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INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL
CENTRO INTERDISCIPLINARIO DE CIENCIAS MARINAS
ACTIVIDAD BIOLÓGICA DE EXTRACTOS
ALGALES CON POTENCIAL COSMECÉUTICO
TESIS
PARA OBTENER EL GRADO DE MAESTRO EN CIENCIAS EN
MANEJO DE RECURSOS MARINOS
PRESENTA
ARACELI RODRÍGUEZ CUAUTLE
LA PAZ, B.C.S. JUNIO DE 2016.
ii
AGRADECIMIENTOS
Al Director de este trabajo: Dr. Mauricio Muñoz Ochoa, por tu enseñanza, por todas
esas ideas para este trabajo, por su confianza y toda esa ayuda. Agradezco al comité
revisor: a mi consejero de estudios Dr. Gustavo Hernández Carmona, Dra. Bárbara
González Acosta, Dra. Christine Johanna Band Schmidt y Dr. Sergio Martínez Díaz
por sus constantes comentarios y sugerencias para este trabajo.
Al Instituto Politécnico Nacional por el financiamiento del proyecto SIP20150538;
SIP20160656, al Programa de becas de CONACYT y a la beca BEIFI por el apoyo
económico para la realización de este trabajo. Así mismo agradezco al personal
administrativo, especialmente a Humberto, Cesar y Magda.
A mis padres: Nicolasa y Ernesto infinitamente gracias, por su enorme apoyo,
esfuerzo, por ayudarme siempre y por su paciencia. A mi hermana y hermano por su
ayuda para que cada momento sea diferente. Gracias mi pequeña gran familia.
A todo el equipo que conforma al Laboratorio de Química de Algas por su apoyo y
por facilitar las instalaciones. A mis compañeros de Laboratorio, por esos buenos
ratos y por su apoyo.
Agradezco a la Dra. Bárbara González por su ayuda y por facilitar las instalaciones
del Laboratorio de Microbiología. A Lina por su gran ayuda y sobre todo por
enseñarme a sembrar a las pequeñas bacterias.
Agradezco a mis amigos a esas personas que han estado desde la carrera y al inició
de todo esto, por apoyándome de la mejor forma para que todo salga adelante,
muchas gracias por todo.
Finalmente a los que colaboraron de alguna forma para la realización de este trabajo.
¡Gracias!
iii
ÍNDICE
AGRADECIMIENTOS ................................................................................................. II
ÍNDICE DE TABLAS ................................................................................................... V
ÍNDICE DE FIGURAS ................................................................................................ VI
GLOSARIO ............................................................................................................... VII
ABREVIATURAS ...................................................................................................... IX
RESUMEN .................................................................................................................. X
ABSTRACT ............................................................................................................... XI
1. INTRODUCCIÓN .................................................................................................. 12
2. ANTECEDENTES ................................................................................................. 14
2.1. Búsqueda de cosmecéuticos .......................................................................... 17
2.2. Propiedades antibacterianas de extractos de algas ........................................ 18
2.3. Extractos de algas con capacidad antioxidante ............................................... 21
2.4. Extracto de algas con actividad inhibitoria de la enzima tirosinasa ................. 22
2.5. Actividad antitumoral ....................................................................................... 23
2.6. Algas como ingredientes en cosmecéuticos .................................................... 25
3. JUSTIFICACIÓN ................................................................................................... 27
4. HIPÓTESIS ........................................................................................................... 28
5. OBJETIVO ............................................................................................................ 28
OBJETIVOS PARTICULARES .............................................................................. 28
6. MATERIAL Y MÉTODOS ...................................................................................... 29
6.1. Recolecta de macroalgas y obtención de extractos ........................................ 29
6.2. Selección de extractos etanólicos de macroalgas ........................................... 30
6.3. Evaluación de actividad antimicrobiana .......................................................... 31
6.3.1. Microorganismos de prueba ......................................................................... 31
6.3.2. Evaluación de la actividad antimicrobiana por el método de difusión en agar
con discos. ............................................................................................................. 32
6.4. Actividad antioxidante ..................................................................................... 32
6.5. Ensayo de inhibición enzimática ..................................................................... 33
6.5.1. Ensayo autográfico: determinación de la actividad antitirosinasa por medio
de cromatografía de capa fina. .............................................................................. 33
6.5.2. Ensayo colorimétrico de inhibición de la enzima tirosinasa .......................... 33
6.6. Evaluación de la actividad antitumoral in vitro en disco de zanahoria ............. 34
iv
6.7. Perfil de compuestos por análisis fitoquímico .................................................. 35
6.8. Análisis de datos ............................................................................................. 36
7. RESULTADOS ..................................................................................................... 36
7.1. Extractos etanólicos de macroalgas ................................................................ 36
7.2. Actividad antimicrobiana por el método de difusión en agar con discos .......... 36
7.3. Ensayo autográfico de actividad antioxidante ................................................. 40
7.4. Ensayo de inhibición de la enzima tirosinasa .................................................. 41
7.4.1. Ensayo autográfico: determinación de la actividad antitirosinasa por medio
de cromatografía de capa fina ............................................................................... 41
7.4.2. Ensayo colorimétrico de inhibición de la enzima tirosinasa .......................... 41
7.5. Actividad antitumoral de los extractos por el método de disco zanahoria ........ 42
7.6. Análisis fitoquímico de los extractos................................................................ 44
8. DISCUSIÓN .......................................................................................................... 47
9. CONCLUSIONES ................................................................................................. 55
10. RECOMENDACIONES ....................................................................................... 56
11. BIBLIOGRAFÍA .................................................................................................. 57
v
ÍNDICE DE TABLAS
Tabla I. Ejemplos de extractos algales, sus propiedades y aplicaciones (Tomada de
Thomas & Kim, 2013; Bedoux et al., 2014, Martins et al., 2014). .............................. 17
Tabla II. Ejemplos de componentes obtenidos a partir de macroalgas con actividad
antitirosinasa (Tomada y modificada de Thomas & Kim (2013); Balboa et al., 2015) 23
Tabla III. Ejemplos de extractos y compuestos obtenidos a partir de macroalgas
utilizados en cosmecéuticos (Tomada de Bedoux et al., 2014; Wang et al., 2015). .. 26
Tabla IV. 19 extractos de algas evaluadas en cada bioensayo ................................. 30
Tabla V. Revelador utilizado para identificar cada tipo de compuesto ....................... 36
Tabla VI. Halos de inhibición (mm) promedio (n=2) de los extractos de macroalgas
contra Staphylococcus epidermidis, Candida albicans, Propionibacterium acnes y
Agrobaceterium tumefaciens. .................................................................................... 39
Tabla VII. Actividad secuestrante de radicales libres de los extractos crudos de
macroalgas ............................................................................................................... 40
Tabla VIII. Porcentaje de inhibición de los extractos de macroalgas evaluados en el
ensayo colorimétrico de la enzima tirosinasa. ........................................................... 42
Tabla IX. Resultados de la actividad antitumoral de los extractos de macroalgas
evaluados en el ensayo de disco de zanahoria ......................................................... 43
Tabla X. Porcentaje de inhibición tumoral relativa (ITR) de los extractos de
macroalgas evaluados. ............................................................................................. 44
Tabla XI. Análisis fitoquímico de extractos de especies de macroalgas (+++
abundante, + +moderado, +poca y – ausente). ......................................................... 46
vi
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1. Estructura química del retinaldehído. ......................................................... 15
Figura 2. Estructura de Sargafuran aislado de Sargassum macrocarpum. ................ 20
Figura 3. Estructuras de los compuestos: a) Zonarol, b) Isozonarol aislados del alga
Dictyopteris zonaroides. ............................................................................................ 20
Figura 4. Estructura del florotanino 7-floroeckol aislado del alga parda Ecklonia cava.
.................................................................................................................................. 22
Figura 5. Localización de las zonas de recolecta 1) Caleritas y 2) Punta Roca
Caimancito, B.C.S., México. ...................................................................................... 29
Figura 6. Resultado del ensayo de actividad antibacteriana por medio del método de
difusión en agar con 2 mg/discos sobre agar MH. Halo de inhibición de 12 mm del
extracto de Laurencia lajolla contra Candida albicans. .............................................. 37
Figura 7. Resultado del ensayo de actividad antibacteriana por medio del método de
difusión en agar con 2 mg/discos sobre agar MH. Halo de inhibición de 24.5 mm del
extracto Laurencia lajolla contra Propionibacterium acnes. ....................................... 38
Figura 8. Zonas decoloradas que indican inhibición de la enzima tirosinasa de los
extractos: 1) U. dactilifera, 2) C. sertularioides, 3) Cladophora sp., 4) Enteromorpha
sp. 5) C. amplivesiculatum, 6) C. cuneatum, 7) C. simulans, 8) R. californica, 9) S.
filamentosa 10) P. perforata, 11) A. valonioides, 12) H. valentiae, 13) L. lajolla, 14) M.
pyrifera, 15) S. horridum, 16) H. clathrathus, 17) D. flabellata, 18) P. concrescens y
19) C. osmundacea. Placas cromatográficas de fase normal desarrollada con CH2Cl2:
MeOH (90:10), rociada con el sustrato L-tirosina 2 mM y con la enzima tirosinasa a
3333 U mL-1. ............................................................................................................. 41
Figura 9. Compuestos bromofenoles aislados del alga roja Symphyocladia latiuscula:
1.1) (2R)-2-(2,3,6-tribromo-4,5-dihidroxybenzil)-ciclo hexano, 1.2) 2,3,6-tribromo-4,5-
dihidroxibenzilalcohol, 1.3) 1-(2,3,6-tribromo-4,5-dihidroxibenzil) pirrolidin; 1.4) 2,3
1.4) 2,3,6-tribromo-4,5-dihidroxibenzil metil sulfano (Tomado de Liu et al., 2011). .... 49
Figura 10. Estructuras derivadas de florotaninos obtenidos a partir de algas marinas:
1) phloroglucinol, 2) eckol, 3) fucofuroeckol-A, 4) phlorofucofuroeckol-A, 5)
dioxinodehydroeckol, 6) 8,80-bieckol, 7) 7-phloroeckol, y 8) dieckol (Tomada de
Thomas & Kim, 2013). .............................................................................................. 50
vii
GLOSARIO
Ácido kójico: Derivado pirónico con actividad despigmentante de la piel.
Antibacteriano: Compuesto que inhibe el desarrollo de bacterias.
Antitumoral: Compuesto que inhibe el crecimiento de tumores y el crecimiento
anormal de las células.
Cosmecéutico: Producto que incorpora compuestos biológicos y/o naturales que
tienen un efecto farmacológico para el tratamiento y prevención de enfermedades en
la piel.
Cosmético: Producto que se utiliza para la belleza o higiene del cuerpo.
Cromatografía: Método físico de separación en el que los componentes de una
mezcla se separan y se distribuyen entre dos fases: estacionaria y móvil.
Extracto: Producto obtenido a partir de un organismo o parte de él, a través de la
extracción con un solvente orgánico o agua.
Fitoquímica: Estudia los componentes químicos de los vegetales. Desde su
estructura química molecular, hasta las propiedades biológicas de los vegetales.
Flavonoides: Pigmentos fotosintéticos naturales presentes en los vegetales que
protegen al organismo de los daños producidos por sustancias o elementos
oxidantes como los rayos ultravioleta.
Ingrediente natural: Cualquier elemento obtenido sin modificación a partir de
plantas, minerales o de organismos marinos, que formarán parte de la elaboración de
un producto y que permanecerán en él.
Principio activo: Componente que porta las cualidades farmacológicas presentes en
una sustancia.
Producto natural: Compuesto químico o sustancia producida por un organismo
encontrado en la naturaleza que tiene generalmente una actividad farmacológica o
viii
biológica. Los productos naturales pueden ser extraídos de los tejidos de las plantas,
organismos marinos o caldos de fermentación de microorganismos.
Potencial: tiene la posibilidad de suceder o de existir en el futuro.
Tirosinasa: Enzima fundamental en la síntesis de la melanina, debido a que regula
directamente la cantidad de melanina producida en la ruta bioquímica de la
pigmentación.
ix
ABREVIATURAS
CH2Cl2 diclorometano o cloruro de metileno
DPPH 2,2-difenil-1-picrilhidracilo
DMSO dimetil sulfóxido
ERO especies reactivas de oxigeno
EPS exopolisacáridos
MeOH metanol
MH agar Mueller-Hinton
UV ultravioleta
x
ACTIVIDAD BIOLÓGICA DE EXTRACTOS ALGALES CON POTENCIAL
COSMECÉUTICO
RESUMEN
El potencial cosmecéutico de los extractos etanólicos de 19 macroalgas, fue
determinado a través de la evaluación de la actividad inhibitoria de la enzima
tirosinasa, la actividad antioxidante, antimicrobiana y antitumoral. La actividad
antibacteriana fue evaluada por medio del método de difusión en agar con discos,
empleando tres microorganismos involucrados en diversas patologías cutáneas
(Candida albicans, Staphylococcus epidermidis y Propionibacterium acnes) y una
bacteria, que induce la formación de tumores en plantas (Agrobacterium
tumefaciens). La inhibición de A. tumefaciens, se utilizó como medida discriminatoria
para el ensayo antitumoral. Nueve de los extractos de algas evaluados: Ulva
dactylifera, Caulerpa sertularioides, Enteromorpha sp., Caulerpa amplivesiculatum,
Macrocystis pyrifera, Dictyota flabellata, Hydroclathrus clathrathus, Spyridia
filamentosa, Laurencia lajolla y Padina concrescens, mostraron actividad contra C.
albicans. Ocho extractos inhibieron el crecimiento de S. epidermidis, siete extractos
indicaron inhibición de la bacteria P. acnes y nueve contra A. tumefaciens. Los
extractos de L. lajolla y M. pyrifera fueron los únicos que mostraron actividad contra
los tres patógenos cutáneos evaluados. En el ensayo de la actividad antioxidante, los
extractos de C. sertularioides, P. concrescens y D. flabellata presentaron actividad
secuestrante del radical libre 2,2-difenil-1-picrilhidracilo. Además, en el ensayo de
inhibición de la tirosinasa, P. concrescens también mostró actividad con 100% de
inhibición a la concentración de 500 µg mL-1 similar a la del control (ácido kójico
100±0). En el ensayo de inhibición de tumores inducidos por A. tumefaciens, el
extracto de H. clathrathus inhibió la generación de tumores a todas las
concentraciones evaluadas. El análisis fitoquímico de los extractos determinó la
presencia de alcaloides, esteroles, fenoles, flavonoides, antraquinonas y saponinas.
Los resultados muestran que los extractos tienen propiedades antibacterianas,
actividad antitumoral, antioxidante y antitirosinasa, lo que indica su potencialidad
como principio activo en la elaboración de productos cosmecéuticos. Sin embargo,
xi
es necesario continuar con la investigación para determinar su inocuidad y seguridad
para la aplicación en humanos.
ABSTRACT
The cosmeceutical potential of ethanolic extracts of 19 macroalgae was determined
by the evaluation of antioxidant, antimicrobial, antitumor and enzyme inhibitor of
tyrosine activity by the extracts. The antibacterial activity against three
microorganisms involved in various skin diseases (Candida albicans, Staphylococcus
epidermidis and Propionibacterium acnes) and one bacterium that induces tumor
formation in plants (Agrobacterium tumefaciens) was determined by the agar diffusion
method. The inhibition of A. tumefaciens was used as a discriminatory measure for
the antitumor assay. Nine of the extracts (U. dactylifera, C. sertularioides,
Enteromorpha sp., C. amplivesiculatum, M. pyrifera, D. flabellata, H. clathrathus, S.
filamentosa and L. lajolla) showed activity against C. albicans. Eight extracts showed
inhibition towards S. epidermidis, seven extracts showed inhibition of P. acnes and
nine extracts showed activity against A. tumefaciens. Laurencia lajolla and M. pyrifera
extracts were the only two that showed activity against the three cutaneous
pathogens evaluated. In the trial of antioxidant activity, extracts of C. sertularioides, P.
concrescens and D. flabellata demonstrated free radical scavenging activity on 2,2-
diphenyl-1-picrilhidracil. Also in the inhibition assay tyrosinase activity was
demonstrated that P. concrescens produced 100% inhibition at a concentration of 500
µg mL-1, similar to the control (100 ± 0.0 kojic acid). In the inhibition of induced tumors
assay by A. tumefaciens, the extract from H. clathrathus inhibited tumorigenesis at all
the concentrations. Phytochemical analysis of extracts showed the presence of
alkaloids, sterols, phenols, flavonoids, saponins and anthraquinones. The results
show that the algae extracts have antibacterial, anti-tumor, antioxidant, and anti-
tyrosinase activity. This suggests that those extracts have a potential application as
an active ingredient in the production of cosmeceuticals. However, it is necessary to
continue the research on seaweed extracts to determine their safety for humans.
12
1. INTRODUCCIÓN
La piel humana tiene como función principal proteger al cuerpo de diversos
patógenos y contaminantes ambientales, incluyendo la radiación ultravioleta (UV). La
exposición a dosis elevadas de UV conducen a numerosas complicaciones de la piel,
que se producen al exceder la capacidad protectora de cada individuo (Gilaberte et
al., 2003; Katiyar, 2007). Estas complicaciones se correlacionan con el desequilibrio
entre los componentes del tejido que conllevan a efectos perjudiciales incluyendo
alteración de moléculas de ADN, inactivación de enzimas y formación de radicales
libres; los cuales dañan a las membranas celulares y alteran su funcionalidad
(Gilaberte et al., 2003). Las especies reactivas de oxígeno (ERO) formadas en estas
condiciones, inducen a procesos de inflamación y neurodegenerativos que están
relacionados con enfermedades de larga duración: Alzheimer, Parkinson, cáncer,
cardiovasculares y enfermedades cutáneas como la hiperpigmentación (Thomas &
Kim, 2013).
La hiperpigmentación cutánea es un problema causado por diversos factores como la
exposición excesiva a la luz UV y reacciones a fármacos, en algunos casos suele ser
causa del envejecimiento natural (Masaki, 2010). Los desórdenes dermatológicos
asociados con la hiperpigmentación son manchas, melasma y sitios de daños
actínico por mencionar algunos (Pandya & Guevera, 2000).
Otros factores que causan un desequilibrio en la barrera cutánea son la humedad, el
polvo, el aumento de temperatura, químicos, diversas enfermedades o el uso de
antibióticos en infecciones cutáneas desarrolladas por diferentes bacterias, a su vez,
provocando mayores afecciones en la piel formando un amplio grupo de cuadros
clínicos. Por ejemplo, el acné es relacionado con las proliferaciones de
Propionibacterium acnes, una bacteria anaeróbica que prolifera en el ambiente, se
desarrolla por la mezcla de exceso de sebo con las células foliculares y produce la
liberación de factores que promueven la inflamación de la piel (Kamei et al., 2009).
Existen alternativas para la prevención de los efectos mencionados anteriormente, tal
como los antioxidantes obtenidos de fuentes naturales que disminuyen el efecto
13
dañino de los radicales libres en las células del organismo (Wijesekara et al., 2012).
Los compuestos pueden disminuir las enfermedades asociadas a las ERO como la
hiperpigmentación cutánea. Dicha enfermedad se desarrolla por el incremento del
número de melanocitos o en la actividad de enzimas melanogénicas como la
tirosinasa (Del Mármol & Beermann, 1996).
La enzima tirosinasa modifica la velocidad de biosíntesis de la melanina y es clave
de la coloración de la piel. Con lo anterior, la inhibición de la tirosinasa resulta ser un
importante tratamiento para las enfermedades de hiperpigmentación en humanos
(derivadas de sobre-expresión de la enzima). Por ello, diversos compuestos que se
han aislado a partir de organismos marinos (Tabla I), se han analizado y reportado
como inhibidores de la actividad de tirosinasa (Van Gelder et al., 1997).
Actualmente, las algas son una alternativa para la obtención de nuevos compuestos
bioactivos con potencial aplicación en la cosmecéutica para el cuidado de la piel
(Balboa et al., 2015). El uso de cosmecéuticos se ha incrementado debido a la
creciente demanda de productos naturales, por considerarse seguros y
ecológicamente amigables. Son productos prometedores para la industria cosmética
natural por el alto valor agregado que poseen (Thomas & Kim, 2013).
Los cosmecéuticos contienen ingredientes funcionales para tratar o prevenir
enfermedades de la piel (Kligman, 2005). Hoy en día son una línea entre los
productos de cuidado personal y productos farmacéuticos (Kim et al., 2008). Debido
a la creciente demanda, es necesaria la búsqueda de nuevas alternativas.
Al respecto, las algas marinas han sido utilizadas como tratamiento de belleza desde
la antigüedad por sus propiedades para el cuidado de la piel (Wijesinghe & Jeon,
2011). Sin embargo, el poco conocimiento de sus propiedades biológicas ha limitado
su uso. Recientemente, algunos extractos y compuestos obtenidos a partir de algas
marinas han presentado importantes actividades biológicas, entre las que se
encuentran; la actividad antibacteriana, antifúngica, anticancerígena, antiviral y
antioxidante (Faulkner, 2002; Wijesinghe & Jeon, 2011; Wijesekara et al., 2012). Por
ello, en el presente trabajo, se determinó el potencial cosmecéutico de 19 extractos
14
obtenidos de algas recolectadas en las costas de la Bahía de La Paz, BCS., México.
Dicho potencial fue evaluado, mediante la capacidad de los extractos para inhibir la
actividad de la enzima tirosinasa, la capacidad de secuestrar radicales libres
(antioxidante), su actividad antibacteriana y la capacidad de inhibir la formación de
tumores (antitumoral), todas ellas a través de ensayos in vitro.
2. ANTECEDENTES
La cosmecéutica es una nueva rama dirigida a la utilización de recursos del ambiente
para obtener productos de belleza con propiedades farmacológicas. Este nuevo
término “cosmecéutico” está conformado por la combinación de dos palabras:
cosmético y farmacéutico, se refiere a productos que contienen un ingrediente activo
que ofrece beneficios similares a los fármacos ya que mejoran, protegen y mantienen
una piel sana (Kligman, 2000; Kim et al., 2008; 2010).
Los cosmecéuticos se clasifican de acuerdo a sus principales ingredientes o efecto
sobre la piel, tal como: protectores solares, antioxidantes, botánicos, ceramidas,
antiinflamatorios, agentes despigmentantes, reparador de colágeno, exfoliantes,
hidratantes, hidroxi-ácidos, péptidos tópicos y retinoides (Sorg et al., 2006; Sharma &
Sharma, 2012).
Adicionalmente, se han reportado productos que presentan ingredientes con
beneficios multifactoriales (Reszko et al., 2009). En esta área, los antioxidantes son
un ingrediente muy utilizado e innovador en aplicaciones tópicas. Los antioxidantes
más importantes y utilizados son vitamina E, vitamina C, tioles y flavonoides (Balboa
et al., 2015).
De igual forma los retinoides son uno de los ingredientes esenciales que se
encuentran en los cosmecéuticos, debido a que forman parte de los derivados
naturales y sintéticos de la vitamina A, tienen como principal objetivo reducir la
hiperpigmentación y la inhibición de enzimas (Mukherjee et al., 2006). Las
propiedades cosmecéuticas de los retinoides se basan principalmente en datos
obtenidos a partir de estudios sobre la tretinoína y otras clases de fármacos. Algunos
15
retinoides tópicos cosmecéuticos son: el ácido retinoico (tretinoína), ésteres de
retinol, retinol, retinaldehído (Figura 1) y el grupo de los retinoides (Sorg et al., 2006).
Figura 1. Estructura química del retinaldehído.
Extractos activos de origen marino se utilizan por su efectividad para el cuidado de la
piel; algunos de ellos ya se aplican en productos comerciales como Elemis que
utiliza Padina pavonica (The Steiner Group, Londres, Reino Unido), La Prarie
emplea extractos de caviar y extractos de algas (Beiersdorf, Montreux, Suiza), Créme
de la Mer menciona como principal ingrediente el extracto de algas marinas (Estée
Lauder, Nueva York, EUA), Blue Therapy utiliza microalgas y extracto de Alaria
esculenta (Biotherm, Tours, Francia), entre otros productos (Martins et al., 2014).
Algunos productos mencionan ciertos aspectos de su composición y su introducción
al mercado (Martins et al., 2014), como el Abyssine de Unipex (New York, E.U.A.)
que está conformado por exopolisacáridos (EPS), son de los compuestos
moleculares utilizados como ingredientes bioactivos para cuidado personal. Varios
microorganismos producen EPS, incluyendo proteobacteria, cianobacterias y
arqueas (Vincent et al., 1994; Le Costaouëc et al., 2012). Se han realizado varias
evaluaciones biológicas con el fin de identificar la bioactividad de los EPS y se
demostró que protegen eficazmente los queratinocitos de agentes inflamatorios
(Thibodeau & Takeoka, 2006), respecto a la entrada de este producto hacia el
mercado se indica que fue a través de la aplicación en cosmecéuticos y está
disponible bajo el nombre de Abyssine, presenta compuestos desinflamantorios y
reducen la irritación de la piel sensible a la radiación UV. Cabe destacar que este
ingrediente se comercializa bajo la descripción de un extracto fermentado, rico en
16
minerales, proteínas, sales orgánicas e inorgánicas y aminoácidos (Thibodeau &
Takeoka, 2006).
Otro producto es Resilience una línea de productos para el cuidado de la piel, de la
compañía Estée Lauder que contiene un extracto extracelular obtenido a partir de
Pseudopterogorgia elisabethae (Gorgoniidae); el extracto está compuesto
principalmente por pseudopterosinas, que son glucósidos diterpénicos tricíclicos. Las
pseudopterosinas son agentes anti-inflamatorios y analgésicos (Potts et al., 1992). El
extracto de P. elisabethae se utiliza para el cuidado de la piel como un aditivo para
prevenir la irritación causada por la exposición al sol y a productos químicos (Rouhi,
2003; Martins et al., 2014). Al igual que otros compuestos naturales el objetivo inicial
era la aplicación farmacéutica, no obstante, su aplicación dirigida al cuidado de la piel
resultó más rápida, dado que el marco regulatorio para los cosméticos permite el uso
inmediato de extractos una vez demostrada su eficacia y su seguridad (Martins et al.,
2014).
Las algas son uno de los ingredientes naturales utilizados en la formulación de
cosmecéuticos, debido a su capacidad de producir una gran diversidad de agentes
bioactivos con efectos benéficos para la salud cutánea. Las algas se utilizan en
diferentes tipos de productos básicos: mascarillas faciales, cremas para el cuerpo,
protectores solares y tratamientos contra el acné, entre otros (Wang et al., 2015;
Tabla I).
17
Tabla I. Ejemplos de extractos algales, sus propiedades y aplicaciones (Tomada de Thomas & Kim, 2013; Bedoux et al., 2014, Martins et al., 2014).
Extractos de Alga Propiedades Aplicación Productor
Laminaria ochroleuca Antiinflamatoria,
Antifotoalergénicos
Estimulante, producción de colágeno
Crema antiacné
Crema antiacné
Crema limpiadora
Fotoprotectora
Thalgo,
La Mer,
Dermika, Ziaja,
y Pat
Laminaria hyperborea
Hidratante,
Suavizante
Antibacterial y
Anticelulitis
Hidratantes
Antienvejecimiento
Facial
La Mer,
AA Cosmetics,
y Eveline
Cosmetics
Chlorella vulgaris
Antioxidante
Protector de UV
Hidratante
Antiinflamatoria
Antibacteriano
Crema para contorno
de ojos,
mascarilla
y gel de ducha
La Mer,
Efektima,
Marion y
Bielenda
Chondrus crispus
Antioxidante,
Anti-envejecimiento,
Anti-inflamatoria,
Suavizante,
Hidratante,
Regeneración del cabello
Crema facial,
desmaquillante,
loción corporal,
champú
Thalgo.
Nívea,
Pat & Rub y
Dr. Irena Eris
Ulva (Enteromorpha) compressa
Antienvejecimiento,
Antiarrugas,
Anti-inflamatoria,
Antioxidante,
Hidratante,
Anti acné,
Estimula la producción de elastina y
colágeno
Crema para contorno
de ojos,
mascarilla,
gel de limpieza,
loción corporal
Thalgo,
La Mer,
Ziaja y Dr.
Irena Eris
Las macroalgas representan una fuente alternativa de compuestos debido a que
producen una amplia diversidad de metabolitos como florotaninos, polisacáridos,
pigmentos carotenoides y otros más, con posibles usos como antioxidantes,
antibacterianos, antifúngicos, antitumorales e inhibidores de enzimas (Faulkner,
2002; Katiyar, 2007; Kim et al., 2008; Wijesekara et al., 2012).
2.1. Búsqueda de cosmecéuticos
En este trabajo se presentan aspectos básicos sobre el potencial de los extractos de
algas como ingredientes activos en futuras formulaciones de cosmecéuticos, debido
a que las algas han sido reportadas como fuente de compuestos con variedad de
funciones biológicas (Thomas & Kim, 2013). Por lo tanto, se pretende identificar
aquellas algas con actividad potencialmente útil para el tratamiento de enfermedades
18
cutáneas. Las tendencias recientes en el desarrollo de cosmecéuticos incluyen la
protección de la piel frente a la radiación solar y el daño oxidativo provocado por una
variedad de factores tanto ambientales como biológicos (Reszko et al., 2009). Por
esta razón, es de gran importancia el descubrimiento de compuestos bioactivos con
la capacidad de eliminar radicales libres para prevenir diversas enfermedades donde
el estrés oxidativo es el principal causante (Wijesinghe & Jeon, 2011). Actualmente
se pone especial atención a los ingredientes para el desarrollo de productos más
seguros con componentes de organismos marinos.
Las algas tienen un gran potencial debido a su adaptación para sobrevivir en un
amplio rango de condiciones ambientales (Pérez et al., 2016), que les obliga a
producir sustancias químicas que les permitan crecer y desarrollarse en las
condiciones particulares en las que se encuentran (Dawczynski et al., 2007).
Positivamente, no existen reportes sobre toxicidad (salvo intoxicaciones por iodo y
dermatitis provocada por epibiontes) de las macroalgas ya sea por contacto o por
ingesta, lo que las convierte en un excelente candidato para su uso en productos de
uso cosmético (Rhodes et al., 2009). Por otra parte, aún no existe regulación
específica para los productos cosmecéuticos debido a su situación ambigua, ya que
no se encuentran clasificados ni como cosmético ni como fármaco, por lo cual su
regulación depende de las leyes sanitarias de cada país (Newgreen, 2005;
Golubovic-Liakopoulos et al., 2011) lo que, de cierta manera, facilita la elaboración y
comercialización de este tipo de productos.
2.2. Propiedades antibacterianas de extractos de algas
Las infecciones bacterianas de la piel son muy comunes. Los principales
microorganismos implicados en las infecciones graves de la piel son:
Propionibacterium acnes, Staphylococcus epidermidis y Candida albicans por
mencionar algunos (Adams, 1988; Kumar et al., 2007).
El acné es una enfermedad inflamatoria de las glándulas sebáceas que se
caracteriza por la aparición de comedones comúnmente llamados pápulas, pústulas
y quistes purulentos superficiales o profundos y en algunos casos descamación e
19
hiperpigmentación cutánea (Leyden, 2001; Kumar et al., 2007). Este proceso se
asocia con proliferaciones de P. acnes, S. epidermidis y otras bacterias que
conforman la flora normal del folículo sebáceo (Burkhart et al., 1999).
P. acnes es una bacteria anaeróbica, que no forma esporas, es un bacilo Gram-
positivo, prolifera en el ambiente creado por la mezcla del exceso de sebo con las
células foliculares, produciéndose la liberación de factores mediadores de la
inflamación en la piel (Leyden, 2001).
Por otra parte, S. epidermidis es una bacteria aerobia Gram-positiva, coagulasa
negativo, por lo general implicada en infecciones superficiales dentro de la unidad
sebácea (Burkhart et al., 1999) y C. albicans, que pertenece al filo Ascomycota, es
un hongo dimórfico, se reproduce de forma asexual por gemación y se desarrolla de
forma distinta en función de la temperatura, como levadura, normalmente a 37 ºC en
el huésped, y como hongo de aspecto filamentoso, a 25 ºC en la naturaleza.
Diversos compuestos de las algas tienen aplicación potencial en cosmecéuticos. Así,
existen estudios donde se ha identificado actividad antibacteriana en extractos
obtenidos a partir de las algas: Acanthophora sp., Bryothamnion triquetrum,
Gracilaria sp., Gelidium sp., Caulerpa mexicana, Caulerpa sp., Codium decortictum,
Halimeda incrassata, Ulva sp., Sargassum sp., que resultaron activas, sobre
bacterias tales como: P. acnes, Pseudomona aeruginosa, Klebsiella pneumoniae,
Escherichia coli, Salmonella paratyphi, Staphylococcus aureus, Enterococcus
faecalis; Pseudomnas aeruginosa, Aeromonas sobria, Vibrio vulnificus y Vibrio
parahaemolyticus; por mencionar algunas (Rios et al., 2009).
Particularmente se han realizado estudios con extractos de algas cafés (Sargassum
macrocarpum, Eisenia bicyclis) con el fin de evaluar la actividad contra la bacteria P.
acnes (Kamei et al., 2009). Lee et al. (2014), evaluaron la eficacia del extracto
etanólico crudo de Eisenia bicyclis contra P. acnes. El posterior fraccionamiento del
extracto activo de esta alga, permitió el aislamiento del compuesto fucofuroeckol-A
con alta actividad con una concentración mínima inhibitoria de 32 a 128 µg mL-1. En
el estudio de S. macrocarpum se aisló el compuesto sargafuran (Figura 2), el cual
20
mostró actividad a una concentración de 15 µg mL-1 con una baja citotoxicidad
(Kamei et al., 2009; Shridhar et al., 2009).
Figura 2. Estructura de Sargafuran aislado de Sargassum macrocarpum.
Entre los compuestos algales identificados con actividad anti fúngica se encuentran
las hidroquinonas zonarol e isozonarol (Figura 3), aisladas a partir del alga
Dictyopteris zonaroides, el cicloendesmol aislado de Chondria oppositoclada y la
naftoquinona extraída del alga café Landsburgia quercifolia. Estos compuestos
mostraron actividad inhibitoria del crecimiento de C. albicans y algunas especies del
género Trichophyton (Gunasekera et al., 1995). Los extractos acuosos de varias
algas entre las cuales se mencionan a Laurencia obtusa, Halimeda opuntia, Udotea
flabellum, Dictyota bartayresii, Dictyota cervicornis, Dictyota ciliolata, Dictyota
divaricata, Dictyota indica, Padina gymnospora, Codium simplex, Cladophora
prolifera, Ulva fasciata, Colpomenia sinuosa, Dictyopteris delicatula, Padina
boergesenii, Padina pavonica, Sargassum vulgare, Sargassum polyceratium y
Spatoglossum schroederii, mostraron actividad contra C. albicans (Zamora &
Ballantine, 2000; De Lara-Isassi et al., 2005; Sujatha et al., 2012).
Figura 3. Estructuras de los compuestos: a) Zonarol, b) Isozonarol aislados del alga Dictyopteris zonaroides.
a) b)
21
2.3. Extractos de algas con capacidad antioxidante
La piel presenta agentes antioxidantes que tienen como función bloquear las
especies reactivas de oxígeno y así evitar la desestabilización celular. Sin embargo,
cuando se incrementa la cantidad de especies reactivas se desarrolla un estrés
oxidativo que produce daños en las células, sobre todo a las proteínas y membranas
lipídicas. La acumulación de especies reactivas de oxígeno puede ser responsable
de complicaciones como inflamación cutánea, melanoma y cáncer de piel (Masaki,
2010).
Actualmente, se ha estudiado la actividad antioxidante de diversos compuestos a
partir de organismos marinos, entre ellos, los polifenoles que son los metabolitos más
abundantes en las algas pardas y presentan propiedades antioxidantes con
importante aplicación para el cuidado de la piel (Nichols & Katiyar, 2010). En la Tabla
II, se presentan algunos ejemplos de los principales componentes obtenidos de
macroalgas, que son reportados como antioxidantes.
Se han realizado pruebas con extractos de Laminaria digitata, Himanthalia elongata,
Fucus vesiculosus, F. serratus y Ascophyllum nodosum, relacionados con captación
de radicales libres, para determinar su actividad antioxidante; además mostraron
sinergia con la vitamina E que indica una gran capacidad oxidativa (Le Tutour et al.,
1998; Kang et al., 2004; 2012).
Para el año 2000, Chkhikvishvili y Ramazanov determinaron el porcentaje en peso
seco de compuestos fenólicos en varias algas pardas, encontrando mayor porcentaje
en Cystoceira compressa con 4.83% mientras que Padina pavonica fue una de las
más bajas con 0.69%; identificaron florotaninos acetilados en Cystoceira compressa,
los cuales se sometieron a la prueba de actividad antioxidante con el radical libre
estable 2,2-difenil-1-picrilhidracilo (DPPH) al igual que los antioxidantes comerciales
pycnogenol y floroglucinol siendo éstos últimos los que presentaron mayor actividad.
22
2.4. Extracto de algas con actividad inhibitoria de la enzima tirosinasa
La melanina es el principal pigmento del color de la piel humana, es secretada por
los melanocitos de las células en la capa basal de la epidermis. En la síntesis de la
melanina, la enzima tirosinasa es parte fundamental, regula directamente la cantidad
de melanina producida, mientras que otras enzimas sólo modifican el tipo de
melanina que es sintetizada en las rutas bioquímicas de la pigmentación (Ando et al.,
2007). El exceso de actividad de esta enzima provoca una sobreproducción de
melanina y consecuentemente la hiperpigmentación de la piel (Briganti et al., 2003) y
en algunos casos el desarrollo de melanomas. Por lo tanto, una serie de agentes
despigmentantes se han desarrollado para estos problemas. El uso de inhibidores de
la tirosinasa, tales como el ácido kójico y la hidroquinona, se utilizan cada vez más,
debido a sus efectos antipigmentarios (blanqueo). Dichos agentes, a menudo
desarrollan inflamación en la piel, por lo que se están buscando alternativas a los
mismos, incluyendo compuestos de origen algal (Shalini et al., 2012).
Se han identificado compuestos a partir de organismos marinos que son aplicables
en cosméticos como agentes aclarantes de la piel y también como fármacos para su
uso en el tratamiento de trastornos de la pigmentación a través de la inhibición de la
enzima tirosinasa. Por ejemplo, el compuesto florotanino 7-floroeckol aislado del alga
parda Ecklonia cava (Figura 4), ha sido reportado como un agente potencial de
despigmentante de la piel a través de la reducción o inhibición de la tirosinasa en la
melanogénesis (Kim et al., 2008). En la Tabla II, se muestran los compuestos activos
responsables de la inhibición de la tirosinasa en la síntesis de la melanina.
Figura 4. Estructura del florotanino 7-floroeckol aislado del alga parda Ecklonia cava.
23
Tabla II. Ejemplos de componentes obtenidos a partir de macroalgas con actividad antitirosinasa (Tomada y modificada de Thomas & Kim (2013); Balboa et al., 2015)
Componente activo Organismo Actividad Potencial aplicación
Autor
Dieckol E. cava Inhibidor tirosinasa
Despigmentante Kang et al., 2012
Diphlorethohydroxycarmaol E. cava Inhibidor tirosinasa
Despigmentante Heo et
al., 2010
Fucoxantina E. cava Antioxidante Antienvejecimiento Heo et
al., 2009
Florotaninos E. cava MMP
inhibición Anti envejecimiento
Li et al., 2011
Extractos con diferente solvente
Pseudomonas Antioxidante Despigmentante Kang et al., 2011
Polisacáridos sulfatados: fucoidan
Sargassum sp., Fucus
vesiculosus
Antioxidante
Anti cancerígena,
antimelanoma Li et al.,
2011
2.5. Actividad antitumoral
El cáncer es un grupo de enfermedades caracterizadas por la proliferación excesiva
de células anormales que invaden y alteran los tejidos circundantes (Gennari et al.,
2007). Según Erb et al. (2005) los cánceres de piel son las neoplasias más
frecuentemente diagnosticadas, mientras que su incidencia va en aumento, debido a
la alta exposición a radiación ultravioleta (UV). El melanoma, un tumor cancerígeno
que se origina en los melanocitos, frecuentemente es causado por altas dosis de
radiación UV que superan la capacidad antioxidante protectora natural de la piel
(Sander et al., 2004). Debido a los efectos secundarios tóxicos y adversos de las
drogas sintéticas utilizadas en el tratamiento de estas enfermedades, se buscan
alternativas menos drásticas y más seguras para el tratamiento de dichos
padecimientos (Harun-ur-Rashid et al., 2002).
Existen referencias donde se ha reportado el aislamiento de los compuestos con
propiedades antitumorales a partir de organismos marinos (González et al., 1982;
Fadli et al., 1991; Kim et al., 2008; Nobili et al., 2009; Islam et al., 2009). Por lo
anterior, en la actualidad, se utilizan diferentes bioensayos que ofrecen grandes
ventajas para la identificación de compuestos y extractos con actividad
anticancerígena. El bioensayo de disco de papa es uno de ellos, se desarrolla con
base a la inducción de formación de tumores provocados por la infección producida
24
por la bacteria Agrobacterium tumefeciens. El mecanismo tumorigénico iniciado por
A. tumefaciens en las plantas, es similar a la generación de tumores en animales
(Anand & Heberleim, 1977; Ferrigni et al., 1982; McLaughlin, 1992; Hostettmann et
al., 1997). Durante la infección del material vegetal con A. tumefaciens, un tumor es
inducido por el plásmido Ti, encontrado en el ADN de la bacteria, el cual es
incorporado en el ADN cromosomal de la planta. El plásmido Ti causa multiplicación
rápida de las células, por consiguiente, la formación de tumores (Kunik et al., 2001;
Tzfira & Citovsky 2001). Dicho ensayo ha sido reportado como un bioensayo claro y
fiable de actividad antitumoral (McLaughlin, 1992; Coker et al., 2003).
El ensayo de disco de papa se ha utilizado mayormente para determinar la actividad
biológica de plantas terrestres. Sin embargo, se ha implementado para evaluar
extractos y compuestos de origen marino, tal es el caso del trabajo realizado por El-
Masry et al. (1995), donde fueron evaluados 35 extractos de 17 especies de algas
marinas, recolectas en diferentes estaciones del año, para identificar actividad anti-
tumorigénica. 11 de los extractos mostraron inhibición de la formación de tumores
mayor al 20% (Codium tomentosum, invierno; Jania rubens, verano; Padina paoonia,
invierno), lo cual es considerada por los autores como una actividad alta.
Por otra parte, estudios in vitro han demostrado que las algas marinas son fuente de
compuestos con actividad citotóxica, ejemplo de ello, son el trabajo de Yuan & Walsh
(2006), donde reportan actividad antiproliferativa de los extractos de Palmaria
palmata, Laminaria setchellii, Macrocystis pyrifera y Nereocystis luetkeana sobre la
línea celular de adenocarcinoma de humano. El extracto de Stypopodium zonale
también demostró gran actividad citotóxica contra la línea celular de melanoma
humano (Rocha et al., 2007).
Se ha encontrado que varias especies de algas marinas producen metabolitos
secundarios (bromofenoles, florotaninos, flavonoides, esteroles, carotenoides,
polisacáridos, entre otros) con actividad antitumoral (Blunt et al., 2006). Los
polisacáridos extraídos de Sargassum stenophyllum y de Capsosiphon fulvescens
inhibieron la migración y la viabilidad de las células de melanoma humano in vitro e in
vivo (Dias et al., 2005) y la inducción de apoptosis en células gástricas humanas
25
(Kwon & Nam, 2007), respectivamente. Los fucanos de bajo peso molecular
extraídos de Ascophyllum nodosum mostraron actividad antiproliferativa contra el
adeno-carcinoma de colon humano (Ellouali et al., 1993) y la línea celular de
carcinoma broncopulmonar (Riou et al., 1996).
Por otro lado, los esteroles aislados de Galaxaura marginata y de Galaxaura
oblongata han demostrado ser citotóxicos a varios tipos de células cancerígenas
(Maruyama et al., 1991; Sheu et al., 1996; Huang et al., 2005). Además, estudios en
modelos con roedores, muestran actividad en especies de algas rojas y verdes
contra la carcinogénesis de mama (Funahashi et al., 2001), intestinal y de la piel
(Higashi-Okai et al., 1999).
2.6. Algas como ingredientes en cosmecéuticos
Los cosmecéuticos han atraído la atención de nuevas investigaciones debido a sus
efectos benéficos sobre la salud humana. De tal forma que, se ha reconocido a los
extractos y compuestos derivados de las algas marinas con propiedades que pueden
aplicarse al desarrollo de cosmecéuticos ya sea como ingredientes en su producción,
principalmente polisacáridos, como el alginato, el agar y los carragenanos (Pulz &
Gross, 2004). Estos actúan como aditivos que contribuyen a las propiedades como la
textura, el olor, el color, así como la estabilización y conservación de los productos,
también actúan como un ingrediente activo en cremas hidratantes, bloqueadores
solares y cremas blanqueadoras principalmente para el cuidado de la piel.
El ingrediente activo es la principal sustancia o sustancias que confieren al
cosmecéutico la actividad requerida. Existen varias formulaciones de cosmecéuticos
como cremas, geles y tónicos, elaboradas en función de su capacidad y eficiencia de
penetración y aceptación en la piel. En la Tabla III, se mencionan algunos extractos y
moléculas de las macroalgas que han sido descritas con propiedades como anti-UV,
fotoprotección, antipigmentación y antioxidantes (Bedoux et al., 2014). Lo anterior
pone de manifiesto el gran potencial de las algas, sus extractos y sus componentes
aislados, para su aplicación como ingrediente activo en formulaciones cosmecéuticas
para el cuidado de la piel.
26
Tabla III. Ejemplos de extractos y compuestos obtenidos a partir de macroalgas utilizados en cosmecéuticos (Tomada de Bedoux et al., 2014; Wang et al., 2015).
Macroalga Metabolito Producto Actividad Manufactura Referencia
Phaoephyceae
Fucus
vesiculosus Fucoidan -
Antioxidante
Estimulación de
fibroblastos
- Ruperez et
al., 2002
Fucus
vesiculosus -
Topical
cosmetic
Tratamiento para
la prevención de
celulitis
Oriflame Al-bader et
al., 2012
Kjellmaniella Fucoidan -
Antienvejecimiento Takara Bio Inc. Mizutani et
al., 2010
Padina pavonica - -
Diferenciación de
queratinocitos
Activación de
sintesís de
proteína
Texinfine
Patrinove
Mizutani et
al., 2010
Gutiérrez,
1995
Pelvetia
canaliculata
Flavonoides
Aminoacidos
-
Antioxidantes
Síntesis de
colágeno
-
Hupel et al.,
2011
Ascophyllum
nodosum - Algowhite
Inhibición de la
tirosinasa
Antiradicales libres
Codif int
Codif
Recherche
et Nature,
2016
Sargassum
polycystum
Saponinas
Flavonoides
Taninos
Terpenoides,
Fenoles
Aminoacidos
- Antipigmentación -
Song et al.,
2009
Chan et al.,
2011
Rhodopyceae
Corallina
officinallis Sulfatos
- Antioxidante
- Yang et al.,
2011
Palmaria palmata - -
Anti-UV Yuang et al.,
2009
Porphyra
haytanensis
Galactanos
sulfatados
- Actividad
antioxidante
- Zhang et al.,
2004
Chlorophyceae
Ulva lactuca clay-
polisacáridos Revertime Antioxidante Olmix
Demais et al.,
2007
27
3. JUSTIFICACIÓN
Las algas son un recurso renovable en el medio marino y una fuente de un amplio
rango de compuestos con actividades biológicas (Chandini et al., 2008; Kim 2010;
Pérez et al., 2016). Por lo tanto, las algas pueden ser una fuente natural para la
obtención de fármacos y la elaboración de cosmecéuticos entre otras aplicaciones
(Plaza et al., 2008). En las costas de la Península de Baja California se han descrito
alrededor de 650 especies de macroalgas de las cuales 55 son de importancia
económica (Pedroche & Santiés, 2003). Algunas especies de los géneros Sargassum
y Ulva son productoras de altas biomasas (Pacheco-Ruíz & Zertuche-González,
1996). Estas especies, ya sea por su ciclo de vida o por fenómenos ambientales
(ciclones, oleaje, etc.), terminan en arribazones en las playas sin aprovecharse,
ocasionando, en algunos casos, malos olores por efecto de su descomposición.
Además de dar mal aspecto a las playas, esto causa un problema serio de índole
económico y ecológico e implica costos de mantenimiento para la remoción del
material varado (SAGARPA, 2012; Pacheco-Ruíz & Zertuche-González, 1996). El
material algal removido termina en la basura como confinamiento final, es decir se
desecha un material que pudiera ser aprovechado para la generación de productos
de interés comercial, como alimento para ganado, fertilizantes o para la elaboración
de productos para el cuidado de la piel (Pacheco-Ruíz et al., 2003). En México se
debe avanzar en investigaciones sobre algas marinas, evaluar sus componentes, así
como se realizar bioensayos con los diferentes productos encontrados. Por lo tanto,
el empleo de las algas marinas como compuestos cosmecéuticos es una alternativa
para aprovechar sus características, además de beneficiarse por la bioactividad
positiva que pueden tener los diferentes componentes de las algas y sus
aplicaciones para el aprovechamiento de este recurso.
28
4. HIPÓTESIS
Las macroalgas se encuentran expuestas a diversos factores que las someten a
continuo estrés ya sea biótico (depredación, competencia, epifitismo, patógenos) o
abiótico (luz, nutrientes, oxígeno, etc.), para disminuir el efecto de éstos, las
macroalgas generan compuestos específicos y necesarios para protegerse. Por lo
que se plantea que los extractos de las algas tendrán un efecto multifuncional
(antimicrobiana, antioxidante, inhibidora de enzimas y antitumoral) debido a su
amplio rango de compuestos, que pueden ser aprovechados para la generación de
productos del cuidado de la piel.
5. OBJETIVO
Evaluar la actividad biológica como un indicador de la potencial aplicación
cosmecéutica de extractos algales de 19 especies recolectadas de la Bahía de La
Paz.
OBJETIVOS PARTICULARES
A. Obtener extractos etanólicos a partir de macroalgas
B. Determinar la actividad antimicrobiana de los extractos obtenidos.
C. Evaluar el efecto fotoprotector por actividad secuestrante de radicales libres.
D. Determinar el porcentaje de inhibición de la enzima tirosinasa.
E. Evaluar la actividad antitumoral in vitro.
F. Analizar el perfil de compuestos de los extractos por análisis fitoquímico.
29
6. MATERIAL Y MÉTODOS
6.1. Recolecta de macroalgas y obtención de extractos
Las macroalgas Laurencia lajolla y Caulerpa sertularioides fueron recolectadas en la
zona de Caleritas; Ulva lactuca fue obtenida en la zona de Punta Roca Caimancito
en Bahía de La Paz, BCS., México (Figura 5). Se obtuvieron de la zona intermareal,
se colocaron en bolsas etiquetadas y se llevaron al laboratorio. Se lavaron con agua
para eliminar epifitos y arena. Se secaron directo al sol y se almacenaron hasta el
momento de su evaluación. Se preservó un espécimen de cada alga y fueron
enviadas al Laboratorio de Botánica Marina de la U.A.B.C.S para su posterior
identificación taxonómica.
Figura 5. Localización de las zonas de recolecta 1) Caleritas y 2) Punta Roca Caimancito, B.C.S., México.
En las muestras recolectadas se utilizó el mismo protocolo de extracción utilizado en
la obtención de los extractos de la colección. Brevemente: 100g de alga seca y
molida, se extrajeron por maceración con 500 mL de etanol destilado, haciendo
recambios del solvente cada tercer día. La mezcla del solvente y alga fue separada
por filtración simple, el tejido recuperado fue sometido dos veces más al mismo
proceso. Las tres soluciones obtenidas fueron mezcladas y se concentraron a
2
1
30
presión reducida en un rotavapor a temperatura de 40°C. El sólido obtenido fue
colocado en un vial previamente pesado y etiquetado para su posterior evaluación.
6.2. Selección de extractos etanólicos de macroalgas
Se seleccionaron extractos de los tres grupos de algas (Rodhophyta, Ochrophytas y
Chlorophytas) de la colección de extractos etanólicos realizada por Muñoz (2010) del
Laboratorio de Química de Algas Marinas (Tabla IV).
Tabla IV. 19 extractos de algas evaluadas en cada bioensayo
Especie
Chlorophytas
Ulva dactylifera
Caulerpa sertularioides
Cladophora sp.
Enteromorpha sp.
Codium amplivesiculatum
Codium cuneatum
Codium simulans
Rhodophytas
Rhodymenia califórnica
Spyridia filamentosa
Porphyra perforata
Amphyroa velanoides
Hypnea valentiae
Laurencia lajolla
Ochrophytas
Macrocystis pyrifera
Sargassum horridum
Hydroclathrus clathrathus
Dyctiota flabellata
Padina concrescens
Cystoseira osmundacea
31
6.3. Evaluación de actividad antimicrobiana
6.3.1. Microorganismos de prueba
Para la evaluación de la actividad antibacteriana se seleccionaron tres
microorganismos responsables de diversas infecciones cutáneas. La cepa de P.
acnes (Leyden, 2001; Calderone & Fonzi, 2001), implicada en la patogénesis del
acné; la levadura C. albicans, la cual está involucrada en enfermedades de la piel
como la candidiasis cutánea y S. epidemidis una bacteria oportunista colonizadora de
la superficie cutánea y mucosas (Calderone & Fonzi, 2001).
Por otra parte, se evaluó la actividad contra la cepa de A. tumefaciens, involucrada
en la inducción de tumores de tubérculos, principalmente en el cuello y las raíces de
plantas dicotiledóneas y gimnospermas. La inhibición del crecimiento de esta
bacteria, es importante como un criterio de exclusión en el ensayo antitumoral, ya
que es necesario identificar que los extractos no tengan ningún efecto sobre A.
tumefaciens para que pueda ejercer su efecto inductor de tumores (Trigui et al.,
2013).
Cultivo de microorganismos
P. acnes fue cultivada en tubos vacutainer que contenían medio líquido de infusión
de cerebro-corazón (BHI) suplementado con glucosa al 1%. Los tubos fueron
incubados a 37 °C, 72 h, en condiciones anaeróbicas mediante la utilización del
sistema BD GasPakTM EZ (Hayes & Markovic, 2002; Kumar et al., 2007). Candida
albicans fue cultivada en placas de agar dextrosa sabouraud (DSA) y S. epidermidis
en agar tripticaseína de soya (TSA) e incubados a 35 °C durante 24 h, en
condiciones aerobias (Kumar et al., 2007). Para preparar el cultivo de la bacteria A.
tumefaciens se utilizó caldo de Luria Bertani (LB), se mantuvo en incubación a 28 °C
por 48 h en condiciones aerobias (Trigui et al., 2013; Atlas, 2006).
32
6.3.2. Evaluación de la actividad antimicrobiana por el método de difusión en
agar con discos.
Los extractos fueron evaluados utilizando discos de papel filtro Whatman No. 4 de
6.4 mm, impregnados con 2 mg de cada extracto. Los discos impregnados y secos,
fueron colocados sobre la superficie de placas de agar Mueller-Hinton (MH),
inoculadas previamente con una suspensión del microrganismo a evaluar (C.
albicans y S. epidermidis) a una concentración de 106 células mL-1. Las placas se
incubaron a 37 °C por 24 h, posteriormente se midió el diámetro de los halos de
inhibición. Para la evaluación de P. acnes se utilizó una suspensión a una
concentración de 2x108 células mL-1 en agar base y se incubó a 37 °C durante 72 h
en un sistema anaeróbico. Posterior al tiempo de incubación, se determinó como
activos a los extractos que mostraron halo de inhibición. Cada ensayo se realizó por
duplicado (Kumar et al., 2007).
Con el fin de evitar falsos positivos en el ensayo antitumoral, los extractos fueron
evaluados en el ensayo antibacteriano utilizando discos impregnados con 2 mg de
cada muestra, fueron colocados sobre la superficie de placas de agar Mueller-Hinton
inoculadas con A. tumefaciens a una concentración de 106 células mL-1 y fueron
incubados en oscuridad durante 6 días a 25 °C (Trigui et al., 2013).
6.4. Actividad antioxidante
Esta actividad fue evaluada por medio de la reducción del radical libre estable 2,2-
difenil-1-picrilhidracilo (DPPH) utilizando el método autográfico. Las muestras se
colocaron en una placa cromatográfica de sílica gel fase normal. La placa se
desarrolló en una cámara cromatográfica con un sistema eluyente de diclorometano-
metanol (90:10). La placa desarrollada fue rociada con una solución de DPPH al
0.4% en metanol, se mantuvo en reposo y en obscuridad por 30 min. Las zonas
decoloradas en la placa son indicativas de actividad antioxidante (Brand et al., 1995).
33
6.5. Ensayo de inhibición enzimática
6.5.1. Ensayo autográfico: determinación de la actividad antitirosinasa por
medio de cromatografía de capa fina.
Este ensayo cualitativo se realizó con el propósito de seleccionar los extractos
activos, los cuales posteriormente fueron evaluados por el método colorimétrico. La
evaluación se desarrolló con base a lo descrito por Wangthong et al. (2007). Para la
solución de tirosinasa a 3333 U mL-1, se utilizó 1 mL de enzima en 10 mL de buffer
de fosfato a pH 6.5. Para el sustrato se utilizaron 0.0036 g de L-tirosina en 10 mL de
buffer de fosfato para dar una concentración de 2 mM.
Para el ensayo, se utilizó 10 µl de cada extracto disuelto en dimetil sulfóxido (DMSO)/
buffer de fosfato de potasio 50 mM (pH 6.5), se colocaron en una placa de sílica gel
fase normal. La placa se desarrolló en una cámara cromatográfica con un sistema
eluyente de diclorometano-metanol (90:10) y se roció con la solución de L-tirosina (2
mM). Se mantuvo en incubación por 10 min a temperatura ambiente, en seguida se
roció con la solución de tirosinasa y se dejó en incubación por 30 min. La placa con
los reactivos agregados desarrolla una coloración gris-violeta y las zonas
decoloradas sobre la placa indican inhibición de la enzima.
6.5.2. Ensayo colorimétrico de inhibición de la enzima tirosinasa
El porcentaje de inhibición de la tirosinasa, se realizó con algunas modificaciones a
partir del método descrito por Chen y Kubo (2002). Se preparó una solución de cada
extracto a una concentración de 500 µg mL-1, fueron disueltos en una mezcla de
DMSO/ buffer de fosfato de potasio 50 mM (pH 6.5). El ensayo se realizó en
microplacas de 96 pozos, se colocó 70 µl de extracto y 30 µl de tirosinasa (333 U mL-
1 en buffer de fosfato, pH 6.5). Esta mezcla se dejó incubando 5 min y se adicionó
110 µL de sustrato (L-tirosina 2 mM). Las microplacas fueron incubadas por 30 min a
una temperatura de 30 °C. Se realizaron 10 lecturas durante 5 min en un
espectrofotómetro a 450 nm. Cada ensayo se realizó por cuadruplicado. Los
resultados se reportaron como promedio y desviación estándar. El ácido kójico se
34
utilizó como inhibidor estándar y se asignó como muestra control la celda con la
solución sin extracto. El porcentaje de inhibición se determinó mediante la siguiente
ecuación:
Donde: A0= absorbancia del control y A1= absorbancia con el extracto a evaluar.
6.6. Evaluación de la actividad antitumoral in vitro en disco de zanahoria
El ensayo se realizó con algunas modificaciones al método descrito por Ferrigni et al.
(1982). Se indujeron tumores en discos de zanahoria por medio de la bacteria A.
tumefaciens; se seleccionaron sólo los extractos que no tuvieron ningún efecto sobre
la bacteria, ya que se buscó que los extractos inhiban la generación de tumores.
Se realizaron experimentos previos para la selección de la mejor fuente de discos de
tubérculos que permitiera el desarrollo adecuado de A. tumefaciens (Trigui et al.,
2013), para ello se evaluaron discos de 1 cm de papa, betabel y zanahoria
obteniendo las mejores condiciones y resultados con discos de zanahoria mini
orgánicas.
Las zanahorias fueron lavadas y desinfectadas con hipoclorito de sodio al 1% por 20
min. Enseguida se eliminó el residuo de hipoclorito con agua destilada y se realizaron
discos de aproximadamente 1 cm de diámetro. Los discos se lavaron y se dejaron
reposar con agua estéril por 5 min, posteriormente fueron colocados sobre papel filtro
Whatman No. 4 en cajas de Petri. Sobre cada disco de zanahoria se agregaron 100
µL del extracto de prueba a una concentración de 0.5 mg mL-1, disuelto en una
solución de DMSO al 5% en agua destilada, seguidamente se adicionaron 100 µL de
la suspensión de A. tumefaciens al 1x109 células mL-1 en buffer de fosfato y
finalmente se agregó 50 µL de agua destilada estéril para evitar la deshidratación de
los discos.
Para la muestra control, se utilizaron discos a los que sólo se les agregó agua-
DMSO- bacteria y otra muestra que contenía la bacteria. El experimento se mantuvo
35
por 30 días a temperatura de 18 °C para evitar la pérdida de humedad. Todo el
procedimiento se realizó bajo condiciones asépticas y en atmósfera controlada.
Se registró el crecimiento de los tumores a los 10, 20 y 30 días; los resultados se
expresaron en relación al número de tumores presentes en el control de la siguiente
forma: cantidad de tumores similar al control (+++), cantidad moderada frente al
control (++), cantidad muy inferior o casi nula frente al control (+) y ausencia de
crecimiento de tumores (NC), lo cual representó actividad antitumoral. Los extractos
(activos) que no permitieron el desarrollo de tumores, fueron evaluados nuevamente
a diferentes concentraciones: 0.05, 0.01, 0.001 y 0.0001 mg mL-1. Se realizó el
conteo de tumores y se determinó el porcentaje de inhibición tumoral relativa (ITR)
de acuerdo a la siguiente formula:
Donde:
Tcontrol: promedio de tumores contabilizados en el control.
Text: promedio de tumores contabilizados en las muestras tratadas con el extracto evaluado.
6.7. Perfil de compuestos por análisis fitoquímico
Se realizó el análisis fitoquímico de cada extracto por medio de cromatografía en
placa de capa fina, para lo cual se preparó una solución de 10 mg mL-1 de cada
extracto. Se colocó 10 µL de cada solución en una placa de sílica gel de fase normal,
la placa fue desarrollada en un sistema eluyente de diclorometano-metanol (90:10) y
el núcleo fitoquímico se determinó de manera cualitativamente por la posible
presencia o ausencia de los diversos metabolitos, determinándose a partir de nivel
de coloración obtenido en la placa de cromatografía al ser aplicado el revelador
específico para cada grupo de metabolitos (Tabla V), siguiendo el método descrito
por Harborne (1991).
36
Tabla V. Revelador utilizado para identificar cada tipo de compuesto
Núcleo fitoquímico Revelador
Alcaloides Dragendorff
Triterpenos y /o esteroles Lieberman-Burchard
Fenoles y taninos Cloruro de hierro
Flavonoides Cloruro de aluminio
Cumarinas Hidróxido de sodio
Saponinas Ácido sulfúrico-Etanol
6.8. Análisis de datos
Se comprobaron los supuestos estadísticos de normalidad (Kolmogorov-Smirnov) y
homocedasticidad y se realizaron análisis de varianza en el ensayo antitumoral. Los
análisis fueron realizados con el software Statistica 8.
7. RESULTADOS
7.1. Extractos etanólicos de macroalgas
Se evaluaron un total de 19 extractos etanólicos, siete de los cuales fueron
Chlorophytas, seis pertenecientes a las Rhodophytas y seis a Ochrophytas (Tabla
IV).
7.2. Actividad antimicrobiana por el método de difusión en agar con discos
De los 19 extractos etanólicos evaluados, ocho extractos inhibieron el crecimiento de
S. epidermidis. De los cuales, tres extractos pertenecen a las Chlorophytas: U.
dactylifera, Cladophora sp. y C. cuneatum. Cuatro extractos pertenecen a las
Rhodophytas: R. califórnica, A. velanoides, H. valentiae y L. lajolla, este último con
un halo de inhibición (12 mm) mayor que los otros extractos y la muestra control. De
las Ochrophytas solo M. pyrifera presentó actividad con un halo de inhibición de 8
mm (Tabla VI).
37
Los extractos evaluados contra C. albicans, nueve resultaron activos: U. dactylifera,
C. sertularioides, Enteromorpha sp. y C. amplivesiculatum con halos de inhibición de
8 mm, al igual que el extracto de M. pyrifera, D. flabellata, H. clathrathus y Spyridia
filamentosa. Sin embargo, el extracto obtenido de L. lajolla mostró el mayor halo de
inhibición (24.5 mm; Figura 6).
Figura 6. Resultado del ensayo de actividad antibacteriana por medio del método de difusión en agar con 2 mg/discos sobre agar MH. Halo de inhibición de 12 mm del extracto de Laurencia lajolla contra Candida albicans.
Los extractos que mostraron actividad contra P. acnes fueron: C. sertularioides,
Cladophora sp., A. velanoides, M. pyrifera, S. horridum, H. clathrathus y L. lajolla
siendo este último extracto el que presentó el mayor halo de inhibición (Figura 7;
Tabla VI).
38
Figura 7. Resultado del ensayo de actividad antibacteriana por medio del método de difusión en agar con 2 mg/discos sobre agar MH. Halo de inhibición de 24.5 mm del extracto Laurencia lajolla contra Propionibacterium acnes.
Por otra parte, los extractos que tuvieron actividad contra A. tumefaciens (Tabla VI);
fueron U. datilifera, C. amplivesiculatum, P. perforata, A. velanoides, S. horridum, D.
flabellata, P. concrescens, L. lajolla y C. osmundacea. Los extractos anteriormente
mencionados, fueron descartados para el ensayo antitumoral en disco de zanahoria.
39
Tabla VI. Halos de inhibición (mm) promedio (n=2) de los extractos de macroalgas contra Staphylococcus epidermidis, Candida albicans, Propionibacterium acnes y Agrobaceterium
tumefaciens.
Extracto S. epidermidis C. albicans P. acnes A. tumefaciens
Ulva dactylifera 8 ± 0 7.5 ± 0.70 - 8 ± 0
Caulerpa sertularioides - 8 ± 0 8 ± 0 -
Cladophora sp. 8 ± 0 - 9 ± 0 -
Enteromorpha sp. - 8 ± 0 - -
Codium amplivesiculatum - 8 ± 0 - 9 ± 0
Codium cuneatum 8 ± 0 - - -
Codium simulans - - - -
Rhodymenia californica 7.5 ± 0.70 - - -
Spyridia filamentosa - 8 ± 0 - -
Porphyra perforata - - - -
Amphyroa velanoides 8 ± 0 - 8.75 ± 0.35 8 ± 0
Hypnea valentiae 8 ± 0 - - -
Laurencia lajolla 10.5 ± 0.70 12 ± 0.70 24.5 ± 0.70 25 ± 0
Macrocystis pyrifera 8 ± 0 8 ± 0 10 ± 0 -
Sargassum horridum - - 9 ± 0 10 ± 0.70
Hydroclathrus clathrathus - 8 ± 0 9 ± 0
Dyctiota flabellata - 8 ± 0 - 10 ± 0.70
Padina concrescens - - - 12 ± 0.70
Cystoseira osmundacea - - - 12 ± 0.70
Control Vancomicina
(8 ± 0.70)
Ampicilina
(8 ± 0.)
Eritromicina
(8 ± 0.70)
(-) no se observó halo de inhibición.
40
7.3. Ensayo autográfico de actividad antioxidante
De los 19 extractos evaluados en este ensayo, los extractos de C. sertularioides, M.
pyrifera, S. horridum, H. clathrathus, D. flabellata y P. concrescens mostraron
actividad antioxidante, siendo estos dos últimos los que provocaron la mayor
decoloración de la placa (Tabla VII).
Tabla VII. Actividad secuestrante de radicales libres de los extractos crudos de macroalgas
Macroalga Actividad antioxidante
Ulva dactilifera -
Caulerpa sertularioides ++
Cladophora sp. -
Enteromorpha -
Codium amplivesiculatum -
Codium cuneatum -
Codium simulans -
Rhodymenia califórnica -
Spyridia filamentosa -
Porphyra perforata -
Amphiroa valonioides -
Hypnea valentiae -
Laurencia lajolla -
Macrocystis pyrifera +
Sargassum horridum +
Hydroclathrus clathrathus +
Dictyota flabellata ++
Padina concrescens ++
Cystoseira osmundacea +
Observaciones en la placa: (-) sin decoloración de la placa, (+) con poca decoloración y (++) con mayor decoloración
41
7.4. Ensayo de inhibición de la enzima tirosinasa
7.4.1. Ensayo autográfico: determinación de la actividad antitirosinasa por
medio de cromatografía de capa fina
En el ensayo autográfico, 17 extractos mostraron inhibición de la enzima tirosinasa,
en la Figura 8 las zonas claras son la decoloración provocada por cada extracto lo
cual indicó la inhibición de la enzima. Los extractos con poca decoloración fueron los
de 4) Enteromorpha sp. y de 8) Rhodymenia califórnica.
Figura 8. Zonas decoloradas que indican inhibición de la enzima tirosinasa de los extractos: 1) U. dactilifera, 2) C. sertularioides, 3) Cladophora sp., 4) Enteromorpha sp. 5) C. amplivesiculatum, 6) C. cuneatum, 7) C. simulans, 8) R. californica, 9) S. filamentosa 10) P. perforata, 11) A. valonioides, 12) H. valentiae, 13) L. lajolla, 14) M. pyrifera, 15) S. horridum, 16) H. clathrathus, 17) D. flabellata, 18) P. concrescens y 19) C. osmundacea. Placas cromatográficas de fase normal desarrollada con CH2Cl2: MeOH (90:10), rociada con el sustrato L-tirosina 2 mM y con la enzima tirosinasa a 3333 U mL
-1.
7.4.2. Ensayo colorimétrico de inhibición de la enzima tirosinasa
En la figura 10 muestran los resultados de la inhibición de la enzima tirosinasa, el
extracto de P. concrescens presentó actividad significativa de inhibición de la enzima
tirosinasa (ANDEVA, P=0.000) e indicó actividad igual al control 100 ± 0.16 %.
De acuerdo a El-Masry et al., (1995), los extractos con actividad inhibitoria fueron los
de C. sertularioides (33.20±0.14), Cladophora sp. (35.67±0.14), A. velanoides
(34.11±0.14), M. pyrifera (34.11±0.15), D. flabellata (34.76±0.17) y al contrario el
extracto con menor inhibición fue L. lajolla (Tabla VIII).
.
1 2 3 4 5 6 7 19 8 9 10 11 12 14 15 16 17 13 19
18
42
Tabla VIII. Porcentaje de inhibición de los extractos de macroalgas evaluados en el ensayo colorimétrico de la enzima tirosinasa.
Extracto Porcentaje de Inhibición
Ulva dactylifera 26.82 ± 0.15
Caulerpa sertularioides 33.20 ± 0.14
Cladophora sp. 35.67 ± 0.14
Enteromorpha sp. 22.00 ± 0.19
Codium amplivesiculatum 13.80 ± 0.18
Codium cuneatum 15.62 ± 0.17
Codium simulans 19.40 ± 0.16
Rhodymenia californica 23.3 ± 0.16
Spyridia filamentosa 14.71 ± 0.17
Porphyra perforata 19.66 ± 0.17
Amphyroa velanoides 34.11 ± 0.14
Hypnea valentiae 29.42 ± 0.14
Laurencia lajolla 11.84 ± 0.0
Macrocystis pyrifera 34.11 ± 0.15
Sargassum horridum 19.27 ± 0.15
Hydroclathrus clathrathus 15.75 ± 0.17
Dyctiota flabellata 34.76 ± 0.17
Padina concrescens 100 ± 0.16
Cystoseira osmundacea 22.91 ± 0.19
Inhibidor Ácido kójico 100 ± 0.0
7.5. Actividad antitumoral de los extractos por el método de disco zanahoria
Para determinar la actividad antitumoral in vitro, previamente se realizó el ensayo
antibacteriano, evaluando los extractos contra la bacteria inductora de tumores A.
tumefaciens, en el cual los extractos U. dactilifera, C. amplivesiculatum, P. perforata,
A. velanoides, S. horridum, D. flabellata, P. concrescens, L. lajolla y C. osmundacea
inhibieron el crecimiento de la bacteria. Por lo tanto, dichos extractos no fueron
evaluados en el ensayo antitumoral.
43
En la Tabla IX se muestra los resultados del ensayo antitumoral, los extractos con
actividad inhibitoria de tumores son: C. sertularioides, Enteromorpha sp., C.
cuneatum, C. simulans, R. californica, S. filamentosa, H. clathrathus e H. valentiae.
Por otra parte, los discos que contenían extracto de Cladophora mostraron poco
desarrollo de tumores.
Tabla IX. Resultados de la actividad antitumoral de los extractos de macroalgas evaluados en el ensayo de disco de zanahoria
Alga Crecimiento de tumores
Caulerpa sertularioides NC
Enteromorpha NC
Codium cuneatum +
Codium simulans NC
Rhodimenia califórnica NC
Spyridia filamentosa +
Hypnea valentiae NC
Sargassum horridum ++
Hydroclathrus clathrathus NC
Disco con bacteria +++
Disco con PBS y bacteria (control) +++
Disco con DMSO y Bacteria +++
Disco con solo agua NC
Disco con agua y bacteria ++
Buffer NC
Cantidad de tumores: similar al control (+++), moderada frente al control (++), casi nula (+) y
no crecimiento de tumores (NC).
44
En el ensayo antitumoral con diferentes concentraciones, el extracto de H.
clathrathus resultó con actividad antitumoral con un porcentaje de inhibición
significativo (ANDEVA, P= 0.0001) en todas las concentraciones evaluadas. Dicho
extracto mantuvo los discos sin presencia de tumores durante los 30 días del
experimento. El extracto de C. cuneatum presentó inhibición de tumores entre un 96
y el 100%. Por otra parte, como se puede observar en la Tabla X, el extracto con
menor porcentaje de inhibición fue el de Enteromorpha sp. a una concentración de
0.0001 µg mL-1 (43%).
Tabla X. Porcentaje de inhibición tumoral relativa (ITR) de los extractos de macroalgas evaluados.
Inhibición de tumores (%)
Concentración (µg mL
-1) Cs E sp. Ca Cc Csi Rc Sf Hv Hc
0.05 96±0 100±0 99±0 98±0.7 92±0.7 97±0 99±0 92±0 100±0
0.01 96±0.5 75±0.5 100±0 96±0 85±0.7 93±0.5 100±0.5 85±0.7 100±0
0.001 95±1 60±0.5 100±0 100±0 89±0.7 100±0 99±0.5 97±0 100±0
0.0001 94±0 43±0 91±1 100±0 78±0.7 93±0.5 100±0 89±0.7 100±0
Cs: C. sertularioides, E sp.: Enteromorpha sp., Ca: C. amplivescivulatum, Cc: C. cuneatum,
Csi: C. simulans, Rc: R. californica, Sf: S. filamentosa, Hv: H. valentiae, Hc: H. clathrathus
7.6 Análisis fitoquímico de los extractos
El análisis fitoquímico de los extractos de las algas verdes (U. dactylifera, C.
sertularioides, Cladophora sp., Enteromorpha sp., C. amplivesiculatum, C. cuneatum
y C. simulans) determinó la presencia de antraquinonas y saponinas, seguido de
fenoles, taninos y flavonoides. En menor presencia fueron los compuestos de tipo
alcaloides para los extractos de C. sertularioides y Cladophora. La presencia de
antronas solo se observó en el extracto de C. cuneatum.
Las algas rojas (R. californica, S. filamentosa, L. lajolla, A. velanoides y H. valentiae)
indicaron presencia de fenoles, flavonoides y saponinas. No obstante, los
compuestos en menor abundancia fueron los alcaloides, antronas y antraquinonas.
45
Sin embargo, el extracto L. lajolla fue el único extracto que indicó presencia de
triterpenos (Tabla XI).
En el análisis de los extractos de algas cafés, los alcaloides, flavonoides,
antraquinonas y saponinas fueron los de mayor presencia, seguido de los taninos y
esteroles. Los esteroles fueron identificados en los extractos de M. pyrifera, D.
flabellata y P. concresces. El grupo de compuesto tipo antronas solo se observó en el
extracto de D. flabellata. Por el contrario, los triterpenos y cumarinas no se
identificaron para estos extractos.
46
Tabla XI. Análisis fitoquímico de extractos de especies de macroalgas (+++ abundante, + +moderado, +poca y – ausente).
Especie Alcaloides Triterpenos Esteroles Fenoles Taninos Flavoniodes Cumarinas Antraquinonas Antronas Saponinas
Ulva dactylifera + - - + ++ ++ - ++ - ++
Caulerpa sertularioides ++ ++ - - ++ +++ - ++ - ++
Cladophora ++ - ++ ++ - + - ++ ++
Enteromorpha + - - - ++ + - ++ - ++
Codium amplivesiculatum - - - + ++ ++ ++ ++ - ++
Codium cuneatum - - ++ ++ - + - ++ ++ ++
Codium simulans + - ++ ++ - ++ ++ ++ ++
Rhodymenia califórnica + - - ++ - ++ - - ++ ++
Spyridia filamentosa - - - + - ++ - - ++ ++
Laurencia lajolla ++ +++ - ++ - ++ - - - +
Porphyra perforata - - - ++ - ++ - - - ++
Amphyroa velanoides ++ - - + - ++ - ++ - ++
Hypnea valentiae ++ - - ++ - + - ++ - ++
Macrocystis pyrifera ++ - ++ ++ - +++ - ++ - ++
Sargassum horridum ++ - + + ++ ++ - ++ - ++
Hydroclathrus clathrathus ++ - ++ + ++ ++ - ++ - +++
Dyctiota flabellata ++ - ++ - ++ ++ - - ++ ++
Padina concrescens ++ - ++ ++ - +++ - ++ - +++
Cystoseira osmundacea ++ - - - ++ ++ - ++ - +
47
8. DISCUSIÓN
Las algas sobreviven dentro de comunidades asociadas con otros organismos en un
entorno competitivo, por lo cual producen metabolitos secundarios complejos como
respuesta a la presión ecológica (Pérez et al., 2016). Varios autores han reportado
una diversidad de metabolitos con actividad antimicrobiana, anti tumoral, anti
oxidante, antitirosinasa y anti cancerígenas.
A partir de extractos de algas se busca compuestos que presenten propiedades con
aplicación para el desarrollo de nuevos productos cosmecéuticos. Se han realizado
estudios sobre los aspectos generales, estructuras químicas, propiedades físicas y
bioquímicas, y aplicaciones biotecnológicas de sustancias bioactivas derivadas de
organismos marinos para ser utilizados en productos cosmecéuticos.
En este trabajo se evaluó la actividad antibacteriana, antioxidante, antitirosinasa y
antitumoral de 19 extractos de algas, con el objetivo de determinar propiedades
biológicas de interés que les permita en un futuro ser considerados como
ingredientes activos para desarrollar un producto cosmecéutico.
Actividad antimicrobiana
Los trabajos de actividad antimicrobiana reportan la diferencia estructural de las
bacterias, la cual es importante en la susceptibilidad ante los compuestos de
extractos algales. Por esta razón, la efectividad de los extractos, contra bacterias
Gram positivas se debe a que no presentan una membrana externa, la cual puede
ser alterada con facilidad por compuestos que pueden interrumpir la fuerza motriz de
protones, el flujo de electrones y el transporte activo (Burt, 2004).
En este trabajo se demostró que los extractos de U. dactylifera, Cladophora sp., C.
cuneatum, R. californica, A. velanoides, H. valentiae, L. lajolla y M. pyrifera,
presentan actividad contra bacterias Gram positiva. Esta inhibición se debe a la
presencia diversos compuestos como: alcaloides, triterpenos, esteroles,
antraquinonas y en mayor presencia los flavonoides (Lee et al., 2013).
48
La poca actividad contra bacterias Gram negativas se debe a la presencia de la
membrana externa que rodea la pared celular, de este modo existe la restricción de
difusión de los compuestos hidrófobos a través de este revestimiento de
lipopolisacárido (Balboa et al., 2015). Aún con lo anterior, se determinó actividad
contra bacterias Gram negativas y contra Candida albicans (Tabla VI).
En el ensayo antimicrobiano los extractos de L. lajolla y M. pyrifera, demostraron
actividad contra los microorganismos evaluados. Sin embargo, el extracto de L.
lajolla presentó halos de inhibición de mayor diámetro con respecto a los otros
extractos y a la muestra control (Tabla VI). El efecto de los extractos activos se
relaciona particularmente con la presencia de fenoles (Eom et al., 2011), lo cual se
corroboró en el análisis fitoquímico.
Adicionalmente, las algas rojas son conocidas por producir una serie de compuestos
fenólicos halogenados (Vairappan et al., 2001; Liu et al., 2011), principalmente
bromofenoles (Figura 9) con diversas actividades biológicas entre las que se
encuentran actividad antibacteriana, antioxidante, anticancerígena y antitrombotica
(Ming et al., 2011), lo anterior, indica que la actividad del extracto de L. lajolla contra
los microorganismos patógenos evaluados en este trabajo es por la presencia de ese
tipo de compuestos. Específicamente del género Laurencia, se han aislado
compuestos sesquiterpenos (Laurene) reportándolos con mayor actividad frente a
bacterias Gram positivas y hongos como C. albicans (Alarif et al., 2012; Balboa et al.,
2015). En el presente estudio, L. lajolla reveló compuestos similares a los
mencionados, debido a que fue el único extracto que presentó triterpenos en su perfil
fitoquímico, no obstante, la actividad antibacteriana del extracto de Macrocystis
pyrifera, se atribuye a la presencia de metabolitos de tipo polifenoles e
hidroquinonas.
49
Figura 9. Compuestos bromofenoles aislados del alga roja Symphyocladia latiuscula: 1.1) (2R)-2-(2,3,6-tribromo-4,5-dihidroxybenzil)-ciclo hexano, 1.2) 2,3,6-tribromo-4,5-dihidroxibenzilalcohol, 1.3) 1-(2,3,6-tribromo-4,5-dihidroxibenzil) pirrolidin; 1.4) 2,3 1.4) 2,3,6-tribromo-4,5-dihidroxibenzil metil sulfano (Tomado de Liu et al., 2011).
Metabolitos secundarios derivados del phloroglucinol (florotaninos) como eckol,
fucofuroeckol y dieckol (Figura 10) también han sido relacionados con la actividad
antibacteriana contra cepas del Genero Staphylococcus (Lopes et al., 2012; Eom et
al., 2013), además de actividad anticancerígena y actividad antioxidante, estos
florotaninos han sido aislados de algas pardas de los géneros Macrocystis, Padina,
Cystoseira, Hydroclathrus, Ecklonia y Sargassum, por nombrar algunas (Schulz et
al., 1991; Cahyana et al., 1992; Kang et al., 2003; Dias et al., 2005; Kang, 2012;
Ayyad et al., 2011). El análisis fitoquímico dio evidencia de la presencia de
compuestos que puede ser responsables de la actividad mostrada por M. pyrifera, S.
horridum, D. flabellata y H. clathrathus. Además, también se ha reportado la actividad
antimicrobiana de terpenos, alcaloides, flavonoides y saponinas (Pérez et al., 2016),
los cuales están presentes en los extractos de las algas evaluadas.
Del género Sargassum se ha reportado al diterpeno sargafuran con importante
actividad inhibitoria para la bacteria P. acnes (Kamei et al., 2009; Balboa et al.,
2015), el extracto de S. horridum sólo inhibió el crecimiento de P. acnes y A.
tumefaciens. Es posible que la actividad contra P. acnes se deba a la presencia de
sargafuran en el extracto.
El uso combinado de los extractos de M. pyrifera o L. lajolla con el de S. horridum en
un producto cosmecéutico tendría un efecto benéfico muy prometedor para
tratamientos de infecciones cutáneas provocadas por microorganismos como P.
acnes, S. epidermidis y C. albicans y probablemente un efecto conservador debido a
que los extractos de M. pyrifera y L. lajolla inhibieron el crecimiento de bacterias
50
Gram negativas, Gram positivas y contra hongos, lo cual cubre de manera
representativa a los tres principales grupos de microorganismos.
Los extractos orgánicos con actividad antimicrobiana son de particular interés por su
aplicación en la producción de cosmecéuticos, por sus diferentes enfoques: como
conservador, aumentando la vida de anaquel del producto y evitando el uso de
conservadores, adicional a su efecto protector de la piel.
Figura 10. Estructuras derivadas de florotaninos obtenidos a partir de algas marinas: 1) phloroglucinol,
2) eckol, 3) fucofuroeckol-A, 4) phlorofucofuroeckol-A, 5) dioxinodehydroeckol, 6) 8,80-bieckol, 7) 7-
phloroeckol, y 8) dieckol (Tomada de Thomas & Kim, 2013).
51
Inhibición de la enzima tirosinasa
La cosmecéutica busca fuentes naturales de inhibidores de tirosinasa para su
aplicación en productos cosméticos y médicos para controlar la hiperpigmentación
cutánea (Xu et al., 1997; Kim et al., 2002; Pérez-Bernal et al., 2002). En el presente
estudio, los extractos con actividad inhibitoria de la enzima tirosinasa fueron los
obtenidos a partir de C. sertularioides (Chlorophyta); A. flabellata (Rhodophyta); P.
concrescens, M. pyrifera y D. flabellata (Phaeophytas).
De las 19 algas evaluadas P. concrescens demostró un porcentaje de inhibición
mayor con respecto al control y comparativamente similar con lo reportado por Cho
et al. (2011) que evaluó el efecto antipardeamiento de 43 algas marinas; solo
Endarachne binghamiae, Schizymenia dubyi, Ecklonia cava y Sargassum
siliquastrum inhibieron la tirosinasa de manera similar al control.
Existen trabajos que muestran la capacidad de extractos obtenidos a partir de algas,
para actuar como agentes despigmentantes de la piel y con propiedades para inhibir
la tirosinasa. Así mismo se ha reportado la correlación entre la actividad de captación
de radicales libres y la actividad de inhibición de esta enzima (Vidal et al., 2001;
Wang et al., 2001; Choi et al., 2011). Dicha actividad se debe a compuestos tipo
fenoles, que han sido caracterizado en algas cafés y en algunas algas rojas; los
cuales se consideran inhibidores eficaces de la tirosinasa e ingredientes potenciales
para el tratamiento de trastornos dermatológicos asociados con la melanina y
aquellos provocados por el estrés oxidativo (Li et al., 2011).
En el presente trabajo se demostró que el extracto P. concrescens inhibe la enzima
tirosinasa, posiblemente en combinación con su capacidad de captación de radicales
libres y al efecto sinérgico de moléculas. Dado que el análisis fitoquímico demostró
presencia de compuestos tipo alcaloides, esteroles, antraquinonas y en mayor
presencia fenoles y flavonoides.
Recientemente, diversos estudios se han enfocado en aislar y caracterizar
compuestos como floroglucinol, eckol y dieckol a partir de algas cafés; por su efecto
52
inhibidor de la enzima tirosinasa, entre ellos el dieckol que demostró tener mayor
actividad que el ácido kójico (Choi et al., 2011). Por su parte, Chan et al. (2011),
evaluaron extractos algales, logrando reducir la actividad de la tirosinasa, sin
embargo, no superó la actividad del ácido kójico. Según los autores dicho resultado
está relacionado por la presencia de saponinas, flavonoides, taninos, terpenoides,
fenoles, azúcares, aminoácidos y aminas en las fracciones activas, que han sido
referidos con actividad antioxidante, antiinflamatoria, antiviral, antitumoral y
antidiabetes (Mori et al., 2006; Hur et al., 2008; Chan, 2009; Munir et al., 2013).
Considerando los resultados obtenidos, los extractos P. concrescens, M. pyrifera y S.
horridum indican ser candidatos como ingredientes potenciales para la elaboración
de productos cosmecéuticos, a causa de la actividad múltiple y a la presencia de
compuestos como florotaninos y flavonoides.
Actividad antitumoral in vitro de los extractos por inhibición del crecimiento
tumoral en disco de zanahoria.
Se ha reportado que la inducción de tumores por medio de la bacteria A. tumefaciens
en el ensayo de disco de papa, es un método útil para comprobar propiedades
biológicas e identificar compuestos antitumorales (Galsky et al., 1980; Islam et al.,
2009). Se ha evidenciado la actividad de moléculas antitumorales conocidas y de uso
terapéutico como el vinblastin, paclitaxel y vincristin por medio de este método,
dando validez y soporte al uso de éste para la detección de actividad antitumoral
(Kempf et al., 2002; Coker et al., 2003, David, 2004; Srirama et al., 2007). Varios
estudios han encontrado una similitud significativa entre los mecanismos utilizados
en las plantas y los seres humanos (David, 2004).
De acuerdo a lo obtenido, se puede descartar la posibilidad de falsos positivos en la
actividad antitumoral, debido a que, solo se evaluaron los extractos que no inhibieron
el crecimiento de la bacteria A. tumefaciens. Los extractos de: C. sertularioides,
Enteromorpha sp., C. cuneatum, C. simulans, R. califórnica, S. filamentosa, H.
clathrathus y H. valentiae, mostraron un alto porcentaje de actividad inhibitoria de
tumores.
53
El-Masry et al. (1995), evaluaron la actividad antitumoral en el ensayo de discos de
papa. Solo nueve de 17 especies mostraron actividad con una inhibición de 20% de
la iniciación del tumor, tres de éstos (Codium tomentosum, Jania rubens y Padina
pavonia) presentaron una actividad relativamente alta. Nuestros resultados
mostraron mayor actividad antitumoral, con una inhibición mínima de 40% que es el
doble de la máxima reportada en los trabajos anteriores. No obstante, la máxima
(100%) actividad antitumoral obtenida en nuestro trabajo fue encontrada con el
extracto de H. clathrathus a una concentración de 1 X 10-4 µg mL-1.
Particularmente, el ensayo antitumoral en disco de papa se ha realizado con mayor
frecuencia para extractos de plantas superiores (Ito et al., 2000), reconociendo a los
compuestos de tipo fenólico con actividad específica sobre mecanismos de control
del ciclo celular y por ende sobre la capacidad de la célula para dividirse. Sin
embargo, según Yoshie et al. (2002), los compuestos polifenólicos como los
derivados del floroglucinol y los flavonoides, son responsables de la mayoría de los
efectos antitumorales y anticancerígenos. En el caso de H. clathrathus la actividad
antitumoral potencial, probablemente se deba, a un efecto sinérgico de varios
compuestos presentes en el extracto. Puede ser debido a la presencia de
compuestos del tipo alcaloide, esteroles, fenoles, antraquinonas y saponinas que han
sido señaladas en la literatura como los responsables de actividad antitumoral (Ito et
al., 2000).
El análisis fitoquímico se llevó a cabo para identificar los componentes presentes en
el extracto de cada alga y relacionar la potencial aplicación de los extractos. Con
dicho análisis, el presente trabajo propone de forma general, los compuestos activos
presentes en los extractos evaluados son en su mayoría polifenoles (florotaninos,
fenoles y flavonoides), alcaloides, saponinas y antraquinonas. Los cuales han sido
reportados como responsables de la actividad biológica (Xu et al., 2002).
La capacidad antioxidante de los compuestos se ha relacionado con la prevención de
varias enfermedades incluyendo el cáncer, las enfermedades de trastornos
inflamatorios, degeneración neurológica y el envejecimiento (Wollgast & Anklam,
2000). Al relacionar el resultado obtenido del ensayo antioxidante y antitirosinasa,
54
con el perfil de compuestos, se pudo observar que el núcleo fitoquímico corresponde
a los alcaloides, fenoles, flavonoides y antraquinonas a los cuales se les atribuye la
actividad observada.
Las algas producen una amplia gama de metabolitos secundarios con actividad
antioxidante, por ejemplo, tocoferol (Yuan & Walsh, 2006), carotenoides, polifenoles
(incluyendo florotaninos (Lee et al., 2013), flavonoides, taninos) y lignanos (Gupta et
al., 2011). A los compuestos fenólicos, se les atribuye principalmente la actividad
antioxidante, sin embargo, los florotaninos, de estructura más compleja, se han
aislado de algas pertenecientes a la clase Phaeophyceae. Dichos compuestos se
caracterizan por poseer diversas actividades biológicas, incluyendo la actividad
antibacteriana (Wijesekara et al., 2010), protección de rayos UV (Artan et al., 2008) y
efectos anti proliferativos (Kong et al., 2009). Con base en lo anterior, la actividad
biológica se puede atribuir a la presencia del conjunto de compuestos de tipo
alcaloides, flavonoides, saponinas, taninos y antraquinonas, principalmente de los
extractos de algas cafés, en la actividad antioxidante, la inhibición de tirosinasa (P.
concrescens) y en la inhibición de tumores (H. clathrathus), en todas las
concentraciones evaluadas. Los dos extractos de algas cafés anteriormente
mencionados no mostraron actividad antibacteriana.
Nuestros resultados sugieren que el extracto de M. pyrifera y el extracto de L. lajolla
tienen actividad antibacterial; los extractos de H. clathrathus y P. concrescens
presentan efecto antioxidante, antitirosinasa y antitumoral. Por lo tanto, la hipótesis
propuesta es aceptada.
55
9. CONCLUSIONES
Los resultados obtenidos indican que los extractos de algas, particularmente los que
presentan compuestos de tipo alcaloides, esteroles, antraquinonas, fenoles y
flavonoides tal como el extracto de L. lajolla, tiene la capacidad de actuar como
agente antibacteriano, debido a que se demostró inhibición en el crecimiento de S.
epidermidis, C. albicans, P. acnes y A. tumefaciens.
El efecto antitumoral in vitro del extracto de H. clathrathus demostró la mayor
actividad. En la búsqueda de la inhibición de la enzima tirosinasa, el extracto de P.
concrescens inhibió significativamente la enzima y también demostró mayor
capacidad de captación de radicales libres.
Debido a las propiedades antibacterianas, antioxidantes y anti enzimática
presentadas por los extractos de L. lajolla y M. pyrifera, se concluye que pueden ser
considerados como candidatos para la formulación de productos cosmecéuticos en el
cuidado de la piel.
Los extractos H. clathrathus y P. concrecens, tienen aplicación potencial como
ingredientes activos en la formulación de productos cosmecéuticos encaminados a la
protección de la piel contra daños ocasionados por el efecto de la radiación UV y el
estrés oxidativo (hiperpigmentación y cáncer de piel).
Los extractos de L. lajolla, M. pyrifera y S. horridum son candidatos potenciales como
ingredientes activos en formulaciones cosmecéuticas para el tratamiento de
infecciones cutáneas, provocadas por P. acnes, S. epidermidis y C. albicans.
56
10. RECOMENDACIONES
El fraccionamiento del extracto de S. horridum, para buscar aumentar
considerablemente la concentración de los compuestos activos, e incrementar
su actividad. Por lo que se sugiere continuar con el fraccionamiento de los
extractos para identificar los posibles compuestos activos.
Evaluar la actividad anticancerígena de los extractos que resultaron activos en
el ensayo antitumoral con discos de zanahorias sobre líneas celulares
humanas.
Demostrar la seguridad e inocuidad de los extractos activos, a través de
ensayos de citotoxicidad, antialérgicos, anti inflamación, por nombrar algunos.
Elaborar diversos cosmecéuticos (cremas, geles, jabones, bloqueadores)
utilizando los extractos activos para analizar su efectividad y sus posibles
efectos sobre la piel. En la formulación del cosmecéutico se debe tener en
cuenta el excipiente o vehículo que ayudara ejercer la acción del
cosmecéutico, favoreciendo su aplicación y penetración. El principio activo
que en este caso será alguno de los extractos activos liposolubles o incluso
insolubles, en un sistema estable. Se recomienda buscar el sistema que
permita el transporte de los principios activos a su lugar de acción de forma
precisa y continua.
Adicionalmente, en el presente trabajo se encontró que los extractos de U.
dactilifera, C. amplivesiculatum, P. perforata, A. velanoides, S. horridum, D.
flabellata, P. concrescens, L. lajolla y C. osmundacea, mostraron actividad
inhibitoria de la bacteria Agrobacterium tumefaciens, dicha bacteria es
causante de tumoraciones en diversas plantas de importancia económica por
lo cual su control trae beneficios para los agricultores. Los extractos pueden
ser considerados para aplicación en agricultura en el control de A.
tumefaciens, por lo que se recomienda continuar con el estudio sobre esta vía.
57
11. BIBLIOGRAFÍA
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