actividad anti-inflamatoria in vitro de los...

ACTIVIDAD ANTI-INFLAMATORIA IN VITRO DE LOS EXTRACTOS Y

FRACCIONES OBTENIDAS DE LA CORTEZA INTERNA DE Tabebuia

chrysantha (JACQ.) G.NICHOLSON.

Presentado por:

STEFANYA VELÁSQUEZ GÓMEZ

VANESSA POSADA TABARES

UNIVERSIDAD TECNOLÓGICA DE PEREIRA

FACULTAD DE TECNOLOGÍA

ESCUELA DEQUÍMICA

GRUPO POLIFENOLES

Pereira, Febrero 1 de 2013

GRUPO POLIFENOLES

ACTIVIDAD ANTI-INFLAMATORIA IN VITRO DE LOS EXTRACTOS Y FRACCIONES OBTENIDAS DE LA CORTEZA INTERNA DE Tabebuia


TRABAJO DE GRADO

Requisito parcial para optar al título de Químico Industrial

Presentado por:



Directora:

Dra. LUZ ANGELA VELOZA CASTIBLANCO

Codirector:

Dr. JUAN CARLOS SEPÚLVEDA ARIAS

UNIVERSIDAD TECNOLÓGICA DE PEREIRA

FACULTAD DE TECNOLOGÍA

ESCUELA DE QUÍMICA

GRUPO POLIFENOLES

Pereira, Febrero 1 de 2013

GRUPO POLIFENOLES

NOTA DE ACEPTACIÓN DEL TRABAJO DE GRADO

ACTIVIDAD ANTI-INFLAMATORIA IN VITRO DE LOS EXTRACTOS Y

FRACCIONES OBTENIDAS DE LA CORTEZA INTERNA DE Tabebuia


Presentado por:



Los suscritos director y jurado del presente trabajo de grado, una vez

revisada la versión escrita y presenciado la sustentación oral, decidimos

otorgar la nota de : ______________________

Con la connotación: ______________________

Para constancia firmamos en la ciudad de Pereira hoy

_________________________________.

El director: _________________________________

Nombre: Luz Angela Veloza Castiblanco

Jurado: ________________________________

Nombre: Carlos Alberto Isaza Mejía

GRUPO POLIFENOLES

DEDICATORIA

Les dedicamos este trabajo a nuestras familias por todo el apoyo incondicional

que nos dieron para la realización de este proyecto, por su empeño, dedicación y

constancia que nos permito culminar nuestros estudios.

Stefanya Velásquez Gómez

Vanessa Posada Tabares

GRUPO POLIFENOLES

AGRADECIMIENTOS

Le agradecemos a nuestra familia por el apoyo incondicional que nos brindaron

durante toda nuestra etapa universitaria.

A la vicerrectoría de investigaciones innovación y extensión de la Universidad

Tecnológica de Pereira, por la financiación parcial de este proyecto.

A la Dra. Luz Angela Veloza Castiblanco y al Dr. Juan Carlos Sepúlveda Arias

por habernos permitido desarrollar este proyecto.

A Iván Alberto Lopera Castrillón por el apoyo constante para realizar el

presente trabajo.

A los integrantes del Grupo Polifenoles y el Laboratorio de Fisiología Celular e

Inmunología por toda la compañía y por hacer más agradable el trabajo.

A los trabajadores del jardín botánico de la UTP por su ayuda en la recolección

del material vegetal.

A la oficina de relaciones internacionales de la Universidad Tecnológica de

Pereira, por la financiación parcial del viaje a la Universidad Nacional

Autónoma de México.

Al Dr. Leovigildo Quijano por habernos dado la oportunidad de realizar la

estancia de investigación en el Instituto de Química de la UNAM y

complementar este proyecto.

A nuestros amigos por darnos momentos felices y apoyarnos durante todo este

proceso.

GRUPO POLIFENOLES

TABLA DE CONTENIDO

1 ANTECEDENTES 1

1.1 Surgimiento del problema 1

1.2 Formulación del problema 2

1.3 Objetivos 2

1.3.1 Objetivo general 2

1.3.2 Objetivos específicos 2

1.4 Justificación 3

2 MARCO TEÓRICO 7

2.1 Generalidades de la especie Tabebuia chrysantha 7

2.1.1 Usos y propiedades de la especie Tabebuia chrysantha 8

2.1.2 Compuestos químicos presentes en Tabebuia chrysantha 9

2.2 Inflamación 11

2.2.1 Tipos de inflamación 12

2.2.2 Fases de la inflamación 13

2.2.3 Mediadores de la inflamación 13

2.3 Técnicas para detectar la producción de mediadores de inflamación 18

2.3.1 Prueba de ELISA 18

2.3.2 Reacción en cadena de la polimerasa con transcripción reversa (RT-

PCR) 19

2.4 Anti-inflamatorios no esteroidales (AINES) 21

3 SECCIÓN EXPERIMENTAL 22

3.1 Materiales, equipos y reactivos 22

GRUPO POLIFENOLES

3.1.1 Material vegetal y biológico 22

3.1.2 Equipos 22

3.1.3 Reactivos 23

3.2 Obtención de los extractos 24

3.3 Fraccionamiento del extracto en cloroformo 26

3.4 Perfiles cromatográficos por HPLC 27

3.5 Marcha fitoquímica de la corteza interna de Tabebuia chrysantha 28

3.6 Ensayos biológicos 30

3.6.1 Test de viabilidad celular 30

3.6.2 Determinación de la producción de PGE2 y TNF-α 31

3.6.3 Determinación de la producción de NO 32

3.6.4 Extracción de RNA y análisis por medio de RT-PCR (transcripción

reversa reacción en cadena de la polimerasa) 32

3.6.5 Cuantificación de RNA 33

3.6.6 Electroforesis de los productos de RT-PCR 33

3.7 Fraccionamiento de la fracción F-16 del extracto en cloroformo 33

3.8 Purificación de compuestos de la F-16-3 de la fracción F-16 34

3.9 Espectroscopia de resonancia magnética nuclear (RMN) 34

3.10 Análisis estadístico 35

4 RESULTADOS Y DISCUSIÓN 36

4.1 Rendimiento de extracción 36

4.2 Perfiles cromatográficos por HPLC de los extractos de corteza interna de

T. chrysantha 37

4.3 Marcha fitoquímica 39

GRUPO POLIFENOLES

4.4 Ensayo de viabilidad celular 41

4.5 Actividad anti-inflamatoria in vitro de los extractos de T.chrysantha. 42

4.5.1 Inhibición en la producción de PGE2 42

4.5.2 Inhibición en la producción de TNF-α 43

4.5.3 Inhibición en la producción de óxido nítrico (NO) 44

4.6 CUANTIFICACIÓN DE mRNA EN LA LINEA CELULAR RAW264.7

ESTIMULADAS CON LPS 45

4.7 Efecto de los extractos sobre la expresión de mRNA de COX-2, TNFα e

iNOS en macrófagos murinos RAW264.7 estimulados con LPS. 46

4.8 Rendimiento del fraccionamiento del extracto en cloroformo. 49

4.9 Viabilidad celular de las fracciones del extracto en cloroformo 50

4.10 Efecto de las fracciones del extracto en cloroformo de T. chrysantha

sobre la producción de PGE2, TNF-α y NO 52

4.11 Rendimiento del fraccionamiento de la fracción F16 del extracto en

cloroformo 54

4.12 Purificación de compuestos de la fracción F16-3 54

5 CONCLUSIONES 58

6 RECOMENDACIONES 60

7 BIBLIOGRAFIA 61

GRUPO POLIFENOLES

INDICE DE TABLAS

Tabla 3.1. Condiciones del HPLC-DAD para fracciones polares. .......................... 27

Tabla 3.2. Pruebas de caracterización de compuestos químicos. ......................... 29

Tabla 4.1. Resultados de la marcha fitoquímica del extracto de corteza interna de

T. Chrysantha. ....................................................................................................... 40

Tabla 4.2. Cuantificación de mRNA de los macrofagos RAW264.7 estimulados con

LPS. ....................................................................................................................... 46

Tabla 4.3. Rendimiento del fraccionamiento del extracto en cloroformo ................ 50

Tabla 4.4. Viabilidad celular de los macrófagos RAW264.7 frente a las fracciones

del extracto en cloroformo de T.chrysantha. .......................................................... 51

Tabla 4.5. Rendimiento del fraccionamiento de la fracción F16. ............................ 54

GRUPO POLIFENOLES

INDICE DE FIGURAS

Figura 2.1. Compuestos químicos de la familia Bignoniaceae. ................................ 7

Figura 2.2. Tabebuia chrysantha ............................................................................. 8

Figura 2.3. Compuestos químicos de Tabebuia spp. ............................................. 10

Figura 2.4. Naftoquinonas presentes en T chrysantha. ......................................... 10

Figura 2.5. Células y matriz del tejido conjuntivo implicado en la respuesta

inflamatoria. ........................................................................................................... 12

Figura 2.6. Migración de leucocitos al tejido lesionado durante la respuesta

inflamatoria. ........................................................................................................... 13

Figura 2.7. Biosíntesis del ácido araquidónico y sus metabolitos. ......................... 15

Figura 2.8. Prostaglandina E2. ............................................................................... 16

Figura 2.9. Etapas de un ensayo de ELISA. .......................................................... 19

Figura 2.10. Reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa reversa. ..... 20

Figura 2.11. Estructura química de algunos anti-inflamatorios. ............................. 21

Figura 3.1. Diagrama de extracción líquido – líquido de T. chrysantha. ................ 25

Figura 3.2. Fraccionamiento del extracto en cloroformo. ....................................... 26

Figura 3.3. Gradiente de ácido fosfórico–acetonitrilo. ............................................ 28

Figura 3.4. Marcha fitoquímica de la corteza interna de T. chrysantha. ................. 30

Figura 3.5. Fraccionamiento de la fracción F-16 del extracto en cloroformo ......... 34

Figura 4.1. Rendimiento de extracción líquido-líquido del extracto en metanol. .... 36

Figura 4.2. Perfiles cromatográficos del extracto en cloroformo. (A) Cromatograma,

(B) Espectro UV/VIS del pico 4 y (C) Espectro UV/VIS del pico 7. ........................ 37

GRUPO POLIFENOLES

Figura 4.3. Perfiles cromatográficos del extracto en acetato de etilo. (A)

Cromatograma, (B) Espectro UV/VIS del pico 2 y (C) Espectro UV/VIS del pico 7.

............................................................................................................................... 38

Figura 4.4. Espectro UV/VIS de la 1,4-benzoquinona. ........................................... 39

Figura 4.5. Viabilidad celular de los macrófagos murinos RAW264.7 frente a los

extractos de corteza interna de T. chrysantha. ...................................................... 41

Figura 4.6. Efecto inhibitorio de los extractos de la corteza interna de T. chrysantha

sobre la producción de PGE2 en macrófagos murinos estimulados con LPS. ....... 43


sobre la producción de TNF-α en macrófagos murinos estimulados con LPS. ...... 44


sobre la producción de NO en macrófagos murinos estimulados con LPS. .......... 45

Figura 4.9. Efecto inhibitorio de las expresiones de mRNA de COX-2, TNF-α e

iNOS sobre macrófagos murinos RAW264.7 estimulados con LPS. ..................... 47

Figura 4.10. Efecto inhibitorio de las fracciones del extracto en cloroformo de la

corteza interna de T. chrysantha sobre la producción de PGE2 (A), TNF-α (B) y NO

(C) en macrófagos murinos estimulados con LPS. ................................................ 53

Figura 4.11. Espectro de RMN de 1H de la fracción F16-3-b ................................. 55

Figura 4.12. Espectro de RMN de 13C de la fracción F16-3-b ................................ 56

Figura 4.13.Posible estructura de compuesto mayoritario de la fracción F16-3-b . 57

Figura 4.14. Espectro de RMN de 1H del ácido veratrico. ...................................... 57

GRUPO POLIFENOLES

RESUMEN

Tabebuia chrysantha es una especie perteneciente a la familia Bignoniaceae, es

un árbol de hasta 35 m de altura, la corteza es de color gris a café oscuro, y las

flores son grandes de color amarillo. Esta especie está distribuida en

Centroamérica y en parte de Sudamérica. Es apreciada por su belleza ornamental,

por la dureza de su madera y se reportan diversos usos en medicina tradicional

como antifúngico, antitumoral y anti-inflamatorio. Estas actividades son similares a

las encontradas en otras especies pertenecientes a la familia Bignoniaceae como

Tabebuia impetiginosa, Tabebuia rosea, Tabebuia aurea, entre otras.

En el presente estudio se evaluó la actividad anti-inflamatoria in vitro de los

extractos en n-hexano, cloroformo, acetato de etilo, butanol y agua obtenidos a

partir de la corteza interna de Tabebuia chrysantha. La marcha fitoquímica

realizada a partir del material vegetal muestra la presencia de glicósidos

cardiotónicos, quinonas y lactonas sesquiterpenicas.

Se realizaron ensayos de viabilidad celular para evaluar los efectos citotóxicos de

los extractos a tres concentraciones (2,5 µg/mL, 1,2 µg/mL y 0,6 µg/mL). La

concentración de 2,5 µg/mL mostró porcentajes de viabilidad celular superiores al

80% y por lo tanto se empleó esta concentración para estimular macrófagos

murinos (RAW264.7) con Lipopolisacárido bacteriano (LPS), en presencia de los

extractos vegetales y se determinó la producción de Prostaglandina E2 (PGE2),

Factor de Necrosis Tumoral alfa (TNF-α) y Óxido Nítrico (NO).

El extracto en cloroformo mostró efecto anti-inflamatorio in vitro, inhibiendo la

producción de PGE2 y TNF-α, constituyéndose en el extracto más promisorio de

todos los evaluados. Dicho extracto fue fraccionado mediante cromatografía en

columna, obteniéndose 21 fracciones a las cuales se les evaluó su efecto sobre la

viabilidad celular de células RAW264.7. La evaluación de la actividad anti-

inflamatoria de las fracciones con mayor rendimiento (F12, F13 y F16) mostró que

las fracciones F13 y F16 inhibieron la producción tanto de PGE2 como de NO.

GRUPO POLIFENOLES

La fracción F16 fue fraccionada mediante cromatografía en columna,

obteniéndose 9 fracciones de las cuales se decidió purificar la fracción F16-3 por

cromatografía preparativa, las fracciones resultantes fueron analizadas por

espectroscopia de resonancia magnética nuclear (RMN) de 1H y 13C.

GRUPO POLIFENOLES

ABSTRACT

Tabebuia chrysantha belongs to the family Bignoniaceae, is a tree of 35 m high,

the bark is gray to dark brown, and the flowers are bright yellow. This species are

distributed in Central America and parts of South America. It is treasure for its

ornamental beauty, because of the hardness of their wood and reported several

uses in traditional medicine as antifungal, antitumor and anti-inflammatory. These

activities are similar to those found in other species that belong to the family

Bignoniaceae as Tabebuia impetiginosa, Tabebuia rosea, Tabebuia aurea.

In the present study we assessed the anti-inflammatory activity in vitro of the

extracts in n-hexane, chloroform, ethyl acetate, butanol and water derived from the

inner bark of Tabebuia chrysantha. The phytochemical study of the plant material

shows the presence of cardiac glycosides, quinones and sesquiterpene lactones

Cell viability assays were performed to test cytotoxic effects of the extracts at three

concentrations (2.5 µg / mL, 1.2 µg / mL and 0.6 µg / mL). The concentration of 2.5

µg / mL exhibits cell viability over 80% this concentration was used to stimulate

murine macrophages (RAW264.7) with bacterial lipopolysaccharide (LPS) in the

presence of plant extracts and determined the production of prostaglandin E2

(PGE2), tumor necrosis factor alpha (TNF-α) and nitric oxide (NO).

The chloroform extract showed anti-inflammatory effects in vitro, inhibiting the

production of PGE2 and TNF-α, and it becomes the most promising extract

evaluated. This extract was fractionated by chromatography column to give 21 Cell

viability assays were performed to test cytotoxic effects of the fractions F13 and

F16 inhibited PGE2 production and NO.

Fraction F16 was fractionated by chromatography column and getting 9 fractions.

F16-3 was purified by chromatography preparative; the resulting fractions were

analyzed by nuclear magnetic resonance spectroscopy (NMR) 1H and 13C.

GRUPO POLIFENOLES

INTRODUCCIÓN

A lo largo de los años las plantas han sido usadas para el tratamiento de diversas

enfermedades, incluyendo aquellas de origen inflamatorio y es por esta razón que

en el presente trabajo se pretende brindar información sobre la actividad anti-

inflamatoria de Tabebuia chrysantha.

Las especies pertenecientes al género Tabebuia tienen usos etnomédicos en

Sudamérica, en especial la especie Tabebuia impetiginosa, a la cual se la ha

demostrado actividades citotóxica y antitumoral, inmunosupresora, anti-

inflamatoria, inmunomoduladora, anti-ulceroso, antibacterial y antioxidante, entre

otras, convirtiéndose así en un referente para la presente investigación.

En el caso específico de T. chrysantha el extracto de su corteza interna es

considerado como agente antirreumático, se utiliza para el tratamiento de úlceras,

infecciones crónicas y alergias. Se ha demostrado que esta especie presenta

actividad antifúngica, larvicida y anti-inflamatoria. A partir de esta especie se han

aislado compuestos como antraquinonas, naftoquinonas y furanoquinonas.

Las enfermedades neurodegenerativas e inflamatorias son actualmente un

problema de salud pública a nivel mundial. Debido al hecho de que dichas

enfermedades poseen algunos mecanismos fisiopatológicos similares, se ha

decidido buscar alternativas terapéuticas en plantas de la familia Bignoniaceae,

específicamente en Tabebuia chrysantha, la cual ha sido poco estudiada tanto

desde el punto de vista de sus constituyentes como de sus actividades biológicas

y en especial, la actividad anti-inflamatoria. Se pretende obtener compuestos que

tengan actividad anti-inflamatoria, que puedan ser promisorios como nuevos

medicamentos. La identificación de moléculas promisorias como anti-inflamatorios

permitirá avanzar en la búsqueda de opciones terapéuticas para los pacientes con

enfermedades como aterosclerosis, artritis, entre otras.

GRUPO POLIFENOLES

1

1 ANTECEDENTES

1.1 Surgimiento del problema

En la actualidad los medicamentos anti-inflamatorios no esteroidales (AINEs)

causan efectos secundarios como sangrado intestinal, entre otras patologías

denominadas gastropatías (1), convirtiéndose en un problema para la salud.

En el proceso inflamatorio se han involucrado diferentes mediadores químicos que

pueden ser sintetizados por la vía de la ciclooxigenasa, de la que existen dos

isoformas denominadas COX-1 y COX-2. La primera se expresa en forma

constitutiva en casi todas las células y la COX-2 necesita ser inducida por

estímulos inflamatorios, induciendo la producción de mediadores de la inflamación

como la PGE2 (2).

Los denominados anti-inflamatorios no esteroideos (AINEs) que son utilizados

actualmente, inhiben las actividades de COX-1, COX-2 o ambas enzimas (3). La

inhibición de COX-1 lleva al desarrollo de efectos indeseables en el organismo

como las gastropatías. Los inhibidores selectivos de COX-2 disminuyen la

inflamación y son menos gastrolesivos, sin embargo el uso prolongado de estos

puede generar efectos secundarios indeseables como problemas cardiovasculares

(4).

Las enfermedades de origen inflamatorio como la artritis, el cáncer, la

aterosclerosis y la obesidad, entre otras, se consideran actualmente como

problemas importantes de salud pública y tienen como origen el desarrollo de un

proceso inflamatorio crónico y por tanto, la búsqueda de nuevas moléculas anti-

inflamatorias permitirá desarrollar nuevos medicamentos que puedan ser usados

para el tratamiento de dichas enfermedades.

A lo largo de los años las plantas han sido un recurso para el desarrollo de nuevos

medicamentos, por lo tanto, con base en hallazgos realizados en plantas del

genero Tabebuia, se pretende evaluar la actividad anti-inflamatoria de los

GRUPO POLIFENOLES

2

extractos obtenidos de la corteza interna de Tabebuia chrysantha, como una

alternativa para el desarrollo de nuevos medicamentos para el tratamiento de

procesos inflamatorios agudos y/o crónicos (2).

Algunas especies pertenecientes al género Tabebuia han demostrado tener

actividad biológica como lo son Tabebuia impetiginosa que tiene actividad

antitumoral y anti-inflamatoria (5), Tabebuia rosea que posee actividad

antimicrobiana (6), y Tabebuia chrysantha la cual se ha empleado en medicina

tradicional en Sudamérica como anti-inflamatorio, antifúngico y larvicida (7). Sin

embargo, se requiere de confirmación experimental de los usos etnomédicos de la

especie T. chrysantha, en especial, la evaluación de su efecto anti-inflamatorio.

1.2 Formulación del problema

¿Poseen los extractos y fracciones de Tabebuia chrysantha actividad inhibitoria

sobre las enzimas COX-2, iNOS y TNF-α?

1.3 Objetivos

1.3.1 Objetivo general

Determinar la actividad anti-inflamatoria in-vitro de los extractos y fracciones

obtenidas de la corteza interna de Tabebuia chrysantha.

1.3.2 Objetivos específicos

Obtener los extractos y fracciones de la corteza interna de Tabebuia

chrysantha.

Caracterizar los extractos y fracciones mediante HPLC-UV-DAD

(Cromatografía liquida de alta eficiencia con detector UV de arreglo de diodos).

Evaluar la actividad inhibitoria de COX-2, iNOS y TNF-α en los extractos y

fracciones de Tabebuia chrysantha.

GRUPO POLIFENOLES

3

1.4 Justificación

En la familia Bignoniaceae se encuentra el género Tabebuia, dentro del cual se

conocen varias especies que han sido introducidas en Colombia. En la región del

eje cafetero se encuentran las especies Tabebuia rosea (bertol.) DC. y Tabebuia

chrysantha (jacq.) Nicholson, las cuales poseen inflorescencia rosada y amarilla

respectivamente.

El género Tabebuia pertenece a áreas tropicales y subtropicales, comprende

varias especies productoras de madera, la cual es utilizada en la construcción

naval y de edificios, debido a que su madera es muy pesada, durable y resistente

(8); este género se caracteriza por sus flores de colores vistosos y el uso de su

corteza como tratamiento en medicina tradicional.

Los usos en medicina tradicional de plantas pertenecientes al género Tabebuia se

respaldan en estudios realizados en otras especies de este mismo género, como

Tabebuia impetiginosa conocida también como “lapacho”, originaria del Brasil y

norte de Argentina, la cual ha mostrado tener actividad inmunosupresora (9), anti-

inflamatoria (10), inmunomoduladora (11), anti-ulceroso (12), antibacterial (13) y

antioxidante (14). De esta especie se han aislado compuestos como quinonas,

furanonaftoquinonas, lapachol y naftoquinonas. Se ha demostrado que dichos

compuestos tienen actividad antitumoral y anti-inflamatoria (15). En el caso de

Tabebuia rosea, se ha encontrado actividad antimicrobiana contra Bacillus subtilis,

Salmonella typhimurium y Candida albicans.(7)

Tabebuia chrysantha es un árbol de hasta 35 m de altura y diámetro de hasta 60

cm, ramas escasas, gruesas y ascendentes. La corteza es áspera de color gris a

café oscuro, tiene grietas verticales, profundas y forman placas anchas de color

café oscuro. Las flores son grandes de 5 a 12 cm de largo, de color amarillo claro,

muy vistosas con líneas rojas en el cuello (16).

Existen pocos estudios fitoquímicos de la especie Tabebuia chrysantha, sin

embargo, se han aislado metabolitos secundarios de su corteza interna tales como

GRUPO POLIFENOLES

4

naftoquinonas y lapachos; además se ha demostrado que dichos compuestos

poseen actividad antifúngica (17) y larvicida (18).

Varias especies de Tabebuia tienen usos etnomédicos en Sudamérica, tal es el

caso de Tabebuia chrysantha, debido a que el extracto de su corteza interna es

considerado como agente antirreumático, se utiliza para el tratamiento de úlceras,

infecciones crónicas y alergias (19). Estas enfermedades tienen en común el

desarrollo de un proceso inflamatorio.

La inflamación básicamente se define como un cambio del equilibrio morfológico

en un área específica de un tejido, causada por diferentes agentes: físicos,

químicos, o biológicos (20). En este contexto, la respuesta inflamatoria es una

reacción crítica protectora a la irritación, lesión, o infección, caracterizada por

enrojecimiento, calor, hinchazón, pérdida de la función y dolor, a pesar de esto, los

procesos inflamatorios pueden ser perjudiciales, como ocurre en las reacciones de

hipersensibilidad luego de picaduras de insectos o en procesos inflamatorios

crónicos como la artritis reumatoidea (21).

Existe una amplia variedad de mediadores químicos implicados en el proceso

inflamatorio, dentro de los cuales se pueden incluir las aminas vasoactivas,

eicosanoides, citocinas y óxido nítrico.

Cuando las células son activadas por diversos estímulos, los lípidos de la

membrana celular generan mediadores lipídicos que van a actuar a nivel del

proceso inflamatorio. Dentro de estos lípidos, el ácido araquidónico es importante

porque da origen a los denominados eicosanoides (metabolitos del ácido

araquidónico), sintetizados mediante dos vías: la vía de la ciclooxigenasa

(generadora de prostaglandinas y tromboxanos) y la vía de la lipoxigenasas

(generadora de leucotrienos) (22).

La vía de la ciclooxigenasa es mediada por dos enzimas diferentes (COX-1 y

COX-2), denominadas isoenzimas. La COX-1 se expresa constitutivamente en

varias células, mientras que la COX-2 es inducida por estímulos proinflamatorios

GRUPO POLIFENOLES

5

como citoquinas y lipopolisacáridos, siendo muy importante en los procesos

inflamatorios (23).

La acción de la COX sobre el ácido araquidónico genera la prostaglandina H2

(PGH2), muy inestable, y precursora de otras prostaglandinas, como la PGE2 o la

PGF2α. Las prostaglandinas estimulan la inflamación, regulan el flujo sanguíneo

local y participan en la patogenia del dolor y la fiebre.(24).

El óxido nítrico (NO) es otro mediador del proceso de inflamación generado por la

isoforma inducible de la óxido nítrico sintasa (iNOS). En las células de mamíferos

se han identificado tres isoformas de esta enzima; a nivel del endotelio (eNOS), a

nivel neuronal (nNOS) y la inducida a través de un estímulo bacterial (iNOS) (25).

El NO se encarga de la vasodilatación y reduce la agregación plaquetaria, produce

a la vez radicales libres tóxicos a nivel celular (22).

Las citocinas son un grupo de proteínas producidas por distintos tipos de células

del sistema inmune en respuesta a una activación celular, entre estas se

encuentra el factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α) (26) ,el cual se origina en los

macrófagos y actúa sobre las células endoteliales, provocando exudación de

líquidos y factores de adherencia (27).

Actualmente, las drogas anti-inflamatorias no esteroidales (AINEs) son

ampliamente empleadas en el tratamiento del dolor, fiebre y como alternativas

terapéuticas para el tratamiento de inflamaciones crónicas. Dentro de este grupo

de medicamentos, hay inhibidores de COX-1 y COX-2 en las dosis empleadas

como anti-inflamatorios. Tanto el efecto anti-inflamatorio, analgésico y antipirético

se basan en la inhibición de COX-2 pero su toxicidad gastrointestinal (asociada

con sangrado) es el resultado de la inhibición de COX-1 (28). Los efectos

desfavorables de los AINEs han restringido su uso a largo plazo, existiendo

entonces una demanda constante de nuevas opciones terapéuticas. (29)

Las enfermedades de origen inflamatorio como la artritis, el cáncer, la

aterosclerosis y la obesidad, entre otras, se consideran actualmente como

GRUPO POLIFENOLES

6

problemas importantes de salud pública y tienen como origen el desarrollo de un

proceso inflamatorio crónico y por tanto, la búsqueda de nuevas moléculas anti-

inflamatorias permitirá desarrollar nuevos medicamentos que puedan ser usados

para el tratamiento de dichas enfermedades.

Los productos naturales, incluidos los derivados de las plantas superiores, a lo

largo de los años han contribuido en gran medida al desarrollo de medicamentos.

Algunos de los metabolitos secundarios que poseen actividad anti-inflamatoria

son: terpenos, compuestos fenólicos, cumarinas y compuestos lactónicos (30),

estos metabolitos tienen efectos sobre diversos mediadores de la inflamación,

entre los cuales se encuentran los eicosanoides, generados por la acción de la

ciclooxigenasa sobre el ácido araquidónico para generar leucotrienos y

prostaglandinas (PGE2 y PGF2a) (21)

Debido a la poca información disponible con relación a los componentes y al

efecto anti-inflamatorio de los extractos vegetales de la especie T. chrysantha y

teniendo en cuenta la necesidad de identificar nuevos agentes anti-inflamatorios,

es importante iniciar estudios tendientes a evaluar la actividad biológica de dichos

extractos con el fin de determinar compuestos de origen vegetal que puedan

convertirse en una alternativa para el desarrollo de nuevos medicamentos dirigidos

al tratamiento de procesos inflamatorios agudos y/o crónicos.

GRUPO POLIFENOLES

7

2 MARCO TEÓRICO

2.1 Generalidades de la especie Tabebuia chrysantha

T. chrysantha pertenece a la familia Bignoniaceae que comprende más de 120

géneros y 650 especies distribuidas en los bosques montanos, secos y de tierras

bajas (31), primordialmente de área tropical con escasa presencia en regiones

templadas de climas cálidos.

En esta familia existen reportes de compuestos químicos (Fig. 2.1) tales como

saponinas, quinonas y taninos(32).

O

O

OR

Saponina

O

O

OH

HO

OH

OH

O OH Quinona

Tanino

Figura 2.1. Compuestos químicos de la familia Bignoniaceae.

En Colombia la familia Bignoniaceae está representada por 45 géneros nativos y

algunos introducidos por su carácter ornamental, siendo los géneros Arrabidaea y

Tabebuia los más representativos (33); este último ha sido uno de los más

estudiados, por ser una fuente de compuestos naftoquinónicos sustituidos (34) con

propiedades anticancerígenas (35), (36). Algunas especies pertenecientes al

GRUPO POLIFENOLES

8

género Tabebuia han demostrado tener actividad anti-inflamatoria (37),

antioxidante (14), antiofídica (6), antibacterial (38), entre otras.

Tabebuia chrysantha (Fig. 2.2) es un árbol conocido en Colombia como Guayacán

amarillo, el cual se distribuye geográficamente desde México hasta Venezuela. Se

desarrolla en suelos franco arenosos con alta cantidad de materia orgánica y un

pH de 6 a 8,5.

Es un árbol de hasta 35 m de altura, corteza de color gris pálido a oscuro. Las

hojas son alternas, digitadamente compuestas, de 5 a 25 cm de largo y de 8 a 20

cm de ancho, caducifolias con el haz verde oscuro y el envés verde claro y

densamente cubierto por pelos estrellados color café. Las flores son

campanuladas, grandes, de 5 a 12 cm de largo, de color amarillo claro, muy

vistosas con líneas rojas en el cuello (16).

Figura 2.2. Tabebuia chrysantha

2.1.1 Usos y propiedades de la especie Tabebuia chrysantha

El principal uso de esta especie no maderable es medicinal. Se considera que la

corteza es eficaz para tratar reumatismo, artritis, cáncer, infecciones,

inflamaciones y úlceras. Es muy apreciada como ornamental en Tarapacá

GRUPO POLIFENOLES

9

(Amazonas, Colombia) y presenta varios usos medicinales. Para curar el “meo de

arco” (sarpullido que se presenta en los niños pequeños) se raspa la corteza y el

polvillo se aplica sobre la parte afectada (39).

Estudios etnofarmacológicos realizados en personas del área rural, urbana y en

herbolarios de diferentes municipios del eje cafetero han permitido identificar las

plantas más utilizadas como antimicrobianos o estimulantes del sistema inmune,

dentro de dichas plantas se encuentra T. chrysantha (40), (41). Investigaciones

preliminares han indicado que los extractos obtenidos de las hojas de T.

chrysantha pueden tener efecto sobre la respuesta inmune al incrementar in vivo

en ratas Wistar los niveles de anticuerpos dirigidos contra glóbulos rojos de

carnero (42). Un estudio reciente reporta que tanto el extracto acuoso como el

metanólico obtenidos de las hojas de T. chrysantha poseen actividad anti-

inflamatoria in vivo (43).

2.1.2 Compuestos químicos presentes en Tabebuia chrysantha

Los principales constituyentes de los extractos de la corteza de Tabebuia spp.

incluyen furanonaftoquinonas (44), (45), (46), quinonas (47),naftoquinonas (48)

(Fig. 2.3), ácido benzóico y derivados del benzaldehido (49), ciclopenteno

dialdehidos (37), flavonoides (50) y glicósidos, principalmente del tipo iridoides

(51). Dentro de las naftoquinonas, el lapacol y la beta lapacona se han estudiado

intensivamente dadas sus propiedades antiinflamatorias (52) y anticancerígenas

(36), (53), (54), (55), (56).

GRUPO POLIFENOLES

10

O

O

O

R

O

O

R

RC

O OH

Naftoquinona

Furanonaftoquinona

Ácido bezóico

Figura 2.3. Compuestos químicos de Tabebuia spp.

Los estudios fitoquímicos llevados a cabo con la especie T. chrysantha indican

que los componentes presentes en la corteza interna son lapacol, α y β-lapacona,

dehidrotectol, tetrahidrotectol (57), entre otras naftoquinonas (58), (34) (Fig. 2.4).

O

O

OH

Lapachol

O

O

O

-lapachona

O

O

O

-lapachona

O

O

O

O

Dehidrotectol

Figura 2.4. Naftoquinonas presentes en T chrysantha.

GRUPO POLIFENOLES

11

2.2 Inflamación

La inflamación es una respuesta esencial en la supervivencia de los organismos

multiceluares frente a la agresión y consiste básicamente en una respuesta de los

vasos sanguíneos y de los leucocitos. La lesión tisular que desencadena esta

respuesta puede ser causada por un agente físico, químico o biológico. La

respuesta inflamatoria es fundamental para inducir una respuesta inmune

específica que sea adecuada y finalmente para iniciar el proceso de reparación de

los tejidos lesionados. La reparación inicia durante las fases iniciales de la

inflamación, aunque no finaliza hasta que se ha neutralizado el estímulo lesivo.

Durante la reparación, el tejido lesionado es substituido por nuevo tejido

(cicatrización).

A pesar de que el proceso inflamatorio es un mecanismo de defensa ante la

agresión tisular, muchas enfermedades como las reacciones de hipersensibilidad

o enfermedades crónicas como la artritis reumatoidea, la aterosclerosis, la fibrosis

pulmonar y la obesidad, la respuesta inflamatoria persistente induce patología y

daño tisular.

La respuesta inflamatoria tiene lugar en el tejido conectivo vascularizado (Fig. 2.5)

e involucra diferentes tipos de células como monocitos, neutrófilos, eosinófilos,

linfocitos, plaquetas, mastocitos, macrófagos y fibroblastos.

GRUPO POLIFENOLES

12

Mastocito Fibroblasto Macrófago

Fibras elásticas

Fibras de colágeno Proteoglucanos

Leucocito polimorfonuclear

Linfocito

Plaquetas

Monocito Eosinófilo

Basófilo

Células deltejido conjuntivo

Vasos

Matriz deltejido conjuntivo

Figura 2.5. Células y matriz del tejido conjuntivo implicado en la respuesta

inflamatoria.

2.2.1 Tipos de inflamación

La respuesta inflamatoria presenta dos tipos, que se diferencian por su duración

2.2.1.1 Inflamación aguda

Es la respuesta inicial e inmediata a la lesión, relacionada principalmente con

cambios hemodinámicos locales que llevan a manifestaciones clínicas como rubor,

calor, edema y dolor en la zona afectada. Posteriormente, hay salida de leucocitos

hacia el tejido lesionado e iniciar el proceso de degradación de los tejidos

necróticos. Este tipo de inflamación tiene una duración que oscila entre, minutos,

horas y pocos días.

2.2.1.2 Inflamación crónica

Es una inflamación de larga duración (semanas, meses o años) en la cual la

inflamación activa, la lesión tisular y el proceso de reparación suceden al mismo

tiempo. La inflamación crónica es nociva para la salud y se constituye en el

GRUPO POLIFENOLES

13

mecanismo patogénico básico de algunas enfermedades crónicas como artritis

reumatoidea, aterosclerosis fibrosis pulmonar, obesidad, entre otras.

2.2.2 Fases de la inflamación

Después de un corto periodo de vasoconstricción a nivel arterial, se produce

vasodilatación y aumento de flujo sanguíneo en la zona de la lesión, que causa

enrojecimiento y aumento de la temperatura; posteriormente el flujo sanguíneo

disminuye por un aumento de la permeabilidad vascular que permite la salida de

líquido de los vasos y aumento de la viscosidad sanguínea, lo que se denomina

estasis (parálisis total del flujo). A medida que evoluciona la estasis se produce la

migración de los leucocitos a través del endotelio vascular mediante un

mecanismo denominado transmigración (Fig.2.6), el cual permite que las células

inflamatorias lleguen al sitio de la lesión. (22).

Rodamiento Activación Adhesión Transmigración

Estímulo

Figura 2.6. Migración de leucocitos al tejido lesionado durante la respuesta

inflamatoria.

2.2.3 Mediadores de la inflamación

Los mediadores químicos producidos por células del sistema inmune son los

responsables del desarrollo de la respuesta inflamatoria (59). Los mediadores

http://es.wikipedia.org/wiki/Vasoconstrictor

http://es.wikipedia.org/wiki/Vasodilatador

GRUPO POLIFENOLES

14

inflamatorios pueden ser secretados por células especializadas del sistema

inmune y muchos de ellos son liberados a partir de gránulos intracelulares que

liberan dichos mediadores en respuesta al estímulo inflamatorio.

Como respuesta al fenómeno inflamatorio, se liberan una serie de mediadores que

funcionan de manera coordinada. Dichos mediadores se generan a partir de

células o derivan de proteínas del plasma sanguíneo. Entre los mediadores de

origen celular se tienen la histamina, serotonina, prostaglandinas, leucotrienos,

NO, citocinas (IL-1, TNF-α) y quimiocinas, entre otros. Los mediadores derivados

de proteínas plasmáticas incluyen las proteínas del complemento (C3a, C4a, C5a),

cininas y proteasas activadas durante la coagulación (22).

Para efectos de esta tesis, se mencionarán aspectos relacionados con los

mediadores evaluados en el trabajo experimental y que corresponden a

prostaglandinas, NO y citocinas.

2.2.3.1 Metabolitos del ácido araquidónico: (AA)

El ácido araquidónico es un ácido graso poliinsaturado de 20 átomos de carbono

que procede de la dieta a partir del ácido linoléico, éste se encuentra esterificado

en los fosfolípidos de la membrana celular y se libera por medio de fosfolipasas

celulares que se activan mediante estímulos proinflamatorios.

Los metabolitos del AA, llamados eicosanoides, son sintetizados mediante dos

vías: la vía de la ciclooxigenasa (generadora de prostaglandinas y tromboxanos) y

la vía de la lipooxigenasa (generadora de leucotrienos y lipoxinas) (Fig. 2.7). Las

prostaglandinas y los tromboxanos son responsables de la vasodilatación, la

generación del dolor y la fiebre. También está la vía de la lipoxigenasa que genera

leucotrienos (los cuales participan en el incremento de la permeabilidad vascular,

quimiotaxis, activación y adhesión de leucocitos) y las lipoxinas, que inhiben la

adhesión de neutrófilos y la quimiotaxis (22).

GRUPO POLIFENOLES

15

Fosfolípidos

Fosfolipasa A

Ácido araquidónico

5-Lipoxigenasa Cicloxigenasa

PGG2LTA4

LTC4

LTD4

LTD4

PGH2

PGH2

PGI2

Prostaciclina sintetasa Tromboxano sintetasa

TXA2

PGD2 PGE2 PGF2

Figura 2.7. Biosíntesis del ácido araquidónico y sus metabolitos.

La prostaglandina E2 (PGE2) (Fig. 2.8) induce vasodilatación y actúa

sinergísticamente con otros mediadores como la histamina y las bradiquininas

para incrementar la permeabilidad vascular durante la respuesta inflamatoria y

generar edema. Adicionalmente, la PGE2 es un mediador central de la respuesta

febril inducida durante el proceso inflamatorio.

GRUPO POLIFENOLES

16

O

HO

COOH

OH

Prostaglandina E2

Figura 2.8. Prostaglandina E2.

2.2.3.2 Óxido nítrico: (NO)

El oxido nítrico es un gas soluble sintetizado principalmente por vía enzimática

catalizada por la óxido nítrico sintasa (NOS) a través de una serie de reacciones

redox, con degradación de L-arginina a L-citrulina en presencia de oxígeno y

NADPH. Se conocen tres isoformas de la NOS: endotelial (eNOS o NOS3),

neuronal (nNOS o NOS1) e inducible (iNOS o NOS2). La iNOS es una enzima

inducible a nivel transcripcional y se expresa en macrófagos y otros tejidos en

respuesta a estímulos inflamatorios (60). La reacción se muestra a continuación:

NADPH, O2

L-Arg L-citrulina + NO

Tiene como función relajar y vasodilatar el musculo liso de la pared vascular y

reducir la agregación y adhesión plaquetaria (22). Adicionalmente, el NO generado

por los macrófagos tiene como función destruir microorganismos. El NO reacciona

con radicales libres del oxígeno (O2-) generando peroxinitrito, el cual tiene efectos

tóxicos sobre las células y los tejidos (61).

NO + O2 ONOO-

GRUPO POLIFENOLES

17

El peroxinitrito es un anión altamente oxidativo, capaz de oxidar tioles y las bases

del DNA, además de iniciar la peroxidación de lípidos (62).

2.2.3.3 Citocinas

Son proteínas producidas principalmente por el sistema inmune en respuesta a

una activación celular, tienen como función, regular la respuesta inmune y la

respuesta inflamatoria (26).

Las citocinas se dividen en cinco grupos dependiendo de su función: citocinas que

regulan la función leucocitaria, implicadas en la inmunidad natural, las que

estimulan la hematopoyesis, las quimiocinas y las que participan de la respuesta

inflamatoria. Las citocinas proinflamatorias por excelencia corresponden al TNF-α

y a la Interleucina-1b (IL-1β) y son producidas principalmente por los macrófagos

activados por endotoxinas como el LPS u otros productos microbianos, complejos

inmunes o daño tisular.

La principal función del TNF-α es el reclutamiento de monocitos y neutrófilos en el

sitio de entrada del agente extraño, sin embargo, hay otra gran variedad de

funciones, entre las que tenemos: estimular la capacidad de macrófagos y células

endoteliales para secretar quimiocinas y otras citocinas como la IL-1, aumentar la

capacidad microbicida de los neutrófilos, estimular la angiogénesis, coestimulación

en la activación de la célula T, inducción de fiebre (pirógeno endógeno),

incrementar la síntesis de proteínas de fase aguda como la proteína C reactiva,

inducción de muerte celular por apoptosis, inducción de caquexia, estimular la

producción del factor tisular por el endotelio activando la coagulación (22).

Con relación a la IL-1β, algunas de sus acciones son indirectas debido a la

inducción de la síntesis de otras moléculas como la PGE2, la IL-6 y la IL-8. Una de

sus principales funciones es la activación de los linfocitos T ayudadores, actúa

sinérgicamente con el TNF-α para incrementar la síntesis de proteínas de fase

aguda y activar el sistema de la coagulación. A diferencia del TNF-α, la IL-1β no

induce daño celular por apoptosis pero se induce en respuesta a LPS y potencia

los daños tisulares inducidos por el TNF- (22).

GRUPO POLIFENOLES

18

2.3 Técnicas para detectar la producción de mediadores de inflamación

A continuación se describen algunas de las técnicas empleados para la medición

de los mediadores de la inflamación como prostaglandinas, NO y citocinas.

2.3.1 Prueba de ELISA

La prueba de ELISA (Ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas), es una

técnica de laboratorio muy común que es utilizada para determinar una sustancia,

generalmente una antígeno, contenido en una muestra liquida. Este tipo de prueba

es comúnmente usada en medicina como herramienta para la detección de

anticuerpos y el diagnóstico de enfermedades infecciosas, sin embargo, sus usos

a nivel clínico son muy amplios. Esta técnica también se usa en la industria para

determinar la calidad de un producto.

El principio de la prueba se basa en la especificidad de los anticuerpos por un

antígeno, al cual se unen de manera similar a la llave con su cerradura. En esta

técnica inmunoenzimática, un antígeno inmovilizado en un soporte sólido

(generalmente placas de poliestireno) se detecta mediante un anticuerpo enlazado

a una enzima (ELISA directa) o un anticuerpo primario que reconoce al antígeno y

que a su vez es reconocido por un anticuerpo secundario que lleva enlazado la

enzima (ELISA indirecta). Al final, una reacción de color permite medir mediante

espectrofotometría la molécula de interés presente en la muestra que se está

analizando (63) (Fig 2.9).

GRUPO POLIFENOLES

19

Figura 2.9. Etapas de un ensayo de ELISA.

2.3.2 Reacción en cadena de la polimerasa con transcripción reversa (RT-

PCR)

La amplificación de los blancos del RNA mensajero (mRNA) son convertidos a

DNA complementario (cDNA) mediante la acción de una enzima llamada

transcriptasa reversa (RT), para luego ser amplificados por PCR.

La PCR es una técnica de amplificación de ácidos nucleicos; se basa en la

capacidad de la ADN polimerasa para copiar una cadena de DNA por

alargamiento de cadenas complementarias a partir de un cebador o “primer” con

sentido y antisentido. Su amplificación se da mediante varios ciclos en un

termociclador, los cuales se llevan a cabo mediante los tres siguientes pasos:

Desnaturalización del cDNA, en el cual se separan sus dobles cadenas a una alta

temperatura.

Unión de los “primers” o cebadores (alineación), en la cual al disminuir la

temperatura, se permite la unión de ellos a las secuencias complementarias del

cDNA.

Anticuerpo específico unido al soporte sólido

Adición del la muestra y unión del antígeno al anticuerpo

Adición del sengudo anticuerpo unido a la enzima

Adición del sustrato de la enzima

Desarrollo de color

:Anticuerpo

:Sustrato de la enzima

:Anticuerpo unido a una enzima

GRUPO POLIFENOLES

20

Extensión, la enzima ADN polimerasa extiende las secuencias entre los “primers”.

Al final de los ciclos el número de moléculas de cDNA se amplifica, después de

30-50 ciclos ocurre un crecimiento exponencial en el número total de copias de

cDNA sintetizadas (Fig 2.10) (64).

Transcriptasa reversa

mRNA

cDNA

Alineación

Desnaturalización

Extensión(ADN polimerasa)

3'

5'

5'

3'

"Primers" conantisentido

"Primers" consentido

5'

5'

5'

5' 3'

3'

3'

3'

5'

5'

5'

5'

3'3'

3'

3'

Después de XX ciclos

>1000000 de copias

Figura 2.10. Reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa reversa.

GRUPO POLIFENOLES

21

2.4 Anti-inflamatorios no esteroidales (AINES)

Los anti-inflamatorios no esteroidales (AINEs) son un amplio grupo de fármacos

empleados como anti-inflamatorios, analgésicos y antipiréticos. los AINEs tienen

diversas estructuras químicas (Fig. 2.11) sin embargo el mecanismo de acción se

basa en la inhibición de las enzimas COX-1 y/o COX-2, lo cual conlleva a una

inhibición en la producción de mediadores de la inflamación como prostaglandinas

y tromboxanos (65).

O

O

SO

O

H3C

Rofecoxib (inhibidor selectivo de COX-2)

OH

O

Ibuprofeno (AINEs)

O

O OH

O

Aspirina (AINEs)

Figura 2.11. Estructura química de algunos anti-inflamatorios.

Aunque los AINEs son muy efectivos para tratar la inflamación presentan algunos

efectos secundarios, producto de la inhibición de COX-1, la cual es expresada de

manera constitutiva en la mayoría de los tejidos y es la responsable de funciones

fisiológicas normales como el mantenimiento de la integridad de la mucosa

gástrica y la regulación del flujo sanguíneo renal (19), por lo tanto, al inhibirse la

COX-1, se generan gastropatías (36). Aunque existen inhibidores selectivos de

COX-2 que disminuyen la inflamación y son menos gastrolesivos, éstos pueden

generar efectos secundarios indeseables como problemas cardiovasculares (37).

GRUPO POLIFENOLES

22

3 SECCIÓN EXPERIMENTAL

3.1 Materiales, equipos y reactivos

3.1.1 Material vegetal y biológico

La especie Tabebuia chrysantha (JACQ.) G.Nicholson. se recolectó en Septiembre

de 2010 en el edificio de la Facultad de Ingeniería Industrial de la Universidad

Tecnológica de Pereira. Dicha planta ya había sido identificada en el Jardín

Botánico de la Universidad Tecnológica de Pereira y se confirmó en la Facultad de

Ciencias de la Universidad del Tolima.

Se empleó la línea celular RAW264.7 (monocitos - macrófagos de ratón

leucémico), la cual fue adquirida por el Laboratorio de Fisiología Celular e

Inmunología.

3.1.2 Equipos

Los equipos fueron suministrados por el Laboratorio de Fitoquímica y el

Laboratorio de Fisiología Celular e Inmunología.

Rotavaporador HEIDOLPH- 4003.

Balanza analítica OHAUS Adventurer AR2140.

Balanza electrónica OHAUS Explorer Pro EP4102.

Ultrasonido Fisher Scientific SF60H.

Horno BINDER ED-115.

Espectrofotómetro UV-Vis Shimadzu-UV-1700 Pharmaspec.

Jasco HPLC 2000 Plus. Sistema equipado con bomba de gradiente cuaternario

PU-2089 Plus, automuestreador inteligente AS-2059 Plus, horno para columna

CO-2065 Plus, columna analítica Ultra Aqueous C-18 Restek (2 µm tamaño de

GRUPO POLIFENOLES

23

partícula, 100 x 3.2 mm D.I), detector inteligente de arreglo de diodos MD-2015

Plus y LC Net II/ADC, controlado por el Software EZChrom Elite.

BIO-RAD. Molecular imager. Gel DOCTM XR+. With Image LabTM Software.

Model Universal Hood II.

Applied Biosystems Veriti 96well Thermal Cycler. Model 9902

Incubadora Thermo Electron Corporation Forma series II. Water Jacketed CO2

incubador. Hepa Class 100.

Centrifuge 5804R 15amp Version. Eppendorf.

Cámara de electroforesis. Bio-RAD y fuente de poder PowerPac HC.

Centrífuga Mini Spin plus. Eppendorf.

Cabina de flujo laminar C4 y Streamline.

Microscopio Nikon eclipse E100.

Balanza analítica OHAUS PioneerTM.

Microscopio invertido Leica.

Lector de placas Stat Fax 3200, AWARENESS Technology inc.

NanoDrop 2000c

3.1.3 Reactivos

Metanol grado industrial para la extracción (protokimica).

Hexano (Merck).

Cloroformo (Merck).

GRUPO POLIFENOLES

24

Acetato de etilo (J.T. Backer).

Butanol (Merck).

Acetona (Merck).

Metanol (Merck).

Reactivos marcha fitoquímica: Cloruro férrico, cloruro de sodio, ácido pícrico,

hidróxido de sodio, etanol, clorhidrato de hidroxilamina, hidróxido de potasio,

ácido clorhídrico, zin en polvo, ácido tricloroacetico, cloroamina T, ácido

sulfúrico, ácido acético, magnesio en polvo, alcohol amílico, anhídrido acético,

solución salina 0,9%, hidroxilamina, α-naftol, yoduro de mercurio II, yoduro de

potasio y subnitrato de bismuto.

Dimetilsulfóxido (Sigma).

RNeasy plus mini kit (Qiagen).

RNeasy mini kit (Qiagen).

BD OptEiA set mouse TNF (mono/mono) (BD Biosciences).

Griess reagent (modified) (Sigma).

3.2 Obtención de los extractos

Se tomaron 2 Kg de corteza interna de Tabebuia chrysantha previamente molida a

la cual se le realizó una extracción con metanol industrial y se aplicó ultrasonido

por 1 hora. Posteriormente se sometió a percolación durante 87 horas. El extracto

en metanol se filtró y se concentró a presión reducida.

Se tomaron 25 g del extracto en metanol y se disolvieron en 250 mL de metanol-

H2O (35% H2O). Posteriormente se realizaron extracciones sucesivas líquido-

GRUPO POLIFENOLES

25

líquido con hexano, cloroformo, acetato de etilo y butanol respectivamente (Fig

3.1).

2 Kg de Corteza interna

Percolar con metanol x 87 h

m=25,01 g

Concentrar el extracto en metanol

Extracto en n-Hexanom=0,7984 g

Metanol (35% H20)

n-Hexano

Extracto en Cloroformom=5,9546 g

Clorofórmo

Evaporar el metanol

Extracto en Acetato de Etilom=0,3940 g

Acetato de Etilo

Extracto en Aguam=10,6981 g

Butanol

Extracto en Butanolm=4,94721 g

Figura 3.1. Diagrama de extracción líquido – líquido de T. chrysantha.

GRUPO POLIFENOLES

26

3.3 Fraccionamiento del extracto en cloroformo

Del extracto en cloroformo de obtuvieron 5,9 g, de los cuales se tomó 1 g para el

fraccionamiento. Se utilizó una columna de vidrio con 80g de Silica gel 60 (0,063-

0,200 mm) (Merck). Como eluentes se usaron gradientes de 600 mL de n-hexano-

acetona y acetona-metanol en las proporciones descritas (Fig 3.2). Se

recolectaron 430 fracciones de 20 mL cada una, las cuales fueron reunidas de

acuerdo a sus perfiles cromatográficos por cromatografía en capa fina (TLC),

obteniéndose finalmente 21 fracciones, las cuales fueron concentradas a presión

reducida.

1 g de extracto en cloroformo

..........

F-1 F-2 F-3 F-5 F-6 F-7 F-8 F-9 F-10 F-11 F-19 F-20 F-21

VLecho= 200 mL

Vetapa = 600 mL

Gradientes n-Hexano-Acetona:

(10:0), (9,5:0,5), (9:1), (8,5:1,5),

(8:2), (7,5:2,5), (7:3), (6:4), (5:5),

(4:6).

Gradientes Acetona-Metanol:

(9:1), (6:4), (3:7), (1:9).

Figura 3.2. Fraccionamiento del extracto en cloroformo.

GRUPO POLIFENOLES

27

3.4 Perfiles cromatográficos por HPLC

Los perfiles cromatográficos de los extractos en n-hexano, cloroformo, acetato de

etilo, butanol y agua, se realizaron mediante cromatografía líquida de alta

eficiencia (HPLC), a una concentración de 2000 ppm y empleando una columna

de fase reversa Ultra Aqueous C-18 Restek de 3,2 mm de diámetro interno y 100

mm de largo.

Los extractos fueron eluidos con un gradiente de ácido fosfórico 0,05% (solvente

A): acetonitrilo (solvente B), variando las proporciones de éstos en un gradiente,

según se muestra en la Fig. 3.3. Los parámetros empleados en el equipo se

muestran en la Tabla 3.1:

Parámetros Condiciones

Detector PDA (200-701 nm)

Gradiente

Ácido fosfórico 0,05% : Acetonitrilo

90:10

68:32

45:55

68:32

90:10

Flujo 0,5 mL/min

Temperatura 35 °C

Tiempo de corrida 30,1 min

Volumen de inyección 20 µL

Tabla 3.1. Condiciones del HPLC-DAD para fracciones polares.

GRUPO POLIFENOLES

28

Figura 3.3. Gradiente de ácido fosfórico–acetonitrilo.

3.5 Marcha fitoquímica de la corteza interna de Tabebuia chrysantha

Se realizaron diferentes pruebas de caracterización fitoquímica al material vegetal

con el fin de conocer de manera preliminar los metabolitos secundarios presentes

en la corteza interna de T. chrysantha, siguiendo los procedimientos descritos en

materiales bibliográficos (66), (67) como se observa en la Fig. 3.4.

Para la identificación de los compuestos se emplearon diferentes pruebas, las

cuales se mencionan en la Tabla 3.2.

GRUPO POLIFENOLES

29

Compuesto Prueba

Taninos Gelatina-sal

FeCl3

Flavonoides Shinoda

Rosenhein

Cardiotónicos

Baljet

Molish

Liebermann-Burchard

Ácido tricloro acético

Saponinas Hemolisis de sangre

Espuma

Quinonas

Comportamiento frente a una base

Comportamiento frente a un ácido

Latonas

sesquiterpenicas Óleum

Alcaloides

Dragendorff

Valser

Bouchardat

Tabla 3.2. Pruebas de caracterización de compuestos químicos.

GRUPO POLIFENOLES

30

10 g Corteza interna

Lixiviar en etanol 95% y filtrar

FILTRADOA

RESIDUO(Descatar)

10 mL 5 mL 5 mL

Evaporar elsolvente

Evaporar elsolvente

Concentrar a lamitad delvolumen

EXTRACTO I EXTRACTO II EXTRACTO III

Esteroides,flavonoides,quinonas,saponinas,taninos.

Lactonas terpenicas,cumarinas,cardiotonicos.

Alcaloides.

Realizar pruebas para



Figura 3.4. Marcha fitoquímica de la corteza interna de T. chrysantha.

3.6 Ensayos biológicos

3.6.1 Test de viabilidad celular

En una placa de 96 pozos se incubó la línea celular de macrófagos murinos

RAW264.7 (5x104 células/pozo) durante 24 horas en medio de cultivo, el cual

GRUPO POLIFENOLES

31

consistió en Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) con Glutamax II

(GIBCO/BRL, USA), 10% de suero bovino fetal inactivado por calor, antibióticos

(200 μg/mL penicilina, 200 μg/mL estreptomicina y 400 μg/mL neomicina), 10

mg/mL anfotericina B, 1 mM piruvato de sodio y 0,05 mM de 2-β-mercaptoetanol.

Posteriormente se adicionaron los extractos a diferentes concentraciones (0,625-

2,5 µg/mL) y se incubaron las células durante 24 horas. Después del tratamiento,

se descartó el medio de cultivo y se adicionaron 200 µL de una solución de MTT (5

mg/mL) a cada pozo. Se incubaron las placas durante 4 horas a 37 ⁰C bajo una

atmósfera de 5% de CO2. Luego de descartar el medio, se agregaron 100 μL de

isopropanol 0,04 N en HCl con el fin de solubilizar el formazán generado. La

densidad óptica se midió a 492 nm en un lector de placas (Stat Fax 3200,

Awareness technology Inc., USA).

3.6.2 Determinación de la producción de PGE2 y TNF-α

En una placa de 96 pozos se incubaron macrófagos RAW264.7 (1x106

células/pozo) durante 24 horas y durante las últimas 22 horas de cultivo se

adicionó una solución de ácido acetilsalicílico (50 µM), con el fin de inactivar la

COX-1 endógena. Luego de lavar con PBS y agregar medio de cultivo fresco, se

estimularon los macrófagos con LPS (5 µg/mL durante 12 h), con el fin de detectar

los niveles de PGE2/TNF-α. La concentración de LPS y los tiempos de

estimulación se seleccionaron basados en experimentos cinéticos previos. Las

células se estimularon con LPS en presencia o ausencia de los extractos

vegetales (2,5 µg/mL). Como control, se empleó medio de cultivo sin la presencia

de LPS. En todos los casos, la concentración final de DMO en el cultivo fue menor

del 0,2%. El nivel de endotoxina en los extractos se evaluó empleando el kit E-

toxate (Sigma). Todas las muestras fueron negativas para la presencia de

endotoxina (límite de detección 0,05 – 0,1 EU/mL).

La concentración de PGE2 en el medio de cultivo se determinó usando un kit

comercial de Cayman Chemical Co. (Ann Arbor, Mi, USA), siguiendo las

GRUPO POLIFENOLES

32

instrucciones del fabricante. El porcentaje de inhibición en la producción de la

PGE2 se expresó como [1 – (PGE2 en la muestra/ PGE2 en el blanco – PGE2 en el

control)] x 100. La concentración de TNF-α se determinó empleando kits de ELISA

comerciales (OptEIA ELISA Set, BD Biosciences, USA), Siguiendo las

indicaciones del fabricante. El porcentaje de inhibición en la producción de la TNF-

se expresó como [1 – (TNF-α en la muestra/TNF-α en el blanco – TNF-α en el

control)] x 100.

3.6.3 Determinación de la producción de NO

La estimulación de los macrófagos se realizó de manera similar a la realizada para

detectar los niveles de PGE2 y TNF-α. A diferencia de dicho experimento, se

estimuló a los macrófagos murinos con 10 µg/mL de LPS durante 18 h. La

concentración de NO en el medio de cultivo se determinó mezclando 100 µL del

sobrenadante de cultivo con 100 µL del reactivo de Griess (50 µL 1% sulfanilamida

en 5% H3PO4 y 50 µL 0.1% N-1-naptiletilendiamina) durante 5 min. Se determinó

la absorbancia a 550 nm. Se empleó medio de cultivo fresco como blanco en

todos los experimentos. La cantidad de nitrito en cada muestra se calculó usando

una curva standard preparada con nitrito de sodio (NaNO2). El porcentaje de

inhibición en la producción de NO se expresó como [1 – (NO en la muestra/NO en

el blanco – NO en el control)] x 100.

3.6.4 Extracción de RNA y análisis por medio de RT-PCR (transcripción

reversa reacción en cadena de la polimerasa)

Se extrajo el RNA de las células RAW264.7 tratadas con los extractos obtenidos

de la corteza interna de T. chrysantha y estimuladas con LPS, utilizando el Kit

RNeasy mini kit y siguiendo las instrucciones del fabricante. Dicho RNA se

almacenó a – 80 °C hasta su uso.

La evaluación de la expresión de los genes COX-2, TNF-α e iNOS se realizó

mediante una RT-PCR empleando el Kit GeneAmp Gold RT-PCR (Applied

GRUPO POLIFENOLES

33

Biosystems), siguiendo las instrucciones del fabricante. Los primers utilizados se

muestran en el ANEXO 1.

3.6.5 Cuantificación de RNA

Para determinar la pureza y concentración del RNA extraído se utilizó un

espectrofotómetro NanoDrop 2000/2000c, utilizando como blanco agua libre de

RNasas. Los resultados fueron analizados mediante el software Nanodrop

2000/2000c versión 1.4.2.

3.6.6 Electroforesis de los productos de RT-PCR

Los productos de RT-PCR se sometieron a electroforesis en un gel de agarosa al

2%, utilizando como marcador de peso molecular Hyperladder II y como agente

intercalante SyBR-safe. Se aplicaron 80 voltios durante 90 minutos. El gel se

reveló en un fotodocumentador BIO-RAD. Molecular Imager. Gel DOCTM XR+.

With Image LabTM Software.

3.7 Fraccionamiento de la fracción F-16 del extracto en cloroformo

De la fracción F-16 se tomaron aproximadamente 200 mg para el fraccionamiento.

Se utilizó una columna de vidrio en fase reversa empacada con octadecilsilano

(Aldrich). Como eluentes se usaron 400 mL de metanol, 400 mL de acetona y

finalmente 400 mL de acetato de etilo (Fig 3.5). Se recolectaron 9 fracciones, las

cuales fueron concentradas a presión reducida.

GRUPO POLIFENOLES

34

200 mg de fracción F16

F-1 F-2 F-3 F-4 F-5 F-6 F-7 F-8 F-9

Vetapa = 400 mL

Eluentes:

Metanol

Acetona

Acetato de etilo

Figura 3.5. Fraccionamiento de la fracción F-16 del extracto en cloroformo

3.8 Purificación de compuestos de la F-16-3 de la fracción F-16

De la fracción F-16-3 se tomaron aproximadamente 80 mg para su separación,

mediante cromatografía preparativa. Se utilizó una placa de vidrio de silica gel 60

F254 de 20x20 cm con 1 mm de espesor (Merck). Como eluente se utilizó una

mezcla de 100 mL de diclorometano-acetona (9:1). Se obtuvieron 6 fracciones, las

cuales fueron concentradas a presión reducida.

3.9 Espectroscopia de resonancia magnética nuclear (RMN)

Los espectros de RMN de 1H y 13C de la fracción F-16-3-b, fueron obtenidos

mediante un equipo de resonancia magnética nuclear (Bruker Avance III 400

MHz). La fracción fue disuelta en 0,7 mL de una mezcla de acetona- agua (5:2).

GRUPO POLIFENOLES

35

3.10 Análisis estadístico

Todos los experimentos de estimulación se realizaron tres veces por duplicado. Se

expresan los resultados como Media ± SEM. Dado que no fue posible determinar

la normalidad de los datos debido al tamaño de la muestra, se realizaron

comparaciones mediante la prueba de Kruskal-Wallis con una prueba “Pos – hoc”

correspondiente al test de comparaciones múltiples de Dunn´s, Se consideraron

estadísticamente significativos valores de p ≤ 0,05. El análisis estadístico se

realizó con el programa GraphPad Prism versión 6,0 (GraphPad Software, San

Diego, CA, USA).

GRUPO POLIFENOLES

36

4 RESULTADOS Y DISCUSIÓN

4.1 Rendimiento de extracción

Se obtuvieron 132,9 g de extracto en metanol de la corteza interna de T.

chrysantha con un rendimiento de extracción de 6,6% con respecto al material

vegetal seco y molido.

El porcentaje de rendimiento de extracción en todo el proceso fue de 91 % y los

rendimientos obtenidos para las extracciones sucesivas del extracto en metanol de

corteza interna de T. chrysantha se muestran en la Fig. 4.1.

n-Hex

ano

Clo

rofo

rmo

AcO

Et

BuO

H

Agua

0

10

20

30

40

50

% d

e r

en

dim

ien

to

Figura 4.1. Rendimiento de extracción líquido-líquido del extracto en

metanol.

Se puede observar que el extracto en n-hexano y acetato de etilo tienen un

rendimiento muy bajo (3,2 y 1,6%, respectivamente), mientras que los extractos en

cloroformo, butanol y agua presentan un alto rendimiento (23,8, 19,8 y 42,8%,

respectivamente). Lo anterior indica que la mayoría de los compuestos están

presentes en los extractos de mayor polaridad (Fig. 4.1).

GRUPO POLIFENOLES

37

4.2 Perfiles cromatográficos por HPLC de los extractos de corteza interna

de T. chrysantha

A todos los extractos de la corteza interna de T.chrysantha se les realizó un perfil

cromatográfico por HPLC. Los cromatogramas obtenidos para los extractos en n-

hexano, butanol y agua (VER ANEXO 2, 3 Y 4) no brindan información suficiente

para hacer un análisis sobre la naturaleza de los compuestos que contienen, a

diferencia de los perfiles cromatográficos de los extractos en cloroformo (Fig. 4.2)

y acetato de etilo (Fig. 4.3) que se muestran a continuación.

Figura 4.2. Perfiles cromatográficos del extracto en cloroformo. (A)

Cromatograma, (B) Espectro UV/VIS del pico 4 y (C) Espectro UV/VIS del pico

7.

GRUPO POLIFENOLES

38

Figura 4.3. Perfiles cromatográficos del extracto en acetato de etilo. (A)

Cromatograma, (B) Espectro UV/VIS del pico 2 y (C) Espectro UV/VIS del pico

7.

Se puede observar que los picos 4 y 7 del cromatograma del extracto en

cloroformo y los picos 2 y 7 del extracto en acetato de etilo absorben intensamente

entre 240-290 nm. Este tipo de absorbancia es característica de las naftoquinonas,

antraquinonas, benzoquinonas y homólogos (67). Se compararon los espectros de

los extractos antes mencionados con espectros reportados para compuestos de

este tipo (Fig. 4.4) (68), observándose gran similitud entre estos. Teniendo en

GRUPO POLIFENOLES

39

cuenta lo anterior y los resultados obtenidos en la marcha fitoquímica, se puede

inferir la posible presencia de compuestos de la familia quinona.

Figura 4.4. Espectro UV/VIS de la 1,4-benzoquinona.

4.3 Marcha fitoquímica

La caracterización preliminar de los compuestos químicos presentes en la corteza

de T chrysantha se realizó mediante una marcha fitoquímica, cuyos resultados se

muestran en la Tabla 4.1.

GRUPO POLIFENOLES

40

Compuesto Prueba Pruebas de tubos TLC

Taninos Gelatina-sal - *

FeCl3 - -

Flavonoides

Shinoda - *

Rosenhein + *

Cardiotónicos

Baljet + *

Molish + *

Liebermann-Burchard + *

Ácido tricloro acético * +

Saponinas

Hemolisis de sangre + *

Espuma - *

Quinonas

Comportamiento frente a una base + *

Comportamiento frente a un ácido + *

Latonas

sesquiterpenicas Óleum * +

Alcaloides

Dragendorff - *

Valser - *

Bouchardat - *

Tabla 4.1. Resultados de la marcha fitoquímica del extracto de corteza

interna de T. Chrysantha.

Convenciones: *: No se realizó.

+: Prueba positivo

-: Prueba negativa

GRUPO POLIFENOLES

41

Con la caracterización preliminar se puede inferir que la corteza interna de T.

chrysantha, presenta glicósidos cardiotónicos, quinonas y lactonas

sesquiterpenicas.

4.4 Ensayo de viabilidad celular

Previo a la evaluación de la actividad anti-inflamatoria se determinó la viabilidad

celular de los macrófagos murinos RAW264.7 frente a los extractos de corteza

interna de T. chrysantha a tres concentraciones expresadas en [µg/mL] (VER

ANEXO 5). A continuación se presentan los resultados (Fig. 4.5).

n-hex

ano [2

,5]

n-hex

ano [1

,3]

n-hex

ano [0

,6]

Clo

rofo

rmo [2

,3]

Clo

rofo

rmo [1

,2]

Clo

rofo

rmo [0

,6]

AcO

Et [2,

4]

AcO

Et [1,

2]

AcO

Et [0,

6]

BuO

H [2

,1]

BuO

H [1

,1]

BuO

H [0

,5]

Agua

[2,2

]

Agua

[1,1

]

Agua

[0,6

]

Contr

ol (+)

Contr

ol (-)

0

50

100

150

200

% V

iab

ilid

ad

Figura 4.5. Viabilidad celular de los macrófagos murinos RAW264.7 frente a

los extractos de corteza interna de T. chrysantha.

Se logró determinar que todos los extractos presentan una viabilidad celular

superior al 70% con respecto al control positivo a concentraciones menores o

iguales a 2,5 µg/mL, excepto el extracto en butanol que presenta una mayor

viabilidad (89%) a una concentración menor o igual a 1,1 µg/mL (Fig 4.5).

Teniendo en cuenta lo anterior se seleccionó la concentración más alta de los

GRUPO POLIFENOLES

42

extractos para los bioensayos, a diferencia del extracto en butanol, para el cual se

utilizó la concentración de 1,1 µg/mL.

4.5 Actividad anti-inflamatoria in vitro de los extractos de T.chrysantha.

La línea celular de macrófagos murinos RAW264.7 estimulados con LPS generan

una serie de mediadores de la inflamación tales como PGE2, TNF-α y NO (25). En

estos ensayos se determinó la capacidad de los extractos de la corteza interna de

T. chrysantha para inhibir la producción de dichos mediadores.

Para la determinación de la inhibición en la producción de TNF-α y NO se usaron

dos controles; LPS (+) y LPS (-) que permiten ver la máxima y mínima producción

del mediador respectivamente. Para PGE2 se utilizaron dos controles adicionales a

los mencionados anteriormente, Asp-LPS (+), en el cual inhibe selectivamente la

enzima COX-1 y Asp-DUP-LPS (+), en el cual se inhiben tanto COX-1 como COX-

2. A continuación se muestran los resultados.

4.5.1 Inhibición en la producción de PGE2

Los macrófagos murinos RAW264.7 estimulados con LPS en presencia de los

extractos en n-hexano, cloroformo, acetato de etilo butanol y agua inhibieron la

producción de PGE2 en un rango entre el 5% y el 47% (VER ANEXO 6). El mayor

efecto inhibitorio se observó con el extracto en cloroformo (47%), mientras que el

extracto en butanol mostró la menor inhibición (5%). (Fig 4.6). Sin embargo, no se

encontraron diferencias significativas al comparar con el control de inhibición Asp-

DUP-LPS (+).

GRUPO POLIFENOLES

43

n-Hex

ano

Clo

rofo

rmo

AcO

Et

BuO

H

Agua

LPS (-

)

LPS (+

)

Asp

, LPS (+

)

Asp

, Dup, L

PS (+

)

0

50

100

150

% I

nh

ibic

ión

de P

GE

2

Figura 4.6. Efecto inhibitorio de los extractos de la corteza interna de T.

chrysantha sobre la producción de PGE2 en macrófagos murinos

estimulados con LPS.

4.5.2 Inhibición en la producción de TNF-α

La estimulación de los macrófagos murinos RAW264.7 con LPS indujo a la

producción de citocinas pro-inflamatorias como el TNF-α. Los extractos en n-

hexano, cloroformo, acetato de etilo y agua mostraron los niveles más altos de

inhibición en la producción de TNF-α, destacándose el extracto en n-hexano, con

una inhibición del 112 %, mientras que el extracto en butanol mostró la menor

inhibición con 5% (VER ANEXO 7). Se observaron diferencias estadísticamente

significativas para los extractos en n-hexano (p=0,030), cloroformo (p=0,004) y

acetato de etilo (p=0,038) comparados con el control LPS (+) (Fig. 4.7).

GRUPO POLIFENOLES

44

n-Hex

ano

Clo

rofo

rmo

AcO

Et

BuO

H

Agua

LPS (-

)

LPS(+

)

0

50

100

150

*P=0,030

**P=0,004

*P=0,038

% I

nh

ibic

ión

de T

NF

-


chrysantha sobre la producción de TNF-α en macrófagos murinos


4.5.3 Inhibición en la producción de óxido nítrico (NO)

La producción de NO por macrófagos murinos RAW 264.7 estimulados con LPS

se evaluó midiendo la concentración de nitritos presentes en el medio de cultivo,

mediante una reacción de coloración empleando el reactivo de Griess. Los

macrófagos estimulados en presencia de los extractos en n-hexano, acetato de

etilo y agua aumentan la producción de NO en un porcentaje superior al 100%

comparados con el control LPS (+). El extracto en cloroformo promueve la

producción en un 13% mientras que por el contrario, el extracto en butanol inhibe

la producción de NO en un 60%. (VER ANEXO 8)

Se observó una diferencia estadísticamente significativa (p=0,011) en la

producción de NO entre el extracto en n-hexano comparado con el control LPS (-),

para los demás extractos no se observaron diferencias significativas (Fig 4.8).

GRUPO POLIFENOLES

45

n-Hex

ano

Clo

rofo

rmo

AcO

Et

BuO

H

Agua

LPS (-

)

LPS (+

)-600

-400

-200

0

200*P=0,011

% I

nh

ibic

ión

de N

O


chrysantha sobre la producción de NO en macrófagos murinos estimulados

con LPS.

4.6 CUANTIFICACIÓN DE mRNA EN LA LINEA CELULAR RAW264.7

ESTIMULADAS CON LPS

La normalización de las concentraciones del mRNA de los macrofagos RAW264.7

estimulados con LPS y tratados con los extractos de corteza interna de T.

chrysantha, se llevó a cabo mediante técnicas espectrofotométricas, las lecturas

se realizaron utilizando como blanco el RNasa Free Water del RNeasy Plus mini

kit. Los resultados se muestran en la Tabla 4.2.

GRUPO POLIFENOLES

46

Muestra Concentración

(µg/µl)

A260

(nm)

A280

(nm) 260/280

n-Hexano 0,233 5,827 2,791 2,090

Cloroformo 0,238 5,949 2,834 2,100

Acetato de etilo 0,247 6,185 2,946 2,097

Butanol 0,264 6,612 3,140 2,110

Agua 0,241 6,034 2,881 2,087

LPS (-) 0,190 4,541 2,158 2,113

LPS (+) 0,219 5,634 2,668 2,110

Asp, LPS (+) 0,283 7,168 3,405 2,107

Asp, DUP, LPS (+) 0,212 6,627 3,156 2,100

Tabla 4.2. Cuantificación de mRNA de los macrofagos RAW264.7


Mediante la cuantificación de mRNA se estableció la cantidad a emplear en la

mezcla de reacción de la RT-PCR.

Debido a que las bases púricas y pirimidínicas del DNA absorben a 260 nm y las

proteínas a 280 nm, la relación entre estas dos absorbancias (260/280) se utiliza

para evaluar la pureza del RNA. Dicha relación debe estar en el rango entre 1,8 -

2,0 (69). Dado que todas las muestras de mRNA obtenidas a partir de macrofagos

RAW264.7 estimulados con LPS y tratados con los extractos de corteza interna de

T. chrysantha, se encuentran en dicho rango, podemos decir que dicho mRNA

está libre de contaminantes como proteínas o fenoles (70).

4.7 Efecto de los extractos sobre la expresión de mRNA de COX-2, TNFα e

iNOS en macrófagos murinos RAW264.7 estimulados con LPS.

Para establecer si hay una relación entre la inhibición de la producción de los

mediadores de inflamación (PGE2, TNF-α y NO) y la regulación de las expresiones

GRUPO POLIFENOLES

47

de COX-2, TNF-α e iNOS, se realizó una RT-PCR a partir del mRNA obtenido de

los macrófagos RAW 264.7 estimulados con LPS, usando como gen control β-

actina y un marcador de peso molecular Hyperladder II (100-2000 pb). En Fig. 4.9

se muestran los resultados obtenidos, expresados en forma de intensidad relativa

con respecto al gen control.

n-Hex

ano

Clo

rofo

rmo

Ace

tato

de

etilo

Buta

nol

Agua

LPS (-

)

LPS (+

)

Asp

, LPS (+

)

Asp

, Dup, L

PS (+

)

0

1

2

3

COX-2

TNF-a

iNOs

Niv

ele

s r

ela

tivo

s d

e m

RN

A

Figura 4.9. Efecto inhibitorio de las expresiones de mRNA de COX-2, TNF-α e

iNOS sobre macrófagos murinos RAW264.7 estimulados con LPS.

Se observa que la línea celular de macrófagos murinos RAW264.7 presenta bajos

niveles relativos de expresión de los genes COX-2, TNF-α e iNOS, cuando no han

sido estimulados, a diferencia de las células que han sido tratadas con LPS (71),

en las cuales se incrementa la expresión de dichos genes.

Con relación a la expresión de COX-2, los extractos en n-hexano y cloroformo

inducen una baja expresión de dicho gen, mientras que los extractos en acetato de

etilo, butanol y agua promueven la expresión del gen, al comparar con el control

de estimulación LPS (+).

GRUPO POLIFENOLES

48

Los extractos en n-hexano, cloroformo, butanol y agua incrementaron la expresión

de TNF-a comparado con el control de estimulación LPS (+), mientras que el

extracto en acetato de etilo disminuyó su expresión.

Los extractos en n-hexano y acetato de etilo disminuyeron la expresión de iNOS,

mientras que los extractos en cloroformo, butanol y agua no alteraron su expresión

al comparar con el control de estimulación LPS (+).

No se encontraron diferencias estadísticamente significativas en los patrones de

expresión de los genes analizados.

Los macrófagos murinos RAW 264.7 estimulados con LPS producen una serie de

mediadores de la inflamación tales como la PGE2, implicada en la vasodilatación y

el NO, involucrado en los procesos de vasodilatación y reducción de la agregación

y adhesión plaquetaria. Los macrófagos estimulados con LPS también secretan

otro tipo de sustancias como las citocinas pro-inflamatorias, entre las que se

encuentran IL-6, IL-8, IL-1β y TNF-α (22). En el presente estudio se evaluó el

efecto de los extractos obtenidos de la corteza interna de T.chrysantha sobre la

producción de PGE2, NO y TNF-α y la expresión de los genes que codifican por

las enzimas responsables de la producción de PGE2 y NO (COX-2 e iNOS,

respectivamente).

Todos los extractos de corteza interna de T.chrysantha inhiben la producción de

PGE2, destacándose el extracto en cloroformo, el cual presenta la mayor inhibición

(47%), al evaluar la expresión de COX-2 se puede observar que los extractos en

n-hexano y cloroformo disminuyen la expresión del gen, indicando que esta

disminución se encuentra directamente relacionada con la inhibición en la

producción de PGE2. Por el contrario, los extractos en acetato de etilo y agua

mostraron un incremento en la expresión de COX-2 e inhibición en la producción

de PGE2, indicando que estos extractos tienen efecto directo sobre la actividad

catalítica de la enzima COX-2. Esto se confirma al emplear el control de DUP 697,

el cual es un inhibidor selectivo de COX-2 que inhibe la actividad de la enzima y

para compensar este efecto la célula incrementa la expresión de COX-2 (72).

GRUPO POLIFENOLES

49

El extracto en butanol inhibe la producción de NO en un 60%, pero la expresión de

de iNOS no disminuye lo que sugiere que el mecanismo responsable de la

inhibición de NO es un efecto directo de estos compuestos sobre la actividad de la

enzima, a diferencia de los extractos en n- hexano, cloroformo, acetato de etilo y

agua que promueven la producción de NO.

Todos los extractos de corteza interna inhiben la producción de TNF-α comparado

con el estímulo de LPS (+) en porcentajes superiores al 70%, presentando una

mayor inhibición el extracto en n-hexano (116%).

Éstos resultados indican que la corteza interna de T. chrysantha tiene un efecto

inhibitorio in vitro sobre la producción de mediadores de la inflamación en

macrófagos murinos, dando soporte a los usos etnomédicos reportados en

Sudamérica.

El extracto en cloroformo se puede considerar como el más promisorio de todos

los evaluados, dado que inhibe la producción de PGE2 y TNF- y adicionalmente

inhibe la expresión de la enzima COX-2. Por lo tanto, dicho extracto podría

convertirse en una fuente de compuestos o metabolitos secundarios que pueden

llegar a ser utilizados como anti-inflamatorios. Estos resultados llevaron al

fraccionamiento del extracto en cloroformo, con el fin de identificar los compuestos

responsables de dicha actividad.

4.8 Rendimiento del fraccionamiento del extracto en cloroformo.

Dado que el extracto en cloroformo fue el más promisorio en la actividad biológica,

se continuó con el fraccionamiento de éste. El porcentaje de rendimiento del

fraccionamiento en columna fue del 97,76%. A continuación se presenta el

rendimiento de las fracciones obtenidas de dicho extracto en la Tabla 4.3.

GRUPO POLIFENOLES

50

Fracción Tc-F1

Tc-F2

Tc-F3

Tc-F14

Tc-F5

Tc-F6

Tc-F7

Tc-F8

Tc-F9

Tc-F10

Tc-F11

Rendimiento (%)

0,67 0,69 0,80 1,01 0,90 0,53 0,75 1,17 0,30 0,47 1,96

Fracción Tc-F12

Tc-F13

Tc-F14

Tc-F15

Tc-F16

Tc-F17

Tc-F18

Tc-F19

Tc-F20

Tc-F21

Rendimiento (%)

49,88 7,33 1,94 3,64 5,91 14,05 0,90 2,82 1,79 0,28

Tabla 4.3. Rendimiento del fraccionamiento del extracto en cloroformo

Se puede observar que el porcentaje de rendimiento de las fracciones (Tabla 4.3)

Tc-F1 a Tc-F11 es muy bajo comparado con el resto de las fracciones, indicando

que estas primeras son de carácter apolar, por lo tanto, la mayoría de los

compuestos presentes en el extracto en cloroformo son de alta polaridad.

4.9 Viabilidad celular de las fracciones del extracto en cloroformo

Posterior al fraccionamiento del extracto en cloroformo se realizó el ensayo de

viabilidad celular para determinar qué fracciones podían emplearse en los

posteriores ensayos de actividad anti-inflamatoria, con el fin de identificar los

compuestos responsables de dicha actividad. Los resultados obtenidos se

muestran en la Tabla 4.4.

GRUPO POLIFENOLES

51

Fracciones

Muestra Concentración

(μg/mL) % de

viabilidad Muestra

Concentración (μg/mL)

% de viabilidad

Tc-F1 1 98,1

Tc-F12

2 72,2

0,5 110,5 1 103

Tc-F3

2 77,4 0,5 120,4

1 98,2

Tc-F13

2 97,7

0,5 121,9 1 89,2

Tc-F4

2 18,7 0,5 117,4

1 56,8

Tc-F14

2 80,8

0,5 98,3 1 85

Tc-F5

2 73,9 0,5 109

1 85,7

Tc-F15

2 89,5

0,5 100,2 1 77,4

Tc-F6

2 78,7 0,5 105,6

1 70,2

Tc-F16

2 80,8

0,5 118,2 1 102,4

Tc-F7

2 62,3 0,5 118,3

1 98,4

Tc-F17

2 85,3

0,5 122,9 1 86,3

Tc-F8

2 67,2 0,5 103,8

1 62,9

Tc-F18

2 100,6

0,5 101,7 1 78,5

Tc-F9 1 97,6 0,5 87,6

0,5 103,4

Tc-F19

2 99,8

Tc-F10

2 77,8 1 94

1 88,5 0,5 117,7

0,5 113,5

Tc-F11

2 76,6

1 69,4

0,5 107,4

Controles

Control % de

viabilidad

Control positivo con células 100

Control negativo sin células 0

Tabla 4.4. Viabilidad celular de los macrófagos RAW264.7 frente a las

fracciones del extracto en cloroformo de T.chrysantha.

GRUPO POLIFENOLES

52

La mayoría de las fracciones del extracto en cloroformo de T. chrysantha

presentan una viabilidad celular superior al 80% a una concentración menor o

igual a 2 μg/mL con respecto al control positivo. Las fracciones Tc-F1, Tc-F7y Tc-

F9 mostraron una viabilidad superior al 80% a concentraciones menores o iguales

a 1 μg/mL, mientras que las fracciones Tc-F4 y Tc-F8 mostraron porcentajes de

viabilidad inferiores al 70% y por tanto, se descartaron para realizar los ensayos

de actividad anti-inflamatoria.

Teniendo en cuenta estos resultados y la poca cantidad de masa de las fracciones

se decidió unir algunas, (Tc-F13+Tc-F14) que se nombro como F13 y (Tc-F16+Tc-

F17+Tc-F18+Tc-F19) la cual se nombro como F16, debido a que la fracción Tc-

F12 tenía suficiente masa no se unió con otras fracciones, pero se nombro

nuevamente como F12. Finalmente para posteriores ensayos se usaron las tres

fracciones F12, F13 y F16.

4.10 Efecto de las fracciones del extracto en cloroformo de T. chrysantha

sobre la producción de PGE2, TNF-α y NO

Los macrófagos murinos RAW264.7 fueron estimulados con LPS en presencia de

las fracciones F12, F13 y F16 del extracto en cloroformo de T. chrysantha. Se

observó que las fracciones F13 y F16, fueron las que presentaron mayor inhibición

en la producción de PGE2 (35% y 40% respectivamente), NO (67% y 25%

respectivamente) y TNF-α (49% y 44% respectivamente). La fracción F12 inhibió

la producción de PGE2 (46,5%) y TNF-α (35%), sin embargo, estimuló la

producción de NO (Fig 4.10). Se observaron diferencias estadísticamente

significativas para la fracción F12 comparada con el control LPS (-) para la

inhibición en la producción de TNF-α (p=0,0450) y en la producción de NO

(p=0,0010).

Las fracciones F13 y F16 del extracto en cloroformo presentan los mayores

porcentajes de inhibición, por lo tanto se puede inferir que los metabolitos

GRUPO POLIFENOLES

53

responsables de la actividad anti-inflamatoria del extracto se encuentran

concentrados en estas fracciones.

F12 F13 F16

LPS (-

)

LPS (+

)

LPS+A

SP

ASP

+LPS+D

UP

0

50

100

150

A

% I

nh

ibic

ión

de P

GE

2

F12 F13 F16

LPS(-)

LPS(+

)0

50

100

150

*p=0,0450

B

% I

nh

ibic

ión

de T

NF

-

F12 F13 F16

LPS(-)

LPS(+

)-300

-200

-100

0

100

200 ***p=0,0010

C

% I

nh

ibic

ión

de N

O

Figura 4.10. Efecto inhibitorio de las fracciones del extracto en cloroformo de

la corteza interna de T. chrysantha sobre la producción de PGE2 (A), TNF-α

(B) y NO (C) en macrófagos murinos estimulados con LPS.

GRUPO POLIFENOLES

54

4.11 Rendimiento del fraccionamiento de la fracción F16 del extracto en

cloroformo

Dado que la fracción F16 presentó actividad anti-inflamatoria, se continúo con su

fraccionamiento, en la tabla 4.5 se muestra el rendimiento de las fracciones

obtenidas.

Fracción % de rendimiento

F16-1 …

F16-2 0,5

F16-3 46,8

F16-4 13,3

F16-5 8,1

F16-6 1,5

F16-7 0,6

F16-8 0,7

F16-9 0,3

Tabla 4.5. Rendimiento del fraccionamiento de la fracción F16.

Se observa que la mayor cantidad de compuestos son de carácter polar debido a

que hay gran cantidad de masa en las primeras fracciones, esto se debe al tipo de

columna empleada (octadecilsilano), por tanto los compuestos polares son los

primeros en eluir.

4.12 Purificación de compuestos de la fracción F16-3

Dado que la fracción F16-3 presentó la mayor cantidad de masa, se decidió

purificar mediante cromatografía preparativa, se obtuvieron 6 fracciones de las

cuales, la fracción F16-3-b mostró ser la menos compleja mediante espectros de

Resonancia Magnética Nuclear RMN 1H (Fig. 4.11) y 13C (Fig. 4.12) en

GRUPO POLIFENOLES

55

comparación con las otras fracciones que mostraron tener altas cantidades de

grasas vegetales.

Figura 4.11. Espectro de RMN de 1H de la fracción F16-3-b

GRUPO POLIFENOLES

56

Figura 4.12. Espectro de RMN de 13C de la fracción F16-3-b

En el espectro de RMN de 1H (Fig. 4.11) se observan en la región de aromáticos

dos dobletes con acoplamiento orto J:8,4 Hz entre (7,59-7,56) ppm, un doblete con

acoplamiento meta J:1,8 Hz entre (7,46-7,45) ppm, un doblete entre (6,99-6,97)

ppm con acoplamiento orto J:8,7 Hz, un multiplete (3,81-3,79) ppm

correspondiente a hidrógenos provenientes de grupos metoxilos; de otro lado en el

espectro de RMN de 13C (Fig. 4.12) se observan 9 carbonos, dentro de los cuales

se encuentran 3 carbonos cuaternarios aromáticos entre (153,24-148,75) ppm, 3

carbonos terciarios aromáticos entre (112,53-107,43) ppm y 3 carbonos primarios

correspondientes a grupos metoxilos entre (56,29-55,83) ppm. Con base en al

análisis anterior, se puede inferir que se trata de un sistema aromático tri-

sustituido que podría tener como sustituyentes grupos metoxilos (Fig.4.13), sin

embargo en los espectros de 1H y 13C se observan señales en 7,46 ppm y 124,33

GRUPO POLIFENOLES

57

ppm respectivamente, las cuales corresponden a otros compuestos o impurezas y

no permiten la clara elucidación de la estructura.

H

H

H

R1

R3

R2

R1:OCH3

R3:OCH3

R2:OCH3

Figura 4.13.Posible estructura de compuesto mayoritario de la fracción F16-

3-b

Al comparar con la literatura se han reportado compuestos derivados del ácido

benzoico aislados de la corteza de otras Tabebuias como el ácido veratrico

(Fig.4.13) aislado de Tabebuia heptaphylla (73), que tienen similitud con el

sistema aromático propuesto para el compuesto mayoritario presente en la

fracción F16-3-b.

O

OH

O

O

7.786,93

7,608,6

3,94

3,98

Ácido 3,4-dimetoxibenzóico

(Ácido veratrico)

Figura 4.14. Espectro de RMN de 1H del ácido veratrico.

GRUPO POLIFENOLES

58

5 CONCLUSIONES

Se puede observar que los compuestos del extracto en metanol de corteza

interna de T. chrysantha son principalmente de carácter polar, debido a que el

mayor porcentaje de rendimiento de los extractos son para el extracto en agua.

La viabilidad celular de los macrófagos murinos tratados con los extractos de

corteza interna de T. chrysantha, es superior al 90% con respecto al control.

La mayoría de los extractos mostraron una inhibición superior al 20% en la

producción de PGE2, excepto el extracto en butanol, el cual mostró una

inhibición menor al 10%.

La mayoría de los extractos inhibieron completamente la producción de TNF-α,

excepto el extracto en butanol el cual mostró una inhibición inferior al 90%.

En la determinación de la producción de óxido nítrico (NO) se pudo determinar

que los extractos en n-hexano, cloroformo, acetato de etilo y agua promueven

la producción de este mediador mientras que el extracto en butanol inhibió su

producción.

De todos los extractos evaluados, el extracto en cloroformo fue el más

promisorio por su actividad anti-inflamatoria.

Los extractos en n-hexano y cloroformo inhiben la producción de PGE2 y dicho

efecto se relaciona con la disminución en la expresión de COX-2.

El fraccionamiento del extracto en cloroformo mostró que la mayoría de sus

compuestos son de carácter polar y la viabilidad celular de los macrófagos

murinos frente a las fracciones es alta, excepto las fracciones Tc-F4 y Tc-F8

que fueron tóxicas para los macrófagos murinos.

GRUPO POLIFENOLES

59

Los resultados de la marcha fitoquímica mostraron que hay posibles

metabolitos secundarios, tales como glicósidos cardiotónicos, lactonas

sesquiterpenicas y quinonas. Las quinonas se han identificado en otras

especies de la familia Bignoniaceae.

La fracción F13 y F16 del extracto en cloroformo presentan la mayor actividad

anti-inflamatoria.

El fraccionamiento de la fracción F16 mostró que la mayoría de sus

compuestos son de carácter polar.

El análisis por medio de espectroscopia de resonancia magnética nuclear de

1H y 13C mostró que la fracción F16-3-b podría contener una mezcla de

derivados de ácido benzoico.

GRUPO POLIFENOLES

60

6 RECOMENDACIONES

Evaluar la actividad antioxidante y antibacteriana de los extractos de

T.chrysantha, teniendo en cuenta los resultados obtenidos en la presente

investigación y los reportes de estas actividades en la literatura para otras

especies de Tabebuia.

Evaluar la actividad anti-inflamatoria de la fracción F16-3-b.

Realizar nuevamente el fraccionamiento del extracto en cloroformo con una

mayor cantidad de masa.

Purificar las fracciones obtenidas del fraccionamiento del extracto en

cloroformo con una mezcla de solventes de menor polaridad.

GRUPO POLIFENOLES

61

7 BIBLIOGRAFIA

1. Daniell HW. Gastroesophageal reflux disease stimulation of nsaid-associated atrial fibrillation. Archives of Internal Medicine. 2011;171(7):702-10.

2. Gómez HA, González KN, Medina JD. Actividad Antiinflamatoria de Productos Naturales2011.

3. Molina SC. Farmacología en enfermería: Elsevier; 2007.

4. Ichiyanagu C. Epidemiología de la hemorragia digestiva. Acta Médica Peruana. 2006;23:152-5.

5. Lourenço JA, Pitangui CP, Jordão AA, Vannucchi H, Cecchi AO. Ausência de mutagenicidade e antimutagenicidade do extrato obtido das flores do ipê roxo [Tabebuia impetiginosa (Mart. ex DC.) Standl.]. Revista Brasileira de Plantas Medicinais. 2010;12:414-20.

6. Sathiya M, Muthuchelian K. Studies on Phytochemical Profile and Antibacterial Activity of Ethanolic Leaf Extract of Tabebuia rosea (Bertol.) DC. Ethnobotanical Leaflets. 2008;12:1153-7.

7. Gupta MP, Farmacéutica CSdQF, Bello SEPdCA. 270 plantas medicinales iberoamericanas: Programa Iberoamericano de Ciencia y Tecnología para el Desarrollo, Subprograma de Química Fina Farmacéutica; 1995.

8. Nakano K, Maruyama K, Murakami K, Takaishi Y, Tomimatsu T. Iridoids from Tabebuia avellanedae. Phytochemistry. 1993;32(2):371-3.

9. Böhler T, Nolting J, Gurragchaa P, Lupescu A, Neumayer H-H, Budde K, et al. Tabebuia avellanedae extracts inhibit IL-2-independent T-lymphocyte activation and proliferation. Transplant Immunology. 2008;18(4):319-23.

10. Byeon SE, Chung JY, Lee YG, Kim BH, Kim KH, Cho JY. In vitro and in vivo anti-inflammatory effects of taheebo, a water extract from the inner bark of Tabebuia avellanedae. Journal of Ethnopharmacology. 2008;119(1):145-52.

11. Kim BH, Lee J, Kim KH, Cho JY. Regulation of macrophage and monocyte immune responses by water extract from the inner bark of Tabebuia avellanedae. Journal of Medicinal Plants Research 2010;4(6):431-8.

12. Twardowschy A, Freitas CS, Baggio CH, Mayer B, dos Santos AC, Pizzolatti MG, et al. Antiulcerogenic activity of bark extract of Tabebuia avellanedae, Lorentz ex Griseb. Journal of Ethnopharmacology. 2008;118(3):455-9. Epub 2008/06/27.

13. Pereira E, Machado T, Leal I, Jesus D, Damaso C, Pinto A, et al. Tabebuia avellanedae naphthoquinones: activity against methicillin-resistant staphylococcal strains, cytotoxic activity and in vivo dermal irritability analysis. Annals of Clinical Microbiology and Antimicrobials. 2006;5(1):5.

GRUPO POLIFENOLES

62

14. Park B-S, Lee K-G, Shibamoto T, Lee S-E, Takeoka GR. Antioxidant Activity and Characterization of Volatile Constituents of Taheebo (Tabebuia impetiginosa Martius ex DC). Journal of Agricultural and Food Chemistry. 2003;51(1):295-300.

15. de Santana CF, de Lima O, d' Albuquerque IL, Lacerda AL, Martins DG. [Antitumoral and toxicological properties of extracts of bark and various wood components of Pau d'arco (Tabebuia avellanedae)]. Rev Inst Antibiot (Recife). 1968;8(1):89-94. Epub 1968/12/01. Observacoes sobre as propriedades antitumorais e toxicologicas do extra to do liber e de alguns componentes do cerne do Pau d'arco (Tabebuia avellanedae.

16. Méndez JM. Manejo de semillas de 100 especies forestales de América Latina: CATIE; 2000.

17. Ali RM, Houghton PJ, Hoo TS. Antifungal activity of some Bignoniaceae found in Malaysia. Phytotherapy Research. 1998;12(5):331-4.

18. Consoli RAGB, Mendes NM, Pereira JP, Santos BdS, Lamounier MA. Influência de diversos derivados de vegetais na sobrevida das larvas de Aedes fluviatilis(Lutz) (Diptera: Culicidade) em laboratorio. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz. 1988;83:87-93.

19. Justiniano MJ, Fredericksen TS, Nash D. Ecología y silvicultura de especies menos conocidas. Tajibos o lapachos.: Proyecto de Manejo Forestal Sostenible (BOLFOR); 2000.

20. Almeida ECd, Menezes H. Anti-inflammatory activity of propolis extracts: a review. Journal of Venomous Animals and Toxins. 2002;8:191-212.

21. Calixto JB, Otuki MF, Santos ARS. Anti-Inflammatory Compounds of Plant Origin. Part I. Action on Arachidonic Acid Pathway, Nitric Oxide and Nuclear Factor κ B (NF-κB). Planta Med. 2003;69(11):973-83.

22. Kumar V, Cotran RS, Robbins SL. Patología humana: Elsevier Health Sciences; 2008.

23. Seibert K, Zhang Y, Leahy K, Hauser S, Masferrer J, Perkins W, et al. Pharmacological and biochemical demonstration of the role of cyclooxygenase 2 in inflammation and pain. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 1994;91(25):12013-7. Epub 1994/12/06.

24. Beca T, Hernández G, Bascones A. AINEs como tratamiento coadyuvante de la enfermedad periodontal. Avances en Periodoncia e Implantología Oral. 2007;19:101-13.

25. Kim YK, Kim RG, Park SJ, Ha JH, Choi JW, Park HJ, et al. In Vitro Antiinflammatory Activity of Kalopanaxsaponin A Isolated from Kalopanax pictus in Murine Macrophage RAW 264.7 Cells. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 2002;25(4):472-6.

GRUPO POLIFENOLES

63

26. Villena AA, Regueiro JR, Larrea CL. Inmunología: Editorial Complutense; 1995.

27. Rang HP. Rang y Dale, farmacología: Elsevier; 2008.

28. López JL, Gulias A, Gutiérrez C, Cárdenas MdC, Carrillo E, Terrazas H, et al. Actitud ante los inhibidores selectivos de COX-2. Revista de investigación clínica. 2005;57:6-12.

29. Raghav SK, Gupta B, Agrawal C, Goswami K, Das HR. Anti-inflammatory effect of Ruta graveolens L. in murine macrophage cells. Journal of Ethnopharmacology. 2006;104(1–2):234-9.

30. Victoria MdC, Morón F, Morejón Z, Martínez MJ, López M. Tamizaje fitoquímico, actividad antiinflamatoria y toxicidad aguda de extractos de hojas de Annona squamosa L. Revista Cubana de Plantas Medicinales. 2006;11:0-0.

31. Olmstead RG, Zjhra ML, Lohmann LG, Grose SO, Eckert AJ. A molecular phylogeny and classification of Bignoniaceae. American journal of botany. 2009;96(9):1731-43.

32. Blair S. Plantas antimaláricas de Tumaco: Costa Pacífica colombiana: Universidad de Antioquia; 2005.

33. Flora de la Real Expedición Botánica del Nuevo Reino de Granada: Ed. Cultura Hispánica; 1985.

34. Girard M, Kindack D, Dawson BA, Ethier J-C, Awang DVC, Gentry AH. Naphthoquinone Constituents of Tabebuia spp. Journal of Natural Products. 1988;51(5):1023-4.

35. Rao MM, Kingston DGI. Plant Anticancer Agents. XII. Isolation and Structure Elucidation of New Cytotoxic Quinones From Tabebuia cassinoides. Journal of Natural Products. 1982;45(5):600-4.

36. Linardi MdCF, De Oliveira MM, Sampaio MRP. Lapachol derivative active against mouse lymphocytic leukemia P-388. Journal of Medicinal Chemistry. 1975;18(11):1159-61.

37. Koyama J, Morita I, Tagahara K, Hirai K-I. Cyclopentene dialdehydes from Tabebuia impetiginosa. Phytochemistry. 2000;53(8):869-72.

38. Otero R, Núñez V, Jiménez SL, Fonnegra R, Osorio RG, García ME, et al. Snakebites and ethnobotany in the northwest region of Colombia: Part II: Neutralization of lethal and enzymatic effects of Bothrops atrox venom. Journal of Ethnopharmacology. 2000;71(3):505-11.

39. Camacho RL. Manual de identificación de especies no maderables del corregimiento de Tarapacá Colombia: Instituto Amazónico de Investigaciones Científicas; 2006.

GRUPO POLIFENOLES

64

40. Bueno J, Isaza G, Gutiérrez F, Carmona W, Pérez J. Estudio etnofarmacológico de plantas usadas empíricamente por posibles efectos inmunoestimulantes. . Rev Med de Risaralda 2001;7(1):7-11.

41. Isaza G, Bueno J, Jaramillo R, Gutiérrez F, Guzmán A. Estudio etnofarmacológico de plantas usadas empíricamente en 4 ciudades del centro-occidente colombiano. Medomai. 2001;2(1):8-9.

42. Perez JE, Isaza G, Bueno JG, Arango MC, Hincapié BL, Nieto AM, Londoño DP. Efecto de los extractos de Phenax rugosus, Tabebuia chrysantha, Althernantera illiamsii y Solanum dolichosepalum sobre el leucograma y la producción de anticuerpos en ratas. Revista medica de Risaralda. 2004;10 (2):13-21.

43. Ospina LF, Aragon DM, Vergel NE, Isaza G, Pérez JE. Anti-inflammatory and antioxidant activities of Phenax rugosus (Poir.) Wedd and Tabebuia chrysanta G. Nicholson. Vitae. 2011;18:49-55.

44. Zani CL, De Oliveira AB, De Oliviera GG. Furanonaphthoquinones from Tabebuia ochracea. Phytochemistry. 1991;30(7):2379-81.

45. B. de Oliveira A, Raslan DS, G. de Oliveira G, Maia JGS. Lignans and naphthoquinones from Tabebuia incana. Phytochemistry. 1993;34(5):1409-12.

46. Díaz F, Medina JD. Furanonaphthoquinones from Tabebuia ochracea ssp. neochrysanta. Journal of Natural Products. 1996;59(4):423-4.

47. Sharma PK, Khanna RN, Rohatgi BK, Thomson RH. Tecomaquinone-III: A new quinone from Tabebuia pentaphylla. Phytochemistry. 1988;27(2):632-3.

48. Manners GD, Jurd L. A new naphthaquinone from Tabebuia guayacan. Phytochemistry. 1976;15(1):225-6.

49. Wagner H, Kreher B, Lotter H, Hamburger MO, Cordell GA. Structure Determination of New Isomeric Naphtho[2,3-b]furan-4,9-diones from Tabebuia avellanedae by the selective-INEPT technique. Helvetica Chimica Acta. 1989;72(4):659-67.

50. Blatt CTT, Salatino A, Salatino MLF. Flavonoids of Tabebuia caraiba (Bignoniaceae). Biochemical Systematics and Ecology. 1996;24(1):89.

51. Warashina T, Nagatani Y, Noro T. Constituents from the Bark of Tabebuia impetiginosa. Chemical and Pharmaceutical Bulletin. 2006;54(1):14-20.

52. de Almeida ER, da Silva Filho AA, Dos Santos ER, Correia Lopes CA. Antiinflammatory action of lapachol. Journal of Ethnopharmacology. 1990;29(2):239-41.

53. Subramanian S, Ferreira MMC, Trsic M. A Structure-Activity Relationship Study of Lapachol and Some Derivatives of 1,4-Naphthoquinones Against Carcinosarcoma Walker 256. Struct Chem. 1998;9(1):47-57.

GRUPO POLIFENOLES

65

54. Dolan ME, Frydman B, Thompson CB, Diamond AM, Garbiras BJ, Safa AR, et al. Effects of 1,2-naphthoquinones on human tumor cell growth and lack of cross-resistance with other anticancer agents. Anti-cancer drugs. 1998;9(5):437-48.

55. Renou SG, Asis SE, Abasolo MI, Bekerman DG, Bruno AM. Monoarylhydrazones of alpha-lapachone: synthesis, chemical properties and antineoplastic activity. Die Pharmazie. 2003;58(10):690-5.

56. Byung C, Jun L, KO Woo S, Young K, Yung C, Ho-Sung K, et al. Anti-inflammatory effects of aqueous extract from Dichroa febrifuga root in rat liver. Acta Pharcologica sinica. 2003;24 (2):127-32.

57. Burnett AR, Thomson RH. Naturally occurring quinones. Part XII. Extractives from Tabebuia chrysantha nichols and other bignoniaceae. Journal of the Chemical Society C: Organic. 1968(0):850-3.

58. Awang DVC, Dawson BA, Ethier J-C, Gentry AH, Girard M, Kindack D. Naphthoquinone Constituents of Commercial Lapacho/Pau d'arco/Taheebo Products. Journal of Herbs, Spices & Medicinal Plants. 1995;2(4):27-43.

59. Roitt I BJ, Male D, Roth D. Inmunología: Elsevier España; 2007.

60. Chen K, Pittman RN, Popel AS. Nitric oxide in the vasculature: where does it come from and where does it go? A quantitative perspective. Antioxidants & redox signaling. 2008;10(7):1185-98.

61. Reumatología SEd. Artrosis: Fisiopatología, diagnóstico y tratamiento: Editorial Medica Panamericana Sa de; 2010.

62. Tamargo J, Caballero R, Gómez R, Núñez L, Vaquero M, Delpón E. Efectos del óxido nítrico sobre la función cardíaca. Revista Española de Cardiología. 2006;6(Supl.A):3-20.

63. Anderson GL, McNellis LA. Enzyme-Linked Antibodies: A Laboratory Introduction to the ELISA Assay. Journal of Chemical Education. 1998;75(10):1275.

64. Losada FL. Fundamentos moleculares en medicina: El Manual Moderno; 2005.

65. Tintinalli JE, Stapczynski JS. Tintinalli's Emergency Medicine: A Comprehensive Study Guide: McGraw-Hill; 2011.

66. Bilbao MdR. Análisis fitoquímico preliminar: Oficina de publicaciones Universidad del Quindío; 1997.

67. Dominguez XA. Métodos de investigación fitoquímica: Editorial Limusa; 1973.

68. INEP CP RAS NO, Commerce CCcbtUSSo, reserved. obotUSoAAr. p-Benzoquinone. 2007.

GRUPO POLIFENOLES

66

69. Concepción J, Puerta B, P C, Ureña P. Prácticas de biología molecular: Pontificia Universidad Javeriana.

70. Escrig AJ. Manual de Neurogenética: Díaz de Santos; 2003.

71. Yoon WJ, Ham YM, Yoo B-S, Moon JY, Koh J, Hyun CG. Oenothera laciniata inhibits lipopolysaccharide induced production of nitric oxide, prostaglandin E2, and proinflammatory cytokines in RAW264.7 macrophages. Journal of Bioscience and Bioengineering. 2009;107(4):429-38.

72. Hay C, de Belleroche J. Carrageenan-induced hyperalgesia is associated with increased cyclo-oxygenase-2 expression in spinal cord. NeuroReport. 1997;8(5):1249-51.

73. Garcez FR, Garcez WS, Mahmoud TS, Figueiredo PdO, Resende UM. Novos constituintes químicos das cascas do caule de Tabebuia heptaphylla. Química Nova. 2007;30:1887-91.

GRUPO POLIFENOLES

67

ANEXO 1

Primers Sequence

Sense mCOX2 5’-GGA GAG ACT ATC AAG ATA GTG ATC-3’

Antisense mCOX2 5’-ATG GTC AGT AGA CTT TTA CAG CTA-3’

Sense mbactin 5’-TGT GAT GGT GGG AAT GGG TCA G-3’

Antisense mbactin 5’-TTT GAT GTC ACG CAG GAT TTC C-3’

Forward miNOS 5’-CCC TTC CGA AGT TTC TGG CAG CAG C-3’

Reverse miNOS 5’-GGC TGT CAG AGC CTC GTG GCT TTG G-3’

Forward mTNF-α 5’-TTG ACC TCA GCG CTG AGT TG-3’

Reverse mTNF-α 5’-CCT GTA GCC CAC GTC GTA GC-3’

GRUPO POLIFENOLES

68

ANEXO 2

Cromatograma del extracto en n-hexano

Espectro UV/VIS del pico 1

GRUPO POLIFENOLES

69


GRUPO POLIFENOLES

70

ANEXO 3

Cromatograma del extracto en butanol


GRUPO POLIFENOLES

71

Espectro UV/ViS del pico 5

GRUPO POLIFENOLES

72

ANEXO 4

Cromatograma del extracto en agua


GRUPO POLIFENOLES

73


GRUPO POLIFENOLES

74

ANEXO 5

Viabilidad celular de los macrófagos RAW264.7 frente a los extractos de

corteza interna de T. chrysantha.

Extractos

Muestra Concentración (μg/mL) Viabilidad (%)

n-Hexano

2,5 79

1,2 78

0,6 130

Cloroformo

2,3 113

1,2 104

0,6 139

Acetato de etilo

2,4 98

1,2 98

0,6 129

Butanol

2,1 64

1,1 89

0,5 115

Agua

2,2 103

1,1 82

0,6 92

Controles

Control Viabilidad (%)

Control positivo con células 100

Control negativo sin células 0

GRUPO POLIFENOLES

75

ANEXO 6

Efecto inhibitorio de los extractos de la corteza interna de T. chrysantha

sobre la producción de PGE2 en macrófagos murinos estimulados con LPS.

Muestra Inhibición (%)

n-Hexano 23,5

Cloroformo 47,1

Acetato de etilo 30,8

Butanol 5,6

Agua 34,3

LPS (-) 100,0

LPS (+) 0,0

Asp, LPS (+) 2,5

Asp, DUP, LPS (+) 88,3

GRUPO POLIFENOLES

76

ANEXO 7


sobre la producción de TNF-α en macrófagos murinos estimulados con LPS


n-Hexano 112,8

Cloroformo 111,8

Acetato de etilo 121,7

Butanol 71,0

Agua 101,4

LPS (-) 100,0

LPS (+) 0,0

GRUPO POLIFENOLES

77

ANEXO 8


sobre la producción de NO en macrófagos murinos estimulados con LPS


n-Hexano -312,2

Cloroformo -13,3

Acetato de etilo -139,0

Butanol 59,6

Agua -187,7

LPS (-) 100,0

LPS (+) 0,0

GRUPO POLIFENOLES

78

ANEXO 9

Efecto inhibitorio de las expresiones de mRNA de COX-2, TNF-α e iNOS

sobre macrófagos murinos RAW264.7 estimulados con LPS

Muestra COX-2

(Rf)

TNFα

(Rf)

iNOS

(Rf)

n-Hexano 0,04 1,93 0,99

Cloroformo 0,07 1,33 0,70

Acetato de etilo 0,17 0,95 0,56

Butanol 0,15 1,26 0,70

Agua 0,18 1,91 1,05

LPS (-) 0,06 1,22 0,64

LPS (+) 0,14 1,15 0,65

Asp, LPS (+) 0,04 1,66 0,85

Asp, DUP, LPS (+) 0,14 1,33 0,74

actividad anti-inflamatoria in vitro de los...

Documents