cido desoxirribonucleico

Situacin del ADN dentro de una clula eucariota.

El cido desoxirribonucleico, abreviado como ADN, esun cido nucleico que contiene instrucciones genticasusadas en el desarrollo y funcionamiento de todos losorganismos vivos conocidos y algunos virus, y es respon-sable de su transmisin hereditaria. La funcin principalde la molcula de ADN es el almacenamiento a largo pla-zo de informacin. Muchas veces, el ADN es comparadocon un plano o una receta, o un cdigo, ya que contie-ne las instrucciones necesarias para construir otros com-ponentes de las clulas, como las protenas y las mol-culas de ARN. Los segmentos de ADN que llevan estainformacin gentica son llamados genes, pero las otrassecuencias de ADN tienen propsitos estructurales o to-man parte en la regulacin del uso de esta informacingentica.Desde el punto de vista qumico, el ADN es un polmerode nucletidos, es decir, un polinucletido. Un polmeroes un compuesto formado por muchas unidades simplesconectadas entre s, como si fuera un largo tren formadopor vagones. En el ADN, cada vagn es un nucletido,y cada nucletido, a su vez, est formado por un azcar(la desoxirribosa), una base nitrogenada (que puede seradeninaA, timinaT, citosinaC o guaninaG) y ungrupo fosfato que acta como enganche de cada vagncon el siguiente. Lo que distingue a un vagn (nucleti-do) de otro es, entonces, la base nitrogenada, y por ello lasecuencia del ADN se especica nombrando slo la se-

Animacin de parte de una estructura de ADN de doble hlice

cuencia de sus bases. La disposicin secuencial de estascuatro bases a lo largo de la cadena (el ordenamiento delos cuatro tipos de vagones a lo largo de todo el tren) esla que codica la informacin gentica: por ejemplo, unasecuencia de ADN puede ser ATGCTAGATCGC... En losorganismos vivos, el ADN se presenta como una doblecadena de nucletidos, en la que las dos hebras estn uni-das entre s por unas conexiones denominadas puentes dehidrgeno.[1]

Para que la informacin que contiene el ADN pueda serutilizada por la maquinaria celular, debe copiarse en pri-mer lugar en unos trenes de nucletidos, ms cortos y conunas unidades diferentes, llamados ARN. Las molculasde ARN se copian exactamente del ADN mediante unproceso denominado transcripcin. Una vez procesadasen el ncleo celular, las molculas de ARN pueden salir

1

2 1 HISTORIA DE LA GENTICA

al citoplasma para su utilizacin posterior. La informa-cin contenida en el ARN se interpreta usando el cdigogentico, que especica la secuencia de los aminocidosde las protenas, segn una correspondencia de un triple-te de nucletidos (codn) para cada aminocido. Esto es,la informacin gentica (esencialmente: qu protenas sevan a producir en cada momento del ciclo de vida de unaclula) se halla codicada en las secuencias de nucleti-dos del ADN y debe traducirse para poder funcionar. Taltraduccin se realiza usando el cdigo gentico a modode diccionario. El diccionario secuencia de nucletido-secuencia de aminocidos permite el ensamblado de lar-gas cadenas de aminocidos (las protenas) en el citoplas-ma de la clula. Por ejemplo, en el caso de la secuenciade ADN indicada antes (ATGCTAGATCGC...), la ARNpolimerasa utilizara como molde la cadena complemen-taria de dicha secuencia de ADN (que sera TAC-GAT-CTA-GCG-...) para transcribir una molcula de ARNmque se leera AUG-CUA-GAU-CGC-...; el ARNm resul-tante, utilizando el cdigo gentico, se traducira comola secuencia de aminocidos metionina-leucina-cido as-prtico-arginina...Las secuencias de ADN que constituyen la unidad fun-damental, fsica y funcional de la herencia se denominangenes. Cada gen contiene una parte que se transcribe aARN y otra que se encarga de denir cundo y dndedeben expresarse. La informacin contenida en los genes(gentica) se emplea para generar ARN y protenas, queson los componentes bsicos de las clulas, los ladrillosque se utilizan para la construccin de los orgnulos u or-ganelos celulares, entre otras funciones.Dentro de las clulas, el ADN est organizado en es-tructuras llamadas cromosomas que, durante el ciclo ce-lular, se duplican antes de que la clula se divida. Losorganismos eucariotas (por ejemplo, animales, plantas, yhongos) almacenan la mayor parte de su ADN dentro delncleo celular y una mnima parte en elementos celula-res llamados mitocondrias, y en los plastos y los centrosorganizadores demicrotbulos o centrolos, en caso de te-nerlos; los organismos procariotas (bacterias y arqueas) loalmacenan en el citoplasma de la clula, y, por ltimo, losvirus ADN lo hacen en el interior de la cpside de natu-raleza proteica. Existen multitud de protenas, como porejemplo las histonas y los factores de transcripcin, quese unen al ADN dotndolo de una estructura tridimensio-nal determinada y regulando su expresin. Los factores detranscripcin reconocen secuencias reguladoras del ADNy especican la pauta de transcripcin de los genes. Elmaterial gentico completo de una dotacin cromosmi-ca se denomina genoma y, con pequeas variaciones, escaracterstico de cada especie.

1 Historia de la genticaEl ADN lo aisl por primera vez, durante el invierno de1869, el mdico suizo Friedrich Miescher mientras tra-

Friedrich Miescher, bilogo y mdico suizo (1844-1895).

bajaba en la Universidad de Tubinga. Miescher realizabaexperimentos acerca de la composicin qumica del pusde vendas quirrgicas desechadas cuando not un preci-pitado de una sustancia desconocida que caracteriz qu-micamente ms tarde.[2][3] Lo llam nuclena, debido aque lo haba extrado a partir de ncleos celulares.[4] Senecesitaron casi 70 aos de investigacin para poder iden-ticar los componentes y la estructura de los cidos nu-cleicos.En 1919 Phoebus Levene identic que un nucletidoest formado por una base nitrogenada, un azcar y unfosfato.[5] Levene sugiri que el ADN generaba una es-tructura con forma de solenoide (muelle) con unidadesde nucletidos unidos a travs de los grupos fosfato. En1930 Levene y su maestro Albrecht Kossel probaron quela nuclena de Miescher es un cido desoxirribonucleico(ADN) formado por cuatro bases nitrogenadas (citosina(C), timina (T), adenina (A) y guanina (G)), el azcardesoxirribosa y un grupo fosfato, y que, en su estructurabsica, el nucletido est compuesto por un azcar unidoa la base y al fosfato.[6] Sin embargo, Levene pensaba quela cadena era corta y que las bases se repetan en un ordenjo. En 1937 William Astbury produjo el primer patrnde difraccin de rayos X que mostraba que el ADN tenauna estructura regular.[7]

La funcin biolgica del ADN comenz a dilucidarse en1928, con una serie bsica de experimentos de la genti-ca moderna realizados por Frederick Grith, quien esta-ba trabajando con cepas lisas (S) o rugosas (R) de labacteria Pneumococcus (causante de la neumona), segn

3Maclyn McCarty con Francis Crick y James D Watson.

la presencia (S) o no (R) de una cpsula azucarada, quees la que conere virulencia (vase tambin experimentode Grith). La inyeccin de neumococos S vivos en ra-tones produce la muerte de stos, y Grith observ que,si inyectaba ratones con neumococos R vivos o con neu-mococos S muertos por calor, los ratones no moran. Sinembargo, si inyectaba a la vez neumococos R vivos yneumococos S muertos, los ratones moran, y en su san-gre se podan aislar neumococos S vivos. Como las bac-terias muertas no pudieron haberse multiplicado dentrodel ratn, Grith razon que deba producirse algn ti-po de cambio o transformacin de un tipo bacteriano aotro por medio de una transferencia de alguna sustanciaactiva, que denomin principio transformante. Esta sus-tancia proporcionaba la capacidad a los neumococos Rde producir una cpsula azucarada y transformarse as envirulentas. En los siguientes 15 aos, estos experimen-tos iniciales se replicaron mezclando distintos tipos decepas bacterianas muertas por el calor con otras vivas,tanto en ratones (in vivo) como en tubos de ensayo (invitro).[8] La bsqueda del factor transformante que eracapaz de hacer virulentas a cepas que inicialmente no loeran continu hasta 1944, ao en el cual Oswald Avery,Colin MacLeod y Maclyn McCarty realizaron un expe-rimento hoy clsico. Estos investigadores extrajeron lafraccin activa (el factor transformante) y, mediante an-lisis qumicos, enzimticos y serolgicos, observaron queno contena protenas, ni lpidos no ligados, ni polisac-ridos activos, sino que estaba constituido principalmentepor una forma viscosa de cido desoxirribonucleico al-tamente polimerizado, es decir, ADN. El ADN extradode las cepas bacterianas S muertas por el calor lo mezcla-ron in vitro con cepas R vivas: el resultado fue que seformaron colonias bacterianas S, por lo que se concluyinequvocamente que el factor o principio transformanteera el ADN.[9]

A pesar de que la identicacin del ADN como principiotransformante an tard varios aos en ser universalmen-te aceptada, este descubrimiento fue decisivo en el cono-cimiento de la base molecular de la herencia, y constituye

el nacimiento de la gentica molecular. Finalmente, el pa-pel exclusivo del ADN en la heredabilidad fue conrma-do en 1952 mediante los experimentos de Alfred Hersheyy Martha Chase, en los cuales comprobaron que el fagoT2 transmita su informacin gentica en su ADN, pe-ro no en su protena[10] (vase tambin experimento deHershey y Chase).En cuanto a la caracterizacin qumica de la molcu-la, en 1940 Charga realiz algunos experimentos quele sirvieron para establecer las proporciones de las ba-ses nitrogenadas en el ADN. Descubri que las propor-ciones de purinas eran idnticas a las de pirimidinas, la"equimolecularidad" de las bases ([A]=[T], [G]=[C]) yel hecho de que la cantidad de G+C en una determinadamolcula de ADN no siempre es igual a la cantidad deA+T y puede variar desde el 36 hasta el 70 por ciento delcontenido total.[6] Con toda esta informacin y junto conlos datos de difraccin de rayos X proporcionados porRosalind Franklin, James Watson y Francis Crick propu-sieron en 1953 el modelo de la doble hlice de ADN pararepresentar la estructura tridimensional del polmero.[11]En una serie de cinco artculos en el mismo nmero deNature se public la evidencia experimental que apoyabael modelo de Watson y Crick.[12] De stos, el artculo deFranklin y Raymond Gosling fue la primera publicacincon datos de difraccin de rayos X que apoyaba el mode-lo de Watson y Crick,[13][14] y en ese mismo nmero deNature tambin apareca un artculo sobre la estructuradel ADN de Maurice Wilkins y sus colaboradores.[15]

Watson, Crick y Wilkins recibieron conjuntamente, en1962, despus de la muerte de Rosalind Franklin, elPremio Nobel en Fisiologa o Medicina.[16] Sin embar-go, el debate contina sobre quin debera recibir crditopor el descubrimiento.[17]

2 Propiedades fsicas y qumicas

El ADN es un largo polmero formado por unidades repe-titivas, los nucletidos.[18][19] Una doble cadena de ADNmide de 22 a 26 angstroms (2,2 a 2,6 nanmetros) deancho, y una unidad (un nucletido) mide 3,3 (0,33nm) de largo.[20] Aunque cada unidad individual quese repite es muy pequea, los polmeros de ADN pue-den ser molculas enormes que contienen millones denucletidos. Por ejemplo, el cromosoma humanoms lar-go, el cromosoma nmero 1, tiene aproximadamente 220millones de pares de bases.[21]

En los organismos vivos, el ADN no suele existir comouna molcula individual, sino como una pareja de mol-culas estrechamente asociadas. Las dos cadenas de ADNse enroscan sobre s mismas formando una especie de es-calera de caracol, denominada doble hlice. El modelode estructura en doble hlice fue propuesto en 1953 porJames Watson y Francis Crick (el artculo MolecularStructure of Nucleic Acids: A Structure for Deoxyribo-

4 2 PROPIEDADES FSICAS Y QUMICAS

Adenina

CitosinaGuanina

Timina

O

O

O

O O

O

O

O O

O O

O

O

O

O

O

O O

O

O

O

O O

O O

O

O O

O

O O

O O

O

O

O O

O

N

N N

N

N

N

N

N

N N

N N N

N

N

N N N

N N

O _

O _

O _

O _

O _

_ O

_ O

_ O

_ O

_ O

P

P P

P

P

P

P

P

NH 2

OH

OH

NH

H 2 N

HN

NH 2

H 2 N

HN

H 2 N

NH

NH 2

extremo 3'

extremo 5'extremo 3'

extremo 5'

Esqueletodesoxirribosa-fosfato

Estructura qumica del ADN: dos cadenas de nucletidos conec-tadas mediante puentes de hidrgeno, que aparecen como lneaspunteadas.

se Nucleic Acid fue publicado el 25 de abril de 1953en Nature), despus de obtener una imagen de la estruc-tura de doble hlice gracias a la refraccin por rayos Xhecha por Rosalind Franklin.[22] El xito de este mode-lo radicaba en su consistencia con las propiedades fsicasy qumicas del ADN. El estudio mostraba adems quela complementariedad de bases poda ser relevante en sureplicacin, y tambin la importancia de la secuencia debases como portadora de informacin gentica.[23][24][25]Cada unidad que se repite, el nucletido, contiene un seg-mento de la estructura de soporte (azcar + fosfato), quemantiene la cadena unida, y una base, que interaccionacon la otra cadena de ADN en la hlice. En general, unabase ligada a un azcar se denomina nuclesido y una ba-se ligada a un azcar y a uno o ms grupos fosfatos recibeel nombre de nucletido.Cuando muchos nucletidos se encuentran unidos, comoocurre en el ADN, el polmero resultante se denominapolinucletido.[26]

2.1 ComponentesEstructura de soporte: La estructura de soporte de unahebra de ADN est formada por unidades alternas de gru-pos fosfato y azcar (desoxirribosa).[27] El azcar en elADN es una pentosa, concretamente, la desoxirribosa.

cido fosfrico:

Su frmula qumica es H3PO4. Cadanucletido puede contener uno (monofos-

N

NN

N

H N2

PO

O

O O

N

NN

N

H N2

5

3

3

PO

O

O O

5

3

5

T

A

A

PO 4 3

Enlace fosfodister. El grupo fosfato (PO43-) une el carbono 5'del azcar de un nuclesido con el carbono 3' del siguiente.

fato: AMP), dos (difosfato: ADP) o tres(trifosfato: ATP) grupos de cido fosfrico,aunque como monmeros constituyentes delos cidos nucleicos slo aparecen en forma denuclesidos monofosfato.

Desoxirribosa:

Es un monosacrido de 5 tomos de carbono(una pentosa) derivado de la ribosa, que formaparte de la estructura de nucletidos del ADN.Su frmula es C5H10O4. Una de las principalesdiferencias entre el ADNy el ARN es el azcar,pues en el ARN la 2-desoxirribosa del ADNes reemplazada por una pentosa alternativa, laribosa.[25]Las molculas de azcar se unen entre s a tra-vs de grupos fosfato, que forman enlaces fos-fodister entre los tomos de carbono tercero(3, tres prima) y quinto (5, cinco prima)de dos anillos adyacentes de azcar. La for-macin de enlaces asimtricos implica que ca-da hebra de ADN tiene una direccin. En unadoble hlice, la direccin de los nucletidos en

2.1 Componentes 5

una hebra (3 5) es opuesta a la direccinen la otra hebra (5 3). Esta organizacinde las hebras de ADN se denomina antiparale-la; son cadenas paralelas, pero con direccionesopuestas. De la misma manera, los extremosasimtricos de las hebras de ADN se denomi-nan extremo 5 (cinco prima) y extremo 3(tres prima), respectivamente.

Bases nitrogenadas:

Las cuatro bases nitrogenadas mayoritarias quese encuentran en el ADN son la adenina (A),la citosina (C), la guanina (G) y la timina (T).Cada una de estas cuatro bases est unida al ar-mazn de azcar-fosfato a travs del azcar pa-ra formar el nucletido completo (base-azcar-fosfato). Las bases son compuestos heteroc-clicos y aromticos con dos o ms tomos denitrgeno, y, dentro de las bases mayoritarias,se clasican en dos grupos: las bases pricaso purinas (adenina y guanina), derivadas de lapurina y formadas por dos anillos unidos entres, y las bases pirimidnicas o bases pirimdicaso pirimidinas (citosina y timina), derivadas dela pirimidina y con un solo anillo.[25] En los ci-dos nucleicos existe una quinta base pirimid-nica, denominada uracilo (U), que normalmen-te ocupa el lugar de la timina en el ARN y die-re de sta en que carece de un grupo metilo ensu anillo. El uracilo no se encuentra habitual-mente en el ADN, slo aparece raramente co-mo un producto residual de la degradacin dela citosina por procesos de desaminacin oxi-dativa.

O

C

C CN

N C

H

O

H

H

CH

HH

12

3 5

6

4

Grupo oxo

Grupo metil

Grupo oxo

Timina: 2, 4-dioxo, 5-metilpirimidina.

Timina:

En el cdigo gentico se repre-senta con la letra T. Es un de-rivado pirimidnico con un grupooxo en las posiciones 2 y 4, y ungrupo metil en la posicin 5. For-ma el nuclesido timidina (siempredesoxitimidina, ya que slo apa-rece en el ADN) y el nucletidotimidilato o timidina monofosfa-to (dTMP). En el ADN, la timi-na siempre se empareja con la ade-nina de la cadena complementa-ria mediante 2 puentes de hidr-geno, T=A. Su frmula qumica esC5H6N2O2 y su nomenclatura 2, 4-dioxo, 5-metilpirimidina.

N

C

C CN

N C

H

O H

H

12

3 5

6

4

H H

Grupo oxo

Grupo amino

Citosina: 2-oxo, 4-aminopirimidina.

Citosina:

En el cdigo gentico se represen-ta con la letra C. Es un derivadopirimidnico, con un grupo aminoen posicin 4 y un grupo oxo enposicin 2. Forma el nuclesidocitidina (desoxicitidina en el ADN)y el nucletido citidilato o (des-oxi)citidina monofosfato (dCMPen el ADN, CMP en el ARN). Lacitosina siempre se empareja en elADN con la guanina de la cadenacomplementaria mediante un tripleenlace, CG. Su frmula qumica

6 2 PROPIEDADES FSICAS Y QUMICAS

es C4H5N3O y su nomenclatura 2-oxo, 4 aminopirimidina. Su masamolecular es de 111,10 unidades demasa atmica. La citosina se descu-bri en 1894, al aislarla del tejidodel timo de carnero.

N

C

C CN

C N

N H34

5 1

2

6

H H

H

H

N

C9

8

7

Grupo amino

Adenina: 6-aminopurina.

Adenina:En el cdigo gentico se repre-senta con la letra A. Es un de-rivado de la purina con un gru-po amino en la posicin 6. Formael nuclesido adenosina (desoxia-denosina en el ADN) y el nucle-tido adenilato o (desoxi)adenosinamonofosfato (dAMP, AMP). En elADN siempre se empareja con latimina de la cadena complemen-taria mediante 2 puentes de hi-drgeno, A=T. Su frmula qumi-ca es C5H5N5 y su nomenclatu-ra 6-aminopurina. La adenina, jun-to con la timina, fue descubier-ta en 1885 por el mdico alemnAlbrecht Kossel.

Guanina:En el cdigo gentico se represen-ta con la letra G. Es un deriva-do prico con un grupo oxo en laposicin 6 y un grupo amino enla posicin 2. Forma el nuclesi-do (desoxi)guanosina y el nucle-tido guanilato o (desoxi)guanosinamonofosfato (dGMP, GMP). La

O

C

C CN

C N

N N3

4

5 1

2

6

H

H

N

C9

8

7

H

H

H

Grupo oxo

Grupo amino

Guanina: 6-oxo, 2-aminopurina.

guanina siempre se empareja en elADN con la citosina de la cadenacomplementaria mediante tres en-laces de hidrgeno, GC. Su fr-mula qumica es C5H5N5Oy su no-menclatura 6-oxo, 2-aminopurina.

Tambin existen otras bases nitrogenadas (las llamadasbases nitrogenadas minoritarias), derivadas de formanatural o sinttica de alguna otra base mayoritaria. Lo sonpor ejemplo la hipoxantina, relativamente abundante en eltRNA, o la cafena, ambas derivadas de la adenina; otras,como el aciclovir, derivadas de la guanina, son anlogossintticos usados en terapia antiviral; otras, como una delas derivadas del uracilo, son antitumorales.Las bases nitrogenadas tienen una serie de caractersti-cas que les coneren unas propiedades determinadas. Unacaracterstica importante es su carcter aromtico, conse-cuencia de la presencia en el anillo de dobles enlaces enposicin conjugada. Ello les conere la capacidad de ab-sorber luz en la zona ultravioleta del espectro en torno alos 260 nm, lo cual puede aprovecharse para determinarel coeciente de extincin del ADN y hallar la concentra-cin existente de los cidos nucleicos. Otra de sus caracte-rsticas es que presentan tautomera o isomera de gruposfuncionales, debido a que un tomo de hidrgeno unidoa otro tomo puede migrar a una posicin vecina; en lasbases nitrogenadas se dan dos tipos de tautomeras: tau-tomera lactama-lactima, donde el hidrgeno migra delnitrgeno al oxgeno del grupo oxo (forma lactama) y vi-ceversa (forma lactima), y tautomera imina-amina pri-maria, donde el hidrgeno puede estar formando el grupoamina (forma amina primaria) o migrar al nitrgeno ad-yacente (forma imina). La adenina slo puede presentartautomera amina-imina, la timina y el uracilo muestrantautomera doble lactama-lactima, y la guanina y citosinapueden presentar ambas. Por otro lado, y aunque se tra-te de molculas apolares, las bases nitrogenadas presen-tan suciente carcter polar como para establecer puentesde hidrgeno, ya que tienen tomos muy electronegativos

2.2 Apareamiento de bases 7

(nitrgeno y oxgeno) que presentan carga parcial nega-tiva, y tomos de hidrgeno con carga parcial positiva,de manera que se forman dipolos que permiten que seformen estos enlaces dbiles.Se estima que el genoma humano haploide tiene alrede-dor de 3000 millones de pares de bases. Para indicar eltamao de las molculas de ADN se indica el nmero depares de bases, y como derivados hay dos unidades demedida muy utilizadas, la kilobase (kb), que equivale a1000 pares de bases, y la megabase (Mb), que equivale aun milln de pares de bases.

2.2 Apareamiento de bases

Un par de bases CG con tres puentes de hidrgeno.

Un par A=T con dos puentes de hidrgeno. Los puentes de hi-drgeno se muestran como lneas discontinuas.

La dble hlice de ADN se mantiene estable mediante laformacin de puentes de hidrgeno entre las bases aso-ciadas a cada una de las dos hebras. Para la formacin deun enlace de hidrgeno una de las bases debe presentar undonador de hidrgenos con un tomo de hidrgeno concarga parcial positiva (-NH2 o -NH) y la otra base debepresentar un grupo aceptor de hidrgenos con un tomocargado electronegativamente (C=O o N). Los puentes dehidrgeno son uniones ms dbiles que los tpicos enlacesqumicos covalentes, como los que conectan los tomosen cada hebra de ADN, pero ms fuertes que interaccio-nes hidrfobas individuales, enlaces de Van der Waals,etc. Como los puentes de hidrgeno no son enlaces co-valentes, pueden romperse y formarse de nuevo de formarelativamente sencilla. Por esta razn, las dos hebras de la

doble hlice pueden separarse como una cremallera, bienpor fuerza mecnica o por alta temperatura.[28] La doblehlice se estabiliza adems por el efecto hidrofbico y elapilamiento, que no se ven inuidos por la secuencia debases del ADN.[29]

Cada tipo de base en una hebra forma un enlace nica-mente con un tipo de base en la otra hebra, lo que sedenomina complementariedad de las bases. As, las pu-rinas forman enlaces con las pirimidinas, de forma queA se enlaza slo con T, y C slo con G. La organizacinde dos nucletidos apareados a lo largo de la doble hlicese denomina apareamiento de bases. Este emparejamien-to corresponde a la observacin ya realizada por ErwinCharga (1905-2002),[30] que mostr que la cantidad deadenina era muy similar a la cantidad de timina, y quela cantidad de citosina era igual a la cantidad de guaninaen el ADN. Como resultado de esta complementariedad,toda la informacin contenida en la secuencia de doblehebra de la hlice de ADN est duplicada en cada hebra,lo cual es fundamental durante el proceso de replicacindel ADN. En efecto, esta interaccin reversible y espec-ca entre pares de bases complementarias es crtica paratodas las funciones del ADN en los organismos vivos.[18]

Como se ha indicado anteriormente, los dos tipos de pa-res de bases forman un nmero diferente de enlaces de hi-drgeno: A=T forman dos puentes de hidrgeno, y CGforman tres puentes de hidrgeno (ver imgenes). El parde bases GC es por tanto ms fuerte que el par de ba-ses AT. Como consecuencia, tanto el porcentaje de paresde bases GC como la longitud total de la doble hlice deADN determinan la fuerza de la asociacin entre las doshebras de ADN. Las dobles hlices largas de ADN con al-to contenido en GC tienen hebras que interaccionan msfuertemente que las dobles hlices cortas con alto con-tenido en AT.[31] Por esta razn, las zonas de la doblehlice de ADN que necesitan separarse fcilmente tien-den a tener un alto contenido en AT, como por ejemplola secuencia TATAAT de la caja de Pribnow de algunospromotores.[32] En el laboratorio, la fuerza de esta inter-accin puede medirse buscando la temperatura requeridapara romper los puentes de hidrgeno, la temperatura defusin (tambin denominado valor Tm, del ingls meltingtemperature). Cuando todas las pares de bases en una do-ble hlice se funden, las hebras se separan en solucin endos hebras completamente independientes. Estas mol-culas de ADN de hebra simple no tienen una nica formacomn, sino que algunas conformaciones son ms esta-bles que otras.[33]

2.2.1 Otros tipos de pares de bases

Existen diferentes tipos de pares de bases que se puedenformar segn el modo como se forman los puentes de hi-drgeno. Los que se observan en la doble hlice de ADNson los llamados pares de bases Watson-Crick, pero tam-bin existen otros posibles pares de bases, como los de-nominados Hoogsteen y Wobble u oscilante, que pueden

8 2 PROPIEDADES FSICAS Y QUMICAS

N

C

C CN

C N

NH3

4

5 1

2

6

H H

H

H

N

C9

8

7

NH

N H

C

O

C

C C

HCH3

6

O

2

1

3

4

5

Par de bases A=T de tipoWatson-Crick. En azul el donador dehidrgenos y en rojo el aceptor.

N

C

C CN

C N

NH3

4

5 1

2

6

H H

H

H

N

C9

8

7

NH

NH

C

O

CC

C

H

CH3

6

O

4

5

3

2

1

Par de bases A=T de tipoWatson-Crick reverso. En azul el do-nador de hidrgenos y en rojo el aceptor. Ntese que la pirimidi-na ha sufrido un giro de 180 sobre el eje del carbono 6.

aparecer en circunstancias particulares. Adems, para ca-da tipo existe a su vez el mismo par reverso, es decir, elque se da si se gira la base pirimidnica 180 sobre su eje.

Watson-Crick (pares de bases de la doble hlice):los grupos de la base prica que intervienen en elenlace de hidrgeno son los que corresponden a lasposiciones 1 y 6 (N aceptor y -NH2 donador si lapurina es una A) y los grupos de la base pirimid-nica, los que se encuentran en las posiciones 3 y 4(-NH donador y C=O aceptor si la pirimidina es unaT). En el par de bases Watson-Crick reverso parti-ciparan los grupos de las posiciones 2 y 3 de la basepirimidnica (ver imgenes).

Hoogsteen: en este caso cambian los grupos de la ba-se prica, que ofrece una cara diferente (posiciones6 y 7) y que forman enlaces con los grupos de las pi-rimidinas de las posiciones 3 y 4 (como en Watson-Crick). Tambin puede haber Hoogsteen reversos.Con este tipo de enlace pueden unirse A=U (Hoogs-teen y Hoogsteen reverso) y A=C (Hoogsteen rever-

so).

Wobble u oscilante: este tipo de enlace permiteque se unan guanina y citosina con un doble enla-ce (G=T). La base prica (G) forma enlace con losgrupos de las posiciones 1 y 6 (como en Watson-Crick) y la pirimidina (T) con los grupos de las po-siciones 2 y 3. Este tipo de enlace no funcionara conA=C, ya que quedaran enfrentados los 2 aceptoresy los 2 donadores, y slo se podra dar en el casoinverso. Encontramos pares de bases de tipo osci-lante en el ARN, durante el apareamiento de codny anticodn. Con este tipo de enlace pueden unirseG=U (oscilante y oscilante reverso) y A=C (oscilan-te reverso).

En total, en su forma tautomrica mayoritaria, existen 28posibles pares de bases nitrogenadas: 10 posibles pares debases purina-pirimidina (2 pares Watson-Crick y 2 Wat-son Crick reverso, 1 par Hoogsteen y 2 pares Hoogsteenreverso, 1 par oscilante y 2 pares oscilante reverso), 7 pa-res homo purina-purina (A=A, G=G), 4 pares A=G y 7pares pirimidina-pirimidina. Esto sin contar con los pa-res de bases que pueden formarse si tambin tenemosen cuenta las otras formas tautomricas minoritarias delas bases nitrogenadas; stos, adems, pueden ser respon-sables de mutaciones puntuales por sustitucin de tipotransicin.

2.3 EstructuraEl ADN es una molcula bicatenaria, es decir, est for-mada por dos cadenas dispuestas de forma antiparalela ycon las bases nitrogenadas enfrentadas. En su estructuratridimensional, se distinguen distintos niveles:[34][35]

1. Estructura primaria:

Secuencia de nucletidos encadenados. Es enestas cadenas donde se encuentra la informa-cin gentica, y dado que el esqueleto es elmismo para todos, la diferencia de la informa-cin radica en la distinta secuencia de basesnitrogenadas. Esta secuencia presenta un c-digo, que determina una informacin u otra,segn el orden de las bases.

2. Estructura secundaria:

Es una estructura en doble hlice. Permite ex-plicar el almacenamiento de la informacingentica y el mecanismo de duplicacin delADN. Fue postulada por Watson y Crick, ba-sndose en la difraccin de rayos X que habanrealizado Franklin y Wilkins, y en la equiva-lencia de bases de Charga, segn la cual lasuma de adeninas ms guaninas es igual a lasuma de timinas ms citosinas.

2.3 Estructura 9

Es una cadena doble, dextrgira o levgira, se-gn el tipo de ADN. Ambas cadenas son com-plementarias, pues la adenina y la guanina deuna cadena se unen, respectivamente, a la ti-mina y la citosina de la otra. Ambas cadenasson antiparalelas, pues el extremo 3 de una seenfrenta al extremo 5 de la homloga.

Existen tres modelos de ADN. El ADN de ti-po B es el ms abundante y es el que tiene laestructura descrita por Watson y Crick.

3. Estructura terciaria: Se reere a cmo se almacena el ADNen un espacio reducido, para formar loscromosomas. Vara segn se trate de organis-mos procariotas o eucariotas:

(a) En procariotas el ADN se pliega como unasper-hlice, generalmente en forma circulary asociada a una pequea cantidad de prote-nas. Lo mismo ocurre en orgnulos celularescomo las mitocondrias y en los cloroplastos.

(b) En eucariotas, dado que la cantidad de ADNde cada cromosoma es muy grande, el em-paquetamiento ha de ser ms complejo ycompacto; para ello se necesita la presen-cia de protenas, como las histonas y otrasprotenas de naturaleza no histnica (enlos espermatozoides estas protenas son lasprotaminas).[34]

4. Estructura cuaternaria:

La cromatina presente en elncleo tiene un grosor de 300, pues la bra de cromati-na de 100 se enrolla for-mando una bra de cromati-na de 300 . El enrollamien-to de los nucleosomas reci-be el nombre de solenoide.Dichos solenoides se enrollanformando la cromatina del n-cleo interfsico de la clula eu-cariota. Cuando la clula entraen divisin, el ADN se com-pacta ms, formando as loscromosomas.

2.3.1 Estructuras en doble hlice

ElADN existe enmuchas conformaciones.[27] Sin embar-go, en organismos vivos slo se han observado las confor-maciones ADN-A, ADN-B y ADN-Z. La conformacinque adopta el ADN depende de su secuencia, la cantidady direccin de superenrollamiento que presenta, la pre-sencia de modicaciones qumicas en las bases y las con-diciones de la solucin, tales como la concentracin de

De izquierda a derecha, las estructuras de ADN A, B y Z.

iones de metales y poliaminas.[36] De las tres conforma-ciones, la forma B es la ms comn en las condicionesexistentes en las clulas.[37] Las dos dobles hlices alter-nativas del ADN dieren en su geometra y dimensiones.La forma A es una espiral que gira hacia la derecha,ms amplia que la B, con una hendidura menor super-cial y ms amplia, y una hendidura mayor ms estrechay profunda. La forma A ocurre en condiciones no sio-lgicas en formas deshidratadas de ADN, mientras queen la clula puede producirse en apareamientos hbridosde hebras ADN-ARN, adems de en complejos enzima-ADN.[38][39]

Los segmentos de ADN en los que las bases han sidomodicadas por metilacin pueden sufrir cambios con-formacionales mayores y adoptar la forma Z. En estecaso, las hebras giran alrededor del eje de la hlice en unaespiral que gira a mano izquierda, lo opuesto a la formaB ms frecuente.[40] Estas estructuras poco frecuentespueden ser reconocidas por protenas especcas que seunen a ADN-Z y posiblemente estn implicadas en la re-gulacin de la transcripcin.[41]

2.3.2 Estructuras en cudruplex

En los extremos de los cromosomas lineales existen re-giones especializadas de ADN denominadas telmeros.La funcin principal de estas regiones es permitir a laclula replicar los extremos cromosmicos utilizando laenzima telomerasa, puesto que las enzimas que repli-can el resto del ADN no pueden copiar los extremos3' de los cromosomas.[43] Estas terminaciones cromos-micas especializadas tambin protegen los extremos delADN, y evitan que los sistemas de reparacin del ADNen la clula los procesen como ADN daado que debeser corregido.[44] En las clulas humanas, los telmerosson largas zonas de ADN de hebra sencilla que contie-nen algunos miles de repeticiones de una nica secuenciaTTAGGG.[45]

Estas secuencias ricas en guanina pueden estabilizar losextremos cromosmicos mediante la formacin de es-tructuras de juegos apilados de unidades de cuatro bases,

10 2 PROPIEDADES FSICAS Y QUMICAS

Estructura de un ADN en cudruplex formada por repeticionesen los telmeros. La conformacin de la estructura de sopor-te del ADN diere signicativamente de la tpica estructura enhlice.[42]

en lugar de los pares de bases encontrados normalmenteen otras estructuras de ADN. En este caso, cuatro basesguanina forman unidades con supercie plana que se api-lan una sobre otra, para formar una estructura cudruple-G estable.[46] Estas estructuras se estabilizan formandopuentes de hidrgeno entre los extremos de las bases y laquelatacin de un metal inico en el centro de cada uni-dad de cuatro bases.[47] Tambin se pueden formar otrasestructuras, con el juego central de cuatro bases proce-dente, o bien de una hebra sencilla plegada alrededor delas bases, o bien de varias hebras paralelas diferentes, deforma que cada una contribuye con una base a la estruc-tura central.Adems de estas estructuras apiladas, los telmeros tam-bin forman largas estructuras en lazo, denominadas la-zos telomricos o lazos-T (T-loops en ingls). En este ca-so, las hebras simples de ADN se enroscan sobre s mis-mas en un amplio crculo estabilizado por protenas quese unen a telmeros.[48] En el extremo del lazo T, el ADNtelomrico de hebra sencilla se sujeta a una regin deADN de doble hebra porque la hebra de ADN telom-rico altera la doble hlice y se aparea a una de las doshebras. Esta estructura de triple hebra se denomina lazode desplazamiento o lazo D (D-loop).[46]

2.4 Hendiduras mayor y menorLa doble hlice es una espiral dextrgira, esto es, cadauna de las cadenas de nucletidos gira a derechas; estopuede vericarse si nos jamos, yendo de abajo a arriba,en la direccin que siguen los segmentos de las hebrasque quedan en primer plano. Si las dos hebras giran a de-rechas se dice que la doble hlice es dextrgira, y si girana izquierdas, levgira (esta forma puede aparecer en hli-ces alternativas debido a cambios conformacionales en el

Animacin de la estructura de una seccin de ADN. Las basesse encuentran horizontalmente entre las dos hebras en espiral.Versin ampliada[49]

Doble hlice: a) Dextrgira, b) Levgira.

ADN). Pero en la conformacin ms comn que adoptael ADN, la doble hlice es dextrgira, girando cada parde bases respecto al anterior unos 36.[50]

Cuando las dos hebras de ADN se enrollan una sobre laotra (sea a derechas o a izquierdas), se forman huecos ohendiduras entre una hebra y la otra, dejando expuestoslos laterales de las bases nitrogenadas del interior (ver la

2.6 Superenrollamiento 11

animacin). En la conformacin ms comn que adoptael ADN aparecen, como consecuencia de los ngulos for-mados entre los azcares de ambas cadenas de cada parde bases nitrogenadas, dos tipos de hendiduras alrededorde la supercie de la doble hlice: una de ellas, la hendi-dura o surco mayor, que mide 22 (2,2 nm) de ancho, yla otra, la hendidura o surco menor, que mide 12 (1,2nm) de ancho.[51] Cada vuelta de hlice, que es cuandosta ha realizado un giro de 360 o lo que es lo mismo, deprincipio de hendidura mayor a nal de hendidura menor,medir por tanto 34 , y en cada una de esas vueltas hayunos 10,5 pb.

Hendiduras mayor y menor de la doble hlice.

La anchura de la hendidura mayor implica que los ex-tremos de las bases son ms accesibles en sta, de formaque la cantidad de grupos qumicos expuestos tambin esmayor lo cual facilita la diferenciacin entre los pares debases A-T, T-A, C-G, G-C. Como consecuencia de ello,tambin se ver facilitado el reconocimiento de secuen-cias de ADN por parte de diferentes protenas sin la ne-cesidad de abrir la doble hlice. As, protenas como losfactores de transcripcin que pueden unirse a secuenciasespeccas, frecuentemente contactan con los laterales delas bases expuestos en la hendidura mayor.[52] Por el con-trario, los grupos qumicos que quedan expuestos en lahendidura menor son similares, de forma que el recono-cimiento de los pares de bases es ms difcil; por ello sedice que la hendidura mayor contiene ms informacinque la hendidura menor.[50]

2.5 Sentido y antisentidoUna secuencia de ADN se denomina "sentido" (en ingls,sense) si su secuencia es la misma que la secuencia deun ARN mensajero que se traduce en una protena. Lasecuencia de la hebra de ADN complementaria se deno-mina antisentido (antisense). En ambas hebras de ADNde la doble hlice pueden existir tanto secuencias sentido,que codican ARNm, como antisentido, que no lo codi-can. Es decir, las secuencias que codican ARNm noestn todas presentes en una sola de las hebras, sino re-partidas entre las dos hebras. Tanto en procariotas comoen eucariotas se producen ARN con secuencias antisenti-do, pero la funcin de esos ARN no est completamenteclara.[53] Se ha propuesto que los ARN antisentido estn

implicados en la regulacin de la expresin gnica me-diante apareamiento ARN-ARN: los ARN antisentido seaparearan con los ARNm complementarios, bloqueandode esta forma su traduccin.[54]

En unas pocas secuencias de ADN en procariotas y euca-riotas (este hecho es ms frecuente en plsmidos y virus),la distincin entre hebras sentido y antisentido es ms di-fusa, debido a que presentan genes superpuestos.[55] Enestos casos, algunas secuencias de ADN tienen una fun-cin doble, codicando una protena cuando se lee a lolargo de una hebra, y una segunda protena cuando selee en la direccin contraria a lo largo de la otra hebra.En bacterias, esta superposicin puede estar involucradaen la regulacin de la transcripcin del gen,[56] mientrasque en virus los genes superpuestos aumentan la cantidadde informacin que puede codicarse en sus diminutosgenomas.[57]

2.6 Superenrollamiento

Estructura de molculas de ADN lineales con los extremos josy superenrolladas. Por claridad, se ha omitido la estructura enhlice del ADN.

El ADN puede retorcerse como una cuerda en un proce-so que se denomina superenrollamiento del ADN (su-percoiling, en ingls). Cuando el ADN est en un es-tado relajado, una hebra normalmente gira alrededordel eje de la doble hlice una vez cada 10,4 pares de ba-ses, pero si el ADN est retorcido las hebras pueden estarunidas ms estrechamente o ms relajadamente.[58] Si elADN est retorcido en la direccin de la hlice, se di-ce que el superenrollamiento es positivo, y las bases semantienen juntas de forma ms estrecha. Si el ADN seretuerce en la direccin opuesta, el superenrollamiento sellama negativo, y las bases se alejan. En la naturaleza, lamayor parte del ADN tiene un ligero superenrollamien-to negativo que es producido por enzimas denominadastopoisomerasas.[59] Estas enzimas tambin son necesariaspara liberar las fuerzas de torsin introducidas en las he-bras de ADN durante procesos como la transcripcin y lareplicacin.[60]

12 4 FUNCIONES BIOLGICAS

3 Modicaciones qumicasEstructura de la citosina con y sin el grupo metilo.Tras la desaminacin, la 5-metil-citosina tiene la mismaestructura que la timina.

3.1 Modicaciones de bases del ADNLa expresin de los genes est inuenciada por la formaen la que el ADN est empaquetado en cromosomas, enuna estructura denominada cromatina. Las modicacio-nes de bases pueden estar implicadas en el empaqueta-miento del ADN: las regiones que presentan una expre-sin gnica baja o nula normalmente contienen nivelesaltos de metilacin de las bases citosina. Por ejemplo, lametilacin de citosina produce 5-metil-citosina, que esimportante para la inactivacin del cromosoma X.[61] Elnivel medio de metilacin vara entre organismos: el gu-sano Caenorhabditis elegans carece de metilacin de cito-sina, mientras que los vertebrados presentan un nivel alto- hasta 1% de su ADN contiene 5-metil-citosina.[62] Apesar de la importancia de la 5-metil-citosina, sta pue-de desaminarse para generar una base timina. Las cito-sinas metiladas son por tanto particularmente sensiblesa mutaciones.[63] Otras modicaciones de bases incluyenla metilacin de adenina en bacterias y la glicosilacin deuracilo para producir la base-J en kinetoplastos.[64][65]

3.2 Dao del ADNEl ADN puede resultar daado por muchos tipos demutgenos, que cambian la secuencia del ADN: agentesalquilantes, adems de radiacin electromagntica de al-ta energa, como luz ultravioleta y rayos X. El tipo dedao producido en el ADN depende del tipo de mut-geno. Por ejemplo, la luz UV puede daar al ADN pro-duciendo dmeros de timina, que se forman por ligamien-to cruzado entre bases pirimidnicas.[67] Por otro lado,oxidantes tales como radicales libres o el perxido de hi-drgeno producen mltiples daos, incluyendo modica-ciones de bases, sobre todo guanina, y roturas de doblehebra (double-strand breaks).[68] En una clula humanacualquiera, alrededor de 500 bases sufren dao oxidati-vo cada da.[69][70] De estas lesiones oxidativas, las mspeligrosas son las roturas de doble hebra, ya que son dif-ciles de reparar y pueden producir mutaciones puntuales,inserciones y deleciones de la secuencia de ADN, as co-mo translocaciones cromosmicas.[71]

Muchos mutgenos se posicionan entre dos pares de ba-ses adyacentes, por lo que se denominan agentes interca-lantes. La mayora de los agentes intercalantes son mol-culas aromticas y planas, como el bromuro de etidio, ladaunomicina, la doxorubicina y la talidomida. Para queun agente intercalante pueda integrarse entre dos paresde bases, stas deben separarse, distorsionando las he-

Molcula de Benzopireno, mutgeno presente por ejemplo en elhumo del tabaco, ligada una hlice de ADN.[66]

bras de ADN y abriendo la doble hlice. Esto inhibe latranscripcin y la replicacin del ADN, causando toxi-cidad y mutaciones. Por ello, los agentes intercalantesdel ADN son a menudo carcingenos: el benzopireno,las acridinas, la aatoxina y el bromuro de etidio sonejemplos bien conocidos.[72][73][74] Sin embargo, debi-do a su capacidad para inhibir la replicacin y la trans-cripcin del ADN, estas toxinas tambin se utilizan enquimioterapia para inhibir el rpido crecimiento de lasclulas cancerosas.[75]

El dao en el ADN inicia una respuesta que activa dife-rentes mecanismos de reparacin que reconocen lesionesespeccas en el ADN, que son reparadas en el momentopara recuperar la secuencia original del ADN. Asimismo,el dao en el ADN provoca una parada en el ciclo celular,que conlleva la alteracin de numerosos procesos siol-gicos, que a su vez implica sntesis, transporte y degra-dacin de protenas (vase tambin Checkpoint de daosen el ADN). Alternativamente, si el dao genmico esdemasiado grande para que pueda ser reparado, los me-canismos de control inducirn la activacin de una seriede rutas celulares que culminarn en la muerte celular.

4 Funciones biolgicasLas funciones biolgicas del ADN incluyen el almacena-miento de informacin (genes y genoma), la codicacin

4.1 Genes y genoma 13

de protenas (transcripcin y traduccin) y su autodupli-cacin (replicacin del ADN) para asegurar la transmi-sin de la informacin a las clulas hijas durante la divi-sin celular.

4.1 Genes y genomaEl ADN se puede considerar como un almacn cuyo con-tenido es la informacin (mensaje) necesaria para cons-truir y sostener el organismo en el que reside, la cual setransmite de generacin en generacin. El conjunto de in-formacin que cumple esta funcin en un organismo dadose denomina genoma, y el ADN que lo constituye, ADNgenmico.El ADN genmico (que se organiza en molculas decromatina que a su vez se ensamblan en cromosomas)se encuentra en el ncleo celular de los eucariotas,adems de pequeas cantidades en las mitocondrias ycloroplastos. En procariotas, el ADN se encuentra en uncuerpo de forma irregular denominado nucleoide.[76]

4.1.1 El ADN codicante

ARN polimerasa T7 (azul) produciendo un ARNm (verde) a par-tir de un molde de ADN (naranja).[77]

La informacin gentica de un genoma est contenida enlos genes, y al conjunto de toda la informacin que corres-ponde a un organismo se le denomina su genotipo. Un genes una unidad de herencia y es una regin de ADN queinuye en una caracterstica particular de un organismo(como el color de los ojos, por ejemplo). Los genes con-tienen un marco de lectura abierto (open reading frame)que puede transcribirse, adems de secuencias regulado-ras, tales como promotores y enhancers, que controlan latranscripcin del marco de lectura abierto.Desde este punto de vista, las obreras de este mecanismoson las protenas. Estas pueden ser estructurales, como lasprotenas de los msculos, cartlagos, pelo, etc., o funcio-nales, como la hemoglobina o las innumerables enzimasdel organismo. La funcin principal de la herencia es laespecicacin de las protenas, siendo el ADN una espe-cie de plano o receta para producirlas. La mayor parte

de las veces la modicacin del ADN provocar una dis-funcin proteica que dar lugar a la aparicin de algunaenfermedad. Pero en determinadas ocasiones, las modi-caciones podrn provocar cambios beneciosos que da-rn lugar a individuos mejor adaptados a su entorno.Las aproximadamente treinta mil protenas diferentesen el cuerpo humano estn constituidas por veinteaminocidos diferentes, y una molcula de ADN debe es-pecicar la secuencia en que se unen dichos aminocidos.En el proceso de elaborar una protena, el ADN de un gense lee y se transcribe a ARN. Este ARN sirve como men-sajero entre el ADN y la maquinaria que elaborar lasprotenas y por eso recibe el nombre de ARN mensajeroo ARNm. El ARN mensajero sirve de molde a la ma-quinaria que elabora las protenas, para que ensamble losaminocidos en el orden preciso para armar la protena.El dogma central de la biologa molecular estableca queel ujo de actividad y de informacin era: ADN ARN protena. No obstante, en la actualidad ha quedado de-mostrado que este dogma debe ser ampliado, pues sehan encontrado otros ujos de informacin: en algunosorganismos (virus de ARN) la informacin uye de ARNa ADN; este proceso se conoce como transcripcin in-versa o reversa, tambin llamada retrotranscripcin.Adems, se sabe que existen secuencias de ADN que setranscriben a ARN y son funcionales como tales, sin lle-gar a traducirse nunca a protena: son los ARN no codi-cantes, como es el caso de los ARN interferentes.[34][35]

4.1.2 El ADN no codicante

El ADN del genoma de un organismo puede dividir-se conceptualmente en dos: el que codica las protenas(los genes) y el que no codica. En muchas especies, s-lo una pequea fraccin del genoma codica protenas.Por ejemplo, slo alrededor del 1,5% del genoma hu-mano consiste en exones que codican protenas (20.000a 25.000 genes), mientras que ms del 90% consiste enADN no codicante.[78]

El ADN no codicante (tambin denominado ADN ba-sura o junk DNA) corresponde a secuencias del genomaque no generan una protena (procedentes de transposi-ciones, duplicaciones, translocaciones y recombinacionesde virus, etc.), incluyendo los intrones. Hasta hace pocotiempo se pensaba que el ADN no codicante no tenautilidad alguna, pero estudios recientes indican que esoes inexacto. Entre otras funciones, se postula que el lla-mado ADN basura regula la expresin diferencial delos genes.[79] Por ejemplo, algunas secuencias tienen a-nidad hacia protenas especiales que tienen la capacidadde unirse al ADN (como los homeodominios, los comple-jos receptores de hormonas esteroides, etc.), con un papelimportante en el control de los mecanismos de trascrip-cin y replicacin. Estas secuencias se llaman frecuente-mente secuencias reguladoras, y los investigadores su-ponen que slo se ha identicado una pequea fraccin

14 4 FUNCIONES BIOLGICAS

de las que realmente existen. La presencia de tanto ADNno codicante en genomas eucariticos y las diferenciasen tamao del genoma entre especies representan un mis-terio que es conocido como el "enigma del valor de C".[80]Los elementos repetitivos tambin son elementos funcio-nales. Si no se considerasen as, se excluira ms del 50%de los nucletidos totales, ya que constituyen elementosde repeticin. Recientemente, un grupo de investigadoresde la Universidad de Yale ha descubierto una secuencia deADN no codicante que sera la responsable de que losseres humanos hayan desarrollado la capacidad de aga-rrar y/o manipular objetos o herramientas.[81]

Por otro lado, algunas secuencias de ADN desempeanun papel estructural en los cromosomas: los telmerosy centrmeros contienen pocos o ningn gen codican-te de protenas, pero son importantes para estabilizar laestructura de los cromosomas. Algunos genes no codi-can protenas, pero s se transcriben en ARN: ARNribosmico, ARN de transferencia y ARN de interfe-rencia (ARNi, que son ARN que bloquean la expresinde genes especcos). La estructura de intrones y exo-nes de algunos genes (como los de inmunoglobulinas yprotocadherinas) son importantes por permitir los cortesy empalmes alternativos del pre-ARN mensajero que ha-cen posible la sntesis de diferentes protenas a partir deun mismo gen (sin esta capacidad no existira el siste-ma inmune, por ejemplo). Algunas secuencias de ADNno codicante representan pseudogenes que tienen valorevolutivo, ya que permiten la creacin de nuevos genescon nuevas funciones.[35] Otros ADN no codicantes pro-ceden de la duplicacin de pequeas regiones del ADN;esto tiene mucha utilidad, ya que el rastreo de estas se-cuencias repetitivas permite estudios de logenia.

4.2 Transcripcin y traduccinEn un gen, la secuencia de nucletidos a lo largo deuna hebra de ADN se transcribe a un ARN mensaje-ro (ARNm) y esta secuencia a su vez se traduce a unaprotena que un organismo es capaz de sintetizar o ex-presar en uno o varios momentos de su vida, usando lainformacin de dicha secuencia.La relacin entre la secuencia de nucletidos y la secuen-cia de aminocidos de la protena viene determinada porel cdigo gentico, que se utiliza durante el proceso detraduccin o sntesis de protenas. La unidad codicadoradel cdigo gentico es un grupo de tres nucletidos (tri-plete), representado por las tres letras iniciales de las ba-ses nitrogenadas (por ej., ACT, CAG, TTT). Los triple-tes del ADN se transcriben en sus bases complementariasen el ARN mensajero, y en este caso los tripletes se de-nominan codones (para el ejemplo anterior, UGA, GUC,AAA). En el ribosoma cada codn del ARN mensajerointeracciona con una molcula de ARN de transferencia(ARNt o tRNA) que contenga el triplete complementa-rio, denominado anticodn. Cada ARNt porta el amino-cido correspondiente al codn de acuerdo con el cdigo

gentico, de modo que el ribosoma va uniendo los ami-nocidos para formar una nueva protena de acuerdo conlas instrucciones de la secuencia del ARNm. Existen64 codones posibles, por lo cual corresponde ms de unopara cada aminocido (por esta duplicidad de codones sedice que el cdigo gentico es un cdigo degenerado: noes unvoco); algunos codones indican la terminacin dela sntesis, el n de la secuencia codicante; estos codo-nes de terminacin o codones de parada son UAA, UGAy UAG (en ingls, nonsense codons o stop codons).[34]

4.3 Replicacin del ADN

ADN primasaCebadorADN ligasa

ADN polimerasa (Pol)

fragmento de Okazaki

ADN polimerasa (Pol)Helicasa

Protenas de Unina Cadena Simple (ssb)

Topoisomerasa

Cadenaretrasada

Cadenaadelantada

Esquema representativo de la replicacin del ADN.

La replicacin del ADN es el proceso por el cual se obtie-nen copias o rplicas idnticas de una molcula de ADN.La replicacin es fundamental para la transferencia de lainformacin gentica de una generacin a la siguiente y,por ende, es la base de la herencia. El mecanismo consis-te esencialmente en la separacin de las dos hebras de ladoble hlice, las cuales sirven de molde para la posteriorsntesis de cadenas complementarias a cada una de ellas,que llevar por nombre ARNm. El resultado nal son dosmolculas idnticas a la original. Este tipo de replicacinse denomina semiconservativa debido a que cada una delas dos molculas resultantes de la duplicacin presentauna cadena procedente de la molcula madre y otra re-cin sintetizada.

4.3.1 Hiptesis sobre la duplicacin del ADN

En un principio, se propusieron tres hiptesis:

Semiconservativa: Segn el experimento deMeselson-Stahl, cada hebra sirve de molde paraque se forme una hebra nueva, mediante la com-plentariedad de bases, quedando al nal dos dobleshlices formadas por una hebra antigua (molde) yuna nueva hebra (copia).

Conservativa: Tras la duplicacin quedaran las doshebras antiguas juntas y, por otro lado, las dos he-bras nuevas formando una doble hlice.

Dispersiva: Segn esta hiptesis, las hebras resul-tantes estaran formadas por fragmentos en doblehlice ADN antiguo y ADN recin sintetizado.

5.1 Protenas que unen ADN 15

5 Interacciones ADN-protenaTodas las funciones del ADN dependen de sus interaccio-nes con protenas. Estas interacciones pueden ser inespe-ccas, o bien la protena puede unirse de forma espec-ca a una nica secuencia de ADN. Tambin pueden unir-se enzimas, entre las cuales son particularmente impor-tantes las polimerasas, que copian las secuencia de basesdel ADN durante la transcripcin y la replicacin.

5.1 Protenas que unen ADN

5.1.1 Interacciones inespeccas

Interaccin de ADN con histonas (en blanco, arriba).Los aminocidos bsicos de estas protenas (abajo a laizquierda, en azul) se unen a los grupos cidos de losfosfatos del ADN (abajo a la derecha, en rojo).

Las protenas estructurales que se unen al ADN son ejem-plos bien conocidos de interacciones inespeccas ADN-protenas. En los cromosomas, el ADN se encuentra for-mando complejos con protenas estructurales. Estas pro-tenas organizan el ADN en una estructura compacta de-nominada cromatina. En eucariotas esta estructura im-plica la unin del ADN a un complejo formado por pe-queas protenas bsicas denominadas histonas, mien-tras que en procariotas estn involucradas una gran va-riedad de protenas.[82][83] Las histonas forman un com-plejo de forma cilndrica denominado nucleosoma, entorno al cual se enrollan casi dos vueltas de ADN de do-ble hlice. Estas interacciones inespeccas quedan de-terminadas por la existencia de residuos bsicos en lashistonas, que forman enlaces inicos con el esqueleto deazcar-fosfato del ADN y, por tanto, son en gran parteindependientes de la secuencia de bases.[84] Estos ami-nocidos bsicos experimentan modicaciones qumicasde metilacin, fosforilacin y acetilacin,[85] que alte-ran la fuerza de la interaccin entre el ADN y las his-tonas, haciendo al ADN ms o menos accesible a losfactores de transcripcin y por tanto modicando la ta-sa de transcripcin.[86]

Otras protenas que se unen a ADN de manera inespe-cca en la cromatina incluyen las protenas del gru-po de alta movilidad (HMG, High Mobility Group) quese unen a ADN plegado o distorsionado.[87] Estas pro-tenas son importantes durante el plegamiento de los nu-cleosomas, organizndolos en estructuras ms complejaspara constituir los cromosomas[88] durante el proceso decondensacin cromosmica. Se ha propuesto que en esteproceso tambin intervendran otras protenas, forman-do una especie de andamio sobre el cual se organizala cromatina; los principales componentes de esta estruc-tura seran la enzima topoisomerasa II (topoIIalpha)y la condensina 13S.[89] Sin embargo, el papel estruc-tural de la topoIIalpha en la organizacin de los cromo-

somas an es discutido, ya que otros grupos argumentanque esta enzima se intercambia rpidamente tanto en losbrazos cromosmicos como en los cinetocoros durante lamitosis.[90]

5.1.2 Interacciones especcas

Un grupo bien denido de protenas que unen ADN esel conformado por las protenas que se unen especca-mente a ADN monocatenario o ADN de hebra senci-lla (ssDNA). En humanos, la protena A de replicacines la mejor conocida de su familia y acta en procesosen los que la doble hlice se separa, como la replicacindel ADN, la recombinacin o la reparacin del ADN.[91]Estas protenas parecen estabilizar el ADN monocatena-rio, protegindolo para evitar que forme estructuras detallo-lazo (stem-loop) o que sea degradado por nucleasas.

El factor de transcripcin represor del fago lambda unido a suADN diana mediante un motivo hlice-giro-hlice (helix-turn-helix).[92]

Sin embargo, otras protenas han evolucionado para unir-se especcamente a secuencias particulares de ADN. Laespecicidad de la interaccin de las protenas con elADN procede de los mltiples contactos con las bases deADN, lo que les permite leer la secuencia del ADN. Lamayora de esas interacciones con las bases ocurre en lahendidura mayor, donde las bases son ms accesibles.[93]

Las protenas especcas estudiadas con mayor detalleson las encargadas de regular la transcripcin, denomi-

16 5 INTERACCIONES ADN-PROTENA

nadas por ello factores de transcripcin. Cada factor detranscripcin se une a una secuencia concreta de ADN yactiva o inhibe la transcripcin de los genes que presentanestas secuencias prximas a sus promotores. Los factoresde transcripcin pueden efectuar esto de dos formas:

En primer lugar, pueden unirse a la polimerasa deARN responsable de la transcripcin, bien directa-mente o a travs de otras protenas mediadoras. Deesta forma. se estabiliza la unin entre la ARN poli-merasa y el promotor, lo que permite el inicio de latranscripcin.[94]

En segundo lugar, los factores de transcripcin pue-den unirse a enzimas que modican las histonas delpromotor, lo que altera la accesibilidad del molde deADN a la ARN polimerasa.[95]

Como los ADN diana pueden encontrarse por todo elgenoma del organismo, los cambios en la actividad de untipo de factor de transcripcin pueden afectar a miles degenes.[96] En consecuencia, estas protenas son frecuen-temente las dianas de los procesos de transduccin de se-ales que controlan las respuestas a cambios ambientaleso diferenciacin y desarrollo celular.

La enzima de restriccin EcoRV (verde) formando un complejocon su ADN diana.[97]

5.2 Enzimas que modican el ADN

5.2.1 Nucleasas y ligasas

Las nucleasas son enzimas que cortan las hebras de ADNmediante la catlisis de la hidrlisis de los enlaces fosfo-dister. Las nucleasas que hidrolizan nucletidos a par-tir de los extremos de las hebras de ADN se denomi-nan exonucleasas, mientras que las endonucleasas cortanen el interior de las hebras. Las nucleasas que se utili-zan con mayor frecuencia en biologa molecular son lasenzimas de restriccin, endonucleasas que cortan el ADNpor determinadas secuencias especcas. Por ejemplo, laenzima EcoRV, que se muestra a la izquierda, reconoce

la secuencia de 6 bases 5-GAT|ATC-3, y hace un cor-te en ambas hebras en la lnea vertical indicada, gene-rando dos molculas de ADN con los extremos romos.Otras enzimas de restriccin generan sin embargo extre-mos cohesivos, ya que cortan de forma diferente las doshebras de ADN. En la naturaleza, estas enzimas protegena las bacterias contra las infecciones de fagos, al digerir elADN de dicho fago cuando entra a travs de la pared bac-teriana, actuando como un mecanismo de defensa.[98] Enbiotecnologa, estas nucleasas especcas de la secuen-cias de ADN se utilizan en ingeniera gentica para clonarfragmentos de ADN y en la tcnica de huella gentica.Las enzimas denominadas ADN ligasas pueden reunirhebras de ADN cortadas o rotas.[99] Las ligasas son parti-cularmente importantes en la replicacin de la hebra quesufre replicacin discontinua en el ADN, ya que unen losfragmentos cortos de ADN generados en la horquilla dereplicacin para formar una copia completa del molde deADN. Tambin se utilizan en la reparacin del ADN y enprocesos de recombinacin gentica.[99]

5.2.2 Topoisomerasas y helicasas

Las topoisomerasas son enzimas que poseen a la vez acti-vidad nucleasa y ligasa. Estas protenas varan la cantidadde ADN superenrollado. Algunas de estas enzimas fun-cionan cortando la hlice de ADN y permitiendo que unaseccin rote, de manera que reducen el grado de super-enrollamiento. Una vez hecho esto, la enzima vuelve aunir los fragmentos de ADN.[59] Otros tipos de enzimasson capaces de cortar una hlice de ADN y luego pasarla segunda hebra de ADN a travs de la rotura, antes dereunir las hlices.[100] Las topoisomerasas son necesariaspara muchos procesos en los que interviene el ADN, co-mo la replicacin del ADN y la transcripcin.[60]

Las helicasas son unas protenas que pertenecen al gru-po de los motores moleculares. Utilizan energa qumi-ca almacenada en los nuclesidos trifosfatos, fundamen-talmente ATP, para romper puentes de hidrgeno en-tre bases y separar la doble hlice de ADN en hebrassimples.[101] Estas enzimas son esenciales para la mayorade los procesos en los que las enzimas necesitan accedera las bases del ADN.

5.2.3 Polimerasas

Las polimerasas son enzimas que sintetizan cadenas denucletidos a partir de nuclesidos trifosfatos. La secuen-cia de sus productos son copias de cadenas de polinucle-tidos existentes, que se denominanmoldes. Estas enzimasfuncionan aadiendo nucletidos al grupo hidroxilo en 3'del nucletido previo en una hebra de ADN. En conse-cuencia, todas las polimerasas funcionan en direccin 5--> 3.[102] En los sitios activos de estas enzimas, el nu-clesido trifosfato que se incorpora aparea su base con lacorrespondiente en el molde: esto permite que la polime-

17

rasa sintentice de forma precisa la hebra complementariaal molde.Las polimerasas se clasican de acuerdo al tipo de moldeque utilizan:

En la replicacin del ADN, una ADN polimerasadependiente de ADN realiza una copia de ADN apartir de una secuencia de ADN. La precisin es vi-tal en este proceso, por lo que muchas de estas po-limerasas tienen una actividad de vericacin de lalectura (proofreading). Mediante esta actividad, lapolimerasa reconoce errores ocasionales en la reac-cin de sntesis, debido a la falta de apareamien-te entre el nucletido errneo y el molde, lo quegenera un desacoplamiento (mismatch). Si se de-tecta un desacoplamiento, se activa una actividadexonucleasa en direccin 3 --> 5 y la base incorrec-ta se elimina.[103] En la mayora de los organismoslas ADN polimerasas funcionan en un gran com-plejo denominado replisoma, que contiene mltiplesunidades accesorias, como helicasas.[104]

Las ADN polimerasas dependientes de ARN sonuna clase especializada de polimerasas que copianla secuencia de una hebra de ARN en ADN. Inclu-yen la transcriptasa inversa, que es una enzima viralimplicada en la infeccin de clulas por retrovirus,y la telomerasa, que es necesaria para la replicacinde los telmeros.[105][43] La telomerasa es una poli-merasa inusual, porque contiene su propio molde deARN como parte de su estructura.[44]

La transcripcin se lleva a cabo por una ARN poli-merasa dependiente de ADN que copia la secuen-cia de una de las hebras de ADN en ARN. Para em-pezar a transcribir un gen, la ARN polimerasa se unea una secuencia del ADN denominada promotor, ysepara las hebras del ADN. Entonces copia la se-cuencia del gen en un transcrito de ARN mensajerohasta que alcanza una regin de ADN denomimadaterminador, donde se detiene y se separa del ADN.Como ocurre con las ADN polimerasas dependien-tes de ADN en humanos, la ARN polimerasa II (laenzima que transcribe la mayora de los genes delgenoma humano) funciona como un gran comple-jo multiproteico que contiene mltiples subunidadesreguladoras y accesorias.[106]

6 Recombinacin genticaEstructura de un intermedio en unin de Holliday en larecombinacin gentica. Las cuatro hebras de ADN sepa-radas estn coloreadas en rojo, azul, verde y amarillo.[107]Una hlice de ADN normalmente no interacciona conotros segmentos de ADN, y en las clulas humanas

C C GG A

A G C C G M

G A T T A F

A G T T A C1

C2

La recombinacin implica la rotura y reunin de dos cromoso-mas homlogos (M y F) para producir dos cromosomas nuevosreorganizados (C1 y C2).

los diferentes cromosomas incluso ocupan reas se-paradas en el ncleo celular denominadas territorioscromosmicos.[108] La separacin fsica de los dife-rentes cromosomas es importante para que el ADNmantenga su capacidad de funcionar como un alma-cn estable de informacin. Uno de los pocos momen-tos en los que los cromosomas interaccionan es duranteel sobrecruzamiento cromosmico (chromosomal crosso-ver), durante el cual se recombinan. El sobrecruzamientocromosmico ocurre cuando dos hlices de ADN se rom-pen, se intercambian y se unen de nuevo.La recombinacin permite a los cromosomas intercam-biar informacin gentica y produce nuevas combinacio-nes de genes, lo que aumenta la eciencia de la seleccinnatural y puede ser importante en la evolucin rpida denuevas protenas.[109] Durante la profase I de la meiosis,una vez que los cromosomas homlogos estn perfecta-mente apareados formando estructuras llamadas bivalen-tes, se produce el fenmeno de sobrecruzamiento o en-trecruzamiento (crossing-over), en el cual las cromtidashomlogas no hermanas (procedentes del padre y de lamadre) intercambian material gentico. La recombina-cin gentica resultante hace aumentar en gran medida lavariacin gentica entre la descendencia de progenitoresque se reproducen por va sexual. La recombinacin ge-ntica tambin puede estar implicada en la reparacin delADN, en particular en la respuesta celular a las roturas dedoble hebra (double-strand breaks).[110]

La forma ms frecuente de sobrecruzamiento cromos-mico es la recombinacin homloga, en la que los doscromosomas implicados comparten secuencias muy simi-lares. La recombinacin no-homloga puede ser dainapara las clulas, ya que puede producir translocacionescromosmicas y anomalas genticas. La reaccin de re-combinacin est catalizada por enzimas conocidas comorecombinasas, tales como RAD51.[111] El primer paso enel proceso de recombinacin es una rotura de doble he-bra, causada bien por una endonucleasa o por dao en elADN.[112] Posteriormente, una serie de pasos catalizadosen parte por la recombinasa, conducen a la unin de las

18 8 TCNICAS COMUNES

dos hlices formando al menos una unin de Holliday, enla que un segmento de una hebra simple es anillado con lahebra complementaria en la otra hlice. La unin de Ho-lliday es una estructura de unin tetrahdrica que puedemoverse a lo largo del par de cromosomas, intercambian-do una hebra por otra. La reaccin de recombinacin sedetiene por el corte de la unin y la reunin de los seg-mentos de ADN liberados.[113]

7 Evolucin del metabolismo deADN

El ADN contiene la informacin gentica que permite ala mayora de los organismos vivientes funcionar, crecery reproducirse. Sin embargo, no est claro durante cuntotiempo ha ejercido esta funcin en los ~3000 millones deaos de la historia de la vida, ya que se ha propuesto quelas formas de vida ms tempranas podran haber utilizadoARN comomaterial gentico.[114][115] ElARNpodra ha-ber funcionado como la parte central de un metabolismoprimigenio, ya que puede transmitir informacin genti-ca y simultneamente actuar como catalizador formandoparte de las ribozimas.[116] Este antiguo Mundo de ARNdonde los cidos nucleicos funcionaran como cataliza-dores y como almacenes de informacin gentica podrahaber inuido en la evolucin del cdigo gentico actual,basado en cuatro nucletidos. Esto se debera a que el n-mero de bases nicas en un organismo es un compromisoentre un nmero pequeo de bases (lo que aumentara laprecisin de la replicacin) y un nmero grande de ba-ses (que a su vez aumentara la eciencia cataltica de lasribozimas).[117]

Desafortunadamente, no se cuenta con evidencia directade los sistemas genticos ancestrales porque la recupera-cin del ADN a partir de la mayor parte de los fsiles esimposible. Esto se debe a que el ADN es capaz de so-brevivir en el medio ambiente durante menos de un mi-lln de aos, y luego empieza a degradarse lentamenteen fragmentos de menor tamao en solucin.[118] Algu-nas investigaciones pretenden que se ha obtenido ADNms antiguo, por ejemplo un informe sobre el aislamien-to de una bacteria viable a partir de un cristal salino de250 millones de aos de antigedad,[119] pero estos datosson controvertidos.[120][121]

Sin embargo, pueden utilizarse herramientas deevolucin molecular para inferir los genomas deorganismos ancestrales a partir de organismoscontemporneos.[122][123] En muchos casos, estasinferencias son sucientemente ables, de manera queuna biomolcula codicada en un genoma ancestralpuede resucitarse en el laboratorio para ser estudiadahoy.[124][125] Una vez que la biomolcula ancestral se haresucitado, sus propiedades pueden ofrecer inferenciassobre ambientes y estilos de vida primigenios. Esteproceso se relaciona con el campo emergente de la

paleogentica experimental.[126]

A pesar de todo, el proceso de trabajo hacia atrs des-de el presente tiene limitaciones inherentes, razn por lacual otros investigadores tratan de elucidar el mecanis-mo evolutivo trabajando desde el origen de la Tierra enadelante. Dada suciente informacin sobre la qumicaen el cosmos, la manera en la que las sustancias csmicaspodran haberse depositado en la Tierra, y las transfor-maciones que podran haber tenido lugar en la super-cie terrestre primigenia, tal vez podramos ser capaces deaprender sobre los orgenes para desarrollar modelos deevolucin ulterior de la informacin gentica[127] (vasetambin el artculo sobre el origen de la vida).

8 Tcnicas comunesEl conocimiento de la estructura del ADN ha permiti-do el desarrollo de multitud de herramientas tecnolgicasque explotan sus propiedades sicoqumicas para anali-zar su implicacin en problemas concretos: por ejemplo,desde anlisis logeeticos para detectar similitudes en-tre diferentes taxones, a la caracterizacin de la variabi-lidad individual de un paciente en su respuesta a un de-terminado frmaco, pasando por un enfoque global, a ni-vel genmico, de cualquier caracterstica especca en ungrupo de individuos de inters. [128]

Podemos clasicar las metodologas de anlisis del ADNen aquellas que buscan su multiplicacin, ya in vivo, co-mo la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR), ya invitro, como la clonacin, y aquellas que explotan las pro-piedades especcas de elementos concretos, o de geno-mas adecuadamente clonados. Es el caso de la secuencia-cin de ADN y de la hibridacin con sondas especcas(southern blot y chips de ADN).

8.1 Tecnologa del ADN recombinanteLa tecnologa del ADN recombinante, piedra angular dela ingeniera gentica, permite propagar grandes cantida-des de un fragmento de ADN de inters, el cual se diceque ha sido clonado. Para ello, debe introducirse dichofragmento en otro elemento de ADN, generalmente unplsmido, que posee en su secuencia los elementos nece-sarios para que la maquinaria celular de un hospedador,normalmente Escherichia coli, lo replique. De este mo-do, una vez transformada la cepa bacteriana, el fragmen-to de ADN clonado se reproduce cada vez que aquella sedivide.[129]

Para clonar la secuencia de ADN de inters, se empleanenzimas como herramientas de corte y empalme del frag-mento y del vector (el plsmido). Dichas enzimas corres-ponden a dos grupos: en primer lugar, las enzimas de res-triccin, que poseen la capacidad de reconocer y cortarsecuencias especcas; en segundo lugar, la ADN liga-sa, que establece un enlace covalente entre extremos de

8.4 Southern blot 19

ADN compatibles[128] (ver seccin Nucleasas y ligasas).

8.2 Secuenciacin

La secuenciacin del ADN consiste en dilucidar el ordende los nucletidos de un polmero de ADN de cualquierlongitud, si bien suele dirigirse hacia la determinacin degenomas completos, debido a que las tcnicas actualespermiten realizar esta secuenciacin a gran velocidad, locual ha sido de gran importancia para proyectos de se-cuenciacin a gran escala como el Proyecto Genoma Hu-mano. Otros proyectos relacionados, en ocasiones frutode la colaboracin de cientcos a escala mundial, hanestablecido la secuencia completa del ADN de muchosgenomas de animales, plantas y microorganismos.El mtodo de secuenciacin de Sanger ha sido el ms em-pleado durante el siglo XX. Se basa en la sntesis de ADNen presencia de didesoxinuclesidos, compuestos que, adiferencia de los desoxinuclesidos normales (dNTPs),carecen de un grupo hidroxilo en su extremo 3'. Aun-que los didesoxinucletidos trifosfatados (ddNTPs) pue-den incorporarse a la cadena en sntesis, la carencia deun extremo 3'-OH imposibilita la generacin de un nuevoenlace fosfodister con el nuclesido siguiente; por tanto,provocan la terminacin de la sntesis. Por esta razn, elmtodo de secuenciacin tambin se denomina de ter-minacin de cadena. La reaccin se realiza usualmentepreparando un tubo con el ADNmolde, la polimerasa, uncebador, dNTPs convencionales y una pequea cantidadde ddNTPs marcados uorescentemente en su base ni-trogenada. De este modo, el ddTTP puede ir marcado enazul, el ddATP en rojo, etc. Durante la polimerizacin, sevan truncando las cadenas crecientes, al azar, en distintasposiciones. Por tanto, se produce una serie de productosde distinto tamao, coincidiendo la posicin de la termi-nacin debido a la incorporacin del ddNTP correspon-diente. Una vez terminada la reaccin, es posible correrla mezcla en una electroforesis capilar (que resuelve to-dos los fragmentos segn su longitud) en la cual se lee lauorescencia para cada posicin del polmero. En nuestroejemplo, la lectura azul-rojo-azul-azul se traducira comoTATT.[130][131]

8.3 Reaccin en cadena de la polimerasa(PCR)

La reaccin en cadena de la polimerasa, habitualmen-te conocida como PCR por sus siglas en ingls, es unatcnica de biologa molecular descrita en 1986 por KaryMullis,[132] cuyo objetivo es obtener un gran nmero decopias de un fragmento de ADN dado, partiendo de unaescasa cantidad de aqul. Para ello, se emplea una ADNpolimerasa termoestable que, en presencia de una mezclade los cuatro desoxinucletidos, un tampn de la fuer-za inica adecuada y los cationes precisos para la acti-vidad de la enzima, dos oligonucletidos (denominados

cebadores) complementarios a parte de la secuencia (si-tuados a distancia suciente y en sentido antiparalelo) ybajo unas condiciones de temperatura adecuadas, modu-ladas por un aparato denominado termociclador, generaexponencialmente nuevos fragmentos de ADN semejan-tes al original y acotados por los dos cebadores.[129]

La PCR puede efectuarse como una tcnica de puntonal, esto es, como una herramienta de generacin delADN deseado, o como un mtodo continuo, en el quese evale dicha polimerizacin a tiempo real. Esta ltimavariante es comn en la PCR cuantitativa.[128]

8.4 Southern blotEl mtodo de hibridacin Southern o Southern blot(el nombre original en el idioma ingls) permite la detec-cin de una secuencia de ADN en una muestra comple-ja o no del cido nucleico. Para ello, combina una sepa-racin mediante masa y carga (efectuada mediante unaelectroforesis en gel) con una hibridacin con una son-da de cido nucleico marcada de algn modo (ya sea conradiactividad o con un compuesto qumico) que, tras va-rias reacciones, d lugar a la aparicin de una seal decolor o uorescencia. Dicha hibridacin se realiza tras latransferencia del ADN separado mediante la electrofo-resis a una membrana de ltro. Una tcnica semejante,pero en la cual no se produce la mencionada separacinelectrofortica se denomina dot blot.El mtodo recibe su nombre en honor a su inventor, elbilogo ingls Edwin Southern.[133] Por analoga al m-todo Southern, se han desarrollado tcnicas semejan-tes que permiten la deteccin de secuencias dadas deARN (mtodo Northern, que emplea sondas de ARN oADN marcadas)[134] o de protenas especcas (tcnicaWestern, basada en el uso de anticuerpos).[135]

8.5 Chips de ADN

Microarray con 37.500 oligonucletidos especcos. Arriba a laizquierda se puede apreciar una regin ampliada del chip.

Los chips de ADN son colecciones de oligonucletidos deADN complementario dispuestos en hileras jadas sobreun soporte, frecuentemente de cristal. Se utilizan para el

20 9 APLICACIONES

estudio de mutaciones de genes conocidos o para moni-torizar la expresin gnica de una preparacin de ARN.

9 Aplicaciones

9.1 Ingeniera genticaLa investigacin sobre el ADN tiene un impacto signi-cativo, especialmente en el mbito de la medicina, perotambin en agricultura y ganadera (donde los objetivosson los mismos que con las tcnicas tradicionales que elhombre lleva utilizando desde hace milenios - la domes-ticacin, la seleccin y los cruces dirigidos - para obtenervariedades de animales y plantas ms productivos). Lamoderna biologa y bioqumica hacen uso intensivo de latecnologa del ADN recombinante, introduciendo genesde inters en organismos, con el objetivo de expresar unaprotena recombinante concreta, que puede ser:

aislada para su uso posterior: por ejemplo, se pue-den transformar microorganismos para convertir-los en autnticas fbricas que producen grandescantidades de sustancias tiles, como insulina ovacunas, que posteriormente se aslan y se utilizanteraputicamente.[136][137][138]

necesaria para reemplazar la expresin de un gen en-dgeno daado que ha dado lugar a una patologa, loque permitira el restablecimiento de la actividad dela protena perdida y eventualmente la recuperacindel estado siolgico normal, no patolgico. Este esel objetivo de la terapia gnica, uno de los camposen los que se est trabajando activamente en medi-cina, analizando ventajas e inconvenientes de dife-rentes sistemas de administracin del gen (virales yno virales) y los mecanismos de seleccin del pun-to de integracin de los elementos genticos (distin-tos para los virus y los transposones) en el genomadiana.[139] En este caso, antes de plantearse la po-sibilidad de realizar una terapia gnica en una de-terminada patologa, es fundamental comprender elimpacto del gen de inters en el desarrollo de dichapatologa, para lo cual es necesario el desarrollo deun modelo animal, eliminando o modicando dichogen en un animal de laboratorio, mediante la tcnicaknockout.[140] Slo en el caso de que los resulta-dos en el modelo animal sean satisfactorios se pro-cedera a analizar la posibilidad de restablecer el gendaado mediante terapia gnica.

utilizada para enriquecer un alimento: por ejemplo,la composicin de la leche (una importante fuente deprotenas para el consumo humano y animal) puedemodicarse mediante transgnesis, aadiendo genesexgenos y desactivando genes endgenos para me-jorar su valor nutricional, reducir infecciones en las

glndulas mamarias, proporcionar a los consumido-res protenas antipatgenas y preparar protenas re-combinantes para su uso farmacutico.[141][142]

til para mejorar la resistencia del organismo trans-formado: por ejemplo en plantas se pueden in-troducir genes que coneren resistencia a patge-nos (virus, insectos, hongos), as como a agentesestresantes abiticos (salinidad, sequedad, metalespesados).[143][144][145]

9.2 Medicina forenseLos mdicos forenses pueden utilizar el ADN presenteen la sangre, el semen, la piel, la saliva o el pelo en laescena de un crimen para identicar al responsable. Estatcnica se denomina huella gentica, o tambin perl deADN. Al realizar la huella gentica, se compara la longi-tud de secciones altamente variables de ADN repetitivo,como los microsatlites, entre personas diferentes. Estemtodo es frecuentemente muy able para identicar a uncriminal.[146] Sin embargo, la identicacin puede com-plicarse si la escena est contaminada con ADN de per-sonas diferentes.[147] La tcnica de la huella gentica fuedesarrollada en 1984 por el genetista britnico Sir AlecJereys,[148] y fue utilizada por primera vez en medicinaforense para condenar a Colin Pitchfork por los asesina-tos de Narborough en 1983 y de Enderby en 1986.[149]Se puede requerir a las personas acusadas de ciertos ti-pos de crmenes que proporcionen una muestra de ADNpara introducirlos en una base de datos. Esto ha facilita-do la labor de los investigadores en la resolucin de casosantiguos, donde slo se obtuvo una muestra de ADN de laescena del crimen, en algunos casos permitiendo exonerara un convicto. La huella gentica tambin puede utilizar-se para identicar vctimas de accidentes en masa,[150] opara realizar pruebas de consanguinidad.[151]

9.3 BioinformticaLa bioinformtica implica la manipulacin, bsqueda yextraccin de informacin de los datos de la secuenciadel ADN. El desarrollo de las tcnicas para almacenary buscar secuencias de ADN ha generado avances en eldesarrollo de software de los ordenadores, para muchasaplicaciones, especialmente algoritmos de bsqueda defrases, aprendizaje automtico y teoras de bases de da-tos.[152] La bsqueda de frases o algoritmos de coinci-dencias, que buscan la ocurrencia de una secuencia de le-tras dentro de una secuencia de letras mayor, se desarro-ll para buscar secuencias especcas de nucletidos.[153]En otras aplicaciones como editores de textos, inclusoalgoritmos simples pueden funcionar, pero las secuen-cias de ADN pueden generar que estos algoritmos pre-senten un comportamiento de casi-el-peor-caso, debi-do al bajo nmero de caracteres. El problema relacio-nado del alineamiento de secuencias persigue identi-

21

car secuencias homlogas y localizar mutaciones espe-ccas que las diferencian. Estas tcnicas, fundamental-mente el alineamiento mltiple de secuencias, se utilizanal estudiar las relaciones logenticas y la funcin de lasprotenas.[154] Las colecciones de datos que representansecuencias de ADN del tamao de un genoma, tales comolas producidas por el Proyecto Genoma Humano, son di-fciles de usar sin anotaciones, que marcan la localizacinde los genes y los elementos reguladores en cada cromo-soma. Las regiones de ADN que tienen patrones asocia-dos con genes que codican protenas o ARN pue-den identicarse por algoritmos de localizacin de genes,lo que permite a los investigadores predecir la presenciade productos gnicos especcos en un organismo inclusoantes de que haya sido aislado experimentalmente.[155]

9.4 Nanotecnologa de ADN

La estructura de ADN de la izquierda (mostrada de forma es-quemtica) se auto-ensambla en la estructura visualizada pormicroscopa de fuerza atmica a la derecha. La nanotecnologade ADN es el campo que busca disear estructuras a nanoesca-la utilizando las propiedades de reconocimiento molecular de lasmolculas de ADN. Imagen de Strong, 2004. Plantilla:Doi-inline

La nanotecnologa de ADN utiliza las propiedades ni-cas de reconocimiento molecular del ADN y otros ci-dos nucleicos para crear complejos ramicados auto-ensamblados con propiedades tiles. En este caso, elADN se utiliza como un material estructural, ms quecomo un portador de informacin biolgica.[156] Esto haconducido a la creacin de lminas peridicas de dos di-mensiones (ambas basadas en azulejos, as como usandoel mtodo de ADN origami[157]), adems de estructurasen tres dimensiones con forma de poliedros.

9.5 Historia, antropologa y paleontologaA lo largo del tiempo, el ADN almacena mutaciones quese heredan y, por tanto, contiene informacin histrica,de manera que comparando secuencias de ADN, los ge-netistas pueden inferir la historia evolutiva de los orga-nismos, su logenia.[158] La investigacin logentica esuna herramienta fundamental en biologa evolutiva. Sise comparan las secuencias de ADN dentro de una es-pecie, los genetistas de poblaciones pueden conocer la

historia de poblaciones particulares. Esto se puede uti-lizar en una amplia variedad de estudios, desde ecologahasta antropologa, como ilustra el anlisis de ADN lle-vado a cabo para identicar las Diez Tribus Perdidas deIsrael.[159][160] Por otro lado, el ADN tambin se utilizapara estudiar relaciones familiares recientes.Igualmente en paleontologa (en la paleogentica) elADN en algunos casos tambin se puede utilizar para es-tudiar a especies extintas (ADN fsil).

10 Vase tambin ARN Cromatina Cromosoma Genoma Genoma humano Glosario de trminos relacionados con el genoma Genes MEIS Cerberus Desoxirribonucletido Genes HOX y genes PARAHOX Gentica Medicina genmica Prueba de ADN Elementos funcionales del ADN

11 Referencias

11.1 Notas[1] Sergio Ferrer. El verdadero sentido de la vida Journal of

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