la cepa y
efectuarle las diferentes pruebas para confirmar el genera y determinar la especie
de cada una de eas (Ver Figura 2)
Figura 2 Cepas en tubos con agar inclinado
30
223 Pruebas para determinar et genero
2231 Coforaci6n de Gram
A cada cepa sospechosa de Lactobacilos se 1e hizo la coloraci6n de gram y se
seleccionaron las gram positivas
2232 Morfologfa
En agar MRS y despues de incubar en anaerobios~s crecian colonias grandes
cremosas de color beige con bordes homogeneos y c6ncavas(Ver Figura 3)
Figura 3 Colonias aisladas en agar MRS
31
2233 Prueba de esporulaci6n
A cada cepa aislada se Ie hizo esta prueba la cuel consistia en incubar en
aerobiosis durante ocho dias las cajas de agar MRS donde crecieron colonias de
Lactobacilo$ y luego se les (ealize) coloraci6n de espora Las capas que dieron
negativa a la prueba de espora se considararort sospechosas de sar Lactobacilos
y se continuo con la prueba de la catalasa (Ver Tabla 3)
2234 Prueba de la catalasa
los lactobacilos carecen de catalasa Eata prueba se hizo tomando una colonis
se deposito en vidrio de reloj y se Ie adicion6 dos gotas de peroxida de hidr6geno
(H202) la que no presentaba efervescencie eran cepe sospechosa de ser
Lactobacilo (Ver Tabla 4
Sa seleccionaron las capas euyo resultado fue aeorde con el genera Lactobacilfu$
y se continuo con la comirmaeion del genera y determinacion de la eSpecie
meqiante las pruebas bioqulmicas
32
224 Prueba para determlnar la especie
Para confirmar el genero y determinar la especie de las diferentes capas aisladas
se hizo una caracterizaci6n bioqufmica utilizando un kit de API 50 CHL Medium
Ref 50 410 que contiene una galed8 de medios que permite realizar el estudio
de fermentaci6n de los 49 azucares de 52 especies de Lactobacillus (Ver Figura 4
y tabla 5)
Figura 4 API CHL 50-Prueba bioquimica
33
225 Pruebas para determinar microorganismos probi6ticos
2251 Resistencia a pH=2 y sales biliares de concentraci6n O3pv
A las cepas idantificades como Lactobacillus brevis y Lactobacillus pantarum sa
las realiz6 Ie prueba dfl resistencia a pH=2 y sales biliares de concentraci6n 03
pv ( Jacobsen et al 1999) Una colonia de cada cepe aislada se inocul6 en 4 mt
de caldo MRS durante cinco dras bajo condiciones de anaerobiosis Oespues de
esta tiempo se dejaron pracipltar los microorganismos por sedimentaci6n se Ie
retire el sobrenadante y al precipitado se Ie adicion6 Sml de caldo MRS
previamente ajustado a pH=2 can seido clorhfdrico (HCI) dentro del mismo tuba de
ensayo G igual sa hizo can otro tubo previamente incubado pero a este se Ie
adiciono 5ml de caldo MRS con sales biliares a una concentra~i6n de 03 plv y
ambos se incuberon a 37deg C por 2 haras Sa midio 01 mi de cada uno de los
tubas al tiempo 0 y a las 2 horas y sa inoculeron en superficie en caJas de petri
con agar MRS S9 incubaron a 37deg C bajo anaerobiosis durante 48 horas Se
compararon visualrrente en cada caja de petri el crecimiento en superficie y las
que presentaron crecimiento en tos dos tiempos (0 y 2 horas) tanto en at media
acido como en sales I se consideraron resistentes a pH=2 y sales biliares (03
pv)
(Ver Tabla 6)
34
226 Conservacion
Todas fas capas que habian dado positiva Jas pruebas anteriores y que reaultaron
resistentes a pH=2 y sales biliares 03 pv y despues de identificadas en API 50
CHL sa repicaron en agar MRS en tuba inclinado y despues de Incubar a 37deg C
por 48 horas bajo anaerobiosis se Ctlbrie el biser completamente can aceite
mineral esteril y sa guardaron en refrigeraci6n
227 Elaboracj6n de fa bebida fermentada
2271 Preparaci6n de la mue$tra
Sa tome 1 mt de caldo MRS previamante inoculado e incubado que presentaba
una concentracion de Lactobacillus brevis de 27x108 Iml segun la escaJa de Mac
Farlan y sa adiciono a 9ml de leche pasteurizada en un tubo sa dej6 incubanda
en anaerobiosis por 48 hores Luego se pasaron estos 10 ml a un frasco qua
cont~nie 90 ml de leche pasterizada y se dej6 incubando par 48 haras en
anaerobiosis
35
2272 Adici6n del inOculo
A 900ml de leche pasteurizada se Ie adicion61os 100 ml de leche que habia sido
previamente ino(ulada dos veces con la cepa posteriormente se deja
fermantando la lache a temperatura de 37deg C
2273 Control de Ja fermentaci6n
Las muestras se hicieron por cuadruplicado y se les hizo un seguimiento de
aoidez hasta un valor entre 04 y 05 expresada como Bcido lactico esta
procedimiento corresponde a la babida fermentada sin prebi6tico La bebida ~on
prebi6tico tiene al mismo proeedirnianto pero adicionalmente se agrag6 avena a
una concentraci6n de 05 en el momento de la adici6n del in6e410 a los 900 ml
de leehe pasteurlzada y el procedimiento sigui6 igual al de la bebida sin prebi6tico
tambien se hizo por cuadruplicado
2274 Refrigeracl6n
Despues que las mezclas con y sin prebiotico alcanzaron el de acidez
requarido se IIeva ron a refrigeraci6n a una temperatura de 4deg C p~r 24 horas
para frenar proce~os metab6licos de los microorganisrtlos Despues de este
ti~mpo se procedi6 al batido
36
1 2275 Batido
Con un agitador se procedi6 a batir las bebidas para romper et coagulo formado
y de esta manera homogeneizar la mazela y obtener asf la bebida fermentada
2276 Envasado y almacenamiento
Ambas bebidas se envasaron en frascos vidrio para hacerles seguimiento de pH
acidez(expresado como acido tacticol y recuento de Lactobacillus breviSf los
dies 27 14 Y 21 despues de elaboradas las bebidas perfodo durante el cualta
muestra permanecfa afmacenada a temperatura de refrigeracion(Ver Figura 5
37
Fjgura 5 Diagrama de Flujo
PREPARACION DE LA MUESTRA
ADICION DEL INOCULO
~_____~_B~ATIDO~______~
INCUBACION 37deg C hasta acidez = 04-05 acido laotico
ENFRIAMIENTO
hasta 4 0 C ~------~ ~------~
ENVASADO Y ALMACENAMJENTO
dUrante 21 dfas a Temperatura 4 0 C
38
1
228 Determinaci6n del pH
Se determino por el metoda potenciometrico en un pH-metro manual durante los
dias 2) 7 14 Y 21 de las bebidas lacteas sin y con prebi6tica (Ver Tablas 7 y 8)
229 Oeterminaci6n de la acidez (Expresadfl como acido
lactica)
Se tomaron 9 mJ de las bebida~ sa Ie adicionaron 2 gotas de fanoftaleina como
indicador y sa titulo fa acidez con NaOH 01 N hasta la aparicion de un cotor rosado
debit EI volumen de NaOH utilizado se reporta como valor de de acidez
(VerTablas 10 y 11)
2210 Prueba de viabilidad
Qurante el perfoda de almacenamiento de la bebida lactea se procedi6 a hacer la
prueba de viabiHdad en los dias 7 14 Y 21 para determinar Si los lactobacilfus
permanecfan vivOs a una concentraci6n minima de 106 hasta el dia 21 como 10
establece eJ Articulo 10 de la Rasolucion 2310 del Ministerio de $alud de
Colombja
39
Para asta prueba se tamaron 10 rnl de muestra y se adicionaron a 90 ml de caldo
MRS ruego a partir de esta se hicieron diluciones de 10-2 hasta 10-11 de las
diluciones 109101deg 10-11 se inocul6 1 ml de cada uno en agar MRS siguiendo el
metodo de siembra en profundidad y por duplicado e incubando a 370 C x 5 dras
en anaerobiosis y luego se hicieron tos recuentos por duplicado para esi reportar
los recuentos promedio (Ver Tablas 13 y 14)
2211 AniUisls microbiol6glco de las bebidas Iicteas(con y sin
avena)
Con el fin de determinar las condiciones higienico-sanitarias del producto se
realizaron las pruebas microbiol6gicas de Recuento de mohos y fevadurasml en
agar OGY Recuento en superficia de Staphylococcus coagulasa positivoml en
agar Baird Parker Numero Mas Probable (NMP) de coUfor-mes totales y
Escherichia coliml en caldo Fluorocult y Presencia de Salmonela25ml con BHI
caldo tetrationato y agar Hecktoen (Montoya 1999)
(Var tabla 16)
2212 AnaUsis estadistico
A los datos obtenidos en la medici6n de pH acidez (expresada como Beido
laclico) en los dras 2714 Y 21 y el recuento de Lactobacillus en los dras 714 y21
40
realizados a los dos tratamlentos se tes aplic6 1a prueba t porque solo difieren
en la presencia 0 ausencia del prebi6tico para evaluar si habra diferencia
estadfsticamente significativa para los dos tratamientbs(Ver Tablas9 12 y 15)
41
3 RESULTADOS Y DISCUSION
31 Coloraci6n de Gram y morfologfa
Las cepas aisladas fesultaron Gram positivas (Ver Figura 6) colonias grandes
cremosas dE) color beige con bordes homogeneos y c6ncavos en su
morfologia (Ver Figura 3) resultando de acuerdo a 10 especificado en Stanley
1989 para Lactobacillus
32 Prueba de esporulaci6n y cataJasa
Los resultados de la pruebas de esporulaci6n y catalasa indicados en las
Tablas 3 y 4 respeclivamente dieron conforme a 10 especificado en Stanley
1989 para Lactobacillus
42
1
2 3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
TABLA 3 Resultado de prueba de esporuJaci6n
CEPA RESULfADO ESPORULACION
-- -------------
43
l i ~II bull ~ I I
TABLA 4 Resultado prueba de la catalasa
CEPA RESULTADO CATALASA
1 -2 -3 -4 -5 -6 -7 8 -9 -10 -11 12 -13 -14 -15 -16
3~3 Prueba para determinar la especie
Oespues de hacer las pruebas para seleccionar las cepas sospechosas de ser
Lactobacillus se realizo las pruebas bioquimicas fograndose identificar
Lactobacillus plantarum aislctdo de pepino repollo y repollitas de bruselas
44
fermentados y Lactobacillus brevis de mucosa vaginal y leche fermentada (Ver
Anexos del A al E y Tabla 5)
TABLA 5 Resultado identlficaci6n cepa~
CEPA NOMBRE
1 Lactobacillus planfarum
3 Lactobacillus plantarum
5 Lactobacillus brevis
13 Lactobacillus brevis
15 Lactobacillus plantarum
34 Pruebas para determinar microorganismos probi6ticos
las cepas de Lactobacillus brevis y Lactobacillus plantarum mostraron
rasistencia al medio acido de pH =2 Y sales biliares 03 pv resultado similar al
encontrado por Jacobsen et al 1999 para Lactobacillus plantarum (Ver tabla 6)
45
middot
~~~ttiI lltlmiddot~COX~dtJ ~xtc_~ 2 tr~ k-JlL~middot
-)~~TO DE lJIBUOTECUl rjRL]OTtCA twn GO1IU1
TABLA 6 Resultados a pruebas de resistencia a pH=2 y sales biliares 03 plv
CEPA RESISTENCIA pH=2 RESISTENCfA A SALES BIUARES ()3 pv
1 + +
2 + +
3 + +
4 + +
5 +
6 + +
7 + +
8 + +
9 + +
10 + +
11 + +
12 + +
13 + +
14 +1shy +M
15 + +
16 + +
+1 crecimiento debil
+ crecimiento abundante
46
Figura 6 Lactobacillus brevis Gram + aislado de leche fermentada
Ai observar en placa las celulas de lactobacilos despues de real1zar las pruebas
de resistenCia a la acidez y sales biliares se observo una tendencia a aglomerarse
posiblemente como un mecanismo de proteccion cOlitra estos medios que pueden
lIegar a ser adversos para elias (Ver figuras 7 y 8)
47
Figura 7 Lactobacillus brevis aislada de leche fermentada despu~s de la prueba de resistencia a pH=2
Figura 8 Lactobacillus brevis aislada de leche fermentada despues de la prueba de resistencie asales biUares 03 plv
fI
48
35 --Seguimiento del-pH-en-la-bebidaJacteacon y sin -prebi6tico
A continuacion se muestran las Tablas 7 y 8 donde sa registian los datos
recopilados de pHdurante 10$ dras Z 7 14 Y21 para las bebidas laaeas con ysin
prebi6tioo
TABLA 1 ResultadopH yogur sin avena
Dia Repetition 1 Repetici6n 2 Repeticion 3 Repetici6n 4
2 526 501 51 52
7 446 433 438 44
14 439 435 437 436
21 439 437 438 437
TABLA 8 -ResultadopHyogur con avena
Dia Repeticion 1 Repeticion2 Repeticion 3 - Repeticion 4
2 509 523 51 515
7 447 442 445 442
14 436 -438 439 437
21 432 433 435 434
Observando la Figura 9podamos ver que el pH en el -dfado$ para los dos
tratamientos as igual y empieza a descender rapidamente para estabilizarse a
partir del dra 7(Ver figura 9)
49
Figura 9 Comparacj6n de medias para -el pH
Comparaci6n de medias para pH
55 ~ 5 +----=gtIIIi-~i~~----=-r--it~ -- pH sin avena
a 45 1--~~~~=~~ 4 --- pH con
avena35 t-----r-- -------=------=--= ------- - ----
2 7 14 21
Dias
Aplicando la prueba t para comparar las medias de pH I S6 muestia una diferencia
altamants significativa en los dos tratamientos para el dia 21 (pltO05)
(Ver tabla 9)
TABLA 9 Compaiaci6n de medias para pH
DtAS SIN AVENA CON AVENA te p (VALOR)
2 514 514 0 10
7 439 444 -1 61 0159
14 437 I
438 -070 0510
21 438 433 528 00019 shy
- DiFERENCIA AlTAMENTE SIGNIFICATIVA
50
I
AI aplicar regrasi6n a los datos sa obtiene al modelo estimado
pHSinAyena =535606 - 01505650Ia +0005044340IaI2
La variabilidad en la respuesta de pH asta siendo explicada en un 8S7522 por
el modelo (Ver Anexo F)
EI tratamiento con avena mostro el siguiente modelo al analisis de ragresi6n
pHConAvena =534463 ~ 0140407Dia + 0004480980Ia2
La variabilidad an la respuesta de pH asta siendo explicada en un 903315 par
el nlodelo(Ver anexo G)
36 Seguimiento de la acidezmiddotmiddot expresada comomiddot de acido
lactico
A continuaci6n sa muestran las Tablas 10 y 11 donde sa registran los datos
tecopilados de acidezmiddotdurante los dias 27 14 Y 21 para las pebidas taetees con y
sin prebi6tico
TABLA 10 Resuttadode acidez (expresadocomo acido tactico) yogurt sin avena
CIA R~petici6n1 Repeticion2 Repetici6n 3 Repeticion 4
2 054 06 057 058
7 072 074 073 0]2
14 080 083 082 082
21 0]4 079 078 077
51
TABLA 11 Resultado de aCidez (expresado como acido Icktico) yogurt con avena
Dia Repetici6n 1 RepetiCi6n 2 Repetici6n 3 Repetici9n 4
2 059 055 058 057
7 071 073 072 072
14 089 087 088 086
21 092 091 090 091
Observando la Figura 10 se puede concluir que la acidez empieza a aumentar
hasta el dia 14 y luego trata de estabilizarse para los dos tratamientos
(Ver figura 10)
Figura 10 Comparaci6n de medias para la acidez
N G)
Comparacion de medias para acidez
1
2 0I 5 -+--=--------=-~~~= u
ltC
- Acidez sin avena
2 7 14
Dias
52
21
-it- Acidez con avena
Aplicando la prueba t para camparar las madias de acidez se muestra una
diferencia altarnante significativa en los dos tratamiantos para los dias 14 y 21
(pltO05)
(Var tabla 12)
TABLA 12Comparaci6n de medias para Acidez
DIASmiddot SIN AVENA CON AVENA te p(VALOR)
2 0572 0572 0 10
7 0727 0720 119 0278
14 0818 0875 -638 000070shy
21 077 091 -1212 i 0000019 shy
DIFERENCIA AL TAMENTE SlGNIFICATIVA
AI aplicar r~gresi6n a los datos se obtiene el modelo estimado
AcidezSlnAIena = 0491897 + O0436032Dia O00144613DfaA2
La variabilidad en la respuesta de acidez asta siendoexplicada en un 970978
por al modelo (Ver anexo H)
EI tratamiento con avena mostro elsiguiente modeloj a1 analisis de regresion
AcidezConAvena = 0491638 + 00406572Oia - OQOO982559OiaA2
La variabilidad enla respuesta acidez esta siendo explicadaen un 99212 por
el modelo (Ver anexo J)
53
I ~
37 Prueba de viabiJidad
A continuaci6n sa muestran las Tab~as 13 y 14 donde sa presentan los datos
recopilados del recuento de Lactobacilos durante los dias 7 14 Y 21 para las
bebidas lacteas con y sin prebi6tico
TABLA 13 Recuento de Lactobacilos (UFCml) yogurt sin avena
Dia Repetici6n 1 Repetici6n 2 Repeticion 3 Reptttici6n 4
7 1880X10l1 1454X1011 1642X1011 1780X10~
14 1560X10~ 646X1011J 1890X10l 140X10l1
21 1200x10lu 128Ox10u 1745x10J 1520x101V
TABLA 14 Recuento de Lactobacilos (UFCml) yogurt con avena
Dfa Repetieion 1 Repetici6n 2 Repeticion 3 Repeticf6n 4
7 1600X10lt 1240X10t 1640X10ll 1980X10t
14 540X1011 427X10n 546X10n 720X10ll
21 500x1011 492x1011 712)(1011 980x10~
AI analizar la Figura 11 sa puede observar un recuento mayor de Lactobacilos
en al tratamiento con avena resultado de acuerdo a 10 encontrado por Alander at
aI 1999 Kontula et aI 1998 y Jaskari et aI 1998
54
Figura 11 Comparaci6n de medias para Log Lactobacillus
Comparacion de medias para log Lactobacillus
~ 1350
-+- Sac Sin--() 13 co avenaIII
bull 125 -- Bac con 0)
0 12 avenaJ
115 7 14 21
Dias
Aplicando la prueba t para comparar las medias de recuento de Lactobacillus no
se encontr6 una diferenc1a estadfsUcamente significative entre los dos
tratamientos (Ver tabla 15)
Este aumento en al racuento influy6 en la disminuci6n del pH y en el aumento de
fa aeidez por la fermentacion que realizan los Lactobacillus sobre fa lactosa de la
lache y la avena adicionada como prebi6tico
55
1
TABLA 15 Comparaci6n medias lag Lactobacillus
DIAS SIN AVENA CON AVENA tc p(VALOR)
7 122257 122022 04846 06451
14 121065 132393 -19602 00977
21 129025 133087 -08236 04416
At aplicar regresion a los datos se obtiane al modelo astimado
LactobacillusSinAvena= 117347 + 004834640Ia
La variabilidad en la respuesta del recuento de LactobaCillus ssta siendo
explicada en un 260054 por el mod$loVar anexo J)
EI tratamiento con avena mostr6 al siguiente modalo al anal isis de regresion
Lactobacillu$ConAvena =118103 + 007903040Ias
La variabilidad en la respuesta de recuento esta siendo explicada en un 3068
por al modelo(Ver anexo K)~
38 Analisi$ microbiol6gicos de las bebidas lacteas con y sin
En la Tabla 16 estan recopilados los resultados microbiol6gieos obtenidos en ras
muestras con los dos tratamientos (con y sin avena)
I [
sa
TABLA 16 Resultados analisis microbiologico
Recuento de mohos y levaduras Iml lt10
Recuento de Staphylococcus coagulase positiva Iml lt100
NMP coliformes fotales y Escherichia coli Iml lt3
Presencia de Salmonella25ml Ausente
Los resultados de este analisis demuestran que las bebidas fermentadas con y
sin avena~ astan fibres de microorganismos patogenos
57
1
4 CONCLUSIONES
Se aislaron cepas nativas de Lactobacillus plantarum de las muestras vegetates
de repollo pepino repollitas de bruselas fermentadas y Lactobacillus brevis de
lache fermentada y mucosa vaginal humana Ambas cepas resistieran un pH=2 y
una concentraci6n de sales biliares det 03 ptv dos earacteristicas importantes
en los probi6ticos
Lamiddot cepa de Lactobacillus brevis aislada de lache Sa utiliz6 para elaborar una
bebida fermentada sin y con avana comoingrediente prebiotico obteniendose un
aJimento centon recuento del probi6tico viable durante 21 dras de seguimiento
ademas libre de microorganismos )at6gen05
No se encontr6 efecta significativo de la avena sobre Ie viabilidad del Lactobacillus
brevis aunque sa presento un aumento en 61 recuento de estos en la bebida con
avena
58
plusmn ~
5 RECOMENDACIONES
Ensayar la cepa de Lactobacillus plantartJm en productos carnicos madurados
como el salami
Ensayar la cepa de Lactobacillus l)revs en otros derivados lecteos como queso
quesito queso crema
Continuar con el estudio de estos microorganismos y caracterizarlos
molecularmente ademas de estudiar su capacidad de adherencja a fa mucosa
intestinal sobre algunes Hneas celulares como las CaCo~2
Estudiarel efedo de la avena sabre la viabiJidad del Lactobacillus breyis a una
concentraci6n mayor de 05
Realizer ensayos can las cepas de Lactobacillus brevis y Lactobrlcillus pJantarum
para elaborar masas acidas para panificacion reemplazando el Bromato de
Potasio aditivo prohibido desde marzo del 2003 en nuestro pais per 5U toxicidad
59
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65
ANEXOS
66
ANEXO A RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AlSLADA DE i
PEPINO it
Referencia Pepino 1 Fecha 06122002
IEXCELENTE IDENTIFICACION
Latto plantarum 1
Galeria API 50 CHL V50 Leida el 06122002
Perfil - -- - ++ - -- - ++++ - - -+- + - I I I I I I I I +t+ - +f- ~ - - + + ~ - - - +- + - shy
o - GLY - ERY DARA - LARA + RIB + DXYL - LXYL - ADO - MDX - GAL + GLU + FRU + MNE + SBE - RHA - DUL - INO bull MAN + SOR - MDM + MUG shyNAG + AMY + ARB + ESC + SAL + CEL + MAL + LAC + MEL + SAC + TRE + 1NU - MLZ + RAF + AMD - GLYG - XLT - GEN + TIJR + LYX - TAG - DFUC shyLFUC - DARL + LARL - aNT + 2KG - 5KG shy
--- Taxones significativos rd -----T -- Tests en contra
Lactoplantarum 1 999 092 1
Taxon siguiente Lactobrevis 1 OJ 044 3
i i
Lactoplantarum 1 1 test (5) en contra
D-SORBITOL (SOR) 78
Tax6n siguiente Lactobrevis 1 3 test (s) ert contra
METHYLD-MANNOSIDE (MOlM) 0 MELEZITOSE (MLZ) 14 D-TURANOSE (TUR) 14
67
ampb
ANEXO B RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AISLADA DE REPOLLO FERMENTADO
~
Referencia Repollo fermentado - 3 Fecha 03072003
EXCELENTE IDENTIFICACION
Lactoplantarum 1
Galena API 50 CRL V50 Leida el 03072003
Perfil - - ++ - - - - -H++ - - ~ + - + - I I 1 I I I I -H+ - ++ - - - + + - -- - - + - shy
o - GLY - ERY - DARA - LARA + RIB + DXYL - LXYL - ADO ~ MDX - GAL + GLU + FRU + MNE + SBE ~ RHA - DUL - INO - MAN + SOR - MDM + MDG shyNAG + AMY + ARR + ESC + SAT + CRL + MAL + LAC + MEL + SAC + TRE + lNU - MLZ + RAF + AMI) - GLYG - XLT - GEN + TOR + LYX - TAG - DFUC shyLFUC - DARL - LARL - GNT + 2KG - 5KG shy
------Taxones significativos _ _----- Id--- ---T---- Tests en contra
Lactoplantarum 1 999 095 1
Tax6n siguiente Lactobrevis 1 01 OA8 3
lJactoplantaru01 1 1 test (s) en contra
DSORBITOL (SOR) 78
Taxon siguiente Lactobrevis
METHYL-D-MANNOSIDE D-TURANOSE
1
(MOM) (TOR)
3 test (5) en contra
0 MELEZITOSE 14
(MLZ) 14
i
I
68
ANEXO C RESULTADO PRUEBAS BIOQUWICAS DE CEPA AISLADA DE MUCOSA HUMANA
Referenda Mucosa - 5 Fecha 27012003
BUENA IDENTlFICACION
Galeria API 50 CHL vso Leida el 270112003
Perfil - - - - +t--t - - - + - + - - - - - - - - -+- - - - - + - + - - - - - - - - - - - - - bull - - -+ - +
o - GLY ~ ERY - DARA bull LARA + RID + DXYL + LXYL - ADO bull MDX - GAL + OLU - FRU + MNE - SBE - IlliA - DUL - INa - MAN - SOR - MDM - MOO shyNAG + AMY - ARB - ESC ~ SAL bull CEL - MAL + lAC - MEL + SAC - TRE shyINU - MLZ - RAF - AMD - GLYG - XLT - GEN - 11JR - LYX - TAG - DFUC shyLFUC - DARL - IARL - ONT + 2KO - 5KG +
- - - - - - Taxones significativos - - - - - - - Id T -- Test en contra
Lactobrevis 3 963 088 1
Taxon siguiente Lactoco11inoides 36 075 2
Lactobrevis 3 1 test (s) en contra
GLUCOSE (GLU) 95
-~~~------------~---------------------------~--~-------~--~-----~----------~--------~------------~~--Taxon siguiente Lactocollinoides 2 test (s) en contra
GLUCOSE (GLU) 100 MELIBIOSE (MEL) 25
69
i r
ANEXO D RESULTADO PRUEBAS BIOQIJiMICAS DE CEPA AISLADA DE LECHE FERMENTADA
Referenda Leche fennentada ~ 13 Fecha 27012003
BUENA IDENTIFICACI6N
Galeria API 50 CHL V50 Leida el 270112003
Perfil - - - - -t-t+- - - - + - + - - - bull - - - - -+- - - - - + - + - - - - - - - - - - - - - - - - -+ - +
0 - GLY - ERY - DARA - LARA +Rll3 + DXYL + LXYL - ADO - MDX ~GAL + GLU - FRU + MNE SBE - RHA DUL bull INO MAN - SOR MDM bull MDG shy
~NAG + AMY - ARB - ESC - SAL - CEL - MAL + LAC - MEL + SAC - TRE I lNU - MLZ - RAF - AMD - GLYG - XLT - OEN - IUR LYX - TAG - DFUC bull i
LFUC - DARL - LARL -ONr + 2KG - SKO + 1
- -- - - Taxones significativos - - Id -- T --- Test en contra
Lacta brevis 3 963 088 1
Taxon siguiente Lactocollinoides 36 075 2
Lactobrevis 3 1 test (s) en contra
GLUCOSE (GLU) 95
-----------------------------------------------------------~------------------------------~-------------------Taxon siguiente Lactocollinoides 2 test (s) en contra
GLUCOSE (GLD) 100 MELffiIOSE (MEL) 25
70
II iJ1
I
I ANEXO E RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AISLADA DE REPOLLITAS DE BRUSELAS FERMENTADA
Referencia repollitas de bruselas 15 Fecha 03072003
EXCELENTE IDENTIFICACION
Lactoplantarum 1
Galeria API 50 CHL vsO Leida el 03072003
Perfil - - - - +t - - - - +H+ - +- - +t + - I I I I I I I f ++t - + - - - -+ + - - - -+ -+ - - I ij
o - GLY - ERY - DARA - LARA + RJB + DXYL - LXYL - ADO - MDX - GAL +
GLU + FRU + MNE + SBE RHA + DUL - INO - MAN + SOR + MDM + MOG shyNAG + AMY + ARB + ESC + SAL + eEL + MAL + LAC + MEl + SAC + TRE + i
I1NU - MLZ + RAF AMD GLYG - XLT - aEN + TUR + LYX - TAG - Druc LFUC - DARt + LARL - aNT + 2KG - 5KG shy n ----Taxones significativos ------ Id Tests en contra
Lactoplantarum 1 999 090 o
Taxon siguiente Lacto pentosus 01 012 7
Lactoplantarum 1 o test (s) en contra
Taxon siguiente Lacto pentosus 7 test (8) en contra
GLYCEROL (GLY) 75 D-XYLOSE (DXYL) 100 L-RHAMNOSE (RHA) 25 METHYL-D-MANNOSIDE (MOM) 1 MELEZITOSE (MLZ) 25 RAFFINOSE (RAF) 75 D-ARABITOL (DARL) 0
71
~
I i I
ANEXO F - ANALISIS DE REGRESION PARA pH EN BEBIDA SIN AVENA
Aruilisis de regresi6n polinomial
---~-~-------------------------------------------~-----------~~---------------------~--------------Variable dependiente pHSinAvena ---------------------------~-------------~--------------------~---------------------------------
Error T Parametro Estimado Estandar Estadistico P-Valor
CONSTANTE 535606 0094535 56657 00000 Dia -0150565 0020706 727154 00000 Dia2 000504434 0000871488 578819 00001
---~---------------------------------------------------------------------------------------------------
Anfllisis de Variama -------------------------------------------~-----------~-----------------------------~-~--- jSource Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor 11
------------------------~------------------------------------------------------------------------------~ Mod-elo 155772 2 0118861 4256 00000 Residual 0237877 13 00182983
Total (Corr) 11956 IS
R2 == 867522 percent
pHSinAvena == 535606 - 0150565Dia + 000504434Dia2
72
____
middot ANEXO G - ANALISIS DE REGRESION PARA pH EN BEBIDA CON AVENA
AmUisis de regresion polinomial _____~_____~__-_____~___4____________________bull____bull__________bull_____________~~----_------___________
Variable depcndiente pHConA vena ------------------------------------------------------------------------------------------~--------
Error T Parametro Estimado StAndar Estadfstico P-Valor
---------------------------------------------~-----------------------------------------------_---------CONSTANTE 534463 00801045 667208 00000 Dia -0140407 00175453 800253 00000 DiaA 2 000448098 0000738458 606803 00000
----------------------~---~-----------------------------~------------------------------~----AmUisis de Varianza
---~---------------------------------~---------------------~------------~-------------------~------Source Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio PValor --------------------------~-----------------------------------------------~------------~-----~~--~ ModeJo 159575 2 0797873 6073 00000 Residual 02170798 middot13 00131383 _______~_~ ~_~----------~------~--~-----~-M-----~-----____ _____________~-----------------------Total (COlT) 176654 15
R12 903315 percent
-----------~------------------------------------------------------------------------~-----------pHConAvena 534463 - 0140407Dia + 000448098DfaA 2
73
ANEXO H - ANALTSIS DE REGRESTON PARA ACIDEZ EN BEBJDA SIN AVENA
An8Jisis de Regtesi6fi P6lifJomial
Variable Depefidiefile~ AcidezSinAVenll _______________w_____~______~________________~-----------_________~_________________~~____~___~_____
Error T Pariirnetro Estimado Estandar Estadistico ---------------------------------------~--------------~-~-------~--------------------~------------CONSTANT 0491697 00123217 399051 00000 Dia 00436032 000269882 161564 00000 D1a2 -000144613 000011359 127312 00000 __w___~________________________~-_______-_____~----____________________________~__~---~_--__~___
AriiiJisis de varianza ~_~__~__________~_~____~________~___________- _________e_____________________________bull _____-________
Source Smn de cuadr Df Mean Square F-Ratio PmiddotValor_~~___________________________________bull ______~___________bull ____________bull ______~________w________________
Model 0135203 2 00676013 21747 00000 Residual 000404118 13 000031086
Total (Corr) 0139244 15
R2 970978 percent
AcidezSlnAvena 0491697 + O0436032Dia - 0OOl44613Dia2
74
I
ANEXO I ANALISIS DE REGRESION PARA ACIDEZ EN BEBIDA CON AVENA
1
Anwisis de tegtesi6fi polinomial
Variable dependiente Acidez Con Avena
Error T ParametTo Estimado Stlindar Estadfstico P-Valor ----------------~-------~---------------------~-----------------------------------------------------CONSTANT 0491639 000926607 530578 00000 Diamiddot 00406572 000202955 200326 00000 DfaA 2 0000982559 0000085421 -115025 00000
-------------~----------------------------~-------------------------~-----------------------------------
-------------~-----~~-----------------------------~---------------------------------------------_--Source Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio PValor
-~-------------~----------------------------------~------------------~~-------------------------- Modelo 0288008 2 0144004 81914 00000 Residual 000228539 13 0000175799
----------~~--------------~---------------------------------------------~---------------------------Total (Corr) 0290294 15
RA2 = 992127 percent
-------------------------~----~---~------------~---------------------------------~---------------~
AcidezConAvena == 049163amp + 00406572D1a - 0000982559DiaA2
75
I
(Ilmiddot il
ANEXO J- ANALISIS DE REGRESION PARA RECUENTO LACTOBACILOS PARA BEBIDA SIN AVENA
Amilisis de regresion - Modelo lineal Y = a + bX
------------------------~----------------------~-----------------------------~----------~-----------Variable Dcpendiente LactobacilJusSinAvena Variable independiente Dia
I--------~----------~-----------------------------------~-------~-~--~--------------------------~-Error T
Paramctro Estimado Standard Stadistico P-Valor
----~----~------------~-----~-----------------------~-------------~-----------------------------Intereepto 117347 0389973 300911 00000 Pendiente 00483464 00257889 18747 00903
Analisis de Varianza
---------~------------------~----------------~---------------------------------~---------~----------Source Sum decuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor
------------~---------------------~---------------------~--------------------------------~-----~----Modelo 0916252 1 244835 443 00616 Residual 260706 10 0260706
--~------------~---~------------------~~~-----~-------~---------~~-------------------------------------Total (Corr)352332 11
Coeficiente Correlaci6n = 0509955 R2 = 260054 percent
LactobacillusSinAvena= 117347 + 00483464Dfa
76
ANEXO K- ANALTSIS DE REGRESION PARA RECUENTO LACTOBACILOS PARA DEBIDA CON AVENA
Aruilisis de regresion - Modelo lineal Y = a + hX
Variable Dependiente LactobacillusConAvena Variable Independiente Dia ---~--------------------------------------------------------__-----------__--_--_-----------shy
Error T Paramctro Estimado Standard Estadistico P-Valor -~--------------------------------------------------------------------------------------------------
Irttercepto 118103 0567963 207942 00000 Pendiente 00790304 00375594 210414 00616
-----------------~----------------------------~----~-------~----~----------------------------
Analisis de Varianza
----------------~----------------~------------------~--------------------------~------~--------shySource Swn de cuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor
-----------------~--~--------------------------------------------------------------------------~---~ Mode10 244835 1 244835 443 00616 Residual 552997 10 0552997
Total (Corr)797832 11
Coeficiente Correlacion = 0553964 RI2 = 306875 percent
-----~--------------------------------------------------------~--------------------------------------
LactobacillusConAvena = 118103 + 00790304Dfas
77
TABLA 2 Fuente de aislarniento de cepas nativas
CEPA FUENTE
1 Pepino fermentadQ
2 repollitas de bruselas fermentadas
3 Repolltgt fermentado
4 Repollo fermentado
5 Mucosa va~inal humana
6 Mucosa vaginal humana
7 repollitas de bruselas fermentadas
8 Repollo fermentado
9 repollitas de bruselas fermentadas
10 Mueo~a vaginal humana
11 Repollo fermentado
12 RepolJo fermentado
13 Leche fermentada
14 Mucosa vaginal humana
15 repollitas de bruselas fermentadas
16 Repollb fermentado
29
222 Almacenamiento de las cepas aisladas
Cuando las cepas crecieron en agar MRS homogEmeas en color morfologia
coloraci6n de Gram etc se pssaron a agar inclinado en tuba se cubrieron con
aceite mineral y se guardaran en refrigeraci6n a 4deg C para tomar de alii la cepa y
efectuarle las diferentes pruebas para confirmar el genera y determinar la especie
de cada una de eas (Ver Figura 2)
Figura 2 Cepas en tubos con agar inclinado
30
223 Pruebas para determinar et genero
2231 Coforaci6n de Gram
A cada cepa sospechosa de Lactobacilos se 1e hizo la coloraci6n de gram y se
seleccionaron las gram positivas
2232 Morfologfa
En agar MRS y despues de incubar en anaerobios~s crecian colonias grandes
cremosas de color beige con bordes homogeneos y c6ncavas(Ver Figura 3)
Figura 3 Colonias aisladas en agar MRS
31
2233 Prueba de esporulaci6n
A cada cepa aislada se Ie hizo esta prueba la cuel consistia en incubar en
aerobiosis durante ocho dias las cajas de agar MRS donde crecieron colonias de
Lactobacilo$ y luego se les (ealize) coloraci6n de espora Las capas que dieron
negativa a la prueba de espora se considararort sospechosas de sar Lactobacilos
y se continuo con la prueba de la catalasa (Ver Tabla 3)
2234 Prueba de la catalasa
los lactobacilos carecen de catalasa Eata prueba se hizo tomando una colonis
se deposito en vidrio de reloj y se Ie adicion6 dos gotas de peroxida de hidr6geno
(H202) la que no presentaba efervescencie eran cepe sospechosa de ser
Lactobacilo (Ver Tabla 4
Sa seleccionaron las capas euyo resultado fue aeorde con el genera Lactobacilfu$
y se continuo con la comirmaeion del genera y determinacion de la eSpecie
meqiante las pruebas bioqulmicas
32
224 Prueba para determlnar la especie
Para confirmar el genero y determinar la especie de las diferentes capas aisladas
se hizo una caracterizaci6n bioqufmica utilizando un kit de API 50 CHL Medium
Ref 50 410 que contiene una galed8 de medios que permite realizar el estudio
de fermentaci6n de los 49 azucares de 52 especies de Lactobacillus (Ver Figura 4
y tabla 5)
Figura 4 API CHL 50-Prueba bioquimica
33
225 Pruebas para determinar microorganismos probi6ticos
2251 Resistencia a pH=2 y sales biliares de concentraci6n O3pv
A las cepas idantificades como Lactobacillus brevis y Lactobacillus pantarum sa
las realiz6 Ie prueba dfl resistencia a pH=2 y sales biliares de concentraci6n 03
pv ( Jacobsen et al 1999) Una colonia de cada cepe aislada se inocul6 en 4 mt
de caldo MRS durante cinco dras bajo condiciones de anaerobiosis Oespues de
esta tiempo se dejaron pracipltar los microorganismos por sedimentaci6n se Ie
retire el sobrenadante y al precipitado se Ie adicion6 Sml de caldo MRS
previamente ajustado a pH=2 can seido clorhfdrico (HCI) dentro del mismo tuba de
ensayo G igual sa hizo can otro tubo previamente incubado pero a este se Ie
adiciono 5ml de caldo MRS con sales biliares a una concentra~i6n de 03 plv y
ambos se incuberon a 37deg C por 2 haras Sa midio 01 mi de cada uno de los
tubas al tiempo 0 y a las 2 horas y sa inoculeron en superficie en caJas de petri
con agar MRS S9 incubaron a 37deg C bajo anaerobiosis durante 48 horas Se
compararon visualrrente en cada caja de petri el crecimiento en superficie y las
que presentaron crecimiento en tos dos tiempos (0 y 2 horas) tanto en at media
acido como en sales I se consideraron resistentes a pH=2 y sales biliares (03
pv)
(Ver Tabla 6)
34
226 Conservacion
Todas fas capas que habian dado positiva Jas pruebas anteriores y que reaultaron
resistentes a pH=2 y sales biliares 03 pv y despues de identificadas en API 50
CHL sa repicaron en agar MRS en tuba inclinado y despues de Incubar a 37deg C
por 48 horas bajo anaerobiosis se Ctlbrie el biser completamente can aceite
mineral esteril y sa guardaron en refrigeraci6n
227 Elaboracj6n de fa bebida fermentada
2271 Preparaci6n de la mue$tra
Sa tome 1 mt de caldo MRS previamante inoculado e incubado que presentaba
una concentracion de Lactobacillus brevis de 27x108 Iml segun la escaJa de Mac
Farlan y sa adiciono a 9ml de leche pasteurizada en un tubo sa dej6 incubanda
en anaerobiosis por 48 hores Luego se pasaron estos 10 ml a un frasco qua
cont~nie 90 ml de leche pasterizada y se dej6 incubando par 48 haras en
anaerobiosis
35
2272 Adici6n del inOculo
A 900ml de leche pasteurizada se Ie adicion61os 100 ml de leche que habia sido
previamente ino(ulada dos veces con la cepa posteriormente se deja
fermantando la lache a temperatura de 37deg C
2273 Control de Ja fermentaci6n
Las muestras se hicieron por cuadruplicado y se les hizo un seguimiento de
aoidez hasta un valor entre 04 y 05 expresada como Bcido lactico esta
procedimiento corresponde a la babida fermentada sin prebi6tico La bebida ~on
prebi6tico tiene al mismo proeedirnianto pero adicionalmente se agrag6 avena a
una concentraci6n de 05 en el momento de la adici6n del in6e410 a los 900 ml
de leehe pasteurlzada y el procedimiento sigui6 igual al de la bebida sin prebi6tico
tambien se hizo por cuadruplicado
2274 Refrigeracl6n
Despues que las mezclas con y sin prebiotico alcanzaron el de acidez
requarido se IIeva ron a refrigeraci6n a una temperatura de 4deg C p~r 24 horas
para frenar proce~os metab6licos de los microorganisrtlos Despues de este
ti~mpo se procedi6 al batido
36
1 2275 Batido
Con un agitador se procedi6 a batir las bebidas para romper et coagulo formado
y de esta manera homogeneizar la mazela y obtener asf la bebida fermentada
2276 Envasado y almacenamiento
Ambas bebidas se envasaron en frascos vidrio para hacerles seguimiento de pH
acidez(expresado como acido tacticol y recuento de Lactobacillus breviSf los
dies 27 14 Y 21 despues de elaboradas las bebidas perfodo durante el cualta
muestra permanecfa afmacenada a temperatura de refrigeracion(Ver Figura 5
37
Fjgura 5 Diagrama de Flujo
PREPARACION DE LA MUESTRA
ADICION DEL INOCULO
~_____~_B~ATIDO~______~
INCUBACION 37deg C hasta acidez = 04-05 acido laotico
ENFRIAMIENTO
hasta 4 0 C ~------~ ~------~
ENVASADO Y ALMACENAMJENTO
dUrante 21 dfas a Temperatura 4 0 C
38
1
228 Determinaci6n del pH
Se determino por el metoda potenciometrico en un pH-metro manual durante los
dias 2) 7 14 Y 21 de las bebidas lacteas sin y con prebi6tica (Ver Tablas 7 y 8)
229 Oeterminaci6n de la acidez (Expresadfl como acido
lactica)
Se tomaron 9 mJ de las bebida~ sa Ie adicionaron 2 gotas de fanoftaleina como
indicador y sa titulo fa acidez con NaOH 01 N hasta la aparicion de un cotor rosado
debit EI volumen de NaOH utilizado se reporta como valor de de acidez
(VerTablas 10 y 11)
2210 Prueba de viabilidad
Qurante el perfoda de almacenamiento de la bebida lactea se procedi6 a hacer la
prueba de viabiHdad en los dias 7 14 Y 21 para determinar Si los lactobacilfus
permanecfan vivOs a una concentraci6n minima de 106 hasta el dia 21 como 10
establece eJ Articulo 10 de la Rasolucion 2310 del Ministerio de $alud de
Colombja
39
Para asta prueba se tamaron 10 rnl de muestra y se adicionaron a 90 ml de caldo
MRS ruego a partir de esta se hicieron diluciones de 10-2 hasta 10-11 de las
diluciones 109101deg 10-11 se inocul6 1 ml de cada uno en agar MRS siguiendo el
metodo de siembra en profundidad y por duplicado e incubando a 370 C x 5 dras
en anaerobiosis y luego se hicieron tos recuentos por duplicado para esi reportar
los recuentos promedio (Ver Tablas 13 y 14)
2211 AniUisls microbiol6glco de las bebidas Iicteas(con y sin
avena)
Con el fin de determinar las condiciones higienico-sanitarias del producto se
realizaron las pruebas microbiol6gicas de Recuento de mohos y fevadurasml en
agar OGY Recuento en superficia de Staphylococcus coagulasa positivoml en
agar Baird Parker Numero Mas Probable (NMP) de coUfor-mes totales y
Escherichia coliml en caldo Fluorocult y Presencia de Salmonela25ml con BHI
caldo tetrationato y agar Hecktoen (Montoya 1999)
(Var tabla 16)
2212 AnaUsis estadistico
A los datos obtenidos en la medici6n de pH acidez (expresada como Beido
laclico) en los dras 2714 Y 21 y el recuento de Lactobacillus en los dras 714 y21
40
realizados a los dos tratamlentos se tes aplic6 1a prueba t porque solo difieren
en la presencia 0 ausencia del prebi6tico para evaluar si habra diferencia
estadfsticamente significativa para los dos tratamientbs(Ver Tablas9 12 y 15)
41
3 RESULTADOS Y DISCUSION
31 Coloraci6n de Gram y morfologfa
Las cepas aisladas fesultaron Gram positivas (Ver Figura 6) colonias grandes
cremosas dE) color beige con bordes homogeneos y c6ncavos en su
morfologia (Ver Figura 3) resultando de acuerdo a 10 especificado en Stanley
1989 para Lactobacillus
32 Prueba de esporulaci6n y cataJasa
Los resultados de la pruebas de esporulaci6n y catalasa indicados en las
Tablas 3 y 4 respeclivamente dieron conforme a 10 especificado en Stanley
1989 para Lactobacillus
42
1
2 3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
TABLA 3 Resultado de prueba de esporuJaci6n
CEPA RESULfADO ESPORULACION
-- -------------
43
l i ~II bull ~ I I
TABLA 4 Resultado prueba de la catalasa
CEPA RESULTADO CATALASA
1 -2 -3 -4 -5 -6 -7 8 -9 -10 -11 12 -13 -14 -15 -16
3~3 Prueba para determinar la especie
Oespues de hacer las pruebas para seleccionar las cepas sospechosas de ser
Lactobacillus se realizo las pruebas bioquimicas fograndose identificar
Lactobacillus plantarum aislctdo de pepino repollo y repollitas de bruselas
44
fermentados y Lactobacillus brevis de mucosa vaginal y leche fermentada (Ver
Anexos del A al E y Tabla 5)
TABLA 5 Resultado identlficaci6n cepa~
CEPA NOMBRE
1 Lactobacillus planfarum
3 Lactobacillus plantarum
5 Lactobacillus brevis
13 Lactobacillus brevis
15 Lactobacillus plantarum
34 Pruebas para determinar microorganismos probi6ticos
las cepas de Lactobacillus brevis y Lactobacillus plantarum mostraron
rasistencia al medio acido de pH =2 Y sales biliares 03 pv resultado similar al
encontrado por Jacobsen et al 1999 para Lactobacillus plantarum (Ver tabla 6)
45
middot
~~~ttiI lltlmiddot~COX~dtJ ~xtc_~ 2 tr~ k-JlL~middot
-)~~TO DE lJIBUOTECUl rjRL]OTtCA twn GO1IU1
TABLA 6 Resultados a pruebas de resistencia a pH=2 y sales biliares 03 plv
CEPA RESISTENCIA pH=2 RESISTENCfA A SALES BIUARES ()3 pv
1 + +
2 + +
3 + +
4 + +
5 +
6 + +
7 + +
8 + +
9 + +
10 + +
11 + +
12 + +
13 + +
14 +1shy +M
15 + +
16 + +
+1 crecimiento debil
+ crecimiento abundante
46
Figura 6 Lactobacillus brevis Gram + aislado de leche fermentada
Ai observar en placa las celulas de lactobacilos despues de real1zar las pruebas
de resistenCia a la acidez y sales biliares se observo una tendencia a aglomerarse
posiblemente como un mecanismo de proteccion cOlitra estos medios que pueden
lIegar a ser adversos para elias (Ver figuras 7 y 8)
47
Figura 7 Lactobacillus brevis aislada de leche fermentada despu~s de la prueba de resistencia a pH=2
Figura 8 Lactobacillus brevis aislada de leche fermentada despues de la prueba de resistencie asales biUares 03 plv
fI
48
35 --Seguimiento del-pH-en-la-bebidaJacteacon y sin -prebi6tico
A continuacion se muestran las Tablas 7 y 8 donde sa registian los datos
recopilados de pHdurante 10$ dras Z 7 14 Y21 para las bebidas laaeas con ysin
prebi6tioo
TABLA 1 ResultadopH yogur sin avena
Dia Repetition 1 Repetici6n 2 Repeticion 3 Repetici6n 4
2 526 501 51 52
7 446 433 438 44
14 439 435 437 436
21 439 437 438 437
TABLA 8 -ResultadopHyogur con avena
Dia Repeticion 1 Repeticion2 Repeticion 3 - Repeticion 4
2 509 523 51 515
7 447 442 445 442
14 436 -438 439 437
21 432 433 435 434
Observando la Figura 9podamos ver que el pH en el -dfado$ para los dos
tratamientos as igual y empieza a descender rapidamente para estabilizarse a
partir del dra 7(Ver figura 9)
49
Figura 9 Comparacj6n de medias para -el pH
Comparaci6n de medias para pH
55 ~ 5 +----=gtIIIi-~i~~----=-r--it~ -- pH sin avena
a 45 1--~~~~=~~ 4 --- pH con
avena35 t-----r-- -------=------=--= ------- - ----
2 7 14 21
Dias
Aplicando la prueba t para comparar las medias de pH I S6 muestia una diferencia
altamants significativa en los dos tratamientos para el dia 21 (pltO05)
(Ver tabla 9)
TABLA 9 Compaiaci6n de medias para pH
DtAS SIN AVENA CON AVENA te p (VALOR)
2 514 514 0 10
7 439 444 -1 61 0159
14 437 I
438 -070 0510
21 438 433 528 00019 shy
- DiFERENCIA AlTAMENTE SIGNIFICATIVA
50
I
AI aplicar regrasi6n a los datos sa obtiene al modelo estimado
pHSinAyena =535606 - 01505650Ia +0005044340IaI2
La variabilidad en la respuesta de pH asta siendo explicada en un 8S7522 por
el modelo (Ver Anexo F)
EI tratamiento con avena mostro el siguiente modelo al analisis de ragresi6n
pHConAvena =534463 ~ 0140407Dia + 0004480980Ia2
La variabilidad an la respuesta de pH asta siendo explicada en un 903315 par
el nlodelo(Ver anexo G)
36 Seguimiento de la acidezmiddotmiddot expresada comomiddot de acido
lactico
A continuaci6n sa muestran las Tablas 10 y 11 donde sa registran los datos
tecopilados de acidezmiddotdurante los dias 27 14 Y 21 para las pebidas taetees con y
sin prebi6tico
TABLA 10 Resuttadode acidez (expresadocomo acido tactico) yogurt sin avena
CIA R~petici6n1 Repeticion2 Repetici6n 3 Repeticion 4
2 054 06 057 058
7 072 074 073 0]2
14 080 083 082 082
21 0]4 079 078 077
51
TABLA 11 Resultado de aCidez (expresado como acido Icktico) yogurt con avena
Dia Repetici6n 1 RepetiCi6n 2 Repetici6n 3 Repetici9n 4
2 059 055 058 057
7 071 073 072 072
14 089 087 088 086
21 092 091 090 091
Observando la Figura 10 se puede concluir que la acidez empieza a aumentar
hasta el dia 14 y luego trata de estabilizarse para los dos tratamientos
(Ver figura 10)
Figura 10 Comparaci6n de medias para la acidez
N G)
Comparacion de medias para acidez
1
2 0I 5 -+--=--------=-~~~= u
ltC
- Acidez sin avena
2 7 14
Dias
52
21
-it- Acidez con avena
Aplicando la prueba t para camparar las madias de acidez se muestra una
diferencia altarnante significativa en los dos tratamiantos para los dias 14 y 21
(pltO05)
(Var tabla 12)
TABLA 12Comparaci6n de medias para Acidez
DIASmiddot SIN AVENA CON AVENA te p(VALOR)
2 0572 0572 0 10
7 0727 0720 119 0278
14 0818 0875 -638 000070shy
21 077 091 -1212 i 0000019 shy
DIFERENCIA AL TAMENTE SlGNIFICATIVA
AI aplicar r~gresi6n a los datos se obtiene el modelo estimado
AcidezSlnAIena = 0491897 + O0436032Dia O00144613DfaA2
La variabilidad en la respuesta de acidez asta siendoexplicada en un 970978
por al modelo (Ver anexo H)
EI tratamiento con avena mostro elsiguiente modeloj a1 analisis de regresion
AcidezConAvena = 0491638 + 00406572Oia - OQOO982559OiaA2
La variabilidad enla respuesta acidez esta siendo explicadaen un 99212 por
el modelo (Ver anexo J)
53
I ~
37 Prueba de viabiJidad
A continuaci6n sa muestran las Tab~as 13 y 14 donde sa presentan los datos
recopilados del recuento de Lactobacilos durante los dias 7 14 Y 21 para las
bebidas lacteas con y sin prebi6tico
TABLA 13 Recuento de Lactobacilos (UFCml) yogurt sin avena
Dia Repetici6n 1 Repetici6n 2 Repeticion 3 Reptttici6n 4
7 1880X10l1 1454X1011 1642X1011 1780X10~
14 1560X10~ 646X1011J 1890X10l 140X10l1
21 1200x10lu 128Ox10u 1745x10J 1520x101V
TABLA 14 Recuento de Lactobacilos (UFCml) yogurt con avena
Dfa Repetieion 1 Repetici6n 2 Repeticion 3 Repeticf6n 4
7 1600X10lt 1240X10t 1640X10ll 1980X10t
14 540X1011 427X10n 546X10n 720X10ll
21 500x1011 492x1011 712)(1011 980x10~
AI analizar la Figura 11 sa puede observar un recuento mayor de Lactobacilos
en al tratamiento con avena resultado de acuerdo a 10 encontrado por Alander at
aI 1999 Kontula et aI 1998 y Jaskari et aI 1998
54
Figura 11 Comparaci6n de medias para Log Lactobacillus
Comparacion de medias para log Lactobacillus
~ 1350
-+- Sac Sin--() 13 co avenaIII
bull 125 -- Bac con 0)
0 12 avenaJ
115 7 14 21
Dias
Aplicando la prueba t para comparar las medias de recuento de Lactobacillus no
se encontr6 una diferenc1a estadfsUcamente significative entre los dos
tratamientos (Ver tabla 15)
Este aumento en al racuento influy6 en la disminuci6n del pH y en el aumento de
fa aeidez por la fermentacion que realizan los Lactobacillus sobre fa lactosa de la
lache y la avena adicionada como prebi6tico
55
1
TABLA 15 Comparaci6n medias lag Lactobacillus
DIAS SIN AVENA CON AVENA tc p(VALOR)
7 122257 122022 04846 06451
14 121065 132393 -19602 00977
21 129025 133087 -08236 04416
At aplicar regresion a los datos se obtiane al modelo astimado
LactobacillusSinAvena= 117347 + 004834640Ia
La variabilidad en la respuesta del recuento de LactobaCillus ssta siendo
explicada en un 260054 por el mod$loVar anexo J)
EI tratamiento con avena mostr6 al siguiente modalo al anal isis de regresion
Lactobacillu$ConAvena =118103 + 007903040Ias
La variabilidad en la respuesta de recuento esta siendo explicada en un 3068
por al modelo(Ver anexo K)~
38 Analisi$ microbiol6gicos de las bebidas lacteas con y sin
En la Tabla 16 estan recopilados los resultados microbiol6gieos obtenidos en ras
muestras con los dos tratamientos (con y sin avena)
I [
sa
TABLA 16 Resultados analisis microbiologico
Recuento de mohos y levaduras Iml lt10
Recuento de Staphylococcus coagulase positiva Iml lt100
NMP coliformes fotales y Escherichia coli Iml lt3
Presencia de Salmonella25ml Ausente
Los resultados de este analisis demuestran que las bebidas fermentadas con y
sin avena~ astan fibres de microorganismos patogenos
57
1
4 CONCLUSIONES
Se aislaron cepas nativas de Lactobacillus plantarum de las muestras vegetates
de repollo pepino repollitas de bruselas fermentadas y Lactobacillus brevis de
lache fermentada y mucosa vaginal humana Ambas cepas resistieran un pH=2 y
una concentraci6n de sales biliares det 03 ptv dos earacteristicas importantes
en los probi6ticos
Lamiddot cepa de Lactobacillus brevis aislada de lache Sa utiliz6 para elaborar una
bebida fermentada sin y con avana comoingrediente prebiotico obteniendose un
aJimento centon recuento del probi6tico viable durante 21 dras de seguimiento
ademas libre de microorganismos )at6gen05
No se encontr6 efecta significativo de la avena sobre Ie viabilidad del Lactobacillus
brevis aunque sa presento un aumento en 61 recuento de estos en la bebida con
avena
58
plusmn ~
5 RECOMENDACIONES
Ensayar la cepa de Lactobacillus plantartJm en productos carnicos madurados
como el salami
Ensayar la cepa de Lactobacillus l)revs en otros derivados lecteos como queso
quesito queso crema
Continuar con el estudio de estos microorganismos y caracterizarlos
molecularmente ademas de estudiar su capacidad de adherencja a fa mucosa
intestinal sobre algunes Hneas celulares como las CaCo~2
Estudiarel efedo de la avena sabre la viabiJidad del Lactobacillus breyis a una
concentraci6n mayor de 05
Realizer ensayos can las cepas de Lactobacillus brevis y Lactobrlcillus pJantarum
para elaborar masas acidas para panificacion reemplazando el Bromato de
Potasio aditivo prohibido desde marzo del 2003 en nuestro pais per 5U toxicidad
59
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ANEXOS
66
ANEXO A RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AlSLADA DE i
PEPINO it
Referencia Pepino 1 Fecha 06122002
IEXCELENTE IDENTIFICACION
Latto plantarum 1
Galeria API 50 CHL V50 Leida el 06122002
Perfil - -- - ++ - -- - ++++ - - -+- + - I I I I I I I I +t+ - +f- ~ - - + + ~ - - - +- + - shy
o - GLY - ERY DARA - LARA + RIB + DXYL - LXYL - ADO - MDX - GAL + GLU + FRU + MNE + SBE - RHA - DUL - INO bull MAN + SOR - MDM + MUG shyNAG + AMY + ARB + ESC + SAL + CEL + MAL + LAC + MEL + SAC + TRE + 1NU - MLZ + RAF + AMD - GLYG - XLT - GEN + TIJR + LYX - TAG - DFUC shyLFUC - DARL + LARL - aNT + 2KG - 5KG shy
--- Taxones significativos rd -----T -- Tests en contra
Lactoplantarum 1 999 092 1
Taxon siguiente Lactobrevis 1 OJ 044 3
i i
Lactoplantarum 1 1 test (5) en contra
D-SORBITOL (SOR) 78
Tax6n siguiente Lactobrevis 1 3 test (s) ert contra
METHYLD-MANNOSIDE (MOlM) 0 MELEZITOSE (MLZ) 14 D-TURANOSE (TUR) 14
67
ampb
ANEXO B RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AISLADA DE REPOLLO FERMENTADO
~
Referencia Repollo fermentado - 3 Fecha 03072003
EXCELENTE IDENTIFICACION
Lactoplantarum 1
Galena API 50 CRL V50 Leida el 03072003
Perfil - - ++ - - - - -H++ - - ~ + - + - I I 1 I I I I -H+ - ++ - - - + + - -- - - + - shy
o - GLY - ERY - DARA - LARA + RIB + DXYL - LXYL - ADO ~ MDX - GAL + GLU + FRU + MNE + SBE ~ RHA - DUL - INO - MAN + SOR - MDM + MDG shyNAG + AMY + ARR + ESC + SAT + CRL + MAL + LAC + MEL + SAC + TRE + lNU - MLZ + RAF + AMI) - GLYG - XLT - GEN + TOR + LYX - TAG - DFUC shyLFUC - DARL - LARL - GNT + 2KG - 5KG shy
------Taxones significativos _ _----- Id--- ---T---- Tests en contra
Lactoplantarum 1 999 095 1
Tax6n siguiente Lactobrevis 1 01 OA8 3
lJactoplantaru01 1 1 test (s) en contra
DSORBITOL (SOR) 78
Taxon siguiente Lactobrevis
METHYL-D-MANNOSIDE D-TURANOSE
1
(MOM) (TOR)
3 test (5) en contra
0 MELEZITOSE 14
(MLZ) 14
i
I
68
ANEXO C RESULTADO PRUEBAS BIOQUWICAS DE CEPA AISLADA DE MUCOSA HUMANA
Referenda Mucosa - 5 Fecha 27012003
BUENA IDENTlFICACION
Galeria API 50 CHL vso Leida el 270112003
Perfil - - - - +t--t - - - + - + - - - - - - - - -+- - - - - + - + - - - - - - - - - - - - - bull - - -+ - +
o - GLY ~ ERY - DARA bull LARA + RID + DXYL + LXYL - ADO bull MDX - GAL + OLU - FRU + MNE - SBE - IlliA - DUL - INa - MAN - SOR - MDM - MOO shyNAG + AMY - ARB - ESC ~ SAL bull CEL - MAL + lAC - MEL + SAC - TRE shyINU - MLZ - RAF - AMD - GLYG - XLT - GEN - 11JR - LYX - TAG - DFUC shyLFUC - DARL - IARL - ONT + 2KO - 5KG +
- - - - - - Taxones significativos - - - - - - - Id T -- Test en contra
Lactobrevis 3 963 088 1
Taxon siguiente Lactoco11inoides 36 075 2
Lactobrevis 3 1 test (s) en contra
GLUCOSE (GLU) 95
-~~~------------~---------------------------~--~-------~--~-----~----------~--------~------------~~--Taxon siguiente Lactocollinoides 2 test (s) en contra
GLUCOSE (GLU) 100 MELIBIOSE (MEL) 25
69
i r
ANEXO D RESULTADO PRUEBAS BIOQIJiMICAS DE CEPA AISLADA DE LECHE FERMENTADA
Referenda Leche fennentada ~ 13 Fecha 27012003
BUENA IDENTIFICACI6N
Galeria API 50 CHL V50 Leida el 270112003
Perfil - - - - -t-t+- - - - + - + - - - bull - - - - -+- - - - - + - + - - - - - - - - - - - - - - - - -+ - +
0 - GLY - ERY - DARA - LARA +Rll3 + DXYL + LXYL - ADO - MDX ~GAL + GLU - FRU + MNE SBE - RHA DUL bull INO MAN - SOR MDM bull MDG shy
~NAG + AMY - ARB - ESC - SAL - CEL - MAL + LAC - MEL + SAC - TRE I lNU - MLZ - RAF - AMD - GLYG - XLT - OEN - IUR LYX - TAG - DFUC bull i
LFUC - DARL - LARL -ONr + 2KG - SKO + 1
- -- - - Taxones significativos - - Id -- T --- Test en contra
Lacta brevis 3 963 088 1
Taxon siguiente Lactocollinoides 36 075 2
Lactobrevis 3 1 test (s) en contra
GLUCOSE (GLU) 95
-----------------------------------------------------------~------------------------------~-------------------Taxon siguiente Lactocollinoides 2 test (s) en contra
GLUCOSE (GLD) 100 MELffiIOSE (MEL) 25
70
II iJ1
I
I ANEXO E RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AISLADA DE REPOLLITAS DE BRUSELAS FERMENTADA
Referencia repollitas de bruselas 15 Fecha 03072003
EXCELENTE IDENTIFICACION
Lactoplantarum 1
Galeria API 50 CHL vsO Leida el 03072003
Perfil - - - - +t - - - - +H+ - +- - +t + - I I I I I I I f ++t - + - - - -+ + - - - -+ -+ - - I ij
o - GLY - ERY - DARA - LARA + RJB + DXYL - LXYL - ADO - MDX - GAL +
GLU + FRU + MNE + SBE RHA + DUL - INO - MAN + SOR + MDM + MOG shyNAG + AMY + ARB + ESC + SAL + eEL + MAL + LAC + MEl + SAC + TRE + i
I1NU - MLZ + RAF AMD GLYG - XLT - aEN + TUR + LYX - TAG - Druc LFUC - DARt + LARL - aNT + 2KG - 5KG shy n ----Taxones significativos ------ Id Tests en contra
Lactoplantarum 1 999 090 o
Taxon siguiente Lacto pentosus 01 012 7
Lactoplantarum 1 o test (s) en contra
Taxon siguiente Lacto pentosus 7 test (8) en contra
GLYCEROL (GLY) 75 D-XYLOSE (DXYL) 100 L-RHAMNOSE (RHA) 25 METHYL-D-MANNOSIDE (MOM) 1 MELEZITOSE (MLZ) 25 RAFFINOSE (RAF) 75 D-ARABITOL (DARL) 0
71
~
I i I
ANEXO F - ANALISIS DE REGRESION PARA pH EN BEBIDA SIN AVENA
Aruilisis de regresi6n polinomial
---~-~-------------------------------------------~-----------~~---------------------~--------------Variable dependiente pHSinAvena ---------------------------~-------------~--------------------~---------------------------------
Error T Parametro Estimado Estandar Estadistico P-Valor
CONSTANTE 535606 0094535 56657 00000 Dia -0150565 0020706 727154 00000 Dia2 000504434 0000871488 578819 00001
---~---------------------------------------------------------------------------------------------------
Anfllisis de Variama -------------------------------------------~-----------~-----------------------------~-~--- jSource Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor 11
------------------------~------------------------------------------------------------------------------~ Mod-elo 155772 2 0118861 4256 00000 Residual 0237877 13 00182983
Total (Corr) 11956 IS
R2 == 867522 percent
pHSinAvena == 535606 - 0150565Dia + 000504434Dia2
72
____
middot ANEXO G - ANALISIS DE REGRESION PARA pH EN BEBIDA CON AVENA
AmUisis de regresion polinomial _____~_____~__-_____~___4____________________bull____bull__________bull_____________~~----_------___________
Variable depcndiente pHConA vena ------------------------------------------------------------------------------------------~--------
Error T Parametro Estimado StAndar Estadfstico P-Valor
---------------------------------------------~-----------------------------------------------_---------CONSTANTE 534463 00801045 667208 00000 Dia -0140407 00175453 800253 00000 DiaA 2 000448098 0000738458 606803 00000
----------------------~---~-----------------------------~------------------------------~----AmUisis de Varianza
---~---------------------------------~---------------------~------------~-------------------~------Source Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio PValor --------------------------~-----------------------------------------------~------------~-----~~--~ ModeJo 159575 2 0797873 6073 00000 Residual 02170798 middot13 00131383 _______~_~ ~_~----------~------~--~-----~-M-----~-----____ _____________~-----------------------Total (COlT) 176654 15
R12 903315 percent
-----------~------------------------------------------------------------------------~-----------pHConAvena 534463 - 0140407Dia + 000448098DfaA 2
73
ANEXO H - ANALTSIS DE REGRESTON PARA ACIDEZ EN BEBJDA SIN AVENA
An8Jisis de Regtesi6fi P6lifJomial
Variable Depefidiefile~ AcidezSinAVenll _______________w_____~______~________________~-----------_________~_________________~~____~___~_____
Error T Pariirnetro Estimado Estandar Estadistico ---------------------------------------~--------------~-~-------~--------------------~------------CONSTANT 0491697 00123217 399051 00000 Dia 00436032 000269882 161564 00000 D1a2 -000144613 000011359 127312 00000 __w___~________________________~-_______-_____~----____________________________~__~---~_--__~___
AriiiJisis de varianza ~_~__~__________~_~____~________~___________- _________e_____________________________bull _____-________
Source Smn de cuadr Df Mean Square F-Ratio PmiddotValor_~~___________________________________bull ______~___________bull ____________bull ______~________w________________
Model 0135203 2 00676013 21747 00000 Residual 000404118 13 000031086
Total (Corr) 0139244 15
R2 970978 percent
AcidezSlnAvena 0491697 + O0436032Dia - 0OOl44613Dia2
74
I
ANEXO I ANALISIS DE REGRESION PARA ACIDEZ EN BEBIDA CON AVENA
1
Anwisis de tegtesi6fi polinomial
Variable dependiente Acidez Con Avena
Error T ParametTo Estimado Stlindar Estadfstico P-Valor ----------------~-------~---------------------~-----------------------------------------------------CONSTANT 0491639 000926607 530578 00000 Diamiddot 00406572 000202955 200326 00000 DfaA 2 0000982559 0000085421 -115025 00000
-------------~----------------------------~-------------------------~-----------------------------------
-------------~-----~~-----------------------------~---------------------------------------------_--Source Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio PValor
-~-------------~----------------------------------~------------------~~-------------------------- Modelo 0288008 2 0144004 81914 00000 Residual 000228539 13 0000175799
----------~~--------------~---------------------------------------------~---------------------------Total (Corr) 0290294 15
RA2 = 992127 percent
-------------------------~----~---~------------~---------------------------------~---------------~
AcidezConAvena == 049163amp + 00406572D1a - 0000982559DiaA2
75
I
(Ilmiddot il
ANEXO J- ANALISIS DE REGRESION PARA RECUENTO LACTOBACILOS PARA BEBIDA SIN AVENA
Amilisis de regresion - Modelo lineal Y = a + bX
------------------------~----------------------~-----------------------------~----------~-----------Variable Dcpendiente LactobacilJusSinAvena Variable independiente Dia
I--------~----------~-----------------------------------~-------~-~--~--------------------------~-Error T
Paramctro Estimado Standard Stadistico P-Valor
----~----~------------~-----~-----------------------~-------------~-----------------------------Intereepto 117347 0389973 300911 00000 Pendiente 00483464 00257889 18747 00903
Analisis de Varianza
---------~------------------~----------------~---------------------------------~---------~----------Source Sum decuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor
------------~---------------------~---------------------~--------------------------------~-----~----Modelo 0916252 1 244835 443 00616 Residual 260706 10 0260706
--~------------~---~------------------~~~-----~-------~---------~~-------------------------------------Total (Corr)352332 11
Coeficiente Correlaci6n = 0509955 R2 = 260054 percent
LactobacillusSinAvena= 117347 + 00483464Dfa
76
ANEXO K- ANALTSIS DE REGRESION PARA RECUENTO LACTOBACILOS PARA DEBIDA CON AVENA
Aruilisis de regresion - Modelo lineal Y = a + hX
Variable Dependiente LactobacillusConAvena Variable Independiente Dia ---~--------------------------------------------------------__-----------__--_--_-----------shy
Error T Paramctro Estimado Standard Estadistico P-Valor -~--------------------------------------------------------------------------------------------------
Irttercepto 118103 0567963 207942 00000 Pendiente 00790304 00375594 210414 00616
-----------------~----------------------------~----~-------~----~----------------------------
Analisis de Varianza
----------------~----------------~------------------~--------------------------~------~--------shySource Swn de cuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor
-----------------~--~--------------------------------------------------------------------------~---~ Mode10 244835 1 244835 443 00616 Residual 552997 10 0552997
Total (Corr)797832 11
Coeficiente Correlacion = 0553964 RI2 = 306875 percent
-----~--------------------------------------------------------~--------------------------------------
LactobacillusConAvena = 118103 + 00790304Dfas
77
222 Almacenamiento de las cepas aisladas
Cuando las cepas crecieron en agar MRS homogEmeas en color morfologia
coloraci6n de Gram etc se pssaron a agar inclinado en tuba se cubrieron con
aceite mineral y se guardaran en refrigeraci6n a 4deg C para tomar de alii la cepa y
efectuarle las diferentes pruebas para confirmar el genera y determinar la especie
de cada una de eas (Ver Figura 2)
Figura 2 Cepas en tubos con agar inclinado
30
223 Pruebas para determinar et genero
2231 Coforaci6n de Gram
A cada cepa sospechosa de Lactobacilos se 1e hizo la coloraci6n de gram y se
seleccionaron las gram positivas
2232 Morfologfa
En agar MRS y despues de incubar en anaerobios~s crecian colonias grandes
cremosas de color beige con bordes homogeneos y c6ncavas(Ver Figura 3)
Figura 3 Colonias aisladas en agar MRS
31
2233 Prueba de esporulaci6n
A cada cepa aislada se Ie hizo esta prueba la cuel consistia en incubar en
aerobiosis durante ocho dias las cajas de agar MRS donde crecieron colonias de
Lactobacilo$ y luego se les (ealize) coloraci6n de espora Las capas que dieron
negativa a la prueba de espora se considararort sospechosas de sar Lactobacilos
y se continuo con la prueba de la catalasa (Ver Tabla 3)
2234 Prueba de la catalasa
los lactobacilos carecen de catalasa Eata prueba se hizo tomando una colonis
se deposito en vidrio de reloj y se Ie adicion6 dos gotas de peroxida de hidr6geno
(H202) la que no presentaba efervescencie eran cepe sospechosa de ser
Lactobacilo (Ver Tabla 4
Sa seleccionaron las capas euyo resultado fue aeorde con el genera Lactobacilfu$
y se continuo con la comirmaeion del genera y determinacion de la eSpecie
meqiante las pruebas bioqulmicas
32
224 Prueba para determlnar la especie
Para confirmar el genero y determinar la especie de las diferentes capas aisladas
se hizo una caracterizaci6n bioqufmica utilizando un kit de API 50 CHL Medium
Ref 50 410 que contiene una galed8 de medios que permite realizar el estudio
de fermentaci6n de los 49 azucares de 52 especies de Lactobacillus (Ver Figura 4
y tabla 5)
Figura 4 API CHL 50-Prueba bioquimica
33
225 Pruebas para determinar microorganismos probi6ticos
2251 Resistencia a pH=2 y sales biliares de concentraci6n O3pv
A las cepas idantificades como Lactobacillus brevis y Lactobacillus pantarum sa
las realiz6 Ie prueba dfl resistencia a pH=2 y sales biliares de concentraci6n 03
pv ( Jacobsen et al 1999) Una colonia de cada cepe aislada se inocul6 en 4 mt
de caldo MRS durante cinco dras bajo condiciones de anaerobiosis Oespues de
esta tiempo se dejaron pracipltar los microorganismos por sedimentaci6n se Ie
retire el sobrenadante y al precipitado se Ie adicion6 Sml de caldo MRS
previamente ajustado a pH=2 can seido clorhfdrico (HCI) dentro del mismo tuba de
ensayo G igual sa hizo can otro tubo previamente incubado pero a este se Ie
adiciono 5ml de caldo MRS con sales biliares a una concentra~i6n de 03 plv y
ambos se incuberon a 37deg C por 2 haras Sa midio 01 mi de cada uno de los
tubas al tiempo 0 y a las 2 horas y sa inoculeron en superficie en caJas de petri
con agar MRS S9 incubaron a 37deg C bajo anaerobiosis durante 48 horas Se
compararon visualrrente en cada caja de petri el crecimiento en superficie y las
que presentaron crecimiento en tos dos tiempos (0 y 2 horas) tanto en at media
acido como en sales I se consideraron resistentes a pH=2 y sales biliares (03
pv)
(Ver Tabla 6)
34
226 Conservacion
Todas fas capas que habian dado positiva Jas pruebas anteriores y que reaultaron
resistentes a pH=2 y sales biliares 03 pv y despues de identificadas en API 50
CHL sa repicaron en agar MRS en tuba inclinado y despues de Incubar a 37deg C
por 48 horas bajo anaerobiosis se Ctlbrie el biser completamente can aceite
mineral esteril y sa guardaron en refrigeraci6n
227 Elaboracj6n de fa bebida fermentada
2271 Preparaci6n de la mue$tra
Sa tome 1 mt de caldo MRS previamante inoculado e incubado que presentaba
una concentracion de Lactobacillus brevis de 27x108 Iml segun la escaJa de Mac
Farlan y sa adiciono a 9ml de leche pasteurizada en un tubo sa dej6 incubanda
en anaerobiosis por 48 hores Luego se pasaron estos 10 ml a un frasco qua
cont~nie 90 ml de leche pasterizada y se dej6 incubando par 48 haras en
anaerobiosis
35
2272 Adici6n del inOculo
A 900ml de leche pasteurizada se Ie adicion61os 100 ml de leche que habia sido
previamente ino(ulada dos veces con la cepa posteriormente se deja
fermantando la lache a temperatura de 37deg C
2273 Control de Ja fermentaci6n
Las muestras se hicieron por cuadruplicado y se les hizo un seguimiento de
aoidez hasta un valor entre 04 y 05 expresada como Bcido lactico esta
procedimiento corresponde a la babida fermentada sin prebi6tico La bebida ~on
prebi6tico tiene al mismo proeedirnianto pero adicionalmente se agrag6 avena a
una concentraci6n de 05 en el momento de la adici6n del in6e410 a los 900 ml
de leehe pasteurlzada y el procedimiento sigui6 igual al de la bebida sin prebi6tico
tambien se hizo por cuadruplicado
2274 Refrigeracl6n
Despues que las mezclas con y sin prebiotico alcanzaron el de acidez
requarido se IIeva ron a refrigeraci6n a una temperatura de 4deg C p~r 24 horas
para frenar proce~os metab6licos de los microorganisrtlos Despues de este
ti~mpo se procedi6 al batido
36
1 2275 Batido
Con un agitador se procedi6 a batir las bebidas para romper et coagulo formado
y de esta manera homogeneizar la mazela y obtener asf la bebida fermentada
2276 Envasado y almacenamiento
Ambas bebidas se envasaron en frascos vidrio para hacerles seguimiento de pH
acidez(expresado como acido tacticol y recuento de Lactobacillus breviSf los
dies 27 14 Y 21 despues de elaboradas las bebidas perfodo durante el cualta
muestra permanecfa afmacenada a temperatura de refrigeracion(Ver Figura 5
37
Fjgura 5 Diagrama de Flujo
PREPARACION DE LA MUESTRA
ADICION DEL INOCULO
~_____~_B~ATIDO~______~
INCUBACION 37deg C hasta acidez = 04-05 acido laotico
ENFRIAMIENTO
hasta 4 0 C ~------~ ~------~
ENVASADO Y ALMACENAMJENTO
dUrante 21 dfas a Temperatura 4 0 C
38
1
228 Determinaci6n del pH
Se determino por el metoda potenciometrico en un pH-metro manual durante los
dias 2) 7 14 Y 21 de las bebidas lacteas sin y con prebi6tica (Ver Tablas 7 y 8)
229 Oeterminaci6n de la acidez (Expresadfl como acido
lactica)
Se tomaron 9 mJ de las bebida~ sa Ie adicionaron 2 gotas de fanoftaleina como
indicador y sa titulo fa acidez con NaOH 01 N hasta la aparicion de un cotor rosado
debit EI volumen de NaOH utilizado se reporta como valor de de acidez
(VerTablas 10 y 11)
2210 Prueba de viabilidad
Qurante el perfoda de almacenamiento de la bebida lactea se procedi6 a hacer la
prueba de viabiHdad en los dias 7 14 Y 21 para determinar Si los lactobacilfus
permanecfan vivOs a una concentraci6n minima de 106 hasta el dia 21 como 10
establece eJ Articulo 10 de la Rasolucion 2310 del Ministerio de $alud de
Colombja
39
Para asta prueba se tamaron 10 rnl de muestra y se adicionaron a 90 ml de caldo
MRS ruego a partir de esta se hicieron diluciones de 10-2 hasta 10-11 de las
diluciones 109101deg 10-11 se inocul6 1 ml de cada uno en agar MRS siguiendo el
metodo de siembra en profundidad y por duplicado e incubando a 370 C x 5 dras
en anaerobiosis y luego se hicieron tos recuentos por duplicado para esi reportar
los recuentos promedio (Ver Tablas 13 y 14)
2211 AniUisls microbiol6glco de las bebidas Iicteas(con y sin
avena)
Con el fin de determinar las condiciones higienico-sanitarias del producto se
realizaron las pruebas microbiol6gicas de Recuento de mohos y fevadurasml en
agar OGY Recuento en superficia de Staphylococcus coagulasa positivoml en
agar Baird Parker Numero Mas Probable (NMP) de coUfor-mes totales y
Escherichia coliml en caldo Fluorocult y Presencia de Salmonela25ml con BHI
caldo tetrationato y agar Hecktoen (Montoya 1999)
(Var tabla 16)
2212 AnaUsis estadistico
A los datos obtenidos en la medici6n de pH acidez (expresada como Beido
laclico) en los dras 2714 Y 21 y el recuento de Lactobacillus en los dras 714 y21
40
realizados a los dos tratamlentos se tes aplic6 1a prueba t porque solo difieren
en la presencia 0 ausencia del prebi6tico para evaluar si habra diferencia
estadfsticamente significativa para los dos tratamientbs(Ver Tablas9 12 y 15)
41
3 RESULTADOS Y DISCUSION
31 Coloraci6n de Gram y morfologfa
Las cepas aisladas fesultaron Gram positivas (Ver Figura 6) colonias grandes
cremosas dE) color beige con bordes homogeneos y c6ncavos en su
morfologia (Ver Figura 3) resultando de acuerdo a 10 especificado en Stanley
1989 para Lactobacillus
32 Prueba de esporulaci6n y cataJasa
Los resultados de la pruebas de esporulaci6n y catalasa indicados en las
Tablas 3 y 4 respeclivamente dieron conforme a 10 especificado en Stanley
1989 para Lactobacillus
42
1
2 3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
TABLA 3 Resultado de prueba de esporuJaci6n
CEPA RESULfADO ESPORULACION
-- -------------
43
l i ~II bull ~ I I
TABLA 4 Resultado prueba de la catalasa
CEPA RESULTADO CATALASA
1 -2 -3 -4 -5 -6 -7 8 -9 -10 -11 12 -13 -14 -15 -16
3~3 Prueba para determinar la especie
Oespues de hacer las pruebas para seleccionar las cepas sospechosas de ser
Lactobacillus se realizo las pruebas bioquimicas fograndose identificar
Lactobacillus plantarum aislctdo de pepino repollo y repollitas de bruselas
44
fermentados y Lactobacillus brevis de mucosa vaginal y leche fermentada (Ver
Anexos del A al E y Tabla 5)
TABLA 5 Resultado identlficaci6n cepa~
CEPA NOMBRE
1 Lactobacillus planfarum
3 Lactobacillus plantarum
5 Lactobacillus brevis
13 Lactobacillus brevis
15 Lactobacillus plantarum
34 Pruebas para determinar microorganismos probi6ticos
las cepas de Lactobacillus brevis y Lactobacillus plantarum mostraron
rasistencia al medio acido de pH =2 Y sales biliares 03 pv resultado similar al
encontrado por Jacobsen et al 1999 para Lactobacillus plantarum (Ver tabla 6)
45
middot
~~~ttiI lltlmiddot~COX~dtJ ~xtc_~ 2 tr~ k-JlL~middot
-)~~TO DE lJIBUOTECUl rjRL]OTtCA twn GO1IU1
TABLA 6 Resultados a pruebas de resistencia a pH=2 y sales biliares 03 plv
CEPA RESISTENCIA pH=2 RESISTENCfA A SALES BIUARES ()3 pv
1 + +
2 + +
3 + +
4 + +
5 +
6 + +
7 + +
8 + +
9 + +
10 + +
11 + +
12 + +
13 + +
14 +1shy +M
15 + +
16 + +
+1 crecimiento debil
+ crecimiento abundante
46
Figura 6 Lactobacillus brevis Gram + aislado de leche fermentada
Ai observar en placa las celulas de lactobacilos despues de real1zar las pruebas
de resistenCia a la acidez y sales biliares se observo una tendencia a aglomerarse
posiblemente como un mecanismo de proteccion cOlitra estos medios que pueden
lIegar a ser adversos para elias (Ver figuras 7 y 8)
47
Figura 7 Lactobacillus brevis aislada de leche fermentada despu~s de la prueba de resistencia a pH=2
Figura 8 Lactobacillus brevis aislada de leche fermentada despues de la prueba de resistencie asales biUares 03 plv
fI
48
35 --Seguimiento del-pH-en-la-bebidaJacteacon y sin -prebi6tico
A continuacion se muestran las Tablas 7 y 8 donde sa registian los datos
recopilados de pHdurante 10$ dras Z 7 14 Y21 para las bebidas laaeas con ysin
prebi6tioo
TABLA 1 ResultadopH yogur sin avena
Dia Repetition 1 Repetici6n 2 Repeticion 3 Repetici6n 4
2 526 501 51 52
7 446 433 438 44
14 439 435 437 436
21 439 437 438 437
TABLA 8 -ResultadopHyogur con avena
Dia Repeticion 1 Repeticion2 Repeticion 3 - Repeticion 4
2 509 523 51 515
7 447 442 445 442
14 436 -438 439 437
21 432 433 435 434
Observando la Figura 9podamos ver que el pH en el -dfado$ para los dos
tratamientos as igual y empieza a descender rapidamente para estabilizarse a
partir del dra 7(Ver figura 9)
49
Figura 9 Comparacj6n de medias para -el pH
Comparaci6n de medias para pH
55 ~ 5 +----=gtIIIi-~i~~----=-r--it~ -- pH sin avena
a 45 1--~~~~=~~ 4 --- pH con
avena35 t-----r-- -------=------=--= ------- - ----
2 7 14 21
Dias
Aplicando la prueba t para comparar las medias de pH I S6 muestia una diferencia
altamants significativa en los dos tratamientos para el dia 21 (pltO05)
(Ver tabla 9)
TABLA 9 Compaiaci6n de medias para pH
DtAS SIN AVENA CON AVENA te p (VALOR)
2 514 514 0 10
7 439 444 -1 61 0159
14 437 I
438 -070 0510
21 438 433 528 00019 shy
- DiFERENCIA AlTAMENTE SIGNIFICATIVA
50
I
AI aplicar regrasi6n a los datos sa obtiene al modelo estimado
pHSinAyena =535606 - 01505650Ia +0005044340IaI2
La variabilidad en la respuesta de pH asta siendo explicada en un 8S7522 por
el modelo (Ver Anexo F)
EI tratamiento con avena mostro el siguiente modelo al analisis de ragresi6n
pHConAvena =534463 ~ 0140407Dia + 0004480980Ia2
La variabilidad an la respuesta de pH asta siendo explicada en un 903315 par
el nlodelo(Ver anexo G)
36 Seguimiento de la acidezmiddotmiddot expresada comomiddot de acido
lactico
A continuaci6n sa muestran las Tablas 10 y 11 donde sa registran los datos
tecopilados de acidezmiddotdurante los dias 27 14 Y 21 para las pebidas taetees con y
sin prebi6tico
TABLA 10 Resuttadode acidez (expresadocomo acido tactico) yogurt sin avena
CIA R~petici6n1 Repeticion2 Repetici6n 3 Repeticion 4
2 054 06 057 058
7 072 074 073 0]2
14 080 083 082 082
21 0]4 079 078 077
51
TABLA 11 Resultado de aCidez (expresado como acido Icktico) yogurt con avena
Dia Repetici6n 1 RepetiCi6n 2 Repetici6n 3 Repetici9n 4
2 059 055 058 057
7 071 073 072 072
14 089 087 088 086
21 092 091 090 091
Observando la Figura 10 se puede concluir que la acidez empieza a aumentar
hasta el dia 14 y luego trata de estabilizarse para los dos tratamientos
(Ver figura 10)
Figura 10 Comparaci6n de medias para la acidez
N G)
Comparacion de medias para acidez
1
2 0I 5 -+--=--------=-~~~= u
ltC
- Acidez sin avena
2 7 14
Dias
52
21
-it- Acidez con avena
Aplicando la prueba t para camparar las madias de acidez se muestra una
diferencia altarnante significativa en los dos tratamiantos para los dias 14 y 21
(pltO05)
(Var tabla 12)
TABLA 12Comparaci6n de medias para Acidez
DIASmiddot SIN AVENA CON AVENA te p(VALOR)
2 0572 0572 0 10
7 0727 0720 119 0278
14 0818 0875 -638 000070shy
21 077 091 -1212 i 0000019 shy
DIFERENCIA AL TAMENTE SlGNIFICATIVA
AI aplicar r~gresi6n a los datos se obtiene el modelo estimado
AcidezSlnAIena = 0491897 + O0436032Dia O00144613DfaA2
La variabilidad en la respuesta de acidez asta siendoexplicada en un 970978
por al modelo (Ver anexo H)
EI tratamiento con avena mostro elsiguiente modeloj a1 analisis de regresion
AcidezConAvena = 0491638 + 00406572Oia - OQOO982559OiaA2
La variabilidad enla respuesta acidez esta siendo explicadaen un 99212 por
el modelo (Ver anexo J)
53
I ~
37 Prueba de viabiJidad
A continuaci6n sa muestran las Tab~as 13 y 14 donde sa presentan los datos
recopilados del recuento de Lactobacilos durante los dias 7 14 Y 21 para las
bebidas lacteas con y sin prebi6tico
TABLA 13 Recuento de Lactobacilos (UFCml) yogurt sin avena
Dia Repetici6n 1 Repetici6n 2 Repeticion 3 Reptttici6n 4
7 1880X10l1 1454X1011 1642X1011 1780X10~
14 1560X10~ 646X1011J 1890X10l 140X10l1
21 1200x10lu 128Ox10u 1745x10J 1520x101V
TABLA 14 Recuento de Lactobacilos (UFCml) yogurt con avena
Dfa Repetieion 1 Repetici6n 2 Repeticion 3 Repeticf6n 4
7 1600X10lt 1240X10t 1640X10ll 1980X10t
14 540X1011 427X10n 546X10n 720X10ll
21 500x1011 492x1011 712)(1011 980x10~
AI analizar la Figura 11 sa puede observar un recuento mayor de Lactobacilos
en al tratamiento con avena resultado de acuerdo a 10 encontrado por Alander at
aI 1999 Kontula et aI 1998 y Jaskari et aI 1998
54
Figura 11 Comparaci6n de medias para Log Lactobacillus
Comparacion de medias para log Lactobacillus
~ 1350
-+- Sac Sin--() 13 co avenaIII
bull 125 -- Bac con 0)
0 12 avenaJ
115 7 14 21
Dias
Aplicando la prueba t para comparar las medias de recuento de Lactobacillus no
se encontr6 una diferenc1a estadfsUcamente significative entre los dos
tratamientos (Ver tabla 15)
Este aumento en al racuento influy6 en la disminuci6n del pH y en el aumento de
fa aeidez por la fermentacion que realizan los Lactobacillus sobre fa lactosa de la
lache y la avena adicionada como prebi6tico
55
1
TABLA 15 Comparaci6n medias lag Lactobacillus
DIAS SIN AVENA CON AVENA tc p(VALOR)
7 122257 122022 04846 06451
14 121065 132393 -19602 00977
21 129025 133087 -08236 04416
At aplicar regresion a los datos se obtiane al modelo astimado
LactobacillusSinAvena= 117347 + 004834640Ia
La variabilidad en la respuesta del recuento de LactobaCillus ssta siendo
explicada en un 260054 por el mod$loVar anexo J)
EI tratamiento con avena mostr6 al siguiente modalo al anal isis de regresion
Lactobacillu$ConAvena =118103 + 007903040Ias
La variabilidad en la respuesta de recuento esta siendo explicada en un 3068
por al modelo(Ver anexo K)~
38 Analisi$ microbiol6gicos de las bebidas lacteas con y sin
En la Tabla 16 estan recopilados los resultados microbiol6gieos obtenidos en ras
muestras con los dos tratamientos (con y sin avena)
I [
sa
TABLA 16 Resultados analisis microbiologico
Recuento de mohos y levaduras Iml lt10
Recuento de Staphylococcus coagulase positiva Iml lt100
NMP coliformes fotales y Escherichia coli Iml lt3
Presencia de Salmonella25ml Ausente
Los resultados de este analisis demuestran que las bebidas fermentadas con y
sin avena~ astan fibres de microorganismos patogenos
57
1
4 CONCLUSIONES
Se aislaron cepas nativas de Lactobacillus plantarum de las muestras vegetates
de repollo pepino repollitas de bruselas fermentadas y Lactobacillus brevis de
lache fermentada y mucosa vaginal humana Ambas cepas resistieran un pH=2 y
una concentraci6n de sales biliares det 03 ptv dos earacteristicas importantes
en los probi6ticos
Lamiddot cepa de Lactobacillus brevis aislada de lache Sa utiliz6 para elaborar una
bebida fermentada sin y con avana comoingrediente prebiotico obteniendose un
aJimento centon recuento del probi6tico viable durante 21 dras de seguimiento
ademas libre de microorganismos )at6gen05
No se encontr6 efecta significativo de la avena sobre Ie viabilidad del Lactobacillus
brevis aunque sa presento un aumento en 61 recuento de estos en la bebida con
avena
58
plusmn ~
5 RECOMENDACIONES
Ensayar la cepa de Lactobacillus plantartJm en productos carnicos madurados
como el salami
Ensayar la cepa de Lactobacillus l)revs en otros derivados lecteos como queso
quesito queso crema
Continuar con el estudio de estos microorganismos y caracterizarlos
molecularmente ademas de estudiar su capacidad de adherencja a fa mucosa
intestinal sobre algunes Hneas celulares como las CaCo~2
Estudiarel efedo de la avena sabre la viabiJidad del Lactobacillus breyis a una
concentraci6n mayor de 05
Realizer ensayos can las cepas de Lactobacillus brevis y Lactobrlcillus pJantarum
para elaborar masas acidas para panificacion reemplazando el Bromato de
Potasio aditivo prohibido desde marzo del 2003 en nuestro pais per 5U toxicidad
59
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65
ANEXOS
66
ANEXO A RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AlSLADA DE i
PEPINO it
Referencia Pepino 1 Fecha 06122002
IEXCELENTE IDENTIFICACION
Latto plantarum 1
Galeria API 50 CHL V50 Leida el 06122002
Perfil - -- - ++ - -- - ++++ - - -+- + - I I I I I I I I +t+ - +f- ~ - - + + ~ - - - +- + - shy
o - GLY - ERY DARA - LARA + RIB + DXYL - LXYL - ADO - MDX - GAL + GLU + FRU + MNE + SBE - RHA - DUL - INO bull MAN + SOR - MDM + MUG shyNAG + AMY + ARB + ESC + SAL + CEL + MAL + LAC + MEL + SAC + TRE + 1NU - MLZ + RAF + AMD - GLYG - XLT - GEN + TIJR + LYX - TAG - DFUC shyLFUC - DARL + LARL - aNT + 2KG - 5KG shy
--- Taxones significativos rd -----T -- Tests en contra
Lactoplantarum 1 999 092 1
Taxon siguiente Lactobrevis 1 OJ 044 3
i i
Lactoplantarum 1 1 test (5) en contra
D-SORBITOL (SOR) 78
Tax6n siguiente Lactobrevis 1 3 test (s) ert contra
METHYLD-MANNOSIDE (MOlM) 0 MELEZITOSE (MLZ) 14 D-TURANOSE (TUR) 14
67
ampb
ANEXO B RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AISLADA DE REPOLLO FERMENTADO
~
Referencia Repollo fermentado - 3 Fecha 03072003
EXCELENTE IDENTIFICACION
Lactoplantarum 1
Galena API 50 CRL V50 Leida el 03072003
Perfil - - ++ - - - - -H++ - - ~ + - + - I I 1 I I I I -H+ - ++ - - - + + - -- - - + - shy
o - GLY - ERY - DARA - LARA + RIB + DXYL - LXYL - ADO ~ MDX - GAL + GLU + FRU + MNE + SBE ~ RHA - DUL - INO - MAN + SOR - MDM + MDG shyNAG + AMY + ARR + ESC + SAT + CRL + MAL + LAC + MEL + SAC + TRE + lNU - MLZ + RAF + AMI) - GLYG - XLT - GEN + TOR + LYX - TAG - DFUC shyLFUC - DARL - LARL - GNT + 2KG - 5KG shy
------Taxones significativos _ _----- Id--- ---T---- Tests en contra
Lactoplantarum 1 999 095 1
Tax6n siguiente Lactobrevis 1 01 OA8 3
lJactoplantaru01 1 1 test (s) en contra
DSORBITOL (SOR) 78
Taxon siguiente Lactobrevis
METHYL-D-MANNOSIDE D-TURANOSE
1
(MOM) (TOR)
3 test (5) en contra
0 MELEZITOSE 14
(MLZ) 14
i
I
68
ANEXO C RESULTADO PRUEBAS BIOQUWICAS DE CEPA AISLADA DE MUCOSA HUMANA
Referenda Mucosa - 5 Fecha 27012003
BUENA IDENTlFICACION
Galeria API 50 CHL vso Leida el 270112003
Perfil - - - - +t--t - - - + - + - - - - - - - - -+- - - - - + - + - - - - - - - - - - - - - bull - - -+ - +
o - GLY ~ ERY - DARA bull LARA + RID + DXYL + LXYL - ADO bull MDX - GAL + OLU - FRU + MNE - SBE - IlliA - DUL - INa - MAN - SOR - MDM - MOO shyNAG + AMY - ARB - ESC ~ SAL bull CEL - MAL + lAC - MEL + SAC - TRE shyINU - MLZ - RAF - AMD - GLYG - XLT - GEN - 11JR - LYX - TAG - DFUC shyLFUC - DARL - IARL - ONT + 2KO - 5KG +
- - - - - - Taxones significativos - - - - - - - Id T -- Test en contra
Lactobrevis 3 963 088 1
Taxon siguiente Lactoco11inoides 36 075 2
Lactobrevis 3 1 test (s) en contra
GLUCOSE (GLU) 95
-~~~------------~---------------------------~--~-------~--~-----~----------~--------~------------~~--Taxon siguiente Lactocollinoides 2 test (s) en contra
GLUCOSE (GLU) 100 MELIBIOSE (MEL) 25
69
i r
ANEXO D RESULTADO PRUEBAS BIOQIJiMICAS DE CEPA AISLADA DE LECHE FERMENTADA
Referenda Leche fennentada ~ 13 Fecha 27012003
BUENA IDENTIFICACI6N
Galeria API 50 CHL V50 Leida el 270112003
Perfil - - - - -t-t+- - - - + - + - - - bull - - - - -+- - - - - + - + - - - - - - - - - - - - - - - - -+ - +
0 - GLY - ERY - DARA - LARA +Rll3 + DXYL + LXYL - ADO - MDX ~GAL + GLU - FRU + MNE SBE - RHA DUL bull INO MAN - SOR MDM bull MDG shy
~NAG + AMY - ARB - ESC - SAL - CEL - MAL + LAC - MEL + SAC - TRE I lNU - MLZ - RAF - AMD - GLYG - XLT - OEN - IUR LYX - TAG - DFUC bull i
LFUC - DARL - LARL -ONr + 2KG - SKO + 1
- -- - - Taxones significativos - - Id -- T --- Test en contra
Lacta brevis 3 963 088 1
Taxon siguiente Lactocollinoides 36 075 2
Lactobrevis 3 1 test (s) en contra
GLUCOSE (GLU) 95
-----------------------------------------------------------~------------------------------~-------------------Taxon siguiente Lactocollinoides 2 test (s) en contra
GLUCOSE (GLD) 100 MELffiIOSE (MEL) 25
70
II iJ1
I
I ANEXO E RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AISLADA DE REPOLLITAS DE BRUSELAS FERMENTADA
Referencia repollitas de bruselas 15 Fecha 03072003
EXCELENTE IDENTIFICACION
Lactoplantarum 1
Galeria API 50 CHL vsO Leida el 03072003
Perfil - - - - +t - - - - +H+ - +- - +t + - I I I I I I I f ++t - + - - - -+ + - - - -+ -+ - - I ij
o - GLY - ERY - DARA - LARA + RJB + DXYL - LXYL - ADO - MDX - GAL +
GLU + FRU + MNE + SBE RHA + DUL - INO - MAN + SOR + MDM + MOG shyNAG + AMY + ARB + ESC + SAL + eEL + MAL + LAC + MEl + SAC + TRE + i
I1NU - MLZ + RAF AMD GLYG - XLT - aEN + TUR + LYX - TAG - Druc LFUC - DARt + LARL - aNT + 2KG - 5KG shy n ----Taxones significativos ------ Id Tests en contra
Lactoplantarum 1 999 090 o
Taxon siguiente Lacto pentosus 01 012 7
Lactoplantarum 1 o test (s) en contra
Taxon siguiente Lacto pentosus 7 test (8) en contra
GLYCEROL (GLY) 75 D-XYLOSE (DXYL) 100 L-RHAMNOSE (RHA) 25 METHYL-D-MANNOSIDE (MOM) 1 MELEZITOSE (MLZ) 25 RAFFINOSE (RAF) 75 D-ARABITOL (DARL) 0
71
~
I i I
ANEXO F - ANALISIS DE REGRESION PARA pH EN BEBIDA SIN AVENA
Aruilisis de regresi6n polinomial
---~-~-------------------------------------------~-----------~~---------------------~--------------Variable dependiente pHSinAvena ---------------------------~-------------~--------------------~---------------------------------
Error T Parametro Estimado Estandar Estadistico P-Valor
CONSTANTE 535606 0094535 56657 00000 Dia -0150565 0020706 727154 00000 Dia2 000504434 0000871488 578819 00001
---~---------------------------------------------------------------------------------------------------
Anfllisis de Variama -------------------------------------------~-----------~-----------------------------~-~--- jSource Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor 11
------------------------~------------------------------------------------------------------------------~ Mod-elo 155772 2 0118861 4256 00000 Residual 0237877 13 00182983
Total (Corr) 11956 IS
R2 == 867522 percent
pHSinAvena == 535606 - 0150565Dia + 000504434Dia2
72
____
middot ANEXO G - ANALISIS DE REGRESION PARA pH EN BEBIDA CON AVENA
AmUisis de regresion polinomial _____~_____~__-_____~___4____________________bull____bull__________bull_____________~~----_------___________
Variable depcndiente pHConA vena ------------------------------------------------------------------------------------------~--------
Error T Parametro Estimado StAndar Estadfstico P-Valor
---------------------------------------------~-----------------------------------------------_---------CONSTANTE 534463 00801045 667208 00000 Dia -0140407 00175453 800253 00000 DiaA 2 000448098 0000738458 606803 00000
----------------------~---~-----------------------------~------------------------------~----AmUisis de Varianza
---~---------------------------------~---------------------~------------~-------------------~------Source Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio PValor --------------------------~-----------------------------------------------~------------~-----~~--~ ModeJo 159575 2 0797873 6073 00000 Residual 02170798 middot13 00131383 _______~_~ ~_~----------~------~--~-----~-M-----~-----____ _____________~-----------------------Total (COlT) 176654 15
R12 903315 percent
-----------~------------------------------------------------------------------------~-----------pHConAvena 534463 - 0140407Dia + 000448098DfaA 2
73
ANEXO H - ANALTSIS DE REGRESTON PARA ACIDEZ EN BEBJDA SIN AVENA
An8Jisis de Regtesi6fi P6lifJomial
Variable Depefidiefile~ AcidezSinAVenll _______________w_____~______~________________~-----------_________~_________________~~____~___~_____
Error T Pariirnetro Estimado Estandar Estadistico ---------------------------------------~--------------~-~-------~--------------------~------------CONSTANT 0491697 00123217 399051 00000 Dia 00436032 000269882 161564 00000 D1a2 -000144613 000011359 127312 00000 __w___~________________________~-_______-_____~----____________________________~__~---~_--__~___
AriiiJisis de varianza ~_~__~__________~_~____~________~___________- _________e_____________________________bull _____-________
Source Smn de cuadr Df Mean Square F-Ratio PmiddotValor_~~___________________________________bull ______~___________bull ____________bull ______~________w________________
Model 0135203 2 00676013 21747 00000 Residual 000404118 13 000031086
Total (Corr) 0139244 15
R2 970978 percent
AcidezSlnAvena 0491697 + O0436032Dia - 0OOl44613Dia2
74
I
ANEXO I ANALISIS DE REGRESION PARA ACIDEZ EN BEBIDA CON AVENA
1
Anwisis de tegtesi6fi polinomial
Variable dependiente Acidez Con Avena
Error T ParametTo Estimado Stlindar Estadfstico P-Valor ----------------~-------~---------------------~-----------------------------------------------------CONSTANT 0491639 000926607 530578 00000 Diamiddot 00406572 000202955 200326 00000 DfaA 2 0000982559 0000085421 -115025 00000
-------------~----------------------------~-------------------------~-----------------------------------
-------------~-----~~-----------------------------~---------------------------------------------_--Source Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio PValor
-~-------------~----------------------------------~------------------~~-------------------------- Modelo 0288008 2 0144004 81914 00000 Residual 000228539 13 0000175799
----------~~--------------~---------------------------------------------~---------------------------Total (Corr) 0290294 15
RA2 = 992127 percent
-------------------------~----~---~------------~---------------------------------~---------------~
AcidezConAvena == 049163amp + 00406572D1a - 0000982559DiaA2
75
I
(Ilmiddot il
ANEXO J- ANALISIS DE REGRESION PARA RECUENTO LACTOBACILOS PARA BEBIDA SIN AVENA
Amilisis de regresion - Modelo lineal Y = a + bX
------------------------~----------------------~-----------------------------~----------~-----------Variable Dcpendiente LactobacilJusSinAvena Variable independiente Dia
I--------~----------~-----------------------------------~-------~-~--~--------------------------~-Error T
Paramctro Estimado Standard Stadistico P-Valor
----~----~------------~-----~-----------------------~-------------~-----------------------------Intereepto 117347 0389973 300911 00000 Pendiente 00483464 00257889 18747 00903
Analisis de Varianza
---------~------------------~----------------~---------------------------------~---------~----------Source Sum decuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor
------------~---------------------~---------------------~--------------------------------~-----~----Modelo 0916252 1 244835 443 00616 Residual 260706 10 0260706
--~------------~---~------------------~~~-----~-------~---------~~-------------------------------------Total (Corr)352332 11
Coeficiente Correlaci6n = 0509955 R2 = 260054 percent
LactobacillusSinAvena= 117347 + 00483464Dfa
76
ANEXO K- ANALTSIS DE REGRESION PARA RECUENTO LACTOBACILOS PARA DEBIDA CON AVENA
Aruilisis de regresion - Modelo lineal Y = a + hX
Variable Dependiente LactobacillusConAvena Variable Independiente Dia ---~--------------------------------------------------------__-----------__--_--_-----------shy
Error T Paramctro Estimado Standard Estadistico P-Valor -~--------------------------------------------------------------------------------------------------
Irttercepto 118103 0567963 207942 00000 Pendiente 00790304 00375594 210414 00616
-----------------~----------------------------~----~-------~----~----------------------------
Analisis de Varianza
----------------~----------------~------------------~--------------------------~------~--------shySource Swn de cuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor
-----------------~--~--------------------------------------------------------------------------~---~ Mode10 244835 1 244835 443 00616 Residual 552997 10 0552997
Total (Corr)797832 11
Coeficiente Correlacion = 0553964 RI2 = 306875 percent
-----~--------------------------------------------------------~--------------------------------------
LactobacillusConAvena = 118103 + 00790304Dfas
77
223 Pruebas para determinar et genero
2231 Coforaci6n de Gram
A cada cepa sospechosa de Lactobacilos se 1e hizo la coloraci6n de gram y se
seleccionaron las gram positivas
2232 Morfologfa
En agar MRS y despues de incubar en anaerobios~s crecian colonias grandes
cremosas de color beige con bordes homogeneos y c6ncavas(Ver Figura 3)
Figura 3 Colonias aisladas en agar MRS
31
2233 Prueba de esporulaci6n
A cada cepa aislada se Ie hizo esta prueba la cuel consistia en incubar en
aerobiosis durante ocho dias las cajas de agar MRS donde crecieron colonias de
Lactobacilo$ y luego se les (ealize) coloraci6n de espora Las capas que dieron
negativa a la prueba de espora se considararort sospechosas de sar Lactobacilos
y se continuo con la prueba de la catalasa (Ver Tabla 3)
2234 Prueba de la catalasa
los lactobacilos carecen de catalasa Eata prueba se hizo tomando una colonis
se deposito en vidrio de reloj y se Ie adicion6 dos gotas de peroxida de hidr6geno
(H202) la que no presentaba efervescencie eran cepe sospechosa de ser
Lactobacilo (Ver Tabla 4
Sa seleccionaron las capas euyo resultado fue aeorde con el genera Lactobacilfu$
y se continuo con la comirmaeion del genera y determinacion de la eSpecie
meqiante las pruebas bioqulmicas
32
224 Prueba para determlnar la especie
Para confirmar el genero y determinar la especie de las diferentes capas aisladas
se hizo una caracterizaci6n bioqufmica utilizando un kit de API 50 CHL Medium
Ref 50 410 que contiene una galed8 de medios que permite realizar el estudio
de fermentaci6n de los 49 azucares de 52 especies de Lactobacillus (Ver Figura 4
y tabla 5)
Figura 4 API CHL 50-Prueba bioquimica
33
225 Pruebas para determinar microorganismos probi6ticos
2251 Resistencia a pH=2 y sales biliares de concentraci6n O3pv
A las cepas idantificades como Lactobacillus brevis y Lactobacillus pantarum sa
las realiz6 Ie prueba dfl resistencia a pH=2 y sales biliares de concentraci6n 03
pv ( Jacobsen et al 1999) Una colonia de cada cepe aislada se inocul6 en 4 mt
de caldo MRS durante cinco dras bajo condiciones de anaerobiosis Oespues de
esta tiempo se dejaron pracipltar los microorganismos por sedimentaci6n se Ie
retire el sobrenadante y al precipitado se Ie adicion6 Sml de caldo MRS
previamente ajustado a pH=2 can seido clorhfdrico (HCI) dentro del mismo tuba de
ensayo G igual sa hizo can otro tubo previamente incubado pero a este se Ie
adiciono 5ml de caldo MRS con sales biliares a una concentra~i6n de 03 plv y
ambos se incuberon a 37deg C por 2 haras Sa midio 01 mi de cada uno de los
tubas al tiempo 0 y a las 2 horas y sa inoculeron en superficie en caJas de petri
con agar MRS S9 incubaron a 37deg C bajo anaerobiosis durante 48 horas Se
compararon visualrrente en cada caja de petri el crecimiento en superficie y las
que presentaron crecimiento en tos dos tiempos (0 y 2 horas) tanto en at media
acido como en sales I se consideraron resistentes a pH=2 y sales biliares (03
pv)
(Ver Tabla 6)
34
226 Conservacion
Todas fas capas que habian dado positiva Jas pruebas anteriores y que reaultaron
resistentes a pH=2 y sales biliares 03 pv y despues de identificadas en API 50
CHL sa repicaron en agar MRS en tuba inclinado y despues de Incubar a 37deg C
por 48 horas bajo anaerobiosis se Ctlbrie el biser completamente can aceite
mineral esteril y sa guardaron en refrigeraci6n
227 Elaboracj6n de fa bebida fermentada
2271 Preparaci6n de la mue$tra
Sa tome 1 mt de caldo MRS previamante inoculado e incubado que presentaba
una concentracion de Lactobacillus brevis de 27x108 Iml segun la escaJa de Mac
Farlan y sa adiciono a 9ml de leche pasteurizada en un tubo sa dej6 incubanda
en anaerobiosis por 48 hores Luego se pasaron estos 10 ml a un frasco qua
cont~nie 90 ml de leche pasterizada y se dej6 incubando par 48 haras en
anaerobiosis
35
2272 Adici6n del inOculo
A 900ml de leche pasteurizada se Ie adicion61os 100 ml de leche que habia sido
previamente ino(ulada dos veces con la cepa posteriormente se deja
fermantando la lache a temperatura de 37deg C
2273 Control de Ja fermentaci6n
Las muestras se hicieron por cuadruplicado y se les hizo un seguimiento de
aoidez hasta un valor entre 04 y 05 expresada como Bcido lactico esta
procedimiento corresponde a la babida fermentada sin prebi6tico La bebida ~on
prebi6tico tiene al mismo proeedirnianto pero adicionalmente se agrag6 avena a
una concentraci6n de 05 en el momento de la adici6n del in6e410 a los 900 ml
de leehe pasteurlzada y el procedimiento sigui6 igual al de la bebida sin prebi6tico
tambien se hizo por cuadruplicado
2274 Refrigeracl6n
Despues que las mezclas con y sin prebiotico alcanzaron el de acidez
requarido se IIeva ron a refrigeraci6n a una temperatura de 4deg C p~r 24 horas
para frenar proce~os metab6licos de los microorganisrtlos Despues de este
ti~mpo se procedi6 al batido
36
1 2275 Batido
Con un agitador se procedi6 a batir las bebidas para romper et coagulo formado
y de esta manera homogeneizar la mazela y obtener asf la bebida fermentada
2276 Envasado y almacenamiento
Ambas bebidas se envasaron en frascos vidrio para hacerles seguimiento de pH
acidez(expresado como acido tacticol y recuento de Lactobacillus breviSf los
dies 27 14 Y 21 despues de elaboradas las bebidas perfodo durante el cualta
muestra permanecfa afmacenada a temperatura de refrigeracion(Ver Figura 5
37
Fjgura 5 Diagrama de Flujo
PREPARACION DE LA MUESTRA
ADICION DEL INOCULO
~_____~_B~ATIDO~______~
INCUBACION 37deg C hasta acidez = 04-05 acido laotico
ENFRIAMIENTO
hasta 4 0 C ~------~ ~------~
ENVASADO Y ALMACENAMJENTO
dUrante 21 dfas a Temperatura 4 0 C
38
1
228 Determinaci6n del pH
Se determino por el metoda potenciometrico en un pH-metro manual durante los
dias 2) 7 14 Y 21 de las bebidas lacteas sin y con prebi6tica (Ver Tablas 7 y 8)
229 Oeterminaci6n de la acidez (Expresadfl como acido
lactica)
Se tomaron 9 mJ de las bebida~ sa Ie adicionaron 2 gotas de fanoftaleina como
indicador y sa titulo fa acidez con NaOH 01 N hasta la aparicion de un cotor rosado
debit EI volumen de NaOH utilizado se reporta como valor de de acidez
(VerTablas 10 y 11)
2210 Prueba de viabilidad
Qurante el perfoda de almacenamiento de la bebida lactea se procedi6 a hacer la
prueba de viabiHdad en los dias 7 14 Y 21 para determinar Si los lactobacilfus
permanecfan vivOs a una concentraci6n minima de 106 hasta el dia 21 como 10
establece eJ Articulo 10 de la Rasolucion 2310 del Ministerio de $alud de
Colombja
39
Para asta prueba se tamaron 10 rnl de muestra y se adicionaron a 90 ml de caldo
MRS ruego a partir de esta se hicieron diluciones de 10-2 hasta 10-11 de las
diluciones 109101deg 10-11 se inocul6 1 ml de cada uno en agar MRS siguiendo el
metodo de siembra en profundidad y por duplicado e incubando a 370 C x 5 dras
en anaerobiosis y luego se hicieron tos recuentos por duplicado para esi reportar
los recuentos promedio (Ver Tablas 13 y 14)
2211 AniUisls microbiol6glco de las bebidas Iicteas(con y sin
avena)
Con el fin de determinar las condiciones higienico-sanitarias del producto se
realizaron las pruebas microbiol6gicas de Recuento de mohos y fevadurasml en
agar OGY Recuento en superficia de Staphylococcus coagulasa positivoml en
agar Baird Parker Numero Mas Probable (NMP) de coUfor-mes totales y
Escherichia coliml en caldo Fluorocult y Presencia de Salmonela25ml con BHI
caldo tetrationato y agar Hecktoen (Montoya 1999)
(Var tabla 16)
2212 AnaUsis estadistico
A los datos obtenidos en la medici6n de pH acidez (expresada como Beido
laclico) en los dras 2714 Y 21 y el recuento de Lactobacillus en los dras 714 y21
40
realizados a los dos tratamlentos se tes aplic6 1a prueba t porque solo difieren
en la presencia 0 ausencia del prebi6tico para evaluar si habra diferencia
estadfsticamente significativa para los dos tratamientbs(Ver Tablas9 12 y 15)
41
3 RESULTADOS Y DISCUSION
31 Coloraci6n de Gram y morfologfa
Las cepas aisladas fesultaron Gram positivas (Ver Figura 6) colonias grandes
cremosas dE) color beige con bordes homogeneos y c6ncavos en su
morfologia (Ver Figura 3) resultando de acuerdo a 10 especificado en Stanley
1989 para Lactobacillus
32 Prueba de esporulaci6n y cataJasa
Los resultados de la pruebas de esporulaci6n y catalasa indicados en las
Tablas 3 y 4 respeclivamente dieron conforme a 10 especificado en Stanley
1989 para Lactobacillus
42
1
2 3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
TABLA 3 Resultado de prueba de esporuJaci6n
CEPA RESULfADO ESPORULACION
-- -------------
43
l i ~II bull ~ I I
TABLA 4 Resultado prueba de la catalasa
CEPA RESULTADO CATALASA
1 -2 -3 -4 -5 -6 -7 8 -9 -10 -11 12 -13 -14 -15 -16
3~3 Prueba para determinar la especie
Oespues de hacer las pruebas para seleccionar las cepas sospechosas de ser
Lactobacillus se realizo las pruebas bioquimicas fograndose identificar
Lactobacillus plantarum aislctdo de pepino repollo y repollitas de bruselas
44
fermentados y Lactobacillus brevis de mucosa vaginal y leche fermentada (Ver
Anexos del A al E y Tabla 5)
TABLA 5 Resultado identlficaci6n cepa~
CEPA NOMBRE
1 Lactobacillus planfarum
3 Lactobacillus plantarum
5 Lactobacillus brevis
13 Lactobacillus brevis
15 Lactobacillus plantarum
34 Pruebas para determinar microorganismos probi6ticos
las cepas de Lactobacillus brevis y Lactobacillus plantarum mostraron
rasistencia al medio acido de pH =2 Y sales biliares 03 pv resultado similar al
encontrado por Jacobsen et al 1999 para Lactobacillus plantarum (Ver tabla 6)
45
middot
~~~ttiI lltlmiddot~COX~dtJ ~xtc_~ 2 tr~ k-JlL~middot
-)~~TO DE lJIBUOTECUl rjRL]OTtCA twn GO1IU1
TABLA 6 Resultados a pruebas de resistencia a pH=2 y sales biliares 03 plv
CEPA RESISTENCIA pH=2 RESISTENCfA A SALES BIUARES ()3 pv
1 + +
2 + +
3 + +
4 + +
5 +
6 + +
7 + +
8 + +
9 + +
10 + +
11 + +
12 + +
13 + +
14 +1shy +M
15 + +
16 + +
+1 crecimiento debil
+ crecimiento abundante
46
Figura 6 Lactobacillus brevis Gram + aislado de leche fermentada
Ai observar en placa las celulas de lactobacilos despues de real1zar las pruebas
de resistenCia a la acidez y sales biliares se observo una tendencia a aglomerarse
posiblemente como un mecanismo de proteccion cOlitra estos medios que pueden
lIegar a ser adversos para elias (Ver figuras 7 y 8)
47
Figura 7 Lactobacillus brevis aislada de leche fermentada despu~s de la prueba de resistencia a pH=2
Figura 8 Lactobacillus brevis aislada de leche fermentada despues de la prueba de resistencie asales biUares 03 plv
fI
48
35 --Seguimiento del-pH-en-la-bebidaJacteacon y sin -prebi6tico
A continuacion se muestran las Tablas 7 y 8 donde sa registian los datos
recopilados de pHdurante 10$ dras Z 7 14 Y21 para las bebidas laaeas con ysin
prebi6tioo
TABLA 1 ResultadopH yogur sin avena
Dia Repetition 1 Repetici6n 2 Repeticion 3 Repetici6n 4
2 526 501 51 52
7 446 433 438 44
14 439 435 437 436
21 439 437 438 437
TABLA 8 -ResultadopHyogur con avena
Dia Repeticion 1 Repeticion2 Repeticion 3 - Repeticion 4
2 509 523 51 515
7 447 442 445 442
14 436 -438 439 437
21 432 433 435 434
Observando la Figura 9podamos ver que el pH en el -dfado$ para los dos
tratamientos as igual y empieza a descender rapidamente para estabilizarse a
partir del dra 7(Ver figura 9)
49
Figura 9 Comparacj6n de medias para -el pH
Comparaci6n de medias para pH
55 ~ 5 +----=gtIIIi-~i~~----=-r--it~ -- pH sin avena
a 45 1--~~~~=~~ 4 --- pH con
avena35 t-----r-- -------=------=--= ------- - ----
2 7 14 21
Dias
Aplicando la prueba t para comparar las medias de pH I S6 muestia una diferencia
altamants significativa en los dos tratamientos para el dia 21 (pltO05)
(Ver tabla 9)
TABLA 9 Compaiaci6n de medias para pH
DtAS SIN AVENA CON AVENA te p (VALOR)
2 514 514 0 10
7 439 444 -1 61 0159
14 437 I
438 -070 0510
21 438 433 528 00019 shy
- DiFERENCIA AlTAMENTE SIGNIFICATIVA
50
I
AI aplicar regrasi6n a los datos sa obtiene al modelo estimado
pHSinAyena =535606 - 01505650Ia +0005044340IaI2
La variabilidad en la respuesta de pH asta siendo explicada en un 8S7522 por
el modelo (Ver Anexo F)
EI tratamiento con avena mostro el siguiente modelo al analisis de ragresi6n
pHConAvena =534463 ~ 0140407Dia + 0004480980Ia2
La variabilidad an la respuesta de pH asta siendo explicada en un 903315 par
el nlodelo(Ver anexo G)
36 Seguimiento de la acidezmiddotmiddot expresada comomiddot de acido
lactico
A continuaci6n sa muestran las Tablas 10 y 11 donde sa registran los datos
tecopilados de acidezmiddotdurante los dias 27 14 Y 21 para las pebidas taetees con y
sin prebi6tico
TABLA 10 Resuttadode acidez (expresadocomo acido tactico) yogurt sin avena
CIA R~petici6n1 Repeticion2 Repetici6n 3 Repeticion 4
2 054 06 057 058
7 072 074 073 0]2
14 080 083 082 082
21 0]4 079 078 077
51
TABLA 11 Resultado de aCidez (expresado como acido Icktico) yogurt con avena
Dia Repetici6n 1 RepetiCi6n 2 Repetici6n 3 Repetici9n 4
2 059 055 058 057
7 071 073 072 072
14 089 087 088 086
21 092 091 090 091
Observando la Figura 10 se puede concluir que la acidez empieza a aumentar
hasta el dia 14 y luego trata de estabilizarse para los dos tratamientos
(Ver figura 10)
Figura 10 Comparaci6n de medias para la acidez
N G)
Comparacion de medias para acidez
1
2 0I 5 -+--=--------=-~~~= u
ltC
- Acidez sin avena
2 7 14
Dias
52
21
-it- Acidez con avena
Aplicando la prueba t para camparar las madias de acidez se muestra una
diferencia altarnante significativa en los dos tratamiantos para los dias 14 y 21
(pltO05)
(Var tabla 12)
TABLA 12Comparaci6n de medias para Acidez
DIASmiddot SIN AVENA CON AVENA te p(VALOR)
2 0572 0572 0 10
7 0727 0720 119 0278
14 0818 0875 -638 000070shy
21 077 091 -1212 i 0000019 shy
DIFERENCIA AL TAMENTE SlGNIFICATIVA
AI aplicar r~gresi6n a los datos se obtiene el modelo estimado
AcidezSlnAIena = 0491897 + O0436032Dia O00144613DfaA2
La variabilidad en la respuesta de acidez asta siendoexplicada en un 970978
por al modelo (Ver anexo H)
EI tratamiento con avena mostro elsiguiente modeloj a1 analisis de regresion
AcidezConAvena = 0491638 + 00406572Oia - OQOO982559OiaA2
La variabilidad enla respuesta acidez esta siendo explicadaen un 99212 por
el modelo (Ver anexo J)
53
I ~
37 Prueba de viabiJidad
A continuaci6n sa muestran las Tab~as 13 y 14 donde sa presentan los datos
recopilados del recuento de Lactobacilos durante los dias 7 14 Y 21 para las
bebidas lacteas con y sin prebi6tico
TABLA 13 Recuento de Lactobacilos (UFCml) yogurt sin avena
Dia Repetici6n 1 Repetici6n 2 Repeticion 3 Reptttici6n 4
7 1880X10l1 1454X1011 1642X1011 1780X10~
14 1560X10~ 646X1011J 1890X10l 140X10l1
21 1200x10lu 128Ox10u 1745x10J 1520x101V
TABLA 14 Recuento de Lactobacilos (UFCml) yogurt con avena
Dfa Repetieion 1 Repetici6n 2 Repeticion 3 Repeticf6n 4
7 1600X10lt 1240X10t 1640X10ll 1980X10t
14 540X1011 427X10n 546X10n 720X10ll
21 500x1011 492x1011 712)(1011 980x10~
AI analizar la Figura 11 sa puede observar un recuento mayor de Lactobacilos
en al tratamiento con avena resultado de acuerdo a 10 encontrado por Alander at
aI 1999 Kontula et aI 1998 y Jaskari et aI 1998
54
Figura 11 Comparaci6n de medias para Log Lactobacillus
Comparacion de medias para log Lactobacillus
~ 1350
-+- Sac Sin--() 13 co avenaIII
bull 125 -- Bac con 0)
0 12 avenaJ
115 7 14 21
Dias
Aplicando la prueba t para comparar las medias de recuento de Lactobacillus no
se encontr6 una diferenc1a estadfsUcamente significative entre los dos
tratamientos (Ver tabla 15)
Este aumento en al racuento influy6 en la disminuci6n del pH y en el aumento de
fa aeidez por la fermentacion que realizan los Lactobacillus sobre fa lactosa de la
lache y la avena adicionada como prebi6tico
55
1
TABLA 15 Comparaci6n medias lag Lactobacillus
DIAS SIN AVENA CON AVENA tc p(VALOR)
7 122257 122022 04846 06451
14 121065 132393 -19602 00977
21 129025 133087 -08236 04416
At aplicar regresion a los datos se obtiane al modelo astimado
LactobacillusSinAvena= 117347 + 004834640Ia
La variabilidad en la respuesta del recuento de LactobaCillus ssta siendo
explicada en un 260054 por el mod$loVar anexo J)
EI tratamiento con avena mostr6 al siguiente modalo al anal isis de regresion
Lactobacillu$ConAvena =118103 + 007903040Ias
La variabilidad en la respuesta de recuento esta siendo explicada en un 3068
por al modelo(Ver anexo K)~
38 Analisi$ microbiol6gicos de las bebidas lacteas con y sin
En la Tabla 16 estan recopilados los resultados microbiol6gieos obtenidos en ras
muestras con los dos tratamientos (con y sin avena)
I [
sa
TABLA 16 Resultados analisis microbiologico
Recuento de mohos y levaduras Iml lt10
Recuento de Staphylococcus coagulase positiva Iml lt100
NMP coliformes fotales y Escherichia coli Iml lt3
Presencia de Salmonella25ml Ausente
Los resultados de este analisis demuestran que las bebidas fermentadas con y
sin avena~ astan fibres de microorganismos patogenos
57
1
4 CONCLUSIONES
Se aislaron cepas nativas de Lactobacillus plantarum de las muestras vegetates
de repollo pepino repollitas de bruselas fermentadas y Lactobacillus brevis de
lache fermentada y mucosa vaginal humana Ambas cepas resistieran un pH=2 y
una concentraci6n de sales biliares det 03 ptv dos earacteristicas importantes
en los probi6ticos
Lamiddot cepa de Lactobacillus brevis aislada de lache Sa utiliz6 para elaborar una
bebida fermentada sin y con avana comoingrediente prebiotico obteniendose un
aJimento centon recuento del probi6tico viable durante 21 dras de seguimiento
ademas libre de microorganismos )at6gen05
No se encontr6 efecta significativo de la avena sobre Ie viabilidad del Lactobacillus
brevis aunque sa presento un aumento en 61 recuento de estos en la bebida con
avena
58
plusmn ~
5 RECOMENDACIONES
Ensayar la cepa de Lactobacillus plantartJm en productos carnicos madurados
como el salami
Ensayar la cepa de Lactobacillus l)revs en otros derivados lecteos como queso
quesito queso crema
Continuar con el estudio de estos microorganismos y caracterizarlos
molecularmente ademas de estudiar su capacidad de adherencja a fa mucosa
intestinal sobre algunes Hneas celulares como las CaCo~2
Estudiarel efedo de la avena sabre la viabiJidad del Lactobacillus breyis a una
concentraci6n mayor de 05
Realizer ensayos can las cepas de Lactobacillus brevis y Lactobrlcillus pJantarum
para elaborar masas acidas para panificacion reemplazando el Bromato de
Potasio aditivo prohibido desde marzo del 2003 en nuestro pais per 5U toxicidad
59
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65
ANEXOS
66
ANEXO A RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AlSLADA DE i
PEPINO it
Referencia Pepino 1 Fecha 06122002
IEXCELENTE IDENTIFICACION
Latto plantarum 1
Galeria API 50 CHL V50 Leida el 06122002
Perfil - -- - ++ - -- - ++++ - - -+- + - I I I I I I I I +t+ - +f- ~ - - + + ~ - - - +- + - shy
o - GLY - ERY DARA - LARA + RIB + DXYL - LXYL - ADO - MDX - GAL + GLU + FRU + MNE + SBE - RHA - DUL - INO bull MAN + SOR - MDM + MUG shyNAG + AMY + ARB + ESC + SAL + CEL + MAL + LAC + MEL + SAC + TRE + 1NU - MLZ + RAF + AMD - GLYG - XLT - GEN + TIJR + LYX - TAG - DFUC shyLFUC - DARL + LARL - aNT + 2KG - 5KG shy
--- Taxones significativos rd -----T -- Tests en contra
Lactoplantarum 1 999 092 1
Taxon siguiente Lactobrevis 1 OJ 044 3
i i
Lactoplantarum 1 1 test (5) en contra
D-SORBITOL (SOR) 78
Tax6n siguiente Lactobrevis 1 3 test (s) ert contra
METHYLD-MANNOSIDE (MOlM) 0 MELEZITOSE (MLZ) 14 D-TURANOSE (TUR) 14
67
ampb
ANEXO B RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AISLADA DE REPOLLO FERMENTADO
~
Referencia Repollo fermentado - 3 Fecha 03072003
EXCELENTE IDENTIFICACION
Lactoplantarum 1
Galena API 50 CRL V50 Leida el 03072003
Perfil - - ++ - - - - -H++ - - ~ + - + - I I 1 I I I I -H+ - ++ - - - + + - -- - - + - shy
o - GLY - ERY - DARA - LARA + RIB + DXYL - LXYL - ADO ~ MDX - GAL + GLU + FRU + MNE + SBE ~ RHA - DUL - INO - MAN + SOR - MDM + MDG shyNAG + AMY + ARR + ESC + SAT + CRL + MAL + LAC + MEL + SAC + TRE + lNU - MLZ + RAF + AMI) - GLYG - XLT - GEN + TOR + LYX - TAG - DFUC shyLFUC - DARL - LARL - GNT + 2KG - 5KG shy
------Taxones significativos _ _----- Id--- ---T---- Tests en contra
Lactoplantarum 1 999 095 1
Tax6n siguiente Lactobrevis 1 01 OA8 3
lJactoplantaru01 1 1 test (s) en contra
DSORBITOL (SOR) 78
Taxon siguiente Lactobrevis
METHYL-D-MANNOSIDE D-TURANOSE
1
(MOM) (TOR)
3 test (5) en contra
0 MELEZITOSE 14
(MLZ) 14
i
I
68
ANEXO C RESULTADO PRUEBAS BIOQUWICAS DE CEPA AISLADA DE MUCOSA HUMANA
Referenda Mucosa - 5 Fecha 27012003
BUENA IDENTlFICACION
Galeria API 50 CHL vso Leida el 270112003
Perfil - - - - +t--t - - - + - + - - - - - - - - -+- - - - - + - + - - - - - - - - - - - - - bull - - -+ - +
o - GLY ~ ERY - DARA bull LARA + RID + DXYL + LXYL - ADO bull MDX - GAL + OLU - FRU + MNE - SBE - IlliA - DUL - INa - MAN - SOR - MDM - MOO shyNAG + AMY - ARB - ESC ~ SAL bull CEL - MAL + lAC - MEL + SAC - TRE shyINU - MLZ - RAF - AMD - GLYG - XLT - GEN - 11JR - LYX - TAG - DFUC shyLFUC - DARL - IARL - ONT + 2KO - 5KG +
- - - - - - Taxones significativos - - - - - - - Id T -- Test en contra
Lactobrevis 3 963 088 1
Taxon siguiente Lactoco11inoides 36 075 2
Lactobrevis 3 1 test (s) en contra
GLUCOSE (GLU) 95
-~~~------------~---------------------------~--~-------~--~-----~----------~--------~------------~~--Taxon siguiente Lactocollinoides 2 test (s) en contra
GLUCOSE (GLU) 100 MELIBIOSE (MEL) 25
69
i r
ANEXO D RESULTADO PRUEBAS BIOQIJiMICAS DE CEPA AISLADA DE LECHE FERMENTADA
Referenda Leche fennentada ~ 13 Fecha 27012003
BUENA IDENTIFICACI6N
Galeria API 50 CHL V50 Leida el 270112003
Perfil - - - - -t-t+- - - - + - + - - - bull - - - - -+- - - - - + - + - - - - - - - - - - - - - - - - -+ - +
0 - GLY - ERY - DARA - LARA +Rll3 + DXYL + LXYL - ADO - MDX ~GAL + GLU - FRU + MNE SBE - RHA DUL bull INO MAN - SOR MDM bull MDG shy
~NAG + AMY - ARB - ESC - SAL - CEL - MAL + LAC - MEL + SAC - TRE I lNU - MLZ - RAF - AMD - GLYG - XLT - OEN - IUR LYX - TAG - DFUC bull i
LFUC - DARL - LARL -ONr + 2KG - SKO + 1
- -- - - Taxones significativos - - Id -- T --- Test en contra
Lacta brevis 3 963 088 1
Taxon siguiente Lactocollinoides 36 075 2
Lactobrevis 3 1 test (s) en contra
GLUCOSE (GLU) 95
-----------------------------------------------------------~------------------------------~-------------------Taxon siguiente Lactocollinoides 2 test (s) en contra
GLUCOSE (GLD) 100 MELffiIOSE (MEL) 25
70
II iJ1
I
I ANEXO E RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AISLADA DE REPOLLITAS DE BRUSELAS FERMENTADA
Referencia repollitas de bruselas 15 Fecha 03072003
EXCELENTE IDENTIFICACION
Lactoplantarum 1
Galeria API 50 CHL vsO Leida el 03072003
Perfil - - - - +t - - - - +H+ - +- - +t + - I I I I I I I f ++t - + - - - -+ + - - - -+ -+ - - I ij
o - GLY - ERY - DARA - LARA + RJB + DXYL - LXYL - ADO - MDX - GAL +
GLU + FRU + MNE + SBE RHA + DUL - INO - MAN + SOR + MDM + MOG shyNAG + AMY + ARB + ESC + SAL + eEL + MAL + LAC + MEl + SAC + TRE + i
I1NU - MLZ + RAF AMD GLYG - XLT - aEN + TUR + LYX - TAG - Druc LFUC - DARt + LARL - aNT + 2KG - 5KG shy n ----Taxones significativos ------ Id Tests en contra
Lactoplantarum 1 999 090 o
Taxon siguiente Lacto pentosus 01 012 7
Lactoplantarum 1 o test (s) en contra
Taxon siguiente Lacto pentosus 7 test (8) en contra
GLYCEROL (GLY) 75 D-XYLOSE (DXYL) 100 L-RHAMNOSE (RHA) 25 METHYL-D-MANNOSIDE (MOM) 1 MELEZITOSE (MLZ) 25 RAFFINOSE (RAF) 75 D-ARABITOL (DARL) 0
71
~
I i I
ANEXO F - ANALISIS DE REGRESION PARA pH EN BEBIDA SIN AVENA
Aruilisis de regresi6n polinomial
---~-~-------------------------------------------~-----------~~---------------------~--------------Variable dependiente pHSinAvena ---------------------------~-------------~--------------------~---------------------------------
Error T Parametro Estimado Estandar Estadistico P-Valor
CONSTANTE 535606 0094535 56657 00000 Dia -0150565 0020706 727154 00000 Dia2 000504434 0000871488 578819 00001
---~---------------------------------------------------------------------------------------------------
Anfllisis de Variama -------------------------------------------~-----------~-----------------------------~-~--- jSource Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor 11
------------------------~------------------------------------------------------------------------------~ Mod-elo 155772 2 0118861 4256 00000 Residual 0237877 13 00182983
Total (Corr) 11956 IS
R2 == 867522 percent
pHSinAvena == 535606 - 0150565Dia + 000504434Dia2
72
____
middot ANEXO G - ANALISIS DE REGRESION PARA pH EN BEBIDA CON AVENA
AmUisis de regresion polinomial _____~_____~__-_____~___4____________________bull____bull__________bull_____________~~----_------___________
Variable depcndiente pHConA vena ------------------------------------------------------------------------------------------~--------
Error T Parametro Estimado StAndar Estadfstico P-Valor
---------------------------------------------~-----------------------------------------------_---------CONSTANTE 534463 00801045 667208 00000 Dia -0140407 00175453 800253 00000 DiaA 2 000448098 0000738458 606803 00000
----------------------~---~-----------------------------~------------------------------~----AmUisis de Varianza
---~---------------------------------~---------------------~------------~-------------------~------Source Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio PValor --------------------------~-----------------------------------------------~------------~-----~~--~ ModeJo 159575 2 0797873 6073 00000 Residual 02170798 middot13 00131383 _______~_~ ~_~----------~------~--~-----~-M-----~-----____ _____________~-----------------------Total (COlT) 176654 15
R12 903315 percent
-----------~------------------------------------------------------------------------~-----------pHConAvena 534463 - 0140407Dia + 000448098DfaA 2
73
ANEXO H - ANALTSIS DE REGRESTON PARA ACIDEZ EN BEBJDA SIN AVENA
An8Jisis de Regtesi6fi P6lifJomial
Variable Depefidiefile~ AcidezSinAVenll _______________w_____~______~________________~-----------_________~_________________~~____~___~_____
Error T Pariirnetro Estimado Estandar Estadistico ---------------------------------------~--------------~-~-------~--------------------~------------CONSTANT 0491697 00123217 399051 00000 Dia 00436032 000269882 161564 00000 D1a2 -000144613 000011359 127312 00000 __w___~________________________~-_______-_____~----____________________________~__~---~_--__~___
AriiiJisis de varianza ~_~__~__________~_~____~________~___________- _________e_____________________________bull _____-________
Source Smn de cuadr Df Mean Square F-Ratio PmiddotValor_~~___________________________________bull ______~___________bull ____________bull ______~________w________________
Model 0135203 2 00676013 21747 00000 Residual 000404118 13 000031086
Total (Corr) 0139244 15
R2 970978 percent
AcidezSlnAvena 0491697 + O0436032Dia - 0OOl44613Dia2
74
I
ANEXO I ANALISIS DE REGRESION PARA ACIDEZ EN BEBIDA CON AVENA
1
Anwisis de tegtesi6fi polinomial
Variable dependiente Acidez Con Avena
Error T ParametTo Estimado Stlindar Estadfstico P-Valor ----------------~-------~---------------------~-----------------------------------------------------CONSTANT 0491639 000926607 530578 00000 Diamiddot 00406572 000202955 200326 00000 DfaA 2 0000982559 0000085421 -115025 00000
-------------~----------------------------~-------------------------~-----------------------------------
-------------~-----~~-----------------------------~---------------------------------------------_--Source Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio PValor
-~-------------~----------------------------------~------------------~~-------------------------- Modelo 0288008 2 0144004 81914 00000 Residual 000228539 13 0000175799
----------~~--------------~---------------------------------------------~---------------------------Total (Corr) 0290294 15
RA2 = 992127 percent
-------------------------~----~---~------------~---------------------------------~---------------~
AcidezConAvena == 049163amp + 00406572D1a - 0000982559DiaA2
75
I
(Ilmiddot il
ANEXO J- ANALISIS DE REGRESION PARA RECUENTO LACTOBACILOS PARA BEBIDA SIN AVENA
Amilisis de regresion - Modelo lineal Y = a + bX
------------------------~----------------------~-----------------------------~----------~-----------Variable Dcpendiente LactobacilJusSinAvena Variable independiente Dia
I--------~----------~-----------------------------------~-------~-~--~--------------------------~-Error T
Paramctro Estimado Standard Stadistico P-Valor
----~----~------------~-----~-----------------------~-------------~-----------------------------Intereepto 117347 0389973 300911 00000 Pendiente 00483464 00257889 18747 00903
Analisis de Varianza
---------~------------------~----------------~---------------------------------~---------~----------Source Sum decuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor
------------~---------------------~---------------------~--------------------------------~-----~----Modelo 0916252 1 244835 443 00616 Residual 260706 10 0260706
--~------------~---~------------------~~~-----~-------~---------~~-------------------------------------Total (Corr)352332 11
Coeficiente Correlaci6n = 0509955 R2 = 260054 percent
LactobacillusSinAvena= 117347 + 00483464Dfa
76
ANEXO K- ANALTSIS DE REGRESION PARA RECUENTO LACTOBACILOS PARA DEBIDA CON AVENA
Aruilisis de regresion - Modelo lineal Y = a + hX
Variable Dependiente LactobacillusConAvena Variable Independiente Dia ---~--------------------------------------------------------__-----------__--_--_-----------shy
Error T Paramctro Estimado Standard Estadistico P-Valor -~--------------------------------------------------------------------------------------------------
Irttercepto 118103 0567963 207942 00000 Pendiente 00790304 00375594 210414 00616
-----------------~----------------------------~----~-------~----~----------------------------
Analisis de Varianza
----------------~----------------~------------------~--------------------------~------~--------shySource Swn de cuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor
-----------------~--~--------------------------------------------------------------------------~---~ Mode10 244835 1 244835 443 00616 Residual 552997 10 0552997
Total (Corr)797832 11
Coeficiente Correlacion = 0553964 RI2 = 306875 percent
-----~--------------------------------------------------------~--------------------------------------
LactobacillusConAvena = 118103 + 00790304Dfas
77
2233 Prueba de esporulaci6n
A cada cepa aislada se Ie hizo esta prueba la cuel consistia en incubar en
aerobiosis durante ocho dias las cajas de agar MRS donde crecieron colonias de
Lactobacilo$ y luego se les (ealize) coloraci6n de espora Las capas que dieron
negativa a la prueba de espora se considararort sospechosas de sar Lactobacilos
y se continuo con la prueba de la catalasa (Ver Tabla 3)
2234 Prueba de la catalasa
los lactobacilos carecen de catalasa Eata prueba se hizo tomando una colonis
se deposito en vidrio de reloj y se Ie adicion6 dos gotas de peroxida de hidr6geno
(H202) la que no presentaba efervescencie eran cepe sospechosa de ser
Lactobacilo (Ver Tabla 4
Sa seleccionaron las capas euyo resultado fue aeorde con el genera Lactobacilfu$
y se continuo con la comirmaeion del genera y determinacion de la eSpecie
meqiante las pruebas bioqulmicas
32
224 Prueba para determlnar la especie
Para confirmar el genero y determinar la especie de las diferentes capas aisladas
se hizo una caracterizaci6n bioqufmica utilizando un kit de API 50 CHL Medium
Ref 50 410 que contiene una galed8 de medios que permite realizar el estudio
de fermentaci6n de los 49 azucares de 52 especies de Lactobacillus (Ver Figura 4
y tabla 5)
Figura 4 API CHL 50-Prueba bioquimica
33
225 Pruebas para determinar microorganismos probi6ticos
2251 Resistencia a pH=2 y sales biliares de concentraci6n O3pv
A las cepas idantificades como Lactobacillus brevis y Lactobacillus pantarum sa
las realiz6 Ie prueba dfl resistencia a pH=2 y sales biliares de concentraci6n 03
pv ( Jacobsen et al 1999) Una colonia de cada cepe aislada se inocul6 en 4 mt
de caldo MRS durante cinco dras bajo condiciones de anaerobiosis Oespues de
esta tiempo se dejaron pracipltar los microorganismos por sedimentaci6n se Ie
retire el sobrenadante y al precipitado se Ie adicion6 Sml de caldo MRS
previamente ajustado a pH=2 can seido clorhfdrico (HCI) dentro del mismo tuba de
ensayo G igual sa hizo can otro tubo previamente incubado pero a este se Ie
adiciono 5ml de caldo MRS con sales biliares a una concentra~i6n de 03 plv y
ambos se incuberon a 37deg C por 2 haras Sa midio 01 mi de cada uno de los
tubas al tiempo 0 y a las 2 horas y sa inoculeron en superficie en caJas de petri
con agar MRS S9 incubaron a 37deg C bajo anaerobiosis durante 48 horas Se
compararon visualrrente en cada caja de petri el crecimiento en superficie y las
que presentaron crecimiento en tos dos tiempos (0 y 2 horas) tanto en at media
acido como en sales I se consideraron resistentes a pH=2 y sales biliares (03
pv)
(Ver Tabla 6)
34
226 Conservacion
Todas fas capas que habian dado positiva Jas pruebas anteriores y que reaultaron
resistentes a pH=2 y sales biliares 03 pv y despues de identificadas en API 50
CHL sa repicaron en agar MRS en tuba inclinado y despues de Incubar a 37deg C
por 48 horas bajo anaerobiosis se Ctlbrie el biser completamente can aceite
mineral esteril y sa guardaron en refrigeraci6n
227 Elaboracj6n de fa bebida fermentada
2271 Preparaci6n de la mue$tra
Sa tome 1 mt de caldo MRS previamante inoculado e incubado que presentaba
una concentracion de Lactobacillus brevis de 27x108 Iml segun la escaJa de Mac
Farlan y sa adiciono a 9ml de leche pasteurizada en un tubo sa dej6 incubanda
en anaerobiosis por 48 hores Luego se pasaron estos 10 ml a un frasco qua
cont~nie 90 ml de leche pasterizada y se dej6 incubando par 48 haras en
anaerobiosis
35
2272 Adici6n del inOculo
A 900ml de leche pasteurizada se Ie adicion61os 100 ml de leche que habia sido
previamente ino(ulada dos veces con la cepa posteriormente se deja
fermantando la lache a temperatura de 37deg C
2273 Control de Ja fermentaci6n
Las muestras se hicieron por cuadruplicado y se les hizo un seguimiento de
aoidez hasta un valor entre 04 y 05 expresada como Bcido lactico esta
procedimiento corresponde a la babida fermentada sin prebi6tico La bebida ~on
prebi6tico tiene al mismo proeedirnianto pero adicionalmente se agrag6 avena a
una concentraci6n de 05 en el momento de la adici6n del in6e410 a los 900 ml
de leehe pasteurlzada y el procedimiento sigui6 igual al de la bebida sin prebi6tico
tambien se hizo por cuadruplicado
2274 Refrigeracl6n
Despues que las mezclas con y sin prebiotico alcanzaron el de acidez
requarido se IIeva ron a refrigeraci6n a una temperatura de 4deg C p~r 24 horas
para frenar proce~os metab6licos de los microorganisrtlos Despues de este
ti~mpo se procedi6 al batido
36
1 2275 Batido
Con un agitador se procedi6 a batir las bebidas para romper et coagulo formado
y de esta manera homogeneizar la mazela y obtener asf la bebida fermentada
2276 Envasado y almacenamiento
Ambas bebidas se envasaron en frascos vidrio para hacerles seguimiento de pH
acidez(expresado como acido tacticol y recuento de Lactobacillus breviSf los
dies 27 14 Y 21 despues de elaboradas las bebidas perfodo durante el cualta
muestra permanecfa afmacenada a temperatura de refrigeracion(Ver Figura 5
37
Fjgura 5 Diagrama de Flujo
PREPARACION DE LA MUESTRA
ADICION DEL INOCULO
~_____~_B~ATIDO~______~
INCUBACION 37deg C hasta acidez = 04-05 acido laotico
ENFRIAMIENTO
hasta 4 0 C ~------~ ~------~
ENVASADO Y ALMACENAMJENTO
dUrante 21 dfas a Temperatura 4 0 C
38
1
228 Determinaci6n del pH
Se determino por el metoda potenciometrico en un pH-metro manual durante los
dias 2) 7 14 Y 21 de las bebidas lacteas sin y con prebi6tica (Ver Tablas 7 y 8)
229 Oeterminaci6n de la acidez (Expresadfl como acido
lactica)
Se tomaron 9 mJ de las bebida~ sa Ie adicionaron 2 gotas de fanoftaleina como
indicador y sa titulo fa acidez con NaOH 01 N hasta la aparicion de un cotor rosado
debit EI volumen de NaOH utilizado se reporta como valor de de acidez
(VerTablas 10 y 11)
2210 Prueba de viabilidad
Qurante el perfoda de almacenamiento de la bebida lactea se procedi6 a hacer la
prueba de viabiHdad en los dias 7 14 Y 21 para determinar Si los lactobacilfus
permanecfan vivOs a una concentraci6n minima de 106 hasta el dia 21 como 10
establece eJ Articulo 10 de la Rasolucion 2310 del Ministerio de $alud de
Colombja
39
Para asta prueba se tamaron 10 rnl de muestra y se adicionaron a 90 ml de caldo
MRS ruego a partir de esta se hicieron diluciones de 10-2 hasta 10-11 de las
diluciones 109101deg 10-11 se inocul6 1 ml de cada uno en agar MRS siguiendo el
metodo de siembra en profundidad y por duplicado e incubando a 370 C x 5 dras
en anaerobiosis y luego se hicieron tos recuentos por duplicado para esi reportar
los recuentos promedio (Ver Tablas 13 y 14)
2211 AniUisls microbiol6glco de las bebidas Iicteas(con y sin
avena)
Con el fin de determinar las condiciones higienico-sanitarias del producto se
realizaron las pruebas microbiol6gicas de Recuento de mohos y fevadurasml en
agar OGY Recuento en superficia de Staphylococcus coagulasa positivoml en
agar Baird Parker Numero Mas Probable (NMP) de coUfor-mes totales y
Escherichia coliml en caldo Fluorocult y Presencia de Salmonela25ml con BHI
caldo tetrationato y agar Hecktoen (Montoya 1999)
(Var tabla 16)
2212 AnaUsis estadistico
A los datos obtenidos en la medici6n de pH acidez (expresada como Beido
laclico) en los dras 2714 Y 21 y el recuento de Lactobacillus en los dras 714 y21
40
realizados a los dos tratamlentos se tes aplic6 1a prueba t porque solo difieren
en la presencia 0 ausencia del prebi6tico para evaluar si habra diferencia
estadfsticamente significativa para los dos tratamientbs(Ver Tablas9 12 y 15)
41
3 RESULTADOS Y DISCUSION
31 Coloraci6n de Gram y morfologfa
Las cepas aisladas fesultaron Gram positivas (Ver Figura 6) colonias grandes
cremosas dE) color beige con bordes homogeneos y c6ncavos en su
morfologia (Ver Figura 3) resultando de acuerdo a 10 especificado en Stanley
1989 para Lactobacillus
32 Prueba de esporulaci6n y cataJasa
Los resultados de la pruebas de esporulaci6n y catalasa indicados en las
Tablas 3 y 4 respeclivamente dieron conforme a 10 especificado en Stanley
1989 para Lactobacillus
42
1
2 3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
TABLA 3 Resultado de prueba de esporuJaci6n
CEPA RESULfADO ESPORULACION
-- -------------
43
l i ~II bull ~ I I
TABLA 4 Resultado prueba de la catalasa
CEPA RESULTADO CATALASA
1 -2 -3 -4 -5 -6 -7 8 -9 -10 -11 12 -13 -14 -15 -16
3~3 Prueba para determinar la especie
Oespues de hacer las pruebas para seleccionar las cepas sospechosas de ser
Lactobacillus se realizo las pruebas bioquimicas fograndose identificar
Lactobacillus plantarum aislctdo de pepino repollo y repollitas de bruselas
44
fermentados y Lactobacillus brevis de mucosa vaginal y leche fermentada (Ver
Anexos del A al E y Tabla 5)
TABLA 5 Resultado identlficaci6n cepa~
CEPA NOMBRE
1 Lactobacillus planfarum
3 Lactobacillus plantarum
5 Lactobacillus brevis
13 Lactobacillus brevis
15 Lactobacillus plantarum
34 Pruebas para determinar microorganismos probi6ticos
las cepas de Lactobacillus brevis y Lactobacillus plantarum mostraron
rasistencia al medio acido de pH =2 Y sales biliares 03 pv resultado similar al
encontrado por Jacobsen et al 1999 para Lactobacillus plantarum (Ver tabla 6)
45
middot
~~~ttiI lltlmiddot~COX~dtJ ~xtc_~ 2 tr~ k-JlL~middot
-)~~TO DE lJIBUOTECUl rjRL]OTtCA twn GO1IU1
TABLA 6 Resultados a pruebas de resistencia a pH=2 y sales biliares 03 plv
CEPA RESISTENCIA pH=2 RESISTENCfA A SALES BIUARES ()3 pv
1 + +
2 + +
3 + +
4 + +
5 +
6 + +
7 + +
8 + +
9 + +
10 + +
11 + +
12 + +
13 + +
14 +1shy +M
15 + +
16 + +
+1 crecimiento debil
+ crecimiento abundante
46
Figura 6 Lactobacillus brevis Gram + aislado de leche fermentada
Ai observar en placa las celulas de lactobacilos despues de real1zar las pruebas
de resistenCia a la acidez y sales biliares se observo una tendencia a aglomerarse
posiblemente como un mecanismo de proteccion cOlitra estos medios que pueden
lIegar a ser adversos para elias (Ver figuras 7 y 8)
47
Figura 7 Lactobacillus brevis aislada de leche fermentada despu~s de la prueba de resistencia a pH=2
Figura 8 Lactobacillus brevis aislada de leche fermentada despues de la prueba de resistencie asales biUares 03 plv
fI
48
35 --Seguimiento del-pH-en-la-bebidaJacteacon y sin -prebi6tico
A continuacion se muestran las Tablas 7 y 8 donde sa registian los datos
recopilados de pHdurante 10$ dras Z 7 14 Y21 para las bebidas laaeas con ysin
prebi6tioo
TABLA 1 ResultadopH yogur sin avena
Dia Repetition 1 Repetici6n 2 Repeticion 3 Repetici6n 4
2 526 501 51 52
7 446 433 438 44
14 439 435 437 436
21 439 437 438 437
TABLA 8 -ResultadopHyogur con avena
Dia Repeticion 1 Repeticion2 Repeticion 3 - Repeticion 4
2 509 523 51 515
7 447 442 445 442
14 436 -438 439 437
21 432 433 435 434
Observando la Figura 9podamos ver que el pH en el -dfado$ para los dos
tratamientos as igual y empieza a descender rapidamente para estabilizarse a
partir del dra 7(Ver figura 9)
49
Figura 9 Comparacj6n de medias para -el pH
Comparaci6n de medias para pH
55 ~ 5 +----=gtIIIi-~i~~----=-r--it~ -- pH sin avena
a 45 1--~~~~=~~ 4 --- pH con
avena35 t-----r-- -------=------=--= ------- - ----
2 7 14 21
Dias
Aplicando la prueba t para comparar las medias de pH I S6 muestia una diferencia
altamants significativa en los dos tratamientos para el dia 21 (pltO05)
(Ver tabla 9)
TABLA 9 Compaiaci6n de medias para pH
DtAS SIN AVENA CON AVENA te p (VALOR)
2 514 514 0 10
7 439 444 -1 61 0159
14 437 I
438 -070 0510
21 438 433 528 00019 shy
- DiFERENCIA AlTAMENTE SIGNIFICATIVA
50
I
AI aplicar regrasi6n a los datos sa obtiene al modelo estimado
pHSinAyena =535606 - 01505650Ia +0005044340IaI2
La variabilidad en la respuesta de pH asta siendo explicada en un 8S7522 por
el modelo (Ver Anexo F)
EI tratamiento con avena mostro el siguiente modelo al analisis de ragresi6n
pHConAvena =534463 ~ 0140407Dia + 0004480980Ia2
La variabilidad an la respuesta de pH asta siendo explicada en un 903315 par
el nlodelo(Ver anexo G)
36 Seguimiento de la acidezmiddotmiddot expresada comomiddot de acido
lactico
A continuaci6n sa muestran las Tablas 10 y 11 donde sa registran los datos
tecopilados de acidezmiddotdurante los dias 27 14 Y 21 para las pebidas taetees con y
sin prebi6tico
TABLA 10 Resuttadode acidez (expresadocomo acido tactico) yogurt sin avena
CIA R~petici6n1 Repeticion2 Repetici6n 3 Repeticion 4
2 054 06 057 058
7 072 074 073 0]2
14 080 083 082 082
21 0]4 079 078 077
51
TABLA 11 Resultado de aCidez (expresado como acido Icktico) yogurt con avena
Dia Repetici6n 1 RepetiCi6n 2 Repetici6n 3 Repetici9n 4
2 059 055 058 057
7 071 073 072 072
14 089 087 088 086
21 092 091 090 091
Observando la Figura 10 se puede concluir que la acidez empieza a aumentar
hasta el dia 14 y luego trata de estabilizarse para los dos tratamientos
(Ver figura 10)
Figura 10 Comparaci6n de medias para la acidez
N G)
Comparacion de medias para acidez
1
2 0I 5 -+--=--------=-~~~= u
ltC
- Acidez sin avena
2 7 14
Dias
52
21
-it- Acidez con avena
Aplicando la prueba t para camparar las madias de acidez se muestra una
diferencia altarnante significativa en los dos tratamiantos para los dias 14 y 21
(pltO05)
(Var tabla 12)
TABLA 12Comparaci6n de medias para Acidez
DIASmiddot SIN AVENA CON AVENA te p(VALOR)
2 0572 0572 0 10
7 0727 0720 119 0278
14 0818 0875 -638 000070shy
21 077 091 -1212 i 0000019 shy
DIFERENCIA AL TAMENTE SlGNIFICATIVA
AI aplicar r~gresi6n a los datos se obtiene el modelo estimado
AcidezSlnAIena = 0491897 + O0436032Dia O00144613DfaA2
La variabilidad en la respuesta de acidez asta siendoexplicada en un 970978
por al modelo (Ver anexo H)
EI tratamiento con avena mostro elsiguiente modeloj a1 analisis de regresion
AcidezConAvena = 0491638 + 00406572Oia - OQOO982559OiaA2
La variabilidad enla respuesta acidez esta siendo explicadaen un 99212 por
el modelo (Ver anexo J)
53
I ~
37 Prueba de viabiJidad
A continuaci6n sa muestran las Tab~as 13 y 14 donde sa presentan los datos
recopilados del recuento de Lactobacilos durante los dias 7 14 Y 21 para las
bebidas lacteas con y sin prebi6tico
TABLA 13 Recuento de Lactobacilos (UFCml) yogurt sin avena
Dia Repetici6n 1 Repetici6n 2 Repeticion 3 Reptttici6n 4
7 1880X10l1 1454X1011 1642X1011 1780X10~
14 1560X10~ 646X1011J 1890X10l 140X10l1
21 1200x10lu 128Ox10u 1745x10J 1520x101V
TABLA 14 Recuento de Lactobacilos (UFCml) yogurt con avena
Dfa Repetieion 1 Repetici6n 2 Repeticion 3 Repeticf6n 4
7 1600X10lt 1240X10t 1640X10ll 1980X10t
14 540X1011 427X10n 546X10n 720X10ll
21 500x1011 492x1011 712)(1011 980x10~
AI analizar la Figura 11 sa puede observar un recuento mayor de Lactobacilos
en al tratamiento con avena resultado de acuerdo a 10 encontrado por Alander at
aI 1999 Kontula et aI 1998 y Jaskari et aI 1998
54
Figura 11 Comparaci6n de medias para Log Lactobacillus
Comparacion de medias para log Lactobacillus
~ 1350
-+- Sac Sin--() 13 co avenaIII
bull 125 -- Bac con 0)
0 12 avenaJ
115 7 14 21
Dias
Aplicando la prueba t para comparar las medias de recuento de Lactobacillus no
se encontr6 una diferenc1a estadfsUcamente significative entre los dos
tratamientos (Ver tabla 15)
Este aumento en al racuento influy6 en la disminuci6n del pH y en el aumento de
fa aeidez por la fermentacion que realizan los Lactobacillus sobre fa lactosa de la
lache y la avena adicionada como prebi6tico
55
1
TABLA 15 Comparaci6n medias lag Lactobacillus
DIAS SIN AVENA CON AVENA tc p(VALOR)
7 122257 122022 04846 06451
14 121065 132393 -19602 00977
21 129025 133087 -08236 04416
At aplicar regresion a los datos se obtiane al modelo astimado
LactobacillusSinAvena= 117347 + 004834640Ia
La variabilidad en la respuesta del recuento de LactobaCillus ssta siendo
explicada en un 260054 por el mod$loVar anexo J)
EI tratamiento con avena mostr6 al siguiente modalo al anal isis de regresion
Lactobacillu$ConAvena =118103 + 007903040Ias
La variabilidad en la respuesta de recuento esta siendo explicada en un 3068
por al modelo(Ver anexo K)~
38 Analisi$ microbiol6gicos de las bebidas lacteas con y sin
En la Tabla 16 estan recopilados los resultados microbiol6gieos obtenidos en ras
muestras con los dos tratamientos (con y sin avena)
I [
sa
TABLA 16 Resultados analisis microbiologico
Recuento de mohos y levaduras Iml lt10
Recuento de Staphylococcus coagulase positiva Iml lt100
NMP coliformes fotales y Escherichia coli Iml lt3
Presencia de Salmonella25ml Ausente
Los resultados de este analisis demuestran que las bebidas fermentadas con y
sin avena~ astan fibres de microorganismos patogenos
57
1
4 CONCLUSIONES
Se aislaron cepas nativas de Lactobacillus plantarum de las muestras vegetates
de repollo pepino repollitas de bruselas fermentadas y Lactobacillus brevis de
lache fermentada y mucosa vaginal humana Ambas cepas resistieran un pH=2 y
una concentraci6n de sales biliares det 03 ptv dos earacteristicas importantes
en los probi6ticos
Lamiddot cepa de Lactobacillus brevis aislada de lache Sa utiliz6 para elaborar una
bebida fermentada sin y con avana comoingrediente prebiotico obteniendose un
aJimento centon recuento del probi6tico viable durante 21 dras de seguimiento
ademas libre de microorganismos )at6gen05
No se encontr6 efecta significativo de la avena sobre Ie viabilidad del Lactobacillus
brevis aunque sa presento un aumento en 61 recuento de estos en la bebida con
avena
58
plusmn ~
5 RECOMENDACIONES
Ensayar la cepa de Lactobacillus plantartJm en productos carnicos madurados
como el salami
Ensayar la cepa de Lactobacillus l)revs en otros derivados lecteos como queso
quesito queso crema
Continuar con el estudio de estos microorganismos y caracterizarlos
molecularmente ademas de estudiar su capacidad de adherencja a fa mucosa
intestinal sobre algunes Hneas celulares como las CaCo~2
Estudiarel efedo de la avena sabre la viabiJidad del Lactobacillus breyis a una
concentraci6n mayor de 05
Realizer ensayos can las cepas de Lactobacillus brevis y Lactobrlcillus pJantarum
para elaborar masas acidas para panificacion reemplazando el Bromato de
Potasio aditivo prohibido desde marzo del 2003 en nuestro pais per 5U toxicidad
59
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ANEXOS
66
ANEXO A RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AlSLADA DE i
PEPINO it
Referencia Pepino 1 Fecha 06122002
IEXCELENTE IDENTIFICACION
Latto plantarum 1
Galeria API 50 CHL V50 Leida el 06122002
Perfil - -- - ++ - -- - ++++ - - -+- + - I I I I I I I I +t+ - +f- ~ - - + + ~ - - - +- + - shy
o - GLY - ERY DARA - LARA + RIB + DXYL - LXYL - ADO - MDX - GAL + GLU + FRU + MNE + SBE - RHA - DUL - INO bull MAN + SOR - MDM + MUG shyNAG + AMY + ARB + ESC + SAL + CEL + MAL + LAC + MEL + SAC + TRE + 1NU - MLZ + RAF + AMD - GLYG - XLT - GEN + TIJR + LYX - TAG - DFUC shyLFUC - DARL + LARL - aNT + 2KG - 5KG shy
--- Taxones significativos rd -----T -- Tests en contra
Lactoplantarum 1 999 092 1
Taxon siguiente Lactobrevis 1 OJ 044 3
i i
Lactoplantarum 1 1 test (5) en contra
D-SORBITOL (SOR) 78
Tax6n siguiente Lactobrevis 1 3 test (s) ert contra
METHYLD-MANNOSIDE (MOlM) 0 MELEZITOSE (MLZ) 14 D-TURANOSE (TUR) 14
67
ampb
ANEXO B RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AISLADA DE REPOLLO FERMENTADO
~
Referencia Repollo fermentado - 3 Fecha 03072003
EXCELENTE IDENTIFICACION
Lactoplantarum 1
Galena API 50 CRL V50 Leida el 03072003
Perfil - - ++ - - - - -H++ - - ~ + - + - I I 1 I I I I -H+ - ++ - - - + + - -- - - + - shy
o - GLY - ERY - DARA - LARA + RIB + DXYL - LXYL - ADO ~ MDX - GAL + GLU + FRU + MNE + SBE ~ RHA - DUL - INO - MAN + SOR - MDM + MDG shyNAG + AMY + ARR + ESC + SAT + CRL + MAL + LAC + MEL + SAC + TRE + lNU - MLZ + RAF + AMI) - GLYG - XLT - GEN + TOR + LYX - TAG - DFUC shyLFUC - DARL - LARL - GNT + 2KG - 5KG shy
------Taxones significativos _ _----- Id--- ---T---- Tests en contra
Lactoplantarum 1 999 095 1
Tax6n siguiente Lactobrevis 1 01 OA8 3
lJactoplantaru01 1 1 test (s) en contra
DSORBITOL (SOR) 78
Taxon siguiente Lactobrevis
METHYL-D-MANNOSIDE D-TURANOSE
1
(MOM) (TOR)
3 test (5) en contra
0 MELEZITOSE 14
(MLZ) 14
i
I
68
ANEXO C RESULTADO PRUEBAS BIOQUWICAS DE CEPA AISLADA DE MUCOSA HUMANA
Referenda Mucosa - 5 Fecha 27012003
BUENA IDENTlFICACION
Galeria API 50 CHL vso Leida el 270112003
Perfil - - - - +t--t - - - + - + - - - - - - - - -+- - - - - + - + - - - - - - - - - - - - - bull - - -+ - +
o - GLY ~ ERY - DARA bull LARA + RID + DXYL + LXYL - ADO bull MDX - GAL + OLU - FRU + MNE - SBE - IlliA - DUL - INa - MAN - SOR - MDM - MOO shyNAG + AMY - ARB - ESC ~ SAL bull CEL - MAL + lAC - MEL + SAC - TRE shyINU - MLZ - RAF - AMD - GLYG - XLT - GEN - 11JR - LYX - TAG - DFUC shyLFUC - DARL - IARL - ONT + 2KO - 5KG +
- - - - - - Taxones significativos - - - - - - - Id T -- Test en contra
Lactobrevis 3 963 088 1
Taxon siguiente Lactoco11inoides 36 075 2
Lactobrevis 3 1 test (s) en contra
GLUCOSE (GLU) 95
-~~~------------~---------------------------~--~-------~--~-----~----------~--------~------------~~--Taxon siguiente Lactocollinoides 2 test (s) en contra
GLUCOSE (GLU) 100 MELIBIOSE (MEL) 25
69
i r
ANEXO D RESULTADO PRUEBAS BIOQIJiMICAS DE CEPA AISLADA DE LECHE FERMENTADA
Referenda Leche fennentada ~ 13 Fecha 27012003
BUENA IDENTIFICACI6N
Galeria API 50 CHL V50 Leida el 270112003
Perfil - - - - -t-t+- - - - + - + - - - bull - - - - -+- - - - - + - + - - - - - - - - - - - - - - - - -+ - +
0 - GLY - ERY - DARA - LARA +Rll3 + DXYL + LXYL - ADO - MDX ~GAL + GLU - FRU + MNE SBE - RHA DUL bull INO MAN - SOR MDM bull MDG shy
~NAG + AMY - ARB - ESC - SAL - CEL - MAL + LAC - MEL + SAC - TRE I lNU - MLZ - RAF - AMD - GLYG - XLT - OEN - IUR LYX - TAG - DFUC bull i
LFUC - DARL - LARL -ONr + 2KG - SKO + 1
- -- - - Taxones significativos - - Id -- T --- Test en contra
Lacta brevis 3 963 088 1
Taxon siguiente Lactocollinoides 36 075 2
Lactobrevis 3 1 test (s) en contra
GLUCOSE (GLU) 95
-----------------------------------------------------------~------------------------------~-------------------Taxon siguiente Lactocollinoides 2 test (s) en contra
GLUCOSE (GLD) 100 MELffiIOSE (MEL) 25
70
II iJ1
I
I ANEXO E RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AISLADA DE REPOLLITAS DE BRUSELAS FERMENTADA
Referencia repollitas de bruselas 15 Fecha 03072003
EXCELENTE IDENTIFICACION
Lactoplantarum 1
Galeria API 50 CHL vsO Leida el 03072003
Perfil - - - - +t - - - - +H+ - +- - +t + - I I I I I I I f ++t - + - - - -+ + - - - -+ -+ - - I ij
o - GLY - ERY - DARA - LARA + RJB + DXYL - LXYL - ADO - MDX - GAL +
GLU + FRU + MNE + SBE RHA + DUL - INO - MAN + SOR + MDM + MOG shyNAG + AMY + ARB + ESC + SAL + eEL + MAL + LAC + MEl + SAC + TRE + i
I1NU - MLZ + RAF AMD GLYG - XLT - aEN + TUR + LYX - TAG - Druc LFUC - DARt + LARL - aNT + 2KG - 5KG shy n ----Taxones significativos ------ Id Tests en contra
Lactoplantarum 1 999 090 o
Taxon siguiente Lacto pentosus 01 012 7
Lactoplantarum 1 o test (s) en contra
Taxon siguiente Lacto pentosus 7 test (8) en contra
GLYCEROL (GLY) 75 D-XYLOSE (DXYL) 100 L-RHAMNOSE (RHA) 25 METHYL-D-MANNOSIDE (MOM) 1 MELEZITOSE (MLZ) 25 RAFFINOSE (RAF) 75 D-ARABITOL (DARL) 0
71
~
I i I
ANEXO F - ANALISIS DE REGRESION PARA pH EN BEBIDA SIN AVENA
Aruilisis de regresi6n polinomial
---~-~-------------------------------------------~-----------~~---------------------~--------------Variable dependiente pHSinAvena ---------------------------~-------------~--------------------~---------------------------------
Error T Parametro Estimado Estandar Estadistico P-Valor
CONSTANTE 535606 0094535 56657 00000 Dia -0150565 0020706 727154 00000 Dia2 000504434 0000871488 578819 00001
---~---------------------------------------------------------------------------------------------------
Anfllisis de Variama -------------------------------------------~-----------~-----------------------------~-~--- jSource Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor 11
------------------------~------------------------------------------------------------------------------~ Mod-elo 155772 2 0118861 4256 00000 Residual 0237877 13 00182983
Total (Corr) 11956 IS
R2 == 867522 percent
pHSinAvena == 535606 - 0150565Dia + 000504434Dia2
72
____
middot ANEXO G - ANALISIS DE REGRESION PARA pH EN BEBIDA CON AVENA
AmUisis de regresion polinomial _____~_____~__-_____~___4____________________bull____bull__________bull_____________~~----_------___________
Variable depcndiente pHConA vena ------------------------------------------------------------------------------------------~--------
Error T Parametro Estimado StAndar Estadfstico P-Valor
---------------------------------------------~-----------------------------------------------_---------CONSTANTE 534463 00801045 667208 00000 Dia -0140407 00175453 800253 00000 DiaA 2 000448098 0000738458 606803 00000
----------------------~---~-----------------------------~------------------------------~----AmUisis de Varianza
---~---------------------------------~---------------------~------------~-------------------~------Source Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio PValor --------------------------~-----------------------------------------------~------------~-----~~--~ ModeJo 159575 2 0797873 6073 00000 Residual 02170798 middot13 00131383 _______~_~ ~_~----------~------~--~-----~-M-----~-----____ _____________~-----------------------Total (COlT) 176654 15
R12 903315 percent
-----------~------------------------------------------------------------------------~-----------pHConAvena 534463 - 0140407Dia + 000448098DfaA 2
73
ANEXO H - ANALTSIS DE REGRESTON PARA ACIDEZ EN BEBJDA SIN AVENA
An8Jisis de Regtesi6fi P6lifJomial
Variable Depefidiefile~ AcidezSinAVenll _______________w_____~______~________________~-----------_________~_________________~~____~___~_____
Error T Pariirnetro Estimado Estandar Estadistico ---------------------------------------~--------------~-~-------~--------------------~------------CONSTANT 0491697 00123217 399051 00000 Dia 00436032 000269882 161564 00000 D1a2 -000144613 000011359 127312 00000 __w___~________________________~-_______-_____~----____________________________~__~---~_--__~___
AriiiJisis de varianza ~_~__~__________~_~____~________~___________- _________e_____________________________bull _____-________
Source Smn de cuadr Df Mean Square F-Ratio PmiddotValor_~~___________________________________bull ______~___________bull ____________bull ______~________w________________
Model 0135203 2 00676013 21747 00000 Residual 000404118 13 000031086
Total (Corr) 0139244 15
R2 970978 percent
AcidezSlnAvena 0491697 + O0436032Dia - 0OOl44613Dia2
74
I
ANEXO I ANALISIS DE REGRESION PARA ACIDEZ EN BEBIDA CON AVENA
1
Anwisis de tegtesi6fi polinomial
Variable dependiente Acidez Con Avena
Error T ParametTo Estimado Stlindar Estadfstico P-Valor ----------------~-------~---------------------~-----------------------------------------------------CONSTANT 0491639 000926607 530578 00000 Diamiddot 00406572 000202955 200326 00000 DfaA 2 0000982559 0000085421 -115025 00000
-------------~----------------------------~-------------------------~-----------------------------------
-------------~-----~~-----------------------------~---------------------------------------------_--Source Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio PValor
-~-------------~----------------------------------~------------------~~-------------------------- Modelo 0288008 2 0144004 81914 00000 Residual 000228539 13 0000175799
----------~~--------------~---------------------------------------------~---------------------------Total (Corr) 0290294 15
RA2 = 992127 percent
-------------------------~----~---~------------~---------------------------------~---------------~
AcidezConAvena == 049163amp + 00406572D1a - 0000982559DiaA2
75
I
(Ilmiddot il
ANEXO J- ANALISIS DE REGRESION PARA RECUENTO LACTOBACILOS PARA BEBIDA SIN AVENA
Amilisis de regresion - Modelo lineal Y = a + bX
------------------------~----------------------~-----------------------------~----------~-----------Variable Dcpendiente LactobacilJusSinAvena Variable independiente Dia
I--------~----------~-----------------------------------~-------~-~--~--------------------------~-Error T
Paramctro Estimado Standard Stadistico P-Valor
----~----~------------~-----~-----------------------~-------------~-----------------------------Intereepto 117347 0389973 300911 00000 Pendiente 00483464 00257889 18747 00903
Analisis de Varianza
---------~------------------~----------------~---------------------------------~---------~----------Source Sum decuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor
------------~---------------------~---------------------~--------------------------------~-----~----Modelo 0916252 1 244835 443 00616 Residual 260706 10 0260706
--~------------~---~------------------~~~-----~-------~---------~~-------------------------------------Total (Corr)352332 11
Coeficiente Correlaci6n = 0509955 R2 = 260054 percent
LactobacillusSinAvena= 117347 + 00483464Dfa
76
ANEXO K- ANALTSIS DE REGRESION PARA RECUENTO LACTOBACILOS PARA DEBIDA CON AVENA
Aruilisis de regresion - Modelo lineal Y = a + hX
Variable Dependiente LactobacillusConAvena Variable Independiente Dia ---~--------------------------------------------------------__-----------__--_--_-----------shy
Error T Paramctro Estimado Standard Estadistico P-Valor -~--------------------------------------------------------------------------------------------------
Irttercepto 118103 0567963 207942 00000 Pendiente 00790304 00375594 210414 00616
-----------------~----------------------------~----~-------~----~----------------------------
Analisis de Varianza
----------------~----------------~------------------~--------------------------~------~--------shySource Swn de cuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor
-----------------~--~--------------------------------------------------------------------------~---~ Mode10 244835 1 244835 443 00616 Residual 552997 10 0552997
Total (Corr)797832 11
Coeficiente Correlacion = 0553964 RI2 = 306875 percent
-----~--------------------------------------------------------~--------------------------------------
LactobacillusConAvena = 118103 + 00790304Dfas
77
224 Prueba para determlnar la especie
Para confirmar el genero y determinar la especie de las diferentes capas aisladas
se hizo una caracterizaci6n bioqufmica utilizando un kit de API 50 CHL Medium
Ref 50 410 que contiene una galed8 de medios que permite realizar el estudio
de fermentaci6n de los 49 azucares de 52 especies de Lactobacillus (Ver Figura 4
y tabla 5)
Figura 4 API CHL 50-Prueba bioquimica
33
225 Pruebas para determinar microorganismos probi6ticos
2251 Resistencia a pH=2 y sales biliares de concentraci6n O3pv
A las cepas idantificades como Lactobacillus brevis y Lactobacillus pantarum sa
las realiz6 Ie prueba dfl resistencia a pH=2 y sales biliares de concentraci6n 03
pv ( Jacobsen et al 1999) Una colonia de cada cepe aislada se inocul6 en 4 mt
de caldo MRS durante cinco dras bajo condiciones de anaerobiosis Oespues de
esta tiempo se dejaron pracipltar los microorganismos por sedimentaci6n se Ie
retire el sobrenadante y al precipitado se Ie adicion6 Sml de caldo MRS
previamente ajustado a pH=2 can seido clorhfdrico (HCI) dentro del mismo tuba de
ensayo G igual sa hizo can otro tubo previamente incubado pero a este se Ie
adiciono 5ml de caldo MRS con sales biliares a una concentra~i6n de 03 plv y
ambos se incuberon a 37deg C por 2 haras Sa midio 01 mi de cada uno de los
tubas al tiempo 0 y a las 2 horas y sa inoculeron en superficie en caJas de petri
con agar MRS S9 incubaron a 37deg C bajo anaerobiosis durante 48 horas Se
compararon visualrrente en cada caja de petri el crecimiento en superficie y las
que presentaron crecimiento en tos dos tiempos (0 y 2 horas) tanto en at media
acido como en sales I se consideraron resistentes a pH=2 y sales biliares (03
pv)
(Ver Tabla 6)
34
226 Conservacion
Todas fas capas que habian dado positiva Jas pruebas anteriores y que reaultaron
resistentes a pH=2 y sales biliares 03 pv y despues de identificadas en API 50
CHL sa repicaron en agar MRS en tuba inclinado y despues de Incubar a 37deg C
por 48 horas bajo anaerobiosis se Ctlbrie el biser completamente can aceite
mineral esteril y sa guardaron en refrigeraci6n
227 Elaboracj6n de fa bebida fermentada
2271 Preparaci6n de la mue$tra
Sa tome 1 mt de caldo MRS previamante inoculado e incubado que presentaba
una concentracion de Lactobacillus brevis de 27x108 Iml segun la escaJa de Mac
Farlan y sa adiciono a 9ml de leche pasteurizada en un tubo sa dej6 incubanda
en anaerobiosis por 48 hores Luego se pasaron estos 10 ml a un frasco qua
cont~nie 90 ml de leche pasterizada y se dej6 incubando par 48 haras en
anaerobiosis
35
2272 Adici6n del inOculo
A 900ml de leche pasteurizada se Ie adicion61os 100 ml de leche que habia sido
previamente ino(ulada dos veces con la cepa posteriormente se deja
fermantando la lache a temperatura de 37deg C
2273 Control de Ja fermentaci6n
Las muestras se hicieron por cuadruplicado y se les hizo un seguimiento de
aoidez hasta un valor entre 04 y 05 expresada como Bcido lactico esta
procedimiento corresponde a la babida fermentada sin prebi6tico La bebida ~on
prebi6tico tiene al mismo proeedirnianto pero adicionalmente se agrag6 avena a
una concentraci6n de 05 en el momento de la adici6n del in6e410 a los 900 ml
de leehe pasteurlzada y el procedimiento sigui6 igual al de la bebida sin prebi6tico
tambien se hizo por cuadruplicado
2274 Refrigeracl6n
Despues que las mezclas con y sin prebiotico alcanzaron el de acidez
requarido se IIeva ron a refrigeraci6n a una temperatura de 4deg C p~r 24 horas
para frenar proce~os metab6licos de los microorganisrtlos Despues de este
ti~mpo se procedi6 al batido
36
1 2275 Batido
Con un agitador se procedi6 a batir las bebidas para romper et coagulo formado
y de esta manera homogeneizar la mazela y obtener asf la bebida fermentada
2276 Envasado y almacenamiento
Ambas bebidas se envasaron en frascos vidrio para hacerles seguimiento de pH
acidez(expresado como acido tacticol y recuento de Lactobacillus breviSf los
dies 27 14 Y 21 despues de elaboradas las bebidas perfodo durante el cualta
muestra permanecfa afmacenada a temperatura de refrigeracion(Ver Figura 5
37
Fjgura 5 Diagrama de Flujo
PREPARACION DE LA MUESTRA
ADICION DEL INOCULO
~_____~_B~ATIDO~______~
INCUBACION 37deg C hasta acidez = 04-05 acido laotico
ENFRIAMIENTO
hasta 4 0 C ~------~ ~------~
ENVASADO Y ALMACENAMJENTO
dUrante 21 dfas a Temperatura 4 0 C
38
1
228 Determinaci6n del pH
Se determino por el metoda potenciometrico en un pH-metro manual durante los
dias 2) 7 14 Y 21 de las bebidas lacteas sin y con prebi6tica (Ver Tablas 7 y 8)
229 Oeterminaci6n de la acidez (Expresadfl como acido
lactica)
Se tomaron 9 mJ de las bebida~ sa Ie adicionaron 2 gotas de fanoftaleina como
indicador y sa titulo fa acidez con NaOH 01 N hasta la aparicion de un cotor rosado
debit EI volumen de NaOH utilizado se reporta como valor de de acidez
(VerTablas 10 y 11)
2210 Prueba de viabilidad
Qurante el perfoda de almacenamiento de la bebida lactea se procedi6 a hacer la
prueba de viabiHdad en los dias 7 14 Y 21 para determinar Si los lactobacilfus
permanecfan vivOs a una concentraci6n minima de 106 hasta el dia 21 como 10
establece eJ Articulo 10 de la Rasolucion 2310 del Ministerio de $alud de
Colombja
39
Para asta prueba se tamaron 10 rnl de muestra y se adicionaron a 90 ml de caldo
MRS ruego a partir de esta se hicieron diluciones de 10-2 hasta 10-11 de las
diluciones 109101deg 10-11 se inocul6 1 ml de cada uno en agar MRS siguiendo el
metodo de siembra en profundidad y por duplicado e incubando a 370 C x 5 dras
en anaerobiosis y luego se hicieron tos recuentos por duplicado para esi reportar
los recuentos promedio (Ver Tablas 13 y 14)
2211 AniUisls microbiol6glco de las bebidas Iicteas(con y sin
avena)
Con el fin de determinar las condiciones higienico-sanitarias del producto se
realizaron las pruebas microbiol6gicas de Recuento de mohos y fevadurasml en
agar OGY Recuento en superficia de Staphylococcus coagulasa positivoml en
agar Baird Parker Numero Mas Probable (NMP) de coUfor-mes totales y
Escherichia coliml en caldo Fluorocult y Presencia de Salmonela25ml con BHI
caldo tetrationato y agar Hecktoen (Montoya 1999)
(Var tabla 16)
2212 AnaUsis estadistico
A los datos obtenidos en la medici6n de pH acidez (expresada como Beido
laclico) en los dras 2714 Y 21 y el recuento de Lactobacillus en los dras 714 y21
40
realizados a los dos tratamlentos se tes aplic6 1a prueba t porque solo difieren
en la presencia 0 ausencia del prebi6tico para evaluar si habra diferencia
estadfsticamente significativa para los dos tratamientbs(Ver Tablas9 12 y 15)
41
3 RESULTADOS Y DISCUSION
31 Coloraci6n de Gram y morfologfa
Las cepas aisladas fesultaron Gram positivas (Ver Figura 6) colonias grandes
cremosas dE) color beige con bordes homogeneos y c6ncavos en su
morfologia (Ver Figura 3) resultando de acuerdo a 10 especificado en Stanley
1989 para Lactobacillus
32 Prueba de esporulaci6n y cataJasa
Los resultados de la pruebas de esporulaci6n y catalasa indicados en las
Tablas 3 y 4 respeclivamente dieron conforme a 10 especificado en Stanley
1989 para Lactobacillus
42
1
2 3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
TABLA 3 Resultado de prueba de esporuJaci6n
CEPA RESULfADO ESPORULACION
-- -------------
43
l i ~II bull ~ I I
TABLA 4 Resultado prueba de la catalasa
CEPA RESULTADO CATALASA
1 -2 -3 -4 -5 -6 -7 8 -9 -10 -11 12 -13 -14 -15 -16
3~3 Prueba para determinar la especie
Oespues de hacer las pruebas para seleccionar las cepas sospechosas de ser
Lactobacillus se realizo las pruebas bioquimicas fograndose identificar
Lactobacillus plantarum aislctdo de pepino repollo y repollitas de bruselas
44
fermentados y Lactobacillus brevis de mucosa vaginal y leche fermentada (Ver
Anexos del A al E y Tabla 5)
TABLA 5 Resultado identlficaci6n cepa~
CEPA NOMBRE
1 Lactobacillus planfarum
3 Lactobacillus plantarum
5 Lactobacillus brevis
13 Lactobacillus brevis
15 Lactobacillus plantarum
34 Pruebas para determinar microorganismos probi6ticos
las cepas de Lactobacillus brevis y Lactobacillus plantarum mostraron
rasistencia al medio acido de pH =2 Y sales biliares 03 pv resultado similar al
encontrado por Jacobsen et al 1999 para Lactobacillus plantarum (Ver tabla 6)
45
middot
~~~ttiI lltlmiddot~COX~dtJ ~xtc_~ 2 tr~ k-JlL~middot
-)~~TO DE lJIBUOTECUl rjRL]OTtCA twn GO1IU1
TABLA 6 Resultados a pruebas de resistencia a pH=2 y sales biliares 03 plv
CEPA RESISTENCIA pH=2 RESISTENCfA A SALES BIUARES ()3 pv
1 + +
2 + +
3 + +
4 + +
5 +
6 + +
7 + +
8 + +
9 + +
10 + +
11 + +
12 + +
13 + +
14 +1shy +M
15 + +
16 + +
+1 crecimiento debil
+ crecimiento abundante
46
Figura 6 Lactobacillus brevis Gram + aislado de leche fermentada
Ai observar en placa las celulas de lactobacilos despues de real1zar las pruebas
de resistenCia a la acidez y sales biliares se observo una tendencia a aglomerarse
posiblemente como un mecanismo de proteccion cOlitra estos medios que pueden
lIegar a ser adversos para elias (Ver figuras 7 y 8)
47
Figura 7 Lactobacillus brevis aislada de leche fermentada despu~s de la prueba de resistencia a pH=2
Figura 8 Lactobacillus brevis aislada de leche fermentada despues de la prueba de resistencie asales biUares 03 plv
fI
48
35 --Seguimiento del-pH-en-la-bebidaJacteacon y sin -prebi6tico
A continuacion se muestran las Tablas 7 y 8 donde sa registian los datos
recopilados de pHdurante 10$ dras Z 7 14 Y21 para las bebidas laaeas con ysin
prebi6tioo
TABLA 1 ResultadopH yogur sin avena
Dia Repetition 1 Repetici6n 2 Repeticion 3 Repetici6n 4
2 526 501 51 52
7 446 433 438 44
14 439 435 437 436
21 439 437 438 437
TABLA 8 -ResultadopHyogur con avena
Dia Repeticion 1 Repeticion2 Repeticion 3 - Repeticion 4
2 509 523 51 515
7 447 442 445 442
14 436 -438 439 437
21 432 433 435 434
Observando la Figura 9podamos ver que el pH en el -dfado$ para los dos
tratamientos as igual y empieza a descender rapidamente para estabilizarse a
partir del dra 7(Ver figura 9)
49
Figura 9 Comparacj6n de medias para -el pH
Comparaci6n de medias para pH
55 ~ 5 +----=gtIIIi-~i~~----=-r--it~ -- pH sin avena
a 45 1--~~~~=~~ 4 --- pH con
avena35 t-----r-- -------=------=--= ------- - ----
2 7 14 21
Dias
Aplicando la prueba t para comparar las medias de pH I S6 muestia una diferencia
altamants significativa en los dos tratamientos para el dia 21 (pltO05)
(Ver tabla 9)
TABLA 9 Compaiaci6n de medias para pH
DtAS SIN AVENA CON AVENA te p (VALOR)
2 514 514 0 10
7 439 444 -1 61 0159
14 437 I
438 -070 0510
21 438 433 528 00019 shy
- DiFERENCIA AlTAMENTE SIGNIFICATIVA
50
I
AI aplicar regrasi6n a los datos sa obtiene al modelo estimado
pHSinAyena =535606 - 01505650Ia +0005044340IaI2
La variabilidad en la respuesta de pH asta siendo explicada en un 8S7522 por
el modelo (Ver Anexo F)
EI tratamiento con avena mostro el siguiente modelo al analisis de ragresi6n
pHConAvena =534463 ~ 0140407Dia + 0004480980Ia2
La variabilidad an la respuesta de pH asta siendo explicada en un 903315 par
el nlodelo(Ver anexo G)
36 Seguimiento de la acidezmiddotmiddot expresada comomiddot de acido
lactico
A continuaci6n sa muestran las Tablas 10 y 11 donde sa registran los datos
tecopilados de acidezmiddotdurante los dias 27 14 Y 21 para las pebidas taetees con y
sin prebi6tico
TABLA 10 Resuttadode acidez (expresadocomo acido tactico) yogurt sin avena
CIA R~petici6n1 Repeticion2 Repetici6n 3 Repeticion 4
2 054 06 057 058
7 072 074 073 0]2
14 080 083 082 082
21 0]4 079 078 077
51
TABLA 11 Resultado de aCidez (expresado como acido Icktico) yogurt con avena
Dia Repetici6n 1 RepetiCi6n 2 Repetici6n 3 Repetici9n 4
2 059 055 058 057
7 071 073 072 072
14 089 087 088 086
21 092 091 090 091
Observando la Figura 10 se puede concluir que la acidez empieza a aumentar
hasta el dia 14 y luego trata de estabilizarse para los dos tratamientos
(Ver figura 10)
Figura 10 Comparaci6n de medias para la acidez
N G)
Comparacion de medias para acidez
1
2 0I 5 -+--=--------=-~~~= u
ltC
- Acidez sin avena
2 7 14
Dias
52
21
-it- Acidez con avena
Aplicando la prueba t para camparar las madias de acidez se muestra una
diferencia altarnante significativa en los dos tratamiantos para los dias 14 y 21
(pltO05)
(Var tabla 12)
TABLA 12Comparaci6n de medias para Acidez
DIASmiddot SIN AVENA CON AVENA te p(VALOR)
2 0572 0572 0 10
7 0727 0720 119 0278
14 0818 0875 -638 000070shy
21 077 091 -1212 i 0000019 shy
DIFERENCIA AL TAMENTE SlGNIFICATIVA
AI aplicar r~gresi6n a los datos se obtiene el modelo estimado
AcidezSlnAIena = 0491897 + O0436032Dia O00144613DfaA2
La variabilidad en la respuesta de acidez asta siendoexplicada en un 970978
por al modelo (Ver anexo H)
EI tratamiento con avena mostro elsiguiente modeloj a1 analisis de regresion
AcidezConAvena = 0491638 + 00406572Oia - OQOO982559OiaA2
La variabilidad enla respuesta acidez esta siendo explicadaen un 99212 por
el modelo (Ver anexo J)
53
I ~
37 Prueba de viabiJidad
A continuaci6n sa muestran las Tab~as 13 y 14 donde sa presentan los datos
recopilados del recuento de Lactobacilos durante los dias 7 14 Y 21 para las
bebidas lacteas con y sin prebi6tico
TABLA 13 Recuento de Lactobacilos (UFCml) yogurt sin avena
Dia Repetici6n 1 Repetici6n 2 Repeticion 3 Reptttici6n 4
7 1880X10l1 1454X1011 1642X1011 1780X10~
14 1560X10~ 646X1011J 1890X10l 140X10l1
21 1200x10lu 128Ox10u 1745x10J 1520x101V
TABLA 14 Recuento de Lactobacilos (UFCml) yogurt con avena
Dfa Repetieion 1 Repetici6n 2 Repeticion 3 Repeticf6n 4
7 1600X10lt 1240X10t 1640X10ll 1980X10t
14 540X1011 427X10n 546X10n 720X10ll
21 500x1011 492x1011 712)(1011 980x10~
AI analizar la Figura 11 sa puede observar un recuento mayor de Lactobacilos
en al tratamiento con avena resultado de acuerdo a 10 encontrado por Alander at
aI 1999 Kontula et aI 1998 y Jaskari et aI 1998
54
Figura 11 Comparaci6n de medias para Log Lactobacillus
Comparacion de medias para log Lactobacillus
~ 1350
-+- Sac Sin--() 13 co avenaIII
bull 125 -- Bac con 0)
0 12 avenaJ
115 7 14 21
Dias
Aplicando la prueba t para comparar las medias de recuento de Lactobacillus no
se encontr6 una diferenc1a estadfsUcamente significative entre los dos
tratamientos (Ver tabla 15)
Este aumento en al racuento influy6 en la disminuci6n del pH y en el aumento de
fa aeidez por la fermentacion que realizan los Lactobacillus sobre fa lactosa de la
lache y la avena adicionada como prebi6tico
55
1
TABLA 15 Comparaci6n medias lag Lactobacillus
DIAS SIN AVENA CON AVENA tc p(VALOR)
7 122257 122022 04846 06451
14 121065 132393 -19602 00977
21 129025 133087 -08236 04416
At aplicar regresion a los datos se obtiane al modelo astimado
LactobacillusSinAvena= 117347 + 004834640Ia
La variabilidad en la respuesta del recuento de LactobaCillus ssta siendo
explicada en un 260054 por el mod$loVar anexo J)
EI tratamiento con avena mostr6 al siguiente modalo al anal isis de regresion
Lactobacillu$ConAvena =118103 + 007903040Ias
La variabilidad en la respuesta de recuento esta siendo explicada en un 3068
por al modelo(Ver anexo K)~
38 Analisi$ microbiol6gicos de las bebidas lacteas con y sin
En la Tabla 16 estan recopilados los resultados microbiol6gieos obtenidos en ras
muestras con los dos tratamientos (con y sin avena)
I [
sa
TABLA 16 Resultados analisis microbiologico
Recuento de mohos y levaduras Iml lt10
Recuento de Staphylococcus coagulase positiva Iml lt100
NMP coliformes fotales y Escherichia coli Iml lt3
Presencia de Salmonella25ml Ausente
Los resultados de este analisis demuestran que las bebidas fermentadas con y
sin avena~ astan fibres de microorganismos patogenos
57
1
4 CONCLUSIONES
Se aislaron cepas nativas de Lactobacillus plantarum de las muestras vegetates
de repollo pepino repollitas de bruselas fermentadas y Lactobacillus brevis de
lache fermentada y mucosa vaginal humana Ambas cepas resistieran un pH=2 y
una concentraci6n de sales biliares det 03 ptv dos earacteristicas importantes
en los probi6ticos
Lamiddot cepa de Lactobacillus brevis aislada de lache Sa utiliz6 para elaborar una
bebida fermentada sin y con avana comoingrediente prebiotico obteniendose un
aJimento centon recuento del probi6tico viable durante 21 dras de seguimiento
ademas libre de microorganismos )at6gen05
No se encontr6 efecta significativo de la avena sobre Ie viabilidad del Lactobacillus
brevis aunque sa presento un aumento en 61 recuento de estos en la bebida con
avena
58
plusmn ~
5 RECOMENDACIONES
Ensayar la cepa de Lactobacillus plantartJm en productos carnicos madurados
como el salami
Ensayar la cepa de Lactobacillus l)revs en otros derivados lecteos como queso
quesito queso crema
Continuar con el estudio de estos microorganismos y caracterizarlos
molecularmente ademas de estudiar su capacidad de adherencja a fa mucosa
intestinal sobre algunes Hneas celulares como las CaCo~2
Estudiarel efedo de la avena sabre la viabiJidad del Lactobacillus breyis a una
concentraci6n mayor de 05
Realizer ensayos can las cepas de Lactobacillus brevis y Lactobrlcillus pJantarum
para elaborar masas acidas para panificacion reemplazando el Bromato de
Potasio aditivo prohibido desde marzo del 2003 en nuestro pais per 5U toxicidad
59
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65
ANEXOS
66
ANEXO A RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AlSLADA DE i
PEPINO it
Referencia Pepino 1 Fecha 06122002
IEXCELENTE IDENTIFICACION
Latto plantarum 1
Galeria API 50 CHL V50 Leida el 06122002
Perfil - -- - ++ - -- - ++++ - - -+- + - I I I I I I I I +t+ - +f- ~ - - + + ~ - - - +- + - shy
o - GLY - ERY DARA - LARA + RIB + DXYL - LXYL - ADO - MDX - GAL + GLU + FRU + MNE + SBE - RHA - DUL - INO bull MAN + SOR - MDM + MUG shyNAG + AMY + ARB + ESC + SAL + CEL + MAL + LAC + MEL + SAC + TRE + 1NU - MLZ + RAF + AMD - GLYG - XLT - GEN + TIJR + LYX - TAG - DFUC shyLFUC - DARL + LARL - aNT + 2KG - 5KG shy
--- Taxones significativos rd -----T -- Tests en contra
Lactoplantarum 1 999 092 1
Taxon siguiente Lactobrevis 1 OJ 044 3
i i
Lactoplantarum 1 1 test (5) en contra
D-SORBITOL (SOR) 78
Tax6n siguiente Lactobrevis 1 3 test (s) ert contra
METHYLD-MANNOSIDE (MOlM) 0 MELEZITOSE (MLZ) 14 D-TURANOSE (TUR) 14
67
ampb
ANEXO B RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AISLADA DE REPOLLO FERMENTADO
~
Referencia Repollo fermentado - 3 Fecha 03072003
EXCELENTE IDENTIFICACION
Lactoplantarum 1
Galena API 50 CRL V50 Leida el 03072003
Perfil - - ++ - - - - -H++ - - ~ + - + - I I 1 I I I I -H+ - ++ - - - + + - -- - - + - shy
o - GLY - ERY - DARA - LARA + RIB + DXYL - LXYL - ADO ~ MDX - GAL + GLU + FRU + MNE + SBE ~ RHA - DUL - INO - MAN + SOR - MDM + MDG shyNAG + AMY + ARR + ESC + SAT + CRL + MAL + LAC + MEL + SAC + TRE + lNU - MLZ + RAF + AMI) - GLYG - XLT - GEN + TOR + LYX - TAG - DFUC shyLFUC - DARL - LARL - GNT + 2KG - 5KG shy
------Taxones significativos _ _----- Id--- ---T---- Tests en contra
Lactoplantarum 1 999 095 1
Tax6n siguiente Lactobrevis 1 01 OA8 3
lJactoplantaru01 1 1 test (s) en contra
DSORBITOL (SOR) 78
Taxon siguiente Lactobrevis
METHYL-D-MANNOSIDE D-TURANOSE
1
(MOM) (TOR)
3 test (5) en contra
0 MELEZITOSE 14
(MLZ) 14
i
I
68
ANEXO C RESULTADO PRUEBAS BIOQUWICAS DE CEPA AISLADA DE MUCOSA HUMANA
Referenda Mucosa - 5 Fecha 27012003
BUENA IDENTlFICACION
Galeria API 50 CHL vso Leida el 270112003
Perfil - - - - +t--t - - - + - + - - - - - - - - -+- - - - - + - + - - - - - - - - - - - - - bull - - -+ - +
o - GLY ~ ERY - DARA bull LARA + RID + DXYL + LXYL - ADO bull MDX - GAL + OLU - FRU + MNE - SBE - IlliA - DUL - INa - MAN - SOR - MDM - MOO shyNAG + AMY - ARB - ESC ~ SAL bull CEL - MAL + lAC - MEL + SAC - TRE shyINU - MLZ - RAF - AMD - GLYG - XLT - GEN - 11JR - LYX - TAG - DFUC shyLFUC - DARL - IARL - ONT + 2KO - 5KG +
- - - - - - Taxones significativos - - - - - - - Id T -- Test en contra
Lactobrevis 3 963 088 1
Taxon siguiente Lactoco11inoides 36 075 2
Lactobrevis 3 1 test (s) en contra
GLUCOSE (GLU) 95
-~~~------------~---------------------------~--~-------~--~-----~----------~--------~------------~~--Taxon siguiente Lactocollinoides 2 test (s) en contra
GLUCOSE (GLU) 100 MELIBIOSE (MEL) 25
69
i r
ANEXO D RESULTADO PRUEBAS BIOQIJiMICAS DE CEPA AISLADA DE LECHE FERMENTADA
Referenda Leche fennentada ~ 13 Fecha 27012003
BUENA IDENTIFICACI6N
Galeria API 50 CHL V50 Leida el 270112003
Perfil - - - - -t-t+- - - - + - + - - - bull - - - - -+- - - - - + - + - - - - - - - - - - - - - - - - -+ - +
0 - GLY - ERY - DARA - LARA +Rll3 + DXYL + LXYL - ADO - MDX ~GAL + GLU - FRU + MNE SBE - RHA DUL bull INO MAN - SOR MDM bull MDG shy
~NAG + AMY - ARB - ESC - SAL - CEL - MAL + LAC - MEL + SAC - TRE I lNU - MLZ - RAF - AMD - GLYG - XLT - OEN - IUR LYX - TAG - DFUC bull i
LFUC - DARL - LARL -ONr + 2KG - SKO + 1
- -- - - Taxones significativos - - Id -- T --- Test en contra
Lacta brevis 3 963 088 1
Taxon siguiente Lactocollinoides 36 075 2
Lactobrevis 3 1 test (s) en contra
GLUCOSE (GLU) 95
-----------------------------------------------------------~------------------------------~-------------------Taxon siguiente Lactocollinoides 2 test (s) en contra
GLUCOSE (GLD) 100 MELffiIOSE (MEL) 25
70
II iJ1
I
I ANEXO E RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AISLADA DE REPOLLITAS DE BRUSELAS FERMENTADA
Referencia repollitas de bruselas 15 Fecha 03072003
EXCELENTE IDENTIFICACION
Lactoplantarum 1
Galeria API 50 CHL vsO Leida el 03072003
Perfil - - - - +t - - - - +H+ - +- - +t + - I I I I I I I f ++t - + - - - -+ + - - - -+ -+ - - I ij
o - GLY - ERY - DARA - LARA + RJB + DXYL - LXYL - ADO - MDX - GAL +
GLU + FRU + MNE + SBE RHA + DUL - INO - MAN + SOR + MDM + MOG shyNAG + AMY + ARB + ESC + SAL + eEL + MAL + LAC + MEl + SAC + TRE + i
I1NU - MLZ + RAF AMD GLYG - XLT - aEN + TUR + LYX - TAG - Druc LFUC - DARt + LARL - aNT + 2KG - 5KG shy n ----Taxones significativos ------ Id Tests en contra
Lactoplantarum 1 999 090 o
Taxon siguiente Lacto pentosus 01 012 7
Lactoplantarum 1 o test (s) en contra
Taxon siguiente Lacto pentosus 7 test (8) en contra
GLYCEROL (GLY) 75 D-XYLOSE (DXYL) 100 L-RHAMNOSE (RHA) 25 METHYL-D-MANNOSIDE (MOM) 1 MELEZITOSE (MLZ) 25 RAFFINOSE (RAF) 75 D-ARABITOL (DARL) 0
71
~
I i I
ANEXO F - ANALISIS DE REGRESION PARA pH EN BEBIDA SIN AVENA
Aruilisis de regresi6n polinomial
---~-~-------------------------------------------~-----------~~---------------------~--------------Variable dependiente pHSinAvena ---------------------------~-------------~--------------------~---------------------------------
Error T Parametro Estimado Estandar Estadistico P-Valor
CONSTANTE 535606 0094535 56657 00000 Dia -0150565 0020706 727154 00000 Dia2 000504434 0000871488 578819 00001
---~---------------------------------------------------------------------------------------------------
Anfllisis de Variama -------------------------------------------~-----------~-----------------------------~-~--- jSource Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor 11
------------------------~------------------------------------------------------------------------------~ Mod-elo 155772 2 0118861 4256 00000 Residual 0237877 13 00182983
Total (Corr) 11956 IS
R2 == 867522 percent
pHSinAvena == 535606 - 0150565Dia + 000504434Dia2
72
____
middot ANEXO G - ANALISIS DE REGRESION PARA pH EN BEBIDA CON AVENA
AmUisis de regresion polinomial _____~_____~__-_____~___4____________________bull____bull__________bull_____________~~----_------___________
Variable depcndiente pHConA vena ------------------------------------------------------------------------------------------~--------
Error T Parametro Estimado StAndar Estadfstico P-Valor
---------------------------------------------~-----------------------------------------------_---------CONSTANTE 534463 00801045 667208 00000 Dia -0140407 00175453 800253 00000 DiaA 2 000448098 0000738458 606803 00000
----------------------~---~-----------------------------~------------------------------~----AmUisis de Varianza
---~---------------------------------~---------------------~------------~-------------------~------Source Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio PValor --------------------------~-----------------------------------------------~------------~-----~~--~ ModeJo 159575 2 0797873 6073 00000 Residual 02170798 middot13 00131383 _______~_~ ~_~----------~------~--~-----~-M-----~-----____ _____________~-----------------------Total (COlT) 176654 15
R12 903315 percent
-----------~------------------------------------------------------------------------~-----------pHConAvena 534463 - 0140407Dia + 000448098DfaA 2
73
ANEXO H - ANALTSIS DE REGRESTON PARA ACIDEZ EN BEBJDA SIN AVENA
An8Jisis de Regtesi6fi P6lifJomial
Variable Depefidiefile~ AcidezSinAVenll _______________w_____~______~________________~-----------_________~_________________~~____~___~_____
Error T Pariirnetro Estimado Estandar Estadistico ---------------------------------------~--------------~-~-------~--------------------~------------CONSTANT 0491697 00123217 399051 00000 Dia 00436032 000269882 161564 00000 D1a2 -000144613 000011359 127312 00000 __w___~________________________~-_______-_____~----____________________________~__~---~_--__~___
AriiiJisis de varianza ~_~__~__________~_~____~________~___________- _________e_____________________________bull _____-________
Source Smn de cuadr Df Mean Square F-Ratio PmiddotValor_~~___________________________________bull ______~___________bull ____________bull ______~________w________________
Model 0135203 2 00676013 21747 00000 Residual 000404118 13 000031086
Total (Corr) 0139244 15
R2 970978 percent
AcidezSlnAvena 0491697 + O0436032Dia - 0OOl44613Dia2
74
I
ANEXO I ANALISIS DE REGRESION PARA ACIDEZ EN BEBIDA CON AVENA
1
Anwisis de tegtesi6fi polinomial
Variable dependiente Acidez Con Avena
Error T ParametTo Estimado Stlindar Estadfstico P-Valor ----------------~-------~---------------------~-----------------------------------------------------CONSTANT 0491639 000926607 530578 00000 Diamiddot 00406572 000202955 200326 00000 DfaA 2 0000982559 0000085421 -115025 00000
-------------~----------------------------~-------------------------~-----------------------------------
-------------~-----~~-----------------------------~---------------------------------------------_--Source Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio PValor
-~-------------~----------------------------------~------------------~~-------------------------- Modelo 0288008 2 0144004 81914 00000 Residual 000228539 13 0000175799
----------~~--------------~---------------------------------------------~---------------------------Total (Corr) 0290294 15
RA2 = 992127 percent
-------------------------~----~---~------------~---------------------------------~---------------~
AcidezConAvena == 049163amp + 00406572D1a - 0000982559DiaA2
75
I
(Ilmiddot il
ANEXO J- ANALISIS DE REGRESION PARA RECUENTO LACTOBACILOS PARA BEBIDA SIN AVENA
Amilisis de regresion - Modelo lineal Y = a + bX
------------------------~----------------------~-----------------------------~----------~-----------Variable Dcpendiente LactobacilJusSinAvena Variable independiente Dia
I--------~----------~-----------------------------------~-------~-~--~--------------------------~-Error T
Paramctro Estimado Standard Stadistico P-Valor
----~----~------------~-----~-----------------------~-------------~-----------------------------Intereepto 117347 0389973 300911 00000 Pendiente 00483464 00257889 18747 00903
Analisis de Varianza
---------~------------------~----------------~---------------------------------~---------~----------Source Sum decuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor
------------~---------------------~---------------------~--------------------------------~-----~----Modelo 0916252 1 244835 443 00616 Residual 260706 10 0260706
--~------------~---~------------------~~~-----~-------~---------~~-------------------------------------Total (Corr)352332 11
Coeficiente Correlaci6n = 0509955 R2 = 260054 percent
LactobacillusSinAvena= 117347 + 00483464Dfa
76
ANEXO K- ANALTSIS DE REGRESION PARA RECUENTO LACTOBACILOS PARA DEBIDA CON AVENA
Aruilisis de regresion - Modelo lineal Y = a + hX
Variable Dependiente LactobacillusConAvena Variable Independiente Dia ---~--------------------------------------------------------__-----------__--_--_-----------shy
Error T Paramctro Estimado Standard Estadistico P-Valor -~--------------------------------------------------------------------------------------------------
Irttercepto 118103 0567963 207942 00000 Pendiente 00790304 00375594 210414 00616
-----------------~----------------------------~----~-------~----~----------------------------
Analisis de Varianza
----------------~----------------~------------------~--------------------------~------~--------shySource Swn de cuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor
-----------------~--~--------------------------------------------------------------------------~---~ Mode10 244835 1 244835 443 00616 Residual 552997 10 0552997
Total (Corr)797832 11
Coeficiente Correlacion = 0553964 RI2 = 306875 percent
-----~--------------------------------------------------------~--------------------------------------
LactobacillusConAvena = 118103 + 00790304Dfas
77
225 Pruebas para determinar microorganismos probi6ticos
2251 Resistencia a pH=2 y sales biliares de concentraci6n O3pv
A las cepas idantificades como Lactobacillus brevis y Lactobacillus pantarum sa
las realiz6 Ie prueba dfl resistencia a pH=2 y sales biliares de concentraci6n 03
pv ( Jacobsen et al 1999) Una colonia de cada cepe aislada se inocul6 en 4 mt
de caldo MRS durante cinco dras bajo condiciones de anaerobiosis Oespues de
esta tiempo se dejaron pracipltar los microorganismos por sedimentaci6n se Ie
retire el sobrenadante y al precipitado se Ie adicion6 Sml de caldo MRS
previamente ajustado a pH=2 can seido clorhfdrico (HCI) dentro del mismo tuba de
ensayo G igual sa hizo can otro tubo previamente incubado pero a este se Ie
adiciono 5ml de caldo MRS con sales biliares a una concentra~i6n de 03 plv y
ambos se incuberon a 37deg C por 2 haras Sa midio 01 mi de cada uno de los
tubas al tiempo 0 y a las 2 horas y sa inoculeron en superficie en caJas de petri
con agar MRS S9 incubaron a 37deg C bajo anaerobiosis durante 48 horas Se
compararon visualrrente en cada caja de petri el crecimiento en superficie y las
que presentaron crecimiento en tos dos tiempos (0 y 2 horas) tanto en at media
acido como en sales I se consideraron resistentes a pH=2 y sales biliares (03
pv)
(Ver Tabla 6)
34
226 Conservacion
Todas fas capas que habian dado positiva Jas pruebas anteriores y que reaultaron
resistentes a pH=2 y sales biliares 03 pv y despues de identificadas en API 50
CHL sa repicaron en agar MRS en tuba inclinado y despues de Incubar a 37deg C
por 48 horas bajo anaerobiosis se Ctlbrie el biser completamente can aceite
mineral esteril y sa guardaron en refrigeraci6n
227 Elaboracj6n de fa bebida fermentada
2271 Preparaci6n de la mue$tra
Sa tome 1 mt de caldo MRS previamante inoculado e incubado que presentaba
una concentracion de Lactobacillus brevis de 27x108 Iml segun la escaJa de Mac
Farlan y sa adiciono a 9ml de leche pasteurizada en un tubo sa dej6 incubanda
en anaerobiosis por 48 hores Luego se pasaron estos 10 ml a un frasco qua
cont~nie 90 ml de leche pasterizada y se dej6 incubando par 48 haras en
anaerobiosis
35
2272 Adici6n del inOculo
A 900ml de leche pasteurizada se Ie adicion61os 100 ml de leche que habia sido
previamente ino(ulada dos veces con la cepa posteriormente se deja
fermantando la lache a temperatura de 37deg C
2273 Control de Ja fermentaci6n
Las muestras se hicieron por cuadruplicado y se les hizo un seguimiento de
aoidez hasta un valor entre 04 y 05 expresada como Bcido lactico esta
procedimiento corresponde a la babida fermentada sin prebi6tico La bebida ~on
prebi6tico tiene al mismo proeedirnianto pero adicionalmente se agrag6 avena a
una concentraci6n de 05 en el momento de la adici6n del in6e410 a los 900 ml
de leehe pasteurlzada y el procedimiento sigui6 igual al de la bebida sin prebi6tico
tambien se hizo por cuadruplicado
2274 Refrigeracl6n
Despues que las mezclas con y sin prebiotico alcanzaron el de acidez
requarido se IIeva ron a refrigeraci6n a una temperatura de 4deg C p~r 24 horas
para frenar proce~os metab6licos de los microorganisrtlos Despues de este
ti~mpo se procedi6 al batido
36
1 2275 Batido
Con un agitador se procedi6 a batir las bebidas para romper et coagulo formado
y de esta manera homogeneizar la mazela y obtener asf la bebida fermentada
2276 Envasado y almacenamiento
Ambas bebidas se envasaron en frascos vidrio para hacerles seguimiento de pH
acidez(expresado como acido tacticol y recuento de Lactobacillus breviSf los
dies 27 14 Y 21 despues de elaboradas las bebidas perfodo durante el cualta
muestra permanecfa afmacenada a temperatura de refrigeracion(Ver Figura 5
37
Fjgura 5 Diagrama de Flujo
PREPARACION DE LA MUESTRA
ADICION DEL INOCULO
~_____~_B~ATIDO~______~
INCUBACION 37deg C hasta acidez = 04-05 acido laotico
ENFRIAMIENTO
hasta 4 0 C ~------~ ~------~
ENVASADO Y ALMACENAMJENTO
dUrante 21 dfas a Temperatura 4 0 C
38
1
228 Determinaci6n del pH
Se determino por el metoda potenciometrico en un pH-metro manual durante los
dias 2) 7 14 Y 21 de las bebidas lacteas sin y con prebi6tica (Ver Tablas 7 y 8)
229 Oeterminaci6n de la acidez (Expresadfl como acido
lactica)
Se tomaron 9 mJ de las bebida~ sa Ie adicionaron 2 gotas de fanoftaleina como
indicador y sa titulo fa acidez con NaOH 01 N hasta la aparicion de un cotor rosado
debit EI volumen de NaOH utilizado se reporta como valor de de acidez
(VerTablas 10 y 11)
2210 Prueba de viabilidad
Qurante el perfoda de almacenamiento de la bebida lactea se procedi6 a hacer la
prueba de viabiHdad en los dias 7 14 Y 21 para determinar Si los lactobacilfus
permanecfan vivOs a una concentraci6n minima de 106 hasta el dia 21 como 10
establece eJ Articulo 10 de la Rasolucion 2310 del Ministerio de $alud de
Colombja
39
Para asta prueba se tamaron 10 rnl de muestra y se adicionaron a 90 ml de caldo
MRS ruego a partir de esta se hicieron diluciones de 10-2 hasta 10-11 de las
diluciones 109101deg 10-11 se inocul6 1 ml de cada uno en agar MRS siguiendo el
metodo de siembra en profundidad y por duplicado e incubando a 370 C x 5 dras
en anaerobiosis y luego se hicieron tos recuentos por duplicado para esi reportar
los recuentos promedio (Ver Tablas 13 y 14)
2211 AniUisls microbiol6glco de las bebidas Iicteas(con y sin
avena)
Con el fin de determinar las condiciones higienico-sanitarias del producto se
realizaron las pruebas microbiol6gicas de Recuento de mohos y fevadurasml en
agar OGY Recuento en superficia de Staphylococcus coagulasa positivoml en
agar Baird Parker Numero Mas Probable (NMP) de coUfor-mes totales y
Escherichia coliml en caldo Fluorocult y Presencia de Salmonela25ml con BHI
caldo tetrationato y agar Hecktoen (Montoya 1999)
(Var tabla 16)
2212 AnaUsis estadistico
A los datos obtenidos en la medici6n de pH acidez (expresada como Beido
laclico) en los dras 2714 Y 21 y el recuento de Lactobacillus en los dras 714 y21
40
realizados a los dos tratamlentos se tes aplic6 1a prueba t porque solo difieren
en la presencia 0 ausencia del prebi6tico para evaluar si habra diferencia
estadfsticamente significativa para los dos tratamientbs(Ver Tablas9 12 y 15)
41
3 RESULTADOS Y DISCUSION
31 Coloraci6n de Gram y morfologfa
Las cepas aisladas fesultaron Gram positivas (Ver Figura 6) colonias grandes
cremosas dE) color beige con bordes homogeneos y c6ncavos en su
morfologia (Ver Figura 3) resultando de acuerdo a 10 especificado en Stanley
1989 para Lactobacillus
32 Prueba de esporulaci6n y cataJasa
Los resultados de la pruebas de esporulaci6n y catalasa indicados en las
Tablas 3 y 4 respeclivamente dieron conforme a 10 especificado en Stanley
1989 para Lactobacillus
42
1
2 3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
TABLA 3 Resultado de prueba de esporuJaci6n
CEPA RESULfADO ESPORULACION
-- -------------
43
l i ~II bull ~ I I
TABLA 4 Resultado prueba de la catalasa
CEPA RESULTADO CATALASA
1 -2 -3 -4 -5 -6 -7 8 -9 -10 -11 12 -13 -14 -15 -16
3~3 Prueba para determinar la especie
Oespues de hacer las pruebas para seleccionar las cepas sospechosas de ser
Lactobacillus se realizo las pruebas bioquimicas fograndose identificar
Lactobacillus plantarum aislctdo de pepino repollo y repollitas de bruselas
44
fermentados y Lactobacillus brevis de mucosa vaginal y leche fermentada (Ver
Anexos del A al E y Tabla 5)
TABLA 5 Resultado identlficaci6n cepa~
CEPA NOMBRE
1 Lactobacillus planfarum
3 Lactobacillus plantarum
5 Lactobacillus brevis
13 Lactobacillus brevis
15 Lactobacillus plantarum
34 Pruebas para determinar microorganismos probi6ticos
las cepas de Lactobacillus brevis y Lactobacillus plantarum mostraron
rasistencia al medio acido de pH =2 Y sales biliares 03 pv resultado similar al
encontrado por Jacobsen et al 1999 para Lactobacillus plantarum (Ver tabla 6)
45
middot
~~~ttiI lltlmiddot~COX~dtJ ~xtc_~ 2 tr~ k-JlL~middot
-)~~TO DE lJIBUOTECUl rjRL]OTtCA twn GO1IU1
TABLA 6 Resultados a pruebas de resistencia a pH=2 y sales biliares 03 plv
CEPA RESISTENCIA pH=2 RESISTENCfA A SALES BIUARES ()3 pv
1 + +
2 + +
3 + +
4 + +
5 +
6 + +
7 + +
8 + +
9 + +
10 + +
11 + +
12 + +
13 + +
14 +1shy +M
15 + +
16 + +
+1 crecimiento debil
+ crecimiento abundante
46
Figura 6 Lactobacillus brevis Gram + aislado de leche fermentada
Ai observar en placa las celulas de lactobacilos despues de real1zar las pruebas
de resistenCia a la acidez y sales biliares se observo una tendencia a aglomerarse
posiblemente como un mecanismo de proteccion cOlitra estos medios que pueden
lIegar a ser adversos para elias (Ver figuras 7 y 8)
47
Figura 7 Lactobacillus brevis aislada de leche fermentada despu~s de la prueba de resistencia a pH=2
Figura 8 Lactobacillus brevis aislada de leche fermentada despues de la prueba de resistencie asales biUares 03 plv
fI
48
35 --Seguimiento del-pH-en-la-bebidaJacteacon y sin -prebi6tico
A continuacion se muestran las Tablas 7 y 8 donde sa registian los datos
recopilados de pHdurante 10$ dras Z 7 14 Y21 para las bebidas laaeas con ysin
prebi6tioo
TABLA 1 ResultadopH yogur sin avena
Dia Repetition 1 Repetici6n 2 Repeticion 3 Repetici6n 4
2 526 501 51 52
7 446 433 438 44
14 439 435 437 436
21 439 437 438 437
TABLA 8 -ResultadopHyogur con avena
Dia Repeticion 1 Repeticion2 Repeticion 3 - Repeticion 4
2 509 523 51 515
7 447 442 445 442
14 436 -438 439 437
21 432 433 435 434
Observando la Figura 9podamos ver que el pH en el -dfado$ para los dos
tratamientos as igual y empieza a descender rapidamente para estabilizarse a
partir del dra 7(Ver figura 9)
49
Figura 9 Comparacj6n de medias para -el pH
Comparaci6n de medias para pH
55 ~ 5 +----=gtIIIi-~i~~----=-r--it~ -- pH sin avena
a 45 1--~~~~=~~ 4 --- pH con
avena35 t-----r-- -------=------=--= ------- - ----
2 7 14 21
Dias
Aplicando la prueba t para comparar las medias de pH I S6 muestia una diferencia
altamants significativa en los dos tratamientos para el dia 21 (pltO05)
(Ver tabla 9)
TABLA 9 Compaiaci6n de medias para pH
DtAS SIN AVENA CON AVENA te p (VALOR)
2 514 514 0 10
7 439 444 -1 61 0159
14 437 I
438 -070 0510
21 438 433 528 00019 shy
- DiFERENCIA AlTAMENTE SIGNIFICATIVA
50
I
AI aplicar regrasi6n a los datos sa obtiene al modelo estimado
pHSinAyena =535606 - 01505650Ia +0005044340IaI2
La variabilidad en la respuesta de pH asta siendo explicada en un 8S7522 por
el modelo (Ver Anexo F)
EI tratamiento con avena mostro el siguiente modelo al analisis de ragresi6n
pHConAvena =534463 ~ 0140407Dia + 0004480980Ia2
La variabilidad an la respuesta de pH asta siendo explicada en un 903315 par
el nlodelo(Ver anexo G)
36 Seguimiento de la acidezmiddotmiddot expresada comomiddot de acido
lactico
A continuaci6n sa muestran las Tablas 10 y 11 donde sa registran los datos
tecopilados de acidezmiddotdurante los dias 27 14 Y 21 para las pebidas taetees con y
sin prebi6tico
TABLA 10 Resuttadode acidez (expresadocomo acido tactico) yogurt sin avena
CIA R~petici6n1 Repeticion2 Repetici6n 3 Repeticion 4
2 054 06 057 058
7 072 074 073 0]2
14 080 083 082 082
21 0]4 079 078 077
51
TABLA 11 Resultado de aCidez (expresado como acido Icktico) yogurt con avena
Dia Repetici6n 1 RepetiCi6n 2 Repetici6n 3 Repetici9n 4
2 059 055 058 057
7 071 073 072 072
14 089 087 088 086
21 092 091 090 091
Observando la Figura 10 se puede concluir que la acidez empieza a aumentar
hasta el dia 14 y luego trata de estabilizarse para los dos tratamientos
(Ver figura 10)
Figura 10 Comparaci6n de medias para la acidez
N G)
Comparacion de medias para acidez
1
2 0I 5 -+--=--------=-~~~= u
ltC
- Acidez sin avena
2 7 14
Dias
52
21
-it- Acidez con avena
Aplicando la prueba t para camparar las madias de acidez se muestra una
diferencia altarnante significativa en los dos tratamiantos para los dias 14 y 21
(pltO05)
(Var tabla 12)
TABLA 12Comparaci6n de medias para Acidez
DIASmiddot SIN AVENA CON AVENA te p(VALOR)
2 0572 0572 0 10
7 0727 0720 119 0278
14 0818 0875 -638 000070shy
21 077 091 -1212 i 0000019 shy
DIFERENCIA AL TAMENTE SlGNIFICATIVA
AI aplicar r~gresi6n a los datos se obtiene el modelo estimado
AcidezSlnAIena = 0491897 + O0436032Dia O00144613DfaA2
La variabilidad en la respuesta de acidez asta siendoexplicada en un 970978
por al modelo (Ver anexo H)
EI tratamiento con avena mostro elsiguiente modeloj a1 analisis de regresion
AcidezConAvena = 0491638 + 00406572Oia - OQOO982559OiaA2
La variabilidad enla respuesta acidez esta siendo explicadaen un 99212 por
el modelo (Ver anexo J)
53
I ~
37 Prueba de viabiJidad
A continuaci6n sa muestran las Tab~as 13 y 14 donde sa presentan los datos
recopilados del recuento de Lactobacilos durante los dias 7 14 Y 21 para las
bebidas lacteas con y sin prebi6tico
TABLA 13 Recuento de Lactobacilos (UFCml) yogurt sin avena
Dia Repetici6n 1 Repetici6n 2 Repeticion 3 Reptttici6n 4
7 1880X10l1 1454X1011 1642X1011 1780X10~
14 1560X10~ 646X1011J 1890X10l 140X10l1
21 1200x10lu 128Ox10u 1745x10J 1520x101V
TABLA 14 Recuento de Lactobacilos (UFCml) yogurt con avena
Dfa Repetieion 1 Repetici6n 2 Repeticion 3 Repeticf6n 4
7 1600X10lt 1240X10t 1640X10ll 1980X10t
14 540X1011 427X10n 546X10n 720X10ll
21 500x1011 492x1011 712)(1011 980x10~
AI analizar la Figura 11 sa puede observar un recuento mayor de Lactobacilos
en al tratamiento con avena resultado de acuerdo a 10 encontrado por Alander at
aI 1999 Kontula et aI 1998 y Jaskari et aI 1998
54
Figura 11 Comparaci6n de medias para Log Lactobacillus
Comparacion de medias para log Lactobacillus
~ 1350
-+- Sac Sin--() 13 co avenaIII
bull 125 -- Bac con 0)
0 12 avenaJ
115 7 14 21
Dias
Aplicando la prueba t para comparar las medias de recuento de Lactobacillus no
se encontr6 una diferenc1a estadfsUcamente significative entre los dos
tratamientos (Ver tabla 15)
Este aumento en al racuento influy6 en la disminuci6n del pH y en el aumento de
fa aeidez por la fermentacion que realizan los Lactobacillus sobre fa lactosa de la
lache y la avena adicionada como prebi6tico
55
1
TABLA 15 Comparaci6n medias lag Lactobacillus
DIAS SIN AVENA CON AVENA tc p(VALOR)
7 122257 122022 04846 06451
14 121065 132393 -19602 00977
21 129025 133087 -08236 04416
At aplicar regresion a los datos se obtiane al modelo astimado
LactobacillusSinAvena= 117347 + 004834640Ia
La variabilidad en la respuesta del recuento de LactobaCillus ssta siendo
explicada en un 260054 por el mod$loVar anexo J)
EI tratamiento con avena mostr6 al siguiente modalo al anal isis de regresion
Lactobacillu$ConAvena =118103 + 007903040Ias
La variabilidad en la respuesta de recuento esta siendo explicada en un 3068
por al modelo(Ver anexo K)~
38 Analisi$ microbiol6gicos de las bebidas lacteas con y sin
En la Tabla 16 estan recopilados los resultados microbiol6gieos obtenidos en ras
muestras con los dos tratamientos (con y sin avena)
I [
sa
TABLA 16 Resultados analisis microbiologico
Recuento de mohos y levaduras Iml lt10
Recuento de Staphylococcus coagulase positiva Iml lt100
NMP coliformes fotales y Escherichia coli Iml lt3
Presencia de Salmonella25ml Ausente
Los resultados de este analisis demuestran que las bebidas fermentadas con y
sin avena~ astan fibres de microorganismos patogenos
57
1
4 CONCLUSIONES
Se aislaron cepas nativas de Lactobacillus plantarum de las muestras vegetates
de repollo pepino repollitas de bruselas fermentadas y Lactobacillus brevis de
lache fermentada y mucosa vaginal humana Ambas cepas resistieran un pH=2 y
una concentraci6n de sales biliares det 03 ptv dos earacteristicas importantes
en los probi6ticos
Lamiddot cepa de Lactobacillus brevis aislada de lache Sa utiliz6 para elaborar una
bebida fermentada sin y con avana comoingrediente prebiotico obteniendose un
aJimento centon recuento del probi6tico viable durante 21 dras de seguimiento
ademas libre de microorganismos )at6gen05
No se encontr6 efecta significativo de la avena sobre Ie viabilidad del Lactobacillus
brevis aunque sa presento un aumento en 61 recuento de estos en la bebida con
avena
58
plusmn ~
5 RECOMENDACIONES
Ensayar la cepa de Lactobacillus plantartJm en productos carnicos madurados
como el salami
Ensayar la cepa de Lactobacillus l)revs en otros derivados lecteos como queso
quesito queso crema
Continuar con el estudio de estos microorganismos y caracterizarlos
molecularmente ademas de estudiar su capacidad de adherencja a fa mucosa
intestinal sobre algunes Hneas celulares como las CaCo~2
Estudiarel efedo de la avena sabre la viabiJidad del Lactobacillus breyis a una
concentraci6n mayor de 05
Realizer ensayos can las cepas de Lactobacillus brevis y Lactobrlcillus pJantarum
para elaborar masas acidas para panificacion reemplazando el Bromato de
Potasio aditivo prohibido desde marzo del 2003 en nuestro pais per 5U toxicidad
59
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65
ANEXOS
66
ANEXO A RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AlSLADA DE i
PEPINO it
Referencia Pepino 1 Fecha 06122002
IEXCELENTE IDENTIFICACION
Latto plantarum 1
Galeria API 50 CHL V50 Leida el 06122002
Perfil - -- - ++ - -- - ++++ - - -+- + - I I I I I I I I +t+ - +f- ~ - - + + ~ - - - +- + - shy
o - GLY - ERY DARA - LARA + RIB + DXYL - LXYL - ADO - MDX - GAL + GLU + FRU + MNE + SBE - RHA - DUL - INO bull MAN + SOR - MDM + MUG shyNAG + AMY + ARB + ESC + SAL + CEL + MAL + LAC + MEL + SAC + TRE + 1NU - MLZ + RAF + AMD - GLYG - XLT - GEN + TIJR + LYX - TAG - DFUC shyLFUC - DARL + LARL - aNT + 2KG - 5KG shy
--- Taxones significativos rd -----T -- Tests en contra
Lactoplantarum 1 999 092 1
Taxon siguiente Lactobrevis 1 OJ 044 3
i i
Lactoplantarum 1 1 test (5) en contra
D-SORBITOL (SOR) 78
Tax6n siguiente Lactobrevis 1 3 test (s) ert contra
METHYLD-MANNOSIDE (MOlM) 0 MELEZITOSE (MLZ) 14 D-TURANOSE (TUR) 14
67
ampb
ANEXO B RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AISLADA DE REPOLLO FERMENTADO
~
Referencia Repollo fermentado - 3 Fecha 03072003
EXCELENTE IDENTIFICACION
Lactoplantarum 1
Galena API 50 CRL V50 Leida el 03072003
Perfil - - ++ - - - - -H++ - - ~ + - + - I I 1 I I I I -H+ - ++ - - - + + - -- - - + - shy
o - GLY - ERY - DARA - LARA + RIB + DXYL - LXYL - ADO ~ MDX - GAL + GLU + FRU + MNE + SBE ~ RHA - DUL - INO - MAN + SOR - MDM + MDG shyNAG + AMY + ARR + ESC + SAT + CRL + MAL + LAC + MEL + SAC + TRE + lNU - MLZ + RAF + AMI) - GLYG - XLT - GEN + TOR + LYX - TAG - DFUC shyLFUC - DARL - LARL - GNT + 2KG - 5KG shy
------Taxones significativos _ _----- Id--- ---T---- Tests en contra
Lactoplantarum 1 999 095 1
Tax6n siguiente Lactobrevis 1 01 OA8 3
lJactoplantaru01 1 1 test (s) en contra
DSORBITOL (SOR) 78
Taxon siguiente Lactobrevis
METHYL-D-MANNOSIDE D-TURANOSE
1
(MOM) (TOR)
3 test (5) en contra
0 MELEZITOSE 14
(MLZ) 14
i
I
68
ANEXO C RESULTADO PRUEBAS BIOQUWICAS DE CEPA AISLADA DE MUCOSA HUMANA
Referenda Mucosa - 5 Fecha 27012003
BUENA IDENTlFICACION
Galeria API 50 CHL vso Leida el 270112003
Perfil - - - - +t--t - - - + - + - - - - - - - - -+- - - - - + - + - - - - - - - - - - - - - bull - - -+ - +
o - GLY ~ ERY - DARA bull LARA + RID + DXYL + LXYL - ADO bull MDX - GAL + OLU - FRU + MNE - SBE - IlliA - DUL - INa - MAN - SOR - MDM - MOO shyNAG + AMY - ARB - ESC ~ SAL bull CEL - MAL + lAC - MEL + SAC - TRE shyINU - MLZ - RAF - AMD - GLYG - XLT - GEN - 11JR - LYX - TAG - DFUC shyLFUC - DARL - IARL - ONT + 2KO - 5KG +
- - - - - - Taxones significativos - - - - - - - Id T -- Test en contra
Lactobrevis 3 963 088 1
Taxon siguiente Lactoco11inoides 36 075 2
Lactobrevis 3 1 test (s) en contra
GLUCOSE (GLU) 95
-~~~------------~---------------------------~--~-------~--~-----~----------~--------~------------~~--Taxon siguiente Lactocollinoides 2 test (s) en contra
GLUCOSE (GLU) 100 MELIBIOSE (MEL) 25
69
i r
ANEXO D RESULTADO PRUEBAS BIOQIJiMICAS DE CEPA AISLADA DE LECHE FERMENTADA
Referenda Leche fennentada ~ 13 Fecha 27012003
BUENA IDENTIFICACI6N
Galeria API 50 CHL V50 Leida el 270112003
Perfil - - - - -t-t+- - - - + - + - - - bull - - - - -+- - - - - + - + - - - - - - - - - - - - - - - - -+ - +
0 - GLY - ERY - DARA - LARA +Rll3 + DXYL + LXYL - ADO - MDX ~GAL + GLU - FRU + MNE SBE - RHA DUL bull INO MAN - SOR MDM bull MDG shy
~NAG + AMY - ARB - ESC - SAL - CEL - MAL + LAC - MEL + SAC - TRE I lNU - MLZ - RAF - AMD - GLYG - XLT - OEN - IUR LYX - TAG - DFUC bull i
LFUC - DARL - LARL -ONr + 2KG - SKO + 1
- -- - - Taxones significativos - - Id -- T --- Test en contra
Lacta brevis 3 963 088 1
Taxon siguiente Lactocollinoides 36 075 2
Lactobrevis 3 1 test (s) en contra
GLUCOSE (GLU) 95
-----------------------------------------------------------~------------------------------~-------------------Taxon siguiente Lactocollinoides 2 test (s) en contra
GLUCOSE (GLD) 100 MELffiIOSE (MEL) 25
70
II iJ1
I
I ANEXO E RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AISLADA DE REPOLLITAS DE BRUSELAS FERMENTADA
Referencia repollitas de bruselas 15 Fecha 03072003
EXCELENTE IDENTIFICACION
Lactoplantarum 1
Galeria API 50 CHL vsO Leida el 03072003
Perfil - - - - +t - - - - +H+ - +- - +t + - I I I I I I I f ++t - + - - - -+ + - - - -+ -+ - - I ij
o - GLY - ERY - DARA - LARA + RJB + DXYL - LXYL - ADO - MDX - GAL +
GLU + FRU + MNE + SBE RHA + DUL - INO - MAN + SOR + MDM + MOG shyNAG + AMY + ARB + ESC + SAL + eEL + MAL + LAC + MEl + SAC + TRE + i
I1NU - MLZ + RAF AMD GLYG - XLT - aEN + TUR + LYX - TAG - Druc LFUC - DARt + LARL - aNT + 2KG - 5KG shy n ----Taxones significativos ------ Id Tests en contra
Lactoplantarum 1 999 090 o
Taxon siguiente Lacto pentosus 01 012 7
Lactoplantarum 1 o test (s) en contra
Taxon siguiente Lacto pentosus 7 test (8) en contra
GLYCEROL (GLY) 75 D-XYLOSE (DXYL) 100 L-RHAMNOSE (RHA) 25 METHYL-D-MANNOSIDE (MOM) 1 MELEZITOSE (MLZ) 25 RAFFINOSE (RAF) 75 D-ARABITOL (DARL) 0
71
~
I i I
ANEXO F - ANALISIS DE REGRESION PARA pH EN BEBIDA SIN AVENA
Aruilisis de regresi6n polinomial
---~-~-------------------------------------------~-----------~~---------------------~--------------Variable dependiente pHSinAvena ---------------------------~-------------~--------------------~---------------------------------
Error T Parametro Estimado Estandar Estadistico P-Valor
CONSTANTE 535606 0094535 56657 00000 Dia -0150565 0020706 727154 00000 Dia2 000504434 0000871488 578819 00001
---~---------------------------------------------------------------------------------------------------
Anfllisis de Variama -------------------------------------------~-----------~-----------------------------~-~--- jSource Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor 11
------------------------~------------------------------------------------------------------------------~ Mod-elo 155772 2 0118861 4256 00000 Residual 0237877 13 00182983
Total (Corr) 11956 IS
R2 == 867522 percent
pHSinAvena == 535606 - 0150565Dia + 000504434Dia2
72
____
middot ANEXO G - ANALISIS DE REGRESION PARA pH EN BEBIDA CON AVENA
AmUisis de regresion polinomial _____~_____~__-_____~___4____________________bull____bull__________bull_____________~~----_------___________
Variable depcndiente pHConA vena ------------------------------------------------------------------------------------------~--------
Error T Parametro Estimado StAndar Estadfstico P-Valor
---------------------------------------------~-----------------------------------------------_---------CONSTANTE 534463 00801045 667208 00000 Dia -0140407 00175453 800253 00000 DiaA 2 000448098 0000738458 606803 00000
----------------------~---~-----------------------------~------------------------------~----AmUisis de Varianza
---~---------------------------------~---------------------~------------~-------------------~------Source Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio PValor --------------------------~-----------------------------------------------~------------~-----~~--~ ModeJo 159575 2 0797873 6073 00000 Residual 02170798 middot13 00131383 _______~_~ ~_~----------~------~--~-----~-M-----~-----____ _____________~-----------------------Total (COlT) 176654 15
R12 903315 percent
-----------~------------------------------------------------------------------------~-----------pHConAvena 534463 - 0140407Dia + 000448098DfaA 2
73
ANEXO H - ANALTSIS DE REGRESTON PARA ACIDEZ EN BEBJDA SIN AVENA
An8Jisis de Regtesi6fi P6lifJomial
Variable Depefidiefile~ AcidezSinAVenll _______________w_____~______~________________~-----------_________~_________________~~____~___~_____
Error T Pariirnetro Estimado Estandar Estadistico ---------------------------------------~--------------~-~-------~--------------------~------------CONSTANT 0491697 00123217 399051 00000 Dia 00436032 000269882 161564 00000 D1a2 -000144613 000011359 127312 00000 __w___~________________________~-_______-_____~----____________________________~__~---~_--__~___
AriiiJisis de varianza ~_~__~__________~_~____~________~___________- _________e_____________________________bull _____-________
Source Smn de cuadr Df Mean Square F-Ratio PmiddotValor_~~___________________________________bull ______~___________bull ____________bull ______~________w________________
Model 0135203 2 00676013 21747 00000 Residual 000404118 13 000031086
Total (Corr) 0139244 15
R2 970978 percent
AcidezSlnAvena 0491697 + O0436032Dia - 0OOl44613Dia2
74
I
ANEXO I ANALISIS DE REGRESION PARA ACIDEZ EN BEBIDA CON AVENA
1
Anwisis de tegtesi6fi polinomial
Variable dependiente Acidez Con Avena
Error T ParametTo Estimado Stlindar Estadfstico P-Valor ----------------~-------~---------------------~-----------------------------------------------------CONSTANT 0491639 000926607 530578 00000 Diamiddot 00406572 000202955 200326 00000 DfaA 2 0000982559 0000085421 -115025 00000
-------------~----------------------------~-------------------------~-----------------------------------
-------------~-----~~-----------------------------~---------------------------------------------_--Source Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio PValor
-~-------------~----------------------------------~------------------~~-------------------------- Modelo 0288008 2 0144004 81914 00000 Residual 000228539 13 0000175799
----------~~--------------~---------------------------------------------~---------------------------Total (Corr) 0290294 15
RA2 = 992127 percent
-------------------------~----~---~------------~---------------------------------~---------------~
AcidezConAvena == 049163amp + 00406572D1a - 0000982559DiaA2
75
I
(Ilmiddot il
ANEXO J- ANALISIS DE REGRESION PARA RECUENTO LACTOBACILOS PARA BEBIDA SIN AVENA
Amilisis de regresion - Modelo lineal Y = a + bX
------------------------~----------------------~-----------------------------~----------~-----------Variable Dcpendiente LactobacilJusSinAvena Variable independiente Dia
I--------~----------~-----------------------------------~-------~-~--~--------------------------~-Error T
Paramctro Estimado Standard Stadistico P-Valor
----~----~------------~-----~-----------------------~-------------~-----------------------------Intereepto 117347 0389973 300911 00000 Pendiente 00483464 00257889 18747 00903
Analisis de Varianza
---------~------------------~----------------~---------------------------------~---------~----------Source Sum decuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor
------------~---------------------~---------------------~--------------------------------~-----~----Modelo 0916252 1 244835 443 00616 Residual 260706 10 0260706
--~------------~---~------------------~~~-----~-------~---------~~-------------------------------------Total (Corr)352332 11
Coeficiente Correlaci6n = 0509955 R2 = 260054 percent
LactobacillusSinAvena= 117347 + 00483464Dfa
76
ANEXO K- ANALTSIS DE REGRESION PARA RECUENTO LACTOBACILOS PARA DEBIDA CON AVENA
Aruilisis de regresion - Modelo lineal Y = a + hX
Variable Dependiente LactobacillusConAvena Variable Independiente Dia ---~--------------------------------------------------------__-----------__--_--_-----------shy
Error T Paramctro Estimado Standard Estadistico P-Valor -~--------------------------------------------------------------------------------------------------
Irttercepto 118103 0567963 207942 00000 Pendiente 00790304 00375594 210414 00616
-----------------~----------------------------~----~-------~----~----------------------------
Analisis de Varianza
----------------~----------------~------------------~--------------------------~------~--------shySource Swn de cuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor
-----------------~--~--------------------------------------------------------------------------~---~ Mode10 244835 1 244835 443 00616 Residual 552997 10 0552997
Total (Corr)797832 11
Coeficiente Correlacion = 0553964 RI2 = 306875 percent
-----~--------------------------------------------------------~--------------------------------------
LactobacillusConAvena = 118103 + 00790304Dfas
77
226 Conservacion
Todas fas capas que habian dado positiva Jas pruebas anteriores y que reaultaron
resistentes a pH=2 y sales biliares 03 pv y despues de identificadas en API 50
CHL sa repicaron en agar MRS en tuba inclinado y despues de Incubar a 37deg C
por 48 horas bajo anaerobiosis se Ctlbrie el biser completamente can aceite
mineral esteril y sa guardaron en refrigeraci6n
227 Elaboracj6n de fa bebida fermentada
2271 Preparaci6n de la mue$tra
Sa tome 1 mt de caldo MRS previamante inoculado e incubado que presentaba
una concentracion de Lactobacillus brevis de 27x108 Iml segun la escaJa de Mac
Farlan y sa adiciono a 9ml de leche pasteurizada en un tubo sa dej6 incubanda
en anaerobiosis por 48 hores Luego se pasaron estos 10 ml a un frasco qua
cont~nie 90 ml de leche pasterizada y se dej6 incubando par 48 haras en
anaerobiosis
35
2272 Adici6n del inOculo
A 900ml de leche pasteurizada se Ie adicion61os 100 ml de leche que habia sido
previamente ino(ulada dos veces con la cepa posteriormente se deja
fermantando la lache a temperatura de 37deg C
2273 Control de Ja fermentaci6n
Las muestras se hicieron por cuadruplicado y se les hizo un seguimiento de
aoidez hasta un valor entre 04 y 05 expresada como Bcido lactico esta
procedimiento corresponde a la babida fermentada sin prebi6tico La bebida ~on
prebi6tico tiene al mismo proeedirnianto pero adicionalmente se agrag6 avena a
una concentraci6n de 05 en el momento de la adici6n del in6e410 a los 900 ml
de leehe pasteurlzada y el procedimiento sigui6 igual al de la bebida sin prebi6tico
tambien se hizo por cuadruplicado
2274 Refrigeracl6n
Despues que las mezclas con y sin prebiotico alcanzaron el de acidez
requarido se IIeva ron a refrigeraci6n a una temperatura de 4deg C p~r 24 horas
para frenar proce~os metab6licos de los microorganisrtlos Despues de este
ti~mpo se procedi6 al batido
36
1 2275 Batido
Con un agitador se procedi6 a batir las bebidas para romper et coagulo formado
y de esta manera homogeneizar la mazela y obtener asf la bebida fermentada
2276 Envasado y almacenamiento
Ambas bebidas se envasaron en frascos vidrio para hacerles seguimiento de pH
acidez(expresado como acido tacticol y recuento de Lactobacillus breviSf los
dies 27 14 Y 21 despues de elaboradas las bebidas perfodo durante el cualta
muestra permanecfa afmacenada a temperatura de refrigeracion(Ver Figura 5
37
Fjgura 5 Diagrama de Flujo
PREPARACION DE LA MUESTRA
ADICION DEL INOCULO
~_____~_B~ATIDO~______~
INCUBACION 37deg C hasta acidez = 04-05 acido laotico
ENFRIAMIENTO
hasta 4 0 C ~------~ ~------~
ENVASADO Y ALMACENAMJENTO
dUrante 21 dfas a Temperatura 4 0 C
38
1
228 Determinaci6n del pH
Se determino por el metoda potenciometrico en un pH-metro manual durante los
dias 2) 7 14 Y 21 de las bebidas lacteas sin y con prebi6tica (Ver Tablas 7 y 8)
229 Oeterminaci6n de la acidez (Expresadfl como acido
lactica)
Se tomaron 9 mJ de las bebida~ sa Ie adicionaron 2 gotas de fanoftaleina como
indicador y sa titulo fa acidez con NaOH 01 N hasta la aparicion de un cotor rosado
debit EI volumen de NaOH utilizado se reporta como valor de de acidez
(VerTablas 10 y 11)
2210 Prueba de viabilidad
Qurante el perfoda de almacenamiento de la bebida lactea se procedi6 a hacer la
prueba de viabiHdad en los dias 7 14 Y 21 para determinar Si los lactobacilfus
permanecfan vivOs a una concentraci6n minima de 106 hasta el dia 21 como 10
establece eJ Articulo 10 de la Rasolucion 2310 del Ministerio de $alud de
Colombja
39
Para asta prueba se tamaron 10 rnl de muestra y se adicionaron a 90 ml de caldo
MRS ruego a partir de esta se hicieron diluciones de 10-2 hasta 10-11 de las
diluciones 109101deg 10-11 se inocul6 1 ml de cada uno en agar MRS siguiendo el
metodo de siembra en profundidad y por duplicado e incubando a 370 C x 5 dras
en anaerobiosis y luego se hicieron tos recuentos por duplicado para esi reportar
los recuentos promedio (Ver Tablas 13 y 14)
2211 AniUisls microbiol6glco de las bebidas Iicteas(con y sin
avena)
Con el fin de determinar las condiciones higienico-sanitarias del producto se
realizaron las pruebas microbiol6gicas de Recuento de mohos y fevadurasml en
agar OGY Recuento en superficia de Staphylococcus coagulasa positivoml en
agar Baird Parker Numero Mas Probable (NMP) de coUfor-mes totales y
Escherichia coliml en caldo Fluorocult y Presencia de Salmonela25ml con BHI
caldo tetrationato y agar Hecktoen (Montoya 1999)
(Var tabla 16)
2212 AnaUsis estadistico
A los datos obtenidos en la medici6n de pH acidez (expresada como Beido
laclico) en los dras 2714 Y 21 y el recuento de Lactobacillus en los dras 714 y21
40
realizados a los dos tratamlentos se tes aplic6 1a prueba t porque solo difieren
en la presencia 0 ausencia del prebi6tico para evaluar si habra diferencia
estadfsticamente significativa para los dos tratamientbs(Ver Tablas9 12 y 15)
41
3 RESULTADOS Y DISCUSION
31 Coloraci6n de Gram y morfologfa
Las cepas aisladas fesultaron Gram positivas (Ver Figura 6) colonias grandes
cremosas dE) color beige con bordes homogeneos y c6ncavos en su
morfologia (Ver Figura 3) resultando de acuerdo a 10 especificado en Stanley
1989 para Lactobacillus
32 Prueba de esporulaci6n y cataJasa
Los resultados de la pruebas de esporulaci6n y catalasa indicados en las
Tablas 3 y 4 respeclivamente dieron conforme a 10 especificado en Stanley
1989 para Lactobacillus
42
1
2 3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
TABLA 3 Resultado de prueba de esporuJaci6n
CEPA RESULfADO ESPORULACION
-- -------------
43
l i ~II bull ~ I I
TABLA 4 Resultado prueba de la catalasa
CEPA RESULTADO CATALASA
1 -2 -3 -4 -5 -6 -7 8 -9 -10 -11 12 -13 -14 -15 -16
3~3 Prueba para determinar la especie
Oespues de hacer las pruebas para seleccionar las cepas sospechosas de ser
Lactobacillus se realizo las pruebas bioquimicas fograndose identificar
Lactobacillus plantarum aislctdo de pepino repollo y repollitas de bruselas
44
fermentados y Lactobacillus brevis de mucosa vaginal y leche fermentada (Ver
Anexos del A al E y Tabla 5)
TABLA 5 Resultado identlficaci6n cepa~
CEPA NOMBRE
1 Lactobacillus planfarum
3 Lactobacillus plantarum
5 Lactobacillus brevis
13 Lactobacillus brevis
15 Lactobacillus plantarum
34 Pruebas para determinar microorganismos probi6ticos
las cepas de Lactobacillus brevis y Lactobacillus plantarum mostraron
rasistencia al medio acido de pH =2 Y sales biliares 03 pv resultado similar al
encontrado por Jacobsen et al 1999 para Lactobacillus plantarum (Ver tabla 6)
45
middot
~~~ttiI lltlmiddot~COX~dtJ ~xtc_~ 2 tr~ k-JlL~middot
-)~~TO DE lJIBUOTECUl rjRL]OTtCA twn GO1IU1
TABLA 6 Resultados a pruebas de resistencia a pH=2 y sales biliares 03 plv
CEPA RESISTENCIA pH=2 RESISTENCfA A SALES BIUARES ()3 pv
1 + +
2 + +
3 + +
4 + +
5 +
6 + +
7 + +
8 + +
9 + +
10 + +
11 + +
12 + +
13 + +
14 +1shy +M
15 + +
16 + +
+1 crecimiento debil
+ crecimiento abundante
46
Figura 6 Lactobacillus brevis Gram + aislado de leche fermentada
Ai observar en placa las celulas de lactobacilos despues de real1zar las pruebas
de resistenCia a la acidez y sales biliares se observo una tendencia a aglomerarse
posiblemente como un mecanismo de proteccion cOlitra estos medios que pueden
lIegar a ser adversos para elias (Ver figuras 7 y 8)
47
Figura 7 Lactobacillus brevis aislada de leche fermentada despu~s de la prueba de resistencia a pH=2
Figura 8 Lactobacillus brevis aislada de leche fermentada despues de la prueba de resistencie asales biUares 03 plv
fI
48
35 --Seguimiento del-pH-en-la-bebidaJacteacon y sin -prebi6tico
A continuacion se muestran las Tablas 7 y 8 donde sa registian los datos
recopilados de pHdurante 10$ dras Z 7 14 Y21 para las bebidas laaeas con ysin
prebi6tioo
TABLA 1 ResultadopH yogur sin avena
Dia Repetition 1 Repetici6n 2 Repeticion 3 Repetici6n 4
2 526 501 51 52
7 446 433 438 44
14 439 435 437 436
21 439 437 438 437
TABLA 8 -ResultadopHyogur con avena
Dia Repeticion 1 Repeticion2 Repeticion 3 - Repeticion 4
2 509 523 51 515
7 447 442 445 442
14 436 -438 439 437
21 432 433 435 434
Observando la Figura 9podamos ver que el pH en el -dfado$ para los dos
tratamientos as igual y empieza a descender rapidamente para estabilizarse a
partir del dra 7(Ver figura 9)
49
Figura 9 Comparacj6n de medias para -el pH
Comparaci6n de medias para pH
55 ~ 5 +----=gtIIIi-~i~~----=-r--it~ -- pH sin avena
a 45 1--~~~~=~~ 4 --- pH con
avena35 t-----r-- -------=------=--= ------- - ----
2 7 14 21
Dias
Aplicando la prueba t para comparar las medias de pH I S6 muestia una diferencia
altamants significativa en los dos tratamientos para el dia 21 (pltO05)
(Ver tabla 9)
TABLA 9 Compaiaci6n de medias para pH
DtAS SIN AVENA CON AVENA te p (VALOR)
2 514 514 0 10
7 439 444 -1 61 0159
14 437 I
438 -070 0510
21 438 433 528 00019 shy
- DiFERENCIA AlTAMENTE SIGNIFICATIVA
50
I
AI aplicar regrasi6n a los datos sa obtiene al modelo estimado
pHSinAyena =535606 - 01505650Ia +0005044340IaI2
La variabilidad en la respuesta de pH asta siendo explicada en un 8S7522 por
el modelo (Ver Anexo F)
EI tratamiento con avena mostro el siguiente modelo al analisis de ragresi6n
pHConAvena =534463 ~ 0140407Dia + 0004480980Ia2
La variabilidad an la respuesta de pH asta siendo explicada en un 903315 par
el nlodelo(Ver anexo G)
36 Seguimiento de la acidezmiddotmiddot expresada comomiddot de acido
lactico
A continuaci6n sa muestran las Tablas 10 y 11 donde sa registran los datos
tecopilados de acidezmiddotdurante los dias 27 14 Y 21 para las pebidas taetees con y
sin prebi6tico
TABLA 10 Resuttadode acidez (expresadocomo acido tactico) yogurt sin avena
CIA R~petici6n1 Repeticion2 Repetici6n 3 Repeticion 4
2 054 06 057 058
7 072 074 073 0]2
14 080 083 082 082
21 0]4 079 078 077
51
TABLA 11 Resultado de aCidez (expresado como acido Icktico) yogurt con avena
Dia Repetici6n 1 RepetiCi6n 2 Repetici6n 3 Repetici9n 4
2 059 055 058 057
7 071 073 072 072
14 089 087 088 086
21 092 091 090 091
Observando la Figura 10 se puede concluir que la acidez empieza a aumentar
hasta el dia 14 y luego trata de estabilizarse para los dos tratamientos
(Ver figura 10)
Figura 10 Comparaci6n de medias para la acidez
N G)
Comparacion de medias para acidez
1
2 0I 5 -+--=--------=-~~~= u
ltC
- Acidez sin avena
2 7 14
Dias
52
21
-it- Acidez con avena
Aplicando la prueba t para camparar las madias de acidez se muestra una
diferencia altarnante significativa en los dos tratamiantos para los dias 14 y 21
(pltO05)
(Var tabla 12)
TABLA 12Comparaci6n de medias para Acidez
DIASmiddot SIN AVENA CON AVENA te p(VALOR)
2 0572 0572 0 10
7 0727 0720 119 0278
14 0818 0875 -638 000070shy
21 077 091 -1212 i 0000019 shy
DIFERENCIA AL TAMENTE SlGNIFICATIVA
AI aplicar r~gresi6n a los datos se obtiene el modelo estimado
AcidezSlnAIena = 0491897 + O0436032Dia O00144613DfaA2
La variabilidad en la respuesta de acidez asta siendoexplicada en un 970978
por al modelo (Ver anexo H)
EI tratamiento con avena mostro elsiguiente modeloj a1 analisis de regresion
AcidezConAvena = 0491638 + 00406572Oia - OQOO982559OiaA2
La variabilidad enla respuesta acidez esta siendo explicadaen un 99212 por
el modelo (Ver anexo J)
53
I ~
37 Prueba de viabiJidad
A continuaci6n sa muestran las Tab~as 13 y 14 donde sa presentan los datos
recopilados del recuento de Lactobacilos durante los dias 7 14 Y 21 para las
bebidas lacteas con y sin prebi6tico
TABLA 13 Recuento de Lactobacilos (UFCml) yogurt sin avena
Dia Repetici6n 1 Repetici6n 2 Repeticion 3 Reptttici6n 4
7 1880X10l1 1454X1011 1642X1011 1780X10~
14 1560X10~ 646X1011J 1890X10l 140X10l1
21 1200x10lu 128Ox10u 1745x10J 1520x101V
TABLA 14 Recuento de Lactobacilos (UFCml) yogurt con avena
Dfa Repetieion 1 Repetici6n 2 Repeticion 3 Repeticf6n 4
7 1600X10lt 1240X10t 1640X10ll 1980X10t
14 540X1011 427X10n 546X10n 720X10ll
21 500x1011 492x1011 712)(1011 980x10~
AI analizar la Figura 11 sa puede observar un recuento mayor de Lactobacilos
en al tratamiento con avena resultado de acuerdo a 10 encontrado por Alander at
aI 1999 Kontula et aI 1998 y Jaskari et aI 1998
54
Figura 11 Comparaci6n de medias para Log Lactobacillus
Comparacion de medias para log Lactobacillus
~ 1350
-+- Sac Sin--() 13 co avenaIII
bull 125 -- Bac con 0)
0 12 avenaJ
115 7 14 21
Dias
Aplicando la prueba t para comparar las medias de recuento de Lactobacillus no
se encontr6 una diferenc1a estadfsUcamente significative entre los dos
tratamientos (Ver tabla 15)
Este aumento en al racuento influy6 en la disminuci6n del pH y en el aumento de
fa aeidez por la fermentacion que realizan los Lactobacillus sobre fa lactosa de la
lache y la avena adicionada como prebi6tico
55
1
TABLA 15 Comparaci6n medias lag Lactobacillus
DIAS SIN AVENA CON AVENA tc p(VALOR)
7 122257 122022 04846 06451
14 121065 132393 -19602 00977
21 129025 133087 -08236 04416
At aplicar regresion a los datos se obtiane al modelo astimado
LactobacillusSinAvena= 117347 + 004834640Ia
La variabilidad en la respuesta del recuento de LactobaCillus ssta siendo
explicada en un 260054 por el mod$loVar anexo J)
EI tratamiento con avena mostr6 al siguiente modalo al anal isis de regresion
Lactobacillu$ConAvena =118103 + 007903040Ias
La variabilidad en la respuesta de recuento esta siendo explicada en un 3068
por al modelo(Ver anexo K)~
38 Analisi$ microbiol6gicos de las bebidas lacteas con y sin
En la Tabla 16 estan recopilados los resultados microbiol6gieos obtenidos en ras
muestras con los dos tratamientos (con y sin avena)
I [
sa
TABLA 16 Resultados analisis microbiologico
Recuento de mohos y levaduras Iml lt10
Recuento de Staphylococcus coagulase positiva Iml lt100
NMP coliformes fotales y Escherichia coli Iml lt3
Presencia de Salmonella25ml Ausente
Los resultados de este analisis demuestran que las bebidas fermentadas con y
sin avena~ astan fibres de microorganismos patogenos
57
1
4 CONCLUSIONES
Se aislaron cepas nativas de Lactobacillus plantarum de las muestras vegetates
de repollo pepino repollitas de bruselas fermentadas y Lactobacillus brevis de
lache fermentada y mucosa vaginal humana Ambas cepas resistieran un pH=2 y
una concentraci6n de sales biliares det 03 ptv dos earacteristicas importantes
en los probi6ticos
Lamiddot cepa de Lactobacillus brevis aislada de lache Sa utiliz6 para elaborar una
bebida fermentada sin y con avana comoingrediente prebiotico obteniendose un
aJimento centon recuento del probi6tico viable durante 21 dras de seguimiento
ademas libre de microorganismos )at6gen05
No se encontr6 efecta significativo de la avena sobre Ie viabilidad del Lactobacillus
brevis aunque sa presento un aumento en 61 recuento de estos en la bebida con
avena
58
plusmn ~
5 RECOMENDACIONES
Ensayar la cepa de Lactobacillus plantartJm en productos carnicos madurados
como el salami
Ensayar la cepa de Lactobacillus l)revs en otros derivados lecteos como queso
quesito queso crema
Continuar con el estudio de estos microorganismos y caracterizarlos
molecularmente ademas de estudiar su capacidad de adherencja a fa mucosa
intestinal sobre algunes Hneas celulares como las CaCo~2
Estudiarel efedo de la avena sabre la viabiJidad del Lactobacillus breyis a una
concentraci6n mayor de 05
Realizer ensayos can las cepas de Lactobacillus brevis y Lactobrlcillus pJantarum
para elaborar masas acidas para panificacion reemplazando el Bromato de
Potasio aditivo prohibido desde marzo del 2003 en nuestro pais per 5U toxicidad
59
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65
ANEXOS
66
ANEXO A RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AlSLADA DE i
PEPINO it
Referencia Pepino 1 Fecha 06122002
IEXCELENTE IDENTIFICACION
Latto plantarum 1
Galeria API 50 CHL V50 Leida el 06122002
Perfil - -- - ++ - -- - ++++ - - -+- + - I I I I I I I I +t+ - +f- ~ - - + + ~ - - - +- + - shy
o - GLY - ERY DARA - LARA + RIB + DXYL - LXYL - ADO - MDX - GAL + GLU + FRU + MNE + SBE - RHA - DUL - INO bull MAN + SOR - MDM + MUG shyNAG + AMY + ARB + ESC + SAL + CEL + MAL + LAC + MEL + SAC + TRE + 1NU - MLZ + RAF + AMD - GLYG - XLT - GEN + TIJR + LYX - TAG - DFUC shyLFUC - DARL + LARL - aNT + 2KG - 5KG shy
--- Taxones significativos rd -----T -- Tests en contra
Lactoplantarum 1 999 092 1
Taxon siguiente Lactobrevis 1 OJ 044 3
i i
Lactoplantarum 1 1 test (5) en contra
D-SORBITOL (SOR) 78
Tax6n siguiente Lactobrevis 1 3 test (s) ert contra
METHYLD-MANNOSIDE (MOlM) 0 MELEZITOSE (MLZ) 14 D-TURANOSE (TUR) 14
67
ampb
ANEXO B RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AISLADA DE REPOLLO FERMENTADO
~
Referencia Repollo fermentado - 3 Fecha 03072003
EXCELENTE IDENTIFICACION
Lactoplantarum 1
Galena API 50 CRL V50 Leida el 03072003
Perfil - - ++ - - - - -H++ - - ~ + - + - I I 1 I I I I -H+ - ++ - - - + + - -- - - + - shy
o - GLY - ERY - DARA - LARA + RIB + DXYL - LXYL - ADO ~ MDX - GAL + GLU + FRU + MNE + SBE ~ RHA - DUL - INO - MAN + SOR - MDM + MDG shyNAG + AMY + ARR + ESC + SAT + CRL + MAL + LAC + MEL + SAC + TRE + lNU - MLZ + RAF + AMI) - GLYG - XLT - GEN + TOR + LYX - TAG - DFUC shyLFUC - DARL - LARL - GNT + 2KG - 5KG shy
------Taxones significativos _ _----- Id--- ---T---- Tests en contra
Lactoplantarum 1 999 095 1
Tax6n siguiente Lactobrevis 1 01 OA8 3
lJactoplantaru01 1 1 test (s) en contra
DSORBITOL (SOR) 78
Taxon siguiente Lactobrevis
METHYL-D-MANNOSIDE D-TURANOSE
1
(MOM) (TOR)
3 test (5) en contra
0 MELEZITOSE 14
(MLZ) 14
i
I
68
ANEXO C RESULTADO PRUEBAS BIOQUWICAS DE CEPA AISLADA DE MUCOSA HUMANA
Referenda Mucosa - 5 Fecha 27012003
BUENA IDENTlFICACION
Galeria API 50 CHL vso Leida el 270112003
Perfil - - - - +t--t - - - + - + - - - - - - - - -+- - - - - + - + - - - - - - - - - - - - - bull - - -+ - +
o - GLY ~ ERY - DARA bull LARA + RID + DXYL + LXYL - ADO bull MDX - GAL + OLU - FRU + MNE - SBE - IlliA - DUL - INa - MAN - SOR - MDM - MOO shyNAG + AMY - ARB - ESC ~ SAL bull CEL - MAL + lAC - MEL + SAC - TRE shyINU - MLZ - RAF - AMD - GLYG - XLT - GEN - 11JR - LYX - TAG - DFUC shyLFUC - DARL - IARL - ONT + 2KO - 5KG +
- - - - - - Taxones significativos - - - - - - - Id T -- Test en contra
Lactobrevis 3 963 088 1
Taxon siguiente Lactoco11inoides 36 075 2
Lactobrevis 3 1 test (s) en contra
GLUCOSE (GLU) 95
-~~~------------~---------------------------~--~-------~--~-----~----------~--------~------------~~--Taxon siguiente Lactocollinoides 2 test (s) en contra
GLUCOSE (GLU) 100 MELIBIOSE (MEL) 25
69
i r
ANEXO D RESULTADO PRUEBAS BIOQIJiMICAS DE CEPA AISLADA DE LECHE FERMENTADA
Referenda Leche fennentada ~ 13 Fecha 27012003
BUENA IDENTIFICACI6N
Galeria API 50 CHL V50 Leida el 270112003
Perfil - - - - -t-t+- - - - + - + - - - bull - - - - -+- - - - - + - + - - - - - - - - - - - - - - - - -+ - +
0 - GLY - ERY - DARA - LARA +Rll3 + DXYL + LXYL - ADO - MDX ~GAL + GLU - FRU + MNE SBE - RHA DUL bull INO MAN - SOR MDM bull MDG shy
~NAG + AMY - ARB - ESC - SAL - CEL - MAL + LAC - MEL + SAC - TRE I lNU - MLZ - RAF - AMD - GLYG - XLT - OEN - IUR LYX - TAG - DFUC bull i
LFUC - DARL - LARL -ONr + 2KG - SKO + 1
- -- - - Taxones significativos - - Id -- T --- Test en contra
Lacta brevis 3 963 088 1
Taxon siguiente Lactocollinoides 36 075 2
Lactobrevis 3 1 test (s) en contra
GLUCOSE (GLU) 95
-----------------------------------------------------------~------------------------------~-------------------Taxon siguiente Lactocollinoides 2 test (s) en contra
GLUCOSE (GLD) 100 MELffiIOSE (MEL) 25
70
II iJ1
I
I ANEXO E RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AISLADA DE REPOLLITAS DE BRUSELAS FERMENTADA
Referencia repollitas de bruselas 15 Fecha 03072003
EXCELENTE IDENTIFICACION
Lactoplantarum 1
Galeria API 50 CHL vsO Leida el 03072003
Perfil - - - - +t - - - - +H+ - +- - +t + - I I I I I I I f ++t - + - - - -+ + - - - -+ -+ - - I ij
o - GLY - ERY - DARA - LARA + RJB + DXYL - LXYL - ADO - MDX - GAL +
GLU + FRU + MNE + SBE RHA + DUL - INO - MAN + SOR + MDM + MOG shyNAG + AMY + ARB + ESC + SAL + eEL + MAL + LAC + MEl + SAC + TRE + i
I1NU - MLZ + RAF AMD GLYG - XLT - aEN + TUR + LYX - TAG - Druc LFUC - DARt + LARL - aNT + 2KG - 5KG shy n ----Taxones significativos ------ Id Tests en contra
Lactoplantarum 1 999 090 o
Taxon siguiente Lacto pentosus 01 012 7
Lactoplantarum 1 o test (s) en contra
Taxon siguiente Lacto pentosus 7 test (8) en contra
GLYCEROL (GLY) 75 D-XYLOSE (DXYL) 100 L-RHAMNOSE (RHA) 25 METHYL-D-MANNOSIDE (MOM) 1 MELEZITOSE (MLZ) 25 RAFFINOSE (RAF) 75 D-ARABITOL (DARL) 0
71
~
I i I
ANEXO F - ANALISIS DE REGRESION PARA pH EN BEBIDA SIN AVENA
Aruilisis de regresi6n polinomial
---~-~-------------------------------------------~-----------~~---------------------~--------------Variable dependiente pHSinAvena ---------------------------~-------------~--------------------~---------------------------------
Error T Parametro Estimado Estandar Estadistico P-Valor
CONSTANTE 535606 0094535 56657 00000 Dia -0150565 0020706 727154 00000 Dia2 000504434 0000871488 578819 00001
---~---------------------------------------------------------------------------------------------------
Anfllisis de Variama -------------------------------------------~-----------~-----------------------------~-~--- jSource Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor 11
------------------------~------------------------------------------------------------------------------~ Mod-elo 155772 2 0118861 4256 00000 Residual 0237877 13 00182983
Total (Corr) 11956 IS
R2 == 867522 percent
pHSinAvena == 535606 - 0150565Dia + 000504434Dia2
72
____
middot ANEXO G - ANALISIS DE REGRESION PARA pH EN BEBIDA CON AVENA
AmUisis de regresion polinomial _____~_____~__-_____~___4____________________bull____bull__________bull_____________~~----_------___________
Variable depcndiente pHConA vena ------------------------------------------------------------------------------------------~--------
Error T Parametro Estimado StAndar Estadfstico P-Valor
---------------------------------------------~-----------------------------------------------_---------CONSTANTE 534463 00801045 667208 00000 Dia -0140407 00175453 800253 00000 DiaA 2 000448098 0000738458 606803 00000
----------------------~---~-----------------------------~------------------------------~----AmUisis de Varianza
---~---------------------------------~---------------------~------------~-------------------~------Source Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio PValor --------------------------~-----------------------------------------------~------------~-----~~--~ ModeJo 159575 2 0797873 6073 00000 Residual 02170798 middot13 00131383 _______~_~ ~_~----------~------~--~-----~-M-----~-----____ _____________~-----------------------Total (COlT) 176654 15
R12 903315 percent
-----------~------------------------------------------------------------------------~-----------pHConAvena 534463 - 0140407Dia + 000448098DfaA 2
73
ANEXO H - ANALTSIS DE REGRESTON PARA ACIDEZ EN BEBJDA SIN AVENA
An8Jisis de Regtesi6fi P6lifJomial
Variable Depefidiefile~ AcidezSinAVenll _______________w_____~______~________________~-----------_________~_________________~~____~___~_____
Error T Pariirnetro Estimado Estandar Estadistico ---------------------------------------~--------------~-~-------~--------------------~------------CONSTANT 0491697 00123217 399051 00000 Dia 00436032 000269882 161564 00000 D1a2 -000144613 000011359 127312 00000 __w___~________________________~-_______-_____~----____________________________~__~---~_--__~___
AriiiJisis de varianza ~_~__~__________~_~____~________~___________- _________e_____________________________bull _____-________
Source Smn de cuadr Df Mean Square F-Ratio PmiddotValor_~~___________________________________bull ______~___________bull ____________bull ______~________w________________
Model 0135203 2 00676013 21747 00000 Residual 000404118 13 000031086
Total (Corr) 0139244 15
R2 970978 percent
AcidezSlnAvena 0491697 + O0436032Dia - 0OOl44613Dia2
74
I
ANEXO I ANALISIS DE REGRESION PARA ACIDEZ EN BEBIDA CON AVENA
1
Anwisis de tegtesi6fi polinomial
Variable dependiente Acidez Con Avena
Error T ParametTo Estimado Stlindar Estadfstico P-Valor ----------------~-------~---------------------~-----------------------------------------------------CONSTANT 0491639 000926607 530578 00000 Diamiddot 00406572 000202955 200326 00000 DfaA 2 0000982559 0000085421 -115025 00000
-------------~----------------------------~-------------------------~-----------------------------------
-------------~-----~~-----------------------------~---------------------------------------------_--Source Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio PValor
-~-------------~----------------------------------~------------------~~-------------------------- Modelo 0288008 2 0144004 81914 00000 Residual 000228539 13 0000175799
----------~~--------------~---------------------------------------------~---------------------------Total (Corr) 0290294 15
RA2 = 992127 percent
-------------------------~----~---~------------~---------------------------------~---------------~
AcidezConAvena == 049163amp + 00406572D1a - 0000982559DiaA2
75
I
(Ilmiddot il
ANEXO J- ANALISIS DE REGRESION PARA RECUENTO LACTOBACILOS PARA BEBIDA SIN AVENA
Amilisis de regresion - Modelo lineal Y = a + bX
------------------------~----------------------~-----------------------------~----------~-----------Variable Dcpendiente LactobacilJusSinAvena Variable independiente Dia
I--------~----------~-----------------------------------~-------~-~--~--------------------------~-Error T
Paramctro Estimado Standard Stadistico P-Valor
----~----~------------~-----~-----------------------~-------------~-----------------------------Intereepto 117347 0389973 300911 00000 Pendiente 00483464 00257889 18747 00903
Analisis de Varianza
---------~------------------~----------------~---------------------------------~---------~----------Source Sum decuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor
------------~---------------------~---------------------~--------------------------------~-----~----Modelo 0916252 1 244835 443 00616 Residual 260706 10 0260706
--~------------~---~------------------~~~-----~-------~---------~~-------------------------------------Total (Corr)352332 11
Coeficiente Correlaci6n = 0509955 R2 = 260054 percent
LactobacillusSinAvena= 117347 + 00483464Dfa
76
ANEXO K- ANALTSIS DE REGRESION PARA RECUENTO LACTOBACILOS PARA DEBIDA CON AVENA
Aruilisis de regresion - Modelo lineal Y = a + hX
Variable Dependiente LactobacillusConAvena Variable Independiente Dia ---~--------------------------------------------------------__-----------__--_--_-----------shy
Error T Paramctro Estimado Standard Estadistico P-Valor -~--------------------------------------------------------------------------------------------------
Irttercepto 118103 0567963 207942 00000 Pendiente 00790304 00375594 210414 00616
-----------------~----------------------------~----~-------~----~----------------------------
Analisis de Varianza
----------------~----------------~------------------~--------------------------~------~--------shySource Swn de cuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor
-----------------~--~--------------------------------------------------------------------------~---~ Mode10 244835 1 244835 443 00616 Residual 552997 10 0552997
Total (Corr)797832 11
Coeficiente Correlacion = 0553964 RI2 = 306875 percent
-----~--------------------------------------------------------~--------------------------------------
LactobacillusConAvena = 118103 + 00790304Dfas
77
2272 Adici6n del inOculo
A 900ml de leche pasteurizada se Ie adicion61os 100 ml de leche que habia sido
previamente ino(ulada dos veces con la cepa posteriormente se deja
fermantando la lache a temperatura de 37deg C
2273 Control de Ja fermentaci6n
Las muestras se hicieron por cuadruplicado y se les hizo un seguimiento de
aoidez hasta un valor entre 04 y 05 expresada como Bcido lactico esta
procedimiento corresponde a la babida fermentada sin prebi6tico La bebida ~on
prebi6tico tiene al mismo proeedirnianto pero adicionalmente se agrag6 avena a
una concentraci6n de 05 en el momento de la adici6n del in6e410 a los 900 ml
de leehe pasteurlzada y el procedimiento sigui6 igual al de la bebida sin prebi6tico
tambien se hizo por cuadruplicado
2274 Refrigeracl6n
Despues que las mezclas con y sin prebiotico alcanzaron el de acidez
requarido se IIeva ron a refrigeraci6n a una temperatura de 4deg C p~r 24 horas
para frenar proce~os metab6licos de los microorganisrtlos Despues de este
ti~mpo se procedi6 al batido
36
1 2275 Batido
Con un agitador se procedi6 a batir las bebidas para romper et coagulo formado
y de esta manera homogeneizar la mazela y obtener asf la bebida fermentada
2276 Envasado y almacenamiento
Ambas bebidas se envasaron en frascos vidrio para hacerles seguimiento de pH
acidez(expresado como acido tacticol y recuento de Lactobacillus breviSf los
dies 27 14 Y 21 despues de elaboradas las bebidas perfodo durante el cualta
muestra permanecfa afmacenada a temperatura de refrigeracion(Ver Figura 5
37
Fjgura 5 Diagrama de Flujo
PREPARACION DE LA MUESTRA
ADICION DEL INOCULO
~_____~_B~ATIDO~______~
INCUBACION 37deg C hasta acidez = 04-05 acido laotico
ENFRIAMIENTO
hasta 4 0 C ~------~ ~------~
ENVASADO Y ALMACENAMJENTO
dUrante 21 dfas a Temperatura 4 0 C
38
1
228 Determinaci6n del pH
Se determino por el metoda potenciometrico en un pH-metro manual durante los
dias 2) 7 14 Y 21 de las bebidas lacteas sin y con prebi6tica (Ver Tablas 7 y 8)
229 Oeterminaci6n de la acidez (Expresadfl como acido
lactica)
Se tomaron 9 mJ de las bebida~ sa Ie adicionaron 2 gotas de fanoftaleina como
indicador y sa titulo fa acidez con NaOH 01 N hasta la aparicion de un cotor rosado
debit EI volumen de NaOH utilizado se reporta como valor de de acidez
(VerTablas 10 y 11)
2210 Prueba de viabilidad
Qurante el perfoda de almacenamiento de la bebida lactea se procedi6 a hacer la
prueba de viabiHdad en los dias 7 14 Y 21 para determinar Si los lactobacilfus
permanecfan vivOs a una concentraci6n minima de 106 hasta el dia 21 como 10
establece eJ Articulo 10 de la Rasolucion 2310 del Ministerio de $alud de
Colombja
39
Para asta prueba se tamaron 10 rnl de muestra y se adicionaron a 90 ml de caldo
MRS ruego a partir de esta se hicieron diluciones de 10-2 hasta 10-11 de las
diluciones 109101deg 10-11 se inocul6 1 ml de cada uno en agar MRS siguiendo el
metodo de siembra en profundidad y por duplicado e incubando a 370 C x 5 dras
en anaerobiosis y luego se hicieron tos recuentos por duplicado para esi reportar
los recuentos promedio (Ver Tablas 13 y 14)
2211 AniUisls microbiol6glco de las bebidas Iicteas(con y sin
avena)
Con el fin de determinar las condiciones higienico-sanitarias del producto se
realizaron las pruebas microbiol6gicas de Recuento de mohos y fevadurasml en
agar OGY Recuento en superficia de Staphylococcus coagulasa positivoml en
agar Baird Parker Numero Mas Probable (NMP) de coUfor-mes totales y
Escherichia coliml en caldo Fluorocult y Presencia de Salmonela25ml con BHI
caldo tetrationato y agar Hecktoen (Montoya 1999)
(Var tabla 16)
2212 AnaUsis estadistico
A los datos obtenidos en la medici6n de pH acidez (expresada como Beido
laclico) en los dras 2714 Y 21 y el recuento de Lactobacillus en los dras 714 y21
40
realizados a los dos tratamlentos se tes aplic6 1a prueba t porque solo difieren
en la presencia 0 ausencia del prebi6tico para evaluar si habra diferencia
estadfsticamente significativa para los dos tratamientbs(Ver Tablas9 12 y 15)
41
3 RESULTADOS Y DISCUSION
31 Coloraci6n de Gram y morfologfa
Las cepas aisladas fesultaron Gram positivas (Ver Figura 6) colonias grandes
cremosas dE) color beige con bordes homogeneos y c6ncavos en su
morfologia (Ver Figura 3) resultando de acuerdo a 10 especificado en Stanley
1989 para Lactobacillus
32 Prueba de esporulaci6n y cataJasa
Los resultados de la pruebas de esporulaci6n y catalasa indicados en las
Tablas 3 y 4 respeclivamente dieron conforme a 10 especificado en Stanley
1989 para Lactobacillus
42
1
2 3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
TABLA 3 Resultado de prueba de esporuJaci6n
CEPA RESULfADO ESPORULACION
-- -------------
43
l i ~II bull ~ I I
TABLA 4 Resultado prueba de la catalasa
CEPA RESULTADO CATALASA
1 -2 -3 -4 -5 -6 -7 8 -9 -10 -11 12 -13 -14 -15 -16
3~3 Prueba para determinar la especie
Oespues de hacer las pruebas para seleccionar las cepas sospechosas de ser
Lactobacillus se realizo las pruebas bioquimicas fograndose identificar
Lactobacillus plantarum aislctdo de pepino repollo y repollitas de bruselas
44
fermentados y Lactobacillus brevis de mucosa vaginal y leche fermentada (Ver
Anexos del A al E y Tabla 5)
TABLA 5 Resultado identlficaci6n cepa~
CEPA NOMBRE
1 Lactobacillus planfarum
3 Lactobacillus plantarum
5 Lactobacillus brevis
13 Lactobacillus brevis
15 Lactobacillus plantarum
34 Pruebas para determinar microorganismos probi6ticos
las cepas de Lactobacillus brevis y Lactobacillus plantarum mostraron
rasistencia al medio acido de pH =2 Y sales biliares 03 pv resultado similar al
encontrado por Jacobsen et al 1999 para Lactobacillus plantarum (Ver tabla 6)
45
middot
~~~ttiI lltlmiddot~COX~dtJ ~xtc_~ 2 tr~ k-JlL~middot
-)~~TO DE lJIBUOTECUl rjRL]OTtCA twn GO1IU1
TABLA 6 Resultados a pruebas de resistencia a pH=2 y sales biliares 03 plv
CEPA RESISTENCIA pH=2 RESISTENCfA A SALES BIUARES ()3 pv
1 + +
2 + +
3 + +
4 + +
5 +
6 + +
7 + +
8 + +
9 + +
10 + +
11 + +
12 + +
13 + +
14 +1shy +M
15 + +
16 + +
+1 crecimiento debil
+ crecimiento abundante
46
Figura 6 Lactobacillus brevis Gram + aislado de leche fermentada
Ai observar en placa las celulas de lactobacilos despues de real1zar las pruebas
de resistenCia a la acidez y sales biliares se observo una tendencia a aglomerarse
posiblemente como un mecanismo de proteccion cOlitra estos medios que pueden
lIegar a ser adversos para elias (Ver figuras 7 y 8)
47
Figura 7 Lactobacillus brevis aislada de leche fermentada despu~s de la prueba de resistencia a pH=2
Figura 8 Lactobacillus brevis aislada de leche fermentada despues de la prueba de resistencie asales biUares 03 plv
fI
48
35 --Seguimiento del-pH-en-la-bebidaJacteacon y sin -prebi6tico
A continuacion se muestran las Tablas 7 y 8 donde sa registian los datos
recopilados de pHdurante 10$ dras Z 7 14 Y21 para las bebidas laaeas con ysin
prebi6tioo
TABLA 1 ResultadopH yogur sin avena
Dia Repetition 1 Repetici6n 2 Repeticion 3 Repetici6n 4
2 526 501 51 52
7 446 433 438 44
14 439 435 437 436
21 439 437 438 437
TABLA 8 -ResultadopHyogur con avena
Dia Repeticion 1 Repeticion2 Repeticion 3 - Repeticion 4
2 509 523 51 515
7 447 442 445 442
14 436 -438 439 437
21 432 433 435 434
Observando la Figura 9podamos ver que el pH en el -dfado$ para los dos
tratamientos as igual y empieza a descender rapidamente para estabilizarse a
partir del dra 7(Ver figura 9)
49
Figura 9 Comparacj6n de medias para -el pH
Comparaci6n de medias para pH
55 ~ 5 +----=gtIIIi-~i~~----=-r--it~ -- pH sin avena
a 45 1--~~~~=~~ 4 --- pH con
avena35 t-----r-- -------=------=--= ------- - ----
2 7 14 21
Dias
Aplicando la prueba t para comparar las medias de pH I S6 muestia una diferencia
altamants significativa en los dos tratamientos para el dia 21 (pltO05)
(Ver tabla 9)
TABLA 9 Compaiaci6n de medias para pH
DtAS SIN AVENA CON AVENA te p (VALOR)
2 514 514 0 10
7 439 444 -1 61 0159
14 437 I
438 -070 0510
21 438 433 528 00019 shy
- DiFERENCIA AlTAMENTE SIGNIFICATIVA
50
I
AI aplicar regrasi6n a los datos sa obtiene al modelo estimado
pHSinAyena =535606 - 01505650Ia +0005044340IaI2
La variabilidad en la respuesta de pH asta siendo explicada en un 8S7522 por
el modelo (Ver Anexo F)
EI tratamiento con avena mostro el siguiente modelo al analisis de ragresi6n
pHConAvena =534463 ~ 0140407Dia + 0004480980Ia2
La variabilidad an la respuesta de pH asta siendo explicada en un 903315 par
el nlodelo(Ver anexo G)
36 Seguimiento de la acidezmiddotmiddot expresada comomiddot de acido
lactico
A continuaci6n sa muestran las Tablas 10 y 11 donde sa registran los datos
tecopilados de acidezmiddotdurante los dias 27 14 Y 21 para las pebidas taetees con y
sin prebi6tico
TABLA 10 Resuttadode acidez (expresadocomo acido tactico) yogurt sin avena
CIA R~petici6n1 Repeticion2 Repetici6n 3 Repeticion 4
2 054 06 057 058
7 072 074 073 0]2
14 080 083 082 082
21 0]4 079 078 077
51
TABLA 11 Resultado de aCidez (expresado como acido Icktico) yogurt con avena
Dia Repetici6n 1 RepetiCi6n 2 Repetici6n 3 Repetici9n 4
2 059 055 058 057
7 071 073 072 072
14 089 087 088 086
21 092 091 090 091
Observando la Figura 10 se puede concluir que la acidez empieza a aumentar
hasta el dia 14 y luego trata de estabilizarse para los dos tratamientos
(Ver figura 10)
Figura 10 Comparaci6n de medias para la acidez
N G)
Comparacion de medias para acidez
1
2 0I 5 -+--=--------=-~~~= u
ltC
- Acidez sin avena
2 7 14
Dias
52
21
-it- Acidez con avena
Aplicando la prueba t para camparar las madias de acidez se muestra una
diferencia altarnante significativa en los dos tratamiantos para los dias 14 y 21
(pltO05)
(Var tabla 12)
TABLA 12Comparaci6n de medias para Acidez
DIASmiddot SIN AVENA CON AVENA te p(VALOR)
2 0572 0572 0 10
7 0727 0720 119 0278
14 0818 0875 -638 000070shy
21 077 091 -1212 i 0000019 shy
DIFERENCIA AL TAMENTE SlGNIFICATIVA
AI aplicar r~gresi6n a los datos se obtiene el modelo estimado
AcidezSlnAIena = 0491897 + O0436032Dia O00144613DfaA2
La variabilidad en la respuesta de acidez asta siendoexplicada en un 970978
por al modelo (Ver anexo H)
EI tratamiento con avena mostro elsiguiente modeloj a1 analisis de regresion
AcidezConAvena = 0491638 + 00406572Oia - OQOO982559OiaA2
La variabilidad enla respuesta acidez esta siendo explicadaen un 99212 por
el modelo (Ver anexo J)
53
I ~
37 Prueba de viabiJidad
A continuaci6n sa muestran las Tab~as 13 y 14 donde sa presentan los datos
recopilados del recuento de Lactobacilos durante los dias 7 14 Y 21 para las
bebidas lacteas con y sin prebi6tico
TABLA 13 Recuento de Lactobacilos (UFCml) yogurt sin avena
Dia Repetici6n 1 Repetici6n 2 Repeticion 3 Reptttici6n 4
7 1880X10l1 1454X1011 1642X1011 1780X10~
14 1560X10~ 646X1011J 1890X10l 140X10l1
21 1200x10lu 128Ox10u 1745x10J 1520x101V
TABLA 14 Recuento de Lactobacilos (UFCml) yogurt con avena
Dfa Repetieion 1 Repetici6n 2 Repeticion 3 Repeticf6n 4
7 1600X10lt 1240X10t 1640X10ll 1980X10t
14 540X1011 427X10n 546X10n 720X10ll
21 500x1011 492x1011 712)(1011 980x10~
AI analizar la Figura 11 sa puede observar un recuento mayor de Lactobacilos
en al tratamiento con avena resultado de acuerdo a 10 encontrado por Alander at
aI 1999 Kontula et aI 1998 y Jaskari et aI 1998
54
Figura 11 Comparaci6n de medias para Log Lactobacillus
Comparacion de medias para log Lactobacillus
~ 1350
-+- Sac Sin--() 13 co avenaIII
bull 125 -- Bac con 0)
0 12 avenaJ
115 7 14 21
Dias
Aplicando la prueba t para comparar las medias de recuento de Lactobacillus no
se encontr6 una diferenc1a estadfsUcamente significative entre los dos
tratamientos (Ver tabla 15)
Este aumento en al racuento influy6 en la disminuci6n del pH y en el aumento de
fa aeidez por la fermentacion que realizan los Lactobacillus sobre fa lactosa de la
lache y la avena adicionada como prebi6tico
55
1
TABLA 15 Comparaci6n medias lag Lactobacillus
DIAS SIN AVENA CON AVENA tc p(VALOR)
7 122257 122022 04846 06451
14 121065 132393 -19602 00977
21 129025 133087 -08236 04416
At aplicar regresion a los datos se obtiane al modelo astimado
LactobacillusSinAvena= 117347 + 004834640Ia
La variabilidad en la respuesta del recuento de LactobaCillus ssta siendo
explicada en un 260054 por el mod$loVar anexo J)
EI tratamiento con avena mostr6 al siguiente modalo al anal isis de regresion
Lactobacillu$ConAvena =118103 + 007903040Ias
La variabilidad en la respuesta de recuento esta siendo explicada en un 3068
por al modelo(Ver anexo K)~
38 Analisi$ microbiol6gicos de las bebidas lacteas con y sin
En la Tabla 16 estan recopilados los resultados microbiol6gieos obtenidos en ras
muestras con los dos tratamientos (con y sin avena)
I [
sa
TABLA 16 Resultados analisis microbiologico
Recuento de mohos y levaduras Iml lt10
Recuento de Staphylococcus coagulase positiva Iml lt100
NMP coliformes fotales y Escherichia coli Iml lt3
Presencia de Salmonella25ml Ausente
Los resultados de este analisis demuestran que las bebidas fermentadas con y
sin avena~ astan fibres de microorganismos patogenos
57
1
4 CONCLUSIONES
Se aislaron cepas nativas de Lactobacillus plantarum de las muestras vegetates
de repollo pepino repollitas de bruselas fermentadas y Lactobacillus brevis de
lache fermentada y mucosa vaginal humana Ambas cepas resistieran un pH=2 y
una concentraci6n de sales biliares det 03 ptv dos earacteristicas importantes
en los probi6ticos
Lamiddot cepa de Lactobacillus brevis aislada de lache Sa utiliz6 para elaborar una
bebida fermentada sin y con avana comoingrediente prebiotico obteniendose un
aJimento centon recuento del probi6tico viable durante 21 dras de seguimiento
ademas libre de microorganismos )at6gen05
No se encontr6 efecta significativo de la avena sobre Ie viabilidad del Lactobacillus
brevis aunque sa presento un aumento en 61 recuento de estos en la bebida con
avena
58
plusmn ~
5 RECOMENDACIONES
Ensayar la cepa de Lactobacillus plantartJm en productos carnicos madurados
como el salami
Ensayar la cepa de Lactobacillus l)revs en otros derivados lecteos como queso
quesito queso crema
Continuar con el estudio de estos microorganismos y caracterizarlos
molecularmente ademas de estudiar su capacidad de adherencja a fa mucosa
intestinal sobre algunes Hneas celulares como las CaCo~2
Estudiarel efedo de la avena sabre la viabiJidad del Lactobacillus breyis a una
concentraci6n mayor de 05
Realizer ensayos can las cepas de Lactobacillus brevis y Lactobrlcillus pJantarum
para elaborar masas acidas para panificacion reemplazando el Bromato de
Potasio aditivo prohibido desde marzo del 2003 en nuestro pais per 5U toxicidad
59
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65
ANEXOS
66
ANEXO A RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AlSLADA DE i
PEPINO it
Referencia Pepino 1 Fecha 06122002
IEXCELENTE IDENTIFICACION
Latto plantarum 1
Galeria API 50 CHL V50 Leida el 06122002
Perfil - -- - ++ - -- - ++++ - - -+- + - I I I I I I I I +t+ - +f- ~ - - + + ~ - - - +- + - shy
o - GLY - ERY DARA - LARA + RIB + DXYL - LXYL - ADO - MDX - GAL + GLU + FRU + MNE + SBE - RHA - DUL - INO bull MAN + SOR - MDM + MUG shyNAG + AMY + ARB + ESC + SAL + CEL + MAL + LAC + MEL + SAC + TRE + 1NU - MLZ + RAF + AMD - GLYG - XLT - GEN + TIJR + LYX - TAG - DFUC shyLFUC - DARL + LARL - aNT + 2KG - 5KG shy
--- Taxones significativos rd -----T -- Tests en contra
Lactoplantarum 1 999 092 1
Taxon siguiente Lactobrevis 1 OJ 044 3
i i
Lactoplantarum 1 1 test (5) en contra
D-SORBITOL (SOR) 78
Tax6n siguiente Lactobrevis 1 3 test (s) ert contra
METHYLD-MANNOSIDE (MOlM) 0 MELEZITOSE (MLZ) 14 D-TURANOSE (TUR) 14
67
ampb
ANEXO B RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AISLADA DE REPOLLO FERMENTADO
~
Referencia Repollo fermentado - 3 Fecha 03072003
EXCELENTE IDENTIFICACION
Lactoplantarum 1
Galena API 50 CRL V50 Leida el 03072003
Perfil - - ++ - - - - -H++ - - ~ + - + - I I 1 I I I I -H+ - ++ - - - + + - -- - - + - shy
o - GLY - ERY - DARA - LARA + RIB + DXYL - LXYL - ADO ~ MDX - GAL + GLU + FRU + MNE + SBE ~ RHA - DUL - INO - MAN + SOR - MDM + MDG shyNAG + AMY + ARR + ESC + SAT + CRL + MAL + LAC + MEL + SAC + TRE + lNU - MLZ + RAF + AMI) - GLYG - XLT - GEN + TOR + LYX - TAG - DFUC shyLFUC - DARL - LARL - GNT + 2KG - 5KG shy
------Taxones significativos _ _----- Id--- ---T---- Tests en contra
Lactoplantarum 1 999 095 1
Tax6n siguiente Lactobrevis 1 01 OA8 3
lJactoplantaru01 1 1 test (s) en contra
DSORBITOL (SOR) 78
Taxon siguiente Lactobrevis
METHYL-D-MANNOSIDE D-TURANOSE
1
(MOM) (TOR)
3 test (5) en contra
0 MELEZITOSE 14
(MLZ) 14
i
I
68
ANEXO C RESULTADO PRUEBAS BIOQUWICAS DE CEPA AISLADA DE MUCOSA HUMANA
Referenda Mucosa - 5 Fecha 27012003
BUENA IDENTlFICACION
Galeria API 50 CHL vso Leida el 270112003
Perfil - - - - +t--t - - - + - + - - - - - - - - -+- - - - - + - + - - - - - - - - - - - - - bull - - -+ - +
o - GLY ~ ERY - DARA bull LARA + RID + DXYL + LXYL - ADO bull MDX - GAL + OLU - FRU + MNE - SBE - IlliA - DUL - INa - MAN - SOR - MDM - MOO shyNAG + AMY - ARB - ESC ~ SAL bull CEL - MAL + lAC - MEL + SAC - TRE shyINU - MLZ - RAF - AMD - GLYG - XLT - GEN - 11JR - LYX - TAG - DFUC shyLFUC - DARL - IARL - ONT + 2KO - 5KG +
- - - - - - Taxones significativos - - - - - - - Id T -- Test en contra
Lactobrevis 3 963 088 1
Taxon siguiente Lactoco11inoides 36 075 2
Lactobrevis 3 1 test (s) en contra
GLUCOSE (GLU) 95
-~~~------------~---------------------------~--~-------~--~-----~----------~--------~------------~~--Taxon siguiente Lactocollinoides 2 test (s) en contra
GLUCOSE (GLU) 100 MELIBIOSE (MEL) 25
69
i r
ANEXO D RESULTADO PRUEBAS BIOQIJiMICAS DE CEPA AISLADA DE LECHE FERMENTADA
Referenda Leche fennentada ~ 13 Fecha 27012003
BUENA IDENTIFICACI6N
Galeria API 50 CHL V50 Leida el 270112003
Perfil - - - - -t-t+- - - - + - + - - - bull - - - - -+- - - - - + - + - - - - - - - - - - - - - - - - -+ - +
0 - GLY - ERY - DARA - LARA +Rll3 + DXYL + LXYL - ADO - MDX ~GAL + GLU - FRU + MNE SBE - RHA DUL bull INO MAN - SOR MDM bull MDG shy
~NAG + AMY - ARB - ESC - SAL - CEL - MAL + LAC - MEL + SAC - TRE I lNU - MLZ - RAF - AMD - GLYG - XLT - OEN - IUR LYX - TAG - DFUC bull i
LFUC - DARL - LARL -ONr + 2KG - SKO + 1
- -- - - Taxones significativos - - Id -- T --- Test en contra
Lacta brevis 3 963 088 1
Taxon siguiente Lactocollinoides 36 075 2
Lactobrevis 3 1 test (s) en contra
GLUCOSE (GLU) 95
-----------------------------------------------------------~------------------------------~-------------------Taxon siguiente Lactocollinoides 2 test (s) en contra
GLUCOSE (GLD) 100 MELffiIOSE (MEL) 25
70
II iJ1
I
I ANEXO E RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AISLADA DE REPOLLITAS DE BRUSELAS FERMENTADA
Referencia repollitas de bruselas 15 Fecha 03072003
EXCELENTE IDENTIFICACION
Lactoplantarum 1
Galeria API 50 CHL vsO Leida el 03072003
Perfil - - - - +t - - - - +H+ - +- - +t + - I I I I I I I f ++t - + - - - -+ + - - - -+ -+ - - I ij
o - GLY - ERY - DARA - LARA + RJB + DXYL - LXYL - ADO - MDX - GAL +
GLU + FRU + MNE + SBE RHA + DUL - INO - MAN + SOR + MDM + MOG shyNAG + AMY + ARB + ESC + SAL + eEL + MAL + LAC + MEl + SAC + TRE + i
I1NU - MLZ + RAF AMD GLYG - XLT - aEN + TUR + LYX - TAG - Druc LFUC - DARt + LARL - aNT + 2KG - 5KG shy n ----Taxones significativos ------ Id Tests en contra
Lactoplantarum 1 999 090 o
Taxon siguiente Lacto pentosus 01 012 7
Lactoplantarum 1 o test (s) en contra
Taxon siguiente Lacto pentosus 7 test (8) en contra
GLYCEROL (GLY) 75 D-XYLOSE (DXYL) 100 L-RHAMNOSE (RHA) 25 METHYL-D-MANNOSIDE (MOM) 1 MELEZITOSE (MLZ) 25 RAFFINOSE (RAF) 75 D-ARABITOL (DARL) 0
71
~
I i I
ANEXO F - ANALISIS DE REGRESION PARA pH EN BEBIDA SIN AVENA
Aruilisis de regresi6n polinomial
---~-~-------------------------------------------~-----------~~---------------------~--------------Variable dependiente pHSinAvena ---------------------------~-------------~--------------------~---------------------------------
Error T Parametro Estimado Estandar Estadistico P-Valor
CONSTANTE 535606 0094535 56657 00000 Dia -0150565 0020706 727154 00000 Dia2 000504434 0000871488 578819 00001
---~---------------------------------------------------------------------------------------------------
Anfllisis de Variama -------------------------------------------~-----------~-----------------------------~-~--- jSource Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor 11
------------------------~------------------------------------------------------------------------------~ Mod-elo 155772 2 0118861 4256 00000 Residual 0237877 13 00182983
Total (Corr) 11956 IS
R2 == 867522 percent
pHSinAvena == 535606 - 0150565Dia + 000504434Dia2
72
____
middot ANEXO G - ANALISIS DE REGRESION PARA pH EN BEBIDA CON AVENA
AmUisis de regresion polinomial _____~_____~__-_____~___4____________________bull____bull__________bull_____________~~----_------___________
Variable depcndiente pHConA vena ------------------------------------------------------------------------------------------~--------
Error T Parametro Estimado StAndar Estadfstico P-Valor
---------------------------------------------~-----------------------------------------------_---------CONSTANTE 534463 00801045 667208 00000 Dia -0140407 00175453 800253 00000 DiaA 2 000448098 0000738458 606803 00000
----------------------~---~-----------------------------~------------------------------~----AmUisis de Varianza
---~---------------------------------~---------------------~------------~-------------------~------Source Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio PValor --------------------------~-----------------------------------------------~------------~-----~~--~ ModeJo 159575 2 0797873 6073 00000 Residual 02170798 middot13 00131383 _______~_~ ~_~----------~------~--~-----~-M-----~-----____ _____________~-----------------------Total (COlT) 176654 15
R12 903315 percent
-----------~------------------------------------------------------------------------~-----------pHConAvena 534463 - 0140407Dia + 000448098DfaA 2
73
ANEXO H - ANALTSIS DE REGRESTON PARA ACIDEZ EN BEBJDA SIN AVENA
An8Jisis de Regtesi6fi P6lifJomial
Variable Depefidiefile~ AcidezSinAVenll _______________w_____~______~________________~-----------_________~_________________~~____~___~_____
Error T Pariirnetro Estimado Estandar Estadistico ---------------------------------------~--------------~-~-------~--------------------~------------CONSTANT 0491697 00123217 399051 00000 Dia 00436032 000269882 161564 00000 D1a2 -000144613 000011359 127312 00000 __w___~________________________~-_______-_____~----____________________________~__~---~_--__~___
AriiiJisis de varianza ~_~__~__________~_~____~________~___________- _________e_____________________________bull _____-________
Source Smn de cuadr Df Mean Square F-Ratio PmiddotValor_~~___________________________________bull ______~___________bull ____________bull ______~________w________________
Model 0135203 2 00676013 21747 00000 Residual 000404118 13 000031086
Total (Corr) 0139244 15
R2 970978 percent
AcidezSlnAvena 0491697 + O0436032Dia - 0OOl44613Dia2
74
I
ANEXO I ANALISIS DE REGRESION PARA ACIDEZ EN BEBIDA CON AVENA
1
Anwisis de tegtesi6fi polinomial
Variable dependiente Acidez Con Avena
Error T ParametTo Estimado Stlindar Estadfstico P-Valor ----------------~-------~---------------------~-----------------------------------------------------CONSTANT 0491639 000926607 530578 00000 Diamiddot 00406572 000202955 200326 00000 DfaA 2 0000982559 0000085421 -115025 00000
-------------~----------------------------~-------------------------~-----------------------------------
-------------~-----~~-----------------------------~---------------------------------------------_--Source Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio PValor
-~-------------~----------------------------------~------------------~~-------------------------- Modelo 0288008 2 0144004 81914 00000 Residual 000228539 13 0000175799
----------~~--------------~---------------------------------------------~---------------------------Total (Corr) 0290294 15
RA2 = 992127 percent
-------------------------~----~---~------------~---------------------------------~---------------~
AcidezConAvena == 049163amp + 00406572D1a - 0000982559DiaA2
75
I
(Ilmiddot il
ANEXO J- ANALISIS DE REGRESION PARA RECUENTO LACTOBACILOS PARA BEBIDA SIN AVENA
Amilisis de regresion - Modelo lineal Y = a + bX
------------------------~----------------------~-----------------------------~----------~-----------Variable Dcpendiente LactobacilJusSinAvena Variable independiente Dia
I--------~----------~-----------------------------------~-------~-~--~--------------------------~-Error T
Paramctro Estimado Standard Stadistico P-Valor
----~----~------------~-----~-----------------------~-------------~-----------------------------Intereepto 117347 0389973 300911 00000 Pendiente 00483464 00257889 18747 00903
Analisis de Varianza
---------~------------------~----------------~---------------------------------~---------~----------Source Sum decuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor
------------~---------------------~---------------------~--------------------------------~-----~----Modelo 0916252 1 244835 443 00616 Residual 260706 10 0260706
--~------------~---~------------------~~~-----~-------~---------~~-------------------------------------Total (Corr)352332 11
Coeficiente Correlaci6n = 0509955 R2 = 260054 percent
LactobacillusSinAvena= 117347 + 00483464Dfa
76
ANEXO K- ANALTSIS DE REGRESION PARA RECUENTO LACTOBACILOS PARA DEBIDA CON AVENA
Aruilisis de regresion - Modelo lineal Y = a + hX
Variable Dependiente LactobacillusConAvena Variable Independiente Dia ---~--------------------------------------------------------__-----------__--_--_-----------shy
Error T Paramctro Estimado Standard Estadistico P-Valor -~--------------------------------------------------------------------------------------------------
Irttercepto 118103 0567963 207942 00000 Pendiente 00790304 00375594 210414 00616
-----------------~----------------------------~----~-------~----~----------------------------
Analisis de Varianza
----------------~----------------~------------------~--------------------------~------~--------shySource Swn de cuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor
-----------------~--~--------------------------------------------------------------------------~---~ Mode10 244835 1 244835 443 00616 Residual 552997 10 0552997
Total (Corr)797832 11
Coeficiente Correlacion = 0553964 RI2 = 306875 percent
-----~--------------------------------------------------------~--------------------------------------
LactobacillusConAvena = 118103 + 00790304Dfas
77
1 2275 Batido
Con un agitador se procedi6 a batir las bebidas para romper et coagulo formado
y de esta manera homogeneizar la mazela y obtener asf la bebida fermentada
2276 Envasado y almacenamiento
Ambas bebidas se envasaron en frascos vidrio para hacerles seguimiento de pH
acidez(expresado como acido tacticol y recuento de Lactobacillus breviSf los
dies 27 14 Y 21 despues de elaboradas las bebidas perfodo durante el cualta
muestra permanecfa afmacenada a temperatura de refrigeracion(Ver Figura 5
37
Fjgura 5 Diagrama de Flujo
PREPARACION DE LA MUESTRA
ADICION DEL INOCULO
~_____~_B~ATIDO~______~
INCUBACION 37deg C hasta acidez = 04-05 acido laotico
ENFRIAMIENTO
hasta 4 0 C ~------~ ~------~
ENVASADO Y ALMACENAMJENTO
dUrante 21 dfas a Temperatura 4 0 C
38
1
228 Determinaci6n del pH
Se determino por el metoda potenciometrico en un pH-metro manual durante los
dias 2) 7 14 Y 21 de las bebidas lacteas sin y con prebi6tica (Ver Tablas 7 y 8)
229 Oeterminaci6n de la acidez (Expresadfl como acido
lactica)
Se tomaron 9 mJ de las bebida~ sa Ie adicionaron 2 gotas de fanoftaleina como
indicador y sa titulo fa acidez con NaOH 01 N hasta la aparicion de un cotor rosado
debit EI volumen de NaOH utilizado se reporta como valor de de acidez
(VerTablas 10 y 11)
2210 Prueba de viabilidad
Qurante el perfoda de almacenamiento de la bebida lactea se procedi6 a hacer la
prueba de viabiHdad en los dias 7 14 Y 21 para determinar Si los lactobacilfus
permanecfan vivOs a una concentraci6n minima de 106 hasta el dia 21 como 10
establece eJ Articulo 10 de la Rasolucion 2310 del Ministerio de $alud de
Colombja
39
Para asta prueba se tamaron 10 rnl de muestra y se adicionaron a 90 ml de caldo
MRS ruego a partir de esta se hicieron diluciones de 10-2 hasta 10-11 de las
diluciones 109101deg 10-11 se inocul6 1 ml de cada uno en agar MRS siguiendo el
metodo de siembra en profundidad y por duplicado e incubando a 370 C x 5 dras
en anaerobiosis y luego se hicieron tos recuentos por duplicado para esi reportar
los recuentos promedio (Ver Tablas 13 y 14)
2211 AniUisls microbiol6glco de las bebidas Iicteas(con y sin
avena)
Con el fin de determinar las condiciones higienico-sanitarias del producto se
realizaron las pruebas microbiol6gicas de Recuento de mohos y fevadurasml en
agar OGY Recuento en superficia de Staphylococcus coagulasa positivoml en
agar Baird Parker Numero Mas Probable (NMP) de coUfor-mes totales y
Escherichia coliml en caldo Fluorocult y Presencia de Salmonela25ml con BHI
caldo tetrationato y agar Hecktoen (Montoya 1999)
(Var tabla 16)
2212 AnaUsis estadistico
A los datos obtenidos en la medici6n de pH acidez (expresada como Beido
laclico) en los dras 2714 Y 21 y el recuento de Lactobacillus en los dras 714 y21
40
realizados a los dos tratamlentos se tes aplic6 1a prueba t porque solo difieren
en la presencia 0 ausencia del prebi6tico para evaluar si habra diferencia
estadfsticamente significativa para los dos tratamientbs(Ver Tablas9 12 y 15)
41
3 RESULTADOS Y DISCUSION
31 Coloraci6n de Gram y morfologfa
Las cepas aisladas fesultaron Gram positivas (Ver Figura 6) colonias grandes
cremosas dE) color beige con bordes homogeneos y c6ncavos en su
morfologia (Ver Figura 3) resultando de acuerdo a 10 especificado en Stanley
1989 para Lactobacillus
32 Prueba de esporulaci6n y cataJasa
Los resultados de la pruebas de esporulaci6n y catalasa indicados en las
Tablas 3 y 4 respeclivamente dieron conforme a 10 especificado en Stanley
1989 para Lactobacillus
42
1
2 3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
TABLA 3 Resultado de prueba de esporuJaci6n
CEPA RESULfADO ESPORULACION
-- -------------
43
l i ~II bull ~ I I
TABLA 4 Resultado prueba de la catalasa
CEPA RESULTADO CATALASA
1 -2 -3 -4 -5 -6 -7 8 -9 -10 -11 12 -13 -14 -15 -16
3~3 Prueba para determinar la especie
Oespues de hacer las pruebas para seleccionar las cepas sospechosas de ser
Lactobacillus se realizo las pruebas bioquimicas fograndose identificar
Lactobacillus plantarum aislctdo de pepino repollo y repollitas de bruselas
44
fermentados y Lactobacillus brevis de mucosa vaginal y leche fermentada (Ver
Anexos del A al E y Tabla 5)
TABLA 5 Resultado identlficaci6n cepa~
CEPA NOMBRE
1 Lactobacillus planfarum
3 Lactobacillus plantarum
5 Lactobacillus brevis
13 Lactobacillus brevis
15 Lactobacillus plantarum
34 Pruebas para determinar microorganismos probi6ticos
las cepas de Lactobacillus brevis y Lactobacillus plantarum mostraron
rasistencia al medio acido de pH =2 Y sales biliares 03 pv resultado similar al
encontrado por Jacobsen et al 1999 para Lactobacillus plantarum (Ver tabla 6)
45
middot
~~~ttiI lltlmiddot~COX~dtJ ~xtc_~ 2 tr~ k-JlL~middot
-)~~TO DE lJIBUOTECUl rjRL]OTtCA twn GO1IU1
TABLA 6 Resultados a pruebas de resistencia a pH=2 y sales biliares 03 plv
CEPA RESISTENCIA pH=2 RESISTENCfA A SALES BIUARES ()3 pv
1 + +
2 + +
3 + +
4 + +
5 +
6 + +
7 + +
8 + +
9 + +
10 + +
11 + +
12 + +
13 + +
14 +1shy +M
15 + +
16 + +
+1 crecimiento debil
+ crecimiento abundante
46
Figura 6 Lactobacillus brevis Gram + aislado de leche fermentada
Ai observar en placa las celulas de lactobacilos despues de real1zar las pruebas
de resistenCia a la acidez y sales biliares se observo una tendencia a aglomerarse
posiblemente como un mecanismo de proteccion cOlitra estos medios que pueden
lIegar a ser adversos para elias (Ver figuras 7 y 8)
47
Figura 7 Lactobacillus brevis aislada de leche fermentada despu~s de la prueba de resistencia a pH=2
Figura 8 Lactobacillus brevis aislada de leche fermentada despues de la prueba de resistencie asales biUares 03 plv
fI
48
35 --Seguimiento del-pH-en-la-bebidaJacteacon y sin -prebi6tico
A continuacion se muestran las Tablas 7 y 8 donde sa registian los datos
recopilados de pHdurante 10$ dras Z 7 14 Y21 para las bebidas laaeas con ysin
prebi6tioo
TABLA 1 ResultadopH yogur sin avena
Dia Repetition 1 Repetici6n 2 Repeticion 3 Repetici6n 4
2 526 501 51 52
7 446 433 438 44
14 439 435 437 436
21 439 437 438 437
TABLA 8 -ResultadopHyogur con avena
Dia Repeticion 1 Repeticion2 Repeticion 3 - Repeticion 4
2 509 523 51 515
7 447 442 445 442
14 436 -438 439 437
21 432 433 435 434
Observando la Figura 9podamos ver que el pH en el -dfado$ para los dos
tratamientos as igual y empieza a descender rapidamente para estabilizarse a
partir del dra 7(Ver figura 9)
49
Figura 9 Comparacj6n de medias para -el pH
Comparaci6n de medias para pH
55 ~ 5 +----=gtIIIi-~i~~----=-r--it~ -- pH sin avena
a 45 1--~~~~=~~ 4 --- pH con
avena35 t-----r-- -------=------=--= ------- - ----
2 7 14 21
Dias
Aplicando la prueba t para comparar las medias de pH I S6 muestia una diferencia
altamants significativa en los dos tratamientos para el dia 21 (pltO05)
(Ver tabla 9)
TABLA 9 Compaiaci6n de medias para pH
DtAS SIN AVENA CON AVENA te p (VALOR)
2 514 514 0 10
7 439 444 -1 61 0159
14 437 I
438 -070 0510
21 438 433 528 00019 shy
- DiFERENCIA AlTAMENTE SIGNIFICATIVA
50
I
AI aplicar regrasi6n a los datos sa obtiene al modelo estimado
pHSinAyena =535606 - 01505650Ia +0005044340IaI2
La variabilidad en la respuesta de pH asta siendo explicada en un 8S7522 por
el modelo (Ver Anexo F)
EI tratamiento con avena mostro el siguiente modelo al analisis de ragresi6n
pHConAvena =534463 ~ 0140407Dia + 0004480980Ia2
La variabilidad an la respuesta de pH asta siendo explicada en un 903315 par
el nlodelo(Ver anexo G)
36 Seguimiento de la acidezmiddotmiddot expresada comomiddot de acido
lactico
A continuaci6n sa muestran las Tablas 10 y 11 donde sa registran los datos
tecopilados de acidezmiddotdurante los dias 27 14 Y 21 para las pebidas taetees con y
sin prebi6tico
TABLA 10 Resuttadode acidez (expresadocomo acido tactico) yogurt sin avena
CIA R~petici6n1 Repeticion2 Repetici6n 3 Repeticion 4
2 054 06 057 058
7 072 074 073 0]2
14 080 083 082 082
21 0]4 079 078 077
51
TABLA 11 Resultado de aCidez (expresado como acido Icktico) yogurt con avena
Dia Repetici6n 1 RepetiCi6n 2 Repetici6n 3 Repetici9n 4
2 059 055 058 057
7 071 073 072 072
14 089 087 088 086
21 092 091 090 091
Observando la Figura 10 se puede concluir que la acidez empieza a aumentar
hasta el dia 14 y luego trata de estabilizarse para los dos tratamientos
(Ver figura 10)
Figura 10 Comparaci6n de medias para la acidez
N G)
Comparacion de medias para acidez
1
2 0I 5 -+--=--------=-~~~= u
ltC
- Acidez sin avena
2 7 14
Dias
52
21
-it- Acidez con avena
Aplicando la prueba t para camparar las madias de acidez se muestra una
diferencia altarnante significativa en los dos tratamiantos para los dias 14 y 21
(pltO05)
(Var tabla 12)
TABLA 12Comparaci6n de medias para Acidez
DIASmiddot SIN AVENA CON AVENA te p(VALOR)
2 0572 0572 0 10
7 0727 0720 119 0278
14 0818 0875 -638 000070shy
21 077 091 -1212 i 0000019 shy
DIFERENCIA AL TAMENTE SlGNIFICATIVA
AI aplicar r~gresi6n a los datos se obtiene el modelo estimado
AcidezSlnAIena = 0491897 + O0436032Dia O00144613DfaA2
La variabilidad en la respuesta de acidez asta siendoexplicada en un 970978
por al modelo (Ver anexo H)
EI tratamiento con avena mostro elsiguiente modeloj a1 analisis de regresion
AcidezConAvena = 0491638 + 00406572Oia - OQOO982559OiaA2
La variabilidad enla respuesta acidez esta siendo explicadaen un 99212 por
el modelo (Ver anexo J)
53
I ~
37 Prueba de viabiJidad
A continuaci6n sa muestran las Tab~as 13 y 14 donde sa presentan los datos
recopilados del recuento de Lactobacilos durante los dias 7 14 Y 21 para las
bebidas lacteas con y sin prebi6tico
TABLA 13 Recuento de Lactobacilos (UFCml) yogurt sin avena
Dia Repetici6n 1 Repetici6n 2 Repeticion 3 Reptttici6n 4
7 1880X10l1 1454X1011 1642X1011 1780X10~
14 1560X10~ 646X1011J 1890X10l 140X10l1
21 1200x10lu 128Ox10u 1745x10J 1520x101V
TABLA 14 Recuento de Lactobacilos (UFCml) yogurt con avena
Dfa Repetieion 1 Repetici6n 2 Repeticion 3 Repeticf6n 4
7 1600X10lt 1240X10t 1640X10ll 1980X10t
14 540X1011 427X10n 546X10n 720X10ll
21 500x1011 492x1011 712)(1011 980x10~
AI analizar la Figura 11 sa puede observar un recuento mayor de Lactobacilos
en al tratamiento con avena resultado de acuerdo a 10 encontrado por Alander at
aI 1999 Kontula et aI 1998 y Jaskari et aI 1998
54
Figura 11 Comparaci6n de medias para Log Lactobacillus
Comparacion de medias para log Lactobacillus
~ 1350
-+- Sac Sin--() 13 co avenaIII
bull 125 -- Bac con 0)
0 12 avenaJ
115 7 14 21
Dias
Aplicando la prueba t para comparar las medias de recuento de Lactobacillus no
se encontr6 una diferenc1a estadfsUcamente significative entre los dos
tratamientos (Ver tabla 15)
Este aumento en al racuento influy6 en la disminuci6n del pH y en el aumento de
fa aeidez por la fermentacion que realizan los Lactobacillus sobre fa lactosa de la
lache y la avena adicionada como prebi6tico
55
1
TABLA 15 Comparaci6n medias lag Lactobacillus
DIAS SIN AVENA CON AVENA tc p(VALOR)
7 122257 122022 04846 06451
14 121065 132393 -19602 00977
21 129025 133087 -08236 04416
At aplicar regresion a los datos se obtiane al modelo astimado
LactobacillusSinAvena= 117347 + 004834640Ia
La variabilidad en la respuesta del recuento de LactobaCillus ssta siendo
explicada en un 260054 por el mod$loVar anexo J)
EI tratamiento con avena mostr6 al siguiente modalo al anal isis de regresion
Lactobacillu$ConAvena =118103 + 007903040Ias
La variabilidad en la respuesta de recuento esta siendo explicada en un 3068
por al modelo(Ver anexo K)~
38 Analisi$ microbiol6gicos de las bebidas lacteas con y sin
En la Tabla 16 estan recopilados los resultados microbiol6gieos obtenidos en ras
muestras con los dos tratamientos (con y sin avena)
I [
sa
TABLA 16 Resultados analisis microbiologico
Recuento de mohos y levaduras Iml lt10
Recuento de Staphylococcus coagulase positiva Iml lt100
NMP coliformes fotales y Escherichia coli Iml lt3
Presencia de Salmonella25ml Ausente
Los resultados de este analisis demuestran que las bebidas fermentadas con y
sin avena~ astan fibres de microorganismos patogenos
57
1
4 CONCLUSIONES
Se aislaron cepas nativas de Lactobacillus plantarum de las muestras vegetates
de repollo pepino repollitas de bruselas fermentadas y Lactobacillus brevis de
lache fermentada y mucosa vaginal humana Ambas cepas resistieran un pH=2 y
una concentraci6n de sales biliares det 03 ptv dos earacteristicas importantes
en los probi6ticos
Lamiddot cepa de Lactobacillus brevis aislada de lache Sa utiliz6 para elaborar una
bebida fermentada sin y con avana comoingrediente prebiotico obteniendose un
aJimento centon recuento del probi6tico viable durante 21 dras de seguimiento
ademas libre de microorganismos )at6gen05
No se encontr6 efecta significativo de la avena sobre Ie viabilidad del Lactobacillus
brevis aunque sa presento un aumento en 61 recuento de estos en la bebida con
avena
58
plusmn ~
5 RECOMENDACIONES
Ensayar la cepa de Lactobacillus plantartJm en productos carnicos madurados
como el salami
Ensayar la cepa de Lactobacillus l)revs en otros derivados lecteos como queso
quesito queso crema
Continuar con el estudio de estos microorganismos y caracterizarlos
molecularmente ademas de estudiar su capacidad de adherencja a fa mucosa
intestinal sobre algunes Hneas celulares como las CaCo~2
Estudiarel efedo de la avena sabre la viabiJidad del Lactobacillus breyis a una
concentraci6n mayor de 05
Realizer ensayos can las cepas de Lactobacillus brevis y Lactobrlcillus pJantarum
para elaborar masas acidas para panificacion reemplazando el Bromato de
Potasio aditivo prohibido desde marzo del 2003 en nuestro pais per 5U toxicidad
59
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65
ANEXOS
66
ANEXO A RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AlSLADA DE i
PEPINO it
Referencia Pepino 1 Fecha 06122002
IEXCELENTE IDENTIFICACION
Latto plantarum 1
Galeria API 50 CHL V50 Leida el 06122002
Perfil - -- - ++ - -- - ++++ - - -+- + - I I I I I I I I +t+ - +f- ~ - - + + ~ - - - +- + - shy
o - GLY - ERY DARA - LARA + RIB + DXYL - LXYL - ADO - MDX - GAL + GLU + FRU + MNE + SBE - RHA - DUL - INO bull MAN + SOR - MDM + MUG shyNAG + AMY + ARB + ESC + SAL + CEL + MAL + LAC + MEL + SAC + TRE + 1NU - MLZ + RAF + AMD - GLYG - XLT - GEN + TIJR + LYX - TAG - DFUC shyLFUC - DARL + LARL - aNT + 2KG - 5KG shy
--- Taxones significativos rd -----T -- Tests en contra
Lactoplantarum 1 999 092 1
Taxon siguiente Lactobrevis 1 OJ 044 3
i i
Lactoplantarum 1 1 test (5) en contra
D-SORBITOL (SOR) 78
Tax6n siguiente Lactobrevis 1 3 test (s) ert contra
METHYLD-MANNOSIDE (MOlM) 0 MELEZITOSE (MLZ) 14 D-TURANOSE (TUR) 14
67
ampb
ANEXO B RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AISLADA DE REPOLLO FERMENTADO
~
Referencia Repollo fermentado - 3 Fecha 03072003
EXCELENTE IDENTIFICACION
Lactoplantarum 1
Galena API 50 CRL V50 Leida el 03072003
Perfil - - ++ - - - - -H++ - - ~ + - + - I I 1 I I I I -H+ - ++ - - - + + - -- - - + - shy
o - GLY - ERY - DARA - LARA + RIB + DXYL - LXYL - ADO ~ MDX - GAL + GLU + FRU + MNE + SBE ~ RHA - DUL - INO - MAN + SOR - MDM + MDG shyNAG + AMY + ARR + ESC + SAT + CRL + MAL + LAC + MEL + SAC + TRE + lNU - MLZ + RAF + AMI) - GLYG - XLT - GEN + TOR + LYX - TAG - DFUC shyLFUC - DARL - LARL - GNT + 2KG - 5KG shy
------Taxones significativos _ _----- Id--- ---T---- Tests en contra
Lactoplantarum 1 999 095 1
Tax6n siguiente Lactobrevis 1 01 OA8 3
lJactoplantaru01 1 1 test (s) en contra
DSORBITOL (SOR) 78
Taxon siguiente Lactobrevis
METHYL-D-MANNOSIDE D-TURANOSE
1
(MOM) (TOR)
3 test (5) en contra
0 MELEZITOSE 14
(MLZ) 14
i
I
68
ANEXO C RESULTADO PRUEBAS BIOQUWICAS DE CEPA AISLADA DE MUCOSA HUMANA
Referenda Mucosa - 5 Fecha 27012003
BUENA IDENTlFICACION
Galeria API 50 CHL vso Leida el 270112003
Perfil - - - - +t--t - - - + - + - - - - - - - - -+- - - - - + - + - - - - - - - - - - - - - bull - - -+ - +
o - GLY ~ ERY - DARA bull LARA + RID + DXYL + LXYL - ADO bull MDX - GAL + OLU - FRU + MNE - SBE - IlliA - DUL - INa - MAN - SOR - MDM - MOO shyNAG + AMY - ARB - ESC ~ SAL bull CEL - MAL + lAC - MEL + SAC - TRE shyINU - MLZ - RAF - AMD - GLYG - XLT - GEN - 11JR - LYX - TAG - DFUC shyLFUC - DARL - IARL - ONT + 2KO - 5KG +
- - - - - - Taxones significativos - - - - - - - Id T -- Test en contra
Lactobrevis 3 963 088 1
Taxon siguiente Lactoco11inoides 36 075 2
Lactobrevis 3 1 test (s) en contra
GLUCOSE (GLU) 95
-~~~------------~---------------------------~--~-------~--~-----~----------~--------~------------~~--Taxon siguiente Lactocollinoides 2 test (s) en contra
GLUCOSE (GLU) 100 MELIBIOSE (MEL) 25
69
i r
ANEXO D RESULTADO PRUEBAS BIOQIJiMICAS DE CEPA AISLADA DE LECHE FERMENTADA
Referenda Leche fennentada ~ 13 Fecha 27012003
BUENA IDENTIFICACI6N
Galeria API 50 CHL V50 Leida el 270112003
Perfil - - - - -t-t+- - - - + - + - - - bull - - - - -+- - - - - + - + - - - - - - - - - - - - - - - - -+ - +
0 - GLY - ERY - DARA - LARA +Rll3 + DXYL + LXYL - ADO - MDX ~GAL + GLU - FRU + MNE SBE - RHA DUL bull INO MAN - SOR MDM bull MDG shy
~NAG + AMY - ARB - ESC - SAL - CEL - MAL + LAC - MEL + SAC - TRE I lNU - MLZ - RAF - AMD - GLYG - XLT - OEN - IUR LYX - TAG - DFUC bull i
LFUC - DARL - LARL -ONr + 2KG - SKO + 1
- -- - - Taxones significativos - - Id -- T --- Test en contra
Lacta brevis 3 963 088 1
Taxon siguiente Lactocollinoides 36 075 2
Lactobrevis 3 1 test (s) en contra
GLUCOSE (GLU) 95
-----------------------------------------------------------~------------------------------~-------------------Taxon siguiente Lactocollinoides 2 test (s) en contra
GLUCOSE (GLD) 100 MELffiIOSE (MEL) 25
70
II iJ1
I
I ANEXO E RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AISLADA DE REPOLLITAS DE BRUSELAS FERMENTADA
Referencia repollitas de bruselas 15 Fecha 03072003
EXCELENTE IDENTIFICACION
Lactoplantarum 1
Galeria API 50 CHL vsO Leida el 03072003
Perfil - - - - +t - - - - +H+ - +- - +t + - I I I I I I I f ++t - + - - - -+ + - - - -+ -+ - - I ij
o - GLY - ERY - DARA - LARA + RJB + DXYL - LXYL - ADO - MDX - GAL +
GLU + FRU + MNE + SBE RHA + DUL - INO - MAN + SOR + MDM + MOG shyNAG + AMY + ARB + ESC + SAL + eEL + MAL + LAC + MEl + SAC + TRE + i
I1NU - MLZ + RAF AMD GLYG - XLT - aEN + TUR + LYX - TAG - Druc LFUC - DARt + LARL - aNT + 2KG - 5KG shy n ----Taxones significativos ------ Id Tests en contra
Lactoplantarum 1 999 090 o
Taxon siguiente Lacto pentosus 01 012 7
Lactoplantarum 1 o test (s) en contra
Taxon siguiente Lacto pentosus 7 test (8) en contra
GLYCEROL (GLY) 75 D-XYLOSE (DXYL) 100 L-RHAMNOSE (RHA) 25 METHYL-D-MANNOSIDE (MOM) 1 MELEZITOSE (MLZ) 25 RAFFINOSE (RAF) 75 D-ARABITOL (DARL) 0
71
~
I i I
ANEXO F - ANALISIS DE REGRESION PARA pH EN BEBIDA SIN AVENA
Aruilisis de regresi6n polinomial
---~-~-------------------------------------------~-----------~~---------------------~--------------Variable dependiente pHSinAvena ---------------------------~-------------~--------------------~---------------------------------
Error T Parametro Estimado Estandar Estadistico P-Valor
CONSTANTE 535606 0094535 56657 00000 Dia -0150565 0020706 727154 00000 Dia2 000504434 0000871488 578819 00001
---~---------------------------------------------------------------------------------------------------
Anfllisis de Variama -------------------------------------------~-----------~-----------------------------~-~--- jSource Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor 11
------------------------~------------------------------------------------------------------------------~ Mod-elo 155772 2 0118861 4256 00000 Residual 0237877 13 00182983
Total (Corr) 11956 IS
R2 == 867522 percent
pHSinAvena == 535606 - 0150565Dia + 000504434Dia2
72
____
middot ANEXO G - ANALISIS DE REGRESION PARA pH EN BEBIDA CON AVENA
AmUisis de regresion polinomial _____~_____~__-_____~___4____________________bull____bull__________bull_____________~~----_------___________
Variable depcndiente pHConA vena ------------------------------------------------------------------------------------------~--------
Error T Parametro Estimado StAndar Estadfstico P-Valor
---------------------------------------------~-----------------------------------------------_---------CONSTANTE 534463 00801045 667208 00000 Dia -0140407 00175453 800253 00000 DiaA 2 000448098 0000738458 606803 00000
----------------------~---~-----------------------------~------------------------------~----AmUisis de Varianza
---~---------------------------------~---------------------~------------~-------------------~------Source Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio PValor --------------------------~-----------------------------------------------~------------~-----~~--~ ModeJo 159575 2 0797873 6073 00000 Residual 02170798 middot13 00131383 _______~_~ ~_~----------~------~--~-----~-M-----~-----____ _____________~-----------------------Total (COlT) 176654 15
R12 903315 percent
-----------~------------------------------------------------------------------------~-----------pHConAvena 534463 - 0140407Dia + 000448098DfaA 2
73
ANEXO H - ANALTSIS DE REGRESTON PARA ACIDEZ EN BEBJDA SIN AVENA
An8Jisis de Regtesi6fi P6lifJomial
Variable Depefidiefile~ AcidezSinAVenll _______________w_____~______~________________~-----------_________~_________________~~____~___~_____
Error T Pariirnetro Estimado Estandar Estadistico ---------------------------------------~--------------~-~-------~--------------------~------------CONSTANT 0491697 00123217 399051 00000 Dia 00436032 000269882 161564 00000 D1a2 -000144613 000011359 127312 00000 __w___~________________________~-_______-_____~----____________________________~__~---~_--__~___
AriiiJisis de varianza ~_~__~__________~_~____~________~___________- _________e_____________________________bull _____-________
Source Smn de cuadr Df Mean Square F-Ratio PmiddotValor_~~___________________________________bull ______~___________bull ____________bull ______~________w________________
Model 0135203 2 00676013 21747 00000 Residual 000404118 13 000031086
Total (Corr) 0139244 15
R2 970978 percent
AcidezSlnAvena 0491697 + O0436032Dia - 0OOl44613Dia2
74
I
ANEXO I ANALISIS DE REGRESION PARA ACIDEZ EN BEBIDA CON AVENA
1
Anwisis de tegtesi6fi polinomial
Variable dependiente Acidez Con Avena
Error T ParametTo Estimado Stlindar Estadfstico P-Valor ----------------~-------~---------------------~-----------------------------------------------------CONSTANT 0491639 000926607 530578 00000 Diamiddot 00406572 000202955 200326 00000 DfaA 2 0000982559 0000085421 -115025 00000
-------------~----------------------------~-------------------------~-----------------------------------
-------------~-----~~-----------------------------~---------------------------------------------_--Source Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio PValor
-~-------------~----------------------------------~------------------~~-------------------------- Modelo 0288008 2 0144004 81914 00000 Residual 000228539 13 0000175799
----------~~--------------~---------------------------------------------~---------------------------Total (Corr) 0290294 15
RA2 = 992127 percent
-------------------------~----~---~------------~---------------------------------~---------------~
AcidezConAvena == 049163amp + 00406572D1a - 0000982559DiaA2
75
I
(Ilmiddot il
ANEXO J- ANALISIS DE REGRESION PARA RECUENTO LACTOBACILOS PARA BEBIDA SIN AVENA
Amilisis de regresion - Modelo lineal Y = a + bX
------------------------~----------------------~-----------------------------~----------~-----------Variable Dcpendiente LactobacilJusSinAvena Variable independiente Dia
I--------~----------~-----------------------------------~-------~-~--~--------------------------~-Error T
Paramctro Estimado Standard Stadistico P-Valor
----~----~------------~-----~-----------------------~-------------~-----------------------------Intereepto 117347 0389973 300911 00000 Pendiente 00483464 00257889 18747 00903
Analisis de Varianza
---------~------------------~----------------~---------------------------------~---------~----------Source Sum decuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor
------------~---------------------~---------------------~--------------------------------~-----~----Modelo 0916252 1 244835 443 00616 Residual 260706 10 0260706
--~------------~---~------------------~~~-----~-------~---------~~-------------------------------------Total (Corr)352332 11
Coeficiente Correlaci6n = 0509955 R2 = 260054 percent
LactobacillusSinAvena= 117347 + 00483464Dfa
76
ANEXO K- ANALTSIS DE REGRESION PARA RECUENTO LACTOBACILOS PARA DEBIDA CON AVENA
Aruilisis de regresion - Modelo lineal Y = a + hX
Variable Dependiente LactobacillusConAvena Variable Independiente Dia ---~--------------------------------------------------------__-----------__--_--_-----------shy
Error T Paramctro Estimado Standard Estadistico P-Valor -~--------------------------------------------------------------------------------------------------
Irttercepto 118103 0567963 207942 00000 Pendiente 00790304 00375594 210414 00616
-----------------~----------------------------~----~-------~----~----------------------------
Analisis de Varianza
----------------~----------------~------------------~--------------------------~------~--------shySource Swn de cuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor
-----------------~--~--------------------------------------------------------------------------~---~ Mode10 244835 1 244835 443 00616 Residual 552997 10 0552997
Total (Corr)797832 11
Coeficiente Correlacion = 0553964 RI2 = 306875 percent
-----~--------------------------------------------------------~--------------------------------------
LactobacillusConAvena = 118103 + 00790304Dfas
77
Fjgura 5 Diagrama de Flujo
PREPARACION DE LA MUESTRA
ADICION DEL INOCULO
~_____~_B~ATIDO~______~
INCUBACION 37deg C hasta acidez = 04-05 acido laotico
ENFRIAMIENTO
hasta 4 0 C ~------~ ~------~
ENVASADO Y ALMACENAMJENTO
dUrante 21 dfas a Temperatura 4 0 C
38
1
228 Determinaci6n del pH
Se determino por el metoda potenciometrico en un pH-metro manual durante los
dias 2) 7 14 Y 21 de las bebidas lacteas sin y con prebi6tica (Ver Tablas 7 y 8)
229 Oeterminaci6n de la acidez (Expresadfl como acido
lactica)
Se tomaron 9 mJ de las bebida~ sa Ie adicionaron 2 gotas de fanoftaleina como
indicador y sa titulo fa acidez con NaOH 01 N hasta la aparicion de un cotor rosado
debit EI volumen de NaOH utilizado se reporta como valor de de acidez
(VerTablas 10 y 11)
2210 Prueba de viabilidad
Qurante el perfoda de almacenamiento de la bebida lactea se procedi6 a hacer la
prueba de viabiHdad en los dias 7 14 Y 21 para determinar Si los lactobacilfus
permanecfan vivOs a una concentraci6n minima de 106 hasta el dia 21 como 10
establece eJ Articulo 10 de la Rasolucion 2310 del Ministerio de $alud de
Colombja
39
Para asta prueba se tamaron 10 rnl de muestra y se adicionaron a 90 ml de caldo
MRS ruego a partir de esta se hicieron diluciones de 10-2 hasta 10-11 de las
diluciones 109101deg 10-11 se inocul6 1 ml de cada uno en agar MRS siguiendo el
metodo de siembra en profundidad y por duplicado e incubando a 370 C x 5 dras
en anaerobiosis y luego se hicieron tos recuentos por duplicado para esi reportar
los recuentos promedio (Ver Tablas 13 y 14)
2211 AniUisls microbiol6glco de las bebidas Iicteas(con y sin
avena)
Con el fin de determinar las condiciones higienico-sanitarias del producto se
realizaron las pruebas microbiol6gicas de Recuento de mohos y fevadurasml en
agar OGY Recuento en superficia de Staphylococcus coagulasa positivoml en
agar Baird Parker Numero Mas Probable (NMP) de coUfor-mes totales y
Escherichia coliml en caldo Fluorocult y Presencia de Salmonela25ml con BHI
caldo tetrationato y agar Hecktoen (Montoya 1999)
(Var tabla 16)
2212 AnaUsis estadistico
A los datos obtenidos en la medici6n de pH acidez (expresada como Beido
laclico) en los dras 2714 Y 21 y el recuento de Lactobacillus en los dras 714 y21
40
realizados a los dos tratamlentos se tes aplic6 1a prueba t porque solo difieren
en la presencia 0 ausencia del prebi6tico para evaluar si habra diferencia
estadfsticamente significativa para los dos tratamientbs(Ver Tablas9 12 y 15)
41
3 RESULTADOS Y DISCUSION
31 Coloraci6n de Gram y morfologfa
Las cepas aisladas fesultaron Gram positivas (Ver Figura 6) colonias grandes
cremosas dE) color beige con bordes homogeneos y c6ncavos en su
morfologia (Ver Figura 3) resultando de acuerdo a 10 especificado en Stanley
1989 para Lactobacillus
32 Prueba de esporulaci6n y cataJasa
Los resultados de la pruebas de esporulaci6n y catalasa indicados en las
Tablas 3 y 4 respeclivamente dieron conforme a 10 especificado en Stanley
1989 para Lactobacillus
42
1
2 3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
TABLA 3 Resultado de prueba de esporuJaci6n
CEPA RESULfADO ESPORULACION
-- -------------
43
l i ~II bull ~ I I
TABLA 4 Resultado prueba de la catalasa
CEPA RESULTADO CATALASA
1 -2 -3 -4 -5 -6 -7 8 -9 -10 -11 12 -13 -14 -15 -16
3~3 Prueba para determinar la especie
Oespues de hacer las pruebas para seleccionar las cepas sospechosas de ser
Lactobacillus se realizo las pruebas bioquimicas fograndose identificar
Lactobacillus plantarum aislctdo de pepino repollo y repollitas de bruselas
44
fermentados y Lactobacillus brevis de mucosa vaginal y leche fermentada (Ver
Anexos del A al E y Tabla 5)
TABLA 5 Resultado identlficaci6n cepa~
CEPA NOMBRE
1 Lactobacillus planfarum
3 Lactobacillus plantarum
5 Lactobacillus brevis
13 Lactobacillus brevis
15 Lactobacillus plantarum
34 Pruebas para determinar microorganismos probi6ticos
las cepas de Lactobacillus brevis y Lactobacillus plantarum mostraron
rasistencia al medio acido de pH =2 Y sales biliares 03 pv resultado similar al
encontrado por Jacobsen et al 1999 para Lactobacillus plantarum (Ver tabla 6)
45
middot
~~~ttiI lltlmiddot~COX~dtJ ~xtc_~ 2 tr~ k-JlL~middot
-)~~TO DE lJIBUOTECUl rjRL]OTtCA twn GO1IU1
TABLA 6 Resultados a pruebas de resistencia a pH=2 y sales biliares 03 plv
CEPA RESISTENCIA pH=2 RESISTENCfA A SALES BIUARES ()3 pv
1 + +
2 + +
3 + +
4 + +
5 +
6 + +
7 + +
8 + +
9 + +
10 + +
11 + +
12 + +
13 + +
14 +1shy +M
15 + +
16 + +
+1 crecimiento debil
+ crecimiento abundante
46
Figura 6 Lactobacillus brevis Gram + aislado de leche fermentada
Ai observar en placa las celulas de lactobacilos despues de real1zar las pruebas
de resistenCia a la acidez y sales biliares se observo una tendencia a aglomerarse
posiblemente como un mecanismo de proteccion cOlitra estos medios que pueden
lIegar a ser adversos para elias (Ver figuras 7 y 8)
47
Figura 7 Lactobacillus brevis aislada de leche fermentada despu~s de la prueba de resistencia a pH=2
Figura 8 Lactobacillus brevis aislada de leche fermentada despues de la prueba de resistencie asales biUares 03 plv
fI
48
35 --Seguimiento del-pH-en-la-bebidaJacteacon y sin -prebi6tico
A continuacion se muestran las Tablas 7 y 8 donde sa registian los datos
recopilados de pHdurante 10$ dras Z 7 14 Y21 para las bebidas laaeas con ysin
prebi6tioo
TABLA 1 ResultadopH yogur sin avena
Dia Repetition 1 Repetici6n 2 Repeticion 3 Repetici6n 4
2 526 501 51 52
7 446 433 438 44
14 439 435 437 436
21 439 437 438 437
TABLA 8 -ResultadopHyogur con avena
Dia Repeticion 1 Repeticion2 Repeticion 3 - Repeticion 4
2 509 523 51 515
7 447 442 445 442
14 436 -438 439 437
21 432 433 435 434
Observando la Figura 9podamos ver que el pH en el -dfado$ para los dos
tratamientos as igual y empieza a descender rapidamente para estabilizarse a
partir del dra 7(Ver figura 9)
49
Figura 9 Comparacj6n de medias para -el pH
Comparaci6n de medias para pH
55 ~ 5 +----=gtIIIi-~i~~----=-r--it~ -- pH sin avena
a 45 1--~~~~=~~ 4 --- pH con
avena35 t-----r-- -------=------=--= ------- - ----
2 7 14 21
Dias
Aplicando la prueba t para comparar las medias de pH I S6 muestia una diferencia
altamants significativa en los dos tratamientos para el dia 21 (pltO05)
(Ver tabla 9)
TABLA 9 Compaiaci6n de medias para pH
DtAS SIN AVENA CON AVENA te p (VALOR)
2 514 514 0 10
7 439 444 -1 61 0159
14 437 I
438 -070 0510
21 438 433 528 00019 shy
- DiFERENCIA AlTAMENTE SIGNIFICATIVA
50
I
AI aplicar regrasi6n a los datos sa obtiene al modelo estimado
pHSinAyena =535606 - 01505650Ia +0005044340IaI2
La variabilidad en la respuesta de pH asta siendo explicada en un 8S7522 por
el modelo (Ver Anexo F)
EI tratamiento con avena mostro el siguiente modelo al analisis de ragresi6n
pHConAvena =534463 ~ 0140407Dia + 0004480980Ia2
La variabilidad an la respuesta de pH asta siendo explicada en un 903315 par
el nlodelo(Ver anexo G)
36 Seguimiento de la acidezmiddotmiddot expresada comomiddot de acido
lactico
A continuaci6n sa muestran las Tablas 10 y 11 donde sa registran los datos
tecopilados de acidezmiddotdurante los dias 27 14 Y 21 para las pebidas taetees con y
sin prebi6tico
TABLA 10 Resuttadode acidez (expresadocomo acido tactico) yogurt sin avena
CIA R~petici6n1 Repeticion2 Repetici6n 3 Repeticion 4
2 054 06 057 058
7 072 074 073 0]2
14 080 083 082 082
21 0]4 079 078 077
51
TABLA 11 Resultado de aCidez (expresado como acido Icktico) yogurt con avena
Dia Repetici6n 1 RepetiCi6n 2 Repetici6n 3 Repetici9n 4
2 059 055 058 057
7 071 073 072 072
14 089 087 088 086
21 092 091 090 091
Observando la Figura 10 se puede concluir que la acidez empieza a aumentar
hasta el dia 14 y luego trata de estabilizarse para los dos tratamientos
(Ver figura 10)
Figura 10 Comparaci6n de medias para la acidez
N G)
Comparacion de medias para acidez
1
2 0I 5 -+--=--------=-~~~= u
ltC
- Acidez sin avena
2 7 14
Dias
52
21
-it- Acidez con avena
Aplicando la prueba t para camparar las madias de acidez se muestra una
diferencia altarnante significativa en los dos tratamiantos para los dias 14 y 21
(pltO05)
(Var tabla 12)
TABLA 12Comparaci6n de medias para Acidez
DIASmiddot SIN AVENA CON AVENA te p(VALOR)
2 0572 0572 0 10
7 0727 0720 119 0278
14 0818 0875 -638 000070shy
21 077 091 -1212 i 0000019 shy
DIFERENCIA AL TAMENTE SlGNIFICATIVA
AI aplicar r~gresi6n a los datos se obtiene el modelo estimado
AcidezSlnAIena = 0491897 + O0436032Dia O00144613DfaA2
La variabilidad en la respuesta de acidez asta siendoexplicada en un 970978
por al modelo (Ver anexo H)
EI tratamiento con avena mostro elsiguiente modeloj a1 analisis de regresion
AcidezConAvena = 0491638 + 00406572Oia - OQOO982559OiaA2
La variabilidad enla respuesta acidez esta siendo explicadaen un 99212 por
el modelo (Ver anexo J)
53
I ~
37 Prueba de viabiJidad
A continuaci6n sa muestran las Tab~as 13 y 14 donde sa presentan los datos
recopilados del recuento de Lactobacilos durante los dias 7 14 Y 21 para las
bebidas lacteas con y sin prebi6tico
TABLA 13 Recuento de Lactobacilos (UFCml) yogurt sin avena
Dia Repetici6n 1 Repetici6n 2 Repeticion 3 Reptttici6n 4
7 1880X10l1 1454X1011 1642X1011 1780X10~
14 1560X10~ 646X1011J 1890X10l 140X10l1
21 1200x10lu 128Ox10u 1745x10J 1520x101V
TABLA 14 Recuento de Lactobacilos (UFCml) yogurt con avena
Dfa Repetieion 1 Repetici6n 2 Repeticion 3 Repeticf6n 4
7 1600X10lt 1240X10t 1640X10ll 1980X10t
14 540X1011 427X10n 546X10n 720X10ll
21 500x1011 492x1011 712)(1011 980x10~
AI analizar la Figura 11 sa puede observar un recuento mayor de Lactobacilos
en al tratamiento con avena resultado de acuerdo a 10 encontrado por Alander at
aI 1999 Kontula et aI 1998 y Jaskari et aI 1998
54
Figura 11 Comparaci6n de medias para Log Lactobacillus
Comparacion de medias para log Lactobacillus
~ 1350
-+- Sac Sin--() 13 co avenaIII
bull 125 -- Bac con 0)
0 12 avenaJ
115 7 14 21
Dias
Aplicando la prueba t para comparar las medias de recuento de Lactobacillus no
se encontr6 una diferenc1a estadfsUcamente significative entre los dos
tratamientos (Ver tabla 15)
Este aumento en al racuento influy6 en la disminuci6n del pH y en el aumento de
fa aeidez por la fermentacion que realizan los Lactobacillus sobre fa lactosa de la
lache y la avena adicionada como prebi6tico
55
1
TABLA 15 Comparaci6n medias lag Lactobacillus
DIAS SIN AVENA CON AVENA tc p(VALOR)
7 122257 122022 04846 06451
14 121065 132393 -19602 00977
21 129025 133087 -08236 04416
At aplicar regresion a los datos se obtiane al modelo astimado
LactobacillusSinAvena= 117347 + 004834640Ia
La variabilidad en la respuesta del recuento de LactobaCillus ssta siendo
explicada en un 260054 por el mod$loVar anexo J)
EI tratamiento con avena mostr6 al siguiente modalo al anal isis de regresion
Lactobacillu$ConAvena =118103 + 007903040Ias
La variabilidad en la respuesta de recuento esta siendo explicada en un 3068
por al modelo(Ver anexo K)~
38 Analisi$ microbiol6gicos de las bebidas lacteas con y sin
En la Tabla 16 estan recopilados los resultados microbiol6gieos obtenidos en ras
muestras con los dos tratamientos (con y sin avena)
I [
sa
TABLA 16 Resultados analisis microbiologico
Recuento de mohos y levaduras Iml lt10
Recuento de Staphylococcus coagulase positiva Iml lt100
NMP coliformes fotales y Escherichia coli Iml lt3
Presencia de Salmonella25ml Ausente
Los resultados de este analisis demuestran que las bebidas fermentadas con y
sin avena~ astan fibres de microorganismos patogenos
57
1
4 CONCLUSIONES
Se aislaron cepas nativas de Lactobacillus plantarum de las muestras vegetates
de repollo pepino repollitas de bruselas fermentadas y Lactobacillus brevis de
lache fermentada y mucosa vaginal humana Ambas cepas resistieran un pH=2 y
una concentraci6n de sales biliares det 03 ptv dos earacteristicas importantes
en los probi6ticos
Lamiddot cepa de Lactobacillus brevis aislada de lache Sa utiliz6 para elaborar una
bebida fermentada sin y con avana comoingrediente prebiotico obteniendose un
aJimento centon recuento del probi6tico viable durante 21 dras de seguimiento
ademas libre de microorganismos )at6gen05
No se encontr6 efecta significativo de la avena sobre Ie viabilidad del Lactobacillus
brevis aunque sa presento un aumento en 61 recuento de estos en la bebida con
avena
58
plusmn ~
5 RECOMENDACIONES
Ensayar la cepa de Lactobacillus plantartJm en productos carnicos madurados
como el salami
Ensayar la cepa de Lactobacillus l)revs en otros derivados lecteos como queso
quesito queso crema
Continuar con el estudio de estos microorganismos y caracterizarlos
molecularmente ademas de estudiar su capacidad de adherencja a fa mucosa
intestinal sobre algunes Hneas celulares como las CaCo~2
Estudiarel efedo de la avena sabre la viabiJidad del Lactobacillus breyis a una
concentraci6n mayor de 05
Realizer ensayos can las cepas de Lactobacillus brevis y Lactobrlcillus pJantarum
para elaborar masas acidas para panificacion reemplazando el Bromato de
Potasio aditivo prohibido desde marzo del 2003 en nuestro pais per 5U toxicidad
59
REFERENCfAS BIBUOGRAFICAS
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ANEXOS
66
ANEXO A RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AlSLADA DE i
PEPINO it
Referencia Pepino 1 Fecha 06122002
IEXCELENTE IDENTIFICACION
Latto plantarum 1
Galeria API 50 CHL V50 Leida el 06122002
Perfil - -- - ++ - -- - ++++ - - -+- + - I I I I I I I I +t+ - +f- ~ - - + + ~ - - - +- + - shy
o - GLY - ERY DARA - LARA + RIB + DXYL - LXYL - ADO - MDX - GAL + GLU + FRU + MNE + SBE - RHA - DUL - INO bull MAN + SOR - MDM + MUG shyNAG + AMY + ARB + ESC + SAL + CEL + MAL + LAC + MEL + SAC + TRE + 1NU - MLZ + RAF + AMD - GLYG - XLT - GEN + TIJR + LYX - TAG - DFUC shyLFUC - DARL + LARL - aNT + 2KG - 5KG shy
--- Taxones significativos rd -----T -- Tests en contra
Lactoplantarum 1 999 092 1
Taxon siguiente Lactobrevis 1 OJ 044 3
i i
Lactoplantarum 1 1 test (5) en contra
D-SORBITOL (SOR) 78
Tax6n siguiente Lactobrevis 1 3 test (s) ert contra
METHYLD-MANNOSIDE (MOlM) 0 MELEZITOSE (MLZ) 14 D-TURANOSE (TUR) 14
67
ampb
ANEXO B RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AISLADA DE REPOLLO FERMENTADO
~
Referencia Repollo fermentado - 3 Fecha 03072003
EXCELENTE IDENTIFICACION
Lactoplantarum 1
Galena API 50 CRL V50 Leida el 03072003
Perfil - - ++ - - - - -H++ - - ~ + - + - I I 1 I I I I -H+ - ++ - - - + + - -- - - + - shy
o - GLY - ERY - DARA - LARA + RIB + DXYL - LXYL - ADO ~ MDX - GAL + GLU + FRU + MNE + SBE ~ RHA - DUL - INO - MAN + SOR - MDM + MDG shyNAG + AMY + ARR + ESC + SAT + CRL + MAL + LAC + MEL + SAC + TRE + lNU - MLZ + RAF + AMI) - GLYG - XLT - GEN + TOR + LYX - TAG - DFUC shyLFUC - DARL - LARL - GNT + 2KG - 5KG shy
------Taxones significativos _ _----- Id--- ---T---- Tests en contra
Lactoplantarum 1 999 095 1
Tax6n siguiente Lactobrevis 1 01 OA8 3
lJactoplantaru01 1 1 test (s) en contra
DSORBITOL (SOR) 78
Taxon siguiente Lactobrevis
METHYL-D-MANNOSIDE D-TURANOSE
1
(MOM) (TOR)
3 test (5) en contra
0 MELEZITOSE 14
(MLZ) 14
i
I
68
ANEXO C RESULTADO PRUEBAS BIOQUWICAS DE CEPA AISLADA DE MUCOSA HUMANA
Referenda Mucosa - 5 Fecha 27012003
BUENA IDENTlFICACION
Galeria API 50 CHL vso Leida el 270112003
Perfil - - - - +t--t - - - + - + - - - - - - - - -+- - - - - + - + - - - - - - - - - - - - - bull - - -+ - +
o - GLY ~ ERY - DARA bull LARA + RID + DXYL + LXYL - ADO bull MDX - GAL + OLU - FRU + MNE - SBE - IlliA - DUL - INa - MAN - SOR - MDM - MOO shyNAG + AMY - ARB - ESC ~ SAL bull CEL - MAL + lAC - MEL + SAC - TRE shyINU - MLZ - RAF - AMD - GLYG - XLT - GEN - 11JR - LYX - TAG - DFUC shyLFUC - DARL - IARL - ONT + 2KO - 5KG +
- - - - - - Taxones significativos - - - - - - - Id T -- Test en contra
Lactobrevis 3 963 088 1
Taxon siguiente Lactoco11inoides 36 075 2
Lactobrevis 3 1 test (s) en contra
GLUCOSE (GLU) 95
-~~~------------~---------------------------~--~-------~--~-----~----------~--------~------------~~--Taxon siguiente Lactocollinoides 2 test (s) en contra
GLUCOSE (GLU) 100 MELIBIOSE (MEL) 25
69
i r
ANEXO D RESULTADO PRUEBAS BIOQIJiMICAS DE CEPA AISLADA DE LECHE FERMENTADA
Referenda Leche fennentada ~ 13 Fecha 27012003
BUENA IDENTIFICACI6N
Galeria API 50 CHL V50 Leida el 270112003
Perfil - - - - -t-t+- - - - + - + - - - bull - - - - -+- - - - - + - + - - - - - - - - - - - - - - - - -+ - +
0 - GLY - ERY - DARA - LARA +Rll3 + DXYL + LXYL - ADO - MDX ~GAL + GLU - FRU + MNE SBE - RHA DUL bull INO MAN - SOR MDM bull MDG shy
~NAG + AMY - ARB - ESC - SAL - CEL - MAL + LAC - MEL + SAC - TRE I lNU - MLZ - RAF - AMD - GLYG - XLT - OEN - IUR LYX - TAG - DFUC bull i
LFUC - DARL - LARL -ONr + 2KG - SKO + 1
- -- - - Taxones significativos - - Id -- T --- Test en contra
Lacta brevis 3 963 088 1
Taxon siguiente Lactocollinoides 36 075 2
Lactobrevis 3 1 test (s) en contra
GLUCOSE (GLU) 95
-----------------------------------------------------------~------------------------------~-------------------Taxon siguiente Lactocollinoides 2 test (s) en contra
GLUCOSE (GLD) 100 MELffiIOSE (MEL) 25
70
II iJ1
I
I ANEXO E RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AISLADA DE REPOLLITAS DE BRUSELAS FERMENTADA
Referencia repollitas de bruselas 15 Fecha 03072003
EXCELENTE IDENTIFICACION
Lactoplantarum 1
Galeria API 50 CHL vsO Leida el 03072003
Perfil - - - - +t - - - - +H+ - +- - +t + - I I I I I I I f ++t - + - - - -+ + - - - -+ -+ - - I ij
o - GLY - ERY - DARA - LARA + RJB + DXYL - LXYL - ADO - MDX - GAL +
GLU + FRU + MNE + SBE RHA + DUL - INO - MAN + SOR + MDM + MOG shyNAG + AMY + ARB + ESC + SAL + eEL + MAL + LAC + MEl + SAC + TRE + i
I1NU - MLZ + RAF AMD GLYG - XLT - aEN + TUR + LYX - TAG - Druc LFUC - DARt + LARL - aNT + 2KG - 5KG shy n ----Taxones significativos ------ Id Tests en contra
Lactoplantarum 1 999 090 o
Taxon siguiente Lacto pentosus 01 012 7
Lactoplantarum 1 o test (s) en contra
Taxon siguiente Lacto pentosus 7 test (8) en contra
GLYCEROL (GLY) 75 D-XYLOSE (DXYL) 100 L-RHAMNOSE (RHA) 25 METHYL-D-MANNOSIDE (MOM) 1 MELEZITOSE (MLZ) 25 RAFFINOSE (RAF) 75 D-ARABITOL (DARL) 0
71
~
I i I
ANEXO F - ANALISIS DE REGRESION PARA pH EN BEBIDA SIN AVENA
Aruilisis de regresi6n polinomial
---~-~-------------------------------------------~-----------~~---------------------~--------------Variable dependiente pHSinAvena ---------------------------~-------------~--------------------~---------------------------------
Error T Parametro Estimado Estandar Estadistico P-Valor
CONSTANTE 535606 0094535 56657 00000 Dia -0150565 0020706 727154 00000 Dia2 000504434 0000871488 578819 00001
---~---------------------------------------------------------------------------------------------------
Anfllisis de Variama -------------------------------------------~-----------~-----------------------------~-~--- jSource Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor 11
------------------------~------------------------------------------------------------------------------~ Mod-elo 155772 2 0118861 4256 00000 Residual 0237877 13 00182983
Total (Corr) 11956 IS
R2 == 867522 percent
pHSinAvena == 535606 - 0150565Dia + 000504434Dia2
72
____
middot ANEXO G - ANALISIS DE REGRESION PARA pH EN BEBIDA CON AVENA
AmUisis de regresion polinomial _____~_____~__-_____~___4____________________bull____bull__________bull_____________~~----_------___________
Variable depcndiente pHConA vena ------------------------------------------------------------------------------------------~--------
Error T Parametro Estimado StAndar Estadfstico P-Valor
---------------------------------------------~-----------------------------------------------_---------CONSTANTE 534463 00801045 667208 00000 Dia -0140407 00175453 800253 00000 DiaA 2 000448098 0000738458 606803 00000
----------------------~---~-----------------------------~------------------------------~----AmUisis de Varianza
---~---------------------------------~---------------------~------------~-------------------~------Source Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio PValor --------------------------~-----------------------------------------------~------------~-----~~--~ ModeJo 159575 2 0797873 6073 00000 Residual 02170798 middot13 00131383 _______~_~ ~_~----------~------~--~-----~-M-----~-----____ _____________~-----------------------Total (COlT) 176654 15
R12 903315 percent
-----------~------------------------------------------------------------------------~-----------pHConAvena 534463 - 0140407Dia + 000448098DfaA 2
73
ANEXO H - ANALTSIS DE REGRESTON PARA ACIDEZ EN BEBJDA SIN AVENA
An8Jisis de Regtesi6fi P6lifJomial
Variable Depefidiefile~ AcidezSinAVenll _______________w_____~______~________________~-----------_________~_________________~~____~___~_____
Error T Pariirnetro Estimado Estandar Estadistico ---------------------------------------~--------------~-~-------~--------------------~------------CONSTANT 0491697 00123217 399051 00000 Dia 00436032 000269882 161564 00000 D1a2 -000144613 000011359 127312 00000 __w___~________________________~-_______-_____~----____________________________~__~---~_--__~___
AriiiJisis de varianza ~_~__~__________~_~____~________~___________- _________e_____________________________bull _____-________
Source Smn de cuadr Df Mean Square F-Ratio PmiddotValor_~~___________________________________bull ______~___________bull ____________bull ______~________w________________
Model 0135203 2 00676013 21747 00000 Residual 000404118 13 000031086
Total (Corr) 0139244 15
R2 970978 percent
AcidezSlnAvena 0491697 + O0436032Dia - 0OOl44613Dia2
74
I
ANEXO I ANALISIS DE REGRESION PARA ACIDEZ EN BEBIDA CON AVENA
1
Anwisis de tegtesi6fi polinomial
Variable dependiente Acidez Con Avena
Error T ParametTo Estimado Stlindar Estadfstico P-Valor ----------------~-------~---------------------~-----------------------------------------------------CONSTANT 0491639 000926607 530578 00000 Diamiddot 00406572 000202955 200326 00000 DfaA 2 0000982559 0000085421 -115025 00000
-------------~----------------------------~-------------------------~-----------------------------------
-------------~-----~~-----------------------------~---------------------------------------------_--Source Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio PValor
-~-------------~----------------------------------~------------------~~-------------------------- Modelo 0288008 2 0144004 81914 00000 Residual 000228539 13 0000175799
----------~~--------------~---------------------------------------------~---------------------------Total (Corr) 0290294 15
RA2 = 992127 percent
-------------------------~----~---~------------~---------------------------------~---------------~
AcidezConAvena == 049163amp + 00406572D1a - 0000982559DiaA2
75
I
(Ilmiddot il
ANEXO J- ANALISIS DE REGRESION PARA RECUENTO LACTOBACILOS PARA BEBIDA SIN AVENA
Amilisis de regresion - Modelo lineal Y = a + bX
------------------------~----------------------~-----------------------------~----------~-----------Variable Dcpendiente LactobacilJusSinAvena Variable independiente Dia
I--------~----------~-----------------------------------~-------~-~--~--------------------------~-Error T
Paramctro Estimado Standard Stadistico P-Valor
----~----~------------~-----~-----------------------~-------------~-----------------------------Intereepto 117347 0389973 300911 00000 Pendiente 00483464 00257889 18747 00903
Analisis de Varianza
---------~------------------~----------------~---------------------------------~---------~----------Source Sum decuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor
------------~---------------------~---------------------~--------------------------------~-----~----Modelo 0916252 1 244835 443 00616 Residual 260706 10 0260706
--~------------~---~------------------~~~-----~-------~---------~~-------------------------------------Total (Corr)352332 11
Coeficiente Correlaci6n = 0509955 R2 = 260054 percent
LactobacillusSinAvena= 117347 + 00483464Dfa
76
ANEXO K- ANALTSIS DE REGRESION PARA RECUENTO LACTOBACILOS PARA DEBIDA CON AVENA
Aruilisis de regresion - Modelo lineal Y = a + hX
Variable Dependiente LactobacillusConAvena Variable Independiente Dia ---~--------------------------------------------------------__-----------__--_--_-----------shy
Error T Paramctro Estimado Standard Estadistico P-Valor -~--------------------------------------------------------------------------------------------------
Irttercepto 118103 0567963 207942 00000 Pendiente 00790304 00375594 210414 00616
-----------------~----------------------------~----~-------~----~----------------------------
Analisis de Varianza
----------------~----------------~------------------~--------------------------~------~--------shySource Swn de cuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor
-----------------~--~--------------------------------------------------------------------------~---~ Mode10 244835 1 244835 443 00616 Residual 552997 10 0552997
Total (Corr)797832 11
Coeficiente Correlacion = 0553964 RI2 = 306875 percent
-----~--------------------------------------------------------~--------------------------------------
LactobacillusConAvena = 118103 + 00790304Dfas
77
1
228 Determinaci6n del pH
Se determino por el metoda potenciometrico en un pH-metro manual durante los
dias 2) 7 14 Y 21 de las bebidas lacteas sin y con prebi6tica (Ver Tablas 7 y 8)
229 Oeterminaci6n de la acidez (Expresadfl como acido
lactica)
Se tomaron 9 mJ de las bebida~ sa Ie adicionaron 2 gotas de fanoftaleina como
indicador y sa titulo fa acidez con NaOH 01 N hasta la aparicion de un cotor rosado
debit EI volumen de NaOH utilizado se reporta como valor de de acidez
(VerTablas 10 y 11)
2210 Prueba de viabilidad
Qurante el perfoda de almacenamiento de la bebida lactea se procedi6 a hacer la
prueba de viabiHdad en los dias 7 14 Y 21 para determinar Si los lactobacilfus
permanecfan vivOs a una concentraci6n minima de 106 hasta el dia 21 como 10
establece eJ Articulo 10 de la Rasolucion 2310 del Ministerio de $alud de
Colombja
39
Para asta prueba se tamaron 10 rnl de muestra y se adicionaron a 90 ml de caldo
MRS ruego a partir de esta se hicieron diluciones de 10-2 hasta 10-11 de las
diluciones 109101deg 10-11 se inocul6 1 ml de cada uno en agar MRS siguiendo el
metodo de siembra en profundidad y por duplicado e incubando a 370 C x 5 dras
en anaerobiosis y luego se hicieron tos recuentos por duplicado para esi reportar
los recuentos promedio (Ver Tablas 13 y 14)
2211 AniUisls microbiol6glco de las bebidas Iicteas(con y sin
avena)
Con el fin de determinar las condiciones higienico-sanitarias del producto se
realizaron las pruebas microbiol6gicas de Recuento de mohos y fevadurasml en
agar OGY Recuento en superficia de Staphylococcus coagulasa positivoml en
agar Baird Parker Numero Mas Probable (NMP) de coUfor-mes totales y
Escherichia coliml en caldo Fluorocult y Presencia de Salmonela25ml con BHI
caldo tetrationato y agar Hecktoen (Montoya 1999)
(Var tabla 16)
2212 AnaUsis estadistico
A los datos obtenidos en la medici6n de pH acidez (expresada como Beido
laclico) en los dras 2714 Y 21 y el recuento de Lactobacillus en los dras 714 y21
40
realizados a los dos tratamlentos se tes aplic6 1a prueba t porque solo difieren
en la presencia 0 ausencia del prebi6tico para evaluar si habra diferencia
estadfsticamente significativa para los dos tratamientbs(Ver Tablas9 12 y 15)
41
3 RESULTADOS Y DISCUSION
31 Coloraci6n de Gram y morfologfa
Las cepas aisladas fesultaron Gram positivas (Ver Figura 6) colonias grandes
cremosas dE) color beige con bordes homogeneos y c6ncavos en su
morfologia (Ver Figura 3) resultando de acuerdo a 10 especificado en Stanley
1989 para Lactobacillus
32 Prueba de esporulaci6n y cataJasa
Los resultados de la pruebas de esporulaci6n y catalasa indicados en las
Tablas 3 y 4 respeclivamente dieron conforme a 10 especificado en Stanley
1989 para Lactobacillus
42
1
2 3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
TABLA 3 Resultado de prueba de esporuJaci6n
CEPA RESULfADO ESPORULACION
-- -------------
43
l i ~II bull ~ I I
TABLA 4 Resultado prueba de la catalasa
CEPA RESULTADO CATALASA
1 -2 -3 -4 -5 -6 -7 8 -9 -10 -11 12 -13 -14 -15 -16
3~3 Prueba para determinar la especie
Oespues de hacer las pruebas para seleccionar las cepas sospechosas de ser
Lactobacillus se realizo las pruebas bioquimicas fograndose identificar
Lactobacillus plantarum aislctdo de pepino repollo y repollitas de bruselas
44
fermentados y Lactobacillus brevis de mucosa vaginal y leche fermentada (Ver
Anexos del A al E y Tabla 5)
TABLA 5 Resultado identlficaci6n cepa~
CEPA NOMBRE
1 Lactobacillus planfarum
3 Lactobacillus plantarum
5 Lactobacillus brevis
13 Lactobacillus brevis
15 Lactobacillus plantarum
34 Pruebas para determinar microorganismos probi6ticos
las cepas de Lactobacillus brevis y Lactobacillus plantarum mostraron
rasistencia al medio acido de pH =2 Y sales biliares 03 pv resultado similar al
encontrado por Jacobsen et al 1999 para Lactobacillus plantarum (Ver tabla 6)
45
middot
~~~ttiI lltlmiddot~COX~dtJ ~xtc_~ 2 tr~ k-JlL~middot
-)~~TO DE lJIBUOTECUl rjRL]OTtCA twn GO1IU1
TABLA 6 Resultados a pruebas de resistencia a pH=2 y sales biliares 03 plv
CEPA RESISTENCIA pH=2 RESISTENCfA A SALES BIUARES ()3 pv
1 + +
2 + +
3 + +
4 + +
5 +
6 + +
7 + +
8 + +
9 + +
10 + +
11 + +
12 + +
13 + +
14 +1shy +M
15 + +
16 + +
+1 crecimiento debil
+ crecimiento abundante
46
Figura 6 Lactobacillus brevis Gram + aislado de leche fermentada
Ai observar en placa las celulas de lactobacilos despues de real1zar las pruebas
de resistenCia a la acidez y sales biliares se observo una tendencia a aglomerarse
posiblemente como un mecanismo de proteccion cOlitra estos medios que pueden
lIegar a ser adversos para elias (Ver figuras 7 y 8)
47
Figura 7 Lactobacillus brevis aislada de leche fermentada despu~s de la prueba de resistencia a pH=2
Figura 8 Lactobacillus brevis aislada de leche fermentada despues de la prueba de resistencie asales biUares 03 plv
fI
48
35 --Seguimiento del-pH-en-la-bebidaJacteacon y sin -prebi6tico
A continuacion se muestran las Tablas 7 y 8 donde sa registian los datos
recopilados de pHdurante 10$ dras Z 7 14 Y21 para las bebidas laaeas con ysin
prebi6tioo
TABLA 1 ResultadopH yogur sin avena
Dia Repetition 1 Repetici6n 2 Repeticion 3 Repetici6n 4
2 526 501 51 52
7 446 433 438 44
14 439 435 437 436
21 439 437 438 437
TABLA 8 -ResultadopHyogur con avena
Dia Repeticion 1 Repeticion2 Repeticion 3 - Repeticion 4
2 509 523 51 515
7 447 442 445 442
14 436 -438 439 437
21 432 433 435 434
Observando la Figura 9podamos ver que el pH en el -dfado$ para los dos
tratamientos as igual y empieza a descender rapidamente para estabilizarse a
partir del dra 7(Ver figura 9)
49
Figura 9 Comparacj6n de medias para -el pH
Comparaci6n de medias para pH
55 ~ 5 +----=gtIIIi-~i~~----=-r--it~ -- pH sin avena
a 45 1--~~~~=~~ 4 --- pH con
avena35 t-----r-- -------=------=--= ------- - ----
2 7 14 21
Dias
Aplicando la prueba t para comparar las medias de pH I S6 muestia una diferencia
altamants significativa en los dos tratamientos para el dia 21 (pltO05)
(Ver tabla 9)
TABLA 9 Compaiaci6n de medias para pH
DtAS SIN AVENA CON AVENA te p (VALOR)
2 514 514 0 10
7 439 444 -1 61 0159
14 437 I
438 -070 0510
21 438 433 528 00019 shy
- DiFERENCIA AlTAMENTE SIGNIFICATIVA
50
I
AI aplicar regrasi6n a los datos sa obtiene al modelo estimado
pHSinAyena =535606 - 01505650Ia +0005044340IaI2
La variabilidad en la respuesta de pH asta siendo explicada en un 8S7522 por
el modelo (Ver Anexo F)
EI tratamiento con avena mostro el siguiente modelo al analisis de ragresi6n
pHConAvena =534463 ~ 0140407Dia + 0004480980Ia2
La variabilidad an la respuesta de pH asta siendo explicada en un 903315 par
el nlodelo(Ver anexo G)
36 Seguimiento de la acidezmiddotmiddot expresada comomiddot de acido
lactico
A continuaci6n sa muestran las Tablas 10 y 11 donde sa registran los datos
tecopilados de acidezmiddotdurante los dias 27 14 Y 21 para las pebidas taetees con y
sin prebi6tico
TABLA 10 Resuttadode acidez (expresadocomo acido tactico) yogurt sin avena
CIA R~petici6n1 Repeticion2 Repetici6n 3 Repeticion 4
2 054 06 057 058
7 072 074 073 0]2
14 080 083 082 082
21 0]4 079 078 077
51
TABLA 11 Resultado de aCidez (expresado como acido Icktico) yogurt con avena
Dia Repetici6n 1 RepetiCi6n 2 Repetici6n 3 Repetici9n 4
2 059 055 058 057
7 071 073 072 072
14 089 087 088 086
21 092 091 090 091
Observando la Figura 10 se puede concluir que la acidez empieza a aumentar
hasta el dia 14 y luego trata de estabilizarse para los dos tratamientos
(Ver figura 10)
Figura 10 Comparaci6n de medias para la acidez
N G)
Comparacion de medias para acidez
1
2 0I 5 -+--=--------=-~~~= u
ltC
- Acidez sin avena
2 7 14
Dias
52
21
-it- Acidez con avena
Aplicando la prueba t para camparar las madias de acidez se muestra una
diferencia altarnante significativa en los dos tratamiantos para los dias 14 y 21
(pltO05)
(Var tabla 12)
TABLA 12Comparaci6n de medias para Acidez
DIASmiddot SIN AVENA CON AVENA te p(VALOR)
2 0572 0572 0 10
7 0727 0720 119 0278
14 0818 0875 -638 000070shy
21 077 091 -1212 i 0000019 shy
DIFERENCIA AL TAMENTE SlGNIFICATIVA
AI aplicar r~gresi6n a los datos se obtiene el modelo estimado
AcidezSlnAIena = 0491897 + O0436032Dia O00144613DfaA2
La variabilidad en la respuesta de acidez asta siendoexplicada en un 970978
por al modelo (Ver anexo H)
EI tratamiento con avena mostro elsiguiente modeloj a1 analisis de regresion
AcidezConAvena = 0491638 + 00406572Oia - OQOO982559OiaA2
La variabilidad enla respuesta acidez esta siendo explicadaen un 99212 por
el modelo (Ver anexo J)
53
I ~
37 Prueba de viabiJidad
A continuaci6n sa muestran las Tab~as 13 y 14 donde sa presentan los datos
recopilados del recuento de Lactobacilos durante los dias 7 14 Y 21 para las
bebidas lacteas con y sin prebi6tico
TABLA 13 Recuento de Lactobacilos (UFCml) yogurt sin avena
Dia Repetici6n 1 Repetici6n 2 Repeticion 3 Reptttici6n 4
7 1880X10l1 1454X1011 1642X1011 1780X10~
14 1560X10~ 646X1011J 1890X10l 140X10l1
21 1200x10lu 128Ox10u 1745x10J 1520x101V
TABLA 14 Recuento de Lactobacilos (UFCml) yogurt con avena
Dfa Repetieion 1 Repetici6n 2 Repeticion 3 Repeticf6n 4
7 1600X10lt 1240X10t 1640X10ll 1980X10t
14 540X1011 427X10n 546X10n 720X10ll
21 500x1011 492x1011 712)(1011 980x10~
AI analizar la Figura 11 sa puede observar un recuento mayor de Lactobacilos
en al tratamiento con avena resultado de acuerdo a 10 encontrado por Alander at
aI 1999 Kontula et aI 1998 y Jaskari et aI 1998
54
Figura 11 Comparaci6n de medias para Log Lactobacillus
Comparacion de medias para log Lactobacillus
~ 1350
-+- Sac Sin--() 13 co avenaIII
bull 125 -- Bac con 0)
0 12 avenaJ
115 7 14 21
Dias
Aplicando la prueba t para comparar las medias de recuento de Lactobacillus no
se encontr6 una diferenc1a estadfsUcamente significative entre los dos
tratamientos (Ver tabla 15)
Este aumento en al racuento influy6 en la disminuci6n del pH y en el aumento de
fa aeidez por la fermentacion que realizan los Lactobacillus sobre fa lactosa de la
lache y la avena adicionada como prebi6tico
55
1
TABLA 15 Comparaci6n medias lag Lactobacillus
DIAS SIN AVENA CON AVENA tc p(VALOR)
7 122257 122022 04846 06451
14 121065 132393 -19602 00977
21 129025 133087 -08236 04416
At aplicar regresion a los datos se obtiane al modelo astimado
LactobacillusSinAvena= 117347 + 004834640Ia
La variabilidad en la respuesta del recuento de LactobaCillus ssta siendo
explicada en un 260054 por el mod$loVar anexo J)
EI tratamiento con avena mostr6 al siguiente modalo al anal isis de regresion
Lactobacillu$ConAvena =118103 + 007903040Ias
La variabilidad en la respuesta de recuento esta siendo explicada en un 3068
por al modelo(Ver anexo K)~
38 Analisi$ microbiol6gicos de las bebidas lacteas con y sin
En la Tabla 16 estan recopilados los resultados microbiol6gieos obtenidos en ras
muestras con los dos tratamientos (con y sin avena)
I [
sa
TABLA 16 Resultados analisis microbiologico
Recuento de mohos y levaduras Iml lt10
Recuento de Staphylococcus coagulase positiva Iml lt100
NMP coliformes fotales y Escherichia coli Iml lt3
Presencia de Salmonella25ml Ausente
Los resultados de este analisis demuestran que las bebidas fermentadas con y
sin avena~ astan fibres de microorganismos patogenos
57
1
4 CONCLUSIONES
Se aislaron cepas nativas de Lactobacillus plantarum de las muestras vegetates
de repollo pepino repollitas de bruselas fermentadas y Lactobacillus brevis de
lache fermentada y mucosa vaginal humana Ambas cepas resistieran un pH=2 y
una concentraci6n de sales biliares det 03 ptv dos earacteristicas importantes
en los probi6ticos
Lamiddot cepa de Lactobacillus brevis aislada de lache Sa utiliz6 para elaborar una
bebida fermentada sin y con avana comoingrediente prebiotico obteniendose un
aJimento centon recuento del probi6tico viable durante 21 dras de seguimiento
ademas libre de microorganismos )at6gen05
No se encontr6 efecta significativo de la avena sobre Ie viabilidad del Lactobacillus
brevis aunque sa presento un aumento en 61 recuento de estos en la bebida con
avena
58
plusmn ~
5 RECOMENDACIONES
Ensayar la cepa de Lactobacillus plantartJm en productos carnicos madurados
como el salami
Ensayar la cepa de Lactobacillus l)revs en otros derivados lecteos como queso
quesito queso crema
Continuar con el estudio de estos microorganismos y caracterizarlos
molecularmente ademas de estudiar su capacidad de adherencja a fa mucosa
intestinal sobre algunes Hneas celulares como las CaCo~2
Estudiarel efedo de la avena sabre la viabiJidad del Lactobacillus breyis a una
concentraci6n mayor de 05
Realizer ensayos can las cepas de Lactobacillus brevis y Lactobrlcillus pJantarum
para elaborar masas acidas para panificacion reemplazando el Bromato de
Potasio aditivo prohibido desde marzo del 2003 en nuestro pais per 5U toxicidad
59
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65
ANEXOS
66
ANEXO A RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AlSLADA DE i
PEPINO it
Referencia Pepino 1 Fecha 06122002
IEXCELENTE IDENTIFICACION
Latto plantarum 1
Galeria API 50 CHL V50 Leida el 06122002
Perfil - -- - ++ - -- - ++++ - - -+- + - I I I I I I I I +t+ - +f- ~ - - + + ~ - - - +- + - shy
o - GLY - ERY DARA - LARA + RIB + DXYL - LXYL - ADO - MDX - GAL + GLU + FRU + MNE + SBE - RHA - DUL - INO bull MAN + SOR - MDM + MUG shyNAG + AMY + ARB + ESC + SAL + CEL + MAL + LAC + MEL + SAC + TRE + 1NU - MLZ + RAF + AMD - GLYG - XLT - GEN + TIJR + LYX - TAG - DFUC shyLFUC - DARL + LARL - aNT + 2KG - 5KG shy
--- Taxones significativos rd -----T -- Tests en contra
Lactoplantarum 1 999 092 1
Taxon siguiente Lactobrevis 1 OJ 044 3
i i
Lactoplantarum 1 1 test (5) en contra
D-SORBITOL (SOR) 78
Tax6n siguiente Lactobrevis 1 3 test (s) ert contra
METHYLD-MANNOSIDE (MOlM) 0 MELEZITOSE (MLZ) 14 D-TURANOSE (TUR) 14
67
ampb
ANEXO B RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AISLADA DE REPOLLO FERMENTADO
~
Referencia Repollo fermentado - 3 Fecha 03072003
EXCELENTE IDENTIFICACION
Lactoplantarum 1
Galena API 50 CRL V50 Leida el 03072003
Perfil - - ++ - - - - -H++ - - ~ + - + - I I 1 I I I I -H+ - ++ - - - + + - -- - - + - shy
o - GLY - ERY - DARA - LARA + RIB + DXYL - LXYL - ADO ~ MDX - GAL + GLU + FRU + MNE + SBE ~ RHA - DUL - INO - MAN + SOR - MDM + MDG shyNAG + AMY + ARR + ESC + SAT + CRL + MAL + LAC + MEL + SAC + TRE + lNU - MLZ + RAF + AMI) - GLYG - XLT - GEN + TOR + LYX - TAG - DFUC shyLFUC - DARL - LARL - GNT + 2KG - 5KG shy
------Taxones significativos _ _----- Id--- ---T---- Tests en contra
Lactoplantarum 1 999 095 1
Tax6n siguiente Lactobrevis 1 01 OA8 3
lJactoplantaru01 1 1 test (s) en contra
DSORBITOL (SOR) 78
Taxon siguiente Lactobrevis
METHYL-D-MANNOSIDE D-TURANOSE
1
(MOM) (TOR)
3 test (5) en contra
0 MELEZITOSE 14
(MLZ) 14
i
I
68
ANEXO C RESULTADO PRUEBAS BIOQUWICAS DE CEPA AISLADA DE MUCOSA HUMANA
Referenda Mucosa - 5 Fecha 27012003
BUENA IDENTlFICACION
Galeria API 50 CHL vso Leida el 270112003
Perfil - - - - +t--t - - - + - + - - - - - - - - -+- - - - - + - + - - - - - - - - - - - - - bull - - -+ - +
o - GLY ~ ERY - DARA bull LARA + RID + DXYL + LXYL - ADO bull MDX - GAL + OLU - FRU + MNE - SBE - IlliA - DUL - INa - MAN - SOR - MDM - MOO shyNAG + AMY - ARB - ESC ~ SAL bull CEL - MAL + lAC - MEL + SAC - TRE shyINU - MLZ - RAF - AMD - GLYG - XLT - GEN - 11JR - LYX - TAG - DFUC shyLFUC - DARL - IARL - ONT + 2KO - 5KG +
- - - - - - Taxones significativos - - - - - - - Id T -- Test en contra
Lactobrevis 3 963 088 1
Taxon siguiente Lactoco11inoides 36 075 2
Lactobrevis 3 1 test (s) en contra
GLUCOSE (GLU) 95
-~~~------------~---------------------------~--~-------~--~-----~----------~--------~------------~~--Taxon siguiente Lactocollinoides 2 test (s) en contra
GLUCOSE (GLU) 100 MELIBIOSE (MEL) 25
69
i r
ANEXO D RESULTADO PRUEBAS BIOQIJiMICAS DE CEPA AISLADA DE LECHE FERMENTADA
Referenda Leche fennentada ~ 13 Fecha 27012003
BUENA IDENTIFICACI6N
Galeria API 50 CHL V50 Leida el 270112003
Perfil - - - - -t-t+- - - - + - + - - - bull - - - - -+- - - - - + - + - - - - - - - - - - - - - - - - -+ - +
0 - GLY - ERY - DARA - LARA +Rll3 + DXYL + LXYL - ADO - MDX ~GAL + GLU - FRU + MNE SBE - RHA DUL bull INO MAN - SOR MDM bull MDG shy
~NAG + AMY - ARB - ESC - SAL - CEL - MAL + LAC - MEL + SAC - TRE I lNU - MLZ - RAF - AMD - GLYG - XLT - OEN - IUR LYX - TAG - DFUC bull i
LFUC - DARL - LARL -ONr + 2KG - SKO + 1
- -- - - Taxones significativos - - Id -- T --- Test en contra
Lacta brevis 3 963 088 1
Taxon siguiente Lactocollinoides 36 075 2
Lactobrevis 3 1 test (s) en contra
GLUCOSE (GLU) 95
-----------------------------------------------------------~------------------------------~-------------------Taxon siguiente Lactocollinoides 2 test (s) en contra
GLUCOSE (GLD) 100 MELffiIOSE (MEL) 25
70
II iJ1
I
I ANEXO E RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AISLADA DE REPOLLITAS DE BRUSELAS FERMENTADA
Referencia repollitas de bruselas 15 Fecha 03072003
EXCELENTE IDENTIFICACION
Lactoplantarum 1
Galeria API 50 CHL vsO Leida el 03072003
Perfil - - - - +t - - - - +H+ - +- - +t + - I I I I I I I f ++t - + - - - -+ + - - - -+ -+ - - I ij
o - GLY - ERY - DARA - LARA + RJB + DXYL - LXYL - ADO - MDX - GAL +
GLU + FRU + MNE + SBE RHA + DUL - INO - MAN + SOR + MDM + MOG shyNAG + AMY + ARB + ESC + SAL + eEL + MAL + LAC + MEl + SAC + TRE + i
I1NU - MLZ + RAF AMD GLYG - XLT - aEN + TUR + LYX - TAG - Druc LFUC - DARt + LARL - aNT + 2KG - 5KG shy n ----Taxones significativos ------ Id Tests en contra
Lactoplantarum 1 999 090 o
Taxon siguiente Lacto pentosus 01 012 7
Lactoplantarum 1 o test (s) en contra
Taxon siguiente Lacto pentosus 7 test (8) en contra
GLYCEROL (GLY) 75 D-XYLOSE (DXYL) 100 L-RHAMNOSE (RHA) 25 METHYL-D-MANNOSIDE (MOM) 1 MELEZITOSE (MLZ) 25 RAFFINOSE (RAF) 75 D-ARABITOL (DARL) 0
71
~
I i I
ANEXO F - ANALISIS DE REGRESION PARA pH EN BEBIDA SIN AVENA
Aruilisis de regresi6n polinomial
---~-~-------------------------------------------~-----------~~---------------------~--------------Variable dependiente pHSinAvena ---------------------------~-------------~--------------------~---------------------------------
Error T Parametro Estimado Estandar Estadistico P-Valor
CONSTANTE 535606 0094535 56657 00000 Dia -0150565 0020706 727154 00000 Dia2 000504434 0000871488 578819 00001
---~---------------------------------------------------------------------------------------------------
Anfllisis de Variama -------------------------------------------~-----------~-----------------------------~-~--- jSource Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor 11
------------------------~------------------------------------------------------------------------------~ Mod-elo 155772 2 0118861 4256 00000 Residual 0237877 13 00182983
Total (Corr) 11956 IS
R2 == 867522 percent
pHSinAvena == 535606 - 0150565Dia + 000504434Dia2
72
____
middot ANEXO G - ANALISIS DE REGRESION PARA pH EN BEBIDA CON AVENA
AmUisis de regresion polinomial _____~_____~__-_____~___4____________________bull____bull__________bull_____________~~----_------___________
Variable depcndiente pHConA vena ------------------------------------------------------------------------------------------~--------
Error T Parametro Estimado StAndar Estadfstico P-Valor
---------------------------------------------~-----------------------------------------------_---------CONSTANTE 534463 00801045 667208 00000 Dia -0140407 00175453 800253 00000 DiaA 2 000448098 0000738458 606803 00000
----------------------~---~-----------------------------~------------------------------~----AmUisis de Varianza
---~---------------------------------~---------------------~------------~-------------------~------Source Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio PValor --------------------------~-----------------------------------------------~------------~-----~~--~ ModeJo 159575 2 0797873 6073 00000 Residual 02170798 middot13 00131383 _______~_~ ~_~----------~------~--~-----~-M-----~-----____ _____________~-----------------------Total (COlT) 176654 15
R12 903315 percent
-----------~------------------------------------------------------------------------~-----------pHConAvena 534463 - 0140407Dia + 000448098DfaA 2
73
ANEXO H - ANALTSIS DE REGRESTON PARA ACIDEZ EN BEBJDA SIN AVENA
An8Jisis de Regtesi6fi P6lifJomial
Variable Depefidiefile~ AcidezSinAVenll _______________w_____~______~________________~-----------_________~_________________~~____~___~_____
Error T Pariirnetro Estimado Estandar Estadistico ---------------------------------------~--------------~-~-------~--------------------~------------CONSTANT 0491697 00123217 399051 00000 Dia 00436032 000269882 161564 00000 D1a2 -000144613 000011359 127312 00000 __w___~________________________~-_______-_____~----____________________________~__~---~_--__~___
AriiiJisis de varianza ~_~__~__________~_~____~________~___________- _________e_____________________________bull _____-________
Source Smn de cuadr Df Mean Square F-Ratio PmiddotValor_~~___________________________________bull ______~___________bull ____________bull ______~________w________________
Model 0135203 2 00676013 21747 00000 Residual 000404118 13 000031086
Total (Corr) 0139244 15
R2 970978 percent
AcidezSlnAvena 0491697 + O0436032Dia - 0OOl44613Dia2
74
I
ANEXO I ANALISIS DE REGRESION PARA ACIDEZ EN BEBIDA CON AVENA
1
Anwisis de tegtesi6fi polinomial
Variable dependiente Acidez Con Avena
Error T ParametTo Estimado Stlindar Estadfstico P-Valor ----------------~-------~---------------------~-----------------------------------------------------CONSTANT 0491639 000926607 530578 00000 Diamiddot 00406572 000202955 200326 00000 DfaA 2 0000982559 0000085421 -115025 00000
-------------~----------------------------~-------------------------~-----------------------------------
-------------~-----~~-----------------------------~---------------------------------------------_--Source Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio PValor
-~-------------~----------------------------------~------------------~~-------------------------- Modelo 0288008 2 0144004 81914 00000 Residual 000228539 13 0000175799
----------~~--------------~---------------------------------------------~---------------------------Total (Corr) 0290294 15
RA2 = 992127 percent
-------------------------~----~---~------------~---------------------------------~---------------~
AcidezConAvena == 049163amp + 00406572D1a - 0000982559DiaA2
75
I
(Ilmiddot il
ANEXO J- ANALISIS DE REGRESION PARA RECUENTO LACTOBACILOS PARA BEBIDA SIN AVENA
Amilisis de regresion - Modelo lineal Y = a + bX
------------------------~----------------------~-----------------------------~----------~-----------Variable Dcpendiente LactobacilJusSinAvena Variable independiente Dia
I--------~----------~-----------------------------------~-------~-~--~--------------------------~-Error T
Paramctro Estimado Standard Stadistico P-Valor
----~----~------------~-----~-----------------------~-------------~-----------------------------Intereepto 117347 0389973 300911 00000 Pendiente 00483464 00257889 18747 00903
Analisis de Varianza
---------~------------------~----------------~---------------------------------~---------~----------Source Sum decuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor
------------~---------------------~---------------------~--------------------------------~-----~----Modelo 0916252 1 244835 443 00616 Residual 260706 10 0260706
--~------------~---~------------------~~~-----~-------~---------~~-------------------------------------Total (Corr)352332 11
Coeficiente Correlaci6n = 0509955 R2 = 260054 percent
LactobacillusSinAvena= 117347 + 00483464Dfa
76
ANEXO K- ANALTSIS DE REGRESION PARA RECUENTO LACTOBACILOS PARA DEBIDA CON AVENA
Aruilisis de regresion - Modelo lineal Y = a + hX
Variable Dependiente LactobacillusConAvena Variable Independiente Dia ---~--------------------------------------------------------__-----------__--_--_-----------shy
Error T Paramctro Estimado Standard Estadistico P-Valor -~--------------------------------------------------------------------------------------------------
Irttercepto 118103 0567963 207942 00000 Pendiente 00790304 00375594 210414 00616
-----------------~----------------------------~----~-------~----~----------------------------
Analisis de Varianza
----------------~----------------~------------------~--------------------------~------~--------shySource Swn de cuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor
-----------------~--~--------------------------------------------------------------------------~---~ Mode10 244835 1 244835 443 00616 Residual 552997 10 0552997
Total (Corr)797832 11
Coeficiente Correlacion = 0553964 RI2 = 306875 percent
-----~--------------------------------------------------------~--------------------------------------
LactobacillusConAvena = 118103 + 00790304Dfas
77
Para asta prueba se tamaron 10 rnl de muestra y se adicionaron a 90 ml de caldo
MRS ruego a partir de esta se hicieron diluciones de 10-2 hasta 10-11 de las
diluciones 109101deg 10-11 se inocul6 1 ml de cada uno en agar MRS siguiendo el
metodo de siembra en profundidad y por duplicado e incubando a 370 C x 5 dras
en anaerobiosis y luego se hicieron tos recuentos por duplicado para esi reportar
los recuentos promedio (Ver Tablas 13 y 14)
2211 AniUisls microbiol6glco de las bebidas Iicteas(con y sin
avena)
Con el fin de determinar las condiciones higienico-sanitarias del producto se
realizaron las pruebas microbiol6gicas de Recuento de mohos y fevadurasml en
agar OGY Recuento en superficia de Staphylococcus coagulasa positivoml en
agar Baird Parker Numero Mas Probable (NMP) de coUfor-mes totales y
Escherichia coliml en caldo Fluorocult y Presencia de Salmonela25ml con BHI
caldo tetrationato y agar Hecktoen (Montoya 1999)
(Var tabla 16)
2212 AnaUsis estadistico
A los datos obtenidos en la medici6n de pH acidez (expresada como Beido
laclico) en los dras 2714 Y 21 y el recuento de Lactobacillus en los dras 714 y21
40
realizados a los dos tratamlentos se tes aplic6 1a prueba t porque solo difieren
en la presencia 0 ausencia del prebi6tico para evaluar si habra diferencia
estadfsticamente significativa para los dos tratamientbs(Ver Tablas9 12 y 15)
41
3 RESULTADOS Y DISCUSION
31 Coloraci6n de Gram y morfologfa
Las cepas aisladas fesultaron Gram positivas (Ver Figura 6) colonias grandes
cremosas dE) color beige con bordes homogeneos y c6ncavos en su
morfologia (Ver Figura 3) resultando de acuerdo a 10 especificado en Stanley
1989 para Lactobacillus
32 Prueba de esporulaci6n y cataJasa
Los resultados de la pruebas de esporulaci6n y catalasa indicados en las
Tablas 3 y 4 respeclivamente dieron conforme a 10 especificado en Stanley
1989 para Lactobacillus
42
1
2 3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
TABLA 3 Resultado de prueba de esporuJaci6n
CEPA RESULfADO ESPORULACION
-- -------------
43
l i ~II bull ~ I I
TABLA 4 Resultado prueba de la catalasa
CEPA RESULTADO CATALASA
1 -2 -3 -4 -5 -6 -7 8 -9 -10 -11 12 -13 -14 -15 -16
3~3 Prueba para determinar la especie
Oespues de hacer las pruebas para seleccionar las cepas sospechosas de ser
Lactobacillus se realizo las pruebas bioquimicas fograndose identificar
Lactobacillus plantarum aislctdo de pepino repollo y repollitas de bruselas
44
fermentados y Lactobacillus brevis de mucosa vaginal y leche fermentada (Ver
Anexos del A al E y Tabla 5)
TABLA 5 Resultado identlficaci6n cepa~
CEPA NOMBRE
1 Lactobacillus planfarum
3 Lactobacillus plantarum
5 Lactobacillus brevis
13 Lactobacillus brevis
15 Lactobacillus plantarum
34 Pruebas para determinar microorganismos probi6ticos
las cepas de Lactobacillus brevis y Lactobacillus plantarum mostraron
rasistencia al medio acido de pH =2 Y sales biliares 03 pv resultado similar al
encontrado por Jacobsen et al 1999 para Lactobacillus plantarum (Ver tabla 6)
45
middot
~~~ttiI lltlmiddot~COX~dtJ ~xtc_~ 2 tr~ k-JlL~middot
-)~~TO DE lJIBUOTECUl rjRL]OTtCA twn GO1IU1
TABLA 6 Resultados a pruebas de resistencia a pH=2 y sales biliares 03 plv
CEPA RESISTENCIA pH=2 RESISTENCfA A SALES BIUARES ()3 pv
1 + +
2 + +
3 + +
4 + +
5 +
6 + +
7 + +
8 + +
9 + +
10 + +
11 + +
12 + +
13 + +
14 +1shy +M
15 + +
16 + +
+1 crecimiento debil
+ crecimiento abundante
46
Figura 6 Lactobacillus brevis Gram + aislado de leche fermentada
Ai observar en placa las celulas de lactobacilos despues de real1zar las pruebas
de resistenCia a la acidez y sales biliares se observo una tendencia a aglomerarse
posiblemente como un mecanismo de proteccion cOlitra estos medios que pueden
lIegar a ser adversos para elias (Ver figuras 7 y 8)
47
Figura 7 Lactobacillus brevis aislada de leche fermentada despu~s de la prueba de resistencia a pH=2
Figura 8 Lactobacillus brevis aislada de leche fermentada despues de la prueba de resistencie asales biUares 03 plv
fI
48
35 --Seguimiento del-pH-en-la-bebidaJacteacon y sin -prebi6tico
A continuacion se muestran las Tablas 7 y 8 donde sa registian los datos
recopilados de pHdurante 10$ dras Z 7 14 Y21 para las bebidas laaeas con ysin
prebi6tioo
TABLA 1 ResultadopH yogur sin avena
Dia Repetition 1 Repetici6n 2 Repeticion 3 Repetici6n 4
2 526 501 51 52
7 446 433 438 44
14 439 435 437 436
21 439 437 438 437
TABLA 8 -ResultadopHyogur con avena
Dia Repeticion 1 Repeticion2 Repeticion 3 - Repeticion 4
2 509 523 51 515
7 447 442 445 442
14 436 -438 439 437
21 432 433 435 434
Observando la Figura 9podamos ver que el pH en el -dfado$ para los dos
tratamientos as igual y empieza a descender rapidamente para estabilizarse a
partir del dra 7(Ver figura 9)
49
Figura 9 Comparacj6n de medias para -el pH
Comparaci6n de medias para pH
55 ~ 5 +----=gtIIIi-~i~~----=-r--it~ -- pH sin avena
a 45 1--~~~~=~~ 4 --- pH con
avena35 t-----r-- -------=------=--= ------- - ----
2 7 14 21
Dias
Aplicando la prueba t para comparar las medias de pH I S6 muestia una diferencia
altamants significativa en los dos tratamientos para el dia 21 (pltO05)
(Ver tabla 9)
TABLA 9 Compaiaci6n de medias para pH
DtAS SIN AVENA CON AVENA te p (VALOR)
2 514 514 0 10
7 439 444 -1 61 0159
14 437 I
438 -070 0510
21 438 433 528 00019 shy
- DiFERENCIA AlTAMENTE SIGNIFICATIVA
50
I
AI aplicar regrasi6n a los datos sa obtiene al modelo estimado
pHSinAyena =535606 - 01505650Ia +0005044340IaI2
La variabilidad en la respuesta de pH asta siendo explicada en un 8S7522 por
el modelo (Ver Anexo F)
EI tratamiento con avena mostro el siguiente modelo al analisis de ragresi6n
pHConAvena =534463 ~ 0140407Dia + 0004480980Ia2
La variabilidad an la respuesta de pH asta siendo explicada en un 903315 par
el nlodelo(Ver anexo G)
36 Seguimiento de la acidezmiddotmiddot expresada comomiddot de acido
lactico
A continuaci6n sa muestran las Tablas 10 y 11 donde sa registran los datos
tecopilados de acidezmiddotdurante los dias 27 14 Y 21 para las pebidas taetees con y
sin prebi6tico
TABLA 10 Resuttadode acidez (expresadocomo acido tactico) yogurt sin avena
CIA R~petici6n1 Repeticion2 Repetici6n 3 Repeticion 4
2 054 06 057 058
7 072 074 073 0]2
14 080 083 082 082
21 0]4 079 078 077
51
TABLA 11 Resultado de aCidez (expresado como acido Icktico) yogurt con avena
Dia Repetici6n 1 RepetiCi6n 2 Repetici6n 3 Repetici9n 4
2 059 055 058 057
7 071 073 072 072
14 089 087 088 086
21 092 091 090 091
Observando la Figura 10 se puede concluir que la acidez empieza a aumentar
hasta el dia 14 y luego trata de estabilizarse para los dos tratamientos
(Ver figura 10)
Figura 10 Comparaci6n de medias para la acidez
N G)
Comparacion de medias para acidez
1
2 0I 5 -+--=--------=-~~~= u
ltC
- Acidez sin avena
2 7 14
Dias
52
21
-it- Acidez con avena
Aplicando la prueba t para camparar las madias de acidez se muestra una
diferencia altarnante significativa en los dos tratamiantos para los dias 14 y 21
(pltO05)
(Var tabla 12)
TABLA 12Comparaci6n de medias para Acidez
DIASmiddot SIN AVENA CON AVENA te p(VALOR)
2 0572 0572 0 10
7 0727 0720 119 0278
14 0818 0875 -638 000070shy
21 077 091 -1212 i 0000019 shy
DIFERENCIA AL TAMENTE SlGNIFICATIVA
AI aplicar r~gresi6n a los datos se obtiene el modelo estimado
AcidezSlnAIena = 0491897 + O0436032Dia O00144613DfaA2
La variabilidad en la respuesta de acidez asta siendoexplicada en un 970978
por al modelo (Ver anexo H)
EI tratamiento con avena mostro elsiguiente modeloj a1 analisis de regresion
AcidezConAvena = 0491638 + 00406572Oia - OQOO982559OiaA2
La variabilidad enla respuesta acidez esta siendo explicadaen un 99212 por
el modelo (Ver anexo J)
53
I ~
37 Prueba de viabiJidad
A continuaci6n sa muestran las Tab~as 13 y 14 donde sa presentan los datos
recopilados del recuento de Lactobacilos durante los dias 7 14 Y 21 para las
bebidas lacteas con y sin prebi6tico
TABLA 13 Recuento de Lactobacilos (UFCml) yogurt sin avena
Dia Repetici6n 1 Repetici6n 2 Repeticion 3 Reptttici6n 4
7 1880X10l1 1454X1011 1642X1011 1780X10~
14 1560X10~ 646X1011J 1890X10l 140X10l1
21 1200x10lu 128Ox10u 1745x10J 1520x101V
TABLA 14 Recuento de Lactobacilos (UFCml) yogurt con avena
Dfa Repetieion 1 Repetici6n 2 Repeticion 3 Repeticf6n 4
7 1600X10lt 1240X10t 1640X10ll 1980X10t
14 540X1011 427X10n 546X10n 720X10ll
21 500x1011 492x1011 712)(1011 980x10~
AI analizar la Figura 11 sa puede observar un recuento mayor de Lactobacilos
en al tratamiento con avena resultado de acuerdo a 10 encontrado por Alander at
aI 1999 Kontula et aI 1998 y Jaskari et aI 1998
54
Figura 11 Comparaci6n de medias para Log Lactobacillus
Comparacion de medias para log Lactobacillus
~ 1350
-+- Sac Sin--() 13 co avenaIII
bull 125 -- Bac con 0)
0 12 avenaJ
115 7 14 21
Dias
Aplicando la prueba t para comparar las medias de recuento de Lactobacillus no
se encontr6 una diferenc1a estadfsUcamente significative entre los dos
tratamientos (Ver tabla 15)
Este aumento en al racuento influy6 en la disminuci6n del pH y en el aumento de
fa aeidez por la fermentacion que realizan los Lactobacillus sobre fa lactosa de la
lache y la avena adicionada como prebi6tico
55
1
TABLA 15 Comparaci6n medias lag Lactobacillus
DIAS SIN AVENA CON AVENA tc p(VALOR)
7 122257 122022 04846 06451
14 121065 132393 -19602 00977
21 129025 133087 -08236 04416
At aplicar regresion a los datos se obtiane al modelo astimado
LactobacillusSinAvena= 117347 + 004834640Ia
La variabilidad en la respuesta del recuento de LactobaCillus ssta siendo
explicada en un 260054 por el mod$loVar anexo J)
EI tratamiento con avena mostr6 al siguiente modalo al anal isis de regresion
Lactobacillu$ConAvena =118103 + 007903040Ias
La variabilidad en la respuesta de recuento esta siendo explicada en un 3068
por al modelo(Ver anexo K)~
38 Analisi$ microbiol6gicos de las bebidas lacteas con y sin
En la Tabla 16 estan recopilados los resultados microbiol6gieos obtenidos en ras
muestras con los dos tratamientos (con y sin avena)
I [
sa
TABLA 16 Resultados analisis microbiologico
Recuento de mohos y levaduras Iml lt10
Recuento de Staphylococcus coagulase positiva Iml lt100
NMP coliformes fotales y Escherichia coli Iml lt3
Presencia de Salmonella25ml Ausente
Los resultados de este analisis demuestran que las bebidas fermentadas con y
sin avena~ astan fibres de microorganismos patogenos
57
1
4 CONCLUSIONES
Se aislaron cepas nativas de Lactobacillus plantarum de las muestras vegetates
de repollo pepino repollitas de bruselas fermentadas y Lactobacillus brevis de
lache fermentada y mucosa vaginal humana Ambas cepas resistieran un pH=2 y
una concentraci6n de sales biliares det 03 ptv dos earacteristicas importantes
en los probi6ticos
Lamiddot cepa de Lactobacillus brevis aislada de lache Sa utiliz6 para elaborar una
bebida fermentada sin y con avana comoingrediente prebiotico obteniendose un
aJimento centon recuento del probi6tico viable durante 21 dras de seguimiento
ademas libre de microorganismos )at6gen05
No se encontr6 efecta significativo de la avena sobre Ie viabilidad del Lactobacillus
brevis aunque sa presento un aumento en 61 recuento de estos en la bebida con
avena
58
plusmn ~
5 RECOMENDACIONES
Ensayar la cepa de Lactobacillus plantartJm en productos carnicos madurados
como el salami
Ensayar la cepa de Lactobacillus l)revs en otros derivados lecteos como queso
quesito queso crema
Continuar con el estudio de estos microorganismos y caracterizarlos
molecularmente ademas de estudiar su capacidad de adherencja a fa mucosa
intestinal sobre algunes Hneas celulares como las CaCo~2
Estudiarel efedo de la avena sabre la viabiJidad del Lactobacillus breyis a una
concentraci6n mayor de 05
Realizer ensayos can las cepas de Lactobacillus brevis y Lactobrlcillus pJantarum
para elaborar masas acidas para panificacion reemplazando el Bromato de
Potasio aditivo prohibido desde marzo del 2003 en nuestro pais per 5U toxicidad
59
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65
ANEXOS
66
ANEXO A RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AlSLADA DE i
PEPINO it
Referencia Pepino 1 Fecha 06122002
IEXCELENTE IDENTIFICACION
Latto plantarum 1
Galeria API 50 CHL V50 Leida el 06122002
Perfil - -- - ++ - -- - ++++ - - -+- + - I I I I I I I I +t+ - +f- ~ - - + + ~ - - - +- + - shy
o - GLY - ERY DARA - LARA + RIB + DXYL - LXYL - ADO - MDX - GAL + GLU + FRU + MNE + SBE - RHA - DUL - INO bull MAN + SOR - MDM + MUG shyNAG + AMY + ARB + ESC + SAL + CEL + MAL + LAC + MEL + SAC + TRE + 1NU - MLZ + RAF + AMD - GLYG - XLT - GEN + TIJR + LYX - TAG - DFUC shyLFUC - DARL + LARL - aNT + 2KG - 5KG shy
--- Taxones significativos rd -----T -- Tests en contra
Lactoplantarum 1 999 092 1
Taxon siguiente Lactobrevis 1 OJ 044 3
i i
Lactoplantarum 1 1 test (5) en contra
D-SORBITOL (SOR) 78
Tax6n siguiente Lactobrevis 1 3 test (s) ert contra
METHYLD-MANNOSIDE (MOlM) 0 MELEZITOSE (MLZ) 14 D-TURANOSE (TUR) 14
67
ampb
ANEXO B RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AISLADA DE REPOLLO FERMENTADO
~
Referencia Repollo fermentado - 3 Fecha 03072003
EXCELENTE IDENTIFICACION
Lactoplantarum 1
Galena API 50 CRL V50 Leida el 03072003
Perfil - - ++ - - - - -H++ - - ~ + - + - I I 1 I I I I -H+ - ++ - - - + + - -- - - + - shy
o - GLY - ERY - DARA - LARA + RIB + DXYL - LXYL - ADO ~ MDX - GAL + GLU + FRU + MNE + SBE ~ RHA - DUL - INO - MAN + SOR - MDM + MDG shyNAG + AMY + ARR + ESC + SAT + CRL + MAL + LAC + MEL + SAC + TRE + lNU - MLZ + RAF + AMI) - GLYG - XLT - GEN + TOR + LYX - TAG - DFUC shyLFUC - DARL - LARL - GNT + 2KG - 5KG shy
------Taxones significativos _ _----- Id--- ---T---- Tests en contra
Lactoplantarum 1 999 095 1
Tax6n siguiente Lactobrevis 1 01 OA8 3
lJactoplantaru01 1 1 test (s) en contra
DSORBITOL (SOR) 78
Taxon siguiente Lactobrevis
METHYL-D-MANNOSIDE D-TURANOSE
1
(MOM) (TOR)
3 test (5) en contra
0 MELEZITOSE 14
(MLZ) 14
i
I
68
ANEXO C RESULTADO PRUEBAS BIOQUWICAS DE CEPA AISLADA DE MUCOSA HUMANA
Referenda Mucosa - 5 Fecha 27012003
BUENA IDENTlFICACION
Galeria API 50 CHL vso Leida el 270112003
Perfil - - - - +t--t - - - + - + - - - - - - - - -+- - - - - + - + - - - - - - - - - - - - - bull - - -+ - +
o - GLY ~ ERY - DARA bull LARA + RID + DXYL + LXYL - ADO bull MDX - GAL + OLU - FRU + MNE - SBE - IlliA - DUL - INa - MAN - SOR - MDM - MOO shyNAG + AMY - ARB - ESC ~ SAL bull CEL - MAL + lAC - MEL + SAC - TRE shyINU - MLZ - RAF - AMD - GLYG - XLT - GEN - 11JR - LYX - TAG - DFUC shyLFUC - DARL - IARL - ONT + 2KO - 5KG +
- - - - - - Taxones significativos - - - - - - - Id T -- Test en contra
Lactobrevis 3 963 088 1
Taxon siguiente Lactoco11inoides 36 075 2
Lactobrevis 3 1 test (s) en contra
GLUCOSE (GLU) 95
-~~~------------~---------------------------~--~-------~--~-----~----------~--------~------------~~--Taxon siguiente Lactocollinoides 2 test (s) en contra
GLUCOSE (GLU) 100 MELIBIOSE (MEL) 25
69
i r
ANEXO D RESULTADO PRUEBAS BIOQIJiMICAS DE CEPA AISLADA DE LECHE FERMENTADA
Referenda Leche fennentada ~ 13 Fecha 27012003
BUENA IDENTIFICACI6N
Galeria API 50 CHL V50 Leida el 270112003
Perfil - - - - -t-t+- - - - + - + - - - bull - - - - -+- - - - - + - + - - - - - - - - - - - - - - - - -+ - +
0 - GLY - ERY - DARA - LARA +Rll3 + DXYL + LXYL - ADO - MDX ~GAL + GLU - FRU + MNE SBE - RHA DUL bull INO MAN - SOR MDM bull MDG shy
~NAG + AMY - ARB - ESC - SAL - CEL - MAL + LAC - MEL + SAC - TRE I lNU - MLZ - RAF - AMD - GLYG - XLT - OEN - IUR LYX - TAG - DFUC bull i
LFUC - DARL - LARL -ONr + 2KG - SKO + 1
- -- - - Taxones significativos - - Id -- T --- Test en contra
Lacta brevis 3 963 088 1
Taxon siguiente Lactocollinoides 36 075 2
Lactobrevis 3 1 test (s) en contra
GLUCOSE (GLU) 95
-----------------------------------------------------------~------------------------------~-------------------Taxon siguiente Lactocollinoides 2 test (s) en contra
GLUCOSE (GLD) 100 MELffiIOSE (MEL) 25
70
II iJ1
I
I ANEXO E RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AISLADA DE REPOLLITAS DE BRUSELAS FERMENTADA
Referencia repollitas de bruselas 15 Fecha 03072003
EXCELENTE IDENTIFICACION
Lactoplantarum 1
Galeria API 50 CHL vsO Leida el 03072003
Perfil - - - - +t - - - - +H+ - +- - +t + - I I I I I I I f ++t - + - - - -+ + - - - -+ -+ - - I ij
o - GLY - ERY - DARA - LARA + RJB + DXYL - LXYL - ADO - MDX - GAL +
GLU + FRU + MNE + SBE RHA + DUL - INO - MAN + SOR + MDM + MOG shyNAG + AMY + ARB + ESC + SAL + eEL + MAL + LAC + MEl + SAC + TRE + i
I1NU - MLZ + RAF AMD GLYG - XLT - aEN + TUR + LYX - TAG - Druc LFUC - DARt + LARL - aNT + 2KG - 5KG shy n ----Taxones significativos ------ Id Tests en contra
Lactoplantarum 1 999 090 o
Taxon siguiente Lacto pentosus 01 012 7
Lactoplantarum 1 o test (s) en contra
Taxon siguiente Lacto pentosus 7 test (8) en contra
GLYCEROL (GLY) 75 D-XYLOSE (DXYL) 100 L-RHAMNOSE (RHA) 25 METHYL-D-MANNOSIDE (MOM) 1 MELEZITOSE (MLZ) 25 RAFFINOSE (RAF) 75 D-ARABITOL (DARL) 0
71
~
I i I
ANEXO F - ANALISIS DE REGRESION PARA pH EN BEBIDA SIN AVENA
Aruilisis de regresi6n polinomial
---~-~-------------------------------------------~-----------~~---------------------~--------------Variable dependiente pHSinAvena ---------------------------~-------------~--------------------~---------------------------------
Error T Parametro Estimado Estandar Estadistico P-Valor
CONSTANTE 535606 0094535 56657 00000 Dia -0150565 0020706 727154 00000 Dia2 000504434 0000871488 578819 00001
---~---------------------------------------------------------------------------------------------------
Anfllisis de Variama -------------------------------------------~-----------~-----------------------------~-~--- jSource Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor 11
------------------------~------------------------------------------------------------------------------~ Mod-elo 155772 2 0118861 4256 00000 Residual 0237877 13 00182983
Total (Corr) 11956 IS
R2 == 867522 percent
pHSinAvena == 535606 - 0150565Dia + 000504434Dia2
72
____
middot ANEXO G - ANALISIS DE REGRESION PARA pH EN BEBIDA CON AVENA
AmUisis de regresion polinomial _____~_____~__-_____~___4____________________bull____bull__________bull_____________~~----_------___________
Variable depcndiente pHConA vena ------------------------------------------------------------------------------------------~--------
Error T Parametro Estimado StAndar Estadfstico P-Valor
---------------------------------------------~-----------------------------------------------_---------CONSTANTE 534463 00801045 667208 00000 Dia -0140407 00175453 800253 00000 DiaA 2 000448098 0000738458 606803 00000
----------------------~---~-----------------------------~------------------------------~----AmUisis de Varianza
---~---------------------------------~---------------------~------------~-------------------~------Source Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio PValor --------------------------~-----------------------------------------------~------------~-----~~--~ ModeJo 159575 2 0797873 6073 00000 Residual 02170798 middot13 00131383 _______~_~ ~_~----------~------~--~-----~-M-----~-----____ _____________~-----------------------Total (COlT) 176654 15
R12 903315 percent
-----------~------------------------------------------------------------------------~-----------pHConAvena 534463 - 0140407Dia + 000448098DfaA 2
73
ANEXO H - ANALTSIS DE REGRESTON PARA ACIDEZ EN BEBJDA SIN AVENA
An8Jisis de Regtesi6fi P6lifJomial
Variable Depefidiefile~ AcidezSinAVenll _______________w_____~______~________________~-----------_________~_________________~~____~___~_____
Error T Pariirnetro Estimado Estandar Estadistico ---------------------------------------~--------------~-~-------~--------------------~------------CONSTANT 0491697 00123217 399051 00000 Dia 00436032 000269882 161564 00000 D1a2 -000144613 000011359 127312 00000 __w___~________________________~-_______-_____~----____________________________~__~---~_--__~___
AriiiJisis de varianza ~_~__~__________~_~____~________~___________- _________e_____________________________bull _____-________
Source Smn de cuadr Df Mean Square F-Ratio PmiddotValor_~~___________________________________bull ______~___________bull ____________bull ______~________w________________
Model 0135203 2 00676013 21747 00000 Residual 000404118 13 000031086
Total (Corr) 0139244 15
R2 970978 percent
AcidezSlnAvena 0491697 + O0436032Dia - 0OOl44613Dia2
74
I
ANEXO I ANALISIS DE REGRESION PARA ACIDEZ EN BEBIDA CON AVENA
1
Anwisis de tegtesi6fi polinomial
Variable dependiente Acidez Con Avena
Error T ParametTo Estimado Stlindar Estadfstico P-Valor ----------------~-------~---------------------~-----------------------------------------------------CONSTANT 0491639 000926607 530578 00000 Diamiddot 00406572 000202955 200326 00000 DfaA 2 0000982559 0000085421 -115025 00000
-------------~----------------------------~-------------------------~-----------------------------------
-------------~-----~~-----------------------------~---------------------------------------------_--Source Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio PValor
-~-------------~----------------------------------~------------------~~-------------------------- Modelo 0288008 2 0144004 81914 00000 Residual 000228539 13 0000175799
----------~~--------------~---------------------------------------------~---------------------------Total (Corr) 0290294 15
RA2 = 992127 percent
-------------------------~----~---~------------~---------------------------------~---------------~
AcidezConAvena == 049163amp + 00406572D1a - 0000982559DiaA2
75
I
(Ilmiddot il
ANEXO J- ANALISIS DE REGRESION PARA RECUENTO LACTOBACILOS PARA BEBIDA SIN AVENA
Amilisis de regresion - Modelo lineal Y = a + bX
------------------------~----------------------~-----------------------------~----------~-----------Variable Dcpendiente LactobacilJusSinAvena Variable independiente Dia
I--------~----------~-----------------------------------~-------~-~--~--------------------------~-Error T
Paramctro Estimado Standard Stadistico P-Valor
----~----~------------~-----~-----------------------~-------------~-----------------------------Intereepto 117347 0389973 300911 00000 Pendiente 00483464 00257889 18747 00903
Analisis de Varianza
---------~------------------~----------------~---------------------------------~---------~----------Source Sum decuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor
------------~---------------------~---------------------~--------------------------------~-----~----Modelo 0916252 1 244835 443 00616 Residual 260706 10 0260706
--~------------~---~------------------~~~-----~-------~---------~~-------------------------------------Total (Corr)352332 11
Coeficiente Correlaci6n = 0509955 R2 = 260054 percent
LactobacillusSinAvena= 117347 + 00483464Dfa
76
ANEXO K- ANALTSIS DE REGRESION PARA RECUENTO LACTOBACILOS PARA DEBIDA CON AVENA
Aruilisis de regresion - Modelo lineal Y = a + hX
Variable Dependiente LactobacillusConAvena Variable Independiente Dia ---~--------------------------------------------------------__-----------__--_--_-----------shy
Error T Paramctro Estimado Standard Estadistico P-Valor -~--------------------------------------------------------------------------------------------------
Irttercepto 118103 0567963 207942 00000 Pendiente 00790304 00375594 210414 00616
-----------------~----------------------------~----~-------~----~----------------------------
Analisis de Varianza
----------------~----------------~------------------~--------------------------~------~--------shySource Swn de cuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor
-----------------~--~--------------------------------------------------------------------------~---~ Mode10 244835 1 244835 443 00616 Residual 552997 10 0552997
Total (Corr)797832 11
Coeficiente Correlacion = 0553964 RI2 = 306875 percent
-----~--------------------------------------------------------~--------------------------------------
LactobacillusConAvena = 118103 + 00790304Dfas
77
realizados a los dos tratamlentos se tes aplic6 1a prueba t porque solo difieren
en la presencia 0 ausencia del prebi6tico para evaluar si habra diferencia
estadfsticamente significativa para los dos tratamientbs(Ver Tablas9 12 y 15)
41
3 RESULTADOS Y DISCUSION
31 Coloraci6n de Gram y morfologfa
Las cepas aisladas fesultaron Gram positivas (Ver Figura 6) colonias grandes
cremosas dE) color beige con bordes homogeneos y c6ncavos en su
morfologia (Ver Figura 3) resultando de acuerdo a 10 especificado en Stanley
1989 para Lactobacillus
32 Prueba de esporulaci6n y cataJasa
Los resultados de la pruebas de esporulaci6n y catalasa indicados en las
Tablas 3 y 4 respeclivamente dieron conforme a 10 especificado en Stanley
1989 para Lactobacillus
42
1
2 3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
TABLA 3 Resultado de prueba de esporuJaci6n
CEPA RESULfADO ESPORULACION
-- -------------
43
l i ~II bull ~ I I
TABLA 4 Resultado prueba de la catalasa
CEPA RESULTADO CATALASA
1 -2 -3 -4 -5 -6 -7 8 -9 -10 -11 12 -13 -14 -15 -16
3~3 Prueba para determinar la especie
Oespues de hacer las pruebas para seleccionar las cepas sospechosas de ser
Lactobacillus se realizo las pruebas bioquimicas fograndose identificar
Lactobacillus plantarum aislctdo de pepino repollo y repollitas de bruselas
44
fermentados y Lactobacillus brevis de mucosa vaginal y leche fermentada (Ver
Anexos del A al E y Tabla 5)
TABLA 5 Resultado identlficaci6n cepa~
CEPA NOMBRE
1 Lactobacillus planfarum
3 Lactobacillus plantarum
5 Lactobacillus brevis
13 Lactobacillus brevis
15 Lactobacillus plantarum
34 Pruebas para determinar microorganismos probi6ticos
las cepas de Lactobacillus brevis y Lactobacillus plantarum mostraron
rasistencia al medio acido de pH =2 Y sales biliares 03 pv resultado similar al
encontrado por Jacobsen et al 1999 para Lactobacillus plantarum (Ver tabla 6)
45
middot
~~~ttiI lltlmiddot~COX~dtJ ~xtc_~ 2 tr~ k-JlL~middot
-)~~TO DE lJIBUOTECUl rjRL]OTtCA twn GO1IU1
TABLA 6 Resultados a pruebas de resistencia a pH=2 y sales biliares 03 plv
CEPA RESISTENCIA pH=2 RESISTENCfA A SALES BIUARES ()3 pv
1 + +
2 + +
3 + +
4 + +
5 +
6 + +
7 + +
8 + +
9 + +
10 + +
11 + +
12 + +
13 + +
14 +1shy +M
15 + +
16 + +
+1 crecimiento debil
+ crecimiento abundante
46
Figura 6 Lactobacillus brevis Gram + aislado de leche fermentada
Ai observar en placa las celulas de lactobacilos despues de real1zar las pruebas
de resistenCia a la acidez y sales biliares se observo una tendencia a aglomerarse
posiblemente como un mecanismo de proteccion cOlitra estos medios que pueden
lIegar a ser adversos para elias (Ver figuras 7 y 8)
47
Figura 7 Lactobacillus brevis aislada de leche fermentada despu~s de la prueba de resistencia a pH=2
Figura 8 Lactobacillus brevis aislada de leche fermentada despues de la prueba de resistencie asales biUares 03 plv
fI
48
35 --Seguimiento del-pH-en-la-bebidaJacteacon y sin -prebi6tico
A continuacion se muestran las Tablas 7 y 8 donde sa registian los datos
recopilados de pHdurante 10$ dras Z 7 14 Y21 para las bebidas laaeas con ysin
prebi6tioo
TABLA 1 ResultadopH yogur sin avena
Dia Repetition 1 Repetici6n 2 Repeticion 3 Repetici6n 4
2 526 501 51 52
7 446 433 438 44
14 439 435 437 436
21 439 437 438 437
TABLA 8 -ResultadopHyogur con avena
Dia Repeticion 1 Repeticion2 Repeticion 3 - Repeticion 4
2 509 523 51 515
7 447 442 445 442
14 436 -438 439 437
21 432 433 435 434
Observando la Figura 9podamos ver que el pH en el -dfado$ para los dos
tratamientos as igual y empieza a descender rapidamente para estabilizarse a
partir del dra 7(Ver figura 9)
49
Figura 9 Comparacj6n de medias para -el pH
Comparaci6n de medias para pH
55 ~ 5 +----=gtIIIi-~i~~----=-r--it~ -- pH sin avena
a 45 1--~~~~=~~ 4 --- pH con
avena35 t-----r-- -------=------=--= ------- - ----
2 7 14 21
Dias
Aplicando la prueba t para comparar las medias de pH I S6 muestia una diferencia
altamants significativa en los dos tratamientos para el dia 21 (pltO05)
(Ver tabla 9)
TABLA 9 Compaiaci6n de medias para pH
DtAS SIN AVENA CON AVENA te p (VALOR)
2 514 514 0 10
7 439 444 -1 61 0159
14 437 I
438 -070 0510
21 438 433 528 00019 shy
- DiFERENCIA AlTAMENTE SIGNIFICATIVA
50
I
AI aplicar regrasi6n a los datos sa obtiene al modelo estimado
pHSinAyena =535606 - 01505650Ia +0005044340IaI2
La variabilidad en la respuesta de pH asta siendo explicada en un 8S7522 por
el modelo (Ver Anexo F)
EI tratamiento con avena mostro el siguiente modelo al analisis de ragresi6n
pHConAvena =534463 ~ 0140407Dia + 0004480980Ia2
La variabilidad an la respuesta de pH asta siendo explicada en un 903315 par
el nlodelo(Ver anexo G)
36 Seguimiento de la acidezmiddotmiddot expresada comomiddot de acido
lactico
A continuaci6n sa muestran las Tablas 10 y 11 donde sa registran los datos
tecopilados de acidezmiddotdurante los dias 27 14 Y 21 para las pebidas taetees con y
sin prebi6tico
TABLA 10 Resuttadode acidez (expresadocomo acido tactico) yogurt sin avena
CIA R~petici6n1 Repeticion2 Repetici6n 3 Repeticion 4
2 054 06 057 058
7 072 074 073 0]2
14 080 083 082 082
21 0]4 079 078 077
51
TABLA 11 Resultado de aCidez (expresado como acido Icktico) yogurt con avena
Dia Repetici6n 1 RepetiCi6n 2 Repetici6n 3 Repetici9n 4
2 059 055 058 057
7 071 073 072 072
14 089 087 088 086
21 092 091 090 091
Observando la Figura 10 se puede concluir que la acidez empieza a aumentar
hasta el dia 14 y luego trata de estabilizarse para los dos tratamientos
(Ver figura 10)
Figura 10 Comparaci6n de medias para la acidez
N G)
Comparacion de medias para acidez
1
2 0I 5 -+--=--------=-~~~= u
ltC
- Acidez sin avena
2 7 14
Dias
52
21
-it- Acidez con avena
Aplicando la prueba t para camparar las madias de acidez se muestra una
diferencia altarnante significativa en los dos tratamiantos para los dias 14 y 21
(pltO05)
(Var tabla 12)
TABLA 12Comparaci6n de medias para Acidez
DIASmiddot SIN AVENA CON AVENA te p(VALOR)
2 0572 0572 0 10
7 0727 0720 119 0278
14 0818 0875 -638 000070shy
21 077 091 -1212 i 0000019 shy
DIFERENCIA AL TAMENTE SlGNIFICATIVA
AI aplicar r~gresi6n a los datos se obtiene el modelo estimado
AcidezSlnAIena = 0491897 + O0436032Dia O00144613DfaA2
La variabilidad en la respuesta de acidez asta siendoexplicada en un 970978
por al modelo (Ver anexo H)
EI tratamiento con avena mostro elsiguiente modeloj a1 analisis de regresion
AcidezConAvena = 0491638 + 00406572Oia - OQOO982559OiaA2
La variabilidad enla respuesta acidez esta siendo explicadaen un 99212 por
el modelo (Ver anexo J)
53
I ~
37 Prueba de viabiJidad
A continuaci6n sa muestran las Tab~as 13 y 14 donde sa presentan los datos
recopilados del recuento de Lactobacilos durante los dias 7 14 Y 21 para las
bebidas lacteas con y sin prebi6tico
TABLA 13 Recuento de Lactobacilos (UFCml) yogurt sin avena
Dia Repetici6n 1 Repetici6n 2 Repeticion 3 Reptttici6n 4
7 1880X10l1 1454X1011 1642X1011 1780X10~
14 1560X10~ 646X1011J 1890X10l 140X10l1
21 1200x10lu 128Ox10u 1745x10J 1520x101V
TABLA 14 Recuento de Lactobacilos (UFCml) yogurt con avena
Dfa Repetieion 1 Repetici6n 2 Repeticion 3 Repeticf6n 4
7 1600X10lt 1240X10t 1640X10ll 1980X10t
14 540X1011 427X10n 546X10n 720X10ll
21 500x1011 492x1011 712)(1011 980x10~
AI analizar la Figura 11 sa puede observar un recuento mayor de Lactobacilos
en al tratamiento con avena resultado de acuerdo a 10 encontrado por Alander at
aI 1999 Kontula et aI 1998 y Jaskari et aI 1998
54
Figura 11 Comparaci6n de medias para Log Lactobacillus
Comparacion de medias para log Lactobacillus
~ 1350
-+- Sac Sin--() 13 co avenaIII
bull 125 -- Bac con 0)
0 12 avenaJ
115 7 14 21
Dias
Aplicando la prueba t para comparar las medias de recuento de Lactobacillus no
se encontr6 una diferenc1a estadfsUcamente significative entre los dos
tratamientos (Ver tabla 15)
Este aumento en al racuento influy6 en la disminuci6n del pH y en el aumento de
fa aeidez por la fermentacion que realizan los Lactobacillus sobre fa lactosa de la
lache y la avena adicionada como prebi6tico
55
1
TABLA 15 Comparaci6n medias lag Lactobacillus
DIAS SIN AVENA CON AVENA tc p(VALOR)
7 122257 122022 04846 06451
14 121065 132393 -19602 00977
21 129025 133087 -08236 04416
At aplicar regresion a los datos se obtiane al modelo astimado
LactobacillusSinAvena= 117347 + 004834640Ia
La variabilidad en la respuesta del recuento de LactobaCillus ssta siendo
explicada en un 260054 por el mod$loVar anexo J)
EI tratamiento con avena mostr6 al siguiente modalo al anal isis de regresion
Lactobacillu$ConAvena =118103 + 007903040Ias
La variabilidad en la respuesta de recuento esta siendo explicada en un 3068
por al modelo(Ver anexo K)~
38 Analisi$ microbiol6gicos de las bebidas lacteas con y sin
En la Tabla 16 estan recopilados los resultados microbiol6gieos obtenidos en ras
muestras con los dos tratamientos (con y sin avena)
I [
sa
TABLA 16 Resultados analisis microbiologico
Recuento de mohos y levaduras Iml lt10
Recuento de Staphylococcus coagulase positiva Iml lt100
NMP coliformes fotales y Escherichia coli Iml lt3
Presencia de Salmonella25ml Ausente
Los resultados de este analisis demuestran que las bebidas fermentadas con y
sin avena~ astan fibres de microorganismos patogenos
57
1
4 CONCLUSIONES
Se aislaron cepas nativas de Lactobacillus plantarum de las muestras vegetates
de repollo pepino repollitas de bruselas fermentadas y Lactobacillus brevis de
lache fermentada y mucosa vaginal humana Ambas cepas resistieran un pH=2 y
una concentraci6n de sales biliares det 03 ptv dos earacteristicas importantes
en los probi6ticos
Lamiddot cepa de Lactobacillus brevis aislada de lache Sa utiliz6 para elaborar una
bebida fermentada sin y con avana comoingrediente prebiotico obteniendose un
aJimento centon recuento del probi6tico viable durante 21 dras de seguimiento
ademas libre de microorganismos )at6gen05
No se encontr6 efecta significativo de la avena sobre Ie viabilidad del Lactobacillus
brevis aunque sa presento un aumento en 61 recuento de estos en la bebida con
avena
58
plusmn ~
5 RECOMENDACIONES
Ensayar la cepa de Lactobacillus plantartJm en productos carnicos madurados
como el salami
Ensayar la cepa de Lactobacillus l)revs en otros derivados lecteos como queso
quesito queso crema
Continuar con el estudio de estos microorganismos y caracterizarlos
molecularmente ademas de estudiar su capacidad de adherencja a fa mucosa
intestinal sobre algunes Hneas celulares como las CaCo~2
Estudiarel efedo de la avena sabre la viabiJidad del Lactobacillus breyis a una
concentraci6n mayor de 05
Realizer ensayos can las cepas de Lactobacillus brevis y Lactobrlcillus pJantarum
para elaborar masas acidas para panificacion reemplazando el Bromato de
Potasio aditivo prohibido desde marzo del 2003 en nuestro pais per 5U toxicidad
59
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65
ANEXOS
66
ANEXO A RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AlSLADA DE i
PEPINO it
Referencia Pepino 1 Fecha 06122002
IEXCELENTE IDENTIFICACION
Latto plantarum 1
Galeria API 50 CHL V50 Leida el 06122002
Perfil - -- - ++ - -- - ++++ - - -+- + - I I I I I I I I +t+ - +f- ~ - - + + ~ - - - +- + - shy
o - GLY - ERY DARA - LARA + RIB + DXYL - LXYL - ADO - MDX - GAL + GLU + FRU + MNE + SBE - RHA - DUL - INO bull MAN + SOR - MDM + MUG shyNAG + AMY + ARB + ESC + SAL + CEL + MAL + LAC + MEL + SAC + TRE + 1NU - MLZ + RAF + AMD - GLYG - XLT - GEN + TIJR + LYX - TAG - DFUC shyLFUC - DARL + LARL - aNT + 2KG - 5KG shy
--- Taxones significativos rd -----T -- Tests en contra
Lactoplantarum 1 999 092 1
Taxon siguiente Lactobrevis 1 OJ 044 3
i i
Lactoplantarum 1 1 test (5) en contra
D-SORBITOL (SOR) 78
Tax6n siguiente Lactobrevis 1 3 test (s) ert contra
METHYLD-MANNOSIDE (MOlM) 0 MELEZITOSE (MLZ) 14 D-TURANOSE (TUR) 14
67
ampb
ANEXO B RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AISLADA DE REPOLLO FERMENTADO
~
Referencia Repollo fermentado - 3 Fecha 03072003
EXCELENTE IDENTIFICACION
Lactoplantarum 1
Galena API 50 CRL V50 Leida el 03072003
Perfil - - ++ - - - - -H++ - - ~ + - + - I I 1 I I I I -H+ - ++ - - - + + - -- - - + - shy
o - GLY - ERY - DARA - LARA + RIB + DXYL - LXYL - ADO ~ MDX - GAL + GLU + FRU + MNE + SBE ~ RHA - DUL - INO - MAN + SOR - MDM + MDG shyNAG + AMY + ARR + ESC + SAT + CRL + MAL + LAC + MEL + SAC + TRE + lNU - MLZ + RAF + AMI) - GLYG - XLT - GEN + TOR + LYX - TAG - DFUC shyLFUC - DARL - LARL - GNT + 2KG - 5KG shy
------Taxones significativos _ _----- Id--- ---T---- Tests en contra
Lactoplantarum 1 999 095 1
Tax6n siguiente Lactobrevis 1 01 OA8 3
lJactoplantaru01 1 1 test (s) en contra
DSORBITOL (SOR) 78
Taxon siguiente Lactobrevis
METHYL-D-MANNOSIDE D-TURANOSE
1
(MOM) (TOR)
3 test (5) en contra
0 MELEZITOSE 14
(MLZ) 14
i
I
68
ANEXO C RESULTADO PRUEBAS BIOQUWICAS DE CEPA AISLADA DE MUCOSA HUMANA
Referenda Mucosa - 5 Fecha 27012003
BUENA IDENTlFICACION
Galeria API 50 CHL vso Leida el 270112003
Perfil - - - - +t--t - - - + - + - - - - - - - - -+- - - - - + - + - - - - - - - - - - - - - bull - - -+ - +
o - GLY ~ ERY - DARA bull LARA + RID + DXYL + LXYL - ADO bull MDX - GAL + OLU - FRU + MNE - SBE - IlliA - DUL - INa - MAN - SOR - MDM - MOO shyNAG + AMY - ARB - ESC ~ SAL bull CEL - MAL + lAC - MEL + SAC - TRE shyINU - MLZ - RAF - AMD - GLYG - XLT - GEN - 11JR - LYX - TAG - DFUC shyLFUC - DARL - IARL - ONT + 2KO - 5KG +
- - - - - - Taxones significativos - - - - - - - Id T -- Test en contra
Lactobrevis 3 963 088 1
Taxon siguiente Lactoco11inoides 36 075 2
Lactobrevis 3 1 test (s) en contra
GLUCOSE (GLU) 95
-~~~------------~---------------------------~--~-------~--~-----~----------~--------~------------~~--Taxon siguiente Lactocollinoides 2 test (s) en contra
GLUCOSE (GLU) 100 MELIBIOSE (MEL) 25
69
i r
ANEXO D RESULTADO PRUEBAS BIOQIJiMICAS DE CEPA AISLADA DE LECHE FERMENTADA
Referenda Leche fennentada ~ 13 Fecha 27012003
BUENA IDENTIFICACI6N
Galeria API 50 CHL V50 Leida el 270112003
Perfil - - - - -t-t+- - - - + - + - - - bull - - - - -+- - - - - + - + - - - - - - - - - - - - - - - - -+ - +
0 - GLY - ERY - DARA - LARA +Rll3 + DXYL + LXYL - ADO - MDX ~GAL + GLU - FRU + MNE SBE - RHA DUL bull INO MAN - SOR MDM bull MDG shy
~NAG + AMY - ARB - ESC - SAL - CEL - MAL + LAC - MEL + SAC - TRE I lNU - MLZ - RAF - AMD - GLYG - XLT - OEN - IUR LYX - TAG - DFUC bull i
LFUC - DARL - LARL -ONr + 2KG - SKO + 1
- -- - - Taxones significativos - - Id -- T --- Test en contra
Lacta brevis 3 963 088 1
Taxon siguiente Lactocollinoides 36 075 2
Lactobrevis 3 1 test (s) en contra
GLUCOSE (GLU) 95
-----------------------------------------------------------~------------------------------~-------------------Taxon siguiente Lactocollinoides 2 test (s) en contra
GLUCOSE (GLD) 100 MELffiIOSE (MEL) 25
70
II iJ1
I
I ANEXO E RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AISLADA DE REPOLLITAS DE BRUSELAS FERMENTADA
Referencia repollitas de bruselas 15 Fecha 03072003
EXCELENTE IDENTIFICACION
Lactoplantarum 1
Galeria API 50 CHL vsO Leida el 03072003
Perfil - - - - +t - - - - +H+ - +- - +t + - I I I I I I I f ++t - + - - - -+ + - - - -+ -+ - - I ij
o - GLY - ERY - DARA - LARA + RJB + DXYL - LXYL - ADO - MDX - GAL +
GLU + FRU + MNE + SBE RHA + DUL - INO - MAN + SOR + MDM + MOG shyNAG + AMY + ARB + ESC + SAL + eEL + MAL + LAC + MEl + SAC + TRE + i
I1NU - MLZ + RAF AMD GLYG - XLT - aEN + TUR + LYX - TAG - Druc LFUC - DARt + LARL - aNT + 2KG - 5KG shy n ----Taxones significativos ------ Id Tests en contra
Lactoplantarum 1 999 090 o
Taxon siguiente Lacto pentosus 01 012 7
Lactoplantarum 1 o test (s) en contra
Taxon siguiente Lacto pentosus 7 test (8) en contra
GLYCEROL (GLY) 75 D-XYLOSE (DXYL) 100 L-RHAMNOSE (RHA) 25 METHYL-D-MANNOSIDE (MOM) 1 MELEZITOSE (MLZ) 25 RAFFINOSE (RAF) 75 D-ARABITOL (DARL) 0
71
~
I i I
ANEXO F - ANALISIS DE REGRESION PARA pH EN BEBIDA SIN AVENA
Aruilisis de regresi6n polinomial
---~-~-------------------------------------------~-----------~~---------------------~--------------Variable dependiente pHSinAvena ---------------------------~-------------~--------------------~---------------------------------
Error T Parametro Estimado Estandar Estadistico P-Valor
CONSTANTE 535606 0094535 56657 00000 Dia -0150565 0020706 727154 00000 Dia2 000504434 0000871488 578819 00001
---~---------------------------------------------------------------------------------------------------
Anfllisis de Variama -------------------------------------------~-----------~-----------------------------~-~--- jSource Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor 11
------------------------~------------------------------------------------------------------------------~ Mod-elo 155772 2 0118861 4256 00000 Residual 0237877 13 00182983
Total (Corr) 11956 IS
R2 == 867522 percent
pHSinAvena == 535606 - 0150565Dia + 000504434Dia2
72
____
middot ANEXO G - ANALISIS DE REGRESION PARA pH EN BEBIDA CON AVENA
AmUisis de regresion polinomial _____~_____~__-_____~___4____________________bull____bull__________bull_____________~~----_------___________
Variable depcndiente pHConA vena ------------------------------------------------------------------------------------------~--------
Error T Parametro Estimado StAndar Estadfstico P-Valor
---------------------------------------------~-----------------------------------------------_---------CONSTANTE 534463 00801045 667208 00000 Dia -0140407 00175453 800253 00000 DiaA 2 000448098 0000738458 606803 00000
----------------------~---~-----------------------------~------------------------------~----AmUisis de Varianza
---~---------------------------------~---------------------~------------~-------------------~------Source Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio PValor --------------------------~-----------------------------------------------~------------~-----~~--~ ModeJo 159575 2 0797873 6073 00000 Residual 02170798 middot13 00131383 _______~_~ ~_~----------~------~--~-----~-M-----~-----____ _____________~-----------------------Total (COlT) 176654 15
R12 903315 percent
-----------~------------------------------------------------------------------------~-----------pHConAvena 534463 - 0140407Dia + 000448098DfaA 2
73
ANEXO H - ANALTSIS DE REGRESTON PARA ACIDEZ EN BEBJDA SIN AVENA
An8Jisis de Regtesi6fi P6lifJomial
Variable Depefidiefile~ AcidezSinAVenll _______________w_____~______~________________~-----------_________~_________________~~____~___~_____
Error T Pariirnetro Estimado Estandar Estadistico ---------------------------------------~--------------~-~-------~--------------------~------------CONSTANT 0491697 00123217 399051 00000 Dia 00436032 000269882 161564 00000 D1a2 -000144613 000011359 127312 00000 __w___~________________________~-_______-_____~----____________________________~__~---~_--__~___
AriiiJisis de varianza ~_~__~__________~_~____~________~___________- _________e_____________________________bull _____-________
Source Smn de cuadr Df Mean Square F-Ratio PmiddotValor_~~___________________________________bull ______~___________bull ____________bull ______~________w________________
Model 0135203 2 00676013 21747 00000 Residual 000404118 13 000031086
Total (Corr) 0139244 15
R2 970978 percent
AcidezSlnAvena 0491697 + O0436032Dia - 0OOl44613Dia2
74
I
ANEXO I ANALISIS DE REGRESION PARA ACIDEZ EN BEBIDA CON AVENA
1
Anwisis de tegtesi6fi polinomial
Variable dependiente Acidez Con Avena
Error T ParametTo Estimado Stlindar Estadfstico P-Valor ----------------~-------~---------------------~-----------------------------------------------------CONSTANT 0491639 000926607 530578 00000 Diamiddot 00406572 000202955 200326 00000 DfaA 2 0000982559 0000085421 -115025 00000
-------------~----------------------------~-------------------------~-----------------------------------
-------------~-----~~-----------------------------~---------------------------------------------_--Source Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio PValor
-~-------------~----------------------------------~------------------~~-------------------------- Modelo 0288008 2 0144004 81914 00000 Residual 000228539 13 0000175799
----------~~--------------~---------------------------------------------~---------------------------Total (Corr) 0290294 15
RA2 = 992127 percent
-------------------------~----~---~------------~---------------------------------~---------------~
AcidezConAvena == 049163amp + 00406572D1a - 0000982559DiaA2
75
I
(Ilmiddot il
ANEXO J- ANALISIS DE REGRESION PARA RECUENTO LACTOBACILOS PARA BEBIDA SIN AVENA
Amilisis de regresion - Modelo lineal Y = a + bX
------------------------~----------------------~-----------------------------~----------~-----------Variable Dcpendiente LactobacilJusSinAvena Variable independiente Dia
I--------~----------~-----------------------------------~-------~-~--~--------------------------~-Error T
Paramctro Estimado Standard Stadistico P-Valor
----~----~------------~-----~-----------------------~-------------~-----------------------------Intereepto 117347 0389973 300911 00000 Pendiente 00483464 00257889 18747 00903
Analisis de Varianza
---------~------------------~----------------~---------------------------------~---------~----------Source Sum decuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor
------------~---------------------~---------------------~--------------------------------~-----~----Modelo 0916252 1 244835 443 00616 Residual 260706 10 0260706
--~------------~---~------------------~~~-----~-------~---------~~-------------------------------------Total (Corr)352332 11
Coeficiente Correlaci6n = 0509955 R2 = 260054 percent
LactobacillusSinAvena= 117347 + 00483464Dfa
76
ANEXO K- ANALTSIS DE REGRESION PARA RECUENTO LACTOBACILOS PARA DEBIDA CON AVENA
Aruilisis de regresion - Modelo lineal Y = a + hX
Variable Dependiente LactobacillusConAvena Variable Independiente Dia ---~--------------------------------------------------------__-----------__--_--_-----------shy
Error T Paramctro Estimado Standard Estadistico P-Valor -~--------------------------------------------------------------------------------------------------
Irttercepto 118103 0567963 207942 00000 Pendiente 00790304 00375594 210414 00616
-----------------~----------------------------~----~-------~----~----------------------------
Analisis de Varianza
----------------~----------------~------------------~--------------------------~------~--------shySource Swn de cuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor
-----------------~--~--------------------------------------------------------------------------~---~ Mode10 244835 1 244835 443 00616 Residual 552997 10 0552997
Total (Corr)797832 11
Coeficiente Correlacion = 0553964 RI2 = 306875 percent
-----~--------------------------------------------------------~--------------------------------------
LactobacillusConAvena = 118103 + 00790304Dfas
77
3 RESULTADOS Y DISCUSION
31 Coloraci6n de Gram y morfologfa
Las cepas aisladas fesultaron Gram positivas (Ver Figura 6) colonias grandes
cremosas dE) color beige con bordes homogeneos y c6ncavos en su
morfologia (Ver Figura 3) resultando de acuerdo a 10 especificado en Stanley
1989 para Lactobacillus
32 Prueba de esporulaci6n y cataJasa
Los resultados de la pruebas de esporulaci6n y catalasa indicados en las
Tablas 3 y 4 respeclivamente dieron conforme a 10 especificado en Stanley
1989 para Lactobacillus
42
1
2 3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
TABLA 3 Resultado de prueba de esporuJaci6n
CEPA RESULfADO ESPORULACION
-- -------------
43
l i ~II bull ~ I I
TABLA 4 Resultado prueba de la catalasa
CEPA RESULTADO CATALASA
1 -2 -3 -4 -5 -6 -7 8 -9 -10 -11 12 -13 -14 -15 -16
3~3 Prueba para determinar la especie
Oespues de hacer las pruebas para seleccionar las cepas sospechosas de ser
Lactobacillus se realizo las pruebas bioquimicas fograndose identificar
Lactobacillus plantarum aislctdo de pepino repollo y repollitas de bruselas
44
fermentados y Lactobacillus brevis de mucosa vaginal y leche fermentada (Ver
Anexos del A al E y Tabla 5)
TABLA 5 Resultado identlficaci6n cepa~
CEPA NOMBRE
1 Lactobacillus planfarum
3 Lactobacillus plantarum
5 Lactobacillus brevis
13 Lactobacillus brevis
15 Lactobacillus plantarum
34 Pruebas para determinar microorganismos probi6ticos
las cepas de Lactobacillus brevis y Lactobacillus plantarum mostraron
rasistencia al medio acido de pH =2 Y sales biliares 03 pv resultado similar al
encontrado por Jacobsen et al 1999 para Lactobacillus plantarum (Ver tabla 6)
45
middot
~~~ttiI lltlmiddot~COX~dtJ ~xtc_~ 2 tr~ k-JlL~middot
-)~~TO DE lJIBUOTECUl rjRL]OTtCA twn GO1IU1
TABLA 6 Resultados a pruebas de resistencia a pH=2 y sales biliares 03 plv
CEPA RESISTENCIA pH=2 RESISTENCfA A SALES BIUARES ()3 pv
1 + +
2 + +
3 + +
4 + +
5 +
6 + +
7 + +
8 + +
9 + +
10 + +
11 + +
12 + +
13 + +
14 +1shy +M
15 + +
16 + +
+1 crecimiento debil
+ crecimiento abundante
46
Figura 6 Lactobacillus brevis Gram + aislado de leche fermentada
Ai observar en placa las celulas de lactobacilos despues de real1zar las pruebas
de resistenCia a la acidez y sales biliares se observo una tendencia a aglomerarse
posiblemente como un mecanismo de proteccion cOlitra estos medios que pueden
lIegar a ser adversos para elias (Ver figuras 7 y 8)
47
Figura 7 Lactobacillus brevis aislada de leche fermentada despu~s de la prueba de resistencia a pH=2
Figura 8 Lactobacillus brevis aislada de leche fermentada despues de la prueba de resistencie asales biUares 03 plv
fI
48
35 --Seguimiento del-pH-en-la-bebidaJacteacon y sin -prebi6tico
A continuacion se muestran las Tablas 7 y 8 donde sa registian los datos
recopilados de pHdurante 10$ dras Z 7 14 Y21 para las bebidas laaeas con ysin
prebi6tioo
TABLA 1 ResultadopH yogur sin avena
Dia Repetition 1 Repetici6n 2 Repeticion 3 Repetici6n 4
2 526 501 51 52
7 446 433 438 44
14 439 435 437 436
21 439 437 438 437
TABLA 8 -ResultadopHyogur con avena
Dia Repeticion 1 Repeticion2 Repeticion 3 - Repeticion 4
2 509 523 51 515
7 447 442 445 442
14 436 -438 439 437
21 432 433 435 434
Observando la Figura 9podamos ver que el pH en el -dfado$ para los dos
tratamientos as igual y empieza a descender rapidamente para estabilizarse a
partir del dra 7(Ver figura 9)
49
Figura 9 Comparacj6n de medias para -el pH
Comparaci6n de medias para pH
55 ~ 5 +----=gtIIIi-~i~~----=-r--it~ -- pH sin avena
a 45 1--~~~~=~~ 4 --- pH con
avena35 t-----r-- -------=------=--= ------- - ----
2 7 14 21
Dias
Aplicando la prueba t para comparar las medias de pH I S6 muestia una diferencia
altamants significativa en los dos tratamientos para el dia 21 (pltO05)
(Ver tabla 9)
TABLA 9 Compaiaci6n de medias para pH
DtAS SIN AVENA CON AVENA te p (VALOR)
2 514 514 0 10
7 439 444 -1 61 0159
14 437 I
438 -070 0510
21 438 433 528 00019 shy
- DiFERENCIA AlTAMENTE SIGNIFICATIVA
50
I
AI aplicar regrasi6n a los datos sa obtiene al modelo estimado
pHSinAyena =535606 - 01505650Ia +0005044340IaI2
La variabilidad en la respuesta de pH asta siendo explicada en un 8S7522 por
el modelo (Ver Anexo F)
EI tratamiento con avena mostro el siguiente modelo al analisis de ragresi6n
pHConAvena =534463 ~ 0140407Dia + 0004480980Ia2
La variabilidad an la respuesta de pH asta siendo explicada en un 903315 par
el nlodelo(Ver anexo G)
36 Seguimiento de la acidezmiddotmiddot expresada comomiddot de acido
lactico
A continuaci6n sa muestran las Tablas 10 y 11 donde sa registran los datos
tecopilados de acidezmiddotdurante los dias 27 14 Y 21 para las pebidas taetees con y
sin prebi6tico
TABLA 10 Resuttadode acidez (expresadocomo acido tactico) yogurt sin avena
CIA R~petici6n1 Repeticion2 Repetici6n 3 Repeticion 4
2 054 06 057 058
7 072 074 073 0]2
14 080 083 082 082
21 0]4 079 078 077
51
TABLA 11 Resultado de aCidez (expresado como acido Icktico) yogurt con avena
Dia Repetici6n 1 RepetiCi6n 2 Repetici6n 3 Repetici9n 4
2 059 055 058 057
7 071 073 072 072
14 089 087 088 086
21 092 091 090 091
Observando la Figura 10 se puede concluir que la acidez empieza a aumentar
hasta el dia 14 y luego trata de estabilizarse para los dos tratamientos
(Ver figura 10)
Figura 10 Comparaci6n de medias para la acidez
N G)
Comparacion de medias para acidez
1
2 0I 5 -+--=--------=-~~~= u
ltC
- Acidez sin avena
2 7 14
Dias
52
21
-it- Acidez con avena
Aplicando la prueba t para camparar las madias de acidez se muestra una
diferencia altarnante significativa en los dos tratamiantos para los dias 14 y 21
(pltO05)
(Var tabla 12)
TABLA 12Comparaci6n de medias para Acidez
DIASmiddot SIN AVENA CON AVENA te p(VALOR)
2 0572 0572 0 10
7 0727 0720 119 0278
14 0818 0875 -638 000070shy
21 077 091 -1212 i 0000019 shy
DIFERENCIA AL TAMENTE SlGNIFICATIVA
AI aplicar r~gresi6n a los datos se obtiene el modelo estimado
AcidezSlnAIena = 0491897 + O0436032Dia O00144613DfaA2
La variabilidad en la respuesta de acidez asta siendoexplicada en un 970978
por al modelo (Ver anexo H)
EI tratamiento con avena mostro elsiguiente modeloj a1 analisis de regresion
AcidezConAvena = 0491638 + 00406572Oia - OQOO982559OiaA2
La variabilidad enla respuesta acidez esta siendo explicadaen un 99212 por
el modelo (Ver anexo J)
53
I ~
37 Prueba de viabiJidad
A continuaci6n sa muestran las Tab~as 13 y 14 donde sa presentan los datos
recopilados del recuento de Lactobacilos durante los dias 7 14 Y 21 para las
bebidas lacteas con y sin prebi6tico
TABLA 13 Recuento de Lactobacilos (UFCml) yogurt sin avena
Dia Repetici6n 1 Repetici6n 2 Repeticion 3 Reptttici6n 4
7 1880X10l1 1454X1011 1642X1011 1780X10~
14 1560X10~ 646X1011J 1890X10l 140X10l1
21 1200x10lu 128Ox10u 1745x10J 1520x101V
TABLA 14 Recuento de Lactobacilos (UFCml) yogurt con avena
Dfa Repetieion 1 Repetici6n 2 Repeticion 3 Repeticf6n 4
7 1600X10lt 1240X10t 1640X10ll 1980X10t
14 540X1011 427X10n 546X10n 720X10ll
21 500x1011 492x1011 712)(1011 980x10~
AI analizar la Figura 11 sa puede observar un recuento mayor de Lactobacilos
en al tratamiento con avena resultado de acuerdo a 10 encontrado por Alander at
aI 1999 Kontula et aI 1998 y Jaskari et aI 1998
54
Figura 11 Comparaci6n de medias para Log Lactobacillus
Comparacion de medias para log Lactobacillus
~ 1350
-+- Sac Sin--() 13 co avenaIII
bull 125 -- Bac con 0)
0 12 avenaJ
115 7 14 21
Dias
Aplicando la prueba t para comparar las medias de recuento de Lactobacillus no
se encontr6 una diferenc1a estadfsUcamente significative entre los dos
tratamientos (Ver tabla 15)
Este aumento en al racuento influy6 en la disminuci6n del pH y en el aumento de
fa aeidez por la fermentacion que realizan los Lactobacillus sobre fa lactosa de la
lache y la avena adicionada como prebi6tico
55
1
TABLA 15 Comparaci6n medias lag Lactobacillus
DIAS SIN AVENA CON AVENA tc p(VALOR)
7 122257 122022 04846 06451
14 121065 132393 -19602 00977
21 129025 133087 -08236 04416
At aplicar regresion a los datos se obtiane al modelo astimado
LactobacillusSinAvena= 117347 + 004834640Ia
La variabilidad en la respuesta del recuento de LactobaCillus ssta siendo
explicada en un 260054 por el mod$loVar anexo J)
EI tratamiento con avena mostr6 al siguiente modalo al anal isis de regresion
Lactobacillu$ConAvena =118103 + 007903040Ias
La variabilidad en la respuesta de recuento esta siendo explicada en un 3068
por al modelo(Ver anexo K)~
38 Analisi$ microbiol6gicos de las bebidas lacteas con y sin
En la Tabla 16 estan recopilados los resultados microbiol6gieos obtenidos en ras
muestras con los dos tratamientos (con y sin avena)
I [
sa
TABLA 16 Resultados analisis microbiologico
Recuento de mohos y levaduras Iml lt10
Recuento de Staphylococcus coagulase positiva Iml lt100
NMP coliformes fotales y Escherichia coli Iml lt3
Presencia de Salmonella25ml Ausente
Los resultados de este analisis demuestran que las bebidas fermentadas con y
sin avena~ astan fibres de microorganismos patogenos
57
1
4 CONCLUSIONES
Se aislaron cepas nativas de Lactobacillus plantarum de las muestras vegetates
de repollo pepino repollitas de bruselas fermentadas y Lactobacillus brevis de
lache fermentada y mucosa vaginal humana Ambas cepas resistieran un pH=2 y
una concentraci6n de sales biliares det 03 ptv dos earacteristicas importantes
en los probi6ticos
Lamiddot cepa de Lactobacillus brevis aislada de lache Sa utiliz6 para elaborar una
bebida fermentada sin y con avana comoingrediente prebiotico obteniendose un
aJimento centon recuento del probi6tico viable durante 21 dras de seguimiento
ademas libre de microorganismos )at6gen05
No se encontr6 efecta significativo de la avena sobre Ie viabilidad del Lactobacillus
brevis aunque sa presento un aumento en 61 recuento de estos en la bebida con
avena
58
plusmn ~
5 RECOMENDACIONES
Ensayar la cepa de Lactobacillus plantartJm en productos carnicos madurados
como el salami
Ensayar la cepa de Lactobacillus l)revs en otros derivados lecteos como queso
quesito queso crema
Continuar con el estudio de estos microorganismos y caracterizarlos
molecularmente ademas de estudiar su capacidad de adherencja a fa mucosa
intestinal sobre algunes Hneas celulares como las CaCo~2
Estudiarel efedo de la avena sabre la viabiJidad del Lactobacillus breyis a una
concentraci6n mayor de 05
Realizer ensayos can las cepas de Lactobacillus brevis y Lactobrlcillus pJantarum
para elaborar masas acidas para panificacion reemplazando el Bromato de
Potasio aditivo prohibido desde marzo del 2003 en nuestro pais per 5U toxicidad
59
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65
ANEXOS
66
ANEXO A RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AlSLADA DE i
PEPINO it
Referencia Pepino 1 Fecha 06122002
IEXCELENTE IDENTIFICACION
Latto plantarum 1
Galeria API 50 CHL V50 Leida el 06122002
Perfil - -- - ++ - -- - ++++ - - -+- + - I I I I I I I I +t+ - +f- ~ - - + + ~ - - - +- + - shy
o - GLY - ERY DARA - LARA + RIB + DXYL - LXYL - ADO - MDX - GAL + GLU + FRU + MNE + SBE - RHA - DUL - INO bull MAN + SOR - MDM + MUG shyNAG + AMY + ARB + ESC + SAL + CEL + MAL + LAC + MEL + SAC + TRE + 1NU - MLZ + RAF + AMD - GLYG - XLT - GEN + TIJR + LYX - TAG - DFUC shyLFUC - DARL + LARL - aNT + 2KG - 5KG shy
--- Taxones significativos rd -----T -- Tests en contra
Lactoplantarum 1 999 092 1
Taxon siguiente Lactobrevis 1 OJ 044 3
i i
Lactoplantarum 1 1 test (5) en contra
D-SORBITOL (SOR) 78
Tax6n siguiente Lactobrevis 1 3 test (s) ert contra
METHYLD-MANNOSIDE (MOlM) 0 MELEZITOSE (MLZ) 14 D-TURANOSE (TUR) 14
67
ampb
ANEXO B RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AISLADA DE REPOLLO FERMENTADO
~
Referencia Repollo fermentado - 3 Fecha 03072003
EXCELENTE IDENTIFICACION
Lactoplantarum 1
Galena API 50 CRL V50 Leida el 03072003
Perfil - - ++ - - - - -H++ - - ~ + - + - I I 1 I I I I -H+ - ++ - - - + + - -- - - + - shy
o - GLY - ERY - DARA - LARA + RIB + DXYL - LXYL - ADO ~ MDX - GAL + GLU + FRU + MNE + SBE ~ RHA - DUL - INO - MAN + SOR - MDM + MDG shyNAG + AMY + ARR + ESC + SAT + CRL + MAL + LAC + MEL + SAC + TRE + lNU - MLZ + RAF + AMI) - GLYG - XLT - GEN + TOR + LYX - TAG - DFUC shyLFUC - DARL - LARL - GNT + 2KG - 5KG shy
------Taxones significativos _ _----- Id--- ---T---- Tests en contra
Lactoplantarum 1 999 095 1
Tax6n siguiente Lactobrevis 1 01 OA8 3
lJactoplantaru01 1 1 test (s) en contra
DSORBITOL (SOR) 78
Taxon siguiente Lactobrevis
METHYL-D-MANNOSIDE D-TURANOSE
1
(MOM) (TOR)
3 test (5) en contra
0 MELEZITOSE 14
(MLZ) 14
i
I
68
ANEXO C RESULTADO PRUEBAS BIOQUWICAS DE CEPA AISLADA DE MUCOSA HUMANA
Referenda Mucosa - 5 Fecha 27012003
BUENA IDENTlFICACION
Galeria API 50 CHL vso Leida el 270112003
Perfil - - - - +t--t - - - + - + - - - - - - - - -+- - - - - + - + - - - - - - - - - - - - - bull - - -+ - +
o - GLY ~ ERY - DARA bull LARA + RID + DXYL + LXYL - ADO bull MDX - GAL + OLU - FRU + MNE - SBE - IlliA - DUL - INa - MAN - SOR - MDM - MOO shyNAG + AMY - ARB - ESC ~ SAL bull CEL - MAL + lAC - MEL + SAC - TRE shyINU - MLZ - RAF - AMD - GLYG - XLT - GEN - 11JR - LYX - TAG - DFUC shyLFUC - DARL - IARL - ONT + 2KO - 5KG +
- - - - - - Taxones significativos - - - - - - - Id T -- Test en contra
Lactobrevis 3 963 088 1
Taxon siguiente Lactoco11inoides 36 075 2
Lactobrevis 3 1 test (s) en contra
GLUCOSE (GLU) 95
-~~~------------~---------------------------~--~-------~--~-----~----------~--------~------------~~--Taxon siguiente Lactocollinoides 2 test (s) en contra
GLUCOSE (GLU) 100 MELIBIOSE (MEL) 25
69
i r
ANEXO D RESULTADO PRUEBAS BIOQIJiMICAS DE CEPA AISLADA DE LECHE FERMENTADA
Referenda Leche fennentada ~ 13 Fecha 27012003
BUENA IDENTIFICACI6N
Galeria API 50 CHL V50 Leida el 270112003
Perfil - - - - -t-t+- - - - + - + - - - bull - - - - -+- - - - - + - + - - - - - - - - - - - - - - - - -+ - +
0 - GLY - ERY - DARA - LARA +Rll3 + DXYL + LXYL - ADO - MDX ~GAL + GLU - FRU + MNE SBE - RHA DUL bull INO MAN - SOR MDM bull MDG shy
~NAG + AMY - ARB - ESC - SAL - CEL - MAL + LAC - MEL + SAC - TRE I lNU - MLZ - RAF - AMD - GLYG - XLT - OEN - IUR LYX - TAG - DFUC bull i
LFUC - DARL - LARL -ONr + 2KG - SKO + 1
- -- - - Taxones significativos - - Id -- T --- Test en contra
Lacta brevis 3 963 088 1
Taxon siguiente Lactocollinoides 36 075 2
Lactobrevis 3 1 test (s) en contra
GLUCOSE (GLU) 95
-----------------------------------------------------------~------------------------------~-------------------Taxon siguiente Lactocollinoides 2 test (s) en contra
GLUCOSE (GLD) 100 MELffiIOSE (MEL) 25
70
II iJ1
I
I ANEXO E RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AISLADA DE REPOLLITAS DE BRUSELAS FERMENTADA
Referencia repollitas de bruselas 15 Fecha 03072003
EXCELENTE IDENTIFICACION
Lactoplantarum 1
Galeria API 50 CHL vsO Leida el 03072003
Perfil - - - - +t - - - - +H+ - +- - +t + - I I I I I I I f ++t - + - - - -+ + - - - -+ -+ - - I ij
o - GLY - ERY - DARA - LARA + RJB + DXYL - LXYL - ADO - MDX - GAL +
GLU + FRU + MNE + SBE RHA + DUL - INO - MAN + SOR + MDM + MOG shyNAG + AMY + ARB + ESC + SAL + eEL + MAL + LAC + MEl + SAC + TRE + i
I1NU - MLZ + RAF AMD GLYG - XLT - aEN + TUR + LYX - TAG - Druc LFUC - DARt + LARL - aNT + 2KG - 5KG shy n ----Taxones significativos ------ Id Tests en contra
Lactoplantarum 1 999 090 o
Taxon siguiente Lacto pentosus 01 012 7
Lactoplantarum 1 o test (s) en contra
Taxon siguiente Lacto pentosus 7 test (8) en contra
GLYCEROL (GLY) 75 D-XYLOSE (DXYL) 100 L-RHAMNOSE (RHA) 25 METHYL-D-MANNOSIDE (MOM) 1 MELEZITOSE (MLZ) 25 RAFFINOSE (RAF) 75 D-ARABITOL (DARL) 0
71
~
I i I
ANEXO F - ANALISIS DE REGRESION PARA pH EN BEBIDA SIN AVENA
Aruilisis de regresi6n polinomial
---~-~-------------------------------------------~-----------~~---------------------~--------------Variable dependiente pHSinAvena ---------------------------~-------------~--------------------~---------------------------------
Error T Parametro Estimado Estandar Estadistico P-Valor
CONSTANTE 535606 0094535 56657 00000 Dia -0150565 0020706 727154 00000 Dia2 000504434 0000871488 578819 00001
---~---------------------------------------------------------------------------------------------------
Anfllisis de Variama -------------------------------------------~-----------~-----------------------------~-~--- jSource Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor 11
------------------------~------------------------------------------------------------------------------~ Mod-elo 155772 2 0118861 4256 00000 Residual 0237877 13 00182983
Total (Corr) 11956 IS
R2 == 867522 percent
pHSinAvena == 535606 - 0150565Dia + 000504434Dia2
72
____
middot ANEXO G - ANALISIS DE REGRESION PARA pH EN BEBIDA CON AVENA
AmUisis de regresion polinomial _____~_____~__-_____~___4____________________bull____bull__________bull_____________~~----_------___________
Variable depcndiente pHConA vena ------------------------------------------------------------------------------------------~--------
Error T Parametro Estimado StAndar Estadfstico P-Valor
---------------------------------------------~-----------------------------------------------_---------CONSTANTE 534463 00801045 667208 00000 Dia -0140407 00175453 800253 00000 DiaA 2 000448098 0000738458 606803 00000
----------------------~---~-----------------------------~------------------------------~----AmUisis de Varianza
---~---------------------------------~---------------------~------------~-------------------~------Source Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio PValor --------------------------~-----------------------------------------------~------------~-----~~--~ ModeJo 159575 2 0797873 6073 00000 Residual 02170798 middot13 00131383 _______~_~ ~_~----------~------~--~-----~-M-----~-----____ _____________~-----------------------Total (COlT) 176654 15
R12 903315 percent
-----------~------------------------------------------------------------------------~-----------pHConAvena 534463 - 0140407Dia + 000448098DfaA 2
73
ANEXO H - ANALTSIS DE REGRESTON PARA ACIDEZ EN BEBJDA SIN AVENA
An8Jisis de Regtesi6fi P6lifJomial
Variable Depefidiefile~ AcidezSinAVenll _______________w_____~______~________________~-----------_________~_________________~~____~___~_____
Error T Pariirnetro Estimado Estandar Estadistico ---------------------------------------~--------------~-~-------~--------------------~------------CONSTANT 0491697 00123217 399051 00000 Dia 00436032 000269882 161564 00000 D1a2 -000144613 000011359 127312 00000 __w___~________________________~-_______-_____~----____________________________~__~---~_--__~___
AriiiJisis de varianza ~_~__~__________~_~____~________~___________- _________e_____________________________bull _____-________
Source Smn de cuadr Df Mean Square F-Ratio PmiddotValor_~~___________________________________bull ______~___________bull ____________bull ______~________w________________
Model 0135203 2 00676013 21747 00000 Residual 000404118 13 000031086
Total (Corr) 0139244 15
R2 970978 percent
AcidezSlnAvena 0491697 + O0436032Dia - 0OOl44613Dia2
74
I
ANEXO I ANALISIS DE REGRESION PARA ACIDEZ EN BEBIDA CON AVENA
1
Anwisis de tegtesi6fi polinomial
Variable dependiente Acidez Con Avena
Error T ParametTo Estimado Stlindar Estadfstico P-Valor ----------------~-------~---------------------~-----------------------------------------------------CONSTANT 0491639 000926607 530578 00000 Diamiddot 00406572 000202955 200326 00000 DfaA 2 0000982559 0000085421 -115025 00000
-------------~----------------------------~-------------------------~-----------------------------------
-------------~-----~~-----------------------------~---------------------------------------------_--Source Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio PValor
-~-------------~----------------------------------~------------------~~-------------------------- Modelo 0288008 2 0144004 81914 00000 Residual 000228539 13 0000175799
----------~~--------------~---------------------------------------------~---------------------------Total (Corr) 0290294 15
RA2 = 992127 percent
-------------------------~----~---~------------~---------------------------------~---------------~
AcidezConAvena == 049163amp + 00406572D1a - 0000982559DiaA2
75
I
(Ilmiddot il
ANEXO J- ANALISIS DE REGRESION PARA RECUENTO LACTOBACILOS PARA BEBIDA SIN AVENA
Amilisis de regresion - Modelo lineal Y = a + bX
------------------------~----------------------~-----------------------------~----------~-----------Variable Dcpendiente LactobacilJusSinAvena Variable independiente Dia
I--------~----------~-----------------------------------~-------~-~--~--------------------------~-Error T
Paramctro Estimado Standard Stadistico P-Valor
----~----~------------~-----~-----------------------~-------------~-----------------------------Intereepto 117347 0389973 300911 00000 Pendiente 00483464 00257889 18747 00903
Analisis de Varianza
---------~------------------~----------------~---------------------------------~---------~----------Source Sum decuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor
------------~---------------------~---------------------~--------------------------------~-----~----Modelo 0916252 1 244835 443 00616 Residual 260706 10 0260706
--~------------~---~------------------~~~-----~-------~---------~~-------------------------------------Total (Corr)352332 11
Coeficiente Correlaci6n = 0509955 R2 = 260054 percent
LactobacillusSinAvena= 117347 + 00483464Dfa
76
ANEXO K- ANALTSIS DE REGRESION PARA RECUENTO LACTOBACILOS PARA DEBIDA CON AVENA
Aruilisis de regresion - Modelo lineal Y = a + hX
Variable Dependiente LactobacillusConAvena Variable Independiente Dia ---~--------------------------------------------------------__-----------__--_--_-----------shy
Error T Paramctro Estimado Standard Estadistico P-Valor -~--------------------------------------------------------------------------------------------------
Irttercepto 118103 0567963 207942 00000 Pendiente 00790304 00375594 210414 00616
-----------------~----------------------------~----~-------~----~----------------------------
Analisis de Varianza
----------------~----------------~------------------~--------------------------~------~--------shySource Swn de cuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor
-----------------~--~--------------------------------------------------------------------------~---~ Mode10 244835 1 244835 443 00616 Residual 552997 10 0552997
Total (Corr)797832 11
Coeficiente Correlacion = 0553964 RI2 = 306875 percent
-----~--------------------------------------------------------~--------------------------------------
LactobacillusConAvena = 118103 + 00790304Dfas
77
1
2 3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
TABLA 3 Resultado de prueba de esporuJaci6n
CEPA RESULfADO ESPORULACION
-- -------------
43
l i ~II bull ~ I I
TABLA 4 Resultado prueba de la catalasa
CEPA RESULTADO CATALASA
1 -2 -3 -4 -5 -6 -7 8 -9 -10 -11 12 -13 -14 -15 -16
3~3 Prueba para determinar la especie
Oespues de hacer las pruebas para seleccionar las cepas sospechosas de ser
Lactobacillus se realizo las pruebas bioquimicas fograndose identificar
Lactobacillus plantarum aislctdo de pepino repollo y repollitas de bruselas
44
fermentados y Lactobacillus brevis de mucosa vaginal y leche fermentada (Ver
Anexos del A al E y Tabla 5)
TABLA 5 Resultado identlficaci6n cepa~
CEPA NOMBRE
1 Lactobacillus planfarum
3 Lactobacillus plantarum
5 Lactobacillus brevis
13 Lactobacillus brevis
15 Lactobacillus plantarum
34 Pruebas para determinar microorganismos probi6ticos
las cepas de Lactobacillus brevis y Lactobacillus plantarum mostraron
rasistencia al medio acido de pH =2 Y sales biliares 03 pv resultado similar al
encontrado por Jacobsen et al 1999 para Lactobacillus plantarum (Ver tabla 6)
45
middot
~~~ttiI lltlmiddot~COX~dtJ ~xtc_~ 2 tr~ k-JlL~middot
-)~~TO DE lJIBUOTECUl rjRL]OTtCA twn GO1IU1
TABLA 6 Resultados a pruebas de resistencia a pH=2 y sales biliares 03 plv
CEPA RESISTENCIA pH=2 RESISTENCfA A SALES BIUARES ()3 pv
1 + +
2 + +
3 + +
4 + +
5 +
6 + +
7 + +
8 + +
9 + +
10 + +
11 + +
12 + +
13 + +
14 +1shy +M
15 + +
16 + +
+1 crecimiento debil
+ crecimiento abundante
46
Figura 6 Lactobacillus brevis Gram + aislado de leche fermentada
Ai observar en placa las celulas de lactobacilos despues de real1zar las pruebas
de resistenCia a la acidez y sales biliares se observo una tendencia a aglomerarse
posiblemente como un mecanismo de proteccion cOlitra estos medios que pueden
lIegar a ser adversos para elias (Ver figuras 7 y 8)
47
Figura 7 Lactobacillus brevis aislada de leche fermentada despu~s de la prueba de resistencia a pH=2
Figura 8 Lactobacillus brevis aislada de leche fermentada despues de la prueba de resistencie asales biUares 03 plv
fI
48
35 --Seguimiento del-pH-en-la-bebidaJacteacon y sin -prebi6tico
A continuacion se muestran las Tablas 7 y 8 donde sa registian los datos
recopilados de pHdurante 10$ dras Z 7 14 Y21 para las bebidas laaeas con ysin
prebi6tioo
TABLA 1 ResultadopH yogur sin avena
Dia Repetition 1 Repetici6n 2 Repeticion 3 Repetici6n 4
2 526 501 51 52
7 446 433 438 44
14 439 435 437 436
21 439 437 438 437
TABLA 8 -ResultadopHyogur con avena
Dia Repeticion 1 Repeticion2 Repeticion 3 - Repeticion 4
2 509 523 51 515
7 447 442 445 442
14 436 -438 439 437
21 432 433 435 434
Observando la Figura 9podamos ver que el pH en el -dfado$ para los dos
tratamientos as igual y empieza a descender rapidamente para estabilizarse a
partir del dra 7(Ver figura 9)
49
Figura 9 Comparacj6n de medias para -el pH
Comparaci6n de medias para pH
55 ~ 5 +----=gtIIIi-~i~~----=-r--it~ -- pH sin avena
a 45 1--~~~~=~~ 4 --- pH con
avena35 t-----r-- -------=------=--= ------- - ----
2 7 14 21
Dias
Aplicando la prueba t para comparar las medias de pH I S6 muestia una diferencia
altamants significativa en los dos tratamientos para el dia 21 (pltO05)
(Ver tabla 9)
TABLA 9 Compaiaci6n de medias para pH
DtAS SIN AVENA CON AVENA te p (VALOR)
2 514 514 0 10
7 439 444 -1 61 0159
14 437 I
438 -070 0510
21 438 433 528 00019 shy
- DiFERENCIA AlTAMENTE SIGNIFICATIVA
50
I
AI aplicar regrasi6n a los datos sa obtiene al modelo estimado
pHSinAyena =535606 - 01505650Ia +0005044340IaI2
La variabilidad en la respuesta de pH asta siendo explicada en un 8S7522 por
el modelo (Ver Anexo F)
EI tratamiento con avena mostro el siguiente modelo al analisis de ragresi6n
pHConAvena =534463 ~ 0140407Dia + 0004480980Ia2
La variabilidad an la respuesta de pH asta siendo explicada en un 903315 par
el nlodelo(Ver anexo G)
36 Seguimiento de la acidezmiddotmiddot expresada comomiddot de acido
lactico
A continuaci6n sa muestran las Tablas 10 y 11 donde sa registran los datos
tecopilados de acidezmiddotdurante los dias 27 14 Y 21 para las pebidas taetees con y
sin prebi6tico
TABLA 10 Resuttadode acidez (expresadocomo acido tactico) yogurt sin avena
CIA R~petici6n1 Repeticion2 Repetici6n 3 Repeticion 4
2 054 06 057 058
7 072 074 073 0]2
14 080 083 082 082
21 0]4 079 078 077
51
TABLA 11 Resultado de aCidez (expresado como acido Icktico) yogurt con avena
Dia Repetici6n 1 RepetiCi6n 2 Repetici6n 3 Repetici9n 4
2 059 055 058 057
7 071 073 072 072
14 089 087 088 086
21 092 091 090 091
Observando la Figura 10 se puede concluir que la acidez empieza a aumentar
hasta el dia 14 y luego trata de estabilizarse para los dos tratamientos
(Ver figura 10)
Figura 10 Comparaci6n de medias para la acidez
N G)
Comparacion de medias para acidez
1
2 0I 5 -+--=--------=-~~~= u
ltC
- Acidez sin avena
2 7 14
Dias
52
21
-it- Acidez con avena
Aplicando la prueba t para camparar las madias de acidez se muestra una
diferencia altarnante significativa en los dos tratamiantos para los dias 14 y 21
(pltO05)
(Var tabla 12)
TABLA 12Comparaci6n de medias para Acidez
DIASmiddot SIN AVENA CON AVENA te p(VALOR)
2 0572 0572 0 10
7 0727 0720 119 0278
14 0818 0875 -638 000070shy
21 077 091 -1212 i 0000019 shy
DIFERENCIA AL TAMENTE SlGNIFICATIVA
AI aplicar r~gresi6n a los datos se obtiene el modelo estimado
AcidezSlnAIena = 0491897 + O0436032Dia O00144613DfaA2
La variabilidad en la respuesta de acidez asta siendoexplicada en un 970978
por al modelo (Ver anexo H)
EI tratamiento con avena mostro elsiguiente modeloj a1 analisis de regresion
AcidezConAvena = 0491638 + 00406572Oia - OQOO982559OiaA2
La variabilidad enla respuesta acidez esta siendo explicadaen un 99212 por
el modelo (Ver anexo J)
53
I ~
37 Prueba de viabiJidad
A continuaci6n sa muestran las Tab~as 13 y 14 donde sa presentan los datos
recopilados del recuento de Lactobacilos durante los dias 7 14 Y 21 para las
bebidas lacteas con y sin prebi6tico
TABLA 13 Recuento de Lactobacilos (UFCml) yogurt sin avena
Dia Repetici6n 1 Repetici6n 2 Repeticion 3 Reptttici6n 4
7 1880X10l1 1454X1011 1642X1011 1780X10~
14 1560X10~ 646X1011J 1890X10l 140X10l1
21 1200x10lu 128Ox10u 1745x10J 1520x101V
TABLA 14 Recuento de Lactobacilos (UFCml) yogurt con avena
Dfa Repetieion 1 Repetici6n 2 Repeticion 3 Repeticf6n 4
7 1600X10lt 1240X10t 1640X10ll 1980X10t
14 540X1011 427X10n 546X10n 720X10ll
21 500x1011 492x1011 712)(1011 980x10~
AI analizar la Figura 11 sa puede observar un recuento mayor de Lactobacilos
en al tratamiento con avena resultado de acuerdo a 10 encontrado por Alander at
aI 1999 Kontula et aI 1998 y Jaskari et aI 1998
54
Figura 11 Comparaci6n de medias para Log Lactobacillus
Comparacion de medias para log Lactobacillus
~ 1350
-+- Sac Sin--() 13 co avenaIII
bull 125 -- Bac con 0)
0 12 avenaJ
115 7 14 21
Dias
Aplicando la prueba t para comparar las medias de recuento de Lactobacillus no
se encontr6 una diferenc1a estadfsUcamente significative entre los dos
tratamientos (Ver tabla 15)
Este aumento en al racuento influy6 en la disminuci6n del pH y en el aumento de
fa aeidez por la fermentacion que realizan los Lactobacillus sobre fa lactosa de la
lache y la avena adicionada como prebi6tico
55
1
TABLA 15 Comparaci6n medias lag Lactobacillus
DIAS SIN AVENA CON AVENA tc p(VALOR)
7 122257 122022 04846 06451
14 121065 132393 -19602 00977
21 129025 133087 -08236 04416
At aplicar regresion a los datos se obtiane al modelo astimado
LactobacillusSinAvena= 117347 + 004834640Ia
La variabilidad en la respuesta del recuento de LactobaCillus ssta siendo
explicada en un 260054 por el mod$loVar anexo J)
EI tratamiento con avena mostr6 al siguiente modalo al anal isis de regresion
Lactobacillu$ConAvena =118103 + 007903040Ias
La variabilidad en la respuesta de recuento esta siendo explicada en un 3068
por al modelo(Ver anexo K)~
38 Analisi$ microbiol6gicos de las bebidas lacteas con y sin
En la Tabla 16 estan recopilados los resultados microbiol6gieos obtenidos en ras
muestras con los dos tratamientos (con y sin avena)
I [
sa
TABLA 16 Resultados analisis microbiologico
Recuento de mohos y levaduras Iml lt10
Recuento de Staphylococcus coagulase positiva Iml lt100
NMP coliformes fotales y Escherichia coli Iml lt3
Presencia de Salmonella25ml Ausente
Los resultados de este analisis demuestran que las bebidas fermentadas con y
sin avena~ astan fibres de microorganismos patogenos
57
1
4 CONCLUSIONES
Se aislaron cepas nativas de Lactobacillus plantarum de las muestras vegetates
de repollo pepino repollitas de bruselas fermentadas y Lactobacillus brevis de
lache fermentada y mucosa vaginal humana Ambas cepas resistieran un pH=2 y
una concentraci6n de sales biliares det 03 ptv dos earacteristicas importantes
en los probi6ticos
Lamiddot cepa de Lactobacillus brevis aislada de lache Sa utiliz6 para elaborar una
bebida fermentada sin y con avana comoingrediente prebiotico obteniendose un
aJimento centon recuento del probi6tico viable durante 21 dras de seguimiento
ademas libre de microorganismos )at6gen05
No se encontr6 efecta significativo de la avena sobre Ie viabilidad del Lactobacillus
brevis aunque sa presento un aumento en 61 recuento de estos en la bebida con
avena
58
plusmn ~
5 RECOMENDACIONES
Ensayar la cepa de Lactobacillus plantartJm en productos carnicos madurados
como el salami
Ensayar la cepa de Lactobacillus l)revs en otros derivados lecteos como queso
quesito queso crema
Continuar con el estudio de estos microorganismos y caracterizarlos
molecularmente ademas de estudiar su capacidad de adherencja a fa mucosa
intestinal sobre algunes Hneas celulares como las CaCo~2
Estudiarel efedo de la avena sabre la viabiJidad del Lactobacillus breyis a una
concentraci6n mayor de 05
Realizer ensayos can las cepas de Lactobacillus brevis y Lactobrlcillus pJantarum
para elaborar masas acidas para panificacion reemplazando el Bromato de
Potasio aditivo prohibido desde marzo del 2003 en nuestro pais per 5U toxicidad
59
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65
ANEXOS
66
ANEXO A RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AlSLADA DE i
PEPINO it
Referencia Pepino 1 Fecha 06122002
IEXCELENTE IDENTIFICACION
Latto plantarum 1
Galeria API 50 CHL V50 Leida el 06122002
Perfil - -- - ++ - -- - ++++ - - -+- + - I I I I I I I I +t+ - +f- ~ - - + + ~ - - - +- + - shy
o - GLY - ERY DARA - LARA + RIB + DXYL - LXYL - ADO - MDX - GAL + GLU + FRU + MNE + SBE - RHA - DUL - INO bull MAN + SOR - MDM + MUG shyNAG + AMY + ARB + ESC + SAL + CEL + MAL + LAC + MEL + SAC + TRE + 1NU - MLZ + RAF + AMD - GLYG - XLT - GEN + TIJR + LYX - TAG - DFUC shyLFUC - DARL + LARL - aNT + 2KG - 5KG shy
--- Taxones significativos rd -----T -- Tests en contra
Lactoplantarum 1 999 092 1
Taxon siguiente Lactobrevis 1 OJ 044 3
i i
Lactoplantarum 1 1 test (5) en contra
D-SORBITOL (SOR) 78
Tax6n siguiente Lactobrevis 1 3 test (s) ert contra
METHYLD-MANNOSIDE (MOlM) 0 MELEZITOSE (MLZ) 14 D-TURANOSE (TUR) 14
67
ampb
ANEXO B RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AISLADA DE REPOLLO FERMENTADO
~
Referencia Repollo fermentado - 3 Fecha 03072003
EXCELENTE IDENTIFICACION
Lactoplantarum 1
Galena API 50 CRL V50 Leida el 03072003
Perfil - - ++ - - - - -H++ - - ~ + - + - I I 1 I I I I -H+ - ++ - - - + + - -- - - + - shy
o - GLY - ERY - DARA - LARA + RIB + DXYL - LXYL - ADO ~ MDX - GAL + GLU + FRU + MNE + SBE ~ RHA - DUL - INO - MAN + SOR - MDM + MDG shyNAG + AMY + ARR + ESC + SAT + CRL + MAL + LAC + MEL + SAC + TRE + lNU - MLZ + RAF + AMI) - GLYG - XLT - GEN + TOR + LYX - TAG - DFUC shyLFUC - DARL - LARL - GNT + 2KG - 5KG shy
------Taxones significativos _ _----- Id--- ---T---- Tests en contra
Lactoplantarum 1 999 095 1
Tax6n siguiente Lactobrevis 1 01 OA8 3
lJactoplantaru01 1 1 test (s) en contra
DSORBITOL (SOR) 78
Taxon siguiente Lactobrevis
METHYL-D-MANNOSIDE D-TURANOSE
1
(MOM) (TOR)
3 test (5) en contra
0 MELEZITOSE 14
(MLZ) 14
i
I
68
ANEXO C RESULTADO PRUEBAS BIOQUWICAS DE CEPA AISLADA DE MUCOSA HUMANA
Referenda Mucosa - 5 Fecha 27012003
BUENA IDENTlFICACION
Galeria API 50 CHL vso Leida el 270112003
Perfil - - - - +t--t - - - + - + - - - - - - - - -+- - - - - + - + - - - - - - - - - - - - - bull - - -+ - +
o - GLY ~ ERY - DARA bull LARA + RID + DXYL + LXYL - ADO bull MDX - GAL + OLU - FRU + MNE - SBE - IlliA - DUL - INa - MAN - SOR - MDM - MOO shyNAG + AMY - ARB - ESC ~ SAL bull CEL - MAL + lAC - MEL + SAC - TRE shyINU - MLZ - RAF - AMD - GLYG - XLT - GEN - 11JR - LYX - TAG - DFUC shyLFUC - DARL - IARL - ONT + 2KO - 5KG +
- - - - - - Taxones significativos - - - - - - - Id T -- Test en contra
Lactobrevis 3 963 088 1
Taxon siguiente Lactoco11inoides 36 075 2
Lactobrevis 3 1 test (s) en contra
GLUCOSE (GLU) 95
-~~~------------~---------------------------~--~-------~--~-----~----------~--------~------------~~--Taxon siguiente Lactocollinoides 2 test (s) en contra
GLUCOSE (GLU) 100 MELIBIOSE (MEL) 25
69
i r
ANEXO D RESULTADO PRUEBAS BIOQIJiMICAS DE CEPA AISLADA DE LECHE FERMENTADA
Referenda Leche fennentada ~ 13 Fecha 27012003
BUENA IDENTIFICACI6N
Galeria API 50 CHL V50 Leida el 270112003
Perfil - - - - -t-t+- - - - + - + - - - bull - - - - -+- - - - - + - + - - - - - - - - - - - - - - - - -+ - +
0 - GLY - ERY - DARA - LARA +Rll3 + DXYL + LXYL - ADO - MDX ~GAL + GLU - FRU + MNE SBE - RHA DUL bull INO MAN - SOR MDM bull MDG shy
~NAG + AMY - ARB - ESC - SAL - CEL - MAL + LAC - MEL + SAC - TRE I lNU - MLZ - RAF - AMD - GLYG - XLT - OEN - IUR LYX - TAG - DFUC bull i
LFUC - DARL - LARL -ONr + 2KG - SKO + 1
- -- - - Taxones significativos - - Id -- T --- Test en contra
Lacta brevis 3 963 088 1
Taxon siguiente Lactocollinoides 36 075 2
Lactobrevis 3 1 test (s) en contra
GLUCOSE (GLU) 95
-----------------------------------------------------------~------------------------------~-------------------Taxon siguiente Lactocollinoides 2 test (s) en contra
GLUCOSE (GLD) 100 MELffiIOSE (MEL) 25
70
II iJ1
I
I ANEXO E RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AISLADA DE REPOLLITAS DE BRUSELAS FERMENTADA
Referencia repollitas de bruselas 15 Fecha 03072003
EXCELENTE IDENTIFICACION
Lactoplantarum 1
Galeria API 50 CHL vsO Leida el 03072003
Perfil - - - - +t - - - - +H+ - +- - +t + - I I I I I I I f ++t - + - - - -+ + - - - -+ -+ - - I ij
o - GLY - ERY - DARA - LARA + RJB + DXYL - LXYL - ADO - MDX - GAL +
GLU + FRU + MNE + SBE RHA + DUL - INO - MAN + SOR + MDM + MOG shyNAG + AMY + ARB + ESC + SAL + eEL + MAL + LAC + MEl + SAC + TRE + i
I1NU - MLZ + RAF AMD GLYG - XLT - aEN + TUR + LYX - TAG - Druc LFUC - DARt + LARL - aNT + 2KG - 5KG shy n ----Taxones significativos ------ Id Tests en contra
Lactoplantarum 1 999 090 o
Taxon siguiente Lacto pentosus 01 012 7
Lactoplantarum 1 o test (s) en contra
Taxon siguiente Lacto pentosus 7 test (8) en contra
GLYCEROL (GLY) 75 D-XYLOSE (DXYL) 100 L-RHAMNOSE (RHA) 25 METHYL-D-MANNOSIDE (MOM) 1 MELEZITOSE (MLZ) 25 RAFFINOSE (RAF) 75 D-ARABITOL (DARL) 0
71
~
I i I
ANEXO F - ANALISIS DE REGRESION PARA pH EN BEBIDA SIN AVENA
Aruilisis de regresi6n polinomial
---~-~-------------------------------------------~-----------~~---------------------~--------------Variable dependiente pHSinAvena ---------------------------~-------------~--------------------~---------------------------------
Error T Parametro Estimado Estandar Estadistico P-Valor
CONSTANTE 535606 0094535 56657 00000 Dia -0150565 0020706 727154 00000 Dia2 000504434 0000871488 578819 00001
---~---------------------------------------------------------------------------------------------------
Anfllisis de Variama -------------------------------------------~-----------~-----------------------------~-~--- jSource Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor 11
------------------------~------------------------------------------------------------------------------~ Mod-elo 155772 2 0118861 4256 00000 Residual 0237877 13 00182983
Total (Corr) 11956 IS
R2 == 867522 percent
pHSinAvena == 535606 - 0150565Dia + 000504434Dia2
72
____
middot ANEXO G - ANALISIS DE REGRESION PARA pH EN BEBIDA CON AVENA
AmUisis de regresion polinomial _____~_____~__-_____~___4____________________bull____bull__________bull_____________~~----_------___________
Variable depcndiente pHConA vena ------------------------------------------------------------------------------------------~--------
Error T Parametro Estimado StAndar Estadfstico P-Valor
---------------------------------------------~-----------------------------------------------_---------CONSTANTE 534463 00801045 667208 00000 Dia -0140407 00175453 800253 00000 DiaA 2 000448098 0000738458 606803 00000
----------------------~---~-----------------------------~------------------------------~----AmUisis de Varianza
---~---------------------------------~---------------------~------------~-------------------~------Source Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio PValor --------------------------~-----------------------------------------------~------------~-----~~--~ ModeJo 159575 2 0797873 6073 00000 Residual 02170798 middot13 00131383 _______~_~ ~_~----------~------~--~-----~-M-----~-----____ _____________~-----------------------Total (COlT) 176654 15
R12 903315 percent
-----------~------------------------------------------------------------------------~-----------pHConAvena 534463 - 0140407Dia + 000448098DfaA 2
73
ANEXO H - ANALTSIS DE REGRESTON PARA ACIDEZ EN BEBJDA SIN AVENA
An8Jisis de Regtesi6fi P6lifJomial
Variable Depefidiefile~ AcidezSinAVenll _______________w_____~______~________________~-----------_________~_________________~~____~___~_____
Error T Pariirnetro Estimado Estandar Estadistico ---------------------------------------~--------------~-~-------~--------------------~------------CONSTANT 0491697 00123217 399051 00000 Dia 00436032 000269882 161564 00000 D1a2 -000144613 000011359 127312 00000 __w___~________________________~-_______-_____~----____________________________~__~---~_--__~___
AriiiJisis de varianza ~_~__~__________~_~____~________~___________- _________e_____________________________bull _____-________
Source Smn de cuadr Df Mean Square F-Ratio PmiddotValor_~~___________________________________bull ______~___________bull ____________bull ______~________w________________
Model 0135203 2 00676013 21747 00000 Residual 000404118 13 000031086
Total (Corr) 0139244 15
R2 970978 percent
AcidezSlnAvena 0491697 + O0436032Dia - 0OOl44613Dia2
74
I
ANEXO I ANALISIS DE REGRESION PARA ACIDEZ EN BEBIDA CON AVENA
1
Anwisis de tegtesi6fi polinomial
Variable dependiente Acidez Con Avena
Error T ParametTo Estimado Stlindar Estadfstico P-Valor ----------------~-------~---------------------~-----------------------------------------------------CONSTANT 0491639 000926607 530578 00000 Diamiddot 00406572 000202955 200326 00000 DfaA 2 0000982559 0000085421 -115025 00000
-------------~----------------------------~-------------------------~-----------------------------------
-------------~-----~~-----------------------------~---------------------------------------------_--Source Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio PValor
-~-------------~----------------------------------~------------------~~-------------------------- Modelo 0288008 2 0144004 81914 00000 Residual 000228539 13 0000175799
----------~~--------------~---------------------------------------------~---------------------------Total (Corr) 0290294 15
RA2 = 992127 percent
-------------------------~----~---~------------~---------------------------------~---------------~
AcidezConAvena == 049163amp + 00406572D1a - 0000982559DiaA2
75
I
(Ilmiddot il
ANEXO J- ANALISIS DE REGRESION PARA RECUENTO LACTOBACILOS PARA BEBIDA SIN AVENA
Amilisis de regresion - Modelo lineal Y = a + bX
------------------------~----------------------~-----------------------------~----------~-----------Variable Dcpendiente LactobacilJusSinAvena Variable independiente Dia
I--------~----------~-----------------------------------~-------~-~--~--------------------------~-Error T
Paramctro Estimado Standard Stadistico P-Valor
----~----~------------~-----~-----------------------~-------------~-----------------------------Intereepto 117347 0389973 300911 00000 Pendiente 00483464 00257889 18747 00903
Analisis de Varianza
---------~------------------~----------------~---------------------------------~---------~----------Source Sum decuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor
------------~---------------------~---------------------~--------------------------------~-----~----Modelo 0916252 1 244835 443 00616 Residual 260706 10 0260706
--~------------~---~------------------~~~-----~-------~---------~~-------------------------------------Total (Corr)352332 11
Coeficiente Correlaci6n = 0509955 R2 = 260054 percent
LactobacillusSinAvena= 117347 + 00483464Dfa
76
ANEXO K- ANALTSIS DE REGRESION PARA RECUENTO LACTOBACILOS PARA DEBIDA CON AVENA
Aruilisis de regresion - Modelo lineal Y = a + hX
Variable Dependiente LactobacillusConAvena Variable Independiente Dia ---~--------------------------------------------------------__-----------__--_--_-----------shy
Error T Paramctro Estimado Standard Estadistico P-Valor -~--------------------------------------------------------------------------------------------------
Irttercepto 118103 0567963 207942 00000 Pendiente 00790304 00375594 210414 00616
-----------------~----------------------------~----~-------~----~----------------------------
Analisis de Varianza
----------------~----------------~------------------~--------------------------~------~--------shySource Swn de cuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor
-----------------~--~--------------------------------------------------------------------------~---~ Mode10 244835 1 244835 443 00616 Residual 552997 10 0552997
Total (Corr)797832 11
Coeficiente Correlacion = 0553964 RI2 = 306875 percent
-----~--------------------------------------------------------~--------------------------------------
LactobacillusConAvena = 118103 + 00790304Dfas
77
l i ~II bull ~ I I
TABLA 4 Resultado prueba de la catalasa
CEPA RESULTADO CATALASA
1 -2 -3 -4 -5 -6 -7 8 -9 -10 -11 12 -13 -14 -15 -16
3~3 Prueba para determinar la especie
Oespues de hacer las pruebas para seleccionar las cepas sospechosas de ser
Lactobacillus se realizo las pruebas bioquimicas fograndose identificar
Lactobacillus plantarum aislctdo de pepino repollo y repollitas de bruselas
44
fermentados y Lactobacillus brevis de mucosa vaginal y leche fermentada (Ver
Anexos del A al E y Tabla 5)
TABLA 5 Resultado identlficaci6n cepa~
CEPA NOMBRE
1 Lactobacillus planfarum
3 Lactobacillus plantarum
5 Lactobacillus brevis
13 Lactobacillus brevis
15 Lactobacillus plantarum
34 Pruebas para determinar microorganismos probi6ticos
las cepas de Lactobacillus brevis y Lactobacillus plantarum mostraron
rasistencia al medio acido de pH =2 Y sales biliares 03 pv resultado similar al
encontrado por Jacobsen et al 1999 para Lactobacillus plantarum (Ver tabla 6)
45
middot
~~~ttiI lltlmiddot~COX~dtJ ~xtc_~ 2 tr~ k-JlL~middot
-)~~TO DE lJIBUOTECUl rjRL]OTtCA twn GO1IU1
TABLA 6 Resultados a pruebas de resistencia a pH=2 y sales biliares 03 plv
CEPA RESISTENCIA pH=2 RESISTENCfA A SALES BIUARES ()3 pv
1 + +
2 + +
3 + +
4 + +
5 +
6 + +
7 + +
8 + +
9 + +
10 + +
11 + +
12 + +
13 + +
14 +1shy +M
15 + +
16 + +
+1 crecimiento debil
+ crecimiento abundante
46
Figura 6 Lactobacillus brevis Gram + aislado de leche fermentada
Ai observar en placa las celulas de lactobacilos despues de real1zar las pruebas
de resistenCia a la acidez y sales biliares se observo una tendencia a aglomerarse
posiblemente como un mecanismo de proteccion cOlitra estos medios que pueden
lIegar a ser adversos para elias (Ver figuras 7 y 8)
47
Figura 7 Lactobacillus brevis aislada de leche fermentada despu~s de la prueba de resistencia a pH=2
Figura 8 Lactobacillus brevis aislada de leche fermentada despues de la prueba de resistencie asales biUares 03 plv
fI
48
35 --Seguimiento del-pH-en-la-bebidaJacteacon y sin -prebi6tico
A continuacion se muestran las Tablas 7 y 8 donde sa registian los datos
recopilados de pHdurante 10$ dras Z 7 14 Y21 para las bebidas laaeas con ysin
prebi6tioo
TABLA 1 ResultadopH yogur sin avena
Dia Repetition 1 Repetici6n 2 Repeticion 3 Repetici6n 4
2 526 501 51 52
7 446 433 438 44
14 439 435 437 436
21 439 437 438 437
TABLA 8 -ResultadopHyogur con avena
Dia Repeticion 1 Repeticion2 Repeticion 3 - Repeticion 4
2 509 523 51 515
7 447 442 445 442
14 436 -438 439 437
21 432 433 435 434
Observando la Figura 9podamos ver que el pH en el -dfado$ para los dos
tratamientos as igual y empieza a descender rapidamente para estabilizarse a
partir del dra 7(Ver figura 9)
49
Figura 9 Comparacj6n de medias para -el pH
Comparaci6n de medias para pH
55 ~ 5 +----=gtIIIi-~i~~----=-r--it~ -- pH sin avena
a 45 1--~~~~=~~ 4 --- pH con
avena35 t-----r-- -------=------=--= ------- - ----
2 7 14 21
Dias
Aplicando la prueba t para comparar las medias de pH I S6 muestia una diferencia
altamants significativa en los dos tratamientos para el dia 21 (pltO05)
(Ver tabla 9)
TABLA 9 Compaiaci6n de medias para pH
DtAS SIN AVENA CON AVENA te p (VALOR)
2 514 514 0 10
7 439 444 -1 61 0159
14 437 I
438 -070 0510
21 438 433 528 00019 shy
- DiFERENCIA AlTAMENTE SIGNIFICATIVA
50
I
AI aplicar regrasi6n a los datos sa obtiene al modelo estimado
pHSinAyena =535606 - 01505650Ia +0005044340IaI2
La variabilidad en la respuesta de pH asta siendo explicada en un 8S7522 por
el modelo (Ver Anexo F)
EI tratamiento con avena mostro el siguiente modelo al analisis de ragresi6n
pHConAvena =534463 ~ 0140407Dia + 0004480980Ia2
La variabilidad an la respuesta de pH asta siendo explicada en un 903315 par
el nlodelo(Ver anexo G)
36 Seguimiento de la acidezmiddotmiddot expresada comomiddot de acido
lactico
A continuaci6n sa muestran las Tablas 10 y 11 donde sa registran los datos
tecopilados de acidezmiddotdurante los dias 27 14 Y 21 para las pebidas taetees con y
sin prebi6tico
TABLA 10 Resuttadode acidez (expresadocomo acido tactico) yogurt sin avena
CIA R~petici6n1 Repeticion2 Repetici6n 3 Repeticion 4
2 054 06 057 058
7 072 074 073 0]2
14 080 083 082 082
21 0]4 079 078 077
51
TABLA 11 Resultado de aCidez (expresado como acido Icktico) yogurt con avena
Dia Repetici6n 1 RepetiCi6n 2 Repetici6n 3 Repetici9n 4
2 059 055 058 057
7 071 073 072 072
14 089 087 088 086
21 092 091 090 091
Observando la Figura 10 se puede concluir que la acidez empieza a aumentar
hasta el dia 14 y luego trata de estabilizarse para los dos tratamientos
(Ver figura 10)
Figura 10 Comparaci6n de medias para la acidez
N G)
Comparacion de medias para acidez
1
2 0I 5 -+--=--------=-~~~= u
ltC
- Acidez sin avena
2 7 14
Dias
52
21
-it- Acidez con avena
Aplicando la prueba t para camparar las madias de acidez se muestra una
diferencia altarnante significativa en los dos tratamiantos para los dias 14 y 21
(pltO05)
(Var tabla 12)
TABLA 12Comparaci6n de medias para Acidez
DIASmiddot SIN AVENA CON AVENA te p(VALOR)
2 0572 0572 0 10
7 0727 0720 119 0278
14 0818 0875 -638 000070shy
21 077 091 -1212 i 0000019 shy
DIFERENCIA AL TAMENTE SlGNIFICATIVA
AI aplicar r~gresi6n a los datos se obtiene el modelo estimado
AcidezSlnAIena = 0491897 + O0436032Dia O00144613DfaA2
La variabilidad en la respuesta de acidez asta siendoexplicada en un 970978
por al modelo (Ver anexo H)
EI tratamiento con avena mostro elsiguiente modeloj a1 analisis de regresion
AcidezConAvena = 0491638 + 00406572Oia - OQOO982559OiaA2
La variabilidad enla respuesta acidez esta siendo explicadaen un 99212 por
el modelo (Ver anexo J)
53
I ~
37 Prueba de viabiJidad
A continuaci6n sa muestran las Tab~as 13 y 14 donde sa presentan los datos
recopilados del recuento de Lactobacilos durante los dias 7 14 Y 21 para las
bebidas lacteas con y sin prebi6tico
TABLA 13 Recuento de Lactobacilos (UFCml) yogurt sin avena
Dia Repetici6n 1 Repetici6n 2 Repeticion 3 Reptttici6n 4
7 1880X10l1 1454X1011 1642X1011 1780X10~
14 1560X10~ 646X1011J 1890X10l 140X10l1
21 1200x10lu 128Ox10u 1745x10J 1520x101V
TABLA 14 Recuento de Lactobacilos (UFCml) yogurt con avena
Dfa Repetieion 1 Repetici6n 2 Repeticion 3 Repeticf6n 4
7 1600X10lt 1240X10t 1640X10ll 1980X10t
14 540X1011 427X10n 546X10n 720X10ll
21 500x1011 492x1011 712)(1011 980x10~
AI analizar la Figura 11 sa puede observar un recuento mayor de Lactobacilos
en al tratamiento con avena resultado de acuerdo a 10 encontrado por Alander at
aI 1999 Kontula et aI 1998 y Jaskari et aI 1998
54
Figura 11 Comparaci6n de medias para Log Lactobacillus
Comparacion de medias para log Lactobacillus
~ 1350
-+- Sac Sin--() 13 co avenaIII
bull 125 -- Bac con 0)
0 12 avenaJ
115 7 14 21
Dias
Aplicando la prueba t para comparar las medias de recuento de Lactobacillus no
se encontr6 una diferenc1a estadfsUcamente significative entre los dos
tratamientos (Ver tabla 15)
Este aumento en al racuento influy6 en la disminuci6n del pH y en el aumento de
fa aeidez por la fermentacion que realizan los Lactobacillus sobre fa lactosa de la
lache y la avena adicionada como prebi6tico
55
1
TABLA 15 Comparaci6n medias lag Lactobacillus
DIAS SIN AVENA CON AVENA tc p(VALOR)
7 122257 122022 04846 06451
14 121065 132393 -19602 00977
21 129025 133087 -08236 04416
At aplicar regresion a los datos se obtiane al modelo astimado
LactobacillusSinAvena= 117347 + 004834640Ia
La variabilidad en la respuesta del recuento de LactobaCillus ssta siendo
explicada en un 260054 por el mod$loVar anexo J)
EI tratamiento con avena mostr6 al siguiente modalo al anal isis de regresion
Lactobacillu$ConAvena =118103 + 007903040Ias
La variabilidad en la respuesta de recuento esta siendo explicada en un 3068
por al modelo(Ver anexo K)~
38 Analisi$ microbiol6gicos de las bebidas lacteas con y sin
En la Tabla 16 estan recopilados los resultados microbiol6gieos obtenidos en ras
muestras con los dos tratamientos (con y sin avena)
I [
sa
TABLA 16 Resultados analisis microbiologico
Recuento de mohos y levaduras Iml lt10
Recuento de Staphylococcus coagulase positiva Iml lt100
NMP coliformes fotales y Escherichia coli Iml lt3
Presencia de Salmonella25ml Ausente
Los resultados de este analisis demuestran que las bebidas fermentadas con y
sin avena~ astan fibres de microorganismos patogenos
57
1
4 CONCLUSIONES
Se aislaron cepas nativas de Lactobacillus plantarum de las muestras vegetates
de repollo pepino repollitas de bruselas fermentadas y Lactobacillus brevis de
lache fermentada y mucosa vaginal humana Ambas cepas resistieran un pH=2 y
una concentraci6n de sales biliares det 03 ptv dos earacteristicas importantes
en los probi6ticos
Lamiddot cepa de Lactobacillus brevis aislada de lache Sa utiliz6 para elaborar una
bebida fermentada sin y con avana comoingrediente prebiotico obteniendose un
aJimento centon recuento del probi6tico viable durante 21 dras de seguimiento
ademas libre de microorganismos )at6gen05
No se encontr6 efecta significativo de la avena sobre Ie viabilidad del Lactobacillus
brevis aunque sa presento un aumento en 61 recuento de estos en la bebida con
avena
58
plusmn ~
5 RECOMENDACIONES
Ensayar la cepa de Lactobacillus plantartJm en productos carnicos madurados
como el salami
Ensayar la cepa de Lactobacillus l)revs en otros derivados lecteos como queso
quesito queso crema
Continuar con el estudio de estos microorganismos y caracterizarlos
molecularmente ademas de estudiar su capacidad de adherencja a fa mucosa
intestinal sobre algunes Hneas celulares como las CaCo~2
Estudiarel efedo de la avena sabre la viabiJidad del Lactobacillus breyis a una
concentraci6n mayor de 05
Realizer ensayos can las cepas de Lactobacillus brevis y Lactobrlcillus pJantarum
para elaborar masas acidas para panificacion reemplazando el Bromato de
Potasio aditivo prohibido desde marzo del 2003 en nuestro pais per 5U toxicidad
59
REFERENCfAS BIBUOGRAFICAS
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ANEXOS
66
ANEXO A RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AlSLADA DE i
PEPINO it
Referencia Pepino 1 Fecha 06122002
IEXCELENTE IDENTIFICACION
Latto plantarum 1
Galeria API 50 CHL V50 Leida el 06122002
Perfil - -- - ++ - -- - ++++ - - -+- + - I I I I I I I I +t+ - +f- ~ - - + + ~ - - - +- + - shy
o - GLY - ERY DARA - LARA + RIB + DXYL - LXYL - ADO - MDX - GAL + GLU + FRU + MNE + SBE - RHA - DUL - INO bull MAN + SOR - MDM + MUG shyNAG + AMY + ARB + ESC + SAL + CEL + MAL + LAC + MEL + SAC + TRE + 1NU - MLZ + RAF + AMD - GLYG - XLT - GEN + TIJR + LYX - TAG - DFUC shyLFUC - DARL + LARL - aNT + 2KG - 5KG shy
--- Taxones significativos rd -----T -- Tests en contra
Lactoplantarum 1 999 092 1
Taxon siguiente Lactobrevis 1 OJ 044 3
i i
Lactoplantarum 1 1 test (5) en contra
D-SORBITOL (SOR) 78
Tax6n siguiente Lactobrevis 1 3 test (s) ert contra
METHYLD-MANNOSIDE (MOlM) 0 MELEZITOSE (MLZ) 14 D-TURANOSE (TUR) 14
67
ampb
ANEXO B RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AISLADA DE REPOLLO FERMENTADO
~
Referencia Repollo fermentado - 3 Fecha 03072003
EXCELENTE IDENTIFICACION
Lactoplantarum 1
Galena API 50 CRL V50 Leida el 03072003
Perfil - - ++ - - - - -H++ - - ~ + - + - I I 1 I I I I -H+ - ++ - - - + + - -- - - + - shy
o - GLY - ERY - DARA - LARA + RIB + DXYL - LXYL - ADO ~ MDX - GAL + GLU + FRU + MNE + SBE ~ RHA - DUL - INO - MAN + SOR - MDM + MDG shyNAG + AMY + ARR + ESC + SAT + CRL + MAL + LAC + MEL + SAC + TRE + lNU - MLZ + RAF + AMI) - GLYG - XLT - GEN + TOR + LYX - TAG - DFUC shyLFUC - DARL - LARL - GNT + 2KG - 5KG shy
------Taxones significativos _ _----- Id--- ---T---- Tests en contra
Lactoplantarum 1 999 095 1
Tax6n siguiente Lactobrevis 1 01 OA8 3
lJactoplantaru01 1 1 test (s) en contra
DSORBITOL (SOR) 78
Taxon siguiente Lactobrevis
METHYL-D-MANNOSIDE D-TURANOSE
1
(MOM) (TOR)
3 test (5) en contra
0 MELEZITOSE 14
(MLZ) 14
i
I
68
ANEXO C RESULTADO PRUEBAS BIOQUWICAS DE CEPA AISLADA DE MUCOSA HUMANA
Referenda Mucosa - 5 Fecha 27012003
BUENA IDENTlFICACION
Galeria API 50 CHL vso Leida el 270112003
Perfil - - - - +t--t - - - + - + - - - - - - - - -+- - - - - + - + - - - - - - - - - - - - - bull - - -+ - +
o - GLY ~ ERY - DARA bull LARA + RID + DXYL + LXYL - ADO bull MDX - GAL + OLU - FRU + MNE - SBE - IlliA - DUL - INa - MAN - SOR - MDM - MOO shyNAG + AMY - ARB - ESC ~ SAL bull CEL - MAL + lAC - MEL + SAC - TRE shyINU - MLZ - RAF - AMD - GLYG - XLT - GEN - 11JR - LYX - TAG - DFUC shyLFUC - DARL - IARL - ONT + 2KO - 5KG +
- - - - - - Taxones significativos - - - - - - - Id T -- Test en contra
Lactobrevis 3 963 088 1
Taxon siguiente Lactoco11inoides 36 075 2
Lactobrevis 3 1 test (s) en contra
GLUCOSE (GLU) 95
-~~~------------~---------------------------~--~-------~--~-----~----------~--------~------------~~--Taxon siguiente Lactocollinoides 2 test (s) en contra
GLUCOSE (GLU) 100 MELIBIOSE (MEL) 25
69
i r
ANEXO D RESULTADO PRUEBAS BIOQIJiMICAS DE CEPA AISLADA DE LECHE FERMENTADA
Referenda Leche fennentada ~ 13 Fecha 27012003
BUENA IDENTIFICACI6N
Galeria API 50 CHL V50 Leida el 270112003
Perfil - - - - -t-t+- - - - + - + - - - bull - - - - -+- - - - - + - + - - - - - - - - - - - - - - - - -+ - +
0 - GLY - ERY - DARA - LARA +Rll3 + DXYL + LXYL - ADO - MDX ~GAL + GLU - FRU + MNE SBE - RHA DUL bull INO MAN - SOR MDM bull MDG shy
~NAG + AMY - ARB - ESC - SAL - CEL - MAL + LAC - MEL + SAC - TRE I lNU - MLZ - RAF - AMD - GLYG - XLT - OEN - IUR LYX - TAG - DFUC bull i
LFUC - DARL - LARL -ONr + 2KG - SKO + 1
- -- - - Taxones significativos - - Id -- T --- Test en contra
Lacta brevis 3 963 088 1
Taxon siguiente Lactocollinoides 36 075 2
Lactobrevis 3 1 test (s) en contra
GLUCOSE (GLU) 95
-----------------------------------------------------------~------------------------------~-------------------Taxon siguiente Lactocollinoides 2 test (s) en contra
GLUCOSE (GLD) 100 MELffiIOSE (MEL) 25
70
II iJ1
I
I ANEXO E RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AISLADA DE REPOLLITAS DE BRUSELAS FERMENTADA
Referencia repollitas de bruselas 15 Fecha 03072003
EXCELENTE IDENTIFICACION
Lactoplantarum 1
Galeria API 50 CHL vsO Leida el 03072003
Perfil - - - - +t - - - - +H+ - +- - +t + - I I I I I I I f ++t - + - - - -+ + - - - -+ -+ - - I ij
o - GLY - ERY - DARA - LARA + RJB + DXYL - LXYL - ADO - MDX - GAL +
GLU + FRU + MNE + SBE RHA + DUL - INO - MAN + SOR + MDM + MOG shyNAG + AMY + ARB + ESC + SAL + eEL + MAL + LAC + MEl + SAC + TRE + i
I1NU - MLZ + RAF AMD GLYG - XLT - aEN + TUR + LYX - TAG - Druc LFUC - DARt + LARL - aNT + 2KG - 5KG shy n ----Taxones significativos ------ Id Tests en contra
Lactoplantarum 1 999 090 o
Taxon siguiente Lacto pentosus 01 012 7
Lactoplantarum 1 o test (s) en contra
Taxon siguiente Lacto pentosus 7 test (8) en contra
GLYCEROL (GLY) 75 D-XYLOSE (DXYL) 100 L-RHAMNOSE (RHA) 25 METHYL-D-MANNOSIDE (MOM) 1 MELEZITOSE (MLZ) 25 RAFFINOSE (RAF) 75 D-ARABITOL (DARL) 0
71
~
I i I
ANEXO F - ANALISIS DE REGRESION PARA pH EN BEBIDA SIN AVENA
Aruilisis de regresi6n polinomial
---~-~-------------------------------------------~-----------~~---------------------~--------------Variable dependiente pHSinAvena ---------------------------~-------------~--------------------~---------------------------------
Error T Parametro Estimado Estandar Estadistico P-Valor
CONSTANTE 535606 0094535 56657 00000 Dia -0150565 0020706 727154 00000 Dia2 000504434 0000871488 578819 00001
---~---------------------------------------------------------------------------------------------------
Anfllisis de Variama -------------------------------------------~-----------~-----------------------------~-~--- jSource Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor 11
------------------------~------------------------------------------------------------------------------~ Mod-elo 155772 2 0118861 4256 00000 Residual 0237877 13 00182983
Total (Corr) 11956 IS
R2 == 867522 percent
pHSinAvena == 535606 - 0150565Dia + 000504434Dia2
72
____
middot ANEXO G - ANALISIS DE REGRESION PARA pH EN BEBIDA CON AVENA
AmUisis de regresion polinomial _____~_____~__-_____~___4____________________bull____bull__________bull_____________~~----_------___________
Variable depcndiente pHConA vena ------------------------------------------------------------------------------------------~--------
Error T Parametro Estimado StAndar Estadfstico P-Valor
---------------------------------------------~-----------------------------------------------_---------CONSTANTE 534463 00801045 667208 00000 Dia -0140407 00175453 800253 00000 DiaA 2 000448098 0000738458 606803 00000
----------------------~---~-----------------------------~------------------------------~----AmUisis de Varianza
---~---------------------------------~---------------------~------------~-------------------~------Source Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio PValor --------------------------~-----------------------------------------------~------------~-----~~--~ ModeJo 159575 2 0797873 6073 00000 Residual 02170798 middot13 00131383 _______~_~ ~_~----------~------~--~-----~-M-----~-----____ _____________~-----------------------Total (COlT) 176654 15
R12 903315 percent
-----------~------------------------------------------------------------------------~-----------pHConAvena 534463 - 0140407Dia + 000448098DfaA 2
73
ANEXO H - ANALTSIS DE REGRESTON PARA ACIDEZ EN BEBJDA SIN AVENA
An8Jisis de Regtesi6fi P6lifJomial
Variable Depefidiefile~ AcidezSinAVenll _______________w_____~______~________________~-----------_________~_________________~~____~___~_____
Error T Pariirnetro Estimado Estandar Estadistico ---------------------------------------~--------------~-~-------~--------------------~------------CONSTANT 0491697 00123217 399051 00000 Dia 00436032 000269882 161564 00000 D1a2 -000144613 000011359 127312 00000 __w___~________________________~-_______-_____~----____________________________~__~---~_--__~___
AriiiJisis de varianza ~_~__~__________~_~____~________~___________- _________e_____________________________bull _____-________
Source Smn de cuadr Df Mean Square F-Ratio PmiddotValor_~~___________________________________bull ______~___________bull ____________bull ______~________w________________
Model 0135203 2 00676013 21747 00000 Residual 000404118 13 000031086
Total (Corr) 0139244 15
R2 970978 percent
AcidezSlnAvena 0491697 + O0436032Dia - 0OOl44613Dia2
74
I
ANEXO I ANALISIS DE REGRESION PARA ACIDEZ EN BEBIDA CON AVENA
1
Anwisis de tegtesi6fi polinomial
Variable dependiente Acidez Con Avena
Error T ParametTo Estimado Stlindar Estadfstico P-Valor ----------------~-------~---------------------~-----------------------------------------------------CONSTANT 0491639 000926607 530578 00000 Diamiddot 00406572 000202955 200326 00000 DfaA 2 0000982559 0000085421 -115025 00000
-------------~----------------------------~-------------------------~-----------------------------------
-------------~-----~~-----------------------------~---------------------------------------------_--Source Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio PValor
-~-------------~----------------------------------~------------------~~-------------------------- Modelo 0288008 2 0144004 81914 00000 Residual 000228539 13 0000175799
----------~~--------------~---------------------------------------------~---------------------------Total (Corr) 0290294 15
RA2 = 992127 percent
-------------------------~----~---~------------~---------------------------------~---------------~
AcidezConAvena == 049163amp + 00406572D1a - 0000982559DiaA2
75
I
(Ilmiddot il
ANEXO J- ANALISIS DE REGRESION PARA RECUENTO LACTOBACILOS PARA BEBIDA SIN AVENA
Amilisis de regresion - Modelo lineal Y = a + bX
------------------------~----------------------~-----------------------------~----------~-----------Variable Dcpendiente LactobacilJusSinAvena Variable independiente Dia
I--------~----------~-----------------------------------~-------~-~--~--------------------------~-Error T
Paramctro Estimado Standard Stadistico P-Valor
----~----~------------~-----~-----------------------~-------------~-----------------------------Intereepto 117347 0389973 300911 00000 Pendiente 00483464 00257889 18747 00903
Analisis de Varianza
---------~------------------~----------------~---------------------------------~---------~----------Source Sum decuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor
------------~---------------------~---------------------~--------------------------------~-----~----Modelo 0916252 1 244835 443 00616 Residual 260706 10 0260706
--~------------~---~------------------~~~-----~-------~---------~~-------------------------------------Total (Corr)352332 11
Coeficiente Correlaci6n = 0509955 R2 = 260054 percent
LactobacillusSinAvena= 117347 + 00483464Dfa
76
ANEXO K- ANALTSIS DE REGRESION PARA RECUENTO LACTOBACILOS PARA DEBIDA CON AVENA
Aruilisis de regresion - Modelo lineal Y = a + hX
Variable Dependiente LactobacillusConAvena Variable Independiente Dia ---~--------------------------------------------------------__-----------__--_--_-----------shy
Error T Paramctro Estimado Standard Estadistico P-Valor -~--------------------------------------------------------------------------------------------------
Irttercepto 118103 0567963 207942 00000 Pendiente 00790304 00375594 210414 00616
-----------------~----------------------------~----~-------~----~----------------------------
Analisis de Varianza
----------------~----------------~------------------~--------------------------~------~--------shySource Swn de cuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor
-----------------~--~--------------------------------------------------------------------------~---~ Mode10 244835 1 244835 443 00616 Residual 552997 10 0552997
Total (Corr)797832 11
Coeficiente Correlacion = 0553964 RI2 = 306875 percent
-----~--------------------------------------------------------~--------------------------------------
LactobacillusConAvena = 118103 + 00790304Dfas
77
fermentados y Lactobacillus brevis de mucosa vaginal y leche fermentada (Ver
Anexos del A al E y Tabla 5)
TABLA 5 Resultado identlficaci6n cepa~
CEPA NOMBRE
1 Lactobacillus planfarum
3 Lactobacillus plantarum
5 Lactobacillus brevis
13 Lactobacillus brevis
15 Lactobacillus plantarum
34 Pruebas para determinar microorganismos probi6ticos
las cepas de Lactobacillus brevis y Lactobacillus plantarum mostraron
rasistencia al medio acido de pH =2 Y sales biliares 03 pv resultado similar al
encontrado por Jacobsen et al 1999 para Lactobacillus plantarum (Ver tabla 6)
45
middot
~~~ttiI lltlmiddot~COX~dtJ ~xtc_~ 2 tr~ k-JlL~middot
-)~~TO DE lJIBUOTECUl rjRL]OTtCA twn GO1IU1
TABLA 6 Resultados a pruebas de resistencia a pH=2 y sales biliares 03 plv
CEPA RESISTENCIA pH=2 RESISTENCfA A SALES BIUARES ()3 pv
1 + +
2 + +
3 + +
4 + +
5 +
6 + +
7 + +
8 + +
9 + +
10 + +
11 + +
12 + +
13 + +
14 +1shy +M
15 + +
16 + +
+1 crecimiento debil
+ crecimiento abundante
46
Figura 6 Lactobacillus brevis Gram + aislado de leche fermentada
Ai observar en placa las celulas de lactobacilos despues de real1zar las pruebas
de resistenCia a la acidez y sales biliares se observo una tendencia a aglomerarse
posiblemente como un mecanismo de proteccion cOlitra estos medios que pueden
lIegar a ser adversos para elias (Ver figuras 7 y 8)
47
Figura 7 Lactobacillus brevis aislada de leche fermentada despu~s de la prueba de resistencia a pH=2
Figura 8 Lactobacillus brevis aislada de leche fermentada despues de la prueba de resistencie asales biUares 03 plv
fI
48
35 --Seguimiento del-pH-en-la-bebidaJacteacon y sin -prebi6tico
A continuacion se muestran las Tablas 7 y 8 donde sa registian los datos
recopilados de pHdurante 10$ dras Z 7 14 Y21 para las bebidas laaeas con ysin
prebi6tioo
TABLA 1 ResultadopH yogur sin avena
Dia Repetition 1 Repetici6n 2 Repeticion 3 Repetici6n 4
2 526 501 51 52
7 446 433 438 44
14 439 435 437 436
21 439 437 438 437
TABLA 8 -ResultadopHyogur con avena
Dia Repeticion 1 Repeticion2 Repeticion 3 - Repeticion 4
2 509 523 51 515
7 447 442 445 442
14 436 -438 439 437
21 432 433 435 434
Observando la Figura 9podamos ver que el pH en el -dfado$ para los dos
tratamientos as igual y empieza a descender rapidamente para estabilizarse a
partir del dra 7(Ver figura 9)
49
Figura 9 Comparacj6n de medias para -el pH
Comparaci6n de medias para pH
55 ~ 5 +----=gtIIIi-~i~~----=-r--it~ -- pH sin avena
a 45 1--~~~~=~~ 4 --- pH con
avena35 t-----r-- -------=------=--= ------- - ----
2 7 14 21
Dias
Aplicando la prueba t para comparar las medias de pH I S6 muestia una diferencia
altamants significativa en los dos tratamientos para el dia 21 (pltO05)
(Ver tabla 9)
TABLA 9 Compaiaci6n de medias para pH
DtAS SIN AVENA CON AVENA te p (VALOR)
2 514 514 0 10
7 439 444 -1 61 0159
14 437 I
438 -070 0510
21 438 433 528 00019 shy
- DiFERENCIA AlTAMENTE SIGNIFICATIVA
50
I
AI aplicar regrasi6n a los datos sa obtiene al modelo estimado
pHSinAyena =535606 - 01505650Ia +0005044340IaI2
La variabilidad en la respuesta de pH asta siendo explicada en un 8S7522 por
el modelo (Ver Anexo F)
EI tratamiento con avena mostro el siguiente modelo al analisis de ragresi6n
pHConAvena =534463 ~ 0140407Dia + 0004480980Ia2
La variabilidad an la respuesta de pH asta siendo explicada en un 903315 par
el nlodelo(Ver anexo G)
36 Seguimiento de la acidezmiddotmiddot expresada comomiddot de acido
lactico
A continuaci6n sa muestran las Tablas 10 y 11 donde sa registran los datos
tecopilados de acidezmiddotdurante los dias 27 14 Y 21 para las pebidas taetees con y
sin prebi6tico
TABLA 10 Resuttadode acidez (expresadocomo acido tactico) yogurt sin avena
CIA R~petici6n1 Repeticion2 Repetici6n 3 Repeticion 4
2 054 06 057 058
7 072 074 073 0]2
14 080 083 082 082
21 0]4 079 078 077
51
TABLA 11 Resultado de aCidez (expresado como acido Icktico) yogurt con avena
Dia Repetici6n 1 RepetiCi6n 2 Repetici6n 3 Repetici9n 4
2 059 055 058 057
7 071 073 072 072
14 089 087 088 086
21 092 091 090 091
Observando la Figura 10 se puede concluir que la acidez empieza a aumentar
hasta el dia 14 y luego trata de estabilizarse para los dos tratamientos
(Ver figura 10)
Figura 10 Comparaci6n de medias para la acidez
N G)
Comparacion de medias para acidez
1
2 0I 5 -+--=--------=-~~~= u
ltC
- Acidez sin avena
2 7 14
Dias
52
21
-it- Acidez con avena
Aplicando la prueba t para camparar las madias de acidez se muestra una
diferencia altarnante significativa en los dos tratamiantos para los dias 14 y 21
(pltO05)
(Var tabla 12)
TABLA 12Comparaci6n de medias para Acidez
DIASmiddot SIN AVENA CON AVENA te p(VALOR)
2 0572 0572 0 10
7 0727 0720 119 0278
14 0818 0875 -638 000070shy
21 077 091 -1212 i 0000019 shy
DIFERENCIA AL TAMENTE SlGNIFICATIVA
AI aplicar r~gresi6n a los datos se obtiene el modelo estimado
AcidezSlnAIena = 0491897 + O0436032Dia O00144613DfaA2
La variabilidad en la respuesta de acidez asta siendoexplicada en un 970978
por al modelo (Ver anexo H)
EI tratamiento con avena mostro elsiguiente modeloj a1 analisis de regresion
AcidezConAvena = 0491638 + 00406572Oia - OQOO982559OiaA2
La variabilidad enla respuesta acidez esta siendo explicadaen un 99212 por
el modelo (Ver anexo J)
53
I ~
37 Prueba de viabiJidad
A continuaci6n sa muestran las Tab~as 13 y 14 donde sa presentan los datos
recopilados del recuento de Lactobacilos durante los dias 7 14 Y 21 para las
bebidas lacteas con y sin prebi6tico
TABLA 13 Recuento de Lactobacilos (UFCml) yogurt sin avena
Dia Repetici6n 1 Repetici6n 2 Repeticion 3 Reptttici6n 4
7 1880X10l1 1454X1011 1642X1011 1780X10~
14 1560X10~ 646X1011J 1890X10l 140X10l1
21 1200x10lu 128Ox10u 1745x10J 1520x101V
TABLA 14 Recuento de Lactobacilos (UFCml) yogurt con avena
Dfa Repetieion 1 Repetici6n 2 Repeticion 3 Repeticf6n 4
7 1600X10lt 1240X10t 1640X10ll 1980X10t
14 540X1011 427X10n 546X10n 720X10ll
21 500x1011 492x1011 712)(1011 980x10~
AI analizar la Figura 11 sa puede observar un recuento mayor de Lactobacilos
en al tratamiento con avena resultado de acuerdo a 10 encontrado por Alander at
aI 1999 Kontula et aI 1998 y Jaskari et aI 1998
54
Figura 11 Comparaci6n de medias para Log Lactobacillus
Comparacion de medias para log Lactobacillus
~ 1350
-+- Sac Sin--() 13 co avenaIII
bull 125 -- Bac con 0)
0 12 avenaJ
115 7 14 21
Dias
Aplicando la prueba t para comparar las medias de recuento de Lactobacillus no
se encontr6 una diferenc1a estadfsUcamente significative entre los dos
tratamientos (Ver tabla 15)
Este aumento en al racuento influy6 en la disminuci6n del pH y en el aumento de
fa aeidez por la fermentacion que realizan los Lactobacillus sobre fa lactosa de la
lache y la avena adicionada como prebi6tico
55
1
TABLA 15 Comparaci6n medias lag Lactobacillus
DIAS SIN AVENA CON AVENA tc p(VALOR)
7 122257 122022 04846 06451
14 121065 132393 -19602 00977
21 129025 133087 -08236 04416
At aplicar regresion a los datos se obtiane al modelo astimado
LactobacillusSinAvena= 117347 + 004834640Ia
La variabilidad en la respuesta del recuento de LactobaCillus ssta siendo
explicada en un 260054 por el mod$loVar anexo J)
EI tratamiento con avena mostr6 al siguiente modalo al anal isis de regresion
Lactobacillu$ConAvena =118103 + 007903040Ias
La variabilidad en la respuesta de recuento esta siendo explicada en un 3068
por al modelo(Ver anexo K)~
38 Analisi$ microbiol6gicos de las bebidas lacteas con y sin
En la Tabla 16 estan recopilados los resultados microbiol6gieos obtenidos en ras
muestras con los dos tratamientos (con y sin avena)
I [
sa
TABLA 16 Resultados analisis microbiologico
Recuento de mohos y levaduras Iml lt10
Recuento de Staphylococcus coagulase positiva Iml lt100
NMP coliformes fotales y Escherichia coli Iml lt3
Presencia de Salmonella25ml Ausente
Los resultados de este analisis demuestran que las bebidas fermentadas con y
sin avena~ astan fibres de microorganismos patogenos
57
1
4 CONCLUSIONES
Se aislaron cepas nativas de Lactobacillus plantarum de las muestras vegetates
de repollo pepino repollitas de bruselas fermentadas y Lactobacillus brevis de
lache fermentada y mucosa vaginal humana Ambas cepas resistieran un pH=2 y
una concentraci6n de sales biliares det 03 ptv dos earacteristicas importantes
en los probi6ticos
Lamiddot cepa de Lactobacillus brevis aislada de lache Sa utiliz6 para elaborar una
bebida fermentada sin y con avana comoingrediente prebiotico obteniendose un
aJimento centon recuento del probi6tico viable durante 21 dras de seguimiento
ademas libre de microorganismos )at6gen05
No se encontr6 efecta significativo de la avena sobre Ie viabilidad del Lactobacillus
brevis aunque sa presento un aumento en 61 recuento de estos en la bebida con
avena
58
plusmn ~
5 RECOMENDACIONES
Ensayar la cepa de Lactobacillus plantartJm en productos carnicos madurados
como el salami
Ensayar la cepa de Lactobacillus l)revs en otros derivados lecteos como queso
quesito queso crema
Continuar con el estudio de estos microorganismos y caracterizarlos
molecularmente ademas de estudiar su capacidad de adherencja a fa mucosa
intestinal sobre algunes Hneas celulares como las CaCo~2
Estudiarel efedo de la avena sabre la viabiJidad del Lactobacillus breyis a una
concentraci6n mayor de 05
Realizer ensayos can las cepas de Lactobacillus brevis y Lactobrlcillus pJantarum
para elaborar masas acidas para panificacion reemplazando el Bromato de
Potasio aditivo prohibido desde marzo del 2003 en nuestro pais per 5U toxicidad
59
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65
ANEXOS
66
ANEXO A RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AlSLADA DE i
PEPINO it
Referencia Pepino 1 Fecha 06122002
IEXCELENTE IDENTIFICACION
Latto plantarum 1
Galeria API 50 CHL V50 Leida el 06122002
Perfil - -- - ++ - -- - ++++ - - -+- + - I I I I I I I I +t+ - +f- ~ - - + + ~ - - - +- + - shy
o - GLY - ERY DARA - LARA + RIB + DXYL - LXYL - ADO - MDX - GAL + GLU + FRU + MNE + SBE - RHA - DUL - INO bull MAN + SOR - MDM + MUG shyNAG + AMY + ARB + ESC + SAL + CEL + MAL + LAC + MEL + SAC + TRE + 1NU - MLZ + RAF + AMD - GLYG - XLT - GEN + TIJR + LYX - TAG - DFUC shyLFUC - DARL + LARL - aNT + 2KG - 5KG shy
--- Taxones significativos rd -----T -- Tests en contra
Lactoplantarum 1 999 092 1
Taxon siguiente Lactobrevis 1 OJ 044 3
i i
Lactoplantarum 1 1 test (5) en contra
D-SORBITOL (SOR) 78
Tax6n siguiente Lactobrevis 1 3 test (s) ert contra
METHYLD-MANNOSIDE (MOlM) 0 MELEZITOSE (MLZ) 14 D-TURANOSE (TUR) 14
67
ampb
ANEXO B RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AISLADA DE REPOLLO FERMENTADO
~
Referencia Repollo fermentado - 3 Fecha 03072003
EXCELENTE IDENTIFICACION
Lactoplantarum 1
Galena API 50 CRL V50 Leida el 03072003
Perfil - - ++ - - - - -H++ - - ~ + - + - I I 1 I I I I -H+ - ++ - - - + + - -- - - + - shy
o - GLY - ERY - DARA - LARA + RIB + DXYL - LXYL - ADO ~ MDX - GAL + GLU + FRU + MNE + SBE ~ RHA - DUL - INO - MAN + SOR - MDM + MDG shyNAG + AMY + ARR + ESC + SAT + CRL + MAL + LAC + MEL + SAC + TRE + lNU - MLZ + RAF + AMI) - GLYG - XLT - GEN + TOR + LYX - TAG - DFUC shyLFUC - DARL - LARL - GNT + 2KG - 5KG shy
------Taxones significativos _ _----- Id--- ---T---- Tests en contra
Lactoplantarum 1 999 095 1
Tax6n siguiente Lactobrevis 1 01 OA8 3
lJactoplantaru01 1 1 test (s) en contra
DSORBITOL (SOR) 78
Taxon siguiente Lactobrevis
METHYL-D-MANNOSIDE D-TURANOSE
1
(MOM) (TOR)
3 test (5) en contra
0 MELEZITOSE 14
(MLZ) 14
i
I
68
ANEXO C RESULTADO PRUEBAS BIOQUWICAS DE CEPA AISLADA DE MUCOSA HUMANA
Referenda Mucosa - 5 Fecha 27012003
BUENA IDENTlFICACION
Galeria API 50 CHL vso Leida el 270112003
Perfil - - - - +t--t - - - + - + - - - - - - - - -+- - - - - + - + - - - - - - - - - - - - - bull - - -+ - +
o - GLY ~ ERY - DARA bull LARA + RID + DXYL + LXYL - ADO bull MDX - GAL + OLU - FRU + MNE - SBE - IlliA - DUL - INa - MAN - SOR - MDM - MOO shyNAG + AMY - ARB - ESC ~ SAL bull CEL - MAL + lAC - MEL + SAC - TRE shyINU - MLZ - RAF - AMD - GLYG - XLT - GEN - 11JR - LYX - TAG - DFUC shyLFUC - DARL - IARL - ONT + 2KO - 5KG +
- - - - - - Taxones significativos - - - - - - - Id T -- Test en contra
Lactobrevis 3 963 088 1
Taxon siguiente Lactoco11inoides 36 075 2
Lactobrevis 3 1 test (s) en contra
GLUCOSE (GLU) 95
-~~~------------~---------------------------~--~-------~--~-----~----------~--------~------------~~--Taxon siguiente Lactocollinoides 2 test (s) en contra
GLUCOSE (GLU) 100 MELIBIOSE (MEL) 25
69
i r
ANEXO D RESULTADO PRUEBAS BIOQIJiMICAS DE CEPA AISLADA DE LECHE FERMENTADA
Referenda Leche fennentada ~ 13 Fecha 27012003
BUENA IDENTIFICACI6N
Galeria API 50 CHL V50 Leida el 270112003
Perfil - - - - -t-t+- - - - + - + - - - bull - - - - -+- - - - - + - + - - - - - - - - - - - - - - - - -+ - +
0 - GLY - ERY - DARA - LARA +Rll3 + DXYL + LXYL - ADO - MDX ~GAL + GLU - FRU + MNE SBE - RHA DUL bull INO MAN - SOR MDM bull MDG shy
~NAG + AMY - ARB - ESC - SAL - CEL - MAL + LAC - MEL + SAC - TRE I lNU - MLZ - RAF - AMD - GLYG - XLT - OEN - IUR LYX - TAG - DFUC bull i
LFUC - DARL - LARL -ONr + 2KG - SKO + 1
- -- - - Taxones significativos - - Id -- T --- Test en contra
Lacta brevis 3 963 088 1
Taxon siguiente Lactocollinoides 36 075 2
Lactobrevis 3 1 test (s) en contra
GLUCOSE (GLU) 95
-----------------------------------------------------------~------------------------------~-------------------Taxon siguiente Lactocollinoides 2 test (s) en contra
GLUCOSE (GLD) 100 MELffiIOSE (MEL) 25
70
II iJ1
I
I ANEXO E RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AISLADA DE REPOLLITAS DE BRUSELAS FERMENTADA
Referencia repollitas de bruselas 15 Fecha 03072003
EXCELENTE IDENTIFICACION
Lactoplantarum 1
Galeria API 50 CHL vsO Leida el 03072003
Perfil - - - - +t - - - - +H+ - +- - +t + - I I I I I I I f ++t - + - - - -+ + - - - -+ -+ - - I ij
o - GLY - ERY - DARA - LARA + RJB + DXYL - LXYL - ADO - MDX - GAL +
GLU + FRU + MNE + SBE RHA + DUL - INO - MAN + SOR + MDM + MOG shyNAG + AMY + ARB + ESC + SAL + eEL + MAL + LAC + MEl + SAC + TRE + i
I1NU - MLZ + RAF AMD GLYG - XLT - aEN + TUR + LYX - TAG - Druc LFUC - DARt + LARL - aNT + 2KG - 5KG shy n ----Taxones significativos ------ Id Tests en contra
Lactoplantarum 1 999 090 o
Taxon siguiente Lacto pentosus 01 012 7
Lactoplantarum 1 o test (s) en contra
Taxon siguiente Lacto pentosus 7 test (8) en contra
GLYCEROL (GLY) 75 D-XYLOSE (DXYL) 100 L-RHAMNOSE (RHA) 25 METHYL-D-MANNOSIDE (MOM) 1 MELEZITOSE (MLZ) 25 RAFFINOSE (RAF) 75 D-ARABITOL (DARL) 0
71
~
I i I
ANEXO F - ANALISIS DE REGRESION PARA pH EN BEBIDA SIN AVENA
Aruilisis de regresi6n polinomial
---~-~-------------------------------------------~-----------~~---------------------~--------------Variable dependiente pHSinAvena ---------------------------~-------------~--------------------~---------------------------------
Error T Parametro Estimado Estandar Estadistico P-Valor
CONSTANTE 535606 0094535 56657 00000 Dia -0150565 0020706 727154 00000 Dia2 000504434 0000871488 578819 00001
---~---------------------------------------------------------------------------------------------------
Anfllisis de Variama -------------------------------------------~-----------~-----------------------------~-~--- jSource Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor 11
------------------------~------------------------------------------------------------------------------~ Mod-elo 155772 2 0118861 4256 00000 Residual 0237877 13 00182983
Total (Corr) 11956 IS
R2 == 867522 percent
pHSinAvena == 535606 - 0150565Dia + 000504434Dia2
72
____
middot ANEXO G - ANALISIS DE REGRESION PARA pH EN BEBIDA CON AVENA
AmUisis de regresion polinomial _____~_____~__-_____~___4____________________bull____bull__________bull_____________~~----_------___________
Variable depcndiente pHConA vena ------------------------------------------------------------------------------------------~--------
Error T Parametro Estimado StAndar Estadfstico P-Valor
---------------------------------------------~-----------------------------------------------_---------CONSTANTE 534463 00801045 667208 00000 Dia -0140407 00175453 800253 00000 DiaA 2 000448098 0000738458 606803 00000
----------------------~---~-----------------------------~------------------------------~----AmUisis de Varianza
---~---------------------------------~---------------------~------------~-------------------~------Source Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio PValor --------------------------~-----------------------------------------------~------------~-----~~--~ ModeJo 159575 2 0797873 6073 00000 Residual 02170798 middot13 00131383 _______~_~ ~_~----------~------~--~-----~-M-----~-----____ _____________~-----------------------Total (COlT) 176654 15
R12 903315 percent
-----------~------------------------------------------------------------------------~-----------pHConAvena 534463 - 0140407Dia + 000448098DfaA 2
73
ANEXO H - ANALTSIS DE REGRESTON PARA ACIDEZ EN BEBJDA SIN AVENA
An8Jisis de Regtesi6fi P6lifJomial
Variable Depefidiefile~ AcidezSinAVenll _______________w_____~______~________________~-----------_________~_________________~~____~___~_____
Error T Pariirnetro Estimado Estandar Estadistico ---------------------------------------~--------------~-~-------~--------------------~------------CONSTANT 0491697 00123217 399051 00000 Dia 00436032 000269882 161564 00000 D1a2 -000144613 000011359 127312 00000 __w___~________________________~-_______-_____~----____________________________~__~---~_--__~___
AriiiJisis de varianza ~_~__~__________~_~____~________~___________- _________e_____________________________bull _____-________
Source Smn de cuadr Df Mean Square F-Ratio PmiddotValor_~~___________________________________bull ______~___________bull ____________bull ______~________w________________
Model 0135203 2 00676013 21747 00000 Residual 000404118 13 000031086
Total (Corr) 0139244 15
R2 970978 percent
AcidezSlnAvena 0491697 + O0436032Dia - 0OOl44613Dia2
74
I
ANEXO I ANALISIS DE REGRESION PARA ACIDEZ EN BEBIDA CON AVENA
1
Anwisis de tegtesi6fi polinomial
Variable dependiente Acidez Con Avena
Error T ParametTo Estimado Stlindar Estadfstico P-Valor ----------------~-------~---------------------~-----------------------------------------------------CONSTANT 0491639 000926607 530578 00000 Diamiddot 00406572 000202955 200326 00000 DfaA 2 0000982559 0000085421 -115025 00000
-------------~----------------------------~-------------------------~-----------------------------------
-------------~-----~~-----------------------------~---------------------------------------------_--Source Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio PValor
-~-------------~----------------------------------~------------------~~-------------------------- Modelo 0288008 2 0144004 81914 00000 Residual 000228539 13 0000175799
----------~~--------------~---------------------------------------------~---------------------------Total (Corr) 0290294 15
RA2 = 992127 percent
-------------------------~----~---~------------~---------------------------------~---------------~
AcidezConAvena == 049163amp + 00406572D1a - 0000982559DiaA2
75
I
(Ilmiddot il
ANEXO J- ANALISIS DE REGRESION PARA RECUENTO LACTOBACILOS PARA BEBIDA SIN AVENA
Amilisis de regresion - Modelo lineal Y = a + bX
------------------------~----------------------~-----------------------------~----------~-----------Variable Dcpendiente LactobacilJusSinAvena Variable independiente Dia
I--------~----------~-----------------------------------~-------~-~--~--------------------------~-Error T
Paramctro Estimado Standard Stadistico P-Valor
----~----~------------~-----~-----------------------~-------------~-----------------------------Intereepto 117347 0389973 300911 00000 Pendiente 00483464 00257889 18747 00903
Analisis de Varianza
---------~------------------~----------------~---------------------------------~---------~----------Source Sum decuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor
------------~---------------------~---------------------~--------------------------------~-----~----Modelo 0916252 1 244835 443 00616 Residual 260706 10 0260706
--~------------~---~------------------~~~-----~-------~---------~~-------------------------------------Total (Corr)352332 11
Coeficiente Correlaci6n = 0509955 R2 = 260054 percent
LactobacillusSinAvena= 117347 + 00483464Dfa
76
ANEXO K- ANALTSIS DE REGRESION PARA RECUENTO LACTOBACILOS PARA DEBIDA CON AVENA
Aruilisis de regresion - Modelo lineal Y = a + hX
Variable Dependiente LactobacillusConAvena Variable Independiente Dia ---~--------------------------------------------------------__-----------__--_--_-----------shy
Error T Paramctro Estimado Standard Estadistico P-Valor -~--------------------------------------------------------------------------------------------------
Irttercepto 118103 0567963 207942 00000 Pendiente 00790304 00375594 210414 00616
-----------------~----------------------------~----~-------~----~----------------------------
Analisis de Varianza
----------------~----------------~------------------~--------------------------~------~--------shySource Swn de cuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor
-----------------~--~--------------------------------------------------------------------------~---~ Mode10 244835 1 244835 443 00616 Residual 552997 10 0552997
Total (Corr)797832 11
Coeficiente Correlacion = 0553964 RI2 = 306875 percent
-----~--------------------------------------------------------~--------------------------------------
LactobacillusConAvena = 118103 + 00790304Dfas
77
middot
~~~ttiI lltlmiddot~COX~dtJ ~xtc_~ 2 tr~ k-JlL~middot
-)~~TO DE lJIBUOTECUl rjRL]OTtCA twn GO1IU1
TABLA 6 Resultados a pruebas de resistencia a pH=2 y sales biliares 03 plv
CEPA RESISTENCIA pH=2 RESISTENCfA A SALES BIUARES ()3 pv
1 + +
2 + +
3 + +
4 + +
5 +
6 + +
7 + +
8 + +
9 + +
10 + +
11 + +
12 + +
13 + +
14 +1shy +M
15 + +
16 + +
+1 crecimiento debil
+ crecimiento abundante
46
Figura 6 Lactobacillus brevis Gram + aislado de leche fermentada
Ai observar en placa las celulas de lactobacilos despues de real1zar las pruebas
de resistenCia a la acidez y sales biliares se observo una tendencia a aglomerarse
posiblemente como un mecanismo de proteccion cOlitra estos medios que pueden
lIegar a ser adversos para elias (Ver figuras 7 y 8)
47
Figura 7 Lactobacillus brevis aislada de leche fermentada despu~s de la prueba de resistencia a pH=2
Figura 8 Lactobacillus brevis aislada de leche fermentada despues de la prueba de resistencie asales biUares 03 plv
fI
48
35 --Seguimiento del-pH-en-la-bebidaJacteacon y sin -prebi6tico
A continuacion se muestran las Tablas 7 y 8 donde sa registian los datos
recopilados de pHdurante 10$ dras Z 7 14 Y21 para las bebidas laaeas con ysin
prebi6tioo
TABLA 1 ResultadopH yogur sin avena
Dia Repetition 1 Repetici6n 2 Repeticion 3 Repetici6n 4
2 526 501 51 52
7 446 433 438 44
14 439 435 437 436
21 439 437 438 437
TABLA 8 -ResultadopHyogur con avena
Dia Repeticion 1 Repeticion2 Repeticion 3 - Repeticion 4
2 509 523 51 515
7 447 442 445 442
14 436 -438 439 437
21 432 433 435 434
Observando la Figura 9podamos ver que el pH en el -dfado$ para los dos
tratamientos as igual y empieza a descender rapidamente para estabilizarse a
partir del dra 7(Ver figura 9)
49
Figura 9 Comparacj6n de medias para -el pH
Comparaci6n de medias para pH
55 ~ 5 +----=gtIIIi-~i~~----=-r--it~ -- pH sin avena
a 45 1--~~~~=~~ 4 --- pH con
avena35 t-----r-- -------=------=--= ------- - ----
2 7 14 21
Dias
Aplicando la prueba t para comparar las medias de pH I S6 muestia una diferencia
altamants significativa en los dos tratamientos para el dia 21 (pltO05)
(Ver tabla 9)
TABLA 9 Compaiaci6n de medias para pH
DtAS SIN AVENA CON AVENA te p (VALOR)
2 514 514 0 10
7 439 444 -1 61 0159
14 437 I
438 -070 0510
21 438 433 528 00019 shy
- DiFERENCIA AlTAMENTE SIGNIFICATIVA
50
I
AI aplicar regrasi6n a los datos sa obtiene al modelo estimado
pHSinAyena =535606 - 01505650Ia +0005044340IaI2
La variabilidad en la respuesta de pH asta siendo explicada en un 8S7522 por
el modelo (Ver Anexo F)
EI tratamiento con avena mostro el siguiente modelo al analisis de ragresi6n
pHConAvena =534463 ~ 0140407Dia + 0004480980Ia2
La variabilidad an la respuesta de pH asta siendo explicada en un 903315 par
el nlodelo(Ver anexo G)
36 Seguimiento de la acidezmiddotmiddot expresada comomiddot de acido
lactico
A continuaci6n sa muestran las Tablas 10 y 11 donde sa registran los datos
tecopilados de acidezmiddotdurante los dias 27 14 Y 21 para las pebidas taetees con y
sin prebi6tico
TABLA 10 Resuttadode acidez (expresadocomo acido tactico) yogurt sin avena
CIA R~petici6n1 Repeticion2 Repetici6n 3 Repeticion 4
2 054 06 057 058
7 072 074 073 0]2
14 080 083 082 082
21 0]4 079 078 077
51
TABLA 11 Resultado de aCidez (expresado como acido Icktico) yogurt con avena
Dia Repetici6n 1 RepetiCi6n 2 Repetici6n 3 Repetici9n 4
2 059 055 058 057
7 071 073 072 072
14 089 087 088 086
21 092 091 090 091
Observando la Figura 10 se puede concluir que la acidez empieza a aumentar
hasta el dia 14 y luego trata de estabilizarse para los dos tratamientos
(Ver figura 10)
Figura 10 Comparaci6n de medias para la acidez
N G)
Comparacion de medias para acidez
1
2 0I 5 -+--=--------=-~~~= u
ltC
- Acidez sin avena
2 7 14
Dias
52
21
-it- Acidez con avena
Aplicando la prueba t para camparar las madias de acidez se muestra una
diferencia altarnante significativa en los dos tratamiantos para los dias 14 y 21
(pltO05)
(Var tabla 12)
TABLA 12Comparaci6n de medias para Acidez
DIASmiddot SIN AVENA CON AVENA te p(VALOR)
2 0572 0572 0 10
7 0727 0720 119 0278
14 0818 0875 -638 000070shy
21 077 091 -1212 i 0000019 shy
DIFERENCIA AL TAMENTE SlGNIFICATIVA
AI aplicar r~gresi6n a los datos se obtiene el modelo estimado
AcidezSlnAIena = 0491897 + O0436032Dia O00144613DfaA2
La variabilidad en la respuesta de acidez asta siendoexplicada en un 970978
por al modelo (Ver anexo H)
EI tratamiento con avena mostro elsiguiente modeloj a1 analisis de regresion
AcidezConAvena = 0491638 + 00406572Oia - OQOO982559OiaA2
La variabilidad enla respuesta acidez esta siendo explicadaen un 99212 por
el modelo (Ver anexo J)
53
I ~
37 Prueba de viabiJidad
A continuaci6n sa muestran las Tab~as 13 y 14 donde sa presentan los datos
recopilados del recuento de Lactobacilos durante los dias 7 14 Y 21 para las
bebidas lacteas con y sin prebi6tico
TABLA 13 Recuento de Lactobacilos (UFCml) yogurt sin avena
Dia Repetici6n 1 Repetici6n 2 Repeticion 3 Reptttici6n 4
7 1880X10l1 1454X1011 1642X1011 1780X10~
14 1560X10~ 646X1011J 1890X10l 140X10l1
21 1200x10lu 128Ox10u 1745x10J 1520x101V
TABLA 14 Recuento de Lactobacilos (UFCml) yogurt con avena
Dfa Repetieion 1 Repetici6n 2 Repeticion 3 Repeticf6n 4
7 1600X10lt 1240X10t 1640X10ll 1980X10t
14 540X1011 427X10n 546X10n 720X10ll
21 500x1011 492x1011 712)(1011 980x10~
AI analizar la Figura 11 sa puede observar un recuento mayor de Lactobacilos
en al tratamiento con avena resultado de acuerdo a 10 encontrado por Alander at
aI 1999 Kontula et aI 1998 y Jaskari et aI 1998
54
Figura 11 Comparaci6n de medias para Log Lactobacillus
Comparacion de medias para log Lactobacillus
~ 1350
-+- Sac Sin--() 13 co avenaIII
bull 125 -- Bac con 0)
0 12 avenaJ
115 7 14 21
Dias
Aplicando la prueba t para comparar las medias de recuento de Lactobacillus no
se encontr6 una diferenc1a estadfsUcamente significative entre los dos
tratamientos (Ver tabla 15)
Este aumento en al racuento influy6 en la disminuci6n del pH y en el aumento de
fa aeidez por la fermentacion que realizan los Lactobacillus sobre fa lactosa de la
lache y la avena adicionada como prebi6tico
55
1
TABLA 15 Comparaci6n medias lag Lactobacillus
DIAS SIN AVENA CON AVENA tc p(VALOR)
7 122257 122022 04846 06451
14 121065 132393 -19602 00977
21 129025 133087 -08236 04416
At aplicar regresion a los datos se obtiane al modelo astimado
LactobacillusSinAvena= 117347 + 004834640Ia
La variabilidad en la respuesta del recuento de LactobaCillus ssta siendo
explicada en un 260054 por el mod$loVar anexo J)
EI tratamiento con avena mostr6 al siguiente modalo al anal isis de regresion
Lactobacillu$ConAvena =118103 + 007903040Ias
La variabilidad en la respuesta de recuento esta siendo explicada en un 3068
por al modelo(Ver anexo K)~
38 Analisi$ microbiol6gicos de las bebidas lacteas con y sin
En la Tabla 16 estan recopilados los resultados microbiol6gieos obtenidos en ras
muestras con los dos tratamientos (con y sin avena)
I [
sa
TABLA 16 Resultados analisis microbiologico
Recuento de mohos y levaduras Iml lt10
Recuento de Staphylococcus coagulase positiva Iml lt100
NMP coliformes fotales y Escherichia coli Iml lt3
Presencia de Salmonella25ml Ausente
Los resultados de este analisis demuestran que las bebidas fermentadas con y
sin avena~ astan fibres de microorganismos patogenos
57
1
4 CONCLUSIONES
Se aislaron cepas nativas de Lactobacillus plantarum de las muestras vegetates
de repollo pepino repollitas de bruselas fermentadas y Lactobacillus brevis de
lache fermentada y mucosa vaginal humana Ambas cepas resistieran un pH=2 y
una concentraci6n de sales biliares det 03 ptv dos earacteristicas importantes
en los probi6ticos
Lamiddot cepa de Lactobacillus brevis aislada de lache Sa utiliz6 para elaborar una
bebida fermentada sin y con avana comoingrediente prebiotico obteniendose un
aJimento centon recuento del probi6tico viable durante 21 dras de seguimiento
ademas libre de microorganismos )at6gen05
No se encontr6 efecta significativo de la avena sobre Ie viabilidad del Lactobacillus
brevis aunque sa presento un aumento en 61 recuento de estos en la bebida con
avena
58
plusmn ~
5 RECOMENDACIONES
Ensayar la cepa de Lactobacillus plantartJm en productos carnicos madurados
como el salami
Ensayar la cepa de Lactobacillus l)revs en otros derivados lecteos como queso
quesito queso crema
Continuar con el estudio de estos microorganismos y caracterizarlos
molecularmente ademas de estudiar su capacidad de adherencja a fa mucosa
intestinal sobre algunes Hneas celulares como las CaCo~2
Estudiarel efedo de la avena sabre la viabiJidad del Lactobacillus breyis a una
concentraci6n mayor de 05
Realizer ensayos can las cepas de Lactobacillus brevis y Lactobrlcillus pJantarum
para elaborar masas acidas para panificacion reemplazando el Bromato de
Potasio aditivo prohibido desde marzo del 2003 en nuestro pais per 5U toxicidad
59
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65
ANEXOS
66
ANEXO A RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AlSLADA DE i
PEPINO it
Referencia Pepino 1 Fecha 06122002
IEXCELENTE IDENTIFICACION
Latto plantarum 1
Galeria API 50 CHL V50 Leida el 06122002
Perfil - -- - ++ - -- - ++++ - - -+- + - I I I I I I I I +t+ - +f- ~ - - + + ~ - - - +- + - shy
o - GLY - ERY DARA - LARA + RIB + DXYL - LXYL - ADO - MDX - GAL + GLU + FRU + MNE + SBE - RHA - DUL - INO bull MAN + SOR - MDM + MUG shyNAG + AMY + ARB + ESC + SAL + CEL + MAL + LAC + MEL + SAC + TRE + 1NU - MLZ + RAF + AMD - GLYG - XLT - GEN + TIJR + LYX - TAG - DFUC shyLFUC - DARL + LARL - aNT + 2KG - 5KG shy
--- Taxones significativos rd -----T -- Tests en contra
Lactoplantarum 1 999 092 1
Taxon siguiente Lactobrevis 1 OJ 044 3
i i
Lactoplantarum 1 1 test (5) en contra
D-SORBITOL (SOR) 78
Tax6n siguiente Lactobrevis 1 3 test (s) ert contra
METHYLD-MANNOSIDE (MOlM) 0 MELEZITOSE (MLZ) 14 D-TURANOSE (TUR) 14
67
ampb
ANEXO B RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AISLADA DE REPOLLO FERMENTADO
~
Referencia Repollo fermentado - 3 Fecha 03072003
EXCELENTE IDENTIFICACION
Lactoplantarum 1
Galena API 50 CRL V50 Leida el 03072003
Perfil - - ++ - - - - -H++ - - ~ + - + - I I 1 I I I I -H+ - ++ - - - + + - -- - - + - shy
o - GLY - ERY - DARA - LARA + RIB + DXYL - LXYL - ADO ~ MDX - GAL + GLU + FRU + MNE + SBE ~ RHA - DUL - INO - MAN + SOR - MDM + MDG shyNAG + AMY + ARR + ESC + SAT + CRL + MAL + LAC + MEL + SAC + TRE + lNU - MLZ + RAF + AMI) - GLYG - XLT - GEN + TOR + LYX - TAG - DFUC shyLFUC - DARL - LARL - GNT + 2KG - 5KG shy
------Taxones significativos _ _----- Id--- ---T---- Tests en contra
Lactoplantarum 1 999 095 1
Tax6n siguiente Lactobrevis 1 01 OA8 3
lJactoplantaru01 1 1 test (s) en contra
DSORBITOL (SOR) 78
Taxon siguiente Lactobrevis
METHYL-D-MANNOSIDE D-TURANOSE
1
(MOM) (TOR)
3 test (5) en contra
0 MELEZITOSE 14
(MLZ) 14
i
I
68
ANEXO C RESULTADO PRUEBAS BIOQUWICAS DE CEPA AISLADA DE MUCOSA HUMANA
Referenda Mucosa - 5 Fecha 27012003
BUENA IDENTlFICACION
Galeria API 50 CHL vso Leida el 270112003
Perfil - - - - +t--t - - - + - + - - - - - - - - -+- - - - - + - + - - - - - - - - - - - - - bull - - -+ - +
o - GLY ~ ERY - DARA bull LARA + RID + DXYL + LXYL - ADO bull MDX - GAL + OLU - FRU + MNE - SBE - IlliA - DUL - INa - MAN - SOR - MDM - MOO shyNAG + AMY - ARB - ESC ~ SAL bull CEL - MAL + lAC - MEL + SAC - TRE shyINU - MLZ - RAF - AMD - GLYG - XLT - GEN - 11JR - LYX - TAG - DFUC shyLFUC - DARL - IARL - ONT + 2KO - 5KG +
- - - - - - Taxones significativos - - - - - - - Id T -- Test en contra
Lactobrevis 3 963 088 1
Taxon siguiente Lactoco11inoides 36 075 2
Lactobrevis 3 1 test (s) en contra
GLUCOSE (GLU) 95
-~~~------------~---------------------------~--~-------~--~-----~----------~--------~------------~~--Taxon siguiente Lactocollinoides 2 test (s) en contra
GLUCOSE (GLU) 100 MELIBIOSE (MEL) 25
69
i r
ANEXO D RESULTADO PRUEBAS BIOQIJiMICAS DE CEPA AISLADA DE LECHE FERMENTADA
Referenda Leche fennentada ~ 13 Fecha 27012003
BUENA IDENTIFICACI6N
Galeria API 50 CHL V50 Leida el 270112003
Perfil - - - - -t-t+- - - - + - + - - - bull - - - - -+- - - - - + - + - - - - - - - - - - - - - - - - -+ - +
0 - GLY - ERY - DARA - LARA +Rll3 + DXYL + LXYL - ADO - MDX ~GAL + GLU - FRU + MNE SBE - RHA DUL bull INO MAN - SOR MDM bull MDG shy
~NAG + AMY - ARB - ESC - SAL - CEL - MAL + LAC - MEL + SAC - TRE I lNU - MLZ - RAF - AMD - GLYG - XLT - OEN - IUR LYX - TAG - DFUC bull i
LFUC - DARL - LARL -ONr + 2KG - SKO + 1
- -- - - Taxones significativos - - Id -- T --- Test en contra
Lacta brevis 3 963 088 1
Taxon siguiente Lactocollinoides 36 075 2
Lactobrevis 3 1 test (s) en contra
GLUCOSE (GLU) 95
-----------------------------------------------------------~------------------------------~-------------------Taxon siguiente Lactocollinoides 2 test (s) en contra
GLUCOSE (GLD) 100 MELffiIOSE (MEL) 25
70
II iJ1
I
I ANEXO E RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AISLADA DE REPOLLITAS DE BRUSELAS FERMENTADA
Referencia repollitas de bruselas 15 Fecha 03072003
EXCELENTE IDENTIFICACION
Lactoplantarum 1
Galeria API 50 CHL vsO Leida el 03072003
Perfil - - - - +t - - - - +H+ - +- - +t + - I I I I I I I f ++t - + - - - -+ + - - - -+ -+ - - I ij
o - GLY - ERY - DARA - LARA + RJB + DXYL - LXYL - ADO - MDX - GAL +
GLU + FRU + MNE + SBE RHA + DUL - INO - MAN + SOR + MDM + MOG shyNAG + AMY + ARB + ESC + SAL + eEL + MAL + LAC + MEl + SAC + TRE + i
I1NU - MLZ + RAF AMD GLYG - XLT - aEN + TUR + LYX - TAG - Druc LFUC - DARt + LARL - aNT + 2KG - 5KG shy n ----Taxones significativos ------ Id Tests en contra
Lactoplantarum 1 999 090 o
Taxon siguiente Lacto pentosus 01 012 7
Lactoplantarum 1 o test (s) en contra
Taxon siguiente Lacto pentosus 7 test (8) en contra
GLYCEROL (GLY) 75 D-XYLOSE (DXYL) 100 L-RHAMNOSE (RHA) 25 METHYL-D-MANNOSIDE (MOM) 1 MELEZITOSE (MLZ) 25 RAFFINOSE (RAF) 75 D-ARABITOL (DARL) 0
71
~
I i I
ANEXO F - ANALISIS DE REGRESION PARA pH EN BEBIDA SIN AVENA
Aruilisis de regresi6n polinomial
---~-~-------------------------------------------~-----------~~---------------------~--------------Variable dependiente pHSinAvena ---------------------------~-------------~--------------------~---------------------------------
Error T Parametro Estimado Estandar Estadistico P-Valor
CONSTANTE 535606 0094535 56657 00000 Dia -0150565 0020706 727154 00000 Dia2 000504434 0000871488 578819 00001
---~---------------------------------------------------------------------------------------------------
Anfllisis de Variama -------------------------------------------~-----------~-----------------------------~-~--- jSource Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor 11
------------------------~------------------------------------------------------------------------------~ Mod-elo 155772 2 0118861 4256 00000 Residual 0237877 13 00182983
Total (Corr) 11956 IS
R2 == 867522 percent
pHSinAvena == 535606 - 0150565Dia + 000504434Dia2
72
____
middot ANEXO G - ANALISIS DE REGRESION PARA pH EN BEBIDA CON AVENA
AmUisis de regresion polinomial _____~_____~__-_____~___4____________________bull____bull__________bull_____________~~----_------___________
Variable depcndiente pHConA vena ------------------------------------------------------------------------------------------~--------
Error T Parametro Estimado StAndar Estadfstico P-Valor
---------------------------------------------~-----------------------------------------------_---------CONSTANTE 534463 00801045 667208 00000 Dia -0140407 00175453 800253 00000 DiaA 2 000448098 0000738458 606803 00000
----------------------~---~-----------------------------~------------------------------~----AmUisis de Varianza
---~---------------------------------~---------------------~------------~-------------------~------Source Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio PValor --------------------------~-----------------------------------------------~------------~-----~~--~ ModeJo 159575 2 0797873 6073 00000 Residual 02170798 middot13 00131383 _______~_~ ~_~----------~------~--~-----~-M-----~-----____ _____________~-----------------------Total (COlT) 176654 15
R12 903315 percent
-----------~------------------------------------------------------------------------~-----------pHConAvena 534463 - 0140407Dia + 000448098DfaA 2
73
ANEXO H - ANALTSIS DE REGRESTON PARA ACIDEZ EN BEBJDA SIN AVENA
An8Jisis de Regtesi6fi P6lifJomial
Variable Depefidiefile~ AcidezSinAVenll _______________w_____~______~________________~-----------_________~_________________~~____~___~_____
Error T Pariirnetro Estimado Estandar Estadistico ---------------------------------------~--------------~-~-------~--------------------~------------CONSTANT 0491697 00123217 399051 00000 Dia 00436032 000269882 161564 00000 D1a2 -000144613 000011359 127312 00000 __w___~________________________~-_______-_____~----____________________________~__~---~_--__~___
AriiiJisis de varianza ~_~__~__________~_~____~________~___________- _________e_____________________________bull _____-________
Source Smn de cuadr Df Mean Square F-Ratio PmiddotValor_~~___________________________________bull ______~___________bull ____________bull ______~________w________________
Model 0135203 2 00676013 21747 00000 Residual 000404118 13 000031086
Total (Corr) 0139244 15
R2 970978 percent
AcidezSlnAvena 0491697 + O0436032Dia - 0OOl44613Dia2
74
I
ANEXO I ANALISIS DE REGRESION PARA ACIDEZ EN BEBIDA CON AVENA
1
Anwisis de tegtesi6fi polinomial
Variable dependiente Acidez Con Avena
Error T ParametTo Estimado Stlindar Estadfstico P-Valor ----------------~-------~---------------------~-----------------------------------------------------CONSTANT 0491639 000926607 530578 00000 Diamiddot 00406572 000202955 200326 00000 DfaA 2 0000982559 0000085421 -115025 00000
-------------~----------------------------~-------------------------~-----------------------------------
-------------~-----~~-----------------------------~---------------------------------------------_--Source Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio PValor
-~-------------~----------------------------------~------------------~~-------------------------- Modelo 0288008 2 0144004 81914 00000 Residual 000228539 13 0000175799
----------~~--------------~---------------------------------------------~---------------------------Total (Corr) 0290294 15
RA2 = 992127 percent
-------------------------~----~---~------------~---------------------------------~---------------~
AcidezConAvena == 049163amp + 00406572D1a - 0000982559DiaA2
75
I
(Ilmiddot il
ANEXO J- ANALISIS DE REGRESION PARA RECUENTO LACTOBACILOS PARA BEBIDA SIN AVENA
Amilisis de regresion - Modelo lineal Y = a + bX
------------------------~----------------------~-----------------------------~----------~-----------Variable Dcpendiente LactobacilJusSinAvena Variable independiente Dia
I--------~----------~-----------------------------------~-------~-~--~--------------------------~-Error T
Paramctro Estimado Standard Stadistico P-Valor
----~----~------------~-----~-----------------------~-------------~-----------------------------Intereepto 117347 0389973 300911 00000 Pendiente 00483464 00257889 18747 00903
Analisis de Varianza
---------~------------------~----------------~---------------------------------~---------~----------Source Sum decuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor
------------~---------------------~---------------------~--------------------------------~-----~----Modelo 0916252 1 244835 443 00616 Residual 260706 10 0260706
--~------------~---~------------------~~~-----~-------~---------~~-------------------------------------Total (Corr)352332 11
Coeficiente Correlaci6n = 0509955 R2 = 260054 percent
LactobacillusSinAvena= 117347 + 00483464Dfa
76
ANEXO K- ANALTSIS DE REGRESION PARA RECUENTO LACTOBACILOS PARA DEBIDA CON AVENA
Aruilisis de regresion - Modelo lineal Y = a + hX
Variable Dependiente LactobacillusConAvena Variable Independiente Dia ---~--------------------------------------------------------__-----------__--_--_-----------shy
Error T Paramctro Estimado Standard Estadistico P-Valor -~--------------------------------------------------------------------------------------------------
Irttercepto 118103 0567963 207942 00000 Pendiente 00790304 00375594 210414 00616
-----------------~----------------------------~----~-------~----~----------------------------
Analisis de Varianza
----------------~----------------~------------------~--------------------------~------~--------shySource Swn de cuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor
-----------------~--~--------------------------------------------------------------------------~---~ Mode10 244835 1 244835 443 00616 Residual 552997 10 0552997
Total (Corr)797832 11
Coeficiente Correlacion = 0553964 RI2 = 306875 percent
-----~--------------------------------------------------------~--------------------------------------
LactobacillusConAvena = 118103 + 00790304Dfas
77
Figura 6 Lactobacillus brevis Gram + aislado de leche fermentada
Ai observar en placa las celulas de lactobacilos despues de real1zar las pruebas
de resistenCia a la acidez y sales biliares se observo una tendencia a aglomerarse
posiblemente como un mecanismo de proteccion cOlitra estos medios que pueden
lIegar a ser adversos para elias (Ver figuras 7 y 8)
47
Figura 7 Lactobacillus brevis aislada de leche fermentada despu~s de la prueba de resistencia a pH=2
Figura 8 Lactobacillus brevis aislada de leche fermentada despues de la prueba de resistencie asales biUares 03 plv
fI
48
35 --Seguimiento del-pH-en-la-bebidaJacteacon y sin -prebi6tico
A continuacion se muestran las Tablas 7 y 8 donde sa registian los datos
recopilados de pHdurante 10$ dras Z 7 14 Y21 para las bebidas laaeas con ysin
prebi6tioo
TABLA 1 ResultadopH yogur sin avena
Dia Repetition 1 Repetici6n 2 Repeticion 3 Repetici6n 4
2 526 501 51 52
7 446 433 438 44
14 439 435 437 436
21 439 437 438 437
TABLA 8 -ResultadopHyogur con avena
Dia Repeticion 1 Repeticion2 Repeticion 3 - Repeticion 4
2 509 523 51 515
7 447 442 445 442
14 436 -438 439 437
21 432 433 435 434
Observando la Figura 9podamos ver que el pH en el -dfado$ para los dos
tratamientos as igual y empieza a descender rapidamente para estabilizarse a
partir del dra 7(Ver figura 9)
49
Figura 9 Comparacj6n de medias para -el pH
Comparaci6n de medias para pH
55 ~ 5 +----=gtIIIi-~i~~----=-r--it~ -- pH sin avena
a 45 1--~~~~=~~ 4 --- pH con
avena35 t-----r-- -------=------=--= ------- - ----
2 7 14 21
Dias
Aplicando la prueba t para comparar las medias de pH I S6 muestia una diferencia
altamants significativa en los dos tratamientos para el dia 21 (pltO05)
(Ver tabla 9)
TABLA 9 Compaiaci6n de medias para pH
DtAS SIN AVENA CON AVENA te p (VALOR)
2 514 514 0 10
7 439 444 -1 61 0159
14 437 I
438 -070 0510
21 438 433 528 00019 shy
- DiFERENCIA AlTAMENTE SIGNIFICATIVA
50
I
AI aplicar regrasi6n a los datos sa obtiene al modelo estimado
pHSinAyena =535606 - 01505650Ia +0005044340IaI2
La variabilidad en la respuesta de pH asta siendo explicada en un 8S7522 por
el modelo (Ver Anexo F)
EI tratamiento con avena mostro el siguiente modelo al analisis de ragresi6n
pHConAvena =534463 ~ 0140407Dia + 0004480980Ia2
La variabilidad an la respuesta de pH asta siendo explicada en un 903315 par
el nlodelo(Ver anexo G)
36 Seguimiento de la acidezmiddotmiddot expresada comomiddot de acido
lactico
A continuaci6n sa muestran las Tablas 10 y 11 donde sa registran los datos
tecopilados de acidezmiddotdurante los dias 27 14 Y 21 para las pebidas taetees con y
sin prebi6tico
TABLA 10 Resuttadode acidez (expresadocomo acido tactico) yogurt sin avena
CIA R~petici6n1 Repeticion2 Repetici6n 3 Repeticion 4
2 054 06 057 058
7 072 074 073 0]2
14 080 083 082 082
21 0]4 079 078 077
51
TABLA 11 Resultado de aCidez (expresado como acido Icktico) yogurt con avena
Dia Repetici6n 1 RepetiCi6n 2 Repetici6n 3 Repetici9n 4
2 059 055 058 057
7 071 073 072 072
14 089 087 088 086
21 092 091 090 091
Observando la Figura 10 se puede concluir que la acidez empieza a aumentar
hasta el dia 14 y luego trata de estabilizarse para los dos tratamientos
(Ver figura 10)
Figura 10 Comparaci6n de medias para la acidez
N G)
Comparacion de medias para acidez
1
2 0I 5 -+--=--------=-~~~= u
ltC
- Acidez sin avena
2 7 14
Dias
52
21
-it- Acidez con avena
Aplicando la prueba t para camparar las madias de acidez se muestra una
diferencia altarnante significativa en los dos tratamiantos para los dias 14 y 21
(pltO05)
(Var tabla 12)
TABLA 12Comparaci6n de medias para Acidez
DIASmiddot SIN AVENA CON AVENA te p(VALOR)
2 0572 0572 0 10
7 0727 0720 119 0278
14 0818 0875 -638 000070shy
21 077 091 -1212 i 0000019 shy
DIFERENCIA AL TAMENTE SlGNIFICATIVA
AI aplicar r~gresi6n a los datos se obtiene el modelo estimado
AcidezSlnAIena = 0491897 + O0436032Dia O00144613DfaA2
La variabilidad en la respuesta de acidez asta siendoexplicada en un 970978
por al modelo (Ver anexo H)
EI tratamiento con avena mostro elsiguiente modeloj a1 analisis de regresion
AcidezConAvena = 0491638 + 00406572Oia - OQOO982559OiaA2
La variabilidad enla respuesta acidez esta siendo explicadaen un 99212 por
el modelo (Ver anexo J)
53
I ~
37 Prueba de viabiJidad
A continuaci6n sa muestran las Tab~as 13 y 14 donde sa presentan los datos
recopilados del recuento de Lactobacilos durante los dias 7 14 Y 21 para las
bebidas lacteas con y sin prebi6tico
TABLA 13 Recuento de Lactobacilos (UFCml) yogurt sin avena
Dia Repetici6n 1 Repetici6n 2 Repeticion 3 Reptttici6n 4
7 1880X10l1 1454X1011 1642X1011 1780X10~
14 1560X10~ 646X1011J 1890X10l 140X10l1
21 1200x10lu 128Ox10u 1745x10J 1520x101V
TABLA 14 Recuento de Lactobacilos (UFCml) yogurt con avena
Dfa Repetieion 1 Repetici6n 2 Repeticion 3 Repeticf6n 4
7 1600X10lt 1240X10t 1640X10ll 1980X10t
14 540X1011 427X10n 546X10n 720X10ll
21 500x1011 492x1011 712)(1011 980x10~
AI analizar la Figura 11 sa puede observar un recuento mayor de Lactobacilos
en al tratamiento con avena resultado de acuerdo a 10 encontrado por Alander at
aI 1999 Kontula et aI 1998 y Jaskari et aI 1998
54
Figura 11 Comparaci6n de medias para Log Lactobacillus
Comparacion de medias para log Lactobacillus
~ 1350
-+- Sac Sin--() 13 co avenaIII
bull 125 -- Bac con 0)
0 12 avenaJ
115 7 14 21
Dias
Aplicando la prueba t para comparar las medias de recuento de Lactobacillus no
se encontr6 una diferenc1a estadfsUcamente significative entre los dos
tratamientos (Ver tabla 15)
Este aumento en al racuento influy6 en la disminuci6n del pH y en el aumento de
fa aeidez por la fermentacion que realizan los Lactobacillus sobre fa lactosa de la
lache y la avena adicionada como prebi6tico
55
1
TABLA 15 Comparaci6n medias lag Lactobacillus
DIAS SIN AVENA CON AVENA tc p(VALOR)
7 122257 122022 04846 06451
14 121065 132393 -19602 00977
21 129025 133087 -08236 04416
At aplicar regresion a los datos se obtiane al modelo astimado
LactobacillusSinAvena= 117347 + 004834640Ia
La variabilidad en la respuesta del recuento de LactobaCillus ssta siendo
explicada en un 260054 por el mod$loVar anexo J)
EI tratamiento con avena mostr6 al siguiente modalo al anal isis de regresion
Lactobacillu$ConAvena =118103 + 007903040Ias
La variabilidad en la respuesta de recuento esta siendo explicada en un 3068
por al modelo(Ver anexo K)~
38 Analisi$ microbiol6gicos de las bebidas lacteas con y sin
En la Tabla 16 estan recopilados los resultados microbiol6gieos obtenidos en ras
muestras con los dos tratamientos (con y sin avena)
I [
sa
TABLA 16 Resultados analisis microbiologico
Recuento de mohos y levaduras Iml lt10
Recuento de Staphylococcus coagulase positiva Iml lt100
NMP coliformes fotales y Escherichia coli Iml lt3
Presencia de Salmonella25ml Ausente
Los resultados de este analisis demuestran que las bebidas fermentadas con y
sin avena~ astan fibres de microorganismos patogenos
57
1
4 CONCLUSIONES
Se aislaron cepas nativas de Lactobacillus plantarum de las muestras vegetates
de repollo pepino repollitas de bruselas fermentadas y Lactobacillus brevis de
lache fermentada y mucosa vaginal humana Ambas cepas resistieran un pH=2 y
una concentraci6n de sales biliares det 03 ptv dos earacteristicas importantes
en los probi6ticos
Lamiddot cepa de Lactobacillus brevis aislada de lache Sa utiliz6 para elaborar una
bebida fermentada sin y con avana comoingrediente prebiotico obteniendose un
aJimento centon recuento del probi6tico viable durante 21 dras de seguimiento
ademas libre de microorganismos )at6gen05
No se encontr6 efecta significativo de la avena sobre Ie viabilidad del Lactobacillus
brevis aunque sa presento un aumento en 61 recuento de estos en la bebida con
avena
58
plusmn ~
5 RECOMENDACIONES
Ensayar la cepa de Lactobacillus plantartJm en productos carnicos madurados
como el salami
Ensayar la cepa de Lactobacillus l)revs en otros derivados lecteos como queso
quesito queso crema
Continuar con el estudio de estos microorganismos y caracterizarlos
molecularmente ademas de estudiar su capacidad de adherencja a fa mucosa
intestinal sobre algunes Hneas celulares como las CaCo~2
Estudiarel efedo de la avena sabre la viabiJidad del Lactobacillus breyis a una
concentraci6n mayor de 05
Realizer ensayos can las cepas de Lactobacillus brevis y Lactobrlcillus pJantarum
para elaborar masas acidas para panificacion reemplazando el Bromato de
Potasio aditivo prohibido desde marzo del 2003 en nuestro pais per 5U toxicidad
59
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65
ANEXOS
66
ANEXO A RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AlSLADA DE i
PEPINO it
Referencia Pepino 1 Fecha 06122002
IEXCELENTE IDENTIFICACION
Latto plantarum 1
Galeria API 50 CHL V50 Leida el 06122002
Perfil - -- - ++ - -- - ++++ - - -+- + - I I I I I I I I +t+ - +f- ~ - - + + ~ - - - +- + - shy
o - GLY - ERY DARA - LARA + RIB + DXYL - LXYL - ADO - MDX - GAL + GLU + FRU + MNE + SBE - RHA - DUL - INO bull MAN + SOR - MDM + MUG shyNAG + AMY + ARB + ESC + SAL + CEL + MAL + LAC + MEL + SAC + TRE + 1NU - MLZ + RAF + AMD - GLYG - XLT - GEN + TIJR + LYX - TAG - DFUC shyLFUC - DARL + LARL - aNT + 2KG - 5KG shy
--- Taxones significativos rd -----T -- Tests en contra
Lactoplantarum 1 999 092 1
Taxon siguiente Lactobrevis 1 OJ 044 3
i i
Lactoplantarum 1 1 test (5) en contra
D-SORBITOL (SOR) 78
Tax6n siguiente Lactobrevis 1 3 test (s) ert contra
METHYLD-MANNOSIDE (MOlM) 0 MELEZITOSE (MLZ) 14 D-TURANOSE (TUR) 14
67
ampb
ANEXO B RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AISLADA DE REPOLLO FERMENTADO
~
Referencia Repollo fermentado - 3 Fecha 03072003
EXCELENTE IDENTIFICACION
Lactoplantarum 1
Galena API 50 CRL V50 Leida el 03072003
Perfil - - ++ - - - - -H++ - - ~ + - + - I I 1 I I I I -H+ - ++ - - - + + - -- - - + - shy
o - GLY - ERY - DARA - LARA + RIB + DXYL - LXYL - ADO ~ MDX - GAL + GLU + FRU + MNE + SBE ~ RHA - DUL - INO - MAN + SOR - MDM + MDG shyNAG + AMY + ARR + ESC + SAT + CRL + MAL + LAC + MEL + SAC + TRE + lNU - MLZ + RAF + AMI) - GLYG - XLT - GEN + TOR + LYX - TAG - DFUC shyLFUC - DARL - LARL - GNT + 2KG - 5KG shy
------Taxones significativos _ _----- Id--- ---T---- Tests en contra
Lactoplantarum 1 999 095 1
Tax6n siguiente Lactobrevis 1 01 OA8 3
lJactoplantaru01 1 1 test (s) en contra
DSORBITOL (SOR) 78
Taxon siguiente Lactobrevis
METHYL-D-MANNOSIDE D-TURANOSE
1
(MOM) (TOR)
3 test (5) en contra
0 MELEZITOSE 14
(MLZ) 14
i
I
68
ANEXO C RESULTADO PRUEBAS BIOQUWICAS DE CEPA AISLADA DE MUCOSA HUMANA
Referenda Mucosa - 5 Fecha 27012003
BUENA IDENTlFICACION
Galeria API 50 CHL vso Leida el 270112003
Perfil - - - - +t--t - - - + - + - - - - - - - - -+- - - - - + - + - - - - - - - - - - - - - bull - - -+ - +
o - GLY ~ ERY - DARA bull LARA + RID + DXYL + LXYL - ADO bull MDX - GAL + OLU - FRU + MNE - SBE - IlliA - DUL - INa - MAN - SOR - MDM - MOO shyNAG + AMY - ARB - ESC ~ SAL bull CEL - MAL + lAC - MEL + SAC - TRE shyINU - MLZ - RAF - AMD - GLYG - XLT - GEN - 11JR - LYX - TAG - DFUC shyLFUC - DARL - IARL - ONT + 2KO - 5KG +
- - - - - - Taxones significativos - - - - - - - Id T -- Test en contra
Lactobrevis 3 963 088 1
Taxon siguiente Lactoco11inoides 36 075 2
Lactobrevis 3 1 test (s) en contra
GLUCOSE (GLU) 95
-~~~------------~---------------------------~--~-------~--~-----~----------~--------~------------~~--Taxon siguiente Lactocollinoides 2 test (s) en contra
GLUCOSE (GLU) 100 MELIBIOSE (MEL) 25
69
i r
ANEXO D RESULTADO PRUEBAS BIOQIJiMICAS DE CEPA AISLADA DE LECHE FERMENTADA
Referenda Leche fennentada ~ 13 Fecha 27012003
BUENA IDENTIFICACI6N
Galeria API 50 CHL V50 Leida el 270112003
Perfil - - - - -t-t+- - - - + - + - - - bull - - - - -+- - - - - + - + - - - - - - - - - - - - - - - - -+ - +
0 - GLY - ERY - DARA - LARA +Rll3 + DXYL + LXYL - ADO - MDX ~GAL + GLU - FRU + MNE SBE - RHA DUL bull INO MAN - SOR MDM bull MDG shy
~NAG + AMY - ARB - ESC - SAL - CEL - MAL + LAC - MEL + SAC - TRE I lNU - MLZ - RAF - AMD - GLYG - XLT - OEN - IUR LYX - TAG - DFUC bull i
LFUC - DARL - LARL -ONr + 2KG - SKO + 1
- -- - - Taxones significativos - - Id -- T --- Test en contra
Lacta brevis 3 963 088 1
Taxon siguiente Lactocollinoides 36 075 2
Lactobrevis 3 1 test (s) en contra
GLUCOSE (GLU) 95
-----------------------------------------------------------~------------------------------~-------------------Taxon siguiente Lactocollinoides 2 test (s) en contra
GLUCOSE (GLD) 100 MELffiIOSE (MEL) 25
70
II iJ1
I
I ANEXO E RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AISLADA DE REPOLLITAS DE BRUSELAS FERMENTADA
Referencia repollitas de bruselas 15 Fecha 03072003
EXCELENTE IDENTIFICACION
Lactoplantarum 1
Galeria API 50 CHL vsO Leida el 03072003
Perfil - - - - +t - - - - +H+ - +- - +t + - I I I I I I I f ++t - + - - - -+ + - - - -+ -+ - - I ij
o - GLY - ERY - DARA - LARA + RJB + DXYL - LXYL - ADO - MDX - GAL +
GLU + FRU + MNE + SBE RHA + DUL - INO - MAN + SOR + MDM + MOG shyNAG + AMY + ARB + ESC + SAL + eEL + MAL + LAC + MEl + SAC + TRE + i
I1NU - MLZ + RAF AMD GLYG - XLT - aEN + TUR + LYX - TAG - Druc LFUC - DARt + LARL - aNT + 2KG - 5KG shy n ----Taxones significativos ------ Id Tests en contra
Lactoplantarum 1 999 090 o
Taxon siguiente Lacto pentosus 01 012 7
Lactoplantarum 1 o test (s) en contra
Taxon siguiente Lacto pentosus 7 test (8) en contra
GLYCEROL (GLY) 75 D-XYLOSE (DXYL) 100 L-RHAMNOSE (RHA) 25 METHYL-D-MANNOSIDE (MOM) 1 MELEZITOSE (MLZ) 25 RAFFINOSE (RAF) 75 D-ARABITOL (DARL) 0
71
~
I i I
ANEXO F - ANALISIS DE REGRESION PARA pH EN BEBIDA SIN AVENA
Aruilisis de regresi6n polinomial
---~-~-------------------------------------------~-----------~~---------------------~--------------Variable dependiente pHSinAvena ---------------------------~-------------~--------------------~---------------------------------
Error T Parametro Estimado Estandar Estadistico P-Valor
CONSTANTE 535606 0094535 56657 00000 Dia -0150565 0020706 727154 00000 Dia2 000504434 0000871488 578819 00001
---~---------------------------------------------------------------------------------------------------
Anfllisis de Variama -------------------------------------------~-----------~-----------------------------~-~--- jSource Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor 11
------------------------~------------------------------------------------------------------------------~ Mod-elo 155772 2 0118861 4256 00000 Residual 0237877 13 00182983
Total (Corr) 11956 IS
R2 == 867522 percent
pHSinAvena == 535606 - 0150565Dia + 000504434Dia2
72
____
middot ANEXO G - ANALISIS DE REGRESION PARA pH EN BEBIDA CON AVENA
AmUisis de regresion polinomial _____~_____~__-_____~___4____________________bull____bull__________bull_____________~~----_------___________
Variable depcndiente pHConA vena ------------------------------------------------------------------------------------------~--------
Error T Parametro Estimado StAndar Estadfstico P-Valor
---------------------------------------------~-----------------------------------------------_---------CONSTANTE 534463 00801045 667208 00000 Dia -0140407 00175453 800253 00000 DiaA 2 000448098 0000738458 606803 00000
----------------------~---~-----------------------------~------------------------------~----AmUisis de Varianza
---~---------------------------------~---------------------~------------~-------------------~------Source Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio PValor --------------------------~-----------------------------------------------~------------~-----~~--~ ModeJo 159575 2 0797873 6073 00000 Residual 02170798 middot13 00131383 _______~_~ ~_~----------~------~--~-----~-M-----~-----____ _____________~-----------------------Total (COlT) 176654 15
R12 903315 percent
-----------~------------------------------------------------------------------------~-----------pHConAvena 534463 - 0140407Dia + 000448098DfaA 2
73
ANEXO H - ANALTSIS DE REGRESTON PARA ACIDEZ EN BEBJDA SIN AVENA
An8Jisis de Regtesi6fi P6lifJomial
Variable Depefidiefile~ AcidezSinAVenll _______________w_____~______~________________~-----------_________~_________________~~____~___~_____
Error T Pariirnetro Estimado Estandar Estadistico ---------------------------------------~--------------~-~-------~--------------------~------------CONSTANT 0491697 00123217 399051 00000 Dia 00436032 000269882 161564 00000 D1a2 -000144613 000011359 127312 00000 __w___~________________________~-_______-_____~----____________________________~__~---~_--__~___
AriiiJisis de varianza ~_~__~__________~_~____~________~___________- _________e_____________________________bull _____-________
Source Smn de cuadr Df Mean Square F-Ratio PmiddotValor_~~___________________________________bull ______~___________bull ____________bull ______~________w________________
Model 0135203 2 00676013 21747 00000 Residual 000404118 13 000031086
Total (Corr) 0139244 15
R2 970978 percent
AcidezSlnAvena 0491697 + O0436032Dia - 0OOl44613Dia2
74
I
ANEXO I ANALISIS DE REGRESION PARA ACIDEZ EN BEBIDA CON AVENA
1
Anwisis de tegtesi6fi polinomial
Variable dependiente Acidez Con Avena
Error T ParametTo Estimado Stlindar Estadfstico P-Valor ----------------~-------~---------------------~-----------------------------------------------------CONSTANT 0491639 000926607 530578 00000 Diamiddot 00406572 000202955 200326 00000 DfaA 2 0000982559 0000085421 -115025 00000
-------------~----------------------------~-------------------------~-----------------------------------
-------------~-----~~-----------------------------~---------------------------------------------_--Source Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio PValor
-~-------------~----------------------------------~------------------~~-------------------------- Modelo 0288008 2 0144004 81914 00000 Residual 000228539 13 0000175799
----------~~--------------~---------------------------------------------~---------------------------Total (Corr) 0290294 15
RA2 = 992127 percent
-------------------------~----~---~------------~---------------------------------~---------------~
AcidezConAvena == 049163amp + 00406572D1a - 0000982559DiaA2
75
I
(Ilmiddot il
ANEXO J- ANALISIS DE REGRESION PARA RECUENTO LACTOBACILOS PARA BEBIDA SIN AVENA
Amilisis de regresion - Modelo lineal Y = a + bX
------------------------~----------------------~-----------------------------~----------~-----------Variable Dcpendiente LactobacilJusSinAvena Variable independiente Dia
I--------~----------~-----------------------------------~-------~-~--~--------------------------~-Error T
Paramctro Estimado Standard Stadistico P-Valor
----~----~------------~-----~-----------------------~-------------~-----------------------------Intereepto 117347 0389973 300911 00000 Pendiente 00483464 00257889 18747 00903
Analisis de Varianza
---------~------------------~----------------~---------------------------------~---------~----------Source Sum decuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor
------------~---------------------~---------------------~--------------------------------~-----~----Modelo 0916252 1 244835 443 00616 Residual 260706 10 0260706
--~------------~---~------------------~~~-----~-------~---------~~-------------------------------------Total (Corr)352332 11
Coeficiente Correlaci6n = 0509955 R2 = 260054 percent
LactobacillusSinAvena= 117347 + 00483464Dfa
76
ANEXO K- ANALTSIS DE REGRESION PARA RECUENTO LACTOBACILOS PARA DEBIDA CON AVENA
Aruilisis de regresion - Modelo lineal Y = a + hX
Variable Dependiente LactobacillusConAvena Variable Independiente Dia ---~--------------------------------------------------------__-----------__--_--_-----------shy
Error T Paramctro Estimado Standard Estadistico P-Valor -~--------------------------------------------------------------------------------------------------
Irttercepto 118103 0567963 207942 00000 Pendiente 00790304 00375594 210414 00616
-----------------~----------------------------~----~-------~----~----------------------------
Analisis de Varianza
----------------~----------------~------------------~--------------------------~------~--------shySource Swn de cuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor
-----------------~--~--------------------------------------------------------------------------~---~ Mode10 244835 1 244835 443 00616 Residual 552997 10 0552997
Total (Corr)797832 11
Coeficiente Correlacion = 0553964 RI2 = 306875 percent
-----~--------------------------------------------------------~--------------------------------------
LactobacillusConAvena = 118103 + 00790304Dfas
77
Figura 7 Lactobacillus brevis aislada de leche fermentada despu~s de la prueba de resistencia a pH=2
Figura 8 Lactobacillus brevis aislada de leche fermentada despues de la prueba de resistencie asales biUares 03 plv
fI
48
35 --Seguimiento del-pH-en-la-bebidaJacteacon y sin -prebi6tico
A continuacion se muestran las Tablas 7 y 8 donde sa registian los datos
recopilados de pHdurante 10$ dras Z 7 14 Y21 para las bebidas laaeas con ysin
prebi6tioo
TABLA 1 ResultadopH yogur sin avena
Dia Repetition 1 Repetici6n 2 Repeticion 3 Repetici6n 4
2 526 501 51 52
7 446 433 438 44
14 439 435 437 436
21 439 437 438 437
TABLA 8 -ResultadopHyogur con avena
Dia Repeticion 1 Repeticion2 Repeticion 3 - Repeticion 4
2 509 523 51 515
7 447 442 445 442
14 436 -438 439 437
21 432 433 435 434
Observando la Figura 9podamos ver que el pH en el -dfado$ para los dos
tratamientos as igual y empieza a descender rapidamente para estabilizarse a
partir del dra 7(Ver figura 9)
49
Figura 9 Comparacj6n de medias para -el pH
Comparaci6n de medias para pH
55 ~ 5 +----=gtIIIi-~i~~----=-r--it~ -- pH sin avena
a 45 1--~~~~=~~ 4 --- pH con
avena35 t-----r-- -------=------=--= ------- - ----
2 7 14 21
Dias
Aplicando la prueba t para comparar las medias de pH I S6 muestia una diferencia
altamants significativa en los dos tratamientos para el dia 21 (pltO05)
(Ver tabla 9)
TABLA 9 Compaiaci6n de medias para pH
DtAS SIN AVENA CON AVENA te p (VALOR)
2 514 514 0 10
7 439 444 -1 61 0159
14 437 I
438 -070 0510
21 438 433 528 00019 shy
- DiFERENCIA AlTAMENTE SIGNIFICATIVA
50
I
AI aplicar regrasi6n a los datos sa obtiene al modelo estimado
pHSinAyena =535606 - 01505650Ia +0005044340IaI2
La variabilidad en la respuesta de pH asta siendo explicada en un 8S7522 por
el modelo (Ver Anexo F)
EI tratamiento con avena mostro el siguiente modelo al analisis de ragresi6n
pHConAvena =534463 ~ 0140407Dia + 0004480980Ia2
La variabilidad an la respuesta de pH asta siendo explicada en un 903315 par
el nlodelo(Ver anexo G)
36 Seguimiento de la acidezmiddotmiddot expresada comomiddot de acido
lactico
A continuaci6n sa muestran las Tablas 10 y 11 donde sa registran los datos
tecopilados de acidezmiddotdurante los dias 27 14 Y 21 para las pebidas taetees con y
sin prebi6tico
TABLA 10 Resuttadode acidez (expresadocomo acido tactico) yogurt sin avena
CIA R~petici6n1 Repeticion2 Repetici6n 3 Repeticion 4
2 054 06 057 058
7 072 074 073 0]2
14 080 083 082 082
21 0]4 079 078 077
51
TABLA 11 Resultado de aCidez (expresado como acido Icktico) yogurt con avena
Dia Repetici6n 1 RepetiCi6n 2 Repetici6n 3 Repetici9n 4
2 059 055 058 057
7 071 073 072 072
14 089 087 088 086
21 092 091 090 091
Observando la Figura 10 se puede concluir que la acidez empieza a aumentar
hasta el dia 14 y luego trata de estabilizarse para los dos tratamientos
(Ver figura 10)
Figura 10 Comparaci6n de medias para la acidez
N G)
Comparacion de medias para acidez
1
2 0I 5 -+--=--------=-~~~= u
ltC
- Acidez sin avena
2 7 14
Dias
52
21
-it- Acidez con avena
Aplicando la prueba t para camparar las madias de acidez se muestra una
diferencia altarnante significativa en los dos tratamiantos para los dias 14 y 21
(pltO05)
(Var tabla 12)
TABLA 12Comparaci6n de medias para Acidez
DIASmiddot SIN AVENA CON AVENA te p(VALOR)
2 0572 0572 0 10
7 0727 0720 119 0278
14 0818 0875 -638 000070shy
21 077 091 -1212 i 0000019 shy
DIFERENCIA AL TAMENTE SlGNIFICATIVA
AI aplicar r~gresi6n a los datos se obtiene el modelo estimado
AcidezSlnAIena = 0491897 + O0436032Dia O00144613DfaA2
La variabilidad en la respuesta de acidez asta siendoexplicada en un 970978
por al modelo (Ver anexo H)
EI tratamiento con avena mostro elsiguiente modeloj a1 analisis de regresion
AcidezConAvena = 0491638 + 00406572Oia - OQOO982559OiaA2
La variabilidad enla respuesta acidez esta siendo explicadaen un 99212 por
el modelo (Ver anexo J)
53
I ~
37 Prueba de viabiJidad
A continuaci6n sa muestran las Tab~as 13 y 14 donde sa presentan los datos
recopilados del recuento de Lactobacilos durante los dias 7 14 Y 21 para las
bebidas lacteas con y sin prebi6tico
TABLA 13 Recuento de Lactobacilos (UFCml) yogurt sin avena
Dia Repetici6n 1 Repetici6n 2 Repeticion 3 Reptttici6n 4
7 1880X10l1 1454X1011 1642X1011 1780X10~
14 1560X10~ 646X1011J 1890X10l 140X10l1
21 1200x10lu 128Ox10u 1745x10J 1520x101V
TABLA 14 Recuento de Lactobacilos (UFCml) yogurt con avena
Dfa Repetieion 1 Repetici6n 2 Repeticion 3 Repeticf6n 4
7 1600X10lt 1240X10t 1640X10ll 1980X10t
14 540X1011 427X10n 546X10n 720X10ll
21 500x1011 492x1011 712)(1011 980x10~
AI analizar la Figura 11 sa puede observar un recuento mayor de Lactobacilos
en al tratamiento con avena resultado de acuerdo a 10 encontrado por Alander at
aI 1999 Kontula et aI 1998 y Jaskari et aI 1998
54
Figura 11 Comparaci6n de medias para Log Lactobacillus
Comparacion de medias para log Lactobacillus
~ 1350
-+- Sac Sin--() 13 co avenaIII
bull 125 -- Bac con 0)
0 12 avenaJ
115 7 14 21
Dias
Aplicando la prueba t para comparar las medias de recuento de Lactobacillus no
se encontr6 una diferenc1a estadfsUcamente significative entre los dos
tratamientos (Ver tabla 15)
Este aumento en al racuento influy6 en la disminuci6n del pH y en el aumento de
fa aeidez por la fermentacion que realizan los Lactobacillus sobre fa lactosa de la
lache y la avena adicionada como prebi6tico
55
1
TABLA 15 Comparaci6n medias lag Lactobacillus
DIAS SIN AVENA CON AVENA tc p(VALOR)
7 122257 122022 04846 06451
14 121065 132393 -19602 00977
21 129025 133087 -08236 04416
At aplicar regresion a los datos se obtiane al modelo astimado
LactobacillusSinAvena= 117347 + 004834640Ia
La variabilidad en la respuesta del recuento de LactobaCillus ssta siendo
explicada en un 260054 por el mod$loVar anexo J)
EI tratamiento con avena mostr6 al siguiente modalo al anal isis de regresion
Lactobacillu$ConAvena =118103 + 007903040Ias
La variabilidad en la respuesta de recuento esta siendo explicada en un 3068
por al modelo(Ver anexo K)~
38 Analisi$ microbiol6gicos de las bebidas lacteas con y sin
En la Tabla 16 estan recopilados los resultados microbiol6gieos obtenidos en ras
muestras con los dos tratamientos (con y sin avena)
I [
sa
TABLA 16 Resultados analisis microbiologico
Recuento de mohos y levaduras Iml lt10
Recuento de Staphylococcus coagulase positiva Iml lt100
NMP coliformes fotales y Escherichia coli Iml lt3
Presencia de Salmonella25ml Ausente
Los resultados de este analisis demuestran que las bebidas fermentadas con y
sin avena~ astan fibres de microorganismos patogenos
57
1
4 CONCLUSIONES
Se aislaron cepas nativas de Lactobacillus plantarum de las muestras vegetates
de repollo pepino repollitas de bruselas fermentadas y Lactobacillus brevis de
lache fermentada y mucosa vaginal humana Ambas cepas resistieran un pH=2 y
una concentraci6n de sales biliares det 03 ptv dos earacteristicas importantes
en los probi6ticos
Lamiddot cepa de Lactobacillus brevis aislada de lache Sa utiliz6 para elaborar una
bebida fermentada sin y con avana comoingrediente prebiotico obteniendose un
aJimento centon recuento del probi6tico viable durante 21 dras de seguimiento
ademas libre de microorganismos )at6gen05
No se encontr6 efecta significativo de la avena sobre Ie viabilidad del Lactobacillus
brevis aunque sa presento un aumento en 61 recuento de estos en la bebida con
avena
58
plusmn ~
5 RECOMENDACIONES
Ensayar la cepa de Lactobacillus plantartJm en productos carnicos madurados
como el salami
Ensayar la cepa de Lactobacillus l)revs en otros derivados lecteos como queso
quesito queso crema
Continuar con el estudio de estos microorganismos y caracterizarlos
molecularmente ademas de estudiar su capacidad de adherencja a fa mucosa
intestinal sobre algunes Hneas celulares como las CaCo~2
Estudiarel efedo de la avena sabre la viabiJidad del Lactobacillus breyis a una
concentraci6n mayor de 05
Realizer ensayos can las cepas de Lactobacillus brevis y Lactobrlcillus pJantarum
para elaborar masas acidas para panificacion reemplazando el Bromato de
Potasio aditivo prohibido desde marzo del 2003 en nuestro pais per 5U toxicidad
59
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65
ANEXOS
66
ANEXO A RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AlSLADA DE i
PEPINO it
Referencia Pepino 1 Fecha 06122002
IEXCELENTE IDENTIFICACION
Latto plantarum 1
Galeria API 50 CHL V50 Leida el 06122002
Perfil - -- - ++ - -- - ++++ - - -+- + - I I I I I I I I +t+ - +f- ~ - - + + ~ - - - +- + - shy
o - GLY - ERY DARA - LARA + RIB + DXYL - LXYL - ADO - MDX - GAL + GLU + FRU + MNE + SBE - RHA - DUL - INO bull MAN + SOR - MDM + MUG shyNAG + AMY + ARB + ESC + SAL + CEL + MAL + LAC + MEL + SAC + TRE + 1NU - MLZ + RAF + AMD - GLYG - XLT - GEN + TIJR + LYX - TAG - DFUC shyLFUC - DARL + LARL - aNT + 2KG - 5KG shy
--- Taxones significativos rd -----T -- Tests en contra
Lactoplantarum 1 999 092 1
Taxon siguiente Lactobrevis 1 OJ 044 3
i i
Lactoplantarum 1 1 test (5) en contra
D-SORBITOL (SOR) 78
Tax6n siguiente Lactobrevis 1 3 test (s) ert contra
METHYLD-MANNOSIDE (MOlM) 0 MELEZITOSE (MLZ) 14 D-TURANOSE (TUR) 14
67
ampb
ANEXO B RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AISLADA DE REPOLLO FERMENTADO
~
Referencia Repollo fermentado - 3 Fecha 03072003
EXCELENTE IDENTIFICACION
Lactoplantarum 1
Galena API 50 CRL V50 Leida el 03072003
Perfil - - ++ - - - - -H++ - - ~ + - + - I I 1 I I I I -H+ - ++ - - - + + - -- - - + - shy
o - GLY - ERY - DARA - LARA + RIB + DXYL - LXYL - ADO ~ MDX - GAL + GLU + FRU + MNE + SBE ~ RHA - DUL - INO - MAN + SOR - MDM + MDG shyNAG + AMY + ARR + ESC + SAT + CRL + MAL + LAC + MEL + SAC + TRE + lNU - MLZ + RAF + AMI) - GLYG - XLT - GEN + TOR + LYX - TAG - DFUC shyLFUC - DARL - LARL - GNT + 2KG - 5KG shy
------Taxones significativos _ _----- Id--- ---T---- Tests en contra
Lactoplantarum 1 999 095 1
Tax6n siguiente Lactobrevis 1 01 OA8 3
lJactoplantaru01 1 1 test (s) en contra
DSORBITOL (SOR) 78
Taxon siguiente Lactobrevis
METHYL-D-MANNOSIDE D-TURANOSE
1
(MOM) (TOR)
3 test (5) en contra
0 MELEZITOSE 14
(MLZ) 14
i
I
68
ANEXO C RESULTADO PRUEBAS BIOQUWICAS DE CEPA AISLADA DE MUCOSA HUMANA
Referenda Mucosa - 5 Fecha 27012003
BUENA IDENTlFICACION
Galeria API 50 CHL vso Leida el 270112003
Perfil - - - - +t--t - - - + - + - - - - - - - - -+- - - - - + - + - - - - - - - - - - - - - bull - - -+ - +
o - GLY ~ ERY - DARA bull LARA + RID + DXYL + LXYL - ADO bull MDX - GAL + OLU - FRU + MNE - SBE - IlliA - DUL - INa - MAN - SOR - MDM - MOO shyNAG + AMY - ARB - ESC ~ SAL bull CEL - MAL + lAC - MEL + SAC - TRE shyINU - MLZ - RAF - AMD - GLYG - XLT - GEN - 11JR - LYX - TAG - DFUC shyLFUC - DARL - IARL - ONT + 2KO - 5KG +
- - - - - - Taxones significativos - - - - - - - Id T -- Test en contra
Lactobrevis 3 963 088 1
Taxon siguiente Lactoco11inoides 36 075 2
Lactobrevis 3 1 test (s) en contra
GLUCOSE (GLU) 95
-~~~------------~---------------------------~--~-------~--~-----~----------~--------~------------~~--Taxon siguiente Lactocollinoides 2 test (s) en contra
GLUCOSE (GLU) 100 MELIBIOSE (MEL) 25
69
i r
ANEXO D RESULTADO PRUEBAS BIOQIJiMICAS DE CEPA AISLADA DE LECHE FERMENTADA
Referenda Leche fennentada ~ 13 Fecha 27012003
BUENA IDENTIFICACI6N
Galeria API 50 CHL V50 Leida el 270112003
Perfil - - - - -t-t+- - - - + - + - - - bull - - - - -+- - - - - + - + - - - - - - - - - - - - - - - - -+ - +
0 - GLY - ERY - DARA - LARA +Rll3 + DXYL + LXYL - ADO - MDX ~GAL + GLU - FRU + MNE SBE - RHA DUL bull INO MAN - SOR MDM bull MDG shy
~NAG + AMY - ARB - ESC - SAL - CEL - MAL + LAC - MEL + SAC - TRE I lNU - MLZ - RAF - AMD - GLYG - XLT - OEN - IUR LYX - TAG - DFUC bull i
LFUC - DARL - LARL -ONr + 2KG - SKO + 1
- -- - - Taxones significativos - - Id -- T --- Test en contra
Lacta brevis 3 963 088 1
Taxon siguiente Lactocollinoides 36 075 2
Lactobrevis 3 1 test (s) en contra
GLUCOSE (GLU) 95
-----------------------------------------------------------~------------------------------~-------------------Taxon siguiente Lactocollinoides 2 test (s) en contra
GLUCOSE (GLD) 100 MELffiIOSE (MEL) 25
70
II iJ1
I
I ANEXO E RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AISLADA DE REPOLLITAS DE BRUSELAS FERMENTADA
Referencia repollitas de bruselas 15 Fecha 03072003
EXCELENTE IDENTIFICACION
Lactoplantarum 1
Galeria API 50 CHL vsO Leida el 03072003
Perfil - - - - +t - - - - +H+ - +- - +t + - I I I I I I I f ++t - + - - - -+ + - - - -+ -+ - - I ij
o - GLY - ERY - DARA - LARA + RJB + DXYL - LXYL - ADO - MDX - GAL +
GLU + FRU + MNE + SBE RHA + DUL - INO - MAN + SOR + MDM + MOG shyNAG + AMY + ARB + ESC + SAL + eEL + MAL + LAC + MEl + SAC + TRE + i
I1NU - MLZ + RAF AMD GLYG - XLT - aEN + TUR + LYX - TAG - Druc LFUC - DARt + LARL - aNT + 2KG - 5KG shy n ----Taxones significativos ------ Id Tests en contra
Lactoplantarum 1 999 090 o
Taxon siguiente Lacto pentosus 01 012 7
Lactoplantarum 1 o test (s) en contra
Taxon siguiente Lacto pentosus 7 test (8) en contra
GLYCEROL (GLY) 75 D-XYLOSE (DXYL) 100 L-RHAMNOSE (RHA) 25 METHYL-D-MANNOSIDE (MOM) 1 MELEZITOSE (MLZ) 25 RAFFINOSE (RAF) 75 D-ARABITOL (DARL) 0
71
~
I i I
ANEXO F - ANALISIS DE REGRESION PARA pH EN BEBIDA SIN AVENA
Aruilisis de regresi6n polinomial
---~-~-------------------------------------------~-----------~~---------------------~--------------Variable dependiente pHSinAvena ---------------------------~-------------~--------------------~---------------------------------
Error T Parametro Estimado Estandar Estadistico P-Valor
CONSTANTE 535606 0094535 56657 00000 Dia -0150565 0020706 727154 00000 Dia2 000504434 0000871488 578819 00001
---~---------------------------------------------------------------------------------------------------
Anfllisis de Variama -------------------------------------------~-----------~-----------------------------~-~--- jSource Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor 11
------------------------~------------------------------------------------------------------------------~ Mod-elo 155772 2 0118861 4256 00000 Residual 0237877 13 00182983
Total (Corr) 11956 IS
R2 == 867522 percent
pHSinAvena == 535606 - 0150565Dia + 000504434Dia2
72
____
middot ANEXO G - ANALISIS DE REGRESION PARA pH EN BEBIDA CON AVENA
AmUisis de regresion polinomial _____~_____~__-_____~___4____________________bull____bull__________bull_____________~~----_------___________
Variable depcndiente pHConA vena ------------------------------------------------------------------------------------------~--------
Error T Parametro Estimado StAndar Estadfstico P-Valor
---------------------------------------------~-----------------------------------------------_---------CONSTANTE 534463 00801045 667208 00000 Dia -0140407 00175453 800253 00000 DiaA 2 000448098 0000738458 606803 00000
----------------------~---~-----------------------------~------------------------------~----AmUisis de Varianza
---~---------------------------------~---------------------~------------~-------------------~------Source Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio PValor --------------------------~-----------------------------------------------~------------~-----~~--~ ModeJo 159575 2 0797873 6073 00000 Residual 02170798 middot13 00131383 _______~_~ ~_~----------~------~--~-----~-M-----~-----____ _____________~-----------------------Total (COlT) 176654 15
R12 903315 percent
-----------~------------------------------------------------------------------------~-----------pHConAvena 534463 - 0140407Dia + 000448098DfaA 2
73
ANEXO H - ANALTSIS DE REGRESTON PARA ACIDEZ EN BEBJDA SIN AVENA
An8Jisis de Regtesi6fi P6lifJomial
Variable Depefidiefile~ AcidezSinAVenll _______________w_____~______~________________~-----------_________~_________________~~____~___~_____
Error T Pariirnetro Estimado Estandar Estadistico ---------------------------------------~--------------~-~-------~--------------------~------------CONSTANT 0491697 00123217 399051 00000 Dia 00436032 000269882 161564 00000 D1a2 -000144613 000011359 127312 00000 __w___~________________________~-_______-_____~----____________________________~__~---~_--__~___
AriiiJisis de varianza ~_~__~__________~_~____~________~___________- _________e_____________________________bull _____-________
Source Smn de cuadr Df Mean Square F-Ratio PmiddotValor_~~___________________________________bull ______~___________bull ____________bull ______~________w________________
Model 0135203 2 00676013 21747 00000 Residual 000404118 13 000031086
Total (Corr) 0139244 15
R2 970978 percent
AcidezSlnAvena 0491697 + O0436032Dia - 0OOl44613Dia2
74
I
ANEXO I ANALISIS DE REGRESION PARA ACIDEZ EN BEBIDA CON AVENA
1
Anwisis de tegtesi6fi polinomial
Variable dependiente Acidez Con Avena
Error T ParametTo Estimado Stlindar Estadfstico P-Valor ----------------~-------~---------------------~-----------------------------------------------------CONSTANT 0491639 000926607 530578 00000 Diamiddot 00406572 000202955 200326 00000 DfaA 2 0000982559 0000085421 -115025 00000
-------------~----------------------------~-------------------------~-----------------------------------
-------------~-----~~-----------------------------~---------------------------------------------_--Source Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio PValor
-~-------------~----------------------------------~------------------~~-------------------------- Modelo 0288008 2 0144004 81914 00000 Residual 000228539 13 0000175799
----------~~--------------~---------------------------------------------~---------------------------Total (Corr) 0290294 15
RA2 = 992127 percent
-------------------------~----~---~------------~---------------------------------~---------------~
AcidezConAvena == 049163amp + 00406572D1a - 0000982559DiaA2
75
I
(Ilmiddot il
ANEXO J- ANALISIS DE REGRESION PARA RECUENTO LACTOBACILOS PARA BEBIDA SIN AVENA
Amilisis de regresion - Modelo lineal Y = a + bX
------------------------~----------------------~-----------------------------~----------~-----------Variable Dcpendiente LactobacilJusSinAvena Variable independiente Dia
I--------~----------~-----------------------------------~-------~-~--~--------------------------~-Error T
Paramctro Estimado Standard Stadistico P-Valor
----~----~------------~-----~-----------------------~-------------~-----------------------------Intereepto 117347 0389973 300911 00000 Pendiente 00483464 00257889 18747 00903
Analisis de Varianza
---------~------------------~----------------~---------------------------------~---------~----------Source Sum decuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor
------------~---------------------~---------------------~--------------------------------~-----~----Modelo 0916252 1 244835 443 00616 Residual 260706 10 0260706
--~------------~---~------------------~~~-----~-------~---------~~-------------------------------------Total (Corr)352332 11
Coeficiente Correlaci6n = 0509955 R2 = 260054 percent
LactobacillusSinAvena= 117347 + 00483464Dfa
76
ANEXO K- ANALTSIS DE REGRESION PARA RECUENTO LACTOBACILOS PARA DEBIDA CON AVENA
Aruilisis de regresion - Modelo lineal Y = a + hX
Variable Dependiente LactobacillusConAvena Variable Independiente Dia ---~--------------------------------------------------------__-----------__--_--_-----------shy
Error T Paramctro Estimado Standard Estadistico P-Valor -~--------------------------------------------------------------------------------------------------
Irttercepto 118103 0567963 207942 00000 Pendiente 00790304 00375594 210414 00616
-----------------~----------------------------~----~-------~----~----------------------------
Analisis de Varianza
----------------~----------------~------------------~--------------------------~------~--------shySource Swn de cuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor
-----------------~--~--------------------------------------------------------------------------~---~ Mode10 244835 1 244835 443 00616 Residual 552997 10 0552997
Total (Corr)797832 11
Coeficiente Correlacion = 0553964 RI2 = 306875 percent
-----~--------------------------------------------------------~--------------------------------------
LactobacillusConAvena = 118103 + 00790304Dfas
77
35 --Seguimiento del-pH-en-la-bebidaJacteacon y sin -prebi6tico
A continuacion se muestran las Tablas 7 y 8 donde sa registian los datos
recopilados de pHdurante 10$ dras Z 7 14 Y21 para las bebidas laaeas con ysin
prebi6tioo
TABLA 1 ResultadopH yogur sin avena
Dia Repetition 1 Repetici6n 2 Repeticion 3 Repetici6n 4
2 526 501 51 52
7 446 433 438 44
14 439 435 437 436
21 439 437 438 437
TABLA 8 -ResultadopHyogur con avena
Dia Repeticion 1 Repeticion2 Repeticion 3 - Repeticion 4
2 509 523 51 515
7 447 442 445 442
14 436 -438 439 437
21 432 433 435 434
Observando la Figura 9podamos ver que el pH en el -dfado$ para los dos
tratamientos as igual y empieza a descender rapidamente para estabilizarse a
partir del dra 7(Ver figura 9)
49
Figura 9 Comparacj6n de medias para -el pH
Comparaci6n de medias para pH
55 ~ 5 +----=gtIIIi-~i~~----=-r--it~ -- pH sin avena
a 45 1--~~~~=~~ 4 --- pH con
avena35 t-----r-- -------=------=--= ------- - ----
2 7 14 21
Dias
Aplicando la prueba t para comparar las medias de pH I S6 muestia una diferencia
altamants significativa en los dos tratamientos para el dia 21 (pltO05)
(Ver tabla 9)
TABLA 9 Compaiaci6n de medias para pH
DtAS SIN AVENA CON AVENA te p (VALOR)
2 514 514 0 10
7 439 444 -1 61 0159
14 437 I
438 -070 0510
21 438 433 528 00019 shy
- DiFERENCIA AlTAMENTE SIGNIFICATIVA
50
I
AI aplicar regrasi6n a los datos sa obtiene al modelo estimado
pHSinAyena =535606 - 01505650Ia +0005044340IaI2
La variabilidad en la respuesta de pH asta siendo explicada en un 8S7522 por
el modelo (Ver Anexo F)
EI tratamiento con avena mostro el siguiente modelo al analisis de ragresi6n
pHConAvena =534463 ~ 0140407Dia + 0004480980Ia2
La variabilidad an la respuesta de pH asta siendo explicada en un 903315 par
el nlodelo(Ver anexo G)
36 Seguimiento de la acidezmiddotmiddot expresada comomiddot de acido
lactico
A continuaci6n sa muestran las Tablas 10 y 11 donde sa registran los datos
tecopilados de acidezmiddotdurante los dias 27 14 Y 21 para las pebidas taetees con y
sin prebi6tico
TABLA 10 Resuttadode acidez (expresadocomo acido tactico) yogurt sin avena
CIA R~petici6n1 Repeticion2 Repetici6n 3 Repeticion 4
2 054 06 057 058
7 072 074 073 0]2
14 080 083 082 082
21 0]4 079 078 077
51
TABLA 11 Resultado de aCidez (expresado como acido Icktico) yogurt con avena
Dia Repetici6n 1 RepetiCi6n 2 Repetici6n 3 Repetici9n 4
2 059 055 058 057
7 071 073 072 072
14 089 087 088 086
21 092 091 090 091
Observando la Figura 10 se puede concluir que la acidez empieza a aumentar
hasta el dia 14 y luego trata de estabilizarse para los dos tratamientos
(Ver figura 10)
Figura 10 Comparaci6n de medias para la acidez
N G)
Comparacion de medias para acidez
1
2 0I 5 -+--=--------=-~~~= u
ltC
- Acidez sin avena
2 7 14
Dias
52
21
-it- Acidez con avena
Aplicando la prueba t para camparar las madias de acidez se muestra una
diferencia altarnante significativa en los dos tratamiantos para los dias 14 y 21
(pltO05)
(Var tabla 12)
TABLA 12Comparaci6n de medias para Acidez
DIASmiddot SIN AVENA CON AVENA te p(VALOR)
2 0572 0572 0 10
7 0727 0720 119 0278
14 0818 0875 -638 000070shy
21 077 091 -1212 i 0000019 shy
DIFERENCIA AL TAMENTE SlGNIFICATIVA
AI aplicar r~gresi6n a los datos se obtiene el modelo estimado
AcidezSlnAIena = 0491897 + O0436032Dia O00144613DfaA2
La variabilidad en la respuesta de acidez asta siendoexplicada en un 970978
por al modelo (Ver anexo H)
EI tratamiento con avena mostro elsiguiente modeloj a1 analisis de regresion
AcidezConAvena = 0491638 + 00406572Oia - OQOO982559OiaA2
La variabilidad enla respuesta acidez esta siendo explicadaen un 99212 por
el modelo (Ver anexo J)
53
I ~
37 Prueba de viabiJidad
A continuaci6n sa muestran las Tab~as 13 y 14 donde sa presentan los datos
recopilados del recuento de Lactobacilos durante los dias 7 14 Y 21 para las
bebidas lacteas con y sin prebi6tico
TABLA 13 Recuento de Lactobacilos (UFCml) yogurt sin avena
Dia Repetici6n 1 Repetici6n 2 Repeticion 3 Reptttici6n 4
7 1880X10l1 1454X1011 1642X1011 1780X10~
14 1560X10~ 646X1011J 1890X10l 140X10l1
21 1200x10lu 128Ox10u 1745x10J 1520x101V
TABLA 14 Recuento de Lactobacilos (UFCml) yogurt con avena
Dfa Repetieion 1 Repetici6n 2 Repeticion 3 Repeticf6n 4
7 1600X10lt 1240X10t 1640X10ll 1980X10t
14 540X1011 427X10n 546X10n 720X10ll
21 500x1011 492x1011 712)(1011 980x10~
AI analizar la Figura 11 sa puede observar un recuento mayor de Lactobacilos
en al tratamiento con avena resultado de acuerdo a 10 encontrado por Alander at
aI 1999 Kontula et aI 1998 y Jaskari et aI 1998
54
Figura 11 Comparaci6n de medias para Log Lactobacillus
Comparacion de medias para log Lactobacillus
~ 1350
-+- Sac Sin--() 13 co avenaIII
bull 125 -- Bac con 0)
0 12 avenaJ
115 7 14 21
Dias
Aplicando la prueba t para comparar las medias de recuento de Lactobacillus no
se encontr6 una diferenc1a estadfsUcamente significative entre los dos
tratamientos (Ver tabla 15)
Este aumento en al racuento influy6 en la disminuci6n del pH y en el aumento de
fa aeidez por la fermentacion que realizan los Lactobacillus sobre fa lactosa de la
lache y la avena adicionada como prebi6tico
55
1
TABLA 15 Comparaci6n medias lag Lactobacillus
DIAS SIN AVENA CON AVENA tc p(VALOR)
7 122257 122022 04846 06451
14 121065 132393 -19602 00977
21 129025 133087 -08236 04416
At aplicar regresion a los datos se obtiane al modelo astimado
LactobacillusSinAvena= 117347 + 004834640Ia
La variabilidad en la respuesta del recuento de LactobaCillus ssta siendo
explicada en un 260054 por el mod$loVar anexo J)
EI tratamiento con avena mostr6 al siguiente modalo al anal isis de regresion
Lactobacillu$ConAvena =118103 + 007903040Ias
La variabilidad en la respuesta de recuento esta siendo explicada en un 3068
por al modelo(Ver anexo K)~
38 Analisi$ microbiol6gicos de las bebidas lacteas con y sin
En la Tabla 16 estan recopilados los resultados microbiol6gieos obtenidos en ras
muestras con los dos tratamientos (con y sin avena)
I [
sa
TABLA 16 Resultados analisis microbiologico
Recuento de mohos y levaduras Iml lt10
Recuento de Staphylococcus coagulase positiva Iml lt100
NMP coliformes fotales y Escherichia coli Iml lt3
Presencia de Salmonella25ml Ausente
Los resultados de este analisis demuestran que las bebidas fermentadas con y
sin avena~ astan fibres de microorganismos patogenos
57
1
4 CONCLUSIONES
Se aislaron cepas nativas de Lactobacillus plantarum de las muestras vegetates
de repollo pepino repollitas de bruselas fermentadas y Lactobacillus brevis de
lache fermentada y mucosa vaginal humana Ambas cepas resistieran un pH=2 y
una concentraci6n de sales biliares det 03 ptv dos earacteristicas importantes
en los probi6ticos
Lamiddot cepa de Lactobacillus brevis aislada de lache Sa utiliz6 para elaborar una
bebida fermentada sin y con avana comoingrediente prebiotico obteniendose un
aJimento centon recuento del probi6tico viable durante 21 dras de seguimiento
ademas libre de microorganismos )at6gen05
No se encontr6 efecta significativo de la avena sobre Ie viabilidad del Lactobacillus
brevis aunque sa presento un aumento en 61 recuento de estos en la bebida con
avena
58
plusmn ~
5 RECOMENDACIONES
Ensayar la cepa de Lactobacillus plantartJm en productos carnicos madurados
como el salami
Ensayar la cepa de Lactobacillus l)revs en otros derivados lecteos como queso
quesito queso crema
Continuar con el estudio de estos microorganismos y caracterizarlos
molecularmente ademas de estudiar su capacidad de adherencja a fa mucosa
intestinal sobre algunes Hneas celulares como las CaCo~2
Estudiarel efedo de la avena sabre la viabiJidad del Lactobacillus breyis a una
concentraci6n mayor de 05
Realizer ensayos can las cepas de Lactobacillus brevis y Lactobrlcillus pJantarum
para elaborar masas acidas para panificacion reemplazando el Bromato de
Potasio aditivo prohibido desde marzo del 2003 en nuestro pais per 5U toxicidad
59
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65
ANEXOS
66
ANEXO A RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AlSLADA DE i
PEPINO it
Referencia Pepino 1 Fecha 06122002
IEXCELENTE IDENTIFICACION
Latto plantarum 1
Galeria API 50 CHL V50 Leida el 06122002
Perfil - -- - ++ - -- - ++++ - - -+- + - I I I I I I I I +t+ - +f- ~ - - + + ~ - - - +- + - shy
o - GLY - ERY DARA - LARA + RIB + DXYL - LXYL - ADO - MDX - GAL + GLU + FRU + MNE + SBE - RHA - DUL - INO bull MAN + SOR - MDM + MUG shyNAG + AMY + ARB + ESC + SAL + CEL + MAL + LAC + MEL + SAC + TRE + 1NU - MLZ + RAF + AMD - GLYG - XLT - GEN + TIJR + LYX - TAG - DFUC shyLFUC - DARL + LARL - aNT + 2KG - 5KG shy
--- Taxones significativos rd -----T -- Tests en contra
Lactoplantarum 1 999 092 1
Taxon siguiente Lactobrevis 1 OJ 044 3
i i
Lactoplantarum 1 1 test (5) en contra
D-SORBITOL (SOR) 78
Tax6n siguiente Lactobrevis 1 3 test (s) ert contra
METHYLD-MANNOSIDE (MOlM) 0 MELEZITOSE (MLZ) 14 D-TURANOSE (TUR) 14
67
ampb
ANEXO B RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AISLADA DE REPOLLO FERMENTADO
~
Referencia Repollo fermentado - 3 Fecha 03072003
EXCELENTE IDENTIFICACION
Lactoplantarum 1
Galena API 50 CRL V50 Leida el 03072003
Perfil - - ++ - - - - -H++ - - ~ + - + - I I 1 I I I I -H+ - ++ - - - + + - -- - - + - shy
o - GLY - ERY - DARA - LARA + RIB + DXYL - LXYL - ADO ~ MDX - GAL + GLU + FRU + MNE + SBE ~ RHA - DUL - INO - MAN + SOR - MDM + MDG shyNAG + AMY + ARR + ESC + SAT + CRL + MAL + LAC + MEL + SAC + TRE + lNU - MLZ + RAF + AMI) - GLYG - XLT - GEN + TOR + LYX - TAG - DFUC shyLFUC - DARL - LARL - GNT + 2KG - 5KG shy
------Taxones significativos _ _----- Id--- ---T---- Tests en contra
Lactoplantarum 1 999 095 1
Tax6n siguiente Lactobrevis 1 01 OA8 3
lJactoplantaru01 1 1 test (s) en contra
DSORBITOL (SOR) 78
Taxon siguiente Lactobrevis
METHYL-D-MANNOSIDE D-TURANOSE
1
(MOM) (TOR)
3 test (5) en contra
0 MELEZITOSE 14
(MLZ) 14
i
I
68
ANEXO C RESULTADO PRUEBAS BIOQUWICAS DE CEPA AISLADA DE MUCOSA HUMANA
Referenda Mucosa - 5 Fecha 27012003
BUENA IDENTlFICACION
Galeria API 50 CHL vso Leida el 270112003
Perfil - - - - +t--t - - - + - + - - - - - - - - -+- - - - - + - + - - - - - - - - - - - - - bull - - -+ - +
o - GLY ~ ERY - DARA bull LARA + RID + DXYL + LXYL - ADO bull MDX - GAL + OLU - FRU + MNE - SBE - IlliA - DUL - INa - MAN - SOR - MDM - MOO shyNAG + AMY - ARB - ESC ~ SAL bull CEL - MAL + lAC - MEL + SAC - TRE shyINU - MLZ - RAF - AMD - GLYG - XLT - GEN - 11JR - LYX - TAG - DFUC shyLFUC - DARL - IARL - ONT + 2KO - 5KG +
- - - - - - Taxones significativos - - - - - - - Id T -- Test en contra
Lactobrevis 3 963 088 1
Taxon siguiente Lactoco11inoides 36 075 2
Lactobrevis 3 1 test (s) en contra
GLUCOSE (GLU) 95
-~~~------------~---------------------------~--~-------~--~-----~----------~--------~------------~~--Taxon siguiente Lactocollinoides 2 test (s) en contra
GLUCOSE (GLU) 100 MELIBIOSE (MEL) 25
69
i r
ANEXO D RESULTADO PRUEBAS BIOQIJiMICAS DE CEPA AISLADA DE LECHE FERMENTADA
Referenda Leche fennentada ~ 13 Fecha 27012003
BUENA IDENTIFICACI6N
Galeria API 50 CHL V50 Leida el 270112003
Perfil - - - - -t-t+- - - - + - + - - - bull - - - - -+- - - - - + - + - - - - - - - - - - - - - - - - -+ - +
0 - GLY - ERY - DARA - LARA +Rll3 + DXYL + LXYL - ADO - MDX ~GAL + GLU - FRU + MNE SBE - RHA DUL bull INO MAN - SOR MDM bull MDG shy
~NAG + AMY - ARB - ESC - SAL - CEL - MAL + LAC - MEL + SAC - TRE I lNU - MLZ - RAF - AMD - GLYG - XLT - OEN - IUR LYX - TAG - DFUC bull i
LFUC - DARL - LARL -ONr + 2KG - SKO + 1
- -- - - Taxones significativos - - Id -- T --- Test en contra
Lacta brevis 3 963 088 1
Taxon siguiente Lactocollinoides 36 075 2
Lactobrevis 3 1 test (s) en contra
GLUCOSE (GLU) 95
-----------------------------------------------------------~------------------------------~-------------------Taxon siguiente Lactocollinoides 2 test (s) en contra
GLUCOSE (GLD) 100 MELffiIOSE (MEL) 25
70
II iJ1
I
I ANEXO E RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AISLADA DE REPOLLITAS DE BRUSELAS FERMENTADA
Referencia repollitas de bruselas 15 Fecha 03072003
EXCELENTE IDENTIFICACION
Lactoplantarum 1
Galeria API 50 CHL vsO Leida el 03072003
Perfil - - - - +t - - - - +H+ - +- - +t + - I I I I I I I f ++t - + - - - -+ + - - - -+ -+ - - I ij
o - GLY - ERY - DARA - LARA + RJB + DXYL - LXYL - ADO - MDX - GAL +
GLU + FRU + MNE + SBE RHA + DUL - INO - MAN + SOR + MDM + MOG shyNAG + AMY + ARB + ESC + SAL + eEL + MAL + LAC + MEl + SAC + TRE + i
I1NU - MLZ + RAF AMD GLYG - XLT - aEN + TUR + LYX - TAG - Druc LFUC - DARt + LARL - aNT + 2KG - 5KG shy n ----Taxones significativos ------ Id Tests en contra
Lactoplantarum 1 999 090 o
Taxon siguiente Lacto pentosus 01 012 7
Lactoplantarum 1 o test (s) en contra
Taxon siguiente Lacto pentosus 7 test (8) en contra
GLYCEROL (GLY) 75 D-XYLOSE (DXYL) 100 L-RHAMNOSE (RHA) 25 METHYL-D-MANNOSIDE (MOM) 1 MELEZITOSE (MLZ) 25 RAFFINOSE (RAF) 75 D-ARABITOL (DARL) 0
71
~
I i I
ANEXO F - ANALISIS DE REGRESION PARA pH EN BEBIDA SIN AVENA
Aruilisis de regresi6n polinomial
---~-~-------------------------------------------~-----------~~---------------------~--------------Variable dependiente pHSinAvena ---------------------------~-------------~--------------------~---------------------------------
Error T Parametro Estimado Estandar Estadistico P-Valor
CONSTANTE 535606 0094535 56657 00000 Dia -0150565 0020706 727154 00000 Dia2 000504434 0000871488 578819 00001
---~---------------------------------------------------------------------------------------------------
Anfllisis de Variama -------------------------------------------~-----------~-----------------------------~-~--- jSource Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor 11
------------------------~------------------------------------------------------------------------------~ Mod-elo 155772 2 0118861 4256 00000 Residual 0237877 13 00182983
Total (Corr) 11956 IS
R2 == 867522 percent
pHSinAvena == 535606 - 0150565Dia + 000504434Dia2
72
____
middot ANEXO G - ANALISIS DE REGRESION PARA pH EN BEBIDA CON AVENA
AmUisis de regresion polinomial _____~_____~__-_____~___4____________________bull____bull__________bull_____________~~----_------___________
Variable depcndiente pHConA vena ------------------------------------------------------------------------------------------~--------
Error T Parametro Estimado StAndar Estadfstico P-Valor
---------------------------------------------~-----------------------------------------------_---------CONSTANTE 534463 00801045 667208 00000 Dia -0140407 00175453 800253 00000 DiaA 2 000448098 0000738458 606803 00000
----------------------~---~-----------------------------~------------------------------~----AmUisis de Varianza
---~---------------------------------~---------------------~------------~-------------------~------Source Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio PValor --------------------------~-----------------------------------------------~------------~-----~~--~ ModeJo 159575 2 0797873 6073 00000 Residual 02170798 middot13 00131383 _______~_~ ~_~----------~------~--~-----~-M-----~-----____ _____________~-----------------------Total (COlT) 176654 15
R12 903315 percent
-----------~------------------------------------------------------------------------~-----------pHConAvena 534463 - 0140407Dia + 000448098DfaA 2
73
ANEXO H - ANALTSIS DE REGRESTON PARA ACIDEZ EN BEBJDA SIN AVENA
An8Jisis de Regtesi6fi P6lifJomial
Variable Depefidiefile~ AcidezSinAVenll _______________w_____~______~________________~-----------_________~_________________~~____~___~_____
Error T Pariirnetro Estimado Estandar Estadistico ---------------------------------------~--------------~-~-------~--------------------~------------CONSTANT 0491697 00123217 399051 00000 Dia 00436032 000269882 161564 00000 D1a2 -000144613 000011359 127312 00000 __w___~________________________~-_______-_____~----____________________________~__~---~_--__~___
AriiiJisis de varianza ~_~__~__________~_~____~________~___________- _________e_____________________________bull _____-________
Source Smn de cuadr Df Mean Square F-Ratio PmiddotValor_~~___________________________________bull ______~___________bull ____________bull ______~________w________________
Model 0135203 2 00676013 21747 00000 Residual 000404118 13 000031086
Total (Corr) 0139244 15
R2 970978 percent
AcidezSlnAvena 0491697 + O0436032Dia - 0OOl44613Dia2
74
I
ANEXO I ANALISIS DE REGRESION PARA ACIDEZ EN BEBIDA CON AVENA
1
Anwisis de tegtesi6fi polinomial
Variable dependiente Acidez Con Avena
Error T ParametTo Estimado Stlindar Estadfstico P-Valor ----------------~-------~---------------------~-----------------------------------------------------CONSTANT 0491639 000926607 530578 00000 Diamiddot 00406572 000202955 200326 00000 DfaA 2 0000982559 0000085421 -115025 00000
-------------~----------------------------~-------------------------~-----------------------------------
-------------~-----~~-----------------------------~---------------------------------------------_--Source Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio PValor
-~-------------~----------------------------------~------------------~~-------------------------- Modelo 0288008 2 0144004 81914 00000 Residual 000228539 13 0000175799
----------~~--------------~---------------------------------------------~---------------------------Total (Corr) 0290294 15
RA2 = 992127 percent
-------------------------~----~---~------------~---------------------------------~---------------~
AcidezConAvena == 049163amp + 00406572D1a - 0000982559DiaA2
75
I
(Ilmiddot il
ANEXO J- ANALISIS DE REGRESION PARA RECUENTO LACTOBACILOS PARA BEBIDA SIN AVENA
Amilisis de regresion - Modelo lineal Y = a + bX
------------------------~----------------------~-----------------------------~----------~-----------Variable Dcpendiente LactobacilJusSinAvena Variable independiente Dia
I--------~----------~-----------------------------------~-------~-~--~--------------------------~-Error T
Paramctro Estimado Standard Stadistico P-Valor
----~----~------------~-----~-----------------------~-------------~-----------------------------Intereepto 117347 0389973 300911 00000 Pendiente 00483464 00257889 18747 00903
Analisis de Varianza
---------~------------------~----------------~---------------------------------~---------~----------Source Sum decuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor
------------~---------------------~---------------------~--------------------------------~-----~----Modelo 0916252 1 244835 443 00616 Residual 260706 10 0260706
--~------------~---~------------------~~~-----~-------~---------~~-------------------------------------Total (Corr)352332 11
Coeficiente Correlaci6n = 0509955 R2 = 260054 percent
LactobacillusSinAvena= 117347 + 00483464Dfa
76
ANEXO K- ANALTSIS DE REGRESION PARA RECUENTO LACTOBACILOS PARA DEBIDA CON AVENA
Aruilisis de regresion - Modelo lineal Y = a + hX
Variable Dependiente LactobacillusConAvena Variable Independiente Dia ---~--------------------------------------------------------__-----------__--_--_-----------shy
Error T Paramctro Estimado Standard Estadistico P-Valor -~--------------------------------------------------------------------------------------------------
Irttercepto 118103 0567963 207942 00000 Pendiente 00790304 00375594 210414 00616
-----------------~----------------------------~----~-------~----~----------------------------
Analisis de Varianza
----------------~----------------~------------------~--------------------------~------~--------shySource Swn de cuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor
-----------------~--~--------------------------------------------------------------------------~---~ Mode10 244835 1 244835 443 00616 Residual 552997 10 0552997
Total (Corr)797832 11
Coeficiente Correlacion = 0553964 RI2 = 306875 percent
-----~--------------------------------------------------------~--------------------------------------
LactobacillusConAvena = 118103 + 00790304Dfas
77
Figura 9 Comparacj6n de medias para -el pH
Comparaci6n de medias para pH
55 ~ 5 +----=gtIIIi-~i~~----=-r--it~ -- pH sin avena
a 45 1--~~~~=~~ 4 --- pH con
avena35 t-----r-- -------=------=--= ------- - ----
2 7 14 21
Dias
Aplicando la prueba t para comparar las medias de pH I S6 muestia una diferencia
altamants significativa en los dos tratamientos para el dia 21 (pltO05)
(Ver tabla 9)
TABLA 9 Compaiaci6n de medias para pH
DtAS SIN AVENA CON AVENA te p (VALOR)
2 514 514 0 10
7 439 444 -1 61 0159
14 437 I
438 -070 0510
21 438 433 528 00019 shy
- DiFERENCIA AlTAMENTE SIGNIFICATIVA
50
I
AI aplicar regrasi6n a los datos sa obtiene al modelo estimado
pHSinAyena =535606 - 01505650Ia +0005044340IaI2
La variabilidad en la respuesta de pH asta siendo explicada en un 8S7522 por
el modelo (Ver Anexo F)
EI tratamiento con avena mostro el siguiente modelo al analisis de ragresi6n
pHConAvena =534463 ~ 0140407Dia + 0004480980Ia2
La variabilidad an la respuesta de pH asta siendo explicada en un 903315 par
el nlodelo(Ver anexo G)
36 Seguimiento de la acidezmiddotmiddot expresada comomiddot de acido
lactico
A continuaci6n sa muestran las Tablas 10 y 11 donde sa registran los datos
tecopilados de acidezmiddotdurante los dias 27 14 Y 21 para las pebidas taetees con y
sin prebi6tico
TABLA 10 Resuttadode acidez (expresadocomo acido tactico) yogurt sin avena
CIA R~petici6n1 Repeticion2 Repetici6n 3 Repeticion 4
2 054 06 057 058
7 072 074 073 0]2
14 080 083 082 082
21 0]4 079 078 077
51
TABLA 11 Resultado de aCidez (expresado como acido Icktico) yogurt con avena
Dia Repetici6n 1 RepetiCi6n 2 Repetici6n 3 Repetici9n 4
2 059 055 058 057
7 071 073 072 072
14 089 087 088 086
21 092 091 090 091
Observando la Figura 10 se puede concluir que la acidez empieza a aumentar
hasta el dia 14 y luego trata de estabilizarse para los dos tratamientos
(Ver figura 10)
Figura 10 Comparaci6n de medias para la acidez
N G)
Comparacion de medias para acidez
1
2 0I 5 -+--=--------=-~~~= u
ltC
- Acidez sin avena
2 7 14
Dias
52
21
-it- Acidez con avena
Aplicando la prueba t para camparar las madias de acidez se muestra una
diferencia altarnante significativa en los dos tratamiantos para los dias 14 y 21
(pltO05)
(Var tabla 12)
TABLA 12Comparaci6n de medias para Acidez
DIASmiddot SIN AVENA CON AVENA te p(VALOR)
2 0572 0572 0 10
7 0727 0720 119 0278
14 0818 0875 -638 000070shy
21 077 091 -1212 i 0000019 shy
DIFERENCIA AL TAMENTE SlGNIFICATIVA
AI aplicar r~gresi6n a los datos se obtiene el modelo estimado
AcidezSlnAIena = 0491897 + O0436032Dia O00144613DfaA2
La variabilidad en la respuesta de acidez asta siendoexplicada en un 970978
por al modelo (Ver anexo H)
EI tratamiento con avena mostro elsiguiente modeloj a1 analisis de regresion
AcidezConAvena = 0491638 + 00406572Oia - OQOO982559OiaA2
La variabilidad enla respuesta acidez esta siendo explicadaen un 99212 por
el modelo (Ver anexo J)
53
I ~
37 Prueba de viabiJidad
A continuaci6n sa muestran las Tab~as 13 y 14 donde sa presentan los datos
recopilados del recuento de Lactobacilos durante los dias 7 14 Y 21 para las
bebidas lacteas con y sin prebi6tico
TABLA 13 Recuento de Lactobacilos (UFCml) yogurt sin avena
Dia Repetici6n 1 Repetici6n 2 Repeticion 3 Reptttici6n 4
7 1880X10l1 1454X1011 1642X1011 1780X10~
14 1560X10~ 646X1011J 1890X10l 140X10l1
21 1200x10lu 128Ox10u 1745x10J 1520x101V
TABLA 14 Recuento de Lactobacilos (UFCml) yogurt con avena
Dfa Repetieion 1 Repetici6n 2 Repeticion 3 Repeticf6n 4
7 1600X10lt 1240X10t 1640X10ll 1980X10t
14 540X1011 427X10n 546X10n 720X10ll
21 500x1011 492x1011 712)(1011 980x10~
AI analizar la Figura 11 sa puede observar un recuento mayor de Lactobacilos
en al tratamiento con avena resultado de acuerdo a 10 encontrado por Alander at
aI 1999 Kontula et aI 1998 y Jaskari et aI 1998
54
Figura 11 Comparaci6n de medias para Log Lactobacillus
Comparacion de medias para log Lactobacillus
~ 1350
-+- Sac Sin--() 13 co avenaIII
bull 125 -- Bac con 0)
0 12 avenaJ
115 7 14 21
Dias
Aplicando la prueba t para comparar las medias de recuento de Lactobacillus no
se encontr6 una diferenc1a estadfsUcamente significative entre los dos
tratamientos (Ver tabla 15)
Este aumento en al racuento influy6 en la disminuci6n del pH y en el aumento de
fa aeidez por la fermentacion que realizan los Lactobacillus sobre fa lactosa de la
lache y la avena adicionada como prebi6tico
55
1
TABLA 15 Comparaci6n medias lag Lactobacillus
DIAS SIN AVENA CON AVENA tc p(VALOR)
7 122257 122022 04846 06451
14 121065 132393 -19602 00977
21 129025 133087 -08236 04416
At aplicar regresion a los datos se obtiane al modelo astimado
LactobacillusSinAvena= 117347 + 004834640Ia
La variabilidad en la respuesta del recuento de LactobaCillus ssta siendo
explicada en un 260054 por el mod$loVar anexo J)
EI tratamiento con avena mostr6 al siguiente modalo al anal isis de regresion
Lactobacillu$ConAvena =118103 + 007903040Ias
La variabilidad en la respuesta de recuento esta siendo explicada en un 3068
por al modelo(Ver anexo K)~
38 Analisi$ microbiol6gicos de las bebidas lacteas con y sin
En la Tabla 16 estan recopilados los resultados microbiol6gieos obtenidos en ras
muestras con los dos tratamientos (con y sin avena)
I [
sa
TABLA 16 Resultados analisis microbiologico
Recuento de mohos y levaduras Iml lt10
Recuento de Staphylococcus coagulase positiva Iml lt100
NMP coliformes fotales y Escherichia coli Iml lt3
Presencia de Salmonella25ml Ausente
Los resultados de este analisis demuestran que las bebidas fermentadas con y
sin avena~ astan fibres de microorganismos patogenos
57
1
4 CONCLUSIONES
Se aislaron cepas nativas de Lactobacillus plantarum de las muestras vegetates
de repollo pepino repollitas de bruselas fermentadas y Lactobacillus brevis de
lache fermentada y mucosa vaginal humana Ambas cepas resistieran un pH=2 y
una concentraci6n de sales biliares det 03 ptv dos earacteristicas importantes
en los probi6ticos
Lamiddot cepa de Lactobacillus brevis aislada de lache Sa utiliz6 para elaborar una
bebida fermentada sin y con avana comoingrediente prebiotico obteniendose un
aJimento centon recuento del probi6tico viable durante 21 dras de seguimiento
ademas libre de microorganismos )at6gen05
No se encontr6 efecta significativo de la avena sobre Ie viabilidad del Lactobacillus
brevis aunque sa presento un aumento en 61 recuento de estos en la bebida con
avena
58
plusmn ~
5 RECOMENDACIONES
Ensayar la cepa de Lactobacillus plantartJm en productos carnicos madurados
como el salami
Ensayar la cepa de Lactobacillus l)revs en otros derivados lecteos como queso
quesito queso crema
Continuar con el estudio de estos microorganismos y caracterizarlos
molecularmente ademas de estudiar su capacidad de adherencja a fa mucosa
intestinal sobre algunes Hneas celulares como las CaCo~2
Estudiarel efedo de la avena sabre la viabiJidad del Lactobacillus breyis a una
concentraci6n mayor de 05
Realizer ensayos can las cepas de Lactobacillus brevis y Lactobrlcillus pJantarum
para elaborar masas acidas para panificacion reemplazando el Bromato de
Potasio aditivo prohibido desde marzo del 2003 en nuestro pais per 5U toxicidad
59
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65
ANEXOS
66
ANEXO A RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AlSLADA DE i
PEPINO it
Referencia Pepino 1 Fecha 06122002
IEXCELENTE IDENTIFICACION
Latto plantarum 1
Galeria API 50 CHL V50 Leida el 06122002
Perfil - -- - ++ - -- - ++++ - - -+- + - I I I I I I I I +t+ - +f- ~ - - + + ~ - - - +- + - shy
o - GLY - ERY DARA - LARA + RIB + DXYL - LXYL - ADO - MDX - GAL + GLU + FRU + MNE + SBE - RHA - DUL - INO bull MAN + SOR - MDM + MUG shyNAG + AMY + ARB + ESC + SAL + CEL + MAL + LAC + MEL + SAC + TRE + 1NU - MLZ + RAF + AMD - GLYG - XLT - GEN + TIJR + LYX - TAG - DFUC shyLFUC - DARL + LARL - aNT + 2KG - 5KG shy
--- Taxones significativos rd -----T -- Tests en contra
Lactoplantarum 1 999 092 1
Taxon siguiente Lactobrevis 1 OJ 044 3
i i
Lactoplantarum 1 1 test (5) en contra
D-SORBITOL (SOR) 78
Tax6n siguiente Lactobrevis 1 3 test (s) ert contra
METHYLD-MANNOSIDE (MOlM) 0 MELEZITOSE (MLZ) 14 D-TURANOSE (TUR) 14
67
ampb
ANEXO B RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AISLADA DE REPOLLO FERMENTADO
~
Referencia Repollo fermentado - 3 Fecha 03072003
EXCELENTE IDENTIFICACION
Lactoplantarum 1
Galena API 50 CRL V50 Leida el 03072003
Perfil - - ++ - - - - -H++ - - ~ + - + - I I 1 I I I I -H+ - ++ - - - + + - -- - - + - shy
o - GLY - ERY - DARA - LARA + RIB + DXYL - LXYL - ADO ~ MDX - GAL + GLU + FRU + MNE + SBE ~ RHA - DUL - INO - MAN + SOR - MDM + MDG shyNAG + AMY + ARR + ESC + SAT + CRL + MAL + LAC + MEL + SAC + TRE + lNU - MLZ + RAF + AMI) - GLYG - XLT - GEN + TOR + LYX - TAG - DFUC shyLFUC - DARL - LARL - GNT + 2KG - 5KG shy
------Taxones significativos _ _----- Id--- ---T---- Tests en contra
Lactoplantarum 1 999 095 1
Tax6n siguiente Lactobrevis 1 01 OA8 3
lJactoplantaru01 1 1 test (s) en contra
DSORBITOL (SOR) 78
Taxon siguiente Lactobrevis
METHYL-D-MANNOSIDE D-TURANOSE
1
(MOM) (TOR)
3 test (5) en contra
0 MELEZITOSE 14
(MLZ) 14
i
I
68
ANEXO C RESULTADO PRUEBAS BIOQUWICAS DE CEPA AISLADA DE MUCOSA HUMANA
Referenda Mucosa - 5 Fecha 27012003
BUENA IDENTlFICACION
Galeria API 50 CHL vso Leida el 270112003
Perfil - - - - +t--t - - - + - + - - - - - - - - -+- - - - - + - + - - - - - - - - - - - - - bull - - -+ - +
o - GLY ~ ERY - DARA bull LARA + RID + DXYL + LXYL - ADO bull MDX - GAL + OLU - FRU + MNE - SBE - IlliA - DUL - INa - MAN - SOR - MDM - MOO shyNAG + AMY - ARB - ESC ~ SAL bull CEL - MAL + lAC - MEL + SAC - TRE shyINU - MLZ - RAF - AMD - GLYG - XLT - GEN - 11JR - LYX - TAG - DFUC shyLFUC - DARL - IARL - ONT + 2KO - 5KG +
- - - - - - Taxones significativos - - - - - - - Id T -- Test en contra
Lactobrevis 3 963 088 1
Taxon siguiente Lactoco11inoides 36 075 2
Lactobrevis 3 1 test (s) en contra
GLUCOSE (GLU) 95
-~~~------------~---------------------------~--~-------~--~-----~----------~--------~------------~~--Taxon siguiente Lactocollinoides 2 test (s) en contra
GLUCOSE (GLU) 100 MELIBIOSE (MEL) 25
69
i r
ANEXO D RESULTADO PRUEBAS BIOQIJiMICAS DE CEPA AISLADA DE LECHE FERMENTADA
Referenda Leche fennentada ~ 13 Fecha 27012003
BUENA IDENTIFICACI6N
Galeria API 50 CHL V50 Leida el 270112003
Perfil - - - - -t-t+- - - - + - + - - - bull - - - - -+- - - - - + - + - - - - - - - - - - - - - - - - -+ - +
0 - GLY - ERY - DARA - LARA +Rll3 + DXYL + LXYL - ADO - MDX ~GAL + GLU - FRU + MNE SBE - RHA DUL bull INO MAN - SOR MDM bull MDG shy
~NAG + AMY - ARB - ESC - SAL - CEL - MAL + LAC - MEL + SAC - TRE I lNU - MLZ - RAF - AMD - GLYG - XLT - OEN - IUR LYX - TAG - DFUC bull i
LFUC - DARL - LARL -ONr + 2KG - SKO + 1
- -- - - Taxones significativos - - Id -- T --- Test en contra
Lacta brevis 3 963 088 1
Taxon siguiente Lactocollinoides 36 075 2
Lactobrevis 3 1 test (s) en contra
GLUCOSE (GLU) 95
-----------------------------------------------------------~------------------------------~-------------------Taxon siguiente Lactocollinoides 2 test (s) en contra
GLUCOSE (GLD) 100 MELffiIOSE (MEL) 25
70
II iJ1
I
I ANEXO E RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AISLADA DE REPOLLITAS DE BRUSELAS FERMENTADA
Referencia repollitas de bruselas 15 Fecha 03072003
EXCELENTE IDENTIFICACION
Lactoplantarum 1
Galeria API 50 CHL vsO Leida el 03072003
Perfil - - - - +t - - - - +H+ - +- - +t + - I I I I I I I f ++t - + - - - -+ + - - - -+ -+ - - I ij
o - GLY - ERY - DARA - LARA + RJB + DXYL - LXYL - ADO - MDX - GAL +
GLU + FRU + MNE + SBE RHA + DUL - INO - MAN + SOR + MDM + MOG shyNAG + AMY + ARB + ESC + SAL + eEL + MAL + LAC + MEl + SAC + TRE + i
I1NU - MLZ + RAF AMD GLYG - XLT - aEN + TUR + LYX - TAG - Druc LFUC - DARt + LARL - aNT + 2KG - 5KG shy n ----Taxones significativos ------ Id Tests en contra
Lactoplantarum 1 999 090 o
Taxon siguiente Lacto pentosus 01 012 7
Lactoplantarum 1 o test (s) en contra
Taxon siguiente Lacto pentosus 7 test (8) en contra
GLYCEROL (GLY) 75 D-XYLOSE (DXYL) 100 L-RHAMNOSE (RHA) 25 METHYL-D-MANNOSIDE (MOM) 1 MELEZITOSE (MLZ) 25 RAFFINOSE (RAF) 75 D-ARABITOL (DARL) 0
71
~
I i I
ANEXO F - ANALISIS DE REGRESION PARA pH EN BEBIDA SIN AVENA
Aruilisis de regresi6n polinomial
---~-~-------------------------------------------~-----------~~---------------------~--------------Variable dependiente pHSinAvena ---------------------------~-------------~--------------------~---------------------------------
Error T Parametro Estimado Estandar Estadistico P-Valor
CONSTANTE 535606 0094535 56657 00000 Dia -0150565 0020706 727154 00000 Dia2 000504434 0000871488 578819 00001
---~---------------------------------------------------------------------------------------------------
Anfllisis de Variama -------------------------------------------~-----------~-----------------------------~-~--- jSource Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor 11
------------------------~------------------------------------------------------------------------------~ Mod-elo 155772 2 0118861 4256 00000 Residual 0237877 13 00182983
Total (Corr) 11956 IS
R2 == 867522 percent
pHSinAvena == 535606 - 0150565Dia + 000504434Dia2
72
____
middot ANEXO G - ANALISIS DE REGRESION PARA pH EN BEBIDA CON AVENA
AmUisis de regresion polinomial _____~_____~__-_____~___4____________________bull____bull__________bull_____________~~----_------___________
Variable depcndiente pHConA vena ------------------------------------------------------------------------------------------~--------
Error T Parametro Estimado StAndar Estadfstico P-Valor
---------------------------------------------~-----------------------------------------------_---------CONSTANTE 534463 00801045 667208 00000 Dia -0140407 00175453 800253 00000 DiaA 2 000448098 0000738458 606803 00000
----------------------~---~-----------------------------~------------------------------~----AmUisis de Varianza
---~---------------------------------~---------------------~------------~-------------------~------Source Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio PValor --------------------------~-----------------------------------------------~------------~-----~~--~ ModeJo 159575 2 0797873 6073 00000 Residual 02170798 middot13 00131383 _______~_~ ~_~----------~------~--~-----~-M-----~-----____ _____________~-----------------------Total (COlT) 176654 15
R12 903315 percent
-----------~------------------------------------------------------------------------~-----------pHConAvena 534463 - 0140407Dia + 000448098DfaA 2
73
ANEXO H - ANALTSIS DE REGRESTON PARA ACIDEZ EN BEBJDA SIN AVENA
An8Jisis de Regtesi6fi P6lifJomial
Variable Depefidiefile~ AcidezSinAVenll _______________w_____~______~________________~-----------_________~_________________~~____~___~_____
Error T Pariirnetro Estimado Estandar Estadistico ---------------------------------------~--------------~-~-------~--------------------~------------CONSTANT 0491697 00123217 399051 00000 Dia 00436032 000269882 161564 00000 D1a2 -000144613 000011359 127312 00000 __w___~________________________~-_______-_____~----____________________________~__~---~_--__~___
AriiiJisis de varianza ~_~__~__________~_~____~________~___________- _________e_____________________________bull _____-________
Source Smn de cuadr Df Mean Square F-Ratio PmiddotValor_~~___________________________________bull ______~___________bull ____________bull ______~________w________________
Model 0135203 2 00676013 21747 00000 Residual 000404118 13 000031086
Total (Corr) 0139244 15
R2 970978 percent
AcidezSlnAvena 0491697 + O0436032Dia - 0OOl44613Dia2
74
I
ANEXO I ANALISIS DE REGRESION PARA ACIDEZ EN BEBIDA CON AVENA
1
Anwisis de tegtesi6fi polinomial
Variable dependiente Acidez Con Avena
Error T ParametTo Estimado Stlindar Estadfstico P-Valor ----------------~-------~---------------------~-----------------------------------------------------CONSTANT 0491639 000926607 530578 00000 Diamiddot 00406572 000202955 200326 00000 DfaA 2 0000982559 0000085421 -115025 00000
-------------~----------------------------~-------------------------~-----------------------------------
-------------~-----~~-----------------------------~---------------------------------------------_--Source Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio PValor
-~-------------~----------------------------------~------------------~~-------------------------- Modelo 0288008 2 0144004 81914 00000 Residual 000228539 13 0000175799
----------~~--------------~---------------------------------------------~---------------------------Total (Corr) 0290294 15
RA2 = 992127 percent
-------------------------~----~---~------------~---------------------------------~---------------~
AcidezConAvena == 049163amp + 00406572D1a - 0000982559DiaA2
75
I
(Ilmiddot il
ANEXO J- ANALISIS DE REGRESION PARA RECUENTO LACTOBACILOS PARA BEBIDA SIN AVENA
Amilisis de regresion - Modelo lineal Y = a + bX
------------------------~----------------------~-----------------------------~----------~-----------Variable Dcpendiente LactobacilJusSinAvena Variable independiente Dia
I--------~----------~-----------------------------------~-------~-~--~--------------------------~-Error T
Paramctro Estimado Standard Stadistico P-Valor
----~----~------------~-----~-----------------------~-------------~-----------------------------Intereepto 117347 0389973 300911 00000 Pendiente 00483464 00257889 18747 00903
Analisis de Varianza
---------~------------------~----------------~---------------------------------~---------~----------Source Sum decuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor
------------~---------------------~---------------------~--------------------------------~-----~----Modelo 0916252 1 244835 443 00616 Residual 260706 10 0260706
--~------------~---~------------------~~~-----~-------~---------~~-------------------------------------Total (Corr)352332 11
Coeficiente Correlaci6n = 0509955 R2 = 260054 percent
LactobacillusSinAvena= 117347 + 00483464Dfa
76
ANEXO K- ANALTSIS DE REGRESION PARA RECUENTO LACTOBACILOS PARA DEBIDA CON AVENA
Aruilisis de regresion - Modelo lineal Y = a + hX
Variable Dependiente LactobacillusConAvena Variable Independiente Dia ---~--------------------------------------------------------__-----------__--_--_-----------shy
Error T Paramctro Estimado Standard Estadistico P-Valor -~--------------------------------------------------------------------------------------------------
Irttercepto 118103 0567963 207942 00000 Pendiente 00790304 00375594 210414 00616
-----------------~----------------------------~----~-------~----~----------------------------
Analisis de Varianza
----------------~----------------~------------------~--------------------------~------~--------shySource Swn de cuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor
-----------------~--~--------------------------------------------------------------------------~---~ Mode10 244835 1 244835 443 00616 Residual 552997 10 0552997
Total (Corr)797832 11
Coeficiente Correlacion = 0553964 RI2 = 306875 percent
-----~--------------------------------------------------------~--------------------------------------
LactobacillusConAvena = 118103 + 00790304Dfas
77
I
AI aplicar regrasi6n a los datos sa obtiene al modelo estimado
pHSinAyena =535606 - 01505650Ia +0005044340IaI2
La variabilidad en la respuesta de pH asta siendo explicada en un 8S7522 por
el modelo (Ver Anexo F)
EI tratamiento con avena mostro el siguiente modelo al analisis de ragresi6n
pHConAvena =534463 ~ 0140407Dia + 0004480980Ia2
La variabilidad an la respuesta de pH asta siendo explicada en un 903315 par
el nlodelo(Ver anexo G)
36 Seguimiento de la acidezmiddotmiddot expresada comomiddot de acido
lactico
A continuaci6n sa muestran las Tablas 10 y 11 donde sa registran los datos
tecopilados de acidezmiddotdurante los dias 27 14 Y 21 para las pebidas taetees con y
sin prebi6tico
TABLA 10 Resuttadode acidez (expresadocomo acido tactico) yogurt sin avena
CIA R~petici6n1 Repeticion2 Repetici6n 3 Repeticion 4
2 054 06 057 058
7 072 074 073 0]2
14 080 083 082 082
21 0]4 079 078 077
51
TABLA 11 Resultado de aCidez (expresado como acido Icktico) yogurt con avena
Dia Repetici6n 1 RepetiCi6n 2 Repetici6n 3 Repetici9n 4
2 059 055 058 057
7 071 073 072 072
14 089 087 088 086
21 092 091 090 091
Observando la Figura 10 se puede concluir que la acidez empieza a aumentar
hasta el dia 14 y luego trata de estabilizarse para los dos tratamientos
(Ver figura 10)
Figura 10 Comparaci6n de medias para la acidez
N G)
Comparacion de medias para acidez
1
2 0I 5 -+--=--------=-~~~= u
ltC
- Acidez sin avena
2 7 14
Dias
52
21
-it- Acidez con avena
Aplicando la prueba t para camparar las madias de acidez se muestra una
diferencia altarnante significativa en los dos tratamiantos para los dias 14 y 21
(pltO05)
(Var tabla 12)
TABLA 12Comparaci6n de medias para Acidez
DIASmiddot SIN AVENA CON AVENA te p(VALOR)
2 0572 0572 0 10
7 0727 0720 119 0278
14 0818 0875 -638 000070shy
21 077 091 -1212 i 0000019 shy
DIFERENCIA AL TAMENTE SlGNIFICATIVA
AI aplicar r~gresi6n a los datos se obtiene el modelo estimado
AcidezSlnAIena = 0491897 + O0436032Dia O00144613DfaA2
La variabilidad en la respuesta de acidez asta siendoexplicada en un 970978
por al modelo (Ver anexo H)
EI tratamiento con avena mostro elsiguiente modeloj a1 analisis de regresion
AcidezConAvena = 0491638 + 00406572Oia - OQOO982559OiaA2
La variabilidad enla respuesta acidez esta siendo explicadaen un 99212 por
el modelo (Ver anexo J)
53
I ~
37 Prueba de viabiJidad
A continuaci6n sa muestran las Tab~as 13 y 14 donde sa presentan los datos
recopilados del recuento de Lactobacilos durante los dias 7 14 Y 21 para las
bebidas lacteas con y sin prebi6tico
TABLA 13 Recuento de Lactobacilos (UFCml) yogurt sin avena
Dia Repetici6n 1 Repetici6n 2 Repeticion 3 Reptttici6n 4
7 1880X10l1 1454X1011 1642X1011 1780X10~
14 1560X10~ 646X1011J 1890X10l 140X10l1
21 1200x10lu 128Ox10u 1745x10J 1520x101V
TABLA 14 Recuento de Lactobacilos (UFCml) yogurt con avena
Dfa Repetieion 1 Repetici6n 2 Repeticion 3 Repeticf6n 4
7 1600X10lt 1240X10t 1640X10ll 1980X10t
14 540X1011 427X10n 546X10n 720X10ll
21 500x1011 492x1011 712)(1011 980x10~
AI analizar la Figura 11 sa puede observar un recuento mayor de Lactobacilos
en al tratamiento con avena resultado de acuerdo a 10 encontrado por Alander at
aI 1999 Kontula et aI 1998 y Jaskari et aI 1998
54
Figura 11 Comparaci6n de medias para Log Lactobacillus
Comparacion de medias para log Lactobacillus
~ 1350
-+- Sac Sin--() 13 co avenaIII
bull 125 -- Bac con 0)
0 12 avenaJ
115 7 14 21
Dias
Aplicando la prueba t para comparar las medias de recuento de Lactobacillus no
se encontr6 una diferenc1a estadfsUcamente significative entre los dos
tratamientos (Ver tabla 15)
Este aumento en al racuento influy6 en la disminuci6n del pH y en el aumento de
fa aeidez por la fermentacion que realizan los Lactobacillus sobre fa lactosa de la
lache y la avena adicionada como prebi6tico
55
1
TABLA 15 Comparaci6n medias lag Lactobacillus
DIAS SIN AVENA CON AVENA tc p(VALOR)
7 122257 122022 04846 06451
14 121065 132393 -19602 00977
21 129025 133087 -08236 04416
At aplicar regresion a los datos se obtiane al modelo astimado
LactobacillusSinAvena= 117347 + 004834640Ia
La variabilidad en la respuesta del recuento de LactobaCillus ssta siendo
explicada en un 260054 por el mod$loVar anexo J)
EI tratamiento con avena mostr6 al siguiente modalo al anal isis de regresion
Lactobacillu$ConAvena =118103 + 007903040Ias
La variabilidad en la respuesta de recuento esta siendo explicada en un 3068
por al modelo(Ver anexo K)~
38 Analisi$ microbiol6gicos de las bebidas lacteas con y sin
En la Tabla 16 estan recopilados los resultados microbiol6gieos obtenidos en ras
muestras con los dos tratamientos (con y sin avena)
I [
sa
TABLA 16 Resultados analisis microbiologico
Recuento de mohos y levaduras Iml lt10
Recuento de Staphylococcus coagulase positiva Iml lt100
NMP coliformes fotales y Escherichia coli Iml lt3
Presencia de Salmonella25ml Ausente
Los resultados de este analisis demuestran que las bebidas fermentadas con y
sin avena~ astan fibres de microorganismos patogenos
57
1
4 CONCLUSIONES
Se aislaron cepas nativas de Lactobacillus plantarum de las muestras vegetates
de repollo pepino repollitas de bruselas fermentadas y Lactobacillus brevis de
lache fermentada y mucosa vaginal humana Ambas cepas resistieran un pH=2 y
una concentraci6n de sales biliares det 03 ptv dos earacteristicas importantes
en los probi6ticos
Lamiddot cepa de Lactobacillus brevis aislada de lache Sa utiliz6 para elaborar una
bebida fermentada sin y con avana comoingrediente prebiotico obteniendose un
aJimento centon recuento del probi6tico viable durante 21 dras de seguimiento
ademas libre de microorganismos )at6gen05
No se encontr6 efecta significativo de la avena sobre Ie viabilidad del Lactobacillus
brevis aunque sa presento un aumento en 61 recuento de estos en la bebida con
avena
58
plusmn ~
5 RECOMENDACIONES
Ensayar la cepa de Lactobacillus plantartJm en productos carnicos madurados
como el salami
Ensayar la cepa de Lactobacillus l)revs en otros derivados lecteos como queso
quesito queso crema
Continuar con el estudio de estos microorganismos y caracterizarlos
molecularmente ademas de estudiar su capacidad de adherencja a fa mucosa
intestinal sobre algunes Hneas celulares como las CaCo~2
Estudiarel efedo de la avena sabre la viabiJidad del Lactobacillus breyis a una
concentraci6n mayor de 05
Realizer ensayos can las cepas de Lactobacillus brevis y Lactobrlcillus pJantarum
para elaborar masas acidas para panificacion reemplazando el Bromato de
Potasio aditivo prohibido desde marzo del 2003 en nuestro pais per 5U toxicidad
59
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65
ANEXOS
66
ANEXO A RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AlSLADA DE i
PEPINO it
Referencia Pepino 1 Fecha 06122002
IEXCELENTE IDENTIFICACION
Latto plantarum 1
Galeria API 50 CHL V50 Leida el 06122002
Perfil - -- - ++ - -- - ++++ - - -+- + - I I I I I I I I +t+ - +f- ~ - - + + ~ - - - +- + - shy
o - GLY - ERY DARA - LARA + RIB + DXYL - LXYL - ADO - MDX - GAL + GLU + FRU + MNE + SBE - RHA - DUL - INO bull MAN + SOR - MDM + MUG shyNAG + AMY + ARB + ESC + SAL + CEL + MAL + LAC + MEL + SAC + TRE + 1NU - MLZ + RAF + AMD - GLYG - XLT - GEN + TIJR + LYX - TAG - DFUC shyLFUC - DARL + LARL - aNT + 2KG - 5KG shy
--- Taxones significativos rd -----T -- Tests en contra
Lactoplantarum 1 999 092 1
Taxon siguiente Lactobrevis 1 OJ 044 3
i i
Lactoplantarum 1 1 test (5) en contra
D-SORBITOL (SOR) 78
Tax6n siguiente Lactobrevis 1 3 test (s) ert contra
METHYLD-MANNOSIDE (MOlM) 0 MELEZITOSE (MLZ) 14 D-TURANOSE (TUR) 14
67
ampb
ANEXO B RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AISLADA DE REPOLLO FERMENTADO
~
Referencia Repollo fermentado - 3 Fecha 03072003
EXCELENTE IDENTIFICACION
Lactoplantarum 1
Galena API 50 CRL V50 Leida el 03072003
Perfil - - ++ - - - - -H++ - - ~ + - + - I I 1 I I I I -H+ - ++ - - - + + - -- - - + - shy
o - GLY - ERY - DARA - LARA + RIB + DXYL - LXYL - ADO ~ MDX - GAL + GLU + FRU + MNE + SBE ~ RHA - DUL - INO - MAN + SOR - MDM + MDG shyNAG + AMY + ARR + ESC + SAT + CRL + MAL + LAC + MEL + SAC + TRE + lNU - MLZ + RAF + AMI) - GLYG - XLT - GEN + TOR + LYX - TAG - DFUC shyLFUC - DARL - LARL - GNT + 2KG - 5KG shy
------Taxones significativos _ _----- Id--- ---T---- Tests en contra
Lactoplantarum 1 999 095 1
Tax6n siguiente Lactobrevis 1 01 OA8 3
lJactoplantaru01 1 1 test (s) en contra
DSORBITOL (SOR) 78
Taxon siguiente Lactobrevis
METHYL-D-MANNOSIDE D-TURANOSE
1
(MOM) (TOR)
3 test (5) en contra
0 MELEZITOSE 14
(MLZ) 14
i
I
68
ANEXO C RESULTADO PRUEBAS BIOQUWICAS DE CEPA AISLADA DE MUCOSA HUMANA
Referenda Mucosa - 5 Fecha 27012003
BUENA IDENTlFICACION
Galeria API 50 CHL vso Leida el 270112003
Perfil - - - - +t--t - - - + - + - - - - - - - - -+- - - - - + - + - - - - - - - - - - - - - bull - - -+ - +
o - GLY ~ ERY - DARA bull LARA + RID + DXYL + LXYL - ADO bull MDX - GAL + OLU - FRU + MNE - SBE - IlliA - DUL - INa - MAN - SOR - MDM - MOO shyNAG + AMY - ARB - ESC ~ SAL bull CEL - MAL + lAC - MEL + SAC - TRE shyINU - MLZ - RAF - AMD - GLYG - XLT - GEN - 11JR - LYX - TAG - DFUC shyLFUC - DARL - IARL - ONT + 2KO - 5KG +
- - - - - - Taxones significativos - - - - - - - Id T -- Test en contra
Lactobrevis 3 963 088 1
Taxon siguiente Lactoco11inoides 36 075 2
Lactobrevis 3 1 test (s) en contra
GLUCOSE (GLU) 95
-~~~------------~---------------------------~--~-------~--~-----~----------~--------~------------~~--Taxon siguiente Lactocollinoides 2 test (s) en contra
GLUCOSE (GLU) 100 MELIBIOSE (MEL) 25
69
i r
ANEXO D RESULTADO PRUEBAS BIOQIJiMICAS DE CEPA AISLADA DE LECHE FERMENTADA
Referenda Leche fennentada ~ 13 Fecha 27012003
BUENA IDENTIFICACI6N
Galeria API 50 CHL V50 Leida el 270112003
Perfil - - - - -t-t+- - - - + - + - - - bull - - - - -+- - - - - + - + - - - - - - - - - - - - - - - - -+ - +
0 - GLY - ERY - DARA - LARA +Rll3 + DXYL + LXYL - ADO - MDX ~GAL + GLU - FRU + MNE SBE - RHA DUL bull INO MAN - SOR MDM bull MDG shy
~NAG + AMY - ARB - ESC - SAL - CEL - MAL + LAC - MEL + SAC - TRE I lNU - MLZ - RAF - AMD - GLYG - XLT - OEN - IUR LYX - TAG - DFUC bull i
LFUC - DARL - LARL -ONr + 2KG - SKO + 1
- -- - - Taxones significativos - - Id -- T --- Test en contra
Lacta brevis 3 963 088 1
Taxon siguiente Lactocollinoides 36 075 2
Lactobrevis 3 1 test (s) en contra
GLUCOSE (GLU) 95
-----------------------------------------------------------~------------------------------~-------------------Taxon siguiente Lactocollinoides 2 test (s) en contra
GLUCOSE (GLD) 100 MELffiIOSE (MEL) 25
70
II iJ1
I
I ANEXO E RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AISLADA DE REPOLLITAS DE BRUSELAS FERMENTADA
Referencia repollitas de bruselas 15 Fecha 03072003
EXCELENTE IDENTIFICACION
Lactoplantarum 1
Galeria API 50 CHL vsO Leida el 03072003
Perfil - - - - +t - - - - +H+ - +- - +t + - I I I I I I I f ++t - + - - - -+ + - - - -+ -+ - - I ij
o - GLY - ERY - DARA - LARA + RJB + DXYL - LXYL - ADO - MDX - GAL +
GLU + FRU + MNE + SBE RHA + DUL - INO - MAN + SOR + MDM + MOG shyNAG + AMY + ARB + ESC + SAL + eEL + MAL + LAC + MEl + SAC + TRE + i
I1NU - MLZ + RAF AMD GLYG - XLT - aEN + TUR + LYX - TAG - Druc LFUC - DARt + LARL - aNT + 2KG - 5KG shy n ----Taxones significativos ------ Id Tests en contra
Lactoplantarum 1 999 090 o
Taxon siguiente Lacto pentosus 01 012 7
Lactoplantarum 1 o test (s) en contra
Taxon siguiente Lacto pentosus 7 test (8) en contra
GLYCEROL (GLY) 75 D-XYLOSE (DXYL) 100 L-RHAMNOSE (RHA) 25 METHYL-D-MANNOSIDE (MOM) 1 MELEZITOSE (MLZ) 25 RAFFINOSE (RAF) 75 D-ARABITOL (DARL) 0
71
~
I i I
ANEXO F - ANALISIS DE REGRESION PARA pH EN BEBIDA SIN AVENA
Aruilisis de regresi6n polinomial
---~-~-------------------------------------------~-----------~~---------------------~--------------Variable dependiente pHSinAvena ---------------------------~-------------~--------------------~---------------------------------
Error T Parametro Estimado Estandar Estadistico P-Valor
CONSTANTE 535606 0094535 56657 00000 Dia -0150565 0020706 727154 00000 Dia2 000504434 0000871488 578819 00001
---~---------------------------------------------------------------------------------------------------
Anfllisis de Variama -------------------------------------------~-----------~-----------------------------~-~--- jSource Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor 11
------------------------~------------------------------------------------------------------------------~ Mod-elo 155772 2 0118861 4256 00000 Residual 0237877 13 00182983
Total (Corr) 11956 IS
R2 == 867522 percent
pHSinAvena == 535606 - 0150565Dia + 000504434Dia2
72
____
middot ANEXO G - ANALISIS DE REGRESION PARA pH EN BEBIDA CON AVENA
AmUisis de regresion polinomial _____~_____~__-_____~___4____________________bull____bull__________bull_____________~~----_------___________
Variable depcndiente pHConA vena ------------------------------------------------------------------------------------------~--------
Error T Parametro Estimado StAndar Estadfstico P-Valor
---------------------------------------------~-----------------------------------------------_---------CONSTANTE 534463 00801045 667208 00000 Dia -0140407 00175453 800253 00000 DiaA 2 000448098 0000738458 606803 00000
----------------------~---~-----------------------------~------------------------------~----AmUisis de Varianza
---~---------------------------------~---------------------~------------~-------------------~------Source Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio PValor --------------------------~-----------------------------------------------~------------~-----~~--~ ModeJo 159575 2 0797873 6073 00000 Residual 02170798 middot13 00131383 _______~_~ ~_~----------~------~--~-----~-M-----~-----____ _____________~-----------------------Total (COlT) 176654 15
R12 903315 percent
-----------~------------------------------------------------------------------------~-----------pHConAvena 534463 - 0140407Dia + 000448098DfaA 2
73
ANEXO H - ANALTSIS DE REGRESTON PARA ACIDEZ EN BEBJDA SIN AVENA
An8Jisis de Regtesi6fi P6lifJomial
Variable Depefidiefile~ AcidezSinAVenll _______________w_____~______~________________~-----------_________~_________________~~____~___~_____
Error T Pariirnetro Estimado Estandar Estadistico ---------------------------------------~--------------~-~-------~--------------------~------------CONSTANT 0491697 00123217 399051 00000 Dia 00436032 000269882 161564 00000 D1a2 -000144613 000011359 127312 00000 __w___~________________________~-_______-_____~----____________________________~__~---~_--__~___
AriiiJisis de varianza ~_~__~__________~_~____~________~___________- _________e_____________________________bull _____-________
Source Smn de cuadr Df Mean Square F-Ratio PmiddotValor_~~___________________________________bull ______~___________bull ____________bull ______~________w________________
Model 0135203 2 00676013 21747 00000 Residual 000404118 13 000031086
Total (Corr) 0139244 15
R2 970978 percent
AcidezSlnAvena 0491697 + O0436032Dia - 0OOl44613Dia2
74
I
ANEXO I ANALISIS DE REGRESION PARA ACIDEZ EN BEBIDA CON AVENA
1
Anwisis de tegtesi6fi polinomial
Variable dependiente Acidez Con Avena
Error T ParametTo Estimado Stlindar Estadfstico P-Valor ----------------~-------~---------------------~-----------------------------------------------------CONSTANT 0491639 000926607 530578 00000 Diamiddot 00406572 000202955 200326 00000 DfaA 2 0000982559 0000085421 -115025 00000
-------------~----------------------------~-------------------------~-----------------------------------
-------------~-----~~-----------------------------~---------------------------------------------_--Source Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio PValor
-~-------------~----------------------------------~------------------~~-------------------------- Modelo 0288008 2 0144004 81914 00000 Residual 000228539 13 0000175799
----------~~--------------~---------------------------------------------~---------------------------Total (Corr) 0290294 15
RA2 = 992127 percent
-------------------------~----~---~------------~---------------------------------~---------------~
AcidezConAvena == 049163amp + 00406572D1a - 0000982559DiaA2
75
I
(Ilmiddot il
ANEXO J- ANALISIS DE REGRESION PARA RECUENTO LACTOBACILOS PARA BEBIDA SIN AVENA
Amilisis de regresion - Modelo lineal Y = a + bX
------------------------~----------------------~-----------------------------~----------~-----------Variable Dcpendiente LactobacilJusSinAvena Variable independiente Dia
I--------~----------~-----------------------------------~-------~-~--~--------------------------~-Error T
Paramctro Estimado Standard Stadistico P-Valor
----~----~------------~-----~-----------------------~-------------~-----------------------------Intereepto 117347 0389973 300911 00000 Pendiente 00483464 00257889 18747 00903
Analisis de Varianza
---------~------------------~----------------~---------------------------------~---------~----------Source Sum decuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor
------------~---------------------~---------------------~--------------------------------~-----~----Modelo 0916252 1 244835 443 00616 Residual 260706 10 0260706
--~------------~---~------------------~~~-----~-------~---------~~-------------------------------------Total (Corr)352332 11
Coeficiente Correlaci6n = 0509955 R2 = 260054 percent
LactobacillusSinAvena= 117347 + 00483464Dfa
76
ANEXO K- ANALTSIS DE REGRESION PARA RECUENTO LACTOBACILOS PARA DEBIDA CON AVENA
Aruilisis de regresion - Modelo lineal Y = a + hX
Variable Dependiente LactobacillusConAvena Variable Independiente Dia ---~--------------------------------------------------------__-----------__--_--_-----------shy
Error T Paramctro Estimado Standard Estadistico P-Valor -~--------------------------------------------------------------------------------------------------
Irttercepto 118103 0567963 207942 00000 Pendiente 00790304 00375594 210414 00616
-----------------~----------------------------~----~-------~----~----------------------------
Analisis de Varianza
----------------~----------------~------------------~--------------------------~------~--------shySource Swn de cuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor
-----------------~--~--------------------------------------------------------------------------~---~ Mode10 244835 1 244835 443 00616 Residual 552997 10 0552997
Total (Corr)797832 11
Coeficiente Correlacion = 0553964 RI2 = 306875 percent
-----~--------------------------------------------------------~--------------------------------------
LactobacillusConAvena = 118103 + 00790304Dfas
77
TABLA 11 Resultado de aCidez (expresado como acido Icktico) yogurt con avena
Dia Repetici6n 1 RepetiCi6n 2 Repetici6n 3 Repetici9n 4
2 059 055 058 057
7 071 073 072 072
14 089 087 088 086
21 092 091 090 091
Observando la Figura 10 se puede concluir que la acidez empieza a aumentar
hasta el dia 14 y luego trata de estabilizarse para los dos tratamientos
(Ver figura 10)
Figura 10 Comparaci6n de medias para la acidez
N G)
Comparacion de medias para acidez
1
2 0I 5 -+--=--------=-~~~= u
ltC
- Acidez sin avena
2 7 14
Dias
52
21
-it- Acidez con avena
Aplicando la prueba t para camparar las madias de acidez se muestra una
diferencia altarnante significativa en los dos tratamiantos para los dias 14 y 21
(pltO05)
(Var tabla 12)
TABLA 12Comparaci6n de medias para Acidez
DIASmiddot SIN AVENA CON AVENA te p(VALOR)
2 0572 0572 0 10
7 0727 0720 119 0278
14 0818 0875 -638 000070shy
21 077 091 -1212 i 0000019 shy
DIFERENCIA AL TAMENTE SlGNIFICATIVA
AI aplicar r~gresi6n a los datos se obtiene el modelo estimado
AcidezSlnAIena = 0491897 + O0436032Dia O00144613DfaA2
La variabilidad en la respuesta de acidez asta siendoexplicada en un 970978
por al modelo (Ver anexo H)
EI tratamiento con avena mostro elsiguiente modeloj a1 analisis de regresion
AcidezConAvena = 0491638 + 00406572Oia - OQOO982559OiaA2
La variabilidad enla respuesta acidez esta siendo explicadaen un 99212 por
el modelo (Ver anexo J)
53
I ~
37 Prueba de viabiJidad
A continuaci6n sa muestran las Tab~as 13 y 14 donde sa presentan los datos
recopilados del recuento de Lactobacilos durante los dias 7 14 Y 21 para las
bebidas lacteas con y sin prebi6tico
TABLA 13 Recuento de Lactobacilos (UFCml) yogurt sin avena
Dia Repetici6n 1 Repetici6n 2 Repeticion 3 Reptttici6n 4
7 1880X10l1 1454X1011 1642X1011 1780X10~
14 1560X10~ 646X1011J 1890X10l 140X10l1
21 1200x10lu 128Ox10u 1745x10J 1520x101V
TABLA 14 Recuento de Lactobacilos (UFCml) yogurt con avena
Dfa Repetieion 1 Repetici6n 2 Repeticion 3 Repeticf6n 4
7 1600X10lt 1240X10t 1640X10ll 1980X10t
14 540X1011 427X10n 546X10n 720X10ll
21 500x1011 492x1011 712)(1011 980x10~
AI analizar la Figura 11 sa puede observar un recuento mayor de Lactobacilos
en al tratamiento con avena resultado de acuerdo a 10 encontrado por Alander at
aI 1999 Kontula et aI 1998 y Jaskari et aI 1998
54
Figura 11 Comparaci6n de medias para Log Lactobacillus
Comparacion de medias para log Lactobacillus
~ 1350
-+- Sac Sin--() 13 co avenaIII
bull 125 -- Bac con 0)
0 12 avenaJ
115 7 14 21
Dias
Aplicando la prueba t para comparar las medias de recuento de Lactobacillus no
se encontr6 una diferenc1a estadfsUcamente significative entre los dos
tratamientos (Ver tabla 15)
Este aumento en al racuento influy6 en la disminuci6n del pH y en el aumento de
fa aeidez por la fermentacion que realizan los Lactobacillus sobre fa lactosa de la
lache y la avena adicionada como prebi6tico
55
1
TABLA 15 Comparaci6n medias lag Lactobacillus
DIAS SIN AVENA CON AVENA tc p(VALOR)
7 122257 122022 04846 06451
14 121065 132393 -19602 00977
21 129025 133087 -08236 04416
At aplicar regresion a los datos se obtiane al modelo astimado
LactobacillusSinAvena= 117347 + 004834640Ia
La variabilidad en la respuesta del recuento de LactobaCillus ssta siendo
explicada en un 260054 por el mod$loVar anexo J)
EI tratamiento con avena mostr6 al siguiente modalo al anal isis de regresion
Lactobacillu$ConAvena =118103 + 007903040Ias
La variabilidad en la respuesta de recuento esta siendo explicada en un 3068
por al modelo(Ver anexo K)~
38 Analisi$ microbiol6gicos de las bebidas lacteas con y sin
En la Tabla 16 estan recopilados los resultados microbiol6gieos obtenidos en ras
muestras con los dos tratamientos (con y sin avena)
I [
sa
TABLA 16 Resultados analisis microbiologico
Recuento de mohos y levaduras Iml lt10
Recuento de Staphylococcus coagulase positiva Iml lt100
NMP coliformes fotales y Escherichia coli Iml lt3
Presencia de Salmonella25ml Ausente
Los resultados de este analisis demuestran que las bebidas fermentadas con y
sin avena~ astan fibres de microorganismos patogenos
57
1
4 CONCLUSIONES
Se aislaron cepas nativas de Lactobacillus plantarum de las muestras vegetates
de repollo pepino repollitas de bruselas fermentadas y Lactobacillus brevis de
lache fermentada y mucosa vaginal humana Ambas cepas resistieran un pH=2 y
una concentraci6n de sales biliares det 03 ptv dos earacteristicas importantes
en los probi6ticos
Lamiddot cepa de Lactobacillus brevis aislada de lache Sa utiliz6 para elaborar una
bebida fermentada sin y con avana comoingrediente prebiotico obteniendose un
aJimento centon recuento del probi6tico viable durante 21 dras de seguimiento
ademas libre de microorganismos )at6gen05
No se encontr6 efecta significativo de la avena sobre Ie viabilidad del Lactobacillus
brevis aunque sa presento un aumento en 61 recuento de estos en la bebida con
avena
58
plusmn ~
5 RECOMENDACIONES
Ensayar la cepa de Lactobacillus plantartJm en productos carnicos madurados
como el salami
Ensayar la cepa de Lactobacillus l)revs en otros derivados lecteos como queso
quesito queso crema
Continuar con el estudio de estos microorganismos y caracterizarlos
molecularmente ademas de estudiar su capacidad de adherencja a fa mucosa
intestinal sobre algunes Hneas celulares como las CaCo~2
Estudiarel efedo de la avena sabre la viabiJidad del Lactobacillus breyis a una
concentraci6n mayor de 05
Realizer ensayos can las cepas de Lactobacillus brevis y Lactobrlcillus pJantarum
para elaborar masas acidas para panificacion reemplazando el Bromato de
Potasio aditivo prohibido desde marzo del 2003 en nuestro pais per 5U toxicidad
59
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65
ANEXOS
66
ANEXO A RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AlSLADA DE i
PEPINO it
Referencia Pepino 1 Fecha 06122002
IEXCELENTE IDENTIFICACION
Latto plantarum 1
Galeria API 50 CHL V50 Leida el 06122002
Perfil - -- - ++ - -- - ++++ - - -+- + - I I I I I I I I +t+ - +f- ~ - - + + ~ - - - +- + - shy
o - GLY - ERY DARA - LARA + RIB + DXYL - LXYL - ADO - MDX - GAL + GLU + FRU + MNE + SBE - RHA - DUL - INO bull MAN + SOR - MDM + MUG shyNAG + AMY + ARB + ESC + SAL + CEL + MAL + LAC + MEL + SAC + TRE + 1NU - MLZ + RAF + AMD - GLYG - XLT - GEN + TIJR + LYX - TAG - DFUC shyLFUC - DARL + LARL - aNT + 2KG - 5KG shy
--- Taxones significativos rd -----T -- Tests en contra
Lactoplantarum 1 999 092 1
Taxon siguiente Lactobrevis 1 OJ 044 3
i i
Lactoplantarum 1 1 test (5) en contra
D-SORBITOL (SOR) 78
Tax6n siguiente Lactobrevis 1 3 test (s) ert contra
METHYLD-MANNOSIDE (MOlM) 0 MELEZITOSE (MLZ) 14 D-TURANOSE (TUR) 14
67
ampb
ANEXO B RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AISLADA DE REPOLLO FERMENTADO
~
Referencia Repollo fermentado - 3 Fecha 03072003
EXCELENTE IDENTIFICACION
Lactoplantarum 1
Galena API 50 CRL V50 Leida el 03072003
Perfil - - ++ - - - - -H++ - - ~ + - + - I I 1 I I I I -H+ - ++ - - - + + - -- - - + - shy
o - GLY - ERY - DARA - LARA + RIB + DXYL - LXYL - ADO ~ MDX - GAL + GLU + FRU + MNE + SBE ~ RHA - DUL - INO - MAN + SOR - MDM + MDG shyNAG + AMY + ARR + ESC + SAT + CRL + MAL + LAC + MEL + SAC + TRE + lNU - MLZ + RAF + AMI) - GLYG - XLT - GEN + TOR + LYX - TAG - DFUC shyLFUC - DARL - LARL - GNT + 2KG - 5KG shy
------Taxones significativos _ _----- Id--- ---T---- Tests en contra
Lactoplantarum 1 999 095 1
Tax6n siguiente Lactobrevis 1 01 OA8 3
lJactoplantaru01 1 1 test (s) en contra
DSORBITOL (SOR) 78
Taxon siguiente Lactobrevis
METHYL-D-MANNOSIDE D-TURANOSE
1
(MOM) (TOR)
3 test (5) en contra
0 MELEZITOSE 14
(MLZ) 14
i
I
68
ANEXO C RESULTADO PRUEBAS BIOQUWICAS DE CEPA AISLADA DE MUCOSA HUMANA
Referenda Mucosa - 5 Fecha 27012003
BUENA IDENTlFICACION
Galeria API 50 CHL vso Leida el 270112003
Perfil - - - - +t--t - - - + - + - - - - - - - - -+- - - - - + - + - - - - - - - - - - - - - bull - - -+ - +
o - GLY ~ ERY - DARA bull LARA + RID + DXYL + LXYL - ADO bull MDX - GAL + OLU - FRU + MNE - SBE - IlliA - DUL - INa - MAN - SOR - MDM - MOO shyNAG + AMY - ARB - ESC ~ SAL bull CEL - MAL + lAC - MEL + SAC - TRE shyINU - MLZ - RAF - AMD - GLYG - XLT - GEN - 11JR - LYX - TAG - DFUC shyLFUC - DARL - IARL - ONT + 2KO - 5KG +
- - - - - - Taxones significativos - - - - - - - Id T -- Test en contra
Lactobrevis 3 963 088 1
Taxon siguiente Lactoco11inoides 36 075 2
Lactobrevis 3 1 test (s) en contra
GLUCOSE (GLU) 95
-~~~------------~---------------------------~--~-------~--~-----~----------~--------~------------~~--Taxon siguiente Lactocollinoides 2 test (s) en contra
GLUCOSE (GLU) 100 MELIBIOSE (MEL) 25
69
i r
ANEXO D RESULTADO PRUEBAS BIOQIJiMICAS DE CEPA AISLADA DE LECHE FERMENTADA
Referenda Leche fennentada ~ 13 Fecha 27012003
BUENA IDENTIFICACI6N
Galeria API 50 CHL V50 Leida el 270112003
Perfil - - - - -t-t+- - - - + - + - - - bull - - - - -+- - - - - + - + - - - - - - - - - - - - - - - - -+ - +
0 - GLY - ERY - DARA - LARA +Rll3 + DXYL + LXYL - ADO - MDX ~GAL + GLU - FRU + MNE SBE - RHA DUL bull INO MAN - SOR MDM bull MDG shy
~NAG + AMY - ARB - ESC - SAL - CEL - MAL + LAC - MEL + SAC - TRE I lNU - MLZ - RAF - AMD - GLYG - XLT - OEN - IUR LYX - TAG - DFUC bull i
LFUC - DARL - LARL -ONr + 2KG - SKO + 1
- -- - - Taxones significativos - - Id -- T --- Test en contra
Lacta brevis 3 963 088 1
Taxon siguiente Lactocollinoides 36 075 2
Lactobrevis 3 1 test (s) en contra
GLUCOSE (GLU) 95
-----------------------------------------------------------~------------------------------~-------------------Taxon siguiente Lactocollinoides 2 test (s) en contra
GLUCOSE (GLD) 100 MELffiIOSE (MEL) 25
70
II iJ1
I
I ANEXO E RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AISLADA DE REPOLLITAS DE BRUSELAS FERMENTADA
Referencia repollitas de bruselas 15 Fecha 03072003
EXCELENTE IDENTIFICACION
Lactoplantarum 1
Galeria API 50 CHL vsO Leida el 03072003
Perfil - - - - +t - - - - +H+ - +- - +t + - I I I I I I I f ++t - + - - - -+ + - - - -+ -+ - - I ij
o - GLY - ERY - DARA - LARA + RJB + DXYL - LXYL - ADO - MDX - GAL +
GLU + FRU + MNE + SBE RHA + DUL - INO - MAN + SOR + MDM + MOG shyNAG + AMY + ARB + ESC + SAL + eEL + MAL + LAC + MEl + SAC + TRE + i
I1NU - MLZ + RAF AMD GLYG - XLT - aEN + TUR + LYX - TAG - Druc LFUC - DARt + LARL - aNT + 2KG - 5KG shy n ----Taxones significativos ------ Id Tests en contra
Lactoplantarum 1 999 090 o
Taxon siguiente Lacto pentosus 01 012 7
Lactoplantarum 1 o test (s) en contra
Taxon siguiente Lacto pentosus 7 test (8) en contra
GLYCEROL (GLY) 75 D-XYLOSE (DXYL) 100 L-RHAMNOSE (RHA) 25 METHYL-D-MANNOSIDE (MOM) 1 MELEZITOSE (MLZ) 25 RAFFINOSE (RAF) 75 D-ARABITOL (DARL) 0
71
~
I i I
ANEXO F - ANALISIS DE REGRESION PARA pH EN BEBIDA SIN AVENA
Aruilisis de regresi6n polinomial
---~-~-------------------------------------------~-----------~~---------------------~--------------Variable dependiente pHSinAvena ---------------------------~-------------~--------------------~---------------------------------
Error T Parametro Estimado Estandar Estadistico P-Valor
CONSTANTE 535606 0094535 56657 00000 Dia -0150565 0020706 727154 00000 Dia2 000504434 0000871488 578819 00001
---~---------------------------------------------------------------------------------------------------
Anfllisis de Variama -------------------------------------------~-----------~-----------------------------~-~--- jSource Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor 11
------------------------~------------------------------------------------------------------------------~ Mod-elo 155772 2 0118861 4256 00000 Residual 0237877 13 00182983
Total (Corr) 11956 IS
R2 == 867522 percent
pHSinAvena == 535606 - 0150565Dia + 000504434Dia2
72
____
middot ANEXO G - ANALISIS DE REGRESION PARA pH EN BEBIDA CON AVENA
AmUisis de regresion polinomial _____~_____~__-_____~___4____________________bull____bull__________bull_____________~~----_------___________
Variable depcndiente pHConA vena ------------------------------------------------------------------------------------------~--------
Error T Parametro Estimado StAndar Estadfstico P-Valor
---------------------------------------------~-----------------------------------------------_---------CONSTANTE 534463 00801045 667208 00000 Dia -0140407 00175453 800253 00000 DiaA 2 000448098 0000738458 606803 00000
----------------------~---~-----------------------------~------------------------------~----AmUisis de Varianza
---~---------------------------------~---------------------~------------~-------------------~------Source Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio PValor --------------------------~-----------------------------------------------~------------~-----~~--~ ModeJo 159575 2 0797873 6073 00000 Residual 02170798 middot13 00131383 _______~_~ ~_~----------~------~--~-----~-M-----~-----____ _____________~-----------------------Total (COlT) 176654 15
R12 903315 percent
-----------~------------------------------------------------------------------------~-----------pHConAvena 534463 - 0140407Dia + 000448098DfaA 2
73
ANEXO H - ANALTSIS DE REGRESTON PARA ACIDEZ EN BEBJDA SIN AVENA
An8Jisis de Regtesi6fi P6lifJomial
Variable Depefidiefile~ AcidezSinAVenll _______________w_____~______~________________~-----------_________~_________________~~____~___~_____
Error T Pariirnetro Estimado Estandar Estadistico ---------------------------------------~--------------~-~-------~--------------------~------------CONSTANT 0491697 00123217 399051 00000 Dia 00436032 000269882 161564 00000 D1a2 -000144613 000011359 127312 00000 __w___~________________________~-_______-_____~----____________________________~__~---~_--__~___
AriiiJisis de varianza ~_~__~__________~_~____~________~___________- _________e_____________________________bull _____-________
Source Smn de cuadr Df Mean Square F-Ratio PmiddotValor_~~___________________________________bull ______~___________bull ____________bull ______~________w________________
Model 0135203 2 00676013 21747 00000 Residual 000404118 13 000031086
Total (Corr) 0139244 15
R2 970978 percent
AcidezSlnAvena 0491697 + O0436032Dia - 0OOl44613Dia2
74
I
ANEXO I ANALISIS DE REGRESION PARA ACIDEZ EN BEBIDA CON AVENA
1
Anwisis de tegtesi6fi polinomial
Variable dependiente Acidez Con Avena
Error T ParametTo Estimado Stlindar Estadfstico P-Valor ----------------~-------~---------------------~-----------------------------------------------------CONSTANT 0491639 000926607 530578 00000 Diamiddot 00406572 000202955 200326 00000 DfaA 2 0000982559 0000085421 -115025 00000
-------------~----------------------------~-------------------------~-----------------------------------
-------------~-----~~-----------------------------~---------------------------------------------_--Source Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio PValor
-~-------------~----------------------------------~------------------~~-------------------------- Modelo 0288008 2 0144004 81914 00000 Residual 000228539 13 0000175799
----------~~--------------~---------------------------------------------~---------------------------Total (Corr) 0290294 15
RA2 = 992127 percent
-------------------------~----~---~------------~---------------------------------~---------------~
AcidezConAvena == 049163amp + 00406572D1a - 0000982559DiaA2
75
I
(Ilmiddot il
ANEXO J- ANALISIS DE REGRESION PARA RECUENTO LACTOBACILOS PARA BEBIDA SIN AVENA
Amilisis de regresion - Modelo lineal Y = a + bX
------------------------~----------------------~-----------------------------~----------~-----------Variable Dcpendiente LactobacilJusSinAvena Variable independiente Dia
I--------~----------~-----------------------------------~-------~-~--~--------------------------~-Error T
Paramctro Estimado Standard Stadistico P-Valor
----~----~------------~-----~-----------------------~-------------~-----------------------------Intereepto 117347 0389973 300911 00000 Pendiente 00483464 00257889 18747 00903
Analisis de Varianza
---------~------------------~----------------~---------------------------------~---------~----------Source Sum decuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor
------------~---------------------~---------------------~--------------------------------~-----~----Modelo 0916252 1 244835 443 00616 Residual 260706 10 0260706
--~------------~---~------------------~~~-----~-------~---------~~-------------------------------------Total (Corr)352332 11
Coeficiente Correlaci6n = 0509955 R2 = 260054 percent
LactobacillusSinAvena= 117347 + 00483464Dfa
76
ANEXO K- ANALTSIS DE REGRESION PARA RECUENTO LACTOBACILOS PARA DEBIDA CON AVENA
Aruilisis de regresion - Modelo lineal Y = a + hX
Variable Dependiente LactobacillusConAvena Variable Independiente Dia ---~--------------------------------------------------------__-----------__--_--_-----------shy
Error T Paramctro Estimado Standard Estadistico P-Valor -~--------------------------------------------------------------------------------------------------
Irttercepto 118103 0567963 207942 00000 Pendiente 00790304 00375594 210414 00616
-----------------~----------------------------~----~-------~----~----------------------------
Analisis de Varianza
----------------~----------------~------------------~--------------------------~------~--------shySource Swn de cuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor
-----------------~--~--------------------------------------------------------------------------~---~ Mode10 244835 1 244835 443 00616 Residual 552997 10 0552997
Total (Corr)797832 11
Coeficiente Correlacion = 0553964 RI2 = 306875 percent
-----~--------------------------------------------------------~--------------------------------------
LactobacillusConAvena = 118103 + 00790304Dfas
77
Aplicando la prueba t para camparar las madias de acidez se muestra una
diferencia altarnante significativa en los dos tratamiantos para los dias 14 y 21
(pltO05)
(Var tabla 12)
TABLA 12Comparaci6n de medias para Acidez
DIASmiddot SIN AVENA CON AVENA te p(VALOR)
2 0572 0572 0 10
7 0727 0720 119 0278
14 0818 0875 -638 000070shy
21 077 091 -1212 i 0000019 shy
DIFERENCIA AL TAMENTE SlGNIFICATIVA
AI aplicar r~gresi6n a los datos se obtiene el modelo estimado
AcidezSlnAIena = 0491897 + O0436032Dia O00144613DfaA2
La variabilidad en la respuesta de acidez asta siendoexplicada en un 970978
por al modelo (Ver anexo H)
EI tratamiento con avena mostro elsiguiente modeloj a1 analisis de regresion
AcidezConAvena = 0491638 + 00406572Oia - OQOO982559OiaA2
La variabilidad enla respuesta acidez esta siendo explicadaen un 99212 por
el modelo (Ver anexo J)
53
I ~
37 Prueba de viabiJidad
A continuaci6n sa muestran las Tab~as 13 y 14 donde sa presentan los datos
recopilados del recuento de Lactobacilos durante los dias 7 14 Y 21 para las
bebidas lacteas con y sin prebi6tico
TABLA 13 Recuento de Lactobacilos (UFCml) yogurt sin avena
Dia Repetici6n 1 Repetici6n 2 Repeticion 3 Reptttici6n 4
7 1880X10l1 1454X1011 1642X1011 1780X10~
14 1560X10~ 646X1011J 1890X10l 140X10l1
21 1200x10lu 128Ox10u 1745x10J 1520x101V
TABLA 14 Recuento de Lactobacilos (UFCml) yogurt con avena
Dfa Repetieion 1 Repetici6n 2 Repeticion 3 Repeticf6n 4
7 1600X10lt 1240X10t 1640X10ll 1980X10t
14 540X1011 427X10n 546X10n 720X10ll
21 500x1011 492x1011 712)(1011 980x10~
AI analizar la Figura 11 sa puede observar un recuento mayor de Lactobacilos
en al tratamiento con avena resultado de acuerdo a 10 encontrado por Alander at
aI 1999 Kontula et aI 1998 y Jaskari et aI 1998
54
Figura 11 Comparaci6n de medias para Log Lactobacillus
Comparacion de medias para log Lactobacillus
~ 1350
-+- Sac Sin--() 13 co avenaIII
bull 125 -- Bac con 0)
0 12 avenaJ
115 7 14 21
Dias
Aplicando la prueba t para comparar las medias de recuento de Lactobacillus no
se encontr6 una diferenc1a estadfsUcamente significative entre los dos
tratamientos (Ver tabla 15)
Este aumento en al racuento influy6 en la disminuci6n del pH y en el aumento de
fa aeidez por la fermentacion que realizan los Lactobacillus sobre fa lactosa de la
lache y la avena adicionada como prebi6tico
55
1
TABLA 15 Comparaci6n medias lag Lactobacillus
DIAS SIN AVENA CON AVENA tc p(VALOR)
7 122257 122022 04846 06451
14 121065 132393 -19602 00977
21 129025 133087 -08236 04416
At aplicar regresion a los datos se obtiane al modelo astimado
LactobacillusSinAvena= 117347 + 004834640Ia
La variabilidad en la respuesta del recuento de LactobaCillus ssta siendo
explicada en un 260054 por el mod$loVar anexo J)
EI tratamiento con avena mostr6 al siguiente modalo al anal isis de regresion
Lactobacillu$ConAvena =118103 + 007903040Ias
La variabilidad en la respuesta de recuento esta siendo explicada en un 3068
por al modelo(Ver anexo K)~
38 Analisi$ microbiol6gicos de las bebidas lacteas con y sin
En la Tabla 16 estan recopilados los resultados microbiol6gieos obtenidos en ras
muestras con los dos tratamientos (con y sin avena)
I [
sa
TABLA 16 Resultados analisis microbiologico
Recuento de mohos y levaduras Iml lt10
Recuento de Staphylococcus coagulase positiva Iml lt100
NMP coliformes fotales y Escherichia coli Iml lt3
Presencia de Salmonella25ml Ausente
Los resultados de este analisis demuestran que las bebidas fermentadas con y
sin avena~ astan fibres de microorganismos patogenos
57
1
4 CONCLUSIONES
Se aislaron cepas nativas de Lactobacillus plantarum de las muestras vegetates
de repollo pepino repollitas de bruselas fermentadas y Lactobacillus brevis de
lache fermentada y mucosa vaginal humana Ambas cepas resistieran un pH=2 y
una concentraci6n de sales biliares det 03 ptv dos earacteristicas importantes
en los probi6ticos
Lamiddot cepa de Lactobacillus brevis aislada de lache Sa utiliz6 para elaborar una
bebida fermentada sin y con avana comoingrediente prebiotico obteniendose un
aJimento centon recuento del probi6tico viable durante 21 dras de seguimiento
ademas libre de microorganismos )at6gen05
No se encontr6 efecta significativo de la avena sobre Ie viabilidad del Lactobacillus
brevis aunque sa presento un aumento en 61 recuento de estos en la bebida con
avena
58
plusmn ~
5 RECOMENDACIONES
Ensayar la cepa de Lactobacillus plantartJm en productos carnicos madurados
como el salami
Ensayar la cepa de Lactobacillus l)revs en otros derivados lecteos como queso
quesito queso crema
Continuar con el estudio de estos microorganismos y caracterizarlos
molecularmente ademas de estudiar su capacidad de adherencja a fa mucosa
intestinal sobre algunes Hneas celulares como las CaCo~2
Estudiarel efedo de la avena sabre la viabiJidad del Lactobacillus breyis a una
concentraci6n mayor de 05
Realizer ensayos can las cepas de Lactobacillus brevis y Lactobrlcillus pJantarum
para elaborar masas acidas para panificacion reemplazando el Bromato de
Potasio aditivo prohibido desde marzo del 2003 en nuestro pais per 5U toxicidad
59
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65
ANEXOS
66
ANEXO A RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AlSLADA DE i
PEPINO it
Referencia Pepino 1 Fecha 06122002
IEXCELENTE IDENTIFICACION
Latto plantarum 1
Galeria API 50 CHL V50 Leida el 06122002
Perfil - -- - ++ - -- - ++++ - - -+- + - I I I I I I I I +t+ - +f- ~ - - + + ~ - - - +- + - shy
o - GLY - ERY DARA - LARA + RIB + DXYL - LXYL - ADO - MDX - GAL + GLU + FRU + MNE + SBE - RHA - DUL - INO bull MAN + SOR - MDM + MUG shyNAG + AMY + ARB + ESC + SAL + CEL + MAL + LAC + MEL + SAC + TRE + 1NU - MLZ + RAF + AMD - GLYG - XLT - GEN + TIJR + LYX - TAG - DFUC shyLFUC - DARL + LARL - aNT + 2KG - 5KG shy
--- Taxones significativos rd -----T -- Tests en contra
Lactoplantarum 1 999 092 1
Taxon siguiente Lactobrevis 1 OJ 044 3
i i
Lactoplantarum 1 1 test (5) en contra
D-SORBITOL (SOR) 78
Tax6n siguiente Lactobrevis 1 3 test (s) ert contra
METHYLD-MANNOSIDE (MOlM) 0 MELEZITOSE (MLZ) 14 D-TURANOSE (TUR) 14
67
ampb
ANEXO B RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AISLADA DE REPOLLO FERMENTADO
~
Referencia Repollo fermentado - 3 Fecha 03072003
EXCELENTE IDENTIFICACION
Lactoplantarum 1
Galena API 50 CRL V50 Leida el 03072003
Perfil - - ++ - - - - -H++ - - ~ + - + - I I 1 I I I I -H+ - ++ - - - + + - -- - - + - shy
o - GLY - ERY - DARA - LARA + RIB + DXYL - LXYL - ADO ~ MDX - GAL + GLU + FRU + MNE + SBE ~ RHA - DUL - INO - MAN + SOR - MDM + MDG shyNAG + AMY + ARR + ESC + SAT + CRL + MAL + LAC + MEL + SAC + TRE + lNU - MLZ + RAF + AMI) - GLYG - XLT - GEN + TOR + LYX - TAG - DFUC shyLFUC - DARL - LARL - GNT + 2KG - 5KG shy
------Taxones significativos _ _----- Id--- ---T---- Tests en contra
Lactoplantarum 1 999 095 1
Tax6n siguiente Lactobrevis 1 01 OA8 3
lJactoplantaru01 1 1 test (s) en contra
DSORBITOL (SOR) 78
Taxon siguiente Lactobrevis
METHYL-D-MANNOSIDE D-TURANOSE
1
(MOM) (TOR)
3 test (5) en contra
0 MELEZITOSE 14
(MLZ) 14
i
I
68
ANEXO C RESULTADO PRUEBAS BIOQUWICAS DE CEPA AISLADA DE MUCOSA HUMANA
Referenda Mucosa - 5 Fecha 27012003
BUENA IDENTlFICACION
Galeria API 50 CHL vso Leida el 270112003
Perfil - - - - +t--t - - - + - + - - - - - - - - -+- - - - - + - + - - - - - - - - - - - - - bull - - -+ - +
o - GLY ~ ERY - DARA bull LARA + RID + DXYL + LXYL - ADO bull MDX - GAL + OLU - FRU + MNE - SBE - IlliA - DUL - INa - MAN - SOR - MDM - MOO shyNAG + AMY - ARB - ESC ~ SAL bull CEL - MAL + lAC - MEL + SAC - TRE shyINU - MLZ - RAF - AMD - GLYG - XLT - GEN - 11JR - LYX - TAG - DFUC shyLFUC - DARL - IARL - ONT + 2KO - 5KG +
- - - - - - Taxones significativos - - - - - - - Id T -- Test en contra
Lactobrevis 3 963 088 1
Taxon siguiente Lactoco11inoides 36 075 2
Lactobrevis 3 1 test (s) en contra
GLUCOSE (GLU) 95
-~~~------------~---------------------------~--~-------~--~-----~----------~--------~------------~~--Taxon siguiente Lactocollinoides 2 test (s) en contra
GLUCOSE (GLU) 100 MELIBIOSE (MEL) 25
69
i r
ANEXO D RESULTADO PRUEBAS BIOQIJiMICAS DE CEPA AISLADA DE LECHE FERMENTADA
Referenda Leche fennentada ~ 13 Fecha 27012003
BUENA IDENTIFICACI6N
Galeria API 50 CHL V50 Leida el 270112003
Perfil - - - - -t-t+- - - - + - + - - - bull - - - - -+- - - - - + - + - - - - - - - - - - - - - - - - -+ - +
0 - GLY - ERY - DARA - LARA +Rll3 + DXYL + LXYL - ADO - MDX ~GAL + GLU - FRU + MNE SBE - RHA DUL bull INO MAN - SOR MDM bull MDG shy
~NAG + AMY - ARB - ESC - SAL - CEL - MAL + LAC - MEL + SAC - TRE I lNU - MLZ - RAF - AMD - GLYG - XLT - OEN - IUR LYX - TAG - DFUC bull i
LFUC - DARL - LARL -ONr + 2KG - SKO + 1
- -- - - Taxones significativos - - Id -- T --- Test en contra
Lacta brevis 3 963 088 1
Taxon siguiente Lactocollinoides 36 075 2
Lactobrevis 3 1 test (s) en contra
GLUCOSE (GLU) 95
-----------------------------------------------------------~------------------------------~-------------------Taxon siguiente Lactocollinoides 2 test (s) en contra
GLUCOSE (GLD) 100 MELffiIOSE (MEL) 25
70
II iJ1
I
I ANEXO E RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AISLADA DE REPOLLITAS DE BRUSELAS FERMENTADA
Referencia repollitas de bruselas 15 Fecha 03072003
EXCELENTE IDENTIFICACION
Lactoplantarum 1
Galeria API 50 CHL vsO Leida el 03072003
Perfil - - - - +t - - - - +H+ - +- - +t + - I I I I I I I f ++t - + - - - -+ + - - - -+ -+ - - I ij
o - GLY - ERY - DARA - LARA + RJB + DXYL - LXYL - ADO - MDX - GAL +
GLU + FRU + MNE + SBE RHA + DUL - INO - MAN + SOR + MDM + MOG shyNAG + AMY + ARB + ESC + SAL + eEL + MAL + LAC + MEl + SAC + TRE + i
I1NU - MLZ + RAF AMD GLYG - XLT - aEN + TUR + LYX - TAG - Druc LFUC - DARt + LARL - aNT + 2KG - 5KG shy n ----Taxones significativos ------ Id Tests en contra
Lactoplantarum 1 999 090 o
Taxon siguiente Lacto pentosus 01 012 7
Lactoplantarum 1 o test (s) en contra
Taxon siguiente Lacto pentosus 7 test (8) en contra
GLYCEROL (GLY) 75 D-XYLOSE (DXYL) 100 L-RHAMNOSE (RHA) 25 METHYL-D-MANNOSIDE (MOM) 1 MELEZITOSE (MLZ) 25 RAFFINOSE (RAF) 75 D-ARABITOL (DARL) 0
71
~
I i I
ANEXO F - ANALISIS DE REGRESION PARA pH EN BEBIDA SIN AVENA
Aruilisis de regresi6n polinomial
---~-~-------------------------------------------~-----------~~---------------------~--------------Variable dependiente pHSinAvena ---------------------------~-------------~--------------------~---------------------------------
Error T Parametro Estimado Estandar Estadistico P-Valor
CONSTANTE 535606 0094535 56657 00000 Dia -0150565 0020706 727154 00000 Dia2 000504434 0000871488 578819 00001
---~---------------------------------------------------------------------------------------------------
Anfllisis de Variama -------------------------------------------~-----------~-----------------------------~-~--- jSource Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor 11
------------------------~------------------------------------------------------------------------------~ Mod-elo 155772 2 0118861 4256 00000 Residual 0237877 13 00182983
Total (Corr) 11956 IS
R2 == 867522 percent
pHSinAvena == 535606 - 0150565Dia + 000504434Dia2
72
____
middot ANEXO G - ANALISIS DE REGRESION PARA pH EN BEBIDA CON AVENA
AmUisis de regresion polinomial _____~_____~__-_____~___4____________________bull____bull__________bull_____________~~----_------___________
Variable depcndiente pHConA vena ------------------------------------------------------------------------------------------~--------
Error T Parametro Estimado StAndar Estadfstico P-Valor
---------------------------------------------~-----------------------------------------------_---------CONSTANTE 534463 00801045 667208 00000 Dia -0140407 00175453 800253 00000 DiaA 2 000448098 0000738458 606803 00000
----------------------~---~-----------------------------~------------------------------~----AmUisis de Varianza
---~---------------------------------~---------------------~------------~-------------------~------Source Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio PValor --------------------------~-----------------------------------------------~------------~-----~~--~ ModeJo 159575 2 0797873 6073 00000 Residual 02170798 middot13 00131383 _______~_~ ~_~----------~------~--~-----~-M-----~-----____ _____________~-----------------------Total (COlT) 176654 15
R12 903315 percent
-----------~------------------------------------------------------------------------~-----------pHConAvena 534463 - 0140407Dia + 000448098DfaA 2
73
ANEXO H - ANALTSIS DE REGRESTON PARA ACIDEZ EN BEBJDA SIN AVENA
An8Jisis de Regtesi6fi P6lifJomial
Variable Depefidiefile~ AcidezSinAVenll _______________w_____~______~________________~-----------_________~_________________~~____~___~_____
Error T Pariirnetro Estimado Estandar Estadistico ---------------------------------------~--------------~-~-------~--------------------~------------CONSTANT 0491697 00123217 399051 00000 Dia 00436032 000269882 161564 00000 D1a2 -000144613 000011359 127312 00000 __w___~________________________~-_______-_____~----____________________________~__~---~_--__~___
AriiiJisis de varianza ~_~__~__________~_~____~________~___________- _________e_____________________________bull _____-________
Source Smn de cuadr Df Mean Square F-Ratio PmiddotValor_~~___________________________________bull ______~___________bull ____________bull ______~________w________________
Model 0135203 2 00676013 21747 00000 Residual 000404118 13 000031086
Total (Corr) 0139244 15
R2 970978 percent
AcidezSlnAvena 0491697 + O0436032Dia - 0OOl44613Dia2
74
I
ANEXO I ANALISIS DE REGRESION PARA ACIDEZ EN BEBIDA CON AVENA
1
Anwisis de tegtesi6fi polinomial
Variable dependiente Acidez Con Avena
Error T ParametTo Estimado Stlindar Estadfstico P-Valor ----------------~-------~---------------------~-----------------------------------------------------CONSTANT 0491639 000926607 530578 00000 Diamiddot 00406572 000202955 200326 00000 DfaA 2 0000982559 0000085421 -115025 00000
-------------~----------------------------~-------------------------~-----------------------------------
-------------~-----~~-----------------------------~---------------------------------------------_--Source Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio PValor
-~-------------~----------------------------------~------------------~~-------------------------- Modelo 0288008 2 0144004 81914 00000 Residual 000228539 13 0000175799
----------~~--------------~---------------------------------------------~---------------------------Total (Corr) 0290294 15
RA2 = 992127 percent
-------------------------~----~---~------------~---------------------------------~---------------~
AcidezConAvena == 049163amp + 00406572D1a - 0000982559DiaA2
75
I
(Ilmiddot il
ANEXO J- ANALISIS DE REGRESION PARA RECUENTO LACTOBACILOS PARA BEBIDA SIN AVENA
Amilisis de regresion - Modelo lineal Y = a + bX
------------------------~----------------------~-----------------------------~----------~-----------Variable Dcpendiente LactobacilJusSinAvena Variable independiente Dia
I--------~----------~-----------------------------------~-------~-~--~--------------------------~-Error T
Paramctro Estimado Standard Stadistico P-Valor
----~----~------------~-----~-----------------------~-------------~-----------------------------Intereepto 117347 0389973 300911 00000 Pendiente 00483464 00257889 18747 00903
Analisis de Varianza
---------~------------------~----------------~---------------------------------~---------~----------Source Sum decuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor
------------~---------------------~---------------------~--------------------------------~-----~----Modelo 0916252 1 244835 443 00616 Residual 260706 10 0260706
--~------------~---~------------------~~~-----~-------~---------~~-------------------------------------Total (Corr)352332 11
Coeficiente Correlaci6n = 0509955 R2 = 260054 percent
LactobacillusSinAvena= 117347 + 00483464Dfa
76
ANEXO K- ANALTSIS DE REGRESION PARA RECUENTO LACTOBACILOS PARA DEBIDA CON AVENA
Aruilisis de regresion - Modelo lineal Y = a + hX
Variable Dependiente LactobacillusConAvena Variable Independiente Dia ---~--------------------------------------------------------__-----------__--_--_-----------shy
Error T Paramctro Estimado Standard Estadistico P-Valor -~--------------------------------------------------------------------------------------------------
Irttercepto 118103 0567963 207942 00000 Pendiente 00790304 00375594 210414 00616
-----------------~----------------------------~----~-------~----~----------------------------
Analisis de Varianza
----------------~----------------~------------------~--------------------------~------~--------shySource Swn de cuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor
-----------------~--~--------------------------------------------------------------------------~---~ Mode10 244835 1 244835 443 00616 Residual 552997 10 0552997
Total (Corr)797832 11
Coeficiente Correlacion = 0553964 RI2 = 306875 percent
-----~--------------------------------------------------------~--------------------------------------
LactobacillusConAvena = 118103 + 00790304Dfas
77
I ~
37 Prueba de viabiJidad
A continuaci6n sa muestran las Tab~as 13 y 14 donde sa presentan los datos
recopilados del recuento de Lactobacilos durante los dias 7 14 Y 21 para las
bebidas lacteas con y sin prebi6tico
TABLA 13 Recuento de Lactobacilos (UFCml) yogurt sin avena
Dia Repetici6n 1 Repetici6n 2 Repeticion 3 Reptttici6n 4
7 1880X10l1 1454X1011 1642X1011 1780X10~
14 1560X10~ 646X1011J 1890X10l 140X10l1
21 1200x10lu 128Ox10u 1745x10J 1520x101V
TABLA 14 Recuento de Lactobacilos (UFCml) yogurt con avena
Dfa Repetieion 1 Repetici6n 2 Repeticion 3 Repeticf6n 4
7 1600X10lt 1240X10t 1640X10ll 1980X10t
14 540X1011 427X10n 546X10n 720X10ll
21 500x1011 492x1011 712)(1011 980x10~
AI analizar la Figura 11 sa puede observar un recuento mayor de Lactobacilos
en al tratamiento con avena resultado de acuerdo a 10 encontrado por Alander at
aI 1999 Kontula et aI 1998 y Jaskari et aI 1998
54
Figura 11 Comparaci6n de medias para Log Lactobacillus
Comparacion de medias para log Lactobacillus
~ 1350
-+- Sac Sin--() 13 co avenaIII
bull 125 -- Bac con 0)
0 12 avenaJ
115 7 14 21
Dias
Aplicando la prueba t para comparar las medias de recuento de Lactobacillus no
se encontr6 una diferenc1a estadfsUcamente significative entre los dos
tratamientos (Ver tabla 15)
Este aumento en al racuento influy6 en la disminuci6n del pH y en el aumento de
fa aeidez por la fermentacion que realizan los Lactobacillus sobre fa lactosa de la
lache y la avena adicionada como prebi6tico
55
1
TABLA 15 Comparaci6n medias lag Lactobacillus
DIAS SIN AVENA CON AVENA tc p(VALOR)
7 122257 122022 04846 06451
14 121065 132393 -19602 00977
21 129025 133087 -08236 04416
At aplicar regresion a los datos se obtiane al modelo astimado
LactobacillusSinAvena= 117347 + 004834640Ia
La variabilidad en la respuesta del recuento de LactobaCillus ssta siendo
explicada en un 260054 por el mod$loVar anexo J)
EI tratamiento con avena mostr6 al siguiente modalo al anal isis de regresion
Lactobacillu$ConAvena =118103 + 007903040Ias
La variabilidad en la respuesta de recuento esta siendo explicada en un 3068
por al modelo(Ver anexo K)~
38 Analisi$ microbiol6gicos de las bebidas lacteas con y sin
En la Tabla 16 estan recopilados los resultados microbiol6gieos obtenidos en ras
muestras con los dos tratamientos (con y sin avena)
I [
sa
TABLA 16 Resultados analisis microbiologico
Recuento de mohos y levaduras Iml lt10
Recuento de Staphylococcus coagulase positiva Iml lt100
NMP coliformes fotales y Escherichia coli Iml lt3
Presencia de Salmonella25ml Ausente
Los resultados de este analisis demuestran que las bebidas fermentadas con y
sin avena~ astan fibres de microorganismos patogenos
57
1
4 CONCLUSIONES
Se aislaron cepas nativas de Lactobacillus plantarum de las muestras vegetates
de repollo pepino repollitas de bruselas fermentadas y Lactobacillus brevis de
lache fermentada y mucosa vaginal humana Ambas cepas resistieran un pH=2 y
una concentraci6n de sales biliares det 03 ptv dos earacteristicas importantes
en los probi6ticos
Lamiddot cepa de Lactobacillus brevis aislada de lache Sa utiliz6 para elaborar una
bebida fermentada sin y con avana comoingrediente prebiotico obteniendose un
aJimento centon recuento del probi6tico viable durante 21 dras de seguimiento
ademas libre de microorganismos )at6gen05
No se encontr6 efecta significativo de la avena sobre Ie viabilidad del Lactobacillus
brevis aunque sa presento un aumento en 61 recuento de estos en la bebida con
avena
58
plusmn ~
5 RECOMENDACIONES
Ensayar la cepa de Lactobacillus plantartJm en productos carnicos madurados
como el salami
Ensayar la cepa de Lactobacillus l)revs en otros derivados lecteos como queso
quesito queso crema
Continuar con el estudio de estos microorganismos y caracterizarlos
molecularmente ademas de estudiar su capacidad de adherencja a fa mucosa
intestinal sobre algunes Hneas celulares como las CaCo~2
Estudiarel efedo de la avena sabre la viabiJidad del Lactobacillus breyis a una
concentraci6n mayor de 05
Realizer ensayos can las cepas de Lactobacillus brevis y Lactobrlcillus pJantarum
para elaborar masas acidas para panificacion reemplazando el Bromato de
Potasio aditivo prohibido desde marzo del 2003 en nuestro pais per 5U toxicidad
59
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65
ANEXOS
66
ANEXO A RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AlSLADA DE i
PEPINO it
Referencia Pepino 1 Fecha 06122002
IEXCELENTE IDENTIFICACION
Latto plantarum 1
Galeria API 50 CHL V50 Leida el 06122002
Perfil - -- - ++ - -- - ++++ - - -+- + - I I I I I I I I +t+ - +f- ~ - - + + ~ - - - +- + - shy
o - GLY - ERY DARA - LARA + RIB + DXYL - LXYL - ADO - MDX - GAL + GLU + FRU + MNE + SBE - RHA - DUL - INO bull MAN + SOR - MDM + MUG shyNAG + AMY + ARB + ESC + SAL + CEL + MAL + LAC + MEL + SAC + TRE + 1NU - MLZ + RAF + AMD - GLYG - XLT - GEN + TIJR + LYX - TAG - DFUC shyLFUC - DARL + LARL - aNT + 2KG - 5KG shy
--- Taxones significativos rd -----T -- Tests en contra
Lactoplantarum 1 999 092 1
Taxon siguiente Lactobrevis 1 OJ 044 3
i i
Lactoplantarum 1 1 test (5) en contra
D-SORBITOL (SOR) 78
Tax6n siguiente Lactobrevis 1 3 test (s) ert contra
METHYLD-MANNOSIDE (MOlM) 0 MELEZITOSE (MLZ) 14 D-TURANOSE (TUR) 14
67
ampb
ANEXO B RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AISLADA DE REPOLLO FERMENTADO
~
Referencia Repollo fermentado - 3 Fecha 03072003
EXCELENTE IDENTIFICACION
Lactoplantarum 1
Galena API 50 CRL V50 Leida el 03072003
Perfil - - ++ - - - - -H++ - - ~ + - + - I I 1 I I I I -H+ - ++ - - - + + - -- - - + - shy
o - GLY - ERY - DARA - LARA + RIB + DXYL - LXYL - ADO ~ MDX - GAL + GLU + FRU + MNE + SBE ~ RHA - DUL - INO - MAN + SOR - MDM + MDG shyNAG + AMY + ARR + ESC + SAT + CRL + MAL + LAC + MEL + SAC + TRE + lNU - MLZ + RAF + AMI) - GLYG - XLT - GEN + TOR + LYX - TAG - DFUC shyLFUC - DARL - LARL - GNT + 2KG - 5KG shy
------Taxones significativos _ _----- Id--- ---T---- Tests en contra
Lactoplantarum 1 999 095 1
Tax6n siguiente Lactobrevis 1 01 OA8 3
lJactoplantaru01 1 1 test (s) en contra
DSORBITOL (SOR) 78
Taxon siguiente Lactobrevis
METHYL-D-MANNOSIDE D-TURANOSE
1
(MOM) (TOR)
3 test (5) en contra
0 MELEZITOSE 14
(MLZ) 14
i
I
68
ANEXO C RESULTADO PRUEBAS BIOQUWICAS DE CEPA AISLADA DE MUCOSA HUMANA
Referenda Mucosa - 5 Fecha 27012003
BUENA IDENTlFICACION
Galeria API 50 CHL vso Leida el 270112003
Perfil - - - - +t--t - - - + - + - - - - - - - - -+- - - - - + - + - - - - - - - - - - - - - bull - - -+ - +
o - GLY ~ ERY - DARA bull LARA + RID + DXYL + LXYL - ADO bull MDX - GAL + OLU - FRU + MNE - SBE - IlliA - DUL - INa - MAN - SOR - MDM - MOO shyNAG + AMY - ARB - ESC ~ SAL bull CEL - MAL + lAC - MEL + SAC - TRE shyINU - MLZ - RAF - AMD - GLYG - XLT - GEN - 11JR - LYX - TAG - DFUC shyLFUC - DARL - IARL - ONT + 2KO - 5KG +
- - - - - - Taxones significativos - - - - - - - Id T -- Test en contra
Lactobrevis 3 963 088 1
Taxon siguiente Lactoco11inoides 36 075 2
Lactobrevis 3 1 test (s) en contra
GLUCOSE (GLU) 95
-~~~------------~---------------------------~--~-------~--~-----~----------~--------~------------~~--Taxon siguiente Lactocollinoides 2 test (s) en contra
GLUCOSE (GLU) 100 MELIBIOSE (MEL) 25
69
i r
ANEXO D RESULTADO PRUEBAS BIOQIJiMICAS DE CEPA AISLADA DE LECHE FERMENTADA
Referenda Leche fennentada ~ 13 Fecha 27012003
BUENA IDENTIFICACI6N
Galeria API 50 CHL V50 Leida el 270112003
Perfil - - - - -t-t+- - - - + - + - - - bull - - - - -+- - - - - + - + - - - - - - - - - - - - - - - - -+ - +
0 - GLY - ERY - DARA - LARA +Rll3 + DXYL + LXYL - ADO - MDX ~GAL + GLU - FRU + MNE SBE - RHA DUL bull INO MAN - SOR MDM bull MDG shy
~NAG + AMY - ARB - ESC - SAL - CEL - MAL + LAC - MEL + SAC - TRE I lNU - MLZ - RAF - AMD - GLYG - XLT - OEN - IUR LYX - TAG - DFUC bull i
LFUC - DARL - LARL -ONr + 2KG - SKO + 1
- -- - - Taxones significativos - - Id -- T --- Test en contra
Lacta brevis 3 963 088 1
Taxon siguiente Lactocollinoides 36 075 2
Lactobrevis 3 1 test (s) en contra
GLUCOSE (GLU) 95
-----------------------------------------------------------~------------------------------~-------------------Taxon siguiente Lactocollinoides 2 test (s) en contra
GLUCOSE (GLD) 100 MELffiIOSE (MEL) 25
70
II iJ1
I
I ANEXO E RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AISLADA DE REPOLLITAS DE BRUSELAS FERMENTADA
Referencia repollitas de bruselas 15 Fecha 03072003
EXCELENTE IDENTIFICACION
Lactoplantarum 1
Galeria API 50 CHL vsO Leida el 03072003
Perfil - - - - +t - - - - +H+ - +- - +t + - I I I I I I I f ++t - + - - - -+ + - - - -+ -+ - - I ij
o - GLY - ERY - DARA - LARA + RJB + DXYL - LXYL - ADO - MDX - GAL +
GLU + FRU + MNE + SBE RHA + DUL - INO - MAN + SOR + MDM + MOG shyNAG + AMY + ARB + ESC + SAL + eEL + MAL + LAC + MEl + SAC + TRE + i
I1NU - MLZ + RAF AMD GLYG - XLT - aEN + TUR + LYX - TAG - Druc LFUC - DARt + LARL - aNT + 2KG - 5KG shy n ----Taxones significativos ------ Id Tests en contra
Lactoplantarum 1 999 090 o
Taxon siguiente Lacto pentosus 01 012 7
Lactoplantarum 1 o test (s) en contra
Taxon siguiente Lacto pentosus 7 test (8) en contra
GLYCEROL (GLY) 75 D-XYLOSE (DXYL) 100 L-RHAMNOSE (RHA) 25 METHYL-D-MANNOSIDE (MOM) 1 MELEZITOSE (MLZ) 25 RAFFINOSE (RAF) 75 D-ARABITOL (DARL) 0
71
~
I i I
ANEXO F - ANALISIS DE REGRESION PARA pH EN BEBIDA SIN AVENA
Aruilisis de regresi6n polinomial
---~-~-------------------------------------------~-----------~~---------------------~--------------Variable dependiente pHSinAvena ---------------------------~-------------~--------------------~---------------------------------
Error T Parametro Estimado Estandar Estadistico P-Valor
CONSTANTE 535606 0094535 56657 00000 Dia -0150565 0020706 727154 00000 Dia2 000504434 0000871488 578819 00001
---~---------------------------------------------------------------------------------------------------
Anfllisis de Variama -------------------------------------------~-----------~-----------------------------~-~--- jSource Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor 11
------------------------~------------------------------------------------------------------------------~ Mod-elo 155772 2 0118861 4256 00000 Residual 0237877 13 00182983
Total (Corr) 11956 IS
R2 == 867522 percent
pHSinAvena == 535606 - 0150565Dia + 000504434Dia2
72
____
middot ANEXO G - ANALISIS DE REGRESION PARA pH EN BEBIDA CON AVENA
AmUisis de regresion polinomial _____~_____~__-_____~___4____________________bull____bull__________bull_____________~~----_------___________
Variable depcndiente pHConA vena ------------------------------------------------------------------------------------------~--------
Error T Parametro Estimado StAndar Estadfstico P-Valor
---------------------------------------------~-----------------------------------------------_---------CONSTANTE 534463 00801045 667208 00000 Dia -0140407 00175453 800253 00000 DiaA 2 000448098 0000738458 606803 00000
----------------------~---~-----------------------------~------------------------------~----AmUisis de Varianza
---~---------------------------------~---------------------~------------~-------------------~------Source Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio PValor --------------------------~-----------------------------------------------~------------~-----~~--~ ModeJo 159575 2 0797873 6073 00000 Residual 02170798 middot13 00131383 _______~_~ ~_~----------~------~--~-----~-M-----~-----____ _____________~-----------------------Total (COlT) 176654 15
R12 903315 percent
-----------~------------------------------------------------------------------------~-----------pHConAvena 534463 - 0140407Dia + 000448098DfaA 2
73
ANEXO H - ANALTSIS DE REGRESTON PARA ACIDEZ EN BEBJDA SIN AVENA
An8Jisis de Regtesi6fi P6lifJomial
Variable Depefidiefile~ AcidezSinAVenll _______________w_____~______~________________~-----------_________~_________________~~____~___~_____
Error T Pariirnetro Estimado Estandar Estadistico ---------------------------------------~--------------~-~-------~--------------------~------------CONSTANT 0491697 00123217 399051 00000 Dia 00436032 000269882 161564 00000 D1a2 -000144613 000011359 127312 00000 __w___~________________________~-_______-_____~----____________________________~__~---~_--__~___
AriiiJisis de varianza ~_~__~__________~_~____~________~___________- _________e_____________________________bull _____-________
Source Smn de cuadr Df Mean Square F-Ratio PmiddotValor_~~___________________________________bull ______~___________bull ____________bull ______~________w________________
Model 0135203 2 00676013 21747 00000 Residual 000404118 13 000031086
Total (Corr) 0139244 15
R2 970978 percent
AcidezSlnAvena 0491697 + O0436032Dia - 0OOl44613Dia2
74
I
ANEXO I ANALISIS DE REGRESION PARA ACIDEZ EN BEBIDA CON AVENA
1
Anwisis de tegtesi6fi polinomial
Variable dependiente Acidez Con Avena
Error T ParametTo Estimado Stlindar Estadfstico P-Valor ----------------~-------~---------------------~-----------------------------------------------------CONSTANT 0491639 000926607 530578 00000 Diamiddot 00406572 000202955 200326 00000 DfaA 2 0000982559 0000085421 -115025 00000
-------------~----------------------------~-------------------------~-----------------------------------
-------------~-----~~-----------------------------~---------------------------------------------_--Source Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio PValor
-~-------------~----------------------------------~------------------~~-------------------------- Modelo 0288008 2 0144004 81914 00000 Residual 000228539 13 0000175799
----------~~--------------~---------------------------------------------~---------------------------Total (Corr) 0290294 15
RA2 = 992127 percent
-------------------------~----~---~------------~---------------------------------~---------------~
AcidezConAvena == 049163amp + 00406572D1a - 0000982559DiaA2
75
I
(Ilmiddot il
ANEXO J- ANALISIS DE REGRESION PARA RECUENTO LACTOBACILOS PARA BEBIDA SIN AVENA
Amilisis de regresion - Modelo lineal Y = a + bX
------------------------~----------------------~-----------------------------~----------~-----------Variable Dcpendiente LactobacilJusSinAvena Variable independiente Dia
I--------~----------~-----------------------------------~-------~-~--~--------------------------~-Error T
Paramctro Estimado Standard Stadistico P-Valor
----~----~------------~-----~-----------------------~-------------~-----------------------------Intereepto 117347 0389973 300911 00000 Pendiente 00483464 00257889 18747 00903
Analisis de Varianza
---------~------------------~----------------~---------------------------------~---------~----------Source Sum decuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor
------------~---------------------~---------------------~--------------------------------~-----~----Modelo 0916252 1 244835 443 00616 Residual 260706 10 0260706
--~------------~---~------------------~~~-----~-------~---------~~-------------------------------------Total (Corr)352332 11
Coeficiente Correlaci6n = 0509955 R2 = 260054 percent
LactobacillusSinAvena= 117347 + 00483464Dfa
76
ANEXO K- ANALTSIS DE REGRESION PARA RECUENTO LACTOBACILOS PARA DEBIDA CON AVENA
Aruilisis de regresion - Modelo lineal Y = a + hX
Variable Dependiente LactobacillusConAvena Variable Independiente Dia ---~--------------------------------------------------------__-----------__--_--_-----------shy
Error T Paramctro Estimado Standard Estadistico P-Valor -~--------------------------------------------------------------------------------------------------
Irttercepto 118103 0567963 207942 00000 Pendiente 00790304 00375594 210414 00616
-----------------~----------------------------~----~-------~----~----------------------------
Analisis de Varianza
----------------~----------------~------------------~--------------------------~------~--------shySource Swn de cuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor
-----------------~--~--------------------------------------------------------------------------~---~ Mode10 244835 1 244835 443 00616 Residual 552997 10 0552997
Total (Corr)797832 11
Coeficiente Correlacion = 0553964 RI2 = 306875 percent
-----~--------------------------------------------------------~--------------------------------------
LactobacillusConAvena = 118103 + 00790304Dfas
77
Figura 11 Comparaci6n de medias para Log Lactobacillus
Comparacion de medias para log Lactobacillus
~ 1350
-+- Sac Sin--() 13 co avenaIII
bull 125 -- Bac con 0)
0 12 avenaJ
115 7 14 21
Dias
Aplicando la prueba t para comparar las medias de recuento de Lactobacillus no
se encontr6 una diferenc1a estadfsUcamente significative entre los dos
tratamientos (Ver tabla 15)
Este aumento en al racuento influy6 en la disminuci6n del pH y en el aumento de
fa aeidez por la fermentacion que realizan los Lactobacillus sobre fa lactosa de la
lache y la avena adicionada como prebi6tico
55
1
TABLA 15 Comparaci6n medias lag Lactobacillus
DIAS SIN AVENA CON AVENA tc p(VALOR)
7 122257 122022 04846 06451
14 121065 132393 -19602 00977
21 129025 133087 -08236 04416
At aplicar regresion a los datos se obtiane al modelo astimado
LactobacillusSinAvena= 117347 + 004834640Ia
La variabilidad en la respuesta del recuento de LactobaCillus ssta siendo
explicada en un 260054 por el mod$loVar anexo J)
EI tratamiento con avena mostr6 al siguiente modalo al anal isis de regresion
Lactobacillu$ConAvena =118103 + 007903040Ias
La variabilidad en la respuesta de recuento esta siendo explicada en un 3068
por al modelo(Ver anexo K)~
38 Analisi$ microbiol6gicos de las bebidas lacteas con y sin
En la Tabla 16 estan recopilados los resultados microbiol6gieos obtenidos en ras
muestras con los dos tratamientos (con y sin avena)
I [
sa
TABLA 16 Resultados analisis microbiologico
Recuento de mohos y levaduras Iml lt10
Recuento de Staphylococcus coagulase positiva Iml lt100
NMP coliformes fotales y Escherichia coli Iml lt3
Presencia de Salmonella25ml Ausente
Los resultados de este analisis demuestran que las bebidas fermentadas con y
sin avena~ astan fibres de microorganismos patogenos
57
1
4 CONCLUSIONES
Se aislaron cepas nativas de Lactobacillus plantarum de las muestras vegetates
de repollo pepino repollitas de bruselas fermentadas y Lactobacillus brevis de
lache fermentada y mucosa vaginal humana Ambas cepas resistieran un pH=2 y
una concentraci6n de sales biliares det 03 ptv dos earacteristicas importantes
en los probi6ticos
Lamiddot cepa de Lactobacillus brevis aislada de lache Sa utiliz6 para elaborar una
bebida fermentada sin y con avana comoingrediente prebiotico obteniendose un
aJimento centon recuento del probi6tico viable durante 21 dras de seguimiento
ademas libre de microorganismos )at6gen05
No se encontr6 efecta significativo de la avena sobre Ie viabilidad del Lactobacillus
brevis aunque sa presento un aumento en 61 recuento de estos en la bebida con
avena
58
plusmn ~
5 RECOMENDACIONES
Ensayar la cepa de Lactobacillus plantartJm en productos carnicos madurados
como el salami
Ensayar la cepa de Lactobacillus l)revs en otros derivados lecteos como queso
quesito queso crema
Continuar con el estudio de estos microorganismos y caracterizarlos
molecularmente ademas de estudiar su capacidad de adherencja a fa mucosa
intestinal sobre algunes Hneas celulares como las CaCo~2
Estudiarel efedo de la avena sabre la viabiJidad del Lactobacillus breyis a una
concentraci6n mayor de 05
Realizer ensayos can las cepas de Lactobacillus brevis y Lactobrlcillus pJantarum
para elaborar masas acidas para panificacion reemplazando el Bromato de
Potasio aditivo prohibido desde marzo del 2003 en nuestro pais per 5U toxicidad
59
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65
ANEXOS
66
ANEXO A RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AlSLADA DE i
PEPINO it
Referencia Pepino 1 Fecha 06122002
IEXCELENTE IDENTIFICACION
Latto plantarum 1
Galeria API 50 CHL V50 Leida el 06122002
Perfil - -- - ++ - -- - ++++ - - -+- + - I I I I I I I I +t+ - +f- ~ - - + + ~ - - - +- + - shy
o - GLY - ERY DARA - LARA + RIB + DXYL - LXYL - ADO - MDX - GAL + GLU + FRU + MNE + SBE - RHA - DUL - INO bull MAN + SOR - MDM + MUG shyNAG + AMY + ARB + ESC + SAL + CEL + MAL + LAC + MEL + SAC + TRE + 1NU - MLZ + RAF + AMD - GLYG - XLT - GEN + TIJR + LYX - TAG - DFUC shyLFUC - DARL + LARL - aNT + 2KG - 5KG shy
--- Taxones significativos rd -----T -- Tests en contra
Lactoplantarum 1 999 092 1
Taxon siguiente Lactobrevis 1 OJ 044 3
i i
Lactoplantarum 1 1 test (5) en contra
D-SORBITOL (SOR) 78
Tax6n siguiente Lactobrevis 1 3 test (s) ert contra
METHYLD-MANNOSIDE (MOlM) 0 MELEZITOSE (MLZ) 14 D-TURANOSE (TUR) 14
67
ampb
ANEXO B RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AISLADA DE REPOLLO FERMENTADO
~
Referencia Repollo fermentado - 3 Fecha 03072003
EXCELENTE IDENTIFICACION
Lactoplantarum 1
Galena API 50 CRL V50 Leida el 03072003
Perfil - - ++ - - - - -H++ - - ~ + - + - I I 1 I I I I -H+ - ++ - - - + + - -- - - + - shy
o - GLY - ERY - DARA - LARA + RIB + DXYL - LXYL - ADO ~ MDX - GAL + GLU + FRU + MNE + SBE ~ RHA - DUL - INO - MAN + SOR - MDM + MDG shyNAG + AMY + ARR + ESC + SAT + CRL + MAL + LAC + MEL + SAC + TRE + lNU - MLZ + RAF + AMI) - GLYG - XLT - GEN + TOR + LYX - TAG - DFUC shyLFUC - DARL - LARL - GNT + 2KG - 5KG shy
------Taxones significativos _ _----- Id--- ---T---- Tests en contra
Lactoplantarum 1 999 095 1
Tax6n siguiente Lactobrevis 1 01 OA8 3
lJactoplantaru01 1 1 test (s) en contra
DSORBITOL (SOR) 78
Taxon siguiente Lactobrevis
METHYL-D-MANNOSIDE D-TURANOSE
1
(MOM) (TOR)
3 test (5) en contra
0 MELEZITOSE 14
(MLZ) 14
i
I
68
ANEXO C RESULTADO PRUEBAS BIOQUWICAS DE CEPA AISLADA DE MUCOSA HUMANA
Referenda Mucosa - 5 Fecha 27012003
BUENA IDENTlFICACION
Galeria API 50 CHL vso Leida el 270112003
Perfil - - - - +t--t - - - + - + - - - - - - - - -+- - - - - + - + - - - - - - - - - - - - - bull - - -+ - +
o - GLY ~ ERY - DARA bull LARA + RID + DXYL + LXYL - ADO bull MDX - GAL + OLU - FRU + MNE - SBE - IlliA - DUL - INa - MAN - SOR - MDM - MOO shyNAG + AMY - ARB - ESC ~ SAL bull CEL - MAL + lAC - MEL + SAC - TRE shyINU - MLZ - RAF - AMD - GLYG - XLT - GEN - 11JR - LYX - TAG - DFUC shyLFUC - DARL - IARL - ONT + 2KO - 5KG +
- - - - - - Taxones significativos - - - - - - - Id T -- Test en contra
Lactobrevis 3 963 088 1
Taxon siguiente Lactoco11inoides 36 075 2
Lactobrevis 3 1 test (s) en contra
GLUCOSE (GLU) 95
-~~~------------~---------------------------~--~-------~--~-----~----------~--------~------------~~--Taxon siguiente Lactocollinoides 2 test (s) en contra
GLUCOSE (GLU) 100 MELIBIOSE (MEL) 25
69
i r
ANEXO D RESULTADO PRUEBAS BIOQIJiMICAS DE CEPA AISLADA DE LECHE FERMENTADA
Referenda Leche fennentada ~ 13 Fecha 27012003
BUENA IDENTIFICACI6N
Galeria API 50 CHL V50 Leida el 270112003
Perfil - - - - -t-t+- - - - + - + - - - bull - - - - -+- - - - - + - + - - - - - - - - - - - - - - - - -+ - +
0 - GLY - ERY - DARA - LARA +Rll3 + DXYL + LXYL - ADO - MDX ~GAL + GLU - FRU + MNE SBE - RHA DUL bull INO MAN - SOR MDM bull MDG shy
~NAG + AMY - ARB - ESC - SAL - CEL - MAL + LAC - MEL + SAC - TRE I lNU - MLZ - RAF - AMD - GLYG - XLT - OEN - IUR LYX - TAG - DFUC bull i
LFUC - DARL - LARL -ONr + 2KG - SKO + 1
- -- - - Taxones significativos - - Id -- T --- Test en contra
Lacta brevis 3 963 088 1
Taxon siguiente Lactocollinoides 36 075 2
Lactobrevis 3 1 test (s) en contra
GLUCOSE (GLU) 95
-----------------------------------------------------------~------------------------------~-------------------Taxon siguiente Lactocollinoides 2 test (s) en contra
GLUCOSE (GLD) 100 MELffiIOSE (MEL) 25
70
II iJ1
I
I ANEXO E RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AISLADA DE REPOLLITAS DE BRUSELAS FERMENTADA
Referencia repollitas de bruselas 15 Fecha 03072003
EXCELENTE IDENTIFICACION
Lactoplantarum 1
Galeria API 50 CHL vsO Leida el 03072003
Perfil - - - - +t - - - - +H+ - +- - +t + - I I I I I I I f ++t - + - - - -+ + - - - -+ -+ - - I ij
o - GLY - ERY - DARA - LARA + RJB + DXYL - LXYL - ADO - MDX - GAL +
GLU + FRU + MNE + SBE RHA + DUL - INO - MAN + SOR + MDM + MOG shyNAG + AMY + ARB + ESC + SAL + eEL + MAL + LAC + MEl + SAC + TRE + i
I1NU - MLZ + RAF AMD GLYG - XLT - aEN + TUR + LYX - TAG - Druc LFUC - DARt + LARL - aNT + 2KG - 5KG shy n ----Taxones significativos ------ Id Tests en contra
Lactoplantarum 1 999 090 o
Taxon siguiente Lacto pentosus 01 012 7
Lactoplantarum 1 o test (s) en contra
Taxon siguiente Lacto pentosus 7 test (8) en contra
GLYCEROL (GLY) 75 D-XYLOSE (DXYL) 100 L-RHAMNOSE (RHA) 25 METHYL-D-MANNOSIDE (MOM) 1 MELEZITOSE (MLZ) 25 RAFFINOSE (RAF) 75 D-ARABITOL (DARL) 0
71
~
I i I
ANEXO F - ANALISIS DE REGRESION PARA pH EN BEBIDA SIN AVENA
Aruilisis de regresi6n polinomial
---~-~-------------------------------------------~-----------~~---------------------~--------------Variable dependiente pHSinAvena ---------------------------~-------------~--------------------~---------------------------------
Error T Parametro Estimado Estandar Estadistico P-Valor
CONSTANTE 535606 0094535 56657 00000 Dia -0150565 0020706 727154 00000 Dia2 000504434 0000871488 578819 00001
---~---------------------------------------------------------------------------------------------------
Anfllisis de Variama -------------------------------------------~-----------~-----------------------------~-~--- jSource Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor 11
------------------------~------------------------------------------------------------------------------~ Mod-elo 155772 2 0118861 4256 00000 Residual 0237877 13 00182983
Total (Corr) 11956 IS
R2 == 867522 percent
pHSinAvena == 535606 - 0150565Dia + 000504434Dia2
72
____
middot ANEXO G - ANALISIS DE REGRESION PARA pH EN BEBIDA CON AVENA
AmUisis de regresion polinomial _____~_____~__-_____~___4____________________bull____bull__________bull_____________~~----_------___________
Variable depcndiente pHConA vena ------------------------------------------------------------------------------------------~--------
Error T Parametro Estimado StAndar Estadfstico P-Valor
---------------------------------------------~-----------------------------------------------_---------CONSTANTE 534463 00801045 667208 00000 Dia -0140407 00175453 800253 00000 DiaA 2 000448098 0000738458 606803 00000
----------------------~---~-----------------------------~------------------------------~----AmUisis de Varianza
---~---------------------------------~---------------------~------------~-------------------~------Source Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio PValor --------------------------~-----------------------------------------------~------------~-----~~--~ ModeJo 159575 2 0797873 6073 00000 Residual 02170798 middot13 00131383 _______~_~ ~_~----------~------~--~-----~-M-----~-----____ _____________~-----------------------Total (COlT) 176654 15
R12 903315 percent
-----------~------------------------------------------------------------------------~-----------pHConAvena 534463 - 0140407Dia + 000448098DfaA 2
73
ANEXO H - ANALTSIS DE REGRESTON PARA ACIDEZ EN BEBJDA SIN AVENA
An8Jisis de Regtesi6fi P6lifJomial
Variable Depefidiefile~ AcidezSinAVenll _______________w_____~______~________________~-----------_________~_________________~~____~___~_____
Error T Pariirnetro Estimado Estandar Estadistico ---------------------------------------~--------------~-~-------~--------------------~------------CONSTANT 0491697 00123217 399051 00000 Dia 00436032 000269882 161564 00000 D1a2 -000144613 000011359 127312 00000 __w___~________________________~-_______-_____~----____________________________~__~---~_--__~___
AriiiJisis de varianza ~_~__~__________~_~____~________~___________- _________e_____________________________bull _____-________
Source Smn de cuadr Df Mean Square F-Ratio PmiddotValor_~~___________________________________bull ______~___________bull ____________bull ______~________w________________
Model 0135203 2 00676013 21747 00000 Residual 000404118 13 000031086
Total (Corr) 0139244 15
R2 970978 percent
AcidezSlnAvena 0491697 + O0436032Dia - 0OOl44613Dia2
74
I
ANEXO I ANALISIS DE REGRESION PARA ACIDEZ EN BEBIDA CON AVENA
1
Anwisis de tegtesi6fi polinomial
Variable dependiente Acidez Con Avena
Error T ParametTo Estimado Stlindar Estadfstico P-Valor ----------------~-------~---------------------~-----------------------------------------------------CONSTANT 0491639 000926607 530578 00000 Diamiddot 00406572 000202955 200326 00000 DfaA 2 0000982559 0000085421 -115025 00000
-------------~----------------------------~-------------------------~-----------------------------------
-------------~-----~~-----------------------------~---------------------------------------------_--Source Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio PValor
-~-------------~----------------------------------~------------------~~-------------------------- Modelo 0288008 2 0144004 81914 00000 Residual 000228539 13 0000175799
----------~~--------------~---------------------------------------------~---------------------------Total (Corr) 0290294 15
RA2 = 992127 percent
-------------------------~----~---~------------~---------------------------------~---------------~
AcidezConAvena == 049163amp + 00406572D1a - 0000982559DiaA2
75
I
(Ilmiddot il
ANEXO J- ANALISIS DE REGRESION PARA RECUENTO LACTOBACILOS PARA BEBIDA SIN AVENA
Amilisis de regresion - Modelo lineal Y = a + bX
------------------------~----------------------~-----------------------------~----------~-----------Variable Dcpendiente LactobacilJusSinAvena Variable independiente Dia
I--------~----------~-----------------------------------~-------~-~--~--------------------------~-Error T
Paramctro Estimado Standard Stadistico P-Valor
----~----~------------~-----~-----------------------~-------------~-----------------------------Intereepto 117347 0389973 300911 00000 Pendiente 00483464 00257889 18747 00903
Analisis de Varianza
---------~------------------~----------------~---------------------------------~---------~----------Source Sum decuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor
------------~---------------------~---------------------~--------------------------------~-----~----Modelo 0916252 1 244835 443 00616 Residual 260706 10 0260706
--~------------~---~------------------~~~-----~-------~---------~~-------------------------------------Total (Corr)352332 11
Coeficiente Correlaci6n = 0509955 R2 = 260054 percent
LactobacillusSinAvena= 117347 + 00483464Dfa
76
ANEXO K- ANALTSIS DE REGRESION PARA RECUENTO LACTOBACILOS PARA DEBIDA CON AVENA
Aruilisis de regresion - Modelo lineal Y = a + hX
Variable Dependiente LactobacillusConAvena Variable Independiente Dia ---~--------------------------------------------------------__-----------__--_--_-----------shy
Error T Paramctro Estimado Standard Estadistico P-Valor -~--------------------------------------------------------------------------------------------------
Irttercepto 118103 0567963 207942 00000 Pendiente 00790304 00375594 210414 00616
-----------------~----------------------------~----~-------~----~----------------------------
Analisis de Varianza
----------------~----------------~------------------~--------------------------~------~--------shySource Swn de cuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor
-----------------~--~--------------------------------------------------------------------------~---~ Mode10 244835 1 244835 443 00616 Residual 552997 10 0552997
Total (Corr)797832 11
Coeficiente Correlacion = 0553964 RI2 = 306875 percent
-----~--------------------------------------------------------~--------------------------------------
LactobacillusConAvena = 118103 + 00790304Dfas
77
1
TABLA 15 Comparaci6n medias lag Lactobacillus
DIAS SIN AVENA CON AVENA tc p(VALOR)
7 122257 122022 04846 06451
14 121065 132393 -19602 00977
21 129025 133087 -08236 04416
At aplicar regresion a los datos se obtiane al modelo astimado
LactobacillusSinAvena= 117347 + 004834640Ia
La variabilidad en la respuesta del recuento de LactobaCillus ssta siendo
explicada en un 260054 por el mod$loVar anexo J)
EI tratamiento con avena mostr6 al siguiente modalo al anal isis de regresion
Lactobacillu$ConAvena =118103 + 007903040Ias
La variabilidad en la respuesta de recuento esta siendo explicada en un 3068
por al modelo(Ver anexo K)~
38 Analisi$ microbiol6gicos de las bebidas lacteas con y sin
En la Tabla 16 estan recopilados los resultados microbiol6gieos obtenidos en ras
muestras con los dos tratamientos (con y sin avena)
I [
sa
TABLA 16 Resultados analisis microbiologico
Recuento de mohos y levaduras Iml lt10
Recuento de Staphylococcus coagulase positiva Iml lt100
NMP coliformes fotales y Escherichia coli Iml lt3
Presencia de Salmonella25ml Ausente
Los resultados de este analisis demuestran que las bebidas fermentadas con y
sin avena~ astan fibres de microorganismos patogenos
57
1
4 CONCLUSIONES
Se aislaron cepas nativas de Lactobacillus plantarum de las muestras vegetates
de repollo pepino repollitas de bruselas fermentadas y Lactobacillus brevis de
lache fermentada y mucosa vaginal humana Ambas cepas resistieran un pH=2 y
una concentraci6n de sales biliares det 03 ptv dos earacteristicas importantes
en los probi6ticos
Lamiddot cepa de Lactobacillus brevis aislada de lache Sa utiliz6 para elaborar una
bebida fermentada sin y con avana comoingrediente prebiotico obteniendose un
aJimento centon recuento del probi6tico viable durante 21 dras de seguimiento
ademas libre de microorganismos )at6gen05
No se encontr6 efecta significativo de la avena sobre Ie viabilidad del Lactobacillus
brevis aunque sa presento un aumento en 61 recuento de estos en la bebida con
avena
58
plusmn ~
5 RECOMENDACIONES
Ensayar la cepa de Lactobacillus plantartJm en productos carnicos madurados
como el salami
Ensayar la cepa de Lactobacillus l)revs en otros derivados lecteos como queso
quesito queso crema
Continuar con el estudio de estos microorganismos y caracterizarlos
molecularmente ademas de estudiar su capacidad de adherencja a fa mucosa
intestinal sobre algunes Hneas celulares como las CaCo~2
Estudiarel efedo de la avena sabre la viabiJidad del Lactobacillus breyis a una
concentraci6n mayor de 05
Realizer ensayos can las cepas de Lactobacillus brevis y Lactobrlcillus pJantarum
para elaborar masas acidas para panificacion reemplazando el Bromato de
Potasio aditivo prohibido desde marzo del 2003 en nuestro pais per 5U toxicidad
59
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65
ANEXOS
66
ANEXO A RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AlSLADA DE i
PEPINO it
Referencia Pepino 1 Fecha 06122002
IEXCELENTE IDENTIFICACION
Latto plantarum 1
Galeria API 50 CHL V50 Leida el 06122002
Perfil - -- - ++ - -- - ++++ - - -+- + - I I I I I I I I +t+ - +f- ~ - - + + ~ - - - +- + - shy
o - GLY - ERY DARA - LARA + RIB + DXYL - LXYL - ADO - MDX - GAL + GLU + FRU + MNE + SBE - RHA - DUL - INO bull MAN + SOR - MDM + MUG shyNAG + AMY + ARB + ESC + SAL + CEL + MAL + LAC + MEL + SAC + TRE + 1NU - MLZ + RAF + AMD - GLYG - XLT - GEN + TIJR + LYX - TAG - DFUC shyLFUC - DARL + LARL - aNT + 2KG - 5KG shy
--- Taxones significativos rd -----T -- Tests en contra
Lactoplantarum 1 999 092 1
Taxon siguiente Lactobrevis 1 OJ 044 3
i i
Lactoplantarum 1 1 test (5) en contra
D-SORBITOL (SOR) 78
Tax6n siguiente Lactobrevis 1 3 test (s) ert contra
METHYLD-MANNOSIDE (MOlM) 0 MELEZITOSE (MLZ) 14 D-TURANOSE (TUR) 14
67
ampb
ANEXO B RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AISLADA DE REPOLLO FERMENTADO
~
Referencia Repollo fermentado - 3 Fecha 03072003
EXCELENTE IDENTIFICACION
Lactoplantarum 1
Galena API 50 CRL V50 Leida el 03072003
Perfil - - ++ - - - - -H++ - - ~ + - + - I I 1 I I I I -H+ - ++ - - - + + - -- - - + - shy
o - GLY - ERY - DARA - LARA + RIB + DXYL - LXYL - ADO ~ MDX - GAL + GLU + FRU + MNE + SBE ~ RHA - DUL - INO - MAN + SOR - MDM + MDG shyNAG + AMY + ARR + ESC + SAT + CRL + MAL + LAC + MEL + SAC + TRE + lNU - MLZ + RAF + AMI) - GLYG - XLT - GEN + TOR + LYX - TAG - DFUC shyLFUC - DARL - LARL - GNT + 2KG - 5KG shy
------Taxones significativos _ _----- Id--- ---T---- Tests en contra
Lactoplantarum 1 999 095 1
Tax6n siguiente Lactobrevis 1 01 OA8 3
lJactoplantaru01 1 1 test (s) en contra
DSORBITOL (SOR) 78
Taxon siguiente Lactobrevis
METHYL-D-MANNOSIDE D-TURANOSE
1
(MOM) (TOR)
3 test (5) en contra
0 MELEZITOSE 14
(MLZ) 14
i
I
68
ANEXO C RESULTADO PRUEBAS BIOQUWICAS DE CEPA AISLADA DE MUCOSA HUMANA
Referenda Mucosa - 5 Fecha 27012003
BUENA IDENTlFICACION
Galeria API 50 CHL vso Leida el 270112003
Perfil - - - - +t--t - - - + - + - - - - - - - - -+- - - - - + - + - - - - - - - - - - - - - bull - - -+ - +
o - GLY ~ ERY - DARA bull LARA + RID + DXYL + LXYL - ADO bull MDX - GAL + OLU - FRU + MNE - SBE - IlliA - DUL - INa - MAN - SOR - MDM - MOO shyNAG + AMY - ARB - ESC ~ SAL bull CEL - MAL + lAC - MEL + SAC - TRE shyINU - MLZ - RAF - AMD - GLYG - XLT - GEN - 11JR - LYX - TAG - DFUC shyLFUC - DARL - IARL - ONT + 2KO - 5KG +
- - - - - - Taxones significativos - - - - - - - Id T -- Test en contra
Lactobrevis 3 963 088 1
Taxon siguiente Lactoco11inoides 36 075 2
Lactobrevis 3 1 test (s) en contra
GLUCOSE (GLU) 95
-~~~------------~---------------------------~--~-------~--~-----~----------~--------~------------~~--Taxon siguiente Lactocollinoides 2 test (s) en contra
GLUCOSE (GLU) 100 MELIBIOSE (MEL) 25
69
i r
ANEXO D RESULTADO PRUEBAS BIOQIJiMICAS DE CEPA AISLADA DE LECHE FERMENTADA
Referenda Leche fennentada ~ 13 Fecha 27012003
BUENA IDENTIFICACI6N
Galeria API 50 CHL V50 Leida el 270112003
Perfil - - - - -t-t+- - - - + - + - - - bull - - - - -+- - - - - + - + - - - - - - - - - - - - - - - - -+ - +
0 - GLY - ERY - DARA - LARA +Rll3 + DXYL + LXYL - ADO - MDX ~GAL + GLU - FRU + MNE SBE - RHA DUL bull INO MAN - SOR MDM bull MDG shy
~NAG + AMY - ARB - ESC - SAL - CEL - MAL + LAC - MEL + SAC - TRE I lNU - MLZ - RAF - AMD - GLYG - XLT - OEN - IUR LYX - TAG - DFUC bull i
LFUC - DARL - LARL -ONr + 2KG - SKO + 1
- -- - - Taxones significativos - - Id -- T --- Test en contra
Lacta brevis 3 963 088 1
Taxon siguiente Lactocollinoides 36 075 2
Lactobrevis 3 1 test (s) en contra
GLUCOSE (GLU) 95
-----------------------------------------------------------~------------------------------~-------------------Taxon siguiente Lactocollinoides 2 test (s) en contra
GLUCOSE (GLD) 100 MELffiIOSE (MEL) 25
70
II iJ1
I
I ANEXO E RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AISLADA DE REPOLLITAS DE BRUSELAS FERMENTADA
Referencia repollitas de bruselas 15 Fecha 03072003
EXCELENTE IDENTIFICACION
Lactoplantarum 1
Galeria API 50 CHL vsO Leida el 03072003
Perfil - - - - +t - - - - +H+ - +- - +t + - I I I I I I I f ++t - + - - - -+ + - - - -+ -+ - - I ij
o - GLY - ERY - DARA - LARA + RJB + DXYL - LXYL - ADO - MDX - GAL +
GLU + FRU + MNE + SBE RHA + DUL - INO - MAN + SOR + MDM + MOG shyNAG + AMY + ARB + ESC + SAL + eEL + MAL + LAC + MEl + SAC + TRE + i
I1NU - MLZ + RAF AMD GLYG - XLT - aEN + TUR + LYX - TAG - Druc LFUC - DARt + LARL - aNT + 2KG - 5KG shy n ----Taxones significativos ------ Id Tests en contra
Lactoplantarum 1 999 090 o
Taxon siguiente Lacto pentosus 01 012 7
Lactoplantarum 1 o test (s) en contra
Taxon siguiente Lacto pentosus 7 test (8) en contra
GLYCEROL (GLY) 75 D-XYLOSE (DXYL) 100 L-RHAMNOSE (RHA) 25 METHYL-D-MANNOSIDE (MOM) 1 MELEZITOSE (MLZ) 25 RAFFINOSE (RAF) 75 D-ARABITOL (DARL) 0
71
~
I i I
ANEXO F - ANALISIS DE REGRESION PARA pH EN BEBIDA SIN AVENA
Aruilisis de regresi6n polinomial
---~-~-------------------------------------------~-----------~~---------------------~--------------Variable dependiente pHSinAvena ---------------------------~-------------~--------------------~---------------------------------
Error T Parametro Estimado Estandar Estadistico P-Valor
CONSTANTE 535606 0094535 56657 00000 Dia -0150565 0020706 727154 00000 Dia2 000504434 0000871488 578819 00001
---~---------------------------------------------------------------------------------------------------
Anfllisis de Variama -------------------------------------------~-----------~-----------------------------~-~--- jSource Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor 11
------------------------~------------------------------------------------------------------------------~ Mod-elo 155772 2 0118861 4256 00000 Residual 0237877 13 00182983
Total (Corr) 11956 IS
R2 == 867522 percent
pHSinAvena == 535606 - 0150565Dia + 000504434Dia2
72
____
middot ANEXO G - ANALISIS DE REGRESION PARA pH EN BEBIDA CON AVENA
AmUisis de regresion polinomial _____~_____~__-_____~___4____________________bull____bull__________bull_____________~~----_------___________
Variable depcndiente pHConA vena ------------------------------------------------------------------------------------------~--------
Error T Parametro Estimado StAndar Estadfstico P-Valor
---------------------------------------------~-----------------------------------------------_---------CONSTANTE 534463 00801045 667208 00000 Dia -0140407 00175453 800253 00000 DiaA 2 000448098 0000738458 606803 00000
----------------------~---~-----------------------------~------------------------------~----AmUisis de Varianza
---~---------------------------------~---------------------~------------~-------------------~------Source Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio PValor --------------------------~-----------------------------------------------~------------~-----~~--~ ModeJo 159575 2 0797873 6073 00000 Residual 02170798 middot13 00131383 _______~_~ ~_~----------~------~--~-----~-M-----~-----____ _____________~-----------------------Total (COlT) 176654 15
R12 903315 percent
-----------~------------------------------------------------------------------------~-----------pHConAvena 534463 - 0140407Dia + 000448098DfaA 2
73
ANEXO H - ANALTSIS DE REGRESTON PARA ACIDEZ EN BEBJDA SIN AVENA
An8Jisis de Regtesi6fi P6lifJomial
Variable Depefidiefile~ AcidezSinAVenll _______________w_____~______~________________~-----------_________~_________________~~____~___~_____
Error T Pariirnetro Estimado Estandar Estadistico ---------------------------------------~--------------~-~-------~--------------------~------------CONSTANT 0491697 00123217 399051 00000 Dia 00436032 000269882 161564 00000 D1a2 -000144613 000011359 127312 00000 __w___~________________________~-_______-_____~----____________________________~__~---~_--__~___
AriiiJisis de varianza ~_~__~__________~_~____~________~___________- _________e_____________________________bull _____-________
Source Smn de cuadr Df Mean Square F-Ratio PmiddotValor_~~___________________________________bull ______~___________bull ____________bull ______~________w________________
Model 0135203 2 00676013 21747 00000 Residual 000404118 13 000031086
Total (Corr) 0139244 15
R2 970978 percent
AcidezSlnAvena 0491697 + O0436032Dia - 0OOl44613Dia2
74
I
ANEXO I ANALISIS DE REGRESION PARA ACIDEZ EN BEBIDA CON AVENA
1
Anwisis de tegtesi6fi polinomial
Variable dependiente Acidez Con Avena
Error T ParametTo Estimado Stlindar Estadfstico P-Valor ----------------~-------~---------------------~-----------------------------------------------------CONSTANT 0491639 000926607 530578 00000 Diamiddot 00406572 000202955 200326 00000 DfaA 2 0000982559 0000085421 -115025 00000
-------------~----------------------------~-------------------------~-----------------------------------
-------------~-----~~-----------------------------~---------------------------------------------_--Source Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio PValor
-~-------------~----------------------------------~------------------~~-------------------------- Modelo 0288008 2 0144004 81914 00000 Residual 000228539 13 0000175799
----------~~--------------~---------------------------------------------~---------------------------Total (Corr) 0290294 15
RA2 = 992127 percent
-------------------------~----~---~------------~---------------------------------~---------------~
AcidezConAvena == 049163amp + 00406572D1a - 0000982559DiaA2
75
I
(Ilmiddot il
ANEXO J- ANALISIS DE REGRESION PARA RECUENTO LACTOBACILOS PARA BEBIDA SIN AVENA
Amilisis de regresion - Modelo lineal Y = a + bX
------------------------~----------------------~-----------------------------~----------~-----------Variable Dcpendiente LactobacilJusSinAvena Variable independiente Dia
I--------~----------~-----------------------------------~-------~-~--~--------------------------~-Error T
Paramctro Estimado Standard Stadistico P-Valor
----~----~------------~-----~-----------------------~-------------~-----------------------------Intereepto 117347 0389973 300911 00000 Pendiente 00483464 00257889 18747 00903
Analisis de Varianza
---------~------------------~----------------~---------------------------------~---------~----------Source Sum decuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor
------------~---------------------~---------------------~--------------------------------~-----~----Modelo 0916252 1 244835 443 00616 Residual 260706 10 0260706
--~------------~---~------------------~~~-----~-------~---------~~-------------------------------------Total (Corr)352332 11
Coeficiente Correlaci6n = 0509955 R2 = 260054 percent
LactobacillusSinAvena= 117347 + 00483464Dfa
76
ANEXO K- ANALTSIS DE REGRESION PARA RECUENTO LACTOBACILOS PARA DEBIDA CON AVENA
Aruilisis de regresion - Modelo lineal Y = a + hX
Variable Dependiente LactobacillusConAvena Variable Independiente Dia ---~--------------------------------------------------------__-----------__--_--_-----------shy
Error T Paramctro Estimado Standard Estadistico P-Valor -~--------------------------------------------------------------------------------------------------
Irttercepto 118103 0567963 207942 00000 Pendiente 00790304 00375594 210414 00616
-----------------~----------------------------~----~-------~----~----------------------------
Analisis de Varianza
----------------~----------------~------------------~--------------------------~------~--------shySource Swn de cuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor
-----------------~--~--------------------------------------------------------------------------~---~ Mode10 244835 1 244835 443 00616 Residual 552997 10 0552997
Total (Corr)797832 11
Coeficiente Correlacion = 0553964 RI2 = 306875 percent
-----~--------------------------------------------------------~--------------------------------------
LactobacillusConAvena = 118103 + 00790304Dfas
77
TABLA 16 Resultados analisis microbiologico
Recuento de mohos y levaduras Iml lt10
Recuento de Staphylococcus coagulase positiva Iml lt100
NMP coliformes fotales y Escherichia coli Iml lt3
Presencia de Salmonella25ml Ausente
Los resultados de este analisis demuestran que las bebidas fermentadas con y
sin avena~ astan fibres de microorganismos patogenos
57
1
4 CONCLUSIONES
Se aislaron cepas nativas de Lactobacillus plantarum de las muestras vegetates
de repollo pepino repollitas de bruselas fermentadas y Lactobacillus brevis de
lache fermentada y mucosa vaginal humana Ambas cepas resistieran un pH=2 y
una concentraci6n de sales biliares det 03 ptv dos earacteristicas importantes
en los probi6ticos
Lamiddot cepa de Lactobacillus brevis aislada de lache Sa utiliz6 para elaborar una
bebida fermentada sin y con avana comoingrediente prebiotico obteniendose un
aJimento centon recuento del probi6tico viable durante 21 dras de seguimiento
ademas libre de microorganismos )at6gen05
No se encontr6 efecta significativo de la avena sobre Ie viabilidad del Lactobacillus
brevis aunque sa presento un aumento en 61 recuento de estos en la bebida con
avena
58
plusmn ~
5 RECOMENDACIONES
Ensayar la cepa de Lactobacillus plantartJm en productos carnicos madurados
como el salami
Ensayar la cepa de Lactobacillus l)revs en otros derivados lecteos como queso
quesito queso crema
Continuar con el estudio de estos microorganismos y caracterizarlos
molecularmente ademas de estudiar su capacidad de adherencja a fa mucosa
intestinal sobre algunes Hneas celulares como las CaCo~2
Estudiarel efedo de la avena sabre la viabiJidad del Lactobacillus breyis a una
concentraci6n mayor de 05
Realizer ensayos can las cepas de Lactobacillus brevis y Lactobrlcillus pJantarum
para elaborar masas acidas para panificacion reemplazando el Bromato de
Potasio aditivo prohibido desde marzo del 2003 en nuestro pais per 5U toxicidad
59
REFERENCfAS BIBUOGRAFICAS
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65
ANEXOS
66
ANEXO A RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AlSLADA DE i
PEPINO it
Referencia Pepino 1 Fecha 06122002
IEXCELENTE IDENTIFICACION
Latto plantarum 1
Galeria API 50 CHL V50 Leida el 06122002
Perfil - -- - ++ - -- - ++++ - - -+- + - I I I I I I I I +t+ - +f- ~ - - + + ~ - - - +- + - shy
o - GLY - ERY DARA - LARA + RIB + DXYL - LXYL - ADO - MDX - GAL + GLU + FRU + MNE + SBE - RHA - DUL - INO bull MAN + SOR - MDM + MUG shyNAG + AMY + ARB + ESC + SAL + CEL + MAL + LAC + MEL + SAC + TRE + 1NU - MLZ + RAF + AMD - GLYG - XLT - GEN + TIJR + LYX - TAG - DFUC shyLFUC - DARL + LARL - aNT + 2KG - 5KG shy
--- Taxones significativos rd -----T -- Tests en contra
Lactoplantarum 1 999 092 1
Taxon siguiente Lactobrevis 1 OJ 044 3
i i
Lactoplantarum 1 1 test (5) en contra
D-SORBITOL (SOR) 78
Tax6n siguiente Lactobrevis 1 3 test (s) ert contra
METHYLD-MANNOSIDE (MOlM) 0 MELEZITOSE (MLZ) 14 D-TURANOSE (TUR) 14
67
ampb
ANEXO B RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AISLADA DE REPOLLO FERMENTADO
~
Referencia Repollo fermentado - 3 Fecha 03072003
EXCELENTE IDENTIFICACION
Lactoplantarum 1
Galena API 50 CRL V50 Leida el 03072003
Perfil - - ++ - - - - -H++ - - ~ + - + - I I 1 I I I I -H+ - ++ - - - + + - -- - - + - shy
o - GLY - ERY - DARA - LARA + RIB + DXYL - LXYL - ADO ~ MDX - GAL + GLU + FRU + MNE + SBE ~ RHA - DUL - INO - MAN + SOR - MDM + MDG shyNAG + AMY + ARR + ESC + SAT + CRL + MAL + LAC + MEL + SAC + TRE + lNU - MLZ + RAF + AMI) - GLYG - XLT - GEN + TOR + LYX - TAG - DFUC shyLFUC - DARL - LARL - GNT + 2KG - 5KG shy
------Taxones significativos _ _----- Id--- ---T---- Tests en contra
Lactoplantarum 1 999 095 1
Tax6n siguiente Lactobrevis 1 01 OA8 3
lJactoplantaru01 1 1 test (s) en contra
DSORBITOL (SOR) 78
Taxon siguiente Lactobrevis
METHYL-D-MANNOSIDE D-TURANOSE
1
(MOM) (TOR)
3 test (5) en contra
0 MELEZITOSE 14
(MLZ) 14
i
I
68
ANEXO C RESULTADO PRUEBAS BIOQUWICAS DE CEPA AISLADA DE MUCOSA HUMANA
Referenda Mucosa - 5 Fecha 27012003
BUENA IDENTlFICACION
Galeria API 50 CHL vso Leida el 270112003
Perfil - - - - +t--t - - - + - + - - - - - - - - -+- - - - - + - + - - - - - - - - - - - - - bull - - -+ - +
o - GLY ~ ERY - DARA bull LARA + RID + DXYL + LXYL - ADO bull MDX - GAL + OLU - FRU + MNE - SBE - IlliA - DUL - INa - MAN - SOR - MDM - MOO shyNAG + AMY - ARB - ESC ~ SAL bull CEL - MAL + lAC - MEL + SAC - TRE shyINU - MLZ - RAF - AMD - GLYG - XLT - GEN - 11JR - LYX - TAG - DFUC shyLFUC - DARL - IARL - ONT + 2KO - 5KG +
- - - - - - Taxones significativos - - - - - - - Id T -- Test en contra
Lactobrevis 3 963 088 1
Taxon siguiente Lactoco11inoides 36 075 2
Lactobrevis 3 1 test (s) en contra
GLUCOSE (GLU) 95
-~~~------------~---------------------------~--~-------~--~-----~----------~--------~------------~~--Taxon siguiente Lactocollinoides 2 test (s) en contra
GLUCOSE (GLU) 100 MELIBIOSE (MEL) 25
69
i r
ANEXO D RESULTADO PRUEBAS BIOQIJiMICAS DE CEPA AISLADA DE LECHE FERMENTADA
Referenda Leche fennentada ~ 13 Fecha 27012003
BUENA IDENTIFICACI6N
Galeria API 50 CHL V50 Leida el 270112003
Perfil - - - - -t-t+- - - - + - + - - - bull - - - - -+- - - - - + - + - - - - - - - - - - - - - - - - -+ - +
0 - GLY - ERY - DARA - LARA +Rll3 + DXYL + LXYL - ADO - MDX ~GAL + GLU - FRU + MNE SBE - RHA DUL bull INO MAN - SOR MDM bull MDG shy
~NAG + AMY - ARB - ESC - SAL - CEL - MAL + LAC - MEL + SAC - TRE I lNU - MLZ - RAF - AMD - GLYG - XLT - OEN - IUR LYX - TAG - DFUC bull i
LFUC - DARL - LARL -ONr + 2KG - SKO + 1
- -- - - Taxones significativos - - Id -- T --- Test en contra
Lacta brevis 3 963 088 1
Taxon siguiente Lactocollinoides 36 075 2
Lactobrevis 3 1 test (s) en contra
GLUCOSE (GLU) 95
-----------------------------------------------------------~------------------------------~-------------------Taxon siguiente Lactocollinoides 2 test (s) en contra
GLUCOSE (GLD) 100 MELffiIOSE (MEL) 25
70
II iJ1
I
I ANEXO E RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AISLADA DE REPOLLITAS DE BRUSELAS FERMENTADA
Referencia repollitas de bruselas 15 Fecha 03072003
EXCELENTE IDENTIFICACION
Lactoplantarum 1
Galeria API 50 CHL vsO Leida el 03072003
Perfil - - - - +t - - - - +H+ - +- - +t + - I I I I I I I f ++t - + - - - -+ + - - - -+ -+ - - I ij
o - GLY - ERY - DARA - LARA + RJB + DXYL - LXYL - ADO - MDX - GAL +
GLU + FRU + MNE + SBE RHA + DUL - INO - MAN + SOR + MDM + MOG shyNAG + AMY + ARB + ESC + SAL + eEL + MAL + LAC + MEl + SAC + TRE + i
I1NU - MLZ + RAF AMD GLYG - XLT - aEN + TUR + LYX - TAG - Druc LFUC - DARt + LARL - aNT + 2KG - 5KG shy n ----Taxones significativos ------ Id Tests en contra
Lactoplantarum 1 999 090 o
Taxon siguiente Lacto pentosus 01 012 7
Lactoplantarum 1 o test (s) en contra
Taxon siguiente Lacto pentosus 7 test (8) en contra
GLYCEROL (GLY) 75 D-XYLOSE (DXYL) 100 L-RHAMNOSE (RHA) 25 METHYL-D-MANNOSIDE (MOM) 1 MELEZITOSE (MLZ) 25 RAFFINOSE (RAF) 75 D-ARABITOL (DARL) 0
71
~
I i I
ANEXO F - ANALISIS DE REGRESION PARA pH EN BEBIDA SIN AVENA
Aruilisis de regresi6n polinomial
---~-~-------------------------------------------~-----------~~---------------------~--------------Variable dependiente pHSinAvena ---------------------------~-------------~--------------------~---------------------------------
Error T Parametro Estimado Estandar Estadistico P-Valor
CONSTANTE 535606 0094535 56657 00000 Dia -0150565 0020706 727154 00000 Dia2 000504434 0000871488 578819 00001
---~---------------------------------------------------------------------------------------------------
Anfllisis de Variama -------------------------------------------~-----------~-----------------------------~-~--- jSource Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor 11
------------------------~------------------------------------------------------------------------------~ Mod-elo 155772 2 0118861 4256 00000 Residual 0237877 13 00182983
Total (Corr) 11956 IS
R2 == 867522 percent
pHSinAvena == 535606 - 0150565Dia + 000504434Dia2
72
____
middot ANEXO G - ANALISIS DE REGRESION PARA pH EN BEBIDA CON AVENA
AmUisis de regresion polinomial _____~_____~__-_____~___4____________________bull____bull__________bull_____________~~----_------___________
Variable depcndiente pHConA vena ------------------------------------------------------------------------------------------~--------
Error T Parametro Estimado StAndar Estadfstico P-Valor
---------------------------------------------~-----------------------------------------------_---------CONSTANTE 534463 00801045 667208 00000 Dia -0140407 00175453 800253 00000 DiaA 2 000448098 0000738458 606803 00000
----------------------~---~-----------------------------~------------------------------~----AmUisis de Varianza
---~---------------------------------~---------------------~------------~-------------------~------Source Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio PValor --------------------------~-----------------------------------------------~------------~-----~~--~ ModeJo 159575 2 0797873 6073 00000 Residual 02170798 middot13 00131383 _______~_~ ~_~----------~------~--~-----~-M-----~-----____ _____________~-----------------------Total (COlT) 176654 15
R12 903315 percent
-----------~------------------------------------------------------------------------~-----------pHConAvena 534463 - 0140407Dia + 000448098DfaA 2
73
ANEXO H - ANALTSIS DE REGRESTON PARA ACIDEZ EN BEBJDA SIN AVENA
An8Jisis de Regtesi6fi P6lifJomial
Variable Depefidiefile~ AcidezSinAVenll _______________w_____~______~________________~-----------_________~_________________~~____~___~_____
Error T Pariirnetro Estimado Estandar Estadistico ---------------------------------------~--------------~-~-------~--------------------~------------CONSTANT 0491697 00123217 399051 00000 Dia 00436032 000269882 161564 00000 D1a2 -000144613 000011359 127312 00000 __w___~________________________~-_______-_____~----____________________________~__~---~_--__~___
AriiiJisis de varianza ~_~__~__________~_~____~________~___________- _________e_____________________________bull _____-________
Source Smn de cuadr Df Mean Square F-Ratio PmiddotValor_~~___________________________________bull ______~___________bull ____________bull ______~________w________________
Model 0135203 2 00676013 21747 00000 Residual 000404118 13 000031086
Total (Corr) 0139244 15
R2 970978 percent
AcidezSlnAvena 0491697 + O0436032Dia - 0OOl44613Dia2
74
I
ANEXO I ANALISIS DE REGRESION PARA ACIDEZ EN BEBIDA CON AVENA
1
Anwisis de tegtesi6fi polinomial
Variable dependiente Acidez Con Avena
Error T ParametTo Estimado Stlindar Estadfstico P-Valor ----------------~-------~---------------------~-----------------------------------------------------CONSTANT 0491639 000926607 530578 00000 Diamiddot 00406572 000202955 200326 00000 DfaA 2 0000982559 0000085421 -115025 00000
-------------~----------------------------~-------------------------~-----------------------------------
-------------~-----~~-----------------------------~---------------------------------------------_--Source Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio PValor
-~-------------~----------------------------------~------------------~~-------------------------- Modelo 0288008 2 0144004 81914 00000 Residual 000228539 13 0000175799
----------~~--------------~---------------------------------------------~---------------------------Total (Corr) 0290294 15
RA2 = 992127 percent
-------------------------~----~---~------------~---------------------------------~---------------~
AcidezConAvena == 049163amp + 00406572D1a - 0000982559DiaA2
75
I
(Ilmiddot il
ANEXO J- ANALISIS DE REGRESION PARA RECUENTO LACTOBACILOS PARA BEBIDA SIN AVENA
Amilisis de regresion - Modelo lineal Y = a + bX
------------------------~----------------------~-----------------------------~----------~-----------Variable Dcpendiente LactobacilJusSinAvena Variable independiente Dia
I--------~----------~-----------------------------------~-------~-~--~--------------------------~-Error T
Paramctro Estimado Standard Stadistico P-Valor
----~----~------------~-----~-----------------------~-------------~-----------------------------Intereepto 117347 0389973 300911 00000 Pendiente 00483464 00257889 18747 00903
Analisis de Varianza
---------~------------------~----------------~---------------------------------~---------~----------Source Sum decuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor
------------~---------------------~---------------------~--------------------------------~-----~----Modelo 0916252 1 244835 443 00616 Residual 260706 10 0260706
--~------------~---~------------------~~~-----~-------~---------~~-------------------------------------Total (Corr)352332 11
Coeficiente Correlaci6n = 0509955 R2 = 260054 percent
LactobacillusSinAvena= 117347 + 00483464Dfa
76
ANEXO K- ANALTSIS DE REGRESION PARA RECUENTO LACTOBACILOS PARA DEBIDA CON AVENA
Aruilisis de regresion - Modelo lineal Y = a + hX
Variable Dependiente LactobacillusConAvena Variable Independiente Dia ---~--------------------------------------------------------__-----------__--_--_-----------shy
Error T Paramctro Estimado Standard Estadistico P-Valor -~--------------------------------------------------------------------------------------------------
Irttercepto 118103 0567963 207942 00000 Pendiente 00790304 00375594 210414 00616
-----------------~----------------------------~----~-------~----~----------------------------
Analisis de Varianza
----------------~----------------~------------------~--------------------------~------~--------shySource Swn de cuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor
-----------------~--~--------------------------------------------------------------------------~---~ Mode10 244835 1 244835 443 00616 Residual 552997 10 0552997
Total (Corr)797832 11
Coeficiente Correlacion = 0553964 RI2 = 306875 percent
-----~--------------------------------------------------------~--------------------------------------
LactobacillusConAvena = 118103 + 00790304Dfas
77
1
4 CONCLUSIONES
Se aislaron cepas nativas de Lactobacillus plantarum de las muestras vegetates
de repollo pepino repollitas de bruselas fermentadas y Lactobacillus brevis de
lache fermentada y mucosa vaginal humana Ambas cepas resistieran un pH=2 y
una concentraci6n de sales biliares det 03 ptv dos earacteristicas importantes
en los probi6ticos
Lamiddot cepa de Lactobacillus brevis aislada de lache Sa utiliz6 para elaborar una
bebida fermentada sin y con avana comoingrediente prebiotico obteniendose un
aJimento centon recuento del probi6tico viable durante 21 dras de seguimiento
ademas libre de microorganismos )at6gen05
No se encontr6 efecta significativo de la avena sobre Ie viabilidad del Lactobacillus
brevis aunque sa presento un aumento en 61 recuento de estos en la bebida con
avena
58
plusmn ~
5 RECOMENDACIONES
Ensayar la cepa de Lactobacillus plantartJm en productos carnicos madurados
como el salami
Ensayar la cepa de Lactobacillus l)revs en otros derivados lecteos como queso
quesito queso crema
Continuar con el estudio de estos microorganismos y caracterizarlos
molecularmente ademas de estudiar su capacidad de adherencja a fa mucosa
intestinal sobre algunes Hneas celulares como las CaCo~2
Estudiarel efedo de la avena sabre la viabiJidad del Lactobacillus breyis a una
concentraci6n mayor de 05
Realizer ensayos can las cepas de Lactobacillus brevis y Lactobrlcillus pJantarum
para elaborar masas acidas para panificacion reemplazando el Bromato de
Potasio aditivo prohibido desde marzo del 2003 en nuestro pais per 5U toxicidad
59
REFERENCfAS BIBUOGRAFICAS
ALANDER M SATORAKI R KORPELA R (1999) Persistence of colonization
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ANEXOS
66
ANEXO A RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AlSLADA DE i
PEPINO it
Referencia Pepino 1 Fecha 06122002
IEXCELENTE IDENTIFICACION
Latto plantarum 1
Galeria API 50 CHL V50 Leida el 06122002
Perfil - -- - ++ - -- - ++++ - - -+- + - I I I I I I I I +t+ - +f- ~ - - + + ~ - - - +- + - shy
o - GLY - ERY DARA - LARA + RIB + DXYL - LXYL - ADO - MDX - GAL + GLU + FRU + MNE + SBE - RHA - DUL - INO bull MAN + SOR - MDM + MUG shyNAG + AMY + ARB + ESC + SAL + CEL + MAL + LAC + MEL + SAC + TRE + 1NU - MLZ + RAF + AMD - GLYG - XLT - GEN + TIJR + LYX - TAG - DFUC shyLFUC - DARL + LARL - aNT + 2KG - 5KG shy
--- Taxones significativos rd -----T -- Tests en contra
Lactoplantarum 1 999 092 1
Taxon siguiente Lactobrevis 1 OJ 044 3
i i
Lactoplantarum 1 1 test (5) en contra
D-SORBITOL (SOR) 78
Tax6n siguiente Lactobrevis 1 3 test (s) ert contra
METHYLD-MANNOSIDE (MOlM) 0 MELEZITOSE (MLZ) 14 D-TURANOSE (TUR) 14
67
ampb
ANEXO B RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AISLADA DE REPOLLO FERMENTADO
~
Referencia Repollo fermentado - 3 Fecha 03072003
EXCELENTE IDENTIFICACION
Lactoplantarum 1
Galena API 50 CRL V50 Leida el 03072003
Perfil - - ++ - - - - -H++ - - ~ + - + - I I 1 I I I I -H+ - ++ - - - + + - -- - - + - shy
o - GLY - ERY - DARA - LARA + RIB + DXYL - LXYL - ADO ~ MDX - GAL + GLU + FRU + MNE + SBE ~ RHA - DUL - INO - MAN + SOR - MDM + MDG shyNAG + AMY + ARR + ESC + SAT + CRL + MAL + LAC + MEL + SAC + TRE + lNU - MLZ + RAF + AMI) - GLYG - XLT - GEN + TOR + LYX - TAG - DFUC shyLFUC - DARL - LARL - GNT + 2KG - 5KG shy
------Taxones significativos _ _----- Id--- ---T---- Tests en contra
Lactoplantarum 1 999 095 1
Tax6n siguiente Lactobrevis 1 01 OA8 3
lJactoplantaru01 1 1 test (s) en contra
DSORBITOL (SOR) 78
Taxon siguiente Lactobrevis
METHYL-D-MANNOSIDE D-TURANOSE
1
(MOM) (TOR)
3 test (5) en contra
0 MELEZITOSE 14
(MLZ) 14
i
I
68
ANEXO C RESULTADO PRUEBAS BIOQUWICAS DE CEPA AISLADA DE MUCOSA HUMANA
Referenda Mucosa - 5 Fecha 27012003
BUENA IDENTlFICACION
Galeria API 50 CHL vso Leida el 270112003
Perfil - - - - +t--t - - - + - + - - - - - - - - -+- - - - - + - + - - - - - - - - - - - - - bull - - -+ - +
o - GLY ~ ERY - DARA bull LARA + RID + DXYL + LXYL - ADO bull MDX - GAL + OLU - FRU + MNE - SBE - IlliA - DUL - INa - MAN - SOR - MDM - MOO shyNAG + AMY - ARB - ESC ~ SAL bull CEL - MAL + lAC - MEL + SAC - TRE shyINU - MLZ - RAF - AMD - GLYG - XLT - GEN - 11JR - LYX - TAG - DFUC shyLFUC - DARL - IARL - ONT + 2KO - 5KG +
- - - - - - Taxones significativos - - - - - - - Id T -- Test en contra
Lactobrevis 3 963 088 1
Taxon siguiente Lactoco11inoides 36 075 2
Lactobrevis 3 1 test (s) en contra
GLUCOSE (GLU) 95
-~~~------------~---------------------------~--~-------~--~-----~----------~--------~------------~~--Taxon siguiente Lactocollinoides 2 test (s) en contra
GLUCOSE (GLU) 100 MELIBIOSE (MEL) 25
69
i r
ANEXO D RESULTADO PRUEBAS BIOQIJiMICAS DE CEPA AISLADA DE LECHE FERMENTADA
Referenda Leche fennentada ~ 13 Fecha 27012003
BUENA IDENTIFICACI6N
Galeria API 50 CHL V50 Leida el 270112003
Perfil - - - - -t-t+- - - - + - + - - - bull - - - - -+- - - - - + - + - - - - - - - - - - - - - - - - -+ - +
0 - GLY - ERY - DARA - LARA +Rll3 + DXYL + LXYL - ADO - MDX ~GAL + GLU - FRU + MNE SBE - RHA DUL bull INO MAN - SOR MDM bull MDG shy
~NAG + AMY - ARB - ESC - SAL - CEL - MAL + LAC - MEL + SAC - TRE I lNU - MLZ - RAF - AMD - GLYG - XLT - OEN - IUR LYX - TAG - DFUC bull i
LFUC - DARL - LARL -ONr + 2KG - SKO + 1
- -- - - Taxones significativos - - Id -- T --- Test en contra
Lacta brevis 3 963 088 1
Taxon siguiente Lactocollinoides 36 075 2
Lactobrevis 3 1 test (s) en contra
GLUCOSE (GLU) 95
-----------------------------------------------------------~------------------------------~-------------------Taxon siguiente Lactocollinoides 2 test (s) en contra
GLUCOSE (GLD) 100 MELffiIOSE (MEL) 25
70
II iJ1
I
I ANEXO E RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AISLADA DE REPOLLITAS DE BRUSELAS FERMENTADA
Referencia repollitas de bruselas 15 Fecha 03072003
EXCELENTE IDENTIFICACION
Lactoplantarum 1
Galeria API 50 CHL vsO Leida el 03072003
Perfil - - - - +t - - - - +H+ - +- - +t + - I I I I I I I f ++t - + - - - -+ + - - - -+ -+ - - I ij
o - GLY - ERY - DARA - LARA + RJB + DXYL - LXYL - ADO - MDX - GAL +
GLU + FRU + MNE + SBE RHA + DUL - INO - MAN + SOR + MDM + MOG shyNAG + AMY + ARB + ESC + SAL + eEL + MAL + LAC + MEl + SAC + TRE + i
I1NU - MLZ + RAF AMD GLYG - XLT - aEN + TUR + LYX - TAG - Druc LFUC - DARt + LARL - aNT + 2KG - 5KG shy n ----Taxones significativos ------ Id Tests en contra
Lactoplantarum 1 999 090 o
Taxon siguiente Lacto pentosus 01 012 7
Lactoplantarum 1 o test (s) en contra
Taxon siguiente Lacto pentosus 7 test (8) en contra
GLYCEROL (GLY) 75 D-XYLOSE (DXYL) 100 L-RHAMNOSE (RHA) 25 METHYL-D-MANNOSIDE (MOM) 1 MELEZITOSE (MLZ) 25 RAFFINOSE (RAF) 75 D-ARABITOL (DARL) 0
71
~
I i I
ANEXO F - ANALISIS DE REGRESION PARA pH EN BEBIDA SIN AVENA
Aruilisis de regresi6n polinomial
---~-~-------------------------------------------~-----------~~---------------------~--------------Variable dependiente pHSinAvena ---------------------------~-------------~--------------------~---------------------------------
Error T Parametro Estimado Estandar Estadistico P-Valor
CONSTANTE 535606 0094535 56657 00000 Dia -0150565 0020706 727154 00000 Dia2 000504434 0000871488 578819 00001
---~---------------------------------------------------------------------------------------------------
Anfllisis de Variama -------------------------------------------~-----------~-----------------------------~-~--- jSource Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor 11
------------------------~------------------------------------------------------------------------------~ Mod-elo 155772 2 0118861 4256 00000 Residual 0237877 13 00182983
Total (Corr) 11956 IS
R2 == 867522 percent
pHSinAvena == 535606 - 0150565Dia + 000504434Dia2
72
____
middot ANEXO G - ANALISIS DE REGRESION PARA pH EN BEBIDA CON AVENA
AmUisis de regresion polinomial _____~_____~__-_____~___4____________________bull____bull__________bull_____________~~----_------___________
Variable depcndiente pHConA vena ------------------------------------------------------------------------------------------~--------
Error T Parametro Estimado StAndar Estadfstico P-Valor
---------------------------------------------~-----------------------------------------------_---------CONSTANTE 534463 00801045 667208 00000 Dia -0140407 00175453 800253 00000 DiaA 2 000448098 0000738458 606803 00000
----------------------~---~-----------------------------~------------------------------~----AmUisis de Varianza
---~---------------------------------~---------------------~------------~-------------------~------Source Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio PValor --------------------------~-----------------------------------------------~------------~-----~~--~ ModeJo 159575 2 0797873 6073 00000 Residual 02170798 middot13 00131383 _______~_~ ~_~----------~------~--~-----~-M-----~-----____ _____________~-----------------------Total (COlT) 176654 15
R12 903315 percent
-----------~------------------------------------------------------------------------~-----------pHConAvena 534463 - 0140407Dia + 000448098DfaA 2
73
ANEXO H - ANALTSIS DE REGRESTON PARA ACIDEZ EN BEBJDA SIN AVENA
An8Jisis de Regtesi6fi P6lifJomial
Variable Depefidiefile~ AcidezSinAVenll _______________w_____~______~________________~-----------_________~_________________~~____~___~_____
Error T Pariirnetro Estimado Estandar Estadistico ---------------------------------------~--------------~-~-------~--------------------~------------CONSTANT 0491697 00123217 399051 00000 Dia 00436032 000269882 161564 00000 D1a2 -000144613 000011359 127312 00000 __w___~________________________~-_______-_____~----____________________________~__~---~_--__~___
AriiiJisis de varianza ~_~__~__________~_~____~________~___________- _________e_____________________________bull _____-________
Source Smn de cuadr Df Mean Square F-Ratio PmiddotValor_~~___________________________________bull ______~___________bull ____________bull ______~________w________________
Model 0135203 2 00676013 21747 00000 Residual 000404118 13 000031086
Total (Corr) 0139244 15
R2 970978 percent
AcidezSlnAvena 0491697 + O0436032Dia - 0OOl44613Dia2
74
I
ANEXO I ANALISIS DE REGRESION PARA ACIDEZ EN BEBIDA CON AVENA
1
Anwisis de tegtesi6fi polinomial
Variable dependiente Acidez Con Avena
Error T ParametTo Estimado Stlindar Estadfstico P-Valor ----------------~-------~---------------------~-----------------------------------------------------CONSTANT 0491639 000926607 530578 00000 Diamiddot 00406572 000202955 200326 00000 DfaA 2 0000982559 0000085421 -115025 00000
-------------~----------------------------~-------------------------~-----------------------------------
-------------~-----~~-----------------------------~---------------------------------------------_--Source Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio PValor
-~-------------~----------------------------------~------------------~~-------------------------- Modelo 0288008 2 0144004 81914 00000 Residual 000228539 13 0000175799
----------~~--------------~---------------------------------------------~---------------------------Total (Corr) 0290294 15
RA2 = 992127 percent
-------------------------~----~---~------------~---------------------------------~---------------~
AcidezConAvena == 049163amp + 00406572D1a - 0000982559DiaA2
75
I
(Ilmiddot il
ANEXO J- ANALISIS DE REGRESION PARA RECUENTO LACTOBACILOS PARA BEBIDA SIN AVENA
Amilisis de regresion - Modelo lineal Y = a + bX
------------------------~----------------------~-----------------------------~----------~-----------Variable Dcpendiente LactobacilJusSinAvena Variable independiente Dia
I--------~----------~-----------------------------------~-------~-~--~--------------------------~-Error T
Paramctro Estimado Standard Stadistico P-Valor
----~----~------------~-----~-----------------------~-------------~-----------------------------Intereepto 117347 0389973 300911 00000 Pendiente 00483464 00257889 18747 00903
Analisis de Varianza
---------~------------------~----------------~---------------------------------~---------~----------Source Sum decuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor
------------~---------------------~---------------------~--------------------------------~-----~----Modelo 0916252 1 244835 443 00616 Residual 260706 10 0260706
--~------------~---~------------------~~~-----~-------~---------~~-------------------------------------Total (Corr)352332 11
Coeficiente Correlaci6n = 0509955 R2 = 260054 percent
LactobacillusSinAvena= 117347 + 00483464Dfa
76
ANEXO K- ANALTSIS DE REGRESION PARA RECUENTO LACTOBACILOS PARA DEBIDA CON AVENA
Aruilisis de regresion - Modelo lineal Y = a + hX
Variable Dependiente LactobacillusConAvena Variable Independiente Dia ---~--------------------------------------------------------__-----------__--_--_-----------shy
Error T Paramctro Estimado Standard Estadistico P-Valor -~--------------------------------------------------------------------------------------------------
Irttercepto 118103 0567963 207942 00000 Pendiente 00790304 00375594 210414 00616
-----------------~----------------------------~----~-------~----~----------------------------
Analisis de Varianza
----------------~----------------~------------------~--------------------------~------~--------shySource Swn de cuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor
-----------------~--~--------------------------------------------------------------------------~---~ Mode10 244835 1 244835 443 00616 Residual 552997 10 0552997
Total (Corr)797832 11
Coeficiente Correlacion = 0553964 RI2 = 306875 percent
-----~--------------------------------------------------------~--------------------------------------
LactobacillusConAvena = 118103 + 00790304Dfas
77
plusmn ~
5 RECOMENDACIONES
Ensayar la cepa de Lactobacillus plantartJm en productos carnicos madurados
como el salami
Ensayar la cepa de Lactobacillus l)revs en otros derivados lecteos como queso
quesito queso crema
Continuar con el estudio de estos microorganismos y caracterizarlos
molecularmente ademas de estudiar su capacidad de adherencja a fa mucosa
intestinal sobre algunes Hneas celulares como las CaCo~2
Estudiarel efedo de la avena sabre la viabiJidad del Lactobacillus breyis a una
concentraci6n mayor de 05
Realizer ensayos can las cepas de Lactobacillus brevis y Lactobrlcillus pJantarum
para elaborar masas acidas para panificacion reemplazando el Bromato de
Potasio aditivo prohibido desde marzo del 2003 en nuestro pais per 5U toxicidad
59
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65
ANEXOS
66
ANEXO A RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AlSLADA DE i
PEPINO it
Referencia Pepino 1 Fecha 06122002
IEXCELENTE IDENTIFICACION
Latto plantarum 1
Galeria API 50 CHL V50 Leida el 06122002
Perfil - -- - ++ - -- - ++++ - - -+- + - I I I I I I I I +t+ - +f- ~ - - + + ~ - - - +- + - shy
o - GLY - ERY DARA - LARA + RIB + DXYL - LXYL - ADO - MDX - GAL + GLU + FRU + MNE + SBE - RHA - DUL - INO bull MAN + SOR - MDM + MUG shyNAG + AMY + ARB + ESC + SAL + CEL + MAL + LAC + MEL + SAC + TRE + 1NU - MLZ + RAF + AMD - GLYG - XLT - GEN + TIJR + LYX - TAG - DFUC shyLFUC - DARL + LARL - aNT + 2KG - 5KG shy
--- Taxones significativos rd -----T -- Tests en contra
Lactoplantarum 1 999 092 1
Taxon siguiente Lactobrevis 1 OJ 044 3
i i
Lactoplantarum 1 1 test (5) en contra
D-SORBITOL (SOR) 78
Tax6n siguiente Lactobrevis 1 3 test (s) ert contra
METHYLD-MANNOSIDE (MOlM) 0 MELEZITOSE (MLZ) 14 D-TURANOSE (TUR) 14
67
ampb
ANEXO B RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AISLADA DE REPOLLO FERMENTADO
~
Referencia Repollo fermentado - 3 Fecha 03072003
EXCELENTE IDENTIFICACION
Lactoplantarum 1
Galena API 50 CRL V50 Leida el 03072003
Perfil - - ++ - - - - -H++ - - ~ + - + - I I 1 I I I I -H+ - ++ - - - + + - -- - - + - shy
o - GLY - ERY - DARA - LARA + RIB + DXYL - LXYL - ADO ~ MDX - GAL + GLU + FRU + MNE + SBE ~ RHA - DUL - INO - MAN + SOR - MDM + MDG shyNAG + AMY + ARR + ESC + SAT + CRL + MAL + LAC + MEL + SAC + TRE + lNU - MLZ + RAF + AMI) - GLYG - XLT - GEN + TOR + LYX - TAG - DFUC shyLFUC - DARL - LARL - GNT + 2KG - 5KG shy
------Taxones significativos _ _----- Id--- ---T---- Tests en contra
Lactoplantarum 1 999 095 1
Tax6n siguiente Lactobrevis 1 01 OA8 3
lJactoplantaru01 1 1 test (s) en contra
DSORBITOL (SOR) 78
Taxon siguiente Lactobrevis
METHYL-D-MANNOSIDE D-TURANOSE
1
(MOM) (TOR)
3 test (5) en contra
0 MELEZITOSE 14
(MLZ) 14
i
I
68
ANEXO C RESULTADO PRUEBAS BIOQUWICAS DE CEPA AISLADA DE MUCOSA HUMANA
Referenda Mucosa - 5 Fecha 27012003
BUENA IDENTlFICACION
Galeria API 50 CHL vso Leida el 270112003
Perfil - - - - +t--t - - - + - + - - - - - - - - -+- - - - - + - + - - - - - - - - - - - - - bull - - -+ - +
o - GLY ~ ERY - DARA bull LARA + RID + DXYL + LXYL - ADO bull MDX - GAL + OLU - FRU + MNE - SBE - IlliA - DUL - INa - MAN - SOR - MDM - MOO shyNAG + AMY - ARB - ESC ~ SAL bull CEL - MAL + lAC - MEL + SAC - TRE shyINU - MLZ - RAF - AMD - GLYG - XLT - GEN - 11JR - LYX - TAG - DFUC shyLFUC - DARL - IARL - ONT + 2KO - 5KG +
- - - - - - Taxones significativos - - - - - - - Id T -- Test en contra
Lactobrevis 3 963 088 1
Taxon siguiente Lactoco11inoides 36 075 2
Lactobrevis 3 1 test (s) en contra
GLUCOSE (GLU) 95
-~~~------------~---------------------------~--~-------~--~-----~----------~--------~------------~~--Taxon siguiente Lactocollinoides 2 test (s) en contra
GLUCOSE (GLU) 100 MELIBIOSE (MEL) 25
69
i r
ANEXO D RESULTADO PRUEBAS BIOQIJiMICAS DE CEPA AISLADA DE LECHE FERMENTADA
Referenda Leche fennentada ~ 13 Fecha 27012003
BUENA IDENTIFICACI6N
Galeria API 50 CHL V50 Leida el 270112003
Perfil - - - - -t-t+- - - - + - + - - - bull - - - - -+- - - - - + - + - - - - - - - - - - - - - - - - -+ - +
0 - GLY - ERY - DARA - LARA +Rll3 + DXYL + LXYL - ADO - MDX ~GAL + GLU - FRU + MNE SBE - RHA DUL bull INO MAN - SOR MDM bull MDG shy
~NAG + AMY - ARB - ESC - SAL - CEL - MAL + LAC - MEL + SAC - TRE I lNU - MLZ - RAF - AMD - GLYG - XLT - OEN - IUR LYX - TAG - DFUC bull i
LFUC - DARL - LARL -ONr + 2KG - SKO + 1
- -- - - Taxones significativos - - Id -- T --- Test en contra
Lacta brevis 3 963 088 1
Taxon siguiente Lactocollinoides 36 075 2
Lactobrevis 3 1 test (s) en contra
GLUCOSE (GLU) 95
-----------------------------------------------------------~------------------------------~-------------------Taxon siguiente Lactocollinoides 2 test (s) en contra
GLUCOSE (GLD) 100 MELffiIOSE (MEL) 25
70
II iJ1
I
I ANEXO E RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AISLADA DE REPOLLITAS DE BRUSELAS FERMENTADA
Referencia repollitas de bruselas 15 Fecha 03072003
EXCELENTE IDENTIFICACION
Lactoplantarum 1
Galeria API 50 CHL vsO Leida el 03072003
Perfil - - - - +t - - - - +H+ - +- - +t + - I I I I I I I f ++t - + - - - -+ + - - - -+ -+ - - I ij
o - GLY - ERY - DARA - LARA + RJB + DXYL - LXYL - ADO - MDX - GAL +
GLU + FRU + MNE + SBE RHA + DUL - INO - MAN + SOR + MDM + MOG shyNAG + AMY + ARB + ESC + SAL + eEL + MAL + LAC + MEl + SAC + TRE + i
I1NU - MLZ + RAF AMD GLYG - XLT - aEN + TUR + LYX - TAG - Druc LFUC - DARt + LARL - aNT + 2KG - 5KG shy n ----Taxones significativos ------ Id Tests en contra
Lactoplantarum 1 999 090 o
Taxon siguiente Lacto pentosus 01 012 7
Lactoplantarum 1 o test (s) en contra
Taxon siguiente Lacto pentosus 7 test (8) en contra
GLYCEROL (GLY) 75 D-XYLOSE (DXYL) 100 L-RHAMNOSE (RHA) 25 METHYL-D-MANNOSIDE (MOM) 1 MELEZITOSE (MLZ) 25 RAFFINOSE (RAF) 75 D-ARABITOL (DARL) 0
71
~
I i I
ANEXO F - ANALISIS DE REGRESION PARA pH EN BEBIDA SIN AVENA
Aruilisis de regresi6n polinomial
---~-~-------------------------------------------~-----------~~---------------------~--------------Variable dependiente pHSinAvena ---------------------------~-------------~--------------------~---------------------------------
Error T Parametro Estimado Estandar Estadistico P-Valor
CONSTANTE 535606 0094535 56657 00000 Dia -0150565 0020706 727154 00000 Dia2 000504434 0000871488 578819 00001
---~---------------------------------------------------------------------------------------------------
Anfllisis de Variama -------------------------------------------~-----------~-----------------------------~-~--- jSource Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor 11
------------------------~------------------------------------------------------------------------------~ Mod-elo 155772 2 0118861 4256 00000 Residual 0237877 13 00182983
Total (Corr) 11956 IS
R2 == 867522 percent
pHSinAvena == 535606 - 0150565Dia + 000504434Dia2
72
____
middot ANEXO G - ANALISIS DE REGRESION PARA pH EN BEBIDA CON AVENA
AmUisis de regresion polinomial _____~_____~__-_____~___4____________________bull____bull__________bull_____________~~----_------___________
Variable depcndiente pHConA vena ------------------------------------------------------------------------------------------~--------
Error T Parametro Estimado StAndar Estadfstico P-Valor
---------------------------------------------~-----------------------------------------------_---------CONSTANTE 534463 00801045 667208 00000 Dia -0140407 00175453 800253 00000 DiaA 2 000448098 0000738458 606803 00000
----------------------~---~-----------------------------~------------------------------~----AmUisis de Varianza
---~---------------------------------~---------------------~------------~-------------------~------Source Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio PValor --------------------------~-----------------------------------------------~------------~-----~~--~ ModeJo 159575 2 0797873 6073 00000 Residual 02170798 middot13 00131383 _______~_~ ~_~----------~------~--~-----~-M-----~-----____ _____________~-----------------------Total (COlT) 176654 15
R12 903315 percent
-----------~------------------------------------------------------------------------~-----------pHConAvena 534463 - 0140407Dia + 000448098DfaA 2
73
ANEXO H - ANALTSIS DE REGRESTON PARA ACIDEZ EN BEBJDA SIN AVENA
An8Jisis de Regtesi6fi P6lifJomial
Variable Depefidiefile~ AcidezSinAVenll _______________w_____~______~________________~-----------_________~_________________~~____~___~_____
Error T Pariirnetro Estimado Estandar Estadistico ---------------------------------------~--------------~-~-------~--------------------~------------CONSTANT 0491697 00123217 399051 00000 Dia 00436032 000269882 161564 00000 D1a2 -000144613 000011359 127312 00000 __w___~________________________~-_______-_____~----____________________________~__~---~_--__~___
AriiiJisis de varianza ~_~__~__________~_~____~________~___________- _________e_____________________________bull _____-________
Source Smn de cuadr Df Mean Square F-Ratio PmiddotValor_~~___________________________________bull ______~___________bull ____________bull ______~________w________________
Model 0135203 2 00676013 21747 00000 Residual 000404118 13 000031086
Total (Corr) 0139244 15
R2 970978 percent
AcidezSlnAvena 0491697 + O0436032Dia - 0OOl44613Dia2
74
I
ANEXO I ANALISIS DE REGRESION PARA ACIDEZ EN BEBIDA CON AVENA
1
Anwisis de tegtesi6fi polinomial
Variable dependiente Acidez Con Avena
Error T ParametTo Estimado Stlindar Estadfstico P-Valor ----------------~-------~---------------------~-----------------------------------------------------CONSTANT 0491639 000926607 530578 00000 Diamiddot 00406572 000202955 200326 00000 DfaA 2 0000982559 0000085421 -115025 00000
-------------~----------------------------~-------------------------~-----------------------------------
-------------~-----~~-----------------------------~---------------------------------------------_--Source Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio PValor
-~-------------~----------------------------------~------------------~~-------------------------- Modelo 0288008 2 0144004 81914 00000 Residual 000228539 13 0000175799
----------~~--------------~---------------------------------------------~---------------------------Total (Corr) 0290294 15
RA2 = 992127 percent
-------------------------~----~---~------------~---------------------------------~---------------~
AcidezConAvena == 049163amp + 00406572D1a - 0000982559DiaA2
75
I
(Ilmiddot il
ANEXO J- ANALISIS DE REGRESION PARA RECUENTO LACTOBACILOS PARA BEBIDA SIN AVENA
Amilisis de regresion - Modelo lineal Y = a + bX
------------------------~----------------------~-----------------------------~----------~-----------Variable Dcpendiente LactobacilJusSinAvena Variable independiente Dia
I--------~----------~-----------------------------------~-------~-~--~--------------------------~-Error T
Paramctro Estimado Standard Stadistico P-Valor
----~----~------------~-----~-----------------------~-------------~-----------------------------Intereepto 117347 0389973 300911 00000 Pendiente 00483464 00257889 18747 00903
Analisis de Varianza
---------~------------------~----------------~---------------------------------~---------~----------Source Sum decuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor
------------~---------------------~---------------------~--------------------------------~-----~----Modelo 0916252 1 244835 443 00616 Residual 260706 10 0260706
--~------------~---~------------------~~~-----~-------~---------~~-------------------------------------Total (Corr)352332 11
Coeficiente Correlaci6n = 0509955 R2 = 260054 percent
LactobacillusSinAvena= 117347 + 00483464Dfa
76
ANEXO K- ANALTSIS DE REGRESION PARA RECUENTO LACTOBACILOS PARA DEBIDA CON AVENA
Aruilisis de regresion - Modelo lineal Y = a + hX
Variable Dependiente LactobacillusConAvena Variable Independiente Dia ---~--------------------------------------------------------__-----------__--_--_-----------shy
Error T Paramctro Estimado Standard Estadistico P-Valor -~--------------------------------------------------------------------------------------------------
Irttercepto 118103 0567963 207942 00000 Pendiente 00790304 00375594 210414 00616
-----------------~----------------------------~----~-------~----~----------------------------
Analisis de Varianza
----------------~----------------~------------------~--------------------------~------~--------shySource Swn de cuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor
-----------------~--~--------------------------------------------------------------------------~---~ Mode10 244835 1 244835 443 00616 Residual 552997 10 0552997
Total (Corr)797832 11
Coeficiente Correlacion = 0553964 RI2 = 306875 percent
-----~--------------------------------------------------------~--------------------------------------
LactobacillusConAvena = 118103 + 00790304Dfas
77
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STANLEY James (1989) Bergeys manual of systematic bacteriology Vol 2 y
Editorial Board and Trustees ga edition
STRAUSS Evelyn (2000) Fighting bacterial fire with bact~rial fire En Science
Vol 290 pp 2231-2233
TUOMOLA J CRITTENDEN R PLAYNE M ISOULAURI E and SALMEIN
S( 2001) Quality assurance criteria for probiotic bacteria En Supplement to The
American Journal of Clinical Nutrition Vol 73 pp 393- 8
WOLLOSWSKII RECHKEMMER G and POOL 8 (2001) Protective role of
probioties and prebiotics in colon cancer En Supplement to The American
Journal of Clinical Nutrition Vol 73 pp 451-454
65
ANEXOS
66
ANEXO A RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AlSLADA DE i
PEPINO it
Referencia Pepino 1 Fecha 06122002
IEXCELENTE IDENTIFICACION
Latto plantarum 1
Galeria API 50 CHL V50 Leida el 06122002
Perfil - -- - ++ - -- - ++++ - - -+- + - I I I I I I I I +t+ - +f- ~ - - + + ~ - - - +- + - shy
o - GLY - ERY DARA - LARA + RIB + DXYL - LXYL - ADO - MDX - GAL + GLU + FRU + MNE + SBE - RHA - DUL - INO bull MAN + SOR - MDM + MUG shyNAG + AMY + ARB + ESC + SAL + CEL + MAL + LAC + MEL + SAC + TRE + 1NU - MLZ + RAF + AMD - GLYG - XLT - GEN + TIJR + LYX - TAG - DFUC shyLFUC - DARL + LARL - aNT + 2KG - 5KG shy
--- Taxones significativos rd -----T -- Tests en contra
Lactoplantarum 1 999 092 1
Taxon siguiente Lactobrevis 1 OJ 044 3
i i
Lactoplantarum 1 1 test (5) en contra
D-SORBITOL (SOR) 78
Tax6n siguiente Lactobrevis 1 3 test (s) ert contra
METHYLD-MANNOSIDE (MOlM) 0 MELEZITOSE (MLZ) 14 D-TURANOSE (TUR) 14
67
ampb
ANEXO B RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AISLADA DE REPOLLO FERMENTADO
~
Referencia Repollo fermentado - 3 Fecha 03072003
EXCELENTE IDENTIFICACION
Lactoplantarum 1
Galena API 50 CRL V50 Leida el 03072003
Perfil - - ++ - - - - -H++ - - ~ + - + - I I 1 I I I I -H+ - ++ - - - + + - -- - - + - shy
o - GLY - ERY - DARA - LARA + RIB + DXYL - LXYL - ADO ~ MDX - GAL + GLU + FRU + MNE + SBE ~ RHA - DUL - INO - MAN + SOR - MDM + MDG shyNAG + AMY + ARR + ESC + SAT + CRL + MAL + LAC + MEL + SAC + TRE + lNU - MLZ + RAF + AMI) - GLYG - XLT - GEN + TOR + LYX - TAG - DFUC shyLFUC - DARL - LARL - GNT + 2KG - 5KG shy
------Taxones significativos _ _----- Id--- ---T---- Tests en contra
Lactoplantarum 1 999 095 1
Tax6n siguiente Lactobrevis 1 01 OA8 3
lJactoplantaru01 1 1 test (s) en contra
DSORBITOL (SOR) 78
Taxon siguiente Lactobrevis
METHYL-D-MANNOSIDE D-TURANOSE
1
(MOM) (TOR)
3 test (5) en contra
0 MELEZITOSE 14
(MLZ) 14
i
I
68
ANEXO C RESULTADO PRUEBAS BIOQUWICAS DE CEPA AISLADA DE MUCOSA HUMANA
Referenda Mucosa - 5 Fecha 27012003
BUENA IDENTlFICACION
Galeria API 50 CHL vso Leida el 270112003
Perfil - - - - +t--t - - - + - + - - - - - - - - -+- - - - - + - + - - - - - - - - - - - - - bull - - -+ - +
o - GLY ~ ERY - DARA bull LARA + RID + DXYL + LXYL - ADO bull MDX - GAL + OLU - FRU + MNE - SBE - IlliA - DUL - INa - MAN - SOR - MDM - MOO shyNAG + AMY - ARB - ESC ~ SAL bull CEL - MAL + lAC - MEL + SAC - TRE shyINU - MLZ - RAF - AMD - GLYG - XLT - GEN - 11JR - LYX - TAG - DFUC shyLFUC - DARL - IARL - ONT + 2KO - 5KG +
- - - - - - Taxones significativos - - - - - - - Id T -- Test en contra
Lactobrevis 3 963 088 1
Taxon siguiente Lactoco11inoides 36 075 2
Lactobrevis 3 1 test (s) en contra
GLUCOSE (GLU) 95
-~~~------------~---------------------------~--~-------~--~-----~----------~--------~------------~~--Taxon siguiente Lactocollinoides 2 test (s) en contra
GLUCOSE (GLU) 100 MELIBIOSE (MEL) 25
69
i r
ANEXO D RESULTADO PRUEBAS BIOQIJiMICAS DE CEPA AISLADA DE LECHE FERMENTADA
Referenda Leche fennentada ~ 13 Fecha 27012003
BUENA IDENTIFICACI6N
Galeria API 50 CHL V50 Leida el 270112003
Perfil - - - - -t-t+- - - - + - + - - - bull - - - - -+- - - - - + - + - - - - - - - - - - - - - - - - -+ - +
0 - GLY - ERY - DARA - LARA +Rll3 + DXYL + LXYL - ADO - MDX ~GAL + GLU - FRU + MNE SBE - RHA DUL bull INO MAN - SOR MDM bull MDG shy
~NAG + AMY - ARB - ESC - SAL - CEL - MAL + LAC - MEL + SAC - TRE I lNU - MLZ - RAF - AMD - GLYG - XLT - OEN - IUR LYX - TAG - DFUC bull i
LFUC - DARL - LARL -ONr + 2KG - SKO + 1
- -- - - Taxones significativos - - Id -- T --- Test en contra
Lacta brevis 3 963 088 1
Taxon siguiente Lactocollinoides 36 075 2
Lactobrevis 3 1 test (s) en contra
GLUCOSE (GLU) 95
-----------------------------------------------------------~------------------------------~-------------------Taxon siguiente Lactocollinoides 2 test (s) en contra
GLUCOSE (GLD) 100 MELffiIOSE (MEL) 25
70
II iJ1
I
I ANEXO E RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AISLADA DE REPOLLITAS DE BRUSELAS FERMENTADA
Referencia repollitas de bruselas 15 Fecha 03072003
EXCELENTE IDENTIFICACION
Lactoplantarum 1
Galeria API 50 CHL vsO Leida el 03072003
Perfil - - - - +t - - - - +H+ - +- - +t + - I I I I I I I f ++t - + - - - -+ + - - - -+ -+ - - I ij
o - GLY - ERY - DARA - LARA + RJB + DXYL - LXYL - ADO - MDX - GAL +
GLU + FRU + MNE + SBE RHA + DUL - INO - MAN + SOR + MDM + MOG shyNAG + AMY + ARB + ESC + SAL + eEL + MAL + LAC + MEl + SAC + TRE + i
I1NU - MLZ + RAF AMD GLYG - XLT - aEN + TUR + LYX - TAG - Druc LFUC - DARt + LARL - aNT + 2KG - 5KG shy n ----Taxones significativos ------ Id Tests en contra
Lactoplantarum 1 999 090 o
Taxon siguiente Lacto pentosus 01 012 7
Lactoplantarum 1 o test (s) en contra
Taxon siguiente Lacto pentosus 7 test (8) en contra
GLYCEROL (GLY) 75 D-XYLOSE (DXYL) 100 L-RHAMNOSE (RHA) 25 METHYL-D-MANNOSIDE (MOM) 1 MELEZITOSE (MLZ) 25 RAFFINOSE (RAF) 75 D-ARABITOL (DARL) 0
71
~
I i I
ANEXO F - ANALISIS DE REGRESION PARA pH EN BEBIDA SIN AVENA
Aruilisis de regresi6n polinomial
---~-~-------------------------------------------~-----------~~---------------------~--------------Variable dependiente pHSinAvena ---------------------------~-------------~--------------------~---------------------------------
Error T Parametro Estimado Estandar Estadistico P-Valor
CONSTANTE 535606 0094535 56657 00000 Dia -0150565 0020706 727154 00000 Dia2 000504434 0000871488 578819 00001
---~---------------------------------------------------------------------------------------------------
Anfllisis de Variama -------------------------------------------~-----------~-----------------------------~-~--- jSource Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor 11
------------------------~------------------------------------------------------------------------------~ Mod-elo 155772 2 0118861 4256 00000 Residual 0237877 13 00182983
Total (Corr) 11956 IS
R2 == 867522 percent
pHSinAvena == 535606 - 0150565Dia + 000504434Dia2
72
____
middot ANEXO G - ANALISIS DE REGRESION PARA pH EN BEBIDA CON AVENA
AmUisis de regresion polinomial _____~_____~__-_____~___4____________________bull____bull__________bull_____________~~----_------___________
Variable depcndiente pHConA vena ------------------------------------------------------------------------------------------~--------
Error T Parametro Estimado StAndar Estadfstico P-Valor
---------------------------------------------~-----------------------------------------------_---------CONSTANTE 534463 00801045 667208 00000 Dia -0140407 00175453 800253 00000 DiaA 2 000448098 0000738458 606803 00000
----------------------~---~-----------------------------~------------------------------~----AmUisis de Varianza
---~---------------------------------~---------------------~------------~-------------------~------Source Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio PValor --------------------------~-----------------------------------------------~------------~-----~~--~ ModeJo 159575 2 0797873 6073 00000 Residual 02170798 middot13 00131383 _______~_~ ~_~----------~------~--~-----~-M-----~-----____ _____________~-----------------------Total (COlT) 176654 15
R12 903315 percent
-----------~------------------------------------------------------------------------~-----------pHConAvena 534463 - 0140407Dia + 000448098DfaA 2
73
ANEXO H - ANALTSIS DE REGRESTON PARA ACIDEZ EN BEBJDA SIN AVENA
An8Jisis de Regtesi6fi P6lifJomial
Variable Depefidiefile~ AcidezSinAVenll _______________w_____~______~________________~-----------_________~_________________~~____~___~_____
Error T Pariirnetro Estimado Estandar Estadistico ---------------------------------------~--------------~-~-------~--------------------~------------CONSTANT 0491697 00123217 399051 00000 Dia 00436032 000269882 161564 00000 D1a2 -000144613 000011359 127312 00000 __w___~________________________~-_______-_____~----____________________________~__~---~_--__~___
AriiiJisis de varianza ~_~__~__________~_~____~________~___________- _________e_____________________________bull _____-________
Source Smn de cuadr Df Mean Square F-Ratio PmiddotValor_~~___________________________________bull ______~___________bull ____________bull ______~________w________________
Model 0135203 2 00676013 21747 00000 Residual 000404118 13 000031086
Total (Corr) 0139244 15
R2 970978 percent
AcidezSlnAvena 0491697 + O0436032Dia - 0OOl44613Dia2
74
I
ANEXO I ANALISIS DE REGRESION PARA ACIDEZ EN BEBIDA CON AVENA
1
Anwisis de tegtesi6fi polinomial
Variable dependiente Acidez Con Avena
Error T ParametTo Estimado Stlindar Estadfstico P-Valor ----------------~-------~---------------------~-----------------------------------------------------CONSTANT 0491639 000926607 530578 00000 Diamiddot 00406572 000202955 200326 00000 DfaA 2 0000982559 0000085421 -115025 00000
-------------~----------------------------~-------------------------~-----------------------------------
-------------~-----~~-----------------------------~---------------------------------------------_--Source Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio PValor
-~-------------~----------------------------------~------------------~~-------------------------- Modelo 0288008 2 0144004 81914 00000 Residual 000228539 13 0000175799
----------~~--------------~---------------------------------------------~---------------------------Total (Corr) 0290294 15
RA2 = 992127 percent
-------------------------~----~---~------------~---------------------------------~---------------~
AcidezConAvena == 049163amp + 00406572D1a - 0000982559DiaA2
75
I
(Ilmiddot il
ANEXO J- ANALISIS DE REGRESION PARA RECUENTO LACTOBACILOS PARA BEBIDA SIN AVENA
Amilisis de regresion - Modelo lineal Y = a + bX
------------------------~----------------------~-----------------------------~----------~-----------Variable Dcpendiente LactobacilJusSinAvena Variable independiente Dia
I--------~----------~-----------------------------------~-------~-~--~--------------------------~-Error T
Paramctro Estimado Standard Stadistico P-Valor
----~----~------------~-----~-----------------------~-------------~-----------------------------Intereepto 117347 0389973 300911 00000 Pendiente 00483464 00257889 18747 00903
Analisis de Varianza
---------~------------------~----------------~---------------------------------~---------~----------Source Sum decuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor
------------~---------------------~---------------------~--------------------------------~-----~----Modelo 0916252 1 244835 443 00616 Residual 260706 10 0260706
--~------------~---~------------------~~~-----~-------~---------~~-------------------------------------Total (Corr)352332 11
Coeficiente Correlaci6n = 0509955 R2 = 260054 percent
LactobacillusSinAvena= 117347 + 00483464Dfa
76
ANEXO K- ANALTSIS DE REGRESION PARA RECUENTO LACTOBACILOS PARA DEBIDA CON AVENA
Aruilisis de regresion - Modelo lineal Y = a + hX
Variable Dependiente LactobacillusConAvena Variable Independiente Dia ---~--------------------------------------------------------__-----------__--_--_-----------shy
Error T Paramctro Estimado Standard Estadistico P-Valor -~--------------------------------------------------------------------------------------------------
Irttercepto 118103 0567963 207942 00000 Pendiente 00790304 00375594 210414 00616
-----------------~----------------------------~----~-------~----~----------------------------
Analisis de Varianza
----------------~----------------~------------------~--------------------------~------~--------shySource Swn de cuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor
-----------------~--~--------------------------------------------------------------------------~---~ Mode10 244835 1 244835 443 00616 Residual 552997 10 0552997
Total (Corr)797832 11
Coeficiente Correlacion = 0553964 RI2 = 306875 percent
-----~--------------------------------------------------------~--------------------------------------
LactobacillusConAvena = 118103 + 00790304Dfas
77
1
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65
ANEXOS
66
ANEXO A RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AlSLADA DE i
PEPINO it
Referencia Pepino 1 Fecha 06122002
IEXCELENTE IDENTIFICACION
Latto plantarum 1
Galeria API 50 CHL V50 Leida el 06122002
Perfil - -- - ++ - -- - ++++ - - -+- + - I I I I I I I I +t+ - +f- ~ - - + + ~ - - - +- + - shy
o - GLY - ERY DARA - LARA + RIB + DXYL - LXYL - ADO - MDX - GAL + GLU + FRU + MNE + SBE - RHA - DUL - INO bull MAN + SOR - MDM + MUG shyNAG + AMY + ARB + ESC + SAL + CEL + MAL + LAC + MEL + SAC + TRE + 1NU - MLZ + RAF + AMD - GLYG - XLT - GEN + TIJR + LYX - TAG - DFUC shyLFUC - DARL + LARL - aNT + 2KG - 5KG shy
--- Taxones significativos rd -----T -- Tests en contra
Lactoplantarum 1 999 092 1
Taxon siguiente Lactobrevis 1 OJ 044 3
i i
Lactoplantarum 1 1 test (5) en contra
D-SORBITOL (SOR) 78
Tax6n siguiente Lactobrevis 1 3 test (s) ert contra
METHYLD-MANNOSIDE (MOlM) 0 MELEZITOSE (MLZ) 14 D-TURANOSE (TUR) 14
67
ampb
ANEXO B RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AISLADA DE REPOLLO FERMENTADO
~
Referencia Repollo fermentado - 3 Fecha 03072003
EXCELENTE IDENTIFICACION
Lactoplantarum 1
Galena API 50 CRL V50 Leida el 03072003
Perfil - - ++ - - - - -H++ - - ~ + - + - I I 1 I I I I -H+ - ++ - - - + + - -- - - + - shy
o - GLY - ERY - DARA - LARA + RIB + DXYL - LXYL - ADO ~ MDX - GAL + GLU + FRU + MNE + SBE ~ RHA - DUL - INO - MAN + SOR - MDM + MDG shyNAG + AMY + ARR + ESC + SAT + CRL + MAL + LAC + MEL + SAC + TRE + lNU - MLZ + RAF + AMI) - GLYG - XLT - GEN + TOR + LYX - TAG - DFUC shyLFUC - DARL - LARL - GNT + 2KG - 5KG shy
------Taxones significativos _ _----- Id--- ---T---- Tests en contra
Lactoplantarum 1 999 095 1
Tax6n siguiente Lactobrevis 1 01 OA8 3
lJactoplantaru01 1 1 test (s) en contra
DSORBITOL (SOR) 78
Taxon siguiente Lactobrevis
METHYL-D-MANNOSIDE D-TURANOSE
1
(MOM) (TOR)
3 test (5) en contra
0 MELEZITOSE 14
(MLZ) 14
i
I
68
ANEXO C RESULTADO PRUEBAS BIOQUWICAS DE CEPA AISLADA DE MUCOSA HUMANA
Referenda Mucosa - 5 Fecha 27012003
BUENA IDENTlFICACION
Galeria API 50 CHL vso Leida el 270112003
Perfil - - - - +t--t - - - + - + - - - - - - - - -+- - - - - + - + - - - - - - - - - - - - - bull - - -+ - +
o - GLY ~ ERY - DARA bull LARA + RID + DXYL + LXYL - ADO bull MDX - GAL + OLU - FRU + MNE - SBE - IlliA - DUL - INa - MAN - SOR - MDM - MOO shyNAG + AMY - ARB - ESC ~ SAL bull CEL - MAL + lAC - MEL + SAC - TRE shyINU - MLZ - RAF - AMD - GLYG - XLT - GEN - 11JR - LYX - TAG - DFUC shyLFUC - DARL - IARL - ONT + 2KO - 5KG +
- - - - - - Taxones significativos - - - - - - - Id T -- Test en contra
Lactobrevis 3 963 088 1
Taxon siguiente Lactoco11inoides 36 075 2
Lactobrevis 3 1 test (s) en contra
GLUCOSE (GLU) 95
-~~~------------~---------------------------~--~-------~--~-----~----------~--------~------------~~--Taxon siguiente Lactocollinoides 2 test (s) en contra
GLUCOSE (GLU) 100 MELIBIOSE (MEL) 25
69
i r
ANEXO D RESULTADO PRUEBAS BIOQIJiMICAS DE CEPA AISLADA DE LECHE FERMENTADA
Referenda Leche fennentada ~ 13 Fecha 27012003
BUENA IDENTIFICACI6N
Galeria API 50 CHL V50 Leida el 270112003
Perfil - - - - -t-t+- - - - + - + - - - bull - - - - -+- - - - - + - + - - - - - - - - - - - - - - - - -+ - +
0 - GLY - ERY - DARA - LARA +Rll3 + DXYL + LXYL - ADO - MDX ~GAL + GLU - FRU + MNE SBE - RHA DUL bull INO MAN - SOR MDM bull MDG shy
~NAG + AMY - ARB - ESC - SAL - CEL - MAL + LAC - MEL + SAC - TRE I lNU - MLZ - RAF - AMD - GLYG - XLT - OEN - IUR LYX - TAG - DFUC bull i
LFUC - DARL - LARL -ONr + 2KG - SKO + 1
- -- - - Taxones significativos - - Id -- T --- Test en contra
Lacta brevis 3 963 088 1
Taxon siguiente Lactocollinoides 36 075 2
Lactobrevis 3 1 test (s) en contra
GLUCOSE (GLU) 95
-----------------------------------------------------------~------------------------------~-------------------Taxon siguiente Lactocollinoides 2 test (s) en contra
GLUCOSE (GLD) 100 MELffiIOSE (MEL) 25
70
II iJ1
I
I ANEXO E RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AISLADA DE REPOLLITAS DE BRUSELAS FERMENTADA
Referencia repollitas de bruselas 15 Fecha 03072003
EXCELENTE IDENTIFICACION
Lactoplantarum 1
Galeria API 50 CHL vsO Leida el 03072003
Perfil - - - - +t - - - - +H+ - +- - +t + - I I I I I I I f ++t - + - - - -+ + - - - -+ -+ - - I ij
o - GLY - ERY - DARA - LARA + RJB + DXYL - LXYL - ADO - MDX - GAL +
GLU + FRU + MNE + SBE RHA + DUL - INO - MAN + SOR + MDM + MOG shyNAG + AMY + ARB + ESC + SAL + eEL + MAL + LAC + MEl + SAC + TRE + i
I1NU - MLZ + RAF AMD GLYG - XLT - aEN + TUR + LYX - TAG - Druc LFUC - DARt + LARL - aNT + 2KG - 5KG shy n ----Taxones significativos ------ Id Tests en contra
Lactoplantarum 1 999 090 o
Taxon siguiente Lacto pentosus 01 012 7
Lactoplantarum 1 o test (s) en contra
Taxon siguiente Lacto pentosus 7 test (8) en contra
GLYCEROL (GLY) 75 D-XYLOSE (DXYL) 100 L-RHAMNOSE (RHA) 25 METHYL-D-MANNOSIDE (MOM) 1 MELEZITOSE (MLZ) 25 RAFFINOSE (RAF) 75 D-ARABITOL (DARL) 0
71
~
I i I
ANEXO F - ANALISIS DE REGRESION PARA pH EN BEBIDA SIN AVENA
Aruilisis de regresi6n polinomial
---~-~-------------------------------------------~-----------~~---------------------~--------------Variable dependiente pHSinAvena ---------------------------~-------------~--------------------~---------------------------------
Error T Parametro Estimado Estandar Estadistico P-Valor
CONSTANTE 535606 0094535 56657 00000 Dia -0150565 0020706 727154 00000 Dia2 000504434 0000871488 578819 00001
---~---------------------------------------------------------------------------------------------------
Anfllisis de Variama -------------------------------------------~-----------~-----------------------------~-~--- jSource Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor 11
------------------------~------------------------------------------------------------------------------~ Mod-elo 155772 2 0118861 4256 00000 Residual 0237877 13 00182983
Total (Corr) 11956 IS
R2 == 867522 percent
pHSinAvena == 535606 - 0150565Dia + 000504434Dia2
72
____
middot ANEXO G - ANALISIS DE REGRESION PARA pH EN BEBIDA CON AVENA
AmUisis de regresion polinomial _____~_____~__-_____~___4____________________bull____bull__________bull_____________~~----_------___________
Variable depcndiente pHConA vena ------------------------------------------------------------------------------------------~--------
Error T Parametro Estimado StAndar Estadfstico P-Valor
---------------------------------------------~-----------------------------------------------_---------CONSTANTE 534463 00801045 667208 00000 Dia -0140407 00175453 800253 00000 DiaA 2 000448098 0000738458 606803 00000
----------------------~---~-----------------------------~------------------------------~----AmUisis de Varianza
---~---------------------------------~---------------------~------------~-------------------~------Source Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio PValor --------------------------~-----------------------------------------------~------------~-----~~--~ ModeJo 159575 2 0797873 6073 00000 Residual 02170798 middot13 00131383 _______~_~ ~_~----------~------~--~-----~-M-----~-----____ _____________~-----------------------Total (COlT) 176654 15
R12 903315 percent
-----------~------------------------------------------------------------------------~-----------pHConAvena 534463 - 0140407Dia + 000448098DfaA 2
73
ANEXO H - ANALTSIS DE REGRESTON PARA ACIDEZ EN BEBJDA SIN AVENA
An8Jisis de Regtesi6fi P6lifJomial
Variable Depefidiefile~ AcidezSinAVenll _______________w_____~______~________________~-----------_________~_________________~~____~___~_____
Error T Pariirnetro Estimado Estandar Estadistico ---------------------------------------~--------------~-~-------~--------------------~------------CONSTANT 0491697 00123217 399051 00000 Dia 00436032 000269882 161564 00000 D1a2 -000144613 000011359 127312 00000 __w___~________________________~-_______-_____~----____________________________~__~---~_--__~___
AriiiJisis de varianza ~_~__~__________~_~____~________~___________- _________e_____________________________bull _____-________
Source Smn de cuadr Df Mean Square F-Ratio PmiddotValor_~~___________________________________bull ______~___________bull ____________bull ______~________w________________
Model 0135203 2 00676013 21747 00000 Residual 000404118 13 000031086
Total (Corr) 0139244 15
R2 970978 percent
AcidezSlnAvena 0491697 + O0436032Dia - 0OOl44613Dia2
74
I
ANEXO I ANALISIS DE REGRESION PARA ACIDEZ EN BEBIDA CON AVENA
1
Anwisis de tegtesi6fi polinomial
Variable dependiente Acidez Con Avena
Error T ParametTo Estimado Stlindar Estadfstico P-Valor ----------------~-------~---------------------~-----------------------------------------------------CONSTANT 0491639 000926607 530578 00000 Diamiddot 00406572 000202955 200326 00000 DfaA 2 0000982559 0000085421 -115025 00000
-------------~----------------------------~-------------------------~-----------------------------------
-------------~-----~~-----------------------------~---------------------------------------------_--Source Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio PValor
-~-------------~----------------------------------~------------------~~-------------------------- Modelo 0288008 2 0144004 81914 00000 Residual 000228539 13 0000175799
----------~~--------------~---------------------------------------------~---------------------------Total (Corr) 0290294 15
RA2 = 992127 percent
-------------------------~----~---~------------~---------------------------------~---------------~
AcidezConAvena == 049163amp + 00406572D1a - 0000982559DiaA2
75
I
(Ilmiddot il
ANEXO J- ANALISIS DE REGRESION PARA RECUENTO LACTOBACILOS PARA BEBIDA SIN AVENA
Amilisis de regresion - Modelo lineal Y = a + bX
------------------------~----------------------~-----------------------------~----------~-----------Variable Dcpendiente LactobacilJusSinAvena Variable independiente Dia
I--------~----------~-----------------------------------~-------~-~--~--------------------------~-Error T
Paramctro Estimado Standard Stadistico P-Valor
----~----~------------~-----~-----------------------~-------------~-----------------------------Intereepto 117347 0389973 300911 00000 Pendiente 00483464 00257889 18747 00903
Analisis de Varianza
---------~------------------~----------------~---------------------------------~---------~----------Source Sum decuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor
------------~---------------------~---------------------~--------------------------------~-----~----Modelo 0916252 1 244835 443 00616 Residual 260706 10 0260706
--~------------~---~------------------~~~-----~-------~---------~~-------------------------------------Total (Corr)352332 11
Coeficiente Correlaci6n = 0509955 R2 = 260054 percent
LactobacillusSinAvena= 117347 + 00483464Dfa
76
ANEXO K- ANALTSIS DE REGRESION PARA RECUENTO LACTOBACILOS PARA DEBIDA CON AVENA
Aruilisis de regresion - Modelo lineal Y = a + hX
Variable Dependiente LactobacillusConAvena Variable Independiente Dia ---~--------------------------------------------------------__-----------__--_--_-----------shy
Error T Paramctro Estimado Standard Estadistico P-Valor -~--------------------------------------------------------------------------------------------------
Irttercepto 118103 0567963 207942 00000 Pendiente 00790304 00375594 210414 00616
-----------------~----------------------------~----~-------~----~----------------------------
Analisis de Varianza
----------------~----------------~------------------~--------------------------~------~--------shySource Swn de cuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor
-----------------~--~--------------------------------------------------------------------------~---~ Mode10 244835 1 244835 443 00616 Residual 552997 10 0552997
Total (Corr)797832 11
Coeficiente Correlacion = 0553964 RI2 = 306875 percent
-----~--------------------------------------------------------~--------------------------------------
LactobacillusConAvena = 118103 + 00790304Dfas
77
HOlZAPFEL W HAaERER~ P GEISEN R J3JORKROTH J and
SCHILLINGER U( 2001 Taxonomy and important features of probiotics
microorganisms in fooo and nutrition En Supplament to The American Journal of
Clinical Nutrition Vol 73 pp 365--372
fSOULARlE ARVOLA T SUTAS y MOILANEN E SALMEINS
(2000) Prabiotics in the management of atopic eczema En Clin Exp Allergy Vol
30 Nro 11 pp 1604-1610
ISOLAURI E SUTASl Y KANKAANPAA P ARVILOMMI H and
SALMEINEN S ( 2001) Probiotics Effects on immunity En Supplement to The
American Journal of Clinical Nutrition Vol 73 pp445-450
JACOBSEN CN NIELSEN V Rosenfeldt HAYFORD A E MOLLER PL
MICHAELSEN KF PAERREGAARD A SANDSTROM S TV~DE M and
JACOBSEN M (1999) Screening of probiotlc activities of forty-seven strains of
Lactobacillus spp by in vitro techniques and evaluation of the colonization ability
of five selected strains in humans En Applied and environmental Microbiology
VoI65pp4949-4956
62
JASKARI J KONTUlAP and SIITONEN A (1998) Oat j3-g1ucan and xyJan
I
1 j
hydrolysates as selective substrates for Biffidob(fflcterium and Lactobacillus strains
En Appl Microblol Biotechnol Vo149 pp 175-181
KAlLtOMAKI Morko SAlMINEM Seppo ARVILOMMI Heikki KERO Pentti
KOSKINEN PertH and ISOULARI Erika Probiotics in primary prevention of
atopiC disease a randomized placebo-controlled trial En Lancet 2001 April 7
357(9262)1076middot9
KONTULA P JASKARf J and NOLLET L (1998) The colonization of a
simulator of the human intestinal microbial ecosystem by a probiotic strain fed on a
fermented oat bran product effects on the gastrointestinal microbiota En Appf
Microbiol Biotechnol Vol 50 pp 246-252
MARTI=AU P DE VRESSE M CELllER J CHRISTOPHE and
SCHREZENM~IR (2001) Protection from gastrointestinal diseases with the usa
of probiotles En Supplement to The American Journal of Clinical Nutrition Vol
73 pp 430-6
MINISTERIO DE SALUD Articulo 10 de la Resoluci6n 2310 de 1986 de las
clases de (aches fermentadas
63
MOLIN Goran(2001 Probiotics in food not containing milk or milk constituents
with special reference to Lactobacillus plantarum 299v En Supplement to The
American Journal of Clinical Nutrition Vol 73 pp 380-4
MONTOYA CAMPUZANO Olga 1 (1999) Manual de Microbiologla Medellin
Universidad Nacional de Colombia 118 p
PARADA Jose Luis (1998) Bacterias Uicticas usos en fermentaciones y como
probi6ticos Primer Congreso fnternacional de Mlcrobiolagia Industrial Bogota
Colombia pp 64-71
PAROIO V WAl1SZEWSKl K YROSLEDO L (1996) Los probi6ticos y su
Futuro En Archivos Latinoamericanos de nutricion Vol46 pp 6-9
REID Gregor(2001 ) Probiotic agants to protect the urogenital tract against
infection En Supplement to The American Journal of Clinical Nutrition Vol 73
pp 437-443
SCHREZENNlEIR Jurgen DE VRESE Michael ( 2001) Probiotics prebiotics
and synbiotics - approaching a definition En Supplement to The American
Journal of Clinical Nutrition Vol 73 pp 361-364
64
STANLEY James (1989) Bergeys manual of systematic bacteriology Vol 2 y
Editorial Board and Trustees ga edition
STRAUSS Evelyn (2000) Fighting bacterial fire with bact~rial fire En Science
Vol 290 pp 2231-2233
TUOMOLA J CRITTENDEN R PLAYNE M ISOULAURI E and SALMEIN
S( 2001) Quality assurance criteria for probiotic bacteria En Supplement to The
American Journal of Clinical Nutrition Vol 73 pp 393- 8
WOLLOSWSKII RECHKEMMER G and POOL 8 (2001) Protective role of
probioties and prebiotics in colon cancer En Supplement to The American
Journal of Clinical Nutrition Vol 73 pp 451-454
65
ANEXOS
66
ANEXO A RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AlSLADA DE i
PEPINO it
Referencia Pepino 1 Fecha 06122002
IEXCELENTE IDENTIFICACION
Latto plantarum 1
Galeria API 50 CHL V50 Leida el 06122002
Perfil - -- - ++ - -- - ++++ - - -+- + - I I I I I I I I +t+ - +f- ~ - - + + ~ - - - +- + - shy
o - GLY - ERY DARA - LARA + RIB + DXYL - LXYL - ADO - MDX - GAL + GLU + FRU + MNE + SBE - RHA - DUL - INO bull MAN + SOR - MDM + MUG shyNAG + AMY + ARB + ESC + SAL + CEL + MAL + LAC + MEL + SAC + TRE + 1NU - MLZ + RAF + AMD - GLYG - XLT - GEN + TIJR + LYX - TAG - DFUC shyLFUC - DARL + LARL - aNT + 2KG - 5KG shy
--- Taxones significativos rd -----T -- Tests en contra
Lactoplantarum 1 999 092 1
Taxon siguiente Lactobrevis 1 OJ 044 3
i i
Lactoplantarum 1 1 test (5) en contra
D-SORBITOL (SOR) 78
Tax6n siguiente Lactobrevis 1 3 test (s) ert contra
METHYLD-MANNOSIDE (MOlM) 0 MELEZITOSE (MLZ) 14 D-TURANOSE (TUR) 14
67
ampb
ANEXO B RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AISLADA DE REPOLLO FERMENTADO
~
Referencia Repollo fermentado - 3 Fecha 03072003
EXCELENTE IDENTIFICACION
Lactoplantarum 1
Galena API 50 CRL V50 Leida el 03072003
Perfil - - ++ - - - - -H++ - - ~ + - + - I I 1 I I I I -H+ - ++ - - - + + - -- - - + - shy
o - GLY - ERY - DARA - LARA + RIB + DXYL - LXYL - ADO ~ MDX - GAL + GLU + FRU + MNE + SBE ~ RHA - DUL - INO - MAN + SOR - MDM + MDG shyNAG + AMY + ARR + ESC + SAT + CRL + MAL + LAC + MEL + SAC + TRE + lNU - MLZ + RAF + AMI) - GLYG - XLT - GEN + TOR + LYX - TAG - DFUC shyLFUC - DARL - LARL - GNT + 2KG - 5KG shy
------Taxones significativos _ _----- Id--- ---T---- Tests en contra
Lactoplantarum 1 999 095 1
Tax6n siguiente Lactobrevis 1 01 OA8 3
lJactoplantaru01 1 1 test (s) en contra
DSORBITOL (SOR) 78
Taxon siguiente Lactobrevis
METHYL-D-MANNOSIDE D-TURANOSE
1
(MOM) (TOR)
3 test (5) en contra
0 MELEZITOSE 14
(MLZ) 14
i
I
68
ANEXO C RESULTADO PRUEBAS BIOQUWICAS DE CEPA AISLADA DE MUCOSA HUMANA
Referenda Mucosa - 5 Fecha 27012003
BUENA IDENTlFICACION
Galeria API 50 CHL vso Leida el 270112003
Perfil - - - - +t--t - - - + - + - - - - - - - - -+- - - - - + - + - - - - - - - - - - - - - bull - - -+ - +
o - GLY ~ ERY - DARA bull LARA + RID + DXYL + LXYL - ADO bull MDX - GAL + OLU - FRU + MNE - SBE - IlliA - DUL - INa - MAN - SOR - MDM - MOO shyNAG + AMY - ARB - ESC ~ SAL bull CEL - MAL + lAC - MEL + SAC - TRE shyINU - MLZ - RAF - AMD - GLYG - XLT - GEN - 11JR - LYX - TAG - DFUC shyLFUC - DARL - IARL - ONT + 2KO - 5KG +
- - - - - - Taxones significativos - - - - - - - Id T -- Test en contra
Lactobrevis 3 963 088 1
Taxon siguiente Lactoco11inoides 36 075 2
Lactobrevis 3 1 test (s) en contra
GLUCOSE (GLU) 95
-~~~------------~---------------------------~--~-------~--~-----~----------~--------~------------~~--Taxon siguiente Lactocollinoides 2 test (s) en contra
GLUCOSE (GLU) 100 MELIBIOSE (MEL) 25
69
i r
ANEXO D RESULTADO PRUEBAS BIOQIJiMICAS DE CEPA AISLADA DE LECHE FERMENTADA
Referenda Leche fennentada ~ 13 Fecha 27012003
BUENA IDENTIFICACI6N
Galeria API 50 CHL V50 Leida el 270112003
Perfil - - - - -t-t+- - - - + - + - - - bull - - - - -+- - - - - + - + - - - - - - - - - - - - - - - - -+ - +
0 - GLY - ERY - DARA - LARA +Rll3 + DXYL + LXYL - ADO - MDX ~GAL + GLU - FRU + MNE SBE - RHA DUL bull INO MAN - SOR MDM bull MDG shy
~NAG + AMY - ARB - ESC - SAL - CEL - MAL + LAC - MEL + SAC - TRE I lNU - MLZ - RAF - AMD - GLYG - XLT - OEN - IUR LYX - TAG - DFUC bull i
LFUC - DARL - LARL -ONr + 2KG - SKO + 1
- -- - - Taxones significativos - - Id -- T --- Test en contra
Lacta brevis 3 963 088 1
Taxon siguiente Lactocollinoides 36 075 2
Lactobrevis 3 1 test (s) en contra
GLUCOSE (GLU) 95
-----------------------------------------------------------~------------------------------~-------------------Taxon siguiente Lactocollinoides 2 test (s) en contra
GLUCOSE (GLD) 100 MELffiIOSE (MEL) 25
70
II iJ1
I
I ANEXO E RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AISLADA DE REPOLLITAS DE BRUSELAS FERMENTADA
Referencia repollitas de bruselas 15 Fecha 03072003
EXCELENTE IDENTIFICACION
Lactoplantarum 1
Galeria API 50 CHL vsO Leida el 03072003
Perfil - - - - +t - - - - +H+ - +- - +t + - I I I I I I I f ++t - + - - - -+ + - - - -+ -+ - - I ij
o - GLY - ERY - DARA - LARA + RJB + DXYL - LXYL - ADO - MDX - GAL +
GLU + FRU + MNE + SBE RHA + DUL - INO - MAN + SOR + MDM + MOG shyNAG + AMY + ARB + ESC + SAL + eEL + MAL + LAC + MEl + SAC + TRE + i
I1NU - MLZ + RAF AMD GLYG - XLT - aEN + TUR + LYX - TAG - Druc LFUC - DARt + LARL - aNT + 2KG - 5KG shy n ----Taxones significativos ------ Id Tests en contra
Lactoplantarum 1 999 090 o
Taxon siguiente Lacto pentosus 01 012 7
Lactoplantarum 1 o test (s) en contra
Taxon siguiente Lacto pentosus 7 test (8) en contra
GLYCEROL (GLY) 75 D-XYLOSE (DXYL) 100 L-RHAMNOSE (RHA) 25 METHYL-D-MANNOSIDE (MOM) 1 MELEZITOSE (MLZ) 25 RAFFINOSE (RAF) 75 D-ARABITOL (DARL) 0
71
~
I i I
ANEXO F - ANALISIS DE REGRESION PARA pH EN BEBIDA SIN AVENA
Aruilisis de regresi6n polinomial
---~-~-------------------------------------------~-----------~~---------------------~--------------Variable dependiente pHSinAvena ---------------------------~-------------~--------------------~---------------------------------
Error T Parametro Estimado Estandar Estadistico P-Valor
CONSTANTE 535606 0094535 56657 00000 Dia -0150565 0020706 727154 00000 Dia2 000504434 0000871488 578819 00001
---~---------------------------------------------------------------------------------------------------
Anfllisis de Variama -------------------------------------------~-----------~-----------------------------~-~--- jSource Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor 11
------------------------~------------------------------------------------------------------------------~ Mod-elo 155772 2 0118861 4256 00000 Residual 0237877 13 00182983
Total (Corr) 11956 IS
R2 == 867522 percent
pHSinAvena == 535606 - 0150565Dia + 000504434Dia2
72
____
middot ANEXO G - ANALISIS DE REGRESION PARA pH EN BEBIDA CON AVENA
AmUisis de regresion polinomial _____~_____~__-_____~___4____________________bull____bull__________bull_____________~~----_------___________
Variable depcndiente pHConA vena ------------------------------------------------------------------------------------------~--------
Error T Parametro Estimado StAndar Estadfstico P-Valor
---------------------------------------------~-----------------------------------------------_---------CONSTANTE 534463 00801045 667208 00000 Dia -0140407 00175453 800253 00000 DiaA 2 000448098 0000738458 606803 00000
----------------------~---~-----------------------------~------------------------------~----AmUisis de Varianza
---~---------------------------------~---------------------~------------~-------------------~------Source Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio PValor --------------------------~-----------------------------------------------~------------~-----~~--~ ModeJo 159575 2 0797873 6073 00000 Residual 02170798 middot13 00131383 _______~_~ ~_~----------~------~--~-----~-M-----~-----____ _____________~-----------------------Total (COlT) 176654 15
R12 903315 percent
-----------~------------------------------------------------------------------------~-----------pHConAvena 534463 - 0140407Dia + 000448098DfaA 2
73
ANEXO H - ANALTSIS DE REGRESTON PARA ACIDEZ EN BEBJDA SIN AVENA
An8Jisis de Regtesi6fi P6lifJomial
Variable Depefidiefile~ AcidezSinAVenll _______________w_____~______~________________~-----------_________~_________________~~____~___~_____
Error T Pariirnetro Estimado Estandar Estadistico ---------------------------------------~--------------~-~-------~--------------------~------------CONSTANT 0491697 00123217 399051 00000 Dia 00436032 000269882 161564 00000 D1a2 -000144613 000011359 127312 00000 __w___~________________________~-_______-_____~----____________________________~__~---~_--__~___
AriiiJisis de varianza ~_~__~__________~_~____~________~___________- _________e_____________________________bull _____-________
Source Smn de cuadr Df Mean Square F-Ratio PmiddotValor_~~___________________________________bull ______~___________bull ____________bull ______~________w________________
Model 0135203 2 00676013 21747 00000 Residual 000404118 13 000031086
Total (Corr) 0139244 15
R2 970978 percent
AcidezSlnAvena 0491697 + O0436032Dia - 0OOl44613Dia2
74
I
ANEXO I ANALISIS DE REGRESION PARA ACIDEZ EN BEBIDA CON AVENA
1
Anwisis de tegtesi6fi polinomial
Variable dependiente Acidez Con Avena
Error T ParametTo Estimado Stlindar Estadfstico P-Valor ----------------~-------~---------------------~-----------------------------------------------------CONSTANT 0491639 000926607 530578 00000 Diamiddot 00406572 000202955 200326 00000 DfaA 2 0000982559 0000085421 -115025 00000
-------------~----------------------------~-------------------------~-----------------------------------
-------------~-----~~-----------------------------~---------------------------------------------_--Source Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio PValor
-~-------------~----------------------------------~------------------~~-------------------------- Modelo 0288008 2 0144004 81914 00000 Residual 000228539 13 0000175799
----------~~--------------~---------------------------------------------~---------------------------Total (Corr) 0290294 15
RA2 = 992127 percent
-------------------------~----~---~------------~---------------------------------~---------------~
AcidezConAvena == 049163amp + 00406572D1a - 0000982559DiaA2
75
I
(Ilmiddot il
ANEXO J- ANALISIS DE REGRESION PARA RECUENTO LACTOBACILOS PARA BEBIDA SIN AVENA
Amilisis de regresion - Modelo lineal Y = a + bX
------------------------~----------------------~-----------------------------~----------~-----------Variable Dcpendiente LactobacilJusSinAvena Variable independiente Dia
I--------~----------~-----------------------------------~-------~-~--~--------------------------~-Error T
Paramctro Estimado Standard Stadistico P-Valor
----~----~------------~-----~-----------------------~-------------~-----------------------------Intereepto 117347 0389973 300911 00000 Pendiente 00483464 00257889 18747 00903
Analisis de Varianza
---------~------------------~----------------~---------------------------------~---------~----------Source Sum decuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor
------------~---------------------~---------------------~--------------------------------~-----~----Modelo 0916252 1 244835 443 00616 Residual 260706 10 0260706
--~------------~---~------------------~~~-----~-------~---------~~-------------------------------------Total (Corr)352332 11
Coeficiente Correlaci6n = 0509955 R2 = 260054 percent
LactobacillusSinAvena= 117347 + 00483464Dfa
76
ANEXO K- ANALTSIS DE REGRESION PARA RECUENTO LACTOBACILOS PARA DEBIDA CON AVENA
Aruilisis de regresion - Modelo lineal Y = a + hX
Variable Dependiente LactobacillusConAvena Variable Independiente Dia ---~--------------------------------------------------------__-----------__--_--_-----------shy
Error T Paramctro Estimado Standard Estadistico P-Valor -~--------------------------------------------------------------------------------------------------
Irttercepto 118103 0567963 207942 00000 Pendiente 00790304 00375594 210414 00616
-----------------~----------------------------~----~-------~----~----------------------------
Analisis de Varianza
----------------~----------------~------------------~--------------------------~------~--------shySource Swn de cuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor
-----------------~--~--------------------------------------------------------------------------~---~ Mode10 244835 1 244835 443 00616 Residual 552997 10 0552997
Total (Corr)797832 11
Coeficiente Correlacion = 0553964 RI2 = 306875 percent
-----~--------------------------------------------------------~--------------------------------------
LactobacillusConAvena = 118103 + 00790304Dfas
77
JASKARI J KONTUlAP and SIITONEN A (1998) Oat j3-g1ucan and xyJan
I
1 j
hydrolysates as selective substrates for Biffidob(fflcterium and Lactobacillus strains
En Appl Microblol Biotechnol Vo149 pp 175-181
KAlLtOMAKI Morko SAlMINEM Seppo ARVILOMMI Heikki KERO Pentti
KOSKINEN PertH and ISOULARI Erika Probiotics in primary prevention of
atopiC disease a randomized placebo-controlled trial En Lancet 2001 April 7
357(9262)1076middot9
KONTULA P JASKARf J and NOLLET L (1998) The colonization of a
simulator of the human intestinal microbial ecosystem by a probiotic strain fed on a
fermented oat bran product effects on the gastrointestinal microbiota En Appf
Microbiol Biotechnol Vol 50 pp 246-252
MARTI=AU P DE VRESSE M CELllER J CHRISTOPHE and
SCHREZENM~IR (2001) Protection from gastrointestinal diseases with the usa
of probiotles En Supplement to The American Journal of Clinical Nutrition Vol
73 pp 430-6
MINISTERIO DE SALUD Articulo 10 de la Resoluci6n 2310 de 1986 de las
clases de (aches fermentadas
63
MOLIN Goran(2001 Probiotics in food not containing milk or milk constituents
with special reference to Lactobacillus plantarum 299v En Supplement to The
American Journal of Clinical Nutrition Vol 73 pp 380-4
MONTOYA CAMPUZANO Olga 1 (1999) Manual de Microbiologla Medellin
Universidad Nacional de Colombia 118 p
PARADA Jose Luis (1998) Bacterias Uicticas usos en fermentaciones y como
probi6ticos Primer Congreso fnternacional de Mlcrobiolagia Industrial Bogota
Colombia pp 64-71
PAROIO V WAl1SZEWSKl K YROSLEDO L (1996) Los probi6ticos y su
Futuro En Archivos Latinoamericanos de nutricion Vol46 pp 6-9
REID Gregor(2001 ) Probiotic agants to protect the urogenital tract against
infection En Supplement to The American Journal of Clinical Nutrition Vol 73
pp 437-443
SCHREZENNlEIR Jurgen DE VRESE Michael ( 2001) Probiotics prebiotics
and synbiotics - approaching a definition En Supplement to The American
Journal of Clinical Nutrition Vol 73 pp 361-364
64
STANLEY James (1989) Bergeys manual of systematic bacteriology Vol 2 y
Editorial Board and Trustees ga edition
STRAUSS Evelyn (2000) Fighting bacterial fire with bact~rial fire En Science
Vol 290 pp 2231-2233
TUOMOLA J CRITTENDEN R PLAYNE M ISOULAURI E and SALMEIN
S( 2001) Quality assurance criteria for probiotic bacteria En Supplement to The
American Journal of Clinical Nutrition Vol 73 pp 393- 8
WOLLOSWSKII RECHKEMMER G and POOL 8 (2001) Protective role of
probioties and prebiotics in colon cancer En Supplement to The American
Journal of Clinical Nutrition Vol 73 pp 451-454
65
ANEXOS
66
ANEXO A RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AlSLADA DE i
PEPINO it
Referencia Pepino 1 Fecha 06122002
IEXCELENTE IDENTIFICACION
Latto plantarum 1
Galeria API 50 CHL V50 Leida el 06122002
Perfil - -- - ++ - -- - ++++ - - -+- + - I I I I I I I I +t+ - +f- ~ - - + + ~ - - - +- + - shy
o - GLY - ERY DARA - LARA + RIB + DXYL - LXYL - ADO - MDX - GAL + GLU + FRU + MNE + SBE - RHA - DUL - INO bull MAN + SOR - MDM + MUG shyNAG + AMY + ARB + ESC + SAL + CEL + MAL + LAC + MEL + SAC + TRE + 1NU - MLZ + RAF + AMD - GLYG - XLT - GEN + TIJR + LYX - TAG - DFUC shyLFUC - DARL + LARL - aNT + 2KG - 5KG shy
--- Taxones significativos rd -----T -- Tests en contra
Lactoplantarum 1 999 092 1
Taxon siguiente Lactobrevis 1 OJ 044 3
i i
Lactoplantarum 1 1 test (5) en contra
D-SORBITOL (SOR) 78
Tax6n siguiente Lactobrevis 1 3 test (s) ert contra
METHYLD-MANNOSIDE (MOlM) 0 MELEZITOSE (MLZ) 14 D-TURANOSE (TUR) 14
67
ampb
ANEXO B RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AISLADA DE REPOLLO FERMENTADO
~
Referencia Repollo fermentado - 3 Fecha 03072003
EXCELENTE IDENTIFICACION
Lactoplantarum 1
Galena API 50 CRL V50 Leida el 03072003
Perfil - - ++ - - - - -H++ - - ~ + - + - I I 1 I I I I -H+ - ++ - - - + + - -- - - + - shy
o - GLY - ERY - DARA - LARA + RIB + DXYL - LXYL - ADO ~ MDX - GAL + GLU + FRU + MNE + SBE ~ RHA - DUL - INO - MAN + SOR - MDM + MDG shyNAG + AMY + ARR + ESC + SAT + CRL + MAL + LAC + MEL + SAC + TRE + lNU - MLZ + RAF + AMI) - GLYG - XLT - GEN + TOR + LYX - TAG - DFUC shyLFUC - DARL - LARL - GNT + 2KG - 5KG shy
------Taxones significativos _ _----- Id--- ---T---- Tests en contra
Lactoplantarum 1 999 095 1
Tax6n siguiente Lactobrevis 1 01 OA8 3
lJactoplantaru01 1 1 test (s) en contra
DSORBITOL (SOR) 78
Taxon siguiente Lactobrevis
METHYL-D-MANNOSIDE D-TURANOSE
1
(MOM) (TOR)
3 test (5) en contra
0 MELEZITOSE 14
(MLZ) 14
i
I
68
ANEXO C RESULTADO PRUEBAS BIOQUWICAS DE CEPA AISLADA DE MUCOSA HUMANA
Referenda Mucosa - 5 Fecha 27012003
BUENA IDENTlFICACION
Galeria API 50 CHL vso Leida el 270112003
Perfil - - - - +t--t - - - + - + - - - - - - - - -+- - - - - + - + - - - - - - - - - - - - - bull - - -+ - +
o - GLY ~ ERY - DARA bull LARA + RID + DXYL + LXYL - ADO bull MDX - GAL + OLU - FRU + MNE - SBE - IlliA - DUL - INa - MAN - SOR - MDM - MOO shyNAG + AMY - ARB - ESC ~ SAL bull CEL - MAL + lAC - MEL + SAC - TRE shyINU - MLZ - RAF - AMD - GLYG - XLT - GEN - 11JR - LYX - TAG - DFUC shyLFUC - DARL - IARL - ONT + 2KO - 5KG +
- - - - - - Taxones significativos - - - - - - - Id T -- Test en contra
Lactobrevis 3 963 088 1
Taxon siguiente Lactoco11inoides 36 075 2
Lactobrevis 3 1 test (s) en contra
GLUCOSE (GLU) 95
-~~~------------~---------------------------~--~-------~--~-----~----------~--------~------------~~--Taxon siguiente Lactocollinoides 2 test (s) en contra
GLUCOSE (GLU) 100 MELIBIOSE (MEL) 25
69
i r
ANEXO D RESULTADO PRUEBAS BIOQIJiMICAS DE CEPA AISLADA DE LECHE FERMENTADA
Referenda Leche fennentada ~ 13 Fecha 27012003
BUENA IDENTIFICACI6N
Galeria API 50 CHL V50 Leida el 270112003
Perfil - - - - -t-t+- - - - + - + - - - bull - - - - -+- - - - - + - + - - - - - - - - - - - - - - - - -+ - +
0 - GLY - ERY - DARA - LARA +Rll3 + DXYL + LXYL - ADO - MDX ~GAL + GLU - FRU + MNE SBE - RHA DUL bull INO MAN - SOR MDM bull MDG shy
~NAG + AMY - ARB - ESC - SAL - CEL - MAL + LAC - MEL + SAC - TRE I lNU - MLZ - RAF - AMD - GLYG - XLT - OEN - IUR LYX - TAG - DFUC bull i
LFUC - DARL - LARL -ONr + 2KG - SKO + 1
- -- - - Taxones significativos - - Id -- T --- Test en contra
Lacta brevis 3 963 088 1
Taxon siguiente Lactocollinoides 36 075 2
Lactobrevis 3 1 test (s) en contra
GLUCOSE (GLU) 95
-----------------------------------------------------------~------------------------------~-------------------Taxon siguiente Lactocollinoides 2 test (s) en contra
GLUCOSE (GLD) 100 MELffiIOSE (MEL) 25
70
II iJ1
I
I ANEXO E RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AISLADA DE REPOLLITAS DE BRUSELAS FERMENTADA
Referencia repollitas de bruselas 15 Fecha 03072003
EXCELENTE IDENTIFICACION
Lactoplantarum 1
Galeria API 50 CHL vsO Leida el 03072003
Perfil - - - - +t - - - - +H+ - +- - +t + - I I I I I I I f ++t - + - - - -+ + - - - -+ -+ - - I ij
o - GLY - ERY - DARA - LARA + RJB + DXYL - LXYL - ADO - MDX - GAL +
GLU + FRU + MNE + SBE RHA + DUL - INO - MAN + SOR + MDM + MOG shyNAG + AMY + ARB + ESC + SAL + eEL + MAL + LAC + MEl + SAC + TRE + i
I1NU - MLZ + RAF AMD GLYG - XLT - aEN + TUR + LYX - TAG - Druc LFUC - DARt + LARL - aNT + 2KG - 5KG shy n ----Taxones significativos ------ Id Tests en contra
Lactoplantarum 1 999 090 o
Taxon siguiente Lacto pentosus 01 012 7
Lactoplantarum 1 o test (s) en contra
Taxon siguiente Lacto pentosus 7 test (8) en contra
GLYCEROL (GLY) 75 D-XYLOSE (DXYL) 100 L-RHAMNOSE (RHA) 25 METHYL-D-MANNOSIDE (MOM) 1 MELEZITOSE (MLZ) 25 RAFFINOSE (RAF) 75 D-ARABITOL (DARL) 0
71
~
I i I
ANEXO F - ANALISIS DE REGRESION PARA pH EN BEBIDA SIN AVENA
Aruilisis de regresi6n polinomial
---~-~-------------------------------------------~-----------~~---------------------~--------------Variable dependiente pHSinAvena ---------------------------~-------------~--------------------~---------------------------------
Error T Parametro Estimado Estandar Estadistico P-Valor
CONSTANTE 535606 0094535 56657 00000 Dia -0150565 0020706 727154 00000 Dia2 000504434 0000871488 578819 00001
---~---------------------------------------------------------------------------------------------------
Anfllisis de Variama -------------------------------------------~-----------~-----------------------------~-~--- jSource Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor 11
------------------------~------------------------------------------------------------------------------~ Mod-elo 155772 2 0118861 4256 00000 Residual 0237877 13 00182983
Total (Corr) 11956 IS
R2 == 867522 percent
pHSinAvena == 535606 - 0150565Dia + 000504434Dia2
72
____
middot ANEXO G - ANALISIS DE REGRESION PARA pH EN BEBIDA CON AVENA
AmUisis de regresion polinomial _____~_____~__-_____~___4____________________bull____bull__________bull_____________~~----_------___________
Variable depcndiente pHConA vena ------------------------------------------------------------------------------------------~--------
Error T Parametro Estimado StAndar Estadfstico P-Valor
---------------------------------------------~-----------------------------------------------_---------CONSTANTE 534463 00801045 667208 00000 Dia -0140407 00175453 800253 00000 DiaA 2 000448098 0000738458 606803 00000
----------------------~---~-----------------------------~------------------------------~----AmUisis de Varianza
---~---------------------------------~---------------------~------------~-------------------~------Source Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio PValor --------------------------~-----------------------------------------------~------------~-----~~--~ ModeJo 159575 2 0797873 6073 00000 Residual 02170798 middot13 00131383 _______~_~ ~_~----------~------~--~-----~-M-----~-----____ _____________~-----------------------Total (COlT) 176654 15
R12 903315 percent
-----------~------------------------------------------------------------------------~-----------pHConAvena 534463 - 0140407Dia + 000448098DfaA 2
73
ANEXO H - ANALTSIS DE REGRESTON PARA ACIDEZ EN BEBJDA SIN AVENA
An8Jisis de Regtesi6fi P6lifJomial
Variable Depefidiefile~ AcidezSinAVenll _______________w_____~______~________________~-----------_________~_________________~~____~___~_____
Error T Pariirnetro Estimado Estandar Estadistico ---------------------------------------~--------------~-~-------~--------------------~------------CONSTANT 0491697 00123217 399051 00000 Dia 00436032 000269882 161564 00000 D1a2 -000144613 000011359 127312 00000 __w___~________________________~-_______-_____~----____________________________~__~---~_--__~___
AriiiJisis de varianza ~_~__~__________~_~____~________~___________- _________e_____________________________bull _____-________
Source Smn de cuadr Df Mean Square F-Ratio PmiddotValor_~~___________________________________bull ______~___________bull ____________bull ______~________w________________
Model 0135203 2 00676013 21747 00000 Residual 000404118 13 000031086
Total (Corr) 0139244 15
R2 970978 percent
AcidezSlnAvena 0491697 + O0436032Dia - 0OOl44613Dia2
74
I
ANEXO I ANALISIS DE REGRESION PARA ACIDEZ EN BEBIDA CON AVENA
1
Anwisis de tegtesi6fi polinomial
Variable dependiente Acidez Con Avena
Error T ParametTo Estimado Stlindar Estadfstico P-Valor ----------------~-------~---------------------~-----------------------------------------------------CONSTANT 0491639 000926607 530578 00000 Diamiddot 00406572 000202955 200326 00000 DfaA 2 0000982559 0000085421 -115025 00000
-------------~----------------------------~-------------------------~-----------------------------------
-------------~-----~~-----------------------------~---------------------------------------------_--Source Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio PValor
-~-------------~----------------------------------~------------------~~-------------------------- Modelo 0288008 2 0144004 81914 00000 Residual 000228539 13 0000175799
----------~~--------------~---------------------------------------------~---------------------------Total (Corr) 0290294 15
RA2 = 992127 percent
-------------------------~----~---~------------~---------------------------------~---------------~
AcidezConAvena == 049163amp + 00406572D1a - 0000982559DiaA2
75
I
(Ilmiddot il
ANEXO J- ANALISIS DE REGRESION PARA RECUENTO LACTOBACILOS PARA BEBIDA SIN AVENA
Amilisis de regresion - Modelo lineal Y = a + bX
------------------------~----------------------~-----------------------------~----------~-----------Variable Dcpendiente LactobacilJusSinAvena Variable independiente Dia
I--------~----------~-----------------------------------~-------~-~--~--------------------------~-Error T
Paramctro Estimado Standard Stadistico P-Valor
----~----~------------~-----~-----------------------~-------------~-----------------------------Intereepto 117347 0389973 300911 00000 Pendiente 00483464 00257889 18747 00903
Analisis de Varianza
---------~------------------~----------------~---------------------------------~---------~----------Source Sum decuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor
------------~---------------------~---------------------~--------------------------------~-----~----Modelo 0916252 1 244835 443 00616 Residual 260706 10 0260706
--~------------~---~------------------~~~-----~-------~---------~~-------------------------------------Total (Corr)352332 11
Coeficiente Correlaci6n = 0509955 R2 = 260054 percent
LactobacillusSinAvena= 117347 + 00483464Dfa
76
ANEXO K- ANALTSIS DE REGRESION PARA RECUENTO LACTOBACILOS PARA DEBIDA CON AVENA
Aruilisis de regresion - Modelo lineal Y = a + hX
Variable Dependiente LactobacillusConAvena Variable Independiente Dia ---~--------------------------------------------------------__-----------__--_--_-----------shy
Error T Paramctro Estimado Standard Estadistico P-Valor -~--------------------------------------------------------------------------------------------------
Irttercepto 118103 0567963 207942 00000 Pendiente 00790304 00375594 210414 00616
-----------------~----------------------------~----~-------~----~----------------------------
Analisis de Varianza
----------------~----------------~------------------~--------------------------~------~--------shySource Swn de cuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor
-----------------~--~--------------------------------------------------------------------------~---~ Mode10 244835 1 244835 443 00616 Residual 552997 10 0552997
Total (Corr)797832 11
Coeficiente Correlacion = 0553964 RI2 = 306875 percent
-----~--------------------------------------------------------~--------------------------------------
LactobacillusConAvena = 118103 + 00790304Dfas
77
MOLIN Goran(2001 Probiotics in food not containing milk or milk constituents
with special reference to Lactobacillus plantarum 299v En Supplement to The
American Journal of Clinical Nutrition Vol 73 pp 380-4
MONTOYA CAMPUZANO Olga 1 (1999) Manual de Microbiologla Medellin
Universidad Nacional de Colombia 118 p
PARADA Jose Luis (1998) Bacterias Uicticas usos en fermentaciones y como
probi6ticos Primer Congreso fnternacional de Mlcrobiolagia Industrial Bogota
Colombia pp 64-71
PAROIO V WAl1SZEWSKl K YROSLEDO L (1996) Los probi6ticos y su
Futuro En Archivos Latinoamericanos de nutricion Vol46 pp 6-9
REID Gregor(2001 ) Probiotic agants to protect the urogenital tract against
infection En Supplement to The American Journal of Clinical Nutrition Vol 73
pp 437-443
SCHREZENNlEIR Jurgen DE VRESE Michael ( 2001) Probiotics prebiotics
and synbiotics - approaching a definition En Supplement to The American
Journal of Clinical Nutrition Vol 73 pp 361-364
64
STANLEY James (1989) Bergeys manual of systematic bacteriology Vol 2 y
Editorial Board and Trustees ga edition
STRAUSS Evelyn (2000) Fighting bacterial fire with bact~rial fire En Science
Vol 290 pp 2231-2233
TUOMOLA J CRITTENDEN R PLAYNE M ISOULAURI E and SALMEIN
S( 2001) Quality assurance criteria for probiotic bacteria En Supplement to The
American Journal of Clinical Nutrition Vol 73 pp 393- 8
WOLLOSWSKII RECHKEMMER G and POOL 8 (2001) Protective role of
probioties and prebiotics in colon cancer En Supplement to The American
Journal of Clinical Nutrition Vol 73 pp 451-454
65
ANEXOS
66
ANEXO A RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AlSLADA DE i
PEPINO it
Referencia Pepino 1 Fecha 06122002
IEXCELENTE IDENTIFICACION
Latto plantarum 1
Galeria API 50 CHL V50 Leida el 06122002
Perfil - -- - ++ - -- - ++++ - - -+- + - I I I I I I I I +t+ - +f- ~ - - + + ~ - - - +- + - shy
o - GLY - ERY DARA - LARA + RIB + DXYL - LXYL - ADO - MDX - GAL + GLU + FRU + MNE + SBE - RHA - DUL - INO bull MAN + SOR - MDM + MUG shyNAG + AMY + ARB + ESC + SAL + CEL + MAL + LAC + MEL + SAC + TRE + 1NU - MLZ + RAF + AMD - GLYG - XLT - GEN + TIJR + LYX - TAG - DFUC shyLFUC - DARL + LARL - aNT + 2KG - 5KG shy
--- Taxones significativos rd -----T -- Tests en contra
Lactoplantarum 1 999 092 1
Taxon siguiente Lactobrevis 1 OJ 044 3
i i
Lactoplantarum 1 1 test (5) en contra
D-SORBITOL (SOR) 78
Tax6n siguiente Lactobrevis 1 3 test (s) ert contra
METHYLD-MANNOSIDE (MOlM) 0 MELEZITOSE (MLZ) 14 D-TURANOSE (TUR) 14
67
ampb
ANEXO B RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AISLADA DE REPOLLO FERMENTADO
~
Referencia Repollo fermentado - 3 Fecha 03072003
EXCELENTE IDENTIFICACION
Lactoplantarum 1
Galena API 50 CRL V50 Leida el 03072003
Perfil - - ++ - - - - -H++ - - ~ + - + - I I 1 I I I I -H+ - ++ - - - + + - -- - - + - shy
o - GLY - ERY - DARA - LARA + RIB + DXYL - LXYL - ADO ~ MDX - GAL + GLU + FRU + MNE + SBE ~ RHA - DUL - INO - MAN + SOR - MDM + MDG shyNAG + AMY + ARR + ESC + SAT + CRL + MAL + LAC + MEL + SAC + TRE + lNU - MLZ + RAF + AMI) - GLYG - XLT - GEN + TOR + LYX - TAG - DFUC shyLFUC - DARL - LARL - GNT + 2KG - 5KG shy
------Taxones significativos _ _----- Id--- ---T---- Tests en contra
Lactoplantarum 1 999 095 1
Tax6n siguiente Lactobrevis 1 01 OA8 3
lJactoplantaru01 1 1 test (s) en contra
DSORBITOL (SOR) 78
Taxon siguiente Lactobrevis
METHYL-D-MANNOSIDE D-TURANOSE
1
(MOM) (TOR)
3 test (5) en contra
0 MELEZITOSE 14
(MLZ) 14
i
I
68
ANEXO C RESULTADO PRUEBAS BIOQUWICAS DE CEPA AISLADA DE MUCOSA HUMANA
Referenda Mucosa - 5 Fecha 27012003
BUENA IDENTlFICACION
Galeria API 50 CHL vso Leida el 270112003
Perfil - - - - +t--t - - - + - + - - - - - - - - -+- - - - - + - + - - - - - - - - - - - - - bull - - -+ - +
o - GLY ~ ERY - DARA bull LARA + RID + DXYL + LXYL - ADO bull MDX - GAL + OLU - FRU + MNE - SBE - IlliA - DUL - INa - MAN - SOR - MDM - MOO shyNAG + AMY - ARB - ESC ~ SAL bull CEL - MAL + lAC - MEL + SAC - TRE shyINU - MLZ - RAF - AMD - GLYG - XLT - GEN - 11JR - LYX - TAG - DFUC shyLFUC - DARL - IARL - ONT + 2KO - 5KG +
- - - - - - Taxones significativos - - - - - - - Id T -- Test en contra
Lactobrevis 3 963 088 1
Taxon siguiente Lactoco11inoides 36 075 2
Lactobrevis 3 1 test (s) en contra
GLUCOSE (GLU) 95
-~~~------------~---------------------------~--~-------~--~-----~----------~--------~------------~~--Taxon siguiente Lactocollinoides 2 test (s) en contra
GLUCOSE (GLU) 100 MELIBIOSE (MEL) 25
69
i r
ANEXO D RESULTADO PRUEBAS BIOQIJiMICAS DE CEPA AISLADA DE LECHE FERMENTADA
Referenda Leche fennentada ~ 13 Fecha 27012003
BUENA IDENTIFICACI6N
Galeria API 50 CHL V50 Leida el 270112003
Perfil - - - - -t-t+- - - - + - + - - - bull - - - - -+- - - - - + - + - - - - - - - - - - - - - - - - -+ - +
0 - GLY - ERY - DARA - LARA +Rll3 + DXYL + LXYL - ADO - MDX ~GAL + GLU - FRU + MNE SBE - RHA DUL bull INO MAN - SOR MDM bull MDG shy
~NAG + AMY - ARB - ESC - SAL - CEL - MAL + LAC - MEL + SAC - TRE I lNU - MLZ - RAF - AMD - GLYG - XLT - OEN - IUR LYX - TAG - DFUC bull i
LFUC - DARL - LARL -ONr + 2KG - SKO + 1
- -- - - Taxones significativos - - Id -- T --- Test en contra
Lacta brevis 3 963 088 1
Taxon siguiente Lactocollinoides 36 075 2
Lactobrevis 3 1 test (s) en contra
GLUCOSE (GLU) 95
-----------------------------------------------------------~------------------------------~-------------------Taxon siguiente Lactocollinoides 2 test (s) en contra
GLUCOSE (GLD) 100 MELffiIOSE (MEL) 25
70
II iJ1
I
I ANEXO E RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AISLADA DE REPOLLITAS DE BRUSELAS FERMENTADA
Referencia repollitas de bruselas 15 Fecha 03072003
EXCELENTE IDENTIFICACION
Lactoplantarum 1
Galeria API 50 CHL vsO Leida el 03072003
Perfil - - - - +t - - - - +H+ - +- - +t + - I I I I I I I f ++t - + - - - -+ + - - - -+ -+ - - I ij
o - GLY - ERY - DARA - LARA + RJB + DXYL - LXYL - ADO - MDX - GAL +
GLU + FRU + MNE + SBE RHA + DUL - INO - MAN + SOR + MDM + MOG shyNAG + AMY + ARB + ESC + SAL + eEL + MAL + LAC + MEl + SAC + TRE + i
I1NU - MLZ + RAF AMD GLYG - XLT - aEN + TUR + LYX - TAG - Druc LFUC - DARt + LARL - aNT + 2KG - 5KG shy n ----Taxones significativos ------ Id Tests en contra
Lactoplantarum 1 999 090 o
Taxon siguiente Lacto pentosus 01 012 7
Lactoplantarum 1 o test (s) en contra
Taxon siguiente Lacto pentosus 7 test (8) en contra
GLYCEROL (GLY) 75 D-XYLOSE (DXYL) 100 L-RHAMNOSE (RHA) 25 METHYL-D-MANNOSIDE (MOM) 1 MELEZITOSE (MLZ) 25 RAFFINOSE (RAF) 75 D-ARABITOL (DARL) 0
71
~
I i I
ANEXO F - ANALISIS DE REGRESION PARA pH EN BEBIDA SIN AVENA
Aruilisis de regresi6n polinomial
---~-~-------------------------------------------~-----------~~---------------------~--------------Variable dependiente pHSinAvena ---------------------------~-------------~--------------------~---------------------------------
Error T Parametro Estimado Estandar Estadistico P-Valor
CONSTANTE 535606 0094535 56657 00000 Dia -0150565 0020706 727154 00000 Dia2 000504434 0000871488 578819 00001
---~---------------------------------------------------------------------------------------------------
Anfllisis de Variama -------------------------------------------~-----------~-----------------------------~-~--- jSource Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor 11
------------------------~------------------------------------------------------------------------------~ Mod-elo 155772 2 0118861 4256 00000 Residual 0237877 13 00182983
Total (Corr) 11956 IS
R2 == 867522 percent
pHSinAvena == 535606 - 0150565Dia + 000504434Dia2
72
____
middot ANEXO G - ANALISIS DE REGRESION PARA pH EN BEBIDA CON AVENA
AmUisis de regresion polinomial _____~_____~__-_____~___4____________________bull____bull__________bull_____________~~----_------___________
Variable depcndiente pHConA vena ------------------------------------------------------------------------------------------~--------
Error T Parametro Estimado StAndar Estadfstico P-Valor
---------------------------------------------~-----------------------------------------------_---------CONSTANTE 534463 00801045 667208 00000 Dia -0140407 00175453 800253 00000 DiaA 2 000448098 0000738458 606803 00000
----------------------~---~-----------------------------~------------------------------~----AmUisis de Varianza
---~---------------------------------~---------------------~------------~-------------------~------Source Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio PValor --------------------------~-----------------------------------------------~------------~-----~~--~ ModeJo 159575 2 0797873 6073 00000 Residual 02170798 middot13 00131383 _______~_~ ~_~----------~------~--~-----~-M-----~-----____ _____________~-----------------------Total (COlT) 176654 15
R12 903315 percent
-----------~------------------------------------------------------------------------~-----------pHConAvena 534463 - 0140407Dia + 000448098DfaA 2
73
ANEXO H - ANALTSIS DE REGRESTON PARA ACIDEZ EN BEBJDA SIN AVENA
An8Jisis de Regtesi6fi P6lifJomial
Variable Depefidiefile~ AcidezSinAVenll _______________w_____~______~________________~-----------_________~_________________~~____~___~_____
Error T Pariirnetro Estimado Estandar Estadistico ---------------------------------------~--------------~-~-------~--------------------~------------CONSTANT 0491697 00123217 399051 00000 Dia 00436032 000269882 161564 00000 D1a2 -000144613 000011359 127312 00000 __w___~________________________~-_______-_____~----____________________________~__~---~_--__~___
AriiiJisis de varianza ~_~__~__________~_~____~________~___________- _________e_____________________________bull _____-________
Source Smn de cuadr Df Mean Square F-Ratio PmiddotValor_~~___________________________________bull ______~___________bull ____________bull ______~________w________________
Model 0135203 2 00676013 21747 00000 Residual 000404118 13 000031086
Total (Corr) 0139244 15
R2 970978 percent
AcidezSlnAvena 0491697 + O0436032Dia - 0OOl44613Dia2
74
I
ANEXO I ANALISIS DE REGRESION PARA ACIDEZ EN BEBIDA CON AVENA
1
Anwisis de tegtesi6fi polinomial
Variable dependiente Acidez Con Avena
Error T ParametTo Estimado Stlindar Estadfstico P-Valor ----------------~-------~---------------------~-----------------------------------------------------CONSTANT 0491639 000926607 530578 00000 Diamiddot 00406572 000202955 200326 00000 DfaA 2 0000982559 0000085421 -115025 00000
-------------~----------------------------~-------------------------~-----------------------------------
-------------~-----~~-----------------------------~---------------------------------------------_--Source Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio PValor
-~-------------~----------------------------------~------------------~~-------------------------- Modelo 0288008 2 0144004 81914 00000 Residual 000228539 13 0000175799
----------~~--------------~---------------------------------------------~---------------------------Total (Corr) 0290294 15
RA2 = 992127 percent
-------------------------~----~---~------------~---------------------------------~---------------~
AcidezConAvena == 049163amp + 00406572D1a - 0000982559DiaA2
75
I
(Ilmiddot il
ANEXO J- ANALISIS DE REGRESION PARA RECUENTO LACTOBACILOS PARA BEBIDA SIN AVENA
Amilisis de regresion - Modelo lineal Y = a + bX
------------------------~----------------------~-----------------------------~----------~-----------Variable Dcpendiente LactobacilJusSinAvena Variable independiente Dia
I--------~----------~-----------------------------------~-------~-~--~--------------------------~-Error T
Paramctro Estimado Standard Stadistico P-Valor
----~----~------------~-----~-----------------------~-------------~-----------------------------Intereepto 117347 0389973 300911 00000 Pendiente 00483464 00257889 18747 00903
Analisis de Varianza
---------~------------------~----------------~---------------------------------~---------~----------Source Sum decuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor
------------~---------------------~---------------------~--------------------------------~-----~----Modelo 0916252 1 244835 443 00616 Residual 260706 10 0260706
--~------------~---~------------------~~~-----~-------~---------~~-------------------------------------Total (Corr)352332 11
Coeficiente Correlaci6n = 0509955 R2 = 260054 percent
LactobacillusSinAvena= 117347 + 00483464Dfa
76
ANEXO K- ANALTSIS DE REGRESION PARA RECUENTO LACTOBACILOS PARA DEBIDA CON AVENA
Aruilisis de regresion - Modelo lineal Y = a + hX
Variable Dependiente LactobacillusConAvena Variable Independiente Dia ---~--------------------------------------------------------__-----------__--_--_-----------shy
Error T Paramctro Estimado Standard Estadistico P-Valor -~--------------------------------------------------------------------------------------------------
Irttercepto 118103 0567963 207942 00000 Pendiente 00790304 00375594 210414 00616
-----------------~----------------------------~----~-------~----~----------------------------
Analisis de Varianza
----------------~----------------~------------------~--------------------------~------~--------shySource Swn de cuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor
-----------------~--~--------------------------------------------------------------------------~---~ Mode10 244835 1 244835 443 00616 Residual 552997 10 0552997
Total (Corr)797832 11
Coeficiente Correlacion = 0553964 RI2 = 306875 percent
-----~--------------------------------------------------------~--------------------------------------
LactobacillusConAvena = 118103 + 00790304Dfas
77
STANLEY James (1989) Bergeys manual of systematic bacteriology Vol 2 y
Editorial Board and Trustees ga edition
STRAUSS Evelyn (2000) Fighting bacterial fire with bact~rial fire En Science
Vol 290 pp 2231-2233
TUOMOLA J CRITTENDEN R PLAYNE M ISOULAURI E and SALMEIN
S( 2001) Quality assurance criteria for probiotic bacteria En Supplement to The
American Journal of Clinical Nutrition Vol 73 pp 393- 8
WOLLOSWSKII RECHKEMMER G and POOL 8 (2001) Protective role of
probioties and prebiotics in colon cancer En Supplement to The American
Journal of Clinical Nutrition Vol 73 pp 451-454
65
ANEXOS
66
ANEXO A RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AlSLADA DE i
PEPINO it
Referencia Pepino 1 Fecha 06122002
IEXCELENTE IDENTIFICACION
Latto plantarum 1
Galeria API 50 CHL V50 Leida el 06122002
Perfil - -- - ++ - -- - ++++ - - -+- + - I I I I I I I I +t+ - +f- ~ - - + + ~ - - - +- + - shy
o - GLY - ERY DARA - LARA + RIB + DXYL - LXYL - ADO - MDX - GAL + GLU + FRU + MNE + SBE - RHA - DUL - INO bull MAN + SOR - MDM + MUG shyNAG + AMY + ARB + ESC + SAL + CEL + MAL + LAC + MEL + SAC + TRE + 1NU - MLZ + RAF + AMD - GLYG - XLT - GEN + TIJR + LYX - TAG - DFUC shyLFUC - DARL + LARL - aNT + 2KG - 5KG shy
--- Taxones significativos rd -----T -- Tests en contra
Lactoplantarum 1 999 092 1
Taxon siguiente Lactobrevis 1 OJ 044 3
i i
Lactoplantarum 1 1 test (5) en contra
D-SORBITOL (SOR) 78
Tax6n siguiente Lactobrevis 1 3 test (s) ert contra
METHYLD-MANNOSIDE (MOlM) 0 MELEZITOSE (MLZ) 14 D-TURANOSE (TUR) 14
67
ampb
ANEXO B RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AISLADA DE REPOLLO FERMENTADO
~
Referencia Repollo fermentado - 3 Fecha 03072003
EXCELENTE IDENTIFICACION
Lactoplantarum 1
Galena API 50 CRL V50 Leida el 03072003
Perfil - - ++ - - - - -H++ - - ~ + - + - I I 1 I I I I -H+ - ++ - - - + + - -- - - + - shy
o - GLY - ERY - DARA - LARA + RIB + DXYL - LXYL - ADO ~ MDX - GAL + GLU + FRU + MNE + SBE ~ RHA - DUL - INO - MAN + SOR - MDM + MDG shyNAG + AMY + ARR + ESC + SAT + CRL + MAL + LAC + MEL + SAC + TRE + lNU - MLZ + RAF + AMI) - GLYG - XLT - GEN + TOR + LYX - TAG - DFUC shyLFUC - DARL - LARL - GNT + 2KG - 5KG shy
------Taxones significativos _ _----- Id--- ---T---- Tests en contra
Lactoplantarum 1 999 095 1
Tax6n siguiente Lactobrevis 1 01 OA8 3
lJactoplantaru01 1 1 test (s) en contra
DSORBITOL (SOR) 78
Taxon siguiente Lactobrevis
METHYL-D-MANNOSIDE D-TURANOSE
1
(MOM) (TOR)
3 test (5) en contra
0 MELEZITOSE 14
(MLZ) 14
i
I
68
ANEXO C RESULTADO PRUEBAS BIOQUWICAS DE CEPA AISLADA DE MUCOSA HUMANA
Referenda Mucosa - 5 Fecha 27012003
BUENA IDENTlFICACION
Galeria API 50 CHL vso Leida el 270112003
Perfil - - - - +t--t - - - + - + - - - - - - - - -+- - - - - + - + - - - - - - - - - - - - - bull - - -+ - +
o - GLY ~ ERY - DARA bull LARA + RID + DXYL + LXYL - ADO bull MDX - GAL + OLU - FRU + MNE - SBE - IlliA - DUL - INa - MAN - SOR - MDM - MOO shyNAG + AMY - ARB - ESC ~ SAL bull CEL - MAL + lAC - MEL + SAC - TRE shyINU - MLZ - RAF - AMD - GLYG - XLT - GEN - 11JR - LYX - TAG - DFUC shyLFUC - DARL - IARL - ONT + 2KO - 5KG +
- - - - - - Taxones significativos - - - - - - - Id T -- Test en contra
Lactobrevis 3 963 088 1
Taxon siguiente Lactoco11inoides 36 075 2
Lactobrevis 3 1 test (s) en contra
GLUCOSE (GLU) 95
-~~~------------~---------------------------~--~-------~--~-----~----------~--------~------------~~--Taxon siguiente Lactocollinoides 2 test (s) en contra
GLUCOSE (GLU) 100 MELIBIOSE (MEL) 25
69
i r
ANEXO D RESULTADO PRUEBAS BIOQIJiMICAS DE CEPA AISLADA DE LECHE FERMENTADA
Referenda Leche fennentada ~ 13 Fecha 27012003
BUENA IDENTIFICACI6N
Galeria API 50 CHL V50 Leida el 270112003
Perfil - - - - -t-t+- - - - + - + - - - bull - - - - -+- - - - - + - + - - - - - - - - - - - - - - - - -+ - +
0 - GLY - ERY - DARA - LARA +Rll3 + DXYL + LXYL - ADO - MDX ~GAL + GLU - FRU + MNE SBE - RHA DUL bull INO MAN - SOR MDM bull MDG shy
~NAG + AMY - ARB - ESC - SAL - CEL - MAL + LAC - MEL + SAC - TRE I lNU - MLZ - RAF - AMD - GLYG - XLT - OEN - IUR LYX - TAG - DFUC bull i
LFUC - DARL - LARL -ONr + 2KG - SKO + 1
- -- - - Taxones significativos - - Id -- T --- Test en contra
Lacta brevis 3 963 088 1
Taxon siguiente Lactocollinoides 36 075 2
Lactobrevis 3 1 test (s) en contra
GLUCOSE (GLU) 95
-----------------------------------------------------------~------------------------------~-------------------Taxon siguiente Lactocollinoides 2 test (s) en contra
GLUCOSE (GLD) 100 MELffiIOSE (MEL) 25
70
II iJ1
I
I ANEXO E RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AISLADA DE REPOLLITAS DE BRUSELAS FERMENTADA
Referencia repollitas de bruselas 15 Fecha 03072003
EXCELENTE IDENTIFICACION
Lactoplantarum 1
Galeria API 50 CHL vsO Leida el 03072003
Perfil - - - - +t - - - - +H+ - +- - +t + - I I I I I I I f ++t - + - - - -+ + - - - -+ -+ - - I ij
o - GLY - ERY - DARA - LARA + RJB + DXYL - LXYL - ADO - MDX - GAL +
GLU + FRU + MNE + SBE RHA + DUL - INO - MAN + SOR + MDM + MOG shyNAG + AMY + ARB + ESC + SAL + eEL + MAL + LAC + MEl + SAC + TRE + i
I1NU - MLZ + RAF AMD GLYG - XLT - aEN + TUR + LYX - TAG - Druc LFUC - DARt + LARL - aNT + 2KG - 5KG shy n ----Taxones significativos ------ Id Tests en contra
Lactoplantarum 1 999 090 o
Taxon siguiente Lacto pentosus 01 012 7
Lactoplantarum 1 o test (s) en contra
Taxon siguiente Lacto pentosus 7 test (8) en contra
GLYCEROL (GLY) 75 D-XYLOSE (DXYL) 100 L-RHAMNOSE (RHA) 25 METHYL-D-MANNOSIDE (MOM) 1 MELEZITOSE (MLZ) 25 RAFFINOSE (RAF) 75 D-ARABITOL (DARL) 0
71
~
I i I
ANEXO F - ANALISIS DE REGRESION PARA pH EN BEBIDA SIN AVENA
Aruilisis de regresi6n polinomial
---~-~-------------------------------------------~-----------~~---------------------~--------------Variable dependiente pHSinAvena ---------------------------~-------------~--------------------~---------------------------------
Error T Parametro Estimado Estandar Estadistico P-Valor
CONSTANTE 535606 0094535 56657 00000 Dia -0150565 0020706 727154 00000 Dia2 000504434 0000871488 578819 00001
---~---------------------------------------------------------------------------------------------------
Anfllisis de Variama -------------------------------------------~-----------~-----------------------------~-~--- jSource Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor 11
------------------------~------------------------------------------------------------------------------~ Mod-elo 155772 2 0118861 4256 00000 Residual 0237877 13 00182983
Total (Corr) 11956 IS
R2 == 867522 percent
pHSinAvena == 535606 - 0150565Dia + 000504434Dia2
72
____
middot ANEXO G - ANALISIS DE REGRESION PARA pH EN BEBIDA CON AVENA
AmUisis de regresion polinomial _____~_____~__-_____~___4____________________bull____bull__________bull_____________~~----_------___________
Variable depcndiente pHConA vena ------------------------------------------------------------------------------------------~--------
Error T Parametro Estimado StAndar Estadfstico P-Valor
---------------------------------------------~-----------------------------------------------_---------CONSTANTE 534463 00801045 667208 00000 Dia -0140407 00175453 800253 00000 DiaA 2 000448098 0000738458 606803 00000
----------------------~---~-----------------------------~------------------------------~----AmUisis de Varianza
---~---------------------------------~---------------------~------------~-------------------~------Source Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio PValor --------------------------~-----------------------------------------------~------------~-----~~--~ ModeJo 159575 2 0797873 6073 00000 Residual 02170798 middot13 00131383 _______~_~ ~_~----------~------~--~-----~-M-----~-----____ _____________~-----------------------Total (COlT) 176654 15
R12 903315 percent
-----------~------------------------------------------------------------------------~-----------pHConAvena 534463 - 0140407Dia + 000448098DfaA 2
73
ANEXO H - ANALTSIS DE REGRESTON PARA ACIDEZ EN BEBJDA SIN AVENA
An8Jisis de Regtesi6fi P6lifJomial
Variable Depefidiefile~ AcidezSinAVenll _______________w_____~______~________________~-----------_________~_________________~~____~___~_____
Error T Pariirnetro Estimado Estandar Estadistico ---------------------------------------~--------------~-~-------~--------------------~------------CONSTANT 0491697 00123217 399051 00000 Dia 00436032 000269882 161564 00000 D1a2 -000144613 000011359 127312 00000 __w___~________________________~-_______-_____~----____________________________~__~---~_--__~___
AriiiJisis de varianza ~_~__~__________~_~____~________~___________- _________e_____________________________bull _____-________
Source Smn de cuadr Df Mean Square F-Ratio PmiddotValor_~~___________________________________bull ______~___________bull ____________bull ______~________w________________
Model 0135203 2 00676013 21747 00000 Residual 000404118 13 000031086
Total (Corr) 0139244 15
R2 970978 percent
AcidezSlnAvena 0491697 + O0436032Dia - 0OOl44613Dia2
74
I
ANEXO I ANALISIS DE REGRESION PARA ACIDEZ EN BEBIDA CON AVENA
1
Anwisis de tegtesi6fi polinomial
Variable dependiente Acidez Con Avena
Error T ParametTo Estimado Stlindar Estadfstico P-Valor ----------------~-------~---------------------~-----------------------------------------------------CONSTANT 0491639 000926607 530578 00000 Diamiddot 00406572 000202955 200326 00000 DfaA 2 0000982559 0000085421 -115025 00000
-------------~----------------------------~-------------------------~-----------------------------------
-------------~-----~~-----------------------------~---------------------------------------------_--Source Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio PValor
-~-------------~----------------------------------~------------------~~-------------------------- Modelo 0288008 2 0144004 81914 00000 Residual 000228539 13 0000175799
----------~~--------------~---------------------------------------------~---------------------------Total (Corr) 0290294 15
RA2 = 992127 percent
-------------------------~----~---~------------~---------------------------------~---------------~
AcidezConAvena == 049163amp + 00406572D1a - 0000982559DiaA2
75
I
(Ilmiddot il
ANEXO J- ANALISIS DE REGRESION PARA RECUENTO LACTOBACILOS PARA BEBIDA SIN AVENA
Amilisis de regresion - Modelo lineal Y = a + bX
------------------------~----------------------~-----------------------------~----------~-----------Variable Dcpendiente LactobacilJusSinAvena Variable independiente Dia
I--------~----------~-----------------------------------~-------~-~--~--------------------------~-Error T
Paramctro Estimado Standard Stadistico P-Valor
----~----~------------~-----~-----------------------~-------------~-----------------------------Intereepto 117347 0389973 300911 00000 Pendiente 00483464 00257889 18747 00903
Analisis de Varianza
---------~------------------~----------------~---------------------------------~---------~----------Source Sum decuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor
------------~---------------------~---------------------~--------------------------------~-----~----Modelo 0916252 1 244835 443 00616 Residual 260706 10 0260706
--~------------~---~------------------~~~-----~-------~---------~~-------------------------------------Total (Corr)352332 11
Coeficiente Correlaci6n = 0509955 R2 = 260054 percent
LactobacillusSinAvena= 117347 + 00483464Dfa
76
ANEXO K- ANALTSIS DE REGRESION PARA RECUENTO LACTOBACILOS PARA DEBIDA CON AVENA
Aruilisis de regresion - Modelo lineal Y = a + hX
Variable Dependiente LactobacillusConAvena Variable Independiente Dia ---~--------------------------------------------------------__-----------__--_--_-----------shy
Error T Paramctro Estimado Standard Estadistico P-Valor -~--------------------------------------------------------------------------------------------------
Irttercepto 118103 0567963 207942 00000 Pendiente 00790304 00375594 210414 00616
-----------------~----------------------------~----~-------~----~----------------------------
Analisis de Varianza
----------------~----------------~------------------~--------------------------~------~--------shySource Swn de cuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor
-----------------~--~--------------------------------------------------------------------------~---~ Mode10 244835 1 244835 443 00616 Residual 552997 10 0552997
Total (Corr)797832 11
Coeficiente Correlacion = 0553964 RI2 = 306875 percent
-----~--------------------------------------------------------~--------------------------------------
LactobacillusConAvena = 118103 + 00790304Dfas
77
ANEXOS
66
ANEXO A RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AlSLADA DE i
PEPINO it
Referencia Pepino 1 Fecha 06122002
IEXCELENTE IDENTIFICACION
Latto plantarum 1
Galeria API 50 CHL V50 Leida el 06122002
Perfil - -- - ++ - -- - ++++ - - -+- + - I I I I I I I I +t+ - +f- ~ - - + + ~ - - - +- + - shy
o - GLY - ERY DARA - LARA + RIB + DXYL - LXYL - ADO - MDX - GAL + GLU + FRU + MNE + SBE - RHA - DUL - INO bull MAN + SOR - MDM + MUG shyNAG + AMY + ARB + ESC + SAL + CEL + MAL + LAC + MEL + SAC + TRE + 1NU - MLZ + RAF + AMD - GLYG - XLT - GEN + TIJR + LYX - TAG - DFUC shyLFUC - DARL + LARL - aNT + 2KG - 5KG shy
--- Taxones significativos rd -----T -- Tests en contra
Lactoplantarum 1 999 092 1
Taxon siguiente Lactobrevis 1 OJ 044 3
i i
Lactoplantarum 1 1 test (5) en contra
D-SORBITOL (SOR) 78
Tax6n siguiente Lactobrevis 1 3 test (s) ert contra
METHYLD-MANNOSIDE (MOlM) 0 MELEZITOSE (MLZ) 14 D-TURANOSE (TUR) 14
67
ampb
ANEXO B RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AISLADA DE REPOLLO FERMENTADO
~
Referencia Repollo fermentado - 3 Fecha 03072003
EXCELENTE IDENTIFICACION
Lactoplantarum 1
Galena API 50 CRL V50 Leida el 03072003
Perfil - - ++ - - - - -H++ - - ~ + - + - I I 1 I I I I -H+ - ++ - - - + + - -- - - + - shy
o - GLY - ERY - DARA - LARA + RIB + DXYL - LXYL - ADO ~ MDX - GAL + GLU + FRU + MNE + SBE ~ RHA - DUL - INO - MAN + SOR - MDM + MDG shyNAG + AMY + ARR + ESC + SAT + CRL + MAL + LAC + MEL + SAC + TRE + lNU - MLZ + RAF + AMI) - GLYG - XLT - GEN + TOR + LYX - TAG - DFUC shyLFUC - DARL - LARL - GNT + 2KG - 5KG shy
------Taxones significativos _ _----- Id--- ---T---- Tests en contra
Lactoplantarum 1 999 095 1
Tax6n siguiente Lactobrevis 1 01 OA8 3
lJactoplantaru01 1 1 test (s) en contra
DSORBITOL (SOR) 78
Taxon siguiente Lactobrevis
METHYL-D-MANNOSIDE D-TURANOSE
1
(MOM) (TOR)
3 test (5) en contra
0 MELEZITOSE 14
(MLZ) 14
i
I
68
ANEXO C RESULTADO PRUEBAS BIOQUWICAS DE CEPA AISLADA DE MUCOSA HUMANA
Referenda Mucosa - 5 Fecha 27012003
BUENA IDENTlFICACION
Galeria API 50 CHL vso Leida el 270112003
Perfil - - - - +t--t - - - + - + - - - - - - - - -+- - - - - + - + - - - - - - - - - - - - - bull - - -+ - +
o - GLY ~ ERY - DARA bull LARA + RID + DXYL + LXYL - ADO bull MDX - GAL + OLU - FRU + MNE - SBE - IlliA - DUL - INa - MAN - SOR - MDM - MOO shyNAG + AMY - ARB - ESC ~ SAL bull CEL - MAL + lAC - MEL + SAC - TRE shyINU - MLZ - RAF - AMD - GLYG - XLT - GEN - 11JR - LYX - TAG - DFUC shyLFUC - DARL - IARL - ONT + 2KO - 5KG +
- - - - - - Taxones significativos - - - - - - - Id T -- Test en contra
Lactobrevis 3 963 088 1
Taxon siguiente Lactoco11inoides 36 075 2
Lactobrevis 3 1 test (s) en contra
GLUCOSE (GLU) 95
-~~~------------~---------------------------~--~-------~--~-----~----------~--------~------------~~--Taxon siguiente Lactocollinoides 2 test (s) en contra
GLUCOSE (GLU) 100 MELIBIOSE (MEL) 25
69
i r
ANEXO D RESULTADO PRUEBAS BIOQIJiMICAS DE CEPA AISLADA DE LECHE FERMENTADA
Referenda Leche fennentada ~ 13 Fecha 27012003
BUENA IDENTIFICACI6N
Galeria API 50 CHL V50 Leida el 270112003
Perfil - - - - -t-t+- - - - + - + - - - bull - - - - -+- - - - - + - + - - - - - - - - - - - - - - - - -+ - +
0 - GLY - ERY - DARA - LARA +Rll3 + DXYL + LXYL - ADO - MDX ~GAL + GLU - FRU + MNE SBE - RHA DUL bull INO MAN - SOR MDM bull MDG shy
~NAG + AMY - ARB - ESC - SAL - CEL - MAL + LAC - MEL + SAC - TRE I lNU - MLZ - RAF - AMD - GLYG - XLT - OEN - IUR LYX - TAG - DFUC bull i
LFUC - DARL - LARL -ONr + 2KG - SKO + 1
- -- - - Taxones significativos - - Id -- T --- Test en contra
Lacta brevis 3 963 088 1
Taxon siguiente Lactocollinoides 36 075 2
Lactobrevis 3 1 test (s) en contra
GLUCOSE (GLU) 95
-----------------------------------------------------------~------------------------------~-------------------Taxon siguiente Lactocollinoides 2 test (s) en contra
GLUCOSE (GLD) 100 MELffiIOSE (MEL) 25
70
II iJ1
I
I ANEXO E RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AISLADA DE REPOLLITAS DE BRUSELAS FERMENTADA
Referencia repollitas de bruselas 15 Fecha 03072003
EXCELENTE IDENTIFICACION
Lactoplantarum 1
Galeria API 50 CHL vsO Leida el 03072003
Perfil - - - - +t - - - - +H+ - +- - +t + - I I I I I I I f ++t - + - - - -+ + - - - -+ -+ - - I ij
o - GLY - ERY - DARA - LARA + RJB + DXYL - LXYL - ADO - MDX - GAL +
GLU + FRU + MNE + SBE RHA + DUL - INO - MAN + SOR + MDM + MOG shyNAG + AMY + ARB + ESC + SAL + eEL + MAL + LAC + MEl + SAC + TRE + i
I1NU - MLZ + RAF AMD GLYG - XLT - aEN + TUR + LYX - TAG - Druc LFUC - DARt + LARL - aNT + 2KG - 5KG shy n ----Taxones significativos ------ Id Tests en contra
Lactoplantarum 1 999 090 o
Taxon siguiente Lacto pentosus 01 012 7
Lactoplantarum 1 o test (s) en contra
Taxon siguiente Lacto pentosus 7 test (8) en contra
GLYCEROL (GLY) 75 D-XYLOSE (DXYL) 100 L-RHAMNOSE (RHA) 25 METHYL-D-MANNOSIDE (MOM) 1 MELEZITOSE (MLZ) 25 RAFFINOSE (RAF) 75 D-ARABITOL (DARL) 0
71
~
I i I
ANEXO F - ANALISIS DE REGRESION PARA pH EN BEBIDA SIN AVENA
Aruilisis de regresi6n polinomial
---~-~-------------------------------------------~-----------~~---------------------~--------------Variable dependiente pHSinAvena ---------------------------~-------------~--------------------~---------------------------------
Error T Parametro Estimado Estandar Estadistico P-Valor
CONSTANTE 535606 0094535 56657 00000 Dia -0150565 0020706 727154 00000 Dia2 000504434 0000871488 578819 00001
---~---------------------------------------------------------------------------------------------------
Anfllisis de Variama -------------------------------------------~-----------~-----------------------------~-~--- jSource Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor 11
------------------------~------------------------------------------------------------------------------~ Mod-elo 155772 2 0118861 4256 00000 Residual 0237877 13 00182983
Total (Corr) 11956 IS
R2 == 867522 percent
pHSinAvena == 535606 - 0150565Dia + 000504434Dia2
72
____
middot ANEXO G - ANALISIS DE REGRESION PARA pH EN BEBIDA CON AVENA
AmUisis de regresion polinomial _____~_____~__-_____~___4____________________bull____bull__________bull_____________~~----_------___________
Variable depcndiente pHConA vena ------------------------------------------------------------------------------------------~--------
Error T Parametro Estimado StAndar Estadfstico P-Valor
---------------------------------------------~-----------------------------------------------_---------CONSTANTE 534463 00801045 667208 00000 Dia -0140407 00175453 800253 00000 DiaA 2 000448098 0000738458 606803 00000
----------------------~---~-----------------------------~------------------------------~----AmUisis de Varianza
---~---------------------------------~---------------------~------------~-------------------~------Source Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio PValor --------------------------~-----------------------------------------------~------------~-----~~--~ ModeJo 159575 2 0797873 6073 00000 Residual 02170798 middot13 00131383 _______~_~ ~_~----------~------~--~-----~-M-----~-----____ _____________~-----------------------Total (COlT) 176654 15
R12 903315 percent
-----------~------------------------------------------------------------------------~-----------pHConAvena 534463 - 0140407Dia + 000448098DfaA 2
73
ANEXO H - ANALTSIS DE REGRESTON PARA ACIDEZ EN BEBJDA SIN AVENA
An8Jisis de Regtesi6fi P6lifJomial
Variable Depefidiefile~ AcidezSinAVenll _______________w_____~______~________________~-----------_________~_________________~~____~___~_____
Error T Pariirnetro Estimado Estandar Estadistico ---------------------------------------~--------------~-~-------~--------------------~------------CONSTANT 0491697 00123217 399051 00000 Dia 00436032 000269882 161564 00000 D1a2 -000144613 000011359 127312 00000 __w___~________________________~-_______-_____~----____________________________~__~---~_--__~___
AriiiJisis de varianza ~_~__~__________~_~____~________~___________- _________e_____________________________bull _____-________
Source Smn de cuadr Df Mean Square F-Ratio PmiddotValor_~~___________________________________bull ______~___________bull ____________bull ______~________w________________
Model 0135203 2 00676013 21747 00000 Residual 000404118 13 000031086
Total (Corr) 0139244 15
R2 970978 percent
AcidezSlnAvena 0491697 + O0436032Dia - 0OOl44613Dia2
74
I
ANEXO I ANALISIS DE REGRESION PARA ACIDEZ EN BEBIDA CON AVENA
1
Anwisis de tegtesi6fi polinomial
Variable dependiente Acidez Con Avena
Error T ParametTo Estimado Stlindar Estadfstico P-Valor ----------------~-------~---------------------~-----------------------------------------------------CONSTANT 0491639 000926607 530578 00000 Diamiddot 00406572 000202955 200326 00000 DfaA 2 0000982559 0000085421 -115025 00000
-------------~----------------------------~-------------------------~-----------------------------------
-------------~-----~~-----------------------------~---------------------------------------------_--Source Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio PValor
-~-------------~----------------------------------~------------------~~-------------------------- Modelo 0288008 2 0144004 81914 00000 Residual 000228539 13 0000175799
----------~~--------------~---------------------------------------------~---------------------------Total (Corr) 0290294 15
RA2 = 992127 percent
-------------------------~----~---~------------~---------------------------------~---------------~
AcidezConAvena == 049163amp + 00406572D1a - 0000982559DiaA2
75
I
(Ilmiddot il
ANEXO J- ANALISIS DE REGRESION PARA RECUENTO LACTOBACILOS PARA BEBIDA SIN AVENA
Amilisis de regresion - Modelo lineal Y = a + bX
------------------------~----------------------~-----------------------------~----------~-----------Variable Dcpendiente LactobacilJusSinAvena Variable independiente Dia
I--------~----------~-----------------------------------~-------~-~--~--------------------------~-Error T
Paramctro Estimado Standard Stadistico P-Valor
----~----~------------~-----~-----------------------~-------------~-----------------------------Intereepto 117347 0389973 300911 00000 Pendiente 00483464 00257889 18747 00903
Analisis de Varianza
---------~------------------~----------------~---------------------------------~---------~----------Source Sum decuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor
------------~---------------------~---------------------~--------------------------------~-----~----Modelo 0916252 1 244835 443 00616 Residual 260706 10 0260706
--~------------~---~------------------~~~-----~-------~---------~~-------------------------------------Total (Corr)352332 11
Coeficiente Correlaci6n = 0509955 R2 = 260054 percent
LactobacillusSinAvena= 117347 + 00483464Dfa
76
ANEXO K- ANALTSIS DE REGRESION PARA RECUENTO LACTOBACILOS PARA DEBIDA CON AVENA
Aruilisis de regresion - Modelo lineal Y = a + hX
Variable Dependiente LactobacillusConAvena Variable Independiente Dia ---~--------------------------------------------------------__-----------__--_--_-----------shy
Error T Paramctro Estimado Standard Estadistico P-Valor -~--------------------------------------------------------------------------------------------------
Irttercepto 118103 0567963 207942 00000 Pendiente 00790304 00375594 210414 00616
-----------------~----------------------------~----~-------~----~----------------------------
Analisis de Varianza
----------------~----------------~------------------~--------------------------~------~--------shySource Swn de cuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor
-----------------~--~--------------------------------------------------------------------------~---~ Mode10 244835 1 244835 443 00616 Residual 552997 10 0552997
Total (Corr)797832 11
Coeficiente Correlacion = 0553964 RI2 = 306875 percent
-----~--------------------------------------------------------~--------------------------------------
LactobacillusConAvena = 118103 + 00790304Dfas
77
ANEXO A RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AlSLADA DE i
PEPINO it
Referencia Pepino 1 Fecha 06122002
IEXCELENTE IDENTIFICACION
Latto plantarum 1
Galeria API 50 CHL V50 Leida el 06122002
Perfil - -- - ++ - -- - ++++ - - -+- + - I I I I I I I I +t+ - +f- ~ - - + + ~ - - - +- + - shy
o - GLY - ERY DARA - LARA + RIB + DXYL - LXYL - ADO - MDX - GAL + GLU + FRU + MNE + SBE - RHA - DUL - INO bull MAN + SOR - MDM + MUG shyNAG + AMY + ARB + ESC + SAL + CEL + MAL + LAC + MEL + SAC + TRE + 1NU - MLZ + RAF + AMD - GLYG - XLT - GEN + TIJR + LYX - TAG - DFUC shyLFUC - DARL + LARL - aNT + 2KG - 5KG shy
--- Taxones significativos rd -----T -- Tests en contra
Lactoplantarum 1 999 092 1
Taxon siguiente Lactobrevis 1 OJ 044 3
i i
Lactoplantarum 1 1 test (5) en contra
D-SORBITOL (SOR) 78
Tax6n siguiente Lactobrevis 1 3 test (s) ert contra
METHYLD-MANNOSIDE (MOlM) 0 MELEZITOSE (MLZ) 14 D-TURANOSE (TUR) 14
67
ampb
ANEXO B RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AISLADA DE REPOLLO FERMENTADO
~
Referencia Repollo fermentado - 3 Fecha 03072003
EXCELENTE IDENTIFICACION
Lactoplantarum 1
Galena API 50 CRL V50 Leida el 03072003
Perfil - - ++ - - - - -H++ - - ~ + - + - I I 1 I I I I -H+ - ++ - - - + + - -- - - + - shy
o - GLY - ERY - DARA - LARA + RIB + DXYL - LXYL - ADO ~ MDX - GAL + GLU + FRU + MNE + SBE ~ RHA - DUL - INO - MAN + SOR - MDM + MDG shyNAG + AMY + ARR + ESC + SAT + CRL + MAL + LAC + MEL + SAC + TRE + lNU - MLZ + RAF + AMI) - GLYG - XLT - GEN + TOR + LYX - TAG - DFUC shyLFUC - DARL - LARL - GNT + 2KG - 5KG shy
------Taxones significativos _ _----- Id--- ---T---- Tests en contra
Lactoplantarum 1 999 095 1
Tax6n siguiente Lactobrevis 1 01 OA8 3
lJactoplantaru01 1 1 test (s) en contra
DSORBITOL (SOR) 78
Taxon siguiente Lactobrevis
METHYL-D-MANNOSIDE D-TURANOSE
1
(MOM) (TOR)
3 test (5) en contra
0 MELEZITOSE 14
(MLZ) 14
i
I
68
ANEXO C RESULTADO PRUEBAS BIOQUWICAS DE CEPA AISLADA DE MUCOSA HUMANA
Referenda Mucosa - 5 Fecha 27012003
BUENA IDENTlFICACION
Galeria API 50 CHL vso Leida el 270112003
Perfil - - - - +t--t - - - + - + - - - - - - - - -+- - - - - + - + - - - - - - - - - - - - - bull - - -+ - +
o - GLY ~ ERY - DARA bull LARA + RID + DXYL + LXYL - ADO bull MDX - GAL + OLU - FRU + MNE - SBE - IlliA - DUL - INa - MAN - SOR - MDM - MOO shyNAG + AMY - ARB - ESC ~ SAL bull CEL - MAL + lAC - MEL + SAC - TRE shyINU - MLZ - RAF - AMD - GLYG - XLT - GEN - 11JR - LYX - TAG - DFUC shyLFUC - DARL - IARL - ONT + 2KO - 5KG +
- - - - - - Taxones significativos - - - - - - - Id T -- Test en contra
Lactobrevis 3 963 088 1
Taxon siguiente Lactoco11inoides 36 075 2
Lactobrevis 3 1 test (s) en contra
GLUCOSE (GLU) 95
-~~~------------~---------------------------~--~-------~--~-----~----------~--------~------------~~--Taxon siguiente Lactocollinoides 2 test (s) en contra
GLUCOSE (GLU) 100 MELIBIOSE (MEL) 25
69
i r
ANEXO D RESULTADO PRUEBAS BIOQIJiMICAS DE CEPA AISLADA DE LECHE FERMENTADA
Referenda Leche fennentada ~ 13 Fecha 27012003
BUENA IDENTIFICACI6N
Galeria API 50 CHL V50 Leida el 270112003
Perfil - - - - -t-t+- - - - + - + - - - bull - - - - -+- - - - - + - + - - - - - - - - - - - - - - - - -+ - +
0 - GLY - ERY - DARA - LARA +Rll3 + DXYL + LXYL - ADO - MDX ~GAL + GLU - FRU + MNE SBE - RHA DUL bull INO MAN - SOR MDM bull MDG shy
~NAG + AMY - ARB - ESC - SAL - CEL - MAL + LAC - MEL + SAC - TRE I lNU - MLZ - RAF - AMD - GLYG - XLT - OEN - IUR LYX - TAG - DFUC bull i
LFUC - DARL - LARL -ONr + 2KG - SKO + 1
- -- - - Taxones significativos - - Id -- T --- Test en contra
Lacta brevis 3 963 088 1
Taxon siguiente Lactocollinoides 36 075 2
Lactobrevis 3 1 test (s) en contra
GLUCOSE (GLU) 95
-----------------------------------------------------------~------------------------------~-------------------Taxon siguiente Lactocollinoides 2 test (s) en contra
GLUCOSE (GLD) 100 MELffiIOSE (MEL) 25
70
II iJ1
I
I ANEXO E RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AISLADA DE REPOLLITAS DE BRUSELAS FERMENTADA
Referencia repollitas de bruselas 15 Fecha 03072003
EXCELENTE IDENTIFICACION
Lactoplantarum 1
Galeria API 50 CHL vsO Leida el 03072003
Perfil - - - - +t - - - - +H+ - +- - +t + - I I I I I I I f ++t - + - - - -+ + - - - -+ -+ - - I ij
o - GLY - ERY - DARA - LARA + RJB + DXYL - LXYL - ADO - MDX - GAL +
GLU + FRU + MNE + SBE RHA + DUL - INO - MAN + SOR + MDM + MOG shyNAG + AMY + ARB + ESC + SAL + eEL + MAL + LAC + MEl + SAC + TRE + i
I1NU - MLZ + RAF AMD GLYG - XLT - aEN + TUR + LYX - TAG - Druc LFUC - DARt + LARL - aNT + 2KG - 5KG shy n ----Taxones significativos ------ Id Tests en contra
Lactoplantarum 1 999 090 o
Taxon siguiente Lacto pentosus 01 012 7
Lactoplantarum 1 o test (s) en contra
Taxon siguiente Lacto pentosus 7 test (8) en contra
GLYCEROL (GLY) 75 D-XYLOSE (DXYL) 100 L-RHAMNOSE (RHA) 25 METHYL-D-MANNOSIDE (MOM) 1 MELEZITOSE (MLZ) 25 RAFFINOSE (RAF) 75 D-ARABITOL (DARL) 0
71
~
I i I
ANEXO F - ANALISIS DE REGRESION PARA pH EN BEBIDA SIN AVENA
Aruilisis de regresi6n polinomial
---~-~-------------------------------------------~-----------~~---------------------~--------------Variable dependiente pHSinAvena ---------------------------~-------------~--------------------~---------------------------------
Error T Parametro Estimado Estandar Estadistico P-Valor
CONSTANTE 535606 0094535 56657 00000 Dia -0150565 0020706 727154 00000 Dia2 000504434 0000871488 578819 00001
---~---------------------------------------------------------------------------------------------------
Anfllisis de Variama -------------------------------------------~-----------~-----------------------------~-~--- jSource Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor 11
------------------------~------------------------------------------------------------------------------~ Mod-elo 155772 2 0118861 4256 00000 Residual 0237877 13 00182983
Total (Corr) 11956 IS
R2 == 867522 percent
pHSinAvena == 535606 - 0150565Dia + 000504434Dia2
72
____
middot ANEXO G - ANALISIS DE REGRESION PARA pH EN BEBIDA CON AVENA
AmUisis de regresion polinomial _____~_____~__-_____~___4____________________bull____bull__________bull_____________~~----_------___________
Variable depcndiente pHConA vena ------------------------------------------------------------------------------------------~--------
Error T Parametro Estimado StAndar Estadfstico P-Valor
---------------------------------------------~-----------------------------------------------_---------CONSTANTE 534463 00801045 667208 00000 Dia -0140407 00175453 800253 00000 DiaA 2 000448098 0000738458 606803 00000
----------------------~---~-----------------------------~------------------------------~----AmUisis de Varianza
---~---------------------------------~---------------------~------------~-------------------~------Source Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio PValor --------------------------~-----------------------------------------------~------------~-----~~--~ ModeJo 159575 2 0797873 6073 00000 Residual 02170798 middot13 00131383 _______~_~ ~_~----------~------~--~-----~-M-----~-----____ _____________~-----------------------Total (COlT) 176654 15
R12 903315 percent
-----------~------------------------------------------------------------------------~-----------pHConAvena 534463 - 0140407Dia + 000448098DfaA 2
73
ANEXO H - ANALTSIS DE REGRESTON PARA ACIDEZ EN BEBJDA SIN AVENA
An8Jisis de Regtesi6fi P6lifJomial
Variable Depefidiefile~ AcidezSinAVenll _______________w_____~______~________________~-----------_________~_________________~~____~___~_____
Error T Pariirnetro Estimado Estandar Estadistico ---------------------------------------~--------------~-~-------~--------------------~------------CONSTANT 0491697 00123217 399051 00000 Dia 00436032 000269882 161564 00000 D1a2 -000144613 000011359 127312 00000 __w___~________________________~-_______-_____~----____________________________~__~---~_--__~___
AriiiJisis de varianza ~_~__~__________~_~____~________~___________- _________e_____________________________bull _____-________
Source Smn de cuadr Df Mean Square F-Ratio PmiddotValor_~~___________________________________bull ______~___________bull ____________bull ______~________w________________
Model 0135203 2 00676013 21747 00000 Residual 000404118 13 000031086
Total (Corr) 0139244 15
R2 970978 percent
AcidezSlnAvena 0491697 + O0436032Dia - 0OOl44613Dia2
74
I
ANEXO I ANALISIS DE REGRESION PARA ACIDEZ EN BEBIDA CON AVENA
1
Anwisis de tegtesi6fi polinomial
Variable dependiente Acidez Con Avena
Error T ParametTo Estimado Stlindar Estadfstico P-Valor ----------------~-------~---------------------~-----------------------------------------------------CONSTANT 0491639 000926607 530578 00000 Diamiddot 00406572 000202955 200326 00000 DfaA 2 0000982559 0000085421 -115025 00000
-------------~----------------------------~-------------------------~-----------------------------------
-------------~-----~~-----------------------------~---------------------------------------------_--Source Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio PValor
-~-------------~----------------------------------~------------------~~-------------------------- Modelo 0288008 2 0144004 81914 00000 Residual 000228539 13 0000175799
----------~~--------------~---------------------------------------------~---------------------------Total (Corr) 0290294 15
RA2 = 992127 percent
-------------------------~----~---~------------~---------------------------------~---------------~
AcidezConAvena == 049163amp + 00406572D1a - 0000982559DiaA2
75
I
(Ilmiddot il
ANEXO J- ANALISIS DE REGRESION PARA RECUENTO LACTOBACILOS PARA BEBIDA SIN AVENA
Amilisis de regresion - Modelo lineal Y = a + bX
------------------------~----------------------~-----------------------------~----------~-----------Variable Dcpendiente LactobacilJusSinAvena Variable independiente Dia
I--------~----------~-----------------------------------~-------~-~--~--------------------------~-Error T
Paramctro Estimado Standard Stadistico P-Valor
----~----~------------~-----~-----------------------~-------------~-----------------------------Intereepto 117347 0389973 300911 00000 Pendiente 00483464 00257889 18747 00903
Analisis de Varianza
---------~------------------~----------------~---------------------------------~---------~----------Source Sum decuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor
------------~---------------------~---------------------~--------------------------------~-----~----Modelo 0916252 1 244835 443 00616 Residual 260706 10 0260706
--~------------~---~------------------~~~-----~-------~---------~~-------------------------------------Total (Corr)352332 11
Coeficiente Correlaci6n = 0509955 R2 = 260054 percent
LactobacillusSinAvena= 117347 + 00483464Dfa
76
ANEXO K- ANALTSIS DE REGRESION PARA RECUENTO LACTOBACILOS PARA DEBIDA CON AVENA
Aruilisis de regresion - Modelo lineal Y = a + hX
Variable Dependiente LactobacillusConAvena Variable Independiente Dia ---~--------------------------------------------------------__-----------__--_--_-----------shy
Error T Paramctro Estimado Standard Estadistico P-Valor -~--------------------------------------------------------------------------------------------------
Irttercepto 118103 0567963 207942 00000 Pendiente 00790304 00375594 210414 00616
-----------------~----------------------------~----~-------~----~----------------------------
Analisis de Varianza
----------------~----------------~------------------~--------------------------~------~--------shySource Swn de cuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor
-----------------~--~--------------------------------------------------------------------------~---~ Mode10 244835 1 244835 443 00616 Residual 552997 10 0552997
Total (Corr)797832 11
Coeficiente Correlacion = 0553964 RI2 = 306875 percent
-----~--------------------------------------------------------~--------------------------------------
LactobacillusConAvena = 118103 + 00790304Dfas
77
ampb
ANEXO B RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AISLADA DE REPOLLO FERMENTADO
~
Referencia Repollo fermentado - 3 Fecha 03072003
EXCELENTE IDENTIFICACION
Lactoplantarum 1
Galena API 50 CRL V50 Leida el 03072003
Perfil - - ++ - - - - -H++ - - ~ + - + - I I 1 I I I I -H+ - ++ - - - + + - -- - - + - shy
o - GLY - ERY - DARA - LARA + RIB + DXYL - LXYL - ADO ~ MDX - GAL + GLU + FRU + MNE + SBE ~ RHA - DUL - INO - MAN + SOR - MDM + MDG shyNAG + AMY + ARR + ESC + SAT + CRL + MAL + LAC + MEL + SAC + TRE + lNU - MLZ + RAF + AMI) - GLYG - XLT - GEN + TOR + LYX - TAG - DFUC shyLFUC - DARL - LARL - GNT + 2KG - 5KG shy
------Taxones significativos _ _----- Id--- ---T---- Tests en contra
Lactoplantarum 1 999 095 1
Tax6n siguiente Lactobrevis 1 01 OA8 3
lJactoplantaru01 1 1 test (s) en contra
DSORBITOL (SOR) 78
Taxon siguiente Lactobrevis
METHYL-D-MANNOSIDE D-TURANOSE
1
(MOM) (TOR)
3 test (5) en contra
0 MELEZITOSE 14
(MLZ) 14
i
I
68
ANEXO C RESULTADO PRUEBAS BIOQUWICAS DE CEPA AISLADA DE MUCOSA HUMANA
Referenda Mucosa - 5 Fecha 27012003
BUENA IDENTlFICACION
Galeria API 50 CHL vso Leida el 270112003
Perfil - - - - +t--t - - - + - + - - - - - - - - -+- - - - - + - + - - - - - - - - - - - - - bull - - -+ - +
o - GLY ~ ERY - DARA bull LARA + RID + DXYL + LXYL - ADO bull MDX - GAL + OLU - FRU + MNE - SBE - IlliA - DUL - INa - MAN - SOR - MDM - MOO shyNAG + AMY - ARB - ESC ~ SAL bull CEL - MAL + lAC - MEL + SAC - TRE shyINU - MLZ - RAF - AMD - GLYG - XLT - GEN - 11JR - LYX - TAG - DFUC shyLFUC - DARL - IARL - ONT + 2KO - 5KG +
- - - - - - Taxones significativos - - - - - - - Id T -- Test en contra
Lactobrevis 3 963 088 1
Taxon siguiente Lactoco11inoides 36 075 2
Lactobrevis 3 1 test (s) en contra
GLUCOSE (GLU) 95
-~~~------------~---------------------------~--~-------~--~-----~----------~--------~------------~~--Taxon siguiente Lactocollinoides 2 test (s) en contra
GLUCOSE (GLU) 100 MELIBIOSE (MEL) 25
69
i r
ANEXO D RESULTADO PRUEBAS BIOQIJiMICAS DE CEPA AISLADA DE LECHE FERMENTADA
Referenda Leche fennentada ~ 13 Fecha 27012003
BUENA IDENTIFICACI6N
Galeria API 50 CHL V50 Leida el 270112003
Perfil - - - - -t-t+- - - - + - + - - - bull - - - - -+- - - - - + - + - - - - - - - - - - - - - - - - -+ - +
0 - GLY - ERY - DARA - LARA +Rll3 + DXYL + LXYL - ADO - MDX ~GAL + GLU - FRU + MNE SBE - RHA DUL bull INO MAN - SOR MDM bull MDG shy
~NAG + AMY - ARB - ESC - SAL - CEL - MAL + LAC - MEL + SAC - TRE I lNU - MLZ - RAF - AMD - GLYG - XLT - OEN - IUR LYX - TAG - DFUC bull i
LFUC - DARL - LARL -ONr + 2KG - SKO + 1
- -- - - Taxones significativos - - Id -- T --- Test en contra
Lacta brevis 3 963 088 1
Taxon siguiente Lactocollinoides 36 075 2
Lactobrevis 3 1 test (s) en contra
GLUCOSE (GLU) 95
-----------------------------------------------------------~------------------------------~-------------------Taxon siguiente Lactocollinoides 2 test (s) en contra
GLUCOSE (GLD) 100 MELffiIOSE (MEL) 25
70
II iJ1
I
I ANEXO E RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AISLADA DE REPOLLITAS DE BRUSELAS FERMENTADA
Referencia repollitas de bruselas 15 Fecha 03072003
EXCELENTE IDENTIFICACION
Lactoplantarum 1
Galeria API 50 CHL vsO Leida el 03072003
Perfil - - - - +t - - - - +H+ - +- - +t + - I I I I I I I f ++t - + - - - -+ + - - - -+ -+ - - I ij
o - GLY - ERY - DARA - LARA + RJB + DXYL - LXYL - ADO - MDX - GAL +
GLU + FRU + MNE + SBE RHA + DUL - INO - MAN + SOR + MDM + MOG shyNAG + AMY + ARB + ESC + SAL + eEL + MAL + LAC + MEl + SAC + TRE + i
I1NU - MLZ + RAF AMD GLYG - XLT - aEN + TUR + LYX - TAG - Druc LFUC - DARt + LARL - aNT + 2KG - 5KG shy n ----Taxones significativos ------ Id Tests en contra
Lactoplantarum 1 999 090 o
Taxon siguiente Lacto pentosus 01 012 7
Lactoplantarum 1 o test (s) en contra
Taxon siguiente Lacto pentosus 7 test (8) en contra
GLYCEROL (GLY) 75 D-XYLOSE (DXYL) 100 L-RHAMNOSE (RHA) 25 METHYL-D-MANNOSIDE (MOM) 1 MELEZITOSE (MLZ) 25 RAFFINOSE (RAF) 75 D-ARABITOL (DARL) 0
71
~
I i I
ANEXO F - ANALISIS DE REGRESION PARA pH EN BEBIDA SIN AVENA
Aruilisis de regresi6n polinomial
---~-~-------------------------------------------~-----------~~---------------------~--------------Variable dependiente pHSinAvena ---------------------------~-------------~--------------------~---------------------------------
Error T Parametro Estimado Estandar Estadistico P-Valor
CONSTANTE 535606 0094535 56657 00000 Dia -0150565 0020706 727154 00000 Dia2 000504434 0000871488 578819 00001
---~---------------------------------------------------------------------------------------------------
Anfllisis de Variama -------------------------------------------~-----------~-----------------------------~-~--- jSource Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor 11
------------------------~------------------------------------------------------------------------------~ Mod-elo 155772 2 0118861 4256 00000 Residual 0237877 13 00182983
Total (Corr) 11956 IS
R2 == 867522 percent
pHSinAvena == 535606 - 0150565Dia + 000504434Dia2
72
____
middot ANEXO G - ANALISIS DE REGRESION PARA pH EN BEBIDA CON AVENA
AmUisis de regresion polinomial _____~_____~__-_____~___4____________________bull____bull__________bull_____________~~----_------___________
Variable depcndiente pHConA vena ------------------------------------------------------------------------------------------~--------
Error T Parametro Estimado StAndar Estadfstico P-Valor
---------------------------------------------~-----------------------------------------------_---------CONSTANTE 534463 00801045 667208 00000 Dia -0140407 00175453 800253 00000 DiaA 2 000448098 0000738458 606803 00000
----------------------~---~-----------------------------~------------------------------~----AmUisis de Varianza
---~---------------------------------~---------------------~------------~-------------------~------Source Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio PValor --------------------------~-----------------------------------------------~------------~-----~~--~ ModeJo 159575 2 0797873 6073 00000 Residual 02170798 middot13 00131383 _______~_~ ~_~----------~------~--~-----~-M-----~-----____ _____________~-----------------------Total (COlT) 176654 15
R12 903315 percent
-----------~------------------------------------------------------------------------~-----------pHConAvena 534463 - 0140407Dia + 000448098DfaA 2
73
ANEXO H - ANALTSIS DE REGRESTON PARA ACIDEZ EN BEBJDA SIN AVENA
An8Jisis de Regtesi6fi P6lifJomial
Variable Depefidiefile~ AcidezSinAVenll _______________w_____~______~________________~-----------_________~_________________~~____~___~_____
Error T Pariirnetro Estimado Estandar Estadistico ---------------------------------------~--------------~-~-------~--------------------~------------CONSTANT 0491697 00123217 399051 00000 Dia 00436032 000269882 161564 00000 D1a2 -000144613 000011359 127312 00000 __w___~________________________~-_______-_____~----____________________________~__~---~_--__~___
AriiiJisis de varianza ~_~__~__________~_~____~________~___________- _________e_____________________________bull _____-________
Source Smn de cuadr Df Mean Square F-Ratio PmiddotValor_~~___________________________________bull ______~___________bull ____________bull ______~________w________________
Model 0135203 2 00676013 21747 00000 Residual 000404118 13 000031086
Total (Corr) 0139244 15
R2 970978 percent
AcidezSlnAvena 0491697 + O0436032Dia - 0OOl44613Dia2
74
I
ANEXO I ANALISIS DE REGRESION PARA ACIDEZ EN BEBIDA CON AVENA
1
Anwisis de tegtesi6fi polinomial
Variable dependiente Acidez Con Avena
Error T ParametTo Estimado Stlindar Estadfstico P-Valor ----------------~-------~---------------------~-----------------------------------------------------CONSTANT 0491639 000926607 530578 00000 Diamiddot 00406572 000202955 200326 00000 DfaA 2 0000982559 0000085421 -115025 00000
-------------~----------------------------~-------------------------~-----------------------------------
-------------~-----~~-----------------------------~---------------------------------------------_--Source Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio PValor
-~-------------~----------------------------------~------------------~~-------------------------- Modelo 0288008 2 0144004 81914 00000 Residual 000228539 13 0000175799
----------~~--------------~---------------------------------------------~---------------------------Total (Corr) 0290294 15
RA2 = 992127 percent
-------------------------~----~---~------------~---------------------------------~---------------~
AcidezConAvena == 049163amp + 00406572D1a - 0000982559DiaA2
75
I
(Ilmiddot il
ANEXO J- ANALISIS DE REGRESION PARA RECUENTO LACTOBACILOS PARA BEBIDA SIN AVENA
Amilisis de regresion - Modelo lineal Y = a + bX
------------------------~----------------------~-----------------------------~----------~-----------Variable Dcpendiente LactobacilJusSinAvena Variable independiente Dia
I--------~----------~-----------------------------------~-------~-~--~--------------------------~-Error T
Paramctro Estimado Standard Stadistico P-Valor
----~----~------------~-----~-----------------------~-------------~-----------------------------Intereepto 117347 0389973 300911 00000 Pendiente 00483464 00257889 18747 00903
Analisis de Varianza
---------~------------------~----------------~---------------------------------~---------~----------Source Sum decuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor
------------~---------------------~---------------------~--------------------------------~-----~----Modelo 0916252 1 244835 443 00616 Residual 260706 10 0260706
--~------------~---~------------------~~~-----~-------~---------~~-------------------------------------Total (Corr)352332 11
Coeficiente Correlaci6n = 0509955 R2 = 260054 percent
LactobacillusSinAvena= 117347 + 00483464Dfa
76
ANEXO K- ANALTSIS DE REGRESION PARA RECUENTO LACTOBACILOS PARA DEBIDA CON AVENA
Aruilisis de regresion - Modelo lineal Y = a + hX
Variable Dependiente LactobacillusConAvena Variable Independiente Dia ---~--------------------------------------------------------__-----------__--_--_-----------shy
Error T Paramctro Estimado Standard Estadistico P-Valor -~--------------------------------------------------------------------------------------------------
Irttercepto 118103 0567963 207942 00000 Pendiente 00790304 00375594 210414 00616
-----------------~----------------------------~----~-------~----~----------------------------
Analisis de Varianza
----------------~----------------~------------------~--------------------------~------~--------shySource Swn de cuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor
-----------------~--~--------------------------------------------------------------------------~---~ Mode10 244835 1 244835 443 00616 Residual 552997 10 0552997
Total (Corr)797832 11
Coeficiente Correlacion = 0553964 RI2 = 306875 percent
-----~--------------------------------------------------------~--------------------------------------
LactobacillusConAvena = 118103 + 00790304Dfas
77
ANEXO C RESULTADO PRUEBAS BIOQUWICAS DE CEPA AISLADA DE MUCOSA HUMANA
Referenda Mucosa - 5 Fecha 27012003
BUENA IDENTlFICACION
Galeria API 50 CHL vso Leida el 270112003
Perfil - - - - +t--t - - - + - + - - - - - - - - -+- - - - - + - + - - - - - - - - - - - - - bull - - -+ - +
o - GLY ~ ERY - DARA bull LARA + RID + DXYL + LXYL - ADO bull MDX - GAL + OLU - FRU + MNE - SBE - IlliA - DUL - INa - MAN - SOR - MDM - MOO shyNAG + AMY - ARB - ESC ~ SAL bull CEL - MAL + lAC - MEL + SAC - TRE shyINU - MLZ - RAF - AMD - GLYG - XLT - GEN - 11JR - LYX - TAG - DFUC shyLFUC - DARL - IARL - ONT + 2KO - 5KG +
- - - - - - Taxones significativos - - - - - - - Id T -- Test en contra
Lactobrevis 3 963 088 1
Taxon siguiente Lactoco11inoides 36 075 2
Lactobrevis 3 1 test (s) en contra
GLUCOSE (GLU) 95
-~~~------------~---------------------------~--~-------~--~-----~----------~--------~------------~~--Taxon siguiente Lactocollinoides 2 test (s) en contra
GLUCOSE (GLU) 100 MELIBIOSE (MEL) 25
69
i r
ANEXO D RESULTADO PRUEBAS BIOQIJiMICAS DE CEPA AISLADA DE LECHE FERMENTADA
Referenda Leche fennentada ~ 13 Fecha 27012003
BUENA IDENTIFICACI6N
Galeria API 50 CHL V50 Leida el 270112003
Perfil - - - - -t-t+- - - - + - + - - - bull - - - - -+- - - - - + - + - - - - - - - - - - - - - - - - -+ - +
0 - GLY - ERY - DARA - LARA +Rll3 + DXYL + LXYL - ADO - MDX ~GAL + GLU - FRU + MNE SBE - RHA DUL bull INO MAN - SOR MDM bull MDG shy
~NAG + AMY - ARB - ESC - SAL - CEL - MAL + LAC - MEL + SAC - TRE I lNU - MLZ - RAF - AMD - GLYG - XLT - OEN - IUR LYX - TAG - DFUC bull i
LFUC - DARL - LARL -ONr + 2KG - SKO + 1
- -- - - Taxones significativos - - Id -- T --- Test en contra
Lacta brevis 3 963 088 1
Taxon siguiente Lactocollinoides 36 075 2
Lactobrevis 3 1 test (s) en contra
GLUCOSE (GLU) 95
-----------------------------------------------------------~------------------------------~-------------------Taxon siguiente Lactocollinoides 2 test (s) en contra
GLUCOSE (GLD) 100 MELffiIOSE (MEL) 25
70
II iJ1
I
I ANEXO E RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AISLADA DE REPOLLITAS DE BRUSELAS FERMENTADA
Referencia repollitas de bruselas 15 Fecha 03072003
EXCELENTE IDENTIFICACION
Lactoplantarum 1
Galeria API 50 CHL vsO Leida el 03072003
Perfil - - - - +t - - - - +H+ - +- - +t + - I I I I I I I f ++t - + - - - -+ + - - - -+ -+ - - I ij
o - GLY - ERY - DARA - LARA + RJB + DXYL - LXYL - ADO - MDX - GAL +
GLU + FRU + MNE + SBE RHA + DUL - INO - MAN + SOR + MDM + MOG shyNAG + AMY + ARB + ESC + SAL + eEL + MAL + LAC + MEl + SAC + TRE + i
I1NU - MLZ + RAF AMD GLYG - XLT - aEN + TUR + LYX - TAG - Druc LFUC - DARt + LARL - aNT + 2KG - 5KG shy n ----Taxones significativos ------ Id Tests en contra
Lactoplantarum 1 999 090 o
Taxon siguiente Lacto pentosus 01 012 7
Lactoplantarum 1 o test (s) en contra
Taxon siguiente Lacto pentosus 7 test (8) en contra
GLYCEROL (GLY) 75 D-XYLOSE (DXYL) 100 L-RHAMNOSE (RHA) 25 METHYL-D-MANNOSIDE (MOM) 1 MELEZITOSE (MLZ) 25 RAFFINOSE (RAF) 75 D-ARABITOL (DARL) 0
71
~
I i I
ANEXO F - ANALISIS DE REGRESION PARA pH EN BEBIDA SIN AVENA
Aruilisis de regresi6n polinomial
---~-~-------------------------------------------~-----------~~---------------------~--------------Variable dependiente pHSinAvena ---------------------------~-------------~--------------------~---------------------------------
Error T Parametro Estimado Estandar Estadistico P-Valor
CONSTANTE 535606 0094535 56657 00000 Dia -0150565 0020706 727154 00000 Dia2 000504434 0000871488 578819 00001
---~---------------------------------------------------------------------------------------------------
Anfllisis de Variama -------------------------------------------~-----------~-----------------------------~-~--- jSource Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor 11
------------------------~------------------------------------------------------------------------------~ Mod-elo 155772 2 0118861 4256 00000 Residual 0237877 13 00182983
Total (Corr) 11956 IS
R2 == 867522 percent
pHSinAvena == 535606 - 0150565Dia + 000504434Dia2
72
____
middot ANEXO G - ANALISIS DE REGRESION PARA pH EN BEBIDA CON AVENA
AmUisis de regresion polinomial _____~_____~__-_____~___4____________________bull____bull__________bull_____________~~----_------___________
Variable depcndiente pHConA vena ------------------------------------------------------------------------------------------~--------
Error T Parametro Estimado StAndar Estadfstico P-Valor
---------------------------------------------~-----------------------------------------------_---------CONSTANTE 534463 00801045 667208 00000 Dia -0140407 00175453 800253 00000 DiaA 2 000448098 0000738458 606803 00000
----------------------~---~-----------------------------~------------------------------~----AmUisis de Varianza
---~---------------------------------~---------------------~------------~-------------------~------Source Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio PValor --------------------------~-----------------------------------------------~------------~-----~~--~ ModeJo 159575 2 0797873 6073 00000 Residual 02170798 middot13 00131383 _______~_~ ~_~----------~------~--~-----~-M-----~-----____ _____________~-----------------------Total (COlT) 176654 15
R12 903315 percent
-----------~------------------------------------------------------------------------~-----------pHConAvena 534463 - 0140407Dia + 000448098DfaA 2
73
ANEXO H - ANALTSIS DE REGRESTON PARA ACIDEZ EN BEBJDA SIN AVENA
An8Jisis de Regtesi6fi P6lifJomial
Variable Depefidiefile~ AcidezSinAVenll _______________w_____~______~________________~-----------_________~_________________~~____~___~_____
Error T Pariirnetro Estimado Estandar Estadistico ---------------------------------------~--------------~-~-------~--------------------~------------CONSTANT 0491697 00123217 399051 00000 Dia 00436032 000269882 161564 00000 D1a2 -000144613 000011359 127312 00000 __w___~________________________~-_______-_____~----____________________________~__~---~_--__~___
AriiiJisis de varianza ~_~__~__________~_~____~________~___________- _________e_____________________________bull _____-________
Source Smn de cuadr Df Mean Square F-Ratio PmiddotValor_~~___________________________________bull ______~___________bull ____________bull ______~________w________________
Model 0135203 2 00676013 21747 00000 Residual 000404118 13 000031086
Total (Corr) 0139244 15
R2 970978 percent
AcidezSlnAvena 0491697 + O0436032Dia - 0OOl44613Dia2
74
I
ANEXO I ANALISIS DE REGRESION PARA ACIDEZ EN BEBIDA CON AVENA
1
Anwisis de tegtesi6fi polinomial
Variable dependiente Acidez Con Avena
Error T ParametTo Estimado Stlindar Estadfstico P-Valor ----------------~-------~---------------------~-----------------------------------------------------CONSTANT 0491639 000926607 530578 00000 Diamiddot 00406572 000202955 200326 00000 DfaA 2 0000982559 0000085421 -115025 00000
-------------~----------------------------~-------------------------~-----------------------------------
-------------~-----~~-----------------------------~---------------------------------------------_--Source Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio PValor
-~-------------~----------------------------------~------------------~~-------------------------- Modelo 0288008 2 0144004 81914 00000 Residual 000228539 13 0000175799
----------~~--------------~---------------------------------------------~---------------------------Total (Corr) 0290294 15
RA2 = 992127 percent
-------------------------~----~---~------------~---------------------------------~---------------~
AcidezConAvena == 049163amp + 00406572D1a - 0000982559DiaA2
75
I
(Ilmiddot il
ANEXO J- ANALISIS DE REGRESION PARA RECUENTO LACTOBACILOS PARA BEBIDA SIN AVENA
Amilisis de regresion - Modelo lineal Y = a + bX
------------------------~----------------------~-----------------------------~----------~-----------Variable Dcpendiente LactobacilJusSinAvena Variable independiente Dia
I--------~----------~-----------------------------------~-------~-~--~--------------------------~-Error T
Paramctro Estimado Standard Stadistico P-Valor
----~----~------------~-----~-----------------------~-------------~-----------------------------Intereepto 117347 0389973 300911 00000 Pendiente 00483464 00257889 18747 00903
Analisis de Varianza
---------~------------------~----------------~---------------------------------~---------~----------Source Sum decuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor
------------~---------------------~---------------------~--------------------------------~-----~----Modelo 0916252 1 244835 443 00616 Residual 260706 10 0260706
--~------------~---~------------------~~~-----~-------~---------~~-------------------------------------Total (Corr)352332 11
Coeficiente Correlaci6n = 0509955 R2 = 260054 percent
LactobacillusSinAvena= 117347 + 00483464Dfa
76
ANEXO K- ANALTSIS DE REGRESION PARA RECUENTO LACTOBACILOS PARA DEBIDA CON AVENA
Aruilisis de regresion - Modelo lineal Y = a + hX
Variable Dependiente LactobacillusConAvena Variable Independiente Dia ---~--------------------------------------------------------__-----------__--_--_-----------shy
Error T Paramctro Estimado Standard Estadistico P-Valor -~--------------------------------------------------------------------------------------------------
Irttercepto 118103 0567963 207942 00000 Pendiente 00790304 00375594 210414 00616
-----------------~----------------------------~----~-------~----~----------------------------
Analisis de Varianza
----------------~----------------~------------------~--------------------------~------~--------shySource Swn de cuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor
-----------------~--~--------------------------------------------------------------------------~---~ Mode10 244835 1 244835 443 00616 Residual 552997 10 0552997
Total (Corr)797832 11
Coeficiente Correlacion = 0553964 RI2 = 306875 percent
-----~--------------------------------------------------------~--------------------------------------
LactobacillusConAvena = 118103 + 00790304Dfas
77
i r
ANEXO D RESULTADO PRUEBAS BIOQIJiMICAS DE CEPA AISLADA DE LECHE FERMENTADA
Referenda Leche fennentada ~ 13 Fecha 27012003
BUENA IDENTIFICACI6N
Galeria API 50 CHL V50 Leida el 270112003
Perfil - - - - -t-t+- - - - + - + - - - bull - - - - -+- - - - - + - + - - - - - - - - - - - - - - - - -+ - +
0 - GLY - ERY - DARA - LARA +Rll3 + DXYL + LXYL - ADO - MDX ~GAL + GLU - FRU + MNE SBE - RHA DUL bull INO MAN - SOR MDM bull MDG shy
~NAG + AMY - ARB - ESC - SAL - CEL - MAL + LAC - MEL + SAC - TRE I lNU - MLZ - RAF - AMD - GLYG - XLT - OEN - IUR LYX - TAG - DFUC bull i
LFUC - DARL - LARL -ONr + 2KG - SKO + 1
- -- - - Taxones significativos - - Id -- T --- Test en contra
Lacta brevis 3 963 088 1
Taxon siguiente Lactocollinoides 36 075 2
Lactobrevis 3 1 test (s) en contra
GLUCOSE (GLU) 95
-----------------------------------------------------------~------------------------------~-------------------Taxon siguiente Lactocollinoides 2 test (s) en contra
GLUCOSE (GLD) 100 MELffiIOSE (MEL) 25
70
II iJ1
I
I ANEXO E RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AISLADA DE REPOLLITAS DE BRUSELAS FERMENTADA
Referencia repollitas de bruselas 15 Fecha 03072003
EXCELENTE IDENTIFICACION
Lactoplantarum 1
Galeria API 50 CHL vsO Leida el 03072003
Perfil - - - - +t - - - - +H+ - +- - +t + - I I I I I I I f ++t - + - - - -+ + - - - -+ -+ - - I ij
o - GLY - ERY - DARA - LARA + RJB + DXYL - LXYL - ADO - MDX - GAL +
GLU + FRU + MNE + SBE RHA + DUL - INO - MAN + SOR + MDM + MOG shyNAG + AMY + ARB + ESC + SAL + eEL + MAL + LAC + MEl + SAC + TRE + i
I1NU - MLZ + RAF AMD GLYG - XLT - aEN + TUR + LYX - TAG - Druc LFUC - DARt + LARL - aNT + 2KG - 5KG shy n ----Taxones significativos ------ Id Tests en contra
Lactoplantarum 1 999 090 o
Taxon siguiente Lacto pentosus 01 012 7
Lactoplantarum 1 o test (s) en contra
Taxon siguiente Lacto pentosus 7 test (8) en contra
GLYCEROL (GLY) 75 D-XYLOSE (DXYL) 100 L-RHAMNOSE (RHA) 25 METHYL-D-MANNOSIDE (MOM) 1 MELEZITOSE (MLZ) 25 RAFFINOSE (RAF) 75 D-ARABITOL (DARL) 0
71
~
I i I
ANEXO F - ANALISIS DE REGRESION PARA pH EN BEBIDA SIN AVENA
Aruilisis de regresi6n polinomial
---~-~-------------------------------------------~-----------~~---------------------~--------------Variable dependiente pHSinAvena ---------------------------~-------------~--------------------~---------------------------------
Error T Parametro Estimado Estandar Estadistico P-Valor
CONSTANTE 535606 0094535 56657 00000 Dia -0150565 0020706 727154 00000 Dia2 000504434 0000871488 578819 00001
---~---------------------------------------------------------------------------------------------------
Anfllisis de Variama -------------------------------------------~-----------~-----------------------------~-~--- jSource Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor 11
------------------------~------------------------------------------------------------------------------~ Mod-elo 155772 2 0118861 4256 00000 Residual 0237877 13 00182983
Total (Corr) 11956 IS
R2 == 867522 percent
pHSinAvena == 535606 - 0150565Dia + 000504434Dia2
72
____
middot ANEXO G - ANALISIS DE REGRESION PARA pH EN BEBIDA CON AVENA
AmUisis de regresion polinomial _____~_____~__-_____~___4____________________bull____bull__________bull_____________~~----_------___________
Variable depcndiente pHConA vena ------------------------------------------------------------------------------------------~--------
Error T Parametro Estimado StAndar Estadfstico P-Valor
---------------------------------------------~-----------------------------------------------_---------CONSTANTE 534463 00801045 667208 00000 Dia -0140407 00175453 800253 00000 DiaA 2 000448098 0000738458 606803 00000
----------------------~---~-----------------------------~------------------------------~----AmUisis de Varianza
---~---------------------------------~---------------------~------------~-------------------~------Source Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio PValor --------------------------~-----------------------------------------------~------------~-----~~--~ ModeJo 159575 2 0797873 6073 00000 Residual 02170798 middot13 00131383 _______~_~ ~_~----------~------~--~-----~-M-----~-----____ _____________~-----------------------Total (COlT) 176654 15
R12 903315 percent
-----------~------------------------------------------------------------------------~-----------pHConAvena 534463 - 0140407Dia + 000448098DfaA 2
73
ANEXO H - ANALTSIS DE REGRESTON PARA ACIDEZ EN BEBJDA SIN AVENA
An8Jisis de Regtesi6fi P6lifJomial
Variable Depefidiefile~ AcidezSinAVenll _______________w_____~______~________________~-----------_________~_________________~~____~___~_____
Error T Pariirnetro Estimado Estandar Estadistico ---------------------------------------~--------------~-~-------~--------------------~------------CONSTANT 0491697 00123217 399051 00000 Dia 00436032 000269882 161564 00000 D1a2 -000144613 000011359 127312 00000 __w___~________________________~-_______-_____~----____________________________~__~---~_--__~___
AriiiJisis de varianza ~_~__~__________~_~____~________~___________- _________e_____________________________bull _____-________
Source Smn de cuadr Df Mean Square F-Ratio PmiddotValor_~~___________________________________bull ______~___________bull ____________bull ______~________w________________
Model 0135203 2 00676013 21747 00000 Residual 000404118 13 000031086
Total (Corr) 0139244 15
R2 970978 percent
AcidezSlnAvena 0491697 + O0436032Dia - 0OOl44613Dia2
74
I
ANEXO I ANALISIS DE REGRESION PARA ACIDEZ EN BEBIDA CON AVENA
1
Anwisis de tegtesi6fi polinomial
Variable dependiente Acidez Con Avena
Error T ParametTo Estimado Stlindar Estadfstico P-Valor ----------------~-------~---------------------~-----------------------------------------------------CONSTANT 0491639 000926607 530578 00000 Diamiddot 00406572 000202955 200326 00000 DfaA 2 0000982559 0000085421 -115025 00000
-------------~----------------------------~-------------------------~-----------------------------------
-------------~-----~~-----------------------------~---------------------------------------------_--Source Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio PValor
-~-------------~----------------------------------~------------------~~-------------------------- Modelo 0288008 2 0144004 81914 00000 Residual 000228539 13 0000175799
----------~~--------------~---------------------------------------------~---------------------------Total (Corr) 0290294 15
RA2 = 992127 percent
-------------------------~----~---~------------~---------------------------------~---------------~
AcidezConAvena == 049163amp + 00406572D1a - 0000982559DiaA2
75
I
(Ilmiddot il
ANEXO J- ANALISIS DE REGRESION PARA RECUENTO LACTOBACILOS PARA BEBIDA SIN AVENA
Amilisis de regresion - Modelo lineal Y = a + bX
------------------------~----------------------~-----------------------------~----------~-----------Variable Dcpendiente LactobacilJusSinAvena Variable independiente Dia
I--------~----------~-----------------------------------~-------~-~--~--------------------------~-Error T
Paramctro Estimado Standard Stadistico P-Valor
----~----~------------~-----~-----------------------~-------------~-----------------------------Intereepto 117347 0389973 300911 00000 Pendiente 00483464 00257889 18747 00903
Analisis de Varianza
---------~------------------~----------------~---------------------------------~---------~----------Source Sum decuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor
------------~---------------------~---------------------~--------------------------------~-----~----Modelo 0916252 1 244835 443 00616 Residual 260706 10 0260706
--~------------~---~------------------~~~-----~-------~---------~~-------------------------------------Total (Corr)352332 11
Coeficiente Correlaci6n = 0509955 R2 = 260054 percent
LactobacillusSinAvena= 117347 + 00483464Dfa
76
ANEXO K- ANALTSIS DE REGRESION PARA RECUENTO LACTOBACILOS PARA DEBIDA CON AVENA
Aruilisis de regresion - Modelo lineal Y = a + hX
Variable Dependiente LactobacillusConAvena Variable Independiente Dia ---~--------------------------------------------------------__-----------__--_--_-----------shy
Error T Paramctro Estimado Standard Estadistico P-Valor -~--------------------------------------------------------------------------------------------------
Irttercepto 118103 0567963 207942 00000 Pendiente 00790304 00375594 210414 00616
-----------------~----------------------------~----~-------~----~----------------------------
Analisis de Varianza
----------------~----------------~------------------~--------------------------~------~--------shySource Swn de cuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor
-----------------~--~--------------------------------------------------------------------------~---~ Mode10 244835 1 244835 443 00616 Residual 552997 10 0552997
Total (Corr)797832 11
Coeficiente Correlacion = 0553964 RI2 = 306875 percent
-----~--------------------------------------------------------~--------------------------------------
LactobacillusConAvena = 118103 + 00790304Dfas
77
II iJ1
I
I ANEXO E RESULTADO PRUEBAS BIOQUiMICAS DE CEPA AISLADA DE REPOLLITAS DE BRUSELAS FERMENTADA
Referencia repollitas de bruselas 15 Fecha 03072003
EXCELENTE IDENTIFICACION
Lactoplantarum 1
Galeria API 50 CHL vsO Leida el 03072003
Perfil - - - - +t - - - - +H+ - +- - +t + - I I I I I I I f ++t - + - - - -+ + - - - -+ -+ - - I ij
o - GLY - ERY - DARA - LARA + RJB + DXYL - LXYL - ADO - MDX - GAL +
GLU + FRU + MNE + SBE RHA + DUL - INO - MAN + SOR + MDM + MOG shyNAG + AMY + ARB + ESC + SAL + eEL + MAL + LAC + MEl + SAC + TRE + i
I1NU - MLZ + RAF AMD GLYG - XLT - aEN + TUR + LYX - TAG - Druc LFUC - DARt + LARL - aNT + 2KG - 5KG shy n ----Taxones significativos ------ Id Tests en contra
Lactoplantarum 1 999 090 o
Taxon siguiente Lacto pentosus 01 012 7
Lactoplantarum 1 o test (s) en contra
Taxon siguiente Lacto pentosus 7 test (8) en contra
GLYCEROL (GLY) 75 D-XYLOSE (DXYL) 100 L-RHAMNOSE (RHA) 25 METHYL-D-MANNOSIDE (MOM) 1 MELEZITOSE (MLZ) 25 RAFFINOSE (RAF) 75 D-ARABITOL (DARL) 0
71
~
I i I
ANEXO F - ANALISIS DE REGRESION PARA pH EN BEBIDA SIN AVENA
Aruilisis de regresi6n polinomial
---~-~-------------------------------------------~-----------~~---------------------~--------------Variable dependiente pHSinAvena ---------------------------~-------------~--------------------~---------------------------------
Error T Parametro Estimado Estandar Estadistico P-Valor
CONSTANTE 535606 0094535 56657 00000 Dia -0150565 0020706 727154 00000 Dia2 000504434 0000871488 578819 00001
---~---------------------------------------------------------------------------------------------------
Anfllisis de Variama -------------------------------------------~-----------~-----------------------------~-~--- jSource Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor 11
------------------------~------------------------------------------------------------------------------~ Mod-elo 155772 2 0118861 4256 00000 Residual 0237877 13 00182983
Total (Corr) 11956 IS
R2 == 867522 percent
pHSinAvena == 535606 - 0150565Dia + 000504434Dia2
72
____
middot ANEXO G - ANALISIS DE REGRESION PARA pH EN BEBIDA CON AVENA
AmUisis de regresion polinomial _____~_____~__-_____~___4____________________bull____bull__________bull_____________~~----_------___________
Variable depcndiente pHConA vena ------------------------------------------------------------------------------------------~--------
Error T Parametro Estimado StAndar Estadfstico P-Valor
---------------------------------------------~-----------------------------------------------_---------CONSTANTE 534463 00801045 667208 00000 Dia -0140407 00175453 800253 00000 DiaA 2 000448098 0000738458 606803 00000
----------------------~---~-----------------------------~------------------------------~----AmUisis de Varianza
---~---------------------------------~---------------------~------------~-------------------~------Source Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio PValor --------------------------~-----------------------------------------------~------------~-----~~--~ ModeJo 159575 2 0797873 6073 00000 Residual 02170798 middot13 00131383 _______~_~ ~_~----------~------~--~-----~-M-----~-----____ _____________~-----------------------Total (COlT) 176654 15
R12 903315 percent
-----------~------------------------------------------------------------------------~-----------pHConAvena 534463 - 0140407Dia + 000448098DfaA 2
73
ANEXO H - ANALTSIS DE REGRESTON PARA ACIDEZ EN BEBJDA SIN AVENA
An8Jisis de Regtesi6fi P6lifJomial
Variable Depefidiefile~ AcidezSinAVenll _______________w_____~______~________________~-----------_________~_________________~~____~___~_____
Error T Pariirnetro Estimado Estandar Estadistico ---------------------------------------~--------------~-~-------~--------------------~------------CONSTANT 0491697 00123217 399051 00000 Dia 00436032 000269882 161564 00000 D1a2 -000144613 000011359 127312 00000 __w___~________________________~-_______-_____~----____________________________~__~---~_--__~___
AriiiJisis de varianza ~_~__~__________~_~____~________~___________- _________e_____________________________bull _____-________
Source Smn de cuadr Df Mean Square F-Ratio PmiddotValor_~~___________________________________bull ______~___________bull ____________bull ______~________w________________
Model 0135203 2 00676013 21747 00000 Residual 000404118 13 000031086
Total (Corr) 0139244 15
R2 970978 percent
AcidezSlnAvena 0491697 + O0436032Dia - 0OOl44613Dia2
74
I
ANEXO I ANALISIS DE REGRESION PARA ACIDEZ EN BEBIDA CON AVENA
1
Anwisis de tegtesi6fi polinomial
Variable dependiente Acidez Con Avena
Error T ParametTo Estimado Stlindar Estadfstico P-Valor ----------------~-------~---------------------~-----------------------------------------------------CONSTANT 0491639 000926607 530578 00000 Diamiddot 00406572 000202955 200326 00000 DfaA 2 0000982559 0000085421 -115025 00000
-------------~----------------------------~-------------------------~-----------------------------------
-------------~-----~~-----------------------------~---------------------------------------------_--Source Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio PValor
-~-------------~----------------------------------~------------------~~-------------------------- Modelo 0288008 2 0144004 81914 00000 Residual 000228539 13 0000175799
----------~~--------------~---------------------------------------------~---------------------------Total (Corr) 0290294 15
RA2 = 992127 percent
-------------------------~----~---~------------~---------------------------------~---------------~
AcidezConAvena == 049163amp + 00406572D1a - 0000982559DiaA2
75
I
(Ilmiddot il
ANEXO J- ANALISIS DE REGRESION PARA RECUENTO LACTOBACILOS PARA BEBIDA SIN AVENA
Amilisis de regresion - Modelo lineal Y = a + bX
------------------------~----------------------~-----------------------------~----------~-----------Variable Dcpendiente LactobacilJusSinAvena Variable independiente Dia
I--------~----------~-----------------------------------~-------~-~--~--------------------------~-Error T
Paramctro Estimado Standard Stadistico P-Valor
----~----~------------~-----~-----------------------~-------------~-----------------------------Intereepto 117347 0389973 300911 00000 Pendiente 00483464 00257889 18747 00903
Analisis de Varianza
---------~------------------~----------------~---------------------------------~---------~----------Source Sum decuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor
------------~---------------------~---------------------~--------------------------------~-----~----Modelo 0916252 1 244835 443 00616 Residual 260706 10 0260706
--~------------~---~------------------~~~-----~-------~---------~~-------------------------------------Total (Corr)352332 11
Coeficiente Correlaci6n = 0509955 R2 = 260054 percent
LactobacillusSinAvena= 117347 + 00483464Dfa
76
ANEXO K- ANALTSIS DE REGRESION PARA RECUENTO LACTOBACILOS PARA DEBIDA CON AVENA
Aruilisis de regresion - Modelo lineal Y = a + hX
Variable Dependiente LactobacillusConAvena Variable Independiente Dia ---~--------------------------------------------------------__-----------__--_--_-----------shy
Error T Paramctro Estimado Standard Estadistico P-Valor -~--------------------------------------------------------------------------------------------------
Irttercepto 118103 0567963 207942 00000 Pendiente 00790304 00375594 210414 00616
-----------------~----------------------------~----~-------~----~----------------------------
Analisis de Varianza
----------------~----------------~------------------~--------------------------~------~--------shySource Swn de cuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor
-----------------~--~--------------------------------------------------------------------------~---~ Mode10 244835 1 244835 443 00616 Residual 552997 10 0552997
Total (Corr)797832 11
Coeficiente Correlacion = 0553964 RI2 = 306875 percent
-----~--------------------------------------------------------~--------------------------------------
LactobacillusConAvena = 118103 + 00790304Dfas
77
~
I i I
ANEXO F - ANALISIS DE REGRESION PARA pH EN BEBIDA SIN AVENA
Aruilisis de regresi6n polinomial
---~-~-------------------------------------------~-----------~~---------------------~--------------Variable dependiente pHSinAvena ---------------------------~-------------~--------------------~---------------------------------
Error T Parametro Estimado Estandar Estadistico P-Valor
CONSTANTE 535606 0094535 56657 00000 Dia -0150565 0020706 727154 00000 Dia2 000504434 0000871488 578819 00001
---~---------------------------------------------------------------------------------------------------
Anfllisis de Variama -------------------------------------------~-----------~-----------------------------~-~--- jSource Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor 11
------------------------~------------------------------------------------------------------------------~ Mod-elo 155772 2 0118861 4256 00000 Residual 0237877 13 00182983
Total (Corr) 11956 IS
R2 == 867522 percent
pHSinAvena == 535606 - 0150565Dia + 000504434Dia2
72
____
middot ANEXO G - ANALISIS DE REGRESION PARA pH EN BEBIDA CON AVENA
AmUisis de regresion polinomial _____~_____~__-_____~___4____________________bull____bull__________bull_____________~~----_------___________
Variable depcndiente pHConA vena ------------------------------------------------------------------------------------------~--------
Error T Parametro Estimado StAndar Estadfstico P-Valor
---------------------------------------------~-----------------------------------------------_---------CONSTANTE 534463 00801045 667208 00000 Dia -0140407 00175453 800253 00000 DiaA 2 000448098 0000738458 606803 00000
----------------------~---~-----------------------------~------------------------------~----AmUisis de Varianza
---~---------------------------------~---------------------~------------~-------------------~------Source Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio PValor --------------------------~-----------------------------------------------~------------~-----~~--~ ModeJo 159575 2 0797873 6073 00000 Residual 02170798 middot13 00131383 _______~_~ ~_~----------~------~--~-----~-M-----~-----____ _____________~-----------------------Total (COlT) 176654 15
R12 903315 percent
-----------~------------------------------------------------------------------------~-----------pHConAvena 534463 - 0140407Dia + 000448098DfaA 2
73
ANEXO H - ANALTSIS DE REGRESTON PARA ACIDEZ EN BEBJDA SIN AVENA
An8Jisis de Regtesi6fi P6lifJomial
Variable Depefidiefile~ AcidezSinAVenll _______________w_____~______~________________~-----------_________~_________________~~____~___~_____
Error T Pariirnetro Estimado Estandar Estadistico ---------------------------------------~--------------~-~-------~--------------------~------------CONSTANT 0491697 00123217 399051 00000 Dia 00436032 000269882 161564 00000 D1a2 -000144613 000011359 127312 00000 __w___~________________________~-_______-_____~----____________________________~__~---~_--__~___
AriiiJisis de varianza ~_~__~__________~_~____~________~___________- _________e_____________________________bull _____-________
Source Smn de cuadr Df Mean Square F-Ratio PmiddotValor_~~___________________________________bull ______~___________bull ____________bull ______~________w________________
Model 0135203 2 00676013 21747 00000 Residual 000404118 13 000031086
Total (Corr) 0139244 15
R2 970978 percent
AcidezSlnAvena 0491697 + O0436032Dia - 0OOl44613Dia2
74
I
ANEXO I ANALISIS DE REGRESION PARA ACIDEZ EN BEBIDA CON AVENA
1
Anwisis de tegtesi6fi polinomial
Variable dependiente Acidez Con Avena
Error T ParametTo Estimado Stlindar Estadfstico P-Valor ----------------~-------~---------------------~-----------------------------------------------------CONSTANT 0491639 000926607 530578 00000 Diamiddot 00406572 000202955 200326 00000 DfaA 2 0000982559 0000085421 -115025 00000
-------------~----------------------------~-------------------------~-----------------------------------
-------------~-----~~-----------------------------~---------------------------------------------_--Source Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio PValor
-~-------------~----------------------------------~------------------~~-------------------------- Modelo 0288008 2 0144004 81914 00000 Residual 000228539 13 0000175799
----------~~--------------~---------------------------------------------~---------------------------Total (Corr) 0290294 15
RA2 = 992127 percent
-------------------------~----~---~------------~---------------------------------~---------------~
AcidezConAvena == 049163amp + 00406572D1a - 0000982559DiaA2
75
I
(Ilmiddot il
ANEXO J- ANALISIS DE REGRESION PARA RECUENTO LACTOBACILOS PARA BEBIDA SIN AVENA
Amilisis de regresion - Modelo lineal Y = a + bX
------------------------~----------------------~-----------------------------~----------~-----------Variable Dcpendiente LactobacilJusSinAvena Variable independiente Dia
I--------~----------~-----------------------------------~-------~-~--~--------------------------~-Error T
Paramctro Estimado Standard Stadistico P-Valor
----~----~------------~-----~-----------------------~-------------~-----------------------------Intereepto 117347 0389973 300911 00000 Pendiente 00483464 00257889 18747 00903
Analisis de Varianza
---------~------------------~----------------~---------------------------------~---------~----------Source Sum decuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor
------------~---------------------~---------------------~--------------------------------~-----~----Modelo 0916252 1 244835 443 00616 Residual 260706 10 0260706
--~------------~---~------------------~~~-----~-------~---------~~-------------------------------------Total (Corr)352332 11
Coeficiente Correlaci6n = 0509955 R2 = 260054 percent
LactobacillusSinAvena= 117347 + 00483464Dfa
76
ANEXO K- ANALTSIS DE REGRESION PARA RECUENTO LACTOBACILOS PARA DEBIDA CON AVENA
Aruilisis de regresion - Modelo lineal Y = a + hX
Variable Dependiente LactobacillusConAvena Variable Independiente Dia ---~--------------------------------------------------------__-----------__--_--_-----------shy
Error T Paramctro Estimado Standard Estadistico P-Valor -~--------------------------------------------------------------------------------------------------
Irttercepto 118103 0567963 207942 00000 Pendiente 00790304 00375594 210414 00616
-----------------~----------------------------~----~-------~----~----------------------------
Analisis de Varianza
----------------~----------------~------------------~--------------------------~------~--------shySource Swn de cuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor
-----------------~--~--------------------------------------------------------------------------~---~ Mode10 244835 1 244835 443 00616 Residual 552997 10 0552997
Total (Corr)797832 11
Coeficiente Correlacion = 0553964 RI2 = 306875 percent
-----~--------------------------------------------------------~--------------------------------------
LactobacillusConAvena = 118103 + 00790304Dfas
77
____
middot ANEXO G - ANALISIS DE REGRESION PARA pH EN BEBIDA CON AVENA
AmUisis de regresion polinomial _____~_____~__-_____~___4____________________bull____bull__________bull_____________~~----_------___________
Variable depcndiente pHConA vena ------------------------------------------------------------------------------------------~--------
Error T Parametro Estimado StAndar Estadfstico P-Valor
---------------------------------------------~-----------------------------------------------_---------CONSTANTE 534463 00801045 667208 00000 Dia -0140407 00175453 800253 00000 DiaA 2 000448098 0000738458 606803 00000
----------------------~---~-----------------------------~------------------------------~----AmUisis de Varianza
---~---------------------------------~---------------------~------------~-------------------~------Source Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio PValor --------------------------~-----------------------------------------------~------------~-----~~--~ ModeJo 159575 2 0797873 6073 00000 Residual 02170798 middot13 00131383 _______~_~ ~_~----------~------~--~-----~-M-----~-----____ _____________~-----------------------Total (COlT) 176654 15
R12 903315 percent
-----------~------------------------------------------------------------------------~-----------pHConAvena 534463 - 0140407Dia + 000448098DfaA 2
73
ANEXO H - ANALTSIS DE REGRESTON PARA ACIDEZ EN BEBJDA SIN AVENA
An8Jisis de Regtesi6fi P6lifJomial
Variable Depefidiefile~ AcidezSinAVenll _______________w_____~______~________________~-----------_________~_________________~~____~___~_____
Error T Pariirnetro Estimado Estandar Estadistico ---------------------------------------~--------------~-~-------~--------------------~------------CONSTANT 0491697 00123217 399051 00000 Dia 00436032 000269882 161564 00000 D1a2 -000144613 000011359 127312 00000 __w___~________________________~-_______-_____~----____________________________~__~---~_--__~___
AriiiJisis de varianza ~_~__~__________~_~____~________~___________- _________e_____________________________bull _____-________
Source Smn de cuadr Df Mean Square F-Ratio PmiddotValor_~~___________________________________bull ______~___________bull ____________bull ______~________w________________
Model 0135203 2 00676013 21747 00000 Residual 000404118 13 000031086
Total (Corr) 0139244 15
R2 970978 percent
AcidezSlnAvena 0491697 + O0436032Dia - 0OOl44613Dia2
74
I
ANEXO I ANALISIS DE REGRESION PARA ACIDEZ EN BEBIDA CON AVENA
1
Anwisis de tegtesi6fi polinomial
Variable dependiente Acidez Con Avena
Error T ParametTo Estimado Stlindar Estadfstico P-Valor ----------------~-------~---------------------~-----------------------------------------------------CONSTANT 0491639 000926607 530578 00000 Diamiddot 00406572 000202955 200326 00000 DfaA 2 0000982559 0000085421 -115025 00000
-------------~----------------------------~-------------------------~-----------------------------------
-------------~-----~~-----------------------------~---------------------------------------------_--Source Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio PValor
-~-------------~----------------------------------~------------------~~-------------------------- Modelo 0288008 2 0144004 81914 00000 Residual 000228539 13 0000175799
----------~~--------------~---------------------------------------------~---------------------------Total (Corr) 0290294 15
RA2 = 992127 percent
-------------------------~----~---~------------~---------------------------------~---------------~
AcidezConAvena == 049163amp + 00406572D1a - 0000982559DiaA2
75
I
(Ilmiddot il
ANEXO J- ANALISIS DE REGRESION PARA RECUENTO LACTOBACILOS PARA BEBIDA SIN AVENA
Amilisis de regresion - Modelo lineal Y = a + bX
------------------------~----------------------~-----------------------------~----------~-----------Variable Dcpendiente LactobacilJusSinAvena Variable independiente Dia
I--------~----------~-----------------------------------~-------~-~--~--------------------------~-Error T
Paramctro Estimado Standard Stadistico P-Valor
----~----~------------~-----~-----------------------~-------------~-----------------------------Intereepto 117347 0389973 300911 00000 Pendiente 00483464 00257889 18747 00903
Analisis de Varianza
---------~------------------~----------------~---------------------------------~---------~----------Source Sum decuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor
------------~---------------------~---------------------~--------------------------------~-----~----Modelo 0916252 1 244835 443 00616 Residual 260706 10 0260706
--~------------~---~------------------~~~-----~-------~---------~~-------------------------------------Total (Corr)352332 11
Coeficiente Correlaci6n = 0509955 R2 = 260054 percent
LactobacillusSinAvena= 117347 + 00483464Dfa
76
ANEXO K- ANALTSIS DE REGRESION PARA RECUENTO LACTOBACILOS PARA DEBIDA CON AVENA
Aruilisis de regresion - Modelo lineal Y = a + hX
Variable Dependiente LactobacillusConAvena Variable Independiente Dia ---~--------------------------------------------------------__-----------__--_--_-----------shy
Error T Paramctro Estimado Standard Estadistico P-Valor -~--------------------------------------------------------------------------------------------------
Irttercepto 118103 0567963 207942 00000 Pendiente 00790304 00375594 210414 00616
-----------------~----------------------------~----~-------~----~----------------------------
Analisis de Varianza
----------------~----------------~------------------~--------------------------~------~--------shySource Swn de cuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor
-----------------~--~--------------------------------------------------------------------------~---~ Mode10 244835 1 244835 443 00616 Residual 552997 10 0552997
Total (Corr)797832 11
Coeficiente Correlacion = 0553964 RI2 = 306875 percent
-----~--------------------------------------------------------~--------------------------------------
LactobacillusConAvena = 118103 + 00790304Dfas
77
ANEXO H - ANALTSIS DE REGRESTON PARA ACIDEZ EN BEBJDA SIN AVENA
An8Jisis de Regtesi6fi P6lifJomial
Variable Depefidiefile~ AcidezSinAVenll _______________w_____~______~________________~-----------_________~_________________~~____~___~_____
Error T Pariirnetro Estimado Estandar Estadistico ---------------------------------------~--------------~-~-------~--------------------~------------CONSTANT 0491697 00123217 399051 00000 Dia 00436032 000269882 161564 00000 D1a2 -000144613 000011359 127312 00000 __w___~________________________~-_______-_____~----____________________________~__~---~_--__~___
AriiiJisis de varianza ~_~__~__________~_~____~________~___________- _________e_____________________________bull _____-________
Source Smn de cuadr Df Mean Square F-Ratio PmiddotValor_~~___________________________________bull ______~___________bull ____________bull ______~________w________________
Model 0135203 2 00676013 21747 00000 Residual 000404118 13 000031086
Total (Corr) 0139244 15
R2 970978 percent
AcidezSlnAvena 0491697 + O0436032Dia - 0OOl44613Dia2
74
I
ANEXO I ANALISIS DE REGRESION PARA ACIDEZ EN BEBIDA CON AVENA
1
Anwisis de tegtesi6fi polinomial
Variable dependiente Acidez Con Avena
Error T ParametTo Estimado Stlindar Estadfstico P-Valor ----------------~-------~---------------------~-----------------------------------------------------CONSTANT 0491639 000926607 530578 00000 Diamiddot 00406572 000202955 200326 00000 DfaA 2 0000982559 0000085421 -115025 00000
-------------~----------------------------~-------------------------~-----------------------------------
-------------~-----~~-----------------------------~---------------------------------------------_--Source Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio PValor
-~-------------~----------------------------------~------------------~~-------------------------- Modelo 0288008 2 0144004 81914 00000 Residual 000228539 13 0000175799
----------~~--------------~---------------------------------------------~---------------------------Total (Corr) 0290294 15
RA2 = 992127 percent
-------------------------~----~---~------------~---------------------------------~---------------~
AcidezConAvena == 049163amp + 00406572D1a - 0000982559DiaA2
75
I
(Ilmiddot il
ANEXO J- ANALISIS DE REGRESION PARA RECUENTO LACTOBACILOS PARA BEBIDA SIN AVENA
Amilisis de regresion - Modelo lineal Y = a + bX
------------------------~----------------------~-----------------------------~----------~-----------Variable Dcpendiente LactobacilJusSinAvena Variable independiente Dia
I--------~----------~-----------------------------------~-------~-~--~--------------------------~-Error T
Paramctro Estimado Standard Stadistico P-Valor
----~----~------------~-----~-----------------------~-------------~-----------------------------Intereepto 117347 0389973 300911 00000 Pendiente 00483464 00257889 18747 00903
Analisis de Varianza
---------~------------------~----------------~---------------------------------~---------~----------Source Sum decuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor
------------~---------------------~---------------------~--------------------------------~-----~----Modelo 0916252 1 244835 443 00616 Residual 260706 10 0260706
--~------------~---~------------------~~~-----~-------~---------~~-------------------------------------Total (Corr)352332 11
Coeficiente Correlaci6n = 0509955 R2 = 260054 percent
LactobacillusSinAvena= 117347 + 00483464Dfa
76
ANEXO K- ANALTSIS DE REGRESION PARA RECUENTO LACTOBACILOS PARA DEBIDA CON AVENA
Aruilisis de regresion - Modelo lineal Y = a + hX
Variable Dependiente LactobacillusConAvena Variable Independiente Dia ---~--------------------------------------------------------__-----------__--_--_-----------shy
Error T Paramctro Estimado Standard Estadistico P-Valor -~--------------------------------------------------------------------------------------------------
Irttercepto 118103 0567963 207942 00000 Pendiente 00790304 00375594 210414 00616
-----------------~----------------------------~----~-------~----~----------------------------
Analisis de Varianza
----------------~----------------~------------------~--------------------------~------~--------shySource Swn de cuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor
-----------------~--~--------------------------------------------------------------------------~---~ Mode10 244835 1 244835 443 00616 Residual 552997 10 0552997
Total (Corr)797832 11
Coeficiente Correlacion = 0553964 RI2 = 306875 percent
-----~--------------------------------------------------------~--------------------------------------
LactobacillusConAvena = 118103 + 00790304Dfas
77
I
ANEXO I ANALISIS DE REGRESION PARA ACIDEZ EN BEBIDA CON AVENA
1
Anwisis de tegtesi6fi polinomial
Variable dependiente Acidez Con Avena
Error T ParametTo Estimado Stlindar Estadfstico P-Valor ----------------~-------~---------------------~-----------------------------------------------------CONSTANT 0491639 000926607 530578 00000 Diamiddot 00406572 000202955 200326 00000 DfaA 2 0000982559 0000085421 -115025 00000
-------------~----------------------------~-------------------------~-----------------------------------
-------------~-----~~-----------------------------~---------------------------------------------_--Source Sum de cuadr Df Mean Square F-Ratio PValor
-~-------------~----------------------------------~------------------~~-------------------------- Modelo 0288008 2 0144004 81914 00000 Residual 000228539 13 0000175799
----------~~--------------~---------------------------------------------~---------------------------Total (Corr) 0290294 15
RA2 = 992127 percent
-------------------------~----~---~------------~---------------------------------~---------------~
AcidezConAvena == 049163amp + 00406572D1a - 0000982559DiaA2
75
I
(Ilmiddot il
ANEXO J- ANALISIS DE REGRESION PARA RECUENTO LACTOBACILOS PARA BEBIDA SIN AVENA
Amilisis de regresion - Modelo lineal Y = a + bX
------------------------~----------------------~-----------------------------~----------~-----------Variable Dcpendiente LactobacilJusSinAvena Variable independiente Dia
I--------~----------~-----------------------------------~-------~-~--~--------------------------~-Error T
Paramctro Estimado Standard Stadistico P-Valor
----~----~------------~-----~-----------------------~-------------~-----------------------------Intereepto 117347 0389973 300911 00000 Pendiente 00483464 00257889 18747 00903
Analisis de Varianza
---------~------------------~----------------~---------------------------------~---------~----------Source Sum decuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor
------------~---------------------~---------------------~--------------------------------~-----~----Modelo 0916252 1 244835 443 00616 Residual 260706 10 0260706
--~------------~---~------------------~~~-----~-------~---------~~-------------------------------------Total (Corr)352332 11
Coeficiente Correlaci6n = 0509955 R2 = 260054 percent
LactobacillusSinAvena= 117347 + 00483464Dfa
76
ANEXO K- ANALTSIS DE REGRESION PARA RECUENTO LACTOBACILOS PARA DEBIDA CON AVENA
Aruilisis de regresion - Modelo lineal Y = a + hX
Variable Dependiente LactobacillusConAvena Variable Independiente Dia ---~--------------------------------------------------------__-----------__--_--_-----------shy
Error T Paramctro Estimado Standard Estadistico P-Valor -~--------------------------------------------------------------------------------------------------
Irttercepto 118103 0567963 207942 00000 Pendiente 00790304 00375594 210414 00616
-----------------~----------------------------~----~-------~----~----------------------------
Analisis de Varianza
----------------~----------------~------------------~--------------------------~------~--------shySource Swn de cuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor
-----------------~--~--------------------------------------------------------------------------~---~ Mode10 244835 1 244835 443 00616 Residual 552997 10 0552997
Total (Corr)797832 11
Coeficiente Correlacion = 0553964 RI2 = 306875 percent
-----~--------------------------------------------------------~--------------------------------------
LactobacillusConAvena = 118103 + 00790304Dfas
77
I
(Ilmiddot il
ANEXO J- ANALISIS DE REGRESION PARA RECUENTO LACTOBACILOS PARA BEBIDA SIN AVENA
Amilisis de regresion - Modelo lineal Y = a + bX
------------------------~----------------------~-----------------------------~----------~-----------Variable Dcpendiente LactobacilJusSinAvena Variable independiente Dia
I--------~----------~-----------------------------------~-------~-~--~--------------------------~-Error T
Paramctro Estimado Standard Stadistico P-Valor
----~----~------------~-----~-----------------------~-------------~-----------------------------Intereepto 117347 0389973 300911 00000 Pendiente 00483464 00257889 18747 00903
Analisis de Varianza
---------~------------------~----------------~---------------------------------~---------~----------Source Sum decuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor
------------~---------------------~---------------------~--------------------------------~-----~----Modelo 0916252 1 244835 443 00616 Residual 260706 10 0260706
--~------------~---~------------------~~~-----~-------~---------~~-------------------------------------Total (Corr)352332 11
Coeficiente Correlaci6n = 0509955 R2 = 260054 percent
LactobacillusSinAvena= 117347 + 00483464Dfa
76
ANEXO K- ANALTSIS DE REGRESION PARA RECUENTO LACTOBACILOS PARA DEBIDA CON AVENA
Aruilisis de regresion - Modelo lineal Y = a + hX
Variable Dependiente LactobacillusConAvena Variable Independiente Dia ---~--------------------------------------------------------__-----------__--_--_-----------shy
Error T Paramctro Estimado Standard Estadistico P-Valor -~--------------------------------------------------------------------------------------------------
Irttercepto 118103 0567963 207942 00000 Pendiente 00790304 00375594 210414 00616
-----------------~----------------------------~----~-------~----~----------------------------
Analisis de Varianza
----------------~----------------~------------------~--------------------------~------~--------shySource Swn de cuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor
-----------------~--~--------------------------------------------------------------------------~---~ Mode10 244835 1 244835 443 00616 Residual 552997 10 0552997
Total (Corr)797832 11
Coeficiente Correlacion = 0553964 RI2 = 306875 percent
-----~--------------------------------------------------------~--------------------------------------
LactobacillusConAvena = 118103 + 00790304Dfas
77
ANEXO K- ANALTSIS DE REGRESION PARA RECUENTO LACTOBACILOS PARA DEBIDA CON AVENA
Aruilisis de regresion - Modelo lineal Y = a + hX
Variable Dependiente LactobacillusConAvena Variable Independiente Dia ---~--------------------------------------------------------__-----------__--_--_-----------shy
Error T Paramctro Estimado Standard Estadistico P-Valor -~--------------------------------------------------------------------------------------------------
Irttercepto 118103 0567963 207942 00000 Pendiente 00790304 00375594 210414 00616
-----------------~----------------------------~----~-------~----~----------------------------
Analisis de Varianza
----------------~----------------~------------------~--------------------------~------~--------shySource Swn de cuadr Df Mean Square F-Ratio P-Valor
-----------------~--~--------------------------------------------------------------------------~---~ Mode10 244835 1 244835 443 00616 Residual 552997 10 0552997
Total (Corr)797832 11
Coeficiente Correlacion = 0553964 RI2 = 306875 percent
-----~--------------------------------------------------------~--------------------------------------
LactobacillusConAvena = 118103 + 00790304Dfas
77