DETERMINACION DE VITAMINAS

A diferencia de los minerales, las vitaminas son micronutrientes orgánicos, pero tienen en común el ser constituyentes esenciales de la dieta por ser requeridos para el crecimiento y la reproducción.

Las vitaminas se clasifican en 2 grandes grupos:

Vitaminas liposolubles:

- A (Axeroftol)

- D (Antirraquítica) : D₂(ergocalciferol), D₃ (colecalciferol)

- E (Tocoferol) (Vitaminas antiesterilidad)

- K (Factor de coagulación; Factor antihemorrágico).

Vitaminas hidrosolubles :

- C ( Acido ascórbico; vitamina antiescorbútica)

- B₁ (Tiamina en EEUU; Aneurina en Europa)

- B₂ (Riboflavina, lactoflavina)

- Acido pantoténico (Factor antidermático del pollo; factor filtrable).

- Acido nicotínico (Niacina en EEUU; Nicotinamida en Gran Bretaña; vitamina pp- preventiva de la pelagra).

- Acido p-aminobenzoico (PABA; vitamina anticanosa).

- Acido fólico (Vitamina Bc; vitamina M; acido Pteroilglutámico).

- B₆ (Piridoxina, Piridoxal y Piridoxamina).

- B₁₂ (Cianocobalamina; vitamina antianemia perniciosa).

- Inositol y Bios I.

- Biotina (Vitamina H; Bios II).

La determinación de las vitaminas en los alimentos es más difícil que la mayoría de los otros constituyentes, debido a que se encuentran en cantidades extremadamente pequeñas y a su compleja naturaleza y diversidad.

Nielsen (1998) clasifica y describe los siguientes métodos para la determinación de las vitaminas en los alimentos:

1. Métodos biológicos. Involucran ensayos sobre humanos y animales.

2. Métodos microbiológicos. Emplean microorganismos, bacterias y levaduras.

3. Métodos fisicoquímicos. Incluye métodos fluorométricos, espectrofotométricos, cromatográficos, enzimáticos, inmunológicos y radiométricos.

En términos de facilidad de ejecución, los métodos biológicos no son muy utilizados, aun cuando ellos son los más exactos y precisos.

Los criterios para la selección de un método particular dependen de factores como: exactitud, precisión, tiempo, economía o costo y la cantidad de muestra para el análisis.

Algunos de los métodos oficiales reportados por la AOAC Internacional son de aplicación limitada para ciertas matrices alimenticias, tales como concentrados vitamínicos, leche o cereales. Por lo tanto, si se les quiere aplicar a otras matrices, el procedimiento deberá ser modificado.

Hay que considerar que algunas vitaminas son sensibles a factores como la luz, el oxígeno, el pH y el calor; por lo tanto, se deberá tomar las precauciones del caso para no obtener resultados erróneos debido al deterioro de las vitaminas durante el procedimiento analítico.

EXTRACCIÓN DE LAS VITAMINAS PARA EL ANÁLISIS

Con excepción de algunos estudios biológicos de alimentación, la determinación de las vitaminas, en la mayoría de los casos, implica la extracción de ellas de la matriz alimenticia antes del análisis. La extracción normalmente se hace mediante tratamientos diversos: calor, álcali, ácido, solventes, enzimas.

Los procedimientos de extracción, en general, son específicos para cada vitamina con la finalidad de estabilizarla. En algunos casos, algunos procedimientos de extracción son aplicables a más de una vitamina; por ejemplo, la tiamina y la riboflavina, y algunos compuestos solubles en grasa.

Entre los procedimientos típicos más importantes se tiene:

Äcido ascórbico. Extracción en frio con ácido metafosfórico.

Vitaminas B1 y B2. Ebullición o autoclavado en ácido más tratamiento enzimático.

Niacina. Autoclavado en ácido (productos no cereales) o álcali (cereales).

Vitaminas A, D, E. Extracción con solventes orgánicos, saponificación, y reextracción con solventes orgánicos. Para vitaminas inestables como éstas, normalmente se agrega antioxidantres para prevenir e inhibir la oxidación.

El análisis de vitaminas liposolubles puede requerir la saponificación, generalmente durante toda la noche a temperatura ambiente, o por reflujo a 70 °C.

I. MÉTODOS BIOLÓGICOS

Los métodos biológicos generalmente son usados solamente para el análisis de las vitaminas B12 y D

1.1 Determinación de la vitamina D (Método AOAC 936.14)

Este método está basado en la calcificación de los huesos.

Desde que este método implica o involucra estudios de deficiencia así como el sacrificio de los organismos ensayados, está limitado a los animales más que a los humanos.

a) Preparación de la muestra.

La AOAC Internacional propone instrucciones específicas para la preparación de varias matrices. En algunos casos se usa la saponificación.

b) Período de reducción o agotamiento

Las ratas son apropiadas para la reducción a la edad de 30 días o menos con un peso corporal igual o mayor a 40 g, pero menor o igual a 60 g. La dieta raquitogénica es mantenida por un período de 18 a 25 días.

c) Período de ensayo

Este período comprende el intervalo de vida de la rata entre el último día del período de reducción y el octavo u onceavo día posterior. Los protocolos de

alimentación son especificados. Durante el ensayo, las ratas “agotadas” son alimentadas con cantidades conocidas y desconocidas de vitamina provenientes del estándar y la muestra, respectivamente.

d) Potencial de la muestra

La vitamina D en la muestra es determinada por el test de línea desde la mancha en la parte próxima al final de la tibia o el distal al final del radio o del cúbito.

II. METODOS MICROBIOLOGICOS

Estos métodos son limitados al análisis de vitaminas hidrosolubles. Son muy sensibles y específicos para cada vitamina. Consumen tiempo y hay que seguir estrictamente el protocolo analítico a fin de obtener resultados exactos.

Muchas de las vitaminas del complejo B, tales como la tiamina y riboflavina, pueden ser estimadas por la medida del crecimiento microbiano. Existen microorganismos que tienen requerimientos específicos de determinadas vitaminas para su crecimiento.

Estos métodos implican la preparación de una curva de calibración a partir de un set de estándares de concentraciones conocidas de vitaminas. La estimación del contenido de vitamina del alimento se hace por comparación contra los estándares. El crecimiento de los microorganismos puede ser medido con diversas técnicas, como la producción de dióxido de carbono o medidas de turbidez.

Principio

El crecimiento de microorganismos es proporcional a sus requerimientos por una vitamina específica. Así, el crecimiento de un microorganismo en un extracto de la muestra conteniendo la vitamina en estudio es comparado con el crecimiento del mismo microorganismo en presencia de cantidades conocidas de la vitamina. Como organismos de ensayo se utilizan bacterias, levaduras o protozoarios. El crecimiento puede ser medido en términos de turbidez, producción de ácido, gravimetría o por respiración.

La turbidimetría es más usada en bacterias y levaduras. En este caso se requiere extractos de muestras y estándares claros para ser comparados contra los sistemas turbios.

2.1 Determinación de la niacina (Método AOAC 944.13)

Se usa el Lactobacillus plantarum como microorganismo del test o prueba. Se prepara un cultivo stock por inoculación del cultivo liofilizado sobre agar bacto-lactobacilli mantenido a 37 °C por 24 horas y luego se inoculan la muestra y el estándar.

Normalmente el crecimiento se puede medir por turbidimetría, pero, si se usa lactobacillus, también se pueden hacer medidas de acidez. Las medidas de acidez pueden ser necesarias si no es posible obtener un extracto claro de la muestra antes de la inoculación (el cual es un prerrequisito para la turbidimetría). La acidimetría requiere de un período de incubación de 72 horas.

Procedimiento:

1. Preparación de la muestra

Pesar una cantidad de muestra que contenga 0.1 mg de niacina. Agregar ácido sulfúrico 0.1 N, macerara en autoclave a 121 °C por una hora y enfriar. Ajustar el pH a 6.8, diluir a un volumen (0.1 g niacina/ml), mezclar y filtrar.

2. Preparación de los tubos de ensayo

Colocar en tubos de ensayo por duplicado, por lo menos, 0.0, 0.5, 1.0, 2.0, 3.0, 4.0, y 5.0 ml del filtrado de la muestra y llevar a un volumen de 5 ml con agua destilada, luego agregar a cada tubo 5 ml de caldo Medio Basal DIFCO para ensayo de niacina, autoclavar por 10 minutos a 121 °CF y enfriar.

3. Preparación del estándar

Preparar tubos de ensayo por duplicado, por lo menos, usando 0.0, 0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 4.0, y 5.0 ml de la solución estándar (0.1 ul/ml de niacina), llevar a un volumen de 5 ml con agua, luego agregar 5 ml del caldo de ensayo y tratar de forma idéntica a los tubos de la muestra.

4. Inoculación e incubación

Preparar el inóculo utilizando Lactobacillus plantarum, TCC 8014 en caldo AOAC Bacto Lactobacilli (DIFCO). Agregar una gota de inóculo a cada tubo, cubrir los tubos e incubar a 37 °C por 16 a 18 horas, hasta que se alcanza la máxima turbidez en los tubos conteniendo la concentración más alta de niacina.

5. Determinación

Medir el porcentaje de transmitancia o la absorbancia a cualquier longitud de onda entre 540 y 660 nm.

III. MÉTODOS FISICOQUÍMICOS

1. FLUORIMETRIA

Algunas vitaminas, como la riboflavina (B₂), son naturalmente fluorescentes. Esta característica se aprovecha para determinar su concentración midiendo el grado de fluorescencia del extracto del alimento y comparándolo contra un set de estándares.

En otros casos, la vitamina puede ser derivada a un compuesto con propiedades fluorescentes, siguiéndose luego el mismo proceso; tal es el caso de la tiamina (B₁), la cual puede ser convertida a un tiocromo fluorescente.

2. COLORIMETRIA

Existen vitaminas que pueden ser determinadas colorimétricamente haciendo reaccionar el extracto del alimento con un reactivo cromógeno. Tal es el caso de la vitamina A (retinol), la cual puede ser determinada en el extracto alimenticio haciéndola reaccionar con el tricloruro de antimonio para dar un compuesto coloreado, cuya absorbancia se puede medir y comparar contra estándares.

3. TITULACION

La vitamina C puede ser titulada con 2,6 diclorofenolindofenol (2,6 DFIF), el cual es reducido por la vitamina, pasando de color azul a incoloro.

4. HPLC

Muchas vitaminas pueden ser en la actualidad estimadas mediante cromatografía HPLC. Esta es una técnica de gran sensibilidad, precisión y exactitud, mayores a los métodos anteriores. Su dificultad radica en el alto costo de los equipos, se necesita de una gran inversión inicial, y el uso de estándares que también son de costo elevado y que muchas veces no se encuentran disponibles oportunamente en el mercado nacional. Sin embargo esta técnica se usa mucho, sobre todo cuando se tiene una gran cantidad de análisis por hacer, ya que esto abarata los costos por determinación.

3.1 Vitamina A

Para la determinación exacta de la vitamina A se consideran aceptables sólo los métodos basados en cromatografía HPLC.

La vitamina A es sensible a factores como la luz UV, el aire (oxígeno), altas temperaturas y la humedad. Por lo tanto, es necesario tomar las medidads del caso durante el análisis para evitar cambios adversos en la vitamina debidos a dichos factores; se suele usar nitrógeno o vacío así como evitar excesivamente la exposición a altas temperaturas. La adición de un antioxidante también es altamente recomendable.

Principio del método

La muestra es saponificada, la vitamina A (retinol) extraida con un solvente orgánico y concentrada. Todos los niveles de trans-retinol y 13-cis-retinol son determinados por HPLC con columna de sílice.

Todo el trabajo se debe desarrollar bajo luz artificial; se debe tener cuidado para evitar la oxidación del retinol durante el procedimiento. La evaporación del solvente debe completarse bjo nitrógeno y se debe agregar hexadecanopara prevenir la destrucción de la vitamina durante la evaporación del solvente.

BIBLIOGRAFÍA

Nielsen, S. 1998. Food Analysis. Segunda edición. Editorial Aspen Publishers. U.S.A.