Actividad uresica en productos de soja. Propuesta de un nuevo mtodoM.C. Olguin, M.I. Zingale, G.C. Revelant, M.E. Vignale Facultad de Ciencias Bioqumicas y Farmacuticas. U.N.R. Suipacha - Argentina. RESUMEN Actividad uresica en productos de soja. Propuesta de un nuevo mtodo La evaluacin de la actividad uresica residual en productos de soja es habitualmente empleada como indicador de la eficacia del tratamiento de inhibicin practicado. El propsito de este trabajo consisti en realizar una comparacin entre el mtodo propuesto por la AACC (22-90), basado en medir diferencias de pH y una tcnica en la que se mide la actividad uresica por su accin hidroltica de la urea y posterior dosaje del amonio producido mediante la reaccin de Berthelot. Se utilizaron los dos mtodos para procesar 20 muestras de harina de porotos de soja sin tratar y con diferentes tratamientos trmicos de inactivacin. El nuevo mtodo correlaciona satisfactoriamente con el de la AACC, r = 0,9416, (p < 0.0001), asimismo, presenta mayor especificidad ya que mide la concentracin del producto de la reaccin y ofrece una respuesta ms amplificada que el incremento de pH. Palabras clave: Harinas de soja, antinutrientes, actividad uresica.

5. ANTIMETABOLITOS Y TOXINAS EN ALIMENTOSEl valor nutricional de un alimento depende en gran medida de la calidad de los ingredientes utilizados, la cual se mide en funcin de su capacidad de promover el crecimiento y mantener en buen estado a los organismos. En este sentido, el origen y/o el tratamiento previo a que se someten los materiales influir sobre su calidad, en funcin de la disponibilidad de nutrientes para usarse en las funciones metablicas del animal, o tambin, el contenido de factores txicos endgenos caractersticos de cada material, particularmente aquellos de origen vegetal, que funcionan como antinutrientes afectando negativamente al organismo. En este sentido, existen varias tcnicas que permiten conocer la disponibilidad de un nutriente determinado, principalmente aminocidos, as como tambin, determinar el contenido de sustancias txicas a fin de eliminarlas o desechar el material. En este documento se incluyen los mtodos para anlisis de los antinutrientes ms comunes encontrados en las protenas vegetales.

5.1. Mtodo Rpido Potenciomtrico para Medir Actividad Uresica en Harina de SoyaEste mtodo determina la ureasa residual en harina de soya y sus derivados de acuerdo al mtodo Caskey-Knapp (1944) modificado por AACC (1969) y Qum. Leticia Comar (Nutrimentos del Sureste, Mrida, Yucatn, Mxico). El resultado esta dado en unidades de pH proporcionales a la actividad uresica. Los valores aceptables oscilan entre 0.05 y 0.5; valores menores indican sobrecocimiento y mayores falta de cocimiento. Reactivos

Solucin bufer de fosfatos 0.05M. Disuelva 3.403g de fosfato de potasio monobsico g.r. (KH2PO4) en 100ml de agua destilada recin hervida. Disuelva 4.355g de fosfato de potasio dibsico g.r. (K2HPO4) en 100ml de agua destilada. Combine ambas soluciones, adicione 10ml de indicador rojo de fenol al 0.1% y afore a 1000ml con agua destilada. Ajuste el pH a 7.0 con un cido o base fuerte antes de usarse. En refrigeracin tiene una vida til de 90 das. Solucin bufer de urea. Disuelva 15g de urea g.r. en 500ml de sol. bufer de fosfatos. Ajuste el pH a 7.0 como en el caso anterior. Indicador rojo de fenol al 0.1%. Disuelva 0.1g de rojo fenol en 15ml de sol. de hidrxido de sodio 0.02N y afore a 100ml.

Materiales y Equipo

Bao mara con agitacin, precisin 0.5C. Medidor de pH con electrodo de vidrio y calomel adecuado para medir muestras de 5ml, precisin de 0.02 unidades de pH y compensacin de temperatura. Tubos de ensaye, 20 150mm con tapn de hule Vasos de precipitado de 10ml

Procedimiento 1. Pese 0.2g de harina de soya finamente molida (sin sobrecalentar) por duplicado y colocar en tubos de ensaye (A y B); adicione al tubo A 10ml de la solucin bufer de urea. Tape, agite e incube en bao mara por 30 min a 30 0.5C. 2. Despus de 5 min, adicione al tubo B 10ml de sol. bufer de fosfatos, tape, agite y coloque en el bao mara. 3. Agitar cada uno de los tubos cada 5 minutos (seis agitaciones en 30 min). 4. Retire el tubo A del bao mara, decante el sobrenadante en un vaso de pp de 10ml y mida el pH dentro de un perodo menor a 3 min. Repita el procedimiento con el tubo B 5 minutos despus del A. 5. Calcule el ndice de actividad uresica como unidades de pH resultantes de la diferencia de las lecturas del tubo A menos el tubo B y determine la calidad de la muestra segn la tabla de ejemplo incluida: IAU= pH tubo A (muestra + bufer urea) - pH tubo B (muestra + bufer fosfatos)Grado de cocimiento Cruda Subcocida Cocido adecuado Cocido adecuado Sobrecocida Unidades de pH 1.9 0.80 0.30 0.08 0.03 pH tubo A 8.80 7.60 7.10 6.98 6.93 pH tubo B 6.90 6.80 6.80 6.90 6.90 Color Rojo Rosa Rosa Rosa tenue Ambar

FIGURA 24 Determinacin de actividad uresica en harina de soya y sus derivados.

5.2. Gosipol Libre en Harina de Semilla de AlgodnEste antinutriente es caracterstico de la harina de algodn, siendo necesario determinar su contenido debido a sus efectos adversos sobre los organismos alimentados con la semilla, aun cuando los peces aparentemente resisten mayores concentraciones del alcaloide debido al elevado contenido proteico de su dieta. En este documento se describen dos mtodos, el primero para harinas normales y el segundo para harinas que han sido tratadas qumicamente y contienen dianilinogosipol.

Reactivos:

Acetona acuosa, 7 partes de acetona en 3 partes de agua destilada (v/v). Solucin de Acetona acuosa - Anilina. En 700 ml de acetona y 300 ml de agua, adicione 0.5ml de anilina purificada. Prepare diariamente. Solucin acuosa de alcohol isoproplico, 8 partes de alcohol isoproplico + 2 partes de agua destilada (v/v). Anilina purificada. Destile anilina grado reactivo sobre una pequea cantidad de polvo de zinc, descartando el primero y ltimo 10% del destilado. Almacene refrigerada en un frasco mbar de vidrio. Estable por varios meses. Solucin estndar de Gosipol: a. Disuelva 25 mg de gosipol puro en acetona libre de anilina y transfiera a un matraz aforado de 250 ml, usando 100 ml de acetona. Adicione 75 ml de agua destilada, afore con acetona y mezcle. b. Tome 50 ml de la solucin (a), adicione 100 ml de acetona pura, 60 ml de agua destilada, mezcle y diluya a 250 ml con acetona pura. La solucin (b) contiene 0.02 mg de gosipol/ml y es estable por 24 h en oscuridad.

Materiales y Equipo

Agitador mecnico. Espectrofotmetro Matraces erlenmayer de 250 ml Matraces Volumtricos de 25 y 250 ml Bao mara

Procedimiento Muela la muestra para que pase la malla de 1 mm, cuidando de no sobrecalentarla. Tome aproximadamente 1 g de la muestra y agrguele 25 ml de acetona pura. Agite por unos minutos, filtre y divida el filtrado en dos. A una porcin, adicinele una lenteja de Hidrxido de Sodio y caliente en bao mara por unos minutos. Un extracto ligeramente amarillo que no cambia de color con el Hidrxido indica que la harina no ha sido tratada, proceda con el mtodo 1. Si se obtiene un color rojo-anaranjado profundo, indica la presencia de dianilinogosispol y requiere del mtodo 2. Mtodo 1 Pese 0.51 g de muestra, dependiendo de la cantidad de gosipol esperada, en un matraz erlenmayer y adicione 2 3 perlas de vidrio. Agregue 50 ml de solucin de acetona acuosa, tape el matraz y agite por una hora. Filtre, deseche los primeros mililitros de filtrado y luego tome dos alcuotas iguales (210 ml, dependiendo del contenido de gosipol esperado) y pselas a matraces volumtricos de 25 ml. Diluya una de las alcuotas, afore a volumen con alcohol isoproplico acuoso (solucin a), mientras la otra alcuota (solucin b). Adicinele 2 ml de anilina purificada, caliente en bao mara (90100C) por 30 min. junto con un blanco conteniendo 2 ml de anilina y un volumen de solucin acuosa de acetona igual a la alcuota. Retire la solucin b y el blanco, adicione suficiente alcohol isoproplico acuoso para efectuar solucin homognea, y enfra a temperatura ambiente en un bao con agua. Afore con alcohol isoproplico acuoso. Lea las muestras a una absorvancia de 400 nm en el espectrofotmetro. Ajuste el instrumento a 0 absorvancia con alcohol isoproplico acuoso y determine la

absorvancia de la solucin (a) y el blanco de reactivo. Si el blanco est abajo de 0.022 de absorvancia contine con el anlisis, de lo contrario repita el anlisis usando anilina recin destilada. Determine la absorvancia de la solucin (b) con el blanco de reactivo ajuste a 0 absorvancia. Calcule la absorvancia corregida de la alcuota: absorvancia de la solucin (b) menos absorvancia de la solucin (a). Determine los mg de gosipol libre presentes en la solucin de la muestra usando la curva de calibracin. Mtodo 2. Pese 1 g de muestra en un matraz erlenmayer, agregue 50 ml de acetona acuosa, agite y filtre como el anterior. Agregue alcuotas duplicadas del filtrado (de 2 a 5 ml, dependiendo de la cantidad esperada de gosipol libre) a matraces volumtricos de 25 ml. Afore una de las alcuotas (solucin a) con el alcohol isoproplico acuoso y djelo reposar 30 minutos antes de leerlo en el espectrofotmetro. Afore la otra alcuota (solucin b) como en el procedimiento (1), determine las absorvancias de las soluciones a y b como el procedimiento anterior y calcule el contenido aparente de gosipol de ambas soluciones usando la curva de calibracin. Preparacin de la Curva de Calibracin. Tome alcuotas duplicadas de 1, 2, 3, 4, 5, 7, 8 y 10 ml de estndar de gosipol 0.02 mg/ml y colquelas en matraces volumtricos de 25 ml. Diluya una serie (solucin A) aforando con alcohol isoproplico acuoso y determine la absorvancia como en el anterior. A la otra serie (solucin b) adicinele 2 ml de anilina purificada y proceda como anteriormente. Prepare un blanco de reactivos usando 2 ml de anilina y 10 ml de acetona acuosa, calentada junto con el estndar. Determine absorvancias como en el procedimiento (1) y calcule la densidad ptica corregida para cada solucin estndar: Absorvancia Corregida = (Abs. solucin b - Abs. solucin a) Trace la curva estndar, graficando absorvancia corregida contra concentracin de gosipol en 25 ml. Calule % de gosipol libre en harinas normales. Gosipol libre % = 5G/WV Donde: G= Lectura en la Grfica W= Peso de la muestra V= Volumen de la alcuota usada. Para harinas qumicamente tratadas. Gosipol libre % = 5(B - A)/WV Donde: A = mg Gosipol libre aparente en alcuota (a) B= mg Gosipol libre aparente en alcuota (b)

FIGURA 25 Determinacin de gosipol libre en harinas de semilla de algodn.

5.3. Determinacin de TioglucsidosEl mtodo descrito proporciona el contenido aproximado de tioglucsidos pero no determina tioglucsidos e isocianatos individuales. Reactivos y Aparatos

Solucin Cloruro de Bario 5% Matraces volumtricos de 600 ml Bao de vapor

Procedimiento 1. A 10 g de harina (desengrasada por extraccin Soxhlet) adicinele 250 ml de agua destilada, hidrolice a 54C por 1 h y caliente a ebullicin por 2 h., manteniendo el volumen constante. 2. Filtre, reteniendo el filtrado y lave el residuo tres veces con 50 ml de agua caliente, agregando el lquido al filtrado inicial y afore a 600 ml.

3. Precipite el sulfato de bario por calentamiento y adicionando un exceso de solucin de Cloruro de bario. Djelo en un bao de vapor por algunas horas y filtre. 4. Calcine en una mufla y pese el precipitado. Calcule el contenido aproximado de tioglucsido como: % Tiogl= (M. wt. tioglucsido Peso de BaSO4) 100/M.wt. BaSO4 Peso Muestra

FIGURA 26 Determinacin de tioglucsidos en ingredientes alimenticios.

5.4. Anlisis de AflatoxinasEl mtodo que se incluye es adecuado para materiales como harina de cacahuate, harina de copra y harina de palma kernel; para detalles del mtodo, as como para procedimientos alternativos, refirase a Methods of Aflatoxin Analysis por B.D. Jones (1972), Report No. G70, Tropical Products Institute, London. Reactivos:

Cloroformo (G.R.) Eter etlico (G.R.) Mezcla cloroformo/metanol (95/5 v/v) Celita, tierra de diatomeas Gel de slica G (Merck) Estndares Cualitativos. Permiten distinguir marcas de aflatoxina de otras manchas fluorescentes que puedan estar presentes. Se puede usar con este propsito harina de cacahuate conteniendo aflatoxina B obtenible en el Inst. de Productos Tropicales de Londres.

Materiales y Equipo

Placas para cromatografa de capa fina 20 20 cm. Lmparas UV pico de emisin a 365 Botellas de boca ancha de 250 ml Micropipetas Agitador Rotoevaporador

Procedimiento 1. Pese 10 mg del material en un frasco de boca ancha y mzclelo con 10 ml de agua (si se usa material con alto nivel de grasa, ser necesaria una extraccin previa con soxhlet). Adicione 100 ml de cloroformo y agite por 30 min. 2. Filtre el extracto a travs de la celita, tome 20 ml del filtrado y llvelo a 25 ml (solucin a). Tome otros 20 ml del filtrado y concntrelos a 5 ml (solucin b). 3. Prepare placas de cromatografa agitando 100 g de gel de slica G con 220 ml de agua por 20 min y aplicando la mezcla a las placas con el aparato apropiado, con un grosor de 509. Djela reposar por 1 hora y seque a 100C. 4. Coloque gotas de 10 y 20 l de solucin b y 15 y 10l de solucin a en la placa, junto con una gota de estndar cualitativo, en una lnea a 2 cm del fondo de la placa y al menos a 2 cm de cada lado. Realice la aplicacin bajo luz tenue. 5. Revele la placa en ter etlico a una altura de 12 cm, djela secar en luz tenue y luego vulvala a revelar en mezcla de cloroformo/metanol hasta una altura de 10 cm desde la lnea basal. 6. Examine la placa en un cuarto obscuro a 30 cm de la fuente de UV. La presencia de una mancha azul fluorescente a Rf 0.50.55 indica aflatoxina B (asegrese de que la mancha del estndar se encuentre tambin en ese rango). la presencia de una segunda mancha a Rf 0.45 0.5 indica aflatoxina G.

La toxicidad de una muestra puede ser clasificada en trminos de aflatoxinas B y G de acuerdo con la tabla siguiente: TABLA COMPARATIVA PARA DETERMINAR TOXICIDAD DE AFLATOXINAS B Y GConc. de Aflatoxina (mg/kg) Volumen aplicado (ml) No fluoresencia c/fluoresencia 5 (sol. A) 10 (sol. A) 10 (sol. B) 20 (sol. B)