Mecanismos de Acción de carvacrol sobre la Alimentación-Borne Patógeno Bacillus cereus

Carvacrol, un compuesto natural presente principalmente en la fracción de aceite esencial de orégano y tomillo, Se estudió su efecto en los parámetros de bioenergéticos células vegetativas de los patógenos de alimentos Bacillus cereus. Incubación durante 30 minutos en presencia de 1 a 3 mM carvacrol reducido el número de células viables exponencialmente. Carvacrol (2 mM) un agotamiento significativo de la piscina intracelulares de ATP a valores cercanos a 0 en 7 min. No un aumento proporcional de la ATP extracelular se observó piscina. El agotamiento de la piscina interior de la ATP se asoció con un cambio de potencial de membrana ( ). En concentraciones de 0,01 mM carvacrol y el anterior, una reducción significativa de Se observó, lo que lleva a la disipación de la plena en concentraciones de 0,15 mM y superior. Por último, un aumento de la permeabilidad de la membrana citoplásmica de los protones y los iones de potasio se observó (en el 0,25 y 1 mm carvacrol, respectivamente). De este estudio, se podría concluir carvacrol que interactúa con las membranas de B. cereus por cambiar su permeabilidad para cationes como H y K. La disipación de los gradientes de iones provoca el deterioro de procesos esenciales en la célula y, por último, a la celda muerte.

Bacillus cereus es una formadora de esporas alimentos a menudo agentes patógenos asociados con los productos alimenticios, como carne, verduras, sopa, arroz y la leche y otros productos lácteos. Entre el 1 y el 20% de el número total de brotes de infección alimentaria en el mundo es causada por B. cereus (19). Crecimiento vegetativo de las células normalmente ocurre dentro de la gama de temperaturas de 10 a 50 ° C, con una óptimo entre 28 y 35 ° C. Sin embargo, psicrótrofas variables hormigas de B. cereus, capaz de crecer a temperaturas por debajo de 5 ° C, se han identificado (6, 22). Aunque las células vegetativas de B. cereus puede ser fácilmente inactivado por el calor, las esporas se con blemente más resistentes y pueden causar el deterioro de los alimentos después de posterior germinación (6). Leve preservación tecnologías son cada vez más impor - importante en la moderna industria alimentaria. Como consecuencia de ello, las esporas de forma - ción microorganismos pueden proliferar y, por tanto, convertirse en un grave riesgo para la seguridad alimentaria. Procesos de leve a menudo se combinan para obtener productos seguros, con una mejor calidad organoléptica. Un forma novedosa para reducir la proliferación de microorganismos es la uso de aceites esenciales. Los efectos antibacterianos y antifúngicos de estos componentes en diferentes microorganismos han sido de - descrito en varios estudios (5, 14, 16-18, 26-29). Entre los diverso grupo de componentes químicos en los aceites esenciales, carvacrol ejerce una acción antimicrobiana. Es el carvacrol componente importante de la fracción de aceite esencial de orégano (60 a Carvacrol 74%) y el tomillo (45% carvacrol) (1, 20). En la práctica, carvacrol, se añade a diferentes productos, por ejemplo, productos de panadería (15,75 ppm), bebidas sin alcohol (28,54 ppm/0.18 mM), goma de mascar (8,42 ppm), etc (8). Sin embargo, no se sabe mucho sobre los mecanismos de acción de este compuesto. Una mejor conocimiento del modo de acción es importante en relación con pa - aplicación de los sistemas alimentarios. Recientemente, Ultee et al. (29) mostró el efecto de los antibióticos sobre el carvacrol B. cereus. Hidrófobas compuestos como el carvacrol es probable que tengan una influencia en membranas biológicas. La membrana citoplásmica de las bacterias tiene dos funciones principales: (i) la función de barrera y la energía transducción, que permiten a la membrana para formar gradientes iónicos que pueden ser utilizados para conducir los distintos procesos, y (ii) la formación de una matriz de membrana embebido en proteínas (como la F-membrana integrado 0 complejo de la ATP-sintasa) (12, 24). En el presente estudio, los cambios en la energía transducing pro - sos de la B. cereus causados por el carvacrol fueron estudiados en más detalle. El efecto de carvacrol intracelulares de ATP en la piscina, el potencial de membrana, el gradiente de pH en todo el cytoplas - micrófono de membrana, y el gradiente de potasio fue evaluada.

MATERIAL Y MÉTODOS Cepa bacteriana y las condiciones de crecimiento. B. cereus IFR-NL94-25 (obtenida del Instituto de Investigación en Alimentos, Norwich, Reino Unido) fue utilizado a lo largo de este estudio. Las células fueron cultivadas en infusión cerebro corazón (BHI) a medio (Oxoid) suplementado con 0,5% (peso / vol) de glucosa (pH inicial de 6,7) a 30 ° C. Celular se mantuvieron en las culturas 80 ° C en un 15% de glicerol como crioprotector. Productos químicos. Purificada carvacrol se obtuvo de Fluka Chemie AG (Buchs, Suiza). Una solución stock (1 M) se hizo en el 95% de etanol. El último de etanol concentración en los experimentos siempre se ha mantenido por debajo del 2% (vol / vol). Vigilancia de la viabilidad. Vegetativa de las células B. cereus fueron cosechadas por centrifugation, lavado dos veces en un 50 mM tampón HEPES potasio (pH 7,0) que contiene 1 mM MgSO 4 Y diluida a una densidad óptica a 660 nm (OD 660 ) De 0,1 (luz camino de 1 cm). 20 ml de suspensión se mantendrá a 20 ° C. Carvacrol fue añadido a una concentración final de entre 1 y 2 mm. Se tomaron muestras cada 5 minutos durante la exposición (un máximo de tiempo de exposición, 40 min) y diluida inmediatamente (10 2 - A 10 5 veces) en peptona-solución salina fisiológica (1 g por litro de peptona y 8,5 g de NaCl por litro) para saciar la influencia de carvacrol. Diluciones seriadas se chapada en placas de agar BHI y se incuban durante 24 horas a 30 ° C.

Determinación de los intercambios intracomunitarios y las concentraciones extracelulares de ATP. Células de un cultura de la noche a la mañana se lavaron tres veces en un 25 mM fosfato de potasio tampón (pH 7), y se preparó una suspensión con un diámetro exterior 660 de 1 (camino de la luz 1 cm). El experimento se inició mediante la adición de glucosa a una concentración final de 0,5% (peso / volumen). 200 l de las muestras fueron tomadas cada 2 minutos, sumado a Eppendorf tubos que contienen 200 l de una mezcla de aceite de silicona (AR200/AR20 relación 2:1) (Wacker Chemicals, Munich, Alemania) en la parte superior de 100 l de tricloroacéticoácido tampón de EDTA (10% ácido tricloroacético y 2 mM EDTA), y centrifugado directamente (5 min, 12.000 g). El extracelular (capa superior) y el intracelular (capa inferior) se midieron las concentraciones de ATP por medio de un ensayo de ATP 1243-107 Kit (Bio-Orbit, Turku, Finlandia). Luminiscencia se registró con un modelo de 1250 luminometer (Bio-órbita). Influencia de carvacrol sobre el potencial de membrana ( ). Las células de una noche a la mañana la cultura se lavaron dos veces en un 50 mM tampón HEPES potasio (pH 7,0), conteniendo 1 mM MgSO 4 La celda de pellets se diluye hasta una OD 660 (camino de luz de 1 cm), de 10 se alcanzó. Exactamente 30 l de la suspensión celular fue diluida en 2 ml de buffer, que contiene 5 M 3,3-dipropylthiacarbocyanine [Disco 3 (5)] (Molec - Sondas particular, Leiden, Países Bajos). El potencial de membrana ( ) Se monitored con un Perkin-Elmer LS 50B spectrofluorometer a 20 ° C (onda de excitación longitud, 643 nm, longitud de onda de emisión, 666 nm). Tras el equilibrio, 15 mM glucosa se ha añadido a energizar las células. Después de una constante lectura había sido alcanzado, 1 nM nigericin se ha añadido a disminuir el pH a través de la gradiente membrana citoplásmica. Después de una constante lectura de fluorescencia se llegó, diferentes concentraciones de carvacrol (0,01 a 2 mm) se han añadido. Valinomycin (1 nM) se añadió como control. Mediciones de pH intracelular. La determinación del pH intracelular se basa en el método descrito por Breeuwer et al. (3). Células de una noche a la mañana cultura fueron cosechadas, lavadas tres veces en tampón HEPES 50 mM (pH 7,0), y diluido a una OD 660 (camino de luz, 1 cm) de 1. Posteriormente, las células se incuba - debatido en presencia de 1,5 M carboxyfluorescein diacetato succinimidyl éster durante 10 minutos a 30 ° C. Carboxyfluorescein diacetato succinimidyl éster se hidroliza a carboxyfluorescein éster succinimidyl en la celda y posteriormente conjugados De aminas alifáticas. Después de haber sido lavados con 50 mM de tampón fosfato de potasio (pH 5,81), las células fueron incubadas con 10 mM de glucosa durante 30 min a 30 ° C a eliminar nonconjugated carboxyfluorescein succinimidyl éster. Además, las células se lavaron dos veces, resuspendido en 50 mM fosfato de potasio, y mantener en hielo hasta nuevo uso. El análisis se inició el 30 de l de la suspensión celular está añadido a una cubeta de cuarzo que contiene 3 ml de tampón fosfato 50 mM (pH 5,81), colocados en una cubeta de un titular spectrofluorometer (Perkin-Elmer LS 50B), y agita constantemente. Intensidades de fluorescencia se mide a la excitación longitudes de onda de 490 nm (pH sensibles) y 440 nm (pH insensible) rápidamente por alterar el monocromador entre ambas longitudes de onda. La emisión fue de - determinada a 525 nm, y la excitación y de emisión de hendidura anchos se fijaron los días 5 y 10 nm, respectivamente. El pH intracelular se calculó a partir de la relación de la de emisión en 490 - y 440-nm de excitación. Una curva de calibración se determinará de búferes con valores de pH de 3 a 10. Tampones contenía 50 mM glicina, 50 mM ácido cítrico, 50 mM Na 2 HPO 4 2H 2 O, 50 mM y KCl. valores de pH se ajustaron con NaOH o HCl. El pH en y pH fuera (pH intracelular y extracelular,respectivamente) se equilibran Además de 1 M valinomycin y 1 M nigericin. Determinación de los intercambios intra y extracelular cantidades de potasio. Exponenmente cada vez más células (cultura de la noche a la mañana) fueron cosechadas y lavado dos veces en un 50 mM tampón HEPES sodio (pH 7,0). Las células se concentraron hasta un diámetro exterior 660 de 1 (camino de luz de 1 cm) se alcanzó. La extracción de potasio de las células se llevado a cabo según lo descrito para la determinación de ATP. La concentración de potasio ción se midió con un Fotómetro de llama (Jenway, Felsted, Inglaterra), después de dilución de las muestras en agua destilada. Valores se compararon con un estándar curva de calibración de KCl. Determinación de proteínas. La determinación de la cantidad de proteína en la de células B. cereus se llevó a cabo de acuerdo con el trabajo de Lowry et al. (21) con albúmina sérica bovina como estándar.

RESULTADOS Viabilidad de B. cereus en presencia de carvacrol. carvacrol inhibe el crecimiento de B. cereus eficaz. Incubación y exposición a temperaturas afectan significativamente la tasa de mortalidad de B. cereus (29). La viabilidad de B. cereus células cultivadas a 30 ° C se determinó en las condiciones (pH 7, 20 ° C), que fueron utiliza en este estudio. Se tomaron muestras cada 5 minutos vanisado y en placas de BHI para supervisar la viabilidad del producto (Fig. 1). Un inicio de sesión se encontró relación lineal entre el tiempo de exposición seguro y viable contar con la de B. cereus. 1 mM en el carvacrol, casi no viable la reducción de la cuenta se observó después del 30 de min, mientras que 1,25 y 1,5 mM carvacrol como resultado una clara re - de la producción de bacterias. Por lo tanto, puede concluirse que es el carvacrol bactericida hacia B. cereus células a 20 ° C cuando están presentes en concentraciones superiores a 1 mM. Efecto de la ATP en el carvacrol piscinas. La actividad bactericida puede estar en la alteración de la integridad de la membrana, ya que carvacrol es un compuesto lipofílico preferentemente particionado en este compartimento

celular. Membrana citoplásmica interrupción es se espera que tengan un gran impacto en la membrana asociada FIG. 1. Viable contar de B. cereus células (log UFC / ml) en el tiempo entre diferentes vals después de la adición de carvacrol. Las células fueron cultivadas en BHI (30 ° C), lavado, y mantenerse en tampón HEPES a pH 7,0 (20 ° C). Carvacrol concentraciones probados fueron 1 ()), 1,25 (s) y 1,5 (H) mm. Los datos representan valores medios de tres mediciones. La línea discontinua representa el límite de detección. FIG. 2. Intracelular (plazas) y extracelular (círculos) de la glucosa ATP piscinas energía vegetativa de las células B. cereus en ausencia (símbolos abiertos) o la presencia (cerrado los símbolos), de 1 (uno) o 2 (b) el carvacrol mM. Se añadió el carvacrol at 4 min (indicado por la flecha). Representan los valores medios de las mediciones por duplicado. El errores estándar de los medios indicados en las barras de error. energía transducing sistema. Por lo tanto, el efecto de carvacrol en el intra y extracelular ATP piscinas se estudió. Además de 1 mM carvacrol intracelular disminuyó la cantidad de ATP a valores cercanos a 0 en 14 min (Fig. 2a). Ningún aumento extracelular de la ATP se observó piscina. Resultados similares se obtuvieron con la adición de 2 mM carvacrol (Fig. 2b). La piscina intracelulares de ATP se redujo a 0 en 10 min. Un pequeño aumento de la ATP extracelular piscina se observó, aunque esto no era proporcional a la disminución de la en - ATP tracellular piscina. Influencia del potencial de membrana en el carvacrol ( ). Agotamiento ción de la piscina interior de la ATP por el carvacrol puede estar asociada con una reducción de la síntesis de ATP. Por lo tanto, se investigó la efecto de carvacrol sobre el potencial de membrana, la conducción vigor para la síntesis de ATP. Cambios en el potencial de membrana pueden ser visualizados por los cambios en la fluorescencia de una potentio métricas tinte. B. cereus células fueron incubadas en presencia de DISC 3 (5). Después de la adición de la glucosa y la nigericin, carvacrol se ha añadido (Fig. 3). Carvacrol reducido de la membrana si está presente en el potencial de 0,01 mm o superior. El aumento de concenciones provocó una mayor tasa de reducción (0,01 y 0,25 U / s en 0,01 y 0,5 mm, respectivamente), y un menor de estado miemBrane potencial alcanzado. En concentraciones superiores al 0,15 mm, una completa desaparición de la membrana potencial Se observó. Efecto del pH intracelular en el carvacrol. Agotamiento de los intercambios intracomunitarios de celular y la disipación de la ATP por el carvacrol sugieren efectos sobre los gradientes de iones a través de la membrana celular. Por lo tanto, la pH en se investigó en más detalle. Para descartar otras esencial de gradientes de protones además de rampas y pendientes, todas las mediciones se llevaron a cabo en presencia de valinomycin. El pH en de B. cereus, cultivados en BHI a pH 6,7 y lavada con HEPES tampón (pH 5,81), fue de aproximadamente 7.1. Además de la glucosa y la valinomycin noafectó el pH en Como era de esperar, nigericin disipa el pH a través de la gradiente membrana (datos no mostrados). La exposición de las células de carvacrol (Fig. 4) disminución del pH en En presencia de 0,25 mM carvacrol, el gradiente de pH a través de la membrana de la célula se redujo a 1 U. Una nueva reducción del pH a 0,5 U se observó con 0,5 mM carvacrol. Ningún efecto sobre el pH se observó en concentrciones por debajo de 0,25 mm. Completa disipación del pH gra ingrediente se alcanzó en la presencia de 1 mM carvacrol o superior. Influencia del flujo de salida de potasio en el carvacrol. Carvacrol afecta las concentraciones intracelulares de ATP y la transmembrana potencial eléctrico y se disipa el pH. Posteriormente, el efecto de carvacrol sobre la permeabilidad de la membrana al sala de iones de potasio se ha investigado. Además de la glucosa (a energía de las células) en t 0 causado alrededor de un 100% aumento de las piscinas intracelulares de potasio (K en ) (Fig. 5). Extracelular piscinas (K fuera ) Disminuyó de 0,98 a 0,67 mol / litro. Adición de 1 mM carvacrol después de 5 minutos de incubación rápida disminución de la cantidad de K intracelular. Después de 9 min de incubación, la cantidad intracelular de K se redujo del 12 mol / mg de proteína de la célula (en t 5 min) a 0,99 mol / mg proteína de la célula y el K extracelular se elevó de 0,67 mol / litro después de 5 minutos a 1,14 mol / litro a los 9 minutos de incubación. La cantidad total de potasio (K en K fuera ) Se mantuvieron con permanente durante todo el experimento. DISCUSIÓN Este estudio describe el efecto de carvacrol en células de la alimentos patógeno B. cereus. Carvacrol actúa como bactericida compuesto, con su actividad depende de la concentración ción y el tiempo de exposición. Sikkema et al. (23) encontró que la acumulación de compuestos lipófilos en miembros de la célula FIG. 3. Efecto de carvacrol sobre el potencial de membrana de B. cereus en presencia de glucosa (glu), nigericin (NIG) y diferentes concentraciones de carvacrol. Exponencialmente creciente células se lavaron y se mantendrá en tampón HEPES a pH 7,0 (20 ° C). Se añadió el carvacrol at 250 s. El potencial de membrana se vigila utilizando la sonda fluorescente DISC 3 (5). au, unidades arbitrarias. Brane (probado en liposomas preparados a partir de Escherichia coli labios IDS) es proporcional a la concentración en la fase acuosa y la membrana de la fase acuosa, coeficiente de partición. Eno moto et al. (7) observó una disminución de en liposomas en la exposición a algunos compuestos de fragancia. Estos hidrófobas compuestos se disuelven en la membrana, y su actividad se estrechamente relacionada con la fluidez de la membrana. Sobre la base de estos estudios, se espera que más se disuelve en el carvacrol membrana en concentraciones más altas. Nuestro estudio ha demostrado que la exposición a carvacrol conduce a una disminución de la ATP en concentración. No aumento proporcional de la ATP fuera Se observó. Por lo tanto, se concluye que carvacrol no aumentar la permeabilidad de la membrana de la ATP. En consecuencia, el agotamiento

de la piscina interior de la ATP el resultado de un tipo reducido de síntesis de ATP o el aumento de la ATP hidrólisis. El agotamiento de la reserva de ATP a la adición de un componente lipófilos se ha observado en diferentes estudios (13, 15). En contraste con el presente estudio, Helander et al. (11) observó una fuga de ATP a partir de células que fueron expuestas a carvacrol (2 mM). Sin embargo, este estudio se llevó a cabo con bacterias gram-negativas, que tienen una dotación de células diferentes. La observación de que ya bajas concentraciones de carvacrol (0,01 mM) provocan una disminución del potencial de membrana sugiere que la membrana se vuelve más permeable para los pro toneladas. Esta conclusión es apoyada por la observación de que exposición de las células a carvacrol también causa de la disipación gradiente de protones a través de la membrana. De conformidad con el estos resultados, Sikkema et al. (25) mostró un aumento de protones liposómica permeabilidad de las membranas durante la exposición a la te - tralin. Del mismo modo, Cartwright et al. (4) describe la disipación de el pH en presencia de etanol, debido a una mayor afluencia de protones. Análisis de la intracelulares y extracelulares de potasio piscinas de manifiesto unaumento de la permeabilidad de la membrana de la célula para K a la exposición a carvacrol. K es el principal cytoplas ción del crecimiento de micro células bacterianas, que participan en varias funciones de las células bacterianas. Este ión juega un papel en la activación citoplásmica de las enzimas, el mantenimiento de la presión de turgencia seguro y, posiblemente, la regulación de la citoplásmica de pH (2). Diferentes estudios demostraron que un flujo de salida de iones de potasio es un primera indicación de daños en la membrana de las bacterias (10, 24, 30). depende sobre todo de la concentración de potasio en la célula (2). Heipieper et al. (9) mostraron una significativa a la excreción de K el entorno externo durante la exposición de Pseudomonas putida P8 al fenol. Gradientes de solutos a través de la cytoplas - micrófono de membrana que utilicen H como el acoplamiento de iones puede ser ambién afectados por una dispersión de la fuerza motriz de protones. Aunque no hubo efecto inmediato de carvacrol sobre la viabilidad a concentraciones de 1 mM y más bajo, claro los efectos en bioenergético diferentes parámetros se han observado. Células probablemente puede hacer frente a muy bajas concentraciones de carvacrol. No sólo la reducción de la síntesis de ATP por una dispersión de la la fuerza motriz de protones, pero también otros (secundaria) los efectos del auto - vacrol puede dar lugar a la acción bactericida o bacteriostático. Por ejemplo, una inhibición de varias enzimas, debido a las fugas esencial de iones, la pérdida de turgencia de presión, influencia sobre el ADN síntesis, la reducción de actividades metabólicas, y en otros procesos la célula puede ser una causa de la disminución de viabilidad durante la expo - Asegúrese de carvacrol. Una pérdida de integridad de membrana a causa de disturbio Bance hidrófobas de las interacciones entre los lípidos y proteínas es a menudo un factor importante al considerar la actividad de compuestos tóxicos (24). Se puede concluir que la hydropho - BIC carvacrol compuesto interactúa con las membranas de B. cereus por cambiar su permeabilidad para cationes como H y FIG. 5. Cambios en la intracelular (K en ) (E) y extracelular (K fuera ) (F) potasio piscinas de B. cereus células durante la exposición a 1 mM carvacrol. Las células fueron cultivadas en el BHI, lavado, y se mantendrá en Na-HEPES buffer (pH 7,0). Carvacrol se añadió en t 5 min. FIG. 4. Efecto del pH sobre el carvacrol en y pH de las células vegetativas de B. cereus. Las células fueron cultivadas en el BHI, lavado, y se incuban en un 50 mM fosfato de potasio tampón (pH 7) (véase Materiales y Métodos). K. La disipación de los gradientes de iones da lugar a alteraciones de la procesos esenciales en la célula y, por último, a la muerte celular. Este estudio muestra que el carvacrol tiene efectos biológicos en la con centraciones que son pertinentes para el sabor de los alimentos (por ejemplo, bebidas sin alcohol [0,18 mM/28.54 ppm], y productos horneados [15.75 ppm]) (8). A los productos asociados con brotes de B. cereus (por ejemplo, el arroz, la pasta, y la sopa), el carvacrol puede ser re ca como un antimicrobiano y un sabor complejo.