act1. reacciones cruzadas entre alergenos (villalba)

REACTIVIDAD CRUZADA ENTREALERGENOS

De todos es sabido que la reacción alérgica,en un individuo hipersensible a una sustanciadada, surge ante un segundo encuentro con lafuente alergénica, después de un contacto inicialcon ella. El primero de tales contactos sensibili-za al individuo frente a tal alergeno, induciendola síntesis de IgE específicas de dicho alergenoy preparando así su organismo para respondercon mayor eficacia a posteriores encuentros conél. En estos contactos, la población de anticuer-pos sintetizados desencadena una respuestainflamatoria diversa que da lugar a los síntomasclínicos característicos de la alergia tipo-I.

Sin embargo, un individuo puede sufrir proce-sos de alergia frente a sustancias o materialescon los cuales nunca ha tenido contacto previo.Ello puede ser explicado por el hecho de que lafuente de alergia comparta una sustancia alergé-nica con otro material con el que el paciente síhaya tenido relación directa y que aportó elagente sensibilizante en aquel primer encuentro.Ante este tipo de acciones, se dice que existereactividad cruzada entre ambos materiales: elindividuo posee IgE responsables de esa activi-dad y será hipersensible indistintamente a una uotra fuente de alergia.

Pero, la identidad estructural de los agentesalergénicos que conducen a la reactividad cruza-da no ha de ser necesariamente absoluta. Bastacon que exista una cierta similitud molecular, enalgunos casos incluso mínima. Basta con quecompartan un epítopo alergénico.

Naturaleza de los agentes implicados en lareactividad cruzada

La mayor parte de los alergenos de origen natu-ral son de naturaleza polipeptídica. Pero muchasproteínas alergénicas poseen además grupos quí-micos de diferente naturaleza, siendo los más fre-cuentes los carbohidratos. Así, tanto las proteínascomo los glicanos constituyen los mejores candi-datos para ejercer un papel en la reactividad cru-zada entre diversas fuentes alergénicas naturales.

La mayor parte de las células de un organismocomparten numerosas funciones, y cada una deestas funciones están ejecutadas por la misma pro-teína. Este concepto podemos extenderlo a célulasde diferentes organismos. En general, idénticasfunciones son desempeñadas en organismos dis-tintos por la misma proteína. Sin embargo, laestructura de esa proteína puede diferir de unasespecies biológicas a otras en un grado muy diver-so, constituyendo una familia de proteínas homó-logas. La similitud entre ellas viene frecuente-mente regida por la proximidad filogenética de lasespecies comparadas. Tanto más parecidas seránlas secuencias de aminoácidos (también llamadasestructuras primarias) de las proteínas con idénti-ca función cuanto más cercanas se encuentren lasespecies en el árbol evolutivo. Así, si la reactivi-dad cruzada depende de la similitud de estructu-ras, tanto mayor probabilidad de ofrecer talesreacciones presentarán las proteínas alergénicasprocentes de fuentes biológicas distintas cuantomás relacionadas filogenéticamente se encuentrenéstas.

Además de las proteínas, los azúcares puedentambién encontrarse implicados en reacciones

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Revisión

Reacciones cruzadas entre alergenos: implicación de los carbohidratos

R. Rodríguez, M. Villalba

Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Facultad de Ciencias Químicas, Universidad Complutense, Madrid.

Rev. Esp. Alergol Inmunol Clín, Octubre 1997 Vol. 12, Núm. 5, pp. 269-281

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cruzadas. Como discutiremos más adelante conmayor profundidad, ello se debe a la confluenciade estructuras, esto es, a la restringida diversidadde sus estructuras alergénicas.

Factores que condicionan la existencia dereactividad cruzada

Del análisis de la naturaleza y función de lasmoléculas principalmente implicadas en la reacti-vidad cruzada se puede desprender que hay tresfactores que favorecen su existencia:

a) Una estructura molecular altamente conser-vada

Del propio concepto de reactividad cruzada sededuce que ésta será posible cuando el alergeno,casi siempre una proteína, posea una secuencia deaminoácidos muy parecida en las diversas fuentesalergénicas en las que se encuentre. Esa similitudestructural puede y suele ocurrir, como ya hemoscomentado, entre proteínas con idéntica funciónbiológica en las distintas especies. A menudo, lafunción de la proteína ejerce una presión conserva-tiva tan fuerte que no es posible alterar apenas susecuencia en un gran número de posiciones de lacadena polipeptídica sin que se perturbe su activi-dad biológica; incluso, ciertos cambios puedendesembocar en una proteína totalmente inactiva. Lacoincidencia de estructuras entre proteínas homólo-gas será tanto mayor cuanto más sometida seencuentre a restricciones conformacionales. Ello setraduce en el hecho de que la molécula debe pose-er una estructura sumamente conservada a lo largode las diversas especies, por lo que, si la proteína esalergénica, la reactividad cruzada debida a ella seráaltamente probable. Así, por ejemplo, una proteínaque posea múltiples ligandos con los que debe esta-blecer numerosos contactos, en los que son insusti-tuibles determinados aminoácidos de la cadenapolipeptídica -frecuentemente residuos expuestos almedio acuoso circundante-, son las candidatas másidóneas para encontrarse involucradas en las reac-ciones cruzadas. Cuando, por el contrario, la per-misividad a los cambios secuenciales es grande,esto es, la proteína presenta actividad biológica aúndisponiendo de estructuras primarias poco simila-res, la reactividad cruzada es más improbable: lasdiferencias estructurales entre el alergeno original ysu homólogo pueden ser detectadas por los anti-cuerpos específicos del primero, y no ser capaces

de reconocer en el homólogo los epítopos corres-pondientes, lo que se traduce en una ausencia dealergenicidad por parte de este último en lospacientes sensibles al alergeno original.

En el primero de los casos se encuentran dosalergenos a los que se ha atribuido un importantepapel en la reactividad cruzada1: Bet v 1 -alergenoprincipal del polen de abedul- y sus homólogas enotros pólenes, y las profilinas. Ambas familias deproteínas poseen secuencias suficientemente con-servadas en numerosas especies para ser reconoci-das en mayor o menor grado por los anticuerposIgE producidos por la estimulación con cualquie-ra de sus homólogos. Mucha menor similitudsecuencial presentan, sin embargo, Ole e 1, Lol p11 y sus equivalentes de otros pólenes no relacio-nados filogenéticamente como el de maíz o el deabedul, evitándose así la alergenicidad cruzadaentre especies evolutivamente alejadas. Así, difí-cilmente dichos alergenos serán responsables detal reactividad entre los pólenes de oleáceas y gra-míneas, o betuláceas.

b) Coincidencia de tejido Lógicamente, la presencia de proteínas con

idéntica función biológica -y por tanto con estruc-turas semejantes- se acentúa en tejidos homólo-gos. Las células de los tejidos poseen muchas pro-teínas especializadas en desempeñar funcionespropias de dicho tejido, y que son diferentes de lasde otros órganos. Por ello, la reactividad cruzadaserá tanto más probable e intensa cuanto más rela-cionados se encuentren los tejidos alergénicos.Por ejemplo, la frecuencia de esta reactividad serásuperior entre los propios pólenes de diversasespecies de plantas que con los frutos, las semi-llas, las hojas; o bien los epitelios de animalesdomésticos entre sí, o entre las esporas de hongos,o entre los excrementos de ácaros, etc.

Se salen de este patrón proteínas ubicuas, queposeen una actividad universal, indispensable paramuchos tipos de células, por lo que se puedenencontrar en cantidades detectables desempeñan-do un papel relevante en la reactividad cruzada.Este es el caso de las profilinas, y quizás la tropo-miosina y proteínas ligantes de calcio, de másreciente implicación en estos procesos de reactivi-dad cruzada.

c) Proximidad filogenética de las especies aler-génicas

La similitud estructural entre proteínas homólo-

270 R. Rodríguez y M. Villalba Volumen 12

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gas es mayor para las procedentes de fuentes aler-génicas filogenéticamente cercanas. La presiónevolutiva no ha dispuesto del tiempo suficientepara crear y aceptar los mismos cambios en laestructura de una proteína de dos especies próxi-mas que los que pueden mostrarse entre dos másalejadas. Esta consideración permite agrupar, porun lado, las especies biológicas animales, por otrolado, las vegetales y finalmente los microorganis-mos, teniendo presente que dentro de cada grupoespecies muy próximas poseerán más probabili -dad de compartir alergenos que aquéllas menosrelacionadas. Por ejemplo, los pólenes de betulá-ceas presentarán más frecuentemente reaccionescruzadas entre ellos, que con los de oleáceas o conlos de gramíneas.

En algunas ocasiones, no es necesario que lasimilitud estructural entre las proteínas alergéni-cas se extienda a la molécula completa para quetenga lugar la reactividad cruzada entre ellas. Bas-ta con que el parecido exista en una pequeña par-cela del polipéptido para que los anticuerpos IgEpuedan unirse al antígeno. Esta situación puedeser ilustrada mediante los «motivos funcionales».Se trata de regiones muy definidas de la estructu-ra de las proteínas, frecuentemente de carácterconformacional (es decir, tridimensional), queposeen funciones específicas en proteínas muydiferentes, funciones tales como catalítica, recep-tora de un ligando concreto -que puede ser unsimple ion-, sustrato de una actividad ajena, etc.La conservatividad de la estructura de estos«motivos» suele ser muy alta, precisamente parapreservar esa función característica, y cambiosmínimos en ella dan lugar a proteínas inoperantes.Un ejemplo de este tipo de estructura polipeptídi-ca serían los bucles característicos de unión delion calcio, motivos funcionales muy difundidos alo largo de un gran número de proteínas, proteínasmuy diversas y con funciones particulares diferen-tes. Su presencia en la estructura polipeptídica tri-dimensional en lugares de alta exposición almedio acuoso, su gran conservatividad, su notablepolaridad (ricos en aminoácidos de carácter áci-do), su ubicuidad, y su estabilidad en presenciadel ion, hacen de ellos firmes candidatos a consti-tuir determinantes alergénicos responsables denumerosas reacciones cruzadas entre una ampliadiversidad de especies.

Además de los factores mencionados, existen

otros secundarios que condicionan la expresión delas reacciones cruzadas, como son la solubilidaddel alergeno o su abundancia en la fuente biológi-ca. Pequeños cambios en la secuencia de una pro-teína pueden afectar profundamente a su solubili-dad, por ejemplo la sustitución de un residuopolar de la superficie de la proteína -como un resi-duo de aspártico- por uno de carácter hidrofóbicocomo sería una valina. Esta alteración, además derebajar la solubilidad del polipéptido, puede indu-cir la autoasociación de las moléculas formandoagregados difícilmente extraíbles en sistemasacuosos, y por ello menos capaces de inducir pro-cesos alérgicos. Por otro lado, proteínas homólo-gas en especies distintas pueden presentarse enniveles de concentración muy diferentes, y consti-tuirse o no en alergenos dependiendo de esosniveles, ya que darían lugar a títulos altos o bajosde anticuerpos IgE; no en vano se ha observadoque la mayor parte de los alergenos principalesson proteínas abundantes en los extractos alergé-nicos.

Fuentes biológicas entre las que se dafr ecuentemente la reactividad cruzada

En la práctica, la reactividad cruzada -al mar-gen de algunos escarceos con insectos, peces yácaros- posee fundamentalmente dos frentes deestudio: la que tiene lugar entre los pólenes, y laque se da entre pólenes y algunos alimentos deorigen vegetal como son las frutas y hortalizas. Laescasez de datos moleculares sobre alergenos y laausencia de unas bases coherentes para el análisisde esas reacciones cruzadas pueden ser la causade que, hasta la fecha, apenas se hayan analizadoaquellas responsables de las polinosis que, comola alergia al polen de abedul, se había observadoen la década de los 80 que predisponían al pacien-te al síndrome de alergia oral o a síntomas rela-cionados con el consumo de vegetales crudos1,sobre todo frutas de la familia de las rosáceas,entre las que se encuentran la manzana y el melo-cotón. Otros casos de alergias relacionadas entresí son a ambrosía y melón o plátano, o a algunosinsectos y ácaros, a castaña y látex, a caracoles yácaros, etc. Pero estas últimas están poco docu-mentadas aún.

Con todo ello, raramente se han estudiado otrasacciones que no sean las de Bet v 1 y las profili -

Núm. 5 Reacciones cruzadas entre alergenos 271

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nas, ambos alergenos importantes en vegetales.Cuando el estudio se generalice a otros materialesalergénicos, o implicando a nuevas proteínas, esmuy probable que la incidencia de la reactividadcruzada se observe para un gran colectivo de aler-genos. Cada uno de ellos puede tener por cuentapropia una baja incidencia clínica, pero la diagno-sis de su implicación en reacciones cruzadas pue-de ser esencial para el tratamiento y prevención delas alergias del paciente.

Como hemos dicho, dos proteínas han sidoprincipalmente involucradas en reacciones cruza-das1: las profilinas y el alergeno principal delpolen de abedul, Bet v 1. La profilina, una pro-teína capaz de interaccionar con el citoesqueletocelular y con fosfoinosítidos, está presente encasi todas las células eucarióticas. Posee unaestructura muy conservada en especies relaciona-das filogenéticamente: las profilinas procedentesde especies vegetales presentan una identidad desecuencia de alrededor del 80%, mientras que laprofilina humana tiene alrededor de un 30% deidentidad con la de Acanthamoeba. Dada su ubi-cuidad y su carácter alergénico, se la ha definidocomo «panalergeno»2. Alrededor del 20% de lospacientes alérgicos al polen de abedul son sensi-bles a la profilina, incrementándose este valornotablemente si consideramos las alergias aalgunos alimentos como manzana y melocotón.Aunque la intensidad de la unión de la profilinaa las IgE de pacientes alérgicos es moderada, lareactividad cruzada debida a ella tiene lugarentre numerosos organismos, incluso muy pocorelacionados evolutivamente, por lo que se laconsidera como uno de los principales alergenosresponsables de esta actividad. Por otro lado, sesabe que la alergia a manzana es muy frecuenteentre los pacientes sensibles al polen de abedul.De ello se ha responsabilizado a las proteínashomólogas de la familia de Bet v 13, que poseensecuencias muy semejantes, encontrándose tam-bién implicadas en las reacciones cruzadas anivel de IgE entre pólenes de abedul, avellano,aliso y carpe.

Recientemente se ha observado en pólenes dediversas especies, incluso no relacionadas filo-genéticamente, la existencia de una proteínaligante de calcio que podría constituir un nuevopanalergeno, al menos a nivel de especies vege-tales4. Se ha detectado en todos los pólenes tes-

tados (oleáceas, gramíneas, betuláceas, com-puestas, pináceas, cupresáceas), lo que hacesuponer que posee una secuencia de aminoáci-dos altamente conservada. Se ha podido demos-trar que, en la interacción de las IgE de suerosde pacientes alérgicos a polen de Cynodon dac-tilon con la proteína aislada de este polen, estáimplicado uno de los sitios de unión de calcio.Esto podría estar relacionado con la incipienteinhibición que ejerce el extracto de polen deabedul sobre la interacción entre la parvalbúmi-na de bacalao (con tres sitios de unión de calcio)y los sueros de pacientes alérgicos a ella, datoque sorprendió notablemente a Apold y Elsayedhace cerca de dos décadas y que nunca habíanpodido explicar. Los estudios sobre esta nuevafamilia de proteínas son aún preliminares, peropodrían relacionar epítopos alergénicos presen-tes en proteínas de células animales con otros decélulas vegetales, con el interés que ello tendríapara explicar las alergias cruzadas, por ejemplo,entre pólenes y pescados, o de forma más gene-ral entre especies biológicas muy alejadas filo-genéticamente.

Finalmente, la tropomiosina constituye otroobjetivo más en los estudios de reactividad alergé-nica cruzada. Aunque aún existen pocos datos alrespecto, esta proteína animal, implicada en lamaquinaria contráctil de las células, ha atraído laatención como posible responsable de procesos dereactividad cruzada entre fuentes alergénicas muydiversas, tales como las gambas, los ácaros y losinsectos5.

LOS CARBOHIDRA TOS COMOESTRUCTURAS ANTIGENICAS

Papel de los carbohidratos en la natur alezaLas funciones atribuidas a las estructuras glico-

sídicas son muy numerosas y diversas, y proba-blemente la lista no haya sido aún completada.Además de tareas meramente estructurales, comocontribuir a la estabilidad, conformación y solubi-lidad de la proteína de la que forman parte, loscarbohidratos pueden también proporcionarle pro-tección frente a actividades proteolíticas extra-celulares, o modular la función proteica. Papelesmás dinámicos pueden resumirse en una implica-ción en procesos de reconocimiento que incluyen


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el control de la vida celular, la provisión de ligan-dos para la unión específica entre proteínas, o deestructuras diana para microorganismos, elenmascaramiento de dichas estructuras, o bien lamediación en las interacciones célula-célula océlula-matriz extracelular. Muchas de estas activi-dades las desempeñan pequeñas estructuras glico-sídicas, oligosacáridos, con no más de diez o doceunidades monosacáridas, formando parte de pro-teínas, glicoproteínas, que pueden ser muy activasantigénicamente. La heterogeneidad de las cade-nas glicosídicas, incluso de las que comparten lamisma posición de enlace a la cadena polipeptídi-ca, junto con la dificultad de disponer de ensayosbioquímicos adecuados, son los principales moti-vos de que aún no sea fácil realizar una asignaciónespecífica de roles biológicos a carbohidratos con-cretos.

Los glicanos de glicoproteínas pueden ser clasi-ficados en dos grupos: aquellos que poseen unaunión a la cadena polipeptídica de tipo O-glicosí-dico a través de la cadena lateral de una serina ode una treonina -generalmente contienen un resi-duo de N-acetilgalactosamina en su extremoreductor-; y los que se unen mediante un enlaceN-glicosídico a una asparagina del polipéptido,empleando para ello un resto de N-acetilglucosa-mina del extremo reductor. Los primeros, engeneral, juegan un papel en las propiedades fisi-coquímicas de las glicoproteínas portadoras. Losúltimos cumplen funciones de ligandos en fenó-menos de reconocimiento entre moléculas de lasuperficie celular.

Variedad estructural de los carbohidratosLos carbohidratos no se han considerado duran-

te mucho tiempo moléculas inmunogénicas idó-neas. En general, de menor envergadura y varie-dad estructural que las proteínas, su capacidadantigénica sería dudosa. Sin embargo, en las últi-mas dos décadas ha sido tal el avance en su análi-sis molecular y funcional que aquellos criterioshan quedado obsoletos. Así, se ha observado quela presencia de determinados monosacáridos en laestructura del carbohidrato les capacita para cons-tituirse en potentes antígenos, sobre todo cuandose encuentran formando parte de glicoproteínas,esto es, conjugados con cadenas polipeptídicas6.Y, dado que los carbohidratos se encuentran loca-lizados en la periferia de la estructura de las gli-

coproteínas, accesibles a la interacción con otrasmoléculas tales como los anticuerpos, se conside-ran ahora muy aptos para constituirse en determi-nantes antigénicos.

Los seres vivos poseen en su organizaciónmacromolecular tres tipos de biopolímeros mayo-ritarios: ácidos nucleicos, proteínas y carbohidra-tos. Todos ellos se encuentran constituidos porunidades monoméricas enlazadas covalentemente,pero la existencia de ramificaciones y el anome-rismo distingue a las cadenas polisacáridas de lasnucleotídicas y aminoacídicas. La variedad demonosacáridos (por ejemplo, hexosas) integrantesde los carbohidratos es aparentemente menor quela de los aminoácidos que forman las proteínas.Sin embargo, la posibilidad de unión entre ellos através de cuatro posiciones distintas, la configura-ción a o ß del enlace, o la conformación alterna-tiva piranósido/furanósido de cada monómero,conduce a una gran diversidad de isómeros. Conuna glucosa y una manosa se pueden formar has-ta 16 disacáridos diferentes.

Sin embargo, la variedad de carbohidratos natu-rales no puede compararse con la de las estructu-ras proteicas; éstas poseen 20 monómeros diferen-tes, organizados en todas las combinacionesposibles, y además plegados en una arquitecturatridimensional, lo que les confiere una diversidadcasi imposible de imaginar. La razón que subyaceal limitado número de estructuras oligosacáridas ypolisacáridas naturales es que los organismos, lascélulas, poseen sólo unos pocos sistemas distintosde síntesis de carbohidratos, que conducen a laformación de moléculas bastantes definidas,muchas de las cuales poseen en común una por-ción importante de su estructura. De ello da cuen-ta incluso el reducido número de tipos de unióndel glicano a la cadena polipeptídica: N-glicosídi-co y O-glicosídico. Sin embargo, y a pesar deexistir fórmulas mínimas comunes a muchos car-bohidratos, el hecho de que en los vegetales, porejemplo, estos sistemas posean rutas de síntesis (oenzimas distintas para completar el proceso) dife-rentes que en las especies animales, hace que losproductos finales no sean idénticos, y, por tanto,los carbohidratos de aquéllos puedan resultar anti-génicos en éstos. Así, la antigenicidad de los car-bohidratos en mamíferos se refiere casi exclusiva-mente a los glicanos procedentes de plantas-especialmente los de glicoproteínas vegetales-, y


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en menor grado a los de algunos microorganismose invertebrados.

¿Qué característica del carbohidrato puede serresponsable de su alergenicidad?

Los tipos de oligosacáridos presentes en glico-proteínas de plantas, enlazados mediante unionesN-glicosídicas, se encuentran resumidos en la Fig.1. Todos los carbohidratos N-glicosídicos poseenen común el «núcleo pentasacárido» Mana1-6(Mana1-3)Manß1-4NAcGlcß1-4NAcGlc. De-pendiendo de los sustituyentes que posean sobreeste núcleo, se obtendrán las tres subclases decadenas: de tipo complejo, rico en manosas, ehíbrido. El tipo complejo no posee más residuosde manosa que los contenidos en el núcleo penta-sacárido, pero posee unidades de diversos mono-sacáridos tales como N-acetilglucosamina, fucosa,o xilosa, en diferentes posiciones del núcleo. Porel contrario, las cadenas del tipo rico en manosaspresentan sólo residuos de este monosácaridoenlazados al núcleo y frecuentemente al menoshasta un número de cinco. El tercer tipo poseecaracterísticas de ambos, se alternan residuoscomplementarios de manosas -casi siempre unidassobre la manosaa1-6 del núcleo-, con otros com-ponentes típicos de los complejos como es la xilo-sa.

Los glicanos complejos de las células de mamí-feros, además de ser de mayor envergadura quelos de vegetales, poseen frecuentemente ácido siá-lico y galactosa, raramente fucosa y nunca xilosa.Estas diferencias pueden marcar la antigenicidadde los carbohidratos de glicoproteínas de plantasen el hombre. De hecho, la presencia de una xilo-saß1-2 sobre la N- acetilglucosamina interna delnúcleo pentasacárido parece tener un valor decisi-vo en la antigenicidad, e incluso en la alergenici-dad de algunas glicoproteínas vegetales. En estesentido, también se le ha atribuido actividad anti-génica en mamíferos a la fucosaa1-3 enlazada ala N-acetilglucosamina terminal, incluso se hanpurif icado anticuerpos específicos que la recono-cen y que pueden ser empleados en la determina-ción de la presencia de residuos equivalentes enotros carbohidratos.

En efecto, mediante experimentos de inhibiciónse demostró en 1991 que el residuo de fucosaa1-3 enlazado a la N- acetilglucosamina terminalcontribuye de manera importante a la antigenici-dad de la peroxidasa de rábano en conejos7, pueslos anticuerpos IgG específicos inducidos alinyectar el conejo con esta proteína reconocían demanera especial esa fucosa. Estos datos han sidoposteriormente corroborados por otros equiposque, además de atribuir un papel a ese residuo enla alergenicidad de la fosfolipasa A2

8 (PLA2), hanimplicado también a la xilosaß1-2 en tales accio-nes9, e incluso han purif icado aquellos anticuerposIgG específicos de fucosa o xilosa10.

Estos datos ponen de manifiesto la naturalezade los grupos monosacáridos que pueden estarimplicados en la antigenicidad de los oligosacári-dos de las glicoproteínas de plantas; xilosa y fuco-sa son residuos ausentes o muy poco frecuentes enlas células de mamíferos y pueden ser reconoci-dos como elementos extraños por el sistemainmunológico humano.

Sin embargo, la importancia de cada carbohi-drato, o de cada monosacárido, en la reactividadfrente a las IgE de sueros de pacientes hipersensi-bles es característica de cada alergeno. La presen-cia de xilosa o fucosa en un oligosacárido no esgarantía de su alergenicidad.

Análisis de la alergenicidad y estructura decarbohidratos

Los procedimientos disponibles para el aisla-


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Gal NAG FucGal NAG ManGal NAG Man – NAG – NAG – AsnGal NAG

Man COMPLEJOGal NAG

Man ManMan

Man Man Man – NAG – NAG – AsnMan Man Man

RICO EN MANOSA

ManMan Fuc

ManGal NAG Man – NAG – NAG – Asn

ManNAG Xil HIBRIDO

Fig. 1. Tipos de oligosacáridos N-glicosídicos. Se muestrantres ejemplos representativos, indicándose la unión a la aspa-ragina. En sombreado se recogen los núcleos pentasacáridos.Fuc: fucosa; Gal: galactosa; Man: manosa: NAG: N-acetilglu-cosamina; Xil: xilosa.

miento y manipulación de los carbohidratos pre-sentes en glicoproteínas están lejos de poderseconsiderar sencillos; incluso la cuantificación delglicano obliga a determinaciones laboriosas ymuchas veces adolece de un alto grado de inexac-titud. Además, la cantidad de proteína de partidaes, muy a menudo, insuficiente para completar losdatos deseados. Por ello, la mayor parte de losmétodos utilizados implican comparar la potenciaalergénica de la proteína glicosilada con la de for-mas parcial o totalmente desglicosiladas. Estopone de relevancia los sistemas de desglicosila-ción, porque de su efectividad y control depende-rá la fiabilidad de las conclusiones.

Existen dos tipos de sistemas de desglicosila-ción, los que utilizan reactivos químicos y los queemplean enzimas. De entre los primeros destaca-mos los tratamientos con ácido trif luorometano-sulfónico (TFMS) y con ácido peryódico. ElTFMS hidroliza el enlace entre el carbohidrato yla cadena polipeptídica, lo que conduce a la sepa-ración completa del azúcar. Este tratamiento pue-de afectar a la fracción aminoacídica de la proteí-na, de manera que una pérdida de antigenicidadcomo consecuencia de su utilización podría serdebida a la alteración de uno o varios epítopospolipeptídicos. El ácido peryódico, por otro lado,elimina secuencialmente monosacárido a monosá-carido de la cadena oligosácarida, por lo que, paraasegurarse de la retirada completa del glicano, esimportante determinar la cinética de desglicosila-ción, y elegir las condiciones más adecuadas. Estetratamiento también puede originar oxidacionesindeseables en la estructura polipeptídica y con-ducir a la alteración de su antigenicidad. Así, des-pués de ambos tratamientos se aconseja analizarel estado de la proteína, no sólo a nivel conforma-cional sino sobre todo revisar la composición ori-ginal de sus aminoácidos constituyentes.

Teniendo en cuenta las anteriores consideracio-nes, serían los métodos enzimáticos los más con-venientes para una desglicosilación delicada, sinalteración de la estructura polipeptídica, pero efi-caz en la eliminación del glicano. Hasta hace pocotiempo no existían enzimas comerciales adecua-das a tal objetivo. En la actualidad disponemos deglicosidasas que escinden específicamente el enla-ce N-glicosídico entre la cadena polipeptídica y elcarbohidrato, dependiendo de la naturaleza delazúcar. Entre ellas se encuentra la endoglicosida-

sa H (Endo H) que actúa únicamente cuando eloligosacárido es de tipo rico en manosas. Quizásla enzima más útil es la péptido-N-(acetil-ß- glu-cosaminil)-asparagina amidasa F (PNGasa F) queutiliza un sustrato N-glicosídico, siempre que noposea fucosa unida en posición a1-3 a la N-ace-tilglucosamina terminal del núcleo pentasacárido.Finalmente, la PNGasa A escinde todo carbohi-drato con enlace N-glicosídico; sin embargo, aun-que pudiera parecer la más adecuada por la mag-nitud de su hidrólisis, su actividad no siempre espatente ya que muchas proteínas se resisten, en lapráctica, a ser desglicosiladas por esta enzima;además, su gran inestabilidad es otro factor a con-siderar antes de decidir su utilización. Una vezretirado el carbohidrato de la cadena polipeptídicase puede analizar la actividad antigénica y alergé-nica de la proteína remanente y compararla con lade la glicoproteína nativa.

Como alternativa a la utilización de glicosida-sas específicas en la preparación del carbohidratopara su análisis molecular o inmunológico, se dis-pone de proteasas inespecíficas - como proteinasaK o pronasa- que producen la degradación casicompleta de la fracción polipeptídica respetandoel azúcar anclado a una mínima secuencia de ami-noácidos (glicopéptido) que puede llegar a ser tanreducida como la propia asparagina enlazante delcarbohidrato.

El glicano, por su parte, puede ser fraccionadoy aislado por diversas técnicas cromatográficas,entre las que se encuentran la cromatografía deafinidad con soportes de lectinas, o la de alta pre-sión en fase reversa y con matrices especialmentediseñadas para esta finalidad. El manejo y ladetección del oligosacárido se ven facilitados si semarca previamente, bien mediante radiactividad,bien con un producto que origina un derivadofluorescente o coloreado. Una vez separadas todaslas especies de carbohidrato que coexisten en unaproteína alergénica, la técnica por excelencia parael análisis de cada una de ellas es la resonanciamagnética nuclear que, mediante las señales origi-nadas por los protones de la muestra y en compa-ración con las de moléculas conocidas, proporcio-na la estructura completa del carbohidrato. Estatécnica puede también emplearse sobre la glico-proteína intacta, pero algunas señales inherentesal glicano podrían permanecer enmascaradas porlas de los aminoácidos y quedar sin resolver.


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Además de la metodología descrita anterior-mente, existen diversos procedimientos que pro-porcionan datos más o menos completos sobrela estructura de los azúcares de glicoproteínas, orinden formas defectivas en el glicano que pue-den ser objeto de estudio. Tal es el uso de laslectinas, de los anticuerpos específicos de mono-sacáridos y de las exoglicosidasas. Las lectinasson proteínas que unen estructuras glicosídicas,mostrando frecuentemente una afinidad selecti-va hacia ciertos tipos de residuos monosacári-dos, con lo que su interacción con un carbohi-drato dado indicaría la existencia de tales restosglicosídicos. Una de las lectinas más utilizada esla concanavalina A, capaz de unirse a las rami-ficaciones de manosas terminales que suelenaparecer en los oligosacáridos con unión a laproteína de tipo N-glicosídico. En otro lugar seencuentran los anticuerpos específicos de mono-sacáridos concretos: algunos grupos de investi-gación han obtenido anticuerpos frente a xilosao frente a fucosa, anticuerpos que se unen selec-tivamente a carbohidratos que poseen uno deestos residuos en su estructura. El problema parasu uso es que no son comerciales, y por lo tantono disponibles para la comunidad científica. Deigual forma que las lectinas, la reactividad deestos anticuerpos con un azúcar dado indicaríala existencia del monosacárido específico reco-nocido por la inmunoglobulina. Como alternati-va a este método, se puede hacer uso de un anti-cuerpo comercial obtenido frente a peroxidasade nabo, que reconoce específicamente la pre-sencia de xilosa y/o fucosa en la glicoproteínaanalizada. El uso de este anticuerpo con el aler-geno Ole e 1 del polen de olivo dio magníficosresultados11. Por último, exoglicosidasas talescomo fucosidasa, manosidasa, xilosidasa, etc,proporcionan un producto defectivo en unmonosacárido concreto cuya actividad antigéni-ca puede ser analizada en comparación con ladel glicano original.

Finalmente, de la existencia de reactividadcruzada de un alergeno glicoproteico con unaglicoproteína de cuyo carbohidrato se conoce laestructura pueden extraerse importantes conclu-siones sobre la estructura del glicano del prime-ro. La coincidencia de reconocimientos indica,al menos sugiere, coincidencia en algún compo-nente.

ALERGENOS GLICOPR OTEICOS

EstructuraLa verdadera investigación sobre proteínas aler-

génicas ha tenido lugar durante la última década.A principios de 1990 sólo se habían clonado ysecuenciado los genes de cinco alergenos. A fina-les de 1994 ya eran 48 los alergenos clonados, yen la actualidad hay registrados más de 100 en lalista oficial del Comité de Nomenclatura de laIUIS. A mediados de la década de los ochenta, secomenzó a tener indicios de la existencia de car-bohidratos en la estructura de algunos alergenospolipeptídicos. El primero en ser caracterizadocomo glicoproteína fue un alergeno principal deApis mellifera, PLA2, en la década de los 70. Des-de entonces la lista se ha incrementado considera-blemente. La Tabla I recoge los glicoalergenosque se conocen en la actualidad, así como las refe-rencias más relacionadas con el carácter alergéni-co de su carbohidrato12-25. De ellos destacan, por sunúmero, los procedentes de pólenes, aunqueencontramos también un alergeno de epitelio degato, Fel d 1, y uno de insecto, la PLA2 de vene-no de abeja. Mención aparte requiere el antígenoH del tunicado Styela plicata (parásito adherido alas ostras), alergeno ocupacional que extrañamen-te no ha sido recogido en las más recientes listasde alergenos caracterizados26, 27.

Aunque se conocen la mayor parte de lasestructuras polipeptídicas de estos alergenos, muypoco se sabe de su componente glicosídico, aexcepción de los de la PLA2 y de los alergenos Artv 2 y Cry j 1 de los pólenes de artemisa y cedrojaponés. Del alergeno Ole e 1 del polen de olivose tienen algunos datos muy preliminares aún,como son el sitio de glicosilación y el número ytipo de especies que posee. Todos los oligosacári-dos de estos alergenos se encuentran enlazados ala cadena aminoacídica a través de una asparagina(enlace tipo N- glicosídico) y se presentan comoestructuras polimórficas, esto es, existen variasespecies moleculares distintas (aunque similares)formando parte del componente carbohidrato de lamisma cadena polipeptídica. La unión N-glicosí-dica es prácticamente la única encontrada en losglicoalergenos analizados.

El polimorfismo, por otra parte, es muy fre-cuente en las glicoproteínas de plantas. No apare-ce una única especie de glicano unido a la frac-


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ción polipeptídica. Por el contrario, suelen coexis-tir varias diferentes, incluso compartiendo la mis-ma posición de la cadena de aminoácidos. Art v 2posee una mezcla de carbohidratos ricos en mano-sas que no han sido encontrados, sin embargo, nien PLA2 ni en Cri j 1. En PLA2 se han obtenidomás de 6 estructuras de oligosacárido de tipocomplejo muy similares, varias de ellas con fuco-sa y ninguna con xilosa, y todas unidas al mismoresiduo de la proteína. En el caso del alergeno decedro japonés, Cri j 1, se han determinado hastacuatro estructuras distintas del oligosacárido, tam-bién de tipo complejo todas ellas, unidas a dosposiciones diferentes del polipéptido, las asparagi-nas 120 y 333. En ambos alergenos, sobre unaestructura mínima común del carbohidrato, sealternan varios sustituyentes distintos: en Cry j 1se encuentran xilosa, fucosas, galactosas y N-ace-tilglucosaminas, y en PLA2 fucosas y manosas.

Por otro lado, el alergeno Ole e 1 del polen de oli-vo, también glicoproteico, posee un sitio de glico-silación conocido, que debe ser compartido porlos dos oligosacáridos mayoritarios que contiene,uno rico en manosa y otro híbrido con xilosa; nin-guno de ellos presenta fucosa. Además, posee unaespecie minoritaria (menos del 10% del total gli-cosídico) probablemente de tipo complejo coneste monosacárido.

Como puede observarse, las estructuras de lasfracciones glicosídicas de las glicoproteínas aler-génicas conocidas no guardan un patrón único,aunque sí poseen algunas características comunes,como son el núcleo pentasacárido y, en muchasocasiones, la presencia de xilosa y/o fucosa.

Alergenicidad del carbohidratoLa presencia de carbohidrato en la estructura de

un alergeno proteico no es, sin embargo, garantía


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Tabla I. Alergenos glicoproteicos documentados

Glicoalergeno Estra Origen Refb IgEc

Api m 1 SI Apis mellifera (abeja) 12 SIFosfolipasa A2 (PLA2) insecto-veneno 9 fucosa

8 SI13 poco

Art v 2 SI Artemisia vulgaris 14 NOvegetal-polen

Cla h 2 NO Cladosporium herbarum 15 –hongo-esporas

Par j 1 NO Parietaria judaica 16 dudosovegetal-polen 17 NO

Fel d 1 NO Felis domesticus (gato) 18 –animal-epitelio

CM16* y CM6* NO Triticum turgidum (trigo) 19 SIHor v 1 (BMAI-1) NO Hordeum vulgare (cebada) 20 SI

Inhibidores a-amilasa vegetal-semilla

Cri j 1 SI Criptomeria japonica 21 SIpeptato liasa (cedro japonés) 22 poco

vegetal-polen

Ole e 1 NO Olea europaea (olivo) 23 –vegetal-polen 24 SI

11 SI

Antígeno H SI Styela plicata (tunicado) 25 SIprocordado

a: Estructura conocida del carbohidrato.b: Referencia en relación con el carácter glicoproteico del alergeno.c: Existencia de IgE específicas del carbohidrato y/o actividad alergénica de éste.

de alergenicidad. En efecto, de entre los alergenosglicoproteicos vegetales estudiados (Tabla I) sólolos oligosacáridos de PLA2

8, 9, 12, de los inhibidoresde a-amilasa de los pólenes de cebada y trigo19, 20,y de Ole e 1 del polen de olivo11, 24, se ha demos-trado que están implicados en la alergenicidad dela proteína completa. En todos los casos, la des-glicosilación del alergeno proporciona un deriva-do con una capacidad de unirse a las inmunoglo-bulinas IgE de los sueros de los pacienteshipersensibles menor que la del alergeno glicosi-lado.

La contribución del glicano a la alergenicidadde otras proteínas tales como Par j 1 o Cry j 1 esdudosa o cuando menos muy reducida. En Cry j 1,el carbohidrato podría influir sólo conformacio-nalmente a la reactividad con las IgE específicas22,y aunque Par j 1 pierde la capacidad de unir IgEde los sueros de pacientes alérgicos después deltratamiento desglicosilante, éste distorsionó tantola estructura tridimensional de la proteína queaquella inhabilitación pudo ser el resultado de loscambios polipeptídicos17. Así, ni para Cri j 1 nipara Par j 1 se ha encontrado una correlación defi-nitiva entre la presencia del oligosacárido y laactividad enlazante al anticuerpo. Finalmente, elcarbohidrato de Art v 2 no posee actividad alergé-nica14 - aunque unos primeros resultados parecíanindicar lo contrario-, lo que estaría de acuerdo,según la hipótesis formulada sobre la participa-ción de fucosa y xilosa en la actividad alergénica,con su natural composición de glicano rico enmanosas en el que están ausentes estos monosacá-ridos.

Además de los alergenos glicosilados de laTabla I, se han analizado numerosos extractoscuya capacidad de unión de IgE de sueros depacientes alérgicos es sensible al tratamiento conperyodato. Y, aunque proceden fundamentalmentede alimentos vegetales1 como avellana, cacahuete,trigo, arroz, guisante, espinaca, plátano, patata,soja, fresa, y tomate28, también se han detectadoen moluscos como el mejillón1.

Algunos de los datos obtenidos por distintosgrupos acerca de la contribución particular de uncarbohidrato a la alergenicidad de la glicoproteí-na de la que forman parte entran en controversia,pues según el tipo de ensayo así como el mode-lo utilizado en la comparación pueden derivar aconclusiones diferentes. Antes hemos menciona-

do los trabajos realizados con PLA2, fundamen-talmente estudios de modificación química yenzimática, y análisis antigénico mediante ensa-yos de ELISA e «immunoblotting» con el pro-ducto modificado, estudios que probaban laimplicación del carbohidrato en la unión delalergeno a las inmunoglobulinas IgE de los sue-ros de pacientes alérgicos al veneno de los vés-pidos8, 9, 12. Sin embargo, experimentos recientesde liberación de histamina de basófilos sensibili-zados y reacciones cutáneas, utilizando alternati-vamente la proteína natural, la forma recombi-nante producida en E. coli -que no puede estarglicosilada debido a la inexistencia de los siste-mas correspondientes en la bacteria-, y el deriva-do natural desglicosilado, llevaron a la conclu-sión de que, si bien el correcto plegamiento de lacadena polipeptídica es esencial en la reactividadcutánea de tipo I y para la actividad estimulantede secreción de histamina, la glicosilación pare-ce resultar de menor relevancia, ya que la reacti-vidad cutánea fue similar para las formas glico-silada y desglicosilada del alergeno, y tanto laproteína natural como la recombinante eran efec-tivas en la liberación del mediador desde losbasófilos13. Así, no hay evidencia de que los gru-pos carbohidratos de la PLA2 sean epítopos Bdominantes ni esenciales para anticuerpos IgE13.Pero debemos recordar que este alergeno noposee xilosa en su estructura glicosídica.

Hasta el momento, y como se puede observar,los datos obtenidos se refieren a la comparaciónde actividades entre formas completas de losalergenos y derivados defectuosos en los car-bohidratos; no se han presentado estudios con elpropio glicano aislado, lo que llevaría a una con-clusión definitiva. Recientemente se ha purif ica-do el componente oligosacárido liberado por laPNGasa F del alergeno Ole e 1. Con él se hanrealizado ensayos de liberación de histamina apartir de basófilos obtenidos de pacientes alérgi-cos al polen de olivo (Rodríguez y cols., manus-crito en preparación). Los resultados son muyprometedores, pues se han obtenido respuestaspositivas para muestras en las que no existenindicios de la presencia de fragmentos polipep-tídicos del alergeno. En la actualidad se estánllevando a cabo estudios de este tipo, así comoensayos cutáneos, con los dos componentesmayoritarios de ese carbohidrato separados por


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cromatografía de afinidad. Una respuesta positi-va en cualquiera de los dos frentes iluminaríadefinitivamente los conceptos sobre la capacidadreal de determinadas especies de carbohidratosen la respuesta alérgica.

Impor tancia de los carbohidratos en lasreacciones cruzadas alergénicas

La existencia de lectinas en los extractos vege-tales planteó importantes dudas sobre el papel delos carbohidratos en las reacciones cruzadas, yaque son moléculas que unen anticuerpos a travésde su fracción glicosídica y habrían podido ser losresponsables de la respuesta positiva a los suerosde pacientes alérgicos. Sin embargo, al menos dosdatos primarios apoyan la actividad de los epíto-pos glicosídicos: los extractos alergénicos tratadoscon peryodato perdían su capacidad de unión aIgE, y muchos sueros con títulos de IgE muy altosno poseían capacidad de unión a los extractos. Porotro lado, y como argumento definiti vo, se hademostrado la existencia de anticuerpos IgE espe-cíficos de carbohidratos1, 8, 11, 12, 20, 25, 28.

Como acabamos de ver, los carbohidratosimplicados en la actividad alergénica de glicopro-teínas presentan estructuras con numerosos rasgosen común, aunque pertenezcan a fuentes biológi-cas poco o nada relacionadas entre sí. Por estemotivo, los carbohidratos pueden jugar un papelimportante en las reacciones cruzadas ya que enlos extractos alergénicos, sobre todo en los proce-dentes de vegetales, las glicoproteínas puedenrepresentar un componente muy abundante. Lapresencia de xilosa o de fucosa en una glicopro-teína que acceda al paciente hipersensible podríaser fácilmente reconocida por las IgE de su suero,IgE específicas de esos monosacáridos y produci-das previamente en el contacto con otro alergenoglicoproteico, que aunque no fuera idéntico, con-tuviera la xilosa o la fucosa en su carbohidrato.Además se ha observado que los sueros de algu-nos pacientes alérgicos son capaces de distinguirpequeñas diferencias estructurales en los glicanosreconocidos ya que la magnitud de su respuesta esdistinta hacia los diversos extractos1. Esta propie-dad podría contribuir al análisis molecular de losalergenos glicosídicos.

Ya que las fuentes alergénicas de origen vegetalson las que a priori más glicoproteínas conten-drían, debemos discutir aquí el papel que podrían

jugar los azúcares en la reactividad cruzada aler-génica a alimentos procedentes de plantas. Puesbien, la responsabilidad de los glicanos en la aler-gia a alimentos vegetales de un paciente cuyo sue-ro posee IgE anti-carbohidrato, por haber sidosensibilizado quizás por un polen con alergenoglicoproteico, podemos suponer que debe sernula, o cuando menos dudosa. En todo caso leproduciría síndrome alérgico oral. En efecto, lasestructuras glicosídicas son sensibles a actividadesdegradantes que actúan en las primeras etapas dela digestión, a-amilasas que intervienen en la acti-vidad digestiva bucal hidrolizando los carbohidra-tos rápidamente a monosacáridos, que son yaestructuras sin valor antigénico. Así, la existenciade carbohidratos en alergenos alimentarios noimplica su actividad alergénica cruzada, pues eseglicano será destruido antes de que pueda llegar atomar contacto con las IgE del suero; sin embar-go, sí puede ser responsable de las reaccionesderivadas de su presencia en la regiones altas delaparato digestivo, de ahí que puedan explicarselos síntomas del síndrome alérgico oral. Por todoello, la validez de las reacciones cruzadas a nivelde los carbohidratos se debería restringir a aque-llos alergenos que en su vía de asalto al individuoeviten las actividades glicolíticas. Alergenos inha-lados, o inyectados, no están sometidos a estasactividades, al menos en la misma cuantía, por loque sí podrían ser reconocidos por los anticuerposdel suero.

La implicación de los carbohidratos en reaccio-nes antigénicas y alergénicas cruzadas ha sido cla-ramente demostrada in vitro. Es su responsabili -dad en la actividad alergénica in vivo, en lasreacciones cutáneas o en la liberación de histami-na, lo que aún plantea dudas -el reducido tamañodel glicano, 1-1,5 kDa de masa molecular, es unode los principales escollos para aceptar su partici-pación en la asociación de los receptores celula-res-. Las expectativas para resolver este importan-te item se encuentran centradas en la posibilidadde realizar los análisis con preparaciones de car-bohidratos puros, aislados del correspondiente gli-coalergeno o de síntesis, una vez determinadas lasestructuras moleculares a las que se atribuye elposible papel alergénico. Y del hallazgo de datosgeneralizables en esos experimentos depende lavalidez de las conclusiones que puedan extraerse.Pero las respuestas no están muy lejos.


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Rosalía RodríguezDpto. Bioquímica y Biología MolecularFacultad de QuímicaUniversidad Complutense28040 Madrid

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