Tecnología del ADN recombinante

Alejandro Martínez Carballo LACC2

ENZIMAS DE RESTRICCIÓN

Las enzimas de restricción son proteínas cuya función es cortar las hebras de ADN. Se podría decir que son “tijeras moleculares” que cortan ADN. Lo hacen en forma específica. Esto significa que cada enzima reconoce un sitio particular del ADN, es decir que reconoce una secuencia particular de nucleótidos. Esa secuencia específica para cada enzima se denomina “sitio de restricción”. Una vez que la enzima reconoce estos sitios, se posiciona sobre la molécula de ADN y corta dentro o en torno de esa secuencia.

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Acorde a como realizan el corte, las enzimas se pueden clasificar en:

*Enzimas que generan “extremos romos” (parejos) *Enzimas que generan “extremos cohesivos” (desparejos). Estos extremos “colgantes” de simple cadena pueden pegarse con otros extremos de cadena simple que tengan la secuencia complementaria. Las enzimas encargadas de unir los extremos de ambas cadenas se denominan ligasas.

Usos de las enzimas de restricción

Las enzimas de restricción tienen diferentes aplicaciones que son de gran importancia en

investigaciones en biología molecular y en las técnicas que emplea la biotecnología moderna:

Hacer mapa de restricción de un plásmido o bacteriófago.

Generación de fragmentos para ser clonados en los vectores apropiados, y crear ADN recombinante.

Se puede cortar una molécula de ADN con una enzima y, con el mismo tipo de enzima, cortar el fragmento de ADN de interés para clonar. Se unen con ligasas estas dos moléculas de ADN, generando así una molécula de ADN recombinante. Este vector recombinante puede usarse para transformar células que expresen el gen de interés o puede usarse simplemente para tener clonado ese fragmento de ADN de interés.

Fragmentar ADN para separación por electroforesis.

Los fragmentos obtenidos después de la actuación de las distintas enzimas de restricción,

se pueden separar por tamaños mediante la técnica de electroforesis y así estudiar los distintos fragmentos.

ElectroforesisLa electroforesis en gel es un grupo de técnicas empleadas por los científicos para

separar moléculas basándose en propiedades como el tamaño, la forma o el punto isoeléctrico.

Se utiliza generalmente con propósitos analíticos, pero puede ser una técnica preparativa para purificar moléculas parcialmente antes de aplicar espectrometría de masas, PCR, clonación o secuenciación de ADN.

En esta técnica las proteínas sufren un tratamiento por agentes reductores que provocan la

pérdida de las estructuras secundaria . De este modo, la estructura tridimensional de las proteínas no influye en la electroforesis, y pueden separarse únicamente en función del

tamaño.

Esto se logra por la diferencia de desplazamiento de las moléculas a lo largo de un gel sometido a un campo eléctrico. La carga eléctrica sirve como fuerza impulsora que atrae las moléculas cargadas negativamente hacia el otro extremo del gel que posee carga positiva.

Bacteriófago Lambda

Bacteriófago Lambda: un operón complejo

Cuando una bacteria es infectada por una partícula de fago lambda, dos posibles situaciones pueden ocurrir:

(1) el fago puede integrarse al cromosoma bacteriano como profago inerte.

(2) el fago puede producir las enzimas necesarias para la reproducción, maduración y lisis celular.

Para finalizar, dos enlaces de videos de apoyo para comprender mejor las tecnicas del ADN recombinante:

http://www.youtube.com/watch?v=QEG8dz7cbnYhttp://www.youtube.com/watch?v=6vKLT5mQoBM